docOhjelmalehtinen - Turun yliopisto
download 
Report Transcription
Ohjelmalehtinen - Turun yliopisto
NUORET TUTKIJAT 2015 Biokemian laitos NUORET TUTKIJAT 2015 Ida Alm-Ndiaye Niklas Ekman Riitta Haataja Anna Haavisto Kaisa Halme Teppo Heimo Pekka Heljakka Marke Hovi Rosita Johansson Joni Juvonen Annika Järvinen Antti Kulmala Susanna Lammi Anna-Maija Lempainen Annika Lyytikäinen Moona Miettinen Reijo Niemi Johanna Paasio Tiina Pasma Antti Pihlava Jonna Pörsti Anssi Rantasalo Essi Ruohisto Johanna Salo Anita Santana Sanchez Elina Taipalus Minna Tuovinen Aleksi Uusitupa Karlo Villa Mira Virkki Markus Virtanen 1 NUORET TUTKIJAT 2015 -ESITELMÄT Tiistai 17.3.2015 - perjantai 20.3.2015 Alkaen kello 12.15 Arcanum Arc1-Sali POSTERINÄYTTELY Tiistai 17.3.2015 - perjantai 20.3.2015 Arcanum ala-aula POSTERITAPAHTUMA Keskiviikko 18.3.2015 13.35 -15.00 Arcanum ala-aula EVÄITÄ TYÖELÄMÄÄN -PUHEENVUOROT Torstai 19.3. klo 15.55 Perjantai 20.3. klo 14.35 Arcanum Arc1-sali LOPPUSANAT Perjantai 20.3.2015 kello 15.10 2 Tiistai 17.3.2015 Sessio I Puheenjohtaja: Kati Thiel Viikon avaus 12.15 Prof. Eevi Rintamäki Molekulaarisen kasvibiologian professori 12.25 Anita Santana Sanchez MOLEKULAARINEN KASVIBIOLOGIA Potential of native microalgae strains grown in wastewater for biodiesel production in the Nordic climate 12.45 Essi Ruohisto MOLEKULAARINEN KASVIBIOLOGIA Quest for the interaction partners of flv4-sll0218-flv2 operon-encoded proteins in cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 13.05 – 13.25 TAUKO 20 minuuttia TIISTAI 17.3.2015 13.25 – 14.45 Sessio II Puheenjohtaja: Jarmo Käpylä 13.25 Elina Taipalus BIOKEMIA Soluväliaineen vaikutus eturauhassyöpäsolujen lääkeaineherkkyyteen 13.45 Jonna Pörsti BIOKEMIA Prk-proteiinien aktiivisuuden tai ilmenemisen eston vaikutukset Caenorhabditis elegans –sukkulamadoissa 14.05 Reijo Niemi BIOKEMIA Fagolysosomaalisten hapettavien aineiden toksisuus E. colia kohtaan 3 14.25 Moona Miettinen BIOKEMIA Parechovirustyyppien 1 ja 3 pH-riippuvainen endosytoosi 14.45 – 15.05 TAUKO 20 minuuttia TIISTAI 17.3.2015 15.05 – 16.15 Sessio III Puheenjohtaja: Maaria Kortesniemi 15.05 Antti Väisänen Luonnontieteiden Akateemisten Liitto LAL ry ”Katsaus bioalan työllisyyteen ja työelämässä tarvittavat taidot” 15.35 Rosita Johansson ELINTARVIKEKEHITYS DI Uuden kananmunajalosteen tuotekehitys 15.55 Kaisa Halme ELINTARVIKEKEHITYS FM Kauran beetaglukaanin vaikutus puolukan aistittavaan laatuun 4 KESKIVIIKKO 18.3.2015 12.15 – 13.35 Sessio IV Puheenjohtaja: Leenamaija Mäkilä 12.15 Mira Virkki ELINTARVIKEKEHITYS DI Omenan fenoliset yhdisteet siiderin valmistusprosessissa 12.35 Karlo Villa ELINTARVIKEKEHITYS DI Nestemäisen hiilidioksidiuuttomenetelmän mallintaminen ja mausteuutteiden analyysiin tarkoitetun kaasukromatografisen menetelmän kehittäminen 12.55 Riitta Haataja ELINTARVIKEKEHITYS DI Flavonolien biosynteesi tyrnin (Hippophaë rhamnoides L.) marjoissa 13.15 Johanna Paasio ELINTARVIKEKEHITYS DI Suolan korvaaminen leivässä – vaikutus makuun ja miellyttävyyteen KESKIVIIKKO 18.3.2015 13.35 -15.00 Posterisessio Arcanum ala-aula Opiskelijat postereidensa äärellä Tarjoilua 5 KESKIVIIKKO 18.3.2015 15.00 – 16.20 Sessio V Puheenjohtaja: Juhani Aakko 15.00 Aleksi Uusitupa ELINTARVIKEKEMIA Kasvi- ja marjauutteiden antioksidanttikapasiteetin määritys TRAPmenetelmää käyttäen 15.20 Tiina Pasma ELINTARVIKEKEMIA Prosessoidun maidon ja raakamaidon aiheuttamat vatsaoireet ja aterian jälkeinen aineenvaihdunta tutkimushenkilöillä 15.40 Johanna Salo ELINTARVIKEKEMIA Sinisten perunoiden antosyaniinit ja aterianjälkeinen glykemia 16.00 Markus Virtanen ELINTARVIKEKEMIA Mausteiden ja yrttien haihtuvien yhdisteiden aistiminen 6 TORSTAI 19.3.2015 12.15 – 13.15 Sessio VI Puheenjohtaja: Henna Päkkilä 12.15 Anna Haavisto BIOTEKNIIKKA DI Lihasperäiselle kreatiinikinaasille spesifisen immunomäärityksen suunnittelu ja automatisointi 12.35 Minna Tuovinen BIOTEKNIIKKA DI Mikropartikkelit kiintokantajina potilasläheisessä hepatiitti B -määrityksessä 12.55 Marke Hovi MOLEKULAARINEN BIOTEKNIIKKA JA DIAGNOSTIIKKA Lysosomaalisten kertymäsairauksien seulonnassa käytettävän reagenssikomponentin valmistusprosessin karakterisointi 13.15 - 13.35 TAUKO 20 minuuttia TORSTAI 19.3.2015 13.35 – 14.35 Sessio VII Puheenjohtaja:Markus Vehniäinen 13.35 Pekka Heljakka BIOTEKNIIKKA DI Upkonvertoivien nanopartikkelien luminesenssin tehostaminen orgaanisten kromoforien avulla 13.55 Joni Juvonen BIOTEKNIIKKA DI Panossyöttökasvatusprosessin automatisointi 14.15 Anssi Rantasalo BIOTEKNIIKKA DI Modular and tunable gene expression system for Saccharomyces cerevisiae 14.35-14.55 TAUKO 20 minuuttia 7 TORSTAI 19.3.2015 14.55 – 16.20 Sessio VIII Puheenjohtaja: Susanne Lahdenperä 14.55 Anna-Maija Lempainen BIOTEKNIIKKA DI Kelaattikomplementaatioon perustuvan integroidun DNA:n monistus- ja detektointimenetelmän kehitys 15.15 Annika Järvinen BIOTEKNIIKKA DI Munasarjasyöpäspesifisen diagnostiikkamäärityksen kehittäminen: CA125lektiinimääritys 15.35 Antti Pihlava BIOTEKNIIKKA DI Upkonvertoivien nanopartikkelileimojen erottelumenetelmät 15.55 Aluminpuheenvuoro Petri Susi Turun yliopisto, Biolääketieteen laitos, Virusoppi 8 PERJANTAI 20.3.2015 12.55 – 13.15 Sessio IX Puheenjohtaja: Heidi Hyytiä 12.15 Ida Alm-Ndiaye MOLEKULAARINEN BIOTEKNIIKKA JA DIAGOSTIIKKA Veritäpläpohjaisen fragiili X -testauksen pystyttäminen 12.35 Annika Lyytikäinen MOLEKULAARINEN BIOTEKNIIKKA JA DIAGNOSTIIKKA Heterogeeninen upkonvertoiviin nanopartikkeleihin perustuva immunomääritys sydänspesifiselle troponiini I:lle 12.55 Antti Kulmala MOLEKULAARINEN BIOTEKNIIKKA JA DIAGNOSTIIKKA Fab-fragmentin DNA-sekvenssin vaikutus Escherichia colin kasvuun ja tuottoominaisuuksiin 13.15 – 13.35 TAUKO 20 minuuttia 9 PERJANTAI 20.3.2015 13.35 – 15.25 Sessio X Puheenjohtaja: Janne Leivo 13.35 Teppo Heimo MOLEKULAARINEN BIOTEKNIIKKA JA DIAGNOSTIIKKA Rekombinanttivasta-aineen affiniteetin parantaminen suunnatun evoluution avulla 13.55 Susanna Lammi MOLEKULAARINEN BIOTEKNIIKKA JA DIAGNOSTIIKKA Faaginäyttötekniikalla uusia vasta-aineita luustolihasperäiselle troponiini I:lle 14.15 Niklas Ekman MOLEKULAARINEN BIOTEKNIIKKA JA DIAGNOSTIIKKA Eksosomispesifisten vasta-aineiden kehittäminen eturauhassyövän seulontaan 14.35 Alumnipuheenvuoro Olli Sjövall Terveysvalvonnan johtaja, Pyhäjärviseudun ympäristötoimisto, Säkylä kunta 15.10 Loppupuheenvuoro Prof. Eevi Rintamäki Molekulaarisen kasvibiologian professori 10 Potential of native microalgae strains grown in wastewater for biodiesel production in the Nordic climate Anita Santana Sanchez Supervisors: Ph.D. Fiona Lynch & Ph.D. Yagut Allahverdiyeva-Rinne MOLECULAR PLANT BIOLOGY The imminent depletion of fossil fuels and their significant contribution to environmental pollution have increased the need for new alternatives which are clean, sustainable and renewable. Microalgae have been shown to be a promising biodiesel feedstock, predicted to outperform traditional energy crops on an area basis. An exceptional adaptability to changes in environmental conditions is an advantage towards a more efficient and inexpensive production of biodiesel. Drastic seasonal variations in temperature and daylight availability are characteristic for Nordic climates. The screening of Nordic native microalgae strains to find well-adapted organisms may potentially reduce the energy input in the cultivation process. We have assessed eight native Finnish microalgae strains, using synthetic municipal wastewater as a low-cost nutrient source, for their lipid and biomass productivity coupled with nutrient removal ability. A one-step in situ transesterification method was employed to maximize the coverage of lipids detected in the whole microalgal biomass. These lipids were converted to Fatty Acid Methyl Esters (FAME) and identified by GC/MS analysis. Native Finnish green algae UHCC0027 stood out as the best candidate for dual application in wastewater nutrient removal and as a biodiesel feedstock, having high lipid content and suitable fatty acids composition (C16:0, 20.8%; C18:1, 25.29%; C18:2, 15.76%; C18:3, 24.29%). However; further optimizations of cultivation conditions are needed to meet economically feasible biofuel production using this native strain. Keywords: Native microalgae, biodiesel, wastewater 11 Quest for the interaction partners of flv4-sll0218-flv2 operon-encoded proteins in cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 Essi Ruohisto Supervisor: PhD, docent Natalia Battchikova MOLECULAR PLANT BIOLOGY Oxygenic photosynthesis creates a highly oxidizing intracellular environment and therefore several photoprotective mechanisms have evolved to safeguard the photosynthetic machinery from oxidative stress. Recently, the flv4-sll0218-flv2 operon was shown to have a role in photoprotection in cyanobacteria. The operon encodes flavodiiron proteins Flv4 and Flv2 along with a small hydrophobic protein (Sll0218 in Synechocystis sp. PCC 6803) with unknown function. It is strongly suggested that Flv2 and Flv4 form a heterodimer which is capable of rapid electron transfer from FMN moiety of Flv2 to diiron centre of Flv4 and safeguards photosystem II activity by sequestering the excess of electrons from the photosynthetic chain. Sll0218 has been shown to be associated with so far unidentified large protein complex. The exact photoprotection mechanisms of Flv4/Flv2 heterodimer and function of Sll0218 remain to be clarified. The aim of our study was to elucidate the interaction partners of flv4-sll0218-flv2 operon-encoded proteins by purifying the proteins with affinity chromatography. For that purpose C- and N- termini of Flv2 and Flv4 were tagged with either FLAG-tag or STREP-tag. Further, His6-tag was attached to C-terminus of Sll0218 but this approach resulted in a loss of Flv2 production. Stable expression was obtained only for NFLAG-Flv4, C-STREP-Flv2 and Sll0218-His6. However, purification of tagged Flv2 and Flv4 with standard affinity chromatography method proved to be inefficient. We speculate that attached tags might be enclosed inside the putative Flv2/Flv4 heterodimer, and thus binding to corresponding affinity resin is obstructed. Nevertheless, Flv2/Flv4 heterodimer formation got further support from our results as the presence of Flv2 protein was verified in N-FLAG-Flv4 preparation by immunoblot analysis. Purification of Sll0218-His6 was more successful, but the interaction partners of this protein remain to be elucidated. Next we will reintroduce Flv2 into a system that expresses Flv4 and Sll0218-His6 in order to study further the possible interactions of these proteins. Keywords: flavodiiron proteins, Sll0218, flv-operon, photoprotection, affinity chromatography 12 13 Soluväliaineen vaikutus eturauhassyöpäsolujen lääkeaineherkkyyteen Elina Taipalus Ohjaajat: FM Marjaana Ojalill ja prof. Jyrki Heino BIOKEMIA Syöpäkasvaimen mikroympäristön tiedetään vaikuttavan syövän etenemiseen ja invaasioon. Mikroympäristössä syöpäsolujen aktivoimat fibroblastit tuottavat liukoisia tekijöitä ja muokkaavat soluväliainetta siten, että mikroympäristö muuttuu syövän etenemisen kannalta edulliseksi. Tätä dynaamista ympäristöä pidetään yhtenä syynä eturauhassyövän lääkeresistenttiyden kehittymiseen. Mikroympäristön arvellaan myös ylläpitävän kantasolunkaltaista solupopulaatiota, joka eturauhassyöpäsoluilla tunnistetaan α2β1-integriinin, CD44:n ja CD133:n korkean ilmentymisen perusteella. Erikoistyössä tutkittiin, miten eturauhaskudoksesta eristettyjen fibroblastien tuottama soluväliaine vaikuttaa DU145-eturauhassyöpäsolujen lääkeaineherkkyyteen. Fibroblastien tuottaman soluväliaineen, kollageeni I:n tai fibronektiinin päällä kasvavat DU145-solut altistettiin doketakseli-syöpälääkkeelle ja eloonjääneet solut havaittiin kolorimetrisesti. Eloonjääneiden solujen α2-integriinin ja CD44:n ilmentymistasot analysoitiin lisäksi virtaussytometrisesti. Lopuksi määritettiin α2integriinin ilmentymiseen perustuvien α2Matala ja α2Korkea alapopulaatioiden doketakseliherkkyys. Fibroblastien tuottaman soluväliaineen ei havaittu suojaavan DU145-soluja doketakselilta in vitro: lääkkeen sytotoksisuutta kuvaavat IC50-arvot olivat sekä soluväliaineella että yksittäisillä soluväliaineen proteiineilla 18 – 20 nM. Lääkekäsittelystä eloonjääneet solut ilmensivät kuitenkin tilastollisesti merkitsevästi enemmän α2-integriiniä ja CD44:ää (P < 0.05, parittainen t-testi). Vastaavasti α2Korkea alapopulaatiossa CD44:n ilmentyminen oli lisääntynyt ja doketakselikäsittelystä eloonjääneiden solujen määrä hieman suurentunut. Tämä viittaa siihen, että vaikka suurin osa syöpäsoluista on soluväliaineesta riippumatta herkkiä doketakselille, pieni α2Korkea/CD44Korkea fenotyypin solupopulaatio jää henkiin ja mahdollisesti edistää doketakseliresistenttiyttä. Lääkeresistenttiyden ja α2-integriinin lisääntyneen ilmentymisen välisen yhteyden vuoksi tutkimukset kohdistuvat jatkossa α2-integriinin ja soluväliaineen vuorovaikutuksen selvittämiseen. Asiasanat: Eturauhassyöpä, soluväliaine, doketakseliherkkyys, α2Korkea/CD44Korkea 14 Prk-proteiinien aktiivisuuden tai ilmenemisen eston vaikutukset Caenorhabditis elegans -sukkulamadoissa Jonna Pörsti Ohjaajat: Dos. Päivi Koskinen, FM Niina Santio BIOKEMIA Prk-proteiinit (engl. Pim-related kinase) ovat sukkulamadoista löydettyjä nisäkkäiden Pim-kinaasien ortologeja. Pim-kinaasit ovat onkogeenisiä seriini/treoniiniproteiinikinaaseja, joiden aktiivisuutta soluissa säädellään pääasiassa transkription kautta. Niitä ilmennetään liiallisesti niin kiinteissä kuin hematologisissa kasvaimissa, jolloin niiden yliaktiivisuus edistää syöpäsolujen liikkuvuutta ja elinkykyä. Siksi Pimkinaasit ovatkin lupaavia syöpälääkekehittelyn kohteita. Pienimolekyyliset Piminhibiittorit estävät myös Prk-proteiinien aktiivisuutta, joten niiden avulla voidaan tutkia Pim-ortologien säätelemiä, evolutiivisesti konservoituneita fysiologisia ilmiöitä. C. elegans –sukkulamadon kahden Prk-proteiinin toimintaa tutkittiin aluksi in vitro. Prk2- ja Prk1c-kinaaseja tuotettiin E. coli –bakteerisoluissa GST-fuusioproteiineina. Proteiinien ilmentymistä tarkastettiin SDS-PAGE –geeliajomenetelmällä ja niiden fosforylaatiokykyä tutkittiin radioaktiivisen ATP:n (isotooppi 32P) avulla. Positiivisena kontrollina käytettiin ihmisen Pim1 –kinaasia, kinaasien substraattina NFATc1transkriptiotekijää. Sitten Prk-proteiinien inhibition fysiologisia vaikutusta tutkittiin sukkulamadoilla kemotaksiakokein, joissa joko käytettiin Pim-inhibiittoreita tai hiljennettiin Prk-proteiinien tuotantoa RNA-interferenssin avulla. Hiljennyksen onnistumisen varmistamiseksi ja Prk2-proteiinin ilmentymisalueiden tunnistamiseksi suunniteltiin GFP-Prk2 –fuusiokonstrukti, joka on tarkoitus siirtää sukkulamatoihin mikroinjektiolla. Vastaavalla GFP-Prk1-konstruktilla on jo osoitettu, että Prk1 ilmenee hermostossa ja suolistossa. Tutkimuksessa havaittiin, että Prk2-kinaasi toimii Pim-kinaasin tavoin in vitro. Kaikkien Pim-perheen jäsenten aktiivisuutta inhiboiva pyrrolokarbatsoliyhdiste DHPCC-9 vähentää sekä Prk2:n autofosforylaatiota että NFATc1-substraatin fosforylaatiota. Kemotaksiakokeet osoittivat, että se myös heikentää sukkulamatojen hajuaistia. Sen sijaan Pim3-spesifiset bentsoatsuleeniyhdisteet eivät merkittävästi vaikuttaneet Prk2:n aktiivisuuteen tai sukkulamatojen kemotaksiaan. RNAhiljennyksestä saatiin vaihtelevia tuloksia, minkä takia olisi hyvä osoittaa hiljennyskonstruktien toimivuus GFP-Prk –fuusioproteiinien avulla. Asiasanat: Pim-kinaasit, Prk (Pim related kinase), Caenorhabditis elegans, kemotaksia 15 Fagolysosomaalisten hapettavien aineiden toksisuus E. colia kohtaan Reijo Niemi Ohjaajat: FM Janne Atosuo, Dos. Esa-Matti Lilius BIOKEMIA Fagosytoosi on prosessi, jossa immuunijärjestelmän solut–keskeisimpinä neutrofiilit, monosyytit ja makrofagit–ottavat sisäänsä ja tuhoavat patogeenejä. Fagosyytti ympäröi kohteensa solukalvollaan ja ottaa sen sisään sytoplasmaan fagosomiksi kutsutun vakuolin sisällä. Sytoplasmassa fagosomi yhdistyy antimikrobiaalisia aineita sisältäviin lysosomeihin ja rakkuloihin muodostaen fagolysosomin, jossa kohde tuhotaan joko hapesta riippuvaisissa tai riippumattomissa prosesseissa. Happiyhdisteistä keskeisiä ovat NADPH-oksidaasin valmistamasta superoksidista dismutaatioreaktiolla muodostuva vetyperoksidi (H2O2) ja myeloperoksidaasin (MPO) valmistama hypokloriitti (HOCl), joiden toimintaa tässä tutkittiin. H2O2:n, HOCl:n ja MPO:n tehoa tarkasteltiin eri konsentraatioilla ja bakteeripitoisuuksilla ja eri pH-arvoissa. Koeorganismina käytettiin Photorhabdus luminescensin lusiferaasigeeneillä transfektoituja Escherichia coli K12 -soluja, joiden bioluminesenssia seuraamalla saatiin tietoa tappoprosessin etenemisestä. Hapettavien aineiden mahdollisesti indusoimaa ohjelmoitua solukuolemaa tutkittiin leimaamalla E. colin genomi radioaktiivisella tymidiinillä, erottamalla pilkkoutunut DNA ehjästä, ja vertaamalla fraktioiden radioaktiivisuutta. Yhdisteiden tappokäyrissä havaittiin eroja, jotka saattavat viitata erilaisiin tappomekanismeihin. H2O2-pitoisuuden kasvu johti tehokkaampaan tappoon, kun taas HOCl-konsentraation kasvulla ei ollut vaikutusta. HOCl:llä suurempi bakteeripitoisuus heikensi tappoa, kun taas H2O2:lla bakteeripitoisuus ei vaikuttanut merkittävästi tappotehoon. MPO-reaktioissa tappo oli korkeilla pH-arvoilla H2O2:n kaltaista, mutta tehostui merkittävästi alemmilla pH-arvoilla, mikä viittaa MPO:n inhibitioon korkeissa pH:issa. H2O2-tappoon pH ei vaikuttanut merkittävästi, mutta HOCl:llä alempi pH tehosti tappoa huomattavasti. Ohjatun solukuoleman markkerina käytetyn DNA:n pilkkoutumisen tutkiminen on vielä kesken. Asiasanat: fagosytoosi, Escherichia coli, ohjelmoitu solukuolema, myeloperoksidaasi 16 17 Parechovirustyyppien 1 ja 3 pH-riippuvainen endosytoosi Moona Miettinen Ohjaajat: FM Pirjo Merilahti, Dos. Petri Susi BIOKEMIA Ihmisen parechovirukset (HPeV) kuuluvat pikornaviruksiin ja niistä tunnetaan tällä hetkellä 16 genotyyppiä. Ne ovat positiivissäikeisiä RNA-viruksia, joiden genomi on noin 7300 emästä pitkä ja se on pakattu ikosahedraaliseen proteiinikuoreen. Parechovirukset aiheuttavat pääasiassa lieviä ruuansulatuskanavaan tai hengitysteihin kohdistuvia oireita, mutta myös aivokalvontulehduksia ja vakavia yleisinfektioita, etenkin pienillä lapsilla. Osa viruksista läpäisee solukalvon suoraan fuusioitumalla, mutta valtaosa tarvitsee endosytoosia. Endosytoosissa virus sitoutuu solupinnan reseptoriin, minkä jälkeen solukalvolta kuroutuu sytoplasman puolelle vesikkeli (endosomi), jossa virus kulkeutuu replikaatiopaikkaansa. Endosytoosimekanismit vaihtelevat solu- ja viruskohtaisesti. Endosytoosi voi olla esimerkiksi klatriinivälitteistä, makropinosytoosia, kaveoliiniin tai lipidilaittoihin liittyvää. Endosomit kulkeutuvat ja muokkautuvat liikkuessaan solulimassa, jolloin muun muassa niiden sisäinen pH voi laskea. Tämän ajatellaan olevan oleellista joidenkin virusten, kuten parechovirusten, infektiokyvylle Tässä erikoistyössä parechovirustyyppien 1 ja 3 pH-riippuvaista endosytoosia tutkittiin inhibitiokokeiden avulla. Infektiokokeiden avulla valittiin käyttöön HeLa Ohio ja A549-solulinjat, joita molemmat virustyypit infektoivat. Käytössä oli kymmenen erilaista inhibiittoria, jotka vaikuttavat eri tavoilla endosomeihin tai niiden kulkeutumiseen solussa. Osa oli muun muassa vakuolaarisen H+ATPaasin estäjiä, kuten bafilomysiini A1 ja konkanamysiini A, osa ionoforeja, esimerkiksi monensiini ja nigerisiini. Muilla mekanismeilla toimii muun muassa käytetyt amantadiini, niklosamidi ja klorokiini. Soluille lisättiin inhibiittoria, jonka annettiin vaikuttaa määrätty aika, minkä jälkeen lisättiin joko HPeV-1:ä tai HPeV-3:ä. Inhibiittorin pitoisuus pidettiin koko ajan vakiona. Inhibiittorien vaikutusta infektioon tutkittiin fluoresenssimikroskoopin avulla. Immunofluoresenssissa käytettävät vasta-aineet puhdistettiin soluaffiniteettipuhdistuksella HeLa Ohio -soluilla. Tutkimuksissa havaittiin, että käytetyillä pitoisuuksilla inhibiittorit vaikuttavat parechovirusten infektioihin aiheuttamatta solutoksisuutta. Osalle inhibiittoreista pitää vielä optimoida sopiva käyttöpitoisuus. Tutkimuksessani selvitän vielä toimivien inhibiittorien tarkkoja vaikutuskohteita ja sitä, mihin vaiheeseen infektioita yhdiste vaikuttaa sekä onko parechovirustyyppien 1 ja 3 välillä huomattavia eroja. Asiasanat: parechovirus, endosytoosi, inhibiittori, infektio 18 Uuden kananmunajalosteen tuotekehitys Rosita Johansson Ohjaajat: FT Oskar Laaksonen ja FT Jukka Kaitaranta ELINTARVIKEKEHITYS DI Kananmunan tuotekehitystyö ei Suomessa ole pysynyt muun elintarviketeollisuuden tahdissa. Kuitenkin jalostevalikoimaa kasvattamalla voitaisiin parantaa myös kuorimunatuotannosta syntyvän hävikin uudelleenhyödyntämismahdollisuuksia. Yksi kananmunajalosteiden tuotekehitystä hillinnyt tekijä on kananmunan lämpöherkkyys ja sen seurauksena kananmunan rakenteessa tapahtuvat irreversiibelit muutokset, jotka rajoittavat lämpökäsittelymenetelmien hyödyntämistä mikrobiologisen laadun takaamisessa. Tämän työn tavoitteena oli selvittää, voidaanko kananmunaa ja erityisesti sen valkuaista pääraaka-aineena hyödyntämällä kehittää proteiinipitoinen kananmunajaloste. Tätä varten ideoitiin salaattijuustokuutioiden tavoin käytettävä valkuaistuote, jonka tuotekehitysprosessi sisälsi muun muassa tuotteen valmistusteknisten ratkaisujen kartoittamista sekä erilaisten aromi- ja maustevaihtoehtojen testaamista. Lisäksi tuotekehitystyön yhteydessä selvitettiin korkeapainepastöroinnin vaikutuksia koaguloituneen valkuaisen sekä mahdollisten aromi- ja mausteyhdistelmien aistittavaan laatuun. Työn lopuksi valikoitujen tuotekehitysversioiden miellyttävyyttä ja hyväksyttävyyttä selvitettiin aistinvaraisen arvioinnin kuluttajatestein (70 arvioijaa; 73 % naisia, 27 % miehiä), joissa mielenkiinnon kohteena olivat näytteiden ulkonäön, hajun, maun ja rakenteen tuttuus, miellyttävyys ja voimakkuus, arvioijien taustamuuttujat ja kulutustottumukset sekä tuotekonseptin markkinapotentiaali. Näytteinä käytettiin neljää tuotekehitysversiota sekä kahta maustamatonta, erilaisiin liemipohjiin pakattua valkuaisnäytettä. Työstä saatujen tulosten perusteella korkeapainepastörointia voidaan pitää potentiaalisena vaihtoehtona koaguloituneen valkuaisen säilyvyysajan pidentämiselle. Kuitenkin aistittavassa laadussa raportoidut muutokset rajaavat käytettävissä olevaa paine- ja käsittelyaikahaarukkaa. Kuluttajatestien perusteella tuotekonsepti yleisesti koettiin kiinnostavaksi, minkä lisäksi tuotekehitysversioista erityisesti kahdella todettiin olevan jo sellaisenaan markkinapotentiaalia. Valkuaisesta valmistetut salaatinlisukkeet herättivät kuluttajatestiin osallistuneissa arvioijissa selvää kiinnostusta, minkä perusteella voitaisiin ennustaa myös muunlaisille kananmunajalosteille olevan kysyntää. Asiasanat: valkuainen, tuotekehitys, korkeapainepastörointi, aistittava laatu 19 Kauran beetaglukaanin vaikutus puolukan aistittavaan laatuun Kaisa Halme Ohjaajat: FT Oskar Laaksonen, prof. Baoru Yang ELINTARVIKEKEHITYS FM Puolukan vuosittainen satomäärä on yli 250 miljoonaa kiloa, josta poimitaan vain noin 5-10 %. Terveysvaikutusten tiedostamisesta huolimatta maun karvaus ja astringoivuus vaikuttavat puolukan hyödynnettävyyteen merkittävästi. Puolukassa on paljon sekä kuitua että fenolisia yhdisteitä. Fenoliset yhdisteet toimivat antioksidantteina ja niillä on havaittu olevan myös antimutageenisia, antikarsinogeenisia ja antimikrobisia ominaisuuksia. Kauran ja ohran beetaglukaanille on myönnetty EU:n hyväksymät terveysväittämät, joiden mukaan se alentaa aterianjälkeistä glukoositasoa ja veren rasvapitoisuutta. Yli 3 grammaa kauran beetaglukaania vuorokaudessa alentaa myös veren LDL- ja kokonaiskolesterolia. Työn tavoitteena on tarkastella kauran beetaglukaanin vaikutusta puolukkamehun aistinvaraisiin ominaisuuksiin. Puolukkamehusta valmistetaan näytteitä 35 % - 100 %:n konsentraatioilla, joissa on eri pitoisuuksilla lisättynä beetaglukaania sekä erilaisia muita kaupallisia sakeuttamisaineita, kuten pektiiniä, ksantaani- ja guarkumia. Mehuun lisättävän beetaglukaanin molekyylien koko on tärkeä, sillä viskositeetti riippuu liukoisuudesta, konsentraatiosta sekä beetaglukaanin molekyylipainosta. Korkean molekyylipainon beetaglukaani tuottaa paremman viskositeetin kuin alhaisen molekyylipainon samalla konsentraatiolla mitattaessa. Mehun eri pitoisuuksiin lisätään kahta eri beetaglukaanivalmistetta, ensimmäinen on suuren molekyylipainon beetaglukaani ja toinen pienen. Näistä suoritetaan aistinvaraiset laadunarvioinnit sekä Turun AMK:n kanssa yhteistyössä reologisia mittauksia kuten viskositeettiin ja elastisuuteen liittyviä testejä. Lisäksi mehuista selvitetään fenoliset yhdisteet spektrofotometrisin menetelmin. Tuotekehityksen onnistuessa kyseessä olisi täysin kotimainen mehujuoma, jossa on vain puhtaita luonnon omia raaka-aineita ilman sokeria. Ravitsemuksellisesti tuotteessa on yhdistetty antioksidanttivaikutus, suoliston toimintaa edistävä kuitu sekä kolesterolia ja veren glukoositasoa alentava vaikutus. Asiasanat: aistittava laatu, beetaglukaani, puolukka, reologia, viskositeetti 20 21 Omenan fenoliset yhdisteet siiderin valmistusprosessissa Mira Virkki Ohjaajat: FT Oskar Laaksonen ja dos. Jukka-Pekka Suomela ELINTARVIKEKEHITYS DI Siideri on fermentoitu alkoholijuoma, joka koostuu pääasiassa vedestä, sokerista, orgaanisista hapoista, fenolisista yhdisteistä ja haihtuvista yhdisteistä. Fenolisilla yhdisteillä voi olla vaikutusta siiderin aistittaviin ominaisuuksiin, kuten karvauteen ja astringoivuuteen. Lopputuotteen fenolisten yhdisteiden profiiliin vaikuttavat omenalajike, omenan kypsyysaste sekä siiderin valmistusprosessi. Työn tavoitteena on selvittää eri omenalajikkeiden, eri kypsyysasteisten omenien ja valmistusprosessissa käytettyjen hiivojen vaikutusta omenasiiderin fenolisten yhdisteiden koostumukseen sekä pitoisuuksiin. Työssä selvitetään erityisesti fermentoinnin vaikutusta siiderin fenolisiin yhdisteisiin. Tutkimus tehdään yhteistyössä CCFFT:n (Competence Center of Food and Fermentation Technologies, Tallinna, Viro) kanssa. Työssä sovelletaan mustaherukkamehun fenolisten yhdisteiden analysointiin käytettyä menetelmää omenasiidereille. Omenasiiderin fenoliset yhdisteet kerätään talteen uuttamalla etyyliasetaatilla ja yhdisteet määritetään kvalitatiivisesti sekä kvantitatiivisesti. Yhdisteet erotetaan ja analysoidaan nestekromatografialla. Uuttomenetelmän ja nestekromatografisen menetelmän kehitys tapahtuu ensin kaupallisilla siidereillä sekä eri omenalajikkeilla. Varsinaisten siiderinäytteiden valmistus ja aistittavan laadun analyysit tapahtuvat Virossa. Yhdisteitä tunnistetaan massa- ja UV-spektrien sekä vertailuyhdisteiden ja kirjallisuuden perusteella. Ensimmäisten tulosten perusteella kaupallisista siidereistä löytyi erityisesti klorogeenihappoa ja muita kahvihapon johdannaisia sekä flavonoleja ja flavan-3-oleja. Kaupallisilla siidereillä analysoidut näytteet olivat liian laimeita kvantitatiiviseen analyysiin, joten uuttomenetelmä vaatii kehitystä ennen varsinaisten näytteiden analysointia. Aiemmissa tutkimuksissa havaittiin erityisesti kversetiinin johdannaisten ja klorogeenihapon pitoisuuksien vaihtelevan omenalajikkeesta riippuen. On oletettavissa, että fermentointi vaikuttaa lopputuotteen fenolisten yhdisteiden pitoisuuksiin. Asiasanat: omena, massaspektrofotometri siideri, fenoliset 22 yhdisteet, nestekromatografia, Nestemäisen hiilidioksidiuuttomenetelmän mallintaminen ja mausteuutteiden analyysiin tarkoitetun kaasukromatografisen menetelmän kehittäminen Karlo Villa Ohjaajat: FM Marika Kalpio, Prof. Baoru Yang, prof. Heikki Kallio ELINTARVIKEKEHITYS DI Nestemäinen hiilidioksidi (LCO2) on houkutteleva vaihtoehto mausteiden aromikomponenttien uutossa käytettäväksi liuottimeksi. Turun yliopiston elintarvikekemian osastolla on tutkittu LCO2-menetelmällä tuotettuja mausteuutteita 1980-luvulta lähtien. Ympäristöystävällisyyden ja myrkyttömyyden lisäksi LCO2:n etuja ovat selektiivisyys aromaattisia yhdisteitä kohtaan ja prosessissa käytettävät alhaiset lämpötilat. Haasteena on kuitenkin uutossa käytettävän paineastian sisällä vallitsevien olosuhteiden määrittäminen ja prosessin seuraaminen. LCO2-uutteiden analysointi kaasukromatografilla (GC) edellyttää uutteiden komponenttien fraktiointia niiden haihtuvuuden mukaan. Jos uutteita ei fraktioida, herkästi haihtuvat komponentit eluoituvat ja huonosti haihtuvat komponentit jäävät kolonniin heikentäen sen suorituskykyä. Fraktioimattomia uutteita voidaan analysoida laitteistolla, jossa kolonni on jaettu venttiilillä preparatiiviseen ja analyyttiseen osaan. Diplomityön tarkoituksena on valmistaa mausteuutteita korianterista ja oreganosta vaihtelemalla prosessin olosuhteita kuten liuottimen määrää, uuttoaikaa sekä liuottimen tiheyttä. Fraktioimattomien uutteiden koostumus analysoidaan liekkiionisaatiodetektorilla varustetulla kaasukromatografilla. Analyysissä hyödynnetään uutteille kehitettävää menetelmää. Uutteiden koostumusten perusteella muodostetaan malli, joka kuvaa valittujen komponenttien saantoa prosessin parametrien funktiona. Asiasanat: soxhlet-uutto, mausteuute, nestemäinen hiilidioksidi, kaasukromatografia 23 Flavonolien biosynteesi tyrnin (Hippophaë rhamnoides L.) marjoissa Riitta Haataja Ohjaajat: MMT Anssi Vuorinen ja prof. Baoru Yang ELINTARVIKEKEHITYS DI Tyrni (Hippophaë rhamnoides L.) on karuja ja niukkaravinteisia olosuhteita hyvin kestävä piikikäs pensaskasvi. Luonnonvaraisena kasvavat tyrnit esiintyvät laajalla alueella Euraasian mantereella ja luontaisten kasvupaikkojen lisäksi se menestyy myös viljelykasvina. Tyrnin marjat sisältävät runsaasti fenolisiin yhdisteisiin luokiteltuja flavonoideja, joilla on tutkitusti todettu olevan terveyttä edistäviä vaikutuksia. Flavonoidien ryhmään kuuluvat flavonolit ovat viime aikoina olleet monipuolisesti tutkimuksen kohteena. Etenkin tyrnin hedelmälihassa esiintyy flavonoleista erityisesti kversetiiniä, isoramnetiinia, myrisetiiniä ja kamferolia. Suomalaisista luonnonkannoista on jalostettu kestävät sekä runsassatoiset tyrnilajikkeet Tytti ja Terhi. Diplomityön tutkimuskohteena ovat Tytti- ja Terhi-tyrnilajikkeista vuosina 2012 ja 2013 kerätyt marjat, joiden sisältämien flavonolien muodostumista selvitetään geenitasolla. Näytteet on kerätty kasvukauden aikana viikoittain Kittilästä ja Turusta. Työn tarkoituksena on tutkia kuinka eri kehitysvaiheessa olevien marjojen tiettyjen biosynteesigeenien ilmenemistasot muuttuvat ja kuinka eri lajike sekä kasvuympäristö vaikuttavat näiden geenien ilmenemistasoihin. Marjoista on eristetty sekä hedelmälihan että siementen kokonais-RNA CTAB-puskurilla ja litiumkloridisaostuksella. Eristetty RNA syntetisoidaan cDNA:ksi käänteistranskriptaasireaktiolla ja cDNA:sta määritetään flavonolien biosynteesigeenien ilmenemistasot kvantitatiivisella, reaaliaikaisella polymeraasiketjureaktiolla (engl. quantitative real-time polymerase chain reaction, qPCR). Tutkimus on vasta alussa, joten lopullisia tuloksia ei ole vielä esitettävänä. Työ on aloitettu etsimällä tyrnin transkriptomista kiinnostuksen kohteena olevien flavonolien biosynteesigeenejä lituruohon vastaavien geenien koodaamien aminohapposekvenssien perusteella. Valittujen geenien ilmenemistasojen qPCRanalyysiin on suunniteltu ja testattu toimivia alukkeita. Lopullisten tulosten odotetaan vahvistavan oletusta, että valittujen geenien ilmenemistasot muuttuvat lajikkeen, kasvukauden ja -ympäristön mukaan. Lisäksi tiettyjen geenien yhtäaikainen ilmentyminen voisi viitata siihen, että ne ovat saman geneettisen säätelyn alla. Asiasanat: tyrni, Hippophaë rhamnoides L., fenoliset yhdisteet, flavonolit, geenien ilmenemistaso 24 MAAHOVI OY Vedenkäsittelyä vuodesta 1965 25 Suolan korvaaminen leivässä – vaikutus makuun ja miellyttävyyteen Johanna Paasio Ohjaajat: ETM Kristiina Tuukkanen, FT Oskar Laaksonen, dos. Antti Knaapila, prof. Baoru Yang ELINTARVIKEKEHITYS DI Ruokasuolan eli natriumkloridin liiallisen käytön on todettu aiheuttavan terveydellisiä haittoja, mm. lisääntyneen riskin sairastua sydän- ja verisuonitauteihin. Suolan saantisuositus Suomessa on 5 g/vrk, joka ylittyy väestötasolla. Runsaimmat suolansaannin lähteet ovat vilja- ja lihavalmisteet. Suolan saannin vähentämiseksi on kiinnitetty huomiota yhä enemmän leivän suolapitoisuuteen. Tässä työssä tutkittiin yhteistyössä Fazerin tutkimusyksikön kanssa suolan korvaamista ja sen vaikutusta vehnäleivän suolaisuuden aistimiseen sekä leivän maun miellyttävyyteen. Tutkimukseen valittiin koemalliksi vehnävuokaleipä NaCl-pitoisuuksilla 1,2 % (normaalisuolainen); 0,6 % ja 0,3 %. Korvaaviksi ainesosiksi valikoitui esikokeiden perusteella kuivattu timjami ja suppilovahverojauhe pitoisuuksilla 0,2–0,3 %. Korvaavia ainesosia lisättiin 0,6 % ja 0,3 % NaCl-leipiin. Suolan maun korvaamista tutkittiin analyyttisellä tutkimusmenetelmällä koulutetun 10-henkisen raadin avulla. Leipien hajun, maun ja kokonaisuuden miellyttävyyttä tutkittiin kuluttajaraadin avulla. Kuluttajaraatiin osallistui 89 vapaaehtoista 20–74 vuotiasta (naisia 71 %) koehenkilöä. Muita tarkasteltavia ominaisuuksia olivat leivän suolaisuuden sopivuus ja ostohalukkuus. Analyyttisen tutkimuksen perusteella timjami ja suppilovahverojauhe eivät pystyneet jäljittelemään suolan makua. Maun kokonaisvoimakkuus timjamia sisältäneissä leivissä ei kuitenkaan eronnut normaalisuolaisesta verrokkinäytteestä. Kuluttajatutkimuksen perusteella 0,6 % NaCl-timjamileipä oli kokonaisuudeltaan miellyttävämpi kuin saman NaCl-pitoisuuden omaava verrokkileipä (p<0,05), eikä eroa havaittu normaalisuolaiseen leipään. Kuluttajista 33 % ostaisi kaikkein todennäköisimmin 0,6 % NaCl-timjamileivän ja 30 % normaalisuolaisen leivän. Kuvailevassa mieltymyskartoitus (PLS) -analyysissa kokonaismiellyttävyys korreloi voimakkaammin maun kokonaisvoimakkuuden kanssa kuin pelkän suolaisen maun voimakkuuden kanssa. Tulosten perusteella timjamilla on mahdollista korvata puolet normaalisuolaisen vehnäleivän suolasta leivän miellyttävyyden tai ostohalukkuuden kärsimättä. Asiasanat: suolan korvaaminen, vehnäleipä, timjami, mieltymyskartoitus 26 Kasvi- ja marjauutteiden antioksidanttikapasiteetin määritys TRAP-menetelmää käyttäen Aleksi Uusitupa Ohjaajat: Dos. Jukka-Pekka Suomela ja Prof. Baoru Yang ELINTARVIKEKEMIA Hengittämämme ilman happi on välttämätöntä ihmisille ja hapenkulutuksen seurauksena ihmisen kehossa tapahtuu monia entsymaattisia ja ei-entsymaattisia reaktioita, joissa syntyy reaktiivisia happiyhdisteitä. Antioksidanttien tarkoitus elimistössä on neutralisoida näitä haitallisia reaktiivisia happiyhdisteitä. Suuret pitoisuudet reaktiivisia happiyhdisteitä voivat altistaa erilaisille sairauksille, kuten erityyppisille syöville, sydän- ja verisuonitaudeille ja ikääntymiselle. Kasveista eristettyjä antioksidantteja voidaan lisätä elintarvikkeisiin parantamaan tuotteiden laatua. Männyn petusta, pakurikäävästä, mustaherukan marjoista ja lehdistä eristettiin uutteita eri alkoholipitoisuuksilla 1 % etikkahapossa tai ilman etikkahappoa, joista määritettiin antioksidanttikapasiteetit TRAP-menetelmää käyttäen (Total Radical-Trapping Antioxidant Parameter). TRAP-menetelmä perustuu luminometriaan, jossa NaH2PO4 – Na2HPO4- puskurissa AAPH (2,2'-atsobis (2-amidinopropaani) dihydrokloridi) tuottaa keinotekoisia peroksidiradikaaleja, jotka hapettavat luminolista luminoliradikaaleja. Muodostuneet luminoliradikaalit tuottavat valoa, joka voidaan havaita luminometrillä. Näyteuutteiden antioksidantit estävät kemiluminesenssia tietyn ajan, mikä on suoraan verrannollinen näytteen antioksidanttikapasiteettiin. Näytteiden antioksidanttikapasiteetteja verrataan Trolox-standardeilla saatuihin kapasiteetteihin, minkä tuloksena voidaan määrittää kvantitatiivisesti näytteiden antioksidanttikapasiteetit. Suurimmat antioksidanttikapasiteetit saatiin männyn petusta ja mustaherukan lehdistä. Pienimmät antioksidanttikapasiteetit olivat mustaherukan marjalla ja pakurikäävällä. Uuttoliuoksen etanolipitoisuus tai etikkahapon käyttö uuttamisessa ei vaikuttanut mustaherukan marjojen tai pakurikäävän antioksidanttikapasiteettiin. Männyn petun ja mustaherukan lehden antioksidanttikapasiteetti oli parempi uutettaessa 30 % etanolissa 1 % etikkahapolla, kun puolestaan 90 % etanolissa ilman happoa uutetuilla oli parempi antioksidanttikapasiteetti kuin hapollisilla uutteilla. Petulla ja mustaherukan lehdellä oli korkeimmat kokonaisfenolipitoisuudet, mikä on yhteydessä suurempiin antioksidanttikapasiteetteihin. Asiasanat: antioksidanttikapasiteetti, TRAP, trolox, luminometria 27 Prosessoidun maidon ja raakamaidon aiheuttamat vatsaoireet ja aterian jälkeinen aineenvaihdunta tutkimushenkilöillä Tiina Pasma Ohjaajat: dos. Kaisa Linderborg, FM Anu Nuora ja prof. Heikki Kallio ELINTARVIKEKEMIA Viime aikoina mediassa on ollut paljon esillä kiista maidon homogenoinnista ja homogenoidun maidon aiheuttamista vatsavaivoista. Jotkut kertovat saavansa vatsaoireita homogenoidusta maidosta, mutta voivansa juoda homogenoimatonta maitoa. Maidon homogenointi saa aikaan proteiinien erilaisen jakautumisen rasvapisaroiden ja vesifaasin välillä verrattuna homogenoimattomaan maitoon. Ongelmana aikaisemmissa kliinisissä kokeissa on ollut se, että todetut vatsaoireet perustuvat henkilön omaan kertomukseen, jolloin vaivojen objektiivinen todentaminen on vaikeaa. Kliinisen ravitsemustutkimuksen tarkoituksena oli selvittää homogenoidun ja pastöroidun eli prosessoidun maidon sekä homogenoimattoman ja pastöroimattoman eli niin sanotun raakamaidon aiheuttamia vatsavaivoja sekä aterianjälkeistä aineenvaihduntaa sellaisilla henkilöillä, jotka kokevat voivansa nauttia raakamaitoa, mutta eivät prosessoitua maitoa. Ravitsemustutkimukseen osallistui 7 tervettä tutkimushenkilöä. Tutkimushenkilöt nauttivat 12 tunnin paaston jälkeen satunnaisessa järjestyksessä kahtena eri tutkimuspäivänä kuitupitoisen patukan ja joko 4 dl raakamaitoa tai 4 dl prosessoitua maitoa. Aterian yhteydessä nielaistiin myös SmartPill-kapseli. SmartPill on kapseli, joka mittaa ruoansulatuskanavan pH:ta, painetta ja lämpötilaa. Tutkimushenkilöiden kokemat vatsaoireet todennettiin oirepäiväkirjan avulla. Maitoaterioiden jälkeistä aineenvaihduntaa tutkittiin vertaamalla veren glukoosi-, insuliini- ja triasyyliglyserolipitoisuuksia. SmartPillkapselin dataa verrattiin henkilön raportoimiin vatsaoireisiin. Tutkimuksen toisena tavoitteena oli selvittää, korreloiko SmartPill-kapselin mittaama paine suolistossa tutkimushenkilöiden kokemiin vatsaoireisiin. Tutkimuksessa saatiin viitteitä siitä, että prosessoitu maito ja raakamaito käyttäytyvät ruuansulatuskanavassa eri tavoin. Tämä näkyi erityisesti veren triasyyliglyseroli- ja glukoosipitoisuuksissa. Suuresta hajonnasta ja pienestä otoksesta johtuen erot eivät kuitenkaan ole tilastollisesti merkitseviä. Prosessoidun maitoaterian jälkeen tutkimushenkilöt kokivat enemmän vatsaoireita kuin raakamaitoaterian jälkeen, mutta ero ei ollut tilastollisesti merkitsevä. SmartPill-kapselin tietojen osalta tulosten käsittely on kesken. Asiasanat: homogenointi, pastörointi, raakamaito, vatsavaivat, SmartPill 28 29 Sinisten perunoiden antosyaniinit ja aterianjälkeinen glykemia Johanna Salo Ohjaajat: FM Marika Kalpio, MMT Anssi Vuorinen, dos. Kaisa Linderborg ja prof. Heikki Kallio ELINTARVIKEKEMIA Antosyaniinit ovat luontaisia flavonoidiväriaineita, joiden värit vaihtelevat punaisesta siniseen. Kemialliselta rakenteeltaan ne ovat glykosyloituja flavyliumkationeja, jotka eroavat toisistaan hydroksi- ja metoksiryhmien, sokeriryhmien sekä alifaattisen ja aromaattisten happojen määrän ja sijainnin perusteella. Antosyaniineilla on havaittu terveyttä edistäviä ominaisuuksia. Tässä erikoistyössä tutkittiin tummansinisen Synkeä Sakari -perunalajikkeen antosyaniinikoostumusta ja siitä valmistetun keitetyn survoksen vaikutusta aterianjälkeiseen glykemiaan ja insulinemiaan verrattuna keltaisesta perunasta valmistettuun survokseen ja mustikkakiisseliin. Tutkimushenkilöt (n=13) nauttivat antosyaniini- ja tärkkelyspitoisuuksien suhteen vakioituja aterioita yksöissokotetussa vaihtovuorotutkimuksessa satunnaisessa järjestyksessä. Aterian jälkeen heiltä kerättiin plasma- ja virtsanäytteitä tietyin väliajoin. Tutkimusaterioiden antosyaniinit ja fenoliset hapot tunnistettiin UHPLC-DAD-ESIMS -menetelmällä. Antosyaniinipitoisuus määritettiin HPLC-DAD:lla sekä vapaat sokerit ja orgaaniset hapot GC-FID:lla. Antosyaniinien ja niiden aineenvaihduntatuotteiden aterianjälkeistä kertymistä virtsaan aloitettiin tutkia kehittämällä näytteiden esikäsittely- ja UHPLC-ESI-MS/MS -menetelmiä.Sininen perunasurvos sisälsi asyloituja peonidiinin, petunidiinin ja malvidiinin glykosideja. Sininen ja keltainen perunasurvos sisälsivät klorogeenihappoa ja kahvihappoa. Keltaisessa perunasurvoksessa oli siniseen perunaan verrattuna enemmän glukoosia ja vähemmän sakkaroosia. Sininen perunasurvos aiheutti pienemmän glykeemisen kuorman kuin mustikkakiisseli ja pienemmän insuliinikuorman kuin keltainen perunasurvos tai mustikkakiisseli. Glukoosi- ja insuliinipitoisuuksissa oli merkitseviä eroja 20 ja 40 minuuttia aterian jälkeen. Tutkimus antaa viitteitä siitä, että antosyaniinipitoiset perunalajikkeet ovat glykeemisiltä ominaisuuksiltaan keltaisia perunoita edullisempia. Tämä on erityisen merkittävää, koska perunat ovat tärkeä osa suomalaista ruokavaliota, ja toistuvat korkeat aterianjälkeiset veren glukoosi- ja insuliinipitoisuudet ovat yhteydessä moniin elintasosairauksiin. Asiasanat: sininen peruna, antosyaniini, kromatografia, glykemia 30 Mausteiden ja yrttien haihtuvien yhdisteiden aistiminen Markus Virtanen Ohjaajat: FT Oskar Laaksonen ja dos. Antti Knaapila ELINTARVIKEKEMIA Suurin osa ruoan mausta muodostuu hajuaistimuksista. Hajujen aistimisessa esiintyy paljon yksilöllistä vaihtelua, jonka taustalla vaikuttavat monenlaiset eri tekijät, kuten perintötekijät, sukupuoli ja aiempi kokemus hajusta. Elintarvikkeiden ortonasaalisti eli nuuhkaisemalla havaittua hajua kutsutaan aromiksi. Erikoistyön tavoitteena oli kartoittaa mausteiden ja yrttien sekä hajuyhdisteiden aromien aistimista sekä selvittää kokemusten yksilöllisten erojen syitä. Työ toteutettiin kutsumalla vapaaehtoisia henkilöitä aistinvaraisiin arviointeihin Funktionaalisten elintarvikkeiden kehittämiskeskuksen aistilaboratorioon. Tutkimukseen osallistui yhteensä 126 (naisia 74 %, miehiä 26 %) henkilöä. Osallistujat olivat 25–61-vuotiaita. Heiltä kerättiin taustatietoja, kuten halukkuutta kokeilla uusia ruokia, tutkimusta varten laaditun kyselylomakkeen avulla. Aistinvaraisessa arvioinnissa tutkittavat arvioivat 12 mausteen/yrtin miellyttävyyttä ja tuttuutta sekä lisäksi yrittivät tunnistaa näytteen. Hajuyhdisteistä (12 näytettä) he arvioivat voimakkuutta ja miellyttävyyttä sekä yrittivät nimetä tai kuvailla näytteen aromia. Miellyttävimmäksi mausteeksi tai yrtiksi arvioitiin kaneli ja vähiten miellyttäväksi kumina. Tutuimpana pidettiin kanelia ja vähiten tuttuna meiramia. Parhaiten tunnistettiin valkosipuli (99 %) ja huonoiten fenkoli (29 %). Hajuyhdisteistä parhaimpana pidettiin vanilliinia (vanilja) ja huonoimpana 1-okten-3-olia (sieni). Parhaiten tunnistettiin allyylidisulfidi (87 %), joka on valkosipulin tuoksun pääkomponentti ja huonoiten kanelialdehydi (21 %), joka on kanelin haihtuva yhdiste. Naiset arvioivat useimmat hajut miellyttävämmäksi kuin miehet (p<0.05). Kyvyllä tunnistaa hajuja ja halulla kokeilla uusia ruokia oli positiivinen yhteys hajujen miellyttävyysarvioihin (p<0.05). Tutkittavat olivat hyvin tietoisia hajuaististaan, sillä kun he pitävät hajua tuttuna, niin he myös tunnistivat sen. Asiasanat: mausteet, yrtit, hajuyhdisteet, aromi, miellyttävyys 31 Lihasperäiselle kreatiinikinaasille spesifisen immunomäärityksen suunnittelu ja automatisointi Anna Haavisto Ohjaajat: FT Teemu Korpimäki ja FT Tanja Savukoski BIOTEKNIIKKA DI Duchennen lihasdystrofia (engl. Duchenne muscular dystrophy, DMD) on lähes pelkästään pojilla ilmenevä lihasrappeumatauti, joka johtaa kuolemaan noin 25 vuoden iässä. Noin yksi 3500 pojasta sairastaa DMD:tä. Taudin aiheuttaa X-kromosomissa sijaitsevan dystrofiinigeenin mutaatio, jonka seurauksena toimivaa, lihaksia koossapitävää dystrofiinia ei tuotu. Taudille kehitteillä olevat hoidot ovat niin pitkällä, että DMD:n vastasyntyneiden seulonnan aloittamista harkitaan. DMD:n seulonnassa analyyttina olisi mahdollista käyttää lihasperäistä kreatiinikinaasia (engl. creatine kinase MM isoform, CK-MM), jota päätyy vereen moninkertaisesti tavalliseen verrattuna lihassolujen hajotessa. Perinteisesti kreatiinikinaasia on mitattu entsyymiaktiivisuusmäärityksillä, jotka mittaavat kaikkia kreatiinikinaasimuotoja (CK-MM, CK-MB ja CK-BB). Työn tarkoituksena oli kehittää kuivatuista veritäplistä tehtävä CK-MM:lle spesifinen kaksipuoleinen immunomääritys, joka olisi siirrettävissä PerkinElmerin automaattiselle GSP® Genetic Screening Processor -analysaattorille. Työ suoritettiin kolmessa vaiheessa. Ensimmäiseksi vertailtiin kaupallisesti saatavilla olevien CK-MM-vasta-aineiden affiniteetteja biosensorilla. Seuraavassa vaiheessa pystytettiin manuaalinen kaksipuoleinen immunomääritys käyttäen ensimmäisessä vaiheessa valittuja vasta-aineita ja optimoitiin immunomäärityksen parametreja. Lopuksi immunomääritys sovitettiin GSP-laitteelle. Biosensorimittausten ja manuaalisten immunomääritysten tulosten perusteella valittiin kaksi potentiaalista leimavasta-ainetta ja yksi sitojavasta-aineeksi sopiva vasta-aine. Niitä käytettäessä määritys on melko spesifinen CK-MM:lle, sillä CK-BB ei tuottanut lainkaan signaalia ja CK-MB:n signaali oli alle 10 % CK-MM:n signaalista. GSPlaitteella mitattaessa DMD:tä sairastavien (n = 10) CK-MM-pitoisuuksien mediaani oli 7591 ng/ml (vaihtelu 1493–13360 ng/ml) ja terveiden vastasyntyneiden (n = 8) 164,8 ng/ml (107,9–263,0 ng/ml). Määrityksen dynaamista aluetta ei vielä selvitetty, mutta alustavien mittausten perusteella se kattaa terveiden vastasyntyneiden pitoisuudet ja sairaiden pitoisuudet ainakin 8770 ng/ml asti, mikä mahdollistaa sairaiden erottumisen. Määritys vaikuttaa siis sopivalta DMD:n seulontaan vastasyntyneiltä. Asiasanat: Duchennen lihasdystrofia, immunomääritys, kreatiinikinaasi, dystrofiini 32 33 Mikropartikkelit kiintokantajina potilasläheisessä hepatiitti B -määrityksessä Minna Tuovinen Ohjaajat: DI Merja Lahdenranta, FM Teppo Salminen ja FM Etvi Juntunen BIOTEKNIIKKA DI Heterogeenisissa diagnostisissa immunomäärityksissä sitojavasta-aineet kiinnitetään tavallisesti määrityskaivon pintaan eli kiintokantajaan. Mikropartikkelit voivat toimia kiintokantajina ja ne voivat olla materiaaliltaan esimerkiksi lateksia, tai polystyreeniä, kuten tässä määrityksessä. Mikropartikkelien etuja ovat suurempi sitoutumispinta-ala pienessä tilavuudessa sekä nopeampi reaktiokinetiikka verrattuna muihin kiintokantajiin, kuten esimerkiksi mikrotiitterilevyjen polymeerikaivoihin. Mikropartikkelien pintaa voidaan muokata lisäämällä siihen funktionaalisia ryhmiä. Tämän lisäksi vasta-aineita voidaan sitoa pintaan välillisesti hyödyntämällä esimerkiksi biotiinin ja streptavidiinin (SA) välistä vahvaa sidosta. Diplomityössä käytettiin Turun yliopistossa kehitettyä uudenlaista potilasläheiseen diagnostiikkaan sopivaa määritysalustaa ja mallianalyyttina oli hepatiitti B -viruksen pinta-antigeeni (HBsAg). Määritysalusta perustuu mikropartikkelikiintokantajiin ja niiden keräämiseen suodattimelle. Määrityksessä mikropartikkelien SA-pintaan sidottiin biotinyloitu Tb-leimattu sekundaarileima sekä biotinyloitu sitojavasta-aine. Tämän jälkeen määritysalustalle lisättiin pinnoitetut mikropartikkelit, HBsAg-analyytti sekä Eu-leimattu tunnistusvasta-aine. Inkubaation jälkeen mikropartikkeleihin sitoutunut analyytti ja siihen sitoutunut leimavasta-aine kulkeutuivat pesupuskurin ja paineen avulla suodattimelle, josta signaali mitattiin. Sitoutumaton analyytti sekä leima kulkeutuivat suodattimen läpi. Eu-leimoista mitattava signaali riippuu analyytin määrästä ja Tb-leimoista syntyvä signaalia käytetään kompensoimaan vaihtelevasta mikropartikkelimäärästä johtuvaa vaihtelua. Hepatiitti B -määritys toimi parhaiten käytettäessä Eu-nanopartikkeleita leimana. Määrityksen herkkyys uudella määritysalustalla oli parhaimmillaan 0,4 ng/ml ja SAmikrotiitterilevyllä vastaavasti 0,04 ng/ml. Herkkyyttä rajoittava tekijä uudella määritysalustalla on rinnakkaisten näytteiden välinen korkea vaihtelu. Määrityksen tulokset kuitenkin osoittavat potilasläheiseen testaukseen suunnitellun määritysalustan toimivan kliinisesti merkittävässä määrityksessä. Asiasanat: Mikropartikkelit, potilasläheinen diagnostiikka, hepatiitti B 34 Lysosomaalisten kertymäsairauksien seulonnassa käytettävän reagenssikomponentin valmistusprosessin karakterisointi Marke Hovi Ohjaaja: FM väit. Jaana Kantola, PerkinElmer Wallac Oy MOLEKULAARINEN BIOTEKNIIKKA JA DIAGNOSTIIKKA Lysosomaaliset kertymäsairaudet (engl. Lysosomal Storage Disorder, LSD) ovat joukko eteneviä, usein kuolemaan johtavia sairauksia, jotka johtuvat lysosomaalisten entsyymien puuttumisesta tai niiden alentuneesta aktiivisuudesta. PerkinElmer kehittää kittiä, jota voidaan käyttää apuna kuuden LSD –sairauden: Gaucherin taudin, Niemann-Pickin taudin (tyypit A ja B), Pompen taudin, Krabben taudin ja mukopolysakkaridoosi I:n seulonnassa vastasyntyneiden väritäplänäytteistä. Kitillä voidaan määrittää entsyymien aktiivisuus kvantitatiivisella entsymaattisella määrityksellä, jota mitataan tandemmassaspektrometrialla. Erikoistyön tarkoituksena oli karakterisoida valmistusprosessi ja laadunvalvonta kitin reagenssikomponentille, joka sisältää kuusi synteettistä LSD -entsyymin substraattia, kuusi entsyymituotteen kaltaista, stabiilia isotooppileimattua sisäistä standardia (IS) sekä natriumoleaattia kuivattuna. Komponentin valmistuksen päävaiheita ovat raakaaineiden punnitus, liuotus ja yhdistäminen kantaliuokseksi, valmiin liuoksen annostelu pulloihin, kuivaus sekä valmiin komponentin laadunvalvonta. Karakterisoinnin aikana testattiin erilaisia tapoja liuottaa ja yhdistää raaka-aineita, sekä kuivata kantaliuosta. Puhdas metanoli toimi raaka-aineiden liuotuksessa metanoli-vesiseoksia paremmin, joten se valittiin liuottimeksi kantaliuoksen valmistukseen. Kuivaukseen valittiin haihdutin, jonka toiminta perustuu liuoksen kiehuttamiseen alipaineessa. Kuivuminen oli liian hidasta menetelmässä, jossa kantaliuos jätettiin haihtumaan itsestään. Komponentille kehitettiin massaspektrometrinen laadunvalvontamenetelmä, jossa ei tehdä entsyymimääritystä. Laadunvalvontamenetelmän toistettavuus todettiin riittämättömäksi ja komponentin laadunvalvonnan kehitystä jatkettiin entsymaattisella MSMS -määrityksellä. Karakterisoinnin aikana valmistettujen erien sisäinen hajonta ja erien välinen toistettavuus oli hyvä ja komponentit todettiin toimiviksi entsymaattisessa LSD – määrityksessä. Komponentin laadunvalvonnan hyväksyntärajojen määrittelyä jatketaan ja karakterisoitu valmistusprosessi tullaan validoimaan PerkinElmerin Turun tuotantoon. Asiasanat: Lysosomaaliset kertymäsairaudet, tandemmassaspektrometria 35 Upkonvertoivien nanopartikkelien luminesenssin tehostaminen orgaanisten kromoforien avulla Pekka Heljakka Ohjaajat: FM Satu Lahtinen ja prof. Tero Soukka BIOTEKNIIKKA DI Upkonvertoivat nanopartikkelit (engl. upconverting nanoparticles, UCNP) ovat lantanidi-ioneja sisältäviä epäorgaanisia leimoja, jotka kykenevät muuntamaan matalaenergisen 980 nm viritysvalon korkeaenergiseksi näkyväksi valoksi. Tämän ominaisuuden avulla mittausalue voidaan erottaa taustahäiriötä aiheuttavasta autofluoresenssista. Lantanidi-ionit kuitenkin absorboivat viritysvaloa heikosti. Partikkelien luminesenssia voidaan tehostaa absorboivien ionien määrää lisäämällä, mutta se kasvattaa partikkelin kokoa. Viritysvalon absorptiota voidaan mahdollisesti parantaa kiinnittämällä partikkelien pintaan 808 nm aallonpituudella virittyviä orgaanisia kromoforeja, jotka toimivat valoa tehokkaasti keräävinä antennirakenteina. Kromoforit virittävät UCNP:n energiansiirron kautta ja mahdollistavat luminesenssin tehostumisen. Diplomityössä tutkittiin erilaisia tapoja pinnoittaa nanopartikkeli siten, että kromofori voitiin kiinnittää siihen pysyvästi. Tavoitteina olivat myös pinnoitetun partikkelin vesiliukoisuus sekä samanaikaisesti sen suojaaminen veden aiheuttamalta luminesenssin sammuttavalta vaikutukselta. UCNP:n emissio mitattiin spektrofluorometrillä käyttäen 808 nm ja 980 nm lähi-infrapunalasereita virityslähteinä. Työssä kehitettiin kaksi pinnoitusmenetelmää, jotka mahdollistivat partikkelin virittämisen kromoforin kautta 808 nm aallonpituudella. UCNP pinnoitettiin polyakryylihapolla (PAA) tai poly(maleiinianhydridi-alt-1-oktadekaani):lla (PMAO), johon kromofori kiinnitettiin adsorptiolla. Partikkelin luminesenssi 808 nm viritysaallonpituudella ei kuitenkaan tehostunut verrattuna viritykseen 980 nm laserilla. PMAO-pinnoituksella 808 nm laserilla viritettäessä mitattu signaali jäi 2,7 kertaa heikommaksi ja PAA-pinnoitetun UCNP:n emissio jäi noin 40 kertaa heikommaksi. Menetelmät eivät suojanneet partikkelia veden luminesenssia sammuttavalta vaikutukselta ja kromoforien avulla herkistetty upkonversio toimi vain käyttämällä liuottimena raskasta vettä. Asiasanat: upkonvertoiva nanopartikkeli, energiansiirto, kromofori 36 37 Panossyöttökasvatusprosessin automatisointi Joni Juvonen Ohjaajat: FM Markus Vehniäinen ja prof. Tero Soukka BIOTEKNIIKKA DI Tutkimuskäyttöön tarkoitettujen rekombinanttiproteiinien tuottaminen fermentoimalla on yleinen menetelmä bioteollisuudessa. Mikrobit kasvatetaan biologisessa reaktorissa, joka tarjoaa kontrolloidun kasvuympäristön ja sopivat tuotto-olosuhteet halutulle tuotteelle. Eräs fermentointimuodoista on korkeatuottoinen ja pitkäkestoinen panossyöttökasvatus, jossa saavutetaan panoskavatusta merkittävästi korkeampi solutiheys jatkamalla panosvaiheen jälkeen kasvua rajoittavan substraatin syöttöä. Laboratoriomittakaavassa fermentorikasvatusten tilavuudet vaihtelevat muutamasta litrasta kymmeniin ja niissä kasvatusta seurataan sekä ohjataan joko fermentorista tai tietokoneesta. Tyypillisessä fermentointiprosessissa operaattori tarkkailee muun muassa vaahdonkorkeutta sekä käynnistää pumppuja olosuhteiden muuttuessa. Tällaiset tehtävät ovat teollisen mittakaavan laitteistoissa usein automatisoituja. Diplomi-insinöörityön tarkoituksena oli päivittää kahden Turun yliopiston biotekniikan laboratoriossa sijaitsevan BioFlo® -sarjan pöytäfermentorin MS-DOS pohjainen tietokoneohjausohjelma nykyaikaiseksi ja lisätä siihen etäseuranta ja ohjaus. Lisäksi vaahdonestoaineen ja indusorin lisäykset haluttiin automatisoida panossyöttökasvatuksessa. Fermentorien ohjaukseen kirjoitettiin Visual Basic .NET ohjelmointikielellä uusi pääkäyttöliittymä ja sen rinnalle etäkäyttöliittymä, joka keskusteli pääkäyttöliittymän kanssa yliopiston sisäisessä verkossa. Tuottoprosessin automatisointi toteutettiin käyttöliittymän sisäisellä ohjelmointiympäristöllä, joka mahdollisti pumppujen, sekoitusnopeuden ja lämpötilan säätöarvojen ohjelmoinnin. Vaahdonkorkeuden tunnistuksessa käytettiin web-kameraa, jonka ottamasta kuvasta erotettiin vaahdonkorkeus kuvankäsittelyn avulla. Koekasvatuksilla osoitettiin päivitetyn ohjausohjelman toimivan panos- ja panossyöttömuodoilla. Uuden käyttöliittymän avulla pystyttiin tummien kasvatusliuosten vaahdonkorkeutta mittaamaan riittävällä tarkkuudella, mutta ongelmia aiheuttivat vaaleammat kasvatusliuokset, joista vaahtoa oli vaikea tunnistaa. Lisäksi käyttöliittymä mahdollisti automaattisen vaahdonestoaineen ja indusorin lisäyksen, fermentorin lämpötilan ja sekoitusnopeuden säädön etänä sekä kasvatuksen seuraamisen web-kameran suoratoistosta. Asiasanat: fermentori, konenäkö, panossyöttökasvatus 38 Modular and tunable gene expression system for Saccharomyces cerevisiae Anssi Rantasalo Supervisors: PhD Dominik Mojzita, PhD Jussi Jäntti BIOTECHNOLOGY (TECH.) Typical methods for metabolic engineering of microbial strains include expression of heterologous genes involved in the production of desired compound(s). This might however lead to metabolic imbalances where substrates and intermediates are consumed and produced at suboptimal rate. Metabolic imbalances might decrease the flux through the production pathway which underlies the importance of pathway optimization. The optimization of production pathways requires tools to control enzyme levels in a cell. However, the lack of well-defined and predictable tools for tuning enzyme levels limits the expansion of biobased compounds production. In order to tackle this problem, we developed a genetic tool for simultaneous control of transcription levels of multiple genes. The system utilized modular DNA parts which were assembled into functional devices allowing precise control of expression of multi-gene encoded pathways. The system functions as a transcription amplifier in which input signal is modulated to output signal. The input signal was a trigger for expression of a synthetic transcription factor (sTF) which is a fusion protein of DNA binding domain (DBD) and activation domain (AD). DBD recognized a specific binding site upstream of a core promoter of the target gene(s), and the AD of the sTF recruited transcription machinery which triggered the expression of the target gene(s) (output signal). The system was established to monitor the expression of fluorescent GFP and mCherry reporter proteins. The expression level of these target genes were tuned by changing the number sTF binding sites in the output promoter and by using different yeast’s core promoters having different expression strengths. The expression levels of reporters were tested by fluorescent measurements. The expression range of the system spanned from minimal expression activity up to the level of the yeast’s strongest native promoters. Based on these observations we believe that this system can be applied in industrial or in academic applications as it provides wide range of expression levels and could be precisely fine-tuned. Keywords: synthetic biology, pathway optimization, yeast expression system 39 Kelaattikomplementaatioon perustuvan integroidun DNA:n monistus- ja detektointimenetelmän kehitys Anna-Maija Lempainen Ohjaaja: FM Susanne Lahdenperä BIOTEKNIIKKA DI Kelaattikomplementaatio perustuu kahteen, itsessään ei-fluoresoivaan koettimeen, jotka sitoutuessaan lähekkäin samaan vastinjuosteeseen muodostavat fluoresoivan kokonaisuuden. Kehittämässäni menetelmässä kohdesekvenssi monistetaan polymeraasiketjureaktiolla (PCR) ja havainnoidaan paikkaspesifisesti reaktiokammion pinnalla ilman pesuvaiheita tai reaktiokammion avausta. Pintadetektio mahdollistaa usean eri analyytin määrittämisen käyttäen vain yhdenlaista leimaa. Polypropyleenilastujen pinta aktivoitiin primaarisilla aminoryhmillä (diaminosykloheksaani (DACH), allyyliamiini (AA), aminopropyylitrietoksysilaani (APTES) tai aminopropyylitrimetoksysilaani (APTMS)) ja atsidifunktionalisoitiin, minkä jälkeen reaktiokammion pintaan kiinnitettiin 5’-alkyynimodifioitu antennaligandikoetin kuparikatalysoidulla atsidi-alkyyni sykloadditiolla. Hybridisaatioliuoksessa kullekin monistustuotteelle oli spesifinen Eu3+-kelaattikoetin. Aikaerotteinen fluoresenssi mitattiin reaktiokammion alueelta 10 × 10 rasterina. Paras signaali-tausta-suhde saatiin antennakoetinkonsentraatiolla 1,67 µM. Koska primaariset aminoryhmät häiritsevät PCR:ää testattiin erilaisia pienimolekulaarisia yhdisteitä (Tween, glysiini, butyynihappo ja alkyyni-polyetyleeniglykoli5-happo) pinnan blokkaamiseen. Testattaessa pinnan ja antennakoettimen välisen kiinnityksen lämpöstabiilisuutta DACH-, AA- ja APTES-pinnoilla signaali-tausta-suhde pysyi hyvänä 40 PCR-syklin jälkeenkin. Menetelmän analyyttinen herkkyys (määriteltynä taustasignaalina lisättynä kolme kertaa taustan keskihajonnalla) oli DACH:lla 0,02 nM, AA:lla 0,01 nM, APTES:lla 0,03 nM ja APTMS:lla 0,21 nM. Kelaattikomplementaatioon perustuva integoitu monistus- ja detektointimenetelmä on lupaava uusi menetelmä nukleiinihappodiagnostiikan alalla. Paikkaspesifisen pintadetektoinnin ansiosta sillä saattaisi olla potentiaalia monianalyyttimääritykseksi, joka voisi haastaa tällä hetkellä käytössä olevat, eri fluoroforien mittaukseen perustuvat menetelmät. Avainsanat: kelaattikomplementaatio, PCR, monianalyyttimääritys, pintadetektio, integroitu DNA määritys 40 41 Munasarjasyöpäspesifisen diagnostiikkamäärityksen kehittäminen: CA125lektiinimääritys Annika Järvinen Ohjaajat: FT Kamlesh Gidwani, prof. Kim Pettersson BIOTEKNIIKKA DI Munasarjasyöpä, joka on usein oireeton ennen leviämistään, on naisten vaarallisin gynekologinen syöpä. CA125 on glykoproteiini ja ainoa käytössä oleva biomerkkiaine munasarjasyövän havaitsemiseen. CA125:lla on huono herkkyys munasarjasyövälle ennen oireiden ilmaantumista. CA125:n viitearvo on 35 U/ml, mutta tämän ylittäviä pitoisuuksia ei voida suoraa yhdistää syöpään, sillä CA125 on todettu olevan koholla myös maksasairauden, endometrioosin, munasarjakystan tai ovulaatiokierron takia. Munasarjasyöpään liittyvässä CA125:ssä on todettu poikkeamia glykosylaatiossa, minkä vuoksi glykosylaatiomuutokset voisivat olla kannattavia diagnostisia kohteita munasarjasyövän tutkimisessa. Diplomityön tavoitteena oli kehittää munasarjasyövän varhaiseen havaitsemiseen spesifinen diagnostiikkatesti, joka perustui CA125 glykoproteiinin muuttuneeseen glykosylaatioon ja lektiinien hyödyntämiseen sitojamolekyyleinä. Työssä käytettiin neljästä eri kudoksesta olevaa CA125:tä. Lähteinä olivat munasarjasyövän (OvCan) OVCAR3-solulinjassa tuotettu CA125, sekä istukasta (Pla) eristetty ja maksakirroosin (LC) ja itusolukasvaimen (IT) normaalista kudoksesta peräisin oleva CA125. Detektiossa verrattiin kymmentä eri kasvilektiiniä, jotka olivat konjugoitu joko Eu3+kelattiin tai Eu3+-nanopartikkeliin. Lektiinejä hyödyntävän määrityksen suorituskykyä verrattiin immunomääritykseen, jossa käytettiin CA125:n eri etitoopit tunnistavaa monoklonaalista vasta-ainetta (Mab). Suurin osa työssä käytetyistä lektiininanopartikkeleista tunnistivat spesifisesti istukasta eristetyn CA125:den. Wisteria floribunda (WFA) oli ainoa lektiini, joka antoi 3-4 kertaisesti korkeamman signaalin munasarjasyövän kanssa verrattuna muihin CA125lähteisiin, mutta sen tausta nousi korkeaksi. Muiden lektiinien kanssa ongelmaksi muodostui myös korkea tausta sekä vähäinen ero eri CA125-lähteiden välillä. Eu3+nanopartikkelien käyttö leimana paransi lektiinien affiniteettia CA125glykaanivarianttien kanssa. Työssä kehitettyä määritystä CA125-WFA lektiininanopartikkelille voitaisiin tulevaisuudessa käyttää erottamaan munasarjasyöpä hyvänlaatuisista tapauksista jo olemassa olevan CA125-immunomäärityksen kanssa. Asiasanat: munasarjasyöpä, CA125, lektiini, Eu3+-nanopartikkeli 42 Upkonvertoivien nanopartikkelileimojen erottelumenetelmät Antti Pihlava Ohjaajat: FT Terhi Riuttamäki, FM Riikka Arppe BIOTEKNIIKKA DI Upkonvertoivat nanopartikkelileimat ovat epäorgaanisia, lantanideilla seostettuja partikkeleja. Bioanalytiikan kannalta nämä leimat ovat erityisen mielenkiintoisia siksi, että niitä virittävällä lähi-infrapunasäteilyllä voidaan välttää useassa luminesenssiin perustuvassa detektiomenetelmässä ongelmaksi muodostuva autofluoresenssi, sekä viritysvalon sironta ja absorptio biologiseen näytemateriaaliin. Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli selvittää erilaisten erottelu- ja analyytisten menetelmien sopivuutta upkonvertoivien nanopartikkelien erotteluun partikkeliaggregaateista ja valmistusreagensseista siirryttäessä suuremman tuotannon mittakaavaan. Nykyisen sentrifugointiin perustuvan erottelun mittakaava ei ole tarkoitukseen riittävä, eikä se poista mahdollisia aggregaatteja partikkelimonodispersion joukosta. Tutkimuksen aikana puhdistettiin ja karakterisoitiin karboksyloiduilla silikakerroksella pinnoitettuja sekä streptavidiini-konjugoituja upkonvertoivia nanopartikkeleja. Erottelumenetelmistä tutkimuksen kohteena olivat korkean gradientin magneettierottelu (HGMS), geelisuodatus ja eri huokoskoon suodattimien läpi ajaminen. Partikkelierien aggregoitumistaipumusta tutkittiin polyakryyliamidi- ja agaroosigeelielektroforeesilla. Nanopartikkelipitoisuudet määritettiin luminesenssiintensiteetin perusteella ja partikkelien koko ja aggregaatio arvioitiin läpäisyelektronimikroskoopin avulla. Upkonvertoivat nanopartikkelit saatiin eroteltua vapaasta streptavidiinista sekä HGMS-, että geelisuodatus-menetelmillä, mutta partikkelisaannot (saannot <50%) jäivät hyvin pieniksi verrattuna nykyisin käytössä olevaan sentrifugaalivoimiin perustuvaan menetelmään (saannot >95%). Filtterisuodatus (∅ 0,22 ja 0,1 µm) soveltui aggregaattien poistamiseen laimeista partikkelisuspensioista, mutta konsentroidut suspensiot vaatisivat ruiskusuodatinta erityisemmän välineistön suodattimien tukkeutumisen minimoimiseksi. Agaroosigeelielektroforeesi vaikuttaa käytännölliseltä ja edulliselta tavalta selvittää nanopartikkeleiden aggregaatiota. Jatkotutkimuksissa on selvitettävä HGMS-menetelmän magneettikentän voimakkuuden riittävyys nanokokoistenpartikkelien kaappaamiseen, sekä partikkelien mahdollinen epätoivottu vuorovaikutus erottelumatriisien kanssa. Asiasanat: Upkonvertoivat nanopartikkelit, geelisuodatus, HGMS, geelielektroforeesi, filtterisuodatus 43 Veritäpläpohjaisen fragiili X -testauksen pystyttäminen Ida Alm-Ndiaye Ohjaajat: FT Tuomas Nikula ja dos. FT Harri Hakala MOLEKULAARINEN BIOTEKNIIKKA JA DIAGOSTIIKKA Fragiili X (frax) -oireyhtymä on yleisin kehitysvammaisuuden perinnöllinen syy. Oireyhtymä periytyy X-kromosomissa, ja sen aiheuttaa sytosiini-guaniini-guaniiniemäskolmikon (CGG) monistuminen X-kromosomin Fragile X mental retardation 1 (FMR1) -geenin promoottorialueella. FMR1-alleelit voidaan luokitella (CGG)ntoistojen määrän mukaan neljään ryhmään : normaali (5–44), harmaa alue (45–54), epästabiili esimutaatio (55–200) tai täysmutaatio (yli 200). Esimutaatiotapauksissa toistojakso voi laajentua täysmutaatioksi jo yhden sukupolven aikana. Esimutaation kantajilla on havaittu monenlaisia oireita. Esimerkiksi osalla kantajanaisista on munarauhasen toiminnanhäiriöitä ja erityisesti miehillä on riski sairastua neurologiseen rappeumasairauteen. Täysmutaatiotapauksessa FMR1-promoottorialue metyloituu epänormaalisti ja geeni inaktivoituu. Täysmutaatiota kantavilla miehillä on aina frax-oireyhtymä, kun taas naisilla toisen terveen X-kromosomin suojavaikutus yleensä lieventää oireita sekä täys- että esimutaatiotapauksissa. Oireyhtymän yleisyyden, laajan oirekirjon ja lääkekehityksen edistymisen takia kiinnostus vastasyntyneiden ja kantajien seulontaa kohtaan on kasvanut. Erikoistyön tavoitteena oli pystyttää veritäpläpohjainen automatisoitu DNAeristysmenetelmä, joka soveltuu frax-oireyhtymän ja sen kantajien testaukseen PerkinElmerin FragilEaseTM-PCR-määrityksen kanssa. Kokonaisuudessaan testaus koostui DNA-eristyksestä, FragilEaseTM-PCR:stä, PCR-tuotteen puhdistuksesta ja monistustuotteiden havainnoinnista kapillaarigeeli-elektroforeesilla. Jokaista vaihetta optimoitiin veritäplätestaukseen sopivaksi. Frax-testaus todistettiin toimivaksi sekä aikuisten että vastasyntyneiden veritäplillä. Halkaisijaltaan 3,2 mm veritäplistä eristettyjen DNA-näytteiden epäpuhtauksista ja alhaisista pitoisuuksista huolimatta FragilEaseTM-PCR:ssä onnistuttiin monistamaan (CGG)n-alueet pienentämällä eristysnäytteiden reaktiotilavuutta ja nostamalla PCRsyklimäärää. Pisin testattu monistusalue oli 200 toistojaksoa. Lisäksi muokkaamalla DNA-eristysvaihetta ja muuttamalla PCR-tuotteen puhdistusmenetelmää onnistuttiin nostamaan lopullista saantoa. Veritäpläpohjaisen frax-testauksen osoitettiin soveltuvan niin vastasyntyneiden kuin kantajien seulontaan. Asiasanat: Fragiili X -oireyhtymä, veritäplä, DNA-eristys, PCR 44 45 Heterogeeninen upkonvertoiviin nanopartikkeleihin perustuva immunomääritys sydänspesifiselle troponiini I:lle Annika Lyytikäinen Ohjaajat: FM Nina Sirkka, FM Riikka Arppe, prof. Tero Soukka MOLEKULAARINEN BIOTEKNIIKKA JA DIAGNOSTIIKKA Epäorgaaniset upkonvertoivat nanopartikkelit (engl. upconverting nanoparticles, UCNP) koostuvat kiteisestä isäntämateriaalista ja siihen seostetuista lantanidi-ioneista. Upkonversiossa lähi-infrapunavalolla tapahtuvaa vähintään kahden fotonin absorptiota vaativaa viritystä seuraa emissio viritysaallonpituutta lyhyemmällä aallonpituudella. Sydänperäinen troponiini-I (engl. cardiac troponin I, cTnI) on kliinisesti merkittävä merkkiaine. Herkkä cTnI-määritys auttaa akuutin sepelvaltimotautikohtauksen havaitsemista ja siten oikean hoidon nopeaa aloitusta. Autofluoresenssi ei häiritse upkonversioluminesenssin mittausta ja siksi UCNP-leiman käyttö, ja lantanidi-ionien viritys pienikokoisella diodilaserilla sallivat herkän immunomäärityksen kehittämisen, jossa voidaan käyttää edullisia ja yksinkertaisia mittalaitteita. Hydrofobiset UCNP:t pinnoitettiin perinteisesti hydrofiilisellä silikalla tai vaitoehtoisesti eri kokoisilla polyakryylihapoilla. cTnI:tä spesifisesti tunnistava vastaaine konjugoitiin kovalenttisesti UCNP:n pintaan sulfo-NHS/EDC-aktivoinnilla. Vasta-aineella konjugoituja UCNP-leimoja käytettiin heterogeenisessä kaksipuolisessa cTnI-immunomäärityksessä ja upkonversioluminesenssi mitattiin kuivista kaivoista levylukijalla. Käytettyjä menetelmiä optimoitiin UCNP:n epäspesifisen sitoutumisen vähentämiseksi ja analyyttisen herkkyyden parantamiseksi. Kehitetyn immunomäärityksen toimivuutta testattiin terveiden henkilöiden plasmanäytteillä, joihin oli lisätty tunnettu cTnI-pitoisuus. UCNP:n pinnoitus alhaisen molekyylipainon polyakryylihapolla vähensi selvästi kaivon sisäistä vaihtelua sekä paransi määrityksen toistettavuutta ja analyyttistä herkkyyttä silikapintaiseen UCNP-leimaan verrattuna. Parhaalla sitojavasta-aineiden, leimavasta-aineen ja -inkubointipuskurin yhdistelmällä kehitetyn immunomäärityksen analyyttinen herkkyys oli alle 1,2 ng/l CV:n ollessa alle 10 %. Tutkimus osoitti, että UCNP-leimalla on mahdollista havaita erittäin alhaisia cTnI-pitoisuuksia. Plasmanäytteiden cTnI-sannoissa oli eroja valituilla määritysolosuhteilla, joten toimiva immunomääritys vaatii vielä olosuhteiden lisäoptimointia. Asiasanat: upkonvertoivat nanopartikkelit, polyakryylihappopinnoitus, heterogeeninen immunomääritys, cTnI 46 Fab-fragmentin DNA-sekvenssin vaikutus Escherichia colin kasvuun ja tuottoominaisuuksiin Antti Kulmala Ohjaajat: FT Tuomas Huovinen, FT Eeva-Christine Brockmann, FT Urpo Lamminmäki MOLEKULAARINEN BIOTEKNIIKKA JA DIAGNOSTIIKKA Synonyymisillä kodoneilla tarkoitetaan kodoneja, jotka ovat erilaisia, mutta koodaavat samaa aminohappoa. Synonyymisten mutaatioiden, eli kodonin vaihtaminen samaa aminohappoa koodaavaan toiseen kodoniin, on pitkään ajateltu olevan yhdentekeviä, mutta synonyymit muutokset DNA-sekvenssissä voivat kuitenkin vaikuttaa esimerkiksi proteiinin laskostumiseen ja proteiinin toimintaan solussa. Eri organismit käyttävät synonyymisiä kodoneja eri frekvensseillä. Tätä ilmiötä kutsutaan kodonikäytön poikkeamaksi. Kodonikäytön poikkeamien on osoitettu olevan tärkein yksittäinen prokaryoottien geeniekspressioon vaikuttava tekijä, ja usein proteiineja on hankala tuottaa vieraassa isännässä, jos kodonikäytön poikkeamat ovat liian suuria. Erilaisia kodonioptimointistrategioita on kehitetty näiden ongelmien ratkaisemiseksi. Kodonikäyttöä optimoitaessa on otettava huomioon lisäksi erilaiset paikalliset muuttujat, jotka lisäävät optimoinnin monimutkaisuutta. Työn lähtökohtana oli synteettinen ihmisen vasta-aineen Fab-fragmentin geeni. Geeni oli optimoitu kahdella eri strategialla, jotka tuottivat eri DNA-sekvenssit, mutta saman aminohapposekvenssin. Toinen varianteista tuotti aktiivista Fab-fragmenttia, toinen ei. DNA-sekvenssin vaikutuksen tutkimiseksi, toimivan geenin osia korvattiin toimimattoman variantin vastaavalla osalla. Kaikkiaan seitsemän geenivariantin kykyä ilmentää Fab-fragmenttia sekä liukoisena proteiinina että filamenttifaagin pinnalla vertailtiin. Lisäksi tutkittiin varianttien vaikutusta isäntäsolun kasvukinetiikkaan. Muunneltuja variantteja verrattiin alkuperäiseen toimivaan varianttiin. Faagituotossa havaittiin Fab-fragmentin kevyen ketjun DNA-sekvenssin synonyymisten muutosten vaikuttavan faagien immunoreaktiivisuuteen. Erityisen olennainen oli kevyen ketjun vakioisen alueen muuttaminen, joka myös aiheutti 45 % laskun faagien kokonaismäärässä. Liukoista proteiinia tuotettaessa kevyen ketjun vakioisen alueen muutos laski Fab-määrän tasolle, jota ei voitu mitata. Tämän lisäksi, avoimen lukukehyksen alun kodonien synonyymiset mutaatiot aiheuttivat 86 % laskun aktiivisen liukoisen proteiinin määrässä verrattuna alkuperäiseen toimivaan varianttiin. Asiasanat: Kodonikäyttö, geenioptimointi, Escherichia coli 47 Rekombinanttivasta-aineen affiniteetin parantaminen suunnatun evoluution avulla Teppo Heimo Ohjaajat: FT Ramkrashan Kasera, FT Urpo Lamminmäki MOLEKULAARINEN BIOTEKNIIKKA JA DIAGNOSTIIKKA Plasmodium -suvun itiöloiset aiheuttavat malariaa, joka on maailmanlaajuisesti yksi suurimmista kuolemaan johtavista taudeista ja leviää Anopheles -suvun hyttysten välityksellä. Suurin ongelma malarian hoidossa on viivästynyt tai väärä diagnoosi. Yleisin ja vaarallisin malariaa aiheuttava laji on P. falciparum. Ainoastaan P. falciparumin on havaittu erittävän tartunnan saaneen verenkiertoon HRPII-antigeenia, joka voidaan havaita paitsi verestä myös jopa virtsasta. Nopean ja tarkan HRPIIantigeeniin perustuvan malariadiagnostiikan kehittäminen vaatii korkealaatuisia HRPII-spesifisiä vasta-aineita. Työssä pyrittiin parantamaan synteettisestä vasta-ainekirjastosta eristetyn HRPIIspesifisen Fab-vasta-ainefragmentin sitomisvoimakkuutta suunnatun evoluution avulla. Vasta-ainegeeniin tehtiin satunnaismutaatioita selektiivisellä RCA menetelmällä kahdella eri strategialla: virhealttiilla PCR:llä (EP-PCR) mutatoituja mega-alukkeita tai oligonukleotidi-kohdennettua mutageneesiä käyttäen. EP-PCR:llä substituutiomutaatioita pyrittiin saamaan aikaan eri puolille vasta-aineen kevyen- (VL) ja raskaanketjun (VH) variaabeliosia koodaavia geenejä. Oligonukleotidikohdennetulla menetelmällä substituutioita, lyhyitä insertioita ja deleetioita kohdennettiin VL- ja VH-osien hybervariaabelialueille. Mutatoiduista vastaainefragmenttigeeneistä valmistettiin geenikirjastot, jotka rikastettiin faaginäyttötekniikalla. EP-PCR:llä mutatoidut VL- ja VH-ketjut eivät toimineet tehokkaasti samanaikaisesti mega-alukkeina selektiivisessä RCA -menetelmässä. Lisäksi EP-PCR:ssä mutaatioaste jäi pieneksi kaikissa testatuissa reaktio-olosuhteissa. Oligonukleotideihin perustuvalla strategialla tuotetut kirjastot sen sijaan sisälsivät halutunlaisia mutaatioita ja kattoivat myös kirjastolle suunnitellun teoreettisen diversiteetin. Faaginäyttötekniikalla rikastettujen kirjastojen HRPII-sitomisaktiivisuus oli voimakkaasti kasvanut. Jatkossa seulotaan yksittäisiä klooneja sitomisaktiivisuuden määrittämiseksi. Asiasanat: faaginäyttötekniikka, Plasmodium falciparum, malaria vasta-ainemuokkaus, 48 satunnaismutageneesi, Faaginäyttötekniikalla uusia vasta-aineita luustolihasperäiselle troponiini I:lle Susanna Lammi Ohjaajat: FT Eeva-Christine Brockmann, FT Tanja Savukoski, FM Heidi Hyytiä MOLEKULAARINEN BIOTEKNIIKKA JA DIAGNOSTIIKKA Troponiinit I, T ja C ovat poikkijuovaisten lihasten (sydän- ja luustolihakset) rakenneproteiineja, jotka säätelevät lihasten supistumista. Sydän- ja luustolihasten vaurioitumisen seurauksena troponiineja vapautuu verenkiertoon, josta niitä pystytään mittaamaan immunomääritysten avulla. Koska troponiinit I ja T ovat erilaisia luustolihaksissa (engl. skeletal troponin, skTn) ja sydänlihaksessa (engl. cardiac troponin, cTn), pidetään niitä varsin spesifisinä merkkiaineina. cTnI ja cTnT ovat vakiinnuttaneet asemansa sydäninfarktin merkkiaineina. Toisaalta skTnI:tä pidetään mahdollisena merkkiaineena luustolihassairauksien diagnosoinnissa, mutta tutkimusta asiasta on vähän. Kaupallisia skTnI-määrityksiä ei ole, eikä tällä hetkellä markkinoilla ei ole juurikaan skTnI-spesifisiä vasta-aineita. Työn tarkoituksena oli etsiä faaginäyttötekniikan avulla uusia skTnI:n tunnistavia vasta-aineita, jotka mahdollistaisivat herkän skTnI-immunomäärityksen kehittämisen. Vasta-aineet rikastettiin Turun yliopistossa valmistetusta synteettisestä vastaainekirjastosta. Rikastetut sitojat kloonattiin tuottovektoriin ja scFv-sitojavasta-aineita (engl. single chain variable fragment) tuotettiin Escherihia coli -bakteereissa. Sitojista parhaat seulottiin mittaamalla niiden aktiivisuus skTnI:tä ja ristireaktiivisuus cTn:tä vastaan immunomäärityksissä. Alustavien tulosten perusteella vasta-ainekirjastoista rikastui sitojia, jotka tunnistavat skTnI:n. Suurin osa näistä sitojista vaikuttaisi olevan myös sellaisia, jotka eivät merkittävästi ristireagoi cTn:n kanssa. Lupaavimmat sitojat sekvensoidaan ja karakterisoidaan tarkemmin, jonka jälkeen ne kloonataan Fab-fragmenteiksi. Kloonatut vasta-aineet tuotetaan ja niiden toimivuutta testataan skTnIimmunomäärityksissä. Kehitettävien määritysten avulla voitaisiin mitata skTnIpitoisuudet terveiden ja sairaiden verestä ja tätä kautta tutkia skTnI:n asemaa kliinisenä merkkiaineena. Asiasanat: faaginäyttötekniikka, immunomääritys, luustolihasperäinen troponiini I, vasta-aine 49 Eksosomispesifisten vasta-aineiden kehittäminen eturauhassyövän seulontaan Niklas Ekman Ohjaajat: FM Janne Leivo, FT Urpo Lamminmäki MOLEKULAARINEN BIOTEKNIIKKA JA DIAGNOSTIIKKA Eturauhassyöpä on miesten toiseksi yleisin syöpä maailmanlaajuisesti. Sen diagnosoinnissa yleisimmin käytettävä merkkiaine, prostataspesifinen antigeeni (PSA), ei ole spesifinen pelkästään syövälle, vaan kohonneet arvot voivat johtua myös eturauhasen hyvälaatuisesta liikakasvusta. Tämän takia PSA-mittaukset voivat johtaa ylidiagnosointiin ja turhiin hoitoihin. Eturauhassyövälle tarvitaan spesifisempiä merkkiaineita diagnosoinnin ja taudin seurannan parantamiseksi. Eksosomit kuuluvat solujen erittämiin nanokokoisiin vesikkeleihin ja niiden on havaittu sisältävän samoja RNA- ja proteiinimolekyylejä kuin solut, joista eksosomit ovat lähtöisin. Tästä syystä eksosomit ovat mielenkiintoinen lähde uusille biomerkkiaineille. Tutkimuksessa pyrittiin seulomaan vasta-ainekirjastosta sellaisia vasta-aineita, jotka sitoutuvat spesifisesti eturauhassyöpäperäisiin eksosomeihin. Eksosomit eristettiin eturauhassyöpäpotilaiden antamista virtsanäytteistä, jotka oltiin jaoteltu neljään ryhmään syövän aggressiivisuutta kuvaavan Gleason scoren perusteella. Lisäksi eristettiin eksosomit näytteistä, jotka olivat peräisin eturauhasen hyvälaatuista liikakasvua sairastavilta sekä terveiltä. Vasta-ainekirjastosta seulottiin vasta-aineita eri eksosomeille faaginäyttötekniikan avulla. Eksosomit kiinnitettiin streptavidiinillä päällystettyjen magneettisten partikkelien pintaan biotinyloidulla vasta-aineella, joka sitoutuu yleiseen eksosomaaliseen transmembraaniproteiini-CD9:ään. Selektioita tehtiin kolme kierrosta. Kunkin kierroksen päätteeksi seulotusta faagipopulaatiosta monistettiin vasta-aineiden geenit polymeraasiketjureaktiolla käyttäen alukkeita, jotka mahdollistavat geenien sekvensoinnin Illuminan MiSeq-laitteistolla. Tutkimus jatkuu geenikirjastojen sekvensoinnilla ja sekvenssidatan analysoinnilla. Tarkoituksena on löytää vasta-aineita, jotka rikastuvat seulonnoissa vain syöpäperäisillä eksosomeilla. Tällaisen vasta-aineen löytyminen voisi mahdollistaa myös uuden merkkiaineen löytymisen. Asiasanat: eturauhassyöpä, eksosomi, vasta-ainekirjasto, faaginäyttötekniikka 50 NUORET TUTKIJAT 2015 KIITTÄÄ ABACUS Diagnostica Apetit DHR Finland Oy, Innotrac Diagnostics Fazer Hidex HyTest Immuno diagnostic Oy Kaivogen Luonnontieteiden Akateemisten Liitto LVI-insinööritoimisto Alfa Oy Maahovi Oy Medix Biochemica Oligomer Oy PerkinElmer Tekniikan akateemiset Turku Science Park NUORET TUTKIJAT 2015 verkossa: http://www.utu.fi/fi/yksikot/sci/yksikot/biokemia/laitos/NT/Sivut/home.aspx 51
