Aspectos fisiológicos y moleculares de la acumulación heteróloga

Transcription

Universidad Nacional de San Martín
Instituto de Investigaciones Biotecnológicas
Aspectos fisiológicos y moleculares de la acumulación
heteróloga de poli(3-hidroxibutirato) en Escherichia coli:
análisis del rol de los sistemas de dos componentes
ArcAB y CreBC sobre la respuesta redox y el
catabolismo de carbono
Lic. Pablo Iván Nikel
Director: Dr. Miguel A. Galvagno
Co-directora: Dra. Beatriz S. Méndez
Tesis presentada para optar al título de Doctor en Biología
Molecular y Biotecnología de la Universidad Nacional
de San Martín
2009
« […] La fermentation s’y montre corrélative de la vie, de l’organisation de globules,
non de la mort ou de la putréfaction de ces globules, pas plus qu’elle n’y apparaît comme un
phénomène de contact, où la transformation du sucre s’accomplirait en présence du ferment
sans lui rien donner, sans lui rien prendre. Ces derniers faits, on le verra bientôt, sont
contredits par l’expérience quotidien. »
Louis Pasteur
Mémoires de la Société des sciences, de l’agriculture et des arts de Lille
Sesión del 8 de agosto de 1857
2 a ser., V, 1858, p. 13-26
Agradecimientos
Al Dr. Miguel A. Galvagno, por dirigir esta tesis doctoral, y por la enorme cantidad
de conocimiento que supo transmitirme durante todos estos años. Por permitirme formarme
como científico, porque siempre que estuvo en sus manos el hacerlo promovió mi
crecimiento profesional, porque supo fomentar mi (humilde) espíritu creativo dándome
mucha libertad, y por los momentos lindos dentro y fuera del laboratorio. A la Dra. Beatriz S.
Méndez, por darme un espacio en su laboratorio y enseñarme todo lo que sé de genética de
bacterias, por guiarme en muchos aspectos de esta tesis, por mostrarme su particular enfoque
filosófico de la ciencia, por alentarme y apoyarme incondicionalmente en los buenos y malos
momentos, y darme siempre un contexto de trabajo cuidadosamente planificado. A ambos,
por facilitarme las herramientas y por ayudarme a convertirme en científico, y entender lo
que eso significa.
Al Dr. George N. Bennett, por aceptarme en su laboratorio de Rice University en una
pasantía como estudiante graduado durante la cual se desarrollaron los experimentos
descriptos en el Capítulo V. Al Dr. Jiangfeng Zhu por ayudarme en los experimentos y
explicarme pacientemente una y mil veces todo aquello que no entendía de flujos
metabólicos. Al Dr. Ka-Yiu San por compartir elementos y espacio de su laboratorio. A Mary
L. Harrison, por ayudar a que mi estadía en Houston y en el laboratorio fueran no sólo
llevaderas, si no también divertidas. ¡También por su fabuloso chocolate and pecan pie! Al
resto del personal de los laboratorios del Dr. Bennett y del Dr. San, por la ayuda y por
aceptarme como parte del equipo desde el día que llegué.
A la Dra. M. Julia Pettinari, que me ayudó mil veces y con quien ha sido (y es) un
placer trabajar, y de quien he aprendido muchísimas cosas, por su voluntad, predisposición, y
su contagiosa buena onda. A la Dra. Nancy I. López, por compartir conocimientos y
materiales, y por estar siempre dispuesta a ayudar.
A todos los amigos que me deja este período de mi vida. Del IIB, Flor Kronberg,
quien entendió mejor que nadie lo que es compartir el día a día en la ciencia. Porque
considero que es una persona genial, excelente científica, y aún mejor amiga. A SilMar Rosa,
con quien actualmente comparto el laboratorio, por su buen humor, su empuje para afrontar
todo con una sonrisa, y porque en el medio de todo, también es una buena amiga. A Ceci
Ramírez, por ser una persona muy especial y predispuesta, y por haber tenido la paciencia de
soportarme como co-director de su tesina. A Maite Recalde, por hacer más ameno el día a
día. De Química Biológica, a Ale de Almeida, con quien hemos compartido experimentos y
charlas desde la tesina, por los fructíferos ‘trabajos en conjunto’, por darme una mano
siempre que la necesité, y porque aprendimos (¿aprendimos?) a lidiar con los biopolímeros.
Porque es no solamente una excelente persona, si no que además es una buena amiga. A
Andy Giordano, por su buena onda y predisposición para hacer fermentaciones a cualquier
hora, cualquier día. A Jimena A. Ruiz, porque desinteresadamente me ayudó muchísimo
enseñándome infinidad de técnicas. A tutti gli altri (Lau Raiger, Nico Ayub, Paulita Tribelli,
Marie Cattone et alii) por haber sido buenos compañeros y por compartir el día a día en el
laboratorio. A todos, por los momentos lindos que compartimos tanto dentro como fuera del
laboratorio.
Al pas de trois colectivamente denominado “Los Ruzal”: Mariano, Mer, y Marianita.
Por ayudar siempre con toda la predisposición, y por compartir SAIB 2008 conmigo.
Especialmente a Marianito, por Boston, por las charlas y salidas compartidas, y por poner
siempre la mejor de las ondas. A sus jefas, las Dras. Carmen Sánchez de Rivas y Sandra M.
Ruzal, por compartir materiales e información valiosa.
A la gente del IIB (becarios y jefes de grupo), por la predisposición para compartir
equipos, conocimientos, y por los innumerables préstamos (normalmente, sin devolución) de
montones de cosas. En especial, a la gente del laboratorio del Dr. Juan J. Cazzulo, por oficiar
de “asesores de proteínas” con infinita paciencia y buena onda.
Al Dr. Rubén O. Fernández (Unidad de Actividad Química, Comisión Nacional de
Energía Atómica, CNEA), por ser mi primer mentor en la ciencia, y por las infinitas
mediciones cromatográficas de PHB y ácidos orgánicos que hizo. Al Dr. Ramón Pizarro (del
Departamento de Radiobiología, CNEA) por permitirme utilizar el equipamiento para la
determinación de capacidad respiratoria.
Al personal de apoyo del IIB (Susana, Ernesto, Graciela, Mirna, Paola, Mónica), por
contribuir a que se pueda trabajar con mayor libertad. A Nelly y Tere, por preparar y limpiar
toneladas de materiales, y por autoclavar el fermentador a las horas más inverosímiles. A
Zulma, por contribuir con voluntad admirable a la limpieza del laboratorio (muy a pesar de
sus habitantes).
A mis amigos de la vida, por haberme escuchado pacientemente declamar horas y
horas acerca de E. coli y los bioplásticos. En especial a Juancho, por haber compartido y
soportado los buenos y malos momentos derivados del labo (y otros que no), por estar
siempre dispuesto a escuchar y entender, y por estar ahí desde hace veinte años.
A mi familia (a todos ellos). Porque todo esto se los debo a ellos, porque supieron
entenderme cuando decidí ser científico, y me apoyaron con el mayor de los cariños. Porque
siempre estuvieron (y están) ahí cuando los necesito. A Hernán, porque también me enseñó
algunas cosas del pensamiento científico (las cuales ni siquiera sabía que existían). Por estar
siempre dispuesto a alentarme, incluyendo los momentos realmente difíciles. Por haber
compartido infinidad de proyectos, y por ayudarme a seguir planeándolos y creer en ellos.
Al Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET) y la
American Society for Microbiology (ASM) por el apoyo económico brindado durante la
realización de la tesis y en la pasantía en el laboratorio del Dr. George N. Bennett,
respectivamente.
A los que no agradezco puntualmente, pero aportaron su esfuerzo y voluntad para que
pudiera hacer mi trabajo.
A todos, muchas gracias…
Abreviaturas
ADN
ARN
pb
kb
kDa
Ap
Km
Cm
Str
Sp
IPTG
SDS
EDTA
Tris
CAS
TES
HEPES
DCDHF-DA
MTT
Bicina
PMSF
ε
λ
nm
DO/DO600
UV
UA
κ
q
μ(max)
YA/B
Mr(’)
s
min
h
r.p.m.
vol
Conc.
UFP
MM
PCR
ArcA∼P
Pi
PHA
PHB
H+
H
Ácido desoxirribonucleico
Ácido ribonucleico
Par(es) de bases
103 pb
103 Dalton
Ampicilina
Kanamicina
Cloranfenicol
Estreptomicina
Espectinomicina
Isopropil-β-D-tiogalactopiranósido
Dodecilsulfato de sodio
Ácido etilendiaminotetracético
2-Amino-2-hidroximetil-1,3-propanodiol
Casaminoácidos (hidrolizado ácido de caseína)
Solución de elementos traza
Ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazino-etanosulfónico
Diacetato de 2’,7’-diclorodihidrofluoresceína
Azul de tiazolilo [3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio]
N,N-Bis(2-hidroxietil)glicina
Fenilmetilsulfonilfluoruro
Coeficiente de extinción molar
Longitud de onda
Nanómetro
Densidad óptica/densidad óptica medida a λ = 600 nm
Ultravioleta
Unidades arbitrarias
Grado de reducción
Velocidad específica de síntesis/consumo de metabolitos
Velocidad específica (máxima) de crecimiento
Rendimiento de A respecto del parámetro B
Masa molecular relativa (aparente)
Segundo(s)
Minuto(s)
Hora(s)
Revoluciones por min
Volumen(es)
Concentración
Unidades formadoras de placa
Medio de cultivo mínimo
Reacción en cadena de la polimerasa
Forma fosforilada del regulador ArcA
Ortofosfato inorgánico
Polihidroxialcanoato
Poli(3-hidroxibutirato)
Protón
Equivalente de reducción/transportador de electrones (H+ + e–)
Q
ATP
ADP
AMPc
DHA
NAD+
NADH
NADP+
NADPH
FAD
Acetil-CoA
Ciclo TCA
cPdh
Pfl
Pta
AckA
PP
Pir
FEP
Gli
OAA
CIT
ORF
FRT
RI
EROs
CG/MS
ANOVA
LCA
Exp.
Quinona/quinol
Adenosina trifosfato
Adenosina difosfato
Adenosina monofosfato cíclico
Dihidroxiacetona
Nicotinamida adenina dinucleótido (forma oxidada)
Nicotinamida adenina dinucleótido (forma reducida)
Nicotinamida adenina dinucleótido fosfato (forma oxidada)
Nicotinamida adenina dinucleótido fosfato (forma reducida)
Flavina adenina dinucleótido
Acetil-coenzima A
Ciclo de ácidos tricarboxílicos
Complejo piruvato deshidrogenasa
Piruvato-formiato liasa
Fosfotransacetilasa
Acetato quinasa
Pentosa(s) fosfato
Piruvato
Fosfoenolpiruvato
Glioxilato
Oxaloacetato
Citrato
Marco de de lectura abierto (open reading frame)
Sitio de reconocimiento de la recombinasa Flp
Repeticiones terminales invertidas
Especies reactivas de oxígeno
Cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas
Análisis de la varianza
Análisis del ciclo de vida
Experimento
Índice temático
Página
Resumen………………………………………………………………………………… 1
Abstract…………………………………………………………………………………. 4
Capítulo I: Introducción general
1.1. Evolución de las respuestas celulares al oxígeno…………………………………...7
1.1.1. Generalidades__________________________________________________ 7
1.1.2. Evolución de otras respuestas específicas a nivel celular_________________ 8
1.2. Sensores de oxígeno………………………………………………………………... 8
1.3. Percepción de la disponibilidad de oxígeno en Enterobacteriaceae: Escherichia
coli como modelo paradigmático……………………………………………………… 9
1.3.1. Fnr: El regulador global dominante en condiciones anaeróbicas___________ 11
1.3.1.1. El modulón Fnr____________________________________________ 11
1.3.1.2. El mecanismo de detección de oxígeno por Fnr in vitro____________ 11
1.3.1.3. Proteínas homólogas a Fnr en otros microorganismos______________ 13
1.3.2. El sistema de regulación de dos componentes ArcAB: Adaptación
metabólica a cambios en la concentración de oxígeno en el rango microaeróbico…. 14
1.3.2.1. Sistemas de transducción de señales de dos componentes___________ 14
1.3.2.2. El sensor de membrana ArcB_________________________________ 14
1.3.2.3. El regulador citoplasmático de respuesta ArcA___________________ 17
1.3.2.4. Mecanismo de señalización__________________________________ 19
1.4. Respuestas de E. coli a cambios en la disponibilidad de oxígeno…………………. 21
1.4.1. Cambios en el metabolismo catabólico_______________________________21
1.4.2. Catabolismo (an)aeróbico de glucosa en E. coli________________________21
1.4.2.1. Degradación aeróbica de piruvato_____________________________ 23
1.4.2.2. Degradación anaeróbica de piruvato___________________________ 25
1.5. Los polihidroxialcanoatos bacterianos (PHAs): Algunos antecedentes históricos y
características generales………………………………………………………………… 28
1.5.1. Propiedades de los PHAs_________________________________________ 30
1.5.1.1. Estructura química_________________________________________ 30
1.5.1.2. Características físicas_______________________________________ 31
1.5.2. Fisiología y biosíntesis de PHB____________________________________ 32
1.5.3. Biología molecular y enzimología de la biosíntesis de PHAsSCL___________ 33
1.5.4. Consideraciones biológicas________________________________________34
1.5.4.1. Biodegradabilidad__________________________________________34
1.5.4.2. Naturaleza renovable de los sustratos___________________________35
1.5.5. Aplicaciones de los PHAs_________________________________________ 36
1.6. Referencias bibliográficas………………………………………………………….. 37
Capítulo II: Evaluación de mutantes arcA para la acumulación
heteróloga de PHB en condiciones microaeróbicas
2.1. Prefacio…………………………………………………………………………….. 55
2.2. Objetivos…………………………………………………………………………… 55
2.3. Introducción………………………………………………………………………... 56
2.3.1. Polihidroxialcanoatos bacterianos (PHAs): Características generales_______ 56
2.3.2. Antecedentes en la producción de PHAs por fermentaciones microbianas___ 58
2.3.2.1. Microorganismos productores naturales_________________________58
2.3.2.2. Cepas bacterianas recombinantes______________________________ 59
2.3.2.3. Cultivos mixtos____________________________________________ 62
2.3.2.4. Organismos eucariotas como productores de PHAs________________63
2.3.3. Producción biotecnológica de PHAs en la actualidad___________________ 64
2.4. Materiales y métodos……………………………………………………………… 64
2.4.1. Cepas y plásmidos_______________________________________________64
2.4.2. Medios y condiciones de cultivo____________________________________65
2.4.3. Manipulaciones genéticas_________________________________________ 67
2.4.4. Métodos analíticos______________________________________________ 70
2.5. Resultados y discusión……………………………………………………………... 73
2.5.1. Caracterización preliminar de una cepa ΔarcA de colección para la
acumulación heteróloga de PHB en frascos agitados_________________________ 73
2.5.2. Caracterización de la capacidad respiratoria y requerimientos nutricionales
de distintas cepas arcA de E. coli________________________________________ 76
2.5.3. Síntesis de PHB por cepas recombinantes de E. coli con mutaciones ΔarcA y
arcA::IS10-L________________________________________________________ 78
Capítulo III: Análisis de las bases bioquímicas del fenotipo Dye en
mutantes arcA y supresión de la sensibilidad a colorantes redox por
expresión heteróloga de los genes pha
3.1. Prefacio…………………………………………………………………………….. 91
3.2. Objetivos…………………………………………………………………………… 91
3.3. Introducción………………………………………………………………………... 91
3.4. Materiales y métodos________________________________________________ 93
3.4.1. Cepas, plásmidos, y condiciones de cultivo___________________________ 93
3.5.1. Caracterización del fenotipo Dye en mutantes arcA de E. coli____________ 94
3.5.2. Supresión de la sensibilidad de mutantes arcA a colorantes redox como
respuesta a la expresión heteróloga de los genes pha_________________________ 95
3.5.3. La supresión del fenotipo Dye debida a la expresión de los genes pha implica
una disminución en la capacidad respiratoria y en la generación de especies
reactivas de oxígeno__________________________________________________ 96
Capítulo IV: Estudio de aspectos fisiológicos y metabólicos de
mutantes arc y cre
4.1. Prefacio…………………………………………………………………………….. 101
4.2. Objetivos…………………………………………………………………………… 101
4.3. Introducción………………………………………………………………………... 101
4.4. Materiales y métodos………………………………………………………………. 104
4.4.2. Manipulaciones genéticas_________________________________________ 106
4.4.4. Manipulación de proteínas________________________________________ 109
4.5. Resultados y discusión…………………………………………………………….. 110
4.5.1. Análisis del genotipo y fenotipo de mutantes arcA::IS10-L_______________110
4.5.2. Presencia de una mutación constitutiva en el gen creC de E. coli CT1061___ 112
4.5.3. Estudio de la contribución de mutaciones en los sistemas ArcAB y CreBC a
algunas de las características fenotípicas de E. coli CT1061___________________ 114
4.5.4. Rol del sistema CreBC en otras diferencias metabólicas y enzimáticas
observadas en E. coli CT1061__________________________________________ 117
4.5.5. Regulación de la actividad de los citocromos bd y bo en E. coli CT1061____ 119
Capítulo V: Análisis de flujos metabólicos de mutantes arcA y creB
5.1. Prefacio…………………………………………………………………………….. 127
5.2. Objetivos…………………………………………………………………………… 127
5.3. Abreviaturas utilizadas en este capítulo……………………………………………. 127
5.4. Introducción………………………………………………………………………... 127
5.5.2. Marcación con 13C-glucosa y análisis de flujos metabólicos______________ 132
5.6.1. Parámetros de crecimiento de las mutantes creB y arcA de E. coli en cultivos
en quimióstato_______________________________________________________135
5.6.2. Análisis de flujos metabólicos_____________________________________ 136
5.7. Apéndice A: Reacciones bioquímicas incluidas en la red metabólica……………... 142
Capítulo VI: Evaluación de cultivos microaeróbicos de mutantes arc y
cre utilizando glicerol como fuente de carbono principal
6.1. Prefacio…………………………………………………………………………….. 149
6.2. Objetivos…………………………………………………………………………… 149
6.3. Introducción………………………………………………………………………... 149
6.3.1. Conversión de glicerol en productos de valor agregado__________________ 150
6.3.2. Metabolismo fermentativo del glicerol_______________________________ 152
6.3.3. Fermentación anaeróbica de glicerol como fuente de biocombustibles ya
productos químicos___________________________________________________ 152
6.3.4. Utilización anaeróbica de glicerol por especies de los géneros
Propionibacterium, Anaerobiospirillum, y Escherichia_______________________153
6.4.1. Cepas y condiciones de cultivo_____________________________________155
6.4.3. Reactivos______________________________________________________157
6.5.1. Parámetros cinéticos de los cultivos microaeróbicos____________________ 157
6.5.2. Patrón de fermentación en glicerol__________________________________ 158
6.5.3. Disponibilidad de poder reductor___________________________________ 164
Capítulo
VII: Diseño de un bioproceso para la producción
microaeróbica de PHB a partir de glicerol como sustrato carbonado
principal
7.1. Prefacio…………………………………………………………………………….. 171
7.2. Objetivos…………………………………………………………………………… 171
7.3. Introducción………………………………………………………………………... 171
7.4.1. Cepa y condiciones de cultivo_____________________________________ 174
7.4.2. Diseños experimentales estadísticos y análisis de los resultados___________ 175
7.5.1. Efecto de aditivos redox en el crecimiento y acumulación de PHB en cultivos
en lote en frascos agitados_____________________________________________ 177
7.5.2. Formulación de un medio de cultivo apropiado para la síntesis de PHB
utilizando la metodología de los diseños experimentales estadísticos____________ 178
7.5.2.1. Diseños de selección de Plackett-Burman_______________________ 179
7.5.2.2. Diseños de optimización de Box-Wilson________________________ 182
7.5.3. Comparación entre glicerol y glucosa como posibles fuentes carbonadas en
condiciones optimizadas para la síntesis de PHB____________________________ 186
7.5.4. Análisis de la acumulación de PHB en condiciones optimizadas en cultivos
en lote en biorreactor_________________________________________________ 187
7.5.5. Cultivos microaeróbicos en lote alimentado__________________________ 188
Capítulo VIII: Conclusiones y perspectivas
8.1. Prefacio…………………………………………………………………………….. 195
8.2. Conclusiones……………………………………………………………………...... 196
8.3. Perspectivas………………………………………………………………………… 199
Resumen
Un mecanismo importante para la supervivencia bacteriana en un medio ambiente
cambiante es la capacidad de la célula procariota para establecer una respuesta rápida que
facilite el ajuste de las vías metabólicas a nuevas condiciones. En el (an)aerobio facultativo
Escherichia coli, la regulación redox como respuesta a cambios en la disponibilidad de
oxígeno está mayormente modulada por el sistema de transducción de señales de dos
componentes ArcAB. Por otra parte, el sistema CreBC regula el catabolismo de carbono en
relación a disponibilidad y tipo de fuente carbonada. Existen numerosos microorganismos
capaces de acumular polihidroxialcanoatos (PHAs); polímeros de reserva compuestos por C,
H, y O, que poseen características biotecnológicas relevantes dado que se trata de poliésteres
completamente biodegradables. La síntesis de PHAs en bacterias responde a deficiencias
nutricionales en presencia de un exceso de fuente de carbono, y está parcialmente regulada
por el estado redox intracelular (en virtud de que consume equivalentes de reducción, como
NADPH). E. coli es un microorganismo modelo adecuado para estudiar la síntesis heteróloga
de numerosos biocompuestos (entre ellos, PHAs), ya que provee un contexto genético y
metabólico estudiado en cierto detalle.
En este trabajo se evaluaron diversos aspectos de la síntesis heteróloga de poli(3hidroxibutirato) (PHB, el PHA más ampliamente difundido) en mutantes arcA de E. coli en
condiciones microaeróbicas de crecimiento. Como modelo de estudio se utilizaron los genes
pha de Azotobacter sp. cepa FA8, los cuales codifican las enzimas involucradas en la síntesis
de PHB. Se estudió la acumulación de PHB en dos tipos de mutantes: una mutante
conteniendo una deleción confinada en arcA (E. coli CT1062), y una mutante de inserción en
la cual arcA está interrumpido por una secuencia de tipo Tn10 (E. coli CT1061). Las
mutaciones en arcA favorecieron la acumulación microaeróbica de PHB, probablemente
porque la desregulación redox en estas mutantes proveería un exceso de equivalentes de
reducción en comparación con cepas ArcA+. Se observaron diferencias significativas entre
ambas cepas arc en varios parámetros fisiológicos; entre ellos, la capacidad respiratoria,
velocidad de crecimiento, y acumulación de PHB. E. coli CT1061 presentó una velocidad de
consumo de oxígeno mayor y fue capaz de crecer en un medio semi-sintético en condiciones
en las cuales E. coli CT1062 requirió de la adición de suplementos nutricionales complejos
para su desarrollo. También se registró un aumento significativo en la acumulación de PHB
por CT1061 (35 ± 3%) en comparación con la cepa salvaje K1060 (<4%) y su derivada
isógenica ΔarcA (27 ± 2%).
Un aspecto fenotípico intrigante de las mutantes arc es el fenotipo Dye, el cual se
caracteriza por la ausencia de crecimiento en presencia de colorantes redox, como el azul de
toluidina. En este trabajo se determinó que el fenotipo Dye se debería al daño oxidativo que
resulta de la elevada capacidad respiratoria de las mutantes arc. Además, se demostró que la
expresión heteróloga de los genes pha suprime el fenotipo Dye y que este fenómeno estaría
mediado por la disminución del nivel intracelular de especies reactivas de oxígeno, ya que el
polímero actuaría como captador de electrones.
1
Con el objetivo de determinar las bases genéticas y bioquímicas de las diferencias
fenotípicas observadas en E. coli CT101 y CT1062, se determinó que varias de las
características fenotípicas de la cepa CT1061 están asociadas a una mutación constitutiva en
el gen creC [creC(Con)], cercano a arcA en el cromosoma. Dado que el sistema CreBC
media las respuestas en las vías metabólicas para la utilización de la fuente de carbono,
creC(Con) parecería conferir una mayor capacidad catabólica a las cepas que expresan este
alelo. Esta capacidad catabólica se evidenció en un aumento en el consumo de oxígeno, en la
velocidad de consumo de la fuente carbonada, en la velocidad específica de crecimiento, y en
la síntesis de metabolitos de fermentación en comparación con las cepas experimentales
restantes. Adicionalmente, la presencia de mutaciones en arcA determinó que el metabolito
de fermentación mayoritario fuese el etanol, dada la elevada disponibilidad de equivalentes
de reducción. Un fenómeno similar se observó cuando se utilizó glicerol como sustrato
carbonado. Dado que se generan equivalentes de reducción adicionales durante el
catabolismo de glicerol cuando se lo compara con el de glucosa, la biosíntesis de metabolitos
de elevado grado de reducción se vio altamente favorecida incluso en condiciones de
crecimiento aeróbicas. En particular, la velocidad específica de síntesis de etanol para E. coli
CT1061 y CT1062 en condiciones microaeróbicas de crecimiento fue de 3,38 ± 0,09 y 2,34 ±
0,19 mmol · g biomasa-1 · h-1, respectivamente; mientras que para la cepa salvaje fue de 0,58
± 0,07 mmol · g biomasa-1 · h-1. De acuerdo con este resultado, se observó que el cociente
NADH/NAD+, que cuantifica el estado redox intracelular, fue mayor para E. coli CT1061
(0,97 ± 0,07) y CT1062 (0,63 ± 0,07) en comparación con el de K1060 (0,18 ± 0,03).
Para una mejor comprensión de la regulación ejercida por los sistemas ArcAB y
CreBC sobre el metabolismo central en E. coli en condiciones de limitación de carbono y
oxígeno, se estudiaron los flujos metabólicos basados en marcación con 13C-glucosa y
cuantificación de metabolitos por cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas
en E. coli K1060, las mutantes simples ΔarcA y ΔcreB, y una doble mutante ΔarcA ΔcreB.
En general, se encontró que tanto Arc como Cre ejercen efectos importantes sobre el
catabolismo de glucosa. Todos los flujos catabólicos mostraron una disminución significativa
en cepas ΔcreB en relación a la cepa salvaje, y se registraron diferencias importantes en el
nodo de distribución de esqueletos carbonados a partir de piruvato. Se postuló que la
acumulación intracelular de piruvato podría correlacionar con el aumento del rendimiento de
biomasa respecto a glucosa observado en mutantes creB. A su vez, en las cepas arcA se
observó un direccionamiento de la fuente carbonada a la síntesis de etanol, lo cual se tradujo
en un aumento de los cocientes molares etanol/acetato. También se observó una disminución
en los flujos a través del ciclo de ácidos tricarboxílicos en todas las cepas experimentales,
aunque éste conservó el carácter cíclico en lugar de las dos bifurcaciones comúnmente
propuestas en la literatura para esta secuencia bioquímica en condiciones de limitación de
oxígeno.
2
Finalmente, y con la información obtenida en las etapas de caracterización fenotípica,
se decidió diseñar un proceso microaeróbico para la síntesis de PHB a partir de glicerol. Se
eligió E. coli CT1061 como biocatalizador, y se empleó la técnica de diseños experimentales
estadísticos para optimizar las variables de proceso que afectaron significativamente la
producción del biopolímero en frascos agitados, lo cual se tradujo en un incremento de ca.
2,7 veces en la concentración de PHB. El bioproceso también se evaluó en fermentadores de
tipo tanque agitado a escala laboratorio, y se encontró que la máxima productividad
volumétrica de PHB (0,18 g · l-1 · h-1) tuvo lugar en cultivos microaeróbicos en lote
alimentado con adición de glicerol. Tomados en conjunto, los resultados presentados podrían
contribuir al desarrollo de bioprocesos destinados a la generación sostenible de productos
biocompatibles de interés biotecnológico.
3
Abstract
Bacterial survival in changing environments depends on the ability of the prokaryotic
cell to establish a prompt response in order to adjust metabolic pathways to new conditions.
In Escherichia coli, a facultative (an)aerobe, redox regulation in response to oxygen
availability is mainly modulated by the ArcAB two-component signal transduction system.
On the other hand, the CreBC system regulates carbon catabolism according to carbon source
type and availability. Several microorganisms are able to accumulate polyhydroxyalkanoates
(PHAs); reserve polymers composed of C, H, and O, which have relevant biotechnological
characteristics, since they are completely biodegradable polyesters. PHAs synthesis in
bacteria takes place under nutritional stressful conditions and excess of carbon source, and is
partly regulated by the intracellular redox status (as it consumes reducing equivalents, like
NADPH). E. coli is an adequate model microorganism to study the heterologous synthesis of
a number of biocompounds (among them, PHAs), as it provides a well-known genetic and
metabolic background.
In this work, several aspects of heterologous poly(3-hydroxybutyrate) synthesis
(PHB, the most widely distributed PHA) have been evaluated in E. coli arcA mutants under
microaerobic growth conditions. The pha genes of Azotobacter sp. strain FA8, which codify
the enzymes involved in PHB synthesis, have been chosen as a model. PHB accumulation
was studied in two kinds of mutants: one of them containing a confined deletion in arcA (E.
coli CT1062), and an insertion mutant in which arcA is interrupted by a Tn10 sequence (E.
coli CT1061). Mutations in arcA favored microaerobic PHB accumulation, most probably
because redox deregulation in these mutants would provide an excess of reducing equivalents
when compared with ArcA+ strains. Significant differences were observed among both arc
strains regarding several physiological parameters; among them, respiration, growth rate, and
PHB accumulation. E. coli CT1061 had a higher oxygen uptake rate and was able to grow in
a semi-synthetic medium, while E. coli CT1062 required complex nutritional additives in
order to grow. A significant increase in PHB accumulation was also registered in strain
CT1061 (35 ± 3%) when compared to the wild-type strain K1060 (<4%) and its isogenic
ΔarcA derivative (27 ± 2%).
The Dye phenotype, an intriguing phenotypic trait of arc mutants, is characterized by
their inability to grow in presence of redox dyes such as toluidine blue. In this work it has
been shown that the Dye phenotype would be a consequence of oxidative damage due to the
higher respiratory rates observed in arc mutants. Moreover, it was demonstrated that
heterologous expression of the pha genes suppresses the Dye phenotype, a phenomenon that
could be related to a lowering in the intracellular oxygen reactive species level as the polymer
would act as an electron sink.
4
When genetic and biochemical basis of the observed phenotypic differences in E. coli
CT101 and CT1062 were investigated, it was found that several phenotypic traits in strain
CT1061 are associated to a constitutive mutation in the creC gene [creC(Con)], nearby to
arcA in the chromosome. Given that CreBC mediates the responses in metabolic pathways
for carbon source utilization, creC(Con) would confer a higher catabolic capability to strains
expressing this allele. This catabolic capability was reflected in a higher oxygen uptake,
enhanced carbon source utilization, and an increase in fermentation metabolite synthesis
when compared to the remaining experimental strains. Additionally, mutations in arcA
resulted in higher ethanol synthesis rates, as a result of elevated reducing equivalents
availability. A similar phenomenon was observed when glycerol was used as the carbon
source. Taking into account that more reducing equivalents are produced during glycerol
catabolism when compared to that of glucose, highly reduced metabolite synthesis was
favored even under aerobic growth conditions. Therefore, specific synthesis rates for ethanol
under microaerobic growth conditions were 3.38 ± 0.09 and 2.34 ± 0.19 mmol · g cell dry
weight-1 · h-1 for E. coli CT1061 and CT1062, respectively; while that of the wild-type strain
was 0.58 ± 0.07 mmol · g cell dry weight-1 · h-1. Accordingly, the NADH/NAD+ ratio, which
reflects the intracellular redox status, was higher in E. coli CT1061 (0.97 ± 0.07) and CT1062
(0.63 ± 0.07) when compared to that of K1060 (0.18 ± 0.03).
To gain further insight into the regulation exerted by the ArcAB and CreBC systems
on E. coli central metabolism under carbon- and oxygen-limited conditions, metabolic flux
analysis based on 13C-glucose labeling and metabolite detection by gas chromatography
coupled to mass spectrometry was performed for E. coli K1060, its single-mutant derivatives
ΔarcA and ΔcreB, as well as a double mutant ΔarcA ΔcreB. Overall, it was found that both
Arc and Cre exert important effects on glucose catabolism. Catabolic fluxes showed a
significant diminution in ΔcreB strains when compared to the wild-type strain, and important
differences were observed at the piruvate branching node. It was postulated that intracellular
piruvate accumulation could correlate with the higher biomass yield on glucose observed in
creB mutants. On the other hand, carbon source was funneled into ethanol synthesis in arcA
strains, which was also reflected in ethanol-to-acetate ratios. Lower fluxes through the
tricarboxylic acid cycle were observed in all the experimental strains, even when it worked in
a cyclic fashion rather than the two branches commonly proposed in the literature.
Finally, a microaerobic process for PHB synthesis from glycerol was designed based
on the information obtained through phenotypic characterization. E. coli CT1061 was chosen
as the biocatalyst, and a statistical experimental design approach was employed in order to
optimize those process variables that significantly affected biopolymer production in shaken
flasks. This technique allowed a ca. 2.7-fold increase in PHB concentration. The bioprocess
was also evaluated in laboratory-scale stirred tank fermentors, and it was found that the
maximal volumetric productivity (0.18 g · l-1 · h-1) took place in microaerobic fed-batch
cultures with glycerol feeding. Taken together, these results could contribute to the
development of bioprocesses aimed at the sustainable production of biotechnology-relevant
biocompounds.
5
Capítulo I
Introducción general
Capítulo I – Introducción general
1.1. Evolución de las respuestas celulares al oxígeno
1.1.1. Generalidades
La capacidad de las células para responder a los cambios ambientales ha sido clave
para el desarrollo de la vida en la Tierra. Durante millones de años los únicos habitantes de la
tierra fueron microorganismos anaeróbicos, probablemente protótrofos anóxicos y
heterótrofos fermentativos [Wächtershäuser, 1999], dado que la atmósfera primitiva de la
Tierra no contenía oxígeno molecular. Por lo tanto, la fermentación pudo haber sido la más
antigua (o una de las más antiguas) forma de metabolismo energético adquirida por las
células [Walker, 1980].
Varios estudios señalan que la acumulación de oxígeno en la atmósfera comenzó a
partir del período Arqueno (ca. 3,8 mil millones de años atrás) o durante las primeras fases
del período Proterozónico (hace 2,2-2,3 mil millones de años) [Canfield et al., 2000; Paytan,
2000]. Tan pronto la Tierra comenzó a oxigenarse, debido al advenimiento de la fotosíntesis
oxigénica, comenzaron a surgir los microorganismos aerobios. La concentración atmosférica
de oxígeno aumentó rápidamente, y para poder sobrevivir a esta nueva condición fue
necesaria la evolución de un mecanismo de defensa que permitiera resistir este gas altamente
tóxico (dado que forma una serie de radicales libres cuando es parcialmente reducido). A
pesar de que algunos microorganismos, como los metanógenos y otros Archaea, no han
logrado adquirir mecanismos de defensa para resistir al oxígeno (permaneciendo como
anaerobios estrictos), muchos otros sí lo hicieron. Estos últimos han desarrollado mecanismos
sofisticados para utilizar oxígeno en una vía metabólica muy eficiente para la obtención de
energía: la respiración aeróbica [Gennis y Stewart, 1996]. En ésta, se genera energía en una
serie de pasos, el último de los cuales implica la reducción del oxígeno molecular a H2 O
cuando acepta electrones provenientes de la oxidación de intermediarios metabólicos. Con el
tiempo, el oxígeno se ha convertido en un elemento esencial para la vida de la mayoría de los
organismos aerobios. No es sorprendente, por lo tanto, que prácticamente todas las células,
tejidos, y organismos puedan detectar y responder a cambios en la disponibilidad de oxígeno
ambiental. En general, como respuesta a ambientes con deficiencia de oxígeno los
organismos procariotas utilizan una serie de vías alternativas para la generación de energía,
como la respiración anaeróbica [Unden y Bongaerts, 1997], fermentación [Becker et al.,
1997], o fotosíntesis anoxigénica [Zeilstra-Ryalls et al., 1998]; las cuales proveen energía
cuando no se dispone de oxígeno molecular que actúe como aceptor final de electrones.
Así como ocurre con muchas otras respuestas fisiológicas, aquellas relacionadas a un
cambio en la disponibilidad de oxígeno pueden ser clasificadas en respuestas inmediatas
(agudas) y tardías (crónicas). Una respuesta inmediata ocurre en el orden de los segundos y
está mayormente determinada por un cambio en la velocidad de reacción (como resultado de
un cambio en las condiciones externas, y por lo tanto dependiente de la cinética del
catalizador), o bien involucra modificaciones post-traduccionales de proteínas u otras
macromoléculas pre-existentes (tales como fosforilación, proteólisis, o reacciones de
oxidación-reducción). En cambio, una respuesta tardía generalmente incluye alteraciones en
7
la expresión génica y síntesis de novo de proteínas, por lo cual el cambio fisiológico puede
tener lugar varias horas después de ocurrido el fenómeno que le dio origen.
Todas las células experimentan cambios significativos cuando pasan de un ambiente
aeróbico a uno anaeróbico o vice versa. Las células capaces de adaptarse a la falta de oxígeno
(al menos temporariamente) experimentan un cambio adaptativo tanto en su metabolismo
catabólico como en la expresión génica. Ambos mecanismos aseguran una concordancia
entre la disponibilidad y la demanda de oxígeno, a pesar de que existe una amplia
variabilidad en las respuestas celulares específicas para diferentes organismos o tipos
celulares.
1.1.2. Evolución de otras respuestas específicas a nivel celular
Además de los cambios catabólicos, existen otros ejemplos que ilustran la variedad de
mecanismos en los cuales la disponibilidad de oxígeno juega un rol fundamental. Por
ejemplo, en una gran variedad de microorganismos patógenos una disminución en la
disponibilidad de oxígeno es la señal que dispara la virulencia e invasión de tejidos [Bracha y
Mirelman, 1984; Bukholm y Kapperud, 1987; Mahan et al., 1996]. Probablemente, en estos
microorganismos la hipoxia sea la indicación de un ambiente adecuado para el desarrollo
[Wayne y Lin, 1982; Auzat et al., 1999]. Por otro lado, el oxígeno es el principal factor
ambiental responsable de la regulación de la fijación de nitrógeno por bacterias diazotróficas
[Fisher, 1994; Hill et al., 1996], y de la iniciación de la fotosíntesis en bacterias púrpura del
azufre [Cohen-Bazire et al., 1957]. Además, distintas células de mamíferos responden a la
hipoxia liberando neurotransmisores, segregando eritropoyetina, o factores de crecimiento
vascular [Bickler y Buck, 1998; Bunn et al., 1998]. También se ha sugerido que la progresión
de ciertos tumores al estado metastásico, y consecuentemente más invasivo, es disparada por
adaptación a condiciones de hipoxia [Brizel et al., 1996; Hockel et al., 1996; Richard et al.,
1999a].
1.2. Sensores de oxígeno
La iniciación de una respuesta celular requiere de un mecanismo de detección, el cual
percibe la disponibilidad de oxígeno en el medio circundante y transfiere dicha información a
través de una vía de transducción de señales [Acker, 1994b]. Este proceso finalmente culmina
con la activación de una serie de respuestas específicas. De esta manera, los sensores de
oxígeno inician la mayoría de las actividades celulares descriptas en las secciones
precedentes con el objetivo de evitar diferencias entre el consumo y la disponibilidad de
oxígeno [Acker, 1994a; Patschkowski et al., 2000]. Es interesante notar que solamente unos
pocos ‘sensores’ de oxígeno son activados por oxígeno per se, dado que la mayoría de ellos
responde a la condición de (micro/an)aerobiosis indirectamente [Dixon, 1998; Gong et al.,
1998; Beinert y Kiley, 1999; Rodgers, 1999]. Para los sensores que detectan indirectamente
la disponibilidad de oxígeno, se ha propuesto que la señal es un cambio en el estado redox,
velocidad de transporte de electrones y/o fuerza protón (H+)-motriz, o bien que el mecanismo
involucra la detección de intermediarios respiratorios, tales como especies reactivas de
oxígeno (EROs). Por otra parte, para aquellos sensores de oxígeno en los cuales el oxígeno es
la señal directa se desconoce el mecanismo exacto de detección.
8
Una conclusión general que surge de los estudios tendientes a la identificación de
reguladores de la respuesta a oxígeno es que numerosos co-factores poseen funciones
esenciales en la captación y transducción de la señal. En particular, se ha individualizado el
rol de tres co-factores involucrados en i) unión a oxígeno (grupos hemo y flavinas), y ii)
transferencia de electrones (grupos hemo, flavinas, y grupos Fe-S).
A pesar de que las distintas especies bacterianas han adquirido jerarquías particulares
en las estrategias regulatorias, se ha encontrado que, en general, existe un grado significativo
de conservación respecto al tipo de co-factor involucrado en la detección de la señal y en el
tipo de proteínas con el cual dichos co-factores están asociados.
1.3. Percepción de la disponibilidad de oxígeno en Enterobacteriaceae:
Escherichia coli como modelo paradigmático
La gran mayoría de las Enterobacterias es capaz de adaptarse rápida y efectivamente a
los cambios en el ambiente circundante. Dicha adaptación implica la modificación simultánea
y coordinada de la expresión de diferentes genes u operones, de manera que se requiere una
modulación en los niveles superiores de organización transcripcional [Martínez-Antonio y
Collado-Vives, 2003]. En la mayoría de los casos, sobre los sistemas de regulación
específicos de determinados operones se superponen sistemas regulatorios globales que
afectan y controlan la expresión de numerosos genes implicados en diversas funciones
celulares, constituyendo las denominadas redes regulatorias globales. La coordinación de
estas redes es tanto o más compleja que la regulación de los operones individuales, y tiene
como objetivo proporcionar una respuesta global frente a un cambio ambiental [Gunsalus y
Park, 1994]. Quizás uno de los mejores modelos de la diversidad mecanística y funcional de
los sistemas de percepción de condiciones de (micro/an)aerobiosis sea el de E. coli. En virtud
de que se trata de un microorganismo modelo, no resulta sorprendente que la mayoría de los
sistemas paradigmáticos de transducción de señales haya sido descubierta y descripta en esta
Enterobacteria.
Por lo menos ocho proteínas (SoxR, OxyR, Hmp, Aer, DsbB, Dos, Fnr, y ArcB)
controlan las complejas respuestas moleculares y fisiológicas que se inducen en E. coli como
consecuencia a cambios en la disponibilidad de oxígeno. Algunas de ellas actúan mediando
respuestas inmediatas, como mecanismos de protección o taxis, mientras otras modulan
respuestas adaptativas a largo plazo. En este complejo escenario, los sensores de oxígeno en
E. coli pueden clasificarse de acuerdo con su función fisiológica. Muchos de ellos modulan la
respuesta al estrés oxidativo que tiene lugar durante el metabolismo aeróbico, el cual genera
EROs [Imlay y Fridovich, 1991; González-Flecha y Demple, 1995; Storz y Zheng, 2000]. La
concentración intracelular de peróxido de hidrógeno (H2O2) y anión superóxido (O2·–) se
mantiene baja por acción de las enzimas destoxificantes catalasa y superóxido dismutasa
[Greenberg y Demple, 1989; Greenberg et al., 1990; González-Flecha y Demple, 1997;
2000], aún cuando la generación de EROs continúe por actividad de la cadena respiratoria.
Tanto SoxRS como OxyR regulan este fenómeno de protección a nivel transcripcional en E.
coli [Zheng et al., 1998b; Aslund et al., 1999] y otras especies bacterianas [Christman et al.,
1985; Deretic et al., 1995; Maciver y Hansen, 1996; Loprasert et al., 1997; Miguel et al.,
9
2000; Rocha et al., 2000]. Hmp podría actuar amplificando la señal generada por el estrés
oxidativo, y se ha postulado que esta amplificación de la señal permitiría una respuesta más
inmediata de las actividades destoxificantes [Membrillo-Hernández et al., 1999]. Por otra
parte, al igual que ocurre en la mayoría de las bacterias flageladas, la ventaja de la motilidad
se ve mayormente evidenciada en la capacidad de explorar un (micro)ambiente y colonizarlo
si el mismo presenta condiciones apropiadas para el desarrollo y crecimiento del organismo.
La aerotaxis es el movimiento hacia una fuente de oxígeno mediada por la concentración del
mismo. El sensor de aerotaxis Aer asegura que E. coli se mueva en dirección del ambiente
energéticamente más favorable con respecto a la disponibilidad de un aceptor de electrones
(en este caso, oxígeno) [Bibikov et al., 1997; 2000; Repik et al., 2000]. Además de Aer, la
proteína Tsr, originalmente descripta como una proteína receptora de serina, podría funcionar
como un sensor/transductor independiente para modular el fenómeno de aerotaxis
[Rebbapragada et al., 1997]. DsbBA, por su parte, está asociado al plegamiento oxidativo de
numerosas proteínas periplásmicas [Bader et al., 1998; 1999], modulando su actividad en
respuesta al oxígeno [Bardwell et al., 1991; 1993]. Finalmente Dos, una hemoproteína capaz
de interactuar directamente con oxígeno [Delgado-Nixon et al., 2000], no posee una función
fisiológica claramente identificable, aunque se ha postulado que su acción regularía la
concentración intracelular de AMPc e indirectamente los procesos dependientes de este
nucleótido cíclico, como la represión por catabolito.
Si bien las respuestas recién mencionadas dependen colectivamente de la generación
de EROs y/o daño oxidativo, o de la existencia de un gradiente de concentración de oxígeno,
existe una adaptación mucho más compleja en el metabolismo bacteriano como consecuencia
del consumo de oxígeno del medio circundante durante el crecimiento celular [Smith y
Neidhardt, 1983b,c]. Este proceso ocurre naturalmente durante la multiplicación celular, y
por lo tanto se ha postulado que es la vraie raison d’être de la existencia de mecanismos
regulatorios que responden a la concentración de oxígeno. El metabolismo catabólico de E.
coli en condiciones aeróbicas o anaeróbicas indudablemente requiere de distintas vías
metabólicas. Las enzimas involucradas en cada vía metabólica están reguladas a nivel
transcripcional y a nivel cinético. Sawers et al. [1988] han demostrado que el nivel de
expresión de al menos 120 proteínas cambia como consecuencia del pasaje de un cultivo de
E. coli de condiciones aeróbicas a condiciones anaeróbicas. Al menos 40 operones (cuyos
genes codifican las proteínas recién mencionadas) son controlados transcripcionalmente por
acción de ArcB (del sistema de dos componentes ArcAB; acrónimo por anaerobic redox
control), y alrededor de 30 operones (ca. 70 genes) son modulados por el regulador Fnr
(fumarate and nitrate respiration) [Lynch y Lin, 1996a]. Estos dos reguladores globales son
los efectores más importantes del control de la expresión de genes catabólicos, y en muchos
casos operan en forma coordinada para lograr una regulación fina del catabolismo en
respuesta a las condiciones redox y la disponibilidad de oxígeno en el medio [Green y Paget,
2004]. En general, ArcAB reprime las funciones asociadas a la respiración aeróbica, así como
la expresión génica de varias enzimas del ciclo de ácidos tricarboxílicos (TCA); mientras Fnr
actúa mayormente como activador de vías estrictamente anaeróbicas.
10
A pesar de que se han descripto numerosas estrategias celulares para la regulación
como respuesta al oxígeno molecular, las bases moleculares por las cuales las células son
capaces de percibir condiciones de hipoxia o superoxia recién han comenzado a ser
comprendidas, y se desconocen numerosos detalles de los mecanismos involucrados.
1.3.1. Fnr: El regulador global dominante en condiciones anaeróbicas
1.3.1.1. El modulón Fnr
El cambio metabólico que tiene lugar en la transición entre condiciones aeróbicas de
crecimiento a anaerobiosis conduce a un incremento significativo en la expresión de vías
respiratorias anaeróbicas y, simultáneamente, a una reducción en la expresión de ciertas
funciones respiratorias aeróbicas [Iuchi y Weiner, 1996]. Como se dijo, esta alteración en el
patrón de expresión génica como respuesta a la ausencia de oxígeno molecular está
parcialmente mediada por la proteína regulatoria Fnr [Guest et al., 1996]. Las mutaciones en
fnr poseen un efecto pleiotrópico, que tiene como resultado general la incapacidad de crecer
en ausencia de oxígeno a través de respiración anaeróbica utilizando la mayoría de los
aceptores alternativos de electrones [Melville y Gunsalus, 1990]. Los genes activados por Fnr
incluyen aquellos que codifican las reductasas necesarias para la respiración anaeróbica, e.g.,
narGHJI (nitrato reductasa), frdABCD (fumarato reductasa), y dmsABC (dimetilsulfóxido/
óxido de N-trimetilamina reductasa) [Guest et al., 1996]; así como algunos genes cuyos
productos son esenciales para la fermentación, e.g., pfl (piruvato-formiato liasa)
[Patschkowski et al., 2000]. Por otra parte, la expresión de algunos genes es reprimida por
Fnr, siendo un ejemplo notable en este sentido es el de ndh, que codifica la enzima aeróbica
NADH deshidrogenasa I [Spiro et al., 1989; Green y Guest, 1994].
La forma activa de Fnr [cf. siguiente sección] ejerce su función regulatoria uniéndose
a sitios de unión en el ADN de 22 pb de extensión, cuya secuencia consenso es 5’-TTGATn4-ATCAA-3’ (n representa cualquier nucleótido) [Spiro, 1994]. La posición del sitio de
unión de Fnr en la región promotora de los genes regulados aparentemente determinaría si
Fnr actúa como activador o represor de dichos genes. Mientras los promotores activados por
Fnr típicamente poseen sitios de unión centrados en la posición –41,5 respecto del codón de
inicio de la transcripción [Li et al., 1998], la localización de los sitios de unión de Fnr en
promotores reprimidos es altamente variable [Williams et al., 1991; Green y Marshall, 1999].
1.3.1.2. El mecanismo de detección de oxígeno por Fnr in vitro
En los últimos años se han caracterizado numerosas ferrosulfoproteínas (es decir,
aquellas que contienen grupos Fe-S), identificándolas como componentes esenciales en la
percepción de oxígeno, señalización, y regulación de la expresión génica en varios
organismos. La proteína Fnr en E. coli fue originalmente descripta como un factor de
transcripción requerido para la expresión de genes cuyos productos están involucrados en
respiración anaerobia [Lambden y Guest, 1976]. A pesar de que Fnr se encuentra presente en
E. coli en condiciones de crecimiento tanto aeróbicas como anaeróbicas, este regulador ejerce
su función únicamente en ausencia de oxígeno [Kiley y Beinert, 1998]. Muchos estudios in
vitro demostraron que, de hecho, la unión de Fnr al ADN es sensible a la presencia de
11
oxígeno, lo cual explica la observación experimental en relación a que Fnr es sólo activo en
condiciones de crecimiento anaeróbicas [Popescu et al., 1998].
La forma activa de Fnr contiene un grupo [4Fe-4S]2+ regulatorio, esencial para la
dimerización y la unión al ADN [Green et al., 1996; Lazazzera et al., 1996]. Dicho grupo
[4Fe-4S]2+ es rápida y reversiblemente convertido a la forma [2Fe-2S]2+ por exposición a
oxígeno [Khoroshilova et al., 1997]. Sin embargo, un exceso de oxígeno destruye
irreversiblemente el arreglo [4Fe-4S]2+ [Jordan et al., 1997]. Este sería el motivo por el cual
la expresión génica dependiente de Fnr se observa in vivo sólo durante condiciones
anaeróbicas de crecimiento [Dibden y Green, 2005]. Se supone que el ligando para el grupo
[4Fe-4S]2+ está constituido por cuatro residuos de cisteína muy conservados en distintas
especies [Melville y Gunsalus, 1990; Sharrocks et al., 1990], dado que la sustitución de
dichos residuos tiene como resultado la pérdida del grupo de Fe y S. También se ha descripto
una mutante de la proteína Fnr en la cual existe una única sustitución de un residuo de leucina
en la posición 28, adyacente a una de las cisteínas del ligando (Cys29), por un residuo de
histidina (Fnr-L28H) [Kiley y Reznikoff, 1991]. Esta proteína modificada retiene su actividad
in vivo independientemente de la concentración de oxígeno.
Un estudio hecho por Bates et al. [2000] demuestra que la sustitución de leucina por
histidina estabiliza directamente el grupo [4Fe-4S]2+ frente a la acción del oxígeno. Estos
resultados i) confirman que el grupo Fe-S es un componente clave para la unión de Fnr al
ADN, y ii) indican que el ambiente aminoacídico que circunda al grupo Fe-S modifica la
sensibilidad de Fnr al oxígeno. A pesar de que se demostró que Fnr es capaz de interaccionar
directamente con el oxígeno molecular, estudios efectuados con Fnr-L28H mostrarían que,
bajo ciertas condiciones, la presencia de oxígeno no necesariamente desactiva Fnr in vivo. La
forma oxidada del grupo puede ser restituida a la forma [4Fe-4S]2+, permitiendo por lo tanto
la unión al ADN, cuando se incuba anaeróbicamente la proteína con cisteína, Fe2+,
ditiotreitol, Na2S2O4, o NifS (una proteína de Azotobacter vinelandii que participa en la
movilización de Fe y S para la formación de un grupo ferrosulfoproteico que confiere
actividad nitrogenasa) (Fig. 1.1). Estos resultados sugieren que las reacciones redox estarían
involucradas en la activación de Fnr en respuesta a condiciones anóxicas in vivo, y que la
reconstitución del grupo [4Fe-4S]2+ podría involucrar otras proteínas y transportadores de Fe
y S [Zheng et al., 1998a; Beinert y Kiley, 1999].
12
Nivel de O2
X
+O2
[4Fe-4S]2+
- Cisteína
- Fe2+
- Ditiotreitol
- Na2S2O4
- NifS (A. vinelandii)
+O2
[4Fe-4S]2+
[4Fe-4S]2+
–O2
+
–
ARN
polimerasa
ADN
Fig. 1.1. Mecanismo de activación-desactivación de la proteína Fnr de E. coli en respuesta
a la disponibilidad de oxígeno. La unión de Fnr a regiones regulatorias en el ADN (que
cuentan con una secuencia específica reconocida por Fnr) puede activar (+) o reprimir (–) la
transcripción de genes. El símbolo (x) indica la conversión irreversible de la forma activa de
Fnr a la forma inactiva.
1.3.1.3. Proteínas homólogas a Fnr en otros microorganismos
Las proteínas que contienen un núcleo regulatorio [4Fe-4S]2+ se han encontrado en
varias especies bacterianas. En Azotobacter vinelandii, por ejemplo, CydR es un represor de
la síntesis de la oxidasa terminal de alta afinidad CydAB [Poole y Hill, 1997; Wu et al.,
2000]. También se ha identificado un regulador transcripcional en Actinobacillus
pleuropneumoniae (HlyX) por análisis de homología con Fnr de E. coli [Green y Baldwin,
1997], y, aunque la función de esta proteína no se ha explorado en detalle, su acción se ha
relacionado con el desarrollo de virulencia. Un fenómeno similar se ha descripto en
Bordetella pertussis [Bannan et al., 1993] y en Neisseria gonorrhoeae [Householder et al.,
1999].
13
1.3.2. El sistema de regulación de dos componentes ArcAB: Adaptación
metabólica a cambios en la concentración de oxígeno en el rango
microaeróbico
1.3.2.1. Sistemas de transducción de señales de dos componentes
Los sistemas de transducción de señales de dos componentes constituyen el principal
mecanismo mediante el cual las Enterobacterias modulan la expresión génica respondiendo a
cambios en el medio ambiente [Stock et al., 1990]. Como su nombre lo indica, estos sistemas
están formados por dos proteínas: una de ellas detecta las señales del medio ambiente
(actuando como sensor), y una segunda proteína (cuya actividad es controlada por la primera)
que en la mayoría de los casos actúa como regulador transcripcional [Parkinson, 1993].
El primer componente normalmente es una proteína con actividad de histidina
quinasa. La parte amino terminal de estas proteínas contiene dos dominios transmembrana,
los cuales flanquean una porción periplasmática (involucrada en la detección de señales
ambientales), y se la conoce como dominio de entrada. La región citoplasmática de estas
quinasas contiene varios motivos conservados que tienen un papel importante en la actividad
de fosforilación. Entre éstos se encuentra un motivo que contiene un residuo de histidina que
se fosforila en este tipo de proteínas. A estos motivos en su conjunto se les conoce como
módulo transmisor. El segundo componente es la proteína que se conoce como regulador de
respuesta, y generalmente está constituida por dos dominios. El dominio de fosforilación se
encuentra en el extremo amino terminal y contiene un residuo de aspartato capaz de ser
fosforilado; a este dominio se le conoce como módulo receptor. El segundo dominio es
generalmente de unión a ADN y se conoce como dominio de salida.
1.3.2.2. El sensor de membrana ArcB
En E. coli, ArcB (Arc originalmente fue denominado con este acrónimo según
aerobic respiration control) es un sensor de membrana y ArcA es su contraparte regulatoria
en el citoplasma. ArcAB pertenece a una numerosa familia de sistemas de transducción de
señales de dos componentes en bacterias [Parkinson y Kofoid, 1992]. Como se mencionó
anteriormente, en dichos sistemas un sensor unido a la membrana celular detecta un cambio
en las condiciones externas y transfiere dicha señal a un regulador de respuesta
citoplasmático a través de un mecanismo de trans-fosforilación (generando la forma
fosforilada de ArcA, ArcA∼P) [Bauer et al., 1999]. ArcA y ArcB controlan la expresión de al
menos 135 genes [Lynch y Lin, 1996a], aunque estudios recientes muestran que dicho
número podría incrementarse a más de 1400 genes regulados [Salmon et al., 2005]. La
mayoría de los genes están involucrados en el catabolismo aeróbico y anaeróbico.
ArcB pertenece a una sub-familia de sensores híbridos tripartitos con actividad
quinasa [Ishige et al., 1994; Tsuzuki et al., 1995; Kato et al., 1997]. Esto implica que, además
de poseer un dominio primario de transmisión, ArcB también contiene un dominio de
recepción de señales y un dominio Hpt (histidine phosphotransfer). Además, ArcB es un
miembro de la superfamilia PAS de dominios de unión a flavina. PAS es un acrónimo que
refiere a las primeras proteínas en las cuales este dominio fue identificado: PER (periodic
14
clock protein, de Drosophila melanogaster), ARNT (aryl hydrocarbon receptor nuclear
translocator, de vertebrados), y SIM (single-minded protein, de D. melanogaster). Existen
numerosas proteínas cuya actividad responde a variaciones en el nivel de oxígeno y que no
requieren de co-factores, entre ellas ArcB. Para muchas de estas proteínas se desconocen los
detalles del mecanismo de percepción del estímulo, y en la mayoría de los casos no se han
podido identificar proteínas o reacciones redox a las que pueda atribuirse la modulación de la
actividad en forma inequívoca. La presencia de un dominio PAS, una característica común a
la mayoría de los sensores redox, de oxígeno, y de luz, permite la clasificación de estas
proteínas en un grupo [Taylor y Zhulin, 1998; Taylor et al., 2001].
Actualmente se cuenta con información experimental suficiente para explicar el
mecanismo de acción del sistema ArcAB en respuesta a cambios en la concentración de
oxígeno (Fig. 1.2). En primer lugar, la regulación metabólica dependiente de ArcAB como
respuesta a un cambio de condiciones aeróbicas a condiciones de baja disponibilidad de
oxígeno no se evidencia en mutantes que carecen de las citocromo oxidasas terminales de la
cadena respiratoria [Iuchi et al., 1990a]. Se ha mostrado que ArcB no es capaz de
interaccionar directamente con oxígeno molecular, de modo que el cambio en la
concentración de oxígeno no es la señal per se [Lin y Iuchi, 1991]. También es posible
inducir una respuesta como la que provoca Arc en anaerobiosis por adición de desacoplantes
protonóforos en condiciones aeróbicas de crecimiento [Bogachev et al., 1995]. Estos hechos
experimentales indicarían que ciertos procesos relacionados a la cadena de transporte de
electrones, o la fuerza H+-motriz, podrían jugar un rol primordial en la percepción de la señal.
Por otro lado, experimentos in vitro han mostrado que algunos intermediarios metabólicos
(D-lactato, acetato, piruvato, y NADH) pueden facilitar la autofosforilación de His292 en el
módulo primario de transmisión de ArcB, un paso esencial en la transducción de la señal
[Iuchi, 1993]. En concordancia con esta hipótesis, la transición de aerobiosis a
microaerobiosis (y/o anoxia, durante la fase estacionaria de la curva de crecimiento)
determina un aumento en la acumulación intracelular de piruvato (2 mM en condiciones
anaeróbicas, en contraste con ca. 0,5 mM en aerobiosis), D-lactato (ca. 1,7 mM en
anaerobiosis, versus ca. 0,07 mM en aerobiosis), y NADH [de Graef et al., 1999]. Además de
la actividad quinasa en la autofosforilación, ArcB posee actividad autofosfatasa (la cual, por
otra parte, es inhibida por los intermediarios metabólicos recién mencionados), así como
actividad fosfatasa de ArcA~P, liberando ArcA y ortofosfato (Pi) [Georgellis et al., 1999].
Luego de numerosos estudios realizados en más de una década de investigación se ha
identificado la naturaleza exacta del estímulo percibido por ArcB [Malpica et al., 2006]. La
evidencia experimental muestra que el nivel de oxígeno sería detectado a través de cambios
en la relación que existe entre quinonas oxidadas y reducidas (i.e., en la forma quinol)
[Georgellis et al., 2001; Malpica et al., 2004]. Este es el motivo por el cual ArcAB ejerce un
efecto importante en condiciones microaeróbicas de crecimiento. Los aspectos fisiológicos y
moleculares de la regulación mediada por ArcAB serán discutidos con mayor detalle en
secciones subsiguientes de este capítulo.
15
Nivel de O2
Membrana
NH2
PAS
Citoplasma
COOH
His
ArcB
HOOC
NH2
Asp
ArcA
ADN
–O2
- Desacoplantes protonóforos
- Ausencia de oxidasas terminales
- Agentes quelantes
- Fase estacionaria
- Crecimiento a temperatura elevada
- Actividad de la cadena respiratoria
(relación entre quinonas reducidas y
oxidadas)
- Aceptores alternativos de
electrones
- pH alcalino
+O2
Membrana
NH2
PAS
Citoplasma
COOH
His-P
ATP
ArcB~P
ADP
NH2
Asp-P
+
ArcA~P
–
ARN
polimerasa
ADN
COOH
Fig. 1.2. Mecanismo de activación/desactivación del sistema ArcAB de E. coli como
respuesta a variaciones del nivel de oxígeno en el rango microaeróbico. Cuando ArcA~P se
une a regiones regulatorias en el ADN puede activar (+) o reprimir (–) la transcripción de
genes. Se muestran en forma esquemática los residuos esenciales para la cascada de
fosforilación.
16
1.3.2.3. El regulador citoplasmático de respuesta ArcA
El regulador citoplasmático ArcA (codificado por el gen arcA, también conocido
como dye, sfrA, fexA, msp, o seg) posee un efecto pleiotrópico sobre numerosas funciones
celulares [Iuchi y Lin, 1988]. En respuesta a cambios en la disponibilidad de oxígeno, ArcA
modula la expresión génica de ciertos genes cuyos productos están involucrados en el
catabolismo [Lynch y Lin, 1996a], genes que conferirían resistencia a colorantes redox (viz.,
azul de metileno y azul de toluidina) [Roeder y Somerville, 1979], y la expresión de los genes
de transferencia de ADN (genes tra) del plásmido F (función denominada Sfr, sex factor
regulation) [Buxton y Drury, 1983; Buxton et al., 1983; Strohmaier et al., 1998]. Asimismo,
se requiere de ArcA para el proceso de recombinación mediado por Xer en el sitio psi del
plásmido pSC101 [Colloms et al., 1998], un mecanismo que asegura la mantención de
plásmidos en estado monomérico y contribuye a la transferencia vertical del plásmido desde
células madre a células hija.
De esta manera, ArcAB representa un sistema de regulación global que modula
negativamente (Tabla 1.1) o positivamente (Tabla 1.2) la expresión de numerosos genes en al
menos 40 operones en E. coli; y codifican, entre muchas otras proteínas, varias
deshidrogenasas de tipo flavoproteína, oxidasas terminales, enzimas del ciclo TCA, del ciclo
del glioxilato, y enzimas involucradas en la degradación de ácidos grasos.
Gen(es)
aceB
acnAB
aldA
bet
cyoABCDE
dctA
fadB
fdnGHI
fumA
fumC
glcDEFGB
glpD
gltA
icd
hybOABCDEFG
lld (lctD)
mdh
pdhR-aceEF-lpd
lpdA
nuoA-N
sdhCDAB
sucAB
Enzima y/o función
Isocitrato liasa
Aconitasa
Aldehído deshidrogenasa
Síntesis del osmoprotector glicilbetaína a
partir de colina
Citocromo o oxidasa
Transportador aeróbico de dicarboxilatos-C4
3-Hidroxiacil-CoA deshidrogenasa
Formiato deshidrogenasa-N
Fumarasa A (conteniendo Fe) aeróbica
Fumarasa C aeróbica
Ciclo del glioxilato
Glicerol-3-fosfato deshidrogenasa aeróbica
Citrato sintasa
Isocitrato deshidrogenasa
Hidrogenasa II [Ni-Fe]
L-Lactato deshidrogenasa
Malato deshidrogenasa
Complejo piruvato deshidrogenasa y proteína
regulatoria
Lipoamida deshidrogenasa
NADH deshidrogenasa I
Succinato deshidrogenasa
α-Cetoglutarato deshidrogenasa
Ref.
*
Cunningham et al., 1997
Pellicer et al., 1999b
Lamark et al., 1996
*
Davies et al., 1999
Cho et al., 2006
*
*
Park y Gunsalus, 1995
Pellicer et al., 1999a
*
*
Chao et al., 1997
Richard et al., 1999b
*
*
*
Cunningham et al., 1998
Bongaerts et al., 1995
Park et al., 1995
Park et al., 1997
17
sucCD
sodA
tpx
Succinato tioquinasa
Superóxido dismutasa dependiente de Mn
Tiol peroxidasa
Park et al., 1997
Compan y Touati, 1993
Kim et al., 1999
Tabla 1.1. Algunos genes reprimidos por ArcA bajo condiciones anaeróbicas. El asterisco
(*) denota información obtenida de Lynch y Lin [1996a]. CoA, coenzima A.
Gen
arcA
cadA
cob
cydAB
fumB
focA-pfl
cyx-appA
hyaADCDEF
pdu
pocR
tdcABC
traY
Enzima y/o función
ArcA
Lisina decarboxilasa
Síntesis de cobalamina
Citocromo d oxidasa
Fumarasa anaeróbica
Proteína de transporte de formiato y piruvatoformiato liasa
Fosfatasa ácida y posible citocromo oxidasa
Hidrogenasas [Ni-Fe]
Degradación de 1,2-propanodiol
Regulador positivo de cob y pdu
Treonina deshidratasa degradativa asociada a
membrana, L-treonina-L-serina permeasa,
y proteína regulatoria
Funciones de transferencia de ADN del
plásmido F
Ref.
*
Reams et al., 1997
*
*
Tseng, 1997
*
Brondsted y Atlung, 1996
Darie y Gunsalus, 1994
*
*
Chattopadhyay et al., 1997
Taki et al., 1998
Tabla 1.2. Algunos genes activados por ArcA bajo condiciones anaeróbicas. El asterisco
(*) denota información obtenida de Lynch y Lin [1996a].
ArcA es un regulador transcripcional citoplasmático de 29 kDa (238 aminoácidos)
que consiste en un dominio receptor N-terminal con un sitio de fosforilación en Asp 54 y un
dominio C-terminal hélice-giro-hélice (HTH) de unión al ADN [Iuchi y Lin, 1988; 1992b].
ArcA no posee una secuencia consenso estricta de unión al ADN, aunque se ha postulado que
una posible secuencia consenso para la unión de ArcA∼P sería 5’-[A/T]GTTAATTA[A/T]-3’
[Lynch y Lin, 1996b]. Se han propuesto diversos operones que podrían tener sitios de unión a
ArcA (muchos de ellos no considerados en estudios anteriores, basados mayormente en
análisis de la transcripción utilizando fusiones a lacZ) a través del empleo de matrices
probabilísticas, que adjudican un valor a cada par de bases que podría formar parte del sitio
de unión de ArcA [McGuire et al., 1999]. Algunos de estos operones, sujetos a regulación
por ArcAB, se enumeran en la Tabla 1.3.
Operón
ndh
caiT/fixA
dinJ
dcuB
araE
fimE
Proteína(s) codificada(s)
NADH deshidrogenasa
Metabolismo de carnitina
Gen inducible por daño al ADN
Transportador de dicarboxilatos anaeróbico
Transporte de L-arabinosa, sistema de simporte de H+
Gen regulatorio de la expresión de fimbrias
18
ompC
ompF
ddlA
xthA
acs/nrfA
hisL
stpA
appY
pykF
gcvT
atpI
flhD
Proteína de membrana externa 1b
Proteína de membrana externa 1a
D-Alanina:D-alanina ligasa
Exonucleasa III
Acetil-CoA sintetasa y nitrato reductasa dependiente de formiato
Miembro del operón para la síntesis de histidina
Proteína tipo Hns, función no asignada
Regulación de hya y appY en fase estacionaria o ausencia de Pi
Piruvato quinasa I activada por fructosa 1,6-bisfosfato
Aminometiltransferasa dependiente de tetrahidrofolato
Subunidad de la F1F0–H+-ATPasa unida a membrana
Activador transcripcional de los genes para flagelo de tipo 3
Tabla 1.3. Operones conteniendo posibles sitios de unión a ArcA (identificados a través
de matrices probabilísticas). Datos obtenidos de McGuire et al. [1999]. CoA, coenzima A; Pi,
ortofosfato.
Los sitios de unión de ArcA están localizados tanto ‘río arriba’ como ‘río abajo’ de
los promotores blanco, y exhiben diferentes grados de afinidad para la forma fosforilada y no
fosforilada de ArcA in vitro [Drapal y Sawers, 1995; Cotter et al., 1997; Chao et al., 1997;
Shen y Gunsalus, 1997]. Algunos estudios basados en ensayos de protección a DNAsa I con
regiones promotoras que unen ArcA sugieren que ArcA∼P cubriría regiones relativamente
extensas de ADN, de hasta 230 pb cuando la concentración de ArcA∼P es >1 μM [Iuchi y
Lin, 1992b; Tardat y Touati, 1993; Liu y De Wulf, 2004]. Esta evidencia experimental
sugeriría que ArcA∼P se une al ADN como un oligómero de alto número de subunidades
[Lynch y Lin, 1996b; Pellicer et al., 1999a].
1.3.2.4. Mecanismo de señalización
ArcB es una proteína transmembrana multidominio de 82 kDa (778 aminoácidos), que
se expresa constitutivamente tanto en condiciones aeróbicas como anaeróbicas [Iuchi y Lin,
1992a]. Se encuentra anclada a la membrana citoplasmática por medio de dos segmentos
transmembrana en el dominio N-terminal, conectados por un corto puente periplasmático
[Iuchi et al., 1990b; Kwon et al., 2000b]. Se han identificado una secuencia similar a
cremallera de leucina [Georgellis et al., 1999] y un dominio de recepción tipo PAS [Taylor y
Zhulin, 1999] unidos a la cara citoplasmática de la membrana. Como sucede con la mayoría
de las quinasas de histidina en sistemas de dos componentes, ArcB se autofosforila a partir de
ATP en el residuo de His292 del dominio transmisor primario [Iuchi y Lin, 1992b]. Este
parece ser el paso esencial para la transducción de la señal [Tsuzuki et al., 1995]. Según se
discutió en secciones anteriores, ArcB pertenece a una familia de quinasas de histidina
tripartitas, cuyos miembros contienen un dominio de recepción intrínseco y un dominio Hpt
(histidine phosphotransfer) en el extremo COOH terminal, además del mencionado dominio
transmisor primario [Mizuno, 1997; Matsushika y Mizuno, 1998a,b,c; 2000]. No se han
detectado grupos prostéticos en ArcB, ni similitudes en la secuencia de arcB con sitios de
unión a grupos hemo, flavinas, o metales. Existe evidencia molecular y fisiológica que
señalaría la presencia de más de un estímulo capaz de desencadenar la actividad del sistema
Arc in vivo [Alexeeva et al., 2000]; entre otros, puede citarse la disponibilidad de poder
19
reductor [NAD(P)H] y, según se mencionó anteriormente, se sabe que la señal primaria es
transmitida a través del estado redox de las quinonas [Malpica et al., 2006].
Una vez percibido el estímulo, ArcB se autofosforila y luego trans-fosforila al
regulador ArcA (generando ArcA∼P), el cual cambia su actividad actuando como factor de
transcripción o represor de los genes blanco que controla. El modelo aceptado para la transfosforilación de ArcA a partir de los residuos His292 o His717 de ArcB (de los dominios
primario de transmisión y Hpt, respectivamente) involucraría la transferencia del grupo Pi en
forma intramolecular según HisArcB292 → AspArcB576 → HisArcB717 → Asp ArcA54 (Fig. 1.3)
[Georgellis et al., 1997]. En primer lugar, se ha demostrado que la remoción del extremo
COOH terminal de ArcB (incluyendo el dominio de recepción) no afecta significativamente
el control transcripcional mediado por ArcA in vivo (analizado a través de una fusión sdhlacZ) [Iuchi y Lin, 1992a]. En segundo lugar, estudios in vitro han confirmado que el residuo
His∼P ArcB292 puede fosforilar a ArcA [Iuchi, 1993], aunque otros estudios muestran que la
transferencia de fosfato según HisArcB292 → AspArcA54 no sería el mecanismo favorecido in
vivo [Kwon et al., 2000a]. En este último trabajo, el nivel de fosforilación de ArcA se
determina indirectamente a través de la expresión de cydA-lacZ y lldp-lacZ. La sustitución de
los residuos receptores de fosfato en ArcB (i.e., His292, His576, e His717) en forma individual o
conjunta dio lugar a la desaparición de actividad β-galactosidasa casi por completo, razón por
la cual los autores concluyeron que la secuencia de fosforilación in vivo sería HisArcB292 →
AspArcB576 → HisArcB717 → AspArcA54.
ADP
ATP
P
HOOC
His
717
576
2e–
P
292
His
Q
P
A
P
H+
H+
S
2e–
H2N
ArcB
?
Citoplasma
ArcA
Deshidrogenasa
primaria
NADH
P
Asp
2e–
0,5O2
Asp54
H2O
ADP
ATP
Oxidasa
terminal
H+
Espacio extracelular
NAD+
H+
+
H+ H
Fig. 1.3. Modelo propuesto para la transferencia del grupo fosfato entre ArcB y ArcA
como consecuencia de un cambio en el estado redox de las quinonas. Se destaca el rol de los
equivalentes de reducción (NADH) como promotores de la actividad quinasa de histidina de
ArcB. La flecha en línea de trazos muestra una posible ruta alternativa de fosforilación de
ArcA. Q, quinona/quinol.
20
1.4. Respuestas de E. coli a cambios en la disponibilidad de oxígeno
1.4.1. Cambios en el metabolismo catabólico
Como ya se mencionó, en muchas células la hipoxia o anoxia conducen a un cambio
en el catabolismo energético, de aeróbico a anaeróbico, y en este último la fosforilación a
nivel de sustrato es la única fuente de energía. Sin embargo, muchas bacterias son capaces de
utilizar otros compuestos como aceptores terminales de electrones en lugar de oxígeno
molecular, en un proceso conocido como respiración anaeróbica [Gottschalk, 1986; Böck y
Sawers, 1996; Unden y Bongaerts, 1997]. Fenómenos similares a éste tienen lugar en algunos
gusanos [Kita et al., 1997] y en células de mamífero [Penney y Cascarano, 1970; Hochachka
et al., 1975; Wiesner et al., 1988; Pisarenko, 1996]. La respiración anaeróbica consiste en la
generación de energía a través de la cadena de transporte de electrones (a través de distintos
componentes de la cadena respiratoria) utilizando aceptores finales de electrones alternativos
al oxígeno. Resulta evidente, entonces, que la ventaja adaptativa de los organismos capaces
de llevar a cabo este proceso se basa en poder ocupar nichos ecológicos en los cuales los
organismos dependientes de oxígeno no podrían sobrevivir. Los microorganismos conocidos
como (an)aerobios facultativos, por su parte, son aquellos capaces de crecer en condiciones
aeróbicas pudiendo adaptar su metabolismo a condiciones de deficiencia de oxígeno e incluso
anoxia durante el tiempo que duren estas condiciones [Neidhardt et al., 1990; Lynch y Lin,
1996a]. Esta situación difiere de la que ocurre, por ejemplo, en la mayoría de las células de
mamíferos. Dichas células son capaces de responder a la carencia de oxígeno a corto plazo
cambiando el catabolismo de respiración aeróbica a metabolismo glicolítico, con ácido
láctico como producto final. Sin embargo, si la condición anóxica persiste en el tiempo, la
síntesis de ácido láctico no produce energía suficiente como para cumplir con los
requerimientos celulares de ATP, y como consecuencia, la célula pierde la capacidad de
mantener los gradientes de H+, Na+, Ca2+, y K+. La consecuente pérdida de homeostasis
finalmente lleva a la muerte celular [Bernelli-Zazzera, 1980; Siesjo, 1992; Nathan y Singer,
1999]. Es interesante señalar que algunas especies de vertebrados, como las tortugas de agua,
han desarrollado estrategias metabólicas para la supervivencia prolongada en ausencia de
oxígeno [Hochachka et al., 1996]. Dichas estrategias adaptativas involucran un balance entre
el suministro y la demanda de energía (e.g., aumento de la actividad glicolítica en relación a
la gluconeogénesis), y estabilización de los gradientes electroquímicos a través de las
membranas celulares (e.g., control de la apertura y cierre de canales iónicos) [Hochachka et
al., 1997].
1.4.2. Catabolismo (an)aeróbico de glucosa en E. coli
E. coli, así como muchas otras Enterobacterias, posee un metabolismo que está
adaptado a la disponibilidad de oxígeno del medio ambiente. La respiración aeróbica,
anaeróbica y la fermentación en E. coli se llevan a cabo por diferentes rutas metabólicas,
cuyo control por redes regulatorias globales le permite a las bacterias optimizar la generación
de energía de acuerdo a los niveles de oxígeno presentes en el medio de cultivo [Iuchi y Lin,
1991; Green y Paget, 2004]. Una disminución en la disponibilidad de oxígeno determina que
las células puedan, por un lado, cambiar a un sistema de conservación de la energía y, por
otro lado, poner en marcha un mecanismo de re-oxidación de NAD(P)H para la mantención
21
del balance redox [Clark, 1989; Holms, 1996; Bauer et al., 1999]. Para evitar un reajuste
dependiente de la síntesis de novo de una gran cantidad de proteínas para cada uno de los
requerimientos celulares mencionados (situación energéticamente desfavorable), la síntesis
enzimática está íntimamente ligada a la percepción de la disponibilidad de oxígeno a través
de la regulación transcripcional mediada por ArcAB y Fnr, según se describió en secciones
anteriores. Además, existe una regulación de la actividad enzimática in vivo por modulación a
nivel de la cinética de algunas enzimas. En conjunto, la regulación transcripcional y cinética
aseguran que el pasaje de condiciones aeróbicas a condiciones de baja disponibilidad de
oxígeno proceda coordinadamente, permitiendo que la célula se adapte a la nueva situación
nutricional y energética.
Como anaerobio facultativo, E. coli posee características metabólicas versátiles que le
permiten respirar o fermentar diversos sustratos. Si se considera el proceso general de
generación aeróbica de energía por respiración, la secuencia metabólica puede resumirse en
la oxidación de una fuente carbonada acompañada de la generación de equivalentes de
reducción, como NAD(P)H [Neidhardt et al., 1990]. Los electrones derivados de estos
transportadores se transfieren a quinonas por la acción de NADH deshidrogenasas (I y II), y
posteriormente dichos electrones son captados por oxidasas terminales (citocromos bd y bo)
[Gennis y Stewart, 1996]. Finalmente, la transferencia de 4e– al oxígeno molecular genera dos
moléculas de H2O. Los electrones también pueden provenir de la oxidación de compuestos
tales como succinato, lactato, o glicerol, a través de las correspondientes deshidrogenasas.
Durante la oxidación fosforilativa, la mayoría de la energía liberada como consecuencia del
transporte de electrones se acopla a la formación un gradiente electroquímico de H+ a través
de la membrana citoplasmática, lo cual consiste en la fuerza motriz para la síntesis de ATP
por acción de la F1F0–H+-ATPasa.
E. coli puede crecer utilizando hexosas, como la glucosa, como única fuente de
carbono y energía. Dado que se trata del sustrato utilizado par excellence, se describirá el
metabolismo catabólico a partir de esta fuente carbonada. En sus pasos iniciales, el
metabolismo de glucosa a través de la vía glicolítica de Embden-Meyerhoff-Parnas, es
independiente de la presencia de oxígeno, y genera piruvato. La glicólisis, por lo tanto, es un
proceso en el cual se conserva la energía y se generan equivalentes de reducción [Fraenkel,
1996]. No obstante, el oxígeno posee un papel fundamental en el destino del piruvato. Bajo
condiciones aeróbicas, los equivalentes de reducción generados en la glicólisis y ciclo TCA
[Cronan y LaPorte, 1996], son re-oxidados a través de la cadena respiratoria, generando
fuerza H+-motriz y, consecuentemente, síntesis de ATP.
En ausencia de oxígeno, E. coli también puede respirar, reemplazando el oxígeno con
aceptores de electrones alternativos tales como nitrato, nitrito, fumarato, dimetilsulfóxido, y
óxido de N-trimetilamina [Unden et al., 1995; Unden y Bongaerts, 1997]. La utilización de
aceptores alternativos requiere de la síntesis de las oxidasas terminales correspondientes,
dependiendo de qué compuesto se trate. Adicionalmente, los electrones pueden derivar de la
oxidación anaeróbica de compuestos tales como glicerol, formiato, NADH, o H2, y este
proceso también requiere de la acción de deshidrogenasas específicas. Finalmente, en
ausencia total de aceptores de electrones, el ATP puede ser generado por fosforilación a nivel
22
de sustrato utilizando vías fermentativas en forma exclusiva [Becker et al., 1997]. En este
caso el balance redox se consigue mediante la transferencia de electrones desde los
equivalentes de reducción hacia un aceptor de electrones interno, como piruvato o acetilCoA.
Existen tres puntos de ramificación principales entre las vías catabólicas aeróbicas y
anaeróbicas (figura 1.2). El primer punto es el piruvato, sustrato que puede ser convertido en
acetil-CoA por dos enzimas alternativas: piruvato-formiato liasa (Pfl) y el complejo piruvato
deshidrogenasa (cPdh). El segundo punto de ramificación es la acetil-CoA, que puede entrar
en el ciclo TCA o puede ser convertida en acetato o etanol. Finalmente, dado que E. coli
posee una cadena respiratoria ramificada, el flujo de electrones en la respiración puede seguir
rutas alternativas al oxígeno. El sistema ArcAB está involucrado en el control transcripcional
de casi todas las enzimas de los tres puntos de ramificación.
1.4.2.1. Degradación aeróbica de piruvato
El complejo piruvato deshidrogenasa (cPdh)
Bajo condiciones completamente aeróbicas el piruvato es metabolizado a través de
cPdh, un complejo enzimático de ca. 5000 kDa [Guest et al., 1989; Mattevi et al., 1992] que
consta, a su vez, de tres complejos proteicos principales:
i) E1 o piruvato deshidrogenasa (24 subunidades)
ii) E2 o dihidrolipoil transacetilasa (24 subunidades)
iii) E3 o dihidrolipoamida deshidrogenasa (12 subunidades, sujeta a control por ArcAB)
La reacción neta catalizada por cPdh es la siguiente:
Piruvato + CoA + NAD+ → Acetil-CoA + CO2 + NADH + H+
El piruvato es un efector positivo de cPdh [Smith y Neidhardt, 1983a], mientras que
los productos de la reacción (acetil-CoA y NADH) actúan como inhibidores de cPdh debido a
la sensibilidad de la subunidad E3 al NADH [Snoep et al., 1993].
El ciclo de los ácidos tricarboxílicos (TCA)
Cuando la acetil-CoA se combina con oxalacetato experimenta una oxidación
posterior en el ciclo TCA (también conocido como ciclo de Krebs o ciclo del ácido cítrico),
una vía metabólica central para todos los procesos celulares aeróbicos. Este ciclo es
responsable de la oxidación completa de unidades de C2 (acetil-CoA) a CO2, generando poder
reductor (o equivalentes de reducción) en forma de NADH o FADH2, y conservando al
mismo tiempo la energía debido a la fosforilación a nivel de sustrato (una molécula de GTP
por ciclo, que puede ser convertida en ATP). La reacción neta del ciclo TCA puede escribirse
como:
23
Acetil-CoA + 3NAD+ + FAD + GDP + 2H2O →
3NADH + FADH + GTP + CoA + 2CO2
La actividad cíclica de esta secuencia de reacciones se supone estrictamente aeróbica,
y es controlada transcripcionalmente por ArcAB y Fnr, y también a nivel cinético [Cronan y
LaPorte, 1996]. Bajo condiciones completamente aeróbicas toda la glucosa, suplementada
como sustrato limitante del crecimiento, es convertida a CO2 [Holms, 1996]. Los
equivalentes de reducción producidos durante la oxidación de la glucosa [12 NADH (o
FADH2) por molécula de glucosa consumida], pueden ser conducidos directamente (en forma
de electrones) a la cadena de transporte de electrones. La re-oxidación de los equivalentes de
reducción generados por la oxidación de la fuente de energía ocurre en la cadena respiratoria.
Este proceso puede ser acoplado a la formación de una fuerza H+-motriz y, por lo tanto,
constituye una vía eficiente para la generación de energía.
La cadena respiratoria
La respiración tiene dos objetivos principales: la conservación de energía y la reoxidación de los equivalentes de reducción generados en las reacciones anteriores. Dado que
E. coli posee una cadena respiratoria ramificada (Fig. 1.4), el flujo de electrones en la
respiración puede seguir rutas alternativas para llegar al oxígeno, a través de NADH
deshidrogenasas acopladas (NDHI) o no acopladas (NDHII) a quinonas [Matsushita et al.,
1987; Hayashi et al., 1989]. Posteriormente, el quinol es oxidado por los complejos oxidasa
terminales, citocromo bd o el citocromo bo, los cuales finalmente ceden los electrones al
oxígeno molecular con la reducción concomitante del mismo a H2O. Las oxidasas terminales
difieren en su afinidad por el oxígeno, así como en la estequiometría H+/e–. El citocromo bd
presumiblemente transporta 1 H+/e– [Miller y Gennis, 1985; Puustinen et al., 1991], y posee
alta afinidad por oxígeno [Rice y Hempfling, 1978; Kita et al., 1984; D’Mello et al., 1996];
mientras el citocromo bo, de baja afinidad por oxígeno, probablemente excreta 2 H+/e–
[Puustinen et al., 1991; Calhoun et al., 1993].
Los genes que codifican ambos citocromos, cyd y cyo, se expresan mayormente
cuando el oxígeno no es limitante, aunque el primero llega a su máximo nivel de expresión en
condiciones microaeróbicas y el segundo en condiciones completamente aeróbicas. El control
transcripcional de cyd y cyo está modulado por ArcAB, entre otros reguladores globales y
específicos [Iuchi y Lin, 1988; Cotter et al., 1990; 1997; Iuchi et al., 1990a]. Por su parte, la
deshidrogenasa primaria NDHII, acoplada a quinonas, se expresa en condiciones de
crecimiento aeróbicas [Spiro et al., 1989; Green y Guest, 1994], y su expresión está reprimida
por ArcA en micro o anaerobiosis. NDHI es inducible por oxígeno [Lin y Iuchi, 1991; Tran et
al., 1997], y se han identificado seis sitios de unión para ArcA en la región regulatoria de ndh
(entre 9 y 11 pb ‘río arriba’ del codón de inicio de la transcripción) [McGuire et al., 1999].
En conclusión, la oxidación de glucosa a CO2 (cuando el sustrato carbonado es
limitante) es la vía más favorable respecto a la conservación de energía, debido a la
formación de poder reductor y fuerza H+-motriz. Es importante notar que en la discusión
desarrollada acerca de la hidrólisis de glucosa no se han incluido interferencias en los
24
balances de carbono y redox debido a las vías anabólicas (e.g., oxidación de NADH durante
la síntesis de aminoácidos o componentes de la pared celular).
Glucosa (0,5 mol)
NAD+
ADP
NDHI
H+
–
ATP
e
NADH
NDHII
H2 + CO 2
5
NAD+
2
2NAD
CO2
e
2NADH
2H+ + 0,5O2
e–
H2O
Acetato
ADP
4NAD+
Ciclo
TCA
4NADH
H+
Citocromo
d
H+
ADP
ATP
4
–
Acetil-CoA
Etanol
3
1
NADH
Formiato
+
Q
e–
Piruvato
ATP
Citocromo
o
H+
H+
H+
2CO2
Fig. 1.4. Principales vías catabólicas de la glucosa en E. coli bajo condiciones aeróbicas
(derecha) y anaeróbicas (izquierda). Las reacciones/metabolitos señalados con flechas grises
indican puntos de control por el sistema ArcAB. Algunas de las enzimas clave que catalizan
las reacciones descriptas se señalan con números: 1, complejo piruvato deshidrogenasa; 2,
piruvato-formiato liasa; 3, acetato quinasa/fosfotransacetilasa; 4, alcohol deshidrogenasa; 5,
formiato-hidrógeno liasa. También se producen cantidades menores de lactato (a partir de
piruvato), y succinato (intermediario del ciclo TCA). Q, quinona/quinol.
1.4.2.2. Degradación anaeróbica de piruvato
Cuando no hay presentes aceptores externos de electrones, la respiración no puede
llevarse a cabo y la fosforilación a nivel de sustrato es la única fuente de generación de
energía. El rendimiento de energía es, obviamente, mucho menor, y los equivalentes de
reducción formados durante la glicólisis deben encontrar una ruta alternativa para su reoxidación. E. coli puede solucionar este problema usando aceptores de electrones internos. La
oxidación de la glucosa resulta en una mezcla de ácidos de fermentación como etanol,
acetato, formiato (y/o CO2 y H2), y cantidades menores de lactato y succinato, durante el
proceso conocido como fermentación ácido-mixta [Sokatch, 1969; Gottschalk, 1986; Clark,
25
1989]. A diferencia de lo que ocurre en condiciones aeróbicas, el piruvato formado durante la
glicólisis es catabolizado mediante una enzima alternativa anaeróbica (Pfl).
Producción de formiato por piruvato-formiato liasa (Pfl)
La enzima Pfl, codificada por el operón focA-pfl, es un enzima radical [Wagner et al.,
1992] que cataliza la conversión anaeróbica de piruvato a acetil-CoA y formiato.
Piruvato + CoA → Acetil-CoA + Formiato
Pfl es cinéticamente estable sólo bajo condiciones estrictamente anaeróbicas y es
extremadamente sensible a la presencia de oxígeno. El radical glicilo de Pfl es rápida e
irreversiblemente destruido por oxígeno, fragmentando la cadena polipeptídica de la enzima.
Además de la inactivación por oxígeno, Pfl está sujeta a control post-traduccional. El
producto del gen adhE, alcohol deshidrogenasa/acetil-CoA reductasa (AdhE), actúa como Pfl
desactivasa [Kessler et al., 1991]. A su vez, Pfl puede ser activada por acción de una Pfl
activasa [Knappe et al., 1969; 1984; Knappe y Sawers, 1990].
AdhE cataliza la inactivación del radical glicilo de Pfl utilizando Fe2+, NAD, y CoA
como co-factores. Esta inactivación da lugar a una enzima Pfl carente de radicales, y estable
independientemente de la tensión de oxígeno. La reacción de desactivación es drásticamente
inhibida por NADH y piruvato. De esta manera, la actividad catalítica de AdhE respecto a Pfl
es mayormente determinada por las condiciones redox intracelulares, reflejadas en el cociente
NADH/NAD+. A su vez, la expresión de adhE parece ser inhibida por concentraciones
intracelulares elevadas de NADH [Leonardo et al., 1996]. La forma de Pfl carente de
radicales puede ser reactivada por introducción del radical libre en la cadena polipeptídica.
Esta conversión es catalizada por la enzima Pfl activasa, dependiente de Fe2+ como co-factor.
Para completar la compleja regulación in vivo de la actividad Pfl, su síntesis está bajo
el control de varios factores de transcripción que responden a cambios ambientales,
incluyendo ArcA, IHF (integration host factor), Fnr, NarL, y NarQ (estos dos últimos son
factores de transcripción cuya actividad responde a la presencia de nitrato) [Sawers y Böck,
1988; 1989; Sawers et al., 1989; Sawers y Suppmann, 1992; Sawers, 1993; Sirko et al., 1993;
Kaiser y Sawers, 1995].
Producción de H2 y CO2 - Complejo formiato-hidrógeno liasa (Fhl)
El formiato producido por la reacción catalizada por Pfl puede ser convertido en CO2
y H2 por otra enzima, el complejo Fhl [Böck y Sawers, 1996].
Formiato → H2 + CO2
26
La síntesis del complejo Fhl requiere Se y Mo [Pinsent, 1954], y está regulada por el
pH y la concentración de formiato [Birkmann et al., 1987; Rossmann et al., 1991; Suppmann
y Sawers, 1994]. A altas concentraciones de formiato y bajo pH el formiato es internalizado
por la célula y activa la transcripción del regulador transcripcional FhlA, que
consecuentemente induce la biosíntesis del complejo Fhl [Schlensog y Böck, 1990;
Rossmann et al., 1991].
Producción de acetato y etanol
El segundo producto de la reacción de Pfl, acetil-CoA, puede ser convertido en
acetato o en etanol. La formación de etanol por AdhE permite la re-oxidación de NADH, y de
hecho, en términos energéticos el etanol es el aceptor interno de electrones más importante
producido durante el catabolismo anaeróbico de glucosa. La reacción neta es la siguiente:
Acetil-CoA + 2NADH → Etanol + 2NAD+ + CoA
La formación de acetato produce energía por fosforilación a nivel de sustrato:
Acetil-CoA + Pi + ADP → CoA + ATP + Acetato
Esta última reacción es catalizada por la acción secuencial de las enzimas
fosfotransacetilasa (Pta) y acetato quinasa (AckA) [Dittrich et al., 2005], codificadas por el
operón ack-pta. Bajo condiciones estrictamente fermentativas se producen iguales cantidades
de acetato y etanol [Sokatch, 1969; Clark, 1989].
Los productos secundarios de fermentación: lactato y succinato
La enzima D-lactato deshidrogenasa (LdhA) es una alternativa anaeróbica a la
actividad de Pfl para la hidrólisis del piruvato [Garvie, 1980; Bunch et al., 1997].
Piruvato + NADH → Lactato + NAD+
La principal vía de formación de succinato involucra la rama reductora del ciclo TCA
[Ashworth y Kornberg, 1966; Gottschalk, 1986; Cronan y LaPorte, 1996]. La reacción neta
es la siguiente:
Fosfoenolpiruvato + CO2 + 2NADH + FADH → Succinato + 2NAD+ + FAD
En esta rama del ciclo TCA, la fumarato reductasa remplaza a la succinato
deshidrogenasa proporcionando una vía respiratoria anaeróbica. De esta manera, el fumarato,
intermediario de esta vía, puede ser usado como aceptor interno de electrones. También
existen otras vías que dan como resultado succinato como producto final de fermentación,
27
dado que una mutante que carece de la enzima fosfoenolpiruvato carboxilasa (la cual cataliza
la reacción inicial de la vía recién comentada) es aún capaz de producir cantidades
sustanciales de succinato [Gokarn et al., 2000]. Bajo ciertas condiciones de crecimiento, el
succinato puede convertirse en uno de los principales productos de fermentación de la
glucosa [Stols y Donnelly, 1997; Stols et al., 1997; Donnelly et al., 1998; Wendisch et al.,
2006], a pesar de que se desconocen los detalles del balance redox en dichas condiciones.
1.5. Los polihidroxialcanoatos bacterianos (PHAs): Algunos antecedentes
históricos y características generales
En el desarrollo de este trabajo se estudiarán diversas respuestas fisiológicas en E. coli
como consecuencia de la expresión de genes heterólogos. Como modelo se utilizaron los
genes pha de Azotobacter sp. cepa FA8, que codifican las enzimas involucradas en la síntesis
de poli(3-hidroxibutirato) (PHB) [Pettinari et al., 2001]. Por este motivo, en las secciones
siguientes se exponen los lineamientos generales de las características y propiedades de los
polihidroxialcanoatos bacterianos (PHAs).
Los PHAs son polímeros que poseen C, O, e H como principales constituyentes
[Anderson y Dawes, 1990]; y son completamente biodegradables [Suriyamongkol et al.,
2007]. Desde el punto de vista químico, se trata de poliésteres de varios tipos de ácidos
hidroxialcanoicos [Anderson et al., 1990]. Muchas bacterias sintetizan y acumulan PHAs en
forma de gránulos discretos, como materiales de reserva nutricional (fuente de carbono) y
energética (fuente de equivalentes de reducción) [Dawes y Senior, 1973]. La síntesis de estos
polímeros tiene lugar en condiciones de desbalance nutricional (mayormente, P, N, u
oxígeno) o estrés ambiental, cuando existe una fuente de carbono en exceso (i.e., alta relación
C/N) [Khanna y Srivastava, 2005]. Esta situación determina que se restrinja el ingreso de
acetil-CoA generada durante los primeros pasos del catabolismo al ciclo TCA. Cuando el
nutriente limitante es restablecido (o desaparece la condición de estrés ambiental) el PHA
puede ser degradado por depolimerasas intracelulares y subsecuentemente las subunidades
del polímero se metabolizan como fuente de carbono y energía [Sudesh et al., 2000;
Steinbüchel y Hein, 2001]. Desde el punto de vista ecológico, los PHAs cumplen una
importante función en la supervivencia y tolerancia al estrés de las distintas especies
bacterianas que los acumulan [López et al., 1995; Ruiz et al., 1999; 2001; Kadouri et al.,
2005].
El primer tipo de PHA descripto fue el PHB [poli(β-hidroxibutirato) o poli(3hidroxibutirato)]. Maurice Lemoigne, director del Laboratorio de Fermentación del Instituto
Pasteur (Lille, Francia), aisló y caracterizó por primera vez entre 1923 y 1927 las inclusiones
de PHB presentes en Bacillus megaterium [Lemoigne, 1926]. Lemoigne se interesó en el
estudio del PHB a partir de la observación de que las suspensiones acuosas de B. megaterium
se acidificaban cuando se mantenían en una atmósfera libre de oxígeno (dado que el PHB es
degradado originando acetato y acetil-CoA como productos finales) [Lemoigne et al., 1950b].
Denominó a la fuente de la acidificación lipide-β-hydroxybutirique, e incluso sugirió que el
polímero se producía en la célula por reacciones de deshidratación y polimerización
[Lemoigne et al., 1950a]. Por entonces la mayoría de los químicos orgánicos no creían en las
28
observaciones de Lemoigne, y negaban la existencia de polímeros biológicos. El argumento
esgrimido por Karrer (un importante químico orgánico alemán) durante los años ‘20s en
relación a la existencia de macromoléculas en plantas ilustra la idea general que se tenía en
ese momento acerca de los polímeros biológicos: “Resulta totalmente impensable suponer
que una planta gaste energía en convertir azúcares en polímeros de reserva como el
almidón, de los cuales debería recuperar monómeros inmediatamente después de la
polimerización […] ¿Qué sentido biológico tendría un trabajo tan complejo? […] Es
evidente de que el almidón es sencillamente un agregado coloidal de moléculas de glucosa,
generado durante el proceso de aislamiento”. Al mismo tiempo, Herman Staudinger
(Universidad de Friburgo, Alemania) era ridiculizado por sus colegas cuando presentó su
hipótesis acerca de la existencia de polímeros o ‘moléculas encadenadas’, a las que él llamó
macromoléculas (lo cual le valdría el Premio Nobel de Química en 1953).
Pasarían ca. 30 años hasta que el PHB fuese re-descubierto simultáneamente por
microbiólogos en Estados Unidos y en el Reino Unido. En 1958, Doudoroff, Stanier, y
colaboradores de la Universidad de California (Berkeley) trataban de elucidar las vías
metabólicas que intervenían en la síntesis y degradación de polímeros intracelulares en
bacterias fototróficas [Doudoroff y Stanier, 1959]. Por otro lado Wilkinson y colaboradores,
de la Universidad de Edimburgo (Escocia), comenzaron en 1957 una serie de estudios con el
objetivo de explicar el rol fisiológico de las inclusiones de PHB de Bacillus cereus
[Williamson y Wilkinson, 1958]. Finalmente, las enzimas involucradas en la síntesis de
PHAs fueron caracterizadas independientemente por Schlegel (Universidad de Göttingen,
Alemania), y Dawes (Universidad de Hull, Inglaterra). Schlegel y Dawes publicaron sus
resultados en el mismo volumen del Biochemical Journal en 1973, describiendo las enzimas
necesarias para la síntesis de PHB en Cupriavidus necator y en Azotobacter beijerinckii
[Oeding y Schlegel, 1973; Senior y Dawes, 1973]. Merece la pena destacar aquí que
Cupriavidus necator ha sido incluida en diversas taxas con el transcurso del tiempo, de
manera que el nombre por el cual se conoce esta bacteria ha cambiado frecuentemente, y de
hecho aún se utilizan varios nombres en paralelo. Los primeros aislamientos fueron
originalmente incluidos dentro del género Hydrogenomonas (H. eutropha) y posteriormente
dentro del género Alcaligenes (A. eutrophus) [Davis et al., 1969]. En 1995 se cambió
nuevamente el nombre denominándola Ralstonia eutropha [Yabuuchi et al., 1995]; el cual
fue válido hasta 2004 cuando cambió nuevamente a Wautersia eutropha [Vaneechoutte et al.,
2004], y poco después en el mismo año a Cupriavidus necator [Vandamme y Coenye, 2004].
En esta tesis se adopta esta última denominación por tratarse del nombre taxonómicamente
aceptado en la actualidad.
A partir de los trabajos científicos seminales arriba mencionados, se ha descripto la
acumulación de PHAs en una gran variedad de microorganismos procariotas: miembros
representativos de todas las Eubacteriaceae Gram positivas y Gram negativas (i.e.,
autótrofos, heterótrofos, fotótrofos, aerobios, anaerobios, et cetera), y en algunas especies del
dominio Archaea. En total existen al menos 75 géneros bacterianos, los cuales comprenden
más de 300 especies, capaces de acumular PHAs [Anderson y Dawes, 1990; Madison y
Huisman, 1999; Steinbüchel y Hein, 2001; Zinn et al., 2001; Reddy et al., 2003; Lenz y
Marchessault, 2005; Suriyamongkol et al., 2007].
29
1.5.1. Propiedades de los PHAs
1.5.1.1. Estructura química
La gran mayoría de los PHAs descriptos
hasta la fecha consisten en poliésteres lineales
compuestos por monómeros de ácidos 3hidroxicarboxílicos [Doi, 1990]. El polímero se
genera (y elonga) mediante la formación de un
enlace éster entre el grupo COOH de un
monómero y el grupo OH del monómero
contiguo [Steinbüchel et al., 1999]. En la amplia
mayoría de los PHAs caracterizados, el átomo
de carbono sustituido con el grupo OH posee
configuración absoluta R, exceptuando algunos
pocos casos en los cuales no posee quiralidad
definida. Esta característica es resultado de la
estereoespecificidad de las enzimas involucradas en la síntesis del polímero [Anderson et al.,
1990; Braunegg et al., 1998]. Asimismo, en la
posición C3 (i.e., β) existe un radical alquilo,
cuya extensión puede variar desde metil (C1) a
tetradecil (C14).
Fig. 1.5. Representación esquemática
de la estructura de una subunidad de
PHA. En la mayoría de los casos, x varía
entre 100 y 30.000. El subíndice n indica
la extensión del monómero, y R
representa la cadena alquílica lateral. En
el caso de PHB, n = 1 y R = CH3.
Un esquema de la estructura general de los PHAs se muestra en la Fig. 1.5. Un hecho
interesante es que todos los polímeros descriptos dentro de esta familia son isotácticos, i.e.,
todos los sustituyentes alquílicos se encuentran del mismo lado respecto del esqueleto
carbonado principal [Khanna y Srivastava, 2005]. La cadena alquílica lateral no es
necesariamente saturada: se han encontrado radicales aromáticos, insaturados, halogenados,
epoxídicos, y radicales ramificados [Steinbüchel y Valentin, 1995; Madison y Huisman,
1999; Steinbüchel y Lütke-Eversloh, 2003; Verlinden et al., 2007]. Además de la variabilidad
en la cadena sustituyente lateral, la posición del grupo OH es relativamente variable: se ha
reportado la incorporación a los polímeros de ácidos 4-, 5-, y 6-hidroxicarboxílicos [Witholt
y Kessler, 1999]. La variación en longitud y composición de las cadenas laterales en los
PHAs y la posibilidad de incorporar distintos sustituyentes es la causa de la diversidad
material de esta familia de polímeros y por lo tanto, de su potencial utilización en diversas
aplicaciones.
Los PHAs habitualmente se clasifican en virtud de la extensión del monómero a partir
del cual se generan [Madison y Huisman, 1999]. Así, aquellos poliésteres formados a partir
de la polimerización de subunidades de 3 a 5 átomos de carbono se denominan PHAs de
cadena corta (PHAsSCL), y aquellos que poseen monómeros de 6 a 14 átomos de carbono son
llamados PHAs de cadena media (PHAsMCL). Los PHAs de cadena larga, o PHAsLCL, poseen
constituyentes monoméricos de más de 14 átomos de carbono. El PHB pertenece al grupo de
los PHAsSCL.
30
1.5.1.2. Características físicas
La masa molecular relativa (Mr) de los PHAs varía en relación a la especie productora
considerada y las condiciones de cultivo, pero generalmente se encuentra en el rango
comprendido entre Mr = 50-1.000 kDa [Byrom, 1987]. A pesar de los estudios llevados a
cabo para caracterizar nuevos polímeros desde principios del siglo XX, los poliésteres
alifáticos no despertaron un interés económico inmediato. Esto se debió fundamentalmente a
la imposibilidad de sintetizar poliésteres de elevada M r en el laboratorio: las impurezas en los
sustratos empleados limitaban la M r de estos polímeros a 20-30 kDa.
Dado que los PHAs poseen una Mr suficientemente elevada como para presentar
propiedades termoplásticas de interés económico, en diversos estudios se los ha comparado
con los plásticos ‘tradicionales’ (derivados del petróleo, como el propileno) a fin de evaluar
su aplicabilidad material (Tabla 1.4).
Parámetro
Tm (°C)
Tg (°C)
Cristalinidad (%)
Extensión de ruptura (%)
Valor para
PHB P(HB-co-HV) P(HB-co-HB) P(HO-co-HHx) Polipropileno
177
145
150
61
176
2
–2
–7
–36
–10
70
56
45
30
60
5
50
444
300
400
Tabla 1.4. Propiedades físicas de los PHAs. Los polímeros elegidos para la comparación
son PHB [poli(3-hidroxibutirato)]; P(HB-co-HV) [poli(3-hidroxibutirato-co-3-hidroxivalerato), conteniendo 20% de 3HV]; P(HB-co-HB) [poli(3-hidroxibutirato-co-4-hidroxibutirato), conteniendo 16% de 4HB]; P(HO-co-HHx) [poli(3-hidroxi-octanoato-co-3-hidroxihexanoato), conteniendo 11% de 3HHx]; y polipropileno (un miembro representativo de la
familia de los plásticos tradicionales). Tm, temperatura de fusión; Tg, temperatura de
transición vítrea. Datos tomados de Doi [1995].
Dentro de las bacterias, el PHB se encuentra en un estado semilíquido, amorfo.
Después de ser extraído utilizando algún tratamiento físico-químico (e.g., extracción con
solventes orgánicos), el polímero adquiere un aspecto cristalino, rígido, y algo quebradizo.
Por esta última razón, el PHB no es demasiado resistente desde el punto de vista
elastomérico. Además, la temperatura de fusión (Tm ≈ 170°C) se encuentra muy cercana a la
temperatura de descomposición termal del polímero (Td ≈ 200°C) [Steinbüchel y
Füchtenbusch, 1998; Madison y Huisman, 1999; Zinn et al., 2001], limitando la posibilidad
de manipulación. Desde el punto de vista biotecnológico, el desafío de obtener biopolímeros
más resistentes fue abordado generando co-polímeros con características físicas y materiales
marcadamente distintas respecto a los homopolímeros (e.g., nivel de cristalinidad, elasticidad,
temperatura de fusión, et cetera) [cf. Tabla 1.4]. No obstante, el PHB sigue siendo el punto
de partida para la mayoría de las aplicaciones que utilizan PHAs [Hänggi, 1995], dado que
sus características materiales pueden modificarse al utilizarlo conjuntamente con agentes
plastificantes.
31
1.5.2. Fisiología y biosíntesis de PHB
En la mayoría de las bacterias productoras de PHB el polímero se sintetiza en una
serie de tres reacciones a partir de acetil-CoA cuando el microorganismo es cultivado
utilizando carbohidratos, piruvato, o acetato como fuente de carbono [Schlegel et al., 1961;
Anderson et al., 1990; Madison y Huisman, 1999; Reinecke y Steinbüchel, 2009]. Esta
misma ruta biosintética es la propuesta para la síntesis de PHB en E. coli transformada con
los genes estructurales de un microorganismo productor natural de PHAsSCL [Fidler y Dennis,
1992; Li et al., 2007]. Como se muestra en la Fig. 1.6.A, en primer lugar se acoplan dos
moléculas de acetil-CoA, generando acetoacetil-CoA en una reacción de condensación de
Claisen catalizada por la enzima 3-cetoacil-CoA tiolasa (PhaB). Luego, el producto es
reducido estereoselectivamente dando (R)-3-hidroxibutiril-CoA en una reacción catalizada
por la acetoacetil-CoA reductasa dependiente de NADPH (PhaA). Finalmente, el PHB se
sintetiza por polimerización de las moléculas de (R)-3-hidroxibutiril-CoA por la acción de
una PHA sintasa (PhaC). Un modelo simplificado propuesto para la reacción de
polimerización se muestra en la Fig. 1.6.B.
A
a
b
c
B
Iniciación
E–SH + (R)-CH3CH(OH)CH2CO–CoA →
CH3CH(OH)CH2CO–S–E + CoA–SH
Propagación
PHBn–1–O–CH(CH3)CH2CO–S–E + (R)-CH3CH(OH)CH2CO–CoA →
PHBn–O–CH(CH3)CH2CO–S–E + CoA–SH
Transferencia de cadena (terminación)
PHBn–O–CH(CH3)CH2CO–S–E + H2O →
PHBn–O–CH(CH3)CH2COOH + E–SH
Fig. 1.6. Biosíntesis de PHB y reacción de polimerización. Esquema de la vía biosintética
de PHB (A). Las enzimas involucradas son: a, 3-cetoacil-CoA tiolasa; b, acetoacetil-CoA
reductasa; y c, PHB sintasa. n = número de monómeros de 3-hidroxibutirato. La
polimerización de PHB ocurre en tres pasos secuenciales: iniciación, propagación, y
transferencia de cadena o terminación (B). La enzima PHB sintetasa, con el grupo tiol
catalítico, se representa como E–SH. En la reacción de terminación un agente terminador
como una molécula de H2O u otra especie con pares electrónicos libres cataliza la liberación
de la cadena naciente del polímero. Tomado de Doi et al. [1992].
32
Se ha encontrado que las concentraciones intracelulares de acetil-CoA y de CoA libre
poseen un rol central en la regulación de la biosíntesis de PHB [Senior y Dawes, 1973;
Anderson y Dawes, 1990; Lee, 1996]. Durante el crecimiento balanceado, la acetil-CoA es
oxidada a través del ciclo TCA. En esta secuencia de reacciones, se genera NADH que luego
es usado en diversas rutas biosintéticas. Cuando cesa el crecimiento activo se incrementa la
concentración de NADH, situación que reduce la actividad de al menos dos enzimas del ciclo
TCA (citrato sintasa e isocitrato deshidrogenasa). Como consecuencia de esta inhibición, la
acetil-CoA no es oxidada en el ciclo de TCA y entra en la vía de la producción de PHB
[Kessler y Witholt, 2001]. La 3-cetoacil-CoA tiolasa de esta ruta biosintética es inhibida por
CoA libre [Peoples y Sinskey, 1989b], generada a su vez por oxidación de acetil-CoA en el
curso del ciclo TCA.
1.5.3. Biología molecular y enzimología de la biosíntesis de PHAsSCL
En C. necator los genes estructurales para la síntesis de PHA están organizados en el
operón phaCAB; y codifican las enzimas PHB sintasa, 3-cetoacil-CoA tiolasa, y acetoacetilCoA reductasa dependiente de NADPH, respectivamente [Reinecke y Steinbüchel, 2009].
Los genes estructurales para la biosíntesis de PHAs de numerosas especies bacterianas se han
clonado y secuenciado [Steinbüchel, 2001]. En este estudio se utilizan cepas recombinantes
de E. coli que expresan los genes phaBAC de Azotobacter sp. FA8 (Fig. 1.7) en forma
episomal [Nikel et al., 2006]. Los genes estructurales involucrados en la síntesis de PHAs
difieren según el microorganismo productor considerado, especialmente respecto al tipo de
PHA sintasa, que determina el tipo de monómero incorporado al PHA [Haywood et al., 1989;
Rehm y Steinbüchel, 2001; Nomura y Taguchi, 2007]. Otros genes poseen influencia directa
o indirecta en la síntesis de polímeros. Por ejemplo, el gen phaJ de Aeromonas caviae
codifica una enoil-CoA hidratasa que provee monómeros para la síntesis de PHA
provenientes de la vía de β-oxidación de ácidos grasos [Fukui et al., 2001]. Existen otros
genes regulatorios, como phaF en diversas especies (el cual codifica una fasina, cuya función
es estabilizar los gránulos de PHA) [Pötter y Steinbüchel, 2005; de Almeida et al., 2007;
Kuchta et al., 2007], o phaD en Pseudomonas putida (de función desconocida, pero que
parece ser requerido para la acumulación de polímeros) [Raiger-Iustman y Ruiz, 2008].
La PHB sintasa de C. necator, una de las enzimas intervinientes en la síntesis de PHB
mejor caracterizadas, es un multímero de subunidades idénticas con una Mr = 63,9 kDa y alta
especificidad para 3-hidroxiacil-CoAs comprendiendo entre 3 y 5 átomos de carbono
[Peoples y Sinskey, 1989a; Steinbüchel y Schlegel, 1991]. Ensayos de mutagénesis sitiodirigida demostraron que el residuo Cys319 se encuentra involucrado en la actividad catalítica
de la enzima [Gerngross et al., 1994]. En el mismo trabajo se ha demostrado que la enzima
requiere un tipo de modificación post-traduccional que sería esencial para la catálisis: la
adición de un grupo fosfopantoteína al residuo de Ser259, modificación que provee un
segundo grupo tiol para la síntesis de PHB.
El modelo generalizado para la síntesis de PHB, basado en la síntesis de novo de
ácidos grasos, se basa en una serie de pasos secuenciales [Kessler y Witholt, 1999]. El
mecanismo de la reacción de polimerización fue propuesto por Ballard y colaboradores en
33
1987 (Imperial Chemical Industries Ltd., Reino Unido) [Ballard et al., 1987], y
posteriormente refinado por Doi y colaboradores en 1992 (Instituto RIKEN, Japón) [Doi et
al., 1992]. En primer lugar ocurre una reacción de iniciación en la cual el motivo de ácido 3hidroxibutírico, proveniente de una molécula de 3-hidroxibutiril-CoA, es transferido al grupo
tiol del residuo de fosfopantoteínserina, liberando una molécula de CoA en el proceso. Este
motivo 3-hidroxibutiril es luego transferido al grupo tiol del residuo Cys319. Se ha demostrado
recientemente que la acilación de este residuo de cisteína provoca la dimerización de la PHB
sintasa. Esta dimerización va acompañada de un aumento en la actividad específica de la
enzima, y una disminución en el tiempo requerido para la iniciación. Posteriormente se
añaden otros monómeros al grupo tiol de la fosfopantoteínserina en forma secuencial, y en
cada reacción de la secuencia el grupo 3’-OH ataca el enlace tioéster del primer monómero
unido al residuo de cisteína. Cuando se transfiere el dímero covalentemente unido, el grupo
tiol de la serina modificada está listo para aceptar una nueva subunidad de ácido 3hidroxibutírico.
En cada paso de la propagación (elongación) de la cadena naciente de PHB, se añade
una subunidad al polímero. Se asume que el polímero es liberado de la enzima si ocurre una
reacción de transferencia de cadena con una molécula de agua u otro agente terminador
nucleofílico.
phaB
phaA
phaC
1 kb
Fig. 1.7. Esquema de la organización estructural en la región genómica de Azotobacter sp.
cepa FA8 que comprende los genes phaB (acetoacetil-CoA reductasa), phaA (3-cetoacil-CoA
tiolasa), y phaC (PHB sintasa). Tomado de Pettinari et al. [2001].
1.5.4. Consideraciones biológicas
1.5.4.1. Biodegradabilidad
Además de las características materiales intrínsecas de los PHAs, una de las razones
más importantes para la elección de estos polímeros como posible reemplazo de los plásticos
derivados de petróleo se fundamenta en su capacidad de ser completamente biodegradados
[Anderson y Dawes, 1990; Jendrossek, 2001].
En ambientes naturales, las comunidades de microorganismos endógenos
(principalmente bacterias y ciertos hongos filamentosos) son capaces de degradar PHAs
utilizando PHA depolimerasas e hidrolasas extracelulares. La actividad de estas enzimas varía
dependiendo de la composición del polímero, su forma física (amorfa o cristalina), la
dimensión de la muestra considerada y, especialmente, las condiciones ambientales.
34
La degradación de una pieza de PHB
insume un lapso típico que varía entre unos
pocos meses (en aerobiosis) y varios años (en
ambientes marinos) [Mergaert et al., 1994;
1995]. Una ventaja adicional de estos
materiales es el hecho de que los mismos no
sufren corrosión o deterioro cuando no están
en contacto directo con comunidades
microbianas, lo cual permite su utilización en
diversas aplicaciones comerciales. El proceso
de biodegradación de botellas de P(HB-coHV) (co-polímero de 3-hidroxibutirato y 3hidroxivalerato) en lodos activados se ilustra
en la Fig. 1.8.
Fig. 1.8. Botellas de poli(3-hidroxibutirato-co-3-hidroxivalerato)
incubadas
aeróbicamente en lodos activados a una
temperatura promedio de 20°C. Las
botellas fueron sometidas al tratamiento
durante 0, 2, 4, 6, 8, y 10 semanas (de
izquierda a derecha). Tomado de Mergaert
et al. [1994].
1.5.4.2. Naturaleza renovable de los sustratos
La producción de PHAs presenta el atractivo de poder realizarse a partir de numerosos
recursos renovables [Tsuge, 2002; Koller et al., 2005; Keenan et al., 2006; Solaiman et al.,
2006; Verlinden et al., 2007; Serafim et al., 2008]. La biosíntesis de PHAs por
fermentaciones microbianas puede ser diseñada de modo de utilizar productos de origen
agrícola (e.g., melaza de caña, almidón, glicerol, triacilgliceroles), o ganadero (e.g.,
lactosuero, hidrolizados de hueso) como principales fuentes de nutrientes. Incluso se ha
descripto la acumulación fotosintética de PHAs por Nostoc muscorum y Synechocystis sp.
[Hein et al., 1998; Sharma y Mallick, 2005], y la producción de biopolímeros a partir de H2 y
CO2 [Schlegel, 1965; Ishizaki et al., 2001].
Fuentes de
carbono
Luz solar
H2O y O2
Fermentación
CO2
Extracción y
purificación
PHAs
Vegetales
Degradación
Fig. 1.9. Ciclo de vida de los PHAs. A
diferencia de lo que ocurre con los
plásticos derivados de petróleo, el CO2 es
capturado durante el proceso, dismuyendo
la emisión de gases que contribuyen al
efecto invernadero. Tomado de Verlinden
et al. [2007].
En general, los sustratos industriales
mencionados son derivados orgánicos de
CO2 y H2O, y después de su conversión a
PHAs se transforman nuevamente en CO2 y
H2O (en aerobiosis), o CH4 y H2O (en
anaerobiosis), cuando los poliésteres son
biodegradados (Fig. 1.9). Por este motivo,
los PHAs han recibido especial atención
dado que pueden ser obtenidos a partir de
recursos renovables en lugar de las
habituales fuentes de combustible fósil, en
constante disminución. Adicionalmente, el
elevado costo del petróleo está sometido a
variables políticas y económicas que
condicionan su utilización masiva, además
de tratarse de un recurso no renovable.
35
1.5.5. Aplicaciones de los PHAs
Dado que los PHAs son poliésteres termoplásticos naturales, no tóxicos, y
biodegradables, su principal aplicación se relaciona con el reemplazo de polímeros
petroquímicos especialmente para envolturas y empaquetado [Zinn et al., 2001]. El amplio
rango de propiedades físicas de los distintos miembros de la familia de PHAs ha permitido
ampliar el espectro de aplicaciones en las que se utilizan estos polímeros. Los primeros
logros se obtuvieron en artículos moldeados, como botellas, envases para cosméticos,
lapiceras, e incluso pelotas de golf. También se han patentado películas de PHB y P(HB-coHV) para ser utilizadas como recubrimiento externo de pañales y productos de higiene íntima
femenina. Como se mencionó anteriormente, el PHB puede ser laminado conjuntamente con
otros polímeros que actúan como plastificantes (e.g., alcohol polivinílico), generando placas
de un material termo-resistente y altamente flexible [Hazer, 2002]. Ciertos PHAs pueden ser
convertidos en fibras; hilando estas fibras se obtienen tramas que pueden reemplazar ciertos
aislantes industriales. Además, estos poliésteres pueden ser utilizados como adhesivos
resistentes a altas presiones y elevadas temperaturas, y como polímeros semi-conductores en
ciertas aplicaciones electrónicas. Las aplicaciones materiales de los PHAs pueden
diversificarse por reacciones de modificación a nivel de la síntesis, y químicamente después
de la extracción y purificación del producto [Hazer y Steinbüchel, 2007; Nomura y Taguchi,
2007].
Adicionalmente, los PHAs pueden ser hidrolizados químicamente, y los monómeros
pueden transformarse en moléculas de importancia comercial, como ácidos β-hidroxicarboxílicos, ácidos 2-alquenoicos, β-hidroxialcanoles, (β-acil)lactonas, β-aminoácidos, y
ésteres de ácidos β-hidroxicarboxílicos (industrialmente utilizados como solventes). Por otra
parte, dado que los PHAs están compuestos por monómeros de quiralidad definida, las
subunidades del poliéster pueden ser utilizadas como generadores de compuestos ópticamente
activos en estrategias de síntesis orgánica (‘química fina’) [Chen y Wu, 2005]. El PHB, por
ejemplo, es hidrolizado a ácido (R)-3-hidroxibutírico y utilizado como precursor en la síntesis
de TruspotTM, una droga anti-glaucoma comercializada por Merck [Reddy et al., 2003].
También se ha planteado la posibilidad de utilizar los PHAs como vehículo para la
liberación lenta y progresiva de drogas medicinales, hormonas, insecticidas, y herbicidas
[Madison y Huisman, 1999]. Desde el punto de vista médico se trata de componentes
biocompatibles, razón por la cual también se han sido utilizados como materiales
osteosintéticos (i.e., como estimulante del crecimiento óseo, debido a las propiedades
piezoeléctricas del polímero), implantes óseos, suturas quirúrgicas, y prótesis vasculares
[Williams, 2005].
36
1.6. Referencias bibliográficas
Acker, H. 1994a. Cellular oxygen sensors.
Ann. N. Y. Acad. Sci. 718:3-10.
Acker, H. 1994b. Mechanisms and meaning
of cellular oxygen sensing in the organism.
Respir. Physiol. 95:1-10.
Alexeeva, S., B. de Kort, G. Sawers, K. J.
Hellingwerf, y M. J. Teixeira de Mattos.
2000. Effects of limited aeration and of the
ArcAB system on intermediary pyruvate
catabolism in Escherichia coli. J. Bacteriol.
182:4934-4940.
Anderson, A. J., y E. A. Dawes. 1990.
Occurrence, metabolism, metabolic role,
and industrial uses of bacterial polyhydroxyalkanoates. Microbiol. Rev. 54:450-472.
Anderson, A. J., G. W. Haywood, y E. A.
Dawes.
1990.
Biosynthesis
and
composition of bacterial poly(hydroxyalkanoates). Int. J. Biol. Macromol.
12:102-105.
Ashworth, J. M., y H. L. Kornberg. 1966.
The anaplerotic fixation of carbon dioxide
by Escherichia coli. Proc. R. Soc. Lond. B
Biol. Sci. 165:179-188.
Aslund, F., M. Zheng, J. Beckwith, y G.
Storz. 1999. Regulation of the OxyR
transcription factor by hydrogen peroxide
and the cellular thiol-disulfide status. Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 96:6161-6165.
Auzat, I., S. Chapuy-Regaud, G. Le Bras, D.
Dos Santos, A. D. Ogunniyi, I. Le
Thomas, J. R. Garel, J. C. Paton, y M. C.
Trombe. 1999. The NADH oxidase of
Streptococcus pneumoniae: its involvement
in competence and virulence. Mol.
Microbiol. 34:1018-1028.
Bader, M., W. Muse, T. Zander, y J.
Bardwell. 1998. Reconstitution of a protein
disulfide catalytic system. J. Biol. Chem.
273:10302-10307.
Bader, M., W. Muse, D. P. Ballou, C.
Gassner, y J. C. Bardwell. 1999.
Oxidative protein folding is driven by the
electron transport system. Cell 98:217-227.
Ballard, D. G., P. A. Holmes, y P. J. Senior.
1987. Formation of polymers of βhydroxybutyric acid in bacterial cells and a
comparison of the morphology of growth
with the formation of polyethylene in the
solid state, p. 293-314. En M. Fontanille y
A. Guyot (ed.), Recent advances in
mechanistic and synthetic aspects of
polymers. Reidel (Kluwer) Pub., Lancaster,
Reino Unido.
Bannan, J. D., M. J. Moran, J. I. MacInnes,
G. A. Soltes, y R. L. Friedman. 1993.
Cloning and characterization of btr, a
Bordetella pertussis gene encoding an
FNR-like transcriptional regulator. J.
Bacteriol. 175:7228-7235.
Bardwell, J. C., K. McGovern, y J.
Beckwith. 1991. Identification of a protein
required for disulfide bond formation in
vivo. Cell 67:581-589.
Bardwell, J. C., J. O. Lee, G. Jander, N.
Martin, D. Belin, y J. Beckwith. 1993. A
pathway for disulfide bond formation in
vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:10381042.
Bates, D. M., C. V. Popescu, N.
Khoroshilova, K. Vogt, H. Beinert, E.
Münck, y P. J. Kiley. 2000. Substitution
of leucine 28 with histidine in the
Escherichia coli transcription factor FNR
results in increased stability of the [4Fe4S]2+ cluster to oxygen. J. Biol. Chem.
275:6234-6240.
Bauer, C. E., S. Elsen, y T. H. Bird. 1999.
Mechanisms for redox control of gene
expression. Annu. Rev. Microbiol. 53:495523.
Becker, S., D. Vlad, S. Schuster, P. Pfeiffer,
y G. Unden. 1997. Regulatory O2 tensions
for the synthesis of fermentation products
in Escherichia coli and relation to aerobic
respiration. Arch. Microbiol. 168:290-296.
Beinert, H., y P. J. Kiley. 1999. Fe-S proteins
in sensing and regulatory functions. Curr.
Opin. Chem. Biol. 3:152-157.
37
Bernelli-Zazzera, A. 1980. Pathobiology of
anoxic cells. Minerva Anestesiol. 46:967978.
Bibikov, S. I., R. Biran, K. E. Rudd, y J. S.
Parkinson. 1997. A signal transducer for
aerotaxis in Escherichia coli. J. Bacteriol.
179:4075-4079.
Bibikov, S. I., L. A. Barnes, Y. Gitin, y J. S.
Parkinson. 2000. Domain organization and
flavin
adenine
dinucleotide-binding
determinants in the aerotaxis signal
transducer Aer of Escherichia coli. Proc.
Bickler, P. E., y L. T. Buck. 1998.
Adaptations of vertebrate neurons to
hypoxia and anoxia: maintaining critical
Ca2+ concentrations. J. Exp. Biol.
201:1141-1152.
Birkmann, A., F. Zinoni, G. Sawers, y A.
Böck.
1987.
Factors
affecting
transcriptional regulation of the formatehydrogen-lyase pathway of Escherichia
coli. Arch. Microbiol. 148:44-51.
Böck, A., y G. Sawers. 1996. Fermentation, p.
262-282. En F. C. Neidhardt, R. Curtiss III,
J. L. Ingraham, E. C. C. Lin, K. B. Low, B.
Magasanik, W. S. Reznikoff, M. Riley, M.
Schaechter, y H. E. Umbarger (ed.),
Escherichia coli and Salmonella: cellular
and molecular biology, 2da ed., vol. 1.
ASM Press, Washington, D.C.
Bogachev, A. V., R. A. Murtazine, A. I.
Shestopalov, y V. P. Skulachev. 1995.
Induction of the Escherichia coli
cytochrome d by low ΔμH+ and by sodium
ions. Eur. J. Biochem. 232:304-308.
Bongaerts, J., S. Zoske, U. Weidner, y G.
Unden. 1995. Transcriptional regulation of
the
proton
translocating
NADH
dehydrogenase
genes
(nuoA-N)
of
Escherichia coli by electron acceptors,
electron donors and gene regulators. Mol.
Microbiol. 16:521-534.
Bracha, R., y D. Mirelman. 1984. Virulence
of Entamoeba histolytica trophozoites.
Effects
of
bacteria,
microaerobic
conditions, and metronidazole. J. Exp.
Med. 160:353-368.
Braunegg, G., G. Lefebvre, y K. F. Genser.
1998. Polyhydroxyalkanoates, biopolyesters
from
renewable
resources:
physiological and engineering aspects. J.
Biotechnol. 65:127-161.
Brizel, D. M., S. P. Scully, J. M. Harrelson,
L. J. Layfield, J. M. Bean, L. R. Prosnitz,
y M. W. Dewhirst. 1996. Tumor
oxygenation predicts for the likelihood of
distant metastases in human soft tissue
sarcoma. Cancer Res. 56:941-943.
Brondsted, L., y T. Atlung. 1996. Effect of
growth conditions on expression of the acid
phosphatase (cyx-appA) operon and the
appY gene, which encodes a transcriptional
activator of Escherichia coli. J. Bacteriol.
178:1556-1564.
Bukholm, G., y G. Kapperud. 1987.
Expression of Campylobacter jejuni
invasiveness in cell cultures coinfected
with other bacteria. Infect. Immun.
55:2816-2821.
Bunch, P. K., F. Mat-Jan, N. A. Lee, y D. P.
Clark. 1997. The ldhA gene encoding the
fermentative lactate dehydrogenase of
Escherichia coli. Microbiology 143:187195.
Bunn, H. F., J. Gu, L. E. Huang, J. W.
Park, y H. Zhu. 1998. Erythropoietin: a
model system for studying oxygendependent gene regulation. J. Exp. Biol.
201:1197-1201.
Buxton, R. S., y L. S. Drury. 1983. Cloning
and insertional inactivation of the dye
(sfrA) gene, mutation of which affects sex
factor F expression and dye sensitivity of
Escherichia coli K-12. J. Bacteriol.
154:1309-13014.
Buxton, R. S., L. S. Drury, y C. A. Curtis.
1983. Dye sensitivity correlated with
envelope protein changes in dye (sfrA)
mutants of Escherichia coli K12 defective
in the expression of the sex factor F. J.
Gen. Microbiol. 129:3363-3370.
Byrom, D. 1987. Polymer synthesis by microorganisms: technology and economics.
Trends Biotechnol. 5:246-250.
38
Calhoun, M. W., K. L. Oden, R. B. Gennis,
M. J. Teixeira de Mattos, y O. M.
Neijssel. 1993. Energetic efficiency of
Escherichia coli: effects of mutations in
components of the aerobic respiratory
chain. J. Bacteriol. 175:3020-3025.
Canfield, D. E., K. S. Habicht, y B.
Thamdrup. 2000. The Archean sulfur
cycle and the early history of atmospheric
oxygen. Science 288:658-661.
Clark, D. P. 1989. The fermentation pathways
of Escherichia coli. FEMS Microbiol. Rev.
5:223-234.
Cohen-Bazire, G., W. R. Sistrom, y R. Y.
Stanier. 1957. Kinetic studies of pigment
synthesis by non-sulfur purple bacteria. J.
Cell Physiol. 49:25-68.
Colloms, S. D., C. Alen, y D. J. Sherratt.
1998. The ArcA/ArcB two-component
regulatory system of Escherichia coli is
essential for Xer site-specific recombination at psi. Mol. Microbiol. 28:521-530.
Compan, I., y D. Touati. 1993. Interaction of
six global transcription regulators in
expression of manganese superoxide
dismutase in Escherichia coli K-12. J.
Bacteriol. 175:1687-1696.
Cotter, P. A., V. Chepuri, R. B. Gennis, y R.
P. Gunsalus. 1990. Cytochrome o
(cyoABCDE) and d (cydAB) oxidase gene
expression in Escherichia coli is regulated
by oxygen, pH, and the fnr gene product. J.
Bacteriol. 172:6333-6338.
Cotter, P. A., S. B. Melville, J. A. Albrecht,
y R. P. Gunsalus. 1997. Aerobic
regulation of cytochrome d oxidase
(cydAB) operon expression in Escherichia
coli: roles of Fnr and ArcA in repression
and activation. Mol. Microbiol. 25:605615.
Cronan, J. E., y D. LaPorte. 1996.
Tricarboxylic acid cycle and glyoxylate
bypass, p. 206-216. En F. C. Neidhardt, R.
Curtiss III, J. L. Ingraham, E. C. C. Lin, K.
B. Low, B. Magasanik, W. S. Reznikoff,
M. Riley, M. Schaechter, y H. E. Umbarger
(ed.), Escherichia coli and Salmonella:
cellular and molecular biology, 2da ed.,
vol. 1. ASM Press, Washington, D.C.
Cunningham, L., M. J. Gruer, y J. R. Guest.
1997. Transcriptional regulation of the
aconitase genes (acnA and acnB) of
Cunningham, L., D. Georgellis, J. Green, y
J. R. Guest. 1998. Co-regulation of
lipoamide
dehydrogenase
and
2oxoglutarate dehydrogenase synthesis in
Escherichia coli: characterisation of an
ArcA binding site in the lpd promoter.
FEMS Microbiol. Lett. 169:403-408.
Chao, G., J. Shen, C. P. Tseng, S. J. Park, y
R. P. Gunsalus. 1997. Aerobic regulation
of isocitrate dehydrogenase gene (icd)
expression in Escherichia coli by the arcA
and fnr gene products. J. Bacteriol.
179:4299-4304.
Chattopadhyay, S., Y. Wu, y P. Datta. 1997.
Involvement of Fnr and ArcA in anaerobic
expression of the tdc operon of Escherichia
coli. J. Bacteriol. 179:4868-4873.
Chen, G. Q., y Q. Wu. 2005. Microbial
production and applications of chiral
hydroxyalkanoates.
Appl.
Microbiol.
Cho, B. K., E. M. Knight, y B. Ø. Palsson.
2006. Transcriptional regulation of the fad
regulon genes of Escherichia coli by ArcA.
Microbiology 152:2207-2219.
Christman, M. F., R. W. Morgan, F. S.
Jacobson, y B. N. Ames. 1985. Positive
control of a regulon for defenses against
oxidative stress and some heat-shock
proteins in Salmonella typhimurium. Cell
41:753-762.
D’Mello, R., S. Hill, y R. K. Poole. 1996. The
cytochrome bd quinol oxidase in
Escherichia coli has an extremely high
oxygen affinity and two oxygen-binding
haems: implications for regulation of
activity in vivo by oxygen inhibition.
Darie, S., y R. P. Gunsalus. 1994. Effect of
heme and oxygen availability on hemA
gene expression in Escherichia coli: role of
the fnr, arcA, and himA gene products. J.
Bacteriol. 176:5270-5276.
39
Davies, S. J., P. Golby, D. Omrani, S. A.
Broad, V. L. Harrington, J. R. Guest, D.
J. Kelly, y S. C. Andrews. 1999.
Inactivation and regulation of the aerobic
C4-dicarboxylate transport (dctA) gene of
Escherichia coli. J. Bacteriol. 181:56245635.
Davis, D., M. Doudoroff, R. Y. Stanier, y M.
Mandel. 1969. Proposal to reject the genus
Hydrogenomonas: taxonomic implications.
Int. J. Syst. Bacteriol. 19:375-390.
Dawes, E. A., y P. J. Senior. 1973. The role
and regulation of energy reserve polymers
in micro-organisms. Adv. Microb. Physiol.
10:135-266.
de Almeida, A., P. I. Nikel, A. M. Giordano,
y M. J. Pettinari. 2007. Effects of granuleassociated protein PhaP on glyceroldependent growth and polymer production
in
poly(3-hydroxybutyrate)-producing
Escherichia coli. Appl. Environ. Microbiol.
73:7912-7916.
de Graef, M. R., S. Alexeeva, J. L. Snoep, y
M. J. Teixeira de Mattos. 1999. The
steady-state
internal
redox
state
(NADH/NAD) reflects the external redox
state and is correlated with catabolic
adaptation in Escherichia coli. J. Bacteriol.
181:2351-2357.
Delgado-Nixon, V. M., G. González, y M. A.
Gilles-González. 2000. Dos, a hemebinding PAS protein from Escherichia coli,
is a direct oxygen sensor. Biochemistry
39:2685-2691.
Deretic,
V.,
W.
Philipp,
S.
Dhandayuthapani, M. H. Mudd, R.
Curcic, T. Garbe, B. Heym, L. E. Via, y
S. T. Cole. 1995. Mycobacterium
tuberculosis is a natural mutant with an
inactivated oxidative-stress regulatory
gene: implications for sensitivity to
isoniazid. Mol. Microbiol. 17:889-900.
Dibden, D. P., y J. Green. 2005. In vivo
cycling of the Escherichia coli transcription
factor FNR between active and inactive
states. Microbiology 151:4063-4070.
Dittrich, C. R., G. N. Bennett, y K. Y. San.
2005. Characterization of the acetateproducing pathways in Escherichia coli.
Biotechnol. Prog. 21:1062-1067.
Dixon, R. 1998. The oxygen-responsive NifLNifA complex: a novel two-component
regulatory system controlling nitrogenase
synthesis in γ-proteobacteria. Arch.
Microbiol. 169:371-380.
Doi, Y. 1990. Microbial polyesters. VCH
Publishers, New York.
Doi, Y., Y. Kawaguchi, N. Koyama, S.
Nakamura, M. Hiramitsu, Y. Yoshida, y
H. Kimura. 1992. Synthesis and
degradation of polyhydroxyalkanoates in
Alcaligenes eutrophus. FEMS Microbiol.
Rev. 103:103-108.
Doi, Y. 1995. Microbial synthesis, physical
properties,
and biodegradability of
polyhydroxyalkanoates. Macromol. Symp.
98:585-599.
Donnelly, M. I., C. S. Millard, D. P. Clark,
M. J. Chen, y J. W. Rathke. 1998. A
novel fermentation pathway in an
Escherichia coli mutant producing succinic
acid, acetic acid, and ethanol. Appl.
Biochem. Biotechnol. 70-72:187-198.
Doudoroff, M., y R. Y. Stanier. 1959. Role
of poly-β-hydroxybutyric acid in the
assimilation of organic carbon by bacteria.
Nature 183:1440-1442.
Drapal, N., y G. Sawers. 1995. Purification of
ArcA and analysis of its specific interaction
with the pfl promoter-regulatory region.
Mol. Microbiol. 16:597-607.
Fidler, S., y D. Dennis. 1992. Polyhydroxyalkanoate production in recombinant
Escherichia coli. FEMS Microbiol. Rev.
103:231-236.
Fisher, H. M. 1994. Genetic regulation of
nitrogen fixation in rhizobia. Microbiol.
Rev. 58:352-386.
40
Fraenkel, D. G. 1996. Glycolysis, p. 189-198.
En F. C. Neidhardt, R. Curtiss III, J. L.
Ingraham, E. C. C. Lin, K. B. Low, B.
Fukui, T., T. Kichise, T. Iwata, y Y. Doi.
2001. Characterization of 13 kDa granuleassociated protein in Aeromonas caviae and
biosynthesis of polyhydroxyalkanoate with
altered molar composition by recombinant
bacteria Biomacromolecules 2:148-153.
Garvie, E. I. 1980. Bacterial lactate
dehydrogenases. Microbiol. Rev. 44:106139.
Gennis, R. B., y V. Stewart. 1996.
Respiration, p. 217-261. En F. C.
Neidhardt, R. Curtiss III, J. L. Ingraham, E.
C. C. Lin, K. B. Low, B. Magasanik, W. S.
Reznikoff, M. Riley, M. Schaechter, y H.
E. Umbarger (ed.), Escherichia coli and
Salmonella: cellular and molecular biology,
2da ed., vol. 1. ASM Press, Washington,
D.C.
Georgellis, D., A. S. Lynch, y E. C. C. Lin.
1997. In vitro phosphorylation study of the
arc two-component signal transduction
system of Escherichia coli. J. Bacteriol.
179:5429-5435.
Georgellis, D., O. Kwon, y E. C. C. Lin.
1999. Amplification of signaling activity of
the arc two-component system of
Escherichia coli by anaerobic metabolites.
An in vitro study with different protein
modules. J. Biol. Chem. 274:35950-35954.
2001. Quinones as the redox signal for the
arc two-component system of bacteria.
Science 292:2314-2316.
Gerngross, T. U., K. D. Snell, O. P. Peoples,
A. J. Sinskey, E. Csuhai, S. Masamune, y
J. Stubbe. 1994. Overexpression and
purification of the soluble polyhydroxyalkanoate synthase from Alcaligenes
eutrophus: evidence for a required
posttranslational modification for catalytic
activity. Biochemistry 33:9311-9320.
Gokarn, R. R., M. A. Eiteman, y E. Altman.
2000. Metabolic analysis of Escherichia
coli in the presence and absence of the
carboxylating
enzymes
phosphoenolpyruvate carboxylase and pyruvate
carboxylase. Appl. Environ. Microbiol.
66:1844-1850.
Gong, W., B. Hao, S. S. Mansy, G.
González, M. A. Gilles-González, y M. K.
Chan. 1998. Structure of a biological
oxygen sensor: a new mechanism for
heme-driven signal transduction. Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 95:15177-15182.
González-Flecha, B., y B. Demple. 1995.
Metabolic sources of hydrogen peroxide in
aerobically growing Escherichia coli. J.
Biol. Chem. 270:13681-13687.
Homeostatic regulation of intracellular
hydrogen peroxide concentration in
aerobically growing Escherichia coli. J.
Bacteriol. 179:382-388.
Genetic responses to free radicals.
Homeostasis and gene control. Ann. N. Y.
Acad. Sci. 899:69-87.
Gottschalk, G. 1986. Bacterial metabolism.
Springer Verlag, New York.
Green, J., y J. R. Guest. 1994. Regulation of
transcription at the ndh promoter of
Escherichia coli by FNR and novel factors.
Green, J., B. Bennett, P. Jordan, E. T.
Ralph, A. J. Thomson, y J. R. Guest.
1996. Reconstitution of the [4Fe-4S]
cluster in FNR and demonstration of the
aerobic-anaerobic transcription switch in
vitro. Biochem. J. 316:887-892.
Green, J., y M. L. Baldwin. 1997. HlyX, the
FNR
homologue
of Actinobacillus
pleuropneumoniae,
is
a
[4Fe-4S]containing oxygen-responsive transcription
regulator that anaerobically activates FNRdependent class I promoters via an
enhanced AR1 contact. Mol. Microbiol.
24:593-605.
41
Green, J., y F. A. Marshall. 1999.
Identification of a surface of FNR
overlapping activating region 1 that is
required for repression of gene expression.
J. Biol. Chem. 274:10244-10248.
Green, J., y M. S. Paget. 2004. Bacterial
redox sensors. Nat. Rev. Microbiol. 2:954966.
Greenberg, J. T., y B. Demple. 1989. A
global response induced in Escherichia coli
by redox-cycling agents overlaps with that
induced by peroxide stress. J. Bacteriol.
171:3933-3939.
Greenberg, J. T., P. Monach, J. H. Chou, P.
D. Josephy, y B. Demple. 1990. Positive
control of a global antioxidant defense
regulon activated by superoxide-generating
agents in Escherichia coli. Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 87:6181-6185.
Guest, J. R., S. J. Angier, y G. C. Russell.
1989. Structure, expression, and protein
engineering of the pyruvate dehydrogenase
complex of Escherichia coli. Ann. N. Y.
Acad. Sci. 573:76-99.
Guest, J. R., J. Green, A. S. Irvine, y S.
Spiro. 1996. The FNR modulon and FNRregulated gene expression, p. 317-342. En
E. C. C. Lin y A. S. Lynch (ed.),
Regulation of gene expression in
Escherichia coli. R. G. Landes Company,
Austin, TX.
Gunsalus, R. P., y S. J. Park. 1994. Aerobicanaerobic gene regulation in Escherichia
coli: control by the ArcAB and Fnr
regulons. Res. Microbiol. 145:437-450.
Hänggi, U. J. 1995. Requirements on bacterial
polyesters as future substitute for
conventional plastics for consumer goods.
FEMS Microbiol. Rev. 16:213-220.
Hayashi, M., T. Miyoshi, S. Takashina, y T.
Unemoto. 1989. Purification of NADHferricyanide dehydrogenase and NADHquinone reductase from Escherichia coli
membranes and their roles in the
respiratory chain. Biochim. Biophys. Acta
977:62-69.
Haywood, G. W., A. J. Anderson, y E. A.
Dawes. 1989. The importance of PHB
synthase
substrate
specificity
in
polyhydroxyalkanoate
synthesis
by
Alcaligenes eutrophus. FEMS Microbiol.
Lett. 57:1-6.
Hazer, B. 2002. Chemical modification of
bacterial polyester. Curr. Trends Polym.
Sci. 7:131-138.
Hazer, B., y A. Steinbüchel. 2007. Increased
diversification of polyhydroxyalkanoates
by modification reactions for industrial and
medical applications. Appl. Microbiol.
Hein, S., H. Iran, y A. Steinbüchel. 1998.
Synechocystis sp. PCC6803 possesses a
two-component polyhydroxyalkanoic acid
synthase similar to that of anoxygenic
purple sulfur bacteria. Arch. Microbiol.
170:162-170.
Hill, S., S. Austin, T. Eydmann, T. Jones, y
R. Dixon. 1996. Azotobacter vinelandii
NifL is a flavoprotein that modulates
transcriptional activation of nitrogenfixation genes via a redox-sensitive switch.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:2143-2148.
Hockel, M., K. Schlenger, B. Aral, M.
Mitze, U. Schaffer, y P. Vaupel. 1996.
Association between tumor hypoxia and
malignant progression in advanced cancer
of the uterine cervix. Cancer Res. 56:45094515.
Hochachka, P. W., T. G. Owen, J. F. Allen,
y G. C. Whittow. 1975. Multiple end
products of anaerobiosis in diving
vertebrates. Comp. Biochem. Physiol. B
50:17-22.
Hochachka, P. W., L. T. Buck, C. J. Doll, y
S. C. Land. 1996. Unifying theory of
hypoxia tolerance: molecular/metabolic
defense and rescue mechanisms for
surviving oxygen lack. Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 93:9493-9498.
Hochachka, P. W., S. C. Land, y L. T. Buck.
1997. Oxygen sensing and signal
transduction in metabolic defense against
hypoxia: lessons from vertebrate facultative
anaerobes. Comp. Biochem. Physiol. A
118:23-29.
42
Holms, H. 1996. Flux analysis and control of
the central metabolic pathways in
19:85-116.
Iuchi, S., y E. C. C. Lin. 1992b. Purification
and phosphorylation of the Arc regulatory
components of Escherichia coli. J.
Bacteriol. 174:5617-5623.
Householder, T. C., W. A. Belli, S.
Lissenden, J. A. Cole, y V. L. Clark.
1999. Cis- and trans-acting elements
involved in regulation of aniA, the gene
encoding the major anaerobically induced
outer membrane protein in Neisseria
gonorrhoeae. J. Bacteriol. 181:541-551.
Iuchi, S. 1993. Phosphorylation/dephosphorylation of the receiver module at the
conserved aspartate residue controls
transphosphorylation activity of histidine
kinase in sensor protein ArcB of
Escherichia coli. J. Biol. Chem.
268:23972-23980.
Imlay, J. A., y I. Fridovich. 1991. Assay of
metabolic superoxide production in
Escherichia coli. J. Biol. Chem. 266:69576965.
Iuchi, S., y L. Weiner. 1996. Cellular and
molecular physiology of Escherichia coli in
the adaptation to aerobic environments. J.
Biochem. 120:1055-1063.
Ishige, K., S. Nagasawa, S. Tokishita, y T.
Mizuno. 1994. A novel device of bacterial
signal transducers. EMBO J. 13:5195-5202.
Jendrossek, D. 2001. Microbial degradation
of biopolyesters. Adv. Biochem. Eng.
Ishizaki, A., K. Tanaka, y N. Taga. 2001.
Microbial
production of poly-D-3Appl.
hydroxybutyrate
from
CO2.
Microbiol. Biotechnol. 57:6-12.
Jordan, P. A., A. J. Thomson, E. T. Ralph,
J. R. Guest, y J. Green. 1997. FNR is a
direct oxygen sensor having a biphasic
response curve. FEBS Lett. 416:349-352.
Iuchi, S., y E. C. C. Lin. 1988. arcA (dye), a
global regulatory gene in Escherichia coli
mediating repression of enzymes in aerobic
pathways. Proc. Natl. Acad. Sci. USA
85:1888-1892.
Kadouri, D., E. Jurkevitch, Y. Okon, y S.
Castro-Sowinski. 2005. Ecological and
agricultural significance of bacterial polyhydroxyalkanoates. Crit. Rev. Microbiol.
31:55-67.
Iuchi, S., V. Chepuri, H. A. Fu, R. B.
Gennis, y E. C. C. Lin. 1990a.
Requirement for terminal cytochromes in
generation of the aerobic signal for the arc
regulatory system in Escherichia coli:
study utilizing deletions and lac fusions of
cyo and cyd. J. Bacteriol. 172:6020-6025.
Kaiser, M.,
repression
operon is
NarQ and
NarL and
3655.
Iuchi, S., Z. Matsuda, T. Fujiwara, y E. C.
C. Lin. 1990b. The arcB gene of
Escherichia coli encodes a sensor-regulator
protein for anaerobic repression of the arc
modulon. Mol. Microbiol. 4:715-727.
Iuchi, S., y E. C. C. Lin. 1991. Adaptation of
Escherichia coli to respiratory conditions:
regulation of gene expression. Cell 66:5-7.
Iuchi, S., y E. C. C. Lin. 1992a. Mutational
analysis of signal transduction by ArcB, a
membrane sensor protein responsible for
anaerobic repression of operons involved in
the central aerobic pathways in Escherichia
y G. Sawers. 1995. Nitrate
of the Escherichia coli pfl
mediated by the dual sensors
NarX and the dual regulators
NarP. J. Bacteriol. 177:3647-
Kato, M., T. Mizuno, T. Shimizu, y T.
Hakoshima. 1997. Insights into multistep
phosphorelay from the crystal structure of
the C-terminal HPt domain of ArcB. Cell
88:717-723.
Keenan, T. M., J. M. Nakas, y S. W.
Tanenbaum. 2006. Polyhydroxyalkanoate
copolymers from forest biomass. J. Ind.
Kessler, B., y B. Witholt. 1999. Poly(3hydroxyalkanoates), p. 2024-2040. En M.
C. Flickinger y S. W. Drew (ed.),
Encyclopedia of bioprocess technology,
vol. 4. John Wiley & Sons, New York.
43
Kessler, B., y B. Witholt. 2001. Factors
involved in the regulatory network of
metabolism.
J.
Kessler, D., I. Leibrecht, y J. Knappe. 1991.
Pyruvate-formate-lyase-deactivase
and
acetyl-CoA
reductase
activities
of
Escherichia coli reside on a polymeric
protein particle encoded by adhE. FEBS
Lett. 281:59-63.
Khanna, S., y A. K. Srivastava. 2005. Recent
advances in microbial polyhydroxyalkanoates. Process Biochem. 40:607-619.
Khoroshilova, N., C. Popescu, E. Münck, H.
Beinert, y P. J. Kiley. 1997. Iron-sulfur
cluster disassembly in the FNR protein of
Escherichia coli by O2: [4Fe-4S] to [2Fe2S] conversion with loss of biological
activity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA
94:6087-6092.
Kiley, P. J., y W. S. Reznikoff. 1991. Fnr
mutants that activate gene expression in the
presence of oxygen. J. Bacteriol. 173:1622.
Kiley, P. J., y H. Beinert. 1998. Oxygen
sensing by the global regulator, FNR: the
role of the iron-sulfur cluster. FEMS
Microbiol. Rev. 22:341-352.
Kim, S. J., Y. H. Han, I. H. Kim, y H. K.
Kim. 1999. Involvement of ArcA and Fnr
in expression of Escherichia coli thiol
peroxidase gene. IUBMB Life 48:215-218.
Kita, K., K. Konishi, y Y. Anraku. 1984.
Terminal oxidases of Escherichia coli
aerobic respiratory chain. II. Purification
and properties of cytochrome b558-d
complex from cells grown with limited
oxygen and evidence of branched electroncarrying systems. J. Biol. Chem. 259:33753381.
Kita, K., H. Hirawake, y S. Takamiya. 1997.
Cytochromes in the respiratory chain of
helminth mitochondria. Int. J. Parasitol.
27:617-630.
Knappe, J., J. Schacht, W. Mockel, T.
Hopner, H. Vetter, Jr., y R. Edenharder.
1969. Pyruvate formate-lyase reaction in
Escherichia coli. The enzymatic system
converting an inactive form of the lyase
into the catalytically active enzyme. Eur. J.
Biochem. 11:316-327.
Knappe, J., F. A. Neugebauer, H. P.
Blaschkowski, y M. Ganzler. 1984. Posttranslational activation introduces a free
radical into pyruvate formate-lyase. Proc.
Knappe, J., y G. Sawers. 1990. A radicalchemical route to acetyl-CoA: the
anaerobically induced pyruvate formatelyase system of Escherichia coli. FEMS
Koller, M., R. Bona, G. Braunegg, C.
Hermann, P. Horvat, M. Kroutil, J.
Martinz, J. Neto, L. Pereira, y P. Varila.
2005. Production of polyhydroxyalkanoates
from agricultural waste and surplus
materials. Biomacromolecules 6:561-565.
Kuchta, K., L. F. Chi, H. Fuchs, M. Pötter,
y A. Steinbüchel. 2007. Studies on the
influence of phasins on accumulation and
mobilization of PHB and nanostructure of
PHB granules in Ralstonia eutropha H16.
Biomacromolecules 8:657-662.
Kwon, O., D. Georgellis, y E. C. C. Lin.
2000a. Phosphorelay as the sole
physiological route of signal transmission
by the arc two-component system of
Kwon, O., D. Georgellis, A. S. Lynch, D.
Boyd, y E. C. C. Lin. 2000b. The ArcB
sensor kinase of Escherichia coli: genetic
exploration of the transmembrane region. J.
Bacteriol. 182:2960-2966.
Lamark, T., T. P. Røkenes, J. McDougall, y
A. R. Strøm. 1996. The complex bet
promoters of Escherichia coli: regulation
by oxygen (ArcA), choline (BetI), and
osmotic stress. J. Bacteriol. 178:16551662.
44
Lambden, P. R., y J. R. Guest. 1976.
Mutants of Escherichia coli K12 unable to
use fumarate as an anaerobic electron
acceptor. J. Gen. Microbiol. 97:145-160.
Lazazzera, B. A., H. Beinert, N.
Khoroshilova, M. C. Kennedy, y P. J.
Kiley.
1996.
DNA
binding
and
dimerization of the Fe-S-containing FNR
protein from Escherichia coli are regulated
by oxygen. J. Biol. Chem. 271:2762-2768.
Lee, S. Y. 1996. Bacterial polyhydroxyalkanoates. Biotechnol. Bioeng. 49:1-14.
Lemoigne, M. 1926. Dehydration and
polymerization products of β-oxobutyric
acid. Bull. Soc. Chem. Biol. (París) 8:770782.
Lemoigne, M., N. Grelet, y M. Croson.
1950a. Origin of β-hydroxybutyric lipids
formed by bacterial process. Bull. Soc.
Chem. Biol. (París) 32:719-721.
Lemoigne, M., C. Peaud Lenoel, y M.
Croson.
1950b.
Assimilation
of
acetylacetic acid and β-hydroxybutyric acid
by B. megaterium. Ann. Inst. Pasteur
(París) 78:705-710.
Lenz, R. W., y R. H. Marchessault. 2005.
Bacterial
polyesters:
biosynthesis,
biodegradable plastics and biotechnology
Leonardo, M. R., Y. Dailly, y D. P. Clark.
1996. Role of NAD in regulating the adhE
gene of Escherichia coli. J. Bacteriol.
178:6013-6018.
Li, E., H. Wing, D. Lee, H. Wu, y S. Busby.
1998.
Transcription
activation
by
Escherichia coli FNR protein: similarities
to, and differences from, the CRP
paradigm. Nucleic Acids Res. 26:20752081.
Li, R., H. Zhang, y Q. Qi. 2007. The
production of polyhydroxyalkanoates in
recombinant Escherichia coli. Biores.
Technol. 98:2313-2320.
Lin, E. C. C., y S. Iuchi. 1991. Regulation of
gene expression in fermentative and
respiratory systems in Escherichia coli and
related bacteria. Annu. Rev. Genet. 25:361387.
Liu, X., y P. De Wulf. 2004. Probing the
ArcA-P modulon of Escherichia coli by
whole genome transcriptional analysis and
sequence recognition profiling. J. Biol.
Chem. 279:12588-12597.
López, N. I., M. E. Floccari, A. Steinbüchel,
A. F. García, y B. S. Méndez. 1995. Effect
of poly(3-hydroxybutyrate) (PHB) content
on the starvation-survival of bacteria in
natural waters. FEMS. Microbiol. Ecol.
16:95-112.
Loprasert, S., S. Atichartpongkun, W.
Whangsuk, y S. Mongkolsuk. 1997.
Isolation and analysis of the Xanthomonas
alkyl hydroperoxide reductase gene and the
peroxide sensor regulator genes ahpC and
ahpF-oxyR-orfX. J. Bacteriol. 179:39443949.
Lynch, A. S., y E. C. C. Lin. 1996a.
Responses to molecular oxygen, p. 15261538. En F. C. Neidhardt, R. Curtiss III, J.
L. Ingraham, E. C. C. Lin, K. B. Low, B.
Lynch, A. S., y E. C. C. Lin. 1996b.
Transcriptional control mediated by the
ArcA two-component response regulator
protein of Escherichia coli: characterrization of DNA binding at target
promoters. J. Bacteriol. 178:6238-6249.
Maciver, I., y E. J. Hansen. 1996. Lack of
expression of the global regulator OxyR in
Haemophilus influenzae has a profound
effect on growth phenotype. Infect. Immun.
64:4618-4629.
Madison, L. L., y G. W. Huisman. 1999.
Metabolic
engineering
of
poly(3hydroxyalkanoates): from DNA to plastic.
Microbiol. Mol. Biol. Rev. 63:21-53.
45
Mahan, M. J., J. M. Slauch, y J. J.
Mekalanos.
1996.
Environmental
regulation of virulence gene expression in
Escherichia, Salmonella, and Shigella spp.,
p. 2803-2815. En F. C. Neidhardt, R.
Matsushita, K., T. Ohnishi, y H. R. Kaback.
1987. NADH-ubiquinone oxidoreductases
of the Escherichia coli aerobic respiratory
chain. Biochemistry 26:7732-7737.
Malpica, R., B. Franco, C. Rodríguez, y D.
Georgellis. 2004. Identification of a
quinone-sensitive redox switch in the ArcB
sensor kinase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA
101:13318-13323.
McGuire, A. M., P. De Wulf, G. M. Church,
y E. C. C. Lin. 1999. A weight matrix for
binding recognition by the redox-response
regulator ArcA-P of Escherichia coli. Mol.
Malpica, R., G. R. Sandoval, C. Rodríguez,
B. Franco, y D. Georgellis. 2006.
Signaling by the arc two-component
system provides a link between the redox
state of the quinone pool and gene
expression. Antioxid. Redox Signal. 8:781795.
Melville, S. B., y R. P. Gunsalus. 1990.
Mutations in fnr that alter anaerobic
regulation of electron transport-associated
genes in Escherichia coli. J. Biol. Chem.
265:18733-18736.
Martínez-Antonio, A., y J. Collado-Vives.
2003. Identifying global regulators in
transcriptional regulatory networks in
bacteria. Curr. Opin. Microbiol. 6:482-489.
Matsushika, A., y T. Mizuno. 1998a. A dualsignaling mechanism mediated by the ArcB
hybrid sensor kinase containing the
histidine-containing
phosphotransfer
domain in Escherichia coli. J. Bacteriol.
180:3973-3977.
Matsushika, A., y T. Mizuno. 1998b.
Mutational analysis of the histidinecontaining phosphotransfer (HPt) signaling
domain of the ArcB sensor in Escherichia
coli. Biosci. Biotechnol. Biochem. 62:22362238.
Matsushika, A., y T. Mizuno. 1998c. The
structure and function of the histidinecontaining phosphotransfer (HPt) signaling
domain of the Escherichia coli ArcB
sensor. J. Biochem. 124:440-445.
Matsushika, A., y T. Mizuno. 2000.
Characterization of three putative subdomains in the signal-input domain of the
ArcB hybrid sensor in Escherichia coli. J.
Biochem. 127:855-860.
Mattevi, A., G. Obmolova, E. Schulze, K. H.
Kalk, A. H. Westphal, A. de Kok, y W.
G. Hol. 1992. Atomic structure of the cubic
core of the pyruvate dehydrogenase
multienzyme complex. Science 255:15441550.
Membrillo-Hernández,
J.,
M.
D.
Coopamah, M. F. Anjum, T. M.
Stevanin, A. Kelly, M. N. Hughes, y R.
K. Poole. 1999. The flavohemoglobin of
Escherichia coli confers resistance to a
nitrosating agent, a "nitric oxide releaser,"
and paraquat and is essential for
transcriptional responses to oxidative
stress. J. Biol. Chem. 274:748-754.
Mergaert, J., C. Anderson, A. Wouters, y J.
Swings. 1994. Microbial degradation of
poly(3-hydroxybutyrate)
and
poly(3hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) in
compost. J. Environ. Polym. Degrad.
2:177-183.
Mergaert, J., A. Wouters, C. Anderson, y J.
Swings. 1995. In situ biodegradation of
and
poly(3hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) in
natural waters. Can. J. Microbiol. 41:154159.
Miguel, E., C. Poza-Carrión, E. LópezSolanilla, I. Aguilar, A. Llama-Palacios,
F. García-Olmedo, y P. RodríguezPalenzuela. 2000. Evidence against a
direct antimicrobial role of H2O2 in the
infection
of
plants
by
Erwinia
chrysanthemi. Mol. Plant Microbe Interact.
13:421-429.
46
Miller, M. J., y R. B. Gennis. 1985. The
cytochrome d complex is a coupling site in
the aerobic respiratory chain of Escherichia
coli. J. Biol. Chem. 260:14003-14008.
Mizuno, T. 1997. Compilation of all genes
encoding two-component phosphotransfer
signal transducers in the genome of
Escherichia coli. DNA Res. 4:161-168.
Nathan, A. T., y M. Singer. 1999. The
oxygen trail: tissue oxygenation. British
Med. Bull. 55:96-108.
Neidhardt, F. C., J. L. Ingraham, y M.
Schaechter. 1990. Physiology of the
bacterial cell: a molecular approach.
Sinauer Associates, Sunderland, MA.
Nikel, P. I., A. de Almeida, E. C. Melillo, M.
A. Galvagno, y M. J. Pettinari. 2006.
New recombinant Escherichia coli strain
tailored for the production of poly(3hydroxybutyrate) from agroindustrial byproducts. Appl. Environ. Microbiol.
72:3949-3954.
Nomura, C. T., y S. Taguchi. 2007. PHA
synthase engineering toward superbiocatalysts for custom-made biopolymers.
Appl. Microbiol. Biotechnol. 73:969-979.
Oeding, V., y H. G. Schlegel. 1973. βKetothiolase
from
Hydrogenomonas
eutropha H16 and its significance in the
regulation
of
poly-β-hydroxybutyrate
metabolism. Biochem. J. 134:239-248.
Park, S. J., y R. P. Gunsalus. 1995. Oxygen,
iron, carbon, and superoxide control of the
fumarase fumA and fumC genes of
Escherichia coli: role of the arcA, fnr, and
soxR gene products. J. Bacteriol. 177:
6255-6262.
Park, S. J., C. P. Tseng, y R. P. Gunsalus.
1995. Regulation of succinate dehydrogenase (sdhCDAB) operon expression in
Escherichia coli in response to carbon
supply and anaerobiosis: role of ArcA and
Fnr. Mol. Microbiol. 15:473-482.
Park, S. J., G. Chao, y R. P. Gunsalus. 1997.
Aerobic regulation of the sucABCD genes
of Escherichia coli, which encode αketoglutarate dehydrogenase and succinyl
coenzyme A synthetase: roles of ArcA,
Fnr, and the upstream sdhCDAB promoter.
J. Bacteriol. 179:4138-4142.
Parkinson, J. S., y E. C. Kofoid. 1992.
Communication modules in bacterial
signaling proteins. Annu. Rev. Genet.
26:71-112.
Parkinson, J. S. 1993. Signal transduction
schemes of bacteria. Cell 73:857-871.
Patschkowski, T., D. N. Bates, y P. J. Kiley.
2000. Mechanisms for sensing and
responding to oxygen deprivation, p. 61-78.
En G. Storz y R. Hengge-Aronis (ed.),
Bacterial stress responses. ASM Press,
Washington, D.C.
Paytan, A. 2000. Sulfate clues for the early
history of atmospheric oxygen. Science
288:626-627.
Pellicer, M. T., C. Fernández, J. Badia, J.
Aguilar, E. C. C. Lin, y L. Baldom.
1999a. Cross-induction of glc and ace
operons of Escherichia coli attributable to
pathway intersection. Characterization of
the glc promoter. J. Biol. Chem. 274:17451752.
Pellicer, M. T., A. S. Lynch, P. De Wulf, D.
Boyd, J. Aguilar, y E. C. C. Lin. 1999b. A
mutational study of the ArcA-P binding
sequences in the aldA promoter of
Escherichia coli. Mol. Gen. Genet.
261:170-176.
Penney, D. G., y J. Cascarano. 1970.
Anaerobic rat heart. Effects of glucose and
tricarboxylic acid-cycle metabolites on
metabolism and physiological performance.
Biochem. J. 118:221-227.
Peoples, O., y A. J. Sinskey. 1989a. Poly-βhydroxybutyrate (PHB) biosynthesis in
Alcaligenes eutrophus H16. Identification
and characterization of the PHB
polymerase gene (phbC). J. Biol. Chem.
264:15298-15303.
47
Peoples, O., y A. J. Sinskey. 1989b. Poly-βhydroxybutyrate
biosynthesis
in
Alcaligenes eutrophus H16. Characterization of the genes encoding β-ketothiolase
and acetoacetyl-CoA reductase. J. Biol.
Chem. 264:15293-15297.
Pettinari, M. J., G. J. Vázquez, D.
Silberschmidt, B. H. A. Rehm, A.
Steinbüchel, y B. S. Méndez. 2001.
Poly(3-hydroxybutyrate) synthesis genes in
Azotobacter sp. strain FA8. Appl. Environ.
Microbiol. 67:5331-5334.
Pinsent, J. 1954. The need for selenite and
molybdate in the formation of formic
dehydrogenase by members of the coliaerogenes group of bacteria. Biochem. J.
57:10-16.
Pisarenko, O. I. 1996. Mechanisms of
myocardial protection by amino acids: facts
and hypotheses. Clin. Exp. Pharmacol.
Physiol. 23:627-633.
Poole, R. K., y S. Hill. 1997. Respiratory
protection of nitrogenase activity in
Azotobacter vinelandii - roles of the
terminal oxidases. Biosci. Rep. 17:303-317.
Popescu, C. V., D. M. Bates, H. Beinert, E.
Münck, y P. J. Kiley. 1998. Mössbauer
spectroscopy as a tool for the study of
activation/inactivation of the transcription
regulator FNR in whole cells of
Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 95:13431-13435.
Pötter, M., y A. Steinbüchel. 2005. Poly(3hydroxybutyrate)
granule-associated
proteins: impacts on poly(3-hydroxybutyrate) synthesis and degradation.
Puustinen, A., M. Finel, T. Haltia, R. B.
Gennis, y M. Wikstrom. 1991. Properties
of the two terminal oxidases of Escherichia
coli. Biochemistry 30:3936-3942.
Raiger-Iustman, L. J., y
The alternative sigma
Pseudomonas putida.
Lett. 284:218-224.
J. A. Ruiz. 2008.
factor, σS, affects
metabolism
in
FEMS Microbiol.
Reams, S. G., N. Lee, F. Mat-Jan, y D. P.
Clark. 1997. Effect of chelating agents and
respiratory inhibitors on regulation of the
cadA gene in Escherichia coli. Arch.
Microbiol. 167:209-216.
Rebbapragada, A., M. S. Johnson, G. P.
Harding, A. J. Zuccarelli, H. M.
Fletcher, I. B. Zhulin, y B. L. Taylor.
1997. The Aer protein and the serine
chemoreceptor Tsr independently sense
intracellular energy levels and transduce
oxygen, redox, and energy signals for
Escherichia coli behavior. Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 94:10541-10546.
Reddy, C. S. K., R. Ghai, A. Rashmi, y V. C.
Kalia. 2003. Polyhydroxyalkanoates: an
overview. Biores. Technol. 87:137-146.
Rehm, B. H. A., y A. Steinbüchel. 2001.
PHA synthases - the key enzymes of PHA
synthesis, p. 173-215. En Y. Doi y A.
Steinbüchel (ed.), Biopolymers, 1era ed.
Wiley-VCH, Weinheim, Alemania.
Reinecke, F., y A. Steinbüchel. 2009.
Ralstonia eutropha strain H16 as model
organism for PHA metabolism and for
biotechnological production of technically
interesting biopolymers. J. Mol. Microbiol.
Repik, A., A. Rebbapragada, M. S.
Johnson, J. O. Haznedar, I. B. Zhulin, y
B. L. Taylor. 2000. PAS domain residues
involved in signal transduction by the Aer
redox sensor of Escherichia coli. Mol.
Rice, C. W., y W. P. Hempfling. 1978.
Oxygen-limited continuous culture and
respiratory
energy
conservation
in
Richard, D. E., E. Berra, y J. Pouyssegur.
1999a. Angiogenesis: how a tumor adapts
to hypoxia. Biochem. Biophys. Res.
Commun. 266:718-722.
48
Richard, D. J., G. Sawers, F. Sargent, L.
McWalter, y D. H. Boxer. 1999b.
Transcriptional regulation in response to
oxygen and nitrate of the operons encoding
the [Ni-Fe] hydrogenases 1 and 2 of
Rocha, E. R., G. Owens, Jr., y C. J. Smith.
2000. The redox-sensitive transcriptional
activator OxyR regulates the peroxide
response regulon in the obligate anaerobe
Bacteroides
fragilis.
J.
Bacteriol.
182:5059-5069.
Rodgers, K. R. 1999. Heme-based sensors in
biological systems. Curr. Opin. Chem.
Biol. 3:158-167.
Roeder, W., y R. Somerville. 1979. Cloning
the trpR gene. Mol. Gen. Genet. 176:361368.
Rossmann, R., G. Sawers, y A. Böck. 1991.
Mechanism of regulation of the formatehydrogen lyase pathway by oxygen, nitrate,
and pH: definition of the formate regulon.
Ruiz, J. A., N. I. López, y B. S. Méndez.
1999. Polyhydroxyalkanoates degradation
affects
survival
of
Pseudomonas
oleovorans in river water microcosms. Rev.
Argent. Microbiol. 31:201-204.
Ruiz, J. A., N. I. López, R. O. Fernández, y
B. S. Méndez. 2001. Polyhydroxyalkanoate degradation is associated with
nucleotide accumulation and enhances
stress resistance and survival
of
Pseudomonas oleovorans in natural water
microcosms. Appl. Environ. Microbiol.
67:225-230.
Salmon, K. A., S. P. Hung, N. R. Steffen, R.
Krupp, P. Baldi, G. W. Hatfield, y R. P.
Gunsalus. 2005. Global gene expression
profiling in Escherichia coli K-12: effects
of oxygen availability and ArcA. J. Biol.
Chem. 280:15084-15096.
Sawers, G., y A. Böck. 1988. Anaerobic
regulation of pyruvate formate-lyase from
170:5330-5336.
Sawers, G., y A. Böck. 1989. Novel
transcriptional control of the pyruvate
formate-lyase gene: upstream regulatory
sequences and multiple promoters regulate
anaerobic
expression.
J.
Bacteriol.
171:2485-2498.
Sawers, G., A. F. Wagner, y A. Böck. 1989.
Transcription initiation at
multiple
promoters of the pfl gene by σ70-dependent
transcription in vitro and heterologous
expression in Pseudomonas putida in vivo.
J. Bacteriol. 171:4930-4937.
Sawers, G., y B. Suppmann. 1992. Anaerobic
induction of pyruvate formate-lyase gene
expression is mediated by the ArcA and
FNR proteins. J. Bacteriol. 174:3474-3478.
Sawers, G. 1993. Specific transcriptional
requirements for positive regulation of the
anaerobically inducible pfl operon by ArcA
and FNR. Mol. Microbiol. 10:737-747.
Sawers, R. G., E. Zehelein, y A. Böck. 1988.
Two-dimensional
gel
electrophoretic
analysis of Escherichia coli proteins:
influence of various anaerobic growth
conditions and the fnr gene product on
cellular protein composition. Arch.
Microbiol. 149:240-244.
Schlegel, H. G., G. Gottschalk, y R. von
Bartha. 1961. Formation and utilization of
poly-β-hydroxybutyric acid by Knallgas
bacteria
(Hydrogenomonas).
Nature
191:463-465.
Schlegel, H. G. 1965. Growth of 'Knallgas'
bacteria (Hydrogenomonas) using direct
electrolysis of the culture medium. Nature
205:308-309.
Schlensog, V., y A. Böck. 1990. Identification
and sequence analysis of the gene encoding
the transcriptional activator of the formate
hydrogen lyase system of Escherichia coli.
Senior, P. J., y E. A. Dawes. 1973. The
regulation
of
metabolism in Azotobacter beijerinckii.
Biochem. J. 134:225-238.
49
Serafim, L. S., P. C. Lemos, M. G. E.
Albuquerque, y M. A. M. Reis. 2008.
Strategies for PHA production by mixed
cultures and renewable waste materials.
Sharma, L., y N. Mallick. 2005.
Accumulation of poly-β-hydroxybutyrate
in Nostoc muscorum: regulation by pH,
light-dark cycles, N and P status and
carbon sources. Biores. Technol. 96:13041310.
Sharrocks, A. D., J. Green, y J. R. Guest.
1990. In vivo and in vitro mutants of FNR,
the anaerobic transcriptional regulator of E.
coli. FEBS Lett. 270:119-122.
Shen, J., y R. P. Gunsalus. 1997. Role of
multiple ArcA recognition sites in
anaerobic
regulation
of
succinate
dehydrogenase (sdhCDAB) gene expression
in Escherichia coli. Mol. Microbiol.
26:223-236.
Siesjo, B. K. 1992. Pathophysiology and
treatment of focal cerebral ischemia. Part
II: Mechanisms of damage and treatment.
J. Neurosurg. 77:337-354.
Sirko, A., E. Zehelein, M. Freundlich, y G.
Sawers. 1993. Integration host factor is
required for anaerobic pyruvate induction
of pfl operon expression in Escherichia
Smith, M. W., y F. C. Neidhardt. 1983a. 2Oxoacid dehydrogenase complexes of
Escherichia coli: cellular amounts and
patterns of synthesis. J. Bacteriol. 156:8188.
Smith, M. W., y F. C. Neidhardt. 1983b.
Proteins induced by anaerobiosis in
Smith, M. W., y F. C. Neidhardt. 1983c.
Proteins induced by aerobiosis in
Snoep, J. L., M. R. de Graef, A. H.
Westphal, A. de Kok, M. J. Teixeira de
Mattos, y O. M. Neijssel. 1993.
Differences in sensitivity to NADH of
purified
pyruvate
dehydrogenase
complexes of Enterococcus faecalis,
Lactococcus lactis, Azotobacter vinelandii
and Escherichia coli: implications for their
activity in vivo. FEMS Microbiol. Lett.
114:279-283.
Sokatch, J. R. 1969. Bacterial physiology and
metabolism. Academic Press Ltd., London,
UK.
Solaiman, D. K. Y., R. D. Ashby, T. Foglia,
y W. N. Marmer. 2006. Conversion of
agricultural feedstock and coproducts into
poly(hydroxyalkanoates). Appl. Microbiol.
Spiro, S., R. E. Roberts, y J. R. Guest. 1989.
FNR-dependent repression of the ndh gene
of Escherichia coli and metal ion
requirement for FNR-regulated gene
expression. Mol. Microbiol. 3:601-608.
Spiro, S. 1994. The FNR family of
transcriptional regulators. Antonie van
Leeuwenhoek 66:23-36.
Steinbüchel, A., y H. G. Schlegel. 1991.
Physiology and molecular genetics of
poly(β-hydroxyalkanoic acid) synthesis in
Alcaligenes eutrophus. Mol. Microbiol.
5:523-542.
Steinbüchel, A., y H. E. Valentin. 1995.
Diversity of bacterial polyhydroxyalkanoic
acids. FEMS Microbiol. Lett. 128:219-228.
Steinbüchel, A., y B. Füchtenbusch. 1998.
Bacterial and other biological systems for
polyester production. Trends Biotechnol.
16:419-427.
Steinbüchel,
A.,
C.
Brämer,
B.
Füchtenbusch, V. Gorenflo, S. Hein, R.
Jossek, R. Kalscheuer, S. Langenbach,
Q. Qi, B. H. A. Rehm, S. Song, y H.
Tran. 1999. Poly(hydroxyalkanoic acid)
biosynthesis pathways, p. 35-47. En A.
Steinbüchel (ed.), Biochemical principles
and mechanisms of biosynthesis and
biodegradation of polymers. Wiley-VCH,
Weinheim, Alemania.
50
Steinbüchel, A. 2001. Perspectives for
biotechnological production and utilization
of biopolymers: metabolic engineering of
polyhydroxyalkanoate biosynthesis as a
successful example. Macromol. Biosci. 1:124.
Suppmann, B., y G. Sawers. 1994. Isolation
and characterization of hypophosphiteresistant mutants of Escherichia coli:
identification of the FocA protein, encoded
by the pfl operon, as a putative formate
transporter. Mol. Microbiol. 11:965-982.
Steinbüchel, A., y S. Hein. 2001.
Biochemical and molecular basis of
microbial synthesis of polyhydroxyalkanoates in microorganisms. Adv.
Biochem. Eng. Biotechnol. 71:81-123.
Suriyamongkol, P., R. Weselake, S. Narine,
M. Moloney, y S. Shah. 2007.
Biotechnological approaches for the
microorganisms and plants - A review.
Biotechnol. Adv. 25:148-175.
Steinbüchel, A., y T. Lütke-Eversloh. 2003.
Metabolic engineering and pathway
construction
for
biotechnological
production of relevant polyhydroxyalkanoates in microorganisms. Biochem.
Eng. J. 16:81-96.
Stock, J. B., A. M. Stock, y J. M. Mottonen.
1990. Signal transduction in bacteria.
Nature 344:395-400.
Stols, L., y M. I. Donnelly. 1997. Production
of succinic acid through overexpression of
NAD+-dependent malic enzyme in an
Escherichia coli mutant. Appl. Environ.
Microbiol. 63:2695-2701.
Stols, L., G. Kulkarni, B. G. Harris, y M. I.
Donnelly. 1997. Expression of Ascaris
suum malic enzyme in a mutant
Escherichia coli allows production of
succinic acid from glucose. Appl. Biochem.
Biotechnol. 63-65:153-158.
Storz, G., y M. Zheng. 2000. Oxidative
stress, p. 47-59. En G. Storz y R. HenggeAronis (ed.), Bacterial stress responses.
Strohmaier, H., R. Noiges, S. Kotschan, G.
Sawers, G. Hogenauer, E. L. Zechner, y
G. Koraimann. 1998. Signal transduction
and bacterial conjugation: characterization
of the role of ArcA in regulating
conjugative transfer of the resistance
plasmid R1. J. Mol. Biol. 277:309-316.
Sudesh, K., H. Abe, y Y. Doi. 2000.
Synthesis, structure and properties of
polyhydroxyalkanoates: biological polyesters. Prog. Polym. Sci. 25:1503-1555.
Taki, K., T. Abo, y E. Ohtsubo. 1998.
Regulatory mechanisms in expression of
the traY-I operon of sex factor plasmid
R100: involvement of traJ and traY gene
products. Genes Cells 3:331-345.
Tardat, B., y D. Touati. 1993. Iron and
oxygen regulation of Escherichia coli
MnSOD expression: competition between
the global regulators Fur and ArcA for
binding to DNA. Mol. Microbiol. 9:53-63.
Taylor, B. L., y I. B. Zhulin. 1998. In search
of higher energy: metabolism-dependent
behaviour in bacteria. Mol. Microbiol.
28:683-690.
Taylor, B. L., y I. B. Zhulin. 1999. PAS
domains: internal sensors of oxygen, redox
potential, and light. Microbiol. Mol. Biol.
Rev. 63:479-506.
Taylor, B. L., A. Rebbapragada, y M. S.
Johnson. 2001. The FAD-PAS domain as a
sensor for behavioral responses in
Escherichia coli. Antioxid. Redox Signal.
3:867-879.
Tran, Q. H., J. Bongaerts, D. Vlad, y G.
Unden. 1997. Requirement for the protonpumping NADH dehydrogenase I of
Escherichia coli in respiration of NADH to
fumarate and its bioenergetic implications.
Eur. J. Biochem. 244:155-160.
Tseng, C. P. 1997. Regulation of fumarase
(fumB) gene expression in Escherichia coli
in response to oxygen, iron and heme
availability: role of the arcA, fur, and hemA
gene products. FEMS Microbiol. Lett.
157:67-72.
51
Tsuge, T. 2002. Metabolic improvements and
use of inexpensive carbon sources in
microbial production of polyhydroxyalkanoates. J. Biosci. Bioeng. 94:579-584.
Tsuzuki, M., K. Ishige, y T. Mizuno. 1995.
Phosphotransfer circuitry of the putative
multi-signal
transducer,
ArcB,
of
Escherichia coli: in vitro studies with
mutants. Mol. Microbiol. 18:953-962.
Unden, G., S. Becker, J. Bongaerts, G.
Holighaus, J. Schirawski, y S. Six. 1995.
O2-sensing and O2-dependent gene
regulation in facultatively anaerobic
bacteria. Arch. Microbiol. 164:81-90.
Unden, G., y J. Bongaerts. 1997. Alternative
respiratory pathways of Escherichia coli:
energetics and transcriptional regulation in
response to electron acceptors. Biochim.
Biophys. Acta 1320:217-234.
Vandamme, P., y T. Coenye. 2004.
Taxonomy of the genus Cupriavidus: a tale
of lost and found. Int. J. Syst. Evol.
Microbiol. 54:2285-2289.
Vaneechoutte, M., P. Kampfer, T. De Baere,
E. Falsen, y G. Verschraegen. 2004.
Wautersia gen. nov., a new genus
accommodating the phylogenetic lineage
including Ralstonia eutropha and related
species, and proposal of Ralstonia
[Pseudomonas] syzygii (Roberts et al.
1990) comb. nov. Int. J. Syst. Evol.
Verlinden, R. A. J., D. J. Hill, M. A.
Kenward, C. D. Williams, y I. Radecka.
2007. Bacterial synthesis of biodegradable
polyhydroxyalkanoates. J. Appl. Microbiol.
102:1437-1449.
Wächtershäuser, G. 1999. The origin of life
as a transition from inorganic to organic
polymers, p. 1-8. En A. Steinbüchel (ed.),
Biochemical principles and mechanisms of
biosynthesis and biodegradation of
polymers.
Wiley-VCH,
Weinheim,
Alemania.
Wagner, A. F., M. Frey, F. A. Neugebauer,
W. Schafer, y J. Knappe. 1992. The free
radical in pyruvate formate-lyase is located
on glycine-734. Proc. Natl. Acad. Sci. USA
89:996-1000.
Walker, J. C. 1980. Atmospheric constraints
on the evolution of metabolism. Orig. Life
10:93-104.
Wayne, L. G., y K. Y. Lin. 1982. Glyoxylate
metabolism
and
adaptation
of
Mycobacterium tuberculosis to survival
under anaerobic conditions. Infect. Immun.
37:1042-1049.
Wendisch, V. F., M. Bott, y B. J. Eikmanns.
2006.
Metabolic
engineering
of
Escherichia coli and Corynebacterium
glutamicum
for
biotechnological
production of organic acids and amino
acids. Curr. Opin. Microbiol. 9:268-274.
Wiesner, R. J., P. Rosen, y M. K.
Grieshaber. 1988. Pathways of succinate
formation and their contribution to
improvement of cardiac function in the
hypoxic rat heart. Biochem. Med. Metab.
Biol. 40:19-34.
Williams, D. 2005. The proving of
polyhydroxybutyrate and its potential in
medical technology. Med. Device Technol.
16:9-10.
Williams, R., A. Bell, G. Sims, y S. Busby.
1991. The role of two surface exposed
loops in transcription activation by the
Escherichia coli CRP and FNR proteins.
Nucleic Acids Res. 19:6705-6712.
Williamson, D. H., y J. F. Wilkinson. 1958.
The isolation and estimation of the poly-βhydroxybutyrate inclusions of Bacillus
species. J. Gen. Microbiol. 19:198-209.
Witholt, B., y B. Kessler. 1999. Perspectives
of medium chain length poly(hydroxyalkanoates), a versatile set of bacterial
bioplastics. Curr. Opin. Biotechnol.
10:279-285.
Wu, G., H. Cruz-Ramos, S. Hill, J. Green,
G. Sawers, y R. K. Poole. 2000.
Regulation of cytochrome bd expression in
the obligate aerobe Azotobacter vinelandii
by CydR (Fnr). Sensitivity to oxygen,
reactive oxygen species, and nitric oxide. J.
Biol. Chem. 275:4679-4686.
52
Yabuuchi, E., Y. Kosako, I. Yano, H. Hotta,
y Y. Nishiuchi. 1995. Transfer of two
Burkholderia and an Alcaligenes species to
Ralstonia gen. nov.: proposal of Ralstonia
pickettii (Ralston, Palleroni and Doudoroff
1973) comb. nov., Ralstonia solanacearum
(Smith 1896) comb. nov. and Ralstonia
eutropha (Davis 1969) comb. nov.
Microbiol. Immunol. 39:897-904.
Zeilstra-Ryalls, J. H., M. Gomelsky, J. M.
Eraso, A. Yeliseev, J. O’Gara, y S.
Kaplan. 1998. Control of photosystem
formation in Rhodobacter sphaeroides. J.
Bacteriol. 180:2801-2809.
Zheng, L., V. L. Cash, D. H. Flint, y D. R.
Dean. 1998a. Assembly of iron-sulfur
clusters. Identification of an iscSUAhscBA-fdx gene cluster from Azotobacter
vinelandii. J. Biol. Chem. 273:1326413272.
Zheng, M., F. Aslund, y G. Storz. 1998b.
Activation of the OxyR transcription factor
by reversible disulfide bond formation.
Science 279:1718-1721.
Zinn, M., B. Witholt, y T. Egli. 2001.
Occurence,
synthesis
and
medical
application of bacterial polyhydroxyalkanoate. Adv. Drug Deliv. Rev. 53:5-21.
53
Capítulo II
Evaluación de
mutantes arcA para la
acumulación
heteróloga de PHB en
condiciones
microaeróbicas
Capítulo II – Caracterización de mutantes arc para la síntesis heteróloga de PHB
2.1. Prefacio
Escherichia coli, al igual que muchos otros miembros pertenecientes a la familia
Enterobacteriaceae, es capaz de adaptarse rápida y efectivamente a cambios físico-químicos
en el ambiente que la rodea. En particular, el control mediado por el sistema de dos
componentes ArcAB regula, junto a la proteína Fnr, la respuesta a la disponibilidad de
oxígeno. ArcB es un sensor con actividad de quinasa que en condiciones de crecimiento
reductoras se autofosforila y transfosforila establemente a ArcA. Ésta actúa como proteína
represora de caminos metabólicos aerobios y activadora de vías fermentativas (ver
Introducción general). La desregulación metabólica en condiciones de baja disponibilidad de
oxígeno implicaría un contexto redox intracelular particular. Por este motivo, en este capítulo
se propone analizar el efecto de la expresión de genes heterólogos en mutantes arcA de E.
coli para evaluar dicho contexto metabólico. Como modelo para este estudio se utilizaron los
genes pha de Azotobacter sp. cepa FA8, los cuales codifican las enzimas involucradas en la
síntesis de poli(3-hidroxibutirato) (PHB). La principal hipótesis planteada en este capítulo es
que la biosíntesis de un polímero altamente reducido como el PHB podría captar el exceso de
equivalentes de reducción (en la forma de NADPH, co-factor necesario para la síntesis de
PHB), modificando de esta manera las características fenotípicas de las mutantes arcA. Por
otra parte, los resultados que pudieran surgir de este estudio podrían ser aplicados a la
producción sostenible de biopolímeros en condiciones de limitación de oxígeno.
En la Introducción de este capítulo se describirán algunas estrategias para la
producción industrial de polihidroxialcanoatos (PHAs), con énfasis en la síntesis de estos
polímeros en sistemas heterólogos. Posteriormente se describirá el desarrollo de los estudios
tendientes a la utilización de dos tipos de mutantes arcA de E. coli y su evaluación para la
síntesis heteróloga de PHB en condiciones microaeróbicas; analizando, además, la
disponibilidad intracelular de poder reductor y las características fenotípicas de las cepas en
estudio en distintas condiciones de crecimiento respecto a la disponibilidad de oxígeno.
2.2. Objetivos
- Evaluar el efecto de la expresión de los genes phaBAC de Azotobacter sp. cepa FA8 en
distintas mutantes arcA de E. coli, con características fenotípicas dispares respecto a la
regulación redox del metabolismo.
- Caracterizar las cepas recombinantes respecto a parámetros fisiológicos (velocidad
específica de crecimiento, actividad respiratoria, síntesis de biomasa, y producción de PHB)
en distintas condiciones de disponibilidad de oxígeno.
- Estudiar la acumulación heteróloga de PHB por las cepas recombinantes en cultivos
microaeróbicos en biorreactores.
55
2.3. Introducción
2.3.1. Polihidroxialcanoatos bacterianos (PHAs): Características generales
Los plásticos se han convertido en uno de los grupos de materiales más importantes
en una gran variedad de aplicaciones industriales y usos cotidianos. A partir de la década de
1930 se comenzaron a producir por síntesis química a partir de compuestos derivados de la
industria petroquímica. Su elevada masa molecular (Mr), su baja reactividad química, y
posibilidad de manipulación para la obtención de derivados con propiedades materiales
interesantes, son características que les confieren especial utilidad en aplicaciones que
requieren materiales durables e inertes. Sin embargo, estas características son las que ca. 40
años más tarde comenzaron a convertirse en la principal desventaja de los plásticos
tradicionales (la denominación ‘tradicional’ se aplica a los plásticos derivados del
procesamiento del petróleo; tales como polietileno, cloruro de polivinilo, y poliestireno)
[Guillet, 2002]. Dado que se trata de compuestos xenobióticos químicamente inertes, los
plásticos permanecen prácticamente inalterados luego de ser descartados ya que resisten la
degradación biológica [Derraik, 2002; Baker y Mead, 2005], y el período necesario para
comenzar su descomposición normalmente es mayor a 300 años. Actualmente se producen
ca. 25 millones de toneladas de plásticos tradicionales a nivel mundial por año. Entre los
países con mayor consumo per capita de plásticos tradicionales se encuentran Estados
Unidos (80 kg · año-1), algunos países europeos (ca. 60 kg · año-1), e India (2 kg · año -1)
[Kalia et al., 2000; Reddy et al., 2003]. De esta manera, una gran cantidad de plásticos se
acumulan indefinidamente en el medio ambiente, incluyendo ambientes marinos. Por otro
lado, la eliminación de resinas por incineración genera sustancias altamente tóxicas; e.g.,
HCN y HCl, cuando se incineran plásticos que incluyen acrilonitrilo [Johnstone, 1990]. La
opción del reciclaje es relativamente costosa para ser aplicada masivamente, y sólo puede
reciclarse una fracción de los plásticos desechados. Debe mencionarse, además, que con la
tecnología actualmente disponible se estima que las reservas petrolíferas podrían agotarse en
ca. 15 años [Bevan y Franssen, 2006], lo cual limitaría en forma directa la posibilidad de
continuar produciendo plásticos tradicionales.
Este escenario motivó, desde hace ca. 25 años, la búsqueda de alternativas a los
recalcitrantes plásticos tradicionales y despertó un interés generalizado en varios tipos de
polímeros biodegradables. Los plásticos biodegradables pueden ser divididos en tres
categorías:
i) Polímeros obtenidos por síntesis química: por ejemplo, ácido poli(glicólico), ácido
poli(láctico), poli(ε-caprolactona), alcohol poli(vinílico), y poli(óxido de etileno). Si bien
estos polímeros son relativamente susceptibles al ataque enzimático y microbiano, sus
propiedades termoplásticas limitan su utilización comercial como sustituto de plásticos
petroquímicos. En algunas variantes de estos compuestos se agregan grupos químicos
fotosensibles a la estructura de los mismos, de manera que la exposición intensiva del
polímero a la radiación UV facilita su descomposición.
ii) Plásticos biodegradables derivados de almidón: en los cuales el almidón se añade a un
plástico tradicional como agente plastificante para generar un polímero mixto (e.g., almidón-
56
polietileno). A pesar de que los microorganismos presentes en el suelo pueden degradar
fácilmente la fracción amilácea del polímero, un porcentaje significativo de éste permanece
inalterado, de manera que los fragmentos recalcitrantes derivados de la digestión parcial del
biopolímero representan una fuente de contaminación importante, aunque menor si se
compara con un plástico tradicional.
iii) Polihidroxialcanoatos (PHAs): los únicos polímeros completamente biodegradables. Se
trata de poliésteres de varios tipos de ácidos hidroxialcanoicos. Muchas bacterias sintetizan y
acumulan PHAs en forma de gránulos discretos, como materiales de reserva nutricional
(fuente de carbono) y energética (fuente de equivalentes de reducción) [Anderson y Dawes,
1990; Madison y Huisman, 1999]. La síntesis de estos polímeros tiene lugar en condiciones
de desbalance nutricional o estrés ambiental, cuando existe una fuente de carbono en exceso
[Senior y Dawes, 1973]. Cuando el nutriente limitante es restablecido (o desaparece la
condición de estrés ambiental) el PHA puede ser degradado por depolimerasas intracelulares
y subsecuentemente las subunidades del polímero se metabolizan como fuente de carbono y
energía [Jendrossek, 2001; Zinn et al., 2001].
Se ha descripto la acumulación de PHAs en una gran variedad de microorganismos:
miembros representativos de todas las especies Gram positivas y Gram negativas (i.e.,
autótrofos, heterótrofos, fotótrofos, aerobios, anaerobios, etc.), y en algunas especies del
dominio Archaea [Anderson y Dawes, 1990; Madison y Huisman, 1999; Steinbüchel y Hein,
2001]. La capacidad de acumular PHAs se utiliza en ocasiones como característica para la
clasificación taxonómica, ya que se encuentra en al menos 75 géneros bacterianos [Lee,
1996a; Lenz y Marchessault, 2005]. La forma más ampliamente difundida de PHA, y
consecuentemente la mejor estudiada, es el poli(3-hidroxibutirato) (PHB). Además de su rol
como polímero de reserva bacteriano, se ha descripto en detalle la presencia del PHB bajo la
forma de oligómeros de baja Mr (constituidos por 120-200 monómeros) en levaduras, plantas,
y animales, incluyendo a los seres humanos [Reusch et al., 1997]. Esta forma de PHB se
encuentra como un complejo PHB/polifosfato de calcio [Reusch, 1989], asociado al dominio
citoplasmático de la membrana celular. Parecería funcionar como canal de Ca2+, y además
protegería de la degradación proteolítica a ciertas moléculas a las cuales el complejo está
asociado físicamente. En E. coli, esta forma de PHB se encuentra en gran cantidad en la
membrana celular y cumple un rol importante en la adquisición de competencia para el
proceso de transformación genética [Reusch y Sadoff, 1983]. A lo largo de los experimentos
descriptos en esta tesis se hará referencia al PHB de elevada Mr, el cual posee características
materiales de interés.
Los PHAs habitualmente se clasifican en virtud de la extensión del monómero a partir
del cual se generan. A la fecha se han identificado más de 100 tipos de monómeros distintos
como componentes de los PHAs [Steinbüchel y Valentin, 1995]. En general, aquellos
poliésteres formados a partir de la polimerización de subunidades de 3 a 5 átomos de carbono
se denominan PHAs de cadena corta (PHAsSCL), y aquellos que poseen monómeros de 6 a 14
átomos de carbono son llamados PHAs de cadena media (PHAsMCL). El PHB pertenece al
grupo de los PHAsSCL.
57
A pesar de la gran variedad de aplicaciones que puede darse a los PHAs, la causa
principal por la cual no han sido masivamente utilizados es su elevado costo productivo
[Verlinden et al., 2007]. En comparación con los plásticos tradicionales, cuyo costo varía
entre U$S 0,50-1,25/kg, los PHAs poseen un costo productivo que oscila entre U$S 4-16/kg,
dependiendo del microorganismo, el sustrato carbonado, y la estrategia productiva utilizados
[Reddy et al., 2003; Khanna y Srivastava, 2005; Suriyamongkol et al., 2007]. Algunos
factores importantes que determinan el costo de producción del PHA son el costo del
sustrato, el rendimiento de polímero respecto del sustrato, y la eficiencia en la formulación
del producto durante la purificación [Braunegg et al., 1998]. Se ha postulado que el valor
límite del costo productivo para algunas aplicaciones especiales del biopolímero no debería
superar U$S 3 [Choi y Lee, 1997].
2.3.2. Antecedentes
microbianas
en
la
producción
de
PHAs
por
fermentaciones
2.3.2.1. Microorganismos productores naturales
Existe una gran diversidad en las diferentes vías metabólicas que conducen a la
acumulación de PHAs en distintos microorganismos [Anderson y Dawes, 1990; Steinbüchel
et al., 1999; Aldor y Keasling, 2003; Khanna y Srivastava, 2005; Suriyamongkol et al.,
2007]: cada una de ellas puede ser aprovechada y modificada para la producción de
polímeros con fines industriales [Solaiman et al., 2006].
Uno de los primeros microorganismos que se utilizó para la producción de PHAs a
escala industrial fue Cupriavidus necator [Byrom, 1987]. La compañía Imperial Chemical
Industries Ltd. del Reino Unido comercializó PHB y P(HB-co-HV) en los años ‘80s (el copolímero fue conocido comercialmente como BioPolTM); producidos por fermentación con
una cepa mutante capaz de utilizar glucosa como sustrato carbonado, C. necator H16; aislada
y mejorada por Schlegel, quien la cediera a ICI para ensayos de producción [Schlegel et al.,
1961; Schlegel y Gottschalk, 1965; Braunegg et al., 1998]. Cuando esta empresa comenzó los
estudios de factibilidad en 1978, la posibilidad de producir bioplásticos durante la crisis de
petróleo de los años ‘70s resultaba comercialmente atractiva. Sin embargo, finalmente la
compañía debió abandonar la producción dado que los costos de obtención del polímero eran
prohibitivos para la difusión masiva del producto. Las patentes para la producción de PHB
utilizando este proceso fueron cedidas a Monsanto [Sudesh et al., 2000]. Algunos ensayos de
producción biotecnológica que no llegaron a comercializarse fueron llevados a cabo en
Estados Unidos por Baptist y Werber [1964] en Maryland, utilizando cepas salvajes de
Rhizobium capaces de acumular hasta un 58% de PHB respecto a biomasa [Forsyth et al.,
1958]; y por Marchessault y colaboradores en 1962 en New York [Alper et al., 1963]. A
partir de los resultados obtenidos por ICI Ltd., se ha intentado desarrollar procesos
fermentativos efectivos para la producción de polímero utilizando cepas salvajes y
recombinantes de C. necator, pero a la fecha no se han aplicado para la obtención comercial
del producto en forma masiva. Aún así, C. necator sigue siendo el microorganismo modelo
para estudiar la síntesis de PHAs y optimizar procesos productivos [Reinecke y Steinbüchel,
2009], en particular después de la reciente publicación de su genoma completo [Pohlmann et
al., 2006].
58
Una especie relacionada, Azohydromonas lata (anteriormente Alcaligenes latus),
también se utilizó para la producción de PHB obteniéndose mayores productividades respecto
a C. necator [Grothe y Chisti, 2000], en virtud de que ésta última acumula el polímero
solamente cuando el cultivo entra en la fase estacionaria de crecimiento. A. lata es capaz de
acumular PHB en forma parcialmente asociada al crecimiento [Hänggi, 1990; Hrabak, 1992].
Otro microorganismo capaz de acumular PHAs es Pseudomonas sp. Diversas especies
de este género (e.g., P. aeruginosa, P. putida, P. resinovorans, y P. denitrificans) se han
propuesto para la obtención comercial de PHAsMCL, en especial en el rango de longitud de
monómero C8-C10, a partir de una gran variedad de fuentes de carbono de bajo costo,
incluyendo aceites vegetales y desechos de la industria alimenticia y cosmética [Preusting et
al., 1990; Hori et al., 1994; Cromwick et al., 1996; Tobin y O’Connor, 2005; Hartmann et
al., 2006].
Otro grupo de bacterias que se ha propuesto para la obtención biotecnológica de
PHAs son los metilótrofos. El principal atractivo de este género es la posibilidad de utilizar
CH3OH o CH4 como sustratos carbonados, situación que permitiría reducir los costos
productivos asociados al proceso fermentativo [Bourque et al., 1995; Wendlandt et al., 2005].
Sin embargo, en algunos ensayos realizados con Methylobacterium extorquens y M.
rhodesianum la productividad obtenida no fue adecuada desde el punto de vista comercial
[Suzuki et al., 1988; Ackermann y Babel, 1997; Yellore y Desai, 1998].
Si bien existe una gran variedad de bacterias capaces de acumular diversos PHAs;
incluyendo distintas especies de los géneros Sphaerotilus [Takeda et al., 1995],
Agrobacterium [Lee et al., 1995a], Aeromonas [Lee et al., 2000; Han et al., 2004],
Rhodobacter [Hassan et al., 1997], Rhizobium [Mercan y Beyatli, 2005], Actinobacillus [Son
et al., 1996], y Azotobacter [Brivonese y Sutherland, 1989; Kim y Chang, 1998]; la
producción industrial de biopolímero utilizando estos microorganismos no se ha llevado a
cabo por diversas desventajas desde el punto de vista biotecnológico [cf. siguiente sección].
2.3.2.2. Cepas bacterianas recombinantes
En general, las especies bacterianas que acumulan naturalmente PHAs poseen
tiempos de duplicación largos, necesitan una temperatura de crecimiento óptima entre 25 y
28°C (lo cual implica un costo significativo desde el punto de vista industrial, asociado al
enfriamiento del fermentador), son difíciles de lisar (situación que complica el proceso de
extracción de PHAs, haciendo necesario el tratamiento con solventes orgánicos y
surfactantes), y poseen vías degradativas del biopolímero (hecho que limita los tiempos de
fermentación y/o requiere de estrategias de fermentación sofisticadas, no aptas para la escala
industrial) [Anderson y Dawes, 1990; Sudesh et al., 2000; Verlinden et al., 2007]. Algunas
bacterias, como E. coli, no son capaces de sintetizar el polímero, y obviamente no poseen la
maquinaria enzimática para degradarlo [Steinbüchel y Füchtenbusch, 1998]. Además, E. coli
puede crecer a una temperatura óptima mayor a la de los microorganismos productores
naturales de PHAs y es fácilmente lisable [Suriyamongkol et al., 2007]. Adicionalmente, se
conoce en relativo detalle su genética, fisiología, y metabolismo, lo cual permite un diseño
racional de estrategias de expresión heteróloga de los genes para la producción de PHAs,
59
manipulaciones de Ingeniería Metabólica para aumentar los rendimientos del polímero [Aldor
y Keasling, 2003; Li et al., 2007], y el desarrollo de bioprocesos en condiciones de alta
densidad celular [Shiloach y Fass, 2005].
Productores naturales genéticamente modificados
Las primeras estrategias para la construcción de cepas sobre-productoras de PHAs
involucraron la adición de copias episomales de los genes pha a especies que naturalmente
producen el polímero, como C. necator [Park et al., 1995; Kichise et al., 1999]. Sin embargo,
la producción de PHAs no siempre correlaciona con el nivel de expresión de los genes
involucrados en la biosíntesis del polímero [Taguchi et al., 2003], e incluso se ha descripto
una disminución en la acumulación de PHA en presencia de los plásmidos multicopia
adicionales. Otras manipulaciones de genes del microorganismo huésped, cuyos productos
están involucrados en catabolismo de carbono [Huisman et al., 1992; Choi et al., 2003] o
balance redox [Lee et al., 1995b], han generado resultados variables respecto de la
acumulación del polímero y consecuentemente se ha descartado su aplicación industrial.
Cepas recombinantes de E. coli como productores de PHAs
El conocimiento de los mecanismos moleculares de la síntesis de PHAs, así como el
clonado de los genes involucrados a partir de diversos organismos productores, ha permitido
la construcción de organismos recombinantes capaces de acumular distintos biopolímeros. A
pesar de que C. necator es un excelente productor de PHAs, esta bacteria posee varias
limitaciones que dificultan su aplicabilidad comercial masiva. Además de las desventajas ya
nombradas, esta especie no está completamente caracterizada desde el punto de vista
fisiológico y genético, situación que limita la aplicabilidad de algunas de las técnicas
habituales de manipulación genética para obtener cepas productoras eficientes.
Por estos motivos, la producción de PHAs en organismos que normalmente no
acumulan estos poliésteres es una alternativa adecuada para la obtención industrial de
biopolímeros [Lee, 1996b; Li et al., 2007]. Como se mencionó, el microorganismo procariota
mejor caracterizado en los aspectos fisiológico y genético es E. coli, bacteria utilizada para
propósitos múltiples en el trabajo rutinario de laboratorio, tratándose además de un
organismo ampliamente utilizado en la industria para la obtención de compuestos
biotecnológicamente relevantes. En virtud que no produce el polímero en forma natural, la
manipulación de las vías sintéticas heterólogas en este huésped es más sencilla [Park et al.,
2005; Park y Lee, 2005]. Además, dado que carece de depolimerasas que degraden PHAs, el
polímero permanece inalterado en el interior de las células [Khanna y Srivastava, 2005].
Estudios utilizando técnicas como calorimetría diferencial de barrido, análisis
termogravimétrico, y resonancia magnética nuclear, demostraron que el PHB acumulado por
cepas recombinantes de E. coli se encuentra en un estado de mayor cristalinidad (equiparable
en este contexto a la resistencia elastomérica del polímero) que en los gránulos aislados de C.
necator [Hahn et al., 1995]. Además, el PHB producido en cultivos de alta densidad celular
de E. coli puede presentar características físicas superiores al acumulado en productores
naturales (e.g., con respecto a Mr), y puede ser utilizado en aplicaciones para las cuales el
polímero nativo no puede ser usado [Kusaka et al., 1999; Choi y Lee, 2004].
60
La primera indicación de que puede producirse PHB en organismos que naturalmente
no acumulan PHAs surgió en 1988 a partir del clonado de los genes pha de C. necator, los
cuales forman un operón, y la posterior transformación de E. coli con el plásmido resultante;
trabajo realizado en forma concomitante e independiente por los grupos de Schlegel y Dennis
[Schubert et al., 1988; Slater et al., 1988]. En el caso de C. necator, el promotor nativo de los
genes pha es reconocido por la maquinaria transcripcional (σ70) de E. coli [Li et al., 2007].
Estudios posteriores que incluyeron el clonado de los correspondientes genes pha de otras
especies procariotas, y expresión de los mismos en E. coli, dieron lugar a resultados similares
[Anderson y Dawes, 1990; Suriyamongkol et al., 2007]. Algunas de las cepas recombinantes
de E. coli obtenidas en estos estudios fueron capaces de acumular hasta 90% del peso seco en
PHB [Fidler y Dennis, 1992], un contenido que supera los niveles acumulados por la mayoría
de los productores naturales. Posteriormente se demostró la capacidad de cepas
recombinantes de E. coli de acumular otros PHAs y copolímeros, e.g., P(HB-co-HV), P(3HBco-4HB), P(4HB), y P(3HO-co-3HHx) [Slater et al., 1992; Park et al., 2001; Snell et al.,
2002; Steinbüchel y Lütke-Eversloh, 2003; Park et al., 2005]. Por otro lado, a partir del
trabajo del grupo de Anthony Sinskey en el Massachusetts Institute for Technology en 1994
(Boston, Estados Unidos) se determinó que algunas cepas recombinantes que expresan
solamente el gen que codifica la PHA sintasa producen la enzima en cantidades suficientes
como para permitir su purificación y estudios in vitro [Gerngross et al., 1994].
Entre los inconvenientes de la utilización de E. coli como huésped para la producción
de PHB se encuentra el hecho de que la mayoría de los plásmidos de expresión no son
estables en procesos fermentativos (en particular, en cultivos en lote alimentado, fed-batch, o
cultivos continuos). En general, una parte considerable de la población bacteriana pierde el
vector, lo cual obviamente implica una reducción en la cantidad de polímero producida, ya
que las células carentes de plásmidos poseen una velocidad de crecimiento mayor respecto de
las recombinantes, y la población bacteriana no recombinante aumenta rápidamente [Zhang et
al., 1994]. Esta problemática ha sido parcialmente resuelta modificando el gen que confiere
resistencia a antibióticos en el plásmido que lleva los genes pha [Nikel et al., 2006], o
agregando secuencias de estabilización, e.g., el locus hok/sok o par del plásmido R1 [Lee et
al., 1994]. En la Tabla 2.1 se comparan algunos estudios para la producción aeróbica de
PHAs en cepas recombinantes de E. coli.
61
Cepa
E. coli
XL1-Blue
E. coli
HMS174
E. coli
CGSC 4401
E. coli
K1060
E. coli
XL1-Blue
E. coli
XL1-Blue
E. coli
RS3097
Fuente de los
genes pha
Tipo de
PHA
Sustrato(s)
principal(es)
A. lata
PHB
Glucosa
73
C. necator
PHB
80
A. lata
PHB
Azotobacter
sp. cepa FA8
A. lata
PHB
Melaza
(glucosa)
Lactosuero
(lactosa)
Lactosuero
(lactosa)
Glucosa, ácido
propiónico y
oleico
Glucosa,
4-hidroxibutirato
C. necator,
Clostridium
kluyveri
P. aeruginosa
P(HBco-HV)
P(4HB)
PHAMCL
Ácido decanoico
PHA (%)
87
72,9
78,2
Productividad
volumétrica
Ref.
de PHA
-1
-1
(g · l · h )
4,63
Choi et al.,
1998
1
Liu et al.,
1998
4,6
Ahn et al.,
2000
2,13
Nikel et al.,
2006
2,88
Choi y Lee,
1999
36
0,07
Song et al.,
1999
38
0,06
Qi et al.,
1998
Tabla 2.1. Comparación de varios bioprocesos para la producción de PHAs por cepas
recombinantes de E. coli. En todos los casos, los procesos se desarrollaron en la modalidad de
cultivo en lote alimentado. El contenido de PHA se expresa como porcentaje de la biomasa.
2.3.2.3. Cultivos mixtos
Todos los bioprocesos hasta aquí mencionados utilizan cultivos puros del
microorganismo en cuestión (cepas salvajes o modificadas genéticamente) para la producción
de PHAs. Debe mencionarse, sin embargo, que en la actualidad existe una tendencia a la
utilización de cultivos microbianos mixtos [Satoh et al., 1998; Serafim et al., 2008]. En las
primeras etapas de estos cultivos, ciertas biomoléculas complejas (e.g., almidón, celulosa)
son hidrolizadas a ácidos orgánicos solubles y biodegradables (e.g., acetato, propionato).
Éstos son los sustratos para la acumulación de PHAs por los microorganismos [Mata-Álvarez
et al., 2000]. Las ventajas de la utilización de este tipo de sistemas para la producción de
PHAs serían el ahorro energético (dado que normalmente se eliminan los pasos de
esterilización de los sustratos y biorreactores), la reducción de costos en el diseño de
biorreactores, y una menor demanda tecnológica en el equipamiento para el control del
bioproceso [Oehmen et al., 2007], lo cual contribuiría a la sostenibilidad del mismo. Además,
estos sistemas utilizan residuos industriales como sustratos. En general, los microorganismos
que sintetizan PHAs en estas condiciones de crecimiento son bacterias que también acumulan
polifosfatos y glicógeno [Levantesi et al., 2002]. Sin embargo, se conoce relativamente poco
acerca del metabolismo de los polímeros en dichos cultivos, y la predicción de los parámetros
de interés industrial respecto a la acumulación de PHAs es dificultosa debido a que el sistema
normalmente presenta características metabólicas y de proceso fluctuantes [Takabatake et al.,
2002; Lemos et al., 2007].
62
2.3.2.4. Organismos eucariotas como productores de PHAs
Organismos eucariotas unicelulares
Algunos de los organismos eucariotas en los cuales se ha intentando la producción de
PHAs son las levaduras Saccharomyces cerevisiae [Leaf et al., 1996; Poirier et al., 2001] y
Pichia pastoris [Poirier et al., 2002], y células de insecto (Spodoptera frugiperda)
transfectadas con baculovirus [Williams et al., 1996]. En ninguno de los casos citados se
alcanzó un nivel de acumulación del polímero adecuado para considerar la producción
masiva del mismo (<8% de la biomasa), aunque se ha obtenido información valiosa acerca de
la regulación de la biosíntesis de PHAs en contextos genéticos y metabólicos muy distintos a
los nativos.
Plantas
En 1994, Sommerville y colaboradores aislaron un clon transgénico de Arabidopsis
thaliana capaz de acumular PHB hasta un 14% del peso seco vegetal [Nawrath et al., 1994].
Si bien en dicho trabajo se ha logrado la expresión estable de los genes pha de C. necator en
A. thaliana, obteniéndose un polímero de características similares al PHB nativo en lo que
respecta a propiedades térmicas, la Mr del PHA no resultó homogénea. Adicionalmente, y
dado que el metabolismo en las células vegetales es altamente compartimentalizado, las
construcciones de ADN que contienen los genes estructurales pha deben ser cuidadosamente
dirigidas al compartimento subcelular adecuado para lograr un suplemento adecuado de
acetil-coenzima A (CoA) y equivalentes de reducción [Poirier et al., 1992].
La ventaja que ofrecería la producción de PHAs in planta en escala agronómica
radicaría en la posibilidad de obtener grandes cantidades de polímero (superiores a las
obtenidas en fermentaciones microbianas) utilizando solamente CO2, H2O, y luz solar como
sustratos; e implicaría una reducción potencial del costo de producción hasta ca. U$S 0,50/kg
si el contenido de PHA llegase a valores >40% del peso seco vegetal [Snell y Peoples, 2002;
Suriyamongkol et al., 2007]. Sin embargo, y a diferencia de lo que ocurre con los
bioprocesos para la producción de PHAs por fermentaciones microbianas, la utilización de
cultivos transgénicos es un proceso biotecnológico no confinado, y en consecuencia no ha
tenido aceptación masiva. Además, el proceso de purificación de PHA a partir de tejido
vegetal implica dificultades técnicas considerables [Poirier et al., 1995]; y el desarrollo de los
cultivos está sometido a variaciones estacionales en el régimen de lluvias, exposición solar, et
cetera. Por estas razones, la producción de biopolímeros a gran escala en cultivos
transgénicos ha sido prácticamente descartada. Sin embargo, se han realizado algunos
estudios biotecnológicos de transgénesis en plantas para la producción de PHAs en maíz (Zea
mays) y algodón (Gossypium hirsutum) [John y Keller, 1996; Hahn et al., 1997]. En el Reino
Unido se ha desarrollado una estrategia de producción de PHA en colza (Zeneca Seeds Ltd.);
mientras que en Estados Unidos se ha investigado la síntesis de polímeros utilizando soja
transgénica (Monsanto) [Reddy et al., 2003].
63
2.3.3. Producción biotecnológica de PHAs en la actualidad
En la actualidad existen al menos dos programas de desarrollo en compañías
dedicadas a la producción de PHAs en Estados Unidos: un programa conjunto de Procter &
Gamble Co. y Kaneka Corp. para la obtención de co-polímeros de tipo PHAMCL, en especial
P(3HV-co-3HHx); y desarrollo de PHAs para aplicaciones biomédicas por Metabolix Inc.
[Reddy et al., 2003]. En Brasil se encuentra PHB Industrial o Biocycle, empresa que produce
y comercializa P(HB-co-HV) (São Paulo). Este último polímero también es producido en
China por la compañía Tianan Biologic Material Ltd. (Ningbo, Zhejiang).
2.4. Materiales y métodos
2.4.1. Cepas y plásmidos
Las cepas de E. coli utilizadas a lo largo de este trabajo son derivadas de K-12, y se
detallan en la Tabla 2.2, junto a los plásmidos y oligonucleótidos utilizados en este capítulo.
Las construcciones de ADN fueron propagadas y mantenidas en E. coli DH5α, exceptuando
el plásmido pKNG101 y derivados (conteniendo el origen de replicación oriR6K, dependiente
de la proteína π codificada por el gen pir), los cuales fueron amplificados en E. coli CC118 λpir o S17-1 λ-pir. Las cepas se mantuvieron en punciones en agar LB blando a 25°C, o como
suspensiones bacterianas gliceroladas a –70°C (mezclando 2 ml de un cultivo crecido a
saturación en LB y 1 ml de solución de criopreservación) [cf. siguiente sección].
Cepa,
Características relevantesa
oligonucleótido, o
plásmido
E. coli
DH5α
F– λ– endA1 hsdR17 hsdM+ supE44 thi-1
recA1 gyrA96 relA1 Δ(argF lacZYA)U169
φ80d Δ(lacZ)M15
CC118 λ-pir
Δ(ara-leu) araD ΔlacX74 galE galK phoA20
thi-1 rpsE rpoB argE(Am) recA1, lisógeno
λ-pir; Spr
S17-1 λ-pir
recA thi-1 hsdRM+ RP4-2Tc::Mu::kan Tn7,
lisógeno λ-pir; Kmr Strr
b
SP314
araD139 Δ(argF-lac)U169 rpsL150 relA1
deoC1 flb-5301 ptsF25 Δ(galK-bioD)76 thi1 Δ(deoD-arcA)253
K1060b
F– fadE62 lacI60 tyrT58(AS) fabB5 mel-1
CT1062
K1060 ΔarcA
ECL618
arcA::IS10-L Δ(lac-proAB)X111 supE44
thiA/F’ proAB+ lacIQ ΔlacZ(M15); Tcr
CT1061
K1060 arcA::IS10-L, obtenida según
K1060×P1(ECL618); Tcr
ECL547
araD139 Δ(argF-lac)U169 rpsL150 relA1
deoC1 flb-5301 ptsF25 Δfrd-101 sdh+
Φ(sdh-lacZ)
Fuente
o referencia
Invitrogen Corp.;
Carlsbad, CA,
EE.UU.
Herrero et al.,
1990
de Lorenzo y Timmis,
1994
Roeder y Somerville,
1979
Overath et al., 1970
Este capítulo
Iuchi et al.,
1989
Este capítulo
Iuchi y Lin,
1988
64
CT548
Oligonucleótido
arcA-F
arcA-R
ΔarcAN-F
ΔarcAN-R
ΔarcAC-F
ΔarcAC-R
Plásmido
pGEM-T Easy
pQE32
pJP24
pKNG101c
pG-ΔarcA
pK-ΔarcA
ECL547 arcA::IS10-L, obtenida
ECL547×P1(ECL618); Tcr
según Este capítulo
5’-CCG AAA ATG AAA GCC AGT A-3’
5’-GAA AGT ACC CAC GAC CAA G-3’
5’-CCG GAT CCT CCG CGC CAT CTG
TCG CTT C-3’
5’-CCC GTC GAC AAA GCC CTT TAC
TTA GCT TA-3’
5’-GGG GAG CTC GGT TGA AAA ATA
AAA ACG GC-3’
5’-GAA GCG ACA GAT GGC GCG GAG
GAT CCG GAA AGC TAC AAG TTC
AAT GGT-3’
Este capítulo
Este capítulo
Este capítulo
Este capítulo
Este capítulo
Este capítulo
Vector de clonado A/T para productos de Promega; Madison,
WI, EE.UU.
PCR; PT7/SP6, lacZα, Apr
Vector de expresión; PT5, Apr
Qiagen; Valencia, CA,
EE.UU.
pQE32 conteniendo los genes phaBAC de Nikel et al.,
2006
Azotobacter sp. cepa FA8; Ap r
Vector suicida mobilizable; oriR6K, sacBR, Kaniga et al.,
Strr
1991
pGEM-T Easy conteniendo el producto de Este capítulo
PCR generado con los oligos ΔarcA; Ap r
pKNG101 conteniendo el producto de PCR Este capítulo
generado con los oligos ΔarcA; Strr
Tabla 2.2. Cepas de E. coli, oligonucleótidos cebadores, y plásmidos utilizados en este
capítulo.
a
Ap, ampicilina; Km, kanamicina; Sp, espectinomicina; Str, estreptomicina; Tc, tetraciclina.
b
Cepas obtenidas a través de Mary Berlin; E. coli Genetic Stock Center, Yale University,
New Haven, CT, EE.UU.
c
Plásmido obtenido a través de BCCM/LMBP, Ghent, Bélgica.
2.4.2. Medios y condiciones de cultivo
Medios de cultivo. Para la mantención rutinaria de las cepas y durante la
construcción de mutantes, se utilizó medio LB (extracto de levadura 5 g · l-1; triptona 10 g ·
l-1; y NaCl 5 g · l-1), o medio LB sólido [conteniendo agar 1,5% (m · vol-1)]. El medio LB
agar blando contuvo agar 0,75% (m · vol-1). La solución de criopreservación [glicerol 65%
(vol · vol-1); MgSO4 100 mM; y Tris·HCl 25 mM pH = 8,0] fue utilizada para conservación
de las cepas a –70°C. Para identificación rápida de cepas Lac+ se utilizó medio McConkey
agarizado, conteniendo peptona de caseína 17 g · l-1; peptona de carne 3 g · l-1; lactosa 10 g ·
l-1; sales biliares 1,5 g · l-1; NaCl 5 g · l-1; rojo neutro 0,03 g · l-1; cristal violeta 0,001 g · l-1; y
agar 1,35% (m · vol-1).
65
La selección de transformantes Suc+ (resistentes a concentraciones elevadas de
sacarosa) se efectuó en medio Blomfield [extracto de levadura 5 g · l-1; triptona 10 g · l-1;
Na2HPO4 2,5 g · l-1; NaCl 0,5 g · l-1; sacarosa 60 g · l-1; y agar 1,5% (m · vol-1); pHinicial =
7,0]. El medio MT contuvo triptona 10 g · l-1; y NaCl 8 g · l-1. El medio MTX contuvo los
mismos componentes que el medio MT y xilosa 20 g · l-1. El medio TB fue usado para
analizar la sensibilidad de mutantes arcA a colorantes redox [triptona 10 g · l-1; NaCl 8 g · l-1;
azul de toluidina O 200 μg · ml-1; y agar 1,5% (m · vol-1)]. Para los ensayos de
caracterización metabólica en frascos agitados se utilizó el medio MYA/Glucosa,
conteniendo Na2HPO4 6 g · l-1; KH2PO4 3,0 g · l-1; (NH4)2SO4 1,4 g · l-1; NaCl 0,5 g · l-1;
extracto de levadura 10 g · l-1; casaminoácidos (hidrolizado ácido de caseína) 5 g · l-1;
MgSO4·7H2O 0,2 g · l-1; y glucosa 30 g · l-1 (pHinicial = 7,2). En otros ensayos se utilizó el
medio SMA/Glucosa, cuya composición fue igual a la de MYA/Glucosa, se suprimió el
extracto de levadura, la concentración de casaminoácidos se redujo a 0,3 g · l-1 y se añadieron
5 ml · l-1 de una solución de elementos traza [compuesta, por litro de HCl 5 N, por
FeSO4·7H2O 10,0 g; CaCl2·2H2O 2,0 g; ZnSO4·7H2O 2,2 g; MnSO4·4H2O 0,5 g;
CuSO4·5H2O 1,0 g; (NH4)6Mo 7O24·4H2O 0,1 g; NiCl2 0,1 g; CoCl2·4H2O 0,1 g; Na2SeO3
0,05 g; y Na2B4O7·10H2O 0,02 g].
El pH de los medios se ajustó a los valores indicados para cada caso con NaOH 2 M
antes de autoclavar. Los antibióticos utilizados y sus concentraciones finales fueron: Ap, 100
μg · ml-1; Km, 50 μg · ml-1; Sp, 15 μg · ml-1; Str, 75 μg · ml-1; y Tc, 15 μg · ml-1. Cuando se
estudió la acumulación de PHB en cepas LacI+, la expresión de los genes pha se indujo
añadiendo isopropil-β-D-tiogalactopiranósido (IPTG) 1 mM al comienzo del cultivo. En
todos los casos, las soluciones de MgSO4, glicerol, azul de toluidina O, antibióticos, IPTG, y
azúcares (sacarosa, glucosa, o xilosa) se esterilizaron por filtración (membrana de acetato de
celulosa de 0,22 μm de poro), y se agregaron a las concentraciones requeridas después de
autoclavar los restantes componentes del medio (121°C, 1 atm, 15 min).
Condiciones de cultivo. En todos los casos, y para evitar la aparición de posibles
mutaciones supresoras, los experimentos se iniciaron a partir de cepas criopreservadas
estriando una placa de LB con un ansada de material congelado. Para la preparación de
inóculos, se tomaron tres o cuatro colonias aisladas de una placa fresca de LB de la cepa de
E. coli correspondiente, y se dispersaron en el medio de cultivo a utilizar durante el ensayo
con los antibióticos apropiados según el requerimiento de cada cepa. Los cultivos se hicieron
crecer durante 18 h a 37°C en distintas condiciones de aireación según el experimento (i.e.,
bajo las mismas condiciones de aireación en las cuales posteriormente se desarrollaron los
cultivos experimentales). La biomasa utilizada como inóculo fue ca. 0,05 g · l-1. Las
condiciones de aireación fueron definidas de la siguiente manera. Los cultivos se
desarrollaron en frascos Erlenmeyer de 250 ml de volumen nominal. En los cultivos
aeróbicos estándar el volumen de trabajo fue de 50 ml (relación volumen de medio:volumen
de frasco = 1:5), con agitación a 250 r.p.m. Los cultivos altamente aeróbicos se desarrollaron
con la misma agitación utilizando 12,5 ml de medio de cultivo (relación volumen de medio:
volumen de frasco = 1:20). Para los cultivos microaeróbicos se trabajó con un volumen de
medio de 250 ml (relación volumen de medio:volumen de frasco = 1:1) y agitación magnética
(ca. 75 r.p.m.) para evitar la sedimentación de la biomasa.
66
Cultivo en biorreactor. Con el fin de obtener un monitoreo continuo y un mayor
control de los factores físicos y nutricionales (pH, oxígeno disuelto, agitación, et cetera), se
realizaron cultivos en un biorreactor modular provisto de un vaso de fermentación de vidrio
de hasta 5 L de volumen de trabajo (BioFlo 110; New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ,
EE.UU.). El fermentador utilizado fue de tipo tanque agitado y aireado, equipado con dos
series de seis agitadores (turbinas Rushton) y difusores (bafles) laterales.
La concentración de oxígeno disuelto fue determinada utilizando un electrodo de
oxígeno (Ag/AgCl, polarimétrico; Mettler Toledo Co., Columbus, OH, EE.UU.). Para
mantener condiciones microaeróbicas, se suprimió el suministro de aire y la velocidad de
agitación se mantuvo en 75 r.p.m. para evitar la sedimentación de la biomasa. Se utilizó un
volumen de medio de 4,5 L (i.e., 80% del volumen nominal del biorreactor). El pH se fijó en
7,20 ± 0,03 y se controló mediante adición automática de KOH 3 M o H2SO4 1,5 M. La
formación de espuma se evitó por adición de 30 μl · l-1 antiespumante (AntiFoam 289;
Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE.UU.) al comienzo del cultivo.
Sensibilidad a azul de toluidina. Las cepas a analizar se crecieron durante 18 h en 50
ml de medio MT líquido (en frascos Erlenmeyer de 250 ml) a 37°C y 250 r.p.m. Los cultivos
se diluyeron en solución de NaCl 9 g · l-1 y se sembraron en placas de TB. La aparición de
colonias se analizó luego de 24 h de incubación a 37°C [Roeder y Somerville, 1979].
2.4.3. Manipulaciones genéticas
Aislamiento de ADN cromosómico. Se centrifugaron 2 ml de un cultivo crecido a
saturación en medio LB (8.000 r.p.m., 20 min), y la biomasa resultante se resuspendió en 300
μl de medio LB adicionado con dodecilsulfato de sodio (SDS) 0,1% (m · vol-1). Luego se
agregaron 400 μl de fenol saturado en Tris·HCl (pH = 8,0) y la suspensión se agitó
suavemente a temperatura ambiente durante 2 h. Posteriormente se centrifugó la suspensión a
13000 r.p.m. durante 15 min, y la fase superior (acuosa) se transfirió a un nuevo tubo. Se
agregó 1 vol de fenol:CHCl3:alcohol isoamílico (25:24:1), se agitó suavemente la suspensión
durante 10 min, y se transvasó la fase acuosa a un nuevo tubo. Se añadió 1 vol de
CHCl3:alcohol isoamílico (24:1), se agitó suavemente por inversión, y luego de centrifugar a
13.000 r.p.m. durante 5 min y la fase acuosa se transfirió nuevamente a un tubo limpio para
luego agregar 0,6 vol de 2-propanol. La suspensión se agitó por inversión y se centrifugó a
13.000 r.p.m. durante 30 min. Luego de descartar el sobrenadante, el sedimento (ADN
cromosómico) fue lavado con 500 μl de etanol 70% (vol · vol-1), se centrifugó, se descartó el
sobrenadante, y se dejó secar el ADN a temperatura ambiente durante 25 min. El ADN
cromosómico fue resuspendido suavemente en 100 μl de H2O deionizada estéril conteniendo
RNAsa A 10 μg · ml-1, e incubado a 37°C durante 1 h. Finalmente, la solución de ADN
cromosómico se cuantificó en geles de agarosa y se conservó a –70°C.
67
Aislamiento de ADN plasmídico. La purificación de ADN plasmídico se realizó
según el protocolo descripto por Birnboim y Doly [1979]. Brevemente, el sedimento celular
proveniente de 1,5 ml de cultivo (crecido a saturación en LB adicionado con los antibióticos
adecuados) se resuspendió en 150 μl de una solución de Tris·HCl 25 mM (pH = 8,0); EDTA
10 mM; glucosa 50 mM; y RNAsa A 100 μg · ml-1. Luego se agregaron 150 μl de solución
de lisis, conteniendo NaOH 200 mM y SDS 1% (m · vol-1), mezclando el tubo por inversión
hasta que la suspensión se volvió translúcida. Después de incubar 5 min a temperatura
ambiente, se agregaron 150 μl de solución de CH3COOK 3 M (pH = 5,5), se mezcló por
inversión, y los tubos se colocaron en hielo durante 10 min. La suspensión se centrifugó a
13.000 r.p.m. durante 10 min, el sobrenadante se transfirió a un nuevo tubo y se agregaron
900 μl de etanol absoluto previamente enfriado para precipitar el ADN. La solución se
centrifugó a velocidad máxima (13.000 r.p.m.) durante 20 min para sedimentar el ADN. Se
descartó el sobrenadante, y tras secar el ADN durante 10 min a temperatura ambiente, se
resuspendió en 20 μl de H2O deionizada estéril. Para preparaciones de ADN plasmídico de
alta pureza, se utilizó el kit comercial Wizard DNA Purification System (Promega).
Electroforesis en geles de agarosa. Los geles de agarosa para análisis y purificación
de fragmentos de ADN fueron preparados de acuerdo a Sambrook et al. [1989]. La
concentración de agarosa se varió entre 0,75 y 2% (m · vol-1), según el tamaño del fragmento
a analizar. Las electroforesis se realizaron utilizando solución TAE [Tris 40 mM, CH3COOH
20 mM, EDTA 5 mM] a 75-100 V en cubas Sigma-Aldrich. Como marcadores de peso
molecular se utilizó ADN del bacteriófago λ digerido con HindIII (New England Biolabs) y
marcador de 1 kb (Promega). Los geles se tiñeron con una solución de bromuro de etidio 0,5
μg · ml-1 durante 15 min, se lavaron en H2O deionizada durante 5 min, y se visualizaron en
un transiluminador UV.
Análisis de secuencias de ADN y diseño de oligonucleótidos cebadores. El análisis
de secuencias de ADN, e.g., búsqueda de sitios de restricción, secuencias promotoras y/o
regulatorias, et cetera, se realizó utilizando el programa informático JellyfishTM
(Biowire.com Inc., Mountain View, CA, EE.UU.). Los cebadores para reacciones de PCR se
diseñaron con el programa Oligo TM 6.0 (Molecular Biology Insights Inc., Cascade, CO,
EE.UU.).
Generación de mutantes arcA derivadas de E. coli K1060. Para construir una
mutante de deleción de E. coli K1060 en el gen arcA se utilizó el protocolo descripto por
Link et al. [1997]. Las reacciones de PCR, PCR mutagénica, y sub-clonado se llevaron a
cabo según se describe en dicho trabajo, con las siguientes modificaciones: las mezclas de
reacción de PCR contuvieron Tris·HCl 10 mM pH = 9,0; KCl 50 mM; Tritón X-100 0,1% (m
· vol-1); MgCl2 1,25 mM; 0,1 mM de cada deoxinucleósido fosfato; 6 μM de cada cebador;
100 ng de templado (DNA genómico de E. coli K1060); y 1 U de Taq ADN polimerasa
(GoTaq; Promega). Este protocolo de PCR, omitiendo la adición de Tritón X-100, fue
utilizado como protocolo genérico de amplificación de ADN en éste y otros capítulos. El
templado en la reacción de PCR fue desnaturalizado a 94°C (5 min) antes de añadir la ADN
polimerasa, y la amplificación se llevó a cabo en 30 ciclos que consistieron de un paso inicial
68
de desnaturalización (15 s a 94°C), unión de los oligonucleótidos a las secuencias homólogas
(15 s a 55°C), y extensión (30 s a 72°C), seguidos de una extensión final de 5 min a 72°C.
Las reacciones de PCR mutagénica se llevaron a cabo en dos pasos. En el primero, se
generaron fragmentos con homología a las secuencias que flanquean a arcA en el genoma de
E. coli en dos reacciones asimétricas de PCR de 50 μl. Las condiciones de amplificación
fueron tal como se describió anteriormente, con la modificación de que se utilizó una relación
molar de oligonucleótidos 10:1 (6 μM del oligonucleótido externo y 0,6 μM del
oligonucleótido interno). Para la generación del extremo amino terminal, se utilizaron los
oligonucleótidos ΔarcAN-F y ΔarcAN-R, mientras que para la generación del extremo
carboxilo terminal se utilizaron los oligonucleótidos ΔarcAC-F y ΔarcAC-R. En el segundo
paso, los fragmentos generados en el paso anterior (1 μl de cada una de las reacciones de
PCR) fueron utilizados como templados para generar un único fragmento de amplificación,
utilizando 6 μM de cada oligonucleótido externo (ΔarcAN-R y ΔarcAC-F), aprovechando la
superposición de los fragmentos amino y carboxilo a través de regiones complementarias
introducidas ad hoc en los oligonucleótidos ΔarcAN-F y ΔarcAC-R. El fragmento de ADN de
1 kb fue separado en un gel de agarosa, purificado, y ligado en el vector pGEM-T Easy para
generar el plásmido pGΔarcA. Esta construcción fue propagada en E. coli DH5α, purificada,
y digerida con NotI; y el segmento correspondiente al fragmento de deleción fue clonado en
el vector suicida pKNG101 digerido con la misma enzima, generando el vector mutagénico
pKΔarcA.
El vector mutagénico pKΔarcA contiene los genes sacBR, cuyos productos son la
enzima SacB (levanosacarasa o sacarosa:2,6-β-D-fructano 6-β-D-fructosil transferasa, la cual
hidroliza sacarosa y elonga levanos, polímeros ramificados de fructosa), y un regulador de
sacB. La acumulación de levanos en E. coli es letal, por lo tanto en un medio conteniendo
sacarosa, solamente pueden crecer aquellas bacterias en las cuales haya tenido lugar el
segundo evento de recombinación, que elimina sacB [Reyrat et al., 1998]. El plásmido
pKΔarcA se transfirió a E. coli K1060 por electroporación [Hanahan, 1985], se plaquearon
las transformantes en medio LB conteniendo estreptomicina, y se seleccionaron diez
transformantes Strr. Dicho fenotipo correspondería al evento de recombinación simple de
pKΔarcA en el locus arcA. Para obtener mutantes de reemplazo alélico, se siguió el protocolo
de Kaniga et al. [1991], con las siguientes modificaciones. Las merodiploides (Strr Sucs
ArcA+) se crecieron sin selección en medio LB líquido para favorecer la eliminación del
vector por un segundo evento de recombinación homóloga (dado que en ausencia de la
presión de selección los marcadores integrados al cromosoma son inestables). Luego se
plaquearon alícuotas de cultivos exponenciales de las transformantes en medio Blomfield, y
se seleccionaron revertantes Strs Sucr [Blomfield et al., 1991]. De esta manera, eligiendo
aquellas colonias que presentaban resistencia a sacarosa y sensibilidad a estreptomicina, se
deberían haber seleccionado las mutantes en las cuales el plásmido fue eliminado del
cromosoma. Este segundo evento puede eliminar la secuencia del plásmido, dejando el gen
delecionado en el cromosoma, o puede restituir la copia salvaje del gen (intercambio alélico
abortivo). Aproximadamente un 40% de las colonias que presentaron fenotipo Strs Sucr
fueron derivadas ΔarcA de E. coli K1060. Una de ellas, denominada CT1062, fue
69
seleccionada para continuar los estudios. La presencia de la deleción en arcA fue
caracterizada por la ausencia de crecimiento de las mutantes en medio TBX (conteniendo
azul de toluidina O), y por PCR de colonias utilizando los oligonucleótidos arcA-F y arcA-R.
El protocolo general para la obtención de una derivada ΔarcA de E. coli K1060 por
intercambio alélico se esquematiza en la Fig. 2.1.
Para efectuar la interrupción de arcA se utilizó la cepa ECL618 como dadora del alelo
arcA::IS10-L (Tcr), en el cual arcA está interrumpido por una secuencia de inserción de tipo
Tn10. La transducción con bacteriófago P1 se efectuó esencialmente siguiendo el protocolo
descripto por Sternberg y Maurer [1991]. Brevemente, para la preparación del lisado, se
realizó una dilución 1/100 de un cultivo de 24 h de la cepa dadora en medio LB adicionado
con CaCl2 5 mM y glucosa 2 g · l-1. ECL618 se hizo crecer con agitación a 37°C durante 1 h.
Posteriormente, se agregó al cultivo 100 μl de un lisado de fago P1 [título ~108 UFP
(unidades formadoras de placas) · ml-1], y se continuó incubando a 37°C durante 2-3 h hasta
lisis completa. El lisado se centrifugó (14.000 r.p.m., 2 min) y se transfirió el sobrenadante a
un nuevo tubo, al cual se le añadieron unas gotas de CHCl3, y se guardó a 4°C. El lisado tuvo
un título de 5 × 109 UFP · ml-1. Para llevar a cabo la transducción, se recuperaron las células
de un cultivo de 18 h de K1060 o CT547 por centrifugación (6.000 r.p.m., 2 min) y se
resuspendieron en 2 ml de medio LB conteniendo MgSO4 100 mM y CaCl2 5 mM. Luego se
añadió a 100 μl de la suspensión bacteriana el volumen de lisado adecuado para obtener
multiplicidades de infección de 0,1; 1; y 10. La suspensión se incubó a 37°C durante 30 min
sin agitación, luego se agregó 1 ml de medio LB conteniendo citrato de sodio 100 mM (pH =
5,5), y se incubó durante 1 h a 37°C con agitación (250 r.p.m.) para permitir la expresión de
la resistencia. Finalmente, se plaquearon diluciones del cultivo en placas de LB conteniendo
tetraciclina, y se incubó a 37°C hasta aparición de colonias.
2.4.4. Métodos analíticos
Ensayo de sensibilidad a diamida para la estimación del contenido de NADPH.
Para el ensayo de sensibilidad a diamida, las cepas SP314/pQE32 y SP314/pJP24 se hicieron
crecer en medio MTX líquido durante 18 h, a 37°C y 250 r.p.m. Las células se cosecharon
por centrifugación (6.000 r.p.m., 4°C, durante 10 min), se lavaron dos veces con una solución
de HEPES 20 mM previamente enfriada, y se resuspendieron en la misma solución hasta una
DO600 (densidad óptica medida a 600 nm) = 1,0. Se sembraron alícuotas de 100 μl de esta
suspensión en placas de medio MTX agarizado, y se depositaron sobre el césped bacteriano
dos discos de papel de filtro estériles, sobre los cuales se agregaron 5 μl de soluciones de
diamida 0,1 ó 0,5 M (en dimetilsulfóxido). Las placas se incubaron a 37°C durante 24 h, y la
sensibilidad a la droga se estimó midiendo los halos de inhibición de crecimiento.
70
sacBR
A
oriR6K
strAB
*
arcA
B
strAB
*
C
sacBR
oriR6K
arcA
D
sacBR
strAB
oriR6K
*
arcA
*
Fig. 2.1. Esquema de la estrategia utilizada para la construcción de E. coli CT1062
(ΔarcA). Durante el primer evento de recombinación (A) el plásmido pKΔarcA, que lleva una
copia del gen arcA de menor longitud con respecto al gen arcA salvaje (construida por PCR,
e identificada en el diagrama con un asterisco), se integra al cromosoma de E. coli (B). El
segundo evento de recombinación elimina el plásmido (C), dejando la copia mutada de arcA
en el cromosoma (D). strAB, genes de resistencia a estreptomicina (marcador de selección);
sacBR, gen de la enzima levanosacarasa y regulador (marcador de contra-selección); oriR6K,
origen de replicación derivado del plásmido R6K, dependiente de la proteína π.
Determinación de biomasa y PHB. El crecimiento celular se estimó por
turbidometría, registrando la DO600 del cultivo (o una dilución apropiada del mismo) en un
espectrofotómetro GeneSys5 UV-Vis (Spectronic Instruments Inc.; Rochester, NY, EE.UU.).
La concentración celular se expresó como g biomasa (materia celular seca) · l-1 de cultivo.
Con este fin, se tomaron muestras valoradas de los cultivos (ca. 15 ml) a distintos tiempos
según se detalla en la descripción de cada experimento, se centrifugaron (6.000 r.p.m., 4°C,
durante 10 min), se lavaron dos veces por resuspensión (con 1 vol de NaCl 9 g · l-1) y
centrifugación, y el sedimento celular fue secado en estufa a 70°C hasta peso constante, o
71
liofilizado (0,01 mPa a –20°C, durante 18 h). Paralelamente, se procesó un tubo conteniendo
1 vol de la solución salina según el procedimiento recién descripto, y la masa de este tubo fue
restada de la obtenida para los tubos conteniendo biomasa.
Las inclusiones de PHB fueron detectadas cualitativamente por tinción de las células
con la oxazina básica azul del Nilo A (Sigma-Aldrich) según el protocolo descripto por Ostle
y Holt [1982], seguida de observación bajo microscopio de fluorescencia (λexcitación = 460
nm). La forma oxazona del colorante (rosa del Nilo) se forma por oxidación espontánea del
azul del Nilo A en solución acuosa y es soluble en lípidos neutros, de manera que tiñe
específicamente las inclusiones de PHAs.
La concentración de PHB se determinó por cromatografía gaseosa, siguiendo el
protocolo de metanólisis y detección de los metilésteres de 3-hidroxibutirato, esencialmente
como se describe en Braunegg et al. [1978]. Se colocaron alrededor de 10 mg de biomasa
(pesados con exactitud) en tubos de vidrio con tapa de TeflonTM . La metanólisis se desarrolló
añadiendo 2 ml de CH3OH:H2SO4 [85:15 (vol · vol-1)] y 2 ml de CHCl3 a las muestras, las
cuales se incubaron a 120°C durante 150 min. Los tubos se enfriaron a temperatura ambiente,
y se agregaron 2 ml de NaHCO3 1 M para neutralizar el exceso de H2SO4. Se descartó la fase
acuosa y la fase orgánica se extrajo dos veces con H2O destilada. Luego de que se
establecieron dos fases claramente diferenciadas, la fase inferior fue separada con ayuda de
una pipeta de vidrio, secada sobre Na2SO4 anhidro, y finalmente transferida a un tubo con
tapa hermética. Los metilésteres se detectaron en un cromatógrafo de gases Hewlett Packard
HP5890 (Hewlett-Packard Co.; Palo Alto, CA, EE.UU.) equipado con una columna Hewlett
Packard FFAP. Como estándar se utilizó PHB comercial purificado de C. necator [Nikel et
al., 2006]. La concentración de PHB se expresó como g PHB · l-1 de cultivo, y el contenido
de polímero se definió como el cociente porcentual de g PHB · g biomasa-1, o como el
rendimiento de polímero respecto a biomasa (YPHB/X).
Determinación del consumo específico de oxígeno. La velocidad específica de
consumo de oxígeno se determinó utilizando un electrodo de oxígeno disuelto polarográfico
de tipo Clark (Biological Oxygen Monitor 53; Yellow Spring Instruments Inc., Yellow
Spring, OH, EE.UU.). La cámara de medición se cargó con 3 ml de medio LB y se equilibró
a 37°C durante 5 min (i.e., hasta que la lectura arrojada por el electrodo se mantuvo estable),
con agitación magnética constante (100 r.p.m.), y bajo atmósfera de aire. Se agregó una
alícuota de 100 μl de un cultivo de 18 h de la cepa en estudio, crecida en el mismo medio
utilizado para la medición, y se registró la lectura del electrodo durante 10 min. La velocidad
específica de consumo de oxígeno (qO2, expresada en μmol de O2 · min-1 · mg proteína-1) se
determinó a partir de la pendiente de la curva obtenida al graficar saturación de oxígeno
como función del tiempo, y se normalizó respecto a la concentración total de proteínas. La
concentración de proteínas se determinó a partir de un lisado alcalino del cultivo por el
método de Lowry, basado en el reactivo fenólico de Folin [Lowry et al., 1951], utilizando
albúmina sérica bovina cristalina como estándar.
72
2.5. Resultados y discusión
2.5.1. Caracterización preliminar de una cepa ΔarcA de colección para la
acumulación heteróloga de PHB en frascos agitados
Según se comentó en el prefacio de este capítulo, una desregulación en las vías
metabólicas aeróbicas en condiciones de baja disponibilidad de oxígeno, producto de la
ausencia del regulador ArcA se debería traducir en una mayor disponibilidad de equivalentes
de reducción [NAD(P)H] y, al mismo tiempo, considerando que las vías metabólicas
aeróbicas serían parcialmente activas en un contexto arcA, podría esperarse que la
disponibilidad de acetil-CoA sea elevada en estas condiciones. Dado que ambos son sustratos
de las enzimas involucradas en la síntesis de PHAs [Anderson et al., 1990], la acumulación
de estos polímeros debería estar favorecida en mutantes arcA. Considerando el rol de los
PHAs como captadores de equivalentes de reducción [Dawes y Senior, 1973], nuestra
hipótesis se basó en que la desregulación redox podría tener un efecto positivo sobre la
acumulación de PHB, dado el mayor aporte de acetil-CoA y/o de equivalentes de reducción.
Por estos motivos, se procedió a evaluar la acumulación de PHB en un contexto arcA. La
síntesis de PHB se analizó en primer lugar en una cepa ΔarcA de colección previamente
caracterizada en la literatura, E. coli SP314 [Roeder y Somerville, 1979]. Dicha cepa lleva
una mutación cromosomal extendida que abarca arcA, y fue transformada con el plásmido
pJP24, el cual expresa los genes phaBAC de Azotobacter sp. cepa FA8 a partir de un
elemento promotor-operador que contiene el promotor fuerte y constitutivo del fago T5, y dos
secuencias operadoras lac [Nikel et al., 2006].
Como ensayo preliminar para evaluar la disponibilidad intracelular de poder reductor,
el direccionamiento de los equivalentes de reducción hacia la síntesis del polímero se analizó
mediante un ensayo semi-cuantitativo in vivo. La diamida [1,1’-azobis-(N,N-dimetilformamida)] provoca la formación de puentes disulfuro en proteínas y tioles de bajo peso
molecular, y se descripto que dicho efecto es altamente nocivo para el metabolismo celular,
generando respuestas similares a las provocadas por estrés oxidativo. En E. coli, este estrés
oxidativo es mayormente neutralizado a través de la acción de la enzima tioredoxina
reductasa (Fig. 2.2., A), la cual utiliza NADPH como co-factor para la reducción de los
puentes disulfuro tóxicos a tioles libres [Carmel-Harel y Storz, 2000]. Por este motivo, la
sensibilidad a la diamida provee una estimación indirecta acerca de la disponibilidad
intracelular de NADPH (i.e., una mayor sensibilidad evidencia limitación de NADPH como
co-sustrato de la tioredoxina reductasa), fenómeno que ha sido previamente demostrado y
caracterizado en Streptomyces lividans [Butler et al., 2002]. De esta manera, se analizó la
sensibilidad a diamida en placas de medio MTX de E. coli SP314 conteniendo el vector
pQE32, o el plásmido pJP24 (derivado de pQE32, phaBACAzotobacter sp. cepa FA8). El medio MTX
contiene xilosa como sustrato carbonado para evitar cualquier efecto derivado de la represión
catabólica ejercida por la glucosa sobre los genes controlados por ArcA.
73
La cepa conteniendo los genes pha mostró mayor sensibilidad a diamida (evidenciada
por un halo de inhibición de mayor diámetro) comparada con la cepa control, lo cual
reflejaría una menor disponibilidad intracelular de poder reductor debida a la expresión de los
genes pha y la síntesis de polímero (Fig. 2.2, B y C). La acumulación de PHB fue chequeada
en forma cualitativa por tinción con azul del Nilo A y observación en microscopio de
fluorescencia, encontrándose gránulos naranja fuertemente fluorescentes en E. coli
SP314/pJP24, pero no en SP314/pQE32 (datos no mostrados).
B
A
S–S
Trx–(S–S)
NADP+
Trx reductasa
C
2SH
Trx–(SH)2
+
NADPH + H
Fig. 2.2. Ensayo de sensibilidad a diamida. Se muestra el mecanismo de acción de la
enzima tiorredoxina reductasa, la cual utiliza NADPH para la reducción de puentes disulfuro
citoplasmáticos (A). Ensayo de sensibilidad a diamida para E. coli SP314 transformada con
los plásmidos pQE32 (B), o pJP24 (C). Un cultivo de 18 h en MTX de cada una de las cepas
a ensayar se plaqueó en medio MTX sólido, se aplicaron discos de papel de filtro conteniendo
diamida 0,1 M (izquierda) o 0,5 M (derecha), y la sensibilidad se determinó indirectamente
por medición de los halos de inhibición del crecimiento después de 24 h de incubación a
37°C. Trx, tiorredoxina.
Los únicos requerimientos nutricionales teóricos para la cepa auxótrofa SP314 son
serina y biotina, como se deriva del genotipo disponible para esta mutante [Roeder y
Somerville, 1979]. Sin embargo, dicha cepa fue incapaz de crecer en medio mínimo
suplementado con los aditivos nutricionales mencionados. El escaso crecimiento (o incluso la
ausencia del mismo) de cepas arcA en medio mínimo ha sido anteriormente descripto en la
literatura, y se ha reportado la necesidad de añadir casaminoácidos (un hidrolizado ácido
completo de la caseína), extracto de levadura, o triptona al medio de cultivo para alcanzar un
crecimiento significativo [Fu et al., 1991]. Por este motivo E. coli SP314/pJP24 se hizo
crecer en un medio formulado específicamente para su crecimiento óptimo, MYA/Glucosa,
cuya composición se describe en Materiales y métodos. Por otro lado, y según se mencionó
en la descripción del ensayo de sensibilidad a diamida, la xilosa es un sustrato carbonado
74
usualmente utilizado para muchos estudios sobre la regulación mediada por ArcAB, con el
fin de evitar la represión catabólica ejercida por la glucosa sobre muchos de los genes que
este sistema regulatorio modula. En nuestro caso, ensayos preliminares diseñados para elegir
una fuente carbonada apropiada para la síntesis heteróloga de PHB en medio MYA mostraron
que no hubo diferencias significativas respecto a la acumulación del polímero entre la
utilización de xilosa o glucosa como fuentes de carbono (datos no mostrados). Por lo tanto, y
en base a estos resultados, en la mayoría de los experimentos tendientes a la caracterización
fisiológica de las cepas recombinantes, se utilizó glucosa como principal sustrato carbonado.
En la siguiente etapa se estudió la influencia de la disponibilidad de oxígeno sobre la
síntesis de PHB por E. coli SP314/pJP24. Dado que el rol de ArcA en la modulación de las
respuestas fisiológicas resulta altamente dependiente de la disponibilidad de oxígeno, se
analizaron diversas condiciones de cultivo con el objetivo de individualizar cuál de ellas
podría resultar más efectiva para la acumulación de PHB. En la Tabla 2.3 se muestran los
resultados respecto a crecimiento y acumulación del polímero luego de 48 h de cultivo en
frascos agitados. Se observó un aumento significativo en la acumulación de PHB (análisis de
la varianza, ANOVA; P < 0,05) en condiciones microaeróbicas respecto a las condiciones de
mayor aireación, a pesar de que se registró una disminución en la concentración final de
biomasa. El incremento en la acumulación del polímero correlacionó en forma directa con la
disminución en la disponibilidad de oxígeno.
Condición de cultivo
Alta aerobiosis
Aerobiosis normal
Microaerobiosis
Relación volumen de
medio:volumen de frasco
1:20
1:5
1:1
Biomasa (g · l-1)
PHB (%)
4,81 ± 0,38
4,36 ± 0,25
1,73 ± 0,15
13 ± 3
16 ± 2
24 ± 4
Tabla 2.3. Comparación del crecimiento y acumulación de PHB (expresado como
porcentaje de la biomasa) a partir de glucosa por E. coli SP314/pJP24 en diferentes
condiciones de cultivo. Para cada experimento, se inocularon frascos Erlenmeyer conteniendo
el volumen adecuado de MYA/Glucosa con 0,05 g · l-1 de biomasa provenientes de un cultivo
de 18 h crecido en las mismas condiciones de disponibilidad de oxígeno que las utilizadas en
cada ensayo. Los resultados representan el promedio obtenido a partir de mediciones por
triplicado en al menos dos cultivos independientes ± desviación estándar.
En un estudio anterior de nuestro laboratorio hemos analizamos la síntesis de PHB
por E. coli K1060/pJP24. Esta cepa fue capaz de acumular aeróbicamente hasta un 65% de
polímero (respecto a biomasa) a partir de lactosuero como principal sustrato carbonado y
macerado de maíz como suplemento nitrogenado complejo [Nikel et al., 2005]. Para
comparar la síntesis microaeróbica de polímero en una cepa arcA+ con la observada en E. coli
SP314/pJP24, evaluando la contribución de la mutación en el regulador global sobre los
parámetros de interés, ambas cepas se hicieron crecer en condiciones de baja disponibilidad
de oxígeno en frascos agitados. Dado que la síntesis de PHB por la cepa SP314 se ve
favorecida en condiciones microaeróbicas (Tabla 2.3), la comparación entre la cepa salvaje y
la mutante ΔarcA se estableció bajo dichas condiciones de disponibilidad de oxígeno. Como
controles, ambas cepas se hicieron crecer paralelamente en condiciones estándar de
aerobiosis. Los resultados de estos experimentos se muestran en la Tabla 2.4.
75
Cepa
SP314/pJP24
K1060/pJP24
SP314/pJP24
K1060/pJP24
Condición
Aerobiosis
Aerobiosis
Microaerobiosis
Microaerobiosis
Biomasa (g · l-1)
2,95 ± 0,09
3,85 ± 0,14
2,21 ± 0,12
1,45 ± 0,05
PHB (g · l-1)
0,35 ± 0,07
1,04 ± 0,21
0,51 ± 0,06
<0,05
PHB (%)
12 ± 2
27 ± 2
23 ± 2
<4
Tabla 2.4. Relación entre la disponibilidad de oxígeno, crecimiento y acumulación de
PHB por E. coli SP314 (ΔarcA) y K1060 (arcA+) transformadas con el plásmido pJP24. Las
condiciones de disponibilidad de oxígeno se definieron según se detalla en la leyenda de la
Tabla 2.3. Se muestran los promedios de mediciones por triplicado en al menos dos cultivos
independientes ± desviación estándar.
Se comprobó que E. coli SP314/pJP24 presentó el máximo rendimiento de PHB
respecto a biomasa en microaerobiosis (23 ± 2%), repitiendo los resultados ya obtenidos (ver
Tabla 2.3.), mientras que E. coli K1060/pJP24 (la cepa salvaje) no acumuló cantidades
detectables de polímero en dichas condiciones (<4%, cercano al límite de detección del
método cromatográfico utilizado para el análisis de PHB). En particular, el rendimiento de
PHB, expresado como porcentaje de biomasa, en E. coli SP314/pJP24 en microaerobiosis fue
comparable al obtenido con la cepa salvaje en condiciones aeróbicas (siendo éste de 27 ± 2%,
P < 0,05). La generación de biomasa, a su vez, correlacionó positivamente con la
disponibilidad de oxígeno. Este es un resultado esperable, dado que a una mayor aireación del
medio de cultivo corresponde una mayor funcionalidad del ciclo de ácidos tricarboxílicos
(TCA) y de las vías anabólicas para generación de componentes de la biomasa [Neidhardt et
al., 1990]. Según lo expuesto, ambas cepas presentaron mayor crecimiento en condiciones
aeróbicas. En condiciones microaeróbicas, sin embargo, la cepa ΔarcA presentó un
crecimiento mayor que la cepa salvaje. Este comportamiento podría atribuirse al hecho de
que en las mutantes arcA la actividad del ciclo TCA se encuentra desregulada, proveyendo
componentes para la síntesis de biomasa aún en condiciones de baja disponibilidad de
oxígeno. Tomados en conjunto, estos resultados sugerirían que la presencia de mutaciones en
el gen para el regulador global ArcA favorece la síntesis heteróloga de PHB.
2.5.2. Caracterización de la capacidad respiratoria
nutricionales de distintas cepas arcA de E. coli
y
requerimientos
Dado que ArcA es un regulador global que modula positiva o negativamente la
expresión de al menos 51 operones [Lynch y Lin, 1996; Liu y De Wulf, 2004], puede
asumirse que la desregulación transcripcional en dichas mutantes podría tener un efecto
negativo sobre el crecimiento de las mismas. Dicha desregulación también se relacionaría con
los extensivos requerimientos nutricionales de las mutantes de deleción, mencionados en la
sección precedente. En la literatura se ha descripto la utilización de una mutante arcA de
inserción capaz de crecer en medio mínimo suplementado con una pequeña cantidad de
casaminoácidos (0,3 g · l-1) [Fu et al., 1991]. Se trata de E. coli ECL618, que lleva la
mutación arcA::IS10-L (originalmente denominada arcA2, cercana a zij::Tn10) [Iuchi et al.,
1989]. Esta mutación fue aislada y descripta por su capacidad de suprimir la expresión de los
genes tra del plásmido F y activar la expresión del citocromo d oxidasa. La secuenciación
parcial del locus arcA en esta cepa confirmó la existencia de una secuencia de inserción de
tipo Tn10 interrumpiendo el gen [Iuchi et al., 1994; cf. Capítulo IV].
76
Considerando el efecto pleiotrópico de una mutación en un regulador global, se decidió
completar la caracterización fenotípica de esta mutante, comparándola con la de una cepa de
deleción obtenida del E. coli Genetic Stock Center (SP314), y la cepa salvaje.
En primer lugar, se estudió el fenotipo Dye de E. coli ECL618. El fenotipo Dye se
caracteriza por la ausencia de crecimiento de mutantes ΔarcA en presencia de colorantes
redox, como el azul de toluidina o el azul de metileno [Iuchi y Lin, 1988]. De hecho, uno de
los primeros nombres que se dio al gen arcA fue dye, en virtud del mencionado fenotipo de
las cepas mutantes para este gen [Roeder y Somerville, 1979]. Aún cuando las características
del fenotipo Dye han sido documentadas desde el aislamiento del gen arcA, no se dispone de
una explicación de las causas que determinan la ausencia de crecimiento. Cuando ECL618 se
plaqueó en medio TB (conteniendo azul de toluidina O 200 μg · ml-1), se encontró que esta
cepa es capaz de generar colonias pequeñas a medianas. La cepa de deleción SP314 no
presentó crecimiento evidente en las mismas condiciones, razón por la cual esta interesante
diferencia fenotípica entre las cepas en estudio fue sometida a otros análisis. La capacidad
respiratoria de las mutantes se determinó polarimétricamente según se describe en Materiales
y métodos. El consumo de oxígeno (qO2) se midió en cultivos de 18 h en frascos agitados de
las cepas K1060 (arcA+), SP314 (arcA) y ECL618 (arcA::IS10-L) en medio líquido
MYA/Glucosa. Se encontró que el consumo específico de oxígeno de SP314 fue de 10,81 ±
0,95 μmol O2 · min-1 · mg proteína-1, y el de ECL618 fue 19,64 ± 1,07 μmol O2 · min-1 · mg
proteína-1, mientras que el de K1060 fue de 7,18 ± 0,11 μmol O2 · min-1 · mg proteína-1. En
concordancia con el comportamiento distintivo de las mutantes respecto al fenotipo Dye, se
encontraron diferencias fenotípicas significativas respecto a la capacidad respiratoria (P <
0,01) entre las cepas que llevan diferentes mutaciones en el gen arcA.
Por otro lado, se encontró que la expresión de los genes pha no afectó en forma
significativa la capacidad respiratoria en un contexto arcA. Para ello, se construyó la cepa
CT548, transfiriendo el alelo arcA::IS10-L de ECL618 a la cepa CT547 por transducción
generalizada utilizando el fago P1. En CT548 la expresión del gen sdh (que codifica la
enzima succinato deshidrogenasa) puede determinarse a través de una fusión cromosomal
Φ(sdh-lacZ). La presencia del alelo arcA::IS10-L aumentó la tasa respiratoria en ca. 2,3 veces
(datos no mostrados) respecto a la observada en ECL547. Asimismo, se midió el consumo de
oxígeno en CT548/pQE32 (arcA::IS10-L, cepa control), y CT548/pJP24 (arcA::IS10-L,
pha+). Los valores obtenidos fueron qO2 = 20,05 ± 0,83 y 21,16 ± 0,92 μmol O2 · min-1 · mg
proteína-1, respectivamente. Un resultado interesante fue que la expresión de sdh no difirió
significativamente en ambas cepas (determinaciones no mostradas). Estos resultados
sugerirían que una cepa portando la mutación arcA::IS10-L podría ser adecuada para la
acumulación heteróloga de PHB, considerando que: i) la expresión de los genes pha no afecta
la capacidad respiratoria de la cepa, ii) la actividad del ciclo TCA probablemente no se vería
significativamente modificada, y iii) la mutante es capaz de crecer sin los extensivos
requerimientos nutricionales necesarios para el crecimiento de mutantes de deleción.
77
2.5.3. Síntesis de PHB por cepas recombinantes de E. coli con mutaciones
ΔarcA y arcA::IS10-L
En virtud de los resultados hasta aquí discutidos, el análisis de las características
fenotípicas de cepas portando la mutación arcA::IS10-L resultó en la elección de dichas
mutantes para continuar con el estudio de la acumulación heteróloga de PHB. Con el objetivo
de comparar la influencia de distintas mutaciones en arcA sobre la síntesis de PHB en el
mismo contexto genético, se construyó una cepa arcA::IS10-L isogénica a E. coli K1060 (la
cepa protótrofa utilizada en ensayos anteriores) por transducción con fago P1 del locus
arcA::IS10-L de ECL618 a K1060, y posterior selección de las transductantes por resistencia
a tetraciclina. Por otro lado, y según se discutió oportunamente, la cepa SP314 lleva una
mutación cromosomal extendida en la región arcA, razón por la cual se construyó una
mutante ΔarcA derivada de K1060 por PCR mutagénica y reemplazo alélico (la descripción
detallada de la construcción se expone en Materiales y métodos). El plásmido pJP24 fue
introducido por transformación en las cepas CT1062 (ΔarcA) y CT1061 (arcA::IS10-L),
generando las correspondientes derivadas pha +.
El crecimiento y la capacidad de acumular PHB en microaerobiosis se evaluó en
condiciones de crecimiento controladas en cultivos de 48 h en biorreactor en las tres cepas
experimentales isogénicas. Las condiciones microaeróbicas se obtuvieron a través de
agitación suave (75 r.p.m., para mantener condiciones de homogeneidad en el cultivo), y sin
burbujeo de aire en el biorreactor. En estas condiciones, la concentración inicial de oxígeno
fue de alrededor de 15-20% de saturación de aire, y rápidamente se redujo en ca. 6 h a <5%.
Según se discutió anteriormente, las cepas de E. coli que llevan la mutación arcA::IS10-L son
capaces de crecer en un medio salino siempre que el mismo sea suplementado con una
pequeña cantidad de casaminoácidos. Por lo tanto, el cultivo de E. coli CT1061/pJP24 se
llevó a cabo en el medio SMA/Glucosa, el cual contiene la misma concentración de sales que
MYA, con una reducción de la concentración de casaminoácidos a 0,3 g · l-1, sin extracto de
levadura, y con adición de elementos traza.
En la Fig. 2.3 se muestran los resultados obtenidos para los cultivos en biorreactor de
E. coli K1060/pJP24 (A) y E. coli CT1062/pJP24 (B) en medio MYA/Glucosa. Ambas cepas
fueron capaces de crecer en condiciones microaeróbicas, alcanzando la fase estacionaria de la
curva de crecimiento luego de ca. 8 h de crecimiento exponencial. Puede observarse que la
concentración final de biomasa fue similar para ambas cepas (i.e., 48 h de cultivo). Sin
embargo, y de acuerdo a los resultados anteriormente obtenidos en frascos agitados,
K1060/pJP24 no acumuló cantidades significativas de PHB; mientras CT1062/pJP24 alcanzó
valores de acumulación de PHB similares a los obtenidos en cultivos en frascos agitados. Por
otro lado, las velocidades máximas de crecimiento observadas para las cepas K1060/pJP24 y
CT102/pJP24 en estas condiciones fueron μ = 0,55 ± 0,04 y 0,56 ± 0,02 h-1, respectivamente.
78
2,5
A
-1
0,20
0,15
1,0
0,10
0,5
0,05
-1
1,5
PHB (g · l ), YPHB/X
2,0
Biomasa (g · l )
0,25
Conc. biomasa
Conc. PHB
YPHB/X
0,00
0,0
0
10
20
30
40
50
Tiempo (h)
B
-1
2,0
1,5
1,0
0,5
0,0
0
10
20 30 40
Tiempo (h)
-1
0,9
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0,0
Conc. biomasa
Conc. PHB
YPHB/X
Biomasa (g · l )
2,5
50
Fig. 2.3. Perfiles de biomasa, PHB, y rendimiento de PHB respecto a biomasa (YPHB/X)
para cultivos microaeróbicos en biorreactor de E. coli K1060/pJP24 (A) y CT1062/pJP24 (B)
en medio MYA/Glucosa. Los resultados muestran el valor promedio para cada parámetro ±
desviación estándar, obtenidos a partir de mediciones por duplicado en dos cultivos
independientes. Conc., concentración.
Los resultados obtenidos para CT1061/pJP24 cultivada en las mismas condiciones de
disponibilidad de oxígeno, pero en medio SMA/Glucosa, se muestran en la Fig. 2.4. La
concentración final de biomasa y de PHB fueron significativamente mayores (P < 0,05) que
las alcanzadas por la cepa salvaje y la cepa ΔarcA, lo cual resultó en un mayor porcentaje de
acumulación de polímero respecto a biomasa. Además, CT1061/pJP24 creció en el medio
semi-sintético SMA/Glucosa con μ = 0,69 ± 0,03 h-1, mayor a la observada en las restantes
cepas en estudio (P < 0,05). Para completar la caracterización de la mutación arcA::IS10-L,
CT1061/pJP24 se hizo crecer en condiciones microaeróbicas en medio MYA/Glucosa y al
evaluar los parámetros de interés anteriormente descriptos, se obtuvieron valores similares de
biomasa, concentración de PHB, y acumulación de polímero, aunque se registró una mayor
velocidad de crecimiento en el medio complejo respecto de la observada en SMA/Glucosa
(datos no mostrados).
79
-1
2,0
1,8
1,6
1,4
1,2
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
Conc. biomasa
Conc. PHB
YPHB/X
0
10
20
30
40
-1
5,0
4,5
4,0
3,5
3,0
2,5
2,0
1,5
1,0
0,5
0,0
Biomasa (g · l )
Recientemente se ha descripto la acumulación de PHB por E. coli DH5α expresando
los genes pha de C. necator en condiciones estrictamente anaeróbicas [Carlson et al., 2005].
A diferencia de los resultados descriptos en dicho estudio, en el cual se utiliza un medio de
cultivo complejo, en este trabajo se alcanzaron mayores velocidades de crecimiento y de
acumulación de polímero en un medio semi-sintético utilizando E. coli CT1061/pJP24.
50
Tiempo (h)
Fig. 2.4. Perfiles de biomasa, PHB, y rendimiento de PHB respecto a biomasa (YPHB/X)
para los cultivos microaeróbicos en biorreactor de E. coli CT1061/pJP24 (arcA::IS10-L) en
medio SMA/Glucosa. Los resultados representan el valor promedio para cada parámetro ±
desviación estándar, obtenidos a partir de mediciones efectuadas por triplicado en dos
cultivos independientes. Conc., concentración.
La Tabla 2.5 resume las propiedades fenotípicas estudiadas en las cepas
experimentales en relación a la acumulación microaeróbica de PHB.
Cepa
K1060
CT1062
CT1061
Biomasa
(g · l-1)
1,95 ± 0,12
1,96 ± 0,05
4,12 ± 0,21
PHB (%)
μmax (h-1)
<4
27 ± 2
35 ± 3
0,55 ± 0,04
0,56 ± 0,02
0,69 ± 0,03
qO2
(μmol O2 · min-1 · mg proteína-1)
7,21 ± 0,07
12,35 ± 0,97
29,07 ± 1,14
Tabla 2.5. Resumen de las características fenotípicas de las distintas cepas en estudio.
Todas las cepas fueron transformadas con pJP24, y crecidas en cultivos en batch en
biorreactor. E. coli K1060 (arcA+) y CT1062 (ΔarcA) se hicieron crecer en MYA/Glucosa,
mientras que los cultivos de CT1061 (arcA::IS10-L) se desarrollaron en el medio semisintético SMA/Glucosa. En todos los casos, se muestran los promedios ± desviación estándar
de mediciones efectuadas por duplicado a partir de al menos dos cultivos independientes. Las
diferencias observadas entre E. coli CT1061 y las cepas restantes fue significativa para todos
los parámetros estudiados (P ≤ 0,05). qO2, velocidad específica de consumo de oxígeno.
80
La caracterización de E. coli SP314 anteriormente descripta mostró que la misma
posee un bajo rendimiento de biomasa y requerimientos nutricionales que no resultan
compatibles con la formulación de un medio de cultivo para su aplicación en bioprocesos a
mayor escala. Dado que esta cepa lleva dos deleciones extendidas (una de ellas comienza en
los genes deo y se extiende más allá de arcA, y la otra incluye los genes gal y bio), las
características fenotípicas observadas (fundamentalmente, los requerimientos nutricionales
extensivos) podrían haberse debido a otras mutaciones además de la ausencia de ArcA. Sin
embargo E. coli CT1062, una cepa ΔarcA con una deleción confinada, fue incapaz de crecer
en medio mínimo si éste no era suplementado con casaminoácidos y extracto de levadura
(requerimientos también observados para SP314). Este resultado sugeriría que esta
característica fenotípica podría estar indirectamente relacionada con la deleción en arcA. Por
otra parte, no resulta sorprendente considerar la necesidad de dichos requerimientos
nutricionales para el crecimiento si se consideran los efectos pleiotrópicos de una mutación
en un regulador global, los cuales no siempre son directamente predecibles. El hecho de que
E. coli CT1061 no requiera de tales suplementos nutricionales no sólo presenta relevancia
biotecnológica, si no que además facilitó su caracterización fenotípica, dado que la presencia
de componentes complejos en el medio de cultivo (e.g., extracto de levadura) introduce
variables adicionales que podrían tener efectos difíciles de individualizar en la interpretación
de los resultados.
Existen algunos estudios en los cuales se discuten técnicas para la manipulación de
reacciones metabólicas tendientes al incremento de NADPH para la síntesis heteróloga de
PHAs en E. coli, pero la mayoría de ellos fueron desarrollados en condiciones estrictamente
aeróbicas [Wang y Lee, 1997; van Wegen et al., 2001]. En este capítulo se ha descripto la
manipulación de la disponibilidad de equivalentes de reducción y del sustrato carbonado para
la vía biosintética de PHAs a través de mutaciones en un regulador del estado redox
intracelular de E. coli, un abordaje que no había sido considerado a la fecha.
Ackermann, J. U., y W. Babel. 1997.
Growth-associated synthesis of poly
(hydroxybutyric acid) in Methylobacterium
rhodesianum as an expression of an
internal bottleneck. Appl. Microbiol.
Alper, R., D. G. Lundgren, R. H.
Marchessault, y W. A. Cote. 1963.
Properties of poly-β-hydroxybutyrate. I.
General considerations concerning the
naturally occurring polymer. Biopolymers
1:545-556.
Ahn, W. S., S. J. Park, y S. Y. Lee. 2000.
Production of poly(3-hydroxybutyrate) by
fed-batch
culture
of
recombinant
Escherichia coli with a highly concentrated
whey solution. Appl. Environ. Microbiol.
66:3624-3627.
Aldor, I. S., y J. S. Keasling. 2003. Process
design for microbial plastic factories:
metabolic engineering of polyhydroxyalkanoates. Curr. Opin. Biotechnol. 14:1-9.
Anderson, A. J., G. W. Haywood, y E. A.
Dawes.
1990.
Biosynthesis
and
composition of bacterial poly(hydroxyalkanoates). Int. J. Biol. Macromol.
12:102-105.
81
Baker, A. M. M., y J. Mead. 2005.
Thermoplastics, p. 1.1-1.9. En C. A. Harper
(ed.), Modern plastics handbook. McGrawHill Professional, New York.
Baptist, J., y F. Werber. 1964. Poly-βhydroxybutyric acid - A naturally occurring
thermo-plastic material. Soc. Plast. Eng.
Trans. 4:245-250.
Bevan, M. W., y M. C. R. Franssen. 2006.
Investing in green and white biotech. Nat.
Birnboim, H., y J. Doly. 1979. A rapid
alkaline extraction procedure for screening
recombinant plasmid DNA. Nucleic Acids
Res. 7:1513-1523.
Blomfield, I. C., V. Vaughn, R. F. Rest, y B.
I. Eisenstein. 1991. Allelic exchange in
Escherichia coli using the Bacillus subtilis
sacB gene and a temperature-sensitive
pSC101 replicon. Mol. Microbiol. 5:14471457.
Bourque, D., Y. Pomerleau, y D. Groleau.
1995. High-cell-density production of polyβ-hydroxybutyrate (PHB) from methanol
by
Methylobacterium
extorquens:
production of high-molecular-mass PHB.
Braunegg, G., B. Sonnleitner, y R. M.
Lafferty. 1978. A rapid gas chromatographic method for the determination of
poly-β-hydroxybutyric acid in microbial
biomass. Eur. J. Appl. Microbiol.
Braunegg, G., G. Lefebvre, y K. F. Genser.
1998. Polyhydroxyalkanoates, biopolyesters
from
renewable
resources:
physiological and engineering aspects. J.
Brivonese, A. C., y I. W. Sutherland. 1989.
Polymer production by a mucoid strain of
Azotobacter vinelandii in batch culture.
Butler, M. J., P. Bruheim, S. Jovetic, F.
Marinelli, P. W. Postma, y M. J. Bibb.
2002. Engineering of primary carbon
metabolism for improved antibiotic
production in Streptomyces lividans. Appl.
Environ. Microbiol. 68:4731-4739.
Byrom, D. 1987. Polymer synthesis by microorganisms: technology and economics.
Trends Biotechnol. 5:246-250.
Carlson, R., A. Wlaschin, y F. Srienc. 2005.
Kinetic studies and biochemical pathway
analysis
of
anaerobic
poly-(R)-3hydroxybutyric
acid
synthesis
in
71:713-720.
Carmel-Harel, O., y G. Storz. 2000. Roles of
the glutathione- and thioredoxin-dependent
reduction systems in the Escherichia coli
and Saccharomyces cerevisiae responses to
oxidative stress. Annu. Rev. Microbiol.
54:439-461.
Cromwick, A. M., T. Foglia, y R. W. Lenz.
1996. The microbial production of poly
(hydroxyalkanoates) from tallow. Appl.
Choi, J. C., H. D. Shin, y Y. H. Lee. 2003.
Modulation of the 3-hydroxyvalerate molar
fraction in poly(3-hydroxybutyrate-co-3hydroxyvalerate) using Ralstonia eutropha
transformant co-amplifying phbC and
NADPH generation-related zwf genes.
Enzyme Microb. Technol. 32:178-185.
Choi, J. I., y S. Y. Lee. 1997. Process analysis
and economic evaluation for poly(3-hydroxybutyrate) production by fermentation.
Bioprocess Eng. 17:335-342.
Choi, J. I., S. Y. Lee, y K. Han. 1998.
Cloning of the Alcaligenes latus
polyhydroxyalkanoate biosynthesis genes
and use of these genes for enhanced
production of poly(3-hydroxybutyrate) in
64:4897-4903.
Choi, J. I., y S. Y. Lee. 1999. High-level
production of poly(3-hydroxybutyrate-co3-hydroxyvalerate) by fed-batch culture of
recombinant Escherichia coli. Appl.
Choi, J. I., y S. Y. Lee. 2004. High level
production of supra molecular weight
poly(3-hydroxybutyrate) by metabolically
engineered Escherichia coli. Biotechnol.
Bioprocess Eng. 9:196-200.
82
10:135-266.
de Lorenzo, V., y K. N. Timmis. 1994.
Analysis and construction of stable
phenotypes in gram-negative bacteria with
Tn5- and Tn10-derived minitransposons.
Methods Enzymol. 235:386-405.
Derraik, J. G. 2002. The pollution of the
marine environment by plastic debris: a
review. Mar. Pollut. Bull. 44:842-852.
Fidler, S., y D. Dennis. 1992. Polyhydroxyalkanoate production in recombinant
103:231-236.
Forsyth, W. G., A. C. Hayward, y J. B.
Roberts. 1958. Occurrence of poly-βhydroxybutyric acid in aerobic gramnegative bacteria. Nature 182:800-801.
Fu, H. A., S. Iuchi, y E. C. C. Lin. 1991. The
requirement of ArcA and Fnr for peak
expression of the cyd operon in Escherichia
coli under microaerobic conditions. Mol.
Gen. Genet. 226:209-213.
Gerngross, T. U., K. D. Snell, O. P. Peoples,
A. J. Sinskey, E. Csuhai, S. Masamune, y
J. Stubbe. 1994. Overexpression and
purification of the soluble polyhydroxyalkanoate synthase from Alcaligenes
eutrophus: evidence for a required
posttranslational modification for catalytic
activity. Biochemistry 33:9311-9320.
Grothe, E., y Y. Chisti. 2000. Poly(βhydroxybutyric
acid)
thermoplastic
production by Alcaligenes latus: behavior
of fed-batch cultures. Bioprocess Eng.
22:441-449.
Guillet, J. 2002. Plastics and environment, p.
413-448. En G. Scott (ed.), Degradable
polymers: principles and applications.
Kluwer Academic Publisher, Dordrecht,
Holanda.
Hahn, J. J., A. Eschenlauer, A. M. Narrol,
D. Somers, y F. Srienc. 1997. Growth
kinetics, nutrient uptake, and expression of
the
Alcaligenes
eutrophus
poly(βhydroxybutyrate) synthesis pathway in
transgenic maize cell suspension cultures.
Hahn, S. K., Y. K. Chang, y S. Y. Lee. 1995.
Recovery and characterization of poly(3hydroxybutyric acid) synthesized in
Alcaligenes eutrophus and recombinant
61:34-39.
Han, J., Y. Z. Qiu, D. C. Liu, y G. Q. Chen.
2004. Engineered Aeromonas hydrophyla
for enhanced production of poly(3hydroxybutyrate-co-3-hydroxyhexanoate)
with alterable monomers composition.
Hanahan, D. 1985. Techniques for
transformation of Escherichia coli, p. 109135. En D. M. Glover (ed.), DNA cloning:
a practical approach, vol. 1. IRL Press,
Oxford, Inglaterra.
Hänggi, U. J. 1990. Pilot scale production of
PHB with Alcaligenes latus, p. 65-70. En
E. A. Dawes (ed.), Novel biodegradable
microbial polymers. Kluwer Academic
Publishers, Dordrecht, Holanda.
Hartmann, R., R. Hany, E. Pletscher, A.
Ritter, B. Witholt, y M. Zinn. 2006.
Tailor-made olefinic medium-chain-length
poly[(R)-3-hydroxyalkanoates]
by
Pseudomonas putida GPo1: batch versus
chemostat production. Biotechnol. Bioeng.
93:737-746.
Hassan, M. A., Y. Shirai, N. Kusubayashi,
M. L. A. Karim, K. Nakanishi, y K.
Hashimoto. 1997. The production of
polyhydroxyalkanoate from anaerobically
treated palm oil mill effluent by
Rhodobacter spheroides. J. Ferment.
Bioeng. 83:485-488.
Herrero, M., V. de Lorenzo, y K. N.
Timmis. 1990. Transposon vectors
containing
non-antibiotic
resistance
selection markers for cloning and stable
chromosomal insertion of foreign genes in
gram-negative bacteria. J. Bacteriol. 172:
6557-6567.
83
Hori, K., K. Soga, y Y. Doi. 1994. Effect of
culture conditions on molecular weights of
poly(3-hydroxyalkanoates) produced by
Pseudomonas putida from octanoate.
Biotechnol. Lett. 16:709-714.
Hrabak, O. 1992. Industrial production of
poly-β-hydroxybutyrate. FEMS Microbiol.
Rev. 103:251-256.
Huisman, G. W., E. Wonink, G. J. M. de
Koning, H. Preusting, y B. Witholt. 1992.
Synthesis of poly(3-hydroxyalkanoates) by
mutant and recombinant Pseudomonas
strains. Appl. Microbiol. Biotechnol. 38:15.
pathways. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:
1888-1892.
Iuchi, S., D. Furlong, y E. C. C. Lin. 1989.
Differentiation of arcA, arcB, and cpxA
mutant phenotypes of Escherichia coli by
sex pilus formation and enzyme regulation.
J. Bacteriol. 171:2889-2893.
Iuchi, S., A. Aristarkhov, J. M. Dong, J. S.
Taylor, y E. C. C. Lin. 1994. Effects of
nitrate respiration on expression of the Arccontrolled operons encoding succinate
dehydrogenase and flavin-linked L-lactate
dehydrogenase. J. Bacteriol. 176:16951701.
Jendrossek, D. 2001. Microbial degradation
of biopolyesters. Adv. Biochem. Eng.
John, M. E., y G. Keller. 1996. Metabolic
pathway
engineering
in
cotton:
biosynthesis of polyhydroxybutyrate in
fiber cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA
93:12768-12773.
Johnstone, B. 1990. A throw away answer.
Far Eastern Econ. Rev. 147:62-63.
Kaniga, K., I. Delor, y G. R. Cornelis. 1991.
A wide-host-range suicide vector for
improving reverse genetics in gramnegative bacteria: inactivation of the blaA
gene of Yersinia enterocolitica. Gene 109:
137-141.
Kichise, T., T. Fukui, Y. Yoshida, y Y. Doi.
1999. Biosynthesis of polyhydroxyalkanoates
(PHA)
by
recombinant
Ralstonia eutropha and effects of PHA
synthase activity on in vivo PHA
biosynthesis. Int. J. Biol. Macromol. 25:6977.
Kim, B. S., y H. N. Chang. 1998. Production
of poly(3-hydroxybutyrate) from starch by
Azotobacter chroococcum. Biotechnol.
Lett. 20:109-112.
Kusaka, S., T. Iwata, y Y. Doi. 1999.
Properties and biodegradability of ultrahigh-molecular-weight poly[(R)-3-hydroxybutyrate] produced by a recombinant
Escherichia coli. Int. J. Biol. Macromol.
25:87-94.
Leaf, T., M. Peterson, M. S. Stoup, D.
Somers, y F. Srienc. 1996. Saccharomyces
cerevisiae expressing bacterial polyhydroxybutyrate synthase produces poly-3hydroxybutyrate. Microbiology 142:11691180.
Lee, E. Y., S. H. Kang, y C. Y. Choi. 1995a.
Biosynthesis of poly(3-hydroxybutyrateco-3-hydroxyvalerate) by newly isolated
Agrobacterium sp. SH-1 and GW-014 from
structurally unrelated single carbon
substrates. J. Ferment. Bioeng. 79:328-334.
Lee, I. Y., M. K. Kim, H. N. Chang, y Y. H.
Park. 1995b. Regulation of poly-βhydroxybutyrate biosynthesis by nicotinamide nucleotides in Alcaligenes eutrophus.
Kalia, V. C., N. Raizada, y V. Sonakya.
2000. Bioplastics. J. Sci. Ind. Res. 59:433445.
84
Lee, S. H., D. H. Oh, W. S. Ahn, Y. Lee, J. I.
Choi, y S. Y. Lee. 2000. Production of
poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyhexanoate) by high-cell-density cultivation
of Aeromonas hydrophyla. Biotechnol.
Bioeng. 67:240-244.
Lee, S. Y., K. S. Kim, H. N. Chang, y Y. K.
Chang. 1994. Construction of plasmids,
estimation of plasmid stability, and use of
these plasmids for the production of
poly(3-hydroxybutyric acid) by recombinant Escherichia coli. J. Biotechnol.
32:203-211.
Lee, S. Y. 1996a. Bacterial polyhydroxyalkanoates. Biotechnol. Bioeng. 49:1-14.
Lee, S. Y. 1996b. Plastic bacteria? Progress
and prospects for polyhydroxyalkanoate
production in bacteria. Trends Biotechnol.
14:431-438.
Lemos, P. C., Y. Dai, Z. Yuan, H. Santos, J.
Keller, y M. A. M. Reis. 2007.
Metabolism of glycogen-accumulating
organisms (GAO) revealed by in vivo 13C
nuclear magnetic resonance. Environ.
Microbiol. 9:2694-2706.
Lenz, R. W., y R. H. Marchessault. 2005.
Bacterial
polyesters:
biosynthesis,
biodegradable plastics and biotechnology.
Levantesi, C., L. S. Serafim, G. R. Crocetti,
P. C. Lemos, S. Rossetti, L. L. Blackall,
M. A. M. Reis, y V. Tandoi. 2002.
Analysis of the microbial community
structure and function of a laboratory scale
enhanced biological phosphate removal
reactor. Environ. Microbiol. 4:559-569.
Technol. 98:2313-2320.
Link, A. J., D. Phillips, y G. M. Church.
1997. Methods for generating precise
deletions and insertions in the genome of
wild-type Escherichia coli: application to
open reading frame characterization. J.
Bacteriol. 179:6228-6237.
Liu, F., W. Li, D. Ridgway, T. Gu, y Z.
Shen. 1998. Production of poly-β-hydroxybutyrate on molasses by recombinant
Escherichia coli. Biotechnol. Lett. 20:345348.
Liu, X., y P. De Wulf. 2004. Probing the
ArcA-P modulon of Escherichia coli by
whole genome transcriptional analysis and
sequence recognition profiling. J. Biol.
Chem. 279:12588-12597.
Lowry, O. H., N. J. Rosebrough, A. L. Farr,
y R. J. Randall. 1951. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol.
Chem. 193:265-275.
Lynch, A. S., y E. C. C. Lin. 1996. Responses
to molecular oxygen, p. 1526-1538. En F.
C. Neidhardt, R. Curtiss III, J. L. Ingraham,
E. C. C. Lin, K. B. Low, B. Magasanik, W.
S. Reznikoff, M. Riley, M. Schaechter, y
H. E. Umbarger (ed.), Escherichia coli and
D.C.
Metabolic
engineering
of
poly(3hydroxyalkanoates): from DNA to plastic.
Mata-Álvarez, J., S. Mace, y P. Llabres.
2000. Anaerobic digestion of organic solid
wastes. An overview of research achievements and perspectives. Biores. Technol.
74:3-16.
Mercan, N., y Y. Beyatli. 2005. Production of
(PHB)
by
Rhizobium meliloti, R. viciae and
Bradyrhizobium japonicum with different
carbon and nitrogen sources, and
inexpensive substrates. Zuckerindustrie
130:410-415.
Nawrath, C., Y. Poirier, y C. Sommerville.
1994. Targeting of the polyhydroxybutyrate
biosynthetic pathway to the plastids of
Arabidopsis thaliana results in high levels
of polymer accumulation. Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 91:12760-12764.
85
Nikel, P. I., M. J. Pettinari, B. S. Méndez, y
M. A. Galvagno. 2005. Statistical
optimization of a culture medium for
biomass and poly(3-hydroxybutyrate)
production by a recombinant Escherichia
coli strain using agroindustrial by-products.
Internatl. Microbiol. 8:243-250.
72:3949-3954.
Oehmen, A., P. C. Lemos, G. Carvalho, Z.
Yuan, J. Keller, L. L. Blackall, y M. A.
M. Reis. 2007. Advances in enhanced
biological phosphorus removal: from micro
to macro scale. Water Res. 30:2128-2138.
Ostle, A. G., y J. G. Holt. 1982. Nile blue A
as a fluorescent stain for poly-βhydroxybutyrate. Appl. Environ. Microbiol.
44:238-241.
Overath, P., H. U. Schairer, y W. Stoffel.
1970. Correlation of in vivo and in vitro
phase transitions of membrane lipids in
USA 67:606-612.
Park, J. S., H. C. Park, T. L. Huh, y Y. H.
Lee. 1995. Production of poly-β-hydroxybutyrate
by Alcaligenes
eutrophus
transformants harbouring cloned phbCAB
genes. Biotechnol. Lett. 17:735-740.
Park, S. J., W. S. Ahn, P. R. Green, y S. Y.
Lee. 2001. Biosynthesis of poly(3hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate-co3-hydroxyhexanoate) by metabolically
engineered Escherichia coli strains.
Biotechnol. Bioeng. 74:81-86.
Park, S. J., J. I. Choi, y S. Y. Lee. 2005.
Engineering of Escherichia coli fatty acid
metabolism for the production of
polyhydroxyalkanoates. Enzyme Microb.
Technol. 36:579-588.
Park, S. J., y S. Y. Lee. 2005. Systems
biological approach for the production of
various
polyhydroxyalkanoates
by
metabolically engineered Escherichia coli.
Macromol. Symp. 224:1-9.
Pohlmann, A., W. Fricke, F. Reinecke, B.
Kusian, H. Liesegang, R. Cramm, T.
Eitinger, C. Ewering, M. Pötter, E.
Schwartz, A. Strittmatter, I. Voss, G.
Gottschalk, A. Steinbüchel, B. Friedrich,
y B. Bowien. 2006. Genome sequence of
the
bioplastic-producing
‘Knallgas’
bacterium Ralstonia eutropha H16. Nat.
Poirier, Y., D. E. Dennis, K. Klomparens, y
C. Somerville. 1992. Polyhydroxybutyrate,
a biodegradable thermoplastic, produced in
transgenic plants. Science 256:520-523.
Poirier, Y., C. Newrath, y C. Sommerville.
1995.
Production
of
polyhydroxyalkanoates, a family of biodegradable
plastics and elastomers, in bacteria and
plants. Bio/Technology 13:142-150.
Poirier, Y., N. Erard, y J. MacDonaldComber Petétot. 2001. Synthesis of
polyhydroxyalkanoate in the peroxisomes
of Saccharomyces cerevisiae by using
intermediates of fatty acid β-oxidation.
Appl. Environ. Microbiol. 67:5254-5260.
Poirier, Y., N. Erard, y J. MacDonaldComber Petétot. 2002. Synthesis of polyhydroxyalkanoate in the peroxisome of
Pichia pastoris. FEMS Microbiol. Lett.
207:97-102.
Preusting, H., A. Nijenhuis, y B. Witholt.
1990. Physical characteristics of poly(3hydroxyalkanoates) and poly(3-hydroxyalkenoates) produced by Pseudomonas
oleovorans grown on aliphatic hydrocarbons. Macromolecules 23:4220-4224.
Qi, Q., A. Steinbüchel, y B. H. A. Rehm.
1998. Metabolic routing towards polyhydroxyalkanoic
acid
synthesis
in
Escherichia coli expressing the PHA
synthase gene phaC2 from Pseudomonas
aeruginosa: comparison of PhaC1 and
PhaC2. FEMS Microbiol. Lett. 157:155162.
86
Reinecke, F., y A. Steinbüchel. 2009.
Ralstonia eutropha strain H16 as model
organism for PHA metabolism and for
biotechnological production of technically
interesting biopolymers. J. Mol. Microbiol.
Schubert, P., A. Steinbüchel, y H. G.
Schlegel. 1988. Cloning of the Alcaligenes
eutrophus genes for synthesis of poly(βhydroxybutyric acid) (PHB) and synthesis
of PHB in Escherichia coli. J. Bacteriol.
170:5837-5847.
Reusch, R. N., y H. L. Sadoff. 1983. D-(–)Poly-β-hydroxybutyrate in membranes of
genetically
competent
bacteria.
J.
Bacteriol. 156:778-788.
Senior, P. J., y E. A. Dawes. 1973. The
regulation
of
metabolism in Azotobacter beijerinckii.
Biochem. J. 134:225-238.
Reusch, R. N. 1989. Poly-β-hydroxybutyrate
/calcium polyphosphate complexes in
eukaryotic membranes. Proc. Soc. Exp.
Biol. Med. 191:377-381.
Serafim, L. S., P. C. Lemos, M. G. E.
Albuquerque, y M. A. M. Reis. 2008.
Strategies for PHA production by mixed
cultures and renewable waste materials.
Reusch, R. N., R. Huang, y D. KoskKosicka. 1997. Novel components and
enzymatic activities of the human
erythrocyte plasma membrane calcium
pump. FEBS Lett. 412:592-596.
Shiloach, J., y R. Fass. 2005. Growing E. coli
to high cell density - A historical
perspective on method development.
Reyrat, J. M., V. Pelicic, B. Gicquel, y R.
Rappuoli.
1998.
Counterselectable
markers: untapped tools for bacterial
genetics and pathogenesis. Infect. Immun.
66:4011-4017.
Slater, S., W. Voige, y D. Dennis. 1988.
Cloning and expression in Escherichia coli
of the Alcaligenes eutrophus H16 poly-βhydroxybutyrate biosynthetic pathway. J.
Bacteriol. 170:4431-4436.
Slater, S., T. Gallaher, y D. Dennis. 1992.
Production of poly(3-hydroxybutyrate-co3-hydroxyvalerate) in a recombinant
Escherichia coli strain. Appl. Environ.
Microbiol. 58 1089-1094.
Sambrook, J., E. F. Fritsch, y T. Maniatis.
1989. Molecular cloning: a laboratory
manual, 2da ed. Cold Spring Harbor
Laboratory Press, Cold Spring Harbor,
N.Y.
Satoh, H., Y. Iwamoto, T. Mino, y T.
Matsuo. 1998. Activated sludge as a
possible source of biodegradable plastic.
Water Sci. Technol. 38:103-109.
Schlegel, H. G., G. Gottschalk, y R. von
Bartha. 1961. Formation and utilization of
poly-β-hydroxybutyric acid by Knallgas
bacteria (Hydrogenomonas). Nature 191:
463-465.
Schlegel, H. G., y G. Gottschalk. 1965.
Utilization of glucose by a mutant of
Hydrogenomonas H16. Biochem. J. 341:
249-259.
Snell, K. D., F. Feng, L. Zhong, D. Martin, y
L. L. Madison. 2002. YfcX enables
medium-chain-length
poly(3-hydroxyalkanoate) formation from fatty acids in
recombinant Escherichia coli fadB strains.
J. Bacteriol. 184:5696-5705.
Snell, K. D., y O. Peoples. 2002.
Polyhydroxyalkanoate polymers and their
production in transgenic plants. Metabol.
Eng. 4:29-40.
87
Son, H., G. Park, y S. Lee. 1996. Growthassociated production of poly-β-hydroxybutyrate from glucose or alcoholic distillery
wastewater by Actinobacillus sp. EL-9.
Song, S., S. Hein, y A. Steinbüchel. 1999.
Production of poly(4-hydroxybutyric acid)
by fed-batch cultures of recombinant
strains of Escherichia coli. Biotechnol.
Lett. 21:193-197.
Steinbüchel, A., y H. E. Valentin. 1995.
Diversity of bacterial polyhydroxyalkanoic
acids. FEMS Microbiol. Lett. 128:219-228.
16:419-427.
Steinbüchel,
A.,
C.
Brämer,
B.
Füchtenbusch, V. Gorenflo, S. Hein, R.
Jossek, R. Kalscheuer, S. Langenbach,
Q. Qi, B. H. A. Rehm, S. Song, y H.
Tran. 1999. Poly(hydroxyalkanoic acid)
biosynthesis pathways, p. 35-47. En A.
Steinbüchel (ed.), Biochemical principles
and mechanisms of biosynthesis and
biodegradation of polymers. Wiley-VCH,
Weinheim, Alemania.
Suzuki, T., H. Deguchi, T. Yamane, S.
Shimizu, y K. Gekko. 1988. Control of
molecular weight of poly-β-hydroxybutyric
acid produced in fed-batch culture of
Protomonas extorquens. Appl. Microbiol.
Taguchi, S., H. Nakamura, T. Kichise, T.
Tsuge, I. Yamato, y Y. Doi. 2003.
Production of polyhydroxyalkanoate (PHA)
from renewable carbon sources in
recombinant Ralstonia eutropha using
mutants of original PHA synthase.
Biochem. Eng. J. 16:107-113.
Takabatake, H., H. Satoh, T. Mino, y T.
Matsuo. 2002. PHA production potential
of activated sludge treating wastewater.
Water Sci. Technol. 45:119-126.
Takeda, M., H. Matsuoka, H. Hamana, y M.
Hikuma. 1995. Biosynthesis of poly-3hydroxybutyrate by Sphaerotilus natans.
Tobin, K. M., y K. E. O’Connor. 2005.
Polyhydroxyalkanoate
accumulating
diversity of Pseudomonas species utilising
aromatic hydrocarbons. FEMS Microbiol.
Lett. 253:111-118.
Steinbüchel, A., y T. Lütke-Eversloh. 2003.
Metabolic engineering and pathway
construction
for
biotechnological
production of relevant polyhydroxyalkanoates in microorganisms. Biochem.
Eng. J. 16:81-96.
van Wegen, R. J., S. Y. Lee, y A. P.
Middelberg. 2001. Metabolic and kinetic
analysis
of
production by recombinant Escherichia
coli. Biotechnol. Bioeng. 74:70-80.
Sternberg, N. L., y R. Maurer. 1991.
Bacteriophage-mediated
generalized
transduction in Escherichia coli and
Salmonella
typhimurium.
Methods
Enzymol. 204:18-43.
Sudesh, K., H. Abe, y Y. Doi. 2000.
Synthesis, structure and properties of
polyhydroxyalkanoates: biological polyesters. Prog. Polym. Sci. 25:1503-1555.
Verlinden, R. A. J., D. J. Hill, M. A.
Kenward, C. D. Williams, y I. Radecka.
2007. Bacterial synthesis of biodegradable
polyhydroxyalkanoates. J. Appl. Microbiol.
102:1437-1449.
Wang, F., y S. Y. Lee. 1997. Production of
poly(3-hydroxybutyrate) by fed-batch
culture
of
filamentation-supressed
recombinant Escherichia coli. Appl.
88
Wendlandt, K. D., W. Geyer, G. Mirschel, y
F. Al-Haj Hemidi. 2005. Possibilities of
controlling a PHB accumulation process
using various analytical methods. J.
Williams, M. D., J. A. Rahn, y D. H.
Sherman. 1996. Expression and analysis of
a
bacterial
poly(hydroxyalkanoate)
synthase in insect cells using baculovirus
system. Protein Express. Purif. 7:203-211.
Yellore, V., y A. Desai. 1998. Production of
poly-3-hydroxybutyrate from lactose and
whey by Methylobacterium sp. ZP24. Lett.
Appl. Microbiol. 26:391-394.
Zhang, H., V. Obias, K. Gonyer, y D.
Dennis.
1994.
Production
of
polyhydroxyalkanoates in sucrose-utilizing
recombinant
Escherichia
coli
and
Klebsiella
strains.
Appl.
Environ.
Microbiol. 60:1198-1205.
Zinn, M., B. Witholt, y T. Egli. 2001.
Occurence,
synthesis
and
medical
application of bacterial polyhydroxyalkanoate. Adv. Drug Deliv. Rev. 53:5-21.
89
Capítulo III
Análisis de las bases
bioquímicas del fenotipo
Dye en mutantes arcA y
supresión de la
sensibilidad a colorantes
redox por expresión
heteróloga de
los genes pha
Capítulo III – Análisis del fenotipo Dye en mutantes arc
3.1. Prefacio
Los resultados encontrados durante la caracterización de distintas cepas de
Escherichia coli con mutaciones en arcA respecto a ciertas características fenotípicas
(Capítulo II) dirigieron nuestro interés al estudio de las bases fisiológicas y moleculares de
dichas diferencias. En este capítulo se describen en primer término los experimentos
originales que permitieron el aislamiento del gen arcA. Como consecuencia de dichos
experimentos se pudo relacionar el fenotipo de sensibilidad a colorantes redox con
mutaciones en arc. A pesar de que se esgrimieron diversas explicaciones al respecto, entre
ellas la divergencia de electrones de la cadena respiratoria, el fenotipo Dye no había sido
satisfactoriamente explicado a la fecha. En este contexto, la principal hipótesis de este
capítulo se fundamenta en que la expresión de los genes involucrados en la biosíntesis de
poli(3-hidroxibutirato) (PHB), un polímero que actúa como captador de equivalentes de
reducción, sería capaz de alterar el flujo de electrones en la cadena respiratoria. De esta
manera, en este capítulo se estudió si la expresión heteróloga de los genes pha podría
modificar el fenotipo Dye en mutantes arcA.
3.2. Objetivos
- Caracterizar el fenotipo Dye de las distintas mutantes arc utilizadas.
- Analizar el efecto de la expresión heteróloga de los genes phaBAC de Azotobacter sp. cepa
FA8 sobre el fenotipo Dye.
- Explicar las bases bioquímicas del fenotipo de sensibilidad a colorantes redox.
3.3. Introducción
Como se dijo en capítulos anteriores, ArcAB es uno de los sistemas más importantes
en la regulación redox del metabolismo como consecuencia de cambios en la disponibilidad
de oxígeno en el medio ambiente [Lynch y Lin, 1996; Green y Paget, 2004]. En la mayoría de
los casos la expresión de los genes involucrados en funciones respiratorias, cuya modulación
es ejercida por ArcAB, también está coordinada por el metabolismo de C, N, y P
[Patschkowski et al., 2000; Salmon et al., 2005]. Uno de los pocos ejemplos en los cuales
ArcA~P actúa como activador transcripcional es el de los genes del operón cydAB (que
codifican las subunidades de la citocromo d oxidasa) [Iuchi et al., 1990; Iuchi y Lin, 1991].
El nivel de esta oxidasa terminal de alta afinidad por el oxígeno es máximo en condiciones
microaeróbicas, cuando su función resulta más necesaria para la célula [Gennis y Stewart,
1996]. De esta manera, las células podrían continuar respirando en condiciones de baja
disponibilidad de oxígeno. Otro ejemplo de regulación positiva es el ejercido sobre pfl, cuyo
producto es la piruvato-formiato liasa [Sawers y Böck, 1988; Drapal y Sawers, 1995;
Alexeeva et al., 2000], una enzima que convierte el piruvato en acetil-coenzima A y cuya
actividad es clave para el direccionamiento del carbono hacia las vías fermentativas [Böck y
Sawers, 1996].
91
Como se mencionó oportunamente, el gen arcA de E. coli fue originalmente
denominado dye [Iuchi y Lin, 1988] porque se encontró que mutaciones en este locus
conferían sensibilidad a colorantes redox de la familia de las fenotiazinas, como el azul de
metileno y el azul de toluidina O [Buxton y Drury, 1983; 1984]. En el trabajo original de
Roeder y Somerville [1979] se describió la sensibilidad de cepas de E. coli conteniendo
deleciones cromosomales entre trpR y thr (99-100 min en el cromosoma) al azul de metileno,
contenido en el medio agar eosina-azul de metileno. Posteriormente se determinó que la
ausencia del gen arcA era la causa de este fenotipo de sensibilidad, denominado fenotipo Dye
[Buxton y Drury, 1983]. También se ha demostrado que las mutaciones en arcB dan lugar a
un fenotipo similar. Las cepas salvajes para arcA o arcB, en cambio, pueden crecer en
presencia de los mencionados colorantes. Curiosamente, y a pesar de que la sensibilidad a
colorantes redox fue una de las primeras características fenotípicas atribuidas a mutaciones en
arcA, a la fecha no se había propuesto una explicación para el fenotipo Dye.
El estudio de Buxton et al. [1983] mostró que la sensibilidad a colorantes redox no se
debe directamente a una mayor permeabilidad de la membrana, como fuera demostrado en el
caso de la sensibilidad a ciertos antibióticos en bacterias Gram negativas [Nikaido, 1979]. Por
otro lado, Lynch y Lin [1996] sugirieron que los electrones podrían entrar a un ciclo fútil en
presencia de los colorantes, evitándose la cadena de transporte de electrones y la
correspondiente generación de ATP. Esta explicación es compatible con las observaciones
experimentales, que muestran que el fenotipo Dye es evidente sólo en condiciones aeróbicas
de crecimiento. Por otra parte, se ha demostrado que ciertos colorantes con propiedades redox
pueden actuar como transportadores de electrones, lo cual proveería evidencia adicional a
favor de la teoría recién comentada.
Los polihidroxialcanoatos bacterianos (PHAs) poseen un rol importante en el estado
redox celular, dado que el ciclo de síntesis y degradación del cual forman parte consume (o
genera, durante la hidrólisis del polímero) equivalentes de reducción en la forma de
NAD(P)H [Dawes y Senior, 1973; Anderson y Dawes, 1990; Steinbüchel y Hein, 2001]. Se
ha demostrado que en condiciones de acumulación de PHAs muchas bacterias, incluyendo
cepas recombinantes de E. coli, sufren alteraciones en varios parámetros fisiológicos; e.g., en
el cociente intracelular NAD(P)H/NAD(P)+ [Lee et al., 1996; Madison y Huisman, 1999],
disponibilidad de intermediarios metabólicos y distribución de los mismos en la red central
del metabolismo [van Wegen et al., 2001], capacidad de supervivencia [López et al., 1995;
López et al., 1998; Ruiz et al., 2001], et cetera. Teniendo en cuenta estos antecedentes, y
continuando con la caracterización fenotípica de las mutantes arc, se decidió estudiar si la
alteración redox producto de la expresión heteróloga de los genes pha de Azotobacter sp.
cepa FA8 era capaz de modificar el fenotipo Dye.
92
3.4.1. Cepas, plásmidos, y medios de cultivos
Cepas y plásmidos. Todas las cepas de Escherichia coli utilizadas son derivadas de
K-12, y se detallan en la Tabla 2.1 junto a los plásmidos utilizados en este capítulo.
Cepa
o plásmido
E. coli
SP314b
K1060b
Plásmido
pWKS30-arcADH5α
pQE32
pJP24
Fuente
o referencia
araD139 Δ(argF-lac)U169 rpsL150 relA1 Roeder y Somerville,
1979
deoC1 flb-5301 ptsF25 Δ(galK-bioD)76
thi-1 Δ(deoD-arcA)253
F– fadE62 lacI60 tyrT58(AS) fabB5 mel-1 Overath et al., 1970
Vector de expresión y clonado de bajo Ruiz et al., 2006
número de copias, PT3/T7, lacZα,
conteniendo la secuencia completa de arcA
amplificada de ADN genómico de E. coli
DH5α; Apr
Vector de expresión; PT7, Apr
Qiagen; Valencia, CA,
EE.UU.
pQE32 conteniendo los genes phaBAC de Nikel et al., 2006
Azotobacter sp. cepa FA8; Ap r
capítulo.
a
Ap, ampicilina; Km, kanamicina; Sp, espectinomicina; Str, estreptomicina; Tc, tetraciclina.
b
Cepas obtenidas a través de Mary Berlin; E. coli Genetic Stock Center, Yale University,
New Haven, CT, EE.UU.
Medios y condiciones de cultivo. Las cepas se crecieron rutinariamente en medio LB
a 37°C con agitación a 250 r.p.m. La sensibilidad a azul de toluidina se ensayó en medio TB
[triptona 10 g · l-1; NaCl 8 g · l-1; azul de toluidina O 200 μg · ml-1; y agar 1,5% (m · vol-1)],
o TBX [conteniendo los mismos componentes de TB con el agregado de xilosa 1,5% (m ·
vol-1)]; según el protocolo detallado en el Capítulo I. La expresión de los genes pha se indujo
por agregado de isopropil-β-D-tiogalactopiranósido (IPTG) 1 mM a las placas de TBX, y en
algunos casos se adicionó ampicilina 100 μg · ml-1 a los medios de cultivo para asegurar la
mantención de plásmidos.
Análisis de la producción de especies reactivas de oxígeno (EROs). La generación
de EROs fue analizada a través de la desacetilación y oxidación intracelular del compuesto
diacetato de 2’,7’-diclorodihidrofluoresceína (DCDHF-DA) a 2’,7’-diclorofluoresceína, la
cual es altamente reactiva frente a H2O2 [Somerville et al., 2002; Balzan et al., 2004]. Para
las determinaciones, se diluyeron 1:100 cultivos de 18 h de la cepa en estudio (previamente
93
crecida en medio MTX a 37°C y 250 r.p.m.) en el mismo medio de cultivo. En algunos casos,
se suplementó el cultivo secundario con azul de toluidina O 200 μg · ml-1 según se detalla en
el texto. Después de 4 h de crecimiento en las mismas condiciones descriptas para los
cultivos de 18 h, se agregó IPTG a una concentración final de 1 mM, y se continuó
cultivando otras 2 h. En ese momento se añadió DCDHF-DA 10 mM (en etanol) a los
cultivos hasta una concentración final de 50 μM. Después de 2 h de crecimiento, las células
se recuperaron por centrifugación (6.000 r.p.m., 10 min a 4°C), se resuspendieron en solución
de HEPES 20 mM (pH = 7,0) fría, y las suspensiones celulares fueron colocadas en hielo. A
una alícuota de 1 ml de dicha suspensión celular se agregaron 20 μl de dodecilsulfato de
sodio (SDS) 0,1% (m · vol-1), y 40 μl de CHCl3. La suspensión fue agitada en vortex durante
30 s (3 veces, con intervalos de 1 min en hielo entre cada una de ellas), y colocadas 15 min en
hielo para permitir la difusión de la 2’,7’-diclorofluoresceína. Los restos celulares se
separaron por centrifugación, y se utilizaron 500 μl del sobrenadante para realizar las
determinaciones espectrofluorométricas en un equipo Thermospectronic series 2 (AMINCOBowman, Waltham, MA, EE.UU.). Las longitudes de onda de excitación y de emisión fueron
λ = 490 y 521 nm, respectivamente. La intensidad de fluorescencia relativa se expresó en
unidades arbitrarias (UA) correspondientes a 107 células.
3.5.1. Caracterización del fenotipo Dye en mutantes arcA de E. coli
En la primera etapa de este estudio, se analizaron las características del fenotipo Dye
en mutantes arc de E. coli, una característica fenotípica de las mismas dada por la
sensibilidad a ciertos colorantes redox como el azul de toluidina o el azul de metileno. E. coli
SP314, una mutante arcA previamente caracterizada en la literatura y aislada originalmente
por su incapacidad de crecer en medio agar eosina-azul de metileno [Roeder y Somerville,
1979], posee una deleción cromosomal extendida que abarca arcA. Esta cepa fue utilizada
como huésped para la expresión heteróloga de los genes pha de Azotobacter sp. cepa FA8
[Pettinari et al., 2001]. Los resultados obtenidos mostraron que la ausencia de arcA estimuló
la acumulación de PHB en condiciones microaeróbicas de crecimiento [cf. Capítulo II].
Cuando se sembraron diluciones de cultivos de SP314 en medio TB (conteniendo azul
de toluidina O 200 μg · ml-1), se encontró que esta mutante era incapaz de generar colonias,
en tanto E. coli K1060 (ArcA+, considerada salvaje) crecía normalmente en las mismas
condiciones. Para analizar si el defecto en el crecimiento de E. coli SP314 se debía solamente
a la deleción de arcA, el gen se amplificó por PCR a partir de ADN cromosómico de E. coli
DH5α [Ruiz et al., 2006]. La complementación de E. coli SP314 con el producto de
amplificación clonado en el vector de bajo número de copias pWKS30 (pWKS30-arcADH5α)
restituyó la resistencia a azul de toluidina. Al mismo tiempo, E. coli SP314/pWKS30 fue
incapaz de crecer en las condiciones del ensayo. Paralelamente, se plaquearon diluciones de
cultivos de ambas cepas en placas de medio LB agarizado, y no se detectaron diferencias en
la morfología y número de colonias después de 24 h de incubación a 37°C (datos no
mostrados). Estos resultados mostrarían que la deficiencia en el crecimiento de E. coli SP314
en medios de cultivo que contienen azul de toluidina se debe solamente a la ausencia del gen
arcA, dado que el fenotipo Dye puede ser revertido por complementación en trans de arcA.
94
Como se mencionó en el Capítulo II, otras cepas de E. coli conteniendo mutaciones en
arcA disponibles en nuestro laboratorio, i.e., E. coli ECL618 y CT1061, forman colonias
pequeñas en presencia de azul de toluidina. Si bien la complementación de estas cepas con
pWKS30-arcADH5α dio lugar a la formación de colonias grandes en medio TBX, semejantes a
las formadas por la cepa salvaje, las bases moleculares de estas diferencias fenotípicas se
desarrollarán in extenso en el Capítulo IV.
3.5.2. Supresión de la sensibilidad de mutantes arcA a colorantes redox como
respuesta a la expresión heteróloga de los genes pha
Si la inhibición del crecimiento de las mutantes arc de E. coli por azul de toluidina se
debiese a un ciclo fútil de transferencia de electrones al oxígeno a través del colorante [Lynch
y Lin, 1996], una reducción en la generación de dadores de electrones daría como resultado la
supresión del fenotipo de sensibilidad. De hecho, se hipotetizó que la biosíntesis de PHB, que
capta equivalentes de reducción en la forma de NAD(P)H [Anderson y Dawes, 1990], debería
provocar una alteración del fenotipo Dye. Cuando se analizó el crecimiento de E. coli
SP314/pQE32 en presencia de azul de toluidina se observó, como se esperaba, que dicha cepa
no pudo formar colonias en las condiciones del ensayo (en medio TBX, conteniendo xilosa
como fuente carbonada). Sin embargo, cuando se analizó el crecimiento de E. coli
SP314/pJP24 (pha+) crecida en las mismas condiciones se detectó la supresión del fenotipo
de sensibilidad por acumulación de PHB, permitiendo el desarrollo de la mutante en
presencia de azul de toluidina. Los resultados hasta aquí descriptos se muestran en la Fig. 3.1.
E. coli
A
SP314
K1060
SP314/
pWKS30-arcADH5α
SP314/
pWKS30
SP314
K1060
SP314/pJP24
SP314/pQE32
10-3
10-5
10-7
B
10-3
10-5
10-7
E. coli
Fig. 3.1. Caracterización del fenotipo Dye, y supresión del fenotipo Dye por expresión
heteróloga de los genes pha de Azotobacter sp. cepa FA8. Los cultivos se realizaron en medio
TB (A), o medio TBX [TB suplementado con xilosa 1% (m · vol-1) e IPTG 1 mM] (B). A la
izquierda de la figura se muestra la dilución del cultivo. Las fotografías se tomaron después
de incubar las placas durante 24 h a 37°C.
95
3.5.3. La supresión del fenotipo Dye debida a la expresión de los genes pha
implica una disminución en la capacidad respiratoria y en la generación de
especies reactivas de oxígeno
El azul de toluidina, así como otras fenotiazinas, funcionaría como un transportador
alternativo de electrones, captando los mismos en un proceso que no genera energía y
transfiriéndolos a un aceptor de electrones terminal (en condiciones aeróbicas, oxígeno
molecular). Siguiendo el razonamiento expuesto en relación a la supresión del fenotipo Dye
por la expresión de los genes pha, y dado que el PHB actúa como captador de equivalentes de
reducción, podría esperarse una disminución de la actividad respiratoria en las
recombinantes. De hecho, la medición de la actividad respiratoria de E. coli SP314 en
presencia y ausencia del plásmido pJP24 mostró que la expresión heteróloga de los genes pha
determina una reducción de ca. 50% en el consumo específico de oxígeno (qO2) en
comparación con las mismas cepas portando el vector vacío [Ruiz et al., 2006].
-1
20
7
Para estudiar el efecto que ejerce
la expresión de los genes pha sobre el
estrés oxidativo en mutantes arcA, se
determinó la generación de EROs (H2O2)
por desacetilación y posterior oxidación
intracelular del fluoróforo DCDHF-DA.
Los resultados expuestos en la Fig. 3.2
muestran que el valor de fluorescencia
relativo a la concentración celular
obtenido para E. coli SP314/pQE32 (cepa
control) fue de 8,36 ± 0,94; mientras que
para la cepa SP314/ pJP24 (pha+) fue ca.
36% menor. De esta manera, se comprobó
que la expresión heteróloga de los genes
pha en la mutante arcA disminuyó la
generación de EROs.
Fluorescencia (UA · 10 células )
Una mayor actividad respiratoria podría derivar en un aumento de la producción de
EROs; tales como anión superóxido (O2·–), peróxido de hidrógeno (H2O2), y radical oxhidrilo
(OH·–), hecho que ha sido demostrado en bacterias y mitocondrias durante el crecimiento
aeróbico [Ballesteros et al., 2001]. La mayoría de las EROs derivan de la reducción de
oxígeno molecular catalizada por enzimas de la cadena respiratoria. También se ha descripto
que una mayor tasa de respiración correlaciona con una menor viabilidad celular y un
aumento en la senescencia debido a la toxicidad de las EROs generadas durante la
respiración, capaces de dañar macromoléculas esenciales para el crecimiento; e.g., ADN,
ARN, y lípidos [Cabiscol et al., 2000]. De esta manera, sería posible que las mutantes arcA
presenten el fenotipo de sensibilidad a colorantes redox debido a una mayor generación de
EROs derivada del aumento observado en la tasa respiratoria. El exceso de EROs generados
excedería la capacidad limitada de los sistemas de detoxificación de estrés oxidativo, y se
traduciría en una reducción de la viabilidad.
15
SP314/pQE32
SP314/pJP24
10
5
0
–AT
+AT
Fig. 3.2. Análisis de la generación de
EROs en mutantes arcA. Las diferencias
entre tratamientos para la misma cepa, así
como entre cepas distintas con/sin AT,
fueron significativas (análisis de la varianza,
P < 0,05). UA, unidades arbitrarias de
fluorescencia; AT, azul de toluidina O.
96
La misma tendencia fue observada cuando el ensayo se realizó en presencia de azul de
toluidina, obteniéndose una diminución en la generación de EROs de ca. 44% para la cepa
que acumula PHB. Como era esperable, el azul de toluidina determina una mayor
concentración de EROs como consecuencia del aumento en la capacidad respiratoria.
Tomados en conjunto, los resultados hasta aquí expuestos sugieren que la sensibilidad
de las cepas arcA a los colorantes redox podría deberse, al menos parcialmente, a una elevada
producción de EROs, y que la expresión de los genes phaBAC de Azotobacter sp. FA8
suprimiría el fenotipo Dye al canalizar el exceso de equivalentes de reducción a los cuerpos
de inclusión del biopolímero.
182:4934-4940.
Buxton, R. S., L. S. Drury, y C. A. Curtis.
1983. Dye sensitivity correlated with
envelope protein changes in dye (sfrA)
mutants of Escherichia coli K12 defective
in the expression of the sex factor F. J.
and industrial uses of bacterial polyhydroxyalkanoates. Microbiol. Rev. 54:
450-472.
Buxton, R. S., y L. S. Drury. 1984.
Identification of the dye gene product,
mutational loss of which alters envelope
protein composition and also affects sex
factor F expression in Escherichia coli K12. Mol. Gen. Genet. 194:241-247.
Balzan, R., K. Sapienza, D. R. Galea, N.
Vassallo, H. Frey, y W. H. Bannister.
2004. Aspirin commits yeast cells to
apoptosis depending on carbon source.
Ballesteros, M., A. Fredriksson, J.
Henriksson, y T. Nyström. 2001.
Bacterial senescence: protein oxidation in
non-proliferating cells is dictated by the
accuracy of the ribosomes. EMBO J.
20:5280-5289.
Buxton, R. S., y L. S. Drury. 1983. Cloning
and insertional inactivation of the dye
(sfrA) gene, mutation of which affects sex
factor F expression and dye sensitivity of
Escherichia coli K-12. J. Bacteriol. 154:
1309-13014.
Cabiscol, E., J. Tamarit, y J. Ros. 2000.
Oxidative stress in bacteria and protein
damage by reactive oxygen species.
10:135-266.
D.C.
97
Green, J., y M. S. Paget. 2004. Bacterial
redox sensors. Nat. Rev. Microbiol. 2:954966.
85:1888-1892.
Gennis, y E. C. C. Lin. 1990. Requirement
for terminal cytochromes in generation of
the aerobic signal for the arc regulatory
system in Escherichia coli: study utilizing
deletions and lac fusions of cyo and cyd. J.
Bacteriol. 172:6020-6025.
Escherichia coli to respiratory conditions:
regulation of gene expression. Cell 66:5-7.
Lee, I. Y., M. K. Kim, Y. H. Park, y S. Y.
Lee. 1996. Regulatory effects of cellular
nicotinamide nucleotides and enzyme
activities
on
synthesis in recombinant Escherichia coli.
López, N. I., M. E. Floccari, A. Steinbüchel,
A. F. García, y B. S. Méndez. 1995. Effect
of poly(3-hydroxybutyrate) (PHB) content
on the starvation-survival of bacteria in
natural waters. FEMS. Microbiol. Ecol.
16:95-112.
López, N. I., J. A. Ruiz, y B. S. Méndez.
1998. Survival of poly-3-hydroxybutyrateproducing bacteria en soil microcosms.
World J. Microbiol. Biotechnol. 14:681684.
D.C.
Metabolic engineering of poly(3-hydroxyalkanoates): from DNA to plastic.
Nikaido, H. 1979. Non-specific transport
through the outer membrane, p. 361-407.
En M. Inouye (ed.), Bacterial outer
membranes: biogenesis and function.
Wiley-VCH, New York.
72:3949-3954.
USA 67:606-612.
Washington, D.C.
Pettinari, M. J., G. J. Vázquez, D.
Silberschmidt, B. H. A. Rehm, A.
Steinbüchel, y B. S. Méndez. 2001.
Poly(3-hydroxybutyrate) synthesis genes in
Azotobacter sp. strain FA8. Appl. Environ.
Microbiol. 67:5331-5334.
Ruiz, J. A., N. I. López, R. O. Fernández, y
B. S. Méndez. 2001. Polyhydroxyalkanoate degradation is associated with
nucleotide accumulation and enhances
stress resistance and survival
of
Pseudomonas oleovorans in natural water
microcosms. Appl. Environ. Microbiol.
67:225-230.
Ruiz, J. A., R. O. Fernández, P. I. Nikel, B.
S. Méndez, y M. J. Pettinari. 2006. dye
(arc) mutants: insights into an unexplained
phenotype and its suppression by the
synthesis of poly(3-hydroxybutyrate) in
Escherichia coli recombinants. FEMS
Microbiol. Lett. 258:55-60.
98
Chem. 280:15084-15096.
170:5330-5336.
van Wegen, R. J., S. Y. Lee, y A. P.
Middelberg. 2001. Metabolic and kinetic
analysis
of
production by recombinant Escherichia
coli. Biotechnol. Bioeng. 74:70-80.
Somerville, G. A., S. B. Beres, J. R.
Fitzgerald, F. R. DeLeo, R. L. Cole, J. S.
Hoff, y J. M. Musser. 2002. In vitro serial
passage of Staphylococcus aureus: changes
in physiology, virulence factor production,
and agr nucleotide sequence. J. Bacteriol.
184:1430-1437.
99
Capítulo IV
Estudio de aspectos
fisiológicos y
metabólicos de
mutantes arc y cre
Capítulo IV – Análisis molecular y fenotípico de mutantes arc y cre
4.1. Prefacio
En los dos capítulos precedentes se ha discutido la aplicabilidad de mutantes arc para
la expresión heteróloga de los genes pha de Azotobacter sp. cepa FA8, dado que constituyen
un contexto metabólico adecuado para la síntesis de poli(3-hidroxibutirato) (PHB), y se han
postulado algunas de las bases bioquímicas que contribuirían a explicar el fenotipo Dye de
estas mutantes. También se observó la supresión del fenotipo de sensibilidad a colorantes por
expresión heteróloga de los genes pha. Se mencionó además que las mutantes ECL618 y
CT1061, las cuales poseen una inserción de tipo Tn10 en arcA, expresan un fenotipo
distintivo que las diferencia de las cepas con deleciones en el gen del regulador. En virtud de
que E. coli CT1061 mostró ser la cepa más adecuada para la acumulación de PHB en
condiciones microaeróbicas de cultivo [cf. Capítulo II], en este capítulo se discutirán los
experimentos tendientes a explicar las bases moleculares y bioquímicas de las mencionadas
diferencias. En primer lugar se enumeran algunos aspectos de la caracterización molecular
del sistema de transducción de señales de dos componentes CreBC de E. coli. Durante
muchos años después de su descubrimiento este sistema de señalización no poseía un
fenotipo claramente asociado. Actualmente, se sabe que el mismo interviene en el
catabolismo de carbono; y de hecho, en este capítulo se demuestra que ciertas mutaciones en
los genes de este sistema regulatorio modifican el fenotipo característico de mutantes arc.
4.2. Objetivos
- Estudiar las bases moleculares de las diferencias fenotípicas existentes en las cepas con
mutaciones ΔarcA y arcA::IS10-L.
- Caracterizar el efecto de mutaciones en los genes creB y creC del sistema de dos
componentes CreBC sobre distintos aspectos fenotípicos de E. coli (i.e., capacidad
respiratoria, crecimiento en medio mínimo, perfil de metabolitos de fermentación, actividad
acetato quinasa, et cetera).
- Analizar el efecto del sistema CreBC sobre el fenotipo Dye en mutantes arcA.
4.3. Introducción
Según se ha discutido en capítulos anteriores, el sistema de transducción de señales de
dos componentes ArcAB de Escherichia coli se encarga de modular la respuesta redox del
metabolismo como consecuencia de cambios en la disponibilidad de oxígeno en el medio
[Iuchi y Lin, 1988; Lynch y Lin, 1996]. Existen numerosos genes cuya expresión está
regulada por este sistema, en conjunción con Fnr, otra proteína reguladora de la respuesta a
condiciones anóxicas [Iuchi y Lin, 1991; Guest et al., 1996; Patschkowski et al., 2000]. Dado
el efecto pleiotrópico que la ausencia de un regulador global puede originar sobre las
características fenotípicas de una mutante, muchas veces las consecuencias de tales
mutaciones son difíciles de predecir. Por otra parte, es un hecho ampliamente conocido que la
eliminación de reguladores globales normalmente trae aparejados cambios en vías
metabólicas que pueden no estar directamente relacionadas con los genes cuya expresión es
modulada por el sistema regulatorio en cuestión [Yamamoto et al., 2005].
101
El sistema de regulación de dos componentes PhoBR es otro de los ejemplos
paradigmáticos de sistemas de señalización y modulación transcripcional en E. coli. En este
caso, PhoR es el sensor con actividad quinasa y responde a una disminución en la
concentración de fosfato inorgánico (Pi) [Wanner, 1996]. En condiciones de hambreado de Pi,
PhoR se autofosforila y luego trans-fosforila PhoB, el regulador citoplasmático de la
respuesta [Makino et al., 1989; Wanner, 1993]. En la forma fosforilada PhoB se une a
secuencias pho en el ADN e interactúa con la ARN polimerasa para estimular la transcripción
de los genes del regulón pho, cuyos productos actúan coordinadamente con el objetivo de
aumentar la concentración intracelular de Pi [Blanco et al., 2002; Bachhawat et al., 2005;
Baek y Lee, 2006]. Uno de estos genes, phoA, codifica una fosfatasa alcalina bacteriana
(FAB) cuyo nivel de actividad es usualmente utilizado como indicador indirecto de la
expresión de genes del regulón pho [Wanner y Latterell, 1980].
Ciertas mutantes de E. coli poseen el alelo phoR68, el cual teóricamente codificaría
una proteína PhoR carente de función, y expresan un fenotipo de expresión de FAB conocido
como 1A. Dicho nivel de expresión es constitutivo y moderado (alrededor de un tercio del
observado en una cepa phoR+). La expresión del fenotipo 1A es dependiente del gen phoM
[Wanner, 1987]; y una mutante ΔphoM que además lleva el alelo phoR68 produce FAB en
forma constitutiva a niveles muy bajos [Wanner y Latterell, 1980]. El clonado y
secuenciación de phoM mostró que se trata del tercer gen de un grupo constituido por cuatro
marcos abiertos de lectura consecutivos [Amemura et al., 1986; Wanner et al., 1988a]. El gen
phoM se analizó por homología de secuencia nucleotídica y se encontró que debería codificar
una proteína sensora con actividad quinasa, y poco tiempo después se determinó que PhoM
puede sufrir auto-fosforilación y trans-fosforilar PhoB in vitro. También se dedujo que el
segundo gen del grupo, conocido como phoM-ORF2, debería codificar un posible regulador
de respuesta y, nuevamente, se demostró que PhoM podía trans-fosforilar esta posible
proteína reguladora in vitro [Amemura et al., 1990]. Con esta evidencia experimental, se
postuló que PhoM respondería a alguna otra señal ambiental distinta del hambreado de Pi y
que en ausencia de PhoR (i.e., en el contexto genotípico phoR68) podría regular la
producción de FAB trans-fosforilando PhoB. Mutatis mutandi, PhoM no es capaz de
modificar la actividad de PhoB en presencia de PhoR [Wanner y Latterell, 1980]. De esta
manera, se propuso que en un contexto genético phoR+ la proteína PhoM actuaría en
conjunción con PhoM-ORF2 controlando la expresión de una serie de genes por entonces no
identificados [Wanner, 1993].
Cuando se observaron estos resultados experimentales existía poca evidencia para la
identificación de una señal de activación para PhoM. Se había demostrado que la producción
de FAB dependiente de PhoM en la mutante phoR68 respondía a la presencia de glucosa en el
medio de cultivo [Wanner y Wilmes-Riesenberg, 1992], y de hecho la producción de FAB
era significativamente mayor cuando se utilizaba dicho sustrato carbonado [Wanner et al.,
1988b]. De acuerdo con estos resultados el locus phoM fue renombrado como cre, un
acrónimo por carbon source responsive. Los cuatro genes del locus pasaron a llamarse creA
(phoM-ORF1, un marco de lectura abierto hipotético); creB (phoM-ORF2, el sensor
citoplasmático); creC (phoM, el sensor con actividad quinasa asociado a membrana); y creD
(phoM-ORF4, también conocido como cet, el cual codifica una proteína interna de membrana
102
de función desconocida) [Wanner, 1996]. Originalmente se supuso que los cuatro genes del
locus formaban un operón [Amemura et al., 1986], pero Drury y Buxton [1988], los mismos
autores que describieron y caracterizaron el fenotipo Dye de mutantes arcA, demostraron que
además de formar parte del posible operón cre, creD (cet) posee su propio promotor y es
selectivamente sobre-expresado en mutantes con fenotipo Cet2 (caracterizado por la
resistencia a colicinas, colicin E2 tolerant).
Por muchos años luego del descubrimiento de CreBC la identificación de los genes
del regulón cre resultó elusiva. La clave para la detección de algunos miembros de este
regulón fue provista por la observación de que existía alta similitud de secuencia entre el
sistema CreBC de E. coli y el sistema de transducción de señales de dos componentes BlrAB
de Aeromonas hydrophyla [Avison et al., 2000]. El sistema BlrAB de A. hydrophyla regula la
expresión del regulón blrAB, el cual comprende tres genes que codifican β-lactamasas (viz.,
cepH, imiH, y ampH), y al menos un gen adicional (blrD), homólogo de creD en E. coli.
Siguiendo las observaciones de Rasmussen et al. [1994], se encontró que el nivel de
expresión de cepH, imiH, y ampH era dependiente de CreBC cuando los tres genes se
clonaban junto a sus secuencias regulatorias en E. coli DH5α. De esta manera, fue posible
definir una secuencia cre/blr (TTCACnnnnnnTTCAC, en donde n representa cualquier
nucleótido) localizada en posición –60 respecto del sitio de inicio de la transcripción [Avison
et al., 2004]. Dado que dicha secuencia es esencial para el control de la expresión de cepH
ejercido por BlrA se ha postulado que CreB también podría controlar la expresión de cepH a
través de la secuencia cre/blr y, además, que dicha secuencia también estaría presente ‘río
arriba’ de genes pertenecientes al regulón cre en E. coli. Una búsqueda bioinformática reveló
que existen 8 unidades transcripcionales en el genoma de E. coli, las cuales codifican diversas
funciones, localizadas ‘río abajo’ de la posible secuencia cre/blr. Posteriormente se mostró
que todos los marcos abiertos de lectura precedidos de la secuencia cre/blr están bajo el
control transcripcional de CreBC en E. coli DH5α (7 unidades transcripcionales son activadas
por CreBC, y una de ellas es reprimida) [Avison et al., 2001]. A la fecha, los genes cuya
expresión es activada por CreBC son ackA-pta (codifican las enzimas acetato quinasa y
fosfotransacetilasa), talA (transaldolasa A, enzima de la rama no oxidativa de la vía de
pentosas fosfato), radC (cuyo producto está involucrado en la reparación de ADN
dependiente de RecA), trgB (una ADP-ribosa pirofosforilasa), yieI, yidS (ambos sin función
asignada), y creD. La expresión de malE, cuyo producto es un componente del transportador
de maltosa, es reprimida por CreBC.
Curiosamente, y según se mencionó en el párrafo precedente, uno de los genes más
estrictamente regulados por CreBC es creD. Se encontró que la cepa mutante descripta por
Drury y Buxton [1988], que sobre-expresa creD (y posee el fenotipo Cet2), lleva una
mutación en creC que se traduce en el cambio de un aminoácido del dominio quinasa que
activa CreC. Estudios de análisis de la expresión utilizando RT (transcriptasa reversa)-PCR
realizados por Avison et al. [2001], siguiendo la evidencia experimental que muestra que la
producción de FAB responde a la presencia de glucosa, demostraron que la expresión de los
genes del regulón cre en E. coli DH5α es menos activa en medios de cultivo complejos, como
el caldo nutritivo. Sin embargo, el nivel de expresión génica es sensiblemente incrementado
cuando se emplea un medio mínimo conteniendo glucosa como única fuente carbonada. La
103
hipótesis planteada en ese momento fue que existía algún componente en el medio de cultivo
complejo y ausente en un medio mínimo [Sezonov et al., 2007] que impedía o eliminaba la
actividad de CreBC. Sin embargo, no se observa regulación de la expresión via CreBC
sencillamente haciendo crecer las células en un medio mínimo. La evidencia experimental
posterior demostró que CreBC es inactivo cuando las células están generando energía por
respiración (aún en ausencia de oxígeno) a partir de fuentes carbonadas glicolíticas, tal como
la glucosa. De hecho, la activación de CreBC tiene lugar cuando se fermentan fuentes de
carbono glicolíticas. Adicionalmente, el sistema CreBC es activo en condiciones aeróbicas de
crecimiento cuando se utilizan metabolitos fermentativos de bajo peso molecular (e.g.,
acetato, lactato, piruvato) como fuente de carbono y energía, los cuales se generan durante la
fermentación de glucosa [Aguayo et al., 1988; Clark, 1989; Böck y Sawers, 1996]. El modelo
actualmente aceptado para la activación de CreBC es el siguiente: CreC respondería a
cambios en el medio de cultivo y/o en la concentración interna de metabolitos autofosforilándose; este grupo Pi sería transferido a CreB, el cual se une a las secuencias cre/blr.
En algunos promotores (e.g., creD, talA, ackA-pta) CreB funcionaría como activador
transcripcional ‘reclutando’ la ARN polimerasa en la forma típica en la que lo hacen las
proteínas reguladoras de otros sistemas de dos componentes, como PhoB [Bachhawat et al.,
2005] o ArcA [Sawers, 1993; Shen y Gunsalus, 1997; Cunningham y Guest, 1998]; en otros
promotores (viz., malE) la unión de CreB a la secuencia cre/blr reprimiría la expresión por
oclusión del promotor. En general, la respuesta mediada por CreBC tendría como objetivo
encauzar el metabolismo de E. coli a condiciones de crecimiento fermentativo y/o
gluconeogénico [Cariss et al., 2008], en el cual muchas vías metabólicas intermedias deben
ser re-dirigidas para una adaptación eficiente.
En este capítulo se describirán los experimentos que permitieron relacionar algunas de
las características fenotípicas de E. coli CT1061 (y otras cepas que poseen el alelo
arcA::IS10-L) con la presencia de una mutación puntual en el gen creC. Esta mutación
modifica significativamente el fenotipo catabólico de las cepas en las que está presente, y
conjuntamente con la mutación en arcA, determina un comportamiento distintivo respecto del
patrón respiratorio, perfil fermentativo, y resistencia a colorantes redox.
4.4.1. Cepas, plásmidos, y condiciones de cultivo
Cepas, oligonucleótidos, y plásmidos. Las cepas de E. coli utilizadas se detallan en
la Tabla 4.1, junto a los plásmidos y oligonucleótidos utilizados en este capítulo. Las
construcciones de ADN fueron propagadas en E. coli DH5α, exceptuando el plásmido molde
pKD4 (conteniendo el origen de replicación oriRγ, dependiente de la proteína π codificada
por el gen pir) utilizados durante la construcción de la mutante IV1061K. Dichos plásmidos
fueron amplificados en E. coli DH5α λ-pir.
104
Cepa, oligonucleótido,
o plásmido
E. coli
DH5α
F– λ– endA1 hsdR17 hsdM+ supE44
thi-1 recA1 gyrA96 relA1 Δ(argF
lacZYA)U169 φ80d Δ(lacZ)M15
DH5α λ-pir
DH5α lisógeno λ-pir
b
K1060
F– fadE62 lacI60 tyrT58(AS) fabB5
mel-1
CT1061
K1060 arcA::IS10-L; Tcr
CT1062
K1060 ΔarcA
IV1061K
CT1061 ΔcreB::kan; Kmr
ECL618
arcA::IS10-L
Δ(lac-proAB)X111
lacIQ
supE44
thiA/F’
proAB+
r
ΔlacZ(M15); Tc
Hfr 3000 b
Hfr λ– relA1 spoT1 thi-1 Δ(lacproAB)X111
Oligonucleótido
arcA-F
5’-CCG AAA ATG AAA GCC
AGT A-3’
arcA-R
5’-GAA AGT ACC CAC GAC
CAA G-3’
IS10-F
5’-GTT CAA TGG TTG GGA
ACT GG-3’
IS10-R
5’-ACA CGG ACT CAT TGT
CAC CA-3’
creC-F
5’- CCT GAG GGG CCT GTA
ATG-3’
creC-R
5’- CTG CAC CGT ATA AAG
CTC-3’
5’-TTA GCG CGG TTC CTG TCA
ΔcreB-Fcd
TGC CGT GGC GGC AAT AAC
AGA GGC GAT TTA TGG TGT
AGG CTG GAG CTG CTT C-3’
5’-GCC CAG CAA CAA CCG CAT
ΔcreB-Rc
GCC GAT ACG CAT TAC AGG
CCC CTC AGG CTA TAC ATA
TGA ATA TCC TCC TTA G-3’
Plásmido
pGEM-T Easy
Vector de clonado A/T para productos
de PCR; PT7/SP6, lacZα, Ap r
pG-arcAK1060
pG-arcA::IS10-L
Fuente
o referencia
Invitrogen Corp.;
Carlsbad, CA,
EE.UU.
Elias et al., 1999
Capítulo II
Capítulo II
Este capítulo
Iuchi et al., 1989
Thèze et al., 1974
Capítulo II
Capítulo II
Este capítulo
Este capítulo
Este capítulo
Este capítulo
Este capítulo
Este capítulo
Promega;
Madison, WI,
EE.UU.
pGEM-T Easy conteniendo un Este capítulo
fragmento de PCR amplificado de E.
coli K1060 con los oligos arcA; Apr
pGEM-T Easy conteniendo un Este capítulo
fragmento de PCR amplificado de E.
coli CT1061 con los oligos arcA; Apr,
Tcr
105
pWKS30
pWKS30-arcAK1060
pWKS30-arcA::IS10-L
Vector de expresión y clonado de bajo Wang y Kushner, 1991
número de copias; PT3/T7, lacZα, Ap r
pWKS30 conteniendo el inserto de Este capítulo
pG-arcAK1060 digerido con EcoRI; Ap r
pWKS30 conteniendo el inserto de Este capítulo
pG-arcA::IS10-L digerido con EcoRI;
Apr Tcr
capítulo.
a
Ap, ampicilina; Km, kanamicina; Tc, tetraciclina.
b
Obtenidas a través de Mary Berlin; E. coli Genetic Stock Center, Yale University, New
Haven, CT, EE.UU.
c
Las bases en negrita indican la secuencia complementaria a FRT-kan-FRT en el plásmido
molde pKD4.
d
Se subraya el codón de inicio de la transcripción de creB.
Condiciones de cultivo. La mayoría de los experimentos descriptos en este capítulo
se desarrollaron en 50 ml de medio LBG (extracto de levadura 5 g · l-1; triptona 10 g · l-1;
NaCl 5 g · l-1; y glucosa 30 g · l-1) contenidos en frascos Erlenmeyer de 250 ml. Los cultivos
se incubaron a 37°C con agitación constante de 250 r.p.m. Algunos experimentos se
desarrollaron en medio mínimo (MM), conteniendo Na2HPO4 6 g · l-1; KH2PO4 3,0 g · l-1;
(NH4)2SO4 1,4 g · l-1; NaCl 0,5 g · l-1; y MgSO4·7H2O 0,2 g · l-1 [Sambrook et al., 1989]. Se
agregó al MM glucosa, CH3COONa, o maltosa como fuentes carbonadas a las
concentraciones indicadas en el texto. Los medios sólidos contuvieron agar 30 g · l-1.
4.4.2. Manipulaciones genéticas
Construcción de mutantes. La construcción de E. coli IV1061K, una mutante ΔcreB
derivada de CT1061, se realizó de acuerdo al protocolo de intercambio alélico mediado por
las funciones λ-Red [Datsenko y Wanner, 2000]. Esta metodología se discutirá in extenso en
el Capítulo V.
Clonado del gen arcA para ensayos de complementación. El gen arcA de E. coli
K1060 fue amplificado por PCR utilizando los cebadores arcA-F y arcA-R. Las reacciones de
PCR se llevaron a cabo esencialmente como fue descripto en la sección Materiales y métodos
del Capítulo II, utilizando las siguientes condiciones de ciclado (35 ciclos): un paso inicial de
desnaturalización (15 s a 95°C), unión de los oligonucleótidos a las secuencias homólogas
(15 s a 56°C), y extensión (30 s a 72°C), seguidos de una extensión final de 5 min a 72°C. El
fragmento de ADN resultante midió 1.012 pb y abarcó la secuencia completa de arcA y 170
pb ‘río arriba’ del codón de inicio de la transcripción. El producto de PCR se clonó en el
vector pGEM-T Easy, y el plásmido resultante (pG-arcAK1060) fue digerido con EcoRI para
liberar un único fragmento que fue ligado al vector de bajo número de copias pWKS30,
generando el plásmido pWKS30-arcAK1060 utilizado en los ensayos de complementación.
Secuenciación de ADN y análisis de secuencias. La secuenciación de fragmentos de
ADN se realizó como servicio ofrecido por el Instituto de Investigaciones Biotecnológicas
(IIB-UNSAM); Departamento de Biología, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales (UBA);
106
y Macrogen Inc. (Geumcheon-gu, Seúl, Corea). Los fragmentos de ADN se obtuvieron por
PCR siguiendo el protocolo genérico descripto la sección Materiales y métodos del Capítulo
II, utilizando ADN genómico de E. coli CT1061 como templado y los oligonucleótidos arcAF, arcA-R, IS10-F, y IS10-R. En todos los casos, los protocolos de secuenciación se basaron
esencialmente en el método de interrupción de cadena por dideoxinucleótidos [Sanger et al.,
1977]. El análisis de las secuencias y alineamientos múltiples se llevó a cabo utilizando la
herramienta BLAST (Basic Local Alignment Search Tool; disponible a través del sitio de
Internet del National Center for Biotechnology Information, Bethesda, MD, EE.UU.).
Métodos generales de manipulación de ácidos nucleicos. Los protocolos para
restricción de fragmentos de ADN, purificación de ADN, electroforesis horizontal en geles de
agarosa, ligaciones, y transformación de células competentes fueron realizados según se
describió en la sección Materiales y métodos del Capítulo II, y/o siguiendo las instrucciones
específicas de los proveedores de insumos para Biología molecular.
Fenotipo Dye y determinación del consumo de oxígeno. El fenotipo Dye se analizó
sembrando diluciones en NaCl 9 g · l-1 de cultivos de 18 h de las cepas en estudio en medio
TBX, según los protocolos descriptos en los Capítulos II y III. El consumo de oxígeno se
determinó por mediciones polarográficas efectuadas en suspensiones celulares preparadas de
acuerdo a la descripción detallada en el Capítulo II.
Determinación de biomasa y ácidos de fermentación. La concentración de biomasa
se efectuó por medición gravimétrica a partir de alícuotas valoradas de cultivo, según se
describió en el Capítulo II. La concentración de metabolitos de secreción en los
sobrenadantes de cultivos se realizó por trans-esterificación de los ácidos orgánicos y
detección de los metilésteres por cromatografía gaseosa, siguiendo un protocolo similar al
descripto por Braunegg et al. [1978]. Para las determinaciones, 1 ml de los sobrenadantes de
los cultivos fueron tratados con 0,4 ml de H2SO4 50% (vol · vol-1) y 2 ml de CH3OH en baño
termostatizado a 60°C durante 30 min, obteniendo así los metilésteres de los ácidos presentes
en la muestra. Posteriormente se añadió 1 ml de H2O y 1 ml de CHCl3 y se agitó la mezcla
vigorosamente, permitiendo la separación de las fases. La fase orgánica fue transferida a un
tubo conteniendo ca. 20 mg de CaCl2 anhidro para eliminar las trazas de H2O, y se mantuvo a
–20°C hasta el análisis cromatográfico. Los metilésteres se detectaron en un cromatógrafo de
gases Hewlett-Packard HP 5890 (Hewlett-Packard Co.; Palo Alto, CA, EE.UU.) equipado
con una columna Hewlett-Packard FFAP. Como estándares se utilizaron cantidades
conocidas de los ácidos a evaluar, tratados como se describió anteriormente.
Determinación de etanol y glucosa. La concentración de etanol se determinó
utilizando un kit comercial (Randox Laboratories Ltd.; Oceanside, CA, EE.UU.), basado en el
método de la alcohol deshidrogenasa de Saccharomyces cerevisiae (Adh) según la reacción
que se muestra abajo, midiendo el incremento en la concentración de NADH por
espectrofotometría a λ = 340 nm.
107
Adh
CH3CH2OH + NAD+ → CH3CHO + NADH + H+
Las determinaciones se llevaron a cabo según las instrucciones del proveedor, y se
elaboró una curva estándar con diluciones de una solución valorada de etanol 1,5 mg · ml-1.
La concentración de glucosa fue determinada utilizando un kit enzimático basado en la
reacción secuencial de la glucosa oxidasa (Gox) y peroxidasa (Wiener Labs.; Rosario,
Argentina). Como se muestra en las siguientes reacciones, el peróxido de hidrógeno (H2O2)
producto de la primera reacción se combina con un cromóforo en presencia de fenol para
generar una quinona coloreada, la cual posee un máximo de absorbancia a λ = 625 nm.
Gox
D-Glucosa + O2 + H2O → D-Glucono-1,5-lactona + H2O2
Peroxidasa
2H2O2 + fenol + 4-aminofenazona → Quinona coloreada + 4H2O
Determinación de actividad acetato quinasa. La actividad de acetato quinasa
(AckA) se determinó siguiendo el protocolo de Dittrich et al. [2005]. Este protocolo se basa
en la determinación colorimétrica de la producción de ácido acetilhidroxámico [Lipmann y
Tuttle, 1945; Rose et al., 1954]. En la primera etapa de la reacción, el acetato es convertido
en acetilfosfato por acción de la enzima AckA, y posteriormente el residuo acilo del
anhídrido de ácido se convierte en acetilhidroxamato al combinarse con hidroxilamina. El
acetilhidroxamato reacciona con hierro trivalente para generar un complejo púrpura altamente
estable.
Los extractos libres de células se prepararon a partir de cultivos exponenciales de las
cepas en estudio [densidad óptica a 600 nm (DO600) = 0,4-0,6] en medio LBG. La ruptura de
las células se realizó por sonicación (Ultrasonic Homogenizer; Cole Parmer Instruments Co.,
Chicago, IL, EE.UU.). Se efectuaron 6 ciclos de sonicación de 10 s cada uno, con intervalos
de 10 s en baño de hielo entre cada ciclo. Finalmente, los restos celulares fueron separados
centrifugando los extractos a 12.000 r.p.m. durante 30 min a 4°C. La mezcla de reacción para
las determinaciones contuvo Tris·HCl 50 mM pH = 7,4; MgCl2 10 mM; ATP 10 mM;
CH3COOK 800 mM; y NH2OH·HCl neutralizada 700 mM. El ensayo se inició por adición de
100 μl del extracto libre de células a 1 ml de la mezcla de reacción. Tras homogeneizar
cuidadosamente la mezcla, se incubó durante 5 min a temperatura ambiente. Luego se agregó
1 ml de Cl3CCOOH 10% (m · vol-1) para precipitar las proteínas, seguido por 1 ml de FeCl3
1,25% (m · vol-1) en HCl 1 M. La reacción se homogeneizó y después de incubar por 5 min a
temperatura ambiente, se centrifugó a 12.000 r.p.m. durante 5 min. Finalmente, la
absorbancia del sobrenadante se determinó a 540 nm. La concentración total de proteínas se
estimó por el método de Lowry et al. [1951].
Determinación del contenido de citocromos. Para determinar el contenido de
citocromos bo y bd se utilizaron extractos crudos de las cepas en estudio, preparados a partir
de suspensiones celulares en Tris·HCl 50 mM pH = 7,0 tal como se indicó en la sección
precedente. Los espectros diferenciales de los extractos crudos fueron analizados en un
108
espectrofotómetro Beckman DU 650 UV-Vis (Beckman Coulter Inc.; Fullerton, CA,
EE.UU.) termostatizado a 25°C. Los espectros fueron tomados utilizando una velocidad de
barrido de 0,5 nm · s-1 utilizando un paso de banda de 1 nm y una constante de tiempo τ = 1 s.
La diferencia entre los espectros oxidado y reducido se obtuvo por adición de K3Fe(CN)6 1
mM o Na2S2O4 1 mM a la muestra, respectivamente. En algunos experimentos, se analizaron
los espectros correspondientes a la forma de los citocromos unida a CO. Para ello, el CO se
preparó in situ tratando HCOOH con el mismo volumen de H2SO4 concentrado y el extracto
celular se burbujeó con el gas durante 5 min. Los pares de longitudes de onda usados para el
análisis espectral fueron λcitocromo bo = 542 y 558 nm, y λcitocromo bd = 628 y 649 nm [Miller y
Gennis, 1983; Kita et al., 1989]. A su vez, los coeficientes de extinción molar utilizados para
los cálculos fueron εcitocromo bo = 20,7 cm-1 · mM-1, y εcitocromo bd = 18,8 cm-1 · mM-1 [Kita et al.,
1984a,b]. La concentración total de proteínas en los extractos se analizó por el método de
Lowry et al. [1951].
4.4.4. Manipulación de proteínas
Preparación de extractos celulares y determinación de proteínas totales. Las
cepas bacterianas a partir de las cuales se realizaron los ensayos fueron crecidas en medio
LBG durante 24 h. Para la extracción, se centrifugaron 10 ml del cultivo a 10.000 r.p.m. y
4°C, y el sedimento resultante se lavó dos veces por resuspensión en 1 vol de solución de
lavado (Na2HPO4 87 mM, KH2PO4 13 mM, pH = 7,5), y centrifugación. Finalmente, la
biomasa se resuspendió en 1 ml de solución de lavado conteniendo fenilmetilsulfonilfluoruro
(PMSF; Sigma-Aldrich) 1 mM. Los extractos crudos se obtuvieron por sonicación, tal como
se indicó en la sección dedicada a la determinación de actividad AckA. Los extractos libres
de células se conservaron a –70°C hasta su utilización. La concentración total de proteínas
fue determinada por el método de Bradford [1976], utilizando albúmina sérica bovina
cristalina como estándar.
Electroforesis en geles de poliacrilamida. Las electroforesis desnaturalizantes en
presencia de dodecilsulfato de sodio (SDS) se realizaron en una unidad de electroforesis para
proteínas vertical (10 cm × 10 cm × 1 mm; BioRad Labs., Hercules, CA, EE.UU.),
esencialmente de acuerdo al protocolo descripto por Laemmli [1970]. Se utilizó una
concentración de acrilamida en el gel separador de 12,5% (m · vol-1), mientras que la
concentración en el gel concentrador fue de 4,5% (m · vol-1). La solución para la corrida
electroforética contuvo Tris 25 mM; glicina 0,2 M; y SDS 3,5 mM. La electroforesis se
desarrolló con amperaje constante (20 mA) hasta que las muestras atravesaron el gel
concentrador; a partir de ese momento la corriente se aumentó a 25 mA.
Una vez terminada la electroforesis, los geles se transfirieron a una solución de
tinción durante 1 h [azul brillante de Coomassie R-250 0,2% (m · vol-1); CH3OH 45% (vol ·
vol-1); y CH3COOH 10% (vol · vol-1)]. Para decolorar, los geles fueron transferidos a una
solución de decoloración [CH3OH 45% (vol · vol-1); y CH3COOH 10% (vol · vol-1)] en la
cual fueron mantenidos con agitación lenta durante 18 h.
109
Transferencia de proteínas a membranas de nitrocelulosa y detección de ArcA
utilizando un antisuero α-ArcA (Western blotting). Luego de visualizar las proteínas en el
gel, éste fue sumergido en solución de transferencia [Tris 50 mM; glicina 40 mM; SDS 1,3
mM; CH3OH 20% (vol · vol-1)] durante 30 min. La membrana de nitrocelulosa se cortó de
acuerdo al tamaño del gel (7,0 cm × 5,5 cm), y fue hidratada secuencialmente en H2O y
solución de transferencia. La transferencia de las proteínas se efectuó utilizando el equipo
Trans-Blot de transferencia semi-seca (BioRad). Finalizada la transferencia, la membrana se
lavó con H2O destilada, y se visualizaron las proteínas después de tratarla 10 min con una
solución de rojo Pounceau 0,5% (m · vol-1) en CH3COOH 1% (vol · vol-1). Para verificar la
transferencia de proteínas, el gel se tiñó con solución de azul brillante de Coomassie R-250.
La membrana se lavó varias veces con H2O deionizada para eliminar los restos de rojo
Pounceau, y el bloqueo se efectuó incubando la membrana a 4°C durante 18 h en solución
TBS [Tris·HCl 10 mM pH = 8,0; NaCl 150 mM], conteniendo Tween-20 0,05% (vol · vol-1)
y leche descremada 5% (m · vol-1). Luego, la membrana se lavó dos veces con TBS, y se
incubó a temperatura ambiente con agitación suave en 30 ml de una dilución 1:10.000 del
antisuero policlonal α-ArcA de conejo en TBS conteniendo Tween-20 0,01% (vol · vol-1) y
leche descremada 5% (m · vol-1). El antisuero policlonal α-ArcA se preparó por inmunización
de conejos con ArcA-His6× [Alexeeva et al., 2003]; y fue gentilmente cedido por el Dr. M.
Joost Teixeira de Mattos (Universidad de Amsterdam, Holanda). Después del tratamiento con
el antisuero, la membrana se lavó tres veces con TBS conteniendo Tween-20 0,01% (vol ·
vol-1), y una vez con TBS. Posteriormente, la membrana se incubó durante 1 h con una
dilución 1:3.000 del anticuerpo secundario α-IgG de ratón conjugado a fosfatasa alcalina
(BioRad) en TBS–Tween-20 0,01% (vol · vol-1) con leche descremada 5% (m · vol-1).
Después de este paso, la membrana se lavó según se explicó anteriormente, y se reveló por
quimioluminiscencia siguiendo las instrucciones del proveedor (kit ImmunoStar; BioRad).
4.5.1. Análisis del genotipo y fenotipo de mutantes arcA::IS10-L
Los resultados del análisis fenotípico mencionados en capítulos anteriores revelaron
características diferentes en las cepas de E. coli con las mutaciones ΔarcA y arcA::IS10-L.
Esta última mutación fue originalmente denominada arcA2, cercana a zij::Tn10 [Iuchi et al.,
1989], y se encontró que una cepa de E. coli con este alelo poseía algunas de las
características fenotípicas de mutantes arcA de deleción. La secuenciación parcial del alelo
arcA2 obtenido a partir de E. coli ECL618 había mostrado que se trata de un elemento de
inserción IS10 en el codón 170 de arcA [Iuchi et al., 1994]. Como primer paso en la
caracterización molecular de la región arcA en E. coli CT1061, se decidió amplificar todo el
alelo arcA2 y secuenciarlo usando los oligonucleótidos descriptos en Materiales y métodos.
Según se mencionó en abrégé en el Capítulo II, la secuenciación del locus permitió
identificar un elemento de tipo IS10-L [Halling et al., 1982] interrumpiendo la secuencia
codificante de arcA. De esta manera, la denominación utilizada en esta tesis para el alelo
arcA2 es arcA::IS10-L (número de acceso NCBI: AM269884). Un esquema del locus arcA
en el cromosoma de E. coli CT1061 se muestra en la Fig. 4.1.
110
RI-3’
arcA’
Extremo N
terminal
RI-5’
IS10-L
‘arcA
Extremo C
terminal
1 kb
Fig. 4.1. Organización de la región genómica arcA en E. coli CT1061. Se indica la
secuencia de inserción de tipo Tn10 que interrumpe el marco abierto de lectura de arcA, así
como las repeticiones invertidas (RI) que flanquean dicha secuencia de inserción. kb,
kilobase.
Dado que la secuencia de inserción que interrumpe arcA introduce un codón de
terminación de la transcripción prematuro, el resultado de la transcripción del locus
arcA::IS10-L sería un ARN mensajero de menor longitud, y, consecuentemente, podría
originar una proteína truncada. Considerando esto, para analizar la estabilidad de la posible
proteína ArcA truncada se realizaron ensayos de Western blotting a partir de extractos crudos
de las cepas en estudio; i.e., K1060 (la cepa salvaje parental), CT1061 (arcA::IS10-L), y
CT1062 (ΔarcA). La detección de ArcA se realizó con un antisuero policlonal α-ArcA (Fig.
4.2). En los extractos de E. coli K1060, la cepa salvaje, pudo detectarse una única banda
correspondiente a la proteína ArcA nativa con un peso molecular aparente (Mr’) de 29 kDa.
No se detectaron bandas reactivas en extractos de la cepa de deleción CT1062, mientras que
se pudo identificar una banda reactiva en los extractos de E. coli CT1061 (producto del alelo
arcA::IS10-L) con Mr’ = 19 kDa. El Mr’ de este fragmento proteico es coincidente con la
predicción efectuada in silico a partir de la secuencia de ADN del alelo arcA::IS10-L (Mr =
19,4 kDa). Además, el análisis in silico de las características de esta proteína demostró que la
versión truncada de ArcA no posee un sitio de unión a ADN. Esto sugiere a priori que el
fragmento proteico no poseería una función regulatoria relevante respecto al metabolismo
redox. En conjunto, los resultados hasta aquí expuestos señalarían que E. coli CT1061 es una
mutante de inserción cuyo genotipo relevante es arcA::IS10-L, y con fenotipo nulo para
ArcA. Debe señalarse que, tratándose de un regulador global, existe la posibilidad de que este
fragmento proteico truncado pueda interaccionar con otras proteínas modificando y/o
regulando su actividad por interacciones directas de tipo proteína-proteína. Sin embargo, y
según se discutirá en secciones posteriores, varios de los fenotipos de interés aquí estudiados
no se encuentran afectados en forma significativa por estos posibles efectos.
111
1
2
3
30 kDa
19 kDa
Fig. 4.2. Análisis de la proteína ArcA por Western blotting. En cada una de las calles se
sembraron 20 μg de proteínas totales provenientes de extractos crudos libres de células. Las
proteínas se resolvieron en un gel de poliacrilamida 12,5% (m · vol-1) en condiciones
desnaturalizantes, se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa, y se efectuó la detección
con un antisuero policlonal α-ArcA. La detección de las bandas se realizó por
quimioluminiscencia utilizando un kit comercial, según se detalla en Materiales y métodos.
Calle 1, K1060 (cepa salvaje); calle 2, CT1062 (ΔarcA); calle 3, CT1061 (arcA::IS10-L).
kDa, 103 dalton.
4.5.2. Presencia de una mutación constitutiva en el gen creC de E. coli CT1061
Como se discutió en el Capítulo II, E. coli CT1061 fue construida por transducción
generalizada mediada por el bacteriófago P1 utilizando E. coli ECL618 como cepa dadora, y
posterior selección de las transductantes derivadas de E. coli K1060 (la cepa salvaje
receptora) por resistencia a tetraciclina. Dado que el fago P1 es capaz de encapsular 110-115
kb de ADN, en un evento de transducción se podría transferir ca. 2,3% del cromosoma de E.
coli a la célula receptora [Sternberg, 1990]. También se ha determinado que la distancia
máxima que puede existir entre dos marcadores moleculares en el genoma bacteriano de
manera que haya co-transducción de los mismos es ca. 2,3 min, evento que ocurre con una
frecuencia de 0,3% [Taylor y Trotter, 1967]. De esta manera, y teniendo en cuenta la
evidencia experimental recién discutida, se consideró la posibilidad de que el fenotipo
particular observado en E. coli CT1061 pudiera deberse a la presencia de mutaciones
secundarias transferidas inadvertidamente desde ECL618. Es preciso mencionar aquí que el
genotipo provisto en la literatura para la cepa dadora en los experimentos de transducción con
fago P1 no sugiere la presencia de ninguna mutación caracterizada cercana al locus arcA que
pudiese dar lugar a las diferencias fenotípicas observadas. Por este motivo, se analizó la
región genómica adyacente a ambos extremos de arcA en el cromosoma de E. coli y se
encontró que existe un conjunto de genes denominados cre (Fig. 4.3), que incluye los marcos
de lectura abiertos creABCD, ubicado a una distancia de entre 60 y 4.069 pb respecto al gen
arcA [Bachmann, 1983]. En virtud de la cercanía física entre arcA y este conjunto de genes,
la transferencia por transducción generalizada del marcador de resistencia a tetraciclina en
arcA::IS10-L implicaría una co-transferencia de los genes creABCD de ca. 90%.
112
1 kb
rob
arcA
creA
creB
creC
creD
Fig. 4.3. Genes cercanos al gen arcA en el genoma de E. coli. Los genes creABCD se
extienden entre 60 y 5.069 pb desde el último nucleótido de arcA. El gen rob codifica otra
proteína regulatoria que poseería varios efectos sobre la fisiología y metabolismo de E. coli
[Bachmann, 1983]. kb, kilobase.
A pesar de que existe escasa información disponible sobre la función y regulación de
estos genes, es un hecho bien establecido que los productos de creB y creC forman un
sistema de transducción de señales de dos componentes [Avison et al., 2001]. En este sistema
regulatorio, CreB es el regulador citoplasmático y CreC es la quinasa sensora asociada a
membrana. Dado que varios de los genes regulados por CreBC están involucrados en el
metabolismo central y fermentativo de E. coli (e.g., ackA-pta, talA, trgB) y son activados en
medio mínimo, se continuó con el análisis del locus cre para estudiar si este sistema ejercía
alguna influencia sobre el fenotipo de E. coli CT1061, capaz de crecer en medios semisintéticos sin los requerimientos nutricionales extensivos necesarios para otras mutantes arcA
estudiadas. En el trabajo de Avison et al. [2001] se ha descripto el efecto de una mutación
puntual en creC que confiere un fenotipo constitutivo para CreC. Esta mutación, conocida
como creC510 (y originalmente, phoM510) [Wanner, 1987] causa la sustitución de un
residuo de arginina por uno de prolina en la posición 77 en CreC (R77P), y aumenta
significativamente el nivel de expresión de los genes positivamente modulados por Cre.
Analizando la genealogía del alelo creC510 se encontró que éste estaba originalmente
presente en HfrH, y su derivada directa Hfr 3000 thi [Bachmann, 1972]. Por otro lado, se
conoce que la cepa ECL618 (dadora de arcA::IS10-L) lleva una deleción que abarca lac-pro
[Δ(lac-pro)X111] la cual fue originalmente construida en HfrH. De esta manera, parecería
probable que ECL618 también tuviese la mutación constitutiva en creC [a la cual
denominaremos creC(Con)]. Según se mencionó en la Introducción, malE es un gen
reprimido por CreBC cuyo producto está involucrado en el metabolismo de maltosa. El
primer indicio de la presencia de creC(Con) en E. coli CT1061 y ECL618 fue obtenido
cuando se sembraron placas de medio mínimo con maltosa como única fuente de carbono.
Mientras E. coli K1060 (la cepa salvaje de la cual deriva CT1061) fue capaz de crecer en
dichas condiciones, CT1061 y ECL618 no mostraron crecimiento significativo (datos no
mostrados). Estos experimentos mostrarían que el metabolismo de maltosa se encuentra
negativamente afectado en estas cepas, posiblemente debido a la represión ejercida por
creC(Con) sobre malE.
113
Posteriormente se secuenció el gen creC amplificado a partir de E. coli K1060,
CT1061, CT1062, ECL618, y Hfr 3000. Como se esperaba, las cepas CT1061, ECL618, y
Hfr 3000 poseían la mutación creC(Con) que origina la mencionada sustitución R77P,
evidenciando la relación filogenética que existe entre ellas. Al mismo tiempo E. coli K1060 y
CT1062, su derivada ΔarcA, presentaron la secuencia de creC salvaje. Como control
fenotípico adicional, se comprobó que Hfr 3000 tampoco fue capaz de crecer en medio
mínimo conteniendo maltosa como único sustrato carbonado. Por otra parte, tratándose de
que la diferencia encontrada en creC es una mutación puntual en dicho gen, sería esperable
que exista un porcentaje de reversión. De hecho, luego de 48-72 h de incubación a 37°C se
pudieron aislar algunas pocas colonias de revertantes que poseían la secuencia salvaje en
creC. Curiosamente, estas revertantes aisladas por su fenotipo Mal+ mostraron un fenotipo
Dye igual al de cepas arcA, i.e., incapacidad de crecer en presencia de azul de toluidina
(resultados no mostrados). Esta información permitió relacionar en forma cualitativa la
presencia de la mutación creC(Con) con la diferencia observada entre las cepas CT1061 y
CT1062 respecto del crecimiento en presencia de colorantes redox.
4.5.3. Estudio de la contribución de mutaciones en los sistemas ArcAB y
CreBC a algunas de las características fenotípicas de E. coli CT1061
Para continuar con la evaluación del efecto de mutaciones en creC sobre el fenotipo
Dye sugerido en los experimentos de la sección precedente, se efectuaron ensayos de
complementación en E. coli CT1062 (ΔarcA). Como puede observarse en la Fig. 4.4, la cepa
CT1062 fue complementada por el alelo arcA salvaje expresado en un vector de bajo número
de copias. Sin embargo, el alelo arcA::IS10-L expresado a partir del mismo vector fue
incapaz de restituir el crecimiento de CT1062 en presencia de azul de toluidina. Este ensayo
aporta evidencia en relación al hecho de que las características fenotípicas de CT1061 no
estarían relacionadas solamente con la presencia del alelo arcA::IS10-L. Además, se observó
que E. coli CT1061 [arcA::IS10-L creC(Con)] fue la única cepa arc que presentó crecimiento
en azul de toluidina, originando colonias de tamaño pequeño a mediano en comparación con
las colonias de la cepa salvaje. Como confirmación adicional del efecto ejercido por
creC(Con) sobre el fenotipo Dye se construyó la cepa de E. coli IV1061K (una derivada
ΔcreB::kan de CT1061) por el método de reemplazo alélico de Datsenko y Wanner [2000].
Cuando IV1061K se analizó respecto al fenotipo Dye, se encontró que esta cepa era incapaz
de crecer en medios conteniendo azul de toluidina, tal como se espera para una cepa mutante
arc. Este resultado confirma que CT1061 se comporta como mutante nula para ArcA, en
concordancia con las observaciones experimentales previas. Al mismo tiempo, dado que
IV1061K carece del regulador citoplasmático del sistema Cre, se elimina el efecto que la
mutación creC(Con) pudiera ejercer en el fenotipo de esta cepa. Los resultados discutidos en
esta sección aportan evidencia que mostraría que el fenotipo particular de E. coli CT1061 es
debido a la contribución parcial de mutaciones en los genes que codifican los reguladores
globales ArcAB y CreBC.
114
A
1
2
3
4
5
B
10-3
1
2
10-5
5
3
10-7
4
Fig. 4.4. Análisis del fenotipo Dye. Se realizaron diluciones seriadas de cultivos de 18 h
en LBG de las cepas a analizar, y se sembraron en medio TB. Las cepas de E. coli analizadas
en este ensayo fueron: 1, K1060/pWKS30; 2, CT1062/pWKS30; 3, CT1061/pWKS30; 4,
CT1062/pWKS30-arcAK1060; 5, CT1062/pWKS30-arcA::IS10-L. La aparición de colonias se
estudió luego de 24 h de incubación a 37°C (A). A la izquierda de la figura se indican las
diluciones sembradas. Las cepas en estudio no mostraron diferencias significativas en el
crecimiento en placas de medio LB (B).
Se ha mostrado en el Capítulo III que el fenotipo Dye en las mutantes arcA podría
deberse a la elevada actividad respiratoria de dichas cepas, lo cual trae aparejado un aumento
significativo en la producción de especies reactivas de oxígeno. Sin embargo, y según los
resultados mostrados en la Fig. 4.5, E. coli CT1061 (una mutante arc) fue capaz de crecer en
presencia de azul de toluidina. ¿Cuál es, entonces, el efecto ejercido por creC(Con) que
contribuye a la supresión parcial del fenotipo Dye? El sistema CreBC juega un rol importante
en el catabolismo de carbono [Cariss et al., 2008], activando vías fermentativas y también
vías metabólicas relacionadas al crecimiento en medio mínimo, en el cual la bacteria debe
sintetizar los componentes celulares necesarios para el crecimiento. Por este motivo, la
presencia de creC(Con) determinaría un metabolismo catabólico activo aún en condiciones
de crecimiento en medios de cultivo ricos. Posiblemente, el estado redox altamente reducido
en esta cepa (producto de la mutación en arcA), junto a su mayor capacidad catabólica
[consecuencia de la presencia del alelo creC(Con)], determine que los equivalentes de
reducción sean captados en productos de fermentación reducidos, de forma similar a lo
ocurrido cuando se expresan los genes pha [cf. Capítulo III]. De esta manera, los dadores de
electrones serían consumidos utilizando un aceptor interno abundante como el acetilcoenzima A y/o acetaldehído, permitiendo el crecimiento de esta mutante en condiciones en
las cuales el daño oxidativo normalmente impediría el desarrollo de mutantes arc de deleción.
El fenotipo Dye de E. coli IV1061K, incapaz de crecer en medios con azul de toluidina,
aportaría evidencia adicional a favor de esta explicación.
115
Otra característica fenotípica en la cual difieren las cepas CT1061 y CT1062 es su
capacidad respiratoria. Según se discutió en el párrafo precedente, la presencia de creC(Con)
permitiría la expresión de los genes regulados por CreBC aún en medios de cultivo
complejos. Para continuar la caracterización de la influencia de CreBC en las características
fenotípicas de las cepas en estudio, y teniendo en cuenta que CT1062 e IV1061K no fueron
capaces de crecer en medios con azul de toluidina, se midió la capacidad respiratoria (qO2) en
cultivos de 18 h en medios de cultivo complejos y mínimos con distintas fuentes carbonadas.
Dada la activación de los genes ackA-pta por CreBC, se esperaría a priori que las cepas
conteniendo la mutación creC(Con) presentasen una mayor tasa respiratoria en presencia de
acetato como única fuente de carbono en comparación con las cepas restantes. En efecto,
CT1061 presentó mayor qO2 en los tres medios de cultivo (medio LB con glucosa, y MM con
glucosa o acetato). Como fuera observado en otros experimentos de consumo de oxígeno de
cepas arc, las cepas CT1062 e IV1061K presentaron mayores valores de qO2 respecto a la
cepa salvaje en los medios conteniendo glucosa (P < 0,05). No se observaron diferencias
significativas en presencia de acetato como fuente de carbono. Este resultado proporciona
evidencia adicional acerca de la activación de la vía fermentativa/catabólica AckA-Pta en
presencia del alelo creC(Con), dado que en la mutante IV1061K (ΔcreB::kan) la tasa
respiratoria no difiere de la observada para K1060. En general, puede concluirse que el
aumento en la actividad catabólica de las cepas de E. coli creC(Con)+ se traduciría en una
tasa respiratoria elevada como consecuencia de la generación de intermediarios metabólicos
que actuarían como transportadores y dadores de electrones en la cadena respiratoria.
Consumo de oxígeno
-1
-1
(μmol O2 · min · mg proteína )
24
LB
MM/Acetato
MM/Glucosa
20
16
12
8
4
0
E. coli K1060
CT1061
CT1062
IV1061K
Fig. 4.5. Análisis de la actividad respiratoria (qO2) de las cepas en estudio. Los cultivos de
las cepas K1060 (salvaje), CT1062 (ΔarcA), CT1061 [arcA::IS10-L creC(Con)], e IV0161K
[arcA::IS10-L creC(Con) ΔcreB::kan] se desarrollaron durante 18 h en medio LBG a 37°C.
Posteriormente, se transfirieron alícuotas de estos cultivos a la cámara de medición en la cual
se había termostatizado el mismo medio de cultivo o medio mínimo (MM) conteniendo
glucosa 20 mM o acetato 60 mM como única fuente de carbono (lo cual corresponde a una
concentración total de átomos de carbono de 120 mM en cada caso). La composición del MM
está basada en las sales del medio MYA [Sambrook et al., 1989].
116
4.5.4. Rol del sistema CreBC en otras diferencias metabólicas y enzimáticas
observadas en E. coli CT1061
Como se mencionó en la sección anterior, E. coli CT1061 exhibió una mayor tasa
respiratoria en presencia de acetato en comparación con la cepa salvaje. En virtud de la
regulación sobre el operón ackA-pta mediada por CreBC, se decidió estudiar si también
existían diferencias a nivel de la actividad acetato quinasa (AckA). En la Tabla 4.2 se
muestran los resultados de las mediciones de actividad AckA en cultivos exponenciales de las
cepas en estudio crecidas en medio LBG. Como puede observarse, E. coli CT1061 mostró un
aumento de ca. 4 veces en la actividad AckA en comparación con la cepa salvaje K1060 o
con CT1062 (ΔarcA). De hecho, la interrupción de creB por un cassette de kanamicina (cepa
IV1061K) restituyó los valores de actividad AckA a niveles cercanos a los observados para la
cepa salvaje. Análogamente las cepas ECL618 y Hfr 3000 [las cuales poseen la mutación
creC(Con)] también exhibieron elevados niveles de actividad AckA, aún cuando no se trata
de cepas isogénicas respecto a K1060.
Cepa
Genotipo relevante
K1060
CT1061
CT1062
IV1061K
ECL618
Hfr 3000
Salvaje
arcA::IS10-L creC(Con)
ΔarcA
arcA::IS10-L creC(Con) ΔcreB::kan
creC(Con)
Actividad AckA
(μmol · min-1 ·
mg proteína-1)
2,49 ± 0,67
10,71 ± 2,14
2,98 ± 0,68
3,15 ± 0,97
7,96 ± 1,89
9,72 ± 1,45
Actividad relativa
a E. coli K1060
1,0
4,3
1,2
1,3
3,2
3,9
Tabla 4.2. Actividad específica de acetato quinasa (AckA). Las cepas se hicieron crecer
en medio LBG a 37°C hasta alcanzar la fase exponencial de crecimiento y se cosecharon a
una DO600 = 0,6-0,9. Las determinaciones se realizaron sobre extractos libres de células
siguiendo el protocolo descripto en Materiales y métodos. La actividad está expresada en
función de la formación de acetilhidroxamato [Dittrich et al., 2005].
También se estudió el perfil metabólico en medio LBG en cultivos de 24 h de las
cepas K1060 (salvaje), CT1061 [arcA::IS10-L creC(Con)], CT1062 (ΔarcA), e IV1061K
[arcA::IS10-L creC(Con) ΔcreB::kan]. En la Fig. 4.6 se muestran los resultados expresados
en términos de la velocidad específica de producción de cada uno de los metabolitos. En
general, se observa que en las cepas arc la síntesis de metabolitos oxidados se encuentra
disminuida en relación a la producción de etanol. Esta tendencia fue aún más evidente para E.
coli CT1061. Es interesante mencionar que la mutación del gen creB dio lugar a un perfil
metabólico muy similar al observado para E. coli CT1062, cepa en la cual la mutación ΔarcA
determinaría mayormente las características del perfil de metabolitos de fermentación.
117
-1
-1
qp (mmol · g biomasa · h )
4,0
K1060
CT1061
CT1062
IV1061K
3,5
3,0
2,5
2,0
1,5
1,0
0,5
Etanol
Piruvato
Lactato
Succinato
Formato
Acetato
0,0
Fig. 4.6. Perfil metabólico de las cepas en estudio. Los resultados se expresan en términos
de la velocidad específica de producción para cada metabolito (qp). La concentración de los
metabolitos de fermentación se determinó en sobrenadantes de cultivos de 24 h desarrollados
en medio LBG (conteniendo glucosa 20 mM) por cromatografía de gases y/o a través de
ensayos enzimáticos comerciales. Los valores corresponden al promedio de determinaciones
realizadas por duplicado en al menos dos cultivos independientes ± desviación estándar.
Una característica interesante observada durante la caracterización metabólica fue que
el cociente molar etanol/acetato, el cual refleja el estado redox intracelular [Sánchez et al.,
2005], presentó un valor considerablemente mayor para E. coli CT1061 que para las restantes
cepas (ca. 5,7 veces mayor que el obtenido para la cepa salvaje) (Tabla 4.3). A su vez, la
deleción de creB dio lugar a un perfil metabólico similar al observado para la cepa CT1062,
evidenciando el hecho de que en ausencia de la mutación creC(Con) E. coli CT1061 se
comporta como una cepa arcA de deleción. Todas las mutantes presentaron un valor mayor
para el cociente etanol/acetato, como puede esperarse en virtud de la desregulación redox en
mutantes arc. También se observó un aumento de ca. 40% en el catabolismo de glucosa en
CT1061, reflejado en un mayor consumo específico de sustrato carbonado (QGlucosa) en
comparación con las restantes cepas. Nuevamente, en la mutante IV1061K se observó una
disminución en este parámetro cuando se compara con su cepa isogénica creB+. En conjunto,
estos resultados fisiológicos muestran claramente que las características distintivas de E. coli
CT1061 se deben al efecto combinado de mutaciones en arcA y creC.
118
Cepa
Genotipo relevante
K1060
CT1061
CT1062
IV1061K
Salvaje
ΔarcA
QGlucosa
(mmol · min-1 ·
g biomasa-1)
5,25 ± 0,07
7,36 ± 0,11
4,12 ± 0,09
4,85 ± 0,12
Cociente
etanol/acetato
(mol · mol-1)
0,29 ± 0,05
1,65 ± 0,53
0,57 ± 0,14
0,41 ± 0,11
Tabla 4.3. Parámetros fisiológicos de las cepas crecidas en medio LBG. El consumo
específico de glucosa (QGlucosa) se calculó durante la fase exponencial de crecimiento. El
cociente etanol/acetato se determinó en cultivos estacionarios (24 h).
4.5.5. Regulación de la actividad de los citocromos bd y bo en E. coli CT1061
Como se mencionó en la Introducción general de esta tesis, E. coli posee dos oxidasas
terminales, el citocromo bo y el citocromo bd, los cuales poseen baja y alta afinidad por
oxígeno molecular, respectivamente [Gennis y Stewart, 1996]. El análisis de la expresión de
los operones cyo y cyd a través de fusiones a lacZ había mostrado que ArcA reprime la
expresión de cyo y activa la de cyd en condiciones de baja disponibilidad de oxígeno [Iuchi et
al., 1990]. Para estudiar el papel de ArcA en conjunción con la mutación creC(Con) en la
modulación de la actividad de citocromos en E. coli CT1061, se midió el contenido de los
mismos en cultivos estacionarios de las cepas en estudio en medio LBG. Los resultados se
muestran en la Tabla 4.4, en la cual puede observarse que el contenido de citocromos estaría
regulado mayormente por ArcA. De hecho, en las condiciones del ensayo no se observó
activación del citocromo bd (i.e., se detectó un menor contenido de esta oxidasa terminal), y
tampoco se detectó represión del citocromo bo en las cepas con mutaciones en arcA (CT1062
y CT1061) en comparación con la cepa salvaje (K1060). Estos resultados sugerirían que
CreBC no interviene en la regulación de la actividad de la cadena respiratoria como
consecuencia de cambios en la disponibilidad de oxígeno.
Cepa
K1060
CT1061
CT1062
IV1061K
Genotipo relevante
Salvaje
ΔarcA
Contenido de citocromos
(pmol · mg proteína-1)
Citocromo bd
Citocromo bo
223 ± 67
115 ± 21
78 ± 11
332 ± 53
69 ± 18
308 ± 42
75 ± 13
325 ± 31
Tabla 4.4. Contenido de citocromos bd y bo. Las cepas fueron crecidas en medio LBG a
37°C durante 24 h. Las determinaciones se realizaron por espectrofotometría diferencial
sobre extractos libres de células siguiendo el protocolo descripto en Materiales y métodos.
Por primera vez se ha encontrado que las características fenotípicas que distinguen a
CT1061 de otras mutantes arc se debe a la presencia de una mutación secundaria en creC, un
gen que forma parte de un sistema de dos componentes involucrado en el catabolismo de
carbono del cual se dispone de escasa información. Cuando E. coli es sometida a condiciones
de limitación de oxígeno se sintetizan diferentes productos de fermentación para alcanzar el
119
balance redox necesario para que el microorganismo pueda seguir creciendo a expensas de la
fuente de carbono [Clark, 1989; Böck y Sawers, 1996]. Tomando en consideración la
información disponible en la literatura junto con algunos de los resultados hasta aquí
discutidos, el efecto de una mutación en arcA se traduce en la desrepresión de las enzimas del
ciclo de ácidos tricarboxílicos y del citocromo bo [Lynch y Lin, 1996], lo cual resulta en un
aumento de la producción de equivalentes de reducción [NAD(P)H] y elevada capacidad
respiratoria. Gran parte de estos equivalentes de reducción debe ser re-oxidada para que el
crecimiento pueda continuar normalmente, de manera que se generan metabolitos de
fermentación reducidos tales como el etanol. Esto explicaría el hecho de que en las mutantes
arcA se registren elevados cocientes molares etanol/acetato. Por otro lado, la mutación
creC(Con) contribuye a aumentar el catabolismo de carbono, lo cual es confirmado por la
elevada tasa de consumo de glucosa en la cepa CT1061. Teniendo en cuenta la evidencia
experimental, podría plantearse que el exceso de equivalentes de reducción producidos por
mutantes arcA como consecuencia del desbalance redox del catabolismo es consumido
debido a una mayor disponibilidad de intermediarios carbonados debidos a creC(Con), lo
cual explicaría la elevada síntesis de etanol y otros productos reducidos.
El tamaño y la estabilidad de la proteína ArcA truncada podrían permitir su
interacción con otros reguladores, pero los ensayos de complementación y el contenido de
citocromos confirmarían que arcA::IS10-L es una mutación nula. Por otra parte, en virtud de
que el bacteriófago P1 es capaz de empaquetar en su cápside proteica ca. 100 kb de ADN
podrían haberse transferido a E. coli CT1061 otra(s) mutación(es) además de creC(Con).
Dada la imposibilidad material de conocer la extensión del fragmento de ADN transferido,
esta posibilidad no puede ser descartada. Sin embargo, si se han co-transferido otros genes
con mutaciones, su contribución a las características fenotípicas es menor y despreciable en
relación al efecto de creC(Con) sobre el catabolismo de carbono.
Es oportuno señalar aquí que la mutación creC(Con) se encuentra ampliamente
distribuida en cepas de laboratorio de E. coli usualmente utilizadas en el trabajo rutinario de
Biología Molecular. Como ejemplo basta considerar que la deleción Δ(lac-proAB)X111
proveniente de HfrH ha sido utilizada para la construcción de cepas de clonado, como la serie
de cepas JM a la cual pertenece la ampliamente difundida cepa de E. coli JM109 [YanischPerron et al., 1985]. De esta manera, algunos resultados acerca de la expresión heteróloga de
genes y/o modificaciones genéticas introducidas en estas cepas huésped podrían estar
parcialmente modificados por la presencia de creC(Con), como queda ilustrado en el fenotipo
de mutantes arc que llevan este alelo.
En estudios relacionados a la función del regulador Fnr, Kang et al. [2005] destacaron
el hecho de que no existe una visión completa de la fisiología de E. coli en condiciones de
baja disponibilidad de oxígeno. Desde dicho trabajo se han llevado a cabo diversos estudios
tendientes a la elucidación del efecto de diversos reguladores globales cuya acción modula el
estado redox celular [Alexeeva et al., 2000; 2003; Shalel-Levanon et al., 2005a,b,c], entre los
cuales ArcA parece ser summo inter pares en relación al fenotipo de las mutantes para este
regulador. Sin embargo, la función de CreBC no ha sido estudiada en detalle, y solamente
disponemos de estudios basados en el análisis de la transcripción de algunos genes.
120
El efecto de CreBC, por otra parte, podría ser menor o incluso indetectable en
presencia de un regulador global potente (e.g., ArcA), pero en un contexto en el cual el efecto
de Arc deja de ser preponderante la regulación ejercida por otros sistemas de control se
volvería más importante, y su participación comenzaría a ser relevante. En general, los
experimentos aquí discutidos tienden a la comprensión del catabolismo de carbono en un
contexto redox desregulado. Debe mencionarse, además, que la mutación constitutiva en
creC junto al fenotipo ArcA– podría tener un impacto considerable en el diseño de cepas de
E. coli para bioprocesos destinados a la obtención de bioproductos reducidos de interés
biotecnológico en condiciones de baja disponibilidad de oxígeno.
Aguayo, J. B., M. P. Gamcsik, y J. D. Dick.
1988. High resolution deuterium NMR
studies of bacterial metabolism. J.
Biol. Chem. 263:19552-19557.
Hellingwerf, y M. J. Teixeira de
Mattos. 2000. Effects of limited
aeration and of the ArcAB system on
intermediary pyruvate catabolism in
Escherichia coli. J. Bacteriol. 182:
4934-4940.
Alexeeva, S., K. J. Hellingwerf, y M. J.
Teixeira
de
Mattos.
2003.
Requirement of ArcA for redox
regulation in Escherichia coli under
microaerobic but not anaerobic or
aerobic conditions. J. Bacteriol. 185:
204-209.
Amemura, M., K. Makino, H. Shinagawa, y
A.
Nakata.
1986.
Nucleotide
sequence of the phoM region of
Escherichia coli: four open reading
frames may constitute an operon. J.
Bacteriol. 168:294-302.
A. Nakata. 1990. Cross talk to the
phosphate regulon of Escherichia coli
by PhoM protein: PhoM is a histidine
protein
kinase
and
catalyzes
phosphorylation of PhoB and PhoMopen reading frame 2. J. Bacteriol.
172:6300-6307.
Avison, M. B., P. Niumsup, T. R. Walsh, y
P. M. Bennett. 2000. Aeromonas
hydrophyla AmpH and CepH βlactamases: derepressed expression in
mutants of Escherichia coli lacking
creB. J. Antimicrob. Chemother.
46:695-702.
Avison, M. B., R. E. Horton, T. R. Walsh, y
P. M. Bennett. 2001. Escherichia coli
CreBC is a global regulator of gene
expression that responds to growth in
minimal media. J. Biol. Chem. 276:
26955-26961.
Avison,
M. B., P. Niumsup, K.
Nurmahomed, T. R. Walsh, y P. M.
Bennett. 2004. Role of the 'cre/blr-tag'
DNA sequence in regulation of gene
expression by the
Aeromonas
hydrophyla β-lactamase regulator,
BlrA. J. Antimicrob. Chemother.
53:197-202.
Bachhawat, P., G. V. T. Swapna, G. T.
Montelione, y A. M. Stock. 2005.
Mechanism
of
activation
for
transcription factor PhoB suggested by
different modes of dimerization in the
inactive and active states. Structure
13:1353-1363.
Bachmann, B. J. 1972. Pedigrees of some
mutant strains of Escherichia coli K12. Bacteriol. Rev. 36:525-557.
Bachmann, B. J. 1983. Linkage map of
Escherichia coli K-12, edition 7.
121
Baek, J. H., y S. Y. Lee. 2006. Novel
members in the Pho regulon of
Escherichia coli. FEMS Microbiol.
Lett. 264:104-109.
Blanco, A. G., M. Solá, F. X. Gomis-Ruth, y
M. Coll. 2002. Tandem DNA
recognition by PhoB, a twocomponent
signal
transduction
transcriptional activator. Structure
13:701-713.
262-282. En F. C. Neidhardt, R.
Curtiss III, J. L. Ingraham, E. C. C.
Lin, K. B. Low, B. Magasanik, W. S.
Reznikoff, M. Riley, M. Schaechter, y
H. E. Umbarger (ed.), Escherichia coli
and
Salmonella:
cellular
and
molecular biology, 2da ed., vol. 1.
Bradford, M. M. 1976. A rapid and sensitive
method for the quantitation of
microgram quantities of protein
utilizing the principle of protein-dye
binding. Anal. Biochem. 72:248-254.
Braunegg, G., B. Sonnleitner, y R. M.
Lafferty. 1978. A rapid gas
chromatographic method for the
determination of poly-β-hydroxybutyric acid in microbial biomass.
Eur. J. Appl. Microbiol. Biotechnol.
6:29-37.
Cariss, S. J. L., A. E. Tayler, y M. B.
Avison. 2008. Defining the growth
conditions and promoter-proximal
DNA
sequences
required
for
activation of gene expression by
CreBC in Escherichia coli. J.
Bacteriol. 190:3930-3939.
of Escherichia coli. FEMS Microbiol.
Rev. 5:223-234.
Cunningham, L., y J. R. Guest. 1998.
Transcription
and
transcript
processing in the sdhCDAB-sucABCD
operon
of
Escherichia
coli.
Datsenko, K., y B. L. Wanner. 2000. Onestep inactivation of chromosomal
genes in Escherichia coli K-12 using
PCR products. Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 97:6640-6645.
2005. Characterization of the acetateproducing pathways in Escherichia
coli. Biotechnol. Prog. 21:1062-1067.
Drury, L. S., y R. S. Buxton. 1988.
Identification and sequencing of the
Escherichia coli cet gene which codes
for an inner membrane protein,
mutation of which causes tolerance to
colicin E2. Mol. Microbiol. 2:109119.
Elias, W. P., J. R. Czeczulin, I. R.
Henderson, L. R. Trabulsi, y J. P.
Nataro. 1999. Organization of
biogenesis genes for aggregative
adherence fimbria II defines a
virulence gene cluster in enteroaggregative Escherichia coli. J.
Bacteriol. 181:1779-1785.
Gennis,
R. B., y V. Stewart. 1996.
Neidhardt, R. Curtiss III, J. L.
Magasanik, W. S. Reznikoff, M.
Riley, M. Schaechter, y H. E.
Umbarger (ed.), Escherichia coli and
Salmonella: cellular and molecular
biology, 2da ed., vol. 1. ASM Press,
Washington, D.C.
Guest, J. R., J. Green, A. S. Irvine, y S.
Spiro. 1996. The FNR modulon and
FNR-regulated gene expression, p.
317-342. En E. C. C. Lin y A. S.
Lynch (ed.), Regulation of gene
expression in Escherichia coli. R. G.
Landes Company, Austin, TX.
Halling, S. M., R. W. Simons, J. C. Way, R.
B. Walsh, y N. Kleckner. 1982. DNA
sequence organization of IS10-right of
Tn10 and comparison with IS10-left.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:26082612.
122
global regulatory gene in Escherichia
coli mediating repression of enzymes
in aerobic pathways. Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 85:1888-1892.
Iuchi, S., D. Furlong, y E. C. C. Lin. 1989.
Differentiation of arcA, arcB, and
cpxA
mutant
phenotypes
of
Escherichia coli by sex pilus
formation and enzyme regulation. J.
Bacteriol. 171:2889-2893.
Gennis, y E. C. C. Lin. 1990.
Requirement for terminal cytochromes
in generation of the aerobic signal for
the arc regulatory system in
Escherichia coli: study utilizing
deletions and lac fusions of cyo and
cyd. J. Bacteriol. 172:6020-6025.
Escherichia coli to respiratory
conditions: regulation of gene
expression. Cell 66:5-7.
Iuchi, S., A. Aristarkhov, J. M. Dong, J. S.
Taylor, y E. C. C. Lin. 1994. Effects
of nitrate respiration on expression of
the Arc-controlled operons encoding
succinate dehydrogenase and flavinlinked L-lactate dehydrogenase. J.
Bacteriol. 176:1695-1701.
Kang, Y., K. D. Weber, Y. Qiu, P. J. Kiley,
y F. R. Blattner. 2005. Genome-wide
expression analysis indicates that FNR
of Escherichia coli K-12 regulates a
large number of genes of unknown
function. J. Bacteriol. 187:1135-1160.
Kita, K., K. Konishi, y Y. Anraku. 1984a.
aerobic
respiratory
chain.
I.
Purification
and
properties
of
cytochrome b562-o complex from cells
in the early exponential phase of
aerobic growth. J. Biol. Chem. 259:
3368-3374.
Kita, K., K. Konishi, y Y. Anraku. 1984b.
aerobic
respiratory
chain.
II.
Purification
and
properties
of
cytochrome b558-d complex from cells
grown with limited oxygen and
evidence of branched electroncarrying systems. J. Biol. Chem. 259:
3375-3381.
Kita, K., C. R. Vibat, S. Meinhardt, J. R.
Guest, y R. B. Gennis. 1989. Onestep purification from Escherichia coli
of complex II (succinate:ubiquinone
oxidoreductase)
associated
with
succinate-reducible cytochrome b556.
J. Biol. Chem. 264:2672-2677.
Laemmli, U. 1970. Cleavage of the structural
proteins during assembly of the head
of bacteriophage T4. Nature 227:680685.
Lipmann, F., y L. C. Tuttle. 1945. A specific
micromethod for the determination of
acyl phosphates. J. Biol. Chem.
159:21-28.
Lowry, O. H., N. J. Rosebrough, A. L. Farr,
y R. J. Randall. 1951. Protein
measurement with the Folin phenol
reagent. J. Biol. Chem. 193:265-275.
to molecular oxygen, p. 1526-1538.
En F. C. Neidhardt, R. Curtiss III, J. L.
Magasanik, W. S. Reznikoff, M.
Riley, M. Schaechter, y H. E.
Umbarger (ed.), Escherichia coli and
Salmonella: cellular and molecular
biology, 2da ed., vol. 1. ASM Press,
Washington, D.C.
Makino, K., H. Shinagawa, M. Amemura,
T. Kawamoto, M. Yamada, y A.
Nakata. 1989. Signal transduction in
the phosphate regulon of Escherichia
coli involves phosphotransfer between
PhoR and PhoB proteins. J. Mol. Biol.
210:551-559.
123
Miller, M. J., y R. B. Gennis. 1983. The
purification and characterization of the
cytochrome d terminal oxidase
complex of the Escherichia coli
aerobic respiratory chain. J. Biol.
Chem. 258:9159-9165.
1970. Correlation of in vivo and in
vitro phase transitions of membrane
lipids in Escherichia coli. Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 67:606-612.
responding to oxygen deprivation, p.
61-78. En G. Storz y R. HenggeAronis
(ed.),
Bacterial
stress
responses. ASM Press, Washington,
D.C.
Rasmussen, B. A., D. Keeney, Y. Yang, y K.
Bush. 1994. Cloning and expression
of a cloxacillin-hydrolyzing enzyme
and
a
cephalosporinase
from
Aeromonas sobria AER 14M in
Escherichia coli: requirement for an
E. coli chromosomal mutation for
efficient expression of the class D
enzyme.
Antimicrob.
Agents
Chemother. 38:2078-2085.
Rose, I. A., M. Grunberg-Manago, S. R.
Korey, y S. Ochoa. 1954. Enzymatic
phosphorylation of acetate. J. Biol.
Chem. 211:737-756.
Sambrook, J., E. F. Fritsch, y T. Maniatis.
1989. Molecular cloning: a laboratory
manual, 2da ed. Cold Spring Harbor
Laboratory Press, Cold Spring Harbor,
N.Y.
Sánchez, A. M., G. N. Bennett, y K. Y. San.
2005. Effect of different levels of
NADH availability on metabolic
fluxes of Escherichia coli chemostat
cultures in defined medium. J.
Sanger, F., S. Nicklen, y A. R. Coulson.
1977. DNA sequencing with chainterminating inhibitors. Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 74:5463-5467.
Sawers, G. 1993. Specific transcriptional
requirements for positive regulation of
the anaerobically inducible pfl operon
by ArcA and FNR. Mol. Microbiol.
10:737-747.
Sezonov, G., D. Joseleau-Petit, y R. D’Ari.
2007. Escherichia coli physiology in
Luria-Bertani broth. J. Bacteriol.
189:8745-8749.
Shalel-Levanon, S., K. Y. San, y G. N.
Bennett. 2005a. Effect of ArcA and
FNR on the expression of genes
related to the oxygen regulation and
the glycolysis pathway in Escherichia
coli under microaerobic growth
conditions.
Biotechnol.
Bioeng.
92:147-159.
Bennett. 2005b. Effect of oxygen on
the Escherichia coli ArcA and FNR
regulation systems and metabolic
responses.
Biotechnol.
Bioeng.
89:556-564.
Bennett. 2005c. Effect of oxygen, and
ArcA and FNR regulators on the
expression of genes related to the
electron transfer chain and the TCA
cycle in Escherichia coli. Metab. Eng.
7:364–374.
anaerobic regulation of succinate
dehydrogenase
(sdhCDAB)
gene
expression in Escherichia coli. Mol.
Sternberg, N. L. 1990. Bacteriophage P1
cloning system for the isolation,
amplification, and recovery of DNA
fragments as large as 100 kilobase
pairs. Proc. Natl. Acad. Sci. USA
87:103-107.
Taylor, A. L., y C. D. Trotter. 1967. Revised
linkage map of Escherichia coli.
Bacteriol. Rev. 31:332-353.
124
Thèze, J., D. Margarita, G. N. Cohen, F.
Bornes, y J. C. Patte. 1974. Mapping
of the structural genes of the three
aspartokinases and of the two
homoserine
dehydrogenases
of
117:133-143.
Wang, R. F., y S. R. Kushner. 1991.
Construction of versatile low-copynumber
vectors
for
cloning,
sequencing and gene expression in
Escherichia coli. Gene 100:195-199.
Wanner, B. L., y P. Latterell. 1980. Mutants
affected in alkaline phosphatase
expression: evidence for multiple
positive regulators of the phosphate
regulon in Escherichia coli. Genetics
96:353-366.
Wanner, B. L. 1987. Control of phoRdependent bacterial alkaline phosphatase clonal variation by the phoM
region. J. Bacteriol. 169:900-903.
Wanner, B. L., M. R. Wilmes, y E. Hunter.
1988a. Molecular cloning of the wildtype phoM operon in Escherichia coli
K-12. J. Bacteriol. 170:279-288.
Wanner, B. L., M. R. Wilmes, y D. C.
Young. 1988b. Control of bacterial
alkaline phosphatase synthesis and
variation in an Escherichia coli K-12
phoR mutant by adenyl cyclase, the
cyclic AMP receptor protein, and the
phoM operon. J. Bacteriol. 170:10921102.
Wanner, B. L., y M. R. Wilmes-Riesenberg.
1992. Involvement of phosphotransacetylase, acetate kinase, and acetyl
phosphate synthesis in control of the
phosphate regulon in Escherichia coli.
J. Bacteriol. 174:2124-2130.
Wanner, B. L. 1993. Gene regulation by
phosphate in enteric bacteria. J. Cell.
Biochem. 51:47-54.
Wanner, B. L. 1996. Phosphorus assimilation
and control of the phosphate regulon,
p. 1357-1381. En F. C. Neidhardt, R.
Curtiss III, J. L. Ingraham, E. C. C.
Lin, K. B. Low, B. Magasanik, W. S.
Reznikoff, M. Riley, M. Schaechter, y
H. E. Umbarger (ed.), Escherichia coli
and
Salmonella:
cellular
and
molecular biology, 2da ed., vol. 1.
Yamamoto, K., K. Hirao, T. Oshima, H.
Aiba, R. Utsumi, y A. Ishihama.
2005. Functional characterization in
vitro of all two-component signal
transduction systems from Escherichia
coli. J. Biol. Chem. 280:1448-1456.
Yanisch-Perron, C., J. Vieira, y J. Messing.
1985. Improved M13 phage cloning
vectors and host strains: nucleotide
sequences of the M13mp18 and
pUC19 vectors. Gene 33:103-119.
125
Capítulo V
Análisis de flujos
metabólicos de
mutantes arcA y creB
Capítulo V – Análisis de flujos metabólicos de mutantes cre y arc
5.1. Prefacio
En el capítulo anterior se ha descripto el rol de los sistemas de dos componentes
ArcAB y CreBC en la modulación de varias respuestas fisiológicas en Escherichia coli. A
pesar de que el sistema Arc ha sido estudiado en cierto detalle, la mayoría de la información
disponible acerca de la modulación que ejerce se debe a análisis de transcripción de fusiones
lacZ y/o estudios de RT (transcriptasa reversa)-PCR. En el caso de la regulación ejercida por
CreBC, esta situación es aún más evidente. La información de la que disponemos en relación
a la regulación mediada por Cre proviene del análisis de la transcripción de unos pocos genes
de E. coli, que fueron identificados por poseer una posible secuencia blanco de unión a CreB
‘río arriba’ de la secuencia codificante. Indudablemente, el conocimiento de la fisiología de
mutantes para los genes de estos dos sistemas regulatorios requiere del análisis masivo y
concomitante de todas las vías metabólicas centrales. A pesar de que los análisis en relación
al nivel transcripcional de distintos genes permiten conocer en cierta medida el mecanismo
regulatorio de dichos genes a nivel molecular, la información obtenida no puede ser
generalizada al fenotipo (e.g., nivel de proteínas, actividad enzimática, et cetera). Por este
motivo, en este capítulo se propone el estudio de la fisiología de mutantes arcA y creB de E.
coli en condiciones estándar (utilizando glucosa como único sustrato carbonado), y la
reconstrucción de los flujos metabólicos intracelulares en vías metabólicas centrales por
marcación no isotópica de los metabolitos y la biomasa, y análisis in silico.
5.2. Objetivos
- Estudiar la fisiología de mutantes de E. coli desreguladas para el metabolismo redox (Arc) y
de carbono (Cre) en cultivos continuos en medio mínimo, con limitación de oxígeno y
carbono.
- Analizar los flujos metabólicos por técnicas de marcación con 13C-glucosa de dichas
mutantes en las condiciones descriptas.
5.3. Abreviaturas utilizadas en este capítulo
FEP, fosfoenolpiruvato; Pir, piruvato; G6P, glucosa 6-fosfato; F6P, fructosa 6-fosfato;
GAP, gliceraldehído 3-fosfato; 3PG, 3-fosfoglicerato; P5P, pentosas 5-fosfato; E4P, eritrosa
4-fosfato; S7P, sedoheptulosa 7-fosfato; OAA, oxaloacetato; ICT, isocitrato; α-CG,
α-cetoglutarato; SUC, succinato; SUCex, succinato excretado; MAL, malato; Gli, glioxilato.
5.4. Introducción
La regulación transcripcional comprende una compleja red de reguladores globales y
específicos, con funciones diversas sobre los genes cuya expresión modulan. Los reguladores
globales normalmente poseen efectos pleitrópicos, ya que controlan la expresión de
numerosos operones pertenecientes a distintos grupos funcionales. En E. coli la expresión de
más de la mitad de todos los genes está bajo el control de siete reguladores globales (ArcA,
Crp, Fis, Fnr, Ihf, Lrp, y NarL) [Martínez-Antonio y Collado-Vives, 2003]. Según se ha
discutido en el Capítulo IV, los sistemas CreBC y ArcAB son dos sistemas
sensores/regulatorios de gran importancia para la fisiología de E. coli. Estos sistemas, en
127
conjunción con otros reguladores globales y específicos, modulan la expresión de muchos
genes involucrados en el metabolismo central de carbono, y en vías respiratorias y
fermentativas; permitiendo respuestas adaptativas rápidas y efectivas en la célula cuando ésta
es expuesta a cambios en la concentración de la fuente carbonada y/o de oxígeno disuelto.
Estas respuestas adaptativas están mediadas por la coordinación de las vías metabólicas que
intervienen en el flujo de carbono y de electrones.
El locus cre (acrónimo por carbon source responsive) comprende cuatro genes,
creABCD, y fue originalmente denominado locus phoM [Amemura et al., 1986]. En este
conjunto de genes, creA es un marco de lectura abierto hipotético, y creD (también conocido
como cet), codifica una proteína de membrana interna cuya función no ha sido
completamente elucidada. Los dos genes restantes, creB y creC, codifican dos proteínas de
un sistema de regulación de dos componentes; viz., un regulador citoplasmático y un sensor
de membrana con actividad de quinasa. Luego del descubrimiento del sistema CreBC pasaron
muchos años hasta que pudieron identificarse algunos de los genes del regulón cre. En un
estudio propuesto por Avison et al. [2001] se definió una posible secuencia blanco en el ADN
para unión a CreB (TTCACnnnnnnTTCAC, en la cual n es cualquier nucleótido) para
identificar los genes del regulón cre. Se ha demostrado que CreB puede unirse a esta
secuencia blanco in vivo [Cariss et al., 2008]. A la fecha, los genes que componen el regulón
cre bona fide son 7, entre ellos ackA/pta, talA, creD (todos ellos activados por CreBC) y
malE (cuya expresión es reprimida por CreBC). La expresión de los genes del regulón cre
responde al tipo de fuente de carbono y la disponibilidad de oxígeno. De hecho, se ha
demostrado recientemente que la expresión de estos genes es mayor en condiciones
fermentativas cuando se utilizan fuentes de carbono glicolíticas, o bien en condiciones
aeróbicas de crecimiento cuando la fuente de carbono es un producto de fermentación de bajo
peso molecular; e.g., formiato o piruvato (Pir) [Cariss et al., 2008]. Este es el motivo por el
cual las mutantes creB y creC de E. coli no son capaces de crecer normalmente en medios de
cultivo mínimos utilizando glicerol, Pir, o acetato como única fuente de carbono [Avison et
al., 2000; 2001]. Sin embargo, la información disponible acerca del alcance de la regulación
ejercida por CreBC sobre el metabolismo central de E. coli es escasa, y se ha basado
únicamente en estudios del nivel de transcripción de algunos genes del regulón cre.
Como se ha discutido en los capítulos precedentes [cf. Introducción general], el
sistema de regulación Arc comprende las proteínas ArcA, el regulador citoplasmático, y
ArcB, el sensor de membrana con actividad quinasa de histidina [Lynch y Lin, 1996]. En E.
coli, el estado redox es percibido por ArcB a través del conjunto de quinonas oxidadas
generadas por actividad de la cadena respiratoria [Georgellis et al., 2001; Malpica et al.,
2004]. En condiciones microaeróbicas, ArcB sufre auto-fosforilación y luego el grupo fosfato
se transfiere de ArcB~P a ArcA [Kwon et al., 2000]. ArcA~P modula la expresión de más de
135 genes [Salmon et al., 2005]. Entre muchos otros genes, reprime la expresión de los que
codifican las deshidrogenasas del ciclo de ácidos tricarboxílicos (TCA) y el ciclo del
glioxilato (Gli), e.g., gltA, acnAB, icdA, sucABCD, sdhCDAB, fumA, mdh, y aceB [Iuchi y
Lin, 1988; Shalel-Levanon et al., 2005a]. También se reprime la expresión de numerosas
deshidrogenasas primarias, e.g., glpD, lctPRD, y lpdA [Shalel-Levanon et al., 2005c]. Por
otra parte, en condiciones microaeróbicas ArcA regula positivamente la expresión de los
128
genes foc-pfl, que codifican la enzima Pir-formiato liasa (Pfl) y un transportador de formiato
[Drapal y Sawers, 1995]. Entre los genes cuyos productos están involucrados en la cadena
respiratoria, ArcA~P activa la expresión de cydAB, y reprime la de cyoABCDE [Cotter et al.,
1990; Iuchi et al., 1990; Cotter et al., 1997].
En el capítulo anterior se ha demostrado que los sistemas de dos componentes CreBC
y ArcAB poseen efectos aditivos sobre algunas características fenotípicas de E. coli. La
superposición de varios reguladores globales en el control de la expresión génica permite una
mayor flexibilidad en la adaptación a condiciones ambientales y nutricionales cambiantes.
Sin embargo, se desconoce la naturaleza exacta y la extensión de dicha interacción así como
la forma en la que se modulan los flujos metabólicos centrales. La información disponible
señala que el efecto individual de estos sistemas regulatorios sobre el fenotipo celular resulta
más evidente en condiciones microaeróbicas de crecimiento [Alexeeva et al., 2003; ShalelLevanon et al., 2005b; Cariss et al., 2008]. La elucidación y entendimiento del patrón de
regulación metabólica en condiciones de estrés (i.e., limitación de oxígeno y/o carbono) es de
especial importancia desde el punto de vista ecológico y del desarrollo de patogenicidad.
Estas condiciones de estrés existen en la Naturaleza en ciertos nichos ambientales, y ocurren
frecuentemente como fluctuaciones intermitentes que generan respuestas celulares selectivas
[Harder y Dijkhuizen, 1983]. Una situación similar tiene lugar en cultivos industriales debido
a la generación de gradientes dentro de los fermentadores [Lara et al., 2006], especialmente
en cultivos de alta densidad celular desarrollados en condiciones de limitación de la fuente
carbonada [Lee, 1996].
Las vías metabólicas activas y la distribución de flujos metabólicos en el metabolismo
central de carbono son los componentes críticos de una representación fisiológica multidimensional de un microorganismo [Stephanopoulos, 1999]. Las vías metabólicas centrales
controlan y determinan la producción de energía, regeneración de co-factores, síntesis de
componentes celulares, así como cantidad y tipo de sub-productos de excreción. Usualmente
el fenotipo resultante de introducir mutaciones se analiza mediante metodologías de análisis
fenotípico cuantitativo, como los descriptos en capítulos anteriores, y luego se elaboran
conclusiones cualitativas acerca del metabolismo intracelular en base a los resultados de
dichas metodologías. Por este motivo, y con el objetivo de obtener información cuantitativa
acerca de las complejas respuestas metabólicas que tienen lugar como consecuencia de
mutaciones en reguladores globales, es necesario investigar las concentraciones intracelulares
de metabolitos y los flujos que relacionan los intermediarios metabólicos. Normalmente, las
velocidades de reacción intracelulares se estiman a través del análisis de flujos metabólicos,
el cual provee una visión holística del metabolismo celular [Wiechert, 2001].
La mayoría de los estudios relativos a la modulación ejercida por reguladores globales
de E. coli se basaron en análisis a nivel transcripcional. Recientemente se han publicado
algunos trabajos en los cuales se considera el impacto de ArcAB y Fnr en el patrón de
producción de mtabolitos de fermentación en distintas condiciones de disponibilidad de
oxígeno disuelto [Shalel-Levanon et al., 2005b; Zhu et al., 2006]. Para entender las funciones
regulatorias globales ejercidas por los sistemas CreBC y ArcAB sería apropiado estudiar la
distribución de flujos metabólicos intracelular en condiciones de limitación de oxígeno. Los
129
experimentos basados en marcación no isotópica (i.e., utilizando compuestos que contienen
13
C), seguidos del análisis in silico de los flujos, conforman una herramienta muy útil para el
estudio de la regulación metabólica. Por lo tanto, en este capítulo se propone el análisis de
flujos metabólicos de mutantes arcA y creB de E. coli crecidas en quimióstato en condiciones
microaeróbicas con limitación de la fuente de carbono.
5.5.1. Cepas, plásmidos, y condiciones de cultivo
Cepas y plásmidos. Las cepas de E. coli utilizadas se detallan en la Tabla 5.1 junto a
los plásmidos y oligonucleótidos. El plásmido pKD4, cuya replicación es dependiente de la
proteína π, fue mantenido en E. coli DH5α λ-pir.
Cepa,
oligonucleótido,
o plásmido
E. coli
DH5α λ-pir
F– λ– endA1 hsdR17 hsdM+ supE44 thi-1
recA1 gyrA96 relA1 Δ(argF lacZYA)U169
φ80d Δ(lacZ)M15, lisógeno λ-pir
K1060b
F– fadE62 lacI60 tyrT58(AS) fabB5 mel-1
IV1060K
K1060 ΔcreB::FRT-kan-FRT; Kmr
IV1060
K1060 ΔcreB
CT1062
K1060 ΔarcA
IV1062K
CT1062 ΔcreB::FRT-kan-FRT; Kmr
IV1062
K1060 ΔcreB
Oligonucleótido
5’-TTA GCG CGG TTC CTG TCA TGC
ΔcreB-Fcd
CGT GGC GGC AAT AAC AGA GGC
GAT TTA TGG TGT AGG CTG GAG
CTG CTT C-3’
5’-GCC CAG CAA CAA CCG CAT GCC
ΔcreB-Rc
GAT ACG CAT TAC AGG CCC CTC
AGG CTA TAC ATA TGA ATA TCC
TCC TTA G-3’
kan-F
5’-CGG TGC CCT GAA TGA ACT GC3’
kan-R
5’-CGG CCA CAG TCG ATG AAT CC3’
creB-F
5’-CCT GAG GGG CCT GTA ATG-3’
creB-R
5’-CTG CAC CGT ATA AAG CTC-3’
arcA-F
5’-CCG AAA ATG AAA GCC AGT-3’
arcA-R
5’-GAA AGT ACC CAC GAC CAA-3’
Fuente
o referencia
Elias et al., 1999
Este capítulo
Este capítulo
Capítulo II
Este capítulo
Este capítulo
Capítulo IV
Capítulo IV
Este capítulo
Este capítulo
Este capítulo
Este capítulo
Capítulo II
Capítulo II
130
Plásmido
pKD46
pKD4
pCP20
Datsenko y Wanner,
Vector conteniendo las funciones λ-Red
2000
(γ β exo) expresadas a partir del promotor
ParaB, inducible por arabinosa; oriR101,
repA101(ts), Apr
Vector templado para la amplificación de Datsenko y Wanner,
FRT-kan-FRT; oriRγ, Apr Kmr
2000
Vector conteniendo la recombinasa FLP Cherepanov y Wackernagel,
1995
de Saccharomyces cerevisiae; FLP λ
cI857 λ PR repA(ts), Ap r Cmr
capítulo.
a
Ap, ampicilina; Km, kanamicina; Cm, cloranfenicol.
b
Obtenida a través de Mary Berlin, E. coli Genetic Stock Center, Yale University, New
Haven, CT, EE.UU.
c
Las bases en negrita indican la secuencia complementaria a FRT-kan-FRT en el plásmido
molde pKD4.
d
Se subraya el codón de inicio de la transcripción de creB.
Construcción de mutantes. La cepa IV1060, una derivada ΔcreB de E. coli K1060,
se construyó siguiendo el método de reemplazo alélico mediado por las funciones λ-Red
[Datsenko y Wanner, 2000]. Se amplificó por PCR un cassette de resistencia a kanamicina
(FRT-kan-FRT) utilizando el plásmido pKD4 como templado y los oligonucleótidos ΔcreB-F
y ΔcreB-R. Dicho fragmento de ADN (1,2 kb) contiene el gen kan (el cual codifica una
aminoglicósido 3’-fosfotransferasa) flanqueado por las secuencias FRT (FLP recognition
target). El producto de PCR fue purificado utilizando un kit comercial, siguiendo las
instrucciones del proveedor (Wizard; Promega, Madison, WI, EE.UU.). Luego de la
purificación, el fragmento de ADN se sometió a digestión con DpnI, se precipitó con etanol,
y se utilizaron 100 ng de la construcción purificada para electroporar células
electrocompetentes de E. coli K1060 [Hanahan, 1985], previamente transformadas con el
plásmido pKD46 y crecidas en presencia de arabinosa 1 mM. La inserción cromosomal del
cassette se comprobó por PCR de colonias Kmr utilizando los oligonucleótidos kan-F y kanR. Uno de los aislamientos positivos (IV1060K) se transformó con el plásmido pCP20, el
cual contiene la recombinasa FLP de S. cerevisiae [Cherepanov y Wackernagel, 1995]. Las
transformantes Kms fueron seleccionadas a 42°C, y la pérdida del gen kan, así como la
deleción de creB, se comprobó por PCR de colonias utilizando los oligonucleótidos creB-F y
creB-R. La construcción de E. coli IV1062 (ΔcreB ΔarcA) se realizó en forma similar a la
descripta para IV1060, utilizando la cepa CT1062 como huésped para las manipulaciones. El
genotipo de la doble mutante se comprobó por PCR de colonias utilizando los
oligonucleótidos creB-F y creB-R, y arcA-F y arcA-R.
Medio de cultivo y cultivo en quimióstato. Los cultivos se desarrollaron en un
biorreactor de 2 L (BioFlo 110; New Brunswick Scientific, Edison, NJ, EE.UU.), en el
régimen de cultivo continuo con limitación de la fuente carbonada y de oxígeno. El volumen
de medio se mantuvo constante en 1 L utilizando una bomba peristáltica para extraer efluente
de la superficie del cultivo. Se trabajó a 37°C, a una velocidad de dilución D = 0,10 ± 0,01 h-1
131
(i.e., la tasa de alimentación fue de 100 ml · h-1). El crecimiento se desarrolló en un medio
mínimo salino, conteniendo Na2HPO4 7,0 g · l-1; KH2PO4 3,0 g · l-1; NaCl 0,5 g · l-1; NH4Cl
1,0 g · l-1; tiamina·HCl 6 mg · l-1; MgSO4 1 mM; y CaCl2 0,1 mM. La fuente carbonada fue
glucosa (20 mM), utilizada como sustrato limitante. MgSO4, CaCl2, tiamina·HCl, y glucosa
fueron agregados al medio de cultivo después de autoclavar el mismo, como soluciones
concentradas esterilizadas por filtración (membrana = 0,22 μm de poro). La formación de
espuma se suprimió por adición de antiespumante 20 μl · l-1 (Antifoam B; Sigma-Aldrich, St.
Louis, MO, EE.UU.). El pH se mantuvo en 7,00 ± 0,05 durante el ensayo por adición
automática de soluciones de KOH 3 M y/o H2 SO4 1,5 M, y este valor fue chequeado
periódicamente por mediciones independientes en muestras del efluente. La disponibilidad de
O2 en el medio de cultivo se varió burbujeando el biorreactor con una mezcla de 2,5% O2 en
N2 a un flujo de 500 ml · min-1, manteniendo la agitación constante a 285 r.p.m. La
concentración de oxígeno disuelto se confirmó por mediciones polarimétricas utilizando un
electrodo de Ag/AgCl (Mettler, Suiza). Las condiciones microaeróbicas de cultivo descriptas
fueron seleccionadas dado que recientemente se ha demostrado que los sistemas de
regulación ArcAB y CreBC ejercen su efecto en forma más evidente en dichas condiciones
[Shalel-Levanon et al., 2005b; Cariss et al., 2008]. Los cultivos en biorreactor se inocularon
con 25 ml de un cultivo de la cepa correspondiente, crecido durante 18 h en 50 ml del medio
salino descripto anteriormente en frascos Erlenmeyer de 250 ml, a 37°C y 250 r.p.m.
5.5.2. Marcación con
13
C-glucosa y análisis de flujos metabólicos
Experimentos de marcación y análisis de las muestras. Los experimentos de
marcación con 13C se iniciaron luego de que los cultivos llegaron al estado estacionario. Se
consideró que el estado estacionario había sido alcanzado cuando la densidad óptica del
cultivo medida a 600 nm, así como la concentración extracelular de metabolitos de excreción
(acetato, lactato, succinato, formiato, y etanol), se mantuvieron constantes al menos durante
tres tiempos de residencia hidráulica. Cuando ello ocurrió (normalmente después de ca. 7
tiempos de residencia), el medio de cultivo fue reemplazado por una solución de alimentación
basada en el mismo medio salino anteriormente descripto, conteniendo glucosa no marcada
16 mM, [U-13C]–glucosa (uniformemente marcada) 2 mM, y [1-13C]–glucosa 2 mM
(contenido de 13C >99%; Calbiochem, San Diego, CA, EE.UU.). Transcurrido al menos otro
tiempo de residencia, se tomaron las muestras para análisis de aminoácidos por cromatografía
de gases (GC) acoplada a espectrometría de masas (MS). Para ello, la biomasa contenida en
500 ml de cultivo se centrifugó durante 15 min a 10.000 r.p.m. (4°C). El sedimento celular
fue lavado tres veces por resuspensión utilizando Tris·HCl 20 mM (pH = 7,6) y
centrifugación, y finalmente el sedimento se resuspendió en 10 ml de HCl 6 M en un tubo de
vidrio con tapa de TeflonTM . La hidrólisis de la biomasa se llevó a cabo por incubación en
horno a 105°C durante 15 h. Después de enfriar el hidrolizado a temperatura ambiente, se
filtró por membrana de 0,22 μm y se evaporó a sequedad bajo corriente de aire. Dado que la
cisteína y el triptófano son completamente oxidados durante la hidrólisis, mientras la
asparagina y la glutamina son desaminadas, en el hidrolizado hubo 16 aminoácidos
proteinogénicos [Szyperski, 1995]. Los hidrolizados fueron resuspendidos en 3 ml de
acetonitrilo a 50°C, filtrados, y mantenidos a 4°C hasta la derivatización de los aminoácidos.
La derivatización de los aminoácidos presentes en la muestra se llevó a cabo añadiendo 150
132
μl de N-metil-N-(terc-butildimetil-sialil)trifluoroacetamida (grado derivatización; SigmaAldrich) a 150 μl del hidrolizado disuelto en acetonitrilo en un tubo con septo de TeflonTM.
Este tubo se incubó durante 30 min a 110°C [Szyperski, 1995; Dauner y Sauer, 2000]. Luego
de ser enfriada a temperatura ambiente, la mezcla de reacción se filtró y fue analizada en un
equipo de GC-MS (GCMS-QP2010, Shimadzu, Tokio, Japón) con una columna DB-5MS (30
m × 0,25 mm × 0,25 μm; Agilent, Fort Collins, CO, EE.UU.). El programa de detección
usado fue similar al descripto por Zhao y Shimizu [2003]. El flujo del gas soporte (He) se fijó
en 1 ml · min-1, y el volumen de inyección fue de 1 μl, con modo de flujo fijado en control de
partición. La temperatura del horno se mantuvo a 80°C durante 2 min, y luego esta
temperatura se incrementó gradualmente hasta 290°C en un lapso de 30 min. La superficie de
la interfase fue 250°C, y la temperatura de la fuente de iones fue 200°C. La ionización de
impacto de electrones se fijó en 70 eV. Los resultados de los espectros de masa se analizaron
en modo de adquisición de iones selectos para aumentar la sensibilidad de detección.
Análisis de flujos metabólicos y análisis estadístico. Los flujos metabólicos fueron
cuantificados utilizando un programa informático ad hoc escrito en MATLAB (versión 7.1,
The Mathworks Inc., Natick, MA, EE.UU.). La red metabólica elegida incluyó las siguientes
rutas (Apéndice A): glicólisis (vía de Embden-Meyerhoff-Parnas), vía de pentosas fosfato
(PP), ciclo TCA, ciclo del glioxilato, y vías fermentativas. Esta red metabólica fue compilada
a partir de información disponible en literatura [Gottschalk, 1986; Neidhardt et al., 1990], y
bases de datos accesibles a través de Internet [Karp et al., 2000]. Algunos metabolitos, tales
como PPs, succinil-coenzima A (CoA) y succinato (SUC), isocitrato y citrato (CIT), fueron
combinados para simplificar la red metabólica y los cálculos matemáticos. Las reacciones
catalizadas por fosfoenolpiruvato (FEP) carboxilasa y FEP carboxiquinasa fueron
combinadas en una sola reacción bidireccional, considerando la reacción que procede hacia
síntesis de oxaloacetato (OAA) como el sentido positivo de la reacción. La vía de EntnerDoudoroff y el ciclo del metilglioxal (de dihidroxiacetona fosfato a Pir) no fueron
considerados en la red metabólica dado que se utilizó glucosa como único sustrato carbonado
[Stephanopoulos et al., 1998]. La composición celular se asumió constante e igual entre las
distintas cepas analizadas, y fue derivada del análisis efectuado por Neidhardt et al. [1990].
La estimación de flujos se desarrolló utilizando una idea similar a la propuesta por
Schmidt et al. [1999], y Zhao y Shimizu [2003]. Los experimentos de marcación con 13C en
E. coli se basan en algunas consideraciones que debieron verificarse para efectuar el análisis
numérico: i) los isómeros de isótopos conteniendo 13C se encuentran en un estado
estacionario respecto a la distribución de isotopómeros, ii) los efectos de isótopos 13C en las
velocidades de las reacciones bioquímicas consideradas puede despreciarse, iii) la
canalización de metabolitos a una vía preferencial y la compartimentalización son
insignificantes, iv) se conoce el destino de cada uno de los átomos de carbono en los
metabolitos del modelo, y esta distribución puede inferirse a partir del patrón de marcación
con 13C, y v) se conoce la estequiometría de todas las reacciones bioquímicas consideradas.
En este contexto, se adjudicaron valores arbitrarios a un conjunto de flujos considerados
‘libres’, y se obtuvieron diferentes conjuntos de resultados para cada uno de los flujos en la
red, basados en las restricciones estequiométricas impuestas. Luego, los resultados de GCMS fueron simulados in silico basados en la distribución de flujos estimada y el patrón de
133
marcación de la glucosa utilizada como sustrato. La simulación de resultados de GC-MS se
comparó con los resultados de las determinaciones experimentales, de modo de minimizar el
error entre ambos parámetros. Los datos experimentales de GC-MS se corrigieron por la
presencia de isótopos naturales de H, C, N, O, Si, P, y S en los aminoácidos y en el reactivo
utilizado para la derivatización [van Winden et al., 2002]. Los flujos correspondientes a
reacciones reversibles se convirtieron en flujos netos y coeficientes de intercambio (en el
rango [0,1]), según se describe en la literatura [Wiechert y de Graaf, 1997]. Las matrices de
mapeo de isotopómeros necesarias para la estimación de flujos (para analizar los balances
isotópicos en cada conjunto de flujos) se desarrollaron a partir de las correspondientes
matrices de mapeo atómico [Zupke y Stephanopoulos, 1994]. La distribución de
isotopómeros en los aminoácidos se dedujo de la distribución isotópica de los precursores
metabólicos correspondientes. De esta manera, las señales de GC-MS fueron simuladas y
analizadas usando la distribución de isotopómeros de los aminoácidos. Los conjuntos de
soluciones que minimizaron el error experimental fueron seleccionados utilizando las
herramientas de búsqueda directa y algoritmo genético de MATLAB. La distribución de flujos
metabólicos óptima se basó en la mejor interpretación de los datos disponibles: análisis
fisiológico, composición macromolecular de la biomasa, y abundancia de los aminoácidos en
el hidrolizado de la biomasa. Para asegurar la reproducibilidad y consistencia de los
resultados los cultivos de E. coli IV1060 (ΔcreB) e IV1062 (ΔcreB ΔarcA) se repitieron 2 y 3
veces, respectivamente. El análisis estadístico de la distribución de flujos, cuando se
establecieron comparaciones entre distintas cepas, se efectuó a través del método Monte
Carlo [Schmidt et al., 1998; Zhao y Shimizu, 2003], y por análisis de la varianza (ANOVA).
Determinación de biomasa, glucosa, y metabolitos de excreción. La concentración
de biomasa (estimada como peso celular seco) se determinó a partir del sedimento celular de
muestras de 100 ml de cultivo, previamente centrifugadas durante 10 min a 4°C y 10.000
r.p.m., lavadas dos veces con el mismo volumen de solución de NaCl 150 mM, y finalmente
secadas en cápsulas de aluminio hasta peso constante en un horno a 55°C. Para el cálculo de
la concentración de biomasa, se restó al peso seco del sedimento la masa de NaCl proveniente
de la solución utilizada para los lavados de las células.
La concentración de glucosa residual y de metabolitos extracelulares se determinó a
partir de sobrenadantes de cultivo, obtenidos por centrifugación de muestras de 1 ml tomadas
del biorreactor y centrifugadas inmediatamente durante 5 min a 13.000 r.p.m. y 4°C. Los
sobrenadantes se filtraron a través de membranas de 0,22 μm de poro, y se guardaron a 4°C
hasta el análisis por cromatografía líquida de alta presión (HPLC). Los metabolitos
extracelulares y la glucosa residual fueron detectados utilizando un equipo de HPLC
(Shimadzu Scientific Instruments, Columbia, MD, EE.UU.) con una columna de intercambio
de cationes (HPX-87H; BioRad Labs., Hercules, CA, EE.UU.), un detector de índice de
refracción diferencial (Waters, Milford, MA, EE.UU.), y un detector UV-Vis (SPD-10A,
Shimadzu Scientific Instruments). La elución se desarrolló utilizando H2SO4 2,5 mM como
fase móvil con un flujo constante de 0,6 ml · min-1 , y la columna fue operada a 55°C [Yang et
al., 1999].
134
5.6.1. Parámetros de crecimiento de las mutantes creB y arcA de E. coli en
cultivos en quimióstato
Para estudiar la fisiología de E. coli en condiciones de limitación de carbono y
oxígeno se hicieron crecer las cepas K1060 (salvaje), IV1060 (ΔcreB), CT1062 (ΔarcA), e
IV1062 (ΔcreB ΔarcA) en cultivos continuos a una velocidad de dilución (D) de 0,10 h-1.
Para controlar la disponibilidad de oxígeno se burbujeó el biorreactor con una mezcla de
oxígeno 2,5% en nitrógeno y la agitación se mantuvo constante a 285 r.p.m. Esta condición
de agitación se eligió dado que se ha demostrado que en condiciones completamente
aeróbicas dicha velocidad de agitación determina la oxidación completa de la glucosa por E.
coli, evitando la síntesis de acetato [Alexeeva et al., 2003; Shalel-Levanon et al., 2005b].
Además, los sistemas regulatorios ArcAB y CreBC ejercen su acción sobre el metabolismo
en forma más evidente en condiciones microaeróbicas de crecimiento.
En la Tabla 5.2 se muestran el rendimiento de biomasa para cada cepa en condiciones
de estado estacionario y las velocidades específicas de consumo de glucosa (q Glucosa). Todas
las mutantes exhibieron una disminución en el consumo de la fuente carbonada. Por otra
parte, las cepas con la deleción en creB mostraron un aumento en la concentración de
biomasa en el estado estacionario y mayores rendimientos de biomasa respecto a glucosa
(YX/Glucosa) cuando se comparan con la cepa salvaje o la mutante ΔarcA (P < 0,05).
E. coli
K1060 (salvaje)
IV1060 (ΔcreB)
CT1062 (ΔarcA)
IV1062 (ΔcreB ΔarcA)
qGlucosa
(mmol · g
biomasa-1 · h-1)
6,88 ± 0,14
3,66 ± 0,05
5,43 ± 0,11
3,84 ± 0,06
Conc.
biomasa
(g · l-1)
0,32 ± 0,01
0,53 ± 0,01
0,36 ± 0,02
0,51 ± 0,03
YX/Glucosa
(g · g-1)
0,08 ± 0,01
0,14 ± 0,02
0,09 ± 0,01
0,15 ± 0,02
Cociente
etanol/acetato
(mol · mol-1)
0,47 ± 0,03
0,35 ± 0,03
0,91 ± 0,04
0,62 ± 0,03
Tabla 5.2. Parámetros fisiológicos para los cultivos en quimióstato desarrollados a D =
0,1 h-1. Los resultados representan los promedios ± desviación estándar de mediciones
realizadas por triplicado a partir de al menos tres muestras independientes. Conc.,
concentración.
Los coeficientes de balance de carbono se calcularon a partir de las concentraciones
extracelulares de los metabolitos de excreción y de la producción de CO2, que se derivó del
análisis in silico. Los valores porcentuales del balance de carbono muestran que la red
metabólica elegida para la interpretación de los flujos metabólicos fue adecuada (Tabla 5.3).
Asimismo, los balances redox mostraron que >90% de los equivalentes de reducción
generados durante el crecimiento microaeróbico fue capturado en la síntesis de productos de
fermentación (datos no mostrados). En conjunto, estos resultados muestran un excelente
balance de carbono y de equivalentes de reducción, lo cual sugeriría que los metabolitos y
reacciones más relevantes han sido tomados en cuenta para el análisis de flujos metabólicos
propuesto.
135
5.6.2. Análisis de flujos metabólicos
La distribución de flujos metabólicos en la red de reacciones bioquímicas propuesta se
estimó a través del patrón de marcación de la biomasa y los metabolitos de excreción con
13
C-glucosa en condiciones de estado estacionario. Los datos experimentales obtenidos a
partir de las mediciones de GC-MS se corrigieron por la abundancia natural de átomos de H,
C, N, O, Si, P, y S en los aminoácidos y en los reactivos utilizados para la derivatización.
Cuando los datos experimentales de GC-MS se compararon con los datos simulados in silico
se obtuvo una excelente correlación entre ambos (datos no mostrados). Las reacciones bidireccionales se convirtieron en flujos unidireccionales netos y coeficientes de intercambio
[Wiechert y de Graaf, 1997] para simplificar el tratamiento matemático de los datos. Todos
los flujos presentados se normalizaron respecto a la velocidad específica de consumo de
glucosa (Tabla 5.1, reacción v0 en el Apéndice A), la cual fue arbitrariamente considerada
como 100.
Como puede observarse en la Fig. 5.1, la glucosa internalizada a través del sistema
fosfotransferasa fue mayormente catabolizada a través de la vía metabólica de EmbdenMeyerhoff-Parnas (reacciones v1 a v5). Es interesante mencionar que se observó una ligera
reducción en el flujo de FEP a Pir (ca. 15%), catalizado por la enzima Pir quinasa (PykAF),
en las mutantes creB.
En condiciones aeróbicas, la rama oxidativa de la vía de pentosas fosfato (PP) es
utilizada en E. coli principalmente para la generación de poder reductor como NADPH
[Gottschalk, 1986; Neidhardt et al., 1990]. Todas las cepas mutantes mostraron casi los
mismos flujos a través de las reacciones oxidativas de PPs (v8), los cuales fueron >75%
menores que el observado para K1060 (P < 0,01). A su vez, la rama no oxidativa de la vía de
PPs provee principalmente componentes para la formación de biomasa. Las reacciones en
esta secuencia bioquímica mostraron valores bajos, con coeficientes de intercambio cercanos
a 1, lo cual implica que en las condiciones analizadas estas reacciones fueron altamente
reversibles. Se ha demostrado que la expresión de talA (que codifica la transaldolasa A de la
vía de PPs) se encuentra significativamente disminuida en una mutante creC de E. coli
[Avison et al., 2001]. De acuerdo a dichos resultados, en la distribución de flujos aquí
analizada se ha observado una disminución significativa en la reacción catalizada por TalAB
(v11).
136
Tabla 5.3. Velocidad específica de producción de metabolitos de fermentación y balance de carbono para los cultivos continuos
desarrollados a D = 0,1 h -1. Los resultados representan los promedios ± desviación estándar de mediciones realizadas por triplicado a partir
de al menos tres muestras independientes. La generación de CO2 se obtuvo a partir del análisis in silico.
93 ± 5
91 ± 6
96 ± 4
98 ± 2
K1060 (salvaje)
IV1060 (ΔcreB)
CT1062 (ΔarcA)
IV1062 (ΔarcA ΔcreB)
E. coli
Velocidad específica de síntesis (mmol · g biomasa-1 · h -1)
Piruvato
Lactato
Succinato
Formiato
Acetato
Etanol
0,08 ± 0,03 0,01 ± 0,00 0,49 ± 0,02 9,39 ± 0,47 6,21 ± 0,19 2,94 ± 0,16
0,09 ± 0,02 0,00 ± 0,00 0,03 ± 0,01 5,86 ± 0,18 4,12 ± 0,13 1,39 ± 0,08
0,04 ± 0,01 0,41 ± 0,03 0,37 ± 0,02 9,01 ± 0,37 5,16 ± 0,13 4,64 ± 0,17
0,05 ± 0,03 0,09 ± 0,01 0,02 ± 0,01 6,63 ± 0,39 4,01 ± 0,16 2,51 ± 0,15
Balance de carbono (%)
Si se compara la distribución de flujos obtenida
a nivel del nodo de FEP, puede observarse que la
reacción catalizada por la enzima FEP carboxilasa (v12)
mostró una tendencia similar a la observada en el flujo
que convierte precursores metabólicos en biomasa (v23).
Estos flujos fueron mayores para las cepas con la
mutación en creB en comparación con K1060 y CT1062
(P < 0,01). El flujo a través de la reacción anaplerótica
catalizada por la FEP carboxilasa fue usada
principalmente en la cepa salvaje y la mutante ΔarcA
para suplementar OAA para síntesis de biomasa y la
reacciones del ciclo TCA. La reacción a través de la
enzima FEP carboxiquinasa fue tratada como la
reacción reversa de la catalizada por la FEP carboxilasa.
La Fig. 5.1 muestra que los coeficientes de intercambio
para el flujo a través de FEP carboxilasa fueron muy
bajos para la cepa salvaje y la mutante ΔarcA, mientras
que fueron ligeramente mayores para las cepas ΔcreB.
En otras palabras, los flujos gluconeogénicos a través de
la reacción catalizada por FEP carboxiquinasa fueron
bajos en todas las cepas en la condición microaeróbica
analizada. Como se dijo anteriormente, los flujos para la
generación de biomasa fueron mayores para las
mutantes creB en comparación con la cepa salvaje. De
hecho se registró un incremento de 2,5 y 2,1 veces en
dicho flujo para las cepas IV1060 e IV1062,
respectivamente (P < 0,05). El flujo hacia biomasa para
la mutante arcA fue ligeramente mayor que el
observado para K1060 (ca. 1,3 veces).
La distribución de flujos en el nodo de Pir
determina mayormente el patrón de metabolitos de
fermentación en E. coli [Böck y Sawers, 1996]. Las
velocidades específicas de producción de los
metabolitos de fermentación analizados se presentan en
la Tabla 5.3. Como puede observarse, la excreción de
Pir fue despreciable para todas las cepas en estudio.
Algunos estudios sugirieron que ArcA reprime la
expresión de aceEF, genes que codifican subunidades
del complejo Pir deshidrogenasa (cPdh) [Lynch y Lin,
1996]. Por este motivo, el flujo a través de cPdh (v6)
debería ser mayor en E. coli CT1062 en comparación
con K1060.
137
Sin embargo, el flujo de cPdh observado en las mutantes fue menor (>13%) que el
observado para la cepa salvaje (P < 0,05). E. coli IV1062 (doble mutante) exhibió un flujo a
través de cPdh ca. 46% menor que el de la cepa salvaje, sugiriendo un posible efecto
regulatorio aditivo de ArcAB y CreBC sobre la expresión de aceEF. Si se tiene en cuenta que
cPdh es extremadamente sensible a la inhibición ejercida por NADH [Snoep et al., 1993], y
que en las cepas CT1062 e IV1062 (ambas con mutaciones en arc) se observó un aumento
significativo en el cociente etanol/acetato [el cual refleja indirectamente el cociente
NAD(P)H/NAD(P)+ intracelular] (Tabla 5.2), podría argumentarse que la disminución en la
actividad de cPdh sería consecuencia del ambiente redox intracelular. Sin embargo, este
argumento no se aplica al flujo de cPdh observado en la cepa IV1060. La posibilidad de que
exista una regulación de la expresión génica y/o actividad de cPdh ejercida por CreBC
merece ser investigada en mayor detalle.
El flujo a través de Pfl (v7) fue ligeramente menor para la mutante arcA (P < 0,05).
Este resultado es consistente con las observaciones experimentales de Shalel-Levanon et al.
[2005c] y Alexeeva et al. [2000], ya que en estos trabajos se describe la activación
microaeróbica de la expresión de pflAB por el sistema Arc. A su vez, se observó una
disminución en el flujo de Pfl en las cepas creB: en E. coli IV1060 (ΔcreB), este flujo fue ca.
19% menor que el de K1060, mientras que el registrado para IV1062 (ΔarcA ΔcreB) fue ca.
15% menor. Es preciso mencionar que la conversión de Pir en acetil-CoA también puede
ocurrir a través de las reacciones catalizadas por TdcE [Sawers et al., 1998], y/o puede estar
modulada por YfiD [Zhu et al., 2007].
El flujo de síntesis de lactato (v20) fue cercano a cero para la cepa salvaje y las
mutantes creB. Por otro lado, la mutante arcA mostró un aumento de ca. 13 veces en este
flujo (P < 0,01). Shalel-Levanon et al. [2005b] han demostrado que la expresión de ldhA se
encuentra desreprimida en un contexto ΔarcA. Sin embargo, en este trabajo no fue posible
detectar concentraciones significativas de lactato en el sobrenadante de los cultivos de la
doble mutante y, en consecuencia, el flujo catalizado por la enzima lactato deshidrogenasa
(LdhA) fue despreciable. En este sentido, es posible especular que un aumento en el flujo de
LdhA en la mutante ΔarcA podría ser una consecuencia indirecta de concentraciones
intracelulares de Pir elevadas y, al mismo tiempo, acumulación de equivalentes de reducción.
La distribución de flujos en el nodo de Pir es consecuencia de la competencia entre la
síntesis de lactato por LdhA [Bunch et al., 1997] y la síntesis de acetil-CoA por cPdh y/o Pfl.
A pesar de que la acetil-CoA provino principalmente de la actividad Pfl, ya que esta reacción
exhibió valores mayores a los observados para cPdh, ambas rutas metabólicas fueron activas
en las condiciones del ensayo. Por otro lado, y dado que el formiato generado por la actividad
Pfl no se descompone a pH neutro [Clark, 1989; Becker et al., 1997], los flujos a través de Pfl
deberían corresponder con los flujos extracelulares de formiato. Las diferencias obtenidas en
este parámetro (Fig. 5.1 y Tabla 5.3) podrían explicarse parcialmente considerando la
actividad de formiato-hidrógeno liasa, que convierte el formiato en H2 y CO2 [Schlensog y
Böck, 1990; Böck y Sawers, 1996].
138
Fig. 5.1. Análisis de flujos metabólicos de E. coli K1060 (cepa salvaje), IV1060 (ΔcreB),
CT1062 (ΔarcA), e IV1062 (ΔcreB ΔarcA). Las cepas se hicieron crecer en cultivos
continuos a D = 0,10 h-1 en condiciones de limitación de carbono y oxígeno. Los flujos se
normalizaron respecto al consumo de glucosa (v0), arbitrariamente definido como 100. Las
flechas en los flujos muestran el sentido asumido para cada reacción, y se muestran los
coeficientes de intercambio para estas reacciones entre corchetes. Las flechas grises indican
precursores para la síntesis de biomasa. Los valores representan el valor medio obtenido en al
menos 100 cálculos in silico independientes ± intervalos de confianza del 90%. La
descripción de las reacciones bioquímicas se encuentra en el Apéndice A.
139
En base a las restricciones estequiométricas impuestas durante los cálculos in silico,
se observó una disminución significativa en los flujos a través de las enzimas
fosfotransacetilasa (Pta) y acetato quinasa (AckA) (v21) para las cepas mutantes. Este
comportamiento fue especialmente marcado para la doble mutante, en la cual se detectó una
disminución de ca. 42% en la formación de acetato (P < 0,01). Esto podría sugerir un efecto
aditivo de los sistemas Arc y Cre en esta vía metabólica. Estos resultados concuerdan con la
disminución en la expresión de los genes pta-ackA en una mutante creC::kan de E. coli DH5α
[Avison et al., 2001], y en una mutante ΔarcA derivada de E. coli MG1655 [Shalel-Levanon
et al., 2005c]. También debe señalarse que normalmente se asume que la conversión de Pir en
acetato extracelular tiene lugar a través de las reacciones catalizadas por cPdh y/o Pfl, Pta, y
AckA, pero también puede ocurrir por acción de la enzima Pir oxidasa (PoxB) en un paso.
Esta reacción usualmente es activa en cultivos de E. coli en los cuales se produce acetato
[Dittrich et al., 2005]. Ambas vías metabólicas para la síntesis de acetato originan el mismo
patrón de marcación con 13C, de manera que el análisis de flujos aquí presentado no puede
distinguir entre las dos rutas metabólicas. Sin embargo, los resultados generales no se ven
significativamente afectados por la presencia de PoxB.
Se ha demostrado que una reducción en la actividad Pta-AckA correlaciona con un
aumento en el nivel intracelular de Pir cuando se utiliza glucosa como única fuente de
carbono [Chang et al., 1999]. Observando la distribución de flujos puede observarse que en
las mutantes creB existe una marcada disminución en la síntesis de acetato. Por otra parte, y
según se mencionó anteriormente, el Pir puede ser convertido en lactato cuando existe un
exceso de equivalentes de reducción (como se observó para E. coli CT1062, la mutante arc).
Zhu et al. [2006] han demostrado que un aumento en el flujo hacia la síntesis de lactato en
mutantes arcA puede ser atribuido a una disminución en la actividad de enzimas que
transforman Pir en acetil-CoA y, al mismo tiempo, a la presencia de un ambiente intracelular
reductor. La utilización de Pir es importante para mantener los flujos catabólicos de carbono,
dado que cuando la concentración de este metabolito supera un valor límite se inhibe la
síntesis de FEP y se detiene el crecimiento a partir de azúcares internalizados via el sistema
fosfotransferasa, dependiente de FEP [Liao et al., 1996]. De hecho, en este trabajo se ha
detectado una disminución significativa en la conversión de FEP a Pir (v5) en las mutantes
creB y, como consecuencia, las velocidades específicas de consumo de glucosa disminuyeron
en ca. 45% (Tabla 5.2).
Dado que el Pir representa la mayor contribución estequiométrica en la reacción
conducente a la síntesis de biomasa [cf. Apéndice A], y que se observaron disminuciones en
las reacciones que lo utilizan como sustrato (Ldh, cPdh, y Pfl) en las mutantes creB, sería
tentador especular que probablemente el exceso de Pir no metabolizado podría ser desviado a
la generación de biomasa, lo cual correlacionaría con los flujos hacia biomasa (v23) y los
rendimientos de biomasa respecto a sustrato observado para las cepas IV1060 e IV1062
(Tabla 5.2). Una conclusión similar fue elaborada por Delgado y Liao [1997] en un análisis
teórico del balance entre la generación de biomasa y la secreción de metabolitos de
fermentación.
140
En comparación con la cepa salvaje, el flujo conducente a la síntesis de etanol (v22)
fue menor para las cepas con mutaciones en creB y mayor para la cepa ΔarcA. En este último
caso, un aumento en el flujo etanologénico podría ser otro indicativo de un estado redox
intracelular altamente reducido. Aún cuando no se haya demostrado que exista un efecto
directo de los sistemas Arc y Cre sobre la expresión de adhE, se sabe que E. coli sintetiza
etanol con el objetivo principal de mantener el balance redox [Clark, 1989]. Los cocientes
etanol/acetato para las cepas en estudio (Tabla 5.1) también muestran que las cepas arc
exhibirían un ambiente intracelular altamente reductor. Es interesante señalar aquí la
importancia de la interpretación cuantitativa del metabolismo a través de la implementación
del análisis de flujos. Como puede verse en la Tabla 5.1, los efectos de Arc y Cre sobre el
cociente etanol/acetato son opuestos, de manera que el comportamiento metabólico de la
doble mutante no puede ser directamente inferido a partir de la información individual
provista por el análisis de cada mutante. Por otra parte, dado que en las cepas ΔcreB se
produjo una disminución concomitante en la síntesis de acetato y etanol, aumentaría la
acumulación intracelular de acetil-CoA, lo cual a su vez activaría la enzima FEP carboxilasa
[Izui et al., 1981], y podría explicar al menos en parte el aumento en los flujos observados
para dicha reacción (v12) en las cepas IV1060 e IV1062.
En la Fig. 5.1 puede observase que las reacciones del ciclo TCA funcionaron en forma
cíclica en las condiciones experimentales analizadas, en lugar de dos ramificaciones (una
reductora y una oxidativa) [Cronan y LaPorte, 1996]. Todos los valores de los flujos en el
ciclo TCA fueron menores para las mutantes en comparación con E. coli K1060. Los flujos
través de la última parte del ciclo (que regeneran OAA) incluyen las reacciones bidireccionales catalizadas por las enzimas SUC deshidrogenasa, fumarato deshidrogenasa, y
malato deshidrogenasa. Los coeficientes de intercambio para estos flujos (los cuales fueron
>0,95) muestran que todas estas reacciones fueron altamente reversibles en las condiciones
experimentales microaeróbicas. Algunos estudios han mostrado que la expresión de los genes
cuyos productos están involucrados en las reacciones del ciclo TCA, e.g., gltA y icd, se
encuentra desreprimida en condiciones de limitación de oxígeno [Shalel-Levanon et al.,
2005a]. Sin embargo, y en forma análoga a lo observado en el flujo de través de cPdh, las
reacciones a través de CIT sintasa (GltA, v13) e isocitrato deshidrogenasa (v14) presentaron
valores menores en las cepas mutantes en comparación con E. coli K1060. Por otra parte los
flujos a través del ciclo del Gli (v18), consistentes en las reacciones catalizadas por isocitrato
liasa (AceA) y malato sintasa (AceB, GlcB), mostraron un aumento de ca. 5 veces en E. coli
CT1062 (mutante arc) en comparación con K1060 (P < 0,01). Este resultado es coincidente
con la represión de los genes aceBAK por ArcA en condiciones de limitación de oxígeno
[Iuchi y Lin, 1988]. El ciclo del Gli también fue activo en E. coli IV1062 (doble mutante),
mostrando un incremento de ca. 1,3 veces en comparación con la cepa salvaje (P < 0,05).
Finalmente, se detectó actividad residual de esta secuencia de reacciones en K1060 e IV1060,
un fenómeno que ha sido previamente reportado para cepas salvajes de E. coli en condiciones
de limitación de glucosa [Maharjan et al., 2005]. Teniendo en cuenta la disminución en los
flujos del ciclo TCA en las cepas mutantes, se detectó excreción de succinato para la cepa
salvaje y su derivada ΔarcA, y en ambos casos la fracción de succinato excretada parece
haber provenido de las reacciones del ciclo del Gli.
141
La evidencia experimental disponible muestra que el control transcripcional de flujos
por sistemas de regulación globales y específicos normalmente presenta diferencias según la
vía metabólica que se considere, en forma enteramente dependiente de la condición
experimental analizada [Emmerling et al., 2002; Gosset et al., 2004; Hua et al., 2004; ShalelLevanon et al., 2005b]. En virtud de que los flujos metabólicos son la consecuencia integrada
de todas las interacciones bioquímicas y regulatorias de la red metabólica de un organismo,
no resulta sorprendente que los resultados obtenidos en el análisis de flujos metabólicos
difieran de los obtenidos a través de análisis del nivel de expresión génica. Al igual que en los
resultados hallados por Perrenoud y Sauer [2005], en este trabajo se ha encontrado que las
reacciones en el ciclo TCA conservan el carácter cíclico en lugar de las dos ramificaciones
propuestas para esta secuencia bioquímica en condiciones de baja disponibilidad de oxígeno
[Böck y Sawers, 1996; Nam et al., 2005].
Recientemente se han publicado los resultados de un análisis de flujos metabólicos de
varias mutantes de E. coli en la cual se interrumpieron los genes que codifican diversos
reguladores globales [Nanchen et al., 2008]. Curiosamente, en dicho trabajo se encontró que
mutantes ΔcreB::kan y ΔcreC::kan derivadas de E. coli BW25113 presentaron una mayor
velocidad específica de consumo de glucosa en comparación con la cepa salvaje. A pesar de
estas diferencias, no se encontraron otras características metabólicas distintivas en las
mutantes, razón por la cual se determinó que las mutaciones en creB y creC son
fenotípicamente silenciosas. Asimismo, Oshima et al. [2002] consideraron que el sistema
CreBC no ejerce una regulación significativa en el control de la expresión génica en
condiciones aeróbicas a partir de resultados surgidos de experimentos de micro-arreglos de
ADN con mutantes de E. coli en todos los sistemas de dos componentes conocidos. Es
importante mencionar que en los dos trabajos mencionados se utilizaron condiciones
aeróbicas para el crecimiento de las mutantes. Recientemente se ha demostrado que el
sistema CreBC ejerce un efecto significativo sobre la fisiología de E. coli en condiciones de
baja disponibilidad de oxígeno [Cariss et al., 2008], lo cual podría explicar al menos
parcialmente las diferencias metabólicas en la distribución de flujos descriptas en este
capítulo y los resultados disponibles en la literatura.
5.7. Apéndice A: Reacciones bioquímicas incluidas en la red metabólica
v0 = Glucosa + FEP → G6P + Pir
v1 = G6P ↔ F6P
v2 = F6P → 2 GAP
v3 = GAP → 3PG
v4 = 3PG ↔ PEP
v5 = FEP → Pir
v6 = Pir → Acetil-CoA + CO2
v7 = Pir → Acetil-CoA + Formiato
v8 = G6P → P5P + CO2
v9 = P5P + E4P ↔ F6P + GAP
v10 = 2 P5P ↔ GAP + S7P
v11 = GAP + S7P ↔ F6P + E4P
v12 = FEP + CO2 ↔ OAA
142
v13 = Acetil-CoA + OAA → ICT
v14 = ICT → α-CG + CO2
v15 = α-CG → SUC + CO2
v16 = SUC ↔ MAL
v17 = MAL ↔ OAA
v18 = ICT + Acetil-CoA → MAL + SUC
v19 = SUC → SUCex
v20 = Pir → Lac
v21 = Acetil-CoA → Acetato
v22 = Acetil-CoA → Etanol
v23 = 0,133 G6P + 0,071 F6P + 0,107 GAP + 1,661 3PG + 0,964 FEP + 3,635 Pir + 2,523
Acetil-CoA + 0,535 P5P + 0,456 E4P + 1,61 α-CG + 1,786 OAA → Biomasa + 2,828 CO2
182:4934-4940.
Teixeira de Mattos. 2003. Requirement of
ArcA for redox regulation in Escherichia
coli under microaerobic but not anaerobic
or aerobic conditions. J. Bacteriol.
185:204-209.
A. Nakata. 1986. Nucleotide sequence of
the phoM region of Escherichia coli: four
open reading frames may constitute an
operon. J. Bacteriol. 168:294-302.
Avison, M. B., P. Niumsup, T. R. Walsh, y
P. M. Bennett. 2000. Aeromonas
hydrophyla AmpH and CepH β-lactamases:
derepressed expression in mutants of
Escherichia coli lacking creB. J.
Antimicrob. Chemother. 46:695-702.
minimal media. J. Biol. Chem. 276:2695526961.
Becker, S., D. Vlad, S. Schuster, P. Pfeiffer,
y G. Unden. 1997. Regulatory O2 tensions
for the synthesis of fermentation products
in Escherichia coli and relation to aerobic
respiration. Arch. Microbiol. 168:290-296.
Bunch, P. K., F. Mat-Jan, N. A. Lee, y D. P.
Clark. 1997. The ldhA gene encoding the
fermentative lactate dehydrogenase of
Cariss, S. J. L., A. E. Tayler, y M. B.
Avison. 2008. Defining the growth
conditions and promoter-proximal DNA
sequences required for activation of gene
expression by CreBC in Escherichia coli. J.
Bacteriol. 190:3930-3939.
5:223-234.
Cotter, P. A., V. Chepuri, R. B. Gennis, y R.
P. Gunsalus. 1990. Cytochrome o
(cyoABCDE) and d (cydAB) oxidase gene
expression in Escherichia coli is regulated
by oxygen, pH, and the fnr gene product. J.
Bacteriol. 172:6333-6338.
Cotter, P. A., S. B. Melville, J. A. Albrecht,
y R. P. Gunsalus. 1997. Aerobic
regulation of cytochrome d oxidase
(cydAB) operon expression in Escherichia
coli: roles of Fnr and ArcA in repression
and activation. Mol. Microbiol. 25:605615.
143
Cronan, J. E., y D. LaPorte. 1996.
Tricarboxylic acid cycle and glyoxylate
bypass, p. 206-216. En F. C. Neidhardt, R.
Chang, D. E., S. Shin, J. S. Rhee, y J. G.
Pan. 1999. Acetate metabolism in a pta
mutant of Escherichia coli W3110:
importance of maintaining acetyl coenzyme
A flux for growth and survival. J.
Bacteriol. 181:6656-6663.
Cherepanov, P. P., y W. Wackernagel. 1995.
Gene disruption in Escherichia coli: TcR
and KmR cassettes with the option of Flpcatalyzed excision of the antibioticresistance determinant. Gene 158:9-14.
Datsenko, K., y B. L. Wanner. 2000. Onestep inactivation of chromosomal genes in
Escherichia coli K-12 using PCR products.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:6640-6645.
Dauner, M., y U. Sauer. 2000. GC-MS
analysis of amino acids rapidly provides
rich information for the isotopomer
balancing. Biotechnol. Prog. 16:642-649.
Delgado, J., y J. C. Liao. 1997. Inverse flux
analysis for reduction of acetate excretion
in Escherichia coli. Biotechnol. Prog.
13:361-367.
2005. Characterization of the acetateproducing pathways in Escherichia coli.
Elias, W. P., J. R. Czeczulin, I. R.
Henderson, L. R. Trabulsi, y J. P.
Nataro. 1999. Organization of biogenesis
genes for aggregative adherence fimbria II
defines a virulence gene cluster in
enteroaggregative Escherichia coli. J.
Bacteriol. 181:1779-1785.
Emmerling, M., M. Dauner, A. Ponti, J.
Fiaux, M. Hochuli, T. Szyperski, K.
Wüthrich, J. A. Bailey, y U. Sauer. 2002.
Metabolic flux responses to pyruvate
kinase knockout in Escherichia coli. J.
Bacteriol. 184:152-164.
2001. Quinones as the redox signal for the
arc two-component system of bacteria.
Science 292:2314-2316.
Gosset, G., Z. Zhang, S. Nayyar, W. A.
Cuevas, y M. H. Saier Jr. 2004.
Transcriptome analysis of Crp-dependent
catabolite control of gene expression in
Gottschalk, G. 1986. Bacterial metabolism.
Springer Verlag, New York.
Hanahan, D. 1985. Techniques for
transformation of Escherichia coli, p. 109135. En D. M. Glover (ed.), DNA cloning:
a practical approach, vol. 1. IRL Press,
Oxford, Inglaterra.
Harder, W., y L. Dijkhuizen. 1983.
Physiological responses to nutrient
limitation. Annu. Rev. Microbiol. 37:1-24.
Hua, Q., C. Yang, T. Oshima, H. Mori, y K.
Shimizu. 2004. Analysis of gene
expression in Escherichia coli in response
to changes of growth-limiting nutrient in
chemostat
cultures.
Appl.
Environ.
Microbiol. 70:2354-2366.
85:1888-1892.
Gennis, y E. C. C. Lin. 1990. Requirement
for terminal cytochromes in generation of
the aerobic signal for the arc regulatory
system in Escherichia coli: study utilizing
deletions and lac fusions of cyo and cyd. J.
Bacteriol. 172:6020-6025.
144
Izui, K., M. Taguchi, M. Morikawa, y H.
Katsuki. 1981. Regulation of Escherichia
coli phosphoenolpyruvate carboxylase by
multiple effectors in vivo. II. Kinetic
studies with a reaction system containing
physiological concentrations of ligands. J.
Biochem. 90:1321-1331.
Karp, P. D., M. Riley, M. Saier, I. T.
Paulsen, S. M. Paley, y A. PellegriniToole. 2000. The EcoCyc and MetaCyc
databases. Nucleic Acids Res. 28:56-59.
Kwon, O., D. Georgellis, y E. C. C. Lin.
2000. Phosphorelay as the sole physiological route of signal transmission by the
arc two-component system of Escherichia
Lara, A. R., E. Galindo, O. T. Ramírez, y L.
A. Palomares. 2006. Living with
heterogeneities in bioreactors: understandding the effect of environmental gradients
in cells. Mol. Biotechnol. 34:355-381.
Lee, S. Y. 1996. High cell-density culture of
Escherichia coli. Trends Biotechnol. 14:98105.
Liao, J. C., S. Y. Hou, y Y. P. Chao. 1996.
Pathway analysis, engineering, and
physiological considerations for redirecting
central metabolism. Biotechnol. Bioeng.
52:129-140.
D.C.
Maharjan, R. P., P. L. Yu, S. Seeto, y T.
Ferenci. 2005. The role of isocitrate lyase
and the glyoxylate cycle in Escherichia coli
growing under glucose limitation. Res.
Microbiol. 156:178-183.
Malpica, R., B. Franco, C. Rodríguez, y D.
Georgellis. 2004. Identification of a
quinone-sensitive redox switch in the ArcB
sensor kinase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA
101:13318-13323.
Martínez-Antonio, A., y J. Collado-Vives.
2003. Identifying global regulators in
transcriptional regulatory networks in
bacteria. Curr. Opin. Microbiol. 6:482-489.
Nam, T. W., Y. H. Park, H. J. Jeong, S.
Ryu, y Y. J. Seok. 2005. Glucose
repression of the Escherichia coli
sdhCDAB operon revisited: regulation by
the CRP-cAMP complex. Nucleic Acids
Res. 33:6712-6722.
Nanchen, A., A. Schicker, O. Revelles, y U.
Sauer. 2008. Cyclic AMP-dependent
catabolite repression is the dominant
control mechanism of metabolic fluxes
under glucose limitation in Escherichia
Oshima, T., H. Aiba, Y. Masuda, S.
Kanaya, M. Sugiura, B. L. Wanner, H.
Mori, y T. Mizuno. 2002. Transcriptome
analysis of all two-component regulatory
system mutants of Escherichia coli K-12.
USA 67:606-612.
Perrenoud, A., y U. Sauer. 2005. Impact of
global transcriptional regulation by ArcA,
ArcB, Cra, Crp, Cya, Fnr, and Mlc on
glucose catabolism in Escherichia coli. J.
Bacteriol. 187:3171-3179.
Chem. 280:15084-15096.
Sawers, G., C. Heßlinger, N. Muller, y M.
Kaiser. 1998. The glycyl radical enzyme
TdcE can replace pyruvate-formate lyase in
glucose
fermentation.
J.
Bacteriol.
180:3509-3516.
145
Schmidt, K., A. Marx, A. A. de Graaf, W.
Wiechert, H. Sahm, J. Nielsen, y J.
Villadsen. 1998. 13C tracer experiments
and metabolite balancing for metabolic flux
analysis: comparing two approaches.
Schmidt, K., L. C. Nørregaard, B. Pedersen,
A. Meissner, J. O. Duus, J. O. Nielsen, y
J. Villadsen. 1999. Quantification of intracellular metabolic fluxes from fractional
enrichment and 13C-13C coupling constraints on the isotopomer distribution in
labeled biomass components. Metab. Eng.
1:166-179.
Bennett. 2005a. Effect of oxygen, and
ArcA and FNR regulators on the expression of genes related to the electron
transfer chain and the TCA cycle in
Escherichia coli. Metab. Eng. 7:364–374.
Bennett. 2005b. Effect of oxygen on the
Escherichia coli ArcA and FNR regulation
systems
and
metabolic
responses.
Bennett. 2005c. Effect of ArcA and FNR
on the expression of genes related to the
oxygen regulation and the glycolysis
pathway in Escherichia coli under microaerobic growth conditions. Biotechnol.
Bioeng. 92:147-159.
purified pyruvate dehydrogenase complexes of Enterococcus faecalis, Lactococcus
lactis,
Azotobacter
vinelandii
and
Escherichia coli: implications for their
114:279-283.
Stephanopoulos, G., A. A. Aristidou, y J.
Nielsen. 1998. Metabolic engineering:
principles and methodologies. Academic
Press, San Diego, CA.
Stephanopoulos, G. 1999. Metabolic fluxes
and metabolic engineering. Metab. Eng.
1:1-11.
Szyperski, T. 1995. Biosynthetically directed
fractional 13C-labeling of proteinogenic
amino acids. An efficient analytical tool to
investigate intermediary metabolism. Eur.
J. Biochem. 232:433-448.
van Winden, W. A., C. Wittman, E. Heinzle,
y J. J. Heijnen. 2002. Correcting mass
isotopomer distributions for naturally
occurring isotopes. Biotechnol. Bioeng.
80:477-479.
Wiechert, W., y A. A. de Graaf. 1997.
Bidirectional reaction steps in metabolic
networks: I. Modeling and simulation of
carbon isotope labeling experiments.
Wiechert, W. 2001. 13C metabolic flux
analysis. Metab. Eng. 3:195-206.
Yang, Y. T., K. Y. San, y G. N. Bennett.
1999. Redistribution of metabolic fluxes in
E. coli with fermentative lactate dehydrogenase overexpression and deletion. Metab.
Eng. 1:141-152.
Zhao, J., y K. Shimizu. 2003. Metabolic flux
analysis of Escherichia coli K12 grown on
13
C-labeled acetate and glucose using GCMS and powerful flux calculation method.
J. Biotechnol. 101:101-117.
Zhu, J., S. Shalel-Levanon, G. N. Bennett, y
K. Y. San. 2006. Effect of the global redox
sensing/regulation networks on Escherichia
coli and metabolic flux distribution based
on C-13 labeling experiments. Metab. Eng.
8:619-627.
K. Y. San. 2007. The YfiD protein contributes to the pyruvate formate-lyase flux in
an Escherichia coli arcA mutant strain.
146
Zupke, C., y G. Stephanopoulos. 1994.
Modeling of isotope distribution and
intracellular fluxes in metabolic networks
using atom mapping matrices. Biotechnol.
Prog. 10:489-498.
147
Capítulo VI
Evaluación de cultivos
microaeróbicos de
mutantes arc y cre
utilizando glicerol como
fuente de carbono
principal
Capítulo VI – Evaluación de mutantes arc y cre en cultivos microaeróbicos a partir de glicerol
6.1. Prefacio
En los capítulos anteriores se ha desarrollado y discutido la caracterización molecular
y fenotípica de mutantes arcA y creB de Escherichia coli, y se han identificado las vías
metabólicas centrales en las cuales los sistemas de transducción de señales ArcAB y CreBC
ejercen un efecto significativo. De esta manera, se ha completado la descripción fenotípica de
las cepas utilizadas en esta tesis en condiciones estándar, en las cuales se utiliza glucosa
como principal sustrato carbonado. Con el objetivo de aplicar toda esta información a la
obtención biotecnológica de bioproductos reducidos (fuentes de energía), en este capítulo se
estudian las características metabólicas de cultivos desarrollados en condiciones de
crecimiento microaeróbicas utilizando glicerol como principal sustrato carbonado. En virtud
de la desregulación redox mediada por mutaciones en el regulador global arcA, y según se
observó en los experimentos discutidos en el Capítulo II, estas mutantes pueden desarrollarse
adecuadamente en condiciones de baja disponibilidad de oxígeno. Asimismo, se postuló que
el efecto que provoca el alelo creC(Con) sobre el catabolismo podría contribuir a una
utilización efectiva del sustrato carbonado. En la Introducción de este capítulo se describe la
situación actual respecto del uso de glicerol como sustrato en Biotecnología, y algunas
aplicaciones posibles de esta fuente de carbono. Su bajo costo, por tratarse de un subproducto de la industria del biodiesel, así como su estado redox altamente reducido, lo
convierten en una fuente carbonada ideal para su aplicación en bioprocesos industriales
desarrollados en condiciones microaeróbicas y/o anaeróbicas. Asimismo, se discuten las vías
conocidas para la asimilación de glicerol en diferentes microorganismos, incluyendo la
recientemente demostrada fermentación de glicerol por E. coli. En conjunto, los resultados
aquí presentados aportan evidencia de que las mutantes en estudio poseen características
fenotípicas distintivas adecuadas para la fermentación de glicerol en condiciones de
limitación de oxígeno.
6.2. Objetivos
- Estudio de la fisiología de mutantes de E. coli desreguladas en el metabolismo redox (arcA)
y de carbono (creC) en condiciones microaeróbicas utilizando glicerol como sustrato
carbonado principal.
- Evaluación del impacto de la utilización de un sustrato carbonado de alto grado de
reducción en la distribución de metabolitos de fermentación y concentración intracelular de
dinucleótidos de adenina.
6.3. Introducción
La economía actual de los países en desarrollo depende fundamentalmente de la
utilización de recursos fósiles para la generación de combustibles para transporte y diversos
materiales de consumo. Sin embargo, desde hace algunas décadas se han originado
discusiones acerca de dichos recursos no renovables respecto a la disponibilidad sostenida en
el tiempo e impacto de los mismos sobre el medio ambiente (viz., calentamiento global y
contaminación) [Campbell y Laherrère, 1998; Hansen et al., 2005]. Esta situación ha llevado
a la búsqueda de tecnologías alternativas capaces de generar combustibles y materiales a
149
partir de fuentes de carbono renovables, como la biomasa vegetal. Dependiendo del tipo de
biomasa considerado, y del componente de la misma utilizado en los procesos (e.g., azúcares,
aceites/grasas, celulosa, et cetera), así como de la tecnología empleada para la transformación
de estos componentes en el(los) producto(s) de interés, se pueden definir tres plataformas
industriales: la de azúcares [Service, 2007], ‘singás’ (gas sintético, mayormente CH4)
[Henstra et al., 2007], y de derivados oleaginosos [Marchetti et al., 2007]. Las plataformas
industriales basadas en azúcares y en derivados oleaginosos son las que actualmente cuentan
con mayor desarrollo, siendo ejemplos comerciales conspicuos la síntesis de bioetanol y de
biodiesel. El bioetanol se produce por fermentación microbiana de azúcares derivados de
maíz y tubérculos ricos en almidón, y melazas de caña de azúcar o remolacha azucarera
[Gray et al., 2006]. El biodiesel se prepara por reacciones de trans-esterificación de aceites
vegetales o grasas animales con un alcohol de cadena corta (e.g., CH3OH o etanol)
catalizadas por bases para producir una mezcla de ésteres [Marchetti et al., 2007].
Dada la creciente y sostenida demanda de combustibles [Oding-Smee, 2007], y la
necesidad de que los mismos no generen un impacto ambiental negativo, es preciso investigar
y desarrollar nuevas alternativas para la producción sostenible de biocombustibles [Schubert,
2006; Xu et al., 2006; Lee et al., 2008]. Un ejemplo interesante es el desarrollo de
bioprocesos para la conversión de biomasa lignocelulósica a etanol, o la síntesis de biodiesel
utilizando algas capaces de acumular altos contenidos intracelulares de lípidos de reserva.
Estos desarrollos son altamente promisorios, y proveerían abundantes bienes de consumo con
importantes beneficios ambientales y balances energéticos positivos. Sin embargo, un aspecto
de capital importancia en las plataformas de producción de biocombustibles actuales y futuras
es la viabilidad económica. Por ejemplo, en Estados Unidos el costo de la producción de
biodiesel a partir de soja (relacionado a la materia prima y los costos operativos) es de U$S
0,78 · l-1, un valor muy similar al precio de venta del biodiesel (ca. U$S 0,85 · l-1) [Yazdani y
González, 2007]. La implementación de biorrefinerías se ha propuesto como una alternativa
para incrementar la viabilidad económica de la industria de los biocombustibles [Kamm y
Kamm, 2007]. En su forma más convencional, una biorrefinería utiliza una fracción de un
sustrato renovable para co-producir un producto químico de alto valor agregado (el cual
normalmente posee un mercado limitado) junto al biocombustible propiamente dicho. Sin
embargo, un modelo de biorrefinería más adecuado desde el punto de la sostenibilidad
económica y ambiental debería considerar la utilización de un desecho del proceso de
producción del biocombustible. Los efluentes líquidos de la producción de biodiesel, por
ejemplo, son ricos en glicerol y podrían ser potencialmente utilizados con fines
biotecnológicos. De esta manera, en las secciones siguientes se discutirán algunas estrategias
para la conversión de glicerol en productos biotecnológicamente relevantes.
6.3.1. Conversión de glicerol en productos de valor agregado
Durante el proceso de producción de bioetanol y biodiesel se genera una gran
cantidad de glicerol [Aldiguier et al., 2004; Thompson y He, 2006]. En particular, cada 100
kg de biodiesel obtenido por el proceso de trans-esterificación de grasas o aceites se obtienen
10 kg de glicerol crudo como sub-producto. El marcado crecimiento de la industria del
biodiesel ha creado un exceso de glicerol que determinó una disminución del 90% en su
150
precio en un período de 2 años. Las operaciones industriales de producción y/o refinamiento
de glicerol en compañías tales como Dow Chemical y Procter & Gamble Chemicals fueron
canceladas, y al mismo tiempo el exceso de glicerol tuvo un impacto negativo en la industria
oleoquímica [McCoy, 2005; 2006]. El efecto negativo de la disminución en los precios del
glicerol también se hizo evidente en la misma industria del biodiesel. El glicerol crudo se
consideraba como un co-producto que podría contribuir a la viabilidad económica de la
producción de biodiesel, y actualmente se asume que se trata de un desecho industrial con
alta demanda biológica de oxígeno. Como tal, posee asociado un costo de tratamiento y
disposición. Esta situación es claramente ilustrada si se considera el análisis de costos de la
materia prima y de procesamiento en la anteriormente mencionada producción de biodiesel a
partir de soja. Los resultados del análisis arrojan un margen de procesamiento bruto de U$S
0,021 · l biodiesel-1 (el cual incluye un crédito de glicerol de U$S 0,006 y excluye intereses,
tasas de crédito, y costos fijos) [Yazdani y González, 2007]. Si el precio del glicerol fijado en
2004 es aún válido, los costos asociados al procesamiento del glicerol serían ca. 3 veces
mayores que los actuales. De esto se deduce que la conversión del glicerol a productos de
valor agregado es una necesidad urgente, y al mismo tiempo, una oportunidad interesante
desde el punto de vista biotecnológico. Las tecnologías involucradas en dichos desarrollos
podrían incorporarse en forma relativamente sencilla a las plantas de producción de biodiesel,
estableciéndose biorrefinerías que podrían contribuir significativamente a la sostenibilidad
económica y ambiental de la industria de biocombustibles. Adicionalmente, la disponibilidad
de glicerol derivado de la síntesis de biodiesel es la misma independientemente del sustrato
utilizado en la producción de los ésteres (grasas animales o aceites vegetales).
La conversión biológica del glicerol en productos biotecnológicamente relevantes no
sólo evita algunos inconvenientes asociados a la catálisis química (e.g., baja especificidad
estereoquímica, uso de alta presión y/o temperatura, imposibilidad de utilizar glicerol crudo
como sustrato, dado que posee contaminantes que requieren ser purificados, et cetera), si no
que además permite la obtención de una mayor variedad de productos [da Silva et al., 2009].
Con los costos actuales (ca. U$S 0,15 · kg-1) el glicerol es altamente competitivo como
sustrato biotecnológico en comparación con los azúcares tradicionalmente utilizados como
fuente carbonada en la mayoría de los bioprocesos. Dado el alto grado de reducción de los
átomos de carbono en el glicerol, existen ventajas adicionales de este sustrato para su
aplicación biotecnológica. Por ejemplo, la conversión del glicerol en fosfoenolpiruvato o
piruvato genera el doble de equivalentes de reducción que el catabolismo de glucosa o xilosa
hasta los mismos intermediarios glicolíticos [Dharmadi et al., 2006]. Por lo tanto, en estas
condiciones el metabolismo fermentativo podría favorecer la síntesis de biocompuestos
reducidos (viz., biocombustibles). Esta situación se ilustra durante la síntesis de succinato a
partir de glicerol, una ruta metabólica balanceada desde el punto de vista redox. Cuando se
utiliza glucosa o xilosa como sustrato carbonado, se produce una limitación de equivalentes
de reducción que disminuye considerablemente el rendimiento de succinato [Wendisch et al.,
2006]. Por otra parte, las fermentaciones microbianas anaeróbicas o microaeróbicas son
preferibles a los bioprocesos aeróbicos debido, fundamentalmente, a una reducción
significativa en el gasto energético asociado a la operación de los fermentadores. A
continuación se describen algunos ejemplos de procesos anaeróbicos para la conversión del
glicerol en productos biotecnológicos de valor agregado.
151
6.3.2. Metabolismo fermentativo del glicerol
A pesar de que existen numerosos microorganismos capaces de asimilar glicerol en
presencia de un aceptor externo de electrones a través del metabolismo respirativo [Lin,
1976; Schuller, 2003], muy pocos son capaces de fermentar este sustrato. El metabolismo
fermentativo del glicerol se ha estudiado en cierto detalle en algunos miembros de la familia
Enterobacteriaceae, como Citrobacter freundii y Klebsiella pneumoniae. El catabolismo de
glicerol en estos microorganismos está estrictamente asociado a su capacidad de sintetizar un
compuesto altamente reducido, 1,3-propanodiol (1,3-PDO) [Bouvet et al., 1995]. Se ha
demostrado que este fenómeno involucra una dismutación que tiene lugar a través de dos vías
paralelas [Booth, 2005]. A través de la vía oxidativa, el glicerol es deshidrogenado a
dihidroxiacetona (DHA) por una glicerol deshidrogenasa asociada a NAD +. La DHA es
posteriormente fosforilada por quinasas de DHA dependientes de fosfoenolpiruvato y ATP.
En la vía reductora, el glicerol es deshidratado por acción de una glicerol deshidratasa
dependiente de coenzima B12 para generar 3-hidroxipropionaldehído. Este intermediario es
finalmente reducido a 1,3-PDO, el producto fermentativo mayoritario, por acción de una 1,3PDO deshidrogenasa dependiente de NADH (la cual regenera NAD + a través de esta
reacción). Solamente 8 taxas de Enterobacteriaceae (de 128 taxas analizadas) son capaces de
fermentar glicerol [Bouvet et al., 1995], y todas ellas producen 1,3-PDO como producto
fermentativo principal. Además de Citrobacter y Klebsiella, algunas especies de los géneros
Enterobacter, Clostridium, Lactobacillus, y Bacillus son capaces de llevar a cabo el proceso
fermentativo anteriormente descripto. La necesidad de generar 1,3-PDO como producto
principal se debe al estado altamente reducido de los átomos de carbono en el glicerol, cuya
incorporación a la biomasa a través de la síntesis de componentes celulares genera
equivalentes de reducción adicionales. De esta manera, la síntesis de dicho compuesto
mantiene el balance redox.
Muy pocos estudios han descripto el metabolismo fermentativo de glicerol
independiente de la síntesis de 1,3-PDO. Por ejemplo, recientemente se demostró que E. coli
es capaz de utilizar glicerol en forma anaeróbica bajo ciertas condiciones de crecimiento
[Dharmadi et al., 2006; Murarka et al., 2008]. Dichas condiciones incluyen pH ácido, evitar
la acumulación de H2 gaseoso, y una adecuada formulación del medio de cultivo. Se ha
demostrado que la actividad de la enzima formiato-hidrógeno liasa es necesaria para la
fermentación de glicerol. Por otra parte, también se ha demostrado la existencia de un
metabolismo fermentativo de glicerol independiente de 1,3-PDO en especies de los géneros
Propionibacterium [Bories et al., 2004] y Anaerobiospirillum [Lee et al., 2001], pero se
desconocen los mecanismos y vías enzimáticas del proceso.
6.3.3. Fermentación anaeróbica de glicerol como fuente de biocombustibles y
productos químicos
Se han descripto varios intentos para la obtención de combustibles y químicos
biotecnológicamente relevantes a partir de glicerol en microorganismos que lo fermentan en
forma dependiente de la síntesis de 1,3-PDO. La mayoría de los trabajos tuvieron como
objetivo principal la optimización de la producción de 1,3-PDO. Algunos ensayos exitosos de
manipulación genotípica incluyeron la inactivación del gen que codifica una aldehído
152
deshidrogenasa [Zhang et al., 2006b] y sobre-expresión de los genes del regulón dha, el cual
codifica las enzimas involucradas en la síntesis de 1,3-PDO [Zheng et al., 2006]. Desde el
punto de vista de la mejora del bioproceso, se ha descripto la microencapsulación de la cepa
productora [Zhao et al., 2006], electrodiálisis del sustrato crudo [Cheng et al., 2006], análisis
del efecto de aditivos nutricionales en el medio de cultivo [Lin et al., 2005], y manipulación
de los parámetros del cultivo [González-Pajuelo et al., 2004; 2005a]. En algunos estudios, la
combinación de manipulaciones genotípicas y fenotípicas permitió obtener concentraciones
finales de 1,3-PDO cercanas a 100 g · l-1 [Hirschmann et al., 2005; Yang et al., 2007]. Una
alternativa que ha sido recientemente explorada es la introducción de vías metabólicas para la
utilización del glicerol en microorganismos que no son naturalmente capaces de utilizarlo;
e.g., la vía de síntesis de 1,3-PDO de Clostridium butyricum se ha transferido a C.
acetobutylicum, obteniéndose elevados niveles de conversión de glicerol a 1,3-PDO
[González-Pajuelo et al., 2005b].
Otros ejemplos incluyen la síntesis de compuestos potencialmente utilizables como
biocombustibles. Bajo ciertas condiciones de cultivos, Clostridium pasteurianum puede
fermentar glicerol produciendo butanol como metabolito fermentativo principal [Biebl,
2001]. En dicho estudio se alcanzó una concentración máxima de butanol de ca. 17 g · l-1,
probablemente debido a la toxicidad del producto. En otro trabajo se estudió la síntesis de
etanol y formiato a partir de la fermentación de glicerol por una cepa de Klebsiella planticola
aislada del rumen del ciervo rojo [Jarvis et al., 1997]. Ambos metabolitos fueron producidos
en concentraciones similares (ca. 2 g · l-1), pero se requirió de largos tiempos de fermentación
para la utilización anaeróbica de glicerol. Ito et al. [2005] han evaluado la co-producción
anaeróbica de etanol e H2 a partir de residuos industriales ricos en glicerol por Enterobacter
aerogenes. En este caso los mayores rendimientos y productividades se obtuvieron en un
reactor de lecho empaquetado utilizando cerámica porosa como soporte físico para los
microorganismos, obteniéndose concentraciones finales de etanol de 10 g · l-1.
6.3.4. Utilización anaeróbica de glicerol por especies de los géneros
Propionibacterium, Anaerobiospirillum, y Escherichia
Algunos microorganismos son capaces de fermentar glicerol independientemente de
la producción de 1,3-PDO. Propionibacterium acidipropionici y P. freudenreichii sp.
shermannii [Bories et al., 2004] pueden utilizar glicerol generando ácido propiónico como
principal producto de fermentación. Inmovilizando las células en alginato de calcio y
aumentando la concentración inicial de glicerol se han obtenido títulos de ácido propiónico
de hasta 42 g · l-1. Lee et al. [2001] estudiaron la conversión anaeróbica de glicerol en
succinato por Anaerobiospirillum succiniproducens y se encontró que prácticamente no se
produce acetato como sub-producto, lo que permitiría una recuperación mucho más sencilla
del producto. El rendimiento máximo se obtuvo en un esquema de fermentación semicontinuo, con adición periódica de glicerol y extracto de levadura (un aditivo que aporta
factores necesarios, y no completamente identificados, para la fermentación del sustrato
carbonado). Esta estrategia permitió la producción de ca. 19 g · l-1 de succinato.
153
El potencial de los microorganismos hasta aquí descriptos para su aplicación
industrial es relativamente limitado por factores tales como patogenicidad, la necesidad de
establecer y mantener condiciones anaeróbicas estrictas, requerimientos nutricionales
costosos, y la falta de herramientas genéticas y conocimiento fisiológico para la manipulación
y mejora de las cepas productoras. Por motivos como los expuestos, se ha intentando
exitosamente introducir la vía de producción de 1,3-PDO en E. coli (anaerobio facultativo
utilizado par excellence en procesos biotecnológicos), obteniéndose altos rendimientos y
productividades [Zhu et al., 2002; Zhang et al., 2006a]. De hecho, el proceso industrial
actualmente vigente para la síntesis y manufactura de 1,3-PDO, ideado y desarrollado por
DuPont Chemical Co., utiliza cepas recombinantes de E. coli como biocatalizadores.
Un descubrimiento potencialmente interesante publicado recientemente es la
utilización anaeróbica de glicerol por cepas salvajes de E. coli [Dharmadi et al., 2006;
Murarka et al., 2008]. La utilización de E. coli como biocatalizador podría contribuir a
resolver varios de los problemas anteriormente citados en relación a otros microorganismos
que normalmente no pueden ser utilizados en bioprocesos industriales. Por otra parte, la
posibilidad de manipular el metabolismo de esta bacteria para la producción de diversos
compuestos y combustibles a partir de azúcares ha sido extensamente documentada. Por este
motivo, pueden utilizarse estrategias de Ingeniería Metabólica para el desarrollo de
plataformas industriales basadas en E. coli para la producción de compuestos químicos
reducidos en condiciones de baja disponibilidad de oxígeno a partir de glicerol como sustrato.
Algunos ejemplos de dichos biocompuestos se resumen en la Fig. 6.1, en la cual todos los
metabolitos enumerados pueden ser producidos con rendimientos teóricos máximos
superiores a los alcanzables a partir de azúcares. Sin embargo, tratándose de una plataforma
de reciente implementación, es necesario desarrollar estrategias para la manipulación
genotípica y fenotípica de diversas cepas para alcanzar rendimientos y productividades
compatibles con la producción biotecnológica a gran escala.
Por los motivos anteriormente mencionados, en este capítulo se evalúa la capacidad
metabólica de cepas de E. coli con mutaciones en los genes regulatorios arcA y creC para
utilizar glicerol en condiciones microaeróbicas de crecimiento. Estas mutaciones podrían ser
adecuadas para el desarrollo de bioprocesos sostenibles tendientes a la obtención de
productos de elevado grado de reducción.
154
H
Glicerol
1,3-PDO
H
Dihidroxiacetona fosfato
H
Fosfoenolpiruvato
Ácido
succínico
2H
Ácido
propiónico
2H
Piruvato
Ácido
fórmico
Acetil-CoA
4H
Butanol
2H
Etanol
H2 + CO2
Fig. 6.1. Algunos ejemplos de bioproductos cuya síntesis a partir de glicerol se encuentra
balanceada desde el punto de vista redox, o requiere de equivalentes de reducción adicionales
a los obtenidos durante el metabolismo de glucosa. En todos los casos, el rendimiento teórico
máximo a partir de glicerol es mayor al que se obtendría a partir de glucosa o xilosa. Las
líneas discontinuas representan vías metabólicas que comprenden varias reacciones
bioquímicas. 1,3-PDO, 1,3-propanodiol; CoA, coenzima A; H, equivalente de reducción
[NAD(P)H].
6.4.1. Cepas y condiciones de cultivo
Se utilizaron las cepas de E. coli CT1061 [arcA::IS10-L creC(Con)] y CT1062
(ΔarcA), derivadas de la cepa salvaje K1060 [F– fadE62 lacI60 tyrT58(AS) fabB5 mel-1]. La
construcción de las cepas CT1061 y CT1062 se ha descripto en el Capítulo II. Para cada
experimento se tomaron las suspensiones bacterianas almacenadas a –70°C en presencia de
glicerol y se estriaron en placas de medio LB. Las placas se incubaron a 37°C hasta aparición
de colonias. Para minimizar la selección inadvertida de mutantes supresoras se utilizaron
colonias frescas para preparar los inóculos utilizados en cada experimento. Los inóculos se
prepararon transfiriendo una ansada de biomasa de placas frescas a ca. 200 ml de medio
MYA/Glicerol [cf. siguiente sección] en un frasco Erlenmeyer de 250 ml. Los cultivos se
agitaron utilizando una barra magnética a ca. 75 r.p.m., y se incubaron a 37°C durante 18 h.
El fenotipo Arc fue chequeado periódicamente sembrando diluciones de los cultivos en
placas de TBX y analizando el fenotipo Dye según se describió en el Capítulo III.
155
Todos los cultivos descriptos en este capítulo se desarrollaron en medio
MYA/Glicerol [conteniendo Na2HPO4 6,0 g · l-1; KH2PO4 3,0 g · l-1; (NH4)2SO4 1,4 g · l-1;
NaCl 0,5 g · l-1; MgSO4·7H2O 0,2 g · l-1; extracto de levadura 10,0 g · l-1; casaminoácidos
(hidrolizado ácido de caseína) 5,0 g · l-1; glicerol 30,0 g · l-1; pHinicial = 7,20]. La formación de
espuma se evitó añadiendo a todos los cultivos 30 μl · l-1 de antiespumante (Antifoam 289).
Las condiciones de aireación fueron definidas de la siguiente manera. Todos los cultivos se
desarrollaron en frascos Erlenmeyer de 250 ml de volumen nominal. En los cultivos
aeróbicos estándar el volumen de trabajo fue de 50 ml (relación volumen de medio:volumen
de frasco = 1:5), con agitación constante a 250 r.p.m. Para los cultivos microaeróbicos se
trabajó con un volumen de medio de 250 ml (relación volumen de medio:volumen de frasco
= 1:1) y agitación magnética suave (ca. 75 r.p.m.) para evitar la sedimentación de la biomasa.
Determinación de biomasa. El crecimiento celular se estimó por mediciones de la
DO600 en un espectrofotómetro GeneSys5 UV-Vis (Spectronic Instruments Inc.; Rochester,
NY, EE.UU.). La densidad óptica se convirtió en peso seco de biomasa utilizando curvas de
calibración determinadas para cada cepa. Las determinaciones directas de biomasa por
gravimetría se llevaron a cabo tal como se describe en la sección Materiales y métodos del
Capítulo II.
Análisis del perfil de metabolitos de excreción. La concentración de metabolitos de
fermentación se determinó utilizando un kit comercial basado en la actividad alcohol
deshidrogenasa (etanol), y por cromatografía de gases (acetato, formiato, lactato, piruvato, y
succinato). Los protocolos se detallan en la sección correspondiente en el Capítulo IV.
Determinación de glicerol. La concentración residual de glicerol en el medio de
cultivo se determinó utilizando un método colorimétrico desarrollado ad hoc. Para las
determinaciones, se colocó una alícuota de 200 μl del medio de cultivo (o una dilución
apropiada del mismo conteniendo hasta 250 μg · ml-1 de glicerol) en un tubo de Pyrex de
10×75 mm, y se agregó 1 ml de solución de NaIO4 5 mM en CH3COOH/CH3COONH4 20
mM. Después de mezclar utilizando un vortex, se añadieron 2,5 ml de una solución de 2,4pentanodiona 35 mM en 2-propanol. Se homogeneizó nuevamente la mezcla de reacción, y
los tubos se incubaron a 50°C durante 30 min. Luego de enfriar a temperatura ambiente, se
leyó la absorbancia de los ensayos a λ = 410 nm utilizando la misma mezcla de reacción pero
sin glicerol añadido como blanco. Las curvas de calibración se construyeron utilizando
cantidades conocidas de glicerol pro analysi (entre 2 y 50 μg · tubo-1). Los resultados
obtenidos por este método se compararon con los obtenidos en determinaciones paralelas
utilizando un kit comercial (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemania); y mostraron
una alta correlación entre ambos métodos (R2 = 0,994).
Determinación de dinucleótidos de nicotinamida. La concentración intracelular de
NADH y NAD+ se analizó a través de un ensayo cíclico descripto por Leonardo et al. [1996],
con algunas modificaciones. Los dinucleótidos fueron extraídos de la biomasa por
tratamiento del sedimento celular de 1 ml de cultivo con 300 μl de NaOH 0,2 M (para la
156
extracción de NADH), o 300 μl de HCl 0,2 M (para la extracción de NAD+). Las muestras se
colocaron en un baño termostatizado a 50°C por 10 min, luego de lo cual se colocaron en
hielo durante 20 min. Los extractos celulares se neutralizaron añadiendo gota a gota 300 μl de
HCl 0,1 M (para la extracción de NADH), o 300 μl de NaOH 0,1 M (para la extracción de
NAD+). Los restos celulares se separaron por centrifugación a 12.000 r.p.m. durante 5 min y
4°C. Los sobrenadantes se transfirieron a tubos limpios y se guardaron a –70°C hasta las
determinaciones (no más de 24 h). El ensayo enzimático cíclico se basó en el protocolo
descripto por Bernofsky y Swan [1973] y se desarrolló utilizando una mezcla de reacción que
contuvo 500 μl de cada uno de los siguientes componentes: solución de N,N-bis(2hidroxietil)glicina (bicina) pH = 8,0; etanol absoluto; EDTA 40 mM; y 3-(4,5-dimetiltiazol-2il)-2,5-difeniltetrazolio (azul de tiazolilo, MTT) 4 mM; además de 1 ml de etosulfato de
fenazina 15 mM. Esta mezcla de reacción fue equilibrada a 30°C antes de realizar el ensayo.
Los siguientes componentes fueron secuencialmente agregados a cubetas de vidrio de 1 cm
de paso de luz: 50 μl del extracto celular neutralizado (o diluciones apropiadas), 300 μl de
H2O deionizada, y 600 μl de la mezcla de reacción descripta anteriormente. Para comenzar la
reacción, se añadieron 50 μl de alcohol deshidrogenasa II (AdhII) de Saccharomyces
cerevisiae (500 U · ml-1 en solución de bicina 0,1 M; pH = 8,0). Luego se registró el cambio
en la absorbancia a λ = 570 nm durante 10 min a 30°C en un espectrofotómetro Beckman DU
650 (Beckman Coulter Inc.; Fullerton, CA, EE.UU.). El ensayo fue calibrado con soluciones
estándar de NADH y NAD+, conteniendo hasta 50 μM de cada coenzima. La pendiente (ΔA ·
min-1) de la regresión linear de la absorbancia como función del tiempo se correlacionó con la
concentración de la coenzima por regresión lineal. La ecuación resultante fue utilizada para
determinar las concentraciones de NAD(H/+) presentes en las muestras, correlacionando su
ΔA · min-1 con la de cada uno de los estándares.
6.4.3. Reactivos
Las siguientes drogas fueron obtenidas de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EE.UU.):
MTT, bicina, estándares de NAD(+/H), AdhII de S. cerevisiae, y antiespumante (Antifoam
289). El etosulfato de fenazina, 2,4-pentanodiona, etanol, y m-periodato de sodio se
obtuvieron de Fluka (St. Gallen, Suiza). Los componentes de los medios de cultivo fueron de
Difco (Detroit, MI, EE.UU.), excepto por el glicerol (Anedra; Buenos Aires, Argentina). Los
restantes reactivos químicos fueron de la máxima pureza disponible y se utilizaron sin
purificación posterior.
6.5.1. Parámetros cinéticos de los cultivos microaeróbicos
Dado que ArcA es un regulador global cuyo principal efecto es la regulación de las
vías metabólicas de E. coli durante el pasaje de condiciones aeróbicas a anaeróbicas [Lynch y
Lin, 1996; Alexeeva et al., 2003], se decidió estudiar en primer lugar el efecto de mutaciones
arcA sobre el crecimiento en condiciones microaeróbicas. Por otra parte, también se evaluó el
consumo de sustrato dado que se encontró que la mutación constitutiva en creC confiere
mayor capacidad catabólica (Capítulo IV). La hipótesis esgrimida a priori fue, por lo tanto,
que estas dos mutaciones deberían conferir características ventajosas a E. coli CT1061 para la
157
utilización microaeróbica de glicerol. Para la evaluación del fenotipo microaeróbico
utilizando glicerol como principal sustrato carbonado, la cepa salvaje (E. coli K1060) y las
mutantes arcA/creC se hicieron crecer en condiciones de limitación de oxígeno en el medio
MYA suplementado con glicerol 30 g · l-1, tal como se describe en la sección Materiales y
métodos, para comparar sus velocidades específicas de crecimiento (μ), rendimientos de
biomasa (YX/Glicerol ), y consumo de glicerol (qGlicerol ). Todas las cepas evaluadas fueron
capaces de crecer en dichas condiciones, aunque con velocidades específicas de crecimiento
menores a las obtenidas en condiciones similares utilizando glucosa como sustrato carbonado
(datos no mostrados). En todos los casos, los tres parámetros cinéticos analizados siguieron el
mismo patrón: a mayores velocidades de crecimiento correspondieron mayores rendimientos
de biomasa y consumo de glicerol (Tabla 6.1). E. coli CT1061 [arcA::IS10-L creC(Con)]
creció con una μ mayor que CT1062 (ΔarcA), e incluso mayor que la cepa salvaje. Al mismo
tiempo, el rendimiento de biomasa de E. coli CT1061 respecto a sustrato fue ca. 1,2 y 2,3
veces mayor que los de CT1062 y K1060, respectivamente. Estos resultados son coincidentes
con los observados para el comportamiento de las tres cepas en estudio utilizando glucosa
como principal sustrato carbonado (Capítulo II), y validarían la hipótesis propuesta en
relación a que E. coli CT1061 sería una cepa adecuada para el crecimiento en condiciones de
limitación de oxígeno utilizando glicerol como fuente de carbono y energía. Además, la
mayor capacidad catabólica conferida por el alelo creC(Con) se evidenció en las dos fuentes
de carbono utilizadas en este trabajo: glucosa (Capítulo IV) y glicerol (este capítulo).
Cepa
K1060
CT1061
CT1062
μ (h-1)
YX/Glicerol (g · g-1)
0,46 ± 0,01
0,51 ± 0,02
0,32 ± 0,02
0,28 ± 0,02
0,36 ± 0,01
0,14 ± 0,03
qGlicerol
(mmol · g biomasa-1 · h-1)
3,53 ± 0,55
4,22 ± 0,61
1,82 ± 0,32
Tabla 6.1. Características fenotípicas y parámetros cinéticos de cultivos microaeróbicos
de E. coli K1060 y sus derivadas CT1062 (ΔarcA) y CT1061 [arcA::IS10-L creC(Con)],
crecidas en glicerol como principal fuente de carbono. El rendimiento de biomasa (YX/Glicerol)
está expresado como g de biomasa · g de glicerol consumido -1 al final de los cultivos (48 h).
La velocidad específica de crecimiento fue calculada durante la fase exponencial de
crecimiento. Los resultados representan el promedio ± desviación estándar para mediciones
efectuadas por duplicado en tres cultivos independientes. Todas las diferencias entre los
parámetros fueron significativas (análisis de la varianza, ANOVA; P < 0,05).
6.5.2. Patrón de fermentación en glicerol
Una consecuencia de la desregulación redox mediada por ArcA es un incremento en
los niveles de equivalentes de reducción [en la forma de NAD(P)H] [Alexeeva et al., 2003].
De esta manera, es esperable una tendencia hacia la síntesis de productos reducidos en las
mutantes arcA. Esta tendencia a su vez estaría modificada por la capacidad catabólica que se
relaciona, inter alia, con la regulación ejercida por el sistema CreBC [Avison et al., 2001].
Por otra parte, el patrón de fermentación de E. coli cambia dramáticamente en relación a la
fuente carbonada utilizada [Clark, 1989; Böck y Sawers, 1996; Dharmadi et al., 2006]. En el
Capítulo IV se ha descripto el perfil metabólico de mutantes arc y cre en condiciones
microaeróbicas de crecimiento cuando se utiliza glucosa como sustrato carbonado.
158
Recientemente se ha descripto la fermentación anaeróbica de glicerol por una cepa salvaje de
E. coli [Murarka et al., 2008]. Según se describió en la Introducción de este capítulo, este
hallazgo implicaría nuevas e interesantes posibilidades en el desarrollo de plataformas
industriales para la producción de metabolitos biotecnológicos [Yazdani y González, 2007].
Esto requiere de un conocimiento detallado de la fisiología de E. coli en condiciones
compatibles con la síntesis de biocompuestos como conditio sine qua non para el desarrollo
de dichas plataformas industriales. Sin embargo, no se había descripto a la fecha el perfil
metabólico de mutantes redox en condiciones de baja disponibilidad de oxígeno utilizando
glicerol como sustrato. Es importante mencionar aquí que desde el punto de vista de la
sostenibilidad del proceso biotecnológico las condiciones microaeróbicas de crecimiento
podrían resultar ventajosas frente a condiciones estrictamente anaeróbicas [Heinzle et al.,
2006], en las cuales es necesario burbujear los fermentadores con gases (o mezclas de gases)
libres de oxígeno. Esto implicaría una simplificación en el diseño de biorreactores, y en las
estrategias de control de la fermentación. Además, una baja disponibilidad de oxígeno
permite un crecimiento mayor (y también un mayor rendimiento de biomasa respecto de
sustrato) en comparación al obtenido en ausencia estricta de oxígeno molecular.
La Fig. 6.2 muestra el perfil de ácidos orgánicos secretados y etanol para la cepa
parental y las mutantes en estudio, crecidas en condiciones microaeróbicas en frascos
agitados durante 48 h. Dicho perfil metabólico se expresa en términos de la velocidad
específica de síntesis para cada uno de los metabolitos (qp). Puede observarse que, en general,
existe una tendencia al aumento en la síntesis de etanol y una disminución concomitante en la
síntesis de acetato. La distribución relativa de metabolitos fermentativos fue compatible con
la descripta para la fermentación anaeróbica de sustratos carbonados reducidos, como sorbitol
[San et al., 2002]. La tendencia a la síntesis de metabolitos reducidos resulta más evidente si
se comparan estos resultados con el perfil metabólico utilizando glucosa como sustrato
carbonado [cf. Capítulo IV]. Este comportamiento podría explicarse si se tiene en cuenta que
la partición de carbono en el punto de ramificación a nivel de acetil-coenzima A (CoA)
depende fundamentalmente del estado redox intracelular [Böck y Sawers, 1996]. En primer
lugar, el glicerol es el sustrato carbonado cuya conversión a acetil-CoA resulta
energéticamente más favorable [Yazdani y González, 2007] cuando se compara con los
azúcares normalmente utilizados en bioprocesos industriales. En presencia de un ambiente
intracelular reductor, la acetil-CoA es mayormente convertida en etanol en lugar de acetato
(la situación contraria tiene lugar en condiciones de crecimiento oxidativas) [Clark, 1989].
Considerando el alto grado de reducción del glicerol (κ = 4,7) en comparación con el de la
glucosa (κ = 4,0) [Nielsen et al., 2003], un aumento en la producción de metabolitos
reducidos resultaría evidente. Otro parámetro relacionado a la partición de carbono a partir de
acetil-CoA es la relación molar etanol/acetato, un indicador indirecto del estado redox
intracelular [Sánchez et al., 2005]. Los valores obtenidos para este parámetro fueron 0,87 ±
0,05 para E. coli K1060; 2,01 ± 0,08 para CT1062 (ΔarcA); y 12,51 ± 0,12 para CT1061
[arcA::IS10-L creC(Con)]. Claramente, ambas cepas mutantes presentan una desregulación
del balance redox intracelular propia de un ambiente metabólico altamente reductor; y esta
tendencia resultó más marcada en E. coli CT1061, correlacionando en forma proporcional
con la velocidad específica de síntesis de etanol.
159
K1060
CT1061
CT1062
3,5
-1
qp (mmol · g biomasa · h )
4,0
-1
3,0
2,5
2,0
1,5
1,0
0,5
Etanol
Piruvato
Lactato
Succinato
Formiato
Acetato
0,0
Fig. 6.2. Perfil metabólico obtenido para la cepa parental (E. coli K1060) y las mutantes
CT1061 [arcA::IS10-L creC(Con)] y CT1062 (ΔarcA) en cultivos microaeróbicos de 48 h a
partir de glicerol como principal sustrato carbonado.
Otra diferencia interesante se observó en qformiato. E. coli CT1061 mostró una
disminución de ca. 70% en el valor de este parámetro, mientras E. coli CT1062 presentó un
valor ligeramente menor (y comparable) al de la cepa salvaje. Este comportamiento podría
deberse a la mayor secreción de ácidos orgánicos por la mutante ΔarcA en comparación con
la mutante arcA::IS10-L creC(Con). El gen pfl, que codifica la enzima piruvato-formiato
liasa (Pfl), es regulado por el pH del medio de cultivo en condiciones microaeróbicas (en
particular, pfl tiene un alto nivel de expresión a pH = 6 y su expresión es reprimida a pH > 8)
[Sawers y Böck, 1988; Alexeeva et al., 2000]. De esta manera, en las condiciones del ensayo
y teniendo en cuenta que en E. coli CT1061 los flujos de carbono están dirigidos a la síntesis
de etanol en lugar de ácidos fermentativos, sería esperable una menor actividad de Pfl en esta
cepa. También es adecuado mencionar que la enzima que cataliza la conversión de acetilCoA en etanol (AdhE) actúa como Pfl desactivasa [Kessler et al., 1991], de manera que en
condiciones en las cuales se produce un exceso de etanol la actividad Pfl debería estar
disminuida. Finalmente, es preciso recordar que bajo ciertas condiciones el formiato también
puede ser convertido a H2 y CO2 por la enzima formiato-hidrógeno liasa [Schlensog y Böck,
1990]. Así, una posibilidad adicional que debería tenerse en cuenta es que esta enzima sea
más activa en E. coli CT1061, lo cual se reflejaría en una menor excreción de formiato al
medio de cultivo. Con los datos presentados en este estudio no es posible concluir si existen
diferencias entre las cepas a nivel de la degradación de formiato, dado que los balances de
carbono se basaron en la medición de metabolitos de excreción no gaseosos.
160
E. coli posee dos enzimas alternativas para la descarboxilación del piruvato, Pfl y el
complejo piruvato-deshidrogenasa (cPdh) [cf. Capítulo I]. Considerando el balance
estequiométrico de carbono para las mutantes, la acetil-CoA necesaria para la síntesis de los
metabolitos que se generan a partir de este sustrato (viz., acetato, succinato, y etanol) debería
provenir de la actividad simultánea de Pfl y cPdh (datos no mostrados). El catabolismo de
glucosa depende estrictamente de la presencia de al menos una de estas enzimas, dado que
una mutante pfl es auxótrofa para acetato y requiere de CO2 para crecer en condiciones
anaeróbicas [Snoep et al., 1992]; y una mutante aceEF presenta una disminución drástica en
el rendimiento de biomasa respecto a glucosa en condiciones aeróbicas, produciendo lactato y
piruvato [de Graef et al., 1999]. Considerando que el glicerol es convertido a DHA y luego
catabolizado en la vía de Embden-Meyerhoff-Parnas, la actividad de Pfl o cPdh también sería
necesaria para su utilización. En la forma activa, Pfl es una enzima radical, y esta forma se
destruye fácilmente por exposición a oxígeno molecular [Wagner et al., 1992]. A su vez, la
actividad de cPdh es inhibida por un cociente NADH/NAD+ elevado [Snoep et al., 1993],
situación que normalmente tiene lugar en condiciones de crecimiento micro o anaeróbicas,
y/o en un ambiente redox desregulado (como ocurre en las mutantes arcA). Se ha demostrado
que la expresión simultánea de los genes que codifican las enzimas Pfl y cPdh es máxima en
condiciones microaeróbicas [Shalel-Levanon et al., 2005a]; aunque la máxima actividad de
Pfl normalmente se registra en condiciones prácticamente anaeróbicas, y la de cPdh en
aerobiosis. Además, la expresión de los genes pfl y lpd (subunidad E3 de cPdh) [cf. Capítulo
I] es dependiente de Arc. Considerando la evidencia experimental aquí presentada, podría
suponerse que la expresión y actividad simultánea de ambas enzimas en microaerobiosis en
mutantes arc podría tener como objetivo compensar la desactivación de Pfl por las bajas
concentraciones de oxígeno, y la de cPdh por un elevado cociente NADH/NAD+.
La síntesis de lactato y piruvato fue significativamente menor en las cepas mutantes
con respecto a E. coli K1060; correlacionando, una vez más, con el direccionamiento de la
fuente de carbono a la síntesis de metabolitos reducidos. Es importante destacar que la
síntesis de succinato no siguió el mismo patrón, dado que mientras no se observaron
diferencias significativas en q succinato entre E. coli K1060 y CT1061; E. coli CT1062 exhibió
un aumento de ca. 2,9 veces en dicho parámetro en comparación con la cepa parental. Este
resultado sería consistente con la regulación transcripcional de los genes que codifican las
enzimas del ciclo de ácidos tricarboxílicos (TCA) por el sistema ArcAB, especialmente la
enzima succinato deshidrogenasa (codificada por el operón sdhCDAB), dado que estos genes
estarían desreprimidos en un contexto Arc– [Iuchi y Lin, 1988; Park et al., 1995].
Adicionalmente, Wimpenny y Necklen [1971] demostraron que el máximo contenido de
algunas enzimas del ciclo TCA (viz., isocitrato deshidrogenasa y fumarasa) en cultivos
continuos con limitación de la fuente carbonada tenía lugar en condiciones microaeróbicas de
crecimiento en comparación con condiciones estrictamente aeróbicas; lo cual coincidiría con
una mayor actividad del ciclo TCA en condiciones similares a las utilizadas en el presente
estudio. Sin embargo, varios estudios en los que se analizaron los diferentes productos
metabólicos observados para mutantes redox crecidas en distintas condiciones de
disponibilidad de oxígeno han dado resultados variables. Por ejemplo, un estudio realizado
por Zhu et al. [2006] en cultivos en quimióstato con glucosa como sustrato limitante en
microaerobiosis mostró que en una mutante ΔarcA derivada de E. coli MG1655, los flujos
161
metabólicos a través del ciclo TCA fueron menores que en la cepa parental, y por
consiguiente, los niveles intracelulares y excretados de succinato fueron también menores. En
forma análoga, este comportamiento fue observado por E. coli CT1062 en cultivos en
quimióstato con limitación de carbono y oxígeno (Capítulo V). Este fue un resultado
inesperado, dado que los estudios de regulación transcripcional han indicado la desrepresión
de los genes del ciclo TCA en un contexto arcA en presencia de bajas concentraciones de
oxígeno [Salmon et al., 2005]. Por otra parte, es relevante destacar que el análisis detallado
de las unidades transcripcionales cuya expresión es controlada por Arc muestra que las
regiones promotoras contienen sitios múltiples de unión a ArcA, los cuales pueden estar ‘río
arriba’ o ‘río abajo’ del promotor propiamente dicho [Lynch y Lin, 1996]. Por otro lado,
todos los sitios de unión al regulador poseen afinidades distintas por ArcA y ArcA~P [Shen y
Gunsalus, 1997]. Considerados en conjunto, estos resultados llevan a la conclusión de que
ninguno de los operones dependientes de ArcAB responde en forma proporcional al nivel de
fosforilación de ArcA, lo cual se relaciona con el hecho de que distintas mutaciones en arcA
y/o arcB dan lugar a niveles de transcripción variables que se traducen en fenotipos distintos.
Otro análisis realizado en cultivos en lote con glucosa como fuente de carbono mostró otro
resultado inesperado: el flujo a través del ciclo TCA fue mayor en un contexto arcA, tanto en
condiciones aeróbicas como anaeróbicas y, de la misma manera, la actividad succinato
deshidrogenasa se vio incrementada [Perrenoud y Sauer, 2005]. En el presente trabajo, los
valores obtenidos para la velocidad específica de síntesis de succinato para E. coli CT1062
fueron mayores que los observados en la cepa parental, tal como podría esperarse para el
comportamiento de una mutante desreprimida. Sin embargo, q succinato para E. coli CT1061 fue
similar al valor obtenido para la cepa parental. Estos resultados sugieren que las mutaciones
estudiadas tienen efectos diferentes sobre la síntesis de succinato, y que la presencia del alelo
creC(Con) modifica las características fenotípicas conferidas por la mutación en arcA, en
forma similar a lo observado en relación al fenotipo Dye [cf. Capítulo IV].
El rendimiento de productos de fermentación extracelulares con respecto al consumo
de glicerol muestra que la fuente carbonada fue principalmente canalizada hacia la síntesis de
etanol, resultando en una disminución de la síntesis de ácidos orgánicos en las cepas mutantes
(Tabla 6.2). Estos resultados concuerdan con los presentados para las velocidades de síntesis
de los metabolitos (q p). Nuevamente, la tendencia hacia la síntesis de etanol respecto de otros
metabolitos de fermentación con mayor grado de oxidación fue especialmente evidente en E.
coli CT1061, y menos pronunciada para la mutante de deleción CT1062.
162
Cepa
Acetato
Formiato
Succinato
Lactato
Piruvato
Etanol
K1060
0,291
0,482
0,164
0,191
0,133
0,253
CT1061
0,065
0,192
0,214
0,026
0,004
0,814
CT1062
0,278
0,479
0,442
0,087
0,029
0,559
Tabla 6.2. Rendimiento de metabolitos extracelulares respecto a glicerol. Los resultados
se expresan como mol producto · mol glicerol consumido-1 al final del cultivo (48 h). La
desviación estándar fue ≤10% del valor promedio en todos los casos.
Los elevados niveles de etanol observados en E. coli CT1061 nos llevaron a
considerar su síntesis en condiciones aeróbicas (Tabla 6.3). Dado que esta cepa presenta
mutaciones en los sistemas ArcAB y CreBC, decidimos estudiar la regulación de la síntesis
de etanol en distintas condiciones de cultivo. En primer lugar, no se detectó etanol en el
sobrenadante del cultivo de la cepa salvaje (K1060) en condiciones aeróbicas; lo cual es
consistente con un metabolismo mayormente aeróbico. Por otro lado, los valores para la
velocidad específica de síntesis de etanol en las cepas CT1061 y CT1062 fueron qetanol = 0,89
± 0,07 y 0,48 ± 0,03 mmol · g biomasa-1 · h-1, respectivamente. Claramente, existe una
desregulación en el metabolismo de carbono en las mutantes arcA que se evidencia incluso en
condiciones aeróbicas. Probablemente, el exceso de equivalentes de reducción deba ser
canalizado a la síntesis de etanol por ser éste el metabolito de fermentación más reducido; de
esta manera, se regenera NAD+ y el crecimiento en condiciones microaeróbicas puede
continuar [Leonardo et al., 1996]. A su vez, en E. coli CT1061 la actividad catabólica
conferida por la mutación constitutiva en creC determinaría una mayor disponibilidad de
esqueletos carbonados que pueden actuar como aceptores internos de electrones, lo cual se
traduciría en una mayor producción de etanol.
Aerobiosis
Velocidad específica de síntesis de etanol
(mmol · g biomasa-1 · h-1)
K1060
CT1062
CT1061
(salvaje)
(ΔarcA)
[arcA::IS10-L creC(Con)]
N.D.
0,48 ± 0,03
0,89 ± 0,07
Microaerobiosis
0,58 ± 0,07
Condición de
crecimiento
2,34 ± 0,19
3,38 ± 0,09
Tabla 6.3. Síntesis de etanol en cultivos aeróbicos y microaeróbicos. Las condiciones
aeróbicas fueron obtenidas usando una relación volumen de medio a volumen de frasco de
1:5 y agitación vigorosa a 250 r.p.m. En todos los casos, los cultivos se desarrollaron durante
48 h. N.D., no detectado. Las diferencias entre los parámetros mostrados en esta tabla fueron
significativas con P < 0,05 (ANOVA).
163
6.5.3. Disponibilidad de poder reductor
Los experimentos anteriores, describiendo el perfil metabólico de las cepas en estudio,
sugieren una clara correlación entre los niveles intracelulares de equivalentes de reducción y
la síntesis de etanol en cada una de las mutantes estudiadas. Se ha demostrado que el estado
redox intracelular en mutantes arc, caracterizado por la relación NADH/NAD+, es altamente
reductor comparado con el de la cepa parental en cultivos continuos a partir de glucosa
[Shalel-Levanon et al., 2005b]. De acuerdo a los resultados obtenidos durante la
caracterización del perfil metabólico, se decidió determinar el contenido intracelular de
dinucleótidos de adenina para analizar la disponibilidad de poder reductor en las mutantes.
La Tabla 6.4 muestra las determinaciones de dinucleótidos realizadas para las tres
cepas en condiciones microaeróbicas de cultivo utilizando glicerol como principal sustrato
carbonado. Ambas mutantes mostraron un mayor contenido total de NAD(+/H) en
comparación con la cepa parental (registrando un aumento de ca. 1,5 veces). La razón
fisiológica para esta observación experimental no resulta clara, pero es posible que en estas
mutantes sea necesaria una mayor cantidad total de nucleótidos para mantener el equilibrio
redox, dado que la respiración está sensiblemente aumentada [cf. Capítulos II y III]. La
relación NADH/NAD+ alcanzó un valor cercano a la unidad para la cepa CT1061, mientras
que en E. coli CT1062 fue de 0,63. En ambos casos, este parámetro fue considerablemente
mayor que el observado para la cepa parental (5,4 y 3,5 veces mayor para E. coli CT1061 y
CT1062, respectivamente).
Cepa
K1060
Características relevantes
Salvaje
NADH
NAD+
NAD(H/+) NADH/NAD+
0,51 ± 0,06 2,83 ± 0,15 3,34 ± 0,21
0,18 ± 0,03
CT1062 ΔarcA
1,96 ± 0,09 3,12 ± 0,22 5,08 ± 0,31
0,63 ± 0,07
CT1061 arcA::IS10-L creC(Con)
2,54 ± 0,11 2,62 ± 0,08 5,16 ± 0,19
0,97 ± 0,07
Tabla 6.4. Disponibilidad de poder reductor para las cepas en estudio. Las cepas se
crecieron durante 48 h en condiciones microaeróbicas utilizando glicerol como principal
sustrato carbonado. Las concentraciones de NADH y NAD+ se expresan en μmol
dinucleótido · g biomasa-1. Todas las diferencias entre los parámetros fueron significativas
(ANOVA, P < 0,05).
En este Capítulo se ha demostrado que E. coli es capaz de utilizar glicerol como
sustrato carbonado en condiciones de limitación de oxígeno. Como se mencionó en la
Introducción, la utilización de glicerol (en particular, glicerol crudo derivado de la industria
del biodiesel) como fuente carbonada resulta de gran atractivo desde el punto de vista
biotecnológico, dado que se trata de un sustrato abundante, de bajo costo, y elevado grado de
reducción.
164
Aldiguier, A. S., S. Alfenore, X. Cameleyre,
G. Goma, J. L. Uribelarrea, S. E.
Guillouet, y C. Molina-Jouve. 2004.
Synergistic temperature and ethanol effect
on Saccharomyces cerevisiae dynamic
behaviour in ethanol bio-fuel production.
Bioprocess Biosyst. Eng. 26:217-222.
182:4934-4940.
Teixeira de Mattos. 2003. Requirement of
ArcA for redox regulation in Escherichia
coli under microaerobic but not anaerobic
or aerobic conditions. J. Bacteriol.
185:204-209.
minimal media. J. Biol. Chem. 276:2695526961.
Bernofsky, C., y M. Swan. 1973. An
improved cycling assay for nicotinamide
adenine dinucleotide. Anal. Biochem.
53:452-458.
Biebl, H. 2001. Fermentation of glycerol by
Clostridium pasteurianum - batch and
continuous culture studies. J. Ind.
Booth, I. 2005. Glycerol and methylglyoxal
metabolism. En F. C. Neidhardt, J. L.
and molecular biology (versión on-line).
Bories, A., E. Himmi, J. J. A. Jauregui, C.
Pelayo-Ortiz, y V. A. González. 2004.
Glycerol fermentation with Propionibacteria and optimisation of the production
of propionic acid. Sci. Aliments 24:121135.
Bouvet, O. M., P. Lenormand, E. Ageron, y
P. A. Grimont. 1995. Taxonomic diversity
of anaerobic glycerol dissimilation in the
Enterobacteriaceae. Res. Microbiol. 146:
279-290.
Campbell, C. J., y J. H. Laherrère. 1998.
The end of cheap oil. Sci. Amer. 3:78-83.
5:223-234.
Cheng, K. K., J. A. Zhang, D. H. Liu, Y.
Sun, M. D. Yang, y J. M. Xu. 2006.
Production
of
1,3-propanediol
by
Klebsiella pneumoniae from glycerol broth.
da Silva, G. P., M. Mack, y J. Contiero.
2009. Glycerol: a promising and abundant
carbon source for industrial microbiology.
de Graef, M. R., S. Alexeeva, J. L. Snoep, y
M. J. Teixeira de Mattos. 1999. The
steady-state internal redox state (NADH/
NAD) reflects the external redox state and
is correlated with catabolic adaptation in
Dharmadi, Y., A. Murarka, y R. González.
2006. Anaerobic fermentation of glycerol
by Escherichia coli: a new platform for
metabolic engineering. Biotechnol. Bioeng.
94:821-829.
165
González-Pajuelo, M., J. C. Andrade, y I.
Vasconcelos. 2004. Production of 1,3propanediol by Clostridium butyricum VPI
3266 using a synthetic medium and raw
glycerol. J. Ind. Microbiol. Biotechnol.
31:442-446.
González-Pajuelo, M., J. C. Andrade, y I.
Vasconcelos. 2005a. Production of 1,3propanediol by Clostridium butyricum VPI
3266 in continuous cultures with high yield
and productivity. J. Ind. Microbiol.
González-Pajuelo, M., I. Meynial-Salles, F.
Mendes, J. C. Andrade, I. Vasconcelos, y
P. Soucaille. 2005b. Metabolic engineering
of Clostridium acetobutylicum for the
industrial production of 1,3-propanediol
from glycerol. Metab. Eng. 7:329-336.
Gray, K. A., L. Zhao, y M. Emptage. 2006.
Bioethanol. Curr. Opin. Chem. Biol. 10:
141-146.
Hansen, A. C., Q. Zhang, y P. W. L. Lyne.
2005. Ethanol-biodiesel fuel blends - A
review. Biores. Technol. 96:277-285.
Heinzle, E., A. Biwer, y C. Cooney. 2006.
Development of sustainable bioprocesses.
Modeling and assessment. John Wiley &
Sons Ltd., Wiltshire, Reino Unido.
Henstra, A., J. Sipma, A. Rinzema, y A.
Stams. 2007. Microbiology of synthesis
gas fermentation for biofuel production.
Curr. Opin. Biotechnol. 18:200-206.
Hirschmann, S., K. Baganz, I. Koschik, y K.
D. Vorlop. 2005. Development of an
integrated bioconversion process for the
production of 1,3-propanediol from raw
glycerol
waters.
Landbauforschung
Volkenrode 55:261-267.
Ito, T., Y. Nakashimada, K. Senba, T.
Matsui, y N. Nishio. 2005. Hydrogen and
ethanol
production
from
glycerolcontaining
wastes
discharged after
biodiesel manufacturing process. J. Biosci.
Bioeng. 100:260-265.
pathways. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:
1888-1892.
Jarvis, G. N., E. R. B. Moore, y J. H. Thiele.
1997. Formate and ethanol are the major
products of glycerol fermentation produced
by a Klebsiella planticola strain isolated
from red deer. J. Appl. Microbiol. 83:166174.
Kamm, B., y M. Kamm. 2007. Biorefineries Multi-product processes. Adv. Biochem.
Eng. Biotechnol. 105:175-204.
Kessler, D., I. Leibrecht, y J. Knappe. 1991.
Pyruvate-formate-lyase-deactivase
and
acetyl-CoA
reductase
activities
of
Escherichia coli reside on a polymeric
protein particle encoded by adhE. FEBS
Lett. 281:59-63.
Lee, P. C., W. G. Lee, S. Y. Lee, y H. N.
Chang. 2001. Succinic acid production
with reduced by-product fromation in the
fermentation
of
Anaerobiospirillum
succiniproducens using glycerol as a
carbon source. Biotechnol. Bioeng. 72:4148.
Lee, S. K., H. Chou, T. S. Ham, T. S. Lee, y
J. D. Keasling. 2008. Metabolic
engineering of microorganisms for biofuel
production: from bugs to synthetic biology
to fuels. Curr. Opin. Biotechnol. 19:556563.
Leonardo, M. R., Y. Dailly, y D. P. Clark.
1996. Role of NAD in regulating the adhE
gene of Escherichia coli. J. Bacteriol. 178:
6013-6018.
Lin, E. C. C. 1976. Glycerol dissimilation and
its regulation in bacteria. Annu. Rev.
Lin, R. H., H. J. Liu, J. Hao, K. K. Cheng, y
D. H. Liu. 2005. Enhancement of 1,3propanediol production by Klebsiella
pneumoniae with fumarate addition.
166
D.C.
Marchetti, J. M., V. U. Miguel, y A. F.
Errazu. 2007. Possible methods for
biodiesel production. Renew. Sustain.
Energy Rev. 11:1300-1311.
McCoy, M. 2005. An unlikely impact. Chem.
Eng. News 83:24-26.
McCoy, M. 2006. Glycerin surplus. Chem.
Eng. News 84:7.
Murarka, A., Y. Dharmadi, S. S. Yazdani, y
R.
González.
2008.
Fermentative
utilization of glycerol by Escherichia coli
and its implications for the production of
fuels and chemicals. Appl. Environ.
Microbiol. 74:1124-1135.
Nielsen, J., J. Villadsen, y G. Liden. 2003.
Bioreaction engineering principles. Kluwer
Academic/Plenum Publishers, New York.
Oding-Smee, L. 2007. Biofuels bandwagon
hits a rut. Nature 446:483.
Park, S. J., C. P. Tseng, y R. P. Gunsalus.
1995. Regulation of succinate dehydrogenase (sdhCDAB) operon expression in
Escherichia coli in response to carbon
supply and anaerobiosis: role of ArcA and
Fnr. Mol. Microbiol. 15:473-482.
Perrenoud, A., y U. Sauer. 2005. Impact of
global transcriptional regulation by ArcA,
ArcB, Cra, Crp, Cya, Fnr, and Mlc on
glucose catabolism in Escherichia coli. J.
Bacteriol. 187:3171-3179.
Chem. 280:15084-15096.
San, K. Y., G. N. Bennett, S. J. BerríosRivera, R. V. Vidali, Y. T. Yang, R. E.
Horton, F. B. Rudolph, B. Sariyar, y K.
Blackwood. 2002. Metabolic engineering
through cofactor manipulation and its effect
on metabolic flux redistribution in
Escherichia coli. Metab. Eng. 4:182-192.
2005. Effect of different levels of NADH
availability on metabolic fluxes of
Escherichia coli chemostat cultures in
defined medium. J. Biotechnol. 117:395405.
170:5330-5336.
Schubert, C. 2006. Can biofuels finally take
center stage? Nat. Biotechnol. 24:777-784.
Schuller, H. J. 2003. Transcriptional control
of nonfermentative metabolism in the yeast
Saccharomyces cerevisiae. Curr. Genet.
2003:139-160.
Service, R. 2007. Cellulosic ethanol. Biofuel
researchers prepare to reap a new harvest.
Science 315:1488-1491.
Bennett. 2005a. Effect of ArcA and FNR
on the expression of genes related to the
oxygen regulation and the glycolysis
pathway in Escherichia coli under microaerobic growth conditions. Biotechnol.
Bioeng. 92:147-159.
Bennett. 2005b. Effect of oxygen on the
Escherichia coli ArcA and FNR regulation
systems
and
metabolic
responses.
167
anaerobic regulation of succinate dehydrogenase (sdhCDAB) gene expression in
Escherichia coli. Mol. Microbiol. 26:223236.
Snoep, J. L., M. R. de Graef, M. J. Teixeira
de Mattos, y O. M. Neijssel. 1992.
Pyruvate catabolism during transient state
conditions in chemostat cultures of
Enterococcus
faecalis
NCTC
775:
importance
of
internal
pyruvate
concentrations and NADH/NAD+ ratios. J.
purified pyruvate dehydrogenase complexes of Enterococcus faecalis, Lactococcus
lactis,
Azotobacter
vinelandii
and
Escherichia coli: implications for their
114:279-283.
Thompson, J. C., y B. B. He. 2006.
Characterization of crude glycerol from
biodiesel production from multiple
feedstocks. Appl. Eng. Agric. 22:261-265.
Wagner, A. F., M. Frey, F. A. Neugebauer,
W. Schafer, y J. Knappe. 1992. The free
radical in pyruvate formate-lyase is located
on glycine-734. Proc. Natl. Acad. Sci. USA
89:996-1000.
Wendisch, V. F., M. Bott, y B. J. Eikmanns.
2006.
Metabolic
engineering
of
Escherichia coli and Corynebacterium
glutamicum for biotechnological production of organic acids and amino acids Curr.
Opin. Microbiol. 9:268-274.
Wimpenny, J. W. T., y D. K. Necklen. 1971.
The redox environment and microbial
physiology. I. The transition from
anaerobiosis to aerobiosis in continuous
culture of facultative anaerobes. Biochim.
Biophys. Acta 253:352-359.
Xu, H., X. Miao, y Q. Wu. 2006. High quality
biodiesel production from a microalga
Chlorella protothecoides by heterotrophic
growth in fermenters. J. Biotechnol.
126:499-507.
Yang, G., J. S. Tian, y J. L. Li. 2007.
Fermentation of 1,3-propanediol by a
lactate deficient mutant of Klebsiella
oxytoca under microaerobic conditions.
Appl. Microbiol. Biotechnol. 73:10171024.
Yazdani, S. S., y R. González. 2007.
Anaerobic fermentation of glycerol: a path
to economic viability for the biofuels
industry. Curr. Opin. Biotechnol. 18:213219.
Zhang, X. M., Y. Li, B. Zhuge, X. M. Tang,
W. Shen, Z. M. Rao, H. Y. Fang, y J.
Zhuge. 2006a. Optimization of 1,3propanediol production by novel recombinant Escherichia coli using response
surface technology. J. Chem. Technol.
Zhang, Y. P., Y. Li, C. Y. Du, M. Liu, y Z.
Cao. 2006b. Inactivation of aldehyde
dehydrogenase: a
key factor for
engineering 1,3-propanediol production by
Klebsiella pneumoniae. Metab. Eng. 8:578586.
Zhao, Y. N., G. Chen, y S. J. Yao. 2006.
Microbial production of 1,3-propanediol
from glycerol by encapsulated Klebsiella
pneumoniae. Biochem. Eng. J. 32:93-99.
Zheng, P., K. Wereath, J. B. Sun, J. van den
Heuvel, y A. P. Zeng. 2006. Overexpression of genes of the dha regulon and
its effects on cell growth, glycerol
fermentation to 1,3-propanediol and
plasmid stability in Klebsiella pneumoniae.
Process Biochem. 41:2160-2169.
K. Y. San. 2006. Effect of the global redox
sensing/regulation networks on Escherichia
coli and metabolic flux distribution based
on C-13 labeling experiments. Metab. Eng.
8:619-627.
168
Zhu, M. M., P. D. Lawman, y D. C.
Cameron. 2002. Improving 1,3-propanediol production from glycerol in a
metabolically engineered Escherichia coli
by reducing accumulation of sn-glycerol-3phosphate. Biotechnol. Prog. 18:694-699.
169
Capítulo VII
Diseño de un
bioproceso para la
producción
microaeróbica de PHB a
partir de glicerol como
sustrato carbonado
principal
Capítulo VII – Producción microaeróbica de PHB a partir de glicerol
7.1. Prefacio
En el Capítulo VI se ha descripto la caracterización metabólica de Escherichia coli
K1060 y dos mutantes derivadas de esta cepa en condiciones de limitación de oxígeno
utilizando glicerol como sustrato carbonado principal. Una de las mutantes, E. coli CT1061
[arcA::IS10-L creC(Con)], mostró características ventajosas en comparación con las restantes
cepas en los parámetros cinéticos de crecimiento y excreción de metabolitos fermentativos
reducidos. Para mostrar la aplicabilidad de E. coli CT1061 en un proceso biotecnológico, en
este capítulo se estudian los parámetros físico-químicos y las variables de proceso
relacionadas a la síntesis heteróloga de poli(3-hidroxibutirato) (PHB). En la Introducción se
hace referencia a la situación actual respecto de la dependencia del petróleo como materia
prima, y se propone la utilización de sustratos de bajo costo conjuntamente con bioprocesos
llevados a cabo en condiciones de limitación de oxígeno como alternativa sostenible para la
obtención de bioplásticos. El diseño racional de un bioproceso involucra la determinación
cuantitativa del efecto de las variables independientes sobre la respuesta de interés; en este
caso, la acumulación de PHB. El bioproceso microaeróbico descripto en este capítulo se
desarrolla en base a la metodología de los diseños experimentales estadísticos, y se completa
con el estudio de cultivos microaeróbicos en la modalidad de lote alimentado con el objetivo
de aumentar la productividad volumétrica de polímero.
7.2. Objetivos
- Estudiar el efecto de las condiciones redox del medio de cultivo sobre la acumulación
heteróloga de PHB en una mutante de E. coli desregulada para el metabolismo redox y de
carbono.
- Desarrollar un medio de cultivo adecuado para la acumulación de PHB en condiciones de
baja disponibilidad de oxígeno utilizando diseños experimentales estadísticos.
- Analizar el crecimiento y acumulación del polímero en cultivos microaeróbicos en
fermentador en la modalidad de lote y lote alimentado, usando glicerol como sustrato
carbonado.
7.3. Introducción
Las fermentaciones microbiológicas, así como muchos otros procesos industriales,
dependen fundamentalmente de dos combustibles fósiles (viz., petróleo y CH4) como
principales fuentes de energía [Yazdani y González, 2007]. Esta situación ha dejado una
impronta en el medio ambiente, contribuyendo al cambio climático global por emisión de
CO2 a la atmósfera [Campbell y Laherrère, 1998] y, como consecuencia colateral, ha
favorecido la generación de una amplia variedad de bienes de consumo no biodegradables
derivados de la industria petroquímica que se convierten en potenciales agentes de
contaminación debido a la dificultad para disponerlos en forma definitiva y ecológicamente
segura [Gewin, 2006]. En este contexto, es preciso considerar nuevas estrategias basadas en
procesos energéticamente favorables para la generación de materiales biodegradables cuya
obtención no dependa primariamente de la industria petroquímica [Heinzle et al., 2006]. Esto
no sólo permitiría una importante reducción en la contaminación y la utilización de
171
combustibles fósiles, si no que además disminuiría considerablemente la actual dependencia
del petróleo gracias a la utilización de recursos renovables. La situación energética actual ha
renovado el interés en procesos biotecnológicos que puedan considerar dichos objetivos
simultáneamente. Los procesos microbiológicos industriales desarrollados en condiciones de
baja disponibilidad de oxígeno y la generación de bioproductos de bajo o nulo impacto
ambiental en forma sostenible [Zeng y Deckwer, 1996; Carlson et al., 2005; Dharmadi et al.,
2006] son ejemplos interesantes de la reducción en el impacto ambiental.
El PHB es el polímero mejor caracterizado dentro de la familia de poliésteres
colectivamente denominados polihidroxialcanoatos (PHAs) [Anderson y Dawes, 1990], y es
sintetizado en muchas especies bacterianas como fuente de carbono y energía frente a
situaciones de desbalance nutricional [Senior y Dawes, 1971; Khanna y Srivastava, 2005; cf.
Introducción general]. En la actualidad los PHAs continúan atrayendo interés desde el punto
de vista industrial por la posibilidad de ser utilizados como termoplásticos renovables,
biodegradables, y biocompatibles [Reddy et al., 2003]. Sin embargo, los procesos
tradicionalmente utilizados para la síntesis industrial de PHAs requieren condiciones
completamente aeróbicas para el desarrollo del microorganismo productor y la acumulación
de polímeros [Li et al., 2007; Suriyamongkol et al., 2007], lo cual implica que se trata de
procesos de elevada demanda energética. Esta situación determina que los procesos
productivos para la obtención de PHAs deban ser cuidadosamente diseñados [Patnaik, 2005].
El impacto ambiental relacionado con el reemplazo de plásticos ‘tradicionales’, derivados de
petróleo, por biopolímeros ha sido objeto de diversos estudios [Kurdikar et al., 2001; Gross y
Kalra, 2002]. Entre ellos, algunos han analizado la producción de PHAs por fermentación
microbiana [Heyde, 1998; Gerngross, 1999; Gerngross y Slater, 2000; Akiyama et al., 2003].
Recientemente, Harding et al. [2007] han publicado un análisis detallado del ciclo de vida
(LCA, life cycle assessment) para la generación de PHB desde los primeros pasos en la
síntesis del polímero hasta su disposición final. En el análisis LCA se incluyen todas aquellas
categorías en las cuales la generación, procesamiento, y disposición de un determinado
producto pudieran tener algún impacto. Entre ellas, se consideran el impacto abiótico,
calentamiento global, efecto sobre la capa de ozono, toxicidad para humanos, ecotoxicidad
para ambientes acuáticos (marinos y de agua dulce), terrestres, oxidación fotoquímica,
acidificación de corrientes, y eutrofización. En general, dichos estudios mostraron que, a
pesar de que estos biopolímeros son ambientalmente adecuados cuando son comparados con
los plásticos ‘tradicionales’, la gran cantidad de energía utilizada para la producción debe ser
tenida en cuenta a la hora de evaluar el impacto ambiental global del proceso productivo.
Para el diseño de procesos productivos que puedan significar un ahorro de energía
(mejorando la sostenibilidad del bioproceso industrial) se requiere de un profundo
conocimiento de la fisiología de microorganismos productores de PHAs en condiciones de
baja disponibilidad de oxígeno. E. coli, un microorganismo anaerobio facultativo modelo, ha
sido utilizado como huésped para la expresión heteróloga de genes pha de diversas especies
[Steinbüchel y Füchtenbusch, 1998; Li et al., 2007]. Dado que se trata de un microorganismo
capaz de crecer en diversas condiciones en relación a la disponibilidad de oxígeno [Gennis y
Stewart, 1996], se trata de un modelo adecuado para el estudio del efecto de diversas
mutaciones redox sobre la síntesis de bioproductos de interés biotecnológico.
172
El sistema regulatorio de dos componentes ArcAB de E. coli se encarga de regular,
junto a la proteína Fnr, la expresión de genes catabólicos y respiratorios de modo de adaptar
el microorganismo a condiciones de oxígeno cambiantes [Lynch y Lin, 1996; Patschkowski
et al., 2000]. El regulador ArcA posee efectos pleiotrópicos sobre el metabolismo celular,
controlando la expresión de más de 135 genes de acuerdo al estado redox intracelular
[Salmon et al., 2005]. Según se describió en el Capítulo III, la acumulación heteróloga de
PHB en una mutante ΔarcA de E. coli suprime el fenotipo Dye, caracterizado por la
sensibilidad a azul de toluidina. También se ha mostrado que la conjunción de una mutación
en arcA (arcA::IS10-L) y una mutación constitutiva en creC confiere características
particulares a una cepa de E. coli, que la hacen adecuada para la acumulación microaeróbica
de PHB utilizando glucosa como principal sustrato carbonado [cf. Capítulo II]. La abundancia
del glicerol, que constituye ca. 10% de los efluentes del proceso para obtención industrial de
biodiesel, exige un procedimiento adecuado para su disposición, dado que solamente se
utiliza una parte del mismo luego de ser purificado (principalmente en las industrias
farmacéutica y alimenticia) [McCoy, 2006; Yazdani y González, 2007]. Esta situación
particular llevó a la idea de ensayar la utilización de glicerol como sustrato carbonado
alternativo a la glucosa en fermentaciones conducentes a la generación de bioproductos
reducidos [da Silva et al., 2009]. Los resultados de los ensayos preliminares, discutidos en el
capítulo precedente, muestran que cuando E. coli CT1061 [arcA::IS10-L creC(Con)] se hace
crecer en condiciones microaeróbicas con glicerol como principal fuente de carbono se
registra un elevado cociente NADH/NAD+, el cual reflejaría un estado redox intracelular
altamente reductor [Sánchez et al., 2005]. Como consecuencia, se favorece la síntesis de
biocompuestos que actúan como captadores de equivalentes de reducción (i.e., etanol).
Existen algunos antecedentes en la producción de PHAs a partir de glicerol en
procesos fermentativos aeróbicos. Borman y Roth [1999] describieron la producción de PHB
por Methylobacterium rhodesianum y Cupriavidus necator en un medio conteniendo glicerol
y peptona de caseína como principales fuentes de carbono y nitrógeno, respectivamente, pero
la conversión del sustrato carbonado a polímero fue limitada dando lugar a bajos
rendimientos de PHB. También se ha descripto la utilización del glicerol proveniente de
desechos de la industria del biodiesel para la síntesis de PHA por Pseudomonas oleovorans
[Ashby et al., 2004]. En este caso, la utilización del sustrato crudo resultó ventajosa debido a
que el microorganismo fue capaz de incorporar al polímero algunos ácidos grasos libres
presentes en el sustrato. Además de la interesante posibilidad de obtener nuevos PHAs con
diferencias en su composición estructural, uno de los principales atractivos del bioproceso
planteado residiría en utilizar como sustrato el co-producto de la síntesis de biodiesel sin
purificación previa. Debe mencionarse que varios estudios reportan una reducción
significativa en el peso molecular del PHA obtenido [Ashby et al., 2005; Koller et al., 2005]
probablemente debido a que el glicerol actuaría como agente terminador de cadena
prematuro, lo cual impediría que el polímero continúe su elongación [Madden et al., 1999;
Solaiman et al., 2006]. Finalmente, existen algunos estudios que describen la acumulación de
PHB por cepas recombinantes de E. coli a partir de glicerol. En un trabajo reciente, de
Almeida et al. [2007] han demostrado que una cepa salvaje de E. coli que expresa los genes
phaBAC y phaP de Azotobacter sp. cepa FA8 es capaz de acumular ca. 46% de PHB respecto
a biomasa a partir de glicerol en cultivos aeróbicos desarrollados en lote.
173
En este capítulo se amplían los resultados mencionados en relación a la utilización de
glicerol como fuente de carbono para la síntesis microaeróbica de PHB. Este objetivo fue
abordado mediante dos tipos de enfoques: la selección y optimización integrada de factores
físico-químicos que influencian la síntesis microaeróbica de PHB en frascos agitados a través
de diseños experimentales estadísticos, y la evaluación de un proceso en lote alimentado (i.e.,
cultivo fed-batch) para la síntesis de PHB en condiciones de baja disponibilidad de oxígeno.
7.4.1. Cepa y condiciones de cultivo
Cepa y plásmido. En este capítulo se utilizó E. coli CT1061 [F– fadE62 lacI60
tyrT58(AS) fabB5 mel-1 arcA::IS10-L creC(Con)], cuya construcción se detalló en el
Capítulo II. E. coli CT1061 fue transformada con el plásmido pJP24K (vector de expresión
que contiene los genes phaBAC de Azotobacter sp. cepa FA8 expresados a partir de un
elemento promotor-operador T5-lac; Apr Kmr).
Condiciones de cultivo. Los cultivos descriptos en este capítulo se desarrollaron en
medio SMA/Glicerol como medio de cultivo basal [Na2 HPO4 6,0 g · l-1; KH2PO4 3,0 g · l-1;
(NH4)2SO4 1,4 g · l-1; NaCl 0,5 g · l-1; MgSO4·7H2O 0,2 g · l-1; hidrolizado ácido de caseína
(casaminoácidos, CAS) 0,3 g · l-1; glicerol 30,0 g · l-1; pHinicial = 7,20]. Este medio contiene,
además, 5 ml · l-1 de una solución de elementos traza [compuesta, por litro de HCl 5 N, por
FeSO4·7H2O 10,0 g; CaCl2·2H2O 2,0 g; ZnSO4·7H2O 2,2 g; MnSO4·4H2O 0,5 g;
CuSO4·5H2O 1,0 g; (NH4)6Mo 7O24·4H2O 0,1 g; NiCl2 0,1 g; CoCl2·4H2O 0,1 g; Na2SeO3
0,05 g; y Na2B4O7·10H2O 0,02 g]. La formación de espuma se evitó añadiendo a todos los
cultivos 30 μl · l-1 de antiespumante (AntiFoam 289; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO,
EE.UU.), y se agregó kanamicina 50 μg · ml-1 para mantención del plásmido pJP24K. Los
cultivos microaeróbicos se llevaron a cabo a 37°C con un volumen de medio de 250 ml en
frascos Erlenmeyer de 250 ml de volumen nominal (relación volumen de medio:volumen de
frasco = 1:1) y agitación magnética suave (ca. 75 r.p.m.) para evitar la sedimentación de la
biomasa. A menos que se indique lo contrario, los cultivos de trabajo se inocularon a una
concentración inicial de biomasa de 0,1 g · l-1 a partir de un cultivo de 18 h crecido en
SMA/Glicerol en condiciones microaeróbicas.
Cultivo en biorreactor. Con el fin de obtener un monitoreo continuo y un mayor
control de los factores físicos y nutricionales (pH, oxígeno disuelto, agitación, et cetera), se
realizaron cultivos en un biorreactor modular provisto de un vaso de fermentación de vidrio
de hasta 5 L de volumen de trabajo (BioFlo 110; New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ,
EE.UU.). El fermentador utilizado fue de tipo tanque agitado y aireado, equipado con dos
series de seis agitadores (turbinas Rushton) y difusores (bafles) laterales. La concentración de
oxígeno disuelto fue determinada utilizando un electrodo de oxígeno (Ag/AgCl,
polarimétrico; Mettler Toledo Co., Columbus, OH, EE.UU.). En todos los casos, el pH se fijó
en 7,20 ± 0,03 y se controló mediante adición automática de KOH 3 M o H2SO4 1,5 M. La
formación de espuma se evitó por adición de 30 μl · l-1 antiespumante (AntiFoam 289) al
comienzo del cultivo. En los ensayos en lote, se utilizó un volumen de medio de 4,5 L (i.e.,
174
80% del volumen nominal del biorreactor). Para mantener condiciones microaeróbicas, en los
cultivos en lote (i.e., batch) se suprimió el suministro de aire y la velocidad de agitación se
mantuvo en 75 r.p.m. para evitar la sedimentación de la biomasa. Los cultivos en lote
alimentado contuvieron un volumen inicial de medio de 3 L, y se desarrollaron en presencia
de un flujo de aire de 500 ml · min-1 (ca. 0,15 volumen de aire · volumen de vaso-1 · min-1)
con agitación constante a 75 r.p.m. La solución de alimentación utilizada en los ensayos en
lote alimentado consistió en glicerol 500 g · l-1; CAS 40 g · l-1; y MgSO4·7H2O 4 g · l-1.
7.4.2. Diseños experimentales estadísticos y análisis de los resultados
El efecto de algunos aditivos redox añadidos al medio SMA/Glicerol sobre el
crecimiento y la síntesis de PHB se analizó por la metodología de ‘un factor a la vez’
[Kennedy y Krouse, 1999]. Las concentraciones de dichos aditivos redox se detalla en el
texto, y los mismos fueron añadidos como soluciones concentradas previamente esterilizadas
por filtración (0,22 μm).
Los diseños experimentales utilizados en este estudio fueron de dos tipos: diseños de
selección y diseños de optimización. Las respuestas analizadas fueron la producción de
biomasa y la concentración de PHB. Cada una de las k variables independientes estudiadas se
codificó según la Ecuación 7.1.
xi =
Xi − X0
, i = 1, 2, 3, ..., k
ΔX i
Ecuación 7.1
siendo xi el valor codificado de la variable i, Xi su valor real, X0 el valor que adopta la
variable en el punto central (nivel 0), y ΔXi la variación del parámetro entre el nivel cero y el
nivel consecutivo a éste (superior o inferior).
Diseños de selección. Se utilizó el diseño de selección de Plackett-Burman [Plackett y
Burman, 1946] para evaluar el efecto de las variables independientes sobre el crecimiento y
acumulación de PHB. Los parámetros analizados fueron: concentración de glicerol;
concentración de CAS; pH inicial; temperatura de incubación; tamaño del inóculo;
concentración de elementos traza [utilizando la solución de elementos metálicos traza
descripta en la sección Condiciones de cultivo]; y concentración de MgSO4·7H2O. El diseño
de selección se repitió dos veces.
Diseños de optimización. Se empleó el diseño de optimización central compuesto, o
de Box-Wilson [Box y Wilson, 1951]. Los parámetros del diseño de optimización fueron la
concentración de glicerol, la concentración de CAS, y el tamaño del inóculo. El análisis de
las respuestas se realizó según la Ecuación 7.2.
k
k
Y = β0 +
∑
i =1
β i xi +
j −1
∑∑
j =2 i =1
k
β ij xi x j +
∑β
ii x i
2
Ecuación 7.2
i =1
175
siendo Y la respuesta observada, β0 el coeficiente independiente, βi el i-ésimo coeficiente
lineal, βij el i,j-ésimo coeficiente interactivo, y βii el i-ésimo coeficiente cuadrático. El diseño
de optimización se repitió tres veces.
Análisis de los resultados. Los resultados obtenidos fueron sometidos a análisis
estadístico a través de análisis de la varianza (ANOVA), utilizando las plataformas
informáticas Essential Regression 2.205 (desarrollado y distribuido gratuitamente por Dave
Steppan, Joachim Werner, y Robert Yeater, Silicon Valley, CA, EE.UU.), OriginProTM 8.0
(OriginLab Corp., Northampton, MA, EE.UU.), y MathematicaTM 6.0 (Wolfram Research
Inc., Champaign, IL, EE.UU.). La significancia de los coeficientes fue determinada mediante
el test t de Student y el valor P. La adecuación del modelo matemático de regresión para cada
diseño experimental se evaluó mediante el test F de Fischer.
Determinación de metabolitos de fermentación. La concentración de metabolitos
de fermentación se determinó utilizando un kit comercial basado en la actividad alcohol
deshidrogenasa (etanol), y por cromatografía de gases (acetato, formiato, lactato, piruvato, y
succinato). Los protocolos se detallan en la sección correspondiente en el Capítulo IV.
Determinación de etanol. La concentración de etanol se determinó utilizando un kit
comercial (Randox Laboratories Ltd.; Oceanside, CA, EE.UU.), basado en el método de la
alcohol deshidrogenasa, midiendo el incremento en la concentración de NADH por
espectrofotometría a λ = 340 nm. La determinación se llevó a cabo según las instrucciones
detalladas por el proveedor, y se elaboró una curva estándar con diluciones de una solución
valorada de etanol 1,5 mg · ml-1. Los detalles del protocolo se describen en el Capítulo IV.
Determinación de glucosa y glicerol. La concentración de glucosa fue determinada
utilizando un kit enzimático basado en la reacción secuencial de la glucosa oxidasa y
peroxidasa (Wiener Labs.; Rosario, Argentina) [cf. Capítulo IV]. La determinación de
glicerol residual en el medio de cultivo se realizó utilizando un método colorimétrico
desarrollado ad hoc, detallado en la sección correspondiente del Capítulo VI.
176
7.5.1. Efecto de aditivos redox en el crecimiento y acumulación de PHB en
cultivos en lote en frascos agitados
Un aspecto importante del fenotipo característico de las mutantes ΔarcA de E. coli es
su incapacidad de crecer en medio mínimo [Fu et al., 1991]. Según se mostró en los
Capítulos II y VI, las mutantes portadoras de los alelos arcA::IS10-L y creC(Con) son
capaces de crecer en medio mínimo si éste es suplementado con una pequeña cantidad de
CAS. En virtud de la baja concentración de CAS necesaria y suficiente para promover el
crecimiento de dichas mutantes, se decidió analizar si el efecto positivo de este componente
complejo del medio de cultivo se relaciona con el aporte de macronutrientes como carbono
y/o nitrógeno, o si existe algún otro efecto independiente del aporte nutricional (e.g., efectos
redox). El análisis elemental del hidrolizado de caseína muestra que posee un elevado
contenido de cisteína en relación a los restantes aminoácidos (información provista por el
proveedor; Difco, Detroit, MI, EE.UU.). La cisteína posee efecto reductor, y es comúnmente
utilizada como suplemento en medios de cultivo para microorganismos anaerobios. También
se consideró el análisis de metionina, otro aminoácido azufrado con capacidad redox.
Con el objetivo de analizar el efecto de distintos aditivos redox en el crecimiento de
E. coli CT1061/pJP24K y la acumulación de PHB (proceso dependiente del estado redox
intracelular), se estudiaron ambos parámetros en cultivos microaeróbicos en lote en frascos
agitados utilizando el medio semi-sintético SMA/Glicerol (de composición idéntica al medio
SMA/Glucosa descripto en el Capítulo II, pero utilizando glicerol 30 g · l-1 como principal
fuente carbonada en lugar de glucosa). Los resultados obtenidos al reemplazar los CAS por
Na2S, o los aminoácidos L,D-cisteína y L-metionina, se muestran en la Tabla 7.1. Como
puede observarse, cuando el medio de cultivo no fue suplementado con CAS no se registró
crecimiento apreciable, y no fue posible detectar acumulación de PHB. El mayor crecimiento
y síntesis de polímero se registraron en presencia de CAS 0,3 g · l-1, lo cual resultó en un
porcentaje de acumulación de PHB respecto a biomasa de 34 ± 4%. La adición de cisteína,
que puede actuar simultáneamente como aditivo redox y nutricional, también produjo un
aumento significativo en la acumulación de PHB. Por otro lado, la adición de metionina o
Na2S no promovió significativamente la síntesis de polímero.
Parámetro
-1
Biomasa (g · l )
PHB (g · l-1)
PHB (%)
Suplemento
Na2S
L,D-cisteína
Ninguno
CAS
L-metionina
0,15 ± 0,01
N.D.
3,58 ± 0,21
1,25 ± 0,09
2,53 ± 0,18
0,41 ± 0,02
2,85 ± 0,17
0,71 ± 0,06
1,25 ± 0,08
0,14 ± 0,01
N.D.
34 ± 4
16 ± 2
24 ± 3
11 ± 2
Tabla 7.1. Efecto de la adición de distintos suplementos nutricionales y redox al medio
SMA/Glicerol sobre el crecimiento y acumulación de PHB por E. coli CT1061/pJP24K. Las
concentraciones utilizadas para los aditivos fueron 0,3 g · l-1 (CAS, casaminoácidos), 50 mg ·
l-1 (aminoácidos), y 1 g · l-1 (Na2S). Los resultados representan el valor promedio ±
desviación estándar de determinaciones por duplicado en al menos dos cultivos
independientes. N.D., no detectado.
177
Estos resultados muestran que la adición de CAS es necesaria y suficiente para
promover la síntesis microaeróbica de PHB por E. coli CT1061/pJP24K, y que este efecto
positivo no solamente se debería a sus propiedades redox. De hecho, se ha mostrado que la
adición de ciertos aminoácidos al medio de cultivo mejora la acumulación de PHB en
cultivos aeróbicos de cepas recombinantes de E. coli que expresan los genes pha de C.
necator [Lee et al., 1995]. Además de las propiedades redox de la cisteína presente en los
CAS, se deben considerar las rutas biosintéticas de aminoácidos en el metabolismo de E. coli.
La síntesis de ciertos aminoácidos consume intermediarios del ciclo TCA e intermediarios
glicolíticos (que, de no ser consumidos, formarían acetil-coenzima A), además de
equivalentes de reducción (como NADH o NADPH) [Neidhardt et al., 1990]. Por lo tanto, la
adición externa de aminoácidos al medio de cultivo podría evitar la limitación de sustrato
carbonado y NADPH necesarios para la actividad de las enzimas biosintéticas de PHB.
Considerando esto, se decidió incluir a los CAS en la formulación del medio utilizado para la
acumulación de PHB por la cepa recombinante.
7.5.2. Formulación de un medio de cultivo apropiado para la síntesis de PHB
utilizando la metodología de los diseños experimentales estadísticos
En la sección precedente se discutieron algunos ensayos clásicos de optimización del
medio de cultivo con el fin de seleccionar algunos factores categóricos que pudieran
influenciar la producción de biomasa y de PHB por E. coli CT1061/pJP24K. Existen pocos
reportes en la literatura acerca de la utilización de diseños experimentales para optimizar la
producción de biopolímeros [Grothe et al., 1999; Nikel et al., 2005], y en ninguno de ellos se
ha analizado la síntesis microaeróbica de PHB. En los ensayos preliminares descriptos en esta
sección se varió un factor por vez, manteniendo los demás constantes, con el objetivo de
estimar el rango de influencia de los factores seleccionados. Esta información se aplicó a la
implementación de diseños experimentales estadísticos, una serie de técnicas que por medio
del análisis estadístico proveen una alternativa a los ensayos clásicos para mejorar procesos
fermentativos con mayor eficiencia [Strobel y Sullivan, 1999]. Esta metodología es
particularmente útil ya que a través de experimentos cuidadosamente planeados se puede
determinar el sub-conjunto de variables del proceso que tienen mayor influencia sobre la
respuesta de interés [Montgomery, 2001]; en este caso, el crecimiento bacteriano y la
acumulación de PHB.
El objetivo de la técnica de optimización estadística de un bioproceso implica la
selección y mejoramiento de los niveles de las variables críticas para obtener un mejor
rendimiento en el proceso fermentativo. Por otra parte, el análisis de datos mediante el
empleo de métodos estadísticos permite trabajar con mayor objetividad científica en la
obtención de conclusiones, ya que el efecto de cada una de las variables es dimensionado
cuantitativamente. Por ejemplo, en lugar de estudiar la respuesta del microorganismo a
distintas concentraciones de fuentes carbonadas y nitrogenadas en dos series de ensayos
distintas, es posible probar todas las combinaciones simultáneamente en un bajo número de
experimentos. La información básica para planear correctamente los diseños experimentales
se obtuvo a partir de algunos ensayos nutricionales llevados a cabo en las primeras etapas de
este estudio (datos no mostrados), así como la información bibliográfica disponible.
178
Para la realización de un diseño experimental se utiliza una matriz matemática
prefijada, que abarca una zona determinada de valores de las variables a estudiar, sin
necesidad de recurrir a la realización exhaustiva de todas las combinaciones entre los
mismos. En este estudio, se realizó en primer lugar un diseño de selección, el cual consiste en
un programa de mejoramiento del medio de cultivo que permite analizar los factores que
tienen efectos significativos sobre el crecimiento del microorganismo y la acumulación de
PHB. El objetivo de esta etapa fue seleccionar un número pequeño y manejable de factores
que afectasen significativamente la producción de biomasa y acumulación de PHB por E. coli
CT1061/pJP24K. Los niveles óptimos de esas variables independientes fueron hallados en la
etapa de optimización.
7.5.2.1. Diseños de selección de Plackett-Burman
El primer tipo de diseño realizado fue el diseño de selección de Plackett-Burman. Se
trata de un diseño multifactorial a 2 niveles, el cual permite estimar los efectos lineales de
cada factor, representándolos como la pendiente de una recta que conecta la media de las
respuestas del factor en su nivel codificado menor (–1) y mayor (+1). El fundamento de esta
técnica es la construcción racional de varias combinaciones (conjuntos experimentales) de los
componentes a analizar. Con este diseño se puede estudiar el efecto de N–1 factores en N
ensayos (cada uno correspondiente a un conjunto experimental distinto), donde N es múltiplo
de 4. En todos los diseños se agregan puntos centrales (i.e., nivel 0) por triplicado para
calcular el error puro del método. Es importante destacar que en cada uno de los diseños
experimentales las variables se codificaron según la Ecuación 7.1 [cf. Materiales y métodos].
Las variables independientes analizadas fueron las concentraciones de glicerol, CAS,
solución de elementos traza, y de Mg2+; pH inicial; temperatura de cultivo; y tamaño de
inóculo (Tabla 7.2).
Variable
Nombre
Unidad
Glicerol
g · l-1
CAS
g · l-1
pH
U
Temperatura
°C
Tamaño del inóculo
g · l-1
TES
ml · l-1
2+
Mg
g · l-1
Código
A
B
C
D
E
F
G
–1
10,00
0,50
6,00
28,00
0,10
1,50
0,10
Niveles
Punto central (0)
20,00
1,75
7,00
37,00
2,55
3,25
0,55
+1
30,00
3,00
8,00
46,00
5,00
5,00
1,00
Tabla 7.2. Valores codificados y reales para las variables estudiadas en el diseño de
selección de Plackett-Burman. El tamaño del inóculo se calculó como la concentración inicial
de biomasa. La concentración de Mg2+ se varió por adición de MgSO4·7H2O. CAS,
casaminoácidos; TES, solución de elementos traza.
179
La concentración de glicerol fue analizada hasta 30 g · l-1, un rango en el cual podría
ejercer un efecto positivo en la acumulación de PHB sin producir un efecto osmótico
negativo sobre el crecimiento [Neidhardt et al., 1990]. A su vez, la concentración de CAS se
varió entre dos niveles en los cuales el aporte de nitrógeno es sensiblemente menor en
comparación con las sales de amonio presentes en el medio SMA (i.e., el efecto de los CAS
sería catalítico). En la Tabla 7.3 se muestra el diseño de Plackett-Burman junto a las
determinaciones experimentales de las variables dependientes.
Exp.
A
B
C
D
E
F
G
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
+1
–1
–1
+1
–1
+1
+1
–1
+1
–1
–1
+1
0
0
0
–1
+1
+1
–1
+1
+1
+1
–1
+1
–1
–1
–1
0
0
0
+1
+1
–1
+1
+1
–1
–1
–1
+1
+1
–1
–1
0
0
0
–1
+1
–1
+1
–1
+1
+1
+1
–1
+1
–1
–1
0
0
0
–1
–1
–1
–1
+1
+1
–1
+1
+1
+1
–1
+1
0
0
0
–1
+1
+1
+1
–1
–1
–1
+1
+1
–1
–1
+1
0
0
0
+1
+1
+1
–1
–1
+1
–1
–1
–1
+1
–1
+1
0
0
0
Respuesta (g · l-1)
Biomasa
PHB
4,63 ± 0,39
1,29 ± 0,05
5,07 ± 0,45
0,39 ± 0,01
4,98 ± 0,33
0,33 ± 0,02
4,68 ± 0,15
1,29 ± 0,09
5,88 ± 0,21
1,58 ± 0,21
6,28 ± 0,51
2,23 ± 0,17
5,36 ± 0,94
1,02 ± 0,06
5,28 ± 0,36
1,87 ± 0,18
6,21 ± 0,89
2,18 ± 0,22
5,14 ± 0,75
1,84 ± 0,13
4,35 ± 0,58
0,57 ± 0,04
5,71 ± 0,26
2,22 ± 0,19
5,25 ± 0,67
1,47 ± 0,15
5,38 ± 0,55
1,36 ± 0,14
5,22 ± 0,68
1,27 ± 0,.15
Tabla 7.3. Diseño de selección de Plackett-Burman para analizar el efecto de distintas
variables nutricionales y físico-químicas sobre el crecimiento y acumulación de PHB por E.
coli CT1061/pJP24K. Los símbolos para las variables independientes son los descriptos en la
explicación de la Tabla 7.2. Las respuestas se expresan como el valor medio ± desviación
estándar de mediciones efectuadas por duplicado en dos experimentos independientes. Exp.,
experimento.
El análisis matemático del diseño ajustó las respuestas obtenidas mediante una
función de primer orden a 7 variables (parámetros del diseño), cuyos coeficientes lineales se
obtuvieron por análisis de regresión múltiple. La regresión se realizó por el método de
cuadrados mínimos, minimizando el error residual, representado por la suma de cuadrados de
las diferencias entre los valores de respuesta observados y los valores estimados por el
modelo. En la Tabla 7.4 se presentan los resultados del análisis estadístico, los coeficientes de
determinación y los errores estándar, así como los valores t y P para cada uno de los
coeficientes. El test estadístico por el cual se analizó el modelo aplicado fue ANOVA, y su
significación fue estudiada a través del test F de Fischer. Las ecuaciones obtenidas se
presentan a continuación, donde las letras A a G representan los valores codificados para
glicerol, CAS, pH, temperatura, inóculo, TES, y Mg2+, respectivamente. Los términos
destacados en negrita resultaron estadísticamente significativos.
180
Biomasa (g · l-1) = 5,297 + 0,181×A + 0,331×B – 0,106×C + 0,006×D + 0,452×E + 0,024×F
+ 0,003×G
PHB (g · l-1) = 1,394 + 0,304×A – 0,113×B – 0,027×C + 0,039×D + 0,586×E – 0,021×F –
0,017×G
Los valores de los coeficientes βi de la ecuación de regresión están relacionados con
los valores codificados de los parámetros independientes y las respuestas obtenidas para cada
combinación de los mismos. El valor absoluto de cada coeficiente de la regresión es
proporcional al efecto que éste tiene sobre la respuesta. Así, un valor absoluto elevado para
un coeficiente determinado implica que el efecto del mismo será notable (positivo o negativo,
dependiendo del signo de βi), mientras que si tiende a cero el factor tendrá un efecto menor.
Para estudiar la significancia de cada factor se analizan los valores t (del test t de Student) y P
(de ANOVA) de su coeficiente de regresión. El parámetro P puede considerarse como el
nivel de significancia más bajo para el que los datos son significativos en el contexto del
modelo. Dicho de otro modo, P es la probabilidad de que la magnitud del parámetro estimado
en estudio sea producto del azar, como consecuencia de un proceso aleatorio. Un valor P bajo
indica un efecto ‘real’ o significativo estadísticamente. En este trabajo, un coeficiente se
consideró significativo si 1–P > 0,95 (lo cual implica un nivel de significancia del 95%).
Asimismo, un valor absoluto elevado del parámetro t indica alta significancia del efecto del
factor en estudio sobre la respuesta.
Respuesta
Biomasa
PHB
Término
Intercepto
A
B
C
D
E
F
Intercepto
A
B
C
D
E
F
Coeficiente de
regresión
5,297
0,181
0,331
–0,029
0,006
0,452
0,024
1,394
0,304
–0,113
0,027
0,039
0,586
–0,021
Error
estándar
0,017
0,019
0,019
0,019
0,019
0,019
0,019
0,021
0,023
0,023
0,023
0,023
0,023
0,023
Valor t
Valor P
29,015
7,465
9,298
–1,507
0,301
13,517
1,266
67,105
13,074
–4,857
1,159
1,716
25,241
–0,912
<0,0001 **
0,0125 *
0,0021 **
0,1755 §
0,7721 §
0,0009 **
0,2461 §
<0,0001 **
0,0005 **
0,0187 *
0,2851 §
0,1295 §
0,0028 **
0,3922 §
Tabla 7.4. Análisis del diseño de selección de Plackett-Burman. Los símbolos utilizados
para las variables son los descriptos en la leyenda de la Tabla 3.5. Los niveles de
significancia (ANOVA) se codificaron de la siguiente manera: § no significativo; *
significativo con P < 0,05; ** significativo con P < 0,01.
181
El análisis estadístico del modelo, a través de ANOVA, reveló que la ecuación de
primer orden elegida para interpretar las observaciones experimentales fue adecuada y
significativa (datos no mostrados). Normalmente, un modelo de regresión que presente un
valor del coeficiente de determinación R2 > 0,9 se considera de muy alta correlación, y un
modelo con 0,7 ≤ R2 ≤ 0,9 se considera de alta correlación [Kennedy y Krouse, 1999]. En
este diseño experimental, el coeficiente de determinación para biomasa resultó ser R2 =
0,956; lo que significa que un 95,6% de los resultados experimentales puede ser explicado
por el diseño realizado (i.e., sólo un 4,4% de las respuestas observadas podría deberse al
azar). En el caso de la acumulación de PHB, el coeficiente de determinación fue R2 = 0,981
(i.e., sólo un 1,9% de las variaciones no pudo ser explicado por el modelo). Los valores del
coeficiente de determinación ajustado (R2ajustado) fueron 0,904 y 0,935 para biomasa y PHB,
respectivamente. Estos valores indican que el modelo no está ‘sobre-ajustado’ por el grado
del polinomio empleado (o dicho de otro modo, el modelo lineal ajusta adecuadamente). El
valor del estadístico Fsignificativo indicó que los resultados obtenidos a partir del modelo fueron
altamente significativos (P < 0,05) para ambas respuestas, con un valor F = 0,0001 (i.e.,
Pmodelo > F = 0,0001). En el caso del estadístico F (test de Fischer), calculado a partir de los
cuadrados medios del modelo y el error, se obtuvo un valor notablemente mayor al valor de
Fcrítico obtenido de tablas para esta distribución (con un nivel de significación del 95%, con 5
grados de libertad). Como se demuestra por análisis estadístico del modelo aplicado, 3
variables tuvieron un efecto significativo (P < 0,05, marcadas en negrita en las ecuaciones
precedentes): concentración de glicerol y de CAS; y tamaño del inóculo. También puede
observarse en las ecuaciones que los factores que poseen influencia significativa sobre las
variables dependientes muestran coeficientes mayores (β0 y βi) en comparación a los
parámetros restantes.
7.5.2.2. Diseños de optimización de Box-Wilson
Los 3 factores significativos seleccionados en esta primera etapa (los cuales, a su vez,
presentan relevancia desde el punto de vista del proceso industrial a mayor escala) se
optimizaron utilizando un diseño central compuesto direccionable (diseño de Box-Wilson)
con el objetivo de maximizar la síntesis de PHB. El diseño elegido resulta apropiado cuando
el número de factores a optimizar comprende entre 2 y 4 variables [Box y Wilson, 1951]. El
modelo experimental incluye un diseño factorial con 2 niveles codificados para cada variable,
más la cantidad necesaria de puntos (dependiendo del número de factores) para estimar la
curvatura e interacción de los parámetros en estudio en el rango de valores adoptado por cada
uno. Para el análisis de los resultados obtenidos y la optimización se utilizó la metodología de
superficies de respuesta obtenidas por análisis de regresión múltiple. Esta metodología tiene
como objetivos: i) estudiar efectos previamente observados o supuestos (e.g., interacciones),
ii) estimar la curvatura o efectos cuadráticos, y iii) determinar en forma cuantitativa los
valores más apropiados para los parámetros en estudio de modo de maximizar la respuesta.
El diseño central compuesto para 3 parámetros y 5 niveles involucra 14 ensayos (8
correspondientes al bloque factorial 23 y 6 a los puntos externos de estimación de curvatura),
a los que se suman 6 réplicas del punto central para estimar la incertidumbre intrínseca del
método. Para k factores, los 2×k tratamientos adicionales se denominan puntos axiales
182
(estimación de curvatura), y los ensayos en los cuales los factores se mantienen a nivel 0
(cero) son los puntos centrales. Para 3 factores, las coordenadas de los puntos axiales de los
ejes del factor codificado son (±α,0,0), (0,±α,0), y (0,0,±α). Dependiendo de la elección del
parámetro α en dichos puntos experimentales, el diseño central compuesto puede tener
distintas características como rotabilidad, ortogonalidad, y uniformidad. La propiedad
deseable del diseño de Box-Wilson es la rotabilidad [Kennedy y Krouse, 1999]; i.e, varianza
de los valores estimados constante en puntos equidistantes al centro del diseño. Esto se logra
estableciendo α = (2 k)1/4; i.e., el valor de α para un diseño central compuesto con 3 factores es
α = 1,682. Los niveles de las variables estudiadas y el desarrollo del diseño experimental de
optimización se muestran en las Tablas 7.5 y 7.6. La Tabla 7.6 también muestra los valores
predichos para la concentración de PHB en cada uno de los experimentos del diseño.
Factor (g · l-1)
Glicerol
CAS
Inóculo
–α
3,18
0,00
0,24
–1
10,00
0,75
0,75
0
20,00
1,85
1,50
+1
30,00
2,95
2,25
+α
36,82
3,71
2,76
Tabla 7.5. Variables analizadas y sus correspondientes rangos codificados y reales para el
diseño de optimización de Box-Wilson.
Exp.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
Glicerol
CAS
Inóculo
–1
–1
–1
–1
+1
+1
+1
+1
–α
+α
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
–1
–1
+1
+1
–1
–1
+1
+1
0
0
–α
+α
0
0
0
0
0
0
0
0
–1
+1
–1
+1
–1
+1
–1
+1
0
0
0
0
–α
+α
0
0
0
0
0
0
PHB (g · l-1)
Experimental
Predicho
1,67 ± 0,15
1,694
1,69 ± 0,09
1,544
1,55 ± 0,13
1,598
2,09 ± 0,11
1,948
1,93 ± 0,17
1,981
2,81 ± 0,38
2,666
1,25 ± 0,15
1,301
2,61 ± 0,31
2,486
0,74 ± 0,05
0,819
1,45 ± 0,16
1,512
2,44 ± 0,23
2,518
2,22 ± 0,29
2,285
2,09 ± 0,18
1,946
2,53 ± 0,26
2,817
3,29 ± 0,33
3,321
3,25 ± 0,27
3,321
3,35 ± 0,32
3,321
3,33 ± 0,29
3,321
3,39 ± 0,35
3,321
3,31 ± 0,38
3,321
Tabla 7.6. Diseño de optimización de Box-Wilson para acumulación de PHB por E. coli
CT1061/pJP24K. Además de los valores experimentales, se muestra en la última columna el
valor predicho para la concentración de PHB. El valor de α = 1,682 se eligió para asegurar la
rotabilidad del diseño de optimización. Los datos representan el valor medio ± desviación
estándar de mediciones efectuadas por duplicado en tres experimentos independientes. Exp.,
experimento; CAS, casaminoácidos.
183
En este caso, los resultados experimentales fueron interpretados a través de un modelo
de segundo orden, el cual considera todas las posibles interacciones entre los factores, así
como los términos cuadráticos. Este modelo resultó ser adecuado con un nivel de confianza
del 95% según ANOVA, test F de Fischer (datos no mostrados), y R2 = 0,979. El análisis de
regresión múltiple, a su vez, arrojó los resultados que se muestran en la Tabla 7.7, en la cual
se incluyen también los resultados del test t de Student, y los correspondientes valores del
estadístico P. La ecuación que representa al modelo, en la cual se han incluido solamente los
parámetros significativos, resultó adecuada para interpretar las variaciones en la
concentración de PHB como función de los valores codificados de la concentración de
glicerol (G), CAS (C), y tamaño del inóculo (I):
PHB (g · l-1) = 3,321 + 0,206×G + 0,259×I – 0,762×G2 – 0,325×C2 – 0,322×I2 – 0,146×G×C
+ 0,209×G×I
Término
Intercepto
Glicerol
CAS
Inóculo
Glicerol × glicerol
CAS × CAS
Inóculo × inóculo
Glicerol × CAS
Glicerol × inóculo
CAS × inóculo
Coeficiente de
regresión
3,321
0,206
–0,069
0,259
–0,762
–0,325
–0,332
–0,146
0,209
0,125
Error estándar
0,081
0,044
0,044
0,044
0,046
0,046
0,046
0,058
0,058
0,058
Valor t
30,889
4,681
–1,588
5,879
–3,668
–7,104
–7,263
–2,546
3,629
2,175
Valor P
<0,0001 **
0,0016 **
0,1513 §
0,0003 **
0,0043 *
0,0001 **
0,0018 **
0,0344 *
0,0067 **
0,0613 §
Tabla 7.7. Análisis estadístico del diseño de optimización. Los niveles de significancia se
codificaron de la siguiente manera: § no significativo; * significativo con P < 0,05; **
significativo con P < 0,01. CAS, casaminoácidos.
Como puede observarse, todos los términos cuadráticos fueron significativos, así
como las interacciones que involucran glicerol. Los gráficos de superficies de respuesta
descriptos por el modelo fueron construidos a partir de las combinaciones de los pares de
factores, manteniendo el tercer factor a nivel cero, para ilustrar los efectos principales de las
variables y sus efectos interactivos sobre la síntesis de PHB (Fig. 7.1). La naturaleza elíptica
de los gráficos de contorno indica que las interacciones entre las variables independientes
fueron significativas (Fig. 7.1., A y B). En todos los casos, la concentración máxima de PHB
quedó circunscripta a la región experimental analizada.
184
B
4
-1
PHB (g · l )
3
2
1
4
3
2
1
Ni
ve
ld
eC
AS
0
1
0
-2
-1
-1
0
Nive
l de
1
-2
glice
rol 2
2
0
1
0
-2
-1
-1
Nive 0
l de
1
-2
glice
r ol 2
2
de Niv
in el
óc
ul
o
-1
PHB (g · l )
A
C
3,44
3
2,88
2
2,31
1
1,75
1
CAS
-1
2 -2
0
1
2
Ni
ve
l
óc de
ul
o
0
-2 -1
Nive 0
l de
1,18
0,63
0,06
in
-1
PHB (g · l )
4
Fig. 7.1. Análisis de superficies de respuesta para el diseño de optimización de BoxWilson. Se grafica la concentración de PHB sintetizada por E. coli CT1061/pJP24K como
función del nivel codificado de los pares de variables independientes anteriormente
seleccionadas. Los gráficos de contorno se muestran en la parte inferior de cada superficie de
respuesta (i.e., z = 0). La escala de grises muestra los niveles de concentración de PHB (en g ·
l-1). CAS, casaminoácidos.
El análisis gráfico de las superficies de respuesta (Fig. 7.1) permite observar que la
concentración de PHB obtenida a través de las distintas combinaciones posibles entre los
parámetros conduce a valores de respuesta mayores conforme se consideran puntos más
internos del espacio experimental. Esto permite suponer la existencia de una combinación
óptima de los parámetros que maximiza la acumulación de PHB. Para obtener dicha
combinación óptima de valores codificados es necesario hallar el máximo de la función
cuadrática que interpreta las respuestas. Este máximo corresponde a los valores codificados
para los cuales el gradiente de la función escalar de respuesta Fr se anula (i.e., ∇Fr = 0). En
este caso, los términos cuadráticos tuvieron valores estimados negativos (i.e., βii < 0). Esto
implica que el laplaciano de la función escalar (∇2Fr) es negativo, lo cual indica que la
combinación de valores que anula el gradiente corresponde a un máximo de la función.
185
Analíticamente, la solución se obtuvo por eliminación de Gauss y sustitución inversa
del sistema de ecuaciones lineales inhomogéneo, resultante de efectuar las derivadas parciales
de F respecto a cada parámetro. El análisis canónico del modelo reveló que el punto
estacionario de las superficies de respuesta corresponde a G = 0,2019; C = –0,0671; e I =
0,4404. Como se mencionó, dicho punto estacionario representa un máximo de las superficies
de respuesta. Los valores reales para las variables independientes que corresponden a dicho
punto estacionario son glicerol 22,02 g · l-1; CAS 1,78 g · l-1; e inóculo 1,83 g · l-1. En dichas
condiciones, el modelo predice una respuesta máxima de 3,4012 g · l-1 para la concentración
de PHB. Para validar el modelo se llevaron a cabo cultivos en frascos agitados en condiciones
microaeróbicas optimizadas, obteniéndose una concentración de PHB de 3,35 ± 0,26 g · l-1 (N
= 4). La correlación entre la respuesta predicha y la respuesta experimental evidenció la
adecuación del modelo elegido.
7.5.3. Comparación entre glicerol y glucosa como posibles fuentes
carbonadas en condiciones optimizadas para la síntesis de PHB
Con el objetivo de continuar estudiando la acumulación microaeróbica de PHB por E.
coli CT1061/pJP24K, se decidió comparar la síntesis del polímero en frascos agitados
utilizando glicerol o glucosa (utilizando el contenido molar de carbono óptimo hallado
durante la etapa de optimización; i.e., 720 mM de átomos de carbono). Las condiciones de
cultivo restantes se mantuvieron en los niveles óptimos hallados durante la etapa de diseños
experimentales estadísticos. El mayor crecimiento y acumulación de polímero se registraron
cuando la fuente carbonada fue glicerol (8,26 ± 0,97 g · l-1 biomasa y 41 ± 8%,
respectivamente), en comparación con glucosa (6,38 ± 0,22 g · l-1 biomasa y 36 ± 7%). Esta
diferencia puede deberse a las características redox de cada sustrato, dado que el glicerol
provee el doble de equivalentes de reducción comparado con la glucosa cuando es
fermentado por E. coli en ausencia de oxígeno. Resultados adicionales mostraron que la
acumulación de PHB se ve favorecida en condiciones microaeróbicas cuando se utiliza
glicerol como sustrato carbonado, mientras que el máximo contenido de polímero en
aerobiosis tiene lugar cuando se usa glucosa como fuente de carbono (datos no mostrados).
Carlson et al. [2005] observaron que una cepa recombinante de E. coli DH5α, la cual
expresa los genes pha de C. necator, fue capaz de acumular hasta un 50% de PHB respecto a
biomasa en condiciones anaeróbicas cuando se cultivó en un medio de cultivo complejo. Aún
cuando la cepa utilizada por los autores no contiene mutaciones redox, en dicho trabajo
también se reportó un aumento en la síntesis de etanol y una disminución en la secreción de
acetato en condiciones de acumulación de PHB. Estas observaciones ponen de manifiesto la
importancia potencial de la síntesis de co-productos de valor agregado durante el proceso
conducente a la producción de PHB. En un estudio reciente, Wei et al. [2009] analizaron la
utilización de distintos promotores de E. coli activos en condiciones anaeróbicas para dirigir
la expresión heteróloga de los genes pha de C. necator. En dicho trabajo se obtuvieron
niveles de acumulación de PHB de ca. 64% respecto a biomasa en cultivos anaeróbicos en
medio rico con glucosa como principal sustrato carbonado. La cepa de E. coli utilizada fue
una mutante Δpta (fosfotransacetilasa), que presenta una disminución en la síntesis de
acetato; y la expresión de los genes pha estuvo bajo el control del promotor de adhE.
186
7.5.4. Análisis de la acumulación de PHB en condiciones optimizadas en
cultivos en lote en biorreactor
Conc. biomasa
Conc. PHB
Contenido de PHB
-1
8
50
40
6
30
4
20
2
10
0
0
0
8
16 24 32
Tiempo (h)
40
Contenido de PHB (%)
Biomasa, PHB (g · l )
En la etapa siguiente al diseño de un medio de cultivo adecuado para la síntesis de
PHB a partir de glicerol se llevaron a cabo cultivos en biorreactor en las condiciones
optimizadas estadísticamente (Fig. 7.2). E. coli CT1061/pJP24K creció con una velocidad
específica de crecimiento μ = 0,63 ± 0,03 h-1. Esta velocidad de crecimiento resultó mayor a
la observada en condiciones similares para E. coli CT1061 [cf. Capítulo VI]. Resulta
interesante especular que la presencia de una vía biosintética que consume equivalentes de
reducción, como la vía de síntesis de PHB, podría contribuir al crecimiento de E. coli en
condiciones de baja disponibilidad de oxígeno. El papel del polímero como captador de
equivalentes de reducción sería aún más relevante cuando se utiliza una fuente de carbono de
alto grado de reducción como el glicerol. Por otra parte, y tal como puede observarse en la
Fig. 7.2, luego de 48 h las concentraciones de biomasa y PHB fueron de 8,37 y 3,52 g · l-1,
respectivamente (lo cual implica un contenido de PHB en biomasa de 42%). Este resultado es
similar al obtenido en relación a la acumulación de PHB en frascos agitados en etapas
anteriores. Por otro lado, el rendimiento de PHB respecto de sustrato carbonado fue
YPHB/Glicerol = 0,21 g · g-1.
48
Fig. 7.2. Perfiles de la concentración de biomasa, PHB, y porcentaje de acumulación de
polímero para cultivos en lote de E. coli CT1061/pJP24K crecida en condiciones optimizadas
utilizando glicerol como principal sustrato carbonado. Conc., concentración.
Otro aspecto considerado en el análisis metabólico de los cultivos fue la
concentración de metabolitos de secreción, lo cual provee información adicional acerca del
estado redox celular. A las 48 h de cultivo, se detectaron concentraciones de acetato y de
etanol de 2,8 y 38,5 mM, respectivamente (cociente redox etanol/acetato = 13,8 ± 0,4). Esto
indicaría condiciones redox intracelulares reductoras [Sánchez et al., 2005].
187
7.5.5. Cultivos microaeróbicos en lote alimentado
Las mutantes redox de E. coli, como las que llevan mutaciones en arcA, presentan
características que las hacen adecuadas para la síntesis de bioproductos reducidos en distintas
condiciones de disponibilidad de oxígeno. Estas cepas podrían ser utilizadas en procesos en
los cuales las condiciones de aireación son diseñadas de modo de obtener rendimientos
compatibles con la comercialización del producto, y al mismo tiempo disminuir los costos
asociados con la aireación y agitación típicos de bioprocesos aeróbicos. Los cultivos en lote
alimentado son normalmente utilizados en procesos biotecnológicos aeróbicos, y existen
pocos ejemplos de la aplicación de este tipo de esquema de cultivo en condiciones de baja
disponibilidad de oxígeno o en anaerobiosis. Un aumento en la acumulación de biomasa
debida a la alimentación de glicerol durante el crecimiento debería correlacionar con una
mayor acumulación de PHB, y en consecuencia, con una mayor productividad volumétrica.
Existe escasa información en la literatura acerca de procesos en lote alimentado
llevados a cabo en microaerobiosis, y ninguno de ellos describe la síntesis de biocompuestos
en E. coli. La inducción del promotor nar (nitrate reductase regulation), que se expresa en
condiciones anaeróbicas cuando el ión nitrato puede actuar como aceptor de electrones, fue
estudiada en cultivos en lote alimentado en microaerobiosis para evaluar su aplicación en la
síntesis heteróloga de proteínas [Han et al., 1998]. En otro estudio, Chen et al. [2003]
analizaron condiciones de crecimiento similares para la síntesis de 1,3-propanodiol por
Klebsiella pneumoniae. Considerando estos antecedentes, otro abordaje considerado en este
capítulo fue el desarrollo de un bioproceso microaeróbico con alimentación de la fuente
carbonada, y con un suplemento de aire de 500 ml · min-1 (lo cual corresponde
aproximadamente a 0,15 volumen de aire · volumen de vaso -1 · min-1). Las condiciones
microaeróbicas fueron monitoreadas por mediciones polarimétricas de oxígeno disuelto en el
biorreactor, de tal manera que la concentración de oxígeno disuelto fue menor a 15%
(respecto de saturación de aire) durante todo el cultivo. La fase en lote del cultivo (i.e., previa
a comenzar la alimentación) fue desarrollada en las condiciones optimizadas descriptas en la
sección anterior, y luego se adicionó una solución concentrada de glicerol, CAS, y MgSO 4
(solución de alimentación) al biorreactor de manera de mantener una concentración de
glicerol mayor a 5 g · l-1.
La evolución de las concentraciones de biomasa y PHB, así como el contenido de
PHB, se muestran en la Fig. 7.3. Como se esperaba, durante la fase exponencial CT1061/
pJP24K creció con una mayor velocidad de crecimiento (siendo μ = 0,71 ± 0,02 h-1), y
sintetizó más PHB en comparación con los cultivos en lote sin suplemento de aire. Al final
del cultivo, las concentraciones de biomasa y de polímero fueron de 21,17 y 10,18 g · l-1,
respectivamente, lo cual implica un contenido de PHB de 51%. Aún cuando los cultivos en
lote alimentado tuvieron una duración de 60 h, la productividad volumétrica total fue 2,57
veces mayor que la obtenida en los cultivos en lote de 48 h (0,18 y 0,07 g · l-1 · h-1,
respectivamente). En este caso, las concentraciones extracelulares de acetato y etanol fueron
de 3,9 y 64,7 mM. Esto implica un cociente redox etanol/acetato = 16,6 ± 0,8. Este valor es
un 20% mayor que el obtenido para los cultivos en lote, sugiriendo que en estas condiciones
se favorecería un ambiente redox intracelular altamente reductor.
188
-1
Conc. biomasa
Conc. PHB
Contenido de PHB
20
60
50
15
40
10
30
5
20
10
0
0
12
24
36
Tiempo (h)
48
60
Contenido de PHB (%)
Biomasa, PHB (g · l )
25
0
Fig. 7.3. Perfiles de la concentración de biomasa, PHB, y porcentaje de acumulación de
polímero para cultivos de E. coli CT1061/pJP24K en lote alimentado bajo condiciones
optimizadas utilizando glicerol como principal sustrato carbonado. Conc., concentración.
En la mayoría de los procesos biotecnológicos conducentes a la síntesis de PHB, se
requiere de grandes cantidades de energía para la generación del vapor utilizado en la
esterilización de los biorreactores, aireación y agitación durante el proceso productivo
propiamente dicho, y durante el procesamiento ‘aguas abajo’, el cual implica separación de la
biomasa del medio de cultivo, seguida de la extracción y purificación del PHB [Ackerman y
Babel, 1998]. Si bien se han planteado algunas estrategias para disminuir los costos asociados
con la energía consumida durante el procesamiento ‘aguas abajo’ [Nonato et al., 2001;
Akiyama et al., 2003; Yu y Chen, 2006], ninguna de ellas ha sido completamente efectiva
para una reducción de costos adecuada. Por otra parte, se requiere de un mayor conocimiento
de la fisiología y metabolismo microbianos en relación a los procesos regulatorios globales
en condiciones de baja disponibilidad de oxígeno para el desarrollo de técnicas de cultivo
eficientes que permitan el desarrollo de estrategias energéticamente sostenibles.
En este capítulo se han descripto técnicas conducentes a la síntesis de PHB por E. coli
CT1061/pJP24K con el objetivo de maximizar la relación acumulación de PHB/consumo de
energía. Las estrategias de diseños experimentales estadísticos permitieron la selección de las
condiciones apropiadas para la síntesis de PHB utilizando un compuesto carbonado altamente
reducido como el glicerol. Booth [2005] ha sugerido la incapacidad de E. coli de utilizar
glicerol en forma anaeróbica en ausencia de aceptores externos de electrones. Sin embargo,
Dharmadi et al. [2006] demostraron que la producción de CO2 a partir de formiato a valores
ácidos de pH permite a E. coli asimilar glicerol en anaerobiosis. Este trabajo, y los resultados
presentados en las secciones precedentes, contribuyen a demostrar que la elección de cepas y
condiciones adecuadas permite el diseño de bioprocesos microaeróbicos utilizando glicerol
como principal sustrato carbonado.
189
En el Capítulo II se han discutido las características de la síntesis microaeróbica de
PHB por cepas recombinantes de E. coli utilizando glucosa como principal sustrato
carbonado. En dichos experimentos, a las 48 h de cultivo se obtuvieron concentraciones de
biomasa y PHB de 4,12 ± 0,21 y 1,44 ± 0,05 g · l-1, respectivamente. Los resultados
discutidos en la presente sección implican un incremento de ca. 2,3 veces en la concentración
de PHB. Al mismo tiempo, se observó un incremento en la síntesis de etanol, con la
reducción concomitante en la síntesis de acetato. Este fenómeno fue observado en los dos
esquemas de fermentación propuestos pero se evidenció especialmente en los cultivos en lote
alimentado, en los cuales se registró un aumento significativo en el cociente redox
etanol/acetato. Este cociente refleja el estado redox intracelular, y al mismo tiempo es un
indicador indirecto de la disponibilidad de poder reductor. Por este motivo, es esperable que
un incremento en dicho cociente tenga una correlación con el aumento en la síntesis de PHB,
dado que este bioproducto consume equivalentes de reducción en la forma de NADPH.
Tomados en conjunto, los resultados discutidos muestran que, con el objetivo de
desarrollar bioprocesos sostenibles para la síntesis de compuestos de interés biotecnológico,
es necesario llevar a cabo un estudio detallado de la fisiología del microorganismo de interés
en distintas condiciones de cultivo. De esta manera, y considerando la utilización de sustratos
de bajo costo (o incluso de costo negativo) en procesos biotecnológicos desarrollados en
microaerobiosis, la síntesis de PHB a gran escala podría convertirse en un proceso sostenible.
Ackerman, J. U., y W. Babel. 1998.
Approaches to increase the economy of the
PHB production. Polym. Degrad. Stab.
59:183-186.
Akiyama, M., T. Tsuge, y Y. Doi. 2003.
Environmental life cycle comparison of
polyhydroxyalkanoates produced from
renewable carbon resources by bacterial
fermentation. Polym. Degrad. Stab. 80:
183-194.
Ashby, R. D., D. K. Y. Solaiman, y T.
Foglia. 2004. Bacterial poly(hydroxyalkanoate) polymer production from the
biodiesel co-product stream. J. Polym.
Environ. 12:105-112.
Ashby, R. D., D. K. Y. Solaiman, y T.
Foglia. 2005. Synthesis of short-/mediumchain-length
poly(hydroxyalkanoate)
blends by mixed culture fermentation of
glycerol. Biomacromolecules 6:2106-2112.
Booth, I. 2005. Glycerol and methylglyoxal
metabolism. En F. C. Neidhardt, J. L.
and molecular biology (versión on-line).
Borman, E. J., y M. Roth. 1999. The
production of polyhydroxybutyrate by
Methylobacterium
rhodesianum
and
Ralstonia eutropha in media containing
glycerol
and
casein
hydrolysates.
Box, G. E. P., y K. B. Wilson. 1951. On the
experimental attainment of optimum
conditions. J. Roy. Stat. Soc. B 13:1-45.
Campbell, C. J., y J. H. Laherrère. 1998.
The end of cheap oil. Sci. Amer. 3:78-83.
Carlson, R., A. Wlaschin, y F. Srienc. 2005.
Kinetic studies and biochemical pathway
analysis of anaerobic poly-(R)-3-hydroxybutyric acid synthesis in Escherichia coli.
Appl. Environ. Microbiol. 71:713-720.
190
Chen, X., D. J. Zhang, W. T. Qi, S. J. Gao,
Z. L. Xiu, y P. Xu. 2003. Microbial fedbatch production of 1,3-propanediol by
Klebsiella pneumoniae under micro-aerobic
conditions. Appl. Microbiol. Biotechnol.
63:143-146.
da Silva, G. P., M. Mack, y J. Contiero.
2009. Glycerol: a promising and abundant
carbon source for industrial microbiology.
de Almeida, A., P. I. Nikel, A. M. Giordano,
y J. M. Pettinari. 2007. Effects of granuleassociated protein PhaP on glyceroldependent growth and polymer production
in
poly(3-hydroxybutyrate)-producing
73:7912-7916.
Dharmadi, Y., A. Murarka, y R. González.
2006. Anaerobic fermentation of glycerol
by Escherichia coli: a new platform for
metabolic engineering. Biotechnol. Bioeng.
94:821-829.
Fu, H. A., S. Iuchi, y E. C. C. Lin. 1991. The
requirement of ArcA and Fnr for peak
expression of the cyd operon in Escherichia
coli under microaerobic conditions. Mol.
Gen. Genet. 226:209-213.
D.C.
Gerngross, T. U. 1999. Can biotechnology
move us toward a sustainable society? Nat.
Gerngross, T. U., y S. C. Slater. 2000. How
green are green plastics? Sci. Am. 283:3641.
Gewin, V. 2006. Burst of energy. Nature 441:
810-811.
Grothe, E., M. Moo-Young, y Y. Chisti.
1999. Fermentation optimization for the
production of poly(3-hydroxybutyric acid)
microbial thermoplastic. Enzyme Microb.
Technol. 25:132-141.
Han, S. J., H. N. Chang, y J. Lee. 1998. Fedbatch cultivation of an oxygen-dependent
inducible promoter system, the nar
promoter in Escherichia coli with an
inactivated nar operon. Biotechnol. Bioeng.
59:400-406.
Harding, K. G., J. S. Dennis, H. von
Blottnitz, y S. T. L. Harrison. 2007.
Environmental
analysis
of
plastic
production
processes:
comparing
petroleum-based
polypropylene
and
polyethylene with biologically based polyβ-hydroxybutyric acid using life cycle
analysis. J. Biotechnol. 130:57-66.
Heinzle, E., A. Biwer, y C. Cooney. 2006.
Development of sustainable bioprocesses.
Modeling and assessment. John Wiley &
Sons Ltd., Wiltshire, Reino Unido.
Heyde, M. 1998. Ecological considerations on
the use and production of biosynthetic and
synthetic biodegradable polymers. Polym.
Degrad. Stab. 59:3-6.
Kennedy, M., y D. Krouse. 1999. Strategies
for improving fermentation medium
performance: a review. J. Ind. Microbiol.
Koller, M., R. Bona, G. Braunegg, C.
Hermann, P. Horvat, M. Kroutil, J.
Martinz, J. Neto, L. Pereira, y P. Varila.
2005. Production of polyhydroxyalkanoates
from agricultural waste and surplus
materials. Biomacromolecules 6:561-565.
Kurdikar, D., M. Paster, K. J. Gruys, L.
Fournet, T. U. Gerngross, S. C. Slater, y
R. Coulon. 2001. Greenhouse gas profile
of a plastic derived from a genetically
modified plant. J. Ind. Ecol. 4:107-122.
Gross, R. A., y B. Kalra. 2002. Biodegradable polymers for the environment.
Science 297:803-807.
191
Lee, S. Y., Y. K. Lee, y H. N. Chang. 1995.
Stimulatory effects of amino acids and
oleic acid on poly(3-hydroxybutyric acid)
synthesis by recombinant Escherichia coli.
J. Ferment. Bioeng. 79:177-180.
Technol. 98:2313-2320.
D.C.
Madden, L. A., A. J. Anderson, D. T. Shah,
y J. Asrar. 1999. Chain termination in
polyhydroxyalkanoate synthesis: involvement of exogenous hydroxy-compounds
as chain transfer agents. Int. J. Biol.
Macromol. 25:43-53.
McCoy, M. 2006. Glycerin surplus. Chem.
Eng. News 84:7.
Montgomery, D. C. 2001. Design and
analysis of experiments. Marcel Dekker,
New York.
Nikel, P. I., M. J. Pettinari, B. S. Méndez, y
M. A. Galvagno. 2005. Statistical
optimization of a culture medium for
biomass and poly(3-hydroxybutyrate)
production by a recombinant Escherichia
coli strain using agroindustrial byproducts.
Nonato, R. V., P. E. Mantelatto, y C. E. V.
Rossell. 2001. Integrated production of
biodegradable plastic, sugar and ethanol.
Washington, D.C.
Plackett, R. L., y J. P. Burman. 1946. The
design
of
optimum
multifactorial
experiments. Biometrika 33:305-325.
Chem. 280:15084-15096.
2005. Effect of different levels of NADH
availability on metabolic fluxes of
Escherichia coli chemostat cultures in
defined medium. J. Biotechnol. 117:395405.
Senior, P. J., y E. A. Dawes. 1971. Poly-βhydroxybutyrate biosynthesis and the
regulation of glucose metabolism in
Azotobacter beijerinckii. Biochem. J. 125:
55-66.
16:419-427.
Strobel, R., y G. Sullivan. 1999.
Experimental design for improvement of
fermentations, p. 80-93. En A. Demain y J.
Davies (ed.), Manual of industrial
microbiology and biotechnology. ASM
Press, Washington, D.C.
Patnaik, P. R. 2005. Perspectives in the
modeling and optimization of PHB
production by pure and mixed cultures.
Crit. Rev. Biotechnol. 25:153-171.
192
Wei, X. X., Z. Y. Shi, M. Q. Yuan, y G. Q.
Chen. 2009. Effect of anaerobic promoters
on the microaerobic production of polyhydroxybutyrate (PHB) in recombinant
Escherichia
coli.
Appl.
Microbiol.
Biotechnol. En prensa: DOI 10.1007/
s00253-00008-01816-00254.
Yazdani, S. S., y R. González. 2007.
Anaerobic fermentation of glycerol: a path
to economic viability for the biofuels
industry. Curr. Opin. Biotechnol. 18:213219.
Yu, J., y L. X. Chen. 2006. Cost-effective
recovery and purification of polyhydroxyalkanoates by selective dissolution of cell
mass. Biotechnol. Prog. 22:85-90.
Zeng, A. P., y W. D. Deckwer. 1996.
Bioreaction techniques under microaerobic
conditions: from molecular level to pilot
plant reactors. Chem. Eng. Sci. 51:23052314.
193
Capítulo VIII
Conclusiones y
perspectivas
Capítulo VIII – Conclusiones y perspectivas
8.1. Prefacio
Un mecanismo importante para la supervivencia bacteriana en un medio ambiente
cambiante es la capacidad de establecer una respuesta rápida que facilite el ajuste de la célula
procariota a nuevas condiciones. Normalmente, las condiciones de estrés ambiental y/o
físico-químico inducen o reprimen la expresión de genes a través de sistemas de regulación
global y/o específica con el objetivo general de lograr una adaptación adecuada a condiciones
de crecimiento adversas. En particular, las bacterias facultativas han desarrollado una gran
variedad de mecanismos regulatorios para responder a cambios en la concentración de
oxígeno. En Escherichia coli esta adaptación está mediada por el sistema de dos componentes
ArcAB y la proteína Fnr. La acción conjunta de Arc y Fnr permite la represión de las vías
metabólicas aeróbicas y la expresión de las vías fermentativas cuando se produce una
disminución en la concentración de oxígeno en el medio de cultivo. A su vez, el estrés por
hambreado de carbono también produce cambios importantes en la capacidad catabólica de
las células. A pesar de que no se conocen con exactitud los mecanismos de regulación que
actúan para responder a condiciones de limitación de la fuente de carbono, se ha sugerido que
el sistema de dos componentes CreBC de E. coli poseería un rol importante en la percepción
de las condiciones nutricionales y el catabolismo de carbono.
Los polihidroxialcanoatos bacterianos (PHAs) también juegan un rol importante en la
adaptación a condiciones de estrés ambiental en microorganismos productores naturales. Una
característica importante de estos biopolímeros es su capacidad de actuar como captadores de
electrones, ya que durante su biosíntesis se consumen equivalentes de reducción. Además de
su participación en la adaptación a condiciones de estrés ambiental, los PHAs presentan un
atractivo biotecnológico potencialmente interesante dado que se trata de plásticos
completamente biodegradables que pueden ser producidos a partir de recursos renovables.
Sin embargo, el diseño racional de una estrategia para la producción industrial de PHAs debe
considerar la sostenibilidad del bioproceso. En este sentido, una de las contribuciones
energéticas más significativas del proceso la constituye la aireación y agitación de los
fermentadores. Por tal motivo, la posibilidad de producir PHAs en condiciones de baja
disponibilidad de oxígeno en forma sostenible resultaría especialmente relevante desde el
punto de vista industrial.
Los estudios planteados en esta tesis contribuyen a aumentar el conocimiento básico
de la fisiología y metabolismo de un microorganismo (an)aerobio facultativo utilizado como
modelo en el laboratorio y en la industria, E. coli, en condiciones microaeróbicas. Al mismo
tiempo, los resultados obtenidos aportan información que puede ser empleada para el diseño
racional de estrategias tendientes a la producción sostenible de poli(3-hidroxibutirato) (PHB).
195
8.2. Conclusiones
Capítulo II: Evaluación de mutantes arcA para la acumulación heteróloga de
PHB en condiciones microaeróbicas
- El contexto metabólico de las mutantes arcA de E. coli está caracterizado por una
desregulación redox que se traduce en un aumento de la disponibilidad de NAD(P)H (Fig.
1.2). Esto se relacionaría con la mayor capacidad respiratoria de las mutantes arc.
- Como consecuencia del exceso de equivalentes de reducción, la síntesis de biocompuestos
reducidos capaces de captar NAD(P)H se encuentra favorecida. Este hecho se evidenció a
través de la expresión heteróloga de los genes pha de Azotobacter sp. cepa FA8 en las
mutantes arcA. En dichas mutantes se estimuló la acumulación de PHB en condiciones
microaeróbicas a niveles superiores a los observados en cepas ArcA+ (Tabla 2.4).
- Una mutante arcA generada por inserción de una secuencia de tipo Tn10 en el gen
(arcA::IS10-L) mostró características fenotípicas particulares y distintivas en relación a una
mutante ΔarcA. La mutante de inserción (E. coli CT1061) presentó una mayor capacidad
respiratoria, y fue capaz de crecer en un medio semi-sintético; mientras que las mutantes
ΔarcA (E. coli SP314 y CT1062) requirieron de aditivos nutricionales complejos para el
crecimiento. Como consecuencia de estas diferencias fenotípicas, la acumulación heteróloga
de PHB en cultivos microaeróbicos en fermentador también fue mayor en la mutante
arcA::IS10-L (35 ± 3%) en comparación con la obtenida en una cepa ΔarcA isogénica (27 ±
2%) (Tabla 2.5). Las diferencias observadas sugirieron la existencia de otra(s) mutación(es)
con capacidad para modular las respuestas metabólicas y redox.
Capítulo III: Análisis de las bases bioquímicas del fenotipo Dye en mutantes
arcA y supresión de la sensibilidad a colorantes redox por expresión
heteróloga de los genes pha
- La sensibilidad de las mutantes arc al azul de toluidina se debería a la generación de un
exceso de especies reactivas de oxígeno (EROs) como consecuencia de la elevada capacidad
respiratoria observada en estas mutantes.
- La expresión heteróloga de los genes pha determina la acumulación de un polímero
altamente reducido, PHB, el cual actúa como captador de equivalentes de reducción. En
virtud de que el polímero jugaría un papel detoxificante como sumidero de electrones, la
acumulación de PHB fue capaz de suprimir el fenotipo Dye (Fig. 3.1), disminuyendo
significativamente la acumulación de EROs (Fig. 3.2).
Capítulo IV: Estudio de aspectos fisiológicos y metabólicos de mutantes arc y
cre
- El alelo arcA::IS10-L en E. coli CT1061 da lugar a una proteína ArcA truncada (Fig. 4.2).
El análisis in silico de la misma muestra que no presenta sitios de unión al ADN, lo cual
sugiere que esta forma truncada de ArcA no poseería propiedades regulatorias significativas.
- Existe una mutación constitutiva en el gen creC en E. coli CT1061. El alelo creC(Con) fue
transferido durante la construcción de la cepa por transducción generalizada mediada por el
bacteriófago P1. Esta mutación también está presente en cepas parentales de la cepa dadora
utilizada para la transducción, y HfrH sería la primera en dicha genealogía. La presencia de
196
creC(Con) en las cepas en estudio pudo ser reconocida por secuenciación del locus cre y en
forma cualitativa por medición de la actividad de la enzima acetato quinasa (Tabla 4.2).
- La presencia de la mencionada mutación en creC permitiría a E. coli CT1061 crecer en un
medio semi-sintético, dado que confiere una elevada capacidad catabólica a la cepa. Este
aumento en el catabolismo de carbono se ve especialmente evidenciado en el consumo de
sustrato carbonado (Tabla 4.3) y en la capacidad respiratoria (Fig. 4.5). Las diferencias en la
capacidad respiratoria no se deberían a una modulación en el contenido de oxidasas
terminales, dado que este parámetro pareció estar controlado predominantemente por ArcA
(Tabla 4.4).
- La mutación constitutiva en creC fue capaz de suprimir el fenotipo Dye característico de
mutantes arcA (Fig. 4.4). Esta supresión del fenotipo de sensibilidad a colorantes redox se
debería a un fenómeno similar al que tiene lugar durante la acumulación heteróloga de PHB.
La presencia del alelo creC(Con) determinaría una mayor disponibilidad de esqueletos
carbonados, los cuales podrían actuar como detoxificantes captando electrones y dando lugar
a la síntesis de metabolitos reducidos (Fig. 4.6).
Capítulo V: Análisis de flujos metabólicos de mutantes arcA y creB
- Existe una regulación de las vías catabólicas centrales cuyo control está compartido por los
sistemas ArcAB y CreBC. Dicho control resultaría especialmente evidente en condiciones
microaeróbicas de crecimiento en limitación de la fuente de carbono, y en algunas de las
reacciones bioquímicas estudiadas presentaría carácter aditivo.
- Las mutantes creB presentaron un mayor rendimiento de biomasa respecto de sustrato
carbonado (Tabla 5.2), lo cual podría evidenciar la existencia de un mecanismo complejo de
regulación en la distribución de esqueletos carbonados mediado por CreBC.
- La mutación de creB dio lugar a una disminución generalizada en los flujos catabólicos
centrales (Tabla 5.3 y Fig. 5.1).
- En las mutantes arcA existe una regulación en algunos flujos catabólicos (como la reacción
catalizada por el complejo piruvato deshidrogenasa y la síntesis de etanol por la enzima
alcohol deshidrogenasa) mediada por el estado redox intracelular. En ausencia del regulador
ArcA se registró un incremento significativo del cociente molar etanol/acetato (Tabla 5.2), lo
cual reflejaría una mayor disponibilidad de poder reductor. El exceso de equivalentes de
reducción sería captado en la síntesis de lactato.
- En las mutantes creB existiría una acumulación intracelular de piruvato y acetil-coenzima A
como consecuencia de la disminución en los flujos catabólicos. En particular, y dado que la
mantención del catabolismo de piruvato es conditio sine qua non para continuar el
crecimiento activo, sería posible que el exceso de este intermediario fuese captado como
componente precursor de la biomasa. El aumento en el rendimiento de biomasa respecto a
glucosa está en concordancia con la hipótesis expuesta.
- En todas las mutantes analizadas se observó una disminución significativa en los flujos a
través del ciclo de ácidos tricarboxílicos. Sin embargo, la secuencia de reacciones conservó el
carácter cíclico (Fig. 5.1) en lugar de las dos bifurcaciones (una rama oxidativa y una
oxidativa) propuestas en la literatura para condiciones de baja disponibilidad de oxígeno. El
ciclo del glioxilato presentó actividad solamente en la cepa salvaje y en la cepa arcA, en las
cuales, además, se registró excreción de succinato significativa.
197
Capítulo VI: Evaluación de cultivos microaeróbicos de mutantes arc y cre
utilizando glicerol como fuente de carbono principal
- El aumento en la capacidad catabólica conferido por el alelo creC(Con) se reflejó en un
elevado consumo de glicerol por E. coli CT1061 en cultivos microaeróbicos (Tabla 6.1).
Asimismo, se registró un aumento significativo en la velocidad de crecimiento y en el
rendimiento de biomasa respecto al sustrato carbonado en esta mutante en comparación con
la cepa salvaje y una cepa isogénica ΔarcA.
- El perfil metabólico obtenido en condiciones microaeróbicas a partir de glicerol mostró que,
en comparación a lo observado en presencia de glucosa, se favorece la síntesis de metabolitos
de fermentación reducidos. Este fenómeno podría reflejar una mayor síntesis de equivalentes
de reducción durante el catabolismo de glicerol y la ya mencionada desregulación redox
mediada por las mutaciones en arc. La tendencia hacia la síntesis de metabolitos de alto
grado de reducción también se pudo relacionar con la presencia del alelo creC(Con), ya que
E. coli CT1061 presentó la mayor tasa de síntesis de etanol en comparación con las cepas
restantes (Fig. 6.2).
- La disponibilidad de poder reductor como consecuencia de las mutaciones en arcA y la
utilización de glicerol como principal sustrato carbonado permitieron la síntesis de etanol por
E. coli CT1061 y CT1062 aún en condiciones aeróbicas de crecimiento (Tabla 6.3).
- Las tendencias observadas en la síntesis de etanol correlacionaron en forma directa con la
disponibilidad intracelular de NADH y el cociente NADH/NAD+ (Tabla 6.4).
Capítulo VII: Diseño de un bioproceso para la producción microaeróbica de
PHB a partir de glicerol como sustrato carbonado principal
- Los casaminoácidos necesarios para el crecimiento microaeróbico y acumulación de PHB
por E. coli CT1061/pJP24K poseerían un efecto de modulación redox, además del aporte
nutricional intrínseco que implica su adición a los medios de cultivo (Tabla 7.1).
- La metodología de los diseños experimentales estadísticos permitió la selección de tres
factores con influencia significativa sobre la síntesis de PHB (concentración de glicerol, de
casaminoácidos, y tamaño del inóculo). La optimización del proceso en frascos agitados
determinó un aumento de ca. 2,7 veces en la concentración del polímero.
- En las condiciones optimizadas se obtuvo un rendimiento de polímero respecto a biomasa
significativamente mayor cuando se utilizó glicerol como sustrato carbonado en lugar de
glucosa. Esto podría deberse a una mayor disponibilidad de equivalentes de reducción
(sustrato necesario para la acumulación de PHB), derivada del catabolismo de glicerol.
- La evaluación de las condiciones óptimas para la síntesis de PHB en cultivos en biorreactor
permitió un aumento en las concentraciones de biomasa y de polímero. En los cultivos en lote
se obtuvo un porcentaje de acumulación similar al observado en frascos agitados (Fig. 7.2).
La implementación de cultivos microaeróbicos en lote alimentado permitió aumentar las
concentraciones de biomasa y polímero (Fig. 7.3), así como el porcentaje de acumulación
(ca. 1,2 veces). A su vez, la productividad volumétrica del proceso en lote alimentado fue ca.
2,6 veces mayor que la observada para los cultivos en lote. Considerando estos resultados en
conjunto, puede concluirse que el desarrollo de un bioproceso microaeróbico en la modalidad
de lote alimentado podría contribuir a la sostenibilidad de la producción de PHAs,
disminuyendo el costo energético asociado a la aireación y agitación de los biorreactores.
198
8.3. Perspectivas
El análisis de las características fenotípicas de las mutantes arc y cre de E. coli se
tradujo en información importante desde el punto de vista del conocimiento básico de la
fisiología y metabolismo de este microorganismo modelo, y potencialmente valiosa para la
implementación de procesos biotecnológicos basados en dichas mutantes. Dado el efecto
pleiotrópico de las mutaciones en genes que codifican reguladores globales, existen diversos
aspectos aún no explorados cuyo estudio resultaría interesante para ampliar el conocimiento
de la regulación ejercida por ArcAB y CreBC. Por este motivo, a continuación se proponen
algunos experimentos complementarios que permitirían extender y completar los resultados
hasta aquí discutidos.
- Estudio cuantitativo del nivel de expresión de diversos genes regulados por los sistemas
ArcAB y/o CreBC empleando ensayos de RT (transcriptasa reversa)-PCR y microarreglos de
ADN, y comparación de dichos resultados con los obtenidos a través del análisis fenotípico
de flujos metabólicos (Capítulo V). Estos estudios contribuirían a comprender el nivel al cual
actúa la regulación mediada por ArcAB y CreBC. También resultaría interesante analizar el
flujoma de E. coli CT1061, para cuantificar y comprender en mayor profundidad cómo se
modifican los flujos catabólicos por la presencia del alelo creC(Con).
- Análisis de la re-distribución de flujos metabólicos en mutantes creB como consecuencia de
mutaciones en genes que codifican enzimas del catabolismo de piruvato; en particular pflB
(piruvato-formiato liasa), componentes del complejo piruvato deshidrogenasa, y pepc
(fosfoenolpiruvato carboxilasa). Los resultados de este estudio proveerían información
interesante acerca de la regulación del metabolismo de carbono en el nodo a nivel de piruvato
por CreBC, dado que en este punto se observaron las diferencias más significativas durante el
análisis de flujos metabólicos de mutantes ΔcreB.
- Escalado del bioproceso microaeróbico para la producción de PHB en fermentadores a
escala piloto, utilizando un criterio de escalado adecuado. Análisis cuantitativo del impacto
del ahorro en el costo energético sobre el costo de producción de PHAs.
- Evaluación de la aplicabilidad de mutantes arc y cre para la síntesis heteróloga de proteínas
recombinantes de interés industrial. Este aspecto resultaría particularmente promisorio dado
que ambos reguladores poseen roles importantes en el balance redox y la distribución de
carbono. Estos dos parámetros son aspectos clave de la mayoría de los bioprocesos
industriales diseñados para la síntesis heteróloga de biomoléculas, y podrían modularse a
través de la manipulación de los correspondientes reguladores globales.
199

Aspectos fisiológicos y moleculares de la acumulación heteróloga

Transcription

Similar documents

comunicacion integral y sinergia

Estudios Infantiles #1

CARACTERIZACIÓN DE CEPAS DE Escherichia coli DE

Sobre el papel del sistema SOS, la - Biblos

Numero 15 - Revista Anfora

Manual de Procedimientos para E. coli O157 en muestras de

Reporte Anual que se presenta de acuerdo con

Boletin Informativo de Amphibian Ark

El Arca de los Anfibios Campaña