Material und Methoden - Digitale Bibliothek Thüringen

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FUNKTIONELLE LANGZEITEFFEKTE KORTIKALER
SPREADING DEPRESSIONS
DISSERTATION
zur Erlangung des akademischen Grades
doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.)
Vorgelegt dem Rat der Biologisch-Pharmazeutischen Fakultät der
Friedrich-Schiller-Universität Jena
von
Dipl. Biol. Anja Urbach
geboren am 13. November 1974 in Erfurt
Jena, den 05.06.2006
Gutachter:
1. Prof. Dr. O.W. Witte
Klinik für Neurologie, Friedrich-Schiller-Universität Jena
2. Prof. Dr. J. Bolz
Institut für Allgemeine Zoologie und Tierphysiologie, Friedrich-Schiller-Universität Jena
3. Prof. Dr. U. Dirnagl
Klinik für Neurologie, Charité - Universitätsmedizin Berlin
Inhaltsverzeichnis
INHALTSVERZEICHNIS
EINLEITUNG …………………………………………………………………………………………………………..
1
Leao´s Spreading Depression ...……………………………………………………………………………...
1
Theorien zu Entstehungs- und Ausbreitungsmechanismen der SD ..............................................
2
Elektrophysiologische Veränderungen und Ionenverschiebungen ................................................
3
Metabolische Konsequenzen und hämodynamische Effekte .........................................................
4
Einfluss von SD auf die Genexpression ............................................................................................... 6
Pathophysiologische Bedeutung von SD ...........................................................................................
6
SD und Periinfarktdepolarisationen .....................................................................................................
6
SD und Ischämietoleranz ......................................................................................................................
7
Hinweise auf SD im menschlichen Gehirn – Relevanz für Migräne, Schädel-Hirn-Trauma
und Schlaganfall .....................................................................................................................................
7
Neurogenese im adulten Gehirn ...........................................................................................................
9
FRAGESTELLUNG UND ZIELSETZUNG ................................................................................................ 13
MATERIAL UND METHODEN ..................................................................................................................... 14
Versuchstiere ........................................................................................................................................... 14
Projekt 1: Genexpressionsstudie ......................................................................................................... 14
Induktion der Spreading Depressions (SD) und elektrophysiologische Ableitungen .................. 14
RNA Isolierung ........................................................................................................................................ 15
Genexpressionsanalyse mittels Affymetrix Microarrays ................................................................... 16
Erzeugung der Kandidatengen-Listen ................................................................................................. 18
Quantitative RT-PCR .............................................................................................................................. 19
Immunhistochemie (Peroxidase Technik) und Immunfluoreszenz ................................................. 21
Projekt 2: Neurogenesestudie ............................................................................................................... 23
Induktion der Spreading Depressions (SD), MK-801-Injektion und elektrophysiologische
Ableitungen .............................................................................................................................................. 23
Induktion der photothrombotischen Läsionen (PT) ........................................................................... 24
Bromodeoxyuridin-Injektionen .............................................................................................................. 25
Gewebepräparation ................................................................................................................................ 26
BrdU-Immunhistochemie und Immunfluoreszenz ............................................................................. 26
Volumetrie ................................................................................................................................................ 27
Quantifizierung und statistische Analysen .......................................................................................... 28
Projekt 3: Verhaltenstests ....................................................................................................................... 29
Traditionelles Morris Water Maze ........................................................................................................ 29
Modifiziertes Morris Water Maze ……………………………………………………………………………. 31
Statistik ..................................................................................................................................................... 33
Inhaltsverzeichnis
ERGEBNISSE ................................................................................................................................................. 35
Projekt 1: Genexpressionsstudie ......................................................................................................... 35
Ergebnisse der Transkriptomanalyse ..................................................................................................
35
Datenvalidierung ..................................................................................................................................... 43
Quantitative RT-PCR von gepoolten und Einzelproben .........................................................................
43
Proteinexpression ...................................................................................................................................
44
Projekt 2: Neurogenesestudie ...............................................................................................................
48
Kortikale SD steigern die Anzahl neugeborener Zellen im adulten Gyrus dentatus .................... 48
Kortikale SD steigern die Neuroneogenese im adulten Gyrus dentatus ........................................
51
Hippocampale Neurogenese nach kortikalen photothrombotischen Infarkten ............................. 53
Volumetrische Analyse .......................................................................................................................... 54
Korrelation des histologischen Schadens im zerebralen Kortex mit der Neurogeneserate
im Gyrus dentatus ................................................................................................................................... 55
Projekt 3: Verhaltenstests ....................................................................................................................... 57
Standard Morris Water Maze ................................................................................................................ 57
Modifiziertes Water Maze ……………………………………………………………………………………...
60
DISKUSSION ................................................................................................................................................... 63
Differentielle Genexpression nach kortikaler SD .............................................................................
63
Kann die Microarray-basierte Genexpressionsanalyse einen repräsentativen Überblick
über die molekularen Veränderungen nach SD geben? ..................................................................
63
SD reguliert unterschiedliche funktionelle Gruppen von Genen über einen langen
Zeitraum hinweg .....................................................................................................................................
66
Mögliche Schlussfolgerungen zur SD-vermittelten Ischämietoleranz ............................................
70
Vergleich der Genexpressionsmuster nach SD und Schlaganfall ..................................................
71
Hippocampale Neurogenese und räumliches Lernen ....................................................................
73
Kortikale SD steigern die hippocampale Neuroneogenese – Spekulationen zum
Mechanismus der Infarkt-vermittelten Neurogenese ........................................................................
75
Die kortikale Läsion per se – (k)ein Modulator hippocampaler Neurogenese? ............................
80
BrdU als Proliferationsmarker .............................................................................................................. 81
Funktionelle Relevanz der gesteigerten Neurogenese im Gyrus dentatus ................................... 81
ZUSAMMENFASSUNG ................................................................................................................................. 84
REFERENZEN ................................................................................................................................................ 86
ANHANG ..........................................................................................................................................................
I
DATEN DER MICROARRAY-EXPRESSIONSANALYSE ...................................................................
I
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS .................................................................................................................
X
PUFFER UND CHEMIKALIEN .................................................................................................................
XI
Injektionen, Perfusion und histologische Färbungen .....................................................................
XI
Inhaltsverzeichnis
OP und Präparation ………………………………………………………………………………………….
XIII
Molekularbiologische Analysen ........................................................................................................ XIV
EHRENWÖRTLICHE ERKLÄRUNG ......................................................................................................... XVI
DANKSAGUNG ............................................................................................................................................. XVII
LEBENSLAUF ................................................................................................................................................ XVIII
EIGENE PUBLIKATIONEN ......................................................................................................................... XIX
Die Philosophie steht in diesem riesigen Buch geschrieben, das uns ständig offen vor Augen
liegt (…). Aber man kann es nicht verstehen, wenn man nicht zuvor die Sprache lernt und die
Schriftzeichen kennt, in denen es geschrieben ist … Ohne diese Mittel … ist es ein
vergebliches Umherirren in einem dunklen Labyrinth.
Galileo Galilei
- meiner Familie -
1
Einleitung
EINLEITUNG
Der Begriff der Spreading Depression (SD) wurde 1944 durch den brasilianischen Physiologen
Aristides A. P. Leao geprägt. Er beobachtete nach elektrischer Stimulation des Kaninchenkortex eine
transiente Reduktion der spontanen elektrischen Aktivität („spreading depression of the spontaneous
cortical activity“), die sich mit 2-5 mm/min vom Ort der Stimulation in alle Richtungen über den Kortex
ausbreitete [1], (Abb. 1A). Gleichzeitig registrierte er in den betroffenen Arealen Änderungen des
kortikalen Gleichspannungspotentials [6]. Leao war auch der erste, der die mit SD einhergehenden
Blutflussveränderungen
beschrieb
[12]
und
zusammen
mit
R.
S.
Morisson
SD
als
neurophysiologisches Korrelat des wandernden Flimmerskotoms bei Migränepatienten vermutete [13].
Die Physiologie der SD und ihre Bedeutung für die Funktion des Gehirns sind bis heute nicht
vollständig aufgeklärt. Es wurde lange vermutet und besonders in den letzten 20 Jahren verdichteten
sich die Hinweise, dass SD mit einer Reihe neurologischer Erkrankungen, wie der Migräne [15], dem
Schlaganfall [16] oder dem Schädel-Hirn-Trauma [18, 19] assoziiert sind. Es bleibt jedoch nach wie
vor offen, inwieweit SD zur Pathophysiologie dieser Krankheiten beitragen.
Leao´s Spreading Depression
Spreading Depression (SD) können tierexperimentell durch chemische (anorganische Ionen, wie K+,
Rb+; metabolische Inhibitoren, z.B. Ouabain; depolarisierende Aminosäuren, wie Glutamat oder
Aspartat), mechanische (Nadelstich, Berührung mit stumpfen Gegenstand) oder elektrische Reizung
ausgelöst werden [1, 13, 20]. Sie lassen sich nicht nur im zerebralen Kortex, sondern in der grauen
Substanz nahezu jeder Region des zentralen Nervensystems induzieren [20]. Es gibt jedoch eine
klare Prädisposition für Areale mit hoher Neuronendichte. Auch das Alter ist von entscheidender
Bedeutung, im adulten Gehirn lassen sich SD bedeutend einfacher auslösen als in jungem Gewebe
[22]. Dies hängt möglicherweise mit der altersbedingten Schrumpfung des Interstitiums oder der
Reifung der Transmittersysteme zusammen. Nach wie vor ist nicht geklärt, warum SD ohne weiteres
bei lissenzephalen Tieren, aber mit zunehmenden Grad kortikaler Gyrierung immer schwieriger
auslösbar sind [22]. Bei gyrenzephalen Tieren stellen größere Furchen anatomische Grenzen für die
2
Einleitung
Ausbreitung von SD dar, während sie sich im ungefurchten Gehirn über den gesamten ipsilateralen
Kortex ausbreiten.
Theorien zu Entstehungs- und Ausbreitungsmechanismen der SD
Bis heute sind die Mechanismen, die zur Entstehung und Ausbreitung von SD führen, nicht
zufriedenstellend aufgeklärt. Der erste Erklärungsansatz – van Harreveld´s Asphyxie-Hypothese –
wurde unmittelbar wieder verworfen. Er vermutete, dass SD durch eine sich wellenförmig über den
Kortex ausbreitende Vasodilatation verursacht werden, die durch Abfall des Sauerstoffpartialdrucks
zum Stillstand der kortikalen Aktivität führt [23]. Noch im selben Jahrzehnt wurden zwei weitere
Theorien entwickelt: Grafstein´s Kalium-Hypothese und van Harreveld´s Glutamat-Hypothese.
Grafstein postulierte 1956 basierend auf einer Reihe von Experimenten, dass es initial durch starke
neuronale Aktivität zu einem massiven Anstieg der extrazellulären K+-Konzentration kommt, welche zu
einer weiteren Depolarisation und schlussendlich Inaktivierung der Neuronen führt, aus denen K+
freigesetzt wurde. Gleichzeitig diffundiert ein Teil des akkumulierten K+ zu benachbarten Zellen und
bewirkt deren Depolarisation, usw. [24]. Dies nahm sie als kritisches Ereignis für die Selbstausbreitung
von SD an. Drei Jahre später wurde die Glutamat-Hypothese durch van Harreveld aufgestellt [25]. Er
vermutete, dass Glutamat als exzitatorische Substanz zur Ausbreitung von SD beiträgt. Diese
Hypothese wird durch Studien gestützt, die zeigen konnten, dass es durch SD zu einer Erhöhung der
extrazellulären
Glutamatkonzentration
kommt
[26]
und
dass
sich
SD
durch
NMDA-
Rezeptorantagonisten blockieren lassen [27, 28]. Es gibt jedoch auch eine Reihe von
Untersuchungen, die die Gültigkeit dieser Theorien in Frage stellen. Unter anderem sprechen zwei
Befunde gegen Grafstein´s Hypothese: Erstens sind SD nicht durch Tetrodotoxin blockierbar, somit
scheint neuronale Aktivität nicht ausschlaggebend für die Auslösung von SD zu sein [29]. Zweitens
ließe die Theorie erwarten, dass der SD-Welle (DC-Potentialänderungen) eine Erhöhung des
extrazellulären K+ vorausgeht, auch dies konnte nicht bestätigt werden - beide Phänomene treten
simultan auf [30]. Die Notwendigkeit einer erhöhten extrazellulären Glutamatkonzentration zur
Auslösung und Ausbreitung einer SD-Welle erscheint inzwischen ebenfalls zweifelhaft [31].
Neuerdings wird ein transzellulärer Ausbreitungsmechanismus über gap junctions diskutiert [33, 34].
Basierend auf diesen und neueren Arbeiten [35, 36], entwickelte Nedergaard ein Modell, welches die
Beteiligung von Kalziumwellen an der Initiation und Ausbreitung von SD beschreibt [37].
3
Einleitung
Zusammengenommen ist die Kausalkette der Ereignisse, die zur Generierung und Ausbreitung einer
SD führen, bis heute nicht schlüssig aufgeklärt. Der Prozess scheint sehr viel komplexer, als von
Grafstein und van Harreveld angenommen, und auf einer Kaskade von Ereignissen zu beruhen. Der
folgende Abschnitt soll einen Überblick der heute allgemein akzeptierten Theorien zur Physiologie und
Ausbreitung von SD geben (Abb. 1).
Elektrophysiologische Veränderungen und Ionenverschiebungen
Aufgrund der massiven simultanen Depolarisation der Zellen des Hirnparenchyms kommt es während
der SD zu einer deutlichen Negativierung des Gleichspannungspotentials (DC) um 5 bis 20 mV [1,
24]. Dieses kehrt sich nach 1-2 min um (Repolarisation) und geht in eine schwache, 3-5 min dauernde
Positivierung (Hyperpolarisation) über (Abb. 1C). Gelegentlich geht der Negativierung eine kleinere
positive Welle voran [6, 20]. Am Beginn der DC-Potentialänderungen steht gewöhnlich ein kurzer, 2-3
s dauernder Anstieg neuronaler Aktivität (population spikes, burst of single unit activity) [24], gefolgt
von 1-2 min absoluter „Stille“ [20]. Damit verbunden tritt eine vorübergehende Depression der
spontanen EEG-Aktivität ein, welche erst nach etwa 5 -10 min vollständig wiederhergestellt wird [1].
Diesen
elektrophysiologischen
Phänomenen
liegen
drastische
Verschiebungen
intra-
und
extrazellulärer Ionengradienten zugrunde [20, 22]. Durch eine initiale Erhöhung der extrazellulären
Kaliumkonzentration ([K+]e) von 3 mM auf etwa 10-12 mM kommt es zur Depolarisation von Neuronen
und Gliazellen. Dies zieht einen weiteren Anstieg der [K+]e auf etwa 60-70 mM nach sich und führt zur
Öffnung von spannungsabhängigen Kalziumkanälen in den präsynaptischen Terminalen, so dass
Kalzium-Ionen
in
Neurotransmitter
die
Zellen
freigesetzt.
einströmt.
Glutamat
Folglich
aktiviert
werden
exzitatorische
rezeptorgekoppelte
und
inhibitorische
Kationenkanäle
an
den
postsynaptischen Membranen der Nachbarzellen, wodurch Natrium- und Kalzium-Ionen einströmen
und zu deren Depolarisation führen. Die inhibitorischen Transmitter öffnen Anionenkanäle und
verursachen dadurch einen Einwärtsstrom von Chlorid. Im Zuge dessen kommt es zu einem Abfall der
[Ca2+]e von 1.3 auf etwa 0.07 mM, der [Na+]e von ca. 150 auf etwa 60 mM und der [Cl-]e von etwa 130
auf ca. 70 mM [20, 38, 39], (Abb. 1B). Den Ionenverschiebungen folgt freies Wasser nach, was ein
Anschwellen der Zellen und eine Schrumpfung des Extrazellulärraums um ca. 50 % verursacht [40,
41]. Unter normoxischen Bedingungen und adäquater Glukoseversorgung kehren die meisten
Ionenkonzentrationen innerhalb einer Minute zu ihren Ausgangswerten zurück [15].
4
Einleitung
In diese Prozesse sind sowohl Neuronen als auch Gliazellen involviert. Letztere sind beispielsweise
an der Entfernung von überschüssigem K+ aus dem Extrazellulärraum (clearance) und dessen
Transport in benachbarte Bereiche beteiligt (spatial buffering) [42, 43]. Zudem ist ein Teil des
freigesetzten Glutamats glialen Ursprungs [22, 43].
Metabolische Konsequenzen und hämodynamische Effekte
Grafstein wies bereits 1956 nach, dass die Erholung von SD ein oxidativer, energiefordernder Prozess
ist [24]. Insbesondere nach repetitiven SD benötigen die Zellen zusätzliche Energie für die Restitution
der
transmembranalen
Ionengradienten.
Dies
spiegelt
sich
in
einer
Verdopplung
des
Glukoseverbrauches und einem um 50 % erhöhten Sauerstoffverbrauch wider [44, 45], der
Glukosetransport aus dem Blut ins Gewebe nimmt zu [45]. Ein Teil der Glukose wird anaerob
verstoffwechselt, was einen Anstieg der Lactatkonzentration um etwa 100 % und einen
vorübergehenden Abfall des pH-Wertes mit sich bringt [46, 47]. Diese Prozesse gehen mit einer
vorübergehenden Reduktion der energiereichen Substrate Phosphokreatin (um > 40 %), Glykogen
(um ca. 30 %) und ATP einher [47-49]. Durch den Anstieg der oxidativen Phosphorylierung sinkt das
NADH/NAD+-Verhältnis während der Repolarisation des Gewebes [44, 50], (Abb. 1B).
Die beschriebene metabolische Aktivierung während SD ist für 1 - 3 min mit einer Vasodilatation und
einem Anstieg des regionalen zerebralen Blutflusses um bis zu 250 % gekoppelt [51]. Daran schließt
sich eine etwa eine Stunde anhaltende Vasokonstriktion mit Verminderung des Blutflusses um 20 30 % an [51-53], (Abb. 1B).
Zusätzlich zu den bisher beschriebenen Veränderungen führen SD auch zu Modifikationen der
Proteinsynthese. Krivanek zeigte bereits 1970, dass es unmittelbar nach SD zu einer transienten
Verminderung der ipsilateralen Proteinsynthese ([14C]Leucin-Einbau) kommt. Diese erreicht ihr
Minimum eine Stunde nach SD und kehrt in den folgenden fünf Stunden zum Ausgangslevel zurück
[54]. Dieser Befund wurde durch nachfolgende Studien bestätigt [55], so dass allgemein angenommen
wurde, dass SD, vermutlich aufgrund des erhöhten Energieverbrauches für die Restoration der
Ionenhomeostase, zu einer generellen Verminderung der Eiweißsynthese führen. Kawahara et al.
konnten jedoch später zeigen, dass SD langfristig zu einer Erhöhung der ipsilateralen Proteinsynthese
führen (am Tag 3) [56]. Immunhistochemische Studien identifizierten eine Reihe von Proteinen (Cox-2,
5
Einleitung
Abb. 1 Änderungen physiologischer Parameter während
einer Spreading Depression (SD). (A) Leao´s originale
Illustration einer SD von 1944 [1]. Die Spuren zeigen eine
räumlich und zeitlich aufgelöste elektrokortikographische
Ableitung vom Kaninchenkortex nach elektrischer
Stimulation. Im Schema rechts oben sind die Positionen
der Stimulations- (S) und Ableitelektroden eingezeichnet.
(B) Änderungen der Elektrolytkonzentrationen, metabolischer Parameter und des Blutflusses, modifiziert nach
[5]. (ADC = Wasserdiffusionskoeffizient; ATP =
Adenosintriphosphat; CBF = zerebraler Blutfluss, CBV =
zerebrales
Blutvolumen;
Glukose
=
interstitielle
Glukosekonzentration; pO2 = Sauerstoffpartialdruck; ∅ =
Durchmesser;). (C) zeigt die mit einer SD assoziierten
Veränderung des DC-Potentials; aus Leao 1947 [6].
Einleitung
6
BDNF, hsp27, GFAP etc.), deren Abundanz zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach SD parallel zu der
der entsprechenden Transkripte zunahm [10, 56-61].
Einfluss von SD auf die Genexpression
Neben den bisher beschriebenen elektrophysiologischen und metabolischen Veränderungen münden
SD auch in einer Beeinträchtigung der Genexpression. Beispielsweise werden unmittelbar nach SD
eine Reihe von immediate early Genen (z.B. c-Fos, c-Jun), Hitzeschockproteinen (z.B. hsp27, hsp32)
oder inflammatorischen Genen (z.B. MCP-1, Cox-2) induziert [21, 57, 61-63]. In weiteren Studien
konnte die Expression von Genen, welche für Wachstumsfaktoren oder deren Rezeptoren kodieren
(z.B. BDNF, bFGF, trkB), belegt werden [64-66]. Andere Arbeiten zeigten eine Heraufregulation von
GFAP in Astrozyten und eine Beeinflussung von Genen, die für vasoreaktive Proteine oder
Neurotransmitter kodieren [10, 59, 67-69].
Pathophysiologische Bedeutung von SD
SD und Periinfarktdepolarisationen
Nach experimentell induzierten fokalen ischämischen Hirninfarkten treten, vermutlich durch die
anoxische Freisetzung von Kalium-Ionen und Glutamat aus dem Infarktkern, repetitive SD-ähnliche
Periinfarktdepolarisationen (PID) auf [70-72]. Diese pflanzen sich vom Rand des infarzierten Gewebes
über die Penumbra1 bis hinein in benachbarte normoxische Regionen fort. Während jedoch SD im
normal perfundierten Gehirn keinen anatomischen Schaden verursachen [73], führen repetitive PID
durch den gesteigerten metabolischen Stress zu einer sekundären Expansion des irreversibel
geschädigten Infarktgebietes auf Kosten der Penumbra [71, 74]. Hierbei gibt es eine lineare
Korrelation zwischen der Anzahl der PID und dem finalen Infarktvolumen [74]. Lange wurde
angenommen, dass PID hauptsächlich in den ersten 5-6 Stunden nach einer fokalen Ischämie
auftreten, neuere Studien zeigten jedoch, dass es nach einer Pause von mehreren Stunden zu einer
zweiten Phase von PID kommt, die bis zu einem Tag anhalten und zur sekundären Reifung des
Infarktes beitragen [75].
___________________________________________________________________________
1
Penumbra = der den Infarktkern umschließende Hirnbereich mit eingeschränkter Blutversorgung, jedoch vorhandenem
Energiestoffwechsel; die hier auftretenden ischämischen Schädigungen sind potentiell reversibel
Einleitung
7
Studien nach experimentell induzierter fokaler Ischämie in Ratten zeigten eine differentielle
Genexpression sowohl im ischämischen Kortex, als auch in entfernten normoxischen Gebieten
(remote). Es wurde angenommen, dass die meisten dieser ipsilateral remote auftretenden
Veränderungen durch PID verursacht werden [7, 11, 76, 77]. Dies konnte beispielsweise für einige
immediate early Gene (JunB, c-Jun, c-Fos), BDNF, Cox2 und Hitzeschockproteine (hsp27, hsp32)
bestätigt werden [11, 21, 57, 63, 76, 78, 79]. Demgegenüber bleibt der Zusammenhang mit SD für
andere nach fokaler Ischämie beschriebene Genexpressionsänderungen (z.B. NGFI-B, MIP-1α, Stat3,
synaptophysin) im remote Kortex bis heute offen. Eine Zusammenfassung der Ereignisse, die nach
fokalen Ischämien auf entfernte, nicht-ischämische Kortexgebiete wirken (z.B. Ödembildung,
Deafferentierung, Exzitotoxizität, SD), geben verschiedene Übersichtsarbeiten [80, 81].
SD und Ischämietoleranz
Im Gegensatz zu den unmittelbar schädigenden Effekten der SD-ähnlichen PID nach experimentell
induzierten Infarkten, können SD auch zu einer Toleranzentwicklung gegenüber einer nachfolgend
auftretenden Ischämie führen. Zwischen der sog. Präkonditionierung des normoxischen Gehirns mit
SD und der Ischämieinduktion muss jedoch mindestens ein Tag liegen. Der protektive Effekt konnte
sowohl bei globalen [82] als auch bei fokalen [83-87] Ischämien beobachtet werden. Durch die
Präkonditionierung mit SD wurde das Ausmaß des Neuronensterbens als auch das Infarktvolumen
deutlich reduziert.
Bisher ist nicht geklärt, welche molekularen Mechanismen der Toleranzinduktion durch SD zugrunde
liegen. Als Kandidaten kommen unter anderem Transkriptionsfaktoren und immediate early Gene,
Hitzeschockproteine, antioxidative Proteine oder neurotrophe Faktoren in Frage [88]. Yanamoto et al.
zeigten, dass der durch SD verursachte protektive Effekt gegenüber einer mehrere Tage später
induzierten Ischämie durch knock out eines BDNF-Allels verhindert wird [89]. Es ist jedoch
anzunehmen, dass die Toleranzinduktion nicht auf einzelnen molekularen Veränderungen sondern auf
einem Zusammenspiel mehrerer Faktoren beruht.
Hinweise auf SD im menschlichen Gehirn – Relevanz für Migräne, Schädel-HirnTrauma und Schlaganfall
Bis heute wird die Bedeutung kortikaler SD für die Pathogenese von neurologischen Erkrankungen
des Menschen kontrovers diskutiert. Der Nachweis im menschlichen Gehirn blieb bis vor kurzem
8
Einleitung
überaus schwierig, da man primär auf nicht-invasive Methoden angewiesen war. Erste Hinweise auf
ein SD-ähnliches Phänomen beim Menschen gaben die Beschreibungen der während eines seiner
Migräneanfälle auftretenden Auraereignisse von Lashley [90]. Leao and Morrision [13] waren die
ersten, die SD als Ursache des wandernden Flimmerskotoms der klassischen Migräne vermuteten.
Diese Idee wurde 1958 von Milner wieder aufgegriffen [91]. Er schloss aufgrund von
Übereinstimmungen zwischen Ausbreitungsgeschwindigkeit von SD im Tiermodell und der von
Lashley (1941) im Selbstversuch ermittelten Geschwindigkeit des wandernden Flimmerskotoms auf
eine Korrelation zwischen beiden Phänomenen. Spätere Beobachtungen stützten diese Hypothese:
Beispielsweise wiesen die im Zusammenhang mit der Migräneaura auftretenden neurologischen
Dysfunktionen auf Phasen erhöhter (Szintillationen, Paraesthesie) und verminderter (negative
Skotome, Anaesthesie) neuronaler Aktivität hin [92]. Beide Phänomene breiten sich hauptsächlich in
den oberen Kortexschichten aus [20], größere anatomische (z.B. Zentralsulcus) oder pathologische
Hindernisse (z.B. Glianarben) stellen Barrieren dar [20, 93, 94]. Als weiteres Indiz galt, dass die
Migräne-Aura meist im primären visuellen Kortex V1 (Area 17), einer Region mit sehr großer
Neuronendichte, startet. Konsistent lassen sich SD besser in Arealen mit hohem Neuron-Glia
Verhältnis
auslösen
[20].
Mit
dem
Aufkommen
bildgebender
Verfahren
konnten
weitere
übereinstimmende Charakteristika der Migräne-Aura und der experimentellen SD identifiziert werden.
In den 80-er Jahren fand man mit Hilfe der 133Xe-Methode heraus, dass die klassische Migräneattacke
von einer langanhaltenden Reduktion des kortikalen Blutflusses („spreading hypoperfusion“) begleitet
wird [52, 95-97]. Funktionelle MRT-BOLD-Untersuchungen (blood oxygenation level dependent
Magnetresonanztomographie) kamen zu ähnlichen Ergebnissen. Während einer visuellen MigräneAura wurden sich über den okzipitalen Kortex ausbreitende Signalveränderungen beobachtet, die eine
Welle neuronaler Erregung, gefolgt von verminderter neuronaler Aktivität, repräsentierten. Diese
wanderten parallel zur Ausbreitung der Migräne-Aura im Gesichtsfeld des Patienten mit einer
Geschwindigkeit von 3-6 mm/min über den Kortex [98, 99]. Die Magnetenzephalographie erbrachte
den ersten elektrophysiologischen Nachweis SD-ähnlicher Phänomene beim Menschen in vivo.
Bowyer et al. wiesen während des Auftretens von spontanen oder visuell evozierten Auren langsame
DC-Potentialänderungen nach, die sich wellenförmig über den Kortex ausbreiteten und mit einer
gesteigerten neuronalen Aktivität gekoppelt waren [100].
Der direkte Nachweis, dass SD überhaupt in der grauen Substanz des menschlichen Gehirns
ausgelöst werden können, gelang bereits vor etwa 30 Jahren [101]. Die Autoren mikroinjizierten KCl in
9
Einleitung
den Hippocampus oder den Nucleus caudatus von Epilepsiepatienten und lösten dadurch SD aus.
Eine Reihe weiterer Hinweise ergab sich aus in vitro Studien an operativ entferntem Kortexgewebe
von Epilepsiepatienten. Gorji et al. waren in der Lage, in neokortikalen Schnitten durch KCl-Injektion
die für SD charakteristischen wandernden Änderungen des DC-Potentials auszulösen [102]. Diese
bewegten
sich
mit
der
typischen
Geschwindigkeit
fort
und
waren
durch
den
NMDA-
Rezeptorantagonisten APV (2-amino-5-Phosphonovalerat) blockierbar. Ähnliche Beobachtungen
wurden bereits vorher von Avoli et al. gemacht [103].
Es blieb jedoch weiterhin spekulativ, ob SD im Kontext von traumatischen Hirnverletzungen oder des
Schlaganfalls beim Menschen auftreten. Mayevski beobachtete 1996 als erster spontan auftretende
repetitive SD-ähnliche Ereignisse bei einem von 14 Schädel-Hirn-Trauma-Patienten [104]. Diese
zeichneten sich durch die für SD typischen Änderungen des ECoG, von [K+]e, des zerebralen
Blutflusses und -volumens aus. Aufgrund technischer Einschränkungen blieb jedoch ungeklärt, ob sich
das Phänomen ausbreitet oder nicht. Sechs Jahre später führten Strong et al. eine klinische Studie an
Patienten mit traumatischen Kopfverletzungen durch [19]. Hier wurde das ECoG direkt durch
Elektrodenstreifen vom periläsionellen Kortex abgeleitet. Bei 5 Patienten wurden episodische ECoGAmplitudenänderungen detektiert, die mit einer Geschwindigkeit von 0.6 - 5 mm/min über den Kortex
propagierten (n = 29). In der in diesem Jahr veröffentlichten Folgestudie wurden erstmals
überzeugend repetitive Periinfarktdepolarisationen in Patienten mit Subarachnoidalblutungen
nachgewiesen [105]. Es bleibt abzuwarten, ob sich diese Befunde auch nach primär ischämischen
Infarkten (etwa 80-85 % aller Schlaganfälle) reproduzieren lassen.
Neurogenese im adulten Gehirn
Während der Ontogenese eines Organismus von der befruchteten Eizelle zum erwachsenen
Lebewesen werden alle Gewebe aus spezifischen, proliferierenden Vorläuferzellen gebildet. Im
Embryo entwickeln sich nach und nach Organanlagen, aus denen Organe entstehen, deren Zellen
sich weiter zu Geweben spezialisieren. Im Zuge dessen erfahren die Zellen eine immer stärkere
Einengung ihrer Entwicklungsmöglichkeiten: Am Beginn steht die totipotente Zygote (Totipotenz =
Fähigkeit, einen kompletten lebensfähigen Organismus hervorzubringen), aus der pluripotente
Stammzellen (Pluripotenz = Fähigkeit einer Zelle, nahezu jeden Zelltyp eines Organismus
hervorzubringen, z.B. embryonale Stammzellen), multipotente (fähig, verschiedene Zelltypen zu
Einleitung
10
bilden) und unipotente Vorläuferzellen (können Zellen desselben Zelltyps bilden) und letztendlich
terminal differenzierte, i.d.R. teilungsunfähige Zellen, hervorgehen. Dabei behalten viele Organismen
ein gewisses Potential, verloren gegangene Zellen zu regenerieren. Hierfür sind adulte Stammzellen
verantwortlich, die sich ein Leben lang erneuern und dadurch Kopien ihrer selbst und spezialisierte
Zellen des jeweiligen Organs hervorbringen können. Adulte Stammzellen persistieren in fast allen
Organen und Geweben von Vertebraten, wie dem Knochenmark, der Epidermis, dem Darm oder der
Haut [106, 107].
Lange nahm man an, dass das zentrale Nervensystem eine relativ starre, unveränderliche Struktur
ohne Fähigkeit zur Regeneration sei. Diese Vorstellung, die z.T. auf den spanischen Mediziner S.
Ramón y Cajal zurückgeht, blieb dogmatisch über Jahrzehnte erhalten, so dass erste Arbeiten, die die
Entstehung neuer Zellen im adulten Gehirn zeigten, zunächst wenig Anerkennung fanden [108-110].
Erst als Kaplan und Hinds 1977 [111] eindeutig nachweisen konnten, dass es sich bei den neu
gebildeten Zellen im olfaktorischen Bulbus und Gyrus dentatus der adulten Ratte tatsächlich um
Neurone handelt, fand das Konzept der Regenerationsfähigkeit des Gehirns langsam Beachtung. In
den folgenden Jahren gelang der Nachweis adulter Neurogenese in einer Reihe von Vertebraten, so
z.B. in Schildkröten und Vögeln [112], Nagetieren [113, 114], Primaten [115, 116] bis hin zum
Menschen [117].
Es stellte sich heraus, dass im Gehirn von adulten Säugetieren hauptsächlich zwei Regionen
kontinuierlicher Neurogenese existieren – die Subventrikulärzone der lateralen Ventrikel und die
Subgranulärzone des Gyrus dentatus (Abb. 2). In beiden Regionen gibt es eine Population sich
teilender Stamm- und Vorläuferzellen, deren Tochterzellen zu Neuronen oder Gliazellen differenzieren
können. Allerdings überlebt nur ein Teil der neugeborenen Zellen, viele werden über apoptotische
Mechanismen eliminiert [118].
Die in der adulten Subventrikulärzone gebildeten Vorläuferzellen wandern entlang des rostralen
Migrationsstroms zum olfaktorischen Bulbus, wo sie hauptsächlich zu GABA-ergen Interneuronen
ausdifferenzieren, in die Körnerzellschicht integriert werden [113, 119] und funktionelle synaptische
Verbindungen ausbilden [120]. Hinweise darauf gaben Studien, die demonstrierten, dass sich die
Neurogenese im olfaktorischen System von Nagetieren durch sensorische Deprivation hemmen lässt
[121] und dass dieser Effekt umkehrbar ist, wenn die Geruchsdeprivation aufgehoben wird [122].
Außerdem scheinen diese Zellen eine Rolle für die Ausprägung mütterlicher Brutpflege zu spielen –
Schwangerschaft führt bei Ratten zur Steigerung der Neurogenese in der subventrikulären Zone [123].
11
Einleitung
A
B
Abb. 2 Adulte Neurogenese. (A)
Überblick über die Neurogenese im
olfaktorischen System. Die Zeichnung
oben links zeigt einen Saggitalschnitt,
oben rechts einen Koronalschnitt durch
das Hirn der Ratte. In der Seitenwand
(SVZ) der lateralen Ventrikel (LV)
befinden
sich
proliferierende
Stammzellen, aus denen sog. „transit
amplifying
cells“
(Vorläuferzellen)
hervorgehen, welche wiederum der
Ursprung von Neuroblasten sind. Diese
wandern
entlang
des
rostralen
Migrationsstroms
(RMS)
zum
olfaktorischen Bulbus (OB), integrieren
sich in dessen neuronales Netzwerk und
differenzieren zu Interneuronen (E – Ependymzelle, GL – glomeruläre Schicht, EPL – externe plexiforme Schicht). (B)
Neurogenese im adulten Gyrus dentatus. Die Stammzellen des Hippocampus sind in der subgranulären Zone (SGZ) des Gyrus
dentatus (DG) lokalisiert. Die daraus hervorgehenden Neuroblasten wandern ins Stratum granulare (GCL) ein und
differenzieren zu Körnerzellen. Ein Teil der Zellen wird durch Apoptose eliminiert. Die Abbildung wurde modifiziert nach [2].
Einleitung
12
Im Hippocampus werden neue Zellen an der Grenze zwischen Hilus und Körnerzellschicht gebildet
(subgranuläre Zone). Die neuen Zellen verteilen sich entlang der Subgranulärzone, von dort wandern
die Neuroblasten entlang der Fortsätze existierender Neurone und Radialglia-artiger Zellen in die
Körnerzellschicht ein [124]. Hier differenzieren sie zu Neuronen, die morphologisch und
immunzytochemisch nicht von Körnerzellen zu unterscheiden sind. Diese werden vollständig ins
hippocampale Netzwerk integriert: sie entsenden Axone in die CA3-Region, bilden Synapsen aus und
nehmen die elektrophysiologischen Eigenschaften adulter Körnerzellen an [125, 126]. Die
physiologische Funktion der neu gebildeten Zellen im Gyrus dentatus ist bis heute nicht
zufriedenstellend aufgeklärt, eine Reihe von Arbeiten sprechen jedoch dafür, dass sie an
Lernvorgängen und der Gedächtnisbildung beteiligt sind [127]. Beispielsweise konnten van Praag et
al. zeigen, dass eine Steigerung der adulten Neurogenese mit gesteigerter Langzeitpotenzierung
(LTP) einhergeht. Versuche, die hippocampale Neurogenese durch Bestrahlung oder Zytostatika
auszuschalten, resultierten in einer gestörten Leistung in einigen Hippocampus-abhängigen
Lernaufgaben [128-131]. Vermutlich ist eine gestörte hippocampale Neurogenese auch für die
Ausbildung depressiven Verhaltens mitverantwortlich. Diese Hypothese wird gestützt durch die
Beobachtung, dass der Hippocampus depressiver Patienten stark atrophiert ist [132] und dass eine
antidepressive Behandlung im Tierexperiment zu einer Erhöhung der hippocampalen Neurogenese
führt [133, 134].
Die proliferative Aktivität in den neurogenen Zonen ist durch diverse physiologische und
pathophysiologische Einflüsse modulierbar. Zu den physiologischen Aktivatoren gehören z.B. eine
komplexe Umgebung, physische Aktivität oder Lernaufgaben [135-138]. Außerdem hängt die
Neurogenese stark vom Hormonstatus des Tieres ab. Beispielsweise wurde gezeigt, dass eine
Östrogenbehandlung die Proliferation hippocampaler Vorläuferzellen steigert [139], während die
stressbedingte Freisetzung von Glukokortikoiden zu einer Hemmung hippocampaler Neurogenese
führte [140]. Weiterhin kommt es infolge epileptischer Anfälle [141, 142], globaler oder fokaler
ischämischer Infarkte [143, 144] oder einer Elektrokrampftherapie [133, 145] zu einer massiven
Induktion von Neurogenese im Hippocampus und/oder der Subventrikulärzone.
13
Fragestellung und Zielsetzung
FRAGESTELLUNG UND ZIELSETZUNG
Spreading depressions (SD) treten im Kontext verschiedener neurologischer Erkrankungen auf,
darunter auch dem ischämischen Schlaganfall und der Migräne. Nach wie vor ist nicht geklärt,
welchen Teil sie zur Pathophysiologie dieser Erkrankungen beitragen. Hierzu ist es notwendig,
zunächst die Konsequenzen, die sich aus den SD allein ergeben, besser zu verstehen. Dazu sollte
diese Arbeit einen Beitrag leisten.
Zwar wurde bereits in den 90-er Jahren mit der Expressionsanalyse einzelner Gene und Proteine
nach SD begonnen, allerdings existiert bis heute keine Studie, die das Muster und die zeitliche
Dynamik der molekularen Veränderungen nach SD beschreibt. Daher war das erste Ziel der
vorliegenden Arbeit, einen umfassenden chronologischen Einblick in die durch SD verursachten
molekularen Veränderungen zu gewinnen. Dazu wurden SD in vivo durch Applikation hyperosmolarer
KCl-Lösung auf den Rattenkortex induziert und deren Auswirkung auf die Genexpression nach
unterschiedlichen Überlebenszeiten mit Hilfe von Affymetrix Microarrays analysiert. Hilfsmittel zur
Datenvalidierung waren quantitative PCR und die Immunhistochemie ausgewählter Proteine.
Weiterhin bestand Grund zu der Annahme, dass SD bzw. Periinfarktdepolarisationen (PID) an der
nach fokalen Ischämien beobachteten Steigerung der Neurogenese beteiligt sein könnten. Während
eine aktuelle Studie zeigte, dass SD die Zellproliferation in der subventrikulären Zone induzieren
[146], ist bis heute ist nicht bekannt, ob sie auch in die Regulation hippocampaler Neurogenese
eingreifen. Diesem Thema widmete sich der zweite Teil dieser Arbeit. Hierzu wurden Zellproliferation
und
-differenzierung,
sowie
die
Apoptose
im
Gyrus
dentatus
von
SD-Ratten
mittels
immunhistologischer Methoden analysiert. In diesem Kontext ergab sich die dritte Fragestellung: Falls
SD die hippocampale Neurogenese beeinflussen, üben sie dann auch einen Langzeiteffekt auf
hippocampale Funktionen aus? Zur Beantwortung dieser Frage wurden SD-Ratten in einem
hippocampus-abhängigen Lernparadigma – dem Morris Water Maze – getestet.
Inzwischen weiß man sehr gut, welche Prozesse nach fokalen Ischämien auf das umliegende
Gewebe einwirken, allerdings ist nicht hinreichend geklärt, welche funktionellen Veränderungen auf
diese Prozesse im Einzelnen zurückzuführen sind. Die vorliegende Studie kann einen Beitrag dazu
leisten, den Anteil, welchen SD zur Pathophysiologie des Schlaganfalls und anderer neurologischer
Erkrankungen beitragen, zu bestimmen. Weiterhin kann die Entschlüsselung der molekularen
Konsequenzen von SD potentiell neuroprotektive Gene identifizieren.
14
Material und Methoden
MATERIAL UND METHODEN
Versuchstiere
Alle Versuche wurden an männlichen, adulten Wistar-Ratten aus der Zucht des IVTK Jena
durchgeführt (ca. 280-320 g). Die Tiere wurden unter konstanten Bedingungen mit ad libitum Zugang
zu Futter und Wasser und einem 12 h Tag/Nacht-Rhythmus gehalten.
Alle Tierexperimente wurden durch das Thüringer Landesamt für Lebensmittelsicherheit und
Verbraucherschutz,
Dezernat
Tierschutz,
geprüft
und
entsprechend
den
Vorschriften
des
Tierschutzgesetzes durchgeführt (TVA 02-09/04).
Projekt 1: Genexpressionsstudie
Induktion der Spreading Depressions (SD) und elektrophysiologische Ableitungen
Zur Induktion der SD wurden die Tiere (n = 64) mit 2.5 % Isofluran in einem 1:2 O2/N2O-Gemisch (30
l/60 l) anästhesiert und stereotaktisch im Bereich des Ohres fixiert. Die Körpertemperatur wurde mit
einem elektronischen Rektalthermometer überwacht und mit Hilfe einer rückgekoppelten Heizwanne
auf 37°C ± 0.5 gehalten. Nachdem die Kalotte freigelegt wurde, wurden zwei Trepanationen von
1.8 mm Durchmesser über der linken Hemisphäre (2 mm lateral, Bregma +2 mm; 2 mm lateral,
Bregma -6.8 mm) angelegt, die Dura mater blieb dabei intakt. Zur Ableitung des Gleichstrom (DC)Potentials und des Elektrokortikogramms (ECoG) wurden Borosilikatglaselektroden (2-4 MΩ)
hergestellt und mit künstlicher Zerebrospinalflüssigkeit (aCSF: 120 NaCl, 2 CaCl2, 5 KCl, 1.8 MgCl2,
10 HEPES, 1.25 NaH2PO4 und 10 Glucose; in mM; pH 7.4) gefüllt. Anschließend wurde ein chlorierter
Silberdraht (Ag/AgCl) eingebracht, der mit einem DC- und EEG-Verstärker verschaltet war. Die
Elektrode wurde unter mikroskopischer Sichtkontrolle vorsichtig auf die Dura aufgesetzt. Als
Bezugspotential diente das über einen Ag/AgCl-Draht abgegriffene subkutane Nackenpotential. Die
Signale wurden 100-fach verstärkt und nach analog-digitaler Wandlung (CED 1401, Cambridge
Electronic Design Ltd., Cambridge, England) auf einem PC mittels Spike2 Software aufgezeichnet und
gespeichert. Nachdem alle potentiell schmerzhaften Eingriffe beendet waren, wurde die Narkose
sukzessive auf 1.5 % Isofluran herabgesetzt, diese Zeit diente auch zur Stabilisierung der
Elektrodenpotentiale. Zur Induktion der SD wurden Tupfer, die in 3 M KCl getränkt waren, auf die Dura
in der posterioren Trepanation gelegt und ca. alle 15 min erneuert. Nachdem 7 ± 2 SD registriert
15
waren (in einem Zeitraum von 100-120 min), wurde der Tupfer entfernt, die Trepanation mehrmals mit
aCSF gespült und mit Knochenwachs verschlossen. Tiere mit weniger als 5 SD wurden aus der
weiteren Analyse ausgeschlossen. Den scheinoperierten Kontrollen wurde für 110 min equimolare (3
M) NaCl-Lösung auf die posteriore Dura appliziert. Beispiele der DC-Potentiale KCl- und NaClbehandelter Ratten sind in Abb. 3 gezeigt.
Abb. 3 Schema der Induktion und Registrierung von SD (A). 3 M KCl/NaCl wurde epidural über dem okzipitalen Kortex
appliziert (1) während die DC-Potentiale vom frontalen Kortex abgegriffen wurden (2). Das Gewebe wurde im Bereich des
ipsilateralen HL-Kortex zwischen Position 1 und 2 entnommen (schraffiert), um sicherzugehen, dass die registrierten SD auch
das entnommene Gewebe betrafen. Modifiziert nach Zilles [147]. (B) Beispiele zweistündiger DC-Ableitungen nach KCl bzw.
NaCl-Applikation. Typische SD hatten eine Amplitude von ca. 4-10 mV.
RNA Isolierung
Die Tiere (n = 64) wurden 3 h, 1 d, 7 d oder 30 d nach der Applikation von KCl bzw. NaCl unter
Enflurannarkose dekapitiert (n = 16 zu jedem Zeitpunkt: 10 pro KCl- und 6 pro NaCl-Gruppe). Zur
Präparation des Hinterpfotenareals (HL) wurde das Gehirn zunächst aus dem Schädel
herauspräpariert und dabei ständig mit 4°C aCSF gekühlt. Anschließend wurden 2 koronale Schnitte
bei Bregma -1 und -3.3 geführt. Aus dem so gewonnenen 2.3 mm dicken Hirnschnitt wurden ipsi- und
kontralateraler HL entnommen. Die Schnittführung erfolgte dabei jeweils 1.6 und 3.8 mm lateral zur
Mittellinie. Die Gewebeblöckchen wurden sofort in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei -80°C
aufbewahrt. Die Isolation der gesamt-RNA erfolgte nach einem kombinierten TRIZOL- und RNeasyProtokoll. Das gefrorene Gewebe wurde mit einem Miccra D-1 (ART, Müllheim, Deutschland) in 900 µl
eiskaltem TRIZOL (Invitrogen, Life Technologies, Gaithersburg, MD, USA) homogenisiert. Das
Homogenat wurde 5 min bei RT inkubiert und in ein 1.5 ml Phase Lock Gefäß überführt (Eppendorf,
Hamburg, Deutschland). Nach Zugabe von 180 µl Chloroform wurden die Proben geschüttelt und für
16
weitere 2 min bei RT inkubiert. Dann erfolgte ein 15-minütiger Zentrifugationsschritt bei 15700 x g
und12°C. Die obere wässrige Phase wurde in ein neues Gefäß überführt, mit 280 µl Ethanol versetzt,
auf eine RNeasy Mini Säule überführt (Qiagen, Hilden, Deutschland) und bei 7500 x g für 1 min
zentrifugiert. Anschließend wurde die Säule entsprechend den Angaben des RNeasy Protokolls
gewaschen und die RNA mit 30 µl DEPC-behandeltem Wasser eluiert (2 min Inkubation gefolgt von 2
min Zentrifugation bei 15700 x g). Die gereinigte RNA wurde spektrometrisch quantifiziert (ND-1000;
Nanodrop, Wilmington, DE, USA). Die Integrität der Proben wurde in mehreren Schritten überprüft: (i)
auf einem denaturierenden Agarosegel, (ii) spektrometrisch am ND-1000 und (iii) mit einem RNA 6000
LabChip Kit (Agilent 2100 Bioanalyzer, Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA), letzteres jedoch
nur für die gepoolten RNAs. Dementsprechend mussten folgende Kriterien erfüllt sein: (i) diskrete 28S
und
18S
RNA
Banden,
keine
hochmolekularen
Banden
(DNA-Kontamination),
keine
niedermolekularen Banden (degradierte RNA); (ii) A260/A280-Ratios von 1.9 bis 2 (Ausschluss von
Kontamination der Proben durch Proteine oder DNA) und (iii) keine irregulären niedermolekularen
Peaks und 28S/18S RNA-Ratios > 1.8 (Ausschluss von RNA Degradation).
Genexpressionsanalyse mittels Affymetrix Microarrays
Zum Studium der SD-vermittelten Genexpression mit Oligonucleotidarrays wurden die ipsilateralen
HL-RNAs jeder Gruppe gepoolt (n = 10 pro SD Gruppe und n = 6 pro Kontrollgruppe zu jedem
Zeitpunkt), so dass der Pool 10 µg RNA enthielt und der Anteil der Einzelproben äquivalent war. Die
gepoolten RNAs wurden entsprechend des von Affymetrix vorgegebenen Protokolls in biotinylierte
Antisense-cRNA umgeschrieben. Dazu wurden die in der totalen RNA enthaltenen Proteinkodierenden mRNAs mit Hilfe von T7-Oligo(dT) Primern und des Enzyms Reverse Transkriptase
(Superscript II, Life Technologies; GensetSA) zunächst in einzelsträngige cDNA umgeschrieben. In
einem zweiten Schritt wurde die RNA-Matrize durch RNAse H entfernt und der komplementäre cDNAStrang durch DNA-Polymerase I und DNA-Ligase synthetisiert. Die doppelsträngige cDNA wurde über
eine Phenol-Chloroform-Extraktion gereinigt und auf einem 1.5 %-igem Agarosegel analysiert.
Anschließend erfolgte ein in vitro Transkriptionsschritt mit einer T7-Polymerase in Anwesenheit Biotinmarkierter Ribonukleotide (ENZO BioArray Transcript Labeling Kit; Affymetrix, Santa Clara, CA, USA),
welcher gleichzeitig zu einer linearen Amplifikation des Materials führte. Die resultierende cRNA wurde
nach RNeasy-Vorschrift gereinigt und spektrometrisch quantifiziert. Die cRNA wurde NH4Acpräzipitiert and fragmentiert. Nach der Hybridisierung der cRNA-Fragmente auf Affymetrix Rat
17
Expression Set 230 A (RAE230A) Chips wurden diese gewaschen, gegengefärbt und auf einem
Affymetrix GeneChipScanner 2500 gescannt.
Der RAE230A Chip erlaubt die simultane Analyse von ca. 14000 UniGene Clustern, die im Folgenden
als Gene oder Transkripte bezeichnet werden sollen, einschließlich 4700 Full-Length Sequenzen.
Jedes Gen auf diesem Chip wird durch ein oder mehrere von 15866 sog. Oligonucleotid-Probesets
repräsentiert, deren Sequenz von den 600 proximalen Basen am 3´-Ende jedes Transkripts abgeleitet
ist. Ein Probeset besteht aus 11 verschiedenen, über den Chip verteilten sog. probe pairs, wovon
wiederum jedes aus 2 sog. features oder Probenzellen besteht: einer gen-spezifischen perfect match(PM) und einer mismatch- (MM) Probenzelle (Abb. 4). Letztere enthält Oligomere mit einem
homomeren Basenaustausch in der Mitte der Sequenz, sie dient der Detektion und Verrechnung von
unspezifischen Interaktionen (z.B. Kreuz- oder unspezifische Hybridisierungen). Eine einzelne
Probenzelle ist 18x18 µm groß und enthält mehrere Millionen ein- und derselben Oligonucleotidsonde
(25-mer).
mRNA
5`
3`
AAGCTTGGGCAAAAGCCTTGCGGAT
„probe set“
AAGCTTGGGCAAAAGCCTTGCGGAT
PM
AAGCTTGGGCAATAGCCTTGCGGAT
MM
PM
MM
„probe pair“
Array
„feature“ /
Probenzelle
Abb. 4 Schema zum Aufbau
eines Probesets auf dem
Affymetrix RAE230A Chip. Der
Array enthält mehrere Hunderttausend Probenzellen, welche
jeweils Gen-spezifische Oligonucleotide enthalten. Jedes
Gen ist durch ein spezifisches
Probeset repräsentiert. Ein
Probeset setzt sich aus 11
verschiedenen probe pairs
zusammen, die jeweils aus
einer perfect match- (PM) und
einer
mismatch(MM)
Probenzelle bestehen. Die
probe pairs sind über den
gesamten Array verteilt.
Direkt nach dem Scannen der Chips wurde eine Absolutanalyse durchgeführt. Die verwendete
Software war die Microarray Suite 5.0 (MAS 5.0) von Affymetrix. Zunächst musste eine
Normalisierung der Chipdaten vorgenommen werden, um eine direkte Vergleichbarkeit der Arrays zu
gewährleisten. Dies kann zum einen anhand von speziellen probe sets, z.B. einem Set von
Housekeeping Genen oder Hybridisierungskontrollen, oder aber wie in dieser Studie, durch globales
Scaling erfolgen. Beim globalen Scaling wird von der Annahme ausgegangen, dass die
18
Gesamtintensitäten verschiedener Chips vergleichbar sind, da auf jeden Array die gleiche RNAMenge gebracht wurde und normalerweise nur ein kleiner Teil der Transkripte reguliert ist, welcher in
der Gesamtheit nicht ins Gewicht fällt. Hier wurde die Gesamtfluoreszenzintensität eines jeden Chips
auf einen Wert von 150 eingestellt. Die resultierenden Scaling Faktoren aller Chips waren vergleichbar
(0.194 ± 0.047). Anschließend erfolgte eine Statistik-basierte Kalkulation der absoluten Expression der
Transkripte (absolute call), wodurch diese entsprechend der durchschnittlichen Fluoreszenzintensität
als exprimiert (present [P]), nicht exprimiert (absent [A]) oder gering exprimiert (marginal [M])
eingeordnet wurden. Anhand dieser Daten wurde eine paarweise MAS 5.0 basierte Vergleichsanalyse
zwischen den skalierten SD- und Kontrollarrays jedes Zeitpunktes durchgeführt. Hieraus resultierten
die für die weiteren Analysen verwendeten change p-values (CPV; Statistik-basierter Wert zur
Beurteilung der differentiellen Expression) und signal log ratios (SLR), welche den binären
Logarithmus des Faktors, um den sich die Expression eines Genes relativ zur Kontrolle unterscheidet,
darstellt.
Erzeugung der Kandidatengen-Listen
Die Auswertung wurde MAS 5.0 und Excel-basiert vorgenommen. SD- und Kontrollchip eines
Zeitpunktes wurden paarweise verglichen. Alle Probesets, welche zur Qualitätskontrolle dienten und
solche mit A- oder M-Call auf beiden Chips eines Zeitpunktes, wurden von weiteren Analysen
ausgeschlossen. Die Parameter für eine signifikant differentielle Expression waren zum einen change
p-values von < 0.0045 oder > 0.9955 plus eine mindestens 2-fache Hoch- bzw. Herunterregulation
(SLR mind. 1/-1) der entsprechenden Gene. Ausgeschlossen wurden außerdem solche Gene, deren
change-call einzig durch eine Regulation innerhalb der Kontrollgruppen über die Zeit zustande kam.
Die Kriterien hierfür waren eine ≥ 2-fache Regulation zwischen den Kontroll-Gruppen beim Vergleich
konsekutiver Zeitpunkte während sich die Genexpression zwischen den entsprechenden SD-Gruppen
nicht änderte.
Um einen Überblick über den zeitlichen Verlauf der Genexpression nach SD zu gewinnen, wurden die
verbleibenden 353 Gene hierarchisch geclustert (Genesis 1.3.0 Software; [148]). Hierzu wurde ein
multivariates Testverfahren angewendet, als Linkage-Methode diente das average linkage und
Euclidian Distance als Distanzmaß.
19
Quantitative RT-PCR
Als unabhängige Methoden zur Validierung der Microarray-Daten fanden Immunhistochemie und
quantitative RT-PCR (qRT-PCR) Anwendung. Letztere soll im Folgenden näher beschrieben werden.
Jedes der ausgewählten Gene wurde in mindestens 2 unabhängigen Experimenten an den gepoolten
mRNAs und einmal an den einzelnen Proben, welche zur Generierung der Pools verwendet wurden,
getestet. Die Gesamt-RNA (50 ng/µl) wurde in einem Volumen von 20 µl durch Reverse Transkription
in cDNA umgeschrieben (iScript cDNA Synthesis Kit, Biorad, Hercules, CA, USA). Diese wurde 5-fach
mit H2ODEPC verdünnt und bei -20°C gelagert. Die qRT-PCR wurde an ca. 15 ng cDNA pro 15 µl
Ansatz durchgeführt. Hierfür wurden der iQ SYBR Green Supermix (Biorad) und Gen-spezifische
Primer verwendet.
Das Design der Primer erfolgte mit Hilfe von PRIMER3 (Whitehead Institute for Biomedical Research),
die Spezifität und Dimer- bzw. Sekundärstrukturbildung der Primer wurde mittels NCBI-BLAST und
Oligoanalyzer (www.idtdna.com/analyzer/Applications/OligoAnalyzer/Default.aspx) überprüft. Wenn
möglich
wurden
Intron-Exon-überspannende
Primer
generiert.
Für
Primersequenzen,
Konzentrationen, Annealing-Temperaturen (Ta) und Amplifikatlängen siehe Tabelle 1.
Tabelle 1
Primersequenzen
Transkript
fw
rev
Konz.
Länge
Ta
GAPDH
glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase
TCCCTCAAGATTGTCAGCAA
AGATCCACAACGGATACATT
500 nM
308 bp
59°C
rpL32
CTGGTGAAGCCCAAGATCGTC
GAACACAAAACAGGCACACAAGC
200 nM
416 bp
59°C
TGGACAGGACTGAAAGACTTGC
ATGTAATCCAGCAGGTCAGCAA
500 nM
118 bp
56°C
b2M
ribosomal protein L32
hypoxanthine guanine phosphoribosyl
transferase
β2-microglobulin
GGTGACCGTGATCTTTCTGGTG
CTCCTTCAGAGTGACGTGTTTAAC
500 nM
316 bp
59°C
TTR
transthyretin
CTCGCTGGACTGATATTTGCGTC
GAACTTCTCATCTGTGGTGAGCC
300 nM
222 bp
62°C
trkB
neurotrophic tyrosine kinase, receptor, type 2
CTGGACCACGCCAACTGACATC
GCCAAACTTGGAATGTCTCGCC
500 nM
190 bp
63°C
ATP1b2
ATPase, Na+/K+ transporting, β2 polypeptide
GACCCTACTCACTATGGTTACAG
CAAACTTGTCCCGCTCGTCATC
500 nM
340 bp
62.5°C
TIMP1
tissue inhibitor of metalloproteinase 1
GACCACCTTATACCAGCGTTATG
CAGCACTATAGGTCTTTACGAAGG
500 nM
275 bp
61°C
CD74
CD74 antigen
GAGCAAGAACTCCCTGGAGGAG
CTATCCCTGTCAGTGGGCCTAG
200 nM
393 bp
63°C
PRPS2
phosphoribosylpyrophosphatesynthase II
GCAAGATTGCATCCTCATCCAGG
AACCCTTTTGGCTCCTCCAGCAT
500 nM
305 bp
61.5°C
EGR1
early Growth Response 1
GGCAATAACAGCAGCAGCAGCA
GGCGCTGAGGATGAAGAGGTTG
200 nM
347 bp
63°C
DEXRAS1
dexras1
CTCATCCAAAGTGGGCAAGACG
CGGCACGTCCACATTCTCTTTG
500 nM
325 bp
63°C
CML3
camello-like 3
CTTGTTTCCCTGTGGCTCCTTG
GAAGCCCTGCATCTCTGCAAAC
200 nM
300 bp
62.5°C
HPRT
MCP-1
chemokine ligand 2
CTGGGCCTGTTGTTCACAGTTG
AGTTCTCCAGCCGACTCATTGG
400 nM
130 bp
62°C
Cox2
prostaglandin-endoperoxide synthase 2
GTTCGCATTCTTTGCCCAGCAC
ACATCATCAGACCCGGCACCAG
300 nM
311 bp
60°C
BDNF
brain-derived neurotrophic factor
CAAGTGCCTTTGGAGCCTCCTC
AGTTCGGCATTGCGAGTTCCAG
200 nM
336 bp
61.5°C
Um die relative Expression der Gene und die Reaktionseffizienz bestimmen zu können, wurden in
jedem PCR-Lauf externe Standards mitgeführt. Zur Herstellung dieser Standards wurden
konventionelle 20 µl-PCR-Reaktionen in einem Blockcycler durchgeführt (Platinum PCR SuperMix,
20
Invitrogen), dazu fanden dieselben Primer Verwendung, wie später für die qRT-PCR. Die PCRProdukte wurden auf ein 2%-iges Agarosegel aufgetragen, elektrophoretisch aufgetrennt und
anschließend aus dem Gel ausgeschnitten. Die Gelstückchen wurden über Nacht bei 4°C in 200 µl
H2OGIBCO (Invitrogen) inkubiert, anschließend wurden die Eluate als Template in einer weiteren PCR
reamplifiziert: 120 µl Gelextrakt; 16 µl H2OGIBCO; je 25.1 µl 5 pmol/µl Primerlösung; 20 µl 2.5 mM dNTP
(Invitek, Berlin, Deutschland); 7.9 µl 50 mM MgCl2; 26.1 µl Platinum-Puffer; 2.61 µl BSA; 3.2 µl
Platinum-Polymerase (alles Invitrogen). Die resultierende cDNA wurde mit dem Invitek PCRapace Kit
gereinigt, ihre Konzentration bestimmt und eine Stammlösung mit 1010 Molekülen hergestellt. Aus
dieser wurden dann durch sukzessive Verdünnung die Eichreihen hergestellt.
Die Normalisierung von qRT-PCR Daten erfolgt im Allgemeinen relativ zu einem oder mehreren
Housekeeping-Genen. Dies sind solche Gene, die meist relativ konstant und ubiquitär exprimiert
werden. Die geläufigsten Housekeeping-Gene zur Normalisierung sind β-Aktin, GAPDH, Ubiquitin
oder ribosomale Untereinheiten. Da eine Regulation von Housekeeping-Genen nicht ausgeschlossen
werden kann, ist es ratsam, zunächst das Expressionslevel mehrerer dieser Gene zu vergleichen, um
das/die mit der stabilsten Expression zu identifizieren. Im ersten Schritt wurden hierfür die Microarray
Daten gesichtet und eine Gruppe von 4 potentiellen Kandidaten (GAPDH, HPRT, rpL32 und b2M)
ausgewählt. Anschließend wurden qRT-PCR für diese und andere Gene sowohl mit den Einzelproben
als auch Pools durchgeführt. Nach Analyse der qRT-PCR Daten in GeNorm [149] wurden GAPDH,
HPRT und b2M als beste Housekeeping-Gene für diesen experimentellen Ansatz identifiziert. Alle 3
Gene zeigten einen ähnlichen Expressionsverlauf in den verschiedenen Untersuchungsgruppen.
Um die cDNA auf Kontamination mit genomischer DNA (gDNA) zu untersuchen, wurde eine
konventionelle GAPDH PCR mit Intron-übergreifenden Primern durchgeführt (30 s 99.9°C; 150 s
94°C; 40x [je 30 s 94°C, 59°C, 72°C]) und die PCR-Produkte auf einem 2%-igem Agarosegel
analysiert. Bei Kontamination mit gDNA wäre ein zweites, 112 Basen längeres Produkt zu erwarten
gewesen. Alle 116 analysierten cDNA zeigten nur ein Produkt mit einer Länge von 308 Basen, so
dass gDNA-Kontamination ausgeschlossen werden konnte. Da GAPDH Pseudogene besitzt, wurde in
analoger Weise eine Egr1-PCR mit den gepoolten Proben durchgeführt (Ta = 63°C). Hier würde eine
Kontamination mit gDNA zur Amplifikation eines zusätzlichen 1019 Basen langen Produkts führen. Es
wurde nur das kurze aus cDNA resultierende Produkt detektiert.
Auch die für jeden qRT-PCR-Lauf durchgeführte Schmelzkurvenanalyse diente der Identifizierung
möglicher gDNA-Verunreinigungen, als auch der Verifizierung der Primerspezifität (iCycler-Software).
21
Weiterhin wurde in jedem qRT-PCR-Lauf eine non-template Kontrolle eingeschlossen, um mögliche
Kontaminationen des Pipettieransatzes auszuschließen. Hier wurde statt cDNA das gleiche Volumen
H2OGIBCO eingesetzt.
Die Auswertung der qRT-PCR Daten erfolgte nach der Methode von Pfaffl [4]. Vorteil dieses Modells
ist, dass die Berechnung Effizienz-korrigiert erfolgt, im Gegensatz zu anderen Modellen, z.B. der
delta-delta-CT-Methode, die von einer optimalen Effizienz (100%) der Reaktion ausgehen. Letzteres
ist jedoch sehr selten der Fall, so dass sich geringste Schwankungen in den Effizienzen zwischen
Referenz- und Zielgen massiv auf die berechneten Expressionsunterschiede auswirken. Im Modell
nach Pfaffl wird eine Quantifizierung der Expression eines Zielgenes relativ zu einem oder mehreren
Housekeeping-Genen berechnet. Im vorliegenden Fall wurde zunächst das Verhältnis der Expression
der Zielgene in SD- vs. Kontrollproben relativ zur Expression der Housekeeping-Gene berechnet. In
diese Berechnung fließen die o.g. qRT-PCR Effizienzen und der Ct-Wert (threshold cycle, = PCRZyklus, in dem die PCR-Kurve ein festgelegtes Fluoreszenzniveau erreicht) ein. Anschließend wurden
die endgültigen Expressionsunterschiede (Ratios) durch Berechnung des geometrischen Mittels der
einzelnen Ratios, die aus den Vergleichen mit GAPDH, HPRT und b2M resultierten, berechnet.
1
Mathematisches Modell zur Berechnung der relativen Expressionsunterschiede (R) nach Pfaffl. EZielgen ist die qRT-PCR Effizienz
des Zielgens; EReferenzgen ist die qRT-PCR Effizienz des Referenzgens; ΔCtZielgen ist die Differenz der Ct von Kontrolle und SD des
Zielgens; ΔCtReferenzgen ist die Ct-Differenz von Kontrolle und SD des Referenzgens.
Immunhistochemie (Peroxidase Technik) und Immunfluoreszenz
Nach der Entnahme des HL-Kortex wurden die verbleibenden Hirnteile in -25 bis -30°C kaltem
Methylbutan eingefroren und bei -80°C gelagert. Das gefrorene Gewebe wurde direkt in eiskaltes 4%iges PFA überführt und für 4 Tage bei 4°C fixiert. Nach Kryokonservierung (24 h 10%, dann 48 h 30%
Succrose bei 4°C) wurden mit einem Gefriermikrotom (Microm, Walldorf, Deutschland) 40 µm dicke
koronale Schnitte angefertigt und in Antifreeze-Lösung bei -17°C aufbewahrt.
Zur immunhistochemischen Darstellung von c-Fos, Stat3, hsp27 und Cox-2 wurden die Schnitte im
free-floating-Verfahren prozessiert (je 3 Tiere pro Gruppe). Das Gewebe wurde 5 x 10 min in TBS
22
gewaschen, die Blockierung endogener Peroxidasen erfolgte durch 30-minütige Inkubation in 0.18%
H2O2.
Es
folgte
ein
Waschschritt
in
TBS/0.2%
Triton.
Zur
Blockierung
unspezifischer
Antikörperbindungsstellen und zur Permeabilisierung des Gewebes wurden die Schnitte für 1 h bei RT
in TBS plus inkubiert. Alle Antikörper wurden in TBS plus verdünnt. Die Inkubation in primärem
Antikörper erfolgte über Nacht bei 4°C, anschließend wurde das Gewebe dreimal 15 min in TBS
gewaschen und dann 1 h in sekundärem Antikörper inkubiert. Nachdem die Schnitte dreimal
gewaschen wurden, erfolgte eine einstündige Inkubation mit Avidin-Biotin-Peroxidase-Komplex
(Vector Elite Standard Kit, Vector Laboratories) bei RT, danach noch ein Spülgang und schließlich die
Anfärbung der immunmarkierten Zellen mit DAB-Lösung (0.5 mg/ml 3.3`-Diaminobenzidine
Tetrahydrochloride in TBS/0.2% Triton, Sigma; und 0.009% H2O2) für 12 min. Die Hirnschnitte wurden
gewaschen, auf gelatinierte Objektträger aufgezogen, getrocknet und mit Entellan (Merck, Darmstadt,
Deutschland) eingedeckelt.
Zur Phänotypisierung wurden Mehrfachmarkierungen mit neuronalen (NeuN), astrozytären (GFAP),
mikroglialen (OX-42) und oligodendroglialen (O4) Markern durchgeführt. Dazu wurden jeweils Schnitte
des Zeitpunktes analysiert, zu dem zuvor in der Immunhistochemie die stärkste Expression detektiert
wurde. Im Falle von c-Fos, Stat3 und hsp27 wurden die Schnitte über Nacht bei 4°C in primärem
Antikörper inkubiert, mehrmals in TBS gewaschen und für 4 h bei RT mit sekundärem Antikörper plus
DAPI behandelt. Nach mehrmaligem Waschen in TBS wurden sie aufgezogen und in Mowiol
eingedeckt. Für die Cox-2-Immunfluoreszenz musste ein modifiziertes Protokoll verwendet werden, da
mehrere Primärantikörper aus derselben Spezies eingesetzt wurden. Die Markierung erfolgte
schrittweise
mit
zwischengeschalteten
Blockierungen
freier
Antikörperbindungsstellen:
(a)
Präinkubation der Schnitte für 1 h in TBS plus; (b) erste Primärantikörper (Cox-2 und GFAP) über
Nacht bei 4°C; (c) 4 x 10 min waschen in TBS, 1 x TBS/0.2 % Triton; (d) 3-stündige Inkubation im
ersten Sekundärantikörper bei RT; (e) 4 x 10 min waschen in TBS, 1 x TBS/0.2 % Triton; (f) 3 h 10%
Mausnormalserum (Dianova) in TBS plus bei RT, um freie Antigen-Bindungsstellen des
Sekundärantikörpers abzudecken; (g) 4 x 10 min waschen, 1 x TBS/0.2 % Triton; (h) über Nacht (4°C)
Inkubation in unkonjugiertem Fab-Fragment Esel anti-Maus (1:20; Dianova), um alle freien
Bindungsstellen (schwerer und leichter Ketten) abzusättigen; (i) 4 x 10 min waschen, 1 x TBS/0.2 %
Triton; (j) Inkubation im zweiten Primärantikörper (NeuN oder O4 oder OX-42) 3 h bei RT; (k) 4 x 10
min waschen, 1 x TBS/0.2 % Triton; (l) Inkubation im zweiten Sekundärantikörper plus DAPI für 3 h
23
bei RT und (m) waschen und eindecken in Mowiol. Ergänzend wurden Einzelmarkierungen
durchgeführt, um eine mögliche Kreuzmarkierung auszuschließen.
Tabelle 2 Verwendete Antikörper
Antikörper
Verdünnung
Herkunft
primäre Antikörper
Kaninchen anti-c-Fos
Maus anti-Cox-2
Kaninchen anti-Stat3
Ziege anti-hsp27
Maus anti-NeuN
Maus anti-OX-42
Maus anti-O4
Meerschweinchen anti-GFAP
1:600
1:400 / 1:100
1:500 / 1:100
1:500 / 1:100
1:500
1:100
1:50
1:500
Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA
BD Transduction Laboratories, Franklin Lakes, NJ, USA
Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA
Santa Cruz Biotechnology
Chemicon, Temecula, CA, USA
Serotec Ltd, Oxford, UK
Advanced ImmunoChemical, Long Beach, CA, USA
sekundäre Antikörper
Rhodamine-X Esel anti-Meerschweinchen
Alexa-488 Esel anti-Kaninchen
Alexa-488 Esel anti-Maus
Cy5 Esel anti-Maus
Biotin Pferd anti-Maus
Biotin Esel anti-Kaninchen
1:250
1:250
1:250
1:250
1:500
1:500
Dianova, Hamburg, Deutschland
Molecular Probes, Leiden, Niederlande
Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA
Die Verdünnungen sind angegeben für Immunhistochemie und (wenn davon abweichend) Immunfluoreszenz.
Projekt 2: Neurogenesestudie
Induktion der Spreading Depressions (SD), MK-801-Injektion und elektrophysiologische Ableitungen
Die Experimente wurden an einer Gruppe von 32 Ratten durchgeführt. Die chirurgischen Eingriffe und
elektrophysiologischen Ableitungen erfolgten in gleicher Weise wie für die Genexpressionsstudie
beschrieben. Einziger Unterschied war die Position der hinteren Trepanation (3 mm lateral, Bregma -5
mm) zur Applikation der Salzlösungen (Abb. 5A).
Vier weitere Tiere erhielten 45 min vor der KCl-Applikation eine intraperitoneale Injektion des nichtkompetetiven NMDA-Rezeptor-Antagonisten MK-801 (3 mg/kg KG in 0.9% NaCl; Sigma-Aldrich,
Taufkirchen, Deutschland).
In einer Gruppe von 4 Ratten wurde zusätzlich zum kortikalen auch das hippocampale DC-Potential
abgegriffen. Hierzu wurden die Trepanationen bei folgenden Koordinaten angelegt: 2 mm lateral,
Bregma +2 mm zur Ableitung des kortikalen DC-Potentials; 2 mm lateral, Bregma -5.5 mm zur KClApplikation; und 1.5 mm lateral, Bregma -3.5 mm zur Ableitung des hippocampalen DC-Potentials
(Abb. 5B). Nach Einritzen der Dura mater im Bereich der mittleren Trepanation mit einer Kanüle wurde
24
die Ableitelektrode mit einem NANOStepper Type B (Scientific Precision Instruments, Oppenheim,
Deutschland) in 0.5 µm Schritten bis zu einer Tiefe von 2.56 ± 0.1 mm in die CA1-Region des
Hippocampus herabgefahren. Das hippocampale DC-Potential wurde parallel zum kortikalen für 3
Stunden (nachdem erstmals KCl auf den okzipitalen Kortex aufgebracht wurde) registriert, um ein
eventuelles Auftreten von SD im Hippocampus auch nach Ende der 2-stündigen KCl-Applikation
auszuschließen.
A
B
Abb. 5 Schematische Darstellung der Positionen zur Ableitung des kortikalen (2) und hippocampalen (3) DC-Potentials sowie
der KCl- bzw. NaCl-Applikationsstelle (1). (A) und (B) unterscheiden sich durch eine Verschiebung der Salzapplikationsstelle
um 0.5 mm nach caudal in (B), dies war erforderlich, um Platz für die hippocampale Ableitung zu schaffen und ein Übertreten
der KCl-Lösung auf die mittlere Position zu verhindern.
Induktion der photothrombotischen Läsionen (PT)
Die Induktion der neokortikalen ischämischen Läsionen erfolgte nach einer von Watson et al. [150]
entwickelten Methode, modifiziert nach Schiene et al. [151]. Die Tiere (n = 18) wurden initial für 3 min
mit 2.5% Isofluran anästhesiert, anschließend wurde der Isoflurananteil auf 2% gesenkt. Die
Rektaltemperatur wurde über eine Heizmatte auf 37±0.5°C gehalten. Nach einem Hautschnitt im
Leistenbereich
wurde
die
linke
Vena
femoralis
freigelegt
und
ein
Polyethylenkatheder
(Außendurchmesser 0.61 mm) eingeführt. Nach der Aspiration von Blut zur Kontrolle des korrekten
Sitzes des Katheders wurde dieser fixiert und mit 0.9% NaCl freigespült. Nun wurde die Ratte
stereotaktisch fixiert und die Kalotte durch einen medianen Hautschnitt freigelegt. Anschließend wurde
ein Lichtleiter (∅ 1.4 mm) über Bregma -5 und 3 mm lateral platziert (siehe Position 1 in Abb. 5A; Abb.
6). Dieser war mit einer Kaltlichtquelle (KL 1500, Schott; Stufe 4.5, Streulicht) verbunden, welche
zeitgleich mit der intravenösen Verabreichung des photosensitiven Farbstoffes Bengal Rosa (10
mg/ml; 4,5,6,7-Tetrachloro-2',4',5',7'-tetraiodofluorescein disodium salt; Aldrich) eingeschaltet wurde.
25
Innerhalb von 30 s wurden 0.4 ml der Farbstofflösung appliziert, dabei war zwischen Katheder und
Spritze ein 0.20 µm Membranfilter (Sartorius, Göttingen, Deutschland) positioniert. Nach einer 20minütigen Belichtungsphase wurde der Katheder entfernt, die Wunden vernäht und die Narkose
ausgeleitet. Die Kontrolltiere unterschieden sich nur durch fehlende Belichtung, die Eingriffe und
deren Dauer waren analog denen der PT-Tiere.
Bengal Rosa ist ein photosensitiver Farbstoff welcher unter Lichteinwirkung freie Radikale freisetzt.
Dies führt durch Schädigung des Gefäßendothels vermutlich zu einer Aggregation von Thrombozyten
was wiederum einen thrombotischen Gefäßverschluss verursacht [152].
Abb. 6 Schematische Darstellung der
Induktion eines photothrombotischen
kortikalen Infarktes. Die Tiere werden
über eine Atemmaske mit Narkosegas
ventiliert. Über einen Venenkatheder
wird der photosensitive Farbstoff Bengal
Rosa in den Blutkreislauf injeziert,
während der Kortex über einen
Kaltlichtleiter für 20 min durch die
Kalotte hindurch belichtet wird.
Bromodeoxyuridin-Injektionen
Zur Identifizierung von proliferierenden Zellen wurde das Thymidin-Analogon Bromodeoxyuridin
(BrdU; Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Deutschland) verwendet. Um akute Effekte kortikaler SD auf die
Proliferation von Vorläuferzellen aufzudecken, erhielten 5 Gruppen (2 Kontrollgruppen mit jeweils 4
Tieren, 2 SD-Gruppen mit 5 bzw. 6 Tieren und die MK-801-Gruppe) 3 intraperitoneale Injektionen
BrdU (50 mg/kg gelöst in 0.9% NaCl) am Tag 2 oder 4 nach Induktion der SD. Die Tiere überlebten
jeweils bis zum folgenden Tag. Um einzuschätzen, ob und wieviele der neu gebildeten Zellen
überleben, erhielten 2 weitere Gruppen (Kontrollen: n = 4, SD: n = 9) alle 12 Stunden 50 mg/kg BrdU
von Tag 1 bis 7. Diese Tiere überlebten für 42 Tage. In gleicher Weise wurde mit den infarzierten
Ratten verfahren: 3 x täglich BrdU am Tag 2 oder 4 (jeweils 5 PT- und 4 PT-Kontrolltiere), Überleben
bis zum folgenden Tag oder 2 x täglich BrdU für eine Woche und Überleben für weitere 5 Wochen.
Eine Übersicht gibt Abb. 7.
26
A
B
OP
OP
BrdU
BrdU
0
1
2
0
3
1
Tag
C
2
3
4
5
Tag
OP
BrdU
0
1
2
3
4
5
6
7
Abb. 7 BrdU-Injektionsprotokoll. SD/PTund
die
entsprechenden
Kontrolltiere wurden in 3 Gruppen mit
unterschiedlichen
BrdU-Injektionsschemen
und
Überlebenszeiten
eingeteilt. Die Eingriffe (OP) erfolgten
am d0. Zwei Gruppen erhielten 3
BrdU-Injektionen am d2 (A) oder 4 (B)
und wurden am folgenden Tag getötet.
Einer weiteren Gruppe wurde ab Tag 1
für 1 Woche alle 12 h BrdU gespritzt,
diese Tiere überlebten bis zum d42
(C).
42
Tag
Gewebepräparation
Die Tiere wurden unter tiefer Äthernarkose transkardial zunächst mit 90 ml PBS, dann mit 300 ml 4%
Paraformaldehyd (PFA) in 0.1 M Phosphatpuffer perfundiert. Die Hirne wurden vorsichtig aus dem
Schädel herauspräpariert und über Nacht bei 4°C in 4% PFA nachfixiert. Zum Schutz vor
Gefrierschäden wurde das Gewebe für 24 Stunden in 10%-ige und anschließend für 48 Stunden in
30%-ige Succrose verbracht (4°C). Zur Aufbewahrung wurden die Hirne in -25 bis -30°C kaltem
Methylbutan eingefroren und bei -80°C gelagert. Für die histo- und immunhistochemischen Färbungen
wurden am Gefriermikrotom 40 µm dicke koronale Schnitte angefertigt und in Anti-Freeze-Lösung bei
-20°C aufbewahrt.
BrdU-Immunhistochemie und Immunfluoreszenz
Zur free-floating Peroxidase Färbung wurde jeder 6. Schnitt mehrmals in TBS gewaschen, für 30 min
in 0.18% H2O2 geblockt, dreimal gewaschen und zur Denaturierung der nukleären DNA für 30 min bei
37°C in 2 N HCl inkubiert. Anschließend wurden die Schnitte 10 min in 0.1 M Borsäure inkubiert und
nochmals in TBS gewaschen. Zum Blocken unspezifischer Antikörperbindungsstellen verblieben die
Schnitte für 1 Stunde bei RT in TBS plus. Die Antikörperverdünnung erfolgte ebenfalls in diesem
Puffer. Die Schnitte wurden über Nacht bei 4°C im primären Antikörper inkubiert. Nach mehrmaligem
intensivem Waschen in TBS erfolgte die Inkubation im biotinylierten Sekundärantikörper für 2 Stunden
bei RT, gefolgt von weiteren Waschschritten. Nach einstündiger Behandlung des Gewebes mit ABCReagenz (Vectastain Elite Kit; Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) bei RT und
27
anschließendem Waschen in TBS erfolgte die Peroxidasereaktion. Hierfür wurden die Schnitte 12 min
in DAB inkubiert. Nach einem letzten Waschschritt wurden die gefärbten Schnitte in 0.5%-iger
Gelatinelösung auf Objektträger aufgezogen, über Nacht getrocknet und in Entellan eingedeckelt.
Zur Immunfluoreszenzmarkierung wurde jeder 12. Schnitt verwendet und zunächst in derselben
Weise prozessiert wie im vergangenen Abschnitt beschrieben. Die Blockierung endogener
Peroxidasen mit H2O2 entfiel. Die Schnitte wurden für 48 Stunden bei 4°C in primärem Antikörper
inkubiert, mehrmals in TBS gewaschen und über Nacht bei 4°C mit sekundärem Antikörper behandelt.
Am Ende wurden die Schnitte gewaschen, aufgezogen und in Mowiol eingedeckelt. Folgende
Antigene wurden detektiert: BrdU; DCX, als Marker neuronaler Vorläuferzellen; NeuN, um reife
Neuronen zu identifizieren; als astrozytäre Marker S100β und GFAP. Zur Detektion apoptotischer
Zellen wurde jeder 24. Schnitt mit Antikörpern gegen BrdU und aktive Caspase-3 inkubiert. Listen der
verwendeten primären und sekundären Antikörper befinden sich in Tabelle 3.
Tabelle 3 Verwendete Antikörper
Antikörper
Verdünnung
Herkunft
primäre Antikörper
Ratte anti-BrdU
Ziege anti-DCX
Maus anti-NeuN
Kaninchen anti-S100β
Meerschweinchen anti-GFAP
Kaninchen anti-cleaved Caspase-3
1:500
1:200
1:500
1:2500
1:500
1:100
Oxford Biotechnology, Kidlington, UK
Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA
Swant, Bellinzona, Schweiz
Advanced ImmunoChemical, Long Beach, CA, USA
Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA
sekundäre Antikörper
Rhodamine-X Esel anti-Ratte
Rhodamine-X Esel anti-Kaninchen
Alexa-488 Ziege anti-Ratte
Alexa-488 Ziege anti-Meerschweinchen
Alexa-488 Esel anti-Kaninchen
Cy5 Esel anti-Maus
Cy5 Esel anti-Ziege
Biotin Esel anti-Ziege
Biotin Esel anti-Ratte
1:250
1:250
1:250
1:250
1:250
1:250
1:250
1:500
1:500
Volumetrie
Die Applikation der 3 M Salzlösungen verursachte eine kleine nekrotische Läsion im kortikalen
Gewebe. Um einen möglichen Zusammenhang zwischen Gewebsschaden und der Neurogenese im
Gyrus dentatus auszuschließen, wurden volumetrische Analysen der Läsionen durchgeführt. Zur
histologischen Färbung wurden die 40 µm-Hirnschnitte (jeder 6.) in 0.5%-iger Gelatinelösung auf
28
Objektträger aufgezogen und getrocknet. Es folgte eine 8 minütige Inkubation in 60°C heißer
Kresylviolettlösung und ein Spülschritt in H2Odest. Dann wurden die Schnitte in einer aufsteigenden
Alkoholreihe (Ethanol, je 2 x 1 min 70%, 96%, 100%) dehydriert, 5 min in Xylol inkubiert und mit
Entellan eingedeckelt.
Um das Läsionsvolumen zu bestimmen wurden die Schnitte auf einem helligkeitsstabilisierten
Leuchttisch (Imaging Research Inc., Model B95) aufgelegt und mit einer CCD-Kamera (Mandi, YG
9220) aufgenommen. Das Kamerasignal wurde dann über einen Video-Prozessor (Hamamatsu, DVS3000) nachverstärkt, digitalisiert und an einen MacIntosh IIfx übertragen. Die Analyse der
Flächendaten erfolgte mit einem konventionellen Bildverarbeitungsprogramm (NIH-Image 1.44).
Die Abschätzung des Läsionsvolumens erfolgte durch Integration der Flächeninhalte mit der Dicke
und den Abständen der Schnitte (V = A [mm2] x 0.04 mm x 6).
Quantifizierung und statistische Analysen
Zur Bestimmung der Gesamtzahl BrdU-markierter Zellkerne im Gyrus dentatus wurde jeder 6.
Peroxidase-gefärbte Schnitt an einem Zeiss Axioplan 2 bei 20- bis 40-facher Vergrößerung
ausgewertet. Ipsi- und kontralateraler Gyrus dentatus wurden getrennt auszählt. Zur Hochrechnung
auf die Absolutmenge BrdU-positiver Zellen im kompletten ipsi- bzw. kontralateralen Gyrus dentatus
eines Tieres wurden die Zellzahlen addiert und mit 6 multipliziert.
Zur Auswertung der Mehrfachimmunfluoreszenzen wurde jeder 12. Schnitt auf die Kolokalisation
verschiedener Marker mit BrdU untersucht. Dafür wurden von zufällig ausgewählten Bereichen des
Gyrus dentatus z-stacks (z-Ausdehnung ca. 20 µm) an einem konfokalen Lasermikroskop (LSM 510,
Zeiss, Jena, Deutschland) aufgenommen und sowohl ipsi- als auch kontralateral jeweils 50 BrdUpositive Zellen phänotypisiert. Hieraus wurde der prozentuale Anteil der mehrfach markierten Zellen
ermittelt und durch Multiplikation mit der Gesamtzahl BrdU-positiver Zellen in Absolutzahlen
umgerechnet.
Unter Berücksichtigung des z.T. kleinen Gruppenumfanges wurden die statistischen Analysen m.H.
nicht-parametrischer Tests durchgeführt. Der Vergleich abhängiger Stichproben erfolgte mit dem
exakten Vorzeichentest, der von unabhängigen Stichproben mit dem exakten Mann-Whitney Test (2seitig). Das statistische Signifikanzniveau wurde für p ≤ 0.05 gesetzt. Alle angegebenen Werte
entsprechen dem Mittelwert (MW) ± SEM.
29
Projekt 3: Verhaltenstests
Um die Konsequenzen von kortikalen SD auf die kognitive Leistung der Ratten zu ermitteln (eventuell
verursacht durch erhöhte Neurogenese im Gyrus dentatus), wurden zwei Paradigmen zur Erfassung
des räumlichen Lernens und des Gedächtnisses der Tiere verwendet – das Morris Water Maze
(MWM; [153, 154]) und eine modifizierte Form des MWM [155]. Die Testapparatur bestand aus einem
runden Wasserbecken (∅ 181 cm), in dem sich 1.5 cm unter der Wasseroberfläche eine Plattform (∅
16 cm) befand. Die Wassertemperatur betrug 21-22°C. Das Becken befand sich in einem Raum mit
verschiedenen visuellen Landmarken (Poster, Lampen, Experimentator etc.), die im Verlauf des Tests
unverändert blieben. Typischerweise lernen die Tiere in diesem Test, aus dem Wasser zu
entkommen, indem sie sich mit Hilfe der visuellen Landmarken im Raum orientieren und die Plattform
lokalisieren. Der Antrieb dazu resultiert aus der aversiven Haltung der Tiere gegenüber dem Wasser.
Das Becken wurde in 4 virtuelle Quadranten eingeteilt (NO, NW, SO, SW). Die Aufzeichnung der
einzelnen Versuchsdurchgänge erfolgte durch eine sich über dem Becken befindende Videokamera
(ca. 150 cm über der Wasseroberfläche), die sowohl mit einem Videorecorder als auch mit einem PC
verbunden war. Die einzelnen Tests wurden computerbasiert mittels EthoVision-Software (Noldus,
Wageningen, Niederlande) digitalisiert und gespeichert.
Testbeginn war in allen Gruppen 35 Tage nach SD- oder Sham-Operation. Davor wurden die Tiere an
3 aufeinanderfolgenden Tagen an den Experimentator gewöhnt. Dazu wurden sie mehrmals aus dem
Käfig herausgehoben und wieder abgesetzt.
Traditionelles Morris Water Maze
Das traditionelle MWM besteht aus einer Reihe von training trials (Akquisitionsphase) gefolgt von sog.
probe trials (Extinktionsphase). In den training trials befindet sich die Plattform in einer konstanten
Position relativ zu den externen Umgebungsreizen. Das Tier wird an einem von 4 virtuellen
Startpunkten (N, W, O, S) mit dem Kopf zum Beckenrand ins Wasser eingesetzt (Abb. 8).
Anschließend hat es die Möglichkeit, innerhalb einer festgelegten Zeitspanne die unsichtbare
Plattform aufzusuchen und dort zu verweilen. Nach einem bestimmten Intertrial-Intervall wiederholt
sich dieser Vorgang, wobei die Ratte an einer anderen Position ins Becken gesetzt wird.
Typischerweise durchlaufen die Tiere 4 bis 8 Versuche täglich über mehrere Tage hinweg. In dieser
Trainingsphase wird die Zeit oder die zurückgelegte Strecke, die sie zum Erreichen der Plattform
benötigen, aufgezeichnet. Da die Plattform unsichtbar ist, sind die Tiere auf ihr räumliches Gedächtnis
30
angewiesen, um sie zu lokalisieren. An das Training schließt sich oftmals ein probe trial an, in dem die
Plattform aus dem Becken herausgenommen wird und die Tiere an einem Punkt starten, der dem
Zielquadranten (in dem sich vorher die Plattform befand) gegenüberliegt. Hier wird Zeit, die die Tiere
im Zielquadranten mit der Suche nach der Plattform verbringen, gemessen.
Durchführung
Einen Tag vor Beginn des Tests wurden die Tiere (n = 9 SD, n = 6 Sham) an das Becken adaptiert.
Hierfür mussten sie 60 s im Becken ohne Plattform schwimmen. Daran schloss sich eine 7-tägige
Akquisitionsphase mit je 4 training trials pro Tag an, wobei jede Startposition randomisiert einmal pro
Tag verwendet wurde (Tabelle 4). Die Sequenz der Startpositionen änderte sich täglich, war jedoch in
allen Untersuchungsgruppen gleich. Die Plattformposition blieb immer konstant. Die Länge der
einzelnen Versuche wurde auf 90 s festgesetzt. Bei Erreichen der Plattform vor Ablauf dieser Zeit, bei
dem das erfolgreiche Erklimmen der Plattform mit allen vier Pfoten als Kriterium diente, konnten die
Tiere für 20 Sekunden auf der Plattform verweilen. Falls ein Tier die Plattform nicht innerhalb 90 s
finden konnte, wurde es vom Experimentator auf die Plattform gesetzt und verblieb dort ebenfalls
20 s. Das anschließende Intertrial-Intervall betrug 30 s, währenddessen wurden die Ratten in ihren
Käfig zurückgesetzt (Rotlicht), dann begann der nächste Versuch.
Am Ende des Trainings schloss sich direkt nach dem letzten training trial und einem 30 s IntertrialIntervall der erste probe trial (60 s) an. Zwei weitere probe trials wurden 2 und 5 Wochen später
durchgeführt (d56 und d77 nach SD), um zu evaluieren, ob und wie lange die im Training erworbene
räumliche Landkarte im Gedächtnis behalten wird.
Während der training trials wurde die Zeit, die die Tiere zum Erreichen der Plattform benötigen und die
sie im Zielquadranten verbrachten, zur Auswertung herangezogen. In den probe trials wurde die im
Zielquadranten verbrachte Zeit relativ zu den anderen Quadranten sowie der Anteil des
thigmotaktischen Verhaltens (Schwimmen des Tieres im 20 cm breiten Beckenrand; siehe auch Abb.
9C) ermittelt. Außerdem wurde die Schwimmgeschwindigkeit in allen Versuchen analysiert.
31
probe
trial 1
SD/
sham
probe
trial 2
probe
trial 3
training trials
0
35
36
37
38
39
40
41
56
77
Tag
Abb. 8 Schema des Versuchsaufbaus für den traditionellen Morris Water Maze (MWM)-Test. SD- und Sham-operierte Tiere
wurden in der 6. Woche nach dem Eingriff getestet. Vom d35 bis d41 bekamen die Tiere jeweils 4 training trials pro Tag. Direkt
nach dem letzten trainings trial wurden sie ohne Plattform in einem ersten probe trial getestet. Zwei weitere schlossen sich 2
und 5 Wochen später an. Die rechte Abbildung zeigt den Aufbau des MWM. Während der training trials befand sich die
Plattform im SW-Quadranten, die Tiere starteten pro Tag jeweils einmal aus jeder Himmelsrichtung. Zur Durchführung der
probe trials wurde die Plattform entfernt und die Tiere starteten gegenüber dem Zielquadranten (NO; Pfeil).
Tag
1
2
3
4
5
6
7
Tabelle 4 Startpositionen im Standard-Watermaze
Startpositionen
N
O
W
S
N
O
S
O
S
N
W
S
N
O
W
N
S
O
W
W
W
S
W
O
N
O
S
N
Modifiziertes Morris Water Maze
Das Verhalten einer weiteren Gruppe von Ratten (n = 8 SD, n = 5 Sham) wurde in einem
abgewandelten MWM getestet [155], welches die Analyse zusätzlicher kognitiver Parameter zulässt:
1) die Entwicklung des Gedächtnisses zur räumlichen Orientierung kann bereits in der Trainingsphase
beurteilt werden (verschmelzen von Akquisitions- und Extinktionsphase) und 2) nicht nur das
Referenzgedächtnis, sondern auch die Fähigkeit die Suchstrategie zu ändern, kann evaluiert werden.
Schon während des einfachen MWM-Trainings (Plattformposition konstant) nutzen Ratten oder Mäuse
ein Arsenal verschiedener kognitiver und nicht-kognitiver Suchstrategien, um aus dem Wasser zu
entkommen. In einer neuen Umgebung ist ihr Explorationsverhalten zunächst durch Thigmotaxis
(Reaktion auf Berührungsreize, instinktiv) geprägt [156, 157]. Im MWM äußert sich dieses Verhalten
dahingehend, dass die Tiere während der Habituationsphase und z.T. auch noch in den ersten
Versuchsdurchgängen primär am Rand des Beckens entlang schwimmen. Gleichzeitig versuchen sie
immer wieder, an der Wand des Beckens hinaufklettern. Nach und nach ändert sich das
32
Schwimmverhalten, die Ratten beginnen sich zunächst nur kurz und dann immer weiter von der
Peripherie wegzubewegen, um das Becken zu durchstreifen. Im Zuge dessen stoßen die Tiere auf die
verborgene Plattform. Nun müssen die Tiere lernen, dass es eine und genau diese Lösung gibt, aus
dem Wasser zu entkommen (bis hierhin erfordert der Test v.a. prozedurales Lernen). Anschließend
müssen sie sich die Plattformposition einprägen und lernen, sich anhand von distalen Landmarken zu
orientieren und diese zur gezielten Navigation (Interpolation der Plattformposition) zu nutzen [157,
158]. Dieser Test beansprucht sowohl das Arbeits- (kurzzeitig, von trial zu trial) als auch das
Referenzgedächtnis (längerfristig, von Tag zu Tag, Test in probe trials).
Der modifizierte Test enthielt folgende Abwandlungen: Während der Trainingsphase befand sich die
Plattform zwar immer im selben Quadranten, allerdings an ständig variierenden Positionen. Damit
waren die Anforderungen schon zu Beginn des Tests andere. Die Tiere mussten lernen, dass sie
innerhalb eines größeren, aber eingegrenzten Areals eine Plattform finden können. Anschließend
wurden die Tiere einer völlig neuen Situation ausgesetzt: nun befand sich die Plattform an
wechselnden Positionen am Beckenrand. Damit konnte evaluiert werden, wie lange die
Gedächtnisspur des früheren Zielquadranten erhalten blieb, ob die Tiere in der Lage waren, eine neue
Suchstrategie zu entwickeln (strategy switching, resultierend in einer Rückkehr zu thigmotaktischem
Verhalten) und wie lange die Tiere dafür benötigten.
Durchführung
Der zeitliche Verlauf des Tests ist in Abb. 9A dargestellt. Die Adaption erfolgte einen Tag vor
Versuchsbeginn, indem die Ratten für 30 s auf die unter der Wasseroberfläche liegende Plattform
gesetzt wurden. Es schlossen sich 4 Tage mit jeweils 4 training trials an (Abb. 9B). Die Sequenz der
Plattform- und Startpositionen war dabei für alle Tiere gleich, ein Versuch dauerte maximal 90 s,
anschließend blieben die Ratten für weitere 20 s auf der Plattform sitzen.
Am vierten Versuchstag schloss sich unmittelbar nach dem letzten training trial ein 30-sekündiger
probe trial an. Dieser wurde ohne Plattform durchgeführt, die Tiere starteten im dem Zielquadranten
gegenüberliegenden Quadranten (NO).
Nachdem die Ratten die Position der Plattform gelernt hatten, wurde ein sog. strategy switching test
durchgeführt. Hier wird geprüft, inwiefern die Tiere in der Lage sind, von der zuvor erworbenen
Suchstrategie (Plattform im SW-Quadranten) auf eine andere umzulernen. Dazu wurde die Plattform
an wechselnden Positionen am Beckenrand aufgestellt. Die Tiere hatten je 6 Versuche an Tag 5 und
33
6, Start- und Plattformpositionen waren für alle Versuchsgruppen identisch (Abb. 9B). Die Ratten
hatten 90 s Zeit, die Plattform zu lokalisieren, und 20 s, um sich nach jedem Versuch auf der Plattform
aufzuhalten.
Unmittelbar nach dem letzten Versuch am Tag 6 schloss sich ein zweiter probe trial (strategy probe
test) an, um die Strategie-Präferenz der Tiere zu testen. Die Plattform wurde aus dem Becken
entnommen und die Tiere schwammen für 30 s von NO startend. Ein weiterer strategy probe Test
(probe trial 3) wurde am Tag 7 durchgeführt.
In diesem Test wurden folgende Parameter analysiert: 1) die Zeit, die die Tiere im Zielquadranten
verbrachten, 2) die Zeit, die sie sich in der Peripherie aufhielten (20 cm Beckenrand) und 3) die
Schwimmgeschwindigkeit. Die Berechnungen erfolgten jeweils relativ zu den anderen Bereichen.
Statistik
Zur Analyse der in der Lernphase gemessenen Parameter wurden die Tagesmittelwerte und zur
besseren Aufschlüsselung der Daten auch die Mittelwerte für die einzelnen trials berechnet. Zur
Berechnung der Niveauunterschiede zwischen den Lernkurven wurde der Mittelwert aus den
Tagesmittelwerten gebildet. Die Auswertung der probe trials in der Extinktionsphase erfolgte durch
Mittelwertbildung innerhalb der Gruppen.
Die statistischen Analysen wurden für unabhängige Stichproben mit Hilfe des Mann-Whitney- (nichtparametrisch, exakt 2-seitig) und für abhängige mit dem Wilcoxon-Test (nicht-parametrisch, exakt 2seitig) durchgeführt. Das statistische Signifikanzniveau wurde für die Irrtumswahrscheinlichkeit
p ≤ 0.05 festgesetzt. Alle angegebenen Werte sind Mittelwerte (MW) ± SEM.
34
A
SD/
sham
Versuchstag
0
34
probe
trial 3
strategy
switching test
training trials
Tag
probe
trial 2
probe
trial 1
35
36
37
38
39
40
41
1
2
3
4
5
6
7
B
C
Abb. 9 Modifiziertes Water Maze. (A) Versuchsablauf. Der Test erfolgte in der 6. postoperativen Woche. Nach der Habituation
wurden die Tiere zunächst für 4 Tage trainiert, eine Plattform im SW-Quadranten zu finden. Unmittelbar nach dem letzten
Training wurde ein probe trial ohne Plattform durchgeführt (d4). An den folgenden beiden Tagen schloss sich der strategy
switching test an, bei dem sich die Plattform am Rand des Beckens befand. Direkt im Anschluss und am Tag 7 wurden 2
weitere probe trials durchgeführt, wobei die Ratten im NO-Quadranten starteten. (B) zeigt den Versuchsaufbau mit den Startund Plattformpositionen an den einzelnen Tagen. Die grauen Kreise sollen die Plattform darstellen, die Ziffern bezeichnen die
einzelnen Versuche pro Tag und deren Reihenfolge gibt Aufschluss über die Kombination von Plattform- und Startpositionen. C
zeigt ein Standbild des Water Maze mit Quadranten und dem 20 cm breiten Randbereich.
Ergebnisse
35
ERGEBNISSE
Die epidurale Applikation von 3 M KCl löste in einem Zeitraum von 100–120 min durchschnittlich 7±2
SD aus, während in keinem der Kontrolltiere SD beobachtet wurden (Abb. 3B). KCl-Tiere mit weniger
als 5 SD wurden von der weiteren Analyse ausgeschlossen. Im Bereich der hinteren Trepanation
verursachte die Applikation der hyperosmolaren Salzlösungen kleine kortikale Läsionen. Im Rahmen
der Neurogenesestudie wurde eine volumetrische Analyse der Läsionen durchgeführt, auf diese soll
an dieser Stelle verwiesen werden.
Projekt 1: Genexpressionsstudie
In diesem Projekt wurde eine Microarray-basierte, genomweite Analyse der Effekte von kortikalen SD
auf die Genexpression im ipsilateralen Kortex durchgeführt. Die Validierung erfolgte für ein
repräsentatives Set von Transkripten mittels qRT-PCR, zusätzlich wurden immunhistochemische
Färbungen für ausgewählte Proteine durchgeführt.
Ergebnisse der Transkriptomanalyse
Die MAS 5.0-basierte Absolutanalyse der Chips ergab, dass von den 15866 analysierten probe sets
durchschnittlich 57 ± 1.7% detektiert werden konnten (present call), d.h. mehr als die Hälfte der mit
dem Chip nachweisbaren Transkripte wurden in den Proben erkannt. Dieser Prozentsatz entsprach
den Herstellervorgaben für diesen Chip. Die Proben- und Hybridisierungsqualität wurde zusätzlich
durch das Verhältnis der 5´ und 3´ Signalintensitäten von Housekeeping Genen (GAPDH: ∅ 1.28; βActin: ∅ 1.31), Sichtung der Hybridisierungskontrollen und durch vergleichbare Scaling Faktoren
(0.194 ± 0.047) validiert.
Eine zusätzliche Transformation der Daten war nicht erforderlich, wie die Scatterplot- und
Regressionsanalysen zeigten. Hierfür wurden die aus der Absolutanalyse hervorgegangenen
Signalintensitäten jedes Zeitpunktes paarweise (Kontrolle vs. SD) in einem Plot aufgetragen und
einer linearen Regression unterzogen. Die Regressionsgeraden wichen nur unwesentlich von den
Diagrammdiagonalen ab, die Daten waren sehr gut miteinander korreliert (R2 > 0.93, Abb. 10A).
Die nach der MAS 5.0 basierten Vergleichsanalyse identifizierten signifikant regulierten Gene sind in
Abb. 10A schwarz markiert. Die Abbildung illustriert, dass die deutlichsten Effekte nach 3h zu
Ergebnisse
36
Tabelle 5
Abb. 10 (A) Scatterplots der mittleren Signalintensitäten der exprimierten Gene im ipsilateralen HL-Kortex von SD- und
Kontrolltieren. Ein Punkt entspricht einem probe set, wobei dessen X-Position den Signalwert in der Sham-Probe, die YPosition den der SD-Probe definiert. Die Daten wurden vorher durch globales Scaling normalisiert, Gene mit absent oder
marginal call auf allen Chips sind nicht dargestellt. Schwarze Punkte kennzeichnen differentiell exprimierte Gene, graue Punkte
die nicht regulierten Gene. (B) Centroid-Ansicht der 353 Gene, deren Expression durch SD verändert wurde (≥ 2-fach). Die
signal log ratios (SLR) aller regulierten Gene eines Zeitpunktes wurden gemittelt. Die Abbildung verdeutlicht, dass der Betrag
der Regulationen zu den frühren Zeitpunkten zugunsten der Heraufregulationen verschoben ist (= Mean ± SD).
Tabelle 5 Anzahl der durch SD differentiell exprimierten Gene. Die oberen Werte repräsentieren die regulierten Gene nach
Anwendung aller Ausschlußkriterien, jedoch ohne fold change-cut off. Unten ist die Anzahl der Gene gezeigt, welche
mindestens 2-fach reguliert ist.
beobachten waren und dass die Anzahl regulierter Gene sukzessive im Zeitverlauf abnahm. Weiterhin
zeigen die Scatterplots, dass der Betrag der Heraufregulationen zu den frühen Zeitpunkten den der
Herunterregulationen überstieg (siehe auch Abb. 10B). Diese Beobachtung basiert hauptsächlich auf
einer stärkeren Regulation (fold change) und nicht auf einer größeren Anzahl der heraufregulierten
Gene, wie Tabelle 5 veranschaulicht.
Nach Anwendung sämtlicher Ausschlusskriterien verblieben 353 Gene (Tabellen A-E im Anhang), die
zu mindestens einem Zeitpunkt ≥ 2-fach reguliert waren. Basierend auf ihrem Proteinprodukt wurden
diese Gene in funktionelle Gruppen kategorisiert (Tabellen 6-16). Die 12 am stärksten betroffenen
Gruppen waren: [1] IEG und Transkriptionsfaktoren (39 Gene), [2] Immunantwort/Inflammation (8
Gene), [3] Signaltransduktion (24 Gene), [4] Transporter (20 Gene), [5] Stressantwort (9 Gene), [6]
extrazelluläre Matrix (7 Gene), [7] Zytoskelett (11 Gene), [8] Metabolismus (19 Gene), [9]
Zellkommunikation u./o. synaptische Transmission (12 Gene), [10] Wachstum und Differenzierung (9
Gene), [11] Zelladhäsion und Membran (12 Gene) und [12] Zellzyklus (3 Gene).
Ergebnisse
37
Abb. 11 Kortikales Genexpressionsprofil nach SD. Die 353
mindestens 2-fach regulierten
Gene
wurden
hierarchisch
geclustert
(Genesis
1.5.0;
Euclidische Distanz, Average
Linkage, Distanz-schwelle 0.05),
den resultierenden Clustern
wurden biologische Prozesse
bzw. molekulare Funktionen
zugeordnet. Der Clusteralgorithmus
ordnet
die
Gene
entsprechend der Ähnlichkeit
ihres
Expressionsmusters
basierend auf den signal log
ratios
(SLR).
Die
Farben
repräsentieren die SLR relativ
zur Kontrolle, d.h. rot codiert
Herauf-, grün Herabregulation.
Das Maximum wurde zur
besseren Darstellbarkeit der
schwächeren Regulationen auf
SLR von ± 3 (=fold change von
8 bzw. 0.125) begrenzt.
Zur Identifizierung von Gruppen ähnlich exprimierter Gene wurde eine Clusteranalyse nach Sturn et
al. [148] durchgeführt und die daraus resultierenden Cluster m.H. des NetAffx Gene Ontology Mining
Tool (www.affymetrix.com) funktionellen Kategorien zugeordnet. In Abb. 11 ist das Ergebnis dieser
Analyse dargestellt. Die meisten der beobachteten Veränderungen besaßen transienten Charakter
38
Ergebnisse
und traten bereits 3 h nach SD auf. Zu diesem Zeitpunkt waren hauptsächlich die IEG und
Transkriptionsfaktoren (z.B. c-Fos, EGR1, 2 und 4, JunB), Signaltransduktionsmoleküle (z.B. Stat3,
JAK2, RGS2 und 4, DUSP6) sowie Wachstums- und Differenzierungs-assoziierte Gene (z.B. BDNF,
trkB, NUMB, Socs2) betroffen. Außerdem waren die meisten der Gene, welche mit der Immunantwort
(z.B. MCP-1, MIP-1α, MIP-1β, Cox2), dem Transport (z.B. K+ und Ca2+ Kanäle, AQP4), dem
Tabelle 6 Immediate Early Gene und Transkriptionsfaktoren
Genname
Markierungen kennzeichnen Genregulationen, die aus der Literatur bekannt sind: schattiert,
nach SD; fett, im ipsilateralen “remote” Kortex nach fokaler Ischämie; x, in postischämischen Gewebe.
Public ID
x fos-like antigen 2
NM_012954
x c-fos oncogene
BF415939
early growth response 4
x activating transcription factor 3
fold change
Unterstreichung = signifikant
Gensymbol
Ref.
3h
24h
7d
30d
FOSL2 / FRA2
48.5
-
-
1.6
[3, 7]
c-Fos
19.7
-
-2.0
-
NM_019137
EGR4 / NGFI-C
19.7
-
-
-
[3, 811]
[14]
NM_012912
ATF3
16.0
-
-
1.3
[17]
D83508
EGR2 / KROX20
16.0
-
-
-
[14]
Jun-B oncogene
NM_021836
JunB
10.6
2.1
-
-
[11, 21]
nuclear receptor subfamily 4, group A, member 3
NM_031628
NR4A3
9.2
-1.6
-
-
x cAMP responsive element modulator
NM_017334
CREM
8.6
-
-
1.9
[8]
x activity regulated cytoskeletal-associated protein
NM_019361
ARC
8.6
-1.6
-
1.7
[7]
x nuclear receptor subfamily 4, group A, member 1 / immediate early gene transcription
factor NGFI-B
NM_024388
NR4A1 / NGFI-B
7.5
-1.4
-1.6
-
[3, 7,
14]
B-cell translocation gene 2, anti-proliferative
BI288701
BTG2 / PC3
7.5
-
-
-
[7]
Cbp/p300-interacting transactivator, with Glu/Asp-rich carboxy-terminal domain, 2
AI013390
CITED2
6.5
-
-
-
U72345
NR4A2 / Nurr1
5.3
-
-
-
[14]
NM_019242
IFRD1 / PC4
4.9
-
-
-
[32]
D83508
EGR2 / KROX20
4.9
-
-
-
[14]
Cbp/p300-interacting transactivator, with Glu/Asp-rich carboxy-terminal domain, 2
AI013390
CITED2
4.6
1.4
-
-
x nuclear factor, interleukin 3-regulated
NM_053727
NFIL3
4.6
-
-
-
[8]
x v-jun sarcoma virus 17 oncogene homolog (avian)
BI288619
c-Jun
4.6
1.9
-
1.3
[3, 7,
11, 21]
activity and neurotransmitter-induced early gene protein 4 (ania-4)
NM_021584
ANIA4
3.5
1.5
-
-
zinc finger protein 36
x interferon-related developmental regulator 1
AB025017
ZFP36 / TTP
3.5
1.7
-
-
x immediate early response 3
AI176519
LER3
3.5
1.7
-
-
[8]
x early growth response 1 (NGFI-A)
NM_012551
EGR1 / KROX24
3.2
-1.3
-1.6
-
BI288701
BTG2 / PC3
3.2
-
-
-
[3, 7,
14, 21]
[7]
x v-jun sarcoma virus 17 oncogene homolog (avian)
BI288619
c-Jun
3.0
1.7
-
-
four and a half LIM domains 2
NM_031677
FHL2
2.8
-
-
-
Jun dimerization protein 2
[3, 7,
11, 21]
NM_053894
JUNDP2
2.8
-
-
-
x Activity and neurotransmitter-induced early gene 2 (ania-2) mRNA, 3'UTR
AI013468
ANIA2
2.8
-
-
-
[3]
x cAMP responsive element modulator
[8]
NM_017334
CREM
2.3
-
-
-
basic helix-loop-helix domain containing, class B2
NM_053328
BHLHB2
2.1
1.6
-
-
rad and gem related GTP binding protein 2
NM_022685
REM2
2.1
-
-
-
PHD finger protein 13 (predicted)
AI102512
Phf13
2.1
-
-
-
Activity and neurotransmitter-induced early gene 11 (ania-11) mRNA, 3' UTR / Zinc
finger protein RIN ZF
BI289112
ANIA-11 / Rinzf
2.1
-
-
-
B-cell translocation gene 1, anti-proliferative -cell translocation gene 1
NM_017258
BTG1
2.0
-
-
-
NM_012953
FOSL1 / FRA1
2.0
-
-
-
zinc finger protein 189 (predicted)
AI407872
Zfp189
2.0
-
-
-
general transcription factor IIH, polypeptide 3 (predicted)
BM385649
Gtf2h3
-13.9
-
-
-
zinc finger protein 297B (predicted)
AI013512
Zfp297b
-2.1
-
-
-
ankyrin repeat and SOCS box-containing protein 2 (predicted)
BI295982
Asb2
-2.0
-
-
-
activating transcription factor 5
BM391471
ATF5
-
2.0
-
-
x fos-like antigen 1
[3]
39
Ergebnisse
Zytoskelett (z.B. TPM1, MAP2, MAP6), der Kommunikation & Synapsen (z.B. Homer1, Syt4,
GABBR1) oder dem Metabolismus (z.B. Cbr1, IDI1, eNOS, HMGCR) assoziiert sind, bereits nach 3 h
differentiell exprimiert. Die Expression einiger dieser früh regulierten Gene blieb darüber hinaus
langfristig verändert (z.B. Syt4, TIMP1). Vertreter der Stress-assoziierten und DNA-Reparatur-Gene
waren kontinuierlich während der ersten 24 h nach SD induziert (z.B. hsp27, hsp32, Gadd45α). Die
Gruppe der Zelladhäsions- und Membran-assoziierten Gene wiederum war hauptsächlich 24 h nach
SD reguliert (z.B. CD44, GP38), wenngleich einige Änderungen bereits nach 3 h auftraten (z.B.
ICAM1). Auch 1 – 4 Wochen nach SD konnte noch eine signifikante Anzahl differentiell exprimierter
Gene identifiziert werden (z.B. CD74, Dexras1, TTR). Eine klare Präferenz bestimmter funktioneller
Gruppen lag nicht vor.
Tabelle 7 Signaltransduktion
Genname
Markierungen kennzeichnen Genregulationen, die aus der Literatur bekannt sind: fett, im
ipsilateralen “remote” Kortex nach fokaler Ischämie; x, in post-ischämischen Gewebe.
x
Public ID
fold change
Gensymbol
3h
24h
7d
30d
-
dual specificity phosphatase 1 / protein tyrosine phosphatase, non-receptor type 16
BE110108
DUSP1 / PTPN16
7.5
-
-
dual specificity phosphatase 1 / protein tyrosine phosphatase, non-receptor type 16
BE110108
PTPN16 / Dusp1
4.3
-
-1.3
-
dual specificity phosphatase 2 (predicted)
AI408580
DUSP2
2.1
-
-
-
dual specificity phosphatase 5 / MAP-kinase phosphatases
NM_133578
CPG21 / DUSP5
13.0
-
-
-
dual specificity phosphatase 6 / MAPK phosphatase 3
AI602811
DUSP6 / MKP3
4.0
-
-
-
AI231350
DUSP6 / MKP3
3.7
-
-
-
NM_053883
DUSP6 / MKP3
3.7
-
-
-
dual specificity phosphatase 14 (predicted) /// similar to Dual specificity phosphatase
14
dual-specificity tyrosine-(Y)-phosphorylation regulated kinase 2 (predicted)
AI236997
Dusp14
2.0
-
-
-
BM388710
DYRK2
4.6
-
-
-
inositol polyphosphate-4-phosphatase, type II
U96920
INPP4B
-
-
2.3
-
Ref.
[3]
protein phosphatase 2C, magnesium-dependent, catalytic subunit
NM_019372
PDP1
2.0
-
-
-
x
regulator of G-protein signaling protein 2
AY043246
RGS2 / G0S8
4.6
-
-
-
[8]
x
AY043246
RGS2
3.7
-
-
-
[8]
regulator of G-protein signaling 4
U27767
RGS4
3.0
-
-1.5
-
[7]
G protein-coupled receptor kinase 6
NM_031657
GPRK6
2.0
-
-
-1.6
RASD family, member 2
BF404624
RASD2
2.0
-
-
-
RAS, dexamethasone-induced 1
AF239157
RASD1 /
DEXRAS1
-
-1.9
-2.0
-
tribbles homolog 1 (Drosophila)
BM387324
Trib1
4.3
1.4
-
-
x
signal transducer and activator of transcription 3
BI285863
Stat3
2.5
2.5
-
-
[3, 7]
x
Janus kinase 2
NM_031514
JAK2
2.5
1.6
-
-
[3]
serine threonine kinase pim3
NM_022602
PIM3
2.3
-
-
-
Suppressor of cytokine signaling 2
BM384088
Socs2
2.3
-
-
-
serine/threonine kinase 17b (apoptosis-inducing)
AI012590
STK17B / DRAK2
-2.0
-
-
-
protein kinase, cAMP dependent, catalytic, beta (predicted)
D10770
Prkacb
2.1
1.4
-
-
protein kinase, cAMP-dependent, regulatory, type 2, alpha
AW919085
PRKAR2A
2.0
-
-
-
non-catalytic region of tyrosine kinase adaptor protein 1 (predicted)
BM386507
Nck1
-2.1
-
-
calcium/calmodulin-dependent protein kinase I gamma
AW251224
CAMK1G
2.5
-
-
-
calcium/calmodulin-dependent protein kinase II, delta
X77194
CAMK2D
1.3
2.1
-
-
40
Ergebnisse
Tabelle 8 Immunantwort, Inflammation
Genname
Public ID
x
chemokine ligand 2 / monocyte chemoattractant protein-1
NM_031530
x
small inducible cytokine A4 / lymphocyte-activation gene 1
x
chemokine ligand 3, macrophage inflammatory protein 1-α
U22414
x
Fc receptor, IgG, low affinity III
NM_053843
interleukin 1 receptor accessory protein
NM_012968
CD74 antigen (invariant polpypeptide of major histocompatibility class II antigenassociated)
NM_013069
lectin, galactose binding, soluble 3
fold change
Gensymbol
Ref.
3h
24h
7d
30d
CCL2 / MCP-1
32.0
6.5
-
-
U06434
CCL4 / MIP-1β
2.8
-
-
-
U03389
PTGS2 / Cox2
14.9
1.6
1.7
-
CCL3 / MIP-1α
2.6
-
-
-
[62, 63,
159]
[3, 7, 8]
FcγR3
2.5
-
-
-
[8]
IL1RAP
2.0
-
-
-
CD74
-
-
2.0
-
NM_031832
LGALS3
-
4.3
2.0
-
Public ID
Gensymbol
[3, 8,
67]
[8]
Tabelle 9 Transporter
Genname
x kennzeichnet Genregulationen, die in post-ischämischen Gewebe beschrieben wurden.
fold change
3h
24h
7d
30d
-
Ref.
Ionen- und Wassertransport
x
potassium channel, subfamily V, member 1
BF391696
KCNV1
2.8
-1.5
-1.2
calcium channel, voltage-dependent, N type, alpha 1B subunit
AF389419
CACNA1B
2.6
1.6
-
-
voltage-dependent calcium channel gamma-3 subunit
AF361340
CACNG3
2.5
-
-
-
potassium voltage-gated channel, subfamily F, member 1
BI282169
KCNF1
2.0
-
-
-
ATPase, Na+K+ transporting, alpha 1
M74494
ATP1a1
2.0
-
-1.5
-1.2
ATPase, Na+/K+ transporting, alpha 3 polypeptide
NM_012506
ATP1a3
2.0
-
-
-
ATPase, Na+/K+ transporting, beta 2 polypeptide
U45946
ATP1b2
2.0
-
-
-2.0
solute carrier family 10, member 2
NM_017222
SLC10a2
-
2.1
-
-
solute carrier family 25 (mitochondrial carrier, phosphate carrier), member 25
AI177358
SLC25a25
2.8
-1.4
-
-
solute carrier organic anion transporter family, member 1a4
U95011
SLCo1a5
-2.0
-1.2
-
-
aquaporin 4
NM_012825
AQP4
2.1
-
-
-1.4
[160,
161]
Protein- and Vesikeltransport
x
nucleoporin 98
NM_031074
NUP98
9.8
-
-
-
vesicle-associated membrane protein 1
M24104
VAMP1
3.0
-
-
-
peroxisomal biogenesis factor 13 (predicted)
AI012951
Pex13
2.0
-
-
-
translocase of outer mitochondrial membrane 20 homolog (yeast)
D63411
Tomm20
2.0
1.4
-
-
tumor-associated protein 1
NM_017353
TA1 / SLC7a5
3.2
1.7
-
-
S100 calcium binding protein A10 (calpactin)
NM_031114
S100A10
-
2.1
-
-
[162]
Steroid-, Fettsäure und Thyroidhormontransport
carnitine O-octanoyltransferase
J02844
CROT
-2.0
-1.4
-
-
Transthyretin
NM_012681
TTR
1.6
-2.5
1.4
5.3
albumin
NM_134326
ALB
-1.9
-2.3
-
-
Genname
Public ID
Gensymbol
x
NM_031970
Tabelle 10 Stress (Hitzeschockproteine, DNA Reparatur)
x
heat shock 27kDa protein 1
fold change
3h
24h
7d
30d
HSPB1 / hsp27
1.7
7.5
-
-
heme oxygenase 1
NM_012580
HMOX1 / hsp32
1.2
2.0
-
-
DnaJ (Hsp40) homolog, subfamily B, member 5 (predicted)
BM386741
HSC40 / DNAJB5
3.5
-
-
-
BM384926
HSPF1
2.5
-
-
-
x
growth arrest and DNA-damage-inducible 45 alpha
NM_024127
GADD45α
1.3
2.8
-
-
x
growth arrest and DNA-damage-inducible 45 gamma (predicted)
AI599423
Gadd45γ
9.8
-
-
-
growth arrest and DNA-damage-inducible 45 beta (predicted)
BI287978
Gadd45β
4.9
-
-
-
damage-specific DNA binding protein 1
AJ277077
DDB1
-
2.0
-
-
metallothionein
AF411318
MT1A
4.0
-
-
-
x
Ref.
[3, 57,
78, 162,
163]
[3, 63,
76, 163]
[162,
163]
[8]
[3, 8]
41
Ergebnisse
Tabelle 11 Metabolismus
Genname
Public ID
fold change
Gensymbol
3h
24h
7d
30d
Ref.
Phosphofructokinase, liver, B-type
AI408151
Pfkl
3.5
-
-
-
isopentenyl-diphosphate delta isomerase
NM_053539
IDI1
2.8
-
-
-
BI290053
IDI1
2.0
-
-
-
carbonyl reductase 3 (predicted)
BI282197
Cbr3
32.0
-
-
-
ubiquitin-activating enzyme E1-domain containing 1 (predicted)
AI408025
Ube1dc1
2.0
1.5
1.3
-
adenylate cyclase activating polypeptide 1
NM_016989
ADCYAP1
2.5
-
-1.6
-
x
3-hydroxy-3-methylglutaryl (HMG)-Coenzyme A reductase
NM_013134
HMGCR
4.0
1.6
-
-
[8]
x
BM390399
HMGCR
2.3
-
-
-
[8]
prostaglandin E synthase
AF280967
PTGES
2.0
-
-
-
proprotein convertase subtilisin/kexin type 1
M83745
PCSK1
2.1
-
-
-
methionine adenosyltransferase II, alpha
NM_134351
MAT2A
2.0
2.1
-
-
Branched chain aminotransferase 1, cytosolic
BF393120
Bcat1
2.0
-
-
-
selenophosphate synthetase 2 (predicted)
AA799700
Sephs2
-2.0
-
-
-
Phosphoribosyl pyrophosphate synthetase 2
NM_012634
PRPS2
-
-
-
-2.0
glutaminase 2 (liver, mitochondrial)
J05499
GA / GLS2
-
-2.0
-1.3
-
nitric oxide synthase 3, endothelial cell
AJ011116
NOS3 / eNOS
2.0
2.5
-
-
ribosome associated membrane protein 4
AI103695
RAMP4
2.3
1.5
-
-
eukaryotic translation initiation factor 4A, isoform 1
BI284436
EIF4A1
1.5
2.1
-
-
elongation factor RNA polymerase II 2 (predicted)
BI291626
Ell2
2.0
-
-
-
CTD-binding SR-like rA1
NM_019384
SR-A1
1.9
2.1
-
-2.1
heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K
NM_057141
HNRPK
-
2.0
-
-
mRNA Metabolismus und Proteinsynthese
Tabelle 12 Zellkommunikation, Synapsen-assoziierte Gene
Genname
Public ID
x
x
fold change
Gensymbol
3h
24h
7d
30d
homer homolog 1 (Drosophila), neuronal immediate early gene, 1
AF030088
Homer1
14.9
-2.1
-
-
synaptotagmin 4
L38247
SYT4
4.3
2.5
-
-
syntaxin 1a (brain)
NM_053788
STX1A
2.1
-
-
-
syntaxin binding protein 1
U06069
STXBP1
2.3
1.4
-
-
VGF nerve growth factor inducible
NM_030997
VGF
3.0
1.6
-
-
chondroitin sulfate proteoglycan 5 / neuroglycan C
AF292102
CSPG5
2.3
1.6
1.9
RING finger protein LIRF
NM_134374
LIRF / Rnf39
3.0
-
1.3
-
secretogranin 2
NM_022669
SgII / CgC
3.2
-
-
-
glutamate decarboxylase 1
M38350
GAD1
2.5
-
-
-
gamma-aminobutyric acid (GABA) B receptor, 1
Y10369
GABBR1
2.0
1.7
-
-
G protein-coupled receptor 149
AY030276
Gpr149
-3.7
-
-
-
adrenergic receptor, beta 1
NM_012701
ADRB1
2.1
-
-
-
Genname
nach SD; x, in post-ischämischen Gewebe.
Public ID
Gensymbol
x
NM_053819
x
Ref.
[164]
[7]
[7, 59]
Tabelle 13 Extrazelluläre Matrix
fold change
3h
24h
7d
30d
TIMP1
9.2
4.3
8.0
-
NM_021989
TIMP2
1.3
2.0
1.4
-
tissue factor pathway inhibitor 2
AI179507
TFPI2
2.5
-
-
-
Serine protease inhibitor
NM_031531
SPIN2C
-
2.0
-
-
procollagen, type IX, alpha 1 (predicted)
BM388861
Col9a1
8.0
-
-
-
natriuretic peptide precursor type A
NM_012612
NPPA / ANP
2.1
-
-
-
Thrombospondin 2 (predicted)
AI406660
TSP-2
5.7
-
-
-
Ref.
[8, 165,
166]
[67, 68]
42
Ergebnisse
Tabelle 14 Zytoskelett
Genname
x
x
Public ID
fold change
Gensymbol
3h
24h
7d
30d
actin, beta
NM_031144
ACTB
1.5
3.2
-
-
actin, beta
NM_031144
ACTB
1.3
2.3
-
-
actin related protein 2/3 complex, subunit 4 (predicted)
AI411582
Arpc4
2.1
-1.5
-
-
Filamin C, gamma (actin binding protein 280) (predicted)
AI103600
---
-
2.1
-
-
CAP, adenylate cyclase-associated protein 1 (yeast)
BG380723
CAP1
2.1
1.5
-
-
Wiskott-Aldrich syndrome-like (human)
BG375480
Wasl
-2.1
-
-
-
tropomyosin 1, alpha
AF372216
TPM1
2.6
1.7
-
-
NM_019131
TPM1
2.3
-
-
-
AF370889
TPM1
2.3
1.9
-
-
AA875132
TPM1
2.1
-
-
-
microtubule-associated protein 2
X74211
MAP2
2.3
1.7
-
-
AJ002556
MAP6
2.5
-
-
-
Kinesin family member 1B
BE109334
Kif1b
2.5
-
-
-
reversion induced LIM gene
NM_017062
RIL
-
2.3
1.5
-
calponin 3, acidic
BI274457
CNN3
-
2.3
1.3
-
Public ID
Gensymbol
Ref.
[3]
[162]
Tabelle 15 Zelladhäsion, Membran
Genname
fold change
3h
24h
7d
30d
Ref.
Zelladhäsion
x
intercellular adhesion molecule 1
NM_012967
ICAM1
4.0
-
-
-
protocadherin 8
NM_022868
PCDH8
4.0
-
-
-
CEA-related cell adhesion molecule 9
NM_053919
CEACAM9
-
-
-
2.0
camello-like 3
AF187814
CML3
-
-3.0
-1.6
-
camello-like 5
AI717047
CML5
-
-2.0
-
-
claudin 11
NM_053457
CLDN11
1.4
2.1
-
-1.6
cysteine rich protein 61
NM_031327
CYR61
3.0
-
-
-
[8, 17]
[162,
163]
[162,
163]
[162,
163]
Membran-assoziierte Gene
x
CD44 antigen
NM_012924
CD44
-
4.0
-
-
x
CD44 antigen
BI302830
CD44
-
4.0
-
-
x
CD44 antigen
AF065147
CD44
-
3.5
1.5
-
glycoprotein 38
NM_019358
GP38
-
2.6
1.6
-
glycoprotein (transmembrane) NMB
NM_133298
GPNMB
-
1.9
2.0
-
hyaluronan and proteoglycan link protein 2 / brain link protein 1
AI145465
BRAL1
1.2
2.1
-1.1
-
epithelial membrane protein 1
BI275741
EMP1
2.1
3.2
-
-
Genname
Public ID
Gensymbol
x
Tabelle 16 Wachstum und Differenzierung
x
fold change
3h
24h
7d
30d
brain derived neurotrophic factor
X67108
BDNF
14.9
-
-
-
M55292
NTRK2 / TRKB
3.0
-
-
-2.0
fibroblast growth factor 12
AW252096
FGF12
2.1
-
-
-
sprouty homolog 2 (Drosophila) (predicted)
BM390457
Spry2
3.2
-
-
-
numb gene homolog (Drosophila)
BI287975
NUMB
2.0
-1.3
-
-
neurogenic differentiation 1
NM_019218
NeuroD1
-2.0
-
-
-
neural precursor cell expressed, developmentally down-regulated gene 9 (predicted)
BM392374
Nedd9
2.5
-
-
-
diphtheria toxin receptor
NM_012945
DTR
2.3
-
-
-
frizzled-related protein (predicted)
BM391538
FRZB
-
-
-
2.1
Ref.
[8, 9,
65, 167]
[65]
[168]
43
Ergebnisse
Datenvalidierung
Verschiedene
Gesichtspunkte
machen
eine
sekundäre
Überprüfung
von
Microarray-Daten
unerlässlich. Zum einen können technische Probleme wie z.B. fehlerhafte Amplifikation des
Probenmaterials, Kreuzhybridisierungen oder Normalisierungsfehler auftreten. Hinzu kommt, dass es
bisher keinen generellen Konsensus zur Datenanalyse gibt. Zum anderen hat auch das
experimentelle Design Einfluss auf die Aussagekraft von Chipanalysen. In der vorliegenden Studie
wurde mRNA aus Kortexgewebe mehrerer Tiere gepoolt. Neben einem erheblich geringeren
Materialaufwand hat das Poolen von Proben auch den Vorteil, die Zuverlässigkeit der identifizierten
Kandidatengene zu steigern. Jedoch kann keine Aussage zur inter-individuellen Variabilität getroffen
werden [169]. Außerdem kann die Verwendung von Gewebe zu einer Maskierung von Änderungen
führen, welche nur in einer kleinen Subpopulation von Zellen auftreten. Nicht zuletzt bleibt eine
funktionelle Aussage anhand von Transkriptionsstudien hypothetisch, da Änderungen auf mRNALevel nicht zwangsläufig mit solchen der entsprechenden Proteine korreliert sind [170].
Zur Prüfung der Validität der Chipdaten wurden Gene aus 8 funktionellen Kategorien ausgewählt und
deren Expression mit qRT-PCR und/oder Immunhistochemie analysiert.
Quantitative RT-PCR von gepoolten und Einzelproben
Zunächst wurden qRT-PCR Analysen für 12 Transkripte mit
Tabelle 17 qRT-PCR-Daten
Gen
fc MA
den mRNA-Pools durchgeführt. Für mehr als die Hälfte der
fc qRT-PCR
Pools
indiv.
3h
Transkripte
stimmte
die
mit
qRT-PCR
ermittelte
Expressionsänderung nahezu exakt mit den Microarraydaten
überein (z.B. TIMP1, BDNF), für andere wurde eine höhere
(z.B. Cox-2, EGR1) oder geringere (z.B. MCP-1, Ntrk2)
24 h
Änderung relativ zu den sham-Tieren gemessen, jedoch
entsprach die Richtung der Regulation immer der auf den
17).
14.9
32.0
14.9
9.2
3.2
3.0
29.1
9.0
16.2
9.3
10.9
1.5
35.8
19.1
7.7
15.9
1.2
CML3
TTR
TIMP1
-3.0
-2.5
4.3
-3.0
-5.9
3.7
-4.3
-4.8
2.0
CD74
TIMP1
Dexras1
2.0
8.0
-2.0
2.2
4.9
-1.6
6.9
-1.1
TTR
Ntrk2
ATP1b2
Prps2
5.3
-2.0
-2.0
-2.0
6.0
-1.4
-1.4
-1.4
2.0
1.6
1.3
1.0
7d
Chips ermittelten. Somit war die Reproduzierbarkeit der
Microarray-Daten in den gepoolten RNAs sehr gut (Tabelle
Cox2
MCP-1
BDNF
TIMP1
EGR1
Ntrk2
30 d
Zur Klärung der Frage, ob die Verwendung gepoolter Proben
den individuellen Zustand innerhalb der Gruppe gut widerspiegelt, wurden qRT-PCRs mit den mRNAs
von Einzeltieren und 10 gen-spezifischen Primerpaaren durchgeführt (Abb. 11, Tabelle 17). Für TTR,
Ergebnisse
44
BDNF, EGR1, Cox2, DEXRAS1, CML3 und TIMP1 stimmte die Richtung der Regulation mit der
anhand der Microarray-Analysen ermittelten überein. Die Streuung der Proben war gering bis
moderat, nur für TTR gab es nach 30 d eine große interindividuelle Varianz. Die Chip-basierten bzw.
auch die aus den qRT-PCR-Analysen der Pools hervorgegangenen Daten konnten insbesondere für
die schwach regulierten Gene ATP1b2, Prps2 and trkB nicht reproduziert werden. Damit konnten die
Microarraydaten mit einer unabhängigen Methode am selben Ausgangsmaterial reproduziert werden,
während die Analyse von Individuen eine Reproduzierbarkeit von >70% ergab. Vergleichbare Werte
wurden auch in anderen Studien angegeben (Agrawal et al., 2002; Altar et al., 2004).
Abb. 11 Validierung der Expressionsdaten ausgewählter Gene in Pools und Einzelproben (single). Die hellgrauen Balken
zeigen die mit Microarray ermittelten Änderungen, schwarze und weiße Balken stellen die qRT-PCR-Daten dar, wobei die
weißen Balken aus den PCRs der Einzelproben gemittelt wurden. Die Fehlerbalken entsprechen einem Konfidenzintervall von
95%. Die aus den qRT-PCRs von gepoolten Proben resultierenden Daten spiegeln die Microarray-Ergebnisse sehr gut wider,
für alle getesteten Gene konnte die Richtung der differentiellen Expression bestätigt werden. Mehr als 70% der Daten konnten
mit einer Analyse der Einzeltiere reproduziert werden. Die Berechnung der fold changes erfolgte nach Pfaffl [4].
Proteinexpression
Parallel zu den Genexpessionsstudien wurde für 4 der daraus hervorgegangenen Treffer auch die
Expression der entsprechenden Proteinprodukte untersucht. Koronale Hirnschnitte von je 3 Tieren pro
Gruppe wurden zunächst histochemisch mit der ABC-Methode gefärbt, daran schloss sich eine
Phänotypisierung der Zellen mit neuronalen und glialen Markern an.
45
Ergebnisse
Ähnlich wie die mRNA, wurden auch das c-Fos-, Cox-2, Stat3- und hsp27 Protein durch SD
heraufreguliert. Dabei zeigte c-Fos die schnellste Antwort. Das Protein war bereits nach 3 h sehr stark
heraufreguliert (Abb. 12D). Davon war der gesamte ipsilaterale Kortex, aber auch das stratum
granulare des ipsilateralen Gyrus dentatus betroffen. SD führen zu einer Heraufregulation von c-Fos in
allen kortikalen Schichten, wobei die stärkste Expression in den Schichten II/III und IV nachgewiesen
wurde. Im kontralateralen Kortex gab es keine Veränderungen, allerdings zeigte ein Tier eine
schwache Heraufregulation im kontralateralen Gyrus dentatus. Histologisch besaßen die c-Fos
positiven Zellen die Morphologie von Neuronen. Dies konnte durch Mehrfachmarkierungen mit GFAP
und NeuN bestätigt werden (Abb. 13A, B).
Die Expression der anderen Proteine zeigte einen deutlich anderen zeitlichen Verlauf als die der
Transkripte. Cox-2 blieb im Gegensatz zur mRNA über einen Zeitraum von 7 d heraufreguliert. Die
Proteinexpression begann bereits 3 h nach SD, hatte ihr Maximum im Kortex zwischen d1 und d5 und
nahm nach einer Woche wieder ab (Abb. 12A). Anders als bei c-Fos fand die Heraufregulation von
Cox-2 nur in den oberen ipsilateralen Kortexschichten (II/III) statt. Im Hippocampus wurde Cox-2 nur
sehr kurz 24h nach SD induziert, am stärksten im ipsilateralen Gyrus dentatus. Jedoch zeigte sich in
allen Tieren auch eine kontralaterale Induktion unterschiedlichen Ausmaßes. Die Mehrfachmarkierung
identifizierte die Cox-2 immunreaktiven Zellen als Neuronen (Abb. 13H, I).
Expressionsverlauf und -muster von Stat3 und hsp27 waren ähnlich (Abb. 12B,C). Beide Proteine
waren hauptsächlich 3 d nach SD heraufreguliert, jedoch konnten bei starker Vergrößerung auch 5 d
nach SD ipsilateral noch Zellen mit erhöhter Immunreaktivität detektiert werden. Dies betraf alle
kortikalen Schichten, jedoch bestand eine graduelle Abstufung mit der stärksten Expression in den
oberen
Schichten.
Morphologisch
entsprachen
die
hsp27-positiven
Zellen
Astrozyten,
die
Phänotypisierung zeigte eine klare Kolokalisation mit GFAP (Abb. 13C-G). Für Stat3 war die
Zuordnung zu bestimmten Zelltypen schwieriger, da das Protein nur relativ schwach exprimiert wird.
Sicher konnte Stat3 zum einen mit GFAP, aber auch mit NeuN kolokalisiert werden (Abb. 13K, L).
Dabei exprimierten Astrozyten das Protein sowohl im Zellkern, als auch im Zytoplasma, wobei auch
die Zellfortsätze immunreaktiv waren (Abb. 13P). Auch in Neuronen war das Protein intranukleär und
zytoplasmatisch lokalisiert (Abb. 13N, Q). Im Gegensatz zu den anderen Proteinen wird Stat3 auch im
kontralateralen und sham-Kortex exprimiert, zumeist in Zellen mit neuronaler Morphologie sowohl
einigen Astrozyten (Abb. 13M). Keines der untersuchten Proteine konnte mit dem mikroglialen Marker
Ox-42 oder mit Oligodendrozyten (O4) kolokalisiert werden (Abb. 13G, J, N; z.T. ohne Abbildung).
Ergebnisse
46
Abb. 12 Expression verschiedener Proteine nach SD. (A) Cox-2 Immunhistochemie. Die Expression des Proteins beginnt
bereits kurz nach dem Auftreten der SD, bleibt bis zum d5 auf hohem Niveau und fällt zum d7 wieder ab. Die Heraufregulation
betraf die oberen Schichten des gesamten ipsilateralen Kortex. SD führten nach 1 d auch zu einer Induktion von Cox-2 im
stratum granulare des ipsiwie auch des kontralateralen Gyrus dentatus. Morphologisch entsprachen die Cox-2-immunreaktiven
+
Zellen Neuronen. In sham-Tieren fanden sich nur vereinzelt schwach Cox-2 Zellen. (B) Auch die Expression von Stat3 wurde
durch SD beeinflusst. Die stärkste Immunreaktivität wurde am d3 detektiert, in geringerem Ausmaß konnten auch am d5 noch
Zellen mit erhöhter Stat3-Immunreaktivität identifiziert werden. (C) Der Expressionsverlauf von hsp27 ähnelte dem von Stat3,
wobei eine leichte Erhöhung der Immunreaktivität auch noch am d7 detektiert wurde. Die Ausschnitte zeigen, dass der Kortex
+
von sham-Tieren absolut keine hsp-27-Immunreaktivität detektierbar war, die hsp27 Zellen in SD-Tieren hatten eine
astrozytäre Morphologie. (D) c-Fos-IR 3 h nach SD-Induktion. Es kam zu einer starken Erhöhung des Proteins im gesamten
ipsilateralen Kortex, wie auch im ipsilateralen Gyrus dentatus. Die Morphologie entsprach der von Neuronen. In sham-Tieren
+
fanden sich nur vereinzelt c-Fos Zellen. (E) Schema eines koronalen Schnittes bei Bregma -3.8 nach Paxinos [171], die 400fachen Vergrößerungen wurden im Bereich des Par1 aufgenommen. Balken = 50 µm. (Ursache für die unterschiedliche
Lokalisation der nekrotischen Läsion ist die Herkunft der Schnitte aus der Genexpressions- (3h, 1d, 7d) und der
Neurogenesestudie (3d, 5d), siehe entsprechende Abschnitte.)
Ergebnisse
47
Abb. 13 Phänotypisierung der c-Fos-, hsp27-, Cox2- und Stat3-positiven Zellen im ipsilateralen Par1-Kortex nach SD. (A, B)
Die Mehrfachmarkierung gegen c-Fos (rot), NeuN (blau) und GFAP (grün) zeigt, dass c-Fos in allen Neuronen exprimiert wird.
(C-F) Identifizierung der hsp27-positiven Zellen. (C+D) Ausschnitte eines mit Antikörpern gegen hsp27 (grün), NeuN (blau) und
GFAP (rot) gefärbten Schnittes. Hsp27 wird nach SD im Zytoplasma von Astrozyten heraufreguliert, auch die Ausläufer der
+
Zellen sind hsp27 . Eine Kolokalisation mit NeuN oder O4 (E) konnte nicht nachgewiesen werden. Die Doppelmarkierung gegen
hsp27 und DAPI in Abbildung (F) verdeutlicht, dass hsp27 außerhalb der Zellkerne exprimiert wird. (H-I) Mehrfachmarkierung
gegen Cox2 (grün), NeuN (blau) und GFAP (rot). Cox2 wird hauptsächlich im Perikaryon von Neuronen der oberen
Ergebnisse
48
Kortexschichten heraufreguliert. (J-Q) Phänotypisierung der Stat3-positiven Zellen. (J+N) Antikörpermarkierung gegen Stat3
(grün), Ox-42 (blau) und GFAP (rot). Stat3 wurde im Kern, aber auch in den Fortsätzen von GFAP-positiven Astrozyten
nachgewiesen. Es gab keine Kolokalisation mit dem mikroglialen Marker Ox-42. (K+O) Stat3 wurde nach SD auch im Zellkern
und Perikaryon von Neuronen exprimiert. (L) Übersicht über die Stat3/GFAP-Kolokalisation im ipsilateralen Kortex nach SD. (K)
zeigt das Basisniveau von Stat3 im kontralateralen Kortex. Die Expression ist geringer als ipsilateral, einige Astrozyten und
+
hauptsächlich Zellen mit neuronaler Morphologie sind Stat3 . Die Abbildungen (P+Q) zeigen eine starke Vergrößerung von
Stat3-positiven Astrozyten und Neuronen. Beide Abbildungen zeigen zusätzlich eine Kernfärbung (DAPI). Balken: (A-G, I, P, Q)
20 µm, (J, N-O) 30 µm, (H, K-L) 50 µm.
Projekt 2: Neurogenesestudie
Um einen möglichen Effekt von kortikalen SD auf die hippocampale Neurogenese und damit einen
möglichen Zusammenhang zur Neurogenese nach Schlaganfall nachzuweisen, wurden mehrere
Experimente durchgeführt. SD-, photothrombotisch infarzierten (PT)- und den jeweiligen Kontrollratten
wurde zu verschiedenen Zeitpunkten BrdU injiziert, um mitotisch aktive Stamm- und Vorläuferzellen
bzw. deren Nachkommen zu markieren. Anzahl und Phänotyp der BrdU+ Zellen wurde dann nach
unterschiedlichen Überlebenszeiten analysiert (Abb. 7).
Kortikale SD steigern die Anzahl neugeborener Zellen im adulten Gyrus dentatus
SD verursachten eine massive Induktion der proliferativen Aktivität im Gyrus dentatus adulter Ratten
(Tabelle 18 + Abb. 15). Die immunhistochemische Färbung koronaler Schnitte von Tieren, die 3 BrdUInjektionen am d2 erhielten und bis zum d3 überlebten, identifizierte etwa 270 % mehr BrdU+ Zellkerne
im ipsilateralen Gyrus dentatus relativ zu den Kontrollen (p = 0.016). Tendenziell steigerte sich die
proliferative Aktivität noch zum d4 (n.s.). Zu diesem Zeitpunkt übertraf die ipsilaterale Proliferation von
SD-Tieren die der Kontrollen um ca. 470% (evaluiert am d5; p = 0.01). Nahezu alle BrdU+ Zellkerne
waren unregelmäßig geformt und lagen in Clustern in der Subgranulärzone. Diese Cluster waren
zahlreicher und größer im ipsilateralen Gyrus dentatus von SD-Tieren verglichen zum kontralateralen
oder zum Gyrus dentatus von sham-Tieren (Abb. 14).
Eine weitere Gruppe von Ratten erhielt in der ersten Woche nach SD bzw. sham-Behandlung alle
12 h eine BrdU-Injektion. 5 Wochen später hatten SD-Tiere signifikant mehr BrdU+ Zellen im
ipsilateralen Kortex als Kontrolltiere (280 %; p = 0.003). Die BrdU-markierten Zellkerne waren nun
voneinander separiert über das Stratum subgranuläre und die innere Schicht des Stratum granulare
verteilt. Ihre große, runde Morphologie entsprach der von Körnerzellen.
49
Ergebnisse
Alle SD-Gruppen zeigten eine signifikant höhere Anzahl BrdU+ Zellen im ipsilateralen relativ zum
kontralateralen Gyrus dentatus (d3: p = 0.031; d5: p = 0.016; d42: p = 0.002; Tabelle 18, Abb. 15).
Ebenso fanden sich zu allen Untersuchungszeitpunkten mehr BrdU+ Zellen im kontralateralen Gyrus
dentatus von SD Tieren verglichen mit den Kontrollen. Diese Differenz war jedoch nicht signifikant.
+
Abb. 14 Verteilung BrdU Zellen im
adulten Gyrus dentatus nach SD und
sham-Eingriff.
Koronale
Schnitte
wurden immunhistochemisch gegen
den Proliferationsmarker BrdU gefärbt
(ABC Methode). SD Tiere zeigten eine
erhöhte Anzahl BrdU-markierter Zellen
im Vergleich zu sham-Tieren. Zu den
frühen
Untersuchungszeitpunkten
+
lagen die BrdU Zellen als Cluster in
der Sugranulärzone. 6 Wochen später
hatten sich diese Zellen voneinander
separiert, viele waren in die innere
Zone
des
Stratum
granulare
eingewandert. Morphologisch waren
die
Zellen
nun
nicht
mehr
von
Körnerzellen zu unterscheiden. Balken
= 20 µm.
Um auszuschließen, dass der im ipsilateralen Gyrus dentatus beobachtete proliferative Effekt direkt
durch Diffusion des KCl in den Hippocampus verursacht wurde, wurden zwei zusätzliche
experimentelle Gruppen eingeschlossen. Eine Gruppe erhielt 45 min vor Erstapplikation des 3 M KCl
den NMDA-Rezeptorantagonisten MK-801 i.p. verabreicht. Verschiedene Studien belegen, dass
MK-801 SD inhibiert [28, 172]. Die BrdU-Injektionen erfolgten am d2 nach den Eingriffen, die BrdUInkorporation wurde am folgenden Tag analysiert. In 2 der 4 Ratten wurden die SD durch MK-801
vollständig unterdrückt, ein Tier zeigte eine minimale DC-Deflektion und ein Tier eine SD normaler
Amplitude direkt nach Applikation des KCl. In allen Tieren wurden gleich viele BrdU+ Zellen im ipsiwie im kontralateralen Gyrus dentatus nachgewiesen. Die Absolutzahl der Zellen, die BrdU
inkorporiert hatten, war signifikant geringer als in SD-Tieren (p = 0.032) und entsprach in etwa der in
den sham-operierten Kontrollen (Abb. 15B, Tabelle 18).
50
Ergebnisse
Da nicht ausgeschlossen werden konnte, dass das auf den Kortex applizierte 3 M KCl eventuell
hippocampale SD auslöst (durch Diffusion des KCl in den Hippocampus), wurde in einer Gruppe von 4
Ratten auch das hippocampale DC-Potential abgegriffen. Über einen Zeitraum von 3 h, wobei
während der ersten 2 h 3 M KCl auf den okzipitalen Kortex appliziert wurde, konnten in keinem der
Tiere SD im Hippocampus registriert werden (Abb. 16). Außerdem gaben die histologischen
Färbungen keinerlei Hinweise auf Zellveränderungen im Hippocampus.
+
+
Abb. 15 SD steigert die Anzahl BrdU Zellen im ipsilateralen Gyrus dentatus adulter Ratten. (A) BrdU Zellen im ipsi- und
kontralateralen Gyrus dentatus 3, 5 und 42 Tage postoperativ. Die Tiere erhielten entweder 3 BrdU-Injektionen am d2 oder d4
und überlebten jeweils bis zum folgenden Tag oder sie wurden für eine Woche 2 mal täglich mit BrdU gespritzt und überlebten
+
für weitere 5 Wochen. Zu allen Untersuchungszeitpunkten wurden signifikant mehr BrdU Zellen im ipsilateralen Gyrus dentatus
von SD-Tieren nachgewiesen. SD beeinflusste auch die Neurogenese im kontralateralen Gyrus dentatus, dieser Effekt war
jedoch nicht signifikant. (B) Eine Gruppe von Ratten erhielt MK-801 i.p. vor Applikation des KCl. Die Substanz unterdrückte den
proliferativen Effekt, welcher in den anderen Gruppen nach KCl-Applikation auftrat. Alle Werte sind Mittelwerte ± SEM; *p ≤
0,05, **p ≤ 0,01, n.s. = nicht signifikant.
+
+
Tabelle 18 Absolute Anzahl BrdU Zellen und prozentualer Anteil neuronaler Vorläuferzellen (DCX ), Astrozyten
+
+
+
(GFAP , S100β ) und adulter Neurone (NeuN ) im Gyrus dentatus. MK-801 = mit MK-801 vorbehandelte KCl-Tiere.
§
Signifikanzen: p ≤ 0.05 relativ zu sham* und relativ zu kontralateral .
ipsilateral
MW ± SEM
SD
Tag 3
kontralateral
MW ± SEM
(n=5)
BrdU+ abs. 4893.6 ± 912.4*§ 2635.2 ± 596.5
+
DCX (%)
78.8 ± 2.1
78.4 ± 1.7
1.6 ± 0.7
1.6 ± 0.7
S100β+ (%)
NeuN+ (%)
--- ± ----- ± --GFAP+ (%)
--- ± ----- ± ---
(n=6)
6182.0 ± 751.3*§ 2152.0 ± 730.8
87.0 ± 2.3
85.7 ± 2.9
1.0 ± 0.7
1.3 ± 0.7
--- ± ----- ± ----- ± ----- ± ---
(n=4)
1180.5 ± 119.1
83.8 ± 2.0
0.0 ± 0.0
--- ± ----- ± ---
(n=4)
1092.0 ± 148.8 1077.0 ± 168.1
88.0 ± 0.8
84.7 ± 3.2
1.5 ± 1.0
2.5 ± 1.9
--- ± ----- ± ----- ± ----- ± ---
P
sham
BrdU+ abs. 1323.0 ± 69.7
DCX+ (%)
80.5 ± 3.5
0.0 ± 0.0
S100β+ (%)
NeuN+ (%)
--- ± --GFAP+ (%)
--- ± --P
MK-801
Tag 5
ipsilateral
kontralateral
MW ± SEM
MW ± SEM
BrdU+ abs.
(n=4)
1743.0 ± 388.4
1908.0 ± 305.6
ipsilateral
MW ± SEM
Tag 42
kontralateral
MW ± SEM
(n=9)
12692.7 ± 1815.5*§ 6910.7 ± 1241.5
0.4 ± 0.3
0.9 ± 0.5
3.1 ± 0.8
2.4 ± 0.4
90.0 ± 1.1*
84.9 ± 1.3
1.7 ± 0.7
2.0 ± 0.5
3333.0 ± 471.6
2.5 ± 0.5
2.5 ± 0.5
85.0 ± 0.6
2.0 ± 0.8
(n=4)
3063.0 ± 311.9
1.5 ± 1.0
3.0 ± 0.6
85.0 ± 1.9
2.5 ± 1.3
51
Ergebnisse
Abb. 16 DC-Potentialaufzeichnung im Hippocampus (DCHC)
und vom Kortex (DCKortex)
während 2-stündiger KClApplikation auf den occipitalen
Kortex plus eine Stunde
darüber hinaus.
Kortikale SD steigern die Neuroneogenese im adulten Gyrus dentatus
Zur Bestimmung der Phänotypen der BrdU+ Zellen wurden Mehrfachimmunmarkierungen mit
Antikörpern gegen BrdU in Kombination mit DCX, NeuN, GFAP oder S100β durchgeführt (Abb.
17B-D). Unmittelbar nach BrdU-Injektionen, am d3 oder d5, exprimierten etwa 80% der BrdU+ Zellen
den Marker neuronaler Vorläuferzellen DCX (Abb. 17B, F; Tabelle 18). Diese Beobachtung traf
beidseitig, sowohl für SD- als auch sham-Tiere zu, d.h. SD hatte keinen Einfluss auf die
Differenzierung der Vorläuferzellen in DCX-positive Neuroblasten. Nach 42 d exprimierten weniger als
1 % der neu gebildeten Zellen DCX (Abb. 17D, F; Tabelle 18). Stattdessen zeigte die
Doppelmarkierung mit NeuN-Antikörpern, dass mindestens 85 % der BrdU+ Zellen zu reifen Neuronen
differenziert waren (Abb. 17C, G). Dabei übertraf der Prozentsatz BrdU+/NeuN+ Zellen im ipsilateralen
Gyrus dentatus von SD-Tieren den der Kontrollen um 5% (p = 0.034). Dies deutet darauf hin, dass SD
entweder die neuronale Differenzierung oder das Überleben von Neuronen selektiv beeinflussen.
Bezogen auf die Absolutzahl BrdU+ Zellen im ipsilateralen Gyrus dentatus kam es zu einem
signifikanten Anstieg neuronaler Vorläuferzellen am d3 (270 %, p = 0.016) und d5 (462 %, p = 0.01)
und adulter Neurone nach 6 Wochen (305 %, p = 0.003; Abb. 17F, G). Die neu entstandenen Neurone
ließen sich morphologisch nicht von den Körnerzellen des Gyrus dentatus unterscheiden.
Nur wenige der BrdU+ Zellen besaßen einen astrozytären Phänotyp (Tabelle 18; Abb. 17B, C). Es gab
keine signifikanten Unterschiede im prozentualen Anteil oder der absoluten Anzahl BrdU+/GFAP+ bzw.
BrdU+/S100β+ Zellen zwischen ipsi- und kontralateralem Gyrus dentatus der SD-Tiere und im
Vergleich mit den entsprechenden Kontrollen.
Um auszuschließen, dass es nach SD zu einer vermehrten apoptotischen Eliminierung von neu
gebildeten oder bestehenden Neuronen kam, wurden Doppelmarkierungen mit Antikörpern gegen
BrdU und aktive Caspase-3 durchgeführt (Abb. 17E). Weder unmittelbar nach dem Auftreten von SD
52
Ergebnisse
+
Abb. 17 Phänotypisierung der BrdU Zellen. (A) Schematische Darstellung der Zytoarchitektur des Gyrus dentatus (ML –
stratum moleculare, SGZ – stratum subgranulare, GL – stratum granulare; PL – stratum multiforme). (B) Dreifachmarkierung
+
+
gegen BrdU (rot), DCX (blau) und S100β (grün) am d3. Das erste Foto zeigt BrdU /DCX neuronale Vorläuferzellen, das zweite
+
+
+
eine BrdU Zelle mit unklarem Phänotyp und das dritte eine BrdU /S100β Gliazelle. (C) Immunfluoreszenz mit Markern gegen
+
+
BrdU (rot), NeuN (blau) und GFAP (grün) nach 42 d. Die erste Abb. zeigt mehrere BrdU /NeuN Neurone, die zweite einen
+
+
BrdU /GFAP Astrozyten. (D) Mehrfachmarkierung gegen BrdU (rot), DCX (blau) und S100β (grün) 42 d nach SD. (E) Zu keinem
Zeitpunkt wurden Hinweise auf eine vermehrte Apoptose nach SD detektiert. Die Schnitte wurden mit Antikörpern gegen BrdU
+
(grün) und aktivierte Caspase-3 (rot) gefärbt. Balken = 20 µm. (F) Quantifizierung der BrdU neuronalen Vorläufer und
+
+
astrozytärer Zellen. Die meisten BrdU Zellen entsprachen zu den frühen Untersuchungszeitpunkten DCX neuronalen
+
+
Vorläuferzellen. Nach 42 d wurden kaum noch BrdU /DCX Zellen nachgewiesen, während die NeuN-Expression auf etwa 90%
angestiegen ist (G). Im Gyrus dentatus von SD-Ratten entstanden signifikant mehr neue Neuronen als in dem von sham-Tieren,
die Differenzierung der neuen Zellen war um 5% zugunsten eines neuronalen Phänotyps verschoben (p ≤ 0.05* or p ≤ 0.01**).
P
noch 6 Wochen später konnte eine Aktivierung der Caspase-3 im Gyrus dentatus nachgewiesen
werden. Ebenso zeigten die Kontrollen keinerlei Caspase-3-IR. Stark aktive Caspase-3 immunreaktive
Ergebnisse
53
Zellen befanden sich ausschließlich in den Läsionen von 42d Tieren.
Hippocampale Neurogenese nach kortikalen photothrombotischen Infarkten
Ischämische Infarkte wurden photothrombotisch nach Watson et al. [150] induziert. Die Läsionen
durchspannten alle kortikalen Schichten, das Corpus callosum war unbeeinträchtigt (Abb. 19). Die
Einteilung der Untersuchungsgruppen und BrdU-Applikation erfolgte analog den SD-Versuchen
(Abb. 7). Die Resultate der immunhistochemischen Analyse sind in Abb. 18 gezeigt. Am d3 waren
sowohl in infarzierten (PT-) als auch in scheinoperierten Tieren ca. 1500 Zellen/Gyrus dentatus BrdUpositiv. Zwei Tage später war die Anzahl BrdU+ Zellen im ipsilateralen Gyrus dentatus von PT-Ratten
leicht erhöht (32 %; p = 0.016), während sich der kontralaterale Gyrus dentatus der PT-Tiere nicht
vom ipsi- oder kontralateralen Gyrus dentatus von sham-Tieren unterschied. Dieser Effekt setzte sich
jedoch langfristig nicht durch, denn am d42 zeigten sich keinerlei Unterschiede zwischen infarzierten
und scheinoperierten Tieren (jeweils etwa 3700 BrdU+ Zellen/Gyrus dentatus).
Abb. 18 BrdU-Inkorporation im Gyrus dentatus nach photothrombotischen Infarkten. (A) Immunhistochemische Darstellung von
+
BrdU Zellen im ipsilateralen Gyrus dentatus zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach PT. Am d3 und d5, jeweils einen Tag nach
+
BrdU-Injektion, lagen die BrdU Zellkerne in Clustern im Stratum subgranulare. 6 Wochen nach dem Infarkt befanden sich die
nun abgerundeten Zellkerne zerstreut hauptsächlich in der inneren Schicht des stratum granulare (Balken = 20 µm). (B)
Quantifizierung. Der Infarkt führte zu einer leichten Induktion der Proliferation am d2 (detektiert am d3), während die Anzahl neu
gebildeter Zellen im Gyrus dentatus von PT-Tieren zu den anderen Untersuchungszeitpunkten der der entsprechenden
Kontrollen entsprach (MW ± SEM; * p ≤ 0.05).
54
Ergebnisse
Volumetrische Analyse
In allen Untersuchungsgruppen wurde das Volumen der kortikalen Läsionen ermittelt (Tabelle 19,
Abb. 19). Dazu wurde zunächst die Fläche der Läsionen an Kresylviolett-gefärbten Schnitten (jeder 6.)
bestimmt, eine Abschätzung des Volumens erfolgte dann durch Integration der Flächensumme über
die Schnittdicke und Anzahl der Schnitte. Die Volumina der durch 3 M NaCl hervorgerufenen Läsionen
(SD-sham) waren im Durchschnitt kleiner als die der KCl-Läsionen (SD). Am postoperativen d3 gab es
keine signifikanten Volumenunterschiede der KCl-, KCl+MK-801- und photothrombotischen Läsionen
(PT). In der Folgezeit kam es zu einer sukzessiven Verkleinerung aller Läsionen. Dies war bei den PT
am stärksten ausgeprägt (ca. 75 % zwischen d3 und d42), bereits nach 5 Tagen erreichten die
Infarkte die Größe der NaCl-Läsionen. Die KCl-Läsionen hingegen schrumpften etwas weniger (in 42
Tagen ca. 45 %), ihr Volumen überstieg damit zu allen Zeitpunkten das der anderen Läsionen.
Tag 3
MW ± SEM
Tag 5
MW ± SEM
Tag 42
MW ± SEM
SD
SD-sham
8.46 ± 0.65
3.36 ± 1.14
6.47 ± 0.32
3.73 ± 0.76
4.51 ± 0.33
1.96 ± 0.26
SD + MK-801
6.73 ± 1.54
PT
6.75 ± 0.72
--- ± --3.53 ± 0.39
--- ± --1.56 ± 0.17
A
Tabelle 19 Volumen der durch die Applikation
von 3 M KCl (SD), 3 M NaCl (SD-sham)
resultierenden und von photothrombotischen
3
(PT) Läsionen in mm .
B
Abb.19 Analyse der Salzapplikationsstellen und photothrombotischen Infarkte. (A) Histologische Färbung (Kresylviolett) von
koronalen Hirnschnitten (Bregma -4.8 bis 5.3). Die Applikation der hyperosmolaren Salzlösungen führte ähnlich wie die
Infarktinduktion zu kleinen kortikalen Läsionen. Die volumetrische Analyse in (B) zeigte, dass sich die Läsionen abhängig von
der Art ihrer Verursachung unterschiedlich entwickeln. Die KCl-Tiere hatten grundsätzlich die größten Läsionen, wobei die
Infarkte am Tag 3 ein ähnliches Volumen erreichten. Dieses verringerte sich über die Zeit stärker als das der KCl-Läsionen.
Die durch NaCl verursachten Läsionen verkleinerten sich in den 42 Tagen nur geringfügig. Jeder 6. Schnitt wurde zur
Auswertung herangezogen, wobei zunächst der Flächeninhalt der Läsionen in jedem Schnitt ermittelt wurde. Anschließend
wurde die Summe der Flächen pro Hirn ermittelt und mit 240 µm multipliziert (6 x 40 µm). = SD, = SD-sham, c = SD+MK801, { = PT; angegeben sind MW ± SEM.
55
Ergebnisse
Korrelation des histologischen Schadens im zerebralen Kortex mit der Neurogeneserate im Gyrus dentatus
Da SD-Tiere zu jedem Untersuchungszeitpunkt größere kortikale Läsionen aufwiesen als die
entsprechenden Kontrollen, stellte sich die Frage, ob ein Zusammenhang zwischen der Größe der
Läsion und der Anzahl der neu gebildeten Zellen existiert. Zur Klärung dieser Frage wurden die
ermittelten Läsionsvolumina graphisch gegen die Anzahl BrdU+ Zellen in den entsprechenden
Gruppen
aufgetragen,
zusätzlich
wurde
für
jeden
Untersuchungszeitpunkt
eine
lineare
Regressionsanalyse durchgeführt (Abb. 20A). Die aus den Bestimmtheitsmaßen (R2) errechneten
Korrelationskoeffizienten (r) ließen eine positive Korrelation zwischen Neurogeneserate und
Ergebnisse
56
+
Abb. 20 Hippocampale Neurogenese und Läsionensgröße. (A) Graphische Gegenüberstellung der Läsionsvolumina und BrdU
Zellen im ipsilateralen Gyrus dentatus (alle Untersuchungsgruppen). Die Abbildung verdeutlicht, dass im Gyrus dentatus von
NaCl-, PT- und PT-sham-Tieren unabhängig von der Größe des kortikalen Schadens etwa gleich viele Zellen BrdU inkorporiert
hatten. Nur in SD-Tieren wurde eine erhöhte Neurogenesrate detektiert, KCl verursachte jedoch auch die größten Läsionen.
Abbildung (B) zeigt exemplarisch das Verhältnis von Läsionsgröße und Neurogenese in der SD-Gruppe am d42 (n = 9). Die
beiden Variablen sind nicht miteinander korrelliert. In (C) ist der BrdU-Einbau im Gyrus dentatus unläsionierter (PT-sham) und
läsionierter (SD-sham) Tiere dargestellt. Es gibt keinen unterschied zwischen beiden Gruppen.
P
P
Läsionsvolumen vermuten (rd3 = 0.65; rd5 = 0.76; rd42 = 0.88). Dagegen sprechen jedoch mehrere
Punkte: Beispielsweise gab es kaum Unterschiede (am d5) in der Neurogeneserate von SD-sham (3
M NaCl) und PT-sham Tieren (Abb. 20C), obwohl der Kortex der ersten Gruppe läsioniert, der der
zweiten aber intakt war. Desweiteren waren die Läsionen von SD- und PT-Tieren am d3 etwa gleich
groß, während ein signifikanter Anstieg BrdU+ Zellen nur in der SD-Gruppe beobachtet wurde. Auch
im Vergleich der Einzeltiere innerhalb der SD-Gruppe am d42 konnte keinerlei Korrelation von
Läsionsvolumina und BrdU-Absolutzahlen im ipsilateralen Gyrus dentatus detektiert werden (Abb.
20B).
Es lässt sich schlussfolgern, dass es keinen nachweisbaren Zusammenhang zwischen der Größe
einer kortikalen Läsion (des okzipitalen Kortex) und der Bildung neuer Nervenzellen im Gyrus
dentatus gibt. Die erhöhte Neurogeneserate in den SD-Gruppen basiert einzig auf dem Auftreten der
kortikalen SD. Darüber hinaus deuten die Daten darauf hin, dass kleine kortikale Läsionen keinen
Einfluss auf die hippocampale Neurogenese haben.
Ergebnisse
57
Projekt 3: Verhaltenstests
Um die räumliche Lern- und Gedächtnisleistung nach SD zu überprüfen, wurden 2 Versionen des
Morris Water Maze (MWM) Tests durchgeführt. In dieser Aufgabe werden die Ratten in ein rundes
Wasserbecken gesetzt und müssen dort eine unsichtbare Plattform suchen. Dabei bietet das Becken
selbst keine Anhaltspunkte zur Navigation, die Tiere müssen sich an Markierungen außerhalb des
Beckens orientieren. Als Parameter für das Lernvermögen der Tiere dienen die zurückgelegte Zeit
oder Strecke zum Erreichen der Plattform oder in bestimmten Bereichen des Beckens.
Standard Morris Water Maze
Dieser Test wurde in Anlehnung an das ursprünglich von Morris entwickelte Protokoll durchgeführt
[153]. Die Akquisitionsphase dauerte 7 Tage, wobei sich die unsichtbare Plattform immer an
derselben Stelle befand. Am Ende des Trainings wurde das räumliche Erinnerungsvermögen der
Ratten im Becken ohne Plattform getestet.
Akquisitionsphase. Während des Trainings zeigten sowohl SD- als auch Kontrolltiere eine
signifikante Reduktion der Suchzeit zwischen d1 und d2 (pSD < 0.001 und psham = 0.015; Abb. 21A).
Diese setzte sich noch bis zum d6 fort, unterschied sich jedoch nicht signifikant zwischen den
einzelnen Versuchstagen. Außer im trial 10 (p = 0.05) gab es nur tendenziell gruppenspezifische
Unterschiede der Suchlatenzen. SD-Tiere schwammen durchschnittlich 19.4 ± 1.3 s, während shamTiere 23.7 ± 3.1 s benötigten. Die Präferenz für den Zielquadranten (SW) nahm in beiden Gruppen im
Zeitverlauf zu (Abb. 21C). Über die gesamte Trainingsphase betrachtet, verbrachten SD-Tiere
tendenziell mehr Zeit im Zielquadranten als die Kontrollen (Abb. 21D). Geringe Unterschiede zeigten
sich bei differenzierter Betrachtung der einzelnen Versuche (trials) und Versuchstage (sessions): SDRatten hielten sich durchschnittlich mehr im Zielquadranten auf als sham-Tiere in den trials 4 (p =
0.018), 12 (p = 0.05) und 22 (p = 0.008; Abb. 21C rechts). Die Analyse der Versuchstage ergab eine
längere Verweildauer der SD-Tiere im Zielquadranten am d7 (p = 0.036). Die Kontrolltiere hielten sich
tendenziell etwas häufiger am Beckenrand auf als SD-Tiere (Abb. 21B).
Extinktionsphase. Am d7, 22 und 43 nach Beginn des Trainings wurden probe trials durchgeführt, in
denen die Plattform aus dem Becken entfernt wurde. Dieser Test dient der Analyse des räumlichen
Gedächtnisses, ausgewertet wurde die Zeit, die sich die Tiere im früheren Zielquadranten aufhielten.
In keinem der Tests zeigten die SD-Ratten ein anderes Verhalten als die Kontrollgruppe. Im probe
Ergebnisse
58
Abb. 21 Lernen im Morris Water Maze über 7 Trainingstage. Sowohl die
Suchlatenz (A) als auch die mittlere Aufenthaltszeit am Beckenrand (Thigmotaxis,
B) nahmen in beiden Gruppen besonders an den zwei ersten Versuchstagen
stark ab. Dabei benötigten SD-Tiere tendenziell weniger Zeit zum Auffinden der
Plattform als die Kontrollen. (C) Aufenthaltszeit im Plattformquadranten. Die SDRatten wiesen eine höhere Präferenz für den Zielquadranten am d7 und in den
Versuchen 4, 12, 22 auf. (D) Mittlere prozentuale Aufenthaltszeit im
Plattformquadranten über die gesamte Akquisitionsphase hinweg. Alle Werte sind
MW ± SEM; *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01; in A-C wurden die Daten gruppenweise
entweder pro Tag (linker Graph) oder pro trial (rechts) gemittelt.
trial 1 verbrachten beide Gruppen die meiste Zeit (ca. 55 %) im früheren Zielquadranten (Abb. 22A).
Zwei Wochen später war die Gedächtnisspur bereits gelöscht, die Tiere hielten sich etwa ebenso
lange im ehemaligen Plattform- wie in den anderen Quadranten auf (SD: 22.2 ± 3.5 %; Kontrollen:
Ergebnisse
59
24.0 ± 4.5 %). Dies wurde auch im letzten probe trial beobachtet. Ebenso ergaben sich keine
Gruppenunterschiede bei der Analyse des thigmotaktischen Verhaltens (Abb. 22B). Da die
Extinktionsdurchgänge mit 60 s relativ lang waren und Ratten in diesem Test relativ schnell dazu
neigen, die Suche aufzugeben, wenn sie die Plattform nicht am gewohnten Ort vorfinden, wurden die
probe trials zusätzlich in 15 s-Intervallen analysiert (Abb. 22C, D). Auch hier ergaben sich keinerlei
gruppenspezifischen Unterschiede in der Präferenz für den früheren Plattformquadranten. Allerdings
gab es eine deutliche Differenz bezüglich des thigmotaktischen Verhaltens in den ersten 15 s des
dritten probe trials.
Abb. 22 Prozentuale Aufenthaltszeit in verschiedenen Bereichen des MWM in der Extinktionsphase. (A) Mittlere Verweildauer
der SD- und Kontrolltiere in den 4 Quadranten während der 60-sekündigen probe trials. Im ersten probe trial verbrachten alle
Tiere die meiste Zeit im früheren Plattformquadranten (SW). In den anschließenden probe trials unterschied sich die
Aufenthaltszeit im Ziel- nicht mehr von der in den anderen Quadranten, jedoch verbrachten die Tiere nun mehr Zeit in dem
Quadranten, in dem sie ins Becken gesetzt wurden (NO). (B) Das thigmotaktische Verhalten zeigte keine gruppenspezifischen
Unterschiede. Nur in den ersten 15 s des 3. probe trials hielten sich SD-Ratten weniger am Beckenrand auf als die Kontrollen
Ergebnisse
60
(D). (C) Verlaufskurven für die Aufenthaltsdauer der Tiere im ehemaligen Zielquadranten in 15 s-Intervallen. Dargestellt sind die
Mittelwerte ± SEM, **p ≤ 0.01.
Modifiziertes Water Maze
Ob SD die Flexibilität des räumlichen Lernens beeinflussen kann, wurde mit Hilfe einer Variante des
MWM, die in der Gruppe von Schallert entwickelt wurde, untersucht [155].
Training. Zu Beginn des Trainings zeigten SD- und sham-Tiere ein thigmotaktisches Verhalten (Abb.
23C), beide Gruppen lernten jedoch relativ schnell sich vom Beckenrand wegzubewegen und im
Zielquadranten (SW) nach der Plattform zu suchen (Abb. 23B). Dieser Effekt war am ersten
Trainingstag (trials 1-4) am deutlichsten ausgeprägt. Ebenso nahm die Suchlatenz zum Auffinden der
verborgenen Plattform bei beiden Gruppen im Laufe des Trainings sukzessive ab (Abb. 23A).
Probe trial 1. Am d4 schloss sich unmittelbar nach dem letzten trainings trial ein 30-sekündiger probe
trial an, in dem die Plattform aus dem Becken entfernt wurde. Hier zeigten SD-Tiere eine Präferenz für
den ehemaligen Plattformquadranten (42.9 ± 4.4 %), während die Kontrollen etwa gleich viel Zeit in
jedem Quadranten verbrachten (27.4 ± 4.9% in SW; Abb. 23D). Dieser Unterschied war jedoch nicht
signifikant.
Ebenso unterschied sich das thigmotaktische Verhalten nicht, beide Gruppen hielten sich etwa gleich
häufig in der Peripherie des Beckens auf (SD: 31.0 ± 3.0 %; sham: 42.4 ± 7.5%; Abb. 23E).
Strategy switching test. Am d5 und d6 mussten sich die Tiere zum erfolgreichen Absolvieren der
Aufgabe eine neue Suchstrategie aneignen. An beiden Tagen wurden je 6 strategy switching trials
durchgeführt, in denen sich die Plattform an wechselnden Positionen am Beckenrand befand.
Zunächst war in beiden Gruppen ein leichter Anstieg der Suchlatenz zu beobachten (Abb. 23A), diese
nahm jedoch im Verlauf des Tests sukzessive ab. Die Aufenthaltszeit im früheren Zielquadranten war
von Beginn an vermindert (Abb. 23B). Im Gegenzug lernten die Tiere sehr rasch, in der
Beckenperipherie zu suchen, die Präferenz stieg über die 12 strategy switching trials kontinuierlich an
(Abb. 23C).
Probe trial 2+3. Im anschließenden strategy probe trial, in dem die Ratten wieder 30 s im Becken
ohne Plattform schwimmen mussten, verbrachten sowohl SD- also auch Kontrolltiere etwa gleich viel
Zeit in den einzelnen Quadranten (Abb. 23D). Beide Gruppen zeigten keinerlei Präferenz mehr für den
ehemaligen Zielquadranten. Im Vergleich zum probe trial 1 suchten SD-Tiere jetzt signifikant weniger
Ergebnisse
61
Abb. 23 Modifiziertes MWM. (A) Schwimmzeit bis zum Auffinden der Plattform. Die Suchlatenz nahm in beiden Gruppen in den
ersten zwei Trainingstagen (trials 1-8) stetig ab und blieb in den folgenden trainings trials (d3-4) auf etwa gleichem Niveau.
Durch den Strategiewechsel am d5 benötigten die Tiere wieder etwas mehr Zeit, um die nun am Rand positionierte Plattform zu
lokalisieren. (B) Prozentuale Zeit im Zielquadranten an 4 aufeinanderfolgenden Trainingstagen und während des strategy
switching test. Während des Trainings (d1-4) mit der Plattform im SW-Quadranten steigerten beide Gruppen ihre Präferenz für
den Zielquadranten, besonders am d1. Diese nahm im strategy switching test wieder ab. (C) Prozentuale Verweildauer in der
Peripherie des Beckens. In beiden Gruppen nahm der Anteil des thigmotaktischen Verhaltens im Zuge des Trainings (d1-4) ab,
während die Tiere relativ schnell mit einem präferentiellen Aufenthalt am Beckenrand auf die Änderung des Experimentaufbaus
an d5-6 reagierten. (D) Aufenthaltszeit der Ratten im ehemaligen Plattformquadranten in den probe trials. Im probe trial 1, der
sich direkt an das Training der Tiere im Becken mit der Plattform im SW-Quadranten anschloss, verbrachten die SD-Tiere
tendenziell mehr Zeit im Zielquadranten als die sham-Tiere. Der Strategiewandel führte dazu, dass sich die Tiere in den probe
trials 2 + 3 in etwa gleich lange in jedem Quadranten und weniger als im ersten probe trial im SW-Quadranten aufhielten. (E)
Ergebnisse
62
zeigt den Anteil thigmotaktischen Verhaltens in den probe trials. der strategy switching test führte zu einer starken Steigerung
der Suchzeit am Beckenrand. Alle Werte sind MW ± SEM, **p ≤ 0.01.
im früheren Plattformquadranten. Der Test zeigte deutlich, dass in beiden Gruppen ein Wechsel
zurück zur thigmotaktischen Suchstrategie stattfand (Abb. 23E). Die prozentualen Aufenthaltszeiten
im SW-Quadranten und in der Beckenperipherie änderten sich im folgenden strategy probe trial
(probe trial 3, d6) nicht mehr.
Zusammenfassend ergaben sich in beiden Paradigmen keine bedeutenden Unterschiede in der Lernund Gedächtnisleistung. Im traditionell durchgeführten MWM zeigte sich zwar eine gewisse Tendenz,
dass SD-Ratten den Test besser erlernen können, allerdings waren die Differenzen zu den Kontrollen
nur sehr gering.
63
Diskussion
DISKUSSION
Spreading depressions (SD) werden als potentielle pathogenetische Faktoren verschiedener
neurologischer Erkrankungen angesehen. Unter diesem Gesichtspunkt befasste sich die vorliegende
Studie hauptsächlich mit solchen SD-Effekten, die möglicherweise für das Verständnis dieser
Erkrankungen, speziell des Schlaganfalls, von Bedeutung sein könnten. Damit lag der Focus zum
einen auf den molekularen Konsequenzen von SD im Kortex der ipsilateralen Hemisphäre,
andererseits sollte der Einfluss kortikaler SD auf die hippocampale Neurogenese und die Lern- und
Gedächtnisleistung analysiert werden.
Differentielle Genexpression nach kortikaler SD
Kann die Microarray-basierte Genexpressionsanalyse einen repräsentativen Überblick
über die molekularen Veränderungen nach SD geben?
Die Genom-weite Transkriptionsanalyse mit Hilfe von Microarrays (MA) ermöglicht einen umfassenden
Einblick in die Reaktionen von Zellen auf innere oder äußere Stimuli. In der vorliegenden Arbeit wurde
die MA-Technologie eingesetzt, um die Genexpression und deren zeitlichen Verlauf im Kortex von
Ratten nach SD zu charakterisieren. Hierfür wurden Affymetrix RAE230A-Chips verwendet, die
ermöglichten, ca. 14000 UniGene Cluster (in etwa 16000 probe sets, im folgenden als Gene oder
Transkripte bezeichnet) gleichzeitig in einer Probe zu analysieren.
In die paarweise Vergleichsanalyse gingen nur solche Gene ein, die auf mindestens einem der Chips
detektierbar waren (absolut call = present). Eine differentielle Expression wurde angenommen, wenn
der Vergleich von SD- zu sham-Probe einen change p-value < 0.0045 oder > 0.9955 (increase- oder
decrease call) ergab und wenn das Gen in einer der Proben mindestens doppelt so hoch exprimiert
war als in der anderen. Diese relativ stringenten Einschlusskriterien mussten gesetzt werden, um eine
verlässliche Aussage ohne die Durchführung von Replikaten treffen zu können. Sie führten jedoch
auch zum Ausschluss bekannter SD-assoziierter Gene.
Dies traf z.B. für MMP-9, tPA, GFAP, clusterin oder verschiedene inflammatorische Gene wie IL-1α
und IL-6 zu, für die ein Anstieg der mRNA-Expression nach SD bereits beschrieben wurde [9, 10, 173177].
Diese
Studien
nutzten
unterschiedliche
Detektionsmethoden
(in
situ
Hybridisierung,
Immunhistochemie, PCR), wobei jeweils nur einzelne Gene analysiert wurden, womit eine verlässliche
64
Diskussion
Analyse und Prüfung auch von gering exprimierten Genen oder kleinen Änderungen (oft < 2) möglich
war (für die Fülle der in der vorliegenden Studie detektierten Gene war eine einzelne Überprüfung
ausgeschlossen, wobei die Rohdaten jederzeit für entsprechende spätere Analysen zur Verfügung
stehen). In der vorliegenden Arbeit wurden diese Gene nicht in die Kandidatengenliste
eingeschlossen, entweder weil ihre Abundanz in den Proben zu gering war oder weil sie weniger als
2-fach reguliert waren. Beispielsweise wurden MMP-9 und IL-6 aufgrund ihrer sehr niedrigen
Expression (absent call auf jedem Chip) aus der Trefferliste ausgeschlossen. Abgesehen davon ergab
die Vergleichsanalyse, dass SD zu einer 2.6-fachen Heraufregulation von MMP-9 und einer 5.3fachen Erhöhung des IL-6-Transkriptes führten. GFAP, tPA und clusterin wiederum gingen zwar in die
Vergleichsanalyse ein (present call), wurden jedoch aufgrund kleiner fold changes aus den
Trefferlisten ausgeschlossen (tPA 1.9-fach ↑ nach 3 h , GFAP 1.7-fach und clusterin 1.4-fach ↑ 7 d
nach SD). Der Verlust richtig-positiver Gene war jedoch mit Hinblick auf die gleichzeitige Reduktion
falsch-negativer Treffer zu verantworten.
Einige Limitationen der Microarray-Technologie machen eine Überprüfung mit unabhängigen
Methoden zwingend notwendig. Zum einen ist es bis dato sehr schwierig, gering exprimierte Gene
oder kleinere Expressionsunterschiede gesichert zu erfassen. Dies führt v.a. bei der Analyse von
Geweben immer wieder zu Problemen, selbst große Änderungen können, wenn sie in einer sehr
kleinen Zellpopulation auftreten, „ausgedünnt“ bzw. maskiert werden. Diesem Problem kann z.B.
durch zusätzliche in situ Hybridisierung, Immunhistochemie oder Analyse von mikrodissektiertem
Material beigekommen werden.
Auch das Poolen der Proben, wie in der vorliegenden Arbeit geschehen, birgt sowohl Vor- als auch
Nachteile. Allgemein akzeptiert ist, dass es die Effizienz und Zuverlässigkeit von Analysen steigern
kann. Dies geschieht jedoch auf Kosten des Informationsgehaltes über interindividuelle Variabilität
und ist oftmals auch mit einer Maskierung von geringen Effekten verbunden [169].
Schlussendlich kann von Microarrayanalysen nur mit Einschränkungen auf die funktionelle Relevanz
der beobachteten mRNA-Änderungen geschlossen werden, da eine differenzielle Genexpression nicht
immer zwangsläufig zu Änderungen der Abundanz der korrespondierenden Proteine führt. Hierfür sind
sowohl
generelle,
als
auch
bekannte,
SD-spezifische
Diskrepanzen
zwischen
Proteinexpression verantwortlich. Darauf soll im folgenden Absatz eingegangen werden.
Gen-
und
Diskussion
65
Studien zur Korrelation von mRNA- und Proteinexpression wurden in Hefepilzen durchgeführt [178180]. Eine zu diesem Zweck von Greenbaum et al. entwickelte Methode, verschiedene Gen- und
Proteinexpressionsdatensätze zusammenzuführen und vergleichbar zu machen, zeigte, dass
Transkriptom und Translatom in ihrer Gesamtheit relativ schlecht miteinander korreliert sind (r = 0.66).
Darüberhinaus gelang die Identifizierung gruppenspezifischer Auffälligkeiten: (i) mRNA- und
Proteinexpression korrelierten in einigen Kategorien von Genen besser (z.B. Nukleolus), in anderen
schlechter (z.B. Mitochondrien) [170, 180]; (ii) außerdem waren Proteine bestimmter funktioneller
Gruppen tendenziell höher exprimiert als es die mRNA-Expression erwarten ließ (z.B. zelluläre
Organisation, Proteinsynthese, Energiestoffwechsel), andere niedriger (z.B. Transkription, Wachstum,
Differenzierung, DNA-Synthese).
Ferner ist für SD selbst ein modulatorischer Einfluss auf die ipsilaterale Proteinsynthese beschrieben.
Anfangs kommt es zu einer einige Stunden andauernden Inhibition, später zu einer Steigerung der
globalen Proteinsynthese [54-56]. Inwieweit hier eine generelle Entkopplung von Gen- und
Proteinexpression zugrunde liegt, ist nicht bekannt. Dagegen sprechen bislang veröffentlichte Studien,
die sich mit der Expression einzelner Transkripte und korrespondierender Proteine beschäftigten und
in denen deren Co-Regulation belegt werden konnte [10, 56-61].
Aus den erläuterten Gründen wurden die Microarraydaten einer sekundären Analyse unterzogen. Zur
Validierung der Daten wurden zunächst qRT-PCR Untersuchungen am gleichen Probenmaterial
durchgeführt. Von den 12 überprüften Transkripten zeigten alle in den gepoolten Proben untersuchten
Gene eine sehr gute Übereinstimmung mit den Chipdaten. Aufschluss, inwieweit die Pools den
Zustand individueller Proben widerspiegelten, gaben die Analysen der RNAs von Einzeltieren.
Besonders für die stark exprimierten Gene stimmten die Einzeldaten sehr gut mit denen vorher in
Pools ermittelten Änderungen überein. In Übereinstimmung mit anderen Studien konnte in < 30 % der
Einzelanalysen die mittels MA ermittelte differentielle Expression nicht reproduziert werden [181, 182].
Microarray- und PCR-basierte Untersuchungen geben jedoch weder Aufschluss über die Spezifität der
Zellen, welche das entsprechende Molekül exprimieren, noch über die Expression des funktionellen
Proteins. Dementsprechend wurden sie durch immunhistochemische Studien ergänzt. Alle vier
analysierten Proteine (c-Fos, Stat3, Cox2, hsp27) waren, wie durch die Microarray-Analyse
vorhergesagt, ipsilateral heraufreguliert. Dabei war die Kinetik der Proteinexpression meist etwas
langsamer als auch langanhaltender als die der Transkripte. Die Mehrfachimmunfluoreszenz
66
Diskussion
ermöglichte, die betroffenen Zellpopulationen zu identifizieren: c-Fos und Cox-2 wurden ausschließlich
in Neuronen heraufreguliert, während die hsp27-Expression auf Astrozyten beschränkt war. Stat3 war
in normalem Gewebe niedrig in fast allen Neuronen und wenigen Astrozyten exprimiert, während es
nach SD hauptsächlich in den Astrozyten heraufreguliert wurde. Desweiteren zeigte sich besonders
für Cox-2 eine klare schichtspezifische Expression, ein ähnlicher Befund lag bereits aus einer anderen
Studie vor [61].
Die vorliegende Studie ist die bislang umfangreichste Untersuchung der Genexpression nach SD. Sie
bietet eine Übersicht der molekularen Veränderungen im ipsilateralen Kortex. Allerdings bleibt die
funktionelle Interpretation der Daten zu einem hohen Grad artifiziell, da wie oben ausgeführt nicht
zwangsläufig davon ausgegangen werden kann, dass auch die korrespondierenden funktionellen
Proteine synthetisiert werden. Erst durch weitere prospektive Studien können gesicherte Aussagen
zur funktionellen Relevanz der beobachteten Veränderungen getroffen werden. Denkbar sind
Proteom-übergreifende
Analysen
der
Proteinexpression
(SELDI,
etc.),
anschließende
immunhistochemische Untersuchungen ausgewählter Proteine und vor allem funktionelle Studien,
beispielsweise mit Hinblick auf einen möglichen neuroprotektiven Effekt der nach SD regulierten Gene
(z.B. durch siRNA- oder knock-out Technologie).
SD reguliert unterschiedliche funktionelle Gruppen von Genen über einen langen
Zeitraum hinweg
Die vorliegende Arbeit zeigt, dass SD weitreichende Effekte auf die kortikale Genexpression ausüben.
Verschiedene funktionelle Gruppen von Genen wurden in sequentieller Abfolge durch SD beeinflusst,
zum Teil bis 30 Tage später. Eine Übersicht über die Veränderungen und deren zeitlichen Verlauf
geben Abb. 11 und die Tabellen 6-16, und A-E im Anhang. Gene, für die bereits früher ein
Zusammenhang mit SD gezeigt werden konnte, sind dort schattiert hervorgehoben. Im folgenden
sollen die Genexpressionsänderungen basierend auf den Funktionen ihrer Proteinprodukte diskutiert
werden.
Unmittelbar nach dem Auftreten von SD kam es zur Heraufregulation einer Reihe von immediate
early Genen/Transkriptionsfaktoren (IEG). Einige dieser Gene, wie z.B. c-FOS, c-Jun, EGR1, PC3,
Arc, BDNF, Cox2, hsp27, waren bereits aus früheren Studien bekannt [7, 9, 21, 57, 61]. Für viele
Gene ist dies die erste Beschreibung im Zusammenhang mit SD (z.B. NGFI-B, EGR2, EGR4, FRA1,
FRA2, ATF3, PC4). Vertreter der EGR-Genfamilie (hier: EGR1, EGR2, EGR4) beeinflussen
Diskussion
67
genetische Programme, die in Prozesse wie Wachstum, Differenzierung oder neuronale Plastizität
eingreifen [183, 184]. Drei von vier Mitglieder der FOS-Familie (c-Fos, FRA1, FRA2), zwei der JUNFamilie (c-Jun, JunB) und ATF3 wurden durch SD induziert. Deren Genprodukte sind Bestandteile des
Transkriptionsfaktors AP-1. Dieser kann abhängig von der Zusammensetzung seiner Untereinheiten
als Aktivator oder Repressor der Genexpression fungieren und somit ein komplexes Muster zellulärer
Mechanismen kontrollieren. Dazu gehören z.B. der Metabolismus, Wachstum, Migration und
Apoptose [185-189]. Entsprechend konnte im vorliegenden Datenset eine Reihe potentieller AP-1
Zielgene als differentiell exprimiert identifiziert werden (z.B. TIMP1, BDNF, MCP-1).
Keines der für intrazelluläre Signalmoleküle kodierenden Gene wurde bisher im Kontext mit SD
beschrieben. Fünf dieser Moleküle sind MAP-Kinasephosphatasen (MKP/DUSP), deren Funktion die
Regulation von MAPK-Kaskaden (Mitogen-activated protein kinase) ist [190]. MAPK regulieren
wiederum eine Reihe von Prozessen, darunter Wachstum, Proliferation und Apoptose. Andere Gene
in dieser funktionellen Kategorie, die durch SD induziert wurden, sind in G-Protein-Signalwege
involviert (z.B. RGS2, RGS4, RASD1 and 2). Jak2 und Stat3 wurden co-direktional heraufreguliert mit
ihren downstream-Targets Pim3 und sprouty 2. Der JAK/STAT-Signalweg vermittelt Effekte von
Zytokinen, aber auch Wachstumsfakoren. Er kontrolliert biologische Prozesse wie Proliferation,
Differenzierung oder Apoptose [191]. Ebenfalls innerhalb der ersten 24 h nach SD wurden zwei
Ca2+/Calmodulin-abhängige Proteinkinasen induziert. Diese Enzyme vermitteln die neuronale Antwort
auf Änderungen der intrazellulären Ca2+-Konzentration.
Apoptotische Signalwege waren kaum durch SD beeinflusst. Der Chip detektierte eine verminderte
Expression des pro-apoptotischen Gens DRAK2 und einen Anstieg des potentiellen Inhibitors
neuronalen Zelltodes PC3. Darüber hinaus gab es keine Hinweise, dass es durch SD zu einer
veränderten Expression klassischer Apoptosemarker, wie von Caspasen, Granzyme B, BAX (p53)
oder Bcl-2 kam. Dies stützt die Befunde von Nedergaard & Hansen, dass durch SD keinerlei
Schädigungen des kortikalen Gewebes hervorgerufen werden [73]. PC3 scheint eine zentrale Rolle
bei der Entstehung und dem Überleben neuer Nervenzellen innezuhaben. Beispielsweise führt eine
Überexpression von PC3 in NGF-stimulierten PC12-Zellen zu einer Wachstumsinhibition und
Steigerung der neuronalen Differenzierung, während PC3-Antisenseoligonukleotide zum Zelltod
führten [192]. Iacopetti und Kollegen identifizierten PC3 als Neurogenesemarker, dessen Expression
im sich entwickelnden ZNS auf die ventrikuläre Zone beschränkt ist [193]. In vitro ließ sich PC3 durch
Membrandepolarisierungen aufgrund hoher K+-Konzentrationen induzieren [194].
Diskussion
68
Die Gruppe der Kanalproteine schloss Gene ein, deren Produkte eine Rolle bei der
Aufrechterhaltung der Ionenhomeostase spielen: zwei K+- (KCNV1, KCNF1) und zwei Ca2+-Kanäle
(CACNA1B, CACNG3). Änderungen in der Expression dieser Kanäle kann die zelluläre Erregung
beeinflussen. Zusätzlich führten SD unmittelbar zur Heraufregulation des im Hirn vorherrschenden
Wasserkanals Aquaporin 4, wie auch von drei Na+/K+-ATPasen. Letztere gewährleisten den aktiven
Transport von Na+- und K+-Ionen zwischen intrazellulären und extrazellulären Kompartimenten. Ihre
Induktion könnte als kompensatorische Antwort auf die massiven Ionenverschiebungen während SD
angesehen werden.
SD stellen für das Gewebe einen gewissen Stress dar. Konsistent damit wurden mehrere sog. Stress
response Gene induziert. Die Heraufregulation des anti-oxidativen Metallothionin 1 und des DNAReparaturenzyms GADD45γ wurde bereits im ischämischen remote-Kortex, allerdings bisher noch
nicht nach SD nachgewiesen [8, 195]. Ebenfalls konnten HSC40 und HSPF1 erstmals mit SD
assoziiert werden. Sie fungieren vermutlich als Chaperone und sind damit an der Elimination
denaturierter Proteine beteiligt. Einen Tag nach SD wechselte die Stressantwort zu hsp27 und hsp32
(HO-1). Beide wurden bereits früher mit SD assoziiert [57, 63], wobei hsp27, wie in der vorliegenden
Arbeit bestätigt, in Astrozyten heraufreguliert war. Übereinstimmend mit anderen Arbeiten, konnte
weder eine Expressionsänderung anderer Hitzeschockproteine (wie z.B. hsp70 oder hsp72), noch von
Superoxiddismutasen, detektiert werden [66, 196].
Die Aktivierung neurotropher Kaskaden durch SD wurde bereits von anderen Autoren berichtet [6466]. In der vorliegenden Studie konnten nur BDNF und sein Rezeptor trkB als differenziell exprimiert
identifiziert werden. Eine Induktion von z.B. bFGF wurde nicht detektiert. Studien nach adenoviraler
BDNF-Überexpression in der ventrikulären Zone von Ratten als auch an BDNF-knock-out Mäusen
belegen eine Funktion von BDNF bei der Bildung neuer Nervenzellen [197, 198]. BDNF unterstützt
das Überleben von Neuronen in vivo und in vitro [199, 200]. Eine Studie zeigte, dass die intravenöse
Verabreichung von BDNF den funktionellen Ausgang nach photothrombotischen Infarkten verbessert
[201]. In aktuellen Studien verdichten sich die Hinweise, dass BDNF über Aktivierung des trkBRezeptors direkt in die synaptische Transmission eingreift [202].
SD induzierten eine Reihe von Genen, deren Funktion mit der neuronalen Signalübermittlung
assoziiert ist. Die Gruppe der synaptischen Proteine umfasste Gene, die die Aktivität von
Rezeptoren oder den Vesikeltransport regulieren. Das Proteinprodukt von Homer 1 liegt hauptsächlich
an exzitatorischen Synapsen vor, wo es die Signalübertragung metabotroper Glutamatrezeptoren
Diskussion
69
moduliert [203]. STXBP1, STX1a und SYT4 sind in die Ca2+-vermittelte synaptische Freisetzung von
Vesikeln involviert [204-206]. In der Literatur gibt es Hinweise, dass SD auch direkt in
Neurotransmittersysteme eingreifen. Dort wurde eine Induktion von Galanin, dessen Rezeptor GalR1
und der Chromogranine CgB und CgC beschrieben [59, 69]. In der vorliegenden Studie wurde nur ein
Anstieg von CgC detektiert.
SD induzierte im Verlauf des ersten Tages Gene, deren Produkte eine Rolle bei der Immunantwort
spielen, so beispielsweise Cox2 oder die Makrophagen/Monozyten-assoziierten Chemokine MCP-1,
MIP-1α, MIP-1β. Eine Studie des letzten Jahres befasste sich mit der inflammatorischen Antwort des
Gehirns auf SD [177]. Die Autoren detektierten eine differenzielle Expression einer Reihe
inflammatorischer Gene (z.B. TNFα, IL-1β, IL-6, eNOS, MIP-1α). Viele dieser Gene waren auch in der
vorliegenden Studie reguliert, allerdings wurde ein Großteil von den Trefferlisten ausgeschlossen
(siehe vorangehender Abschnitt). Nach 7 d waren CD74/HLA-DRγ und Lectin, beides Marker
mikroglialer Aktivierung, heraufreguliert. Dies, und die Induktion verschiedener inflammatorischer
Gene deuten darauf hin, dass SD zur Aktivierung von Mikroglia führen. Dieser Befund passt zu einer
früheren Arbeit von Gehrmann et al., die eine erhöhte Anzahl von Mikroglia und eine Heraufregulation
von Mikroglia-/Makrophagen-Markern nach SD beschrieben haben.
Auch verschiedene Metabolismus-assoziierte Gene wurden unmittelbar nach SD heraufreguliert.
Zum einen scheint der Energiemetabolismus durch SD verändert zu werden, z.B. durch eine Induktion
des Phosphofruktokinase-Gens, dem Flaschenhalsenzym der Glykolyse. Dies könnte als Reaktion auf
den hohen Energiebedarf angesehen werden, welcher zur Wiederherstellung der Ionengradienten
nach SD besteht. Außerdem waren verschiedene Enzyme der Cholesterol- (z.B. HMGCR, IDI1) und
Prostaglandinsynthese (Cox2, PTGES) induziert. Zu den biologischen Effekten von Prostaglandinen
gehört die Induktion von eNOS im Endothel der zerebralen Mikrogefäße, welches dort die
Hämodynamik beeinflusst [207]. Entsprechend wurde die Heraufregulation von eNOS 3 h nach SD
beobachtet. Nicht zuletzt wurden in den ersten 24 h zahlreiche Gene identifiziert, die mit dem mRNAund Proteinmetabolismus assoziiert sind (e.g. RAMP4, EIF4A1). Diese Gene sind möglicherweise an
dem regulatorischen System beteiligt, welches für die biphasische Veränderung der Proteinsynthese
nach SD verantwortlich ist [54-56].
SD zog auch eine differentielle Expression von Zytoskelett-assoziierten Genen nach sich.
Unmittelbar nach SD waren MAP2 und MAP6 heraufreguliert. Diese beeinflussen die Dynamik
neuronaler Mikrotubuli. Einen Tag später waren primär dem Aktin-Zytoskelett zugehörige Transkripte
Diskussion
70
erhöht. Betroffen waren β-Aktin selbst, wie auch RiL, welches den Umsatz von Aktinstressfasern
moduliert, und S100A10, das die Organisation von Aktinfasern, die Membranarchitektur und die
Verteilung von Ionenkanälen reguliert [208-210].
Die meisten der beobachteten Veränderungen hatten eher transienten Charakter und traten sehr
rasch nach SD auf. Nur wenige Gene waren zu mehr als einem Zeitpunkt reguliert. In diese Gruppe
gehörten z.B. der Matrixmetalloproteinase-Inhibitor TIMP1, welcher von 3 h bis eine Woche nach SD
heraufreguliert war. Der Inhibition von Matrixmetalloproteinasen wurde erst kürzlich eine
neuroprotektive Funktion zugeschrieben, was sich nach intrazerebralen Blutungen in einer Reduktion
des Ödems, der Infiltration von Neutrophilen Granulozyten und des oxidativen Stress äußerte [211].
Ein Gen mit verzögerter Expression war das Transthyretin (TTR). Dies ist der wichtigste Thyroxin (T4)
– und Retinoltransporter von Rodentia [212]. TTR, wie auch Albumin (als zweiter T4-Transporter),
waren 24 h nach SD herabreguliert, und TTR nach 1 Monat heraufreguliert. Somit scheint SD auch mit
T4- und Retinolsäuresignalwegen zu interferieren. Thyroidhormone und Retinolsäure fungieren als
Transkriptionsaktivatoren von Genen, die z.B. die Hirnentwicklung, Differenzierung und Migration von
Neuronen im zerebralen Kortex, die Entwicklung von Oligodendrozyten oder die Axonmyelinisierung
steuern [213-216]. Beobachtungen an TTR-Null-Mäusen, die normale T4- und T3-Konzentrationen in
ihrem Hirnparenchym aufwiesen, ließen Palha et al. schließen, dass die Hauptfunktion von TTR in der
Regulation freier Thyroidhormonlevel liegt [217, 218]. Da nur die freien Hormone biologisch aktiv sind,
müssten SD entsprechend dieser Hypothese zunächst zu erhöhten T4- und Retinolsäure-Wirkungen
führen, während diese später reduziert sind. Eine Heraufregulation von TTR im Gehirn wurde auch
nach Oligämie beobachtet [219]. TTR scheint auch ein Indikator für die Erholung nach einem
Schlaganfall zu sein. Im Vergleich zu gesunden Probanden hatten Patienten, die nach einem
Schlaganfall verstorben sind, weniger und solche die überlebten, vermehrt TTR im Blutserum [220].
Mögliche Schlussfolgerungen zur SD-vermittelten Ischämietoleranz
Ischämietoleranz bezeichnet das Phänomen, welches das Gehirn unempfindlicher gegenüber einem
Sauerstoffmangel macht. Die Mechanismen, die dazu beitragen, sind bisher nur unzureichend
aufgeklärt. Als einer von mehreren Stimuli, die eine Ischämietoleranz auslösen können, wird auch die
SD diskutiert: Eine Reihe von Arbeitsgruppen zeigte, dass repetitive, mindestens einen Tag vor
Ischämieinduktion auftretende SD das Infarktvolumen als auch die Anzahl absterbender Neurone
vermindern [82-86]. Für die folgende Diskussion ist es wichtig zu erwähnen, dass SD in diesen
Diskussion
71
Studien durch kortikale Applikation von hochmolarem KCl ausgelöst wurden, während als Kontrolle
physiologische Kochsalzlösung diente.
Eine aktuelle Studie zum Einfluss kortikaler Läsionen per se stellt die bisher geführten Debatten über
einen neuroprotektiven Effekt von SD in ein neues Licht. Desweiteren hebt sie die enorme Bedeutung
einer sorgfältig ausgewählten Kontrolle für die Interpretation experimenteller Daten hervor. Diese
Studie von Muramatsu et al. zeigte, dass eine kleine kortikale Läsion, hervorgerufen durch epidurale
Applikation von 5 M NaCl, per se schon ausreichend ist, ischämische Toleranz zu induzieren [221]. Da
die Applikation jeglicher hochmolarer Elektrolytlösung, eben auch KCl und NaCl, zur Entstehung
kleiner Läsionen führt, existiert in den im vorigen Absatz genannten Studien (mit 0.9% NaCl als
Kontrolle) neben den SD ein zweiter, gravierender Unterschied zwischen SD- und Kontrollgruppe: die
Läsion. Der dort gezogene Schluss, dass der beobachtete neuroprotektive Effekt auf die SD zurückzuführen sei, ist somit nicht vertretbar. Daneben existiert jedoch mindestens eine Arbeit zu diesem
Thema, in der equimolare KCl- bzw. NaCl-Lösungen für SD- und Kontrolltiere eingesetzt wurden [66].
Hier war das Volumen eines 3 Tage später durch MCAO induzierten Infarktes nach SD um etwa die
Hälfte vermindert, so dass ein neuroprotektiver Effekt von SD eindeutig belegt werden konnte.
Welche der in der vorliegenden Studie beobachteten Veränderungen für die Vermittlung der
Ischämietoleranz nach SD verantwortlich zeichnen, ist an dieser Stelle nicht zu klären. Sicherlich ist
nahezu jedes der identifizierten Gene ein potentieller Kandidat, da sich der Läsionseffekt durch
Verwendung der 3 M NaCl-Kontrolle herauskürzen ließ. Die vorgestellten Daten bieten somit eine
Grundlage, molekulare Targets zur Induktion eines neuroprotektiven Effekts zu identifizieren, dafür
müssen sich jedoch funktionelle Studien zur Charakterisierung der verantwortlichen Gene
anschließen. Die aktuelle Literatur liefert Hinweise auf potentielle Kandidatengene, darunter
Hitzeschockproteine, Superoxid-Dismutasen oder Apoptosesuppressoren. Bisher existieren nur
wenige Studien, die einen kausalen Zusammenhang zwischen SD-vermitteltem neuroprotektiven
Effekt und einem bestimmten Molekül (BDNF, NOS) nachweisen konnten [89, 222].
Vergleich der Genexpressionsmuster nach SD und Schlaganfall
Experimentelle Studien in Ratten fanden eine differentielle Genexpression nach fokalen Ischämien
nicht nur im ischämischen, sondern auch im ipsilateralen remote-Kortex. Da die verwendeten Modelle
meistens sehr klar umschriebene Infarkte verursachten, wurde vermutet, dass die SD-ähnlichen
Periinfarktdepolarisationen (PID) für die Induktion von Genen in nicht-ischämischen Kortexregionen
72
Diskussion
verantwortlich sind [7, 11, 76, 77]. Dies traf etwa für JunB, c-Jun, c-Fos, BDNF, Cox2 oder die
Hitzeschockproteine hsp27 und hsp32 zu [11, 21, 57, 63, 76, 78, 79]. Viele andere nach fokaler
Ischämie beobachteten Expressionsänderungen konnten aufgrund der begrenzten Datenlage bis dato
nicht mit SD in Verbindung gebracht werden (z.B. NGFI-B, MIP-1α, Stat3 oder Synaptophysin).
Anhand der vorliegenden Datensets zur Genexpression nach SD soll an dieser Stelle der Versuch
gemacht werden, ihren Anteil an den beobachteten molekularen Effekten nach Schlaganfall
abzuschätzen.
In den letzten Jahren wurden eine Reihe von Studien veröffentlicht, deren Inhalt groß angelegte
Microarray-basierte Screenings der Genexpression nach fokalen Ischämien waren, allerdings kann
nur in wenigen dieser Studien gesichert davon ausgegangen werden, dass es sich bei dem
untersuchten Gewebe um nicht-ischämischen remote Kortex handelte [7]. Dort wurden nach
photothrombotischen Infarkten 16 differentiell exprimierte Gene identifiziert, 11 davon (NGFI-A und B,
c-Jun, Stat3, FRA2, MIP-1α, PC3, CgC2, Arc, tPA, RGS4) verhielten sich ähnlich wie in der
vorliegenden Arbeit nach SD beobachtet wurde. Alle anderen bisher publizierten Microarraystudien
untersuchten die Genexpression nach Ischämien, die durch den Verschluss hirnversorgender
Arterien, meist der Arteria cerebralis media, induziert wurden. Diese Modelle ahmen zwar die
Pathophysiologie des Schlaganfalls beim Menschen besser nach, bedingen jedoch auch eine große
Heterogenität
der
derzeitigen
Datenlage
zur
Genexpression
nach
fokaler
Ischämie
(z.B.
unterschiedliche Infarktmodelle und Okklusionszeiten; keine klare Abgrenzung von ischämischen und
normoxischen Gewebe, dadurch oft Verwendung unterschiedlich beeinträchtigten Gewebes;
unterschiedliche Analysezeitpunkte) und machen eine Zuordnung zum nicht-ischämischen remote
Kortex schwierig. Im Vergleich mit den bisher publizierten Ischämiestudien wurden > 50 Transkripte
mit ähnlichem Expressionsverhalten wie nach SD identifiziert (in den Tabellen 6-16 und A-E mit x
markiert), allerdings soll im folgenden nur auf solche Studien eingegangen werden, die sich eindeutig
auf den remote Kortex beziehen. Beispielsweise wurde eine Infarkt-bedingte Heraufregulation der
Hitzeschockproteine HO-1 (hsp-32) und HO-2 im gesamten ipsilateralen Kortex beschrieben [78, 223].
Hier wurde jedoch nur hsp-32 durch SD induziert. Ebenso konnte (in Übereinstimmung mit anderen
Studien) in der aktuellen Studie keine SD-bedingte Beeinträchtigung anderer Hitzeschockproteine
(z.B. hsp70 oder 72) oder von Superoxiddismutasen beobachtet werden – Gene, deren
Heraufregulation im remote Kortex bereits dokumentiert wurde [66, 196, 224, 225]. Honkaniemi et al.
untersuchten die Expression von Zink-Finger immediate early Genen nach permanenter MCAO [14].
73
Diskussion
Sie konnten zeigen, dass NGFI-A, NGFI-B, NGFIC, Egr2+3 und Nurr1 im gesamten ipsilateralen
Kortex induziert wurden, ein Effekt, den sie Periinfarktdepolarisationen zuschrieben. Dies konnte in
der vorliegenden Studie für alle Gene bestätigt werden. Die in mehreren Studien nach fokaler
Ischämie nachgewiesene Induktion der inflammatorischen mRNAs TNFα, IL-1β und iNOS [226] kann
hingegen in der vorliegenden Studie nicht mit SD assoziiert werden, andererseits scheint es einen
deutlichen Zusammenhang zwischen Ischämie-induzierter Cox-2-Expression [227] und SD zu geben,
auch dies wurde bereits in einer anderen Studie belegt [159]. Andere Studien beobachteten eine
verminderte GABAA-Rezeptorexpression, besonders eine Woche nach photothrombotischen Infarkten
[151, 228]. Dabei zeigten auch Redecker et al. [228], dass diese nicht durch SD hervorgerufen werden
- dies konnte die vorliegende Studie bestätigen. Weitere Arbeiten deuten darauf hin, dass
photothrombotische Infarkte die Expression von Glutamatrezeptoren (NMDAR, mGluR3, mGluR2)
verändern [229, 230]. Auch diese Befunde ließen sich nach SD nicht beobachten.
Diese Beispiele stellen sehr deutlich heraus, dass offenbar nur ein Teil der bisher SD
zugeschriebenen molekularen Veränderungen nach fokalen Ischämien wirklich auf SD bzw. PID
zurückzuführen sind. Ein Erklärungsansatz für diese Diskrepanz sticht besonders hervor: Alle Studien
fokaler Ischämien verwenden gesunde Tiere als Kontrolle. Sehr wahrscheinlich besteht ein kausaler
Zusammenhang zwischen den nach PT beobachteten ipsilateralen Veränderungen, welche sich durch
die vorliegende Studie nicht auf SD zurückführen lassen, und der Läsionierung des Hirngewebes per
se. Dieses Thema wurde bereits in einem der vorangegangenen Abschnitte diskutiert. Tieferer
Einblick in diese Problematik kann nur durch zukünftige Studien gewonnen werden, in denen
gesundes Hirn systematisch mit läsioniertem (3 M NaCl) und läsioniertem + SD (3 M KCl) Hirn
verglichen wird.
Hippocampale Neurogenese und räumliches Lernen
Im zweiten Teilprojekt dieser Studie wurden die Auswirkungen kortikaler SD auf die Neurogenese im
adulten Gyrus dentatus untersucht. Um einen direkten Vergleich zu rein kortikalen Infarkten zu
ermöglichen,
wurden
Proliferation
und
Überleben
neugeborener
Zellen
auch
nach
photothrombotischen Läsionen untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass SD zu einer drastischen
Steigerung der Neurogenese in der subgranulären Zone führen, dass diese Zellen hauptsächlich zu
Neuronen differenzieren und dass sich auch 6 Wochen später noch erheblich mehr neugeborene
74
Diskussion
Nervenzellen im Gyrus dentatus von SD- als von Kontrollratten finden lassen. SD erhöhten die Anzahl
neugeborener Neurone jedoch nicht allein durch eine gesteigerte Proliferation, sondern propagierten
zusätzlich die neuronale Differenzierung. Bei Vorbehandlung der Tiere mit dem NMDARezeptorblocker MK-801 verblieb die Neurogeneserate nach 2-stündiger Applikation von 3 M KCl auf
dem Level der Kontrollen. Demgegenüber wurde nach photothrombotischen Infarkten (PT) nur eine
geringe Steigerung der Proliferation nachgewiesen. Dieser Effekt war transient, langfristig gab es
keine Zellzahlunterschiede zwischen PT- und Kontrolltieren.
Im dritten Teilprojekt wurde der Effekt von SD auf das räumliche Lernen analysiert. Dazu wurden SDund Kontrollratten in der 6. Woche nach dem Eingriff im Morris water maze trainiert. Dabei gab es
keine gravierenden Unterschiede zwischen den beiden Gruppen. SD-Tiere erlernten die Aufgabe zwar
tendenziell schneller, die langfristige Gedächtnisleistung war jedoch unbeeinflusst.
Die Entdeckung, dass im Gehirn adulter Säugetiere kontinuierlich neue Nervenzellen gebildet werden,
gab den Anstoß, endo- und exogene Modulatoren dieser adulten Neurogenese und deren
physiologische Funktion zu entschlüsseln. Daran knüpft sich die Erwartung, die Neurogenese gezielt
beeinflussen zu können und damit ein therapeutisches Werkzeug zur kausalen Behandlung
neurologischer Erkrankungen in die Hand zu bekommen. Zu den bis dato identifizierten Modulatoren
gehören beispielsweise eine reizreiche Umgebung, physische Aktivität, das Alter, Stress, oder eine
Verletzung
bzw.
neurologische
Erkrankung
des
Gehirns
(Schädel-Hirn-Trauma,
Epilepsie,
ischämische Infarkte, etc.) [231]. Allmählich beginnt man die grundlegenden Mechanismen, die zu
adulter Neurogenese führen zu verstehen. Eine herausragende Rolle scheint der „neurogenen
Permissivität“ des Gewebes zuzukommen. So wurde unlängst entdeckt, dass auch andere
Hirnregionen außer der subventrikulären und subgranulären Zone neuronale Stamm- und
Vorläuferzellen enthalten, obwohl dort niemals adulte Neurogenese beobachtet wurde (nichtneurogen). Aus diesen Zellen lassen sich in vitro unter geeigneten Kulturbedingungen nicht nur Glia-,
sondern auch Nervenzellen heranziehen [232]. Transplantiert man diese Zellen in eine neurogene
Region wie die subgranuläre Zone, können sie auch dort zu Glia oder Neuronen differenzieren [233,
234]. Somit stellt sich natürlich die entscheidende Frage, was eine neurogene von einer nichtneurogenen Hirnregion unterscheidet. Man kam zu dem Konzept der „neurogenen Permissivität“ eine Stamm- bzw. Vorläuferzelle mag zwar das Potential zur neuronalen Differenzierung innehaben,
deren Umsetzung wird jedoch maßgeblich durch das sie umgebende „Microenvironment“ bestimmt
Diskussion
75
(Ortsspezifität). Zu den dieses Mikrogefüge definierenden Faktoren gehören Astrozyten, Blutgefäße
(„vascular niche“), und unreife PSA+ Neurone [235, 236]. Die oben aufgeführten Modulatoren greifen
vermutlich durch Modifikation dieses „Microenvironments“ in die adulte Neurogenese ein. Dabei
spielen vermutlich Neurotransmitter (neuronale Aktivität), Wachstumsfaktoren, Neurotrophine,
Hormone, u.a. Faktoren eine Rolle [231, 237, 238].
Kortikale SD steigern die hippocampale Neuroneogenese – Spekulationen zum
Mechanismus der Infarkt-vermittelten Neurogenese
Da SD ein Epiphänomen einiger der oben genannten neurologischen Erkrankungen sind, war es nahe
liegend anzunehmen, dass sie auch zu einer Aktivierung von Neurogenese führen. Bisher liegt nur
eine Untersuchung zu diesem Thema vor [239]. Yanamoto et al. konnten zeigen, dass eine 48stündige KCl-Injektion ins Vorderhirn der Ratte die Zellproliferation als auch den Anteil neuronaler
Vorläuferzellen in der subventrikulären Zone und im rostralen Migrationsstrom erhöht. Die vorliegende
Arbeit konzentrierte sich daher auf die hippocampale Neurogenese. Im Einklang mit der
Arbeitshypothese steigerten SD die ipsi-, aber auch kontralaterale Neurogenese im Hippocampus.
Überraschend war die Immensität des Effektes – die Proliferation im ipsilateralen Gyrus dentatus von
SD-Tieren übertraf die der Kontrollen um bis zu 470% (d4). Auch 6 Wochen nach SD befanden sich
noch circa 270% mehr neugebildete Zellen im ipsilateralen Gyrus dentatus der SD-Ratten als von
Kontrollen. Zu diesem Zeitpunkt waren die meisten der neugebildeten Zellen in die Körnerzellschicht
eingewandert und zu Neuronen differenziert. Eine Aktivierung der Neurogenese dieses Ausmaßes
entspricht in etwa den Beobachtungen nach einem durch MCAO verursachten Infarkt [240].
Nun stellte sich die Frage, ob dieser durch 3 M KCl verursachte Effekt tatsächlich durch kortikale SD
oder durch in den Hippocampus diffundierendes KCl und möglicherweise dort ausgelöste SD
verursacht wurde. Um dies zu klären, wurde eine Gruppe von Ratten mit dem nicht-kompetetiven
NMDA-Rezeptorantagonisten MK-801 vorbehandelt, eine Substanz, von der man weiß, dass sie SD
blockiert [28]. Damit ließ sich der proliferative Effekt des 3 M KCl unterdrücken. In einer anderen
Gruppe von Tieren wurde zusätzlich das hippocampale DC-Potenial abgeleitet, welches auch eine
Stunde über die KCl-Applikation hinaus keine Deflektionen aufwies. Gemeinsam festigten diese
beiden Kontrollen die These, dass die beobachtete Steigerung der Neurogenese kein direkter K+Effekt oder ein Effekt hippocampaler SD ist, sondern dass vielmehr tatsächlich ein kausaler
Zusammenhang zwischen kortikalen SD und hippocampaler Neurogenese besteht. Es kann natürlich
Diskussion
76
nicht vollständig ausgeschlossen werden, dass zu einem noch späteren Zeitpunkt hippocampale SD
entstanden, dies erscheint jedoch eher unwahrscheinlich.
Allerdings erlauben die MK-801-Daten keine Schlüsse bezüglich des Mechanismus der SDvermittelten Neurogenese. Es existiert eine Reihe von Studien, die sich mit der Funktion von
Glutamat-, und im speziellen der von NMDA-Rezeptoren für die hippocampale Neurogenese
beschäftigten. Konsens besteht darin, dass NMDA-Rezeptoren in die Regulation hippocampaler
Neurogenese involviert sind. Abhängig vom physiologischen Zustand des Organismus scheint ihre
Aktivierung (bzw. Hemmung) jedoch diametrale Folgen zu haben: In naiven Tieren führt die NMDARezeptoraktivierung zu einer Hemmung und die NMDA-Rezeptorblockade zur einer Steigerung der
hippocampalen Neurogenese [241-243]. Demgegenüber unterdrückt die NMDA-Rezeptorblockade
eine durch globale oder fokale Ischämie induzierte Neurogenese [240, 244]. Eine plausible Erklärung
dieser Diskrepanz ist bis dato nicht gelungen, diskutabel wäre jedoch, dass die NMDARezeptorblockade im naiven und ischämischen Gehirn auf unterschiedlichen Ebenen angreift. Es gibt
Hinweise, dass die NMDA-Rezeptoren, welche die basale Neurogenese regulieren, eher proximal3 (im
Hippocampus, möglicherweise direkt auf Stamm- oder Vorläuferzellen) sitzen und für die Suppression
der hippocampalen Neurogenese verantwortlich sind. Demgegenüber wird die Neurogenesehemmende Wirkung von NMDA-Rezeptorantagonisten nach Ischämie vermutlich eher indirekt, durch
Blockade distal sitzender Rezeptoren, vermittelt (z.B. auf Astrozyten oder Neuronen im Hippocampus,
wo es zur Modifikation Neurogenese-relevanter Wachstumsfaktorlevel kommen kann; oder im Kortex).
Im Hinblick auf die in dieser Arbeit gewonnenen Erkenntnisse könnte sich folgendes Szenario
ergeben: Nach Ischämie treten repetitive PID auf, welche zumindest partiell (über Wege, die später
diskutiert werden sollen) für die gesteigerte Neurogenese verantwortlich sind. Die Applikation von
NMDA-Rezeptorantagonisten wie MK-801 führt zu einer Inhibition der kortikalen PID, wodurch die
hippocampale Neurogenese auf ihrem normalen Level verbleibt. Diese Hypothese kann anhand der
vorliegenden Daten nicht verifiziert werden, stellt jedoch einen interessanten und simplen
Erklärungsansatz für die auf den ersten Blick konträren Effekte der NMDA-Rezeptorblockade auf die
Neurogenese im Gyrus dentatus unter physiologischen und pathophysiologischen Bedingungen
(Ischämie) dar.
Bislang existiert nur eine Studie, die sich mit der Rolle von NMDA-Rezeptoren für die
aktivitätsbedingte Neurogenese beschäftigte. In dieser zeigten Kitamura et al. [245], dass die in
________________________________________________________________________________________________________________
3
die Bergriffe proximal und distal werden hier bezüglich der räumlichen Lage der NMDA-Rezeptoren relativ zu den Stamm- bzw.
Vorläuferzellen in der subgranulären Zone gebraucht
Diskussion
77
Wildtyp (WT)-Mäusen durch Lauftraining induzierbare Neurogenese in NR2A (ε1)-/--Mäusen
unterdrückt wird. Gleichzeitig beobachteten sie eine Lauftraining-induzierte Erhöhung der BDNFExpression im Hippocampus der WT-Mäuse, aber nicht in den NR2A-/--Tieren. Demgegenüber
entsprachen basale Neurogenese und BDNF-Expression in NR2A-/--Mäusen denen der Kontrollen.
Die Autoren schlussfolgerten, dass das Lauftraining in gesunden Tieren durch Aktivierung von NMDARezeptoren zu einer gesteigerten BDNF-Produktion führt, welche wiederum die Neurogenese
aktiviert. In ihren Daten sahen sie einen Widerspruch zu den oben aufgeführten Studien, die zeigten,
dass die physiologische Neurogenese durch Blockade von NMDA-Rezeptoren gesteigert wird. Dieser
scheint jedoch auf Basis des derzeitigen Kenntnisstandes nicht begründet, die Daten demonstrieren
lediglich die Funktion einer einzelnen NMDA-Rezeptoruntereinheit. Außerdem ist bekannt, dass der
Knock Out eines Gens oft zu kompensatorischen Regulationen verwandter Moleküle führt. Möglich
wäre auch, dass ganz unterschiedliche NMDA-Rezeptoren (NR1/NR2A, NR1/Nr2B, etc.), die sich
auch durch eine distinkte räumliche Verteilung im Hippocampus auszeichnen [246, 247], in die
Regulation der Neurogenese unter physiologischen und pathophysiologischen Bedingungen involviert
sind. Die Balance zwischen deren Aktivierung und Inaktivierung mag zu den unterschiedlichen
Reaktionen der hippocampalen Neurogenese führen. Falls der in der Studie von Kitamura et al.
vorgeschlagene Mechanismus jedoch auf die Ischämie übertragbar wäre, müssten andere Faktoren
als PID/SD als zugrunde liegender Mechanismus angenommen werden.
Die vorangegangenen Erläuterungen führen zur Frage, über welche Wege und Mechanismen
kortikale SD die hippocampale Neurogenese beeinflussen. Die wichtigste afferente Verbindung
zwischen Kortex und Gyrus dentatus ist der vom entorhinalen Kortex ausgehende Tractus perforans.
Anzunehmen ist, dass dieser durch die massive Depolarisation des ipsilateralen Kortex während einer
SD aktiviert wird. Wernsmann et al. [248] wiesen elektrophysiologisch nach, dass kortikale SD zu
einer gesteigerten hippocampalen Aktivität führen. Denkbar wäre, dass der gesteigerte elektrische
Input direkt auf die Neurogenese im Gyrus dentatus einwirkt, wahrscheinlicher ist jedoch, dass es
infolgedessen zu einer Synthese und Freisetzung verschiedener Neurotrophine oder anderer Faktoren
kommt. Für die letztgenannte Hypothese spricht, dass die Aktivierung des Tractus perforans zu einer
Heraufregulation der für BDNF und NGF kodierenden mRNAs in den Körnerzellen des ipsilateralen
Gyrus dentatus führt [249]. Auch nach kortikalen SD wurde eine Expression von neurotrophen
Faktoren wie BDNF im Gyrus dentatus beobachtet [250]. Eine aktuelle, auf der letztjährigen SfN-
Diskussion
78
Tagung vorgestellte Studie bot eine alternative Hypothese. Die Autoren zeigten, dass eine durch
viralen Gentransfer induzierte BDNF-Überexpression im entorhinalen Kortex per se ausreichend ist,
die hippocampale Neurogenese zu erhöhen [251]. Aus eigenen und anderen Studien ist bekannt,
dass SD die BDNF-Expression im ipsilateralen Kortex erhöht. Die Überprüfung dieser Hypothesen
erfordert zusätzliche tierexperimentelle Studien. Denkbar wäre eine Läsionierung des Tractus
perforans vor Induktion der SD (Tage/Wochen), um mögliche alternative Routen der Kommunikation
zwischen kortikaler SD und Hippocampus zu identifizieren bzw. die vorgeschlagene Route über
selbigen zu bestätigen. Andererseits wäre vorstellbar, gezielt die Heraufregulation von BDNF im
entorhinalen Kortex nach SD zu blocken (z.B. durch viralen Gen-knock down mit RNAi, DNAMethylierung).
Die kontralaterale Steigerung der Neurogenese im Gyrus dentatus der SD-Ratten wird vermutlich über
transkallosale oder kommissurale Verbindungen zwischen ipsi- und kontralateralem Gyrus dentatus
vermittelt. Möglich, jedoch weniger wahrscheinlich wäre auch die Freisetzung endokriner Faktoren.
Neuere Studien wiesen eine Koinzidenz von Neurogenese und programmiertem Zelltod in den
neurogenen Zonen des adulten Gehirns nach [118]. Dabei ist jedoch nicht geklärt, inwieweit die adulte
Neurogenese kontinuierlich neue Nervenzellen zur Körnerzellschicht des Gyrus dentatus hinzufügt
oder Teil eines Austauschprozesses alter Neurone ist. Für beide Theorien lassen sich in der Literatur
Argumente finden: Beispielsweise zeigten longitudinale Studien an der Maus einen Zuwachs an
Körnerzellen bzw. Volumen der Körnerzellschicht während des ersten Lebensjahres [252, 253]. Die
Untersuchungen zum programmierten Zelltod sprechen jedoch dafür, dass neben der Neubildung
auch eine Elimination von Körnerzellen stattfindet. Kürzlich zeigten Silva et al., dass es in der
Körnerzellschicht von Ratten eine graduelle Verteilung apoptotischer Zellen mit der größten Inzidenz
in der äußeren Schicht gibt [254]. Dies lässt einen kontinuierlichen Turnrover von Körnerzellen von
innen (Neurogenese) nach außen (Apoptose) vermuten.
Um herauszufinden, ob SD per se zu einer gesteigerten Apoptose führen oder ob die neu gebildeten
Zellen im Gyrus dentatus vermehrt apoptotisch eliminiert werden, wurden Immunfärbungen gegen
aktivierte Caspase-3 und BrdU durchgeführt. Weder im ipsi- noch kontralateralen Gyrus dentatus oder
zerebralen Kortex konnte Caspase-3-Aktivität nachgewiesen werden. Nur im Bereich der Läsionen
von SD- und Kontrolltieren fanden sich stark immunreaktive Zellen. Aus den Daten lässt sich
schlussfolgern, dass SD grundsätzlich nicht zum Zelluntergang durch klassische Apoptose führen und
dass die neu gebildeten oder andere Neurone im Gyrus dentatus nicht über diesen Mechanismus
Diskussion
79
eliminiert werden. Daneben besteht jedoch die Möglichkeit, dass Zellen durch Caspase-unabhängige
Prozesse des programmierten Zelltodes oder durch Nekrose eliminiert werden. Gemäß der im vorigen
Absatz genannten Studien erscheint dies zumindest in der Körnerzellschicht wahrscheinlich. Um den
Anteil dieser alternativen Zelltodmechanismen abzuklären, sind weitere Untersuchungen notwendig
(TUNEL-Assay, Fluorojade-Färbung).
Ein kleineres Teilprojekt beschäftigte sich mit dem Einfluss kleiner photothrombotischer Infarkte (PT)
auf die Neurogenese im Hippocampus. Die Auswirkungen waren marginal und kurzfristig – die
Proliferation der Vorläuferzellen in der subgranulären Schicht war am Tag 4 nach PT ipsilateral um
etwa 30 % erhöht, die neu gebildeten Zellen überlebten jedoch nicht. Bereits Kluska et al.
untersuchten den Effekt rein kortikaler Infarkte auf die Neurogenese in dieser Region. Sie fanden 4
und 10 Wochen nach einer PT etwa 40% mehr neugeborene Zellen im DG als in den scheinoperierten
Kontrolltieren [255], dies konnte auf ein gesteigertes Überleben neuer Zellen zurückgeführt werden.
Die Autoren untersuchten jedoch nicht die unmittelbaren Effekte von PT, außerdem nutzten sie ein
alternatives BrdU-Injektionsschema. Dies könnte die Unterschiede zur vorliegenden Studie zumindest
partiell erklären. Andererseits stellt sich für beide Studien die Frage, warum PT nur so geringen
Einfluss auf die hippocampale Neurogenese ausüben, wo doch bekannt ist, dass auch PT mit PID/SD
einhergehen können [72]. Antwort darauf können die Faktoren geben, die während eines operativen
Eingriffs SD beeinflussen können. Zum einen sind SD temperaturabhängig – bei niedrigeren
Temperaturen sinkt die Anzahl der auslösbaren SD pro Zeiteinheit [20, 256, 257]. Andererseits haben
Art und Tiefe der Anästhesie einen Einfluss auf SD [258]. Beide Parameter unterscheiden sich
zwischen der Arbeit von Dietrich et al. [72] und der vorliegenden PT-Studie, als auch zwischen SDund PT-Studie dieser Arbeit. Dietrich et al. zeichneten den kortikalen Blutfluss und die K+Umverteilung über 3 Stunden nach PT bei 37°C auf. Demgegenüber blieben die Tiere in der
vorliegenden Studie maximal 30 Minuten nach PT temperaturkontrolliert, anschließend wurden sie in
ihren Käfig zurückgesetzt, wo ihre Körpertemperatur infolge der Inaktivität etwas gesunken sein
könnte. Die in den Studien verwendeten 2 %-igen Halothan- oder Isoflurannarkosen wirken sich
nachweislich nicht unterschiedlich auf SD aus [258]. Allerdings wurden die Eingriffe zur Auslösung der
SD bei einer niedrigeren Narkose durchgeführt als die Infarktinduktionen (1.5 % vs. 2 % Isofluran). Für
die Argumentation der fehlenden PID/SD in den getesteten PT-Tieren sprechen auch die
Immunfärbungen gegen Cox-2. In der vorliegenden Studie kam es nicht zu der von anderen Autoren
[227] beschriebenen ipsilateralen Heraufregulation von Cox-2 nach PT (ohne Abb.), während dies in
80
Diskussion
SD-Tieren der Fall war (Abb. 12). Zusammenfassend kann der PT-Effekt nicht abschließend beurteilt
werden, möglicherweise spielt hier die Temperaturdifferenz zwischen den Studien eine Rolle. Zur
Überprüfung dieser Hypothese könnte die Überwachung von EEG und physiologischer Parameter
nach den Eingriffen an den wachen Tieren und für mehrere Stunden nützlich sein.
Die kortikale Läsion per se – (k)ein Modulator hippocampaler Neurogenese?
Aufgrund der Arbeit von Muramatsu et al. [221] und den in der vorliegenden Studie gewonnenen
Daten zur hippocampalen Neurogenese stellt sich die Frage, welchen Einfluss die Läsionierung des
Kortex per se auf das verbleibende Hirn ausübt. Im Hinblick auf die Genexpression und einen
möglichen Ischämietoleranz-induzierenden Effekt wurden bereits in vorangehenden Abschnitten
entsprechende
Diskussionen
geführt.
Dazu
lässt
sich
an
dieser
Stelle
nochmals
kurz
zusammenfassen, dass Muramatsu et al. zeigten, dass eine durch 5 M NaCl ausgelöste kortikale
Läsion neuroprotektiv gegenüber einem anschließenden ipsilateralen Infarkt wirkt. Bisherige Studien,
inklusive der vorliegenden, die sich histologischer Methoden bedienten, konnten jedoch für die
analysierten Genprodukte keinen Unterschied zwischen ipsi- und kontralateralem Kortex in den NaClKontrolltieren nachweisen (außer an der Läsionsstelle). Somit bleibt offen, wodurch dieser
läsionsinduzierte neuroprotektive Effekt vermittelt wird.
Andererseits deutet die vorliegende Studie darauf hin, dass eine kortikale Läsion allein keinen Einfluss
auf die Neurogenese im Gyrus dentatus hat. Nur in Kombination mit SD kam es zu einer Steigerung
der Proliferation von Vorläuferzellen in diesem Gebiet. Die Anzahl der neugebildeten Zellen im Gyrus
dentatus der NaCl-Kontrolltiere entsprach der von unläsionierten Tieren (PT-Kontrollen), obwohl
erstere eine kortikale Läsion entwickelten. Auch die PT, deren Volumen zumindest kurz nach dem
Eingriff dem der KCl-Läsionen entsprach, beeinflussten die hippocampale Neurogenese kaum. Zwar
verursachte NaCl kleinere Läsionen als KCl, dies erklärt jedoch nicht, warum es im Gyrus dentatus
dieser Tiere keinerlei proliferative Aktivität gab. Auch Arvidsson et al. beobachteten, dass die durch
transiente MCAO induzierte hippocampale Neurogenese unabhängig vom Infarktvolumen ist [240].
Gemeinsam lassen die bisherigen Daten die Vermutung zu, dass nach einem Infarkt nicht die
Läsionierung, sondern andere Prozesse, wie beispielsweise die SD und eventuell bei bestimmten
Ischämiemodellen auch die im Hippocampus auftretende Ischämie selbst, für die Modulation der
Neurogenese im Gyrus dentatus verantwortlich sind. Dies entspricht dem Konzept, dass die durch
einen Infarkt verursachten Reaktionen des Gehirns multifaktoriell bedingt sind.
81
Diskussion
BrdU als Proliferationsmarker
Die BrdU-Markierung ist derzeit die bevorzugte Methode, um Proliferation und Neurogenese in vivo zu
analysieren. Nach systemischer Applikation wird BrdU als Thymidin-Analogon in die DNA aller Zellen
eingebaut, die DNA synthetisieren. Im Falle von mitoseaktiven Zellen wird es während der S-Phase
des Zellzyklus in die DNA integriert. Dadurch werden nicht nur die zum Zeitpunkt der BrdUVerfügbarkeit teilungsaktiven Zellen, sondern auch deren Nachkommen gekennzeichnet. Darüber
hinaus kann BrdU auch im Zuge von DNA-Reparaturprozessen in postmitotischen Neuronen
eingebaut werden. Die daraus resultierende Skepsis gegenüber dieser Methode ließ sich durch
neuere Studien ausräumen, die nachwiesen, dass die durch BrdU markierten Zellen im Gehirn
tatsächlich durch Zellteilung hervorgegangen sind [259, 260]. Unter anderen können die folgenden
Argumente ins Feld geführt werden: 1) wenn BrdU in der in den meisten Studien genutzten
Konzentration von 50 mg/kg verwendet wird, wird es in Zonen neurogener Aktivität eingebaut; 2) kurz
nach BrdU-Injektion gibt es eine klare Kolokalisation mit Proliferationsmarkern wie Ki67 [260]; 3)
verfolgt man die BrdU-markierten Zellen über die Zeit, lässt sich deren Entwicklung von
Vorläuferzellen (BrdU+/Nestin+) über unreife (BrdU+/DCX+) bis hin zu reifen Neuronen (BrdU+/NeuN+)
nachvollziehen [259]; 4) es gibt keine Hinweise auf die Inkorporation von BrdU in reife Neurone
unmittelbar nach dessen Applikation. Langfristig spielen zwei Probleme eine Rolle. Zum einen kann
das BrdU in einer stark teilungsaktiven Population ausgedünnt und damit undetektierbar werden,
andererseits kommt es durch die Größe des Bromid-Ions zu Veränderungen der DNA-Struktur, was
eine veränderte Genexpression oder erhöhte Kanzerogenität hervorrufen kann. Dies spielt jedoch in
der vorliegenden wie in den meisten anderen Studien, in denen es sich um Analysezeiträume von
Tagen bis maximal einigen Monaten handelt, eine zu vernachlässigende Rolle.
Funktionelle Relevanz der gesteigerten Neurogenese im Gyrus dentatus
Es stellt sich die Frage, ob die massive Steigerung der Neurogeneserate in einer Struktur, die im
Zusammenhang
mit
Lern-
und
Gedächtnisleistungen
steht,
sich
positiv
auf
bestimmte
Verhaltensweisen auswirken kann. In der vorliegenden Studie wurde die kognitive Leistung der SDRatten in zwei Varianten des Morris Water Maze evaluiert. Dieser Test gilt als experimentelles
Paradigma für hippocampusabhängige Lernvorgänge. In keinem der beiden Tests konnten
Unterschiede in der Gedächtnisleistung von SD- relativ zu Kontrolltieren festgestellt werden (probe
trials). Demgegenüber zeigten SD-Ratten eine tendenziell bessere Lernleistung über die gesamte
82
Diskussion
Akquisitionsphase des traditionellen Water Maze hinweg. Dieser Unterschied war in einigen
Versuchsdurchgängen signifikant. Unter Berücksichtigung des Befundes, dass die Lernleistung der
SD-Tiere nur marginal über der der Kontrollen lag und sich die signifikanten Unterschiede nicht über
eine längere Testperiode hielten, können die Daten dahingehend interpretiert werden, dass SD bzw.
die große Anzahl neu gebildeter Neurone nicht zu einer relevanten Verbesserung der kognitiven, im
Morris Water Maze evaluierbaren Leistungen führen.
Nach wie vor ist unklar, welche funktionelle Relevanz die adulte Neurogenese im Hippocampus
besitzt. In den letzten Jahren wurden eine Reihe von Studien durchgeführt, die sich mit diesem Thema
beschäftigten (2-7). Beispielsweise konnte gezeigt werden, dass Mäuse, die in einer reizreichen
Umgebung (Enriched Environment) lebten, besser in räumlichen Tests, wie dem Morris Water Maze
abschnitten [261] und weniger Angstverhalten zeigten [262], als unter Standardbedingungen
gehaltene Kontrolltiere. Gleichzeitig führte das Enriched Environment zu einer gesteigerten
hippocampalen Neurogenese [136, 261]. Andere Versuche, die sich dem Zusammenhang zwischen
hippocampaler Neurogenese und bestimmten Verhaltensweisen widmeten, schlossen sich an. In
diesen Studien wurde die adulte Neurogenese durch systemische Gabe von Zytostatika [131] oder
Röntgenbestrahlung des Gehirns [128, 129, 263] ausgeschaltet. Dies resultierte in einer
Verschlechterung der Tiere in einigen hippocampus-abhängigen Lernparadigmen (trace conditioning
[130], räumliches Lernen im Barnes Maze [129]), während andere unbeeinträchtigt blieben
(räumliches Lernen im Morris Water Maze [129, 131]). Andererseits wurde eine durch intraventrikuläre
S100β-Injektion erhöhte hippocampale Neurogenese mit einer gesteigerten Leistung im Morris Water
Maze in Verbindung gebracht [264]. Aufgrund dieser und anderer Ergebnisse wurde vermutet, dass
die adulte hippocampale Neurogenese für bestimmte Hippocampus-abhängige Verhaltensweisen
erforderlich ist. All diese Studien konnten jedoch keinen direkten Beweis dieser Hypothese erbringen –
die Enriched Environment-Daten zeigen eine Koinzidenz, aber keine Korrelation von Neurogenese
und verändertem Verhalten, in den Zytostatika- und Bestrahlungsstudien wurde die mitotische Aktivität
nicht nur im Hippocampus, sondern auch in anderen Hirnregionen blockiert. Dementsprechend wären
auch
alternative
Routen,
als
physiologisches/anatomisches
Korrelat
der
beobachteten
Verhaltensänderungen denkbar (Modulation von Wachstumsfaktoren, der Angiogenese, synaptische
Plastizität, etc.).
Eine kürzlich in Nature Neuroscience publizierte Studie testete die Hypothese, dass adulte
hippocampale Neurogenese die Effekte einer reizreichen Umgebung vermittelt [265]. Durch fokale
83
Diskussion
Röntgenbestrahlung wurde selektiv nur die hippocampale Neurogenese ausgeschaltet. Zwei Monate
später wurden die Mäuse in zwei Gruppen gesplittet, wovon eine von nun an in einer reizreichen
Umgebung, die andere weiterhin unter Standardbedingungen gehalten wurde. Sechs Wochen später
wurden Angstverhalten und räumliches Lernen getestet, eine Woche nach dem letzten Verhaltenstest
wurden teilungsaktive Zellen durch systemische BrdU-Injektion markiert. Die Autoren konnten zeigen,
das das Enriched Environment in gesunden Mäusen zu dem erwarteten Anstieg hippocampaler
Neurogenese führte, während in bestrahlten Tieren keinerlei Teilungsaktivität beobachtete wurde.
Außerdem zeigten die in der reizreichen Umgebung gehaltenen gesunden Kontrolltiere ein
vermindertes Angstverhalten und ein besseres Lernvermögen im Morris Water Maze als die unter
Standardbedingungen
gehaltenen
Mäuse.
Überraschenderweise
schnitten
die
im
Enriched
Environment gehaltenen bestrahlten Tiere genauso gut in diesen Tests ab, wie die unter gleichen
Bedingungen gehaltenen unbestrahlten Kontrollen. Diese Studie verdeutlicht, dass andere Faktoren
und nicht die hippocampale Neurogenese für die durch Enriched Environment hervorgerufenen
Verhaltensänderungen verantwortlich sein müssen. Sie schließt jedoch einen Zusammenhang
zwischen hippocampaler Neurogenese und anderen Lern- bzw. Verhaltensformen nicht aus.
Andererseits wäre auch denkbar, dass die hippocampale Neurogenese unter physiologischen und
pathophysiologischen Bedingungen unterschiedliche Funktionen hat.
Die Interpretation der derzeitig existierenden Daten zu diesem Thema bleibt also hochgradig
spekulativ, ein Zusammenhang zwischen hippocampaler Neurogenese und Hippocampus-abhängigen
Verhaltensweisen konnte bisher nicht schlüssig nachgewiesen werden. Dies erfordert weitere
Untersuchungen, die ganz gezielt die hippocampale Neurogenese modulieren und deren Einfluss auf
die kognitive Leistung untersuchen. Denkbar wäre, dass systematische longitudinale Analysen zu
einem besseren Verständnis führen, da für die Übernahme einer bestimmten Funktion durch neue
Neurone vermutlich sensible Zeitfenster existieren [128]. Deren Existenz würde auch die zum Teil sehr
unterschiedlichen Resultate der bisherigen Studien erklären. Für die Fortführung der vorliegenden
Arbeit böte sich durch Änderung des Zeitfensters zwischen SD und kognitivem Test eine Möglichkeit,
eventuell SD-bedingte Verhaltensänderungen zu detektieren. Auch die Verwendung anderer Tests
könnte sich als sinnvoll erweisen.
84
Zusammenfassung
ZUSAMMENFASSUNG
Die
erstmals
von
Leao
beschriebene
kortikale
Spreading
Depression
(SD)
ist
ein
elektrophysiologisches Phänomen, welches im Zusammenhang mit der Pathophysiologie der
Migräneaura und des Schlaganfalls diskutiert wird. Inwiefern die während einer fokalen zerebralen
Ischämie auftretenden SD-ähnlichen Periinfarktdepolarisationen (PID) kausal an den nachfolgend in
periläsionellen Hirngebieten beobachteten Ereignissen beteiligt sind, ist unklar. Man weiß, dass PID
im Tierexperiment zur sekundären Expansion des infarzierten Gewebes auf Kosten der Penumbra
beitragen. Darüberhinaus ist ungeklärt, ob und wie sie Struktur und Funktion des nicht-ischämischen
remote Kortex beeinflussen. Die vorliegende Studie befasste sich daher primär mit solchen Aspekten
von SD, die für das Verständnis der Pathophysiologie dieser Erkrankungen förderlich sein könnten.
Eine systematische Analyse der durch SD modifizierten Prozesse im normoxischen Gehirn kann
überdies Aufschluss darüber geben, welche molekularen Veränderungen für die Induktion einer
Ischämietoleranz durch SD verantwortlich sind, möglicherweise bieten sich hier neue Ansatzpunkte für
die Entwicklung neuroprotektiver Therapiekonzepte.
Ziel der vorliegenden Arbeit war es, einerseits die molekularen Konsequenzen von SD im Kortex der
ipsilateralen Hemisphäre aufzuklären, andererseits sollte der Einfluss kortikaler SD auf die
hippocampale Neurogenese und die Lern- und Gedächtnisleistung analysiert werden. Repetitive SD
wurden in Ratten in vivo durch 2-stündige epidurale Applikation von 3 M KCl induziert, Kontrolltieren
wurde equimolares NaCl appliziert.
Im ersten Teil der Arbeit konnte gezeigt werden, dass SD zu einer massiven differentiellen
Genexpression im ipsilateralen Kortex führen. Hauptsächlich waren etwa 12 funktionelle Kategorien
von Genen betroffen: Immediate Early Gene bzw. Transkriptionsfaktoren, Signaltransduktion,
Transport, Metabolismus, Stressreaktion, Kommunikation und synaptische Transmission, Zelladhäsion
und
Membran,
Wachstum
und
Differenzierung,
Zytoskelett,
extrazelluläre
Matrix,
Immunantwort/Inflammation und Zellzyklus. Die Expression dieser Gene folgte einem spezifischen
zeitlichen Muster, wobei die meisten Veränderungen innerhalb der ersten 24 Stunden, wenige jedoch
auch nach Tagen bis Wochen auftraten.
Das zweite Projekt beschäftigte sich mit dem Einfluss von SD auf die adulte hippocampale
Neurogenese. Hier wurde gezeigt, dass kortikale SD zu einer massiven Proliferation endogener
85
Zusammenfassung
Stamm- bzw. Vorläuferzellen im ipsilateralen Gyrus dentatus führen und gleichzeitig die neuronale
Differenzierung begünstigen. Zur Absicherung dieses Befundes wurden zwei Kontrollgruppen
eingeschlossen, in denen SD entweder pharmakologisch geblockt oder das hippocampale DCPotential
abgegriffen wurde(n).
Die Inhibition der
SD durch Verabreichung des
NMDA-
Rezeptorantagonisten MK-801 resultierte in einer Stagnation der hippocampalen Neurogenese auf
dem Level der Kontrolltiere. Außerdem gab es keine elektrophysiologischen Hinweise für das
Auftreten von SD im Hippocampus. Daraus konnte geschlussfolgert werden, dass die Beobachtungen
im Gyrus dentatus tatsächlich auf die kortikalen SD zurückzuführen sind. Die immunhistochemische
Analyse der Caspase-3 Aktivität zeigte, dass die gesteigerte Neurogenese im Gyrus dentatus nicht mit
einem erhöhten Absterben von Zellen durch klassische Apoptose einherging.
Die Applikation der hyperosmolaren Salzlösungen führte zur Entstehung kleiner kortikaler Läsionen.
Dabei zeigten nur die SD-Tiere eine gesteigerte Neurogenese im Vergleich mit unläsionierten
Kontrollratten. Diese Untersuchungen deuten darauf hin, dass die Größe einer kortikalen Läsion nicht
mit einer gesteigerten hippocampalen Neurogenese korreliert, im Gegenteil greifen kleine kortikale
Läsionen per se nicht modulatorisch in die Neurogenese im Gyrus dentatus ein.
Zur Untersuchung der langfristigen funktionellen Konsequenzen kortikaler SD wurden die Tiere in zwei
Varianten des Morris Water Maze getestet. In keinem dieser Tests führten SD zu einer relevanten
Verbesserung der Lern- oder Gedächtnisleistung.
Die vorliegende Studie zeigt erstmals, dass kortikale SD zu einer massiven und zum Teil langfristigen
Modifikation der ipsilateralen Genexpression und einer verstärkten Neurogenese im Gyrus dentatus
adulter
Ratten
führen.
Periinfarktdepolarisationen
Die
Ergebnisse
erheblich
zu
den
deuten
darauf
periläsionellen
hin,
dass
strukturellen
die
und
SD-ähnlichen
funktionellen
Veränderungen nach einem Schlaganfall beitragen können und dementsprechend den Prozess der
Funktionsrestitution und Plastizität maßgeblich beeinflussen können.
Referenzen
86
REFERENZEN
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I
Anhang
DATEN DER MICROARRAY-EXPRESSIONSANALYSE
Tabelle A Transkripte, die 3 h nach Spreading depression (SD) mindestens 2-fach differentiell exprimiert waren. Schattiert =
ähnliche Expression nach SD bereits aus Literatur bekannt; Fett = Änderung entspricht der im ipsilateralen remote Kortex
nach fokaler Ischämie; x = Regulation bekannt aus Literatur zu Änderungen in post-ischämischem Gewebe. Für Gene, die
aus früheren Studien im Zusammenhang mit SD oder Ischämie bekannt waren, sind die entsprechenden Referenzen
angegeben.
Gen
Public ID
Gensymbol
fos-like antigen 2
NM_012954
Transcribed locus
BF522317
chemokine ligand 2 / monocyte chemoattractant protein-1
carbonyl reductase 3 (predicted)
Fold change
Referenzen
3h
24h
7d
30d
FOSL2 / FRA2
48.5
-
-
-
---
36.8
-
-
-
NM_031530
CCL2 / MCP-1
32.0
6.5
-
-
BI282197
Cbr3
32.0
-
-
-
c-fos oncogene
BF415939
c-Fos
19.7
-
-2.0
1.6
[1, 4, 7-9]
NM_019137
EGR4 / NGFI-C
19.7
-
-
-
[10]
NM_012912
ATF3
16.0
-
-
-
[11]
D83508
EGR2 / KROX20
16.0
-
-
1.3
[10]
U03389
PTGS2 / Cox2
14.9
1.6
1.7
-
[12-14]
brain derived neurotrophic factor
X67108
BDNF
14.9
-
-
-
[4, 7, 29, 30]
homer homolog 1 (Drosophila), neuronal immediate early gene, 1
AF030088
Homer1
14.9
-2.1
-
-
MAP-kinase phosphatases / dual specificity phosphatase 5
NM_133578
CPG21 / Dusp5
13.0
-
-
-
---
AI228623
---
10.6
1.6
-
-
Jun-B oncogene
NM_021836
JunB
10.6
2.1
-
-
nucleoporin 98
NM_031074
NUP98
9.8
-
-
-
x
growth arrest and DNA-damage-inducible 45 gamma (predicted)
AI599423
Gadd45γ
9.8
-
-
-
[4]
x
NM_053819
TIMP1
9.2
4.3
8.0
-
[4, 26, 27]
NM_031628
NR4A3
9.2
-1.6
-
-
x
cAMP responsive element modulator
NM_017334
CREM
8.6
-
-
-
[4]
x
activity regulated cytoskeletal-associated protein
NM_019361
ARC
8.6
-1.6
-
1.9
[3]
procollagen, type IX, alpha 1 (predicted)
BM388861
Col9a1
8.0
-
-
-
dual specificity phosphatase 1 / protein tyrosine phosphatase, nonreceptor type 16
BE110108
Dusp1 / PTPN16
7.5
-
-
-
nuclear receptor subfamily 4, group A, member 1 / immediate early
gene transcription factor NGFI-B
NM_024388
NR4A1 / NGFI-B
7.5
-1.4
-1.6
1.7
[1, 3, 10]
BI288701
BTG2 / PC3
7.5
-
-
-
[3]
Cbp/p300-interacting transactivator, with Glu/Asp-rich carboxy-terminal
domain, 2
AI013390
CITED2
6.5
-
-
-
MAS1 oncogene
NM_012757
MAS1
6.1
-
-
-
Similar to 106 kDa O-GlcNAc transferase-interacting protein (predicted)
AI175534
---
6.1
-
-
-
Transcribed locus
AI178746
---
6.1
-
-
-
Thrombospondin 2 (predicted)
AI406660
TSP-2
5.7
-
-
-
U72345
NR4A2 / Nurr1
5.3
-
-
-
[10]
interferon-related developmental regulator 1
NM_019242
IFRD1 / PC4
4.9
-
-
-
[19]
growth arrest and DNA-damage-inducible 45 beta (predicted)
BI287978
Gadd45β
4.9
-
-
-
D83508
EGR2 / KROX20
4.9
-
-
-
Cbp/p300-interacting transactivator, with Glu/Asp-rich carboxy-terminal
domain, 2
AI013390
CITED2
4.6
1.4
-
-
x
AY043246
RGS2 / G0S8
4.6
-
-
-
[4]
x
nuclear factor, interleukin 3-regulated
NM_053727
NFIL3
4.6
-
-
-
[4]
x
v-jun sarcoma virus 17 oncogene homolog (avian)
BI288619
c-Jun
4.6
1.9
-
-
[1, 3, 9, 15]
Transcribed locus, weakly similar to NP_002639.1 proviral integration
site 1
AI598401
---
4.6
-
-
-
TCDD-inducible poly(ADP-ribose) polymerase (predicted)
AI179464
Tiparp
4.6
-
-
-
dual-specificity tyrosine-(Y)-phosphorylation regulated kinase 2
(predicted)
BM388710
Dyrk2
4.6
-
-
-
dual specificity phosphatase 1 / protein tyrosine phosphatase, nonreceptor type 16
BE110108
PTPN16 / Dusp1
4.3
-
-1.3
-
tribbles homolog 1 (Drosophila)
BM387324
Trib1
4.3
1.4
-
-
synaptotagmin 4
L38247
SYT4
4.3
2.5
-
-
protocadherin 8
NM_022868
PCDH8
4.0
-
-
-
Hochregulierte mRNAs
x
x
x
x
x
x
x
x
x
[1, 3]
[1, 4, 6]
[1, 19]
[9, 15]
[10]
[24]
II
Anhang
x
[1, 4]
metallothionein
AF411318
MT1A
4.0
-
-
-
Similar to hypothetical protein FLJ13448
AI228596
---
4.0
-
-
-
Transcribed locus, moderately similar to XP_546599.1 PREDICTED:
similar to KIAA0346 [Canis familiaris]
BF396191
---
4.0
-
-
-
AI602811
Dusp6
4.0
-
-
-
intercellular adhesion molecule 1
NM_012967
ICAM1
4.0
-
-
-
NM_013134
HMGCR
4.0
1.6
-
-
myeloid differentiation primary response gene 116
BI284349
MYD116
3.7
1.3
-
-
unknown protein
BE118080
---
3.7
-
-
-
Similar to Ext1
BM384468
---
3.7
-
-
-
AI231350
DUSP6 / MKP3
3.7
-
-
-
NM_053883
DUSP6 / MKP3
3.7
-
-
-
AY043246
RGS2
3.7
-
-
-
tumor necrosis factor induced protein 6
AF159103
TNFIP6
3.5
-
-
-
Phosphofructokinase, liver, B-type
AI408151
Pfkl
3.5
-
-
-
BM386741
HSC40 / DNAJB5
3.5
-
-
-
Transcribed locus, weakly similar to XP_341951.1 PREDICTED: Protein
tyrosine phosphatase, receptor type, epsilon polypeptide [Rattus
norvegicus]
AI031032
---
3.5
-
-1.3
-
BI296482
REM2
3.5
-
-
-
Transcribed locus
AI409904
---
3.5
-
-
-
activity and neurotransmitter-induced early gene protein 4 (ania-4)
NM_021584
ANIA4
3.5
1.5
-
1.3
zinc finger protein 36
AB025017
ZFP36 / TTP
3.5
1.7
-
-
x
immediate early response 3
AI176519
LER3
3.5
1.7
-
-
[4]
x
secretogranin 2
NM_022669
SgII / CgC
3.2
-
-
-
[3, 25]
x
early growth response 1 (NGFI-A)
NM_012551
EGR1 / KROX24
3.2
-1.3
-1.6
-
[1, 3, 10, 15]
Transcribed locus
AI172302
---
3.2
-
-
-
sprouty homolog 2 (Drosophila) (predicted)
BM390457
Spry2
3.2
-
-
-
Transcribed locus
BE101108
---
3.2
-
-
-
BI288701
BTG2 / PC3
3.2
-
-
-
tumor-associated protein 1
NM_017353
TA1 / Slc7a5
3.2
1.7
-
-
x
x
[4]
[4]
[3]
jumonji domain containing 3 (predicted)
BE118720
Jmjd3
3.2
-
-
-
x
cysteine rich protein 61
NM_031327
CYR61
3.0
-
-
-
[4, 11]
x
VGF nerve growth factor inducible
NM_030997
VGF
3.0
1.6
-
-
[3]
regulator of G-protein signaling 4
U27767
RGS4
3.0
-
-1.5
-
[3]
SNF1-like kinase
AB020480
SNF1LK
3.0
-
-
-
RING finger protein LIRF
NM_134374
LIRF / Rnf39
3.0
-
1.3
-
vesicle-associated membrane protein 1
M24104
VAMP1
3.0
-
-
-
M55292
NTRK2 / TRKB
3.0
-
-
-2.0
musculoskeletal, embryonic nuclear protein 1
AW251450
MUSTANG /
Mustn1
3.0
1.5
-
-
Ras homolog gene family, member E
AI103572
Arhe
3.0
1.4
-
-
Transcribed locus
AI145359
---
3.0
-
-
-
Transcribed locus
BF389682
---
3.0
3.5
-
-
Transcribed locus
AW525765
---
3.0
-
-
1.3
Transcribed locus, strongly similar to NP_084275.3 limb-bud and heart
[Mus musculus]
AA800701
---
3.0
-
-
-
Similar to Ab2-095 (predicted)
AI407536
---
3.0
-
-
-
v-jun sarcoma virus 17 oncogene homolog (avian)
BI288619
c-Jun
3.0
1.7
-
-
Transcribed locus
AW531735
---
3.0
-
-
-
NM_053539
IDI1
2.8
-
-
-
four and a half LIM domains 2
NM_031677
FHL2
2.8
-
-
-
Jun dimerization protein 2
NM_053894
JUNDP2
2.8
-
-
-
small inducible cytokine A4 / lymphocyte-activation gene 1
U06434
CCL4 / MIP-1β
2.8
-
-
-
solute carrier family 25 (mitochondrial carrier, phosphate carrier),
member 25
AI177358
Slc25a25
2.8
-1.4
-
-
Activity and neurotransmitter-induced early gene 2 (ania-2) mRNA,
3'UTR
AI013468
ANIA2
2.8
-
-
-
potassium channel, subfamily V, member 1
BF391696
KCNV1
2.8
-1.5
-1.2
-
Transcribed locus
BF283381
---
2.8
1.7
-
-
cyclin L
NM_053662
CCNL
2.6
-
-
-
v-maf musculoaponeurotic fibrosarcoma (avian) oncogene family,
protein G
AB050011
MAFG
2.6
1.9
-
-
chemokine ligand 3, macrophage inflammatory protein 1-α
U22414
CCL3 / MIP-1α
2.6
-
-
-
x
x
x
x
[30]
[1, 3, 9, 15]
[4]
[1]
[1, 3, 4]
III
Anhang
x
x
x
x
x
x
x
x
emerin
NM_012948
EMD
2.6
-
-
-
AF372216
TPM1
2.6
1.7
-
-
calcium channel, voltage-dependent, N type, alpha 1B subunit
AF389419
CACNA1B
2.6
1.6
-
-
similar to hypothetical protein MGC6835
BM390487
---
2.6
-
-
-
similar to mKIAA1107 protein (predicted)
BI300727
---
2.6
-1.5
-1.2
-
---
BE105699
---
2.6
-
-
-
Transcribed sequence with moderate similarity to protein sp:P00722 (E.
coli) BGAL_ECOLI Beta-galactosidase
BE098803
---
2.6
-
-
-
Transcribed locus
AI111965
---
2.6
-
-
-
FERM-domain-containing protein 163SCII
AA892299
---
2.6
-1.4
-
-
Similar to pellino protein
AI712911
---
2.6
-
-
-
Kruppel-like factor 5
NM_053394
KLF5
2.5
-
-
-
Janus kinase 2
NM_031514
JAK2
2.5
1.6
-
-
adenylate cyclase activating polypeptide 1
NM_016989
ADCYAP1
2.5
-
-1.6
-
BMP/retinoic acid-inducible neural-specific protein
NM_080482
Dbccr1
2.5
1.3
-
-
corticotropin releasing hormone binding protein
NM_139183
CRHBP
2.5
1.4
-
-
voltage-dependent calcium channel gamma-3 subunit
AF361340
CACNG3
2.5
-
-
-
glutamate decarboxylase 1
M38350
GAD1
2.5
-
-
-
AJ002556
MAP6
2.5
-
-
-
cholecystokinin B receptor
X79208
CCKBR
2.5
-
-
-
BI285863
Stat3
2.5
2.5
-
-
Similar to KIAA1010 protein (LOC309362), mRNA
BI296334
---
2.5
-
-
-
similar to SETA binding protein 1; SB1 (predicted)
BM389664
---
2.5
-
-
-
neural precursor cell expressed, developmentally down-regulated gene
9 (predicted)
BM392374
Nedd9
2.5
-
-
-
period homolog 1 (Drosophila)
BI279017
PER1
2.5
-
-
-
Kinesin family member 1B
BE109334
Kif1b
2.5
-
-
-
tissue factor pathway inhibitor 2
AI179507
TFPI2
2.5
-
-
-
calcium/calmodulin-dependent protein kinase I gamma
AW251224
CAMK1G
2.5
-
-
-
BM384926
HSPF1
2.5
-
-
-
sterol-C5-desaturase (fungal ERG3, delta-5-desaturase) homolog (S.
cerevisae)
AB052846
SC5D
2.5
1.3
-
-
similar to Antxr2 protein
AI013888
---
2.5
2.5
-
-
Fc receptor, IgG, low affinity III
NM_053843
FcγR3
2.5
-
-
-
serine threonine kinase pim3
NM_022602
PIM3
2.3
-
-
-
insulin induced gene 1
NM_022392
INSIG1
2.3
-
-
-
polo-like kinase 2 (Drosophila)
NM_031821
Plk2
2.3
-
-
-
X74211
MAP2
2.3
1.7
-
-
chondroitin sulfate proteoglycan 5
AF292102
CSPG5
2.3
1.6
1.9
-
NM_019131
TPM1
2.3
-
-
-
diphtheria toxin receptor
NM_012945
DTR
2.3
-
-
-
cholecystokinin B receptor
M99418
CCKBR
2.3
-
-
-
cAMP responsive element modulator
NM_017334
CREM
2.3
-
-
-
syntaxin binding protein 1
U06069
STXBP1
2.3
1.4
-
-
AF370889
TPM1
2.3
1.9
-
-
SERTA domain containing 1
AA945069
Sertad1
2.3
1.6
-
-
Suppressor of cytokine signaling 2
BM384088
Socs2
2.3
-
-
-
similar to Mitogen-inducible gene 6 protein homolog (Mig-6) (Gene 33
polypeptide) (predicted)
AI169756
---
2.3
-
-
-
Transcribed locus
AI599365
---
2.3
-
-
-
BM390399
HMGCR
2.3
-
-
-
Similar to RIKEN cDNA 2310057H16 (predicted)
BI274903
---
2.3
1.9
-
-
Transcribed locus
AI176941
---
2.3
-
-
-
stanniocalcin 1
BM386683
Stc1
2.3
-
-
-
ribosome associated membrane protein 4
AI103695
RAMP4
2.3
1.5
-
-
immediate early response 5
BF285187
IER5
2.3
-
-
-
similar to RIKEN cDNA 1810057C19
BM391248
---
2.3
1.4
-
-
Transcribed locus
AI639181
---
2.3
-
-
-
natriuretic peptide precursor type A
NM_012612
NPPA / ANP
2.1
-
-
-
CAP, adenylate cyclase-associated protein 1 (yeast)
BG380723
CAP1
2.1
1.5
-
-
aquaporin 4
NM_012825
AQP4
2.1
-
-
-1.4
basic helix-loop-helix domain containing, class B2
NM_053328
BHLHB2
2.1
1.6
-
-
NM_022685
REM2
2.1
-
-
-
[1]
[1, 3]
[31]
[4]
[1]
[4]
[4]
[6, 28]
[16, 17]
IV
Anhang
x
adrenergic receptor, beta 1
NM_012701
ADRB1
2.1
-
-
-
fibroblast growth factor 12
AW252096
FGF12
2.1
-
-
-
protein kinase, cAMP dependent, catalytic, beta (predicted)
D10770
Prkacb
2.1
1.4
-
-
BI275741
EMP1
2.1
3.2
-
-
spermidine/spermine N1-acetyl transferase
AA893220
SAT
2.1
-
1.4
-
---
AA800031
FHL2
2.1
-
-
-
---
AI412018
---
2.1
-
-
-
actin related protein 2/3 complex, subunit 4 (predicted)
AI411582
Arpc4
2.1
-1.5
-
-
acidic (leucine-rich) nuclear phosphoprotein 32 family, member E
(predicted)
AI008642
Anp32e
2.1
-
-
-
PHD finger protein 13 (predicted)
AI102512
-
-
-
BI295862
Phf13
Sertad2
2.1
SERTA domain containing 2
2.1
-
-
-
Activity and neurotransmitter-induced early gene 11 (ania-11) mRNA, 3'
UTR / Zinc finger protein RIN ZF
BI289112
ANIA-11 / Rinzf
2.1
-
-
-
similar to RIKEN cDNA 1110056N09 (predicted)
AI233751
---
2.1
-
-
1.3
dual specificity phosphatase 2 (predicted)
AI408580
Dusp2
2.1
-
-
-
Transcribed locus
BI291457
---
2.1
-
-
-
AA875132
TPM1
2.1
-
-
-
proprotein convertase subtilisin/kexin type 1
M83745
PCSK2
2.1
-
-
-
syntaxin 1a (brain)
NM_053788
STX1A
2.1
-
-
-
Transcribed locus
AI112988
---
2.1
-
-
-
abhydrolase domain containing 2 (predicted)
AI013474
Abhd2
2.1
-
-
-
B-cell translocation gene 1, anti-proliferative -cell translocation gene 1
NM_017258
BTG1
2.0
-
-
-
prostaglandin E synthase
AF280967
PTGES
2.0
-
-
-
fos-like antigen 1
NM_012953
FOSL1 / FRA1
2.0
-
-
-
G protein-coupled receptor kinase 6
NM_031657
GPRK6
2.0
-
-
-1.6
ATPase, Na+/K+ transporting, alpha 3 polypeptide
NM_012506
ATP1a3
2.0
-
-
-
protein phosphatase 2C, magnesium-dependent, catalytic subunit
NM_019372
PDP1
2.0
-
-
-
gamma-aminobutyric acid (GABA) B receptor, 1
Y10369
GABBR1
2.0
1.7
-
-
DNA topoisomerase (DNA) I
NM_022615
TOP1
2.0
-
-
-
U45946
ATP1b2
2.0
-
-
-2.0
septin 3
NM_019375
Sept3
2.0
-
-
-
RASD family, member 2
BF404624
RASD2
2.0
-
-
-
translocase of outer mitochondrial membrane 20 homolog (yeast)
D63411
Tomm20
2.0
1.4
-
-
CaM-kinase II inhibitor alpha
AA858621
---
2.0
1.9
-1.3
-
protein kinase, cAMP-dependent, regulatory, type 2, alpha
AW919085
PRKAR2A
2.0
-
-
-
ATPase, Na+K+ transporting, alpha 1
M74494
ATP1a1
2.0
-
-1.5
-1.2
nitric oxide synthase 3, endothelial cell
AJ011116
NOS3 / eNOS
2.0
2.5
-
-
Transcribed locus
BI296577
---
2.0
-
-
-
ubiquitin-activating enzyme E1-domain containing 1 (predicted)
AI408025
Ube1dc1
2.0
1.5
1.3
-
v-maf musculoaponeurotic fibrosarcoma oncogene family, protein K
(avian)
BI284461
Mafk
2.0
-
-
-
Uridine phosphorylase 1 (predicted)
BI292558
---
2.0
2.1
-
-
---
AI176579
---
2.0
-1.3
-
-
dual specificity phosphatase 14 (predicted) /// similar to Dual specificity
phosphatase 14
AI236997
Dusp14
2.0
-
-
-
Similar to TBP-associated factor 172 (TAF-172) (TAF(II)170)
BG374179
---
2.0
-
-
-
similar to mKIAA1002 protein (predicted)
BI291270
---
2.0
-
-
-1.5
peroxisomal biogenesis factor 13 (predicted)
AI012951
Pex13
2.0
-
-
-
similar to 6030410K14Rik protein
BF288461
---
2.0
-
-
-
potassium voltage-gated channel, subfamily F, member 1
BI282169
KCNF1
2.0
-
-
-
Transcribed locus
BG376458
---
2.0
-
-
-
vestigial like 4 (Drosophila) (predicted)
BI289645
Vgll4
2.0
-
-
-
numb gene homolog (Drosophila)
BI287975
NUMB
2.0
-1.3
-
-
destrin (predicted)
AI170442
Dstn
2.0
1.5
-
-
---
AI103155
---
2.0
-
-
-
similar to hypothetical protein 9630025C22
AW528861
---
2.0
-
-
-
zinc finger protein 189 (predicted)
AI407872
Zfp189
2.0
-
-
-
transformed mouse 3T3 cell double minute 2 (predicted)
BI296301
Mdm2
2.0
2.0
-
-
N-arginine dibasic convertase 1
NM_012993
NRD1
2.0
-
-
-
interleukin 1 receptor accessory protein
NM_012968
IL1RAP
2.0
-
-
-
NM_134351
MAT2A
2.0
2.1
-
-
interferon induced transmembrane protein 3
BI285494
IFITM3L
2.0
2.1
1.4
-
[1]
V
Anhang
Transcribed locus
BG381046
---
2.0
-
-
-
BI290053
IDI1
2.0
-
-
-
Sprouty-related, EVH1 domain containing 2 (predicted)
AI409218
---
2.0
-
-
-
Transcribed locus
AA943808
---
2.0
-
-1.2
-
similar to RIKEN cDNA 1810008K03 (predicted)
AI170665
---
2.0
-
-
-
elongation factor RNA polymerase II 2 (predicted)
BI291626
Ell2
2.0
-
-
-
Transcribed locus
BI289584
---
2.0
-
-
-
similar to hypothetical protein AL133206 (predicted)
BE097445
---
2.0
-
-
-
Branched chain aminotransferase 1, cytosolic
BF393120
Bcat1
2.0
-
-
-
general transcription factor IIH, polypeptide 3 (predicted)
BM385649
Gtf2h3
-13.9
-
-
-
Similar to cDNA sequence BC018601
AI013005
---
-8.6
-
-
-
G protein-coupled receptor 149
AY030276
Gpr149
-3.7
-
-
-
similar to hypothetical protein
BF403886
---
-3.7
-
-
-
Transcribed locus
AI010668
---
-3.5
-1.4
-
-
---
BF401709
---
-3.2
-1.7
-
-
Transcribed locus
AA963909
---
-3.0
-
-
-
---
BF409816
---
-2.8
-
-
-
Transcribed locus
AI639109
---
-2.6
-
-
-
Similar to hypothetical protein (predicted)
BM385377
---
-2.5
-
-
-
Transcribed locus
BG670778
---
-2.5
-
-
-
Transcribed locus
BI296683
---
-2.5
-
-
-
Transcribed locus
AA893807
---
-2.3
-1.3
-
-
similar to RIKEN cDNA 4933433P14 gene (predicted)
BI285251
---
-2.3
-
-
-
Transcribed locus
AI231787
---
-2.3
-
-
-
Transcribed locus
BE101126
---
-2.3
-
-
-
Bromodomain containing 4 (predicted)
BF287135
---
-2.1
-
-
-
hypothetical LOC287199 (predicted)
AI010173
---
-2.1
-
-
-
Transcribed locus, weakly similar to XP_488528.1 hypothetical protein
XP_488528 [Mus musculus]
AI411577
---
-2.1
-
-
-
zinc finger protein 297B (predicted)
AI013512
Zfp297b
-2.1
-
-
-
Transcribed locus
AI101164
---
-2.1
-1.2
-
-
non-catalytic region of tyrosine kinase adaptor protein 1 (predicted)
BM386507
Nck1
-2.1
-
-
-
Transcribed locus
AA996836
---
-2.1
-
-
-
---
BI296626
---
-2.1
-
-
-
Wiskott-Aldrich syndrome-like (human)
BG375480
Wasl
-2.1
-
-
-
Transcribed locus
AW533838
---
-2.1
-
-
-
similar to cysteine and tyrosine-rich protein 1
AA818900
---
-2.1
-
-
-
similar to WD repeat membrane protein (predicted)
AI412437
---
-2.1
-
-
-
---
BF398716
---
-2.1
-
-
-
carnitine O-octanoyltransferase
J02844
CROT
-2.0
-1.4
-
-
ankyrin repeat and SOCS box-containing protein 2 (predicted)
BI295982
Asb2
-2.0
-
-
-
selenophosphate synthetase 2 (predicted)
AA799700
Sephs2
-2.0
-
-
-
Calpain 7 (predicted)
AI169441
---
-2.0
-1.4
-
-
serine/threonine kinase 17b (apoptosis-inducing)
AI012590
STK17B / DRAK2
-2.0
-
-
-
Similar to hypothetical protein MGC5391
AI412606
---
-2.0
-
-
-
similar to open reading frame 5 (predicted)
BI295567
---
-2.0
-
-1.3
-
Transcribed locus
AI411374
---
-2.0
-
-
-
Transcribed locus
BI303362
---
-2.0
-
-
-
Transcribed locus
BI295240
---
-2.0
-
-
-
---
BE097945
---
-2.0
-1.7
1.3
-
---
AA891161
---
-2.0
-1.4
-
-
solute carrier organic anion transporter family, member 1a4
U95011
SLC21A5
-2.0
-1.2
-
-
neurogenic differentiation 1
NM_019218
NeuroD1
-2.0
-
-
-
TBC1 domain family, member 14 (predicted)
AI412244
Tbc1d14
-2.0
-
-
-
Transcribed locus
BE109616
---
-2.0
-
-
1.5
Transcribed locus, moderately similar to NP_444348.1 G proteincoupled receptor, family C, group 5, member D [Mus musculus]
BM382847
---
-2.0
-1.3
-
-
biregional cell adhesion molecule-related/down-regulated by oncogenes
(Cdon) binding protein (predicted)
BE110539
Boc
-2.0
-1.3
-
-
Transcribed locus
BE109900
---
-2.0
-
-
-
Similar to hypothetical protein FLJ10706
BM385951
---
-2.0
-
-
-
---
AI639178
---
-2.0
-
-
-
Herabregulierte mRNAs
VI
Anhang
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
22.
23.
24.
Transcribed locus
BE107465
---
-2.0
-
-
-
Similar to SR rich protein (predicted)
BI292166
---
-2.0
-1.6
-
-
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Wiggins, A.K., Shen, P.J., Gundlach, A.L., Atrial natriuretic peptide expression is increased in rat cerebral cortex following spreading
depression: possible contribution to sd-induced neuroprotection. Neuroscience, 2003. 118(3): p. 715-26.
Aoki, K., Uchihara, T., Tsuchiya, K., Nakamura, A., Ikeda, K., Wakayama, Y., Enhanced expression of aquaporin 4 in human brain with
infarction. Acta Neuropathol (Berl), 2003. 106(2): p. 121-4.
Taniguchi, M., Yamashita, T., Kumura, E., Tamatani, M., Kobayashi, A., Yokawa, T., Maruno, M., Kato, A., Ohnishi, T., Kohmura, E.,
Tohyama, M., Yoshimine, T., Induction of aquaporin-4 water channel mRNA after focal cerebral ischemia in rat. Brain Res Mol Brain
Res, 2000. 78(1-2): p. 131-7.
VII
Anhang
Tabelle B Transkripte, die 24 h nach Spreading depression (SD) mindestens 2-fach differentiell exprimiert waren. Schattiert
= ähnliche Expression nach SD bereits aus Literatur bekannt; Fett = Änderung entspricht der im ipsilateralen remote Kortex
nach fokaler Ischämie; x = Regulation bekannt aus Literatur zu Änderungen in post-ischämischem Gewebe. Für Gene, die
aus früheren Studien im Zusammenhang mit SD oder Ischämie bekannt waren, sind die entsprechenden Referenzen
angegeben.
Gen
Public ID
Gensymbol
NM_031970
HSPB1 / hsp27
Fold change
3h
24h
7d
30d
1.7
7.5
-
-
Referenzen
x
heat shock 27kDa protein 1
[1-5]
H19 fetal liver mRNA
BF284168
H19
-
4.6
-
-
NM_053819
TIMP1
9.2
4.3
8.0
-
NM_031832
LGALS3
-
4.3
2.0
-
x
CD44 antigen
NM_012924
CD44
-
4.0
-
-
[1, 3]
x
CD44 antigen
BI302830
CD44
-
4.0
-
-
[1, 3]
tumor necrosis factor receptor superfamily, member 12a
BI303379
TNFRSF12A
1.9
3.5
-
-
Transcribed locus
BF389682
---
3.0
3.5
-
-
CD44 antigen
AF065147
CD44
-
3.5
1.5
-
BI275741
EMP1
2.1
3.2
-
-
x
x
x
x
x
x
x
x
actin, beta
NM_031144
ACTB
1.5
3.2
-
-
similar to RIKEN cDNA D130074J02 gene (predicted)
BI276946
---
1.5
3.0
-
-
growth arrest and DNA-damage-inducible 45 alpha
NM_024127
GADD45α
1.3
2.8
-
-
Similar to small proline-rich protein gene
BI286387
SPRR1
1.5
2.8
3.0
-
Transcribed locus
BG378095
---
1.4
2.8
-
-
---
AI705744
---
1.5
2.8
-
-
glycoprotein 38
NM_019358
GP38
-
2.6
1.6
-
BI285863
STAT3
2.5
2.5
-
-
synaptotagmin 4
L38247
SYT4
4.3
2.5
-
-
similar to Antxr2 protein
AI013888
---
2.5
2.5
-
-
Similar to RECS1
BI292351
---
-
2.3
-
-
Transcribed locus
BI282755
---
-
2.3
-
-
reversion induced LIM gene
NM_017062
RIL
-
2.3
1.5
-
calponin 3, acidic
BI274457
CNN3
-
2.3
1.3
-
similar to chromosome 14 open reading frame 35
BI298587
---
1.4
2.3
-
-
actin, beta
NM_031144
ACTB
1.3
2.3
-
-
heterogeneous nuclear ribonucleoprotein U-like 1 (predicted)
BG381219
HNRPUL1
1.2
2.3
-
-
NM_019384
---
1.9
2.1
-
-2.1
solute carrier family 10, member 2
NM_017222
SLC10A2
-
2.1
-
-
claudin 11
NM_053457
CLDN11
1.4
2.1
-
-1.6
hyaluronan and proteoglycan link protein 2 / brain link protein 1
AI145465
BRAL1
1.2
2.1
-1.1
-
calcium/calmodulin-dependent protein kinase II, delta
X77194
CAMK2D
1.3
2.1
-
-
eukaryotic translation initiation factor 4A, isoform 1
BI284436
EIF4A1
1.5
2.1
-
-
Death associated transcription factor 1 (predicted)
BI275251
---
-
2.1
-
-
protein phosphatase 1, regulatory (inhibitor) subunit 2
BF288097
PPP1R2
1.5
2.1
-
-
S100 calcium binding protein A10 (calpactin)
NM_031114
S100A10
-
2.1
-
-
NM_134351
MAT2A
2.0
2.1
-
-
Jun-B oncogene
NM_021836
JunB
10.6
2.1
-
-
interferon induced transmembrane protein 3
BI285494
IFITM3L
2.0
2.1
1.4
-
Filamin C, gamma (actin binding protein 280) (predicted)
AI103600
---
-
2.1
-
-
NM_021989
TIMP2
1.3
2.0
1.4
-
heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K
NM_057141
HNRPK
-
2.0
-
-
Serine protease inhibitor
NM_031531
SPIN2C
-
2.0
-
-
calcium-independent alpha-latrotoxin receptor homolog 3
AF081159
CIRL3
-
2.0
-
-
heme oxygenase 1
NM_012580
HMOX1 / hsp32
1.2
2.0
-
-
BM391471
ATF5
-
2.0
-
-
[1]
[1, 3]
[1, 3]
[6]
[1]
[1]
[3]
[3, 5, 7, 8]
VIII
Anhang
SWI/SNF related, matrix associated, actin dependent regulator of
chromatin, subfamily a, member 4
BE111847
SMARCA4
-
2.0
2.1
-1.4
transformed mouse 3T3 cell double minute 2 (predicted)
BI296301
MDM2
2.0
2.0
-
-
protein phosphatase 1, regulatory (inhibitor) subunit 2
AW919998
PPP1R2
-
2.0
-
-
H3 histone, family 3B
AI177503
H3F3B
1.4
2.0
-
-
damage-specific DNA binding protein 1
AJ277077
DDB1
-
2.0
-
-
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
camello-like 3
AF187814
CML3
-
-3.0
-1.6
-
transthyretin
NM_012681
TTR
1.6
-2.5
1.4
5.3
---
BI287300
HBB
-
-2.5
-
-
albumin
NM_134326
ALB
-1.9
-2.3
-
-
carbonic anhydrase 3
NM_019292
CA3
-
-2.3
-
-
homer, neuronal immediate early gene, 1
AF030088
Homer1
14.9
-2.1
-
-
Transcribed locus
AA818819
---
-1.4
-2.1
-
-
glutaminase 2 (liver, mitochondrial)
J05499
GA
-
-2.0
-1.3
-
similar to RIKEN cDNA 9230117N10 (predicted)
AI716248
---
-
-2.0
-
-
Similar to hypothetical protein B230399E16
BE113272
---
-
-2.0
-
-
sideroflexin 5
AI575254
SFXN5
-
-2.0
-
-
camello-like 5
AI717047
CML5
-
-2.0
-
-
Tang, Y., et al., Genomic responses of the brain to ischemic stroke, intracerebral haemorrhage, kainate seizures, hypoglycemia, and
hypoxia. Eur J Neurosci, 2002. 15(12): p. 1937-52.
Plumier, J.C., et al., Cortical application of potassium chloride induces the low-molecular weight heat shock protein (Hsp27) in
astrocytes. J Cereb Blood Flow Metab, 1997. 17(7): p. 781-90.
Lu, A., et al., Genomics of the periinfarction cortex after focal cerebral ischemia. J Cereb Blood Flow Metab, 2003. 23(7): p. 786-810.
Plumier, J.C., et al., Differential expression of c-fos, Hsp70 and Hsp27 after photothrombotic injury in the rat brain. Brain Res Mol Brain
Res, 1997. 45(2): p. 239-46.
Lu, X.C., et al., Microarray analysis of acute and delayed gene expression profile in rats after focal ischemic brain injury and
reperfusion. J Neurosci Res, 2004. 77(6): p. 843-57.
Yokota, N., et al., Identification of differentially expressed genes in rat hippocampus after transient global cerebral ischemia using
subtractive cDNA cloning based on polymerase chain reaction. Stroke, 2001. 32(1): p. 168-74.
Koistinaho, J., et al., Spreading depression-induced gene expression is regulated by plasma glucose. Stroke, 1999. 30(1): p. 114-9.
Nimura, T., et al., Heme oxygenase-1 (HO-1) protein induction in rat brain following focal ischemia. Brain Res Mol Brain Res, 1996.
37(1-2): p. 201-8.
IX
Anhang
Tabelle C Transkripte, die 7 Tage nach Spreading depression (SD) mindestens 2-fach differentiell exprimiert
waren.
Gen
Public ID
Gensymbol
Fold change
3h
24h
7d
30d
NM_053819
TIMP1
9.2
4.3
8.0
-
similar to Cornifin alpha (small proline-rich protein gene)
BI286387
SPRR1
1.5
2.8
3.0
-
inositol polyphosphate-4-phosphatase, type II
U96920
INPP4B
-
-
2.3
-
protease, serine, 23
AI177099
Prss23
-
-
2.1
-
SWI/SNF related, matrix associated, actin dependent regulator of
chromatin, subfamily a, member 4
CD74 antigen (invariant polpypeptide of major histocompatibility class
II antigen-associated)
glycoprotein (transmembrane) NMB
BE111847
SMARCA4
-
2.0
2.1
-
NM_013069
CD74
-
-
2.0
-
NM_133298
GPNMB
-
1.9
2.0
-
Transcribed locus
AI413058
---
-
-
2.0
-
NM_031832
LGALS3
-
4.3
2.0
-
Transcribed locus
AI179665
---
-
-
2.0
-
cerebellin 2 precursor protein (predicted)
AA817812
Cbln2
1.5
-
-2.1
-
FBJ murine osteosarcoma viral oncogene homolog / c-fos oncogene
BF415939
c-Fos
19.7
-
-2.0
-
RAS, dexamethasone-induced 1
AF239157
RASD1 /
DEXRAS1
-
-1.9
-2.0
-
Tabelle D Transkripte, die 30 Tage nach Spreading depression (SD) mindestens 2-fach differentiell exprimiert
waren.
Gen
Public ID
Gensymbol
Transthyretin
NM_012681
similar to KIAA1731 protein (predicted)
BM386844
frizzled-related protein (predicted)
Fold change
3h
24h
7d
30d
TTR
1.6
-2.5
1.4
5.3
---
-
-
-
3.5
BM391538
---
-
-
-
2.1
CEA-related cell adhesion molecule 9
NM_053919
CEACAM9
-
-
-
2.0
germinal histone H4 gene
BM986536
---
-
-
-
2.0
BF396481
---
-
-
-
-3.7
Transcribed locus, weakly similar to XP_129042.4 similar to ring
finger protein 111; Arkadia [Mus musculus]
NM_019384
---
1.9
2.1
-
-2.1
Phosphoribosyl pyrophosphate synthetase 2
NM_012634
PRPS2
-
-
-
-2.0
U45946
ATP1B2
2.0
-
-
-2.0
Neurotrophic tyrosine kinase, receptor, type 2
M55292
NTRK2 / TRKB
3.0
-
-
-2.0
X
Anhang
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
BrdU
- Bromodeoxyuridin
DC
- „direct current“ (Gleichstrom; im übertragenen Sinne: Gleichspannung)
DC-Potential
- langsames Summenpotential
DCX
- Doublecortin
HL
- Hinterpfotenkortex
IEG
- Immediate Early Gene
IR
- Immunreaktivität
MA
- Microarray
MCAO
- Okklusion der Arteria cerebri media
MW
- Mittelwert
NeuN
- neuronales nukleäres Antigen
NMDA
- N-Methyl-D-Aspartat
Par1
- primärer somatosensorischer Kortex
PID
- Periinfarktdepolarisationen
PT
- Photothrombose
qRT-PCR
- quantitative Reverse Transkription-Polymerasekettenreaktion
RT
- Raumtemperatur
SD
- Spreading Depression
SEM
- Standardfehler (standard error of mean)
TF
- Transkriptionsfaktoren
XI
Anhang
PUFFER UND CHEMIKALIEN
Injektionen, Perfusion und histologische Färbungen
Anti-freeze-Solution
Phosphatpuffer Stocklösung
Stock I (Base)
Stock II (Säure)_______________
42.588 g Na2HPO4 (MERCK)
13.799 g NaH2PO4 · H2O (MERCK)
3000 ml H2Odest
1000 ml H2Odest
Phosphatpuffer
700 ml H2Odest.
17.5 ml Stock II
mit 26-30 ml Stock I pH auf 7.4 einstellen
mit H2Odest auf 1 l auffüllen
150 g
Glukose (Roth)
300 ml
Ethylenglykol (Fluka)
500 ml
Phosphatpuffer pH 7.4
200 mg
Natriumazid (Merck)
0.1 M Borsäure
6.184 g Borsäure (Roth)
1 l H2Odest
BrdU (Sigma) in 0.9% NaCl (Fresenius)
DAB
Stock: DAB (Sigma) 50 mg/ml in H2Odest
200 ml TBS/0.2% Triton
2 ml 50 mg/ml DAB
60 µl 30% H2O2
Gelatine
1g Gelatine (Merck)
0.1 g Chrom(III)-Kaliumsulfat · 12 H2O (Merck)
200 ml H2Odest
10 min quellen lassen, langsam auf 40°C erwärmen, filtrieren
0.18% H2O2
0.6 ml 30 %-ige H2O2 (Roth)
XII
Anhang
100 ml H2Odest
Kresylviolett
300 ml H2Odest
1.6326 g Na-Acetat (Merck)
2.88 ml Eisessig (Roth)
100 mg Kresylviolett (Waldeck)
Mowiol
10 g Mowiol 4-88 (Calbiochem)
10 g Mowiol 40-88 (Aldrich)
200 ml PBS
100 ml Glyzerol (Roth)
300 mg DAPCO (Diazabicyclo-Octane; Sigma)
PBS
Phosphatpuffer Stocklösung
Stock I (Base)
Stock II (Säure)______________
42.588 g Na2HPO4 (Merck)
13.799 g NaH2PO4 · H2O (Merck)
238.435 g NaCl (Roth)
3000 ml H2Odest
1000 ml H2Odest
1400 ml H2Odest
35 ml Stock II
mit ca. 160 ml Stock I pH 7.4 einstellen
mit H2Odest. auf 2000 ml auffüllen
4% PFA
0.2 M Phosphatpuffer Stocklösung pH 7.4
Stock I (Base)
Stock II (Säure)___________
28.5 g Na2HPO4 · 2 H2O (Merck)
8.3 g NaH2PO4 · H2O (Merck)
800 ml H2Odest
300 ml H2Odest
mit (II) Komponente (I) auf pH 7.4 titrieren (ca. 200 ml)
40 g PFA (Riedel-De Häen)
300 ml H2Odest
6-8 Tropfen 10 M NaOH (Roth)
500 ml 0.2 M Phosphatpuffer
filtrieren
10% und 30% Saccharose
10 g bzw. 30 g Saccharose (Roth)
XIII
Anhang
100 ml PBS pH 7.4
10 x TBS
132.2 g TRIS-HCl
19.4 TRIS base
90 g NaCl
mit H2Odest auf 1l
TBS plus
0.2 % (Immunhistochemie) / 0.1 % (Immunfluoreszenz )Triton X-100 (Merck)
2 % Milchpulver (Roth)
2 % BSA (Fraction V; Sigma)
3 % Serum (entsprechend Sekundärantikörperspezies)
TBS
OP und Präparation
aCSF
aCSF stock
147 mg
CaCl2 · 2 H2O (Merck)
186.5 mg KCl (Merck)
183.0 mg MgCl2 · 6 H2O (Merck)
1.5118 g HEPES (Sigma)
86.2 mg NaH2PO4 (Merck)
in 470 ml H2Odest lösen, pH mit NaOH auf 7.4 einstellen, auf 490 ml auffüllen, sterilfiltrieren
500 mM Glukose (50 x)
360.4 mg D-Glukose (Merck)
4 ml H2Odest
9.8 ml aCSF-stock
200 µl 50 · Glukose
Bengal Rosa
100 mg Bengal Rosa (Aldrich)
10 ml 0.9% NaCl (Fresenius)
3 M KCl
22.374 g KCl (Merck)
100 ml H2Odest
XIV
Anhang
3 M NaCl
100 ml H2Odest
Molekularbiologische Analysen
2% Agarosegel für DNA
2 g Agarose
100 ml 1 x TAE
2 µl 10 mg/ml EtBr
1.2% denaturierendes Agarosegel (FA-Gel)
1.2 g Agarose
10 ml 10x FA-Gelpuffer
90 ml H2ODT, kochen und dann auf 65°C abkühlen
1.8 ml 37% Formaldehyd
2 µl 10 mg/ml EtBr
0.1% DEPC-Wasser (H2ODT)
1 ml DEPC (Sigma)
1 l H2Odest
ü. N. rühren, dann nochmals 1 h über Kopf rühren, autoklavieren
0.5 M EDTA pH 8.0
93.06 g EDTA (Titriplex III, Natrium-EDTA ⋅ 2H2O; Merck)
500 ml H2ODT
ca. 10 g NaOH (Roth)
10x FA-Gelpuffer
41.9 g MOPS, free acid
(SIGMA)
6.8 g Na-Acetat · 3 H2O
(SIGMA)
20 ml 0.5 M EDTA
ad 1 l H2ODT; pH mit NaOH auf 7.0 einstellen.
1x FA-Gel-Laufpuffer
100 ml
10x FA-Gelpuffer
20 ml 37 % Formaldehyd
880 ml H2ODT
Anhang
10x Gelladepuffer
5 ml 100 %-iges Glyzerin
2 ml 0.5 M EDTA pH 8.0
50 µl 20 %-ige SDS
20 µl gesättigte Bromphenolblau-Lösung
auf 10 ml mit H2ODT
aliquotieren, -20°C lagern
5x RNA-Gelladepuffer
16 µl gesättigte wässrige Bromphenolblau-Lösung
80 µl 500 mM EDTA pH 8.0
720 µl 37 % Formaldehyd (Sigma)
2 ml Glyzerin (SIGMA)
3.084 ml Formamid (Sigma)
4 ml 10x FA-Gelpuffer
mit H2ODT auf 10 ml auffüllen, aliquotieren, -20°C
2.5 mM dNTP
dATP, dGTP, dCTP, dTTP (je 25µmol in 500 µl [50 mM]; Invitek)
8 ml H2ODT
aliquotieren, -20°C
5 pmol/µl Primer
20 µl 100 pmol/µl fw-Primer (ROTH)
20 µl 100 pmol/µl rev-Primer (ROTH)
360 µl H2OGIBCO
aliquotieren, -20°C
50 x TAE pH 8.0
242 g TRIS base (Roth)
57.1 ml Eisessig (Roth)
100 ml 0.5 M EDTA pH 8
auf 1 l mit H2Odest auffüllen, autoklavieren
XV
XVI
EHRENWÖRTLICHE ERKLÄRUNG
Hiermit erkläre ich, dass ich die Arbeit selbständig und nur unter Verwendung der angegebenen
Quellen und Hilfsmittel angefertigt habe.
Die geltende Promotionsordnung der Fakultät ist mir bekannt.
Ich versichere, dass ich die Dissertation noch nicht als Prüfungsarbeit für eine staatliche oder andere
wissenschaftliche Prüfung und auch keine ähnliche oder andere Abhandlung bei einer anderen
Hochschule als Dissertation eingereicht habe.
Die Hilfe eines Promotionsberaters wurde nicht in Anspruch genommen, noch haben Dritte geldwerte
Leistungen für Arbeiten erhalten, die im Zusammenhang mit dem Inhalt der vorgelegten Dissertation
stehen.
Anja Urbach
XVII
DANKSAGUNG
Mein besonderer Dank gilt Herrn Prof. Dr. O.W. Witte für die Möglichkeit, in seinem Labor an diesem
sehr interessanten Thema arbeiten zu können. Sein Interesse an den Ergebnissen und dem Fortgang
meiner Studien und die anregenden Diskussionen haben mich sehr motiviert.
Herrn Dr. Claus Bruehl danke ich für seine stetige Hilfs- und Diskussionsbereitschaft auch über seine
Anwesenheit in unserem Labor hinaus. Er gab mir die nötigen Einblicke in die elektrophyiologische
Arbeit.
Ich danke Prof. Tim Schallert, University of Texas, Austin, für die freundliche und hilfreiche
Unterstützung bei den Verhaltensversuchen. Herrn Dr. Krohn und Frau Süptitz der Core Unit DNA
Technologies Leipzig danke ich für die cRNA-Synthesen und Microarray-Hybridisierungen.
Meinen Kollegen danke ich für das gute und stets hilfsbereite Arbeitsklima. Mein besonderer Dank gilt
dabei Lutz Liebmann, Christian Schmeer, Elena Shanina, Silvio Schmidt, Corinna Haupt, Silke Grass,
Christiane Frahm, Christoph Redecker für die regen Diskussionen und die Unterstützung in
technischen Fragen. Lutz danke ich vor allem für seine unermüdliche freundschaftliche
Hilfsbereitschaft. Claudia Sommer, Jessica Heyder und Svetlana Tausch danke ich für die
fachkundige technische Unterstützung.
Einen Dank auch an meine Freunde, die immer mehr an mich geglaubt haben als ich selbst.
Nicht zuletzt gilt mein ganz besonderer Dank meiner Familie. Sie haben mich immer unterstützt und
mir dadurch vieles ermöglicht. Ich danke Euch von ganzem Herzen dafür.
XVIII
LEBENSLAUF
Persönliche Daten:
Anja Urbach
Geboren am 13. November 1974 in Erfurt
Schulbildung:
1981-1985
Grundschule, Gebesee
1985-1990
Polytechnische Oberschule „Karl Marx“, Gebesee
1990-1991
Erweiterte Oberschule G.E. Lessing, Erfurt
1991-1993
von-Bulöw Gymnasium Neudietendorf
Juni 1993
Mittlere Hochschulreife, Note „sehr gut“
Ausbildung:
1993-1994
Versicherungskaufmännische Ausbildung
Studium:
1994-2000
Biologiestudium an der Friedrich-Schiller-Universität Jena
1999-2000
Diplomarbeit am Zoologischen Institut der Friedrich-Schiller-Universität Jena:
Hauptfach: Zoologie; Nebenfächer: Neurobiologie, Pharmakologie, Mikrobiologie
Thema: „Etablierung einer Methode zum immunzytochemischen Nachweis der
Phosphoinositid-3-Kinase γ in einer permanenten hämatopoietischen Zellinie“
Juni 2000
Diplom, Note „sehr gut”
2000-2003
wissenschaftlicher Mitarbeiter an den Instituten für Zoologie und Vaskuläre Biologie
und Medizin, Friedrich-Schiller-Universität Jena
Promotion:
seit Juni 2003
Promotion, Thema:
„Funktionelle Langzeiteffekte kortikaler Spreading Depressions“
Experimentelle Neurologie, Klinik für Neurologie, Friedrich-Schiller-Universität Jena
XIX
EIGENE PUBLIKATIONEN
Originalarbeiten
Lötzer K, Spanbroek R, Hildner M, Urbach A, Heller R, Bretschneider E, Galczenski H, Evans JF, Habenicht AJ.:
Differential leukotriene receptor expression and calcium responses in endothelial cells and macrophages indicate
5-lipoxygenase-dependent circuits of inflammation and atherogenesis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 23(8), 2003
Spanbroek R, Gräbner R, Lötzer K, Hildner M, Urbach A, Rühling K, Moos MP, Kaiser B, Cohnert TU, Wahlers T,
Zieske A, Plenz G, Robenek H, Salbach P, Kuhn H, Radmark O, Samuelsson B, Habenicht AJ: Expanding
expression of the 5-lipoxygenase pathway within the arterial wall during human atherogenesis. PNAS 100(3),
2003
Urbach A, Bruehl C, Witte OW: Microarray based long term detection of genes differentially expressed after
cortical spreading depression. Eur J Neurosci, in press
In Vorbereitung
Frahm C, Urbach A, Witte OW: GAD transcripts are differentially regulated during postnatal development in the
cortex and the hippocampus of rats.
Urbach A, Redecker C, Witte OW: Elevated hippocampal neurogenesis provoked by cortical spreading
depression.
Poster
Urbach A, Bruehl C, Divanach A, Witte OW (2004): Cortical gene expression after spreading depression. 49.
Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für Klinische Neurophysiologie und Funktionelle Bildgebung, Jena.
Urbach A, Bruehl C, Divanach A, Witte OW (2004): Profiling of early and delayed spreading depression induced
gene expression. 34th Annual Meeting of Neuroscience, San Diego/Kalifornien.
Urbach A, Redecker C, Witte OW (2005): Elevated hippocampal neurogenesis provoked by cortical spreading
depression. 35th Annual Meeting of Neuroscience, Washington, DC.
Urbach A, Redecker C, Witte OW (2006): Effects of cortical spreading depression on hippocampal neurogenesis
and spatial learning in rats. 4 th International Symposium: „Neuroprotection and Neurorepair: Cerebral ischermia
and stroke“, Magdeburg
Abstracts
Urbach A, Bruehl C, Divanach A, Witte OW: Cortical gene expression after spreading depression. Klin
Neurophys 4, 2004.

Material und Methoden - Digitale Bibliothek Thüringen

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