Avtomatizirana analiza - This is abra
Transcription
Avtomatizirana analiza - This is abra
Univerza v Ljubljani Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo Univerzitetni študijski program Kemija Izbirni sklop analizna in anorganska kemija Avtomatizirana analiza Seminar 2011 Predavatelj: prof. dr. Boris Pihlar Seminarska naloga je izdelana v okviru študijskih obvez dodiplomskega izbirnega predmeta Avtomatizirana analiza (30-0641). Delo ni lektorirano ali vsebinsko korigirano s strani predavatelja ali drugih univerzitetnih inštitucij. Avtor in inštitucija ne jamčita za pravilnost podatkov in navedb ter ne izključujeta možnosti, da so v objavljenem gradivu napake ali druge nepravilnosti. Gradivo predstavljeno v tem delu je avtorska lastnina, oziroma last navedenih virov, iz katerih je bilo povzeto. Univerza v Ljubljani Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo VESNA VOJSKA Analiza inhibitorjev matričnih metaloproteinaz (MMP) z Elektroforezno mikroanalizno metodo (EMMA) Predmet: Avtomatizirana Analiza Mentor: prof.dr.Boris Pihlar Ljubljana, 29.05.2011 1.UVOD: Matriks metaloproteinaze (MMP) so endoproteinaze, ki sodelujejo pri razgradnji zunajceličnega matriksa. Njihovo nenadzorovano povečanje in aktivnost posameznih MMP so opazili pri številnih vnetjih in rakavih obolenjih, zato inhibicija MMP predstavlja novo terapevtsko možnost v boju s temi boleznimi. Ker pa poznamo veliko naravnih inhibitorjev, je za ugotavljanje njihove učinkovitosti na MMP potrebno opraviti številne raziskave, te pa trajajo dolgo in so v večini neekonomične zaradi velike porabe dragih vzorcev. Zato so raziskovalci težili k odkritju analizne metode, ki bi bila še vedno učinkovita, a cenejša in hitrejša. Kot primerna tehnika se je pokazala elektroforezna mikroanalizna metoda (EMMA) s florescenčnim detektiranjem. Kot modelna encima so si izbrali MMP-2 in MMP-9, ki sta bila obravnavana kot obetavna za zdravljenje rakavih obolenj. 1 2. MATRIKS MELALOPROTEINAZE (MMP) : Matrične metaloproteinaze (MMP) sodelujejo pri preoblikovanju in razgradnji ekstracelularnega matriksa v naravnih fizioloških procesih, kot so embrionalni razvoj, razmnoževanje, remodeliranje tkiva, kot tudi v bolezenskih procesih, kot sta artritis in metastaza. Slika 1: Prikaz MMP razgradnje membrane [1] V normalnem fiziološkem stanju delovanje teh encimov strogo nadzorujejo endogeni tkivni zaviralci metaloproteinaz (TIMP). Če pa je razdrto ravnotežje med MMP in njihovimi inhibitorji, lahko pride do prekomerne degredacije zunajceličnega matriksa, kar omogoča invazijo, metastaze, in angiogenezo tumorskih celic. Zato so raziskave MMP v zadnjem času še toliko bolj zanimive, saj bi lahko dobro poznavanje inhibicije njihovega delovanja pripomoglo k diagnosticiranju in zdravljenju rakavih in drugih obolenj. Predklinični rezultati zatiranja raka z MMP modeli so bili tako prepričljivi, da so pričeli tudi s kliničnimi analizami. Upanje za uporabo MMP je na koncu propadlo zaradi hudih neželenih učinkov, povzročenih zaradi pomankanja selektivnosti njihovega delovanja. Kasneje so odkrili, da so bile nekatere MMP vpletene v proces napredovanja tumorja, nekatere MMP pa so služile kot gostitelji za obrambo proti tumorju. Ta dvojna vloga MMP pri raku v veliki meri pojasnjuje neuspeh inhibitorjev MMP v kliničnih poizkusih. [1], [2], [3] MMP-2 in MMP-9 so vpletene v proces razgrajevanja kolagena tipa IV in V, največja strukturna komponenta osnovnih membran. MMP-2 igra pomembno vlogo pri vaskularni ureditvi in odzivu na vnetja, za MMP-9 pa študije na opicah kažejo, da je vpletena v IL-8-inducirano mobilizacijo krvotvornih matičnih celic iz kostnega mozga, študije opravljene na miših pa kažejo vlogo pri remodeliranju tkiva, ki je povezano z tumorjem. [2], [4] 3. METODE RAZISKOVANJA: ZIMOGRAFIJA: Zimografija je še posebej uporabna metoda za odkrivanje dejavnosti različnih izoencimov MMP v bioloških vzorcih. Največji prednosti te tehnike sta specifičnost in občutljivost, ki sta višji kot pri fluorometričnih metodah. Pomanjkljivost pa je, da ni primerna za hiter sken inhibitorjev MMP zaradi zapletenega procesa. [5] KAPILARNA ELEKTROFOREZA (CE): Kapilarna elektroforeza predstavlja privlačno alternativo za encimske analize zaradi visokih izkoristkov separacije, hitre analize in nizke porabe vzorcev ter reagentov. Poleg tega, da je dobra tehnika ločevanja, CE ponuja tudi možnost 2 za inkapilarno analizo encimov, njihovo ločevanje in detekcijo, vse v eni kapilari. S stališča instrumentalizacije je preprosta tehnika. Za njeno izvedbo potrebujemo vir visoke napetosti, dve elektrodi, anodi in katodni rezervoar, kapilaro, detekcijski sistem in sistem za zapis ter obdelavo signala z detektorja. Separacija je enostavna in temelji na razlikah v hitrosti potovanja nabitih delcev. Kar pa kliče po izboljšanju tehnike je detekcija, saj majhni volumski pretok onemogoča uporabo klasičnih detektorjev uporabnih za HPLC. Najpogostejša je UV-VIS detekcija, pri kateri je prednost predvsem univerzanost, problem pa je nizka občutljivost (meja zaznave: 10-13 -10-16), kar je posledica zelo kratke poti svetlobe . Če za detekcijo uporabimo florescenco, je tu meja zaznave primerna: 10-15 -10-17. Kljub slabši občutljivosti, je CE zelo razširjena metoda, saj omogoča analizo velikega števila skupin analitov (npr. amino kisline, peptide, glikoproteine, nukleotide, oligonukleotide,...).[1],[6] ELEKTROFOREZNA MIKROANALIZNA METODA (EMMA): Slika 2: Prikaz EMMA analize[1] Elektroforezna mikroanaliza (electrophoretically mediated microanalysis-EMMA), se uspešno uporablja za študij encimske kinetike in opazovanje zaviranja encimskega delovanja. Prednosti te metode so popolna avtomatizacija metode in miniaturizacija vzorca (lahko iniciramo že vzorce nanoliterskih dimenzij). Ko jo kombiniramo s fluorescenčno detekcijo, omogoča zaznavo izredno nizke koncentracije analitov v majhnem obsegu vzorca, poleg tega pa so tudi zmanjšane motnje iz drugih sestavin v vzorcu. Če komponente vzorca ne florescirajo same, nanje pred, med ali po ločitvi vežemo posebne kromofore, ki omogočajo detekcijo.[1] 4. EKSPERIMENTALNI DEL: V zadnjem času je več naravnih sestavin pokazalo velike možnosti za inovativno zdravljenje obolenj, ker delujejo kot selektivni zaviralci MMP. Take spojine so na primer: oleinske kisline (OA), resveratrol, kvercetin in glukozamin sulfat. Ti znani MMP inhibitorji so bili zato v tej študiji uporabljeni za oceno učinkovitosti razvitih metod. Kot modelna encima pa so izbrali MMP-2 in MMP-9. Najprej so izvedli meritve z EMMA metodo, nato pa opravili še CE offline analizo, da bi preverili učinkovitost metode.[1] OPIS APARATURE: Za vse elektroforezne poizkuse so uporabili instrument HP3DCE, ki je bil opremljen s standardno kaseto HP vsebujoč kvarčno kapilaro dolžine 60 cm z notranjim premerom 75 mikronov. Kapilara je bila termostatirana pri 25 ° C in priklopljena na Argos 250B fluorescenčni detektor. Optično načelo fluorescenčnega detektorja je prikazano na sliki 3. Po filtriranju je svetloba Hg-Xe svetilke vodena do kapilare po sdsdsdsdsds Slika 3: florescenčni detektor[1] d fdfdfdfdfdfdoptičnih vlaknih in fokusirana v 3 detekcijsko ssdsdsdsdsdsdsdsdsdsdsdsdsdsdsdsdsdsdsdsdsdsdsdsdsokence. Fluorescenčna svetloba, ki jo oddaja analit, je ujeta v notranjost kapilare in vodena vzdolž nje do kremenskega stožca in prek filtra do fotopomnoževalke. [1] IZVEDBA ANALIZE EMMA S FLORESCENČNO DETEKCIJO: Sistem EMMA je bil razvit skupaj s short-end injiciranjem in hitrim preklapljanjem polaritete. Najprej so kapilaro napolnili z ločevalnim pufrom. Uporabili so 50 mM Tris pufra, ker je znano, da MMP deluje optimalno pri pH 7.5. Nato so vbrizgali v izstopni del kapilare raztopine encimov, substrata in inhibitorja.,natančneje (-50 mbar za 3 s) z encimsko raztopino, (-50 mbar za 3 s) s substratom z raztopino inhibitorja in spet enako raztopine encima. Po vsakem injiciranju so izstopni konec kapilare potopili v vodo, da bi prepreči prenos vzorca (0,02 min). Za mešanje se je vbrizgalo pozitivni potencial 5 kV za 5 sekund in se nato obrnilo polariteto na -5 kV za 5 sekund. S tem se ustvarjajo gibanja podobna mehanskemu stresanju, ta izboljšujejo kakovost mešanja in povečajo konvekcijo reaktantov. Ločitev lahko izvedemo z napetostjo -30 kV, saj MMP cepi substrat v negativno nabiti MCA-Pro-Leu-Gly-OH in pozitivno nabiti Leu-DPA-Ala-Arg-NH2, in zaradi različnih elektroforeznih mobilnosti pride do ločitve. Med koraki je bila kapilara izpirana z DMSO in BGE. Za inhibitorske poskuse so pripravili 60 µL zmes, ki vsebuje 10 µL inhibitorske raztopine, 10 µL substratne raztopine, 10 µL IS, in 30 µL pufra Tris (5 mM, pH 7,5) v mini CE štopovnik, v drugega pa raztopino 20 µL MMP. EMMA s fluorescenčno detekcijo razvita za in vitro karakterizacijo inhibitorjev MMP je prikazana na sliki 4. Slika 4: Prikaz metode EMMA [avtorska] Ugotovili so, da z uporabo filtrov namesto monokromatorja, dobijo večjo intenzivnost svetlobe, s čemer je izboljšana občutljivost instrumenta. Zato so za vzbujanje uporabili širokopasovni filter (240-400 nm), emisijo svetlobe pa merili s cutoff filterom (> 418 nm).[1] REZULTATI: -Čas analize: Da smo pospešili analizo, smo uporabili short-end injiciranje. Slika 5a prikazuje tipičen elektroforogram za EMMA s fluorescenčno detekcijo za online hidrolize MMP s short-end injiciranjem. Substrat ima nizko fluorescenco in migrira pred fluorescenčnimi produkti. IS, fluorescein je bil uveden v raztopino substrata z namenom kontrole nihanja v inicjiranju. Ločitev je bila dosežena v 70 sekundah. V primerjavi z normalnim injiciranjem pri vstopu kapilare (slika 5b), je ta tehnika 3-4-krat zmanjšala čas analize in 1,5-2 krat povečala občutljivost. [1] Slika 5: Elektroforogram EMMA analize[1] -Učinek RPS: Preverjali so tudi vpliv hitre menjave polaritet (RPS) na nastajanje produkta. Ugotovili so, da velja linearnosst le za prvih 20 sekund, zato so za nadaljne študije inhibitorjev RPS izvajali 20 sekund. 4 -Ponovljivost: Izvedli so tri sklope meritev, katerim so določili migracijski čas in relativne površine vrhov. RSD (relativne standardne devijacije) vrednosti so bile nižje od 2,3% za migracijske čase in do 5,0% za relativne površine vrhov. -Vpliv koncentracije: Slika 6: vpliv koncentracije na zaviralni učinek Inhibitor polifenol katehin EGCG je naravni inhibitor, ki smo ga dobili z izolacijo iz zelenega čaja (polifenol katehin izoliran iz zelenega čaja). Elektroforogram na sliki 6 ponazarja vpliv koncentracije na zaviralni učinek, EGCG, na MMP-9 hidrolizo. Kot lahko opazimo, se površina vrha fluorescenčnih produktov povečuje s povečanjem koncentracije EGCG. [1] -Kinetika: Za študij kinetike so si izbrali dva referenčna inhibitorja (EGCG in OA) za analizo vpliva na MMP-9 in MMP-2. Za oceno zaviralnega mehanizma in kinetične konstante (Km), so injicirali različne raztopine substratov v rangu 550 µM, vsebujoč naraščujoče koncentracije inhibitojev (0, 20 in 60 nm) in naredili Michaelis-Mentenov graf. Ker je iz Michaelis-Mentenovega grafa težko odčitati točno vrednost za Vmax, ker se krivulja približuje asimptoti Vo=Vmax zelo počasi, Michaelis-Mentenovo enačbo lineariziramo. Z linearizacijo dobimo Lineweaver-Burkov graf za EGCG in OA, ki je prikazan na sliki 7. Slika 7: Lineweaver-Burkov graf za OA [1] Iz grafa odčitamo naklon premice in odsek na ordinatni ali abscisni osi ter izračuna mo po Lineweaver-Burkovi enačbi Vmax in Km. Povišane vrednosti na y osi (zmanšanje Vmax) in zmanjšanje vrednosti na x-osi (višji Km), ob višjih koncenracijah inhibitorja kažejo na mešani tip inhibicije OA pri zaviranju MMP-2 (slika 7a). V primeru EGCG pride do povečanja na y-osi (zmanšan Vmax) in nespremenjenih vrednosti na x-osi (isti Km) pri višjih koncentracijah inhibitorja, kar kaže, da EGCG deluje kot nekompetitivni inhibitor za MMP-9 (slika 7B). Vzorci zaviralnih reakcij za EGCG in OA so se skladali z rezultati predhodno narejenih analiz. Km vrednosti za MMP-2 in MMP-9 online hidrolize so povzete v tabeli 1, skupaj z vrednostmi objavljenimi v literaturi.[1], [7] Slika 7B: Lineweaver-Burkov graf za EGCG[1] 5 -Vpliv vrste MMP: Za nadaljnje poizkuse (IC50 vrednosti) so uporabili višje koncentracije EGCG (200 nM-2 mM) in fiksne koncentracije substrata in encima. IC50-vrednosti (koncentracija inhibitorja, ki daje 50% zaviranje) so bile 59,7 µM za MMP-2 in 31,5 µM za MMP-9. Ta rezultat pomeni, da je zaviralni učinek EGCG na MMP-2 šibkejši od tistega, na MMP-9. Pridobljene IC50 vrednosti iz eksperimenta in tiste znane iz literature so podane v tabeli 1. RSD vrednosti za vse tri analize so bile nižje od 2,7% za čas migracije in niso presegle 7,1% za relativne površine vrha. Zaviralni učinek EGCG na MMP-2 je bil šibkejši od tistega, na MMP-9. [1] 5. KVANTITATIVNA METOD: PRIMERJAVA ONLINE IN OFFLINE Primerjava med vrednosti, določenimi z EMMA in z drugimi tehnikami iz literatur, je bila precej težka, saj so bili tam uporabljeni različni substrati, viri encimov, in testni pogoji, proti EMMA raziskavam. Iz tega razloga, so izvedli še offline CE test za določitev Km in IC50-vrednosti z enakimi encimi, substratom in isto koncentracijo inhibitorjev za EMMA določanje. Rezultati offline analize so navedeni v Tabeli 1. [1] Vidimo, da so Km vrednosti določene z EMMA metodo višje od tistih, pridobljenih iz offline CE testom. Vendar so te razlike majhne. Za razliko od Km vrednosti pa je 2-2.5-kratna razlika v vrednostih IC50 z offline tehniko, ki odraža bolj močan zaviralni učinek. To je lahko posledica dejstva, da je bil zaviralec predhodno inkubiran z encimom v offline stanju. V EMMA metodi inhibitor raztopimo z substratom in dodamo encim. Razlike v vrednostih IC50 med online (pretočno ravnotežje) in offline (statično ravnovesje) postopkom so opazili tudi v drugih raziskavah. Ponovljivost metode EMMA je relativno nizka, saj da visoke vrednosti RSD za relativne površine vrhov, zato je v tem primeru boljše uporabiti offline CE analizo. [1] Za potrditev delovanja metode so izvedli poskuse še z znanimi MMP inhibitorji kot so, EGCG, OA, kvercetin, doksiciklin, resveratrol, glucosamin,... Učinek teh zaviralcev pri 600 µM na MMP-2 in MMP-9 so primerjali, odstotki zaviranja za te naravnih sestavine, so prikazani v tabeli 2. Kot lahko vidimo, se učinek inhibitorjev spreminja z uporabo različnih izoencimov MMP. EGCG in OA sta najmočnejša zaviralca, medtem ko resveratrol deluje le na MMP-2. 6 Jakost inhibitorjev se zmanšuje v vrsti za MMP-2 OA> EGCG> kvercetin> doksiciklin> glukozamin sulfat> resveratrol, medtem ko je za MMP-9 EGCG> OA> kvercetin> doksiciklin > glukozamin sulfat. Zaviralne lastnosti teh spojin so bile določene tudi z offline testom CE. Ugotovljeno je bilo, da so skladne z EMMA testom. Torej, lahko vidimo, da je EMMA s fluorescenčno detekcijo zelo primerna za začetni pregled velikega števila spojin za MMP zaviranja. 6.ZALJUČEK: EMMA s fluorescenčno detekcijo se je izkazala za koristno analizno tehniko za karakterizacijo inhibitorjev MMP. Prednosti pred konvencionalnimi metodami so hitra analizna, v celoti avtomatizirana in miniaturizirana poraba vzorcev. Uporaba EMMA metode v kombinaciji s fluorescenčno detekcijo, uspešno izboljša občutljivost analize in omogoča delo s še mnjšimi količinami vzorcev (približno 0,87 fmol encima je potrebnega za vsako analizo). Ko so metodo EMMA kombinirali še s short-end injiciranjem, se je znižal tudi čas analize. Če primerjamo, smo za celotno online hidrolizo, ločitev in detekcijo porabili le 70s, za klasične metode, pa je v povprečju potebna 1 ura dela. Ta metoda je bila razvita na splošnem MMP substratu, da tako mogoča razširitev analize aktivnosti in selektivnosti inhibitorjev tudi na druge MMP izoencime. 7 6.VIRI IN LITERATURA: [1]-Xin Hai, Xu Wang, Mohamed El-Attug, Erwin Adams, Jos Hoogmartens, and Ann Van Schepdael In-Capillary Screening of Matrix Metalloproteinase by Electrophoretically Mediated Microanalysis with Fluorescence Detection Anal. Chem. 2011, 83, 425–430 [2]-^ "Entrez Gene: MMP2 matrix metallopeptidase 2 (gelatinase A, 72kDa gelatinase, 72kDa type IV collagenase)". http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=gene&Cmd=ShowDetailView&TermToSearch =4313. [3]- Andrea Page-McCaw, Andrew J. Ewald & Zena Werb Matrix metalloproteinases and the regulation of tissue remodelling Nature Reviews Molecular Cell Biology 8.221-223 (March 2007) [4]-a b "Matrix metallopeptidase 9 (gelatinase B, 92kDa gelatinase, 92kDa type IV collagenase)" [5]-http://www.biologyonline.org/articles/metabolic_mapping_proteinase_activity/zymography.html [6]-R. Kuhn and S. Hoffstetter-Kuhn. Capillary Electrophoresis: Principles and Practice Springer-Verlag, Berlin, 1993 [7]-Robert Kuhelj Biokemija v praksi:načela in tehnike 3. izd.- Ljubjana: Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo,2003 8