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Activité 22 – Mise en évidence de la spécificité d'un anticorps
On cherche à vérifier si les anticorps contre un antigène donné, produits par l'organisme après un
premier contact avec cet antigène, sont spécifiques de cet antigène (c'est-à-dire ne se fixent que sur cet
antigène). L'antigène étudié est la β-lactoglobuline bovine (BLG, protéine du lait de vache).
On a injecté à un lapin de la β-lactoglobuline bovine. Dix jours plus tard, on a prélevé le sérum de ce lapin
(sérum = sang débarrassé des globules et plaquettes..., voir chap. 10 : "Complément : principaux constituants
du sang"). Ce sérum de lapin immunisé contient maintenant des anticorps anti-BLG, capables de se fixer sur
la β-lactoglobuline bovine.
Le but de la manipulation est de visualiser le résultat de la réaction entre les anticorps anti-BLG et la
β-lactoglobuline bovine, et de voir si ce même anticorps réagit avec les lactoglobulines présentes dans le lait
d'autres animaux que la vache (jument et chèvre), ou avec une autre protéine présente dans le lait de vache :
la caséine.
On dispose des solutions suivantes :
– n°1 : sérum de lapin immunisé ;
– n°2 : témoin négatif (eau distillée) ;
– n°3 : témoin positif (BLG) ;
– n°4 : lait de vache dilué ;
– n°5 : lait de jument dilué ;
– n°6 : lait de chèvre dilué;
– n°7 : caséine de lait de vache.
Principe de la méthode d’Ouchterlony
C’est une méthode d’immunodiffusion sur gel : les solutions déposées dans les puits creusés dans un gel
d'agarose diffusent de façon homogène dans toutes les directions autour du puits. Deux auréoles de diffusion
peuvent donc entrer en contact lorsqu’elles ont suffisamment progressé. Cette zone de contact reste invisible
s’il n’y a pas de réaction entre les deux solutions. Quand il y a réaction entre les solutions, il se forme un arc
de précipitation visible à l’œil nu. Celui-ci est dû à l’interaction entre de nombreuses molécules d'anticorps et
de nombreuses molécules de l'antigène contre lequel ces anticorps sont dirigés, entraînant la formation de
complexes immuns. Le temps de réaction est de l’ordre de 24h (c’est la raison pour laquelle vous allez
manipuler avec des produits de substitution qui permettront d'observer un résultat dès la fin de la séance).
Déroulement des activités
Barème
1- Choisir la disposition des produits dans la boîte de Pétri et l’indiquer au crayon sur le gabarit de
/2
perçage ci-dessous. Justifier ce choix par écrit.
Appeler le professeur pour vérification
2- Réaliser les parties I puis II du protocole ci-dessous.
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Réaliser la partie II sous contrôle du professeur
3- Observer sur fond noir et en éclairage rasant le résultat obtenu. Représenter ce résultat sur le
/3
gabarit ci-dessous.
4- Déduire des résultats si les anticorps ont une spécificité stricte vis-à-vis de la BLG ou non.
/4
Réaliser deux schémas qui expliquent au niveau moléculaire la présence ou l’absence d’un arc de
précipitation.
5- Ranger le poste de travail.
/1
PROTOCOLE :
Vous disposez d'une boîte de Pétri dans laquelle un gel d'agarose a été coulé.
I- Préparation de la boîte
a. Utiliser le gabarit de perçage ci-contre pour creuser à l’aide du tube emporte-pièce
les puits nécessaires dans le gel d’agar ;
b. Éliminer les disques de gel avec le cure-dents si nécessaire.
II- Réalisation des dépôts
a. Marquer sous le fond de la boîte de Pétri la disposition des produits à déposer dans
les puits (disposition que vous avez proposée à la question 1) ;
b. Remplir les différents puits sans déborder : chaque produit devra être prélevé avec
un compte-gouttes ou un cône propre, puis être déposé dans le puits sans débordement
ni bulles et sans endommager le gel d’agar ;
c. Fermer la boîte.
Le résultat des activités 23 et 24 sera à présenter dans un document texte avec captures d'écran.
Activité 23 – Synthèse des prostaglandines et médicaments anti-inflammatoires
On cherche à savoir comment l'aspirine agit pour diminuer l'inflammation.
Télécharger le dossier "Activite_23.zip" vers votre dossier "Mes documents" puis faire un clic droit dessus
et choisir "Extraire tout...".
- Ouvrir dans RasTop le fichier 1DIY_cyclooxygenase_et_substrat.pdb . Celui-ci présente la structure de
l'enzyme cyclo-oxygénase avec son substrat (l'acide arachidonique) fixé. (L'enzyme, comme la molécule
d'hémoglobine, contient un hème, qu'on peut éventuellement sélectionner en tapant "COH" pour le
colorer d'une couleur différente.) Sélectionner l'acide arachidonique "acd" et le colorer d'une couleur
différente. Positionner la molécule de façon à rendre bien visible l'acide arachidonique dans le site actif
de l'enzyme.
- Ouvrir dans RasTop les fichiers aspirine et 1PTH_cyclooxygenase_et_aspirine.pdb . Ce dernier
présente deux molécules de cyclo-oxygénase associées, avec une molécule d'aspirine fixée sur chacune
d'elle. Sélectionner l'aspirine "sal" (pour acide acétyl-salicylique) et la colorer d'une couleur différente.
Positionner la molécule de façon à rendre bien visible une molécule d'aspirine.
Où se fixe la molécule d'aspirine ? En déduire la réponse à la question de départ.
Activité 24 – Organisation d'une immunoglobuline
Les immunoglobulines sont constituées de chaînes protéiques. On cherche à établir le lien entre leur
organisation et leur fonction, qui est de reconnaître spécifiquement un motif (motif antigénique, appelé
aussi épitope) à la surface d'un antigène.
Télécharger le dossier "Activite_24.zip".
1. Comparaison des séquences ; localisation des régions constante et variable
Le fichier IGG.edi contient les séquences des quatre chaînes d'une même immunoglobuline. Avec
Anagène ou Geniegen, ouvrir le fichier et comparer la longueur des quatre chaînes de l'anticorps.
Justifier le nom de "chaînes lourdes" pour les chaînes H et I et de "chaînes légères" pour L et M.
Comparer deux à deux la séquence des deux chaînes légères puis des deux chaînes lourdes. (Si
les deux chaînes ne comportent pas le même nombre d'acides aminés, penser à choisir le traitement
adéquat dans Anagène : "Alignement avec discontinuité".)
Le fichier 2IGG-1ind.edi contient les séquences des chaînes lourdes et légères de deux anticorps
différents, produits tous les deux par un même individu. Comparer deux à deux les chaînes lourdes et
légères. Localiser la partie variable et la partie constante (=identique dans les deux anticorps).
(Donner les numéros des acides aminés où débute et où finit chaque partie. On considèrera comme
"constante" une région présentant un acide aminé différent de temps en temps, tous les 15 ou 20 acides
aminés par exemple.)
2. Visualisation de l'organisation d'une immunoglobuline
Le fichier IGG-TOTAL.PDB contient la description en 3D de la structure d'une immunoglobuline. Ouvrir le
fichier avec RasTop. Afficher la molécule en squelette carboné. Colorier de deux couleurs proches mais
distinctes les deux chaînes lourdes H et I (bleu foncé et bleu clair pour les garçons, rose foncé et rose
pâle pour les filles) ; faire de même, avec des couleurs différentes, pour les deux chaînes légères L et M.
Sélectionner la partie variable de chaque chaîne et l'afficher en sphères. (Voir fiche technique du logiciel.)
Décrire l'organisation d'une immunoglobuline.
3. Liaison à l'antigène
Le fichier 1ACY.pdb contient la description en 3D non pas de tout un anticorps, mais seulement d'un de
ses bras, lié à l'antigène contre lequel cet anticorps est dirigé, ici la glycoprotéine gp120 du V.I.H.. Ouvrir
le fichier avec Rastop, colorier les chaînes lourde et légère de l'immunoglobuline comme précédemment.
Où est situé le site de reconnaissance de l'antigène ?
Résumer le lien entre structure et fonction d'une immunoglobuline.
Activité 25 – Recherche de la β-lactoglobuline, molécule responsable d'allergies
Des problèmes digestifs et une dermatite atopique (peau sèche, fortes démangeaisons, rougeur)
apparaissent chez Ivan, un jeune enfant, à chaque fois qu'il consomme du lait de vache. Cela a
amené ses parents à consulter un allergologue, qui, après des tests cutanés, a diagnostiqué une
allergie à une protéine du lait, la β-lactoglobuline bovine (BLG). On cherche à savoir si Ivan peut
consommer du lait de soja en substitution du lait de vache.
La détection de la β-lactoglobuline bovine dans les produits alimentaires peut être réalisée par un
test immunologique de type ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay).
Principe et protocole du test ELISA
Les molécules antigéniques peuvent posséder plusieurs déterminants antigéniques (épitopes)
susceptibles d’être reconnus par des anticorps différents. C’est le cas de la β-lactoglobuline bovine
qui peut être reconnue par les anticorps n°1 et 2.
Pour réaliser le test, on utilise des "puits" au fond desquels est déjà fixé l'anticorps n°1.
• Identifier chaque puits par son numéro (ou par une lettre, voir ci-dessous).
• Déposer dans chaque puits 100µL de produit à tester (dont on veut savoir s'il contient de la BLG),
en utilisant une micropipette et en prenant un cône neuf à chaque fois :
-
puits 1 : Eau distillée ;
-
puits 2 : solution de BLG ;
-
puits 3 : lait de Vache dilué ;
- puits 4 : lait de Soja dilué.
Si un des produits testés contient de la BLG, que se passera-t-il à cette étape dans le puits
correspondant ? ………………………………………………………………………………………………
• Ajouter dans chaque puits 100µL de "conjugué enzymatique". Il s'agit d'un anticorps n°2
reconnaissant à la surface de la BLG un épitope différent de celui reconnu par l'anticorps n°1. (Cet
anticorps n°2 est couplé à une enzyme, l'acétylcholinestérase : sur chaque molécule d'anticorps n°2
est fixée une molécule d'enzyme.)
Si un des produits testés contient de la BLG, que se passera-t-il à cette étape ? ………………………
……………………………………………………………………………………………………………………
• Laisser reposer 20 minutes à température ambiante.
• Vider le contenu de la barrette de puits en la secouant vigoureusement au-dessus de l'évier. Rincer
à l'eau distillée, vider en secouant vigoureusement puis en tapant la barrette sur un papier absorbant.
Répéter le rinçage.
• Ajouter dans chaque puits 200µL de réactif d'Ellman. Il s'agit d'un substrat incolore que l'enzyme
acétylcholinestérase transforme en un produit coloré (jaune).
Si un des produits testés contient de la BLG, que se passera-t-il à cette étape ? ………………………
……………………………………………………………………………………………………………………
1.
2.
3.
4.
Activités et déroulement
Expliquer pourquoi on place de l'eau distillée dans le puits n°1 et
de la BLG dans le puits n°2.
Mettre en oeuvre le protocole indiqué dans la fiche protocole.
Préparer la question 3 pendant les temps d’attente.
Appeler le professeur pour vérifier les résultats.
Construire un grand tableau (page entière, paysage)
comprenant les résultats de la manipulation et les schémas des
associations moléculaires présentes dans les puits en fin de test.
Expliquer à partir des résultats obtenus si le lait de soja peut être
recommandé aux personnes allergiques à la BLG.
5. Ranger le poste de travail.
Capacités et critères
Barème
Comprendre la manipulation.
/1
Réaliser une manipulation :
- respect des étapes du protocole
- utilisation maîtrisée du matériel
- organisation de la paillasse
/6
Présenter des données sous forme d’un
tableau.
Traduire des informations par un schéma.
/5
Appliquer une démarche explicative.
/2
Gérer et organiser le poste de travail.
Travailler en sécurité
/1