1 Verwendungszweck 2 Testprinzip 3 Technische Spezifikationen 4

Formato UNIVERSAL
CTXE-U CTXE-G v.2
Alle Reagenzien sind bereits fertig zum Gebrauch, sodass keine
Zugabe weiterer Komponenten nötig ist.
1 Verwendungszweck
RealCycler CTXE ist ein Kit zur qualitativen Detektion der DNA von
Escherichia coli und BLEAS der Gruppe CTX-M1, sowie BLEAS der
Gruppen CTX-M2 und CTX-M9 in klinischen Proben mittels RealTime PCR.
Komponente
Das System enthält eine interne Kontrolle der Amplifikation, um
falsch-negativen Ergebnissen aufgrund von Inhibition der Reaktion
vorzubeugen.
2 Testprinzip
Die Reaktion der DNA-Polymerase am DNA-Strang (PCR) basiert auf
der Amplifikation einer spezifischen DNA/RNA-Region unter
Verwendung von Oligonukleotiden, die komplementär zur
Zielsequenz sind. In der Real-Time PCR werden fluoreszenzmarkierte Sonden verwendet, die im Falle der Amplifikation
Fluoreszenz emittieren. Der PCR-Zyklus, in dem zuerst ein
signifikanter Anstieg der Fluoreszenz detektiert wird, repräsentiert
proportional die Menge an DNA/RNA in der Probe. Dieser Wert wird
auch Cycle Threshold (Ct) oder Cycle Quantifiaction (Cq) genannt.
Viales
Volumen
CTXE-U
CTXE-G
AmpliMix
ECM1
1
2
230 µL
AmpliMix
M2M9
1
2
230 µL
DNA-Positivkontrolle
E. coli
1
2
30 µL
DNA-Positivkontrolle
CTX-M1
1
2
30 µL
DNA-Positivkontrolle
CTX-M2
1
2
30 µL
DNA-Positivkontrolle
CTX-M9
1
2
30 µL
Anzahl der Bestimmungen: RealCycler CTXE-U erlaubt es bis zu
15+15 Bestimmungen (12+12 für den SmartCycler®) durchzuführen.
RealCycler CTXE-G erlaubt es 30+30 Bestimmungen (24+24 für den
SmartCycler®) durchzuführen.
Bei der Amplifikation von ECM1 wird Escherichia coli im
korrespondierenden Kanal durch den Flurophor FAM, CTX-M1 im
korrespndierenden Kanal durch den Fluorophor TxR und die
Amplifikation der internen Kontrolle im korrespondierenden Kanal
durch den Fluorophor Alx532 oder HEX detektiert.
5 Stabilität und Lagerung
Bei der Amplifikation von M2M9 wird CTX-M2 im korrespondierenden
Kanal durch den Flurophor FAM, CTX-M9 im korrespndierenden
Kanal durch den Fluorophor TxR und die Amplifikation der internen
Kontrolle im korrespondierenden Kanal durch den Fluorophor Alx532
oder HEX detektiert.
Alle Komponenten des Kits RealCycler CTXE sollten bei -20°C
gelagert werden. Bei einer Lagerung bei -20°C kann das Kit bis zum
angegebenen Haltbarkeitsdatum, das sich auf der äußeren
Verpackung des Kits befindet, verwendet werden.
6 Zusätzlich benötigtes, nicht mitgeliefertes
Material
3 Technische Spezifikationen
Sensibilität
- Real-Time PCR.
- Kit für DNA-Aufreinigung.
- Einweghandschuhe.
- Kalibrierte Pipetten.
- Pipettenspitze mit Filter.
- Gefrierschrank (-20 °C).
E.coli: 103 Kopien/µL.
CTX-M1: 104 Kopien/µL.
CTX-M2: 103 Kopien/µL.
CTX-M9: 103 Kopien/µL.
Die analytische Sensibilität wurde durch die Methode der maximalen
zulässigen Verdünnung bestimmt. Diese Sensibilität wurde durch die
Wiederholung eines Essay mit einer Reproduzierbarkeit von über
95% bestätigt.
7 Sicherheitshinweise
- Alle Komponenten des Kits sollten während des Gebrauchs auf Eis
gelagert werden.
- Nach Zugabe der DNA sollte schnellstmöglich das Programm für
die Amplifikation gestartet werden.
- Die Reaktionsgefäße mit dem Amplifikationsgemisch sollten nicht
für längere Zeit dem Licht ausgesetzt sein.
- Wiederholtes Einfrieren und Auftauen der Reagenzien kann die
Sensibilität des Kits verringern.
- Einweghandschuhe benutzen.
- Kalibrierte Pipetten und Pipettenspitzen mit Filter benutzen.
- Die Tests sollten durch eine qualifizierte Person und gemäß
gängigen Labormethoden durchgeführt werden.
- Es wird empfohlen bei jeder Analyse sowohl Positiv- als auch
Negativkontrolle durchzuführen.
- Das Kit nicht nach Verfallsdatum verwenden.
- Gebrauch für in vitro Diagnostik.
Spezifität
E.coli: Gen N-Acetylgalaktosamin-6-phosphat Deacetylase.
BLEAS CTX-M1, M2 und M9: Gen beta-Lactamase CTX-M.
Die Gültigkeit der Spezifität wurde expirimentell und durch eine
Analyse mittels BLAST bestätigt (www.ncbi.nlm.nih.gov/blast).
4 Inhalt
RealCycler CTXE enthält das fertige Reaktionsgemisch AmpliMix
ECM1 und AmpliMix M2M9 in den Reaktionsgefäßen für die
Amplifikation sowie eine positive DNA-Kontrolle von E. Coli und
jeweils eine positive DNA-Kontrolle von CTX-M1, CTX-M2 und CTXM9.
1
2
- Cepheid® und SmartCycler® sind eingetragene Schutzmarken der
Cepheid Corporation.
- QIAamp ist eine eingetragene Schutzmarke der Gruppe QIAGEN.
- Maxwell® ist eine eingetragene Schutzmarke der Promega
Corporation.
- NucliSENS® easyMAG® ist eine eingetragene Schutzmarke der
bioMérieux.
- CFX96™ ist eine eingetragene Schutzmarke der Bio-Rad.
c) Vorbereitung der Reaktion
c.1) Für Geräte, die ein Reaktionsvolumen von 20 µL benötigen
(Bsp.: CFX96™ von Bio-Rad).
- Tauen Sie den AmpliMix ECM1 und die Positivkontrolle auf.
- Bereiten Sie die benötigten Reaktionsgefäße für die Amplifikation
der Proben sowie der Kontrolle.
- Pipettieren Sie 14,4 µL vom Amplimix in jedes Reaktionsgefäß.
- Fügen Sie 5,6 µL jeder DNA-Probe bzw. der Kontrolle in jedes
Reaktionsgefäß hinzu.
- Stellen Sie die Reaktionsgefäße in das Gerät für die Real-Time
PCR
- Wählen Sie das Protokoll “CTXE” aus.
- Starten Sie das Programm für die Amplifikation.
8 Klinische Proben
- Die Proben sollten in sterilen Reaktionsgefäßen gesammelt
werden.
- Die Proben sollten bis zum Gebrauch bei -20°C transportiert und
gelagert werden.
c.2) Für Geräte, die ein Reaktionsvolumen von 25 µL benötigen
(Bsp.: SmartCycler® von Cepheid®).
9 Vorgehensweise
- Tauen Sie den AmpliMix ECM1 und die Positivkontrolle auf.
- Bereiten Sie die benötigten Reaktionsgefäße für die Amplifikation
der Proben sowie der Kontrolle.
- Pipettieren Sie 18 µL vom Amplimix in jedes Reaktionsgefäß.
- Fügen Sie 7 µL jeder DNA-Probe bzw. der Kontrolle in jedes
Reaktionsgefäß hinzu.
- Stellen Sie die Reaktionsgefäße in das Gerät für die Real-Time
PCR
- Wählen Sie das Protokoll “CTXE” aus.
- Starten Sie das Programm für die Amplifikation.
a) Aufreinigung der Nukleinsäuren
Die DNA sollte ausgehend von der klinischen Probe unter der
Verwendung einer angemessene Methode aufgereinigt werden. Es
sind viele verschiedene Systeme für die DNA-Aufreinigung auf dem
Markt. Führen Sie die Aufreinigung gemäß der Herstellerangaben
durch und verwenden Sie das empfohlene Probenvolumen.
Dieses Kit wurde gemäß des folgenden Aufreinigungssystems
validiert:
d) Ergebnisse
● Maxwell® 16 Cell LEV DNA Purification kit (Referrenz AS1140).
Promega Corporation.
Interpretieren Sie die erhaltenen Ergebnisse jeder Probe gemäß der
Signalkombinationen in folgender Tabelle:
Dieses Kit kann in Kombination mit folgenden Aufreinigungssystemen verwendet werden:
Kanal
Interpretation
FAM
TxR
Alx532/HEX
POS
NEG
Unverändert
POSITIV
E.coli
NEG
POS
Unverändert
POSITIV
CTX-M1
Vorgehensweise E.coli-BLEAS der Gruppe
CTX-M1
POS
POS
Unverändert
POSITIV
E.coli und CTX-M1
b) Protokoll
NEG
NEG
POS
Nicht detektiert
Programmieren Sie das Protokoll für die Amplifikation von “CTXE”
gemäß den folgenden Angaben:
NEG
NEG
NEG
Nicht detektiert
● QIAamp DNA Blood Mini kit . QIAGEN.
● BioRobot EZ1.QIAGEN.
● QIAcube. QIAGEN.
● NucliSENS® easyMAG®. bioMérieux.
Zeit
Temperatur
Zyklen
Fluoreszenz
15:00
95 °C
1
OFF
0:15
95 °C
0:30
60 °C
0:30
72 °C
OFF
45
ON
OFF
Auswahl der Flurophore:
- FAM: Detektion von E.coli.
- TxR: Detektion von CTX-M1.
- Alx532/HEX: Detektion der internen Kontrolle.
3
4
Kanal
Vorgehensweise BLEAS der Gruppen CTX-M2
und CTX-M9
FAM
TxR
Alx532/HEX
b) Protokoll
POS
NEG
Unverändert
POSITIV
CTX-M2
Programmieren Sie das Protokoll für die Amplifikation von “CTXE”
gemäß den folgenden Angaben:
NEG
POS
Unverändert
POSITIV
CTX-M9
POS
POS
Unverändert
POSITIV
CTX-M2 und CTX-M9
NEG
NEG
POS
Nicht detektiert
NEG
NEG
NEG
Keine Aussage
möglich
Zeit
Temperatur
Zyklen
Fluoreszenz
15:00
95 °C
1
OFF
0:15
95 °C
0:30
60 °C
0:30
72 °C
OFF
45
ON
OFF
Interpretation
Auswahl der Fluorophore:
e) Beispiel
- FAM: Detektion von CTX-M2.
- TxR: Detektion von CTX-M9.
- Alx532/HEX: Detektion der internen Kontrolle.
E.coli und BLEAS der Gruppe CTX-M1
e.1) CFX96™ (Bio-Rad)
c) Vorbereitung der Reaktion
c.1) Für Geräte, die ein Reaktionsvolumen von 20 µL benötigen
(Bsp.: CFX96™ von Bio-Rad).
- Tauen Sie den AmpliMix M2M9 und die Positivkontrolle auf.
- Bereiten Sie die benötigten Reaktionsgefäße für die Amplifikation
der Proben sowie der Kontrolle.
- Pipettieren Sie 14,2 µL vom Amplimix in jedes Reaktionsgefäß.
- Fügen Sie 5,8 µL jeder DNA-Probe bzw. der Kontrolle in jedes
Reaktionsgefäß hinzu.
- Stellen Sie die Reaktionsgefäße in das Gerät für die Real-Time
PCR
- Wählen Sie das Protokoll “CTXE” aus.
- Starten Sie das Programm für die Amplifikation.
Grafik 1 (Kanal FAM: E. coli): Erhaltene Ergebnisse nach der
Amplifikation einer Negativ- und Positivkontrolle. Negativkontrolle:
Kein Signal. Positivkontrolle: Amplifikationssignal.
c.2) Für Geräte, die ein Reaktionsvolumen von 25 µL benötigen
(Bsp.: SmartCycler® von Cepheid®).
- Tauen Sie den AmpliMix M2M9 und die Positivkontrolle auf.
- Bereiten Sie die benötigten Reaktionsgefäße für die Amplifikation
der Proben sowie der Kontrolle.
- Pipettieren Sie 17,75 µL vom Amplimix in jedes Reaktionsgefäß.
- Fügen Sie 7,25 µL jeder DNA-Probe bzw. der Kontrolle in jedes
Reaktionsgefäß hinzu.
- Stellen Sie die Reaktionsgefäße in das Gerät für die Real-Time
PCR
- Wählen Sie das Protokoll “CTXE” aus.
- Starten Sie das Programm für die Amplifikation.
d) Ergebnisse
Interpretieren Sie die erhaltenen Ergebnisse jeder Probe gemäß der
Signalkombinationen in folgender Tabelle:
Grafik 2 (Kanal TxR: CTX-M1Erhaltene Ergebnisse nach der
Amplifikation einer Negativ- und Positivkontrolle. Negativkontrolle:
Kein Signal. Positivkontrolle: Amplifikationssignal.
5
6
Grafik 3 (Kanal Alx532: interne Kontrolle): Erhaltene Ergebnisse
nach der Amplifikation einer Negativ- und jeweils einer
Positivkontrolle von E. Coli und CTX-M1. Negativkontrolle (A1 in
blau): Ct=27,30.. Positivkontrolle E. coli (A2 in grau): Ct=27,51.
Positivkontrolle CTX-M1 (A3 in orange): Ct=27,31.
Grafik 3 (Kanal HEX: interne Kontrolle): Erhaltene Ergebnisse nach
der Amplifikation einer Negativ- und Positivkontrolle.
Negativkontrolle: Amplifikationssignal. Positivkontrolle:
Amplifikationssignal.
e.2) SmartCycler® (Cepheid®)
BLEAS der Gruppen CTX-M2 und CTX-M9
e.1) CFX96™ (Bio-Rad)
Grafik 1 (Kanal FAM: E. coli): Erhaltene Ergebnisse nach der
Amplifikation einer Negativ- und jeweils einer Positivkontrolle von
E. Coli und CTX-M1. Negativkontrolle (A1 in blau): Kein Signal.
Positivkontrolle E. coli (A2 in grau): Ct=29,59. Positivkontrolle CTXM1 (A3 in orange): Kein Signal.
Grafik 1 (Kanal FAM: CTX-M2): Erhaltene Ergebnisse nach der
Amplifikation einer Negativ- und Positivkontrolle. Negativkontrolle:
Kein Signal. Positivkontrolle: Amplifikationssignal.
Grafik 2 (Kanal TxR: CTX-M1): Erhaltene Ergebnisse nach der
Amplifikation einer Negativ- und jeweils einer Positivkontrolle von
E. Coli und CTX-M1. Negativkontrolle (A1 in blau): Kein Signal.
Positivkontrolle E. coli (A2 in grau): Kein Signal. Positivkontrolle CTXM1 (A3 in orange): Ct=24,73.
7
Grafik 2 (Kanal TxR: CTX-M9): Erhaltene Ergebnisse nach der
Amplifikation einer Negativ- und Positivkontrolle. Negativkontrolle:
Kein Signal. Positivkontrolle: Amplifikationssignal.
8
Grafik 3 (Kanal HEX: interne Kontrolle): Erhaltene Ergebnisse nach
der Amplifikation einer Negativ- und Positivkontrolle.
Negativkontrolle: Amplifikationssignal. Positivkontrolle:
Amplifikationssignal.
Gráfica 3 (Canal Alx532: control interno): Erhaltene Ergebnisse nach
der Amplifikation einer Negativ- und jeweils einer Positivkontrolle von
CTX-M2 und CTX-M9. Negativkontrolle (A4 in blau): Ct=31,03.
Positivkontrolle E. coli (A5 in grau): Ct=31,80. Positivkontrolle CTXM9 (A6 in orange): Ct=31,94.
e.2) SmartCycler® (Cepheid®)
10 Qualitätskontrolle
Jede Lieferung des Kits RealCycler CTXE wurde gemäß der
Spezifiikationen der Real-Time PCR unter Verwendung des
SmartCycler® (Cepheid®) geprüft.
11 Beobachtungen
Kompatibilität der Fluorophore:
Grafik 1 (Kanal FAM: CTX-M2): Erhaltene Ergebnisse nach der
Amplifikation einer Negativ- und jeweils einer Positivkontrolle von
CTX-M2 und CTX-M9. Negativkontrolle (A4 in blau): Kein Signal.
Positivkontrolle E. coli (A5 in grau): Ct=26,54. Positivkontrolle CTXM9 (A6 in orange): Kein Signal.
Fluorophor
Emission
(nm)
FAM
519
HEX
556
JOE, VIC, CAL Fluor Orange
560, Alexa 532
Texas Red
610
ROX, LC Red 610, CAL Fluor
Red 610
ATTO 647N
669
Cy5, Alexa 647, LC Red 670,
Quasar 670, Oyster 645
Alternative Fluorophore
Veröffentlicht: März, 2014.
Grafik 2 (Kanal TxR: CTX-M9): Erhaltene Ergebnisse nach der
Amplifikation einer Negativ- und jeweils einer Positivkontrolle von
CTX-M2 und CTX-M9. Negativkontrolle (A4 in blau): Kein Signal.
Positivkontrolle E. coli (A5 in grau): Kein Signal. Positivkontrolle CTXM9 (A6 in orange): Ct=26,09.
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