GRKs

‫תקציר‬
‫חישת הטעם הינה מערכת מורכבת המאפשרת לבעלי חיים לזהות ולברור מקורות מזון איכותיים בהתאם‬
‫לצרכים הפיסיולוגיים ולמנוע הרעלה‪ .‬תאי הטעם )‪ (taste receptor cells‬האחראים על חישה זו‬
‫ממוקמים בעיקר בלשון ומרוכזים יחד ביחידות מורפולוגיות בשם פקיעיות הטעם )‪ (taste buds‬אשר‬
‫בעצמן מאורגנות בתוך שלושה סוגים של פפילות )‪ folate ,fungiform :(papillae‬ו‪circumvallate -‬‬
‫)‪ .(CV‬הקולטנים אשר אחראים על זיהוי וקשירת התרכובות המתוקות )‪ (T1Rs‬והמרות )‪(T2Rs‬‬
‫שבמזון התגלו לפני מספר שנים ומשתייכים למשפחה הרחבה של קולטנים התלויים בחלבון ‪G‬‬
‫)‪ .(GPCRs‬גירוי חוש הטעם הינו תהליך מהיר אשר מסתיים תוך שניות ספורות‪ .‬למרות זאת‪ ,‬טעמם של‬
‫טעמנים מרים וממתיקים לא סוכריים רבים נמשך לתקופות ארוכות יותר‪ ,‬עד מספר דקות‪ ,‬תופעה המכונה‬
‫שאריתיות‪ .‬התחושה הלא נעימה שנגרמת כתוצאה מכך מונעת צריכה גדולה יותר של מגוון רחב של‬
‫מזונות בעלי ערך תזונתי‪ ,‬כגון ירקות המכילים טעמנים מרים או מוצרים דיאטטים המכילים ממתיקים דלי‬
‫קלוריות‪ .‬למרות השלכותיה‪ ,‬המנגנון המולקולרי של תופעה זו אינו ידוע‪.‬‬
‫רבים מן התרכובות המרות והממתיקים המלאכותיים הם בעלי אופי אמפיפטי‪ ,‬כלומר מכילים קבוצות‬
‫הידרופיליות והידרופוביות במבנה הכימי שלהם‪ .‬מחקרים הראו כי תכונה זו מאפשרת למולקולות אלו‬
‫לחדור במהירות ממברנות ליפידיות של ליפוזומים ואף ממברנות פלסמטיות של תאים ביתר קלות‪ .‬בנוסף‪,‬‬
‫מחקרים אלקטרופיזיולוגיים וביוכימיים הראו פעילות מוגברת של תאי הטעם כתוצאה מחשיפתם‬
‫לטעמנים אמפיפטיים‪ .‬השערת העבודה הינה שבמקביל להפעלת קולטני הטעם‪ ,‬טעמנים אמפיפטיים‬
‫חודרים את הממברנה הפלסמטית של תאי הטעם‪ .‬בתוך ציטוזול התאים‪ ,‬אותם הטעמנים יכולים לבוא‬
‫במגע עם מרכיבים ציטוזוליים שונים‪ ,‬ובין היתר לשבש את תהליך הדסנסיטיזציה של הקולטנים ע"י‬
‫עיכוב קינאזות הקשורות לכיבוי הסיגנל‪ ,‬כגון הקינאזות ממשפחת ה‪.(GPCR kinases) GRKs -‬‬
‫במקרה כזה‪ ,‬על פי השערת העבודה‪ ,‬הטעמנים האמפיפטיים גורמים לקולטני הטעם להיות פעילים‬
‫ולסיגנל להימשך לזמן רב יותר‪ ,‬ולכן גורמים לתחושת השאריתיות‪.‬‬
‫מחקרים קודמים הראו שטעמנים אמפיפטיים חודרים לתוך תאי טעם מפפילות ‪ CV‬או פקיעיות טעם‬
‫מבודדות‪ .‬המטרה הראשונה במחקר הנוכחי היה להוכיח כי יכולת זו קיימת גם בתנאים פיזיולוגיים‪ ,‬בהם‬
‫תאי הטעם חשופים לטעמנים אך ורק מצידם האפיקלי‪ .‬חשיפתה של פפילת ‪ CV‬שלמה לתמיסות טעמנים‬
‫אמפיפטיים בעלי פלואורסצנציה עצמית תחת מיקרוסקופ קונפוקלי פלואורסצנטי אפשר לעקוב אחר‬
‫חדירתם של הטעמנים לתוך הפפילה‪ .‬הופעתה של פלואורסצנציה בדיוק בתעלת הפפילה‪ ,‬בה ממוקמות‬
‫מרבית פקיעיות הטעם‪ ,‬הראתה כי הטעמנים חודרים ומצטברים בתוך פקיעיות הטעם עצמן‪ .‬חוסר יכולתו‬
‫של מדעיך הפלואורסצנציה ‪ KI‬להפחית את עוצמת הפלואורסצנציה אשר התקבלה לאחר חשיפתה של‬
‫פפילת ה‪ CV -‬לטעמנים השונים הוכיח כי אלה אכן חדרו לתוך ציטוזול התאים‪ .‬בנוסף‪ ,‬הזרמת תמיסות‬
‫טעמנים שונים לתוך פיה של חולדה מורדמת הובילה למציאת ריכוזים גבוהים )מילימולרים( של אותם‬
‫הטעמנים בתוך ציטוזול תאי הטעם‪ ,‬כפי שנקבע בעזרת ‪ .HPLC‬יחד‪ ,‬תוצאות אלו תומכות לא רק‬
‫‪1‬‬
‫בהשערה כי הטעמנים אכן חודרים בתנאים פיזיולוגיים לתוך ציטוזול תאי הטעם‪ ,‬אלא מראות שבמקרים‬
‫מסוימים‪ ,‬כמו קפאין וכינין‪ ,‬טעמנים אלה עשויים להצטבר כנגד מפל הריכוזים‪.‬‬
‫בהמשך נבחנה נוכחותן של קינאזות ממשפחת ה‪ ,GRKs -‬האחראיות על תהליך הדסנסיטיזציה של‬
‫קולטנים ממשפחת ה‪ ,GPCR -‬בתאי פקיעית הטעם של פפילת ‪ .CV‬תוצאות מניסוי ‪ RT-PCR‬הראו כי‬
‫‪ GRK5 ,GRK3 ,GRK2‬ו‪ GRK6 -‬מתבטאים בפפילת ה‪ CV -‬עצמה אך גם באפיתל הלא‪-‬סנסורי‬
‫הסמוך לה בלשון‪ .‬צביעה פלואורסצנטית של חתכי פפילת ‪ CV‬בעזרת נוגדנים המכוונים כנגד כל אחד‬
‫מה‪ GRKs -‬הראתה שלעומת ‪ GRK5‬ו‪ GRK2 -‬אשר מתבטאים בפקיעיות הטעם עצמן‪ GRK6 ,‬נמצא‬
‫בעיקר בתאים הלא‪-‬סנסוריים שברקמת הפפילה‪ .‬רמת הביטוי של ‪ ,GRK3‬לעומת זאת‪ ,‬נמצאה כה נמוכה‬
‫שמיקומה לא נקבע‪.‬‬
‫מכיוון שתהליך הדסנסיטזציה של הקולטנים לטעם המתוק והמר )‪ (T2Rs ,T1Rs‬אינו ידוע‪ ,‬הקולטן ה‪-‬‬
‫‪ β2AR‬שימש בהמשך המחקר כמודל המייצג את כלל משפחת ה‪ .GPCRs -‬על מנת להוכיח את השערת‬
‫העבודה ולחקור את השפעותיהם של טעמנים אמפיפטיים על תהליך הדסנסיטיזציה של הקולטן ה‪-‬‬
‫‪ ,β2AR‬בוטא הקולטן באופן מלאכותי בתאי ‪ .HeLa‬תאים אלו נבחרו כתאי המודל הטובים ביותר‬
‫להמשך המחקר על בסיס יכולתם של הטעמנים לחדור לתוכם ולהגיע לריכוזים ציטוזוליים הדומים לאלו‬
‫שנמצאו בתאי הטעם‪ .‬נבחנו השפעותיהן של שש תרכובות אמפיפטיות‪ ,‬שלוש מתוקות )סכרין‪D-TRP ,‬‬
‫ו‪ ,(NHD -‬ושלוש מרות )קפאין‪ ,‬נרינגין וכינין(‪ .‬ראשית‪ ,‬נבחנה השפעת הטעמנים על תפקוד הקולטן ה‪-‬‬
‫‪ .β2AR‬חשיפה מוקדמת של התאים לטעמנים השונים למשך ‪ 10‬דקות גרמה להגברה משמעותית ברמות‬
‫ה‪ cAMP -‬בתגובה ל‪ ,(ISO) isoproterenol -‬אשר נמשכה גם ‪ 2‬דקות לאחר גירוי הקולטן‪ .‬התוצאות‬
‫הראו כי הטעמנים לא פעלו כליגנדים לקוטלן ה‪ ,β2AR -‬ושחדירתם לתוך ציטוזול התאים הייתה‬
‫הכרחית על מנת לקבל את ההגברה ברמות ה‪ ,cAMP -‬דבר אשר מוכיח כי מקור השפעת הטעמנים היה‬
‫ציטוזולי ולא רצפטורלי‪ .‬בנוסף‪ ,‬השפעתם של הטעמנים על רמות השליח המשני לא הייתה תלויה‬
‫בפעילותם של ‪ ,PDE‬אשר אחראי על פירוק נוקלאוטידים ציקליים בתא‪ ,‬או של ‪ ,PKA‬אשר משתתף‬
‫בתהליך הדסנסיטיזציה של הקולטן‪ .‬תוצאות אלו יחד מצביעות על כך שההגברה שנראתה ברמות ה‪-‬‬
‫‪ cAMP‬בנוכחות הטעמנים נבעה מהגברה בפעילות הקולטן עצמו‪ .‬בהמשך‪ ,‬נעשה שימוש בנוגדן המכוון‬
‫ספציפית כנגד אתר בקולטן המזורחן ע"י ‪ GRK2‬ו‪ GRK5 -‬בלבד‪ ,‬על מנת לעקוב אחר התקדמותו של‬
‫תהליך הדסנסיטיזציה‪ .‬חשיפה של התאים לטעמנים השונים גרמה לא רק לעיכוב בעוצמת הזרחון של‬
‫הקולטן אלא גם להשהיה בזמן הופעתו‪ .‬בנוסף‪ ,‬תהליך האינטרנליזציה אשר תלוי בזרחון הקולטן ע"י ה‪-‬‬
‫‪ ,GRKs‬ומתאפיין בהחדרת הקולטן לציטוזול התאים‪ ,‬נמצא אף הוא מעוכב בנוכחות הטעמנים‪ .‬עיכוב זה‬
‫תורגם באחוז גבוה יותר של תאים המכילים קולטן ממברנלי ונוכחות גדולה יותר של קולטן בממברנה‬
‫הפלסמטית של התאים גם ‪ 15-20‬דקות לאחר גירוי הקולטן‪ .‬תהליך נוסף אשר תלוי בזרחון הקולטן ע"י‬
‫ה‪ GRKs -‬הינו מסלול ה‪ .(Mitogen-activated protein kinase) MAPK -‬מסלול העברת אותות זה‬
‫מופעל מצד אחד כתוצאה מזרחון הקולטן ה‪ β2AR -‬ע"י ‪ PKA‬אך גם לאחר קשירת ‪ β-arrestin‬לאתרי‬
‫הקולטן המזורחנים ע"י ‪ .GRKs‬כתוצאה מהפעלת מסלול זה‪ ,‬מזורחן ומשופעל ‪ .ERK‬הטעמנים לא‬
‫‪2‬‬
‫השפיעו על רמת הזרחון הבסיסית של ‪, ERK‬וגם לא על השפעול התלוי ב‪ .PKA -‬לעומת זאת‪ ,‬הם‬
‫עיכבו ספציפית את השפעול התלוי במסלול ה‪.GRKs/β-arrestin -‬‬
‫לסיכום‪ ,‬תוצאות עבודה זו מוכיחות את השערת העבודה לפיה טעמנים אמפיפטיים חודרי ממברנות‬
‫מעכבים את הקינאזות ממשפחת ה‪ GRKs -‬ולכן משבשים את מהלך הדסנסיטיזציה של הקולטן‪ .‬כתוצאה‬
‫מכך‪ ,‬הטעמנים גורמים לקולטן עצמו להיות פעיל יותר לזמן ארוך יותר‪ .‬ייתכן ומנגנון זה יסביר בעתיד‬
‫את תחושת השאריתיות המורגשת בזמן טעימת טעמנים מרים וממתיקים מלאכותיים‪ .‬מכיוון שקינאזות ה‪-‬‬
‫‪ GRKs‬משתתפות בדסנסיטיזציה של מגוון רחב של קולטנים‪ ,‬ייתכן ולטעמנים האמפיפטיים השפעות‬
‫רחבות יותר משל חישת הטעם עצמה‪ .‬למשל‪ ,‬ידוע כי טעמנים אלה מגיעים במהירות לאפיתל המעי‪ ,‬אשר‬
‫הוכח לאחרונה כי הוא מכיל קולטנים ‪ T1Rs‬המעורבים בוויסות ספיגת הגלוקוז ואולי רכיבים תזונתיים‬
‫נוספים‪ .‬בנוסף‪ ,‬ידוע כי מספר תרכובות כגון קפאין‪ ,‬נרינגין או סכרין יכולות להימצא בדם ובאיברים‬
‫שונים בגוף מספר דקות לאחר צריכתן‪ .‬ייתכן כי טעמנים כאלה יוכלו להשפיע באותם האיברים על‬
‫תהליכים פיזיולוגיים התלויים בקולטנים אחרים השייכים למשפחת ה‪. GPCRs -‬‬
‫‪3‬‬
‫תוכן עניינים‬
‫‪ .1‬מבוא ‪8.............................................................................................................................‬‬
‫‪ - 1.1‬חושים כימיים ‪8 ........................................................................................................‬‬
‫‪ - 1.2‬חישת הטעם‪8 ...........................................................................................................‬‬
‫‪ - 1.3‬אברוני חוש הטעם ביונקים ‪9 .......................................................................................‬‬
‫‪ - 1.4‬מנגנונים תאיים של חישת הטעם ‪10 .............................................................................‬‬
‫‪ - 1.4.1‬הטעם המר ‪10 ...................................................................................................‬‬
‫‪ - 1.4.2‬הטעם המתוק ‪13 ................................................................................................‬‬
‫‪ - 1.4.3‬הטעם האוממי )חומצות אמינו( ‪15 .........................................................................‬‬
‫‪ - 1.4.4‬הטעם המלוח ‪16 ................................................................................................‬‬
‫‪ - 1.4.5‬הטעם החמוץ ‪16 ................................................................................................‬‬
‫‪ - 1.5‬העברת אותות בין‪-‬תאית וקידוד הטעם במערכת הפריפרית ‪17 ............................................‬‬
‫‪ - 1.5.1‬העברת המידע אל תאי העצב לאחר גירוי קולטני הטעם ‪17 .........................................‬‬
‫‪ - 1.5.2‬תתי אוכלוסיות שונות של תאי טעם מבחינות בין הטעמים השונים‪18 ............................‬‬
‫‪ - 1.6‬מנגנון סיום העברת האותות )דסנסיטיזציה( של קולטנים מסוג ‪20 ............................ GPCR‬‬
‫‪ - 1.6.1‬תהליך הדסנסיטיזציה של קולטני ה‪20 ..................................................... GPCRs -‬‬
‫‪ - 1.6.2‬מאפיינים מבניים של קינאזות ממשפחת ה‪22 ............................................... GRKs -‬‬
‫‪ - 1.6.3‬בקרה על פעילות ‪22 ................................................................................ GRK2‬‬
‫‪ - 1.6.4‬שפעול מסלולי העברת האותות לאחר הדסנסיטיזציה של קולטני ה‪24 .............GPCRs -‬‬
‫‪ - 1.7‬חשיבות המחקר ומטרת העבודה ‪24 ...............................................................................‬‬
‫‪ .2‬חומרים ושיטות ‪28.............................................................................................................‬‬
‫‪ - 2.1‬חומרים ‪28 ...............................................................................................................‬‬
‫‪ - 2.1.1‬רשימת חומרים ‪28 .............................................................................................‬‬
‫‪ - 2.1.2‬נוגדנים‪ ,‬אנזימים‪ ,‬חומצות גרעין וערכות ‪29 .............................................................‬‬
‫‪ - 2.1.3‬בופרים ותמיסות ‪30 ............................................................................................‬‬
‫‪ 2.2‬שיטות ‪32 ..................................................................................................................‬‬
‫‪ - 2.2.1‬הדמיית חדירת טעמנים לתוך פפילות ‪ CV‬שלמות תוך מעקב דינמי )‪ (in situ‬במיקרוסקופ‬
‫קונפוקלי פלואורסצנטי ‪32 ...............................................................................................‬‬
‫‪ - 2.2.2‬הפרדת פפילת ה‪ CV -‬בחולדה ‪33 .........................................................................‬‬
‫‪ - 2.2.3‬הפרדת תוכן התאים מרקמת פפילת ‪ CV‬וקביעת כמות חלבון ‪33 ..................................‬‬
‫‪ - 2.2.4‬חדירת הטעמן לתוך תאי הטעם של פפילת ‪ (in vivo) CV‬בחולדות מורדמות ‪34 ............‬‬
‫‪ - 2.2.5‬קביעה כמותית של טעמנים בתוך תאי טעם מפפילת ‪ CV‬בעזרת שיטת ‪35 ...........HPLC‬‬
‫‪36 ....................................................................................................RT-PCR - 2.2.6‬‬
‫‪ - 2.2.6.1‬הפקת רנ"א כללי )‪ (total RNA‬מתוך פפילת ‪ CV‬ואפיתל לא סנסורי ‪36 ................‬‬
‫‪36 ............................................................... Reverse Transcription (RT) - 2.2.6.2‬‬
‫‪37 ...................................................Polymerase Chain Reaction (PCR) - 2.2.6.3‬‬
‫‪ - 2.2.6.4‬בחירת תחלים ‪37 ........................................................................................‬‬
‫‪ - 2.2.6.5‬קביעת רצף חומצות הגרעין )‪37 ..................................................(sequences‬‬
‫‪ - 2.2.7‬קביעת נוכחות קינאזות ממשפחת ה‪ GRK -‬בפפילת ‪ CV‬ע"י צביעת חתכים מרקמות לשון‬
‫)אימונוהיסטוכימיה( ‪38 ..................................................................................................‬‬
‫‪ - 2.2.7.1‬הכנת חתכים מלשון ‪38 ................................................................................‬‬
‫‪ - 2.2.7.2‬צביעת חתכי פפילת ‪ CV‬בעזרת נוגדנים‪39 .......................................................‬‬
‫‪ - 2.2.7.3‬בדיקת ספציפיות של נוגדנים בשיטת ‪39 ..................................... Western blot‬‬
‫‪ - 2.2.8‬קביעת חדירת טעמנים אמפיפטיים בתאי ‪40 ................................................... HeLa‬‬
‫‪ - 2.2.8.1‬החזקת תאים ‪40 ..........................................................................................‬‬
‫‪ – 2.2.8.2‬הכנת תמיסות סטוק של הטעמנים וקביעת חדירתם לתאי ‪40 ...................... HeLa‬‬
‫‪ - 2.2.9‬מדידת שינויים ברמות ‪41 ......................................................................... cAMP‬‬
‫‪4‬‬
‫‪ - 2.2.9.1‬ביטוי מלאכותי )טרנספקציה( של הקולטן ה‪ β2AR -‬בתאי ‪41 ....................HeLa‬‬
‫‪ - 2.2.9.2‬הכנת הדוגמאות ‪41 ......................................................................................‬‬
‫‪ - 2.2.9.3‬קביעת כמות ‪ cAMP‬בשיטת ה‪42 ....................... (RIA) radioimmunoassay -‬‬
‫‪ - 2.2.9.4‬קביעת חלבון בשיטת ברדפורד ‪42 ..................................................................‬‬
‫‪ - 2.2.10‬קביעת רמת הזרחון של הקולטן הבטא‪-‬אדרנרגי לאחר גירוי ‪42 ..................................‬‬
‫‪ - 2.2.10.1‬הכנת הדוגמאות ‪42 ....................................................................................‬‬
‫‪ - 2.2.10.2‬קשירת החרוזים לנוגדן כנגד ‪43 ............................................................. HA‬‬
‫‪ - 2.2.10.3‬השקעה אימונית )‪ (immunoprecipitation‬של הקולטן הבטא‪-‬אדרנרגי ‪43 .........‬‬
‫‪ - 2.2.11‬מדידת אינטרנליזציה של הקולטן הבטא‪-‬אדרנרגי לאחר גירוי ‪44 ............................‬‬
‫‪ - 2.2.12‬מידור )פרקציונציה( של התא ‪44 .........................................................................‬‬
‫‪ - 2.2.13‬קביעת שפעול של ‪45 ............................................................................... ERK‬‬
‫‪ - 2.2.14‬ניתוח סטטיסטי של התוצאות‪45 ..........................................................................‬‬
‫‪ .3‬תוצאות ‪46........................................................................................................................‬‬
‫‪ - 3.1‬חדירת טעמנים אמפיפטיים לפפילות ‪ CV‬שלמות ‪46 .........................................................‬‬
‫‪ - 3.1.1‬מעקב אחר חדירת הטעמנים במיקרוסקופ קונפוקלי ‪46 ...............................................‬‬
‫‪ - 3.1.2‬חדירת טעמנים אמפיפטיים במודל של חיות ‪47 .........................................................‬‬
‫‪ - 3.2‬נוכחות ודפוס התבטאות של קינאזות ממשפחת ה‪ GRKs -‬בפפילת ‪ CV‬בחולדות ‪48 ...............‬‬
‫‪ -3.2.1‬ביטוי ‪ GRKs‬שונים בפפילת ה‪ CV -‬בשיטת ה‪48 .................................... RT-PCR -‬‬
‫‪ – 3.2.2‬קביעת מיקומם של ה‪ GRKs -‬השונים בשיטת ‪49 ......................... immunostaining‬‬
‫‪ -3.3‬חקר השפעת הטעמנים על מנגנון הדסנסיטיזציה של קולטני ‪ GPCRs‬בעזרת מודל בתאי ‪HeLa‬‬
‫‪51 .................................................................................................................................‬‬
‫‪ -3.3.1‬חדירת טעמנים אמפיפטיים מרים ומתוקים לתאי ‪51 .......................................... HeLa‬‬
‫‪ -3.3.2‬השפעת טעמנים אמפיפטיים על היווצרות השליח המשני ‪ cAMP‬לאחר גירוי הקולטן ה‪-‬‬
‫‪51 ................................................................................................................... β2AR‬‬
‫‪ -3.3.2.1‬הטעמנים האמפיפטיים גורמים להגברה תלוית ריכוז ביצירת ה‪ cAMP -‬בתגובה‬
‫לגירוי הקולטן ה‪ β2AR -‬ע"י ‪52 ........................................................................... ISO‬‬
‫‪ - 3.3.2.2‬הטעמנים האמפיפטיים אינם פועלים כליגנדים אנדוגניים ‪52 .................................‬‬
‫‪ - 3.3.2.3‬פראינקובציה של הטעמן עם התאים הינה הכרחית להשפעתו על יצירת ‪cAMP‬‬
‫בתגובה לגירוי הקולטן ה‪54 ............................................................................. β2AR -‬‬
‫‪ - 3.3.2.4‬השפעת הטעמנים איננה תלויה ב‪ PDE -‬או ב‪55 ................................... .PKA -‬‬
‫‪ - 3.3.3‬השפעת הטעמנים על זרחון הקולטן ה‪ β2AR -‬ע"י ‪ GRK2/5‬בעקבות גירוי ע"י ‪56 ISO‬‬
‫‪ - 3.3.4‬השפעת הטעמנים על מנגנון האינטרנליזציה של הקולטן ה‪58 .......................... β2AR -‬‬
‫‪ – 3.3.5‬השפעת חשיפת התאים לטעמנים על מסלול העברת האותות של ‪ ERK‬בתגובה לגירוי עם‬
‫‪61 ..................................................................................................................... .ISO‬‬
‫‪ .4‬דיון ומסקנות ‪63.................................................................................................................‬‬
‫‪ - 4.1‬חדירת טעמנים אמפיפטיים לתוך תאי הטעם ‪63 ...............................................................‬‬
‫‪ - 4.2‬איפיון ביטוי קינאזות ממשפחת ה‪ GRKs -‬בתאי פפילת ה‪ CV -‬בחולדה ‪66 ...........................‬‬
‫‪ - 4.3‬טעמנים אמפיפטיים מעכבים את הדסנסיטיזציה של קולטני ה‪ GPCRs -‬על ידי עיכוב פעילותן‬
‫של קינאזות ה‪67 .................................................................................................. .GRKs -‬‬
‫רשימת ספרות ‪74...................................................................................................................‬‬
‫‪5‬‬
‫רשימת קיצורים‬
β2AR
β2-adrenergic receptor
BSA
Bovine serum albumin
cAMP
Adenosine 3’-5’ cyclic monophosphate
CAFF
Caffeine
CCCP
Carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone
cGMP
Guanine 3’-5’ cyclic monophosphate
CLT
Cyclo(Leu-Trp) / Cyclo(L-Leucine-L-Tryptophan)
CV
Circumvallate
D-TRP
D-Tryptophan
DABCO
1,4-Diazabicyclo [2.2.2] octane
DAG
Diacylgycerol
DMEM
Dulbecco's Modified Eagle's Medium
DMSO
Dimethylsulfoxide
EGTA
Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N’,N’-tetraacetic
acid
ERK
Extracellular signal-regulated kinase
FBS
Fetal bovine serum
G protein
Guanine nucleotide binding protein
GAPDH
Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase
GMP
Guanosine 5’-monophosphate
GPCR
G-protein-coupled receptor
GRK
G-protein-coupled receptor kinase
HEPES
(N-[2-hydroxyethyl]piperazine-N’-[2-ethanesulfonic acid])
HPLC
High performance liquid chromatography
IBMX
3-Isobutyl 1-methylxanthine
IMP
Inosine 5’-monophosphate
IP3
Inositol 1,4,5-trisphosphate
ISO
Isoproterenol hydrochloride
KI
Potassium iodide
MAPK
Mitogen-activated protein kinase
MSG
Monosodium glutamate
6
NaF
Sodium fluoride
NAR
Naringin
NHD
Neohesperidin dihydrochalcone
PBS
Phosphate buffered saline
PCR
Polymerase chain reaction
PDE
Phosphodiesterase
PI
Propidium iodide
PKA
Phosphokinase A
PKC
Phosphokinase C
PLC
Phospholipase C
QUIN
Quinine
RIA
Radio-immuno assay
RIPA
Radio-immunoprecipitation assay buffer
RT
Reverse transcription
SACC
Saccharin
T1R
Taste receptor family 1
T2R
Taste receptor family 2
TCA
Trichloroacetic acid
7
‫‪ .1‬מבוא‬
‫‪ - 1.1‬חושים כימיים‬
‫היכולת לזהות‪ ,‬לפרש ולהגיב לגירויים סביבתיים הינה תכונה חיונית להתפתחותם‪ ,‬הסתגלותם‬
‫והישרדותם של בעלי חיים בסביבה בה הם חיים‪ .‬מנגנוני החישה הפריפריים הכוללים חישת גירויים‬
‫חיצוניים )חושי הראייה‪ ,‬השמיעה והמישוש( וחישת גירויים החודרים לתוך הגוף )חוש הטעם והריח(‬
‫נועדו למטרה זו‪.‬‬
‫חוש הריח וחוש הטעם המזהים חומרים כימים‪ ,‬נדיפים או מוצקים בהתאמה‪ ,‬הינן שתי מערכות חישה‬
‫המאפשרות זיהוי מקורות מזון וסכנות מסוגים שונים )אויבים או רעלים(‪ .‬מערכת חישת הריח מורכבת‬
‫משני איברים המופרדים מבחינה פיזית‪ :‬האפיתל האולפקטורי באף אשר אחראי על זיהוי המגוון האדיר‬
‫של הריחנים הקיימים )‪ (main olfactory epithelium MOE‬ואזור נוסף הנקרא האברון הוומרונזלי‬
‫)‪ ,(vomeronasal organ VNO‬המשתתף בתהליך חישת הפרומונים המגדירים התנהגות מינית כגון‬
‫רביה‪ ,‬תוקפנות כלפי בעלי חיים אחרים ועוד‪ .‬אפיתל חוש הטעם )‪,(taste sensory epithelium‬‬
‫הממוקם בלשון‪ ,‬בחך ובתחילת הוושט מספק מידע מידי על הרכב היונים‪ ,‬הימצאות מרכיבים עתירי‬
‫קלוריות ונוכחות חומרים לא רצויים במזון‪ .‬למרות מיקום נפרד ותפקידים פיזיולוגיים שונים‪ ,‬חוש הטעם‬
‫והריח משתפים פעולה לעיתים קרובות‪ :‬בהערכת איכות המזון למשל‪ ,‬חוש הריח מאפשר לזהות מראש‬
‫מזון מקולקל או להגביר את התיאבון למאכלים מסוימים‪ .‬בנוסף‪ ,‬ריחנים המשתחררים לאחר לעיסת‬
‫המזון ומגיעים לחלל הפה מגרים את התאים הסנסוריים הממוקמים במוקוזה‪ :‬השילוב בין חוש הטעם‬
‫לחוש הריח יפורש בזיכרון כ"טעם המזון" )‪.(42‬‬
‫‪ - 1.2‬חישת הטעם‬
‫חישת הטעם משחקת תפקיד מרכזי בתזונת בעלי החיים‪ ,‬בהערכת ההרכב היוני והקלורי של המזון ובזיהוי‬
‫חומרים העלולים להיות רעילים‪ .‬כיום הוכח שיונקים מסוגלים להבחין בין חמישה טעמים שונים‪ :‬בנוסף‬
‫לארבעת הטעמים הידועים מתוק‪ ,‬מר‪ ,‬מלוח וחמוץ‪ ,‬טעם המונוסודיום גלוטמאט התגלה כייחודי ומכונה‬
‫כעת בספרות "הטעם האוממי"‪ .‬קיימת עדיין מחלוקת לגבי קיומו של "הטעם השומני"‪ :‬יש הטוענים כי‬
‫מדובר אך ורק בתחושת מרקם‪ ,‬אך לפני כמה שנים התגלו ראיות בהן חומצות שומניות חופשיות מסוגלות‬
‫לעורר תגובה בתאי טעם דרך תעלות אשלגן ולגרום להעברת אותות )‪.(53‬‬
‫טעמנים מתוקים‪ ,‬מלוחים או אוממי וכן נוכחות חומצות שומן במזון מעוררים תחושה שלעיתים מהנה‬
‫ומעוררת תיאבון‪ .‬תגובות אלו חשובות מבחינה אבולוציונית בכך שהן מאפשרות לבעלי החיים להעדיף‬
‫מזונות עתירי אנרגיה הדרושים להישרדות‪ .‬חישת הטעם המר ובמידה מסוימת גם החמוץ חיונית לא פחות‬
‫ומהווה קו הגנה‪ ,‬מאחר והיא מאפשרת‪ ,‬ביחד עם חוש הריח‪ ,‬זיהוי מזון מקולקל או חומרים רעילים‬
‫‪8‬‬
‫טבעיים )טוקסינים( כגון אלקלואידים צמחיים‪ .‬לכן תגובה אופיינית‪ ,‬מולדת ברוב היונקים‪ ,‬לטעם מר‬
‫הינה סלידה‪ .‬יש לציין יחד עם זאת שדחיית הטעם המר איננה חד משמעית‪ :‬חלק משמעותי מן החומרים‬
‫המרים והחמוצים הם בעלי חשיבות תזונתית )חסה‪ ,‬כרוב‪ ,‬כרובית‪ ,‬ברוקולי( ואפילו מעוררי תיאבון‬
‫)לימון‪ ,‬אשכוליות‪ ,‬תפוחים‪ ,‬סודה לשתייה ועוד(‪ .‬בנוסף להערכת הרכב יוני וקלורי‪ ,‬נמצא שלמערכת‬
‫חישת הטעם מנגנונים מיוחדים להערכת ריכוז המים מול ריכוז המומסים במזון הנבלע ולכן לחישת הטעם‬
‫המלוח‪ ,‬החמוץ וטעם המים חשיבות בשמירה על איזון מערכתי של אוסמולריות וריכוז יונים מעבר‬
‫להספקת יונים חיוניים לגוף )‪.(124‬‬
‫‪ - 1.3‬אברוני חוש הטעם ביונקים‬
‫תאי הטעם )‪ (taste receptor cells - TRCs‬האחראים על חישת הטעם הינם תאים נוירואפיתליאליים‬
‫קטנים )אורכם ‪ 40-60 μm‬וקוטרם ‪ (20-40 μm‬בעלי אופי ביפולרי‪ :‬באזור האפיקלי נמצאים מיקרווילי‬
‫)‪ (microvilli‬המכילים את הקולטנים לטעם‪ ,‬ובצד הבזולטרלי מועבר המידע למוח במנגנון מורכב הכולל‬
‫תקשורת בין תאים וקשרים סינפטיים עם סיבים עצביים )‪ .(143‬תאי הטעם מאורגנים ביחידות‬
‫מורפולוגיות הנקראות פקיעיות טעם )‪ ,(taste buds‬ובתוכן בין ‪ 50‬ל‪ 150 -‬תאים‪ ,‬כאשר כל התאים‬
‫מפנים את המיקרווילי לעבר פתח פקיעית הטעם )‪ (taste pore‬החשוף לחלל הפה וכך למזון ולטעמנים‪.‬‬
‫תאי הטעם‪ ,‬המכונים מבחינה היסטורית גם תאים מסוג ‪ ,(type II cells) II‬נמצאים בפקיעית בסמיכות‬
‫לשלושה סוגי תאים נוספים )‪ (type I, III and IV‬האחראים בין היתר על תקשורת בין תאית‪ ,‬העברת‬
‫המידע למוח‪ ,‬חידוש תאי הפקיעית ועוד‪ .‬פקיעיות הטעם נמצאות בעיקר על הלשון אך ניתן למצוא בודדות‬
‫בין תאי האפיתל בכל חלל הפה‪ .‬באדם‪ ,‬בערך שני שליש מפקיעיות הטעם מאורגנות באברונים הנקראים‬
‫פפילות )‪ .(taste papillae‬מבחינים בשלושה סוגי פפילות‪ ,‬הנבדלות במבנה‪ ,‬מיקום ומספר פקיעיות‬
‫הטעם שהן מכילות‪ fungiform papillae :‬הנמצאות במספר רב )מאות( בעיקר בשליש הקדמי של‬
‫הלשון ומכילות פקיעיות בודדות‪ foliate papillae ,‬הממוקמות בצידיו האחוריים של הלשון ומכילים‬
‫מספר גדול יותר של פקיעיות‪ ,‬ו‪ circumvallate papillae -‬הנמצאות בחלק האחורי של הלשון‬
‫במספרים בודדים )‪ 1-5‬לפי בעל החיים( אך מכילות את המספר הרב ביותר של פקיעיות )איור ‪.(1.1‬‬
‫חלוקה טופוגרפית של הלשון על פי רגישותו של כל אזור לטעמים השונים הייתה מקובלת עד לפני כמה‬
‫שנים‪ .‬ידוע כיום שניתן לחוש בכל אחד מן הטעמנים ע"י גירוי של כל אחד מסוגי פפילות הטעם מכל אזור‬
‫בלשון‪ .‬בנוסף לפפילות הטעם‪ ,‬קיימות על פני הלשון פפילות נוספות )‪ (filliform‬אשר אינן מכילות‬
‫פקיעיות טעם והן בעלות תפקידים שונים מחישת טעם כמו למשל ערבוב המזון בפה‪.‬‬
‫‪9‬‬
‫איור ‪ - 1.1‬מיקום ומבנה של פפילות ופקיעיות הטעם בלשון‪.‬‬
‫‪ -a‬שלושה סוגי פפילות )‪ foliate ,fungiform‬ו‪ (circumvallate -‬הנבדלות במבנה‪ ,‬מיקום ומספר פקיעיות הטעם‬
‫)‪ (taste buds‬שהן מכילות‪ .‬בתוך פקיעית הטעם‪ ,‬תאי הטעם )‪ (TRC‬נחשפים לטעמנים דרך ה‪.taste pore -‬‬
‫‪ -b‬ניתן לחוש בכל אחד מחמשת הטעמים המוכרים בכל מקום בלשון‪ .‬לקוח מתוך )‪.(23‬‬
‫‪ - 1.4‬מנגנונים תאיים של חישת הטעם‬
‫‪ - 1.4.1‬הטעם המר‬
‫תרכובות מרות מעוררות חוסר נעימות בריכוזים נמוכים עד לדחייה חזקה בריכוזים גבוהים‪ .‬מגוון רחב‬
‫של תרכובות אורגניות‪ ,‬חלקן מקורן בצומח וחלקן מתוצרת תעשייתית הינן מרות וביניהן ניקוטין‪ ,‬קפאין‪,‬‬
‫סטריכנין‪ ,‬סוכרוז אוקטאצטט‪ ,‬ציקלוהקסימיד‪ ,‬כינין‪ ,‬נרינגין‪ ,‬דנטוניום ועוד‪ .‬אבולוציונית‪ ,‬הטעם המר‬
‫מזהיר אותנו מפני מזונות מקולקלים ורעלים מן הטבע‪ :‬אחד האתגרים המרתקים במחקר הטעם הינו‬
‫להבין כיצד קולטנים לטעם המר עוצבו באבולוציה לשרת מטרה זו‪.‬‬
‫משפחת הקולטנים לטעם מר‪ ,‬כמו זאת לטעם המתוק ואוממי‪ ,‬זוהתה בוודאות רק בסוף שנות התשעים‬
‫הודות למאגרי מידע גנומיים ברשת‪ .‬קבוצה חדשה של קולטנים מצומדים לחלבוני ‪(G-protein- G‬‬
‫)‪ coupled receptors - GPCRs‬מוקמה בכרומוזום מספר ‪ 6‬וקרויה בשם משפחת ה‪.(104 ,2) T2R -‬‬
‫זוהי משפחה רחבה למדיי של עד ‪ 80‬קולטנים בעכברים‪ ,‬חולדות ובני אדם‪ .‬עד כה לפחות ‪ 26‬גנים‬
‫פוטנציאליים זוהו בבני אדם ו‪ 33 -‬בעכברים‪ .‬הקולטנים מראים קרבה לקולטנים הוומרונזאלים‬
‫)הקולטנים לפרומונים ב‪ (VNO -‬ומראים בין ‪ 30 %‬ל‪ 70 % -‬זהות ברצף חומצות האמינו בתוך‬
‫המשפחה‪ .‬ייתכן והשוני בין הקולטנים הוא המאפשר את זיהוי המגוון הרחב של מבנים כימיים הקיים‬
‫בקבוצת הטעמנים המרים‪ .‬בדומה ל‪ GPCRs -‬אחרים בעלי קצה ‪-N‬טרמינלי חוץ תאי קצר‪ ,‬ההנחה היא‬
‫‪10‬‬
‫שחומצות האמינו החשובות לקשירת הליגנד ולקביעת הספציפיות לטעמנים שונים נמצאות באזורים‬
‫הטרנסממברנליים ובאחת הלולאות החוץ תאיות של הקולטן )‪ .(111‬זיהוי ליגנדים לקולטנים שונים‬
‫ממשפחת ה‪ T2Rs -‬התאפשר בשנים האחרונות ע"י ביטוי של אותם הקולטנים בתרביות תאים )‪,18 ,8‬‬
‫‪ ,(149 ,137 ,89 ,24‬אך עד כה רובם של הקולטנים למר עדיין מוגדרים "יתומים"‬
‫‪(orphan‬‬
‫)‪ .receptors‬בנוסף לספציפיות לליגנדים שונים‪ ,‬ייתכן והפולימורפיזם הקיים בגנים המקודדים לקולטני‬
‫ה‪ T2Rs -‬אחראי גם להבדלים ברגישות לטעמנים שונים בפרטים שונים ולקיום ‪ tasters‬ו‪non- -‬‬
‫‪ ,tasters‬תופעה ידועה גם בבעלי חיים וגם בבני אדם )‪.(24‬‬
‫ניסויים שנעשו בחולדות ועכברים הראו נוכחות של ‪ T2R mRNAs‬ב‪ 15% -‬מתאי פקיעיות הטעם‬
‫בפפילות ‪ circumvallate‬ו‪ ,foliate -‬אך רק ב‪ 2% -‬מהתאים בפפילות ה‪ .(24 ,2) fungiform -‬יש‬
‫הטוענים שתא אחד יכול לבטא מגוון רחב של קולטני ‪ ,T2R‬דבר המרמז על היכולת של תא בודד לזהות‬
‫טעמנים מרים שונים )‪ .(2‬בניגוד לטענה זו‪ ,‬מחקר אחר הראה שתאים המגיבים למר מופעלים אך ורק על‬
‫ידי טעמן אחד מתוך חמישה‪ ,‬כך שטעמנים שונים מעוררים תת‪-‬אוכלוסיות שונות של תאי טעם )‪.(21 ,9‬‬
‫חלבון ‪ (Guanine nucleotide binding protein – protein G) G‬בשם ‪ ,gustducin‬בעל הומולוגיה‬
‫גבוהה לחלבון ‪ G‬אחר בשם ‪ transducin‬ומתבטא במערכת הראייה‪ ,‬נמצא ברקמת הטעם )ומאוחר יותר‬
‫גם ברקמות אחרות )‪ ((101 ,10‬ומתבטא באופן סלקטיבי ב‪ 20-30% -‬מתאי הטעם בכל סוגי הפפילות‬
‫)‪ .(107 ,16‬הקשר בין ‪ gustducin‬לטעם המר ידוע כבר מתחילת שנות ה‪ .(107) 90 -‬ניסויי ‪knock-‬‬
‫‪ out‬בעכברים הראו שתת‪-‬היחידה ‪ α-gustducin‬מעורבת בטרנסדוקצית הטעם המר דרך הפעלת‬
‫פוספודיאסטראז ספציפי לטעם שזוהה כ‪ .(147) PDE1A -‬הפעלת אנזים זה גורמת לירידה ברמת‬
‫הנוקלאוטידים הציקליים )‪ (cNMPs‬בתא‪ .‬השפעת ירידה זו בהמשך מסלול העברת האותות איננה‬
‫ברורה‪ .‬ייתכן ורמות נמוכות של נוקלאוטידים משפיעות על פעילות קינאזות בתא או לחילופין תתכן‬
‫בקרה של תעלות יוניות שונות המבוטאות בתאי טעם‪ ,‬אשר חלקן מעוכבות ע"י ‪(cNMP- cNMPs‬‬
‫)‪ inhibited‬וחלקן תלויות ב‪.(179) ( cNMP-gated channels) cNMPs -‬‬
‫בנוסף ל‪ α-gustducin -‬נמצאו בתאי טעם תת‪-‬יחידות ‪ α‬מחלבוני ‪ G‬אחרים‪,Gαq ,Gαs ,Gαi3 ,Gαi2 :‬‬
‫‪ Gα14 ,Gα15‬ו‪ .(179 ,147 ,107) α-transducin -‬סביר שאחת או יותר מתת‪-‬יחידות אלה משחקת‬
‫תפקיד בטרנסדוקצית הטעם המר מכיוון ש‪ knock-out -‬של ‪ α-gustducin‬איננו מבטל לחלוטין את‬
‫התגובה לתרכובות מרות )‪ .(57 ,20‬לאחרונה‪ ,‬הוכח שהקולטנים לטעם המר מתבטאים יחד עם ‪Gαi2‬‬
‫בפקיעיות טעם )‪ (20‬ושקולטנים כגון ‪ mT2R5‬מעוררים מסלולי העברת אותות המערבים שפעול של‬
‫חלבון ‪ G‬מסוג ‪.(127) Gi/o‬‬
‫עוד לפני שזוהו הקולטנים‪ ,‬מסלולי העברת האותות של חישת הטעם המר נחקרו בהרחבה‪ .‬היום‪ ,‬מסלול‬
‫העברת האותות המערב היווצרות ‪ (IP3) Inositol-1,4,5-trisphosphate‬ודיאצילגליצרול )‪(DAG‬‬
‫נחשב למרכזי בחישת הטעם המר )‪.(23‬‬
‫במקביל להפעלת תת‪-‬היחידה ‪ α‬של ‪ ,gustducin‬תת‪-‬היחידה ‪ βγ‬משתחררת כקומפלקס וגורמת לעלייה‬
‫ברמת ה‪ IP3 -‬בתא על ידי הפעלת פוספוליפאז שזוהה כ‪ .(183 ,179 ,146 ,145 ,66) PLCβ2 -‬עלייה‬
‫‪11‬‬
‫ב‪ IP3 -‬גורמת לשחרור מאגרים תוך תאיים של סידן‪ ,‬ובהמשך לשפעול תעלה המשתייכת למשפחת ה‪-‬‬
‫‪ (Transient Receptor Potential protein) TRPs‬וזוהתה כ‪ .(134 ,131) TRPM5 -‬פתיחת‬
‫התעלה וכניסה מסיבית של יוני נתרן דרכה גורמים לדפולריזציה של התא‪ .‬מחקרים הראו ש‪knock- -‬‬
‫‪ out‬של ‪ PLCβ2‬או של ‪ TRPM5‬גורמים לחוסר רגישות לטעם המר וכן לטעם המתוק והאוממי‪ ,‬דבר‬
‫המצביע על חשיבות מרכזית של מסלול זה בחישת שלושת טעמים אלו )‪ .(183 ,34‬מכיוון שהטעמים‬
‫מלוח וחמוץ לא נפגעו מ‪ knock-out -‬זה‪ ,‬נראה כי טעמים אלו מנצלים מסלולי העברת אותות שונים‪.‬‬
‫איור ‪ – 1.2‬שני מסלולי העברת אותות מצטיירים כמרכזיים בחישת הטעם המר‪ ,‬המתוק ואוממי‪.‬‬
‫לאחר גירוי הקולטן‪ ,‬שני מסלולי העברת אותות אפשריים‪ .‬מצד אחד שפעול תת‪-‬היחידה ‪ α‬יכולה לגרום לשפעול‬
‫)או עיכוב( של אדניליל ציקלאז או פוספודיאסטראזות‪ ,‬אשר גורמים לשינוי ברמות נוקלאוטידים ציקליים‪ .‬בנוסף‪,‬‬
‫שחרור תת‪-‬היחידה ‪ βγ‬גורם לשפעול הפוספוליפאז ‪ PLCβ2‬אשר גורם לעלייה ברמות ה‪ IP3 -‬בתא ושפעול‬
‫תעלות ה‪ .TRPM5 -‬מסלול ה‪ TRPM5/PLCβ2 -‬ידוע כחיוני לחישת הטעמים מר‪ ,‬מתוק ואוממי‪ .‬לקוח מתוך‬
‫)‪.(143‬‬
‫תרכובות מרות מגוונות כגון כינין‪ ,‬אוראה‪ ,‬דנטוניום‪ ,‬קפאין‪ ,‬מתיל‪-‬קסאנטין וחומצות אמינו מסוימות‪,‬‬
‫מסוגלות בנוסף למסלולים שפורטו מקודם להשפיע על מסלול העברת האותות ללא תיווך של קולטן אלא‬
‫ע"י חדירה דרך הממברנה הפלסמטית ואינטראקציה ישירה עם חלבוני הטרנסדוקציה ככל הנראה הודות‬
‫למבנה סטרוקטורלי דומה לאתר הקולטן הקושר את החלבון‪ .‬כינין ככל הנראה מסוגל לעבור בדרך זו‬
‫אינטראקציה ישירות עם חלבוני ‪ ,(116) G‬לעכב תעלות אשלגן בסלמנדרה אמריקנית ‪(31) Necturus‬‬
‫ולהפעיל תעלות קטיונים בצפרדע הקרקרנית ‪ .(170) bullfrog‬דנטוניום מעכב תעלות אשלגן התלויות‬
‫במתח )‪ ,(159‬וקפאין מעכב פוספודיאסטראזות וכך גורם לעלייה ברמות הנוקלאוטידים הציקליים כגון‬
‫‪ cGMP‬בתא )‪ .(144‬במקרים אלה‪ ,‬תאים שאינם בהכרח קשורים לטעם המר מסוגלים להגיב לאותן‬
‫תרכובות‪.‬‬
‫‪12‬‬
‫‪ - 1.4.2‬הטעם המתוק‬
‫זמן קצר לאחר זיהוי הקולטנים לטעם המר‪ ,‬מספר קבוצות חוקרים דיווחו על זיהוי קולטן לטעם המתוק‬
‫בשם ‪ T1R3 .(119 ,110 ,106 ,86) T1R3‬התגלה ע"י סריקת גנים ל‪ GPCRs -‬הממוקמים בגנום‬
‫האנושי באזור המקביל לזה בגנום העכברי הנקרא ‪ .Sac locus‬לוקוס זה הינו אחד משני האזורים בגנום‬
‫העכבר )לוקוסים( הידועים למעלה משלושים שנה כאחראים על חישת הטעם המתוק‪ :‬ה‪Sac locus -‬‬
‫שמיקומו בזרוע הדיסטלית של כרומוזום ‪ 4‬ואחראי על תגובה לסוכרוז‪ ,‬סכרין וממתקים מלאכותיים‬
‫נוספים‪ .‬בנוסף‪ ,‬ה‪ Dpa locus -‬שמופה בזרוע הפרוקסימלית של כרומוזום ‪ 4‬נמצא אחראי על תגובה ל‪-‬‬
‫‪-D‬פנילאלנין )‪ .(121 ,96 ,5‬פיזיולוגית‪ ,‬הוכח ששני אזורים אלו משפיעים על העברת תגובה עיצבית‬
‫פריפריאלית לסוכרוז‪ ,‬דבר המרמז על קידוד לקולטן או מרכיב אחר של מסלול הטרנסדוקציה של הטעם‬
‫המתוק‪ .‬ואכן הקולטן הראשון לטעם מתוק אותר בלוקוס ה‪.Sac -‬‬
‫לאחר בדיקות נוספות נמצאה הומולוגיה של ‪ 30%‬בין ‪ T1R3‬לשני קולטנים "יתומים" ממשפחת ה‪-‬‬
‫‪ GPCRs‬המתבטאים בתאי טעם הקרויים ‪ T1R1‬ו‪ T1R2 -‬שתפקידם לא הוגדר עד אז‪ .‬בעכברים‬
‫וחולדות ‪ T1R3‬מתבטא בכ‪ 15-30% -‬מתאי הטעם בכל שלושת סוגי הפפילות‪ .‬לעומתו‪ T1R1 ,‬מבוטא‬
‫בעיקר בפפילות מסוג ‪ fungiform‬ו‪ T1R2 -‬בפפילות מסוג ‪ foliate‬ו‪ .circumvallate -‬ניסויים של ‪in‬‬
‫‪ situ hybridization‬הראו שבכל תא שבו מתבטא ‪ T1R3‬מתבטא איתו ‪ T1R1‬או ‪ T1R2‬בהתאם לסוג‬
‫הפפילה )‪ .(119 ,82‬עובדה זו מרמזת על כך שקולטנים ממשפחת ה‪ ,T1Rs -‬בדומה ל‪GPCRs -‬‬
‫אחרים‪ ,‬פועלים דרך הטרודימריזציה )יצירת קומפלקס בין שתי יחידות קולטן לפני או אחרי קישור‬
‫הליגנד‪ ,‬המאפשרת יציבות בקשירת הליגנד או שפעול פעילות אנזימטית בחלק התוך תאי של הקומפלקס‬
‫כגון פעילות של קינאז(‪ .‬כחיזוק להשערה זו‪ (119) Nelson et al. ,‬הראו שקולטן ‪ T1R‬בודד איננו‬
‫פונקציונלי‪ .‬לעומת זאת תאים המבטאים ‪ T1R3‬ו‪ T1R2 -‬מגיבים בצורה חזקה ביותר לטעמנים מתוקים‬
‫כגון הסוכרים הטבעיים סוכרוז ופרוקטוז אך גם לממתיקים מלאכותיים כמו סכרין ואצסולפאם‪.K-‬‬
‫בנוסף‪ ,‬הטרודימר זה מגיב לחומצות אמינו בעלות טעם מתוק כמו ‪-D‬טריפטופן ולחלבונים מתוקים כמו‬
‫‪ .(94) monellin‬מחקרים רבים נעשו בשנים אחרונות במטרה להסביר את יכולתו של הקולטן‬
‫‪ T1R2/T1R3‬לקשור מגוון כה רחב של מולקולות מתוקות בעלות מבנים ומשקלים מולקולרים כה‬
‫שונים‪ .‬בניגוד לקולטנים לטעם המר )‪ ,(T2Rs‬קולטני ה‪ T1Rs -‬הינם בעלי קצה ‪-N‬טרמינלי ארוך ולכן‬
‫אזור זה נחשב תחילה למרכזי בקשירת הליגנדים‪ .‬מיפוי אזורי הקשירה של הקולטן נעשה בעזרת כימרות‬
‫של ‪ T1R3‬ו‪ T1R2 -‬מאדם ומעכבר והראה שטעמנים שונים נקשרים לקולטן ההטרודימרי באזורים‬
‫שונים‪ .‬למשל האזור הטרנסממברנלי ‪ (transmembranal domain) TMD‬של ‪ T1R3‬מעורב בקשירת‬
‫הממתיק ‪ ,(74) cyclamate‬לעומת האזור החוץ תאי ‪ (Venus flytrap module) VFTM‬של ‪T1R2‬‬
‫אשר אחראי לקשירת הממתיקים ‪ neotame‬ו‪ .(178 ,75) aspartame -‬אזור עשיר בחומצת האמינו‬
‫ציסטאין ב‪ T1R3 -‬ומכונה ‪ (cystein rich domain) CRD‬מקשר בין ה‪ VFTM -‬ל‪ ,TMD -‬ונמצא‬
‫חיוני לקשירת חלבונים מתוקים כגון ‪ monellin‬או ‪ .(75) brazzein‬מולקולת ה‪ ,lactisole -‬הידועה‬
‫‪13‬‬
‫בבני אדם כמעכבת את המתיקות של מגוון סוכרים טבעיים‪ ,‬גליקוזודים וממתיקים‪ ,‬נקשרת ל‪ TMD -‬של‬
‫‪ .(73) T1R3‬ממצא זה מסביר באותה עת את העובדה ש‪ lactisole -‬פועלת גם כמעכב לטעם האוממי‪.‬‬
‫התייחסות לביטוי מקביל של ‪ T1R3‬ו‪ T1R1 -‬תעשה בפרק הדן בטעם האוממי‪.‬‬
‫איור ‪ - 1.3‬מיפוי אזורי הקשירה לתרכובות מתוקות שונות בהטרודימרים ‪ T1R3/T1R2‬ו‪-‬‬
‫‪ .T1R3/T1R1‬לקוח מתוך )‪.(178‬‬
‫על בסיס מחקרים ביוכימיים ופיסיולוגיים רבים‪ ,‬הוצעו מספר מודלים לטרנסדוקצית הטעם המתוק‪:‬‬
‫לאחר גילוי קולטני ה‪ ,T1Rs -‬מחקרים הראו שבדומה לקולטנים לטעם מר‪ ,‬ההטרודימר ‪T1R2/T1R3‬‬
‫מפעיל גם הוא את מסלול העברת האותות המערב את ‪ PLCβ2‬ו‪ ,(183 ,146 ,131) TRPM5 -‬ו‪-‬‬
‫‪ knock-out‬בשני גנים אלו מבטל את תחושת הטעם המתוק )‪ .(183‬למרות שמסלול ה‪ IP3 -‬נחשב היום‬
‫למרכזי בחישת הטעם המתוק )כמו לזו של הטעם המר(‪ ,‬מחקרים אחרים מראים מעורבות של מספר‬
‫מסלולי העברת אותות נוספים )איור ‪ ,(1.2‬ואף על קיום מסלולים שונים לסוכרים טבעיים וממתיקים לא‬
‫סוכריים‪.‬‬
‫סוכרים טבעיים מעוררים מסלול העברת אותות בו מעורבים חלבון ‪ G‬מהסוג ‪ ,Gs‬שפעול האנזים אדניליל‬
‫ציקלאז ויצירת השליח המשני ‪ .(164 ,163 ,115) cAMP‬אותו ‪ cAMP‬יכול מאוחר יותר להשפיע על‬
‫תעלות יוניות תלויות נוקלאוטידים )‪ (109) (cNMPs - gated channels‬או לגרום להפעלת ‪PKA‬‬
‫)‪ (protein kinase A‬וזרחון תעלות אשלגן וכך לדפולריזציה של הממברנה )‪ .(4‬לאחרונה‪ ,‬פורסמו‬
‫מחקרים המראים שהעלייה ברמות ‪ cAMP‬לאחר גירוי תאי טעם בסוכרוז אינה תלויה בנוכחות סידן חוץ‬
‫או תוך תאי‪ .‬בנוסף‪ ,‬ביטוי של איזופורמים ספציפיים לטעם של האדניליל ציקלאז נמצאו מקבילים‬
‫לביטויו של ‪ .PLCβ2‬לאור התוצאות‪ ,‬החוקרים מציעים שלאחר חשיפת תאי טעם לסוכרים טבעיים‬
‫מתקיימים שני מסלולים מקבילים אך בלתי תלויים‪ ,‬והם היווצרות ‪ cAMP‬ועלייה ברמות סידן תוך‬
‫תאיות דרך ‪.(169 ,1) IP3‬‬
‫‪14‬‬
‫במסלול העברת האותות של ממתיקים מלאכותיים כגון סכרין ו‪ SC45647 -‬מעורב חלבון ‪ G‬מסוג ‪Gq‬‬
‫המפעיל פוספוליפאז ‪ C‬לשחרור ‪ IP3‬ו‪ .DAG -‬שיטות של ‪ Calcium imaging‬בפקיעיות טעם מבודדות‬
‫הראו שבניגוד לסוכרים הטבעיים הגורמים לחדירת יוני סידן מחוץ לתוך התא‪ ,‬ממתיקים מלאכותיים‬
‫גורמים לשחרור מאגרים תוך תאיים של יוני סידן‪ ,‬כתוצאה מיצירת ‪.(9) IP3‬‬
‫ממצאים נוספים מסבכים את התמונה‪ :‬לאחר שנמצא שמעכב ל‪ (H89) PKA -‬לא ביטל את התגובה‬
‫לטעם המתוק אלא הגביר אותה‪ ,‬נראה ש‪ PKA -‬איננו מעורב במסלול העברת האותות אלא יותר בתופעת‬
‫האדפטציה )ירידה ברגישות לגירוי לאורך הזמן כאשר גירוי זה מופעל שוב ושוב( )‪ .(173‬ההגברה‬
‫בתגובה התקבלה עבור ממתיקים טבעיים ומלאכותיים כאחד‪ .‬לעומת זאת עיכוב ‪ PKC‬לא השפיע על‬
‫התגובה לסוכרוז אבל ביטל את התגובה לממתיקים מלאכותיים‪ :‬ממצא זה מחזק את ההשערה על פיה‬
‫מתקיימים מסלולים שונים לממתיקים טבעיים ומלאכותיים‪ .‬בנוסף‪ ,‬בדיקת שליחים משניים בזמנים‬
‫קצרים של מילישניות לאחר הפעלת הטעמן הראתה שהנוקלאוטיד ‪ cGMP‬משחק תפקיד בגירוי הראשוני‬
‫)‪ (75-250 ms‬של תהליך הטרנסדוקציה‪ ,‬כאשר ‪ cAMP‬מופיע רק מאוחר יותר )‪.(88‬‬
‫‪ - 1.4.3‬הטעם האוממי )חומצות אמינו(‬
‫"אוממי" שמשמעותו ביפנית "טעים מאוד"‪ ,‬הינו טעם דומיננטי במזונות המכילים חומצות אמינו )מוצרי‬
‫בשר וגבינות ישנות( ובמיוחד ‪-L‬מונוסודיום גלוטמאט )‪ .(MSG‬המשמעות הביולוגית הרבה של הטעם‬
‫הזה היא בכך שהוא מספק לגוף אינדיקציה על תכולת חומצות אמינו חיוניות במזון‪ .‬הוכח שנוכחות של‬
‫'‪-5‬ריבונוקלאוטידים כמו ‪ IMP‬ו‪ GMP -‬מגבירה את עוצמת הטעם האוממי )‪.(90 ,79‬‬
‫בעקבות גילוי הקולטנים לטעם המתוק‪ ,‬נמצאו הקולטנים לטעם האוממי השייכים למשפחת ה‪.T1Rs -‬‬
‫כפי שכבר צוין‪ ,‬קולטנים ממשפחה זו מופעלים דרך הטרודימריזציה‪ :‬בניגוד לקולטן לטעם המתוק‬
‫המורכב מ‪ T1R3 -‬ו‪ ,T1R2 -‬הקולטן לטעם האוממי מורכב מ‪ T1R3 -‬ו‪ ,(118) T1R1 -‬והוכח שצירוף‬
‫זה הינו ספציפי לחומצות האמינו בעלות מבנה איזומרי ‪ .L‬מיפוי אזורי הקשירה של הקולטן‬
‫‪ T1R1/T1R3‬אשר נעשה במקביל לזה של הקולטן למתוק‪ ,‬גילה שקשירת חומצות האמינו מתבצעת ככל‬
‫הנראה באזור החוץ תאי )‪ (VFTM‬של ‪ .(178) T1R1‬נמצא כי התגובה לחומצות האמינו מוגברת‬
‫בנוכחות ‪ ,(90) IMP‬אפילו בריכוזים נמוכים ביותר של הריבונוקלאוטיד‪ .‬ההשערה היא ש‪ IMP -‬נקשר‬
‫אף הוא לקולטן באזור שאינו מתחרה על קישור חומצת האמינו ומגביר את זמינות הליגנד )‪ (167‬או את‬
‫האפיניות שלו )‪ .(91‬על פי ‪ IMP ,(178) Xu et al.‬צפוי להיקשר ל‪ ,T1R1 -‬לאור העובדה שנוכחותו‬
‫לא השפיעה על עוצמת התגובה של הקולטן המתוק ‪ T1R2/T1R3‬לציקלמאט‪.‬‬
‫זמן רב לפני גילוי קולטן ה‪ ,T1R1/T1R3 -‬חוקרים חשדו במעורבות של קולטנים יונוטרופיים ‪(ligand-‬‬
‫)‪ gated ionic channels‬ומטבוטרופיים )קולטנים ממשפחת ה‪(G-protein-coupled receptors -‬‬
‫בחישת הטעם האוממי‪ .‬הקולטן הראשון שהוכחה מעורבותו בטעם האוממי היה קולטן מטבוטרופי בשם‬
‫‪ (25) mGluR4‬המשתייך למשפחת ה‪ mGluR -‬הידועה זמן רב בתאי העצב )‪ .(30‬קולטנים‬
‫יונוטרופיים‪ ,‬המאפשרים זרימת יונים לאחר קישור ספציפי של ליגנד‪ ,‬מתבטאים אף הם בלשון‪ ,‬אך לא‬
‫‪15‬‬
‫הוכח עד היום שביטוי זה הינו ספציפי לתאי טעם ולכן מעורבותם בחישת הטעם האוממי נשארה‬
‫מעורפלת‪ .‬בדומה לטעם המר וטעם המתוק‪ ,‬מסלול הטרנסדוקציה העיקרי בחישת הטעם האוממי הינו‬
‫מסלול ה‪ IP3 ,PLCβ2 -‬ו‪ .(183) TRPM5 -‬למרות זאת‪ ,‬מחקרים אחרים מראים שחלק מחומצות‬
‫האמינו מעלה את רמות ה‪ cAMP -‬במקביל ל‪ ,IP3 -‬לעומת חומצות אחרות אשר מפעילות ישירות‬
‫תעלות יוניות‪ ,‬ביניהן תעלות סידן‪.‬‬
‫‪ - 1.4.4‬הטעם המלוח‬
‫הטעם המלוח והטעם החמוץ מאופיינים בכך שהם נובעים מנוכחות יונים במזון‪ .‬חישת הטעם המלוח‬
‫מספקת אינפורמציה על תכולת ‪ NaCl‬ומינרלים נוספים במזון ולכן משרתת את שימור ההומאוסטאזיס‬
‫של יונים ומים בגוף‪ .‬למרות שמספר מלחים מעוררים את הטעם המלוח )‪,(NaCl, KCl, LiCl, NH4Cl‬‬
‫המלח ‪ NaCl‬הוא האופייני ביותר ליונקים‪ ,‬בגלל הרעב הספציפי כלפיו‪ .‬כיום ידועים שני מנגנונים לחישת‬
‫הטעם המלוח‪ :‬מסלול ספציפי לנתרן )‪ (Na+-specific pathway‬ומסלול שאינו ספציפי ‪(Na+-‬‬
‫)‪.nonspecific pathway‬‬
‫במנגנון הראשון‪ ,‬שנחקר בהרחבה‪ ,‬מתרחשת כניסה של יוני נתרן דרך תעלות נתרן הרגישות ל‪-‬‬
‫‪ (Amiloride sensitive sodium channels) amiloride‬הנקראות בשם מקוצר ‪ASSC or EnaC‬‬
‫)‪ .(58 ,40‬תעלות אלה הינן אפיקליות ומורכבות משלוש תת‪-‬יחידות כאשר אחת מהן לפחות מושפעת‬
‫מההורמון הסטרואידי אלדוסטרון )‪ .(95‬התעלה מתפקדת כקולטן לטעם המלוח ע"י כך שהיא נפתחת‬
‫באופן ספציפי בנוכחות יוני נתרן בחלל הפה ומאפשרת זרימת נתרן פנימה ועקב כך לדפולריזציה של‬
‫הממברנה הבזולטרלית הגוררת אירועים סינפטיים נוספים‪ .‬למרות שמעורבות ה‪ ASSCs -‬בחישת הטעם‬
‫המלוח ברורה‪ ,‬הרגישות לאמילורייד בבני אדם מוגבלת ופחות משמעותית‪ ,‬דבר המרמז על מעורבות של‬
‫מסלול נוסף שאיננו רגיש לאותו מעכב‪ .‬הסברים אפשריים הם נוכחות תעלות יוניות בלתי ספציפיות‬
‫בממברנה האפיקלית של תאי הטעם )‪ (41‬או דיפוזית יוני נתרן דרך ה‪ tight junctions -‬והפעלת תעלות‬
‫נתרן בצד הבזולטרלי של התאים )‪ ,(181 ,157‬דבר הגורם לדפולריזציה‪ .‬מחקרים פיזיולוגיים מראים‬
‫שתעלות ‪ ASSCs‬חדירות ליוני נתרן‪ ,‬ליתיום ופרוטונים אך לא לאשלגן‪ .‬לעומת זאת‪ ,‬חישת מלחי אשלגן‬
‫ואמוניום מתרחשת באופן מקביל למסלול הלא ספציפי לחישת מלחי נתרן )‪ .(162‬למרות שחישת הטעם‬
‫המלוח נחקרה בהרחבה כבר עשרות שנים‪ ,‬עדיין אין לנו הבנה מלאה של כלל התהליכים המתרחשים‬
‫והתורמים לה‪.‬‬
‫‪ - 1.4.5‬הטעם החמוץ‬
‫הטעם החמוץ‪ ,‬המאפשר בטבע לזהות מזונות מקולקלים ולמנוע צריבה ע"י חומצות‪ ,‬יכול להיות נעים או‬
‫נסבל כאשר הוא חלש אך נהיה דוחה כאשר הוא חזק‪ .‬הגירוי העיקרי האחראי על הטעם החמוץ הינו‬
‫כניסת פרוטונים לתוך תא הטעם‪ ,‬דבר המשפיע על ה‪ pH -‬וגורם כך לפוטנציאל פעולה )‪ .(84‬שני‬
‫מסלולים אפשריים מעורבים בחישת הטעם החמוץ‪ :‬במסלול הראשון כניסת פרוטונים לתוך התא‬
‫‪16‬‬
‫מתאפשרת הודות לפתיחת תעלות רגישות אמילורייד )‪ (51) (ASSCs‬ובמסלול השני מעורבות תעלות‬
‫תלויות פרוטונים הנפתחות רק בנוכחות פרוטונים בסביבה‪ ,‬ביניהן תעלות אשלגן בסלמנדרה האמריקנית‬
‫‪ ,(84) Necturus‬תעלות קטיונים בלתי ספציפיות ממשפחת ה‪ ,(171) ENaC/Deg channels -‬ותעלות‬
‫קטיונים המופעלות ע"י דפולריזציה ונפתחות ע"י קשירת נוקלאוטידים ‪(Hyperpolarized-activated‬‬
‫)‪ .(161) nucleotide-gated cation channel‬בנוסף‪ ,‬נראה שפרוטונים יכולים לחדור דרך ה‪tight -‬‬
‫‪ junctions‬וכך למלא את החלל של פקיעית הטעם )‪ .(39‬כתוצאה מתנועת הפרוטונים מחלל הפה לתוך‬
‫הפקיעית‪ ,‬ובהמשך לתאי הטעם‪ ,‬השינויים ב‪ pH -‬יכולים להשפיע על מערכות תוך תאיות רבות ביניהן‬
‫תעלות יוניות שונות ומספר מסלולי טרנסדוקציה‪ .‬לאחרונה‪ ,‬מחקרים הראו כי לתעלה ‪PKD2L1‬‬
‫חשיבות רבה בחישת הטעם החמוץ )‪ .(65‬תעלה זו מתבטאת בכל סוגי פקיעיות הטעם אך בתאים שונים‬
‫מאלה המבטאים את הקולטנים לטעם המר )‪ (T2Rs‬או לטעם המתוק )‪ .(T1Rs‬שימוש בעכברים‬
‫מהונדסים גנטית הראה כי ‪ knock-out‬של תעלה זו בעכברים במטל באופן ספציפי את חישת הטעם‬
‫החמוץ ולא אף טעם אחר‪ .‬המגוון הרחב של מסלולים שנמצאו עבור הטעם החמוץ מדגיש את מורכבות‬
‫מסלול טרנסדוקצית הטעם החמוץ‪.‬‬
‫‪ - 1.5‬העברת אותות בין‪-‬תאית וקידוד הטעם במערכת הפריפרית‬
‫‪ - 1.5.1‬העברת המידע אל תאי העצב לאחר גירוי קולטני הטעם‬
‫עד לפני כמה שנים‪ ,‬סברו החוקרים שלאחר גירוי קולטן הטעם והפעלת מסלול העברת האותות‪ ,‬תא‬
‫הטעם מעביר את המידע אל סיב עצב ע"י קיום סינפסה ושחרור נוירוטרנסמיטור‪ ,‬בדומה למערכות‬
‫עצביות ידועות אחרות כגון חוש הריח )‪ .(113‬מחקרים אשר נערכו בשנים האחרונות מציירים תמונה‬
‫מורכבת הרבה יותר‪.‬‬
‫מבחינה היסטורית‪ ,‬התאים בפקיעית הטעם מוספרו מ‪ I -‬עד ‪ IV‬על פי מאפיינים ציטולוגיים‪ .‬התאים מסוג‬
‫‪ I‬הינם תאי "תמיכה"‪ ,‬ותאים מסוג ‪ ,IV‬הנקראים גם "תאים בזלים"‪ ,‬מהווים מקור לשאר סוגי התאים‬
‫שבפקיעית הטעם‪ .‬שני סוגי תאים אלו אומנם חשובים לתפקוד מלא של פקיעית הטעם אך תפקידם‬
‫בעיבוד המידע לא נחקר עד כה‪ .‬התאים מסוג ‪ II‬ו‪ III -‬מהווים את תאי הטעם המבטאים את הקולטנים‬
‫לטעם והתאים הסינפטיים‪ ,‬בהתאמה )‪.(143‬‬
‫שני מחקרים אשר פורסמו במקביל הראו שתאי הטעם המבטאים את הקולטנים לטעם אינם מבטאים‬
‫חלבונים אשר ממוקמים במערכות אחרות באזור הפרסינפטי של תא עצב‪ .‬החוקרים הראו שהחלבונים‬
‫‪ synaptin II ,SNAP25‬ו‪ ,NCAM -‬אשר מעורבים במנגנון שחרור ווסיקולות מלאות‬
‫נוירוטנסמיטורים לחלל הסינפטי אינם מתבטאים בתאים מסוג ‪ II‬אלא בתאים מסוג ‪.(180 ,36 ,28) III‬‬
‫ממצאים אלו מציעים מנגנון בו תאי הטעם עצמם אינם מקיימים תקשורת ישירה עם תאי עצב אלא עם‬
‫התאים מסוג ‪ ,III‬ואלה הם המעבירים את המידע לתאי העצב )איור ‪.(1.4‬‬
‫בעקבות מחקרים אשר הראו שחרור של הנוירוטרנסמיטור סרוטונין לאחר גירוי תאי טעם )‪(67-69‬‬
‫וביטוי ספציפי של הקולטן לסרוטונין ‪ (5-hydroxytryptamine) 5-HT‬בתאי הטעם )‪,(81 ,80‬‬
‫‪17‬‬
‫סרוטונין הוצע להיות אחד הנוירוטרנסמיטורים המעורבים בהעברת האינפורמציה אל תאי העצב‪ .‬אך‬
‫לאור העובדה שעכברי ‪ knock-out‬ל‪ 5-HT -‬לא הראו שינוי התנהגותי כלשהו )‪ ,(45‬נראה שסרוטונין‬
‫משחק תפקיד שונה‪ .‬לעומת זאת‪ (45) Finger et al. ,‬הראו שמולקולת ה‪ ATP -‬מהווה נוירוטרנסמיטור‬
‫אשר מעורר ישירות את תאי עצב הראשוניים המעצבבים את פקיעית הטעם ‪(primary afferent‬‬
‫)‪ .nerves‬בנוסף‪ ,‬הקולטנים היונוטרופיים ל‪ P2X2 ,ATP -‬ו‪ ,P2X3 -‬מתבטאים ספציפית בתאי עצב‬
‫אלו )‪ (12‬ו‪ knock-out -‬בהם מחליש באופן דרמטי את התגובה לטעמנים מרים‪ ,‬מתוקים ואוממים )‪.(45‬‬
‫הגילוי ש‪ ATP -‬משוחרר מתאים מסוג ‪ II‬וששחרור סרוטונין מתבצע בתאים מסוג ‪ III‬הביא למודל בו‬
‫לאחר גירוי הקולטנים לטעם ע"י טעמנים‪ ,‬תאי הטעם משחררים ‪ ATP‬בצורה פרה‪-‬קרינית אשר יהווה‬
‫מצד אחד נוירוטרנסמיטור ישיר לתאי העצב‪ ,‬אך ייתכן גם לתאים מסוג ‪ .III‬התאים מסוג ‪ ,III‬לעומת‬
‫זאת‪ ,‬משחררים סרוטונין להעברת המידע לתאי עצב המעצבבים אותו )איור ‪.(1.4‬‬
‫איור ‪ – 1.4‬דרכי תקשורת בין תאים בתוך פקיעית הטעם‪.‬‬
‫לאחר גירוי הקולטנים לטעם אשר בקצה האפיקלי של תאי הטעם )תאים מסוג ‪ ATP ,(II‬משוחרר בצורה פרה‪-‬‬
‫קרינית ומהווה נוירוטרנסמיטור לתאי העצב )‪ (sensory afferent fibers‬אך גם לתאים מסוג ‪ .III‬בתגובה‪ ,‬התאים‬
‫מסוג ‪ III‬משחררים סרוטונין להעברת המידע לתאי עצב המעצבבים אותו‪ .‬לקוח מתוך )‪.(143‬‬
‫‪ - 1.5.2‬תתי אוכלוסיות שונות של תאי טעם מבחינות בין הטעמים השונים‬
‫ישנה מחלוקת בספרות לגבי יכולתו של תא טעם בודד לחוש במקביל במספר טעמים )תופעה הקרויה‬
‫בשם ‪ ,(multiple modalities broadly tuned cells‬או שמא מתקיימות תתי אוכלוסיות שונות של‬
‫תאים‪ ,‬כאשר כל אחת רגישה לטעם אחר )‪ .(single taste modalities tuned cells‬בנוסף‪ ,‬מנגנון‬
‫העברת המידע מתא הטעם אל המוח מהווה גם הוא נושא לדיון מדעי‪ :‬אפשרות ראשונה הינה שסיבי העצב‬
‫מעצבבים באופן ייחודי תאים אשר רגישים לאותו הטעם ולכן מעבירים מידע עבור אחד מן טעמים בלבד‪,‬‬
‫וזהות הטעם נקבעת על פי העצב המעוצבב )‪ .(labeled-line model‬מודל מנוגד מציע שסיבי עצב‬
‫‪18‬‬
‫מעצבבים ללא הבחנה תאי טעם שונים ולכן מעבירים את המידע עבור כל הטעמים ‪(across fiber‬‬
‫)‪ ,model‬וזיהוי הטעם עצמו טמון בעיבוד מידע נוסף אשר טרם פוענח‪.‬‬
‫איור ‪ – 1.5‬קידוד הטעם בפריפריה‪.‬‬
‫כאן מוצגים שני מודלים מנוגדים לקידוד הטעמים בפקיעית הטעם‪ - a .‬במודל זה‪ ,‬התאים מתוכננים להגיב לטעם‬
‫אחד בלבד ומעוצבבים ע"י סיב עצבי ייחודי לכל טעם‪ .‬במקרה זה‪ ,‬אין כל חפיפה בין הטעמים השונים‪ – c ,b .‬שתי‬
‫אפשרויות למודל בו סיבי העצב מעבירים מידע עבור מספר טעמים‪ .‬ייתכן ותאי הטעם רגישים לכל הטעמים‬
‫השונים וכל תא טעם מעוצבב ע"י סיב עצב אחר )‪ (b‬או שכל תא טעם רגיש לטעם אחד בלבד וסיבי העצב‬
‫מעצבבים ללא הבחנה תאים בעלי אופי שונה )‪ .(c‬במקרים אלו‪ ,‬ההבחנה הסופית בין הטעמים השונים תיעשה ע"י‬
‫סיבי העצב או המוח בדרך ייחודית‪ .‬לקוח מתוך )‪.(23‬‬
‫מספר מחקרים אלקטרופיזיולוגיים וניסויי ‪ calcium-imaging‬הראו שתאי טעם מבודדים מסוגלים‬
‫להגיב ליותר מטעם אחד והציעו מודל בו תאי הטעם עצמם מגיבים למספר טעמים וההבחנה בין הטעמים‬
‫נעשית ברמת העברת המידע לסיבים עצביים )‪ .(152 ,141 ,52 ,19‬בנוסף‪ ,‬מחקר בו נעשה ‪knock out‬‬
‫ב‪ gustducin -‬הראה ירידה בתגובה לתרכובות מרות וגם מתוקות )‪ .(176‬מצד שני‪ ,‬מספר רב של‬
‫מחקרים מראים שהקולטנים למר ולמתוק אינם מתבטאים באותם תאים‪ .‬כבר ב‪Hoon et al. ,1999 -‬‬
‫)‪ (62‬הראו שבשלושת סוגי הפפילות‪ T1Rs ,‬ו‪ T2Rs -‬מתבטאים בתתי אוכלוסיות שונות של תאי טעם‪.‬‬
‫בשנים האחרונות‪ ,‬שימוש מרובה בחולדות מהונדסות גנטית אפשר לשפוך אור על נושא זה‪ .‬ניסוי בו‬
‫חולדות הונדסו באופן כזה שהגן ‪ PLCβ2‬יבוטא אך ורק בתאים המבטאים את הקולטנים למר‪ ,‬הראה‬
‫שבאופן סלקטיבי מאוד הטעם המר בלבד חודש )למרות ש‪ PLCβ2 -‬מעורב בחישת הטעמים מר‪ ,‬מתוק‬
‫ואוממי(‪ ,‬ומתוך כך הוסק שהטעמים השונים אינם תלויים באותם תאי הטעם )‪ .(183‬במחקר אחר‪ ,‬קולטן‬
‫לאופיואידים )‪ (κ-opioid receptor RASSL‬בוטא בתאי טעם תחת הפרומוטור של הקולטנים למתוק‪.‬‬
‫החוקרים הראו שהמולקולה ‪ spiradoline‬אשר מהווה ליגנד ל‪ RASSL -‬וחסרת טעם בדרך כלל‪ ,‬הפכה‬
‫למולקולה מתוקה‪ .‬לעומת זאת כאשר ‪ RASSL‬בוטא תחת הפרומוטור לקולטנים מרים‪ ,‬הפכה‬
‫‪ spiradoline‬למרה )‪ .(114‬כמו כן‪ (65) Huang et al. ,‬הראו שהרס ספציפי של תאים אשר מבטאים‬
‫את הקולטנים לאחד הטעמים )מר‪ ,‬מתוק או אוממי( מבטל ייחודית את הטעם עצמו מבלי לפגוע בטעמים‬
‫‪19‬‬
‫האחרים‪ .‬מחקרים אלו ביחד עם רבים נוספים מהווים עדויות יותר ויותר מבוססות התומכות במודל ה‪-‬‬
‫‪.labelled line‬‬
‫‪ - 1.6‬מנגנון סיום העברת האותות )דסנסיטיזציה( של קולטנים‬
‫מסוג ‪GPCR‬‬
‫‪ - 1.6.1‬תהליך הדסנסיטיזציה של קולטני ה‪GPCRs -‬‬
‫משפחת ה‪ ,(G-protein-coupled receptors) GPCRs -‬לה משתייכים קולטני הטעם‪ ,‬הינה המשפחה‬
‫הגדולה ביותר של קולטנים המתבטאים על פני הממברנה הפלסמטית של התא‪ .‬לאחר קשירת הליגנד‬
‫לקולטן‪ ,‬קיימים מספר מסלולי העברת אותות אפשריים‪ ,‬התלויים בסוג חלבון ה‪ G -‬המוצמד לקולטן‬
‫עצמו‪ ,‬ומערבים שפעול )או עיכוב( של אנזימים ציטוזוליים )אדניליל ציקלאז‪ ,‬פוספודיאסטראזות‪,‬‬
‫פוספוליפאזות ועוד( אשר מעבירים את ה"מידע" הלאה בתוך ציטוזול התא‪ .‬כל המערכות בהן מעורבים‬
‫קולטנים מסוג ‪ GPCR‬מראות הסתגלות בעוצמת תגובתן לסביבה‪ :‬רגישות התא לסיגנל מסוים בדרך כלל‬
‫משתנה על פי העוצמה ומשך הסיגנל‪ .‬מטרת מנגנון אדפטציה זה הינו למנוע תגובת יתר לסיגנל אינטנסיבי‬
‫או ממושך מדי באופן המסכן את מערכות הגוף‪ .‬כתוצאה מחשיפה חוזרת ונשנית לליגנד או חשיפה‬
‫לריכוזי ליגנד גבוהים‪ ,‬קולטני ה‪ GPCR -‬עוברים תהליך מורכב הנקרא "דסנסיטיזציה"‬
‫)‪ (desensitization‬אשר מוריד את רגישותו של הקולטן ואת יכולתו להגיב לליגנדים סביבתיים‪ .‬אחד‬
‫השלבים העיקריים של תהליך זה הינו זרחון הקולטן בקצה ה‪ C -‬טרמינלי וב‪ loop -‬השלישי התוך‪-‬תאי‬
‫שלו ע"י קינאזות ממשפחת ה‪ serine/threonine kinases -‬הנקראות ‪(G-protein-coupled GRKs‬‬
‫)‪) receptor kinases‬איור ‪ .(1.5‬בעקבות זרחון הקולטן ע"י ה‪ ,GRKs -‬החלבון ‪ β-arrestin‬מונע אל‬
‫הממברנה ונקשר ספציפית לאתרים המזורחנים של הקולטן‪ :‬קשירה זו תמנע מנקודה זו ואילך כל‬
‫אפשרות לשפעל חלבוני ‪ G‬נוספים‪ ,‬ובכך מסמנת את תחילת כיבוי מסלול העברת האותות‪ .‬על מנת‬
‫להרחיק סופית את הקולטן מן הממברנה הפלסמטית וכך למנוע ממנו כל שפעול אפשרי נוסף‪ ,‬מתקיים‬
‫תהליך נוסף הקרוי בשם אינטרנליזציה )‪ .(internalization‬לקומפלקס קולטן‪ β-arrestin/‬נקשרים עתה‬
‫מספר רב של חלבונים נוספים‪ ,‬כגון ‪ AP2‬ו‪ ,clathrin -‬היוצרים יחד קומפלקס ענק אשר גורם להחדרתו‬
‫של הקולטן לתוך ציטוזול התא דרך יצירת ווסיקולה בשם ‪ .clathrin-coated pit‬לאחר האינטרנליזציה‪,‬‬
‫הקולטן יכול לעבור תהליך של מחזור לממברנה הפלסמטית‪ ,‬או לחילופין עיכול אנזימטי לאחר איחוי‬
‫ווסיקולת ה‪ clathrin-coated pit -‬עם ליזוזום‪.‬‬
‫הוכח במספר מחקרים שביטול או פגיעה בפעילותם של ה‪ (142 ,47 ,46) GRKs -‬וכן של ה‪β- -‬‬
‫‪ (15 ,14) arrestin‬גורמים לפעילות יתר של הקולטן ולחוסר יכולת של המערכת הנחקרת "להירגע"‬
‫לאחר גירוי‪.‬‬
‫זרחון של קולטן ה‪ GPCR -‬ע"י ‪ GRKs‬לאחר שפעולו ע"י ליגנד נקרא בספרות "דסנסיטיזציה‬
‫הומולוגית" ונבדל מ‪"-‬הדסנסיטיזציה ההטרולוגית" אשר מתארת זרחון של הקולטן ע"י הקינאז ‪,PKA‬‬
‫‪20‬‬
‫ובמקרים מסוימים גם ע"י ‪ PKA .(150 ,38 ,26) PKC‬ו‪ PKC -‬משתייכים אף הם למשפחת ה‪-‬‬
‫‪ serine/threonine kinases‬אך מזרחנים קולטנים גם כאשר הם אינם תפוסים ע"י ליגנד ובעמדות‬
‫שונות משל ה‪.GRKs -‬‬
‫מעבר לתפקידו בשיתוק הקולטן והרחקת הקולטן מהממברנה הפלסמטית‪ ,‬לזרחון הקולטן ע"י ‪ GRKs‬ו‪-‬‬
‫‪ PKA‬השלכות רבות לגבי מסלולי העברת אותות המשופעלים מאוחר יותר‪ ,‬אשר יפורטו בפרק ‪.1.6.4‬‬
‫עי תהליך הדסנסיטיזציה ואינטרנליזציה‪.‬‬
‫איור ‪ – 1.5‬בקרת פעילותו של קולטן ‪" GPCR‬‬
‫לאחר קשירת הליגנד )מסומן ב‪ ,(∗ -‬תת‪-‬היחידות של חלבון ה‪ G -‬משתחררות ומשפעלות את מסלול העברת‬
‫האותות )שלב ‪ .(1‬לאחר מכן‪ GRKs ,‬מזרחנים את הקולטן התפוס ע"י ליגנד וגורמים כך לקשירת ‪β-arrestin‬‬
‫לקצה ה‪-C -‬טרמינלי שלו )שלב ‪ .(2‬הקומפלקס קולטן‪ β-arrestin/‬הופך מטרה לקשירה למספר חלבונים ביניהם‬
‫‪ (AP-2) adapter protein 2 ,clathrin‬ו‪ -‬פוספואינוזיטידים )‪ ,(PIP2‬אשר גורמים להחדרת הקולטן לציטוזול‬
‫התא )שלב ‪ .(3‬לאחר האינטרנליזציה‪ ,‬הקומפלקס קולטן‪ β-arrestin/‬הינו אחראי לשפעול של מספר מסלולי‬
‫העברת אותות )שלב ‪ (4‬ולאחר מכן יכול לעבור דגרדציה )שלב ‪ (5a‬או מחזור חזרה לממברנה הפלסמטית )שלב‬
‫‪ .(5b‬לקוח מתוך )‪.(112‬‬
‫‪21‬‬
‫‪ - 1.6.2‬מאפיינים מבניים של קינאזות ממשפחת ה‪GRKs -‬‬
‫משפחת ה‪ GRKs -‬מורכבת משבע קינאזות אשר מזהות באופן ייחודי קולטנים תלויי חלבון ‪G‬‬
‫)‪ (GPCRs‬ומזרחנות באופן ספציפי את חומצות האמינו סרין וטראונין‪ .‬משפחה זו מחולקת לשלוש תת‬
‫משפחות‪ :‬א( לתת המשפחה הראשונה משתייכים ‪ GRK1‬ו‪ ,GRK7 -‬אשר מתבטאים יחודית במערכת‬
‫הראייה‪ ,‬ב( לתת המשפחה השנייה‪ ,‬אשר מכונה גם משפחת הקינאזות של הקולטן הבטא‪-‬אדרנרגי‬
‫)‪ (βARK‬משתייכים ‪ GRK2‬ו‪ ,GRK3 -‬ולבסוף ג( משפחת ה‪ GRK4 -‬לה משתייכים ‪,GRK4‬‬
‫‪ GRK5‬ו‪ .GRK6 -‬ל‪ GRKs -‬השונים מבנה שמור למדי המורכב משלושה אזורים‪ :‬מרכז החלבון‬
‫)‪ ∼270‬חומצות אמינו( בעל הפעילות הקטליטית )זרחון חומצות אמינו סרין וטראונין( שמור בתוך‬
‫משפחת ה‪ ∼45%) serine/threonine kinases -‬הומולוגיה(‪ .‬הקצוות ה‪-N -‬טרמינליים )‪ ∼185‬חומצות‬
‫אמינו( מעורבים בזיהוי חלבון המטרה )הסובסטרט( ומראים הומלוגיה נמוכה בין האנזימים השונים‬
‫)‪ .(∼27%‬הקצוות ה‪-C -‬טרמינליים אינם מראים כלל הומולוגיה‪ ,‬הם בעלי אורך משתנה באנזימים שונים‬
‫)‪ ∼105-230‬חומצות אמינו(‪ ,‬וקובעים את מיקום האנזים ותנועתו בתא בכך שהם מקיימים אינטראקציה‬
‫עם ליפידים ו‪/‬או חלבונים ממברנליים שונים‪ .‬הקצה ה‪-C -‬טרמינלי של ‪ GRK2‬ו‪ GRK3 -‬מכיל אזור‬
‫הנקרא ‪ (PH) pleckstrin homology domain‬אשר מאפשר קשירה לפוספוליפיד ‪ PIP2‬ולתת‪-‬‬
‫היחידות ‪ βγ‬של חלבוני ה‪ .G -‬מכיוון ש‪ GRK2 -‬ו‪ GRK3 -‬הינם בעיקר חלבונים ציטוזוליים נראה‬
‫שמטרתן של אינטראקציות מסוג זה לאפשר הימצאות של חלק מן ה‪ GRKs -‬קרוב לממברנה בטרם‬
‫הופעל הקולטן‪ GRK4 .‬ו‪ GRK6 -‬עוברים פלמיטואילציה )‪ (palmitoylation‬אשר גורמת להימצאותם‬
‫הקבועה בממברנה הפלסמטית‪ .‬לעומתם‪ GRK1 ,‬ו‪ GRK7 -‬הינם בעיקר ממברנליים הודות לפרנזילציה‬
‫)‪ (farnesylation‬בקצה ה‪-C -‬טרמינלי שלהם‪ GRK5 .‬נמצא אף הוא קשור לממברנה באופן קבוע‬
‫הודות לאתר בקצה ה‪-N -‬טרמינלי שלו הקושר ‪ PIP2‬ולאתר בקצה ה‪-C -‬טרמינלי הקושר פוספוליפידים‬
‫באופן קונסטיטוטיבי‪.‬‬
‫לעומת ‪ ,GRK4 ,GRK1‬ו‪ GRK7 -‬אשר מתבטאים באופן יחודי ברקמות ספציפיות )‪ GRK1‬ו‪-‬‬
‫‪ GRK7‬מתבטאים אך ורק ב‪ retinal rods -‬ו‪ ,retinal cones -‬כאשר ‪ GRK4‬נמצא בעיקר ברקמות‬
‫הצרבלום במוח‪ ,‬בכליה ובאשכים(‪ GRK5 ,GRK3 ,GRK2 ,‬ו‪ GRK6 -‬מתבטאים בכמעט כל רקמות‬
‫הגוף )‪ .(ubiquitously expressed‬מסיבה זו‪ ,‬ארבעת הקינאזות האלו הינן אחראיות על וויסות המגוון‬
‫הרחב ביותר של מערכות פיזיולוגיות )‪.(135‬‬
‫‪ - 1.6.3‬בקרה על פעילות ‪GRK2‬‬
‫‪ GRK2‬הינו האיזופורם הנחקר ביותר בספרות מכל משפחת ה‪ .GRKs -‬זהו ה‪ GRK -‬היחיד אשר‬
‫‪ knock-out‬בו גורם ל‪ 100% -‬מוות עוברי )‪ ,(70‬כאשר הוא נמצא מעורב בתהליך הדסנסיטיזציה של‬
‫המגוון הרחב ביותר של קולטני ‪ ,GPCR‬שהידוע מביניהם הינו הקולטן ה‪-β2 -‬אדרנרגי‬
‫‪(β2-‬‬
‫)‪ GRK2 .adrenergic receptor – β2AR‬נמצא מעורב בתפקוד תקין של המערכת הקרדיווסקולרית‪,‬‬
‫‪22‬‬
‫המערכת האימונית‪ ,‬מערכת העצבים‪ ,‬התפתחות העצם ועוד )‪ .(135‬בקרת פעילותו של ‪ GRK2‬הינה‬
‫תהליך מורכב המשלב אינטראקציות תוך‪-‬מולקולריות‪ ,‬קשירה לחלבונים ציטוזוליים שונים )כגון תת‪-‬‬
‫היחידה ‪ βγ‬של חלבון ‪ (G‬וזרחון על ידי קינאזות אחרות )‪.(140‬‬
‫איור ‪ – 1.6‬משפחת ה‪.GRKs -‬‬
‫קינאזות ממשפחת ה‪ GRKs -‬חולקו לתתי משפחות על פי הומולוגיה בין הרצפים והשינויים שלאחר תרגום‬
‫החלבון בקצה ה‪-C -‬טרמינלי )‪ farnesylation‬עבור ‪ GRK1‬ו‪ GRK7 -‬לעומת ‪ palmitoylation‬עבור ‪GRK4‬‬
‫ו‪ .(GRK6 -‬לקוח מתוך )‪.(128‬‬
‫אחד ממנגנוני הבקרה על ה‪ GRKs -‬מתווך על ידי קינאזות ממשפחת ה‪.serine/threonine kinases -‬‬
‫זרחון ‪ GRK2‬בעמדות של סרינים ספציפיים יכול‪ ,‬במצבים שונים‪ ,‬לגרום לעיכוב או להגברת פעילות‬
‫האנזים‪ .‬מחקרים הראו שזרחון ‪ GRK2‬בעמדת ‪ Ser670‬ע"י הקינאז ‪ ERK‬ממשפחת ה‪ MAPK -‬גורם‬
‫לעיכובו‪ ,‬ע"י כך שאינו מאפשר את קשירתו ל‪ .(43) Gβγ -‬לעומת זאת זרחון בעמדת ‪ Ser685‬ע"י‬
‫‪ PKA‬גורם להגברת הפעילות‪ ,‬על ידי כך שנחשפים אזורים המעורבים בקשירה ל‪.(29) Gβγ -‬‬
‫מנגנון בקרה נוסף אשר התגלה לאחרונה מתווך על ידי קינאז בשם ‪ ,c-Src‬ממשפחת ה‪tyrosine -‬‬
‫‪ ,kinases‬ומערב זרחון של ‪ GRK2‬בעמדות טירוזינים שונות בקצה ה‪-N -‬טרמינלי )‪ .(151 ,44‬מחקרים‬
‫הראו שזרחון מסוג זה מגדיל את האפיניות של ‪ GRK2‬כלפי חלבונים ממברנליים )קולטנים( וכן‬
‫ציטוזוליים כגון ‪ Gαq‬ו‪ .Gα11 -‬הוכח שאינטראקציה מסוג ‪ Gαq/GRK2‬גורמת לעיכוב של חלבון ה‪-‬‬
‫‪ .(35) Gq‬לכן‪ ,‬זרחון ה‪ GRK -‬ע"י ‪ c-Src‬גורם לדיכוי מזורז של מסלול העברת האותות ע"י עיכוב‬
‫‪23‬‬
‫מסלול ה‪ Gαq/PLCβ2 -‬במקביל לדסנסיטיזציה מוגברת של קולטן ה‪ .GPCR -‬בקרה מסוג זה הינה‬
‫ספציפית ל‪ GRK2 -‬ולא נמצאה ב‪ GRKs -‬אחרים כגון ‪ GRK5‬או ‪.GRK6‬‬
‫‪ - 1.6.4‬שפעול מסלולי העברת האותות לאחר הדסנסיטיזציה של קולטני ה‪GPCRs -‬‬
‫במשך תקופה ארוכה‪ ,‬נחשב תהליך הדסנסיטיזציה של קולטני ה‪ GPCRs -‬לתהליך אשר מטרתו היחידה‬
‫הייתה כיבוי העברת האותות לאחר שפעול הקולטן‪ .‬בשנים האחרונות‪ ,‬מחקרים רבים הראו שלא כך‬
‫המצב‪ :‬ישנן היום ראיות מוצקות לכך שתהליך הדסנסיטיזציה מעורר בעצמו מסלולי העברת אותות‬
‫מאוחרים יותר‪ ,‬כאשר העיקרי מביניהם הינו מסלול ה‪(Mitogen-activated protein MAPK -‬‬
‫)‪.(100 ,99 ,92) kinases‬‬
‫ישנן שתי דרכים דרכן קולטן ה‪) β2AR -‬לגביו נעשו רוב המחקרים בנושא( גורם לשפעול של מסלול ה‪-‬‬
‫‪ :MAPK‬אחת התלויה בזרחון הקולטן ע"י ‪ (PKA dependent) PKA‬והשנייה התלויה בזרחון הקולטן‬
‫ע"י ‪ GRK‬וקשירת ‪ β-arrestin‬אליו )‪.(β-arrestin dependent‬‬
‫גירוי הקולטן ה‪ β2AR -‬גורם לשפעול ושחרור חלבון ‪ Gs‬וכך לשפעול אדניליל ציקלאז‪ ,‬היווצרות‬
‫השליח המשני ‪ cAMP‬ושפעול ‪ PKA .PKA‬עצמו יכול לזרחן בחזרה את הקולטן ה‪) β2AR -‬כמתואר‬
‫בפרק ‪ .(1.6.1‬כתוצאה מזרחון זה‪ ,‬האפיניות של הקולטן לחלבון ‪ Gs‬יורדת לטובת אפיניות גדולה יותר‬
‫לחלבון ‪ .(182 ,32) Gi‬נמצא שתת‪-‬היחידה ‪ βγ‬המשתחררת מחלבון ה‪ Gi -‬מסוגלת לשפעל את מולקולת‬
‫ה‪ ,Ras -‬אשר משפעל את ‪ c-Src‬ומכאן את מסלול ה‪ ,MAPK -‬עד לקינאזות ‪ ,p42/44‬הידועות גם‬
‫בשם ‪ .(98 ,13) ERK1/2‬שפעול זה של ‪ ERK1/2‬דרך ‪ PKA‬הינו מהיר למדי וקורה בפחות מ‪2 -‬‬
‫דקות‪.‬‬
‫בנוסף‪ ,‬נמצא שהקומפלקס של הקולטן המזורחן ע"י ‪ GRK‬יחד עם ה‪ β-arrestin -‬מסוגל לשפעל גם הוא‬
‫את ‪ c-Src‬ולכן גם הוא גורם לשפעול מסלול ה‪ .(97) MAPK -‬שפעול של ‪ ERK1/2‬בדרך זו נראה‬
‫מאוחר יותר יחסית לשפעול ע"י ‪) PKA‬היות וזרחון הקולטן ע"י ‪ GRK‬וקשירת ‪ β-arrestin‬אליו הינו‬
‫תהליך ארוך יותר( ‪ ,‬אך קיים לזמן ארוך הרבה יותר )עד ‪ 30-45‬דקות( )‪ .(155‬מחקרים הראו ששפעול‬
‫‪ ERK1/2‬בדרך זו הינה תלויה בחוזק האינטראקציה בין הקולטן ל‪ (87) β-arrestin -‬אשר תלוי בעצמו‬
‫בזהות חומצות האמינו המזורחנות ע"י ה‪ GRKs -‬השונים )‪.(155‬‬
‫‪ - 1.7‬חשיבות המחקר ומטרת העבודה‬
‫בשנים האחרונות עלתה בעולם המערבי צריכת הסוכר בצורה ניכרת‪ ,‬דבר המגביר את הסיכון והרגישות‬
‫למחלות כגון השמנה‪ ,‬יתר לחץ דם‪ ,‬סכרת וכו'‪ .‬פתרון אפשרי לבעיה זו הוא מציאת ממתיק מלאכותי בעל‬
‫טעם זהה לסוכר טבעי אך במהותו חסר קלוריות‪ .‬טרם נמצא ממתיק מלאכותי כזה שמתיקותו וטעמו יידמו‬
‫לאלה של סוכרים כגון סוכרוז‪ ,‬הנחשב לממתיק אופטימלי‪ .‬בנוסף‪ ,‬צריכת ירקות ופירות מסוימים בעלי‬
‫טעם מר כגון חסה‪ ,‬ברוקולי‪ ,‬כרוב‪ ,‬כרובית‪ ,‬אשכוליות איננה עולה עקב טעם חזק הנתרם ע"י פנולים‬
‫‪24‬‬
‫ותרכובות אחרות )חלקן הגדול בעלות ערך תזונתי או בריאותי(‪ .‬בנוסף‪ ,‬התפתחות מנגנוני עיבוד המזון‬
‫בתעשייה הביאה במקרים מסויימים להיווצרות תרכובות מרות )חלקן בעלות תרומה תזונתית( אשר‬
‫עלולות לגרום לדחייה של מוצרים אלו‪ .‬לכן‪ ,‬על מנת למסך את המרירות במזונות המעובדים‪ ,‬מוסיפות‬
‫חברות המזון ממסכי מרירות הכוללים לעיתים סוכר‪ ,‬דבר הגורם להשקעת כסף רב והפיכת המוצרים‬
‫לעתירי קלוריות‪.‬‬
‫איור ‪ – 1.7‬מבנים מולקולריים של מספר תרכובות מרות ומתוקות אמפיפטיות )המרות מוצגות בצד‬
‫שמאל‪ ,‬המתוקות בצד ימין( אשר שימשו במחקר הנוכחי‪.‬‬
‫ידוע כי תרכובות מרות וממתיקים מלאכותיים מעוררים תחושות "מוזרות" של טעמי לוואי כגון הטעם‬
‫המתכתי‪ .‬תופעה ידועה נוספת הינה תופעת ה‪"-‬טעם המים המתוקים" )‪,(water sweet aftertaste‬‬
‫המתארת מצב בו מים מורגשים כמתוקים כאשר הם נבלעים לאחר טעימת ממתיקים כגון סכרין או‬
‫אצסולפאם‪ .K-‬במשך שנים‪ ,‬לא נמצא הסבר לתופעה זו עד שלאחרונה פורסם מחקר אשר מציע מנגנון‬
‫חדש בו הממתיק עצמו יכול‪ ,‬בריכוזים גבוהים‪ ,‬לפעול כמעכב לקולטן למתוק על ידי קשירה לאזור‬
‫‪25‬‬
‫הטרנסממברנלי של ‪ .T1R3‬שטיפה של הטעמן ע"י בליעת המים משחררת את הקולטן מהמעכב שלו וכך‬
‫המים מורגשים כמתוקים )‪.(49‬‬
‫בנוסף‪ ,‬ידוע כי בניגוד לסוכרים טבעיים המורגשים מיד לאחר הטעימה ולמשך זמן קצר‪ ,‬הטעם של‬
‫תרכובות מרות וממתיקים מלאכותיים מגיע לשיא לאחר זמן ממושך‪ ,‬תופעה הידועה בשם ‪,slow onset‬‬
‫ונשאר זמן רב בפה‪ ,‬תופעה המכונה שאריתיות או ‪ .lingering aftertaste‬תופעת השאריתיות גורמת‬
‫לתחושה לא נעימה לאורך זמן )לעתים עשרות דקות( לאחר סיום צריכת מוצר המזון‪ ,‬ובכך מהווה גורם‬
‫מגביל לצריכה רחבה יותר של מוצרים הכוללים תרכובות מסוג זה‪ .‬המנגנון המולקולרי של תופעת‬
‫השארתיות אינו ידוע‪.‬‬
‫תרכובות מרות וממתיקים מלאכותיים מגוונים מאוד במבנה שלהם אך לרובם תכונה משותפת בהיותם‬
‫תרכובות אמפיפטיות‪ ,‬כלומר מולקולות בעלות חלק הידרופובי וחלק הידרופילי )איור ‪.(1.7‬‬
‫לפני מספר שנים‪ ,‬הועלתה ההשערה לפיה תכונת האמפיפטיות מקנה לתרכובות אלו אפשרות להיצמד‬
‫לממברנת התא‪ ,‬לחדור דרכה לתוך הציטוזול‪ ,‬ושם להשפיע על פעילותם של מרכיבים תוך תאיים‪ .‬בעבר‬
‫נמצא שתרכובות אמפיפטיות מרות יכולות לחדור ממברנות ליפוזומים )‪ ,(133 ,132 ,22‬לעבור‬
‫אינטראקציה ישירות עם חלבוני ‪ ,(116) G‬לעכב או ולהפעיל תעלות מסוגים שונים )‪ ,(170 ,31‬או לעכב‬
‫אנזימים כגון פוספודיאסטראזות )‪ (132) Peri et al. .(144‬הראו שתרכובות מרות כמו כינין ו‪-‬‬
‫)‪ ,cyclo(Leu-Trp‬ותרכובות מתוקות כמו סכרין ו‪-D -‬טריפטופן אכן חודרות לתוך תאי טעם בפפילה‬
‫מבודדת )המופרדת מאפיתל הלשון ע"י טיפול בקולגנאז( וגם לתוך תאי טעם בפקיעיות מבודדות‪.‬‬
‫השערת העבודה הינה שבמקביל לקשירה לקולטן והפעלת מסלול העברת האותות‪ ,‬תרכובות מרות‬
‫ומתוקות אמפיפטיות מסוגלות לחדור את ממברנת תאי הטעם ומרגע שנמצאות בתוך ציטוזול התא‪,‬‬
‫משבשות את פעילותן של קינאזות ממשפחת ה‪ .GRKs -‬עיכוב פעילותן של ה‪ GRKs -‬תגרום לעיכוב‬
‫מנגנון הדסנסיטיזציה של הקולטן )‪ (desensitization‬ולכן למסלול העברת האותות להימשך זמן רב‬
‫יותר‪ .‬תופעה כזו‪ ,‬אם תוכח‪ ,‬תהווה מנגנון אפשרי לתופעת השאריתיות )איור ‪.(1.8‬‬
‫ד"ר מירב צוברי‪-‬סמואלוב הראתה בעבודת הדוקטור שלה כי טעמנים אמפיפטיים מרים ומתוקים מסוגלים‬
‫לעכב ‪ in-vitro‬את פעילותן של ‪ GRK5 ,GRK2‬ו‪ ,PKA -‬שלוש קינאזות אשר אחראיות על מנגנון‬
‫הדסנסיטיזציה של מגוון קולטני ‪.(186) GPCR‬‬
‫‪26‬‬
‫איור ‪ – 1.8‬השערת העבודה‪ :‬טעמנים אמפיפטיים מעכבים את מנגנון הדסנסיטיזציה של קולטני‬
‫‪.GPCRs‬‬
‫המודל מתאר מצב בו טעמנים מרים ומתוקים אמפיפטיים )‪ (T‬משפעלים מצד אחד את הקולטן שלהם )‪ (R‬אך‬
‫במקביל חודרים לתוך ציטוזול תאי הטעם ושם מעכבים את פעילותן של קינאזות ממשפחת ה‪ ,GRK -‬ובדרך זו‬
‫מעכבים את מנגנון הדסנסיטיזציה )‪ (desensitization‬של הקולטן‪ .‬במקרה כזה‪ ,‬הקולטן צפוי להראות פעילות‬
‫ממושכת מהרגיל‪.‬‬
‫מטרה ראשונה של עבודת המחקר הנוכחית הייתה להוכיח את יכולתם של טעמנים אמפיפטיים לחדור‬
‫באופן טבעי לתוך תאי הטעם )דרך הצד האפיקלי‪ ,‬בהתאם לתנאים פיזיולוגיים(‪ .‬לשם כך נעשה בשלב‬
‫ראשון בעזרת מיקרוסקופיה קונפוקלית מעקב דינמי אחר חדירתם של טעמנים אמפיפטיים מרים ומתוקים‬
‫לפפילת ‪ (CV) circumvallate‬שלמה )שלא הופרדה מהלשון(‪ .‬ניסויים נוספים נערכו בחולדות‬
‫מורדמות במטרה להעריך את ריכוז הטעמנים בתוך תאי פקיעית הטעם לאחר צריכתם‪ .‬בשלב הבא‪,‬‬
‫נבדקה נוכחותם של ‪ GRKs‬בתאי פקיעית הטעם מפפילת ‪ CV‬במטרה לזהות קיום מנגנון של‬
‫דסנסיטיזציה הומולוגית לקולטני ‪ GPCRs‬בתאים אלו‪ .‬בנוסף‪ ,‬נבחנה השפעתם של טעמנים אמפיפטיים‬
‫מרים ומתוקים על מנגנון הדסנסיטיזציה המתווך ע"י ‪ ,GRKs‬ע"י שימוש בקולטן ה‪-β2 -‬אדרנרגי‬
‫)‪ (β2AR‬כמודל לקולטנים ממשפחת ה‪ ,GPCRs -‬לה משתייכים הקולטנים לטעם‪ .‬לשם כך נבחנה‬
‫השפעתם של טעמנים חודרי ממברנות על שלושת הקריטריונים האופייניים לדסנסיטיזציה של הקולטן ה‪-‬‬
‫‪ (1 :β2AR‬דסנסיטיזציה של האותות )סיגנל( המועברים על ידי הקולטן; ‪ (2‬מידת זרחון הקולטן; ‪(3‬‬
‫אינטרנליזציה של הקולטן לציטוזול התא‪ .‬בנוסף‪ ,‬נבחנה השפעה אפשרית של הטעמים האמפיפטיים על‬
‫שפעול ‪ ERK‬אשר תלוי בדסנסיטיזציה של הקולטן ה‪ β2AR -‬עצמו‪.‬‬
‫‪27‬‬
‫ חומרים ושיטות‬.2
‫ חומרים‬- 2.1
‫ רשימת חומרים‬- 2.1.1
Acetic acid
Acetic anhydride
Acrylamide-bis
Adenosine 3’5’ cyclic monophosphate (cAMP)
[125-I]- cAMP (Adenosine 3’5’ cyclic phosphoric
acid, 2’-O-succinyl [125-I] iodotyrosine methyl ester
Agarose
Aprotinin
Anti cAMP-BSA serum
Benzamidine
Bovine serum albumin (BSA)
Caffeine
Calcium chloride
Collagenase D
Coomassie brilliant blue G
Cyclo (Leu-Trp)
Deoxycholic acid sodium salt
1,4-Diazabicyclo[2.2.2] octane (DABCO)
Dimethylsulfoxide (DMSO)
Dithiothreithol (DTT)
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)
Ether
Ethidium bromide
Ethyl alcohol
Ethylene diaminetetraacetic acid (EDTA)
Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)
-N,N,N’,N’-tetraacetic acid (EGTA)
Fetal bovine serum (FBS) heat inactivated
Glucose
Glutamine solution
Glycerol
β-Glycerophosphate
Glycine
N-[2-Hydroxyethyl]piperazineN’-[2-ethanesulfonic acid] (HEPES)
3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX)
Isopentane
(−)-Isoproterenol hydrochloride (ISO)
Leupeptin
Magnesium chloride
Frutarom, Israel
Sigma, USA
Serva, Germany
Sigma, USA
NEN, USA
Gibco, USA
Sigma, USA
Sigma, USA
Sigma, USA
Sigma, USA
Sigma, USA
Sigma, USA
Boehringer, Germany
Sigma, USA
Bachem, Switzerland
Fluka, Israel
Sigma, USA
Merck, Germany
Sigma, USA
Sigma, USA
Gadot, Israel
Tamar, Israel
Bio-Lab, Israel
Sigma, USA
Sigma, USA
Gibco, USA
Merck, Germany
Biological Industries,
Israel
Sigma, USA
Sigma, USA
Sigma, USA
Sigma, USA
Sigma, USA
Sigma, USA
Sigma, USA
Sigma, USA
Sigma, USA
28
Magnesium sulfate
Neohesperidin dihydrochalcone (NHD)
Naringin
Optimal Cutting Temperature (OCT)
Opti-MEM® I
Orthovanadate
Paraformaldehyde (PFA)
Penicillin-Streptomycin
Pepstatin A
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)
Potassium carbonate
Potassium chloride
Potassium dihydrogen phosphate
Potassium iodide
Propidium iodide
Protein G PLUS-Agarose beads
Pyruvic acid
Quinine hydrochloride
Sodium acetate
Sodium bicarbonate
Sodium chloride
Sodium dodecyl sulfate (SDS)
Sodium fluoride (NaF)
di- Sodium hydrogen phosphate heptahydrate
Sodium hydroxide
Sodium phosphate
Sodium saccharin
Trichloroacetic acid (TCA)
Tricine
Triethylamine
Tris (Tris [hydroxymethyl]aminomethane)
Triton X-100
Trypsin-EDTA solution C
Trypsin inhibitor (type П-S: soybean)
D-Tryptophan
Tween-20
Sigma, USA
Sigma, USA
Sigma, USA
Menzel-Glazer,
Germany
Gibco, USA
Sigma, USA
Sigma, USA
Biological Industries,
Israel
Sigma, USA
Sigma, USA
Frutarom, Israel
Frutarom, Israel
Merck, Germany
Sigma, USA
Sigma, USA
Santa-Cruz, USA
Sigma, USA
Sigma, USA
Merck, Germany
Merck, Germany
Frutarom, Israel
Sigma, USA
Sigma, USA
Merck, Germany
Frutarom, Israel
Merck, Germany
Sigma, USA
Merck, Germany
Sigma, USA
Sigma, USA
Sigma, USA
Sigma, USA
Biological Industries,
Israel
Sigma, USA
Sigma, USA
Sigma, USA
‫ חומצות גרעין וערכות‬,‫ אנזימים‬,‫ נוגדנים‬- 2.1.2
GRK2, GRK5, GRK6, HA probe, β2AR and
antiphosphoSer(355-356) β2AR first antibodies
ERK and phosphoERK first antibodies
HRP/FITC-conjugated secondary antibodies
ECL luminescence kit
29
all Santa-Cruz, USA
Sigma, USA
Jackson, USA
Santa-Cruz, USA
Rneasy Protect Starter kit
PCR purification kit
Reverse-iT 1st strand synthesis kit
ReddyMix PCR Master kit
Red Load Taq Master
Primers
pcDNA3 plasmid containing human β2AR gene
pcDNA3 plasmid containing HA tagged-β2AR gene
MaxFect™
Qiagen, Germany
Qiagen, Germany
ABgene, UK
ABgene, UK
Larova GmbH, Germany
HyLabs, Israel
Dr. Lefkowitz, R.J.,
Howard Hughes Medical
Institute, Durham, NC,
USA
Missouri S&T cDNA
Resource Center, USA
(www.cdna.org)
Molecula Research Labs,
USA
(www.molecula.com)
‫ בופרים ותמיסות‬- 2.1.3
Phosphate buffered saline (PBS X1): NaCl 120 mM, KCl 2.5 mM, EGTA 1 mM and
Tris 2.0 mM titrated with HCl to pH 7.4.
Bradford solution: Coomassie brilliant Blue G 10% (w/v), ethanol 4.75% (v/v) and
phosphoric acid 8.5% (v/v) in DDW.
Buffer A: β-glycerophosphate 50 mM, EGTA 1.5 mM, orthovanadate 0.1 mM, EDTA
1 mM, DTT 1 mM with HCl to pH 7.3.
Buffer H: β-glycerophosphate 50 mM, EGTA 1.5 mM, orthovanadate 0.1 mM, EDTA
1 mM, DTT 1 mM, benzamidine 1 mM, aprotinin 10 μg/ml, leupeptin 10 μg/ml,
pepstatin A, 2 μg/ml.
Hank's buffer: NaCl 137 mM, KCl 5.3 mM, Na2HPO4 0.3 mM, MgSO4 0.4 mM,
MgCl2 0.5 mM, Hepes 5 mM, Tricine 6.5 mM, glucose 30 mM, NaHCO3 4 mM.
Mounting solution: Glycerol 90% (v/v), Tyrode 10% (v/v), DABCO 3% (w/v),
sodium azide 0.1% (w/v).
RIPA buffer: Tris 20 mM, NaCl 137 mM, Glycerol 10%, SDS 0.1%, Deoxycholate
0.5%, Triton X-100 1%, EDTA 2 mM, PMSF 1 mM, Leupeptin 20 μM.
Running buffer: Tris 25 mM, Glycine 192 mM and SDS 0.1% (w/v).
Sample buffer X4: Tris 0.2 M, glycerol 40% (v/v), SDS 0.08% (w/v), DTT 0.1 M,
bromophenol blue for blue color.
TBST: Tris 20 mM, NaCl 150 mM, Tween-20 0.05% (v/v).
30
Tyrode Buffer: NaCl 140 mM, KCl 5 mM, Hepes 10 mM, MgCl2 1 mM, CaCl2 1 mM
fixed to pH 7.4 with tris.
TGPP: Tyrode buffer containing pyruvic acid 10 mΜ and glucose 10 mM.
TAE buffer: Tris- acetate 40 mM, EDTA 1 mM.
Transfer buffer: Tris 15 mM and Glycine 120 mM.
31
‫‪ 2.2‬שיטות‬
‫‪ - 2.2.1‬הדמיית חדירת טעמנים לתוך פפילות ‪ CV‬שלמות תוך מעקב דינמי )‪(in situ‬‬
‫במיקרוסקופ קונפוקלי פלואורסצנטי‬
‫חולדות נקבות מזן ‪ ,Sprague-Dawley‬במשקל של ‪ 150-175‬גרם‪ ,‬התקבלו מבית החיות‬
‫האוניברסיטאי‪ .‬החיות הוחזקו בכלובים בגודל ‪ 25×40‬ס"מ עם מזון ומים ללא הגבלה‪ ,‬בטמפרטורה של‬
‫‪ 23±2°C‬ובמחזור הארה של ‪ 12‬שעות אור‪ 12 ,‬שעות חושך‪ .‬ביום הניסוי‪ ,‬החולדות הורדמו ע"י אתר‬
‫והומתו ע"י הסרת ראש )‪.(decapitation‬‬
‫על מנת לעקוב אחר תנועה והצטברות של הטעמנים לתוך רקמת הפפילה‪ ,‬ניצלנו את התכונות‬
‫הפלואורסצנטיות שלהם תוך שימוש בשיטת מיקרוסקופיה קונפוקלית פלואורסצנטית‪ .‬בעזרת מספריים‬
‫עדינות וללא טיפול בקולגנאז‪ ,‬הוצא מלשון החולדה משטח רקמת אפיתל בגודל של ‪ 2X2X2‬מ"מ‬
‫ובמרכזו פפילת ה‪ (CV) circumvallate -‬ביחד עם רקמות השומן והשריר שבצד הבזולטרלי‪ ,‬כך שהצד‬
‫האפיקלי בלבד של הפפילה נמצא חשוף לסביבה‪ ,‬בדומה למצב פיזיולוגי‪ .‬משטח זה הונח על זכוכית נושא‬
‫בתוך ‪ 5 μL‬של בופר ‪ .TGPP‬לאחר מכן‪ ,‬הוספו ‪ 5 μL‬של תמיסה מרוכזת של טעמן כך שהריכוז הסופי‬
‫של הטעמנים היה‪ :‬סכרין ‪-D ,10 mM -‬טריפטופן ‪ ,10 mM -‬נרינגין ‪ ,1 mM - CLT ,1 mM -‬כינין‬
‫ ‪ 1 mM‬וקפאין ‪ .10 mM -‬הצילומים התמקדו בתעלה הפנימית של הפפילה )‪,(inner trench circle‬‬‫היכן שפקיעיות הטעם מרוכזות‪ .‬זמן הוספת הטעמן הוגדר כזמן ‪ ,0‬כאשר רמת הפלואורסצנציה הותאמה‬
‫לרמת הרקע‪ .‬לאחר מכן‪ ,‬תמונות נוספות צולמו כל שתי דקות‪ .‬כביקורת‪ ,‬צולמה הפפילה בתוך תמיסת‬
‫‪ TGPP‬בהיעדר טעמן‪ .‬לאחר ‪ 6‬דקות של הדגרה עם הטעמן‪ ,‬הוספה תמיסה של אשלגן יודיד )‪(KI‬‬
‫בריכוז סופי של ‪ 0.5 M‬למשך שתי דקות נוספות‪ KI .‬הינו מלח מדעיך פלואורסצנציה )‪(quencher‬‬
‫אשר אינו חודר ממברנות של תאים ולכן מטרתו בניסוי זה לגרום לדעיכת הפלואורסצנציה של מולקולות‬
‫הטעמנים אשר נספחו על פני שטח ממברנת הפפילה‪ .‬על פי אותו היגיון‪ ,‬מולקולות הטעמנים אשר חדרו‬
‫דרך ממברנות התאים פנימה‪ ,‬לתוך הציטוזול‪ ,‬תהינה מוגנות מפני השפעת ה‪ .KI-‬כביקורת חיובית‬
‫לפעילות המדעיך ולחיותם של תאי הטעם השתמשנו בפרופידיום יודיד ‪ ,(50 μg/mL) PI‬תרכובת‬
‫פלואורסצנטית אשר נקשרת לחומצות הגרעין אך אינה חודרת ממברנות של תאים חיים ולכן משמשת‬
‫במחקרים רבים לזיהוי תאים מתים ע"י צביעת הגרעין שלהם‪ .‬התמונות נשמרו בפורמאט ‪ TIFF‬ועובדו‬
‫בעזרת התוכנות ‪ Image-Pro Plus Media Cybernatics‬ו‪.Adobe Photoshop -‬‬
‫לפני שבוצעו ניסויים במיקרוסקופ הקונפוקלי‪ ,‬נקבע כושרו של ‪ KI‬בהדעכת פלואורסצנציה של הטעמנים‬
‫הנבדקים ופרופידיום יודיד מומסים בתמיסת ‪ TGPP‬בעזרת ספקטרופוטומטר מסוג ‪Carry Eclipse‬‬
‫‪.(Variant Australia PTY LTD, Australia) fluorescence spectrophotometer‬‬
‫‪32‬‬
‫‪ - 2.2.2‬הפרדת פפילת ה‪ CV -‬בחולדה‬
‫רקמת פפילת ה‪ CV -‬הופרדה מהלשון לפי )‪) (163‬איור ‪ .(2.1‬החיות הורדמו בעזרת אתר והומתו ע"י‬
‫הסרת ראש‪ .‬הלשון הוצאה ונשטפה מיד בבופר ‪ TGPP‬קר‪.‬‬
‫במטרה להפריד בין רקמת הפפילה לבין רקמת החיבור בלשון‪ ,‬הוזרקו מסביב לפפילה ומתחתה ‪500 μl‬‬
‫מתמיסה המורכבת מקולגנאז בריכוז של ‪ 4 mg/ml‬ומעכב טריפסין שמקורו מסויה בריכוז ‪.4 mg/ml‬‬
‫ההזרקה נעשתה בשש נקודות שונות ) ‪ 5‬מסביב‪ 1 ,‬מתחת לפפילה( תחת מיקרוסקופ בינוקולרי‪ .‬לאחר‬
‫תהליך ההזרקה‪ ,‬הלשון הודגרה בתמיסת ‪ TGPP‬תוך בעבוע אוויר במשך ‪ 15‬דקות בטמפרטורה של ‪30‬‬
‫‪ . °C‬לאחר מכן ריבוע של אפיתל הכולל את הפפילה נגזר בעזרת מספריים עדינות‪ ,‬הופרד ע"י משיכה‬
‫עם פינצטה עדינה )מספר ‪ (5‬ונשטף בתמיסת ‪ TGPP‬קרה )‪.(4°C‬‬
‫ריבוע האפיתל הונח על צלחת בתוך תמיסת ‪ TGPP‬קרה כך שצינורות ההפרשה ‪(von Ebner gland‬‬
‫)‪ ducts‬פונים כלפי מעלה‪ .‬הצינורות הוסרו בעזרת מספריים עדינות והפפילה הופרדה מרקמת האפיתל‬
‫הלא סנסורי ע"י גזירה‪ ,‬כך שהתקבל מבנה פרסה המכיל את פקיעיות הטעם והוא הפפילה )איור ‪.(2.1‬‬
‫איור ‪ - 2.1‬בידוד פפילת ‪ CV‬מלשון חולדה‪.‬‬
‫א‪ -‬אפיתל הלשון עם פפילת ה‪ CV -‬לאחר‬
‫טיפול בקולגנאז והסרתה מן הלשון השלמה‪.‬‬
‫ב‪ -‬הסרת צינורות ההפרשה‪.‬‬
‫ג‪ -‬חיתוך פפילת ה‪ CV -‬משטח האפיתל‪.‬‬
‫ד‪ -‬פפילת ה‪ CV -‬אשר מכילה את‬
‫האיברונים הסנסוריים מופרדת מן האפיתל‬
‫הלא‪-‬סנסורי‪.‬‬
‫לקוח מתוך )‪.(163‬‬
‫‪ - 2.2.3‬הפרדת תוכן התאים מרקמת פפילת ‪ CV‬וקביעת כמות חלבון‬
‫פפילות ‪ CV‬אשר בודדו כמתואר בסעיף ‪ 2.2.2‬עברו הדגרה עם הטעמנים השונים‪ ,‬נשטפו בבופר ‪TGPP‬‬
‫חמש פעמים‪ ,‬ופוצצו ע"י סידרה של ארבע הקפאות והפשרות ב‪ .-20°C -‬ממברנות התאים הושקעו ע"י‬
‫סרכוז בצנטריפוגת אפנדורף ב‪ 20,000g -‬בטמפרטורה של ‪ 4°C‬למשך ‪ 45‬דקות‪ .‬הנוזל העליון שהכיל‬
‫‪33‬‬
‫את תוכן התאים הופרד‪ ,‬הוקפא‪ ,‬יובש בהקפאה ונשמר בטמפרטורה של ‪ -20°C‬עד לקביעה כמותית ב‪-‬‬
‫‪.HPLC‬‬
‫המשקע שהתקבל אחרי סרכוז הכיל את ממברנות תאי הפפילה ושימש לקביעת כמות החלבון בשיטת‬
‫‪ .(17) Bradford‬למשקע הוספו ‪ 50 μl‬של תמיסת ‪ NaOH 5 M‬והתמיסה הודגרה במשך ‪ 45‬דקות‬
‫בטמפרטורה של ‪ .60°C‬לאחר מכן הוספו ‪ 450 μl‬מים מזוקקים‪ ,‬התמיסה עורבבה ונלקחו שלוש דגימות‬
‫של ‪ 50 μl‬לבדיקה‪ .‬לכל דוגמא הוסף נפח של ‪ 250 μl‬מתמיסת ‪ ,Bradford‬וכמות החלבון נקבעה בעזרת‬
‫קריאת בליעה באורך גל של ‪ 595 nm‬במכשיר ‪ ,(Bio-Tek®Instruments, Inc., USA) Elisa‬כאשר‬
‫‪ BSA‬שימש לעקום כיול‪.‬‬
‫‪ - 2.2.4‬חדירת הטעמן לתוך תאי הטעם של פפילת ‪ (in vivo) CV‬בחולדות מורדמות‬
‫חולדות הורדמו ע"י הזרקת ‪ 0.5 mL‬פנטוברביטל )‪ 60 mg/kg‬משקל גוף( לתוך חלל הבטן והונחו על‬
‫משטח מיוחד שאיפשר הטיה נוחה של הגוף בזווית של ‪ 30°‬כלפי מטה‪ ,‬כך שניתן היה לשמור על חלל‬
‫הפה פתוח בעזרת פינצטה )איור ‪ (2.2‬ולהזרים לסירוגין נפח של ‪ 10‬מ"ל של הטעמן בעזרת פיפטת פסטר‬
‫למשך ‪ 90‬שניות ללא גרימת חנק לחיה‪ .‬ריכוזי הטעמנים היו כדלקמן‪-D :‬טריפטופן ‪- CLT ,30 mM -‬‬
‫‪ ,2 mM‬כינין ‪ 2 mM -‬וקפאין ‪ .10 mM -‬לאחר מכן החיות הומתו ופפילת ה‪ CV -‬הופרדה בעזרת‬
‫קולגנאז )כמתואר בסעיף ‪ .(2.2.2‬הפפילה המופרדת העשירה בפקיעיות טעם הוכנסה ל‪ 100 μL -‬מים‬
‫מזוקקים פעמיים )‪ (DDW‬ונשמרה ב ‪ -70°C‬עד להמשך הטיפול‪ .‬הפרדת תוכן התאים מרקמת פפילת ה‪-‬‬
‫‪ CV‬נעשתה כמתואר בסעיף ‪ .2.2.3‬חיות הביקורת טופלו באופן דומה‪ ,‬אך התמיסה שהוזרמה לתוך חלל‬
‫הפה של החיה לא כללה את הטעמן‪.‬‬
‫מאחר והטיפול בקולגנאז להוצאת פפילת ה‪ CV -‬מן הלשון ארך כ‪ 25 -‬דקות‪ ,‬נעשה ניסיון להעריך את‬
‫כמות הטעמן אשר זרמה החוצה מתאי הטעם )‪ (efflux‬במהלך טיפול זה‪ .‬למטרה זו‪ ,‬בוצעו ניסויים‬
‫נוספים בהם פפילות ‪ CV‬הופרדו כמתואר בסעיף ‪ ,2.2.2‬נחתכו לשני חצאים שווים וכל חצי פפילה‬
‫הודגר בשלב ראשון ‪ 2‬דקות ב ‪ 100 μL‬תמיסת ‪ TGPP‬ב‪ 30°C -‬ולאחר מכן עם טעמן למשך ‪30‬‬
‫שניות באותה טמפרטורה‪ .‬בתום ‪ 30‬השניות‪ ,‬חצי פפילה אחד נשטף ‪ 5‬פעמים בתמיסת ‪ ,TGPP‬הוכנס‬
‫ל ‪ 100 μL‬מים מזוקקים והוקפא ב‪ .-70°C -‬לעומתו‪ ,‬חצי הפפילה השני הועבר לתוך ‪ 100 μL‬תמיסת‬
‫‪ TGPP‬למשך ‪ 25‬דקות ב‪ ,30°C -‬בניסיון לחקות את זמן ההמתנה אותו עוברת פפילת ה‪ CV -‬בטיפול‬
‫קולגנאז לאחר ניסויי ה‪ .in vivo -‬רק לאחר המתנה זו חצי הפפילה נשטף ונשמר בדומה לחצי הפפילה‬
‫הראשון עד להמשך הטיפול של הפרדת תוכן התאים מרקמת פפילת ‪) CV‬סעיף ‪.(2.2.3‬‬
‫לאחר הפרדת תוכן התאים כמתואר בסעיף ‪ ,2.2.3‬כמות הטעמן נקבעה בשיטת ה‪ HPLC -‬כמתואר‬
‫בסעיף ‪ .2.2.5‬שיעור בריחת הטעמן החוצה בזמן הטיפול בקולגנאז הוערך ע"י השוואת כמות הטעמן‬
‫שנמצאה בחצי הפפילה אשר נשטף ‪ 25‬דקות לאחר הדגרה עם הטעמן יחסית לכמות הטעמן שנמצאה‬
‫בחצי הפפילה שלא עבר את שלב "ההמתנה"‪ .‬לניסוי זה שימשו טעמנים בעלי אופי פלואורסצנטי או‬
‫לחילופין בעלי בליעה גבוהה באור ‪ UV‬אשר אפשרה סף זיהוי נמוך במערכת ה‪.HPLC-‬‬
‫‪34‬‬
‫איור ‪ - 2.2‬הזרמת תמיסת טעמנים לתוך פיה של חולדה מורדמת לצורכי בחינת יכולתם של טעמנים‬
‫אמפיפטיים לחדור לתוך פפילת ‪ CV‬בתנאי ‪.in vivo‬‬
‫‪ - 2.2.5‬קביעה כמותית של טעמנים בתוך תאי טעם מפפילת ‪ CV‬בעזרת שיטת ‪HPLC‬‬
‫לאחר ייבוש תוכן התאים כמתואר בסעיף ‪ ,2.2.3‬כמות הטעמן שנכנסה לתוך תאי הטעם נמדדה בעזרת‬
‫כרומטוגרפיה נוזלית ‪ .HPLC‬הבדיקה נעשתה במערכת מתוצרת ‪Merck-Hitachi (Darmstadt,‬‬
‫)‪ Germany‬המצוידת במשאבה ‪ , L-7100‬גלאי פלואורסצנטי ‪F-1050‬‬
‫וגלאי ‪L-7455 UV‬‬
‫)‪ (UltraViolet-visible diode-array‬המחוברים בטור‪ .‬ההפרדה נעשתה בקולונה ארוכה‬
‫))‪ (LiChroCart® 250-4 LiChrospher® 100 RP-18 (5 μm‬או בקולונה קצרה ®‪(LiChroCart‬‬
‫))‪ 55-4 Purospher Star RP-18 (3 μm‬בתוספת פרקולונה מתאימה של ‪.(186 ,132) RP-18‬‬
‫הטעמנים המתוקים סכרין ו‪ ,(NHD) neohesperidin dihydrochalcone -‬והטעמנים המרים קפאין‬
‫ונרינגין הופרדו בקולונה ארוכה וזוהו בגלאי ‪ .UV‬לעומתם‪ ,‬שלושת הטעמנים ‪-D‬טריפטופן‪ ,‬כינין‬
‫והפפטיד )‪ cyclo (Leu-Trp‬הופרדו בקולונה קצרה ונבדקו בגלאי הפלואורסצנטי כל אחד לפי אורכי גל‬
‫עירור ופליטה מתאימים‪ .‬הטעמנים זוהו על פי זמני שהייה של כל אחד מהם בקולונה ‪(RT - Retention‬‬
‫)‪ , Time‬וכומתו על בסיס עקומת כיול והשוואת שטחי פיקים שהתקבלו בדוגמאות לאותה עקומה‪.‬‬
‫הפרדת סכרין נעשתה בהרצה איזוקרטית עם פאזה נעה המורכבת ממתנול ומחומצה אצטית ‪(v/v) 1.5%‬‬
‫ביחסים של ‪ (v/v) 20:80‬בהתאמה‪ ,‬בקצב זרימה של ‪ .0.45 ml/min‬בליעת סכרין נמדדה באורך גל של‬
‫‪.268 nm‬‬
‫‪-D‬טריפטופן הופרד בקולונה קצרה ביחסים משתנים של חומצה אצטית ‪ (v/v) 1.5%‬ומתנול בגרדיאנט‪:‬‬
‫יחסם של שני הסולבנטים )‪ (v/v‬בזמן ‪ 0‬היה ‪ ,5:95‬השתנה תוך ‪ 4‬דקות ל‪ ,25:75 -‬חזר תוך ‪ 4‬דקות‬
‫‪35‬‬
‫ליחס התחלתי של ‪ 5:95‬ונשאר כך עוד ‪ 4‬דקות‪ ,‬סה"כ ‪ 12‬דקות הרצה‪ .‬קצב הזרימה היה ‪.1 ml/min‬‬
‫אורך הגל לעירור היה ‪ 280 nm‬ולפליטה ‪.345 nm‬‬
‫‪ NHD‬הופרד בהרצה איזוקרטית בעזרת פאזה נעה המורכבת מאצטוניטריל ומחומצה אצטית )‪(v/v‬‬
‫‪ 0.5%‬ביחסים של ‪ (v/v) 65:35‬בהתאמה‪ ,‬בקצב זרימה של ‪ .0.75 ml/min‬בליעת ה‪ NHD -‬נמדדה‬
‫באורך גל של ‪.282 nm‬‬
‫נרינגין הופרד בקולונה ארוכה בהרצה איזוקרטית בסולבנט המורכב מאצטוניטריל ומים ביחסים של‬
‫‪ (v/v) 80:20‬בהתאמה‪ ,‬בקצב זרימה של ‪ .1.0 ml/min‬בליעת הנרינגין נמדדה באורך גל של ‪.280 nm‬‬
‫הפאזה הנעה ששימשה להפרדת קפאין הייתה מורכבת ממתנול ומים ביחסים של ‪ (v/v) 50:50‬בהתאמה‪,‬‬
‫בקצב זרימה של ‪ .0.7 ml/min‬בליעתו של הקפאין נמדדה באורך גל של ‪.268 nm‬‬
‫כינין הופרד בקולונה קצרה בהרצה איזוקרטית עם פאזה נעה המורכבת מאצטוניטריל ובופר פוספאט‬
‫שהכיל ‪ SDS 25 mM ,tetrabutylammonium bromide 3 mM‬ו‪ KH2PO4 10 mM -‬והותאם ל‪-‬‬
‫‪ pH 2.3‬ע"י חומצה אורתוזרחתית‪ .‬שני הסולבנטים היו ביחסים של ‪ (v/v) 50:50‬וקצב הזרימה היה ‪0.6‬‬
‫‪ .ml/min‬אורך הגל לעירור היה ‪ 343 nm‬ולפליטה ‪.395 nm‬‬
‫הפאזה הנעה אשר שימשה להפרדת הפפטיד )‪ (CLT) cyclo (Leu-Trp‬הייתה מורכבת מאצטוניטריל‬
‫ומים אשר הכילו )‪ 1% (v/v‬אצטוניטריל ו‪ 0.02% (v/v) -‬חומצה טריפלואורואצטית )‪ (TFA‬ביחסים‬
‫של ‪ (v/v) 70:30‬בהתאמה‪ ,‬בהרצה איזוקרטית‪ ,‬בקצב זרימה של ‪ .0.4 ml/min‬אורך הגל לעירור היה‬
‫‪ 280 nm‬ולפליטה ‪.345 nm‬‬
‫זמני שהייה )‪ (RT‬של הטעמנים היו ‪ 5.0 ,5.8 ,4.5 ,10.2 ,4.25 ,4.39 ,7.05‬דקות עבור סכרין‪-D ,‬‬
‫טריפטופן‪ ,NHD ,‬נרינגין‪ ,‬קפאין‪ ,‬כינין ו‪ CLT -‬בהתאמה‪.‬‬
‫‪RT-PCR - 2.2.6‬‬
‫"א כללי )‪ (total RNA‬מתוך פפילת ‪ CV‬ואפיתל לא סנסורי‬
‫‪ - 2.2.6.1‬הפקת רנ‬
‫פפילות ‪ CV‬מ‪ 7 -‬חולדות הופרדו מאפיתל הלשון ע"י טיפול בקולגנאז כמתואר בסעיף ‪ ,2.2.2‬אוחדו‬
‫והוקפאו במבחנת אפנדורף ב‪ -80 °C -‬עד להפקת הרנ"א‪ .‬דגימות מן האפיתל הלא‪-‬סנסורי אשר בסמוך‬
‫לפפילת ה‪ ,CV -‬בגודל ‪ 1x1x1‬מ"מ בקירוב )שטח דומה לזה של הפפילה(‪ ,‬נלקחו גם כן ואוחסנו‬
‫בתנאים זהים‪ .‬הרנ"א הכללי הופק בסביבה סטרילית ככל האפשר בעזרת ‪Rneasy Protect Starter kit‬‬
‫)‪ ,(Qiagen, Germany‬על פי הוראות היצרן‪.‬‬
‫‪Reverse Transcription (RT) - 2.2.6.2‬‬
‫שלב ה‪ RT -‬נעשה מיידית לאחר הפקת הרנ"א הכללי בעזרת ‪Reverse-iT 1st Strand Synthesis Kit‬‬
‫)‪ (ABgene‬על פי הוראות היצרן‪ :‬בשלב הראשון‪ 0.5 μg ,‬של ‪ RNA‬מתוך ה‪ total RNA -‬הוספו‬
‫למבחנת אפנדורף ביחד עם ‪ oligo-dT‬ומים והודגרו למשך ‪ 5‬דקות ב‪ 70°C -‬ולאחר מכן הועברו לקרח‪.‬‬
‫‪36‬‬
‫למבחנות הוספו ‪ dNTPs ,first standard buffer‬והאנזים ‪ .Reverse Transcriptase‬הראקציה‬
‫התבצעה ב‪ 47°C -‬למשך ‪ 50‬דקות וסיום התגובה נעשתה ע"י הדגרה ב‪ 75°C -‬למשך ‪ 10‬דקות‪ .‬הנפח‬
‫הסופי במבחנה היה ‪ .20 μl‬תוצרי ה‪ cDNA -‬נשמרו ב ‪ -80°C‬עד שישמשו כתבנית בריאקצית ה‪-‬‬
‫‪ .PCR‬דוגמת ‪ RNA‬מקורית ללא שלב ה‪ RT -‬נשמרה על מנת להוכיח בשלב מאוחר יותר כי לא נותרו‬
‫שאריות ‪ DNA‬בעת הפקת ה‪) RNA -‬ביקורת שלילית(‪.‬‬
‫‪Polymerase Chain Reaction (PCR) - 2.2.6.3‬‬
‫תגובת ה‪ PCR -‬להגברת מקטעי ה‪ DNA -‬של הגנים השונים אשר ביטוים נבדק נעשתה בעזרת‬
‫)‪) ReddyMix PCR Master Mix (ABgene‬ערכה מוכנה ל‪ PCR-‬אשר מכילה בופר ובו הוכנסו‬
‫מראש כל המרכיבים הדרושים ל‪ .(PCR -‬עבור כל גן נבדק עורבבו ‪ 1 μl ,cDNA 2.5 µl‬תחלים‬
‫ייחודים לאותו גן )‪ 0.5 µl‬מכל אחד בריכוז ‪ ,10 μM‬ראה סעיף ‪ (2.2.6.4‬ו‪ 12.5 μl -‬של בופר ה‪-‬‬
‫‪ ReddyMix‬והנפח הושלם ל‪ 25 μl -‬עם מים סטריליים‪ .‬תוכנית ה‪ PCR -‬כללה ‪ 5‬שלבים‪ .‬שלב א'‪5 :‬‬
‫דקות ב‪ ,94°C -‬שלב ב'‪ :‬דנטורציה של גדילי התבנית דקה ב‪ ,94°C -‬שלב ג'‪ :‬היברידיזציה של התחל‬
‫עם התבנית דקה ב‪ ,52°C -‬טמפרטורה שהינה נמוכה מטמפרטורת ההיתוך של התחלים ושלב ד'‪ :‬סינטזה‬
‫של התוצר על ידי הדגרה למשך דקה ב‪ 72°C -‬ואז חזרה לשלב ב' לשלושים מחזורים נוספים )שלבים‬
‫ב'‪-‬ד'(‪ ,‬שלב ה'‪ 10 :‬דקות ב‪ .72°C -‬בתום שלב זה‪ ,‬הדוגמאות נשמרו ב‪ .4°C -‬תוצרי ה‪ PCR -‬נבדקו‬
‫על ידי הפרדת ‪ 10 μl‬מכל דוגמה בג'ל אגרוז ‪) (w/v) 1.5%‬צפיפות המתאימה לגודל המקטעים של‬
‫‪ 300-800‬בסיסים(‪ ,‬כאשר הבופר להכנת הג'לים היה ‪ TAE‬בתוספת אתידיום ברומיד‪.‬‬
‫ביקורת לשלילת זיהום דנ"א גנומי לתוך הרנ"א המופק נעשה ע"י ביצוע תגובת ‪ PCR‬כפי שתואר קודם‬
‫לכן על דגימת רנ"א אשר לא עברה את שלב ה‪ ,RT -‬בנוכחות התחלים של ‪.GRK2‬‬
‫‪ - 2.2.6.4‬בחירת תחלים‬
‫התחלים ששמשו לקבלת תבנית ה‪ DNA -‬עבור ה‪ GRKs -‬והקולטנים לטעם הוזמנו מחברת ‪HyLabs‬‬
‫)רחובות‪ ,‬ישראל(‪ .‬התחלים עבור ‪ GAPDH‬התקבלו מהמעבדה של דר' אורן תירוש‪ .‬הרצפים מבוססים‬
‫על רצפי ‪ mRNA‬מחולדה המפורסמים בבנק הגנים ‪ .GenBank‬עבור כל גן תוכננו שני תחלים‪ ,‬אחד‬
‫עבור הקצה ה‪ (sense) 5' -‬והשני עבור הקצה ה‪) (antisense) 3' -‬ראה טבלה ‪.(2.1‬‬
‫‪ - 2.2.6.5‬קביעת רצף חומצות הגרעין )‪(sequences‬‬
‫לאחר שנקבע כי גודלם של תוצרי ה‪ RT-PCR -‬תואמים את הצפוי‪ ,‬הדוגמאות נוקו בעזרת ‪PCR‬‬
‫)‪ Purification Kit (Qiagen, Germany‬ונשלחו לקביעת רצף נוקלאוטידים בחברת ‪.HyLabs‬‬
‫השוואת רצפי האנליזה וזיהוי סופי של התוצרים בוצעו על ידי תוכנת ‪ BLAST‬תוך שימוש במאגר‬
‫הנתונים של ‪.GenBank‬‬
‫‪37‬‬
‫ לגנים‬GenBank -‫ גודל התוצר הצפוי וקוד הרצף ב‬,‫ רשימת התחלים הייחודיים‬- 2.1 ‫טבלה מס‬
.RT-PCR -‫ נבחן בשיטת ה‬CV -‫שביטוים בפפילת ה‬
Gene
Product
Primers
GRK1
GRK2
GRK3
GRK5
GRK6
size (bp)
Sense 5' TTTCCTGCGGTTTCTTCAGT 3'
Antisense 5' CACGTTCTCTGGCTTGAGGT 3'
Sense 5’ CTTTGACATTGGCTCCTTTGA 3’
Antisense 5' GTGGCTTGTTCTTCATCTTGG 3'
Sense 5'ACTGGCTTTGAACGAGAGGA 3'
Antisense 5' GTCGATGCCCTTGAAGAAGA 3'
Sense 5’CTGGCTTTGAGGAAGAACGA 3’
Antisense 5' GTTTTGATGCTGACGCCTGA 3'
Sense 5'AGGTGACCCCAGATGAGAAA 3'
Antisense 5' TCTCGGCAGCATAGAAGACA 3'
Sense 5’ CCACACATACTTACCTTTGGA 3’
T2R4
Antisense 5' GAGTAGGTTGTTTTGTGGCAG 3'
Sense 5’ CATGACCTCTCACCCAAGGTA 3’
T1R3
Antisense 5' CATAGCAGCAGGAATGAAAGC 3'
GAPDH
Sense 5' TCCGCCCCTTCCGCTGATG 3'
Antisense 5' CACGGAAGGCCATGCCAGTGA 3'
GenBank #
460
NM_031096
559
NM_001619
670
NM_012897
841
NM_030829
612
NM_031657
560
AF227142
705
AF456324
350
NM_017008
‫עי צביעת חתכים‬
" CV ‫ בפפילת‬GRK -‫ קביעת נוכחות קינאזות ממשפחת ה‬- 2.2.7
(‫מרקמות לשון )אימונוהיסטוכימיה‬
‫ הכנת חתכים מלשון‬- 2.2.7.1
-‫ הכולל פרפוזיה דרך חדר‬, in-vivo fixation ‫ ועברו תהליך של‬2.2.1 ‫חולדות הורדמו כמתואר בסעיף‬
‫ ולאחר מכן‬,‫ לשטיפת הדם החוצה ומניעת קרישה‬Hank’s ‫ מ"ל בופר פזיולוגי‬50 -‫ הזרמת כ‬,‫הלב השמאלי‬
-‫ ו‬0.1 M ‫( אשר הומס בבופר פוספט בריכוז של‬w/v) 3% paraformaldehyde ‫ מ"ל של תמיסת‬40 -‫כ‬
‫ שעות‬16 ‫ הלשון הוצאה והודגרה למשך‬,‫ לאחר הפרפוזיה‬.(77) ‫ לקיבוע כללי של גופת החיה‬,pH 7.4
‫ במטרה למנוע נזקי קור בהמשך‬,4°C -‫ ב‬0.1 M ‫( בבופר פוספט בריכוז של‬w/v) 20% ‫בתמיסת סוכרוז‬
‫ בתוך‬-70°C -‫ לאחר מכן לשון החולדה הוקפאה ב‬.‫הטיפול ולשמור על רקמות הלשון גם בתנאי הקפאה‬
(Optimal Cutting
OCT ‫ הלשונות הקפואות נעטפו בחומר‬.‫איזופנטן עד להמשך הטיפול‬
38
‫)‪ Temperature‬ונחתכו באזור פפילת ‪ CV‬במכשיר קריוסטט לחתכים בעובי של ‪ .10 μm‬החתכים הונחו‬
‫על זכוכיות נושאות מסוג ‪ ,(Menzel-Glazer, Germany) SuperFrost Plus‬כאשר חתכים עוקבים‬
‫הונחו על זכוכיות שונות על מנת שחתכי הביקורת וגם אלו שעברו טיפול ייצגו את אותו אזור של הפפילה‪.‬‬
‫החתכים יובשו באוויר במשך ‪ 30‬דקות והוקפאו ב‪ -20°C -‬עד להמשך הטיפול‪.‬‬
‫‪ - 2.2.7.2‬צביעת חתכי פפילת ‪ CV‬בעזרת נוגדנים‬
‫החתכים שהתקבלו כמתואר בסעיף הקודם הודגרו למשך שעה אחת עם תמיסת ‪ Blocking‬אשר הכילה‬
‫‪ (v/v) 10% goat serum‬ו‪ (v/v) 0.3% Triton X-100 -‬בתוך בופר פוספט בריכוז של ‪pH 0.1 M‬‬
‫‪ 7.3‬בטמפרטורת החדר‪ ,‬כדי למנוע קשירה לא ספציפית של הנוגדן‪ .‬לאחר מכן‪ ,‬הודגרו החתכים עם נוגדן‬
‫ראשוני ספציפי כנגד ‪ GRK5 ,GRK3 ,GRK2‬או ‪ GRK6‬למשך ‪ 24‬שעות בתא סגור ולח ב‪ .4°C -‬כל‬
‫הנוגדנים נמהלו ביחס ‪ 1:100‬ב‪ .PBS X1 -‬לבדיקת ספציפיות הצביעה‪ ,‬חתכים נוספים נחשפו לנוגדן‬
‫הראשוני ביחד עם החלבון החוסם הייחודי לו )‪ .(25 µg/ml‬לאחר תגובה עם נוגדנים ראשוניים הזכוכיות‬
‫הנושאות נשטפו ‪ 3‬פעמים עם ‪ PBS X1‬ונחשפו לשעה אחת נוספת בטמפרטורת החדר לנוגדן שניוני‬
‫הקשור למולקולה פלואורסצנטית ‪ ,(FITC-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L)) FITC‬מהול‬
‫‪ 1:200‬ב‪ .PBS X1 -‬החתכים נשטפו שוב ‪ 3‬פעמים עם ‪ , PBS X1‬וטיפה מתמיסת ‪ mounting‬טופטפה‬
‫על החתכים אשר כוסו בזכוכית מכסה‪ .‬נוכחות פלואורסצנציה נבדקה במיקרוסקופ קונפוקלי פלואורסצנטי‪.‬‬
‫התמונות נשמרו בפורמאט ‪ TIFF‬ועובדו בעזרת התוכנות ‪Image-Pro Plus Media Cybernatics‬‬
‫ו‪.Adobe Photoshop -‬‬
‫‪ - 2.2.7.3‬בדיקת ספציפיות של נוגדנים בשיטת ‪Western blot‬‬
‫מוחות של חולדות שימשו כמקור ל‪ GRKs -‬השונים‪ .‬המוחות הומגנו בבופר ‪ RIPA‬וסורכזו ב‪20,000g -‬‬
‫למשך ‪ 15‬דקות ב‪ 4oC -‬בצנטריפוגת אפנדורף‪ .‬הנוזל העליון אשר התקבל מהסרכוז הורתח עם ‪sample‬‬
‫‪ buffer‬ב‪ 95 oC -‬למשך ‪ 5-10‬דקות‪ .‬עשרה מיקרוליטרים מן הנוזל העליון נלקחו לפני הרתחה ושימשו‬
‫לקביעת כמות חלבון כמתואר בסעיף ‪ .2.2.3‬עשרים מיקרוגרם חלבונים מן המיצוי הוטענו בכל באר של‬
‫ג'ל ‪-SDS‬אקרילאמיד ‪ ,12%‬ולאחר ההרצה הועברו לממברנת ניטרוצלולוז‪ .‬הממברנות הודגרו עם תמיסת‬
‫‪ blocking‬אשר הכילה ‪ 2% (w/v) BSA‬מומס בבופר ‪ TBST‬במשך שעה ובהמשך הודגרו למשך שעה‬
‫נוספת בטמפרטורת החדר עם הנוגדן ראשוני כנגד ‪) GRK2‬מיהול ‪ GRK5 ,(1:5000‬או ‪) GRK6‬מיהול‬
‫‪ (1:1000‬בהיעדר או בנוכחות )‪ blocking peptide (1µg/ml‬יחודי לנוגדן הנבדק‪ .‬הממברנות נשטפו‬
‫שלוש פעמים‪ 20 ,‬דקות כל פעם‪ ,‬בבופר ‪ TBST‬נקי והודגרו שעה בטמפרטורת החדר עם הנוגדן השניוני‬
‫)‪ .Peroxidase-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L‬לאחר שלוש שטיפות נוספות של ‪ 20‬דקות‬
‫כל אחת‪ ,‬הממברנות נחשפו לתמיסת ‪ ECL‬במשך ‪ 2‬דקות והוצמדו בחדר חושך לפילם ‪Fuji, ) X-ray‬‬
‫‪.(Japan‬‬
‫‪39‬‬
‫‪ - 2.2.8‬קביעת חדירת טעמנים אמפיפטיים בתאי ‪HeLa‬‬
‫‪ - 2.2.8.1‬החזקת תאים‬
‫תאי ‪ HeLa‬גודלו במצע ‪ (DMEM) Dulbecco's Modified Eagle's Medium‬בתוספת ‪10% Fetal‬‬
‫)‪ ,2 mM glutamine ,Bovine Serum (FBS‬ושתי אנטיביוטיקות ‪ 100 U/ml penicillin‬ו‪100 -‬‬
‫‪ - µg/ml streptomycin‬אשר ייקרא להלן ‪ .10% DMEM‬התאים פוצלו כל ‪ 3‬ימים )או לאחר שהגיעו‬
‫לצפיפות של ‪ (90%‬ע"י שטיפה עם ‪ PBS X1‬סטרילי‪ ,‬הוספת טריפסין )אנזים אשר מנתק את התאים‬
‫מצלחת הגידול( והעברת התאים לצלחות חדשות לצפיפות הרצויה‪ .‬התאים הוחזקו באינקובטור בתנאים‬
‫של ‪ 37 °C‬ו‪.5% CO2 -‬‬
‫‪ – 2.2.8.2‬הכנת תמיסות סטוק של הטעמנים וקביעת חדירתם לתאי ‪HeLa‬‬
‫התאים פוצלו לצלחות בקוטר ‪ 60 mm‬בצפיפות של ‪ 50-60%‬וגודלו ל‪ 24-48 -‬שעות נוספות‪16-18 .‬‬
‫שעות לפני הניסוי‪ ,‬הוחלף המצע למצע "הרעבה" אשר הכיל ‪ 0.1% FBS‬בלבד – ייקרא להלן ‪0.1%‬‬
‫‪.DMEM‬‬
‫חשיפת התאים לטעמנים השונים נעשתה ע"י הוספת תמיסה מרוכזת )סטוק( של כל טעמן ישירות אל‬
‫מצע התאים‪ .‬הטעמנים סכרין‪ D-TRP ,‬וקפאין הומסו במדיום ‪ DMEM‬נקי‪ ,‬בריכוז הגבוה פי ‪10‬‬
‫מהריכוז הסופי לו נחשפו התאים‪ .‬הטעמן ‪ NHD‬הומס אף הוא ב‪ ,DMEM -‬אך בריכוז גבוה פי ‪2‬‬
‫מהריכוז הסופי‪ .‬הטעמנים כינין ונרינגין הומסו קודם באתנול ו‪ DMSO -‬בהתאמה‪ ,‬ורק לאחר מכן ב‪-‬‬
‫‪ .DMEM‬ריכוזי הסטוקים חושבו כך שהתאים לא נחשפו לאחוזי ממס )אתנול או ‪ (DMSO‬העולים על‬
‫‪ .0.1%‬כל הסטוקים הובאו ל‪ pH 7-7.5 -‬לפני הוספתם לתאים‪.‬‬
‫התאים הודגרו עם הטעמנים השונים באינקובטור למשך ‪ 10‬דקות )חוץ מכינין – ‪ 3‬דקות(‪ .‬בתום זמן זה‪,‬‬
‫התאים נשטפו ‪ 5‬פעמים עם ‪ PBS X1‬קר‪ 250 µl ,‬של מים הוספו לכל צלחת והתאים נקצרו והועברו‬
‫למבחנה קרה‪ .‬התאים פוצצו ע"י סידרה של שלוש הקפאות והפשרות ב‪ -20°C -‬וממברנות התאים‬
‫הושקעו ע"י סרכוז בצנטריפוגת אפנדורף ב‪ 20,000g -‬בטמפרטורה של ‪ 4°C‬למשך ‪ 30‬דקות‪ .‬הנוזל‬
‫העליון שהכיל את תוכן התאים הופרד‪ ,‬הוקפא‪ ,‬יובש בהקפאה ונשמר בטמפרטורה של ‪ -20°C‬עד‬
‫לקביעה כמותית ב‪ ,HPLC -‬כמתואר בסעיף ‪ .2.2.5‬ריכוז הטעמנים בתאים חושב על פי מספר התאים‬
‫בכל דוגמא ונפח תאי ה‪ HeLa -‬שחושב להיות בממוצע ‪) 0.7 pL‬מכיוון שלתאי ‪ HeLa‬אין צורה אחידה‪,‬‬
‫נפח התאים חושב עבור מספר "צורות" על בסיס מדידות שנלקחו במיקרוסקופ קונפוקלי(‪.‬‬
‫‪40‬‬
‫‪ - 2.2.9‬מדידת שינויים ברמות ‪cAMP‬‬
‫‪ - 2.2.9.1‬ביטוי מלאכותי )טרנספקציה( של הקולטן ה‪ β2AR -‬בתאי ‪HeLa‬‬
‫תאי ‪ HeLa‬גודלו כמתואר בסעיף ‪ .2.2.8.1‬למטרות טרנספקציה‪ ,‬התאים פוצלו ביום אשר קדם לה‬
‫לצפיפות של ‪ 60-70%‬בצלחות בקוטר ‪ .100 mm‬הטרנספקציה בוצעה בעזרת החומר ™‪MaxFect‬‬
‫)‪ (Molecula Research Labs, USA‬בעיקר על פי הוראות היצרן‪ .‬בקצרה‪ ,‬הפלסמיד עורבב ביחד עם‬
‫החומר ™‪ MaxFect‬ביחסים ‪ MaxFect 25 µl) 1:2.5‬עורבבו עם ‪ 10 µg‬פלסמיד עבור צלחת בקוטר‬
‫‪ (100 mm‬בתוך ‪ 400 µl‬בופר ‪ (Gibco, USA) Opti-MEM® I‬וניתנה השהייה של ‪ 25‬דקות‬
‫בטמפרטורת החדר‪ .‬תאי ה‪ HeLa -‬נשטפו פעמיים עם מדיום ‪ DMEM‬נקי ונפח מינימלי של מצע זה‬
‫)‪ 5.5-6‬מ"ל‪ ,‬מספיק על מנת לכסות את התאים( הוסף לצלחת‪ .‬בתום ה‪ 25 -‬דקות השהייה‪ ,‬הפלסמיד‬
‫ביחד עם ה‪ MaxFect™ -‬טופטפו מעל המצע והתאים הוחזרו לאינקובטור ל‪ 5-7 -‬שעות‪ ,‬בסופן הוסף‬
‫מצע המכיל ‪ ,20% FBS‬על מנת להגיע למצב של ‪ .10% DMEM‬לאחר שמונה עשרה שעות‪ ,‬המצע‬
‫הוחלף ל‪ 10% DMEM -‬חדש או שהתאים פוצלו לצלחות חדשות‪ .‬התאים "הורעבו" במשך ‪16-18‬‬
‫שעות לפני כל ניסוי על ידי החלפת מצע התאים ל‪.0.1% DMEM -‬‬
‫‪ - 2.2.9.2‬הכנת הדוגמאות‬
‫תאי ‪ HeLa‬עברו טרנספקציה עם פלסמיד ‪ pcDNA3‬המכיל את הקולטן ה‪-β2 -‬אדרנרגי )להלן ‪(β2AR‬‬
‫כמתואר בסעיף ‪ .2.2.9.1‬שמונה עשרה שעות לאחר סיום הטרנספקציה‪ ,‬התאים פוצלו לתוך פלטות של‬
‫‪ 24‬בארות בצפיפות של כ‪ 60% -‬וגודלו ל‪ 30-36 -‬שעות נוספות‪ .‬שמונה עשרה שעות לפני ביצוע‬
‫הניסוי הוחלף המצע מ‪ 10% DMEM -‬ל‪) 0.1% DMEM -‬מצע הרעבה(‪ .‬ביום הניסוי התאים הודגרו‬
‫למשך ‪ 10‬דקות בנוכחות או בהיעדר טעמן ולאחר מכן עם )‪ 10 μM isoproterenol (ISO‬לזמנים שבין‬
‫‪ 30‬שניות ל‪ 5 -‬דקות‪ ,‬לגירוי הקולטן האדרנרגי‪ .‬סיום הראקציה והמשך הניסוי בוצעו לפי )‪:(185 ,56‬‬
‫הוספו ‪ 450 μl‬חומצת )‪ 5% TCA (v/v‬קרה לכל באר‪ ,‬ולאחר ‪ 30‬דקות ב‪ ,4ºC -‬הנוזלים נאספו לתוך‬
‫מבחנות זכוכית קרות והוספו ‪ TCA 5% 450 μl‬נוספים לכל באר‪ .‬לאחר ‪ 30‬דקות הדגרה נוספות‪,‬‬
‫אוחדו הנוזלים מכל דוגמא וסילוק החומצה אשר בתוכם נעשה ע"י שתי הוספות של ‪ 4.5 ml‬של אתר קר‪,‬‬
‫ערבוב חזק ושאיבת האתר במשאבת וואקום‪ .‬הדוגמאות הוקפאו ויובשו בליופילייזר תחת וואקום‪ .‬לאחר‬
‫הייבוש כל דוגמא הורחפה ב‪ 250-500 μl -‬בופר סודיום אצטט ‪ ,pH 6.2 ,0.05 M‬לקביעת רמות‬
‫‪ .cAMP‬לשם קביעת חלבון הוספו מייד לאחר הוצאת ה‪ 5% TCA -‬האחרון ‪ 500 μl‬של ‪NaOH 0.1‬‬
‫‪ M‬לכל באר למשך שעה‪ .‬בתום זמן זה‪ ,‬הועברו הדוגמאות למבחנת אפנדורף‪ ,‬הוקפאו ונשמרו ב‪-20ºC -‬‬
‫עד לקביעת חלבון‪.‬‬
‫‪41‬‬
‫‪ - 2.2.9.3‬קביעת כמות ‪ cAMP‬בשיטת ה‪(RIA) radioimmunoassay -‬‬
‫כל שלבי הניסוי בוצעו בקרח לפי )‪ .(185 ,56‬ראשית הדוגמאות המומסות בבופר סודיום אצטט עברו‬
‫אצטילציה ע"י הוספת ‪ 20 μl‬של ‪ ,triethylamine‬ערבוב בעזרת וורטקס והוספה מידית של ‪ 10 μl‬של‬
‫‪ .acetic anhydride‬תהליך האצטילציה נועד להגדיל את הרגישות של שיטת ה‪ RIA -‬מאחר והאפיניות‬
‫של ‪ acetyl-cAMP‬לנוגדן הינה פי ‪ 20‬גבוהה יותר בהשוואה ל‪ cAMP -‬עצמו‪ .‬קביעת ‪ cAMP‬נעשתה‬
‫במבחנות פוליסטירן שהכילו ‪ 50 μl‬של הדוגמא הנבדקת ו‪ 50 μl -‬של נוגדן כנגד ‪ cAMP‬המומס ב‪-‬‬
‫‪ .(w/v) 0.1% BSA‬לאחר ערבוב‪ ,‬המבחנות הועברו להשהיה בקור למשך ‪ 4‬שעות ובתום זמן זה הוספו‬
‫‪ 200 μl‬של תמיסת ‪ [125I]-cAMP‬אשר נמהלה בעזרת בופר אצטט בריכוז ‪ ,pH 6.2 0.05 M‬לקבלת‬
‫קריאה של ‪ .3000-4000 cpm‬לאחר הדגרה של ‪ 18-22‬שעות בקור‪ ,‬סיום התגובה בוצע ע"י הוספת‬
‫‪ 100 μl‬של ‪ ,10% (w/v) BSA‬ערבוב כפול בוורטקס והשקעת הקומפלקס ע"י הוספת ‪ 2‬מ"ל של‬
‫אתנול קר‪ .‬הדוגמאות עורבבו פעמיים בוורטקס וסורכזו למשך ‪ 15‬דקות במהירות של ‪ .4,000g‬בתום‬
‫הסרכוז הנוזל העליון נשאב במשאבת וואקום והמשקע נמנה במונה גמא‪ .‬חישוב כמות ה‪ cAMP -‬נעשה‬
‫כנגד עקומת כיול של נוקלאוטיד נקי אשר הוכנה באותם תנאים‪ .‬הערכים בוטאו ביחידות של ‪fmole‬‬
‫‪.cAMP/μg protein‬‬
‫‪ - 2.2.9.4‬קביעת חלבון בשיטת ברדפורד‬
‫חמישים מיקרוליטרים מן הדוגמה המהולה ב‪ 0.1 M NaOH -‬הועברו לפלטה בעלת ‪ 96‬בארות להם‬
‫הוספו ‪ 250 μl‬של תמיסת ברדפורד‪ .‬כל באר עורבבה היטב ולאחר ‪ 15‬דקות השהיה בטמפרטורת החדר‬
‫נמדדה הבליעה במכשיר ‪ Bio-Elisa‬באורך גל של ‪ .595 nm‬חישוב כמות החלבון נעשה מול עקומת‬
‫סטנדרט של ‪ BSA‬אשר הוכנה באותם תנאים‪.‬‬
‫‪ - 2.2.10‬קביעת רמת הזרחון של הקולטן הבטא‪-‬אדרנרגי לאחר גירוי‬
‫‪ - 2.2.10.1‬הכנת הדוגמאות‬
‫תאי ‪ HeLa‬אשר גודלו בצלחות בקוטר ‪ 100 mm‬עברו טרנספקציה עם פלסמיד ‪ pcDNA3‬המכיל את‬
‫הקולטן ה‪-β2 -‬אדרנרגי הקשור לסמן ‪) HA‬להלן‪ ,(β2HA‬כמתואר בסעיף ‪ 48 .2.2.9.1‬שעות לאחר‬
‫הטרנספקציה‪ ,‬התאים הורעבו ע"י החלפת המדיום מ‪ 10% DMEM -‬ל‪ 0.1% DMEM -‬למשך שמונה‬
‫עשרה שעות לפני ביצוע הניסוי‪.‬‬
‫ביום הניסוי‪ ,‬התאים הודגרו קודם בהיעדר או בנוכחות טעמן ולאחר מכן גורו עם ‪ (10 μM) ISO‬לזמנים‬
‫שבין ‪ 5‬ל‪ 25 -‬דקות‪ .‬בתום הגירוי המדיום נשאב והתאים נשטפו פעמיים עם ‪ PBS X1‬קר על קרח‪.‬‬
‫לאחר השטיפה‪ ,‬הוספו לתאים ‪ 400 μl‬של בופר ‪ RIPA‬אשר מכיל בנוסף ‪ ,NaF 25 mM‬הפועל כמעכב‬
‫‪ .serine phosphatases‬התאים נקצרו והנוזלים הועברו לתוך מבחנות אפנדורף קר‪ .‬המבחנות סורכזו‬
‫‪42‬‬
‫‪ 15‬דקות ב‪ 15,000g -‬ב‪ ,4ºC -‬והנוזל העליון הועבר למבחנת אפנדורף נפרדת אשר הכילה חרוזים‬
‫הקשורים לנוגדן כנגד הסמן ‪.HA‬‬
‫‪ - 2.2.10.2‬קשירת החרוזים לנוגדן כנגד ‪HA‬‬
‫כל הכמויות המפורטות בסעיף זה הותאמו לטיפול ב‪ 6 -‬צלחות בהן התאים טופלו כמתואר בסעיף‬
‫‪ .2.2.10.1‬מאה עשרים מיקרוליטרים של חרוזים מסוג אגרוז אליהם קשור חלבון ‪(proteinG-plus G‬‬
‫)‪ agarose beads, Santa-Cruz‬נשטפו שלוש פעמים עם ‪ PBS X1‬קר כאשר כל שטיפה הסתיימה‬
‫בסרכוז של דקה ב‪ 12,000g -‬ב‪ 4ºC -‬ושאיבת הנוזל העליון‪ .‬בסוף הסרכוז האחרון החרוזים הורחפו ב‪-‬‬
‫‪ 500 μl‬של ‪ PBS X1‬ו‪ 12 μl -‬של נוגדן הוספו‪ .‬לאחר ערבוב בצורה של ‪ end-to-end‬כל הלילה בחדר‬
‫קור‪ ,‬החרוזים נשטפו פעמיים ב‪ PBS X1 -‬קר‪ ,‬פעם נוספת בבופר ‪ ,RIPA‬ולבסוף הורחפו ב‪300 µl -‬‬
‫‪ RIPA‬וחולקו ל‪ 6-‬מנות שוות במבחנות אפנדורף קרות‪.‬‬
‫‪ - 2.2.10.3‬השקעה אימונית )‪ (immunoprecipitation‬של הקולטן הבטא‪-‬אדרנרגי‬
‫הנוזל העליון שהתקבל לאחר סרכוז תמצית התאים )כמתואר בסעיף ‪ (2.2.10.1‬הועבר למבחנת אפנדורף‬
‫המכילה את החרוזים הקשורים לנוגדן כנגד ‪) HA‬כמתואר בסעף ‪ .(2.2.10.2‬המבחנות עורבבו בצורה של‬
‫‪ end-to-end‬למשך שעתיים בקור‪ .‬בסוף זמן זה‪ ,‬החרוזים הושקעו ע"י סרכוז למשך דקה ב‪ 10,500g -‬ב‪-‬‬
‫‪ 4ºC‬ונשטפו פעמיים עם תמיסת ‪ LiCl 0.5 mM‬ע"י סרכוזים זהים ושאיבת הנוזל העליון במשאבת‬
‫וואקום‪ .‬לאחר השאיבה האחרונה הדוגמאות הורחפו ב‪ 50 μl -‬של ‪ sample buffer‬והורתחו ב‪95ºC -‬‬
‫למשך ‪ 5‬דקות‪ .‬הדוגמה כולה הורצה לבסוף בג'ל ‪-SDS‬אקרילאמיד ‪ .10%‬לאחר סיום ההרצה‪ ,‬החלבונים‬
‫הועברו לממברנת ניטרוצלולוז ע"י אלקטרוטרנספר‪ .‬לאחר קיבוע הממברנה בעזרת ‪2% (w/v) BSA‬‬
‫מהול ב‪ ,TBST -‬זוהתה נוכחות הקולטן ה‪ β2HA -‬ע"י שימוש בנוגדן המכוון כנגד הפפטיד ‪ ,HA‬מהול‬
‫‪ 1:1000‬ב‪ .TBST -‬לעומת זאת‪ ,‬נוכחות של קולטן מזורחן נבדקה ע"י שימוש בנוגדן ראשוני יחודי‪ ,‬בשם‬
‫‪ ,anti-phosphoSer(355-356) β2-adrenergic receptor‬המכוון כנגד שתי חומצות אמינו סרין‬
‫המזורחנות ספציפית ע"י ‪ .GRK2/5‬הממברנות טולטלו עם נוגדן ראשוני זה‪ ,‬מהול ‪ 1:600‬ב‪,TBST -‬‬
‫למשך ‪ 18‬שעות בחדר קור‪ .‬לאחר שלוש שטיפות של ‪ 20‬דקות כל אחת עם בופר ‪ ,TBST‬הממברנה‬
‫הודגרה שעה בטמפרטורת החדר עם נוגדן שניוני ‪Peroxidase-conjugated goat anti-rabbit IgG‬‬
‫)‪ (H+L‬אשר נמהל ‪ 1:10,000‬ב‪ .TBST -‬לאחר שלוש שטיפות נוספות של ‪ 20‬דקות כל אחת‪ ,‬הממברנות‬
‫נחשפו לתמיסת ‪ ECL‬במשך ‪ 2‬דקות והוצמדו בחדר חושך לפילם ‪ .X-ray‬עוצמת הכתמים היחסית בכל‬
‫טיפול נקבעה ע"י שימוש בתוכנת ‪.ImageJ‬‬
‫‪43‬‬
‫‪ - 2.2.11‬מדידת אינטרנליזציה של הקולטן הבטא‪-‬אדרנרגי לאחר גירוי‬
‫תאי ‪ HeLa‬אשר עברו טרנספקציה לביטוי הקולטן ה‪) β2AR -‬סעיף ‪ (2.2.9.1‬פוצלו ‪ 24‬שעות לאחר‬
‫הטרנספקציה לתוך פלטות של ‪ 12‬בארות שבתוכן הוכנסו זכוכיות מכסות בקוטר ‪ 18‬מ"מ‪ .‬לאחר ‪30-36‬‬
‫שעות נוספות התאים הורעבו ע"י החלפת המצע מ‪ 10% DMEM -‬ל‪ 0.1% DMEM -‬ל‪ 18 -‬שעות‬
‫נוספות‪ .‬ביום הניסוי‪ ,‬התאים עברו פראינקובציה בנוכחות או היעדר טעמן למשך ‪ 10‬דקות ולאחר מכן‬
‫גירוי הקולטן האדרנרגי ע"י ‪ .(10 μM) ISO‬בתום הגירוי התאים נשטפו פעמיים עם ‪ PBS X1‬וקובעו‬
‫ע"י ‪ 3% (w/v) PFA‬למשך ‪ 20‬דקות‪ .‬ה‪ PFA -‬נשטף ‪ 3‬פעמים עם ‪ PBS X1‬והתאים הודגרו עם‬
‫תמיסת ‪ blocking‬אשר הכילה ‪ 3% (w/v) BSA‬ו‪ 0.3% (v/v) Triton X-100 -‬המומסים בבופר‬
‫פוספט בריכוז ‪ pH 7.3 0.1 M‬למשך ‪ 1-2‬שעות בטמפרטורת החדר‪.‬‬
‫הנוגדן הראשוני כנגד הקולטן הבטא‪-‬אדרנרגי הומס בתמיסת ה‪ blocking -‬והדגרה עם הזכוכיות‬
‫הנושאות נעשתה ל‪ 18 -‬שעות בקור בתא לח‪ .‬לאחר מכן התאים נשטפו שלוש פעמים עם ‪PBS X1‬‬
‫והודגרו עם נוגדן שניוני הקשור לסמן הפלואורסצנטי ‪ FITC‬לעוד שעה בטמפרטורת החדר‪ .‬לבסוף‬
‫התאים נשטפו שלוש פעמים עם ‪ PBS X1‬והועברו לזכוכית נושא עליה טופטפה טיפה של תמיסת‬
‫‪.mounting‬‬
‫הפלואורסצנציה נמדדה במיקרוסקופ קונפוקלי פלואורסצנטי )‪ (BioRad‬בעזרת עדשה ‪ ×60‬המצריכה‬
‫שמן מינרלי‪ ,‬ותמונות נלקחו בעזרת תוכנת )‪ .LaserSharp 2000 software (BioRad‬עיבוד התמונות‬
‫נעשה בעזרת תוכנת ‪.(Adobe) Photoshop 7.0‬‬
‫להשוואת מידת האינטרנליזציה של הקולטן הבטא‪-‬אדרנרגי בהיעדר מול נוכחות טעמן אמפיפטי נעשתה‬
‫ספירה של מספר התאים בהם הקולטן נראה על הממברנה הפלסמטית מול מספר התאים בהם הקולטן‬
‫נראה אך ורק בווסיקולות תוך תאיות‪.‬‬
‫‪ - 2.2.12‬מידור )פרקציונציה( של התא‬
‫שיטת מידור התאים התבססה לרוב על )‪ .(37‬לאחר טרנספקציה של הקולטן ה‪ β2HA -‬בתאי ‪HeLa‬‬
‫)סעיף ‪ ,(2.2.9.1‬התאים גודלו בצלחות בקוטר ‪ 60 mm‬ל‪ 48 -‬שעות נוספות בסופן הורעבו ב‪0.1% -‬‬
‫‪ DMEM‬למשך ‪ 16-18‬שעות‪ .‬ביום הניסוי‪ ,‬התאים הודגרו בהיעדר או בנוכחות טעמן במשך ‪ 10‬דקות‬
‫)חוץ מכינין‪ 3 ,‬דקות( והקולטן גורה עם ‪ (10 µM) ISO‬לזמנים שונים )‪ 15 ,10 ,5 ,0‬ו‪ 20 -‬דקות(‪.‬‬
‫בתום זמן הגירוי‪ ,‬התאים נשטפו עם ‪ PBS X1‬קר פעמיים‪ ,‬לאחר מכן עם בופר ‪ A‬קר פעם אחת‪ ,‬ולבסוף‬
‫‪ 150 µl‬של בופר ‪ H‬אשר הכיל סוכרוז בריכוז של ‪ 0.25 M‬הוספו לכל צלחת‪ .‬התאים נקצרו ביחד עם‬
‫הבופר‪ ,‬וכל דוגמא )צלחת( הועברה למבחנת סרכוז קרה נפרדת וסורכזה בשלושה שלבים‪ :‬סרכוז ראשון‬
‫ב‪ 3,000g -‬למשך ‪ 10‬דקות ב‪ ;4 °C -‬המשקע אשר הכיל את גרעיני התאים הושלך והנוזל העליון‬
‫הועבר למבחנת סרכוז קרה חדשה וסורכז ב‪ 10,000g -‬למשך ‪ 10‬דקות ב‪ ; 4 °C -‬המשקע החדש אשר‬
‫הכיל אורגנלות גדולות )גולג'י‪ (...ER ,‬הושלך והנוזל העליון הועבר למבחנת סרכוז עבות ‪(Beckman,‬‬
‫‪44‬‬
‫)‪ Germany‬וסורכז בצנטריפוגת ‪ Ultra‬במהירות של ‪ 100,000g‬למשך ‪ 45‬דקות ב‪ .4 °C -‬הנוזל‬
‫העליון מכל דוגמא‪ ,‬אשר הכיל את התוכן הציטוזולי‪ ,‬הועבר למבחנה חדשה ולאחר הוספת ‪sample‬‬
‫‪ buffer‬הורתח ב‪ 95 °C -‬ל‪ 5 -‬דקות‪ .‬המשקע מכל דוגמא‪ ,‬אשר הכיל את הממברנה הפלסמטית‪ ,‬הומס‬
‫ב‪ 120 µl -‬בופר ‪ RIPA‬ולאחר הוספת ‪ sample buffer‬הורתח אף הוא ב‪ 95 °C -‬ל‪ 5 -‬דקות‪60 µl .‬‬
‫מכל דוגמה הורצו בג'ל ‪-SDS‬אקרילאמיד )‪ 12% (v/v‬והחלבונים הועברו לממברנת ניטרוצלולוז‬
‫באלקטרוטרנספר‪ .‬לאחר קיבוע עם ‪ ,2% (w/v) BSA‬הממברנה הודגרה עם נוגדן כנגד ‪ HA‬במיהול‬
‫‪ 1:1000‬למשך ‪ 16-18‬שעות ב‪ 4 °C -‬ולאחר מכן עם נוגדן שניוני קשור ל‪ HRP -‬במשך שעה‬
‫בטמפרטורת החדר‪ .‬הממברנות נחשפו לתמיסת ‪ ECL‬והוצמדו בחדר חושך לפילם ‪.X-ray‬‬
‫‪ - 2.2.13‬קביעת שפעול של ‪ERK‬‬
‫לאחר טרנספקציה של הקולטן ה‪ β2AR -‬בתאי ‪) HeLa‬סעיף ‪ ,(2.2.9.1‬התאים גודלו ל‪ 48 -‬שעות‬
‫נוספות בסופן הורעבו ב‪ 0.1% DMEM -‬למשך ‪ 16-18‬שעות‪ .‬ביום הניסוי‪ ,‬התאים הודגרו בהיעדר או‬
‫בנוכחות טעמן במשך ‪ 10‬דקות )חוץ מכינין‪ 3 ,‬דקות( והקולטן גורה עם ‪ (10 µM) ISO‬לזמנים שונים‬
‫)‪ 20 ,10 ,5 ,2 ,0‬או ‪ 30‬דקות(‪ .‬בתום זמן הגירוי‪ ,‬התאים נשטפו עם ‪ PBS X1‬קר פעמיים ונקצרו על‬
‫קרח בנוכחות בופר ‪ .RIPA‬התאים ביחד עם הבופר הועברו למבחנות סרכוז קרות וסורכזו בצנטריפוגת‬
‫אפנדורף במהירות ‪ 17,000g‬למשך ‪ 15‬דקות ב‪ .4 °C -‬הנוזל העליון הועבר למבחנה חדשה‪ ,‬ולאחר‬
‫הוצאת דגימה לצורכי קביעת חלבון‪ ,‬הוסף ‪ sample buffer‬והדוגמה הורתחה ב‪ 95 °C -‬ל‪ 5 -‬דקות‪25 .‬‬
‫‪ µg‬מכל דוגמה הורצו בג'ל ‪-SDS‬אקרילאמיד )‪ 12% (v/v‬ולאחר מכן החלבונים הועברו לממברנת‬
‫ניטרוצלולוז באלקטרוטרנספר‪ .‬לאחר קיבוע עם ‪ ,2% (w/v) BSA‬זיהוי חלבון ה‪ ERK -‬וזיהוי ה‪-‬‬
‫‪ ERK‬המזורחן נעשו ע"י שימוש בשני נוגדנים שונים‪ :‬זיהוי הכמות הכללית של ‪ ERK‬בכל דוגמה נעשה‬
‫ע"י נוגדן אשר מזהה את הקצה ה‪ C -‬טרמינלי של ‪ (gERK) ERK‬ונמהל ‪ 1:40,000‬ב‪ .TBST -‬לעומת‬
‫זאת זיהוי ה‪ ERK -‬המזורחן נעשה ע"י נוגדן מכוון כנגד אתרי טירוזין מזורחנים ב‪,(pERK) ERK -‬‬
‫ונמהל ‪ 1:30,000‬ב‪ .(154) TBST -‬ממברנות הניטרוצלולוז נחשפו למשך שעה בטמפרטורת החדר‬
‫לאחד מן הנוגדנים האלו‪ ,‬ולאחר שלוש שטיפות של ‪ 20‬דקות כל אחת‪ ,‬נחשפו לנוגדן שניוני הקשור ל‪-‬‬
‫‪ HRP‬במשך שעה בטמפרטורת החדר‪ .‬לאחר שלוש שטיפות נוספות‪ ,‬הממברנות נחשפו לתמיסת ‪ECL‬‬
‫והוצמדו בחדר חושך לפילם ‪ .X-ray‬עוצמת הכתמים היחסית בכל טיפול חושבה ע"י שימוש בתוכנת‬
‫‪.ImageJ‬‬
‫‪ - 2.2.14‬ניתוח סטטיסטי של התוצאות‬
‫ניתוח סטטיסטי של התוצאות וקביעת מובהקות סטטיסטית בין הטיפולים השונים בכל ניסויי המחקר נעשו‬
‫בעזרת תוכנת ‪ (SAS Institute, Cary, NC) JMP statistical software‬ע"י שימוש במבחן‬
‫‪ Student's t-test‬זוגי דו‪ -‬כיווני‪.‬‬
‫‪45‬‬
‫‪ .3‬תוצאות‬
‫‪ - 3.1‬חדירת טעמנים אמפיפטיים לפפילות ‪ CV‬שלמות‬
‫‪ - 3.1.1‬מעקב אחר חדירת הטעמנים במיקרוסקופ קונפוקלי‬
‫לאחר הוצאתה של פפילת ה‪ CV -‬בצורה שלמה מתוך הלשון‪ ,‬הפפילה הונחה תחת מיקרוסקופ קונפוקלי‬
‫כך שבתמונות אשר צולמו כפי שנראה באיור ‪ 3.1‬מתגלה הצד הדורסלי שלה‪ .‬החיצים באיור מציינים את‬
‫מיקומה של התעלה הפנימית של הפפילה )‪ (inner trench‬שם ממוקמות רוב פקיעיות הטעם‪ .‬בתנאי‬
‫הניסוי הנוכחיים‪ ,‬הצד האפיקלי בלבד של תאי פקיעיות הטעם נחשף לסביבה )במקרה זה לטעמנים‬
‫הפלואורסצנטים( בדומה לתנאים פיזיולוגיים‪ .‬ניתן לראות באיור ‪ 3.1‬שלאחר חשיפה של פפילות ה‪CV -‬‬
‫לטעמנים אמפיפטיים שונים‪ ,‬סכרין )‪ ,(SACC‬הפפטיד המר )‪ (CLT‬וקפאין )‪ ,(CAFF‬מבחינים‬
‫בהופעתה של פלואורסצנציה בעיקר באזור התעלה‪ ,‬ובהתעצמותה עם הזמן‪ .‬פלואורסצנציה נראתה לעין‬
‫כבר לאחר דקה של חשיפה‪ ,‬אך זמני חשיפה מ‪ 0 -‬עד ‪ 6‬דקות נבחרו על מנת להראות את התגברותה של‬
‫רמת הפלואורסצנציה עם הזמן‪ .‬תוצאות אלו מעידות לכאורה על חדירה והצטברות של אותם הטעמנים‬
‫לתוך פקיעיות הטעם עצמן‪ .‬על מנת להוכיח שאכן העלייה ברמת הפלואורסצנציה נבעה מחדירת הטעמנים‬
‫לתוך תאי הפקיעיות ולשלול ספיחה חיצונית לאפיתל הלשון‪ ,‬נעשו שני ניסויים נוספים‪ .‬ראשית‪ ,‬נעשה‬
‫שימוש במלח אשלגן יודיד )‪ (KI‬אשר פועל כמדעיך פלואורסצנציה‪ :‬משמעות הדבר שחומר זה גורם‬
‫לדעיכה של כל מולקולה פלואורסצנטית אשר יפגוש‪ KI .‬איננו חודר ממברנות שלמות של תאים ולכן‬
‫צפוי לגרום לדעיכה של כל מולקולה פלואורסצנטית אשר נמצאת מחוץ לתאי הפפילה‪ .‬ניתן לראות באיור‬
‫‪ 3.1‬שהוספת ‪ KI‬לפפילת ה‪ CV -‬לאחר ‪ 6‬דקות חשיפה לטעמנים לא גרמה לירידה בעוצמת‬
‫הפלואורסצנציה שהתקבלה‪ .‬תוצאות אלו מעידות על חדירה עמוקה של הטעמנים האמפיפטיים לתוך‬
‫ציטוזול תאי פקיעיות הטעם או לכל הפחות לצד הפנימי של הממברנה הפלסמטית‪ ,‬שם אין ל‪ KI -‬גישה‪.‬‬
‫כביקורת נוספת‪ ,‬נעשה ניסוי דומה כאשר הפעם פפילת ה‪ CV -‬נחשפה לפרופידיום יודיד )‪ ,(PI‬חומר‬
‫אשר משמש בניסויים ביולוגיים רבים כמולקולה פלואורסצנטית החודרת ממברנות מפורקות של תאים‬
‫מתים‪ .‬מכיוון שתאי הפפילה נשארים חיים במהלך ניסוי זה‪ PI ,‬אינו צפוי לחדור לתוכם‪ .‬באיור‪ ,‬ניתן‬
‫לראות שכתוצאה מחשיפת פפילת ה‪ CV -‬ל‪ PI -‬התגלתה הופעה של פלואורסצנציה אשר התגברה‬
‫במידה מסוימת עם זמן החשיפה‪ ,‬אך הוספת ‪ KI‬גרמה לדעיכה כמעט מוחלטת שלה‪ .‬תוצאה זו מעידה על‬
‫כך שמולקולות ה‪ ,PI -‬בניגוד לטעמנים האמפיפטיים‪ ,‬לא חדרו לתוך תאי הפפילה אך נספחו חיצונית אל‬
‫האפיתל‪ ,‬ולכן חשיפתן ל‪ KI -‬גרמה במקרה זה לדעיכת הפלואורסצנציה שלהן‪.‬‬
‫‪46‬‬
‫איור ‪ – 3.1‬הסתכלות במיקרוסקופ קונפוקלי על הצטברותם של טעמנים אמפיפטיים פלואורסצנטיים‬
‫בתעלה הפנימית של פפילת ‪.CV‬‬
‫פפילות ‪ CV‬שלמות הונחו מתחת למיקרוסקופ קונפוקלי ונחשפו לטעמנים אמפיפטיים פלואורסצנטיים‪ .‬תמונות של‬
‫הצד הדורסלי של הפפילה מאפשרות לעקוב אחר הופעת פלואורסצנציה בתעלה הפנימית )מצויינת ע"י חיצים( בה‬
‫ממוקמות רוב פקיעיות הטעם של הפפילה‪ .‬התמונות נלקחו לאחר חשיפת הפפילות לתמיסות של ‪ 10 mM‬סכרין‬
‫)‪ 10 mM ,(CLT) cyclo(Leu-Trp) 1 mM ,(SACC‬קפאין )‪ (CAFF‬או בהיעדר טעמן במקרה של הביקורת‬
‫)‪ .(CON‬בזמן ‪ 0‬תמיסת הטעמנים טופטפה על הפפילה ורמת הפלואורסצנציה נמדדה כל דקה )כאן הזמנים ‪ 2 ,0‬ו‪-‬‬
‫‪ 6‬דקות מוצגים(‪ .‬המלח ‪ ,(500 mM) KI‬צורף לתמיסה לאחר ‪ 6‬דקות ותמונות נלקחו ‪ 2‬דקות לאחר מכן‪ .‬ניתן‬
‫לראות שהוספת ‪ KI‬לא השפיעה על רמת הפלואורסצנציה שהתקבלה לאחר חשיפתה של הפפילה לטעמנים‬
‫השונים‪ .‬פרופידיום יודיד )‪ ,(50 µg/ml) (PI‬שימש כביקורת חיובית לניסוי‪ .‬כל תמונה מייצגת חזרה מתוך ‪4‬‬
‫חזרות שנעשו לאותו ניסוי‪ .‬ה‪ scale bar -‬הינו של ‪ 100 µm‬ורוחב הפפילה נמצא קרוב ל‪) 0.6 mm -‬נעשה‬
‫בשיתוף עם מר אלכסנדר אלילויקו(‪.‬‬
‫‪ - 3.1.2‬חדירת טעמנים אמפיפטיים במודל של חיות‬
‫על מנת לבחון את יכולתם של הטעמנים האמפיפטיים לחדור לתוך פפילות טעם בתנאי ‪ ,in-vivo‬נעשה‬
‫ניסוי בו טופטפו לסירוגין תמיסות טעמנים שונות לפיהן של חולדות מורדמות במשך ‪ 90‬שניות‪ ,‬ולאחר‬
‫ניתוח להוצאת פפילת ה‪ CV -‬מתוך אפיתל הלשון‪ ,‬נבחנו נוכחות וכמות הטעמנים בציטוזול התאים‬
‫בשיטת ‪ .HPLC‬על מנת לאמוד את הריכוז התוך תאי של הטעמנים השונים בתוך תאי פקיעיות הטעם‪,‬‬
‫‪47‬‬
‫נעשה בנוסף חישוב בו נלקחה בחשבון בריחתם של הטעמנים החוצה מן הפפילה במשך ‪ 25‬הדקות של‬
‫טיפול הקולגנאז להוצאת הפפילה מתוך אפיתל הלשון‪ ,‬כמתואר בסעיף ‪ .2.2.4‬כפי שרואים בטבלה ‪,3.1‬‬
‫השטף של הטעמנים השונים החוצה נאמד בין ‪ 64%‬ל‪ .86% -‬ניתן לראות שהריכוז התוך תאי הסופי של‬
‫הטעמנים הגיע לרמות גבוהות של מילימולרים )‪ (mM‬ואף נראתה תופעה של הצטברות כנגד מפל‬
‫הריכוזים עבור כינין וקפאין‪ ,‬תופעה אשר תוארה גם בתאי טעם מבודדים )‪.(132‬‬
‫טבלה מס' ‪ - 3.1‬חדירת טעמנים אמפיפטיים מרים ומתוקים לתוך פקיעיות טעם של פפילת ‪CV‬‬
‫שלמה‪.‬‬
‫‪Intracellular conc.‬‬
‫‪(mM) after 90 s of‬‬
‫‪oral stimulation‬‬
‫‪Efflux (%) during 25‬‬
‫‪min of collagenase‬‬
‫‪treatment‬‬
‫‪Extracellular conc.‬‬
‫‪(mM) during 90 s of‬‬
‫‪oral stimulation‬‬
‫‪6.4** ± 1.0‬‬
‫‪86* ± 9.5‬‬
‫‪30‬‬
‫‪D-Tryptophan‬‬
‫‪5.5** ± 0.8‬‬
‫‪75* ± 5.6‬‬
‫‪2‬‬
‫‪Quinine‬‬
‫‪0.96** ± 0.1‬‬
‫‪64* ± 3.0‬‬
‫‪2‬‬
‫)‪Cyclo(Leu-trp‬‬
‫‪13.7* ± 3.6‬‬
‫‪70* ± 2.5‬‬
‫‪10‬‬
‫‪Caffeine‬‬
‫‪Tastant‬‬
‫תמיסת הטעמנים בריכוזים המצויינים טופטפה לתוך פיהן של חולדות מורדמות במשך ‪ 90‬שניות‪ ,‬שבסופן החיות‬
‫הוקרבו‪ .‬תוכן התאים הופרד והורץ ב‪) HPLC -‬כמתואר סעיף ‪ (2.2.5‬במטרה לזהות נוכחות טעמנים אלה ולקבוע‬
‫את ריכוזם התוך תאי‪ .‬דליפת הטעמנים החוצה מן התאים שהתרחשה במשך הוצאת הפפילה מן הלשון שימשה‬
‫כפקטור תיקון לחישוב הריכוז התוך תאי הסופי‪ .‬הערכים הינם ממוצע ‪ ±‬שגיאת תקן של ‪ 4-9‬חזרות‪ * .‬ו‪** -‬‬
‫מציינות ערכים מובהקים סטטיסטית )‪ p<0.03‬ו‪ ,p<0.001 -‬בהתאמה( )נעשה בשיתוף עם מר אלכסנדר‬
‫אלילויקו(‪.‬‬
‫‪ - 3.2‬נוכחות ודפוס התבטאות של קינאזות ממשפחת ה‪GRKs -‬‬
‫בפפילת ‪ CV‬בחולדות‬
‫‪ -3.2.1‬ביטוי ‪ GRKs‬שונים בפפילת ה‪ CV -‬בשיטת ה‪RT-PCR -‬‬
‫לאחר בידוד רקמת פפילת ה‪ CV -‬משאר הרקמות הלא סנסוריות העוטפות אותה )כמתואר בסעיף‬
‫‪ ,(2.2.2‬נבחן ביטוין של הקינאזות ‪ GRK5 ,GRK3 ,GRK2 ,GRK1‬ו‪ GRK6 -‬בשיטת ‪.RT-PCR‬‬
‫‪ GRK4‬אשר מתבטא בעיקר באשכים ו‪ GRK7 -‬אשר משתייך למערכת הראייה אך איננו מתבטא‬
‫בחולדות‪ ,‬לא נבדקו‪ .‬התוצאות המסוכמות באיור ‪ 3.2‬מראות שתוצרים בגודל המצופה התקבלו עבור‬
‫‪ GRK5 ,GRK3 ,GRK2‬ו‪ GRK6 -‬ברקמת הפפילה )‪ ,(CV‬אך גם באפיתל לא סנסורי )‪GRK1 .(EP‬‬
‫אשר מתבטא גם הוא באופן ספציפי ב‪ rod segments -‬שבמערכת הראייה לא התבטא באף אחת‬
‫מהרקמות‪ .‬הקולטן המר ‪ T2R4‬והקולטן המתוק ‪ T1R3‬נמצאו כצפוי רק ברקמת הפפילה‪ ,‬דבר אשר‬
‫מוכיח את הצלחת בידודה של רקמת הפפילה מן האפיתל הלא סנסורי הסובב אותו‪ ,GAPDH .‬חלבון‬
‫המתבטא באופן אחיד ותמידי בכל הרקמות‪ ,‬שימש ביקורת חיובית‪ .‬היעדר תוצר ריאקציה בביקורת‬
‫השלילית )‪ ,(CON‬שלא עברה את שלב ה‪ ,reverse transcription -‬שולל את האפשרות של זיהום‬
‫‪48‬‬
‫דנ"א גנומי במערכת‪ .‬כל התוצרים של ריאקצית ה‪ RT-PCR -‬הובאו ל‪ sequencing -‬לזיהוי וודאי של‬
‫התוצרים‪.‬‬
‫איור ‪ - 3.2‬זיהוי ביטוין של קינאזות ממשפחת ה‪ GRKs -‬בפפילת ה‪ CV -‬ובאפיתל הלא‪-‬סנסורי‬
‫בלשון בשיטת ה‪.RT-PCR -‬‬
‫‪ cDNA‬סונתז מרקמת פפילת ‪ CV‬ומאפיתל לא‪-‬סנסורי מן הלשון )‪ (EP‬וביטוי הגנים השונים נבחן ע"י שימוש‬
‫בפריימרים יחודיים‪ GAPDH .‬שימש כביקורת חיובית‪ .‬כביקורת שלילית )‪ (CON‬שימשה דוגמא שעברה ‪PCR‬‬
‫ללא שלב ה‪ .RT -‬תוצרי ה‪ RT-PCR -‬הורצו בג'ל אגרוז )כמתואר בסעיף ‪ .(2.2.6.3‬גודלם הצפוי של התוצרים‬
‫היו ‪ 460 bp‬עבור ‪ 559 bp ,GRK1‬עבור ‪ 670 bp ,GRK2‬עבור ‪ 841 bp ,GRK3‬עבור ‪612 bp ,GRK5‬‬
‫עבור ‪ 560 bp ,GRK6‬עבור ‪ 705 bp ,T2R4‬עבור ‪ T1R3‬ו‪ 350 bp -‬עבור ‪ .GAPDH‬מעקובת הבסיסים של‬
‫כל התוצרים נקבעה על מנת לוודא את זהותם‪.‬‬
‫‪ – 3.2.2‬קביעת מיקומם של ה‪ GRKs -‬השונים בשיטת ‪immunostaining‬‬
‫על מנת לבחון את מיקום התבטאותם של ה‪ GRKs -‬השונים בתוך הפפילה‪ ,‬משמע בתאי פקיעיות הטעם‬
‫עצמם או בתאי האפיתל שבה‪ ,‬לשון של חולדה נחתכה לרוחב באזור פפילת ה‪ CV -‬בעזרת מכשיר‬
‫קריוסטט‪ ,‬והחתכים בעובי של ‪ 10 µm‬הודגרו עם נוגדנים ספציפיים כנגד כל אחד מה‪.GRKs -‬‬
‫באיור ‪ 3.3A‬ניתן לראות בבירור בחתכים את פקיעיות הטעם בעלות צורת אגס )מודגשות ע"י חיצים(‪.‬‬
‫ניתן לראות שלאחר הדגרה של החתכים עם נוגדנים כנגד ‪ GRK5 ,GRK2‬או ‪ ,GRK6‬התקבלה צביעה‬
‫חזקה של החתכים‪ ,‬כאשר ‪ GRK2‬נראה גם בתוך פקיעיות הטעם אך גם בתאי האפיתל הלא סנסוריים‬
‫העוטפים אותן‪ GRK5 ,‬נראה בעיקר בפקיעיות הטעם עצמן ו‪ GRK6 -‬נראה בעיקר באפיתל הלא‬
‫סנסורי‪ .‬נוגדן כנגד ‪ GRK3‬גרם לצביעה חלשה במיוחד ולכן התוצאות אינן מופיעות כאן‪ .‬צביעת החתכים‬
‫נמנעה כמעט לחלוטין בנוכחות החלבון החוסם )‪ ,(25 µg/ml‬דבר אשר מעיד על הספציפיות של הנוגדנים‬
‫והצביעה‪.‬‬
‫במטרה לבחון בדרך נוספת את הספציפיות של כל אחד מהנוגדנים אשר שימשו בניסוי זה‪ ,‬מיצוי של מוח‬
‫חולדה הורץ בג'ל אקרילאמיד‪ ,‬החלבונים הועברו לממברנת ניטוצלולוז וכל פס הודגר עם נוגדן אחר‪,‬‬
‫בהיעדר או בנוכחות חלבון חוסם‪ .‬כפי שנראה באיור ‪ ,3.2B‬התקבלו פסים יחידים וספציפיים בעלי משקל‬
‫מולקולרי צפוי )‪ GRK2‬בעל משקל של ∼ ‪ 80 kDa‬ו‪ GRK5 -‬ו‪ GRK6 -‬בעלי משקל של ∼ ‪.(65 kDa‬‬
‫‪49‬‬
‫בנוסף‪ ,‬קשירתם של הנוגדנים השונים נחסמה לחלוטין )במקרה של ‪ GRK2‬רק נחלשה( בנוכחות החלבון‬
‫החוסם הספציפי )‪.(1 µg/ml‬‬
‫‪A‬‬
‫‪B‬‬
‫איור ‪ – 3.3‬מיקום התבטאות של ה‪ GRKs -‬בפפילת ה‪ CV -‬בחולדה‪.‬‬
‫)‪ (A‬צביעת חתכים של פפילת ‪ CV‬ע"י נוגדנים ספציפיים כנגד ‪ GRK5 ,GRK2‬ו‪ .GRK6 -‬חתכים של פפילת‬
‫‪ CV‬בעובי של ‪ 10 µm‬הודגרו בבופר בהיעדר )‪ (CON‬או בנוכחות נוגדן ספציפי )‪ (Ab‬המכוון כנגד כל אחד מן‬
‫ה‪ .GRKs -‬מיקומן של פקיעיות הטעם מצויין ע"י חיצים לבנים‪ .‬קשירתם של הנוגדנים נבחנה גם בנוכחות חלבון‬
‫חוסם )‪ (BP - binding protein‬יחודי לכל נוגדן‪ Bar scale .‬של ‪.20 µm‬‬
‫)‪ (B‬ספציפיותם של הנוגדנים השונים נבחנה ע"י הרצת מיצוי ממוח חולדה ב‪ ,SDS-PAGE -‬העברת החלבונים‬
‫לממברנת ניטרוצלולוז )כמתואר בסעיף ‪ (2.2.7.3‬והגבה עם אותם הנוגדנים אשר שימשו ב‪ ,(A) -‬בהיעדר )‪ (-‬או‬
‫בנוכחות )‪ (+‬חלבון חוסם‪) .‬נעשה בשיתוף עם מר אלכסנדר אלילויקו(‪.‬‬
‫‪50‬‬
‫‪ -3.3‬חקר השפעת הטעמנים על מנגנון הדסנסיטיזציה של קולטני‬
‫‪ GPCRs‬בעזרת מודל בתאי ‪HeLa‬‬
‫‪ -3.3.1‬חדירת טעמנים אמפיפטיים מרים ומתוקים לתאי ‪HeLa‬‬
‫ישנן עדויות בספרות על יכולתם של טעמנים אמפיפטיים לחדור לתוך ציטוזול של תאי טעם מבודדים‬
‫ותאי מלנוציטים בתרבית )‪ .(185 ,132‬לאחר בדיקת מספר שורות תאים בתרבית )‪,HEK293 ,HeLa‬‬
‫‪ ,(HCT/116‬נמצא ששלושת הטעמנים המתוקים )סכרין‪ D-TRP ,‬ו‪ (NHD -‬ושלושת הטעמנים המרים‬
‫)קפאין‪ ,‬נרינגין וכינין(‪ ,‬אמפיפטיים כולם‪ ,‬חדרו לציטוזול התאים במידה הרבה ביותר בתאי ‪.HeLa‬‬
‫ריכוזי הטעמנים להם נחשפו התאים תאמו ריכוזים המצויים במזון )‪ .(172 ,158 ,129 ,27 ,7‬זמני‬
‫החשיפה היו לרוב ‪ 10‬דקות חוץ מאשר לכינין‪ ,‬עבורו זמן החשיפה קוצר ל‪ 3 -‬דקות על מנת שלא לפגוע‬
‫בחיות התאים‪ .‬ניתן לראות בטבלה ‪ 3.2‬שלאחר החשיפה התקבלו עבור כל הטעמנים ריכוזים תוך תאיים‬
‫גבוהים מאוד‪ ,‬אשר הגיעו במקרה של קפאין‪ ,‬סכרין ו‪ D-TRP -‬לרמות של עשרות מילימולרים‪ .‬שוב‬
‫נראתה כאן תופעה של הצטברות כנגד מפל הריכוזים‪ ,‬בדומה למה שנצפה בניסויי ה‪) in vivo -‬סעיף‬
‫‪ ,(3.1.2‬תופעה אשר תוארה בתאי טעם מבודדים אך גם בסוגי תאים נוספים‪.‬‬
‫טבלה ‪ – 3.2‬חדירת טעמנים אמפיפטיים מרים ומתוקים לתוך תאי ‪.HeLa‬‬
‫תאי ‪ HeLa‬הודגרו עם כל אחד מחמשת הטעמנים הראשונים במשך ‪ 10‬דקות או במשך ‪ 3‬דקות עם הטעמן המר‬
‫כינין )כמתואר בסעיף ‪ .(2.2.8.2‬בסוף החשיפה‪ ,‬התאים נשטפו ‪ 3‬פעמים‪ ,‬נקצרו ופוצצו במטרה לבודד את התוכן‬
‫התוך‪-‬תאי‪ .‬נוכחות וריכוז הטעמנים בציטוזול נקבעו בעזרת מכשיר ‪ .HPLC‬התוצאות מייצגות את הממוצע ‪±‬‬
‫שגיאת התקן של ‪ 3‬חזרות של ניסוי אשר בוצע פעמיים‪.‬‬
‫‪ -3.3.2‬השפעת טעמנים אמפיפטיים על היווצרות השליח המשני ‪ cAMP‬לאחר גירוי‬
‫הקולטן ה‪β2AR -‬‬
‫על מנת להעריך את השפעת הטעמנים חודרי ממברנות על פעילות הקולטן ה‪ ,β2AR -‬תאי ‪ HeLa‬אשר‬
‫ביטאו את הקולטן הודגרו בהיעדר או בנוכחות טעמן‪ ,‬בריכוזים שונים ולזמנים שונים‪ ,‬ואח"כ גורו ע"י‬
‫‪51‬‬
‫)‪ ,10 µM isoproterenol (ISO‬ליגנד ספציפי ל‪ ,β2AR -‬לזמנים שונים‪ .‬מסלול העברת האותות של‬
‫הקולטן ה‪ β2AR -‬כולל הפעלה של חלבון ‪ G‬מסוג ‪ Gs‬ושפעול האנזים אדניליל ציקלאז ‪(Adenylyl‬‬
‫)‪ cyclase‬אשר מייצר את השליח המשני ‪.cAMP‬‬
‫‪ -3.3.2.1‬הטעמנים האמפיפטיים גורמים להגברה תלוית ריכוז ביצירת ה‪ cAMP -‬בתגובה לגירוי‬
‫עי ‪ISO‬‬
‫הקולטן ה‪" β2AR -‬‬
‫מתוך התוצאות )איור ‪ ,(3.4A‬ניתן לראות שגירוי הקולטן ה‪ β2AR -‬ע"י ‪ ISO‬גורם להיווצרות מהירה‬
‫מאוד של ‪ cAMP‬שמגיעה לשיא תוך ‪ 30‬שניות‪ ,‬אחריהן נצפית ירידה הדרגתית‪ ,‬בעיקר הודות לשפעול‬
‫הפוספודיאסטראזות )‪ .(PDE‬הדגרה מוקדמת של התאים עם טעמנים השונים למשך ‪ 10‬דקות )או ‪3‬‬
‫דקות עבור כינין( גרמה לעלייה מובהקת סטטיסטית ברמת ה‪ cAMP -‬כבר לאחר ‪ 30‬שניות של גירוי‬
‫)עלייה של פי ‪ ,1.3-1.8‬בהתאם לטעמן(‪ .‬ניתן היה לצפות בהבדלים מובהקים גם לאחר ‪ 2‬דקות של גירוי‪,‬‬
‫ואף לאחר ‪ 5‬דקות בחלק מן המקרים‪.‬‬
‫עקומת ה‪ cAMP -‬מתנהגת שונה במקרה של קפאין )‪ ,(CAFF‬בשל הוספת מעכב הפוספודיאסטראזות‬
‫‪ IBMX‬למערכת‪ .‬קפאין ידוע ומשמש במחקרים רבים כמעכב פוספודיאסטראזות‪ ,‬ובשל כך‪ ,‬מעלה את‬
‫רמות ה‪ cAMP -‬בהקשר שונה מזה הנידון במחקר הנוכחי‪ .‬על מנת לנטרל השפעה זו בניסויים שלנו‬
‫ולבחון את השפעת הקפאין על פעילות הקולטן עצמו‪ ,‬הודגרו תאי ה‪ HeLa -‬עם מעכב פוספודיאסטראזות‬
‫אחר‪ ,IBMX ,‬בטרם נחשפו לקפאין וגורו עם ‪ .ISO‬ההדגרה המוקדמת עם ‪ IBMX‬גרמה לעלייה‬
‫משמעותית ברמות ה‪ cAMP -‬אשר הגיעו לאחר גירוי הקולטן למאות ‪ fmole/µg protein‬לעומת‬
‫עשרות בלבד בנוכחות הטעמנים האחרים‪ .‬ובכל זאת ניתן לראות שבנוכחות קפאין נצפתה עלייה מובהקת‬
‫ברמת ה‪ cAMP -‬בהשוואה לביקורת שהכילה ‪ IBMX‬בלבד‪ .‬יכולתם של הטעמנים להגביר את רמות‬
‫‪ cAMP‬לאחר גירוי הקולטן נמצאה גם תלוית ריכוז‪ ,‬כפי שניתן לראות באיור ‪.3.4B‬‬
‫‪ - 3.3.2.2‬הטעמנים האמפיפטיים אינם פועלים כליגנדים אנדוגניים‬
‫‪ (185) Zubare-Samuelov et al.‬דיווחו בעבר על יכולתם של מספר טעמנים אמפיפטיים כגון נרינגין‬
‫וסכרין לשמש ליגנדים לקולטנים שונים מסוג ‪ ,GPCR‬ובכך להשפיע על רמות ‪ cAMP‬בתא‪ .‬על מנת‬
‫לשלול בעבודה זו אפשרות של גירוי קולטנים אנדוגניים ב‪ ,HeLa -‬ושל הקולטן ה‪ β2AR -‬בפרט‪ ,‬ע"י‬
‫הטעמנים‪ ,‬נבחנו רמות בסיסיות של ‪ cAMP‬בהיעדר ובנוכחות טעמן בלבד ללא גירוי של הקולטן ה‪-‬‬
‫‪ β2AR‬עצמו ע"י ‪ .ISO‬התוצאות באיור ‪ 3.5A‬מראות שלטעמנים ‪ ,NHD‬סכרין‪ ,D-TRP ,‬נרינגין‬
‫וכינין לא הייתה שום השפעה על הרמות הבסיסיות של ‪ .cAMP‬במקרה של קפאין התקבלה עלייה של כ‪-‬‬
‫‪ ,45%‬שנגרמה בשל השפעתו על פעילות ה‪.PDE -‬‬
‫‪52‬‬
‫‪A‬‬
‫‪B‬‬
‫איור ‪ – 3.4‬טעמנים אמפיפטיים מגבירים את רמות השליח המשני ‪ cAMP‬לאחר גירוי הקולטן ה‪-‬‬
‫עי ‪.ISO‬‬
‫‪" β2AR‬‬
‫)‪ (A‬הגברת רמות ה‪ cAMP -‬ע"י הטעמנים השונים לאחר גירוי הקולטן ע"י ‪ ISO‬הינה תלויה בזמן‪ .‬תאי ‪HeLa‬‬
‫אשר ביטאו את הקולטן ה‪ β2AR -‬הודגרו בהיעדר )סמנים מלאים( או בנוכחות )סמנים ריקים( כל אחד מחמשת‬
‫הטעמנים‪ ,‬לזמנים וריכוזים המצוינים בטבלה ‪ .3.2‬במקרה של קפאין‪ ,‬התאים הודגרו קודם לכן עם ‪(150 IBMX‬‬
‫)‪ µM‬למשך ‪ 20‬דקות לעיכוב פוספודיאסטראזות‪ .‬בהמשך גורה הקולטן ה‪ β2AR -‬עם ‪ (10 µM) ISO‬לזמנים‬
‫שונים של עד ‪ 5‬דקות‪ ,‬בסופן ה‪ cAMP -‬התוך תאי מוצה וכומת בשיטת ה‪ .RIA -‬התוצאות הינן ממוצע ‪ ±‬שגיאת‬
‫התקן של לפחות ‪ 6‬חזרות מתוך ניסוי אשר בוצע ‪ 2-3‬פעמים‪.‬‬
‫)‪ (B‬השפעת הטעמנים על רמות ‪ cAMP‬הינה תלוית‪-‬ריכוז‪ .‬תאים נחשפו לריכוזים שונים של הטעמנים לזמנים‬
‫המצויינים בטבלה ‪ 3.2‬ולאחר מכן ל‪ (10 µM) ISO -‬במשך דקה‪ .‬כמות ה‪ cAMP -‬התוך תאי נקבעה כמתואר ב‪-‬‬
‫)‪ .(A‬גם כאן‪ ,‬התאים נחשפו ל‪ (150 µM) IBMX -‬למשך ‪ 20‬דקות לפני שהודגרו עם קפאין‪ .‬התוצאות מובאות‬
‫כאחוז יחסי לביקורת המתאימה כאשר הביקורת מהווה ‪ ,100%‬ומייצגת רמות ‪ cAMP‬בהיעדר טעמנים‪ .‬התוצאות‬
‫הינן ממוצע ‪ ±‬שגיאת תקן של לפחות ‪ 6‬חזרות של ניסוי אשר בוצע ‪ 2-3‬פעמים‪ * .‬ו‪ ** -‬מציינות עלייה מובהקת‬
‫סטטיסטית )‪ p<0.05‬ו‪ ,p<0.01 -‬בהתאמה( ברמות ה‪ cAMP -‬בין הביקורת לטיפול‪.‬‬
‫‪53‬‬
‫‪ - 3.3.2.3‬פראינקובציה של הטעמן עם התאים הינה הכרחית להשפעתו על יצירת ‪ cAMP‬בתגובה‬
‫לגירוי הקולטן ה‪β2AR -‬‬
‫בהמשך‪ ,‬נבחנה יכולתם של הטעמנים האמפיפטיים להגביר את רמות ה‪ cAMP -‬לאחר גירוי הקולטן ה‪-‬‬
‫‪ β2AR‬ע"י ‪ ISO‬כתלות בזמן החשיפה של התאים לאותם הטעמנים‪ .‬לשם כך התאים הודגרו עם‬
‫הטעמנים השונים למשך דקה‪ 5 ,‬דקות ו‪ 10 -‬דקות‪ ,‬בטרם גורו עם ‪ ISO‬למשך דקה‪ .‬על פי התוצאות‬
‫המסוכמות באיור ‪ ,3.5B‬פראינקובציה של לפחות ‪ 5‬דקות עם הטעמנים הייתה הכרחית על מנת לראות‬
‫את השפעתם על רמות ה‪ cAMP -‬מאחר ולחלק ניכר מן הטעמנים לא נראתה כלל השפעה לאחר חשיפה‬
‫של דקה בלבד )חוץ מנרינגין(‪ .‬בנוסף‪ ,‬ככל שזמן החשיפה לטעמן היה ארוך יותר כך התעצמה השפעתו‪.‬‬
‫‪A‬‬
‫‪B‬‬
‫איור ‪ – 3.5‬טעמנים אמפיפטיים אינם פועלים כליגנדים לקולטני ה‪ β2AR -‬והשפעתם על רמות‬
‫‪ cAMP‬לאחר גירוי ה‪ β2AR -‬תלויה בחדירתם לתא‪.‬‬
‫)‪ (A‬הטעמנים האמפיפטיים אינם פועלים כליגנדים לקולטן ה‪ .β2AR -‬תאי ‪ HeLa‬אשר מבטאים את הקולטן ה‪-‬‬
‫‪ β2AR‬הודגרו בהיעדר ) ( או בנוכחות ) ( הטעמנים השונים לזמנים וריכוזים המצויים בטבלה ‪) 3.2‬מלבד‬
‫‪ ,(1.25 mM ,NHD‬ללא גירוי נוסף ע"י ‪ .ISO‬לאחר מיצוי תוכן התאים‪ ,‬הרמות הבזליות של ‪ cAMP‬נקבעו‬
‫בשיטת ‪) RIA‬כמתואר בסעיף ‪.(2.2.9.3‬‬
‫)‪ (B‬השפעת הטעמנים על יצירת ‪ cAMP‬לאחר גירוי הקולטן ה‪ β2AR -‬ב‪ ISO -‬תלויה במשך ההדגרה המוקדמת‬
‫של התאים עם הטעמנים‪ .‬תאים אשר מבטאים את הקולטן ה‪ β2AR -‬הודגרו בהיעדר )ביקורת( או בנוכחות‬
‫הטעמנים האמפיפטיים לזמנים שונים )‪ 5 ,1‬ו‪ 10 -‬דקות(‪ .‬לאחר גירוי הקולטן עם ‪ ISO‬למשך דקה‪ ,‬תוכן התאים‬
‫מוצה וכמות ה‪ cAMP -‬נקבעה בשיטת ‪ .RIA‬התוצאות הינן ממוצע ‪ ±‬שגיאת תקן של לפחות ‪ 6‬חזרות בכל טיפול‪.‬‬
‫* ו‪ ** -‬מציינות עלייה מובהקת סטטיסטית )‪ p<0.05‬ו‪ ,p<0.01 -‬בהתאמה( ברמות ה‪ cAMP -‬יחסית לביקורת‪.‬‬
‫‪54‬‬
‫‪ - 3.3.2.4‬השפעת הטעמנים איננה תלויה ב‪ PDE -‬או ב‪.PKA -‬‬
‫מטרה מרכזית בעבודה זו היא חקר יכולתם של טעמנים חודרי ממברנות להשפיע על מסלול‬
‫הדסנסיטיזציה של הקולטן ה‪ .β2AR -‬מאידך‪ ,‬ייתכן והשפעת הטעמנים על רמות ‪ cAMP‬נובעת מעיכוב‬
‫של פוספודיאסטראזות ע"י הטעמנים עצמם‪ ,‬בדומה לקפאין‪ ,‬וזאת למרות שבניגוד לקפאין‪ ,‬הטעמנים‬
‫‪ ,NHD‬סכרין‪ ,D-TRP ,‬נרינגין וכינין לא השפיעו על הרמות הבסיסיות של ‪ .cAMP‬מצד שני‪ ,‬עיכוב‬
‫פעילות ‪ PDE‬נצפה בעיקר לאחר גירוי הקולטן והיווצרות ה‪.cAMP -‬‬
‫‪A‬‬
‫‪B‬‬
‫איור ‪ – 3.6‬השפעת הטעמנים על היווצרות ‪ cAMP‬בעקבות גירוי ה‪ β2AR -‬אינה תלויה בפעילותם‬
‫של פוספודיאסטראזות )‪ (PDE‬או ב‪.PKA -‬‬
‫)‪ (A‬השפעת הטעמנים אינה תלויה ב‪ .PDE -‬רמות ה‪ cAMP -‬הבזליות ולאחר גירוי הקולטן ע"י ‪ ISO‬נבחנו‬
‫בהיעדר או בנוכחות מעכב פוספודיאסטראזות ‪ (150 µM) IBMX‬בשילוב עם היעדר או נוכחות טעמן‪.‬‬
‫)‪ (B‬השפעת הטעמנים אינה תלויה ב‪ .PKA -‬רמות ה‪ cAMP -‬לאחר גירוי הקולטן ע"י ‪ ISO‬נבחנו בהיעדר או‬
‫בנוכחות מעכב ‪ ,(20 µM) H89 ,PKA‬בשילוב או בהיעדר טעמן‪ * .‬ו‪ ** -‬מציינות עלייה מובהקת סטטיסטית‬
‫)‪ p<0.05‬ו‪ ,p<0.01 -‬בהתאמה( ברמות ה‪ cAMP -‬יחסית לביקורת המתאימה‪.‬‬
‫‪55‬‬
‫במטרה לשלול את האפשרות הזו‪ ,‬נבחנה השפעתם של הטעמנים בהיעדר ובנוכחות ‪ .IBMX‬תאי ‪HeLa‬‬
‫אשר ביטאו את הקולטן ה‪ β2AR -‬הודגרו עם ‪ (150 µM) IBMX‬למשך ‪ 20‬דקות בטרם נחשפו למשך‬
‫‪ 10‬דקות לטעמן )‪ 3‬דקות לכינין( ואחר כך ל‪ ISO -‬במשך דקה‪ .‬מן התוצאות )איור ‪ (3.6A‬ניתן לראות‬
‫שבכל המקרים‪ ,‬ההגברה ברמות ה‪) cAMP -‬לאחר גירוי הקולטן( התקבלה גם בהיעדר וגם בנוכחות‬
‫‪ .IBMX‬נוכחותו של מעכב הפוספודיאסטראזות אומנם גרמה לקפיצה משמעותית ברמות ה‪ ,cAMP -‬אך‬
‫מידת ההגברה שהתקבלה בעקבות חשיפת התאים לטעמנים האמפיפטיים נשארה דומה לזו שבהיעדר‬
‫המעכב )פי ‪.(1.5-2‬‬
‫מכיוון שמסלול הדסנסיטיזציה של הקולטן ה‪ β2AR -‬מערב קינאזות מסוג ‪ GRKs‬אך גם ‪ ,PKA‬נשאלה‬
‫השאלה אם לא מסתתר מאחורי השפעת הטעמנים עיכוב של קינאז ה‪ .PKA -‬על מנת לברר נקודה זו‪,‬‬
‫נבחנה השפעתם של הטעמנים על רמות ‪ cAMP‬בהיעדר ובנוכחות מעכב ‪ PKA‬בשם ‪ .H89‬כצפוי‪,‬‬
‫נוכחות ‪ (20 µM) H89‬גרמה לעלייה ברמות ה‪ cAMP -‬לאחר גירוי עם ‪) ISO‬איור ‪ ,(3.6B‬בשל עיכוב‬
‫מסלול הדסנסיטיזציה של הקולטן‪ ,‬אשר כולל בין היתר שפעול חלבון ‪ Gi‬ועיכוב אדניליל ציקלאז )‪,32‬‬
‫‪ .(123‬למרות זאת הדגרה של התאים עם הטעמנים השונים גרמה להגברה ברמות ה‪ cAMP -‬בתגובה‬
‫לגירוי הקולטן ע"י ‪ ,ISO‬בין אם ‪ H89‬היה נוכח לבין אם לא‪.‬‬
‫"י‬
‫"י ‪ GRK2/5‬בעקבות גירוי ע‬
‫‪ - 3.3.3‬השפעת הטעמנים על זרחון הקולטן ה‪ β2AR -‬ע‬
‫‪ISO‬‬
‫על מנת לבחון את השערת העבודה לפיה טעמנים אמפיפטיים מעכבים את מסלול הדסנסיטיזציה של‬
‫קולטני ‪ GPCR‬ע"י עיכוב אינטרצלולרי של הקינאזות ממשפחת ה‪ ,GRKs -‬נעשו ניסויים נוספים בהם‬
‫נבדקה השפעת הטעמנים על זרחון הקולטן ה‪ GRK2 .β2AR -‬ו‪ ,GRK5 -‬שתי הקינאזות העיקריות‬
‫האחראיות על הדסנסיטיזציה של הקולטן ה‪ ,β2AR -‬מתבטאות אנדוגנית בתאי ‪ .HeLa‬בניסויים‬
‫המתוארים להלן נעשה שימוש בקולטן ה‪ β2AR -‬אשר קשור לסמן ‪) HA‬להלן ‪ .(β2HA‬לאחר גירוי‬
‫הקולטן ע"י ‪ ISO‬לזמנים שונים בהיעדר או בנוכחות טעמן‪ ,‬התאים נקצרו בבופר איזוטוני ‪RIPA‬‬
‫לשמירה על שלמותם של חלבונים ממברנליים )כגון קולטנים(‪ .‬לאחר השקעה אימונית של הקולטן‪ ,‬זיהוי‬
‫הקולטנים המזורחנים נעשה ע"י שימוש בנוגדן אשר מזהה ספציפית עמדות המזורחנות ע"י ‪ GRK2‬ו‪-‬‬
‫‪ .GRK5‬באיור ‪ ,3.7A‬ניתן לראות שקולטני ה‪ β2HA -‬מזורחנים בתנאים רגילים )‪ (CON‬במהירות‪,‬‬
‫כאשר שיא הזרחון נראה בערך לאחר ‪ 5-10‬דקות לאחר תחילת הגירוי‪ .‬בהמשך נצפית ירידה ברמת‬
‫הזרחון‪ ,‬כנראה הודות לשפעול פוספטאזות‪ ,‬כך שלאחר ‪ 20‬דקות רוב הקולטנים נמצאים בצורה הלא‪-‬‬
‫מזורחנת שלהם‪ .‬להפתעתנו‪ ,‬חשיפה של התאים לכל אחד מששת הטעמנים השונים גרמה לא רק לירידה‬
‫ברמת הזרחון של הקולטן אלא גם לאיחור בהופעתו‪ .‬זרחון הקולטן נצפה רק לאחר ‪ 15‬דקות בנוכחות‬
‫‪ ,NHD‬סכרין‪ ,‬כינין וקפאין ולאחר ‪ 20‬דקות בנוכחות ‪ D-TRP‬ונרינגין‪.‬‬
‫עיבוד התוצאות ע"י תוכנת ‪ ImageJ‬לכימות עוצמת הכתמים בכל נקודת זמן )איור ‪ (3.7B‬מראה בצורה‬
‫גרפית את השהיית הופעת הזרחון מ‪ 5 -‬דקות עבור הביקורת ל‪ 10-20 -‬דקות בנוכחות ששת הטעמנים‪.‬‬
‫‪56‬‬
‫איור ‪ – 3.7‬טעמנים אמפיפטיים מעכבים את הופעתו של זרחון הקולטן ה‪ β2AR -‬לאחר גירוי עם‬
‫‪.ISO‬‬
‫)‪ (A‬תאים אשר מבטאים את הקולטן ה‪ β2AR -‬אשר קשור לחלבון מזהה ‪ (β2HA) HA‬הודגרו בהיעדר או‬
‫בנוכחות טעמן ולאחר מכן גורו עם ‪ ISO‬לזמנים שונים )כמתואר בסעיף ‪ .(2.2.10.1‬התאים נקצרו והקולטן ה‪-‬‬
‫‪ β2HA‬נוקה משאר חלבוני התאים‪ .‬הדוגמאות הורצו בג'ל ‪-SDS‬אקרילאמיד ‪ ,10%‬הועברו לממברנת‬
‫ניטרוצלולוז וזיהוי הקולטנים המזורחנים )‪ (pβ2AR‬בוצע ע"י שימוש בנוגדן מכוון כנגד עמדות סרינים המזורחנות‬
‫על ידי ‪) ,anti-phosphoSer(355-356) ,GRK2/5‬מיהול ‪ .(1:600‬זיהוי כמויות כלליות של ‪ β2HA‬נעשה ע"י‬
‫שימוש בנוגדן מכוון נגד ‪) HA‬מיהול ‪.(1:1000‬‬
‫)‪ (B‬כימות עוצמת הכתמים מתוך )‪ ,(A‬בכל נקודת זמן עבור כל טיפול‪ ,‬נעשה בעזרת תוכנת ‪ ImageJ‬ומאפשר‬
‫לדמיין את העיכוב בהופעתו של הזרחון בנוכחות הטעמנים יחסית לביקורת )‪ .(CON‬הערכים הינם הממוצע ‪±‬‬
‫שגיאת התקן ביחידות שרירותיות של שלוש חזרות של )‪.(A‬‬
‫‪57‬‬
‫‪ - 3.3.4‬השפעת הטעמנים על מנגנון האינטרנליזציה של הקולטן ה‪β2AR -‬‬
‫אם אכן טעמנים אמפיפטיים מעכבים את זרחון הקולטן ע"י עיכוב ‪ ,GRKs‬קיימת סבירות גבוהה‬
‫שתהליכים ביולוגיים התלויים בזרחון זה יימצאו מעוכבים גם הם‪ .‬אחד מהם הינו מנגנון האינטרנליזציה‬
‫של הקולטן אשר תלוי בקשירת ‪ β-arrestin‬לקולטן המזורחן‪ .‬במטרה לבחון את השפעת הטעמנים על‬
‫תהליך האינטרנליזציה נעשתה טרנספקציה של ‪ β2AR‬בתאי ‪ ,HeLa‬ולאחר הדגרה של התאים בהיעדר‬
‫או בנוכחות טעמן‪ ,‬הקולטן גורה עם ‪ ISO‬לזמנים שונים‪ ,‬התאים קובעו ומיקומם של הקולטנים )ממברנלי‬
‫או ציטוזולי( נבדק במיקרוסקופיה קונפוקלית‪ .‬ניתן לראות )איור ‪ (3.8A‬שלפני גירוי )זמן ‪ ,(0‬הקולטן ה‪-‬‬
‫‪ β2AR‬נראה בצורה ברורה וחדה על גבי הממברנה הפלסמטית של התאים‪.‬‬
‫‪A‬‬
‫‪B‬‬
‫"י קפאין‬
‫איור ‪ -3.8‬מנגנון האינטרנליזציה של הקולטן ה‪ β2AR -‬בעקבות גירוי עם ‪ ISO‬מעוכב ע‬
‫וסכרין‪.‬‬
‫)‪ (A‬תאים אשר ביטאו את הקולטן ה‪ ,β2AR -‬הודגרו במשך ‪ 10‬דקות בהיעדר או בנוכחות קפאין )‪ (5 mM‬או‬
‫סכרין )‪ (10 mM‬ואז גורו עם ‪ ISO‬לזמנים שונים‪ .‬התאים צולמו תחת מיקרוסקופ קונפוקלי לאחר קיבוע וצביעת‬
‫התאים עם נוגדן כנגד הקולטן ה‪ -‬ה‪) β2AR -‬כמתואר בסעיף ‪ .(2.3.11‬התמונות מייצגות את מצבם של רוב‬
‫התאים אשר נצפו בנקודת הזמן הספציפית‪.‬‬
‫‪58‬‬
‫)‪ (B‬תאים אשר ביטאו את הקולטן ה‪ β2AR -‬נחשפו לשני ריכוזים של קפאין או סכרין בטרם גורו ע"י ‪ISO‬‬
‫לזמנים שבין ‪ 0‬ל‪ 15 -‬דקות‪ .‬לאחר קיבוע התאים‪ ,‬מיקומם של הקולטנים )ממברנלי או ציטוזולי( נקבע תחת‬
‫מיקרוסקופ קונפוקלי‪ .‬התוצאות מובאות כאחוז התאים אשר הכילו קולטן ממברנלי יחסית לביקורת )זמן ‪(0‬‬
‫שמהווה ‪ .100%‬התוצאות הינן ממוצע ‪ ±‬שגיאת התקן של ‪ 3‬חזרות‪ ,‬כל אחת של כ‪ 300 -‬תאים‪ ,‬מתוך ניסוי אשר‬
‫נעשה לפחות פעמיים‪ * .‬ו‪ ** -‬מציינות עלייה מובהקת סטטיסטית )‪ p<0.05‬ו‪ ,p<0.01 -‬בהתאמה( באחוז התאים‬
‫המכילים קולטן ממברנלי יחסית לביקורת המתאימה‪.‬‬
‫לעומת זאת‪ ,‬כבר לאחר ‪ 5‬דקות מתחילת הגירוי )ביקורת‪ (CON ,‬ניתן להבחין בהופעתן של נקודות בתוך‬
‫הציטוזול המייצגות את ה‪ clathrin coated pits -‬באמצעותן הקולטן עובר אינטרנליזציה‪ .‬הווזיקולות‬
‫הציטוזוליות נהיות יותר ויותר משמעותיות במספרן ככל שמתארך הגירוי כך שאחרי ‪ 15‬ו‪ 20 -‬דקות לא‬
‫ניתן יותר להבחין בקולטן ממברנלי ברוב התאים )‪ 70-80%‬מהתאים נמצאו עם קולטן ציטוזולי בלבד‪,‬‬
‫איור ‪ .(3.8A‬לעומת זאת בנוכחות קפאין או סכרין‪ ,‬נצפה אחוז גדול יותר של תאים אשר מכילים קולטן‬
‫ממברנלי גם לאחר ‪ 15‬ו‪ 20 -‬דקות‪.‬‬
‫על מנת להעריך זאת נספרו תאים אשר מכילים קולטן ציטוזולי בלבד מול תאים בהם נמצא קולטן‬
‫ממברנלי‪ ,‬בעקבות חשיפתם לסכרין ולקפאין‪ ,‬בריכוזים שונים ולאורך הזמן‪ .‬ניתן לראות באיור ‪ 3.8B‬את‬
‫הירידה ההדרגתית במספר התאים המכילים קולטן ממברנלי לאורך הזמן בביקורת‪ .‬בנוכחות כל אחד מן‬
‫הטעמנים‪ ,‬נצפה עיכוב בירידה זו‪ ,‬המתורגם בעלייה באחוז התאים עם קולטן ממברנלי‪ .‬עלייה זו נמצאה‬
‫תלוית ריכוז עבור קפאין וסכרין )איור ‪ (3.8B‬אך גם עבור כל אחד משאר הטעמנים )איור ‪ ,(3.9‬כך‬
‫שמתקבלים בערך פי ‪ 2-2.5‬תאים עם קולטן ממברנלי אחרי ‪ 15‬דקות גירוי‪.‬‬
‫איור ‪ -3.9‬השפעת הטעמנים על מנגנון האינטרנליזציה של הקולטן ה‪ β2AR -‬הינה תלוית ריכוז‪.‬‬
‫תאים אשר ביטאו את הקולטן ה‪ β2AR -‬נחשפו במשך ‪ 10‬דקות לטעמנים ‪ NAR ,D-TRP ,SACC ,NHD‬או‬
‫‪ CAFF‬או במשך ‪ 3‬דקות ל‪ ,QUIN -‬בריכוזים שונים טרם גורו ע"י ‪ ISO‬ל‪ 15 -‬דקות‪ .‬לאחר קיבוע התאים‪,‬‬
‫מיקומם של הקולטנים )ממברנלי או ציטוזולי( נקבע תחת מיקרוסקופ קונפוקלי‪ .‬התוצאות הינן ממוצע ‪ ±‬שגיאת‬
‫התקן של ‪ 3‬חזרות‪ ,‬כל אחת המייצגת ספירה של כ‪ 300 -‬תאים‪ ,‬מתוך ניסוי אשר נעשה לפחות פעמיים‪.‬‬
‫‪59‬‬
‫דרך נוספת להעריך את השפעתם של טעמנים אמפיפטיים על מנגנון האינטרנליזציה היא בעזרת‬
‫פרקציונציה של התא‪ .‬בשיטה זו מופרדת הפרקציה הציטוזלית מן הפרקציה הממברנלית‪ ,‬ונוכחות ו‪/‬או‬
‫כמות חלבון מסוים )במקרה זה הקולטן ה‪ (β2AR -‬נבדקות בשיטת ‪ Western blot‬ושימוש בנוגדן‬
‫ספציפי‪ .‬באיור ‪ ,3.10‬ניתן לראות בפרקציה הממברנלית של הביקורת )‪ (CON‬את הירידה ההדרגתית‬
‫בכמות הקולטן ככל שמתארך הגירוי ע"י ‪ ,ISO‬לעומת עלייה הדגרתית מקבילה בפרקציה הציטוזולית‪.‬‬
‫לעומת זאת‪ ,‬הדגרה מוקדמת של התאים עם כל אחד מששת הטעמנים בטרם גורו עם ‪ ISO‬גרמה לירידה‬
‫הרבה יותר מתונה בכמות הקולטן בפרקציה הממברנלית‪ ,‬במיוחד במקרים של קפאין ונרינגין‪ ,‬כך שלאחר‬
‫‪ 20‬דקות נוכחותו של הקולטן בפרקציה זו הייתה עדיין ברורה‪.‬‬
‫‪A‬‬
‫‪B‬‬
‫איור ‪ -3.10‬הטעמנים האמפיפטיים מעכבים את הופעתו של הקולטן ה‪ β2AR -‬בפרקציה הציטוזולית‬
‫של התאים בעקבות גירוי עם ‪.ISO‬‬
‫)‪ (A‬לאחר הדגרה של התאים בהיעדר או בנוכחות טעמנים וגירוי הקולטן ה‪ β2HA -‬עם ‪ ISO‬לזמנים שונים‪,‬‬
‫הממברנה הפלסמטית של התאים הופרדה מן התוכן הציטוזולי בעזרת שרשרת של סרכוזים במהירויות שונות‬
‫)כמתואר בסעיף ‪ .(2.2.13‬בסוף הסרכוז האחרון הפרקציה הציטוזולית הופרדה והמשקע הורחף בבופר ‪RIPA‬‬
‫להמסת הממברנות‪ .‬שתי הפקרציות הורתחו בנוכחות ‪ sample buffer‬ודוגמה מכל פרקציה הורצה על ג'ל ‪-SDS‬‬
‫אקרילאמיד ‪ .12%‬נוכחות הקולטן נקבעה ע"י שימוש בנוגדן המכוון כנגד ‪) HA‬מיהול ‪ 1:1000‬ב‪.(TBST -‬‬
‫)‪ (B‬כימות עוצמת הכתמים מתוך )‪ ,(A‬בכל נקודת זמן עבור כל טיפול‪ ,‬נעשה בעזרת תוכנת ‪ .ImageJ‬הירידה‬
‫ההדרגתית בכמות הקולטן הממברנלי אשר נראית בביקורת )‪ (CON‬ככל שמתארך הגירוי‪ ,‬מעוכבת בנוכחות כל‬
‫אחד מהטעמנים האמפיפטיים‪ .‬התוצאות המובאות מייצגות ניסויים אשר נעשו לפחות פעמיים‪.‬‬
‫‪60‬‬
‫‪ – 3.3.5‬השפעת חשיפת התאים לטעמנים על מסלול העברת האותות של ‪ERK‬‬
‫בתגובה לגירוי עם ‪.ISO‬‬
‫מחקרים רבים בשנים האחרונות מצביעים על יכולתו של הקולטן ה‪ β2AR -‬לעורר מספר מסלולי העברת‬
‫אותות נוספים לזה העובר דרך החלבון ‪ ,Gs‬וביניהם מסלול ה‪ .(100 ,99 ,92) (ERK) MAPK -‬ישנן‬
‫שתי דרכים בהן ‪ β2AR‬גורם לשפעול של ‪ :ERK‬לאחר זרחון ע"י ‪ PKA‬בטווח זמנים של ‪ 2-5‬דקות‬
‫ולאחר זרחון ע"י ‪ GRKs‬בטווח זמנים ארוך יותר של ‪ 10-30‬דקות‪ .‬מכיוון שהתוצאות שלנו מהניסויים‬
‫הקודמים מצביעות על יכולתם של הטעמנים לעכב את פעילותן של ‪ ,GRKs‬בשלב זה נבחנה השפעתם‬
‫של הטעמנים על שפעולו של ‪ .ERK‬לאחר שתאים המבטאים את הקולטן ‪ β2AR‬הודגרו בהיעדר או‬
‫בנוכחות טעמן ולאחר מכן גורו ע"י ‪ ISO‬לזמנים שבין ‪ 2‬ל‪ 30 -‬דקות‪ ,‬רמת הזרחון של ‪ ERK‬נבדקה‬
‫בשיטת ‪ Western blot‬ע"י שימוש בנוגדן ספציפי‪ .‬כפי שנראה באיור ‪ ,3.11A‬הטעמנים לא השפיעו על‬
‫רמת הזרחון הבסיסית של ‪) ERK‬ללא גירוי הקולטן(‪ ,‬חוץ מקפאין אשר נראה בעל השפעה מעכבת‪ .‬דבר‬
‫זה מצביע על כך שלפחות לטעמנים סכרין‪ ,D-TRP ,NHD ,‬נרינגין וכינין אין השפעה על מסלול ה‪-‬‬
‫‪ MAPK‬עצמו‪ .‬על מנת לוודא שחוסר התגובה של ‪ ERK‬לטעמנים אינו נובע מחוסר תפקודו מסיבה‬
‫כלשהי בתאים‪ ,‬תאי ה‪ HeLa -‬גורו עם ‪ (Epidermal Growth Factor) EGF‬אשר משפעל את הקולטן‬
‫האנדוגני ‪ (EGF Receptor) EGFR‬בתאים אלה‪ ,‬ו‪ ERK -‬ידוע כאחד ממסלולי העברת האותות‬
‫העיקרי שלו‪ .‬ואכן ניתן לראות באיור ‪ 3.11A‬את השפעול החזק של ‪ ERK‬בתגובה ל‪ .EGF -‬לאחר‬
‫גירוי הקולטן ה‪ β2AR -‬ע"י ‪ ,ISO‬התקבל שפעול חזק יחסית של ‪ ERK‬בטווח הזמנים הקצר )‪2-5‬‬
‫דקות( ונמוך יותר בטווח הזמנים הארוך יותר )‪ 10‬עד ‪ 30‬דקות( בדומה לדיווחים קודמים מהספרות‬
‫)‪ .(155‬בנוכחות הטעמנים‪ ,‬השפעול של ‪ ERK‬בטווח הזמנים של ‪ 2-5‬דקות לא נראה מושפע )חוץ‬
‫מקפאין(‪ .‬לעומת זאת‪ ,‬הדגרה של התאים עם כל ששת הטעמנים גרמה לעיכוב של ‪ ERK‬בטווח הזמנים‬
‫של ‪ 10-30‬דקות‪ ,‬אשר תלוי בזרחון הקולטן ע"י ‪) GRK‬איור ‪ .(3.11B‬קפאין עיכב בצורה משמעותית‬
‫של השפעול של ‪ ERK‬גם בטווח הקצר וגם בטווח הארוך‪ ,‬דבר אשר מעיד על יכולתו של טעמן זה לעכב‬
‫את שני מסלולי הדסנסיטיזציה‪.‬‬
‫‪61‬‬
‫איור ‪ -3.11‬הטעמנים האמפיפטיים מעכבים את שפעול ‪ ERK‬אשר תלוי בזרחונו של הקולטן ה‪-‬‬
‫עי ‪.GRKs‬‬
‫‪" β2AR‬‬
‫)‪ (A‬הטעמנים האמפיפטיים אינם משפעלים את ‪ .ERK‬תאי ‪ HeLa‬המבטאים את הקולטן ה‪ β2AR -‬נחשפו‬
‫לטעמנים השונים במשך ‪ 10‬דקות )כינין – ‪ 3‬דקות( ומיד לאחר מכן‪ ,‬תוכן התאים מוצה‪ 20 µg .‬הורצו בכל באר‬
‫של ג'ל ‪-SDS‬אקרילאמיד ‪ 12%‬וזיהוי נוכחות ‪ ERK‬מזורחן )‪ ,pERK‬מיהול ‪ (1:40,000‬מול כמות ה‪ERK -‬‬
‫הכללית )‪ ,gERK‬מיהול ‪ (1:30,000‬נעשה ע"י שימוש בנוגדנים ספציפיים‪.‬‬
‫)‪ (B‬הטעמנים האמפיפטיים מעכבים את מסלול שפעולו של ‪ ERK‬אשר תלוי ב‪ .GRKs -‬לאחר הדגרה של התאים‬
‫בהיעדר או בנוכחות טעמן ושפעול הקולטן ה‪ β2AR -‬ע"י ‪ ISO‬לזמנים שונים‪ ,‬נמדדה רמת השפעול של ‪ERK‬‬
‫בכל נקודת זמן כמתואר ב‪ .A -‬התוצאות המובאות מייצגות ניסויים אשר נערכו לפחות שלוש פעמים‪ .‬בצד ימין‪,‬‬
‫מוצגים גרפית ההבדלים בעוצמת הכתמים בכל נקודת זמן‪ ,‬בהיעדר )□( או בנוכחות )■( טעמן‪ ,‬כאשר זמן ‪ 0‬הוגדר‬
‫שרירותית כ‪ ∗ .1-‬ו‪ # -‬מציינות עלייה מובהקת סטטיסטית )‪ ,p<0.05‬במבחן ‪ t-test‬דו‪-‬כיווני וחד כיווני‪,‬‬
‫בהתאמה( ברמות הזרחון של ‪ ERK‬יחסית לביקורת המתאימה‪) .‬נעשה בשיתוף עם גברת עינב מלאך(‪.‬‬
‫‪62‬‬
‫‪ .4‬דיון ומסקנות‬
‫תגליות חשובות בעשור האחרון הביאו לפריצת דרך אדירה בהבנת התהליכים הביולוגיים שמאחורי‬
‫חישת הטעם‪ .‬הוכח שקולטנים ממשפחת ה‪ GPCRs -‬הינם אחראים על קשירת הטעמנים המרים‪,‬‬
‫המתוקים והאוממים שבמזון )‪ .(119 ,118 ,24‬למרות שמסלולי העברת אותות אפשריים נחקרו שנים‬
‫רבות קודם לכן‪ ,‬שימוש בביולוגיה מולקולרית ועכברים מהונדסים גנטית אפשר לשפוך אור על‬
‫המרכיבים החיוניים לחישת שלושת הטעמים האלו )‪ .(183‬בנוסף‪ ,‬מנגנון העברת המידע מתא הטעם‬
‫הלאה למערכת העצבית התגלה כשונה מרוב המערכות הידועות )‪ .(143 ,28‬בניגוד למנגנונים האחראים‬
‫על העברת המידע מהקולטן הלאה‪ ,‬מנגנון סיום העברת המידע לא נחקר כלל בספרות‪ .‬בנוסף‪ ,‬לא הוסברו‬
‫עד כה תופעות כגון השאריתיות המורגשת לאחר טעימת טעמנים מרים או ממתיקים לא סוכריים‪ .‬על‬
‫בסיס מספר מחקרים שנערכו‪ ,‬נראה שתופעת השאריתיות בטעם נובעת מהעברת אינפורמציה ממושכת‬
‫מהרגיל מתאי הטעם אל תאי העצב )‪ .(160 ,59‬ההשערה אשר הועלתה מציעה שמסיבה כלשהי מנגנון‬
‫כיבוי העברת האותות של קולטני הטעם )דסנסיטיזציה( אינו מתפקד במלואו ולכן העברת האינפורמציה‬
‫מתמשכת לתקופה ארוכה יותר‪ .‬טעמנים מרים וממתיקים לא סוכריים רבים הינם מולקולות אמפיפטיות‪.‬‬
‫השערת העבודה הנוכחית הינה שהודות לתכונת האמפיפטיות שלהן‪ ,‬מולקולות אלו מסוגלות לעבור את‬
‫הממברנה הפלסמטית של תאי הטעם ומרגע שהגיעו לתוך ציטוזול התאים‪ ,‬מעכבות את תהליך‬
‫הדסנסיטיזציה של קולטני ‪ GPCRs‬כולל אלה של הטעם‪ .‬על מנת להוכיח השערה זו‪ ,‬הוצבו שלוש‬
‫מטרות‪ (1 :‬להוכיח שטעמנים אמפיפטיים‪ ,‬מרים ומתוקים‪ ,‬מסוגלים לחדור לתוך ציטוזול תאי הטעם‬
‫בתנאים פיזיולוגיים )תנאי הכרחי על מנת שיוכלו להשפיע על תהליכים ציטוזוליים(‪ (2 ,‬לבחון את‬
‫נוכחותן של קינאזות ממשפחת ה‪ GRKs -‬בתאי פקיעית הטעם‪ ,‬בידיעה שקינאזות אלו מהוות מרכיב‬
‫חיוני לקיום מנגנון הדסנסיטיזציה ההומולוגית של קולטני ה‪ (3 ,GPCRs -‬לבחון את השפעתם של‬
‫טעמנים אמפיפטיים על תפקודה והתקדמותה של הדסנסיטיזציה ההומולוגית של קולטני ה‪GPCRs -‬‬
‫במערכת תאית אשר תהווה מודל לתאי הטעם וקולטני הטעם‪.‬‬
‫‪ - 4.1‬חדירת טעמנים אמפיפטיים לתוך תאי הטעם‬
‫במחקרים קודמים הוכח שטעמנים אמפיפטיים חודרים ממברנות של ליפוזומים וגם לתוך תאי טעם‬
‫מפקיעיות טעם מבודדות או פפילות טעם מבודדות )‪ .(132‬הבעיתיות המרכזית בניסויים אשר נערכו עד‬
‫כה הינה שתנאי הניסוי אינם תואמים תנאים פיזיולוגיים‪ .‬כאשר פפילת הטעם מעוגנת בתוך הלשון‪ ,‬הצד‬
‫האפיקלי בלבד של תאי הטעם נמצא באינטראקציה עם הטעמנים‪ ,‬דרך ה‪ .taste pore -‬בנוסף‪ ,‬נוכחותם‬
‫של ‪ tight junctions‬המחברים בין התאים בצד האפיקלי של הפקיעית מהווים מחסום‪ ,‬כך שתאי‬
‫הפקיעית אינם צפויים לפגוש בשום מקרה את מרכיבי המזון )טעמנים( בצד הבזולטרלי שלהם‪ .‬תנאים‬
‫‪63‬‬
‫אלו אינם נשמרים כאשר פפילת הטעם מופרדת מרקמות חיבור ושריר לאחר טיפול אנזימטי‪ .‬לכן השלב‬
‫הראשון של עבודה זו הוקדש לבחינת חדירתם של טעמנים אמפיפטיים לתוך תאי פקיעית הטעם בתנאים‬
‫פיזיולוגיים‪ .‬מעקב דינמי אחר חדירת טעמנים אמפיפטיים תוך כדי הדגרתם עם פפילת ‪ CV‬שלמה‬
‫במיקרוסקופ קונפוקלי היתה אחת השיטות לחקור את מידת חדירתם לתוך פפילת הטעם‪ .‬העלייה עם הזמן‬
‫ברמת הפלואורסצנציה בדיוק באזור ה‪ inner trench -‬של פפילת ה‪) CV -‬איור ‪ (3.1‬מעידה על חדירה‬
‫והצטברות הדרגתית של הטעמנים לתוך תאי פקיעיות הטעם עצמן‪ .‬נוכחות פלואורסצנציה גם ברקמה‬
‫האפיתליאלית המקיפה את פפילת הטעם מעידה על יכולתם של אותם הטעמנים לחדור גם לתוך תאים לא‬
‫סנסוריים‪ .‬שימוש ב‪ ,KI -‬אשר פועל כמדעיך פלואורסצנטי אך אינו חודר ממברנות‪ ,‬הוכיח כי העלייה‬
‫ברמת הפלואורסצנציה נובעת מחדירה אמיתית של הטעמנים לתוך פקיעיות הטעם ולא מתוך הצטברות‬
‫חיצונית לתוך תעלת הפפילה או ספיחה חיצונית על פני האפיתל‪ .‬העובדה ש‪ KI -‬גרם לדעיכה מיידית‬
‫ומוחלטת של ‪) PI‬אשר אינו חודר ממברנות( אך לא שינה את רמת הפלואורסצנציה של הטעמנים הוכיחה‬
‫שהטעמנים אכן נמצאים בתוך ציטוזול התאים או לפחות עמוק בתוך הממברנה הפלסמטית שלהם‪ ,‬שם אין‬
‫ל‪ KI -‬גישה‪ .‬קינאזות ה‪ ,GRKs -‬שפעילותן בנוכחות טעמנים נחקרה בעבודה זו‪ ,‬נמצאות חלקן מעוגנות‬
‫בתוך הממברנה הפלסמטית הודות להוספת חומצות שומן בקצה ה‪-C -‬טרמינלי שלהן‪ ,‬או לפחות ממוקמות‬
‫בסמוך לצד הציטוזולי של המבברנה הודות לאפיניות שלהן לפוספוליפידים או חלבונים אחרים כגון תת‪-‬‬
‫היחידה ‪ βγ‬של חלבון ה‪ .G -‬לכן ייתכן והטעמנים מסוגלים לבוא במגע עם אותן ה‪ GRKs -‬גם מבלי‬
‫לחדור עמוק לתוך ציטוזול התא אלא גם כאשר הם פונים כלפי הצד הציטוזולי של הממברנה הפלסמטית‪.‬‬
‫מנגנון חדירת הטעמנים לתוך תאי הטעם איננו ידוע‪ .‬בהיותם מולקולות אמפיפטיות‪ ,‬ההשערה הראשונה‬
‫שהועלתה הייתה שטעמנים אלו חודרים בעזרת דיפוזיה פסיבית דרך הממברנה הפלסמטית‪ .‬ייתכן שהודות‬
‫לשילוב של קבוצות הידרופוביות וקבוצות הידרופיליות שבתוכן‪ ,‬מולקולות הטעמנים מסוגלות להתקרב‬
‫ולהיצמד לממברנה הפלסמטית ואף לנוע בתוכה ולעבור לצד הציטוזולי שלה‪ .‬תמיכה לתיאוריה זו מראה‬
‫שטעמנים אמפיפטיים אכן מסוגלים לחדור לתוך ליפוזומים המורכבים מפוספוליפידים וכולסטרול בלבד‬
‫)‪ .(132‬למרות שתיאוריה זו אפשרית‪ ,‬קצב חדירת הטעמנים נמצא מהיר יותר מזה שמאפשרת דיפוזיה‬
‫פסיבית‪ .‬מצד שני‪ ,‬נראה שלא מדובר גם כן בניצול של תעלה אקטיבית ע"י הטעמנים‪ .‬למרות שמעכב‬
‫האנרגיה ‪ CCCP‬עיכב את כניסתם של סכרין ו‪ D-TRP -‬לתוך תאי טעם מפפילה מבודדת‪ ,‬נמצא‬
‫שהסיבה לכך הייתה בגלל שינוי בפוטנציאל הממברנה ולא בגלל חוסר במולקולות ‪ ATP‬בתא‪ .‬ואכן‪,‬‬
‫מעכב האנרגיה ‪ oligomycin‬לא עיכב את חדירתם של הטעמנים סכרין‪ ,D-TRP ,‬כינין והפפטיד‬
‫)‪ .(117) cyclo(Leu-Trp‬יחד‪ ,‬תוצאות אלו פסלו את האפשרות של ניצול נשא אקטיבי )‪(transporter‬‬
‫להחדרת טעמנים אלו פנימה אל הציטוזול‪.‬‬
‫ייתכן וחדירתם של הטעמנים דרך הממברנה מתאפשרת הודות לתופעה בה מספר מולקולות מתארגנות‬
‫יחד ליצירת פורות )‪ ,(pores‬כאשר הקבוצות ההידרופיליות פונות לצד אחד והקבוצות ההידרופוביות‬
‫פונות לצד שני‪ .‬כך‪ ,‬מולקולות אמפיפטיות "בונות" לעצמן דרך מעבר בתוך הממברנה הליפידית ועוברות‬
‫אותה‪.‬‬
‫‪64‬‬
‫אם אכן הטעמנים חודרים לתוך תאי הטעם בכוחות עצמם )דרך דיפוזיה או בניית פורות( ולא דרך תעלה‬
‫אקטיבית‪ ,‬איך ניתן להסביר את הצטברות הטעמנים כנגד מפל הריכוזים אשר נראתה גם בעבודה זו‬
‫בניסויי ה‪ in-vivo -‬עבור כינין וקפאין )טבלה ‪ (3.1‬ותוארה גם עבור טעמנים אמפיפטיים אחרים‬
‫בעבודות אחרות )‪ ?(185 ,132‬ייתכן והסבר אפשרי טמון ביכולתם של הטעמנים לחדור ולהצטבר גם‬
‫בתוך אורגנלות התא כגון הגרעין )‪ .(132‬חדירת הטעמנים לתוך אורגנלות התא יכולה לגרום למצב בו‬
‫הריכוז הציטוזולי עצמו אינו עולה על הריכוז החוץ תאי ולכן הטעמן ממשיך לחדור פנימה‪ ,‬וכך מצטבר‬
‫בהדרגתיות בתוך התא‪.‬‬
‫מטרת ניסויי ה‪ in-vivo -‬בחולדות מורדמות הייתה לחקות מצב של שתייה המתמשכת כ‪ 90 -‬שניות‪,‬‬
‫ולבחון בסופן נוכחות של טעמנים בתאי פפילת ה‪ .CV -‬על מנת להפריד את התוכן הציטוזולי של תאי‬
‫הטעם בתום ה‪ 90 -‬שניות‪ ,‬היה צורך להפריד את פפילת ה‪ CV -‬מן הלשון בעזרת ניתוח וטיפול אנזימטי‬
‫בקולגנאז אשר ארך כ‪ 25 -‬דקות‪ .‬לאורך כל זמן הניתוח‪ ,‬הלשון ולאחר מכן הפפילה עצמה נמצאו‬
‫בתמיסת ‪ .TGPP‬מכיוון שה‪ TGPP -‬לא הכיל בעצמו טעמן‪ ,‬ניתן לצפות שחלק מהטעמנים אשר היו‬
‫בתאי הפפילה "יברחו" החוצה כתוצאה מהפיכת מפל הריכוזים או ע"י שפעול טרנספורטרים ממשפחת ה‪-‬‬
‫‪ .(multidrug resistance protein) mdr‬טרנספורטרים ממשפחה זו אחראים על הוצאת תרכובות זרות‬
‫או רעילות מתוך ציטוזול התא‪ ,‬ומחקרים הראו כי ‪ mdr1‬מתבטא בפפילת ה‪ .(71) CV -‬לפיכך חושב‬
‫עבור כל טעמן פקטור אשר יהווה אומדן למידת הבריחה של הטעמנים השונים בזמן הניתוח‪ .‬בריחה זו‬
‫הוערכה בין ‪ 64%‬ל‪ ,86% -‬ולפיה חושב הריכוז התוך תאי של הטעמנים לאחר ‪ 90‬שניות שתייה‪.‬‬
‫הריכוזים התוך תאיים אשר נמצאו בניסוי זה הרבה יותר נמוכים משל אלה אשר דווחו בניסויים שנערכו‬
‫בפפילות מבודדות‪ .‬למשל‪ ,‬ריכוזו התוך תאי של ‪ D-TRP‬הוערך כ‪ 6.4 mM -‬בניסוי ה‪ in-vivo -‬במקום‬
‫‪ 60-65 mM‬בפפילה מבודדת‪ .‬ריכוזו של כינין נמצא ‪ 5.5 mM‬במקום ‪ 20 mM‬והפפטיד המר‬
‫)‪ 0.96 mM cyclo(Leu-Trp‬במקום ‪ .3.5 mM‬תוצאות אלו היו צפויות מאחר ובתנאי הניסוי‬
‫הנוכחיים‪ ,‬תאי הטעם אינם חשופים לתמיסת הטעמנים אלא מהצד האפיקלי בלבד‪ ,‬דרך ה‪,taste pore -‬‬
‫אזור בעל שטח מצומצם מאוד‪ .‬מכל מקום‪ ,‬ניסויי ה‪ in-vivo -‬הוכיחו כי טעמנים אמפיפטיים מסוגלים‬
‫בתנאים פיזיולוגיים לחדור לתוך תאי פקיעית הטעם ואף להצטבר בהם כנגד מפל הריכוזים )במקרה של‬
‫כינין וקפאין(‪ .‬מעבר לכך‪ ,‬נראה שטעמנים חודרים לכל סוגי התאים ‪,‬סנסוריים או לא‪ ,‬מאחר והם נמצאו‬
‫גם בתאי האפיתל שמסביב לפפילת ה‪ .CV -‬בנוסף‪ ,‬יש להניח כי הטעמנים חודרים במידה שווה בכל‬
‫התאים המרכיבים את פקיעית הטעם ולכן הריכוזים התוך תאיים שחושבו נחשבים לנכונים בכל סוגי‬
‫התאים שבפקיעית הטעם‪ ,‬וביניהם תאי הטעם עצמם )‪.(taste receptor cells‬‬
‫‪65‬‬
‫‪ - 4.2‬איפיון ביטוי קינאזות ממשפחת ה‪ GRKs -‬בתאי פפילת ה‪-‬‬
‫‪ CV‬בחולדה‬
‫השערת העבודה הינה שמרגע הגעתם אל ציטוזול התאים‪ ,‬הטעמנים האמפיפטיים משבשים את מהלך‬
‫מנגנון הדסנסיטיזציה של הקולטנים לטעם‪ ,‬ובכך גורמים למסלול העברת האותות להימשך זמן רב יותר‪.‬‬
‫מכיוון שהקולטנים לטעם המר )‪ (T2Rs‬והמתוק )‪ (T1Rs‬משתייכים למשפחת ה‪ ,GPCRs -‬סביר להניח‬
‫שמנגנון הדסנסיטיזציה שלהם יהיה דומה לזה של שאר הקולטנים ממשפחה זו‪ ,‬כלומר באמצעות זרחון‬
‫של הקצה ה‪-C -‬טרמינלי ע"י לפחות אחת מהקינאזות ממשפחת ה‪ .GRKs -‬ידוע ממחקרים קודמים כי‬
‫‪ GRK5‬זוהה באפיתל הלשון )‪ .(136‬מכיוון שמטרתנו לחקור את השפעת הטעמנים על פעילותם של ה‪-‬‬
‫‪ ,GRKs‬נרצה קודם לאפיין אילו איזופורמים מהמשפחה הזו מתבטאים בתאי הטעם‪.‬‬
‫ראשית‪ ,‬נבדק ביטויים של ‪ GRK5 ,GRK3 ,GRK2 ,GRK1‬ו‪ GRK6 -‬בפפילת ה‪ CV -‬מחולדה‬
‫בשיטת ‪ ,GRK7 .RT-PCR‬אשר אינו מתבטא בחולדה ו‪ ,GRK4 -‬אשר מתבטא בעיקר במוח ואשכים‪,‬‬
‫לא נבדקו‪ .‬תוצאות ה‪ RT-PCR -‬הראו שהקינאזות ‪ GRK5 ,GRK3 ,GRK2‬ו‪ GRK6 -‬מתבטאות‬
‫בפפילת ה‪ ,CV -‬אך גם באפיתל הלא סנסורי )‪ (EP‬הסמוך לפפילת ה‪ CV -‬בלשון )איור ‪GRK1 .(3.2‬‬
‫אשר מתבטא באופן ייחודי במערכת הראייה לא היה צפוי להתבטא בפפילת ה‪ ,CV -‬ואכן לא נמצא בה‪.‬‬
‫על מנת לוודא כי פפילת ה‪ CV -‬אכן בודדה באופן נקי מרקמת האפיתל הלא סנסורי של הלשון‪ ,‬נבדקו גם‬
‫ביטויים של הקולטנים למר )‪ (T2R4‬ולמתוק )‪ .(T1R3‬הקולטנים נמצאו אכן רק ברקמת ה‪ CV -‬ולא‬
‫באפיתל הלא סנסורי‪.‬‬
‫ארבעת הקינאזות‪ GRK5 ,GRK3 ,GRK2 ,‬ו‪ ,GRK6 -‬מתבטאות בכלל אברי הגוף )‪ (48‬ולכן לא‬
‫מפתיע למצוא אותן גם ברקמה הסנסורית והלא סנסורית‪ .‬סביר גם להניח שלחלק מהן תפקיד שונה בשתי‬
‫רקמות אלו‪ .‬מציאת הקולטנים למר ולמתוק יחד עם ארבעת ה‪ GRKs -‬בשיטת ה‪ RT-PCR -‬אינה עדות‬
‫לכך שכל החלבונים האלו אכן מתבטאים יחד באותם התאים‪ .‬בניסוי מסוג זה ביטוים של החלבונים‬
‫השונים נבדק בכלל התאים שבפפילת ה‪ .CV -‬ידוע כיום כי הקולטנים למר והקולטנים למתוק מתבטאים‬
‫בתאי טעם שונים )‪ ,(183 ,114 ,62‬ובאותה מידה ייתכן וה‪ GRKs -‬השונים מתבטאים גם הם בסוגים‬
‫שונים של תאים מתוך הפפילה ופקיעית הטעם‪ .‬בנוסף‪ ,‬פפילת הטעם אינה מורכבת אך ורק מפקיעיות‬
‫טעם‪ :‬תאי אפיתל לא סנסוריים מקיפים את פקיעיות הטעם ויוצרים את רקמת הפפילה‪ .‬חלק מהרנ"א אשר‬
‫הופק לאחר ריסוק רקמת הפפילה מקורו מתאים אפיתליאלים לא סנסוריים אלו‪ .‬על מנת לוודא את‬
‫מיקומם של ה‪ GRKs -‬השונים בתוך פפילת ה‪ ,CV -‬נעשתה צביעה אימונית של חתכי פפילת ‪ CV‬עם‬
‫נוגדנים ייחודים אשר סונתזו כנגד כל אחד מן ה‪) GRKs -‬איור ‪ .(3.3‬מצביעה זו נראה ש‪GRK5 -‬‬
‫מתבטא בעיקר בתוך פקיעית הטעם‪ .‬לעומתו‪ GRK2 ,‬נראה גם בפקיעיות הטעם וגם באפיתל הלא סנסורי‬
‫המקיף אותן‪ ,‬אך ‪ GRK6‬נראה בעיקר מחוץ לפקיעיות הטעם‪ .‬תוצאות אלו ממקדות בעיקר את ‪GRK5‬‬
‫אך גם ‪ GRK2‬כקינאזות פוטנציאליות המעורבות במנגנון הדסנסיטיזציה של תהליכים אשר קורים בתאי‬
‫פקיעיות הטעם‪ ,‬וביניהם תאי הטעם‪ .‬תוצאה זו מתנגשת קצת עם פרסומים אחרונים אשר דיווחו כי‬
‫‪66‬‬
‫‪ GRK2‬בלבד נמצא בפקיעיות הטעם של פפילת ה‪ CV -‬בעכברים )‪ ,(103‬אך ייתכן שמקור השוני בין‬
‫התוצאות נובע משונות בין בעלי חיים )עכבר מול חולדה(‪.‬‬
‫נוגדן כנגד ‪ GRK3‬לא גרם לצביעה הנראית לעין של חתכי פפילת ה‪ .CV -‬מכיוון שעל פי שיטת ה‪-‬‬
‫‪ GRK3 ,RT-PCR‬מתבטא ברקמה זו‪ ,‬ייתכן כי התוצאה השלילית בצביעה האימונית נובעת מרמת ביטוי‬
‫נמוכה במיוחד של ‪ ,GRK3‬מתחת לסף רגישות השיטה‪ .‬על מנת לקבוע במדויק אלו ‪ GRKs‬מתבטאים‬
‫יחד באותו תא עם קולטנים למר או למתוק‪ ,‬יידרשו ניסויים נוספים כגון ‪ in-situ hybridization‬בהם‬
‫נבדקת נוכחותם של רנ"א מגנים שונים בתאים‪ .‬ניסויים מסוג זה שימשו על מנת לקבוע שחלבונים כגון‬
‫‪ PLCβ2 ,gustducin‬או ‪ TRPM5‬מתבטאים יחד עם קולטנים למר או למתוק )‪ .(183‬נראה כי צביעה‬
‫של רנ"א הינה יותר ספציפית ומאפשרת צביעה והבחנה של תאים בודדים מתוך מצבור התאים‬
‫שבפקיעית הטעם‪ .‬לחילופין ‪ RT-PCR‬של תא בודד יכול לספק מידע על גנים המתבטאים בכל סוג תא‬
‫בפקיעית הטעם‪ .‬למרות רגישותן הגבוהה של שתי שיטות אלו‪ ,‬חסרון מסוים נעוץ בכך שהבדיקה נעשית‬
‫ברמת הרנ"א וידוע מכמה מערכות שרנ"א אינו תמיד אומדן נאמן לרמת החלבון בתא‪.‬‬
‫‪ - 4.3‬טעמנים אמפיפטיים מעכבים את הדסנסיטיזציה של קולטני‬
‫ה‪ GPCRs -‬על ידי עיכוב פעילותן של קינאזות ה‪.GRKs -‬‬
‫לאחר שנמצא כי טעמנים אמפיפטיים יכולים לחדור בתנאים פיזיולוגיים לתוך תאי הטעם ושקיימות‬
‫קינאזות ממשפחת ה‪ GRKs -‬באותם התאים‪ ,‬מטרת חלק זה של העבודה הייתה לבחון האם ביכולתם של‬
‫אותם הטעמנים האמפיפטיים לעכב את תהליך הדסנסיטיזציה של קולטנים ממשפחת ה‪ GPCRs -‬ע"י‬
‫אינטראקציה עם מרכיבים ציטוזוליים כגון קינאזות ה‪ .GRKs -‬על מנת להוכיח טענה זו‪ ,‬התעורר הצורך‬
‫לעבוד במערכת מודל עם קולטן אחר מקולטני הטעם‪ ,‬וזאת ממספר סיבות‪ .‬ראשית‪ ,‬תהליך הדסנסיטיזציה‬
‫של הקולטנים לטעם‪ ,‬מר או מתוק‪ ,‬לא נחקר עד כה‪ .‬בניגוד לרוב קולטני ה‪ ,GPCRs -‬זהותם ותפקודם‬
‫של הקולטנים לטעם התבררו רק בשנים האחרונות ומנגנון הדסנסיטיזציה שלהם אינו ידוע עדיין‪ .‬שנית‪,‬‬
‫ולמרות השיפורים הטכנולוגיים בשנים האחרונות‪ ,‬לא נמצאה עד כה שיטה המאפשרת לגדל תאי טעם‬
‫בתרבית מבלי לגרום עיוות לתאים או מוות לאחר זמן קצר )‪ .(126 ,85‬מסיבה זו‪ ,‬חקירת תפקודם של‬
‫הקולטנים לטעם דורשת ביטוי מלאכותי שלהם בשורות תאים )טרנספקציה(‪ .‬אומנם ביטוי שכזה נעשה‬
‫במספר רב של עבודות‪ ,‬ע"י שימוש בתאים כגון תאי ‪ HEK293‬או ‪ ,COS-7‬אך ידוע כי שיטה זו מביאה‬
‫בעיקר לביטוי ציטוזולי של הקולטן )‪ ,(24 ,18‬ומכאן לקולטן לא פונקציונלי לרוב‪ ,‬דבר אשר מהווה‬
‫מחסום משמעותי עבורנו‪.‬‬
‫ובכל זאת‪ ,‬מכיוון שהקולטנים לטעם המר והמתוק משתייכים למשפחת ה‪ ,GPCRs -‬סביר להניח כי‬
‫מנגנון הדסנסיטיזציה עבורם יהיה דומה לזה אשר תואר בסעיף ‪ ,1.6‬זאת אומרת דרך זרחון ע"י קינאזה‬
‫מסוג ‪ GRK‬ולאחר מכן אינטרנליזציה‪ .‬מסיבות אלו‪ ,‬נבחר הקולטן ה‪ β2AR -‬לשמש מודל במערכת‬
‫שלנו‪ β2AR .‬הינו קולטן ‪ GPCR‬אשר מנגנון הדסנסיטיזציה שלו נחקר בהרחבה שנים רבות‪ ,‬מרכיביו‬
‫‪67‬‬
‫אופיינו והשפעותיו על תהליכים תוך תאיים אחרים הינם בעצמם מקור למחקרים רבים נוספים )‪,99 ,48‬‬
‫‪ .(175 ,174 ,155 ,153 ,100‬בנוסף‪ ,‬ידוע כי קולטן זה מזורחן ע"י ‪ GRK2‬ו‪ ,GRK5 -‬שתי הקינאזות‬
‫אשר זוהו בתוך תאי פקיעית הטעם של פפילת ה‪) CV -‬סעיף ‪ ,(4.2‬ולכן השפעה אפשרית של הטעמנים‬
‫במערכת כזו רלוונטית גם למערכת חישת הטעם‪.‬‬
‫על מנת להשתמש בקולטן ה‪ β2AR -‬ככלי במחקר זה‪ ,‬היה צורך לבטא אותו בתאים הגדלים בתרבית‪.‬‬
‫תאי ה‪ HeLa -‬נבחרו למטרה זו ממספר סיבות‪ :‬ראשית אלה תאים ממקור אפיתליאלי‪ ,‬בדומה לתאי‬
‫הטעם בפקיעית הטעם‪ .‬בנוסף‪ ,‬על מנת להוכיח השפעה אפשרית של הטעמנים האמפיפטיים על מרכיבים‬
‫תוך תאיים‪ ,‬ישנו צורך להשתמש בתאים שלתוכם טעמנים אמפיפטיים חודרים במידה הדומה לזו אשר‬
‫נמצאה בתאי הטעם‪ .‬נמצא שאכן טעמנים אמפיפטיים חודרים במידה הרבה ביותר לתוך תאי ה‪HeLa -‬‬
‫)בהשוואה לתאי ‪ COS7 ,HEK293‬או ‪ .(HCT/116‬בדומה למה שדווח בתאי טעם‪ ,‬הטעמנים‬
‫האמפיפטיים הצטברו גם כאן כנגד מפל הריכוזים‪ .‬למרות זאת‪ ,‬התברר כי קצב החדירה של הטעמנים‬
‫לתוך תאי ‪ HeLa‬הרבה יותר נמוך מזה שבתאי טעם‪ 10 .‬דקות חשיפה עם תאי ה‪ HeLa -‬נדרשו על מנת‬
‫לקבל ריכוזים הדומים לאלו אשר נמצאו לאחר ‪ 30‬שניות חשיפה בלבד בתאי הטעם מפקיעיות טעם‬
‫מבודדות )‪ .(132‬בנוסף תאי ה‪ HeLa -‬נמצאו הרבה יותר רגישים לתרכובת כינין מאשר תאי הטעם‪.‬‬
‫כינין ידוע כחומר רעיל לתאים )‪ .(184 ,120‬אך בניגוד לתאי הטעם אשר יכלו להיחשף לריכוזים של ‪1-‬‬
‫‪) 2 mM‬טבלה ‪ ,((132) ,3.1‬תאי ה‪ HeLa -‬לא שרדו ריכוזים העולים על ‪ .50 µM‬לכן ריכוזי הכינין‬
‫בחלק זה של העבודה הינם בטווח של ‪ ,10-50 µM‬וזמן החשיפה לתאים לפני גירוי הקולטן לא עלה על‬
‫‪ 3‬דקות )טבלה ‪ .(3.2‬ריכוזי חמשת הטעמנים האחרים הינם ריכוזים המצויים במזון‪.‬‬
‫על מנת לבחון את השפעת הטעמנים על תהליך הדסנסיטיזציה של הקולטן ה‪ ,β2AR -‬נבחנה תחילה‬
‫פעילותו של הקולטן לאחר גירוי עם ליגנד ספציפי בשם ‪ ,(ISO) isoproterenol‬כאשר התאים נחשפו‬
‫קודם לכן לטעמנים אמפיפטיים‪ .‬במידה ולטעמנים השפעה מעכבת על התקדמותו של תהליך‬
‫הדסנסיטיזציה‪ ,‬היינו מצפים לפעילות ארוכה יותר של הקולטן‪ ,‬אשר תתורגם ברמות שליחים משניים‬
‫גבוהות יותר לזמנים ארוכים יותר‪ .‬מידת הפעילות של הקולטן נבחנה כאן ע"י מדידת רמות השליח המשני‬
‫‪ cAMP‬אשר נוצר כתוצאה משפעול חלבון ‪ Gs‬ואדניליל ציקלאז ע"י הקולטן ה‪ .β2AR -‬ואכן נמצא‬
‫שחשיפה מוקדמת של התאים לטעמנים האמפיפטיים השונים גרמה לעלייה משמעותית ברמות ה‪cAMP -‬‬
‫שנוצרו בתגובה ל‪ ISO -‬והמשיכה גם ‪ 2‬דקות לאחר גירוי הקולטן‪ .‬הגברה זו ברמות ה‪ cAMP -‬הייתה‬
‫תלויה בריכוז הטעמן )איור ‪ .(3.4‬תוצאות אלו היוו אינדיקציה ראשונית לכך שטעמנים אמפיפטיים אכן‬
‫גורמים לקולטן להיות "פעיל יותר"‪.‬‬
‫מחקרים קודמים הראו שטעמנים אמפיפטיים יכולים להשפיע על מערכות אשר אינן קשורות לטעם‪ ,‬בין‬
‫היתר ע"י קשירה לקולטנים שאינם קולטני טעם והפעלתם‪ .‬למשל‪ ,‬הטעמן ‪ NHD‬נמצא מסוגל לפעול‬
‫כליגנד לקולטן האדרנרגי מסוג ‪ ,(α2AR) α2‬לעומת טעמנים כגון סכרין ו‪ D-TRP -‬אשר פועלים‬
‫כליגנדים לקולטן המלטונין )‪ .(185) (MT1/2‬לעומת זאת‪ ,‬הטעמן המר כינין נמצא פועל כאנטגוניסט‬
‫לקולטן לסרוטונין ‪ .(166) 5-HT3‬לאור עובדות אלו‪ ,‬נעשו מספר ניסויים על מנת להוכיח כי השינוי‬
‫‪68‬‬
‫ברמות ה‪ cAMP -‬נבע מפעילות ציטוזולית של הטעמנים ולא בגלל קשירה חוץ תאית לקולטן ה‪β2AR -‬‬
‫באופן אשר יידמה ליגנד‪ .‬הניסויים הראו כי בהיעדר ‪ ,ISO‬אין לטעמנים עצמם כל השפעה על רמות ה‪-‬‬
‫‪ cAMP‬הבזליות בתא‪ ,‬ויותר מכך‪ ,‬שמידת השפעתם על רמות ה‪ cAMP -‬לאחר גירוי הקולטן עם ‪ISO‬‬
‫הינה תלויה בזמן החשיפה של התאים אליהם )איור ‪ .(3.5‬תוצאות אלו מוכיחות כי הטעמנים אינם פועלים‬
‫כליגנדים לקולטן ה‪ ,β2AR -‬או לכל קולטן אחר ממשפחת ה‪ GPCR -‬אשר מתבטא בצורה אנדוגנית‬
‫בתאי ‪ HeLa‬וקשור לחלבוני ‪ Gs‬או ‪ .Gi‬גם אם סביר להניח כי קולטני ‪ α2AR‬למשל יתבטאו בתאי‬
‫‪ ,HeLa‬נראה כי רמת הביטוי שלהם נמוכה מכדי שטעמנים כגון ‪ NHD‬ישפיעו במידה משמעותית על‬
‫רמות ה‪ .cAMP -‬התלות באורך החשיפה של תאים לטעמנים מוכיחה כי חדירתם ונוכחותם של הטעמנים‬
‫בתוך ציטוזול התא בריכוז גבוה מספיק הינם חיוניים על מנת שתתקבל הגברה בפעילות הקולטן‪ ,‬כלומר‬
‫שהשפעת הטעמנים הינה תוך תאית ולא רצפטורלית‪.‬‬
‫בנוסף לקשירתם לקולטנים שונים‪ ,‬ידוע כי תרכובות אמפיפטיות מסוגלות גם להשפיע על פעילותם של‬
‫מרכיבים ציטוזולים כגון פוספודיאסטראזות )קפאין )‪ ,((64‬פקטורי שעתוק )פלבונואידים )‪ ,((108‬או‬
‫חלבונים ממברנליים כגון תעלות )נרינגין )‪ ,(156 ,6‬כינין )‪ .((170 ,31‬לכן נדרשו צעדים נוספים על‬
‫מנת להוכיח כי ההגברה שנראתה ברמות ה‪ cAMP -‬אכן נובעת מהשפעת הטעמנים על פעילות הקולטן‬
‫ולא בדרך עקיפה על מרכיבים ציטוזולים אשר עיכובם יגרום גם הוא לעלייה ברמת ה‪ cAMP -‬בתא‪ .‬שני‬
‫שחקנים אשר יכלו להשפיע על רמות שליחים משניים היו ‪ ,PDE‬אשר אחראי על פירוק שליחים משניים‬
‫ו‪ PKA -‬אשר מעורב בדסנסיטיזציה ההטרולוגית של הקולטן ה‪ .β2AR -‬ואכן‪ ,‬נוכחותם של מעכב ‪PDE‬‬
‫בשם ‪ IBMX‬או מעכב ‪ PKA‬בשם ‪ H89‬במערכת גרמו‪ ,‬לאחר גירוי הקולטן‪ ,‬לרמות ‪ cAMP‬גבוהות פי‬
‫‪ 10-15‬מאשר בתנאים זהים בהיעדרם‪ .‬אך התוצאות הראו כי ההגברה ברמות ה‪ cAMP -‬לאחר חשיפת‬
‫התאים לטעמנים קרתה גם בנוכחות ‪ IBMX‬או ‪ ,H89‬ובמידה דומה לזו שבהיעדר המעכבים )איור ‪,(3.6‬‬
‫ומהוות הוכחה לכך שההשפעה של הטעמנים על רמות ה‪ cAMP -‬לא נבעה מהשפעה כלשהי על ‪ PDE‬או‬
‫‪ ,PKA‬בהתאמה‪.‬‬
‫הטעמן היחיד אשר התנהג שונה היה קפאין‪ .‬קפאין הינו תרכובת הידועה כמשפיעה על פעילותם של מגוון‬
‫רחב ביותר של אנזימים‪ ,‬תעלות וקולטנים‪ .‬קפאין פועל כאנטגוניסט ל‪,78) adenosine receptor -‬‬
‫‪ ,(138‬גורם לשחרור סידן תוך תאי )‪ ,(177‬מעכב תעלות אשלגן )‪ ,(55‬מעכב ‪ PKC‬ו‪(139) ATM -‬‬
‫והרשימה עוד ארוכה‪ .‬אך אחת מההשפעות הידועות ביותר של קפאין )כמו של המטבוליט שלו תאופילין(‬
‫הינה עיכוב ‪ .PDE‬זו הסיבה לכך שבנוכחותו‪ ,‬רמות ה‪ cAMP -‬לאחר גירוי הקולטן ה‪ β2AR -‬ע"י ‪ISO‬‬
‫גבוהות בהרבה )בערך פי ‪ (5‬ושהירידה ברמות ה‪ cAMP -‬אשר נראית במצב רגיל לאחר ‪ 30‬שניות אינה‬
‫מתקיימת‪ .‬לכן‪ ,‬במטרה לבחון את השפעת קפאין על פעילות הקולטן בלבד‪ ,‬הוסף למערכת הניסוי‬
‫‪ .IBMX‬ואכן נמצא כי השפעתו של קפאין על רמות ה‪ cAMP -‬שנוצרו בעקבות גירוי הקולטן ה‪-‬‬
‫‪ β2AR‬אינה תלויה ב‪ .PDE -‬למרות זאת‪ ,‬ניתן לראות כי אם קפאין לבד גורם לאחר גירוי הקולטן‬
‫להגברת רמות ‪ cAMP‬פי ‪ ,5‬השפעתו על פעילות הקולטן עצמו )ז"א בנוכחות ‪ (IBMX‬יורדת לפי ‪1.5-‬‬
‫‪ 2‬בלבד ‪,‬בדומה לשאר הטעמנים שנבדקו‪.‬‬
‫‪69‬‬
‫בכדי לבחון אם השפעתם של הטעמנים על רמות ‪ cAMP‬נובעת מעיכוב מנגנון הדסנסיטיזציה‬
‫ההומולוגית של הקולטן‪ ,‬נבחנה מידת הזרחון של הקולטן לאחר גירוי בנוכחות הטעמנים‪.‬‬
‫לשם כך‪ ,‬השתמשנו בנוגדן אשר פותח בשנים האחרונות ומזהה אתרי סרינים המזורחנים ספציפית ע"י‬
‫‪ GRK2/5‬לאחר גירוי הקולטן‪ ,‬והן העמדות ‪ Ser355‬ו‪ Ser356 -‬בקצה ה‪-C -‬טרמינלי של הקולטן‬
‫)‪ .(153‬נוגדן זה שימש במספר מחקרים והוכח כספציפי )‪ GRK2 .(168‬ו‪ GRK5 -‬מתבטאים בצורה‬
‫אנדוגנית בתאי ‪ HeLa‬ולכן לא נדרשה טרנספקציה נוספת להפעלת מנגנון הדסנסיטיזציה של הקולטן‬
‫בתאים אלו‪ .‬מן התוצאות ניתן לראות כי זרחון הקולטן אכן הושפע מנוכחות טעמנים אך באופן לא צפוי‪.‬‬
‫בנוסף לירידה ברמת הזרחון של הקולטן‪ ,‬התקבלה דחייה בזמן הופעתו‪ :‬אם במצב רגיל )ביקורת( הקולטן‬
‫נמצא מזורחן בעיקר ‪ 5-10‬דק' לאחר הגירוי‪ ,‬בנוכחות הטעמנים זרחון זה הופיע רק לאחר ‪ 10-20‬דק'‬
‫)איור ‪ .(3.7‬תופעה זו איננה שגרתית במובן זה שעיכוב של אנזים מתורגם בירידה בפעילותו ואילו‬
‫במקרה שלנו‪ ,‬פעילותם של ה‪ GRK2/5 -‬נראית כמושהית ל‪ 5-10 -‬דק' ומתחדשת לאחר מכן‪ .‬ניסויים‬
‫של ‪ in-vitro kinase assay‬הראו כי עיכוב פעילותם של ‪ GRK2‬ו‪ GRK5 -‬ע"י הטעמנים אינו נובע‬
‫מתחרות על אתר הקשירה לסובסטרט או על אתר הקשירה ל‪ ,(186) ATP -‬ומנגנון העיכוב לא פוענח‬
‫עד כה‪ .‬אבל הסבר אפשרי לדחייה בזמן הופעת הזרחון של הקולטן יכול להיות בכך שלאחר הצטברותם‬
‫לתוך ציטוזול התאים‪ ,‬הטעמנים "נעלמים" בדרך כלשהי‪ .‬פירוק אנזימטי לא נראה סביר ולא ידוע על‬
‫פעילות ‪ cytochrome P450‬בתאי ‪ .HeLa‬לעומת זאת‪ ,‬מנגנון ידוע אשר מוציא החוצה תרכובות "זרות"‬
‫המצטברות בציטוזול התא הינו שפעול טרנספורטרים ממשפחת ה‪(multi-drug resistance mdr -‬‬
‫)‪ .transporters‬משפחה זו של טרנספורטרים‪ ,‬הקיימת בתאים אאוקריוטים )‪ (130‬כמו פרוקריוטים‬
‫)‪ ,(76‬אחראית על הוצאת תרופות או חומרים רעילים מתוך התאים ומונעת בדרך זו את מותם‪.‬‬
‫טרנספורטרים אלו פעילים במיוחד בתאי סרטן )וגורמים כך לעמידות לתרופות אנטי‪-‬סרטניות )‪,((125‬‬
‫ומתבטאים גם בתאי ‪ .(165) HeLa‬ניתן לחשוב כי בזמן גירוי הקולטן )אשר ארך עד ‪ 20‬דק'(‪ ,‬הטעמנים‬
‫המשיכו להצטבר בתוך ציטוזול התא מעבר לריכוזים אשר דווחו בטבלה ‪ .3.2‬ייתכן כי ריכוזים כה‬
‫גבוהים הפעילו את הטרנספורטרים מסוג ‪ mdr‬ובכך גרמו להוצאתם של הטעמנים מהציטוזול‪ .‬תוצאה‬
‫ישירה תהיה ירידה מתמדת בריכוז הטעמנים בציטוזול‪ .‬מרגע זה‪ ,‬העיכוב שהפעילו הטעמנים על ה‪-‬‬
‫‪ GRKs‬נעלם ולכן הקינאזות מסוגלות לפעול מחדש ולזרחן "באיחור" את הקולטן‪.‬‬
‫אם אכן הטעמנים מעכבים את זרחון הקולטן ע"י ‪ ,GRK2/5‬ישנה סבירות גבוהה כי תהליכים אשר‬
‫תלויים בזרחון זה יימצאו גם הם מעוכבים‪ ,‬וביניהם קשירה של מולקולת ‪ β-arrestin‬לקולטן המזורחן‪.‬‬
‫כתוצאה מקשירה זו מופעלים מספר תהליכים‪ :‬הראשון הינו אינטרנליזציה של הקולטן לתוך ציטוזול התא‬
‫והשני שפעול מסלולי העברת אותות חדשים‪ .‬לכן השפעת הטעמנים על שני תהליכים אלה נבחנה בהמשך‪.‬‬
‫מידת האינטרנליזציה של הקולטן ה‪ β2AR -‬לאחר גירוי עם ‪ ,ISO‬בהיעדר או נוכחות טעמנים‪ ,‬נבחנה‬
‫קודם כל במיקרוסקופיה פלואורסצנטית‪ .‬התוצאות הראו כי בעקבות פראינקובציה של התאים עם‬
‫הטעמנים וגירוי הקולטן ה‪ β2AR -‬ב‪ ISO -‬חלה עלייה באחוז התאים אשר הכילו קולטן ממברנלי )איור‬
‫‪ .(3.8‬תוצאות אלו ביחד עם תוצאות השהייה בהופעת הזרחון )איור ‪ (3.7‬מתארות יפה את התהליך אשר‬
‫‪70‬‬
‫עובר הקולטן‪ :‬בהיעדר טעמן‪ ,‬הקולטן מזורחן כבר לאחר ‪ 5‬דק' של גירוי ובמקביל ניתן לראות את תחילת‬
‫האינטרנליזציה שלו לתוך הציטוזול‪ .‬אחרי ‪ 15‬דק'‪ ,‬רוב התאים מכילים קולטן ציטוזולי‪ .‬בתוך הציטוזול‪,‬‬
‫הקולטן עובר תהליך של דה‪-‬פוספורילציה )הורדת זרחנים ע"י פוספטאזות(‪ ,‬אשר מתבטא בירידה‬
‫בעוצמת הפסים המתקבלים עם הנוגדן ה‪ .anti-phosphoSer(355-356) β2AR -‬לעומת זאת בנוכחות‬
‫הטעמנים‪ ,‬הקולטן אינו מזורחן באופן בולט גם לאחר ‪ 10‬דק' גירוי‪ ,‬דבר המתבטא בכך שרוב התאים‬
‫עדיין מכילים קולטן ממברנלי בזמן זה‪ .‬הזרחון מופיע בעיקר לאחר ‪ 15‬דק' גירוי וכך גם מתחיל להופיע‬
‫אחוז גבוה יותר של אינטרנליזציה‪ .‬השפעת הטעמנים על קצב האינטרנליזציה של הקולטן נמצאה גם כן‬
‫תלוית‪-‬ריכוז )איור ‪ .(3.9‬מכיוון שהסתכלות על תאים דרך מיקרוסקופ אינה מאפשרת להעריך את כמות‬
‫הקולטן אשר נמצא עדיין על ממברנת התא‪ ,‬נעשתה פרקציונציה של התא ונבדקה נוכחות הקולטן‬
‫בממברנה הפלסמטית ובתוכן הציטוזולי והוכיחה שוב כי חלה ירידה בקצב תהליך האינטרליזציה בנוכחות‬
‫הטעמנים )איור ‪.(3.10‬‬
‫התהליך השני אשר תלוי בזרחון הקולטן ע"י ‪ GRKs‬וקשירת ‪ β-arrestin‬לקולטן הינו שפעול מסלול ה‪-‬‬
‫‪ .(92) MAPK‬מסלול זה מאופיין בקיום תגובת שרשרת בה קינאזה אחת מזרחנת את השנייה ובכך‬
‫משפעלת אותה‪ .‬התגלו מספר רב של מסלולי ‪ MAPK‬אשר מפעילים אפקטורים שונים‪ ,‬הידועים‬
‫מביניהם הינם ‪ JNK ,p38‬ו‪ .ERK1/2 -‬ישנן שתי דרכים דרכן הקולטן ה‪ β2AR -‬משפעל את מסלול‬
‫ה‪ :ERK -‬הדרך הראשונה תלויה בזרחון הקולטן ע"י ‪) PKA‬קורה בטווח של ‪ 2-5‬דק' אחרי גירוי‬
‫הקולטן( והשנייה תלויה ביצירת הקומפלקס קולטן‪) β-arrestin/‬קורה בטווח של ‪ 5-45‬דק' לאחר גירוי‬
‫הקולטן( )‪ .(155‬לכן בשלב הבא‪ ,‬נבחנה השפעתם של הטעמנים על שפעול ‪ .ERK‬ראשית‪ ,‬ללא גירוי‬
‫הקולטן‪ ,‬לא הייתה לטעמנים כל השפעה על רמת הזרחון הבזלית של ‪ ,ERK‬דבר אשר מעיד על כך‬
‫שלטעמנים אין כל השפעה על קולטנים מסוג ה‪ tyrosine kinase receptor -‬כגון קולטן ה‪EGF -‬‬
‫)‪ ,(EGFR‬אך גם לא על מרכיבים ציטוזולים אשר יכולים לשפעל את מסלול ה‪ ,MAPK -‬כגון ‪.PKC‬‬
‫נראה שלטעמנים השפעה מעכבת על שפעול ‪ ERK‬רק בטווח של ‪ 10-30‬דק'‪ .‬לעומת זאת שפעול ה‪-‬‬
‫‪ ERK‬בזמנים של ‪ 2-5‬דקות לא נראה מושפע כלל‪ .‬תוצאה זו מעידה על כך שלטעמנים אין השפעה‬
‫מעכבת על ‪ ,PKA‬דבר אשר תומך בתוצאות שהתקבלו בניסויי מדידות ה‪ cAMP -‬כאשר הטעמנים‬
‫הגבירו את רמות השליח המשני גם בנוכחות ‪) H89‬איור ‪ .(3.6‬לעומת זאת‪ ,‬ובהתאם לציפיותינו‪,‬‬
‫הטעמנים עיכבו את המסלול אשר תלוי בזרחון הקולטן ע"י ה‪ GRKs -‬וקשירת ‪ β-arrestin‬לקולטן‬
‫המזורחן‪ .‬קפאין היה שוב במקרה זה הטעמן היחיד אשר התנהג אחרת מכל האחרים‪ .‬קפאין לא רק עיכב‬
‫את שפעול ה‪ ERK -‬התלוי ב‪ β-arrestin -‬אלא גם את השפעול התלוי ב‪ .PKA -‬קיימים בספרות‬
‫דיווחים רבים על השפעת קפאין על מסלולים התלויים ב‪ ,PKA -‬אך עובדה מפתיעה ביותר הינה כי על‬
‫פי סוג התאים או סוג המערכת נמצאו לקפאין השפעות הפוכות‪ .‬מספר מאמרים דיווחו על שפעול ‪PKA‬‬
‫ע"י קפאין )‪ ,(63 ,3‬לעומת מחקרים אחרים אשר דיווחו על השפעה מעכבת על ‪.(186 ,148) PKA‬‬
‫מתוצאות המחקר הנוכחי‪ ,‬נראה כי קפאין פעל כמעכב ‪ .PKA‬זו יכולה גם להיות הסיבה לכך שקפאין הינו‬
‫הטעמן היחיד מבין השישה אשר גרם לירידה ברמת הזרחון הבזלית של ‪.ERK‬‬
‫‪71‬‬
‫לסיכום תוצאות הניסויים בחלק זה מצביעות על כך שכתוצאה מחדירתם לתוך ציטוזול התאים‪ ,‬הטעמנים‬
‫האמפיפטיים גורמים לקולטן ה‪ β2AR -‬להיות פעיל לתקופה ארוכה יותר ע"י עיכוב קינאזות ה‪GRKs -‬‬
‫האחראיות על תהליך הדסנסיטיזציה ההומולוגית שלו‪.‬‬
‫הטעמנים מצטיירים כמעכבים פחות ספציפיים ורגישים ממעכבים הידועים עבור קינאזות אחרות‬
‫ממשפחת ה‪) serine/threonine kinases -‬כגון ‪ H89‬עבור ‪ (PKA‬ואף קינאזות ממשפחת ה‪tyrosine -‬‬
‫‪) kinases‬כמו ‪ imatinib‬עבור ‪ .(bcr/abl‬ריכוזי הטעמנים אשר נדרשו על מנת לקבל השפעה היו ברמות‬
‫המילימולרים‪ ,‬לעומת רמות של ‪ µM‬הדרושות עבור רוב המעכבים המשווקים מסחרית‪ .‬מצד שני‪ ,‬לא‬
‫נמצאו עד כה מעכבים ספציפים ל‪ GRKs -‬וחקר פעילותה הייחודית של כל אחת מן הקינאזות הללו‬
‫נעשה עד היום ע"י פגיעה בביטוי הקינאזה‪ ,‬למשל ע"י שימוש ב‪ .siRNA -‬בנוסף‪ ,‬בהשוואה למעכבים‬
‫אחרים הדורשים זמן חשיפה ממוצע לתאים של ‪ 20‬עד ‪ 45‬דקות )אך יכול להגיע גם לשעות(‪ ,‬הטעמנים‬
‫האמפיפטיים חודרים במהירות לתוך ציטוזול התאים ומגיעים לריכוזים אפקטיביים תוך זמן קצר יחסית‬
‫)‪ 10‬דקות בלבד(‪.‬‬
‫מכיוון ש‪ GRK2 -‬ו‪ GRK5 -‬הינן שתי הקינאזות האחראיות על הדסנסיטיזציה ההומולוגית של הקולטן‬
‫ה‪ ,β2AR -‬התוצאות שתוארו כאן מתייחסות לשתי הקינאזות האלו בלבד‪ .‬בחינת יכולתם של הטעמנים‬
‫להשפיע בתנאי ‪ in-vivo‬על קינאזות אחרות מתוך המשפחה תדרוש שימוש במודלים אחרים‪ .‬בנוסף‪,‬‬
‫תוצאות המחקר אינן מאפשרות לדעת אם הטעמנים השפיעו במידה שונה על כל אחת משתי הקינאזות‪.‬‬
‫ולמרות זאת‪ ,‬שתי הקינאזות ‪ GRK2‬ו‪ GRK5 -‬מעורבות במנגנון הדסנסיטיזציה של המגוון הרחב ביותר‬
‫של קולטנים ולכן‪ ,‬על אף שהקולטן ה‪ β2AR -‬שימש במחקר זה מודל בלבד לקולטני הטעם‪ ,‬תוצאות‬
‫המחקר הן בעלות משמעות רחבה יותר‪.‬‬
‫רשימה ארוכה של קולטנים אשר משתייכים למשפחת ה‪ GPCR -‬התגלו בתאי פקיעית הטעם‪ :‬בין היתר‬
‫הקולטנים לנוירוטרנסמיטורים סרוטונין )‪ ,(67) (5-HT‬אצטילכולין )‪ ,(122) (mAChR1‬וגלוטמאט‬
‫)‪ (25) (mGluR4‬בעלי חשיבות רבה בתקשורת בין תאית‪ .‬הקולטן לכולציסטוכינין )‪(61) (CCK-A‬‬
‫מתבטא אף הוא בתאי פקיעית הטעם ומשחק כנראה תפקיד בתחושת השובע‪ .‬מספר קולטנים אדרנרגים ‪α‬‬
‫ו‪ ,β -‬וביניהם הקולטן ה‪ ,(60) β2AR -‬מתבטאים גם בתאי פקיעית הטעם‪ ,‬ותפקידם שם עדיין מעורפל‪.‬‬
‫כל הקולטנים הללו משתייכים למשפחת ה‪ GPCRs -‬וברובם התגלה כי ‪ GRK2‬ו‪/‬או ‪ GRK5‬מעורבים‬
‫בתהליך הדסנסיטיזציה שלהם )‪ .(54 ,50 ,33‬לכן ניתן להניח כי לטעמנים האמפיפטיים יכולת להשפיע‬
‫על תיפקודם של כל אחד מהקולטנים הללו במידה ותהיה להם גישה לציטוזול התאים בהם הם מתבטאים‪.‬‬
‫רבים מן הקולטנים אשר הוזכרו כאן מתבטאים לא רק בתאי הטעם )‪ ,(type II‬אלא גם בתאים מסוג ‪III‬‬
‫)‪ ,(type III‬אשר אחראים על פי מחקרים אחרונים על שחרור נוירוטרנסמיטור ותקשורת עם תאי העצב‪.‬‬
‫הטעמנים האמפיפטיים צפויים לחדור לתוך כל סוגי התאים שבתוך פקיעית הטעם באותה מידה‪ ,‬ולכן גם‬
‫לתוך תאים אשר מבטאים את הקולטנים הללו‪ .‬על פי תוצאות המחקר הנוכחי‪ ,‬ייתכן והטעמנים‬
‫האמפיפטיים משפיעים על תחושת הטעם לא רק ע"י שיבוש מנגנון הדסנסיטיזציה של הקולטנים לטעם‬
‫‪72‬‬
‫עצמם אלא גם בדרך עקיפה ע"י השפעה על תפקודם של קולטני ‪ GPCRs‬אחרים האחראים על תהליכים‬
‫פיזיולוגים מגוונים כגון העברת המידע מתא הטעם הלאה‪.‬‬
‫על פי אותו היגיון‪ ,‬ניתן להניח כי לטעמנים האמפיפטיים יכולת להשפיע על כל תהליך פיזיולוגי התלוי‬
‫בקולטני ‪ GPCRs‬במידה ובאפשרותם לחדור לתוך ציטוזול התאים המבטאים אותם‪ .‬ידוע כי תרכובות‬
‫אמפיפטיות רבות‪ ,‬כגון סכרין‪ ,‬נרינגין או קפאין‪ ,‬אינן מפונות מהגוף ביעילות לאחר צריכתן‪ ,‬וניתן למצוא‬
‫אותן בריכוזים שונים בין היתר במערכת העיכול‪ ,‬במערכת השתן ואף בדם‪ .‬סכרין למשל נספג תוך ‪15‬‬
‫דקות בתוך המעי )‪ (105‬וניתן למצוא אותו כמעט בכל איבר בגוף שעה לאחר הצריכה )‪ .(93‬קפאין גם‬
‫הוא מגיע לדם ע"י ספיגה מהירה מאוד דרך המעי )‪ ,(83‬ומכאן מגיע לכל אברי הגוף )‪ .(11‬לכן ייתכן כי‬
‫לטעמנים האלה גישה לתאים מאיברים שונים בגוף‪ .‬בגלל אופיים האמפיפטי‪ ,‬ישנה סבירות לפיה‬
‫הטעמנים האלו חודרים לתוך ציטוזול התאים של איברים שונים‪ ,‬שם הם יכולים להשפיע על מערכות‬
‫אשר אינן קשורות כלל למערכת חישת הטעם‪ .‬אחד האיברים אשר יכול להיות מושפע יותר מאחרים הינו‬
‫המעי‪ ,‬אשר אחראי על ספיגת תרכובות מהמזון‪ .‬מעניין לציין כי מחקרים הראו לאחרונה שהקולטנים‬
‫לטעם המתוק וחלבון ה‪ gustducin G -‬מתבטאים בתאי המעי ונראה שהם מווסתים שם את תהליך‬
‫ספיגת הסוכרים ותחושת השובע )‪ .(102 ,72‬בקרה לא נכונה של תהליכים אלו ידועה במחלות כגון‬
‫סכרת והשמנת יתר‪ .‬ייתכן כי הטעמנים‪ ,‬בתוך ציטוזול תאי המעי‪ ,‬יכולים להשפיע על התהליכים להם‬
‫קולטני הטעם אחראים בתאים אלו‪ ,‬ובכך להשפיע על תהליכים פיזיולוגיים כגון רמות סוכר בדם‪,‬‬
‫התכווצויות המעי ותחושת השובע‪.‬‬
‫‪73‬‬
‫רשימת ספרות‬
1.
Abaffy T, Trubey KR, and Chaudhari N. Adenylyl cyclase expression and
modulation of cAMP in rat taste cells. Am J Physiol Cell Physiol 284: C1420-1428,
2003.
2.
Adler E, Hoon MA, Mueller KL, Chandrashekar J, Ryba NJP, and Zuker
CS. A novel family of mammalian taste receptors. Cell 100: 693-702, 2000.
3.
Al-Wadei HA, Takahashi T, and Schuller HM. Caffeine stimulates the
proliferation of human lung adenocarcinoma cells and small airway epithelial cells via
activation of PKA, CREB and ERK1/2. Oncol Rep 15: 431-435, 2006.
4.
Avenet P, Hofmann F, and Lindemann B. Signalling in taste receptor cells:
cAMP-dependent protein kinase causes depolarization by closure of 44 pS Kchannels. Comp Biochem Physiol A 90: 681-685, 1988.
5.
Bachmanov AA, Li X, Reed DR, Ohmen JD, Li S, Chen Z, Tordoff MG,
de Jong PJ, Wu C, West DB, Chatterjee A, Ross DA, and Beauchamp GK.
Positional cloning of the mouse saccharin preference (Sac) locus. Chem Senses 26:
925-933, 2001.
6.
Bailey DG, Dresser GK, Leake BF, and Kim RB. Naringin is a major and
selective clinical inhibitor of organic anion-transporting polypeptide 1A2 (OATP1A2)
in grapefruit juice. Clin Pharmacol Ther 81: 495-502, 2007.
7.
Barone JJ, and Roberts HR. Caffeine consumption. Food Chem Toxicol 34:
119-129, 1996.
8.
Behrens M, Brockhoff A, Kuhn C, Bufe B, Winnig M, and Meyerhof W.
The human taste receptor hTAS2R14 responds to a variety of different bitter
compounds. Biochem Biophys Res Commun 319: 479-485, 2004.
9.
Bernhardt SJ, Naim M, Zehavi U, and Lindemann B. Changes in IP3 and
cytosolic Ca2+ in response to sugars and non-sugar sweeteners in transduction of
sweet taste in the rat. J Physiol 490 (Pt 2): 325-336, 1996.
10.
Bezencon C, le Coutre J, and Damak S. Taste-signaling proteins are
coexpressed in solitary intestinal epithelial cells. Chem Senses 32: 41-49, 2007.
11.
Biaggioni I, Paul S, and Robertson D. A simple liquid-chromatographic
method applied to determine caffeine in plasma and tissues. Clin Chem 34: 23452348, 1988.
12.
Bo X, Alavi A, Xiang Z, Oglesby I, Ford A, and Burnstock G. Localization
of ATP-gated P2X2 and P2X3 receptor immunoreactive nerves in rat taste buds.
Neuroreport 10: 1107-1111, 1999.
13.
Boguski MS, and McCormick F. Proteins regulating Ras and its relatives.
Nature 366: 643-654, 1993.
14.
Bohn LM, Gainetdinov RR, Sotnikova TD, Medvedev IO, Lefkowitz RJ,
Dykstra LA, and Caron MG. Enhanced rewarding properties of morphine, but not
cocaine, in beta(arrestin)-2 knock-out mice. J Neurosci 23: 10265-10273, 2003.
15.
Bohn LM, Lefkowitz RJ, Gainetdinov RR, Peppel K, Caron MG, and Lin
FT. Enhanced morphine analgesia in mice lacking beta-arrestin 2. Science 286: 24952498, 1999.
16.
Boughter JD, Jr., Pumplin DW, Yu C, Christy RC, and Smith DV.
Differential expression of alpha-gustducin in taste bud populations of the rat and
hamster. J Neurosci 17: 2852-2858, 1997.
74
17.
Bradford MM. A rapid and sensitive method for the quantitation of
microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal
Biochem 72: 248-254, 1976.
18.
Bufe B, Hofmann T, Krautwurst D, Raguse JD, and Meyerhof W. The
human TAS2R16 receptor mediates bitter taste in response to beta-glucopyranosides.
Nat Genet 32: 397-401, 2002.
19.
Caicedo A, Kim KN, and Roper SD. Individual mouse taste cells respond to
multiple chemical stimuli. J Physiol 544: 501-509, 2002.
20.
Caicedo A, Pereira E, Margolskee RF, and Roper SD. Role of the Gprotein subunit alpha-gustducin in taste cell responses to bitter stimuli. J Neurosci 23:
9947-9952, 2003.
21.
Caicedo A, and Roper SD. Taste receptor cells that discriminate between
bitter stimuli. Science 291: 1557-1560, 2001.
22.
Castaing M, Brouant P, Loiseau A, Santelli-Rouvier C, Santelli M,
Alibert-Franco S, Mahamoud A, and Barbe J. Membrane permeation by
multidrug-resistance-modulators and non-modulators: effects of hydrophobicity and
electric charge. J Pharm Pharmacol 52: 289-296, 2000.
23.
Chandrashekar J, Hoon MA, Ryba NJP, and Zuker CS. The receptors and
cells for mammalian taste. Nature 444: 288-294, 2006.
24.
Chandrashekar J, Mueller KL, Hoon MA, Adler E, Feng L, Guo W,
Zuker CS, and Ryba NJP. T2Rs function as bitter taste receptors. Cell 100: 703711, 2000.
25.
Chaudhari N, Landin AM, and Roper SD. A metabotropic glutamate
receptor variant functions as a taste receptor. Nat Neurosci 3: 113-119, 2000.
26.
Cho EY, Cho DI, Park JH, Kurose H, Caron MG, and Kim KM. Roles of
protein kinase C and actin-binding protein 280 in the regulation of intracellular
trafficking of dopamine D3 receptor. Mol Endocrinol 21: 2242-2254, 2007.
27.
Chou KH, and Bell LN. Caffeine content of prepackaged national-brand and
private-label carbonated beverages. J Food Sci 72: C337-342, 2007.
28.
Clapp TR, Medler KF, Damak S, Margolskee RF, and Kinnamon SC.
Mouse taste cells with G protein-coupled taste receptors lack voltage-gated calcium
channels and SNAP-25. BMC Biol 4: 7, 2006.
29.
Cong M, Perry SJ, Lin FT, Fraser ID, Hu LA, Chen W, Pitcher JA, Scott
JD, and Lefkowitz RJ. Regulation of membrane targeting of the G protein-coupled
receptor kinase 2 by protein kinase A and its anchoring protein AKAP79. J Biol Chem
276: 15192-15199, 2001.
30.
Conn PJ, and Pin JP. Pharmacology and functions of metabotropic glutamate
receptors. Annu Rev Pharmacol Toxicol 37: 205-237, 1997.
31.
Cummings TA, and Kinnamon SC. Apical K+ channels in Necturus taste
cells. Modulation by intracellular factors and taste stimuli. J Gen Physiol 99: 591-613,
1992.
32.
Daaka Y, Luttrell LM, and Lefkowitz RJ. Switching of the coupling of the
beta2-adrenergic receptor to different G proteins by protein kinase A. Nature 390: 8891, 1997.
33.
Dale LB, Bhattacharya M, Anborgh PH, Murdoch B, Bhatia M,
Nakanishi S, and Ferguson SS. G protein-coupled receptor kinase-mediated
desensitization of metabotropic glutamate receptor 1A protects against cell death. J
Biol Chem 275: 38213-38220, 2000.
34.
Damak S, Rong M, Yasumatsu K, Kokrashvili Z, Perez CA, Shigemura
N, Yoshida R, Mosinger B, Jr., Glendinning JI, Ninomiya Y, and Margolskee
75
RF. Trpm5 null mice respond to bitter, sweet, and umami compounds. Chem Senses
31: 253-264, 2006.
35.
Day PW, Carman CV, Sterne-Marr R, Benovic JL, and Wedegaertner
PB. Differential interaction of GRK2 with members of the G alpha q family.
Biochemistry 42: 9176-9184, 2003.
36.
DeFazio RA, Dvoryanchikov G, Maruyama Y, Kim JW, Pereira E, Roper
SD, and Chaudhari N. Separate populations of receptor cells and presynaptic cells in
mouse taste buds. J Neurosci 26: 3971-3980, 2006.
37.
DerMardirossian C, Rocklin G, Seo JY, and Bokoch GM. Phosphorylation
of RhoGDI by Src regulates Rho GTPase binding and cytosol-membrane cycling. Mol
Biol Cell 17: 4760-4768, 2006.
38.
Deshpande DA, Pascual RM, Wang SW, Eckman DM, Riemer EC, Funk
CD, and Penn RB. PKC-dependent regulation of the receptor locus dominates
functional consequences of cysteinyl leukotriene type 1 receptor activation. Faseb J
21: 2335-2342, 2007.
39.
DeSimone JA, Callaham EM, and Heck GL. Chorda tympani taste response
of rat to hydrochloric acid subject to voltage-clamped lingual receptive field. Am J
Physiol 268: C1295-1300, 1995.
40.
DeSimone JA, Heck GL, and DeSimone SK. Active ion transport in dog
tongue: a possible role in taste. Science 214: 1039-1041, 1981.
41.
Doolin RE, and Gilbertson TA. Distribution and characterization of
functional amiloride-sensitive sodium channels in rat tongue. J Gen Physiol 107: 545554, 1996.
42.
Dulac C. The physiology of taste, vintage 2000. Cell 100: 607-610, 2000.
43.
Elorza A, Sarnago S, and Mayor F, Jr. Agonist-dependent modulation of G
protein-coupled receptor kinase 2 by mitogen-activated protein kinases. Mol
Pharmacol 57: 778-783, 2000.
44.
Fan G, Shumay E, Malbon CC, and Wang H. c-Src tyrosine kinase binds
the beta 2-adrenergic receptor via phospho-Tyr-350, phosphorylates G-protein-linked
receptor kinase 2, and mediates agonist-induced receptor desensitization. J Biol Chem
276: 13240-13247, 2001.
45.
Finger TE, Danilova V, Barrows J, Bartel DL, Vigers AJ, Stone L,
Hellekant G, and Kinnamon SC. ATP signaling is crucial for communication from
taste buds to gustatory nerves. Science 310: 1495-1499, 2005.
46.
Gainetdinov RR, Bohn LM, Sotnikova TD, Cyr M, Laakso A, Macrae
AD, Torres GE, Kim KM, Lefkowitz RJ, Caron MG, and Premont RT.
Dopaminergic supersensitivity in G protein-coupled receptor kinase 6-deficient mice.
Neuron 38: 291-303, 2003.
47.
Gainetdinov RR, Bohn LM, Walker JK, Laporte SA, Macrae AD, Caron
MG, Lefkowitz RJ, and Premont RT. Muscarinic supersensitivity and impaired
receptor desensitization in G protein-coupled receptor kinase 5-deficient mice.
Neuron 24: 1029-1036, 1999.
48.
Gainetdinov RR, Premont RT, Bohn LM, Lefkowitz RJ, and Caron MG.
Desensitization of G protein-coupled receptors and neuronal functions. Annu Rev
Neurosci 27: 107-144, 2004.
49.
Galindo-Cuspinera V, Winnig M, Bufe B, Meyerhof W, and Breslin PA.
A TAS1R receptor-based explanation of sweet 'water-taste'. Nature 441: 354-357,
2006.
76
50.
Gates LK, Ulrich CD, and Miller LJ. Multiple kinases phosphorylate the
pancreatic cholecystokinin receptor in an agonist-dependent manner. Am J Physiol
264: G840-847, 1993.
51.
Gilbertson TA. The physiology of vertebrate taste reception. Curr Opin
Neurobiol 3: 532-539, 1993.
52.
Gilbertson TA, Boughter JD, Jr., Zhang H, and Smith DV. Distribution of
gustatory sensitivities in rat taste cells: whole-cell responses to apical chemical
stimulation. J Neurosci 21: 4931-4941, 2001.
53.
Gilbertson TA, Fontenot DT, Liu L, Zhang H, and Monroe WT. Fatty acid
modulation of K+ channels in taste receptor cells: gustatory cues for dietary fat. Am J
Physiol 272: C1203-1210, 1997.
54.
Gray JA, Sheffler DJ, Bhatnagar A, Woods JA, Hufeisen SJ, Benovic JL,
and Roth BL. Cell-type specific effects of endocytosis inhibitors on 5hydroxytryptamine(2A) receptor desensitization and resensitization reveal an arrestin, GRK2-, and GRK5-independent mode of regulation in human embryonic kidney 293
cells. Mol Pharmacol 60: 1020-1030, 2001.
55.
Harinath S, and Sikdar SK. Inhibition of human TREK-1 channels by
caffeine and theophylline. Epilepsy Res 64: 127-135, 2005.
56.
Harper JF, and Brooker G. Femtomole sensitive radioimmunoassay for
cyclic AMP and cyclic GMP after 2'0 acetylation by acetic anhydride in aqueous
solution. J Cyclic Nucleotide Res 1: 207-218, 1975.
57.
He W, Danilova V, Zou S, Hellekant G, Max M, Margolskee RF, and
Damak S. Partial rescue of taste responses of alpha-gustducin null mice by transgenic
expression of alpha-transducin. Chem Senses 27: 719-727, 2002.
58.
Heck GL, Mierson S, and DeSimone JA. Salt taste transduction occurs
through an amiloride-sensitive sodium transport pathway. Science 223: 403-405,
1984.
59.
Hellekant G, af Segerstad CH, Roberts T, van der Wel H, Brouwer JN,
Glaser D, Haynes R, and Eichberg JW. Effects of gymnemic acid on the chorda
tympani proper nerve responses to sweet, sour, salty and bitter taste stimuli in the
chimpanzee. Acta Physiol Scand 124: 399-408, 1985.
60.
Herness S, Zhao FL, Kaya N, Lu SG, Shen T, and Sun XD. Adrenergic
signalling between rat taste receptor cells. J Physiol 543: 601-614, 2002a.
61.
Herness S, Zhao FL, Lu SG, Kaya N, and Shen T. Expression and
physiological actions of cholecystokinin in rat taste receptor cells. J Neurosci 22:
10018-10029, 2002b.
62.
Hoon MA, Adler E, Lindemeier J, Battey JF, Ryba NJP, and Zuker CS.
Putative mammalian taste receptors: a class of taste-specific GPCRs with distinct
topographic selectivity. Cell 96: 541-551, 1999.
63.
Horrigan LA, Kelly JP, and Connor TJ. Caffeine suppresses TNF-alpha
production via activation of the cyclic AMP/protein kinase A pathway. Int
Immunopharmacol 4: 1409-1417, 2004.
64.
Howell LL, Coffin VL, and Spealman RD. Behavioral and physiological
effects of xanthines in nonhuman primates. Psychopharmacology (Berl) 129: 1-14,
1997.
65.
Huang AL, Chen X, Hoon MA, Chandrashekar J, Guo W, Trankner D,
Ryba NJP, and Zuker CS. The cells and logic for mammalian sour taste detection.
Nature 442: 934-938, 2006.
66.
Huang L, Shanker YG, Dubauskaite J, Zheng JZ, Yan W, Rosenzweig S,
Spielman AI, Max M, and Margolskee RF. Ggamma13 colocalizes with gustducin
77
in taste receptor cells and mediates IP3 responses to bitter denatonium. Nat Neurosci
2: 1055-1062, 1999.
67.
Huang YJ, Maruyama Y, Lu KS, Pereira E, Plonsky I, Baur JE, Wu D,
and Roper SD. Mouse taste buds use serotonin as a neurotransmitter. J Neurosci 25:
843-847, 2005a.
68.
Huang YJ, Maruyama Y, Lu KS, Pereira E, Plonsky I, Baur JE, Wu D,
and Roper SD. Using biosensors to detect the release of serotonin from taste buds
during taste stimulation. Arch Ital Biol 143: 87-96, 2005b.
69.
Huang YJ, Maruyama Y, Lu KS, Pereira E, and Roper SD. Mouse taste
buds release serotonin in response to taste stimuli. Chem Senses 30 Suppl 1: i39-i40,
2005c.
70.
Jaber M, Koch WJ, Rockman H, Smith B, Bond RA, Sulik KK, Ross J,
Jr., Lefkowitz RJ, Caron MG, and Giros B. Essential role of beta-adrenergic
receptor kinase 1 in cardiac development and function. Proc Natl Acad Sci U S A 93:
12974-12979, 1996.
71.
Jakob I, Hauser IA, Thevenod F, and Lindemann B. MDR1 in taste buds
of rat vallate papilla: functional, immunohistochemical, and biochemical evidence.
Am J Physiol 274: C182-191, 1998.
72.
Jang HJ, Kokrashvili Z, Theodorakis MJ, Carlson OD, Kim BJ, Zhou J,
Kim HH, Xu X, Chan SL, Juhaszova M, Bernier M, Mosinger B, Margolskee
RF, and Egan JM. Gut-expressed gustducin and taste receptors regulate secretion of
glucagon-like peptide-1. Proc Natl Acad Sci U S A 104: 15069-15074, 2007.
73.
Jiang P, Cui M, Zhao B, Liu Z, Snyder LA, Benard LM, Osman R,
Margolskee RF, and Max M. Lactisole interacts with the transmembrane domains of
human T1R3 to inhibit sweet taste. J Biol Chem 280: 15238-15246, 2005a.
74.
Jiang P, Cui M, Zhao B, Snyder LA, Benard LM, Osman R, Max M, and
Margolskee RF. Identification of the cyclamate interaction site within the
transmembrane domain of the human sweet taste receptor subunit T1R3. J Biol Chem
280: 34296-34305, 2005b.
75.
Jiang P, Ji Q, Liu Z, Snyder LA, Benard LM, Margolskee RF, and Max
M. The cysteine-rich region of T1R3 determines responses to intensely sweet
proteins. J Biol Chem 279: 45068-45075, 2004.
76.
Johnson R, Streicher EM, Louw GE, Warren RM, van Helden PD, and
Victor TC. Drug resistance in Mycobacterium tuberculosis. Curr Issues Mol Biol 8:
97-111, 2006.
77.
Johnston PV, and Roots BI. Fixation of the central nervous system by
perfusion with aldehydes and its effect on the extracellular space as seen by electron
microscopy. J Cell Sci 2: 377-386, 1967.
78.
Karcz-Kubicha M, Antoniou K, Terasmaa A, Quarta D, Solinas M,
Justinova Z, Pezzola A, Reggio R, Muller CE, Fuxe K, Goldberg SR, Popoli P,
and Ferre S. Involvement of adenosine A1 and A2A receptors in the motor effects of
caffeine after its acute and chronic administration. Neuropsychopharmacology 28:
1281-1291, 2003.
79.
Kawai M, Okiyama A, and Ueda Y. Taste enhancements between various
amino acids and IMP. Chem Senses 27: 739-745, 2002.
80.
Kaya N, Shen T, Lu SG, Zhao FL, and Herness S. A paracrine signaling
role for serotonin in rat taste buds: expression and localization of serotonin receptor
subtypes. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 286: R649-658, 2004.
81.
Kim DJ, and Roper SD. Localization of serotonin in taste buds: a
comparative study in four vertebrates. J Comp Neurol 353: 364-370, 1995.
78
82.
Kim MR, Kusakabe Y, Miura H, Shindo Y, Ninomiya Y, and Hino A.
Regional expression patterns of taste receptors and gustducin in the mouse tongue.
Biochem Biophys Res Commun 312: 500-506, 2003.
83.
King LA. Absorption of caffeine from beverages. Lancet 1: 1313, 1973.
84.
Kinnamon SC, Dionne VE, and Beam KG. Apical localization of K+
channels in taste cells provides the basis for sour taste transduction. Proc Natl Acad
Sci U S A 85: 7023-7027, 1988.
85.
Kishi M, Emori Y, Tsukamoto Y, and Abe K. Primary culture of rat taste
bud cells that retain molecular markers for taste buds and permit functional expression
of foreign genes. Neuroscience 106: 217-225, 2001.
86.
Kitagawa M, Kusakabe Y, Miura H, Ninomiya Y, and Hino A. Molecular
genetic identification of a candidate receptor gene for sweet taste. Biochem Biophys
Res Commun 283: 236-242, 2001.
87.
Kobayashi H, Narita Y, Nishida M, and Kurose H. Beta-arrestin2 enhances
beta2-adrenergic receptor-mediated nuclear translocation of ERK. Cell Signal 17:
1248-1253, 2005.
88.
Krizhanovsky V, Agamy O, and Naim M. Sucrose-stimulated subsecond
transient increase in cGMP level in rat intact circumvallate taste bud cells. Am J
Physiol Cell Physiol 279: C120-125, 2000.
89.
Kuhn C, Bufe B, Winnig M, Hofmann T, Frank O, Behrens M,
Lewtschenko T, Slack JP, Ward CD, and Meyerhof W. Bitter taste receptors for
saccharin and acesulfame K. J Neurosci 24: 10260-10265, 2004.
90.
Kumazawa T, and Kurihara K. Large synergism between monosodium
glutamate and 5'-nucleotides in canine taste nerve responses. Am J Physiol 259: R420426, 1990.
91.
Kumazawa T, Nakamura M, and Kurihara K. Canine taste nerve responses
to umami substances. Physiol Behav 49: 875-881, 1991.
92.
Lefkowitz RJ, and Shenoy SK. Transduction of receptor signals by betaarrestins. Science 308: 512-517, 2005.
93.
Lethco EJ, and Wallace WC. The metabolism of saccharin in animals.
Toxicology 3: 287-300, 1975.
94.
Li X, Staszewski L, Xu H, Durick K, Zoller M, and Adler E. Human
receptors for sweet and umami taste. Proc Natl Acad Sci U S A 99: 4692-4696, 2002.
95.
Lin W, Finger TE, Rossier BC, and Kinnamon SC. Epithelial Na+ channel
subunits in rat taste cells: localization and regulation by aldosterone. J Comp Neurol
405: 406-420, 1999.
96.
Lush IE. The genetics of tasting in mice. VI. Saccharin, acesulfame, dulcin
and sucrose. Genet Res 53: 95-99, 1989.
97.
Luttrell LM, Ferguson SS, Daaka Y, Miller WE, Maudsley S, Della Rocca
GJ, Lin F, Kawakatsu H, Owada K, Luttrell DK, Caron MG, and Lefkowitz RJ.
Beta-arrestin-dependent formation of beta2 adrenergic receptor-Src protein kinase
complexes. Science 283: 655-661, 1999.
98.
Luttrell LM, Hawes BE, van Biesen T, Luttrell DK, Lansing TJ, and
Lefkowitz RJ. Role of c-Src tyrosine kinase in G protein-coupled receptor- and
Gbetagamma subunit-mediated activation of mitogen-activated protein kinases. J Biol
Chem 271: 19443-19450, 1996.
99.
Luttrell LM, and Lefkowitz RJ. The role of beta-arrestins in the termination
and transduction of G-protein-coupled receptor signals. J Cell Sci 115: 455-465, 2002.
100. Ma L, and Pei G. Beta-arrestin signaling and regulation of transcription. J
Cell Sci 120: 213-218, 2007.
79
101. Mace OJ, Affleck J, Patel N, and Kellett GL. Sweet taste receptors in rat
small intestine stimulate glucose absorption through apical GLUT2. J Physiol 582:
379-392, 2007.
102. Margolskee RF, Dyer J, Kokrashvili Z, Salmon KS, Ilegems E, Daly K,
Maillet EL, Ninomiya Y, Mosinger B, and Shirazi-Beechey SP. T1R3 and
gustducin in gut sense sugars to regulate expression of Na+-glucose cotransporter 1.
Proc Natl Acad Sci U S A 104: 15075-15080, 2007.
103. Masuho I, Tateyama M, and Saitoh O. Characterization of bitter taste
responses of intestinal STC-1 cells. Chem Senses 30: 281-290, 2005.
104. Matsunami H, Montmayeur JP, and Buck LB. A family of candidate taste
receptors in human and mouse. Nature 404: 601-604, 2000.
105. Matthews HB, Fields M, and Fishbein L. Saccharin: distribution and
excretion of a limited dose in the rat. J Agric Food Chem 21: 916-919, 1973.
106. Max M, Shanker YG, Huang L, Rong M, Liu Z, Campagne F, Weinstein
H, Damak S, and Margolskee RF. Tas1r3, encoding a new candidate taste receptor,
is allelic to the sweet responsiveness locus Sac. Nat Genet 28: 58-63, 2001.
107. McLaughlin SK, McKinnon PJ, and Margolskee RF. Gustducin is a tastecell-specific G protein closely related to the transducins. Nature 357: 563-569, 1992.
108. Min YD, Choi CH, Bark H, Son HY, Park HH, Lee S, Park JW, Park EK,
Shin HI, and Kim SH. Quercetin inhibits expression of inflammatory cytokines
through attenuation of NF-kappaB and p38 MAPK in HMC-1 human mast cell line.
Inflamm Res 56: 210-215, 2007.
109. Misaka T, Kusakabe Y, Emori Y, Arai S, and Abe K. Molecular cloning
and taste bud-specific expression of a novel cyclic nucleotide-gated channel. Ann N Y
Acad Sci 855: 150-159, 1998.
110. Montmayeur JP, Liberles SD, Matsunami H, and Buck LB. A candidate
taste receptor gene near a sweet taste locus. Nat Neurosci 4: 492-498, 2001.
111. Montmayeur JP, and Matsunami H. Receptors for bitter and sweet taste.
Curr Opin Neurobiol 12: 366-371, 2002.
112. Moore CA, Milano SK, and Benovic JL. Regulation of receptor trafficking
by GRKs and arrestins. Annu Rev Physiol 69: 451-482, 2007.
113. Mori K, Nagao H, and Yoshihara Y. The olfactory bulb: coding and
processing of odor molecule information. Science 286: 711-715, 1999.
114. Mueller KL, Hoon MA, Erlenbach I, Chandrashekar J, Zuker CS, and
Ryba NJP. The receptors and coding logic for bitter taste. Nature 434: 225-229,
2005.
115. Naim M, Ronen T, Striem BJ, Levinson M, and Zehavi U. Adenylate
cyclase responses to sucrose stimulation in membranes of pig circumvallate taste
papillae. Comp Biochem Physiol B 100: 455-458, 1991.
116. Naim M, Seifert R, Nurnberg B, Grunbaum L, and Schultz G. Some taste
substances are direct activators of G-proteins. Biochem J 297 ( Pt 3): 451-454, 1994.
117. Naim M, Shaul ME, Spielman AI, Huang L, and Peri I. Permeation of
amphipathic sweeteners into taste-bud cells and their interactions with post-receptor
signaling components: possible implications for sweet-taste quality. In: Sweetness and
Sweeteners: Biology, Chemistry and Psychophysics, edited by Weerasinghe DK, and
DuBois GE. Washington, DC: American Chemical Society, 2007, p. In press.
118. Nelson G, Chandrashekar J, Hoon MA, Feng L, Zhao G, Ryba NJP, and
Zuker CS. An amino-acid taste receptor. Nature 416: 199-202, 2002.
119. Nelson G, Hoon MA, Chandrashekar J, Zhang Y, Ryba NJP, and Zuker
CS. Mammalian sweet taste receptors. Cell 106: 381-390, 2001.
80
120. Nilkaeo A, Bhuvanath S, Praputbut S, and Wisessombat S. Induction of
cell cycle arrest and apoptosis in JAR trophoblast by antimalarial drugs. Biomed Res
27: 131-137, 2006.
121. Ninomiya Y, Mizukoshi T, Nishikawa T, and Funakoshi M. Ion specificity
of rat chorda tympani fibers to chemical and electrical tongue stimulations. Brain Res
404: 350-354, 1987.
122. Ogura T. Acetylcholine increases intracellular Ca2+ in taste cells via
activation of muscarinic receptors. J Neurophysiol 87: 2643-2649, 2002.
123. Okamoto T, Murayama Y, Hayashi Y, Inagaki M, Ogata E, and
Nishimoto I. Identification of a Gs activator region of the beta 2-adrenergic receptor
that is autoregulated via protein kinase A-dependent phosphorylation. Cell 67: 723730, 1991.
124. Oliet SH, and Bourque CW. Steady-state osmotic modulation of cationic
conductance in neurons of rat supraoptic nucleus. Am J Physiol 265: R1475-1479,
1993.
125. Ozben T. Mechanisms and strategies to overcome multiple drug resistance in
cancer. FEBS Lett 580: 2903-2909, 2006.
126. Ozdener H, Yee KK, Cao J, Brand JG, Teeter JH, and Rawson NE.
Characterization and long-term maintenance of rat taste cells in culture. Chem Senses
31: 279-290, 2006.
127. Ozeck M, Brust P, Xu H, and Servant G. Receptors for bitter, sweet and
umami taste couple to inhibitory G protein signaling pathways. Eur J Pharmacol 489:
139-149, 2004.
128. Penn RB, Pronin AN, and Benovic JL. Regulation of G protein-coupled
receptor kinases. Trends Cardiovasc Med 10: 81-89, 2000.
129. Pérez-Ruiz T, Martínez-Lozano C, Tomás1 V, Sanz A, and Bravo E.
Quantitative assay for neohesperidin dihydrochalcone in foodstuffs by capillary
electrophoresis. Chromatographia 51: 385-389, 2000.
130. Perez-Tomas R. Multidrug resistance: retrospect and prospects in anti-cancer
drug treatment. Curr Med Chem 13: 1859-1876, 2006.
131. Perez CA, Huang L, Rong M, Kozak JA, Preuss AK, Zhang H, Max M,
and Margolskee RF. A transient receptor potential channel expressed in taste
receptor cells. Nat Neurosci 5: 1169-1176, 2002.
132. Peri I, Mamrud-Brains H, Rodin S, Krizhanovsky V, Shai Y, Nir S, and
Naim M. Rapid entry of bitter and sweet tastants into liposomes and taste cells:
implications for signal transduction. Am J Physiol Cell Physiol 278: C17-25, 2000.
133. Porcar I, Codoner A, Gomez CM, Abad C, and Campos A. Interaction of
quinine with model lipid membranes of different compositions. J Pharm Sci 92: 4557, 2003.
134. Prawitt D, Monteilh-Zoller MK, Brixel L, Spangenberg C, Zabel B, Fleig
A, and Penner R. TRPM5 is a transient Ca2+-activated cation channel responding to
rapid changes in [Ca2+]i. Proc Natl Acad Sci U S A 100: 15166-15171, 2003.
135. Premont RT, and Gainetdinov RR. Physiological roles of G protein-coupled
receptor kinases and arrestins. Annu Rev Physiol 69: 511-534, 2007.
136. Premont RT, Koch WJ, Inglese J, and Lefkowitz RJ. Identification,
purification, and characterization of GRK5, a member of the family of G proteincoupled receptor kinases. J Biol Chem 269: 6832-6841, 1994.
137. Pronin AN, Tang H, Connor J, and Keung W. Identification of ligands for
two human bitter T2R receptors. Chem Senses 29: 583-593, 2004.
81
138. Quarta D, Ferre S, Solinas M, You ZB, Hockemeyer J, Popoli P, and
Goldberg SR. Opposite modulatory roles for adenosine A1 and A2A receptors on
glutamate and dopamine release in the shell of the nucleus accumbens. Effects of
chronic caffeine exposure. J Neurochem 88: 1151-1158, 2004.
139. Ravi D, Muniyappa H, and Das KC. Caffeine inhibits UV-mediated NFkappaB activation in A2058 melanoma cells: an ATM-PKCdelta-p38 MAPKdependent mechanism. Mol Cell Biochem 2007.
140. Ribas C, Penela P, Murga C, Salcedo A, Garcia-Hoz C, Jurado-Pueyo M,
Aymerich I, and Mayor F, Jr. The G protein-coupled receptor kinase (GRK)
interactome: role of GRKs in GPCR regulation and signaling. Biochim Biophys Acta
1768: 913-922, 2007.
141. Richter TA, Caicedo A, and Roper SD. Sour taste stimuli evoke Ca2+ and
pH responses in mouse taste cells. J Physiol 547: 475-483, 2003.
142. Rinner O, Makhankov YV, Biehlmaier O, and Neuhauss SC. Knockdown
of cone-specific kinase GRK7 in larval zebrafish leads to impaired cone response
recovery and delayed dark adaptation. Neuron 47: 231-242, 2005.
143. Roper SD. Cell communication in taste buds. Cell Mol Life Sci 63: 14941500, 2006.
144. Rosenzweig S, Yan W, Dasso M, and Spielman AI. Possible novel
mechanism for bitter taste mediated through cGMP. J Neurophysiol 81: 1661-1665,
1999.
145. Rossler P, Boekhoff I, Tareilus E, Beck S, Breer H, and Freitag J. G
protein betagamma complexes in circumvallate taste cells involved in bitter
transduction. Chem Senses 25: 413-421, 2000.
146. Rossler P, Kroner C, Freitag J, Noe J, and Breer H. Identification of a
phospholipase C beta subtype in rat taste cells. Eur J Cell Biol 77: 253-261, 1998.
147. Ruiz-Avila L, McLaughlin SK, Wildman D, McKinnon PJ, Robichon A,
Spickofsky N, and Margolskee RF. Coupling of bitter receptor to phosphodiesterase
through transducin in taste receptor cells. Nature 376: 80-85, 1995.
148. Sahir N, Mas C, Bourgeois F, Simonneau M, Evrard P, and Gressens P.
Caffeine-induced telencephalic vesicle evagination in early post-implantation mouse
embryos involves cAMP-dependent protein kinase (PKA) inhibition. Cereb Cortex
11: 343-349, 2001.
149. Sainz E, Cavenagh MM, Gutierrez J, Battey JF, Northup JK, and
Sullivan SL. Functional characterization of human bitter taste receptors. Biochem J
403: 537-543, 2007.
150. Saito Y, Tetsuka M, Li Y, Kurose H, and Maruyama K. Properties of rat
melanin-concentrating hormone receptor 1 internalization. Peptides 25: 1597-1604,
2004.
151. Sarnago S, Elorza A, and Mayor F, Jr. Agonist-dependent phosphorylation
of the G protein-coupled receptor kinase 2 (GRK2) by Src tyrosine kinase. J Biol
Chem 274: 34411-34416, 1999.
152. Sato T, and Beidler LM. Broad tuning of rat taste cells for four basic taste
stimuli. Chem Senses 22: 287-293, 1997.
153. Seibold A, Williams B, Huang ZF, Friedman J, Moore RH, Knoll BJ, and
Clark RB. Localization of the sites mediating desensitization of the beta(2)adrenergic receptor by the GRK pathway. Mol Pharmacol 58: 1162-1173, 2000.
154. Shaul YD, and Seger R. ERK1c regulates Golgi fragmentation during
mitosis. J Cell Biol 172: 885-897, 2006.
82
155. Shenoy SK, Drake MT, Nelson CD, Houtz DA, Xiao K, Madabushi S,
Reiter E, Premont RT, Lichtarge O, and Lefkowitz RJ. beta-arrestin-dependent, G
protein-independent ERK1/2 activation by the beta2 adrenergic receptor. J Biol Chem
281: 1261-1273, 2006.
156. Shim CK, Cheon EP, Kang KW, Seo KS, and Han HK. Inhibition effect of
flavonoids on monocarboxylate transporter 1 (MCT1) in Caco-2 cells. J Pharm
Pharmacol 59: 1515-1519, 2007.
157. Simon SA, Holland VF, Benos DJ, and Zampighi GA. Transcellular and
paracellular pathways in lingual epithelia and their influence in taste transduction.
Microsc Res Tech 26: 196-208, 1993.
158. Soares NFF, and Hotchkiss JH. Bitterness reduction in grapefruit juice
through active packaging. Packaging Technol Sci 11: 9-18, 1998.
159. Spielman AI, Mody I, Brand JG, Whitney G, MacDonald JF, and Salter
MW. A method for isolating and patch-clamping single mammalian taste receptor
cells. Brain Res 503: 326-329, 1989.
160. Spielman AI, Nagai H, Sunavala G, Dasso M, Breer H, Boekhoff I, Huque
T, Whitney G, and Brand JG. Rapid kinetics of second messenger production in
bitter taste. Am J Physiol 270: C926-931, 1996.
161. Stevens DR, Seifert R, Bufe B, Muller F, Kremmer E, Gauss R, Meyerhof
W, Kaupp UB, and Lindemann B. Hyperpolarization-activated channels HCN1 and
HCN4 mediate responses to sour stimuli. Nature 413: 631-635, 2001.
162. Stewart RE, DeSimone JA, and Hill DL. New perspectives in a gustatory
physiology: transduction, development, and plasticity. Am J Physiol 272: C1-26,
1997.
163. Striem BJ, Naim M, and Lindemann B. Generation of cyclic AMP in taste
buds of the rat circumvallate papilla in response to sucrose. Cell Physiol Biochem 1:
46-54, 1991.
164. Striem BJ, Pace U, Zehavi U, Naim M, and Lancet D. Sweet tastants
stimulate adenylate cyclase coupled to GTP-binding protein in rat tongue membranes.
Biochem J 260: 121-126, 1989.
165. Takara K, Obata Y, Yoshikawa E, Kitada N, Sakaeda T, Ohnishi N, and
Yokoyama T. Molecular changes to HeLa cells on continuous exposure to cisplatin
or paclitaxel. Cancer Chemother Pharmacol 58: 785-793, 2006.
166. Thompson AJ, Lochner M, and Lummis SC. The antimalarial drugs
quinine, chloroquine and mefloquine are antagonists at 5-HT3 receptors. Br J
Pharmacol 151: 666-677, 2007.
167. Torii K, and Cagan RH. Biochemical studies of taste sensation. IX.
Enhancement of L-[3H]glutamate binding to bovine taste papillae by 5'ribonucleotides. Biochim Biophys Acta 627: 313-323, 1980.
168. Tran TM, Friedman J, Qunaibi E, Baameur F, Moore RH, and Clark RB.
Characterization of agonist stimulation of cAMP-dependent protein kinase and G
protein-coupled receptor kinase phosphorylation of the beta2-adrenergic receptor
using phosphoserine-specific antibodies. Mol Pharmacol 65: 196-206, 2004.
169. Trubey KR, Culpepper S, Maruyama Y, Kinnamon SC, and Chaudhari
N. Tastants evoke cAMP signal in taste buds that is independent of calcium signaling.
Am J Physiol Cell Physiol 291: C237-244, 2006.
170. Tsunenari T, Hayashi Y, Orita M, Kurahashi T, Kaneko A, and Mori T.
A quinine-activated cationic conductance in vertebrate taste receptor cells. J Gen
Physiol 108: 515-523, 1996.
83
171. Ugawa S, Minami Y, Guo W, Saishin Y, Takatsuji K, Yamamoto T,
Tohyama M, and Shimada S. Receptor that leaves a sour taste in the mouth. Nature
395: 555-556, 1998.
172. Valenti LP. Liquid chromatographic determination of quinine, hydroquinine,
saccharin, and sodium benzoate in quinine beverages. J Assoc Off Anal Chem 68:
782-784, 1985.
173. Varkevisser B, and Kinnamon SC. Sweet taste transduction in hamster: role
of protein kinases. J Neurophysiol 83: 2526-2532, 2000.
174. Vaughan DJ, Millman EE, Godines V, Friedman J, Tran TM, Dai W,
Knoll BJ, Clark RB, and Moore RH. Role of the G protein-coupled receptor kinase
site serine cluster in beta2-adrenergic receptor internalization, desensitization, and
beta-arrestin translocation. J Biol Chem 281: 7684-7692, 2006.
175. Violin JD, Ren XR, and Lefkowitz RJ. G-protein-coupled receptor kinase
specificity for beta-arrestin recruitment to the beta2-adrenergic receptor revealed by
fluorescence resonance energy transfer. J Biol Chem 281: 20577-20588, 2006.
176. Wong GT, Gannon KS, and Margolskee RF. Transduction of bitter and
sweet taste by gustducin. Nature 381: 796-800, 1996.
177. Wright DC, Hucker KA, Holloszy JO, and Han DH. Ca2+ and AMPK both
mediate stimulation of glucose transport by muscle contractions. Diabetes 53: 330335, 2004.
178. Xu H, Staszewski L, Tang H, Adler E, Zoller M, and Li X. Different
functional roles of T1R subunits in the heteromeric taste receptors. Proc Natl Acad
Sci U S A 101: 14258-14263, 2004.
179. Yan W, Sunavala G, Rosenzweig S, Dasso M, Brand JG, and Spielman
AI. Bitter taste transduced by PLC-beta(2)-dependent rise in IP(3) and alphagustducin-dependent fall in cyclic nucleotides. Am J Physiol Cell Physiol 280: C742751, 2001.
180. Yang R, Crowley HH, Rock ME, and Kinnamon JC. Taste cells with
synapses in rat circumvallate papillae display SNAP-25-like immunoreactivity. J
Comp Neurol 424: 205-215, 2000.
181. Ye Q, Heck GL, and DeSimone JA. Voltage dependence of the rat chorda
tympani response to Na+ salts: implications for the functional organization of taste
receptor cells. J Neurophysiol 70: 167-178, 1993.
182. Zamah AM, Delahunty M, Luttrell LM, and Lefkowitz RJ. Protein kinase
A-mediated phosphorylation of the beta 2-adrenergic receptor regulates its coupling to
Gs and Gi. Demonstration in a reconstituted system. J Biol Chem 277: 31249-31256,
2002.
183. Zhang Y, Hoon MA, Chandrashekar J, Mueller KL, Cook B, Wu D,
Zuker CS, and Ryba NJP. Coding of sweet, bitter, and umami tastes: different
receptor cells sharing similar signaling pathways. Cell 112: 293-301, 2003.
184. Zhou Q, McCracken MA, and Strobl JS. Control of mammary tumor cell
growth in vitro by novel cell differentiation and apoptosis agents. Breast Cancer Res
Treat 75: 107-117, 2002.
185. Zubare-Samuelov M, Peri I, Tal M, Tarshish M, Spielman AI, and Naim
M. Some sweet and bitter tastants stimulate inhibitory pathway of adenylyl cyclase
via melatonin and alpha 2-adrenergic receptors in Xenopus laevis melanophores. Am J
Physiol Cell Physiol 285: C1255-1262, 2003.
186. Zubare-Samuelov M, Shaul ME, Peri I, Aliluiko A, Tirosh O, and Naim
M. Inhibition of signal termination-related kinases by membrane-permeant bitter and
84
sweet tastants: potential role in taste signal termination. Am J Physiol Cell Physiol
289: C483-492, 2005.
85
‫רשימת פרסומים ותקצירים‬
1. Zubare-Samuelov M, Shaul ME, Peri I, Aliluiko A, Tirosh O, Naim M (2005).
Inhibition of signal termination-related kinases by membrane-permeant bitter and
sweet tastants: potential role in taste signal termination. Am J Physiol Cell Physiol
289: C483-492.
2. Naim M, Shaul ME, Spielman AI, Huang L, Peri I (2007). Permeation of
amphipathic sweeteners into taste-bud cells and their interactions with post-receptor
signaling components: possible implications for sweet-taste quality. In: Sweetness and
Sweeteners: Biology, Chemistry and Psychophysics; ACS Symposium Series 979;
Weerasinghe, D.K. and DuBois, G.E. Eds; American Chemical Society, Washington
DC. In press.
3. Naim M, Huang L, Spielman AI, Shaul ME, Aliluiko A (2006). Stimulation of
taste cells by sweet taste compounds: receptors, downstream signal transduction
components, and the implications to sweet taste quality. In: Optimizing Sweet Taste in
Food, Spillane, W. Ed., Woodhead Publishing, Ltd. Cambridge, UK.
4. Shaul ME, Peri I, Malach E, Huang L, Spielman AI, Seger R, Naim M (2008).
Intracellular inhibition by some sweet and bitter tastants of β2-adrenergic receptor
(β2AR) desensitization. Keystone Symposia, Alberta, Canada. Abstract.
5. Naim M, Zubare-Samuelov M, Peri I, Shaul ME (2004). Amphipathic sweet and
bitter tastants are inhibitors of G-protein-coupled receptor kinases (GRKs) in vitro:
possible implication for delayed taste termination. FASEB J, 18(4): A313. Abstract.
6. Naim M, Zubare-Samuelov M, Peri I, Shaul ME, Aliluiko A (2004). Amphipathic
sweet and bitter tastants permeate cells in vivo and are inhibitors of G-protein-coupled
receptor kinases (GRKs) in vitro: possible implication for delayed taste termination.
ECRO, Dijon, France. Abstract.
7. Shaul ME, Rodin S, Tarshish M, Nir S, Naim M (2003). Active and passive
transport of sweet and bitter amphipathic tastants into taste cells. The Annual Meeting
2003 ISBMB (The Isreali Society for Biochemistry and Molecular Biology), Tel-Aviv
University, Tel-Aviv April 2003. Abstract.
86