1 Verwendungszweck 2 Testprinzip 3 Technische Spezifikationen 4

Formato UNIVERSAL
GRHI-U GRHI-G v.2
1 Verwendungszweck
Komponente
RealCycler GRHI ist ein Reaktions-Kit, welches mittels Real-Time
PCR die qualitative Bestimmung der RNA des Influenza-A-Virus, des
Influenza-B-Virus und des Gens Hämagglutinin, der neuen Variante
des Grippevirus H1N1 2009, in klinischen Proben.
Das System enthält eine interne Kontrolle der Amplifikation, um
falsch-negativen Ergebnissen aufgrund von Inhibition der Reaktion
vorzubeugen.
2 Testprinzip
Die Reaktion der DNA-Polymerse am DNA-Strang (PCR) basiert auf
der Amplifikation einer spezifischen DNA/RNA-Region unter
Verwendung von Oligonukleotiden, die komplementär zur
Zielsequenz sind. In der Real-Time PCR werden fluoreszenzmarkierte Sonden verwendet, die im Falle der Amplifikation
Fluoreszenz emittieren. Der PCR-Zyklus, in dem zuerst ein
signifikanter Anstieg der Fluoreszenz detektiert wird, repräsentiert
proportional die Menge an DNA/RNA in der Probe. Dieser Wert wird
auch Cycle Threshold (Ct) oder Cycle Quantification (Cq) genannt.
Viales
Volumen
GRHI-U
GRHI-G
AmpliMix
GRIP
1
2
220 µL
AmpliMix
HINI
1
2
210 µL
Retrotranskriptase
1
2
60 µL
Positivkontrolle
1
2
60 µL
Anzahl der Bestimmungen: RealCycler GRHI-U erlaubt es bis zu
15+15 Bestimmungen (12+12 für den SmartCycler®) durchzuführen.
RealCycler GRHI-G erlaubt es 30+30 Bestimmungen (24+24 für den
SmartCycler®) durchzuführen.
5 Stabilität und Lagerung
Bei der Amplifikation von GRIP wird der Influenza-A-Virus im
korrespondierenden Kanal durch den Fluorophor FAM, der InfluenzaB-Virus im korrespondieren Kanal durch den Fluorophor TxR und die
interne Kontrolle im korrespondierenden Kanal durch den Fluorophor
Alx532 oder HEX detektiert.
Alle Komponenten des Kits RealCycler GRHI sollten bei -20°C
gelagert werden. Bei einer Lagerung bei -20°C kann das Kit bis zum
angegebenen Haltbarkeitsdatum, das sich auf der äußeren
Verpackung des Kits befindet, verwendet werden.
Bei der Amplifikation von HINI wird H1N1 im korrespondierenden
Kanal durch den Fluorophor FAM und die interne Kontrolle im
korrespondierenden Kanal durch den Fluorophor Alx532 oder HEX
detektiert.
6 Zusätzlich benötigtes, nicht mitgeliefertes
Material
Sensibilität
- Real-Time PCR.
- Kit für RNA-Aufreinigung.
- Einweghandschuhe.
- Kalibrierte Pipetten.
- Pipettenspitze mit Filter.
- Gefrierschrank (-20 °C).
Influenza A: 100 Kopien/µL.
Influenza B: 100 Kopien/µL.
Influenza A H1N1: 500 Kopien/µL.
7 Sicherheitshinweise
3 Technische Spezifikationen
- Alle Komponenten des Kits sollten während des Gebrauchs auf Eis
gelagert werden.
- Nach Zugabe der RNA sollte schnellstmöglich das Programm für
die Amplifikation gestartet werden.
- Die Reaktionsgefäße mit dem Amplifikationsgemisch sollten nicht
für längere Zeit dem Licht ausgesetzt sein.
- Wiederholtes Einfrieren und Auftauen der Reagenzien kann die
Sensibilität des Kits verringern.
- Einweghandschuhe benutzen.
- Kalibrierte Pipetten und Pipettenspitzen mit Filter benutzen.
- Die Tests sollten durch eine qualifizierte Person und gemäß
gängigen Labormethoden durchgeführt werden.
- Es wird empfohlen bei jeder Analyse sowohl Positiv- als auch
Negativkontrolle durchzuführen.
- Das Kit nicht nach Verfallsdatum verwenden.
- Gebrauch für in vitro Diagnostik.
- Cepheid® und SmartCycler® sind eingetragene Schutzmarken der
Cepheid Corporation.
- QIAamp ist eine eingetragene Schutzmarke der Gruppe QIAGEN.
- Maxwell® ist eine eingetragene Schutzmarke der Promega
Corporation.
- NucliSENS® easyMAG® ist eine eingetragene Schutzmarke der
bioMérieux.
- CFX96™ ist eine eingetragene Schutzmarke der Bio-Rad.
Die analytische Sensibilität wurde durch die Methode der maximalen
zulässigen Verdünnung bestimmt. Diese Sensibilität wurde durch die
Wiederholung eines Essay mit einer Reproduzierbarkeit von über
95% bestätigt.
Spezifität
Influenza A: Gen M1 und M2 (matrix protein).
Influenza B: Gen M1 und M2 (matrix protein).
Influenza A H1N1: Gen Hämagglutinin.
Die Gültigkeit der Spezifität wurde experimentell und durch eine
Analyse mittels BLAST bestätigt (www.ncbi.nlm.nih.gov/blast).
4 Inhalt
RealCycler GRHI enthält das fertige Reaktionsgemisch AmpliMix
GRIP und AmpliMix HINI in den Reaktionsgefäßen für die
Amplifikation, eine Retrotranskriptase, und eine positive RNAKontrolle FluA H1N1.
Alle Reagenzien sind bereits fertig zum Gebrauch, sodass keine
Zugabe weiterer Komponenten nötig ist.
1
2
8 Klinische Proben
c) Vorbereitung der Reaktion
- Die Proben sollten in sterilen Reaktionsgefäßen gesammelt
werden.
- Die Proben sollten bis zum Gebrauch bei -20°C transportiert und
gelagert werden.
c.1) Für Geräte, die ein Reaktionsvolumen von 20 µL benötigen
(Bsp.: CFX96™ von Bio-Rad).
- Tauen Sie den AmpliMix GRIP und die Positivkontrolle auf.
- Bereiten Sie die benötigten Reaktionsgefäße für die Amplifikation
der Proben sowie der Kontrolle.
- Pipettieren Sie 13,6 µL vom Amplimix in jedes Reaktionsgefäß.
- Geben Sie 1,6 µL Retrotranskriptase (blauer Deckel) in jedes
Reaktionsgefäß.
- Fügen Sie 4,8 µL jeder RNA-Probe bzw. der Kontrolle in jedes
Reaktionsgefäß hinzu.
- Stellen Sie die Reaktionsgefäße in das Gerät für die Real-Time
PCR
- Wählen Sie das Protokoll “GRIP” aus.
- Starten Sie das Programm für die Amplifikation.
9 Vorgehensweise
a) Aufreinigung der Nukleinsäuren
Die RNA sollte ausgehend von der klinischen Probe unter der
Verwendung einer angemessene Methode aufgereinigt werden. Es
sind viele verschiedene Systeme für die RNA-Aufreinigung auf dem
Markt. Führen Sie die Aufreinigung gemäß der Herstellerangaben
durch und verwenden Sie das empfohlene Probenvolumen.
Dieses Kit wurde gemäß der folgenden Aufreinigungssysteme
validiert:
c.2) Für Geräte, die ein Reaktionsvolumen von 25 µL benötigen
(Bsp.: SmartCycler® von Cepheid®).
● QIAamp Viral RNA Mini kit (Referrenz 52904, 52906). QIAGEN.
● Maxwell® 16 Viral Total Purification kit (Referrenz AS1150).
Promega Corporation.
- Tauen Sie den AmpliMix GRIP und die Positivkontrolle auf.
- Bereiten Sie die benötigten Reaktionsgefäße für die Amplifikation
der Proben sowie der Kontrolle.
- Pipettieren Sie 17 µL vom Amplimix in jedes Reaktionsgefäß.
- Geben Sie 2 µL Retrotranskriptase (blauer Deckel) in jedes
Reaktionsgefäß.
- Fügen Sie 6 µL jeder RNA-Probe bzw. der Kontrolle in jedes
Reaktionsgefäß hinzu.
- Stellen Sie die Reaktionsgefäße in das Gerät für die Real-Time
PCR
- Wählen Sie das Protokoll “GRIP” aus.
- Starten Sie das Programm für die Amplifikation.
Dieses Kit kann in Kombination mit folgenden Aufreinigungssystemen verwendet werden:
● BioRobot EZ1.QIAGEN.
● QIAcube. QIAGEN.
● NucliSENS® easyMAG®. bioMérieux.
Vorgehensweise GRIP
b) Protokoll
d) Ergebnisse
Programmieren Sie das Protokoll für die Amplifikation von “GRIP”
gemäß den folgenden Angaben:
Interpretieren Sie die erhaltenen Ergebnisse jeder Probe gemäß der
Signalkombinationen in folgender Tabelle:
Zeit
Temperatur
Zyklus
Fluoreszenz
20:00
50 °C
1
OFF
FAM
TxR
Alx532/HEX
15:00
95 °C
1
OFF
POS
NEG
Unverändert
POSITIV
Influenza A
0:15
95 °C
0:30
60 °C
NEG
POS
Unverändert
POSITIV
Influenza B
0:30
72 °C
POS
POS
Unverändert
POSITIV
Influenza A + B
Auswahl der Fluorophore:
NEG
NEG
POS
NICHT DETEKTIERT
- FAM: Detektion von FluA.
- TxR: Detektion von FluB.
- Alx532/HEX: Detektion der internen Kontrolle.
NEG
NEG
NEG
KEINE AUSSAGE
MÖGLICH
Kanal
Interpretation
OFF
45
ON
OFF
3
4
Vorgehensweise HINI
Kanal
Interpretation
b) Protokoll
FAM
Alx532/HEX
Programmieren Sie das Protokoll für die Amplifikation von “HINI”
gemäß den folgenden Angaben:
POS
Unverändert
POSITIV
FluA H1N1
NEG
POS
NICHT DETEKTIERT
NEG
NEG
KEINE AUSSAGE MÖGLICH
Zeit
Temperatur
Zyklus
Fluoreszenz
20:00
50 °C
1
OFF
15:00
95 °C
1
OFF
0:15
95 °C
0:30
55 °C
0:30
72 °C
OFF
45
e) Beispiel
ON
GRIP
OFF
e.1) CFX96™ (Bio-Rad)
Auswahl der Fluorophore:
- FAM: Detektion von FluA H1N1.
- Alx532/HEX: Detektion der internen Kontrolle
c) Vorbereitung der Reaktion
c.1) Für Geräte, die ein Reaktionsvolumen von 20 µL benötigen
(Bsp.: CFX96™ von Bio-Rad).
- Tauen Sie den AmpliMix HINI und die Positivkontrolle auf.
- Bereiten Sie die benötigten Reaktionsgefäße für die Amplifikation
der Proben sowie der Kontrolle.
- Pipettieren Sie 13,2 µL vom Amplimix in jedes Reaktionsgefäß.
- Geben Sie 1,6 µL Retrotranskriptase (blauer Deckel) in jedes
Reaktionsgefäß.
- Fügen Sie 5,2 µL jeder RNA-Probe bzw. der Kontrolle in jedes
Reaktionsgefäß hinzu.
- Stellen Sie die Reaktionsgefäße in das Gerät für die Real-Time
PCR
- Wählen Sie das Protokoll “HINI” aus.
- Starten Sie das Programm für die Amplifikation.
Grafik 1 (Kanal FAM: FluA): Erhaltene Ergebnisse nach der
Amplifikation einer Negativ- und Positivkontrolle. Negativkontrolle:
Kein Signal. Positivkontrolle: Amplifikationssignal.
c.2) Für Geräte, die ein Reaktionsvolumen von 25 µL benötigen
(Bsp.: SmartCycler® von Cepheid®).
- Tauen Sie den AmpliMix HINI und die Positivkontrolle auf.
- Bereiten Sie die benötigten Reaktionsgefäße für die Amplifikation
der Proben sowie der Kontrolle.
- Pipettieren Sie 16,5 µL vom Amplimix in jedes Reaktionsgefäß.
- Geben Sie 2 µL Retrotranskriptase (blauer Deckel) in jedes
Reaktionsgefäß.
- Fügen Sie 6,5 µL jeder RNA-Probe bzw. der Kontrolle in jedes
Reaktionsgefäß hinzu.
- Stellen Sie die Reaktionsgefäße in das Gerät für die Real-Time
PCR
- Wählen Sie das Protokoll “HINI” aus.
- Starten Sie das Programm für die Amplifikation.
Grafik 2 (Canal TxR: FluB): Erhaltene Ergebnisse nach der
Amplifikation einer Negativ- und Positivkontrolle. Negativkontrolle:
Kein Signal. Positivkontrolle: Amplifikationssignal.
d) Ergebnisse
Interpretieren Sie die erhaltenen Ergebnisse jeder Probe gemäß der
Signalkombinationen in folgender Tabelle:
5
6
Grafik 3 (Kanal HEX: interne Kontrolle): Erhaltene Ergebnisse nach
der Amplifikation einer Negativ- und Positivkontrolle.
Negativkontrolle: Amplifikationssignal. Positivkontrolle:
Amplifikationssignal.
Grafik 3 (Kanal Alx532: interne Kontrolle): Erhaltene Ergebnisse
nach der Amplifikation zweier Negativ- und jeweils einer
Positivkontrolle von FluA und FluB. Negativkontrolle (A1 in blau):
Ct=26,74. Negativkontrolle (A2 in grau): Ct=27,16. Positivkontrolle
FluA (A3 in orange): Ct=27,33. Positivkontrolle FluB (A4 in grün):
Ct=26,90.
e.2) SmartCycler® (Cepheid®)
HINI
e.1) CFX96™ (Bio-Rad)
Grafik 1 (Kanal FAM: FluA): Erhaltene Ergebnisse nach der
Amplifikation zweier Negativ- und jeweils einer Positivkontrolle von
FluA und FluB. Negativkontrolle (A1 in blau): Kein Signal.
Negativkontrolle (A2 in grau): Kein Signal. Positivkontrolle FluA (A3
in orange): Ct=29,28. Positivkontrolle FluB (A4 in grün): Kein Signal.
Grafik 1 (Kanal FAM: FluA H1N1): Erhaltene Ergebnisse nach der
Amplifikation einer Negativ- und Positivkontrolle. Negativkontrolle:
Kein Signal. Positivkontrolle: Amplifikationssignal.
Grafik 2 (Kanal TxR: FluB): Erhaltene Ergebnisse nach der
Amplifikation zweier Negativ- und jeweils einer Positivkontrolle von
FluA und FluB. Negativkontrolle (A1 in blau): Kein Signal.
Negativkontrolle (A2 in grau): Kein Signal. Positivkontrolle FluA (A3
in orange): Kein Signal. Positivkontrolle FluB (A4 in grün): Ct=27,64.
Grafik 3 (Kanal HEX: interne Kontrolle):Erhaltene Ergebnisse nach
der Amplifikation einer Negativ- und Positivkontrolle.
Negativkontrolle: Amplifikationssignal. Positivkontrolle:
Amplifikationssignal.
7
8
e.2) SmartCycler® (Cepheid®)
Grafik 1 (Kanal FAM: FluA H1N1): Erhaltene Ergebnisse nach der
Amplifikation einer Negativ- und Positivkontrolle. Negativkontrolle (A3
in blau): Kein Signal. Positivkontrolle (A4 in grau): Ct=31,06.
Grafik 2 (Kanal Alx532: interne Kontrolle): Erhaltene Ergebnisse
nach der Amplifikation einer Negativ- und Positivkontrolle.
Negativkontrolle (A3 in blau): Ct=32,80. Positivkontrolle (A4 in grau):
Ct=33,11.
10 Qualitätskontrolle
Jede Lieferung des Kits RealCycler GRHI wurde gemäß der
Spezifiikationen der Real-Time PCR unter Verwendung des
SmartCycler® (Cepheid®) geprüft.
11 Beobachtungen
Kompatibilität der Fluorophore:
Fluorophor
Emission
(nm)
FAM
519
HEX
556
JOE, VIC, CAL Fluor Orange
560, Alexa 532
Texas Red
610
ROX, LC Red 610, CAL Fluor
Red 610
ATTO 647N
669
Cy5, Alexa 647, LC Red 670,
Quasar 670, Oyster 645
Alternative Fluorophore
Veröffentlicht: März, 2014.
9
10