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Lysophosphatidylcholine에 의한 CD4양성 T세포에서의 CXCR4의
Lysophosphatidylcholine에 의한 CD4양성 T세포에서의 CXCR4의 발현 증가 울산의대 서울아산병원 심장내과 박재형·한기훈·박성욱·박승정·김재중 Lysophosphatidylcholine Upregulates CXCR4 Expression in Human CD4 Positive T Cells Jae Hyeong Park, M.D., Ki Hoon Han, M.D., Seong Wook Park, M.D., Seung-Jung Park, M.D., Jae Joong Kim, M.D. Department of Internal Medicine Asan Medical Center, University of Ulsan College of Medicine, Seoul, South Korea Abstract Background and Objectives: Oxidized low density lipoprotein (OxLDL) in atherosclerotic lesions triggers both innate and adaptive immune responses, which are necessary for development of atherosclerosis. The aim of this study was to evaluate lysophosphatidylcholine (lysoPC), the main component of OxLDL, can enhance the CD4-positive T cell mediated immune responses. Results: The treatment of human CD4-positive T cells isolated from the peripheral blood with OxLDL or lysoPC enhanced both CXCR4 transcripts and proteins up to 4 fold in a dose (-10 g/mL) or time (-72 hours) dependent manner. The positive regulatory effect of lysoPC on CXCR4 was almost completely abolished by the incubation with CAPE (10 g/mL), a NF B inhibitor. Vascular resident cells and macrophages in the atherosclerotic plaque express stromal derived factor (SDF-1), which specifically activates CXCR4. The pretreatment of human CD4-positive T cells with lysoPC (10 g/mL/24hrs) promoted the SDF-1induced migration 3 fold. Moreover, when CD4-positive T cells were activated by the immobilization with anti-CD3 antibody and treated with lysoPC, the production of proinflammatory cytokines i.e. IL-2 and TNF- were selectively enhanced up to 4 fold in response to SDF-1. Conclusion: Our study results suggest that the presence of lysoPC and SDF-1 in atherosclerotic lesion actively trigger the proinflammatory responses through overexpression of CXCR4 in CD4-positive T cells, which may play an important role in the progression of atherosclerosis. Key Words: Human T Lymphocytes, Chemokines, Cytokines, Inflammation 책임저자 : 김재중 서울시 송파구 풍납동 388-1번지, 울산의대 서울아산병원 심장내과 Tel: 02)3010-3150, Fax: 02)486-5918, E-mail: [email protected] * 본 논문은 아산생명과학연구소 2002-282 연구비 및 보건의료기술연구개발사업 02-PJ1-PG10-20707-0003의 후원으로 완 성되었음 - 350 - Lysophosphatidylcholine에 의한 CD4양성 T세포에서의 CXCR4의 발현 증가 서 CD4양성 T세포들을 직접 활성화시킬 수 있다는 론 가능성을 보여주었다. Lysophosphatidylcholine (lysoPC)는 산화 저비중 지단백의 주요한 인지질 죽상경화증의 발생은 염증 세포들, 특히 대식 세포, 수지상 세포, 및 T 세포들이 관여하는 면 1 6,7 부분으로 8 죽상종 내에 많은 양이 존재한다 . Lyso PC는 CD4양성 T세포들에 존재하는 G2A, 역 반응들에 의해 조절되어진다 . 처음 시작되는 GPR4 등의 특수한 lysoPC 수용체에 의해 인식되 반응은 선천 면역반응으로 대식세포들의 활성화 어지는데 , CD40 리간드의 발현을 증가시키고 , 와 다양한 염증 유발성 물질들이 분비를 포함한 항원제공 세포들의 작용이 없어도 활성화된 CD4 다. CD4양성 T세포들은 뒤따르는 적응 면역반응 양성 T세포들에서 시토카인 유발성 interferon-발 을 구성하는 한 성분으로 활성화 시 여러 시토카 현을 증가시킨다 . 9 10 11 인들을 분비하고, B세포들을 활성화시키는 표면 죽상경화증 발생의 가장 초기 단계에서는 T세 물질들을 발현한다. 인간에서는 Th1 및 Th2-CD4 포들이 동맥벽으로 이동하며 침투하는 것을 발 양성 T세포들의 구분이 명확하지 않지만, 죽상경 견할 수 있다 . 죽상경화반에서 발견되는 T 림프 화증 병변에서의 활성화된 CD4양성 T 세포들의 구들의 2/3이상은 기억 (CD45O+) T 세포들이며 , 작용은 생체 내에서 이러한 Th1및 Th2 면역적 반 나머지에서는 주로 nave CD4양성 T 세포들이 발 2 3 12 응의 양상을 결정할 수 있을 것이다 . Interferon- , 견된다. CD4양성 T세포들은 CXC chemokine 수 TNF- 및 림프독소 등의 염증 유발성 시토카인 용체중 하나인 CXCR4 수용체를 발현하는데, 이 을 분비하여 항원의 공격에 반응하는 CD4양성 T 의 독점적 리간드는 stromal derived factor-1 세포들의 Th1 아군들은 주로 죽상경화반에 분포 (SDF-1)이다 . SDF-1은 죽상경화증 병변에서 고 3 13 14 한다 . Interferon- 수용체를 갖지 않는 죽상경화 농도로 발현되며 , 실험실 내에서 CD4양성 T세 증 유발 생쥐 모델에서는 죽상경화증이 적게 발 포들을 SDF-1으로 자극하였을 때 이들의 화학주 4 생하나 , 반면에 외부에서 주입된 interferon- 에 5 화성 운동을 유발할 수 있다. CD4양성 T세포들 의해서는 죽상경화증이 촉진되는 것 으로 보아 을 CXCR4/SDF-1으로 자극할 경우 동맥벽 내로 Th1 세포군들이 죽상경화증을 더 악화시키는 것 이들 세포들이 침투하도록 하는 역할 이외에 으로 여겨진다. SDF-1으로 항-CD3 항체에 의해 활성화된 CD4 저비중 지단백 (low density lipoprotein; LDL)은 양성 T세포들을 자극하였을 경우 세포 표면으로 죽상경화증 병변들 내에서 산화되어 자멸된 세 CD40 리간드를 더 많이 발현시키도록 하고, 포들의 인지질과 비슷하게 되며, 선천 및 후천 interferon- 나 IL-12 등의 염증 유발성 및 염증 억 면역 반응들을 유발할 수 있는 면역성을 갖는다. 제성 시토카인들을 더 많이 분비하도록 한다 . 15 산화 저비중 지단백 (OxLDL)은 대식세포들을 활 죽상경화증 병변에서 동맥벽 내에 내재하는 성화시켜 염증 유발성 시토카인들을 분비하도록 세포들 및 대식세포에 의해 SDF-1의 생성과 저 한다. 산화된 에피토프들은 청소 수용체들 및 비중 지단백의 산화가 유발되며, 이는 모여든 Toll-like 수용체들에게 인식되며, 항원제공 세포 CD4양성 T세포들이 SDF-1과 OxLDL에 동시에 들 (대식세포들 및 수지상 세포들) 내로 함입된 노출될 수 있다는 가능성을 증가시킨다. 저자들 다. CD4양성 T세포들은 산화 저비중 지단백 파 은 SDF-1과 OxLDL로 CD4양성 T세포들을 동시 편 / MHC class II complex을 인식하여 ‘effector' 에 자극하였을 시 이들 세포들의 특징이 변화될 1,3 CD4양성 T세포들로 활성화된다 . 최근의 연구 것이라는 가정을 하였고, 이를 알아내기 위해 연 결과들에서 산화 저비중 지단백의 일부 성분이 구를 실시하였다. - 351 - 韓國 脂質·動脈硬化學會誌 13卷 4號 reactive substances (TBARS) per mg protein 미만 재료 및 방법 18 이었다 . 산화 저비중 지단백의 농도는 55 nmol of TBARS per mg protein를 포함하였다. 저비 1. CD4양성 T세포들의 분리와 세포배양 중 지단백의 다른 산화 성분인 1-palmitoyl-2- 건강한 사람의 신선한 혈액을 채혈하여 전혈 3 (5-oxovaleroyl)-sn-glycero-3-phosphorylcholine mL와 3 mM의 EDTA를 섞은 후, Picoll Hypaque (POVPC)와 KLH-conjugated phosphorylcholine (1:1 = v/v, d = 1.077 g/mL, Sigma Chemical Co.) 용 (KLH-PC)는 장미경 선생 (Univ. of California San 액 위에 조심스럽게 넣어 층을 만들고, 22℃에서 Diego, USA)으로부터 제공받았다. 저지방 지단백 600 g로 15분간 원심 분리하여 단핵구 세포층을 준비물 내의 내독소 농도는 내독소 세트 제공회 얻었다. 이렇게 얻어진 세포들을 0.1% BSA와 사 (Sigma Chemical Co.)에서 기술한 것과 같은 0.2% EDTA를 포함한 PBS를 이용하여 두 차례 방법인 timed-gel-formation 방법을 이용하여 측정하 세척하였다 (400 g, 4℃, 15 min). 아직 자극되어지지 였는데, 그 함량이 0.1 ng/mL 이하로 측정되었다. 않은 CD4 양성 T세포들을 mini-MACS microbead 3. CXCR4의 전사량 분석 세포유리 기구 (Miltenyi Biotec Co., Auburn, CA, 인간의 CD4양성 T 세포들을 guanidium thiocyanate- USA)를 이용하여 즉각 분리하였는데, 분리된 CD4양성 T세포들의 순도는 인간의 CD4에 대한 phenol-chloroform으로 처리하여 전체 RNA를 추 phycoerythrin-표지 단클론 항체를 이용하여 유속 출 하였으며 , cDNA는 Superscript II (Roche 혈구계산기로 검사하였을 시 90% 이상으로 측정 Diagnostics GmbH Co., Germany)를 이용한 역전 되었으며, 오염된 단핵구 분획은 전체 세포들 중 사법으로 생산하였다. CXCR4에 대한 cDNA는 1% 미만으로 측정되었다. sense primer 5'-CTTCCTGCCCACCATCTACTC-3' 19 분리된 CD4양성 T세포들을 10% 인체 지단백 와 antisense primer 5'-TTGCTTGATGATTT- 제거 혈청 (LPDS)과 항생제 (penicillin 100 units/mL CCAGGAG-3'을 이용한 반정량적 PCR 증폭법 and streptomycin 100 g/mL, Irvine Scientific)가 포 을 통해 측정하였다. 내부 표준으로는 인간의 GAPDH 함된 RPMI 1640 배지 (Irvine Scientific Co., Santa 를 sense primer 5'-TCGGAGTCAACGGATT- Ana, California, USA)에서 72시간까지 배양하였 TGGTCGTA-3'와 antisense primer 5'-ATGGACTG- 5 다. 세포의 농도는 5×10 cells/mL 이하로 유지 TGGTCAGAGTCCTTC-3'를 이용하여 증폭하여 되었으며, 유지 도중 죽은 세포의 비율은 5% 미 이용하였다. PCR반응은 한 회전 반응당 94℃에서 1분, 58 만이었다. ℃에서 1분, 72℃에서 2분씩으로 구성되었으며, 2. 지단백의 준비 총 30회전 반응을 시켰다. 증폭된 DNA는 아가로 저비중 지단백은 인간 혈장에서 이전부터 사 스 겔 전기영동 후에 ethidium bromide로 염색하 용되었던 방법으로 원심분리를 통하여 분리하였 여 분석하였고, 각각 밴드의 강도는 농도계로 측 16 고 , 4℃에서 1 mM의 EDTA용액에 저장하였다. 정하였다. GAPDH가 상대적으로 더 많이 발현된 산화 지비중 지단백 (OxLDL)은 EDTA-free LDL 것을 보정하기 위해 역전사된 cDNA의 농도가 (100 g protein/mL)을 10 M CuSO4를 포함한 Ham's CXCR4의 발현정도와 맞도록 희석하였다. 주형 17 F-10 배지에서 37℃로 24시간 처리하여 얻었다 . DNA의 농도는 주형과 산물 사이의 선형 관계를 형광 계측법으로 측정 시 산화되지 않은 저비중 갖도록 조정하였다. PCR 증폭의 특이성은 PCR 지단백의 농도는 0.3 nmol of thiobarbituric acid- 산물의 DNA 염기순서분석으로 확인되었다. - 352 - Lysophosphatidylcholine에 의한 CD4양성 T세포에서의 CXCR4의 발현 증가 4. 유세포 분석기를 이용한 CXCR4 단백의 분석 하였으며, 미세소공성의 폴리카보네이트 막 (5 m pore size, Poretics)을 화학주화성 단위의 하부 소 방과 상부 소방 사이에 위치시킨다. 이렇게 만들 CD4양성 T세포들을 채취하여 분리한 다음, 냉 어진 화학주화성 유니트들을 37℃의 5% CO2를 각된 0.1% BSA와 0.01% sodium azide (w/v)를 포 포함한 배양기 내에서 30분간 예열한 후, 화학주 함한 PBS 용액 (완충제 A) 3 mL를 이용하여 두 화성 완충제 속에 2×10 cells/mL의 농도로 들어 차례 세척하였다. 이후 배양용 튜브에 완충제 A 있는 T세포들을 10 개의 농도로 화학주화성 유 5 6 5 100 L씩을 넣은 다음 총 10 개의 세포들을 넣었 니트의 상부 소방에 각각 주입하였다. 이들을 3 다. 인간 CD4양성 T세포들의 표면에 발현된 7℃의 5% CO2를 포함한 배양기내에서 150분 동 CXCR4의 양을 측정하기 위하여 CXCR4에 대한 안 배양한 다음, 미세소공을 통과한 세포들과 폴 phycoerythrin (PE)로 표지된 생쥐의 단클론 항체 리카보네이트 막에 부착되어 있는 세포들을 PBS (Pharmingen Co., San Diego, CA, USA) 0.5 g씩을 용액에 2% glutaraldehyde를 사용하여 고정한 후 각각의 배양용 튜브에 첨가한 후, 4℃에서 30분 0.01% crystal violet을 이용하여 염색하였다. 폴리 간 배양하였다. 다시 3 mL의 완충제 A를 이용하 카보네이트 막에 고정된 세포들의 수는 무작위 여 세포들을 세척한 다음 형광 반응의 정도는 로 추출된 4개의 400배의 고배율 시야들에서 측 CELL QUEST software (Becton Dickinson Co., San 정되었다. 결과는 SDF-1에 반응하여 이동한 세 Jose, California, USA)를 이용한 FACScan으로 측 포수를 완충제에만 반응하여 이동한 세포수로 정 및 분석하였다. 대조 실험에서의 비특이적 결 나누어 계산한 화학주화성 지수로 나타냈다. 합을 측정하기 위해 PE-conjugated 비특이적인 생 6. 시토카인 농도의 측정 쥐 IgG 항체를 사용하였다. 세포표면의 CXCR4 의 상대적 발현은 항 CXCR4항체로 표지된 세포 인간 CD4양성 T세포들을 혈액으로부터 분리 들의 median fluorescence intensity (MFI)에서 대조 하여 항CD3 항체 (Pharmingen Co., San Diego, 군의 MFI를 공제하여 나타냈다. CA, USA)로 코팅되어진 24-well plate에 하나의 4 인간 CD4양성 T세포들은 5% 송아지 혈청을 웰당 10 세포의 농도로 고정되었고, lysoPC (10 포함한 RPMI1640 배지에 1.0 M의 sense 및 g/mL)를 첨가한 것과 첨가하지 않은 것으로 나 antisense oligonucleotides를 하룻밤 동안 처리하였 누어서 하루 밤 동안 배양하였다. 이렇게 고정되 고, 다음에 20 g/mL의 lysoPC를 첨가한 후 24시 어 전처치화된 세포들에 1~10 nM의 SDF-1를 첨 간동안 배양되었다. 세포 표면의 CXCR4 발현 정 가하여 6시간 동안 자극하였고, 여기에서의 배양 도는 유세포 분석기로 측정하였다. 배지를 추출하여 배지 내의 시토카인 농도를 분 석할 때가지 70도에서 보관하였다. 배지 내 시토 5. 화학주화성의 측정 카인의 농도는 ELISA kit (R&D systems Co., Minnea- CD4양성 T세포들의 SDF-1에 반응한 화학주화 polis, MN)를 사용하여 측정하였는데, 이 키트는 성 운동은 48-well microchemotaxis Boyden chamber IL-2, IL-4, TNF- 및 SDF-1과는 교차반응을 하지 20,21 (Neuroprobe Co.)를 사용하여 분석하였다 . 이 를 간단히 기술하면 화학주화성 유니트의 하부 않았고, 또한 배지 내에서 측정한 내독소의 농도 는 0.1 ng/mL이하로 측정되었다. 소방에 화학주화성 완충제 (Tyrodes' salt buffer (Sigma Chemical Co.) with 1% NaHCO3 and 0.1% BSA, pH 7.4)를 넣은 후 10 nM의 SDF-1을 추가 - 353 - 韓國 脂質·動脈硬化學會誌 13卷 4號 Fig. 1. The incubation of CD4 T cells with oxidized LDL up-regulated CXCR4 expression. Human + CD4 cells were incubated with oxidized LDL (OxLDL) for up to 48 hours and the level of CXCR4 proteins was estimated by flow cytometry (A) and total RNA level from CD4 T cells incubated with OxLDL for 24 hours was evaluated by RT-PCR (B). A. Surface expression of CXCR4 proteins significantly enhanced up to sixfold in dose and time dependent manner. B. The presence of OxLDL in the culture medium increased CXCR4 transcripts more than threefold in dose dependent manner. 결 를 24시간 배양하였을 시, CXCR4 전사량이 3배 과 이상 증가하였다 (Fig. 1). CD4양성 T세포들을 제 거한 말초 단핵구 세포들에서도 표면에 CXCR4 1. 인간 CD4양성 T세포들에서 LysoPC 가 발현되나 이들에서는 산화 저비중 지단백을 에 의한 CXCR4의 발현증가 첨가하여 48시간 동안 배양하였을 때 CXCR4의 인간 CD4양성 T세포를 분리하여 10% human 발현이 증가되지 않았다. 산화 저비중 지단백의 주된 구성물인 LysoPC lipoprotein deficient serum (LPDS)이 들어있는 RPMI 1640 배지에 산화 저비중 지단백 (up to 20 g protein/ mL)를 첨가한 후 24∼48시간 배양하여 세포 표 면의 CXCR4 발현정도를 유속 혈구계산기로 특 정하였을 때, CXCR4 발현은 산화 저비중 지단백 의 농도 및 처리 시간에 비례하여 6배까지 증가 하였다. RT-PCR을 이용하여 CD4양성 T세포들이 항정상태에서 존재할 시의 CXCR4의 전사량을 측정하였고 house-keeping 유전자인 GAPDH의 전 사량과 비교하였을 경우, 산화 저비중 지단백으 로 처리하였을 때에 CXCR4의 전사량이 첨가한 산화 저비중 지단백의 농도에 비례하여 증가하 였다. 배양 배지 내에 산화 저비중 지단백을 20 g protein/mL의 농도로 첨가하여 CD4양성 T 세포 (up to 10 g protein/mL) 역시 산화 저비중 지단 백과 같이 CD4양성 T세포들의 CXCR4 단백 및 전 사량을 농도에 비례하여 증가시켰다 (Fig. 2). 하지만 저비중 지단백의 다른 산화 산물인 1-palmitoyl2-(5-oxovaleroyl)-sn-glycero-3-phosphorylcholine (POVPC) 및 KLH conjugated phosphoryl choline (PC-KLH)을 첨가하여 배양하였을 시는 CXCR4 발현이 증가되지 않았고, 바로 추출한 산화되지 않은 저비중 지단백으로 자극하였을 경우에도 CD4양성 T세포 표면에서의 CXCR4의 발현이 증 가되지 않았다. 즉 lysoPC 등의 산화 저비중 지 단백의 특수한 구성물에 의해서만 CXCR4의 발 현이 증가되었다 (Fig. 3). 산화 저비중 지단백의 - 354 - Lysophosphatidylcholine에 의한 CD4양성 T세포에서의 CXCR4의 발현 증가 Fig. 2. The incubation of CD4 T cells with lysophosphatidylcholine upregulated CXCR4 expression. + Human CD4 cells were incubated with lysophosphatidylcholine (lysoPC) for 24 hours and the expression level of CXCR4 was estimated by flow cytometry (A) and RT-PCR (B). LysoPC profoundly upregulated CXCR4 proteins and transcripts in CD4 T cells in a dose dependent manner. Fig. 3. The CXCR4 expression was not induced by PC-KLH, LDL, POPVC-LDL, 15-deoxy PGJ2, or BRL 49653. CD4 T cells were isolated from the whole blood and incubated with phorbol myristate acetate (PMA), KLH-conjugated phosphorylcholine (KLH-PC), non-oxidized LDL, 1-palmitoyl-2-(5-oxovaleroyl)sn-glycero-3-phosphorylcholine (POVPC), 15-deoxy prostaglaindin J2 (15-deoxyPGJ2), or BRL49653 for 24 hours. PMA nearly completely abolished CXCR4 proteins on the cell surface, but KLH-PC, LDL, POVPC-LDL, 15-deoxy PGJ2, and BRL49653 did not change CXCR4 expression in CD4 T cells. - 355 - 韓國 脂質·動脈硬化學會誌 13卷 4號 Fig. 4. The positive regulatory effect of OxLDL on CXCR4 expression was through NF B pathway. CD4 T cells were incubated with lysoPC for 24 hours in the presence or absence of genistein (tyrosine kinase inhibitor), calphostin (PKC inhibitor), and caffeic acid phenethyl ester (CAPE, NFkB inhibitor). The pretreatment of human CD4 T cells with a NF B inhibitor completely abolished the positive regulatory effect of lysoPC on CXCR4 expression, however with tyrosine kinase inhibitor or PKC inhibitor did not change the expression level. The inhibition of tyrosine kinase by genistein generally enhanced the surface expression level of CXCR4 in a dose dependent manner. 여러 독특한 부분들은 단핵구에서 PPAR 를 포 22 lysoPC와 함께 배양하였을 경우 NF B의 전위를 함하는 경로를 활성화시키는 것으로 알려졌다 . 증가시키는 것을 보여주었다. NF B 저해제인 PPAR 의 비특이적 리간드인 15-deoxyPGJ2를 고 caffeic acid phenethyl ester (CAPE; 10 g/mL)를 첨 농도로 첨가하여 CD4양성 T세포를 배양할 경우 가하여 CD4양성 T세포들을 배양하였을 때, CXCR4 24시간 내에 표면의 CXCR4의 발현을 감소시키 의 발현에 대한 lysoPC의 양성 조절효과가 완전히 는 경항을 보였다. 하지만 CD4 양성 T세포들에 없어졌다 (Fig. 4). 배양시킨 세포들을 propidium 서의 PPAR 의 전사물은 고전적인 RT-PCR법으 iodide로 염색한 후 유속 혈구계산기로 검사한 로는 검출되지 않으며, PPAR 의 특이적 리간드 결과 배양 배지 내의 CAPE는 24시간 이내에 세 인 BRL49653를 첨가하여 48시간동안 배양하였 포의 활성에는 영향을 미치지 않았다. 을 때는 CXCR4의 발현정도가 변화되지 않았다. Calphostin (100 nM)로 protein kinase C (PKC)를 CD4양성 T세포들을 phorbol myrisate acetate 저해하였을 경우 CXCR4 발현 정도에 영향을 미 (PMA)로 자극하였을 때 전사량은 변화하지 않았 치지 않았다. Genistein (10 M)로 배양세포를 처 고 세포 표면의 CXCR4 단백의 발현을 거의 완 리하여 타이로신 활성효소의 활성을 억제하였을 전하게 감소시킴을 보여주었다 (Fig. 3). 경우 용량에 비례하여 전사량에는 영향을 미치 지 않으면서 표면의 CXCR4의 발현정도를 증가 2. NF B경로를 이용한 CXCR4발현에 시켰다 (Fig. 4). 대한 lysoPC의 양성 조절효과 Gel-shift assay결과 인간 CD4양성 T세포들을 - 356 - Lysophosphatidylcholine에 의한 CD4양성 T세포에서의 CXCR4의 발현 증가 Fig. 5. The lysoPC - treated CD4 cells showed greater chemotactic activity in response to SDF-1. The treatment of CD4 T cells with lysoPC as low as 5g/ml for 24 hours significantly increased SDF-1 mediated chemotaxis up to threefold when estimated with 48 well Boyden microchemotaxis chamber. 3. LysoPC에 의한 CD4양성 T세포의 SDF-1에 대한 화학주화성 증진효과 경우 세포 표면에 발현되는 CXCR4 단백의 양이 약 30% 정도 감소되었다. 이렇게 자극되어진 CD4양성 T세포들을 lysoPC (10 g/mL/16 hours)로 인간 CD4양성 T세포들을 lysoPC (5∼20 g/mL) 자극하여 검사한 결과 세포 표면의 CXCR4 발현 로 24시간동안 배양한 후 microchemotaxis Boyden 정도가 자극되지 않거나 처리되지 않은 CD4양 chamber로 화학 주화성을 평가하였고, SDF-1 (10 성 T세포들에 비해 2배 이상 증가되었다. nM)에 대한 화학주화성이 증가되는 것을 알 수 있 LysoPC에 의한 CXCR4의 발현증가가 고정된 었다. 5 g/mL의 아주 적은 농도의 lysoPC를 사용 CD4양성 T세포들의 세포 활동에 직접적인 영향 하여 CD4양성 T세포들을 24시간을 배양하였을 경 을 미치는 지를 알아보기 위하여 평판에 쥐의 항 우 SDF-1에 의한 화학주화성이 3배 정도로 확연하 CD3 IgG (UCHT1 clone, PharMingen Co., La Jolla, 게 증가되는 것을 알 수 있었다 (Fig. 5). SDF-1에 USA)를 코팅하여 CD4양성 T세포들을 고정한 다 의해 유발되는 CD4양성 T세포들의 화학주화성 운 음 lysoPC를 첨가하여 하룻밤 동안 (16시간) 전처 동에 대한 lysoPC의 ED50는 2.0 g/mL였다. 치를 하였고, 이후 6시간 동안 주어진 농도의 SDF-1로 자극하였다. 배양 배지의 상층액을 얻 4. 항CD3항체로 고정된 CD4양성 T세포 어 ELISA방법을 통해 IL-2, IL-4, TNF- 의 농도 에서 lysoPC의 전처치 및 SDF-1 자 를 측정하였다. 항 CD3항체로 고정된 CD4 양성 극으로 인한 시토카인의 분비증가 T세포들에서 lysoPC로 전처치 하였을 경우 SDF-1 평판에 항CD3 항체를 코팅한 다음 CD4양성 T 세포들을 고정하였고, 비특이적으로 자극하였을 에 의한 IL-2, TNF- 의 분비는 증가되었으나, 항 염증 시토카인인 IL-4의 분비 증가는 미미하였다 - 357 - 韓國 脂質·動脈硬化學會誌 13卷 4號 Fig. 6. The costimulation of lysoPC - treated CD4 cells with SDF-1 and immobilization with antiCD3 induced the secretion of proinflammatory cytokines. The SDF-1 induced secretion of IL-2 and TNF-alpha in antiCD3 immobilized CD4 T cells was markedly enhanced by the pretreatment with lysoPC, while the secretion of anti-inflammatory cytokine IL-4 was minimal. CD4양성 T세포들을 lysoPC로 자극하였을 경우, (Fig. 6). 고정되었거나 고정되어지지 않은 CD4양성 T 이들 세포의 특성이 변화되는 것을 보여주며, T 세포들을 lysoPC로만 전처치하거나, SDF-1으로 림프구들의 중요한 시토카인 수용체 중의 하나 만 자극하는 것은 시토카인의 분비를 증가시키 인 CXCR4의 발현이 증가되는 것을 보여주었다. 지 않았다. CXCR4 발현에 대한 lysoPC의 양성 조절효과는 매우 특이한 것으로, 이는 저비중 지단백 및 산 고 화 저비중 지단백 중의 다른 산화물들은 CXCR4 찰 발현을 증가시키지 못하기 때문이다. LysoPC와 는 달리 CD4양성 T세포들을 PMA로 비특이적으 저비중 지단백은 동맥벽 내에서 세포 외 세포 로 자극하면 CXCR4 단백이 재빠르게 내재화되 간질 단백에 의해 유지되었을 경우 산화 변형되 어 감소되었고 , 가장 강력한 내독소 중 하나인 23 28 게 된다 . 죽상경화증 병변 및 염증 병변에는 많 lipopolysaccharide (LPS)로 자극할 경우 CXCR4단 은 CD4양성 T세포들 및 대식세포들을 포함하며, 백의 양은 변화되지 않았다 . 29 23 산화 저비중 지단백과 같이 존재하게 된다 . 산 최근 G-protein-coupled receptors (GPCR)의 부분 화 저비중 지단백과 그의 구성 성분들, 특히 들이 배양된 T세포에서 lysophospholipids에 부착 lysoPC는 많은 염증 유발성 및 죽상경화증 유발 되는 것이 관찰되었다. G2A는 림프구에서 주로 성 특성들을 갖는다. LysoPC는 단핵구들과 T세 발현되어지는 transcriptionally regulated GPCR로 24,25 , 혈 lysoPC는 G2A에 고친화성으로 부착되었고, 이를 관 내피세포들에서 부착물질들의 표현을 증가시 활성화시켰다 . T세포들에서의 G2A의 존재는 포들에 대한 화학주화성 인자로 작용하며 26 킴으로써 단핵구의 부착을 증가시킨다 . LysoPC 27 는 NF B 11 및 AP-1 을 활성화시킴으로써 여러 염증 유발성 유전자들의 발현을 증가시키며, 세 23 9,30 세포 내의 lysoPC의 축적을 야기시킬 수 있고, 여러 가지 염증 반응 및 세포 증식을 조절할 수 있을 것이다. 다른 보고에 G2A수용체를 없앤 생 쥐에서 분리한 T세포들은 실험실 내에서 항원 포 자멸사와 세포 괴사를 유발시킨다 . 이번 연구의 결과는 혈액에서 추출한 인간 31 자극에 대해 과증식 반응을 보였다 . 한편 G2A- - 358 - Lysophosphatidylcholine에 의한 CD4양성 T세포에서의 CXCR4의 발현 증가 transfected 세포들을 lysoPC로 자극하였을 시 9 에, CD4양성 T세포들의 SDF-1 매개성 면역반응 ERK와 MAP kinase가 활성화되었다 . LysoPC에 이 증가됨을 알 수 있었다. 이전의 연구에서 항 의한 G2A의 활성화는 RhoA 매개성 actin poly- CD3 항체에 의해 활성화된 CD4양성 T세포들을 32,33 을 유발하며, lysoPC로 자극할 경우 SDF-1으로 자극하였을 경우 CD40 리간드의 발 G2A (+) jurkat T세포들의 화학주화성 이동을 야 현 증가를 보여주었고, 염증 유발성 시토카인 및 merization 9 기시킨다 . 이번 연구 결과는 CD4양성 T세포들 염증 억제성 시토카인들의 분비가 증가됨을 보 의 G2A 활성화는 염증 유발성 반응들을 유발할 고하였다 . 저자들의 연구 결과에서도 CD4양성 가능성을 보여주나 추가 연구가 필요하다. T세포들을 lysoPC로 자극하였을 경우 이들 세포 15 CXCR4는 혈중 림프구들에서 광범위하게 발현 들로부터 분비되는 염증 유발성 및 염증 억제성 되어지는 단백질로 이는 염증 반응의 조절에 광 신호들 사이에 평형 상태를 유지하는 것을 확연 범위하게 작용하는 것으로 알려져 있으며, HIV 하게 나타냈다. 항CD3항체로 고정된 CD4양성 T 감염, 부신 피질 호르몬, IL-4가 CD4양성 T세포 세포들을 lysoPC로 전처치한 다음 SDF-1으로 자 들에서 CXCR4의 발현을 증가시키는 것으로 알 극하였을 경우, 염증 유발성 시토카인인 IL-2 및 34 려졌다 . 또한 CXCR4는 단핵구에서도 발현되 TNF- 등의 분비가 선택적으로 증가되었으나 항 며, 산화 저비중 지단백은 단핵구에서 대식세포로 염증성 시토카인의 분비는 미미하였다. 죽상경화 35 분화되는 과정에서 CXCR4의 발현을 증가시킨다 . 이번 연구 결과는 lysoPC에 의한 CXCR4의 발 증 병변에서 발견되어지는 대부분의 T세포들은 CD3+ CD4+ T세포 수용체 (TCR) 양성 세포들 현 증가가 CD4양성 T세포들의 특성을 직접적으 이고, 주로 IFN- , IL-2, TNF- 및 를 분비하는 로 변화시키는 것을 보여 주었다. 첫째로 lysoPC Th1 (helper) 아형 세포들이다 는 SDF-1에 대한 CD4양성 T세포들의 화학주화 변에서 Th1-과 비슷한 T세포들이 대식세포들이 성을 좀더 효과적으로 유발하였다. 저비중 지단 나 내재하는 혈관세포들에 의해 자극되어진 후 백은 혈청이 존재할 경우 산화 스트레스에 고도 분비하는 많은 염증 유발성 신호들은 염증 상태를 23 12,37 . 동맥 경화성 병 1,3 로 저항성을 보이며 , 혈중에서 LysoPC는 거의 악화시키는 데 일익을 담당한다 . 그러므로 lysoPC 검출되지 않을 만큼의 적은 양이나, 죽상종 내에 와 SDF-1으로 공동 자극할 경우 Th1 세포의 특 36 서는 lysoPC이 비교적 높은 농도로 존재한다 . 성을 가진 T세포들과 비슷한 nave T 세포들의 실험실 환경 하에서 SDF-1/CXCR4 경로를 통해 특성을 변화시킬 것이며 이는 결과적으로 죽상 CD4양성 T세포들의 직접적인 화학주화성 운동 경화 반응을 악화시킬 것이다. 이 유발되나, 생체 내에서는 이렇게 lysoPC에 의 한 증가된 운동이 CD4양성 T세포들을 혈중에서 참 고 문 헌 죽상경화증성 동맥벽으로 모여들게 하지는 못한 다. 반면에 죽상종에서 SDF-1의 발현은 대식세 14 포가 많은 부분에서 강력하게 나타나기 때문에 , 1. Hansson GK. Regulations of immune me- 모여든 CD4양성 T세포들이 lysoPC에 노출되게 chanisms in atherosclerosis. Ann NY Acad Sci 되면 CD4양성 T세포들이 효과적으로 염증성 병 2001;947:157-65 변으로 이동하도록 도와줄 수 있고, 항원 제공 2. Abbas AK, Murphy KM, Sher A. Functional 세포들과 함께 위치하도록 할 수 있을 것이다. diversity of helper T lymphocytes. Nature 1996; 이번 연구에서는 lysoPC에 의해 SDF-1에 매개 되어지는 화학주화성 운동이 증가되는 것 이외 383:787-93 3. Hansson GK, Jonasson L, Seifert PS, Stemme - 359 - 韓國 脂質·動脈硬化學會誌 13卷 4號 S. Immune mechanisms in atherosclerosis. 12. Stemme S, Holm J, Hansson GK. T lymphocy- Arteriosclerosis 1989;9:567-78 tes in human atherosclerotic plaques are memory 4. Gupta S, Pablo AM, Jiang X, Wang N, Tall cells expressing CD45RO and the integrin AR, Schindler C. IFN-g potentiates atherosc- VLA-1. Arterioscler Thromb 1992;12:206-11 lerosis in apoE knock-out mice. J Clin Invest 13. Bleul CC, Fuhlbrigge RC, Casasnovas JM, Aiuti 1997;99:2752-61 A, Springer TA. A highly efficacious lympho- 5. 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