C O S T

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C O S T

CHARAKTERISIERUNG VON ORGANELLEN UND
SIGNALWEGEN DES THROMBOZYTEN
Dissertation zur Erlangung des
naturwissenschaftlichen Doktorgrades
der Bayerischen Julius-Maximilians-Universität Würzburg
vorgelegt von
Silke Mietner
Geboren am 17.05.1978 in Dortmund
Würzburg, Mai 2008
Eingereicht am:
30. Mai 2008
Mitglieder der Promotionskommission:
Vorsitzender:
Prof. Dr. Martin J. Müller
Gutachter:
Prof. Dr. Ulrich Walter
Gutachter:
Prof. Dr. Thomas Dandekar
Tag des Promotionskolloquiums:
12. Dezember 2008
Doktorurkunde ausgehändigt am:
______________________
Inhaltsverzeichnis
1 Abstract / Zusammenfassung
1
1.1
1.2
1
2
Abstract (english)
Zusammenfassung (deutsch)
2 Einleitung
2.1
2.2
2.3
2.4
2.5
2.6
2.7
2.8
Die Thrombozyten oder Blutplättchen
Pathologische Relevanz
Thrombozyten-Aggregation
2.3.1 Primäre Hämostase
2.3.2 Sekundäre Hämostase
Biologische Membranen
2.4.1 Die Thrombozytenmembran
2.4.2 Charakterisierung der lateralen Lipidverteilung
2.4.3 Phosphatidylinositol (PI)
2.4.4 Phosphatidsäure (PA) / Lysophosphatidsäure (LPA)
2.4.5 Membranrezeptoren
2.4.6 Das Thrombozyten-Zytoskelett
Signaltransduktion
2.5.1 Integrin ĮIIbȕ3
2.5.2 Integrin ĮIIbȕ3-vermittelte Signaltransduktion
Interaktom (Interaktionsnetzwerk)
2.6.1 Postulierte Interaktoren von Integrinen
2.6.2 ILK (Beta-Integrin-gekoppelte-Serin/Theronin-Kinase)
2.6.3 Interaktionspartner von ILK
2.6.4 Der ILK-PINCH-Parvin (IPP) – Komplex
Relevanz der Thrombozyten-Reinheit
Problemstellung
4
4
6
7
7
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
20
21
23
23
24
25
26
28
3 Material und Methoden
29
3.1
3.2
3.3
3.4
3.5
3.6
Material
Geräte
Chemikalien
Puffer und Lösungen
Antikörper
3.5.1 Primärantikörper
3.5.2 Sekundärantikörper
Primer
29
29
30
32
35
35
36
36
3.7
Molekularbiologische Methoden
37
3.7.1
3.7.2
3.7.3
3.7.4
3.7.5
3.7.6
3.7.7
3.7.8
3.7.9
37
38
39
39
39
40
40
41
41
SDS-PAGE (SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese)
Coomassie-Färbung von SDS-Polyacrylamid-Gelen
Silberfärbung von SDS-Polyacrylamid-Gelen
„Western-Blot“
Proteinmengenbestimmung
TCA-Fällung (Trichloressigsäure)
RNA-Isolation
RNA-Quantifizierung und Reinheitsüberprüfung
DNA-Quantifizierung
Inhaltsverzeichnis
3.7.10
3.7.11
3.7.12
3.7.13
3.7.14
3.8
cDNA-Synthese
Polymerase-Chain-Reaction (PCR)
Elektrophoretische Trennung von DNA-Fragmenten in Agarose-Gelen
Aufreinigung von PCR-Produkten
Sequenzierung von PCR-Produkten
42
43
44
44
45
Zellbiologische Methoden
45
3.8.1
3.8.2
3.8.3
3.8.4
3.8.5
3.8.6
3.8.7
3.8.8
3.8.9
45
46
46
46
47
48
48
50
51
Präparation von hochreinen Thrombozyten („highly purified platelets“)
Validierung der Thrombozyten-Reinheit
Bestimmung der Thrombozyten-Funktionalität
Isolation von Lymphozyten aus Vollblut
Thrombozyten-Isolation nach Hillmann et al.
Thrombozytenaufschluss mittels French-Press®
Isolation von Thrombozyten-Plasmamembran
Immunopräzipitation mittels „Protein G Immunoprecipitation (IP) Kit“
Immunopräzipitation mittels Dynabeads®
4 Ergebnisse
52
4.1
52
57
62
4.2
4.3
Herstellung von hochreinen Plättchen
4.1.1 Nachweis der Thrombozyten-Reinheit
4.1.2 Hochreine Plättchen sind immer noch funktionell
Charakterisierung von zwei Thrombozyten-Membran-Fraktionen nach
Dichtegradienten-Zentrifugation
Der ILK – PINCH – D-Parvin-Komplex
4.3.1 Experimentelle Validierung des IPP-Subnetzwerkes
5 Diskussion
5.1
5.2
5.3
Generierung von hochreinen Plättchen
Charakterisierung der Plasmamembran von Thrombozyten
Validierung des IPP-Subnetzwerkes in Thrombozyten
6 Literaturverzeichnis
7 Anhang
7.1
7.2
7.3
7.4
Abkürzungsverzeichnis
Publikationsverzeichnis
7.2.1 Originalarbeiten
7.2.2 Poster
Expressionsprofile der Proteine D-Parvin und PINCH
Originaldaten der Lipidanalyse des Kansas Lipidomics Research Centers
65
69
69
79
79
84
89
94
105
105
107
107
107
109
111
Lebenslauf
129
Danksagung
131
Erklärung
133
1. Abstract / Zusammenfassung
1
Abstract /Zusammenfassung
1.1
Abstract (english)
In recent years the role of platelets has changed from one of passive participation in
the coagulation cascade, to one of active production of humoral factors that
potentiate both clot formation and inflammation. In addition to platelet functions in
cardiovascular disorders like myocardial infarction, stroke and peripheral vascular
disease, new functions have been observed which play a role in cancer, infection and
Alzheimer`s disease. For research and also for clinical applications proteomic
methods as well as PCR-based techniques such as SAGE and qRT-PCR are mostly
used today, especially in high-throughput analysis. For these methods the purity of
the platelet sample is of significant importance.
In the framework of this thesis I have developed a new, effective and efficient
technique for purification of human platelets. By using the new purification method
the contamination of leukocytes could be decreased to less than 1.5 leukocytes per
108 platelets. Furthermore erythrocyte and plasma protein contaminations could be
excluded. The presence of functional membrane receptors (i.e. P2Y12 and PGI2
receptors) was proven by FACS analysis of the highly purified platelets
(Birschmann*, Mietner* et al. 2008).
Two different applications of these highly purified platelets will be described in this
thesis. As one example for subsequent analysis they were applied to studies focused
on the different membrane types in thrombocytes. For that the platelets were lysed
and the provided membrane fragments were separated by a gradient. By this
separation two fractions occurred, which were characterised by western-blotting and
lipid-analysis (“lipidomics”). Interpreting the results it became clear that in the first
fraction plasma membrane fragments were accumulated and in the second fraction
intracellular membrane fragments.
In connection with genomics and proteomics the techniques of lipidomics will
contribute to discover the lipid function in biological systems. In addition, it also might
be a helpful tool for the research of mechanisms of lipid-based diseases, for
monitoring biological relevant lipids and for pharmacological therapy supervision.
An additional application of the highly purified platelets was an interactome-study of
platelet proteins. In cooperation with the Department for bioinformatics using
proteome and SAGE data we established an in silico protein interactome focused on
1
the IPP-complex (ILK-PINCH-Parvin). This ternary complex functions as a signaling
platform for integrins by interfacing with the actin cytoskeleton. Based on the
particular proteins ILK and PINCH it is possible to generate an entire signal
transduction cascade in a model, which leads to actin-polymerisation. In the
laboratory these interactions in platelets were verified by immunoprecipitation and
western-blotting for the first time.
Therefore, the established platelet-interactome can be used for systematic „target
screening“. By this means it would be possible to identify potentially new receptors,
proteins or even whole signaling cascades. Thus, the interactome provides a suitable
base for assembling more complex interaction-models by including new data. In the
future this will be of high relevance also in clinical applications, if the importance of
these interactions for signaling pathways in hemostasis will be considered.
1.2
Zusammenfassung (deutsch)
In den letzten Jahren hat sich das gemeinhin gültige Bild von Thrombozyten, in dem
die Blutplättchen eine eher passive Rolle als Bestandteil der Koagulations-Kaskade
inne hatten, hin zu einem Modell gewandelt, in dem ihnen eine aktive Rolle
zugeschrieben wird. Diese ist von besonderer Bedeutung in Hinblick auf die
Produktion humoraler Faktoren, die sowohl die Bildung von Blutgerinnseln als auch
Entzündungsvorgänge potenzieren. Letzteres ist von besonderer Relevanz bei
kardiovaskulären Erkrankungen, wie Myokardinfarkt, Schlaganfall und peripherer
arterieller
Verschlusskrankheit.
Darüber
hinaus
wurden
mittlerweile
neue
Eigenschaften der Thrombozyten beobachtet, die auf deren Beteiligung bei
Krebserkrankungen, Infektionen und Morbus Alzheimer schließen lassen.
In der Forschung – und im weitesten Sinne auch in klinischen Anwendungen –
werden heute zur näheren Erforschung der Thrombozyten sowohl das Proteom
betreffende Analysemethoden, als auch auf PCR basierende Techniken, wie SAGE
und qRT-PCR eingesetzt. Für diese Techniken ist die Reinheit der verwendeten
Thrombozyten-Präparationen von besonderer Wichtigkeit.
Im Rahmen dieser Arbeit, entwickelte ich eine neue, effektive und effiziente Technik
zur Aufreinigung humaner Thrombozyten. Ich erzielte hochreine ThrombozytenPräparationen
mit
weniger
Blutplättchen.
Überdies
als
1,5
erwiesen
kontaminierenden
sich
die
Leukozyten
aufgereinigten
pro
108
Thrombozyten-
Präparationen als frei von kontaminierenden Erythrozyten und Plasma Proteinen.
2
Zudem konnte die Funktionalität der auf der Oberfläche der hochreinen Blutplättchen
vorhandenen Membranrezeptoren (z. B. P2Y12 und PGI2 Rezeptoren) mittels FACS
Analyse bestätigt werden (Birschmann*, Mietner* et al. 2008).
Zwei verschiedene Anwendungen dieser hochreinen Plättchen wurden im Rahmen
dieser Arbeit gezeigt. Zum einen wurden sie in einer Studie zur Aufklärung der
unterschiedlichen
Beschaffenheit
der
in
Thrombozyten
vorkommenden
Membrantypen verwendet. Hierzu wurden nach Lyse und Dichtegradienten der
Plättchen zwei Fraktionen erhalten, welche anschließend sowohl anhand von
Western-Blot- als auch durch Lipid-Analysen („Lipidomics“) charakterisiert wurden.
Dabei
stellte
sich
heraus,
dass
es
sich
bei
einer
Fraktion
um
Plasmamembranfragmente handelte und bei der anderen Fraktion um eine
Anreicherung von Membranen des kanalikulären Systems.
In Verbindung mit Genomics und Proteomics werden diese Techniken der Lipidomics
dazu beitragen, die Lipidfunktionen in biologischen Systemen besser zu verstehen.
Außerdem können sie einflussreiche Werkzeug für die Aufklärung des Mechanismus
von lipid-basierenden Erkrankungen, für die Überwachung biologisch relevanter
Lipide und für die pharmakologische Therapiekontrolle sein.
Eine weitere Anwendung fanden die hochreinen Plättchen in Interaktions-Studien
von Thrombozytenproteinen. In Zusammenarbeit mit dem Lehrstuhl für Bioinformatik
wurde unter Verwendung von Proteom- und SAGE-Daten ein Protein-Interaktom
erstellt. Daraus stellten wir ein Subnetzwerk mit dem IPP-Komplex (ILK-PINCHParvin) als Mittelpunkt dar. Dieser ternäre Komplex fungiert über eine Interaktion mit
dem Aktin-Zytoskelett als eine Signalplattform für Integrine. Ausgehend von den
einzelnen Proteinen ILK und PINCH ist es im Modell möglich, eine vollständige
Signalkaskade zu erstellen, die die Aktin-Polymerisation zur Folge hat. Im Labor
konnten wichtige Interaktionen in Thrombozyten mittels Immunopräzipitation und
anschließender Western-Blot Analyse erstmals nachgewiesen werden.
Das erstellte Thrombozyten-Interaktom kann somit effektiv für ein systematisches
„target screening“ genutzt werden. Auf diese Weise wäre es möglich neue
Rezeptoren, Proteine oder ganze Signalkaskaden zu identifizieren. Somit legt das
Interaktom die Basis für die Generierung von komplexeren Modellen durch das
Einbeziehen von neuen Daten. Dies ist auch in Zukunft von besonderer Wichtigkeit,
wenn
man
die
entscheidende
Bedeutung
dieser
Interaktionen
für
die
Signaltransduktionswege während der Hämostase in Thrombozyten berücksichtigt.
* Both authors contributed equally to this manuscript
3
2. Einleitung
2
Einleitung
2.1
Die Thrombozyten oder Blutplättchen
Thrombozyten sind mit 2 – 4 µm Größe die kleinsten korpuskulären Bestandteile des
zirkulierenden Blutes und erheblich kleiner als die Erythrozyten oder Leukozyten
(Werner et al. 1980) (Abb. 2-1). Im peripheren Blut liegt die physiologische Anzahl
von Blutplättchen zwischen 150 – 350 × 103/µl, wobei etwa
20 % der
Gesamtblutplättchenanzahl täglich neu generiert werden. Da ihnen ebenso wie den
Erythrozyten ein Zellkern fehlt, sind sie keine eigentlichen Zellen sondern
subzelluläre Fragmente, die von den Megakaryozyten abgeschnürt werden (Fox
1996). Durch eben diese Tatsache, dass Blutplättchen keinen Zellkern besitzen, ist
ihre Proteinbiosynthese-Aktivität sehr eingeschränkt. Durch das Vorhandensein von
Polyribosomen, einer speziellen Form des rauhen Endoplasmatischen Retikulums
(kanalikuläres System), welches als Calciumionen-Speicher dient und dessen rasche
Entleerung ins Cytosol eine essentielle Voraussetzung für die physiologische
Thrombozytenaggregation ist, und der von den Megakaryozyten abstammenden
mRNA (Dittrich et al. 2006) (Gnatenko et al. 2006), geht man davon aus, dass sie
dennoch in geringem Maße Proteine synthetisieren. Dass diese mRNA tatsächlich
zur Proteinbiosynthese in Thrombozyten dient, haben u.a. Denis et al. 2005
nachgewiesen. Sie zeigten, dass Blutplättchen ein funktionelles Spliceosom
besitzen, einen Komplex, der in anderen Zelltypen die pre-mRNAs im Zellkern
generiert. Die einzelnen Spliceosom-Komponenten fanden sie im Zytoplasma von
humanen
Megakaryozyten
und
in
Prothrombozyten,
die
sich
von
den
Megakaryozyten ableiten lassen (Denis et al. 2005).
Abb. 2-1: Humane Blutzellen: Thrombozyten (grün), Leukozyten (gelb) & Erythrozyten (rot).
Computer nachkolorierte rasterelektronenmikroskopische Aufnahme. Quelle: Max-Planck-Institut für Entwicklungsbiologie,
Tübingen; Elektronenmikroskopisches Labor Jürgen Berger
4
2. Einleitung
Thrombozyten spielen eine essentielle Rolle in physiologischen und pathologischen
Prozessen der Hämostase, der Thrombose, den Entzündungsreaktionen, der
Wundheilung und beim Schlaganfall (Wagner et al. 2003) (Andrews et al. 2004)
(Gibbins et al. 2004) (Jurk et al. 2005) (Gnatenko et al. 2006). Primär sind sie
demnach
für
die
Gewährleistung
der
Integrität
des
vaskulären
Systems
verantwortlich (Gawaz et al. 1999) (Jurk et al. 2005) (Hartwig et al. 2006). Unter
physiologischen Bedingungen sorgen sie für das Sistieren einer Blutung. In
atherosklerotisch
veränderten
Gefäßen,
deren
Integrität
durch
Endothelschädigungen gestört ist, kann es hingegen durch analoge Vorgänge zu
verstärkter
Thrombozytenaktivierung
und
daraus
folgender
Gerinnselbildung
kommen. Sobald die Blutplättchen auf einen vaskulären Defekt in der Blutgefäßwand
treffen, gehen sie in ihre aktivierte Form über, in welcher sie effektiv die Oberfläche
dieses Bereiches abdecken. Der Vorgang während der Aggregation lässt sich in zwei
Abschnitte einteilen: Adhäsion und Aktivierung. Die Adhäsion beginnt mit dem
Passieren und der Anhaftung von Thrombozyten durch den Kollagen/von-WillebrandFaktor-Komplex und führt zu einem Thrombozyten-Monolayer an der Läsion. Dieser
Prozess führt zur Sekretion weiterer Agonisten wie Thrombin, ADP und Thromboxan
A2 (TxA2), die diesen Vorgang durch die Beteiligung anderer Thrombozyten an der
Thrombusbildung vorantreiben. Alle drei Stimuli aktivieren Thrombozyten über GProtein-gekoppelte Rezeptoren an der Oberfläche (Abrams et al. 2005) (Offermanns
et al. 2006) (Abb. 2-2).
Abb. 2-2: Thrombozyten (violett gefärbt): Beginnende Thrombozytenaggregation und Bindung
an die Blutgefäßwand Quelle: Max-Delbrück-Centrum für Molekulare Medizin (MDC) Berlin-Buch; Dr. Michael Bader
5
2. Einleitung
2.2
Pathologische Relevanz
Es ist heute bekannt, dass Thrombozyten neben ihrer Funktion in der Hämostase
und Thrombose auch eine Anzahl von Entzündungsprozessen regulieren und eine
Schlüsselrolle in der Atherothrombose spielen. Da vaskuläre Erkrankungen
heutzutage
die
Haupttodesursache
in
Industrienationen
darstellen,
ist
die
Erforschung der Rolle von Thrombozyten in vaskulären Entzündungen und der
Atherosklerose von großer Relevanz. Bisher wurden erhebliche Fortschritte im
Verständnis der molekularen Mechanismen von Thrombozyten-Interaktionen mit
endothelialen Zellen der Arterienwand erzielt (Gawaz et al. 2006). Die detaillierte
Analyse dieser Vorgänge wird hinsichtlich des Verständnisses nicht nur der
Hämostase, sondern auch der Funktion von Blutplättchen in Krankheiten wie Krebs,
Diabetes und Atherosklerose eine große Rolle spielen. Hämostaseologische
Erkrankungen sind durch Unterschiede in der Thrombozyten-Aktivität begründet.
Diese Unterschiede reichen von Symptomen wie einer deutlich verlängerten
Blutungszeit, bei Glanzmann-Thrombastenie oder Bernhard-Soulier Syndrom, bis hin
zu pathologisch erhöhter Aggregationsneigung bei der Atherosklerose.
Aktuelle
Daten
ordnen
die
Atherosklerose
als
eine
chronische
Entzündungserkrankung ein (Lusis et al. 2000), wodurch sich die Frage stellt, in wie
weit Thrombozyten an diesem Prozess beteiligt sind, da nachgewiesen wurde, dass
Atherosklerose mit Hyperaggregabilität einhergeht (Fateh-Moghadam et al. 2000)
(Willoughby et al. 2002).
Wie im Folgenden noch detaillierter beschreiben, spielen Thrombozyten eine
entscheidende Rolle in der Hämostase (2.3.1). Sie besitzen in ihrer Membran
spezifische Glykoproteinrezeptoren (GP), welche wichtige Funktionen in der
Thrombozytenadhäsion, -aktivierung und –aggregation übernehmen (Rodgers et al.
2006). Der GPIb-IX-V-Rezeptorkomplex ist hierbei für die Thrombozytenadhäsion
über seine Interaktion mit dem von Willebrand Faktor verantwortlich (Miller et al.
1992). Eben dieser GPIb-IX-V-Rezeptorkomplex fehlt oder
unterliegt
einer
Dysfunktion bei Patienten mit Bernhard-Soulier-Syndrom, was zu einer fehlerhaften
Adhäsion der Blutplättchen an das Subendothelium führt (Clemetson et al. 1982).
Das Bernhard-Soulier-Syndrom ist eine ererbte Thrombozyten Funktionsstörung und
wird autosomal rezessive vererbt. Dieses Syndrom ist charakterisiert durch eine
Thrombozytopenie und besonders große, defekte Blutplättchen. Es zeichnet sich
durch
verschiedene
Blutungs-Symptome
aus,
wie
Epistaxis,
Ekchymose,
6
2. Einleitung
Menometrorrhagie, sowie häufigen Zahnfleisch- oder gastrointestinal Blutungen. Die
Diagnose dieser Krankheit kann durch Thrombozyten-Aggregations-Studien oder
durchflusszytometrische Analysen bestätigt werden (Pham et al. 2007).
Das
Bernhard-Soulier-Syndrom
ist
nur
eine
von
verschiedenen,
ererbten
Riesenthrombozytenerkrankungen, die sich durch eine funktionelle Abnormalität
Thrombozyten-GP-Rezeptorkomplexes auszeichnen. Diese Krankheit ist sehr
variabel in ihren Blutungsneigungen, welche von leicht über schwer bis hin zu
lebensbedrohlich sein können.
Um diese und auch weitere Krankheiten, die in Verbindung mit hämostaseologischen
Erkrankungen stehen, weiter erforschen zu können, ist es notwendig, die
molekularen Vorgänge, die der Thrombozyten-Aggregation zugrunde liegen,
genauestens zu verstehen.
2.3
Thrombozyten-Aggregation
2.3.1 Primäre Hämostase
Zirkulierende Blutplättchen kommen normalerweise nicht mit der subendothelialen
Extrazellulärmatrix in Kontakt, welche die adhäsiven Makromoleküle wie Kollagen
und den vWF enthält, die eine Aktivierung der Plättchen bewirken können (Ruggeri et
al. 2002) (Jackson et al. 2003). Erst wenn eine vaskuläre Verletzung auftritt, kommt
es zur primären Adhäsion, d.h. noch ruhende Blutplättchen lagern sich an den
Wundrand an. Diese Adhäsion der noch ruhenden Thrombozyten an die verletzte
Gefäßwand stellt den ersten Schritt der primären Hämostase dar. Sie führt zur
Formveränderung („shape change“) und Aktivierung der adhärenten Thrombozyten
mit nachfolgender Sekretion von Inhaltsstoffen der Granula und zur Aggregation.
Durch die Interaktion des thrombozytären Oberflächenrezeptors Glykoprotein Ib/IX
(GPIb/IX) mit seinem Liganden, dem von Willebrand Faktor (vWF), wird der erste
Kontakt zirkulierender Blutplättchen mit der Zellwandläsion hergestellt (Meyer et al.
1982). Der vWF tritt in der subendothelialen Matrix, in den D-Granula der
Thrombozyten und im Plasma an den Faktor VIII (Antihämophiles Globulin A)
gebunden auf.
Eine
Stabilisierung
membrangebundene
der
anheftenden
Adhäsionsrezeptoren
Blutplättchen
(Integrine)
findet
wie
über
den
weitere
Kollagen-,
Fibronektin- und Lamininrezeptoren, die die entsprechenden Proteine der Matrix
7
2. Einleitung
binden, statt (Timpl et al. 1994) (Tran et al. 1995). Nach einer Verletzung der
Gefäßwand wird die Adhäsion der Thrombozyten hauptsächlich durch Kollagen
induziert. Hierbei sind vor allem die Kollagen-Klassen I, III und VI wichtig, an die der
vWF bindet (Ruggeri et al. 2002). Diese Interaktion mit Kollagen allein würde nicht
ausreichend sein für eine Thrombozytenadhäsion, dient aber als starker Stimulus für
die Aktivierung. Der Kollagenrezeptor GPVI ist nicht in der Lage eine Adhäsion zu
vermitteln, aber über die Aktivierung der FcRȖ-Kette induziert er intrazelluläre
Signalprozesse, die eine „inside-out“-Aktivierung von Integrinen wie ĮIIbȕ3 (GPIIb/IIIa)
oder Į2ȕ1 (GPIa/IIa) bewirken (Nieswandt et al. 2003) (Nieswandt et al. 2004).
In vivo würden Scherkräfte und Turbulenzen im Blutfluss ein Abreißen der
Thrombozyten vom Kollagen verursachen, wenn die Interaktion nicht stabilisiert
würde. Bei hohen Scherkräften über 1000/s-1 hängt die Thrombozytenadhäsion
entscheidend
von
der
Interaktion
zwischen
GPIb
(vWF-Rezeptor)
und
kollagengebundenem vWF ab. Durch diese Interaktion wird eine intrazelluläre
Signalkaskade induziert (Asazuma et al. 1997), die weitere zelluläre Reaktionen in
den Thrombozyten hervorruft. Dabei kommt es u.a. zur Freisetzung verschiedener
Substanzen wie ADP, ATP, Serotonin und TxA2 aus intrazellulärer Granula. Diese
Substanzen können sowohl autokrin den Aktivierungsprozess verstärken als auch
parakrin weitere ruhende Thrombozyten rekrutieren und diese zur Aggregation mit
schon anheftenden Blutplättchen anregen. Somit ist das TxA2 über Bindung an einen
spezifischen Thromboxanrezeptor auf der Thrombozytenoberfläche in der Lage, den
Aktivierungsvorgang zu verstärken (Thomas et al. 1998). Außerdem wirkt TxA2
vasokonstriktorisch auf das Endothel und begünstigt durch Verlangsamung des
Blutstroms die Thrombusbildung. Sind also die Ränder der Läsion vollständig von
Thrombozyten besetzt, werden weitere Blutplättchen über Fibrinogen gebunden. Auf
diese Weise bildet sich im Verlauf der primären Hämostase ein noch reversibler
Thrombozytenpfropf, welcher zu einer vorläufigen Abdichtung der Wunde führt (Abb.
2-3). Bei gleichzeitiger Stimulierung der Thromboxan-Bildung und Sekretion wird die
Aggregation irreversibel (Gawaz et al. 1999).
8
2. Einleitung
Abb. 2-3: Aktivierung von Thrombozyten nach einer vaskulären Verletzung. Der erste Kontakt
der Plättchen mit der endothelialen Extrazellulärmatrix ist vermittelt durch vWF und GPIbĮ,
gefolgt von der Aktivierung der Plättchen durch Kollagen über den Kollagenrezeptor GPVI.
Dies bewirkt eine Integrin-vermittelten Adhäsion von Plättchen und eine zelluläre Aktivierung,
die zu einer Freisetzung und Produktion von diffusionsfähigen Mediatoren wie ADP, TxA2 und
Thrombin über G-Protein gekoppelte Rezeptoren führt. Die Aktivierung dieser Rezeptoren
verstärkt die Adhäsion des ersten und zweiten Thrombozytenlayers, induziert den shape
change und reguliert die Formation und Freisetzung der Mediatoren. Diese diffusionsfähigen
Mediatoren wirken dann auf benachbarte Thrombozyten und rekrutieren diese zur Aggregation.
(ECM, Extrazellulär-Matrix; Fg, Fibrinogen.) (Quelle: Offermanns 2006)
2.3.2 Sekundäre Hämostase
Da der Thrombus nach der primären Hämostase sehr instabil ist, wäre ein
dauerhafter Verschluss der Wunde so nicht möglich. Um also eine endgültige
Wundheilung zu gewährleisten, ist ein weiterer Prozess, die sekundäre Hämostase,
notwendig. Nach Aktivierung der zellbasierten Gerinnung folgt die Synthese von
Thrombin und Fibrin in der Umgebung des Thrombozytenaggregats. Dabei lagert
sich das Fibrin in den Thrombus ein, was zu einer kovalenten Quervernetzung der
Blutplättchen führt. Durch Zusammenziehen dieses Thrombozyten-Fibrin-Komplexes
kommt es zu einer weiteren Festigung des Plaques .
9
2. Einleitung
Um die morphologischen Veränderungen der Thrombozyten, den sogenannten
shape change während der Hämostase verstehen zu können, ist es notwendig,
zunächst Kenntnisse über den Aufbau der Thrombozytenmembran mit ihren
verschiedenen Rezeptoren zu erlangen.
2.4
Biologische Membranen
Um ein besseres Verständnis für die biochemischen Abläufe während der
Thrombozyten-Aktivierung zu bekommen, wurde während dieser Arbeit die
Thrombozyten-Membran, ein in diesem Zusammenhang wichtiges Zellorganell,
speziellen Analysen unterzogen. Biologische Membranen lassen sich unterteilen in
Plasmamembran und intrazelluläre Membranen. Die Plasmamembran dient als
Barriere zwischen dem Intra- und dem Extrazellulärraum, während die intrazellulären
Membranen innerhalb der Zelle unterschiedliche Kompartimente vom Zytoplasma
abtrennen. Eine Membran ist jedoch nicht nur ein passiver Bestandteil einer Zelle,
sondern spielt auch aktiv eine wichtige Rolle beim Transport von Molekülen und bei
der Signaltransduktion.
Membranen bestehen aus einer Lipiddoppelschicht, die sich hauptsächlich aus
amphiphilen Phospholipiden zusammensetzt, die eine hydrophile Kopfgruppe und
eine hydrophobe Schwanzgruppe besitzen. In Wasser bildet sich eine Doppelschicht,
bei der die hydrophoben Schwänze nach innen und die hydrophilen Köpfe nach
außen zeigen. Wegen des hydrophoben Kerns ist eine solche Lipiddoppelschicht
nahezu undurchlässig für Wasser und wasserlösliche Moleküle, gleichzeitig aber
sehr flexibel und mechanisch schwer zu zerstören (Nagle et al. 2000).
Lipide sind wasserunlösliche Biomoleküle, die in organischen Lösungsmitteln sehr
gut löslich sind (Rouser et al. 1983). Es werden drei Hauptgruppen von
Membranlipiden unterschieden: 1. Phospholipide, 2. Glykolipide und 3. Cholesterin.
Man geht heute davon aus, dass die Verteilung der Phospholipide über die
Eukaryotenzellmembran
eine
charakteristische
Asymmetrie
aufweist.
Die
Aminophospholipide Phosphatidylserin (PS) und Phosphatidylethanolamin (PE) sind
auf der zytoplasmatischen Seite angereichert, die cholinhaltigen Phospholipide
Phosphatidylcholin (PC) und Sphingomyelin (SM) befinden sich hingegen zum
überwiegenden Teil im exoplasmatischen Monolayer der Plasmamembran (Holthuis
et al. 2003).
10
2. Einleitung
Durch eingelagerte Proteine in die Membranen bekommen diese verschiedene
Eigenschaften,
wie
eine
Semi-Permeabilität
auf
Grund
des
selektiven
Molekültransportes. Die transversale Bewegung der Phospholipide kann allgemein
über passive Diffusion, erleichterte Diffusion oder aktiven Transport erfolgen
(Herrmann et al. 1990). Die Lipiddoppelschicht einer Biomembran ist normalerweise
flüssig, d.h. die Lipide und Proteine sind in der Ebene der Membran leicht beweglich.
Lipide und integrale Membranproteine können lateral ungehindert in der Lipidmatrix
diffundieren
(laterale
Diffusion),
sofern
dies
nicht
durch
spezifische
Wechselwirkungen unterbunden wird (Zachowski et al. 1990). Phospho- und
Glykolipide, können neben der lateralen Diffusion noch eine transversale Diffusion,
den sogenannten flip-flop ausführen, welcher aber sehr viel langsamer und unter
ATP-Verbrauch abläuft.
Das dritte Mitglied der Gruppe der Membranlipide, das Cholesterin, erhöht die
Viskosität der Membran, wenn es in großen Mengen am Membranaufbau beteiligt ist.
Zusätzlich kann die Fluidität durch Variation der Doppelbindungszahl und Länge der
Fettsäurereste reguliert werden. Höhere Temperaturen, kurze Fettsäurereste und
viele ungesättigte Bindungen erhöhen ebenfalls den Grad der Fließfähigkeit (fluid
mosaic model) (Singer et al. 1972).
Die Tatsache, dass eine Zelle auf Kosten ihrer Stoffwechselenergie die transversale
Ungleichverteilung der Phospholipide aufrechterhält, wirft die Frage nach der
physiologischen Bedeutung dieser Asymmetrie auf. Hinweise dafür, dass die
Anordnung der Lipide nicht nur für die Homöostase einer Zelle wichtig ist, sondern
vielmehr eine funktionelle Bedeutung für intra- und interzelluläre Wechselwirkungen
hat (Herrmann et al. 1990), lassen sich u.a. in Forschungsarbeiten an Thrombozyten
finden.
2.4.1 Die Thrombozytenmembran
Aufgrund der Membranabhängigkeit vieler zellulärer Funktionen finden heutzutage
zahlreiche Untersuchungen die Membran betreffend statt. Hierbei muss jeweils die
optimale Methode zur Isolierung der Plasmamembran identifiziert werden, die
abhängig ist von der zu untersuchenden Zellpopulation (Gennis et al. 1989). In den
letzten
Jahren
rückte
die
Untersuchung
von
einzelnen
Proteinen
der
Thrombozytenmembran, die aus dem gleichen Phospholipid-Bilayer besteht wie
andere eukaryotische Zellen (Wurzinger et al. 1990), immer mehr in den
11
2. Einleitung
Vordergrund.
So
wurde
Thrombozytenmembranen
bereits
(Plasmamembran
die
und
Zusammensetzung
Organellenmembranen)
aller
auf
Proteinebene aus einem Gesamtlysat analysiert (Moebius et al. 2005).
Weitere Analysen ergaben, dass eine Verminderung der Phospholipidasymmetrie bei
Thrombozyten vor allem nach Stimulation der Gerinnungskaskade (Zwaal et al.
1992) stattfindet. Denn eine Veränderung der Phospholipidorientierung im Bereich
der Plasmamembran erlaubt die Anlagerung von Gerinnungsfaktoren und die Bildung
eines katalytischen Prothombinasekomplexes an der aktivierten Oberfläche (Gawaz
et al. 1999). Wahrscheinlich spielen membranvermittelte Prozesse ebenfalls bei der
Vesikelbildung in Thrombozyten eine entscheidende Rolle. Beschrieben werden
diese Prozesse durch das „Bilayer-Couple“-Modell. Dabei geht man davon aus, dass
die kontrollierte Aktivität von Phospholipidtranslokasen an bestimmten Punkten der
Membran zu einer Ungleichverteilung von Membranlipiden zwischen den beiden
Monolayern und somit zu örtlichen Membrankrümmungen und schließlich zum
Abschnüren von Vesikeln führen. Dies könnte eine Kontrolle von Endo- und
Exozytoseprozessen über die Phospholipidasymmetrie erklären (Devaux et al. 1990).
Die Verringerung der Aminophospholipidtranslokase (APLT)-Aktivität geht bei
aktivierten Thrombozyten schließlich mit der Aufhebung der Phospholipidasymmetrie
und dem Abschnüren von Membranvesikeln einher.
Da jede Membran einer Zelle verschiedene Aufgaben erfüllt, unterscheiden sich die
Membranen in ihrem Lipidaufbau.
2.4.2 Charakterisierung der lateralen Lipidverteilung
In den letzten zwei Jahrzehnten wurden viele Methoden zur Untersuchung lateraler
Lipiddomänen angewandt. Sie machen sich die unterschiedliche Resistenz von
Membranen gegenüber Detergenzien zu Nutze. Man geht davon aus, dass im
endoplasmatischen Retikulum (ER) die Membranlipide lateral gleichförmig verteilt
sind, während sie in der Plasmamembran charakteristische Domänen bilden
(Holthuis et al. 2003). Entscheidend für diese asymmetrische Anordnung sind rein
physikochemische Wechselwirkungen zwischen spezifischen Lipiden, die zur
Phasenseparation führen können. Sowohl in vitro als auch in vivo wurde gezeigt,
dass Sphingolipide sich bevorzugt mit Cholesterol zusammenlagern und eine
geordnete-fluide Phase bilden. Diese koexistiert stabil mit oder in der ungeordnetenfluiden Phase, in der sich vorwiegend ungesättigte Glycerolipide anreichern (Brown
12
2. Einleitung
et al. 1998). Basierend auf dieser Vorstellung stabiler Lipiddomänen in einer sonst
fluiden Membran entstand der Begriff der sogenannten „Lipid rafts“ (Simons et al.
1997). Eine präparative Isolation dieser Lipidrafts kann über die Lyse der Membran in
kaltem
nicht-ionischem
Detergenz
(z.B.
Triton)
und
eine
anschließende
Dichtezentrifugation erfolgen (Hooper et al. 1999). Membrandomänen mit hohem
Sphingolipid- und Cholesterolanteil können nicht solubilisiert werden, da sie von
starken van-der-Waals-Kräften zusammengehalten werden. Sie sind durch eine
geringe Dichte charakterisiert (enthalten relativ wenige Proteine) und steigen
während der Ultrazentrifugation im Dichtegradienten auf (Hooper et al. 1999).
2.4.3 Phosphatidylinositol (PI)
Da Phosphatidylinositol (PI) das am häufigsten vorkommende Phospholipid und
damit Baustein von biologischen Membranen ist, wird man es bei allen
Untersuchungen, die die Membran betreffen, identifizieren. Es reguliert auf
verschiedenen Ebenen die Struktur und den Stoffwechsel von Zellen. Nach
Phosphorylierung des Phosphatidylinositols entsteht in der Plasmamembran
Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphat (PIP2). Durch die Aktivierung eines G-Proteingekoppelten Rezeptors wird die membranständige Phospholipase C stimuliert und
spaltet anschließend das Membranlipid PIP2 zu Diacylglycerol und Inositol-1,4,5trisphosphat (IP3). Inositol-1,4,5-trisphosphat wird im Zellstoffwechsel durch die IP3Phosphatase zu Inositolbisphosphat deaktiviert. Eine weitere Phosphorylierung durch
die IP3 -3-Kinase an der 3-Position, leitet eine Signaltransduktion zu weiteren, höher
phosphorylierten Inositolphosphaten ein, die ebenfalls Funktionen in der Regulation
der Zelle erfüllen können. Inositol-1,4,5-trisphosphat bewirkt über die Bindung an
seinen spezifischen Rezeptor, den IP3-Rezeptor, die Freisetzung von Calcium-Ionen
aus dem endoplasmatischen Retikulum, das als intrazellulärer Calciumspeicher
dient. Die dadurch bewirkte Erhöhung der Konzentration von Calcium im Zytosol hat
vielfältige physiologische Funktionen. Phosphatidylinositol-3,4,5-trisphosphat dient
auf der Zytosolseite der Plasmamembran als spezifische Bindungsstelle für
bestimmte Proteine, die an der Organisation des Zytoskeletts beteiligt sind, wie
beispielsweise ILK (2.8.1.1) (Delcommenne et al. 1998) (Persad et al. 2000). Speziell
in Thrombozyten ist die Biosynthese von Arachidonsäure aus Phosphatidylinositol,
welche die Grundlage für das Eicosanoid Thromboxan ist, das wiederum zur
Thrombozyten-Aktivierung
führt,
essentiell.
Auch
die
Aktivierung
der
13
2. Einleitung
Phosphatidylinositol-3-Kinase (PI3K) unter Beteiligung ihres Cofaktors ADP ist ein
wichtiger Signalüberträger bei der Thrombozytenaggregation (Cattaneo et al. 2001)
(Hirsch et al. 2006).
2.4.4 Phosphatidsäure (PA) / Lysophosphatidsäure (LPA)
Phosphatidsäure ist das einfachste Phospholipid, das man in der Natur findet, aber
bereits in den 1960er Jahren zeigte eine Reihe von Studien verschiedene
biologische Aktivitäten dieses Lipids - darunter war auch die Beteiligung an der
Thrombozytenaggregation (Schumacher et al. 1979) (Gerrard et al. 1979) (Tokumura
et al. 1981). 1989 konnten van Corven et al. beweisen, dass die LPA alle
Eigenschaften eines Wachstumsfaktors besitzt (van Coven et al. 1989). Bis zur
heutigen Zeit ist eine beeindruckende Zahl von weiteren biologischen Aktivitäten der
LPA beschrieben worden. So wirkt sie chemotaktisch, fördert das Wachstum von
Tumorzellen und die Dedifferenzierung bei neuronalen Zellen. Weiterhin sind auch
antiproliferative Effekte (abhängig vom Zelltyp und der Konzentration), zytoskeletale
Umgestaltungen, Kalzium-Mobilisierung ebenso wie eine Modulation der ChloridKanälen im Zusammenhang mit LPA beschrieben (Durieux et al. 1993) (Moolenaar
et al. 1994) (Jalink et al. 1994) (Tokumura et al. 1995) (Moolenaar et al. 1995)
(Moolenaar et al. 1995). Des Weiteren konnte nachgewiesen werden, das LPA in
mikromolaren
Konzentrationen
im
Blutserum
vorhanden
ist
und
von
den
Thrombozyten sekretiert wird (Tigyi et al. 1992) (Eichholtz et al. 1993). Basierend auf
seinem Effekt auf die Fibroblasten-Proliferation, führt dies zu der Annahme, dass
LPA auch in die Wundheilung involviert ist (Durieux et al. 1993) (Moolenaar et al.
1994) (Jalink et al. 1994) (Tokumura et al. 1995) (Moolenaar et al. 1995) (Moolenaar
et al. 1995). Es wurde bereits der Nachweis erbracht, dass Thrombozyten LPA1,
LPA2 und LPA3 Rezeptoren exprimieren (Motohashi et al. 2000) (Rother et al. 2003).
Da LPA und weitere Phospholipid-Spezies in gering oxidierten „low-density“
Lipoproteinen (LDL) ebenso wie bei fortgeschrittenen atherosklerotischen Läsionen
zu finden sind, nimmt man an, dass sie bei der Thrombozytenaktivierung in den
verschiedenen Phasen der Atherosklerose beteiligt sind (Siess et al. 2002).
Eingebettet
in
diese
komplexe
Phospholipidstruktur
der
Thrombozyten-
Plasmamembran sind verschiedene Arten von Glykoprotein-Rezeptoren für die
Aktivierung und Interaktion mit anderen Zellen.
14
2. Einleitung
2.4.5 Membranrezeptoren
Membranrezeptoren
sind
definierte
Bindungsorte
für
biologisch
oder
pharmakologisch aktive Substanzen auf Zelloberflächen. In funktioneller Hinsicht
können zwei Hauptgruppen von Membranrezeptoren unterschieden werden:
Adhäsionsrezeptoren und Aktivierungsrezeptoren. Die Adhäsionsrezeptoren der
Thrombozytenmembran
sind
Glykoproteine,
deren
Oligosaccharide
von
der
Zelloberfläche in die Außenzone (Glykokalyx) ragen. Blutplättchen interagieren mit
Hilfe dieser Membranrezeptoren sowohl untereinander als auch mit Proteinen des
Subendothels, mit Gerinnungsfaktoren und mit Zellen (z.B. Endothelzellen,
Leukozyten). Zu den adhäsiven Proteinen, die größtenteils im Subendothel, aber
auch im Zytoplasma lokalisiert sind, gehören Fibrinogen, Kollagen, Fibronektin,
Thrombospondin, Laminin und der von-Willebrand-Faktor.
Bei der zweiten Gruppe von Membranrezeptoren handelt es sich um Rezeptoren, die
beim Aktivierungsprozess der Blutplättchen wichtige Funktionen besitzen. Bei
diesem Prozess werden verschiedene Agonisten und Induktoren an spezifische
Rezeptoren der Thrombozytenmembran gebunden und führen zur Aktivierung der
Plättchen. Die Aktivierungsrezeptoren sind an sogenannte G-Proteine gekoppelt, die
den Aktivierungsprozess verstärken. Zu den Aktivierungsrezeptoren gehören: ADPRezeptoren, Thrombinrezeptoren, der Į-adrenerge Rezeptor, Serotoninrezeptoren
und der Thromboxanrezeptor.
Der ADP-Rezeptor vermittelt den Ca2+-Einstrom, die intrathrombozytäre Ca2+Freisetzung, die Hemmung der Adenylatzyklase sowie den shape change und die
Aggregation der Blutplättchen.
Die Thrombinrezeptoren üben nach Bindung von Thrombin eine Aktivierungsfunktion
auf die Plättchen aus.
Eine Thrombozyteninhibierung kann durch Hemmung des Aktivierungsprozesses
durch sekundäre Botenstoffe erfolgen, deren Bildung durch Stimulation bestimmter
erfolgt.
Hierzu
gehören:
Adenosinrezeptor,
ȕ-adrenerger
Rezeptor
und
Prostazyklinrezeptor.
Der bereits erwähnte shape change wird u.a. durch die Stimulation G-Proteingekoppelter Rezeptoren ausgelöst. Man unterscheidet vier Subklassen der GProteine: GS und Gi stimulieren bzw. inhibieren die Aktivität der Adenylatcylase und
steuern so den cAMP-Spiegel und damit die Aktivität der cAMP-abhängigen
Proteinkinase. Erhöhte cAMP-Spiegel bewirken allgemein eine Reduzierung der
15
2. Einleitung
Reaktivität der Thrombozyten (Siess et al. 1989). Gq stimuliert die Phospholipase C
und bewirkt dadurch eine Bildung von Inositol-1,4,5-trisphosphat und in Folge einen
Anstieg der zytosolischen Ca2+-Konzentration. Dies führt zur Aktivierung der
Phospholipase
A2,
die
eine
Abspaltung
von
Arachidonsäure
aus
den
Membranphospholipiden katalysiert (Gawaz et al. 1999). Arachidonsäure ist das
Substrat der Acetylsalicylsäure-sensitiven Zyklooxygenase (COX-1), die TxA2 bildet.
Die vierte Subklasse der G-Proteine G12/13 koppelt u.a. an die kleinen GTPbindenden Proteine der Rho-Familie, die bei vielen Zellen an der Signaltransduktion
von Reorganisationsprozessen des Zytoskeletts beteiligt sind (Bauer et al. 1999).
Wie bereits oben erwähnt, können auch Glykoproteinrezeptoren, wie GPVI und
Integrin Į2ȕ1, eine Aktivierung der Thrombozyten hervorrufen (Blake et al. 1994)
(Pasquet et al. 1999). Speziell der Glykoprotein Integrin ĮIIbȕ3-Komplex spielt in der
Thrombozytenaggregation eine zentrale Rolle (Woodside et al. 2001). Durch
Signaltransduktion des aktivierten Thrombozyten wird der Aggregationsrezeptor
Integrin ĮIIbȕ3 stimuliert. Auf der Oberfläche von ruhenden Blutplättchen bildet Integrin
ĮIIbȕ3 einen Komplex, der kein plasmatisches Fibrinogen binden kann. Erst nach
Aktivierung des Thrombozyten wird am Integrin ĮIIbȕ3 die Bindungsstelle für
Fibrinogen exponiert. Für die Bindung von Fibrinogen ist Ca2+ als Cofaktor
notwendig. Über Fibrinogenbrücken entsteht auf diese Weise ein Mikroaggregat
(Gawaz et al. 1999). Neben Fibrinogen bindet das aktivierte Integrin ĮIIbȕ3 noch
weitere, im Plasma vorhandene Adhäsionsmoleküle, wie vWF und Fibronektin, und
erreicht so die Rekrutierung von anderen Thrombozyten (Ruggeri et al. 2002).
Hat der entsprechende Ligand an seinen Membranrezeptor gebunden, ist dies in der
Regel der Beginn einer
komplizierten Signalkaskade, in deren Verlauf auch
bestimmte Komponenten des Zytoskeletts eine wichtige Rolle spielen.
2.4.6
Das Thrombozyten-Zytoskelett
Für den größten Teil der Glykoprotein-Komplexe wurden bereits Verbindungen zum
Zytoskelett identifiziert. Das Zytoskelett ist bei Thrombozyten hauptsächlich aus Aktin
und Myosin aufgebaut. Diese Proteine bilden ein dreidimensionales Netzwerk zur
Stabilisierung innerhalb des gesamten Thrombozyten (Boyles et al. 1985) (Hartwig et
al. 2006). Ein weiteres zweidimensionales Netzwerk aus kürzeren Aktin-Filamenten
ist für die scheibenförmige Gestalt der ruhenden Thrombozyten verantwortlich, an
welchen die Membranrezeptoren über die Aktin-Bindungs-Proteine verankert sind
16
2. Einleitung
(Hartwig et al. 1991). Des Weiteren unterstützt ein am Rand befindliches Bündel von
Mikrotubuli das Aktin-Membran-Skelett die diskoide Form der Plättchen aufrecht zu
erhalten (White et al. 1984) (Hartwig et al. 2006).
Die der Hämostase und Thrombose zugrunde liegenden Prozesse erfordern ein
enges
Zusammenspiel
zwischen
Thrombozyten,
Endothel,
plasmatischen
Gerinnungsfaktoren und der Extrazellulär-Matrix. Wie bereits erwähnt, spielen im
Thrombozyten hierbei besonders die Plasmamembran mit ihren Rezeptoren und das
Zytoskelett eine wichtige Rolle (2.4).
2.5
Signaltransduktion
Eine besondere Bedeutung kommt bei der Signalübertragung in Blutplättchen den
spezifischen Adhäsionsrezeptoren zu. Thrombozyten besitzen membrangebundene
Glykoproteine, die die Interaktion von Blutplättchen untereinander (Integrin ĮIIbȕ3), mit
der subendothelialen Matrix (vWF-Rezeptor, Kollagenrezeptor), mit plasmatischen
Gerinnungsfaktoren (vWF-Rezeptor), mit Endothelzellen (Integrin ĮIIbȕ3) oder
Leukozyten (P-Selektin) vermitteln. Diese Glykoproteine lassen sich aufgrund ihrer
Molekülstruktur in 4 Gruppen einteilen:
Integrine, leuzinreiche Glykoproteine, Selektine und Rezeptoren vom Immunglobulin
(Gawaz et al. 1999). Bei den Rezeptoren unterscheidet man zwischen aktivierenden
und inhibierenden Rezeptoren. Über die aktivierenden Rezeptoren werden innerhalb
der Thrombozyten Signalwege induziert, die zu einer Stimulation von Adhäsion und
Aggregation führen. Inhibierende Rezeptoren hingegen hemmen diese Vorgänge.
Thrombozyten sind in der Lage, auf eine Vielzahl verschiedener Agonisten zu
reagieren, im Falle einer Blutgefäßverletzung schnell zu aggregieren und ein
Fibringerinnsel zu bilden. Einer dieser Agonisten ist das ADP, welches auf die beiden
G-Protein-gekoppleten Rezeptoren P2Y1 und P2Y12 (Abb. 2-5) wirkt, die an der
Zelloberfläche lokalisiert sind und deren kritische Rolle in Bezug auf die
Thrombozytenantwort auf eine vaskuläre Verletzung bereits beschrieben wurde (2.3).
Aus diesem Grund bilden pharmakologische Blockaden des P2Y12-Rezeptors ein
wirkungsvolles, therapeutisches Hilfsmittel in der Behandlung und Vorbeugung von
arteriellen Thrombosen, die im Zusammenhang mit koronarer Atherosklerose stehen
(Geiger et al. 1998) (Mehta et al. 2001) (Steinhubl et al. 2002).
17
2. Einleitung
Abb. 2-5: P2Y12 beeinflusst die P2Y1-abhängige Kalzium-Erhöhung über zwei separate
Mechanismen: (1) die Aktivierung von PI3K und (2) die Inhibition der Adenylatcyclase.
Desweiteren ist P2Y1 in der Lage die P2Y12-Antwort über die kalzium-abhängige Aktivierung der
Src-Kinase negative zu regulieren. (Quelle: Hardy et al. 2005)
2.5.1 Integrin ĮIIbȕ3
Integrine sind nicht-kovalent miteinander verbundene ubiquitäre transmembrane Į/ȕ
Heterodimere, die sich aus einer Į- und einer ȕ-Untereinheit zusammensetzen und
diverse Prozesse, die Zellmatrix und Zell-Zell-Interaktionen betreffend, vermitteln
(Hynes et al. 2002). Sowohl die Į- als auch die ȕ-Untereinheit bestehen aus einer
großen aminoterminalen extrazellulären Domäne, einem kleinen transmembranären
und einem carboxyterminalen zytoplasmatischen Teil. Der zytoplasmatische Teil der
ȕ-Kette
verankert
den
Integrinrezeptor
im
Zytoskelett
und
reguliert
die
Rezeptorfunktion (Gawaz et al. 1999). In Thrombozyten sind Integrine für die
Thrombozytenaggregation und –adhäsion während der Hämostase verantwortlich
(Diavoco et al. 1996). Ein wichtiges Integrin in diesem Prozess ist der
Fibrinogenrezeptor Integrin ĮIIbȕ3. Er ist Bestandteil der Plasmamembran, des
offenen kanalikulären Systems und der Į-Granula, und mit einer durchschnittlichen
Anzahl von ca. 80.000 pro unstimuliertem Thrombozyt, das am häufigsten
18
2. Einleitung
vorkommende Membranglykoprotein (Shattil et al. 1989) (Wagner et al. 1996). Die
Expression von Integrin ĮIIbȕ3 ist ausschließlich auf Zellen, die aus Megakaryozyten
entstehen, begrenzt (Hato et al. 1997). Ein wichtiger Aspekt der ĮIIbȕ3-Funktion ist die
Modulation des Rezeptors durch Thrombozyten-Agonisten. Obwohl ĮIIbȕ3 die
Adhäsion unstimulierter Thrombozyten in vitro an viele seiner immobilisierten
Liganden vermittelt, ist trotzdem die Thrombozytenstimulation notwendig, damit die
ĮIIbȕ3-induzierte
Thrombozytenaggregation
über
die
Bindung
von
löslichem
Fibrinogen und vWF stattfindet (Bennett et al. 1999).
Eine schnelle Regulation der Integrine wird über Affinitätsmodulation ermöglicht.
Affinitätsmodulation bedeutet, dass durch extrazelluläre Einflüsse der Rezeptor seine
Konformation verändert und von einem niedrigaffinen in einen hochaffinen
Funktionszustand übergeht (Müller et al. 1993) (Peerschke et al. 1994). Besonders
bei der Thrombozytenaggregation kommt dem Glykoprotein Integrin ĮIIbȕ3 eine
wichtige Rolle zu, da es für die Bindung von löslichem Fibrinogen an die aktivierte
Thrombozytenoberfläche notwendig ist. In ruhenden Thrombozyten befindet sich der
Fibrinogenrezeptor in seinem inaktiven Zustand, erst nach Bindung eines Agonisten
an
seinen
spezifischen
Rezeptor
kommt
es
zu
einer
intrazellulären
Signaltransduktion („inside signal“), die zu einer Aktivierung des GPIIb-IIIa über
dessen
zytoplasmatischen
Teil
führt
(„inside-out
signalling“).
Sowohl
der
zytoplasmatische Teil als auch die extrazelluläre, ligandenbindende Domäne
verändern ihre Konformation, durch welche die Fibrinogenbindungsstelle freigelegt
wird („outside signal“) (Xiong et al. 2003). Die Bindung von Liganden erfolgt über
eine Erkennung der Aminosäuresequenz Arginin-Glycin-Aspartat (RGD). Die RGDSequenz ist ein Bestandteil von zahlreichen extrazellulären Matrixproteinen und
befindet sich u.a. auch am Fibrinogenmolekül (Bennett et al. 1979).
Wegen seiner Rolle in der Regulation von Thrombozytenfunktionen wurde dieses
Integrin
während
der
letzten
Jahre
intensiven
Studien
unterzogen. Diese
Untersuchungen gaben wesentliche Einblicke in die Beziehung zwischen Struktur
und Funktion und haben zur Entwicklung von anti-thrombotischen Medikamenten, die
auf eben diesen Rezeptor abzielen, geführt. Dennoch machen diese Studien
deutlich, dass das Verständnis der Struktur und Funktion von ĮIIbȕ3 immer noch
unzulänglich ist (Plow et al. 2001).
19
2. Einleitung
2.5.2 Integrin ĮIIbȕ3-vermittelte Signaltransduktion
Wie bereits eingangs erwähnt, ist auch die morphologische Veränderung („shape
change“) der Thrombozyten während der Aggregation die Folge eines komplexen
Signalweges (Wurzinger et al. 1990) (Hartwig et al. 1991). Dieser ist die Antwort der
Blutplättchen auf Aktivatoren wie Thrombin, ADP oder TxA2, welche durch die
Aktivierung von zahlreichen G-Protein-vermittelten Signalwegen die morphologische
Veränderung, die Degranulation und die Integrin ĮIIbȕ3-vermittelte Aggregation
induzieren. Alle drei Aktivatoren wirken über unterschiedliche Mechanismen, um eine
komplette Thrombozyten-Aktivierung zu erreichen. ADP aktiviert Gq und Gi über
seine Rezeptoren P2Y1 und P2Y12, wohingegen TxA2 und Thrombin vornehmlich Gq
und G12/G13 über den TxA2-Rezeptor oder die Protease-aktivierten Rezeptoren
PAR1/PAR4 oder PAR3/PAR4 stimulieren (Offermanns et al. 2006).
P2Y12 ist verantwortlich für die Aggregations- und Sekretions-Antwort der
Thrombozyten. Blutplättchen, die defizient für P2Y12 sind oder in welchen P2Y12
blockiert wurde, zeigen eine reduzierte funktionelle Reaktion auf ADP oder andere
Agonisten wie Thrombin oder Kollagen. Dies lieferte den ersten direkten Beweis
dafür, dass ADP über den P2Y12-Rezeptor wirkt (Hirsch et al. 2001) (Lian et al.
2005). Des Weiteren wurde gezeigt, dass P2Y12 an die Hemmung der
Adenylatcyclase über GĮI gekoppelt ist und in Zusammenhang mit der Aktivierung
der Phosphatidylinositol-3-Kinase (PI3K) steht (Hirsch et al. 2006). Die Bindung von
ADP an den P2Y12-Rezeptor bewirkt Gi-vermittelt eine verstärkte Granulasekretion
und eine Unterstützung der irreversiblen Thrombozyten-Aggregation (Dorsam et al.
2004).
Die Thrombozyten-Aggregation wird schließlich durch das Integrin ĮIIbȕ3, welches
verschiedene extrazelluläre Liganden, wie Fibrinogen und vWF bindet, induziert. Die
dimere Struktur des Fibrinogens und die multimere Struktur des vWF ermöglichen es
hierbei dem Fibrinogen die Thrombozyten miteinander zu verknüpfen und ein
Thrombozyten-Aggregat zu bilden. In ruhenden Thrombozyten befindet sich ĮIIbȕ3 in
seinem inaktiven Zustand, in welchem die Ligandenbindungs-Affinität niedrig ist und
es zu keiner Signalübertragung kommt. Durch rezeptorvermittelte Zellaktivierung
kommt es zur intrazellulären Signaltransduktion, die zur Aktivierung der Integrine
über zytoplasmatische Anteile des Rezeptors führt, dem sogenannten „inside out
signalling“, welches zur Fibrinogen/vWF-vermittelten Thrombozyten-Aggregation
führt (Priddle et al. 1998) (Critchley et al. 2000) (Tadokoro et al. 2003) (Shattil et al.
20
2. Einleitung
2004) (Bennett et al. 2005) (Ratnikov et al. 2005). Umgekehrt bewirkt eine Bindung
von Liganden ebenfalls eine Konformationsänderung des Integrinrezeptors, welche
anschließend zu einer Aktivierung von intrazellulären Signalvorgängen führt, dem
sogenannten „outside in signalling“ (s. 2.7.1 Integrin ĮIIbȕ3).
Im weiteren Verlauf der Signalkaskade führt die Aktivierung von Gi zu einer
Freisetzung einer beträchtlichen Menge an G-Protein-ȕȖ-Untereinheiten, welche
verschiedene Effektoren regulieren und möglicherweise an der ĮIIbȕ3-Aktivierung
beteiligt sind. Der ȕȖ-Komplex aktiviert die beiden Isoformen (PI3Kȕ und PI3KȖ) der
PI3K, welche beide in Thrombozyten exprimiert werden (Hirsch et al. 2006) (Jackson
et al. 2004). Die Aktivierung der PI3K führt weiterhin zur Bildung von 3phosphorylierten Phosphoinositolphosphaten (PIP3), welche eine Vielzahl von
Effektoren, einschließlich die unterschiedlichen Isoformen der PKC oder PKB/Akt,
aktivieren (Vanhaesebroeck et al. 2001) (Wymann et al. 2003). Die Relevanz von
PI3-K in der Aktivierung von Integrin ĮIIbȕ3 wird deutlich durch Untersuchungen an
PI3-KȖ-defizienten Mäusen, die nach Stimulation mit ADP nur eine reduzierte
Aggregation zeigten (Hirsch et al. 2001) (Lian et al. 2005). Dennoch sind
umfassende weitere Studien notwendig, um die Rolle des Integrins ĮIIbȕ3 und
dessen Bedeutung für die Hämostaseforschung zu erläutern.
2.6
Interaktom (Interaktionsnetzwerk)
Ein Interaktom ist die Gesamtheit aller molekularen Interaktionen in einer Zelle.
Seine grundlegende Einheit ist die Protein-Protein-Interaktion. Da ein Interaktom den
kompletten Organismus berücksichtigt, besteht die Notwendigkeit eine sehr große
Menge an Informationen zu sammeln. Bisher wurden diverse experimentelle
Methoden zur Untersuchung von Protein-Protein-Interaktionen verwendet, wie z.B.
die Affinitätsaufreinigung oder das Yeast-Two-Hybrid-System.
Es existieren aktuell diverse Techniken um Untersuchungen der Gen-Translation und
der
Protein-Expression
in
Thrombozyten
voranzubringen.
Gerade
die
Massenspektromerie liefert kontinuierlich zahlreiche neue Daten des ThrombozytenProteoms (Marcus et al. 2000) (O’Neill et al. 2002) (Garcia et al. 2004) (Moebius et
al. 2005) (Martens et al. 2005) (Garcia et al. 2005) Auch bezüglich des
Thrombozyten-Transkriptoms sind einige Studien aktuell publiziert worden (Gnatenko
et al. 2003) (McRedmond et al. 2004) (Dittrich et al. 2006). Obwohl diese Studien
eine so große Anzahl an Thrombozyten-Proteinen und -Transkripten identifizierten,
21
2. Einleitung
hat
bisher
noch
keine
Einordnung
und
Auswertung
dieser
Datenmengen
stattgefunden. Aktuelle Untersuchungen der Hefe Saccharomyces cerevisiae (Uetz
et al. 2000) (Ito et al. 2001) (Gavin et al. 2002) (Ho et al. 2002) und von
Caenorhabditis elegans und Drosophila melanogaster haben eine Anzahl von largescale Interaktionen mittels Yeast-Two-Hybrid-System und TAP-Technologie (tandem
affinity purification) geliefert. 2005 fand zum ersten Mal eine systematische
Identifizierung neuer Interaktionen des menschlichen Proteoms (Rual et al. 2005)
(Stelzl et al. 2005) ebenfalls unter Anwendung des Yeast-Two-Hybrid-Systems statt,
was zu einer besseren „Clusterung" der Interaktions-Datenbanken führte. So können
nun immer mehr Interaktions-Daten der Literatur in Datenbanken eingeordnet
werden (Peri et al. 2003).
Abb. 2-6: Das Thrombozyten-Interaktom: Eine dichte zentrale Komponente mit einer „scale free
topology“ stellt kurze Signalverbindungen sicher und eine Beständigkeit gegen Zufallsfehler.
Farbgebung: Aus SAGE-Analysen gewonnene Daten (grün), Proteomdaten (gelb), sowohl aus SAGEals auch aus Proteom-Analysen gewonnene Daten (blau) (Dittrich et al. 2008).
22
2. Einleitung
2.6.1 Postulierte Interaktoren von Integrinen
Die Extrazellulär-Matrix (ECM) liefert die strukturelle Basis für die Bildung von
Geweben und Organen. Die Interaktion einer Zelle mit der ECM ist essentiell für die
Regulation zellulärer Vorgänge wie Proliferation, Differenzierung, Überleben und
Genexpression. Eine wichtige Familie der Adhäsionsmoleküle, die an die ECM
binden, sind die Integrine (Hynes et al. 2002) (2.5.1). Die Bindung eines Liganden
an ein Integrin aktiviert eine Signalkaskade, die zur Bildung eines MultiproteinKomplexes führt. Diese Ereignisse haben zwei wichtige Auswirkungen auf die Zelle:
Sie formen eine Verbindung zwischen der ECM und dem Zytoskelett und sie
beeinflussen den Ablauf vieler intrazellulärer Signalwege (Calderwood et al. 2000).
Wie bereits eingangs erwähnt, besitzt ȕ3-Integrin eine wichtige adhäsive Funktion in
Thrombozyten. In Studien, bei denen diese Funktion näher beschrieben wurde,
traten drei Proteine als wichtige Regulatoren von Integrin-vermittelten Signalwegen
hervor, das sind ILK (Beta-Integrin-gekoppelte-Serin/Threonin-Kinase) (Hannigan et
al. 1996) (Janji et al. 2000) (Pasquet et al. 2002), PINCH (particularly interesting new
Cys-His protein) (Rearden et al. 1994) (Tu et al. 1999) und Parvin (Yamaji et al.
2001) (Tu et al. 2001).
2.6.2 ILK (Beta-Integrin-gekoppelte-Serin/Theronin-Kinase)
ILK ist eine ubiquitär exprimierte, 451 Aminosäuren große Serin/Threonin Kinase mit
einem Molekulargewicht von 59 kDa. 1996 wurde mittels des Yeast-Two-HybridSystems nachgewiesen, dass ILK an den zytoplasmatischen Teil von Integrin-ȕ1
bindet (Hannigan et al. 1996). Des Weiteren fand man in dieser Studie heraus, dass
ILK in der Zelle im “Focal Adhesion Komplex" lokalisiert ist und aus drei strukturellen
Untereinheiten besteht. Am N-terminalen Ende des Moleküls befindet sich eine
Domäne, die hauptsächlich vier ANK (Ankyrin) Abschnitte enthält, die verantwortlich
für die Interaktion mit PINCH sind (Tu et al. 1999). PINCH ist ein Adaptorprotein, das
fünf
LIM
Domänen
enthält.
LIM
Domänen
ermöglichen
Protein-Protein-
Wechselwirkungen wie beispielsweise zwischen ILK und PINCH. Am ILK-Molekül
befindet sich C-terminal von der Domäne mit den ANK Abschnitten eine PH Domäne
(pleckstrin homology). Hierfür konnte durch Zell-Kultur-Experimente gezeigt werden,
dass der physiologische Ligand dieser Domäne das Phosphatidylinositol-3,4,5trisphosphat ist (Delcommenne et al. 1998) (Persad et al. 2000). Am C-terminalen
23
2. Einleitung
Ende von ILK befindet sich eine Domäne, mit zwölf katalytischen Abschnitten für
Proteinkinasen. Zusätzlich ist in diesem Bereich auch eine Bindungsstelle für die
zytoplasmatische Domäne von ȕ1-Integrin (Abb 2-7).
Abb. 2-7: Multidomänen-Struktur von ILK; ANK: Ankyrin, PH: Pleckstrin Homology
2.6.3 Interaktionspartner von ILK
Zum einen interagiert ILK, wie bereits erwähnt, mit der zytoplasmatischen Domäne
der membrangebundenen ȕ-Integrine (ȕ1 und ȕ3) und zum anderen besitzt es eine
sehr hohe Affinität zu PINCH, einem Protein das ungebunden frei im Zytoplasma
vorkommt (Rearden et al. 1994) (Wu et al. 1999). Die erste LIM-Domäne (LIM1)
enthält zwei aufeinander folgende Zink-Finger Motive. Die ILK-PINCH Interaktion
wird am ILK über einen Abschnitt mit Ankyrin (ANK)-repeats am N-Terminus
vermittelt. Am PINCH Molekül findet die Bindung an der ganz N-terminal gelegenen
LIM-Domäne (LIM1) an einem darin enthaltenen Zink-Finger Motiv statt (Tu et al.
1999).
Ein weiterer Interaktionspartner des ILK ist Parvin (Abb. 2-8), ein Aktin-bindendes
„Focal Adhesion Protein“ mit zwei Calponin homologen (CH) Domänen (Olski et al.
2001). Humanes Parvin ist strukturell dem Actopaxin der Ratte nah verwandt, einem
Aktin und Paxillin bindenden Protein. Die Interaktion zwischen ILK und Parvin wird
über die C-terminale Domäne von ILK und die CH2-Domäne von Parvin vermittelt
(Nikolopoulos et al. 2000) (Tu et al. 2001) (Yamaji et al. 2001).
24
2. Einleitung
Abb. 2-8: Der IPP (ILK-PINCH-Parvin)-Komplex und ein Teil des Thrombozyten
Interaktionsnetzwerkes. Alle direkten Interaktionspartner von ILK, PINCH (LIMS1) und Parvin (Į and
ȕ) wurden aus unserem in silico Interaktom extrahiert. Gestrichelte Linien stellen Interaktionen dar, die
durch large scale Y2H Daten gewonnen wurden und durchgezogene Linien deuten auf Interaktionen
hin, die aus Literaturdaten entnommen wurden. Diese Daten aus anderen Zelltypen legen nahe, dass
auch im Thrombozyten die Interaktionen von ILK und PINCH experimentell zu prüfen sind (fette
durchgezogene Linie) Farbgebung: Aus SAGE-Analysen gewonnene Daten (grün), Proteomdaten
(gelb), sowohl aus SAGE- als auch aus Proteom-Analysen gewonnene Daten (blau), weiß hinterlegte
Proteine sind potentielle Interaktionspartner, aber die Existenz ist in Thrombozyten bisher nicht
beschreiben. (Dittrich et al. 2008) (Abk.: s. Anhang)
2.6.4 Der ILK-PINCH-Parvin (IPP) – Komplex
Gleichzeitige Interaktionen der zwei verschiedenen Domänen von ILK am N- und Cterminalen Ende führen zur Assemblierung eines stabilen ILK-PINCH-ParvinKomplexes. Dieser ternäre Komplex stellt eine wichtige Verbindung zwischen
Transmembranrezeptoren wie Integrinen und Aktin-Filamenten dar (Tu et al. 2001).
Eine Reihe von biochemischen, strukturellen, zellbiologischen und genetischen
Studien haben neue Erkenntnisse über die zelluläre Funktion des IPP-Komplexes
geliefert. So fand man heraus, dass Mutationen in den ILK- (Zervas et al. 2001)
(Mackinnon et al. 2002), PINCH- (Hobert et al. 1999) (Clark et al. 2003) oder Parvin(Lin et al. 2003) kodierenden Genen in Invertebraten wie Caenorhabditis elegans und
Drosophila melanogaster alle zu Interaktionsdefekten mit der ECM führten, da keine
25
2. Einleitung
ILK-Aktin-Bindung stattfinden konnte. Weiterhin resultiert die Inaktivierung des ILKGens bei Mäusen in früher embryonaler Letalität, da Mauszellen, denen das ILKProtein fehlt, eine veränderte Aktin-Zytoskelett-Organisation zeigen (Sakai et al.
2003) (Grashoff et al. 2003) (Terpstra et al. 2003).
Wie demnach eine Reihe von Studien in den letzten Jahren gezeigt hat, besitzt der
IPP-Komplex eine Schlüsselrolle in der Regulierung der Zell-ECM-Kommunikation.
Außerdem wurde mit diesen Studien begonnen, die molekularen Mechanismen, die
der Assemblierung, Funktion und Regulation des Komplexes zugrunde liegen,
aufzudecken. Während durch diese Untersuchungen eine wichtige Basis für
zukünftige Studien geschaffen wurde, bleiben dennoch viele Fragen unbeantwortet.
Ein komplettes Verständnis des Komplexes würde eine wichtige Möglichkeit
eröffnen, um Einblicke in den gesamten Mechanismus der Zell-ECM-Adhäsion und Signaltransduktion zu bekommen. Eine mögliche Relevanz von ILK und seinen
Interaktionspartnern wurde bereits für Krebs (Persad et al. 2003) und anderen
pathologische und physiologische Prozesse wie der Proteinurie (Dai et al. 2006)
nachgewiesen.
Da eine essentielle Rolle des Komplexes beim shape change in verschiedenen
Zelltypen wie C2C12 Mauszellen und humanen 293 embryonalen Nierenzellen
(Zhang et al. 2002) beschrieben wurde, kann man erwarten, dass der Komplex auch
in Thrombozyten, die durch die Aktivierung ebenfalls einer Aktin-ZytoskelettReorganisation unterzogen werden, von Bedeutung sein muss. Bisher konnten
lediglich
die
zwei
der
IPP-Komplex-Komponenten
(ILK
und
D-Parvin)
in
Thrombozyten identifiziert werden (Yamaji et al. 2002), jedoch war man noch nicht in
der Lage den gesamten Komplex mit den morphologischen Veränderungen während
der Aktivierung, in Verbindung zu bringen.
2.7
Relevanz der Thrombozyten-Reinheit
In aktuellen Studien wurden Technologien für die Untersuchung von mRNA (Bugert
et al. 2003) (Gnatenko et al. 2003) (McRedmond et al. 2004) (Rox et al. 2004)
(Dittrich et al. 2006) (Healy et al. 2006) (Hillmann et al. 2006) und Proteinanalysen
(Marcus et al. 2000) (O’Neill et al. 2002) (Garcia et al. 2004) in Thrombozyten
beschrieben, die für zukünftige Forschungsarbeiten unerlässlich sind. Somit hat die
Ära von „Genomics“ und „Proteomics“ in der Thrombozytenforschung Einzug
26
2. Einleitung
gehalten und wird in Zukunft wichtige Werkzeuge für das Verständnis von
Thrombozytenpathologien liefern (Gawaz et al. 2006).
Transkriptom- und Proteom-Studien liefern umfangreiche Einblicke in ThrombozytenSignaltransduktions-Prozesse. Es wird angenommen, dass Thrombozyten ProteomStudien („Proteomics“) für die Untersuchung von komplexen Prozessen der
Thrombozytenfunktion durch die Identifikation neuer plättchen-exprimierter Proteine,
die Aufklärung von metabolischen Signalwegen und die Analyse funktioneller
Änderungen des Plättchen Proteoms im gesundem und im pathologischem Zustand,
von erheblicher Bedeutung sein werden.
Auf der Transkriptom Ebene sind Methoden wie „serial analysis of gene expression“
(SAGE) und Mircroarray Technologie für die Untersuchung von mRNA in
Thrombozyten unerlässlich (Bugert et al. 2003) (Gnatenko et al. 2003) (Rox et al.
2004) (McRedmond et al. 2004) (Dittrich et al. 2006) (Healy et al. 2006) (Hillmann et
al. 2006). Während das Transkriptom einer Zelle die Gene definiert, die exprimiert
werden, sind die kodierten Proteine für den Großteil der zellulären Funktionen
verantwortlich. Während der letzten 20 Jahre haben verschiedene Forschergruppen
Daten über das Thrombozyten Proteom gesammelt, wobei die unterschiedlichen
Aspekte der Plättchen und ihrer Signalnetzwerke fokussiert wurden (Dittrich et al.
2005) (Gnatenko et al. 2006). Zwei-dimensionale Polyacrylamidgel-Elektrophorese
(2-DE) in Kombination mit Massenspektrometrie (MS) haben sich in diesem
Zusammenhang zu den am weitesten verbreiteten Techniken zur Separierung von
komplexen Proteingemischen entwickelt (Marcus et al. 2000) (O’Neill et al. 2002)
(Garcia et al. 2004). Neue Bemühungen zur Präfraktionierung von Thrombozyten vor
der MS-Analyse (Moebius et al. 2005) (Maynard et al. 2007) und zur Untersuchung
von Modifikationen von humanen Thrombozytenproteinen wie Phosphorylierung
(Maguire et al. 2003) (Marcus et al. 2003) (Garcia et al. 2004) (Garcia et al. 2006)
(Zahedi et al. 2006) (Zahedi et al. 2007) und Glykosylierung (Lewandrowski et al.
2006) (Lewandrowski et al 2007) wurden durchgeführt.
Während für alle „large-scale“ mRNA Techniken, einschließlich SAGE und
Mircoarray,
die
Präparationen
der
Thrombozyten
normalerweise
auf
Kontaminationen mit anderen Blutzellen untersucht werden, gibt es aktuell keinen
Standard für eine Reinheitskontrolle für Techniken zur Proteomanalyse. Es existieren
nur wenige Daten, die eine Restkontamination mit Erythrozyten und Serumproteinen
in Erwägung ziehen. Auch sollte eine mögliche Thrombozytenaktivierung während
27
2. Einleitung
der Präparation bedacht und ausgeschlossen werden, um sicherzustellen, dass die
Rezeptoren im Anschluss an die Präparation immer noch funktional sind.
Somit ist bei der Arbeit mit Thrombozyten in neuen, „state-of-the-art“ Methoden wie
SAGE
und
Microarray
zur
Untersuchung
des
Transkriptoms,
oder
Massenspektrometrie für das Proteom, der Grad der Reinheit die größte
Herausforderung. Die Kontamination der Plättchenprobe mit anderen Zelltypen und
Plasmaproteinen muss auf ein Minimum reduziert werden. Demnach ist für die
detaillierte Charakterisierung von Organellen der Blutplättchen ebenfalls ein hoher
Grad an Reinheit erforderlich, um Interferenzen durch Bestandteile anderer
Blutzellen zu vermeiden.
2.8
Problemstellung
Ziel dieser Arbeit war es, eine Methode zu entwickeln, mit welcher es möglich ist,
Thrombozyten aus Vollblut aufzureinigen und dabei von anderen Blutzellen, wie
Leukozyten, Erythrozyten und Blutplasmaproteinen abzutrennen. Da auch geringe
Verunreinigungen in einer Thrombozytenprobe bei Untersuchungen auf Proteomoder Transkriptom-Ebene invalide Ergebnisse liefern, war es von hoher Relevanz
eine effiziente Aufreinigungsmethode zu entwickeln, mit welcher man hochreine
Plättchen generieren kann.
Die nach dem neuen Protokoll hergestellten hochreinen Plättchen wurden
anschließend
für
die
Analyse
der
Phospholipid-Zusammensetzung
der
Thrombozytenplasmamembran und der intrazellulären Membranen verwendet, um
Unterschiede in deren Aufbau identifizieren zu können.
Des Weiteren fanden die aufgereinigten Plättchen Anwendung in einer InteraktionsStudie des Thrombozyten. Hierbei sollten die von der Bioinformatik postulierten
Protein-Interaktionen in Blutplättchen biochemisch bestätigt werden. Um sichergehen
zu können, dass die nachgewiesenen Protein-Interaktionen von Thrombozyten
stammen und nicht von Kontaminationen durch andere Zellen, war es von größter
Wichtigkeit, dass sich im Probenmaterial ausschließlich Thrombozyten befanden.
Daher war es bei diesen Versuchen ebenfalls erforderlich, dass die Analysen mit
hochreinen Plättchen durchgeführt wurden.
28
3. Material und Methoden
3
Material und Methoden
3.1 Material
Material
Hersteller
BD Discardit II Spritze 5 ml
BD biosciences, Heidelberg
BD LeucoCOUNTTM Set
Dynabeads® Pan Mouse IgG
Dynal / Invitrogen GmbH, Karlsruhe
Dynabeads® M-280 Sheep anti-Rabbit IgG
Dynal / Invitrogen GmbH, Karlsruhe
ECL Plus Western Blotting Detection System
GE Healthcare, Buckinghamshire, UK
Gel Blotting Papier
Schleicher & Schuell, Dassel
Einmal-Sterilfilter (0,2 und 0,45 µm)
Röntgenfilme (Super RX)
Fuji GmbH, Düsseldorf
Magentpartikel-Konzentrator
Chemagen, Beasweiler
TM
Micro BCA
Protein Assay Kit
Pierce, Perbio Science GmbH, Bonn
MinElute PCR Purification Kit
Qiagen, Hilden
®
PROTRAN Nitrocellulose Transfer Membran
Protein G Immunoprecipitation Kit
Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München
Sterican Einmal-Kanülen Ø 1,20 × 50 mm
Braun Melsungen AG, Melsungen
SuperScriptIII First-Strand® Synthesis System
Invitrogen, Karlsruhe
Taq PCR Master Mix Kit
Qiagen, Hilden
3.2 Geräte
Gerät
Hersteller
Centrifuge 5415 D
Eppendorf AG, Hamburg
Centrifuge 5810 R
Eppendorf AG, Hamburg
FACSCalibur Durchflusszytometer
French-Press®
Mini PROTEAN3 Gelkammersystem
Polytec GmbH, Waldbronn
Andreas Hettich GmbH &Co. KG,
Tuttlingen
Biorad Laboratories GmbH, München
Mini Transblot Zelle
Peristaltikpumpe Typ ISM829
ISMATEC SA, Glattbrugg-Zürich, Schweiz
POWERPac 200
Bandelin electronic GmbH & Co. KG,
Berlin
Hettich Universal 16 A Zentrifuge
Sonicator (Sonopuls GM 70)
29
L-80 Ultracentrifuge
Beckman Coulter, Krefeld
Vortex Genie 2
Scientific industries, Bohemia, New York
X-OMAT M35 Entwickler
Eastman Kodak Comp., New Haven, USA
3.3 Chemikalien
Substanz
Hersteller
Aceton
Mallinckrodt Baker, Griesheim
Acrylamide/Bis solution 30%
Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe
ADP
Calbiochem, Darmstadt
Agarose
Albumin bovine serum (BSA)
Ammoniumpersulfat
Ammoniumsulfat
AppliChem GmbH, Darmstadt
Antipain
Aprotinin
Apyrase
Bromphenol-blue
Fluka, Buchs SG (Schweiz)
Borsäure
CHAPS
Fluka, Buchs SG (Schweiz)
Chymostatin
Citric Acid
Chloroform
Coomassie Brilliant Blue R250
Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg
DEPC treated water
Ambion, Darmstadt
ECL Plus
®
Amersham Biosciences GmbH, Freiburg
EDTA
Merck KGaA, Darmstadt
EGTA
Ethanol
Ficoll-Paque® Plus
Amersham Biosciences GmbH, Freiburg
D-Glucose 99,5% GC
Glutaraldehyd, 25%, Grade I
Glycerin
Glycine
SERVA Electrophoresis GmbH, Heidelberg
Hank’s balanced salt solution
30
HEPES
Isopropanol
Kaliumchlorid
di-Kaliumhydrogenphosphat
Leupeptin
Magnesiumchlorid
ȕ-Mercaptoethanol
Methanol
Milchpulver Blotting Grade
MOPS
Natrium Fluorid minimum 99%
NatriumdihydrogenphosphatMonohydrat
Natriumhydrogencarbonat
di-NatriumhydrogenphosphatDihydrat
Natronlauge 5 N
Nonidet® P 40 Substitute
Optiprep®
Progen, Heidelberg
ortho-Phosphorsäure 85%
Pepstatin
PMSF
Ponceau S
Rotenone 95%
Salzsäure 5 N
Sodium dodecyl sulfate
Sodium Fluoride, minimum 99%
Sodium orthovanadate 99,98%
Sucrose 99+%
Trichloressigsäure
TEMED
Thrombin
Roche Diagnostics GmbH, Mannheim
Triton X-100
TWEEN® 20
31
3.4 Puffer und Lösungen
Acid Citrate Dextrose-Puffer
10% APS
68 mM Glucose
10% (w/v) Ammoniumpersulfat
74 mM Zitronensäure
CCD-Puffer
CGS-Puffer
100 mM tri-Natrium-Citrat
120 mM NaCl
13
7 mM Zitronensäure
140 mM Glukose
mM tri-Natrium Citrat
30 mM Dextrose
pH 7,0
15 mM EGTA
Coomassie-Färbelösung
Coomassie-Entfärbelösung
200 mg Coomassie R250
70 ml Essigsäure
34
g Ammoniumsulfat
10 ml Methanol
4,5 ml Phosphorsäure (85%)
20 ml Glycerin
68 ml Methanol
ad 1000 m Millipore
ad 200 ml Millipore
Coomassie-Equilibrierungs-Lösung
20 ml Ethanol
10 ml Glycerin
ad 100 ml Millipore
DNA-Probenpuffer (5×)
Ethidiumbromid-Stammlösung
50% (v/v) Glycerin
10 mg/ml Ethidiumbromid
0,1% (w/v) Bromphenolblau
HEPES/NaCl Puffer
Immunopräzipitatios-Puffer
150 mM NaCl
PBS-Puffer
10 mM HEPES
5 µg/ml Antipain
5 mM KCl
2 µg/ml Aprotinin
1 mM MgCl2
6 µg/ml Chymostatin
10 mM D-Glucose
pH 7.4 2,5 µg/ml Leupeptin
2 µg/ml Natrium Fluorid
1 µg/ml Pepstatin
10× Na2CO3-Puffer
100 mM NaHCO3
30 mM Na2CO3
PBS-Puffer
3 mM NaH2PO4 * H2O
22 mM Na2HPO4 * 2H2O
150 mM NaCl
0,1 %
pH 7,2 – 7,6
BSA
32
PonceauS-Färbelösung
Protease-Inhibitoren (1000×)
0,2% (w/v) PonceauS
8 mM Antipain
3% (w/v) Sulfosalicylsäure
0,3 mM Aprotinin
3% (w/v) TCA
10 mM Chymostatin
5 mM Leupeptin
5
M Natriumfluorid
1,5 mM Pepstatin
Puffer A (Hillmann et al.)
10× Puffer B
6 mM Glucose
2,4 M NaCl
2,14 M Glucose in 100 ml H2O lösen (1)
130 mM NaCl
9 mM NaHCO3
0,5 M EGTA
10 mM Natrium Citrat
0,43 M Tris
3 mM KCl
10 mM Tris
0,07 M EDTA in 50 ml H2O lösen durch
81 mM KH2PO4
Zugabe von 10 M NaOH (2)
9 mM MgCl2
pH 7,4
(1) & (2) mischen auf pH 7,4 einstellen
Puffer C
und auf 250 ml auffüllen
SEM-Puffer
1× Puffer B
250 mM Sucrose
50 µg/µl Leupeptin
10 mM MOPS
2 mM
1 mM EGTA
PMSF
Tyrode’s Puffer
145 mmol NaCl
SDS-Probenpuffer (2×)
125 mM Tris/HCl , pH 6,8
5 mmol KCl
20% (v/v) Glycerin
1 mmol MgCl2,
10% (v/v) ȕ-Mercaptoethanol
10 mmol HEPES
6% (w/v) SDS
10 mmol Glukose
pH 7,4 0,1% (w/v) Bromphenolblau
Silberfärbung-Fixierlösung
30% (v/v) Ethanol
Silberfärbung-Färbelösung
1% AgNO3
10% (v/v) Essigsäure
0,025% Formaldehyd
Silberfärbung-Stoplösung
Silberfärbung-Entwicklerlösung
1% (v/v) Essigsäure
pH 7,2
2,5% (w/v) Natrium-Carbonat
0,04% (v/v) Formaldehyd
33
Silberfärbung-Konditioner
SDS-Laufpuffer
0,4 M Natriumacetat
100 ml 10× TG-Puffer
0,5% Essigsäure
0,1% SDS
ad 1000 ml Millipore
30% Ethanol
0,2% Na2S2O3
1% Glutaraldehyd
TBE
90 mM Tris
TBS-T
90 mM Borsäure
500 mM NaCl
2,5 mM EDTA
0,05% (v/v)Tween® 20
TE
10× TG-Puffer
250 mM Tris
1 mM EDTA
1,92 M Glycin
Sammelgel-Puffer
Trenngel-Puffer
0,5 M Tris/HCl , pH 6,8
1,5 mM Tris/HCl , pH 8,0
0,4% (w/v) SDS
0,4% (v/v) SDS
Western-Blot-Puffer
10× Na2CO3-Puffer
0,01% SDS
20% Methanol
ad 1 L H2O
34
3.5 Antikörper (AK)
Abb. 2-1: Organellen einer Eukaryoten-Zelle
3.5.1 Primärantikörper
1. AK
Marker für
Größe
hergestellt
in
Hersteller
Į-Aktin
Zytoskelett
42 kDa
Maus
Acris, Hiddenhausen
Į-Aktinin
Zytoskelett
100 kDa
Maus
Sigma-Aldrich Chemie
GmbH, München
Į-Calnexin
ER
90 kDa
Ziege
Santa Cruz, Heidelberg
Į-Catalase
Peroxisomen
60 kDa
Ziege
Abcam, Cambridge, UK
Į-CD15
Leukozyten
220 kDa
Maus
Į-CD45
Leukozyten
180 kDa
Maus
Į-GAPDH
Zytoplasma
37 kDa
Ziege
Į-Hsp60
MitochondrienMatrix
60 kDa
Kaninchen
Į-ILK
Zytoplasma
59 kDa
Maus
BD GmbH, Heidelberg
Į-ILK
Zytoplasma
59 kDa
Ziege
Į-Integrin ȕ2 Plasmamembran
95 kDa
Maus
86 kDa
Ziege
86 kDa
Maus
Į-Į-Parvin
42 kDa
Kaninchen
Zytoplasma
35
Į-PINCH
Zytoplasma
37 kDa
Maus
BD GmbH, Heidelberg
Į-PMP70
Peroxisomen
70 kDa
Kaninchen
Į-Prohibitin
MitochondrienInnenmembran
30 kDa
Kaninchen
Į-P-Selektin
ǹ-Granula
140 kDa
Ziege
Į-TIM23
MitochondrienInnenmembran
MitochondrienAußenmembran
23 kDa
Maus
BD GmbH, Heidelberg
70 kDa
Ziege
Į-TOM70
D-VASP-PSer157
VASP-PSer157
46/50 kDa
Maus
Nanotools, Teningen
D-VASP-PSer239
VASP-PSer239
46/50 kDa
Maus
Nanotools, Teningen
3.5.2 Sekundärantikörper
2. Antikörper
Hersteller
donkey anti-goat IgG-HRP conjugated
donkey anti-mouse IgG-HRP conjugated
donkey anti-rabbit IgG-HRP conjugated
3.6 Primer
Alle
verwendetetn
Oligonukleotide
wurden
von
der
Firma
TIB
MOLBIOL
Syntheselabor GmbH, Berlin bezogen.
PCR-Produkt Primer
s
5’-gtcttggaaaaaggctttgcgg-3’
as
5’-caatgccactcagcatcttgc-3’
s
5’-gctgcgaagcctggcaagtaac-3’
as
5’-gcgccagagcttctcggtgata-3’
s
5'-tcaaccacaacaatagctact-3'
as
5'-gtctccattgtgaaaataggc-3'
s
5’-tgctgagccttgtggacgtcat-3’
as
5’-tctggctggcaagtcacggtgt-3’
HLA-DQȕ
CD15
CD45
vWF
Größe
Tm
Zyklen
704 bp
60°C
30
370 bp
60°C
40
404 bp
60°C
30
451 bp
60°C
30
36
3.7 Molekularbiologische Methoden
3.7.1 SDS-PAGE (SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese)
Die
elektrophoretische
Auftrennung
von
Proteinen
unter
denaturierenden
Bedingungen wurde unter Verwendung diskontinuierlicher SDS-Polyacrylamid-Gele
(Dimension: 8 cm × 10 cm × 0,8 cm) nach Laemmli (1970), modifiziert nach Kionka
(1986), in einer Mini-Zelle (Biorad Laboratories GmbH, München (Deutschland))
durchgeführt. Bei einer konstanten Stromspannung von 60 V zum Durchlaufen des
Sammelgels
bzw.
120
V
beim
Durchlaufen
des
Trenngels
betrug
die
Auftrennungszeit in 1× Elektrophorese-Puffer (3.4) ca. 1,5 h. Die PolyacrylamidKonzentration des Trenngels variierte hierbei zwischen 8-12,5%. Die Proben wurden
mit SDS-Probenpuffer nach Laemmlie (3.4) versetzt und 5 min bei 95°C erhitzt. Das
Gel
wurde
entweder
zum
`Western-Blotting´
(3.7.4)
eingesetzt
oder
die
Proteinbanden wurden direkt mit Coomassie (3.4) gefärbt.
Trenngel
Millipore
8%
3,54 ml
9%
3,29 ml
10%
3,04 ml
12,5%
2,41 ml
Trenngelpuffer (3.4)
1,85 ml
1,85 ml
1,85 ml
1,85 ml
20% SDS
55 µl
55 µl
55 µl
55 µl
10% APS
50 µl
50 µl
50 µl
50 µl
2,00 ml
2,25 ml
2,50 ml
3,13 ml
5 µl
5 µl
5 µl
5 µl
30% Acrylamid
TEMED
Sammelgel
Millipore
5%
1,40 ml
Sammelgelpuffer (3.4)
1,00 ml
20% SDS
60 µl
10% APS
40 µl
30% Acrylamid
TEMED
0,50 ml
4 µl
Die angegebene Menge für Trenn- und Sammelgel sind für jeweils 2 SDS-Gele.
37
Als Proteinstandard wurden zum einen der „Unstained Protein Molecular Weight
Marker“ (#SM0431) und zum anderen der „PageRuler™ Prestained Protein Ladder“
(#SM0671) der Firma Fermentas, St.Leon-Rot, Deutschland) verwendet.
Abb. 2-3: PageRuler® Prestained Protein
Ladder #SM0671, Fermentas GmbH,
St. Leon-Rot, Deutschland
Abb. 2-2: Unstained Protein Molecular Weight Marker
#SM0431, Fermentas GmbH, St. Leon-Rot, Deutschland
3.7.2 Coomassie-Färbung von SDS-Polyacrylamid-Gelen
Nach der Elektrophorese wird das Gel über Nacht oder mindestens 2 h in
Coomassie-Equilibrierungs-Lösung
(3.4)
fixiert.
Nach
kurzem
Abspülen
mit
destilliertem Wasser erfolgt die Inkubation in Coomassie-Färbelösung (3.4) für 3 bis
12 h unter leichtem Schütteln. Die Entfärbung erfolgt ebenfalls unter leichtem
Schütteln mittels Coomassie-Entfärbelösung (3.4), bis die gewünschte Farbintensität
erreicht ist.
38
3.7.3 Silberfärbung von SDS-Polyarylamid-Gelen
Die Silberfärbung wurde wie folgt durchgeführt:
Lösungen (3.4)
1. Fixierlösung
2. Konditioner
3. Destilliertes Wasser
4. Färbelösung
5. Destilliertes Wasser
6. Entwicklerlösung
7. Stoplösung
Inkubationszeit
60 min
30 min
3 × 10 min
30 min
30 sec
je nach Intensität
10 min
3.7.4 „Western-Blot“
Nach SDS-PAGE (3.7.1) erfolgte der Transfer der Proteine auf Nitrozellulose
(Porengröße: 0,45 Pm) unter Verwendung einer Mini-Transblot-Zelle (Biorad
Laboratories GmbH, München) nach Herstellerangaben und Kionka (1986). Das
„Blotten“ erfolgte für 1 h bei 300 mA in Proteintransferpuffer (3.4). Die Nitrozellulose
wurden 1 min in PonceauS-Färbelösung (3.4) inkubiert und anschließend wurden die
angefärbten Markerbanden markiert.
Die Immundetektion erfolgte nach folgendem Schema:
Lösung
5 % (w/v) Milchpulver o. BSA in TBST o. PBST
Blocken
TBST o. PBST
Waschen
1. Antikörper AK-spezifische Verdünnung (2.5)
TBST o. PBST
Waschen
2. Antikörper 1:10.000 anti-Kaninchen, anti-Maus o. anti-Ziege
TBST o. PBST
Waschen
Inkubation
1 h bei RT
3 × 10 min
ü.N. bei 4°C
3 × 10 min
1 h bei RT
3 × 10 min
Bei den Sekundärantikörpern handelt es sich um IgG-Antikörper, die mit MeerrettichPeroxidase (3.5) gekoppelt sind.
Die Detektion erfolgte gemäß dem ECL Plus Western Blotting Detection System
(3.1).
3.7.5 Proteinmengenbestimmung
Zur Bestimmung des Proteingehaltes einer Lösung wurde das „Micro BCATM Protein
Assay Kit“ von Pierce verwendet. Die Durchführung der Messung wurde nach
Herstellervorgaben vorgenommen.
39
3.7.6 TCA-Fällung (Trichloressigsäure)
Um Proteine aus einer Lösung auszufällen wurden zu 500 µl der Lösung 100 µl
50%iger Trichloressigsäure (TCA) zu gegeben. Die Suspension wurde durch
Inversion gemischt und für 60 min bei -80°C eingefroren.
Im Anschluss daran wurden die Proben bei 21.000 × g für 10 min bei 4°C
zentrifugiert (Eppendorf Kühlzentrifuge 5810R). Der Überstand wurde abgenommen
und das Pellet in 500 µl eiskaltem 80%igem Aceton resuspendiert. Anschließend
wurde erneut bei 21.000 × g für 5 min bei 4°C zentrifugiert. Der Waschschritt wurde
zweimal wiederholt und danach wurde das Pellet in 50 µl 2× SDS-Probenpuffer
aufgenommen, auf 95°C erhitzt und bei -20°C eingefroren. Nun waren die Proben für
Analysen mittels SDS-PAGE (3.7.1) verwendbar.
3.7.7 RNA-Isolation
Zur Isolation von Gesamt-RNA aus Thrombozyten bzw. Leukozyten wurden
entsprechend ca. 3 × 109 Zellen bei 1.000 × g für 10 min bei Raumtemperatur
zentrifugiert. Das entstandene Pellet wurde nach Entfernen des Überstandes in 1 ml
TRIZOL®-Reagenz (3.3) lysiert. Nach einer Inkubationszeit von 5 min bei
Raumtemperatur wurden jeweils 200 µl Chloroform zugefügt, die Suspension wurde
für 15 sec gründlich geschüttelt und anschließend für 3 min erneut bei
Raumtemperatur inkubiert. Danach wurden die Proben bei 11.900 × g für 15 min bei
4°C zentrifugiert. Nach der Zentrifugation erhielt man von unten nach oben eine
Einteilung in eine rote Phenol-Chloroform-Phase, eine Zwischenphase und eine
farblose, wässrige Phase, in der sich die RNA befand. Um die RNA auszufällen
wurde die wässrige Phase in ein steriles Mikrozentrifugengefäß überführt, mit 500 µl
Isopropanol versetzt und nach einer Inkubation von 10 min bei Raumtemperatur bei
11.900 × g für 10 min bei 4°C zentrifugiert. Für jede Probe war nach der
Zentrifugation ein gel-artiges Pellet am Boden des Gefäßes sichtbar.
Um das RNA-Präzipitat zu waschen, wurde der Überstand entfernt, 1 ml 75%
Ethanol hinzu gegeben und da Gefäß für etwa 10 sec auf dem Vortexer geschüttelt.
Anschließend wurde die Probe bei 7370 × g für 5 min bei 4°C zentrifugiert, der
Überstand entfernt und das RNA-Pellet für 5 min luftgetrocknet.
40
Um den Löslichkeitsverlust zu vermeiden, durfte das Pellet nicht komplett trocknen.
An diesem Punkt wurde die RNA in 30 µl DEPC versetztem Wasser gelöst und
gelegentlich gemischt, während sie 10 min bei Raumtemperatur inkubierte.
Für jede Probe wurden zur Quantifikation drei Verdünnungen (3 × 1:100) mit DEPC
treated water hergestellt. Die restliche RNA wurde bei -80°C aufbewahrt.
3.7.8 RNA-Quantifizierungs und Reinheitsüberprüfung
Die Konzentration von RNA wurde durch eine Absorptionsmessung bei 260 nm
(A260) in einem Spektrophotometer, mittels einer Quartz Küvette und DEPC treated
water als Referenz, gemessen. Um die Aussagekraft zu gewährleisten wurden nur
A260 Messungen, die größer als 0,15 waren als zuverlässig angesehen. Eine
Absorption von 1 Einheit bei 260 nm entspricht 44 µg ssRNA pro ml. Daher konnte
der Gehalt an RNA von jeder 1:100-Verdünnung wie folgt berechnet werden:
RNA [µg/ml] : 44 µg/ml × Verdünnungsfaktor (1:100) × A260
Die Reinheitskontrolle wurde ebenfalls mit Hilfe von photospektrometrischen
Messungen durchgeführt. Hierfür wurde der Absorptionswert jeder Probe bei 280 nm
zusätzlich zu dem bei 260 nm bestimmt. Das Verhältnis zwischen den beiden
Absorptionswerten (A260/A280) ließ somit eine Bewertung der RNA-Reinheit in
Hinsicht auf die Verunreinigungen, die das UV Licht absorbieren, wie beispielsweise
Proteine, zu. Reine RNA hat einen A260/A280 Verhältnis von 1,7 – 2,0. Nur Proben,
die dieses Kriterium erfüllt haben wurden für eine anschließende cDNA-Synthese
weiterverwendet.
3.7.9 DNA-Quantifizierung
Der Gehalt an DNA wurde auch photospektrometrisch gemessen. Eine Absorption
von 1 Einheit bei 260 nm entspricht 50 µg dsDNA pro ml. Die DNA-Konzentration der
1:100-Verdünnungen konnte, wie folgt, bestimmt werden:
DNA [µg/ml] : 50 µg/ml × Verdünnungsfaktor (1:100) × A260
DNA-Proben mit einem A260/A280 Verhältnis von 1,8 – 2,0 wurden als rein gewertet
und standen für anschließende Versuche zur Verfügung.
41
3.7.10 cDNA-Synthese
cDNA wurde anhand von RNA aus Thrombozyten bzw. Leukozyten mittels des
SuperScriptIII First-Strand® Synthesis System für RT-PCR (3.1) unter Verwendung
von Random Hexameren synthetisiert. 1 µg Gesamt-RNA wurde, gemäß den
Empfehlungen des Herstellers, in einem Volumen von 20 µl revers-transkribiert.
Hierfür wurde pro Ansatz ein Mix mit folgenden Komponenten in einem 0,2-mlReaktionsgefäß hergestellt:
Komponente
Menge
RNA
1 µg
Primer (50 µg/µl Random Hexamere)
1 µl
10 mM dNTP Mix
1 µl
DEPC treated water
ad 10 µl
Dieser Pre-Mix wurde bei 65°C für 5 min inkubiert und danach für 1 min auf Eis
gekühlt. Währenddessen wurde der cDNA-Mix wie folgt präpariert:
Komponente
Menge
10 × RT Puffer
2 µl
25 mM MgCl2
4 µl
100 mM DTT
2 µl
RNase OUT (40 U/µl)
1 µl
SuperScript III RT (200 U/µl)
1 µl
10 µl des cDNA-Mixes wurden zu jedem Ansatz des Pre-Mixes gegeben und wie
folgt inkubiert:
Temperatur
Dauer
25°C
10 min
50°C
50 min
85°C
5 min
Nach der Inkubation wurden die Reaktionsansätze auf Eis gekühlt und durch kurze
Zentrifugation am Boden des Reaktionsgefäßes gesammelt. Anschießend wurde je 1
µl der RNase H zu jedem Reaktionsgefäß zugefügt und ein weiteres Mal bei 37°C für
20 min inkubiert. Dieser RNase H Verdauungsschritt entfernt cDNA-RNA-HybridMoleküle aus dem RNA template, wodurch eine erhöhte Sensitivität für die folgende
PCR erreicht wird. Dieser cDNA-Synthese-Mix wurde bei -20°C gelagert oder
umgehend für eine PCR verwendet.
42
3.7.11 Polymerase-Chain-Reaction (PCR)
Um die Existenz von bestimmten RNAs, die in cDNA revers-transkribiert wurden,
nachzuweisen, wurde die Methode der PCR mit Gen-spezifischen Primern (3.6) in
einem Gesamtvolumen von 50 µl mittels des Taq DNA Polymerase Master Mix (3.1)
durchgeführt. Dieser Mix ist ein Pre-Mix bestehend aus Taq DNA Polymerase, PCR
Puffer 1,5 M MgCl2 und 200 µM dNTPs.
Wie der Reaktions-Mix herzustellen ist, ist der folgenden Tabelle zu entnehmen:
Komponente
Menge
cDNA
4 µl
Gen-spezifischer Primer (s) (12,5 pmol/µl)
1 µl
Gen-spezifischer Primer (as) (12,5 pmol/µl)
1 µl
Taq PCR Master Mix
25 µl
DEPC treated water
19 µl
Das PCR-Programm sah wie folgt aus:
Schritt
Reaktion
Dauer
Temperatur
1
Denaturierung
3 min
94°C
2
Denaturierung
30 sec
94°C
3
Hybridisierung
1 min
Tm der Primer + 3°C
4
Amplifikation
1 - 2 min
72°C
5
Amplifikation
10 min
72°C
6
Pause
unendlich
4°C
Die Schritte 2 – 4 wurden 30 – 40 Zyklen hinter einander wiederholt.
Die Annealing-Temperatur der Primer wurde mittels der folgenden Formel berechnet:
Tm = 69,3°C + 0,41 × %GC – 650/Länge des Primers
Die Dauer des Amplifikations-Schrittes (Schritt 4) ist abhängig von der individuellen
Länge des zu amplifizierenden DNA-Fragments (1 min pro 1000 bp).
Die Größe der Fragmente, die Primer, die Zyklen und die Annealing-Temperatur der
einzelnen PCR-Produkte sind unter 3.6 zusammengefasst.
43
3.7.12 Elektrophoretische Trennung von DNA-Fragmenten in Agarose-Gelen
Die Auftrennung von DNA-Fragmenten erfolgte durch Horizontal-Elektrophorese in
1,5 %igen Agarose-Gelen. Die Agarose wurde in 1× TBE-Puffer (3.4) unter Zusatz
von Ethidiumbromid (200 µg/l) durch Aufkochen gelöst und, nach Abkühlen auf 60°C,
in eine Gießvorrichtung mit einem Probenkamm gegossen. Nach Auspolymerisieren
des Gels wurde die zu untersuchende DNA-Probe mit 5× DNA-Probenpuffer (3.4)
versetzt und in einem Gesamt-Volumen von 12,5 µl in die Probentaschen des
Agarose-Gels aufgetragen. Die Elektrophorese wurde bei Raumtemperatur bei 120 V
in 1× TBE-Puffer durchgeführt. Als DNA-Größenstandard wurden, je nach Größe des
zu erwartenden Fragments,
4 µl „GeneRulerTM 100 bp DNA Ladder Plus“
(Fermentas, St Leon-Roth) bzw. „GeneRulerTM 1kb DNA Ladder“ (Fermentas, St.
Leon-Roth) verwendet.
Abb. 2-4: GeneRulerTM 100 bp DNA Ladder #SM0242,
Fermentas GmbH, St. Leo-Rot, Deutschland
TM
Abb. 2-5: GeneRuler 1 kb DNA Ladder
#SM0344, Fermentas GmbH, St. LeonRot, Deutschland
3.7.13 Aufreinigung von PCR-Produkten
Die Reinigung der PCR-Produkte von Primern, Nukleotiden, Polymerase und Salzen
wurde mit Hilfe des MinElute PCR Purification Kits (3.1) vorgenommen. Die
Durchführung wurde nach den Empfehlungen des Herstellers mittels des PCR
Purification Spin Protokolls für Mikrozentrifugen vorgenommen.
44
3.7.14 Sequenzierung von PCR-Produkten
Um die erwarteten PCR-Fragmente zu verifizieren, wurde nach der GelElektrophorese eine Sequenzierung durchgeführt. Hierfür wurden 10 µl des PCRReaktionsansatzes und 10 µl jedes Gen-spezifischen Primers in einer Konzentration
von 10 pmol/µl an den Sequenzierungs-Service der Firma Qiagen in Hilden geliefert.
Die Bewertung der Sequenzierungs-Ergebnisse wurde mit Hilfe des Programms
Blast 2.0 (Basic Local Alignment Search Tool) vorgenommen.
3.8 Zellbiologische Methoden
3.8.1 Präparation von hochreinen Thrombozyten („highly purified platelets“)
Zur Generierung von hochreinen Thrombozyten wurden sowohl Vollblut als auch
Thrombozytenkonzentrate von gesunden Spendern verwendet, die innerhalb der
letzten 2 Wochen keine Medikamente eingenommen hatten.
Es wurden 40 ml Vollblut in 10 ml CCD-Puffer (3.4) aufgenommen und für 20 min bei
300 × g bei Raumtemperatur ohne Bremse zentrifugiert. Nach der Zentrifugation
wurde die oberste Fraktion (PRP = „Plättchen-reiches-Plasma“ (Abb. ...) vorsichtig
mit einer Plastikpipette abgenommen ohne dabei die Leukozytenschicht zu stören.
Das PRP wurde erneut für 10 min bei 500 × g bei Raumtemperatur ohne Bremse
zentrifugiert.
Anschließend
wird
der
Überstand
abgenommen
und
das
Thrombozyten-Pellet in HEPES/NaCl Puffer (3.4) aufgenommen.
Die Thrombozytenkonzentrate wurden von der Abteilung für Transfusionsmedizin
bereits nach Standardmethoden vorgereinigt. Die washed platelets aus den
Konzentraten (WP) wurden ebenso hergestellt, wie beim Vollblut.
Die beiden Suspensionen (WP) wurden auf je einen diskontinuierlichen Gradienten
mittels einer Pumpe geschichtet. Der Gradient bestand, von unten nach oben, aus 15
ml 17%iger Optiprep®-Lösung mit einem Brechungsindex von 1,3495, 14 ml 13%iger
Optiprep®-Lösung
mit einem Brechungsindex von 1,346 und 14 ml 10%iger
Optiprep®-Lösung mit einem Brechungsindex von 1,343 in HEPES/NaCl-Puffer.
Anschließend wurde der Gradient bei 300 × g
für 20 min ohne Bremse bei
Raumtemperatur zentrifugiert. Nach der Zentrifugation wurde eine 7,5-ml-Fraktion
(W1, Abb. ...), die vorwiegend Serumproteine enthielt, von oberhalb des Gradienten
45
abgenommen und verworfen. Die zweite Fraktion W2 hatte etwa ein Volumen von
12,5 ml und enthielt die gereinigten Thrombozyten. Die übrigen 29 ml (W3,
Leukozyten und Erythrozyten) wurden verworfen. Die Fraktion W2 wurde
abgenommen, in ein neues Zentrifugationsgefäß gefüllt und bei 1000 × g für 10 min
bei Raumtemperatur zentrifugiert. Das resultierende Pellet wurde in 2 ml Tyrode’s
Puffer (3.4) resuspendiert. Diese Fraktion wird als „highly purified platelets“ (PP)
bezeichnet und kann für anschließende Analysen verwendet werden.
3.8.2 Validierung der Thrombozyten Reinheit
Zur Quantifizierung von möglichen Leukozytenkontaminationen wurden das BD
LeucoCountTM
Set
und
der
FACSCalibur
Durchflusszytometer
gemäß
des
Herstellerprotokolls verwendet. Für jede Probe wurde eine festgelegt Anzahl von
30.000 bead events gezählt.
Verunreinigungen durch Erythrozyten wurden unter Verwendung der Bürker
Zählkammer (100 µm Porentiefe) mittels Mikroskopie bestimmt.
Der Gehalt an Serumalbumin als Hauptserumprotein wurde mit Hilfe der
Immunonephelometrie gemessen (Thomas et al).
3.8.3 Bestimmung der Thrombozyten-Funktionalität
Die Funktionalität der „highly purified platelets“ wurde mittels eines EnzymImmunoassays überprüft (Geiger et al.). Um die Phosphorylierung von VASP zu
messen wurden je 500 µl Thrombozyten Suspension für 2 min mit 4 nM Iloprost, mit
4 nM Iloprost + 10 µM ADP und zur Kontrolle mit Wasser inkubiert (Grunberg et al.,
Saniabadi et al.) und anschließend mit je 500 µl Lyse-Puffer (3.4) lysiert. Um die
Proben auswerten zu können, wurden diese zum einen mit P-VASP-spezifischem
Antikörper 16C2 (0,5 µg/well) inkubiert, der selektiv das Ser-239-phosphorylierte
VASP erkennt und zum anderen mit IE273 (0,1 µg/well), der VASP ungeachtet
seines Phosphorylierungszustandes erkennt.
3.8.4 Isolation von Lymphozyten aus Vollblut
Für die Isolation von Lymphozyten wurden 15 ml Vollblut mit CCD-Puffer (3.4) mit
dem gleichen Volumen an Hank’s balanced salt solution (HBSS, 3.3) verdünnt und
vorsichtig auf einen 15 ml-Ficoll-Paque®-Gradienten (3.3) in einem 50 ml46
Reaktionsgefäß geschichtet. Anschließend wurde der Gradient bei 400 × g für 40 min
bei Raumtemperatur zentrifugiert. Nach der Zentrifugation erhielt man eine
Auftrennung in 4 Phasen, welche die verschiedenen Zelltypen beinhalteten. Diese 4
Schichten hatten sich entsprechend der zelltypischen Migrations-Eigenschaften
während der Zentrifugation gebildet. In der Bodenfraktion befanden sich die
Erythrozyten, in der darauf folgenden Schicht die Granulozyten, dann kam die
Schicht mit den Lymphozyten und die oberste enthielt die Thrombozyten und das
Blutplasma.
Um
die
Lymphozyten
zu
isolieren
musste
die
Thrombozyten/Plasmaschicht mit einer Pasteur Pipette entfernt werden. Die
Lymphozytenphase selbst wurde dann in ein sauberes Zentrifugengefäß überführt,
es wurden 30 ml HBSS zugegeben und anschließend bei 100 × g für 10 min bei
Raumtemperatur zentrifugiert. Dieser Wasch-Schritt wurde zweimal wiederholt, um
mögliche Verunreinigungen durch Thrombozyten, Ficoll-Paque® und Plasma zu
entfernen.
Für eine folgende RNA-Isolation (3.7.7) wurden die Lymphozyten in 1 ml HBSS
resuspendiert.
3.8.5 Thrombozyten-Isolation nach Hillmann et al.
Eine bestehende Methode zur Aufreinigung von Thrombozyten wurde von Hillmann
et al. 2006 publiziert. Die Gruppe nahm 60 ml Vollblut in 15 % ACD-Puffer (3.4) mit
2 mM EDTA auf und verdünnte dies mit 40 ml Puffer A (3.4). Anschließend wurden
16 6 ml Aliquots aufgeteilt und bei 170 × g für 12 min bei Raumtemperatur
zentrifugiert. Die oberen 80 % des hergestellten PRP wurden gesammelt und
zusammengeführt, so dass sich etwa 40 ml Gesamtvolumen PRP ergaben.
Prostaglandin E1 wurde in einer Konzentration von 1µM und EDTA in einer
Konzentration von 2 mM zugefügt. Nach Aufteilung in vier gleiche Volumina wurden
die PRPs erneut bei 170 × g für 10 min bei Raumtemperatur zentrifugiert, die
Überstände danach zusammengeführt und erneut bei 720 × g für 10 min bei
Raumtemperatur zentrifugiert. Nach Einstellung der Thrombozytenkonzentration auf
1 × 109/ml wurden 200 µl anti-CD45- und 100 µl anti-CD15-ummantelte Dynabeads®
(3.1) in Puffer A + 2 mM EDTA) gewaschen, zu den Thrombozyten zugegeben und
bei 4°C für 60 min auf dem Über-Kopf-Schüttler inkubiert. Nach der Inkubation wurde
die Probe mit 10 ml Puffer A + 2 mM EDTA verdünnt und in einen Dynal-MPC®
(magnetic particle concentrator, 3.1) gesteckt. Die Thrombozytensuspension wurde
47
in ein frisches Reaktionsgefäß überführt
und erneut bei 720 × g für 12 min
zentrifugiert. Die Thrombozyten wurden anschließend in 1,5 ml Puffer A + 2 mM
EDTA resuspendiert und in ein 2-ml-Mikrozentrifugengefäß überführt und wiederum
pelletiert. Um den Grad der Thrombozytenaktivierung bestimmen zu können wurden
die Thrombozyten unter dem Lichtmikroskop betrachtet und auf Anzeichen einer
möglichen, durch die Aktivierung bedingten, Formveränderung überprüft.
3.8.6 Thrombozytenaufschluss mittels French-Press®
Die Thrombozyten wurden aus humanem Vollblut präpariert. Hierfür wurden 40 ml
Vollblut in 10 ml CCD-Puffer (3.4) aufgenommen. Das PRP (platelet rich plasma)
wurde für 20 min bei 300 × g bei Raumtemperatur abgetrennt und mittels einer
Plastikpipette
abgenommen.
Nach
der
Präparation
des
PRP
wurde
die
Thrombozyten-Suspension erneut bei 500 × g für 10 min bei Raumtemperatur
zentrifugiert.
Das
Thrombozytenpellet
wurde
in
HEPES/NaCl-Puffer
(3.4)
resuspendiert.
Bevor die „Standard French Pressure Cell“ (35 ml Kapazität, Maximaldruck 40.000
psi) verwendet wurde, musste sie auf 4°C vorgekühlt werden. Außerdem wurde zu
der Thrombozytensuspension in HEPES/NaCl-Puffer ein Mix aus Proteaseinhibitoren
(3.4) gegeben und anschließend unter einem Druck von 800 psi aufgeschlossen. Um
eine hohe Effizienz des Aufschlusses zu erreichen, wurden die 20 ml Suspension 3-4
Mal bearbeitet. Dabei wurde darauf geachtet, dass die Probe ständig kühl gehalten
wurde, um Proteaseaktivität zu verringern. Nach dem Aufschluss durch die FrenchPress folgte eine Zentrifugation bei 1.000 × g für 10 min bei 4°C und anschließend
eine weitere bei 100.000 × g für 1 h bei 4°C. Das entstandene Pellet wurde für
weitere Analyse verwendet.
3.8.7 Isolation von Thrombozyten-Plasmamembran
Für die Subfraktionierung von Thrombozyten wurden 7,5 × 106 Zellen highly purified
platelets verwendet (3.8.1), die in 5 ml Puffer B (s. 3.4) resuspendiert wurden. Um
die Thrombozyten zu lysieren, wurden die Zellen mittels einer Pumpe auf einen
kontinuierlichen Glycerolgradienten (0% - 40%) mit einem Gesamtvolumen von 32 ml
geschichtet und anschließend bei 1.500 × g bei 4°C zentrifugiert. Ohne die
Zentrifugation zu unterbrechen, wurde nach 30 min die Geschwindigkeit für weitere
10 min auf 5.900 × g erhöht und danach ohne Bremse zum Stillstand gebracht. Die
48
Thrombozyten
haben
während
der
Zentrifugation
die
unterschiedlichen
Konzentrationsbereiche des Gradienten durchwandert und sich dabei mit Glycerol
angereichert. Werden die mit Glycerol angereicherten Thrombozyten in eine Lösung
mit geringerem osmotischen Potential (Puffer C, 3.4) gegeben, lysieren sie
schließlich. Durch eine zusätzliche mechanische Zelllyse mit Hilfe einer Spritze mit
einer 18 G Nadel wurden die bis dahin unlysierten Thrombozyten ebenfalls
aufgeschlossen (Harmon, JT et al. 1992).
Eine anschließende Zentrifugation bei 5.900 x g für 15 min bei 4°C bewirkte das
Sedimentieren der noch intakten Zellen und somit das Abtrennen von den
entstandenen Zellfragmenten im Überstand.
Die im Überstand befindlichen Plasmamembranfragmente wurden für 1 h bei
100.000 × g bei 4°C zentrifugiert um sie von weitern Zellbestandteilen abzutrennen.
Dieser Zentrifugationsschritt wurde nach Waschen des Pellets mit 4 ml Puffer B
erneut durchgeführt.
Um
eine
sensitivere
Auftrennung
der
Membranfragmente
von
weiteren
Zellkomponenten zu erreichen wurde das Pellet in 52%iger Sucrose-Lösung mit
Puffer B resuspendiert und in einen diskontinuierlichen Sucrose-Gradienten
geschichtet. Der Gradient setzte sich aus folgenden Sucrose-Konzentrationen
zusammen:
Abb. 3-6: Sucrose-Gradient zur Plasmamembran-Isolation
Der Sucrose-Gradient wurde bei 4°C über Nacht bei 100.000 × g zentrifugiert und
anschließend in 2-ml-Schritten von oben nach unten fraktioniert.
49
3.8.8 Immunopräzipitation mittels „Protein G Immunoprecipitation (IP) Kit“
Die Immunopräzipitation ist eine Methode, bei welcher speziell ein Protein von aus
einem
ganzen
Komplexgemisch
aufgereinigt werden kann. Sie ermöglicht
so die Detektion von kleinen oder in
geringer Menge exprimierten Proteinen,
welche
anderenfalls
detektieren
schwierig
zu
da
die
wären,
Immunopräzipitation sie bis zu 10.000 fach
ankonzentrieren
kann.
Eine
häufig
verwendete Matrix ist hierbei Protein G
gebundene Agarose. Zunächst wurden zu
2 × 109 Thrombozyten (100 – 600 µl
Zelllysat) 3 µg Antikörper (3.5) zugegeben
und das Gemisch mit dem mitgelieferten 1×
IP-Puffer auf 600 µl in einer geschlossenen
Zentrifugen-Säule
aufgefüllt.
Diese
Suspension wurde über Nacht auf einem
Über-Kopf-Schüttler
bei
4°C
inkubiert.
Währenddessen wurden pro Ansatz je 30
µl Protein-G-Agarose-Matrix entnommen,
mit 1 ml kaltem 1× IP-Puffer gewaschen
und bei 12.000 × g für 30 sec pelletiert. Das
Pellet wurde in 50 µl frischem 1× IP-Puffer
resuspendiert
und
nach
beendeter
Inkubation zum Zelllysat gegeben. Dann
wurde die Säule erneut für 2 h bei 4°C auf
dem Über-Kopf-Schüttler inkubiert. Abb. 3-7: Fließschema: Immunopräzipitation mittels Protein G
Anschließend wurde die Spitze der Säule abgebrochen und die Säule in ein 2-mlMikrozentrifugengefäß gestellt. Das Zentrifugengefäß wurde bei 12.000 × g für 30
sec bei 4°C zentrifugiert und der Durchlauf verworfen. Die in der Säule verbliebene
Matrix wurde in 700 µl 1× IP-Puffer resuspendiert und ein weiteres Mal bei 12.000 ×
g für 30 sec bei 4°C zentrifugiert. Diese Prozedur wurde 6 × wiederholt und beim
letzten Mal mit 0,1× IP-Puffer durchgeführt. Um die Proben für eine Auswertung
50
mittels SDS-PAGE verwenden zu können wurden nach der letzten Zentrifugation 50
µl 2× SDS-Probenpuffer auf die Matrix gegeben, alles vorsichtig gemischt, die Säule
unten verschlossen und bei 95°C im Heizblock erhitzt. Nach 5 min wurde die Säule
unten wieder geöffnet, in ein neues Mikrozentrifugengefäß gestellt und bei 12.000 ×
g für 30 sec bei 4°C zentrifugiert. Das eluierte Immunopräzipitat ist danach zur
weiteren Analyse präpariert.
3.8.9 Immunopräzipitation mittels Dynabeads®
Für die gesamte Immunopräzipitation wurde Immunopräzipitations-Puffer (3.4)
verwendet. Zunächst wurden die Dynabeads® mit dem entsprechenden Antikörper
beschichtet. Dazu wurden je Ansatz 50 µl der Dynabeads® benötigt, diese wurden 3×
mit je 1 ml Immunopräzipitations-Puffer gewaschen. Anschließend wurden auf jeden
Ansatz 800 µl Immunopräzipitations-Puffer gegeben und 2 µg des entsprechenden
Antikörpers (3.5) gegeben bei 4°C auf dem Über-Kopf-Schüttler über Nacht inkubiert.
Am folgenden Tag wurde zunächst die Anzahl der highly purified platelets (3.8.1)
bestimmt. Anschließend wurde ein Ansatz entweder mit 0,01 U/ml Thrombin oder 10
µM ADP für 5 min bei 37°C stimuliert und der andere Ansatz durch 0,02 U/ml
Apyrase in unstimuliertem Zustand gehalten. Proteaseinhibitoren wurden in
folgenden Konzentrationen zu den Proben gegeben: 5 µg/ml Antipain, 2 µg/ml
Aprotinin, 6 µg/ml Chymostatin, 2,5 µg/ml Leupeptin, 1 µg/ml Pepstatin und 2 µg/ml
Natrium Fluorid als Phosphataseinhibitor. Beide Ansätze wurden 5 Mal 30 sec
(dazwischen immer wieder 30 sec auf Eis) mittels Ultraschall lysiert. Die Lysate
wurden 1 h bei 100.000 × g, 4°C zentrifugiert.
Nachdem die Dynabeads® mit dem Antikörper über Nacht inkubiert hatten, wurden
die Reaktionsgefäße in einen Dynal-MPC® gestellt, in welchem die Dynabeads sich
an der Wand des Reaktionsgefäßes sammelten, die dem Magneten zugewandt war,
und somit der Überstand mit einer Pipette leicht entfernen und verworfen werden
konnte. Nach einmaligem Waschen der beads mit Immunopräzipitations-Puffer (3.4)
wurden 1 × 109 Thrombozyten auf die beads gegeben, das Endvolumen auf 800 µl
aufgefüllt und alles erneut für 2h im Kühlraum auf dem Über-Kopf-Schüttler inkubiert.
Nach der Inkubation wurden die Proben erneut in den Dynal-MPC® gestellt, der
Überstand wurde abgenommen und die Dynabeads® 5 Mal mit je 1 ml
Immunopräzipitations-Puffer gewaschen. Nach dem letzten Waschschritt wurden die
Dynabeads® in 50 µl 2× SDS-Proben-Puffer aufgenommen und waren zur Analyse in
der SDS-PAGE verwendbar.
51
4. Ergebnisse
4
Ergebnisse
Ein Ziel dieser Arbeit war es, eine Methode zu entwickeln, mit welcher sich
Thrombozyten von anderen Blutbestandteilen separieren lassen, so dass für
anschließende Untersuchungen Kontaminationen wie mRNA oder Proteine aus
anderen Quellen als den Thrombozyten ausgeschlossen werden konnten. Nach
Entwicklung dieser Aufreinigungsprozedur standen diese sogenannten hochreinen
Plättchen für die detailliertere Charakterisierung von Thrombozyten zur Verfügung.
Im Rahmen der Arbeit fanden sie Anwendung durch die Analyse der ThrombozytenPlasmamembran und durch die biochemische Untersuchung von postulierten
Proteininteraktionen, zwischen membrangebundenen Proteinen und Zytoskelettorganisierenden Proteinen, die bei Signalwegen der Thrombozyten-Aggregation eine
wichtige Rolle spielen.
4.1
Herstellung von hochreinen Plättchen
Die größte Herausforderung bei der Arbeit mit Thrombozyten mRNA ist die
Vermeidung von Kontaminationen durch Leukozyten mRNA. Um dieses Problem zu
beheben, haben wir eine effektive Aufreinigungsmethode entwickelt, die auf einem
diskontinuierlichen Gradienten aus Optiprep® Lösung basiert.
Bei Aufreingungen nach Hillmann et al. oder Ford et al. hat man während der
Prozedur einen geringen Plättchenverlust und die Thrombozyten behalten ihre
Funktionalität während der Aufreinigung, wie durch Aggregations-Studien und
Nukleotid-Sekretions-Untersuchungen bewiesen wurde (Ford et al. 1990) (Hillmann
et al. 2006). Wir fanden heraus, dass für weiterführende Anwendungen wie ProteomAnalysen, SAGE oder zur Erstellung einer cDNA-Bibliothek, der Reinheitsgrad der
Thrombozyten
dieser
publizierten
Protokolle
insuffizient
hinsichtlich
der
Kontamination mit Erythrozyten (mikroskopisch untersucht, Daten nicht gezeigt) und
Leukozyten sind, was anhand einer cDNA-Untersuchung mittels einer PCR-Analyse
nachgewiesen werden konnte (Abb. 4-1).
52
4. Ergebnisse
Abbildung 4-1: Reinheitskontrolle nach Aufreinigung von Hillmann et al. Das Agarosegel zeigt
die Reinheitsüberprüfung der cDNA aus aufgereinigten Plättchen mittels PCR und der genspezifischen Primer vWf (Thrombozyten-Marker), CD15, CD45 und HLA-DQȕ (Leukozyten-Marker).
Zur Validierung wurde jeweils eine Wasserkontrolle auf das Gel aufgetragen.
Ein Schwerpunkt dieser Arbeit war der systematische Vergleich zwischen
unterschiedlichen Protokollen zur Gewinnung reiner Thrombozyten. Hierbei wurden
humanes
Blut
von
freiwilligen
Spendern
sowie
Thrombozyten-Konzentrate
verwendet. Bewertet wurden die Protokolle hinsichtlich ihrer Fähigkeit, die
Thrombozyten
effektiv
von
den
restlichen
Blutzellen
zu
depletieren.
Die
Qualitätskontrolle erfolgte mittels mikroskopischer (Erythrozyten), nephelometrischer
(Serumproteine), FACS-Analyse und mRNA-Nachweis (Leukozyten). Gewaschene
Plättchen wurden durch mehrere Zentrifugationsschritte isoliert, in HEPES/NaClPuffer resuspendiert und anschließend in einem diskontinuierlichen DichteGradienten separiert. Um die ideale Gradientenlösung zur Auftrennung von
Blutkomponenten zu erhalten, wurden unterschiedliche Dichten und Volumina der
Gradientenlösung getestet und die Effektivität sowohl von einem kontinuierlichen als
auch von einem diskontinuierlichen Gradienten überprüft. Der diskontinuierliche
Gradient (3.8.1) war in diesem Vergleich die effektivste Methode um eine
größtmögliche Ausbeute an Thrombozyten mit der geringsten Kontamination an
Serumproteinen, Erythrozyten und Leukozyten zu erhalten (Nr. 5 Abb. 4-2).
53
4. Ergebnisse
Gradientenoptimierung
Thrombozyten x 1.000
Leukozyten
600
500
Zellen pro µl
400
300
200
100
0
1
2
3
4
5
vorgereinigte Thrombozyten verschiedener Gradienten
Abbildung 4-2: Aufreinigungs-Effizient vorgereinigten Plättchen durch verschiedene Gradienten,
verglichen anhand des Kontaminationsgrades von Leukozyten
1 – Zwei-Schichtgradient, 2 – Flotationsgradient, 3 – Sedimentationsgradient, 4 – Vier-Schichtgradient
mit CGS-Puffer, 5 – Vier-Schichtgradient mit HEPES/NaCl-Puffer
Nach der Zentrifugation ließ sich der Gradient in drei Phasen unterteilen: Die erste
Phase (W1) enthielt vorwiegend Serumproteine, die zweite Phase (W2) den größten
Anteil an vorgereinigten Thrombozyten und die dritte Phase (W3) beinhaltete den
Hauptteil der Erythrozyten und Leukozyten (Abb. 4-3 und Abb. 4-4). Anschließend
wurden die Blutplättchen der entsprechenden Phase (W2) abgenommen und erneut
sedimentiert. Die danach entstandenen hochreinen Plättchen können in jedem
beliebigen Puffer, der für die nachfolgenden Analysen erforderlich ist, resuspendiert
werden.
54
4. Ergebnisse
Abbildung: 4-3: Fließschema zur Generierung hochreiner Thrombozyten. Nach Herstellung von
gewaschenen Plättchen werden diese auf einen Optiprep®-Gradienten geschichtet und man erhält
nach Zentrifugation des Gradienten eine Auftrennung in 3 Schichten (W1 enthält Serumproteine, W2
enthält Thrombozyten, W3 enthält Erythrozyten und Leukozyten). Nach einer weiteren Zentrifugation
der Schicht W2 befinden sich im Pellet die hochreinen Plättchen.
P - Pellet, Ü - Überstand, RT - Raumtemperatur, PRP - Plättchen-reiches-Plasma
55
4. Ergebnisse
Thrombozyten-Anteil
0%
47%
53%
W1
W2
W3
Leukozyten-Anteil
1%
0%
99%
W1
W2
W3
Albumin-Anteil
1%
11%
88%
W1
W2
W3
Abbildung 4-4: Verteilung der Blutbestandteile (Thrombozyten, Leukozyten, Serumproteine) auf die
einzelnen Fraktionen des Optiprep®-Gradienten. Nahezu die Hälfte, der zuvor auf den Gradienten
geschichteten gewaschenen Plättchen (47%) findet sich nach der Zentrifugation in der Fraktion W2
wieder. Die Fraktion W3 weist den meisten Gehalt an Leukozyten (99%) und die Fraktion W1 an
Serumalbumin (88%) auf.
56
4. Ergebnisse
4.1.1 Nachweis der Thrombozyten-Reinheit
Präparationen von allgemein angewandten gewaschenen Plättchen enthalten
beträchtliche Anteile an Leukozyten und Serumproteinen. Um die Reinheit der
hochreinen Plättchen möglichst genau zu verifizieren, wurden Techniken mit einem
sehr sensitiven Detektions-Grenzwert verwendet. Da Albumin das in größter Menge
im Blut vorkommende Protein ist, stellt es somit auch einen sensitiven Marker für
Serumproteine
im
Allgemeinen
dar.
Daher
wurde
der
Albumingehalt
der
Präparationen mittels eines hoch sensitiven Nephelometers bestimmt (Thomas et al.
1990). Die Albumin-Messungen ergaben einen Gehalt von 405,5 r 4,1 µg/ml, was
einer Menge von 203,4 r16,2µg Albumin pro 109 Thrombozyten für eine
Standardpräparation von gewaschenen Plättchen (WP) aus frisch isolierten
Thrombozyten entspricht. Vergleichbare Werte wurden für Präparationen aus
Thrombozyten-Konzentraten erzielt: 380,8 r8,3 µg/ml entsprechen 260,0 r2,81 µg
Albumin pro 109 Thrombozyten. Mit Hilfe der neu entwickelten Aufreinigungsmethode
ist es möglich den Albumingehalt aus den gewaschenen Plättchen (WP) sowohl in
den
Vollblut-Proben
als
auch
in
den
Thrombozyten-Konzentrat-Proben
zu
eliminieren, so dass kein Albumin in den Proben W4 gemessen werden kann (Abb.
4-5). Bei einem Detektionslimit von 2 µg/ml für die nephelometrische Messung, ergibt
sich ein Aufreinigungsfaktor von 200 für isolierte Thrombozyten aus Vollblut und von
190 aus Thrombozyten-Konzentraten.
57
4. Ergebnisse
Albumin/Thrombozytenprotein
0,200
** p < 0.01
*** p < 0.001
0,180
0,160
WP
PP
0,140
w/w
0,120
0,100
0,080
0,060
0,040
0,020
0,000
VB
TK
Abbildung 4-5: Serumprotein-Kontamination. Stellvertretend für alle Blutplasmaproteine wurde der
durchschnittliche Wert (n=8) des häufigsten Serumproteins Albumin in der Standard-Präparation von
gewaschenen Plättchen (WP) im Vergleich zur Präparation von hochreinen Plättchen (PP) sowohl aus
Vollblut (VB) als auch aus Thrombozyten-Konzentraten (TK) nephelometrisch gemessen. Dargestellt
ist der Gehalt an Albumin pro Thrombozytenprotein. Die Fehlerbalken zeigen den Standardfehler des
Mittelwertes an.
Da Verunreinigungen durch Leukozyten-Proteine und -mRNA ein Hauptproblem von
Proteom- und Transkriptom-Studien an Thrombozyten sind, wurde großer Wert auf
eine
Validierung
des
Aufreinigungsprotokolls
hinsichtlich
geringster
Leukozytenkontaminationen gelegt. Zu diesem Zweck wurde das standardisierte
LeucoCount-Set der Firma BD biosciences, Heidelberg (3.8.2) als wirksame und
empfindliche Methode des quantitativen Nachweises der Restleukozyten mit dem
Durchflusszytometer angewandt. Die Probenröhrchen enthalten eine vorgegebene
Menge an Referenzpartikel, anhand derer die absolute Anzahl der Restleukozyten
bestimmt werden kann. Die genaue Leukozytenzahl wird durch eine Berechung aus
den Referenzpartikeln und dem Probenvolumen ermittelt. Diese Methode ermöglicht
die exakte Quantifizierung von Leukozyten bis zu einer Grenze von 5 Zellen/100 µl
Probenvolumen (Dzik et al. 1997) (van der Meer et al. 2001).
Während bei der Präparationen von washed platelets nach bisherigen Methoden,
471,5 r110,6 Leukozyten pro 108 Thrombozyten gemessen wurden, konnten nach
der neuen Aufreinigungs-Technik lediglich 21,9 r8,5 Leukozyten pro 108
Thrombozyten nach Isolation aus Vollblut detektiert werden (Abb. 4-6). Für
58
4. Ergebnisse
gewaschene Plättchen, die aus Thrombozyten-Konzentraten gewonnen wurden,
ergab sich ein Gehalt von 12,2 r 5,1 Leukozyten pro 108 Thrombozyten und für die
hochreine Plättchen ein Wert von 1,5 r0,9 Leukozyten pro 108 Thrombozyten.
Daraus folgt, dass nach Anwendung des neuen entwickelten Aufreinigungsprotokolls
eine Reduktion um das 22-fache des Leukozyten-Gehalts für Thrombozyten aus
Vollblut und um das 8-fach aus Thrombozyten-Konzentraten erreicht werden konnte
(Abb 4-6).
Außerdem wurde die Proteinmenge von 33 verschiedenen Thrombozyten- und 4
verschiedenen Leukozyten-Präparationen mittels des Micro BCATM Protein Assay
Kits (3.7.3) bestimmt. Dies führte zu einem Protein-Gehalt von 2,57 r0,16 pg für
Thrombozyten und 162,8 r 12,4 pg für Leukozyten, was einer etwa 65-fach höheren
Proteinmenge pro Zelle in Leukozyten verglichen mit Thrombozyten entspricht. Diese
Werte, angewandt auf die Protein-Messungen von washed platelets aus Vollblut,
führten zu einem Proteingehalt von 307,6 r 66,9 ng Leukozyten-Protein pro mg
Thrombozyten-Protein
und
Thrombozyten-Protein
nach
zu
7,8
Isolation
r
3,2
aus
ng
Leukozyten-Protein
pro
Thrombozyten-Konzentraten.
mg
Nach
Durchführung des neuen Protokolls, konnte diese Verunreinigung signifikant auf
13,9 r 5,1 und 1,0 r 0,5 ng Leukozyten-Protein pro mg Thrombozyten-Protein
reduziert werden (Abb. 4-6).
Da die Detektionsgrenze des für die FACS-Analyse verwendeten LeucoCountTM-Kits
zwischen 1-350 Leukozyten/µl liegt, wurde, um die Effektivität der neuen
Aufreinigungs-Methode für Thrombozyten zusätzlich auf der Basis der RNA-Reinheit
nachzuweisen, die sensitivere Methode der RT-PCR angewandt. Hierbei lässt sich
bereits ein Molekül der Leukozyten-spezifischen mRNA detektieren (3.7.11). Die für
die Analyse notwendige, in cDNA umgeschriebene RNA von ThrombozytenPräparationen wurde positiv auf thrombozyten-spezifische mRNA (vWF) und negativ
auf granulozyten-spezifische (CD15) und lymphozyten-spezifische (HLA-DQȕ)
mRNA getestet (Abb. 4-7).
59
4. Ergebnisse
Abbildung 4-6: Leukozyte-Kontamination. Durchschnittlicher Wert (n=18) der Restkontamination an
Leukozyten in der Standard-Präparation von gewaschenen Plättchen (WP) im Vergleich zur
Präparation von hochreinen Plättchen (PP) sowohl aus Vollblut (VB) als auch aus ThrombozytenKonzentraten (TK), gemessen mittels FACS. Die Fehlerbalken zeigen den Standardfehler des
Mittelwertes an.
60
4. Ergebnisse
Abbildung 4-7: Repräsentative Agarosegelelektrophorese der PCR-Produkte zur Reinheitskontrolle
1. Spur: GesamtRNA von Leukozyten
2. Spur: GesamtRNA von Thrombozyten
3. Spur: Wasser-Kontrolle
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese neue Aufreinigungs-Methode zur
Generierung von hochreinen Plättchen jegliche Kontaminationen durch andere
Blutzellen ausschließt, wie durch Mikroskopie, nephelometrische Messungen, FACS
Analysen und die sensitive RT-PCR-Untersuchungen bestätigt wurde.
61
4. Ergebnisse
4.1.2 Hochreine Plättchen sind immer noch funktionell
Neben der außergewöhnlichen Reinheit der Thrombozyten, die durch diese neue
Aufreinigungsmethode erzielt werden kann, ist ein weiterer wichtiger Aspekt
die
Beibehaltung der Funktionalität der Thrombozyten für funktionelle Analysen nach der
Aufreinigung.
Um
diese
nachzuweisen
wurde
eine
P-VASP-Untersuchung
durchgeführt (Geiger et al. 2005). Dieser „Enzym Immuno-Assay“ (EIA) bestimmt
gleichzeitig phosphoryliertes VASP und Gesamt-VASP. VASP, das abundant in
humanen Thrombozyten vorkommt, ist ein Substrat der cGMP-abhängigen
Proteinkinase (cGK) und der cAMP-abhängigen Proteinkinase (PKA) und kann
genutzt werden, um den Aktivierungs-Status von Thrombozyten zu bestimmen
(Schwarz et al. 1999) (Geiger et al. 2005) (Aleil et al. 2005). Durch die Inkubation von
Thrombozyten mit dem Prostacyclin-Analogon Iloprost, welches den IP-Rezeptor
aktiviert, steigt die intrazelluläre Konzentration von cAMP und die PKA-Aktivität und
infolgedessen die VASP-Phosphorylierung. Die Zugabe von ADP, welches den
P2Y12-Rezeptor aktiviert, gleicht den Effekt des Prostaglandins durch Inhibierung der
Adenylatcyclase
und
damit
die
PKA-Aktivität
aus,
was
wiederum
zur
Dephosphorylierung von VASP führt (Geiger et al. 2005).
Abbildung 4-8: Schematische Darstellung des VASP-Signalweges in Thrombozyten
AC – Adenylatcyclase, ADP – Adenosindiphosphat, cAMP – cyclic Adenosinmonophosphat, Gi –
G-Protein inhibitory, Gs – G-Protein stimulatory, IP - Prostazyklin-Rezeptor, P2Y12 - P2Y
purinoceptor 12, PG-E1 - Prostaglandin E1, PKA - cAMP-abhängige Protein Kinase A, P-VASP –
phosphoryliertes VASP, VASP - vasodilator-stimuliertes Phosphoprotein
62
4. Ergebnisse
Wenn der P2Y12-Rezeptor nicht intakt ist, bewirkt das ADP keine Herabsetzung der
VASP-Phosphorylierung und das Verhältnis zwischen P-VASP/VASP bleibt ähnlich
dem der Proben, die nur mit Iloprost behandelt wurden. Im Gegensatz dazu ist der
Effekt des ADP offensichtlich wenn der P2Y12-Rezeptor funktionell ist. In diesem Fall
ist das Verhältnis zwischen P-VASP/VASP erniedrigt, im Vergleich zu der Probe, die
nur mit Iloprost behandelt wurde. Für die gewaschenen Plättchen wurde nach
Zugabe von Iloprost ein 3-facher Anstieg des Verhältnisses zwischen P-VASP und
VASP von 0,08 r 0,02 (Basal-Level) auf 0,26 r 0,03 gemessen, während die
Behandlung mit Iloprost in Kombination mit ADP eine signifikante Reduktion auf 0,10
r 0,02 (p<0,001) der Phosphorylierung bewirkte, was im Bereich von unbehandelten
Thrombozyten (basal Bedingungen) liegt. Nach der Aufreinigung konnte eine
Erhöhung der Phosphorylierung um mehr als das 3-fache von 0,09 r 0,02 auf 0,30 r
0,03 nach Stimulation des Prostaglandin-Signalweges und eine Herabsenkung von
0,17 r 0,02 (p<0,01) nach zusätzlicher Stimulation des ADP-Signalweges beobachtet
werden. Diese Werte differieren kaum zwischen Präparationen aus Vollblut und
Thrombozyten-Konzentraten und auch nicht im Vergleich zwischen washed und
hochreinen Plättchen. Daher bestätigen der beträchtliche Anstieg der VASPPhosphorylierung aufgrund der Aktivierung des PGI2 (oder Prostacyclin)-Rezeptors
und die starke Inhibierung der VASP-Phosphorylierung durch die gleichzeitige
Stimulierung des P2Y12-Rezeptors, dass beide Signalwege nach der Aufreinigung
erhalten geblieben sind (Abb. 4-9).
63
4. Ergebnisse
Phospho VASP
0,45
*** p < 0.001
** p < 0.01
0,40
WP
** p < 0.01
** p < 0.01
PP
0,35
P-VASP / VASP
0,30
0,25
0,20
0,15
0,10
0,05
0,00
Kontrolle
Iloprost
Vollblut
Iloprost + ADP
Kontrolle
Iloprost
Iloprost + ADP
Thrombozytenkonzentrat
Abbildung 4-9: P-VASP/VASP-Verhältnis bestätigt Integrität der aufgereinigten Thrombozyten
Die durchschnittliche VASP-Phosphorylierung und der Standardfehler des Mittelwertes (se) sind
gezeigt. Für die Vollblut-Proben (VB) wurden elf unabhängige Experimente für jedes Protokoll (WP:
gewaschene Plättchen; PP: hochreine Plättchen) durchgeführt und fünf Experimente für die
Thrombozyten-Konzentrat-Proben (TK). Die Reduktion der PGI2-stimulierten und IP-Rezeptorvermittelten VASP-Phosphorylierung von Thrombozyten durch den P2Y12-ADP-Rezeptor im Verhältnis
zum Gehalt an Gesamt VASP ist gezeigt.
Die nach der neu entwickelten Methode aufgereinigten hochreinen Plättchen können
im Anschluss beispielsweise für biochemische Untersuchungen von Zellorganellen in
Thrombozyten verwendet werden. Im Rahmen dieser Arbeit fanden sie Anwendung
in weiterführenden Analysen zur Thrombozyten-Membran-Charakterisierung.
64
4. Ergebnisse
4.2 Charakterisierung von zwei Thrombozyten-Membran-Fraktionen nach
Dichtegradienten-Zentrifugation
Als Grundlage für die detaillierte Analyse der Thrombozyten-Plasmamembran diente
die Aufreinigungsmethode, die in der Diplom-Arbeit von Katja Maaß am Institut für
klinische Biochemie und Pathobiochemie des Universitätsklinikums Würzburg
beschrieben worden war (3.8.7). Bei dieser Methode werden die lysierten
Thrombozyten in einem Succrose-Gradienten flotiert und man erhält nach der
Zentrifugation
eine
Anreicherung
von
Plasmamembran-Fragmenten
in
zwei
verschiedenen Bereichen des Gradienten. Die Nummerierung der Fraktionen erfolgte
von oben nach unten (Abb. 4-10).
Abbildung 4-10: Fließschema zur Aufreinigung und Separierung von ThrombozytenMembranvesikeln aus hochreinen Plättchen (PP)
65
4. Ergebnisse
Die Abbildung 4-11 zeigt unter P100.000 eine Western-Blot-Analyse der Fraktion, die
anschließend unter den Sucrose-Gradienten geschichtet wurde. Die folgenden
Fraktionen zeigen die Verteilung von Membran-Vesikeln über den Gradienten nach
Zentrifugation. Anhand des Proteins Integrin ȕ3 konnten die Fragmente detektiert
werden (Abb. 4-11). Eine große Menge fand sich in den Fraktionen 2 und 3 und dann
wieder in den Fraktionen 9 und 10. Zur näheren Charakterisierung dieser Fraktionen
wurden weitere immunobiochemische Untersuchungen durchgeführt.
So fand man das Į-Granula-Marker-Protein P-Selektin ebenfalls in diesen vier
Fraktionen. Weiterhin fanden sich geringe Mengen des Zytoskelett-Proteins Aktin in
der Fraktion 3 und etwas höhere Mengen in der Fraktion 10. Eine ähnliche Verteilung
konnte für den IP3-Rezeptor, der im Endoplasmatischen Retikulum lokalisiert ist,
gezeigt werden, da hierbei auch geringe Mengen in der Fraktion 3 und sehr große
Mengen in der Fraktionen 9 und 10 nachweisbar waren. Eine gegensätzliche
Aufteilung war für die Integrin-linked Kinase (ILK) zu beobachten, da dieses Protein
lediglich in der Fraktion 3 in geringer Menge detektiert werden konnte und ansonsten
in keiner weiteren Fraktion (Abb. 4-11).
Proteine wie GAPDH, welches ausschließlich im Zytoplasma vorkommt, konnten
weder im Gradienten-Auftrag P100.000, noch in einer Faktion des Gradienten nach
Zentrifugation entdeckt werden (Abb. 4-11). Auch die mitochondrial lokalisierten
Proteine TIM23, Prohibitin, TOM70 waren bereits im Gradientenauftrag nicht
vorhanden und somit auch nicht in den verschiedenen Fraktionen des Gradienten
(Abb. 4-11).
66
4. Ergebnisse
Abbildung 4-11: Representative Western-Blot-Analyse von Plasmamembranen aus hochreinen
Plättchen in einem Flotations-Gradienten. Gezeigt ist das Pellet nach einer 100.000 × g-Zentrifugation
der lysierten Thrombozyten, das zur Flotation unter den Succrose-Gradienten geschichtet wurde
(P100.000). Nach der Zentrifugation wurde der Gradient von oben nach unten in jeweils 2-ml-Proben
fraktioniert (Fraktion 1-14) und nach TCA-Fällung der Proben, wurden diese mittels SDS-PAGE und
Western-Blot analysiert. Zur eindeutigen Untersuchung wurden aliquote Mengen der einzelnen
Proben auf das SDS-Gel aufgetragen (20 µg/Spur).
Da die bisherigen Untersuchungen mittels Western-Blot eine Einteilung in zwei
Plasmamembranfraktionen
(Fraktionen
2/3
und
9/10)
zeigten,
sollte
eine
detailliertere Analyse der Fraktionen durchgeführt werden, um eine bessere
Charakterisierung zu erreichen. Zu diesem Zweck wurden nach der GradientenFraktionierung die Fraktion 2 mit 3 und Fraktion 9 mit 10 vereint und bei 100.000 × g
sedimentiert.
Das
entstandene
Pellet
wurde
zur
massenspektrometrischen
Untersuchung zum „Kansas Lipidomics Research Center“ geschickt (Originaldaten
im Anhang). Die Daten der Analysen sind in der Abbildung 4-12 dargestellt. In den
Diagrammen sind jeweils die verschiedenen Phospholipide (X-Achse) mit ihrem
67
4. Ergebnisse
relativen Anteil am Gesamtlipidgehalt (Y-Achse) aufgetragen. In Abbildung 4-12 ist
die Verteilung der fünf Phospholipde auf die beiden Fraktionen 2/3 und 9/10
dargestellt.
Hierbei
handelt
es
sich
um
Phosphatidylcholin
(PC),
Phosphatidylethanolamin (PE), Phosphatidylinositol (PI), Phosphatidylserin (PS) und
Phosphatidsäure (PA).
Demnach zeigen die Diagramme, dass ein größerer Anteil von PC und PE in der
Fraktion
2/3
vorhanden
ist.
Ein
ebenso
auffälliger
Unterschied
in
der
Lipidzusammensetzung der Fraktionen wird für die Phospholipide PI und PA
besonders deutlich. Die Fraktion 9/10 ist wesentlich reicher an PI und PA als die
Fraktion 2/3. Dies bedeutet, dass nahezu die Hälfte der in der Probe enthaltenen
Phospholipide Phosphatidsäure ist (Abb. 4-12).
Phospholipidverteilung
0,6
rel. Anteil an Gesamtlipid
0,5
0,4
Fraktion 2/3
0,3
Fraktion 9/10
0,2
0,1
0
PC
PE
PI
PS
PA
Abbildung 4-12: Ergebnis einer massenspektrometrischen Analyse der Membranfraktionen (2/3 und
9/10) zur Bestimmung des relativen Anteils von verschiedenen Phospholipiden am Gesamtlipidgehalt.
Dargestellt sind nur Phospholipide, die einen Unterschied in ihrer Verteilung auf die beiden zu
untersuchenden Fraktionen aufwiesen. PC-Phosphatidylcholin, PE-Phosphatidylethanolamin, PIPhosphatidylinositol, PS-Phosphatidylserin, PA-Phosphatidsäure
Diese Ergebnisse der Western-Blot-Analysen und der massenspektrometrischen
Lipidanalysen
zeigen,
dass
die
Membranen
aus
den
beiden
Fraktionen
unterschiedliche Zusammensetzungen haben und somit ggf. auch unterschiedlicher
Herkunft sind.
68
4. Ergebnisse
4.3
Der ILK - PINCH - Į-Parvin -Komplex
Nach erfolgreicher Aufreinigung von hochreinen Plättchen, deren Aufschluss mittels
hypotoner
Lyse
und
die
anschließende
Auftrennung
der
entstandenen
Plasmamembranfragmente, bestand ein weiteres Projekt dieser Arbeit darin, die
durch ein Protein-Interaktom postulierten membrangebundenen Signalwege des
Thrombozyten biochemisch zu verifizieren. Hierbei entschieden wir uns für den ILK PINCH - Į-Parvin (IPP)-Komplex, da dieser bisher in Thrombozyten nicht
nachgewiesen wurde, jedoch die Interaktion der zentralen Komplex-Komponente ILK
mit
dem
membranintegralen
Plasmamembranfragmenten
Protein
detektiert
Integrin
werden
ȕ3,
konnte
welches
(Abb.
in
4-11),
den
bereits
beschrieben wurde (Hannigan et al. 1996).
4.3.1 Experimentelle Validierung des IPP-Subnetzwerkes
Massenspektrometrische Techniken (Marcus et al. 2000) (O’Neill et al. 2002)
(Garcia et al. 2004) (Martens et al. 2005) (Moebius et al. 2005) (Garcia et al. 2005)
und die Analyse des Plättchen-Transkriptoms (Gnatenko et al. 2003) (McRedmond et
al. 2004) (Dittrich et al. 2006) haben eine große Anzahl an Plättchen-spezifischen
Komponenten identifiziert. Obwohl diese Komponenten und ihre Interaktionen die
Signaleigenschaften und Funktionen von Thrombozyten bestimmen (Dittrich et al.
2005), wurde bisher noch keine Einordnung dieser Datenmengen vorgenommen.
Daher entwickelte das Institut für Bioinformatik der Bayerischen Julius-MaximiliansUniversität
Würzburg
ein
zell-spezifisches
Model
des
humanen
Plättchen-
Interaktoms, welches sich von eben diesen gesammelten Daten von verschiedenen
Plättchen-spezifischen Proteinen ableiten lässt (Dittrich et al. 2008). Nachdem aus
dieser umfangreichen Datenbank des Thrombozyten-Proteoms ein Netzwerk aus
über 1800 Protein-Interaktionen für humane Plättchen postuliert worden war, sollten
bestimmte, hypothetische Interaktionspartner auf biochemischer Basis nachgewiesen
werden.
Anhand dieses Thrombozyten-Interaktoms können jegliche Subnetzwerke näher
charakterisiert werden und es liefert zudem eine Basis für weiterführende
experimentelle Untersuchungen von spezifischen Interaktions-Modulen. In dieser
Arbeit steht die Analyse des Subnetzwerkes um den IPP-Komplex (ILK-PINCH-DParvin, Abb. 4-13) im Fokus. Dieser Komplex bildet die Schnittstelle zwischen der
69
4. Ergebnisse
Integrin-Signaltransduktion und dem Aktin-Zytoskelett (Legate et al. 2006) und wurde
kürzlich als kritischer Regulator in Herzzellen beschreiben (Hannigan et al. 2007).
Dieses bis dahin nur theoretisch entworfene Subnetzwerk um den IPP-Komplex
(Abb. 4-13) wurde als nächstes experimentell analysiert.
Abbildung 4-13: Der IPP (ILK-PINCH-Parvin)-Komplex und ein Teil des Thrombozyten
Interaktionsnetzwerkes. Alle direkten Interaktionspartner von ILK, PINCH (LIMS1) und Parvin (Į and
ȕ) wurden aus unserem in silico Interaktom extrahiert. Gestrichelte Linien stellen Interaktionen dar, die
durch large scale Y2H Daten gewonnen wurden und durchgezogene Linien deuten auf Interaktionen
hin, die aus Literaturdaten entnommen wurden. Diese Daten aus anderen Zelltypen legen nahe, dass
auch im Thrombozyten die Interaktionen von ILK und PINCH experimentell zu prüfen sind (fette
durchgezogene Linie) Farbgebung: Aus SAGE-Analysen gewonnene Daten (grün), Proteomdaten
(gelb), sowohl aus SAGE- als auch aus Proteom-Analysen gewonnene Daten (blau), weiß hinterlegte
Proteine sind potentielle Interaktionspartner, aber die Existenz ist in Thrombozyten bisher nicht
beschreiben. (Dittrich et al. 2008) (Abk.: s. Anhang)
Während das Protein ILK bereits in Thrombozyten beschrieben wurde (Barry et al.
2002), ist PINCH bisher nur in humanen 293 embryonalen Nierenzellen (Tu et al.
1998) und Į-Parvin in humanen intestinalen glatten Muskelzellen und Fibroblasten
aus Rattenembryonen (Nikolopoulos et al. 2000) nachgewiesen worden. Daher
wurden zunächst hochreine Plättchen auf das Vorhandensein dieser beiden IPPKomplex-Komponenten mittels Western-Blot Analyse untersucht (Birschmann*,
Mietner* et al. 2008) (Abb.4-14), damit anschließend der gesamte Komplex näher
analysiert werden konnte. Das Vorhandensein von ILK in hochreinen Plättchen
konnte entsprechend bestätigt werden (Daten nicht gezeigt).
Die Abbildung 4-14A zeigt zwei Agarose-Gele zum Nachweis von PINCH und ĮParvin mittels PCR-Analyse (3.7.11). Hierfür wurden Gen-spezifische Primer zum
70
4. Ergebnisse
einen für PINCH und zum anderen für Į-Parvin verwendet (3.6). Als Positiv-Kontrolle
wurde Kolon-DNA genutzt, da beide Proteine nach den NCBI Expressions-Profilen in
diesem Gewebe exprimiert werden. Als Negativ-Kontrolle eignet sich, nach der
Datenbank, für PINCH DNA aus Gehirnzellen (Tu et al. 1999) und für Į-Parvin DNA
aus Nabelschnurzellen, da in diesen Geweben die Proteine entweder gar nicht oder
in nur sehr geringen Mengen exprimiert werden (siehe Anhang Tab. 1 und Tab. 2,
Expressionsprofile). Aus der Abbildung 4-14A geht weiterhin hervor, dass die DNA
der beiden Proteine in den Positiv-Kontrollen (Kolon) und in hochreine Plättchen
nachgewiesen werden konnte.
Zusätzlich wurde dieses Ergebnis durch eine Proteinexpressions-Analyse bestätigt
(Abb. 4-14B). Eine Expression in den Negativ-Kontrollen war wie erwartet nicht
detektierbar (PINCH) oder nur sehr gering, da berücksichtigt werden muss, dass
RNA aus Nabelschnur nicht komplett frei von Verunreinigungen durch andere
Zelltypen, wie Blutzellen ist (Į-Parvin). Eine hohe Expression hingegen zeigte sich in
den beiden Positiv-Kontrollen und in den hochreinen Plättchen.
Abbildung 4-14A: Repräsentative Agarose-Gelelektrophorese der PCR-Produkte zur mRNAVerifizierung von PINCH und Į-Parvin in Thrombozyten.
Zelluläre Gesamt-RNA (1 µg) von hochreine Plättchen, als auch von Kolon (Positiv-Kontrolle) und
Gehirn (Negativ-Kontrolle) für PINCH und Kolon (Positiv-Kontrolle) und Nabelschnur (NegativKontrolle) für Į-parvin, wurden revers-transkribiert und mittels PCR unter Verwendung von Genspezifischen Primern für PINCH und Į-Parvin analysiert. Zehn µl des 50-µl Reaktions-Mixes wurden
durch Ethidiumbromid-gefärbte Agarose-Gelelektrphorese analysiert.
Abbildung 4-14B: Repräsentative Western-Blot Analyse von PINCH und Į-Parvin. Eine PINCHspezifische Bande wurde bei 37 kDa detektiert und eine Į-Parvin-spezifische Bande bei 42 kDa. Der
obere Teil der Abbildung zeigt die Immunodetektion von PINCH in hochreine Plättchen, Kolon (PositivKontrole) und Gehirn (Negativ-Kontrolle). Der untere Teil der Abbildung zeigt die Immunodetektion
von Į-Parvin in hochreine Plättchen, Kolon (Positiv-Kontrolle) und Nabelschnur (Negativ-Kontrolle). Es
wurden für jede Probe aliquote Mengen auf die Gele aufgetragen (20 µg/Spur). (Birschmann*,
Mietner* et al. 2008)
71
4. Ergebnisse
Da nun alle Elemente des IPP-Komplexes in Thrombozyten nachgewiesen waren,
konnten die Schlüssel-Interaktionen des Komplexes anschließend validiert werden.
Hierzu wurde die Technik der Immunopräzipitation angewandt. Zunächst wurde der
IgG-Antikörper ILK an eine Protein G-Sepharose-Säule gebunden und die Säule
anschließend mit Lysat aus hochreine Plättchen inkubiert. Als Negativ-Kontolle
wurde die gleiche Säule ohne Antikörper verwendet, die lediglich mit dem
Thrombozytenlysat inkubiert wurde. Nach mehrmaligem Waschen wurde 2x SDSProbenpuffer auf die Säulen gegeben und auf diese Weise die gebundenen Proteine
denaturiert und von der Säule abgelöst. Alle Proben des Versuchs wurden einer
SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (3.7.1) unterzogen und mittels Western-Blot
(3.7.4) analysiert.
Abbildung 4-15: Immunopräzipitation von ILK, durchgeführt mit Protein G-Sepharose. Vergleich des
Einflusses von verschiedenen Detergenzien (2% Triton X-100, 2,5% Nonidet P40) auf die Spezifität
der Proteinbindungen. Es wurde als Negativ-Kontrolle reine Protein G-Sepharose verwendet und als
Probe zum Vergleich ILK-gekoppelte Protein G-Sepharose. Nach Inkubation wurden beide Ansätze 3
× mit den entsprechenden Immunopräzipitationspuffern incl. des speziellen Detergenzes gewaschen
und anschließend mit 2× SDS-Probenpuffer (3.4) für die Analyse mittels SDS-PAGE (3.7.1) eluiert.
Da eine sehr hohe unspezifische Bindung des Proteins ILK an die Säulen-Matrix
stattgefunden hatte und auch nach Zugabe von Detergenzien wie Triton X-100,
Nonidet
P40
(Abb.
4-15),
SDS
oder
NaCl
(Daten
nicht
gezeigt)
zum
Immunopräzipitations-Puffer keine spezifischere Bindung an den Antikörper erreicht
werden konnte, wurde ein alternatives Säulenmaterial für die Immunopräzipitation
gewählt. Doch auch bei der Anwendung von Protein A-Agarose war ebenfalls diese
72
4. Ergebnisse
unspezifische Bindung an die Säulen-Matrix zu beobachten (Daten nicht gezeigt)
(3.8.8). Erst die Optimierung des Versuchsprotokolls und die Verwendung von
Antikörper-gekoppelten,
magnetischen
Dynabeads®
(3.8.9)
zeigten
eine
zufriedenstellende, spezifische Bindung der Proteine (ILK und PINCH) und eine reine
Negativ-Kontrolle (Abb. 4-17A).
Somit wurde im Rahmen dieser Arbeit eine zuverlässige und leicht anwendbare
Methode zur Untersuchung von Protein-Interaktionen in Thrombozyten entwickelt
(Abb. 4-16).
Abbildung 4-16: Fließschema der Immunopräzipitation unter Anwendung von magnetischen
Dynabeads® zur Identifizierung von Protein-Protein-Interaktionen in Thrombozyten.
Da viele Protein-Interaktionen in Zellen durch eine Umorganisation des Zytoskeletts
bedingt sind, sollte der Einfluss der Thrombozyten-Aktivierung und -Aggregation auf
die Assemblierung des IPP-Komplexes untersucht werden. Zu diesem Zweck wurde
der Vergleich zwischen unstimulierten, ADP-stimulierten und TRAP-stimulierten
Thrombozyten durchgeführt.
73
4. Ergebnisse
Um unspezifische Bindungen an die beads bzw. die konstanten IgG’s ausschließen
zu
können,
wurden
als
Negativkontrolle
Maus-IgG-gekoppelte
Dynabeads
verwendet. Da das Protein ILK eine Größe von 59 kDa hat und die Maus IgG’s 55
kDa groß sind, wurde zur eindeutigen Detektion die Immunopräzipitation von ILK mit
einem Antikörper aus Maus durchgeführt und im Western-Blot schließlich mit einem
ILK-Antikörper aus Ziege detektiert. Zunächst ließ sich erkennen, dass, unabhängig
von einer Stimulation der Thrombozyten, eine Bindung von ILK und PINCH an die
jeweils mit entsprechendem Antikörper gekoppelten Dynabeads® stattgefunden hatte
(Abb. 4-17A rote Kreise). Weiterhin ließen sich Interaktionen von ILK-gekoppelten
beads mit PINCH und von PINCH-gekoppelten beads mit ILK nachweisen (Abb. 417A grüne Kreise). Diese endogenen Interaktionen konnte sowohl in unstimulierten
als auch in ADP- oder TRAP-stimulierten Plättchen nachgewiesen werden (Abb. 417A). Um sicherzustellen, dass die Proteine im Eluat aus dem Zytosol stammten und
nicht membrangebunden waren, wurden die Eluate auf das Vorhandensein von PSelektin hin analysiert.
Die Funktionelle Integrität der Thromboyzten-Plasmamembanrezeptoren wurde, wie
von Geiger et al. 1999 beschrieben, analysiert (Geiger et al. 1999). Die Stimulation
und Inhibition der VASP-Phosphorylierung durch PGI2 und ADP, weisen auf die
funktionelle Integrität des PGI2- und P2Y12 ADP Rezeptors hin (Abb. 4-17B).
74
4. Ergebnisse
Abb. 4-17A: PINCH assoziiert mit ILK in vivo in humanen Plättchen. Die hochreinen Plättchen wurden
mit verschiedenen Agonisten stimuliert und anschließend lysiert. Der 100.000 × g Überstand wurde
mit PINCH-, ILK-Antikörpern und Maus IgG immunopräzipitiert. Die Eluate wurden einer SDS-PAGE
und anschließender Western-Blot Analyse mit Antikörpern gegen ILK, PINCH und P-Selektin
unterzogen. Als Positiv-Kontrolle für den P-Selektin-Nachweis wurde Lysat aus gewaschenen
Plättchen aufgetragen. Als Negativ-Kontrolle wurden ungekoppelte Dynabeads® mit Lysat aus
hochreinen Plättchen inkubiert.
Abb. 4-17B: Der 100.000 × g Überstand wurde auf VASP Phosphorylierung (VASP-PSer157, VASPPSer239) mittels der Western-Blot Methode hin untersucht. Funktionelle Integrität und die Kapazität der
Thromboyztenmembanrezeptoren wurden anhand der Thrombozytrenrezeptor-regulierten VASPPhosphorylierung analysiert
Es wurden aliquote Mengen an Protein für jede Probe auf die SDS-PAGE-Gele aufgetragen (20
µg/Spur).
P
Nach der Detektion von ILK und PINCH in Thrombozyten sollten anschließend neue
Proteine identifiziert werden, die mit den IPP-Komplex-Komponenten in Plättchen
interagieren. Um weitere neue Protein-Protein-Interaktionen in Thrombozyten zu
identifizieren, konnte im Rahmen dieser Arbeit eine weiterführende Methode gezeigt
werden. Zu diesem Zweck wurden die Immunopräzipitations-Proben von ILK und
PINCH auf ein SDS-Polyacrylamid-Gel aufgetragen und das Gel anschließend
mittels Silberfärbung angefärbt (Abb. 4-18).
75
4. Ergebnisse
Im visuellen Vergleich der beiden Proben mit der Negativ-Kontrolle konnten
Unterschiede im Expressionsmuster festgestellt werden. Aus diesem Grund wurden
die individuellen Banden A1 und A2, die in der PINCH-Probe aber nicht in der
Negativ-Kontrolle zu sehen waren und die Banden B1 und B2, die in der ILK-Probe
aber nicht in der Negativ-Kontrolle erkennbar waren, aus dem Gel ausgeschnitten
und massenspektrometrisch analysiert.
Abbildung 4-18: Silbergel-Färbung zur Überprüfung der Expressionsunterschiede von Proteinen, die
in Thrombozyten mit den IPP-Komplex-Bausteinen PINCH bzw. ILK interagieren. Die Ausschnitte A1
und A2 zeigen Proteine, die möglicherweise mit PINCH interagieren, jedoch nicht in der NegativKontrolle detektiert wurden. Die Ausschnitte B1 und B2 stellen Proteine dar, die eventuell mit ILK
interagieren, aber ebenfalls nicht in der Negativ-Kontrolle nachgewiesen werden konnten.
76
4. Ergebnisse
Bei dieser Analyse konnten folgende Proteine in den ausgeschnittenen Banden
identifiziert werden:
Probe
A1
Proteine
1. Ig kappa chain C region (P01837)
2. Apolipoprotein A-I precursor (Apo-AI) (ApoA-I) [Contains: Apolipoprotein A-I(1-242)] (P02647)
4. Complement C1q subcomponent, C chain precursor (P02747)
5. Keratin
6. Trypsin
B1
1. Apolipoprotein A-I precursor (Apo-AI) (ApoA-I) [Contains: Apolipoprotein A-I(1-242)]
(P02647)
4. Ig lambda chain C regions (P01842)
5. Serum albumin precursor (Allergen Bos d 6) (BSA) (P02769)
6. Ras-related protein Rab-10 (P61026)
7. Ras-related protein Rab-6A (Rab-6) (P20340)
8. Platelet glycoprotein Ib beta chain precursor (GP-Ib beta) (GPIbB) (GPIb-beta) (P13224)
9. Trypsin
A2
1. Major vault protein (MVP) (Lung resistance-related protein) (Q14764)
3. Integrin alpha-IIb precursor (Platelet membrane glycoprotein IIb) (P08514)
4. Talin-1 (Q9Y490)
5. Thrombospondin-1 precursor (P07996)
6. Keratin
7. Trypsin
B2
1. Unc-112 related protein 2 (Kindlin-3) (MIG2-like) (Q86UX7)
3. Heat shock cognate 71 kDa protein (Heat shock 70 kDa protein 8) (P11142)
4. Keratin
5. Arachidonate 12-lipoxygenase, 12S-type (EC 1.13.11.31) (12-LOX) (Platelet-type
Lipoxygenas (P18054)
Tabelle 4-19: Auflistung der Ergebnisse einer massenspektrometrischen Analyse zur Identifizierung
möglicher Interaktionspartner von PINCH (A1 und A2) und ILK (B1 und B2) aus zuvor bestimmten
Bereichen eines SDS-Polyacrylamid-Gels.
77
4. Ergebnisse
Die postulierten Interaktionspartner von ILK und PINCH aus Tabelle 4-19 können
nun mit den Literaturdaten abgeglichen werden. Durch diesen Vergleich lassen sich
potentiell neue, noch nicht beschriebene Interaktionen identifizieren, mittels derer
weiterführende Interaktionsanalysen geplant und durchgeführt werden können.
Anhand der oben beschriebenen Ergebnisse wird deutlich, dass die neu entwickelte
Aufreinigungsmethode für Thrombozyten ein wichtiges Werkzeug für verschiedenste
Untersuchungen an Blutplättchen darstellt. Zur Verdeutlichung der unterschiedlichen
Applikationsgebiete, fand sie im Rahmen dieser Arbeit Anwendung in zwei möglichen
Analysebereichen: der Charakterisierung von Membranzusammensetzungen auf
Lipidebene und der Protein-Interaktions-Studien.
78
5. Diskussion
5
Diskussion
5.1
Generierung von hochreinen Plättchen
Ein Ziel dieser Arbeit war es, eine zuverlässige Technik zur Herstellung von
hochreinen Plättchen zu entwickeln, welche anschließend für Protein- oder mRNAAnalysen verwendet werden können. Die Methode sollte in allen biologischen Labors
durchführbar sein, auch wenn keine Thrombozyten-Konzentrate zur Verfügung
stehen. Da die Aufreinigung von Thrombozyten von steigender Relevanz für die
neuen
Proteom-
und
Transkriptom-Techniken
ist,
die
einen
sehr
hohen
Reinheitsgrad der Proben für valide Ergebnisse erfordern, hat das „Platelet
Physiology Subcommittee der ISTH Scientific Standardisation Committee (SSC)„
explizit darauf hingewiesen, dass die Reinheit der Thrombozyten wichtig für
Hochdurchsatzverfahren wie massenspektrometrische Analysen oder SAGE ist
(Watson et al. 2005).
Um die Probleme der Aufreinigung anzugehen, wurden bisher verschiedene
Techniken, wie laserunterstützte Mikrodissektion und Manipulation (Fink et al. 2003),
serielle Filtration und Gel-Filtration (Bugert et al. 2003) (Gnatenko et al. 2003) (Rox
et
al.
2004)
und
Antikörper-vermittelte
Depletion
von
Leukozyten
mittels
Magnetbeads (Bugert et al. 2003) (Gnatenko et al. 2003) (Fink et al. 2003) (Hillmann
et al. 2006) durchgeführt. Filtration wird allgemein in Labors genutzt, die die
Möglichkeit haben Thrombozyten-Konzentrate über die Transfusionsmedizin zu
beziehen, da diese einen höheren Anteil an Blutplättchen aufweisen als das gleiche
Volumen an Vollblut. Denn durch die Filtration geht ein großer Anteil an
Thrombozyten
verloren,
so
dass
eine
dementsprechend
hohe
Menge
an
Blutplättchen eingesetzt werden muss, um eine, für weiterführende Versuche
erforderliche Anzahl an Thrombozyten nach der Filtration zu behalten. Somit hat die
Methode der Filtration zum einen den Nachteil, dass sie nach einer sehr hohe Menge
an Thrombozyten als Ausgangsmaterial verlangt, zum zweiten, dass während der
Filtration die Thrombozyten teilweise aktiviert werden können und zum dritten, dass
auch weiterhin Kontaminationen durch andere Blutzellen und Serumproteine in den
aufgereinigten
Proben
vorhanden
sind,
was
wir
während
unserer
Arbeit
nachgewiesen haben (Birschmann*, Mietner* et al. 2008).
Für die im Rahmen dieser Arbeit neu entwickelte Aufreinigungsmethode ist bereits
eine relativ geringe Menge an Vollblut ausreichend. So ergibt die Aufreinigung von
79
5. Diskussion
80 mL Vollblut einen Gehalt an 2,4 × 109 hochreinen Plättchen und eine
Proteinmenge von 3,5 mg. Aus der Aufreinigung von 20 mL ThrombozytenKonzentrat erhält man 1,7 × 109 hochreine Plättchen und 2,8 mg Protein.
Darüber hinaus bergen die oben genannten Thrombozyten-Präparations-Methoden
weitere Nachteile, wie hohe Kosten und partielle Aktivierung der Thrombozyten
während der Filtrationsprozesse. Aus diesen Gründen kam bei der neuen Technik
ein Optiprep® Gradient zur Anwendung, welcher nachweislich schonend für die
Blutplättchen ist und die Zellen daher während der Prozedur einen hervorragenden
morphologischen Status beibehalten (Ford et al. 1990) (Bagamery et al. 2005). Nach
Vergleich mehrerer alternativer Zentrifugations- und Waschschritte wurde die
beschriebene Aufreinigungstechnik (3.8.1) als am effektivsten bewertet, da die oben
erwähnten Probleme, wie Kontamination durch andere Zellen oder Aktivierung
während der Aufreinigung, behoben werden konnten. Der Beweis für die Effektivität
dieser Methode wurde erbracht, indem die Effizienz von Leukozyten-, Erythrozytenund Serumprotein-Depletion (Abb. 4-5, 4-6) und die Funktionalität zweier wichtiger
Thrombozyten-Rezeptoren, dem Prostacyclin- (PGI2) und dem ADP- (P2Y12)
Rezeptor, überprüft wurden (Abb. 4-9).
Gerade die Kontamination durch Leukozyten ist ein schwerwiegendes Problem bei
der Thrombozyten-mRNA-Analyse, da der mRNA-Gehalt in Leukozyten etwa
12.500fach höher ist als der in Blutplättchen (Fink et al. 2003). Anhand von
durchflusszytometrischen Untersuchungen konnte eine vollständig Eliminierung von
Leukozyten in beiden Präparationen (Abb. 4-6) nachgewiesen werden. Die effektive
Eliminierung von Leukozyten wurde zudem noch mittels RT-PCR unter Verwendung
von gen-spezifischen Primern für Leukozyten (CD15 und HLA-DQȕ) (Abb. 4-7)
verifiziert. Da die Detektionsgrenze bei der FACS-Analyse zwischen 1-350
Leukozyten/µl liegt, erfolgte diese zusätzliche Reinheitsüberprüfung auf der Basis der
RNA, da die RT-PCR eine wesentlich sensitivere Methode ist und bereits ein Molekül
Leukozyten-mRNA nachweist. Es war keiner der beiden Marker (CD15 und HLADQȕ) in der Thrombozyten-cDNA nachweisbar, die aus den aufgereinigten
Blutplättchen des neu entwickelten Protokolls isoliert worden waren.
Während diese Reinheitskontrollen eine generelle Standardüberprüfung bei mRNAAnalysetechniken wie Microarray und SAGE Analysen sind, fehlen sie meist bei
Untersuchungen mittels Proteom-Techniken. Diese Tatsache muss sehr kritisch
betrachtet werden, da der Proteingehalt von Leukozyten 65x höher ist, als der von
80
5. Diskussion
Thrombozyten und demnach schon eine geringe Anzahl von Restleukozyten keine
zuverlässigen
Ergebnisse
mehr
liefert.
Daher
ist
es
bei
den
bisherigen
Untersuchungen nicht eindeutig, ob neu detektierte Proteine in den Präparationen
wirklich in Thrombozyten exprimiert werden oder z.B. von Leukozyten, die die Probe
kontaminieren, stammen. Zudem erschweren Verunreinigungen eine Detektion von
niedrig abundanten Proteinen. Viele Publikationen, auch die, die sich mit ProteomAnalysetechniken befassen (Maguire et al. 2002) (Marcus et al. 2003) (Moebius et
al. 2005), haben diesen Fakt vernachlässigt, was zu der Frage führt, ob die
publizierten Proteine tatsächlich Thrombozytenproteine sind oder in Leukozyten oder
Erythrozyten exprimiert werden. Dies hebt erneut die Notwendigkeit einer leicht
handhabbaren Methode zur Generierung von hochreinen Plättchen hervor, um die
bestehenden Ergebnisse der bisherigen Untersuchungen zu validieren.
Darüber hinaus wurde in unserer neu entwickelten Methode der Gehalt an
Serumproteinen untersucht. Dieses ist ebenfalls von großer Bedeutung für Analysen
auf
Proteom-Basis,
da
auch
hierbei
stark
exprimierte
Blutplasmaproteine
fälschlicherweise als Thrombozyten-Proteinen identifiziert werden könnten. ProteinPräparationen,
die
nach
dem
Standardprotokoll
durchgeführt
wurden,
enthalten
gewaschene
Plättchen
durch
annähernd
zwei
10%
für
gewaschene
(w/w)
Plättchen
Serumalbumin.
Standardzentrifugationsschritte
Da
hergestellt
werden, sind nachweislich in den aus Vollblut aufgereinigten Thromboyzten-Proben
62,3 µg Serumalbumin/mL und die aus Thrombozytenkonzentraten aufgereinigten
Proben enthalten auch noch 56,8 µg Serumalbumin/mL. Somit zeigt sich deutlich die
wesentlich
höhere
Aufreinigungseffizienz
der
von
uns
beschriebenen
Aufreinigungsmethode, da hierbei die Menge an Serumalbumin unterhalb des
Detektionsniveaus von <2 µg/mL liegt. Um den Gehalt an Serumalbumin bis
unterhalb
des
Detektionsniveaus
Aufreinigungsmethoden
notwendig,
zu
die
reduzieren,
war
es
Thrombozytenproben
bei
drei
bisherigen
Mal
zu
zentrifugieren. Dies ist nach der von unserer Gruppe neu entwickelten Methode nicht
erforderlich, wodurch sich das Risiko der Thrombozytenaktivierung während der
Aufreinigung erheblich reduziert (Birschmann*, Mietner* et al. 2008).
Wie bereits erwähnt, kommt es bei der Aufreinigung von Thrombozyten häufig zu
deren Aktivierung, wenn Methoden wie Filtration verwendet werden. Berichte
verschiedener Gruppen zeigen einen Verlust der Thrombozyten-Funktionalität und
81
5. Diskussion
nur
eine
geringe
Ausbeute
an
Thrombozyten
nach
Verwendung
von
Filtrationsmethoden (Shiba et al. 1997) (van der Meer et al. 2001). Aus diesem
Grund war ein weiterer wichtiger Aspekt dieser Arbeit die Aktivierung von
Thrombozyten nach Anwendung des entwickelten Aufreinigungsprotokolls zu
überprüfen. Zu diesem Zweck, wurde die Funktionalität von zwei verschiedenen
Rezeptoren (IP und P2Y12 Rezeptor) mittels einer erst kürzlich entwickelten Methode
bestätigt (Geiger et al. 2005) (Abb. 4-9). Die Aktivierung der Thrombozyten durch
Thrombin, Kollagen oder mechanische Reize bewirken eine ADP-Freisetzung aus
den dichten Granula. Werden Blutplättchen andauernd aktiviert – also ständig ADP
ausgeschüttet – dann werden sie desensitiviert, genauer gesagt ihre P2Y1- und
P2Y12-Rezeptoren sind nicht länger funktionell (Holme et al. 1977) (Poole et al.
1993) (Enjyoji et al. 1999) (Baurand et al. 2000) (Hardy et al. 2005). Wenn nach der
Aufreinigungsprozedur die Aktivierung dieser beiden Rezeptoren in hochreinen
Plättchen überprüft wurde und die beiden noch aktiv sind, heißt das, dass die
Thrombozyten durch unsere neue Methode nicht aktiviert worden sind.
Da eine Aktivierung Veränderungen in den posttranslationalen Modifikationen
hervorrufen könnte, ist es essentiell, den Grad der Thrombozyten-Aktivierung
während der Blutspende und der anschließenden Zellisolation zu minimieren. Posttranslationale Modifikationen wie Phosphorylierung (Maguire et al. 2003) (Marcus et
al. 2003) (Garcia et al. 2004) (Garcia et al. 2006) (Zahedi et al. 2006) (Zahedi et al.
2007) und Glykosylierung (Lewandrowski et al. 2006) (Lewandrowski et al. 2007)
werden aktuell in Proteom-Studien an humanen Thrombozyten intensiv untersucht.
Um diese Komponenten der Thrombozyten-Signaltransduktion zu identifizieren,
muss der Grad der Protein-Modifikationen von aktivierten Thrombozyten mit dem von
unstimulierten, ruhenden Thrombozyten verglichen werden. In Hinblick darauf muss
die Verwendung von Substanzen zur Stabilisierung von Thrombozyten-Proben
während der Isolation, wie Agenzien zur Erhöhung des cAMP-Spiegels (z.B.
Prostacyclin), kritisch betrachtet werden, da diese neue Proteinformen durch
Phosphorylierung generieren könnten. Für die Untersuchungen während dieser
Arbeit wurde keine dieser Substanzen verwendet und daher ist eine Veränderung in
post-translationalen Modifikationen auszuschließen.
Anwendung fanden die hochreinen Plättchen zum einen in Arbeiten unseres
Institutes
über
die
Bildung/Speicherung
von
NOS
in
humanen
Plättchen
(Diplomarbeit Stefan Hartmann, 2007) (Gambaryan et al. 2008). Es konnte gezeigt
82
5. Diskussion
werden, dass Thrombozyten keine eNOS/iNOS Transkripte enthalten. Dabei wurde
angenommen, dass die positiven eNOS und iNOS-Signale bei der RT-PCR in
früheren Forschungsarbeiten (Mehta et al. 1995) (Chen et al. 1996) (Freedman et al.
1999) durch Kontaminationen von anderen Blutzellen oder Blutzellbestandteilen in
konventionell aufgereinigten Thrombozyten verursacht werden. Die Ergebnisse der
Arbeit bestätigten diese Annahme, da sie zeigen konnten, dass die eNOS und iNOS
mRNA-Signale aus den bisherigen Aufreinigungsmethoden von LeukozytenKontaminationen herrührten und diese Signale in den nach unserer Methode
aufgereinigten hochreinen Plättchen nicht detektiert werden konnten (Gabaryan et al.
2008). Entsprechende Daten konnten auch für die Proteine eNOS und iNOS gezeigt
werden. Auch die standardmäßig in der Literatur verwendete Methode der
Immunopräzipitation führte aus den hochreinen Plättchen zu keinem Nachweis von
eNOS in Thrombozyten, während die entsprechende Positivkontrolle aus HUVECZellen eine immense Anreicherung des Proteins zeigte (I. Birschmann, personal
communication).
Die zweite Möglichkeit zur Anwendung der hochreinen Plättchen konnte im Rahmen
der vorliegenden Arbeit gezeigt werden. Dazu wurde ein wichtiger Signalweg in
Thrombozyten untersuchten und die Anwesenheit von zwei, in Blutplättchen neu
identifizierten, Proteinen dieses Signalweges bestätigt PINCH und Į-Parvin sind
Komponenten des sogenannten IPP-Komplexes (2.7.2), welcher bisher in C2C12
Mauszellen und humanen 293 embryonalen Nierenzellen (Zhang et al. 2002)
ausführlich beschrieben wurde. In Thrombozyten ist dieser Signalweg für die
Aggregation
verantwortlich
(5.3).
Diese
Funktion
ist
abhängig
vom
Oberflächenrezeptor Integrin ĮIIbȕ3, welcher durch intrazelluläre Signale („inside-out
signaling“) aktiviert wird, die zu einer Modifikation der Integrin-Konformation und
einer Fibrinogenbindung führen. Der besetzte Rezeptor wiederum sendet ein Signal
zurück in die Zelle („outside-in signaling“), was eine zytoskeletale Modifikation, eine
Multikomplex-Bildung und ein Integrin-Clustering zur Folge hat (Law et al. 1996)
(Payrastre et al. 2000). Ein Protein, das an der Regulation von Integrinen beteiligt ist,
ist ILK (integrin-linked kinase) (2.7.1.1). Während ILK in Thrombozyten bereits
beschrieben ist (Pasquet et al. 2002), sind die zwei weiteren Proteine des IPPKomplexes, Į-Parvin (Martens et al. 2005) (Dittrich et al. 2006) und PINCH (Garcia
et al. 2004) (Martens et al. 2005) (Dittrich et al. 2006), bisher nur in Hochdurchsatz-
83
5. Diskussion
Analysen des Thrombozyten-Proteoms und -Transkriptoms (Massenspektrometrie
und SAGE) identifiziert worden.
Die Beteiligung des assemblierten IPP-Komplexes an der Zytoskelett-Organisation
(Legate et al. 2006), in Herzzellen (Hannigan et al. 2007) und in glatten Muskelzellen
(Zhang et al. 2007) wurde bereits bestätigt. Somit war davon auszugehen, dass der
IPP-Komplex auch in Thrombozyten mitverantwortlich ist für biochemische Vorgänge
bei der Zytoskelett-Organisation. Mit der Absicht alle Komponenten des Komplexes
in Thrombozyten nachzuweisen, war es im Rahmen dieser Arbeit möglich, die
Anwesenheit von D-Parvin und PINCH, sowohl auf mRNA-Basis mittels PCR als
auch auf Protein-Basis mittels Western-Blot in hochreinen Plättchen zu verifizieren
(Abb. 4-14A/B).
Diese Nachweise sind lediglich ein Beispiel für die Anwendung des neu entwickelten
Aufreinigungsprotokolls für Thrombozyten, um Daten aus massenspektrometrischen
oder SAGE Analysen zu validieren.
Die Identifizierung von Į-Parvin und PINCH war Grundlage weiterer Untersuchungen
zur Charakterisierung des IPP-Komplexes in Thrombozyten und wird im Folgenden in
Kapitel 5.3 beschrieben.
5.2
Charakterisierung der Plasmamembran von Thrombozyten
Durch die im Rahmen dieser Arbeit entwickelte Methode zur Generierung von
hochreinen Plättchen war es in einem weiteren Schritt möglich, die aufgereinigten
Thrombozyten zur anschließenden detaillierten Untersuchung und Charakterisierung
der Thrombozyten-Plasmamembran einzusetzen.
Plasmamembranen stellen die äußere Begrenzung jeder eukaryotischen Zelle dar
und teilen intrazelluläre Kompartimente vom Zytosol der Zelle ab. Somit sind sie nicht
nur für den Molekülaustausch zwischen Extra- und Intrazellulärraum verantwortlich,
sondern sind ebenso an den meisten grundlegenden biochemischen Funktionen
innerhalb einer Zelle beteiligt (Gennis et al. 1989). Durch eine große Anzahl von
membrangebundenen Proteinen fungieren Plasmamembranen als Plattform für
weitere Proteine, die in verschiedensten Signaltransduktionswegen eine wichtige
Rolle spielen. Somit können mittels detaillierter Untersuchungen neue Erkenntnisse
über Rezeptoren und Interaktionspartner gewonnen werden. Eine Arbeitsgruppe
unseres
Institutes
hat
beispielsweise
in
aktuellen
Studien
gezeigt,
dass
Untersuchungen an Plasmamembran-stabilisierenden Proteinen wie den Spektrinen
84
5. Diskussion
von
großem
Interesse
Zytoskelettorganisation
für
bei
die
Forschung
endothelialen
sind.
Sie
zeigten,
Zell-Zell-Kontakten
dass
durch
die
den
Proteinkomplex DII-Spektrin - VASP reguliert wird und eine Prostaglandin-induzierte
VASP-Phosphorylierung den DII-Spektrin Abbau in apoptotischen Zellen kontrolliert
(Benz et al. 2008, Benz et al. 2008).
Ebenso interessant für die Charakterisierung von Membranen sind neben den
Proteinen auch die Lipide, die Bausteine jeder biologischen Membran. Die meisten
Membranen einer Eukaryontenzelle, auch die Plasmamembran, werden im
Endoplasmatischen Retikulum (ER) synthetisiert; eben hier wird auch die
Phospholipid-Asymmetrie geschaffen. Diese Asymmetrie kann von funktioneller
Bedeutung sein. Je nach Aufgabe der Membran werden bei der Synthese im ER
entsprechende Phospholipide in die Membran eingebaut. Die zelluläre Lokalisation,
die lokale Konzentration und die Interaktionspartner von Lipiden bestimmen somit die
Funktionalität der Membranen. Daher liefert eine Lipid-Analyse eine geeignete Basis
für das Verständnis der Rolle von Lipiden bei der Aufrechterhaltung des
elektrochemischen Gradienten, der subzellulären Einteilung, der Primär- und
Sekundäre-Messenger-Signalübertragungen,
der
Energiespeicherung
und
der
Regelung des Proteintransportes innerhalb einer Zelle (van Meer et al. 2005). Die
physiologische Relevanz von Lipiden wird durch die zahlreichen Erkrankungen, wie
Atherosklerose, Diabetes, Fettleibigkeit und die Alzheimer Erkrankung, welche durch
eine Lipidabnormalität gekennzeichnet sind, verdeutlicht (Watson et al. 2006). In
Verbindung mit Genomics und Proteomics werden die Lipidomics dazu beitragen, die
Lipidfunktionen in biologischen Systemen zu verstehen. Zudem können sie
einflussreiche Werkzeug für die Aufklärung des Mechanismus von lipid-basierenden
Erkrankungen, für die Überwachung biologisch relevanter Lipide und für die
pharmakologische Therapiekontrolle sein (Watson et al. 2006).
Lipidanalysen werden somit in Zukunft von immer größerer Relevanz für die
Diagnostik sein. So ist bereits seit langem die Untersuchung von Fettsäuren in den
Membranen von Erythrozyten ein diagnostischer Indikator für den Mangel an
essentiellen Fettsäuren bei Kindern. Dieser Test wurde zu einer RoutineUntersuchung, lange bevor die molekulare Diversität von Membranlipiden bekannt
war (Wolf et al. 2008).
Weiterhin ist es der Gruppe um Han et al. 2007 gelungen, bei der Erforschung der
Ursache von diabetischer Kardiomyopathie, welche durch Diabetes mellitus
85
5. Diskussion
hervorrufen wird, neue Erkenntnisse zu erlangen. Die Forscher untersuchten
diabeteserkrankte Mäuse mit Hilfe der „Lipidomics“-Methode. Hierbei analysierten sie
die genaue Lipidzusammensetzung im Herzmuskelgewebe der Mäuse und fanden
heraus, dass die Herzen der diabetischen Mäuse große Mengen an Cardiolipin
verlieren. Dieses Phospholipid ist ein wichtiger Baustein der Herzmuskulatur und
unterstützt u.a. die Pumpfunktion des Herzens. Sie fanden weiterhin heraus, dass die
Veränderungen beim Cardiolipin deutlich eher auftreten als andere Kardiomyopathietypische
Anzeichen,
wie
die
Einlagerung
schädlicher
Fettdepots
in
die
Herzmuskulatur. Somit wäre es denkbar, dass das Cardiolipin zukünftig als Marker
für die frühzeitige Diagnostik einer diabetischen Kardiomyopathie verfügbar ist (Han
et al. 2007).
Um thrombozytäre Membranen während meiner Arbeit näher untersuchen und
charakterisieren zu können, wurden hochreine Plättchen mittels Glycerolgradienten
und osmotischen Lyse aufgeschlossen (3.8.7). Zur Abtrennung von weiteren
Zelldebris wurde das Lysat unter einen Sucrose-Dichte-Gradienten geschichtet und
nach erfolgter Zentrifugation konnte anhand der SDS-PAGE eine deutliche
Auftrennung der aufgereinigten Membranfragmente in zwei eindeutige Fraktionen
festgestellt werden (4.2). Wie aus der Abbildung 4-9 hervorgeht, konnte anhand des
membranintegralen Proteins Integrin E3, welches in der Plasmamembran von Zellen
lokalisiert ist, eine definitive Aussage über die Verteilung der Membranfragmente im
Gradienten getroffen werden. Denn es war zu erkennen, dass sich in den Fraktionen
2 und 3, die zusammengeführt wurden und im Folgenden als Fraktion 2/3 bezeichnet
werden, eine deutlich höhere Konzentration an Integrin E3 nachweisen ließ als in den
Fraktionen 9 und 10, im Folgenden Fraktion 9/10 genannt. Diese Tatsache deutete
darauf hin, dass sich in der Fraktion 2/3 die Fragmente der Plasmamembran
angereichert hatten, wohingegen die Membranfragmente in der Fraktion 9/10
hauptsächlich von intrazellulären Membranen stammen mussten, da diese geringere
Mengen an Integrin E3 enthielten.
Für die Annahme, dass sich im Dichtegradienten Plasmamembran-Fragmente und
Organellenmembran-Fragmente aufgetrennt haben, sprach zusätzlich die Verteilung
des Proteins ILK, welches, wie bereits in Kapitel 2.8.2 beschrieben wurde, an der
Zytoskelett-Organisation beteiligt ist. Hierbei ist es in einem Komplex mit weiteren
Proteinen über das Integrin E3 an der Plasmamembran in aktivierten Thrombozyten
lokalisiert. Durch diese Tatsache lässt sich erklären, dass ILK im Western-Blot in der
86
5. Diskussion
Fraktion 2/3 deutlich stärker detektiert werden konnte, wohingegen sich in der
Fraktion 9/10 kein Protein bzw. deutlich weniger nachweisen ließ. Daraus folgt, dass
in der Fraktion 9/10 erheblich weniger Plasmamembran-Fragmente, mit dem
entsprechenden Proteinkomplex, vorhanden waren oder sich sogar gar kein Komplex
gebildet hat. Um diese Aussage zu bestärken, müsste der Versuch mit einem
wesentlich höheren Gehalt an lysierten Thrombozyten und mehreren Gradienten
wiederholt werden, um die eventuell sehr geringen Mengen des Kompexes
nachweisen zu können.
Eine weitere Bestätigung fand diese Annahme durch die Western-Blot-Analyse des
IP3-Rezeptors,
der
hauptsächlich
in
der
intrazellulären
Membran
des
endoplasmatischen Retikulums lokalisiert ist (Vermassen et al. 2004). Auch für das
ER in Thrombozyten konnte dieser Rezeptor als Markerprotein identifiziert werden
(Authi et al.1991).
Da eine nähere Charakterisierung der beiden Gradienten-Fraktionen notwendig war,
um
diese
Ergebnisse
zu
bestätigen,
wurden
beide
Fraktionen
massenspektrometrisch untersucht und auf ihre Lipidzusammensetzung hin überprüft
(„Lipidomics“). Bereits durch Studien von Zwaal et al. wurde belegt, dass die
Phospholipid-Zusammensetzung
von
Membranen
in
eukaryotischen
Zellen
charakteristisch für jeden einzelnen Membrantyp ist (Zwaal et al. 1997). Auch für
Thrombozyten ist diese Phosholipid-Diversität bereits beschrieben (Zachowski et al.
1990).
Somit konnte im Laufe der Untersuchungen gezeigt werden, dass deutliche
Unterschiede in der Lipidzusammensetzung der beiden Fraktionen 2/3 und 9/10
bestanden (Abb. 4-10). Durch die Ergebnisse der massenspektrometrischen
Lipidomics-Analyse stellte sich schließlich heraus, dass ein signifikanter Unterschied
zwischen
den
beiden
Membranfraktionen
in
ihrem
relativen
Anteil
an
Phosphatidylinositol (PI) und Phosphatidsäure (PA) am Gesamtlipidgehalt bestand.
Aus der Abbildung 4-10 geht hervor, dass sowohl der Anteil an PI als auch an PA in
der Fraktion 9/10 um etwa das 8fache höher war als in der Fraktion 2/3. Betrachtet
man dieses Ergebnis mit dem Hintergrund, dass schon in früheren Publikationen
nachgewiesen wurde, dass in intrazellulären Membranen eine um einiges höhere
Konzentration an PI identifiziert wurde (Lagarde et al. 1981), so bestätigt dies die
Annahme, dass es sich bei der Fraktion 9/10 um intrazelluläre Membranen von
87
5. Diskussion
Zellorganellen handelt, weil eine selektive Anreicherung von Phosphatidylinositol
nachgewiesen werden konnte.
Wie
bereits
erwähnt,
konnte
zum
einen
mittels
immunobiochemischer
Untersuchungen im Western-Blot gezeigt werden, dass in der Fraktion 9/10 ein
größerer Anteil des IP3-Rezeptors vorhanden war, was auf die Membran des
endoplasmatischen Retikulums schließen lässt. Zum zweiten wurde durch die
Lipidomics-Analyse die Phosphatidsäure (PA) in höherer Konzentration detektiert,
die
den
Grundbestandteil
aller
Glycerolphosphatide
bildet
und
durch
ein
Kettenverlängerungssystem im endoplasmatischen Retikulum synthetisiert wird
(Karlson et al. 1994). Und zum dritten ließ sich ein größerer Gehalt an PI
identifizieren, welches ein Precursor von Phosphoinositiden ist und in erster Linie im
endoplasmatischen Retikulum synthetisiert wird, um anschließend zu anderen
Membranen mittels vesikulärem Transport gebracht zu werden (Di Paolo et al. 2006).
All diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass mit dieser Aufreinigungsmethode,
basierend auf einer Kombination aus Gradienten, eine äußerst effektive Methode zur
Anreicherung des Thrombozyten-ER’s entwickelt wurde.
Da Arachidonsäure aus Phosphatidylinositol synthetisiert wird und sie die Grundlage
für das Eicosanoid Thromboxan ist, welches zur Thrombozyten-Aktivierung führt,
stellt das PI in Thrombozyten eine essentielle Komponente bei einer physiologisch
intakten Thrombozyten-Aggregation dar. In früheren Studien wurde bereits gezeigt,
dass aus der Zugabe von 0,1 µM/ml Thrombin, welches in der Lage ist eine
komplette Thrombozyten-Aktivierung zu bewirken, die Synthese von 0,5 nmol
Thromboxan B2/109 Thrombozyten resultiert. Daher lässt sich vermuten, dass die
intrazellulären Thrombozytenmembranen eine adäquate Versorgung an PI für die
Synthese von Thromboxan während der Thrombozyten-Aktivierung gewährleisten
(Lagarde et al. 1982). Weiterhin ist das Phosphatidylinositol in Thrombozyten an der
Signaltransduktion
Phosphorylierung
zur
in
der
Regulation
des
Plasmamembran
Ca2+-Haushaltes
entsteht
aus
beteiligt.
Nach
Phosphatidylinositol
Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphat und durch die Phospholipase C wird dieses zu
Inositol-1,4,5-trisphosphat (IP3) und Diacylglycerin gespalten. Die anschließende
Bindung
des
Inositol-1,4,5-trisphosphates
an
den
IP3-Rezeptor
im
endoplasmatischen Retikulum bewirkt die Öffnung der Ca2+-Kanäle in dessen
Membran, wodurch das gespeicherte Ca2+ ins Zytosol freigesetzt wird und die dortige
88
5. Diskussion
Konzentration auf etwa 10-6 M ansteigt, wodurch die Thrombozyten-Aggregation
initiiert wird (Lehninger et al. 2001).
Somit lässt sich sagen, dass es durch die Untersuchungen im Rahmen dieser Arbeit
möglich ist, die Bestandteile der Organellenmembran des endoplasmatischen
Retikulums in Thrombozyten, die für eine physiologische Hämostase wichtig sind,
spezifisch anzureichern und wichtige Analysen an ihnen durchzuführen. Für klinische
Analysen von Gerinnungsdefekten ist dies ein relevanter Hintergrund, der in
zukünftigen Studien berücksichtigt werden sollte.
5.3
Validierung des IPP-Subnetzwerkes in Thrombozyten
An der Grenzfläche zwischen Zellmembranen und dem Zytoplasma entstehen
ständig
neue
Interaktionsmöglichkeiten
in
einer
Zelle.
Diese
Interaktionen
ermöglichen mittels molekularer Anker, Brücken und Signalkaskaden einen
bidirektionalen Austausch von Informationen zwischen Extra- und Intrazellulärraum.
Die Interaktionen einer Zelle mit der Extrazellulär-Matrix ermöglichen so die
Regulation zellulärer Vorgänge wie Proliferation, Differenzierung, Überleben und
Genexpression.
In
diesem
Zusammenhang
erbringen
Untersuchungen
von
Protein-Protein-
Interaktionen neue Details über funktionelle Komplexe und Interaktionen in
eukaryotischen
Zellen
(Goh
et
al.
2007)
(Stuart
et
al.
2007).
Aktuelle
Forschungsergebnisse von Zaidel-Bar et al. liefern z.B eine funktionelle Darstellung
des Integrin-Adhäsoms durch die Erstellung eines Interaktom-Netzwerkes von
Integrin-assoziierten Proteinen (Zaidel-Bar et al. 2007).
Während unserer Studien etablierten wir zum ersten Mal eine umfassende
Thrombozyten-Proteom-Datenbank und ein Model eines Thrombozyten-Interaktoms.
Auf Basis dieses Interaktoms war es uns möglich, Proteine, die bisher noch nicht in
Blutplättchen beschrieben waren, zu detektieren. Diese Datenbank erlaubt auch in
Zukunft die Identifikation von neuen potentiellen Thrombozytenproteinen, die
Wechselwirkungen
mit
bereits
bekannten
Thrombozytenproteinen
eingehen.
Interaktionen mit anderen Proteinen, lassen darüber hinaus Schlüsse über ihre
Funktion in Blutplättchen zu. Des Weiteren können durch Protein-Subnetzwerke
Verbindungen zwischen verschiedenen klassischen Signalwegen identifiziert werden,
die durch traditionelle Analyse-Methoden nicht erkannt werden konnten (Dittrich et al.
2008).
89
5. Diskussion
Einen besonderen Fokus setzten wir bei den Untersuchungen auf den IPP-(ILKPINCH-D-Parvin)-Komplex, der bereits in Herzzellen (Hannigan et al. 2007) und
glatten Muskelzellen (Zhang et al. 2007) beschrieben wurde. In diesen beiden
Zelltypen
ist
eine
essentielle
Rolle
des
Komplexes
bei
der
zellulären
Formveränderung (shape change) gezeigt worden. Daher stellten wir die Hypothese
auf, dass er auch in Thrombozyten, die durch die Aktivierung ebenfalls einer AktinZytoskelett-Organisation unterworfen sind, von Bedeutung sein muss. Weiterhin war
in unserem in silico Netzwerk das Vorhandensein verschiedener Signalproteine in
direkter
Nachbarschaft
zum
Kernkomplexes
(IPP-Komplex)
in
humanen
Thrombozyten postuliert. Von unseren Analyseergebnissen her konnten wir die
Interaktion des IPP-Komplexes in Thrombozyten bestätigen. Grundlage hierfür waren
die vorhandenen in silico Interaktionsdaten anderer Zelltypen.
Es ist beschrieben, dass in humanen Thrombozyten die Assoziation von ILK mit
Integrin E3 aktivierungs-abhängig stattfindet (Pasquet et al. 2002) (Yamaji et al.
2002), während E-Parvin mit ILK auch in unstimulierten Plättchen interagiert (Yamaji
et al. 2002). Übereinstimmend mit diesen Daten fanden wir während unserer Studien
eine Assoziation von PINCH mit ILK in ruhenden ebenso wie in aktivierten
Thrombozyten (Abb. 4-17). Verglichen mit anderen Zelltypen, ist es in Thrombozyten
sehr viel schwieriger die spezifische Beteiligung des IPP-Komplexes an der IntegrinFunktion zu verstehen. Unsere Daten weisen auf die Existenz von einem präassemblierten ternären IPP-Komplex in ruhenden Blutplättchen hin, welcher nach
Thrombozyten-Stimulation mit dem zytoplasmatischen Teil des Integrin E3 interagiert.
Unsere Beobachtungen deuten darauf hin, dass ADP-Rezeptor- und Gi/Gq-Protein
vermittelte Signalwege keinen Effekt auf die Assemblierung des IPP-Komplexes
haben. Dennoch muss die Rolle von weiteren Thrombozyten-aktivierenden
Signalwegen und im Besonderen des Tyrosin-Kinase Signalweges in der IPPSignaltransduktion in Blutplättchen in weiterführenden Studien näher untersucht
werden.
Das Interaktom war demnach sehr hilfreich für die Validierung postulierter
Interaktionen, die bisher noch nicht in Thrombozyten beschrieben waren. Auf Basis
der Versuche besteht die Möglichkeit, das Interaktom durch die Identifizierung neuer
Interaktionen zu erweitern, mit dem Ziel die Gesamtheit aller Protein-ProteinInteraktionen in Thrombozyten zu beschreiben. Nach der Detektion von ILK und
90
5. Diskussion
PINCH in Thrombozyten sollten anschließend neue Proteine identifiziert werden, die
mit den IPP-Komplex-Komponenten in Blutplättchen interagieren. Zur Verdeutlichung
der Relevanz des erstellten Thrombozyten-Interaktoms und um auf mögliche Wege
zur weiteren Nutzung hinzuweisen, konnte im Rahmen dieser Arbeit eine Methode
gezeigt werden, indem zwei Immunopräzipitations-Proben von ILK und PINCH
massenspektrometrisch
analysiert
wurden.
Bei
der
Untersuchung
wurden
verschiedene Proteine identifiziert (Abb. 4-19).
Um die Anwendbarkeit dieser Methode zu zeigen, konzentrierte ich mich auf drei
spezielle Proteine, die als Interaktoren von ILK und PINCH identifiziert wurden. Das
sind zum einen die Proteine Ras-related protein Rab-10 und Ras-related protein
Rab-6A. Beide Proteine sind auf den Membranen des rauhen endoplasmatischen
Retikulums bzw. auf den Zisternen des Golgi-Apparates lokalisiert und steuern den
Transport
von
Lipidvesikeln.
Sie
regulieren
als
Stellglieder
in
einer
Signaltransduktionskette den Organisationsgrad des polymerisierten Aktins und sind
somit auch an Aktin-abhängigen Transportprozessen beteiligt (Goud et al. 1990)
(Martinez et al. 1994) (Mayer et al. 1996) (Martinez et al. 1997). In diesen
Zusammenhang ist auch das dritte Protein einzuordnen, welches bei der
massenspektrometrischen Analyse identifiziert wurde, das Talin. Dieses Protein
wurde
in
Thrombozyten
bereits
identifiziert
und
macht
3-8%
des
Gesamtthrombozyten-Proteins aus (O’Halloran et al. 1985). Seine Kopfdomäne
enthält Bindestellen für verschiedene Integrin-Untereinheiten (Calderwood et al.
1999) und für weitere Membranproteine. Die Stabdomäne hingegen enthält
Bindestellen für Vinculin und F-Aktin. Aus diesen Gründen fungiert das Talin als ein
kritisches Bindungsglied zwischen Integrinen und dem Aktin-Zytoskelett (Critchley et
al. 2004). Darüber hinaus ist es in Evertebraten notwendig für die Assemblierung des
Integrin-assoziierten zytoplasmatischen Proteinkomplexes, welcher die Proteine
Paxillin, Vinculin, ILK, PINCH und Parvin umfasst (Brown et al. 2002). Besonders in
fokalen Zellkontakten und der Wachstumsfront wandernder Zellen ist Talin
anzutreffen.
Es
wurde
herausgefunden,
dass
Mäuse
mit
Talin-defizienten
Thrombozyten einen schweren hämostatischen Defekt aufweisen und komplett
resistent gegenüber arterieller Thrombose sind (Nieswandt et al. 2007) (Petrich et al.
2007).
In wiederholten Versuchen konnten diese Interaktions-Ergebnisse mit Ras-related
protein Rab-10, Ras-related protein Rab-6A und Talin jedoch bisher nicht valiidert
91
5. Diskussion
werden,
da
die
Proteine
sowohl
in
der
Kontrolle
als
auch
in
der
Immunopräzipitations-Probe von ILK in gleichen Mengen detektiert wurden. Somit
liefert diese Analyse-Methode in diesem Zusammenhang keine zuverlässigen
Ergebnisse, da zu viele unspezifische Bindungen auftreten. Um die vorhandenen
Daten mit einer weiteren Methode untersuchen zu können, sollte ein Fusionsprotein
erstellt werde, mit welchem sich Proteine aufreinigen lassen. Hierbei beruht die
Separation auf der Fusion mit einem Peptid, einer Domäne oder einem anderen
Protein, um in einem einstufigen Affinitätschromatographieschritt eine Aufreinigung
zu erzielen. Aufgrund ihrer hohen Spezifität zur Matrix, der Elution mittels
niedermolekularen Substanzen, der möglichen N- oder C-terminalen Fusion, der
minimalen Effekte auf die Tertiärstruktur und die biologische Aktivität sowie der
einfachen Nachweisbarkeit, bieten Protein-Tags sehr gute Möglichkeiten zur
Proteinaufreinigung (Terpe et al. 2003). Ein gebräuchlicher Affinitäts-Tag ist der
GST-Tag (Glutathion-S-Transferase). Bereits seit 1991 wird er in Studien zur
Untersuchung von Protein-Protein-Interaktionen verwendet (Mayer et al. 1991). Um
diese Methode beispielsweise für Interaktionsstudien der beiden Proteine ILK und
PINCH einzusetzen, müsste die Sequenz des GST-Tags vor/hinter die Gene der
beiden Proteine kloniert werden und in einem Wirtsorganismus (z.B. E. coli) eine
heterologe Überexpression durchgeführt werden. Das Zelllysat wird anschließend
über eine Glutathion-Säule gegeben, damit die Fusionsproteine an die Matrix binden
(Terpe et al. 2003). Im nächsten Schritt wird das Thrombozyten-Zelllysat über die
Säule gegeben, damit die darin enthaltenen Proteine mit ILK bzw. PINCH
interagieren können. Gebundene Proteine werden schließlich von der Säule eluiert.
Diese Eluate können danach mit Hilfe des Interaktoms auf postulierte Proteine mit
spezifischen Antikörpern hin untersucht werden oder in der Massenspektrometrie
analysiert werden. Auf diese Art und Weise ist eine hohe Spezifität bei der ProteinAufreinigung
gewährleistet
und
durch
die
wesentlich
größere
Menge
an
Fusionsprotein befindet sich im Eluat ebenfalls ein höherer Anteil an gebundenen
Proteinen, wodurch eine bessere Analyse ermöglicht wird.
Ausgehend von den Einzelproteinen ILK und PINCH, ließe sich so eine komplette
Signaltransduktionskette, die eine Aktinpolymerisation und somit einen shape
change des Thrombozyten zur Folge hat, untersuchen.
Die physiologische Relevanz dieser komplexen Signalkaskade wurde durch einige
Studien in der Vergangenheit bereits belegt. So lässt sich sagen, dass Integrine
92
5. Diskussion
einen erheblichen Einfluss auf die Entwicklung und die Aufgaben des Blutes und die
Integrität des kardiovaskulären Systems haben (Ratnikov et al. 2005). Die IntegrinAktivierung ist wichtig für die Thrombozyten-Aggregation, Leukozyten-Extravasation
und die Zelladhäsion und Migration, wodurch Prozesse wie die Hämostase,
Inflammation und Angiogenese beeinflusst werden. In aktuellen Studien wurde damit
begonnen, den Mechanismus der Integrin-Aktivierung zu untersuchen. Hierbei wird
der Bindung des Zytoskelett-Proteins Talin an den zytoplasmatischen Teil der
Integrin E Untereinheit eine wichtige Rolle zugeordnet. Durch einen Knock-Down der
Talin-Expression mit Hilfe von siRNA konnte gezeigt werden, dass es für die
Aktivierung von Integrin E3 unerlässlich ist (Paddison et al. 2002).
Um die intrazelluläre Regulation Integrin-vermittelter Zellkontakte während der
Thrombozyten-Aggregation anhand weiterer Zytoskelett-Proteinen untersuchen zu
können, bedarf es zunächst einer weiterentwickelten Form des bioinformatisch
erstellten Interaktoms. Dieses kann somit als ein nützliches Werkzeug für weitere
Analysen dienen. Hierfür können proteinbiochemische Untersuchungen und
Strukturinformationen genutzt werden, um die Funktion weiterer Zytoskelett-Proteine
beispielsweise mittels Immunfluoreszenz oder genetischen Modellen zu analysieren.
Anhand verschiedener Modelle wäre es möglich, aufzuzeigen wie die Regulation
zentraler Zytoskelett-Proteine das Verhalten und die Funktion von Zellen im
Gewebeverband in normalen und pathophysiologischen Situationen beeinflusst und
Ansatzpunkte für die diagnostische und therapeutische Verwendung zu entwickeln.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Informationen, die das erstellte
Thrombozyten-Interaktom liefert, effektiv für ein systematisches „target screening“
genutzt werden können. Auf diese Weise wäre es möglich neue Rezeptoren,
Proteine oder ganze Signalkaskaden zu identifizieren. Somit legt das Interaktom die
Basis für die Erstellung von komplexeren Modellen durch das Einbeziehen von
neuen Daten (Dittrich et al. 2008). Die in silico Analysen von ThrombozytenSignalwegen werden in Zukunft immer relevanter werden, da sie die Möglichkeit
bieten einen wesentlich tieferen Einblick in Signaltransduktionswege zu erlangen, als
dies bisher möglich war.
93
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104
7. Anhang
7
Anhang
7.1
Abkürzungsverzeichnis
*
°C
µg
µl
ACTA1
ADP
AKT1
APS
ARHGEF6
as
ATP
BSA
c
cAMP
CAV1
cDNA
CO2
DMSO
dNTP
dsDNA
ECL
EDTA
EHMT2
ER
EtBr
EtOH
FACS
g
G
Gi
Gs
HLA-DQȕ
hPP
HRP
IgG
ILK
ILKAP
-
IP-Rezeptor ISTH
ITGB1
ITGB2
-
ITGB3
-
Both authors contributed equally to this manuscript
Grad Celsius
Mikrogramm
Mikroliter
actin, alpha 1, skeletal muscle
Adenosindiphosphat
v-akt murine thymoma viral oncogene homolog 1
Ammoniumpersulfat
Rac/Cdc42 guanine nucleotide exchange factor (GEF) 6
antisense
Adenosintriphosphat
bovine serum albumin
Konzentration
cyclic adenosinmonophosphate
Caveolin 1
komplementäre DNA
Kohlendioxid
Dimethylsulfoxid
desoxy-Nukleosidtriphosphate
double-stranded DNA
Enhanced Chemical Luminescence-Detektionssystem
Ethylendiamintetraacetat
euchromatic histone-lysine N-methyltransferase 2
endoplasmatisches Retikulum
Ethidiumbromid
Ethanol
fluorescence activated cell sorting
Erdbeschleunigung
gauche
G-Protein inhibitory
G-Protein stimulatory
human leukocyte antigen-DQȕ
hochreine Blutplättchen
horseradish peroxidase
Immunglobulin G
Integrin-linked kinase
Integrin-linked kinase-associated serine/threonine phosphatase
2C
Prostazyklin-Rezeptor
International Society of Thrombosis and haemostasis
Integrin, beta 1 (fibronectin receptor, beta polypeptide, antigen
CD29 includes MDF2, MSK12)
Integrin, beta 2 (antigen CD18 (p95), lymphocyte functionassociated antigen 1; macrophage antigen 1 (mac-1) beta
subunit)
Integrin, beta 3 (platelet glycoprotein IIIa, antigen CD61)
105
7. Anhang
kDa
LIMS1
LIMS2
LPXN
M
mA
mg
min
ml
mm
mM
MPC
MS
NCK2
ng
OD
P2Y12
PA
PAGE
PARVA
PARVB
PBS
PCR
PDKP1
PG-E1
PI
PINCH
PKA
PRP
P-VASP
PXN
qRT-PCR
RBBP8
RNA
s
SAGE
SDS
ssRNA
TBE
TBS
TCA
TEMED
TMSB4X
Tris
TxA2
u
v/v
VASP
vWf
w/v
WBC
-
Kilodalton
LIM and senescent cell antigen-like domains 1 (= PINCH)
LIM and senescent cell antigen-like domains 2
Leupaxin
Molar
Milliamper
Milligramm
Minuten
Milliliter
Millimeter
Millimolar
magnetic particle concentrator
Massenspektrometrie
NCK adaptor protein 2
Nanogramm
optische Dichte
P2Y purinoceptor 12
Phosphatidsäure
Polyacrylamid-Gelelektrophorese
Parvin, alpha
Parvin, beta
Phosphate-buffered Saline
Polymerase-Kettenreaktion
3-phosphoinositide dependent protein kinase-1
Prostaglandin E1
Phosphatidylinositol
particularly interesting new cys-his protein
cAMP-abhängige Proteinkinase K
Plättchenreiches Plasma
phosphoryliertes VASP
Paxillin
quantitative Real Time PCR
retinoblastoma binding protein 8
Ribonukleinsäure
sense
serial analysis of gene expression
sodium dodecyl sulfate
sigle-stranded RNA
Tris-Borat-EDTA-Puffer
Tris-buffered Saline
Trichloressigsäure
N,N,N’,N’-Tetramethylethylendiamin
thymosin, beta 4, X-linked
Tris(hydroxymethyl)aminomethan
Thromboxan A2
Units
volume / volume
vasodilator-stimuliertes Phosphoprotein
von-Willebrand-Faktor
weight / volume
white blood cell
106
7. Anhang
7.2
Publikationsverzeichnis
7.2.1 Originalarbeiten
Birschmann* I., Mietner* S., Dittrich M., Pfrang J., Dandekar Th., Walter U.
“Use of functional highly purified human platelets for the identification of new
proteins of the IPP signaling pathway” - Thrombosis Research, 2008; 122(1):
p. 59-68. Epub 2007 October 10
Dittrich M., Birschmann I., Mietner S., Sickmann A., Walter U., Dandekar Th.
“Platelet protein interactions. Map, Signaling Components, and
Phosphorylation Groundstate” – Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular
Biology, published online May 1, 2008
7.2.2 Poster
1)
“Platelet Proteomic – Gaining information of subcellular structures”
Mietner S., Dittrich M., Walter U., Sickmann A., Birschmann I.
XIX. European Platelet Meeting in Bad Brückenau (Oktober 2004)
2)
“The virtual platelet – New approach with well-known cells”
Mietner S., Dittrich M., Walter U., Sickmann A., Birschmann I.
International Meeting on the Topogenesis of Organellar Proteins in Bochum
(Oktober 2004)
3)
„Proteomic approach to detect new organellar functions in platelets“
Mietner S., Dittrich M., Maaß K., Walter U., Sickmann A., Birschmann I.
49. Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für Thrombose- und
Hämostaseforschung in Mannheim (Februar 2005)
4)
„Optimizing Purification of Platelets for Subsequent Analysis“
Mietner S., Pfrang J., Schinzel R., Walter U., Birschmann I.
Hämostaseforschung in Basel (Februar 2006)
107
7. Anhang
5)
„Isolation of highly purified functional human platelets for the purpose to
validate the platelet expression of postulated signaling proteins“
Mietner S., Pfrang J., Dittrich M., Walter U., Birschmann I.
3. Jahrestagung der Deutschen Vereinten Gesellschaft für klinische Chemie und
Laboratoriumsmedizin in Mannheim (Oktober 2006)
6)
„The platelet interactome“
Dittrich M., Birschmann I., Mietner S., Walter U., Dandekar Th.
3. Jahrestagung der Deutschen Vereinten Gesellschaft für klinische Chemie und
Laboratoriumsmedizin in Mannheim (Oktober 2006)
7)
„Application of highly purified platelets for verifying signaling pathways
concerning the IPP-complex and VASP in platelets“
Mietner S., Dittrich M., Rose Y., Dandekar T., Walter U., Birschmann I.
Hämostaseforschung in Dresden (Februar 2007)
108
7. Anhang
7.3
Expressionsprofile der Proteine D-Parvin und PINCH
Tabelle 1:
Expression profile suggested by analysis of EST counts
(Quelle: NCBI » UniGene » EST Profile Viewer)
PARVA: Parvin, alpha
Breakdown by Body Sites
adrenal gland
ascites
bladder
blood
bone
bone marrow
brain
cervix
connective tissue
ear
embryonic tissue
esophagus
eye
heart
intestine
kidney
larynx
liver
lung
lymph
lymph node
mammary gland
muscle
nerve
ovary
pancreas
parathyroid
pharynx
pituitary gland
placenta
prostate
salivary gland
skin
soft tissue
spleen
stomach
testis
thymus
thyroid
tongue
tonsil
trachea
umbilical cord
uterus
vascular
30
0
33
0
97
40
54
144
173
0
64
98
56
210
114
51
0
48
76
0
0
110
83
317
77
9
96
48
0
102
47
49
165
76
55
51
57
73
41
136
0
381
0
188
154
1
0
1
0
7
2
60
7
26
0
14
2
12
19
27
11
0
10
26
0
0
17
9
5
8
2
2
2
0
29
9
1
35
1
3
5
19
6
2
9
0
20
0
44
8
/
/
/
/
/
/
/
/
/
/
/
/
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/
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/
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/
/
/
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/
/
/
/
/
/
/
33320
40067
30133
124121
71794
49155
1104170
48501
149627
16343
215806
20292
210747
90308
235308
212568
24435
208302
338047
44399
91858
154293
108148
15765
102646
215273
20633
41490
16734
283906
190868
20295
210888
13146
54059
97138
331289
81256
47933
65977
17031
52430
13765
233915
51930
109
7. Anhang
Tabelle 2:
Expression profile suggested by analysis of EST counts
(Quelle: NCBI » UniGene » EST Profile Viewer)
PINCH: LIM and senescent cell antigen-like domains 1
Breakdown by Body Sites
adrenal gland
ascites
bladder
blood
bone
bone marrow
brain
cervix
connective tissue
ear
embryonic tissue
esophagus
eye
heart
intestine
kidney
larynx
liver
lung
lymph
lymph node
mammary gland
muscle
nerve
ovary
pancreas
parathyroid
pharynx
pituitary gland
placenta
prostate
salivary gland
skin
soft tissue
spleen
stomach
testis
thymus
thyroid
tongue
tonsil
trachea
umbilical cord
uterus
vascular
30
24
66
64
0
264
11
20
46
0
41
197
4
33
12
51
0
9
26
0
87
6
9
0
0
4
0
24
0
10
10
49
37
0
0
20
27
36
0
45
0
38
72
38
57
1
1
2
8
0
13
13
1
7
0
9
4
1
3
3
11
0
2
9
0
8
1
1
0
0
1
0
1
0
3
2
1
8
0
0
2
9
3
0
3
0
2
1
9
3
/
/
/
/
/
/
/
/
/
/
/
/
/
/
/
/
/
/
/
/
/
/
/
/
/
/
/
/
/
/
/
/
/
/
/
/
/
/
/
/
/
/
/
/
/
33320
40067
30133
124121
71794
49155
1104170
48501
149627
16343
215806
20292
210747
90308
235308
212568
24435
208302
338047
44399
91858
154293
108148
15765
102646
215273
20633
41490
16734
283906
190868
20295
210888
13146
54059
97138
331289
81256
47933
65977
17031
52430
13765
233915
51930
110
7. Anhang
7.4
Originaldaten der Lipianalyse des Kansas Lipidomics Research Centers
(vgl. Ergebnisse Abb. 4-12)
Experiment:
Silke Mietner011807
Sample no.
Sample description
LysoPC 16:1
LysoPC 16:0
LysoPC 18:3
LysoPC 18:2
LysoPC 18:1
LysoPC 18:0
LysoPC 20:5
LysoPC 20:4
LysoPC 20:3
LysoPC 20.2
LysoPC 20:1
LysoPC 20:0
LysoPC 22:6
LysoPC 22:5
Total LysoPC
PC 28:0
PC 28:1
PC 30:1
PC 30:0
PC 32:2
PC 32:1
PC 32:0
PC 34:4
PC 34:3
PC 34:2
PC 34:1
PC 34:0
PC 36:6
PC 36:5
PC 36:4
PC 36:3
PC 36:2
PC 36:1
PC 36:0
PC 38:6
PC 38:5
PC 38:4
PC 38:3
PC 38:2
PC 38:1
PC 38:0
PC 40:8
PC 40:7
PC 40:6
PC 40:5
PC 40:4
PC 40:3
PC 40:2
PC 42:11
PC 42:10
PC 42:9
PC 42:8
PC 42:7
PC 42:6
PC 42:5
PC 42:4
PC 42:3
PC 42:2
PC 44:12
PC 44:11
PC 44:10
PC 44:9
PC 44:8
PC 44:7
PC 44:6
PC 44:5
PC 44:4
PC 44:3
PC 44:2
Total PC
ePC 32:3
ePC 32:2
ePC 32:1
WITHOUT I.S.
SUBTRACTION
Isobaric species
Masses of + ions
494,3
496,3
518,3
520,3
522,4
524,4
542,3
544,3
546,5
548,4
550,4
552,4
568,3
570,4
Chemical formula
C24H49O7PN
C24H51O7PN
C26H49O7PN
C26H51O7PN
C26H53O7PN
C26H55O7PN
C28H49O7PN
C28H51O7PN
C28H53O7PN
C28H55O7PN
C28H57O7PN
C28H59O7PN
C30H51O7PN
C30H53O7PN
678,5
676,5
704,5
706,5
730,5
732,6
734,6
754,5
756,6
758,6
760,6
762,6
778,5
780,6
782,6
784,6
786,6
788,6
790,6
806,6
808,6
810,6
812,6
814,6
816,6
818,7
830,6
832,6
834,6
836,6
838,6
840,6
842,7
852,6
854,6
856,6
858,6
860,6
862,6
864,6
866,7
868,7
870,7
878,6
880,6
882,6
884,6
886,6
888,6
890,7
892,7
894,7
896,7
898,7
C36H69O8PN
C36H71O8PN
C38H75O8PN
C38H77O8PN
C40H77O8PN
C40H79O8PN
C40H81O8PN
C42H77O8PN
C42H79O8PN
C42H81O8PN
C42H83O8PN
C42H85O8PN
C44H77O8PN
C44H79O8PN
C44H81O8PN
C44H83O8PN
C44H85O8PN
C44H87O8PN
C44H89O8PN
C46H81O8PN
C46H83O8PN
C46H85O8PN
C46H87O8PN
C46H89O8PN
C46H91O8PN
C46H93O8PN
C48H81O8PN
C48H83O8PN
C48H85O8PN
C48H87O8PN
C48H89O8PN
C48H91O8PN
C48H93O8PN
C50H79O8PN
C50H81O8PN
C50H83O8PN
C50H85O8PN
C50H87O8PN
C50H89O8PN
C50H91O8PN
C50H93O8PN
C50H95O8PN
C50H97O8PN
C52H81O8PN
C52H83O8PN
C52H85O8PN
C52H87O8PN
C52H89O8PN
C52H91O8PN
C52H93O8PN
C52H95O8PN
C52H97O8PN
C52H99O8PN
C52H101O8PN
714,5
716,6
718,6
C40H77O7PN
C40H79O7PN
C40H81O7PN
2
1a
3,7842E-05
0,00221093
0,0014155
0,00219431
0,00088248
0,0007718
7,6496E-05
0,0001734
5,0808E-06
6,3783E-05
0,00021567
0,00018474
0,00017968
0
0,00841171
0
0,00127069
0
0,00229868
0,00069444
0,00494833
0,01198676
0,00123896
0,01951219
0,04011845
0,1030843
0,00070136
0,00782173
0,02331817
0,0652884
0,01386588
0,02987789
0,04153952
0
0,00578795
0,02161013
0,05045523
0,00524776
0,00223246
0,00122361
0,00059281
0,00298679
0,00433112
0,00549735
0,00749503
0,00450072
3,1325E-05
0,00046829
0,00078909
0,00061319
0,00080917
0,0017394
0,00063713
0,00081358
0,00073262
0,00046316
0,00013497
0,00015951
0,00085071
0,00016847
0,00019026
0,00021917
0,00043654
3,1956E-05
0,00022501
5,4555E-05
9,6637E-05
0,00010086
1,4887E-06
0,48929376
0,00012718
0,000382
0,00119487
3
1b
5,9936E-05
0,00137034
0,0007448
0,00122453
0,0005594
0,00064925
2,6009E-05
6,3497E-05
2,7849E-05
5,8744E-05
0,00026385
0,00019937
0,00020224
0,00010443
0,00555426
0
0,00123442
0
0,00192509
0,0007309
0,00482876
0,01188271
0,00093045
0,0124109
0,03363692
0,0974236
0,00022812
0,00484375
0,01188864
0,05536838
0,01181299
0,02999597
0,0392347
0
0,00488832
0,02062929
0,05730598
0,00301204
0,00092197
0,00100367
0,00036457
0,0033566
0,00428838
0,0047358
0,00854242
0,00385478
0
0,00044126
0,00080198
0,00092438
0,00095034
0,0018744
0,00073272
0,0005879
0,00055924
0,00048063
0,00032331
0,00021735
0,00095061
6,3994E-05
0,00027052
0,00017312
0,00018475
0,00018066
0,00015582
0,0002964
5,1703E-05
6,9605E-05
0
0,44157085
0,0001831
0,00034242
0,00133235
4
1c
0,00012067
0,00114681
0,00055324
0,00115931
0,00044203
0,00059915
3,7111E-05
0,00013243
6,0459E-06
3,9175E-05
0,00025359
0,00022103
0,00014636
7,6462E-05
0,00493344
0
0,00096794
0
0,00194424
0,00049747
0,00444113
0,01233922
0,00082892
0,00942588
0,02989224
0,09535142
0
0,00325322
0,01020229
0,05542366
0,00875121
0,0273553
0,03729442
0
0,00518677
0,01981653
0,04513279
0,00312517
0,00079709
0,00059872
0,00046528
0,00291356
0,00365415
0,00486223
0,00701465
0,00359724
0
0,00028714
0,00061349
0,00071698
0,00094133
0,00162385
0,00050089
0,00067298
0,00060189
0,00023283
0,00031857
0,00028137
0,00087015
0,00023864
0,00022954
0,00013618
0,00032778
0,00011506
0,00012368
0,00029229
5,8512E-05
9,3706E-05
2,3895E-05
0,40443352
7,9495E-05
0,00026903
0,00091017
5
1d
8,7686E-05
0,00118877
0,00019753
0,00085528
0,00051618
0,0004362
2,9088E-05
5,3877E-05
9,8585E-06
4,834E-05
0,00030643
4,4333E-05
0,0001111
1,8104E-05
0,00390278
0
0,00077182
0
0,00200687
0,00046549
0,0047133
0,01361993
0,00093628
0,00799489
0,03071859
0,10467539
0,0003507
0,00308823
0,00829195
0,05472978
0,0101951
0,02817424
0,04139089
0
0,0055661
0,02023905
0,04791171
0,00454596
0,00148942
0,00082282
0,00058655
0,00308009
0,00412265
0,0045743
0,00760876
0,00350929
0,0001272
0,00030044
0,00063372
0,00099843
0,00087175
0,0018324
0,00051096
0,00054543
0,00053899
0,00031922
1,0759E-05
0,00029555
0,00105632
0,00019145
0,00010484
0,00017739
0,00023116
0,00012945
7,0305E-05
2,7356E-05
9,0575E-05
0
1,1261E-05
0,42525511
2,8164E-05
0,00013829
0,00091483
6
1e
6,6014E-05
0,00124883
0,00032459
0,00069892
0,0004181
0,00056762
0,00012182
0,00011888
7,0632E-06
0,00012636
0,00025336
0,00011487
5,2053E-05
0,00010357
0,00422206
0
0,00076737
0
0,00150996
0,00056923
0,00462071
0,01112224
0,00081788
0,00875866
0,02925396
0,09713389
0
0,00304898
0,00859925
0,05136687
0,0099224
0,02753088
0,04156534
0
0,00534034
0,02014549
0,04719899
0,00502665
0,00137547
0,00113648
0,00051791
0,00292987
0,00415237
0,00491391
0,00775978
0,00381064
0,00014279
0,00046967
0,00070251
0,00100041
0,00090559
0,00191796
0,00052625
0,00051319
0,00067169
0,00044492
0,00017623
9,0763E-05
0,00072346
0,00025856
0,00031351
0,00019476
0,0003029
0,00013066
0,00010089
0,0002268
0,00012773
2,0725E-05
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746,5
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PG 34:1
PG 34:0
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0
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0
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0
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0
0
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0
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0,88721863
0,930160187
PI excluded
Sample no.
average of 4
average of 3
nmol / sample sent
nmol / sample sent
7
8
9
10
11
2
Sample description
stdev
2a
2b
2c
2d
2e
ave
stdev
2
ave
stdev
LysoPC 16:1
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excluded
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from
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0,0001099
averages-
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2,712E-05
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4,812E-05
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3,805E-05
LysoPC 18:2
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0,0001386
poor
8,15E-05
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0,000137496
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0,000137132
7,039E-05
LysoPC 18:1
0,000187
7,657E-05
spray in
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8,48E-06
6,407E-05
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3,29E-05
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LysoPC 18:0
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0,0002163
PC scan
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0,000200228
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0,0001083
LysoPC 20:5
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3,637E-05
4,75E-05
3,202E-05
0,0001388
6,36758E-05
5,051E-05
7,27778E-05
5,771E-05
LysoPC 20:4
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0
0
0
1,33338E-06
2,667E-06
0
0
LysoPC 20:3
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0
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1,505E-05
0
5,67671E-06
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7,56894E-06
7,525E-06
LysoPC 20.2
3,437E-05
2,077E-05
1,878E-05
6,338E-06
6,434E-06
1,30798E-05
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1,0518E-05
7,157E-06
LysoPC 20:1
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0
8,144E-06
2,277E-05
0
7,72961E-06
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1,03061E-05
1,154E-05
LysoPC 20:0
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0,0001293
4,71E-05
1,632E-05
5,02E-05
6,07371E-05
4,822E-05
3,78729E-05
1,873E-05
LysoPC 22:6
5,925E-05
0,0001257
6,24E-05
1,178E-05
6,02E-05
6,50243E-05
4,672E-05
4,47933E-05
2,861E-05
LysoPC 22:5
4,873E-05
3,778E-06
4,574E-06
8,417E-06
7,438E-06
6,05208E-06
2,226E-06
6,80999E-06
1,997E-06
0,0002646
Total LysoPC
0,0017987
0,0016184
0,0011635
0,001129
0,0016035
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PC 28:0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
PC 28:1
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0,0002082
0,0001869
0,0002789
0,000246248
5,838E-05
0,000224661
4,813E-05
PC 30:1
0
0,0001715
0
8,986E-05
7,755E-05
8,47395E-05
7,022E-05
5,58029E-05
4,872E-05
PC 30:0
0,0002821
0,0008
0,0008984
0,000978
0,0014106
0,00102174
0,0002693
0,001095666
0,0002757
PC 32:2
0,0001175
0,0001145
7,715E-05
0,0001023
0,0001528
0,000111684
3,149E-05
0,000110745
3,85E-05
PC 32:1
0,0001944
0,0007275
0,0005524
0,0007225
0,0009478
0,000737549
0,0001621
0,000740898
0,0001983
PC 32:0
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0,0009818
0,0009957
0,0009852
0,0013164
0,001069774
0,0001645
0,001099087
0,0001883
PC 34:4
0,0001704
0,000276
0,0002438
0,0001642
0,0001951
0,000219776
4,98E-05
0,000201038
4,016E-05
PC 34:3
0,0047184
0,0040139
0,0021556
0,0019477
0,0020167
0,002533487
0,0009908
0,002040001
0,0001059
PC 34:2
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0,0022468
0,0018564
0,0021918
0,002537422
0,0008949
0,002098347
0,0002113
PC 34:1
0,0040849
0,0027332
0,001933
0,0017881
0,0027135
0,002291948
0,0005017
0,002144867
0,0004977
PC 34:0
0,0002912
0
1,731E-05
0
1,806E-05
8,84324E-06
1,022E-05
1,1791E-05
1,022E-05
PC 36:6
0,0020473
0,0018981
0,0009822
0,000826
0,0009516
0,001164497
0,0004937
0,000919963
8,276E-05
PC 36:5
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0,0030903
0,0024226
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0,003370045
0,0012775
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0,0003344
PC 36:4
0,0052234
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0,002129
0,0021316
0,002697005
0,0009926
0,002203404
0,0001266
PC 36:3
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0,001075184
0,0003783
0,000902746
0,0001904
115
7. Anhang
PC 36:2
0,0012703
0,0012396
0,0008188
0,000826
0,0011231
0,00100185
0,0002127
0,000922612
0,0001737
PC 36:1
0,0019007
0,0005348
0,0004226
0,0005212
0,000652
0,000532625
9,397E-05
0,000531907
0,0001151
PC 36:0
0
5,476E-05
5,8E-05
2,123E-05
3,327E-05
4,18176E-05
1,757E-05
3,7502E-05
1,874E-05
PC 38:6
0,0003458
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0,000465923
7,401E-05
PC 38:5
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0,0001865
PC 38:4
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0,0006843
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0,000528312
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0,0001411
PC 38:3
0,0010568
0,0004265
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0,0001394
0,0002095
0,000230638
0,0001343
0,000165343
3,844E-05
PC 38:2
0,0005672
0,0001262
6,304E-05
8,025E-05
0,0002477
0,000129283
8,33E-05
0,000130321
0,000102
PC 38:1
0,0002509
5,957E-05
7,206E-05
5,066E-05
5,523E-05
5,93798E-05
9,202E-06
5,93163E-05
1,127E-05
PC 38:0
9,464E-05
8,939E-05
5,25E-05
5,006E-06
5,971E-05
5,16512E-05
3,496E-05
3,9072E-05
2,972E-05
PC 40:8
0,0001816
0,0001935
0,0002068
0,0001566
0,0002782
0,000208792
5,09E-05
0,000213877
6,109E-05
PC 40:7
0,0002695
0,0002549
4,664E-05
0,0001197
0,0002257
0,000161745
9,625E-05
0,000130679
9,003E-05
PC 40:6
0,00035
0,0001052
0,0001104
0,0001367
0,0002071
0,000139853
4,692E-05
0,000151405
5,002E-05
PC 40:5
0,000555
0,0001236
1,232E-05
9,815E-05
0,0002015
0,000108895
7,796E-05
0,000103984
9,472E-05
PC 40:4
0,0003889
6,268E-05
4,594E-05
3,593E-05
6,736E-05
5,29768E-05
1,462E-05
4,97436E-05
1,606E-05
PC 40:3
6,963E-05
1,262E-06
6,625E-07
6,37E-06
3,827E-05
1,16408E-05
1,794E-05
1,51004E-05
2,027E-05
PC 40:2
9,172E-05
5,441E-05
3,275E-05
8,061E-06
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3,189E-05
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3,823E-05
PC 42:11
8,644E-05
6,9E-05
0,0001214
8,86E-05
6,056E-05
8,48908E-05
2,702E-05
9,01869E-05
3,045E-05
PC 42:10
0,000176
8,734E-05
1,448E-05
3,442E-05
3,351E-05
4,24382E-05
3,132E-05
2,74709E-05
1,126E-05
PC 42:9
5,75E-05
4,976E-06
9,66E-06
7,659E-06
9,363E-05
2,89824E-05
4,314E-05
3,69847E-05
4,907E-05
PC 42:8
0,0001174
8,193E-05
3,566E-05
1,712E-05
0,0001002
5,8728E-05
3,883E-05
5,0993E-05
4,361E-05
PC 42:7
0,0001006
0,0001639
0,0002421
8,688E-05
0,000222
0,000178702
6,963E-05
0,000183652
8,441E-05
PC 42:6
0,0001205
2,771E-05
2,612E-05
3,569E-05
4,541E-05
3,37328E-05
8,839E-06
3,57402E-05
9,645E-06
PC 42:5
8,052E-05
5,565E-05
1,691E-05
1,909E-06
2,241E-05
2,42192E-05
2,267E-05
1,3743E-05
1,061E-05
PC 42:4
0,0001076
2,187E-05
2,414E-05
9,952E-06
6,12E-05
2,92891E-05
2,216E-05
3,17612E-05
2,646E-05
PC 42:3
0,0001319
8,476E-06
1,256E-05
1,656E-05
4,634E-05
2,09839E-05
1,722E-05
2,51531E-05
1,846E-05
PC 42:2
8,548E-05
7,938E-06
6,483E-06
4,272E-06
9,939E-06
7,15763E-06
2,389E-06
6,89767E-06
2,856E-06
PC 44:12
0,0001235
0,0001426
9,2E-05
2,226E-05
9,988E-05
8,91797E-05
4,984E-05
7,13783E-05
4,272E-05
PC 44:11
7,623E-05
0
0
1,029E-05
0
2,57347E-06
5,147E-06
3,4313E-06
5,943E-06
PC 44:10
7,987E-05
5,372E-06
1,005E-05
1,893E-05
5,553E-05
2,24722E-05
2,275E-05
2,81721E-05
2,411E-05
PC 44:9
3,052E-05
0
4,348E-06
0
0
1,08692E-06
2,174E-06
1,44923E-06
2,51E-06
PC 44:8
9,668E-05
1,86E-05
4,997E-06
4,658E-06
0
7,06462E-06
8,023E-06
3,2184E-06
2,792E-06
PC 44:7
5,392E-05
0,0005813
0,000155
0,0001757
0,0003396
0,000312883
0,0001971
0,000223407
0,0001011
PC 44:6
5,919E-05
0
0
1,115E-05
0
2,78784E-06
5,576E-06
3,71712E-06
6,438E-06
PC 44:5
0,0001298
6,58E-05
0,0002549
0,0002249
0,0004918
0,000259353
0,0001758
0,000323871
0,0001462
PC 44:4
3,083E-05
8,425E-06
8,242E-06
0
0
4,16661E-06
4,812E-06
2,74721E-06
4,758E-06
PC 44:3
4,471E-05
1,342E-05
1,955E-05
2,194E-06
5,197E-06
1,00906E-05
7,893E-06
8,97975E-06
9,276E-06
PC 44:2
1,115E-05
0
0
3,998E-06
0
9,99401E-07
1,999E-06
1,33253E-06
2,308E-06
Total PC
0,0339098
0,0333034
0,0210989
0,0190479
0,0250766
0,024631677
0,0062996
0,021741118
0,0030652
ePC 32:3
5,735E-05
2,342E-05
4,092E-06
9,399E-06
2,88E-06
9,94863E-06
9,419E-06
5,45689E-06
3,467E-06
ePC 32:2
9,506E-05
0,0001086
2,946E-05
1,878E-05
7,096E-05
5,69581E-05
4,115E-05
3,97345E-05
2,756E-05
ePC 32:1
0,0002109
0,0003067
0,0001801
0,0002443
0,0002584
0,000247364
5,223E-05
0,000227578
4,175E-05
ePC 32:0
0,0001654
0,0005297
0,000362
0,0004593
0,0004747
0,000456449
6,982E-05
0,000432029
6,11E-05
ePC 34:4
5,28E-05
2,762E-05
4,026E-05
3,525E-05
2,793E-05
3,27652E-05
6,118E-06
3,44818E-05
6,202E-06
ePC 34:3
4,378E-05
7,421E-05
5,085E-05
1,177E-05
4,447E-05
4,53252E-05
2,577E-05
3,56954E-05
2,096E-05
ePC 34:2
0,000124
0,0001334
3,995E-05
4,291E-05
9,404E-05
7,75774E-05
4,474E-05
5,89666E-05
3,041E-05
ePC 34:1
0,0001566
0,0003149
0,0002326
0,0001871
0,0002824
0,000254258
5,609E-05
0,000234052
4,764E-05
ePC 34:0
0,0001077
8,34E-05
9,34E-05
6,592E-05
8,664E-05
8,23405E-05
1,171E-05
8,19866E-05
1,432E-05
ePC 36:5
0,0001292
0,0001728
7,688E-05
8,193E-05
0,0001421
0,000118412
4,681E-05
0,000100286
3,626E-05
ePC 36:4
0,000446
6,925E-05
4,273E-05
3,795E-05
9,676E-05
6,16735E-05
2,714E-05
5,91479E-05
3,266E-05
ePC 36:3
0,0001015
0,0001192
9,836E-05
2,343E-05
7,652E-05
7,93855E-05
4,118E-05
6,61054E-05
3,854E-05
ePC 36:2
0,0003414
0,0003185
0,0001815
0,0001248
0,0001969
0,000205419
8,15E-05
0,000167739
3,802E-05
ePC 36:1
0,000383
0,0003087
0,0002032
0,0001312
0,000191
0,000208539
7,38E-05
0,000175161
3,854E-05
ePC 36:0
0,0001635
0,0001068
2,549E-05
3,028E-05
6,608E-05
5,71614E-05
3,772E-05
4,06175E-05
2,218E-05
ePC 38:6
0,0001456
0,0001329
0,0001131
8,919E-05
3,328E-05
9,21081E-05
4,31E-05
7,85124E-05
4,095E-05
ePC 38:5
0,0005716
0,0003451
0,0002286
0,0002147
0,0003395
0,000281978
6,994E-05
0,000260927
6,84E-05
ePC 38:4
0,000587
0,0004054
0,0002188
0,0001132
0,0002286
0,000241519
0,0001211
0,000186886
6,398E-05
ePC 38:3
0,0002131
0,0003244
0,0001036
5,179E-05
0,0001041
0,000145954
0,0001214
8,64813E-05
3,004E-05
ePC 38:2
0,0001548
0,0001541
6,071E-05
7,357E-05
6,881E-05
8,93095E-05
4,355E-05
6,76974E-05
6,505E-06
ePC 38:1
0,0002022
6,737E-05
7,785E-05
8,133E-05
6,914E-05
7,39237E-05
6,738E-06
7,61089E-05
6,281E-06
ePC 38:0
8,541E-05
6,599E-05
0,0001109
0
0,0001018
6,96782E-05
5,034E-05
7,09088E-05
6,158E-05
ePC 40:6
0,0001809
0,0001184
6,594E-05
9,771E-05
3,861E-05
8,01592E-05
3,511E-05
6,74182E-05
2,958E-05
ePC 40:5
0,0001808
8,82E-05
4,397E-05
3,11E-05
6,272E-05
5,64972E-05
2,481E-05
4,59286E-05
1,59E-05
ePC 40:4
5,913E-05
1,644E-05
3,426E-05
0
6,419E-05
2,87234E-05
2,747E-05
3,28165E-05
3,212E-05
ePC 40:3
3,948E-05
0,0001155
6,209E-05
5,112E-05
7,91E-05
7,69655E-05
2,818E-05
6,41069E-05
1,41E-05
ePC 40:2
0,0001383
8,492E-05
0,0001087
0,0001102
0,0001326
0,000109115
1,947E-05
0,000117181
1,335E-05
Total ePC
0,0034328
0,004616
0,0028895
0,0024183
0,0034343
0,003339508
0,0009469
0,002914011
0,0005084
SM 16:1
0,0002476
0,0001496
0,0001939
4,132E-05
8,176E-05
0,000116645
6,817E-05
0,00010565
7,903E-05
SM 16:0 (or DSM 16:1) 0,0016207
0,0039799
0,0039713
0,0035774
0,0040929
0,003905356
0,0002256
0,003880524
0,0002695
DSM 16:0
0,0004502
0,0003818
0,00021
0,0001971
0
0,000197203
0,0001561
0,000135684
0,0001177
SM 18:1
0,0001588
0,0002033
0
4,628E-05
8,632E-05
8,39773E-05
8,702E-05
4,41996E-05
4,32E-05
SM 18:0 (or DSM 18:1) 0,0003568
0,0004665
0,0005102
0,0003769
0,0003929
0,000436621
6,269E-05
0,000426675
7,282E-05
DSM 18:0
0
0
3,567E-05
0
0
8,91651E-06
1,783E-05
1,18887E-05
2,059E-05
SM 22:1
0,0017013
0
0
0,0001224
0
3,0597E-05
6,119E-05
4,07961E-05
7,066E-05
0,0001113
0,0001234
3,588E-05
0
6,76418E-05
5,944E-05
5,30892E-05
6,347E-05
SM 22:0 or DSM 22:1) 0,0049223
116
7. Anhang
DSM 22:0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
SM 24:1
0,0026625
0,0001568
0,0002948
0,0002074
0,0001911
0,000212538
5,874E-05
0,00023111
5,573E-05
SM 24:0 (or DSM 24:1) 0,0008253
0,0003969
0,00012
0,000218
0,0001266
0,000215345
0,000129
0,000154839
5,476E-05
DSM 24:0
0
0
0
0
3,928E-05
9,82029E-06
1,964E-05
1,30937E-05
2,268E-05
Total SM
0,0064136
0,005846
0,0054592
0,0048226
0,0050109
0,005284661
0,0004597
0,005097549
0,000327
LysoPE 16:1
6,474E-05
2,198E-05
0
6,57E-05
2,693E-05
1,661E-05
2,62444E-05
2,428E-05
3,64143E-05
2,588E-05
LysoPE 16:0
5,878E-05
8,177E-05
0,0001233
8,005E-05
3,907E-05
0,0001467
9,41663E-05
4,181E-05
8,85948E-05
5,431E-05
LysoPE 18:3
3,284E-05
1,606E-05
1,031E-05
4,603E-05
2,876E-05
4,722E-05
2,9676E-05
1,686E-05
4,06704E-05
1,033E-05
LysoPE 18:2
4,735E-05
1,347E-05
0
4,227E-05
2,841E-05
2,234E-05
2,12982E-05
1,586E-05
3,10056E-05
1,021E-05
LysoPE 18:1
0,0001031
0,000127
3,669E-05
0,0002137
6,739E-05
8,434E-05
0,000105809
6,854E-05
0,000121792
8E-05
LysoPE 20:5
0,0002381
0,0013373
0,0015537
0,0014059
0,001399
0,0016054
0,001460276
0,0001136
0,001470119
0,0001172
LysoPE 20:4
0,000182
0,000944
0,0009107
0,0012083
0,0010148
0,0011078
0,001037129
0,0001219
0,001110287
9,679E-05
LysoPE 20:3
4,333E-05
0
0
0
0
4,652E-05
9,30409E-06
2,08E-05
1,55068E-05
2,686E-05
LysoPE 20.2
0,0001464
4,023E-06
1,924E-05
1,302E-05
0
4,68E-05
1,66181E-05
1,848E-05
1,99408E-05
2,415E-05
LysoPE 20:1
0,0002742
8,982E-05
1,834E-05
9,517E-05
4,336E-05
8,043E-05
6,54246E-05
3,32E-05
7,29869E-05
2,67E-05
LysoPE 20:0
2,168E-05
1,78E-05
0
1,285E-05
7,223E-05
2,35E-05
2,52768E-05
2,765E-05
3,61955E-05
3,166E-05
LysoPE 22:6
0,0001127
0
1,047E-05
1,336E-05
3,531E-05
1,347E-05
1,45231E-05
1,286E-05
2,07145E-05
1,264E-05
LysoPE 22:5
0,0002285
3,045E-05
0,0002179
9,285E-05
0
0,0002972
0,000127678
0,0001263
0,00013002
0,0001521
Total LysoPE
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0,0026837
0,0029007
0,0032892
0,0027553
0,0035383
0,003033423
0,0003666
0,003194247
0,0004
PE 28:0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
PE 28:1
3,723E-05
0,0002112
0,0002057
0,0002275
0,0001155
0,0002976
0,000211502
6,502E-05
0,000213545
9,183E-05
PE 30:1
7,573E-05
6,589E-05
4,506E-05
2,683E-05
8,964E-06
0,0001226
5,38706E-05
4,386E-05
5,28001E-05
6,111E-05
PE 30:0
5,957E-05
0,0001328
0,0001202
0,0001582
0,0001151
0,0002043
0,000146129
3,651E-05
0,000159199
4,457E-05
PE 32:2
2,946E-05
0
5,261E-06
0
5,536E-06
9,087E-06
3,97695E-06
3,931E-06
4,87445E-06
4,579E-06
PE 32:1
0,0001459
0,0005148
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0,0004369
0,0003981
0,000414702
7,558E-05
0,000379989
6,781E-05
PE 32:0
8,503E-06
0
2,322E-05
3,521E-05
0
0
1,16846E-05
1,655E-05
1,17358E-05
2,033E-05
PE 34:4
8,889E-06
0
0
3,749E-06
0
0
7,49845E-07
1,677E-06
1,24974E-06
2,165E-06
PE 34:3
0,0003766
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0,0004093
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0,000474472
0,0001403
0,000389633
2,701E-05
PE 34:2
0,0003981
0,0011986
0,0009494
0,0008794
0,0008263
0,0009979
0,000970319
0,0001435
0,0009012
8,788E-05
PE 34:1
0,0006655
0,0004193
0,0002483
0,0002368
0,0004203
0,0004346
0,000351863
0,0001001
0,000363912
0,0001103
PE 34:0
0
7,333E-07
3,949E-05
0
0
3,039E-05
1,41209E-05
1,927E-05
1,01287E-05
1,754E-05
PE 36:6
8,509E-05
0,0001058
4,482E-05
0,0001219
1,737E-05
4,257E-05
6,65012E-05
4,493E-05
6,06262E-05
5,458E-05
PE 36:5
0,0005781
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0,0001634
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2,13E-05
PE 36:4
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4,255E-05
PE 36:3
0,0003074
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3,237E-05
8,953E-05
8,756E-05
0,000109947
6,542E-05
6,98197E-05
3,245E-05
PE 36:2
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0,0003332
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9,876E-05
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PE 36:1
0,0007219
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1,239E-05
PE 36:0
0,0003287
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3,575E-05
3,567E-05
3,258E-05
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PE 38:6
0,0005363
2,14E-06
1,329E-05
3,476E-05
1,055E-05
0
1,21485E-05
1,381E-05
1,51033E-05
1,782E-05
PE 38:5
0,0018193
9,657E-05
3,523E-05
0,0002414
0,0002852
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0,0001104
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2,218E-05
PE 38:4
0,0063155
0,0010679
0,0007444
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0,0007421
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0,0001579
0,000710647
2,739E-05
PE 38:3
0,0004885
0
2,266E-05
0
3,527E-05
0
1,1586E-05
1,648E-05
1,17556E-05
2,036E-05
PE 38:2
0,0002128
0,0001208
2,14E-05
4,946E-06
1,716E-05
1,238E-05
3,5338E-05
4,817E-05
1,14948E-05
6,154E-06
PE 38:1
0,0001917
0
3,576E-05
1,931E-05
0
0
1,10147E-05
1,617E-05
6,43691E-06
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PE 38:0
0,0003631
4,575E-05
0
9,484E-06
0
0
1,10477E-05
1,983E-05
3,16131E-06
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PE 40:8
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0
2,178E-05
0
1,086E-05
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9,031E-06
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PE 40:7
0,0004435
4,832E-05
3,578E-05
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1,707E-05
5,002E-06
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2,414E-05
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PE 40:6
0,0004727
5,226E-05
1,875E-05
6,906E-06
2,416E-05
6,038E-05
3,24921E-05
2,281E-05
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PE 40:5
0,0011534
2,646E-05
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0,000101
1,429E-05
3,60438E-05
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PE 40:4
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0
0
8,523E-07
0
0
1,70466E-07
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PE 40:3
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0
0
0
0
3,62279E-06
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0
0
PE 40:2
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1,164E-05
0
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PE 42:10
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0
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0
0
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PE 42:9
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0
0
0
0
0
0
0
0
PE 42:8
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PE 42:7
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0
0
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PE 42:6
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0
PE 42:5
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0
1,33971E-06
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PE 42:4
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0
0
0
0
0
0
0
0
PE 42:3
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0
0
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0
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9,233E-06
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1,192E-05
PE 42:2
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0
0
0
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0
0
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PE 44:12
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0
0
0
7,4E-06
0
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3,309E-06
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PE 44:11
2,558E-05
0
0
0
0
0
0
0
0
0
PE 44:10
4,859E-06
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0
0
0
1,857E-05
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1,072E-05
2,986E-05
PE 44:9
9,536E-06
8,275E-06
0
0
0
5,172E-05
1,19993E-05
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PE 44:8
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0
0
0
0
0
0
0
0
0
PE 44:7
1,92E-05
9,928E-05
6,133E-05
1,14E-05
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4,336E-05
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PE 44:6
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
PE 44:5
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0
1,327E-05
0
0
0
2,65301E-06
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0
0
PE 44:4
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
PE 44:3
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0
0
0
0
0
0
PE 44:2
0
0
0
0
0
1,099E-05
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Total PE
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0,000903
0,005426352
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ePE 32:3
6,299E-06
0
4,966E-06
6,453E-06
0
0
2,28368E-06
3,171E-06
2,15091E-06
3,725E-06
ePE 32:2
1,3E-05
6,854E-06
2,648E-05
0
3,333E-06
1,723E-05
1,07792E-05
1,09E-05
6,85358E-06
9,137E-06
117
7. Anhang
ePE 32:1
8,456E-06
0
6,573E-05
0
0
3,583E-05
2,03123E-05
2,975E-05
1,19445E-05
2,069E-05
ePE 32:0
0,0002221
0,0001092
0,0005215
1,846E-05
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0,000474812
0,0006896
0,000581142
0,0009307
ePE 34:4
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1,272E-05
0
3,549E-06
0
0
3,25325E-06
5,509E-06
1,18307E-06
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ePE 34:3
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0
0
0
1,242E-05
0
2,4841E-06
5,555E-06
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7,171E-06
ePE 34:2
9,225E-05
1,975E-05
0
3,604E-06
9,643E-06
0
6,59933E-06
8,341E-06
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4,872E-06
ePE 34:1
8,195E-05
0,0002007
4,586E-05
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0,0002876
0,0002875
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3,131E-06
ePE 34:0
9,484E-06
0
4,616E-07
3,273E-06
0
2,86E-05
6,466E-06
1,245E-05
1,06228E-05
1,565E-05
ePE 36:5
0,0003914
0
4,372E-05
2,52E-05
4,014E-06
3,522E-05
2,16295E-05
1,913E-05
2,14759E-05
1,593E-05
ePE 36:4
0,0001519
0
7,5E-07
0
0
0
1,50008E-07
3,354E-07
0
0
ePE 36:3
0,0001297
0
0
0
0
0
0
0
0
0
ePE 36:2
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0
1,746E-05
0
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0
8,26489E-06
1,154E-05
7,95467E-06
1,378E-05
ePE 36:1
6,053E-05
0
0
0
2,867E-06
2,011E-05
4,59545E-06
8,761E-06
7,65908E-06
1,088E-05
ePE 36:0
6,012E-06
0
0
0
9,692E-06
2,133E-06
2,36498E-06
4,199E-06
3,94163E-06
5,093E-06
ePE 38:6
0,0004817
5,527E-06
1,875E-05
8,045E-05
4,977E-05
7,969E-06
3,2493E-05
3,208E-05
4,6064E-05
3,638E-05
ePE 38:5
0,001213
8,675E-06
2,374E-05
3,122E-05
6,403E-05
4,232E-05
3,39967E-05
2,077E-05
4,58573E-05
1,669E-05
ePE 38:4
0,0003918
4,544E-05
3,797E-06
3,281E-05
0
0
1,6408E-05
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1,894E-05
ePE 38:3
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0
0
0
0
0
0
0
0
ePE 38:2
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0
0
0
1,42378E-06
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0
0
ePE 38:1
5,132E-05
1,861E-05
0
1,116E-05
0
3,158E-05
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1,337E-05
1,42456E-05
1,602E-05
ePE 38:0
0,0001153
2,124E-05
1,017E-05
1,634E-05
0
1,074E-06
9,76292E-06
9,298E-06
5,80443E-06
9,139E-06
ePE 40:6
0,0003154
9,875E-06
0
1,402E-05
0
2,45E-05
9,67826E-06
1,032E-05
1,28389E-05
1,229E-05
ePE 40:5
0,0004466
1,162E-05
0
0
1,041E-05
7,055E-06
5,81562E-06
5,566E-06
5,82031E-06
5,312E-06
ePE 40:4
0,000283
1,59E-05
1,943E-05
0
0
1,571E-05
1,0207E-05
9,435E-06
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9,067E-06
ePE 40:3
9,738E-05
0
0
0
1,277E-05
6,179E-06
3,7889E-06
5,687E-06
6,31483E-06
6,384E-06
ePE 40:2
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0
0
0
0
0
0
0
0
0
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0,001102339
0,0009667
PE-cer 16:1
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3,26E-06
0
0
1,141E-05
6,8E-06
4,2939E-06
4,87E-06
6,06987E-06
5,74E-06
PE-cer 16:0
1,263E-05
2,964E-06
0
0
0
2,4E-05
5,39197E-06
1,048E-05
7,99877E-06
1,385E-05
PE-cer 18:1
1,002E-05
0
0
0
4,879E-06
0
9,75897E-07
2,182E-06
1,6265E-06
2,817E-06
PE-cer 18:0
3,306E-07
0
3,035E-06
0
0
0
6,06969E-07
1,357E-06
0
0
PE-cer 24:0
0
0
0
0
3,539E-06
1,878E-05
4,46395E-06
8,149E-06
7,43992E-06
9,98E-06
Total PE-cer
5,907E-05
6,223E-06
3,035E-06
0
1,983E-05
4,958E-05
1,57327E-05
2,038E-05
2,31351E-05
2,495E-05
PI 34:4
0
1,572E-05
0
0
0
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7,86E-06
0
0
PI 34:3
0,0001512
0,0003379
0,0003125
0,0003309
0,0003499
0,000332807
1,564E-05
0,000331112
1,87E-05
PI 34:2
0,0002543
0,0009822
0,0007373
0,0004056
0,0005286
0,000663412
0,0002528
0,00055716
0,0001677
PI 34:1
0,0002136
0
0
0,000193
0,0009038
0,000274193
0,0004295
0,000365591
0,000476
PI 36:6
9,105E-05
5,98E-05
0,0001669
0,0002317
5,314E-05
0,00012788
8,665E-05
0,000150573
9,04E-05
PI 36:5
2,738E-05
1,047E-05
2,431E-05
0
2,136E-05
1,40343E-05
1,109E-05
1,52229E-05
1,327E-05
PI 36:4
6,81E-05
0,0001919
0,0003103
0,0001304
0,0002407
0,00021832
7,615E-05
0,000227132
9,073E-05
PI 36:3
2,514E-05
3,016E-05
0
7,996E-07
6,409E-05
2,37636E-05
3,033E-05
2,16299E-05
3,677E-05
PI 36:2
6,066E-05
0,0001554
0,0001836
0,0001581
0,0002084
0,000176391
2,485E-05
0,000183386
2,516E-05
PI 36:1
0,000308
0,0006133
0,0004133
0,0005313
0,0006664
0,000556101
0,0001102
0,00053703
0,0001267
PI 38:6
5,603E-05
0,0001892
2,808E-05
5,234E-05
4,291E-05
7,8138E-05
7,472E-05
4,11114E-05
1,223E-05
PI 38:5
5,642E-05
4,105E-05
2,998E-05
9,728E-05
3,795E-05
5,15638E-05
3,083E-05
5,50673E-05
3,677E-05
PI 38:4
0,0001901
0,0001021
9,62E-05
3,382E-05
0,0001403
9,31153E-05
4,41E-05
9,01048E-05
5,35E-05
PI 38:3
5,739E-05
2,181E-05
1,931E-06
0
2,975E-05
1,33724E-05
1,471E-05
1,05609E-05
1,665E-05
PI 38:2
2,096E-05
0,0001044
7,374E-05
2,595E-05
1,68E-05
5,52138E-05
4,12E-05
3,88277E-05
3,058E-05
PI 38:1
4,503E-05
6,25E-05
2,034E-05
7,472E-06
5,691E-05
3,68076E-05
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2,82429E-05
2,565E-05
PI 38:0
0,000251
0,0002729
6,41E-05
0
3,388E-05
9,27285E-05
0,000123
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3,207E-05
PI 40:8
6,087E-05
0,0001259
8,701E-05
8,057E-05
0,0001441
0,000109376
3,058E-05
0,000103882
3,495E-05
PI 40:7
2,894E-05
9,92E-05
9,977E-05
2,944E-05
1,248E-05
6,02224E-05
4,586E-05
4,72292E-05
4,628E-05
PI 40:6
3,873E-05
2,541E-05
1,115E-05
4,932E-06
2,295E-05
1,61105E-05
9,711E-06
1,30099E-05
9,153E-06
PI 40:5
3,793E-05
4,679E-05
5,317E-06
0
0,0001056
3,94319E-05
4,883E-05
3,69777E-05
5,95E-05
PI 40:4
2,294E-05
3,548E-05
3,334E-05
5,461E-06
4,675E-05
3,02584E-05
1,755E-05
2,85195E-05
2,106E-05
PI 40:3
2,586E-05
1,061E-05
5,789E-05
3,618E-05
2,046E-05
3,12848E-05
2,063E-05
3,81758E-05
1,88E-05
PI 40:2
8,724E-05
0
5,751E-06
2,593E-05
5,688E-05
2,21415E-05
2,569E-05
2,9522E-05
2,575E-05
PI 40:1
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0,0007542
0,000821619
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0,0002296
PI 40:0
7,14E-05
0,0001575
0
0,0001476
0
7,62784E-05
8,817E-05
4,92083E-05
8,523E-05
PI 42:10
1,18E-05
7,761E-06
1,028E-05
1,001E-05
3,066E-06
7,78024E-06
3,34E-06
7,78666E-06
4,091E-06
PI 42:9
1,501E-05
3,169E-05
2,545E-06
4,087E-06
2,645E-06
1,02425E-05
1,432E-05
3,09249E-06
8,63E-07
PI 42:8
4,605E-05
5,47E-05
4,396E-06
3,813E-05
2,783E-05
3,12644E-05
2,106E-05
2,34524E-05
1,729E-05
PI 42:7
0,0001192
3,861E-05
5,912E-05
4,439E-05
0
3,55287E-05
2,521E-05
3,45012E-05
3,077E-05
PI 42:6
7,127E-05
6,884E-05
0
0
0
1,72097E-05
3,442E-05
0
0
PI 42:5
2,966E-05
2,599E-05
3,52E-05
4,916E-05
3,985E-05
3,75528E-05
9,646E-06
4,14055E-05
7,106E-06
PI 42:4
0
0
0
0
0
0
0
0
0
PI 42:3
0
0
0
0
0
0
0
0
0
PI 42:2
0
0
0
0
0
0
0
0
0
PI 44:12
0
0
0
0
0
0
0
0
0
PI 44:11
0
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0
0
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0
0
0
0
PI 44:10
0
0
0
0
0
0
0
0
0
PI 44:9
0
0
0
0
0
0
0
0
0
PI 44:8
0
0
0
0
0
0
0
0
0
PI 44:7
0
0
0
0
0
0
0
0
0
PI 44:6
0
0
0
0
0
0
0
0
0
PI 44:5
0
0
0
0
0
0
0
0
0
118
7. Anhang
PI 44:4
0
0
0
0
0
0
0
0
0
PI 44:3
0
0
0
0
0
0
0
0
0
PI 44:2
0
0
0
0
0
0
0
0
0
Total PI
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0
0
0
0
0
0
0
0
0
PS 32:0
0
0
0
0
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0
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PS 34:4
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
PS 34:3
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
PS 34:2
0
0
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0
0
1,11682E-05
1,533E-05
9,78137E-06
1,694E-05
PS 34:1
0,0001039
0
4,311E-05
0,0002346
0
0,0001648
8,85144E-05
0,000106
0,000133155
0,0001205
PS 34:0
4,658E-05
0
3,396E-05
2,018E-05
0
0
1,08274E-05
1,561E-05
6,72601E-06
1,165E-05
PS 36:6
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
PS 36:5
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0
0
0
0,000205
0
4,09955E-05
9,167E-05
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0,0001183
PS 36:4
0
0
0
0
0,0004356
0
8,711E-05
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PS 36:3
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
PS 36:2
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0
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7,7E-05
9,67645E-05
8,4E-05
PS 36:1
0,002468
0,0007267
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0,0009496
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PS 36:0
0,000149
0
0
0
0
0
0
0
0
0
PS 38:7
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0
0
1,981E-05
0
0
3,96256E-06
8,861E-06
6,60426E-06
1,144E-05
PS 38:6
2,547E-05
0
4,433E-05
0
0
0
8,86599E-06
1,982E-05
0
0
PS 38:5
0,0004647
0
1,376E-05
2,044E-05
0
0
6,83857E-06
9,657E-06
6,8118E-06
1,18E-05
PS 38:4
0,0012213
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PS 38:3
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0
0
0
0
0
0
0
0
0
PS 38:2
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0
0
0
0
0
0
PS 38:1
0,0001606
0
0
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0
0
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9,76E-06
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1,26E-05
PS 38:0
5,41E-05
0
0
0
0
0
0
0
0
0
PS 40:8
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0
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0
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PS 44:4
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0
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ePS 36:3
0
0
2,851E-05
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ePS 38:6
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0
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0
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0
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0
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0
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0
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ePS 38:1
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0
0
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0
0
3,96256E-06
8,861E-06
6,60426E-06
1,144E-05
ePS 40:5
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0
0
0
0
0
0
0
0
ePS 40:4
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0
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0
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0
0
ePS 40:0
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0,0003003
0,00074765
0,0002428
119
7. Anhang
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PA 32:4
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0
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0
0
0,000112909
0,0001549
8,92448E-05
0,0024015
0,0001546
PA 32:3
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0
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0,0003383
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PA 32:2
0,0004921
0
5,488E-05
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0
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PA 32:1
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0
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0
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PA 32:0
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0
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0
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PA 34:4
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PA 34:3
0,0009494
0
5,665E-05
0
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PA 34:2
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0
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0
0
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PA 34:1
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0
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0,0077402
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PA 36:6
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0
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PA 36:5
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PA 36:4
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0
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PA 36:3
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0
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PA 36:2
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0
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0
0
0
6,94044E-05
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0
0
PA 38:6
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0
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0
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PA 38:5
0,0003959
0
1,082E-05
0,0003489
0,0005771
0,0001903
0,000225428
0,0002434
0,000372106
0,0001944
PA 38:4
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0
0,0012435
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PA 38:3
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0
0,0005987
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0,0008245
0,000948615
0,0012663
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0,0015539
PA 38:2
0,0003984
0
0,0002592
0,0001962
0
0
9,10854E-05
0,0001267
6,54105E-05
0,0001133
PA 40:7
0,0021883
0
0,004716
0,0047958
0,0011683
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PA 40:6
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0,0070241
0,0044858
0,0079184
0,006956591
0,0014396
0,006476092
0,0017807
PA 40:5
0,0005439
0
0
0
0
0
0
0
0
0
Total PA
0,0200205
0,0160796
0,0420414
0,0438854
0,0248276
0,0409425
0,033555314
0,0123983
0,036551845
0,0102595
Total
0,0506723
0,0764983
0,0609012
0,0913797
0,0725509
0,1015447
0,08057495
0,0160042
0,088491752
0,0147111
Total minus PA
0,0630501
0,0604187
0,0188598
0,0474943
0,0477232
0,0606022
0,047019636
0,0170126
0,051939907
0,0075027
Experiment:
Silke Mietner011807
Sample no.
Sample description
LysoPC 16:1
LysoPC 16:0
LysoPC 18:3
LysoPC 18:2
LysoPC 18:1
LysoPC 18:0
LysoPC 20:5
LysoPC 20:4
LysoPC 20:3
LysoPC 20.2
LysoPC 20:1
LysoPC 20:0
LysoPC 22:6
LysoPC 22:5
Total LysoPC
PC 28:0
PC 28:1
PC 30:1
PC 30:0
PC 32:2
PC 32:1
PC 32:0
PC 34:4
PC 34:3
PC 34:2
PC 34:1
PC 34:0
PC 36:6
PC 36:5
PC 36:4
PC 36:3
PC 36:2
PC 36:1
PC 36:0
PC 38:6
PC 38:5
PC 38:4
PC 38:3
PC 38:2
PC 38:1
PC 38:0
PC 40:8
PC 40:7
PC 40:6
PC 40:5
PC 40:4
PC 40:3
PC 40:2
PC 42:11
WITH I.S. SUBTRACTION
Isobaric species
Masses of + ions
494,3
496,3
518,3
520,3
522,4
524,4
542,3
544,3
546,5
548,4
550,4
552,4
568,3
570,4
Chemical formula
C24H49O7PN
C24H51O7PN
C26H49O7PN
C26H51O7PN
C26H53O7PN
C26H55O7PN
C28H49O7PN
C28H51O7PN
C28H53O7PN
C28H55O7PN
C28H57O7PN
C28H59O7PN
C30H51O7PN
C30H53O7PN
678,5
676,5
704,5
706,5
730,5
732,6
734,6
754,5
756,6
758,6
760,6
762,6
778,5
780,6
782,6
784,6
786,6
788,6
790,6
806,6
808,6
810,6
812,6
814,6
816,6
818,7
830,6
832,6
834,6
836,6
838,6
840,6
842,7
852,6
C36H69O8PN
C36H71O8PN
C38H75O8PN
C38H77O8PN
C40H77O8PN
C40H79O8PN
C40H81O8PN
C42H77O8PN
C42H79O8PN
C42H81O8PN
C42H83O8PN
C42H85O8PN
C44H77O8PN
C44H79O8PN
C44H81O8PN
C44H83O8PN
C44H85O8PN
C44H87O8PN
C44H89O8PN
C46H81O8PN
C46H83O8PN
C46H85O8PN
C46H87O8PN
C46H89O8PN
C46H91O8PN
C46H93O8PN
C48H81O8PN
C48H83O8PN
C48H85O8PN
C48H87O8PN
C48H89O8PN
C48H91O8PN
C48H93O8PN
C50H79O8PN
2
1a
0
0
0
0
4,4299E-06
0,00034257
5,1052E-05
0,00010376
0
0
0,00014814
0
0
0
0,00064995
0
0,00022982
0
0,00094333
0,0002847
0,00319136
0,01086628
0,00016073
0,00011882
0,02053742
0,09693932
0,00065905
0
0
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0,000646942
120
7. Anhang
PC 42:10
PC 42:9
PC 42:8
PC 42:7
PC 42:6
PC 42:5
PC 42:4
PC 42:3
PC 42:2
PC 44:12
PC 44:11
PC 44:10
PC 44:9
PC 44:8
PC 44:7
PC 44:6
PC 44:5
PC 44:4
PC 44:3
PC 44:2
Total PC
ePC 32:3
ePC 32:2
ePC 32:1
ePC 32:0
ePC 34:4
ePC 34:3
ePC 34:2
ePC 34:1
ePC 34:0
ePC 36:5
ePC 36:4
ePC 36:3
ePC 36:2
ePC 36:1
ePC 36:0
ePC 38:6
ePC 38:5
ePC 38:4
ePC 38:3
ePC 38:2
ePC 38:1
ePC 38:0
ePC 40:6
ePC 40:5
ePC 40:4
ePC 40:3
ePC 40:2
Total ePC
SM 16:1
SM 16:0 (or DSM 16:1)
DSM 16:0
SM 18:1
SM 18:0 (or DSM 18:1)
DSM 18:0
SM 22:1
SM 22:0 or DSM 22:1)
DSM 22:0
SM 24:1
SM 24:0 (or DSM 24:1)
DSM 24:0
Total SM
LysoPE 16:1
LysoPE 16:0
LysoPE 18:3
LysoPE 18:2
LysoPE 18:1
LysoPE 20:5
LysoPE 20:4
LysoPE 20:3
LysoPE 20.2
LysoPE 20:1
LysoPE 20:0
LysoPE 22:6
LysoPE 22:5
Total LysoPE
PE 28:0
PE 28:1
PE 30:1
PE 30:0
PE 32:2
PE 32:1
PE 32:0
PE 34:4
PE 34:3
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856,6
858,6
860,6
862,6
864,6
866,7
868,7
870,7
878,6
880,6
882,6
884,6
886,6
888,6
890,7
892,7
894,7
896,7
898,7
C50H81O8PN
C50H83O8PN
C50H85O8PN
C50H87O8PN
C50H89O8PN
C50H91O8PN
C50H93O8PN
C50H95O8PN
C50H97O8PN
C52H81O8PN
C52H83O8PN
C52H85O8PN
C52H87O8PN
C52H89O8PN
C52H91O8PN
C52H93O8PN
C52H95O8PN
C52H97O8PN
C52H99O8PN
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716,6
718,6
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744,6
746,6
748,6
766,6
768,6
770,6
772,6
774,6
776,7
792,6
794,6
796,6
798,6
800,7
802,7
804,7
820,6
822,6
824,7
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828,7
C40H77O7PN
C40H79O7PN
C40H81O7PN
C40H83O7PN
C42H79O7PN
C42H81O7PN
C42H83O7PN
C42H85O7PN
C42H87O7PN
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C44H89O7PN
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C46H85O7PN
C46H87O7PN
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C46H93O7PN
C46H95O7PN
C48H87O7PN
C48H89O7PN
C48H91O7PN
C48H93O7PN
C48H95O7PN
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703,6
705,4
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731,6
733,6
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787,7
789,5
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815,7
817,5
C39H78N2O6P
C39H80N2O6P
C39H802N2O6P
C41H82N2O6P
C41H84N2O6P
C41H86N2O6P
C45H90N2O6P
C45H92N2O6P
C45H94N2O6P
C47H94N2O6P
C47H96N2O6P
C47H98N2O6P
452,3
454,3
476,3
478,3
480,3
500,3
502,3
504,3
506,3
508,3
510,3
526,3
528,3
C21H43O7PN
C21H45O7PN
C23H43O7PN
C23H45O7PN
C23H49O7PN
C25H43O7PN
C25H45O7PN
C25H47O7PN
C25H49O7PN
C25H51O7PN
C25H53O7PN
C27H45O7PN
C27H47O7PN
632,4
634,4
662,5
664,5
688,5
690,5
692,5
712,5
714,5
C33H63O8PN
C33H65O8PN
C35H69O8PN
C35H71O8PN
C37H71O8PN
C37H73O8PN
C37H75O8PN
C39H71O8PN
C39H73O8PN
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3,8626E-05
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0,00014104
0,00019026
0,00020881
0,00040109
1,9641E-05
0,00021681
0
9,6637E-05
8,912E-05
0
0,36598897
0
0,00012214
0,00054345
0,001545
0,00015437
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0,00107999
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0,0003078
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6,8096E-05
0,00062726
0,00127933
0,00019671
0,00109816
0,00137666
0,00165377
0,00010328
7,3376E-06
0,04849615
0,00217929
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0,00196497
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0
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0
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0
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1,9796E-05
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0
6,011E-05
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8,7311E-05
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2,3502E-05
0,00045147
0,00104156
0,00894728
0
2,0287E-05
0,00013598
7,9547E-05
2,8767E-05
0,00086802
0
8,195E-06
0,00034603
0,00086644
0,00083225
0,00180778
0,00051159
0,00055691
0,00049228
0,00042581
0,00022697
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3,657E-05
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0,00016277
0,00014929
0,00016835
0,00014762
2,4608E-06
5,1703E-05
5,7868E-05
0
0,33959724
3,5636E-05
8,256E-05
0,00068092
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6,3981E-05
0,00013311
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0
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PE 44:4
PE 44:3
PE 44:2
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ePE 32:2
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ePE 34:4
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ePE 34:2
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PE-cer 16:0
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PE-cer 18:0
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718,5
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748,6
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776,6
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800,6
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7. Anhang
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PS 44:7
PS 44:6
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PS 44:4
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PS 44:2
Total PS
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ePS 36:0
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ePS 38:5
ePS 38:4
ePS 38:3
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ePS 38:1
ePS 38:0
ePS 40:5
ePS 40:4
ePS 40:3
ePS 40:2
ePS 40:1
ePS 40:0
Total ePS
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PA 32:3
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PA 32:1
PA 32:0
PA 34:4
PA 34:3
PA 34:2
PA 34:1
PA 36:6
PA 36:5
PA 36:4
PA 36:3
PA 36:2
PA 38:6
PA 38:5
PA 38:4
PA 38:3
PA 38:2
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PA 40:6
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Total PA
Total
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PG 34:0
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721,5
723,5
725,5
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745,5
747,5
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C35H60O8P
C35H62O8P
C35H64O8P
C35H66O8P
C35H68O8P
C37H64O8P
C37H66O8P
C37H68O8P
C37H70O8P
C39H64O8P
C39H66O8P
C39H68O8P
C39H70O8P
C39H72O8P
C41H68O8P
C41H70O8P
C41H72O8P
C41H74O8P
C41H76O8P
C43H70O8P
C43H72O8P
C43H74O8P
Total minus PA
Sample no.
Sample description
LysoPC 16:1
LysoPC 16:0
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LysoPC 18:2
LysoPC 18:1
LysoPC 18:0
LysoPC 20:5
LysoPC 20:4
LysoPC 20:3
LysoPC 20.2
LysoPC 20:1
LysoPC 20:0
LysoPC 22:6
LysoPC 22:5
Total LysoPC
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PC 28:1
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PC 32:1
PC 32:0
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PC 34:2
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PC 36:5
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PC 38:5
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PC 40:5
PC 40:4
PC 40:3
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PC 42:11
PC 42:10
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PC 42:8
PC 42:7
PC 42:6
PC 42:5
PC 42:4
PC 42:3
PC 42:2
PC 44:12
PC 44:11
PC 44:10
PC 44:9
PC 44:8
PC 44:7
PC 44:6
PC 44:5
PC 44:4
PC 44:3
PC 44:2
Total PC
ePC 32:3
ePC 32:2
ePC 32:1
ePC 32:0
ePC 34:4
ePC 34:3
ePC 34:2
ePC 34:1
ePC 34:0
ePC 36:5
ePC 36:4
ePC 36:3
ePC 36:2
ePC 36:1
ePC 36:0
ePC 38:6
ePC 38:5
ePC 38:4
ePC 38:3
ePC 38:2
ePC 38:1
ePC 38:0
ePC 40:6
ePC 40:5
ePC 40:4
ePC 40:3
ePC 40:2
Total ePC
SM 16:1
SM 16:0 (or DSM 16:1)
DSM 16:0
SM 18:1
SM 18:0 (or DSM 18:1)
DSM 18:0
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SM 22:0 or DSM 22:1)
DSM 22:0
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SM 24:0 (or DSM 24:1)
DSM 24:0
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5,377E-05
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7. Anhang
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PE 42:8
PE 42:7
PE 42:6
PE 42:5
PE 42:4
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PE 44:9
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ePE 34:0
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ePE 36:1
ePE 36:0
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PI 36:1
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PI 38:0
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PI 42:6
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PS 38:0
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PS 40:7
PS 40:6
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PS 40:4
PS 40:3
PS 40:2
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PS 42:11
PS 42:10
PS 42:9
PS 42:8
PS 42:7
PS 42:6
PS 42:5
PS 42:4
PS 42:3
PS 42:2
PS 44:12
PS 44:11
PS 44:10
PS 44:9
PS 44:8
PS 44:7
PS 44:6
PS 44:5
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ePS 38:1
ePS 38:0
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PA 32:3
PA 32:2
PA 32:1
PA 32:0
PA 34:4
PA 34:3
PA 34:2
PA 34:1
PA 36:6
PA 36:5
PA 36:4
PA 36:3
PA 36:2
PA 38:6
PA 38:5
PA 38:4
PA 38:3
PA 38:2
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0,03380545
0,0492188
0,012347419
0,0037774
128
Danksagung
Danksagung
Die
vorliegende
Arbeit
Universitätsklinikum
entstand
Würzburg
am
von
März
Institut
für
2004
bis
Klinische
März
2007
Biochemie
am
und
Pathobiochemie.
Herrn Prof. Dr. Ulrich Walter danke ich, dass er mir ermöglicht hat an seinem Institut
diese Arbeit anzufertigen, für seine konstruktiven Vorschläge während fachlicher
Diskussionen, für sein stets offenes Ohr, wenn ich mit Fragen zu ihm kam und für die
Übernahme der Korrektur dieser Arbeit.
Herrn Prof. Dr. Thomas Dandekar danke ich für die Übernahme des Ko-Referats und
für die erfolgreichen Kooperationen im Rahmen gemeinsamer Veröffentlichungen mit
dem Lehrstuhl für Bioinformatik.
Frau Dr. Dr. Ingvild Birschmann danke ich für die Betreuung während meiner Arbeit
und für ihre Ausdauer und Unterstützung.
Herrn Dr. Jörg Geiger danke ich für seine fachliche Unterstützung, insbesondere
beim Thema der Lipidanalysen.
Herrn Marcus Dittrich danke ich für die gute Zusammenarbeit und seine
Kooperationsbereitschaft in sämtlichen Projekten und für die Zeit, die er sich
genommen hat um kritische Sachverhalte zu besprechen. Außerdem danke ich ihm
für die Erstellung von Grafiken und dafür, dass er sie mir für meine Arbeit zur
Verfügung gestellt hat.
Frau Julia Pfrang danke ich für die gemeinsame Laborzeit, die alles andere als
langweilig war und für ihre unterhaltsame Art. Ich danke ihr auch für ihre fachliche
Unterstützung im Rahmen dieser Arbeit und der gemeinsamen Veröffentlichung.
Dem gesamten Institut für Klinische Biochemie und Pathobiochemie danke ich für
drei ganz tolle Jahre. Ich habe mich immer sehr wohl gefühlt und danke jedem
Einzelnen für seine Hilfsbereitschaft, ob im Labor oder in administrativen
Angelegenheiten.
131
Danksagung
Frau
Dr.
Yvonne
Reinders
danke
ich
für
die
Durchführung
der
massenspektrometrischen Analysen meiner Proben.
Mrs. Mary Roth vom Kansas Lipidomics Research Center danke ich für die schnellen
und exakten Analysen meiner Proben und für ihre Hilfe beim troubleshooting.
Kontakt:
Mary Roth, Analytical Laboratory Manager
Email: [email protected]
Phone:
785-532-5756
Fax:
785-532-6653
Kansas Lipidomics Research Center
Division of Biology, Ackert Hall
Kansas State University
Manhattan, KS 66506-4901
Meiner Mutter, Christel Mietner, danke ich für all die Unterstützung, die ich von ihr
während meines bisherigen Lebens bekommen habe. Sie hat mir Vieles ermöglicht
und hat mich stets motiviert, wenn ich das Gefühl hatte, nicht weiter zu kommen.
Sie ist die wichtigste Person in meinem Leben und ich widme diese Arbeit ihr allein,
in der Hoffnung, dass sie immer stolz auf mich sein wird und ich ihr auf diesem Wege
meinen Dank zeigen kann.
132
Erklärung
Hiermit versichere ich, dass die vorliegende Arbeit selbständig verfasst
wurde und keine anderen als die angegebenen Hilfsmittel verwendet
wurden.
Silke Mietner
Würzburg, den 30. Mai 2008
133

C O S T

Transcription

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