sod1

Sclerosi laterale amiotrofica (SLA)
Descritta per la prima volta nel
1860 dal neurologo francese
Jean-Martin Charcot
Jean-Martin Charcot
sclerosi = "indurimento”
laterale = riferito alla zona del
midollo spinale che manifesta
le prime alterazioni
amiotrofica = a (negazione) +
mio ("muscolo") + trofico
("nutrimento") : i muscoli del
malato si atrofizzano per un
“nutrimento insufficiente”
CLINICA
• Esordio : spinale - debolezza ad uno o più arti (di solito
laterale), fascicolazioni, o bulbare – difficoltà di parola e di
deglutizione
• Paralisi progressiva dovuta alla degenerazione dei
motoneuroni (è anche detta malattia dei motoneuroni)
spinali e corticali, ad eccezione di quelli oculomotori e del
nucleo di Onuf.
• Perdita progressiva e irreversibile della capacità di
deglutizione (disfagia), dell'articolazione della parola
(disartria) e del controllo dei muscoli scheletrici, fino alla
compromissione dei muscoli respiratori e alla morte.
• La SLA non altera funzioni sensoriali, sessuali e sfinteriali
del malato. Le funzioni cognitive sono compromesse solo in
una piccola percentuale dei casi (demenza frontotemporale).
Molte delle malattie neurodegenerative presentano entrambe
le classi di sintomi in qualche momento nel corso della
progressione della malattia
Due tipi principali di sintomi clinici
DEMENZE:
disordini cognitivi, associativi, caratteriali e di memoria
DISORDINI DEL MOVIMENTO:
Ipercinesia, acinesia, paralisi
Le manifestazioni cliniche dipendono dai sistemi neuronali
coinvolti nel corso della malattia
TERAPIA
Non esistono terapie in grado di arrestare il decorso della
malattia.
Terapie sintomatiche per fascicolazioni, crampi, effetto
pseudobulbare (attacchi di riso o pianto incontrollati),
ansia, depressione.
Terapia di supporto per
• insufficiente deglutizione/alimentazione (fino a PEG)
• insufficiente ventilazione (respiratore, fino a
tracheotomia)
Unico farmaco approvato : riluzolo (estende la vita in media
di 3 mesi in una parte dei pazienti).
EPIDEMIOLOGIA
La SLA è la malattia del motoneurone più comune.
• Età media di esordio : ~ 50 anni (+ forme giovanili)
• Durata media : 3-4 anni
• Incidenza : 2-8 / 100.000 ( come Sclerosi Multipla)
FATTORI DI RISCHIO EPIDEMIOLOGICI
•
•
•
•
•
•
•
Età
Sesso maschile (lieve prevalenza)
Pratica agonistica (calcio)
Traumi cranici (?)
Esposizione a tossici (metalli) (?)
Fumo (?)
Familiarità
– 10-20% dei casi la malattia è trasmessa in modalità
Aut/Dom (raramente Aut/Rec) a penetranza completa
(tutte le generazioni sono colpite)
Simone Beretta, Maria Teresa Carrì,
Ettore Beghi, Adriano Chiò, and Carlo
Ferrarese
Putting the boot in: soccer linked to ALS?
THE LANCET Neurology Vol 2 November 2003
CNS
Brain
Spinal cord
(anterior horns)
Prosencephalon
Brain stem
Telencephalon
Diencephalon
Mesencephalon
Rhinencephalon,
Amygdala,
Hippocampus,
Neocortex, Basal
ganglia, Lateral
ventricles
Epithalamus,
Thalamus,
Hypothalamus,
Subthalamus,
Pituitary gland,
Pineal gland,
Third ventricle
Tectum, Cerebral
peduncle, Pretectum,
Mesencephalic duct
Rhombencephalon
Metencephalon
Pons,
Cerebellum
Myelencephalon
Medulla
oblongata
ISTOPATOLOGIA
1. Neurodegenerazione di regioni cerebrali
specifiche – perdita 1° e 2° motoneurone
• Midollo spinale (corna anteriori)
• Corteccia cerebrale (lobo frontale, temporale e
parietale)
In stadi avanzati : proliferazione astrocitaria e attivazione
microgliale (neuroinfiammazione)
Degenerazione muscolare :
Dying back o dying forward ?
9
Sclerosi laterale amiotrofica:
la malattia del motoneurone, ma non solo
Motoneurone “sano”
Motoneurone in degenerazione
La malattia del motoneurone
(ma non solo)
La SLA è una patologia multifattoriale
Stress Ossidativo
Aggregazione
Proteica
Eccitotossicità
Neuroinfiammazione
Fattori Genetici
SLA
Deficit di
Fattori
Neurotrofici
Alterazione del
Trasporto Assonale
Processamento
dell’mRNA
2. Presenza di depositi proteici intracellulari
Simili a corpi di
Lewy o skineinlike.
Positivi per
ubiquitina – NON
amiloidi
Fattori genetici associati alla SLA familiare
SOD1
2008
unknown
unknown SOD1TDP43
FUS
C9ORF72
20092012
“La SLA sporadica e la SLA familiare, benchè
presentino una certa
eterogeneità di manifestazione,
sono clinicamente indistinguibili”
Modelli di SLA associata alla
espressione di SOD1 mutante
Experimental models for the
study of SOD1-linked FALS
C
O
M
P
L
E
X
I
T
Y
• Recombinant proteins
• Saccharomyces cerevisiae
• Transfected mouse cell lines
• Transfected human cell lines
• Transgenic Drosophila melanogaster flies
• Zebrafish
• Transgenic mice/rats
Every model has pros and cons….
SOD1 and FALS
• About 20% of FALS patients carry point mutations in
the gene sod1.
• More than 140 different mutations in sod1 have been
described in FALS families.
• Mutations of critical residues alter metal binding
ability and/or protein stability, conferring a new function.
wtSOD1
fALS-SOD1 G37R
Oxidative damage markers found
in ALS spinal cord
> Free protein carbonyls
> Lipid peroxidation adducts
> Mitochondrial DNA oxidation adducts
> Nuclear DNA oxidation adducts
> Cytoplasmatic RNA oxidation adducts
> Protein nitration
2
H+
.
+O
2
-
H 2 O2
SOD1-Cu1+
.O
O2
GSH-Px
catalase
H 2O
SOD1-Cu2+
2
-
wtSOD1
CO.
H2O2
SOD1-Cu1+
Oxidized
+ SOD1-Cu2+
substrate
.
OH + SOD1-Cu2+
.
SOD1-Cu2+-OH
+OH -
substrate
fALS-SOD1
DMPO rescues paralysis and death in fALS transgenic mice
+ DMPO
+ DMPO
- DMPO
- DMPO
Liu et al. J.Neurochem. (2002)
Is SOD1-linked fALS a copper-mediated disease ?
Force-fed
In food
Wt mice
Untreated G93A
G93A treated with D-penicillamine
Hottinger et al. Eur.J.Neurosci.(1997)
redox
control
H2O2
Cu
CCS
CCS
Zn
+ Zn
Zn
+ disulfide
C57-C146
Zn
+ Cu
O2
Cu,Zn SOD1
SOD1 monomer
disulfide-linked
oligomers
intracellular
aggregates
aggregates
SOD1 is :
• Cytosolic, mitochondrial
• abundant
• ubiquitous
• homodimeric
fALS-SOD1
Protein
aggregation
Oxidative
damage
Proteasome
disfunction
wild-type
SOD1
2 O2- + 2H+
O2
H2 O 2 +
Mitochondrial
disfunction
N
E
U
R
O
N
A
L
D
E
A
T
H
SOD1 aggregates are ubiquitine-positive
SOD1
Ubiquitine
Trypan blue
SH
WT
250
G93A
H46R
merge
% of basal value
200
*
*
*
*
150
100
50
0
Beretta et al.(2003) Neurobiol.Dis.
B
L
PI
B
L
PI
B
L
PI
B
L
PI
More than 150 different sod1 mutations
have been found in FALS patients.
Do ALL mutant SOD1s share
the SAME toxic function ?
Bendotti and Carrì (2004) Trends Mol.Med.
S134N5
E133D15
D125H8
D124V9
G93A22
D90A11
G85R13
H80R18
H48R9
H46R8
G37R4
A4V12
WT18
nonTG7
fALS-SOD1s behave differently in motoneuronal cells
myc-hSOD1
mSOD1
mSOD1 (dimer)
myc-hSOD1(dimer)
myc-hSOD1(monomer)
- + - + - + - + - + - + - +
- + -+ - + - + - + - + - +
doxycycline48hrs
S134N
E133D
D125H
D124V
G93A
D90A
G85R
MCMC MC MC MCMC MCMC MC
1,8
1.6
*
*
1,6
1,4
1.2
1,2
*
1
0.8
*
*
*
* *
* * * *
*
0,8
0,6
0.4
0,4
0,2
0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
WT
G93A
WT
A4V
G37R
H46R
H48Q
H80R
G85R
D90A
G93A
D124V
D125H
E133D
S134N
mito/cyto SOD1
MC MC M C MC
H80R
H48Q
H46R
G37R
A4V
WT
ALL mutSOD1s localize into mitochondria
hSOD1
hSOD1-myc
Ferri et al. PNAS 103,13860-5 (2006)
Do mutant SOD1s exert their toxic function
INSIDE (or IN ASSOCIATION with) MITOCHONDRIA ?
Mitochondria are damaged early in patients (and models)
Increasing the fraction of mutSOD1 in mitochondria is toxic
OD 490nm (% control)
1,60
1,40
*
1,20
**
1,00
**
0h
24h
0,80
48h
72h
0,60
0,40
0,20
0,00
1
ctrl
2
wtSOD1
3
G93A
4
mito
wtSOD1
mito
wtSOD1
5
6
mito
G93A
7
mito
G93A
Cozzolino et al. ARS 2009
reduced SOD1
monomer
Cu
CCS
Zn
disulfide-linked
oligomers
IMS
matrix
C57S
G93A
C6F/
C111S
C6F
C111S
G93A
C111S
C6F
WT
Cys111 mediates mutSOD1s association with mitochondria
hSOD1-myc
Hsp60
C M C M
1,6
1,4
1.2
1,2
1
0.8
0,8
0,6
0.4
0,4
0,2
0
5
C57S
4
G93A
3
C6F/
C111S
2
C6F
1
C111S
0
WT
mito/cito SOD1
(U.A.)
C M C M C M C M C M C M C M
6
mutSOD1 induces mitochondrial fragmentation
Drp1
WT
G93A
H80R
G93A-SOD1
WT-SOD1
CTRL
OPA1
ALL mutSOD1s damage mitochondria
400
Complex IV
Complex I
Complex II-III
300
*
250
*
200
*
*
*
*
* *
*
*
*
*
150
* *
* * *
100
*
50
WT
A4V
H46R
H80R
D90A
G93A
D125H
D125H
WT
A4V
H46R
H80R
D90A
G93A
D125H
H46R
H80R
D90A
G93A
0
WT
A4V
nmol/min/mg protein
350
ALL mutSOD1s damage mitochondria
5
4
3
2
1
D125H
G93A
D90A
H80R
WT
0
5
4
44
3
3
2
22
1
1
*
*
0
0 0
hSOD1-myc
mSOD1
WT
Ferri et al. PNAS 2006
*
0.05
0.2
1
6
5
0
7
66
0.2
1
8
6
0.05
9
7
0
ATP
(nmol/mg)
10
7
ATP
(nmol/mg)
* *
*
10
*
8
6
4
2
0
- + -+ - + -+-+
Doxy
H80R
Doxy
(mg/ml)
ALL mutSOD1s alter mitochondrial redox state
12
8
6
4
*
*
2
*
0
*
*
*
*
*
*
*
S134N
E133Δ
D125H
D124V
G93A
D90A
G85R
H80R
H48Q
H46R
G37R
WT
G93A
- + - + -+ - + - +- + -+ -+ -+ - + -+ - + - +- + - +
WT
Doxy
**
*
A4V
GSH/GSSG
10
hSOD1-myc
Ferri et al. PNAS (2006)
mutSOD1 progressively aggregates into mitochondria
also in transgenic G93A mice (spinal cord)
hSOD1 input
hSOD1
mito soluble
mito insoluble
VDAC
30
150
30
G93A
wt
G93A
wt
ctrl
G93A
wt
+b-ME
G93A
SOD1
wt
-b-ME
ctrl
SOD1
150
Age (days)
Cozzolino et al. ARS 2009
SOD1
Bcl-2
family
ROS
Ca2+
SOD1
caspaseindependent
cell death
apoptosome
Apaf1
SOD1
cyt c
casp9
apoptosis
effector
caspases
ALS is a multifactorial disease
Oxidative Stress
Mitochondrial
damage
Protein
Aggregation
Excitotoxicity
Neuroinflammation
mutSOD1
Deficit in
RNA processing
Impairment of
Axonal Transport
Genetic Factors
ims
motor neuron
Ca2+
SOD1
EAAT2
astrocyte
inflammatory
mediators
astrocyte
glutamate
motor neuron
Motor neurons express a large number of
Ca2+-permeable receptors lacking the GluR2
subunit. Thus, glutamatergic stimulation
increases the intracellular Ca2+ concentration
and because of the low Ca2+-buffering
capacity of motor neurons part of this Ca2+
will be taken up by mitochondria.
Mutant SOD1 severely disrupts
mitochondrial Ca2+ regulation in SH-SY5Y cells
Carrì et al. FEBS lett. (1997)
WT
WT
G93A
G93
A
G93A
WT
Jaiswal, et al. BMC Neurosci. 2009
ER stress occurs when the ER–mitochondria calcium cycle is
disturbed and misfolded proteins accumulate in the ER.
Activation of markers of ER stress/UPR is detectable in
mutated SOD1G93A motor neurons.
Prell et al. EJN 2012
Meccanismo
In modelli
In pazienti
Terapia ?
Stress ossidativo
SI
SI
Non funziona
Metalli
SI
FORSE
Non provato
Aggregati proteici
SI
SI
Non provato
Danno
mitocondriale
SI
SI
Non funziona ?
Eccitotossicità
SI
SI
Non funziona
Alterazioni
geniche
SI
SI
?
Are experimental models “good”
representations of the situation in patients ?
From experimental models to man…a difficult step
La malattia del motoneurone
(ma non solo)
IL FUTURO DELLA TERAPIA PER LA SLA
Terapia “combinata”
Target :
• Aggregazione proteica
• Danno mitocondriale
• Proteine mutanti
• Fattori trofici
target gene
siRNA therapy
mRNA transcription and processing
mature mRNA
association with ribosomes
siRNAs
translation
mRNA degradation
protein
Retroviral therapy
viral
vector
injection
motor neuron
muscle
spinal cord
retrograde
transport
exogenous
protein/siRNA
Stem cell therapy
NPCs
NSCs
injection
trophic
factors
motor neuron
muscle
NPCs
NSCs
spinal cord
trophic
factors
In vivo veritas
spinal cord
brain
muscle
spinal cord
brain
SOD1-G93A p66Shc-/-
muscle
Reversion of mitochondrial damage:
Testing the hypothesis in G93A mice
p66
p52
p46
SOD1
SOD1-G93A/p66Shc-/-
G93A
G93A
p66 +/+ p66 -/-
Shc
Model of p66Shc redox activity during mitochondrial apoptosis
p66
Ser36-P
Cys59
EE132/133
Giorgio et al. Cell 2005
Ablation of p66Shc improves mitochondrial function
in the spinal cord of G93A mice
GSH/GSSG
Complex IV
140
240120
*
8
6
*
6
*
4
4
2
2
0
90 120 150 days
G93A
p66+/+
p66Shc-/-
G9
3AC
T
RL
G 9 Ctrl
3A
90g
g
G9
3A
120
gg
G9
3A
150
gg
s hc
-/-C
trl
s hc
-/- G
93A
90g
s hc
g
-/- G
93A
120
s hc
gg
-/- G
93A
150
gg
90 120 150
G93A
p66 -/-
*
16080
*
12060
8040
4020
0
1
90 120 150 days
90 120 150
G93A
p66+/+
p66Shc-/-
8
0
GSH/GSSG
10
200100
Ctrl
nmol/min/mg protein
12
10
0
12
G93A
p66 -/-
118.96±10.98, days vs.
98,07±8,9 days, p< 0.0001
onset
probability (%)
Ablation of p66Shc
ameliorates ALS
phenotype in G93A mice
days
average of
performance (sec)
350 350
G93A p66Shc -/G93A p66Shc +/+
250 250
200 200
150 150
100 100
50 50
00
81
88
96
104
81
88
96
104
112
112
119
126
119 126
133
140
147
154
133 140 147 154
163
163
days
survival
probability (%)
24 < n < 32
300 300
157,50± 9.11 days vs.
141.26 ± 14,42 days, p< 0.0001
days
A putative
mitochondrial
modulator,
dexpramipexol
e
increases the
efficiency of
oxidative
phosphorylation