שימוש בספקטרוסקופיה או טרה מהירה חקר התה יכים הראשונים בח בונים רטינ

שימוש בספקטרוסקופיה או טרה מהירה חקר התה יכים הראשונים בח בונים רטינ

‫שימוש בספקטרוסקופיה אולטרה‬
‫מהירה לחקר התהליכים הראשונים‬
‫בחלבונים רטינליים ובמערכות מודל‬
‫חיבור לשם קבלת תואר דוקטור לפילוסופיה‬
‫מאת אושרת ביסמוט‬
‫הוגש לסנט האוניברסיטה העברית‪ ,‬בירושלים‬
‫תמוז ‪ /‬תשע"ב‬
‫שימוש בספקטרוסקופיה אולטרה‬
‫מהירה לחקר התהליכים הראשונים‬
‫בחלבונים רטינליים ובמערכות מודל‬
‫חיבור לשם קבלת תואר דוקטור לפילוסופיה‬
‫מאת אושרת ביסמוט‬
‫הוגש לסנט האוניברסיטה העברית‪ ,‬בירושלים‬
‫תמוז ‪ /‬תשע"ב‬
‫עבודה זו נעשתה בהדרכתו של‬
‫פרופ' סנפורד רוכמן‬
‫שלמי תודות‬
‫בראש ובראשונה ברצוני להודות לפרופ' סנדי רוכמן על ההנחיה המסורה במהלך העבודה‪ ,‬על שחשף‬
‫בפני ולימד אותי את מדע הספקטרוסקופיה האולטרה מהירה‪.‬‬
‫תודה לפרופ' מודי שבס ומעבדתו על שיתוף הפעולה הפורה והנעים ועל כל החומרים שסופקו בכל עת‬
‫אשר בלעדיהם מחקר זה לא היה מתקיים‪.‬‬
‫תודה לחבריי לקבוצה על האווירה הטובה במעבדה‪ .‬תודה לידידי אמיר ונד על העזרה לאורך כל הדרך‬
‫ועל העבודה הפורייה במחקר המאתגר שביצענו יחדיו‪.‬‬
‫תודה לבעלי נוי‪ ,‬בני יובל‪ ,‬להורי אילן ודליה ולמשפחתי המדהימה על התמיכה‪ ,‬ההתעניינות‪ ,‬הסבלנות‬
‫לאורך כל הדרך ועל היותם‪.‬‬
‫תודה לכל אלו שימצאו עניין בעבודה זו‪.‬‬
‫תודה לאל‪.‬‬
‫"הביטו בקו הזמן‪.‬‬
‫כמובן הוא רק אשליה‪ .‬הזמן הוא מרחב‪ ,‬לא קו‪.‬‬
‫אבל לצורך העניין‪ ,‬הביטו בקו הזמן‪.‬‬
‫צפו בו‪ ,‬זהו כיצד כל אירוע בו גורם ונגרם‪ ,‬נסו לאתר את תחילתו‪.‬‬
‫לא תצליחו‪ ,‬כמובן‪.‬‬
‫לכל עכשיו יש לפני‪".‬‬
‫)יואב בלום(‬
‫לזכרו של סבי יוסף סרוסי‬
‫תקציר‬
‫משפחת החלבונים הרטינליים מורכבת מאוסף של חלבונים טרנס‪-‬ממברנליים שונים‪ ,‬שהינם‬
‫בעלי חשיבות רבה בפעילויות ביולוגיות מגוונות של אורגניזמים שונים בכל ממלכות החי‪ .‬כל החברים‬
‫במשפחה בעלי דמיון מבני‪ :‬בנויים משבעה סלילי‪-‬אלפא הכולאים בתוכם מולקולת רטינל )הכרומופור‬
‫בחלבון( הקשורה לחלבון דרך בסיס ‪ Schiff‬שעבר פרוטונציה )‪.(RPSB – Protonated Schiff Base‬‬
‫בנוסף‪ ,‬בכולם התפקוד הביולוגי מתחיל בבליעה של פוטון מתאים מקרינת השמש‪ ,‬שמניע התחלה של‬
‫שרשרת תהליכים ‪ -‬תהליך פוטוכימי ולאחריו שלבים תרמיים נוספים‪ ,‬ומאפשר ניצול של אנרגיה סולרית‬
‫כאנרגיה כימית‪ .‬לאור פרויקט מיפוי הגנום‪ ,‬מתגלים בשנים האחרונות עוד ועוד חברים במשפחה זו‪,‬‬
‫שהופכים אותה לאחת הפלטפורמות הנפוצות ביותר בעולם החי לניצול אנרגית אור‪.‬‬
‫מחקרינו מתמקד בחקר האירועים הראשונים המתרחשים בשני חלבונים רטינליים ‪-‬‬
‫בקטריורודופסין המשמש כמשאבת פרוטונים והלורודופסין המשמש בעיקר כמשאבת יוני כלוריד וכן‬
‫בכרומופור ה‪ RPSB-‬בתמיסה‪ .‬אף על פי שהתפקיד הביולוגי של שני החלבונים שונה‪ ,‬נראה כי מנגנון‬
‫הפעולה בזמנים המוקדמים דומה ‪ -‬מנגנון זה מערב איזומריזציה סביב קשר כפול מסוים כתוצאה מבליעת‬
‫אור ברטינל‪ .‬הכרומופור במשאבות אלו מצוי בקונפיגורצית ‪ all trans‬ולאחר בליעת הפוטון עובר‬
‫איזומריזציה ל‪ .13-cis-‬חלבונים אלו מאופיינים ע"י סדרת מצבי ביניים הנבדלים אופטית כאשר תוך כ‪-‬‬
‫‪ 15ms‬החלבון והרטינל חוזרים למצבם ההתחלתי‪ ,‬מה שמכונה "מעגל האור"‪.‬‬
‫השלבים הראשונים‪ ,‬הבנת תהליך ההיפוך הפנימי ודינאמיקת המצב המעורר חיוניים לא רק‬
‫להבנת מנגנון הייצוב והאחסון של אנרגית הבליעה הפוטונית והיעילות הגבוהה של התהליך )מגיעה עד‬
‫כדי כ‪ 70%-‬בחלק מן החלבונים(‪ ,‬אלא גם להבהרת מנגנון הפעולה המשותף שיסלול את הדרך להבנת‬
‫כלל החלבונים הרטינליים‪ .‬מטרותינו הן לחשוף את הדינאמיקה והקינטיקה של האירועים המוקדמים‬
‫בחלבונים וב‪ RPSB-‬בתמיסה והן למפות את ההתפתחות המבנית המובילה לאיזומריזציה‪.‬‬
‫דינאמיקת האירועים הראשונים בחלבונים הרטינלים‪ ,‬ובפרט בחבר הנחקר ביותר במשפחה –‬
‫הבקטריורודופסין‪ ,‬נחקרה כבר במספר רב של מחקרים לאורך העשורים האחרונים בשיטות שונות של‬
‫ספקטרוסקופיה תלוית זמן‪ .‬מחקרים אלו התמקדו בדינאמיקת האירועים הראשונים בכוונה לפענח את‬
‫התזמון והדינאמיקה של תהליך האיזומריזציה וחיוניותו לפעילות הביולוגית‪ .‬מחקרי בליעה טרנזיינטיים‬
‫הראו שבליעת הפוטון גוררת שינויים ספקטראליים דרמטיים‪ :‬הופעה של בליעה בכחול ב‪ ~460nm-‬יחד‬
‫עם קיומה של פליטה מאולצת רחבה בתחום ה‪ IR-‬הקרוב שמרכזה ב‪ .850nm-‬שינויים אלו יוחסו למצב‬
‫המעורר שסומן ב‪ – I460 -‬המכונה "המצב הפלורוסנטי"‪ .‬הפליטה המאולצת הרדודה שהתקבלה ואי‬
‫התאמתה לפליטה הספונטנית הוסברה ע"י כך שחלק מספקטרום הפליטה בוטל על ידי פיק בליעה עוצמתי‬
‫השייך למצב המעורר ומצוי בסביבות ‪ .720nm‬מצב ה‪ I460 -‬מוביל למצב הביניים ‪ ,J625‬המציג פיק‬
‫בליעה מוסט לאדום‪ ,‬ב‪ .625nm-‬גילוי המצב הפלורסנטי ‪ ,I460,‬והעובדה כי חלק מהאוכלוסייה חוזרת‬
‫חזרה אל מצב היסוד ולא ממשיכה במעגל האור‪ ,‬הובילו לסדרת שאלות חדשות‪ :‬מהי סקלת הזמן לתהליך‬
‫האיזומריזציה? האם המצב הפלורסנטי מאופיין היטב‪ ,‬כלומר בעל מבנה ואנרגיה מוגדרים‪ ,‬ומה חשיבותו‬
‫לתהליך? האם הוא חלק חיוני ממעגל האור? וכיו"ב‪.‬‬
‫תשובות לשאלות אלו התקבלו מביצוע מחקרים על פיגמנטים מלאכותיים בהם הקשר הכפול‬
‫הספציפי ננעל וסיבובו נמנע כימית ע"י קישור לטבעת פחמן קשיחה‪ .‬תוצאות ניסויים אלו הוכיחו‬
‫ספקטראלית את קיומו של המצב הפלורסנטי ‪ I460‬גם בפיגמנטים הנעולים‪ ,‬דבר שהעיד כי בליעת הפוטון‬
‫מובילה תחילה למתיחה בשלד הרטינל ולא לפיתול סביב הקשר הכפול הספציפי‪ ,‬דבר שעולה בקנה אחד‬
‫עם חישובים שנעשו‪ .‬דעיכת המצב המעורר ‪ I460‬למצב ‪ J625‬מתרחשת תוך כ‪ 0.5ps-‬וזוהתה כשלב בו‬
‫מתבצעת האיזומריזציה‪ ,‬שכן בנקודה זו הפיתול נדרש וההתפתחות באנלוגים הנעולים נעצרה‪ .‬מחקרים‬
‫במרכז ה‪ IR-‬הראו כי בנית מצב הביניים ‪ 13-cis‬אכן תואמת סקאלת זמן זו‪ .‬מידע משלים הושג מניסוי‬
‫שאיבת פליטה מעוררת )‪ (SEP – Stimulated Emission Pumping‬המערב שלושה פולסים‪ .‬בניסוי‬
‫זה‪ ,‬שהרציונל מאחוריו יוסבר בהמשך העבודה‪ ,‬ונמצאה התאמה בין אוכלוסייה ש"הוצאה" ממעגל האור‬
‫ע"י פולס נוסף לזו שנצפתה בהמשך המעגל )מצב הביניים ‪ .(K‬דבר שהוכיח כי המצב הפלורסנטי הוא‬
‫תוצר ביניים במעגל האור של בקטריורודופסין‪ .‬בנוסף‪ ,‬נצפה כי מבנה המצב הפלורסנטי קבוע ומוגדר‬
‫היטב כלומר ריכוז המצבים המעוררים בו דועך אקספוננציאלית אך חתך הפעולה לפליטה זהה‪.‬‬
‫האירועים המוקדמים בחלבון הרטינלי הלורודופסין נחקרו גם כן במגוון שיטות‬
‫בספקטרוסקופיות‪ ,‬ובאופן מעניין הראו מאפיינים דומים לאלו שנצפו בבקטריורודופסין‪ .‬הבדל נראה‬
‫בדעיכת המצב המעורר שהינה בי‪-‬אקספוננציאלית ומתאימה לקבועים של ‪ ~1.5ps‬ו‪ .~5ps-‬כמו כן‪,‬‬
‫באזור יצירת התוצר )‪ (640nm‬נצפה מעבר מהיר )‪ (~0.1ps‬מפליטה לבליעה בטרם הושלמה דעיכת‬
‫הפליטה המאולצת‪ .‬במטרה להסביר את הממצאים הניסיוניים הללו סיפקו החוקרים מודל רמות אנרגיה‬
‫בחלבון זה‪ .‬במודל זה הדעיכה הבי‪-‬אקספוננציאלית מתייחסת לשתי קורדינטות שונות‪ .‬לאחר עירור פרנק‬
‫קונדון מתקיימת רלקסציה של המצב המעורר תוך ‪ , ~150fs‬המצב המעורר מתפצל לשתי אוכלוסיות‬
‫שונות הניתנות להבחנה‪ .‬התהליך המהיר בדעיכה )‪ (1.5ps‬מוביל ליצירת תוצר שזוהה כמופיע בסקאלת‬
‫זמן זו )"המסלול הריאקטיבי"(‪ ,‬והתהליך הארוך )‪ (5ps‬מוביל למסלול לא פעיל שמחזיר את האוכלוסייה‬
‫לקונפיגורציה המקורית במצב היסודי )"המסלול הלא‪-‬ריאקטיבי"(‪ .‬מודל זה שונה מזה שהוצע‬
‫לבקטריורודופסין‪.‬‬
‫בהיותו הכרומופור המשותף לכל משפחת החלבונים הרטינליים‪ ,‬נחקר גם ה‪ RPSB-‬בתמיסה‬
‫במגוון שיטות‪ .‬מחקרים השוואתיים בין המשאבות היוניות לבין הכרומופור מראים כי החלבון משחק‬
‫תפקיד מכריע‪ ,‬הן בספקטרום הבליעה‪ ,‬הן בקביעת קואורדינאטת האיזומריזציה והסלקטיביות שלה‪ ,‬הן‬
‫בקביעת היעילות הקוונטית של התהליך והן בדינאמיקת האירועים הראשוניים‪ .‬הבדל גדול ניכר כבר‬
‫בספקטרום הבליעה של המשאבות היוניות )‪ BR‬ו‪ (HR-‬שמוסט למרכז התחום הנראה )‪ (~570nm‬ביחס‬
‫ל‪ RPSB -‬בתמיסת אתנול שבליעתו מרוכזת סביב ‪ .~450nm‬התזוזה לאדום הנובעת מסביבת החלבון‬
‫מכונה בעגה המקצועית ‪ .opsin shift‬הבדל נוסף הוא שהאיזומריזציה בחלבון ספציפית לקשר ‪C13=C14‬‬
‫ובעלת יעילות קוונטית גבוהה יותר מזו הקיימת ל‪ PSB-‬בתמיסה‪ ,‬בו קשרים נוספים עוברים איזומריזציה‬
‫והיעילות לקשר הספציפי נמוכה ביותר מפי ‪ .3‬כמו כן‪ ,‬קצב ההיפוך הפנימי ברטינל בתמיסה איטי פי ‪10‬‬
‫מזה המתרחש בבקטריורודופסין ומראה דעיכה בי אקספוננציאלית שמקורה טרם הובן‪ .‬ההסברים שניתנו‬
‫למרכיבי הדעיכה השונים הם קיומה של קינטיקה לא הומוגנית או אפקטים תרמיים כגון קירור ויברציוני‪.‬‬
‫עבודות תיאורטיות טוענות כי מאפייני פוטנציאל מורכבים לאורך ערוץ הריאקציה הם שאחראיים‬
‫לקינטיקה המולטי‪-‬אקספוננציאלית בתהליכי הרגיעה כגון קיומם של מחסומים או סכמות מקבילות עם‬
‫ענפים ריאקטיביים ולא ריאקטיביים במצב המעורר‪ .‬מחקרים רבים ניסו להבין‪ ,‬כיצד החלבון משפיע על‬
‫הדינאמיקה? והאם יש קשר בין ההשפעות השונות שמשרה החלבון? מחקר שבוצע על שני חלבונים‬
‫רטינליים נוספים במשפחה )‪ SR1‬ו‪ (SR2-‬ניסה להעריך את התרומה של תזוזת הבליעה על קצב ההיפוך‬
‫הפנימי‪ ,‬המסקנה הייתה כי לא קיים קשר ישיר בין היסט הבליעה לקצב ההיפוך הפנימי‪ .‬זאת על אף‬
‫שהגיוני לחשוב כי ייתכן קשר ביניהם שכן עבודות תיאורטיות שבוצעו דיווחו על תזוזה של רמות‬
‫האנרגיה ונמצא כי ממסים יכולים לשנות את טופולוגית המשטחים ואף להזיזם בצורה מושלמת‪.‬‬
‫מטרותינו במחקר הנוכחי היו לגבש מודל דינמי וקינטי לפוטוכימיה של החלבונים הרטינליים‬
‫ולכרומופור המשותף להם שכן בכל החלבונים הרטינליים התהליך הראשוני מערב היפוך פנימי‬
‫ואיזומריזציה ברטינל‪.‬‬
‫כמו כן‪ ,‬רצינו להרחיב הבנתנו את השפעות החלבון והקשר ביניהם לבין‬
‫הדינאמיקה הראשונית‪.‬‬
‫לשם הגשמת מטרות אלו חקרנו באמצעות ספקטרוסקופית ‪ pump-probe‬אולטרה מהירה הן‬
‫את המשאבות היוניות הלורודופסין ובקטריורודופסין והן את הכרומופור בתמיסה‪ .‬להלן נציג את‬
‫המחקרים הספציפיים והמסקנות העיקריות שהתקבלו בכל חלק‪:‬‬
‫)א( המשאבות היוניות ‪ -‬חקר ההלורודופסין בוצע במטרה לאשר או להפריך את מודל רמות האנרגיה‬
‫שניתן לחלבון זה והוצג לעיל‪ .‬המחקר בוצע הן בספקטרוסקופיית ‪ pump-probe‬רגילה והן ע"י‬
‫ניסויים בשלושה פולסים לפי פרוטוקול ה‪ .SEP-‬התוצאות שלנו מראות כי קינטיקת ההיפוך הפנימי‬
‫הבי‪-‬אקספוננציאלית בהלורודופסין מובילה לתוצר ואין הפרדה קינטית לשני מסלולים )ריאקטיבי ולא‬
‫ריאקטיבי(‪ .‬כמו כן‪ ,‬חתך הפעולה לפליטה קבוע במהלך זמן החיים של המצב המעורר‪ ,‬וזאת בדומה‬
‫לממצאים שנצפו בבקטריורודופסין‪ .‬בנוסף נצפה תהליך מהיר של כ‪ 200fs-‬ויתר קבועי הדעיכה‬
‫שהתקבלו היו בעלי זמן ארוך ביחס לנצפה בבקטריורודופסין ובהתאמה למה שדווח בעבר‪ .‬כמו כן‪,‬‬
‫באזור התוצר )‪ (~640nm‬נצפתה בליעה מהירה שנבנית ביחד עם הבליעה והפליטה של המצב‬
‫המעורר‪ .‬תצפית זו עוררה את השאלה‪ :‬כיצד ייתכן שהתוצר נבנה כל כך מוקדם‪ ,‬ביחד עם בנייתו של‬
‫המצב המעורר‪ ,‬ולא רק לאחריו? במטרה לענות על שאלה זו‪ ,‬בוצע מחקר השוואתי נוסף בין‬
‫בקטריורודופסין טבעי לאנאלוג נעול שלו )נעילת הקשר הכפול הספציפי שעובר איזומריזציה( תוך‬
‫התמקדות באזור בו מתקבל התוצר‪ .‬הרציונאל מאחורי ניסוי זה הוא שבאנאלוג הנעול יצירת התוצר‬
‫אינה אפשרית )עקב נעילת הקשר לסיבוב( ולכן ניתן לבודד את המצב המעורר‪ .‬התוצאות הראו כי‬
‫הבליעה המהירה נוצרת הן בחלבון הטבעי והן באנאלוג הנעול ביחד עם המצב המעורר‪ ,‬כאשר במקרה‬
‫של בקטריורודופסין אזור זה מייצג את התוצר ארוך החיים בסקאלת המחקר שלנו בעוד בנעול ישנה‬
‫דעיכה עם קינטיקה הדומה לקינטיקת המצב המעורר‪ .‬כתוצאה מכך הסקנו כי העלייה המהירה הנצפת‬
‫באזור התוצר בחלבונים הרטינליים שייכת למצב המעורר ולמעשה יותר ממצב מעורר אחד מעורב‬
‫ואנו רואים חפיפה בין פליטה לבליעה של המצב המעורר )טיעון שניתן בעבר להסבר הפליטה הרדודה‬
‫הנצפת בחלבונים רטינליים אך לא הוכח ניסיונית(‪ .‬נציין כי גם בנעול נראה תהליך מהיר של כ‪.150fs-‬‬
‫כעת לאור ממצאים אלו ופסילת המודל שהוצע עד כה‪ ,‬נותר לספק מודל רמות אנרגיה חדש לתהליך‬
‫ההיפוך הפנימי והאיזומריזציה מודל זה עשוי גם להסביר את מקור ההבדלים בתהליך הראשוני בין שני‬
‫חלבונים רטינליים אלו‪.‬‬
‫)ב( להערכת השפעות החלבון על הדינאמיקה והקשר בין ההשפעות השונות חקרנו כרומופור סינתטי‪,‬‬
‫לכרומופור זה הוכנסו שינויים המחקים את היסט הבליעה הקיימת בחלבון )היסט לאדום(‪ ,‬במטרה‬
‫לבדוק האם קיים קשר בין היסט ה‪ opsin-‬לקצב הדעיכה‪ .‬התוצאות הראו כי לא קיים קשר ישיר בין‬
‫היסט הבליעה לקצב ההיפוך הפנימי‪ ,‬והקצב שהתקבל )‪ 2ps‬ו‪ (11ps-‬היה אף איטי יותר מזה שנצפה‬
‫ב‪ PSB-‬בתמיסה‪ .‬עוד נראו עדויות לתהליך המהיר )‪ ,(150fs‬ולפליטה הרדודה ולבליעה של המצב‬
‫המעורר שחופפת עליה‪ .‬כמו כן‪ ,‬עירור באורכי גל שונים הציג קיום הרחבה אנהומוגניות במצב היסוד‪.‬‬
‫)ג( חקר הרטינל בתמיסה ‪ -‬במטרה להבין את הדינאמיקה ודרגות החופש השונות המעורבות במצב‬
‫המעורר חקרנו את הכרומופור בתמיסה כמערכת המשותפת לכלל החלבונים הרטינליים‪ .‬ניסויים אלו‬
‫הראו בליעה ב‪ ~520nm-‬יחד עם פליטה מאולצת ב‪ ~650nm-‬הדועכים בו זמנית עם קבועי דעיכה‬
‫של ‪ ~2ps‬ו‪ ~7ps-‬ומיוחסים למצב המעורר‪ .‬כמו כן‪ ,‬נצפתה פליטה רדודה שנמשכת עמוק ל‪IR-‬‬
‫ובעלת מבנה דו דבשתי שנובע גם כאן מחפיפה בין בליעה לפליטה של המצב המעורר‪ .‬גם בדגם זה‬
‫נמצאו עדויות לרכיב ספקטראלי מהיר )‪ .(~150fs‬בניסוי זה גם בדקנו את התלות באורך גל העירור‬
‫וההבדל שנצפה העיד כי גם כאן קיימת אנהומוגניות במצב היסוד‪ .‬מחקרי ‪ NMR‬הראו כי הרחבה שכזו‬
‫עשויה לנבוע ממצבי ‪ syn‬ו‪ anti-‬של הקשר הכפול בין הפחמן לחנקן‪ .‬לאור כך‪ ,‬ביצענו ניסיון דומה על‬
‫כרומופור שבו הוחלפה קבוצת ה‪ n-butyl-‬בקבוצת ‪ ,tert-butyl‬בטענה כי חילוף זה מונע קיומם של‬
‫מצבים אלו‪ .‬ואכן במקרה זה התוצאות הראו כי אין הרחבה אנהומוגנית‪ .‬ממצא שהבהיר את מקור‬
‫ההרחבה והוביל למציאת מערכת המשקפת טוב יותר את המתרחש בחלבונים הרטינליים‪ .‬ייחוס איברי‬
‫הדעיכה השונים והצבתם בסכימה דינאמית נותרו באפלה‪ ,‬דבר בעל חשיבות כשרוצים למצוא את‬
‫מנגנון הפעולה של חלבונים רטינליים‪.‬‬
‫)ד( מבנה המצב המעורר ‪ -‬הספקטראות האלקטרוניים שנצפו למצב הפלורוסנטי הינם רחבים וחסרי‬
‫מבנה כך שקשה להסיק מהם מידע על שינויים בקשר הכימי ובגיאומטרית המצב המעורר‪ .‬מכאן נדרש‬
‫מחקר מעמיק שיאפשר את הבנת המבנה ודרגות החופש המעורבות בתהליך ההיפוך הפנימי‪ .‬נציין כי‪,‬‬
‫ניסויי ראמן‪ ,IR ,‬ו‪ X-ray-‬טרם הצליחו להגיע לסקאלת הזמן הנדרשת לקבלת מידע זה‪ .‬ועל כן יש‬
‫צורך לקבל מידע מבני חסר זה ע"י שימוש בשיטות ספקטרוסקופיית אולטרה‪-‬מהירות‪ ,‬כגון‬
‫ספקטרוסקופיה‬
‫ויברציונית אימפולסיבית )‪ ,(IVS‬שיטה המאפשרת ללוות שינויים גיאומטריים‬
‫ומדווחת על העוצמה והתדרים של ויברציות פעילות במצב המעורר לאורך הזמן‪ .‬יתרונותיה של שיטה‬
‫זו היא בכך שהיא מספקת מידע על הפאזה והתדר הויברציוני ברזולוציית זמן גבוהה‪ .‬ניסיונות‬
‫להשתמש בשיטה זו על מערכות של חלבונים רטינליים מדווחים בספרות‪ ,‬החל מן העבודות החלוציות‬
‫של ‪ Shank‬ושותפיו‪ ,‬המשך בעבודתם של ‪ Kobayashi‬וקבוצתו‪ ,‬וכלה בניסויים מקבוצתינו‪ .‬במרבית‬
‫הניסויים הראשוניים יוחסו הויברציות שנצפו בעיקר למצב היסוד‪ .‬בעבודתם‪ Kobayashi ,‬וקבוצתו‬
‫חקרו את דינאמיקת המצב המעורר בבקטריורודופסין עם רזולוצית זמן של ‪ 5fs‬והויברציות שנצפו‬
‫יוחסו למצב המעורר‪ ,‬אם כי השימוש באורך גל זהה לפולס המעורר ולפולס החוקר מקשה על הפרדת‬
‫התרומות הויברציוניות שנצפו למצב היסוד ולמצב המעורר‪ .‬עם זאת‪ ,‬העבודה החדשה יותר של‬
‫‪ Ruhman‬וקבוצתו נתנה פרשנות אחרת לתוצאות‪ ,‬ושוב ייחסה את מרבית הויברציות המהירות למצב‬
‫היסוד‪ .‬מספר "שכלולים" של שיטת ‪ IVS‬אמורים לעזור בעירורן ובגילוין של ויברציות במצב‬
‫המעורר‪ .‬כך‪ ,‬למשל‪ ,‬שימוש בשלושה פולסים בפרוטוקול שהוצע ע"י ‪ Cerullo‬ו‪ ,Ruhman-‬שחשף‬
‫לכאורה דרך לבודד את המודולציות השייכות למצב המעורר ע"י הוכחת ייתכנות על פוליאן מצומד‪.‬‬
‫בנוסף‪ ,‬ישנה אפשרות לשנות את מבנה הפאזות של הפולסים המעוררים )ע"י תוספת ‪ ,(chirp‬שיטה‬
‫שהוכחה ככלי יעיל לעודד או לדכא את ויברציות מצב היסוד‪.‬‬
‫במטרה לחשוף מודל לדינאמיקה הראשונית‪ ,‬ולהבין אילו דרגות חופש נוטלות חלק בדינאמיקת המצב‬
‫המעורר ביצענו ניסויים המבוססים על שיטת ה‪ IVS-‬תוך שילוב של פולסים קצרים במיוחד בסכמות‬
‫של שניים ושלושה פולסים וכן בפולסים עם ‪ .chirp‬אומנם מגוון הניסויים שבוצעו הציגו תזוזות‬
‫המספקות אינפורמציה שקשורה לשינויים הגיאומטריים אך הפרדה בין המודולציות השייכות למצב‬
‫היסוד לאלו הנובעות מן המצב המעורר הייתה קשה ותשובה ברורה באשר למבנה המצב המעורר לא‬
‫התקבלה ואף נראה כי שיטת העבודה מוטלת בספק כך שמחקר בעל אתגר מדעי גדול נדרש‪ .‬כך שעד‬
‫כה רק תדר ויברציה נמוך שנצפה הן בחלבונים והן ב‪ RPSB-‬בתמיסה יוחס בוודאות למצב המעורר‬
‫כאשר ויברציות אלו יוחסו לתזוזות בשלד הרטינל‪.‬‬
‫לסיכום‪ ,‬המחקר הנוכחי הוא נדבך נוסף בדרך להבנת הדינאמיקה והקינטיקה של התהליכים‬
‫הראשונים בחלבונים הרטינליים והשפעת סביבת החלבון השונה על תהליך ראשוני זה‪.‬‬
‫תוכן עניינים‬
‫‪1‬‬
‫סקירה ספרותית‬
‫‪1.1‬‬
‫חלבונים רטינליים‬
‫‪1‬‬
‫‪1.1.1‬‬
‫בקטריורודופסין‬
‫‪2‬‬
‫‪1.1.2‬‬
‫הלורודופסין‬
‫‪5‬‬
‫‪1.1.3‬‬
‫השוואה בין המשאבות היוניות‬
‫‪7‬‬
‫‪1.2‬‬
‫חקר הדינאמיקה והקינטיקה‬
‫‪8‬‬
‫‪1.2.1‬‬
‫כרומופור ה‪ PSB-‬בתמיסה‬
‫‪8‬‬
‫‪1.2.2‬‬
‫בקטריורודופסין‬
‫‪11‬‬
‫‪1.2.3‬‬
‫הלורודופסין‬
‫‪15‬‬
‫‪1.2.4‬‬
‫השפעת החלבון הרטינלי על הפוטוכימיה בבקטריה‬
‫‪17‬‬
‫‪1.2.5‬‬
‫ספקטרוסקופיה ויברציונית‬
‫‪20‬‬
‫‪1.3‬‬
‫מטרות המחקר‬
‫‪2‬‬
‫מערכות הניסוי ושיטות הניתוח‬
‫‪2.1‬‬
‫כללי‬
‫‪28‬‬
‫‪2.2‬‬
‫הלייזר הבסיסי‬
‫‪29‬‬
‫‪27‬‬
‫‪2.2.1‬‬
‫האוסילטור‬
‫‪29‬‬
‫‪2.2.2‬‬
‫הפורס‬
‫‪30‬‬
‫‪2.2.3‬‬
‫בורר פולסים‬
‫‪31‬‬
‫‪2.2.4‬‬
‫המגבר‬
‫‪31‬‬
‫‪2.2.5‬‬
‫המכווץ‬
‫‪32‬‬
‫מגברים פרמטרים‬
‫‪33‬‬
‫‪2.3.1‬‬
‫‪TOPAS‬‬
‫‪33‬‬
‫‪2.3.2‬‬
‫‪NOPA‬‬
‫‪33‬‬
‫‪2.3‬‬
‫‪2.4‬‬
‫כיווץ‬
‫‪34‬‬
‫‪2.4.1‬‬
‫‪shaper‬‬
‫‪34‬‬
‫‪2.4.2‬‬
‫יצירת פולסים עם ‪chirp‬‬
‫‪36‬‬
‫‪2.5‬‬
‫אפיון פולסים קצרים‬
‫‪37‬‬
‫‪2.5.1‬‬
‫אוטוקורלציה והכפלת תדר‬
‫‪37‬‬
‫‪2.5.2‬‬
‫אפקט ‪ kerr‬אופטי‬
‫‪38‬‬
‫‪2.6‬‬
‫המערך הניסיוני‬
‫‪40‬‬
‫‪2.6.1‬‬
‫שיטת ‪pump-probe‬‬
‫‪40‬‬
‫‪2.6.2‬‬
‫מערכות מדידה‬
‫‪41‬‬
‫‪2.6.3‬‬
‫עיבוד הנתונים‬
‫‪44‬‬
‫‪2.6.4‬‬
‫הדוגמאות‬
‫‪47‬‬
‫‪2.6.5‬‬
‫תאים אופטיים לדוגמאות‬
‫‪49‬‬
‫‪2.6.6‬‬
‫מערכי הניסוי הספציפיים‬
‫‪49‬‬
‫‪3‬‬
‫תוצאות ודיון‬
‫‪3.1‬‬
‫‪ n-Bu RPSB‬בתמיסת אתנול‬
‫‪51‬‬
‫‪3.1.1‬‬
‫ממצאים ניסיוניים‬
‫‪51‬‬
‫‪3.1.2‬‬
‫דיון‬
‫‪55‬‬
‫‪3.2‬‬
‫חלבונים רטינליים ‪ -‬המשאבות היוניות‬
‫‪61‬‬
‫‪3.2.1‬‬
‫הלורודופסין ‪ -‬ממצאים ניסיוניים‬
‫‪61‬‬
‫‪3.2.2‬‬
‫הלורודופסין – דיון‬
‫‪67‬‬
‫‪3.2.3‬‬
‫בקטריורודופסין והאנלוג הנעול שלו ‪ -‬ממצאים ניסיוניים‬
‫‪71‬‬
‫‪3.2.4‬‬
‫בקטריורודופסין והאנלוג הנעול שלו – דיון‬
‫‪77‬‬
‫‪3.2.5‬‬
‫השוואה בין המשאבות היוניות שנחקרו‬
‫‪83‬‬
‫‪3.3‬‬
‫ספקטרוסקופיה ויברציונית של ‪ RPSB‬בתמיסה‬
‫‪85‬‬
‫‪3.3.1‬‬
‫ניסוי שני פולסים ברזולוציה של ‪7fs‬‬
‫‪86‬‬
‫‪3.3.2‬‬
‫ניסוי שלושה פולסים‬
‫‪91‬‬
‫‪3.3.3‬‬
‫ניסויים המערבים שימוש בפולסים עם ‪chirp‬‬
‫‪96‬‬
‫‪3.3.4‬‬
‫מסקנות הפרק‬
‫‪100‬‬
‫‪4‬‬
‫מסקנות‬
‫‪101‬‬
‫‪5‬‬
‫כיוונים עתידיים‬
‫‪103‬‬
‫‪6‬‬
‫ביבליוגרפיה‬
‫‪104‬‬
‫‪1‬‬
‫‪ .1‬סקירה ספרותית‬
‫‪ .1.1‬חלבונים רטינליים‬
‫‪1‬‬
‫חלבונים רטינליים )‪ (RP's‬נפוצים במגוון רחב של אורגניזמים החל מארכי‪-‬בקטריות וכלה ביונקים‪ .‬הם‬
‫בעלי תפקיד מרכזי בפעילויות ביולוגיות שונות כגון‪ :‬משאבות יוניות מושרות אור )כדוגמת‬
‫בקטריורודופסין )‪ (BR‬והלורודופסין )‪ ,((HR‬גלאי אור הגורמים לתנועה )סנסורי רודופסין )‪((SR‬‬
‫וכרצפטורים הרגישים לאור בעיני חיות ואדם‪.‬‬
‫משפחת החלבונים הרטינליים מכילה חלבונים טרנסממברנליים שונים בעלי מאפיינים דומים‪ .‬כולם‬
‫בנויים משבעה סלילי אלפא )ממוספרים מ‪ A-‬עד ‪ (G‬הכולאים בתוכם מולקולת רטינל‪ .‬הרטינל הינו‬
‫נגזרת של ויטמין ‪ A‬הקשור קוולנטית לחומצה האמינית ‪ Lys‬בסליל ‪ G‬שבחלבון‪ ,‬דרך בסיס ‪schiff‬‬
‫שעבר פרוטונציה )‪ .(PSB‬הרטינל הנושא מטען חיובי‪ ,‬מהווה חלק חשוב מהאתר הפעיל והוא הכרומופור‬
‫הבולע את האור‪ .‬כתוצאה מתגובה פוטוכימית מאותחלת פעילות החלבון ומתקיימת סדרה של שינויים‬
‫מבניים בכרומופור ובחלבון‪ .‬מבנים אלו מאובחנים בסדרת מצבי ביניים הניתנים לאפיון ספקטרוסקופי‪,‬‬
‫אשר בסופם חוזרים הכרומופור והחלבון למצבם ההתחלתי והפעילות הביולוגית מתאפשרת מחדש‪.‬‬
‫ניתן לחלק משפחה זו לשני סוגים עיקריים‪:‬‬
‫‪ .1‬הסוג הראשון )‪ (type 1‬כולל רודופסינים הנמצאים בארכאות ובחיידקים אאוקריוטים‪ .‬חלבונים אלו‬
‫מתפקדים כמשאבות יוניות מושרות אור וכפוטורצפטורים לתנועה מוכוונת אור )סנסורי‪-‬רודופסין(‪.‬‬
‫‪ .2‬הסוג השני )‪ (type 2‬כולל רודופסינים המצויים באאוקריוטים גבוהים לדג' נמצאים בעיני חיות ואדם‬
‫)‪ (cone‬ומשמשים כרצפטורים הרגישים לאור‪.‬‬
‫המיון למשפחות השונות נעשה על סמך הרצף‪ ,‬המבנה הקריסטלוגרפי שמציג מיקום שונה של סלילי‬
‫האלפא בכל משפחה‪ ,‬הקונפיגורציה האיזומרית וקונפורמצית הטבעת‪.‬‬
‫נעמוד על ההבדלים בין הסוגים השונים‪:‬‬
‫‪ .1‬מבנה קריסטלוגרפי‪ -‬הבדל במיקום החלבון בממברנה‪ :‬חלבוני הסיגנל )‪ (type 2‬חציים טמונים‬
‫בממברנה וחציים מחוץ לה בעוד חלבוני המשאבה )‪ (type 1‬מצויים בעיקר בממברנה‪ .‬נציין כי מבנה‬
‫חלבונים רטינליים אלו פוענח ברזולוציה הטובה ביותר למרות הקושי הקיים בפענוח מבנה קריסטלוגרפי‬
‫לחלבונים ממברנאליים‪.‬‬
‫‪ .2‬קונפיגורציה איזומרית‪ -‬קיים הבדל בקונפיגורציה של התהליך הראשוני המשותף לכל החלבונים‬
‫הרטינליים )באיזומריזצית הכרומופור סביב קשר כפול ספציפי(‪ .‬ב‪ type 1 -‬הכרומופור מצוי במבנה ‪all‬‬
‫‪ trans‬שעובר איזומריזציה ל‪ 13-cis -‬בעוד שב‪ type 2-‬המצב הטבעי הוא ‪ 11-cis‬שעובר איזומריזציה‬
‫למבנה ‪.all-trans‬‬
‫‪ .3‬קונפורמצית הטבעת‪ -‬הבדל נוסף מצוי בקונפורמציה של טבעת היונון הקיימת בקצה הלא קשור‬
‫לחלבון ב‪) PSB-‬ראה תמונה מספר ‪ .(1.2‬הקשר ‪ C6-C7‬המחבר בין הפוליאן לטבעת שונה )‪ s-cis‬או ‪s-‬‬
‫‪ .(trans‬הסיבה לשוני הינה הפרעות אלקטרוסטטיות וסטריות ויש הטוענים כי הבדל זה גורם להכוונת‬
‫אורך גל הבליעה והוא אחד המנגנונים החשובים לויסות מקסימום הבליעה‪.‬‬
‫‪1‬‬
‫‪2‬‬
‫למרות ההבדלים שנצפו לא ניתן לקבוע בוודאות האם התפתחותם הגנטית של משפחות אלו נפרדת או‬
‫שהם תולדה אחד של השני‪ .‬על סמך הרצף הגנומי הידוע עד כה נראה כי הטבע גילה חלבונים אלו בנפרד‬
‫אך ייתכן ובעתיד ימצא חלבון או גן שלישי החופף בהומולוגיה לשני הסוגים ומהווה את החוליה החסרה‬
‫להוכחה‪.‬‬
‫יכולתם של החלבונים הרטינליים להיות דומים מחד‪ ,‬ולקיים קטליזה מוכוונת המובילה לפעילות מגוונת‬
‫ושונה בתא מאידך‪ ,‬הופכת אותם מושא למחקרים רבים‪ .‬כמו כן הם עשויים להוות מודל לחקר יחסי‬
‫תפקיד או מבנה ברמה האטומית‪.‬‬
‫במחקריי התמקדתי במשאבות היוניות בקטריורודופסין והלורודופסין השייכים למשפחת החלבונים‬
‫הרטינליים הראשונה )‪ .(type 1‬מכאן ארחיב על המבנה‪ ,‬התפקיד והמנגנון שלהם ולסיום אף אשווה‬
‫ביניהם‪.‬‬
‫‪ .1.1.1‬בקטריורודופסין‬
‫בקטריורודופסין הינו חלבון טרנסממברנלי המצוי בבקטריה ‪ ,Halobacterium salinarum‬ולו תפקיד‬
‫מרכזי בתהליך הפוטוסינתזה‪ .2‬בשל התנאים הקיצוניים בהם חיה בקטריה זו )ריכוזי מלח גבוהים ומעט‬
‫חמצן( חלבון זה בעל תפקיד עיקרי בהישרדותה‪.‬‬
‫הבקטריורודופסין הינו חלבון הפועל כמשאבת פרוטונים המורכב מ‪ 248-‬חומצות אמינו‪.‬‬
‫הבקטריורודופסין נמצא בתוך ‪ domain‬בממברנה הליפידית המכונה הממברנה הסגולה‪ .‬הממברנה‬
‫הסגולה מכילה חלבון אחד בלבד ‪ -‬את הבקטריורודופסין וכעשרה ליפידים שונים‪ .2‬מולקולת‬
‫הבקטריורודופסין מאורגנת במערך הקסאגונלי צפוף במבנה טרימרי בממברנה של הבקטריה‪) 3‬ראה‬
‫תמונה מספר ‪.(1.1‬‬
‫מולקולת הרטינל הכלואה בחלבון מצויה במבנה ‪ all-trans‬וקשורה קוולנטית דרך ‪ PSB‬לשייר ‪Lys216‬‬
‫בסליל ‪) G‬ראה תמונה מספר ‪ .(1.1‬בחשיכה‪ ,‬מצוי הבקטריורודופסין בערבוב מצבים הנקרא ‪dark-‬‬
‫‪ adapted‬ובו ‪ 60%‬מצוי במבנה ‪ cis‬ותחת חשיפה לאור הבקטריורודופסין מצוי רק במבנה ‪all-trans‬‬
‫ומנקודה זו מתחיל מעגל האור‪ .‬מעגל זה מתחיל מבליעת פוטון ברטינל וכתוצאה מכך נגרמים שינויים‬
‫במבנה המולקולה ובמטען החלבון אשר מניעים את משאבת הפרוטונים‪ .‬הרטינל עובר איזומריזציה מ‪-‬‬
‫‪ all-trans‬ל‪ ,13cis-‬איזומריזציה זו היא המאתחלת את מעבר הפרוטון מהציטופלזמה של התא לחוץ‬
‫התא המופרדים ע"י הממברנה‪ .‬תהליך האיזומריזציה במעגל האור של בקטריורודופסין מתרחש ביעילות‬
‫רבה ובסלקטיביות סביב הקשר ‪ C13=C14‬עם ניצולת קוונטית של כ‪ .65% -‬מרגע התרחשות‬
‫האיזומריזציה מומנט הדיפול של הקשר ‪ N-H‬בבסיס ה‪ schiff-‬מתהפך ביחס ל‪ Asp-85-‬מבלי לגרום‬
‫לשינויים גדולים בחלבון ומכאן יתחיל מעבר הפרוטון בתעלה כך שלמעשה‪ ,‬האיזומריזציה מהווה את‬
‫צוואר הבקבוק של התהליך‪ .‬כתוצאה מתהליך מעבר הפרוטון במשאבה נוצר מפל פוטנציאל המספק את‬
‫הכוח ליצירת ‪ ATP‬מ‪ .ADP-‬נציין כי הממברנה הסגולה לא מאפשרת דיפוזיה פסיבית של פרוטונים‬
‫חזרה לתא‪.‬‬
‫‪2‬‬
‫‪3‬‬
‫תמונה מס' ‪:1.1‬‬
‫מצד ימין ‪ -‬המבנה הגבישי )הרבעוני(‬
‫של הבקטריורודופסין‪ ,‬כל יחידת תא‬
‫מורכבת משלוש מולקולות של ‪28 ,BR‬‬
‫ליפידים ו‪ 8410-‬מולקולות מים‪ .‬תא‬
‫יחידה זה חוזר על עצמו בכל הכיוונים‬
‫ויוצר סימטריה הקסאגונלית בממברנה‬
‫הסגולה‪.‬‬
‫מצד שמאל‪ -‬מבנה שלישוני של‬
‫בקטריורודופסין‪ ,‬ה‪ BR-‬מורכב משבעה‬
‫סלילי אלפא "הכולאים" את מולקולת‬
‫הרטינל בתוכם‪ .‬כמו כן‪ ,‬ניתן לראות את‬
‫מעבר הפרוטון מפנים לחוץ התא ‪.‬‬
‫מתוך‪:‬‬
‫‪http://www.ks.uiuc.edu/Research‬‬
‫‪/ifu/‬‬
‫מעגל האור של בקטריורודופסין‬
‫מעגל האור של הבקטריורודופסין )מוצג בתמונה ‪ (1.2‬הינו תהליך שמשכו כ‪ 15-‬מילי‪-‬שניות‪ ,‬תחילתו‬
‫בבליעת פוטון ברטינל וסיומו בחזרת החלבון והרטינל למצבם ההתחלתי‪ .‬במעגל האור מספר מצבי ביניים‬
‫המאופיינים בזמן חיים שונה ובתכונות ספקטרוסקופיות שונות כגון‪ :‬שיעור בליעה מקסימאלי‪ .4‬שינויי‬
‫מבנה דינאמיים מתרחשים בכרומופור ובחלבון במהלך המעגל‪ .‬שינויים אלו נחקרו ישירות ע"י טכניקות‬
‫ספקטרוסקופיות במרחב הזמן כגון‪ :‬ספקטרוסקופיות ‪ ,5,6pump-probe‬ראמאן‪ ,7,4‬ו‪ 8IR-‬או ע"י שיטות‬
‫סטאטיות לקביעת מבנה כגון‪ :‬מיקרוסקופ אלקטרוני‪ 11,10X-ray, 9‬תוך השוואתם למצב היסוד‪.‬‬
‫תמונה מספר ‪:3.1.2‬‬
‫מפת מתאר של השינויים בספקטרום הטרנזיינטי לאחר ביצוע תיקון זמן עקב דיספרסיה של ה‪probe-‬‬
‫עבור עיכוב ‪ probe‬מ‪ 0.5ps-‬ועד ‪ 25ps‬בשני אורכי גל עירור )מצד שמאל‪ , 395nm-‬מצד ימין‪-‬‬
‫‪.(480nm‬‬
‫‪3‬‬
‫‪4‬‬
‫השלבים העיקריים של מעגל האור בבקטריורודופסין‪:‬‬
‫* הריאקציה הראשונית ‪ :‬פוטואיזומריזציה של הרטינל מ‪ all trans-‬ל‪ 13 cis-‬ומעבר מ‪ J-‬ל‪K-‬‬
‫הרטינל עובר איזומריזציה בתהליך שנמשך כ‪ .500fs-‬כתוצאה מבליעת אור ברטינל‪ ,‬הוא עובר ממבנה‬
‫‪ all trans‬למבנה של ‪ .13-cis‬שלב ‪ J‬הוא האיזומר הבולע ב‪ 625nm-‬שעובר תוך ‪ 3ps‬ל‪ K-‬שבולע ב‪-‬‬
‫‪.590nm‬‬
‫* משלב ה‪ K590 -‬ל‪L550-‬‬
‫מצב הביניים ‪ K590‬עובר למצב הביניים ‪ L550‬תוך ‪ .2µs‬בשלב זה האינטראקציה של קשרי המימן בתעלה‬
‫החוץ תאית בין בסיס ‪ schiff‬וה‪ Asp 85-‬מתחזקת ‪ ,‬באמצעות מולקולות מים‪.12‬‬
‫* שלב ראשון של מעבר הפרוטון‪ :‬מ‪ L550-‬ל‪M410(EC)-‬‬
‫למצב ה‪ M-‬מגיעים ממצב ‪ L‬תוך מספר מיקרו‪-‬שניות‪ .‬מצב מעבר זה מערב מעבר פרוטון מהבסיס‬
‫‪ schiff‬ל‪ Asp 85-‬בחצי התעלה החוץ תאית‪.‬‬
‫* ריאקצית מעבר ראשונה מחוץ התא לפנים התא‪M410(EC)-M410(CP):‬‬
‫בכדי לאפשר העברה מכוונת של הפרוטון‪ ,‬הרה‪-‬פרוטונציה והדה‪-‬פרוטונציה של בסיס ה‪ schiff -‬חייבים‬
‫להתרחש מצידיה השונים של הממברנה‪ .‬מעבר זה מתרחש ברמת תוצר הביניים ‪ .M‬למעשה‪ ,‬תוצר‬
‫הביניים ‪ M‬מפוצל למספר תוצרי ביניים‪ ,‬שכולם מאופיינים בצבעם הצהוב‪.13‬‬
‫* שלב שני של מעבר פרוטון‪ :‬מ‪ M410(EC) -‬ל‪N560-‬‬
‫רה‪-‬פרוטונציה של בסיס ה‪ schiff -‬מ‪ Asp 96-‬בחצי התעלה התוך תאית מתרחשת במהלך המעבר מ‪-‬‬
‫)‪ M410(EC‬למצב הביניים ‪ N560‬תוך מספר מילי‪-‬שניות‪ .‬במהלך זמן החיים של מצב ביניים זה )‪(N560‬‬
‫מתבצעת גם רה‪-‬פרוטונציה של ‪ Asp 96‬ע"י פרוטון מפנים התא‪ .‬מקור הפרוטון אינו ישירות‬
‫בציטופלזמה‪ ,‬שכן ‪ Asp 96‬משמשת לאחסון פרוטון לתהליך הרה‪-‬פרוטונציה של בסיס ‪.schiff‬‬
‫* איזומריזציה תרמית של הרטינל ממצב ה‪ 13 cis-‬ל‪: all trans -‬מ‪ N560 -‬ל‪O640-‬‬
‫במעבר מ‪ N560 -‬ל‪ O640 -‬מתרחשת איזומריזציה תרמית מ‪ 13-cis -‬חזרה למבנה ה‪ all trans-‬של‬
‫הרטינל בסביבת החומצות ‪ Asp 96‬ו‪ Asp 85-‬שעברו פרוטונציה‪.‬‬
‫* ריאקצית מעבר שנייה מהציטופלזמה לצד החוץ תאי‪ O640 :‬ל‪BR-‬‬
‫דה‪-‬פרוטונציה של ‪ Asp 85‬משלימה את המעגל הקטליטי תוך ‪ 5‬מילי‪-‬שניות והמצב ההתחלתי משוחזר‬
‫כולל מעבר בסיס ‪ schiff‬מהצד החוץ תאי לתוך תאי‪.‬‬
‫‪ #‬ניכר כי שתי חומצות האמינו‪ Asp-96 ,‬בציטופלזמה ו‪ Asp-85-‬בצד החוץ תאי‪ ,‬הן הפעילות העיקריות‬
‫בתהליך זה‪ .‬חומצות אלו מצויות בסביבת הרטינל‪ ,‬משפיעות על תכונות הבליעה ושולטות במסלול‬
‫הפוטוכימי של הרטינל‪.‬‬
‫‪4‬‬
‫‪5‬‬
‫‪ .1.1.2‬הלורודופסין‬
‫‪14‬‬
‫חלבון ההלורודופסין הינו משאבה מכוונת המונעת ע"י אור של יוני‬
‫כלוריד מחוץ לפנים התא‪ .‬תנועת האניון פחות ברורה מתנועת הפרוטון‬
‫בחלבון הבקטריורודופסין עקב הממברנה הטעונה שלילית‪ .‬משאבה זו‬
‫חוסכת כמות משמעותית של אנרגיה מטבולית והיא משאבת האניונים‬
‫היחידה הידועה עד כה המאותחלת ע"י אור‪ .‬חלבון זה בעל חשיבות‬
‫גדולה לא רק בשל האמור לעיל אלא גם בשל חיוניותו למהלך החיים‬
‫הבקטריאלי‪ .‬נדגיש כי‪ ,‬משאבה זו יכולה להניע הלידים נוספים‬
‫וניטרטים אך היא מניעה בעיקר יוני כלוריד‪.‬‬
‫בקטריות רבות מבטאות את חלבון ההלורודופסין וביניהן נתמקד ב‪-‬‬
‫‪ salinarum‬ו‪ .pharaonis-‬מחקרים רבים חקרו את ההבדלים ביניהם‬
‫ואנו נרחיב על כך בהמשך‪.‬‬
‫תמונה מספר ‪ :1.3‬מבנה‬
‫שלישוני של בקטריורודופסין‪.‬‬
‫הבדל מהותי קיים בתפקידו של חלבון ההלורודופסין בכל בקטריה‪ ,‬בעוד שה‪ sHR -‬דואג לשמירת הלחץ‬
‫האוסמוטי במהלך הגידול התאי‪ ,‬ה‪ pHR-‬משמש לצורך הפקת אנרגיה בהעדר חמצן כאשר הכח המניע‬
‫למעבר פרוטונים דרך הממברנה התאית הוא הקיטוב הנוצר ב‪ pHR-‬כתוצאה משאיבת יוני הכלוריד‬
‫)בבקטריה זו חלבון ה‪ BR-‬חסר כך שה‪ pHR-‬מבצע את תפקידו(‪.‬‬
‫חלבון ההלורודופסין הינו בעל מבנה שלישוני דומה לזה הקיים בבקטריורודופסין כלומר‪ ,‬גם הוא בנוי‬
‫משבעה סלילי אלפא טרנסממברנליים עם לולאות קצרות המחברות ביניהם‪ .‬הסלילים מסודרים במבנה‬
‫דמוי קשת וכולאים בתוכם מולקולת רטינל בקונפיגורצית ‪ , all-trans‬המחוברת בקשר קוולנטי דרך‬
‫בסיס ‪ schiff‬ל‪ Lys242-‬בסליל ‪) G‬ראה תמונה מספר ‪ .(1.3‬הרטינל ממוקם במרכז התעלה ומפריד בין‬
‫שני חלקיה‪ ,‬האניון מצוי בקרבתו‪ .‬חומצות אמינו מעורבות במעבר האניון ובמיוחד הזוג ‪ Thr203‬ו‪-‬‬
‫‪ Arg200‬בצד התוך תאי והזוג ‪ Thr111‬ו‪ Arg108-‬בצד החוץ תאי של התעלה‪.‬‬
‫מעגל האור של ‪HR‬‬
‫‪14‬‬
‫כמו ב‪ BR-‬גם כאן ישנו מעגל קטליטי המאופיין ע"י מספר מצבי ביניים המאופיינים ספקטרוסקופית‪ ,‬ראה‬
‫תמונה מספר ‪ .(B)1.4‬תחילתו של המעגל בבליעת פוטון והתרחשותה של פוטו‪-‬איזומריזציה‬
‫מקונפיגורצית ‪ all trans‬ל‪ 13-cis-‬ברטינל‪ .‬האיזומריזציה הראשונית היא הגוררת את תנועתו המוגדרת‬
‫של האניון‪ .‬ההבדל העיקרי בין מעגל האור ב‪ sHR -‬לזה הקיים ב‪ pHR-‬הוא בשלבים המאוחרים במעגל‪.‬‬
‫נתאר את המעגל במספר השלבים המינימאלי הדרוש לקטליזה הכיוונית בהלורודופסין‪ :‬איזומריזציה )‪,(I‬‬
‫העברה )‪ (T‬ונגישות ומטען )‪ .(switch S‬האיזומריזציה גוררת את תנועתו של האניון בחצי התעלה‬
‫הפונה לצד החוץ תאי‪ .‬ואז הנגישות של בסיס ה‪ schiff-‬ברטינל מתחלף ועובר מהצד החוץ תאי לפנים‬
‫תאי‪ ,‬ככל הנראה האניון נע אל ‪ .Thr203‬בסופו של התהליך הרטינל עובר איזומריזציה תרמית ובסיס ה‪-‬‬
‫‪ schiff‬עובר היפוך וחוזר למצבו הראשוני‪.‬‬
‫האניון אינו חודר לתא דרך הממברנה בשל מטענה השלילי‪ .‬הדמיית מטען ממוחשבת של החלבון חשפה‬
‫כי בצד החוץ תאי מתקיים פוטנציאל חיובי בעוד בצד הפנים תאי הפוטנציאל שלילי‪ ,‬כך שהאניון‬
‫‪5‬‬
‫‪6‬‬
‫)כלוריד( חודר לצד החוץ תאי של החלבון‪ ,‬נעצר ומיוצב שם בשל הקוטב החיובי המתקיים בצד זה ורק‬
‫כתוצאה מהאיזומריזציה המשנה את הדיפול בקשר ‪ N-H‬שברטינל הוא עובר לצד הפנים תאי הטעון‬
‫שלילית ועקב הדחייה נכנס לתא )ראה תמונה מספר ‪ ((C)1.4‬וכלוריד חדש נכנס לאתר המעבר‪ .‬נציין כי‬
‫הכלוריד קשור חלש בתעלה‪.‬‬
‫בחשיכה‪ ,‬הלורודופסין מצוי בערבוב מצבי ‪ all trans‬ו‪) cis-‬ב‪ 45% pHR-‬במצב ‪ all-trans‬וב‪sHR -‬‬
‫‪ 85%‬במצב זה( ותחת תנאי ההארה עדין מתקיים עירבוב מצבים זה אם כי ב‪ pHR-‬האחוזים עולים ל‪-‬‬
‫‪ 75%‬במצב ‪.14all-trans‬‬
‫השלבים העיקריים של מעגל האור ב‪:HR-‬‬
‫* הריאקציה הראשונית ‪ :‬פוטואיזומריזציה של הרטינל מ‪ all trans-‬ל‪13 cis-‬‬
‫הרטינל עובר איזומריזציה בתהליך פוטוסלקטיבי מ‪ all trans -‬ל‪ HR600 .13-cis -‬הינו האיזומר‬
‫המתקבל בסקאלת זמן של ‪.5ps‬‬
‫* צעד ראשון במעבר הכלוריד‪ :‬מ‪ HR600-‬ל‪HR520(EC)-‬‬
‫שלב זה מערב שינוי במיקום הכלוריד בחצי החוץ תאי של התעלה בסקאלת הזמן של מיקרו‪-‬שניות‪.‬‬
‫* ריאקצית החלפת נגישות ראשונה מהצד החוץ תאי לתוך תאי‪ :‬מ‪ HR520(EC)-‬ל‪HR520 (CP)-‬‬
‫על מנת לאפשר מעבר מכוון של הכלוריד‪,‬בסיס ה‪ schiff-‬חייב להתהפך‪ .‬היפוך זה מתרחש בתוצר‬
‫הביניים ‪.HR520‬‬
‫* צעד שני במעבר הכלוריד‪ :‬מ‪ HR520(CP)-‬ל‪HR640 -‬‬
‫יון הכלוריד נע מבסיס ‪ schiff‬דרך ‪ Thr203‬לצד התוך תאי בסקאלת זמן של מילי‪-‬שניות‪.‬‬
‫* איזומריזציה תרמית של הרטינל מ‪ 13-cis-‬ל‪ all trans-‬וריאקצית החלפת נגישות שנייה מהצד‬
‫התוך תאי לחוץ תאי‪ :‬מ‪ HR640 -‬ל‪HR-‬‬
‫איזומריזציה תרמית והיפוך של בסיס ה‪ schiff -‬חזרה מפנים לחוץ התא מתרחש בסקאלת זמן של מילי‪-‬‬
‫שניות ובסיומו משתחזר המצב ההתחלתי‪.‬‬
‫תמונה מספר ‪ .A :141.4‬מנגנון המשאבה היונית הנשלט ע"י אינטרקצית יון‪-‬דיפול‪ .‬ניתן לראות את‬
‫ההיפוך שעובר בסיס ה‪ schiff-‬ברטינל על מנת לאפשר מעבר מכוון של יון הכלוריד מהצד החוץ תאי‬
‫)טעון חיובית( לתוך תאי )טעון שלילית(‪ .B .‬מעגל האור של הלורודופסין מאופיין ב‪ 6-‬שלבים‬
‫עיקריים שביניהם שתי תגובות איזומריזציה )‪ (I‬שני שלבי מעבר כלוריד )‪ (T‬ושני שינויים בנגישות‬
‫של האתר הפעיל )‪ .C .(S‬הדמיה ממוחשבת של משטח הפוטנציאל האלקטרוסטאטי כאשר הצבע‬
‫הכחול מייצג מטענים חיוביים והאדום מטענים שליליים‪.‬‬
‫‪6‬‬
‫‪7‬‬
‫‪ .1.1.3‬השוואה בין המשאבות היוניות בקטריורודופסין והלורודופסין‪:‬‬
‫למרות שמבחינה הומולוגית )רצף החומצות המרכיבות את החלבון( ישנו דמיון של רק כ‪ 25% -‬בין‬
‫בקטריורודופסין להלורודופסין‪ ,15‬הטופולוגיה המבנית דומה‪ .‬כלומר בשתי משאבות יוניות אלו המבנה‬
‫השלישוני דומה )שבעה סלילי אלפא הכולאים בתוכם מולקולת רטינל בקונפיגורצית ‪ all trans‬הקשורה‬
‫קוולנטית ל‪ Lys-‬בסליל ‪ G‬באמצעות בסיס ‪ schiff‬שעבר פרוטונציה )‪ ((PSB‬בעוד המבנה הראשוני‬
‫שונה והוא מספק דוגמא טובה לחיסכון אבולוציוני של הטבע‪ .‬בשני החלבונים מעגל האור מתחיל מבליעה‬
‫המתבצעת ברטינל שגוררת איזומריזציה סביב קשר כפול ספציפי ומעבר לקונפיגורצית ‪ 13-cis‬ומסתיים‬
‫בסקאלת זמן של מילי‪-‬שניות כאשר הוא מותיר את החלבון במצבו ההתחלתי זמין למחזור חדש‪ .‬גם מנגנון‬
‫הנגישות של בסיס ה‪ schiff-‬דומה ובשניהם כתוצאה מהאיזומריזציה ישנו היפוך דיפול בקשר ‪ N-H‬כפי‬
‫שנראה עבור ההלורודופסין בתמונה מספר ‪ .1.4‬הסיבות האנרגטיות הגורמות לתנועת היון בשני המקרים‬
‫זהות על אף המטען השונה והכיווניות ההפוכה )מטען שלילי ומעבר יון הכלוריד מחוץ לפנים התא‬
‫בהלורודופסין לעומת מטען חיובי ומעבר פרוטון מפנים לחוץ התא בבקטריורודופסין(‪ .‬הכלור ב‪HR-‬‬
‫ממלא תפקיד זהה לתפקידה של החומצה האספרטית ב‪ ,BR-‬בבקטריורודופסין המטען השלילי הקבוע של‬
‫‪ Asp85‬מושך פרוטון מה‪ PSB-‬ובהעדר חומצה זו מנגנון ההלורודופסין מתקיים גם ב‪ BR-‬בתנאי‬
‫שכלוריד נוכח‪ .‬נציין כי בסיס ה‪ schiff-‬בהלורודופסין נותר עם פרוטונציה לאורך כל מעגל האור שלו‬
‫בעוד בבקטריורודופסין הפרוטונציה משתנה במצבי הביניים השונים‪.‬‬
‫על אף קיומם של מצבי ביניים רבים במעגלי האור השונים אנו נתמקד בחקר השלב הראשוני בשני‬
‫חלבונים רטינליים אלו )‪ BR‬ו‪) (HR-‬שלב ראשוני זה מתחיל בבליעת פוטון ברטינל ומסתיים‬
‫באיזומריזציה(‪ .‬שלב זה כמו יתר השלבים מורכב ואינו ברור לחלוטין אך מחקרו בעל חשיבות רבה‪.‬‬
‫הסיבות לחיוניות מחקרו הן‪:‬‬
‫‪ .1‬תהליך ראשוני זה משותף למשפחת החלבונים הרטינליים ולכן שתי המשאבות היוניות בהם התמקדנו‬
‫תהוונה מודל‪.‬‬
‫‪ .2‬בשלב הראשוני מתרחשת איזומריזציה ביעילות מסוימת אך משהתרחשה יעבור היון בתעלה )ב‪-‬‬
‫‪ .(100%‬על כן‪ ,‬הבנת מנגנון האיזומריזציה‪ ,‬שהינו השלב הקריטי בתהליך‪ ,‬בעל חשיבות רבה‪.‬‬
‫‪ .3‬בתהליך ראשוני זה אנרגית אור מומרת ביעילות לאנרגיה כימית‪ .‬לכן על מנת להבין כיצד ישנו חיסכון‬
‫אנרגטי בטבע ולחקותו יש לחשוף את התהליכים המולקולאריים שביסוד המרת האנרגיה‪.‬‬
‫‪ #‬הכלים הניסיוניים הרבים )כגון‪ (11,10X-ray:‬שקיימים לחקר השלבים המאוחרים במעגל האור )שלבים‬
‫המאופיינים בסקאלת זמנים ארוכה(‪ ,‬אינם מתאימים לשלבים הראשונים בהם בחרנו להתמקד )בשל‬
‫משכם הקצר( ולכן היה צורך בפיתוח שיטות אחרות‪ .‬עם ההתפתחות הטכנולוגית בתחום הלייזרים‬
‫האולטרה מהירים ניתן היה לפתח שיטות ספקטרוסקופיות המאפשרות איסוף אינפורמציה על הדינאמיקה‬
‫של ריאקציות כימיות‪ .‬ספקטרוסקופיה האולטרה מהירה הן במרחב התדר )כגון‪ IR8:‬וראמאן‪ (7‬והן‬
‫במרחב הזמן )‪ pump-probe‬אפילו עם פולסים של ‪ (~5fs‬הינה כלי עיקרי לחקר דינאמיקת השלבים‬
‫המוקדמים במעגל‪.‬‬
‫‪7‬‬
‫‪8‬‬
‫‪ .1.2‬חקר הדינאמיקה והקינטיקה של הפוטוכימיה בחלבונים רטינליים וב‪ RPSB-‬בתמיסה‬
‫‪ .1.2.1‬כרומופור ה‪ PSB-‬בתמיסה‬
‫האיזומריזציה המתרחשת בשלבים הראשוניים של מעגל האור משותפת לכלל החלבונים הרטינליים‬
‫ולמראית עין מתרחשת ברטינל עצמו ללא מעורבות החלבון‪ .‬נתחיל בסקירת הדינאמיקה הפוטוכימית של‬
‫‪ (PSB) Protonated Schiff Bases‬בתמיסה מבודד מהשפעות חלבון ואז נרחיב מה קורה בסביבת כל‬
‫אחת מהמשאבות היוניות‪ .‬חוקרים רבים התעניינו בדינאמיקה הראשונית של כרומופור זה‪ ,‬במטרה הן‬
‫להבין את המנגנון הראשוני והן לענות על השאלה‪ :‬האם וכיצד האינטראקציה עם החלבון משפיעה על‬
‫הפוטוכימיה?‬
‫תמונה מספר ‪:1.5‬‬
‫מבנה ה‪ PSB-‬בתמיסה )נבחין כי‬
‫הטבעת מעט שונה מהמצוי‬
‫במשאבות היוניות אך החיבור‬
‫לאמין שעבר פרוטונציה דומה(‪.‬‬
‫בתמונה מספר ‪ 1.5‬נראה הרטינל‪ ,‬הבולע את האור‪ ,‬עם חיבור לאמין טעון חיובית )כנמצא בחלבון(‪.‬‬
‫מחקרי פלואורסצנציה ובליעה של ‪ PSB‬עם בוטיל אמין בתמיסות שונות עם פרוטונציה ובהעדרה‬
‫‪18,17,16‬‬
‫הובילו למסקנה כי סביבה פולארית מעלה את הסיכוי לאיזומריזציה‪ .‬זמן החיים שנמדד למצב‬
‫הפלורסצנטי בתמיסת מתנול היה קצר מ‪ 195ps-‬והיו שטענו כי זמן דעיכה זה תלוי באורך הגל‪ ,‬ולצמיגות‬
‫הממס כמעט ואין השפעה על זמן החיים והניצולת של המצב המעורר‪ .20‬פליטת המצב המעורר דועכת תוך‬
‫‪ 2.5-5ps‬בעוד בליעתו דועכת בי‪-‬אקספוננציאלית עם קבועי דעיכה של ‪ 2.5-5ps‬ושל ‪ .10-12ps‬הוסק‬
‫כי קיים מחסום במצב המעורר שנגרם מתנועות אלקטרוניות תוך מולקולאריות‪ ,‬והפליטה של המצב‬
‫המעורר שייכת למעבר ‪ (1Ag-1Bu) S1-S0‬וזה בניגוד למודל הרמות שניתן ל‪ 21carotene-‬בו דווח על‬
‫רמת ‪ S1‬חשוכה‪.‬‬
‫‪ 22Hamm et al‬חקרו את ה‪ PSB-‬בתמיסת אתנול בספקטרוסקופית ‪ pump) pump-probe‬ב‪400nm -‬‬
‫ו‪ probe-‬רחב( וסיפקו ספקטרום טרנזיינטי בזמנים שונים בתחום ספקטראלי של ‪.430nm-740nm‬‬
‫מספר מאפיינים ספקטראליים דווחו‪:‬‬
‫‪) bleach .1‬חוסר באוכלוסיית מצב היסוד( באורכי הגל הקצרים מ‪.460nm-‬‬
‫‪ .2‬פליטה מאולצת המיוחסת למצב האלקטרוני המעורר ‪ S1‬באורכי הגל הארוכים מ‪.575nm-‬‬
‫‪ .3‬בליעה המיוחסת למצב האלקטרוני המעורר הנמצאת בין ה‪ bleach-‬לבין הפליטה המאולצת‬
‫)בתחום הביניים ‪.(460nm-575nm‬‬
‫בתוצאותיהם המצב המעורר מתחיל מבליעה רחבה סביב ‪ 530nm‬הנראת "בזמן אפס" )זמן אפס תלוי‬
‫אורך פולס(‪ .‬לאורך הזמן‪ ,‬פיק בליעת המצב המעורר הוסט מעט לכחול בעוד פיק הפליטה של מצב זה‬
‫הוסט מעט לאדום‪ .‬לאחר כ‪ 30ps-‬מושלמת דעיכת המצב המעורר שיוחסה למעבר מ‪ S1-‬ל‪ .S0-‬ההתאמה‬
‫הקינטית לדעיכה מן המצב המעורר הינה בי‪-‬אקספוננציאלית והניבה קבועי זמן של ‪ 2ps‬ו‪.7.5ps-‬‬
‫לטענתם‪ 22‬ריאקצית הדעיכה האלקטרונית לא יכולה להיות מתוארת בסכמת שתי רמות פשוטה ועל מנת‬
‫להשלים את האינפורמציה הם חקרו באותם תנאים את דוגמא זו גם בספקטרוסקופית ‪ IR‬ברזולוציה‬
‫‪8‬‬
‫‪9‬‬
‫הנמוכה מפיקו‪-‬שניו ת‪ . 23‬שני הקבועים הקינטיים לדעיכת המצב המעורר שנצפו בניסוי ה‪ IR-‬הם‬
‫)בגבולות הדיוק הניסיוני( אותם קבועים שנצפו בתחום הנראה‪ .‬הדמיון בתוצאות הוסבר ע"י מודל המניח‬
‫מולקולות חמות בו התהליך המהיר משקף מולקולות במצב יסוד חם ‪ S0,hot‬שנוצרות ממצב ‪.S1relaxed‬‬
‫בשל חילופי אנרגיה בין המולקולות לממס המולקולות מתחילות להתקרר‪ ,‬בהתאם לזמן הקירור ‪ . tcool‬בו‬
‫בזמן‪ ,‬מולקולות חמות נוספות נוצרות בתהליך איטי יותר )‪ (7.2ps‬היוצר תוצר אור קר‪ ,‬המתאר את‬
‫ירידת הטמפרטורה‪.‬‬
‫סכמת המודל‪:‬‬
‫‪τ cool‬‬
‫‪S 0,hot ‬‬
‫‪→ S 0,cold‬‬
‫‪τ1 = 2 ps‬‬
‫‪‬‬
‫→‬
‫‪τ 2 = 7.2 ps‬‬
‫‪‬‬
‫→‬
‫‪hυ‬‬
‫‪S0 ‬‬
‫‪→ S1 ‬‬
‫‪→ S1,relaxed‬‬
‫‪τ 1 < τ cool < τ 2‬‬
‫מודל זה סיפק הסבר לדעיכה הבי‪-‬אקספוננציאלית בתהליך ההיפוך הפנימי מ‪ S1-‬ל‪ ,S0-‬כך שלטענתם‬
‫דעיכה זו נובעת מהצימוד התרמי של הכרומופור והסביבה כאשר ספקטרוסקופית ‪ IR‬שימשה כמדחום‬
‫תוך מולקולארי‪.‬‬
‫‪ 24Hou et al‬חקרו בספקטרוסקופיה מהירה של פמטושניות הן את ה‪ PSB-‬הטבעי והן אנלוגים נעולים‬
‫שלו‪ .‬מחקר זה השווה בין ה‪ PSB-‬הטבעי לשני האנלוגים‪ ,‬בהם תזוזת העיוות ‪ C13=C14‬נחסמה ע"י מבנה‬
‫טבעתי מחומש במצב ‪ cis‬ובמצב ‪ .trans‬נדגיש כי‪ ,‬בניגוד לחלבון‪ ,‬נעילה זו אינה חוסמת סיבוב סביב‬
‫קשרים כפולים אחרים כגון‪ C11=C12 :‬או ‪ C9=C10‬ובתמיסה יתכנו איזומרים נוספים‪ .25‬מטרתם הייתה‬
‫להשיג מדידות של דינאמיקת ההיפוך הפנימי בכרומופורים אלו ולהשוותם לפיגמנטים מבחינת‬
‫התנהגויותיהם הפוטופיזיקליות כגון‪ :‬ניצולת קוונטית וסקלת זמן תגובת האור המוקדמת‪ ,‬ובכך להעריך‬
‫את תפקיד החלבון בקטליזת מעבר האנרגיה בבקטריורודופסין‪ .‬בזמן האפס הם צפו בבליעה סביב‬
‫‪ .600nm‬המצב הפלורוצנטי של ה‪ PSB-‬הטבעי אופיין ע"י יצירת בליעה רחבה סביב ‪ 490nm‬ופליטה‬
‫סביב ‪ 680nm‬אשר דועכים תוך מספר פיקו‪-‬שניות‪ .‬הם הציגו נתונים קינטיים עבור ‪trans-PSB‬‬
‫באתנול‪ ,‬ביונים נגדיים שונים ועבור האנלוגים הנעולים של ‪ .PSB‬הם צפו במספר מאפיינים עיקריים‪:‬‬
‫‪ .1‬בין ‪ 50-100fs‬מתקיימת רלקסציה ראשונית מחוץ לתחום פרנק קונדון‪.‬‬
‫‪ .2‬הדעיכה הפלואורסצנטית בי‪-‬אקספוננציאלית עם קבועי זמן של ‪ 1-2ps‬ו‪.4-7ps-‬‬
‫‪ .3‬בפליטת המצב הפלואורסצנטי ישנם מודולציות ספקטראליות‪.‬‬
‫מאפיינים אלו כמעט ולא הושפעו מנעילת הקשר ‪ .C13=C14‬נעילת הקשר הכפול ‪ C13=C14‬ב‪ PSB-‬אינה‬
‫משפיע על קצב ההיפוך הפנימי שנותר עם זמני דעיכה של ‪ t1=1-2ps‬ו‪ .t2=4-7ps-‬הממצאים שהתקבלו‬
‫התאימו לתוצאות של ‪Hamm‬‬
‫‪22‬‬
‫שתוארו קודם ואף תאמו מאוד את מחקריהם של ‪Logunov‬‬
‫‪20‬‬
‫ו‪-‬‬
‫‪.19Kandori‬‬
‫‪ 26Zgrablic et al‬חקרו את דינאמיקת פליטת המצב המעורר של רטינל ה‪ all trans PSB -‬בניסוי‬
‫פלואורסצנצית ‪ up-conversion‬ברזולוציה של ‪ 120fs‬עבור ממסים פרוטיים ואפרוטיים עם צמיגות‬
‫ופולאריות שונה בכדי להבין את השפעת החלבון על הניצולת והסלקטיביות‪ .‬ניסוי זה מטרתו להפריד את‬
‫הדינאמיקות התוך מולקולאריות )היפוך פנימי‪ ,‬איזומריזציה( מאלו החוץ מולקולאריות )תגובה‬
‫דיאלקטרית או צמיגות( וכך להבין את המשחק הפנימי ביניהם‪ .‬ספקטרום המצב העמיד הציג תזוזות‬
‫‪9‬‬
‫‪10‬‬
‫‪ stokes‬גדולות‪ ,‬והצביע על רלקסציה תוך מולקולארית‪ .‬הצרה ספקטראלית דרמטית נצפתה בסקאלת זמן‬
‫של ‪ 150fs‬ויוחסה למעבר ממצב ‪ S2‬ל‪ .S1-‬הם זיהו שני פסי פליטה שאינם מיוחסים למולקולות חמות‬
‫במצב המעורר )בניגוד להצעתו של ‪ (23Hamm‬או לתגובה דיאלקטרית מהירה של הממס אלא יוחסו‬
‫למעברים ‪ S1-S0‬ו‪ .S2-S0-‬הראשון זמנו ארוך והוא בעל אנרגיה נמוכה שדועכת מולטי אקספוננציאלית‬
‫והשני בתחום האנרגיה גבוהה‪ ,‬זמנו קצר )יוחס להיפוך הפנימי מ‪ S2-‬ל‪ .(S0-‬קבועי הדעיכה המולטי‪-‬‬
‫אקספוננציאלית שהם קיבלו היו רכיב מהיר של ‪ 0.5-0.65ps‬המשפיע על האכלוס מחדש של מצב היסוד‬
‫ומקושר למסלול הלא איזומרי )שאינו ריאקטיבי( לטענתם‪ ,‬ושני רכיבי דעיכה ארוכים יותר שכמעט זהים‬
‫לקבועים שמצאו החוקרים האחרים‪ ,24,22,20,19‬ויוחסו לתזוזת העיוות שמובילה לאיזומריזצית אור סביב‬
‫קשרי פחמן ליצירת איזומרי ‪) cis‬נדגיש כי רוב המולקולות המעוררות ברטינל כלל לא עוברות‬
‫איזומריזציה(‪ .‬לטענתם זה ההסבר לזמני הדעיכה השונים שהם צפו ברטינל‪ .‬בתוצאותיהם הדעיכה‬
‫הפלואורסצנטית הושלמה לאחר ‪ 15ps‬וערוצי הדעיכה השונים מראים תלות מינימאלית בצמיגות ובקבוע‬
‫הדיאלקטרי של הממסים ולמעשה לא ניכרת נטייה ברורה בין הממסים‪ ,‬לכן הדינאמיקות בממס נשלטות‬
‫ע"י מנגנונים תוך מולקולאריים‪ .‬מסקנתם מכך היא שבחלבון השפעות סטריות שולטות בסלקטיביות של‬
‫האיזומריזציה‪ ,‬בעוד ה‪ PSB-‬אינו מושפע מכלוב הממס ולכן חופשי לנוע בתמיסה‪ ,‬כך שתזוזות‬
‫אמפליטודה גדולות מתאפשרות והסלקטיביות סביב הקשר הכפול הקריטי נעלמת‪.‬‬
‫נציין שעל אף הממצאים הרבים‪ ,‬טרם סופק ההסבר לדעיכה הבי‪-‬אקספוננציאלית ומספר הסברים ניתנו‬
‫לדעיכה הבי‪-‬אקספוננציאלית של ‪ PSB‬בתמיסה‪:‬‬
‫‪.1‬קירור אוכלוסיית המצב המעורר במהלך תהליך ההיפוך הפנימי‪.23‬‬
‫‪.2‬קיומם של שתי אוכלוסיות שונות )איזומרים שונים‪ (26‬שניתנות להבחנה קינטית‪.‬‬
‫‪.3‬הבי‪-‬אקספוננציאליות נובעת מטופולוגית המשטח במצב המעורר‪ .‬לדג'‪ :‬קיומו של מחסום לאורך מסלול‬
‫האיזומריזציה יכול להוביל לדעיכה בי‪-‬אקספוננציאלית‪.20‬‬
‫סיבת הדעיכה הבי‪-‬אקספוננציאלית חשובה עקב העובדה שמדובר בכרומופור המשותף לכלל החלבונים‬
‫הרטינליים‪.‬‬
‫הוסכם כי ל‪ PSB-‬בתמיסה מצב מעורר המאופיין ע"י בליעה ופליטה שקצב דעיכתו הינו בסקאלת זמן של‬
‫פיקושניות אך מודל הרמות‪ ,‬דינאמיקת ומבנה המצב המעורר אינם ידועים ומחקרים החושפים ממצאים‬
‫אלו חשובים כיוון שחקר ה‪ PSB-‬בתמיסה עשוי להוביל להבנת הדינאמיקה הראשונית ותפקידו של‬
‫החלבון בשלבים מוקדמים אלו‪.‬‬
‫‪10‬‬
‫‪11‬‬
‫‪ .1.2.2‬בקטריורודופסין‬
‫מחקרים רבים התמקדו באירועים המוקדמים בבקטריורודופסין בכוונה לפענח את התרגום היעיל של‬
‫אנרגית הפוטון לפעילות ביולוגית ולקבוע את סקלת הזמן המדויקת לאיזומריזציה‪ .4‬מחקרי בליעה‬
‫טרנזיינטים הראו כי בליעת הפוטון גוררת שינויים ספקטראלים דרמטיים‪ ,‬הופעה של בליעה בכחול ב‪-‬‬
‫‪ 460nm‬יחד עם פליטה מאולצת רחבה בתחום ה‪ IR-‬הקרוב שמרכזה ב‪ .850nm-‬שינויים אלו יוחסו‬
‫למצב המעורר שסומן ב‪ .27 I460nm-‬מצב זה מוביל לשלב אדום המסומן ב‪ J625nm-‬שמתפתח ליצירת חומר‬
‫הביניים ‪ . 28K610‬עבודות נוספות‪ ,29, 4,6‬קבעו זמני חיים של ‪ 0.5ps‬ו‪ 4ps-‬למעברים ‪ IJ‬ו‪JK-‬‬
‫בהתאמה‪ .‬לאחרונה‪ ,‬ניסוי ‪ 30Kerr-gate‬חשף פליטה ספונטנית רחבה ועמוקה‪ ,‬המתחילה ב‪630nm-‬‬
‫ומרכזה ב‪ .720nm-‬הפליטה המאולצת הרדודה שהתקבלה ואי התאמתה לפליטה הספונטנית הוסברה ע"י‬
‫כך שחלק מספקטרום הפליטה בוטל על ידי פיק בליעה עוצמתי השייך למצב המעורר ומצוי‬
‫בסביבות ‪ .31,32720nm‬מאפיין עיקרי נוסף שהתגלה בניסוי ה‪ 30Kerr-gate-‬היא סקאלת זמן מהירה של‬
‫כ‪ 200fs-‬שיוחסה לסידור מחדש על המשטח הראקטיבי‪ .‬סקאלת זמן מהירה דומה נצפתה ל‪PSB-‬‬
‫בתמיסה אך שם היא יוחסה למעבר ממצב ‪ S2‬ל‪ .S1-‬ניסויים ברזולוצית זמן גבוהה‪ 29‬הציגו מעבר מהיר‬
‫מפליטה לבליעה בתחום בו ‪ J‬בולע המתרחש גם כן תוך ‪ 200fs‬ויוחס לאיזומריזציה‪.‬‬
‫גילוי המצב הפלורוסנטי‪ ,I460nm ,‬הוביל לסדרת שאלות חדשות‪ :‬מהי סקלת הזמן המדויקת לאיזומריזציה?‬
‫האם המצב הפלורוסצנטי מאופיין היטב )מבנה ואנרגיה( ומה חשיבותו לתהליך? אתגר עיקרי היה לספק‬
‫מנגנון לאירועים המוקדמים בבקטריורודופסין‪ .‬חלק מהמנגנונים הציעו פיצול למסלול פעיל שמוביל‬
‫לתוצרי ביניים במעגל האור‪ ,‬ולמסלול לא פעיל שמחזיר את האוכלוסייה לקונפיגורציה המקורית במצב‬
‫היסוד‪ .‬המודלים העיקריים שהוצעו הם‪:‬‬
‫‪ .1‬בשלב הראשוני במודל מתקיימת תנועת עיוות מחוץ לאזור פרנק‪-‬קונדון לאורך קואורדינטת הקשר‬
‫הכפול ‪)35,34,33,29C13=C14‬התנועה מלווה בויברציות ובהרפיה(‪ .‬תנועה זו מובילה למצב הפלואורסצנטי‪,‬‬
‫‪ , I460‬העובר עיוות חלקי )‪ (~900‬בדרך לאיזומריזציה שמסתיימת במצב הביניים ‪ (~1800) J‬המצוי על‬
‫המשטח היסודי‪ .‬מודל דומה הוצע להלורודופסין‪ 36‬ולרודופסין‪.37‬‬
‫‪ .2‬במודל זה ישנו פיצול לשני מצבים פלואורסנטים‪ ,‬האחד קשור למעגל האור ולעיוות סביב הקשר‬
‫הכפול הקריטי והאחר מוביל למסלול לא ריאקטיבי‪ .‬מודל זה הוצע ע"י ‪Polland‬‬
‫הלורודופסין )‪ (HR‬ובהססנות ע"י ‪ Kandori‬עבור בקטריורודופסין‪.40‬‬
‫‪11‬‬
‫‪38‬‬
‫‪ ,‬ו‪Arlt-‬‬
‫‪39‬‬
‫עבור‬
‫‪12‬‬
‫‪ .3‬במודל זה שהוצע ע"י ‪ 41Kobayashi et al‬המצב הפלואורסצנטי כלל אינו נמצא במסלול הפעיל‪.‬‬
‫* מודלים מורכבים יותר אף עירבו שלושה מצבים אלקטרונים‪ 44,43,42‬אולם חישובים קוונטים הטילו ספק‬
‫בכך‪.‬‬
‫‪ 45Ye et al‬בחנו מודלים אלו ע"י השוואת האירועים הספקטרוסקופים הראשונים ברזולוצית פמטו‪-‬‬
‫שניות בבקטריורודופסין טבעי ובשני אנלוגים סינטטיים‪ ,‬בהם חוברה טבעת מחומשת קשיחה במצב ‪cis‬‬
‫או ‪ trans‬הבולמת את סיבוב הקשר ‪ .C13=C14‬עד כה‪ ,‬שינוי כזה חסם פעילות ביולוגית והדגיש את‬
‫החשיבות המכרעת של האיזומריזציה לפעילות האור של בקטריורודופסין‪ .46‬מחקר אנלוגים אלו הכרחי‬
‫לבחינת האיזומריזציה כי מניחים שהדינאמיקה תישאר זהה עד שסיבוב סביב הקשר ‪ C13=C14‬יידרש‬
‫להמשך התגובה‪ .‬התוצאות הראו כי המצב הפלורוסנטי ‪ I‬המאופיין בבליעה ב‪ 460nm-‬ובפליטה ב‪-‬‬
‫‪ 850nm‬ניכר גם בפיגמנטים הנעולים‪ .‬אם כי‪ ,‬בבקטריורודופסין הטבעי הבליעה והפליטה דעכו תוך ‪1ps‬‬
‫לבליעה אדומה סביב ‪ 625nm‬שיוחסה לחומר הביניים ‪ J‬המצוי על המשטח האלקטרוני היסודי וזאת‬
‫בהתאמה עם דיווחים קודמים‪ 48,47‬בעוד האנלוגים שלא הובילו לתוצר הציגו זמן דעיכה ארוך בהרבה‬
‫‪ 11ps‬ו‪ 19ps-‬לאכלוס המצב היסודי מחדש‪ .‬השוואת תוצאות אלו ל‪ PSB-‬בתמיסה ולאנלוגים שלו חשפה‬
‫כי בעוד בבקטריורודופסין ההיפוך הפנימי מתרחש בזמן דעיכה של ‪ ,0.5ps‬ונעילת הקשר ‪C13=C14‬‬
‫בבקטריורודופסין מעלה זמן זה‪ ,‬נעילת הקשר הכפול ‪ C13=C14‬ב‪ PSB-‬אינה משפיע על קצב ההיפוך‬
‫הפנימי שנותר עם זמני דעיכה של ‪ t1=1-2ps‬ו‪.t2=4-7ps-‬‬
‫לאור התצפית בבקטריורודופסין שהבליעה והפליטה‪ ,‬המיוחסים למצב הפלואורסצנטי‪ ,‬נצפו גם באנלוגים‬
‫הסינטטיים הוסק כי המצב הפלואורסצנטי אינו יכול להסתובב בצורה ניכרת ולעבור איזומריזציה בניגוד‬
‫למודלים ‪ 1‬ו‪ 2-‬שהוצעו‪ ,‬ורעיון האיזומריזציה בשלב הפלואורסצנטי נשלל ויש צורך במודל חדש‬
‫לאירועים הראשונים בבקטריורודופסין‪ .‬גם בניסוי זה נצפה רכיב מעבר מהיר מבליעה לפליטה באזור ה‪-‬‬
‫‪) 660nm‬אזור בליעת התוצר ‪ (J‬ולטענתם רכיב מהיר זה אינו משקף את האיזומריזציה ויחוסו טרם‬
‫הובהר‪ .‬ניסוי זה רמז כי הדעיכה מ‪ I-‬ל‪ J-‬עשויה לשקף את השלב של איזומריזצית הרטינל בחלבון‬
‫הטבעי‪ ,‬ונראה כי האיזומריזציה בחלבון מתרחשת תוך ‪ .0.5ps‬עובדה זו אושרה בניסוי בספקטרוסקופית‬
‫‪ IR‬שקבע כי מצב ‪ J‬הינו האיזומר‪ 8‬אם כי יש הטוענים כי ‪ J‬אינו האיזומר המצוי על המשטח היסודי‪.49‬‬
‫מה קורה במצב ה‪) I-‬מצב מעורר(? חישובי ‪ 51,50ab-intio‬הובילו למסקנה כי בחלבון הרטינל תנועת‬
‫המצב המעורר הראשוני ממצב ‪ S1FC‬נשלטת ע"י מתיחה והשינויים הספקטראליים הראשונים במצב‬
‫המעורר מערבים תזוזה שאינה עיוות‪ Garavelli et al .‬פירשו את התזוזות הראשוניות כמתיחה של‬
‫קשרי ‪ C=C‬בשלד הפוליאן‪ .‬ניסוי רזוננס ראמאן הצביע אף הוא על שינויים בתדירות מתיחת ‪C=C‬‬
‫במצב הפלואורסצנטי‪ .4‬מחקר חלבון הרודופסין הראה כי גם שם אין עיוות סביב הקשר הקריטי ביציאתו‬
‫‪12‬‬
‫‪13‬‬
‫מאזור פרנק‪-‬קונדון‪ .54,53,52‬קושי רב היה לייחס באופן חד משמעי מודולציות ספקטראליות למצב המעורר‬
‫של חלבוני הרטינל‪ 55‬ואנו נרחיב על כך בהמשך )‪.(1.2.2.5‬‬
‫למרות תגליות אלו לא ניתן היה לקבוע האם המצב הפלואורסצנטי ‪ , I,‬מצוי במסלול הריאקטיבי או לאו‪,‬‬
‫והאם השינויים הספקטראליים הנצפים קשורים בבירור לערוץ הפעיל‪ .‬ניסויי ‪ pump-probe‬ישירים‬
‫בפמטושניות לא נתנו תשובות שאין להפריכם‪ Ruhman et al .‬ביצעו ניסוי המערב שלושה פולסים‬
‫מהירים‪ .57‬מטרות הניסוי היו‪ .1 :‬לייחס בוודאות את המצב הפלואורסצנטי כחלק ממעגל האור‪ ,‬באמצעות‬
‫פולסי ‪ probe‬ב‪ 650nm-‬שעוקבים אחר מצב הביניים ‪ ,K‬כך שהאוכלוסייה המוחסרת מן המצב‬
‫הפלואורסצנטי תושווה עם יצירת מצב ‪ K‬המצוי בהמשך המעגל‪.‬‬
‫‪ .2‬לבחון באמצעות פולסי ‪ probe‬ב‪ 900nm-‬את אופיו של המצב הפלואורסצנטי‪.‬‬
‫זו אינה הפעם הראשונה שמשתמשים בפולס מעורר כפול למעקב אחר התפתחות המצב המעורר‬
‫בחלבונים רטינלים‪ . 56, 37,32‬הייחודיות בניסיונם הוא שפולס העירור השני‪ ,‬הקרוי ‪ ,dump‬לא עורר‬
‫למצבים מעוררים גבוהים יותר אלא הוריד אוכלוסיה הבלעדית למצב המעורר חזרה למצב היסוד‪ .‬שיטה‬
‫זו מכונה ‪ -(SEP) Stimulated Emission Pumping‬שאיבת פליטה מאולצת‪ .‬הם השתמשו בפולס‬
‫מעורר ראשון ב‪ 535nm-‬לאתחול הריאקציה‪ .‬ובפולס מעורר שני ב‪ 1070nm-‬לשאיבת הפליטה‬
‫המאולצת מן המצב הפלואורסצנטי‪ ,‬פולס זה ניתן לשינוי בזמן ההגעה שלו‪ .‬הפולס השלישי נעשה או ב‪-‬‬
‫‪ 900nm‬לחקר אוכלוסיית המצב הפלואורסצנטי או ב‪ 650nm-‬לחקר ההבדל בבליעה של מצב הביניים‬
‫‪.K590‬‬
‫שני מודלים עיקריים ניתנו לדעיכת המצב הפלואורסצנטי‪: I ,‬‬
‫‪.1‬המודל הדינאמי‪ -‬כל המצבים המעוררים מתפתחים ברציפות‪ ,‬ריכוז המצבים המעוררים אינו משתנה‪,‬‬
‫אך חתך הפעולה לפליטה משתנה‪.‬‬
‫‪.2‬המודל הקינטי )תרמי(‪-‬ריכוז המצבים המעוררים דועך אקספוננציאלי‪ ,‬חתך הפעולה לפליטה זהה‬
‫והאוכלוסייה הנפלטת בעלת מבנה קבוע‪.‬‬
‫ההבחנה בין המודלים נעשתה ספקטרוסקופית בניסוי שלושה פולסים עם פולס ‪ dump‬בהשהיה משתנה‪.‬‬
‫במקרה הקינטי הסיכוי של אילוץ הפליטה צריך להיות בלתי תלוי בהשהיית הזמן‪ ,‬ופולס ה‪ dump-‬מרוקן‬
‫אחוז מהאוכלוסייה שצריך להצטמצם עם ההופעה הספקטראלית של ‪ I460‬בעוד שלאחריו הדעיכה תדעך‬
‫עם אותו קבוע קצב לאותו מקום‪ ,‬בעוד במודל הדינמי הדעיכה לאחר הריקון שונה‪.‬‬
‫תמונה מס' ‪ -571.6‬מציגה את‬
‫דעיכת הפליטה בניסוי שלושה‬
‫פולסים כאשר ה‪ dump-‬מגיע‬
‫בהשהיית זמן שונה‪ .‬ניתן‬
‫לראות שלמרות הריקון של‬
‫ה‪ dump-‬בזמנים שונים‬
‫הפליטה מורכבת מחדש וזהה‬
‫לכל השהייה‪.‬‬
‫‪13‬‬
‫‪14‬‬
‫התוצאות הנראות בתמונה ‪ 1.6‬מראות דעיכה לאותו המקום ללא תלות בזמן הגעת ה‪ dump-‬ולכן נראה‬
‫כי ההסתברות והדינאמיקה של הפליטה זהה בזמן החיים של המצב הפלואורסצנטי‪ ,‬והתוצאות תואמות את‬
‫המודל הקינטי‪ .‬תוצאה זו אפשרית רק כאשר מבנה המצב הפלואורסצנטי יציב‪ ,‬קבוע‪ ,‬שומר על ספקטרום‬
‫הבליעה והפליטה שלו‪ ,‬מוגדר היטב‪ ,‬ושונה משמעותית מהפליטה הספונטאנית‪ .‬אולם קשה להאמין‬
‫שמבנה יציב מתפתח מהר במולקולה כזו גדולה‪ .‬יתכן כי קיים מחסום בדרך לאזור החתך הקוני‪,‬שעוצר‬
‫את שינוי המבנה לפני התרחשות האיזומריזציה‪.42‬‬
‫האופי הקבוע של המצב הפלואורסצנטי חיזק עוד יותר את השאלה האם מצב זה שייך למעגל האור?‬
‫כדי לבחון זאת עקבו החוקרים אחר שלב ביניים מאוחר במעגל ‪ -‬שלב ‪ .K‬חישוב ריקון האוכלוסייה‬
‫הפלואורסצנטית תאם את ההפחתה שהתקבלה במצב המאוחר‪ K-‬ששייך למעגל האור )בגבול שגיאה של‬
‫‪ .(10%‬ממצא זה סיפק הוכחה ישירה לכך ש‪ I-‬הינו מצב ביניים במעגל האור של הבקטריורודופסין‪.‬‬
‫ניסוי זה אומנם סיפק מידע משלים על דינאמיקת המצב המעורר‪ 57‬והראה כי המצב הפלורוסנטי הוא תוצר‬
‫ביניים במעגל האור אך שאלת המתרחש במצב הפלואורסצנטי נותרה ללא מענה‪.‬‬
‫נסכם את הממצאים המוסכמים )על פי רוב החוקרים( עבור המתרחש בשלבים הראשונים של מעגל האור‬
‫בבקטריורודופסין‪:‬‬
‫‪.1‬האיזומריזציה אינה התהליך הראשוני במעגל האור )בניגוד למה שנטען בעבר(‪ ,‬מצב מעורר )‪(I‬‬
‫המאופיין ע"י פליטה ובליעה מקדים אותה ומוביל אליה‪.‬‬
‫‪ .2‬המצב הפלורוסנטי )‪ (I‬מצוי בקונפיגורצית ‪ all-trans‬ומוביל למצב ‪ .J‬מצב ‪ J‬מצוי על המשטח היסודי‬
‫והאיזומריזציה מתרחשת תוך ‪ 0.5ps‬במעבר מ‪ I-‬ל‪ .J-‬היווצרותו של המצב הפלואורסצנטי ‪ I‬אינו מחייב‬
‫עיוות סביב הקשר הכפול ‪ C13=C14‬ובמצב זה מעורבת תזוזת מתיחה בשלד הרטינל‪.‬‬
‫יחד עם הסכמות אלו‪ ,‬החוקרים לא סיפקו מודל רמות לאירועים הראשונים במעגל האור של‬
‫בקטריורודופסין ולא ברור מה מתרחש במצב ה‪ ?I-‬דיווחים סותרים התקבלו עבור דינאמיקת המצב‬
‫המעורר וטרם נמצא מודל המבהיר מה מבנה המצב המעורר? כמה משטחי פוטנציאל מעורבים בתהליך‬
‫ומה הטופולוגיה שלהם?‬
‫‪14‬‬
‫‪15‬‬
‫‪ .1.2.3‬הלורודופסין‬
‫שני חלבוני הלורודופסין עיקריים נחקרו ‪ 58sHR‬ו‪ .59pHR -‬האירועים המוקדמים בהלורודופסין נחקרו‬
‫הן בספקטרוסקופית ‪ pump-probe‬במרחב הזמן והן בספקטרוסקופיה ויברציונית ב‪ . 60IR -‬בתחילה‬
‫מחקרים אלו בוצעו על ‪ 41,40, 39,36sHR‬ולאחרונה נחקרו אירועים אלו גם עבור ה‪ .61pHR-‬בשני המקרים‬
‫שנחקרו נוצר תוצר ה‪ HR600nm-‬בסקלת זמן של פיקו‪-‬שניות‪ .‬כמו כן‪ ,‬המסלול לתוצר עובר דרך מצב‬
‫מעורר המאופיין ספקטרוסקופית ע"י בליעה חזקה בעלת מבנה באזור ה‪ 40460nm-‬ופליטה רחבה ורדודה‬
‫שנמשכת ל‪ IR-‬הקרוב‪ Kobayashi .36‬בעבודתו‪ 41‬על ‪ sHR‬חשף כי גם הפליטה בעלת מבנה דו דבשתי‪.‬‬
‫עבודות אלו‪ ,‬קבעו כי למצב המעורר דעיכה בי‪-‬אקספוננציאלית המתאימה לקבועים של ‪ ~1.5ps‬ו‪.~5ps-‬‬
‫המודל הפשוט והראשוני שניתן להלורודופסין הינו‪:36‬‬
‫במודל זה לאחר עירור פרנק‪-‬קונדון המולקולות המעוררות עוברות רלקסציה למצב ש"מ מעורר‬
‫)‪ hR*(EQ‬לאורך קורדינטת הקשר הכפול ‪ .C13=C14‬לאחר שלב זה יש פיצול לשני מסלולים האחד‬
‫מוביל לתוצר והאחר חזרה למצב ההתחלתי‪.‬‬
‫אולם הממצאים הניסיוניים ב‪ .1 :sHR-‬דעיכת המצב המעורר הבי‪-‬אקספוננציאלית‪ .2 .‬הניצולת‬
‫הקוונטית הנמוכה לתהליך האיזומריזציה )‪ (30%‬לעומת ‪ .3 .(65%) BR‬מעבר מהיר )‪ (~0.1ps‬מפליטה‬
‫לבליעה באזור יצירת התוצר )‪ (640nm‬בטרם הושלמה דעיכת הפליטה המאולצת‪ ,‬הובילו את החוקרים‬
‫להסכמה כי המנגנון המתקיים ב‪ 39sHR-‬הוא‪:‬‬
‫במנגנון זה הדעיכה הבי‪-‬אקספוננציאלית מתייחסת לשתי קורדינטות שונות‪ .‬לאחר עירור פרנק קונדון‬
‫מתקיימת רלקסציה של המצב המעורר תוך ‪ , ~150fs‬המצב המעורר מתפצל לשתי אוכלוסיות שונות‬
‫הניתנות להבחנה‪ .‬התהליך המהיר בדעיכה )‪ (1.5ps‬מוביל ליצירת תוצר שזוהה כמופיע בסקלת זמן זו‪,‬‬
‫והתהליך הארוך )‪ (5ps‬מוביל למסלול לא פעיל שמחזיר את האוכלוסייה לקונפיגורציה המקורית במצב‬
‫‪15‬‬
‫‪16‬‬
‫היסודי‪ .‬אופן חלוקת האוכלוסיות במצב המעורר הוסק מיחס מקדמי הדעיכה )אמפליטודות זהות התקבלו‬
‫עבור שני קבועי הדעיכה כך שיחס האמפליטודות ‪ (1‬והאוכלוסיות התחלקו באופן שווה‪.‬‬
‫‪Nakamura et al‬‬
‫‪61‬‬
‫חקרו את ‪ pHR‬תוך שימוש ביוני הליד שונים‪ ,‬הם גילו כי קבועי הדעיכה ויחסי‬
‫האמפליטודות משתנים בהתאם ליון ההליד‪ ,‬ככל שרדיוס היון גדול יותר זמן הדעיכה מתארך‪ ,‬הם ייחסו‬
‫את השינויים בזמן דעיכת המסלול הלא ריאקטיבי לשינויים גיאומטריים המעורבים בתהליך הרלקסציה‬
‫ותלויים בסוג היון‪ .‬כמו כן‪ ,‬הניצולת הקוונטית לאיזומריזציה גבוהה יותר במקרה של ‪ pHR‬והיא גם כן‬
‫תלויה בסוג היון‪ ,‬כאשר לכלוריד היא הנמוכה ביותר )הניצולת של כל יון הוסקה גם כאן מיחס‬
‫האמפליטודות(‪ .‬לטענתם קיים מחסום‪ ,‬ויותר משני מצבים מעורבים בתהליך )בניגוד למה שהוסכם עד כה‬
‫עבור ה‪ ,(BR-‬על אף ההבדל בניצולת הקוונטית עבור ‪ pHR‬הם אימצו מנגנון דומה לזה שניתן ל‪.sHR-‬‬
‫במקרה זה‪ ,‬בניגוד ל‪ ,BR-‬החוקרים הגיעו להסכמה לגבי המודל‪ ,‬והמנגנון שניתן הסביר את הממצאים‬
‫שהתקבלו )תאם לנתוני הדעיכה הבי‪-‬אקספוננציאלית שהתקבלה ולניצולת הקוונטית הנמוכה יחסית‬
‫‪ .(30%‬נדגיש כי האנלוגיה שנעשתה בין שני סוגי ה‪ HR-‬אינה ברורה‪ ,‬והסיבה לבי‪-‬אקספוננציאליות‬
‫הינה נושא קריטי‪ ,‬שכן דעיכה מולטי‪-‬אקספוננציאלית משותפת לכלל החלבונים הרטינליים וה‪PSB-‬‬
‫בתמיסה מציג קבועי דעיכה דומים כך שייתכן ומדובר במנגנון דומה‪ .‬לאור חשיבות העניין נרצה לבחון‬
‫מחדש את המנגנון שהוצע‪ ,‬על ידי ביצוע ניסוי דומה לזה שבוצע עבור ‪ .(SEP) BR‬כמו כן‪ ,‬זמן דעיכה‬
‫מהיר במיוחד נצפה בחלבונים רטינליים נוספים ויש להבין מה בדיוק מתרחש בזמן מהיר זה והאם הוא‬
‫קריטי במנגנון‪.‬‬
‫‪16‬‬
‫‪17‬‬
‫‪ .1.2.4‬השפעת החלבון הרטינלי על הפוטוכימיה בבקטריה‬
‫למרות שהרטינל מהווה את אבן היסוד בכל החלבונים הרטינליים והתהליך הראשוני מתרחש בו‪,‬‬
‫הפעילות והתפקיד של כל חלבון רטינלי שונה‪ .‬על אף הדמיון במבנה השלישוני ובעובדה כי המנגנון‬
‫מתחיל בבליעת אור ואיזומריזציה של הכרומופור ניכרים הבדלים מהותיים בתהליך הראשוני במשפחת‬
‫חלבונים זו‪.‬‬
‫בטבלה הבאה מובאת השוואה בין חלבונים רטינליים שונים מבחינת קואורדינטת התגובה‪ -‬מעבר מ‪all -‬‬
‫‪ trans‬לאיזומר ה‪ ,(bond) cis-‬הניצולת הקוונטית לאיזומריזציה ) ‪ ,( φ‬זמן דעיכת המצב המעורר )קצב‬
‫ההיפוך הפנימי ‪ ( τ -‬ולצידה גרף המציג את ספקטרומי בליעת מצב היסוד של חלבונים אלו‪:22‬‬
‫‪2 / 7 ps‬‬
‫‪0.25‬‬
‫‪RPSB‬‬
‫‪0.5 ps‬‬
‫‪0.6‬‬
‫‪C13=C14‬‬
‫‪BR‬‬
‫‪2 / 5 ps‬‬
‫‪0.5‬‬
‫‪C13=C14‬‬
‫‪pHR‬‬
‫‪2 / 8 ps‬‬
‫‪0.25‬‬
‫‪C13=C14‬‬
‫‪sHR‬‬
‫‪0.5 ps‬‬
‫‪0.5‬‬
‫‪C13=C14‬‬
‫‪SR‬‬
‫‪2 / 20 ps‬‬
‫‪0.6‬‬
‫‪C13=C14‬‬
‫‪PR‬‬
‫‪500 550 600 650700‬‬
‫‪400‬‬
‫‪450‬‬
‫)‪α (normalized‬‬
‫‪τ‬‬
‫‪φ‬‬
‫‪Bond‬‬
‫‪C11/C7/C13‬‬
‫‪HR‬‬
‫‪BR‬‬
‫‪PR‬‬
‫‪SR‬‬
‫‪XR‬‬
‫‪RPSB‬‬
‫‪350‬‬
‫)‪λ(nm‬‬
‫עניין מרכזי במחקר חלבוני רטינל הינו להבין כיצד סביבת החלבון שולטת בתהליכים הראשונים‪,‬‬
‫והשוואה בין רטינל בתמיסה )‪ (PSB‬לחלבוני הרטינל מתחייבת‪ .‬אנו שוב נתמקד בחלבונים הרטינליים‬
‫אותם חקרנו אך נזכור כי הם חלק קטן ממשפחה ענפה‪.‬‬
‫פירוט תכונות החלבונים הספציפיים וה‪ PSB-‬בתמיסה בשלבים הראשוניים מסוכמות בטבלה הבאה‪:22‬‬
‫‪ PSB‬בתמיסה‬
‫‪pHR / sHR‬‬
‫‪Native BR‬‬
‫מקסימום פיק בליעה‬
‫‪446‬‬
‫‪578‬‬
‫‪568‬‬
‫זמן דעיכת המצב‬
‫‪2.0ps (50%) +‬‬
‫‪1.5ps (50%) +‬‬
‫‪500fsec‬‬
‫המעורר‬
‫)‪7.2ps (50%‬‬
‫)‪8ps (50%‬‬
‫קואורדינטת התגובה‪ -‬בטבלה ניתן לראות דמיון בקואורדינטת התגובה בין שני החלבונים הרטינליים‬
‫שאינו קיים ב‪ PSB-‬בתמיסה‪ .‬ככל הנראה הפרעות סטריות ואלקטרוסטטיות בחלבון הם התורמות‬
‫לסלקטיביות בקשר הקריטי בעוד ה‪ PSB-‬חופשי לנוע בתמיסה וליצור מספר איזומרים‪.‬‬
‫קינטיקת המצב המעורר )קבועי זמן הדעיכה(‪ -‬נראה כי ב‪ BR-‬סביבת החלבון מאיצה את ההיפוך‬
‫הפנימי כמעט בסדר גודל בהשוואה ל‪ PSB-‬בתמיסה ומאפשרת התרחשות איזומריזציה רק סביב קשר‬
‫כפול ספציפי‪ .‬דבר המדגים את תפקידו המכריע של החלבון בשליטה על דינאמיקת המצב המעורר של‬
‫הכרומופור‪ ,‬בכיוון הכוונת האיזומריזציה לקשר הכפול הפעיל ובעליית קצב ההיפוך הפנימי‪.‬‬
‫‪17‬‬
‫‪18‬‬
‫המנגנון עבור דעיכת המצב הפלואורסצנטי ב‪ PSB-‬הטבעי טרם נפתר‪ ,‬אך מספר הסברים ניתנו להבדל‬
‫בין בקטריורודופסין ל‪ PSB-‬בתמיסה‪:‬‬
‫‪ .1‬ה‪ PSB-‬משלב קואורדינטת היפוך פנימי שונה מזו המעורבת בבקטריורודופסין בו ההגעה לחתך הקוני‬
‫מתרחשת לאורך קואורדינטה ספציפית‪ .C13=C14 ,‬למעשה תפקידו של החלבון הינו לבטל או להקטין את‬
‫המחסום סביב קואורדינטה זו ולהעלות את המחסום עבור קואורדינטות אחרות‪.62,20‬‬
‫‪ .2‬ה‪ PSB-‬משלב מעבר דרך מצב ביניים מעורר‪ .‬לפי גישה זו דעיכת המצב המעורר אינה עקב היפוך‬
‫פנימי מ‪ S1-‬ל‪ S0-‬אלא משקפת מעבר לנקודה על משטח )‪ ,S1(1Bu+‬או על משטח שונה )‪ , (1Ag-‬כך‬
‫שאכלוס מחודש של מצב היסוד מתרחש בזמנים מאוחרים‪.‬‬
‫הסברים אלו אינם עומדים בקנה אחד עם הדמיון הנראה בין ה‪ PSB-‬בתמיסה להלורודופסין מבחינת קצב‬
‫הריאקציה הבי‪-‬אקספוננציאלי והניצולת הקוונטית הנמוכה יחסית )‪ .(30%‬בכל החלבונים נצפתה דעיכה‬
‫מולטי‪-‬אקספוננציאלית שיכולה להעיד על מנגנון זהה ולכן יש צורך בהבנת הסיבה לדעיכה זו‪.‬‬
‫מקסימום פיק בליעה‪ -‬הבדל קטן ניכר במקסימום הבליעה בין החלבונים בעוד הספקטרום של ‪PSB‬‬
‫בתמיסה מוסט משמעותית לכחול‪ .‬ההיסט לאדום של פיק הבליעה בחלבונים בהשוואה ל‪ PSB-‬בתמיסה‬
‫קריטי לתפקודם בטבע ומכונה "‪ ."opsin shift‬מספר סיבות ניתנו להיסט בבליעה‪:‬‬
‫‪ .1‬בחלבונים הרטינלים המרחק בין היון הנגדי לכרומופור גדול וזה בניגוד למתרחש ב‪ PSB-‬שם היון‬
‫הנגדי יכול להיות קרוב לכרומופור‪ .‬היון הנגדי משחק תפקיד חשוב בעיקר בממסים שאינם פולארים‬
‫בעוד עבור ממסים פולארים האינטראקציה החזקה עם ה‪ PSB-‬ניתנת ע"י הממס עצמו והוא שקובע את‬
‫ההסטה‪ .‬לדוגמא‪ ,‬אתנול הינו ממס פולארי המייצב את מצב היסוד ולכן תורם להסטה לכחול‪.‬‬
‫‪ .2‬מבנה הרטינל בתמיסה שונה מצורתו בחלבון‪ .‬בחלבון מבנה הטבעת היא ‪ s-trans‬מה שתורם להארכת‬
‫השרשרת הפוליאנית בעוד ב‪ PSB-‬בעקבות ההפרעה הסטרית של המתילים הטבעת מקבלת מבנה של‬
‫‪ s-cis‬מה שמקצר את פלנאריות שרשרת הפוליאן )ראה תמונה ‪ 1.5‬לעומת ‪ .(1.2‬ולפי מודל חלקיק‬
‫בקופסא כיוון שבחלבון המטען מתפלג על שרשרת ארוכה יותר תתרחש הסטה לאדום‪.‬‬
‫מחקרים רבים‪ 64,63‬ניסו להצביע על קשר בין תזוזת הבליעה לדינאמיקות החלבון‪ .‬היו שטענו כי הקבוצות‬
‫הפולאריות המצויות בסביבת החלבון )טריפטופנים( מגדילות את הדיפול המושרה ובכך משפיעות על‬
‫הדינאמיקה ומסיטות את הבליעה לאדום כך שקיים קשר בין תזוזת הבליעה לדינאמיקה‪Sheves et al .‬‬
‫‪63‬‬
‫חקרו סידרה של פיגמנטים מלכותיים בהם שונה אורך הפוליאן והטבעת הוחלפה‪ .‬תוצאותיהם הדגימו כי‬
‫האפקט המשפיע על עלית הדיפול המושרה בחלבון מקורו בסביבת החלבון ובקרבת טבעת הרטינל‪.‬‬
‫מחקרם הצביע על השפעתם החשובה של שיירי טריפטופנים )במיוחד ‪ Trp138‬ו‪ (Trp189-‬המגדילים‬
‫את הדיפול המושרה בבקטריורודופסין ויכולים לגרום להיסט לאדום בחלבון‪ .‬למעשה הדיפול הגדול הוא‬
‫שמאתחל את שינוי המבנה בחלבון שכן בבקטריורודופסין ישנם שינויי דיפול גדולים במצב המעורר‪,‬‬
‫הדיפול הנוצר גדול ביותר מ‪ 50%-‬מהדיפול המתקבל ברטינל בתמיסה‪ .66,65‬לטענת ‪ Sheves‬השפעות‬
‫הטריפטופנים לא רק מייצבות את תרומת המטען המושרה אלא אף מאפשרות נדידה של מטען חיובי‬
‫לעבר הטבעת במצב המעורר‪ .‬יתר על כן‪ ,‬פעילות החלבון נגרמת מאל איתור של מטען שנוצר במצב‬
‫המעורר של הכרומופור‪ ,‬מה שתואם השערות תיאורטיות‪ 69,68,4Song, Norella, Heyne .67‬טענו כי‬
‫‪18‬‬
‫‪19‬‬
‫פעילות החלבון נקבעת על ידי אחוזים של שיירים טעונים )‪ (Asp 212, Asp 85, Arg 82‬בסביבת‬
‫הרטינל‪ 70Sheves et al .‬חידדו את הקשר בין מאפייני הבקטריורודופסין‪ ,‬וטענו כי פולריזצית החלבון‬
‫שולטת על מסלול הריאקציה והנוכחות של חלוקת המטען הינה דרישת קדם להופעת מחזור האור‪ .‬מחקר‬
‫על רודופסוני חישה‪ SR1) 71‬ו‪ (SR2-‬הציע כי השלבים הראשונים אכן נשלטים ע"י חלוקת מטען‪ ,‬אולם‪,‬‬
‫לא נצפה קשר ישיר בין דינאמיקת הריאקציה לתכונות הבליעה בחלבוני הרטינל‪ .‬כך שהקשר בין היסט‬
‫הבליעה לדינאמיקה טרם הובהר‪.‬‬
‫במעבדתנו ניסינו לברר האם קטליזת ההיפוך הפנימי בחלבון ה‪ BR-‬קשורה להיסט לאדום של תחום‬
‫הבליעה )ל‪ .("opsin shift"-‬לשם כך חקרנו בספקטרוסקופית ‪ pump-probe‬רב ערוצית כרומופור‬
‫סינטטי בתמיסת טריפלורואתנול שהוסט לאדום בהשוואה ל‪) PSB-‬פיק בליעה ב‪ .(520nm-‬התוצאות‬
‫הראו דעיכה מולטי‪-‬אקספוננציאלי עם קבוע זמן מהיר של כ‪ 150fs -‬וקצב היפוך פנימי של כ‪ t1=2ps -‬ו‪-‬‬
‫‪ .t2=11ps‬מכאן שעל אף שכרומופור סינטטי זה מחקה את ההיסט בבליעה של החלבון קצב ההיפוך‬
‫הפנימי לא הואץ וזמן החיים של המצב המעורר הינו ארוך אפילו בהשוואה ל‪ PSB-‬בתמיסה‪ .‬כמו כן‪,‬‬
‫בדיקת השפעת אורך גל העירור על הדינאמיקה ועל קינטיקת ההיפוך הפנימי לא הציגה הבדלים‬
‫משמעותיים בקצב ההיפוך הפנימי‪ .‬הספקטרום הטרנזיינטי מראה כי המצב המעורר מאופיין ע"י שתי‬
‫בליעות האחת ב‪ 450nm-‬והשנייה ב‪ 600nm-‬ופליטה רדודה ורחבה ‪ ,670nm-920nm‬נראה כי פליטה‬
‫זו ממשיכה עמוק ל‪ .IR-‬ההבדלים הספקטראליים שנראו בין שני אורכי גל העירור היו ביחס‬
‫האמפליטודות השונה של מאפייני המצב המעורר ובשייר ספקטראלי ארוך חיים )מעל ‪ (60ps‬שנראה רק‬
‫בעירור בצד הכחול )‪ .(475nm‬ההבדל הראשון הוסבר ע"י התפלגות אוכלוסיות שונה התלויה באורך גל‬
‫העירור ייתכן וקיים מחסום במצב המעורר המפריד בין שתי אוכלוסיות אלו‪ .‬ההבדל השני הוסבר ע"י‬
‫קיומה של אי‪-‬הומוגניות בבליעת מצב היסוד כך שאורך גל עירור שונה מעורר יחס אוכלוסיות שונה‬
‫במצב היסוד‪.72‬‬
‫בליעת האיזומר‪ -‬האיזומרים השונים של ‪ PSB‬בתמיסה מאופיינים בפיקי בליעה קרובים )הבדל של עד‬
‫‪ (5nm‬למרות ההבדל הקיים במקדם הבליעה המולרי )‪ (ε‬על כן ההפרדה לאיזומרים השונים רק מבחינת‬
‫ספקטרוסקופית קשה )מוגבלים ביכולת דיוק הספקטרופוטומטר(‪ .73‬בעוד בחלבונים ישנו הבדל משמעותי‬
‫בין המגיב המצוי במבנה ‪ all-trans‬לתוצר ה‪ cis-‬המוסט לאדום )מצב ‪.(J‬‬
‫דינאמיקת המצב המעורר‪ -‬על מנת להבין את תפקידו של החלבון בדינאמיקה הראשונית נעמוד על‬
‫הבדלים נוספים מעבר למוזכרים לעיל בספקטרום המצב המעורר‪ .‬המצב המעורר בכל המקרים מאופיין‬
‫ע"י פליטה רדודה למצב היסוד ובליעה חזקה לרמות גבוהות יותר‪ .‬בספקטרומים הטרנזינטיים נראה כי‬
‫בליעת המצב המעורר של חלבוני הרטינל בעלת פיק ב‪ 460nm-‬וה‪ bleach-‬ממוקם בין הבליעה לפליטה‬
‫של המצב המעורר‪ ,‬בעוד ב‪ PSB-‬הפיק ממוקם ב‪ ,520nm-‬פליטת ובליעת המצב המעורר סמוכות‪.‬‬
‫עובדות אלו הובילו את התיאורטיקנים לטעון שהמרווחים בין הרמות משתנים או שמדובר במעורבות של‬
‫רמות שונות‪.74‬‬
‫‪ #‬ניכר כי החלבון בעל תפקיד חיוני בתהליך הפוטוכימי והאינטראקציה עימו משפיעה על הדינאמיקה של‬
‫איזומריזצית הרטינל‪ .‬למרות כל התגליות‪ ,‬הדינאמיקה במצב המעורר ותפקידי החלבון כסביבה עדין אינם‬
‫‪19‬‬
‫‪20‬‬
‫ברורים ברמה המיקרוסקופית‪ .‬מתחייבת בדיקה שיטתית והסתכלות עמוקה על הדמיון והשוני בין‬
‫החלבונים והכרומופור‪ ,‬על מנת לפענח את קצב ההיפוך הפנימי בחלבון‪ ,‬להבין מה בסביבת החלבון גורם‬
‫להבדלים והאם יש קורלציה ביניהם? הייתכן כי החלבון יכול לשלוט על דינאמיקת המצב המעורר‬
‫ולהחליט איזו דינאמיקה תתרחש?‬
‫‪ .1.2.5‬ספקטרוסקופיה ויברציונית‬
‫האיזומריזציה בחלבונים הרטינליים מתרחשת תוך כדי תהליך היפוך פנימי‪ .‬הבנת תהליך זה חיונית על‬
‫מנת להעריך כיצד אנרגית הפוטון מאוחסנת ונעשית זמינה לפעילות התאית המאוחרת‪.‬‬
‫מחקרי ‪) pump-probe‬שהוזכרו לעיל( במערכות רטינליות אלו הציגו ספקטרומים )בליעה ופליטה(‬
‫רחבים וחסרי מבנה המאפיינים את המצב המעורר אשר מהם לא ניתן להסיק את מבנה המצב המעורר‪.‬‬
‫מניסויים קודמים שבוצעו על בקטריורודופסין )ניסוי שאיבת פליטה מאולצת(‬
‫‪57‬‬
‫ועל אנלוגים נעולים‬
‫שלו‪ 75‬ידוע לנו כי הקונפיגורציה של המצב המעורר ‪ I‬הינה ‪ all-trans‬והוא חיוני למעגל האור של חלבון‬
‫זה‪ ,‬ממצאים אלו מעצימים את שאלת המתרחש במצב המעורר ושינויי המבנה הקיימים בתהליך ההיפוך‬
‫הפנימי ובמעבר בין הקונפיגורציות המערב את המצב המעורר‪.‬‬
‫ספקטרוסקופיה ויברציונית יכולה לתת מענה לגבי המתרחש בתהליך האיזומריזציה ולספק מידע לגבי‬
‫השינויים בקשר הכימי ובגיאומטרית המולקולה‪ ,‬מידע מבני החסר בספקטרוסקופיה אולטרה‪-‬מהירה‬
‫)אלקטרונית( רגילה‪.‬‬
‫הדילמה בין מרחב התדר למרחב הזמן‬
‫‪76,7,4‬‬
‫מחקרים ספקטרוסקופיים במרחב התדר במצב עמיד כגון ‪ :‬ניסויי רזוננס ראמאן‬
‫סיפקו מידע מבני‬
‫עשיר על הגיאומטריה‪ ,‬הסימטריה‪ ,‬הקבוצות פונקציונליות וכו'‪ .‬יתרונותיה של שיטה ספקטרוסקופית זו‬
‫שהיא כוללת מבנים חדים )הרחבות קטנות(‪ ,‬בעלת סיכוי מופחת לחפיפות ספקטראליות‪ ,‬יכולת לתיאום‬
‫מאפיין לתנודה ויברציונית מסוימת ונגישות למולקולות קטנות )הבולעות ב‪ UV-‬הרחוק(‪.‬‬
‫למרות החשיבות והיתרונות הרבים שיטות אלו יעילות עבור מולקולות יציבות ו‪/‬או צורונים ארוכי חיים‬
‫ואינם מספקות מידע על המעבר בין המגיב לתוצר‪ ,‬הדינאמיקה של התגובה והמבנה הויברציוני של המצב‬
‫המעורר‪ .‬ספקטרוסקופיה אלקטרונית במרחב הזמן אומנם יכולה לספק מידע חסר זה אך נכשלת בפאזה‬
‫מעובה עקב אופי ההרחבה של הבנדים האלקטרונים בתמיסה שמוחק את המבנה הויברוני ומסתיר פרטים‬
‫על התפתחות בגיאומטרית הקשר‪ .‬שיטת ‪ X-ray‬במרחב הזמן ודיפרקציה אלקטרונית עדין מוגבלת‬
‫טכנולוגית ברזולוציה הזמנית )במקרה הטוב סקלת זמן של מאות פיקו שניות(‪.‬‬
‫מכאן שבעבודה בספקטרוסקופיות טרנזיינטיות במרחב התדר קשה יהיה לצפות בויברציות השייכות‬
‫למצב המעורר הדועך תוך מאות פמטו‪-‬שניות ולצפות בשינויים בקשר הכימי ובמבנה משטח הפוטנציאל‬
‫האלקטרוני המעורר‪ .‬יותר מכך‪ ,‬עבודה במרחב הזמן מאפשרת קבלת מידע על הדינאמיקה גם לאחר‬
‫שיכוך דיפול המעבר האלקטרוני )‪ .(dephasing‬בשל כך ועקב סקאלת הזמנים האולטרה מהירה‬
‫בחלבונים אלו מחקר ספקטרוסקופיה ויברציונית במרחב הזמן מתחייב‪.‬‬
‫‪20‬‬
‫‪21‬‬
‫ספקטרוסקופיה ויברציונית במרחב הזמן התגלתה בעשורים האחרונים ככלי הפותר מבנים מולקולאריים‬
‫המשתנים דינמית כגון‪ :‬מעבר אלקטרון‪ ,‬פוטוכימיה של מולקולות קטנות‪ ,‬איזומריזצית ‪,cis-trans‬‬
‫דינאמיקות של חלבונים רטינליים ומחקרים חשובים נוספים‪.‬‬
‫באופן כללי ניתן לחלק את השיטות הללו למבוססות ‪ mid –IR‬ומבוססות ראמן‪ ,‬במסגרת עבודה זו לא‬
‫נכנס לתיאור מפורט בשיטות אלו‪ .‬בעוד ה‪ mid IR-‬מבוסס על בליעה ישירה בין רמות ויברציוניות‪ ,‬ראמן‬
‫מבוסס על מנגנון פיזור אור‪ .‬למרות השיפור ברזולוציה הזמנית בשיטת ראמן ספונטני‪ ,‬שיטה זו עדין‬
‫מוגבלת ביכולתה לצפות בדינאמיקה אולטרה מהירה )פחות מ‪ (1ps-‬בשל עיקרון אי הוודאות של‬
‫הייזנברג‪ .‬יותר מכך חתך הפעולה הקטן גורר אות חלש ולכן נדרשת עוצמת קרינה גבוהה‪.‬‬
‫גם שיטת ה‪ mid IR-‬שהתפתחה מאוד טכנולוגית ובעלת יתרונות בולטים שכן אינה דורשת שדה קרינת‬
‫‪ probe‬חזק‪ ,‬אזור העירור מופרד מאזור הגילוי והמעברים הויברציוניים מדווחים ישירות )בהשוואה‬
‫לשיטת ראמן( עדין סובלת מקשיים טכניים ביצירת פולסי ‪ IR‬ברזולוציה גבוהה‪ .‬רזולוציית הזמן בשיטה‬
‫זו נקבעת על סמך הקרוס קורלציה בין החוקר לשואב המופרדים דבר שברוב המקרים מגדיל את‬
‫רזולוצית הזמן עקב ‪ (Group Velocity Mismatch) GVD‬עם הדגם‪.‬‬
‫המגבלות שהוזכרו לעיל יכולים להיפתר ע"י שימוש בשיטת ראמן מושרה )קוהרנטי( ‪ IVS‬במרחב הזמן‬
‫ו‪ FSRS-‬במרחב התדר‪ .‬שיטות אלו מסתמכות על עקרונות זהים כך שבמקום להסתכל על פיזור ראמן‪,‬‬
‫השדה האלקטרוני מוביל או משרה את מעברי ראמן‪ .‬שיטות אלו מתגברות על עיקרון אי הוודאות כך ניתן‬
‫לקבל רזולוציה זמנית גבוהה ורזולוציה ספקטראלית‪ .‬השימוש בפולס רחב ודיספרסיבי בתהליך הגילוי‬
‫מספק רזולוציה ספקטראלית גבוהה בעל זמן החיים קצר שנקבע לא על סמך משך הפולס אלא ע"י משך‬
‫הפולס המאתחל את הפולריזציה המקרוסקופית בדגם‪ .‬יותר מכך‪ ,‬ראמן מושרה בעל יתרון עוצמה‬
‫בהשוואה לראמן הספונטני‪ .‬שיטות אלו אפשרו את ההסתכלות על הדינאמיקה וההתפתחות המולקולארית‬
‫בזמנים המוקדמים של התגובה ואת חשיפת דינאמיקת המצב המעורר‪.‬‬
‫ספקטרוסקופיה ויברציונית במרחב הזמן ברזולוציה של פמטושניות‬
‫ספקטרוסקופיה במרחב הזמן ברזולוציה גבוהה חיונית כאשר רוצים לעקוב אחר הדינאמיקה הראשונית‬
‫של ריאקציות פוטוכימיות מהירות )כמתקיים בחלבונים הרטינליים( ולחשוף את מבנה מצבי המעבר בזמן‬
‫אמת‪ .‬ספקטרוסקופית ‪) pump-probe‬מתוארת בהרחבה בשיטות( יכולה לשמש בתנאים מסוימים‬
‫)שימוש בפולס הקצר מזמן המחזור של הוויברציה הנחקרת או מזמן התארגנותו של המצב המעורר(‬
‫לחקר ויברציות במצב האלקטרוני היסודי והמעורר‪ ,‬ולמעקב אחר הופעת תוצרים בריאקציות כימיות‬
‫בפאזה מעובה‪ .‬נדגיש כי על מנת להשיג פולס קצר בזמן ספקטרום רחב אינו מספיק יש לדרוש שגם יחסי‬
‫הפאזה יהיו מוגדרים )נדרש פולס קוהרנטי בעל יחס פאזה מוגדר(‪.‬‬
‫מבחינה ניסיונית ויברציות אלו נצפות במדידה ספקטרוסקופית באורך גל נתון )לדג' מתוך הספקטרום‬
‫הטרנזיינטי( כמודולציות על פני סיגנל ה‪ .probe-‬למעשה ה‪ probe-‬המגיע לאחר עירור ה‪ pump-‬סורק‬
‫את המצב הקוהרנטי שנוצר והסיגנל הינו קונבולוציה של תגובת המערכת )התגובה לעירור ע"י‬
‫פונקציית‪-‬דלתא( עם קרוס‪-‬קורלציה של הפולסים המעורר והחוקר‪.77‬‬
‫‪21‬‬
‫‪22‬‬
‫שימוש בפולס קצר הכרחי למחקר שכן בדרך זו ניתן לחפוף מספר רמות ויברציה וליצור חבילת גלים‬
‫מאותרת וקוהרנטית‪ ,‬אם כי יש להיזהר משימוש בפולס קצר מידי כיוון שהוא יעורר מצבים קוהרנטיים‬
‫רבים ויגרור חבילת גלים שאינה מאותרת כך שמחקר דינמי לא יתאפשר‪.‬‬
‫בניסויינו השתמשנו בספקטרוסקופיה ויברציונית אימפולסיבית בתנאי רזוננס‪ ,‬בה נוכל לצפות בויברציות‬
‫קוהרנטיות הנוצרות במצב מעורר קושר )ראה בהמשך( ובכאלו הנוצרות במצב היסוד ע"י תהליך המכונה‬
‫‪) Resonant Impulsive Stimulated Raman Scattering‬מכונה ‪ ,(RISRS‬הרעיון מבוסס על שתי‬
‫אינטראקציות אור‪-‬חומר כתוצאה מהפולס הקצר בזמן‪:78‬‬
‫‪ .1‬הפולס המעורר מעביר אוכלוסיה )חבילת גלים מוגדרת( ממצב היסוד למצב המעורר‪ ,‬אוכלוסיה זו‬
‫המתוארת כצירוף ליניארי של מצבים ויברציונים‪ ,‬מתפתחת בזמן ומשנה את מיקומה‪.‬‬
‫‪ .2‬חלק מאוכלוסיית המצב המעורר יורדת למצב היסוד לפי הפרמטרים של הפולס והמשטחים‬
‫האלקטרוניים ומתפתחת בזמן‪ .‬העירור המיידי לא מאפשר תנועה גרעינית במצב היסוד‪ ,‬ובמשטח‬
‫הפוטנציאל היסודי נוצר "חור" קוהרנטי המתפתח בזמן ומאפשר את קבלת הויברציות‪.‬‬
‫במידה והעירור נעשה למצב אלקטרוני קושר‪ -‬החור וחבילת הגלים יעברו תנודות בתדר המתאים‬
‫לויברציה במצב היסוד ובמצב המעורר בהתאמה )ניתן לדמות את מצב היסוד לפיזור ראמאן רגיל עם‬
‫המשטח המעורר כרמה וירטואלית(‪ .‬במקרה זה‪ ,‬בליעת הפולס החוקר )‪ (probe‬מהרמה האלקטרונית‬
‫המעוררת או פליטה מאולצת חזרה לרמת היסוד תלויים במיקום חבילת הגלים ברמה המעוררת ביחס‬
‫למיקום הרזוננס האלקטרוני שלו‪ .‬כלומר הבליעה משתנה באופן מחזורי בתדר הויברציה‪ ,‬ובמופע התלוי‬
‫בתדר פולס ה‪ .probe-‬אנו נצפה במודולציות הקשורות הן למצב היסוד )תנועת ה"חור" הלא סטציונירי(‬
‫והן למצב המעורר )תנועה קוהרנטית במשטח העליון( שיכולות להיות זהות או שונות בהבדל מופע‪,‬‬
‫כלומר בעקבות ההסחה הקיימת בין משטחי הפוטנציאל יהיה הבדל פאזה בין ויברציות מצב היסוד‬
‫המתחילות ממינימום הסחה ומקסימום תנע לויברציות המצב המעורר המוסחות מקסימלית‪.‬‬
‫במקרה שהבליעה היא למצב אלקטרוני שאינו קושר‪ -‬ניתן לעקוב אחר התקדמות חבילת הגל מרגע העירור‬
‫ועד להגעה לתוצרים‪ .‬וכשאורך גל הקרן החוקרת מצוי ברזוננס אלקטרוני עם בליעת התוצרים נוכל‬
‫לקבל אינפורמציה על היווצרותם והדרך בה הם מגיעים לשיווי משקל עם הממס או נעלמים ליצירת תוצר‬
‫נוסף‪.79‬‬
‫‪22‬‬
‫‪23‬‬
‫מכאן ניתן להבחין מחד ביתרונה של השיטה‪ -‬המאפשרת מחקר ברזולוצית זמן גבוהה )פמטו‪-‬שניות(‬
‫וגילוי הפאזה ומאידך בחיסרונה‪ -‬שכן יש להפריד בין תדירויות הנובעות מהמצב היסודי לאלו הנובעות‬
‫מהמצב המעורר שכן אנו צופים בתדירויות הנובעות משני משטחי הפוטנציאל ובמידה ותדרים אלו‬
‫קרובים או שההסחה הקיימת קטנה‪ ,‬ההפרדה ביניהם בכל השיטות הויברציוניות קשה עוד יותר‪ .‬אם כי‪,‬‬
‫הפאזה עשויה לעזור בייחוס התדרים השונים שכן משטחי הפוטנציאל מוסחים ולכן העירור מוביל‬
‫לחבילת גלים מוסטת ובעלת פאזה שונה מזו של מצב היסוד‪.‬‬
‫הספקטרוסקופיה הויברציונית של החלבונים הרטינליים‬
‫מדידות טרנזיינטיות המספקות ספקטרום במרחב התדר בזמנים שונים‪ ,60‬בוצעו לחלבונים הרטינליים ול‪-‬‬
‫‪ PSB‬בתמיסה‪ 82, 81, 80‬במטרה לחקור את הדינאמיקה המולקולארית ולמפות את ההתפתחות המבנית‪.‬‬
‫מחקרים אלו חשפו מספר רב של דרגות חופש המופעלות כתוצאה מהעירור ובניהם עיוות ומתיחת הקשר‬
‫הכפול‪ .‬תרומה עיקרית למידע ויברציוני של הכרומופור בחלבונים רטינליים אלו ניתנה ע"י ‪Mathies‬‬
‫‪80‬‬
‫שביצע ניסויי רזוננס ראמאן תוך שימוש בהתמרות איזוטופים הן לבקטריורודופסין‬
‫בתמיסה‬
‫‪81‬‬
‫והן ל‪PSB-‬‬
‫ואף סיפק חישובים תיאורטיים תומכים‪ .‬בעבודותיו על האנלוגים האיזוטופיים הנחיל את‬
‫הבסיס לאנליזה הויברציונית במשפחה זו‪.‬‬
‫בטבלה הבאה מופיעים תדרי הויברציה של מצב היסוד בפאזה מוצקה שנצפו ע"י ‪ Mathies‬לחלבון ה‪-‬‬
‫‪ BR‬ול‪:PSB-‬‬
‫סיווג לקשר‬
‫‪13-cis BR‬‬
‫‪all-trans BR‬‬
‫‪all-trans PSB‬‬
‫]‪[cm-1‬‬
‫]‪[cm-1‬‬
‫]‪[cm-1‬‬
‫‪1008‬‬
‫‪1006‬‬
‫‪1012‬‬
‫‪C10-C11‬‬
‫‪1159‬‬
‫‪1169‬‬
‫‪1159‬‬
‫‪C14-C15‬‬
‫‪1191‬‬
‫‪1201‬‬
‫‪1191‬‬
‫‪C8-C9‬‬
‫‪1214‬‬
‫‪1204‬‬
‫‪C12-C13‬‬
‫‪1255‬‬
‫‪1237‬‬
‫‪1298‬‬
‫‪1272‬‬
‫‪1282‬‬
‫‪1520‬‬
‫‪1528‬‬
‫‪1563‬‬
‫‪C=C‬‬
‫‪1582‬‬
‫‪1596‬‬
‫‪C=NH‬‬
‫‪1640‬‬
‫‪1654‬‬
‫ספציפי‬
‫)אם קיים(‬
‫‪C=C‬‬
‫ניתן לחלק את דרגות החופש הויברציוניות שנצפו למספר אזורים עיקריים‪:‬‬
‫‪ -1500-1580cm-1 .1‬מתיחת קשרי ‪ .C=C‬סביר כי תחום זה יהיה רגיש לשינויים המתקיימים בשלד‬
‫הכרומופור במהלך האיזומריזציה‪.‬‬
‫‪.2‬‬
‫‪ -1270-1350cm-1‬תנועת ‪ wagging‬של המימנים‪ ,‬תנועה מימנים מחוץ למישור המולקולה‪.‬‬
‫‪23‬‬
‫‪24‬‬
‫‪ -1150-1300cm-1 .3‬מתיחת קשרי ‪ C-C‬יחד עם תנועת כיפוף במישור המולקולה של קשר ה‪.C-H-‬‬
‫תחום זה מכונה ה‪ fingerprint-‬בשל רגישותו לתהליך האיזומריזציה‪.‬‬
‫‪ ,rocking motion –1000cm-1 .4‬מתיחה הקשורה לכיפוף סימטרי בתוך המישור של קשרי ‪.C-H‬‬
‫‪ ,(hydrogen out of plane) HOOP –850-1000cm-1 .5‬ויברציה של מימנים מחוץ למישור‪.‬‬
‫בהשוואה שביצע ‪ Mathies‬בין ‪ PSB‬בתמיסה לבקטריורודופסין‪ 82‬נראה כי סביבת החלבון מוסיפה כ‪-‬‬
‫‪ 10cm-1‬למתיחת הקשר היחיד )‪ (C-C‬ומקטינה את תדר המתיחה המיוחס לתדר הכפול )‪ .(C=C‬הם‬
‫ייחסו הסטות אלו להגברת האל איתור של מערכת ה‪ π-‬בחלבון‪ .‬ממצא זה הינו בהתאמה עם הקורלציה‬
‫שהתקבלה בניסוי רזוננס ראמן של ‪ Aton‬בין ההסחה לכחול של ספקטרום הבליעה )תדר המעבר‬
‫האלקטרוני( לבין העלייה בתדר ויברצית מתיחת הקשר הכפול‪.83‬‬
‫תדירויות מצב היסוד שנחשפו אינן מספקות אינפורמציה מבנית של המצב המעורר וההנחה היא‬
‫שמולקולה זו משנה משמעותית את אופן הקישור שלה במצב המעורר ועל כן נצפה לשינוי גדול במצב זה‪.‬‬
‫ידוע כי בפוליגנים ישנו צימוד בין מצב היסוד למעורר כיוון שהמתיחה הסימטרית יכולה לערבב בין‬
‫מצבים בעלי סימטריה זהה‪ .‬כאשר שני משטחים מצומדים משתנים באנרגיה )מצב היסוד יורד בעוד המצב‬
‫המעורר עולה( האחד מתרכך )ויברצית מצב היסוד מתרככת( בעוד האחר מתקשה )ויברצית המצב‬
‫המעורר מתקשה( ועל כן נצפה לתדר מצב מעורר גבוה יותר‪.‬‬
‫עבודות שונות שבוצעו על בקטריורודופסין דיווחו על ממצאים סותרים עבור תדר הקשר הכפול )‪.(C=C‬‬
‫ניסיון של ‪ 4El Sayed‬במרחב הזמן הציג הסטה לתדירות גבוהה יותר )כמצופה(‪ 87Kobayoshi .‬שחקר‬
‫חלבון זה באמצעות ספקטרוסקופיה ויברציונית במרחב הזמן עם רזולוציה של ‪ 5fs‬ו‪ Diller-‬בעבודותיו‬
‫בספקטרוסקופית ‪ 8IR‬הראו ירידה של תדירות הקשר הכפול בניגוד לתצפיות של ‪Atkinson .El Sayed‬‬
‫בניסיונותיו בשיטת ‪ 84,7,5CARS‬על חלבון ה‪ BR-‬ועל אנלוגים נעולים שלו טען כי התדר הכפול במצב ‪J‬‬
‫מעט גבוה יותר )‪ (1532cm-1‬מהמגיב בעוד תדירותו של מצב ‪ K‬חוזרת לתדר נמוך יותר הדומה לזה‬
‫המתקיים במצב היסוד )‪ .(1524cm-1‬נדגיש כי בניגוד לכל יתר החוקרים טוען ‪ Atkinson‬כי מצב ‪ J‬הינו‬
‫מצב מעורר והתוצר הוא למעשה מצב ‪ ,K‬ומכאן משתמע כי לטענתו תדירויות המגיב והתוצר נותרות ללא‬
‫שינוי משמעותי בעוד תדירות המצב המעורר )‪ (J‬מוסטת לתדר גבוה יותר )מעטים הם החוקרים התומכים‬
‫בכך‪ .(49‬עבודה אחרונה של ‪ 85Mathies‬במרחב התדר הראתה תדר נמוך יותר עבור הקשר הכפול‬
‫במעבר לתוצר ‪ J‬ועליה של ‪ 5cm-1‬במעבר לתוצר ‪.K‬‬
‫אפיון המצב המעורר דורש שיטות אחרות )בשל זמן החיים הקצר שלו( ברמת דיוק גבוהה )בשל הקרבה‬
‫בין תדרי מצב היסוד(‪Mathies .‬‬
‫‪76‬‬
‫אומנם ביצע חישובים תיאורטיים המעריכים את מידת הסטייה‬
‫הגיאומטרית )ביחידות מנורמלות( של ויברציית המצב המעורר מויברציית מצב היסוד )חישוב ה‪-‬‬
‫‪ (∆) displacement‬עבור כל ויברציה( בהנחה כי אין שינוי בתדר )הנחה זו אינה בהכרח נכונה‬
‫פיזיקאלית(‪ .‬אך עד כה הניסיונות השונים שבוצעו במטרה לחשוף את תדרי הויברציה של המצב המעורר‬
‫לא הובילו לחשיפת מבנה ויברציוני ברור ולהסכמה בנוגע למגמת השינוי בהשוואה למצב היסוד‪.‬‬
‫אפילו ניסויים שבוצעו ברזולוציית זמן גבוהה )‪ 87(5fs‬ובשיטתו הספקטרוסקופית החדישה של ‪Mathies‬‬
‫שיטת ‪ (Femtosecond Stimulated Raman Spectroscopy) FSRS‬המספקת רזולוציה זמנית‬
‫‪24‬‬
‫‪25‬‬
‫גבוהה ונמצאה יעילה לקבלת מידע ויברציונ י‬
‫‪86‬‬
‫לא סיפקו את תדרי המצב המעורר בחלבון‬
‫הבקטריורודופסין‪ .‬ויותר מכך בעוד ‪ 87Kobayoshi‬טען כי הוא צופה בויברציות השייכות למצב המעורר‪,‬‬
‫‪ 55Mathies‬ו‪ 88Ruhman -‬טענו כי ויברציות אלו שייכות למצב היסוד‪ .‬ככל הנראה‪ ,‬ההבדל בשיוך טמון‬
‫באופן בו בוצעה האנליזה‪.‬‬
‫באופן כללי קשה להסתמך על תדרים אלו‪ ,‬בהתחשב בממצאים השונים שהתקבלו‪ ,‬בדיוקה של כל שיטת‬
‫מדידה ובהסטות הקטנות שנצפו‪ .‬ויתרה מכך‪ ,‬הסתירה הקיימת בין החוקרים השונים ממחישה את הקושי‬
‫הקיים בחשיפת תדירויות המצב המעורר וההתפתחות המבנית במצב המעורר נותרה כחידה‪.‬‬
‫תנודות איטיות השייכות למצב המעורר‬
‫הויברציות היחידות שנצפו ושויכו בוודאות למצב המעורר הם המודולציות האיטיות שנראו ע"י‪Ye 75‬‬
‫שביצעו ניסוי הן בבקטריורודופסין והן באנלוגים סינטטיים שלו תוך שימוש בפולסי ‪ pump‬ארוכים בזמן‬
‫)פרט ניסיוני זה הגביל את התדירויות הנצפות להיות מתחת ל‪ .(500cm-1 -‬פולסי ה‪ probe-‬היו ב‪IR-‬‬
‫הקרוב‪ ,‬אזור המייצג בלעדית את המצב המעורר‪ .‬בדרך זו הם בודדו את המודולציות הספקטראליות‬
‫השייכות למצב המעורר מאלו של מצב היסוד‪ .‬אנליזת טרנספורם פורייה הראתה פיק עיקרי ב‪157cm-1-‬‬
‫עבור בקטריורודופסין ופיק עיקרי ב‪ 137cm-1-‬עבור האנלוגים הנעולים )השגיאה המוערכת בניסוי היא‬
‫של ‪ . (20cm-1‬פיקים אלו עלו בבירור על גבולות הרעש ויוחסו לתנועה בשלד הרטינל‪ .‬האופי המהיר של‬
‫התגובה מצביע שזהו סידור תוך מולקולארי‪ .‬אם כי הם לא קבעו היכן סידור זה מתרחש‪ :‬ברטינל‬
‫בלבד‪,‬בחלבון או בממס‪ .‬ההבדל שנצפה בתדר זה בין הבקטריורודופסין הטבעי לאנלוג הנעול שלו מעיד‬
‫על כך שקורדינטות אלו עשויות להיות רלוונטיות לפעילות הביולוגית‪ .‬עוד יתכן כי התזוזה שהתגלתה הן‬
‫בטבעי והן באנלוגים הנעולים מהווה תנאי מקדים בדרך לחתך הקוני המוביל לתוצר במצב היסוד‪ ,‬אם כי‬
‫אין עדות ברורה לכך‪.‬‬
‫במטרה להבין כיצד אופן ויברציוני נמוך זה מושפע מסביבת החלבון ‪ Hou et al‬ביצעו ניסוי ‪pump-‬‬
‫‪ probe‬דומה ל‪ PSB-‬חופשי‪ 89‬ולאנלוגים שלו‪ .24‬התוצאות הצביעו על תדירות של ‪ ~120cm-1‬ב‪PSB-‬‬
‫טבעי כאשר תדירות זו אינה משתנה עם נעילת הקשר ‪ C13=C14‬בניגוד למה שהתקבל בבקטריורודופסין‪.‬‬
‫אופן תנודה זה משוייך בעיקר לעיוותים סביב קשרי ‪ C-C‬יחידים וכפולים לאורך שלד הרטינל‪ .‬לאחרונה‬
‫‪ 90Zgrablic et al‬הראה תדירויות נמוכות זהות ל‪ PSB-‬בתמיסה בניסוי פלורסנציה תלויה בזמן‪.‬‬
‫ההבדלים הקיימים במבנים הגיאומטריים של המצב המעורר עשויים לחזק את הטענה כי פעילות אופן זה‬
‫חייבת להיות משמעותית בדינאמיקת המצב המעורר‪ .‬נראה כי ההגבלות המבניות בחלבון מאלצות עליה‬
‫בתדירות של אופני תנודה נמוכים המערבים את דרגות החופש התורמות להזזת הפחמנים של השלד‬
‫ולעיוותים סביב הקשר הכפול‪ .‬נקודה נוספת בתוצאות אלו היא העדר ההבדל בתדירויות בין ‪ PSB‬טבעי‬
‫לאנלוגים הנעולים שלו‪ .‬ההשערות הם שיש עיוות של קשר איזומרי אחר כגון‪ C9=C10 ,C11=C12 :‬או‬
‫שזו אינה התגובה הראשונית המאותחלת ע"י אור‪ ,‬ממצא זה תואם מחקרים נוספים‪ .91,51,45,5‬עם זאת‪,‬‬
‫תוצאות אלו שונות מתוצאותיו של ‪ Lin et al‬שהתקבלו לרודופסין‪ ,92‬ולכן מחקר התדירויות הנמוכות‬
‫ברטינל חייב להמשך‪.‬‬
‫‪25‬‬
‫‪26‬‬
‫התדירויות הנמוכות שאופיינו למצב המעורר לא סיפקו מידע על שינויים מבניים מקומיים אלא העידו על‬
‫פיתול באזור מוגבל של המולקולה‪ .‬אפילו התדירויות הגבוהות של מצב היסוד התקבלו תוך שימוש‬
‫בהתמרות איזוטופים מקומיות ע"י ‪. 81,80Mathies‬‬
‫מחד שיפור ברזולוצית הזמן יאפשר לצפות בתדרים גבוהים של המצב המעורר ולחשוף את מבנהו שכן‬
‫תדרים גבוהים אלו קשורים לתנועת האיזומריזציה ויתנו מידע עליה וכפי שצוין קודם צפויים להשתנות‬
‫משמעותית ומאידך ניסויים שהציגו רזולוצית זמן גבוהה לא סיפקו ויברציות ששויכו בוודאות למצב‬
‫המעורר וזה בניגוד לסימולציות שבוצעו והניחו כי למצב המעורר חותם ויברציוני שונה מזה של מצב‬
‫היסוד‪ .‬כך שעד כה רק התדירות הנמוכה שנצפתה יוחסה בוודאות למצב המעורר‪ .‬ויותר מכך מהתוצאות‬
‫נראה כי למרות רזולוציית הזמן הנמוכה השפעת החלבון נראית ביתר קלות באופנים הויברציונים‬
‫הנמוכים )שם ניכר היסט משמעותי(‪.‬‬
‫למרות חשיבות המידע הדינאמי לגבי השינויים הגיאומטריים המלווים את תהליך ההיפוך הפנימי ויצירת‬
‫המצב הפלואורסצנטי‪ ,‬התפתחות המצב המעורר טרם נחשפה ובעניין זה רב הנסתר על הגלוי ומחקרים‬
‫ויברציוניים נוספים במרחב הזמן וברמת דיוק גבוהה נדרשים‪.‬‬
‫אחת השיטות לשלוט קוהרנטית באוכלוסיות השונות ובכך להפריד בין התרומות היא על ידי שימוש‬
‫בפולסים מאופנני‪-‬פאזה‪ ,‬שכבר הודגם שיכולים לעודד תרומה יחסית מאחד המשטחים‪ .93,88‬פולס בעל‬
‫‪ NC‬מגביר את אוסילציות מצב היסוד ע"י התאבכות בונה ולכן יציג הגדלה באמפליטודה בעוד פולס בעל‬
‫‪ PC‬פועל כנגד היווצרות האוסילציות מבצע התאבכות הורסת ומקטין את אמפליטודת התדר של מצב‬
‫היסוד‪ .‬הסבר לתופעה‪ :‬בפולס בעל ‪ NC‬בו החלק ה"כחול" של הפולס המקדים בזמן את החלק ה"אדום"‬
‫מעלה אוכלוסיה למצב האלקטרוני המעורר‪ ,‬אוכלוסייה זו מתפתחת בזמן ואז מגיע החלק האדום של‬
‫הפולס ומוריד אוכלוסיה למצב היסוד במיקום גרעיני שונה כך נוצר "חור" מוסח במצב היסוד‪ ,‬פולס ‪NC‬‬
‫עוקב אחר תנאי הרזוננס בין האוכלוסיות על שני המשטחים‪ .‬נקודת מבט נוספת היא שפולס בעל ‪NC‬‬
‫המעודד את תדירויות מצב היסוד יראה פחות את תדירויות המצב המעורר בעוד פולס בעל ‪ PC‬המדכא‬
‫את תדירויות מצב היסוד יראה יותר את תרומת המצב המעורר‪ .‬תופעה זו תעזור בהכרעה האם ויברציה‬
‫מסוימת שייכת למצב היסודי או המעורר לפי התנהגותה כפונקציה של ה‪ chirp-‬שניצור לפולס‪.‬‬
‫במחקרינו ננסה להשתמש בפולסים "מעוצבים" להפרדה בין מודולציות הנובעות מהמצב המעורר לאלו‬
‫הנובעות מהמצב היסודי במטרה לפתח כלי המאפשר להתגבר על מגבלת השיטה‪ .‬כמו כן‪ ,‬נשתמש בידע‬
‫מוקדם )כגון‪:‬ספקטרומי ראמאן שהנחיל לנו ‪ Mathies‬בעבודותיו( עבור ויברציות מצב היסוד של‬
‫המולקולה ושל הממס‪ .‬דיון מורחב בדרך הניסיונית ליצירה ועיצוב הפולסים הקצרים יובא בשיטות‬
‫המחקר ותיאור המערכת‪.‬‬
‫‪26‬‬
‫‪27‬‬
‫‪.1.3‬מטרות המחקר‬
‫א‪ .‬גיבוש מודל דינמי וקינטי לפוטוכימיה של החלבונים הרטינליים ולכרומופור המשותף להם על ידי ‪-‬‬
‫ מעקב אחר הספקטרום הטרנזיינטי הנלווה ליצירת האיזומר‪ ,‬בטווח ספקטראלי רחב‪ .‬זיהוי‬
‫ספקטרוסקופי של המצב המעורר וקביעת סקאלת זמני דעיכתו‪.‬‬
‫ הבנת מספר המצבים המעוררים המעורבים בתהליך הראשוני וחשיפת טופולוגית המשטחים‪.‬‬
‫ חשיפת מבנה המצב המעורר תוך מחקר דרגות החופש הנוטלות חלק בתהליך ההיפוך הפנימי‬
‫והאיזומריזציה‪.‬‬
‫ בחינת מודל רמות האנרגיה שניתן לחלבון ההלורודופסין‪.‬‬
‫ב‪ .‬הבנת תפקידו של החלבון והשפעתו על הדינאמיקה על ידי‪-‬‬
‫ חקר הכרומופור בתמיסה המשותף לכלל החלבונים הרטינליים והשוואה ביניהם‪.‬‬
‫ מחקר מערכות סינטטיות כגון‪ :‬אנלוגים נעולים‪ ,‬במטרה לחשוף כיצד שולט החלבון בדינאמיקה‬
‫והאם קיים קשר בין השפעותיו השונות?‬
‫לשם הגשמת יעדים אלו נבצע את סדרת הניסויים הבאים‪:‬‬
‫‪ .1‬מחקר ה‪ PSB-‬במטרה לקבל ספקטרום טרנזיינטי רחב‪ ,‬שכן כרומופור זה משותף לכלל משפחת‬
‫החלבונים הרטינליים ועל כן מהווה בסיס ראשוני להשוואה‪.‬‬
‫‪ .2‬מחקר ההלורודופסין לבחינת המנגנון שהוסכם עבורו‪.‬‬
‫‪ .3‬מחקר בקטריורודופסין טבעי ואנלוג נעול שלו הן לשם הבנת הדינאמיקה הראשונית והן כמדד‬
‫להשוואה תוך שימוש ברזולוציה גבוהה וספקטרום חוקר )‪ (probe‬רחב‪.‬‬
‫‪ .4‬מחקר ויברציוני בסקאלת זמנים קצרה )‪ (~7fs‬של ה‪ RPSB-‬בתמיסה במטרה לחשוף את מבנה המצב‬
‫המעורר‪ .‬בשל מיעוט דרגות החופש ותחומי הבליעה והפליטה המופרדים ב‪ RPSB-‬הוא נראה כמעומד‬
‫טוב יותר בהשוואה לחלבון‪.‬‬
‫‪27‬‬
‫‪28‬‬
‫‪ .2‬מערכות הניסוי ושיטות הניתוח‬
‫‪78,94‬‬
‫‪ .2.1‬כללי‬
‫לרשותנו שתי מערכות לייזר מוצק פולסי )מעשה ידינו( ובשתיהן נעשה שימוש בעבודה זו‪ .‬אומנם‬
‫המערכות ביסודם דומות אך ההבדלים הקיימים הובילו לבחירת המערכת המתאימה עבור כל ניסוי‪ .‬באחת‬
‫המגבר הפרמטרי הוא ‪TOPAS - Traveling wave Optical Parametric Amplifier of‬‬
‫‪ Superfluorescence‬המאפשר עבודה בתחום ה‪ IR-‬הקרוב והרחוק אך עם פולסים ארוכים יחסית )כ‪-‬‬
‫‪ .(30fs‬באחרת המגבר הפרמטרי הוא ‪NOPA - Non-collinear Optical Parametric Amplifier‬‬
‫המספקת פולס רחב בנראה המכווץ באמצעות ‪ shaper‬לפולסים קצרים ביותר )‪ .(6fs‬במדידות שינוי‬
‫הבליעה בזמן נדרש טווח ספקטראלי רחב ואין צורך ברזולוציה זמנית גבוהה )‪(Transient Absorption‬‬
‫נעשה שימוש במערכת הראשונה בעוד שבמדידות המבוססות על ספקטרוסקופיה ויברציונית במרחב הזמן‬
‫הרזולוציה הזמנית היא קריטית והשימוש הינו במערכת השנייה‪.‬‬
‫באופן כללי‪ ,‬על מנת לבחון ריאקציות כימיות בזמן אמת נדרשת מערכת ניסיונית שעונה על הדרישות‬
‫הבאות‪:‬‬
‫‪ .1‬הפולסים של המערכת חייבים להיות קצרים משמעותית ממשך התהליך שאת הדינאמיקה שלו‬
‫אנו בוחנים‪.‬‬
‫‪ .2‬אפשרות לכיוון אורכי גל שונים הן לשואב והן לחוקר‪ ,‬הכרחי על מנת למפות את תכונותיהם של‬
‫התוצרים ושל המגיבים‪.‬‬
‫הדוגמאות אותם ברצוננו לחקור דורשות פולסים שאורכם בין פמטושניות בודדות לכמה עשרות‬
‫פמטושניות‪ .‬יצירת פולסים מהירים מבוססת על נעילת פאזות פסיבית או אקטיבית בין אופני תנודה‬
‫אורכיים בלייזר רחב פס‪ .‬פולס קצר נוצר כאשר מספר סופי של אופנים אורכיים מתנדנדים במהוד‬
‫בתיאום פאזה )בלזירה רציפה האופנים האורכיים מתנדנדים במופע אקראי(‪ .‬נעילת הפאזות גוררת יצירה‬
‫של פולסים בגבול הטרנספורם‪ ,‬ההגבלה היא שרוחב הפולס בזמן פרופורציוני הפוך לרוחב הספקטראלי‬
‫לפי עקרון אי הוודאות‪.‬‬
‫שתי המערכות מורכבות באופן דומה‪:‬‬
‫‪ .1‬לייזר המבוסס על גביש טיטניום ספיר ומספק פולסים של ‪ 30fs‬באזור ה‪ .790nm-‬חלק זה מהווה את‬
‫לב המערכת )החלק הבסיסי והזהה( בו נוצרים פולסים קצרים בעוצמות נמוכות באוסילטור‪ ,‬פולסים אלו‬
‫עוברים פריסה בזמן‪ ,‬הגברה וכיווץ חזרה לתחום הפמטושניות‪ ,‬קרוב ככל שניתן לגבול הטרנספורם‪.‬‬
‫‪ .2‬מגבר פרמטרי הממיר אורך גל )‪.(TOPAS/NOPA‬‬
‫‪ .3‬כיווץ‪ -‬יצירת פולסים קצרים באמצעות ‪, shaper‬שריג או זוג פריזמות ואף שילוב בניהם‪ .‬ואפיון‬
‫הפולסים בשתי שיטות‪ FROG :‬ו‪/‬או אוטוקורלציה‪.‬‬
‫‪ .4‬הדגם‪ ,‬המערך הניסיוני הספציפי לניסוי המספק את רזולוצית הזמן ‪,‬עוצמת הפולס ובד בבד מרחיב את‬
‫תחום אורכי הגל ‪ -‬מבוסס על ספקטרוסקופית ‪) pump-probe‬בחלק מהניסויים השתמשנו ביותר משני‬
‫פולסים ואף שיחקנו עם מבנה הפאזות של הפולס הקצר( ואופן איסוף המידע‪.‬‬
‫‪28‬‬
‫‪29‬‬
‫‪100 ps‬‬
‫‪30 fs‬‬
‫‪0.2 nJ/pulse1 mJ/pulse‬‬
‫‪Compressor‬‬
‫‪Amplifier‬‬
‫‪0.19-1 kHz, 800 nm‬‬
‫‪30 fs, 0.6 mJ/pulse‬‬
‫‪86 MHz‬‬
‫‪0.19-1 kHz‬‬
‫‪20 fs‬‬
‫‪100 ps‬‬
‫‪Single pulse‬‬
‫‪selector‬‬
‫‪Stretcher‬‬
‫‪NOPA‬‬
‫‪86 MHz, 790 nm 20 fs,‬‬
‫‪6 nJ/pulse‬‬
‫‪Oscillator‬‬
‫‪Shaper‬‬
‫‪TOPAS‬‬
‫‪Experiment‬‬
‫תמונה מספר ‪ :2.1‬תיאור המערכת בצורה סכמתית והשינויים הנגרמים לפולסים כתוצאה מהמעבר ברכיבי המערכת שיתוארו‬
‫בפירוט בהמשך‪.‬‬
‫‪ .2.2‬הלייזר הבסיסי‬
‫‪ .2.2.1‬האוסילטור )‪(oscillator‬‬
‫האוסילטור מהווה את נקודת ההתחלה במערכת הלייזר הפולסי המהיר והוא מבוסס על עיצובו של‬
‫‪ .95 Asaki‬התווך הלוזר במהוד הינו גביש טיטניום ספיר )‪ Al2O3‬מאולח בטיטניום(‪ .‬גביש זה בעל‬
‫מוליכות תרמית גבוהה‪ ,‬סף נזק גבוה ובליעה רחבה באזור ה‪ 500nm-‬ועל כן מושלם לעירור עם‬
‫‪ Nd:YLF/YAG‬מוכפל‪ .‬במעבדתנו גביש ה‪ Ti:Sapphire -‬נשאב ע"י לייזר ‪ Nd:YVO‬מסחרי רציף‬
‫)‪ (CW-continues wave‬שאוב דיודות ומוכפל תדר‪ ,‬מספק אורך גל של ‪ 532nm‬בעוצמה של ‪.~4W‬‬
‫הוא מספק טווח פליטה רחב מ‪ 700nm-‬עד ‪ ,1100nm‬ספקטרום הפולסים היוצאים מהמהוד הוא בעל‬
‫רוחב של ‪ (full width half max) FWHM 45nm‬עם שיא ב‪ 790nm-‬ואורך זמני של ‪ .20fs‬אורך‬
‫זמני זה חיוני על מנת לקבל עוצמה רגעית גבוהה‪ .‬ולקבלתו אנו משתמשים בזוג פריזמות מקוורץ המפצות‬
‫על הדיספרסיה של הפולס בעוברו בגביש‪ .‬הגביש והפריזמות חתוכים בזווית ברוסטר על מנת למנוע‬
‫הפסדים כתוצאה מהחזרות‪.‬‬
‫על מנת לייצר פולסים קצרים נדרשים שני תנאים עיקריים‪:‬‬
‫‪ .1‬לייזר בעל רוחב פס גדול‪.‬‬
‫‪ .2‬מנגנון שינעל את הפאזות של אופני התנודה השונים )‪.(mode locking‬‬
‫נעילת האופנים באוסילטור היא פסיבית ומתבססת על תופעה המכונה ‪ Kerr Lensing‬שנגרמת בגביש‪.‬‬
‫תופעה זו ניתנת להסבר תוך התחשבות בשתי עובדות האחת שבעוצמות גבוהות מקדם השבירה של חומר‬
‫הוא פונקציה של עוצמת הקרינה ‪ ,n(I)=n0+n1I‬והשנייה היא שקרן הלייזר המתפתחת באוסילטור בעלת‬
‫פרופיל רוחבי גאוסי‪ ,‬שבו העוצמה מקסימאלית במרכז ובהתאם מקדם השבירה גבוה‪ ,‬אפקט לא לינארי‬
‫זה גורם למעין עדשה‪ .‬עדשה וירטואלית זו מתקיימת במצב של נעילת אופנים בלבד בשל העוצמה‬
‫הרגעית הגבוהה של הפולסים כך נגרם אופן לזירה רוחבי שונה מאופן הלזירה ב‪.CW-‬‬
‫הגביש מצוי בין שתי מראות דיכרואיות קמורות )‪ ,(f=5cm‬המחזירות וממקדות את קרינת הלייזר בתחום‬
‫אורכי הגל הארוכים מ‪ 700nm-‬ומעבירות את קרינת הלייזר השואב‪ .‬בשל אפקט המיקוד העצמי קיים‬
‫‪29‬‬
‫‪30‬‬
‫מרחק אידיאלי בין המראות הממקדות הללו עבור לזירה בפולסים ומרחק שונה עבור ‪ .CW‬כך שניתן‬
‫ללזור בשתי האפשרויות אם כי אנו נותנים עדיפות ללזירה בפולסים‪.‬‬
‫המהוד בנוי משתי מראות קצה דיאלקטריות האחת ‪ (HR) high reflector‬המחזירה כמעט ‪100%‬‬
‫מהקרן כאשר השארית הקטנה נכנסת לפוטודיודה מהירה המשמשת הן לדיאגנוסטיקה והן למיתוג ותזמון‪.‬‬
‫והשנייה ‪ (OC) output coupler‬המחזירה כ‪ 90% -‬מהקרן ומעבירה כ‪ 10%) 10%-‬אלו מכונים‬
‫‪.(seed‬‬
‫אורך‬
‫המהוד‬
‫כ‪1.8m-‬‬
‫הוא‬
‫והוא‬
‫הקובע‬
‫קצב‬
‫את‬
‫‪3 ×108 m‬‬
‫‪sec = 83 Mpulses‬‬
‫= ‪ υ = c‬לכן אנרגית כל פולס נמוכה‬
‫‪sec‬‬
‫‪2 ⋅1.8m‬‬
‫‪2L‬‬
‫‪pulse‬‬
‫יציאת‬
‫הפולסים‬
‫‪= 6 nJ‬‬
‫‪sec‬‬
‫שכן‬
‫‪500mW‬‬
‫‪83 × 106 pulses‬‬
‫‪.‬‬
‫על מנת לגרום לשינוי משמעותי בחומר יש להגביר את הפולסים‪ .‬הגבר הפולסים הכולל הוא בפקטור של‬
‫כ‪ ,100000-‬על כן לא ניתן להגביר את כולם ומתוך ‪ 86‬מיליון פולסים בשנייה היוצאים מהאוסילטור אנו‬
‫מגבירים בין ‪ 190‬ל‪ 1000-‬פולסים בשנייה כתלות בניסוי‪.‬‬
‫פירזמה‬
‫‪H. R.‬‬
‫עדשה‬
‫‪Ti;Sapphire‬‬
‫‪O. C.‬‬
‫‪532 nm‬‬
‫פוטודיודה‬
‫לייזר ‪CW‬‬
‫יציאת טיטניו ספיר‬
‫תמונה‬
‫מספר ‪:2.2‬‬
‫תרשים של‬
‫האוסילטור‬
‫)מבט על(‪.‬‬
‫מראה‬
‫דיכרואית‬
‫‪ .2.2.2‬הפורס )‪(stretcher‬‬
‫אנו מעוניינים להגביר את האנרגיה של הפולס הקצר‪ ,‬תוך הימנעות מפיק עוצמתי בתהליכי ההגברה‪ ,‬פיק‬
‫העולה על סף הנזק של חלקי המגבר ויוצר תהליכים לא ליניאריים מסדר גבוה )כגון‪self phase :‬‬
‫‪ .(modulation‬לשם כך יש להאריך את משך הפולס בזמן לפני הכניסה למגבר ע"י דיספרסיה מתאימה‪.‬‬
‫עקרון הפעולה של הפורס הוא יצירת הפרש דרכים אופטיות רציף לצבעים השונים הבונים את הפולס‬
‫באמצעות שריג בודד )‪ ,(1200 lines/mm‬מראת כסף פרבולית עם מוקד של ‪ 61cm‬ושתי מראות זהב‬
‫שטוחות האחת באורך ‪ 5cm‬והשנייה באורך ‪ ,15cm‬הגודל של המראות חשוב על מנת שיכיל את כל‬
‫הספקטרום הנפרש‪ .‬השימוש במראות ממקדות במקום בעדשות מונע כניסת דיספרסיה נוספת לפולס‪.‬‬
‫בפרישה זו אנו מספקים דרך ארוכה יותר לאורכי הגל הקצרים וקצרה יותר לאורכי הגל הארוכים בפולס‪.‬‬
‫כך שלאחר פרישה זו הפולס מגיע לעשרות פיקו‪-‬שניות‪ .‬חישוב המתיחה בזמן נעשה על פי מטריצות ג'ונס‬
‫כטלסקופ ‪ ,1:1‬כאשר הפרש הדרכים האופטיות בין קצוות הספקטרום קובע את מידת הארכה שעובר‬
‫הפולס )מ‪ 20fs-‬לכ‪.(100ps -‬‬
‫תמונה מספר‬
‫‪:2.3‬‬
‫תרשים של‬
‫ה‪stretcher -‬‬
‫המצוי במערכת‬
‫)מבט על(‪.‬‬
‫‪f‬‬
‫‪f-L‬‬
‫‪L‬‬
‫‪30‬‬
‫‪31‬‬
‫‪ .2.2.3‬בורר פולסים )‪(single pulse selector‬‬
‫אנו בוררים את הפולסים טרם כניסתם למגבר‪ ,‬הן כיוון שלא ניתן להגביר את כל הפולסים והן כדי שניתן‬
‫יהיה לבחור את הפולס הטוב ביותר‪ ,‬לתזמנו עם הלייזר השואב את המגבר ולנקות את הפולס כך‬
‫שהיציבות וההגברה תיהיה טובה ויעילה יותר‪ .‬עד כאן פער הזמנים בין פולס לפולס הינו כ‪11ns-‬‬
‫ובאמצעות ‪ pockell's cell‬המבוסס על גביש אלקטרואופטי המוצב בין מקטבי ‪ glan-laser‬נפתח חלון‬
‫למשך מספר ננושניות המאפשר בחירתו של פולס בודד מתוך שרשרת פולסים‪ .‬הרעיון הוא שהפולס‬
‫עובר דרך לוחית חצי גל המסובבת את קיטוב הקרן ב‪ 90o-‬ולאחר הגביש ממוקם מקטב החוסם את כל‬
‫הפולסים מלבד אלו שעוברים בזמן שמופעל מתח על הגביש שאז הוא משמש כלוחית חצי גל שנייה אשר‬
‫מסובבת את הקיטוב חזרה לכיוונו המקורי כך שהפולסים עוברים את המקטב‪ .‬בסופו של התהליך מתוך‬
‫‪ 86MHz‬הפולסים שיצאו מהאוסילטור נקבל בין ‪ 190‬ל‪) 1000-‬כתלות בניסוי( פולסים בשנייה‬
‫במרווחים קבועים‪.‬‬
‫‪ .2.2.4‬המגבר )‪(multipass amplifier‬‬
‫תהליך הגברת הפולסים מבוסס על תכנון שפורסם על ידי ‪ .96Backus et al‬יתרונו של מגבר זה הוא‬
‫בכך שאינו צובר סדרים גבוהים של דיספרסיה‪.‬‬
‫תמונה מספר ‪:2.4‬‬
‫תרשים של‬
‫המגבר הרב שלבי‬
‫)מבט על(‪.‬‬
‫‪Q-switched Nd;YLF‬‬
‫‪~10W max‬‬
‫מסיכה‬
‫‪Amplified‬‬
‫‪0.5W output‬‬
‫‪Ti;Sapphire‬‬
‫‪Pulses input‬‬
‫הגברת הפולסים מתבצעת ע"י שאיבת גביש ‪ Ti:Sapphire‬הזהה לזה שבאוסילטור באמצעות לייזר‬
‫‪ Q-switch Nd:YLF‬מסחרי‪ ,‬שמוכפל בתדר ומסונכרן עם הפולסים היוצאים מן האוסילטור‪ ,‬בקצב‬
‫הגעת הפולסים בהתאם לבורר הפולסים‪ .‬הפולס השואב מרוכז ע"י עדשה לגביש הממוקם במרכז המגבר‬
‫כאשר הוא עובר זוג מראות דכרואיות ממקדות אשר מעבירות את קרינת השואב ומחזירות את ה‪.seed-‬‬
‫ה‪ seed-‬היוצא מן האוסילטור נכנס באמצעות מראה לקצה המראה הדיכרואית הראשונה‪ ,‬משם דרך‬
‫הגביש לקצה השני של המראה הדיכרואית השנייה‪ ,‬ממנה למראת זהב מישורית וחזרה למראה‬
‫הדיכרואית הראשונה מעט הצידה וכך במהלך כל תשעת המעברים )ראה תמונה מס' ‪ .(2.4‬מספר‬
‫המעברים נקבע ניסיונית על פי ההגבר הטוב ביותר המתקבל‪ .‬במעבר התשיעי הפולס המוגבר נפלט‬
‫החוצה דרך מראת זהב נוספת עם אנרגיה של ‪ .~1mJ/pulse‬מראה ספרית נוספת ממוקמת לאחר המראה‬
‫הדיכרואית השנייה‪ ,‬ומשמשת למרכז את השואב בחזרה לגביש וכך להגביר את העוצמה ביעילות‪ .‬כאשר‬
‫הפולס השואב מצוי במגבר נוצרת גם הגברה של הפליטה הספונטנית של הגביש בדיוק בכיוון ה‪seed-‬‬
‫לכן יש לכוון ולתזמן נכון את פולס ה‪ seed-‬כך שהגברתו תהיה יעילה והפליטה הספונטנית של הגביש‬
‫תופחת‪ .‬הגברה יעילה דורשת חפיפה מרחבית והתאמה זמנית מדויקת כך שהפולס הנשאב יקדים את אחד‬
‫‪31‬‬
‫‪32‬‬
‫הפולסים האדומים מהאוסילטור‪ .‬ההשהיה בין הפולסים נשמרת ולכן התזמון הראשוני הוא קריטי להשגת‬
‫הגברה יעילה‪ .‬כמו כן‪ ,‬כל המעברים עוברים דרך רצף חורים להפחתת אפקטי הפליטה ומרכוז טוב יותר‬
‫)הקטנת גודל הקרן בגביש( כך נמנע אפקט ‪ self focusing‬בגביש כתוצאה מהעוצמה הרגעית הגבוהה‪.‬‬
‫קוטר הקרן השואבת בגביש גדולה מקוטר הקרן של האוסילטור ובכך מובטח שהקרן האדומה תפגוש‬
‫אוכלוסיה מעוררת בכל מקום בו היא פוגעת‪.‬‬
‫נציין כי הפולס המוגבר עובר הצרה ספקטראלית והסטה לאדום של ‪ 10nm‬ביחס לפולס הנכנס למגבר‬
‫)החלק האדום של הפולס הוא בעל הגברה מעודפת שכן חתך הפעולה להגברה אינו קבוע ותלוי אורך גל(‪.‬‬
‫המגבר מעלה את אנרגית הפולס פי ‪ 1x105‬ל ‪ .1mJ/pulse -‬לאחר המגבר‪ ,‬הפולסים מסוננים במרחב‬
‫ע"י חריר טפלון המעצב ומשפר את פרופיל הקרן להיות בעלת התפלגות אנרגיה גאוסית )מוד לזירה‬
‫רוחבי ‪ TEM00‬בקירוב(‪.‬‬
‫‪ .2.2.5‬המכווץ )‪(compressor‬‬
‫השלב הסופי של יצירת הפולסים הינו איסוף מחדש‬
‫של מרכיבי התדירויות שנפרסו טרם כניסתם‬
‫מראה‬
‫סריג‬
‫למגבר‪ ,‬תוך ניסיון להגיע ככל שניתן לגבול‬
‫הטרנספורם‪ .‬המכווץ צריך לפצות הן על הדיספרסיה‬
‫שהכניס‬
‫הפורס‬
‫והן‬
‫על‬
‫שאר‬
‫האלמנטים‬
‫סריג‬
‫הדיספרסיביים המרכיבים את המערכת‪ .‬עקרון‬
‫פעולתו הוא הכנסת דיספרסיה שלילית הניתנת‬
‫לשליטה ע"י כיוון המרחק בין השריגים ופיצוי על‬
‫תמונה מספר ‪:2.5‬‬
‫תרשים של ה‪ compressor-‬המצוי במערכת )מבט על(‪.‬‬
‫הדיספרסיה החיובית שנוצרה במעבר במערכת‪ .‬מבנה המכווץ הנראה בציור ‪ 2.5‬מבוסס על שני שריגים‬
‫של ‪) 1200lines/mm‬בדומה לשריג המצוי בפורס( המוצבים במקביל זה לזה במרחק של )‪) 2(f-L‬מרחק‬
‫המתאים לגודל הפריסה ב‪ (stretcher-‬ומראת זהב שגודלה )‪ (5cm‬מתאים לפריסה הספקטראלית‬
‫המתקבלת‪ .‬הקרן הפוגעת בשריג הראשון נפרסת לאורכי הגל השונים בעוד השריג השני דואג שהצבעים‬
‫השונים התקדמו באותו כיוון‪ .‬המראה מחזירה את הספקטרום על עצמו בגובה שונה כך שניתן להפריד בין‬
‫הקרן הנכנסת לזו היוצאת‪ .‬בחזרה מתקבל פולס קצר ובעל אנרגיה גבוהה העלול לגרום נזק לשריג‬
‫הראשון למניעת נזק זה אנו מגדילים את הקרן לפני הכניסה למכווץ ע"י טלסקופ ובכך מקטינים את‬
‫העוצמה ליחידת שטח על השריג למתחת לסף הנזק‪ .‬נדגיש כי מבנה זה מאפשר דרגת חופש נוספת ‪ -‬כיוון‬
‫של זוויות השריגים המאפשר להשיג את הפולס הקצר יותר‪ .‬המדד להעריך את אורך הפולס הינו‬
‫להשתמש בעדשה ולגרום לפריצה באוויר ויצירת אור לבן כאשר ככל שהפולס קצר יותר האפקט הלא‬
‫ליניארי באוויר חזק יותר‪.‬‬
‫עד שלב זה מערכות הלייזר זהות ומכאן מתחילים ההבדלים‪ .‬בשלב זה קיבלנו פולסים עוצמתים של‬
‫‪ ~0.5mJ/pulse‬עם רוחב ספקטראלי של ‪ 40nm‬המרוכז סביב ‪ ~790nm‬ואורך זמני של ‪ 30fs‬בקצב‬
‫הניתן לשינוי כתלות בניסוי‪ .‬יציבות המערכת נבדקה והינה מסדר גודל של ‪.~1%‬‬
‫‪32‬‬
‫‪33‬‬
‫‪ .2.3‬מגברים פרמטרים‬
‫המגבר הפרמטרי מאפשר לקבל גמישות באורך הגל‪ .‬גמישות זו חיונית על מנת לעורר מולקולות בעלי‬
‫ספקטרום בליעה שונה ולאפשר מחקר צורונים ומצבי ביניים שונים בריאקציות כימיות‪ .‬המגבר הפרמטרי‬
‫גם תורם להרחבת הספקטרום‪ ,‬כך שפוטנציאלית ניתן להגיע לפולסים הקצרים מאלו המשמשים‬
‫לשאיבתו‪ .‬ההמרה באורך הגל מבוססת על תהליך אופטי לא לינארי מסדר שני בגביש‪ .‬מהות ההגברה‬
‫נעשית ע"י פיצול כל פוטון שואב לשני פוטונים‪ ,‬ביחס שניתן לשינוי באמצעות שינוי זווית הכניסה‬
‫לגביש‪ .‬תהליך זה מערב ‪ 3‬פוטונים המקיימים‪ w1=w2+w3 :‬יחד עם שימור תנע הפוטונים ‪.k1=k2+k3‬‬
‫קרן אחת היא הקרן השואבת )‪ ,(w1‬קרן שנייה מוגברת ומכונה ‪ signal‬וקרן שלישית המשלימה את מאזן‬
‫האנרגיה והתנע ומכונה ‪.idler‬‬
‫‪traveling wave optical parametric amplifier of superfluorescence - TOPAS .2.3.1‬‬
‫ב‪ TOPAS-‬הקרן עוברת חמישה שלבי הגברה בגביש ‪ BBO‬יחיד המשמש כתווך המגביר‪ .‬המעבר‬
‫הראשון משמש לפליטת סופר‪-‬פלואורסנציה רחבת פס‪ .‬המעברים השני‪ ,‬השלישי והרביעי קובעים את‬
‫פרופיל הקרן המרחבי ופועלים כמגבר פרמטרי‪ .‬המעבר החמישי והאחרון משמש להגברת התהליך‪ .‬רק‬
‫‪ 70%‬מהפלט של ה‪ compressor-‬משמש לשאיבה ולהגברה ב‪) TOPAS-‬לחמשת המעברים(‪30% ,‬‬
‫נותרים ב‪ 790nm-‬ומשמשים או לעירור ב‪) 400nm-‬תוך שימוש בגביש מכפיל( או כשיש צורך בפולס‬
‫היסודי השואב למחקר‪ .‬נציין כי החלק הנותר יציב יותר ונטול דיספרסיה ביחס ל‪ 70%-‬העוברים ב‪-‬‬
‫‪ .TOPAS‬התדרים הנפלטים הם בתחום ה‪ (1160-2600nm) IR-‬ועל מנת להרחיב את טווח התדרים‬
‫ניתן להשתמש בגביש מכפיל נוסף )ניתן להכפיל הן את ה‪ signal-‬והן את ה‪ .(idler-‬כמו כן‪ ,‬ניתן לערבב‬
‫את התדר שנוצר ב‪ TOPAS-‬עם התדר השואב )‪ .(790nm‬כך המגבר הפרמטרי יכול ליצור פולסים‬
‫בתחום רחב של אורכי גל מ‪ 470nm-‬עד ל‪ .2600nm-‬פולסים אלו בעלי רוחב ספקטראלי של‬
‫‪) FWHM~50nm‬תלוי אורך גל(‪.‬‬
‫במטרה לפצות על האלמנטים הדיספרסיביים הקיימים ב‪ TOPAS-‬אנו מכווצים פולסים אלו או ע"י‬
‫שימוש בזוג פריזמות עשויות קוורץ או ע"י שימוש בשריג‪ .‬לאחר כיווץ הפולסים אנו מקבלים פולסים‬
‫באורך זמני של כ‪) 30fs-‬כתלות ברוחב הספקטראלי שהתקבל(‪.‬‬
‫‪non-collinear optical parametric amplifier – NOPA .2.3.2‬‬
‫‪97‬‬
‫ה‪ NOPA-‬ממירה את אורך הגל היוצא מן המגבר )‪ (~790nm‬לאזור התחום הנראה תוך הרחבת הטווח‬
‫הספקטראלי )‪ ,(FWHM~3000cm-1‬טווח זה מאפשר קבלת פולסים קצרים של ‪) 7fs‬לאחר כיווץ(‪ .‬אנו‬
‫משתמשים רק במחצית האנרגיה היוצאת מה‪ compressor -‬לפעולת ה‪ NOPA-‬המחצית האחרת שימשה‬
‫אותנו הן לעירור ב‪) 400nm-‬תוך שימוש בגביש מכפיל( והן לאפיון משך הפולס וכיווצו תוך שימוש‬
‫בפולס היסודי )‪.(~800nm‬‬
‫ה‪ NOPA-‬בנויה משלושה שלבים עיקריים‪:‬‬
‫‪ .1‬הכפלת חלק מפולסי הלייזר הנכנס‪ -‬התדר המוכפל עובר דרך שתי לוחיות ‪ fused silica‬בזווית‬
‫ברוסטר המאריכות את הפולס המוכפל בזמן‪ ,‬קרן זו מתמקדת מעט לפני גביש ה‪ BBO-‬ומשמשת כקרן‬
‫השואבת בהגברה הפרמטרית‪.‬‬
‫‪33‬‬
‫‪34‬‬
‫‪ .2‬יצירת אור לבן בספיר משארית פולסי הלייזר תוך שימוש במראות ממקדות לאחר יצירת האור הלבן‬
‫על מנת לקבל פולס רחב יותר ופחות דיספרסיבי ‪ .‬פולס האור הלבן משמש כ‪ seed-‬להגברה‪.‬‬
‫‪ .3‬שתי הקרניים הללו נכנסות לגביש בצורה לא קולינארית‪ ,‬בדרך זו אנו מגדילים את טווח התדרים של‬
‫ה‪ phase matching-‬בגביש )שיטה המאפשרת יחסי פאזה מתאימים בין הגלים האינטראקטיביים וקבלת‬
‫אינטראקציה לא ליניארית יעילה(‪ .‬קרניים אלו חופפות בזמן ובמרחב ליצירת הגברה יעילה בגביש ה‪-‬‬
‫‪) BBO‬גביש בעובי של ‪.(2mm‬‬
‫הפוטון באורך הגל הקצר )‪ (400nm‬מתפצל ל‪) signal-‬בנראה ‪ (480-720nm -‬ול‪) idler-‬ב‪ (IR-‬אם‬
‫כי‪ ,‬אנו חסמנו את ה‪ idler-‬והשתמשנו רק ב‪ .signal-‬ספקטרום טיפוסי של ה‪ NOPA-‬נראה בתמונה‬
‫מספר ‪ ,2.10‬מרכזו ב‪ 600nm -‬והוא בעל אנרגית פולס אופיינית של ‪ .5µJ/pulse‬תיאורטית הטרנספורם‬
‫פורייה של פולס כזה הינו ‪ ,5fs‬בפועל הפולס היוצא מה‪ NOPA-‬ארוך מאוד בשל הדיספרסיה בספיר‬
‫ובגבישים‪,‬כך שעל מנת להגיע קרוב לגבול הטרנספורם יש צורך לכווצו‪ .‬כיווץ זה נעשה באמצעות שילוב‬
‫של זוג פריזמות ו‪ shaper-‬ומספק פולס של כ‪.6fs-‬‬
‫‪ .2.4‬כיווץ‬
‫הפולסים היוצאים מן המגברים הפרמטרים אינם קצרים אך בעלי פוטנציאל להיות כאלה )פוטנציאל‬
‫הטמון ברוחב הספקטראלי(‪ .‬איפוס אופטימאלי של סדרים אלו מבוצע באמצעות מכווצים אופטיים אנו‬
‫השתמשנו בניסויים בפריזמות‪ ,‬שריג ו‪ shaper-‬ואף שילבנו בניהם‪ .‬הכיווץ שבוצע תוך שימוש בזוג‬
‫פריזמות או בשריג סיפק פולסים ארוכים יותר )‪ (~30fs‬ולא איפשר להשיג את גבול הטרנספורם )עיקרון‬
‫פעולת הכיווץ של הפריזמות והשריג אינו מתואר כאן( ‪ .‬לקבלת פולסים קצרים במיוחד )‪(FWHM=7fs‬‬
‫אנו משתמשים בשילוב של פריזמות ו‪ .shaper-‬ואפיונם של פולסים קצרים אלו מבוצע באמצעות‬
‫‪ FROG‬ואוטוקורלציה המפורטים בהמשך‪.‬‬
‫‪shaper .2.4.1‬‬
‫מערך ה‪ shaper-‬מבוסס על שריג‪ ,‬מראה מתעוותת‬
‫)‪ 98(DM‬ומראה קמורה ונראה בתמונה מספר ‪ .2.6‬הקרן‬
‫הנכנסת פוגעת בשריג הפורס את הספקטרום על המראה‬
‫‪DM‬‬
‫‪f = 22 cm‬‬
‫הקמורה שנמצאת במרחק ‪ f‬ממנו‪ .‬המראה מחד דואגת כי‬
‫כל הצבעים יתקדמו באותו כיוון מרחבי הואיל והשריג‬
‫נמצא במרחק של אורך מוקד המראה ומאידך ממקדת כל‬
‫צבע על המראה המתעוותת‪ .‬בצורה כזו יש לוקליות‬
‫תמונה מספר ‪ :2.6‬מבנה ה‪ shaper-‬המבוסס על‬
‫מראה מתעוותת )‪.(DM‬‬
‫גבוהה של כל אורך גל על המראה המתעוותת‬
‫והספקטרום פרוס עליה כפס דק כך נמנעים מעיוותים בכיוון הניצב לפריסת הספקטרום‪ .‬המראה‬
‫המתעוותת מחזירה את הספקטרום באותו מסלול אך בגובה שונה‪ .‬כך שבפגיעת הקרן החוזרת בשריג‬
‫מתאחדים הצבעים מחדש‪ .‬השריג מוצב על טרנסלטור כך ניתן לשנות את המרחק בין המראה הממקדת‬
‫והשריג ולספק פיצוי נכון של הדיספרסיה‪ .‬בכיוון הראשוני המדד לכיווץ הינו אור לבן כך שככל שהפיצוי‬
‫‪34‬‬
‫‪35‬‬
‫טוב יותר כלומר הפולס קצר יותר האפקט חזק יותר )האור הלבן מושג ע"י שימוש במראה הממקדת לתוך‬
‫ספיר ולא ע"י שימוש בעדשה בלבד כמו שנעשה ב‪.(compresor-‬‬
‫המראה המתעוותת עשויה ממבראנה ומצופה בחומר מחזיר )זהב‪ ,‬כסף וכו'( גודלה כ‪ 4cm-‬ובה ‪19‬‬
‫אלקטרודות )ראה תמונה מספר ‪.(2.7‬‬
‫כתוצאה מהפעלת מתחים )עד ‪ (270volt‬על‬
‫האקטואטורים ישנו עיוות בצורת המראה וכך‬
‫נגרמים שינויי פאזה קלים עבור כל אורך גל‪.‬‬
‫אנו למעשה לא מנצלים את כל המראה כיוון‬
‫שהאלקטרודות בקצוות המראה לא כל כך‬
‫אפקטיביים‪ .‬על המראה לקבל צורה על מנת‬
‫תמונה מספר ‪ :2.7‬מבנה המראה המתעוותת )‪ .(DM‬ממבראנה‬
‫דקה עשויה ‪ Si3N4‬ומצופה‪ 19 .‬אלקטרודות שכתוצאה מהפעלת‬
‫מתח מסוגלות למשוך אלקטרוסטטית ובכך לעצב את צורת‬
‫המראה והפולס‪.‬‬
‫לפצות על הדיספרסיה שנוצרה עד למקום הדגם )שכן שם אנו זקוקים שם לפולס הקצר ביותר(‪ .‬צורת‬
‫המראה נקבעת ע"י המתח הספציפי המופעל על האלקטרודה‪ ,‬כך שלכל אלקטרודה ‪ 270‬אפשרויות‪.‬‬
‫במידה ודיספרסית הפולס ידועה‪ ,‬העיוות הדרוש ידוע וניתן לקבע את צורת המראה אך בניסויים שביצענו‬
‫המערך הניסיוני עבר שינויים )ניסויי ‪ (control‬ואפילו במהלך ניסוי ידוע עם מערך זהה ישנם שינויים‬
‫בספקטרום היוצא מה‪) NOPA-‬ככל הנראה כתוצאה משינוי בטמפרטורה( אנו לא יכולים לחזות את‬
‫צורת המראה מראש ועלינו לאפשר גמישות בצורת המראה‪ .‬על מנת לענות על דרישה זו השתמשנו‬
‫באלגוריתם אבולוציוני‪ .‬תחילה ישנו ניחוש אקראי אשר ממנו נבחרים הטובים ביותר ומהם יוצרים דור‬
‫חדש אשר ממנו מחלצים את הטובים ביותר ליצירת דור חדש וכך הלאה עד שמתכנסים לנקודת הקיצון‪.‬‬
‫יתרונות האלגוריתם הגנטי הם שהוא אינו דורש מידע מוקדם לגבי התהליך אלא רק פרמטר להערכת‬
‫הפיתרון והוא גם מטפל בבעיית התלות בין חלקי המראה‪ .‬החסרונות של אלגוריתם זה‪ .1 :‬לא בטוח כי‬
‫נגיע לנקודת הקיצון המוחלטת כלומר לא בהכרח נגיע לניחוש הטוב ביותר אלא נעמוד בנקודת קיצון‬
‫מקומית‪ .2 .‬כיוון שמתחילים מניחוש אקראי זמן ההתכנסות ארוך וניחושים רבים נפסלים‪.‬‬
‫פיתרון חלקי ניתן לבעיות אלו‪ .1 :‬אנו יודעים את הספקטרום שלנו ולכן יכולים לחשב את גבול‬
‫הטרנספורם שלו‪ .‬כמו כן אנו יכולים לאפיין את הפולס שיצרנו )נרחיב בהמשך( כך שבמידה ולא‬
‫התקרבנו לגבול הטרנספורם נדע כי נפלנו לנקודת קיצון מקומית ואז נפעיל שוב את האלגוריתם‪ .2 .‬אנו‬
‫יכולים להתחיל מניחוש התחלתי מסוים שאנו יודעים ניסיונית כי הוא קרוב לניחוש הרצוי כך שזמן‬
‫ההתכנסות הינו מספר דקות‪.‬‬
‫אנו זקוקים למדד המעיד על הפולס הקצר ביותר‪ ,‬מדד על פיו יעבוד האלגוריתם ויגיע לנקודת הקיצון‪,‬‬
‫מדד כזה הינו או הכפלת הספקטרום על גביש מכפיל )דק במיוחד( כך שככל שהפולס קצר יותר‪ ,‬השטף‬
‫הרגעי גדול יותר ועוצמת ההכפלה גבוהה יותר או ע"י מקסום עוצמת האוטוקורלציה על אותו הגביש‬
‫)נרחיב על כך בחלק העוסק באפיון הפולסים(‪.‬‬
‫‪35‬‬
‫‪36‬‬
‫‪88‬‬
‫‪ .2.4.2‬יצירת פולסים עם ‪chirp‬‬
‫יצירת פולסים קצרים ומבנה הפאזות של הפולס‬
‫‪94,99‬‬
‫פולס אור המתקדם בחומר מורחב בזמן כיוון שכל רכיב פורייה מתקדם בחומר כתלות בסוג ועובי החומר‬
‫)בדיספרסיה שלו( ונוצר הפרש פאזה בין הרכיבים‪.‬‬
‫כדי לאפיין את אפקט מעבר פולס האור בחומר נניח פולס המתואר במרחב הזמן ע"י שדה בצורת גאוסיאן‬
‫המתקדם בכיוון ציר ‪) z‬תיאור המאפשר טיפול מתמטי פשוט ומקורב עבור הפולסים שלנו(‪ ,‬התנהגות‬
‫השדה הינה ‪ , E( z ,ω ) = E0(ω ) ⋅ exp(−iϕ(ω ) ) :‬כאשר ‪ ϕ‬מייצג את הפאזה התלויה בתדר ונתונה ע"י‬
‫‪ ϕ(ω ) = k(ω ) ⋅ z ϕ(ω ) = k(ω ) ⋅ z‬ו‪ E0 -‬מייצג גיאוסיאן במרחב התדר‪ .‬ניתן לפתח לטור טיילור את הפאזה‬
‫סביב התדר המרכזי‪ ,ω0,‬בתנאי שהיא משתנה לאט בתדר באופן הבא‪:‬‬
‫) ‪∂ϕ (ω0‬‬
‫) ‪1 ∂ 2ϕ (ω0‬‬
‫) ‪1 ∂ 3ϕ (ω0‬‬
‫‪2‬‬
‫‪ω‬‬
‫‪ω‬‬
‫⋅ ‪⋅ (ω − ω0 ) +‬‬
‫⋅‬
‫(‬
‫‪−‬‬
‫)‬
‫‪+‬‬
‫⋅‬
‫‪⋅ (ω − ω0 )3 + ...‬‬
‫‪0‬‬
‫‪∂ω‬‬
‫‪2 ∂ω 2‬‬
‫‪6 ∂ω 3‬‬
‫‪ϕ (ω ) = ϕ (ω0 ) +‬‬
‫ האיבר הראשון ‪ ϕ (ω 0 ) -‬הינו פאזה קבועה שאינה משפיעה על צורת הפולס או מיקומו בזמן‪.‬‬‫ הנגזרת הראשונה ‪ -‬נקראת )‪ .Group Delay (GD‬היא מהווה "עיכוב" של הפולס כולו‪ ,‬אך ללא שינוי‬‫במבנה המעטפת או הגל הנושא‪.‬‬
‫מכאן ואילך יתר הסדרים מייצגים עיוות בצורת הפולס ומשנים את משך הפולס‪:‬‬
‫ הנגזרת השנייה ‪ Group Delay Dispersion(GDD) -‬או )‪.Group Velocity Dispersion (GVD‬‬‫ הנגזרות הבאות ‪ FOD (Forth Order Dispersion) ,TOD (Third Order Dispersion) -‬וכו'‪.‬‬‫בסימונים אלו‪ ,‬ניתן לרשום את פונקצית הפאזה כ‪-‬‬
‫‪1‬‬
‫‪2‬‬
‫‪1‬‬
‫‪6‬‬
‫‪ϕ (ω ) = ϕ (ω0 ) + GD ⋅ (ω − ω0 ) + ⋅ GVD ⋅ (ω − ω0 ) 2 + ⋅ TOD ⋅ (ω − ω0 )3 + ...‬‬
‫פולס מכונה )‪ TL (transform limited‬כאשר כל רכיבי הפאזה )רכיבי פורייה הבונים אותו( מתאפסים‬
‫וזהו הפולס הקצר ביותר שניתן לקבל עבור ספקטרום נתון‪ .‬מכאן שעל מנת לקבל פולס קצר בזמן יש‬
‫הכרח למלא שתי דרישות )דרישה אחת אינה מספיקה(‪:‬‬
‫‪ .1‬ספקטרום רחב בתדר‪.‬‬
‫‪ .2‬תיאום פאזות בין התדרים השונים‪.‬‬
‫כאשר הפולס אינו ‪ TL‬הוא מורחב בזמן והתופעה מכונה ‪ .chirp‬אם מתייחסים רק לנגזרת השנייה בעוד‬
‫יתר איברי הטור ניתנים להזנחה ניתן להגיד כי אנו קיבלנו ‪ chirp‬ליניארי וניתן לחשב את פקטור‬
‫‪τ out‬‬
‫ההארכה כתוצאה מ‪ GVD-‬בלבד על פי הנוסחא‪= 1 + 4 ⋅ GVD 2 ⋅ Γ 02 :‬‬
‫‪τ0‬‬
‫כאשר‬
‫‪2 ln 2‬‬
‫‪2‬‬
‫‪0‬‬
‫‪τ‬‬
‫= ‪τ0) Γ 0‬‬
‫זהו רוחב הפולס ה‪ TL -‬ב‪ GVD .(FWHM -‬חיובי מעיד כי התדירות הרגעית של הפולס גדלה עם הזמן‬
‫כלומר הדיספרסיה חיובית )‪ (positive chirp - PC‬משמעותה הפיסיקאלית היא כי התקדמותם של‬
‫אורכי הגל הארוכים בתווך )האדומים( מהירה יותר מהתקדמות אורכי הגל הקצרים בו )הכחולים(‪ .‬בעוד‬
‫‪ GVD‬שלילי מעיד כי התדירות הרגעית של הפולס קטנה עם הזמן כלומר הדיספרסיה שלילית )‪– NC‬‬
‫‪ (negative chirp‬כלומר הכחולים מקדימים את האדומים‪ .‬נציין כי רוב החומרים בטבע הינם בעלי‬
‫‪36‬‬
‫‪37‬‬
‫דיספרסיה חיובית בתחום הנראה וה‪ NIR -‬ועל מנת לפצות על הדיספרסיה הנובעת ממעבר באלמנטים‬
‫האופטיים ולכווץ את הפולס יש להתגבר על דיספרסיה זו‪ .‬אלמנטים אופטיים כגון‪ :‬פריזמות‪ ,‬שריג‪,‬‬
‫‪ shaper‬וכדומה עוזרים לנו להשיג פולס קצר בזמן‪.‬‬
‫פולסי ‪ chirped‬בהם אלמנטי התדר לא מגיעים בו זמנית משמשים למיון ושיוך תדרי ויברציה שונים‪.‬‬
‫בניסיונותינו אנו נשתמש ב‪ . linear chirp -‬ב‪ linear chirp-‬לא קיימים איברים מסדר הגבוה מ‪GVD-‬‬
‫כך שלפי הגדרה הפאזה משתנה באופן פרבולי כתלות בתדירות והתדרים השונים של הפולס מגיעים‬
‫בזמנים שונים עם תלות ליניארית בזמן‪ .‬על מנת להכניס ‪ linear chirp‬באופן כפוי אך מבוקר לפולס אנו‬
‫נוסיף ונוציא חומר לדרך האופטית של פולס ה‪ NOPA-‬הקצר והעוצמתי‪ .‬כלומר אנו מלכתחילה מבצעים‬
‫כיווץ של המראה המתעוותת בנוכחות חלונות קווארץ בעובי זהה המצויות הן על ה‪ pump-‬והן על ה‪-‬‬
‫‪) probe‬לשם איזון הדיספרסיה( כאשר מצב זה מוגדר כ‪ TL-‬ומספק את הפולס הקצר ביותר‪ .‬כאשר אנו‬
‫מעוניינים ב‪ NC-‬נוציא את חלון הקווארץ של ה‪ pump-‬ובמקומו נשים חלון דק יותר וכך למעשה פיצינו‬
‫ביתר בעוד כאשר נרצה ‪ PC‬נוסיף חלון קוורץ נוסף על זרוע ה‪ .pump-‬בדרך זו תוך שימוש בחלונות‬
‫קווארץ )‪ (fused silica‬איכותיות בעובי שונה ניתן לייצר דיספרסיות שונות‪ .‬החלונות הושמו בזווית‬
‫‪ Brewster‬על מנת להימנע מאיבודים והחזרות פנימיות‪ .‬נדגיש כי אפיינו את הפולסים השונים שיצרנו‬
‫עבור כל מקרה באמצעות אוטוקורלציה ו‪ FROG-‬ודאגנו לכך שה‪ TL-‬נשמר לכל אורך יום הניסוי והוא‬
‫אכן הפולס הקצר ביותר שכן הוצאה והכנסה של חלונות עשויה לשנות את הדרך האופטית ולא לאפשר‬
‫חזרה ל‪ .TL-‬נדגיש כי יש להימנע מהוספת כמות גדולה של חומר שכן פולס ארוך מדי יהיה ארוך‬
‫ממחצית זמן מחזור הויברציה הרצויה ולא יאפשר את מחקרה‪.‬‬
‫‪ .2.5‬אפיון פולסים קצרים‬
‫זמן התגובה של מערכות מדידה אלקטרוניות אינו מאפשר למדוד באופן ישיר פולס של פמטושניות‪ .‬לכן‬
‫כאשר אנו רוצים למדוד ולאפיין פולסים קצרים )של ‪ (7fs‬אנו נדרשים לשיטות אחרות העוקפות את‬
‫הבעיה האלקטרונית‪ .‬אנו השתמשנו באוטוקורלציה וב‪ FROG-‬לאפיון הפולסים‪ .‬שתי השיטות מספקות‬
‫מידע משלים על הפולסים למרות ששתיהן מבוססות על מבנה אינטרפרומטר ויש משמעות לקיטוב‬
‫הקרניים כלומר חשוב שהקרניים יהיו מקוטבות בצורה סבירה‪.‬‬
‫‪ .2.5.1‬אוטוקורלציה )‪ (autocorrelation‬והכפלת תדר‬
‫אוטוקורלציה מבוססת על אינטרפרומטר מאוזן זרועות אשר מודד שינויים ביחס לעוצמת קרינה אפס‪ .‬אנו‬
‫יוצרים מהפולס אותו אנו מעוניינים לאפיין שני עתקים זהים בעזרת מפצל )‪ .(beam splitter‬הקרן‬
‫שמוחזרת ואינה עוברת במפצל עוברת דרך חומר בעל דיספרסיה זהה דבר החשוב כאשר עוסקים‬
‫בפולסים מאוד קצרים )בניסוי אנו גם מכניסים פיצוי של חלון התא(‪ .‬אחת הקרניים ניצבת על מסוע‬
‫המסוגל לנוע בדיוק גבוה )‪ (1µ=3.3fs‬וכך גורמים להפרש דרכים אופטי בין הפולסים‪ .‬שתי הקרניים‬
‫מתמקדות לגביש מכפיל תדר‪ .‬כאשר שני הפולסים חופפים בזמן ובמרחב נוצרת קרן מוכפלת תדר במרכז‬
‫שמקורה בפוטון אחד מקרן אחת ופוטון שני מהקרן השנייה‪ .‬בשל שימור תנע‪ ,‬קרן זו מתקדמת בכיוון‬
‫‪37‬‬
‫‪38‬‬
‫שונה ולכן קל להפרידה‪ .‬עוצמת האוטוקורלציה פרופורציונית לקונבולוצית העוצמות של שתי הקרניים‬
‫∞‬
‫המרכיבות אותה או להפרש הדרכים האופטיות בין הפולסים‪(t − τ )dτ :‬‬
‫‪2‬‬
‫‪∫ I (t )I‬‬
‫‪1‬‬
‫∝ ) ‪. I a .c (t‬‬
‫∞‪−‬‬
‫אנו עוסקים בפולסים גאוסיים ולכן פיתרון האינטגרל נותן את הרוחב‪2σ :‬‬
‫‪σ1 =σ 2‬‬
‫= ‪. σ a . c = σ 12 + σ 2 2‬‬
‫מכיוון ששתי הזרועות זהות בדיספרסיה‪ ,‬האוטוקורלציה סימטרית ביחס לאפס‪ .‬חסרונה של שיטת אפיון‬
‫זו היא שלא ניתן לקבל מידע על פאזת השדה ועל דיספרסית הפולס‪ .‬כמו כן‪ ,‬כיוון שאנו עוסקים בפולס‬
‫קצר בעל רוחב ספקטראלי גדול קשה לקיים בגביש הלא לינארי את תנאי התאמת הפאזות ) ‪phase‬‬
‫‪ (match‬לכל אורכי הגל ולכן ייתכן שחלק מאורכי הגל אינם מוכפלים ולכן לא באים לידי ביטוי במדידה‬
‫משחק עם הזווית של הגביש ושימוש בגביש דק במיוחד )‪ (BBO 20µm‬מאפשר לנו להשיג את ההתאמה‬
‫הטובה ביותר ולשפר את יעילות ההגברה עבור רוב הצבעים כך שנשארת בעיה רק בקצוות‪.‬‬
‫באוטוקורלציה יש משמעות לקיטוב הפולס‪ ,‬חשוב ששתי הקרניים יהיו מקוטבות בצורה זהה לקבלת‬
‫סיגנל חזק‪ .‬עוצמת ההכפלה מעידה על אורך הפולס כאשר ככל שהפולס קצר יותר עוצמת ההכפלה גדלה‬
‫באותו הפקטור‪ .‬כמו כן‪ ,‬עוצמה זו משמשת מדד לכיווץ המבוצע ע"י ה‪ shaper-‬כפי שצוין לעיל ואף‬
‫בעזרת האוטוקורלציה ניתן למצוא את זמן האפס בין שני הפולסים )אינדיקציה לכך שהדרכים זהות(‪.‬‬
‫עוצמת ההכפלה והאוטוקורלציה נקראת באמצעות פוטודיודה למחשב )תוצאת האוטוקורלציה מוצגת‬
‫בתמונה מספר ‪.( 2.10‬‬
‫תמונה מספר ‪:2.8‬‬
‫מערך האוטוקורלציה‪.‬‬
‫הקרן האמצעית היא‬
‫האוטוקורלציה בעוד‬
‫שבצדדים‬
‫הקרניים‬
‫הכפלה )מבט על(‪.‬‬
‫‪Beam‬‬
‫‪Splitter‬‬
‫‪t1‬‬
‫‪Photo-diode‬‬
‫‪Photo-diode‬‬
‫‪Barrier‬‬
‫‪t2‬‬
‫‪Doubling‬‬
‫‪Crystal‬‬
‫‪Compensation‬‬
‫‪Focusing‬‬
‫‪Optics‬‬
‫‪Delay line‬‬
‫‪optical Kerr effect .2.5.2‬‬
‫תמונה מספר ‪:2.9‬‬
‫מערך לאפיון‬
‫דיספרסיית הפולסים‬
‫הקצרים באמצעות‬
‫אפקט ‪ kerr‬האופטי‬
‫)מבט על( ‪.‬‬
‫‪100‬‬
‫‪λ/2‬‬
‫‪Pump\Gate‬‬
‫‪Polarizer‬‬
‫‪CCD array‬‬
‫‪Probe‬‬
‫‪Barrier‬‬
‫‪Kerr‬‬
‫‪Medium‬‬
‫‪Focusing‬‬
‫‪Optics‬‬
‫‪Delay line‬‬
‫אפקט ‪) kerr‬כפי שנרשם באוסילטור( הינו אפקט לא לינארי בו מקדם השבירה של חומר שקוף משתנה‬
‫בנוכחות שדה‪ .‬כאשר האור מקוטב נוצרים בחומר שני מקדמי שבירה שונים האחד גבוה בכיוון קיטוב‬
‫השדה והשני נמוך ובכיוון ניצב לו‪ ,‬תופעה זו גורמת לחומר להפוך ללוחית גל וירטואלית‪ .‬אנו משתמשים‬
‫בתופעה זו כדי לאפיין את דיספרסיית הפולסים הקצרים )מה שבלתי אפשרי לדעת באוטוקורלציה(‪.‬‬
‫‪38‬‬
‫‪39‬‬
‫למעשה פותחים חלון של ‪) 30fs‬מכונה ‪ (gate‬באמצעות פולס שואב בחומר )שארית הקרן שיוצאת‬
‫מהלייזר הבסיסי )‪ ((800nm‬חלון זה נפתח בחומר רק בזמן מעבר הפולס השואב ופולס זה הוא שקובע‬
‫את רזולוצית המדידה‪ .‬חופפים את שתי הקרניים כאשר ישנה זווית קיטוב של ‪ 45‬מעלות בין השואב )ה‪-‬‬
‫‪ (gate‬לקרן אותה ברצוננו לאפיין )הקרן היוצאת מה‪ (NOPA-‬בתווך השקוף )חתיכת קוורץ דק(‪ .‬אחרי‬
‫התווך מכניסים מקטב הניצב לקיטוב הפולס אותו מאפיינים‪ ,‬ומשנים את התזמון היחסי בין שני הפולסים‬
‫באמצעות מסוע מדויק )ראה מערך ניסיוני בתמונה ‪ .(2.9‬כאשר שני הפולסים חופפים בזמן נוצרת לוחית‬
‫גל בכיוון הפולס השואב והפולס הנבחן מקבל קיטוב אליפטי‪ .‬ככל שהחפיפה גדולה יותר הפולס הנבחן‬
‫הופך מעגלי יותר ולכן העוצמה הנמדדת לאחר המקטב גדולה יותר ופרופורציונית ל‪-‬‬
‫∞‬
‫‪(t ) I NOPA (t − τ )dτ‬‬
‫‪2‬‬
‫‪gate‬‬
‫‪∫I‬‬
‫∝ ) ‪ . I ker r (t‬בשיטה זו נחוץ כי קיטוב הקרניים יהיה סביר כדי להימנע‬
‫∞‪−‬‬
‫מהתאבכויות המפריעות למדידה שנובעות ממעבר קרינה במקטב ללא תלות בשער‪ .‬אנו מודדים את‬
‫ספקטרום השדה שעובר באמצעות ‪) CCD‬נרחיב בהמשך(‪ .‬בדרך זו אומנם לא ניתן לדעת את אורך‬
‫הפולס הנבחן כיוון שהרזולוציה נקבעת על פי הפולס השואב )כ‪ (30fs-‬בעוד הפולס הנבחן קצר ביותר‬
‫מפקטור ‪ 3‬אך בדרך זו ניתן לאפיין את דיספרסיית הפולס‪.‬‬
‫מדידה זו מכונה ‪ (frequency resolved optical gating) PG-FROG‬כיוון שהשער הוא שער‬
‫הפולריזציה‪ .‬נציין שאפיון זה בעל חשיבות עצומה כשמבצעים "משחקים" עם הפולסים הקצרים ורוצים‬
‫לדעת מה דיספרסיית הפולס שיצרנו‪ .‬התוצאה המתקבלת מוצגת בתמונה ‪ .1012.10‬אפיון פולסים עם‬
‫‪ chirp‬שלילי וחיובי נראה בתמונה ‪.1012.11‬‬
‫תמונה מספר ‪ :2.10‬משמאל למעלה‪-‬‬
‫ספקטרום ‪NOPA‬טיפוסי‪.‬‬
‫מימין‪ -‬תוצאת האוטוקורלציה בין שני‬
‫פולסי ה‪ NOPA-‬לאחר כיווץ וקבלת‬
‫הפולס הקצר ביותר המתאים ל‪.7fs-‬‬
‫משמאל למטה‪ -‬תוצאת ה‪PGFROG-‬‬
‫עבור פולס קצר זה )‪ (TL‬ניתן לראות‬
‫שאורכי הגל השונים מגיעים בזמן אפס‬
‫כאשר בקו לבן נראה ה‪ GD-‬של פולס‬
‫ה‪.NOPA-‬‬
‫תמונה מספר ‪:2.11‬‬
‫למעלה‪ -‬עוצמת סיגנל ‪PG-‬‬
‫‪ FROG‬מנורמלת עבור‬
‫‪ PC,TL,NC‬ייצוגיים‪ .‬על פני‬
‫מפות הקונטורים מצוייר בקו לבן‬
‫ה‪ GD-‬שהתקבל ‪.‬‬
‫למטה‪ -‬ציור ה‪ GD-‬עם ההתאמה‬
‫הלינארית הטובה ביותר באדום‪.‬‬
‫)תחום אורכי הגל הינו ‪500-650‬‬
‫לפי ספקטרום ה‪NOPA-‬‬
‫הטיפוסי(‪.‬‬
‫‪39‬‬
‫‪40‬‬
‫‪ .2.6‬המערך הניסיוני‬
‫כל הניסויים מבוססים על שיטת ‪ pump-probe‬והנתונים נאספים במרחב הזמן‪ .‬תחילה נרחיב על שיטה‬
‫ספקטרוסקופית זו ובהמשך נפרט את מערכי הניסוי הספציפיים‪.‬‬
‫‪ .2.6.1‬שיטת ‪pump-probe‬‬
‫בשיטת ‪ pump-probe‬ניתן לעקוב בזמן אמת אחרי תהליכים כימיים כגון‪ :‬העלמות מגיב‪ ,‬מצבי ביניים‬
‫ויצירת תוצר המאופיינים ספקטרוסקופית‪ ,‬כמו כן ניתן לקבל בשיטה זו תזוזות ויברציוניות המצביעות על‬
‫המבנה‪ .‬כפי שציינו במבוא שיטה זו מתגברת על זמן תגובת הגלאי ומתבצעת במרחב הזמן‪.‬‬
‫בספקטרטסקופית ‪ pump-probe‬טיפוסית ישנו פולס ראשון המשמש לעירור פוטוכימי אימפולסיבי של‬
‫הריאקציה הכימית )‪ ,(pump‬ופולס נוסף חלש שמנטר את הדגם לאחר מכן )‪ (probe‬הנמצא בחפיפה עם‬
‫אזור האינטראקציה ומעיד על שינויי הבליעה )עם ובלי עירור פוטוכימי( בזמני השהייה שונים‪ .‬התזמון‬
‫היחסי בין שני פולסים אלו‪ ,‬נעשה ע"י שינוי הדרך האופטית של אחת הקרניים ביחס לשנייה באמצעות‬
‫טרנסלטור עם דיוק רב‪ ,‬כך ניתן לקבל ספקטרום טראנזיאנטי של שינוי הבליעה בזמן בעקבות התגובה‬
‫הפוטוכימית בדגם‪ .‬מערך ניסוי פשוט נראה בתמונה מספר ‪ 2.12‬אך נציין כי ניתן ליצור אלומות אלו‬
‫באורכי גל שונים ובאורך זמני שונה כתלות‬
‫בספקטרום הפולס ואף לבצע ניסוי עם יותר משתי‬
‫‪Chopper‬‬
‫אלומות‪ .‬האלומות השונות חייבות לחפוף בזמן‬
‫‪Beam‬‬
‫‪Splitter‬‬
‫‪t1‬‬
‫‪probe‬‬
‫‪t2‬‬
‫ובמרחב‪ .‬ה‪ probe-‬צריך לעבור בתוך האזור בו‬
‫‪pump‬‬
‫‪sample‬‬
‫‪Barrier‬‬
‫עבר ה‪ pump-‬וכדי להבטיח זאת דאגנו שקוטר‬
‫קרן ה‪ pump-‬באזור החפיפה בדגם יהיה גדול דיו‪,‬‬
‫‪Delay line‬‬
‫על מנת להקיף את קרן ה‪ probe-‬במלואה )בכל‬
‫תמונה מספר ‪ :2.12‬מערך לניסוי ‪ pump-probe‬פשוט‪.‬‬
‫הניסיונות עבדנו עם קרן ‪ pump‬הגדולה ביותר‬
‫מפקטור ‪ 2‬ביחס ל‪ .(probe-‬גודל הקרן בדוגמא מחושב מתוך מדידת העוצמה לפני ואחרי חריר ותחת‬
‫ההנחה כי הקרן גאוסית‪ .‬חישוב אוכלוסיית המצב המעורר )חישוב ה‪ (bleach-‬מתקבל מתוך שטף‬
‫הפוטונים )מספר פוטונים ליחידת שטח( שמוכפל בחתך הפעולה לבליעה‪ .‬את מספר הפוטונים מקבלים‬
‫מחלוקה של האנרגיה הכללית שנמדדה בניסוי באנרגיה של כל פולס‪ ,‬ומהקשר בין העברה לבליעה‬
‫מקבלים את האוכלוסייה שעוררה במונחי בליעה‪ .‬האיסוף שלנו מבוצע באופן רב ערוצי ועל כן אנו‬
‫מקבלים מטריצה של נתונים המייצגת את שינוי הבליעה כפונקציה הן של הזמן והן של אורך הגל )תיאור‬
‫דרך איסוף הנתונים בכל מערכת יובא בהמשך(‪ .‬בצורה כזו ניתן להסתכל על עוצמת סיגנל ) ‪( ∆OD‬‬
‫כפונקציה של אורכי הגל בזמן ספציפי או להסתכל על ההתפתחות בזמן עבור אורך גל ספציפי‪ .‬מנתונים‬
‫אלו ניתן להוציא הן את קבועי הקצב והן את ההתפתחות בזמן )ספקטרום טרנזיינטי( ואף לספק מנגנון‪.‬‬
‫כמו כן‪ ,‬ניתן לחלץ אינפורמציה ויברציונית ע"י ביצוע של טרנספורם פורייה ממרחב הזמן למרחב התדר‬
‫לאחר החסרת הקינטיקה של התהליך‪ ,‬ראה פירוט בעיבוד הנתונים שבהמשך‪.‬‬
‫‪40‬‬
‫‪41‬‬
‫‪ .2.6.2‬מערכות מדידה‬
‫‪102‬‬
‫במחקרים אלו נעשה שימוש במערכת גלאים רב ערוצית כלומר מערכת המספקת מידע על שינויי הבליעה‬
‫עבור טווח תדרים רחב בכל ירייה‪ .‬כאשר משווים דרך איסוף זו לקריאה באמצעות ‪ lock in‬ניכר יתרונה‬
‫בכך שניתן לקבל מידע עצום במדידה בודדת‪ ,‬אך קיימים גם חסרונות‪ ,‬קצב הקריאה איטי )שגם מכתיב‬
‫את קצב מערכת הלייזר( ויחס האות לרעש גבוה‪ .‬כאן עלינו להפריד בין המערך הניסיוני ואופן איסוף‬
‫המידע המבוצע תוך שימוש במגבר הפרמטרי ‪ TOPAS‬לבין המערך עם ה‪ .NOPA-‬במערכת עם ה‪-‬‬
‫‪ TOPAS‬איסוף הנתונים בוצע תוך שימוש ב‪ (Diode Array) DA-‬בעוד במערכת של ה‪NOPA-‬‬
‫המידע נאסף באמצעות ‪ .(Charge Couple Device) CCD‬נציין כי בעוד ב‪ DA-‬יחס האות לרעש טוב‬
‫יותר מזה שב‪ CCD-‬ה‪ CCD-‬יותר רגיש ולכן מאפשר עבודה עם פולסים בעלי עוצמה נמוכה יותר‪.‬‬
‫‪ .2.6.2.1‬מדידה רב ערוצית ב‪DA-‬‬
‫מערך ניסיוני זה הוצב בחדר של ה‪TOPAS-‬‬
‫‪M3‬‬
‫‪M5‬‬
‫‪R‬‬
‫ונראה בתמונה מספר ‪ .2.13‬מערך זה עוצב‬
‫בתחילה ע"י ‪ 103Ernsting et al‬ובו ניתן לאסוף‬
‫‪L2‬‬
‫את כל אורכי הגל בזמן נתון בבת אחת תוך שימוש‬
‫בזוג ספקטרוגרפים )‪ .(DA‬פולסי ה‪ probe-‬הם‬
‫‪Sp F‬‬
‫‪M1‬‬
‫אור לבן )‪ .(supercontinuum‬ליצירתם ממקדים‬
‫‪BS‬‬
‫‪L1‬‬
‫‪Sample‬‬
‫‪M2‬‬
‫‪B‬‬
‫‪S‬‬
‫באמצעות עדשה )‪ (L1, f=20cm‬את מוצא המגבר‬
‫‪M4‬‬
‫)פולסי ה‪ (Ti:Sappire -‬לחלון ספיר בעובי של‬
‫תמונה מספר ‪ :2.13‬הקונפיגורציה הניסיונית של מערך‬
‫המדידה הרב ערוצי עם ה‪ DA-‬במערכת של ה‪.TOPAS-‬‬
‫‪) 2-3mm‬למניעת נזק בספיר אנו עובדים סמוך‬
‫לאזור המוקד( התהליך מבוסס על תופעת ה‪ self phase modulation -‬המתרחשת בחומר‪ .‬הספקטרום‬
‫המתקבל רחב ונפרש על פני ‪ 450nm‬בתחום הנראה וניתן להסיטו‪ .‬האור הלבן עובר דרך תא סרקולציה‬
‫עם פילטר צבע דק )‪ IR 140‬באתנול ומתנול( על מנת לסנן את ה‪ 800nm -‬וליצור אחידות ספקטראלית‬
‫)‪ .(F‬אחידות זו חיונית מחד למזעור עיוותים לא צפויים בספקטרום הנמדד הנובעים כתוצאה מפערי‬
‫עוצמה בין אורכי הגל השונים ומאידך מובילה לקבלת יחס אות לרעש אחיד לכל הרוחב הספקטראלי‪.‬‬
‫כיוון שהקרן ממוקדת לספיר היא מתבדרת במהירות‪ .‬שימוש בסדרת מראות כדוריות גדולות )מראות‬
‫‪ M1-M5‬עם מוקד של ‪ 15cm‬וגודל של ‪ (5inch‬מצופות אלומיניום נועד למנוע את ההתבדרות החזקה‬
‫ולמזער את האברציה הכרומטית‪ .‬לשם נרמול באזור מוקד האור הלבן )לאחר פגיעה במראה ‪ (M1‬מוצב‬
‫מפצל )‪ (BS‬שיוצר ההעתק נוסף של האור הלבן‪ .‬החלק המוחזר ממנו מוזן לספקטוגרף כסיגנל )‪(S‬‬
‫והמועבר לספקטוגרף כרפרנס )‪ (R‬שמדמים ‪ 1:1‬את הקרן באמצעות שריג ממקד המותאם במיוחד לזווית‬
‫הפתיחה שנוצרת בין קרן הכניסה לקרן שמתמקדת על מרכז הגלאי‪ .‬מערך הדיודות מכיל ‪ 512‬גלאים‬
‫צמודים‪ .‬פולס ה‪ brobe-‬ניצב על מסוע )בדיוק של מיקרון( וניתן לשליטה‪ .‬קרן ה‪ pump-‬מקורה או‬
‫בגביש מכפיל ליצירת עירור ב‪ 400nm-‬או ב‪ ,TOPAS-‬כתלות בספקטרום הדגם‪ .‬קרן זו ממוקדת‬
‫לדוגמא באמצעות עדשה ארוכה )‪ (L2,f=50cm‬בזווית מינימלית )‪ (~50‬ככל שניתן ביחס לאור הלבן אך‬
‫עם אפשרות להפרדה וחסימה בטרם הכניסה לספקטוגרף ה‪ .S-‬אורך המוקד הארוך נועד לייצר שטח‬
‫‪41‬‬
‫‪42‬‬
‫חפיפה גדול בדגם ומזעור הזווית מקטינה את זמן חפיפת הפולסים‪ .‬התוצאות שנראות בהמשך מוצעו בכל‬
‫זמן נתון בין ‪ 500-1000‬פעמים לקבלת תוצאות נקיות‪ .‬עוצמת אלומת ה‪ probe-‬הינה ‪ 210nJ/pulse‬זו‬
‫העוצמה הנדרשת לקבלת יחס אות לרעש גבוהה בעוד עוצמת אלומת ה‪ pump-‬הינה ‪.0.5µJ/pulse‬‬
‫עוצמת ה‪ pump-‬נבחרה כפשרה בין סיגנל פליטה משמעותי לבין עבודה בתחום הליניארי ורק לאחר‬
‫בדיקת השפעת ה‪ pump-‬וה‪ probe-‬על הספקטרום הטרנזיינטי‪ .‬בדיקת הימצאות בתחום הליניארי‬
‫נעשתה ע"י שינוי עוצמת ה‪ pump-‬בפקטורים קבועים לעוצמות גבוהות ונמוכות יותר ע"י פילטר‬
‫משתנה‪ ,‬ובדיקת עלית או ירידת עוצמת הפליטה בפיק המרכזי עבור אותה נקודת זמן‪ ,‬באותם פקטורים‪.‬‬
‫גודל הקרניים הוסק מתוך מדידת יחס העברה דרך חריר של ‪ .200µm‬כאשר גודל ה‪ pump-‬גדול‬
‫בלפחות פקטור ‪ 2‬מגודלו של ה‪ probe-‬בדגם‪ ,‬דבר המבטיח חפיפה טובה עם כל מרכיבי תדר ה‪.probe-‬‬
‫על מנת לאפשר משחק בקיטוביות הוספנו בזרוע ה‪ pump-‬לוחית ‪ .(wave plate) λ/2‬כמו כן‪ ,‬לכיווץ‬
‫הוספנו ל‪ pump-‬זוג פריזמות או שריג )ראה פירוט במערך הניסוי הספציפי(‪ .‬כל הניסויים בוצעו‬
‫בטמפרטורת החדר‪ .‬לשם איסוף וקריאת הנתונים מהספקטוגרפים מוכתבת תדירות המערכת להיות‬
‫‪ 190Hz‬וזהו גם התדר של ה‪ probe-‬כאשר תדר ה‪ pump-‬הינו ‪ 95Hz‬וההפחתה מבוצעת ע"י צופר‬
‫מכני‪ .‬הצופר חיוני למדידה‪ ,‬כי הוא מאפשר חסימה חלקית של ה‪ pump-‬כך מתקבל פולס אחד עם שאיבה‬
‫ופולס שני בלעדיה‪ .‬האור נאסף משני הספקטוגרפים באמצעות שני מחזורי קריאה צמודים )עם ובלי‬
‫עירור( מורכב מארבעה משתנים התלויים בזמן ההשהיה ובאורך הגל ומחושבים לנקודה )‪∆OD(λ,t‬‬
‫‪‬‬
‫יחידה כדלהלן ‪ :‬‬
‫‪‬‬
‫‪‬‬
‫‪ I probe ⋅ I refpump‬‬
‫‪ = log ‬‬
‫‪pump‬‬
‫‪‬‬
‫‪ I ref ⋅ I probe‬‬
‫‪pump‬‬
‫‪ I probe ‬‬
‫‪ I probe‬‬
‫‪ . ∆OD = log ‬מנוסחא זו נראה כי‬
‫‪− log  pump‬‬
‫‪ I ‬‬
‫‪I‬‬
‫‪ref‬‬
‫‪‬‬
‫‪‬‬
‫‪ ref‬‬
‫‪ ∆OD>0‬מציין בליעה כלומר הקטנה בעוצמת ה‪ probe-‬ו‪ ∆OD<0-‬מציין פליטה כלומר הגדלה‬
‫בעוצמתו‪ .‬עיבוד הנתונים מחייב תחילה תיקון בזמן הגעת אורכי גל של ה‪time-correction) probe-‬‬
‫ ‪ (TC‬שכן הוא אינו מכווץ ולכן מכיל ‪ chirp‬חיובי באורך של כ‪ .300fs-‬בחינת הארטיפקט הקוהרנטי‬‫בזמן ותיקון ה‪ TC-‬מבוצע על גבי נתוני ניסוי ‪ pump-probe‬שנערך על התא כשבתוכו ממס בלבד‪.‬‬
‫נציין כי לאחרונה בוצעו מספר שינויים במערך זה וחלק מהניסויים הנזכרים בעבודה זו )‪BR ,HR‬‬
‫והאנלוג הנעול שלו( בוצעו לאחר שינויים אלו‪:‬‬
‫‪.1‬פילטר הצבע הוסר ואנו באמצעות חריר חוסמים את מרכז האור הלבן ולוקחים את קצהו‪.‬‬
‫‪ .2‬האיסוף לזוג הספקטוגרפים מבוצע באמצעות סיבים אופטיים ולא במראות‪.‬‬
‫‪ .3‬תדר המערכת הינו ‪ ,450Hz‬ומשתמשים בשני מקצצי פולסים )‪ (optical choppers‬מסונכראנים‬
‫בתהליך הקריאה‪ .‬הראשון מוצב לפני הכניסה ל‪ TOPAS-‬ולכן "מקצץ" את כל הקרניים בניסוי לתדירות‬
‫של ‪ ,112Hz‬כך שמתקבל מחזור של חסימה והעברת שני פולסים בכל פעם‪ ,‬בכך אנו מונעים את חשיפת‬
‫הגלאי לאור בזמן הקריאה ואף מאפשרים זמן לרענון הדגם‪" .‬קיצוץ" שני‪ ,‬נעשה לקרן ה‪pump-‬‬
‫בתדירות של ‪.56Hz‬‬
‫‪42‬‬
‫‪43‬‬
‫‪ .2.6.2.2‬מדידה רב ערוצית ב‪CCD-‬‬
‫מערכת מדידה זו הוצבה ב‪ NOPA-‬בה‬
‫‪Ti:Sapphire amplified pulses‬‬
‫)‪(790 nm, FWHM ~40nm, ~30 fsec‬‬
‫מסופקים לייזרים קצרים בנראה ) ‪FWHM‬‬
‫‪Prism pair‬‬
‫‪ .(= 6fs‬פולסים אלו מפוצלים באמצעות‬
‫‪NOPA‬‬
‫)‪(fused silica‬‬
‫מפצל )‪ (BS‬דק במיוחד )חלון ‪fused‬‬
‫‪Pulse shaper‬‬
‫)‪(DM‬‬
‫‪mirror‬‬
‫‪Chopper‬‬
‫)‪(50 Hz‬‬
‫‪ silica‬בעובי ‪ 0.5 mm‬מצופה אלומיניום(‬
‫‪ref‬‬
‫לקבלת קרן מוחזרת המשמשת כ‪pump-‬‬
‫וקרן מועברת המשמשת כ‪ .probe-‬פער‬
‫‪mirror‬‬
‫‪Pump‬‬
‫‪BS‬‬
‫‪Compensation‬‬
‫‪400 Hz‬‬
‫‪BS‬‬
‫‪Pump for‬‬
‫”‪“PG FROG‬‬
‫‪Delay line‬‬
‫)‪(50 nm-precision‬‬
‫‪λ/2‬‬
‫‪Probe‬‬
‫‪chopper‬‬
‫)‪(25 Hz‬‬
‫הדיספרסיה בין ה ‪ pump‬ל ‪ probe‬אוזן‬
‫ע"י הוספת חלון בעובי זהה בדרך האופטית‬
‫‪sample‬‬
‫‪cell‬‬
‫של ה‪) pump-‬דבר שהינו קריטי כשמדובר‬
‫בפולס קצר כל כך(‪ .‬קיטובי הקרניים לא‬
‫שונו והמדידות נאספו ב‪ .VV-‬ה‪probe-‬‬
‫‪CCD‬‬
‫)‪(1024x256‬‬
‫‪Optical fibers‬‬
‫תמונה מספר ‪ :2.14‬הקונפיגורציה הניסיונית של מערך המדידה‬
‫הרב ערוצי= )‪ (CCD‬במערכת של ה‪.NOPA-‬‬
‫פוצל שוב לשם נרמול לסיגנל ה‪ probe-‬ולרפרנס‪ .‬פולסי האור מה‪ probe-‬ומה‪ reference-‬הוזנו‬
‫באמצעות שני סיבים נפרדים )מועתקים ורטיקאלית( לתוך ספקטרוגרף עם יחס הדמיה של ‪ 1/8‬מטר‬
‫)‪ ,(Oriel‬ומוקדו אחד מעל השני על פני מערך דו‪-‬מימדי של גלאי ‪.(TechnologyAndor ) CCD‬‬
‫תרומת עוצמתם הופרדה בתהליך ה‪ binning-‬במחזור קריאה של ‪ ,10ms‬אשר כלל אינטגרציה של‬
‫ארבעה פולסים סמוכים בזמן‪ .‬אופטימום של יחס אות לרעש בקריאה‪ ,‬הושג ע"י איסוף האות משלוש‬
‫שורות סמוכות סביב מרכז ההדמיה הספקטראלי בגלאי‪ ,‬עבור שני קטעי ‪ binning‬ורטיקאליים אחד לכל‬
‫קרן‪ .‬כמו כן חלק מהרעשים מוזערו ע"י קירור ה‪ CCD-‬למינוס שלושים מעלות‪ .‬מערכת הלייזר הופעלה‬
‫בניסיונות אלו בתדירות של ‪ ,400 Hz‬תוך שימוש בשני ‪ optical choppers‬מסונכראנים )‪(Thorlabs‬‬
‫בתהליך הקריאה‪ .‬הראשון "מקצץ" את כל הקרניים בניסוי )‪ probe ,pump‬ו‪ (reference-‬לתדירות של‬
‫‪ ,50Hz‬כך שמתקבל מחזור של חסימה והעברת ארבעה פולסים בכל פעם‪ ,‬וזאת כדי להימנע מחשיפת‬
‫הגלאי לאור בזמן הקריאה‪" .‬קיצוץ" שני‪ ,‬נעשה לקרן ה‪ pump-‬בתדירות של ‪ .25Hz‬אנו ביצענו‬
‫במערכת זו הן ניסוי שני פולסים והן ניסוי שלושה פולסים כאשר ה"קיצוץ" בוצע או על פולס ה‪NOPA-‬‬
‫העוצמתי או על שארית פולסי המגבר שעברו הכפלה בגביש ‪ (100µm) BBO‬לתת עירור ב‪.400nm-‬‬
‫קביעת תדירות פעולת הלייזר מבטאת פשרה ניסיונית בין מספר גורמים עיקריים במדידה‪ :‬קצב קריאה‬
‫מקסימאלי של הגלאי "בקונפיגורצית ‪ "binning‬ספציפית זו )‪ ,(10 msec‬צבירת עוצמת אור מקסימאלית‬
‫על הגלאי בכל מחזור קריאה לשיפור יחס אות לרעש )תלוי עוצמת ‪ probe‬בניסוי(‪ ,‬ומידת הקורלציה‬
‫האופטית בין פולסים שכנים במוצא ה‪ .NOPA-‬יצוין כי‪ ,‬מחזור קריאה של ‪ 25Hz‬הינו כפולה שלמה של‬
‫תדירות רשת החשמל בישראל )‪ ,(50 Hz‬לפי כך במידה וקיים רכיב רעש מחזורי בתדר זה‪ ,‬השפעתו‬
‫בטלה בשל אינטגרציה על פני זמן מחזור בכל נקודת השהייה‪ .‬חישוב ה‪ ∆OD(λ,t) -‬זהה )לפי המשוואה‬
‫הקודמת(‪ .‬בגלל שהניסויים במקרה זה בוצעו עם פולסים כל כך קצרים לא ביצענו תיקון בזמן אלא חתכנו‬
‫את ההתחלה שמכילה גם ארטיפקט קוהרנטי‪ .‬ויברציות הממס התקבלו מניסוי שבוצע בתא עם הממס‪.‬‬
‫‪43‬‬
‫‪44‬‬
‫‪102‬‬
‫‪ .2.6.3‬עיבוד הנתונים‬
‫בספקטרוסקופית ‪ pump-probe‬רב ערוצית מתקבל מידע רב בצורת מטריצה של נתונים דו מימדית )זמן‬
‫ואורך גל( של שינויי ספקטרום הבליעה הטראנזיאנטי בדגם )‪.∆OD(t, λ‬‬
‫נפריד בין הניתוח של המידע שנאסף במערכת של ה‪ TOPAS-‬לזה שהתקבל במערכת של ה‪.NOPA-‬‬
‫בניתוח של ה‪ TOPAS-‬נבצע התאמה קינטית כוללת )‪ (GF- global fit‬בעוד ב‪ NOPA-‬השימוש‬
‫בפולסים קצרים )‪ (7fs‬מספק מידע ויברציוני אותו יש לנתח‪ .‬נתאר בקצרה את אופן ניתוח התוצאות‬
‫וחילוץ המידע הכמותי מהנתונים הניסיוניים‪.‬‬
‫‪global analysis .2.6.3.1‬‬
‫בספקטרוסקופיה רב ערוצית גלום מידע רב‪ ,‬למיצוי מלא של המידע יש לבצע מודל קינטי‪ ,‬בהנחה כי ניתן‬
‫לתאר את השינויים בספקטרום הטרנזיינטי באמצעות מודל קינטי‪ .‬המודל נבנה על ידע והנחות מדעיות‬
‫והוא משלב רכיבים ספקטראליים‪ .‬מתוך מטריצת הנתונים הדו מימדית ניתן להוציא פרמטרים שונים כגון‬
‫קבועי קצב וספקטרומים התואמים להם ובכך לספק תיאור מדויק עבור מערכות מורכבות‪ .‬אוסף מדידת‬
‫התכונות הספקטרוסקופיות כפונקציה של זמן ואורך גל מכונה ‪.TRS - time resolved spectrum‬‬
‫חלבונים רטינליים מאופיינים במעגל אור המשלב סדרה של ספקטרומים מופרדים בזמן‪ ,‬עובדה שהופכת‬
‫כלי זה לשימושי ובעל חשיבות עבורם‪ .‬פירוט מתמטי מלא מופיע בספרות‪ 104‬אסקור כאן רק את השלבים‬
‫העיקריים והרעיון שבאנליזה‪:‬‬
‫‪ .1‬ביצוע פעולה מתמטית במטריצת הנתונים‪ -‬פעולה זו הינה ‪SVD=singular value decomposition‬‬
‫בה מלכסנים את מטריצת הנתונים‪ .‬כך ניתן הן לנקות רעשים ע"י הוצאת הוקטורים עם המשקל הנמוך‬
‫במטריצה האלכסונית ובכך להקטין את מימד המטריצה ואת זמן החישוב והן לקבל מדד פיסיקלי כלשהוא‬
‫למספר הצורונים המקסימאלי הנדרש לתיאור המערכת‪ .‬ניתן לוודא כי הצמצום שבוצע מתאר נכון את‬
‫הנתונים האמפיריים על ידי הצבת המטריצה המצומצמת על המטריצה המקורית‪ .‬בשלב זה רצוי לקחת‬
‫יותר מימדים ממימד הבעיה הכימית כך שההתאמה תבוצע על הנתונים האמפיריים עצמם ולא על "גרסה‬
‫מצומצמת" ומוכוונת מראש‪ ,‬שהרי במהלך האנליזה יסופק מודל קינטי שיצמצם את המימד‪.‬‬
‫‪ .2‬התאמת ערכים פרמטרים לנתונים שעברו ‪ :SVD‬קבועי מהירות‪ ,ki -‬זמן אפס ניסיוני‪ ,t0 -‬הפרדת‬
‫זמנים במדידה‪ d -‬וכו'‪ ,‬הפרמטרים שיקבעו הם אלה שעבורם מתקבלת התכנסות אופטימאלית‪ .‬ההתכנסות‬
‫לנתונים הניסיוניים מתבצעת תוך שינוי פרמטרי ההתאמה וחיפוש מינימום סטייה )מבחינה סטטסטית(‪.‬‬
‫כמובן שמבחינה מתמטית ניתן להתכנס למינימום גלובאלי אך אנו ממזערים זאת על ידי ניחוש מושכל‬
‫)בהתאם לידע כימי מוקדם( של סט הפרמטריים‪ .‬למעשה‪ ,‬אנו מספקים טווח מעורך להתכנסות פרמטרים‬
‫אלו ובכך מתכנסים לפרמטרים "טובים" בזמן סביר‪ .‬קבועי המהירות הינם זהים לכל אורכי הגל והשוני‬
‫הוא למעשה באמפליטודה המסופקת לכל קבוע קצב באורך גל ספציפי‪ .‬בשלב זה טרם נכנס המודל‬
‫הקינטי ורק מבוצעת התאמה לקבועי דעיכה אקספוננציאליים אחידים עם אמפליטודת מתאימות‪.‬‬
‫מהאמפליטודות השונות ניתן לבנות ספקטרומים כמספר קבועי הדעיכה‪ ,‬כל ספקטרום מייצג את‬
‫האמפליטודות כפונקציה של כל אורכי הגל עבור זמן דעיכה מסוים‪ .‬ספקטרום האמפליטודות מכונה‬
‫‪ (decay associated spectra) DAS‬וכאשר לא ידוע המודל הקינטי ניתן לעצור בשלב זה‪ .‬ההתאמה‬
‫‪44‬‬
‫‪45‬‬
‫הינה לנוסחא הבאה‪DASi (λ ) :‬‬
‫‪τi‬‬
‫‪−t‬‬
‫‪n‬‬
‫‪ . ∆OD(t , λ ) = ∑ e‬נדגיש כי שלב זה לא לוקח בחשבון מודל קינטי‬
‫‪i =1‬‬
‫אלא מניח מודל מקבילי כלומר שכל הצורונים אינם מופרדים בזמן ומתקיימים בו זמנית‪ .‬נציין כי בשלב‬
‫יש להביא בחשבון גם קיום של ארטיפקט קוהרנטי ותגובת החומר )ממס וחלונות התא( עם שדה הקרינה‬
‫בניסוי‪ .‬ביצוע מדידה בלתי תלויה של האחרון בתנאים זהים לניסוי‪ ,‬מאפשר להפחית מראש את תרומה זו‬
‫מהנתונים הניסיוניים ובכך להקטין את מורכבות המודל‪ .‬בפועל אנו ביצענו את ההתאמה הקינטית עבור‬
‫זמני השהייה מאוחרים יותר בנתונים )"חתכנו" מהנתונים עשרות פמטושניות ראשונות טרם האנליזה(‪.‬‬
‫‪ .3‬הכנסת מודל קינטי‪ :‬שלב זה מחייב ידע כימי מוקדם )ניסיוני או תיאורטי( של המערכת או ניחוש מודל‬
‫הגיוני תוך הסתמכות על ניסיונות קודמים דבר שלא תמיד קיים בעיקר עבור מערכות מודל שנחקרו‬
‫במידה מצומצמת‪ ,‬נציין כי בחלק מן המקרים לא ביצענו שלב זה כלומר מודל קינטי לא סופק‪ .‬כמו כן‪,‬‬
‫כאשר במערכת הנחקרת מעורבים שינויים דינמיים‪ ,‬התיאור הקינטי אינו מייצג נכונה את המצב‪.‬‬
‫בשלב זה אנו כופים תלות זמנית בין קבועי הקצב והספקטרומים שיתקבלו‪ .‬מספקים זמנים שמייצגים את‬
‫ההתפתחות הספקטראלית מהמגיבים דרך המצב מעורר לעבר תוצרי ביניים או תוצר הסופי כתלות‬
‫במערכת הנחקרת ובזמן המדידה‪ ,‬תיאור זה יכול להיות מתואר ע"י מודל עקבי פשוט )‪ (EADS‬או מודל‬
‫מסובך יותר‪ .‬הפיתרון מתקבל מפיתרון מערכת המשוואות הדיפרנציאליות המתארות את המודל בעזרת‬
‫שיטת גראם שמידט‪.‬‬
‫עבור הכרומופורים השתמשנו ב‪ DAS-‬בעוד שעבור המשאבות היוניות השתמשנו במודל עקבי פשוט‬
‫‪.(Evolution Associated Difference Spectra) EADS‬‬
‫ה‪ EADS -‬מציג את ההתפתחות הספקטראלית בזמן כך שבעוד שצורון אחד דועך צורון אחר נוצר ודועך‬
‫בזמן אחר‪ ,‬כך שלא כל הצורונים מתחילים באותו הזמן כפי שמתקבל ב‪) DAS-‬כפי שצוין קודם תמיד‬
‫מתחילים ב‪ DAS-‬ואז מכניסים את המודל הקינטי כאשר ה‪ EADS-‬מייצג מודל עקבי פשוט(‪.‬‬
‫הערות‪:‬‬
‫א‪ .‬ככל שנצמצם פחות את המטריצה )נוסיף יותר צורונים( נתכנס טוב יותר לנתונים המקוריים‪ .‬אם כי‪,‬‬
‫לא בהכרח נספק מודל קינטי אמיתי המתאר נכונה את התהליך הפוטוכימי‪ .‬נדגיש כי עלינו להימנע‬
‫"מאינטרפרטצית יתר" )‪ (over interpretation‬של התוצאות‪ .‬לעיתים יש צורך במספר רב של‬
‫צורונים קינטיים לשם התכנסות טובה והדבר נובע רק מניסיון לתאר שינוי דינמי ויש להיזהר מכך‪ .‬לכן‬
‫בהתאמת מודל קינטי אנו נשתדל להסתמך ככל שניתן על ידע קודם באופן מושכל ולא לבצע את‬
‫ההתאמה בצורה מיידית )עיוורת(‪.‬‬
‫ב‪ .‬המשקל היחסי של נתוני ההתאמה נקבע לפי כמותן היחסית בנקודות הניסיוניות ולכן למרות שהזמנים‬
‫המוקדמים מכילים אינפורמציה פוטוכימית חשובה היא אינה באה לידי ביטוי עקב מיעוט הנקודות‪.‬‬
‫אחת הדרכים להתמודד עם בעיה זו היא לצופף את הנקודות במקום בו ענייננו המדעי רב יותר כך‬
‫תתקבל הפרופורציה הרצויה‪.‬‬
‫‪45‬‬
‫‪46‬‬
‫‪IVS - Impulsive Vibrational Spectroscopy.2.6.3.2‬‬
‫שינויי המבנה שעוברת מולקולה במעבר ממגיב לתוצר וכן מבנה המצב המעורר שלה הם מושא למחקרים‬
‫רבים‪ .‬ניתן לקבל מידע זה מביצוע ספקטרוסקופיה ויברציונית רב ערוצית במרחב הזמן‪ .‬גם כאן הנתונים‬
‫הינם מטריצה דו מימדית )זמן ואורך גל( של שינויי ספקטרום הבליעה הטראנזיאנטי )‪ ∆OD(t, λ‬בדגם‪.‬‬
‫שינויי הבליעה כפונקציה של הזמן מלווה באוסילציות הנובעות מתנועה ויברציונית שנוצרת על גבי‬
‫המשטחים האלקטרוניים‪ .‬העירור כאן מבוצע עם פולסים קצרים במיוחד )‪ (~6fs‬המאפשרים לראות תדרי‬
‫ויברציה גבוהים‪ .‬באופן כללי‪ ,‬על מנת לחקור תדר ויברציה מסוים יש להשתמש בפולס שמשכו פחות‬
‫ממחצית זמן המחזור )פולס ארוך או קצר יותר פחות יעיל( כך שהשימוש בפולסים קצרים חיוני במקרה‬
‫בו אנו מעוניינים לצפות בשינוי הקשר הכפול ‪ C=C‬המתאים לתדר של ‪ ~1550cm-1‬ובהתאם לזמן‬
‫מחזור של ‪ .20fs‬השימוש בפולסים קצרים מסייע ליצירת תנודות במצב המעורר והיסודי שכן פולסים‬
‫כאלו הן קצרים ממשך זמן דעיכת המצב המעורר ולכן מאפשרים את דגימתו והן רחבים בתדר ועל כן‬
‫מאכלסים תדרים רבים ומודולציות נוצרות‪.‬‬
‫לספקטרוסקופיה ויברציונית במרחב הזמן מספר מאפיינים‪ ,‬נמנה אותם ונסביר כיצד ניתן לחלץ מהם‬
‫מידע ויברציוני )במרחב התדר(‪:‬‬
‫‪ .1‬בטרם הגיע פולס ה‪ -pump-‬כלומר לפני זמן האפס‪ ,‬ה‪ ∆OD -‬הינו אפס )פולס ה‪ probe-‬נותר‬
‫ללא שינוי( ומאזור זה ניתן לקבל מדד לרעש‪.‬‬
‫‪ .2‬סביב זמן האפס‪ -‬פולס ה‪ pump-‬מגיע ואנו צופים בפיק המתאר את ה‪ coherence-‬בין הפולסים‪,‬‬
‫‪ coherence‬זה נגרם כתוצאה מהתאבכויות ופיזורים של שני הפולסים הקצרים החופפים בזמן‪.‬‬
‫אזור זה נחתך לביצוע ההחסרה והטרנספורם )כלומר את האנליזה אנו מתחילים ב‪.(~60fs-‬‬
‫‪ .3‬שינוי בבליעה התואם את הספקטרום הטרנזיינטי‪ -‬האוסילציות מלוות את השינוי בבליעה ותואמות‬
‫את הספקטרום הטרנזיינטי כאשר סיגנל חיובי מייצג בליעה בעוד סיגנל שלילי מייצג פליטה‪.‬‬
‫‪ .4‬אוסילציות ‪ -‬אוסילציות אלו נראות בבירור מעל לרעש )מדד לרעש ניתן לקבל מהזמן השלילי( והן‬
‫נובעות מתנודות קוהרנטיות הן של מצב היסוד והן של המצב המעורר‪ .‬אוסילציות אלו נראות‬
‫לאחר הפחתת הדעיכה שהותאמה באורך גל ‪ probe‬מסוים‪.‬‬
‫דרך איסוף הנתונים היא במרחב הזמן בעוד אנו מעוניינים באינפורמציה במרחב התדר‪ ,‬טרנספורמציית‬
‫פורייה‪ ,‬הינה טכניקה מקובלת למעבר בין מרחבים אלו‪ .‬בניסויינו אנו מקבלים מטריצות ענק )עוצמת‬
‫סיגנל כתלות בזמן ובאורך הגל( אשר מהן אנו מחלצים את המודולציות המבטאות את הויברציות‬
‫הקוהרנטיות של חבילת הגלים‪ ,‬לשם ניתוח תוצאות אלו עלינו לבצע מספר פעולות‪:‬‬
‫‪ .1‬מתאימים לכל אורך גל דעיכה מולטי‪-‬אקספוננציאלית בזמן וכך מקבלים מטריצה המייצגת את‬
‫ההתאמות‪ .‬אנו מתחילים את ההתאמה מזמן מסוים לאחר שהארטיפקט הקוהרנטי מסתיים והחפיפה עם‬
‫פולס ה‪ pump-‬הושלמה‪ .‬נציין כי כאן איננו מעוניינים שקבועי הקצב יהיו זהים לכל אורכי הגל אלא אנו‬
‫מעוניינים בויברציות וייחוסם‪ .‬אם כי‪ ,‬חשוב לראות כי קבועי הקצב שהותאמו הגיוניים ומתאימים לידוע‬
‫לנו‪.‬‬
‫‪46‬‬
‫‪47‬‬
‫‪ .2‬מחסירים מהמטריצה המקורית את מטריצת ההתאמות וכך מתקבלת מטריצת שאריות‪ .‬במטריצת‬
‫השאריות נותרים עם המודולציות בהעדר הדעיכה הקינטית עליה הם "רוכבות"‪.‬‬
‫‪ .3‬ביצוע טרנספורם פורייה ‪ (fast Fourier transform) FFT‬על מטריצת השאריות )האוסילציות(‬
‫מעביר אותנו ממרחב הזמן למרחב התדר‪ ,‬כך מקבלים את הויברציות השייכות למולקולה )מצב יסוד‬
‫ומצב מעורר( ולממס בו השתמשנו‪.‬‬
‫הערות‪:‬‬
‫א‪ .‬בשל עיקרון אי הוודאות ‪ ∆ω ⋅ ∆t ≥ const‬ואיסוף נתונים באינטרוול מדידה סופי אנו מקבלים אי‬
‫וודאות בתדר עובדה המקשה על קבלת תדרים מוגדרים ואמינים‪.‬‬
‫ב‪ .‬אנו נצפה בתדרים רבים בשל העירור הקוהרנטי שאינו סלקטיבי אך עוצמתם של אופנים מסוימים‬
‫יכולה להיות גבוהה משל אחרים‪.‬‬
‫ג‪ .‬ניתוח זה אומנם מספק תדרי ויברציה אך לא משייך את תדרי הויברציה למצב יסוד‪ ,‬מצב מעורר וממס‬
‫לכן עבודה רבה צריכה להתבצע על מנת לסווגם‪ .‬אנו ביצענו ניסויים המשלבים שלושה פולסים ומשחקים‬
‫עם פולסי ‪ chirp‬בניסיון לשייכם ונרחיב על כך בפרק התוצאות והדיון‪ .‬קביעת משך הפולס וצורתו טרם‬
‫הניסוי קריטיים לניתוח התוצאות‪ .‬נדגיש כי עקרונית הפאזה הניתנת לחילוץ בשיטה זו יכולה לסייע‬
‫בשיוך‪ ,‬בפועל ככל שמדובר בתדר גבוה יותר הוודאות בקביעת הפאזה קטנה והייחוס הופך לקשה‪.‬‬
‫ד‪ .‬ניתן עבור אורך גל מסוים לבצע טרנספורם פורייה עם חלון )‪ (sliding window‬שמוזז על פני‬
‫המערך כולו‪ .‬בדרך זו ניתן לראות את התפתחות התדר כפונקציה של הזמן )באורך גל מסוים( לדוגמא‪:‬‬
‫ניתן לצפות בתדר שזז‪ ,‬נעלם או נוצר כפונקציה של הזמן‪ .‬נציין כי יש להיזהר בבחירת החלון ואורכו שכן‬
‫חלון שונה יכול לספק תוצאות שונות‪ .‬מהרוחב בחצי הגובה של תדר הוויברציה ניתן לחלץ את קבוע‬
‫‪1‬‬
‫הדעיכה של תדר זה לפי‬
‫‪π c∆υ‬‬
‫= ‪.τ‬‬
‫‪ .2.6.4‬הדוגמאות‬
‫כל הדוגמאות איתם עבדנו הוכנו ע"י קבוצתו של פרופ' שבס )‪ (sheves‬ממכון ויצמן במסגרת שיתוף‬
‫פעולה‪ .‬נתאר בקצרה ומתוך המאמרים את הכנת הדוגמאות‪:‬‬
‫‪ -PSB‬הכנת ‪ all-trans PSB‬בוצעה ע"י ערבוב אלדהיד עם עודף ‪-n‬בוטילאמין )‪ 10‬אקוולנט( באתנול‬
‫למשך שעה‪ .‬האתנול ועודף האמין נודפו ואת השאריות המיסו באתנול והחמיצו עם תמיסה מהולה של‬
‫חומצה אצטית טריפלורית‪ .‬סיום הפרוטונציה והיציבות לאורך הזמן של המגיב נוטרו באמצעות‬
‫ספקטרוסקופית בליעה‪ .105‬אנו חקרנו את ה‪ n-BuPSB-‬וה‪ tert-BuPSB-‬בקונפיגורצית ‪ all-trans‬הן‬
‫בתמיסת אתנול והן בתמיסת‬
‫‪CD3OD‬‬
‫‪107, 106‬‬
‫‪ .‬מקדם הבליעה המולרי של ה‪ PSB-‬הינו‬
‫‪. ε λ max = 50000M -1cm -1‬‬
‫בסיום העבודה עם דוגמאות אלו הזרמנו חנקן ולקחנו ספקטרום שהושווה לספקטרום שנלקח טרם‬
‫הניסוי‪ .‬הדוגמא נשמרה בקירור של כ‪ −70 C -‬על מנת להקטין את האיזומריציה ושמירת טריות הדוגמא‪.‬‬
‫הקפדנו לעבוד עם דוגמאות בהם לפחות ‪ 90%‬מהמולקולות בקונפיגורצית ‪ ,all-trans‬שכן בהעדר חלבון‬
‫‪47‬‬
‫‪48‬‬
‫אין חזרה למצב ההתחלתי וכעבור זמן המולקולה מתכלה‪ .‬מערכת ההזרמה הייתה אטומה ככל שניתן‬
‫למניעת התנדפות ושינוי הריכוז במהלך הניסוי‪.‬‬
‫‪ - BR‬הבקטריה גודלה‪ ,‬נקצרה והופרדה ממנה הממברנה הסגולה עם חלבון הבקטריורודופסין‪ .‬שימוש‬
‫בבופר של ‪ K3PO4‬בוצע כדי לקיים ‪ .108pH7‬לפני ואחרי כל הרצה נלקח ספקטרום והדוגמא נשמרה‬
‫במקרר )‪ .(40C‬במהלך הניסוי הדגם הואר עם מנורת סיב )‪ (>EKE 21V/150W‬על מנת שהכרומופור‬
‫יהיה כולו בקונפיגורצית ‪ all-trans‬אך הדבר נעשה בעוצמה מינימאלית ורחוק מהדגם למזעור חימום‬
‫והרס הדגם‪.‬‬
‫‪ - BR5.12‬ממברנות ה‪ BR-‬התקבלו ע"י הקרנת ‪ 1M‬תרחיף הידרוקסילאמין ‪ BR‬ב‪ pH7.3 -‬דרך מסנן‬
‫של ‪ ,550nm‬עד שהצבע הסגול הוחלף בצהוב חיוור‪ .‬הממברנות עברו צנטריפוגה ונשטפו ‪ 5‬פעמים עם‬
‫מים מזוקקים‪ .‬הממברנות הנקיות הושמו באינקובאטור בטמפ' של ‪ 250C‬עם ‪ 25‬אקוולנטים של‬
‫הכרומופור הנעול‪ .‬סינתזת הכרומופור הנעול בטבעת מחומשת במצב ‪ all-trans‬בקשר ‪C13=C14‬‬
‫מתוארת בספרות‪ .109‬זמן הכנת הפיגמנטים האלו הוא ‪ 7‬ימים‪ .‬בסיום התהליך מקבלים זיהום מינימאלי של‬
‫‪ BR‬טבעי‪ ,‬דרגת הזיהום נקבעת ע"י מדידה ספקטרוסקופית של כמות הצורה הכחולה )‪ (605nm‬שנוצרת‬
‫ב‪ BR-‬הטבעי ואינה קיימת באנלוג נעול זה כתוצאה מהחמצה מ‪ pH-‬נטרלי ל‪ .110pH2.8-‬לפני ואחרי כל‬
‫הרצה נלקח ספקטרום והדוגמא נשמרה במקרר )‪.(40C‬‬
‫‪ - pHR‬דוגמאות ה‪ pharaonis Halorhodopsin -‬הוכנו באופן דומה לתיאורים שונים עם מספר‬
‫שינויים קלים‪ .‬חיידקי ‪ E.coli‬מסדרת ‪ BL21‬שעברו התמרות וגודלו ב‪ 370-‬במדיום ‪ LB‬עם ‪50mg/ml‬‬
‫‪ kanamycin‬במתקן תסיסה בנפח ‪ .10L‬הוסיפו ‪ IPTG 0.5Mm‬ו‪ 10µM -‬רטינל ‪ all-trans‬ב‪1-‬‬
‫‪ .OD600‬לאחר ‪ 4‬שעות התאים נקצרו ואוכסנו בטמפ' של ‪ ,-200‬התאים הופשרו והושרו בתרחיף עם‬
‫בופר ‪ Tris-HCl‬ב‪ pH7 -‬ולאחר מכן הוכנסו לצנטריפוגה‪ .‬המשקע הומס בבופר ‪,DM 0.5%) S‬‬
‫‪ ( pH6 ,imidazole 5mM ,MES 50mM , NaCl 500mM‬ועורבבה במשך הלילה ב‪ .40C-‬לאחר‬
‫הצנטריפוגה התרחיף הורץ דרך קולונת ‪ Ni-NTA‬ב‪ .40C-‬שרף ה‪ Ni-NTA-‬נשטף ביסודיות עם בופר‬
‫‪ ( pH6 ,imidazole 5mM ,MES 50mM , NaCl 500mM ,DM 0.06%) W‬תוך הגדלת ריכוז ה‪-‬‬
‫‪)= imidazole‬מעל ‪ (100mM‬כדי להרחיק חלבונים קשורים לא רצויים‪ .‬כתוצאה מכך ה‪ pHR-‬הומס‬
‫בבופר ‪,( pH7.8 ,imidazole 300mM ,Tris-HCl 50mM , NaCl 500mM ,DM 0.06%) E‬‬
‫והועבר לבופר הסופי )‪ (pH7 ,Tris-HCl 50mM , NaCl 300mM ,DM 0.06%‬באמצעות פילטר‬
‫צנטריפוגת ‪ .111(cutoff, 10K) amicon‬לפני ואחרי כל הרצה נלקח ספקטרום והדוגמא נשמרה במקרר‬
‫)‪ (40C‬במידה וראינו כי הדגם מפזר ועכור )מצבו תקין והוא לא מסריח אך הפיזור רב ורעש המדידה‬
‫גדול( ולא ניתן לעבוד איתו יותר ביצענו פילטרציה )פעולה שאיפשרה את המשך העבודה עימו(‪.‬‬
‫‪ #‬עבור כל החלבונים ‪ . ε λ max 60000M -1cm -1‬אם כי‪ ,‬ישנם הבדלים באורך גל מקסימום הבליעה‬
‫בהם נדון בדיון‪.‬‬
‫‪48‬‬
‫‪49‬‬
‫‪ .2.6.5‬תאים אופטיים לדוגמאות‬
‫בניסיונות של חלבונים )‪ (HR ,BR5.12,BR‬עבדנו עם כמויות קטנות של חומר )‪ (~1ml‬ועל כן הניסוי‬
‫בוצע בתא המתאים לנפחים קטנים כאלה‪ .‬תא זה נבנה מפלדת אל חלד וצויד בזוג חלונות זכוכית בעובי‬
‫של ‪ 120µm‬ובקוטר של ‪ 12mm‬המודבקות בדבק סילקון‪ .‬אורך הדרך האופטית בתא‪.~300µm-‬‬
‫הדוגמא נשאבה במעגל סגור תוך שימוש במשאבת מזרק בבנייה ביתית שנבנתה להתאים לנפחים קטנים‬
‫שכאלה‪ .‬החומר בא במגע ישיר עם מזרק של ‪ 1ml‬וצינור טפלון המחובר למזרק גדול יותר )‪(10ml‬‬
‫שנאטם בכפפה אלסטית ללא טלק למניעת כניסת מזהמים‪ .‬קצב הסירקולציה נבחר כפשרה בין רענון‬
‫החומר באזור העירור לבין סרקולציה שאינה מהירה מדי ועלולה לגרום להרס החומר )יצירת אגריגאטים‬
‫כשמדובר בממברנה או בועות כשמדובר בדטרגנט‪ ,‬שמפזרים את קרן ה‪ pump-‬ומפריעים למדידה‬
‫נקייה(‪ .‬בצורה כזו החומרים נשמרו רעננים במהלך הניסוי‪.‬‬
‫בניסויים שבוצעו על ה‪) PSB-‬בצורותיו השונות( סופקו כמויות גדולות יותר של חומר )‪ .(3ml‬חומר זה‬
‫עבר פילטרציה והוכנס לתא שנבנה מפלדת אל חלד וצויד בזוג חלונות קוורץ בעובי של ‪ 120µm‬ובקוטר‬
‫של ‪ 18mm‬המודבקות בדבק סילקון‪ .‬אורך הדרך האופטית בתא הינה של ‪ .~300µm‬הדוגמא נשאבה‬
‫במעגל סגור תוך שימוש במשאבה פריסטלטית ) ‪peristaltic pump, cole parmer, masterflex‬‬
‫‪ (model 751810‬שאינה באה במגע ישיר עם החומר והחומר מוסע בצינורות טפלון‪ .‬קצב הסירקולציה‬
‫שנבחר הינו חצי סיבוב לשנייה‪ ,‬קצב המספיק להחלפת האוכלוסייה בין הפולסים‪.‬‬
‫נציין כי בכל המקרים התא הוצב במוקד ונבחר להיות במקום הממזער את פיזור ה‪ .pump-‬זאת גם הסיבה‬
‫לעבודה בסביבת בופר ולא בסביבת ממברנה במקרה של ההלורודופסין‪ .‬כאשר בכל הדוגמאות הקפדנו על‬
‫צפיפות אופטית של ‪ 0.4‬באורך גל העירור‪ ,‬דבר המאפשר מחד לראות סיגנל ברור ומאידך לא לעבוד עם‬
‫צפיפות אופטית גבוהה שתגרום לסטייה מחוק בר‪-‬למבר כך שכל הבליעה תתרחש בקדמת התא‪.‬‬
‫‪ .2.6.6‬מערכי הניסוי הספציפיים‬
‫‪ PSB‬ב‪ :TOPAS-‬ניסוי שני פולסים )‪ (pump-probe‬כאשר העירור בוצע בשני אורכי גל שונים האחד‬
‫ב‪ 400nm-‬ע"י הכפלת הפולסים היוצאים מהמערכת )‪ ,(800nm‬והשני ב‪) 480nm-‬בצד השני של‬
‫הספקטרום( ע"י ערבוב הקרן היסודית עם ה‪ signal-‬בגביש‪ .‬עוצמת העירור הינה ‪ ~400nJ‬וגודל הקרן‬
‫שנמדדה בחריר של ‪ 100µm‬הינה ‪ ~200µm‬בממוצע‪ .‬החוקר הינו אור לבן )‪ (400nm-950nm‬בעוצמה‬
‫של ‪ ~200nJ‬ובגודל של ‪ ~500µm‬בממוצע‪ ,‬המצוי על מסוע שמאפשר שינוי הפרש הדרכים האופטיות‪.‬‬
‫הכיווץ של השואב בוצע עם זוג פריזמות לספק פולס של ‪ 30fs‬בעוד החוקר לא כווץ ואורכו ‪.~300fs‬‬
‫הקריאה בוצעה ב‪ DA-‬במערך של ה‪) MC-‬ראה תמונה ‪ (2.15‬כאשר מקצץ הפולסים על ה‪.pump-‬‬
‫מבחינת קיטובים עבודה בזווית קסם ) ‪.107,105(magic angle 54.7‬‬
‫‪ PSB‬ב‪ :NOPA-‬ניסוי שלושה פולסים )‪ .(pump-push/dump-probe‬ה‪ pump-‬באורך גל של‬
‫‪ 400nm‬נוצר מהכפלת מחצית הפולסים היוצאים מהמערכת‪ .‬בדרכה של קרן זו מסוע המאפשר שינוי‬
‫בזמן הגעת פולס ה‪ pump-‬ביחס ליתר הפולסים‪ .‬פולס זה אינו עובר כיווץ ואורכו הזמני כ‪ .50fs-‬ה‪-‬‬
‫‪49‬‬
‫‪50‬‬
‫‪ push/dump‬וה‪ probe-‬הם פולסי ‪ NOPA‬מכווצים ל‪ 7fs-‬בתחום הנראה )‪ (500nm-700nm‬פולסים‬
‫אלו כמעט באותו הגודל אך קטנים בפקטור ‪ 2‬מגודל ה‪ .pump-‬ה‪ probe-‬ניצב על מסוע נוסף המאפשר‬
‫את ביצוע המדידה‪ .‬נציין כי בניסויים דומים כבר נצפו ויברציות הן כתלות בזמן הגעת ה‪ 112pump-‬והן‬
‫כתלות בשינוי ‪ chirp‬פולס ה‪ dump/push-‬באמצעות הכנסה והוצאה של זכוכיות קוורץ איכותיות‪.88‬‬
‫בכל הניסויים מקצץ פולסים אחד הוצב על פולסי ה‪ NOPA-‬ושני על פולס ה‪ .push/dump-‬המערך‬
‫נראה בתמונה מספר ‪ 2.16‬רק שבמהלך קרן ה‪ 800nm-‬הוכנס גביש מכפיל ליצירת שואב ב‪.400nm-‬‬
‫הקריאה בוצעה באמצעות ‪ .CCD‬מבחינת הקיטובים כל הקרניים קוטבו באופן זהה )‪ (VVV‬לקבלת‬
‫עוצמה מקסימאלית‪.‬‬
‫‪ BR‬ו‪ : BR5.12-‬ניסוי שני פולסים ‪ pump/probe‬במערכת ה‪ TOPAS-‬בדומה לניסוי של ה‪PSB-‬‬
‫במערכת זו עם ההבדלים הבאים‪ :‬ביצענו את הניסוי בשני אורכי גל עירור ‪ 575nm‬ו‪ 610nm-‬ע"י‬
‫הכפלת ה‪ signal-‬ובמטרה לבצע הדבקה ולהימנע מאיבוד מידע בעקבות הפיזור באזור העירור‪ .‬כיווץ ה‪-‬‬
‫‪ pump‬בוצע תוך שימוש בשריג והספקטרום הוגבל‪ ,‬לשם הגבלת הפיזור והימנעות מאזור פיזור חופף‬
‫ואיבוד מידע‪ .‬האיסוף בוצע באמצעות סיבים שניכנסו לספקטוגרפים )‪ (DA‬ללא שימוש בפילטר על ה‪-‬‬
‫‪ probe‬אלא ע"י חסימת האזור המרכזי )ראה שינויים שבוצעו במערכת ה‪ MC-‬סעיף ‪.(2.6.2.1‬‬
‫‪ :pHR‬ניסוי שלושה פולסים ‪ pump-dump-probe‬במערכת ה‪ .TOPAS-‬ניסוי הדומה לניסוי שבוצע‬
‫על ה‪ .57BR-‬במקרה זה‪ ,‬מחצית מפולסי המגבר הוכנסו ל‪ TOPAS-‬ויצרו פולסי ‪ signal‬ב‪.1160nm-‬‬
‫פולסים אלו עברו פיצול כאשר מחציתם הוכפלו באמצעות גביש מכפיל ‪ BBO‬ליצירת עירור הדגם עם‬
‫פולס ‪ pump‬ב‪ .560nm-‬ומחציתם נותרו ב‪ 1160nm-‬ושימשו כ‪ .dump-‬פולס זה תפקידו לרוקן את‬
‫אוכלוסיית המצב המעורר בזמנים שונים‪ .‬מחצית הפולסים שלא עברו ב‪ (800nm) TOPAS-‬שימשו‬
‫ליצירת אור לבן המשמש כ‪ .probe-‬לצורך המדידה ושינוי זמני הגעת הקרניים הוצבו שני מסועים אחד‬
‫על ה‪ pump-‬והשני על ה‪ .probe-‬כמו כן נעשה שימוש עם שני ‪ optical choppers‬האחד הוצב על כל‬
‫הקרניים טרם הכניסה ל‪ TOPAS-‬והאחר הוצב על זרוע ה‪ .pump-‬הקריאה בוצע ב‪ DA-‬לאחר ביצוע‬
‫השינויים )בדומה למתואר קודם(‪ .‬כיווץ ה‪ pump-‬בוצע תוך שימוש עם פריזמות כאשר יתר הקרניים לא‬
‫כווצו והקיטובים של כל הקרניים זהים )‪ .111(VVV‬המערך הניסיוני המלא נראה בתמונה מספר ‪.2.15‬‬
‫תמונה מספר ‪:2.15‬‬
‫המערך הניסיוני עבור‬
‫ניסוי )‪ (SEP‬המערב‬
‫שלושה הפולסים שבוצע‬
‫על ‪.pHR‬‬
‫‪50‬‬
‫‪51‬‬
‫‪ .3‬תוצאות ודיון‬
‫‪ n-Bu RPSB .3.1‬בתמיסת אתנול‬
‫‪105‬‬
‫ממצאים ניסיוניים‬
‫תהליך ההיפוך הפנימי והאיזומריזציה מאתחלים את הפעילות הביולוגית בכל החלבונים הרטינליים‬
‫ומתרחשים בכרומופור המצוי בכיס החלבון‪ .‬ניכר הבדל בין הדינאמיקה הראשונית המתרחשת בחלבון לזו‬
‫המצויה בהעדרו )בכרומופור בתמיסה(‪ .‬על מנת להבין את השפעותיו של החלבון על הדינאמיקה‬
‫הראשונית נחקור תחילה את ה‪ n-BuRPSB-‬בתמיסת אתנול‪ ,‬המולקולה המשותפת לכלל החלבונים‬
‫הרטינליים ונראית בתמונה מספר ‪) 3.1.1‬למעלה(‪ .‬בתמונה זו למטה נראה ספקטרום בליעת מצב היסוד‬
‫הן של בקטריורודופסין והן של ‪RPSB‬‬
‫בתמיסה‪ .‬ניכר כי ספקטרום הבליעה של ה‪-‬‬
‫‪ RPSB‬מוסט לכחול ורחב ב‪ 50%-‬מזה‬
‫המתקבל‬
‫עבור‬
‫בקטריורודופסין‪.‬‬
‫ניסוי‬
‫‪15000‬‬
‫‪18000‬‬
‫‪21000‬‬
‫שביצענו על מערכת מודל המחקה את ההיסט‬
‫‪24000‬‬
‫בבליעה הקיים בחלבון הציג פליטה הממשיכה‬
‫עמוק ל‪ IR-‬וניכרו הבדלים ספקטראליים בין‬
‫שני אורכי גל עירור בשני צדי פס הבליעה‬
‫ובניהם שייר ספקטראלי ארוך חיים )מעל‬
‫‪ (60ps‬שנראה רק בעירור בצד הכחול של פס‬
‫הבליעה )‪ .72(475nm‬הבדל זה הוסבר ע"י‬
‫)‪O.D\ intensity (a.u‬‬
‫‪BR‬‬
‫‪RPSB‬‬
‫‪395nm‬‬
‫‪477nm‬‬
‫‪27000‬‬
‫קיומה של אי‪-‬הומוגניות בבליעת מצב היסוד‬
‫כך שאורך גל עירור שונה מעורר יחס‬
‫‪550 600 650‬‬
‫)‪λ (nm‬‬
‫אוכלוסיות שונה של מצב היסוד‪ .‬לאור ניסוי‬
‫זה ביצענו ניסוי ‪ pump-probe‬עבור ה‪-‬‬
‫‪ RPSB‬תוך עירור בשני אורכי גל שונים‬
‫הממוקמים משני צדי פס הבליעה )תמונה‬
‫‪500‬‬
‫‪450‬‬
‫‪400‬‬
‫תמונה מספר ‪:3.1.1‬‬
‫למעלה‪ -‬מבנה מולקולת ה‪.RPSB-‬‬
‫למטה‪ -‬ספקטרום בליעה מנורמל של בקטריורודופסין )‪ (BR‬ו‪-‬‬
‫‪ all-trans RPSB‬באתנול ושני אורכי גל פולסי העירור בהם‬
‫השתמשנו בניסוי שלנו מנורמלים גם כן‪.‬‬
‫מספר ‪ -3.1.1‬למטה( כאשר הבדיקה בשני‬
‫המקרים בוצעה עם אור לבן )תחום ספקטראלי רחב ‪ .(420nm-950nm‬מטרתנו הייתה לחשוף טווח‬
‫ספקטראלי רחב‪ ,‬לראות האם הדינאמיקה תלויה באורך גל העירור וניתן לצפות באי‪-‬הומוגניות של בליעת‬
‫מצב היסוד‪.‬‬
‫התוצאות שהתקבלו עבור שני אורכי גל העירור נראות במפה התלת מימדית בתמונה מספר ‪ .3.1.2‬מפה‬
‫זו מייצגת את השינויים בספקטרום הטרנזיינטי בעיכובי זמן ‪ probe‬שונים החל מ‪ 0.5ps-‬עד ‪25ps‬‬
‫כפונקציה של אורכי גל ה‪.probe-‬‬
‫‪51‬‬
‫‪52‬‬
‫תמונה מספר ‪:3.1.2‬‬
‫מפת מתאר של השינויים בספקטרום הטרנזיינטי לאחר ביצוע תיקון זמן עקב דיספרסיה של ה‪probe-‬‬
‫עבור עיכוב ‪ probe‬מ‪ 0.5ps-‬ועד ‪ 25ps‬בשני אורכי גל עירור )מצד שמאל‪ , 395nm-‬מצד ימין‪-‬‬
‫‪.(480nm‬‬
‫‪900‬‬
‫‪800‬‬
‫‪700‬‬
‫‪600‬‬
‫‪500‬‬
‫‪900‬‬
‫‪abs‬‬
‫‪0fs‬‬
‫‪150fs‬‬
‫‪300fs‬‬
‫‪500fs‬‬
‫‪1ps‬‬
‫‪3ps‬‬
‫‪10ps‬‬
‫‪0.010‬‬
‫‪15ps‬‬
‫‪30ps‬‬
‫‪>50ps 0.005‬‬
‫‪0.000‬‬
‫‪800‬‬
‫‪700‬‬
‫‪600‬‬
‫‪500‬‬
‫‪0.16‬‬
‫‪0.12‬‬
‫‪0.08‬‬
‫‪0.04‬‬
‫‪∆OD‬‬
‫‪395 nm‬‬
‫‪395nm‬‬
‫‪0.010‬‬
‫‪-0.04‬‬
‫‪0.005‬‬
‫‪0.04‬‬
‫‪0.000‬‬
‫‪-0.005‬‬
‫‪∆OD‬‬
‫‪-0.005‬‬
‫‪0.00‬‬
‫‪0.00‬‬
‫‪477nm‬‬
‫‪-0.04‬‬
‫‪477 nm‬‬
‫‪900‬‬
‫‪800‬‬
‫‪700‬‬
‫‪600‬‬
‫) ‪λ (nm‬‬
‫‪900‬‬
‫‪500‬‬
‫‪800‬‬
‫‪700‬‬
‫‪600‬‬
‫‪500‬‬
‫)‪λ (nm‬‬
‫תמונה מספר ‪:3.1.3‬‬
‫חתכים במפה בעיכובי ‪ probe‬מסוימים )ראה מקרא( בשני אורכי גל העירור )למעלה‪ 395nm-‬ולמטה ‪.(480nm‬‬
‫מצד שמאל‪ -‬זמנים הנמוכים מ‪ 3ps-‬יחד עם ספקטרום ה‪ bleach-‬שחושב לפי מספר המולקולות שעוררנו ע"י ה‪) pump-‬בשחור(‬
‫כאשר בקווים אפורים מצויינת בהערכה השגיאה שבחישוב‪.‬‬
‫מצד ימין‪ -‬זמנים ארוכים ‪.10ps≤ t ≤100ps‬‬
‫‪52‬‬
‫‪53‬‬
‫ניתן לראות בגרפים אלו כי המצב המעורר נבנה בזמן קצר מתוך בליעה עדינה הנראת "בזמן אפס" באזור‬
‫הפליטה )הגרף האדום בתמונה ‪ .(3.1.3‬בזמנים המאוחרים לאחר שדעיכת המצב המעורר הושלמה נצפית‬
‫בליעה באזור ה‪ 550nm-‬שנשארת יחד עם ה‪) bleach-‬המדידה נמשכה עד ‪ .(100ps‬הספקטרום שנותר‬
‫בזמנים המאוחרים )‪ (~100ps‬שונה מזה שנראה בזמנים המוקדמים )הגרף הורוד בתמונה ‪ .(3.1.3‬כמות‬
‫האוכלוסייה שעוררנו חושבה ונמצאה זהה )בטווח השגיאה( בשני אורכי גל העירור‪ .‬למרות זאת‪ ,‬נראה כי‬
‫עוצמת ה‪ ∆OD -‬שהתקבלה עבור עירור ב‪ 395nm-‬גבוהה מזו שנצפתה ב‪ 480nm-‬בכל זמן השהייה‪.‬‬
‫מעבר להבדל בעוצמה בין שני אורכי גל העירור ניתן בתמונות ‪ 3.1.2‬ו‪ 3.1.3-‬לראות היסט ספקטראלי‬
‫עדין עבור פיק הבליעה ב‪ .500nm-‬היסט זה נראה באופן ברור יותר בהתאמה הגלובאלית שבוצעה‬
‫לנתונים‪ .‬התאמת ‪) DAS‬המוסברת בשיטות( בוצעה עבור הנתונים מ‪ 0.1ps-‬עד ‪) 30ps‬כלומר לאחר‬
‫ביצוע חיתוך הזמן הראשוני המייצג את הקונבולוציה בין הפולסים( ותוצאתה )ספקטרום האמפליטודות‬
‫השונות עבור קבוע דעיכה מסוים( מוצגת בתמונה מספר ‪.3.1.4‬‬
‫‪900‬‬
‫‪0.04‬‬
‫‪800‬‬
‫‪700‬‬
‫‪600‬‬
‫‪500‬‬
‫‪900‬‬
‫‪800‬‬
‫‪700‬‬
‫‪600‬‬
‫‪500‬‬
‫)‪(a‬‬
‫)‪(b‬‬
‫‪200±20 fs‬‬
‫‪123±10 fs‬‬
‫‪1.6±0.03 ps‬‬
‫‪1.25±0.02 ps‬‬
‫‪0.02‬‬
‫‪0.02‬‬
‫‪0.00‬‬
‫‪0.00‬‬
‫)‪(c‬‬
‫)‪(d‬‬
‫‪6.2±0.5 ps‬‬
‫‪6.6±0.2 ps‬‬
‫‪0.0025‬‬
‫‪∆OD‬‬
‫‪-0.02‬‬
‫‪0.04‬‬
‫‪0.02‬‬
‫‪0.0000‬‬
‫‪0.00‬‬
‫‪-0.0025‬‬
‫‪-0.02‬‬
‫‪900‬‬
‫‪800‬‬
‫‪700‬‬
‫‪600‬‬
‫‪500‬‬
‫‪900‬‬
‫‪800‬‬
‫‪700‬‬
‫‪600‬‬
‫‪500‬‬
‫)‪λ(nm‬‬
‫תמונה מספר ‪:3.1.4‬‬
‫התאמה כללית של הנתונים )‪ (DAS‬בשני אורכי גל העירור לדעיכה מולטי‪-‬אקספוננציאלית‪ .‬כל פנל‬
‫מציג קבוע דעיכה אחד עבור שני הניסויים כאשר בכחול‪ -‬עבור עירור ב‪ ,395nm-‬באדום‪ -‬עבור עירור‬
‫ב‪.480nm-‬‬
‫מההתאמה התקבלו ארבעה קבועי דעיכה‪ :‬הראשון מהיר ))‪ ,(~150fs (a‬שני קבועים נוספים של ‪~1.5ps‬‬
‫ו‪ 6.5ps-‬נראים ב‪ (b)-‬ו‪ (c)-‬בהתאמה ובהתאם למדווח בניסויים קודמים‪ .24,22‬הקבוע האחרון‪, (d) ,‬‬
‫מייצג תרומה של "תוצר יציב" במונחי משך המדידה שביצענו )המדידה בוצעה עד ‪ (100ps‬כלומר זהו‬
‫הספקטרום שנותר בזמנים ארוכים לאחר שדעיכת המצב המעורר הושלמה‪ .‬הערכת השגיאה עבור כל‬
‫אחד מקבועי הדעיכה שהתקבלו נגזרה מקיבוע של קבוע הדעיכה שהתקבל מההתאמה החופשית )ההתאמה‬
‫שנתנה את סטיית התקן המינימאלית( כאשר יתר הקבועים הורשו להשתנות באופן שיטתי לערכים‬
‫‪53‬‬
‫‪54‬‬
‫גבוהים ונמוכים מהערך שהתקבל מההתאמה החופשית כאשר ההסתכלות היא על ערך סטיית התקן לאחר‬
‫השינויים במטרה לבדוק שיתר הקבועים אינם מחפים על השינויים בפרמטר שקובע‪ .‬כל גרף בתמונה‬
‫‪ 3.1.4‬מייצג את הספקטרום המיוחס לקבוע דעיכה ספציפי בשני אורכי גל עירור‪ .‬ההתאמה בוצעה באופן‬
‫בלתי תלוי עבור כל מקרה וניכר כי הקבועים שהתקבלו קרובים‪ ,‬בעיקר כאשר מתייחסים לטווח השגיאה‪.‬‬
‫כפי שציינו קודם‪ ,‬השפעת אורך גל העירור ניכרת בבירור בתמונה זו‪ .‬פיק הבליעה בכל התמונות‬
‫הקטנות )‪ (~520nm‬מוסט לכחול ומוגבר כתוצאה משינוי העירור מ‪ 480nm-‬ל‪ .395nm-‬היסט זה ניכר‬
‫גם לאחר שתהליך ההיפוך הפנימי הושלם )‪.(d‬‬
‫בתמונה מספר ‪ 3.1.5‬ניתן לראות את הדעיכות במספר אורכי גל ‪ probe‬אופייניים עבור שני אורכי גל‬
‫העירור יחד עם ההתאמה המולטי‪-‬אקספוננציאלית שנגזרה מהאנליזה )בשחור(‪ - 430nm :‬אזור ה‪-‬‬
‫‪ -530nm ,bleach‬אזור בליעת המצב המעורר‪ 680nm ,‬ו‪ -900nm-‬אזור פליטת המצב המעורר‪.‬‬
‫‪30‬‬
‫‪40‬‬
‫‪20‬‬
‫‪0.05‬‬
‫‪40‬‬
‫‪20‬‬
‫‪0.08‬‬
‫‪0.04‬‬
‫‪0.04‬‬
‫‪0.03‬‬
‫‪0.02‬‬
‫‪10‬‬
‫‪0‬‬
‫‪30‬‬
‫‪10‬‬
‫‪0‬‬
‫‪0.00‬‬
‫‪3‬‬
‫‪1‬‬
‫‪2‬‬
‫‪0‬‬
‫‪430nm‬‬
‫‪3‬‬
‫‪0.00‬‬
‫‪2‬‬
‫‪1‬‬
‫‪-0.01‬‬
‫‪0‬‬
‫‪0.00‬‬
‫‪-0.02‬‬
‫‪530nm‬‬
‫‪0.01‬‬
‫‪-0.02‬‬
‫‪-0.03‬‬
‫‪0.00‬‬
‫‪0.000‬‬
‫‪0.000‬‬
‫‪900nm‬‬
‫‪-0.004‬‬
‫‪3‬‬
‫‪1‬‬
‫‪2‬‬
‫‪680nm‬‬
‫‪0‬‬
‫‪-0.008‬‬
‫‪-0.012‬‬
‫‪-0.016‬‬
‫‪40‬‬
‫‪30‬‬
‫‪∆OD‬‬
‫‪-0.04‬‬
‫‪20‬‬
‫‪3‬‬
‫‪1‬‬
‫‪2‬‬
‫‪0‬‬
‫‪-0.004‬‬
‫‪0.000‬‬
‫‪0.000‬‬
‫‪-0.008‬‬
‫‪-0.006‬‬
‫‪-0.016‬‬
‫‪-0.012‬‬
‫‪10‬‬
‫‪0‬‬
‫‪40‬‬
‫‪30‬‬
‫‪20‬‬
‫‪10‬‬
‫‪-0.008‬‬
‫‪0‬‬
‫)‪time (psec‬‬
‫תמונה מספר ‪:3.1.5‬‬
‫אורכי גל ‪ probe‬מסוימים בספקטרום הטרנזיינטי לאחר עירור ב‪) 395nm-‬בכחול( או ‪) 480nm‬באדום(‪ ,‬יחד‬
‫עם ההתאמה המולטי‪-‬אקספוננציאלית שנגזרה מההתאמה )בשחור(‪.‬‬
‫נציין כי ההפרש בין הנתונים המקוריים להתאמה שבוצעה הינו סביב האפס בטווח של ‪ .0.002‬גודל זה‬
‫מעיד על התאמה טובה ואמינות הניתוח שבוצע‪ ,‬המצביע על קירבה לנתונים המקוריים שנאספו‪.‬‬
‫‪54‬‬
‫‪55‬‬
‫דיון‬
‫על מנת לאפיין את הדינאמיקה והקינטיקה של ‪ RPSB‬בתמיסה‪ ,‬נרצה לייחס את הנתונים הספקטראליים‬
‫רחבי הפס למעברים שונים בין המצבים האלקטרוניים של האוכלוסייה המעוררת ולמצוא את קבועי הזמן‬
‫המיוחסים לרלקסציה ביניהם‪ .‬בנוסף‪ ,‬מחקר תלות הקינטיקה באורך גל העירור יכול להוביל לתובנות‬
‫נוספות לגבי מודל רמות האנרגיה‪.‬‬
‫ספקטרום בליעת מצב היסוד‪ :‬ספקטרום ה‪ RPSB-‬בתמיסה רחב בהרבה מהספקטרום של ה‪ BR-‬כמוראה‬
‫בתמונה מספר ‪ .3.1.1‬הרחבה זו ייתכן ונובעת מגמישות כרומופור ה‪ RPSB-‬בתמיסה שכן סביבת‬
‫החלבון מגבילה את גמישותו‪.‬‬
‫הספקטרום הטרנזיינטי‪ :‬בתמונות מספר ‪ 3.1.2‬ו‪ 3.1.3-‬ניתן לראות את הספקטרום הטרנזיינטי שהתקבל‪.‬‬
‫בתמונות אלו נחשף תחום ספקטראלי רחב הכולל‪:‬‬
‫‪ bleach .1‬באזור ה‪ 450nm-‬שמוסט בהתאם לאורך גל העירור‪.‬‬
‫‪ .2‬בליעת המצב המעורר באזור ה‪ 520nm-‬שמוסטת לאדום כאשר העירור מבוצע ב‪.480nm-‬‬
‫‪ .3‬פליטה רדודה ביחס לבליעה‪ ,‬הנמשכת עמוק לאדום ובעלת מבנה דו‪-‬דבשתי‪ .‬עד כה‪ ,‬פליטה דומה‬
‫‪41‬‬
‫ומחקרי ספקטרום טרנזיינטי קודמים של ‪RPSB‬‬
‫דווחה רק עבור חלבון ההלורודופסין )‪(sHR‬‬
‫בתמיסה‪ 24,22‬לא דיווחו על פליטה עם מבנה שנמשכת עמוק ל‪ .IR-‬אם כי‪ ,‬מחקרי פלורסנציה של ‪RPSB‬‬
‫בתמיסה‪ 26‬ושל בקטריורודופסין‪ 30‬הראו הרחבה חסרת מבנה הנמשכת עמוק לאדום )מרכז ספקטרום ב‪-‬‬
‫‪ (FWHM=4000cm-1,~700nm‬וחישובי פליטה מאולצת )מספקטרום בליעת מצב היסוד מחשבים את‬
‫ספקטרום הפליטה הספונטאנית וממנו מחולצת הפליטה המאולצת( מנבאים שהרחבה כזו צריכה להיות‪.‬‬
‫ממצאים אלו מסבירים את ספקטרום הפליטה הטרנזיינטית הרדודה ובעלת המבנה שנצפתה בתוצאותינו‬
‫כנובע מחפיפה בין בליעה לפליטה השייכים שניהם למצב המעורר‪ .‬הסבר זה תואם להסבר שניתן לאי‬
‫‪32,31‬‬
‫ההתאמה בין הפליטה המאולצת לספונטאנית ב‪BR-‬‬
‫והמחשתו נראית בתמונה מספר ‪ .3.1.7‬בתמונה‬
‫זו רואים כי הספקטרום הטרנזיינטי של ‪ BR‬רדוד ונמשך עמוק ל‪) NIR-‬בריבועים שחורים( כאשר‬
‫האיפוס שנראה באזור ה‪ ,750nm-‬הוסבר עקב חפיפה של בליעה ופליטה השייכים למצב המעורר‪ .‬מן‬
‫הפליטה )נראית בריבועים האדומים( שוערה בליעת המצב המעורר )בריבועים הירוקים(‪ ,‬כך שסכום‬
‫הספקטרומים נותן את הספקטרום הטרנזיינטי שהתקבל בניסוי‪.‬‬
‫‪BR at 0.3ps‬‬
‫‪PSB at 0.3ps‬‬
‫‪bleach BR‬‬
‫‪bleach PSB‬‬
‫‪SE BR‬‬
‫‪SE PSB‬‬
‫‪ES abs. BR‬‬
‫‪0.04‬‬
‫‪0.00‬‬
‫‪-0.04‬‬
‫‪1000‬‬
‫‪900‬‬
‫‪800‬‬
‫‪55‬‬
‫‪700‬‬
‫) ‪λ (nm‬‬
‫‪600‬‬
‫‪500‬‬
‫‪-0.08‬‬
‫‪400‬‬
‫‪∆OD‬‬
‫תמונה מספר ‪:3.1.7‬‬
‫בריבועים‪ -‬בקטרירודופסין‪.‬‬
‫בעיגולים‪-‬מערכת המודל ‪.RPSB‬‬
‫הערה‪ :‬הגרפים המוצגים כאן‬
‫עבור בקטריורודופסין )ריבועים(‬
‫נלקחו מתוך מאמרו של‬
‫‪. 32Hnfinrud‬‬
‫בשחור‪ -‬הספקטרום הטרנזיינטי‬
‫בזמן עיכוב של ‪.0.3ps‬‬
‫בכחול‪ -‬ספקטרום ה‪bleach -‬‬
‫כאשר האמפליטודות הותאמו‬
‫לחישוב כמות המולקולות שעברו‬
‫עירור‪.‬‬
‫באדום‪ -‬הפליטה המאולצת‬
‫שחושבה מתוך הבליעה‪.‬‬
‫בירוק‪ -‬בליעת המצב המעורר‬
‫עם אמפליטודה המתאימה לנתוני‬
‫הספקטרום הטרנזיינטי המוצג‪.‬‬
‫‪0.08‬‬
‫‪56‬‬
‫מחקרים רבים דנו בדמיון והשוני בין ‪ RPSB‬בתמיסה לבין החלבונים רטינליים כך שחשיפת הספקטרום‬
‫עמוק ב‪ NIR-‬הינה בעלת חשיבות‪ .‬ניסויינו מספק ספקטרום טרנזיינטי רחב עבור ‪ RPSB‬בתמיסה בשני‬
‫אורכי גל העירור‪ ,‬וכעת ניתן לבצע השוואה בין הבליעה לפליטה ב‪) RPSB-‬בעיגולים( לבין ‪BR‬‬
‫)בריבועים( בתמונה ‪ 3.1.7‬ניתן לראות כי בליעת מצב היסוד )בכחול( ב‪ RPSB-‬בתמיסה )‪(~450nm‬‬
‫מוסטת לכחול ביחס ל‪ .(~560nm) BR-‬בספקטרום הטרנזיינטי )בשחור( נראה כי בליעת המצב המעורר‬
‫מוסטת לאדום ב‪ RPSB-‬בתמיסה )‪ (~500nm‬ביחס ל‪ (~460nm) BR-‬והפליטה המאולצת )באדום( ב‪-‬‬
‫‪ RPSB‬מוסטת לכחול ביחס ל‪.BR-‬‬
‫עבודתו התיאורטית של ‪Garavelli‬‬
‫‪74‬‬
‫עשויה להסביר את ההבדלים בבליעה ובפליטה שצוינו לעיל‪ .‬הם‬
‫בדקו את השפעת מיקום המטען על משטחי הסינגלט השונים ב‪.RPSB-‬‬
‫תמונה מספר ‪:743.1.8‬‬
‫היון הנגדי ממוקם קרוב ל‪-‬‬
‫‪) C-tail‬רחוק מהחנקן(‪.‬‬
‫במקרה זה מעבר המטען‬
‫מיוצב ב‪ S1-‬ביחס למצבים‬
‫הקוולנטיים )‪ S0‬ו‪ .(S2-‬זה‬
‫מוביל לשינויי מבנה במצבי‬
‫הסינגלט כאשר המרווח‬
‫האנרגתי ‪ S1-S0‬יורד‬
‫)הבליעה מוסטת לאדום( ו‪-‬‬
‫‪ S2-S1‬עולה‪ .‬בהתאמה‬
‫החתך ‪ S1/S0‬מתרחש קודם‬
‫לאורך מסלול האיזומריזציה‬
‫‪.S1‬‬
‫בתמונה מספר ‪ 3.1.8‬ניתן לראות כיצד סביבה שונה )מיקום היון הנגדי רחוק מהחנקן( משנה את מיקום‬
‫רמות הסינגלט ואף את מיקומו של החתך הקוני )מעבר מקווים מקווקווים לרציפים לפי החצים‬
‫שבתמונה(‪ .‬באנלוגיה‪ ,‬ייתכן כי החלבון מהווה סביבה המקטינה את המרווח בין ‪ S0‬ל‪ S1-‬ע"י ייצוב רמת‬
‫‪ S1‬ומעלה את המרווח בין המצב הפלורסנטי למצבי סינגלט גבוהים יותר‪ .‬שינויים אלו המשפיעים גם על‬
‫מיקום החתך הקוני יכולים לא רק להסביר את ההיסטים הספקטראליים אלא אף את זמני הדעיכה השונים‬
‫והיעילות הקוונטית לאיזומריזציה המתקיימים בסביבת החלבון )כלומר את יתר השפעות החלבון(‪.‬‬
‫מתוצאותינו נראה כי ההבדל בין ה‪ RPSB-‬בתמיסה לבקטריורודופסין נובע ממיקום שונה של בליעת‬
‫מצב היסוד וההבדלים הנראים במצב המעורר נובעים רק מחפיפת פסי אנרגית הבליעה והפליטה‪ .‬כלומר‪,‬‬
‫ההיסט הניכר בבליעת המצב המעורר נובע מההבדל במיקום אנרגיית המצב ‪) S0‬המתבטא כ‪bleach-‬‬
‫בספקטרום הטרנזיינטי( ולא מתזוזת כל רמות הסינגלט כפי שטוען ‪ Garavelli‬עבור ה‪RPSB-‬‬
‫בתמיסה‪ .74‬ניתן להסיק כי המצב המעורר דומה בשני המקרים למרות השוני הניכר בספקטרום‬
‫הטרנזיינטי והתיאוריה שהוצעה אינה שלמה ומתעלמת מקיומם של חפיפות בין מצבים‪ .‬מכאן ברור כי‬
‫לצורך אפיון המצב המעורר יש להחסיר את השפעתו של מצב היסוד‪ .‬זאת נעשה ע"י חישוב כמות‬
‫האוכלוסייה המדויקת הנמצאת במצב המעורר והוספתה לספקטרום הטרנזיינטי‪ ,‬כך שנשאר רק עם המצב‬
‫המעורר‪ .‬לצערנו‪ ,‬קיים קושי רב בהערכת ה‪ bleach -‬במדויק והסטייה גדולה )‪ (15%‬כפי שניתן לראות‬
‫‪56‬‬
‫‪57‬‬
‫בגרפים האפורים בתמונה ‪ .3.1.3‬שגיאה כזו בעלת השפעה קריטית על מבנה ספקטרום הבליעה של‬
‫המצב המעורר‪ .‬עם זאת‪ ,‬החסרה איכותית של ה‪ bleach-‬המחושב נותנת פיק מרכזי עבור בליעת המצב‬
‫המעורר ב‪ ~505nm-‬ורוחב של ‪ ,FWHM=~3500cm-1‬כלומר הפיק מוסט לכחול והבליעה דומה לזו‬
‫הקיימת ב‪.BR-‬‬
‫עקב חפיפת הספקטרומים קשה לספק מרווחי רמות ל‪ RPSB-‬ולכן מתחייב מחקר תיאורטי לקבלת‬
‫דיאגראמת פסי האנרגיה והשוואתם למתרחש בסביבת החלבון‪ .‬בשלב זה הסתפקנו בביצוע אנליזת ‪DAS‬‬
‫המאפשרת הפרדה של ההתפתחות הספקטראלית בזמן וקבלת קבועי הדעיכה וקינטיקת התהליך )תמונה‬
‫מספר ‪ .(3.1.4‬נרצה להשוות את תוצאותינו למחקרים קודמים שבוצעו הן על ה‪ RPSB-‬והן על‬
‫החלבונים הרטינליים‪.‬‬
‫קינטיקת התהליך וקבועי הדעיכה‪ :‬בתמונה מספר ‪ 3.1.4‬נראית דעיכה מולטי‪-‬אקספוננציאלית עבור‬
‫‪ RPSB‬בתמיסת אתנול‪ .‬נדון בקבועי הדעיכה השונים‪:‬‬
‫א‪ .‬קבועי דעיכה של ‪ ~1.4ps‬ו‪) ~6.4ps-‬בממוצע עבור שני אורכי גל העירור( שהתקבלו קרובים‬
‫‪24,23,22‬‬
‫לקבועים שדווחו עבור ‪ RPSB‬בעבר‬
‫ודומים לקבועים שנצפו בחלבון הרטינלי‬
‫הלורודופסין‪.61,41,40, 39,36‬‬
‫מספר הסברים ניתנו לדעיכה הבי‪-‬אקספוננציאלית הזו‪:‬‬
‫‪23‬‬
‫‪.1‬קירור ויברציוני של אוכלוסיית המצב המעורר במהלך תהליך ההיפוך הפנימי ‪.‬‬
‫‪.2‬קיומם של שתי אוכלוסיות שונות )איזומרים שונים‪ (26‬שניתנות להבחנה קינטית‪ ,‬בדומה למה שהוצע‬
‫עבור ‪.39HR‬‬
‫‪.3‬טופולוגיה מורכבת של המשטח במצב המעורר‪ .‬לדג'‪ :‬קיומו של מחסום לאורך מסלול האיזומריזציה‬
‫יכול להוביל לדעיכה בי‪-‬אקספוננציאלית‪.20‬‬
‫ב‪ .‬הקבוע המהיר )‪ (~150fs‬שהתקבל בתוצאותינו בשני אורכי גל העירור )ראה בגרפים הפנימיים‬
‫המייצגים זמנים מוקדמים בתמונה מספר ‪ ,(3.1.5‬נצפה בעבר הן עבור ‪RPSB‬‬
‫‪39,30‬‬
‫רטינליים‬
‫‪26‬‬
‫והן עבור חלבונים‬
‫אך ייחוסו שנוי במחלוקת‪ .‬האחד ייחס את הזמן המהיר לרלקסציה בין מצבים אלקטרונים‬
‫קרובים והשני לארגון מחדש של אטומי הפחמן בשלד הרטינל על המשטח המעורר‪ .‬תוצאותינו מראות‬
‫בבירור את הזמן המהיר ובזמנים המוקדמים ניתן לראות בספקטרום הטרנזיינטי בתמונה ‪ 3.1.3‬בנייה של‬
‫בליעת המצב המעורר ב‪ 520nm-‬והיעלמות הבליעה הנוספת באזור ה‪) 700nm-‬נראית בנייה של‬
‫פליטה(‪ .‬שינויים ספקטראליים מהירים אלו יחד עם הפער הקיים בין שני אורכי גל בליעת המצב המעורר‬
‫מובילים אותנו לשער כי ב‪ RPSB-‬הזמן המהיר מיוחס לרגיעה בין מצבים אלקטרונים‪ .‬במחקר שבוצע‬
‫על רטינל המחקה את היסט האופסין שבחלבון רואים בבירור את המעבר בין שתי בליעות המצב המעורר‬
‫מה שמחזק את השערתנו כי מדובר במצבים אלקטרונים שונים‪.‬‬
‫ג‪ .‬בזמן הארוך )‪ (>50ps‬נראה ספקטרום שנותר לאחר שהושלמה דעיכת המצב המעורר )תמונה מספר‬
‫‪ .((d) 3.1.4‬ספקטרום זה לא נראה בזמן אפס ובסקאלת זמן של מילישניות לא נמצאה עדות לקיומו‬
‫וייחוסו אינו ברור‪ .‬ייתכן והדבר נובע או מתוצרי ‪ s-cis‬יציבים )סיבוב סביב קשר יחיד( שמתאימים‬
‫לסקלת זמן של מיקרושניות או ממולקולות מגיב חמות או מתוצרים לא ברורים היציבים בסקלת זמן‬
‫‪57‬‬
‫‪58‬‬
‫זו‪ .25,16‬הסברה כי מדובר בתוצרי ‪ s-cis‬ארוכי חיים היא הסבירה ביותר כי היא מתאימה לדיווחים‬
‫קודמים שדווחו עבור ‪) RSB‬רטינל עם בסיס ‪ Schiff‬ללא פרוטונציה(‪ 16‬אם כי‪ ,‬לא נעשה מחקר המוכיח‬
‫קיומם של תוצרים אלו ב‪ PSB-‬ומחקר נוסף נדרש על מנת לייחס את הספקטרום שנותר‪.‬‬
‫השוואה בין תוצאות שני אורכי גל העירור‪ :‬בשני אורכי גל העירור התקבלו קבועים דעיכה דומים )בטווח‬
‫השגיאה( והדינאמיקה זהה‪ .‬עובדה ניסיונית זו מעידה על כך שאין תלות של הקינטיקה בעודף אנרגית‬
‫הפוטון ומכאן לא סביר כי מדובר בשתי אוכלוסיות שונות )כפי שנטען עבור חלבון ה‪ (30HR-‬עם זמני‬
‫דעיכה דומים ודמיון בספקטרומי ה‪ DAS-‬כנראה בתמונה מספר ‪.3.1.4‬‬
‫למרות הדמיון ניתן להבחין במספר הבדלים בין שני אורכי גל העירור‪:‬‬
‫‪ .1‬הבדל ניכר באמפליטודה בין שני אורכי גל העירור )נראה בבירור בתמונה ‪ -(3.1.3‬עירור ב‪400nm-‬‬
‫)באנרגיה הגבוהה( מראה אמפליטודה גבוהה יותר מהאמפליטודה הנראת בעירור ב‪ 480nm-‬וזאת למרות‬
‫שכמות האוכלוסייה שעוררה זהה בשני המקרים‪ .‬הממצא מתאים לסברה כי טופולוגית המשטח המעורר‬
‫מורכבת וייתכן כי קיים מחסום על המשטח כך שבאנרגיה גבוהה יותר אוכלוסיה רבה יותר עוברת את‬
‫המחסום וכך אמפליטודת המצב המעורר גדלה‪ .20‬אם כי‪ ,‬ייתכן שההבדלים נובעים מהשינוי בחפיפה בין‬
‫בליעת המצב המעורר וה‪ ,bleach-‬שכן שאיבה ב‪ 400nm-‬תגרום ל‪ bleach-‬להיות מוסט לכחול ותשאיר‬
‫יותר עוצמה בקצה האדום של בליעת המצב המעורר ולהיפך‪ .‬אומנם סברה זו לא נבדקה אך היא פחות‬
‫סבירה שכן ניכר גם הבדל באמפליטודה של הפליטה ושם הרי לא ניתן להסביר זאת כחפיפה התלויה‬
‫במקום העירור‪.‬‬
‫‪ .2‬היסט לאדום של ‪ ~15nm‬בפיק בליעת המצב המעורר במעבר מעירור ב‪ 400nm-‬ל‪) 480nm-‬תמונה‬
‫‪ -(3.1.4‬הסטה זו נראית בכל הזמנים ונשמרת גם לאחר שתהליך ההיפוך הפנימי הושלם‪ .‬עובדה זו‬
‫מעידה על כך שההיסט אינו קשור למצב מעורר שונה או לעודף האנרגיה בעירור‪ .‬אנו מייחסים היסט זה‬
‫לאנהומוגניות במבנה מצב היסוד למרות שבליעת מצב היסוד רחבה וחסרת מבנה )נראית בתמונה ‪.(3.1.1‬‬
‫מחקרים קודמים‪ 25,16‬מצביעים על קיומם של איזומרים שונים של ‪ PSB‬בתמיסה במצב היסוד שהם בעלי‬
‫דמיון ספקטראלי ושוני קטן במקדם הבליעה המולרי עובדות שלא סייעו לנו להפריד ספקטרוסקופית בין‬
‫האיזומרים השונים‪ .‬נציין כי מחקרים שנעשו על החלבונים הרטינליים‪ 115,114,113‬לא הצביעו על הרחבה‬
‫אנהומוגניות שכזו וזהו הבדל נוסף בין ה‪ RPSB-‬בתמיסה לחלבון‪ .‬אם כי‪ ,‬ניסויי רזוננס ראמאן של ‪BR‬‬
‫דיווחו על הרחבה אנהומוגנית שמערבת מנגנון דיפוזיוני הארוך משמעותית מזמן הרגיעה האלקטרונית‪.76‬‬
‫נראה כי הגמישות הסיבובית הקיימת ב‪ RPSB-‬בתמיסה מאפשרת את קיומם של מבנים שונים ותורמת‬
‫להרחבה האנהומוגנית‪ .‬היו שסברו‪ 116,106‬כי הגורם לאנהומוגניות במצב היסוד הינו קיומם של איזומרים‬
‫עבור הקשר הכפול ‪ .C15=N‬על מנת לבדוק האם זו הסיבה החלטנו לבצע ניסוי דומה עם עירור ומחקר‬
‫באותם אורכי הגל בתמיסת אתנול על ‪) (TB-PSB) tert-butylamine PSB‬עד כה חקרנו ‪n-butyl‬‬
‫‪ .107((NB-PSB) PSB‬הסיבה לשינוי בדגם היא שב‪ TB-PSB-‬עקב הפרעות סטריות האיזומרים אינם‬
‫נוצרים ואם זו אכן הסיבה לאנהומוגניות הרי שלא נראה הסטה במקרה זה‪ .‬נציין כי מבחינת ספקטרום‬
‫מצב היסוד אנו לא צופים בהצרה ספקטרלית משמעותית על אף מיעוט האיזומרים עבור ‪.TB-PSB‬‬
‫התוצאות שהתקבלו היו דומות מאוד לאלו שהתקבלו במקרה של ה‪ .NB-PSB-‬גם בתוצאות אלו המצב‬
‫‪58‬‬
‫‪59‬‬
‫המעורר אופיין בבליעה חזקה באזור ה‪ 520nm-‬ופליטה רחבה שמתחילה ב‪ ~600nm-‬ונמשכת עמוק‬
‫לאדום )‪ ,(NIR‬רדודה ובעלת מבנה דו דבשתי‪ .‬אנליזת ‪ DAS‬שבוצעה הובילה לדעיכה מולטי‪-‬‬
‫אקספוננציאלית עם קבועי קצב דומים למה שקיבלנו בעבר‪ .‬קבועי הקצב בשני אורכי גל העירור הינם‪:‬‬
‫‪( 8 ± 1) ps , ( 2.0 ± 0.4 ) ps , ( 280 ± 50 ) fs‬‬
‫וגם כאן נותר רכיב ספקטראלי ארוך חיים במונחי משך‬
‫המדידה שביצענו‪ .‬נדגיש כי גם בניסוי זה האמפליטודה של המצב המעורר בעירור ב‪ 400nm-‬הייתה‬
‫גדולה מהאמפליטודה בעירור ב‪ 480nm-‬וזאת על אף הדמיון בכמות המולקולות המעוררות בשני‬
‫המקרים‪ .‬ההבדל היחיד והעיקרי נראה בתמונה מספר ‪ 3.1.9‬המציינת את הספקטרום הטרנזיינטי‬
‫שהתקבל עבור שני הניסויים ובשני אורכי גל העירור בעיכוב זמן של ‪.300fs‬‬
‫ניכר בתוצאות שלא קיימת הסטה‬
‫תמונה מספר‬
‫‪:3.1.9‬‬
‫ספקטרום‬
‫טרנזיינטי‬
‫בעיכוב זמן של‬
‫‪ 300fs‬עבור‬
‫‪ NB-PSB‬ו‪-‬‬
‫‪ TB-PSB‬תוך‬
‫שימוש בשני‬
‫אורכי גל עירור‪.‬‬
‫בקו רציף נראה‬
‫העירור ב‪-‬‬
‫‪ 400nm‬בעוד‬
‫בקו מקווקו‬
‫עירור ב‪-‬‬
‫‪.480nm‬‬
‫משמעותית עבור ‪.TB-PSB‬‬
‫העדר ההיסט עבור ‪TB-PSB‬‬
‫מצביע על כך שהאנהומוגניות‬
‫שנצפתה‬
‫בתוצאותינו‬
‫נובעת‬
‫מקיומם של איזומרי הקשר‬
‫הכפול ‪ C15=N‬שנמנעים במקרה‬
‫של ‪ TB-PSB‬ולכן גוררים את‬
‫העדר ההסטה בניגוד למצב עבור‬
‫‪.NB-PSB‬‬
‫בניסוי זה נבדקה גם השפעת החלפת האמין על הספקטרום הויברציוני של ה‪ RPSB-‬ע"י ביצוע ניסוי שני‬
‫פולסי ‪ NOPA‬קצרים בנראה עבור שתי מולקולות ה‪ .RPSB-‬כמו כן‪ ,‬התדרים שהתקבלו בניסוי ה‪IVS-‬‬
‫הושוו גם לתדרים שהתקבלו בניסוי ‪.FT-IR‬‬
‫תמונה מספר ‪:3.3.14‬‬
‫)‪ (A‬ספקטרום טרנזיינטי‬
‫באורך גל חוקר של‬
‫‪ 600nm‬עבור ‪TB-RPSB‬‬
‫בתמונה הקטנה‪ :‬השארית‬
‫לאחר החסרת הקינטיקה‪.‬‬
‫)‪ (B‬תוצאת הטרנספורם‬
‫פורייה שבוצע על השארית‬
‫של ‪.TB-RPSB‬‬
‫בתמונה הקטנה‪ :‬השוואת‬
‫אזור טביעת האצבע בו‬
‫נחשפו השינויים‬
‫המשמעותיים ביותר בין‬
‫שתי מולקולות ה‪.RPSB-‬‬
‫‪59‬‬
‫‪60‬‬
‫תמונה מספר ‪ 3.3.14‬מציגה את הספקטרום‬
‫הויברציוני האימפולסיבי במרחב הזמן )‪(IVS‬‬
‫באורך גל חוקר של ‪ 600nm‬ותמונה מספר‬
‫‪ 3.3.15‬מציגה את התדרים שהתקבלו‬
‫מספקטרוסקופית ‪ FT-IR‬לשם השוואה‪.‬‬
‫המודים העיקריים הם הקשר היחיד ‪C-C‬‬
‫‪~1200cm-1‬‬
‫והקשר‬
‫הכפול‬
‫‪C=C‬‬
‫‪ .~1550cm-1‬רוב השינויים נצפו באזור‬
‫טביעת האצבע )‪ .(1150-1250cm-1‬תדרים‬
‫אלו מיוחסים למצב היסוד‪ .‬בשני הניסויים‬
‫נצפת הסטה לכחול והרחבה באזור טביעת‬
‫האצבע‪ .‬התדר שהוסח מיוחס למתיחת הקשר‬
‫תמונה מספר ‪:3.3.15‬‬
‫ספקטרום ‪ FT-IR‬עבור ‪) TB-RPSB‬בקו רציף( ועבור ‪NB-RPSB‬‬
‫)בקו מקווקו(‪ .‬בתמונה הקטנה‪ :‬הגדלה של אזור טביעת האצבע בו‬
‫נצפו שינויים גדולים‪.‬‬
‫‪ C14-C15‬בעוד יתר קשרי הפחמן היחידים במולקולה אינם מושפעים‪ .‬בניסוי ה‪ FT-IR-‬נראה גם היסט‬
‫עדין בקשרים הכפולים ‪C=C‬ו‪ .C=N-‬נראה כי כל השינויים הנצפים נובעים מהשינוי בשייר שחובר‬
‫לקצה השרשרת )לקשר ה‪ N-H-‬במולקולה זו(‪ .‬לאור ייחוס התדרים המשתנים נראה כי שייר שונה זה‬
‫משפיע יותר על תדרי הקשרים הסמוכים אליו‪.‬‬
‫ממצא זה בעל חשיבות שכן הוא הופך את ה‪ TB-PSB-‬כמועמד טוב יותר לשיקוף המתרחש בחלבון שם‬
‫דיווחו על העדר אנהומוגניות והשפעת אורך גל העירור‪ .‬חשפנו כאן מדד טוב יותר לאומדן השפעות‬
‫החלבון שתושווה לחלבונים הרטינליים במטרה לענות על השאלה כיצד מולקולה ה‪ RPSB-‬המשותפת‬
‫לחלבונים רטינליים רבים גורמת לתפקיד שונה בסביבת חלבון רטינלי שונה‪.‬‬
‫‪60‬‬
‫‪61‬‬
‫‪ .3.2‬חלבונים רטינליים ‪ -‬המשאבות היוניות‬
‫‪111‬‬
‫‪ .3.2.1‬הלורודופסין ‪ -‬ממצאים ניסיוניים‬
‫דעיכת חלבון ההלורודופסין דומה בדעיכתו ל‪ RPSB-‬בתמיסה אך עבורו התקבלה הסכמה לגבי מודל‬
‫רמות האנרגיה‪ .‬המודל שהוצע מערב את קיומם של שתי אוכלוסיות במצב המעורר שהאחת מובילה‬
‫לתוצר והאחרת למגיב )פיצול לשני מסלולים(‪ .‬מודל זה סיפק את ההסבר לדעיכה הבי‪-‬אקספוננציאלית‬
‫ולניצולת הקוונטית הנמוכה בהשוואה למשאבה היונית בקטריורודופסין‪ .61-58‬אנו חקרנו את חלבון ה‪-‬‬
‫‪ pHR‬בשיטת שאיבת פליטה מאולצת )‪ (SEP‬באמצעות שלושה פולסים ‪ pump-dump-probe‬בדומה‬
‫לניסוי שבוצע בעבר במעבדתנו עבור בקטריורודופסין‪ ,57‬במטרה לאשש או להפריך את המודל שהוצע‬
‫להלורודופסין‪ .‬בניסוי זה פולס ה‪ pump-‬ב‪ 580nm-‬מעלה אוכלוסיה למצב המעורר‪ ,‬אוכלוסיה זו‬
‫מתפתחת ואז בעיכוב הניתן לתזמון מגיע פולס ה‪ dump-‬ב‪ 1160nm-‬ומרוקן חלק מהאוכלוסייה הנמצאת‬
‫במצב המעורר חזרה למצב היסוד‪ .‬ה‪ probe-‬הינו פולס אור לבן רחב שמאפשר לצפות בבת אחת בתחומי‬
‫הבליעה והפליטה השייכים למצב המעורר ובתוצר האיזומר המצוי במצב היסוד‪ .‬מחקר רב ערוצי זה שונה‬
‫מהניסוי הדומה שבוצע עבור בקטריורודופסין שם נדגמו אורכי גל ספציפיים ולא התקבלה תמונה‬
‫ספקטראלית מלאה‪ .‬בתמונה מספר ‪ 3.2.1‬נראה ספקטרום הבליעה המנורמל של ‪pharaonis‬‬
‫הלורודופסין )‪ (pHR‬יחד עם פולס ה‪ (580nm) pump-‬ופולס ה‪.(1160nm) dump-‬‬
‫)‪α (pHR‬‬
‫‪Pump‬‬
‫‪Dump‬‬
‫‪1000 1200‬‬
‫‪800‬‬
‫)‪λ(nm‬‬
‫‪600‬‬
‫תמונה מספר ‪:3.2.1‬‬
‫מצד ימין‪ :‬ספקטרום בליעה מנורמל של ‪ pHR‬עם פולסי ה‪ pump-‬וה‪ dump-‬בהם השתמשנו בניסוי‪ .‬מצד שמאל‪ :‬מודל‬
‫רמות האנרגיה שהוצא של ‪ HR‬יחד עם סכמת פולסים המסבירה את רעיון ניסוי ‪ SEP‬המשלב שלושה פולסים‪.‬‬
‫עוצמת ה‪ pump-‬נבחרה מחד להיות נמוכה מספיק על מנת להימנע מאפקטי עוצמה ומאידך להיות‬
‫עוצמתית דיה כדי שנוכל לראות בבירור )מעל גבול הרעש( את התוצר והשינויים בו לאחר הריקון שכן‬
‫עוצמת התוצר חלשה יחסית‪ .‬הסיבה לבחירה בחקר ה‪) pHR -‬ולא ה‪ sHR -‬כמו רוב החוקרים( היא הן‬
‫הניצולת הקוונטית הגבוהה בהשוואה ל‪ sHR-‬והן זמינותו‪.‬‬
‫התוצאות שהתקבלו מוצגות בתמונה מספר ‪ 3.2.2‬כמפת מתאר צבעונית שהתקבלה מניסוי ללא פולס ה‪-‬‬
‫‪ .dump‬תוצאות אלו ישמשו אותנו כרפרנס לניסוי עם ה‪ dump-‬כלומר לניסוי בו נרוקן אוכלוסיה בעיכוב‬
‫ספציפי‪ .‬בנוסף‪ ,‬עד כה לא סופק ספקטרום‬
‫טרנזיינטי רב ערוצי עבור ‪.pHR‬‬
‫‪61‬‬
‫‪62‬‬
‫תמונה מספר ‪:3.2.2‬‬
‫מפת מתאר של השינוי בספקטרום הטרנזיינטי עבור עיכובי ‪ probe‬שונים ‪ -0.2ps≤ t ≤15ps‬לאחר תיקון‬
‫בזמן עקב דיספרסיה של ה‪ ,probe-‬יש לשים לב לקפיצה בסקלה לאחר ‪.1ps‬‬
‫בתמונה ‪ 3.2.2‬ניתן להבחין במספר מאפיינים עיקריים‪:‬‬
‫‪ .1‬אזור בליעת המצב המעורר ‪ - S1‬הצד הכחול של הספקטרום הטרנזיינטי מייצג את בליעת המצב‬
‫המעורר שמרוכזת סביב ה‪ .475nm-‬אנו רואים כי בליעה זו בעלת מבנה‪ ,‬מתחילה בצורה רחבה ובזמנים‬
‫קצרים נצפה היסט מהיר לכחול והצרה של הבליעה‪.‬‬
‫‪ .2‬אזור ה‪ - bleach-‬סביב ה‪ 580nm-‬ובהתאמה עם ספקטרום הבליעה של ה‪ pHR -‬מופיע ‪bleach‬‬
‫הנובע מהחוסר שנוצר במצב היסוד ‪ S0‬כתוצאה מהעירור )בצבע אדום(‪.‬‬
‫‪ .3‬אזור פליטת המצב המעורר – החל מ‪ 650nm-‬ועד ל‪) NIR-‬בצבע אדום בהיר יותר מה‪ bleach-‬עקב‬
‫הבדלי עוצמה( אנו צופים בפליטה רדודה ובעלת מבנה דו דבשתי בדומה למה שדווח בעבר עבור‬
‫‪ salinarum‬הלורודופסין )‪ (sHR‬ועבור ‪ RPSB‬בתמיסה )בפרק הקודם(‪.‬‬
‫‪ .4‬תוצר הביניים ‪ – K640nm‬התוצר מצוי באזור ה‪ 680nm-‬ונראה בזמנים מאוחרים יותר )בירוק בהיר‬
‫עקב עוצמת בליעה חלשה יחסית(‪.‬‬
‫נציין כי ה‪ bleach-‬מצוי בין הבליעה לפליטה ולכן הוא חופף הן על תחום בליעת המצב המעורר )בצד‬
‫האדום של ה‪ (bleach -‬והן על הפליטה המאולצת הדו דבשתית‪ .‬מאפיינים אלו דועכים תוך ‪~20ps‬‬
‫ומותירים בליעה חלשה שיוחסה לאיזומר )‪ -13-cis‬תוצר הביניים ‪ (K640nm‬הבולע באזור ה‪640nm-‬‬
‫כלומר בליעת התוצר מוסטת לאדום ביחס לבליעת המגיב במצב היסוד המצוי בקונפיגורצית ‪all-trans‬‬
‫ומסומן ‪.HR580nm‬‬
‫‪62‬‬
‫‪63‬‬
‫לקבלת קינטיקת התהליך ביצענו למטריצת נתוני הספקטרום הטרנזיינטי התאמה קינטית למנגנון מקביל‬
‫שכלל קונבולוציה עם גאוסיין )פונקצית תגובה של ‪ (FWHM 70fs‬וזאת לאחר ביצוע ‪ .SVD‬אנליזה זו‬
‫הובילה לסדרת ספקטרומים הנראים בתמונה ‪ 3.2.3‬ומיוחסים לדעיכות המולטי‪-‬אקספוננציאליות‬
‫)‪ ,(DAS‬כל ספקטרום מתייחס לקבוע זמן דעיכה אחר‪ .‬ההתאמה לנתונים הניסיוניים דרשה חמישה קבועי‬
‫דעיכה‪) 0 :‬פונקצית דלתא(‪ (5.0 ± 0.5) ps , (2.0 ± 0.2) ps , (0.22 ± 0.02) ps ,‬וזמן אינסופי‬
‫במונחי משך המדידה המצביע על קיומו של תוצר ארוך חיים‪ .‬הגרף הורוד המייצג את ספקטרום ההפרש‬
‫ושייך ל‪"-‬זמן האינסופי" מייצג את האיזומר )התוצר "‪ ("K‬באזור ה‪ 640nm-‬ואת ה‪ bleach-‬באזור ה‪-‬‬
‫‪ .580nm‬אם נתעלם מזמן האפס )הקו השחור( ומהשייר האינסופי )הקו הורוד( ניתן לראות שבקצוות של‬
‫יתר ספקטרומי ה‪ DAS-‬ישנו דמיון )דמיון בבליעה ובפליטה של המצב המעורר( בעוד במרכז ‪,‬באזורי‬
‫התוצר והמגיב לא נראה דמיון‪.‬‬
‫‪0.0 ps‬‬
‫‪0.22 ± 0.02 ps‬‬
‫‪2.0 ± 0.2 ps‬‬
‫‪5.0 ± 0.5 ps‬‬
‫‪Inf‬‬
‫‪80‬‬
‫‪40‬‬
‫‪∆mOD‬‬
‫‪0‬‬
‫‪-40‬‬
‫‪800‬‬
‫‪700‬‬
‫‪600‬‬
‫)‪λ (nm‬‬
‫‪500‬‬
‫תמונה מספר ‪: 3.2.3‬‬
‫ספקטראות המיוחסים לדעיכות )‪ (DAS‬שנגזרו מאנליזה כללית של הנתונים‬
‫הניסיוניים והתאמה לדעיכה מולטי‪-‬אקספוננציאלית ‪ ,‬קבועי הדעיכה שהתקבלו‬
‫מצויינים‪.‬‬
‫הסתכלות מעמיקה באזור הפליטה המאולצת של המצב המעורר מראה מודולציות בתדר נמוך‪ .‬אנו לקחנו‬
‫את הנתונים באורכי גל ‪ probe‬מסוימים‪ ,‬בהם המודולציות נצפו באופן מובהק‪ ,‬החסרנו מהם את ההתאמה‬
‫הקינטית כך שנותרנו עם השארית‪ .‬לשארית זו ביצענו ניקוי רעש של התדרים הגבוהים והתוצאה מוצגת‬
‫בתמונה מספר ‪ .3.2.4‬אנליזת פורייה למודולציות אלו הובילה לקבלת תדר של ‪ .~90cm-1‬עוד ניתן‬
‫לראות כי המודולציות הופכות פאזה כאשר עוברים מאורך גל ‪ probe‬של ‪ 730nm‬לאורך גל ‪ probe‬של‬
‫‪.810nm‬‬
‫‪63‬‬
‫‪64‬‬
‫תמונה מספר ‪:3.2.4‬‬
‫בנקודות‪ -‬שאריות‬
‫אוסילטוריות‬
‫שהתקבלו לאחר‬
‫החסרת ההתאמה‬
‫הקינטית לנתונים‬
‫בשני אורכי גל ‪probe‬‬
‫שונים משני צדי תחום‬
‫פליטת המצב המעורר‪.‬‬
‫בשחור‪ -‬התאמה לאחר‬
‫ביצוע סינון לרעש‪.‬‬
‫)‪Time (ps‬‬
‫‪1.5‬‬
‫‪0.9‬‬
‫‪1.2‬‬
‫‪0.6‬‬
‫‪0.3‬‬
‫‪1‬‬
‫‪728 nm‬‬
‫‪0‬‬
‫‪-1‬‬
‫‪-2‬‬
‫‪3.0‬‬
‫‪810 nm‬‬
‫‪∆mOD‬‬
‫‪Filtered residual‬‬
‫‪The residual‬‬
‫‪1.5‬‬
‫‪0.0‬‬
‫‪-1.5‬‬
‫‪1.5‬‬
‫‪0.9‬‬
‫‪1.2‬‬
‫‪0.6‬‬
‫‪0.3‬‬
‫)‪Time (ps‬‬
‫בתמונה מספר ‪ 3.2.2‬נראה כי התוצר באזור ה‪ 650nm-‬נבנה בטרם הושלמה דעיכת המצב המעורר )צבע‬
‫ירוק בהיר נראה לאחר כ‪ (1ps-‬מכאן ייתכן כי טענת מודל הרמות כי הקבוע המהיר )‪ (~2ps‬שייך‬
‫למסלול המוביל לתוצר נכונה‪ .‬על מנת לבדוק זאת ביצענו ‪(SEP) Stimulated Emission Pumping‬‬
‫בזמני עיכוב שונים‪ .‬תפקידו של פולס ה‪ dump-‬היה לבחון כיצד ריקון בעיכוב מסוים משפיע על מעגל‬
‫האור של ההלורודופסין‪ ,‬כלומר כיצד משפיע ריקון הפליטה ב‪ 1160nm-‬על התוצר ‪ K‬כתלות בזמן בו‬
‫הוא מבוצע‪ .‬אם המודל שהוצע נכון ורכיב הדעיכה המהיר הוא הגורם לתוצר )המסלול הפעיל( הרי‬
‫‪600‬‬
‫)‪W ave length (nm‬‬
‫‪∆mOD‬‬
‫‪5‬‬
‫‪0‬‬
‫‪-5‬‬
‫‪No dump‬‬
‫‪Dump 0.75 ps‬‬
‫‪a.u.‬‬
‫תמונה מספר ‪:3.2.5‬‬
‫הכמות שרוקנה בתוצר‬
‫‪ K‬יחד עם שגיאה‬
‫כפונקציה של עיכוב‬
‫ה‪ dump-‬על גבי‬
‫המאולצת‬
‫הפליטה‬
‫המייצגת את הריכוז‬
‫המיידי של המצב‬
‫המעורר באותה סקלת‬
‫זמן‪.‬‬
‫הקטנה‪-‬‬
‫בתמונה‬
‫השינוי הספקטראלי ב‪-‬‬
‫‪ 30ps‬שמראה את‬
‫השפעת הריקון ב‪-‬‬
‫‪ 0.75ps‬על יצירת‬
‫התוצר‪.‬‬
‫‪700‬‬
‫‪500‬‬
‫‪S1 decay @ 830 nm‬‬
‫‪"K" depletion‬‬
‫‪8‬‬
‫‪12‬‬
‫)‪Time (ps‬‬
‫‪64‬‬
‫‪4‬‬
‫‪0‬‬
‫‪65‬‬
‫שריקון האוכלוסייה בזמנים הקצרים מרכיב דעיכה מהיר זה‪ ,‬יגרור יצירת פחות תוצר באופן התואם את‬
‫כמות האוכלוסייה שרוקנה‪ ,‬בעוד ריקון בזמנים ארוכים יותר לא ישפיע כלל על כמות התוצר ‪ K‬שהרי‬
‫יצירתו הושלמה‪ .‬נציין כי את בליעת התוצר ‪ K‬בדקנו ב‪ 30ps-‬לאחר שמחד הושלמה דעיכת המצב‬
‫המעורר ומאידך נוצר תוצר שנשאר קבוע )התוצר הינו ארוך חיים ביחס למשך המדידה ‪.(~100ps -‬‬
‫התוצאות שהתקבלו נראות בתמונה מספר ‪ .3.2.5‬הריקון הראשון שבוצע הינו בזמן גדול מ‪ 0.5ps -‬וזאת‬
‫הן על מנת להימנע מריקון אוכלוסיית המצב המעורר טרם היווצרותה והן כדי לרוקן לאחר התהליך‬
‫המהיר של כ‪ ~200fs -‬שייחוסו טרם הובהר‪ .‬בכל ריקון דאגנו כי מחד עוצמת פולס ה‪ dump-‬לא תהיה‬
‫גדולה מדי ותגרום לריקון אוכלוסייה משמעותית )לדג' ריקון האוכלוסייה כולה לא היה מאפשר את‬
‫המשך הניסוי והסקת המסקנות( ומאידך לא חלשה מדי כך שניתן יהיה לצפות בהשפעה ברורה של‬
‫הריקון‪ .‬בתמונה הקטנה ניתן לראות את ספקטרום התוצר ‪ K‬בזמן ‪ probe‬של ‪ 30ps‬בשני מצבים‪ :‬האחד‬
‫ללא פולס ‪) dump‬בקו רציף( והאחר לאחר ריקון ב‪ .0.75ps-‬ניכר כי ישנו שינוי ספקטראלי ופולס ה‪-‬‬
‫‪ dump‬משפיע על כמות התוצר ‪ K‬בזמן ריקון זה אך יש לבדוק את השפעת פולס ה‪ pump-‬גם עבור‬
‫ריקון בזמנים ארוכים יותר‪ .‬בתמונה ‪ 3.2.5‬ניתן לראות את דעיכת הפליטה המאולצת באורך גל ‪probe‬‬
‫של ‪) 830nm‬אזור פליטת המצב המעורר( יחד עם ההפחתה החלקית בספקטרום התוצר ‪) K‬בריבועים‬
‫כולל שגיאה( שנמדד בכל שמונת העיכובים שבוצעו במהלך זמן החיים הפלורוסנטי לשם השוואה‪ .‬נציין‬
‫כי ההתייחסות היחסית הכרחית שכן בזמני עיכוב מאוחרים ישנה פחות אוכלוסייה במצב המעורר ויותר‬
‫אוכלוסייה בתוצר ‪ K‬שנוצר‪ .‬מהתוצאות הנראות בתמונה זו נראה שישנה התאמה בכל עיכוב זמן )בתחום‬
‫השגיאה( בין כמות הריקון בתוצר לדעיכת הפליטה המאולצת‪.‬‬
‫השתמשנו בפולס ה‪ dump-‬למטרה נוספת‪ .‬בדומה לניסוי שבוצע בחלבון ה‪ ,57BR-‬נרצה לראות כיצד‬
‫משפיע הריקון על אוכלוסיית המצב המעורר ומכאן להסיק על אופי המצב המעורר‪ .‬דעיכת המצב המעורר‬
‫יכולה להתאים למודל דינמי או למודל קינטי )תרמי( והקביעה נעשת ספקטרוסקופית‪ .‬תמונה מספר ‪3.2.6‬‬
‫מסכמת את תוצאות השפעתו של פולס ה‪ dump-‬הן על בליעת המצב המעורר )מיצוע טווח אורכי גל‬
‫החוקר באזור ‪ (470nm-480nm‬והן על פליטת המצב המעורר )מיצוע טווח אורכי גל החוקר באזור‬
‫‪ (820nm-830nm‬בזמנים שונים יחד עם תוצאות הניסוי בהעדר פולס ה‪) dump-‬הרפרנס ‪ -‬בריבועים‬
‫שחורים(‪ .‬ניכר כי אנו צופים בבירור בריקון של המצב המעורר שכן האוכלוסייה יורדת באופן פתאומי‪.‬‬
‫עוד נראה כי ללא תלות בהשהיית הזמן של פולס ה‪ dump-‬הדעיכה הינה לאותו המקום עם אותם קבועי‬
‫קצב כשל הרפרנס‪ .‬בגרף הקטן בתמונה זו מוצג היחס בין ניסוי עם ‪ dump‬לנתונים שהתקבלו בהעדרו‬
‫בכל זמן עיכוב‬
‫)‪∆ODdump (t‬‬
‫)‪∆OD no dump (t‬‬
‫= ) ‪ . R(t‬בתמונה זו גם ניכר כי לאחר הריקון וללא קשר לזמן ההגעה‬
‫של פולס ה‪ dump-‬הדעיכה הינה לגבול אחיד‪.‬‬
‫‪65‬‬
‫‪66‬‬
‫למרות שדעיכת הבליעה והפליטה של המצב המעורר הינה לגבול אחיד ניתן לצפות במספר הבדלים בין‬
‫אזור הבליעה לפליטה‪:‬‬
‫‪.1‬התהליך המהיר ניכר בברור באזור בליעת המצב המעורר בעוד באזור הפליטה לא ניכרת דעיכה מהירה‬
‫וברורה‪ .‬הסתכלות בנתונים מראה כי הפליטה בזמן מהיר זה אינה מציגה שינוי משמעותי ב‪. ∆OD -‬‬
‫‪ .2‬אנו צופים באזור הפליטה בעודף ריקון וחזרה תוך ‪ 300fs‬לגבול האחיד בעוד שבאזור הבליעה אין‬
‫הדבר ניכר‪ .‬ניתן לראות זאת בבירור בתמונות הקטנות שם נראה באזור הפליטה תהליך החזרה המהיר‬
‫לגבול האחיד‪.‬‬
‫‪4‬‬
‫‪475nm‬‬
‫‪1.0‬‬
‫)‪R(t‬‬
‫‪0.8‬‬
‫‪180‬‬
‫‪120‬‬
‫‪0.6‬‬
‫‪4.5‬‬
‫‪3.0‬‬
‫‪1.5‬‬
‫)‪Time (ps‬‬
‫‪60‬‬
‫‪No dump‬‬
‫‪Dump at 0.75 ps‬‬
‫‪Dump at 1.2 ps‬‬
‫‪Dump at 1.8 ps‬‬
‫‪Dump at 4 ps‬‬
‫‪0‬‬
‫‪0‬‬
‫‪-20‬‬
‫)‪Time (ps‬‬
‫‪4.5‬‬
‫‪1.5‬‬
‫‪3.0‬‬
‫‪1.2‬‬
‫‪-40‬‬
‫)‪R(t‬‬
‫‪0.9‬‬
‫‪0.6‬‬
‫‪6‬‬
‫‪5‬‬
‫‪2‬‬
‫‪3‬‬
‫)‪Time (ps‬‬
‫‪4‬‬
‫‪66‬‬
‫‪-60‬‬
‫‪825nm‬‬
‫‪1‬‬
‫‪0‬‬
‫‪∆mOD‬‬
‫תמונה מספר‬
‫‪:3.2.6‬‬
‫נתוני ניסוי שלושה‬
‫פולסים בשני אורכי‬
‫גל חוקר )למעלה‪-‬‬
‫אזור בליעת המצב‬
‫למטה‪-‬‬
‫המעורר‪,‬‬
‫הפליטה(‬
‫אזור‬
‫במגוון זמני עיכוב‬
‫של פולס ה‪,dump-‬‬
‫כרפרנס נלקח גם‬
‫סקן בהעדר פולס‬
‫‪) dump‬בריבועים‬
‫שחורים(‪.‬‬
‫בתמונות הקטנות‪-‬‬
‫נראה היחס בין‬
‫הסיגנל עם ‪dump‬‬
‫לזה שבלעדיו עבור‬
‫העיכובים הנראים‬
‫בתמונה הגדולה‪.‬‬
‫‪6‬‬
‫‪5‬‬
‫)‪Time (ps‬‬
‫‪2‬‬
‫‪3‬‬
‫‪1‬‬
‫‪0‬‬
‫‪67‬‬
‫‪ .3.2.2‬הלורודופסין ‪ -‬דיון‬
‫ניסוי ‪ SEP‬בוצע במטרה לאושש או להפריך את מודל רמות האנרגיה שיוחס לחלבון ההלורודופסין )ל‪-‬‬
‫‪ sHR‬ובאנלוגיה ל‪ .(pHR-‬מודל זה עירב שתי אוכלוסיות שונות במצב המעורר בו אחת מובילה לתוצר‬
‫)מסלול ריאקטיבי( והשנייה חוזרת למצב היסוד )אוכלוסיה שאינה ריאקטיבית(‪ .‬המודל שניתן הצליח‬
‫להסביר את הדעיכה הבי‪-‬אקספוננציאלית והניצולת הקוונטית הנמוכה )בהשוואה ל‪ (BR-‬הקיימים‬
‫בחלבון זה‪ .61-58‬ניסוי בשיטה זו )‪ (SEP‬הינו באנלוגיה לניסוי קודם שבוצע במעבדתנו עבור חלבון ה‪-‬‬
‫‪ BR‬השייך לאותה המשפחה‪.57‬‬
‫ספקטרום בליעת מצב היסוד‪ :‬בתמונה ‪ 3.2.1‬נראה ספקטרום מצב עמיד של ה‪ pHR-‬יחד עם פולסי ה‪-‬‬
‫‪ (580nm) pump‬וה‪ .(1160nm) dump-‬בניסוי זה העירור בוצע קרוב למרכז תחום הבליעה ולא‬
‫נבדקה השפעת אורך גל העירור על הדינאמיקה הראשונית )כפי שנעשה ל‪ PSB-‬בתמיסה(‪ .‬שכן ניסויים‬
‫קודמים ב‪ BR-‬טענו כי כל עוד לא מעוררים ממש בקצה התחום אין עדות לקיומה של אנהומוגניות‬
‫בבליעת מצב היסוד ולהשפעת אורך גל העירור על הניצולת הקוונטית והספקטרום הטרנזיינטי‪ .115‬נזכיר‬
‫כי אין הדבר כך עבור ה‪ NB-PSB-‬בתמיסה‬
‫‪105‬‬
‫ורק לאחרונה חשפנו כי ל‪ TB-PSB-‬בתמיסה‬
‫‪107‬‬
‫יש‬
‫יותר דמיון לחלבון מבחינת העדר השפעת אורך גל העירור על הדינאמיקה‪.‬‬
‫הספקטרום הטרנזיינטי‪ :‬תמונה מספר ‪ 3.2.2‬מציגה לראשונה ספקטרום טרנזיינטי רחב של ‪ pHR‬בניסוי‬
‫‪) pump-probe‬ניסוי שני פולסים ללא פולס ה‪ .(dump-‬בספקטרום טרנזיינטי זה צופים בבליעה‬
‫עוצמתית ובעלת מבנה עדין באזור ‪ ,470nm‬ב‪ bleach-‬באזור בליעת מצב היסוד )‪ (580nm‬ובפליטה‬
‫רחבה‪ ,‬רדודה ובעלת מבנה דו דבשתי‪ .‬מאפיינים ספקטראליים אלו דומים לאלו שנראו ב‪ sHR -‬הן‬
‫מבחינת מיקום וצורת הספקטרום והן באמפליטודות היחסיות של האזורים השונים‪ .61,41,39‬נזכיר כי גם‬
‫עבור ‪ PSB‬בתמיסה‪ 105‬נצפתה פליטה רדודה ובעלת המבנה שהוסברה כי נגרמת בשל חפיפה בין פליטה‬
‫לבליעה נוספת השייכת למצב המעורר וממוקמת באותו אזור )באנלוגיה ל‪.(32BR-‬‬
‫קינטיקת התהליך וקבועי הדעיכה‪ :‬אנליזת ‪ DAS‬לדעיכה המולטי‪-‬אקספוננציאלית שהתקבלה‪ ,‬הנראת‬
‫בתמונה ‪ ,3.2.3‬הובילה לקבלת קבועי הקצב הבאים‬
‫‪, (0.22 ± 0.02) ps‬‬
‫‪, (2.0 ± 0.2) ps‬‬
‫‪ (5.0 ± 0.5) ps‬וזמן אינסופי במונחים של משך המדידה‪ .‬זמני הדעיכה שהושגו כאן מניתוח ה‪DAS-‬‬
‫‪41-39,36‬‬
‫מהירים יותר ביחס לזמני הדעיכה שדווחו ל‪sHR-‬‬
‫ותואמים לתוצאותיו של ‪ Nakamura‬עבור‬
‫‪ .61pHR‬הבדל ניכר בקבוע הדעיכה המהיר )‪ ,(~200fs‬הנראה בבירור בבליעת המצב המעורר בתמונה‬
‫‪ ,3.2.6‬שכן קבוע דעיכה מהיר זה לא נצפה בתוצאותיו של ‪ Nakamura‬למרות הדמיון בדוגמאות‬
‫ורזולוציית הזמן בניסוי )כ‪ .(50fs-‬החשש כי זמן מהיר זה נובע מעוצמת ‪ pump‬גבוהה מדי נשלל שכן‬
‫בדקנו טווח רחב של עוצמות ‪ pump‬וראינו כי גם בעוצמות נמוכות התהליך המהיר ניכר‪ .‬ייתכן כי‬
‫התהליך המהיר נעדר בניסיונו של ‪ Nakamura‬עקב ההבדל במיקום ובצורת ה‪ pump-‬בין הניסויים‬
‫)‪ 610nm‬בניסיונם לעומת ‪ 580nm‬בניסיוננו(‪ .‬כמו כן‪ ,‬זמן דעיכה מהיר זה הינו מאפיין כללי‪ ,‬והוא נצפה‬
‫הן ב‪ ,30BR-‬הן ב‪ 39sHR-‬והן ב‪ PSB-‬בתמיסה‪ 26‬אם כי ייחוסו טרם נקבע‪.‬‬
‫‪67‬‬
‫‪68‬‬
‫ניכר כי הקינטיקה של ה‪ pHR-‬דומה לזו של ‪ PSB‬בתמיסה ומכאן עולה חשיבות הבנת הסיבה לדעיכה‬
‫המולטי‪-‬אקספוננציאלית שכן ייתכן ודינאמיקת ‪ S1‬דומה עבור שני המקרים‪.‬‬
‫התדר הנמוך‪ :‬בתמונה מספר ‪ 3.2.4‬נצפו באזור הפליטה מודולציות איטיות של ‪ .90cm-1‬תדר נמוך זה‬
‫יוחס למצב המעורר כיוון שהאוסילציות נראו באזור השייך למצב המעורר )לא נראו באזור המגיב או‬
‫באזור התוצר(‪ .‬מחקרים קודמים ראו מודולציות איטיות שכאלה הן ב‪BR-‬‬
‫‪75‬‬
‫שם צפו בתדר עיקרי של‬
‫‪ 160cm-1‬והן ל‪ PSB-‬בתמיסה‪ 24‬שם נצפתה תדירות של ‪ .~117cm-1‬פיקים אלו עלו בבירור על גבולות‬
‫הרעש ויוחסו לתנועה בשלד הרטינל‪ .‬מחקרים אלו ייחסו את העלייה בתדר בנוכחות החלבון )‪ (BR‬לעליה‬
‫בקשיחות של מבנה הרטינל בסביבת החלבון‪ .‬אולם התוצאה שהתקבלה עבור חלבון ‪ pHR‬הייתה נמוכה‬
‫כמעט בפי ‪ 2‬מזה של ה‪) BR-‬למרות שבשני המקרים מדובר בסביבת חלבון( ואף נמוכה מהתדר שהתקבל‬
‫ל‪ PSB-‬בתמיסה‪ .‬בסימולציה שבוצעה עבור דינאמיקת ה‪ HR-‬נרמז כי במצב ‪ K‬הפוטנציאל השולט‬
‫בסיבוב הקשר ‪ C13=C14‬שטוח יותר ממצב היסוד‪ .117‬באנלוגיה‪ ,‬ניתן להסיק שב‪ pHR-‬משטח פוטנציאל‬
‫הסיבובי של המצב המעורר שטוח יותר )כלומר בעל עקמומיות קטנה יותר וקבוע קפיץ "מרוכך" יותר(‬
‫אפילו בהשוואה ל‪ PSB-‬בתמיסה‪ .‬אך האנלוגיה למתרחש במצב המעורר אינה וודאית וקשה במסגרת‬
‫מחקר זה לספק תשובה מוחלטת למבנה משטח הפוטנציאל של המצב המעורר‪.‬‬
‫עוד ניתן לראות היפוך פאזה בין שני אורכי גל ה‪ probe-‬שנבחרו‪ ,‬היפוך זה מעיד כי אנו בוחנים משני‬
‫צדי תחום המצב המעורר‪ ,‬מכאן שמרכז התחום הוא באזור ה‪ 770nm-‬היכן שנראה המבנה בפליטה‪ .‬אם‬
‫מבנה זה אכן מיוחס לחפיפה בין פליטה לבליעה של המצב המעורר הרי שלמרות שברור שמודולציות אלו‬
‫שייכות למצב המעורר‪ ,‬קשה לייחס מודולציות אלו לפליטת או בליעת המצב המעורר‪ .‬העובדה כי מחקרי‬
‫פלורסנציה שבוצעו על ה‪ PSB-‬בתמיסה‬
‫‪90‬‬
‫צפו במודולציות איטיות שכאלה תורמת לייחוס אוסילציות‬
‫אלו לפליטת המצב המעורר אם כי לא ברור האם האנלוגיה ל‪ pHR-‬נכונה‪.‬‬
‫מודל רמות האנרגיה‪ :‬אתגר עיקרי היה לבחון את מודל רמות האנרגיה שהוצע ל‪) pHR-‬באנלוגיה ל‪-‬‬
‫‪ .(sHR‬לצורך כך השתמשנו בפולס נוסף ‪ dump‬המשמש לריקון הפליטה המאולצת מהמצב המעורר‬
‫חזרה למצב היסוד בעיכובי זמן שונים כאשר אנו בודקים את כמות התוצר )ניסוי זה דורש רעש נמוך‬
‫ודיוק רב שכן ההבדלים יכולים להיות עדינים(‪ .‬תמונה ‪ 3.2.6‬מציגה את השפעת פולס ה‪ dump-‬על אזור‬
‫הבליעה והפליטה של המצב המעורר בזמני עיכוב שונים נזכיר כי הריקון הראשון בוצע ב‪) 750fs-‬לאחר‬
‫התהליך המהיר והשלמת בניית המצב המעורר(‪ ,‬תמונה זו זהה לתמונת הפליטה ב‪) 57BR-‬תמונה מספר‬
‫‪ 1.5‬בסקירה הספרותית(‪ .‬על מנת לפענח את המידע ביצענו השוואה לנתוני ניסוי שני פולסים )לתוצאות‬
‫הנראות בתמונה ‪.(3.2.2‬‬
‫נראה כי לאחר הריקון וללא תלות בזמן בו הוא מגיע‪ ,‬הדעיכה הינה לגבול אחיד‪ .‬תמונה זו מצביעה על‬
‫מודל קינטי כך שחתך הפעולה במצב המעורר נשמר קבוע במשך זמן החיים של המצב המעורר ודומה‬
‫למתרחש במשאבת הפרוטונים ‪ .57BR‬בניגוד ל‪ BR-‬בו נדגם רק אזור הפליטה )אורך גל ספציפי של‬
‫‪ (900nm‬כאן ספקטרום ה‪ probe-‬רחב והאיסוף רב ערוצי כך שניתן לצפות בהשפעת ה‪ dump-‬בטווח‬
‫רחב של אורכי גל גם באזור בליעת המצב המעורר )בתמונה ‪ 3.2.6‬נצפים אורכי גל מרכזים בפליטה‬
‫ובבליעה(‪ .‬בתמונות הפנימיות )בתמונה ‪ (3.2.6‬בהם נראה היחס בין עירור עם ‪ dump‬לעירור בהעדרו‪,‬‬
‫‪68‬‬
‫‪69‬‬
‫רואים באזור הפליטה עודף ריקון שדועך לגבול אחיד תוך כ‪ ,300fs-‬ממצא זה נראה גם ב‪ BR-‬ולא נראה‬
‫בבליעת המצב המעורר‪ .‬ניתן לייחס ממצא זה לרגיעה של חבילות גלים עקב הריקון או ההוספה אך היה‬
‫קושי לסווג זאת למצב ‪ S0‬או למצב ‪ .S1‬מתוצאותינו נראה כי עודף הריקון נובע ממצב היסוד שכן אם זה‬
‫היה מיוחס לריקון המצב המעורר )רמה ‪ (S1‬היינו צופים בהשפעה על שני מצבי המעבר והדבר היה ניכר‬
‫)בסימן הפוך( גם באזור הבליעה של המצב המעורר‪ ,‬אך העדרו באזור הבליעה מצביע על כך שהדבר‬
‫תלוי במצב היסוד אליו מרוקנת האוכלוסייה ואשר בו מעורבת רק הפליטה‪ .‬ממצא זה עשוי לסייע במיפוי‬
‫המצבים האלקטרונים המעורבים בחלבונים הרטינליים‪.74‬‬
‫עוד ניכר בתמונות הקטנות שערך היחס המתקבל בכל עיכוב זמן הינו זהה‪ ,‬דבר זה מחזק את הטענה כי‬
‫חתך הפעולה של המצב המעורר זהה‪ .‬נציין כי טענה זו לבדה כבר מעלה ספק בנוגע למודל שהוצע שכן‬
‫ההסתברות שמדובר בשני מצבים מעוררים שונים )שני המסלולים( בעלי אותו חתך פעולה נמוכה‪ ,‬ונראה‬
‫כי מדובר במצב מעורר יחיד בדיוק כמו ב‪ ,BR-‬אם כי אנו לא נסתפק בכך ונביא הוכחה ישירה‪.‬‬
‫על מנת לספק הוכחה ישירה לקיומו של מצב מעורר יחיד‪ ,‬בדקנו את כמות התוצר ‪ K‬בזמן ארוך )‪(30ps‬‬
‫לאחר ביצוע כל ריקון וללא תלות בזמן בו בוצע הריקון‪ .‬חשוב היה לדאוג ליציבות המערכת ולמצע רבות‬
‫כיוון שההבדלים בספקטרום עדינים וכמות ה‪ ∆OD -‬בתוצר אפילו בהעדר ‪ dump‬נמוכה )במקסימום‬
‫‪ 7 mOD‬כמוראה בתמונה מספר ‪) 3.2.5‬בתמונה הפנימית(‪ ,‬כאשר השגיאה הינה מסדר גודל של‬
‫‪ .( 0.3mOD‬בתמונה הפנימית הזו נראה בבירור השינוי בספקטרום התוצר ‪ K‬עבור עיכוב ספציפי של‬
‫‪ 0.75ps‬וההשפעה ניכרה בכל שמונת זמני הריקון השונים שבוצעו )לא נראה כאן(‪ .‬לשם דיוק ביצענו‬
‫אינטגרל על אזור בליעת התוצר הן בהעדר ‪ dump‬והן לאחר כל ריקון‪ ,‬הפער בין הערכים משקף את‬
‫כמות התוצר שרוקן ואותו השוואנו לכמות האוכלוסייה שרוקנה מהמצב המעורר )הקפיצה במצב המעורר‬
‫הנראת בתמונה מספר ‪ .(3.2.6‬כמו כן‪ ,‬בתמונה מספר ‪ 3.2.5‬ניתן לראות את ההערכה שביצענו לכמות‬
‫הפליטה מתוך כמות התוצר ‪ K‬שרוקנו )בליווי שגיאה מוערכת( בכל זמן ריקון של ה‪ dump-‬על גבי‬
‫הפליטה המאולצת המייצגת את הריכוז הנמדד של המצב המעורר באותו הזמן‪ .‬ניתן לראות שהתקבלה‬
‫התאמה בין כמות התוצר שהתרוקן לכמות המצב המעורר שרוקן בפועל‪ ,‬עבור כל זמן ריקון‪.‬‬
‫תוצאות אלו מדגימות מחד שהמצב המעורר הוא חלק ממעגל האור שכן הריקון בכל הזמנים )הקצרים‬
‫והארוכים( השפיע על התוצר ‪ K‬ומאידך כי מדובר במצב מעורר יחיד כך שהמודל שהוצע עד כה‪,‬‬
‫המפריד את האוכלוסייה לשני זמנים שהקצר מוביל לתוצר והארוך חזרה למגיב‪ ,‬אינו נכון‪ .‬למעשה‪,‬‬
‫בדומה למתרחש ב‪ ,57BR-‬הדעיכה הבי‪-‬אקספוננציאלית שנצפתה ב‪ pHR-‬אינה נובעת מפיצול לשני‬
‫מצבים מעוררים‪ .‬במחקר ה‪BR-‬‬
‫‪57‬‬
‫הוצע גם שקיים מחסום במצב המעורר הממוקם במעבר מהמצב‬
‫הפלורוסנטי לערוץ הפעיל המוביל לתוצר האיזומר וייתכן שתסריט דומה מתקיים ב‪ .pHR-‬למעשה‬
‫ההשערה שניתנה לדעיכה המולטי‪-‬אקספוננציאלית אינה מתאימה ב‪ pHR-‬אך המנגנון לדעיכה המולטי‬
‫אקספוננציאלית טרם נחשף ועד כה לא ברור האם דעיכה זו נובעת מטופולוגיה מורכבת על המשטח‬
‫המעורר או מרגיעה תרמית )פירוט השערות אלו מובא בהסבר למנגנון המולטי אקספוננציאלי של ‪RPSB‬‬
‫בתמיסה(‪.20‬‬
‫‪69‬‬
‫‪70‬‬
‫נציין כי מודל רמות האנרגיה שהוצע ל‪ 61pHR-‬התבסס על העובדה כי כבר בזמנים מוקדמים )‪ (1ps‬נבנה‬
‫ספקטרום באזור התוצר‪ .‬ממצא זה שהוביל את החוקרים לתמוך במודל גרר אותנו להתבוננות מעמיקה‬
‫בזמנים המוקדמים שבתוצאותינו‪ .‬הספקטרום הטרנזיינטי בזמנים המוקדמים נראה בתמונה מספר ‪.3.2.7‬‬
‫)‪λ (nm‬‬
‫‪680‬‬
‫‪640‬‬
‫‪660‬‬
‫‪620‬‬
‫‪0.2‬‬
‫‪0.00‬‬
‫‪640nm‬‬
‫‪fit‬‬
‫‪-0.01‬‬
‫‪2.0‬‬
‫‪1.0‬‬
‫‪∆OD‬‬
‫‪0.0067 ± 0.0005‬‬
‫‪-0.0248 ± 0.0005‬‬
‫‪68‬‬
‫‪±3‬‬
‫‪-0.0287 ± 0.0003‬‬
‫‪1260 ± 52‬‬
‫‪1.5‬‬
‫‪y0‬‬
‫‪A1‬‬
‫‪t1‬‬
‫‪A2‬‬
‫‪t2‬‬
‫‪∆OD‬‬
‫‪Chi^2/DoF‬‬
‫‪= 1E-7‬‬
‫‪R^2‬‬
‫‪= 0.998‬‬
‫‪-0.02‬‬
‫‪0.1‬‬
‫‪-0.03‬‬
‫‪-0.04‬‬
‫‪0.5‬‬
‫‪0.0‬‬
‫‪0.0‬‬
‫‪20fs‬‬
‫‪50fs‬‬
‫‪100fs‬‬
‫‪150fs‬‬
‫)‪Time (ps‬‬
‫תמונה מספר ‪ :3.2.7‬משמאל‪ -‬ספקטרום טרנזיינטי‬
‫של הזמנים המוקדמים )‪ (≤150fs‬לאחר תיקון זמן‬
‫עקב דיספרסיה של ה‪ .probe-‬בתמונה הפנימית‪-‬‬
‫הגדלה של הטווח ‪.620-700nm‬‬
‫מימין‪ -‬אורך גל ‪ probe‬מסוים )‪ (640nm‬בזמנים‬
‫המוקדמים ביחד עם ההתאמה‪.‬‬
‫‪800‬‬
‫‪700‬‬
‫‪600‬‬
‫‪-0.1‬‬
‫‪500‬‬
‫)‪λ (nm‬‬
‫בתמונה זו ניתן לראות כי בזמן שהבליעה )‪ (~475nm‬והפליטה )‪ (~775nm‬של המצב המעורר נבנות‬
‫נבנה במקביל גם ספקטרום באזור התוצר )‪ - ~640nm‬ראה חצים אפורים(‪.‬‬
‫כמו כן‪ ,‬התמקדות באורך גל ‪ probe‬מסוים באזור התוצר )נראה בצידה הימני של התמונה ‪(640nm‬‬
‫מראה כי כבר בזמנים מוקדמים מאוד ניבנת בליעה מתוך הפליטה בעוד שבזמנים הארוכים יותר ) עד ל‪-‬‬
‫‪ - 100ps‬לא נראה כאן( הספקטרום נותר בלא שינוי משמעותי‪.‬‬
‫ממצאים אלו נראים כתומכים במודל שהוצא ל‪ sHR -‬ושניתן באנלוגיה ל‪ pHR-‬ואינם עומדים בקנה אחד‬
‫עם תוצאותינו‪.‬‬
‫לאור זאת נרצה לעמוד על מקור הבנייה המוקדמת הניצפת באזור התוצר במקביל לבניית המצב המעורר‪,‬‬
‫ליישב את הסתירה ולהסיק לגבי מנגנון הדעיכה המולטי‪-‬אקספוננציאלית ומודל רמות האנרגיה בחלבון‬
‫ההלורודופסין ובמערכות דומות נוספות‪.‬‬
‫‪70‬‬
‫‪71‬‬
‫‪ .3.2.3‬בקטריורודופסין והאנלוג הנעול שלו ‪ -‬ממצאים ניסיוניים‬
‫במטרה להבין את הבנייה המוקדמת באזור התוצר בחלבון ההלורודופסין ולהסביר את מקור המבנה‬
‫הנצפה בפליטה הן בחלבון זה והן ב‪ RPSB-‬בתמיסה החלטנו לבצע ניסוי על חלבון ה‪ BR-‬ועל האנלוג‬
‫הנעול שלו‪ ,‬באנלוג הקשור לאותו חלבון )‪ (BR‬חוברה לכרומופור טבעת מחומשת קשיחה במצב ‪trans‬‬
‫החוסמת את סיבוב הקשר ‪) C13=C14‬ראה תמונה מספר ‪.(3.2.8‬‬
‫הרעיון מאחורי מחקר זה היא היכולת להפריד בין הספקטרום הטרנזיינטי השייך לתוצר לבין הספקטרום‬
‫הטרנזיינטי השייך למצב המעורר‪ .‬שכן באנלוג הנעול אנו נצפה רק במצב המעורר )הנעילה בטבעת‬
‫חוסמת את יצירת התוצר( בעוד חלבון הבקטריורודופסין יכיל הן את ספקטרום המצב המעורר והן את‬
‫ספקטרום התוצר‪.‬‬
‫טבעי היה לבחור באנלוג נעול של ‪ HR‬אך בחרנו לבצע את הניסוי על ה‪ BR-‬בשל יציבותו של האנלוג‬
‫הנעול של ה‪) BR-‬האנלוג של ‪ HR‬אינו יציב ולכן טרם נחקר(‪ .‬כמו כן‪ ,‬ניסוי בתנאים דומים של חלבון‬
‫הבקטריורודופסין יאפשר להשוות את הדינאמיקה הראשונית בין שני חלבונים רטינליים אלו )‪ HR‬ו‪-‬‬
‫‪ (BR‬השייכים לאותה המשפחה‪.‬‬
‫‪wt BR‬‬
‫‪locked BR‬‬
‫‪700‬‬
‫‪650‬‬
‫‪600‬‬
‫)‪λ (nm‬‬
‫‪550‬‬
‫‪normalized spectra‬‬
‫תמונה מספר ‪:3.2.8‬‬
‫למעלה‪ -‬מצד שמאל‪ :‬מולקולת ה‪RPSB-‬‬
‫בחלבון הבקטריורודופסין הטבעי ‪ ,‬ומצד ימין‪:‬‬
‫מולקולה זו באנלוג הנעול שלו‪.‬‬
‫למטה‪ -‬ספקטרום בליעה מנורמל של‬
‫בקטריורודופסין )בסגול( ושל האנלוג‬
‫)באדום( יחד עם פולסי ה‪ pump-‬בהם‬
‫השתמשנו בניסוי )עבדנו עם שני אורכי גל‬
‫אלו עבור כל חלבון(‪.‬‬
‫‪500‬‬
‫‪450‬‬
‫‪br‬‬
‫‪locked br‬‬
‫‪pump 580nm‬‬
‫‪pump 610nm‬‬
‫‪700‬‬
‫‪650‬‬
‫‪600‬‬
‫‪550‬‬
‫)‪λ (nm‬‬
‫‪500‬‬
‫‪450‬‬
‫אנו חקרנו את שני חלבוני ה‪) BR-‬הטבעי והנעול( בתנאים דומים תוך שימוש בשני פולסי ‪ pump‬שונים‬
‫הקרובים ואינם חופפים עבור כל חלבון במטרה להתמודד עם איבוד המידע באזור העירור הנגרם כתוצאה‬
‫מפיזור ה‪) pump-‬נציין כי בחלבונים הפיזורים גדולים יותר( ובהסתמך על מחקרים קודמים שטענו כי‬
‫שינוי עדין כזה במיקום העירור אינו משפיע על הדינאמיקה‪ .115‬בתמונה מספר ‪ 3.2.8‬ניתן לראות את‬
‫ספקטרומי הבליעה של חלבונים אלו ביחד עם פולסי ה‪ pump-‬השונים‪ ,‬פולס ה‪ probe-‬בשני המקרים‬
‫)אינו נראה כאן( הינו אור לבן בעל ספקטרום רחב ‪.400-950nm‬‬
‫‪71‬‬
‫‪72‬‬
‫בתמונה מספר ‪ 3.2.9‬ניתן לראות את תוצאות הספקטרום הטרנזיינטי שהתקבלו לאחר תיקון זמן עבור‬
‫שני החלבונים הן כמפת מתאר )בחלק העליון( והן כחתכים בזמנים מסוימים של הספקטרום הטרנזיינטי‬
‫)בחלק התחתון(‪ ,‬לאחר שאזור פיזור ה‪ pump-‬הוחסר והושלם מהעירור הנוסף )בוצע שילוב של שני‬
‫אורכי גל העירור(‪ .‬שילוב שני אורכי גל העירור מצריך נרמול לעוצמת ה‪ pump-‬והדבקת הספקטרום‬
‫הטרנזיינטי )באזור החפיפה( ליצירת רצף ספקטראלי‪.‬‬
‫)‪λ (nm‬‬
‫‪900‬‬
‫‪800‬‬
‫‪700‬‬
‫‪600‬‬
‫‪500‬‬
‫‪0fs‬‬
‫‪50fs 0.05‬‬
‫‪100fs‬‬
‫‪200fs‬‬
‫‪250fs‬‬
‫‪900 400‬‬
‫‪800‬‬
‫‪700‬‬
‫‪600‬‬
‫‪500‬‬
‫‪400‬‬
‫‪0fs‬‬
‫‪50fs‬‬
‫‪100fs‬‬
‫‪150fs‬‬
‫‪200fs‬‬
‫‪0.05‬‬
‫‪0.00‬‬
‫‪0.00‬‬
‫‪-0.05‬‬
‫‪-0.05‬‬
‫‪200fs‬‬
‫‪500fs‬‬
‫‪1ps‬‬
‫‪3ps‬‬
‫‪9ps‬‬
‫‪250fs‬‬
‫‪0.05‬‬
‫‪1ps‬‬
‫‪3ps‬‬
‫‪9ps‬‬
‫‪30ps‬‬
‫‪0.00‬‬
‫‪-0.05‬‬
‫‪0.05‬‬
‫‪0.00‬‬
‫‪locked bR‬‬
‫‪900‬‬
‫‪800‬‬
‫‪700‬‬
‫‪bR‬‬
‫‪600‬‬
‫‪500‬‬
‫‪900 400‬‬
‫‪∆od‬‬
‫‪∆od‬‬
‫‪locked bR‬‬
‫‪bR‬‬
‫‪800‬‬
‫‪700‬‬
‫‪600‬‬
‫‪500‬‬
‫‪-0.05‬‬
‫‪400‬‬
‫)‪λ (nm‬‬
‫תמונה מספר ‪:3.2.9‬‬
‫בחלק העליון‪ -‬מפות מתאר של השינויים בספקטרום הטרנזיינטי לאחר ביצוע תיקון זמן עקב דיספרסיה של ה‪ probe-‬והחסרת פיזור ה‪ pump-‬עבור שני החלבונים‬
‫הרטינלים )מצד שמאל‪ BR :‬טבעי ומצד ימין‪ BR :‬נעול(‪ .‬יש לשים לב להבדלים בסקלות לדג' בעוד את ה‪ BR-‬הטבעי הצגנו רק עד לזמן של ‪ 8ps‬את ה‪ BR-‬הנעול עקב‬
‫זמן דעיכת המצב המעורר הארוך יחסית הצגנו עד ‪.80ps‬‬
‫בחלק התחתון‪ -‬תמונת מגוון חתכים במפות שהוצגו לעיל בעיכובי ‪ probe‬מסוימים עבור שני החלבונים )מצד שמאל‪ BR :‬טבעי ומצד ימין‪ BR :‬נעול( יש לשים לב כי‬
‫נבחרו זמנים שונים עבור כל חלבון )ראה מקרא( כאשר באופן כללי‪ :‬למעלה‪ -‬הזמנים‪72‬המוקדמים )‪ (≤250fs‬למטה‪ -‬הזמנים המאוחרים‪.‬‬
‫‪73‬‬
‫הספקטרומים הטרנזיינטים שנראים בתמונה מספר ‪ ,3.2.9‬מציגים מספר מאפיינים ספקטראליים‪:‬‬
‫‪ .1‬בתחום אורכי הגל הקצרים מ‪ 550nm-‬נראה סיגנל חיובי הנוצר תוך ‪ ~150fs‬ומיוחס לבליעת המצב‬
‫המעורר‪ ,‬עוד ניתן להבחין כי בשני המקרים נראה מבנה ספקטראלי בבליעה כאשר בנעול המבנה ניכר‬
‫יותר‪.‬‬
‫‪ .2‬התחום בין ‪ 550nm‬ל‪ 620nm-‬מייצג סיגנל שלילי המשקף ‪ bleach‬הנובע מעירור חלק מאוכלוסיית‬
‫מצב היסוד למצב המעורר‪.‬‬
‫‪ .3‬בתחום בין ‪ 620nm‬ל‪ 750nm-‬בשני המקרים נצפת פליטה רדודה )סיגנל שלילי( שממנה נבנת בליעה‬
‫)סיגנל חיובי(‪ .‬אך בעוד בזמנים ארוכים ב‪ BR-‬הטבעי רואים כי דעיכת המצב המעורר הושלמה ונוצר‬
‫סיגנל חיובי המשקף את בליעת האיזומר ‪ ,13-cis‬בנעול אזור זה דועך יחד עם דעיכת המצב המעורר‪,‬‬
‫נזכיר כי נעילת הקשר הכפול הספציפי מונעת את יצירת התוצר‪.‬‬
‫‪ .4‬בתחום אורכי הגל הארוכים מ‪ 750nm-‬נראה סיגנל שלילי המיוחס לפליטה המאולצת של המצב‬
‫הפלואורסצנטי‪ .I ,‬עבור ה‪ BR-‬בין ‪ 750nm‬ל‪ 800nm-‬נראה איפוס של הסיגנל‪.‬‬
‫בזמנים ארוכים יותר נראת דעיכת המצב המעורר כאשר ב‪ BR-‬הדעיכה מושלמת תוך ‪ 2ps‬ואנו נותרים‬
‫עם ספקטרום ההפרש בין הבקטריורודופסין לתוצר‪ .‬דעיכת המצב המעורר איטית יותר באנלוג הנעול‬
‫והאוכלוסייה כולה דועכת למצב היסוד )לא נוצר התוצר(‪.‬‬
‫בתמונה מספר ‪ 3.2.10‬נראים חתכים ספקטראליים במספר אורכי גל אופייניים כפונקציה של הזמן‪.‬‬
‫• ‪ 460nm‬ו‪ A) 520nm-‬ו‪ - (B-‬אזור בליעת המצב המעורר‪ .‬בזמנים המוקדמים )הנראים בתמונה‬
‫הפנימית( ניכר תהליך מהיר אשר במקרה של ה‪ BR-‬באורך גל של ‪ 460nm‬נראה כאזור ללא שינוי‪.‬‬
‫בזמנים המאוחרים‪ ,‬בנעול הדעיכה היא לאפס )שכן לא נוצר תוצר( בעוד שב‪ BR-‬הבליעה ב‪520nm-‬‬
‫דועכת לסיגנל שלילי המשקף את האוכלוסייה החסרה שהפכה לתוצר )ה‪.(bleach-‬‬
‫• ‪ - (C) 570nm‬אזור ה‪ bleach-‬אשר ב‪ BR-‬הטבעי אינו דועך לאפס כי ישנה אוכלוסיה החסרה במגיב‬
‫עקב הפיכתה לתוצר בעוד באנלוג הנעול הדעיכה הינה לאפס )התמונה מראה רק עד זמן של ‪15ps‬‬
‫בעוד הנתונים נאספו עד לזמן של ‪.(100ps‬‬
‫• ‪ – (D) 660nm‬בשני המקרים בזמנים המוקדמים )תמונה פנימית( נראת בניה של בליעה )סיגנל חיובי(‬
‫מפליטה )סיגנל שלילי(‪ .‬בזמנים ארוכים יותר ב‪ BR-‬נוצר התוצר ובאנלוג הנעול הדעיכה תואמת‬
‫לקבועי דעיכת המצב המעורר והדעיכה הינה לאפס‪.‬‬
‫• ‪ 800nm‬ו‪ E) 900nm-‬ו‪ - (F-‬אזור הפליטה המאולצת בו גם נצפו מודולציות איטיות‪.‬‬
‫בכל אורכי הגל ניכר כי זמן החיים של המצב המעורר באנלוג הנעול ארוך בהרבה מזה שהתקבל ב‪BR-‬‬
‫ובזמנים המוקדמים ניכר תהליך מהיר‪.‬‬
‫‪73‬‬
‫‪74‬‬
‫)‪time (ps‬‬
‫‪10‬‬
‫‪15‬‬
‫‪5‬‬
‫‪0.06‬‬
‫‪0‬‬
‫‪10‬‬
‫‪15‬‬
‫‪B‬‬
‫‪0.06‬‬
‫‪0.04‬‬
‫‪0.04‬‬
‫‪0.02‬‬
‫‪0.02‬‬
‫‪0.04‬‬
‫‪1.0‬‬
‫‪A‬‬
‫‪0.06‬‬
‫‪0.04‬‬
‫‪0.00‬‬
‫‪0.5‬‬
‫‪5‬‬
‫‪0.06‬‬
‫‪0‬‬
‫‪0.00‬‬
‫‪0.0‬‬
‫‪1.0‬‬
‫‪0.0‬‬
‫‪0.5‬‬
‫‪0.02‬‬
‫‪0.00‬‬
‫‪0.02‬‬
‫‪0.02‬‬
‫‪br‬‬
‫‪locked br‬‬
‫‪520nm‬‬
‫‪460nm‬‬
‫‪660nm‬‬
‫‪570nm‬‬
‫‪0.00‬‬
‫‪0.00‬‬
‫‪0.01‬‬
‫‪∆OD‬‬
‫‪1.0‬‬
‫‪0.0‬‬
‫‪1.0‬‬
‫‪0.02‬‬
‫‪0.00‬‬
‫‪0.5‬‬
‫‪0.0‬‬
‫‪-0.04‬‬
‫‪0.00‬‬
‫‪0.01‬‬
‫‪∆OD‬‬
‫‪0.5‬‬
‫‪-0.02‬‬
‫‪-0.02‬‬
‫‪0.00‬‬
‫‪-0.01‬‬
‫‪-0.04‬‬
‫‪D‬‬
‫‪-0.01‬‬
‫‪0.00‬‬
‫‪0.00‬‬
‫‪C‬‬
‫‪-0.06‬‬
‫‪F‬‬
‫‪-0.06‬‬
‫‪0.00‬‬
‫‪800nm‬‬
‫‪-0.02‬‬
‫‪-0.04‬‬
‫‪0.5‬‬
‫‪1.0‬‬
‫‪-0.01‬‬
‫‪0.0‬‬
‫‪-0.02‬‬
‫‪1.0‬‬
‫‪0.5‬‬
‫‪E‬‬
‫‪0.0‬‬
‫‪0.00‬‬
‫‪-0.02‬‬
‫‪-0.01‬‬
‫‪-0.04‬‬
‫‪-0.02‬‬
‫‪900nm‬‬
‫‪15‬‬
‫‪10‬‬
‫‪5‬‬
‫‪0‬‬
‫‪15‬‬
‫‪10‬‬
‫‪5‬‬
‫‪0‬‬
‫)‪time (ps‬‬
‫תמונה מספר ‪:3.2.10‬‬
‫חתכים במגוון אורכי גל ‪ probe‬בהתאם לתחומים הספקטראליים השונים הן עבור ‪ BR‬טבעי )בשחור( והן עבור האנלוג הנעול )באדום(‪.‬‬
‫בתמונות הפנימיות ‪ -‬הגדלה של המתרחש בזמנים המוקדמים )‪.(≤1.5ps‬‬
‫באנליזה של הנתונים )‪ (EADS‬הן עבור ה‪ BR-‬הטבעי והן עבור האנלוג שלו השתמשנו במודל קינטי‬
‫עוקב‪ ,118‬אנליזה זו הובילה לקבלת קבועי זמן אחידים לכל אורכי הגל ובתמונה מספר ‪ 3.2.11‬נראים‬
‫הספקטרומים המיוחסים להם‪.‬‬
‫קבועי הזמן שהתקבלו עבור בקטריורודופסין )בשחור( הם‪ 2ps , 440fs ,65fs :‬וזמן אינסופי המייצג את‬
‫התוצר‪ ,‬השגיאה הינה ‪ 10%‬מערכים אלו‪ .‬בספקטרום המיוחס לזמן הקצר נראה היסט לכחול של‬
‫ספקטרום הבליעה )היסט זה הינו דינמי אך תיארנו אותו במודל קינטי כשני מצבי קצה(‪ bleach ,‬ופליטה‬
‫רחבה‪ .‬זמן הדעיכה השני של ‪ 440fs‬נצפה בעבר ל‪ BR-‬ומאופיין בבליעה )‪ (~460nm‬ובפליטה‬
‫)‪ .(~850nm‬אנו צופים באזור ה‪ 750nm-‬בהתאפסות של הספקטרום וגם במקרה זה נראה כי התוצר‬
‫‪74‬‬
‫‪75‬‬
‫נבנה )‪ (~650nm‬בזמנים מאוד מוקדמים וזה נראה תואם למחקרים שבוצעו על חלבון ההלורודופסין‬
‫ומודל רמות האנרגיה שהוצע עבורו‪ .61‬אם כי‪ ,‬הבנייה המיידית של התוצר במקרה של ה‪ BR-‬הגיונית‬
‫שכן המצב המעורר קצר חיים והתוצר נוצר תוך ‪ .450.5ps‬במהלך ההתאמה התחייב זמן דעיכה של ‪2ps‬‬
‫)בהעדרו ההתאמות היו גרועות(‪ ,‬והזמן האינסופי במונחי משך המדידה מייצג את תוצר האיזומר וה‪-‬‬
‫‪.bleach‬‬
‫קבועי הזמן שהתקבלו עבור האנלוג הנעול )באדום( הם‪ 8ps , 140fs ,50fs :‬ו‪ 17ps-‬גם כאן ישנה‬
‫שגיאה של ‪ .10%‬גם באנלוג הנעול בזמנים המוקדמים נראה היסט לכחול של ספקטרום הבליעה )התיאור‬
‫שניתן הוא קינטי על אף שזהו תהליך דינמי(‪ bleach ,‬ופליטה‪ .‬זמן הדעיכה השני )‪ (140fs‬נצפה בעבר הן‬
‫בחלבונים הרטינליים והן ב‪ RPSB-‬בתמיסה ומאופיין ע"י בליעה )‪ (~460nm‬ופליטה )‪.(~850nm‬‬
‫באזור ה‪ 650nm-‬נצפה סיגנל חיובי המציין בליעה על אף אי קיומו של תוצר במקרה זה‪ .‬זמני דעיכה‬
‫נוספים בעלי מאפיינים ספקטרליים זהים אך עם אמפליטודות שונות ניצפו גם כן )‪ 8ps‬ו‪(~17ps-‬‬
‫ושייכים למצב המעורר שדועך משמעותית לאט יותר‪.‬‬
‫)‪λ (nm‬‬
‫‪800‬‬
‫‪700‬‬
‫‪600‬‬
‫‪500‬‬
‫‪0.10‬‬
‫‪800‬‬
‫‪700‬‬
‫‪600‬‬
‫‪500‬‬
‫‪0.10‬‬
‫‪bR‬‬
‫‪locked bR‬‬
‫‪0.05‬‬
‫‪0.05‬‬
‫‪0.00‬‬
‫‪0.00‬‬
‫‪-0.05‬‬
‫‪-0.05‬‬
‫‪∆OD‬‬
‫‪440fs‬‬
‫‪140fs -0.10‬‬
‫‪-0.10‬‬
‫‪0.04‬‬
‫‪0.04‬‬
‫‪0.00‬‬
‫‪0.00‬‬
‫‪-0.04‬‬
‫‪Inf‬‬
‫‪16.6ps‬‬
‫‪800‬‬
‫‪2ps‬‬
‫‪8ps‬‬
‫‪700‬‬
‫‪600‬‬
‫‪500‬‬
‫)‪λ (nm‬‬
‫‪800‬‬
‫‪700‬‬
‫‪600‬‬
‫‪∆OD‬‬
‫‪65fs‬‬
‫‪50fs‬‬
‫‪-0.04‬‬
‫‪500‬‬
‫תמונה מספר ‪:3.2.11‬‬
‫אנליזה כללית של הנתונים הניסיוניים תוך שימוש בסכמה קנטית עוקבת )‪ (EADS‬עבור שני החלבונים הרטינליים )בשחור‪BR-‬‬
‫טבעי‪ ,‬ובאדום‪ -‬האנלוג הנעול( ‪ .‬כל פנל מציג ספקטרום המיוחס לרכיב דעיכה אחר‪.‬‬
‫פרט לזמן הדעיכה הארוך משמעותית במקרה של האנלוג הנעול )בהשוואה ל‪ BR-‬הטבעי( נראה גם הבדל‬
‫באמפליטודות היחסיות של הבליעה והפליטה‪ .‬באנלוג הנעול היחס בין בליעת המצב המעורר לפליטה הוא‬
‫‪75‬‬
‫‪76‬‬
‫כמעט אחד לאחד בעוד ב‪ BR-‬הטבעי היחס הוא אחד לשניים כך שהפליטה ב‪ BR-‬הטבעי רדודה יותר מזו‬
‫הקיימת באנלוג הנעול‪ .‬תוצאות אלו התקבלו לאחר שהשתדלנו שכמות המולקולות המעוררות תיהיה זהה‬
‫הן בשני אורכי גל העירור והן בכל דגם )בשגיאה של ‪ (15%‬על מנת שיהיה זה נכון להשוות את יחסי‬
‫האמפליטודות‪.‬‬
‫בניסוי זה הקפיצות היו משתנות וגדולות יחסית כך שקשה לצפות במודולציות איטיות ברורות בתמונה‬
‫מספר ‪ .3.2.10‬אם זאת בניסוי דומה עם יחס סיגנל לרעש טוב יותר שביצענו עבור ה‪ BR-‬הטבעי ומוצג‬
‫בעבודת המסטר שלי‪ 119‬נראו באופן ברור אוסילציות באזור הפליטה‪ .‬ביצוע טרנספורם פורייה הראה‬
‫תדר של כ‪ 170cm-1-‬שעלה בבירור על גבול הרעש‪.‬‬
‫‪76‬‬
‫‪77‬‬
‫‪ .3.2.4‬בקטריורודופסין והאנלוג הנעול שלו ‪ -‬דיון‬
‫ניסויים בתנאים זהים ככל שניתן המבוססים על שיטת ‪ pump-probe‬בוצעו הן על ‪ BR‬טבעי והן על‬
‫אנלוג נעול שלו לשם קבלת רק הבדלים הנובעים מהדגם עצמו ולא הבדלים הנובעים מאופן ביצוע הניסוי‪.‬‬
‫ספקטרום בליעת מצב היסוד‪ :‬בתמונה מספר ‪ 3.2.8‬נראים ספקטרומי הבליעה של שתי הדוגמאות )בסגול‬
‫ה‪ BR-‬הטבעי ובאדום האנלוג הנעול(‪ .‬ניתן לראות כי צורת הספקטרום והרוחב הספקטרלי דומים‬
‫) ‪ ( FWHM = (3800 ± 100)cm −1‬אך קיים הבדל במיקום הפיק המרכזי‪ ,‬מקסימום פיק הבליעה ב‪BR-‬‬
‫הטבעי נמצא ב‪ ( (13800 ± 50)cm−1 ) 568nm-‬בעוד באנלוג הנעול הוא מוסט לאדום וממוקם ב‪-‬‬
‫‪ .( (13480 ± 50)cm−1 ) 571nm‬הוסבר כי ההיסט לאדום נגרם בשל תוספת אטומי הפחמן לנעילת‬
‫הקשר בטבעת המחומשת‪ .115‬כיוון שהנעילה בטבעת משפיעה עדינות על שדה הכח המולקולרי נצפה כי‬
‫יהיו גם שינויים בספקטרום המצב המעורר‪ .‬הבדל נוסף הינו העלייה הניכרת בבליעת האנלוג הנעול‬
‫באורכי גל הנמוכים מ‪) 470nm-‬הקצה הכחול( עלייה זו נובעת מחלבונים עם שיירי רטינל ‪ oxime‬או מ‪-‬‬
‫‪) prepigments‬פיגמנטים שנעולים באופן מלאכותי אשר נמצאים בכיס החלבון ללא החיבור לליזין( ‪.115‬‬
‫עוד נראה בתמונה זו שני אורכי גל העירור )‪ (pump‬שבוצעו בכל דגם‪ .‬דבר זה אפשרי בתנאי ששינוי‬
‫באורך גל העירור לא משפיע על הדינאמיקה והקינטיקה‪ .‬לא די בכך שההיסט בין שני אורכי הגל קטן‬
‫יחסית מרוחב המעבר ועל כן ניתן להזניחו‪ ,‬אנו הסתמכנו על מחקרי פלורסנציה של דגמים אלו‪ ,‬בהם לא‬
‫נצפתה השפעה משמעותית עבור אורכי גל עירור הגדולים מ‪ ,540nm-‬וישנה הסכמה כי קיימת הרחבה‬
‫הומוגנית בבליעת מצב היסוד בשני המקרים‪ .‬אם כי‪ ,‬במחקרם הם צפו בהיסט עדין לכחול אם הירידה‬
‫באורך גל העירור בשני הדגמים‪ .115‬עירור בשני אורכי גל שונים ללא השפעה על הדינאמיקה מאפשר‬
‫לקבל תמונה ספקטראלית מלאה‪ .‬לאור האמור לעיל בחרנו לעורר בשני אורכי גל הגבוהים מ‪550nm-‬‬
‫והקרובים אחד לשני ללא חפיפה בניהם )למניעת אזורי פיזור חופפים(‪.‬‬
‫הספקטרום הטרנזיינטי‪ :‬הספקטרומים הטרנזיינטיים שהתקבלו בשני המקרים לאחר סידורם מופיעים‬
‫בתמונה מספר ‪) 3.2.9‬מצד שמאל תוצאות ה‪ BR-‬הטבעי ומימין תוצאות האנלוג הנעול(‪ .‬המצב המעורר‬
‫נבנה בשני המקרים מיידית תוך כ‪ 50fs -‬ומאפייניו הם‪:‬‬
‫‪ .1‬בליעת המצב המעורר )בקצה הכחול(‪ -‬בליעת המצב המעורר נמצאת באזור ה‪ 400-550nm-‬כאשר‬
‫באנלוג הנעול היא מוסטת לאדום בהשוואה ל‪ BR-‬הטבעי‪ .‬ייתכן כי היסט זה נובע מבליעת מצב היסוד‬
‫שמוסטת אף היא לאדום בנעול כך שחפיפת תחום ה‪ bleach-‬הנובע מבליעת מצב היסוד יחד עם בליעת‬
‫המצב המעורר היא הגורמת להיסט הניכר‪ .‬לשם בדיקה איכותית של טיעון זה חישבנו את כמות‬
‫המולקולות המעוררות במונחי ‪ ∆OD‬כמוראה בתמונה מספר ‪ 3.2.12‬בסגול וורוד‪ .‬וקבענו מה צריכה‬
‫להיות בליעת המצב המעורר )בכחול ותכלת( על מנת שנגיע לספקטרום הטרנזיינטי שהתקבל בעיכוב זמן‬
‫‪ probe‬ספציפי של ‪ 200fs‬עבור שני הדגמים )בשחור ואפור(‪ ,‬זמן מסוים זה נבחר גם לצורך השוואה עם‬
‫תוצאות קודמות שהתקבלו לדגמים אלו‪ .45‬בליעת המצב המעורר שחושבה לאנלוג הנעול מוסטת לאדום‬
‫ביחס לבליעה המחושבת של ה‪) BR-‬בכחול ותכלת( ולכן היסט זה אינו נובע ממיקום ה‪ bleach-‬אלא מן‬
‫‪77‬‬
‫‪78‬‬
‫המצב המעורר וכפי שציינו קודם כשם שהנעילה משפיעה על מצב היסוד היא עשויה להשפיע גם על‬
‫המצב המעורר‪.‬‬
‫בתמונה ‪ 3.2.9‬ניכר בזמנים המוקדמים בשני המקרים מבנה בבליעת המצב המעורר כאשר ב‪ BR-‬הטבעי‬
‫המבנה נעלם מהר יותר כנראה בשל זמן החיים הקצר של המצב המעורר‪ .‬מבנה שכזה יכול לנבוע‬
‫מחפיפה של רמות אנרגיה‪ 120‬או שזה נובע מספקטרום ההפרש המתקבל מחפיפת בליעת המצב המעורר‬
‫ובליעת מצב היסוד‪ .‬כיוון שבתמונה ‪ 3.2.12‬אנו צופים במבנה גם בבליעת המצב המעורר המחושבת‪,‬‬
‫והפער בין המבנים הוא כ‪ 0.2eV-‬נראה כי מבנה זה נובע מחפיפה ויברציונית )מבנה ויברוני(‪.‬‬
‫)‪λ (nm‬‬
‫‪800‬‬
‫‪600‬‬
‫‪700‬‬
‫‪500‬‬
‫‪TS BR at 0.2ps‬‬
‫‪bleach BR‬‬
‫‪fluorescence BR‬‬
‫‪ES abs BR‬‬
‫‪TS T5.12 at 0.2ps‬‬
‫‪bleach T5.12‬‬
‫‪fluorescence T5.12‬‬
‫‪ES abs T5.12‬‬
‫‪0.10‬‬
‫‪0.05‬‬
‫‪-0.05‬‬
‫‪800‬‬
‫‪600‬‬
‫‪700‬‬
‫)‪λ (nm‬‬
‫תמונה מספר ‪:3.2.12‬‬
‫למעלה‪ -‬בריבועים‪ -‬בקטרירודופסין טבעי‪.‬‬
‫בעיגולים‪ -‬האנלוג הנעול ‪.‬‬
‫בשחור ואפור‪ -‬הספקטרום הטרנזיינטי בזמן עיכוב‬
‫של ‪.0.2ps‬‬
‫ספקטרום ה‪ bleach -‬כאשר‬
‫בסגול וורוד‪-‬‬
‫האמפליטודות הותאמו לחישוב כמות המולקולות‬
‫שעברו עירור‪.‬‬
‫באדום ובחום‪ -‬הפלורסנציה שנלקחה מתוך מאמרו‬
‫של ‪.115 Haacke‬‬
‫בכחול ותכלת‪ -‬בליעת המצב המעורר המתאימה‬
‫לקבלת נתוני הספקטרום הטרנזיינטי שהתקבל‪.‬‬
‫למטה‪ -‬תוצאות קודמות של ספקטרום טרנזיינטי‬
‫שנבנה מאיסוף עבור אורכי גל שונים בעיכוב של‬
‫‪ ,0.2ps‬לקוח מתוך מאמרו של ‪.45Ye‬‬
‫‪78‬‬
‫‪500‬‬
‫‪∆OD‬‬
‫‪0.00‬‬
‫‪79‬‬
‫‪ .2‬פליטת המצב המעורר‪ -‬עבור ה‪ BR-‬ניכר אזור של איפוס הסיגנל )‪ (700-800nm‬ואז מתחילה‬
‫להיראות הפליטה בעוד בנעול אין איפוס ברור והפליטה מתחילה ב‪ .750nm-‬מחקרי פלורסנציה שבוצעו‬
‫‪115,30‬‬
‫על דגמים אלו‬
‫הראו פליטות דומות יחסית שמרכזם ב‪ ,700nm-‬פליטות אלו נראות בתמונה מספר‬
‫‪) 3.2.12‬באדום וחום(‪ ,‬כאשר הפליטה של ה‪ BR-‬הטבעי מוסטת מעט לכחול בהשוואה לאנלוג וזה בניגוד‬
‫לנצפה בספקטרום הטרנזיינטי שהתקבל בתוצאותינו בו נראה כי הפליטה באנלוג מוסטת לכחול‬
‫משמעותית בהשוואה ל‪ BR-‬הטבעי‪ .‬סתירה זו יכולה להיות מוסברת על ידי קיומה של בליעה נוספת‬
‫)בקצה האדום( השייכת למצב המעורר וחופפת על הפליטה‪ ,‬הסבר זה כבר ניתן בעבר ל‪.32BR-‬‬
‫בליעת נוספת השייכת למצב המעורר‪ :‬בתמונה מספר ‪ 3.2.12‬נראית הבליעה שחושבה איכותית כך‬
‫שחיבורה עם הספקטרום הפלורוסנטי נותן את הספקטרום הטרנזיינטי שהתקבל‪ .‬מהחישוב האיכותי‬
‫שביצענו נראה כי בליעת המצב המעורר של ה‪ BR-‬הטבעי רחבה יותר מזו של האנלוג הנעול ומרכזה‬
‫מוסט מעט לכחול ביחס לאנלוג בהתאמה עם מגמת הספקטרום הפלורסנטי‪ .‬נראה גם כי הפליטה נמשכת‬
‫לאדום )מעבר ל‪ (850nm-‬בעוד הבליעה המחושבת באזור זה נראת בסופה )אמפליטודה נמוכה יותר(‪.‬‬
‫בתוצאותינו ניתן לצפות במספר הוכחות לקיומה של בליעה נוספת השייכת למצב המעורר‪:‬‬
‫‪ .1‬באנלוג הנעול‪ ,‬בו אין אפשרות ליצור תוצר ואנו צופים רק במצב המעורר‪ ,‬נראה סיגנל חיובי באזור‬
‫ה‪ .650nm-‬סיגנל זה קיים גם ב‪ BR-‬אך בגלל זמן החיים הקצר של המצב המעורר קשה להבחין בו שכן‬
‫הוא חופף עם אזור התוצר‪ .‬כמו כן‪ ,‬באזור זה אין נוכחות של בליעת מצב היסוד לכן מתחייב כי מדובר‬
‫בבליעה נוספת השייכת למצב המעורר‪ .‬עובדה זו יכולה להסביר את הבנייה המהירה של הבליעה באזור‬
‫זה בחלבונים הרטינליים בטרם דעכה אוכלוסיית המצב המעורר כלומר טרם יצירת התוצר‪ .‬ניתן לראות‬
‫זאת בבירור הן בזמנים המוקדמים )עד ‪ (200fs‬בתמונה ‪ 3.2.9‬והן בתמונה ‪ 3.2.10‬באורך גל חוקר של‬
‫‪ .(D) 660nm‬ההשערה כי באנלוג הנעול מסתובב קשר אחר נשללה‪ ,‬הן בגלל שהדעיכה באזור זה בנעול‬
‫זהה לדעיכת המצב המעורר )אותם קבועי דעיכה( והן לאור מחקרים קודמים אשר בדקו את השפעת‬
‫נעילת יתר הקשרים על הדינאמיקה‪.49‬‬
‫‪ .2‬באזור האיפוס של ה‪ BR-‬נצפו בעבר מודולציות ברורות )לא נראה כאן(‪ .‬אם אזור זה היה משקף‬
‫סיגנל אפסי עקב העדר בליעה‪/‬פליטה לא היינו צופים במודולציות איטיות‪ ,‬ברורות וחזקות בו‪ .‬הטיעון כי‬
‫מודולציות אלו יכולות לנבוע ממצב היסוד נשלל כיוון שמחקרים קודמים צפו באזור ה‪ IR-‬במודולציות‬
‫דומות‪ 89,75‬כך שהן יוחסו למצב המעורר‪ .‬דבר זה מהווה הוכחה נוספת לכך שהאיפוס הנצפה ב‪ BR-‬נובע‬
‫מחפיפה בין בליעה לפליטה במצב המעורר‪.‬‬
‫השוואת תוצאותינו לתוצאות קודמות‬
‫‪45‬‬
‫)נראות בתמונה מספר ‪ (3.2.12‬בהם ביצעו סריקה של מספר‬
‫אורכי גל בודדים באזורים השונים )ולא קריאה רב ערוצית(‪ ,‬מראה כי אומנם בעבר לא נצפו מבנים‬
‫בבליעות המצב המעורר אך יחסי האמפליטודות דומות‪ .‬עבור ה‪ BR-‬הטבעי בליעת המצב המעורר גדולה‬
‫בפקטור ‪ 2‬מהפליטה בעוד במקרה של האנלוג הנעול האמפליטודה בין הבליעה לפליטה שווה‪ .‬להערכתנו‬
‫פערי יחס האמפליטודות נובעים מחפיפת תחומי בליעה ופליטה ומרוחב הספקטרומים שהרי הספקטרום‬
‫הטרנזיינטי שהתקבל מציג את תוצאת החפיפה בין הבליעה לפליטה של המצב המעורר כנראה בתמונה‬
‫מספר ‪ .3.2.12‬באשר להעדר מבנה הבליעה )באזור ה‪ (460nm-‬בתוצאות העבר הרי שבניסוי זה האיסוף‬
‫‪79‬‬
‫‪80‬‬
‫נעשה עבור אורכי גל בודדים מה שגורר איבוד מידע וסיכוי גדול יותר לבעיות ניסיוניות )כגון חפיפה‪,‬‬
‫רגישות הגלאי לאורכי הגל השונים וכו'(‪.‬‬
‫קינטיקת התהליך וקבועי הדעיכה‪ :‬בתמונה ‪ 3.2.10‬נראים חתכים במגוון אורכי גל ‪ probe‬עבור תחומים‬
‫ספקטראליים שונים‪ ,‬ובתמונות הקטנות נראה פרק הזמן הראשוני‪ .‬הדמיון בין הדגמים הינו שבאזור‬
‫הבליעה וה‪ bleach-‬רואים בבירור את התהליך המהיר כדעיכה בעלת קבוע מהיר בעוד באזור הפליטה‬
‫התהליך המהיר נראה כמצב בו הסיגנל נותר ללא שינוי‪ ,‬ובאזור ה‪) 660nm-‬אזור בליעת המצב המעורר‬
‫אשר מתפתח ב‪ BR-‬הטבעי לתוצר( צופים במעבר מהיר מפליטה לבליעה שאינו משקף את‬
‫האיזומריזציה‪ .‬השוני בין הדגמים ניכר בקבועי הדעיכה השונים‪ .‬קבועי הדעיכה עבור האנלוג הנעול‬
‫איטיים משמעותית ביחס ל‪ BR-‬הטבעי בדומה לתוצאות קודמות‪.115,45‬‬
‫תוצאות האנליזה הנראות בתמונה ‪ 3.2.11‬סיפקו את קבועי הקצב הבאים עבור ה‪ BR-‬הטבעי‪:‬‬
‫‪ - ( 65 ± 7 ) fs .1‬מאופיין ע"י בליעה ב‪ 500nm-‬בעלת מבנים עדינים השייכת למצב המעורר‪bleach ,‬‬
‫ב‪ 600nm-‬השייך למצב היסוד ופליטה רחבה )החל מ‪ (650nm-‬ובעלת מבנה השייכת למצב המעורר‪.‬‬
‫‪ - ( 440 ± 50 ) fs .2‬מאופיין ע"י בליעה ב‪ 460nm-‬בעלת מבנה עדין‪ ,‬בליעה זו מוסטת לכחול ושייכת‬
‫למצב המעורר‪ bleach ,‬ב‪ 560nm-‬שגם מוסט לכחול בזמנים מוקדמים אלו‪ ,‬בליעה ב‪ 660nm-‬המשלבת‬
‫הן את הבליעה הנוספת השייכת למצב המעורר והן את תוצר האיזומר במצב היסוד ופליטה )המתחילה ב‪-‬‬
‫‪ (720nm‬ללא מבנה בעלת אזור מאופס הנובע מהחפיפה בין הבליעה לפליטה של המצב המעורר‪.‬‬
‫‪ - ( 2.0 ± 0.2 ) ps .3‬כמעט שלא נותרו מאפייני המצב המעורר והספקטרום מייצג את ההפרש בין מצב‬
‫היסוד )‪ (BR570nm‬לתוצר האיזומר במצב היסוד )המולקולות שהפכו ממגיב לתוצר(‪ .‬זמן זה קרוב לוודאי‬
‫משקף את המעבר מ‪ J-‬ל‪ .K-‬העובדה כי קצב יצירת התוצר ב‪ BR-‬מהיר בהשוואה ל‪ HR-‬הקשתה על‬
‫גילוי הבליעה הנוספת של המצב המעורר שכן התוצר והבליעה מצויים באותו אזור‪.‬‬
‫‪ .4‬זמן ארוך במונחי משך המדידה המאפיין את התוצר‪.‬‬
‫השוואה לתוצאות שהתקבלו במעבדתנו בעבר‪ 45‬הראתה דמיון לקבועי הדעיכה שהתקבלו כאן‪ ,‬גם שם על‬
‫מנת להתאים לתוצאות נדרש קבוע קצב מהיר של ‪ ,~60fs‬קבוע קצב של ‪ 400fs‬שמצוי בהתאמה עם‬
‫מחקרים קודמים‪ 115,45,32,30‬שדיווחו על קבוע קצב של כ‪ 500fs-‬לדעיכת המצב המעורר וקבוע קצב של‬
‫‪ 3ps‬שיוחס ליצירת התוצר‪.‬‬
‫עבור האנלוג הנעול )‪ (T5.12‬התקבלו הקבועים )תמונה ‪:(3.2.11‬‬
‫‪ - ( 50 ± 5 ) fs .1‬מאופיין ע"י בליעה ב‪ 550nm-‬בעלת מבנה השייכת למצב המעורר‪ bleach ,‬ב‪-‬‬
‫‪ 630nm‬השייך למצב היסוד ופליטה רחבה )החל מ‪ (650nm-‬המציגה איפוס באזור ה‪ 700nm-‬ושייכת‬
‫למצב המעורר‪.‬‬
‫‪ - (140 ± 20 ) fs .2‬מאופיין ע"י בליעה ב‪ 500nm-‬המוסטת לכחול ובעלת מבנה דומה השייכת למצב‬
‫המעורר‪ bleach ,‬ב‪ 580nm-‬שגם מוסט לכחול‪ ,‬בליעה ב‪ 660nm-‬השייכת למצב המעורר בלבד‬
‫‪80‬‬
‫‪81‬‬
‫)במקרה זה לא נוצר תוצר עקב נעילת הקשר הקריטי בטבעת מחומשת( ופליטה )המתחילה ב‪(720nm-‬‬
‫ללא מבנה ניכר לעין‪.‬‬
‫‪ ( 8.0 ± 0.8 ) ps .3‬ו‪ - (16.6 ± 2.0 ) ps -‬קבועים אלו מציגים ספקטרום דומה כאשר ההבדל טמון רק‬
‫בירידת האמפליטודות בזמן הארוך‪ .‬בשניהם אנו צופים במצב המעורר הדועך לאט )בהשוואה ל‪(BR-‬‬
‫ומאופיין בבליעה מובנת סביב ה‪ bleach ,500nm-‬באזור ה‪ ,580nm-‬בליעה נוספת של המצב המעורר‬
‫ב‪ 660nm-‬ופליטה משמעותית )יחס של ‪ 1:1‬עם הבליעה ה"כחולה"( ללא מבנה המתחילה ב‪.750nm-‬‬
‫קבועי הקצב שנדרשו בעבר הם ‪ 400fs , ~40fs‬וקבוע קצב של ‪ 19ps‬שנראה גם בתוצאות‬
‫אחרות‪ .115,45,32,30‬נטען גם כי תהליך רגיעת האנרגיה הויברונית מתרחש בסקלת זמן הקצרה מ‪3ps-‬‬
‫באנלוג הנעול וניתן להניח כי זמן זה ב‪ BR-‬הטבעי צפוי להיות דומה‪.115‬‬
‫בכל אחד מהדגמים‪ ,‬ניסיון לוותר על אחד הקבועים הוביל להתכנסות גרועה לתוצאות הניסיוניות‬
‫ולשגיאה משמעותית ולכן קבועים אלו הכרחיים ונכונים‪.‬‬
‫השוואה בין ‪ BR‬טבעי לאנלוג הנעול שלו‪ :‬השוואה בין שני דגמים אלו מציגה כי בשני המקרים המצב‬
‫המעורר מאופיין בבליעה "כחולה" בעלת מבנה אשר בזמנים מוקדמים עוברת היסט לכחול ופליטה באדום‬
‫החופפת על בליעה נוספת השייכת למצב המעורר‪ ,‬הפליטה רחבה ונראה שעוברת הצרה בזמנים‬
‫מאוחרים‪ .‬הרעיון כי מדובר בבליעה אחת רחבה אינו סביר‪ ,‬שכן הפער בין הבליעה שמרכזה באזור ה‪-‬‬
‫‪ 460nm‬לבליעה הנוספת שנמצאת באזור ה‪ 720nm-‬מתאים להפרש בין רמות אלקטרוניות שונות כך‬
‫שסביר להניח כי אוכלוסיית המצב המעורר נבלעת לשני מצבים אלקטרונים שונים‪.‬‬
‫הדמיון הניכר בספקטרום הטרנזיינטי של המצב המעורר בשני הדגמים עשוי להצביע על כך שעקומות‬
‫פוטנציאל דומות מעורבות והמצב המעורר מצוי במבנה הקרוב ל‪ .all-trans-‬באופן איכותי נתאר את רצף‬
‫‪ BRall −trans‬‬
‫האירועים במקרה של ה‪ BR-‬הטבעי כ‪-‬‬
‫‪ BR13−cis‬‬
‫‪ BRall −trans → S1FC ( H ) → I ES‬בעוד עבור‬
‫האנלוג הנעול נקבל זהות רק בהעדר תוצר כלומר‪. BRall −trans → S1FC ( H ) → I ES → BRall −trans :‬‬
‫המצב המעורר מאופיין בשתי בליעות )לרמות שונות( ופליטה רחבה כאשר ההבדלים נובעים ממיקום‬
‫שונה של רמות האנרגיה‪ ,‬שוני זה עשוי גם להסביר את ההבדל בקצב הדעיכה‪ .‬כעת נדרש מחקר תיאורטי‬
‫שיספק את ההבדלים במבנה ובמיקום עקומות הפוטנציאל המעורבות‪.‬‬
‫למרות הדמיון הרב ישנם הבדלים עדינים‪:‬‬
‫‪ .1‬בזמנים המאוחרים ב‪) BR-‬תמונה ‪ (3.2.11‬בליעת התוצר מוסטת לכחול בהשוואה לבליעה ה"אדומה"‬
‫השייכת למצב המעורר באנלוג הנעול‪ ,‬בעוד בקבוע הזמן השני )מאות פמטושניות( אנו צופים בבליעה‬
‫זהה באזור ה‪ .670nm-‬למרות הדמיון הנראה בבליעה בזמן הדעיכה השני בין ה‪ BR-‬הטבעי לאנלוג‬
‫לדעתי הבליעה "האדומה" ב‪ BR-‬משלבת את בליעת המצב המעורר ואת בליעת התוצר שכן רואים כי‬
‫המצב המעורר ב‪ BR-‬מתחיל לדעוך בקבוע זמן זה ואנו יודעים כי הוא דועך ליצירת תוצר‪ .‬נקודה נוספת‬
‫היא שעד כה ההבחנה בין מצבי הביניים ‪ J‬ו‪ K-‬נראתה כהיסט לכחול במעבר מתוצר הביניים ‪ J‬שנוצר‬
‫תוך ‪ 500fs‬לתוצר הביניים ‪ K‬שנוצר תוך פרק זמן של ‪ .3ps‬אנו לא יודעים האם ההבחנה בין שני‬
‫‪81‬‬
‫‪82‬‬
‫המצבים האלו נבעה מהמעבר מבליעת המצב המעורר "האדומה" לתוצר שמוסט לכחול‪ .‬עובדה זו מעלה‬
‫שוב את השאלה‪ :‬האם תוצר הביניים המכונה ‪ J‬מצוי על המשטח המעורר או היסודי‪ ?49,8‬אנו לא יכולים‬
‫לענות על שאלה זו ועבורנו זהו סימון בלבד כאשר ברור כי תוך ‪ 2ps‬אנו צופים בתוצר האיזומר ב‪BR-‬‬
‫הטבעי‪.‬‬
‫‪ .2‬אמפליטודת הפליטה במקרה של האנלוג הנעול גדולה יותר בהשוואה ל‪ BR-‬הטבעי למרות שבזמן‬
‫הדעיכה הקצר ביותר האמפליטודות שוות יחסית‪ .‬ייתכן וההבדל נובע מזמן היפוך פנימי קצר המתקיים ב‪-‬‬
‫‪ BR‬שכן זמן דעיכת המצב המעורר באנלוג הנעול ארוך משמעותית מזמן החיים של המצב המעורר ב‪-‬‬
‫‪ .115,45,32,30BR‬בשני המקרים המצב המעורר נוצר מיידית‪.‬‬
‫מחקרים רבים‪ 115,45,32,30‬דיווחו על הדעיכה האיטית בנעול בהשוואה ל‪ BR-‬וניתנו מספר השערות‪:‬‬
‫א‪ .‬הפרעות אלקטרוסטטיות וסטריות עלולות לגרום לזמן דעיכה ארוך יותר עבור המצב המעורר‪,‬ייתכן‬
‫שנעילת הקשר הכפול הקריטי בטבעת גוררת עירוב של חתך קוני שונה‪.‬‬
‫ב‪ .‬בשני הדגמים ה‪ pH-‬של חומצות האמינו בסביבת הרטינל שונה‪ .‬מחקרים שבוצעו על ה‪ BR-‬הטבעי בו‬
‫שונה ה‪ pH -‬של החומצות האספרטיות שבסביבת הרטינל הראו שינוי בקצב דעיכת המצב המעורר‪.‬‬
‫על מנת לאשש או להפריך את ההשערה השנייה החלטנו לשנות את ה‪ pH-‬של החומצה האספרטית‬
‫שבסביבת הרטינל באנלוג הנעול )לעלות את ה‪ .(pH-‬במידה והטענה נכונה שינוי זה עשוי להאריך את‬
‫זמן החיים של המצב המעורר‪ .‬בפועל‪ ,‬ניסוי זה הוביל לתוצאות דעיכה דומות לנראה כאן )התוצאות אינן‬
‫מוצגות כאן( והעיד כי הסיבה לדעיכה האיטית באנלוג הנעול אינה טמונה בהבדלי ה‪ pH-‬הקיימים‬
‫בחומצות האמינו שבסביבת הרטינל ב‪ BR-‬בהשוואה לאנלוג‪.‬‬
‫התדר הנמוך‪ :‬אוסילציות איטיות נראו באזור האיפוס של ה‪ BR-‬הטבעי אוסילציות המתאימות לתדר של‬
‫‪ ,170cm-1‬ותדר זה נראה גם באנלוג הנעול באזור ה‪ .650-750nm -‬תחומים אלו בשני המקרים שייכים‬
‫לאזור החפיפה בין הבליעה לפליטה של המצב המעורר וכאן בניגוד ל‪ PSB-‬בתמיסה‪ 90‬ניסויי פלורסנציה‬
‫טרם דיווחו על מודולציות דומות‪ ,‬כך שלמרות שברור כי הם שייכות למצב המעורר קשה לייחסם‬
‫לבליעה או לפליטה של המצב המעורר‪ .‬השוואה לתוצאות קודמות שהציגו מודולציות איטיות בדגמים אלו‬
‫באורכי גל של ‪ 800nm‬ו‪) 950nm-‬אזור השייך יותר לפליטה( הראו כי ב‪ BR-‬התדר הינו ‪156cm-1‬‬
‫בעוד באנלוג הנעול יורד תדר זה ל‪) 137cm-1-‬הבדלים של ‪ .75(10-20%‬ההשערה היא שההבדלים‬
‫בתדרים נובעים משיוך שונה של המודולציות כתלות באורכי הגל החוקר‪ .‬סביר להניח כי בעבר‬
‫המודולציות האיטיות שנראו ב‪ IR-‬שייכות לפליטה בעוד כאן המודולציות שייכות לבליעת המצב‬
‫המעורר‪ .‬בגלל הרעש קשה היה לצפות בהיפוך פאזה בין שני אורכי גל ‪ probe‬שונים כפי שנראה ל‪-‬‬
‫‪ ,111HR‬וייתכן ומחקר עתידי בתחום רחב מ‪ 600-950nm-‬עם רעש נמוך והתייחסות לפאזה יעזור‬
‫להכריע בעניין הייחוס למרות שהשערת מחקרים קודמים היא שפיק הבליעה והפליטה של המצב המעורר‬
‫ב‪ BR-‬מצוי באותו מקום )‪(720nm‬‬
‫‪32‬‬
‫כך שרק ניסויי פלורסנציה יוכלו להכריע בעניין‪ .‬מודולציות‬
‫איטיות שכאלה יוחסו בעבר לתנועה בשלד הרטינל‪ 75‬והתדר האיטי והדומה שהתקבל כאן מעיד כי למרות‬
‫נעילת הטבעת ייתכן ואותם דרגות חופש מעורבות וקיים דמיון בעקומת פוטנציאל המצב המעורר על אף‬
‫ההבדלים שנצפו ונידונו לעיל‪ ,‬מכאן עולה חשיבות מחקר המודולציות האיטיות‪.‬‬
‫‪82‬‬
‫‪83‬‬
‫השוואה בין שתי המשאבות היוניות שנחקרו )ה‪ BR-‬וה‪:(HR-‬‬
‫‪ .1‬דעיכת המצב המעורר )מתוך ה‪ -(DAS-‬אנליזת תוצאות ה‪) BR-‬נראית בתמונה ‪ (3.2.11‬סיפקה את‬
‫קבועי הקצב הבאים ‪ . 65 fs , 440 fs , 2 ps :‬בעוד עבור ה‪) HR-‬נראה בתמונה ‪ (3.2.3‬התקבלו‬
‫הקבועים‪ , 220 fs , 2 ps ,5 ps :‬בשני המקרים התקבל זמן אינסופי המייצג את התוצר הארוך חיים‬
‫בהשוואה למשך המדידה‪ .‬קצב האיזומריזציה ב‪ HR-‬איטי ביותר מפקטור ‪ 2‬עבור כל קבוע דעיכה‬
‫ביחס למתקבל ב‪ BR-‬כאשר בשני המקרים המצב המעורר נבנה מהר‪ .‬במאמרו של ‪ 40kandori‬נטען‬
‫שההבדל בזמן החיים של המצב המעורר נגרם מקיומם של שיירים שונים בסביבת הרטינל )פירוט‬
‫של השיירים השונים מופיע במאמר(‪.‬‬
‫‪.2‬‬
‫הספקטרום הטרנזיינטי‪ -‬בתמונה מספר ‪3.2.13‬‬
‫נראה הספקטרום הטרנזיינטי ב‪ 200fs -‬עבור‬
‫‪T.A. at 200fs‬‬
‫‪BR‬‬
‫‪HR‬‬
‫שתי המשאבות )בשחור‪ BR-‬ובאדום‪ .(HR -‬בזמן‬
‫)‪∆OD (a.u‬‬
‫זה מחד כבר נבנה המצב המעורר ומאידך טרם‬
‫נוצר התוצר )אפילו ב‪ BR-‬שזמן הדעיכה מהיר‬
‫התוצר בזמן קצר זה זניח( רק לשם השוואה‬
‫התאמנו את אזורי ה‪ bleach-‬ע"י הכפלת נתוני ה‪-‬‬
‫‪ HR‬בקבוע‪ .‬אנו לא נסיק מסקנות מהאמפליטודות‬
‫אלא נדון רק במאפיינים הספקטראליים של המצב‬
‫המעורר‪.‬‬
‫‪900‬‬
‫‪800‬‬
‫‪700‬‬
‫‪600‬‬
‫‪500‬‬
‫)‪λ (nm‬‬
‫תמונה מספר ‪ :3.2.13‬תוצאות הספקטרום טרנזיינטי‬
‫של שני החלבונים הרטינליים בעיכוב של ‪ ,0.2ps‬לשם‬
‫השוואה‪.‬‬
‫קיים דמיון הן במבנה ובמיקום בליעת המצב‬
‫המעורר ב‪ 460nm-‬והן במיקום ה‪ ,bleach-‬למרות שבליעת מצב היסוד ב‪ HR-‬מוסטת לאדום‬
‫)‪ (~580nm‬ביחס ל‪ .(~560nm) BR-‬נראה כי ההבדל הנראה בפליטת המצב המעורר נובע ממיקום‬
‫ומבנה שונים של בליעת המצב המעורר הנוספת ולא מההבדלים העדינים של פליטת המצב המעורר‬
‫או‪/‬ו בליעת מצב היסוד‪ .‬עוד נראה כי הבליעה הנוספת של המצב המעורר מוסטת לאדום במקרה של‬
‫ה‪ HR-‬והחפיפה בין הבליעה "האדומה" לפליטה היא הגורמת לשוני בפליטה שנצפה בספקטרום‬
‫הטרנזיינטי‪.‬‬
‫בזמן הארוך בו נותר רק התוצר )לא נראה כאן( ניתן לצפות באמפליטודת תוצר גדולה יותר ב‪BR-‬‬
‫)‪ (20m∆OD‬ביחס לזו הקיימת ב‪ .(7m∆OD) HR-‬הבדלי האמפליטודות מעידים על היסט שונה‬
‫בתדרי הבליעה של ‪ K‬ביחס למצב ההתחלתי‪.‬‬
‫נציין כי מיקום שונה של רמות האנרגיה כפי שמודגם בתמונה מספר ‪ 3.1.8‬יכול להסביר את‬
‫ההבדלים הנצפים ואף להוביל למיקום שונה של החתך הקוני שעשוי להסביר את הדעיכה האיטית ב‪-‬‬
‫‪.HR‬‬
‫‪83‬‬
‫‪84‬‬
‫‪ .3‬המודולציות האיטיות ‪ -‬התדר ב‪ (170cm-1) BR-‬גדול בכמעט פקטור ‪ 2‬מזה המתקיים ב‪HR-‬‬
‫)‪ (90cm-1‬הבדל זה נידון קודם‪ .‬אך לאור התצפיות באנלוג הנעול לא ברור האם ניתן להשוות בין‬
‫מודולציות אלו כיוון שייתכן והם מיוחסים לתחומים שונים )בליעה או פליטה של המצב המעורר(‪.‬‬
‫‪ #‬לאור כל האמור לעיל‪ ,‬ניתן לענות על השאלה בה פתחנו את מחקר האנלוג הנעול בנוגע למעבר המהיר‬
‫שנצפה מהפליטה לבליעה באזור ה‪ .660nm-‬מעבר מהיר זה המתקיים באופן מקרי באזור התוצר נובע‬
‫מחפיפה בין הבליעה לפליטה של המצב המעורר ולא קשור כלל לאיזומריזציה וליצירת התוצר וזה בניגוד‬
‫‪61-58‬‬
‫למחקרים קודמים‬
‫שם מממצא זה הוסק מודל המערב שני מסלולים שהאחד מוביל לתוצר והאחר‬
‫)הזמן הארוך יותר( חוזר למצב היסוד ההתחלתי‪ .‬תוצאותינו מראות כי המודל שסופק ל‪ 61pHR-‬אינו נכון‬
‫והסקתו נבעה מקיומה של בליעה נוספת השייכת למצב המעורר בזמנים מוקדמים שהופכת לתוצר בזמנים‬
‫הארוכים )שבאופן מקרי חופפים על אותו אזור(‪ .‬על אף פסילת המודל אנו לא סיפקנו מודל רמות אנרגיה‬
‫חדש המסביר את התוצאות‪.‬‬
‫‪84‬‬
‫‪85‬‬
‫‪ .3.3‬ספקטרוסקופיה ויברציונית של ‪ RPSB‬בתמיסה‬
‫הבנת הדינאמיקה הפוטוכימית מחייבת את הבנת מסלול ההיפוך הפנימי והאיזומריזציה שהינה קריטית‬
‫לפעילות החלבון‪ .‬עד כה חשפנו תחום ספקטראלי רחב עבור החלבונים הרטינליים‬
‫‪111‬‬
‫וה‪RPSB-‬‬
‫בתמיסה‪ ,105‬הספקטרום הטרנזיינטי שהתקבל היה רחב וחסר מבנה כך שממנו לא ניתן ללמוד על‬
‫השינויים בקשר הכימי ובגיאומטריית המולקולה במצב המעורר‪ .‬תדרי הויברציה השייכים למצב המעורר‬
‫אינם ידועים‪ 88-85,55,49,8,7,5,4‬ויותר מכך מחקרים תיאורטיים‪ 76‬אינם יכולים להצביע על מגמת תדרי המצב‬
‫‪76,81,82‬‬
‫המעורר ביחס לתדרי מצב היסוד הידועים מרזוננס ראמאן‬
‫אך מחקרים )תיאורטיים וניסיוניים(‬
‫מראים כי כאשר המצב המעורר מערב שינויים גיאומטריים ניכרים נצפה בשינויים גדולים בתדרי‬
‫הויברציה‪ .121,86‬עניין רב נמצא בתדר הקשר הכפול ‪ ,C=C‬המשחק תפקיד חשוב בתהליך ההיפוך הפנימי‬
‫והאיזומריזציה ולכן נצפה לשינויים גדולים בקואורדינטה זו כבר בשלבים הראשונים שכן האיזומריציה‬
‫נובעת מהיחלשות אופי הקשר הכפול הפעיל‪ .‬בכדי לחשוף את מבנה המצב המעורר נשתמש‬
‫בספקטרוסקופיה ויברציונית במרחב הזמן‪.‬‬
‫כל הניסויים המוצגים כאן בוצעו על ‪ RPSB‬בתמיסה תוך שימוש בפולסים הקצרים מ‪.10fs-‬‬
‫הסיבות לחקר ה‪ PSB-‬בתמיסה הן‪:‬‬
‫‪ .1‬ה‪ PSB-‬משותף לכלל החלבונים הרטינליים ולכן הבנת דינאמיקת המצב המעורר שלו וקבלת תדרי‬
‫הויברציה עבורו יהוו בסיס להבנת המנגנון בחלבונים אלו ולהבנת השפעות החלבון‪.‬‬
‫‪ .2‬ניסיון לחשוף את מבנה המצב המעורר ב‪ BR-‬הוביל לסתירות רבות‪ .‬היו שטענו כי מדובר בתדרי‬
‫המצב המעורר‪ 87‬והיו שטענו כי אותם התדרים שייכים למצב היסוד‪ .88,55‬הטענה הייתה כי הסיבה לקושי‬
‫בחשיפת מבנה המצב המעורר טמונה בזמן החיים הקצר שלו ובחפיפות הספקטראליות בין המצב היסודי‬
‫למעורר )קיומו של ה‪ bleach -‬בין הבליעה לפליטה של המצב המעורר(‪ .80‬מכאן נראה היה כי‬
‫הכרומופור בתמיסה )‪ (RPSB‬הינו מעומד טוב יותר למחקר בהשוואה לבקטריורודופסין שכן הוא‬
‫מאופיין בזמן חיים הארוך בכמעט פקטור ‪ 10‬למצב המעורר‪ ,‬והמצב היסודי והמעורר שלו מופרדים )ה‪-‬‬
‫‪ bleach‬ב‪ 450nm-‬והמצב המעורר )בליעה ופליטה( מתחיל ב‪.105,22(500nm-‬‬
‫‪ .3‬מבחינה פרקטית‪ -‬החלבונים הרטינליים מפזרים יותר את הקרניים בגלל קיומם של שיירי ממבראנה‬
‫בסביבת החלבון ולכן הספקטרום הויברציוני שמתקבל עשוי להיות רועש יותר כך שקשה יהיה להפיק‬
‫מידע ויברציוני אמין בפרט לאור ההבדלים העדינים שנצפו עד כה‪ .‬פיזורים אלו נמנעים חלקית‬
‫כשעובדים עם ‪ PSB‬בתמיסה כך שיחס הסיגנל לרעש משתפר‪.‬‬
‫‪ #‬פרק זה יהיה שונה במבנהו משני הפרקים הקודמים‪ .‬כאן לא נבצע הפרדה בין התוצאות לדיון אלא‬
‫נרשום זאת כרצף ניסויים )ממוספרים( שכל אחד מכיל תוצאות ודיון כך שהשאלות העולות מניסוי אחד‬
‫הן המובילות לניסוי הבא‪.‬‬
‫‪85‬‬
‫‪86‬‬
‫‪ .3.3.1‬ניסוי שני פולסים ברזולוציה של ‪(NOPA/NOPA) 7fs‬‬
‫ממצאים ניסיוניים‪:‬‬
‫בניסיון הראשון עוררנו וחקרנו את דגם ה‪ n-BuPSB-‬בתמיסת אתנול עם שני פולסי ‪ NOPA‬זהים‬
‫המכווצים ל‪) 7fs-‬הכיווץ אופיין ונראה תקין עד ‪ – 640nm‬ראה אפיון פולסים בשיטות(‪ .‬כפי שתואר‬
‫בשיטות דרך האיסוף בוצעה באופן רב ערוצי בקפיצות של כ‪ .3fs-‬בניסוי זה הסטנו את פולסי ה‪NOPA-‬‬
‫ככל שניתן לכחול על מנת לחפוף את ספקטרום בליעת מצב היסוד ולעורר את הדגם )פולסי ה‪NOPA-‬‬
‫בהם השתמשנו בניסוי זה נראים בתמונה מספר ‪ 3.3.1‬בורוד למעלה(‪.‬‬
‫)‪λ (nm‬‬
‫‪750‬‬
‫‪650‬‬
‫‪700‬‬
‫‪550‬‬
‫‪600‬‬
‫‪500‬‬
‫‪400‬‬
‫‪450‬‬
‫‪∆OD‬‬
‫‪RPSB‬‬
‫‪NOPA‬‬
‫‪TS @ 500fs‬‬
‫‪520nm‬‬
‫‪520nm‬‬
‫)‪FFT power (a.u‬‬
‫‪550nm‬‬
‫‪∆OD‬‬
‫‪550nm‬‬
‫‪590nm‬‬
‫‪590nm‬‬
‫‪615nm‬‬
‫‪250 500 750 1000 1250 1500 1750‬‬
‫‪615nm‬‬
‫‪2000‬‬
‫‪-1‬‬
‫‪1500‬‬
‫‪1000‬‬
‫‪500‬‬
‫‪0‬‬
‫)‪time (fs‬‬
‫) ‪ν (cm‬‬
‫תמונה מספר ‪:3.3.1‬‬
‫למעלה‪ -‬ספקטרום טיפוסי ומנורמל של ה‪ NOPA-‬בו השתמשנו ביום הניסוי הן עבור ה‪ pump-‬והן עבור ה‪) probe-‬ריבועים‬
‫ורודים(‪ .‬ספקטרום בליעה מנורמל של ‪ RPSB‬בתמיסת אתנול )עיגולים כחולים(‪ .‬וספקטרום טרנזיינטי בזמן עיכוב ‪ probe‬של‬
‫‪) 0.5ps‬ריבועים שחורים(‪.‬‬
‫למטה‪ -‬משמאל‪ :‬ספקטרום טרנזיינטי עבור מספר אורכי גל ‪ probe‬מסוימים )מיקומם על פני הספקטרומים מוצג בקווים בצבעים‬
‫תואמים(‪ .‬מימין‪ :‬מעבר ממרחב הזמן למרחב התדר ע"י טרנספורם פורייה של האוסילציות ביחידות שרירותיות לאחר החסרת‬
‫הרקע מהנתונים המוצגים בצד שמאל‪.‬‬
‫בפאנלים התחתונים של תמונה מספר ‪ 3.3.1‬מוצגים חתכים טרנזיינטים )משמאל( וספקטרום פורייה של‬
‫הנתונים )מימין( ראה פרק שיטות במספר אורכי גל ‪ probe‬נבחרים‪.‬‬
‫‪86‬‬
‫‪87‬‬
‫ניתן לראות כי האוסילציות הברורות ביותר מבחינת העומק‪ ,‬החדות ויחס האות לרעש נראו באזור ה‪-‬‬
‫‪ 590nm‬אזור המעבר בין הבליעה לפליטה של המצב המעורר‪ .‬מקור האוסילציות הנצפות יכול להיות‬
‫בתנועות ויברציוניות של המולקולה או הממס‪ ,‬כאשר עבור המולקולה נצפה לשילוב בין תנודות השייכות‬
‫למצב היסוד לאלו השייכות למצב המעורר כפי שיידון בהרחבה בהמשך‪.‬‬
‫בהתבסס על עבודות קודמות ניתן לייחס את תדרי הויברציה הנצפים כדלקמן‪:‬‬
‫‪ .1‬תדר נמוך באזור ה‪ -150cm-1-‬נצפה בעבר בניסויים עם רזולוציה זמנית נמוכה‪ ,‬תדר משויך‬
‫לתנודות בשלד הרטינל במצב המעורר‪.90,89,24‬‬
‫‪ .2‬תדר ב‪ - ~880cm-1-‬שייך לממס האתנול‪ .122‬הופעת תדר זה צפויה בכל עירור אימפולסיבי ללא‬
‫תלות אם מתקיים רזוננס אלקטרוני או לאו ומכונה ‪Impulsive Stimulated Raman ) ISRS‬‬
‫‪.123(Scattering‬‬
‫‪ .3‬תדר ב‪ - ~1200cm-1 -‬שייך למולקולה ומיוחס לתנודות סביב קשר פחמן יחיד‪. 81‬‬
‫‪ .4‬תדר ב‪ - ~1560cm-1 -‬שייך למולקולה ומיוחס לתנודות סביב קשר פחמן כפול‪.81‬‬
‫‪ .5‬צפויה להיות גם פעילות ‪ HOOP‬באזור ה‪ 850-1000cm-1-‬אך קשה לצפות בה בגלל שתדר‬
‫הממס דומיננטי באזור זה ‪.122,81‬‬
‫תמונה מספר ‪ 3.3.2‬מציגה רשימה מלאה של תדרי מצב היסוד של ‪ RPSB‬ושיוכם‪.81‬‬
‫מבין תדרי הויברציה שנראים בתמונה ‪ 3.1.1‬אמפליטודת התדר הגבוה )‪ (1560cm-1‬היא הדומיננטית‬
‫ביותר הסיבה לכך טמונה בעבודה עם פולסים קצרים של ‪ .7fs‬מחקר עם פולסים קצרים מאפשר לראות‬
‫סופרפוזיציה של ויברציות רבות‪ ,‬כאשר העוצמות היחסיות של האוסילציות תלויות במשך הפולס ובתדר‬
‫הויברציה‪ .‬פולס קצר גורם שויברצית הקשר הכפול )המהירה( תיראה באמפליטודה גבוהה‪ ,‬כנצפה‬
‫בתוצאותינו‪ .‬כאשר הפולס מתארך הויברציה האיטית עולה בעוצמתה בעוד המהירה דועכת‪ .124‬ייתכן וזו‬
‫הסיבה שבעבודותינו הקודמות בהם השתמשנו בפולס ארוך יחסית ראינו תדרים נמוכים וכאן כשעבדנו‬
‫עם פולס קצר התדרים הגבוהים נראים בבירור בעוד התדר הנמוך בעל אמפליטודה קטנה‪ .‬עוצמות‬
‫האוסילציות תלויות במשך הפולס המעורר‪ ,‬בתדר הויברציה ובספקטרום‪ .‬קיימת תלות בין עומק‬
‫המודולציה )ובכלל הופעה או אי הופעה של המודולציה( לאורך הגל‪ .‬קבוצתו של ‪ 125Champion‬עסקה‬
‫במתן הסבר מפורט לצורה הפונקציונאלית של תלות עומק המודולציה בספקטרום הבליעה ובספקטרום‬
‫הפולס המעורר‪ ,‬לכן עלינו לקחת בחשבון את ספקטרום הבליעה של המולקולה ואת ספקטרום הפולס‬
‫החוקר )ה‪ .(NOPA-‬הסבר לתופעה הינה שה‪ probe-‬בודק אוכלוסיה שמעוררת ע"י ה‪ pump-‬למצב‬
‫המעורר ע"י בליעת פוטון‪ .‬היות ואוכלוסיה זו מתנדנדת במצב המעורר הרי שגם חבילת הגלים במצב‬
‫היסוד )פס הבליעה( מתנדנדת ומוסחת לסירוגין לאדום ולכחול‪ probe .‬העוקב באורך גל מסוים מתאר‬
‫למעשה את הנגזרת הראשונה בזמן של חבילת הגלים ולכן במקסימום הבליעה נקבל שינויים מינימאליים‬
‫ועומק מודולציה מינימאלי‪ ,‬במקסימום אף צפוי להופיע תדר מוכפל של הויברציה )שכן בכל מחזור נדגם‬
‫האזור פעמיים ע"י חבילת הגלים( ובאזורים בהם הנגזרת של ספקטרום הבליעה גדולה יחסית )שולי פס‬
‫הבליעה( צפויות מודולציות עמוקות‪ .‬התנועה הגרעינית הממוצעת תלויה בנגזרת הבליעה והמחשה גרפית‬
‫ניתן לראות בעבודת המסטר שלי‪.119‬‬
‫‪87‬‬
‫‪88‬‬
‫דיון ‪ -‬הפרדה בין תרומות המצב המעורר והמצב היסודי‪:‬‬
‫כאמור ייתכנו תרומות במשקלים שונים של ויברציות מצב היסוד והמצב המעורר‪ .‬בניסיון לבודד את‬
‫תרומות המצב המעורר נשווה את הממצאים שקיבלנו באורך גל חוקר של ‪ 595nm‬לתדירויות מצב היסוד‬
‫שהתקבלו בניסויי רזוננס ראמאן עבור ה‪ 81RPSB-‬ולתדרי הממס איתו עבדנו כפי שדווחו בספרות‪.122‬‬
‫בתמונה מספר ‪ 3.3.2‬השוונו בין התדרים השונים ובטבלה‪.‬‬
‫‪1800‬‬
‫‪1600‬‬
‫‪1000‬‬
‫‪800‬‬
‫‪FFT @ 595nm‬‬
‫‪Raman PSB‬‬
‫‪Raman Ethanol‬‬
‫)‪FT (a.u‬‬
‫תמונה מספר ‪:3.3.2‬‬
‫בשחור‪ -‬טרנספורם פורייה עבור‬
‫אורך גל חוקר של ‪ 595nm‬כפי‬
‫‪3.3.1‬‬
‫שקיבלנו בתמונה‬
‫בתחום תדרים של ‪750cm-1 -‬‬
‫‪.1800cm--1‬‬
‫באדום‪ -‬תדרי מצב היסוד של‬
‫‪ RPSB‬שנלקחו מתוך מאמרו‬
‫של ‪.Smith‬‬
‫בירוק‪ -‬תדרי ראמאן של אתנול‬
‫)ממס( כפי שמופיע במאגר‬
‫נתונים‪.122‬‬
‫‪-1‬‬
‫) ‪ν (cm‬‬
‫‪1200‬‬
‫‪1400‬‬
‫הערה‪ :‬אין להתייחס‬
‫לאמפליטודת שכן גרפים אלו‬
‫הוכפלו על מנת שיוכלו להופיע‬
‫בגרף אחד‪.‬‬
‫‪1800‬‬
‫‪1600‬‬
‫‪88‬‬
‫‪1200‬‬
‫‪1400‬‬
‫‪-1‬‬
‫) ‪ν (cm‬‬
‫‪1000‬‬
‫‪800‬‬
‫‪89‬‬
‫רוחב התדר‪:‬‬
‫בתמונה ‪ 3.3.2‬נראה שהתדר הגבוה שהתקבל רחב יותר מתדר מצב היסוד ורוחבו כ‪) 40cm-1-‬קיים קשר‬
‫‪1‬‬
‫בין רוחב הפיק לזמן דעיכתו‬
‫‪π Cτ‬‬
‫= ‪ ∆υ‬כך שככל שהדעיכה מהירה יותר רוחב הפיק גדול(‪ .‬הרוחב‬
‫הנצפה כאן מצביע על זמן חיים קצר שיכול להעיד כי מדובר בתדר השייך למצב המעורר אך גם קירבה‬
‫בין תדירויות יכולה להוביל לזמן דעיכה קצר למרות השתייכותם למצב היסוד‪ .‬כמו כן‪ ,‬ריבוי דרגות‬
‫החופש בתמיסה הוא גורם בפני עצמו להרחבות ואפילו רוחב תדר הממס ב‪) 880cm-1-‬לא נראה כאן(‬
‫נראה רחב יחסית‪ .‬מכאן שמרוחב התדר הכפול לא ניתן להכריע בדבר שייכות התדר למצב היסוד או‬
‫למצב המעורר )רמה ‪ S0‬או ‪ (S1‬ויש להיזהר ממסקנות המבוססות על רוחב הפס‪.‬‬
‫על מנת לבדוק את האפשרות שמדובר‬
‫‪B‬‬
‫בערבוב של שני תדרים אשר האחד קשור‬
‫למצב היסוד והאחר למצב המעורר‪ ,‬לקחנו‬
‫שינינו את זמן ההתחלה וביצענו טרסנפורם‬
‫פורייה‪ ,‬כך קיבלנו סידרת גרפים של התדר‬
‫הכפול בזמני התחלה שונים כנראה בתמונה‬
‫)‪DFT power (a.u‬‬
‫את השארית באורך גל חוקר של ‪595nm‬‬
‫‪t0=300 fsec‬‬
‫‪t0=50 fsec‬‬
‫‪t0=400 fsec‬‬
‫‪t0=100 fsec‬‬
‫‪t0=500 fsec‬‬
‫‪t0=200 fsec‬‬
‫מספר ‪.3.3.3‬‬
‫בתמונה זו נראה כי בזמן התחלה של ‪50fs‬‬
‫התדרים מאוחדים בעוד בזמני התחלה‬
‫מאוחרים התדרים מתפצלים ונצפה היסט‬
‫לתדר נמוך יותר מזה שדווח למצב היסוד‬
‫)‪ .(1562cm-1‬אם כי‪ ,‬השוואה לתוצאות‬
‫‪1640‬‬
‫‪1600‬‬
‫‪1560‬‬
‫‪-1‬‬
‫) ‪υ (cm‬‬
‫‪1520‬‬
‫תמונה מספר ‪:3.3.3‬‬
‫‪ FFT‬עבור אורך גל ‪ probe‬של ‪) 590nm‬נראה באדום בתמונה‬
‫‪ (3.3.1‬שחושב עבור זמני התחלה שונים )ראה מקרא( עבור התדר‬
‫הכפול ‪.(~1560cm-1) C=C‬‬
‫רזוננס ראמאן עבור ‪) RPSB‬בריבועים שחורים( הציגה רוחב ספקטראלי דומה עבור מצב היסוד‪.‬‬
‫מכאן שלא ניתן לייחס את התדר הכפול במולקולה זו בוודאות למצב המעורר והוא יכול לנבוע ממצב יסוד‬
‫חם או ממצב היסוד בעצמו שהרי חבילת הגלים במצב היסוד מבצעת תנודות ויכולה להראות את השפעתה‬
‫אפילו באזור ה‪ .595nm-‬יותר מכך‪ ,‬הניתוחים שבוצעו חשפו כי האוסילציות החזקות ביותר נראות בצידי‬
‫הפס ולא במרכזו וככל שהאוסילציה מהירה יותר ההרחבה הספקטראלית שהיא גורמת גדולה יותר וניתן‬
‫לצפות בה בתדירות ‪ probe‬רחוקה יותר משיא הבליעה המקורי‪ .125,124‬ולכן גם באורך גל חוקר של‬
‫‪ 595nm‬שאינו חופף ממשית על בליעת מצב היסוד‪ ,‬התדר הגבוה יכול להיות מיוחס למצב היסוד‪.‬‬
‫עוצמת האוסילציה ביחס לנגזרת הבליעה‪:‬‬
‫ניסיון נוסף לייחס את הויברציות הוא לבדוק את הקשר בין עוצמת האוסילציות בפיק למגמת נגזרת‬
‫הבליעה )מצב היסוד ומצב המעורר(‪ .‬כיוון שמיקומו של הפיק המרכזי של כל תדר ויברציוני משתנה‬
‫כתלות באורכי גל חוקר שונים אנו ביצענו אינטגרל )בטווח זהה( סביב הפיק עבור אורך הגל החוקר‬
‫הנראים בתמונה ‪ 3.3.1‬בכל מאפיין תנודה והתוצאות נראות בתמונה מספר ‪.3.3.4‬‬
‫‪89‬‬
‫‪90‬‬
‫בתמונה מספר ‪ 3.3.4‬ישנו דמיון במגמת התדרים ‪ ,1200cm-1,880cm-1‬ו‪ ,1562cm-1 -‬מפתיע כי קיים‬
‫דמיון בין התדר השייך לממס )‪ (880cm-1‬לאלו השייכים למולקולה‪ .‬ייתכן והתחום עליו ביצענו אינטגרל‬
‫במקרה של הממס רחב ומכיל בתוכו תדרים נוספים השייכים למולקולה שהרי בטבלה רואים כי ישנם‬
‫תדרים רבים השייכים למולקולה באזור זה‪.‬‬
‫תמונה מספר ‪:3.3.4‬‬
‫משמאל‪ -‬ספקטרום בליעת מצב היסוד‬
‫)בסגול( יחד עם נגזרת הספקטרום‬
‫המייצגת את עוצמת האוסילציות‬
‫השייכות למצב היסוד )בורוד(‪.‬‬
‫מימין‪ -‬ספקטרום בליעה משוער‬
‫)מהספקטרום הטרנזיינטי ומהפליטה(‬
‫של המצב המעורר )בטורקיז( יחד עם‬
‫נגזרת הספקטרום המייצגת את עוצמת‬
‫האוסילציות השייכות לבליעת המצב‬
‫המעורר )בתכלת(‪.‬‬
‫‪ #‬בשני הגרפים רואים בנקודות את‬
‫תוצאת האינטגרל על הטרנספורם‬
‫פורייה בתחום תדרים מסוים באורכי‬
‫גל החוקר שנראים בתמונה ‪3.3.1‬‬
‫)כל תדר בצבע אחר‪ ,‬ראה מקרא‬
‫כאשר רק התדר המרכזי נרשם(‪.‬‬
‫)‪λ (nm‬‬
‫‪700‬‬
‫‪600‬‬
‫)‪λ (nm‬‬
‫‪600‬‬
‫‪500‬‬
‫‪excited state abs‬‬
‫‪500‬‬
‫‪400‬‬
‫‪ground state abs‬‬
‫‪-1‬‬
‫‪880cm‬‬
‫‪-1‬‬
‫‪1015cm‬‬
‫‪-1‬‬
‫‪1200cm‬‬
‫‪-1‬‬
‫‪1562cm‬‬
‫‪700‬‬
‫‪600‬‬
‫‪500‬‬
‫)‪λ (nm‬‬
‫‪600‬‬
‫‪500‬‬
‫)‪λ (nm‬‬
‫‪400‬‬
‫המגמה הזהה אינה דומה לנגזרות הבליעה )הן של מצב היסוד והן של המצב המעורר(‪ ,‬כך שבדיקה זו לא‬
‫הובילה לתוצאות חד משמעיות‪ ,‬ייתכן בשל מיעוט הנקודות שנלקחו‪.‬‬
‫נראה כי התדר ב‪ 1015cm-1-‬בעל מגמה שונה התואמת את נגזרת בליעת המצב המעורר למרות שבטבלה‬
‫ניתן לראות תדרים הקרובים לתדר זה ושייכים למצב היסוד‪ .‬תדר זה מוסט ביחס לתדרי מצב היסוד‬
‫וייתכן ושייך למצב המעורר אם כי עוצמתו הנמוכה הופכת את השגיאה בו לגדולה‪ .‬תדר דומה נצפה‬
‫בניסוי ‪ IR‬בחלבון ההלורודופסין ויוחס למצב המעורר‪ .60‬נראה כי כדאי בעתיד לבצע ניסוי על ‪RPSB‬‬
‫בתמיסה עם פולס בעל אורך אידיאלי לתדר זה‪ .‬מחקר של ‪ RPSB‬מתחייב שכן במולקולה זו ניתן לבודד‬
‫את השפעות האוסילטוריות הנובעות מבליעת התוצר הקיים בחלבונים הרטינליים‪ .‬למרות שניתן היה‬
‫לבדוק את נכונות המגמה ע"י השוואה למגמת התדר הנמוך שמיוחס למצב המעורר‪ ,‬אנו לא עשינו זאת‬
‫עקב עוצמתו הנמוכה )לא עבדנו עם פולס אידיאלי עבורו(‪.‬‬
‫הפאזה‪:‬‬
‫קשר נוסף קיים בין הפאזה והאמפליטודה של מרכיבי האוסילציות לאורך הגל הבוחן‪ .‬הפאזה יכולה לעזור‬
‫בייחוס התדרים השונים שהרי משטח הפוטנציאל של המצב המעורר מוסט ביחס למצב היסוד ולכן‬
‫העירור מוביל לחבילת גלים מוסטת ובעלת פאזה שונה בהשוואה למצב היסוד‪ .‬למרות עובדה זו אנו לא‬
‫בדקנו את הפאזה כיוון שכאשר מדובר בתדרים גבוהים ובעבודה עם פולסים קצרים )‪ (7fs‬אי הוודאות‬
‫בפאזה גדולה והעדר הדיוק יוביל למידע שאינו אמין‪.‬‬
‫מכאן שטרם הצלחנו לייחס בוודאות את התדרים הגבוהים שנצפו וניסויים נוספים ומורכבים יותר‬
‫נדרשים על מנת לזקק את תרומת המצב המעורר מתרומותיו של מצב היסוד‪.‬‬
‫‪90‬‬
‫‪91‬‬
‫‪ .3.3.2‬ניסוי שלושה פולסים )‪(400nm/NOPA/NOPA‬‬
‫הרעיון‪:‬‬
‫ניסוי שלושה פולסים עשוי לסייע‬
‫בבידוד תרומת מצב היסוד מתרומת‬
‫המצב המעורר‪ .‬הרעיון הוא שפולס‬
‫ראשון מעורר את הדגם ומעלה‬
‫אוכלוסייה‬
‫המעורר‪,‬‬
‫למצב‬
‫אוכלוסייה זו מתפתחת בזמן ואז‬
‫תמונה מספר ‪:3.3.5‬‬
‫מודל רמות האנרגיה של‬
‫‪ RPSB‬בתמיסה יחד עם‬
‫פולס ה‪ pump-‬בכחול‬
‫המאתחל את התגובה‬
‫ופולס ה‪ dump-‬בצהוב‬
‫המגיע בעיכובי זמן‬
‫שונים ביחס לפולס ה‪-‬‬
‫‪. pump‬‬
‫בתזמון נשלט מגיע פולס שני החופף‬
‫בעיקר את המצב המעורר ויוצר בו חור כאשר פולס שלישי חוקר את המצב המעורר‪ .‬בדרך זו ניתן לעלות‬
‫את הסיכוי לדגום מודולציות השייכות למצב המעורר‪ .‬רעיון זה יושם על מולקולה אורגנית גדולה‪.112‬‬
‫ניסוי מקדים‪:‬‬
‫כהכנה ביצענו ניסוי שלושה פולסים בו העירור בוצע ב‪ 400nm-‬ופולסי ה‪ dump/probe-‬היו זהים ובעלי‬
‫ספקטרום צר יחסית )‪ (FWHM=40nm‬המרוכז סביב ‪) 690nm‬אזור המצב המעורר כפי שניתן לראות‬
‫בספקטרום הטרנזיינטי בתמונה ‪ 3.3.1‬למעלה(‪ ,‬פולסים אלו כווצו עם פריזמות ל‪ .~20fs-‬ניסוי זה יסייע‬
‫בידינו לוודא כי אכן מתבצע ריקון במצב המעורר‪.‬‬
‫תמונה מספר‬
‫‪:3.3.5‬‬
‫נתוני ניסוי שלושה‬
‫פולסים כאשר‬
‫החוקר ב‪690nm-‬‬
‫במספר עיכובי זמן‪.‬‬
‫כולל סקן שנלקח‬
‫בהעדר פולס ה‪-‬‬
‫‪) dump‬בשחור(‪.‬‬
‫בתמונה הפנימית‪-‬‬
‫היחס בין סיגנלי‬
‫הפליטה עם ובלי‬
‫פולס ה‪ dump-‬בכל‬
‫עיכוב זמן עבור‬
‫הנתונים הנראים‬
‫בתמונה הגדולה‪.‬‬
‫‪1.0‬‬
‫)‪R(t‬‬
‫)‪Transient transmission (a.u‬‬
‫‪0.8‬‬
‫‪0.6‬‬
‫‪0.4‬‬
‫‪6‬‬
‫‪8‬‬
‫‪4‬‬
‫‪2‬‬
‫)‪Time(ps‬‬
‫‪14‬‬
‫‪12‬‬
‫‪10‬‬
‫‪8‬‬
‫‪6‬‬
‫‪4‬‬
‫‪2‬‬
‫‪0‬‬
‫)‪Time(ps‬‬
‫בתמונה זו ניתן לראות כי פולס ה‪ dump-‬משפיע על אזור הפליטה ומתבצע ריקון של אוכלוסיית המצב‬
‫המעורר בזמני עיכוב שונים וזאת בהשוואה לניסוי ללא ‪) dump‬גרף שחור‪ -‬ניסוי שני פולסים(‪ .‬בגרף‬
‫הקטן בתמונה זו מוצג היחס בין ניסוי עם ‪ dump‬לנתונים שהתקבלו בהעדרו בכל זמן עיכוב‪.‬‬
‫‪91‬‬
‫‪92‬‬
‫ממצאים ניסיוניים‪:‬‬
‫הניסוי המקדים לא הראה אוסילציות על פני דעיכת המצב המעורר ייתכן ובשל אורך גל ה‪probe -‬‬
‫שנבחר או בשל אורך הפולס הארוך בו השתמשנו‪ ,‬לכן נבצע ניסוי שלושה פולסים בו הפולס המעורר‬
‫מרוכז סביב ‪) 400nm‬פולס ארוך יחסית ‪ ,(~50fs‬הפולס השני ‪) dump/push‬תלוי אורך גל וספקטרום‬
‫טרנזיינטי( והשלישי )ה‪ (probe-‬הם פולסי ‪ NOPA‬רחבים )‪ (FWHM=100nm‬ומכווצים ל‪7fs-‬‬
‫)הפולסים נראים בתמונה מספר ‪ 3.3.6‬למעלה(‪ .‬איסוף ה‪ probe-‬בוצע באופן רב ערוצי בשונה מהניסוי‬
‫המקדים כך שניתן להפיק מידע רב יותר בירייה אחת‪ .‬פולסי ה‪ NOPA-‬הוסטו לאדום על מנת למזער‬
‫ככל שניתן את החפיפה עם מצב היסוד‪ ,‬בשונה מניסוי שני הפולסים שבוצע קודם ‪ .3.3.1‬המטרה הינה‬
‫לחשוף את התרומות הויברציוניות של המצב המעורר ע"י עירור אוכלוסיה רבה למצב המעורר‪.‬‬
‫טרנספורמי פורייה עבור אורך גל חוקר של ‪) 595nm‬שם נצפו אוסילציות ברורות( בזמני עיכוב שונים‬
‫בין ה‪ pump-‬ל‪ dump/push-‬נראים בתמונה מספר ‪ 3.3.6‬כאשר המקרא מציין את זמן הגעת הפולס‬
‫השני ביחס לפולס המעורר‪ ,‬זמן זה ניתן לתזמון באופן מדויק‪.‬‬
‫‪600‬‬
‫‪∆OD \ Intensty‬‬
‫‪750‬‬
‫‪NOPA‬‬
‫‪400nm‬‬
‫‪RPSB‬‬
‫‪TS @ 0.5ps‬‬
‫‪700‬‬
‫‪650‬‬
‫‪550‬‬
‫‪block UV‬‬
‫‪delay of 250fs‬‬
‫‪delay of 500fs‬‬
‫‪delay of 1ps‬‬
‫)‪DFT Power (a.u‬‬
‫תמונה מספר ‪:3.3.6‬‬
‫למעלה‪ -‬ספקטרומים‬
‫טיפוסיים ומנורמלים של‬
‫ניסוי שלושת הפולסים‪ :‬ה‪-‬‬
‫‪ pump‬ב‪400nm-‬‬
‫)בתכלת(‪ .‬פולסי ה‪NOPA-‬‬
‫)‪ dump/push‬ו‪(probe-‬‬
‫המוסטים לאדום )באדום(‪.‬‬
‫יחד עם ספקטרום בליעה‬
‫מנורמל של ‪RPSB‬‬
‫בתמיסת אתנול )בכחול(‬
‫והספקטרום הטרנזיינטי‬
‫בזמן עיכוב ‪ probe‬של‬
‫‪) 0.5ps‬בשחור(‪.‬‬
‫למטה‪ -‬טרנספורם פורייה‬
‫של האוסילציות ביחידות‬
‫שרירותיות שבוצע לאחר‬
‫החסרת הקינטיקה מן‬
‫הנתונים שהתקבלו במרחב‬
‫הזמן באורך גל חוקר של‬
‫‪ 595nm‬ובזמני עיכוב‬
‫שונים של פולס ה‪pump-‬‬
‫)בצבעים שונים( ובהעדרו‬
‫)בשחור(‪.‬‬
‫* תשומת לב הקורא‬
‫לקפיצה בציר ה‪.x-‬‬
‫)‪λ (nm‬‬
‫‪500‬‬
‫‪450‬‬
‫‪400‬‬
‫‪300 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700 1800‬‬
‫‪-1‬‬
‫‪200‬‬
‫‪100‬‬
‫) ‪ν (cm‬‬
‫התדרים הנמוכים‪:‬‬
‫בזמן העיכוב הקצר ביותר )‪-250fs‬באדום( מופיעים מספר תדרים נמוכים השייכים למצב המעורר‪ ,‬נדגיש‬
‫כי הפולסים הקצרים איתם עבדנו אינם אידיאליים לחקר תדרים נמוכים אלו‪ .‬תדרים אלו כבר נצפו בעבר‬
‫ויוחסו לעיוות סביב שלד הרטינל‪.90,89,24‬‬
‫‪92‬‬
‫‪93‬‬
‫עוצמת האוסילציות‪:‬‬
‫באופן עקרוני שינוי בעוצמת האוסילציות כפונקציה של זמן העיכוב עשוי היה לסייע בייחוס המודולציות‬
‫השונות‪ .‬ירידה באמפליטודה של המודולציה כפונקציה של זמן העיכוב מייחסת אותה למצב המעורר שכן‬
‫אוכלוסייתו פוחתת והוא דועך כפונקציה של הזמן בעוד עלייה באמפליטודה מצביע על שייכות למצב‬
‫היסוד שאוכלוסייתו גדלה כפונקציה של הזמן‪ .‬זמן החיים הארוך של המצב המעורר ב‪ RPSB-‬בתמיסה‬
‫היה צריך להוביל לירידה איטית יותר כפונקציה של זמני העיכוב הללו‪ .‬הדעיכה המהירה שנצפתה כתלות‬
‫בעיכוב הזמן ייתכן ונובעת מאיבוד קשר הפאזה של חבילת הגלים במצב המעורר ולא רק בשל דעיכתו‬
‫של המצב המעורר‪ .‬נציין כי‪ ,‬חזרנו על ניסוי זה מספר פעמים ועוצמת התדרים לא הייתה הדירה לכן לא‬
‫ניתן מעוצמת התדרים לייחסם )למצב היסודי או המעורר(‪.‬‬
‫השוואה בין זמני הריקון השונים‪:‬‬
‫כמו כן‪ ,‬ניתן להשוות את התוצאות בהם אוכלס המצב המעורר ורוקן בעיכובי זמן שונים לניסוי בו נחסם‬
‫הפולס המעורר )בשחור( בו בקושי אכלסנו את המצב המעורר והתרומה הניצפת היא של מצב היסוד‪.‬‬
‫נצפה בתרומת מצב היסוד למרות שספקטרום ה‪ NOPA-‬הוסט לאדום והחפיפה עם מצב היסוד קטנה‬
‫יחסית שכן כפי שנראה עבור תדרי הממס‪ ,‬ניתן לעורר את מצב היסוד גם כאשר הפולס המעורר רחוק‬
‫מרזוננס )תופעה הצפויה בכל עירור אימפולסיבי ומכונה ‪ . 126( ISRS‬ההשוואה מראה כי התדרים‬
‫‪ 1150cm-1 ,1000cm-1,230cm-1,130cm-1‬ו‪ 1370cm-1-‬נראים רק בניסוי שלושת הפולסים בעיכוב‬
‫המוקדם )גרף אדום(‪ .‬בטבלה המייצגת את תדרי מצב היסוד נראה כי תדרים אלו סמוכים מאוד לתדרים‬
‫המיוחסים למצב היסוד ולכן עלולים להשתייך למצב יסוד חם‪ ,‬כך שההפרדה בין המצבים עדין בעייתית‪.‬‬
‫נראה כי גם בניסוי המערב שלושה פולסים כיוון שאנו לא מעוררים את כל האוכלוסייה למצב המעורר‬
‫אנו צופים בהשפעה של שני המצבים האלקטרוניים ותרומת המצב היסודי משמעותית‪ .‬נזכיר כי התדר ב‪-‬‬
‫‪ 1000cm-1‬כבר נראה בניסוי הקודם שלנו וגם נצפה בניסוי ‪ IR‬בהלורודופסין‪ 60‬כך שההשערה כי הוא‬
‫שייך למצב המעורר מתחזקת‪.‬‬
‫הקשר הכפול‪:‬‬
‫הקשר הכפול כפי שהוסבר בהקדמה צפוי להשתנות משמעותית בין מצב היסוד למעורר והוא בעל תפקיד‬
‫עיקרי בתהליך האיזומריזציה מה שמוביל אותנו להתמקד בו‪ .‬התדר הגבוה נראה מוסט לתדר נמוך‬
‫)‪ (1520cm-1‬בהשוואה לתדר הנראה בניסוי שני פולסים )‪ (1562cm-1‬התואם את תדר מצב היסוד‪.‬‬
‫התדר הכפול הינו רחב וקצר כך שייתכן והוא מכיל בתוכו שני תדרים‪ ,‬האחד ב‪ 1560cm-1-‬ושייך למצב‬
‫היסודי והאחר ב‪ 1520cm-1-‬ושייך למצב המעורר ואנו צופים בשילובם‪ .‬בדקנו כיצד התדר הגבוה‬
‫מתפתח בזמן ע"י ביצוע טרנספורם פורייה של התוצאות הנראות לעיל כפונקציה של הזמן‪ .‬אם תדר זה‬
‫שייך למצב המעורר נצפה כי הוא יראה לזמן קצר בעוד מצב היסוד ותדרי הממס יישארו לזמן ארוך יותר‪.‬‬
‫אם כי‪ ,‬בטבלת תדרי מצב היסוד נראה כי למולקולה זו תדרים רבים סמוכים היכולים בקלות )בגלל‬
‫קירבתם( להתלכד לתדר רחב אחד ולהציג דעיכה מהירה‪.‬‬
‫התוצאות מוצגות לאחר מכפלת הנתונים בחלון‪ .‬לצורת החלון ורוחבו השפעה רבה על התוצאות ואפשר‬
‫להגיע לתוצאות שונות ולמסקנות אחרות כתוצאה מאופן הניתוח ולא בגלל דינאמיקת המולקולה‪.127,44‬‬
‫‪93‬‬
‫‪94‬‬
‫לקבלת מסקנות נכונות עלינו לבחור בחוכמה את החלון‪ ,‬חלון קטן מוביל להרחבה ולחיבור התדרים‬
‫השונים וחלון גדול מספק תדרים צרים כך שבשני המקרים יהיה קשה לנתח את התמונה שתתקבל עקב‬
‫מיעוט או ריבוי התדרים בהתאמה‪ .‬אנו בחרנו בחלון סופר‪-‬גאוסי בעל רוחב של ‪ .400fs‬חלון אופטימאלי‬
‫זה )מרובע המרוכך בקצותיו( מאפשר ריכוך של התוצאות בגבולות‪ .‬התוצאות נראות בתמונה מספר‬
‫‪ .3.3.7‬תוצאות המראות את התפתחות התדר הגבוה כפונקציה של הזמן בזמני העיכוב השונים‪:‬‬
‫‪-3‬‬
‫‪-3‬‬
‫‪x 10‬‬
‫‪4‬‬
‫‪x 10‬‬
‫‪4‬‬
‫‪3.5‬‬
‫‪1700‬‬
‫‪B‬‬
‫‪3.5‬‬
‫‪1650‬‬
‫‪A‬‬
‫‪1650‬‬
‫‪3‬‬
‫‪3‬‬
‫‪1600‬‬
‫‪1600‬‬
‫‪2.5‬‬
‫‪2.5‬‬
‫‪2‬‬
‫‪1500‬‬
‫)‪v (cm-1‬‬
‫‪1550‬‬
‫‪2‬‬
‫‪1500‬‬
‫)‪v (cm-1‬‬
‫‪1550‬‬
‫‪1.5‬‬
‫‪1.5‬‬
‫‪1450‬‬
‫‪1450‬‬
‫‪1‬‬
‫‪1‬‬
‫‪1400‬‬
‫‪1400‬‬
‫‪0.5‬‬
‫‪0.5‬‬
‫‪1350‬‬
‫‪0‬‬
‫‪0‬‬
‫‪-3‬‬
‫‪1400‬‬
‫‪1200‬‬
‫‪800‬‬
‫‪1000‬‬
‫)‪time (fsec‬‬
‫‪600‬‬
‫‪400‬‬
‫‪1400‬‬
‫‪1200‬‬
‫‪200‬‬
‫‪800‬‬
‫‪1000‬‬
‫)‪time (fsec‬‬
‫‪600‬‬
‫‪400‬‬
‫‪200‬‬
‫‪-3‬‬
‫‪x 10‬‬
‫‪4‬‬
‫‪3.5‬‬
‫‪1350‬‬
‫‪x 10‬‬
‫‪4‬‬
‫‪1700‬‬
‫‪D‬‬
‫‪3.5‬‬
‫‪1700‬‬
‫‪C‬‬
‫‪1650‬‬
‫‪1650‬‬
‫‪3‬‬
‫‪3‬‬
‫‪1600‬‬
‫‪1600‬‬
‫‪2.5‬‬
‫‪2.5‬‬
‫)‪v (cm-1‬‬
‫‪2‬‬
‫‪1500‬‬
‫‪2‬‬
‫‪1500‬‬
‫‪1.5‬‬
‫‪1.5‬‬
‫‪1450‬‬
‫‪1450‬‬
‫‪1‬‬
‫‪1‬‬
‫‪1400‬‬
‫‪0.5‬‬
‫‪0‬‬
‫)‪v (cm-1‬‬
‫‪1550‬‬
‫‪1550‬‬
‫‪0.5‬‬
‫‪1350‬‬
‫‪1400‬‬
‫‪1200‬‬
‫‪800‬‬
‫‪1000‬‬
‫)‪time (fsec‬‬
‫‪600‬‬
‫‪400‬‬
‫‪1400‬‬
‫‪0‬‬
‫‪200‬‬
‫‪1350‬‬
‫‪1400‬‬
‫‪1200‬‬
‫‪800‬‬
‫‪1000‬‬
‫)‪time (fsec‬‬
‫‪600‬‬
‫‪400‬‬
‫‪200‬‬
‫תמונה מספר ‪:3.3.7‬‬
‫ספקטרוגרמת טרנספורם פורייה כפונקציה של הזמן באזור התדר הכפול )‪ (1560cm-1‬עבור אורך גל ‪ probe‬של ‪ 595nm‬בזמני עיכובי‬
‫שונים ‪-A‬עיכוב של ‪ 600fs -C ,400fs -B ,200fs‬ו‪ UV blocked-D -‬תוך שימוש בחלון ברוחב של ‪.400fs‬‬
‫בתמונה מספר ‪ 3.3.7‬נראה תדר המצוי סביב ‪ ,1550cm-1‬בעל רוחב משמעותי )נמשך עד ל‪(1450cm-1-‬‬
‫וזמן דעיכה קצר‪ ,‬ממצאים אלו לא תלויים בזמן העיכוב או בחסימת ה‪ .(400nm) pump-‬בתוצאות נראה‬
‫תדר נמוך חדש סביב ‪ 1450cm-1‬כאשר תדר חדש זה לא נראה בניסוי בו ה‪ pump-‬נחסם )‪ .(D‬בזמני‬
‫העיכוב המאוחרים‪ ,‬התדר ב‪ 1450cm-1-‬נחלש בעוד התדר סביב ‪) 1550cm-1‬הקרוב יותר לתדר מצב‬
‫היסוד ‪ (~1560cm-1‬מתחזק‪ .‬תדר חדש זה תואם בדיוק את התדר של ממס האתנול כפי שניתן לראות‬
‫בתמונה ‪ .3.3.2‬והממצא בתמונה ‪ A‬המראה כי התדר החדש בעל זמן דעיכה ארוך מזמן דעיכת התדר‬
‫הכפול מעלה את החשד כי אכן מדובר בתדר הממס אם כי ייחוסו לממס אינו מסביר את היחלשות תדר זה‬
‫בזמני עיכוב מאוחרים‪.‬‬
‫‪94‬‬
‫‪95‬‬
‫שינוי ממס‪:‬‬
‫על מנת לבדוק תדר חדש זה ולייחסו ביצענו ניסוי דומה עם ממס אחר הנקי מתדרים באזור זה‪ ,‬כך‬
‫שבמידה ותדר זה שייך למולקולה הוא יופיע גם בממס האחר ואם הוא שייך לממס האתנול אנו לא נצפה‬
‫בו‪ .‬בחרנו ב‪ (CD3OD) deuterated methanol -‬כממס כיוון שהוא עונה על הדרישות הבאות‪:‬‬
‫‪ .1‬הממס נקי מתדרים באזור התדר הכפול )פעיל ראמאן בתחום ‪ 800-1200cm-1‬והחל מ‪- 2000cm-1-‬‬
‫ספקטרום ראמאן של ממס זה אינו מובא כאן(‪.‬‬
‫‪ .2‬מולקולת ה‪ RPSB-‬תימס בו והוא לא יגיב עם הפרוטונציה שבה‪.‬‬
‫‪ .3‬ממס דומה ככל שניתן לאתנול כך שהדינאמיקה לא תשתנה משמעותית‪ .‬ראינו בעבר כי שינוי ממס‬
‫יכול להוביל לשינוי מבנה הרמות ובכך לדינאמיקה שונה‪.74,72‬‬
‫בגלל הפעילות הענפה של הממס באזור ה‪ HOOP-‬הסתכלנו רק על אזור ה‪) 1300-1800cm-1-‬אזור‬
‫התדר הכפול(‪ ,‬כך שממס זה לא יכול לספק מידע עבור התדר ב‪.1000cm-1-‬‬
‫‪-3‬‬
‫‪-3‬‬
‫‪x 10‬‬
‫‪4‬‬
‫‪x 10‬‬
‫‪4‬‬
‫‪3.5‬‬
‫‪1700‬‬
‫‪3‬‬
‫‪1650‬‬
‫‪1600‬‬
‫‪2.5‬‬
‫‪1500‬‬
‫‪1.5‬‬
‫‪1600‬‬
‫‪2.5‬‬
‫)‪v (cm-1‬‬
‫‪2‬‬
‫‪3‬‬
‫‪1650‬‬
‫‪1550‬‬
‫‪2‬‬
‫‪1500‬‬
‫‪1.5‬‬
‫‪1450‬‬
‫‪1‬‬
‫‪1450‬‬
‫‪1‬‬
‫‪1400‬‬
‫‪1400‬‬
‫‪0.5‬‬
‫‪0.5‬‬
‫‪1350‬‬
‫‪1600‬‬
‫‪1400‬‬
‫‪800 1000 1200‬‬
‫)‪time (fsec‬‬
‫‪600‬‬
‫‪400‬‬
‫‪1350‬‬
‫‪0‬‬
‫‪200‬‬
‫‪1600‬‬
‫‪1400‬‬
‫‪800 1000 1200‬‬
‫)‪time (fsec‬‬
‫‪600‬‬
‫‪400‬‬
‫‪200‬‬
‫תמונה מספר ‪:3.3.8‬‬
‫ספקטרוגרמת טרנספורם פורייה כפונקציה של הזמן באזור התדר הכפול עבור אורך גל ‪ probe‬של ‪ 585nm‬בזמן עיכוב של ‪200fs‬‬
‫)משמאל( ‪ ,‬ו ‪) UV blocked-‬מימין( תוך שימוש בחלון ברוחב של ‪.400fs‬‬
‫נציין שעבור ממס זה ביצענו את כל הניסויים שתוארו לעיל )ניסוי שני פולסים‪ ,‬ניסוי שלושה פולסים‬
‫וניסוי עם פולסי ‪ chirped‬המתוארים בהמשך‪ (...‬אך בתמונה מספר ‪ 3.3.8‬מוצגת רק התוצאה המספקת‬
‫תשובה בנוגע לייחוסו של התדר החדש ב‪.1450cm-1-‬‬
‫בתוצאות הנראות בתמונה מספר ‪ 3.3.8‬לא נצפה התדר ב‪ 1450cm-1-‬ולכן נייחס תדר זה לממס האתנול‬
‫ולא למצב המעורר של המולקולה‪.‬‬
‫לסיכום‪ ,‬נראה כי עדין קשה לבודד את תרומת מצב היסוד הדומיננטית מתרומת המצב המעורר העדינה‪.‬‬
‫הקושי להפריד בין תרומות השייכות למצב היסוד לאלו השייכות למצב המעורר הוביל אותנו לבצע ניסוי‬
‫המערב פולסים עם ‪ chirp‬ומטרתו לשלוט קוהרנטית בשתי אוכלוסיות אלו ובכך לבצע את ההפרדה‬
‫ביניהם‪.‬‬
‫‪95‬‬
‫)‪v (cm-1‬‬
‫‪1550‬‬
‫‪3.5‬‬
‫‪1700‬‬
‫‪96‬‬
‫‪ .3.3.3‬ניסויים המערבים שימוש בפולסים עם ‪chirp‬‬
‫הרעיון‪:‬‬
‫הקושי בהפרדת התרומות הויברציוניות השייכות למצב היסוד מאלו השייכות למצב המעורר הוביל אותנו‬
‫להשתמש בפולסים עם ‪ chirp‬על מנת לשלוט קוהרנטית בחבילת הגלים הויברציונית וזאת בהסתמך על‬
‫ניסויים קודמים אשר הדגימו כי שינוי ה‪ chirp-‬של פולס ה‪ pump-‬מאפשר לעודד או לדכא את ויברציות‬
‫מצב היסוד‪ .99,88‬ניסויים המערבים שימוש בפולסים עם ‪ chirp‬בוצעו במעבדתנו הן על ה‪ 88 BR-‬והן על‬
‫מולקולת צבע מרובת דרגות חופש בתמיסה‪ .128,101‬בניסויים אלו הוכח כי ניתן לשלוט קוהרנטית בחבילת‬
‫הגלים הויברציונית במצב היסוד האלקטרוני‪.‬‬
‫בניסוי ה‪ BR-‬נראה כי פולס ה‪ NC-‬הגביר את המודולציות בעוד פולס ה‪ PC-‬הקטין אותם‪ ,‬ומכאן הם‬
‫ייחסו את הויברציות שנצפו למצב היסוד‪ .‬ובניסוי על מולקולת הצבע נצפתה חוסר סימטריה בעומק‬
‫המודולציה סביב ה‪ .TL-‬כלומר קיים פולס ‪ NC‬אופטימאלי הגורם להגברה של כלל תדרי מצב היסוד‪.‬‬
‫עוד הוסק שם כי אפקט ה‪ chirp-‬מלווה את כלל התנועה במולקולה ולא מלווה פרטנית ויברציות בודדות‬
‫כך מתקבל אופטימום אחיד לכלל התדרים‪ ,‬במחקר זה נבדקו גם הסיבות לדבר‪ .‬ניסויים אלו בוצעו תחת‬
‫ההנחה כי הקינטיקה אינה מושפעת מפולסי ה‪ .chirped-‬האופן בו יצרנו פולסים בעלי ‪ NC‬ו‪ PC-‬הינו‬
‫ע"י החסרה או תוספת של כמות קוורץ בזרוע ה‪ pump-‬לאחר כיווץ‪ ,‬בהתאמה‪ .‬ההחסרה והתוספת של‬
‫כמות הקוורץ חייבת להיות מבוקרת שכן הארכה גדולה של הפולס הינה אפקט מכריע הפועל נגד יצירתן‬
‫של ויברציות קוהרנטיות בתדרים גבוהים והאמפליטודת התדרים הגבוהים עשויה לרדת רק בשל משך‬
‫הפולס וללא תלות בפולס ה‪ chirped-‬שיצרנו )חישוב ואפיון ניסיוני של הפולס שלנו מראה כי הפולס בו‬
‫השתמשנו הורחב מ‪ 7fs-‬לכ‪ -12fs-‬לא מוצג כאן(‪.‬‬
‫מכאן ששני גורמים קובעים את משרעת המוד הויברציוני בטרנספורם פורייה בעת שינוי ה‪:chirp-‬‬
‫‪ .1‬האפקט הפיסיקאלי של ה‪) chirp-‬הגודל הנבחן בניסוי(‪ ,‬לדג' ‪ NC‬מגביר את יצירת חבילת הגלים‬
‫במצב היסוד ע"י ליווי דינמי של חבילת הגלים‪.‬‬
‫‪ chirp .2‬מכל סוג מאריך את הפולס ביחס ל‪ TL-‬ולכן מגדיל את זמן הקרוס‪-‬קורלציה של ניסוי הבליעה‬
‫הטרנזיינטי ומוריד את הרזולוציה הזמנית בניסוי‪ .‬לכן נצפה "במריחה" של האוסילציה‪ .‬וככל שהפולס‬
‫ארוך יותר העירור פחות אימפולסיבי וקשר הפאזה נפגע‪ .‬אפקטים אלו יגררו הקטנה של האמפליטודה‪.‬‬
‫הממצאים הניסיוניים‪:‬‬
‫‪88‬‬
‫בתחילה ביצענו ניסוי שני פולסי ‪ NOPA‬בו שונה ‪ chirped‬ה‪) pump-‬בדומה לניסוי שבוצע ב‪( BR-‬‬
‫ונעשה שימוש ב‪ probe-‬רב ערוצי‪ ,‬נציג כאן רק שני אורכי גל ‪ probe‬נבחרים‪ .‬כמו כן‪ ,‬ביצענו מספר‬
‫עיצובי ‪ NC‬ו‪ PC-‬לפולס המעורר אך אנו נציג כאן רק את הפולסים המעוצבים הטובים ביותר מבחינת‬
‫ניקיון הניסוי וטיב הכיווץ )מכונים ‪ NC‬ו‪ .(PC-‬התוצאות מוצגות בתמונה מספר ‪.3.3.9‬‬
‫למרות הדמיון בצורת הספקטרום הויברציוני ב‪ chirps-‬השונים ‪,‬המגמה בכל אורך גל חוקר מעט שונה‪,‬‬
‫‪ Shank‬כבר צפה בתלות באורך הגל החוקר‪ .93‬עבור אורך גל חוקר של ‪ 550nm‬פולסי ה‪ TL-‬וה‪PC-‬‬
‫בעלי מבנה ויברציוני עשיר יותר בעוד באורך גל חוקר של ‪ 595nm‬לא ניכרים שינויי מבנה והסטות‬
‫משמעותיות ב‪ chirps-‬השונים אך האמפליטודות שונות‪.‬‬
‫‪96‬‬
‫‪97‬‬
‫‪595nm‬‬
‫‪550nm‬‬
‫‪Power FFT‬‬
‫‪Power FFT‬‬
‫‪1600‬‬
‫‪-1‬‬
‫) ‪ν (cm‬‬
‫‪1750‬‬
‫‪1500‬‬
‫‪1500‬‬
‫‪1250‬‬
‫‪1600‬‬
‫‪TL‬‬
‫‪PC‬‬
‫‪NC‬‬
‫‪1000‬‬
‫‪1750‬‬
‫‪-1‬‬
‫) ‪ν (cm‬‬
‫‪1500‬‬
‫‪-1‬‬
‫‪1500‬‬
‫‪1250‬‬
‫‪1000‬‬
‫‪750‬‬
‫תמונה מספר‬
‫‪ - :3.3.9‬טרנספורם‬
‫פורייה בפולסי‬
‫‪ chirped‬שונים‪.‬‬
‫משמאל עבור אורך‬
‫גל חוקר של‬
‫‪ 550nm‬ומימין‬
‫עבור אורך גל חוקר‬
‫של ‪.595nm‬‬
‫בתמונה הקטנה‪-‬‬
‫הכפלה של התדר‬
‫הגבוה עבור פולסי‬
‫ה‪ chirped-‬השונים‬
‫לאמפליטודה של ה‪-‬‬
‫‪.TL‬‬
‫‪-1‬‬
‫) ‪ν (cm‬‬
‫) ‪ν (cm‬‬
‫הפיק השייך לממס ב‪ ~880cm-1-‬מראה באורך גל חוקר של ‪ 595nm‬אמפליטודת זהות יחסית בעוד‬
‫באורך גל חוקר של ‪ 550nm‬האמפליטודה מקסימאלית מתקבלת בפולס בעל ה‪ PC-‬בעוד עבור תדרי‬
‫המולקולה פולס זה מציג את האמפליטודה הנמוכה ביותר‪ .‬תוצאות הממס מפתיעות‪ ,‬ציפינו כי כיוון‬
‫שהעירור עבור הממס מבוצע רחוק מרזוננס‪ ,‬לא נראה אפקט ליווי דינמי של ה‪) chirp-‬לא נראה השפעה‬
‫של צורת הפולס על עוצמת ויברצית הממס( וזה לא מה שנראה בתוצאותינו‪ ,‬בהם הויברציה הדומיננטית‬
‫ביותר השייכת לממס מראה התנהגות לא סימטרית ביחס ל‪ .chirp-‬תחילה חשבנו כי הדבר נובע‬
‫מאינטראקציה הדדית עם הכרומופור אך גם ניסוי על אתנול נקי )לא מוצג כאן( הראה חוסר סימטריה כך‬
‫שכרגע אין לנו הסבר לתופעה ומחקר נוסף נדרש‪ ,‬אם כי אנו משערים שהדבר קשור לשדה הקרינה עצמו‬
‫או‪/‬ו להתאבכויות בזמן של הפולסים הקצרים‪.‬‬
‫הקשר הכפול‪:‬‬
‫התדר הכפול השייך למולקולה‪ ,‬מציג שינויי אמפליטודה השונה מהנראה בממס וגם עבורו המגמה משתנה‬
‫באורכי גל חוקר שונים‪ ,‬אם כי בשני אורכי גל החוקר המוצגים כאן האמפליטודה המקסימלית מתקבלת‬
‫ב‪) TL-‬ייתכן כיוון שה‪ TL-‬מציג את הפולס הקצר ביותר(‪ .‬השוואה לפולס ה‪ TL-‬ע"י הכפלת ה‪chirps-‬‬
‫השונים )ה‪ PC-‬הוכפל בשני המקרים ב‪ 1.6-‬בעוד ה‪ NC-‬הוכפל ב‪ 2.7-‬רק במקרה של אורך גל חוקר ב‪-‬‬
‫‪ (550nm‬נראית בתמונה הקטנה‪ .‬לאחר ההכפלה לא ניכרים תדרים שונים אך נראה היסט עדין שמגמתו‬
‫זהה בשני אורכי הגל החוקר‪ ,‬ה‪ PC-‬נמשך לתדר נמוך יותר בעוד ה‪ NC-‬נמשך לתדר גבוה יותר‬
‫בהשוואה ל‪.TL-‬‬
‫ניסוי שלושה פולסים המערב פולסים עם ‪:chirp‬‬
‫עוד ביצענו ניסוי שלושה פולסים אשר בו הפולס השני הינו פולס המערב ‪ .chirp‬כפי שהוסבר קודם‪,‬‬
‫בניסוי שלושה פולסים ניתן לדגום את המצב המעורר כך שבאנלוגיה לניסוי שני פולסים‪ ,‬פולס בעל ‪NC‬‬
‫עשוי להגביר את האוסילציות במצב המעורר בעוד ‪ PC‬מדכא אותם‪ .‬ניסוי שמערב שלושה פולסים וכולל‬
‫עיצוב של הפולסים דורש רמת דיוק גבוהה לכן נביא כאן רק את הניסוי הנקי ביותר כאשר בחרנו להציג‬
‫‪97‬‬
‫‪98‬‬
‫את אותם אורכי גל חוקר בעיכוב זמן של ‪ 200fs‬בו נראה המצב המעורר בצורה הטובה ביותר בניסוי‬
‫הקודם שעירב שלושה פולסים‪ .‬התוצאות נראות בתמונה מספר ‪.3.3.10‬‬
‫‪1750‬‬
‫‪1500‬‬
‫‪1250‬‬
‫‪1000‬‬
‫‪750‬‬
‫‪500‬‬
‫‪250‬‬
‫‪1750‬‬
‫‪1500‬‬
‫‪1250‬‬
‫‪1000‬‬
‫‪750‬‬
‫‪500‬‬
‫‪250‬‬
‫‪TL‬‬
‫)‪Time (fs‬‬
‫‪=550nm‬‬
‫‪probe‬‬
‫‪FFTPower‬‬
‫‪NC‬‬
‫‪Res inλ‬‬
‫תמונה מספר ‪:3.3.10‬‬
‫שאריות‬
‫משמאל‪-‬‬
‫אוסילטוריות של ספקטרום‬
‫הבליעה הטרנזיינטי‪ ,‬באורכי‬
‫גל חוקר של ‪550nm‬‬
‫)למעלה( ו‪) 595nm-‬למטה(‬
‫בצורה מופרדת עבור כל‬
‫‪.chirp‬‬
‫מימין‪ -‬טרנספורם פורייה של‬
‫אוסילציות אלו‪.‬‬
‫‪-1‬‬
‫) ‪ν (cm‬‬
‫)‪Time (fs‬‬
‫‪800 1000 1200 1400 1600‬‬
‫‪PC‬‬
‫‪800 1000 1200 1400 1600‬‬
‫‪-1‬‬
‫) ‪ν (cm‬‬
‫)‪Time (fs‬‬
‫‪-1‬‬
‫) ‪ν (cm‬‬
‫‪1500‬‬
‫‪1750‬‬
‫‪1250‬‬
‫‪1000‬‬
‫‪750‬‬
‫‪600‬‬
‫‪400‬‬
‫‪200‬‬
‫)‪Time (fs‬‬
‫‪500‬‬
‫‪800 1000 1200 1400 1600‬‬
‫‪250‬‬
‫‪600‬‬
‫‪400‬‬
‫‪200‬‬
‫‪TL‬‬
‫‪NC‬‬
‫‪probe‬‬
‫‪Resinλ‬‬
‫‪FFTPower‬‬
‫‪=595nm‬‬
‫ביחידות‬
‫הגרפים‬
‫‪#‬‬
‫שרירותיות כך שמתמונה זו‬
‫אין להסיק דבר מהעוצמות‬
‫רק‬
‫אלא‬
‫האבסולוטיות‬
‫מהעוצמות היחסיות‪.‬‬
‫‪600‬‬
‫‪400‬‬
‫‪200‬‬
‫‪PC‬‬
‫‪1750‬‬
‫‪1500‬‬
‫‪1250‬‬
‫‪1000‬‬
‫‪750‬‬
‫‪500‬‬
‫‪800 1000 1200 1400 1600‬‬
‫‪250‬‬
‫‪-1‬‬
‫) ‪ν (cm‬‬
‫)‪Time (fs‬‬
‫‪-1‬‬
‫) ‪ν (cm‬‬
‫‪1000 1250 1500 1750‬‬
‫‪750‬‬
‫‪probe @ 595nm‬‬
‫‪500‬‬
‫‪250‬‬
‫‪TL‬‬
‫‪PC‬‬
‫‪NC‬‬
‫‪1000 1250 1500 1750‬‬
‫‪750‬‬
‫‪500‬‬
‫‪FFT Power‬‬
‫תמונה מספר ‪- :3.3.11‬‬
‫טרנספורם פורייה‬
‫בפולסי ‪ chirped‬שונים‬
‫לשם השוואה עבור אורך‬
‫גל חוקר של ‪.595nm‬‬
‫‪600‬‬
‫‪400‬‬
‫‪200‬‬
‫‪250‬‬
‫‪-1‬‬
‫) ‪ν (cm‬‬
‫תמונה ‪ 3.3.11‬משווה את הפולסים השונים באורך גל ‪ probe‬של ‪ ,595nm‬ניתן לראות כי עוצמת‬
‫המודולציות משתנה בתדרים השונים‪ .‬תדר הממס העוצמתי ביותר נראה בפולס בעל ה‪) NC-‬אם כי‬
‫עוצמתו קרובה לפולס ה‪ (TL-‬בעוד עבור יתר המודים ה‪ TL-‬מצוי בעוצמה הגבוהה ביותר בעוד הפולס‬
‫‪128‬‬
‫בעל ה‪ PC-‬כמעט ולא מראה תדרים משמעותיים )גם לא את תדר הממס(‪ .‬מחקר שבוצע במעבדתנו‬
‫הראה כי קיים פולס אופטימאלי לכלל התדרים הנצפים )אפילו לממס( במצב היסוד אם כי נצפתה תלות‬
‫באורך הגל‪ .‬מכאן שייתכן ואנו צופים בתרומה מעורבת של מצב היסוד והמעורר‪.‬‬
‫השוואת עוצמת האוסילציות ב‪ chirps-‬השונים בכל אורך גל חוקר מראה דמיון אך המאפיינים‬
‫הספקטראליים מעט שונים‪ .‬פולס ה‪ TL-‬מציג פעילות באזור ה‪ 1000-1200cm-1-‬ובאורך גל חוקר של‬
‫‪ 550nm‬נראה רצף עקב ריבוי התדרים העולה על גבול הרעש‪ .‬השוואה בין טרנספורמי פורייה של ה‪-‬‬
‫‪ TL‬נראית בתמונה מספר ‪.3.3.12‬‬
‫‪98‬‬
‫‪99‬‬
‫בתמונה זו ניתן לצפות בתוספת תדרים באזור ה‪-‬‬
‫‪-1‬‬
‫) ‪ν (cm‬‬
‫‪1750‬‬
‫‪ 1250cm-1‬ובתדר הכפול ב‪ 1562cm-1-‬השייך‬
‫‪1500‬‬
‫‪1250‬‬
‫‪750‬‬
‫‪1000‬‬
‫‪250‬‬
‫‪500‬‬
‫‪probe @ 550nm‬‬
‫‪probe @ 595nm x2.8‬‬
‫‪TL‬‬
‫למצב היסוד ונראה בעוצמה יותר גבוהה באורך גל‬
‫‪probe @ 550nm‬‬
‫‪probe @ 595nm‬‬
‫את הטרנספורם ב‪ 595nm-‬על מנת ללכד את‬
‫‪1500‬‬
‫‪1750‬‬
‫‪1250‬‬
‫‪FFT Power‬‬
‫חוקר של ‪ .595nm‬בתמונה הקטנה הכפלנו פי ‪3‬‬
‫‪1000‬‬
‫עוצמת תדר הממס והסתכלנו על העוצמה באזור‬
‫תדרי ה‪ ,HOOP-‬הקשר היחיד ‪ C-C‬והתדר‬
‫הכפול‪ .‬מחד התדר הנמוך שיוחס למצב המעורר‬
‫‪1500‬‬
‫‪1750‬‬
‫‪1250‬‬
‫‪750‬‬
‫‪1000‬‬
‫‪250‬‬
‫‪500‬‬
‫‪-1‬‬
‫) ‪ν (cm‬‬
‫נראה עוצמתי יותר ב‪ 595nm-‬בעוד הממס מצוי‬
‫תמונה מספר ‪ - :3.3.12‬השוואת התדרים בפולס‬
‫המכווץ )‪ (TL‬עבור אורכי גל חוקר שונים‪ .‬בכחול‬
‫אורך גל חוקר של ‪ 550nm‬ובאדום ‪.595nm‬‬
‫בתמונה הקטנה‪ -‬הכפלת אורך גל חוקר של ‪ 595nm‬עד‬
‫להתאמת פיק הממס ב‪.880cm-1-‬‬
‫בעוצמה נמוכה‪ ,‬מה שמעיד שהמצב המעורר נראה‬
‫ב‪ 595nm-‬באופן ברור יותר‪ .‬מאידך הפיק ב‪-‬‬
‫‪ 1562cm-1‬שיוחס למצב היסוד נראה יותר‬
‫בבירור ב‪ 595nm-‬בעוד אזור ה‪ 1250cm-1-‬כלל לא נצפה ב‪ .595nm-‬ממצאים אלו עשויים להעיד כי‬
‫התדרים הגבוהים ב‪ 595nm-‬מציגים את מצב היסוד‪ .‬אם כי‪ ,‬מחקר בשיטת ‪ IVS‬תוך שימוש בפולסים‬
‫קצרים של ‪ 7fs‬שבוצע במעבדתנו על ה‪ BR-‬הראה פעילות ‪ HOOP‬שדועכת מהר בתדר דומה של‬
‫‪ ,1290cm-1‬הם ייחסו זאת בהססנות למצב המעורר‪ .88‬בתמונה ‪ 3.3.2‬ובטבלת תדרי מצב היסוד של‬
‫‪ PSB‬ניכר כי ישנם תדרים רבים הנמצאים באזור ה‪ 1250cm-1-‬דבר המקשה מאוד על קבלת מסקנות‬
‫עבור אזור זה‪ .‬בדקנו את זמן הדעיכה של‬
‫התדרים החדשים באזור ה‪ 1250cm-1-‬ע"י‬
‫שינוי זמן ההתחלה של השאריות וביצוע ‪FFT‬‬
‫‪-1‬‬
‫) ‪ν (cm‬‬
‫‪1600‬‬
‫‪1800‬‬
‫‪1200‬‬
‫‪1400‬‬
‫‪800‬‬
‫‪1000‬‬
‫‪-1‬‬
‫‪TL probe @ 550nm‬‬
‫‪880cm‬‬
‫‪start @ 120fs‬‬
‫‪start @ 200fs‬‬
‫על האוסילציות המאוחרות יותר‪ .‬תמונה מספר‬
‫‪FFT Power‬‬
‫‪ 3.3.13‬מציגה את התוצאות‪ .‬נראה כי לתדרים‬
‫אלו זמן דעיכה קצר ביותר‪ .‬זמן זה והרוחב של‬
‫תדרים אלו מחד יכול להצביע על המצב‬
‫?‬
‫המעורר ומאידך יכול להיגרם מחיתוך לא נכון‬
‫של הארטיפקט הקוהרנטי שמתחבר עם ריבוי‬
‫‪-1‬‬
‫‪1800‬‬
‫‪1562cm‬‬
‫‪1600‬‬
‫‪1200‬‬
‫‪1400‬‬
‫‪1000‬‬
‫‪800‬‬
‫‪-1‬‬
‫התדרים הקיים באזור זה‪.‬‬
‫גם כאן ההכרעה באשר למבנה המצב המעורר‬
‫נותרה ללא מענה‪.‬‬
‫) ‪ν (cm‬‬
‫תמונה מספר ‪ FFT - :3.3.13‬עבור אורך גל ‪ probe‬של‬
‫‪) 550nm‬נראה בכחול בתמונה ‪ (3.3.10‬שחושב בזמן‬
‫התחלה נוסף‪.‬‬
‫ניסוי עם פולס קצר ב‪:IR-‬‬
‫נציין כי‪ ,‬ביצענו גם ניסוי עם שני פולסי ‪ NOPA‬קצרים שהמעורר בתחום הנראה והחוקר בתחום ה‪IR-‬‬
‫במסגרת שיתוף פעולה עם פרופ' סירולו באיטליה במטרה לצפות בתרומת המצב המעורר שכן באזור ה‪-‬‬
‫‪ IR‬פעילותו של מצב היסוד זניחה והמצב המעורר הוא הדומיננטי‪ .‬לצערנו כאשר מבצעים ניסוי בו הפולס‬
‫המעורר והחוקר שונים ספקטראלית על אף היותם קצרים הם עוברים הרחבה שונה בדגם מתארכים‬
‫‪99‬‬
‫‪100‬‬
‫משמעותית ועוברים התאבכויות שלא מאפשרות לצפות בתדרים הגבוהים של המצב המעורר בגלל‬
‫הרזולציה הזמנית הנמוכה )תופעה המכונה ‪ , GVM-group velocity mishmash‬בניסיוננו החישוב‬
‫מראה כי הפולס התארך מ‪ 6fs-‬לכ‪ .(30fs-‬בעיה טכנית זו לא אפשרה לראות את התדר הכפול של המצב‬
‫המעורר ומחקר המערב שלושה פולסים כאשר הפולס המעורר ב‪ 400nm-‬וה‪ dump -‬וה‪ probe-‬הם‬
‫פולסי ‪ NOPA‬קצרים ב‪ IR-‬נדרש‪ .‬בניסוי זה שטרם בוצע ניתן יהיה להימנע מתופעת ה‪ GVM-‬וייתכן‬
‫ותדרי המצב המעורר ייחשפו‪.‬‬
‫‪ .3.3.4‬מסקנות הפרק‬
‫למרות הניסויים הרבים שבוצעו הניתוח הינו קשה ומבלבל‪ ,‬וקושי רב קיים בחשיפת מבנה המצב‬
‫המעורר‪.‬‬
‫להלן מספר השערות להעדר ויברציות המצב המעורר‪:‬‬
‫א‪ .‬בעיות הקשורות למולקולת ה‪ RPSB-‬איתה עבדנו‪-‬‬
‫‪ .1‬ייתכן והמצב המעורר והיסודי יושבים באותם תדרים או בתדרים סמוכים מאוד‪ .‬קשה להסכים עם‬
‫הנחה זו לאור תוצאות מחקר הבטא‪-‬קרוטן בתמיסה‪ 86‬שבו תדר המצב המעורר נראה בבירור ומוסט ביחס‬
‫למצב היסוד והרי קיים דמיון בין מולקולה זו ל‪.PSB-‬‬
‫‪ .2‬דומיננטיות המצב היסוד ועודף התדרים הקיימים בו לא מאפשרת לחשוף את תדרי המצב המעורר‬
‫המוחלשים יחסית אליהם או הצמודים אליהם‪.‬‬
‫‪ .3‬למרות זמן החיים הארוך של המצב המעורר ב‪ PSB-‬ייתכן ובמולקולה זו מתקיים מנגנון הרס‬
‫הויברציות כתוצאה מאיבוד קוהרנטיות‪ ,‬הקצר בהרבה ממשך המצב המעורר‪.‬‬
‫ב‪ .‬בעיה הקשורה לשיטה בה עבדנו‪-‬‬
‫שיטת ‪ IVS‬בה אנו עובדים מסיבה שאינה ברורה אינה מאפשרת לצפות בתדרי המצב המעורר‪.‬‬
‫לשם בדיקת הטיעון האחרון החלטנו לחקור בשיטת ‪ IVS‬את מולקולת הבטא‪-‬קרוטן מולקולה שעבורה‬
‫נצפה בבירור תדר גבוה השייך למצב המעורר בשיטת ‪ .86FSRS‬התגליות היו מפתיעות תדר זה נצפה‬
‫בעוצמה חלשה ביותר בשיטתנו ואלמלא היינו יודעים כי הוא קיים שם הוא היה נבלע בגבולות הרעש‬
‫מכאן נדרש מחקר מעמיק המשווה בין השיטות וחושף את מגבלות השיטה‪.‬‬
‫‪100‬‬
‫‪101‬‬
‫‪ .4‬מסקנות‬
‫‪ RPSB‬בתמיסה‬
‫בניסוי זה חקרנו את ה‪ RPSB-‬בתמיסת אתנול בספקטרוסקופית ‪ pump‬ו‪ probe-‬רב ערוצי בשני אורכי‬
‫גל עירור במטרה לבדוק את השפעת אורך גל העירור על הקינטיקה והדינאמיקה‪ .‬נזכיר כי‪ ,‬מחקר ה‪-‬‬
‫‪ RPSB‬חשוב שכן הוא הכרומופור המשותף לכלל החלבונים הרטינליים‪.‬‬
‫המסקנות העולות מניסוי זה הם‪:‬‬
‫עבור שני אורכי גל העירור התקבלה פליטה רדודה ובעלת מבנה דו דבשתי שנמשכה עמוק ל‪ IR-‬הקרוב‪.‬‬
‫פליטה רחבה שכזו טרם דווחה עד כה‪ .‬הפליטה הרדודה ובעלת המבנה נראה כנגרמת בשל קיומה של‬
‫בליעה נוספת השייכת למצב המעורר באזור זה‪ ,‬החופפת על הפליטה‪ ,‬בדומה למה שנטען עבור ה‪.BR-‬‬
‫מממצא זה ניתן להקביל בין בליעת המצב המעורר ב‪ PSB-‬בתמיסה הנמצאת ב‪500nm -‬לבליעת המצב‬
‫המעורר ב‪ BR-‬הנמצאת ב‪ .460nm-‬נראה כי כל ההבדל נובע ממיקומה של בליעת מצב היסוד )‪450nm‬‬
‫לעומת ‪ 560nm‬בהתאמה(‪.‬‬
‫בשני אורכי גל העירור נצפתה דעיכה מולטי‪-‬אקספוננציאלית הכוללת בתוכה רכיב מהיר של כ‪150fs-‬‬
‫ושני רכיבי דעיכה של ‪ 1.5ps‬ו‪) 6ps-‬קבועים אלו דומים לקבועי הדעיכה שדווחו בעבר(‪ .‬דעיכה זו דומה‬
‫לדעיכה שדווחה בחלבון ה‪ HR-‬כך שהבנת מקור הדעיכה חשובה‪ .‬לאור התוצאות ההסבר הסביר ביותר‬
‫לדעיכה זו הינו שהיא נגרמת בשל טופולוגית משטח המצב המעורר‪ .‬לדג'‪ :‬קיומו של מחסום לאורך מסלול‬
‫האיזומריזציה‪.‬‬
‫ההבדל שנצפה בין שני אורכי גל העירור הינו היסט ספקטראלי עקבי של ‪ 15nm‬שנשמר גם לאחר‬
‫שדעיכת המצב המעורר הושלמה‪ .‬היסט זה יוחס לאנהומוגניות בבליעת מצב היסוד של ‪.RPSB‬‬
‫הסברים רבים ניתנו לאנהומוגניות זו כאשר אחד ההסברים הינו קיומם של מצבי ‪ syn‬ו‪ anti-‬של הקשר‬
‫הכפול ‪ .N=C‬לשם בדיקת הסבר זה ביצענו ניסיון דומה על ‪) tert-Bu RPSB‬הטענה הינה כי כעת נמנע‬
‫קיומם של מבנים אלו ומקור ההרחבה יובהר(‪ .‬התוצאות שהתקבלו בעלי מאפיינים ספקטראלים וקינטיים‬
‫דומים אך ללא ההיסט הספקטראלי‪ .‬ממצע זה הבהיר את מקור ההרחבה האנהומוגנית והוביל למציאת‬
‫דגם המשקף טוב יותר את המתרחש בחלבונים הרטינליים‪.‬‬
‫חלבונים רטינליים – המשאבות היוניות‬
‫הלורודופסין‪ -‬מודל רמות האנרגיה של חלבון זה הוסכם ע"י כל החוקרים ושונה מהמודל שהוצע ל‪BR-‬‬
‫בו קיימת מחלוקת רבה בין החוקרים‪ .‬מודל זה ניתן על מנת להסביר את הדעיכה הבי‪-‬אקספוננציאלית‬
‫הקיימת בחלבון זה )דעיכה הדומה לנצפה ב‪ RPSB-‬בתמיסה(‪ .‬מודל רמות זה הפריד את אוכלוסיית‬
‫המצב המעורר לשני מסלולים שהאחד בעל קבוע הזמן הקצר מוביל ליצירת תוצר האיזומר והאחר ‪,‬קבוע‬
‫הזמן הארוך‪ ,‬מוביל חזרה למצב היסוד ההתחלתי‪ .‬מטרתנו הייתה לבחון מודל זה ולהשוות את התוצאות‬
‫ל‪ .BR-‬התוצאות הראו כי אכן קינטיקת ההיפוך הפנימי ב‪ HR-‬הינה מולטי אקספוננציאלית ודומה לזו‬
‫שהתקבלה ב‪ RPSB-‬בתמיסה‪ .‬דעיכה זו כוללת רכיב מהיר של ‪ 150fs‬ורכיבי דעיכה ארוכים יותר‬
‫‪101‬‬
‫‪102‬‬
‫שדווחו בעבר ותרמו להסקת מודל רמות האנרגיה )‪ 2ps‬ו‪ .(5ps-‬ניסוי ‪ SEP‬בשלושה פולסים )בדומה‬
‫לניסוי שבוצע בעבר ל‪ (BR-‬במטרה לבדוק הן את אופי המצב המעורר והן את היווצרות התוצר תוך‬
‫ריקון אוכלוסיית המצב המעורר בזמנים שונים לבחינת המודל בוצע‪ .‬התוצאות הראו כי גם ריקון בזמנים‬
‫ארוכים שלפי המודל אינם תורמים ליצירת התוצר נצפתה השפעה על כמות התוצר‪ .‬ממצא זה הראה כי‬
‫אין הפרדה קינטית לשני מסלולים שונים והפריך את מודל רמות האנרגיה שניתן עד כה לחלבון זה‪.‬‬
‫באשר לאופי המצב המעורר נראה כי חתך הפעולה לפליטה קבוע במהלך זמן החיים של המצב המעורר‪.‬‬
‫יוצא שלמרות ההבדל שניכר במשך הדעיכה בין שתי המשאבות )‪ HR‬ו‪ (BR-‬הממצאים שנראו דומים בין‬
‫שני חלבונים רטינליים אלו‪ .‬נציין כי שני החלבונים הציגו זמן דעיכה מהיר של כ‪ 150fs-‬שמקורו טרם‬
‫הובהר‪ .‬הבדל נוסף נראה בפליטה של ה‪ HR-‬שהינה רדודה ובעלת מבנה‪ .‬נראה כי חלבון ה‪ HR-‬דומה גם‬
‫ל‪ RPSB-‬בתמיסה ומחקרו עולה בחשיבות שכן הוא עשוי להיות החוליה המקשרת בין הכרומופור‬
‫בתמיסה לחלבונים‪.‬‬
‫הממצא היחיד שנצפה ונראה כתומך במודל שהוצע הוא קיומה של בליעה מהירה באזור התוצר‬
‫)‪ (~640nm‬שניבנת ביחד עם הבליעה והפליטה של המצב המעורר‪ .‬השאלה המתבקשת היא‪ :‬כיצד‬
‫התוצר נבנה כל כך מוקדם במקביל לבניית המצב המעורר?‬
‫במטרה לענות על שאלה זו השוואנו בין בקטריורודופסין טבעי לאנלוג נעול שלו בו ננעל הקשר הכפול‬
‫הספציפי שעובר איזומריזציה בטבעת מחומשת כך שסיבובו נמנע )התוצר לא נוצר וניתן לבודד את המצב‬
‫המעורר(‪ .‬התוצאות הראו כי גם בטבעי וגם בנעול ישנה עליה מהירה באזור התוצר שנבנת ביחד עם‬
‫המצב המעורר כאשר במקרה של בקטריורודופסין היא הופכת לתוצר ארוך חיים בסקלת המחקר שלנו‬
‫בעוד בנעול היא דועכת עם קינטיקה הדומה לקינטיקת המצב המעורר‪ .‬תוצאות אלו מראות כי העלייה‬
‫המהירה הנצפת באזור התוצר בחלבונים הרטינליים שייכת למצב המעורר ולמעשה יותר ממצב מעורר‬
‫אחד מעורב ואנו אף צופים בחפיפה בין פליטה לבליעה של המצב המעורר )טיעון שניתן בעבר להסבר‬
‫הפליטה הרדודה הנצפת בחלבונים רטינליים אך לא הוכח ניסיונית(‪ .‬נציין כי גם בנעול נראה תהליך מהיר‬
‫של כ‪ .150fs-‬כעת לאור ממצאים אלו נפסל מודל רמות האנרגיה שהוצע ל‪ ,HR-‬אך מודל רמות חדש‬
‫לתהליך ההיפוך הפנימי והאיזומריזציה טרם ניתן ושיתוף פעולה עם קבוצה שעושה חישובים תיאורטיים‬
‫בחלבונים אלו נדרש‪ .‬אם כי נראה שההבדל בין החלבונים טמון בטופולוגית המצב המעורר‪.‬‬
‫ספקטרוסקופיה ויברציונית של ‪ RPSB‬בתמיסה‬
‫הספקטרומים הרחבים שהתקבלו לא סיפקו תשובה באשר למבנה המצב המעורר‪ .‬נראה כי המצב המעורר‬
‫המוביל לאיזומריזציה סביב קשר כפול ספציפי יטמון בתוכו שינויי מבנה גדולים שיבואו לידי ביטוי‬
‫במחקרי ספקטרוסקופיה ויברציונית במרחב הזמן )‪ .(IVS‬קושי רב היה בחשיפת מבנה המצב המעורר‬
‫וניסויים רבים בוצעו‪ .‬המסקנות העולות מניסויים אלו הם‪:‬‬
‫‪ .1‬נראה כי‪ ,‬אנו צופים בעיקר בתרומות ממצב היסוד אך ייתכן וישנם תרומות עדינות של המצב המעורר‬
‫כגון‪ :‬התדר ב‪ 1015cm-1 -‬העשוי לאפיין תנודה של קשר יחיד ‪.C-C‬‬
‫‪102‬‬
‫‪103‬‬
‫‪ .2‬בזמנים מוקדמים ישנה הופעה והיעלמות מהירה של תדרים באזור ה‪ 1250cm-1-‬העשויה לאפיין את‬
‫אזור ה‪ .HOOP-‬אזור זה נצפה בעבר במחקרי ‪ IVS‬עם פולסים קצרים ב‪ .BR-‬הופעה והיעלמות מהירה‬
‫מחד עשויה לייצג את המצב המעורר ומאידך גם תהליכי ‪ dephasing‬ואיבוד קשר פאזה יכולים לגרום‬
‫לדעיכה מהירה של התדירות אם כי‪ ,‬העובדה שהתדר הגבוה‪ ,‬הפגיע יותר לאיבוד הפאזה‪ ,‬נותר ללא שינוי‬
‫מחזקת את הטענה כי אזור זה נתרם מן המצב המעורר‪.‬‬
‫‪ .3‬ייתכן והתדר הכפול מצוי באזור ה‪ 1520cm-1-‬ואנו בגלל הסמיכות לתדר מצב היסוד ולתדר הממס‬
‫הדומיננטיים ביחס למצב המעורר מתקשים להפריד ולבודד אותו‪.‬‬
‫‪ .5‬כיוונים עתידיים‬
‫•‬
‫שיתוף פעולה עם חוקרי תיאוריה של חלבונים שיספקו מודל רמות אנרגיה שיסביר את‬
‫הממצאים הניסיוניים שנצפו‪ .‬מודל כזה עשוי להסביר את ההבדלים הנצפים במערכות אלו ואת‬
‫קבועי הדעיכה השונים‪.‬‬
‫•‬
‫מחקר מערכות מודל נוספות עשוי להסביר את הקשר בין השפעותיו השונות של סביבת החלבון‪.‬‬
‫•‬
‫חשיפת המתרחש במצב המעורר‪ .‬עד כה התדר הנמוך הוא היחיד שיוחס בוודאות למצב המעורר‬
‫לכן מחד נרצה להמשיך ולחקור תדר נמוך זה במערכות נוספות במטרה להבין את הקשר בין‬
‫תדר נמוך זה ליעילות האיזומריזציה ופעילות החלבון‪ .‬מאידך עלינו להבין מדוע ועל אף‬
‫הניסיונות הרבים לא נחשפו תדרים גבוהים עבור המצב המעורר‪ ,‬האם הדבר טמון בשיטה בה‬
‫עבדנו או‪/‬ו באופי הדגמים‪.‬‬
‫"זה אינו הסוף‪ ,‬זה אפילו לא תחילת הסוף‪ ,‬זה רק סופה של ההתחלה"‪...‬‬
‫)וינסטון צ'רצ'יל(‬
‫‪103‬‬
104
1
J.L.Spudich,CS.Yang,KH.Jung,E.N.Spudich;Annu.Rev.Cell Dev.Biol.2000,16,365.
H.Norbert; Chem.Rev. 2000,100,1755.
3
H.Michel, D.Oesterhelt, R.Henderson; Proc.Natl.Acad.Sci.USA.1980,77(1),338.
4
L.Song, M.A.El-Sayed; J.Am.Chem.Soc.1998,120,8889.
5
Q.Zhong, S.Ruhman, M.Ottolenghi; J.Am.Chem.Soc.1996,118,12828.
6
M.C.Nuss, W.Zinth, W.Kaiser; Chem.Phys.Lett.1986,117,1.
7
G.H.Atkinson, L.Ujj, Y. Zhou; J.Phys.Chem.A.2000,104,4130.
8
J.Herbst, K.Heyne, R.Diller; Science.2002,297,822.
9
J.Tittor,S.Paula,S.Subramaniam,J.Heberle,R.Henderson,D.Oesterhelt,J.Mol.Biol. 2002,319,555.
10
J.K.Lanyi; Biochemistry.2001,66,1192.
11
J.K.Lanyi,H.Luecke;Current Opinion in Structural Biology.2001,11,415.
12
R.Neutze,E.Pebay-Peyroula,K.Edman,A.Royant,J.Navarro,E.M.Landau, Biochimica et Biophysica
Acta.2002,1565,144.
13
J.K.Lanyi, B.Schobert; Biochemistry.2004,43,3.
14
(1)M.Kolbe, H.Besir, L.O.Essen,D.Oesterhelt; SCIENCE. 2000, 288,1390.
(2)K.M.Kaplan,V.Brumfeld, M.Engelhard,M.Sheves;Biochemistry.2005,44,14231.
15
Y.Mukohata, K.Ihara, T.Tamura,Y.Sugiyama, J. Biochem.1999,125(4),649.
16
K.A.Freedman,R.S.Becker;J.Am.Chem.Soc.1986,108,1245.
17
R.S.Becker,K.Freedman, J.Am.Chem.Soc.1985,107,1477.
18
S.M.Bachilo,T.Gillbro;J.Phys.Chem.A.1999,103,2481.
19
H.Kandori,H.Sasabe;Chem.Phys.Lett.1993,216,126.
20
(1)S.L.Logunov,L.Song,M.A.El-Sayed;J.Phys.Chem.1996,100,18586.
(2)M.Olivucci,A.Lami,F.Santoro;Angew.Chem.2005,117,5248.
21
S.Shim,R.A.Mathies; J.Phys.Chem.B.2008,112,4826.
22
P.Hamm,M.Zurek,T.Roschinger,H.Patzelt,D.Oesterhelt,W.Zinth; Chem.Phys.Lett.1996,263,613.
23
P.Hamm,M.Zurek,T.Roschinger,H.Patzelt,D.Oesterhelt,W.Zinth; Chem.Phys.Lett.1997,268,180.
24
B.Hou,N.Friedman,S.Ruhman,M.Sheves,M.Ottolenghi; J.Phys.Chem.B.2001,105,7042.
2
25
(1)J.M.Donahue,W.H.Waddell;Photochemistry and Photobiology.1984,40(3),399.
(2)Y.Koyama,K.Kubo,M.Komori,H.Yasuda,Y.Mukai;Photochemistry and Photobiology.1991,54,433.
26
G.Zgrablic,K.Voitchovsky,M.Kindermann,S.Haacke,M.Chergui;Biophysical Journal.2005,88,2779.
27
E.P.Ippen, C.V.Shank, A.Lewis, M.A.Marcus;Science.1978,200,1279.
28
M.L.Applebury, K.S.Peters, P.M.Rentzepis; Biophysical Journal.1978,23,375.
29
J.Dobler, W.Zinth, K.Kaiser,D.Oesterhelt; Chem.Phys.Lett.1988,144,215.
30
B.Schmidt, C.Sobotta, B.Heinz, S.Laimgruber, M.Braun, P.Gilch; Biochimica et Biophysica
Acta.2005,1706,165.
31
R.R.Birge, L.A.Findsen, B.M.Pierce; J.Am.Chem.Soc.1987,109,5041.
32
F.Gai, J.C.McDonald ,P.A.Anfinrud; J.Am.Chem.Soc.1997,119, 6201.
33
R.A.Mathies,C.H.Brito Cruz,W.T.Pollard,C.V.Shank; Science.1988,240,777.
34
T.Rosenfeld,B.Honig,M.Ottolenghi,J.Hurley,T.G.Ebrey; Pure and Appl.Chem.1977,49,341.
35
J.B.Hurley,T.G.Ebrey,B.Honig,M.Ottolenghi;Nature.1977,270,540.
36
H.Kandori,K.Yoshihara,H.Tomioka,H.Sasabe;J.Phys.Chem.1992,96,6066.
37
M.Yan, L.Rothberg,R.Callender; J.Phys.Chem.B.2001,105,856.
38
H.J.Polland,M.A.Franz,W.Zinth,W.Kaiser,P.Hegemann,D.Oesterhelt,Biophysical Journal.1985,47,
55.
39
T.Arlt,S.Schmidt,W.Zinth,U.Haupts,D.Oesterhelt;Chem.Phys.Lett.1995,241,559.
40
H.Kandori,K.Yoshihara,H.Tomioka,H.Sasabe,Y.Shichida; Chem.Phys.Lett.1993,211,385.
41
T.Kobayashi,M.Kim,M.Taiji,T.Iwasa,M.Nakagawa,M.Tsuda;J.Phys.Chem.B.1998,102,272.
42
K.C.Hasson,F.Gai, P.A.Anfinrud; Proc.Natl.Acad.Sci.USA.1996,93,15124.
43
W.Humphrey,H.Lu,I.Logunov,H.J.Werner,K.Schulten;Biophysical Journal.1998, 75,1689.
44
T.Kobayashi,T.Saito,H.Ohtani;Nature.2001,414,531.
45
T.Ye,N.Friedman,Y.Gat,G.H.Atkinson,M.Sheves,M.Ottolenghi,S.Ruhman; J.Phys.Chem.B.1999,103,
5122.
46
J.K.Delaney,T.L.Brack,G.H.Atkinson,M.Ottolenghi,G.Steinberg,M.Sheves,Proc. Natl.Acad.Sci.USA.
1995,92,2101.
47
M.Du,G.R.Fleming; Biophysical Chemistry.1993,48,101.
48
G.Haran,K.Wynne,A.Xie,Q.He,M.Chance,R.M.Hochstrasser;Chem.Phys.Lett.1996,261,389.
49
A.C.Terentis,L.Ujj,H.Abramczyk,G.H.Atkinson;Chem.Phys.2005,313,51.
50
M.Garavelli,P.Celani,F.Bernardi,M.A.Robb,M.Olivucci;J.Am.Chem.Soc.1997,119,6891.
104
105
51
M.Garavelli,F.Nergi,M.Olivucci;J.Am.Chem.Soc.1999,121,1023.
H.Kandori,H.Sasabe,K.Nakanishi,T.Yoshizawa,T.Mizukami,Y.Shichida; J.Am.Chem.Soc.1996,118,
1002.
53
G.Haran,E.A.Morlino,J.Matthes,R.H.Callender,R.M.Hochstrasser;J.Phys.Chem.A.1999,103,2202.
54
T.Kakitani,R.Akiyama,Y.Hatano,Y.Imamoto,Y.Shichida,P.Verdegem,J.Lugtenburg;J.Phys.Chem.B.
1998,102,1334.
55
S.L.Dexheimer,Q.Wang,L.A.Peteanu,W.T.Pollard,R.A.Mathies,C.V.Shank;Chem.Phys.Lett.1992,
188,61.
56
S.L.Logunov,V.V.Volkov,M.Braun,M.A.El-Sayed,PNAS.2001,98,8475.
57
S.Ruhman,B.Hou,N.Friedman,M.Ottolenghi,M.Sheves;J.Am.Chem.Soc.2002,124,8854.
58
J.K.Lanyi; Ann.Rev.Biophys. Biophys.Chem. 1986,15,11.
59
D.B.Bivin,W. Stoeckenius;J.Gen.Microbiol.1986,132,2167.
60
F.Peters,J.Herbst,J.Tittor,D.Oesterhelt,R.Diller;Chem.Phys.2006,323,109.
61
T.Nakamura,S.Takeuchi,M.Shibata,M.Demura,H.Kandori,T.Tahara;J.Phys.Chem.B.2008,112,12795.
62
S.L.Logunov,T.M.Masciangioli,V.F.Kamalov,M.A.El-Sayed; J.Phys.Chem.B.1998,102,2303.
63
A.Aharoni,A.Khatchatouriants,A.Manevitch,A.Lewis,M.Sheves; J.Phys.Chem.B.2003,107,6221.
64
C.Irving,G.Byers,P.Leermakers;J.Am.Chem.Soc.1969,91,2141.
65
J.Y.Huang,Z.Chen,A.Lewis; J.Phys.Chem.1989,93,3314.
66
R.R.Birge,C.F.Zhang; J.Phys.Chem.1990,92,7178.
67
D.Xu,C.Martin,K.Schulten;Biophysical Journal.1996,70,453.
68
K.Heyne,J.Herbst,B.Dominguez-Herradon,U.Alexiev,R.Diller; J.Phys.Chem.B. 2000,104,6053.
69
M.Nonella;J.Phys.Chem.B.2000,104,11379.
70
U.Zadok,A.Khatchatouriants,A.Lewis,M.Ottolenghi,M.Sheves;J.Am.Chem.Soc.2002,124,11844.
71
I.Lutz,A.Sieg,A.A.Wegener,M.Engelhard,I.Boche,M.Otsuka,D.Oesterhelt,J.Wachtveitl,W.Zinth;
Proc.Natl.Acad.Sci.USA.2001,98(3),962.
72
O.Bismuth, N.Friedman, M.Sheves, S. Ruhman; J. Phys. Chem. B, 2007, 111 (9), 2327.
73
(1)K.A.Freedman,R.S.Becker; J.Am.Chem.Soc.1986,108,1245.
(2) R.S.Becker,K.A.Freedman; J.Am.Chem.Soc.1985,107,1477.
74
M.Garavelli;Theor.Chem.Acc.2006,116,87.
75
T.Ye,E.Gershgoren,N.Friedman,M.Ottolenghi,M.Sheves,S.Ruhman;Chem.Phys.Lett.1999,314,429.
76
A.B.Myers,R.A.Harris,R.A.Mathies;J.Chem.Phys.1983,79(2),603.
77
G. Cerullo, C. Manzoni, L. Luer , D. Polli, Photochem. Photobiol. Sci. 2007, 6,135.
‫ עבודת גמר לתואר מוסמך במדעי‬,‫ מעקב אחר דינאמיקה של אוכלוסיות באמצעות פולסי פמטושניות מעוצבים‬,‫ נחמיאס‬.‫ ע‬78
. 2005 ,‫הטבע באוניברסיטה העברית בירושלים‬
‫ חיבור לש קבלת תואר‬,‫ חקר דינאמיקה מולקולארית בפאזה מעובה בסקאלת זמני של פמטושניות‬,‫ ולדמ‬.‫ א‬79
.1994 ,‫דוקטור לפילוסופיה באוניברסיטה העברית בירושלי‬
80
D.W.McCamant,P.Kukura,R.A.Mathies;J.Phys.Chem.B.2005,109,10449.
81
S.O.Smith,A.B.Myers,R.A.Mathies,J.A.Pardoen,C.Winkel,E.M.M.van den Berg,J.Lugtenburg;
Biophys J. 1985,47,653.
82
S.O.Smith,M.S.Braiman,A.B.Myers, J.A.Pardoen,J.M.L.Courtin,C.Winkel,J.Lugtenburg,
R.A.Mathies;J.Am.Chem.Soc.1987,109,3108.
83
B.Aton, A.G. Doukas, R.H.Callender, B. Becher, T.G. Ebrey; Biochem. 1977, 16, 2995.
84
L.Ujj,Y.Zhou,M.Sheves,M.Ottolenghi,S.Ruhman,G.H.Atkinson; J.Am.Chem.Soc.2000,122,96.
85
S.Shim,J.Dasgupta,R.A.Mathies;J.Am.Chem.Soc.2009,131,7592.
86
D.W.McCamant,P.Kukura,R.A.Mathies; J.Phys.Chem.A.2003,107,8208.
87
T.Kobayashi,T.Saito,H.Ohtani;NATURE.2001,414,531.
88
A.Kahan,O.Nahmias,N.Friedman,M.Sheves,S.Ruhman; J.Am.Chem.Soc.2007,129,537.
89
B.Hou,N.Friedman,M.Ottolenghi,M.Sheves,S.Ruhman,Chem.Phys.Lett.2003,381,549.
90
G.Zgrablic,S.Haacke,M.Chergui;Chem.Phys.2007,338,168.
91
G.Haran,K.Wynne,A.Xie,Q.He,M.Chance,R.M.Hochstrasser,Chem.Phys.Lett.1996,261,389.
92
S.W.Lin,M.Groesbeek,I.van der Hoef,P.Verdegem,J.Lugtenburg,R.A.Mathies,J.Phys.Chem.B.1998,
102,2787.
93
(1)C.J.Bardeen,Q.Wand,C.V.Shank;Phys.Rev.Lett.1995,75(19),3410.
(2) C.J.Bardeen,Q.Wand,C.V.Shank;J.Phys.Chem.A.1998,102,2759.
94
G.D.Reid, K.Wynne; Ultrafast Laser Technology and Spectroscopy in Encyclopedia of Analytical
Chemistry , 2000.
95
M.T.Asaki, C.P.Huang, D.Garvey, J.Zhou, H.C.Kapteyn, M.M.Murnane; Opt.Lett.1993,18,977.
96
S.Backus, J.Peatross, C.P.Huang, M.M.Murnane, H.C.Kapteyn, Opt.Lett.1995,20,2000.
97
T.Wilhelm,J.Piel,E.Riedle;Opt.Lett.1997,22(19),1494.
52
105
106
98
M.Loktev,O.Soloviev,G.Vdovin;OKO Technologies.2006.
(1)C.J.Bardeen,Q.Wand,C.V.Shank;Phys.Rev.Lett.1995,75(19),3410.
(2) C.J.Bardeen,Q.Wand,C.V.Shank;J.Phys.Chem.A.1998,102,2759.
100
R.Trebino,K.W.DeLong,D.N.Fittinghoff,J.N.Sweetser,M.A.Krumbugel,A.B.Richman,D.J.Kane;Rev.
Sci.Instrum.1997,68(9),327.
101
A.Wand, Chirp Effects on Impulsive Vibrational Spectroscopy: A Multimode Perspective, Thesis
submitted for the degree of "Master of Sciences", 2009.
‫ חיבור לשם קבלת תואר דוקטור לפילוסופיה באוניברסיטה העברית‬,‫תהליכי העברת אלקטרון מושרים אור בפאזה מעובה‬,‫ שושנים‬.‫א‬102
.2009 ,‫בירושלים‬
103
N.P.Ernsting, S.A.Kovalenko, T.Senyushkina, J.Saam, V.Farztdinov;
J.Phys.Chem.A.2001,105,3443.
104
I.H.M.van Stokkum, D.S.Larsen, R.van Grondelle; Biochimica et Biophysica Acta, 2004,1657,82.
105
O.Bismuth, N.Friedman, M.Sheves, S. Ruhman; Chem. Phys.2007, 341, 267.
106
(1)N.Livnah,M.Sheves;Biochemistry.1993,32(28),7223.
(2)M.Sheves,T.Baasov; J.Am.Chem.Soc.1984,106,6840.
107
J.Zhu,O.Bismuth,I.Gdor,A.Wand,N.Friedman,M.Sheves,S.Ruhman;Chem. Phys Lett.2009, 479, 229.
108
D.Oesterhelt, W.Stoeckenius; Methods Enzymol, 1974, 31, 667.
109
J.Fang, J.Carriker, V.Balogh-Nair, K.Nakanishi, J.Am.Chem.Soc.1983,105,5162.
110
T. Ye, N.Friedman, Y.Gat, G.H.Atkinson, M.Sheves, M.Ottolenghi, S.Ruhman, J.Phys.Chem.B.1999,
103,5122.
111
O.Bismuth, P.Komm, N.Friedman, T.Eliash, M.Sheves, S.Ruhman. J.Phys.Chem.B.2010,114,3046.
112
G.Cerullo,L.Luer,C.Manzoni,S.De Silvestri,O.Shoshana,S.Ruhman;J.Phys.Chem.A.2003,107(40),
8339.
113
V.F.Kamalov,T.M.Masciangioli,M.A.E-Sayed;J.Phys.Chem.1996,100,2762.
114
G.R.Loppnow,R.A.Mathies,T.R.Middendorf,D.S.Gottfried,S.G.Boxer; J.Phys.Chem.1992,96,737.
115
S.Haacke,S.Vinzani,S.Schenkl,M.Chergui;Chem.Phys.Chem.2001,2,310.
116
T.Baasov,N.Friedman,M.Sheves;Biochemistry.1987,26,3210.
117
C.Pfisterer,A.Gruia,S.Fischer;J.Biological.Chemistry.2009,284,13562.
118
A.Aharoni,B.Hou,N.Friedman,M.Ottolenghi,I.Rousso,S.Ruhman,M.Sheves,T.Ye,Q.Zhong;
Biochemistry.2001,66(11),1210.
‫ עבודת גמר לתואר מוסמך במדעי הטבע באוניברסיטה‬,‫ דינאמיקה מושרת אור בבקטריורודופסין וברטינל‬,‫ ביסמוט‬.‫ א‬119
. 2005 ,‫העברית בירושלים‬
120
J.E.Kim,R.A.Mathies;J.Phys.Chem.A.2002,106,8508.
121
J.Lobaugh,P.J.Rossky; J.Phys.Chem.A.1999,103,9432.
122
SDBS Web – Spectral Database for Organic Compounds.
123
S.Ruhman,A.G.Joly,K.A.Nelson; J.Phys.Chem.1987,86(11),6563.
124
W.T.Pollard,S.L.Dexheimer,Q.Wang,L.A.Peteanu,C.V.Shank,R.A.Mathies;J.Phys.Chem.1992,96,
6147.
125
(1)F.Rosca,D.Ionascu,A.T.N.Kumar,A.A.Demidov,P.M.Champion;Chem.Phys.Lett.2001,337,107.
(2) A.T.N.Kumar, F.Rosca,A.Widom, P.M.Champion; J.Phys.Chem.2001,114,701.
126
S.Ruhman,A.G.Joly,K.A.Nelson; J.Phys.Chem.1987,86(11),6563.
127
T.Kobayashi,A.Yabushita,T.Saito,H.Ohtani,M.Tsuda;Photochemistry and Photobiology. 2007,83,
363.
128
A.Wand,S.Kallush,O.Shoshanim,O.Bismuth,R.Kosloff,S.Ruhman;Phys.Chem.Chem.Phys.2010,12,
2149.
99
106
Table of Contents
1
Summary of Literature
1.1
Retinal Proteins
1
1.1.1
Bacteriorhodopsin
2
1.1.2
Halorhodopsin
5
1.1.3
Comparison between the Ion Pumps
7
1.2
Kinetics and Dynamics
8
1.2.1
RPSB in Solution
8
1.2.2
Bacteriorhodopsin
11
1.2.3
Halorhodopsin
15
1.2.4
Influence of Retinal Proteins on the Photochemistry
17
1.2.5
Vibrational Spectroscopy
20
1.3
Research Goals
27
2
Experimental and Analysis Methods
2.1
General
28
2.2
LASER
29
2.2.1
Oscillator
29
2.2.2
Stretcher
30
2.2.3
Single Pulse Selector
31
2.2.4
Multipass Amplifier
31
2.2.5
Compressor
32
2.3
Optical Parametric Amplifier
33
2.3.1
TOPAS
33
2.3.2
NOPA
33
Pulse Shaping
34
2.4.1
Shaper
34
2.4.2
Chirped Pulses
36
2.4
2.5
Pulse Characterization
37
2.5.1
Autocorrelation
37
2.5.2
Kerr Effect
38
2.6
Experimental Setup
40
2.6.1
Pump-Probe
40
2.6.2
Data Collection
41
2.6.3
Data Analysis
44
2.6.4
Samples
47
2.6.5
Optics Cells
49
2.6.6
Specific Experiment Setup
49
3
Results and Discussion
3.1
RPSB in Ethanol
51
3.1.1
Results
51
3.1.2
Discussion
55
3.2
Retinal Protein – Ion Pumps
61
3.2.1
Halorhodopsin - Results
61
3.2.2
Halorhodopsin – Discussion
67
3.2.3
Bacteriorhodopsin and Locked Analogue - Results
71
3.2.4
Bacteriorhodopsin and Locked Analogue - Discussion
77
3.2.5
Comparison between the Ion Pumps
38
3.3
Vibrational Spectroscopy of RPSB in Solution
85
3.3.1
Two Pulses Experiment
86
3.3.2
Three Pulses Experiment
91
3.3.3
Chirped Pulses Experiment
96
3.3.4
Conclusions
100
4
Conclusions
101
5
Future Plan
103
6
References
104
Abstract
Retinal proteins are trans-membrane proteins which convert solar energy into
biological function in organisms as primitive as bacteria and archaea, or as complex
as mammals. In them all, biological activity is fueled by photon energy absorbed by a
retinal chromophore covalently linked to the protein via a Protonated Schiff Base
(RPSB) which is surrounded by 7 α-helices. The retinal moiety consequently
isomerizes around a specific C=C double bond on a timescale which varies from a
few hundred femtosecond (fs) to a few picoseconds (ps). New members of this
ubiquitous family of protein are being discovered even now, demonstrating the
versatility of this basic architecture for bio-utilization of solar energy.
Our research focus in the primary light-induced ultrafast events, which are
believed to hold the key for efficient photon energy storage and fixation in a way that
is readily available to later cellular function, in two retinal ion pumps –
Halorhodopsin and Bacteriorhodopsin. Both of them perform light energized cyclical
transformations which result in directional transport of specific ions across the cell
membrane. Halorhodopsin (HR) transports mainly chloride ions into the archaeon’s
cytoplasm thus controlling intracellular ionic strength. The other, bacteriorhodopsin
(BR), functions as a light activated proton pump and is the most extensively studied
retinal protein.
Primary light induced events have accordingly been investigated for decades,
using ultrafast spectroscopy for opening this window of time on bacterial retinal
proteins. The primary photoinduced dynamics in BR have been recorded. Results
demonstrate that photon absorption unleashes dramatic subpicosecond spectral
changes, consisting of the appearance of a near IR stimulated emission band peaking
at ~850nm, and a strong blue absorption around 460nm, both assigned to the reactive
excited state denoted “I460”. These features decay concertedly within ~1ps , leading to
a ground state intermediate coined “J625”, exhibiting an absorption band peaked at
625nm.
The insight arising from these studies are, first that as expected for asymmetric
conjugated polyenes, the initial light induced response of BR predominantly involves
carbon-carbon stretching, and not torsion of the active C=C double bond of the
retinal. Evidence for this is seen in resonance Raman, absorption spectra and in pumpprobe studies of modified pigments containing “locked” retinal groups where torsion
in the active double bond is prohibited by its inclusion in a tight hydrocarbon ring. In
the locked proteins the earliest spectral changes including the buildup of the red
shifted emission from the fluorescent I460 intermediate still take place. The
predominance of C-C stretching in the early response of excited BR is also upheld by
theoretical simulations. Another point of isomerization dynamics was addressed by
probing BR’s reactive fluorescent state using femtosecond stimulated emission
pumping in the near IR (three pulses involve –pump/dump/probe). The perplexing
result was that akin to the linear absorption and emission spectra of I460, the emission
cross section from this state is constant. The dumping also depletes the generation of
“K” to a degree which is commensurate with the dump induced depletion. These
results show that no obvious difference can be detected between the excited
population before and after culmination of the rapid initial state of IC (Internal
Conversion), either in term of the cross section for stimulated emission in the NIR, or
in term of the effect of that dumping on the generation of later photocycle products.
The primary events of Halorhodopsin also investigating with varied of
spectroscopy methods included pump-probe and similar BR spectroscopy
characterizes were observed. HR kinetics internal conversion was different, compare
to the BR, well fit to a bi-exponential decay function with time constant of ~1.5ps and
~5ps, both with nearly equal amplitudes. In combination with the uncharacteristically
low quantum yield (QY) for isomerization , the bi-exponential IC was assigned to two
distinct excited state populations, only one of which (1.5ps) is a photocycle
intermediate, the other (5ps) leading back to the reactant state, contrary to the
behavior reported for BR.
The protein plays a vital role in controlling the photochemistry of the common
chromophore (RPSB). To assess this, photoinduced dynamics of retinal PSB in
solution have been compared to the retinal protein. Not only does IC take place
slower when all trans retinal PSB is excited in solution, but isomerization of C13=C14
which is the exclusive reactive outcome in ion pumps, is not even the main PSB
photoproduct. The QY of the RPSB in solution at the specific C13=C14 bond is less
compare to the QY of this bond at the ion pumps. The dramatic influence binding to
the protein has on RPSB is evident already from protein absorption spectrum (BR and
HR), which is nearly 5000cm-1 red shifted from that of free RPSB in solution.
Understanding this “opsin shift” remains a major issue in the study of retinal proteins.
Even after a lot of experiments, there are open questions about the
isomarization dynamics: How many vibrational degrees of freedom need be
considered to describe the evolution at the excited state? Are two electronic surfaces
and the crossing between them sufficient for understanding the primary events, or is a
three state model necessary? How does the protein regulate triggering of the
photocycle? How does it increase the rate of isomerization so effectively, and direct
reactivity to a channel which is of secondary importance for free PSB? Can the part
played by the protein be broken down to specific interactions and structural changes?
In order to construct a detailed dynamics model for the initial stages of retinal proteins
photocycle and understand of how particular aspects of retinal-protein interactions
determine those dynamics will be obtain by pump-probe spectroscopy for investigate
retinal protein, RPSB in solution and synthetic cromophores and pigments.
(A) Ion Pumps – The primary photochemical dynamics of Hb. pharaonis
Halorhodopsin (pHR) are investigated by femtosecond visible pump−near IR
dump−hyperspectral probe spectroscopy. The efficiency of excited state depletion
is deduced from transient changes in absorption, recorded with and without
stimulated emission pumping (SEP), as a function of the dump delay. The
concomitant reduction of photocycle population is assessed by probing the “K”
intermediate difference spectrum. Results show that the cross section for
stimulating emission is nearly constant throughout the fluorescent state lifetime.
Probing “K” demonstrates that dumping produces a proportionate reduction in
photocycle yields. We conclude that, despite its nonexponential internal
conversion (IC) kinetics, the fluorescent state in pHR constitutes a single
intermediate in the photocycle. This contrasts with conclusions drawn from the
study of primary events in the related chloride pump from Hb. salinarum (sHR),
believed to produce the “K” intermediate from a distinct short-lived
subpopulation in the excited state and with agreement to behavior reported for
BR. The rapid appearance of absorption near 650nm where the K difference
spectrum peaks was seen at much faster time than the overall relaxation back to
the ground state, as reported at previous studies. This observation assigns the fast
phase of IC to the reactive channel, how can we explain it?
Compare between native BR to locked BR can reveal the answer because at the
locked BR we observe only the excited state without creation of “K”
intermediate. The “locked” protein that can’t create “K” show a buildup of the
absorption near 650nm. The meaning of this is that the rapid absorption, which
located at the same place of the production, related to the excited state. Our
results indicated that more than one excited state involves at the excited state and
the excited state absorption overlaps the stimulated emission band. This
explanation was given at previous studies of BR and RPSB in order to explain the
shallow emission that no matched to the dip spontaneous emission.
(B) Protein Effects – A retinal schiff base analogue which closely mimics the
opsin shift in BR has been investigated with femtosecond multichannel pumpprobe spectroscopy. Results demonstrate that the red shift afforded in the model
system does not hasten internal conversion relative to RPSB in solution, and
stimulated emission takes place with biexponential kinetics and characteristic
timescales of approximately 2 and 10.5 ps. This shows that interactions between
the prosthetic group and the protein, which lead to the opsin shift in BR, are not
directly involved in reducing the excited-state lifetime by nearly an order of
magnitude. A subpicosecond phase of spectral evolution which consists of a
discontinuous red shifting of induced absorption features is detected and assigned
to electronic relaxation within the excitedstate manifold. This interpretation is
based on the appearance of identical spectra changes following excitation
anywhere within the reactants intense visible absorption band, and is bolstered by
the isosbestic point observed throughout. The fact that analogous stages of rapid
spectral change are observed nearly in all retinal proteins and free RPSBs
underlines the importance of these findings. Finally, a transient excess bleach
component which tunes with the excitation wavelength is detected in the data and
tentatively assigned to inhomogeneous broadening in the ground-state absorption
band.
(C) Native RPSB in Solution – Photochemistry of protonated all-trans retinal
Schiff-base (RPSB), the active chromophore in archaeal retinal proteins has been
investigated with femtosecond multichannel pump probe spectroscopy at two
excitation wavelengths. Our aim was to uncover any dynamic variations induced
by the shift in excitation energy, and particularly to seek signatures of ground
state inhomogeneity on excited state evolution and IC. A systematic spectral
shifting of ~15nm, extending beyond the phase of excited state decay, is detected
in the main transient spectral bands upon tuning the excitation wavelength from
480 to 390nm. These variations are assigned to long live ground state structural
inhomogeneity of the RPSB. For both excitation wavelengths the stimulated
emission signal is shallow and double humped with a dip in intensity near
750nm. Stimulated emission extends to the reg edge of our probing region, at
950nm, much deeper in the NIR than reported in previous pump-probe studies.
The shallowness and double peaked from of this feature are attributed to an
overlapping excited state absorption, as reported for BR. This assignment
identifies the documented RPSB excited state absorption band which peaks at
500nm as the counterpart of the 460nm absorption feature reported for the
reactive excited state of BR coined I460. While the source of reactant
inhomogeneity remains unknown, the newly detected absorption band and its
assignment provide new insight into the electronic structure of native RPSB in
solution which is the archtypical model for appreciating apoprotein effects on
retinal protein photochemistry.
Photochemistry of all-trans tert-butylamine retinal protonated Schiff-base (TBRPSB) is investigated by femtosecond pump–hyperspectral probe spectroscopy.
Unlike the n-butyl analogue (NB-RPSB) no shifting of the transient spectral
bands is observed upon tuning the excitation pulses from 395 to 475 nm. The
15 nm shift observed for NB-RPSB in similar experiments was assigned to
unspecified ground state structural inhomogeneity. Present results indicate that is
most likely due to the coexistence of C15
N double bond isomers in NB-RPSB.
Elimination of this inhomogeneity in TB-RPSB makes it a more appropriate
model for appreciating protein effects on RPSB photochemistry in retinal
proteins.
(D) Excited State – RPSB is the light activated mainspring which energized
biological activity in retinal protein. Despite the pivotal role it plays, and years of
investigation, the vibrational spectrum of the reactive S1 state in solvated RPSB,
or in the native protein, has yet to be measured. This information is vital for
understanding the debated structural dynamics accompanying internal conversion
and the role of apoprotein in directing reactivity of retinal proteins. Of particular
interest are the changes in the frequency of C=C stretches, which are indicative of
the alterations in bond order – an essential stage of isomerization. Remarkably,
this frequency has yet to be determined reliably in any retinal protein or in RPSB.
In BR, this proves challenging due to the short lifetime of S1 and to extensive
spectral overlap with S0 bands. Previous studies show slow decay, compare to BR
(2ps and 7ps) that assessed from transient absorption features, variations in such
broad and unstructured electronic bands do not disclose shifts in chemical
bonding and molecular geometry.
The missing structural information can be obtained by impulsive vibrational
spectroscopies (IVS). Initial attempts have been made to use both methods to
follow radiationless decay and isomerization in BR. Low frequency spectral
modulations (~160cm-1) which were observed in I460 stimulated emission were
assigned to excited state coherent torsions. However, coverage of all Raman
active frequencies in retinal requires 10fs laser pulses. In a pioneering study
Shank, Mathies et al used 12fs dye laser pulses to pump and follow dispersed
spectral changes. Spectral modulations observed in their data were assigned
exclusively to RISRS induced motions, providing information equivalent to
ground state resonance Raman spectra. In a similar experiment conducted by
Kobayashi et al with 5fs NOPA pulses, a sliding window Fourier transform
(SWFT) analysis of the observed modulations was interpreted exclusively in term
of excited state evolution, leading from the Franck- Condon region to the primary
ground state photoproducts. In view of these conflicting interpretations, Ruhman
et al. recently completed a degenerate pump dispersed probe experiments on BR
using 7fs NOPA pulses, with Fourier analysis of the resulting modulations and
experiments with chirped pump pulses, suggest that previous studies detected
mainly ground state RISRS induced coherences. In order to map the excited state
dynamics, we used IVS experiments with 2, 3 and chirped pulses on RPSB with
7fs pulses. Our results show modulations were assigned mainly to the ground
state and the separation between the ground and the excited states contributions
was very difficult.
This work was carried out under the supervision of
Prof. Sanford Ruhman
Femtosecond Spectroscopy of
Primary Events in Retinal
Proteins and Model Systems
Thesis submitted for the degree of
“Doctor of Philosophy”
by Oshrat Bismuth
Submitted to the Senate of the Hebrew University
June / 2012
Femtosecond Spectroscopy of
Primary Events in Retinal
Proteins and Model Systems
Thesis submitted for the degree of
“Doctor of Philosophy”
by Oshrat Bismuth
Submitted to the Senate of the Hebrew University
June / 2012