Zbornik povzetkov

Knjiga povzetkov 3. dnevov biofizike
September 2015
V elektronski obliki izdalo:
Društvo biofizikov Slovenije
Slovenian biophysical society
Zbral in uredil:
dr. Andrej Dobovišek
i
Predgovor organizatorja 3. Dnevov biofizike
Biofizika danes ne predstavlja le ozkega področja uporabe fizikalnih znanj v medicini ali
splošneje v bioloških sistemih, temveč množico konceptov delovanja kompleksnih bioloških
sistemov, iz katerih hkrati izhaja tudi vrsta zanimivih tehnoloških rešitev in nadaljnjih razvojnih
možnosti. Biofizika je izrazito interdisciplinarna disciplina, zato jo gojijo skupine z izrazito
mešanimi strokovnimi znanji. Da bi prepoznavnost in uporabnost biofizike še razširili ter hkrati
spodbudili podjetno razmišljanje vsako leto organiziramo Dneva biofizike. Srečanje je
namenjeno vsem, ki se srečujejo z biofiziko na tak ali drugačen način ter na različnih nivojih,
od povsem znanstvenega do čisto aplikativnega nivoja. Na srečanju želimo poglobljeno
razmišljati tudi o vključevanju biofizikalnih znanj v različne izobraževalne procese.
Znanstveni del srečanja je tradicionalno zgrajen okrog poster sekcij, ki z vodenimi kratkimi in
usmerjenimi predstavitvami pred posterji spodbujata udeležence k intenzivnim razpravam o
problemih, metodologijah, rezultatih, špekulacijah, motivi, ciljih, ipd. Na ta način praktično vsi
raziskovalci enakovredno izpostavljamo svoje ideje drugim in spodbujamo vprašanja in iskanje
novih poti. Poleg poster sekcij vsako leto organiziramo tudi vsaj eno okroglo mizo, na kateri
vsi udeleženci razpravljamo o izbrani temi. Letošnja rdeča nit so bili »Izzivi biofizike v
naslednjem desetletju v Sloveniji«. Okroglo mizo smo tokrat izvedli na povsem nov in, po
mnenju udeležencev, privlačen ter motivirajoč način v obliki socialno-znanstvene igre
»ScienceStarter«, kjer so izzivalci (predlagatelji raziskovalnega projekta) skušali prepričati in
zbrati čim več novih sodelavcev za svoj namišljen ali povsem realen predlog projekta s čim bolj
ambicioznim a hkrati izvedljivim predlogom. V zaključni razpravi smo vsi udeleženci okrogle
mize poskušali nadalje razviti idejo zmagovalne skupine in s tem spodbuditi pretok idej ljudi
iz različnih raziskovalnih skupin, ki bi lahko nakazale, v kakšne podvige bomo vključeni
raziskovalci v Sloveniji v naslednjih letih.
Tržni del srečanja smo tudi letos osnovali okrog »Tržnice znanj«, kjer smo v živo ponujali
specifična biofizikalna znanja in različne rešitve uporabne za povsem specifične namene pri
razvoju znanstvenih področij, tehnologij, materialov, postopkov, diagnostike, pedagoškega
dela, morda celo umetnosti. Tržnico smo tudi tokrat organizirali v rotirajočih 5-minutnih
predstavitvah predstavljalcev, od katerih so ostali udeleženci poskušali izvedeti čim več
uporabnih podrobnosti ali se celo dogovoriti za strokovno ali poslovno sodelovanje. Ponudbe
so bile predstavljene ustno, nekatere s pomočjo tiskanega materiala, demonstratorja, prototipa,
ali materiala na tabličnih oz. prenosnih računalnikih.
Dneva biofizike torej na neformalen način odpirata nove poglede, nova poznanstva in nove
načrte. Svežina idej in vključenost večine udeležencev v razprave sta vsakič znova zagotovilo,
da je in bo vaša udeležba poplačana z novimi spoznanji in navdušenjem nad prihodnjim delom.
dr. Janez Štrancar
Vodja organizacijskega odbora 3. Dnevov biofizike
ii
Predgovor predsednika Društva biofizikov Slovenije
Dneva biofizike sta namenjena predvsem mladim, tj. mladim raziskovalcem, dodiplomskim in
doktorskim študentom, ki se ukvarjajo z biofiziko, oziroma jih ta zanima. Področje biofizike je
zelo široko in raznoliko, saj je na stičišču vrste znanstvenih ved: fizike, biologije, medicine,
farmacije, kemije itd. Zato je pomembno, da obstaja možnost druženja raziskovalk in
raziskovalcev iz različnih področij, ki se drugače pogosto ne srečujemo, in na ta način odprejo
priložnosti za nove ideje in znanstvena sodelovanja. Konferenca prav tako nudi z idejami, kot
je “Tržnica znanj”, pregled nad raziskovalnimi interesi biofizikalnih raziskovalnih skupin v
akademski srenji in realnem sektorju v Sloveniji in s tem priložnost pri izbiri nadaljnje kariere
za mlade. Kot predsednik Društva biofizikov Slovenije, ki skrbi za kvaliteten razvoj
biofizikalnih znanosti pri nas, seveda takšno zasnovo konference podpiram in vas ob tej
priložnosti vabim, da se udeležite naslednjih Dnevov biofizike prihodnje leto.
dr. Matej Praprotnik
predsednik Društva biofizikov Slovenije
iii
Seznam prispevkov
P1 Vpliv elastičnosti na učinkovitost hoje citoplazemskega dineina ...................................................... 2
P2 Simulacija adaptivne resolucije polarizabilnih supramolekularnih grobozrnatih vodnih modelov ... 3
P3 Večskalne simulacije vodnega toka vzdolž objektov velikostnega reda nanometra .......................... 4
P4 Biokompatibilnost biopolimernih tkivno inženirskih nosilcev v povezavi z mobilnostjo polimerov
in dinamike pritrjevanja celic .................................................................................................................. 5
P5 Veljavnost principa maksimalne produkcije entropije v encimski kinetiki ....................................... 6
P6 Design and synthesis of fluorescent probes for fluoride-ion detection and stimuli responsive
coatings for nanoparticles ........................................................................................................................ 7
P7 Ekstrahiranje strukturnih in interakcijskih lastnosti v biofizikalnih sistemih .................................... 8
P8 Codon optimization and thermostable serine protease expression in E. coli ..................................... 9
P9 Membrane hydrolysis by phospholipase A2 leads to an intracellular accumulation of lipid droplets
enriched with polyunsaturated fatty acids and enables cancer cell survival ......................................... 10
P10 Diameter dependent mode of exocytosis is indipendent of functional integrity of SNARE proteins
in astrocytes ........................................................................................................................................... 11
P11 Analiza lipidne membrane v mikrofluidični difuzijski komori ...................................................... 12
P12 Odprte simulacije molekulske dinamike ........................................................................................ 13
P13 Identifying the lipid wrap around nanotubes ................................................................................. 14
P14 Modelna napoved forsiranega izdihanega volumna v prvi sekundi (FEV1) pred in po zaužitju
nesteroidnih antirevmatikov .................................................................................................................. 15
P15 Modeliranje vpliva cikličnega gvanozin monofosfata (CGMP) na od kalcija odvisen tonus gladkih
mišičnih celic arterij .............................................................................................................................. 16
P16 Kapsulacija kurkumina v mikro- in nano-dostavne sisteme .......................................................... 17
P17 Topološki defekti na bioloških membranah ................................................................................... 18
P18 Effects of lactational exposure to non-planar PCB-155 and planar PCB-169 on growth,
biochemical and biomechanical parameters of maturing rat femur ...................................................... 19
P19 Protein crowding effect on membrane bending depends on protein lateral confinement .............. 20
P20 Cytoplasmic distribution and mobility of AQP4-vesicles in rat astrocytes ................................... 21
P21 Interakcija lipidne membrane z bakterijskim LPS ......................................................................... 22
iv
Povzetki prispevkov
1
P1
Vpliv elastičnosti na učinkovitost hoje citoplazemskega dineina
Andreja Šarlah1 in Andrej Vilfan2
Fakulteta za matematiko in fiziko, Univerza v Ljubljani, Jadranska 19, 1000 Ljubljana; 2Institut Jožef Stefan,
Jamova 35, 1000 Ljubljana
1
Citoplazemski dinein je procesiven molekulani motor evkariontskih organizmov, ki
med drugim omogoča aktivni transport mehurčkov in organel po mikrotubulih (MT) od
perifernih delov celice proti njenemu jedru. Obstoj motorja je znan že preko 30 let, zaradi
njegove velikosti in kompleksne stukture pa še vedno niso pojasnjeni tako mehanizni sklopitve
uporabe proste energije iz hidrolize molekule adenozin trifosfata (ATP) in mehanskega premika
motorja, sestavljenega iz zamaha ročice in priklapljanja/odklapljanja z MT, kot tudi ne sami
mehanizmi gibanja, kaj določa njegovo usmerjenost, procesivnost, dolžino koraka, produkcijo
sile...
Predstavljamo teoretični kemijsko-mehanski model, ki razjasnjuje nekatera od odprtih
vprašanj [1]. Na podlagi eksperimentalnih podatkov temelji model na mehanizmu, pri katerem
poteka glavni del mehanskega zamaha ročice v smeri proti MT in ne vzporedno z njim, kot je
značilno za številne druge molekularne motorje. Posamezno glavo motorja opišemo s
poenostavljenim elastičnim elementom in mu pripišemo minimalni cikel hidrolize ATP. Dve
identični glavi elastično povežemo v motor, ki reproducira usmerjeno hojo in produkcijo sile,
kot sta opaženi v eksperimentih. Pokažemo, da je v odvisnosti od trdote sklopitve med glavama
motorja hoja lahko bodisi visoko učinkovita koordinirana (močna sklopitev) ali nekoordinirana
(šibka sklopitev). Pri slednji učinkovitost, to je premik na hidroliziran ATP, zmanjšujejo koraki
nazaj ali v prazno. Model močne sklopitve ustreza načinu gibanja dineinov sesalcev. Za to
gibanje je značilno koordinirano enakomerno in izmenično korakanje obeh glav (»hand-overhand«). Po drugi strani model s šibko sklopitvijo predstavlja nekoordinirano hojo dineinov
kvasovk, za katero je značilna večja raznolikost korakov, tako po dolžini in smeri kot tudi po
načinu korakanja. Načini korakanja vključujejo izmenično korakanje, pri katerem glavi bodisi
izmenjujeta vodilno pozicijo (»hand-over-hand«) bodisi ne (»inch-worm«), kot tudi korakanje,
pri katerem ena od glav naredi več zaporednih premikov. Na podlagi modela pokažemo, da
visoko procesivnost dineina kvasovk kljub nekoordinirani hoji omogoča močna upočasnitev
oddaje produktov hidrolize ATP, zaradi česar je hitrost gibanja teh dineinov tudi precej manjša
od hitrosti dineinov sesalcev. Največja sila, ki jo lahko proizvede dinein, je predvsem odvisna
od procesivnosti motorja in lahko v nekoordiniranih dineinih doseže vrednosti do 6 pN.
Literatura:
1. Šarlah A, Vilfan A., The winch model can explain both coordinated and uncoordinated stepping of
cytoplasmic dynein. Biophysical Journal 107 (2014) 662 – 671.
2
P2
Simulacija adaptivne resolucije polarizabilnih supramolekularnih
grobozrnatih vodnih modelov
Julija Zavadlav1, M. N. Melo2, S. J. Marrink2 in Matej Praprotnik1
1. Laboratorij za molekularno modeliranje, Kemijski inštitut, Hajdrihova 19, SI-1001 Ljubljana, Slovenija
2. Groningen Biomolecular Sciences and Biotechnology Institute and Zernike Institute for Advanced Materials,
University of Groningen, Nijenborgh 7, 9747AG Groningen, Nizozemska
Metode večskalne simulacije, kot je shema prilagodljive ločljivosti (AdResS) [1],
postajajo vse bolj priljubljene, saj omogočajo premostitev mnogo redov velikosti v prostorskih
in časovnih skalah, ki so prisotne v biofizikalnih sistemih. Za simulacije te vrste je nujen razvoj
natančnih večskalnih modelov vode, ki jih lahko uporabimo za solvatacijo biofizikalnih
sistemov. Pred kratkim smo izvedli večskalno simulacijo vode s preslikavo 4-v-1, kjer smo štiri
SPC (Simple Point Charge) molekule vode povezane s pol harmonskimi vezmi preslikali v
vodni model MARTINI [2]. Simulacija proteina v tem topilu ni pokazala nobenih opaznih razlik
v primerjavi s popolnoma atomistično simulacijo [3].
Večskalno preslikavo smo razširili na grobozrante vodne modele z eksplicitnimi naboji
[4]. Testirali smo modela: PW (polarizable water) in BMW (big multiple water). Pokazali smo,
da naš pristop vodi do pravilne reprodukcije relevantnih strukturnih in dinamičnih lastnostih.
Sistem smo nadalje študirali pod vplivom zunanjega statičnega električnega polja. Razviti
modeli topila so združljivi s poljem sil MARTINI in bodo zaradi vse večje popularnosti tega
polja sil bistveno povečali obseg biomolekularnih simulacij.
Literatura:
1. Praprotnik M., Delle Site L. and Kremer K. Multiscale simulation of soft matter: From scale bridging to
adaptive resolution. Annual Review of Physical Chemistry 59 (2008), 545.
2. Zavadlav J., Melo M. N., Cunha A. V., de Vries A. H., Marrink S. J. and Praprotnik M. Adaptive resolution
simulation of MARTINI solvents. Journal of Chemical Theory and Computation 10 (2014), 2591–2598.
3. Zavadlav J., Melo M. N., Marrink S. J. and Praprotnik M. Adaptive resolution simulation of an atomistic
protein in MARTINI water. Journal of Chemical Physics 140 (2014), 054114.
4. Zavadlav J., Melo M. N., Marrink S. J. and Praprotnik M. Adaptive resolution simulation of polarizable
supramolecular coarse-grained water models. Journal of Chemical Physics 142 (2015), 244118.
3
P3
Večskalne simulacije vodnega toka vzdolž objektov velikostnega reda
nanometra
Aleksandar Popadić in Matej Praprotnik
Laboratorij za molekularno modeliranje, Kemijski inštitut, Hajdrihova 19, 1001 Ljubljana
Predstavljamo simulacije vodnega toka vzdolž objektov velikostnega reda nanometra,
npr. fulerenov in membran iz ogljikovih nanocevk, z uporabo Navier-Stokesovih enačb in
robnega pogoja z delnim zdrsom [1,2]. Diskretizacija Navier-Stokesovih enačb s končnimi
volumni je sklopljena z robnim pogojem z delnim zdrsom, kjer so zdrsne dolžine dobljene s
simulacijami molekularne dinamike, ki vodni tok opišejo na nanoskali. Fizikalne količine
pridobljene s trenutnim hibridnim pristopom se dobro ujemajo z rezultati simulacij molekularne
dinamike, medtem ko so pridobljene z nekajkrat manjšo računsko zahtevnostjo.
Literatura:
1. Popadić A., Walther J. H., Koumoutsakos P., Praprotnik M. Continuum simulations of water flow in carbon
nanotube membranes. New Journal of Physics 16 (2014) 082001.
2. Popadić A., Praprotnik M., Koumoutsakos P., Walther J. H. Continuum simulation of water flow past a
fullerene molecule. The European Physical Journal Special Topics. DOI: 10.1140/epjst/e2015-02414-y
4
P4
Biokompatibilnost biopolimernih tkivno inženirskih nosilcev v povezavi z
mobilnostjo polimerov in dinamike pritrjevanja celic
Rok Podlipec1,2, Janez Štrancar1,2
1
Laboratorij za biofiziko, Odsek za fiziko trdne snovi F5, Institut Jožef Stefan, Jamova cesta 39
Center odličnosti NAMASTE, Jamova cesta 39
2
Eden od glavnih izzivov na področju tkivnega inženirstva in regenerativne medicine je
razumevanje biokompatibilnosti biomaterialov in razumevanje interakcije biomateriala s
celicami od prvega kontakta naprej. Zapletena narava bioloških sistemov zahteva obsežne
predklinične študije funkcionalnosti razvitih materialov, in sicer s poudarkom na vplivu
različnih lastnosti materialov od morfologije, mehanskih lastnosti do površinskih lastnosti na
molekularni skali na specifičen odziv celic. V našem delu najprej predstavljamo analizo
fizikalnih lastnosti pripravljenih želatinskih poroznih nosilcev na več velikostnih skalah.
Ugotovili smo, da z rastjo celic najbolj korelirajo površinske lastnosti materiala na molekularni
skali, to je molekularna mobilnost verig polimerov. Raziskovali smo jo s pomočjo spinskega
označevanja stranskih verig polimerov v strukturi materiala in metodo elektronske
paramagnetne resonance (EPR) [1]. V nadaljevanju predstavljamo še raziskavo dinamike
pritrjevanja celic na površino nosilcev v realnem času in njen vpliv na rast celic ter analizo
vpliva molekularne mobilnosti polimerov. Za študij smo uporabili optimiziran sistem optične
pincete (OT) za manipulacijo in fluorescenčne mikroskopije (FM) za detekcijo. Ugotovili smo,
da dinamika pritrjevanja na sekundni časovni skali korelira z rastjo celic na dnevni skali [2].
Rezultati študije in razvite eksperimentalne tehnike bi lahko pripomogle k boljšem razumevanju
biokompatibilnosti in hitrejši ter učinkovitejši analizi biokompatibilnosti različnih
biopolimernih materialov in celic za mnoge tkivno inženirske klinične aplikacije.
Literatura:
1. Podlipec R., Gorgieva S., Jurašin D., Urbančič I., Kokol V., Štrancar J., Molecular mobility of scaffolds'
biopolymers influences cell growth. ACS applied materials & interfaces, 2014, vol. 6, iss. 18, str. 15980-15990.
2. Podlipec R., Štrancar J., Cell-scaffold adhesion dynamics measured in first seconds predicts cell growth on
days scale - optical tweezers study. ACS applied materials & interfaces, 2015, vol. 7, no. 12, str. 6782-6791.
5
P5
Veljavnost principa maksimalne produkcije entropije v encimski kinetiki
Andrej Dobovišek1,2, Marko Vitas5, Saša Kos1, Aleš Fajmut1,2,3, Milan Brumen1,2,3,4
1
Univerza v Mariboru, Fakulteta za naravoslovje in matematiko, Koroška cesta 160, 2000 Maribor, Slovenija
2
Univerza v Mariboru, Medicinska Fakulteta, Taborska ulica 8, 2000 Maribor, Slovenija
3
Univerza v Mariboru, Fakulteta za zdravstvene vede, Žitna ulica 15, 2000 Maribor, Slovenija
4
Inštitut Jožef Stefan, Jamova cesta 39, 1000 Ljubljana, Slovenija
5
Neodvisni raziskovalec, Laze pri Borovnici 38, 1353 Borovnica, Slovenija
Princip maksimalne produkcije entropije (MPE) je osnovni optimizacijski neravnovesne
termodinamike [1]. V skladu s tem principom odprt in dovolj kompleksen termodinamski
sistem, ki se sprva nahaja v neravnovesnem nestacionarnem stanju, spontano preide v
neravnovesno stacionarno stanje z maksimalno produkcijo entropije. Kljub temu, da MPE še ni
popolnoma sprejet kot temeljni fizikalni zakon, se uporablja pri raziskavah različnih
neravnovesnih sistemov v fiziki, kemiji, biologiji in ekologiji. Do sedaj je raziskovalcem uspelo
potrditi veljavnost principa na sistemih v stacionarnih stanji blizu ravnovesja. Za sisteme močno
izmaknjene iz ravnovesja veljavnost principa MPE še ni potrjena. Prav tako je izjemo aktualno
vprašanje veljavnosti principa MPE v kemijski kinetiki [1].
V naših raziskavah proučujemo veljavnost principa MPE v kemijskih reakcijah na
primeru encimske reakcije encima glukoze izomeraze. Encimsko reakcijo obravnavamo v
stacionarnem stanju blizu in daleč od ravnovesja. Najprej izpeljemo produkcijo entropije kot
funkcijo hitrostnih konstant encima. Koncentraciji substrata in produkta nastopata kot prosta
parametra. Nato preučujemo optimizacijske pogoje, pod katerimi ima produkcija entropije
maksimum v odvisnosti od poljubno izbrane hitrostne konstante. Izkaže se, da maksimum v
produkciji entropije, blizu in daleč od ravnovesja, obstaja pod enakim optimizacijskim pogojem
in sicer, da sta produkta hitrostnih konstant k1+*k2+ in k1-*k2- konstantna parametra. Z uporabo
Eyringove enačbe, ki hitrostne konstante povezuje z aktivacijskimi energijami posameznih
prehodov encimske reakcije lahko pokažemo, da je sta optimizacijska pogoja enakovredna
ohranitvi proste Gibsove energije encima. Slednje nas pripelje do analogije drugega
Kirchoffovega zakona v encimskih reakcijah.
Z numeričnimi izračuni pokažemo, da so vrednosti koncentracij substrata in produkta,
hitrostnih konstant encima ter hitrosti encimske reakcije, ki ustrezajo maksimalni produkciji
entropije, zelo blizu vrednostim iz eksperimentov [2, 3]. Naša raziskava kaže, da je princip
MPE veljaven v stacionarnih encimskih reakcijah blizu in daleč od ravnovesja. Na tržnici znanj
lahko pokažemo, da je princip MPE uporaben kot teoretično orodje za napovedovanje hitrosti
encimskih reakcij v bioreaktorjih in za napovedovanje izkoristka bioreaktorjev.
Literatura:
1. Martyushev L. M., Seleznev V. D. The restrictions of the maximum entropy production principle. Physica A Statistical mechanics and its applications, 410 (2014) 17 – 21.
2. Converti A., Del Borghi M. Kinetics of glucose isomerization to fructose by immobilized glucose isomerase
in the presence of substrate protection. Bioprocess Engineering 18 (1998) 27 – 33.
3. Converti A., Fisichella A., Riscolo A., Del Borghi M. Simulation of a reactor for glucose isomerization to
fructose by immobilized glucose isomerase with continuos enzyme renewal. Biotechnology Techniques 11
(1997) 99 – 103.
6
P6
Design and synthesis of fluorescent probes for fluoride-ion detection and
stimuli responsive coatings for nanoparticles
Helena Macut,a,b Darja Lisjak,a Stane Pajk,c and Darko Makoveca
Jožef Stefan” Institute, Department for Materials Synthesis, Ljubljana, Slovenia
b
Jožef Stefan International Postgraduate School, Ljubljana, Slovenia
c
University of Ljubljana, Faculty of Pharmacy, Aškerčeva 7, 1000 Ljubljana, Slovenia
a
Fluoride anion is one of the most important anions in biological systems and it has a significant
role in health science. However, a chronic elevated consumption of fluoride causes severe
health problems which can lead even to death. Therefore, it is very important to be able to
sensitively and accurately detect fluoride ions in biological samples and drinking water. [1,2,3]
In our department we are researching the potential use of fluorescent functionalized
nanoparticles (NaYF4 co-doped with Yb3+ and Tm3+) with stimuli responsive biocompatible
coatings that are suitable for bio applications. [4] Therefore, it is essential to measure partial
dissolution of fluorine under physiological conditions in order to ensure the safety of such
delivery systems. [5] Our first aim is to design an effective and efficient smart drug delivery
systems using nanomaterials. We will construct a nanoassembly containing a functionalized
nanoparticle coated with a stimuli responsive polymer loaded with model drug such as
doxorubicin. We are currently synthesizing stimuli responsive polymers with either reducing
agent or UV-light trigger.
Our second aim is to design and synthesize a series of fluorescent probes capable of selective
and sensitive detection of fluoride ions in aqueous solutions. Silyl groups are widely used as
protection groups for hydroxyl- containing compounds and can also be used as reactive
elements in fluoride-sensitive chemosensors. After fluoride-mediated deprotection of the silyl
protected hydroxyl group, fluorescence intensity upon excitation dramatically increases. [6] We
have started synthesis of coumarine based fluorescent probes, with silyl protected hydroxy
group and additional moieties to increase aqueous solubility. [2,3] Recently, we are also
investigating the possibility of determining fluoride in aqueous solutions in the presence of
surfactants. [7]
In conclusion we are working on the design and synthesis of complex smart drug delivery
systems on nanoscale and developing novel chemosensors for detection of fluoride in aqueous
solutions.
Literatura:
1. Ke B., Chen W., Ni N., Cheng Y., Dai C., Dinh H., Wang B. A fluorescent probe for rapid aqueous fluoride
detection and cell imaging. Chemical Communications 49 (2013) 2494-2496.
2. Li L., Ji Y., Tang X. Quaternary ammonium promoted ultra selective and sensitive fluorescence detection of
fluoride ion in water and living cells. Analytical Chemistry 86 (2014), 10006-10009.
3. Kleerekoper M. The role of fluoride in the prevention of osteoporosis. Endocrinology Metabolism Clinics of
North America 27 (1998), 441-452.
4. Dai Y., Ma P., Cheng Z., Kang X., Zhang X., Hou Z., Li C., Yang D., Zhai X., Lin J. Up-Conversion Cell
Imaging and pH-Induced Thermally Controlled Drug Release from NaYF4:Yb3+/Er3+ @Hydrogel Core-Shell
Hybrid Microspheres. ACS Nano 6 (2012), 3327-3338.
5. Lisjak D., Plohl O., Ponikvar-Svet M., Majaron B. Dissolution of upconverting fluoride nanoparticles in aqueous
suspensions. RSC Advances 5 (2015), 27393–27397.
6. Kim S., Hong Y. Chromogenic and fluorescent chemodosimeter for detection of fluoride in aqueous
solution.Organic Letters 9 (2007), 3109-3112.
7. Calderon-Ortiz L., Taeuscher E., Bastos-Leite E., Goerls H., Weiss D., Beckert R. Hydroxythiazole-based
fluorescent probes for Fluoride ion detection. Eur.Journal of Organic Chemistry 13 (2012), 2535-2541.
7
P7
Ekstrahiranje strukturnih in interakcijskih lastnosti
v biofizikalnih sistemih
Rene Markovič1,2, Marko Gosak1,3, Marko Marhl1,2,*
1
Fakulteta za naravoslovje in matematiko, Univerza v Mariboru
2
Pedagoška fakulteta, Univerza v Mariboru
3
Inštitut za fiziologijo, Medicinska Fakulteta, Univerza v Mariboru
Številna obolenja so povezana z okvarjeno ali oslabljeno medcelično komunikacijo in
se izražajo na organizacijski ravni tkiv. Raziskovanje regulacijskih procesov na ravni
posameznih celic in znotrajceličnih signalizacijskih poti zato v mnogih primerih ne zadostuje
za razumevanje mehanizmov, ki izzovejo določeno patološko stanje, kakor tudi ne za analizo
učinkovanja terapevtskih sredstev. Predmet proučevanja tako vse pogosteje postaja kolektivna
aktivnost celic, kar pa je pogojeno z razvojem ustreznih eksperimentalnih tehnik in teoretskih
orodij. Sodobni analitični in računski pristopi vključujejo napredne filtracijske metode,
nelinearno analizo časovnih vrst, izdelavo večskalnih matematičnih modelov in ekstrakcijo
vzorcev funkcionalne povezanosti. Slednje se da zelo učinkovito karakterizirati z orodij s
področja sodobne teorije kompleksnih mrež, ki dandanes predstavlja eno izmed najbolj
uveljavljenih in prodornih metodologij za opis interakcij v kompleksnih bioloških sistemih [1].
Naši rezultati pokažejo, da je kombinacija naprednih eksperimentalnih tehnik, sodobnih
analitičnih orodji in matematičnega modeliranja zelo udarno orodje, s katerim si lahko
pridobimo poglobljen vpogled v delovanje različnih večceličnih sistemov [2-7]. Prav tako nam
tovrstna metodologija nudi dobro izhodišče za preučevanje modifikacij povezanih s
patofiziološkimi stanji in delovanja farmakoloških substanc.
Literatura:
1. Bullmore E., Sporns O. Nature Reviews Neuroscience 10 (2009) 186.
2. Stožer A., Gosak M., Dolenšek J., et. al. PLoS Computational Biology 9 (2013) e1002923.
3. Gosak M., Dolenšek J., Markovič R., et al. Chaos, Solitons & Fractals 80 (2015) 76-82.
4. Gosak M., Stožer A., Markovič R., et al. Chaos 25 (2015) 073115.
5. Markovič R., Stožer A., Gosak M., et. al. Scientific Reports 5 (2015) 7845.
6. Gosak M., Markovič R., Fajmut A., poslano v PloS ONE.
7. Markovič R., Gosak M., Repnik R., et al. Advances in Planar Lipid Bilayersand Liposomes, (Elsevier:
Academic Press, 2014) 197–217.
8
P8
Codon optimization and thermostable serine protease expression in E. coli
Nataša Poklar Ulrih *1, Marko Šnajder1, Marko Mihelič2, Dušan Turk2
1
Biotechnical Faculty, University of Ljubljana, Ljubljana, Slovenia
3
Institute Jozef Stefan, Ljubljana, Slovenia
Pernisine is an extracellular thermostable serine protease from hyperthermophilic archeon
Aeropyrum pernix K1. A lower yield from natural host and expression problems in heterologous
host inhibits its characterization and potential application in industry.
Challenges of pernisine overexpression in Escherichia coli were overcome by codon preference
optimization and DNA synthesis de novo. Wild type (pernisinewt) and codon-optimized
(pernisineco) were cloned into pMCSGx series of vectors and expressed in E. coli cells. Fusion
tagged pernisine were purified using fast protein liquid chromatography system equipped with
Ni2+ chelate and gel filtration chromatography columns. The identity was confirmed with Nterminal sequencing, tandem mass spectrometry analysis and immunodetection. Pernisinewt was
not expressed and could not be detected even with immunodetection; meanwhile pernisineco
was purified as a proform with a yield of around 10 mg per liter of culture. Recombinant
pernisine was heat activated at temperature 90°C for 1 h in buffer 10 mM HEPES pH 8.0
containing 1 mM CaCl2. Proteolytic activity of mature pernisineco was confirmed with
zymogramphy at molecular weight 36 kDa. The temperature and the pH optima of the
enzymatic activity of the recombinant pernisine, evaluated by azocasein assay, were around
105°C and pH 7, respectively.
Our findings reveal that codon optimization is crucial for pernisine overexpression in E. coli.
Recombinant pernisine is activated by autoproteolytical cleavage of its N-terminal proregion
consisting of the first 91 aminoacids. Further on, we confirmed that recombinant pernisine
retains characteristics of a native one being calcium modulated thermostable serine protease.
Acknowledgment: This work was founded by the research program P4-0121 (Biochemical and BiophysicalChemical Characterization of the Natural Compounds), the Centre of Excellence for Integrated Approaches in
Chemistry and Biology of Proteins (CIPKeBIP) and operation research Overproducing Recombinant Pernisine in
Bacterial Expression Systems.
9
P9
Membrane hydrolysis by phospholipase A2 leads to an intracellular
accumulation of lipid droplets enriched with polyunsaturated fatty acids
and enables cancer cell survival
Anja Pucer Janež1, Ema Guštin1, Toni Nagode1, Robert Zimmermann2 and Toni Petan1
Department of Molecular and Biomedical Sciences, Jožef Stefan Institute, Ljubljana, Slovenia
2
Institute of Molecular Biosciences, University of Graz, Graz, Austria
1
Cells store neutral lipids within cytosolic lipid droplets (LDs). These newly recognized
organelles are composed of a core of neutral lipids (triacylglycerols (TAGs) and cholesterol
esters), and are covered by a phospholipid monolayer and LD-associated proteins. Recent
evidence suggests that LDs are not passive repositories of energy, but act as platforms
integrating cell signalling and metabolism with important implications for metabolic diseases
and cancer [1]. Secreted phospholipases A2 (sPLA2s) are lipolytic enzymes that hydrolyse
membrane phospholipids to liberate free fatty acids (FAs) and lysophospholipids. They act in
the extracellular space on cell membranes and lipoproteins and are involved in atherosclerosis,
inflammation and cancer [2]. We have recently described a novel metabolic role of sPLA2s in
cancer cells, which includes a stimulation of LD formation and global changes in lipid
metabolism leading to prevention of cell death during starvation [3]. We show here that the
activity of sPLA2 on cancer cell membranes leads to the release of a mixture of mono- and
polyunsaturated FAs (PUFAs). We found that sPLA2-released FAs are taken up by the cell and
are incorporated into TAGs of growing LDs. Importantly, lipidomic analysis of LDs isolated
from cancer cells treated with sPLA2 revealed a specific enrichment of TAG with PUFAs. To
the best of our knowledge, this is the first example of PUFA enrichment in mammalian LDs
and its (patho) physiological relevance is not yet known. We thus identify sPLA2 as a novel
modulator of lipid metabolism that promotes the growth and survival of invasive cancer cells
by altering both the composition and amount of cytosolic LDs. Our results also suggest that
LDs function as integrators of PUFA metabolism and cell signalling, which may be crucial for
the understanding of the various biological roles of sPLA2s and other lipid-modifying enzymes.
References
1. Farese, R. V., Walther, T. C. Lipid droplets finally get a little R-E-S-P-E-C-T. Cell 139 (2009), 855–860.
2. Brglez, V., Lambeau, G., Petan, T. Secreted phospholipases A2 in cancer: Diverse mechanisms of action.
Biochimie 107PA (2014), 114–123.
3. Pucer, A., Brglez, V., Payré, C., Pungerčar, J., Lambeau, G., Petan, T. Group X secreted phospholipase A2
induces lipid droplet formation and prolongs breast cancer cell survival. Molecular Cancer 12 (2013), e111.
10
P10
Diameter dependent mode of exocytosis is indipendent of functional
integrity of SNARE proteins in astrocytes
Alenka Guček1, Jernej Jorgačevski1,2, Priyanka Singh1, Claudia Geisler3, Nina Vardjan1,2,
Marko Kreft1,2,4, Alexander Egner3, Robert Zorec1,2|
1
Laboratory of Neuroendocrinology-Molecular Cell Physiology, Faculty of Medicine, University of Ljubljana,
1000 Ljubljana, Slovenia; 2Celica BIOMEDICAL, 1000 Ljubljana, Slovenia; 3Department of Optical Nanoscopy,
Laser-Laboratory Göttingen e.V., 37077 Göttingen, Germany; 4Department of Biology, Biotechnical Faculty,
University of Ljubljana, 1000 Ljubljana, Slovenia
Key support for vesicle-based release of gliotransmitters comes from studies of
transgenic mice with astrocyte-specific expression of a dominant-negative domain of
synaptobrevin 2 protein (dnSNARE). To determine how this peptide affects exocytosis, we
used super-resolution stimulated emission depletion microscopy and structured illumination
microscopy to study the anatomy of single vesicles in astrocytes. Smaller vesicles contained
amino acid and peptidergic transmitters and larger vesicles contained ATP. Discrete increases
in membrane capacitance, indicating single-vesicle fusion, revealed that astrocyte stimulation
increases the frequency of predominantly transient fusion events in smaller vesicles, whereas
larger vesicles transitioned to full fusion. To determine whether this reflects a lower density of
SNARE proteins in larger vesicles, we treated astrocytes with botulinum neurotoxins D and E,
which reduced exocytotic events of both vesicle types. dnSNARE peptide stabilized the
fusion-pore diameter to narrow, release-unproductive diameters in both vesicle types,
regardless of vesicle diameter.
11
P11
Analiza lipidne membrane v mikrofluidični difuzijski komori
Saša Vrhovec Hartman in Jure Derganc
Inštitut za biofiziko, Medicinska fakulteta, Univerza v Ljubljani
Transmembranska asimetrija (t.j. razlika v sestavi in količini lipidnih molekul med zunanjim in
notranjim lipidnim slojem membrane) igra ključno vlogo pri mnogih celičnih procesih, vendar
pa zaradi pomanjkanja kvantitativnih eksperimentalnih metod, mehanizmi nastanka in
vzdrževanja te asimetrije, še niso dobro poznani. Namen študije je razvoj metode, ki omogoča
proučevanje in spreminjanje transmembranske asimetrije, na ohlapnih fosfolipidnih mehurčkih
(t.j. vesiklih, ki nimajo napete membrane in zato tudi niso sferične oblike). Membrana ohlapnih
fosfolipidnih mehurčkov je namreč izjemo mehka, zaradi česar je kemijsko okolje okoli njih
težko spreminjati, ne da bi se pri tem v hidrodinamskem toku njihova membrana nereverzibilno
preoblikovala. V izogib deformaciji lipidne membrane smo v novi metodi združili
mikrofluidično difuzijsko komoro in optično pinceto [1]. Prednost mikrofluidične difuzijske
komore je, da se raztopine izmenjajo izključno preko difuzije, kar omogoča večkratno
reverzibilno in kontrolirano spreminjanje kemijskega okolja okoli ohlapnih fosfolipidnih
mehurčkih. S optično pinceto, pa lahko poleg premikov izbranega mehurčka v difuzijski komori
merimo tudi spremembe sile v tetrih (t.j. membranskih izrastkih), kar pa je ključnega pomena
za kvantitativno analizo sprememb v lipidni membrani. S pomočjo merjenja sile tetra lahko
kvantitativno spremljamo, kako z dodajanjem amfipatičnih molekul, kot je to lipopolisaharid
(LPS), v okolico fosfolipidnih mehurčkov, vplivamo na spremembo transmembranske
asimetrije.
Literatura:
1. Vrhovec S., Mally M., Kavčič B., Derganc J. A microfluidic diffusion chamber for reversible environmental
changes around flaccid lipid vesicles. Lab Chip 11 (2011) 4200- 4206.
12
P12
Odprte simulacije molekulske dinamike
Jurij Sablić1, Rafael Delgado Buscalioni2 in Matej Praprotnik1
1
Laboratorij za molekularno modeliranje, Kemijski Inštitut, Hajdrihova 19, SI-1001 Ljubljana, Slovenija
Departamento Fïsica Teórica de la Materia Condensada, Universidad Autónoma de Madrid, Campus de
Cantoblanco, E-28049 Madrid, Spain
2
Predstavljamo metodo za izvajanje odprtih simulacij molekulske dinamike (OBMD).
Simulacijska škatla je v eni smeri odprta, kar pomeni da omogoča izmenjavo mase z okolico.
Molekule lahko difundirajo ven iz sistema, nove molekule pa vanj vstavimo v grobozrnat del
škatle (GZ). Tam so molekule predstavljene kot posamezni delci, med katerimi delujejo
efektivne interakcije, ki so mehkejše od odbojnih atomističnih, kar omogoča vstavljanje
poljubno kompleksnih molekul v goste tekočine. Vstavljene molekule lahko prehajajo v
območje visoke ločljivosti, t.j. atomistično območje (AT), pri čemer jim z metodo prilagodljive
ločljivosti (AdResS) postopoma vklapljamo AT prostostne stopnje ter izklapljamo GZ. Poleg
tega nam metoda v odprti smeri omogoča impozicijo realnih zunanjih robnih pogojev (npr.
zunanji tlak) na sistem, zaradi česar lahko bolje poustvarimo eksperimentalne pogoje [1].
Z metodo raziščemo sistem taline zvezdastih polimerov, pri čemer ima vsak polimer 12
rok s po 6 monomeri, ki so pripete na centralni monomer. V ta namen talino najprej
ekvilibriramo. To storimo v zaprtem sistemu s spremenjeno metodo AdResS, kjer preklapljanje
iz GZ v AT resolucijo ni več prostorsko ampak časovno. Na ta način je omogočeno hitrejše
razvozlanje rok dveh sosednjih polimerov, saj lahko le-te prehajajo ena skozi drugo, dokler AT
resolucija še ni v celoti vklopljena [2].
Ekvilibrirani sistem odpremo in opazujemo njegove lastnosti v ravnovesju ter pod
blagim strigom, ki ga v simulacijo vpeljemo kot robni pogoj na odprtih robovih škatle. Enačba
stanja v ravnovesju, dobljena s spreminjanjem zunajega tlaka ter opazovanjem gostote na katero
se sistem relaksira, se dobro ujema z enačbo, izračunano z zaprto simulacijo, kjer spreminjamo
gostoto sistema in merimo ravnovesni tlak. Rezultati neravnovesnih simulacij sistema pod
strigom pravtako nakazujejo dobro ujemanje z nekaterimi lastnostmi iz zaprtih simulacij, kot
npr. vztrajnostni polmer [1].
Literatura:
1. Delgado-Buscalioni R., Sablić J., Praprotnik M.. Open Boundary Molecular Dynamics. Eur. Phys. J. Special
Topics, 2015, DOI: 10.1140/epjst/e2015-02415-x.
2. Sablić J, Učinkovita ekvilibracija taline zvezdastih polimerov, Diplomsko delo, Univerza v Ljubljani, 2012.
13
P13
Identifying the lipid wrap around nanotubes
Maja Garvas, Iztok Urbančič, Anže Testen, Polona Umek, Miha Škarabot, Zoran Arsov, Tilen
Koklič, Igor Muševič, Janez Štrancar
Jožef Stefan Institute, Ljubljana, Slovenia; Faculty of mathematcics and physics University of Ljubljana
Biological identity of a nanomaterial after the initial contact with a biological system
strongly depend on the interaction between surface of a nanomaterial and a biological system
like plasma or plasma membranes. Depending on the affinity of various proteins and lipids, a
nanoparticle can coat with protein and/or lipids and exchange those at any later time as well.
Here, fluorescence microspectroscopy (FMS), FRET concept and EDS TEM are employed to
identify molecular contact between the lipids and surface of a nanomaterial where the affinity
of lipids to nanomaterial surface is responsible for lipid wrapping around nanomaterial leading
to a destabilization of a lipid bilayer.
14
P14
Modelna napoved forsiranega izdihanega volumna v prvi sekundi (FEV1)
pred in po zaužitju nesteroidnih antirevmatikov
Tadej Emeršič1, Andrej Dobovišek1,2, Milan Brumen1,2,3,4, Aleš Fajmut1,3
1
Fakulteta za naravoslovje in matematiko, Univerza v Mariboru, Koroška cesta 160, 2000 Maribor, Slovenija
2
Medicinska fakulteta, Univerza v Mariboru, Taborska ulica 8, 2000 Maribor, Slovenija
3
Fakulteta za zdravstvene vede, Univerza v Mariboru, Žitna ulica 15, 2000 Maribor, Slovenija
4
Institut "Jožef Stefan", Jamova cesta 39, 1000 Ljubljana, Slovenija
Nesteroidni antirevmatiki (NSAR) lahko po zaužitju pri posameznih osebah povzročijo
značilne klinične znake, poznane kot aspirinska intoleranca [1]. Astmatika, ki je preobčutljiv
na NSAR in ima dva značilna klinična znaka – bronhokonstrikcijo in nosne polipe, imenujemo
aspirinsko intolerantni astmatik [2]. Za pojav aspirinske intolerance je ključna razgradnja
arahidonske kisline (AA) v eikozanoide (prostanoide in levkotriene) v belih krvnih celicah. Ta
poteka po ciklooksigenazni in lipoksigenazni poti. Po prvi poti nastajajo prostanoidi, po drugi
pa cisteinil levkotrieni. NSAR zavirajo produkcijo prostanoidov, kar posledično vodi do
povišane produkcije levkotrienov [1, 3]. Raziskave, ki ločujejo aspirinsko intolerantne
astmatike od aspirinsko tolerantnih astmatikov in neastmatikov, potekajo na različnih nivojih
človeškega organizma. Na proteomskem nivoju so ključne ekspresije encimov v metabolni
mreži AA [4, 5], na metabolomskem nivoju pa koncentracije eikozanoidov in njihova razmerja
[3, 6]. Raziskave na nivoju tkiv in organov pa potekajo s provokacijskimi testi za določanje
mejne doze zdravil, ki sprožijo preobčutljivost na NSAR, pri tem pa se s spirometrijo meri
forsirani izdihani volumen zraka v prvi sekundi (FEV1) [7]. V študiji predlagamo fizikalnomatematični model, s katerim povežemo proteomski in metabolomski nivo [8] na ravni celic
ter napovemo dogajanje na ravni tkiva in organa. Napovemo absolutne koncentracije
eikozanoidov v mišičnem intersticiju pljuč, razvito silo v gladki mišičnini dihalnih poti, polmer
tipične dihalne poti in FEV1 v bazalnem stanju (tj. brez zdravila) ter po simulaciji oralnega
zaužitja različnih NSAR za različne modelne populacije. Pri tem z modelom določimo mejne
doze različnih NSAR v smislu povzročitve bronhokonstrikcije in tveganja astmatičnega napada.
Literatura:
1. Szczeklik A. Mechanism of aspirin-induced asthma. Allergy 52 (1997) 613-619.
2. Samter M., Beers R. F. Jr. Concerning the nature of intolerance to aspirin. Journal of Allergy 40 (1967) 281293.
3. Schäfer D. Schmid M., Gode U. C., Baenkler H. W. Dynamics of eicosanoids in peripheral blood cells during
bronchial provocation in aspirin intolerant asthmatics. European Respiratory Journal 13 (1999) 638-646.
4. Cowburn A. S., Sladek K., Soja J. Adamek L., Nizankowska E., Szczeklik A. et al. Overexpression of
leukotriene C4 synthase in bronchial biopsies from patients with aspirin-intolerant asthma. Journal of Clinical
Investigation 101 (1998) 834-846.
5. Szczeklik A., Stevenson D. D. Aspirin-induced asthma: advances in pathogenesis and management. Journal of
Allergy and Clinical Immunology 104 (1999) 5-13.
6. Pierzchalska M., Szabo Z., Sanak M., Soja J., Szczeklik A. Deficient prostaglandin E2 production by bronchial
fibroblasts of asthmatic patients, with special reference to aspirin-induced asthma. Journal of Allergy and Clinical
Immunology 111 (2003) 1041-1048.
7. Nizankowska E., Bestynska-Krypel A., Cmiel A., Szczeklik A. Oral and bronchial provocation tests with aspirin
for diagnosis of aspirin-induced asthma. European Respiratory Journal 15 (2000) 863-869.
8. Fajmut A., Emeršič T., Dobovišek A., Antić N., Schäfer D., Brumen M. Dynamic model of eicosanoid
production with special reference to non-steroidal anti-inflammatory drug-triggered hypersensitivity. IET Systems
Biology 9 (2015) 204-215.
15
P15
Modeliranje vpliva cikličnega gvanozin monofosfata (CGMP) na od kalcija
odvisen tonus gladkih mišičnih celic arterij
Aleš Fajmut1,2, Nina Šutar1, Milan Brumen1,2,3,4
1
Fakulteta za naravoslovje in matematiko, Univerza v Mariboru, Koroška cesta 160, 2000 Maribor, Slovenija
2
Fakulteta za zdravstvene vede, Univerza v Mariboru, Žitna ulica 15, 2000 Maribor, Slovenija
3
Medicinska fakulteta, Univerza v Mariboru, Taborska ulica 8, 2000 Maribor, Slovenija
4
Institut Jožef Stefan, Jamova cesta 39, 1000 Ljubljana, Slovenija
Predstavljen je kompleksen fizikalno-matematični model s 24 spremenljivkami in preko stotimi
parametri za simulacijo od kalcija (Ca2+) odvisnega razvoja sile v gladkih mišičnih celicah
(GMC) arterij. Z modelom simuliramo vpliv povišane produkcije cikličnega gvanozin
monofosfata (cGMP), ki v celici lahko nastane kot posledica povišane ravni dušikovega oksida
(NO) v endotelijski plasti sten arterij. NO lahko tam nastaja kot posledica povišane strižne
napetosti krvi na stene arterij. NO iz endotelijskih celic difundira v GMC, kjer stimulira
produkcijo cGMP. V modelu simuliramo vpliv različnih koncentracij tega sekundarnega
prenašalca na kodacijo signala Ca2+ v citoplazmi GMC in posledični razvoj sile. Upoštevan je
vpliv molekule cGMP na od kalcija odvisne kanale za kalij (K+) (KCa) in klor (Cl-) (ClCa),
izmenjevalce natrija (Na+) in kalcija (Ca2+) (NCX) in črpalke Na+ in K+ (Na/K-ATPaze). Poleg
tega model vključuje še prehajanje Ca2+ skozi napetostno odvisne kanale (VOCC), skozi
črpalke v celični membrani (PMCA) in v sarkoplazemskem retikulumu (SR) (SERCA) ter skozi
kanale, ki so odvisni od inozitol trifosfata (IP3) in od Ca2+ (ICICR). Model vključuje še pasivno
prehajanje ionov Cl-, Na+, K+ in Ca2+ preko membrane. Z električnimi tokovi teh ionov je
pogojena napetost na membrani GMC. V modelu upoštevamo še vezavo Ca2+ na proteine v SR
in v citoplazmi. Razvoj sile modeliramo s 4-stanjskim modelom interakcij med miozinom in
aktinom, ki jih regulira aktivna oblika encima kinaze lahkih verig miozina (MLCK), ki je
odvisna od interakcije s kompleksi Ca2+-kalmodulin (CaM).
Razvoj sile modeliramo v območju koncentracije cGMP med 0,01 in 10 µM. Pri najnižji
koncentraciji cGMP ([cGMP]=0,01 µM) znaša sila 61% maksimalne možne teoretične razvite
sile v GMC, pri vrednosti [cGMP]=6 µM, ko doseže povprečna vrednost koncentracije Ca2+ v
citoplazmi svoj minimum, pa zgolj 25 %. Padec sile v odvisnosti od cGMP je pogojen s
spremembo frekvence in amplitude oscilacij Ca2+, pri čemer sila dobro kolerira s povprečno
koncentracijo Ca2+ v citoplazmi. Z modelom napovedana odvisnost sile od cGMP ni popolnoma
v skladu z našimi pričakovanji in eksperimentalnimi opažanji, saj model pri vrednostih
[cGMP]>6 µM napove naraščajočo odvisnost sile, čeprav smo pričakovali padajočo odvisnost
na celotnem območju modeliranja. To nakazuje, da v modelu verjetno niso bili upoštevani vsi
mehanizmi učinkovanja cGMP na izmenjavo Ca2+ med shrambami. Model bi bilo v prihodnosti
smiselno nadgraditi z upoštevanjem dodatnih mehanizmov vpliva cGMP na dinamiko Ca2+.
Znano je, da naj bi cGMP posredno preko aktivacije PKG vplival tudi na delovanje črpalk
SERCA in na odprtost kanalov tipa ICICR na membrani SR.
Rezultati modela so bili predstavljeni v magistrskem delu študentke fizike Nine Šutar na
Fakulteti za naravoslovje in matematiko Univerze v Mariboru.
16
P16
Kapsulacija kurkumina v mikro- in nano-dostavne sisteme
Tomaž Lutman, Katja Istenič, Nataša Poklar Ulrih
Biotehniška fakulteta, Univerza v Ljubljani
Kurkumin je hidrofobni polifenol, ki se nahaja v korenini rastline kurkume (Curcuma longa) in
ji daje značilno rumeno barvo. Kurkuma je zdravilna rastlina, ki jo gojijo v tropskih področjih
Azije in je v uporabi že več kot 2500 let. Zaradi svojih lastnosti se kurkumo koristi v različne
namene. V južnoazijski kuhinji se jo jedem dodaja za izboljšan okus in barvo. Je ena izmed
glavnih sestavin mešanice začimb curry [1]. Številne predklinične in klinične študije so
pokazale zdravilne učinke kurkumina na bolezni, kot so rak, nevrološke, kardiovaskularne,
pljučne in metabolične bolezni. Intenzivne raziskave v zadnjih 50 letih so pokazale, da ima
kurkumin antioksidativne, protivnetne in antitumorske lastnosti. Vzrok za širok spekter
delovanja je posledica tega, da kurkumin vpliva na različne nivoje v celičnih signalnih poteh.
Aktivira ali zavira lahko transkripcijske faktorje, aktivacijske proteine, metaloproteaze, člene v
celičnem ciklusu in celični proliferaciji [2].
V našem delu smo kapsulirali kurkumin v nano-dostavni sistem proliposome in mikro-dostavni
sistem alginatne kapsule in v kombinacijo obeh sistemov: proliposom-alginatne kapsule.
Proliposome smo pripravili tako, da smo sojin lecitin raztopili v etanolu s kurkuminom,
mešanico segrevali 5 minut na 60 °C in ji po kapljicah dodajali vodo. Tako so nastali
proliposomi, v katere se je kapsuliral kurkumin. Alginatne kapsule smo pripravili s pomočjo
kapsulatorja B-395 Pro (Büchi, Švica). Raztopino kurkumina v etanolu smo zmešali z 1,3 %
natrijevim alginatom in ga na kapsulatorju razpršili v raztopino 1,5 % CaCl2, kjer je prišlo do
zamreženja alginata in nastanka kapsul. Proliposom-alginatne kapsule smo pripravili tako, da
smo raztopino proliposomov zmešali z natrijevim alginatom in po enakem postopku pripravili
kapsule.
Po pripravi proliposomov, alginatnih in proliposom-alginatnih kapsul smo izmerili uspešnost
kapsulacije in delež kurkumina v dostavnih sistemih. Najvišja izmerjena uspešnost kapsulacije
je bila pri proliposomih (95±2 %), pri proliposom-alginatnih kapsulah je bila 88±1 %, sledi
jima vrednost 67±1 % pri alginatnih kapsulah. Kurkumin se je v največji meri kapsuliral v
proliposome zaradi njegove hidrofobne narave. Izmerili smo tudi sproščanje kurkumina iz
dostavnih sistemov pri segrevanju na 95 °C in pri inkubaciji v vodnih raztopinah z različnimi
pH vrednostmi. Rezultati so pokazali, da kurkumin ne razpade in ne zapusti proliposomov pri
95 °C in pri inkubaciji v vodnih medijih s pH 2,1-6,0. Pri alginatnih kapsulah pride do
sproščanja in razpadanja kurkumina pri 95 °C in razpadanja kapsul v vodnem mediju s pH 2,1.
V vodnih medijih s pH 4,0 in 6,0 pride do počasnega sproščanja, kapsule ostanejo cele. Iz
proliposom-alginatnih kapsul ne pride do sproščanja kurkumina v medij pri 95 °C in inkubaciji
v vodnih medijih s pH 2,1-6,0, pride pa do razpadanja kurkumina znotraj kapsul pri 95 °C in
pH 2,1. Pripravljeni nano- in mikro-dostavni dostavni sistemi so potencialno uporabni v živilski
in farmacevtski industriji.
Literatura:
1.
2.
Gupta S. C., Sung B., Kim, J. H., Prasad S., Li S., Aggarwal B. B. Multitargeting by turmeric, the golden
spice: From kitchen to clinic. Mol Nutr Food Res 57 (2013) 1510-1528.
Mohanty C., Das M., Sahoo S. K. Emerging role of nanocarriers to increase the solubility and bioavailability
of curcumin. Expert Opin Drug Deliv 9 (2012) 1347-1364.
17
P17
Topološki defekti na bioloških membranah
Luka Mesarec1, Aleš Iglič1, Samo Kralj2,3
Laboratorij za biofiziko, Fakulteta za elektrotehniko, Univerza v Ljubljani, Tržaška cesta 25, 1000 Ljubljana,
Slovenija
2
Oddelek za fiziko, Fakulteta za naravoslovje in matematiko, Univerza v Mariboru, Koroška cesta 160, 2000
Maribor, Slovenija
3
Odsek za fiziko trdne snovi, Institut Jožef Stefan,Jamova cesta 39, 1000 Ljubljana, Slovenija
1
Topološki defekti nastanejo na bioloških membranah, na katere je nanesena tanka plast
nematičnih tekočih kristalov. Takšne membrane imenujemo tudi nematične lupine. Za tekoče
kristale je značilen orientacijski red dolgega dosega, njihova usmerjenost v nematičnih lupinah
pa je omejena tangentno na površino lupin [1]. Usmerjenost tekočih kristalov na površini
prikažemo z vektorskim poljem. V jedru topoloških defektov orientacija tekočih kristalov ni
enolično določena.
Ključna lastnost topoloških defektov je njihov topološki naboj, ki je definiran kot
navojno število vektorskega polja na tangentni ravnini v okolici defekta [2]. Kadar je naboj
pozitiven, imamo opravka z defekti, kadar je negativen, pa z antidefekti. Vsota vseh topoloških
nabojev na površini je konstantna in je odvisna zgolj od topologije površine. Na plakatu so bile
predstavljene površine s topologijo krogelne lupine. V to kategorijo spadajo vse površine, ki jih
dobimo z zvezno deformacijo krogelne lupine. Na takšnih lupinah se ne moremo izogniti
topološkim defektom, vsota njihovih nabojev pa je po Poincaréjevem teoremu vedno enaka 2.
Pomembno vlogo pri konfiguracijah topoloških defektov igra Gaussova ukrivljenost, ki
nastopa tudi v funkcionalu proste energije. Območja s pozitivnimi vrednostmi Gaussove
ukrivljenosti so energijsko ugodna za defekte (pozitiven naboj) [3], medtem ko območja z
negativno Gaussovo ukrivljenostjo privlačijo antidefekte (negativen naboj).
Opazna je analogija z elektrostatiko. Podobno kot električni naboji se tudi topološki
defekti z naboji enakega predznaka med sabo odbijajo, defekti z naboji nasprotnih predznakov
pa privlačijo. Gaussova ukrivljenost v tej analogiji nastopa kot električno polje, ki naboje
različnih predznakov privlači ali odbija.
Literatura:
1. Kralj, Samo, Riccardo Rosso, and Epifanio G. Virga. Curvature control of valence on nematic shells. Soft
Matter 7.2 (2011) 670-683.
2. Rosso, Riccardo, Epifanio G. Virga, and Samo Kralj. Parallel transport and defects on nematic
shells. Continuum Mechanics and Thermodynamics 24.4-6 (2012) 643-664.
3. Mesarec, Luka, et al. Numerical study of membrane configurations. Advances in Condensed Matter Physics
vol. 2014 (2014) 7 pages.
18
P18
Effects of lactational exposure to non-planar PCB-155 and planar PCB-169
on growth, biochemical and biomechanical parameters of maturing rat
femur
Jana Brankovič1, Sašo Jovanovski2,3, Alexander Hofmeister4, Matjaž Uršič1, Gregor
Fazarinc1, Azra Pogačnik1, Janja Jan5, and Milka Vrecl1
Institute of Anatomy, Histology and Embryology, Veterinary Faculty, University of Ljubljana, Gerbičeva 60,
1000 Ljubljana, Slovenia
2
Post-doc. Department of Prosthodontics, Faculty of Medicine, University of Ljubljana, Hrvatski trg 6, 1000
Ljubljana, Slovenia
3
Department of Prosthodontics, Faculty of Dental Medicine, University of St.”Cyril and Methodius”,
Vodnjanska 17, 1000 Skopje, Macedonia
4
Biomedical Research, Medical University of Graz, Roseggerweg 48, 8036 Graz, Austria
5
Department of Dental Diseases and Normal Dental Morphology, Faculty of Medicine, University of Ljubljana,
Hrvatski trg 6, 1000 Ljubljana, Slovenia
1
Polychlorinated biphenyls (PCBs) are ubiquitous, highly persistent and bioaccumulative
lipophilic environmental pollutants with a variety of potential health risks in wildlife, laboratory
animals and humans. Exposure to PCBs induces a broad spectrum of toxic effects in various
organs including bone. The aim of our study was to examine effects of a planar and a nonplanar hexachlorobiphenyl (PCB-169 and PCB-155, respectively), individually and in
combination, on selected biochemical parameters and femur growth, geometry, mineral density
and biomechanical properties in rat offspring lactationally exposed to PCBs during the early
postnatal period.
21 lactating female Wistar rats, divided into four groups, were intraperitoneally
administered PCB congeners dissolved in olive oil at different time points after delivery. In
total, group 1 received 3 mg of PCB-169 per kg body weight, group 2 12 mg of PCB-155 and
group 3 3 mg of PCB-169 and 12 mg of PCB-155. The control (group 4) was administered olive
oil only. Offspring were sacrificed on postnatal day 22, body weights were recorded, blood
samples collected and femora dissected. Peripheral quantitative computed tomography (pQCT)
and three-point bending test using purpose-made mechanical testing machine is currently
underway to obtain data on femur geometry and biomechanical properties.
Serum concentration levels of inorganic phosphate were significantly lowered in PCB155+169 and increased in PCB-169 group compared to control and to PCB-155 group. Total
alkaline phosphatase activity was significantly decreased in PCB-169 and PCB-155+169
groups. Changes in serum calcium and sex-by-treatment differences were not observed. Total
femur length (measured from the top of the femur head to the most distal point of the medial
condyle) was decreased in PCB-169 and PCB-155+169 groups compared to control. Femur
length in PCB-155 group was significantly increased compared to control and to PCB-169 and
PCB-155+169 groups. The diameter (measured at the narrowest part of the femur) was reduced
in PCB-169 and PCB-155+169 groups compared to PCB-155 group. Calcium, phosphorus and
their ratio in inorganic substance of femur were not significantly altered.
In conclusion, preliminary results suggest that lactational exposure to PCB-155 and PCB-169
affected femur growth parameters. Effects of planar PCB-169 and the combination PCB155+169 lead to shorter and thinner bones while the non-planar PCB-155 seems to have the
opposite effects on femur growth.
19
P19
Protein crowding effect on membrane bending depends
on protein lateral confinement
Jure Derganc1 and Alenka Čopič2
1
Institute of Biophysics, Faculty of Medicine, University of Ljubljana, 1000 Ljubljana, Slovenia
2
Institut Jacques Monod, University Paris Diderot and CNRS, 75013 Paris, France
Crowding of membrane proteins with large extra-membrane domains has been recently
recognized as one of the important factors affecting bending of cellular membranes, e.g., COPII
vesicle formation. We have theoretically analyzed this effect and examined its dependence on
protein size, shape, transmembrane asymmetry and lateral confinement. By comparing the tugof-war between the entropic pressure of crowded proteins and the bending energy of lipid
bilayer, we identify the length scale parameter that defines the effective bending properties of
a crowded membrane and show that the effect of protein crowding is larger for proteins with
elongated extra-membrane domains. The spontaneous curvature of a membrane with a
physiologically-relevant amount of membrane proteins depends primarily on the degree of
protein asymmetry, whereas the membrane's effective bending modulus depends on protein
lateral confinement. If the proteins are not confined to the bending membrane patch, the
effective membrane bending modulus is the same as in a pure bilayer, but it can increase
significantly if the proteins are confined by a diffusion barrier. Thus, protein crowding can
considerably alter the energetic cost of a transport vesicle formation for all membranes except
for symmetric membranes with unconfined proteins.
20
P20
Cytoplasmic distribution and mobility of AQP4-vesicles in rat astrocytes
Maja Potokar 1,2, Matjaž Stenovec1,2, Jernej Jorgačevski1,2, Torgeir Holen3, Marko Kreft1,2,4,
Ole Petter Ottersen3, Robert Zorec1,2 |
1
Institute of Pathophysiology, Faculty of Medicine, University of Ljubljana, Ljubljana, Slovenia; 2Celica
Biomedical, Ljubljana, Slovenia; 3Center for Molecular Biology and Neuroscience, University of Oslo, Oslo,
Norway; 4Biotechnical Faculty, University of Ljubljana, Večna pot 111, 1000 Ljubljana, Slovenia
Brain edema is associated with many neurological disorders and is a major clinical issue.
Aquaporin-4 (AQP4) water channel is supposed to have a major role in the development of
brain edema and is strongly expressed in astrocytic end-feet membranes [1,2]. Regulation of
the plasma membrane density of AQP4 is unclear. We tested the hypothesis that the plasma
membrane localization of AQP4 correlates with the properties of AQP4 vesicle traffic which
may be altered in pathologic conditions.
We identified the plasma membrane localization of AQP4 and the localization of two
newly described AQP4 isoforms, AQP4d and AQP4e [3], in cultured rat astrocytes. These
experiments were coupled with quantitative vesicle mobility studies. The results show that
AQP4e is mainly present in the plasma membrane, but AQP4d isoform also has a minor plasma
membrane distribution. The vesicle mobility studies of the predominant plasma membrane
isoform AQP4e were performed in several conditions mimicking pathological states and the
results indicate that the plasma membrane distribution of AQP4e correlates with alterations in
vesicle mobility. Stimulation with dbcAMP, to induce reactive gliosis, the hallmark of which
is overexpression of intermediate filaments, and hypoosmotic stimulation, to mimic edema,
significantly affected the mobility of AQP4e carrying vesicles. In reactive astrocytes, AQP4evesicle mobility was diminished, but hypoosmotic stimulation triggered a time-dependent
biphasic response in AQP4e vesicle mobility: an initial transient reduction followed by an
increase in vesicle mobility. Hypoosmotic stimulation also triggered major rearrangements of
the vimentin cytoskeleton mesh.
Different responses of AQP4e vesicle mobility in conditions mimicking pathological
states, indicate complex vesicle mobility regulation, which may in part be due to alterations of
cytoskeleton, as seen in hypoosmotic conditions. Other mechanisms remain to be identified in
future studies.
Literature:
1. Papadopoulos M.C., Manley G.T., Krishna S., Verkman A.S. Aquaporin-4 facilitates reabsorption of excess
fluid in vasogenic brain edema. FASEB J 18 (2004) 1291-1293.
2. Nase G., Helm P.J., Enger R., Ottersen O.P. Water entry into astrocytes during brain edema formation. Glia 56
(2008) 895-902.
3. Moe S.E., Sorbo J.G., Sogaard R., Zeuthen T., Petter Ottersen O., Holen T. 2008. New isoforms of rat
Aquaporin-4. Genomics 91 (2008) 367-377.
21
P21
Interakcija lipidne membrane z bakterijskim LPS
Mojca Mally, Jure Derganc, MarušaVitek, Saša Vrhovec Hartman,
Urška Klančnik, Saša Svetina
Inštitut za biofiziko, Medicinska fakulteta, Univerza v Ljubljani
Predstavili bomo študijo nadzorovanega preoblikovanja umetne membrane zaradi vgrajevanja
snovi v eno plast membranskega dvosloja. Bakterijski lipopolisaharid (LPS) je uporabljen kot
modelna molekula, saj se z lipidnimi verigami vrine v zgornjo plast membrane, zaradi svoje
velikosti pa ne more prehajati na spodnjo plast. LPS je glavna sestavina zunanje stene Gram
negativnih bakterij in je v fokusu razvoja novih antimikrobnih učinkovin [1]. Prikazali bomo
metodo in poskuse, ki nam v okolju mikrofluidične merilne celice omogočajo opazovanje in
analizo odzivanja ohlapnih lipidnih vesiklov celičnih velikosti na vgrajevanje LPS. Ohlapni
vesikli se nemudoma odzovejo na izjemno majhne spremembe v koncentracijah LPS (reda
velikosti 10 ng/ml), in sicer s spremembo oblike. V difuzijski komori mikrofluidične celice so
spremembe lahko nadzorovane, obrnljive in potekajo počasi, preko difuzije LPS v bližino
vesikla, na ta način pa sferični vesikel največkrat dobi izrastke v obliki niza manjših kroglic. S
kontinuiranim opazovanjem posameznih vesiklov lahko spremljamo časovne odvisnosti
nastajanja kroglic in velikosti nastalih kroglic. Preko teoretične analize sprememb v morfologiji
lahko zaradi visoke občutljivosti metode kvantitativno ovrednotimo particijski koeficient
vezave učinkovine (LPS) v membrano lipidnega mehurčka.
Literatura:
1. Dong H., Xiang Q., Gu Y., Wang Z., Paterson N. G., Stansfeld P. J., He C., Zhang Y., Wang W., Dong C.
Structural basis for outer membrane lipopolysaccharide insertion. Nature 511 (2014) 52 – 56.
22