PRETOČNA CITOMETRIJA - Univerza v Ljubljani

UNIVERZA V LJUBLJANI
FAKULTETA ZA MATEMATIKO IN FIZIKO
ODDELEK ZA FIZIKO
PRETOČNA CITOMETRIJA
Seminar pri Medicinski fiziki
Izidor Tušek
Mentor: dr. Vojko Jazbinšek
Železniki 4.4.2014
Citometrija – metoda za karakterizacijo in merjenje lastnosti celic in celičnih komponent.
1
Kazalo vsebine
1.
Uvod..................................................................................................................................................................................... 3
2.
Zgodovinski razvoj ........................................................................................................................................................... 3
3.
Fizikalno ozadje................................................................................................................................................................. 4
4.
Shema optičnega pretočnega citometra ...................................................................................................................... 7
5.
Področja uporabe.............................................................................................................................................................. 8
6.
Viri ........................................................................................................................................................................................ 9
2
1. Uvod
Pretočna citometrija se največ uporablja za analizo hematopoetskih celic ter razlikovanje
med levkocitnimi populacijami in subpopulacijami, kar imenujemo imunofenotipizacija .
Krvne celice in celice imunskega sistema se analizira in se jim meri antigenske in fizikalne
lastnosti. Metoda se uporablja predvsem v diagnostiki in spremljanju levkemij, limfomov,
imunskih pomanjkljivosti, okužb z virusom HIV in drugih imunsko pogojenih bolezni [6].
Slika 1: Princip pretočne citometrije [5]
2. Zgodovinski razvoj
Razvoj pretočne citometrije sega v 40. Leta 20 stoletja, ko je Wallace Coulter razvijal
napravo za štetje celic. Za detekcijo celic v prevodni tekočini je uporabil električno upornost.
Upornost celic se namreč razlikuje od upornosti prevodne tekočine, ki celice obdaja. Zaradi
tega se padec napetosti ,ki jo prikaže merilnik spremeni vsakič ko skozi kapilaro, ki ima presek
takšen da omogoča hkraten prehod samo ene celice, potuje celica. Iz spremembe napetosti
lahko ugotovimo tudi velikost celice, večja če je sprememba napetosti večja je celica.
Za štetje celic se lahko uporabi tudi dejstvo, da je dielektrična konstanta celice εC razlikuje
od dielektrične konstante obdajajoče tekočine εT . Če imamo tok tekočine s celicami se nam
vedno, ko celica pride v kondenzator spremembo kapacitivnosti le-tega. Sprememba
kapacitivnosti pa je odvisna od velikosti celice, saj imajo vse celice približno enak εC [1].
Slika 2: Princip štetja celic - Coulter
3
Razvoj citometrov se je nadaljeval v 60. letih 20. Stoletja. Citometer s sposobnostjo ločevanja celic
je v reviji Science leta 1965 objavil Mack Fulwyler. Decembra leta 1968 je Wolfgang Göhde iz
univerze v Munstru patentiral prvi pretočni citometer z merjenjem fluorescence [4]. Do danes pa
so razvili cenene citometre , ki uporabljajo kamero mobilnega telefona za detekcijo [7].
Slika 3: Mobilni telefon kot preprost citometer [7]
3. Fizikalno ozadje
Za analizo celic uporabljamo sipanje svetlobe na celici in njenih notranjih strukturah.
Laserski žarek pada na kapilaro citometra po kateri se nosilna tekočina vzorca, v njeni sredini
pa vzorčne celice. Ko celica preseka pot žarku se svetloba na njej siplje. Z dvema
detektorjema merimo intenziteto naprej sipane svetlobe (angl. Forward scatter count oz. FSC
– sipanje pri majhnih kotih) in vstran sipane svetlobe (angl. Side scatter count oz. SSC –
sipanje pri velikih kotih). S prvim detektorjem dobimo informacijo o velikosti celic, z drugim
pa zrnatost. Bolj ko so celice zrnate večja je intenziteta signala. Kot rezultat meritve dobimo
histogram ali pa točkovni diagram.[2]
Osvetljevanje se izvede z laserjem. Lahko se uporablja en ali več laserjev. Laserski žarek
potuje skozi leče, ki ga oblikujejo v elipso širine približno 10-20 µm v smeri toka in dolžine 60
µm prečno na tok vzorca. To nam zagotovi, da je enakomerno osvetljena samo ena celica [4].
Sipanje pri majhnih kotih: Sipanje zaradi uklona svetlobe zazna prednji detektor sipanja, ki
direktno nakazuje velikost celice. Sipanje na celici lahko opišemo z Miejevo teorijo sipanja pri
4
osvetljevanju z monokromatskim ravnim valom. Za osvetljevanje celic se največkrat
uporabljajo laserji valovnih dolžin vidne svetlobe (400 – 700 nm), velikost celicnih struktur in
je od 10 nm do 10µm.
Slika : Sipana svetloba se pretvori v elektronske signale , ki se lahko obdelujejo z računalnikom [8]
Največji vpliv na intenziteto naprej sipane svetlobe imajo sipalci veliko večjih dimenzij od
valovne dolžine vpadnega žarka. Pojav lahko primerjamo z uklonom na okrogli reži, kjer
dobimo prvi minimum intenzitete sipane svetlobe pri kotu [9]:
min
= 1,22
kjer je b velikost sipalca, λ pa valovna dolžina vpadne svetlobe. Pri kotih večjih od βmin je
sipanje zanemarljivo tako, da merimo pri konstantnem sipalnem kotu. Intenziteta izmerjene
svetlobe je sorazmerna z velikostjo in lomnega količnika celice na kateri sipa. Lomni količnik
živih celic je približno enak in ne uplivaa bistveno na signal. Lomni količnik mrtvih celic pa je
podoben lomnemu količniku nosilne tekočine. Glede na to, da pri pretočni citometriji skoraj
vse celice preživijo, mrtve celice nimajo močnega vpliva na rezultat [4].
Celična struktura
Citoplazma
Jedro
Mitohondrij
Melanin (barvilo v koži in laseh)
Lomni količnik
1,36 – 1,375
1,38 – 1,41
1,38 – 1,41
1,6 – 1,7
Lomni količniki različnih struktur
Sipanje pri velikih kotih (90°): Sipanje zaradi odboja zazna stranski detektor, ki kaže
granuliranost in nepravilnost celične površine. Največji vpliv na intenziteto signala imajo
5
sipalci, ki so majhnih dimenzij v primerjavo z vpadno valovno dolžino žarka. Sipanje lahko
opišemo z Rayleighovo teorijo sipanja, ki velja za delce velikosti b < .
σs =
(
)2 [11]
Pri čemer je nb lomni količnik medija, nrel pa je relativni lomni količnik delca,
nrel = ns/nb n
ns pa je lomni količnik delca. Iz Enačbe se vidi, da svetloba krajših valovnih dolžin močneje
siplje, σs pa tudi odvisna od velikosti delca.. S pomočjo Rayleighovega sipanja obravnavamo
sipanje sipanje svetlobe na ribosomih in membranah. Intenziteta pa nam pove število sipalcev
oz. kompleksnost celične strukture [4] .
Slika 4: sipanje svetlobe na celici [10]
Slika 4: Celične subpopulacije glede na sipanje pri
majhnih in velikih kotih [10]
Fluorescenca: Pojav pri katerem molekula pri absorbciji fotona preide iz osnovnega v
vzbujeno stanje imenujemo fluorescenca [3]. Vpadni foton mora imeti energijo, ki je enaka
energijski razliki med osnovnim in vzbujenim stanjem hν = δE kjer je h Planckova konstanta
(h=6,626 x 10 -34 Js), ν pa frekvenca fotona ( c = λν ). Molekula vzbujenega stanja ne ohrani
dolgo in se hitro vrne v osnovno stanje, pri tem pa izseva foton, ki pa ima manjšo energijo in
daljšo valovno dolžino kot vpadni. Razlika med valovnima energijama je Stokesov premik. [5]
6
4. Shema optičnega pretočnega citometra
Pretočni citometer vsebuje kapilarno cevko po kateri potujejo posamezne celice obdane s
tekočino. Z laserjem svetimo na te celice in z detektorji merimo sipanje laserske svetlobe na
celicah v smeri naprej in v stran pod kotom 90°. S temi meritvami pridobimo informacije o
velikosti celice (sipanje naprej), notranji granulaciji (sipanje vstran) in podatke o kemični
sestavi celice (flourescenca). Z nekaterimi citometri lahko tudi fizično ločimo celice.
Slika 5: Shema pretočnega citometra [12]
Glavni deli pretočnega citometra so:
- Pretočna celica
Slika 6: hidrodinamsko fokusiranje v pretočni celici [6]x
-
Vir svetlobe
Zbiralna optika
Detektorji
Sortirnik celic
7
Slika 7: Sortiranje celic [1]
-
Računalnik
V pretočni celici dosežemo tok posameznih celic hidrodinamskim fokusiranjem. [6] V
pretočni celici s premerom okoli 200 µm se pretaka fiziološka raztopina, v središče pa
vbrizgavamo tekočino s celicami. Tekočini se pri določenem premeru in hitrosti pretoka ne
mešata, premer vzorca pa je okoli 20 µm. Na sekundo lahko analiziramo tudi več kot 10 3 celic.
Celice osvetljujemo z laserjem preko fokusirnih leč, tako da je osvetljena samo ena celica.
Sipano svetlobo detektiramo z detektorjema za v stran sipano svetlobo in sipano v smeri
vpadnega žarka. V stran sipano svetlobo usmerimo na zaporedje dikroičnih zrcal, ki odbijajo
svetlobo do neke določene valovne dolžine, ostalo pa prepustijo. Sipana svetloba ne spremeni
valovne dolžine flourescentnemu odzivu se pa podaljša valovna dolžina . S pravilno izbranimi
zrcali razdelimo svetlobo na komponente in jo ojačimo s fotopomnoževalkami. [2]
5. Področja uporabe
Pretočna citometrija je uporabna na zelo različnih področjih, kjer je potrebna celična
analiza, od molekularne biologije, medicine, farmacije, pa do kmetijstva in živilske tehnologije.
Prek analize genetskega materiala jedru celice lahko opazujemo odziv organizma na zdravilne
učinkovine, kar največ uporabljajo v farmacevtski industriji pri testiranju novih izdelkov.
Molekulska pretočna citometrija se uporablja za karakterizacijo posameznih molekul . S to
metodo se detektirajo in karakterizirajo bakterijske celice pri kontroliranju kvalitete hrane in
pijače.
8
6. Viri
[1] Flow cytomety, Wikipedia, http://en.wikipedia.org/wiki/Flow_cytometry
[2] http://sl.wikipedia.org/wiki/Preto%C4%8Dna_citometrija
[3] Introduction to Flow Cytometry: A Learning Guide,
http://www.stemcell.umn.edu/prod/groups/med/@pub/@med/documents/asset/med_80691.p
df
[4] Pretočna citometrija, Nina Turk seminar: http://wwwf9.ijs.si/~krizan/sola/seminar/1112/turk.pdf
[5]Flourescence flow cytometry in haematology,
http://www.sysmex.ru/files/articles/Xtra_online_Flourescence_flow_cytometry_in_haematology.
pdf
[6] http://studentski.net/get/ulj_ffa_lb1_bma_vaj_pretocna_citometrija_01__gradivo.pdf
[7] http://www.medgadget.com/2013/04/scientists-convert-a-cell-phone-camera-to-afluorescent-microscope.html
[8] http://www.ebah.com.br/content/ABAAAfhdIAG/flow-cytometry-bd-biosciences-2000
[9] Janez Strnad, Fizika 2. del: Elektrika, optika, Ljubljana, DMFA, 1995
[10] http://medicine.umich.edu/medschool/research/office-research/biomedical-research-corefacilities/flow-cytometry/training/lesson-one-flow-cytometry-signals
[11] http://en.wikipedia.org/wiki/Rayleigh_scattering
[12] http://www.semrock.com/flow-cytometry.aspx
9