Adskillelse af kloroplastpigmenter

\
P
\aJr p o i/\/ie 1 I,
Den russiske botaniker Tswett var den f0rste, der anvendte en kromatografisk metode (1906). Tswett unders0gte, ligesom i dette fors0g, de stoffer, der findes i en ekstrakt af grenne blade. De kromatografiske adskillelsesmetoder bygger alle pa en gentagen vandring
af komponenterne i en blanding af en stationaer og en mobil fase. I
den form for kromatografi, der benyttes i dette fors0g, papirkromatografi, fastholder filtrerpapir den stationaere vasskefase. En
drabe af den oplasning, der skal analyseres, anbringes naer den ende
af filtrerpapiret, der haenger ned i et opl0sningmiddel. Opl0sningsmidlet vil af kapillarkraefterne i filtrerpapiret suges op, passere pletten og traskke det op!0ste stof med sig. Da filtrerpapir altid indeholder en del vand (15 %), kan den stationaere fase betragtes som vand
masttet med op!0sningsmiddel; den mobile fase er det rene op!0sningsmiddel. Det oploste stof vil derfor f01ge desto laengere med
op!0sningsmidlet pa dets vandring gennem filtrerpapiret, jo mindre
vandop!0seligt det er, og da der er tale om en blanding af forskellige
stoffer med forskellig op!0selighed i vand, vil der efterhanden kunne
finde en adskillelse sted.
STARTPLET
Malerialer
Gronne blade
Ethanol
Papirclips
Saks
Optasningsmiddel*
Reagensglas
Vandbad
Pasteur-pipette
Stort reagensglas og prop (kork)
Petriskal
Filtrerpapir (Whatmann 1)
(strimler og rundfiltre)
Figur3-18
* Som op!0sningsmiddel (lebevasske) kan anvendes felgende blandinger: (1)
8 % acetone og 92 % petroleumsether, (2) 10 % ethanol og 90 % petroleumsether, (3) 90 % benzen og 10 % acetone.
2.
gu!
carotin a og ii
grS
pheeophytin
gul
jlgron
xanthophyll
klorofyl a
blagron
klorofyl b
violet
antocyan
Figur 3-19 Et kromatogram.
Startlinie ved 1. Vaeskefront
ved 2.
Fremga ngsmdde
\. Anbring nogle fa blade i et reagensglas. Daek bladene med ethanol. Kog pa vandbad i nogle minutter, indtil alkoholen blive m0rkegren, nassten sort. Dette er pigmentekstraktet. (ADVARSEL:
Udscst ikke alkoholen for dben flamme).
2. Faest en strimmel filtrerpapir under proppen. Der benyttes en
clips der trykkes ind i proppen, eventuelt en staltradskrog, formet
som et »J«. Bor krogen ind i undersiden af proppen, og haeng
filtrerpapirstrimlen pa krogen. Pas pa, at papirer haenger lige i
reagensglasset og naesten nar bunden (se figur 3-18).
3. Left proppen og papiret, og haeld sa meget opl0sningsmiddel i
reagensglasset, at underkanten af papiret nar ned i vaesken.
4. Med blyant, ikke black, tegnes en linie over papirstrimlen ca. 2 cm
fra underkanten. Spred pa denne linie en drabe af pigmentop!0sningen med pasteurpipetten, og lad papiret t0rre. Anbring pany
en drabe ekstrakt langs blyantstregen og lad den t0rre. Dette
gentages nogle gange, indtil stregen har fact en meget m0rk farve.
5. Anbring det t0rrede filtrerpapir med pigmentpletten i reagensglasset. Kontroller, at underkanten af papirstrimlen dypper ned
i op!0sningsmidlet og s0rg for, at papiret ikke berorer reagensglassets sider. Lad op!0sningsmidlet vandre naesten op til toppen af
papirstrimlen, hvorefter kromatografien afbrydes, og strimlen tages ud og t0rres. Tegn og beskriv resultatet.
Diskussion
\. Noter og beskriv farverne i den orden, de forekommer fra overkant til
underkant af strimlen
2. Find ved hjaelp af figur^-l^ hvilke pigmenter der udg0r de forskellige
band.
3. Hvorfor vandrer farvestofferne ulige langt i kromatogrammet?
4. Hvilke kemiske forskelle er der mellem klorofyl a og klorofyl b, der er
tilstraekkelige til at forklare disse to stoffers adskillelse?
5. Naevn nogle mulige opgaver for de gule farvestoffer.
Yderligere undersagelser
A. Ved papirkromatografi er del muligt at identificere stoffer ved
deres sakaldte Rf-vaerdi - den vejlaengde, de har bevaeget sig pa
papiret i forhold til den vejlaengde opl0sningsmidlet er vandret.
Rf-vaerdien er altsa defineret ved:
Rf =
plettens afstand fra startlinien
vaeskefrontens afstand fra startlinien
R star for rate = hastighed, og f for front, idet et givet stofs vandringshastighed opgives i forhold til oplesningsmidlets hastighed.
Beregn Rf-vaerdierne for de forskelligt farvede band pa kromatogrammerne.
B. Granalger f.eks. Chlorella indeholder naesten de samme pigmenter som blade. Andre alger (som f.eks. brunalger og r0dalger) rummer mere afvigende pigmentsammensaetninger. Hvis der er adgang
til at indsamle alger pa stranden, kan disse Bruges til undersogelse
af, hvilke pigmenter forskellige arter indeholder.
C. Ved hjaslp af papirkromatografi kan man undersoge pigmenter
fra blade af tracer, der lever under forskellige ydre forhold. prov f.eks.
at sammenligne pigmentindholdet i blade af forskellige farver, forskellige arter, eller lys- og skyggeblade hos b0g.
Hvorledes pavirker miljoet pigmentets sammensaetning og maengde?