docLinkki julkaisuun - UEF Electronic Publications - Itä
download 
Report Transcription
Linkki julkaisuun - UEF Electronic Publications - Itä
ULTRASUODATUSMENETELMÄ BAKTEERIEN JA VIRUSTEN SAMANAIKAISEEN KONSENTROINTIIN SUURISTA VESITILAVUUKSISTA Sallamaari Siponen Pro gradu -tutkielma Ympäristötiede Itä-Suomen yliopisto, Ympäristötieteen laitos Elokuu 2014 ITÄ-SUOMEN YLIOPISTO, Luonnontieteiden ja metsätieteiden tiedekunta Ympäristötiede Sallamaari Siponen: Ultrasuodatusmenetelmä bakteerien ja virusten samanaikaiseen konsentrointiin suurista vesitilavuuksista Pro gradu -tutkielma: 82 sivua Tutkielman ohjaajat: FT Tarja Pitkänen, FT dos. Eila Torvinen, FT dos. Ilkka Miettinen Elokuu 2014 ________________________________________________________________________ Avainsanat: ultrasuodatus, konsentrointi, talousvesi, bakteerit, virukset TIIVISTELMÄ Vesimikrobiologisessa analytiikassa käytetään yleisesti melko pieniä vesinäytetilavuuksia. Yleisimmin käytetty kalvosuodatusmenetelmä ei ole erityisen tehokas suurten vesinäytetilavuuksien tutkimisessa. Näytetilavuus on yleisesti 100 ml tai erikoistapauksissa muutamia litroja vettä. Näistä tilavuuksista ei välttämättä havaita pieninä lukumäärinä vedessä esiintyviä tautia-aiheuttavia mikrobeja, joiden havaitseminen esimerkiksi talousvedentuotannon turvallisuuden arvioinnissa ja vesivälitteisten epidemioiden selvitystilanteissa olisi tärkeää. Tässä työssä tutkittiin ultrasuodatusmenetelmän soveltuvuutta eri mikrobiryhmien samanaikaiseen konsentrointiin suurista vesitilavuuksista. Työssä otettiin käyttöön ristivirtaustekniikkaan perustuva ultrasuodatuslaitteisto. Laitteiston toimintaa testattiin ja bakteerien ja virusten konsentroinnin suhteellista saantoa selvitettiin ensin laboratorioolosuhteissa ja pilot-mittakaavan vesilaitoksella näytevedellä, jossa oli tunnettu lukumäärä Escherichia coli -bakteeria, somaattisia ja F-spesifisiä kolifageja tai norovirusta. Satojen litrojen ultrasuodatusta testattiin vesilaitoksilla pohja- ja pintaveden näytteenotossa ja verkostovedestä epidemiatilanteessa. Ultrasuodatusnäytteestä ja pulloihin otetusta samasta näytevedestä määritettiin ympäristöstä peräisin olevien tai suolistoperäistä saastumista ilmentävien mikrobien lukumääriä. Laitteiston suodatusnopeus vaihteli 550-1200 ml/min ja paine 0,7-1,1 baarin välillä. E. coli bakteerin saanto oli 10-71 %, F-spesifisten kolifagien saanto 4-19 % ja somaattisten kolifagien saanto 16-42 %. Yhden suoritetun kokeen perusteella saanto norovirukselle oli 5 %. Kenttäkokeissa saatiin suodatettua 236-1070 litraa alle vuorokaudessa. Tutkimuksen kohdemikrobeja todettiin sekä ultrasuodatusmenetelmällä että pulloihin otetuista näytteistä. Suodatinpatruunan tai laitteiston rakenne voi aiheuttaa mikrobien kiinnittymisen suodatinpatruunaan, minkä arveltiin heikentävän ristivirtausmenetelmän saantoa. Vastavirtahuuhtelun testaaminen tunnistettiin jatkotutkimustarpeeksi, koska se voi olla tehokas menetelmä suodatinpatruunaan kiinnittyneiden mikrobien huuhteluun suodattimelta. Ultrasuodatusmenetelmällä voidaan konsentroida suuren tilavuuden vesinäyte erilaisissa kenttäolosuhteissa. Mikrobien havaitsemistodennäköisyys on suurempi 1000 litran tilavuudesta 50 %:n saannolla verrattuna alle litran tai jopa kymmenen litran näytetilavuuteen 100 %:n saannolla. Menetelmän tehokkuutta erilaatuisten näytevesien mikrobikonsentrointiin ja käyttöä yhdessä molekyylibiologisten menetelmien kanssa on tutkittava lisää. UNIVERSITY OF EASTERN FINLAND, Faculty of Science and Forestry Environmental Science Sallamaari Siponen: Ultrafiltration method for simultaneous concentration of bacteria and viruses in large water volumes Master’s thesis: 82 pages Supervisors: Tarja Pitkänen PhD, Eila Torvinen PhD doc., Ilkka Miettinen PhD doc. August 2014 ________________________________________________________________________ Keywords: ultrafiltration, concentration, drinking water, bacteria, viruses ABSTRACT Water sample volumes for microbial analysis are usually rather small. Membrane filtration is one of the most used methods and it is not very effective for analysing large water volumes. A sample volume is usually 100 ml and in some special cases few litres of water. Microbial numbers may be so small that they are not detected in these volumes. It is important to detect also small numbers of microbes when assessing safety of water supply or during water outbreak investigations. The goal of this study was to test ultrafiltration as a method for concentrating bacteria and viruses simultaneously from large water volumes. An ultrafiltration apparatus was built and the recovery of bacteria and viruses was tested in a laboratory and a pilot-scale water treatment plant with water samples with known numbers of Escherichia coli bacteria, F-spesific coliphages, somatic coliphages or norovirus. Ultrafiltration for filtrating hundreds of litres of ground water and surface water was tested at water treatment plants and of tap water during a waterborne outbreak. Microbes of environmental or feacal origin were analysed from water samples using ultrafiltration method and bulk water sampling. Filtration rate ranged from 550 to 1200 ml/min and pressure from 0.7 to 1.1 bar. Recoveries for E. coli -bacteria, F-spesific coliphages, somatic coliphages and norovirus were 10-71 %, 4-19 %, 16-42 % and 5 % respectively. The ultrafiltration sample volumes varied from 236 to 1070 litres and were filtrated in less than 24 hours. The targeted microbes were detected with the ultrafiltration and the bulk water sampling method. The construction of the ultrafilter or the apparatus was assumed to have an effect on microbes causing low recovery due to the attachment of microbes on the filter. Backflushing the ultrafilter should be tested in the future since it could effectively detach the microbes from the filter. It was found that ultrafiltration method can be used to concentrate large water volumes on-site. For example, with sample volume of 1000 litres and recovery of 50 %, the detection probability of microbes is higher than with the sample volume of some litres with recovery of 100 %. Microbial concentration efficiency of the ultrafiltration method with different water samples should be further tested. Also the use with secondary concentration and molecular microbiolology detection methods together with the ultrafiltration should be investigated in detail. ESIPUHE Tein Pro gradu -tutkielmani kokeellisen osuuden Terveyden ja hyvinvoinnin laitoksen Ympäristöterveyden osastossa Vesi ja terveys -yksikössä vuoden 2012 aikana. Tutkielma on osa Vesihuoltolaitosten kehittämisrahaston rahoittamaa projektia ”Tehostettu vesiturvallisuuden monitorointi: Pikamittausmenetelmä elinkykyisten E. coli -bakteerien havaitsemiseen”, joka toteutettiin yhteistyössä Kuopion Veden, Savonia-ammattikorkeakoulun ja sosiaali- ja terveysministeriön kanssa. Kiitän ohjaajiani FT Tarja Pitkästä, FT dosentti Eila Torvista ja FT dosentti Ilkka Miettistä kärsivällisestä ohjauksesta ja kannustuksesta. Haluan kiittää myös Tiina Heiskasta, Tarja Rahkosta, Ari Kauppista, Pia Räsästä, Maija Nykästä ja koko muuta Vesi ja terveys -yksikön henkilökuntaa avusta tämän työn suorittamisessa. Kiitoksen ansaitsevat myös Tero Kuhmonen ja Eero Antikainen Savonia-ammattikorkeakoululta, Markku Lehtola Kuopion Vedeltä, Ari Kainulainen Siilinjärven kunnalta ja Aki Artimo, Osmo Puurunen ja Jorma Paavola Turun Seudun Vedeltä. Kiitos myös perheelleni ja ystävilleni tärkeästä tuesta ja kannustuksesta. Kuopiossa 27.8.2014 Sallamaari Siponen LYHENTEET CC = Chromocult Coliform Agar DAPI = 4’,6-diamidino-2-phenylindole MF = Membrane filtration, kalvosuodatus NaPP = Natriumpolyfosfaatti PEG = Polyetyleeniglykoli PFU = Plaque forming unit, plakin muodostava yksikkö PMY = Pesäkkeen muodostava yksikkö RCF = Centrifugal rotation force, keskipakoisvoima RPM = Rounds per minute, kierrosta minuutissa STM = Sosiaali- ja terveysministeriö TSA = Tryptone soya agar, tryptooni-soija-agar TSB = Tryptone soya broth, tryptooni-soija-liemi TSC = Tryptoosi-sulfiitti-sykloseriini-agar UF = Ultrafiltration, ultrasuodatus WHO = World Health Organization, Maailman terveysjärjestö WSP = Water safety plan, vesiturvallisuussuunnitelma SISÄLLYS Esipuhe .................................................................................................................. 5 Lyhenteet ............................................................................................................... 6 1 Johdanto .......................................................................................................... 9 2 Kirjallisuuskatsaus........................................................................................ 11 2.1 Talousveden mikrobiologinen turvallisuus ............................................................... 11 2.2 Vesiepidemiat ja niiden syyt...................................................................................... 12 2.3 Talousveden mikrobiologisen laadun valvonta ja hallinta ........................................ 14 2.3.1 Suomen lainsäädäntö .......................................................................................... 15 2.3.2 WSP eli vesiturvallisuussuunnitelma ................................................................. 19 2.3.3 Talousveden mikrobiologisen laadun valvonnan haasteita ................................ 20 2.3.4 Laajennettu mikrobiologinen analytiikka talousveden laadun arviointiin ......... 21 2.4 Vesinäytteiden konsentrointitekniikat mikrobiologisia tutkimuksia varten .............. 25 2.4.1 Suodattaminen mikrobeja pidättävää materiaalia käyttäen ................................ 26 2.4.2 Sentrifugointi ...................................................................................................... 28 2.5 Ultrasuodatusmenetelmä ........................................................................................... 30 2.5.1 Ultrasuodatuksen toteutus .................................................................................. 31 2.5.2 Käytännön sovellutukset .................................................................................... 35 3 Työn tavoitteet .............................................................................................. 37 4 Aineisto ja menetelmät ................................................................................. 38 4.1 Ultrasuodatusmenetelmä ja laitteisto ......................................................................... 38 4.1.1 Ultrasuodatuslaitteisto ........................................................................................ 38 4.1.2 Ultrasuodatuksen esivalmistelut ......................................................................... 39 4.1.3 Näytteen suodatus ultrasuodatuslaitteistolla ...................................................... 40 4.2 Testimikrobit ............................................................................................................. 41 4.2.1 Bakteeri- ja virusliuosten valmistus ................................................................... 41 4.2.2 Bakteerien määritys vesinäytteistä ..................................................................... 43 4.2.3 Virusten määritys vesinäytteistä......................................................................... 44 4.2.4 Heterotrofisen pesäkeluvun ja kokonaissolulukumäärän määritys .................... 45 4.3 Ultrasuodatusmenetelmän saantokokeet laboratorio-olosuhteissa ............................ 46 4.3.1 Laboratoriokoeasetelmat .................................................................................... 46 5 6 7 4.4 Koe pilot-mittakaavan vesilaitoksella ....................................................................... 49 4.5 Ultrasuodatusmenetelmän testaus kenttäolosuhteissa ............................................... 51 4.5.1 Testaus esikäsitellyllä pintavedellä .................................................................... 52 4.5.2 Testaukset pohjavedenottamoilla ....................................................................... 53 4.5.3 Testaus verkostovedellä vesiepidemiatilanteessa............................................... 53 Tulokset ........................................................................................................ 54 5.1 Suodatusnopeuden testaus laboratorio-olosuhteissa .................................................. 54 5.2 Saantokokeet .............................................................................................................. 55 5.3 Koe pilot-mittakaavan vesilaitoksella ....................................................................... 58 5.4 Kenttäkokeet .............................................................................................................. 58 Tulosten tarkastelu........................................................................................ 63 6.1 Ultrasuodatusmenetelmän toiminta ........................................................................... 63 6.2 Bakteerien ja virusten konsentrointitehokkuus.......................................................... 65 6.3 Ultrasuodatusmenetelmän toimintakyky erilaisissa kenttäolosuhteissa .................... 68 Johtopäätökset .............................................................................................. 71 Lähdeluettelo ....................................................................................................... 72 9 1 JOHDANTO Juomaveden turvallisuus on perusedellytys yhteiskunnan normaalien toimintojen ylläpitämiseksi. Tautia-aiheuttavat mikrobit ovat yksi talousveden turvallisuutta uhkaava tekijä. Jo pieni taudinauheuttajamikrobien lukumäärä saastuneessa talousvedessä voi aiheuttaa suuren ihmismäärän samanaikaisen sairastumisen eli juomavesivälitteisen epidemian. Talousveden saastumisen ehkäisemiseksi raakaveden laadun, vesilaitosten toiminnan ja vedenjakeluverkoston tiiveyden turvaaminen on tärkeää. Uusia uhkia juomaveden turvallisuudelle aiheuttavat ilmastonmuutoksen mukanaan tuomat sään ääreisilmiöt. (WHO 2011) Veden saastumista ilmentävien mikrobien ja varsinaisten tautia aiheuttavien mikrobien pienet lukumäärät osittain puhdistetuissa vesissä ja saastuneessa verkostovedessä aiheuttavat haasteita niiden havaitsemiseen. Nykyään näytteet tutkittavasta vedestä otetaan pulloihin tai kanistereihin ja tutkittu näytetilavuus on sadasta millilitrasta muutamiin litroihin vettä. Näistä tilavuuksista pieniä mikrobilukumääriä ei välttämättä havaita. Pienten lukumäärien havaitsemiseksi näytetilavuuden tutkittavasta vedestä tulisi olla riittävän suuri. Suuren vesitilavuuden tutkiminen on nykyisillä menetelmillä aikaa vievää ja kallista. On kuitenkin tilanteita, joissa suuren tilavuuden tutkiminen kannattaa. Esimerkiksi talousveden laadun entistä paremmaksi turvaamiseksi tehtävä tuotantoketjun uhkien tunnistaminen ja riskien arviointi edellyttävät arviota mikrobien lukumäärästä raakavedessä ja poistumasta tuotantoprosessin aikana (Vesiopas 2013). Vesiepidemiatilanteessa mahdollisesti erittäin pienien mikrobilukumäärien tutkiminen on tärkeää veden saastumiseen johtaneiden syiden selvittämiseksi, jotta vastaavanlaisen tilanteen toistuminen voidaan estää. Mikrobien määritysmenetelmissä voidaan käsitellä vain melko pieniä tilavuuksia näytevettä. Sen vuoksi vesimikrobiologisia analyysejä varten veden mikrobit on ensin konsentroitava pienempään tilavuuteen. Tilavuuden pienentäminen näytteenottopaikalla on hyödyllistä näytteen kuljetuksen kannalta. Suuren vesitilavuuden näytteenottoon ja tutkimiseen on kehitetty soveltuvia suodattamalla. konsentrointimenetelmiä, Konsentrointiin tarkoitetuissa joilla näytetilavuutta suodatusmenetelmissä pienennetään näytetilavuudesta suodatetaan pois vettä mikrobeja menettämättä, jolloin tutkittavan näytteen tilavuus pienenee. Suuren näytetilavuuden suodatuksessa ongelmia voivat aiheuttaa suodatukseen kuluva aika ja suodatinmateriaalin tukkeutuminen. 10 Ultrasuodatuksen suodatinkalvon huokoskoko on alle sata nanometriä eli pienempää kokoluokkaa kuin suurin osa mikrobeista, mikä mahdollistaa eri mikrobiryhmien samanaikaisen konsentroinnin. Suuren tilavuuden ultrasuodatusmenetelmässä on käytetty pieneen tilavuuteen ontoiksi kuiduiksi pakattuja suuren pinta-alan kalvoja, jotka mahdollistavat tehokkaan suodattuvuuden eikä suodatin heti tukkeudu. Ultrasuodatusmenetelmällä on voitu suodattaa satoja ja tuhansia litroja vettä siten, että mikrobit jäävät suodattimeen tai tilavuudeltaan pienentyneeseen eli konsentroituneeseen näytteeseen kalvon toiselle puolella. (Morales-Morales ym. 2003, Hill ym. 2005, Lindquist ym. 2007) Menetelmää varten ei ole saatavilla valmiita laitteistoja, vaan ne on valmistettava itse saatavilla olevista tarvikkeista. Valmistetun ultrasuodatuslaitteiston ja -menetelmän toimivuutta erilaisissa vesissä on testattava ennen käyttöönottoa. 11 2 2.1 KIRJALLISUUSKATSAUS TALOUSVEDEN MIKROBIOLOGINEN TURVALLISUUS Hyvä talousveden laatu on ihmisten terveyden edellytys. Vaikka hyvälaatuista talousvettä olisi yleensä saatavilla, vesi voi saastua, jos sen laatua ei pystytä turvaamaan tarpeeksi hyvin. Saastunut talousvesi voi aiheuttaa suuren ihmismäärän samanaikaisen sairastumisen, ja sen vuoksi vedenlaadun jatkuvasta turvallisuudesta on huolehdittava myös yllättävissä ja muuttuvissa tilanteissa. (WHO 2011) Merkittävä talousveden turvallisuutta uhkaava tekijä on veden saastuminen ulosteperäisellä materiaalilla, joka sisältää tautia aiheuttavia mikrobeja. Ihmisten tai eläinten suolistosta peräisin olevat taudinaiheuttajamikrobit aiheuttavat yleisimmin suolistoinfektioita. Talousveden turvallisuutta voivat uhata myös iho- ja hengitystieinfektioita aiheuttavat mikrobit. Mikrobiologisten uhkien lisäksi talousveden turvallisuutta voivat uhata kemiallinen tai radiologinen saastuminen ja talousveden kemiallisessa desinfioinnissa mahdollisesti syntyvät terveydelle haitalliset yhdisteet. (WHO 2011) Tässä tutkielmassa talousveden turvallisuutta tarkastellaan mikrobiologiselta kannalta. Veden saastumisen ennaltaehkäisy on tehokas tapa turvata talousveden laatu. Vedenlaatu on turvattava raakavedestä lähtien veden käyttäjän hanaan asti. Käytetty raakavesi ja tuotetun veden ja kuluttajien määrä vaikuttavat käytännön toimiin, joilla vedenlaatu turvataan. (WHO 2011) Talousvettä voidaan tuottaa pohjavedestä tai pintavedestä. Vedenpuhdistusprosessit vaihtelevat mekaanisista käsittelyistä kemiallisiin ja biologisiin prosesseihin. Raakavedestä poistetaan hiukkasia, orgaanista ainesta ja epäorgaanisia yhdisteitä, ja veden happamuutta voidaan säätää. (Manahan 2004) Erityisesti talousveden tuottamiseen käytettävät pintavedet käsitellään perusteellisesti humusaineiden ja taudinaiheuttajien poistamiseksi ja pintavedestä valmistettu talousvesi lisäksi desinfioidaan aina ennen jakelua. Pohjavesi on puhtaampaa, joten sitä ei tarvitse yleensä käsitellä yhtä paljon kuin pintavettä. Vedenlaatu voi muuttua verkostossakin, mikä täytyy ottaa huomioon vedenlaadun ja toiminnan arvioinnissa. Vesilaitokselta lähtevä vesi saattaa viipyä pitkiäkin aikoja verkostossa ja mikäli olosuhteet ovat mikrobikasvustolle suotuisat tai verkostoon tulee ulkoapäin epäpuhtauksia, vesi voi muuttua huonolaatuiseksi ja jopa terveydelle haitalliseksi. (WHO 2011) 12 Suomessa pääosa talouksista kuuluu vesijohtoverkoston piiriin. On paljon muutamien kotitalouksien vesiosuuskuntia ja pieniä ja keskisuuria talousvesilaitoksia, jotka käyttävät pohjavettä talousveden lähteenä. Suurten vesilaitosten valmistamasta talousvedestä vuonna 2008 46 % valmistettiin pintavedestä, 41 % pohjavedestä ja loppuosa tekopohjavedestä (Zacheus 2010). Suomessa pintavedestä valmistettu talousvesi desinfioidaan aina ennen jakeluverkostoon pumppaamista (THL 2014). Pohjavesi on Suomessa hyvälaatuista eikä sitä aina käsitellä tai desinfioida ennen verkostoon pumppaamista (Hatakka ym. 2001, Miettinen ym. 2001). Suomessa talousveden valvontanäytteissä on todettu vain harvoin suolistoperäistä saastumista ilmentäviä Escherichia coli (E. coli) -bakteereita tai suolistoperäisiä enterokokkeja. Sen sijaan koliformisia bakteereita ja tavanomaisesta poikkeavia heterotrofisia pesäkelukuja havaitaan hieman useammin. Ne voivat ilmentää talousveden puhdistuksen häiriöitä, verkoston olosuhteita tai talousveden pintavesisaastumista. Havaitut mikrobiologiset laatuvirheet talousvedessä liittyvät usein pohjavesilaitosten jakamaan talousveteen, joka voi olla käsittelyn puuttumisen vuoksi laadultaan haavoittuvampaa kuin pintavedestä valmistettu desinfioitu talousvesi. (Zacheus 2010) 2.2 VESIEPIDEMIAT JA NIIDEN SYYT Vesiepidemialla tarkoitetaan tapausta, jossa vähintään kaksi henkilöä on saanut samanlaatuisen sairauden juotuaan samaa alkuperää olevaa vettä, ja missä epidemiologisesti kyseinen vesi voidaan todeta sairauden lähteeksi (Hatakka ym. 2001). Suomessa ja länsimaissa eniten vesiepidemioita ovat aiheuttaneet suolistoinfektioita aiheuttavat mikrobit (Hrudey ja Hrudey 2007, Zacheus ja Miettinen 2011). Merkittävä riski vesiepidemian puhkeamiselle syntyy, jos talousvesi saastuu pinta- tai jätevedellä, tai jos eläinten ulosteita tai eläimiä pääsee talousveden joukkoon. Veteen päässyt ulosteperäinen materiaali voi sisältää taudinaiheuttajamikrobeja. (Deere ym. 2001, Pitkänen 2010, Schijven ym. 2010) Vaikka talousveden laatu on yleisesti ottaen Suomessa hyvä, raportoidaan vesiepidemioita silti vuosittain (Zacheus ja Miettinen 2011, THL 2014). Vuosina 1998–2009 Suomessa raportoitiin 67 vesiepidemiaa, joissa kirjattiin yhteensä 27 000 sairastunutta henkilöä (Zacheus ja Miettinen 2011). Yksittäisissä epidemioissa sairastuneiden määrä on vaihdellut joistakin kymmenistä 13 useisiin tuhansiin ihmisiin. Yleisimpiä oireita ovat olleet ripuli, pahoinvointi, vatsakivut ja kuumeilu. On arvioitu, että sairauden lyhytkestoisuuden vuoksi keskimäärin vain joka sadas sairastunut hakeutuu lääkärin hoitoon, joten vesivälitteisissä epidemioissa sairastuneiden todellinen määrä on huomattavasti suurempi. Suurin osa vesiepidemioista on liittynyt pohjavedestä valmistettuun talousveteen ja näistä tapauksista suuri osa on ollut vesiosuuskuntien ja yksityiskaivojen veden aiheuttamia epidemioita. (Valvira 2009, Zacheus ja Miettinen 2011) Merkittävimpiä vesivälitteisiä taudinaiheuttajia Suomessa ovat olleet norovirus ja kampylobakteeri (Miettinen ym. 2001). Vesivälitteisiä epidemioita Suomessa ja muualla maailmassa ovat aiheuttaneet myös Salmonella-bakteerit, Giardia- ja Cryptosporidiumalkueläimet, enteropatogeeniset E. coli -bakteerit ja useat tautia-aiheuttavat virukset (Hatakka ym. 2001, Hrudey ja Hrudey 2007, Pitkänen 2010). Monet vesiepidemioita aiheuttaneista mikrobeista, kuten virukset ja alkueläimet, säilyvät hyvin vedessä ja niillä on pieni infektiivinen annos. 1-10 infektoivaa yksikköä voi aiheuttaa sairastumisen. (Nel ja Weyer 2004, Theron ja Cloete 2004). Siten pienikin määrä näitä mikrobeja talousvedessä riittää infektion aiheuttamiseen (Aakko ym. 2000, Lecler ym. 2004). Monissa vesiepidemioissa epidemian aiheuttaja on kuitenkin jäänyt selvittämättä. Useissa selvittämättömissä tapauksissa epidemian aiheuttajaa ei ole syystä tai toisesta lainkaan tutkittu tai vesinäytteiden kerääminen on tapahtunut liian myöhään. Selvittämättömät vesiepidemiat ovat olleet usein tapauksia, joissa on vain vähän sairastuneita. (Zacheus ja Miettinen 2011, Pitkänen 2013). Itse asiassa vesiepidemiatilanteiden havaitseminen on hankalaa ja tehotonta monissa maissa (Miettinen 2009). Suomessa on hyvä järjestelmä vesiepidemioiden havaitsemiseksi ja tiedon keräämiseksi (Zacheus ja Miettinen 2011). Vesiepidemioiden huomaaminen ja tutkiminen olisi tärkeää talousveden mikrobiologista laatua uhkaavien tekijöiden tunnistamiseksi. Tutkimuksesta saatavia tietoja voidaan käyttää apuna muun muassa valvontatoiminnan suunnittelussa ja uusien epidemioiden ehkäisyssä (Hatakka ym. 2001). Monet raportoiduista vesiepidemioista ovat saaneet alkunsa yksityisten vesijärjestelmien tai pienten kunnallisten vesilaitosten jakamasta pohjavedestä, joka on ollut pintavesien tai jätevesien saastuttamaa (Miettinen ym. 2001, Hrudey ja Hrudey 2004, Hrudey ja Hrudey 2007). Se, että pohjavesilaitosten jakamaa talousvettä ei yleensä desinfioida, lisää epidemioiden todennäköisyyttä, sillä desinfiointi alentaa tehokkaasti taudinaiheuttajien määrää vedessä (Aakko ym. 2000, Hatakka ym. 2001). Sulamisvedet ja rankkasateet vedenottamoalueella 14 lisäävät veden saastumisriskiä, mikäli tulviva vesi voi päästä vedenottokaivoihin (Thomas ym. 2006, Cann ym. 2013). Pintavesilaitosten jakamaan talousveteen liittyneet vesiepidemiat ovat yleensä aiheutuneet riittämättömästä desinfiointikemikaalin annostuksesta tai vedenjakeluverkostossa sattuneesta veden saastumisesta esimerkiksi putken rikkoutumisen vuoksi. Rankkasateiden aiheuttama maa-aineksen ja mikrobien huuhtoutuma tai jätevedenpuhdistamon ongelmatilanteessa tavanomaista suurempi mikrobikuorma yläjuoksulta voi saastuttaa raakaveden niin pahoin, että talousvesilaitoksen puhdistustehokkuus ei ole enää riittävä. (Smeets ym. 2006, Thomas ym. 2006, Vesiopas 2013) Puutteet vedenkäsittelyssä voivat johtua myös teknisistä ongelmista ja väärin mitoitetusta puhdistusprosessien poistotehokkuudesta. Vesiepidemioihin johtaneita vedenkäsittelyn ongelmia ovat olleet muun muassa huono koagulaatio, sekoitus tai flokkulaatio, suodattimien takaisinhuuhtomisen puuttuminen, heikko suodatus tai liian pieni klooriannos (Deere ym. 2001, Brunkard ym. 2011). Vesiepidemioiden välttämiseksi erityistilanteisiin ja uhkiin olisi osattava varautua. Puhdistustehokkuuksien pitäisi olla riittävät myös ongelmatilanteissa tai raakaveden laadun heikennyttyä (Pitkänen ym. 2011, Pitkänen 2013). 2.3 TALOUSVEDEN MIKROBIOLOGISEN LAADUN VALVONTA JA HALLINTA Talousveden laadunvalvonnalla varmistetaan terveellisen veden jakelu veden käyttäjille. Maailman terveysjärjestö (WHO, World Health Organization) tuottaa talousveden laadusta kansainvälisiä ohjeita, joita voidaan käyttää pohjatietona säädettäessä kansallisia lakeja ja standardeja. Talousveden laatuun liittyvä ohjeistus on koottu WHO:n oppaaseen Guidelines for drinking water quality, jota päivitetään määrävälein ja joka on vapaasti ladattavissa WHO:n verkkosivuilta (WHO 2011). WHO:n ohjeiden tavoitteena on taata ihmisille heidän terveydelleen turvallisen talousveden saanti. Talousvedestä seurataan fysikaalisia, kemiallisia ja mikrobiologisia muuttujia, joista voidaan havaita veden laadun muutokset ja mahdolliset ongelmat vedenlaadussa. Valmiin talousveden laadunvalvonnan lisäksi talousveden hyvän laadun turvaamiseen kuuluvat raakaveden, talousveden tuotannon ja jakelun valvonta ja veden laatua uhkaavien tekijöiden tunnistaminen ja hallinta. Talousveden laadunvalvonnassa käytettävät mikrobiologiset muuttujat ilmaisevat talousvedessä esiintyessään veden käyttäjien välittömiä terveysriskejä (THL 2014). 15 Mikrobiologinen laadunvalvonta keskittyy mikrobiologiseen analytiikkaan eli valittujen mikrobien esiintymisen tai lukumäärien valvontaan. Normaaliolosuhteissa kaikkien mahdollisten taudinaiheuttajamikrobien määrittäminen vesinäytteistä ei ole tarkoituksenmukaista, taloudellisesti kannattavaa eikä mahdollista (Isomäki ym. 2006, Pitkänen 2008). On suositeltavaa tutkia veden laatua usein yksinkertaisella testillä kuin harvoin useilla eri testeillä tai monimutkaisilla testeillä (van Lieverloo ym. 2007, WHO 2011). Siksi talousveden mikrobiologisessa valvonnassa käytetään yleisimmin suolistoperäisiä indikaattoribakteereita, joita on kaikkien lämminveristen eläinten suolistossa. Nämä indikaattorit ilmentävät veden ulosteperäistä saastumista, jolloin veteen on voinut päästä indikaattoribakteerien ohella myös taudinaiheuttajamikrobeja (Edberg ym. 2000, Isomäki ym. 2006, THL 2014). E. coli -bakteeri ja suolistoperäiset enterokokit ilmentävät suolistoperäistä saastumista. Koliformiset bakteerit voivat olla peräisin suolistosta mutta myös ympäristöstä. Clostridium perfringens -bakteeri ja etenkin sen itiöt säilyvät koliformisia bakteereja paremmin ympäristössä. C. perfringens -bakteeri edustaa siten paremmin sellaisia taudinaiheuttajamikrobeja, jotka säilyvät ympäristössä pidempään. C. perfringens voi säilyvyytensä vuoksi olla peräisin ympäristöstä eikä aina ilmennä vasta tapahtunutta ulosteperäistä saastumista (Edberg ym. 2000, Pitkänen 2010). 2.3.1 Suomen lainsäädäntö Suomessa veden laatua koskevat säädökset on määritelty terveydensuojelulaissa 763/1994 (Valtioneuvosto 1994b) ja terveydensuojeluasetuksessa 1280/1994 (Valtioneuvosto 1994a). Sosiaali- ja terveysministeriön asetus talousveden laatuvaatimuksista ja valvontatutkimuksista 461/2000 (STM 2000) perustuu ihmisten käyttöön tarkoitetun veden laadusta annettuun neuvoston direktiiviin 98/83/EY (Euroopan unionin neuvosto 1998). Talousvesiasetus koskee vesilaitoksia, jotka toimittavat vettä vähintään 10 m3 päivässä tai vähintään 50 henkilön tarpeisiin, ja elintarvikealan yritysten tuotteiden valmistamiseen käyttämää vettä. Pienempiä talousvesilaitoksia ja yksityiskaivoja sekä kunnan terveydensuojeluviranomaisen päätöksen nojalla elintarvikealan yritysten tuotteiden valmistamiseen käyttämää vettä koskee asetus 401/2001 pienten yksiköiden talousveden laatuvaatimuksista ja valvontatutkimuksista (STM 2001). Talousvesiasetus 461/2000 ja pikkuasetus 401/2001 määrittelevät talousveden kemialliset ja mikrobiologiset laatuvaatimukset ja laatusuositukset. Mikrobiologiset laatuvaatimukset ja - 16 suositukset on esitetty Taulukossa 1. Talousveden mikrobiologisissa laatuvaatimuksissa on annettu sallittu enimmäistiheys E. coli -bakteerille ja suolistoperäisille enterokokeille. Vedestä tulee määrittää myös Clostridium perfringens -bakteeri, jos raakavesi on pintavettä tai tekopohjavettä. Asetukset sisältävät myös koliformisten bakteerien ja heterotrofisen pesäkeluvun laatusuositukset. Lisäksi pulloissa ja säiliöissä myytävälle talousvedelle on annettu erikseen tavanomaista vettä tarkemmat laatuvaatimukset. Enimmäistiheys E. coli bakteerille, suolistoperäisille enterokokeille ja Pseudomonas aeruginosa -bakteerille on 0 pmy/250 ml pullovettä. Lisäksi pullovedelle asetetut pesäkeluvun enimmäistiheydet ovat 100 pmy/ml 22 °C:ssa ja 20 pmy/ml 37 °C:ssa. Taulukko 1. Talousveden mikrobiologiset laatuvaatimukset ja -suositukset Laatuvaatimukset Laatusuositukset Mikrobiologinen muuttuja Enimmäistiheys STM:n asetus Escherichia coli 0 pmy/100 ml 461/2000, 401/2001 Suolistoperäiset enterokokit 0 pmy/100 ml 461/2000, 401/2001 Koliformiset bakteerit 0 pmy/100 ml 461/2000, 401/2001 Clostridium perfringens 0 pmy/100 ml 461/2000 Heterotrofinen pesäkeluku Ei epätavallisia 461/2000 muutoksia Talousvesiasetusten mukaan talousveden laadunvalvonta on kuntien terveydensuojeluviranomaisten vastuulla ja sen tulee olla jatkuvaa (STM 2000). Talousveden laadun valvontatutkimuksia on tehtävä sitä tiheämmin, mitä enemmän vettä tuotetaan tai mitä useammalle käyttäjälle vettä jaellaan. Tutkimustiheyttä on lisättävä, mikäli on syytä epäillä ongelmia veden laadussa. Laadunvalvonnan tutkimustiheys voi vaihdella talousvettä tuottavan laitoksen koosta riippuen yhdestä kerrasta kolmessa vuodessa yli kolmeen sataan kertaan yhdessä vuodessa. Talousvesilaitokset tarkkailevat myös itse tuottamansa veden laatua käyttötarkkailussaan. Myös elintarvikeyritykset valvovat käyttämänsä veden laatua omavalvonnassaan. Suurten vesilaitosten ja pienten raakavettä käsittelevien vesilaitosten on tarkkailtava myös raakaveden laatua veden käsittelyn riittävyyden varmistamiseksi. Talousveden tuotantoon tarkoitetun pintaveden laatuvaatimuksia ja tarkkailua säätää valtioneuvoston päätös 366/1994 (Valtioneuvosto 1994c). Talousvesiasetuksen 461/2000 mukaan talousveden valvontatutkimuksissa käytetään SFS-ENstandardeja tai niiden puuttuessa ISO-standardien mukaisia määritysmenetelmiä tai 17 menetelmiä, jotka määritystarkkuudeltaan ja luotettavuudeltaan vastaavat näitä menetelmiä. Sosiaali- ja terveysalan lupa- ja valvontavirasto Valvira on julkaissut yhdessä Terveyden ja hyvinvoinnin laitoksen kanssa ohjeistuksen terveydensuojelulain alaisten asetusen mukaisissa valvontatutkimuksissa käytettävistä mikrobiologisista määrityksistä ja niiden tekemiseen hyväksyttävistä menetelmistä (Taulukko 2.) (Valvira 2014). Valvontatutkimuksia tekevillä laboratorioilla tulee olla asianmukainen laatujärjestelmä ja niiden tulee hyväksyttää toimintansa ennen valvontatutkimuksien suorittamisen aloittamista (Valvira 2014). 18 Taulukko 2. Asetuksen 461/2000 mukaiseen talousveden mikrobiologiseen valvontaan Suomessa hyväksytyt tutkimusmenetelmät (Valvira 2014). Muuttuja Koliformiset bakteerit Koliformiset bakteerit Koliformiset bakteerit Escherichia coli Escherichia coli Escherichia coli Suolistoperäiset enterokokit Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas aeruginosa Heterotrofinen pesäkeluku 22 ºC Heterotrofinen pesäkeluku 36 ºC Clostridium perfringens (mukaan lukien itiöt) Clostridium perfringens (mukaan lukien itiöt) Standardi SFS-EN ISO 9308-1 + AC (2010) Menetelmän periaate Kalvosuodatusmenetelmä laktoosi -2,3,5trifenyylitetrazoliumkloridi (LTTC) kasvualustaa käyttäen SFS 3016(2011) Kalvosuodatusmenetelmä Les Endo kasvu-alustaa käyttäen ISO 9308-2 (2012) MPN-menetelmä (todennäköisin lukumäärä) QuantiTray-liuskaa käyttäen SFS-EN ISO 9308-1 Kalvosuodatusmenetelmä laktoosi -2,3,5+ AC (2010) trifenyylitetrazoliumkloridi (LTTC) kasvu-alustaa käyttäen SFS 3016(2011) Kalvosuodatusmenetelmä Les Endo kasvu-alustaa käyttäen ISO 9308-2 (2012) MPN-menetelmä (todennäköisin lukumäärä) QuantiTray-liuskaa käyttäen SFS-EN ISO 7899Kalvosuodatusmenetelmä Slanetzin ja 2(2000) Bartleyn kasvatusalustaa ja sappi-eskuliiniatsidi agaria käyttäen SFS-EN ISO 16266 Kalvosuodatusmenetelmä Cetrimide (2008a) nalidixic acid agar (CN) -kasvualustaa käyttäen SFS-EN ISO 16266 Standardimenetelmän varmistustestien (2008a), muunneltu muunnos SFS-EN ISO 6222 Maljavalumenetelmä hiivauuteagaria (1999) käyttäen SFS-EN ISO 6222 Maljavalumenetelmä hiivauuteagaria (1999) käyttäen m/CPKalvosuodatusmenetelmä Membrane agar/STMa461_2000 Clostridium perfringens (m-CP) (2000) agarmaljaa käyttäen ISO 14189 (2013) Kalvosuodatusmenetelmä tryptoosisulfiitti-sykloseriini (TSC) -agarmaljaa käyttäen. Standardiluonnoksen ISO/CD 6461-2:2002 mukainen menetelmä on hyväksyttävä menetelmä siihen saakka kunnes SFS-EN ISO 14189 vahvistetaan 19 2.3.2 WSP eli vesiturvallisuussuunnitelma Talousveden laadunvalvonta on keskittynyt viime vuosina Euroopassa valmiin talousveden laadun valvontaan (Euroopan unionin neuvosto 1998). WHO ohjeistaa laajentamaan talousveden laadunvarmistuksen koko talousveden tuotantoketjuun. Pyrkimyksenä on vähentää talousveden saastumisriskiä arvioimalla ja hallitsemalla talousveden tuotantoon ja jakeluun liittyviä riskejä (Bartram ym. 2001, WHO 2011). Käytännössä talousvedentuottajat laativat itselleen WHO:n ohjeistuksen mukaisen WSP:n (Water Safety Plan) eli vesiturvallisuussuunnitelman, mikä on tarkoitus sisällyttää myös Suomen lainsäädäntöön (STM ja THL 2014). Vesiturvallisuussuunnitelma (WSP) ja siihen liittyvät toiminnot on esitetty Kuvassa 1. WSP:ssä talousveden tuotannon turvallisuutta ja uhkia arvioidaan järjestelmällisesti ja yksityiskohtaisesti aina raakavedestä ja sen ympäristöstä veden käsittelyn ja jakelun kautta kuluttajalle asti. Vesiturvallisuussuunnitelma koostuu kolmesta osa-alueesta, jotka ovat talousvesijärjestelmän arviointi, toiminnallinen valvonta ja hallintajärjestelmät ja tiedonvaihto. Vesiturvallisuussuunnitelmaa ohjaavat vedenlaadun terveysperusteiset tavoitteet, niiden toteutuminen ja kansanterveysvaikutukset ja riippumattoman tahon valvonta. Järjestelmän arvioinnissa ja toiminnallisessa valvonnassa voidaan käyttää tukena mikrobiologisia, kemiallisia ja radiologisia mittauksia (WHO 2011). Kuva 1.Vesiturvallisuussuunnitelmiin liittyvät toiminnot. (WHO 2011) 20 Kaikkien vesilaitosten tulisi ajoittain tehdä talousvesijärjestelmän riskinarviointi. Riskinarvioinnissa selvitetään toimenpiteet eri kriisitilanteita varten ja laaditaan suunnitelmat eri ongelmatilanteita ja mahdollisia vahinkoja varten. Riskinarviointiin kuuluvat vaaran tunnistaminen, annosvasteen eli annoksen ja vaikutuksen suhteen arviointi, ihmisten altistumisen arviointi ja riskin karakterisointi eli riskin suuruuden arviointi. Mikrobiologiseen riskinarviointiin on kehitetty avuksi kvantitatiivinen riskinarviointimenetelmä QMRA (quantitative microbial risk assessment). Menetelmän avulla lasketaan riskiarvio, joka antaa numeerisen arvon riskin todellisesta suuruudesta (Vesiopas 2013). Lukuarvo auttaa päätöksentekoa valittaessa Talousvesijärjestelmien kahden QMRA:ssa tai useamman otetaan riskinhallintavaihtoehdon huomioon tautia-aiheuttavien välillä. mikrobien lukumäärä raakavedessä, mikrobien poistumistehokkuus eri käsittelyprosesseissa ja lukumäärä valmiissa talousvedessä (Pitkänen ym. 2011). Infektioriskin arvioimiseksi tautia-aiheuttavien mikrobien esiintyminen talousvedessä yhdistetään kulutustietoihin ja tautia-aiheuttavien mikrobien annos-vasteeseen (Petterson ym. 2006, Meriläinen ym. 2012). Vesilaitos voi laskea riskin suuruuden käyttämällä Opasnetissä Vesiopas-mallia, jossa riskin laskemista varten syötetään tiedot raakaveden luokituksesta, tautia aiheuttavien mikrobien lukumääristä raakavedessä, käytetyistä puhdistusprosesseista (myös desinfiointi), juodun veden määrästä kuluttajaa kohti ja kuluttajien määrästä (Vesiopas 2013). 2.3.3 Talousveden mikrobiologisen laadun valvonnan haasteita Craun (1997) vertasi erilaisten kunnallisten ja yksityisten talousvesijärjestelmien koliformisten bakteerien valvontatuloksia tietoihin vesiepidemioista. Tutkimuksessa havaittiin, että vaikka talousveden laatu olisi valvontamittauksissa koliformisten bakteerien osalta sallituissa rajoissa, voi vesiepidemia silti uhata. Vain puolessa talousvesijärjestelmistä, joista oli välittynyt vesiepidemia, koliformisia bakteereita oli todettu valvontamittauksisssa edeltävien kuukausien aikana ennen epidemian puhkeamista. Koliformisten bakteerien positiivisten havaintojen määrissä ei ollut havaittavissa eroa vesiepidemian aiheuttaneiden ja aiheuttamattomien talousvesijärjestelmien välillä. Kirjallisuudessa on raportoitu useita muitakin tilanteita, joissa mikrobiologisten muuttujien osalta vedenlaatu on ollut standardien mukaista ja kuitenkin vesi on aiheuttanut vesiepidemian (Richardson ym. 1991, Hänninen ym. 2003). Syynä tällaisiin havaintoihin voi olla tilanteeseen nähden vääränlainen ja viivästynyt mikrobiologinen analytiikka. Esimerkiksi E. coli -bakteerin tiedetään menettävän elinkykynsä nopeammin kuin monet taudinaiheuttajamikrobit, erityisesti klooratussa vedessä (Smeets ym. 2006, Pitkänen 21 ym. 2011). Tämän vuoksi on mahdollista, että vaikka E. coli -bakteeria ei löydetä, taudinaiheuttajamikrobeja voi olla vedessä. Pienillä vesilaitoksilla valvontanäytteitä otetaan harvemmin kuin suuremmilla, mikä heikentää mahdollisuuksia havaita vedenlaadun muutoksia. Veden saastumiseen johtavat tapahtumat, kuten rankkasateet ja lumien sulaminen kestävät usein vain vähän aikaa, jolloin myös mikrobien esiintyvyys on yleensä lyhytkestoista ja vaihtelee olosuhteiden mukaan. On epätodennäköistä, että vain harvoin otettavan valvontanäytteen avulla pystyttäisiin todentamaan talousveden turvallisuus kaikkina vuodenaikoina. Tämän vuoksi tarvittaisiin merkittävästi tiheämpiä mittauksia laadun heikkenemisen havaitsemiseksi. (van Lieverloo ym. 2007, Pitkänen 2010) Nykyisin käytössä oleva näytetilavuus talousvedestä on yleensä 100 ml, koska talousveden laatuvaatimukset mikrobien osalta on säädetty 100 ml:n tilavuutta kohti ja kyseisen tilavuuden määritys on käytännöllistä asetuksen mukaisilla menetelmillä. Suolistoperäisten indikaattoribakteerien määritystulokset käsitellystä ja puhdistetusta vedestä ja talousvedestä ovat yleisesti alle määritysrajan eli näitä bakteereita ei todeta ja talousveden laatuvaatimukset täyttyvät (Zacheus 2010). Erityistilanteissa, kuten vesiongelmatilanteissa taudinaiheuttajamikrobien analysoimiseksi, ja vedenkäsittelyprosessien poistotehokkuuksien arvioimiseksi, on tarpeen käyttää suurempia tilavuuksia kuin rutiiniluontoisissa valvontamittauksissa. Epäiltäessä talousveden saastumista E. coli -bakteeri ja suolistoperäiset enterokokit voidaan määrittää suuremmasta tilavuudesta ja taudinaiheuttajia määritettäessä näytetilavuuden on oltava useita litroja. (Valvira 2009) Tutkimuksissa riskinarvioinnin tarkoituksia varten on puhtaistakin vesistä voitu saada mitattavia suolistobakteerituloksia, kun analyysitilavuuksia on suurennettu satoihin tai jopa tuhansiin litroihin (Hijnen ym. 2000). 2.3.4 Laajennettu mikrobiologinen analytiikka talousveden laadun arviointiin Suolistoperäistä saastumista ilmentävien indikaattoribakteerien lisäksi vedestä voidaan määrittää indikaattoriviruksia, kuten kolifageja, ja myös varsinaisia taudinaiheuttajamikrobeja. Taudinaiheuttajamikrobeja ovat erilaiset virukset, bakteerit ja alkueläimet, joiden määrittäminen voi vaatia kallista ja aikaa vievää erikoisanalytiikkaa. Viljelymenetelmät vaativat usein rikastuksen ja erottelevan eli selektiivisen kasvualustan käyttöä, jotta taudinaiheuttajat saadaan eristettyä taustamikrobeista. Taudinaiheuttajien alhainen lukumäärä 22 vesinäytteessä vaikeuttaa mikrobien havaitsemista, vaikka mikrobeja olisi ollut tutkittavassa vesijärjestelmässä riittävästi aiheuttamaan infektioita. (Theron ja Cloete 2004) Viljelymenetelmien ohella monien mikrobien tutkimiseen on käytössä molekyylibiologisia menetelmiä, joista on pyritty kehitettämään herkkiä ja spesifisiä. Molekyylibiologiset menetelmät perustuvat kohdemikrobille spesifisen genomin osan havaitsemiseen ja kvantitatiivisissa sovelluksissa genomin kopiolukumäärien määrittämiseen (Marlowe ym. 2000). Molekyylibiologiset menetelmät mahdollistavat yleisten terveyttä uhkaavien mikrobien nopean ja spesifisen havaitsemisen (Girones ym. 2010). Useimmat molekyylibiologiset menetelmät perustuvat nukleiinihappojen monistamiseen PCR-tekniikan (polymerase chain reaction) avulla. Kvantitatiiviset PCR-menetelmät (qPCR) voivat olla näytetyypistä riippuen herkempiä kuin esimerkiksi bakteerien havaitsemiseen käytettävät viljelymenetelmät tai virusten plakkimenetelmät (Marlowe ym. 2000, Theron ja Cloete 2004, Girones ym. 2010) Bakteerit Kampylobakteerit, salmonella ja enterohemorraaginen E. coli (EHEC) ovat esimerkkejä taudinaiheuttajabakteereista, jotka ovat aiheuttaneet vesivälitteisiä vatsatautiepidemioita (Lecler ym. 2004). Taudin itämisaika tartunnasta taudin puhkeamiseen voi kestää päivästä viikkoon (Rusin ym. 2000). Tautia-aiheuttava annos vaihtelee bakteereittan ja voi olla 1010 000 bakteeria. Vesivälitteisten suolistoinfektiota aiheuttavien bakteerien oireita ovat yleensä vatsakipu, ripuli ja kuume. Suolistoinfektioiden oireisiin voi kuulua myös päänsärkyä ja oksentelua ja infektioiden seurauksena voi esiintyä vakavampia oireyhtymiä. (Lecler ym. 2004) Taudinaiheuttajabakteerien erilaiset ominaisuudet ja ympäristöolosuhteet vaikuttavat niiden säilyvyyteen ja kulkeutumiseen ympäristössä (National Research Council 2004). Esimerkiksi kampylobakteerit voivat säilyä kylmässä vedessä auringon valolta suojassa useita päiviä (Patrone ym. 2013). Ympäristöolosuhteet, kuten desinfiointi ja ravinteiden puute, voivat heikentää bakteerien elinkykyä ja viljeltävyyttä (Lecler ym. 2004, Pitkänen 2013). Taudinaiheuttajabakteerien esiintyminen saadaan melko hyvin todettua vesinäytteistä viljelymenetelmillä. Taudinaiheuttajabakteerien määritystä varten näyte yleensä konsentroidaan aluksi kalvosuodatusmenetelmällä (Josephson ym. 2000, SFS 2008b). Bakteereita voidaan rikastaa epäselektiivisessä liemessä tai maljalla tai käyttää selektiivistä kasvualustaa, jolla taustamikrobien kasvun määrää saadaan vähennettyä ja erotettua tutkittu 23 bakteeri paremmin (Josephson ym. 2000). Epäselektiivisen kasvualustan käytön etuna on, että viljeltävyydeltään heikentyneet bakteerit kasvavat selekoivien aineiden poissa ollessa todennäköisemmin. Epäselektiivisellä kasvualustalla kasvanut bakteeri voidaan tunnistaa esimerkiksi entsyymi immunoanalyysillä (EIA) (Theron ja Cloete 2004). Bakteerit voivat olla eläviä, mutta eivät havaittavissa viljelymenetelmillä. Vaikka bakteereita ei voida havaita viljelymenetelmillä, ei voi varmasti sanoa, että ne eivät aiheuta infektioita. (National Research Council 2004, Patrone ym. 2013) Viljelytulokset voidaan varmistaa PCR-menetelmillä määrittämällä bakteerin sille ominaisia tunnettuja geenejä. PCR-menetelmiä varten bakteeria voidaan ensin rikastaa kasvatusliemessä (Sails ym. 2002, Theron ja Cloete 2004). On kehitetty myös menetelmiä, joilla voidaan määrittää esimerkiksi kampylobakteeri suoraan vesinäytteestä tai näytteestä, josta on ensin konsentroitu talteen soluja ja eristetty DNA:ta. Menetelmiä elävien ja kuolleiden bakteerisolujen erottamiseksi on myös kehitetty. (Pitkänen 2013) Virukset Tautia-aiheuttavia viruksia on sekä DNA-viruksia, kuten adenovirukset, ja RNA-viruksia, kuten enterovirukset, A- ja E-hepatiittivirukset, norovirus, rotavirus ja astrovirus (Rusin ym. 2000, Nel ym. 2004). Monien suolistoperäisten virusten tautia-aiheuttava annos on alhainen, tyypillisesti 1–10 infektoivaa yksikköä suolistoperäisesti saastuneessa vedessä riittää aiheuttamaan taudin altistuneelle (Nel ja Weyer 2004). Virusten aiheuttaman taudin yleisin oire on ripuli. Suolistovirukset voivat aiheuttaa myös voimakasta oksentamista ja flunssan oireita ylähengityteissä ja kuumetta. Suolistovirusten itämisaika ja taudin kesto vaihtelevat viruksittain. Norovirustartunnan oireet puhkeavat nopeasti 24–28 tuntia tartunnan jälkeen, mutta tauti menee myös yleensä ohi jo 12 - 60 tunnissa. Voimakas ripuli ja oksentelu voivat aiheuttaa elimistön kuivumistilan. (Rusin ym. 2000, Nel ja Weyer 2004) Hepatiitti-virusten itämisaika on keskimäärin 40 päivää ja oireita, kuten vatsakipua, pahoinvointia, kuumetta ja alipainoa, ei ole helppo tunnistaa hepatiitin aiheuttamaksi (Nel ym. 2004). Virukset eivät pysty lisääntymään ympäristössä ilman isäntäsoluja, mutta säilyvät vesiympäristössä yleisesti ottaen hyvin pitkään. Ne kestävät bakteereita paremmin fysikaalisia ja kemiallisia rasitteita, kuten vedenpuhdistusprosesseja ja desinfiointia. Virukset ovat kooltaan mikrobeista pienimpiä ja kokonsa vuoksi ne myös kulkeutuvat hyvin ympäristössä, myös maaperässä (Schijven ym. 2003, National Research Council 2004, Nel ym. 2004). Virusten viljelymenetelmät ovat usein epäherkkiä ja kaikkia viruksia ei pystytä määrittämään viljelymenetelmillä (Rusin ym. 2000). Sen vuoksi virusten havaitsemiseksi vesinäytteistä on 24 kehitetty molekyylibiologisia PCR-menetelmiä. Näytteestä on ensin eristettävä DNA tai RNA puhtaaksi määritysmenetelmän reaktioita estävistä yhdisteistä. RNA-viruksia tutkittaessa viruksen RNA:sta syntetisoidaan komplementaarinen DNA-juoste käänteiskopiointitekniikalla ennen PCR-detektiota. (Rusin ym. 2000, Theron ja Cloete 2004, Girones ym. 2010) Tulosten varmistamiseksi voidaan tehdä vielä nukleiinihappojen hybridisaatio ja/tai sekvensointi (CEN ISO/TS 15216-1 2013) Laboratorioiden analyysivalmiudet virusten määrittämiseen ovat melko rajallisia ja virusten tutkimiseen vaadittavaa erikoisanalytiikkaa on yleensä tarjolla ainoastaan yliopistojen ja tutkimuslaitoksien laboratorioissa. Vedenlaadun tutkimuksessa voidaan määrittää myös virusindikaattoreina bakteerien viruksia, bakteriofageja. Kolifagit ovat E. coli -bakteerisoluja infektoivia bakteriofageja ja E. coli bakteerin viruksina ne ilmentävät myös ulosteperäistä saastumista. Kolifagit voidaan jakaa ryhmiin sen mukaan, miten ne rakenteensa vuoksi infektoivat bakteerisolun. F-spesifiset kolifaagit ovat DNA tai RNA-viruksia, jotka infektoivat F-tekijän omaavia E. coli bakteerikantoja niiden F-piluksen kautta. Somaattiset kolifaagit ovat DNA-viruksia, jotka infektoivat E. coli -bakteerin niiden solukalvon kautta. (Rusin ym. 2000, US EPA 2001a) Kolifagien määritys perustuu plakkimenetelmään. Näytettä inkuboidaan isäntä E. coli bakteerin läsnäollessa joko tryptoni-hiivauute-glukoosi-agarissa (SFS 2002) tai tryptoosisoijaagarissa (US EPA 2001a), jolloin näytteessä olevat kolifagit hajottavat bakteerikasvustoon kirkkaita pyöreitä alueita, plakkeja. Plakkien määrä lasketaan ja kolifagien määrä näytteessä ilmoitetaan plakin muodostavina yksikköinä, englanniksi plaque forming units (pfu). 100 ml:n näytetilavuus on yleisesti käytetty ja erilaisille vesinäytteille on kehitetty eri menetelmiä. Määritettäessä kolifageja pohja- ja talousvesistä voidaan käyttää plakkimenetelmän kanssa rikastusmenetelmää, jolloin saadaan kvalitatiivinen tulos. (US EPA 2001b) Jätevesiä analysoitaessa näytetilavuus maljalla voi olla alle millilitran. 25 Alkueläimet Yleisimmin vesivälitteisiä tauteja aiheuttavia alkueläimiä ovat Giardia-suvun ja Cryptosporidium-suvun alkueläimet. Alkueläimet tarttuvat ihmisestä toiseen ulosteperäisen tartunnan kautta ja ulosteperäisesti saastuneen talousveden kautta. Jo yksi alkueläin voi aiheuttaa sairastumisen, jolloin oireita ovat yleensä ripuli, voimakkaat vatsakivut ja pahoinvointi. (Nel ym. 2004) Alkueläimet ovat halkaisijaltaan useita mikrometrejä. Niitä esiintyy pinta- ja jätevesissä ja koteloituneina kystamuodossa ne voivat säilyä pitkään vahingoittumattomina erilaisissa olosuhteissa (Reynolds ja Pepper 2000, Nel ym. 2004). Alkueläinten säilyvyyteen ja esiintymiseen ympäristössä vaikuttavat lämpötila, vuodenaika ja maantieteellinen sijainti, suoja, kuten isäntä ja predaatio (National Research Council 2004). Alkueläinten kystat saattavat säilyä vahingoittumattomina joissakin talousveden desinfiointikäsittelyissä, joten niiden poistoon vedestä voidaan tarvita fysikaalisia operaatioita, kuten suodatus (Reynolds ja Pepper 2000, Lecler ym. 2004). Giardia- ja Cryptosporidium-suvun alkueläimien esiintymistä vedessä voidaan määrittää immunofluoresenssimenetelmällä, jossa kystat ja ookystat määritetään immunofluoresenssimäärityksellä värjäämällä ja mikroskopoinnilla. Värjäyksessä (oo)kystat värjätään kiinnittämällä niille spesifisen vasta-aineen avulla niihin fluoresoiva väriaine. (oo)kystiin kiinnittynyt fluoresoiva väriaine voidaan havaita fluoresenssimikroskoopilla. (Theron ja Cloete 2004, US EPA 2005, ISO 2006) Alkueläimien määrityksessä on käytetty myös nukleiinihappojen määritykseen perustuvia molekyylibiologisia PCR-menetelmiä (Rimhanen-Finne ym. 2002, Theron ja Cloete 2004). 2.4 VESINÄYTTEIDEN KONSENTROINTITEKNIIKAT MIKROBIOLOGISIA TUTKIMUKSIA VARTEN Mikrobien havaitsemiseksi talousvedestä tai talousveden raakavedestä vesinäytetilavuus täytyy saada pienemmäksi mikrobiologisia analyysejä varten konsentroimalla (Pepper ym. 2000, Theron ja Cloete 2004). Näytteenotossa ja konsentroinnissa mikrobit eivät saisi vahingoittua, eikä niiden lukumäärä vähentyä tilavuuden pienentyessä. Vesinäytteitä voidaan konsentroida suodattamalla ja sentrifugoimalla. Tekniikat perustuvat mikrobien kokoon, massaan ja sitoutumispotentiaaliin. Suodatuksen ja sentrifugoinnin tehokkuutta voidaan lisätä muuttamalla näytteen olosuhteita kemikaalien avulla. Eri tekniikoita voidaan yhdistää samanaikaisesti tai peräkkäin parhaan lopputuloksen saamiseksi. Suodattamalla tai sentrifugoimalla tehdyn suuren 26 tilavuuden konsentroinnin jälkeen voidaan tarvittaessa tehdä toinen konsentrointi konsentraatin tilavuuden pienentämiseksi. Jatkokonsentroinnin tarve riippuu näyteveden laadusta ja tilavuudesta sekä käytetyistä menetelmistä. Esimerkiksi PCR-menetelmiä varten näytetilavuus on vain joitakin mikrolitroja. Pienen tilavuuden konsentrointimenetelmiä voidaan käyttää suoraan näytteissä, joiden mikrobilukumäärät ovat valmiiksi korkeita, kuten jätevesissä. (Lindquist 2011) Eri mikrobiryhmät ovat kooltaan, muodoltaan, sitoutumisominaisuuksiltaan ja säilyvyydeltään erilaisia, minkä vuoksi eri mikrobeille käytetään yleensä eri konsentrointimenetelmiä (Theron ja Cloete 2004). Eri mikrobiryhmien samanaikaiseen konsentrointiin soveltuvia menetelmiä on tutkittu, mutta menetelmien saannot eri mikrobien suhteen ovat vaihdelleet (Payment ym. 1989, Kfir ym. 1995, Polaczyk ym. 2007). Alkueläinten ja bakteerien konsentrointiin tarkoitetut suuren tilavuuden menetelmät eivät sovi viruksille suuren huokoskoon vuoksi. Virusten konsentroinnissa käytetään mikrokoon suodatusta, mutta silloin tarvitaan kemikaalilisäyksiä tai pH:n säätöä, jotka eivät sovellu aina eri mikrobien konsentrointiin. (Theron ja Cloete 2004, Lindquist ym. 2007, Polaczyk ym. 2007) Eri mikrobiryhmille sopiva konsentrointimenetelmä olisi hyödyllinen ajan ja kustannusten säästämiseksi (Payment ym. 1989, Polaczyk ym. 2007). 2.4.1 Suodattaminen mikrobeja pidättävää materiaalia käyttäen Suodatusmenetelmät perustuvat puoliläpäisevään kalvoon tai materiaaliin, joka päästää läpi tiettyä kokoa tai molekyylimassaa pienemmät partikkelit ja estää sitä suurempien partikkeleiden läpäisyn (SFS 2008b). Suodatustekniikat voidaan jakaa suodattimen huokoskoon mukaan nano-, mikro- ja ultrasuodatukseen tai suodatinmateriaalin ja sen rakenteen mukaan esimerkiksi kalvosuodatukseen ja patruunasuodatukseen. Mikrobien määritysmenetelmissä suodatinmateriaali on yleensä huokoinen kalvo, jonka huokoset ovat mikrobien kokoa pienempiä. Huokoskoko voidaan ilmoittaa huokosen halkaisijana mikrometreinä tai molekyylipainohalkaisijan (MWCO, molecular weight cut-off) mukaan daltoneina (Da). Suodattimen valinnassa on otettava huomioon mikrobien koon lisäksi tutkittu tilavuus, suodatustehokkuus, materiaalin kerrostuminen suodattimeen ja ajan ja energian käyttö. Mikrobien ja partikkelien ominaisuudet, kuten sähköinen pintavaraus, vaikuttavat niiden materiaaleihin sitoutumiseen, jolloin sitoutumista voidaan hyödyntää tai ehkäistä eri kemikaalien ja materiaalien avulla. Suodatinkalvon erilainen pakkaaminen vaikuttaa siihen millaisella paineella suodatus tapahtuu ja miten paljon suodattimelle kerrostuu materiaalia. On 27 huomioitavaa, ettei suodatin rikkoudu tai mikrobit vahingoitu ja vahingoittuneina läpäise suodatinta esimerkiksi liian kovassa paineessa. (Lindquist 2011) Yksinkertaisimmillaan vesi voidaan suodattaa painovoiman avulla suodatinkalvon läpi, mutta suodattimen läpäisyyn käytetään yleensä tehokkuuden parantamiseksi vakuumia tai pumppua. Yleisesti käytössä olevassa kalvosuodatusmenetelmässä (membrane filtration, MF) käytetään tasomaista suodatinkalvoa. Kalvosuodattimien valmistusmateriaaleina käytetään selluloosaasetaattia tai -nitraattia, polykarbonaattia tai polyvinyyliä. Bakteerien määrityksessä, kuten indikaattoribakteerien kalvosuodatusmenetemässä, käytetään yleensä 47 mm halkaisijaltaan ja 0,2–0,45 µm huokoskooltaan olevaa suodatinkalvoa. (Pepper ym. 2000, SFS 2008b) Virusten konsentroinnissa käytettään usein hyödyksi virusten adsorptiota varaukseltaan positiiviseksi tai negatiiviseksi käsitellylle suodattimelle (Lukasik ym. 2000, Pepper ym. 2000, Ikner ym. 2012, CEN ISO/TS 15216-1 2013). Alkueläinanalyysissä on käytetty halkaisijaltaan suurempaa, jopa 293 mm, kalvoa, jonka huokoskoko on 1 µm (Ongerth ja Stibbs 1987). Suodatuksen jälkeen kalvo voidaan asettaa kiinteälle kasvualustalle maljalle tai rikastusliemeen (Pagel ym. 1982, Theron ja Cloete 2004). Mikrobit voidaan myös irrottaa suodattimelta huuhtomalla eli eluoimalla ne sopivaan liuokseen, kuten Legionella -bakteereita ja viruksia määritettäessä (ISO 1998, US EPA 2012, CEN ISO/TS 15216-1 2013). Taudinaiheuttajia määritettäessä suodatuksessa käytetään usein monimutkaisempia suodatinpatruunoita, kun halutaan suodattaa suuri tilavuus. Myös patruunasuodatuksessa suodatin on usein kalvomateriaalia, mutta se on pakattu suodatuspinta-alan suurentamiseksi laskoksille, spiraalikierteelle tai ontoiksi kuiduiksi. Materiaali voi olla myös syväsuodatin esimerkiksi vaahtomaisesta materiaalista. (Lindquist 2011) Negatiivisesti varautuneet virukset voidaan suodattaa positiivisesti varattujen suodattimien läpi, käyttäen esimerkiksi NanoCerampatruunasuodatinta (Argonide, Sanford, Yhdysvallat) tai 1MDS Virosorb -patruunasuodatinta (Cuno, Grou, Alankomaat). NanoCeram-suodattimen keskimääräinen huokoskoko on 2-3 µm, mutta positiivisen varauksen vuoksi huokoskooksi muodostuu 0,2 µm (Argonide 2014). Ennen varsinaista suodatusta samea näyte voidaan suodattaa polypropyleenisella esisuodatinpatruunalla (Gilgen ym. 1997, Gibbons ym. 2010, US EPA 2012). Nykyään Giardia- ja Cryptosporidium-alkueläinten eristämiseen vesinäytteistä käytetään yleensä suodatinpatruunaa standardimenetelmän ISO 15553 (2006) ja menetelmän USEPA 1623 (2005) mukaisesti (US EPA 2005, ISO 2006, Edge ym. 2013, Widerström ym. 2014). 28 Käytettyjä suodatinpatruunoita ovat esimerkiksi Envirochek™ tai Envirochek™ HV (Pall Life Sciences, New York, Yhdysvallat). Suodatinpatruunat on valmistettu hydrofiilisesta polyeetterisulfoni- tai polykarbonaattikalvosta, ja niiden huokoskoko on 1 µm. Konsentroinnissa voidaan käyttää myös vaahtomaisesta suodatinmateriaalista valmistettua patruunaa Filta-Max® (IDEXX, Westbrook, Maine, Yhdysvallat). Patruunalle valmistaja on antanut konsentroinnin vähimmäispaineeksi virtaaman aikaansaamiseksi 0,5 baaria ja suositeltu paine on 5 baaria. Kaupallisia patruunoita edullisempia menetelmiä on testattu taudinaiheuttajien suuren tilavuuden suodatukseen. Virusten konsentroinnissa esimerkiksi on käytetty lasivillapatruunaa. (Gantzer ym. 1997, Lambertini ym. 2008) Elintarvikehygienian ja jätevesien tutkimusmenetelmästä muunnellussa Moore swab -menetelmässä patruunaan tehdään suodatin puuvillaharsosta taittelemalla (Bisha ym. 2011, McEgan ym. 2013, Sbodio ym. 2013). 2.4.2 Sentrifugointi Jos näytetilavuus on sopivan pieni, näyte voidaan konsentroida sentrifugoimalla. Pienen mikrobilukumäärän omaavien vesien konsentrointia varten on kehitetty myös suuren tilavuuden sentrifugointimenetelmiä, jolloin käytetään jatkuvaa virtausta. Kaikki sentrifugointimenetelmät perustuvat tiheyksiltään erilaisten hiukkasten erottumiseen keskipakoisvoiman avulla (Lindquist 2011). Sentrifugoinnissa käytetään usein hyödyksi kemikaaleja tiheysmuutosten ja -erojen aikaansaamiseksi. Mikrobien erottamiseen voidaan myös käyttää voimakkaita suhteellisia keskipakoisvoimia eli ultrasentrifugointia tai suodatinkalvoa sentrifuugiputkessa (Ikner ym. 2012). Bakteereita voidaan konsentroida pienestä tilavuudesta sentrifugoimalla ja liuottaa pelletti eluointiliemeen (Khan ja Edge 2007). Bakteereita pienempien virusten konsentroinnissa sentrifugoimalla käytetään usein kemikaaleja apuna etenkin, jos viruslukumäärä näytteessä on pieni (Theron ja Cloete 2004, Ikner ym. 2012). Kemikaaleilla pyritään usein muuttamaan tiheyttä siten, että mikrobit sedimentoituvat nopeammin sentrifugoitaessa näytettä. Esimerkiksi polyetyleeniglykolisaostuksessa pH-neutraaliin näytteeseen lisätään polyetyleeniglykolia (PEG) ja sentrifugoidaan näytettä, jolloin näytteen virukset laskeutuvat pohjalle (Lewis ja Metcalf 1988, Theron ja Cloete 2004, CEN ISO/TS 15216-1 2013). Toisessa virusten konsentrointimenetelmässä, orgaanisessa flokkuloinnissa, näytteeseen lisätään lihauutetta ja pH säädetään happamaksi noin 3,5:een. Virukset muodostavat tällöin flokkeja lihauutteen 29 proteiinien kanssa ja painuvat sentrifugoitaessa pohjalle. (Katzenelson ym. 1976, Ikner ym. 2012) Alkueläinten määrityksessä on käytetty sentrifugointia yhdistettynä saostukseen kalsiumkarbonaatin avulla (Vesey ym. 1993). Sentrifugointi voidaan yhdistää myös ultrasuodatukseen. Viruksia määritettäessä voidaan konsentrointi pienestä tilavuudesta tehdä sentrifugoimalla näyte ultrasuodatinkalvon läpi (Ikner ym. 2012). Sentrifugoinnin aiheuttaman voiman vuoksi vesi ja ultrakokoisen suodatinkalvon huokoskokoa pienemmät molekyylit läpäisevät kalvon ja laskeutuvat putken alaosaan. Huokoskokoa suuremmat partikkelit, kuten virukset, eivät läpäise kalvoa ja jäävät sen pinnalle. Tähän menetelmään on olemassa kaupallisia mikrokonsentraattoreita, kuten Centricon-100 (Millipore), Centriprep Concentrator 50 (Millipore), Microsep-100 (Pall Corporation) ja Vivaspin (GE Healthcare) (Gilgen ym. 1997, Brassard ym. 2005, CEN ISO/TS 15216-1 2013). Sentrifugointia voidaan käyttää virusten ja makromolekyylien erottamiseen ilman suodatinkalvoa, kun käytetään ultrasentrifugointia eli yli 100 000 x g keskipakoisvoimakkuuksia. Ultrasentrifugointiaika on usein tunteja, jotta pienet kevyet mikrobit, kuten virukset, saadaan laskeutumaan näytteessä. Viruksia painavammat partikkelit voidaan poistaa näytteestä sentrifugoimalla näytettä pienemmillä keskipakoisvoimmilla ennen tai jälkeen ultrasentrifugoinnin. (Nordgren ym. 2009, Ammersbach ja Bienzle 2011, Ikner ym. 2012) Sentrifugointia voidaan tehdä myös jatkuvalla virralla, jos mikrobikonsentraatio on pieni. Alkueläinten määritykseen on kehitetty suuren näytetilavuuden konsentrointiin jatkuvavirtaussentrifugointi -menetelmä (continuous flow centrifugation). Menetelmää on testattu myös bakteerien konsentrointiin (Borchardt ja Spencer 2002, Bisha ym. 2011). Konsentrointia voidaan käyttää laboratorion ulkopuolella ja hyödyntää näytteenottoon. Säädettävä laitteisto menetelmään on kehitetty verisolujen erotuksessa käytetyn stationäärisen differentiaalisen continuous flow centrifuge -menetelmän pohjalta (Zuckerman ym. 1999). Näyte syötetään sentrifuugille letkupumpulla. Sentrifugoinnissa alkueläinten (oo)kystat kerääntyvät pääasiassa seinämille ja vesi ohjataan poistoon. Seinämiltä (oo)kystat eluoidaan talteen eluointiliuoksen ja ravistelun avulla. Zuckermanin ja Tziporin tutkimuksissa (2006) näyte konsentroitiin astiaan alle 250 ml:n tilavuuteen. Nopeus oli noin 750 ml minuutissa ja näytetilavuus 10-50 litraa. Näytteistä, joihin oli lisätty Cryptosporidium- ja Giardiaalkueläimiä, saanto oli jatkuvavirtaussentrifugointimenetelmällä Cryptosporidium- 30 alkueläimelle 60 % ja Giardia-alkueläimelle 67 %. Patruunasuodatusmenetelmällä (US EPA 1623) saanto oli Cryptosporidium-alkueläimelle 18 % ja Giardia-alkueläimelle 43 % (Zuckerman ja Tzipori 2006). 2.5 ULTRASUODATUSMENETELMÄ Ultrasuodatusta (Ultrafiltration, UF) käytetään lääketieteessä makromolekyylien, kuten proteiinien, erottamiseen paine- tai pitoisuuseron avulla, elintarviketeollisuudessa proteiinien käsittelyyn talousveden tuotannossa orgaanisen materiaalin ja mikrobien poistoon vedestä. (Zamparo ja Comper 1990, Clever ym. 2000, Manahan 2004, Liikanen 2007, Nigam ym. 2008, Kratzer ym. 2014) Vesimikrobiologiassa sitä on käytetty pienten tilavuuksien viruskonsentrointiin. Suuren tilavuuden ultrasuodatusmenetelmää on alettu kehittää vesimikrobiologiseen tutkimuskäyttöön, koska on haluttu tehokkaampi menetelmä eri mikrobiryhmien suuren tilavuuden konsentrointiin (Morales-Morales ym. 2003, Hill ym. 2005). Menetelmällä pyritään konsentroimaan eri mikrobit samanaikaisesti, mikä nopeuttaa niiden määritystä ja materiaalia kuluu vähemmän. Taudinaiheuttajamikrobien mahdollisimman nopea todentaminen on erityisen tärkeää epidemiaepäilytilanteessa. Tällöin ei usein ennalta tiedetä, mikä mikrobi tautia aiheuttaa, jolloin joudutaan määrittämään eri mikrobeja. Samanaikaista konsentrointia voidaan hyödyntää myös muissa tilanteissa, joissa halutaan määrittää suuri joukko eri mikrobeja (Hill ym. 2005). Ultrasuodatusmenetelmä eroaa muista suuren tilavuuden konsentrointimenetelmistä erityisesti ultrapieneltä huokoskooltaan, minkä vuoksi sen ajatellaan soveltuvan eri mikrobiryhmien samanaikaiseen konsentrointiin. (Morales-Morales ym. 2003) Ultrasuodatusmenetelmässä huokoskoko on 0,001-0,05 µm tai 1-500 kDa. (Lindquist ym. 2007) Vaikka näyteveteen tai suodattimeen ei lisätä virusten sähköisiin vuorovaikutuksiin vaikuttavia aineita, virukset eivät läpäise kalvon niitä pienempiä huokosia. (Morales-Morales ym. 2003, Hill ym. 2005, Lindquist ym. 2007) Sitoutumisominaisuudet on kuitenkin huomioitava, sillä osa mikrobeista voi sitoutua suodattimelle muun muassa van der Waals -voimien tai hydrofobisen sitoutumisen avulla. Sen vuoksi suodatinta voidaan käsitellä sitoutumisen ehkäisemiseksi tai eluoida mikrobien irrottamiseksi. (Garin ym. 1993, Winona ym. 2001) Ultrasuodatustamenetelmän kehityksessä on käytetty tasomaista ja patruunaan eri tavoin pakattua kalvoa ja kalvomateriaalina on käytetty muun muassa selluloosa-asetaattia. (Garin ym. 31 1993, Winona ym. 2001) Suuren tilavuuden ultrasuodatusmenetelmässä käytetään nykyään suodatinpatruunaa, jossa polysulfonista valmistettu kalvomateriaali on onttoina kuituina. (Hill ym. 2005, Ikner ym. 2012) Onttokuitu-ultrasuodatusmenetelmä (HFUF, hollow-fiber ultrafiltration) sopii suuren tilavuuden suodatukseen, sillä suodatinpatruunaan pakatuilla ontoilla suodatinkalvokuiduilla mahdollistetaan suuri suodatuspinta-ala. Suuri pinta-ala ja kalvoon nähden tangentiaalinen suodatus vähentävät veden sisältämän materiaalin kerrostumista ja suodattimen tukkeutumista ja lisäävät siten suodatustilavuutta ja nopeutta. (Morales-Morales ym. 2003, Lindquist 2011) 2.5.1 Ultrasuodatuksen toteutus Suuren tilavuuden konsentrointiin sopivaa ultrasuodatusmenetelmää on kehitetty laitteiston, onttokuituisen suodatinpatruunan valinnan ja esikäsittelyn osalta ja sitä on testattu eri bakteereiden, virusten ja alkueläinten konsentrointiin. Myös erilaisten vesimatriisien, näytetilavuuden ja suodatusnopeuden vaikutusta konsentrointiin ultrasuodatusmenetelmällä on tutkittu. Ultasuodatusmenetelmässä on tutkittu kahta päämenetelmää: normaalimenetelmää (englanniksi dead-end ultrafiltration, DEUF) ja tangentiaalista ristivirtausmenetelmää (tangential ultrafiltration tai cross-flow ultrafiltration). Normaalimenetelmässä koko näytevesitilavuus pakotetaan paineen avulla läpäisemään kuitujen suodatinmateriaali kierrättämättä vettä, jolloin mikrobit ja huokosia suuremmat molekyylit jäävät kuituihin. Suodatinpatruunalta mikrobit huuhdotaan vastavirtaan liuoksella, jonka tilavuus on usein 500 ml. (Smith ja Hill 2009, Leskinen ym. 2012) Ristivirtausmenetelmässä vesi virtaa suodatinkuitujen suuntaisesta ja osa vedestä läpäisee suodatinmateriaalin eli kulkee kohtisuoraan suodatinkuituun nähden sen läpi. Suodatinmateriaalin ohi tangentiaalisesti virrannut suodattumaton vesi taas kierrätetään yleensä uudelleen suodattimelle, kunnes haluttu tilavuus on kokonaan suodattunut. Ristivirtausmenetelmässä mikrobit konsentroituvat kiertävään veteen eli konsentraattiin, jonka tilavuus lopuksi voi olla joitakin satoja millilitroja. (Morales-Morales ym. 2003, Hill ym. 2005, Rhodes ym. 2011) Ristivirtausmenetelmässä kalvon suuntaisesti kulkeva vesi ehkäisee suodatinkalvon tukkeutumista, mikä edesauttaa suuren tilavuuden suodatusta normaaliultrasuodatukseen verrattuna. Suodattimelle kerrostuva vähäinen materiaali voi myös parantaa suodatusta tukkimalla mikrobeja isommat aukot suodattimessa. (Hijnen ym. 2000, Morales-Morales ym. 2003) Normaalimenetelmä on 32 kuitenkin yksinkertaisempi käyttää, joten sitä on kehitetty kentällä käytettäväksi ja rutiinikäyttöön. (Smith ja Hill 2009, Leskinen ym. 2012) Suodatusnopeutta ja painetta on tutkittu eri menetelmissä. Normaalimenetelmässä suodatusnopeus voi olla 1-2 litraa minuutissa (Simmons ym. 2001, Smith ja Hill 2009). Ristivirtaussuodatuksessa kokonaisvirtaus suodattimelle on ollut 1,7 litrasta yli neljään litraan minuutissa, josta veden suodatusnopeus suodatinmateriaalin läpi on vaihdellut välillä 0,8 ja 1,2 litraa minuutissa. Myös korkean virtausnopeuden suodatusta yli kaksi litraa minuutissa on tutkittu (Veenendaal ja Brouwer-Hanzens 2007, Polaczyk ym. 2008). Hyvin nopeassa suodatuksessa, nopeus yli kaksi litraa minuutissa, mikrobisaanto voi olla heikompi (Polaczyk ym. 2008). Suodatuspaineen on raportoitu olleen tutkimuksissa noin yksi baari tai vähemmän (0,4-1,1 bar) (Veenendaal ja Brouwer-Hanzens 2007, Rhodes ym. 2011). Painetta voidaan seurata ennen tai jälkeen suodatinpatruunan (Polaczyk ym. 2008, Rhodes ym. 2011). Paineen seurannalla voidaan myös havaita suodattimen rikkoutuminen (Lindquist ym. 2007). Paineeseen vaikuttavat suodattimen ja laitteiston rakenne, kuten letkut ja kiristimet ja pumppausnopeus (Polaczyk ym. 2008, Smith ja Hill 2009). Menetelmässä on käytetty ja vertailtu eri valmistajien suodatinpatruunoita. Käytetyt patruunat ovat usein dialyysihoidossa käytettyjä malleja, koska niitä on ollut edullisesti saatavilla. (Hill ym. 2005, Rhodes ym. 2011) Mikrobiologiseen käyttöön ei ole vielä kaupallisia ultrakoon suodatinpatruunoita. Suodatinpatruunoiden pinta-alan ja rakenne-erojen on tutkittu vaikuttavan suodatuspaineeseen. Smith ja Hill (2009) vertasivat neljää eri ultrasuodatuspatruunaa paineen, virtaaman ja veden lämpötilan osalta. Freseniuksen valmistamalla suodatinpatruunalla Optiflux F200NR oli testissä korkein paine, kun suodatusnopeus oli yli litra minuutissa ja paine nousi eniten suodatusnopeutta nostettaessa. Asahi Kasei REXEED 21S ja 25S -suodatinpatruunoilla paine oli yleensä ottaen pienin. Suuremman pinta-alan omaavalla suodatinmallilla paine voi olla pienempi verrattuna saman valmistajan pienemmän pinta-alan suodattimeen. Käytettyjen suodatinpatruunoiden pinta-ala on ollut 1,8-2,5 m2 (Hill ym. 2005, Smith ja Hill 2009). Polaczyk ym. (2008) eivät huomanneet Freseniuksen Hemoflow F80A ja F200NR suodatinpatruunoiden eroilla olevan selvää vaikutusta mikrobisaantoon. Kontaminaatioriskin pienentämiseksi ultrasuodatusmenetelmässä käytetään yleensä letkupumppua (Hill ym. 2005, Veenendaal ja Brouwer-Hanzens 2007, Polaczyk ym. 2008). Normaaliultrasuodatuksessa voidaan käyttää muunlaista pumppua, jos pumpun läpi mennyt 33 vesi imetään suodattimelta eli se ei kulje enää suodattimelle tai pääse kontaminoimaan sitä enää pumpun jälkeen (Lindquist 2011). Letkuina on käytetty usein platinavulkanoituja silikoniletkuja, joiden sisähalkaisija on 6,4 mm (Hill ym. 2005, Hill ym. 2007, Polaczyk ym. 2008, Rhodes ym. 2011). Pumpun kohdalla tai suodattuneen veden letkuina on käytetty myös paksumpaa sisähalkaisijaltaan 9,5-9,7 mm olevaa letkua (Polaczyk ym. 2008, Rhodes ym. 2011). Pumpun kohdalla sisähalkaisijaltaan suuremmalla letkulla voidaan nostaa suodattimelle menevän veden virtausnopeutta (Hill ym. 2007, Polaczyk ym. 2008). Suodatuksen mikrobisaantoa voidaan parantaa vaikuttamalla mikrobien sitoutumiseen esikäsittelemällä suodatin tai lisäämällä veteen kemikaaleja. Suodatinta on esikäsitelty ennen suodatusta erilaisilla menetelmillä, joiden tarkoitus on ehkäistä mikrobien kiinnittymistä suodattimeen. (Lindquist ym. 2007, Hill ym. 2010) Esikäsittely voi muokata fysikaalisesti suodatinmateriaalin pintaa ja rakennetta tai muuttaa suodatinmateriaalin varausta. Naudanseerumin ja NaPP:n käyttöä esikäsittelyliuoksina on tutkittu. (Morales-Morales ym. 2003, Hill ym. 2005, Polaczyk ym. 2008) Polyfosfaatit ovat hyvin negatiivisesti varautuneita ja estävät mikrobien kiinnittymistä kalvolle muuttamalla mikrobien zeta-potentiaalia negatiivisemmaksi. Esikäsittely voi estää myös mikrobien havaitsemista estävien yhdisteiden kerääntymisen suodattimelle. (Winona ym. 2001) Esikäsittely vie kuitenkin aikaa ja lisää kontaminaatioriskiä (Hill ym. 2005). Pintavarauksiin vaikuttavia aineita, kuten natriumpolyfosfaattia (NaPP) voidaan lisätä näyteveteen esikäsittelyn sijaan tai lisäksi, minkä on huomattu parantavan mikrobisaantoa (Hill ym. 2005). Näyteveteen voidaan myös syöttää tiosulfaattia kloorin neutraloimiseksi (Polaczyk ym. 2008). Suodatinpatruunalle jääneet mikrobit voidaan huuhtoa liuokseen, mikä on välttämätöntä normaaliultrasuodatusmenetelmässä. Huuhtelu voidaan tehdä vastavirtaan suodatukseen nähden tai ristivirtausmenetelmässä myös suodatuksen suuntaan. Huuhtelussa voidaan käyttää eluointiliuosta tai suodattunutta vettä. (Hill ym. 2005, Polaczyk ym. 2008) Eluointiliuoksessa on käytetty kemikaaleja, joita käytetään yleisesti laboratoriotutkimuksissa, kun halutaan vaikuttaa mikrobien sitoutumiseen. (Morales-Morales ym. 2003, Méndez ym. 2004) NaPP vaikuttaa hiukkasten ja virusten pintavarauksiin, Tween ehkäisee hydrofobisten sidoksien syntymistä suodattimen ja mikrobien välille ja Antifoam-emulsiot estävät nimensä mukaisesti vaahtoamista (Morales-Morales ym. 2003, Hill ym. 2005). Suodatussuuntaan eluoitaessa eluointiliuos tai sama tilavuus suodattunutta vettä voidaan pumpata kerran suodattimen läpi tai kierrättää sitä suodattimella. Kierrätyksen aikana liuoksen tilavuutta voidaan pienentää 34 suodattamalla esimerkiksi 150-200 ml:aan tai estää veden suodattuminen patruunalta korkkien avulla, jolloin liuoksen tilavuus pysyy samana eli usein 500 ml:na (Hill ym. 2007, Mull ja Hill 2009). Eluointi tehdään yleensä ilman paineen nostoa ja virtausnopeus voi olla pienempi kuin varsinaisessa suodatuksessa (Lindquist ym. 2007). Vastavirtahuuhtelussa liuos pumpataan vain kerran suodatinmateriaalin läpi vastakkaiseen suuntaan suodatussuuntaan nähden. Vastavirtahuuhtelumenetelmää käytetään normaaliultrasuodatuksessa, mutta sitä voidaan käyttää myös ristivirtaussuodatuksen lopuksi. (Polaczyk ym. 2008) Suodatinpatruunaa on suodatuksen lopuksi myös puhallettu paineilmalla, jotta kaikki näyte mikrobeineen saadaan patruunalta talteen (Hill ym. 2005). Ristivirtausmenetelmällä on saatu hyviä saantotuloksia ilman eluointia, mutta eluoinnilla voidaan myös parantaa saantoa (Polaczyk ym. 2008). Hill ym. (2005) huomasivat ristivirtausmenetelmässä vastavirtahuuhtelun parantavan mikrobisaantoa huomattavasti verrattuna suodatinpatruunan huuhtomatta jättämiseen. Lindquist ym. (2007) saivat vastavirtahuuhtelulla parempia mikrobisaantoja kuin eluointiliuosta suodatussuuntaan kierrättämällä, mutta ero ei ollut merkittävä. Ultrasuodatusmenetelmällä konsentroitua vesinäytettä voidaan menetelmästä riippuen konsentroida pienempään tilavuuteen tai analysoida suoraan nykyisin käytössä olevilla viljelyja PCR-menetelmillä (Hill ym. 2007, Veenendaal ja Brouwer-Hanzens 2007, Knappett ym. 2011). Jatkokonsentrointina voidaan käyttää kappaleessa 2.4 kerrottuja suodatus- ja sentrifugointimenetelmiä. Bakteereille voidaan käyttää perinteistä kalvosuodatusmenetelmää tai sentrifugointia molekyylibiologisia menetelmiä varten. Virusten jatkokonsentrointina on käytetty mikrokonsentraattoria eli sentrifugoinnin ja ultrasuodatuksen yhdistelmää, PEGsaostusta tai orgaanista flokkulaatiota. (Polaczyk ym. 2008, Mull ja Hill 2009, Hill ym. 2010, Rhodes ym. 2011) 35 2.5.2 Käytännön sovellutukset Ultrasuodatusmenetelmää on käytetty kymmenissä tieteellisissä tutkimuksissa. Sitä on käytetty epidemiaselvityksessä esimerkiksi USA:ssa, talousveden ja sen raakavesien sekä uimavesien laadun ja suolistoperäisten mikrobien esiintymisen tutkimuksessa, mikrobilähteiden seurannassa tai jäljittämisessä (Microbial source tracking, MST) ja molekyylibiologisten menetelmien tutkimuksessa (Santo Domingo ym. 2007, Hill ym. 2010, Hunter ym. 2011, Ahmed ym. 2012). Menetelmää on testattu pohjavesien ja talousvesien konsentrointiin näytetilavuuksilla 10 - 7500 litraa (Hill ym. 2005, Veenendaal ja Brouwer-Hanzens 2007, Polaczyk ym. 2008, Hill ym. 2010). Yleensä näytetilavuus on kymmeniä litroja tai sata litraa etenkin normaalisuodatusmenetelmää käytettäessä (Hill ym. 2010, Knappett ym. 2011). Talousvettä konsentroitaessa menetelmän on tutkittu toimivan kolifagien osalta aina 2000 litran tilavuuteen saakka, mutta yli 2000 litran tilavuuksissa saannon on todettu heikentyvän huomattavasti (Veenendaal ja Brouwer-Hanzens 2007). Normaali- ja ristivirtausultrasuodatusta on käytetty ja soveltuvuutta tutkittu myös uimavesille ja talousveden raakavesille. Pintavesien tutkittu tilavuus on ollut kymmeniä litroja tai sata litraa. (Simmons ym. 2001, Mull ja Hill 2009, Gibson ym. 2011, Leskinen ym. 2012) Vesistä on tutkittu ultrasuodatusmenetelmällä sekä indikaattorimikrobeja että taudinaiheuttajabakteereita, -viruksia ja -alkueläimiä (Hill ym. 2010, Gibson ym. 2011, Ahmed ym. 2012, Wu ym. 2013, Griffin ym. 2014). Tutkimuksissa, joissa talousvesi- tai pohjavesinäytteeseen on lisätty tunnettu lukumäärä mikrobeja, saannoksi ultrasuodatusmenetelmällä on raportoitu 50–100 % (Veenendaal ja Brouwer-Hanzens 2007, Polaczyk ym. 2008, Hill ym. 2009). Pintavesinäytteestä esimerkiksi Veenendaal ja BrouwerHanzens (2007) saivat 50 litran tilavuudesta saannoksi indikaattoribakteereille ja -viruksille ja Giardia-alkueläimelle vähintään noin 80 %, mutta kampylobakteerille saanto oli keskimäärin 35 % ja Cryptosporidium-alkueläimille 67 %. Suuri osa saantotutkimusten tuloksista on saatu molekyylibiologisilla menetelmillä. Konsentroinnin vaikutusta mikrobien viljeltävyyteen ei ole paljon tutkittu. Suodattimen esikäsittelymenetelmät, eluointimenetelmät, kemikaalilisäykset veteen ja suodatusnopeus voivat vaikuttaa eri mikrobeihin eri tavalla (Polaczyk ym. 2008, Wu ym. 2013). Myös jatkokonsentrointimenetelmä vaikuttaa saantoon (Rhodes ym. 2011). 36 Veden laadun on huomattu vaikuttavan ultrasuodatuksen tehokkuuteen ja kaikkia eri vedenlaadun tekijöiden vaikutuksia menetelmään ei vielä tunneta. Sameuden ja lämpötilan vaikutusta ovat tutkineet muun muassa Smith ja Hill (2009). Kylmän veden suodatukseen tarvitaan korkeampi paine kuin lämpimän. Saanto oli paras vesistä, jotka olivat vähiten sameita (Smith ja Hill 2009). Ultrasuodatusta on käytetty joki- ja järvivesien konsentrointiin, joiden sameus on ollut 3,6 ja 18,4 NTU (Mull ja Hill 2009). Hill ym. (2010) käyttivät onnistuneesti ultrasuodatusta konsentroidessaan vesiä, joiden sameudet olivat 0,17 NTU ja 9,7 NTU. Veden laadusta riippuen on mahdollista, että suodattimelle kertyy materiaalia, joka vahingoittaa mikrobeja ja estää mikrobien havaitsemista (Morales-Morales ym. 2003). Laboratorion ulkopuolelle soveltuvia ultrasuodatusmenetelmiä ja kuljetettavia laitteistoja on kehitetty näytteenoton ja näytteen kuljetuksen helpottamiseksi (Kearns ym. 2008, Leskinen ym. 2012). Ultrasuodatuslaitteistot voivat olla laboratoriossa ja kenttäkäytössä osittain tai hyvin pitkälle automatisoituja, esimerkiksi näytevesiastian pinnankorkeuden säädön tai näytteenottoajan suhteen (Veenendaal ja Brouwer-Hanzens 2007, Kearns ym. 2008, Leskinen ym. 2012). Tehokas suuren tilavuuden konsentrointi ultrasuodatusmenetelmällä, jatkokonsentrointi mikrolitratilavuuksiin sentrifugoimalla ja mikrobien havaitseminen molekyylibiologisilla menetelmillä voivat yhdessä mahdollistaa mikrobien havaitsemisen vedestä nopeasti ja tehokkaasti (Leskinen ym. 2009, Leskinen ym. 2012). 37 3 TYÖN TAVOITTEET Tämän opinnäytetyön tavoitteena oli ottaa käyttöön ristivirtausultrasuodatusmenetelmä, jota voidaan käyttää vesiepidemiaselvitystyössä ja riskinarvioinnin apuna Suomen vesilaitoksilla. Työn osatavoitteet olivat: Testata menetelmän toimintaa ja bakteerien ja virusten konsentrointitehokkuutta suurista vesitilavuuksista. Selvittää menetelmän kenttäolosuhteissa. näytteenottoautomatiikan toimintakykyä erilaisissa 38 4 AINEISTO JA MENETELMÄT 4.1 ULTRASUODATUSMENETELMÄ JA LAITTEISTO 4.1.1 Ultrasuodatuslaitteisto Ultrasuodatusmenetelmää varten rakennettiin oma laitteisto Savonia-ammattikorkeakoululla (Kuopio) kirjallisuudessa esitettyjen menetelmäkuvausten pohjalta (Hill ym. 2005, Hill ym. 2007, Rhodes ym. 2011). Laitteiston toimintaperiaatteen kaavio on esitetty Kuvassa 2 ja rakennettu laitteisto Kuvassa 3. Laitteistoon rakennettiin automaattinen pinnankorkeudensäätö pitkäkestoisia suuren tilavuuden suodatuksia varten. Suodatinpatruunat olivat kertakäyttöisiä Fresenius Helixone® High-Flux FX80 -dialysaattoreita (Fresenius Medical Care, Bad Homburg, Saksa), joiden suodatuspinta-ala on 1,8 m2. Suodatinkalvon materiaali oli polysulfonipolyvinyylipyrrolidonisekoitetta ja huokoskoko MWCO:na 5-100 kDa ja 3,3 nm, suodatinkuitukalvon paksuus 35 µm ja kuidun sisähalkaisija 185 µm. Letkut olivat Pumpsilsilikoniletkua seinän paksuudeltaan 1,6 mm ja sisähalkaisijaltaan 8 mm (Watson Marlow Tubing, Falmouth, Englanti). Suodatinpatruunan liittimien ja silikoniletkun liitoskohdassa käytettiin muoviletkua ja suodatetun veden letkut olivat sisähalkaisijaltaan noin 4 mm ja mallia AV-SN-Set-FMC (FA 514 SN C/FV 204 E) (Fresenius Medical Care, Bad Homburg, Saksa). Laitteistossa käytettiin peristalttista Ecoline-pumppua VC-380 (Ismatec, Idex Health and Science, Wertheim, Saksa) ja konsentraattisäiliönä oli viiden litran kanisteri (7270, Plastex, Lohja, Suomi). Painemittari oli aluksi ilmatäytteinen, mutta se vaihdettiin öljytäytteiseen laitteiston tärinän vuoksi. Ultrasuodatuslaitteiston toimintaa, suodatusnopeutta ja automatiikan toimivuutta testattiin Savonia-ammattikorkeakoululla ennen varsinaisia kokeita. 39 Kuva 2. Ultrasuodatuslaitteiston kaaviokuva. Kohta 1. on Ecoline-pumppu, 2. suodatinpatruuna, 3. konsentraattisäiliö, 4. suodattunut vesi (astia tai viemäri), 5. annostelupumppu, 6. NaPP-liuos, a. painemittari ja varoventtiili, b. kiristin, c. pinnankorkeusanturit, d. letkujen sulkijat Kuva 3. Ultrasuodatuslaitteisto edestä ja ylhäältä katsottuna. Kohta 1 on Ecoline-pumppu, 2. suodatinpatruuna, 3. konsentraattisäiliö, 4. suodattuneen veden letku, a. painemittaria ja varoventtiili, b. kiristin, c. pinnankorkeusanturit, d. letkujen sulkijat 4.1.2 Ultrasuodatuksen esivalmistelut Ultrasuodatuslaitteisto desinfioitiin ilman suodatinpatruunaa koetta edeltävänä päivänä natriumhypokloriittiliuoksella, jonka klooripitoisuus oli noin 60 mg/l. Vaikutusaika oli 40 vähintään 20 minuuttia. Klooriliuosta kierrätettiin laitteessa siten, että liuos pääsi vaikuttamaan laitteen kaikkien letkujen ja osien sisälle. Klooriliuos huuhdottiin laitteistosta kierrättämällä sen läpi käänteisosmoosivettä Ecoline-letkupumpulla puoliteholla, joka vastaa noin nopeutta 1700 ml minuutissa. Desinfioinnin ja huuhtelun aikana laitteessa oli suodatinpatruunan tilalla yksinkertainen muovinen välikappale. Muut osat olivat kiinni samalla tavalla kuin näytevettä suodatettaessa. Ensimmäisessä kokeessa huuhteluvedestä mitattiin klooripitoisuus huuhtelun riittävyyden varmistamiseksi (Chlorometer 1000 Palintest, Englanti). Ennen laitteistoon kytkemistä suodatinpatruuna esikäsiteltiin mikrobien kiinnittymisen ehkäisemiseksi Hillin (2005) mukaan kierrättämällä sen läpi 500 ml viisiprosenttista (v/v) naudan seerumia viiden minuutin ajan. Naudan seerumi (Bovine serum 16170, Invitrogen, Gibco, Yhdysvallat) laimennettiin viisiprosenttiseksi steriilillä deionisoidulla vedellä. Naudanseerumiliuosta kierrätettiin suodatinpatruunassa kahden autoklavoidun silikoniletkun avulla letkupumpulla (Watson-Marlow 520S, Englanti) 70 % teholla. Virtaamaa ei mitattu. Seerumia ei pumpattu patruunan suodatinkuitujen läpi, vaan kuitujen suuntaisesti. Kierrättämisen jälkeen patruunan reiät suljettiin korkeilla. Suodatinpatruunaa pyöritettiin pyörittäjällä (FinePCR, Korea) nopeudella 3, 30 asteen kulmassa) 18–24 tuntia. Suodatin huuhdottiin pumppaamalla Watson-Marlow 520S -pumpulla steriiliä vettä sen läpi 70 %:n teholla. Suodatus aloitettiin tunnin sisällä suodattimen esikäsittelyn jälkeen. 4.1.3 Näytteen suodatus ultrasuodatuslaitteistolla Näytevesi pumpattiin Ecoline-letkupumpulla (Kuvat 2 ja 3, kohta 1) näyteastiasta tai hanasta suodatinpatruunaan (Kuvat 2 ja 3, kohta 2). Jos näytevesi otettiin paineellisesta hanasta, järjestelmään liitettiin paineenalennusventtiili hanan ja pumpun väliin ennen sulkijaa. Suodatinpatruunassa osa vedestä suodattui onttojen suodatinkuitujen kalvon läpi ja tuli ulos erillisistä letkuista (Kuvat 2 ja 3, kohta 4) ja osa vedestä kulki suodattumatta kuitujen suuntaisesti patruunan läpi konsentraattisäiliöön (Kuvat 2 ja 3, kohta 3), josta se lähti uudelleen kiertoon, kun säiliö täyttyi. Järjestelmän painetta seurattiin painemittarista (Kuvat 2 ja 3, kohta a), jonka yhteydessä oli varoventtiili. Jos paine nousi yli 1,5 baariin, vesi pääsi ulos varoventtiilin kautta kulkeutumatta suodattimelle. Painetta säädettiin kiristimellä (Kuvat 2 ja 3, kohta b). Konsentraattisäiliön seinämää vasten olevat vedenpinnan korkeutta optisesti mittaavat anturit (Kuvat 2 ja 3, kohta c) säätelivät automaattisesti toimivia sulkijoita (Kuvat 2 ja 3, kohta d). Kun veden pinta oli alemman pinta-anturin alapuolella, näytevesiletkun sulkija (Kuvassa 2 41 oikeanpuoleinen) oli auki ja suodattimelle virtasi uutta näytevettä. Konsentraattisäiliöltä tulevan letkun sulkija (Kuvassa 2 vasemmanpuoleinen) oli silloin kiinni. Kun kanisteri täyttyi eli pinnankorkeus nousi ylemmän pinta-anturin kohdalle, sulkijoiden asennot vaihtuivat, ja vesi virtasi suodatinpatruunalle konsentraattisäiliöstä. Osassa kokeista näyteveteen lisättiin NaPP:a (Merck, Darmstadt, Saksa), jotta mikrobit pysyisivät näytevedessä eivätkä kiinnittysi suodatinmateriaaliin. Näyteveden NaPP:n tavoitepitoisuus oli 0,01 % (v/v). Jos näytevesi suodatettiin kanisterista, NaPP-lisäys tehtiin sekoittamalla NaPP ensin pieneen määrään näytevettä ja sekoittamalla liuos sitten koko näytemäärään kanisteria voimakkaasti ravistelemalla. Jos lisäys tehtiin hanasta otettavaan näyteveteen, NaPP-liuos (Kuva 2, kohta 6) syötettiin annostelupumpulla (Grunfos Alldos DME 19-6, Grundfos, Tanska) (Kuva 2, kohta 5) liittimen kautta näyteveteen siinä vaiheessa, kun konsentroimatonta näytevettä pumpattiin suodatinpatruunalle. Annostelupumppu oli kytketty sulkijoita säätelevään järjestelmään. Haluttu tilavuus näytevettä suodatettiin ja pumppu pysäytettiin, kun konsentraattisäiliössä oli jäljellä noin 300 ml näytettä. Odotusajan säästämiseksi laite voitiin myös käsin kytkeä suodattamaan konsentraattisäiliön vettä missä vaiheessa tahansa siirtämällä pinta-antureita tai vaihtamalla letkujen paikkoja sulkijoissa. Konsentraatin tilavuus mitattiin ja konsentraatti otettiin talteen. Suodatinpatruunan huuhtelussa konsentroinnin jälkeen testattiin eri eluointimenetelmiä. Huuhtominen tehtiin eluointiliuoksella, joka valmistettiin Hillin (2005) mukaan steriiliin deionisoituun veteen ja se sisälsi tilavuusprosentteina 0,01 % Tween 80:aa (Sigma-Aldrich, USA), 0,01 % NaPP:a ja 0,001 % antifoam Y-30:a (Sigma-Aldrich, USA). Huuhtomiseen käytettiin myös suodatinpatruunan läpi suodattunutta vettä ja konsentraattia, johon sekoitettiin huuhteluliuosta. Sekoitussuhde oli 1 osa huuhteluliuosta ja 9 osaa konsentraattia (Polaczyk ym. 2008). 4.2 TESTIMIKROBIT 4.2.1 Bakteeri- ja virusliuosten valmistus Saantokokeissa näyteveteen lisättiin E. coli -bakteeria, F-spesifistä ja somaattista kolifagia tai norovirusta. E. coli -bakteeriliuos valmistettiin viljelemällä syväjäästä ympäristöperäistä E. coli -bakteerikantaa (THL-koodi 07v699/1) tryptoni-soija-agar-alustalle (TSA) (Oxoid, Englanti) ja 42 inkuboimalla alustaa kolme vuorokautta lämpötilassa 36 ºC. Kannan puhtaus tarkastettiin silmämääräisesti ja alustalta siirrostettiin yksi erillispesäke steriilillä silmukalla 10 ml:aan Preston-lientä (Nutrient Broth N:o 2, Oxoid, Englanti). Bakteerilientä inkuboitiin 24 tunnin ajan ravistelijassa (Vibramax 100, Heidolph, Saksa) nopeudella 100 rpm lämpötilassa 36 ºC. Inkuboinnin jälkeen 10 ml:n bakteeriliemi siirrostettiin 100 ml:aan Preston-lientä, jota inkuboitiin taas 24 tuntia ravistelijassa nopeudella 100 rpm lämpötilassa 36 ºC. Inkuboinnin jälkeen bakteerilientä sentrifugoitiin kahdessa fuugiputkessa 30 ml eli yhteensä 60 ml 10 minuuttia (Sigma 6-16K, Swing out -roottori 11150 + 13235, 3283 x g, 4500 rpm). Sentrifugoinnin jälkeen supernatantti dekantoitiin pois ja pelletit pestiin 15 ml:lla fysiologista suolaliuosta eli 0,9 % (w/v) natriumkloridilla kaksi kertaa. Toisen pesun jälkeen supernatantti pipetoitiin tarkasti pois ja molemmat pelletit liuotettiin 5 ml:aan testattavaa vettä ja yhdistettiin 10 ml:ksi. (Lehtola ym. 2007) Kolifagien kasvatusta varten kasvatettiin menetelmäohjeen US EPA 1601 (2001) mukaisesti omat isäntäbakteerikannat log-kasvuvaiheeseen kummallekin kolifagille. F-spesifistä kolifagia varten silmukallinen isäntäbakteeria E. coli Famp (ATCC 700891) siirrostettiin 25 ml:aan tryptoni-soija-lientä (TSB, Oxoid, Englanti), johon oli lisätty 250 µl ampisilliini/streptomysiini (A/S) -antibioottia. Lientä inkuboitiin 37 ºC:ssa 18-24 h ravistelijassa (Vibramax 100 Heidolph, 100 rpm). Inkuboinnin jälkeen 250 µl isäntäbakteerilientä siirrostettiin 25 ml:aan TSB-lientä, johon oli lisätty 250 µl (A/S) -antibioottia, ja inkuboitiin 37 ºC:ssa ravistelijassa noin 1,5 tuntia log-kasvuvaiheeseen, jossa liemen absorbanssi aallonpituudella 520 nm oli 0,1-0,5. Inkuboinnin jälkeen isäntää säilytettiin 4 ºC:ssa. Somaattista kolifagia varten kasvatettiin isäntäbakteeria E. coli CN-13 (ATCC 700609) samalla tavalla kuin E. coli Famp isäntäbakteeria paitsi antibioottina käytettiin nalidiksiinihappoa. Log-kasvuvaiheen E. coli Famp isäntäbakteeriliemeen lisättiin F-spesifistä kolifagia (NCTC 12487) siten, että pitoisuudeksi saatiin noin 107 pfu/ml. Lientä inkuboitiin 37 °C:ssa viisi tuntia ravistelijassa (100 rpm), minkä jälkeen lisättiin suhteessa 1:10 puhdasta kloroformia (Merck) lopulliseen liuokseen, sekoitettiin ja säilytettiin 4 °C:ssa yön yli. Seuraavana aamuna liuoksesta dekantoitiin nestefaasi, joka sentrifugoitiin (5000 x g, 20 minuuttia, 4 °C). Supernatantti otettiin talteen ja suodatettiin vielä 0,45 μm Acrodisc-suodattimen (Pall corporation, Newquay, Cornwall, UK) läpi. Kolifagiliuos säilytettiin 4 °C:ssa. Somaattisten kolifagien liuoksen valmistuksessa somaattista kolifagia (ATCC 13706-B1) lisättiin E. coli CN-13 isäntäbakteeriliemeen ja liuos valmistettiin samalla tavalla kuin F-spesifisten kolifagien liuos. 43 Norovirusliuos valmistettiin potilaan ulostenäytteestä. Näytettä sentrifugoitiin mikrosentrifuugiputkessa (10 000 x g, 2 min) ja supernatantti otettiin talteen ja säilytettiin -80 °C:ssa. 4.2.2 Bakteerien määritys vesinäytteistä E. coli ja koliformiset bakteerit määritettiin näytteistä kalvosuodatusmenetelmällä tai pintaviljelymenetelmällä käyttäen kromogeenistä Chromocult Coliform Agar -kasvualustaa (CC) (Merck, Saksa) tai Chromocult Coliform Agar -kasvualustaa, johon oli lisätty antibiotteja (CC-VK) (E.coli/Coliform Selective supplement, cefsulodin and vancomycin, Merck, Saksa). Kalvosuodatusmenetelmässä käytetty suodatin oli GN-6 Metricel (Pall Corporation, USA). Alustoja inkuboitiin lämpötilassa (36 ± 2) °C 18–24 tuntia. E. coli -bakteeri kasvaa CCalustalla sinisinä tai tumman violetteina ja muut koliformiset bakteerit punaisina pesäkkeinä. Jos kyseessä oli näyte, johon ei ollut lisätty E. coli -bakteeria, alustoja inkuboitiin toinen vuorokausi mikäli ensimmäisen vuorokauden jälkeen alustalla ei ollut tyypillisiä pesäkkeitä. CC-alustalla, johon ei ollut lisätty antibioottia, tyypillisinä kasvaneet pesäkkeet varmistettiin oksidaasi-, kaasunmuodostus-, β-glukuronidaasi- ja indolitesteillä sekä tarvittaessa gramvärjäyksellä (Pitkänen 2010). Clostridium perfringens -bakteerin itiöt määritettiin standardiluonnoksen (ISO/DIS 14189) ISO/CD 6461-2 mukaisesti Tryptoosi-sulfiitti-sykloseriini-agar-kasvualustalla (TSC, Oxoid, Englanti) anaerobisesti. Suodatinkalvo (GN-6 Metricel, Pall Corporation, USA) lämpökäsiteltiin lämpötilassa 60 ºC 15 minuutin ajan ennen alustalle asettamista. Sulfiittia pelkistävät klostridit kasvavat TSC-kasvualustalla mustina pesäkkeinä ja pesäkkeistä varmistettiin C. perfringens-bakteerit hapan-fosfataasitestillä. Suolistoperäiset enterokokit määritettiin standardin SFS-EN ISO 7899-2 mukaisesti käyttäen kalvosuodatusmenetelmää ja Slanetz & Bartley -kasvatusalustaa (Slanetz & Bartley Medium, Oxoid, Englanti). Enterokokit kasvavat alustalla vaaleanpunaisista tummanpunaisiin väriltään olevina pesäkkeinä. Kasvualustoja inkuboitiin lämpötilassa (36 ± 2) °C 40-48 tuntia. Suolistoperäiset enterokokit varmistettiin siirtämällä kalvo sappi-eskuliini-atsidialustalle (Scharlau, Espanja) ja katsomalla mahdollinen tumman värin muodostus alustassa lämpötilassa 44 ºC kahden tunnin kuluttua. 44 4.2.3 Virusten määritys vesinäytteistä F-spesifiset ja somaattiset kolifagit määritettiin näytteen oletetun kolifagilukumäärän mukaan joko kvantitatiivisella kaksikerros- tai yksikerrosmaljausmenetelmällä (US EPA 2001b) tai kvalitatiivisella rikastusmenetelmällä (US EPA 2001a) Kolifagien isäntäbakteerit kasvatettiin log-kasvuvaiheeseen kappaleen 4.2.1 mukaisesti. F-spesifisen kolifagin isäntäbakteeri oli E. coli Famp (ATCC 700891) ja antibiotti ampisilliini/streptomysiini. Somaattisen kolifagin isäntäbakteeri oli E. coli CN-13 (ATCC 700609) ja antibiootti nalidiksiinihappo. Kaksikerrosmaljausmenetelmässä (US EPA 2001b) valettiin menetelmän nimen mukaisesti kaksi kerrosta. Näytteistä tehtiin 1:10 laimennossarja TSB-liemeen haluttuun laimennokseen asti. Ensimmäinen kerros valettiin maljoille sulatetusta 1,5 % tryptoni-soija-agarista (TSA, Oxoid, Englanti), jonka oli annettu temperoitua lämpöhauteessa 46,5 ºC:ssa ennen kuin siihen lisättiin 1 ml antibioottia 100 ml:aa kohden. Valamisen jälkeen maljojen annettiin jähmettyä, minkä jälkeen niitä kuivattiin 15 minuuttia laminaarissa. 0,7 % TSA, joka oli sulatettu, temperoitu 46,5 ºC:ssa ja johon oli lisätty 1 ml antibioottia 100 ml:aa agaria kohden, jaettiin lämpöhauteessa temperoituneisiin koeputkiin siten, että agaria oli 5 ml per koeputki. Maljausvaiheessa jokaiseen koeputkeen lisättiin 100 µl log-kasvuvaiheen isäntäbakteeria ja 500 µl näytettä tai sen laimennosta ja liuos valettiin 1,5 % TSA-maljalle. Maljojen annettiin jähmettyä puoli tuntia, jonka jälkeen niitä inkuboitiin 36 ºC:ssa 16-24 h. Inkuboinnin jälkeen maljoilta laskettiin muodostuneet plakit. Yksikerrosvalumenetelmässä (US EPA 2001b) 100 ml:aan näytevettä lisättiin 0,5 ml magnesiumkloridia (4 M MgCl2). Tämän jälkeen näytevettä pidettiin kahdeksan minuuttia vesihauteessa 36 ºC:ssa, sitten siihen lisättiin 10 ml log-kasvuvaiheen isäntäbakteeria (E. coli Famp F-spesifisille ja E. coli CN-13 somaattisille) ja pidettiin 5 min vesihauteessa 46,5 ºC:ssa. Näytevesi sekoitettiin 100 ml:aan sulatettua ja lämpötilassa 46,5 ºC temperoitua kaksinkertaista TSA:a, johon oli lisätty 2 ml sopivaa antibioottia (A/S tai nalidiksiinihappo). Sekoittamisen jälkeen näytevesiagarliuos valettiin viidelle 14 cm halkaisijaltaan olevalle maljalle. Maljoja inkuboitiin 16-24 tuntia lämpötilassa 36 ºC, minkä jälkeen maljoilta laskettiin muodostuneet plakit. 45 Kaksivaiheisessa rikastusmenetelmässä (US EPA 2001a) 100 ml:aan näytevettä lisättiin 1,25 ml magnesiumkloridia, 0,5 ml log-vaiheen isäntäbakteeria, 5 ml kymmenkertaista tryptonisoijaliemeä (TSB) ja 1 ml antibioottia. Sekoituksen jälkeen näytettä inkubointiin 16-24 tuntia lämpötilassa 36 ºC. 1000 ml:n näytetilavuudesta tehtävässä rikastuksessa näytteeseen lisättiin kymmenkertainen määrä kaikkia reagensseja ja isäntäbakteeria. Inkuboinnin jälkeen näytettä pipetoitiin 16 x 10 µl agarmaljalle, joka sisälsi antibioottia ja isäntäbakteeria, ja inkuboitiin 1624 tuntia lämpötilassa 36 ºC. Inkuboinnin jälkeen maljalta laskettiin, monenko pisaran kohdalle 16 pisarasta oli muodostunut plakki. Norovirusten määrityksessä näyte konsentroitiin joko adsorptio-eluutiomenetelmällä tai PEGsaostuksella. Adsorptio-eluutiomenetelmässä vesinäyte suodatettiin positiivisesti varatun nylonsuodattimen läpi, ja suodattimelta virukset eluoitiin glysiinilihauutepuskuriin, jonka pH oli 9,5. Puskuri jatkokonsentroitiin pienempään tilavuuteen mikrokonsentraattorilla (Vivaspin 2, Vivascience AG, Saksa) (Gilgen ym. 1997). Ultrasuodatusmenetelmällä konsentroidun näytteen jatkokonsentrointina testattiin adsorptio-eluutio-menelmän lisäksi PEG-saostusta, jossa virukset saostuvat erilleen vedestä polyetyleeniglykolin ja sentrifugoinnin avulla (Lewis ja Metcalf 1988). Konsentroidusta näytteestä eristettiin RNA käyttäen kaupallista kittiä (High Pure Viral RNA, Roche Molecular Biochemicals, Saksa) valmistajan ohjeiden mukaan. Eristetty nukleiinihappo säilytettiin lämpötilassa -75 ºC tai alle. Norovirukset määritettiin reaaliaikaisella käänteiskopiointi-polymeraasiketjureaktio -menetelmällä (real-time RT-PCR) (Rotor-Gene 3000 RealTime Thermal Cycler, Qiagen). Noroviruksen genoryhmät GI ja GII määritetään näytteestä erikseen. (Kauppinen ym. 2014) Adenovirusten määritetystä varten näyte konsentroitiin adsorptio-eluutio-menetelmällä, jota käytettiin norovirusten määrityksessä. Adsorptio-eluutio-menetelmällä konsentroidusta näytteestä DNA eristettiin käyttäen kaupallista kiitiä (High Pure Viral Nucleic Acid Kit, Roche Molecular Biochemicals, Saksa) valmistajan ohjeiden mukaan. DNA säilytettiin -75 ºC:ssa tai kylmemmässä. Adenovirukset määritettiin real-time PCR -menetelmällä (Rotor-Gene 3000 RealTime Thermal Cycler, Qiagen) (Kauppinen ym. 2012). 4.2.4 Heterotrofisen pesäkeluvun ja kokonaissolulukumäärän määritys Heterotrofisten mikrobien pesäkelukumäärä määritettiin pintaviljelynä R2A-alustoilla (Difco, Ranska) (Reasoner ja Geldreich 1985) käyttäen seitsemän vuorokauden kasvatusaikaa 22 46 °C:ssa. Kokonaissolulukumäärä määritettiin DAPI-värjäyksellä. Bakteerisolut värjättiin fluoresoivalla DAPI-väriaineella (4’6-diamidino-2-phenylindole, Merck, Saksa) ja solut laskettiin epifluoresenssi-mikroskoopilla (Olympus BX51, Olympus Optical, Japani) (Timberley ja Pepper 2000). DAPI värjää kaikki näytteen nukleiinihapot huolimatta siitä, ovatko ne peräisin näytteessä olevista elävistä vai kuolleista mikrobeista. 4.3 ULTRASUODATUSMENETELMÄN SAANTOKOKEET LABORATORIOOLOSUHTEISSA 4.3.1 Laboratoriokoeasetelmat Koevetenä ensimmäisessä saantokokeessa (Koe I, Taulukko 3) käytettiin Kuopion kaupungin talousvettä, joka valmistetaan pintavedestä tekopohjavesikäsittelyn, saostuksen, flotaation, pikahiekkasuodatuksen ja ja klooridesinfioinin avulla (Kuopion Vesi 2009). Vedestä neutraloitiin kloori lisäämällä näytteeseen 1 ml 18 mg/ml natriumtiosulfaattiliuosta yhtä näytevesilitraa kohden. Muissa saantokokeissa (Kokeet II – VII, Taulukko 3) käytettiin Kuopion Veden Melalahden vedenottamon pohjavettä. Vesi haettiin 30 litran kanistereissa pohjavedenottamolta ennen koetta ja sitä säilytettiin 1-2 vuorokautta lämpötilassa 4 ºC. Vedestä määritettiin absorbanssi spektrofotometrilla (UV-1601 Shimadzu, Japani, aallonpituus 254 nm), pH ja sähkönjohtokyky (Multi 3430, WTW, Saksa), sameus (Turb 555 IR, WTW, Saksa), rauta (DR2800 menetelmä 8008, Hach, USA) heterotrofinen pesäkeluku ja kokonaissolulukumäärä. Ultrasuodatuslaitteisto desinfioitiin ja suodatinpatruuna esikäsiteltiin, kuten kappaleessa 4.1.2 on kuvattu. Suodatus tehtiin kappaleessa 4.1.3 kuvatulla tavalla. Näyte pumpattiin Ecolineletkupumpulla suoraan kanisterista. Taulukossa 3 on esitetty eri kokeissa testatut mikrobit, näytetilavuudet ja mikrobien syöttötapa, testatut suodatukseen vaikuttavat parametrit ja eluointimenetelmä. Kokeissa V, VI ja VII (Taulukko 3) näyteveteen lisättiin NaPP:a kappaleen 4.1.3 mukaisesti. Jokaisen kokeen alussa suodatettiin varsinaisen näytteen tilavuuden verran samaa näytevettä ilman mikrobilisäystä ja konsentraatti otetiin talteen. Suodatinta ei huuhdottu tämän jälkeen ennen varsinaisen näytteen suodatusta. Esisuodatuksella varmistettiin, ettei laitteesta tule kontaminaatiota näytteeseen. Taulukko 3. Saantokokeissa testatut mikrobit, näytetilavuudet, mikrobien jatkuva tai pulssittainen syöttö, testatut suodatukseen vaikuttavat parametrit ja eluointimenetelmä. 47 Koe Mikrobit Näytetilavuus ja mikrobien syöttö 10 litraa jatkuva mikrobien syöttö I MS2- ja ΨX174kolifagit II E. coli III E. coli IV MS2- ja ΨX174kolifagit 30 litraa, jatkuva mikrobien syöttö V, VI, VII MS2- ja ΨX174kolifagit, E. coli 30 litraa, jatkuva mikrobien syöttö 26 litraa, mikrobien syöttö 4,7 litran pulssina 23 litraa, mikrobien syöttö 4,7 litran pulssina Testattavat asiat Eluointimenetelmä -Paineen vaikutus suodatusnopeuteen -Virtaus suodattimella alhaalta ylöspäin -Virtaus suodattimella alhaalta ylöspäin Eluentti kerran läpi filtraattipään ollessa auki -Filtraattiletkujen määrä -Suodattimen asennon vaikutus suodatusnopeuteen Neljä eluointia: 1. Eluentti kerran läpi filtraattipäiden ollessa auki. 2. 500 ml filtraattia kerran läpi filtraattipäiden ollessa auki. 3. Eluentti kerran läpi filtraattipäiden ollessa kiinni, suodatin pyörittäjälle 40 min, jonka jälkeen pumppaus tyhjäksi. 4. 200 ml eluointiliuosta läpi filtraattipäät kiinni, suodatin pyörittäjällä tunnin, jonka jälkeen 300 ml eluenttia läpi Kaksi eluointia: 1. 200 ml eluenttia läpi, pumppu pysäytettiin ja suodatinta käänneltiin, minkä jälkeen 300 ml eluenttia läpi. 2. Kuten 4. eluointi kokeessa III -Suodattimen kääntely ja paineen lasku 0,2 baariin suodatuksen aikana -Suodatin vaakatasossa -Paineiskut -Suodattimen kääntely ja paineen lasku 0,2 baariin suodatuksen aikana -Virtaus suodattimella ylhäältä alaspäin -NaPP-lisäys näyteveteen Eluentti kerran läpi filtraattipään ollessa auki Kolme eluointia: 1. Konsentraattiin sekoitettiin eluenttia 1:9 ja kierrätettiin laitteistossa 5 min filtraattipäät kiinni. (Polaczyk ym. 2008) 2. 500 ml eluenttia kierrätettiin filtraattipäät auki, kunnes tilavuus 300 ml. 3. Kuten 4. eluointi kokeessa III E. coli -bakteeriliuos valmistettiin kappaleen 4.2.1 mukaisesti ja valmistettua liuosta laimennettiin testiveteen siten, että sen absorbanssilukema aallonpituudella 420 nm oli 0,300 0,320. Tämä absorbanssilukema vastasi E. coli -lukumäärää noin 2 x 108 pmy/ml. Laimennetusta liuoksesta tehtiin testiveteen vielä satakertainen laimennos, jota lisättiin konsentroitavaan testivesitilavuuteen 1 ml eli tavoitelukumäärä oli noin 2 x 106 pmy. F- 48 spesifisten kolifagien (MS2) liuos valmistettiin kappaleen 4.2.2 mukaisesti. Liuoksen TSBliemeen laimennettua satakertaista laimennosta lisättiin 100 µl näyteveteen kokeissa I ja IVVII (Taulukko 3). Somaattiset kolifagit (ΨX174) lisättiin samalla tavalla, poikkeuksena kokeet VI ja VII, joissa somaattisten kolifagien laimennosta lisättiin näyteveteen 1 ml eli kymmenen kertaa suurempi lukumäärä kuin kokeissa I - V. Norovirusliuos valmistettiin kappaleen 4.2.2 mukaisesti ja sitä lisättiin 80 µl 30 litran testivesikanisteriin. Osassa kokeista mikrobit lisättiin koko näytetilavuuteen, jolloin niiden syöttö ultrakonsentraattorille oli jatkuvaa. Osassa kokeista 30 litran kanisterista otettiin viisi litraa eri kanisteriin ennen mikrobien lisäystä. Mikrobit lisättiin viiteen litraan, joka syötettiin pulssina konsentroinnin välissä, kun 10 litraa mikrobeilla ymppäämätöntä näytevettä oli konsentroitu. Kokeiden testimikrobit ja näyteveden luontaisesti sisältämät mikrobit ymppäämättömästä näytevedestä ultrasuodatuslaitteistolle ja syötetystä sen ultrasuodatetusta mikrobeilla ympätystä määritettiin konsentraatista, näytevedestä ja sen ultrasuodatetusta konsentraatista, ultrasuodattimen eluointiliuoksista, joilla suodatin oli lopuksi huuhdottu ja suodattuneesta vedestä eli filtraatista. Konsentraatti ja eluaatit jaettiin eri mikrobien määritysmenetelmiin huomioiden eri menetelmiin liittyvät näytetilavuustarpeet. E. coli -bakteeri ja koliformiset bakteerit määritettiin kappaleen 4.2.2 mukaisesti CC-alustalla ilman antibioottia. Ymppäämätön näytevesi ja sen ultrasuodatettu konsentraatti ja suodattunut vesi eli filtraatti analysoitiin vain kalvosuodatusmenetelmällä, koska niissä ei oletettu olevan koliformisia bakteereita. F-spesifiset kolifagit ja somaattiset kolifagit määritettiin kaksikerrosmaljausmenetelmällä, joka on kuvattu kappaleessa 4.2.3. Norovirus määritettiin kappaleen 4.2.3 mukaisesti PEG-saostusta käyttäen. Heterotrofinen pesäkeluku ja kokonaissolulukumäärä määritettiin kappaleen 4.2.4 mukaisesti. Saantokokeissa mikrobiympin syöttöä, suodatuksen kulkua ja eluointia muutettiin parhaimpien suodatusolosuhteiden mikrobisaanto löytämiseksi. mahdollisimman Tavoitteena hyvällä oli saada suodatusnopeudella. mahdollisemman Kokeissa suuri seurattiin suodatusnopeutta ja painetta. Suodatusnopeutta mitattiin sekuntikellon ja mittalasin avulla. Ensimmäisessä kokeessa tutkittiin paineen vaikutusta virtaamaan muuttamalla painetta kiristimellä. Lopuissa kokeista paine säädettiin noin 0,9 baariin. Pumpun nopeuden vaikutusta paineeseen ja suodatusnopeuteen tutkittiin kokeissa I - III (Taulukko 3). Pumppausnopeus oli noin 1700 – 2720 ml/min. Kokeissa IV - VII pumppu oli puoliteholla, jolloin pumppausvirtaus oli noin 1700 ml/min. Eluointi tehtiin laitteistossa pumppaamalla 500 ml:a eluointiliuosta 49 suodatinkuitujen suuntaisesti suodatinpatruunan läpi ilman kiristimellä luotua painetta, ellei toisin mainita. Koe V toistettiin kaksi kertaa (kokeet VI ja VII). Kokeessa VII mukana oli myös norovirusten saantotestaus. Keskimääräinen suodatusnopeus laskettiin jakamalla koko suodatettu näytetilavuus suodatukseen kuluneella ajalla. Näytteiden mikrobilukumäärät laskettiin kertomalla määritetty mikrobilukumäärä näytteen tilavuudella. Lisättyjen mikrobien saantoprosentti laskettiin jakamalla konsentraatin mikrobilukumäärä ultrasuodatuslaitteistolle syötetyn testimikrobeja sisältävän näytteen mikrobilukumäärällä ja kerrottiin sadalla. Eluointien saannot laskettiin samalla tavalla. Heterotrofisen pesäkeluvun ja kokonaissolulukumäärän saannot laskettiin eri tavalla kuin ympättyjen mikrobien saannot, koska näytevedet sisälsivät luonnostaan mikrobeja. Mikrobilukumäärät laskettiin yhteen konsentroimattoman nollanäytteen tilavuudesta ja varsinaisen näytteen tilavuudesta ja saadusta summasta vähennettiin konsentroidun nollanäytteen mikrobilukumäärä. Näin saatiin suodatuslaitteistolle syötetty lukumäärä, jota verrattiin ultrasuodatusmenetelmällä saatuun lukumäärään. 4.4 KOE PILOT-MITTAKAAVAN VESILAITOKSELLA Ultrasuodatusmenetelmää testattiin pilot-mittakaavan vesilaitoksella. Pilot-laitoksen vesi valmistettiin pintavedestä, joka puhdistettiin koagulaatio-, flotaatio- ja pikahiekkasuodatusmenetelmillä, ja puhdistetun veden pH säädettiin kalkin avulla. Kokeen aikana järjestelmän UV-desinfiointi oli pois päältä ja kloorin syöttö siirrettiin siten, että desinfiointi tapahtui vasta ultrasuodatuslaitteiston näytteenottokohdan jälkeen. E. coli -bakteeria ja F-spesifisiä kolifageja lisättiin järjestelmän veteen pikahiekkasuodattimen jälkeen ennen pH:n säätöä. E. coli -bakteeriliuos valmistettiin kuten kappaleessa 4.2.1 on kuvattu ja liuosta laimennettiin pilot-laitoksen veteen siten, että liuoksen absorbanssilukema aallonpituudella 420 nm oli 0,300-0,320 (vastasi noin lukumäärää 2 x 108 pmy/ml). Laimennetusta liuoksesta tehtiin laimennossarja ja tuhatkertaista laimennosta lisättiin 2,5 ml viiteen litraan pilot-laitoksen vettä. F-spesifisiä kolifageja lisättiin käyttämällä samaa fagiliuosta kuin saantokokeissa (ks. kappale 4.2.1). Liuoksesta tehtiin tuhatkertainen laimennos TSB-liemeen ja tätä laimennosta lisättiin 1 ml samaan viiden litran kanisteriin, johon E. coli bakteeri oli lisätty. Sekoittamisen jälkeen viiden litran vesimäärä sekoitettiin 15 litraan pilotlaitoksen vettä, jolloin kokonaistilavuudeksi tuli 20 litraa. 50 Pilot-laitoksen tuottaman veden konsentrointi ultrasuodatusmenetelmällä ja mikrobien syöttö pilot-laitosjärjestelmään aloitettiin samanaikaisesti. Ultrasuodatuslaitteisto otti konsentroitavaksi osan pilot-laitoksen tuottamasta vedestä ja suurin osa vedestä kulki ultrasuodatuslaitteiston ohi astiaan, jossa vesi desinfioitiin kloorilla ennen viemäriin pumppausta. Mikrobeja syötettiin järjestelmään 20 tuntia. Näytteen ultrasuodatusta jatkettiin neljä tuntia mikrobien syöttämisen lopetuksen jälkeen eli ultrasuodatus kesti yhteensä 24 tuntia. Ultrasuodatus tehtiin kappaleen 4.1.3 mukaisesti. Näyte pumpattiin laitteiston pumpulla eikä paineenalennusventtiiiliä käytetty. Näyteveteen ei lisätty NaPP:a. Paine säädettiin noin 0,9 baariin. Vesi virtasi 45 asteen kulmassa olevan suodatinpatruunan läpi ylhäältä alaspäin. Suodatuksen jälkeen suodatinpatruuna huuhdottiin kaksi kertaa. Ensimmäisessä huuhtomisessa konsentraatin tilavuus mitattiin ja siihen sekoitettiin konsentraattisäiliössä eluointiliuosta suhteessa 1 osa eluointiliuosta ja 9 osaa konsentraattia. Konsentraattieluenttiliuosta kierrätettiin laitteistossa kiristin auki suodattuneen veden ulostuloaukot kiinni viisi minuuttia nopeudella 50. (Polaczyk 2008) Viiden minuutin jälkeen pumpun nopeus laskettiin 20:een ja konsentraattisäiliöstä liuosta imevä letku nostettiin pinnankorkeuden yläpuolelle, jolloin liuos tyhjeni letkuista ja osittain suodatinpatruunasta konsentraattisäiliöön. Konsentraattieluaattiliuoksen tilavuus mitattiin ja se otettiin talteen näytepulloon. Toinen huuhtominen tehtiin samalla tavalla, mutta konsentraattieluaattiliuoksen tilalle konsentraattisäiliöön kaadettiin 500 ml:aa eluointiliuosta. Toisen huuhtomisen jälkeen eluointiliuoksen tilavuus mitattiin ja se kaadettiin toiseen näytepulloon. Konsentraattieluaattiliuos ja 500 ml:n eluaattiliuos sekoitettiin yhteen ja jaettiin eri mikrobien määritysmenetelmiin huomioiden eri menetelmiin liittyvät näytetilavuustarpeet. Ultrasuodatuksen aikana otettiin osanäytteitä pulloihin pilot-laitoksen veteen syötetystä mikrobiympistä, pilot-laitoksen vedestä ennen mikrobin syötön aloitusta, mikrobien syötön aikana kolmena eri ajankohtana ja mikrobien syötön loputtua astiasta, josta ultrasuodatuslaitteisto pumppasi veden. Yksi näyte mikrobien syötön aikana otettiin myös hanasta, joka oli välittömästi mikrobien syöttöpisteen jälkeen ennen pH:n säätöä. Näytteistä E. coli -bakteeri määritettiin kappaleen 4.2.2 mukaisesti käyttäen CC-alustaa, johon oli lisätty antibioottia. F-spesifiset kolifagit määritettiin kappaleen 4.2.3 mukaisesti 100 ml:n kvantitatiivisella menetelmällä. 51 4.5 ULTRASUODATUSMENETELMÄN TESTAUS KENTTÄOLOSUHTEISSA Ultrasuodatusta kokeiltiin myös kenttäolosuhteissa, jolloin testattiin sitä miten järjestelmä toimii todellisissa tilanteissa ja miten sen avulla kyetään havaitsemaan talousvedessä mahdollisesti pieninä pitoisuuksina olevat mikrobit. Testauksessa näyteveteen ei lisätty mikrobeja. Ultrasuodatuskokeita tehtiin pohjavedellä, esikäsitellyllä pintavedellä ja verkostovedellä. Ultrasuodatuslaitteisto desinfioitiin ja suodatin esikäsiteltiin, kuten on kuvattu kappaleessa 4.1.2. Poikkeuksena verkostovesinäyte, jonka kohdalla suodatinpatruuna oli esikäsittelyvaiheessa pyörittäjällä vain kolme tuntia. Laboratoriossa tehdyn esikäsittelyn ja suodatuksen aloituksen välillä kului yli tunti aikaa välimatkojen vuoksi. Suodatin huuhdottiin kentällä steriilillä vedellä Ecoline-letkupumpulla puoliteholla ennen suodatuksen aloitusta korkeintaan yhdeksän tuntia esikäsittelyn jälkeen. Suodatus ja suodatinpatruunan huuhtelu suodatuksen lopuksi tehtiin samalla tavalla kuin Pilot-mittakaavan vesilaitoksella. Suodatus on kuvattu kappaleessa 4.1.3 ja suodatinpatruunan huuhtelu kappaleessa 4.4. Kokeiden ultrasuodatusmenetelmällä kerättyjen näytteiden tilavuudet, suodatusajat, mahdollinen NaPPlisäys ja määritetyt mikrobit on esitetty Taulukossa 4. Konsentraattieluaattiliuos jaettiin tasaisesti eri mikrobien määritysmenetelmiin huomioiden eri menetelmiin liittyvät näytetilavuustarpeet. Näytevettä otettiin ultrasuodatuksen lisäksi kanistereihin. Mikrobit määritettiin kanistereista ja ultrasuodatetusta näytteestä kappaleessa 4.2 kuvatuilla menetelmillä ja kanisterinäytteiden tuloksia verrattiin ultrasuodatusmenetelmällä otettujen näytteiden tuloksiin. Bakteerit määritettiin kappaleen 4.2.2 mukaisesti. Esikäsitellystä vedestä (Kokeet 1 ja 2, Taulukko 4) E. coli -bakteeri ja koliformiset bakteerit määritettiin käyttäen CC-kasvualustoja sekä antibiootin kanssa että ilman, sekä suodattamalla ja pintalevitysmenetelmällä. määritettiin vain Muissa kokeissa E. coli -bakteeri ja koliformiset bakteerit kalvosuodatusmenetelmällä CC-alustalla ilman antibiottia. Kalvosuodatusmenetelmällä kanisterinäytteistä pyrittiin suodattamaan mahdollisimman suuri useiden litrojen näytetilavuus bakteerien havaitsemiseksi. Kanisterinäytteiden koliformisia bakteereita määritettäessä myös pienempiä tilavuuksia suodatettiin kalvosuodatusmenetelmällä. F-spesifiset kolifagit määritettiin 100 ml:n kvantitatiivisella menetelmällä, joka on kuvattu kappaleessa 4.2.3. Lisäksi kolifageja määritettiin kanisteriin otetuista näytteistä kaksivaiheisella rikastusmenetelmällä, kuten on kuvattu kappaleessa 4.2.3. Noro- ja adenovirukset määritettiin kuten kappaleessa 4.2.3 on kuvattu. Näytteiden konsentrointimenetelmänä käytettiin adsorptio-eluutio-menetelmää. Esikäsitellyn pohjaveden 52 ultrasuodatusnäytteestä (Koe 4, Taulukko 4) tehtiin myös erikseen jatkokonsentrointi PEGsaostuksella. Taulukko 4. Kenttäkokeiden suodatustavoite, natriumpolyfosfaatti (NaPP) -lisäys ja vedestä määritetyt mikrobit. Näytevesi 1 Esikäsitelty pintavesi 2 Esikäsitelty pintavesi 3 Käsittelemätön pohjavesi 4 Esikäsitelty pohjavesi Tavoite Yön yli suodatus NaPP-lisäys Syöttö ennen letkupumppua Yön yli suodatus Syöttö letkupumpun jälkeen Yön yli suodatus Ei lisätty veteen Yön yli suodatus Syöttö letkupumpun jälkeen Suuren Ei lisätty tilavuuden veteen suodatus vesiepidemia -tilanteessa 5 Saastunut verkostovesi Tutkitut mikrobit E. coli, koliformiset bakteerit, C. perfringen, norovirus, adenovirus, kolifagit, heterotrofinen pesäkeluku, kokonaissolulukumäärä E. coli, koliformiset bakteerit, C. perfringen, adenovirus, kolifagit, heterotrofinen pesäkeluku, kokonaissolulukumäärä E. coli, koliformiset bakteerit, kolifagit, heterotrofinen pesäkeluku, kokonaissolulukumäärä E. coli, koliformiset bakteerit, suolistoperäiset enterokokit, C. perfringen, norovirus, kolifagit heterotrofinen pesäkeluku, kokonaissolulukumäärä E. coli, koliformiset bakteerit, norovirus, kolifagit 4.5.1 Testaus esikäsitellyllä pintavedellä Esikäsitellyn pintaveden suodatusta testattiin Turun Seudun Veden raakaveden esikäsittelylaitoksella. Testivesi oli esikäsiteltyä jokivettä. Veden esikäsittely koostui rumpusuotimilla siivilöinnistä ja kemiallisesta saostuksesta yhdistettynä kontaktisuodatukseen hiekkasuotimissa. Näyte otettiin paineellisesta hanasta, jolloin käytettiin paineenalennusventtiiliä. Kokeessa 1 hanan ja paineenalennusventtiilin välissä oli kiristimillä kiinnitetty muoviletku ja kokeessa 2 korkeaa painetta kestävä letku kiinnitettiin hanaan ja paineenalennusventtiiliin kierreliittimillä. NaPP-liuoksen syöttöletku oli kokeessa 1 liitetty ultrasuodatuslaitteiston letkuun ennen letkupumppua ja kokeessa 2 pumpun jälkeen, kuten kerrottu kappaleessa 4.1.3. 53 4.5.2 Testaukset pohjavedenottamoilla Käsittelemättömän pohjaveden suodatusta testattiin Kuopion Veden Melalahden harjupohjavedenottamolla. Ultrauodatuksessa näyte otettiin hanasta, jossa paine oli alle 1,2 baaria. Kokeessa käytettiin paineenalennusventtiiliä. Toinen suodatus tehtiin Siilinjärven Koivuniemen harjupohjavedenottamolla. Harjupohjavedestä oli hiekkasuodatusmenetelmällä poistettu rautaa ja mangaania. Näyte otettiin paineettomasta hanasta ilman paineenalennusventtiiliä. 4.5.3 Testaus verkostovedellä vesiepidemiatilanteessa Verkostovesinäyte suodatettiin tilanteessa, jossa verkostoveden epäiltiin saastuneen ja aiheuttaneen epidemian Siilinjärven Vuorelassa (Jalava ym. 2014). Vuorelaan vesi tulee Jälänniemen vedenottamolta. Verkostovettä laskettiin hanasta väliastiaan, josta se pumpattiin ultrasuodatuslaitteistoon. Näytevettä suodatettiin vain vajaan viiden tunnin ajan, koska laitetta ei voitu jättää näytteenottotilaan valvomatta. Näytteenottohetkellä oli myös alkamassa verkostoveden tehostettu klooridesinifointi, joka olisi voinut haitata mikrobien havaitsemista, mikäli näytteen keräämistä olisi jatkettu pidempään. Konsentraattiin lisättiin laboratoriossa natriumtiosulfaattia (katso 4.3.1) veden mahdollisesti sisältämän kloorin neutraloimiseksi. 54 5 TULOKSET 5.1 SUODATUSNOPEUDEN TESTAUS LABORATORIO-OLOSUHTEISSA Saantokokeissa II-VII (Taulukko 3) käytetyn pohjaveden fysikaaliset ja kemialliset ominaisuudet sekä heterotrofinen pesäkeluku ja kokonaismikrobilukumäärä on esitetty Taulukossa 5. Taulukko 5. Saantokokeissa käytetyn pohjaveden fysikaalis-kemialliset ominaisuudet ja heterotrofinen pesäkeluku ja kokonaissolulukumäärä. SähkönSameus pH Abs. Rauta HeteroKokonaissolujohtokyky (NTU) 254nm (mg/l) (µS/cm) trofiset lukumäärä mikrobit (solua/ml) (pmy/ml) Keskiarvo Vaihteluväli Mittausten lukumäärä 107 101 - 112 4 0,03 6,6 0,023 0,03 0,01- 6,2- 0,0167- 0,01- 0,10 7,4 0,0273 0,07 5 5 4 4 660 40- 1840 5 21 000 6 10041 000 5 Laboratoriossa tehdyssä kokeessa I painetta ja suodatusnopeutta vaihdeltiin siten, että ne olivat korkeintaan 0,9 baaria ja 800 ml/min. Muissa kokeissa paine vaihteli välillä 0,7–1,2 baaria ja mitattu suodatusnopeus välillä 660–1200 ml/min. Taulukossa 6 on esitetty jokaisen kokeen suodatustilavuus ja -aika ja keskimääräinen ja mitattu suodatusnopeus. Suodatusnopeus ja paine vaihtelivat suodatuksen aikana joka kokeessa. Kokeiden laskennallinen suodatusnopeus eli suodatetun näytteen tilavuus jaettuna kokonaissuodatusajalla vaihteli välillä 510–770 ml/min. Vesi suodattui sitä nopeammin, mitä korkeampi paine oli. Paine muuttui suodatuksen eri vaiheissa siten, että se kävi korkealla, kun laitteisto vaihtoi vedenoton konsentraattiastiasta konsentroimattoman veden ottoon tai toisin päin. Silloin myös veteen sekoittui ilmaa. Kun laite otti uutta näytevettä, paine oli alhaisempi ja nousi, kun laite alkoi kierrättää konsentroitua vettä. Kiristimellä aiheutettu paine nousi, kun pumppausnopeutta nostettiin. Painetta ei voinut tarkasti säätää yhteen lukuun. 0,5 baarin paineen nousu saattoi lähes kaksinkertaistaa suodatusnopeuden 660:sta 1200:aan ml/min. Pumppausnopeutta voitiin vaihtaa suodatusnopeuden muuttumatta, kun paine pidettiin kiristimen avulla vakiona. Vesi ei suodattunut suodattimen läpi ilman 55 kiristimellä luotua painetta, kun pumppu pumppasi puoliteholla eli valmistajan mukaan noin 1700 ml/min. Taulukko 6. Saantokokeiden näytetilavuudet, suodatusajat ja laskennalliset ja mitatut suodatusnopeudet. Näytetilavuu Laskennallinen Suodatusaika Mitattu suodatusnopeus Koe s suodatusnopeus (min) (ml/min) (litraa) (ml/min) I 10,0 Ei tietoa Ei voi laskea 240-800 II 30,4 47 550 1200 III 27,8 45 510 860 IV 30,0 49 610 660 V 30,1 54 560 750-1050 VI 30,4 40 750 930 VII 30,0 39 770 960-990 5.2 SAANTOKOKEET Saantokokeissa selvitettiin eri ultrasuodatus- ja eluointimenetelmien vaikutusta mikrobisaantoihin. Koe V toistettiin kaksi kertaa (Kokeet VI ja VII, Taulukko 3, kappale 4.3.1) koetuloksen uusittavuuden testaamiseksi. Konsentraatin tilavuus oli 280-350 ml ja eluoinnista saadun liuoksen tilavuus 500 ml lukuunottamatta kokeiden V-VII ensimmäistä eluointia, jossa käytettiin konsentraattieluenttiliuosta huuhteluun, ja toista eluointia, jossa eluentin tilavuus laski suodattumalla 300 ml:aan (Taulukko 3). Ultrasuodatuslaitteiston puhdistuskäsittelyjen toimivuus testattiin suodattamalla sillä kokeen aluksi mikrobeilla ymppäämätöntä testivettä, josta ei todettu kokeissa tutkittuja mikrobeja. Klooriliuoksen huuhtelun riittävyyden testaamiseksi huuhteluvedestä mitattiin kerran klooripitoisuus, joka oli sidotun kloorin osalta 0,04 mg/l ja vapaan kloorin osalta 0,00 mg/l. Taulukossa 7 on saantokokeissa veteen lisättyjen mikrobien lukumäärät, havaitut mikrobilukumäärät konsentraatissa, ensimmäisessä ja toisessa eluoinnissa ja eluointien jälkeiset saannot. R2A ja DAPI -menetelmillä määritetyt kokonaismikrobilukumäärät sisältävät testivedessä luonnostaan olleet ja lisätyt bakteerit. Kokeissa I-IV (Taulukko 7), joissa konsentraatin ja ensimmäisen eluoinnin mikrobilukumäärät määritettiin erikseen, useimpien saantotulosten kohdalla eluoinnin saanto oli suurempi kuin konsentraatin. Kaikissa kokeissa yhden eluoinnin jälkeen E. coli -bakteerin saanto oli 10-71 %, F-spesifisten kolifagien saanto 14-19 % ja somaattisten kolifagien saanto 16-42 %, ja yhdessä kokeessa norovirukselle saanto 56 oli 5 % (Taulukko 7). R2A-menetelmän heterotrofisten mikrobien pesäkelukumäärän saanto oli 8-68 % ja DAPI-menetelmän kokonaissolulukumäärän saanto 8-84 %. Toinen ja kolmas eluointi lisäsi E. coli -bakteerin saantoa 9-15 %, F-spesifisten kolifagien saantoa 3-25 % ja somaattisten kolifagien saantoa 4-9 %. Kerran testattu neljäs eluointi (Koe III, Taulukko 3) lisäsi E. coli -bakteerin saantoa 18 %. Noroviruksen osalta kokonaissaanto kahden eluoinnin jälkeen oli vain 5 %, mutta kolmannen eluoinnin jälkeen 24 %. Kuvassa 4 on kolmen toistetun kokeen saannot esitetty erikseen eri eluointikerroilta. R2A ja DAPI -menetelmien saantotulokset vaihtelivat suhteessa E. coli -bakteerin ja kolifagien saantotuloksiin. Osassa kokeista niiden saanto on parempi ja osassa huonompi kuin E. coli -bakteerin ja kolifagien saanto. 100 90 80 Saanto (%) 70 3. eluointi 60 2. eluointi 50 Konsentraatti + 1. eluointi 40 30 20 10 0 V VI VII E. coli V VI VII MS2 VII V VI VII Norovirus ѰX174 Kuva 4. E. coli -bakteerin, F-spesifisten kolifagien (MS2), somaattisten kolifagien (ΨX174) ja norovirusten saannot prosentteina konsentraatista ja ensimmäisestä eluoinnista yhteensä, toisesta eluoinnista ja kolmannesta eluoinnista kolmessa toistetussa kokeessa. 57 Taulukko 7. E. coli -bakteerin, F-spesifisten kolifagien (MS2), somaattisten kolifagien (ΨX174), norovirusten, heterotrofisen pesäkeluvun (R2A) ja kokonaissolulukumäärän (DAPI) saannot konsentraatista (kons.), ensimmäisestä ja toisesta eluoinnista. Mikrobilukumäärä (pmy/pfu/GC) Kons.+1. Kons.+1. Kons. + Kons. + Mikrobit Lisätty 1. eluointi eluointi 2. eluoinnit eluoinnit kokeittain veteen* Kons. eluointi yhteensä yht. (%) eluointi yhteensä yht. (%) I 1,1E+06 2,6E+04 1,6E+04 4,2E+04 4 Ei tehty MS2 8,2E+04 3,4E+03 2,4E+04 2,8E+04 34 Ei tehty ΨX174 3,8E+06 8,8E+05 1,0E+06 1,9E+06 49 Ei tehty R2A II 1,2E+06 9,3E+04 2,9E+04 1,2E+05 10 Ei tehty E. coli 5,0E+07 2,7E+07 6,8E+06 3,4E+07 68 Ei tehty R2A 1,9E+09 2,2E+08 1,7E+08 3,9E+08 20 Ei tehty DAPI III 1,4E+06 1,2E+05 1,7E+05 2,8E+05 20 1,3E+05 4,2E+05 30 E. coli 8,7E+07 3,3E+06 3,4E+06 6,7E+06 8 6,0E+06 1,3E+07 15 R2A 4,7E+08 1,3E+07 1,6E+08 1,8E+08 37 1,4E+08 3,2E+08 67 DAPI IV 1,4E+07 4,7E+05 1,6E+06 2,1E+06 16 3,5E+06 5,6E+06 41 MS2 1,2E+05 1,8E+04 3,2E+04 5,0E+04 42 1,1E+04 6,0E+04 50 ΨX174 2,1E+06 3,3E+05 2,1E+05 5,3E+05 26 1,2E+05 6,6E+05 31 R2A 6,6E+08 7,3E+07 1,8E+08 2,5E+08 38 5,0E+08 7,6E+08 >100 DAPI V 9,3E+05 6,7E+05 6,7E+05 71 1,3E+05 7,9E+05 85 E. coli 4,4E+07 8,1E+06 8,1E+06 19 1,7E+06 9,8E+06 22 MS2 2,4E+05 4,0E+04 4,0E+04 16 8,4E+03 4,8E+04 20 ΨX174 6,8E+06 2,5E+06 2,5E+06 37 4,0E+05 2,9E+06 43 R2A 3,2E+08 2,7E+08 2,7E+08 84 1,6E+09 1,9E+09 >100 DAPI VI 1,4E+06 3,5E+05 3,5E+05 26 1,4E+05 4,9E+05 36 E. coli 3,5E+07 4,1E+06 4,1E+06 12 1,8E+06 5,9E+06 17 MS2 1,2E+06 2,3E+05 2,3E+05 19 9,0E+04 3,2E+05 27 ΨX174 9,4E+06 1,7E+06 1,7E+06 18 4,6E+05 2,2E+06 23 R2A 2,4E+09 1,9E+08 1,9E+08 8 1,9E+08 3,8E+08 16 DAPI VII 1,0E+06 4,0E+05 4,0E+05 39 1,5E+05 5,5E+05 54 E. coli 4,7E+07 5,7E+06 5,7E+06 12 1,5E+06 7,2E+06 15 MS2 1,2E+06 2,0E+05 2,0E+05 16 6,0E+04 2,6E+05 20 ΨX174 6,6E+06 6,6E+06 5 6,6E+05 7,3E+06 5 Norovirus 1,4E+08 1,1E+07 1,6E+06 1,6E+06 15 5,7E+05 2,1E+06 20 R2A 2,5E+09 2,2E+08 2,2E+08 9 1,9E+08 4,0E+08 16 DAPI *R2A ja DAPI; kokonaismikrobilukumäärät sisältäen testiveden luontaiset ja lisätyt bakteerit. 58 5.3 KOE PILOT-MITTAKAAVAN VESILAITOKSELLA Kokeessa pilot-mittakaavan laitoksella suodatettiin 24 tunnin aikana 1436 litraa vettä. Paine oli 0,9–1,1 baaria ja keskimääräinen suodatusnopeus 997 ml/min. Nopeus vaihteli välillä 800-1200 ml/min. Pilot-laitos tuotti vettä 22 650 litraa eli ultrasuodatuksen näytemäärä oli noin 6 % vuorokauden aikana tuotetusta kokonaisvesimäärästä. Pilot-laitosjärjestelmään syötetyn 20 litran mikrobiliuoksen E. coli -bakteerien lukumäärä oli 14 000 pmy/l ja F-spesifisten kolifagien 374 000 pfu/l. Mikrobeilla ympätyn pilot-laitoksen veden mikrobilukumääriä tutkittiin ultrasuodatusmenetelmällä ja pulloon otetuista näytteistä ilman ultrasuodatusta. Pulloihin näytteitä otettiin ultrasuodatuksen ja mikrobien syötön aikana kolmena eri ajankohtana, jolloin vedessä oli E. coli -bakteereita 7 pmy/l, 5 pmy/l ja 3 pmy/l ja kolifageja 200 pfu/l, 190 pfu/l ja 270 pfu/l. Mikrobien syöttökohdan jälkeen olleessa näytteenottopisteessa E. coli -bakteerien lukumäärä oli 4 pmy/l ja kolifagien lukumäärä 40 pfu/l hetkellä, jolloin mikrobien syöttö lopetettiin. Ultrasuodatuksen konsentraatin ja eluentin yhteistilavuus oli 845 ml ja sen E. coli bakteerien lukumäärä oli 220 pmy, joka litraa kohden laskettuna on 260 pmy/l. Konsentraatin F-spesifisten kolifagien lukumäärä konsentraatissa oli 21 000 pfu ja litraa kohden laskettuna 25 000 pfu/l. Suodatinpatruuna värjäytyi konsentroinnin aikana oranssin ruskeaksi ja konsentraatin sameus oli 11 NTU. Pilot-laitoksen veden sameus ei ole tiedossa. Veden rautapitoisuus oli 0,06 mg/l ja konsentraatin 5,10 mg/l. 5.4 KENTTÄKOKEET Kenttäkokeissa testattiin laitteen toimivuutta kenttäolosuhteissa, näyteveden suodatusnopeutta, suolistoperäisten mikrobien esiintymistä vesissä ja mikrobisaantoja verrattuna laboratoriossa käytettyihin rutiinimenetelmiin suuresta tilavuudesta. Taulukossa 9 on kokeiden näytevesien fysikaaliskemialliset ominaisuudet. Taulukossa 10 on kokeiden suodatustilavuudet, -ajat, niiden mukaan lasketut suodatusnopeudet ja natriumpolyfosfaatin lisäykset. Laitteella saatiin suodatettua yli tuhat litraa alle vuorokaudessa. Laitteisto konsentroi veden ilman valvontaa automaattisesti käynnistyksen jälkeen. Kenttäkokeessa 1 (Taulukko 10) esikäsitellyn veden suodatuksen nopeutta ei voi laskea, koska näytevettä ottava letku rikkoutui liian kovan paineen vuoksi, eikä rikkoutumisaikaa tiedetä. Letku korvattiin painetta kestävällä letkulla toista suodatusta varten. Keskimääräinen suodatusnopeus 570 ml/min oli pienin kokeessa 4 esikäsitellyn pohjaveden suodatuksessa (Taulukko 10). Kolmessa muussa kokeessa (Kokeet 35, Taulukko 10) keskimääräinen suodatusnopeus oli 780-850 ml/min. 59 NaPP:n syöttö oli hieman alle tavoitellun 0,01 % (w/v) kokeissa 1, 2 ja 4 (Taulukko 10), joissa sitä syötettiin näyteveteen. Esikäsitellyn veden ensimmäisessä kokeessa (Koe 1, Taulukko 10) tasainen pumppaus ei onnistunut, koska letkupumppu häiritsi sen edellä olevan NaPP:n annostelupumpun toimintaa. Myöhemmissä kokeissa annostelupumppu liitettiin laitteistoon virtaussuunnassa letkupumpun jälkeen. Taulukko 9. Kenttäkokeiden näytevesien fysikaalis-kemialliset ominaisuudet. Näytevesi 1 Esikäsitelty pintavesi 2 Esikäsitelty pintavesi 3 Käsittelemätön pohjavesi 4 Esikäsitelty pohjavesi 5 Saastunut verkostovesi Sähkönjohtokyky Sameus (µS/cm) (NTU) pH Abs Rauta 254 nm (mg/l) 84,4 0,15 6,3 0,484 0,01 81,0 0,11 6,8 0,480 0,01 108,8 0,01 6,3 0,025 Ei tiedossa 382 0,01 8,2 Ei tiedossa 0,02 Ei tiedossa 0,09 Ei tiedossa 0,115 Ei tiedossa Taulukko 10. Kenttäkokeiden suodatustilavuudet, -ajat, laskennalliset suodatusnopeudet ja natriumpolyfosfaatti (NaPP) -lisäys. Näytevesi Suodatustilavuus Suodatusaika (litraa) 1 Esikäsitelty pintavesi 2 Esikäsitelty pintavesi 3 Käsittelemätön pohjavesi 4 Esikäsitelty pohjavesi 5 Saastunut verkostovesi Suodatusnopeus NaPP-lisäys (ml/min) 329 Ei tiedossa Ei tiedossa 0,04 %, syöttö epätasainen 1070 21 h 850 0,009 % 988 21 h 5 min 780 Ei lisätty 807 23 h 44 min 570 0,005 % 236 4 h 55 min 800 Ei lisätty Taulukoissa 11, 12 ja 13 on kenttäkokeiden mikrobitulokset. E. coli -bakteeria todettiin molemmilla esikäsitellyn veden näytteenottokerroilla vain ultrasuodatusmenetelmällä (Kokeet 1 ja 2, Taulukko 11). Pohjavesistä (Kokeet 3 ja 4, Taulukko 11) E. coli -bakteeria ei todettu ja saastuneesta verkostovedestä (Koe 5, Taulukko 11) E. coli -bakteereita todettiin samanlaiset lukumäärät perinteisellä näytteenottomenetelmällä ja ultrasuodatusmenetelmällä. 60 Koliformisten bakteerien tulosten osalta näytteenottomenetelmien välillä ei ollut suurta eroa (Taulukko 11). Koliformisia bakteereita todettiin esikäsitellystä vedestä ja saastuneesta verkostovedestä, mutta ei pohjavesistä. C. perfringens -bakteerin itiöitä todettiin esikäsitellystä vedestä pieniä lukumääriä perinteisellä näytteenottomenetelmällä, mutta ei ultrasuodatusmenetelmällä (Kokeet 1 ja 2, Taulukko 11). Pohjavesistä ja verkostovedestä C. perfringens -bakteerin itiöitä ei määritetty lukuun ottamatta esikäsitellyn pohjaveden perinteisellä menetelmällä otettua näytettä, josta itiöitä ei todettu (Taulukko 11). Esikäsitellystä vedestä eikä käsittelemättömästä pohjavedestä todettu F-spesifisiä kolifageja (Kokeet 1-3, Taulukko 12). Esikäsitellystä pohjavedestä F-spesifisiä kolifageja todettiin litrasta perinteisellä näytteenotto- ja määritysmenetelmällä, mutta ultrasuodatusmenetelmällä Fspesifisiä kolifageja ei todettu näytteestä (Koe 4, Taulukko 12). Saastuneesta verkostovedestä F-spesifiset kolifagit määritettiin vain ultrasuodatusmenetelmällä ja niitä todettiin (Koe 5, Taulukko 12). Somaattisia kolifageja todettiin esikäsitellyn pintaveden näytteenottokerroilla molemmilla menetelmillä (Kokeet 1 ja 2, Taulukko 12). Muista näytevesistä somaattisia kolifageja ei todettu. Saastuneesta verkostovedestä ne määritettiin vain ultrasuodatusmenetelmällä. Taudinaiheuttajaviruksia eli noro- ja adenoviruksia ei todettu esikäsitellystä pintavedestä eikä esikäsitellystä pohjavedestä kummallakaan näytteenotto ja konsentrointitavoilla. Käsittelemättömästä pohjavedestä viruksia ei määritetty. Saastuneesta verkostovedestä ei todettu norovirusta. Ultrasuodatusmenetelmällä otettujen ja konsentroitujen näytevesien heterotrofisten mikrobien pesäkelukumäärät olivat vain 2-10 % kanisteriin otettujen näytevesien lukumääristä (Taulukko 13). Kokonaissolulukumäärät olivat ultrasuodatusmenetelmällä määritettyinä 18-55 % kanisterinäytteenoton lukumääristä. Saastuneesta verkostovedestä heterotrofista pesäkelukua ja kokonaissolulukumäärää ei määritetty (Koe 5, Taulukko 13). 61 Taulukko 11. Indikaattoribakteeritulokset perinteisellä näytteenotto- ja määritysmenetelmällä ja ultrasuodatusmenetelmällä. E. coli Perinteinen menetelmä Ultrasuodatusmenetelmä 1 Esikäsitelty pintavesi Ei todettu /5 110 ml 9 pmy / 10 000 ml 2 Esikäsitelty pintavesi Ei todettu /5 110 ml 9 pmyA / 10 000 ml Ei todettu /5 000 ml Ei todettu / 161 000 ml 3 Käsittelemätön pohjavesi Ei todettu /5 110 ml Ei todettu / 95 000 ml 4 Esikäsitelty pohjavesi B 3 pmy /100 ml 4 pmy / 100 ml 5 Saastunut verkostovesi Koliformiset bakteerit 1 Esikäsitelty pintavesi 2 Esikäsitelty pintavesi 3 Käsittelemätön pohjavesi 4 Esikäsitelty pohjavesi 5 Saastunut verkostovesi C. perfringens, itiöt 1 Esikäsitelty pintavesi 2 Esikäsitelty pintavesi Perinteinen menetelmä Ultrasuodatusmenetelmä 7 pmy /100 ml 2 pmy / 100 ml 360 pmy /100 ml 549 pmy / 100 ml Ei todettu /5 000 ml Ei todettu / 161 000 ml Ei todettu /5 110 ml Ei todettu / 95 000 ml B 20 pmy /100 ml 6 pmy / 100 ml Perinteinen menetelmä Ultrasuodatusmenetelmä 4 pmy /10 000 ml Ei todettu / 25 600 ml A 1 pmy /10 000 ml Ei todettu / 112 000 ml Ei määritetty Ei määritetty 3 Käsittelemätön pohjavesi Ei todettu /1 000 ml Ei määritetty 4 Esikäsitelty pohjavesi Ei määritetty Ei määritetty 5 Saastunut verkostovesi A = Tulos arvio, koska lukumäärä alle luotettavan pesäkelaskennan rajan. B = Tulos saatu Colilert-määritysmenetelmällä toisessa tutkimuslaboratoriossa (Jalava ym. 2014). Taulukko 12. Kenttäkokeiden kolifagitulokset perinteisellä näytteenotto- ja määritysmenetelmällä ja ultrasuodatusmenetelmällä. F-spesifiset kolifagit Perinteinen menetelmä Ultrasuodatusmenetelmä 1 Esikäsitelty pintavesi Ei todettu /1 000 ml Ei todettu / 30 700 ml 2 Esikäsitelty pintavesi Ei todettu /1 000 ml Ei todettu / 113 000 ml Ei todettu /1 000 ml Ei todettu / 163 000 ml 3 Käsittelemätön pohjavesi Todettiin /1 000 ml Ei todettu / 86 000 ml 4 Esikäsitelty pohjavesi Ei määritetty 2 pmy / 25 600 ml 5 Saastunut verkostovesi Somaattiset kolifagit 1 Esikäsitelty pintavesi 2 Esikäsitelty pintavesi 3 Käsittelemätön pohjavesi 4 Esikäsitelty pohjavesi 5 Saastunut verkostovesi Perinteinen menetelmä Ultrasuodatusmenetelmä Todettiin /100 ml 0,5 pmy / 100 ml Todettiin /100 ml 0,05 pmy / 100 ml Ei todettu /1 000 ml Ei todettu / 163 000 ml Ei todettu /1 000 ml Ei todettu / 86 000 ml Ei määritetty Ei todettu / 26 500 ml 62 Taulukko 13. Pesäkelaskennan tulokset ja kokonaissolulukumäärä perinteisellä näytteenotto- ja määritysmenetelmällä ja ultrasuodatusmenetelmällä. Heterotrofinen pesäkeluku Perinteinen menetelmä Ultrasuodatusmenetelmä 1 Esikäsitelty pintavesi 4 600 pmy / ml 230 pmy / ml A 2 Esikäsitelty pintavesi 7 400 pmy / ml 170 pmy / ml 20 pmy / ml 1 pmy / ml 3 Käsittelemätön pohjavesi 40 pmy / ml 4 pmy / ml 4 Esikäsitelty pohjavesi Ei määritetty Ei määritetty 5 Saastunut verkostovesi Kokonaissolulukumäärä Perinteinen menetelmä Ultrasuodatusmenetelmä 1 Esikäsitelty pintavesi 290 000 / ml 160 000 / ml 2 Esikäsitelty pintavesi 680 000 / ml 120 000 / ml 13 000 / ml 3 800 / ml 3 Käsittelemätön pohjavesi 29 000 / ml 13 000 / ml 4 Esikäsitelty pohjavesi Ei määritetty Ei määritetty 5 Saastunut verkostovesi A = Tulos arvio, koska lukumäärä alle luotettavan pesäkelaskennan rajan 63 6 TULOSTEN TARKASTELU 6.1 ULTRASUODATUSMENETELMÄN TOIMINTA Ristivirtausmenetelmään perustuva ultrasuodatuslaitteisto konsentroi vesinäytteen suodattamalla osan vedestä ultrasuodatinpatruunassa ja kierrättämällä suodattumatonta vettä konsetraattisäiliön kautta uudelleen suodatinpatruunalle. Laitteisto konsentroi näytteen automaattisesti konsentraattisäiliön pinnankorkeusanturoiden automatiikan ansiosta. Pumppausnopeutta, painetta ja suodatusnopeutta pystytään haluttaessa säätämään suodatuksen aikana. Pinnankorkeusanturoihin perustuvaa automatiikkaa ultrasuodatuksen yhteydessä ei ole aikaisemmin raportoitu. Ultrasuodatusmenetelmän toiminnan testauksessa kiinnitettiin huomiota suodatusnopeuteen. Suuren tilavuuden konsentroimiseksi tehokkaasti, suodatuksen on oltava tarpeeksi nopeaa. Muissa tutkimuksissa ristivirtaussuodatuksen kokonaispumppausnopeuden on raportoitu olleen välillä 1700- yli 4000 ml/min, josta suodattuneen veden virtaama (eli suodatusnopeus) on ollut 800-1200 ml/min, joissakin kokeissa jopa yli 2000 ml/min. (Hill ym. 2005, Veenendaal ja Brouwer-Hanzens 2007, Polaczyk ym. 2008, Rhodes ym. 2011) Tässä työssä kokonaispumppausnopeutta testattiin ensimmäisessä kolmessa kokeessa välillä 1700-2720 ml/min ja lopuissa kokeista se päädyttiin pitämään noin 1700 ml/min. Suodatusnopeus oli koetta I lukuun ottamatta 660-1200 ml/min. 30 litran näytetilavuuden suodatukseen kului aikaa noin 45 minuuttia. Suodatusnopeus ja kokonaispumppausnopeus suodattimelle olivat tässä työssä samanlaisia kuin muissa tutkimuksissa on raportoitu (Hill ym. 2005, Veenendaal ja Brouwer-Hanzens 2007) ja joitakin tutkimuksia alhaisempia (Hill ym. 2007, Veenendaal ja Brouwer-Hanzens 2007, Rhodes ym. 2011). Suodatuksen aikaista painetta tutkittiin, koska sen huomattiin vaikuttavan suodatusnopeuteen. Liian korkea paine voi vahingoittaa mikrobeja, aiheuttaa niiden kiinnittymisen suodatinmateriaaliin tai mikrobit voivat jopa läpäistä suodatinmateriaalin (Rhodes ym. 2011). Saantokokeissa laboratorio-olosuhteissa paine vaihteli suodatuksen aikana kaikissa kokeissa välillä 0,7-1,2 baaria, joka on lähellä muissa tutkimuksissa raportoituja 0,4-1,1 baarin suodatuspaineita (Hill ym. 2005, Veenendaal ja Brouwer-Hanzens 2007, Polaczyk ym. 2008, Rhodes ym. 2011). Julkaisuissa, joissa suodatuspaine on ollut yli 0,7 baaria, suodatusnopeuden 64 on raportoitu olleen yli 1500 ml/min (Polaczyk ym. 2008, Rhodes ym. 2011). Tässä työssä suodatusnopeus oli kuitenkin alle 1500 ml/min paineen ollessa yli 0,7 baaria. Paineen huomattiin vaikuttavan herkästi suodatusnopeuteen. Painetta ja siten suodatusnopeutta voitiin säätää kiristimellä tai pumppausnopeutta vaihtamalla. Pumppu päädyttiin pitämään puoliteholla, jolloin nopeus oli noin 1700 ml/min, ja säätämään paine noin 0,9 baariin kiristimen avulla. Tutkituista nopeuksista päädyttiin alhaisempaan, 1700 ml/min, pumppausnopeuteen, koska suodatusnopeus pysyi samana kiristintä säätämällä ja laitteisto tärisi letkupumpun vuoksi voimakkaasti suuremmalla virtausnopeudella. Tärinän arvioitiin nostavan riskiä letkujen irtoamiseen. Sama suodatusnopeus olisi voitu saada aikaan nostamalla pumpun nopeutta ja löysäämällä kiristintä, siten, että paine pysyy noin 0,9 baarissa. Suodatinpatruunalle pumpatun veden virtaamaa voisi Polaczykin ym. (2008) mukaan nostaa myös halkaisijaltaan suuremman letkun avulla. Suuremman letkun vuoksi suurempi vesitilavuus olisi samassa ajassa virrannut patruunalle, vaikka pumppausnopeus olisi ollut puoliteholla. Kokeissa ei mitattu suodatinpatruunalle virtaavan veden eikä suodattimelta uudelleen konsentraattisäiliöön virtaavan veden virtausnopeutta. Patruunan suuntaisesti virtaava vesi voi estää materiaalin ja mikrobien kiinnittymistä suodatinpatruunaan (MoralesMorales ym. 2003), mutta virtaaman vaikutusta ei tässä tutkittu. Paineen herkkä vaikutus suodatusnopeuteen voi johtua käytetyn Fresenius FX80suodatinpatruunan rakenteesta. Smith ja Hill (2009) totesivat kokeissaan tutkituista ultrasuodatinpatruunamalleista Fresenius F200NR-mallin patruunan paineen nousevan eniten, kun pumppausnopeutta nostettiin, jolloin myös suodatusnopeus kasvoi. Suurempi pinta-ala vähentää paineen nousua ja Asahi Kasein Rexeed-mallin (pinta-aloiltaan 2,1 m2 ja 2,5 m2) suodattimien paineen nousu oli tutkituista suodattimista pienin. Fresenius FX80 suodatinpatruunan pinta-ala oli 1,8 m2. Muissa tutkimuksissa pinta-ala on ollut 1,8-2,5 m2 (Polaczyk ym. 2008, Smith ja Hill 2009). Tässä työssä käytetystä suodatinpatruunasta ei ole saatavilla aiempia julkaisuja liittyen käyttöön vesimikrobiologisessa analytiikassa. Freseniuksen F200NR ja F80A -mallin suodatinpatruunoilla on saatu 50–100 %:n mikrobisaantoja (Hill ym. 2005, Polaczyk ym. 2008). Suodatinpatruuna, jonka paine ei nouse yhtä herkästi ja jonka pinta-ala on suurempi, olisi voinut soveltua menetelmään paremmin (Smith ja Hill 2009). 65 Muut eivät ole raportoineet samanlaista paineen ja suodatusnopeuden vaihtelua suodatuksen aikana kuin näissä kokeissa ilmeni. Paineen vaihtelu johtui todennäköisesti laitteiston rakenteesta. Tutkimustietoa samanlaista laitteistoa, joka pinta-antureiden avulla vaihtaa välillä ottamaan konsentroitua vettä ja välillä uutta näytevettä, ei ole vertailtavaksi. Vaihtelu paineessa ja suodatusnopeussavaikeutti niiden seuraamista ja mittaustulosten vertailua kokeiden välillä. Myös paineen ja suodatusnopeuden vaikutusten arviointi mikrobituloksiin oli suodatuksen aikaisen vaihtelun vuoksi hankalaa. 6.2 BAKTEERIEN JA VIRUSTEN KONSENTROINTITEHOKKUUS Ultrasuodatusmenetelmän saantotutkimuksissa eri mikrobeille on raportoitu kirjallisuudessa saannoksi 50-100 % (Veenendaal ja Brouwer-Hanzens 2007, Polaczyk ym. 2008, Hill ym. 2009). Tässä työssä saantokokeiden mikrobisaannot eivät olleet yhtä hyviä kuin kirjallisuudessa on ultrasuodatusmenetelmällä raportoitu. E. coli -bakteerin saanto konsentraatista ja ensimmäisestä eluoinnista viidessä kokeessa vaihteli välillä 10-71 %, F-spesifisten kolifagien saanto välillä 4-19 % ja somaattisten kolifagien saanto välillä 16-42 %. Yhden suoritetun kokeen perusteella saanto norovirukselle oli 5 %. Heterotrofisten mikrobien pesäkelukumäärä ja kokonaissolulukumäärän määritykseen käytettävän saannot vaihtelivat DAPI-menetelmän suuresti. suoritusta Kokonaissolulukumäärän hankaloitti suodatuksessa konsentroituvan veden sisältämä materiaali, joka häiritsi solujen laskemista mikroskoopilla. Hillin ym. (2005) kokeissa ristivirtaussuodatuksessa syötetyistä mikrobeista havaittiin yli 80 % jo konsentraatista ennen huuhtelua. Kuitenkin suolistoperäisen Enterococcus faecalis bakteerin saanto oli joissakin olosuhteissa muista mikrobeista poiketen konsentraatissa alle 30 %. Tässä työssä erikseen analysoidut ensimmäisen eluoinnin näytteet sisälsivät lähes puolet tai yli puolet ensimmäisen kokonaislukumäärästä. eluoinnin Suuri osa ja konsentraatin mikrobeista ei yhteenlasketusta siis jäänyt mikrobien konsentraattiin ristivirtausmenetelmän periaatteen mukaisesti. Aiemmissa tutkimuksissa ei ole raportoitu useiden peräkkäisten eluointien tai muiden huuhtelumenetelmien tuloksia. Tässä työssä eluointia tehtiin useita kertoja peräkkäin heikon saannon vuoksi. Eluointi lisäsi mikrobisaantoa 3-25 % toisella, kolmannella ja neljännellä eluointikerralla. Useiden eluointien tekeminen on kuitenkin aikaa vievää, minkä vuoksi suodatusta tai ensimmäistä eluointia pitäisi saada tehokkaammaksi. 66 Saantokokeiden alhaiset mikrobilukumäärät konsentraatissa ja peräkkäisissä eluoinneissa talteen saadut mikrobit viittaavat siihen, että mikrobit olivat kiinnittyneenä suodatinpatruunaan eivätkä pysyneet kiertävässä konsentraatissa. Virtausnopeus suodatinmateriaalin suuntaisesti, paine, sen vaihtelu ja vaihtelun aiheuttama ilman virtaus suodattimelle voivat vaikuttaa mikrobien kiinnittymiseen suodattimelle. Nopeampi virtaama patruunan suuntaisesti voisi ehkäistä mikrobien tarttumisen suodattimelle. (Morales-Morales ym. 2003, Rhodes ym. 2011) Paineen ja suodatusnopeuden suodatuksen aikaisen vaihtelun ja saantokokeissa suodatuksen aikana tehtyjen paineen ja virtauksen säätöjen vuoksi virtausnopeuden ja paineen eroja kenttäkokeiden ja saantokokeiden välillä ei voi verrata. Niiden vaikutusta mikrobitulosten eroihin ei siten voi arvioida. Tässä työssä käytetyt huuhtelumenetelmät eivät olleet tarpeeksi tehokkaita irrottamaan mikrobeja. Koska mikrobit mahdollisesti kiinnittyivät suodatinmateriaaliin eivätkä pysyneet konsentraatissa, kuten ristivirtausmenetelmässä on tavoitteena, käytetty menetelmä muistuttaa siltä osin enemmän normaaliultrasuodatusta eli dead-end -ultrasuodatusta. Normaaliultrasuodatuksessa käytetty vastavirtahuuhtelu voisi olla tehokkaampi menetelmä irrottamaan suodatinpatruunaan kiinnittyneet mikrobit eluointiliuokseen. (Smith ja Hill 2009, Leskinen ym. 2012) Hillin ym. (2005) tutkimuksessa E. faecalis -bakteerin kokonaissaanto ristivirtausultrasuodatus- ja vastavirtahuuhtelumenetelmällä oli yli 70 % vaikka saanto konsentraatissa oli vain alle 30 %. Ristivirtausmenetelmää käytettäessä merkittävää eroa mikrobisaannossa eluointimenetelmän ja vastavirtahuuhtelumenetelmän käytön välillä ei ole huomattu. Suodatuksen suuntaisesti tehtävän eluointimenetelmän saantojen on kuitenkin huomattu vaihtelevan enemmän kuin vastavirtahuuhtelun (Polaczyk ym. 2008). Pilot-mittakaavan vesilaitoskokeessa vedestä havaittiin ultrasuodatusmenetelmällä järjestelmään syötettyjä E. coli -bakteereita ja F-spesifisiä kolifageja. Pilot-laitoksen kokeessa mikrobisaantoa ei voi laskea, koska koeasetelman vuoksi ultrasuodatuslaitteistolle kulkeutuneiden mikrobien lukumäärää ei voi laskea. Suodatus aloitettiin yhtä aikaa mikrobien syötön kanssa eikä tiedetä, miten kauan kului, että mikrobilukumäärä ultrasuodatuslaitteistolle pumpatussa vedessä saavutti tason, jossa sen mittattiin olevan suodatuksen aikana. Mikrobien syöttö lopetettiin neljä tuntia ennen ultrasuodatuksen lopetusta eikä tiedetä, miten mikrobilukumäärä syötön lopetuksen jälkeen vedessä laski. 67 Kenttäkokeissa verrattiin mikrobihavaintoja ultrasuodatusmenetelmällä ja perinteisellä näytteenotto- ja konsentrointimenetelmällä. E. coli -bakteerille ja koliformisille bakteereille ultrasuodatusmenetelmä toimi yhtä hyvin tai paremmin kuin perinteinen menetelmä. Somaattisia kolifageja havaittiin molemmilla menetelmillä. C. perfringens -bakteerin itiöitä ja F-spesifisiä kolifageja ei havaittu ultrasuodatusmenetelmällä yhtä herkästi kuin perinteisillä kanisterinäytteenotto- ja konsentrointimenetelmillä. Heterotrofisen pesäkeluvun tulokset olivat ultrasuodatusmenetelmälle heikommat. Koliformisia bakteereita lukuun ottamatta indikaattorimikrobien lukumäärät näytteissä olivat hyvin pieniä, joten kvantitatiivista arviointia menetelmien välillä ei voi tehdä. Bakteerien ja virusten saannot ultrasuodatusmenetelmällä olivat erilaiset. Toistokokeissa V-VII saanto oli korkein E. coli -bakteerille, toiseksi korkein somaattisille kolifageille ja alhaisin Fspesifisille kolifageille. Samansuuntaisia tuloksia saatiin kenttäkokeissa, joissa pumppausnopeus ja ensimmäinen eluointi olivat samanlaisia kuin toistetuissa saantokokeissa. Kokeissa I-IV, joissa E. coli bakteeri ja kolifagit eivät olleet samoissa kokeissa ja kokeissa käytettiin eri suodatusolosuhteita ja eluointimenetelmää, saanto oli korkein somaattisille kolifageille, toiseksi korkein E. coli -bakteerille ja alhaisin F-spesifisille kolifageille. Somaattisten kolifagien saanto oli yhtä koetta lukuun ottamatta parempi kuin F-spesifisten kolifagien. Myös kenttäkokeissa somaattisia kolifageja havaittiin ultrasuodatusmenetelmällä herkemmin kuin F-spesifisiä kolifageja, kun ultrasuodatusmenetelmää verrattiin perinteiseen näytteenotto- ja konsentrointimenetelmään. Kirjallisuudessa on raportoitu tuloksia, joissa näiden F-spesifisten ja somaattisten kolifagien saantojen suhde vaihtelee molemmin päin. Kirjallisuudessa E. coli -bakteerin ja kolifagien saannot ovat olleet hyviä eikä menetelmän toistuvasti ole raportoitu olevan tehokkaampi bakteerien kuin virusten konsentrointiin tai päinvastoin. (Hill ym. 2007, Veenendaal ja Brouwer-Hanzens 2007) Erilaisilla suodatusolosuhteilla ja eluointimenetelmällä voi olla erilainen vaikutus eri mikrobeihin, koska eri mikrobien saannot olivat parempia eri saantokokeissa. Saantokokeissa mikrobisaantojen tulokset vaihtelivat kokeittain riippuen suodatusolosuhteista tai eluointimenetelmistä. Kokeissa oli monta eri tekijää, joita muutettiin parhaiden olosuhteiden löytämiseksi, joten ei voida sanoa, mikä yksittäinen tekijä eri kokeissa on vaikuttanut muutokseen mikrobisaannossa. Suodatusnopeuden, eluointiliuoksen kemikaalien, natriumpolyfosfaatin lisäyksen, eluointimenetelmän, suodattimen asennon, kääntelyn tai ympin määrän vaikutusta mikrobisaantoon ei voida erikseen arvioida näiden kokeiden perusteella. 68 E. coli -bakteerin osalta kenttäkokeiden tulokset olivat menetelmän tehokkuuden kannalta parempia kuin saantokokeiden tulokset. Saantokokeiden ja kenttäkokeiden erot mikrobien konsentrointitehokkuudessa voivat johtua vedenlaadusta ja suodatustilavuudesta. Saantojen on huomattu vaihtelevan eri laatuisia vesiä suodatettaessa (Smith ja Hill 2009). Pilot-laitoksen vesi värjäsi suodatinpatruunan oranssinruskeaksi suodatuksen aikana. Värjäytyminen johtui todennäköisesti suodatinmateriaalin kertyneestä materiaalista, joka voi vaikuttaa saantoon. Myös suodatustilavuuden on raportoitu vaikuttaneen saantoon (Veenendaal ja BrouwerHanzens 2007). Tässä työssä käytetyillä mikrobien viljelymenetelmillä havaitaan vain elinkykyiset mikrobit. Mikrobien viljeltävyyden tai elinkyvyn menetys voi olla yksi osasyy alhaisiin saantotuloksiin. Elinkykyisetkin mikrobit voivat heikentyä siten, että niitä ei voida havaita viljelymenetelmillä vaikka ne olisivat elossa. Ultrasuodatusnopeuden yli 2200 ml/min on huomattu laskevan virusten saantoa, mikä voi johtua virusten vahingoittumisesta ja infektiokyvyn menetyksestä, jolloin niitä ei saada havaittua viljelymenetelmillä (Rhodes ym. 2011). Molekyylibiologisilla menetelmillä voidaan ultrasuodatuskokeiden havaita elävät ja näytteiden E. coli kuolleet mikrobisolut. -bakteerien lukumääriä Tämän työn määritettiin viljelymenetelmän lisäksi uudella PMA (propidium monoatsidi) -PCR -menetelmällä, joka perustuu elävien solujen havitsemiseen ja erottamiseen kuolleista. Menetelmällä saatuja tuloksia ei kuitenkaan esitetä tässä työssä. Virukset voivat myös nopeassa suodatuksessa läpäistä suodatinmateriaalin (Rhodes ym. 2011). Filtraatista ei todettu mikrobeja, joten alhaisten saantotuloksien syynä ei todennäköisesti ole se, että mikrobit läpäisevät suodatinmateriaalin. Läpäisyn yhteydessä ne kuitenkin ovat voineet menettää viljeltävyytensä, jolloin niitä ei havaita. Mahdolliset kloorijäämät laitteistossa voivat myös vahingoittaa mikrobeja, jos huuhtelu ei ollut riittävä. Klooria ei mitattu joka kerta huuhteluvedestä. Ymppäämättömän näyteveden suodatuksen jälkeen laitteiston voi viimeistään olettaa huuhtoutuneen riittävästi. 6.3 ULTRASUODATUSMENETELMÄN TOIMINTAKYKY ERILAISISSA KENTTÄOLOSUHTEISSA Teknisesti ultrasuodatuslaitteisto toimi kenttäolosuhteissa samalla tavalla kuin laboratoriossa. Suodatusajan ja -tilavuuden mukaan laskettu suodatusnopeus oli kenttäkokeissa samanlainen 69 kuin saantokokeissa. Kenttäkokeissa suodatus saattoi olla kuitenkin hitaampaa, koska saantokokeiden suodatuksen kestoa lisäsivät hetkittäiset paineen alennukset ja tehdyt laitteiston säädöt. Kenttäkokeissa suodatusnopeus oli 570 ml/min esikäsitellyn pohjaveden suodatuksessa ja muissa 780-850 ml/min. Nopeus oli korkein esikäsittelyn veden ja verkostoveden suodatuksessa. Alhaisen nopeuden (570 ml/min) pohjaveden suodatuksessa vesi ei tullut pumpulle paineellisesta hanasta, joten vettä ei välttämättä riittänyt nopeampaan suodatukseen. Suodatusnopeus on merkittävä tekijä, sillä näytteenottoon käytettävä aika on yleensä rajallinen. Viimeistään mikrobien säilyvyys vedessä rajoittaa suodatuksen kestoa. Vettä saatiin suodatettua tunnissa noin 50 litraa ja alle vuorokaudessa 1000 litraa eli 1 m3. Otettaessa näyte paineellisesta hanasta letkujen ja liittimien on kestettävä painetta ja paine on alennettava paineenalennusventtiilillä. Liian korkea paine voi läpäistä sulkijat ja täyttää konsentraattisäiliötä. Toisaalta näytehanan paineen ja virtaaman on oltava riittävä tehokkaat suodatusnopeuden saamiseksi. Paineen alle yhteen baariin alentava venttiili voi olla kallis ja venttiilin rakenteen vuoksi siihen liittyy kontaminaatioriski. Paineeseen liittyviä ongelmia ei ole, jos näyte otetaan ultrasuodatuslaitteiston astiasta välissä pumppaamalla. voisi Sen vuoksi yksinkertaistaa väliastia käyttöä hanan ja vaihtelevissa näytteenottotilanteissa. Laitteiston pystyi kuljettamaan näytteenottopaikalle ja automatiikan avulla ultrasuodatusta ei tarvinnut valvoa, vaan se konsentroi vesinäytteen yön aikana. Laitteiston käyttö vaati osaamista, mutta hyvän ohjeistuksen avulla esimerkiksi vesilaitoksen henkilökunta voisi ottaa näytteen laitoksella. Paineellisen hanan aiheuttamat ongelmat tai letkuston rikkoutumisriskit on minimoitava ennen näytteenottoa. Laitteiston käyttöhelppoutta voisi parantaa ja harkita eluoinnin tekoa vasta laboratoriossa, jos laitetteen käyttöön kouluttautumaton henkilö tekee suodatuksen näytteenottokohteessa (US EPA 2013). Normaalisuodatusmenetelmää käytetään kenttätutkimuksissa enemmän, koska siihen riittää yksinkertaisempi laitteisto. Normaalisuodatusmenetelmällä konsentroitava näytemäärä on kuitenkin pienempi, noin sata litraa, kuin ristivirtausmenetelmällä, jolla tilavuus voi olla jopa yli 1000 litraa (Veenendaal ja Brouwer-Hanzens 2007, Smith ja Hill 2009, Leskinen ym. 2012). Suuren vesitilavuuden konsentrointi mahdollistaa pienten mikrobilukumäärien havaitsemisen esimerkiksi veden puhdistusprosessin jälkeisestä vedestä. Tietoa veden mikrobilukumääristä tarvitaan puhdistusprosessien tehokkuuksien laskemiseen, mikä auttaa, kun päätetään, mitä 70 prosesseja veden puhdistukseen tarvitaan riittävän turvallisuuden takaamiseksi (Pitkänen ym. 2011, Vesiopas 2013). Ultrasuodatusmenetelmällä vesilaitoksen prosessivedestä voidaan konsentroida suuri tilavuus. Näytteenotto laitteistolla vesiepidemiaepäilytilanteen selvitystyössä on mahdollista, jolloin suuri analyysitilavuus parantaa taudinaiheuttajamikrobien havaitsemista. Kanisterinäytteenottoa ja nykyisiä konsentrointimenetelmiä käytettäessä näytetilavuus on muutamia litroja. Tässä työssä ultrasuodatusmenetelmää verrattiin perinteiseen kanisterinäytteenottoon ja konsentrointimenetelmiin. On huomioitava, että perinteisiä menetelmiä käytettäessä kanistereihin otettiin kymmeniä litroja näytevettä, mikä on tavanomaista paljon suurempi näytetilavuus. Suuren näytetilavuuden kuljetus ja kalvosuodatus laboratoriossa ei normaalitilanteissa kuitenkaan ole kustannustehokasta. Jos ultrasuodatusmenetelmän saantoa saadaan parannettua, menetelmän avulla on mahdollista säästää kustannuksissa, kun näytteenotto ja konsentrointi tapahtuvat samanaikaisesti eri mikrobiryhmille. Mikrobien saannon osalta tässä työssä tutkittua ultrasuodatusmenetelmää on kehitettävä. Esimerkiksi 50 %:n saanto ultrasuodatusmenetelmällä tuhannesta litrasta vastaa 500 litran mikrobimäärää, kun saanto on 100 %. Jos menetelmää kehitetään mikrobisaannon osalta tehokkaammaksi, voidaan suodatusaikaa lyhentää, kun pienempi tilavuus riittää. Esimerkiksi epidemiatilanteessa näytteenotto on tehtävä mahdollisimman nopeasti ja tehokkaasti, jotta mikrobit voidaan havaita ja talousvesijärjestelmä korjata ja desinfioida käyttöönottoa varten (Pitkänen 2013). Ohjelmiston avulla säädettäviä automaattisia ultrasuodatusnäytteenottimia on kehitetty kenttäolosuhteisiin (Kearns ym. 2008, Leskinen ym. 2012). Automatiikan vuoksi näytteenottoon tarvitaan entistä vähemmän työaikaa ja näytteitä voidaan ottaa tiheämmin. Automatiikan avulla ultrasuodatusta olisi mahdollista käyttää tulevaisuudessa myös vedenlaadun valvontaan erityistilanteiden ja prosessien tehokkuuksien arvioinnin lisäksi. 71 7 JOHTOPÄÄTÖKSET Ultrasuodatusmenetelmällä saatiin konsentroitua 1000 litran näytetilavuus alle litran tilavuuteen vajaassa vuorokaudessa. 30 litran suodatukseen kului aikaa noin 45 minuuttia. Ultrasuodatusmenetelmällä konsentroidusta näytteestä havaittiin bakteereita ja viruksia. Kenttäkokeissa käytetyllä menetelmällä saatiin satojen litrojen tilavuudesta konsentroitua tehokkaasti E. coli -bakteeria ja koliformisia bakteereita. Menetelmää olisi kuitenkin kehitettävä, jotta sen teho olisi yhtä hyvä sekä bakteerien että virusten konsentrointiin. Ultrasuodatuslaitteisto toimi suodatuksen aloituksen jälkeen automaattisesti ilman valvontaa, mikä mahdollistaa suuren näytetilavuuden keräämiseksi tarvittavan pitkän suodatusajan. Suuri näytetilavuus parantaa mahdollisuutta havaita pienet mikrobilukumäärät vedessä. Ultrasuodatusmenetelmällä voidaan konsentroida suuren tilavuuden näyte erilaisissa kenttäolosuhteissa. Menetelmän tehokkuutta erilaisten vesinäytteiden mikrobikonsentrointiin sekä soveltuvuutta jatkokonsentrointi- ja havaitsemismenetelmiä varten tulisi selvittää jatkotutkimuksissa. 72 LÄHDELUETTELO Aakko K., Haikala O., Hiisvirta L., Holopainen M., Kettunen R., Kurki J., ym. 2000. Ympäristöterveyden erityistilanteiden opas. Sosiaali- Ja Terveysministeriön Oppaita 4, 33-52. Ahmed W., Hodgers L., Sidhu J.P.S. ja Toze S. 2012. Fecal Indicators and Zoonotic Pathogens in Household Drinking Water Taps Fed from Rainwater Tanks in Southeast Queensland, Australia. Applied and Environmental Microbiology 78, 1. 219-226. Ammersbach M. ja Bienzle D. 2011. Methods for assessing feline immunodeficiency virus infection, infectivity and purification. Veterinary Immunology and Immunopathology 143, 3-4. 202-214. Argonide. 2014. NanoCeram -patruunan http://www.argonide.com/commercial/product-line/ 8.8.2014. tuotetietoja. Bartram J., ym. 2001. Harmonised assessment of risk management for water-related infectious desease: an overview. Teoksessa: Fewtrell L and Bartram J. Water Quality: Guidelines, Standards and Health, Assessment of risk and risk management for water-related infectious disease. IWA Publishing. Lontoo, Yhdistynyt kuningaskunta. 1-16. Bisha B., Perez-Mendez A., Danyluk M.D. ja Goodridge L.D. 2011. Evaluation of Modified Moore Swabs and Continuous Flow Centrifugation for Concentration of Salmonella and Escherichia coli O157:H7 from Large Volumes of Water. Journal of Food Protection 74, 11. 1934-1937. Borchardt M. ja Spencer S. 2002. Concentration of Cryptosporidium, microsporidia and other water-borne pathogens by continuous separation channel centrifugation. Journal of Applied Microbiology 92, 4. 649-656. Brassard J., Seyer K., Houde A., Simard C. ja Trottier Y. 2005. Concentration and detection of hepatitis A virus and rotavirus in spring water samples by reverse transcription-PCR. Journal of Virological Methods 123, 2. 163-169. Brunkard J., Ailes E., Roberts V., Hill V., Hilborn E., Craun G., ym. 2011. Surveillance for waterbornedisease outbreaksassociated with drinking water---UnitedStates, 2007--2008. CDC, Morbidity and Mortality Weekly Report 60, 12. 38-68. Cann K.F., Thomas D.R., Salmon R.L., Wyn-Jones A.P. ja Kay D. 2013. Extreme water-related weather events and waterborne disease. Epidemiology and Infection 141, 4. 671-686. CEN ISO/TS 15216-1. 2013. Tekninen spesifikaatio, Microbiology of Food and Animal Feed. Horizontal Method for Determination of Hepatitis A Virus and Norovirus in Food Using RealTime Rt-Pcr. Part 1: Method For Quantification (Corrected Version 2013-05-01). Clever M., Jordt F., Knauf R., Räbiger N., Rüdebusch M. ja Hilker-Scheibel R. 2000. Process water production from river water by ultrafiltration and reverse osmosis. Desalination 131, 3. 325-336. 73 Craun G., Berger P. ja Calderon R. 1997. Coliform bacteria and waterborne disease outbreaks. Journal American Water Works Association 89, 3. 96-104. Deere D., ym. 2001. Management Strategies. Teoksessa: Fewtrell L and Bartram J. Water quality: Guidelines, Standards and Health, Assessment of risk and risk management for waterrelated infectious desease. IWA Publishing. Lontoo, Yhdistynyt kuningaskunta. 257-288. Edberg S., Rice E., Karlin R. ja Allen M. 2000. Escherichia coli: the best biological drinking water indicator for public health protection. Journal of Applied Microbiology 88, 106S-116S. Edge T.A., Khan I.U.H., Bouchard R., Guo J., Hill S., Locas A., ym. 2013. Occurrence of Waterborne Pathogens and Escherichia coli at Offshore Drinking Water Intakes in Lake Ontario. Applied and Environmental Microbiology 79, 19. 5799-5813. Euroopan unionin neuvosto. 1998. Neuvoston direktiivi 98/83/EY ihmisten käyttöön tarkoitetun veden laadusta. Gantzer C., Senouci S., Maul A., Levi Y. ja Schwartzbrod L. 1997. Enterovirus genomes in wastewater: Concentration on glass wool and glass powder and detection by RT-PCR. Journal of Virological Methods 65, 2. 265-271. Garin D., Fuchs F., Crance J., Deloince R., Aymard M. ja Bartoli M. 1993. Validation of an Ultrafiltration Process to Concentrate Viruses from Large Volumes of Water. Environmental Technology 14, 4. 397-400. Gibbons C.D., Rodriguez R.A., Tallon L. ja Sobsey M.D. 2010. Evaluation of positively charged alumina nanofibre cartridge filters for the primary concentration of noroviruses, adenoviruses and male-specific coliphages from seawater. Journal of Applied Microbiology 109, 2. 635-641. Gibson K.E., Opryszko M.C., Schissler J.T., Guo Y. ja Schwab K.J. 2011. Evaluation of Human Enteric Viruses in Surface Water and Drinking Water Resources in Southern Ghana. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene 84, 1. 20-29. Gilgen M., Germann D., Luthy J. ja Hubner P. 1997. Three-step isolation method for sensitive detection of enterovirus, rotavirus, hepatitis A virus, and small round structured viruses in water samples. International Journal of Food Microbiology 37, 2-3. 189-199. Girones R., Antonia Ferrus M., Luis Alonso J., Rodriguez-Manzano J., Calgua B., de Abreu Correa A., ym. 2010. Molecular detection of pathogens in water - The pros and cons of molecular techniques. Water Research 44, 15. 4325-4339. Griffin S.M., Brinkman N.E., Hedrick E.J., Rhodes E.R. ja Fout G.S. 2014. Comparison of nucleic acid extraction and reverse transcription-qPCR approaches for detection of GI and GII noroviruses in drinking water. Journal of Virological Methods 199, 0. 76-85. Hänninen M., Haajanen H., Pummi T., Wermundsen K., Katila M., Sarkkinen H., ym. 2003. Detection and typing of Campylobacter jejuni and Campylobacter coli and analysis of indicator organisms in three waterborne outbreaks in Finland. Applied and Environmental Microbiology 69, 3. 1391-1396. 74 Hatakka M., Loukaskorpi M. ja Pakkala P. 2001. Ruokamyrkytykset Suomessa vuonna 2000. Elintarvikeviraston Julkaisuja 8. http://www.zoonoosikeskus.fi/attachments/ruokamyrkytykset/2000.pdf. Hijnen W., Van Veenendaal D., Van der Speld W., Visser A., Hoogenboezem W. ja Van der Kooij D. 2000. Enumeration of faecal indicator bacteria in large water volumes using on site membrane filtration to assess water treatment efficiency. Water Research 34, 5. 1659-1665. Hill V.R., Kahler A.M., Jothikumar N., Johnson T.B., Hahn D. ja Cromeans T.L. 2007. Multistate evaluation of an ultrafiltration-based procedure for simultaneous recovery of enteric microbes in 100-liter tap water samples. Applied and Environmental Microbiology 73, 13. 4218-4225. Hill V.R., Mull B., Jothikumar N., Ferdinand K. ja Vinje J. 2010. Detection of GI and GII Noroviruses in Ground Water Using Ultrafiltration and TaqMan Real-time RT-PCR. Food and Environmental Virology 2, 4. 218-224. Hill V.R., Polaczyk A.L., Kahler A.M., Cromeans T.L., Hahn D. ja Amburgey J.E. 2009. Comparison of Hollow-Fiber Ultrafiltration to the USEPA VIRADEL Technique and USEPA Method 1623. Journal of Environmental Quality 38, 2. 822-825. Hill V., Polaczyk A., Hahn D., Narayanan J., Cromeans T., Roberts J., ym. 2005. Development of a rapid method for simultaneous recovery of diverse microbes in drinking water by ultrafiltration with sodium polyphosphate and surfactants. Applied and Environmental Microbiology 71, 11. 6878-6884. Hrudey S.E. 2004. Safe Drinking Water. IWA Publishing. Lontoo, Yhdistynyt kuningaskunta. Hrudey S.E. ja Hrudey E.J. 2007. Published case studies of waterborne disease outbreaks Evidence of a recurrent threat. Water Environment Research 79, 3. 233-245. Hunter D.M., Leskinen S.D., Magana S., Schlemmer S.M. ja Lim D.V. 2011. Dead-end ultrafiltration concentration and IMS/ATP-bioluminescence detection of Escherichia coli O157:H7 in recreational water and produce wash. Journal of Microbiological Methods 87, 3. 338-342. Ikner L.A., Gerba C.P. ja Bright K.R. 2012. Concentration and Recovery of Viruses from Water: A Comprehensive Review. Food and Environmental Virology 4, 2. 41-67. ISO. 1998. Water quality - Detection and enumeration of Legionella, ISO 11731. ISO. 2006. Water quality - Isolation and identification of Cryptosporidium oocysts and Giardia cysts from water, ISO 15553. ISO. 2012. Water quality - Enumeration of Escherichia coli and coliform bacteria - Part 2: Most probable number method, ISO 9308-2. ISO. 2013. Water quality - Enumeration of Clostridium perfringens - Method using membrane filtration, ISO 14189. 75 Isomäki E. 2006. Pienten pohjavesilaitosten ylläpito ja valvonta Ympäristöopas. Suomen ympäristökeskus. Vammala. Jalava K., Rintala H., Ollgren J., Maunula L., Gomez-Alvarez V., Revez J., ym. 2014. Novel microbiological and spatial statistical methods to improve strength of epidemiological evidence in a community-wide waterborne outbreak. PlosOne 9, 8. 1-13 http://www.plosone.org/article/fetchObject.action?uri=info%3Adoi%2F10.1371%2Fjournal.p one.0104713&representation=PDF. Josephson K., ym. 2000. Cultural Methods. Teoksessa: Maier R, Pepper I and Gerba C. Environmental Microbiology. Academic Press. Lontoo, Yhdistynyt kuningaskunta. 213-234. Katzenelson E., Fattal B. ja Hostovesky T. 1976. Organic flocculation: an efficient second-step concentration method for the detection of viruses in tap water. Applied and Environmental Microbiology 32, 4. 638-639. Kauppinen A., Ikonen J., Pursiainen A., Pitkanen T. ja Miettinen I.T. 2012. Decontamination of a drinking water pipeline system contaminated with adenovirus and Escherichia coli utilizing peracetic acid and chlorine. Journal of Water and Health 10, 3. 406-418. Kauppinen A., Martikainen K., Matikka V., Veijalainen A., Pitkanen T., Heinonen-Tanski H., ym. 2014. Sand filters for removal of microbes and nutrients from wastewater during a oneyear pilot study in a cold temperate climate. Journal of Environmental Management 133, 206213. Kearns E.A., Magana S. ja Lim D.V. 2008. Automated concentration and recovery of microorganisms from drinking water using dead-end ultrafiltration. Journal of Applied Microbiology 105, 2. 432-442. Kfir R., Hilner C., du Preez M. ja Bateman B. 1995. Studies evaluating the applicability of utilising the same concentration techniques for the detection of protozoan parasites and viruses in water. Water Science and Technology 31, 5–6. 417-423. Khan I.U.H. ja Edge T.A. 2007. Development of a novel triplex PCR assay for the detection and differentiation of thermophilic species of Campylobacter using 16S-23S rDNA internal transcribed spacer (ITS) region. Journal of Applied Microbiology 103, 6. 2561-2569. Knappett P.S.K., Layton A., McKay L.D., Williams D., Mailloux B.J., Huq M.R., ym. 2011. Efficacy of Hollow-Fiber Ultrafiltration for Microbial Sampling in Groundwater. Ground Water 49, 1. 53-65. Kratzer A., Liebchen U., Schleibinger M., Kees M.G. ja Kees F. 2014. Determination of free vancomycin, ceftriaxone, cefazolin and ertapenem in plasma by ultrafiltration: Impact of experimental conditions. Journal of Chromatography B-Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences 961, 97-102. Kuopion Vesi. 2009. Hyvä vesi puhdas ympäristö https://www.kuopio.fi/c/document_library/get_file?uuid=52ba746b-3ada-4e78-b9af008099656186&groupId=518539 28.7.2014. -esite. 76 Lambertini E., Spencer S.K., Bertz P.D., Loge F.J., Kieke B.A. ja Borchardt M.A. 2008. Concentration of enteroviruses, adenoviruses, and noroviruses from drinking water by use of glass wool filters. Applied and Environmental Microbiology 74, 10. 2990-2996. Lecler H., ym. 2004. Microbial agents associated with waterborne diseases. Teoksessa: Cloete T, Rose J, Nel L and Ford T. Microbial Waterborne Pathogens. IWA Publishing. Lontoo, Yhdistynyt kuningaskunta. 1-54. Lehtola M.J., Torvinen E., Kusnetsov J., Pitkanen T., Maunula L., von Bonsdorff C., ym. 2007. Survival of Mycobacterium avium, Legionella pneumophila, Escherichia coli, and caliciviruses in drinking water-associated biofilms grown under high-shear turbulent flow. Applied and Environmental Microbiology 73, 9. 2854-2859. Leskinen S.D., Kearns E.A., Jones W.L., Miller R.S., Bevitas C.R., Kingsley M.T., ym. 2012. Automated dead-end ultrafiltration of large volume water samples to enable detection of lowlevel targets and reduce sample variability. Journal of Applied Microbiology 113, 2. 351-360. Leskinen S.D., Harwood V.J. ja Lim D.V. 2009. Rapid dead-end ultrafiltration concentration and biosensor detection of enterococci from beach waters of Southern California. Journal of Water and Health 7, 4. 674-684. Lewis G. ja Metcalf T. 1988. Polyethylene-Glycol Precipitation for Recovery of Pathogenic Viruses, Including Hepatitis-a Virus and Human Rotavirus, from Oyster, Water, and Sediment Samples. Applied and Environmental Microbiology 54, 8. 1983-1988. Liikanen R. 2007. Kalvosuodatustekniikat – vaihtoehtoja veden- ja jätevedenkäsittelyyn. Vesitalous 3. 7-10. Lindquist H.D.A., ym. 2011. Taking the Hay Out of the Haystack: Collecting and Processing Water Samples. Teoksessa: MacRae J. Environmental microbiology: Current technology and water applications. Univ Chicago Press. Chigago, Yhdysvallat. 39-64. Lindquist H.D.A., Harris S., Lucas S., Hartzel M., Riner D., Rochele P., ym. 2007. Using ultrafiltration to concentrate and detect Bacillus anthracis, Bacillus atrophaeus subspecies globigii, and Cryptosporidium parvum in 100-liter water samples. Journal of Microbiological Methods 70, 3. 484-492. Lukasik J., Scott T., Andryshak D. ja Farrah S. 2000. Influence of salts on virus adsorption to microporous filters. Applied and Environmental Microbiology 66, 7. 2914-2920. Manahan S.E. 2004. Environmental chemistry. 8 Edition. Lewis Publisher. Boca Raton, Florida, Yhdysvallat. Marlowe E., ym. 2000. Nucleic Acid-Based Methods of Analysis. Teoksessa: Maier R, Pepper I and Gerba C. Environmental Microbiology. Academic Press. Lontoo, Yhdistynyt kuningaskunta. 287-317. McEgan R., Rodrigues C.A.P., Sbodio A., Suslow T.V., Goodridge L.D. ja Danyluk M.D. 2013. Detection of Salmonella spp. from large volumes of water by modified Moore swabs and tangential flow filtration. Letters in Applied Microbiology 56, 2. 88-94. 77 Méndez J., Audicana A., Isern A., Llaneza J., Moreno B., Tarancón M.L., ym. 2004. Standardised evaluation of the performance of a simple membrane filtration-elution method to concentrate bacteriophages from drinking water. Journal of Virological Methods 117, 1. 19-25. Meriläinen P., Pitkänen T. ja Miettinen I.T. 2012. Kvantitatiivinen mikrobiologinen riskinarviointi (QMRA) Suomessa/Quantitative microbial risk assessment (QMRA) in Finland. Vesitalous 3. 20-25. Miettinen I.T., ym. 2009. Number of outbreaks of waterborne diseases attributable to drinkingwater and bathing water each year. Outbreaks of Waterborne Diseases, Fact Sheet 1.1. European Environment and Health Information System (ENHIS), WHO. Eurooppa. http://www.euro.who.int/__data/assets/pdf_file/0009/96885/1.1.-Outbreaks-of-waterbornediseases-EDITED_layout_V03.pdf. Miettinen I., Zacheus O., von Bonsdorff C. ja Vartiainen T. 2001. Waterborne epidemics in Finland in 1998-1999. Water Science and Technology 43, 12. 67-71. Morales-Morales H., Vidal G., Olszewski J., Rock C., Dasgupta D., Oshima K., ym. 2003. Optimization of a reusable hollow-fiber ultrafilter for simultaneous concentration of enteric bacteria, protozoa, and viruses from water. Applied and Environmental Microbiology 69, 7. 4098-4102. Mull B. ja Hill V.R. 2009. Recovery and Detection of Escherichia coli O157:H7 in Surface Water, Using Ultrafiltration and Real-Time PCR. Applied and Environmental Microbiology 75, 11. 3593-3597. National Research Council. 2004. Indicators for waterborne pathogens. The National Academies Press. Washington, Yhdysvallat. Nel L., ym. 2004. Emerging infectious waterborne diseases: protozoan agents. Teoksessa: Cloete T, Rose J, Nel L and Ford T. Microbial Waterborne Pathogens. IWA Publishing. Lontoo, Yhdistynyt kuningaskunta. 89-99. Nel L., ym. 2004. Emerging infectious waterborne diseases: viral agents. Teoksessa: Cloete T, Rose J, Nel L and Ford T. Microbial Waterborne Pathogens. IWA Publishing. Lontoo, Yhdistynyt kuningaskunta. 78-88. Nigam M.O., Bansal B. ja Chen X.D. 2008. Fouling and cleaning of whey protein concentrate fouled ultrafiltration membranes. Desalination 218, 1-3. 313-322. Nordgren J., Matussek A., Mattsson A., Svensson L. ja Lindgren P. 2009. Prevalence of norovirus and factors influencing virus concentrations during one year in a full-scale wastewater treatment plant. Water Research 43, 4. 1117-1125. Ongerth J. ja Stibbs H. 1987. Identification of Cryptosporidium Oocysts in River Water. Applied and Environmental Microbiology 53, 4. 672-676. Pagel J., Qureshi A., Young D. ja Vlassoff L. 1982. Comparison of four membrane filter methods for fecal coliform enumeration. Applied and Environmental Microbiology 43, 4. 787793. 78 Patrone V., Campana R., Vallorani L., Dominici S., Federici S., Casadei L., ym. 2013. CadF expression in Campylobacter jejuni strains incubated under low-temperature water microcosm conditions which induce the viable but non-culturable (VBNC) state. Antonie Van Leeuwenhoek International Journal of General and Molecular Microbiology 103, 5. 979-988. Payment P., Berube A., Perreault D., Armon R. ja Trudel M. 1989. Concentration of Giardia lamblia cysts, Legionella pneumophila, Clostridium perfringens, human enteric viruses, and coliphages from large volumes of drinking water, using a single filtration. Canadian Journal of Microbiology 35, 10. 932-935. Pepper I., ym. 2000. Environmental Sample Collection and Processing. Teoksessa: Maier R, Pepper I and Gerba C. Environmental Microbiology. Academic Press. Lontoo, Yhdistynyt kuningaskunta. 177-194. Petterson S., Signor R., Ashbolt N. ja Roser D. 2006. QMRA Methodology. Microrisk-projekti. http://www.microrisk.com/uploads/microrisk_qmra_methodology.pdf. Pitkänen T. 2008. Bathing water quality and microbiological methods. Ympäristö Ja Terveys 2. 16-19. Pitkänen T., Meriläinen P. ja Miettinen I.T. 2011. Quantitative assessment of microbiological risks transmitted by household water. Vesivälitteisten mikrobiologisten riskien kvantitatiivinen arviointi. Vesitalous 3. 6-10. Pitkänen T. 2010. Studies on the detection methods of Campylobacter and faecal indicator bacteria in drinking water. National Istitute for Health and Welfare. Research 39, Helsinki. http://www.thl.fi/thl-client/pdfs/e5b43e6a-021e-40a3-9381-3aa24f98e722. Pitkänen T. 2013. Review of Campylobacter spp. in drinking and environmental waters. Journal of Microbiological Methods 95, 1. 39-47. Polaczyk A., Roberts J. ja Hill V. 2007. Evaluation of 1 MDS electropositive microfilters for simultaneous recovery of multiple microbe classes from tap water. Journal of Microbiological Methods 68, 260-266. Polaczyk A.L., Narayanan J., Cromeans T.L., Hahn D., Roberts J.M., Amburgey J.E., ym. 2008. Ultrafiltration-based techniques for rapid and simultaneous concentration of multiple microbe classes from 100-L tap water samples. Journal of Microbiological Methods 73, 2. 92-99. Reasoner D. ja Geldreich E. 1985. A New Medium for the Enumeration and Subculture of Bacteria from Potable Water. Applied and Environmental Microbiology 49, 1. 1-7. Reynolds K., ym. 2000. Microorganisms in the Environment. Teoksessa: Maier R, Pepper I and Gerba C. Environmental Microbiology. Academic Press. Lontoo, Yhdistynyt kuningaskunta. 741. Rhodes E.R., Hamilton D.W., See M.J. ja Wymer L. 2011. Evaluation of hollow-fiber ultrafiltration primary concentration of pathogens and secondary concentration of viruses from water. Journal of Virological Methods 176, 1-2. 38-45. 79 Richardson A., Frankenberg R., Buck A., Selkon J., Colbourne J., Parsons J., ym. 1991. An Outbreak of Waterborne Cryptosporidiosis in Swindon and Oxfordshire. Epidemiology and Infection 107, 3. 485-495. Rimhanen-Finne R., Horman A., Ronkainen P. ja Hanninen M. 2002. An IC-PCR method for detection of Cryptosporidium and Giardia in natural surface waters in Finland. Journal of Microbiological Methods 50, 3. 299-303. Rusin P., ym. 2000. Environmentally Transmitted Pathogens. Teoksessa: Maier R, Pepper I and Gerba C. Environmental Microbiology. Academic Press. Lontoo, Yhdistynyt kuningaskunta. 447-489. Sails A., Bolton F., Fox A., Wareing D. ja Greenway D. 2002. Detection of Campylobacter jejuni and Campylobacter coli in environmental waters by PCR enzyme-linked immunosorbent assay. Applied and Environmental Microbiology 68, 3. 1319-1324. Santo Domingo J.W., Bambic D.G., Edge T.A. ja Wuertz S. 2007. Quo vadis source tracking? Towards a strategic framework for environmental monitoring of fecal pollution. Water Research 41, 16. 3539-3552. Sbodio A., Maeda S., Lopez-Velasco G. ja Suslow T.V. 2013. Modified Moore swab optimization and validation in capturing E. coli O157:H7 and Salmonella enterica in large volume field samples of irrigation water. Food Research International 51, 2. 654-662. Schijven J.F., Hassanizadeh S.M. ja Husman A.M.d.R. 2010. Vulnerability of unconfined aquifers to virus contamination. Water Research 44, 4. 1170-1181. Schijven J., de Bruin H., Hassanizadeh S. ja Husman A. 2003. Bacteriophages and Clostridium spores as indicator organisms for removal of pathogens by passage through saturated dune sand. Water Research 37, 9. 2186-2194. SFS. 1999. Veden laatu. Viljeltävien mikro-organismien lukumäärän laskeminen. Pesäkelasku siirrostamalla agar-ravintoalustaan, SFS-EN ISO 6222. SFS. 2000. Veden laatu. Suolistoperäisten enterokokkien havaitseminen ja laskeminen. Osa 2: Kalvosuodatusmenetelmä, SFS-EN ISO 7899-2. SFS. 2002. Veden laatu. Bakteriofaagien havaitseminen ja laskeminen. Osa 1: F-spesifisten RNA-bakteriofaagien laskeminen, SFS-EN ISO 10705-1. SFS. 2008a. Veden laatu. Pseudomonas aeruginosan havaitseminen ja lukumäärän määritys. Kalvosuodatustekniikka, SFS-EN ISO 16266. SFS. 2008b. Veden laatu. Yleinen ohje mikro-organismien lukumäärien määrittämiseksi viljelymenetelmällä, SFS-EN ISO 8199. SFS. 2010. Veden laatu. Escherichia colin ja koliformisten bakteerien toteaminen ja laskeminen. Osa 1: Kalvosuodatusmenetelmä, SFS-EN ISO 9308-1 + AC. 80 SFS. 2011. Veden laatu. Koliformisten kalvosuodatusmenetelmällä, SFS 3016. bakteerien kokonaismäärän määritys Simmons O., Sobsey M., Heaney C., Schaefer F. ja Francy D. 2001. Concentration and detection of Cryptosporidium oocysts in surface water samples by method 1622 using ultrafiltration and capsule filtration. Applied and Environmental Microbiology 67, 3. 11231127. Smeets P., Rietveld L., Hijnen W., Medema G. ja Stenström T. 2006. Efficacy of water treatment processes, Microrisk. Microrisk-Projektin Raportti . Smith C.M. ja Hill V.R. 2009. Dead-End Hollow-Fiber Ultrafiltration for Recovery of Diverse Microbes from Water. Applied and Environmental Microbiology 75, 16. 5284-5289. STM. 2000. Sosiaali- ja terveysministeriön asetus 461/2000 talousveden laatuvaatimuksista ja valvontatutkimuksista. STM. 2001. Sosiaali- ja terveysministeriön asetus 401/2001 pienten yksiköiden talousveden laatuvaatimuksista ja valvontatutkimuksista . STM ja THL. 2014. Suomi ottaa vesilaitoksissa käyttöön talousveden riskienhallintajärjestelmän. http://www4.thl.fi/fi_FI/web/fi/tiedote?id=35857 7.8.2014. Theron J., ym. 2004. Emerging microbiological detection techniques. Teoksessa: Cloete T, Rose J, Nel L and Ford T. Microbial Waterborne Pathogens. IWA Publishing. Lontoo, Yhdistynyt kuningaskunta. 155-175. THL. 2014. Vesiepidemiat. http://www.thl.fi/fi/web/ymparistoterveys/vesi/vesiepidemiat 28.7.2014. Thomas M., Charron D., Waltner-Toews D., Schuster C., Maarouf A. ja Holt J. 2006. A role of high impact weather events in waterborne disease outbreaks in Canada, 1975-2001. International Journal of Environmental Health Research 16, 3. 167-180. Timberley M., ym. 2000. Microscopic techniques. Teoksessa: Maier R, Pepper I and Gerba C. Environmental Microbiology. Academic Press. Lontoo, Yhdistynyt kuningaskunta. 195-212. US EPA. 2001a. Method 1601: Male-specific (F+) and Somatic Coliphage in Water by Twostep Enrichment Procedure. US EPA. 2001b. Method 1602: Male-specific (F+) and Somatic Coliphage in Water by Single Agar Layer (SAL) Procedure. US EPA. 2005. Method 1623: Cryptosporidium and Giardia in Water by Filtration/IMS/FA. US EPA. 2012. Method 1651: Measurement of enterovirus and norovirus occurence in water by culture and RT-qPCR. US EPA. 2013. Standard Operating Procedure for Performing Dead-end Ultrafiltration. Revision 4. 81 Valtioneuvosto. 1994a. Terveydensuojeluasetus 1280/1994. Valtioneuvosto. 1994b. Terveydensuojelulaki 763/1994. Valtioneuvosto. 1994c. Valtioneuvoston päätös 366/1994 juomaveden valmistamiseen tarkoitetun pintaveden laatuvaatimuksista ja tarkkailusta. Valvira. 2009. Ohje Talousveden laadun turvaaminen erityistilanteissa. http://www.valvira.fi/files/ohjeet/erityistilannesuunnitelma2009_310309.pdf. Valvira. 2014. Terveydensuojelulain mukaisissa tutkimuksissa käytettävät menetelmät. Ohje nro 2. http://www.valvira.fi/files/ohjeet/TESU/Terveydensuojelulain_mukaisissa_tutkimuksissa_kay tettavat_menetelmat_140214.pdf. van Lieverloo J.H.M., Mesman G.A.M., Bakker G.L., Baggelaar P.K., Hamed A. ja Medema G. 2007. Probability of detecting and quantifying faecal contaminations of drinking water by periodically sampling for E. coli: A simulation model study. Water Research 41, 19. 42994308. Veenendaal H. ja Brouwer-Hanzens A. 2007. A method for the concentration of microbes in large volumes of water. Techneau-projektin raportti. Techneau-projektin raportti. http://www.techneau.org/fileadmin/files/Publications/Publications/Deliverables/D3.2.4.pdf. Vesey G., Slade J., Byrne M., Shepherd K. ja Fricker C. 1993. A new method for the concentration of Cryptosporidium oocysts from Water. Journal of Applied Bacteriology 75, 1. 82-86. Vesiopas. 2013. http://fi.opasnet.org/fi/Vesiopas 7.8.2014. WHO. 2011. Guidelines for drinking water quality, 4 Edition. http://www.who.int/water_sanitation_health/publications/2011/dwq_guidelines/en/ 20.6.2014. Widerström M., Schönning C., Lilja M., Lebbad M., Ljung T., Allestam G., ym. 2014. Large Outbreak of Cryptosporidium hominis Infection Transmitted through the Public Water Supply, Sweden. Emerging Infectious Diseases 20, 4. 581-589. Winona L., Ommani A., Olszewski J., Nuzzo J. ja Oshima K. 2001. Efficient and predictable recovery of viruses from water by small scale ultrafiltration systems. Canadian Journal of Microbiology 47, 11. 1033-1041. Wu J., Simmons O. ja Sobsey M.D. 2013. Uncertainty analysis of the recovery of hollow-fiber ultrafiltration for multiple microbe classes from water: A Bayesian approach. Journal of Microbiological Methods 93, 3. 161-167. Zacheus O. 2010. Talousveden valvonta ja laatu vuonna 2008, Yhteenveto viranomaisvalvonnan tuloksista. Terveyden Ja Hyvinvoinnin Laitoksen Avauksia 18. http://www.thl.fi/thl-client/pdfs/36e9255a-2e2c-409a-ac0f-d2239eccc439. 82 Zacheus O. ja Miettinen I.T. 2011. Increased information on waterborne outbreaks through efficient notification system enforces actions towards safe drinking water. Journal of Water and Health 9, 4. 763-772. Zamparo O. ja Comper W. 1990. Model Anionic Polysaccharide Matrices Exhibit Lower Charge Selectivity than is Normally Associated with Kidney Ultrafiltration. Biophysical Chemistry 38, 1-2. 167-178. Zuckerman U., Armon R., Tzipori S. ja Gold D. 1999. Evaluation of a portable differential continuous flow centrifuge for concentration of Cryptosporidium oocysts and Giardia cysts from water. Journal of Applied Microbiology 86, 6. 955-961. Zuckerman U. ja Tzipori S. 2006. Portable continuous flow centrifugation and method 1623 for monitoring of waterborne protozoa from large volumes of various water matrices. Journal of Applied Microbiology 100, 6. 1220-1227.
