Dopingkontrollen und aktueller Stand der

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Dopingnachweis
Wilhelm Schänzer
Dopingkontrollen und aktueller Stand der Nachweismethoden
Doping controls and current status of detection methods
Institut für Biochemie der DSHS Köln
Zusammenfassung
Summary
Nach Todesfällen im Radrennsport in den 60er Jahren in Verbindung mit
der Einnahme von Stimulantien aus der Reihe der Amphetamine wurden 1967 Antidoping-Regeln vonseiten der Sportverbände erlassen. Das
Verbot umfasste zuerst nur Stimulantien und Narkotika und wurde im
Laufe der Jahre auf die Anwendung von Anabolika, Diuretika, Peptidhormone und β-Blocker ausgeweitet.
Die Dopingregeln werden durch systematische Dopingkontrollen nach
dem Wettkampf oder außerhalb des Wettkampfes überprüft, wobei mit
der Ausnahme der Peptidhormone alle verbotenen Wirkstoffe gut kontrollierbar sind. Für EPO wird eine neue direkte Nachweismethode aktuell diskutiert.
Vom IOC zugelassenen Bestimmungsmethoden basieren mit der Ausnahme der Bestimmung von Peptidhormonen, wobei Enzym-ImmunoAssays angewendet werden, auf chromatographische Trennverfahren in
Verbindung mit einer massenspektrometrischen Detektion (GC/MS =
Gaschromatographie/Massenspektrometrie oder LC/MS = Flüssigkeitschromatographie/Massenspektrometrie). Insbesondere im Bereich der
effektiv wirksamen anabol androgenen Steroide (AAS), auch Anabolika
genannt, konnte die Analytik deutliche Fortschritte durch Einführung
der Hochauflösenden Massenspektrometrie zum Langzeitnachweis von
körperfremden AAS und der Kohlenstoff-Isotopen-Massenspektrometrie zum Nachweis von Doping mit körperidentischen AAS wie z.B.
Testosteron erzielen.
After the deaths which occurred in cycling in the 1960s in conjunction
with taking amphetamines, the sports leagues set up antidoping rules in
1967. The ban included at first only stimulants and narcotics and has
been expanded over the years to include the use of anabolics, diuretics,
peptide hormones and β-blockers.
The doping rules are checked by systematic doping controls after competitions or outside competitions, whereby all of the forbidden substances with the exeption of the peptide hormones are easily controlled.
A new direct method of proof is currently been discussed for EPO. With
the exeption of peptide hormones, for which enzyme-immunoessays are
used, determination methods recognized by the IOC are based on chromatographic separation procedures coupled with mass-spectrometric
detection (GC/MS= gas chromatography/mass spectrometry or LC/MS=
liquid chromatography/mass spectrometry). Especially in the area of effectively active anabol-androgenous steroids (AAS), also called anabolics, analytics have been improved considerably by the introduction of
high-resolution mass spectrometry for long-term proof of exogenous
AAS and carbon-isotope mass spectrometry for proof of doping with endogenous-identical AAS, such as testosterone.
Key words: doping controls, detection methods, peptide hormones,
anabolics
Schlüsselwörter: Dopingsubstanzen, Nachweisverfahren, anabole
Steroide, Peptidhormone
Einleitung
Dopingverbote wurden erstmals in den 60er Jahren nach
spektakulären Todesfällen im Radsport aufgestellt. Hierbei
war der Internationale Radsportbund und das Internationale Olympische Komitee ab 1967 maßgeblich richtungsweisend. Wurden zu diesem Zeitpunkt nur Substanzen aus der
Gruppe der Stimulantien, z.B. Amphetamin, und Substanzen
aus der Gruppe der Narkotika, z.B. Morphin, verboten, so ist
die Liste der verbotenen Substanzen im Laufe der Zeit zunehmend umfangreicher geworden: 1974 wurden synthetische anabole AAS wie Metandienon und Stanozolol auf die
Liste gesetzt, ab 1984 das körpereigene Testosteron, aber
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auch Coffein mit einem Grenzwert, ab 1988 β-Blocker und
Diuretika und schließlich ab 1989 Peptidhormone.
Die zur Zeit aktuelle Dopingregel der Medizinischen Kommission des IOC (1) (Abb. 1) haben fast alle Internationalen
Fachverbände in ihren Dopingbestimmungen einfließen lassen bzw. vollständig übernommen. Die Regel des IOC ist eine pragmatische Definition des Dopings. Sie besagt: Doping
ist die Verwendung von Substanzen aus den verbotenen
Wirkstoffgruppen und die Anwendung verbotener Methoden. Im weiteren werden die verbotenen Wirkstoffgruppen
mit einigen Beispielen aufgelistet sowie die verbotenen Methoden gekennzeichnet. Darüber hinaus sind einige Substanzen nur eingeschränkt zugelassen.
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Jahrgang 51, Nr. 7+8 (2000)
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Verbotene Substanzgruppen
Abbildung 1: Dopingregel des IOC
Es muss darauf hingewiesen werden, dass es zur Zeit keine vollständigen Listen gibt, die alle verbotenen Wirkstoffe
enthalten. Das IOC sowie alle Internationalen Fachverbände
geben in ihren Regeln nur Beispiele zu den verbotenen Substanzen an und fügen zu jeder Gruppe den Zusatz „und verwandte Verbindungen (related substances)“ hinzu. Somit
sind alle Wirkstoffe, die pharmakologisch oder strukturchemisch zu der jeweiligen Gruppe eingeordnet werden können,
auch wenn sie nicht namentlich unter den Beispielen aufgeführt sind, verboten. Diese Regel erfasst auch Substanzen,
die neu auf den Markt kommen, bzw. Substanzen, deren
Missbrauch bisher nicht bekannt war.
Die Überprüfung der Antidoping-Regeln erfolgen durch
Kontrollen, wozu Athleten nach dem Wettkampf bzw. außerhalb des Wettkampfes (sogenannte Trainingskontrollen) eine
entsprechende Urinprobe unter Aufsicht abgeben, die zu 2/3
auf eine A- und zu 1/3 auf eine B-Flasche aufgeteilt wird.
Beide Proben werden nach Versiegelung in ein vom IOC akkreditiertes Analyselabor transportiert, wobei zuerst die AProbe auf die verbotenen Substanzen hin untersucht wird. Ist
das Ergebnis der A-Probe positiv, erfolgt die Benachrichtigung des Sportverbandes, der mit dem Labor einen Termin
für die Analyse der B-Probe vereinbart. Zu der B-Analyse
kann der Athlet selber anwesend sein und/oder einen entsprechenden Gutachter bestellen. Erst, wenn die B-Analyse
das Ergebnis der A-Analyse bestätigt, gilt die Probe als positiv, und der Verband kann eine Sanktion gegenüber dem
Athleten aussprechen.
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Stimulantien
Zur Gruppe der Stimulantien zählen Verbindungen wie z.B.
Amphetamin, Methamphetamin, Cocain, die unter das
Betäubungsmittelgesetz fallen, aber auch Verbindungen wie
Ephedrin, das in sehr vielen Hustenmitteln enthalten ist. Die
Wirkungen vieler dieser Substanzen, insbesondere die vom
Amphetamintyp, entsprechen denen der Catecholamine Adrenalin und Noradrenalin, wobei ihre Wirkungen direkt bzw.
indirekt sein können. Für die verschiedenen Ephedrine gibt
es Grenzwerte im Urin, so dass eine therapeutische Anwendung bis zu einem Tag vor dem Wettkampf möglich ist. Aber
auch Coffein, das eigentlich als Genussmittel in vielen Getränken enthalten ist, gehört zur Gruppe der Stimulantien.
Um den Genuss von coffeinhaltigen Getränken aber nicht
vollständig einzuschränken, wurde für Coffein ein Grenzwert
von 12 µg/ml im Urin festgelegt.
Grundsätzlich können Stimulantien in stark wirksame
Substanzen und schwach wirksame Substanzen eingeteilt
werden. Zur ersten Gruppe werden die meisten Amphetaminderivate gezählt, hierzu gehören alle Stimulantien, die
unter das Betäubungsmittelgesetz fallen, während zu den
schwächer wirksamen Substanzen Ephedrin und Coffein gezählt werden.
Diese Unterteilung hat einen wesentlichen Einfluss auf
die Sanktion von Sportlern nach positiven Befunden. So verurteilt der Internationale Leichtathletikverband (IAAF) nach
seinem Regelwerk Athleten, die ein Stimulanz aus der stark
wirksamen Gruppe verwendet haben im 1. Fall bereits mit
zwei Jahren, während beim Missbrauch von Substanzen aus
der schwächeren Gruppe im 1. Fall nur eine Verwarnung sowie Disqualifikation vom Wettkampf ausgesprochen wird.
Narkotika
Zur Gruppe der Narkotika gehören die opioidartigen Analgetika vom Morphintyp, z.B. Morphin, Heroin, während alle
nichtopioidartigen Analgetika, wie z.B. Aspirin, Naproxen
oder Diclofenac, erlaubt sind. In den letzten Jahren wurden
einige Substanzen, wie z.B. Ethylmorphin, Codein oder Dextropropoxyphen, aufgrund ihrer schwachen analgetischen
Wirkung im Vergleich zum Morphin von der Verbotsliste genommen. Ihre Dopingrelevanz haben diese Substanzen eigentlich darin, dass sie aufgrund ihrer schmerzstillenden
Wirkung missbraucht werden können, wenn Schmerzen die
sportliche Leistung limitieren. Im Vergleich zu den nichtopioidartigen Analgetika werden sie aufgrund ihrer Suchtgefahr durch staatliche Betäubungsmittelgesetze erfasst und der
Handel eingeschränkt bzw. wie für Heroin ganz verboten.
Anabole Wirkstoffe
Stimulantien sind gut kontrollierbar, da sie bei einem Missbrauch unmittelbar vor dem Wettkampf angewendet werden
und in der anschließend gesammelten Urinprobe in ausreichender Menge vorliegen. Problematischer als Stimulantien
ist die Gruppe der anabolen Wirkstoffe, die in der Trainings-
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Skandale in der Tiermast wohl die bekannteste Verbindung. β2-Agonisten haben anabole Wirkungen und stimulieren die Proteinsynthese in der Skelettmuskulatur, wenn
sie in hohen Dosierungen angewendet werden. Der Wirkungsmechanismus ist nach
wie vor unbekannt.
Diuretika
Diuretika erhöhen die Urinausscheidung
und werden aus zwei Gründen im Sport missbraucht:
1. In Sportarten mit Gewichtsklassen kann
durch eine erhöhte Wasserausscheidung
das Körpergewicht so erniedrigt werden,
dass der Start in einer niedrigeren (leichteren) Wettkampfklasse möglich wird;
Abbildung 2: Überblick Dopinganalytik/Analyse
2. zur Manipulation der abgegebenen UrinGC Gaschromatographie, MS Massenspektrometrie, HPLC Hochdruckflüssigkeitschromatographie, UV
Ultraviolett Detection, NP-FID Stickstoff/Phosphor-Flammenionisationsdetektor, HRMS Hochauflösende
probe.
Massenspektrometrie, GC/C/IRMS Kohlenstoffisotopen Massenspektrometrie, HCG Choriongonadotropin
Im letzteren Fall wird nach Gabe eines Diuretikums durch eine Erhöhung der ausgephase von Athleten verwendet werden, um aufgrund der anschiedenen Urinmenge ein „Verdünnungseffekt“ von Doabolen Wirkung einen verbesserten Muskelaufbau und damit
pingsubstanzen erzielt. Damit wird versucht, die Nachweisverbunden eine bessere Leistung zu erzielen. Erst mit Eingrenze des analytischen Verfahrens zu unterschreiten. Der
führung von Trainingskontrollen seit 1989 können anabole
Versuch der Urinverdünnung ist mittlerweile auch durch die
Wirkstoffe effektiv kontrolliert werden. Hierzu ist es aber
Regel erschwert. So muss der Kontrolleur, wenn der abgegenotwendig, dass die Trainingskontrollen unangekündigt
bene Urin bei der Kontrolle eine Dichte von 1.005 unterdurchgeführt werden. Organisatorisch sind Trainingskonschreiten, eine weitere Urinprobe vom Athleten verlangen.
trollen aufwendiger als Wettkampfkontrollen, so müssen
Und zwar so lange bis die Dichte oberhalb des Wertes ist.
Athleten jederzeit erreichbar sein, die Ankündigungszeiten
müssen kurz sein, Athleten, die häufig im Ausland trainiePeptidhormone
ren, müssen mit der gleichen Wahrscheinlichkeit erfasst werEine Gruppe, die im Augenblick besonders nach der Tour de
den, und zwar mit Kontrollen im Ausland, wie Athleten, die
France 1998 an Aktualität gewonnen hat, sind die Peptidsich ständig am gleichen Trainingsort aufhalten. Eine interhormone. Nach der IOC-Regel sind als Beispiele Choriongonationale Vergleichbarkeit der Kontrollsysteme muss genadotropin (HCG) , Wachstumshormon (HGH) und Erythrowährleistet werden, so dass Athleten bei internationalen Verpoietin (EPO) verboten. Von diesen drei Hormonen wird zur
anstaltungen unter gleichen Voraussetzungen starten könZeit nur die Anwendung von HCG beim Mann in den Konnen. Diese Voraussetzungen werden zunehmend erfüllt und
trolllaboratorien routinemäßig zufriedenstellend nachgewieeine der größten Herausforderungen für die neue Weltsen. Weitere Ausführungen zu den Peptidhormonen siehe
antidopingagentur (WADA) wird es sein, eine internationale
weiter unten.
Vergleichbarkeit der Systeme zu gewährleisten mit entsprechenden Akkreditierungsmaßnahmen.
Nachweisverfahren, aktueller Stand
Die Gruppe der anabolen Wirkstoffe unterteilt sich in
a) Anabol androgene Steroidhormone (AAS), auch Anaboliund Neuentwicklungen
ka genannt, die sowohl körperfremd wie z.B. Metandienon, Nandrolon, Stanozolol, aber auch körperidentisch
Die verschiedenen Wirkstoffgruppen umfassen pharmakolosein können wie z.B. Testosteron, Dihydrotestosteron und
gisch wirksame Substanzen, die sich in ihrer chemischen
b) in β2-Agonisten.
Struktur und ihren Eigenschaften stark unterscheiden. Für
Bezog sich das Verbot anfänglich (1974) nur auf synthetieinen empfindlichen Nachweis muss die Analytik diese exsche, körperfremde Anabolika, so wurde ab 1984 auch das
tremen Unterschiede berücksichtigen. Dieses bedeutet zur
männliche Sexualhormon Testosteron, das der menschliche
Zeit, dass nicht alle Substanzen mit einer einzigen Analyse
Körper selber produzieren kann, verboten.
erfasst werden können, sondern dass Substanzen nach Wirk1993 wurde die Wirkstoffgruppe der AAS erweitert und
stoffgruppen mit ähnlich chemisch/ physikalischen Eigenunter Einbeziehung der Substanzklasse der β2-Agonisten
schaften analysiert und identifiziert werden.
umbenannt in die Gruppe der anabolen Wirkstoffe. Aus der
Grundsätzlich wird im Rahmen der Dopinganalytik unGruppe der β2-Agonisten, die therapeutisch zur Behandlung
terschieden zwischen einer
von Asthma eingesetzt werden, ist Clenbuterol durch viele
– Probenvorbereitung, wobei die jeweiligen Wirkstoffe bzw.
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sikalisches Messprinzip Anwendung finden. Die eindeutige
Identifizierung von Dopingsubstanzen erfolgt mit der gleichen Technik, die bereits in der Screeningmethode eingesetzt
wird, nämlich mit der GC/MS bzw. LC/MS-Analyse. Weitere
Entwicklungen in der Massenspektrometrie mit verschiedenen MS/MS Techniken, die neben der Hochauflösung (HRMS)
bereits im Routinebetrieb verwendet werden, haben zu weiteren Verbesserungen in der Qualität der Analytik geführt.
In den folgenden zwei Beispielen und Abbildungen 3 und
4 soll das Vorgehen der Analytik zum Nachweis von Amphetamin (Stimulanz) und Nandrolon (anaboles Steroid) exemplarisch vorgestellt werden. Beide Substanzen können als
niedermolekulare Verbindungen mit Molekulargewichten
von 135 bzw. 274 angesehen werden. Damit lassen sie sich
sehr gut, wie im übrigen alle Wirkstoffe aus den Gruppen 14, mit der Massenspektrometrie nachweisen.
Unterschiede in den Bestimmungsmethoden ergeben sich
aber auch bei den niedermolekularen Substanzen, hinsichtlich ihres Metabolismus und der anschließenden Elimination
in den Urin. So müssen Stimulantien anders erfasst werden
als Anabolika.
Abbildung 3: Nachweis von Amphetamin
A) Probenvorbereitung, B) GC/N-P-FID-Chromatogramm,
C) EI-Massenspektrum von Amphetamin (Mölekülion 135)
deren Metaboliten aus dem Urin isoliert und für die anschließende Messung vorbereitet werden, sowie
– der analytischen Bestimmung (Analyse) (siehe Abb.2).
Die Analyse besteht mit Ausnahme der Analyse von Peptidhormonen aus einer chromatographischen Trennung und einer folgenden massenspektrometrischen (MS) Detektion. Zur
chromatographischen Trennung können zwei Systeme eingesetzt werden: Gaschromatographie (GC) bzw. Flüssigkeitschromatographie (LC). Die Gesamtsysteme haben deshalb die
Bezeichnung GC/MS oder LC/MS. Bei der Gruppe der Peptidhormone wird mit substanzspezifischen Enzym-Immun-Assays gearbeitet, wobei hochreine Antikörper zur Isolierung
und Bestimmung des jeweiligen Peptids eingesetzt werden.
Bei der praktischen Durchführung im Rahmen einer
großen Anzahl zu kontrollierender Proben wird weiterhin
zwischen einer Screening-Methode und einer Identifizierungs-Methode unterschieden. Die Screening-Methode ist
hierbei eine Methode, die im Idealfall mit möglichst wenig
Aufwand alle Substanzen erfassen und dabei gleichzeitig
empfindlich, schnell (mit einem hohen Probendurchsatz) und
kostengünstig arbeiten soll. Dieses ist aber in der Regel, insbesondere beim Nachweis von anabolen Wirkstoffen, nicht
möglich. Bei der Screeningmethode für anabole Wirkstoffe
wird sogar mit einer extrem empfindlichen und kostenintensiven Technik der Hochauflösenden Massenspektrometrie
(HRMS, high resolution mass spectrometry) analysiert.
Werden mit der Screeningmethode verdächtige Substanzen aufgefunden, so erfolgt eine zweite Isolierung und eine
eindeutige Identifizierung des Wirkstoffes. Hierbei kann ein
substanzspezifisches Isolierungsverfahren, zur weiteren Reduzierung der biologischen Matrix, und ein eindeutiges phyJahrgang 51, Nr. 7+8 (2000)
Beispiel Amphetamin (Abb. 3):
Amphetamin wird nach oraler Gabe überwiegend unverändert in den Urin ausgeschieden. Die Probenvorbereitung für
den Nachweis von Amphetamin ist entsprechend schnell und
relativ einfach. Das Amphetamin kann mit einem organischen Lösungsmittel unter alkalischen Bedingungen aus dem
Urin extrahiert werden und dann direkt mit der GC-Analyse
erfasst werden. Abb.3B zeigt das entsprechende ScreeningChromatogramm, wobei parallel zum MS-Detektor ein stickstoffspezifischer Detektor verwendet wird. Die Probe ist verdächtig für Amphetamin. Das entsprechende Massenspektrum (Abb.3C) liefert den eindeutigen Beweis.
Beispiel Nandrolon (Abb. 4):
Nandrolon wird im Körper fast vollständig verstoffwechselt
(2), so dass ein Nachweis nicht über Nandrolon selber, sondern über seinen Hauptmetaboliten Norandrosteron geführt
wird. Dieser Metabolit ist aber gleichzeitig ein Stoffwechselprodukt der verbotenen Vorhormone von Nandrolon,
nämlich Norandrostendion und Norandrostendiol. Die Analytik weist demnach mit dem Metaboliten Norandrosteron
nur nach, dass ein verbotenes 19-Norsteroid missbraucht
wurde, die Zuordnung zu einer der drei Wirkstoffe ist nicht
möglich aber auch nicht notwendig.
Norandrosteron selber wird erst nach Konjugation mit
Glucuronsäure in den Urin ausgeschieden. Diese Glucuronsäure wird enzymatisch im Rahmen der Probenvorbereitung abgespalten, so dass Norandrosteron in freier Form
isoliert und bestimmt werden kann. Zur Verbesserung der
Nachweisempfindlichkeit wird eine zusätzliche Derivatisierung vorgenommen, wobei die Sauerstofffunktionen des
Moleküls mit Trimethylsilylgruppen (TMS) umgesetzt werden. (Anmerkung: Eine verbesserte Nachweisempfindlichkeit bei AAS ist deshalb notwendig, da sie nicht im Wettkampf, sondern im Training missbräuchlich angewendet
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werden. Durch den verbesserten Nachweis kann ein Missbrauch länger nachgewiesen werden, womit eine effiziente
retrospektivere Beurteilung der Kontrollergebnisse ermöglicht wird.) Der derivatisierte Ansatz wird dann der GC/MSAnalyse zugeführt. Abbildung 4B zeigt ein GC/MS-Chromatogramm der Screeninganalyse einer positiven Probe,
wobei mit substanzspezifischen Ionen 420 und 405, die sich
aus dem Massenspektrum in Abbildung 4C ergeben, detektiert wird. Wie im Beispiel von Amphetamin liefert dann das
entsprechende Massenspektrum des derivatisierten Norandrosterons (Abb. 4C) den eindeutigen Nachweis dieser Verbindung.
Die Dopinganalytik hat in den letzten Jahre wesentliche
Fortschritte im Bereich des Nachweises von AAS gemacht.
Hierzu zählen die Aufklärung von Langzeitmetaboliten häufig eingesetzter AAS, sowie die Anwendung neuerer empfindlicherer Techniken wie die Hochauflösende Massenspektrometrie (HRMS = high resolution mass spectrometry).
Eine weitere Verbesserung erfolgte im Nachweis von Doping
mit körperidentischen AAS wie Testosteron, wo grundsätzlich zwischen der körpereigenen Produktion eines Hormons
und einer Zufuhr von außen, zwecks Doping, zu unterscheiden ist. Mit der Einführung der Kohlenstoff-IsotopenMassenspektrometrie kann der Missbrauch von verbotenen
körperidentischen Steroidhormonen wie Testosteron, aber
auch Dihydrotestosteron, Androstendion, etc. besser nachgewiesen werden.
Hochauflösende Massenspektrometrie
Die Analytik zum Nachweis körperfremder AAS wurde dahingehend verbessert, dass ihr Nachweis nach der letzten
Applikation verlängert werden konnte. Ein Nachweis über
Monate ist nur bei Anabolika wie Nandrolondecanoat möglich, die als Depotpräparat angewendet werden. Depotpräparate von Steroidhormonen werden in Form von Derivaten mit langkettigen Fettsäuren in die Muskulatur injiziert. Von dort aus diffundieren sie langsam in die Blutbahn
und gewährleisten einen konstant erhöhten Blutspiegel über
einen Zeitraum von mehreren Wochen. Dagegen werden
oral angewandte Steroiden schneller verstoffwechselt und
die Zeitdauer des Nachweis im Urin nach einer letzten Applikation ist nur in einer kürzeren Zeitspanne nach der letzten Einnahme möglich.
Die Hochauflösende Massenspektrometrie (HRMS = high
resolution mass spectrometry) ist eine Technik, die bereits in
den Anfängen der Dopinganalytik angewendet wurde und
somit keine aktuell neue Erfindung. Die HRMS-Technik war
aber für eine Routineanwendung auf der Grundlage einer
täglich hohen Analysenzahl nicht einsetzbar. Dieses gelang
erst zu Beginn der 90er Jahre mittels moderner Computersoftware, die eine Bearbeitung und Auswertung großer
Mengen an Kontrollproben ermöglichte. Ein hoher Anteil an
positiven Routineproben mit Anabolika, die 1995/96 nur
mit der HRMS-Technik im Vergleich zur bisherigen Technik
ermittelt wurden, führte zum kurzfristigen Einsatz dieser
Technik bei den Olympischen Sommerspielen 1996 in Atlanta (3,4). Das IOC forderte weiterhin von allen akkredi-
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Abbildung 4: Nachweis von Nandrolon, Norandrostendion und Norandrostendiol A) Probenvorbereitung, B) GC/MS-Chromatogramm mit den Ionenspuren 420 und 405, C) EI-Massenspektrum von Norandrosteron bis -TMS
(Mölekülion 420)
tierten Laboratorien, ihre Analytik dahingehend zu verbessern, dass sie zukünftig die HRMS oder eine ähnliche empfindliche massenspektrometrische Technik zur Bestimmung
von AAS in niedrigen Konzentrationen im Urin anwenden
müssen. Die notwendige Qualität und Empfindlichkeit der
Steroid-Analytik wird im Rahmen der jährlichen Reakkreditierung der Laboratorien durch das IOC überprüft.
Kohlenstoff-(13C/12C)-Massenspektrometrie
Der Nachweis des körperidentischen Steroidhormons Testosteron wird seit 1984 mit einer Methode vorgenommen, wobei ein Verhältnis des in den Urin ausgeschiedenen Testosterons in Beziehung zu einem chemisch ähnlichen Steroidhormon, dem Epitestosteron, bestimmt wird (5). Das Ergebnis
dieser Bestimmung ist der Testosteron/Epitestosteron-Quotient (T/E-Quotient), der für ein Individuum eine individuelle
Kenngröße darstellt. Nach einer Testosteronanwendung liegt
Testosteron in erhöhter Menge im Urin vor, wobei die Epitestosteronmenge aber nicht verändert wird, so dass hieraus
ein erhöhter T/E-Quotient resultiert. Ist der T/E-Wert größer
als sechs, werden weitere Untersuchungen eingeleitet. So
können zurückliegende Kontrollergebnisse zur Beurteilung
herangezogen werden oder im Rahmen einer endokrinologischen Studie über mehrere Tage der individuelle T/E-Wert eines Athleten sowie die physiologischen Schwankungen des
Wertes ermittelt werden. Mit dieser Untersuchung können
individuelle Stoffwechseleigenarten bzw. pathologische Einflüsse auf den T/E-Wert überprüft werden. Diese weiterführenden Untersuchungen sind zeit- und arbeitsaufwendig
und ein möglicher Dopingverstoß eines Athleten kann erst
nach Abschluss aller Untersuchungen beurteilt werden.
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Dopingnachweis
Die Methode wurde zwar immer wieder von beschuldigten
Athleten kritisiert, hat sich aber als sehr robust erwiesen. Bisher sind keine physiologischen Faktoren bekannt, die den T/EQuotienten beeinflussen können. Pathologische Einflüsse, wie
z.B. ein androgenproduzierender Tumor, können allerdings im
Rahmen weiterer Untersuchungen abgeklärt werden.
Die T/E-Methode kann durch eine neue Methode, die
Kohlenstoffisotopen-Massenspektrometrie (IRMS = isotope
ratio mass spectrometry), abgesichert werden (6,7). Hierbei
wird das Verhältnis der Kohlenstoffisotope 13C und 12C von
Testosteron und/oder seiner Metaboliten ermittelt. Unter Isotopen eines Elementes werden Atome verstanden, die die
gleiche Anzahl an positiv geladenen Protonen aufweisen,
aber eine unterschiedliche Anzahl an Neutronen haben. Das
in der Natur am häufigsten vorkommende Kohlenstoffisotop
hat die Masse 12 (12C) und besteht aus 6 Protonen und 6 Neutronen. Dieses Isotop stellt ca. 98,85% der gesamten Kohlenstoffisotope in der Natur dar. Das Kohlenstoffisotop 13C besitzt 6 Protonen und 7 Neutronen und liegt mit nur 1.15%
gemessen am Gesamtkohlenstoff vor. Der Quotient aus 13C
und 12C von organischen Verbindungen ist dagegen notwendigermaßen keine konstante Größe. So unterscheidet
sich z.B. das 13C/12C-Verhältnis von körpereigenem Testosteron vom 13C/12C-Verhältnis des in medizinischen Präparaten enthalten Testosterons. Ein Grund hierfür sind die unterschiedlichen Synthesewege des Testosterons. Das medizinisch verwendete Testosteron, das aus pflanzlichen
Vorläufern (hauptsächlich Soja) gewonnen wird, hat einen
anderen Syntheseweg als das Testosteron im menschlichen
Organismus. Dieses ist eine Folge der unterschiedlichen Reaktionsgeschwindigkeit (kinetischer Isotopeneffekt) der 13Cund 12C-Isotope bei der Synthese organischer Verbindungen,
wobei in der Regel das 12C-Isotop aufgrund seiner geringere
Masse schneller reagiert als das 13C-Isotop. Als Resultat weisen die Endprodukte unterschiedliche 13C/12C-Verhältnisse
auf. Mit dieser Technik kann neben Testosteron auch die Anwendung weiterer verbotener körperidentischer Steroidhormone wie DHEA, Androstendion und Androstendiol kontrolliert werden.
Seit Anfang 1999 ist die Anwendung der KohlenstoffIsotopen-Massenspektrometrie zum Nachweis von Doping
mit körperidentischen AAS vom IOC anerkannt.
Peptidhormone
Erythropoietin
Eine Kontrolle von Dopingmanipulationen mit Erythropoietin (EPO), wobei eine Unterscheidung zwischen körpereigenem EPO (humanes, hEPO) und gentechnisch hergestelltem
EPO (rekombinantes, rEPO) erfolgen müsste, ist bisher im
Rahmen der Dopinganalytik noch nicht möglich. Es werden
derzeit zwei Ansätze zum Nachweis von EPO verfolgt: direkte sowie indirekte Nachweisverfahren. Besondere Aktualität hat zur Zeit ein direktes Nachweisverfahren, dass im
französischen Antidopinglabor entwickelt wurde und unter
dem folgenden Punkt näher beschrieben wird.
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Direktes Verfahren: Zwischen humanem EPO und rekombinantem EPO, das mittels gentechnisch veränderter Ovarienzellen chinesischer Hamster hergestellt wird, bestehen geringfügige Unterschiede in den Kohlenhydratketten. Hierbei
zeigt sich eine Heterogenität, die sich in einer unterschiedlichen Anzahl an negativ geladenen endkettigen Zuckergruppen (Sialinsäure) äußern können bzw. in der prozentualen Verteilung der beteiligten Zucker untereinander. Die
von den Autoren Lasne und de Ceaurriz (8) beschriebene
Methodik wendet eine Auftrennung nach Ladungen an, wobei eine elektrophoretische Trennung im Rahmen einer Isoelektrischen Fokusierung erfolgt. Eine anschließende Anfärbung mittels einer gegen EPO entwickelten Antikörperreaktion ergibt ein charakteristisches Pattern im elektrischen
Feld. Hierbei zeigen die bisherigen Ergebnisse, das eine Differenzierung zwischen humanem und rekombinantem EPO
grundsätzlich möglich ist. Eine Arbeitsgruppe des IOC hat
die bisherigen Daten der französischen Kollegen vor der
Tour de France 2000 eingesehen und vorgeschlagen, dass
zur endgültigen Absicherung der Methode (Validierung)
noch verschiedene physiologische Einflussfaktoren (u.a.
Höhenaufenthalt) auf dieses Pattern untersucht werden
müßten, um falsch postive Fälle auszuschließen. Ob diese
Methode dann für die Olympischen Spiele in Sydney einsetzbar ist, bleibt abzuwarten. Zumindest für die Tour de
France wurde vom Internationalen Radsportbund angekündigt, dass alle Kontrollproben während der Tour tiefgefroren
werden. Es wird eine Nachanalyse aller Proben erfolgen,
wenn diese direkte Bestimmungsmethode anerkannt ist.
Sanktionen werden bei positiven Fällen nachträglich ausgesprochen. Eine Anwendung dieser Methode zusammen mit
einem möglichen indirekten Nachweisverfahren ist weiterhin denkbar.
Indirekte Verfahren: Bei der indirekten Bestimmung werden
derzeit Blutparameter erfasst, die sich nach kurz- und langfristiger EPO-Anwendung verändern. Hierzu zählen die Gesamtzahl an Erythrozyten, der Hämatokritwert, die Gesamtzahl an Hämoglobin, die Hämoglobinkonzentration, die Anzahl an Reticulozyten, Makrozyten, die Konzentration an
Eisentransferrin-Rezeptor (9) und die Serum-konzentration
von EPO selber. Anhand dieser Blutparameter sollen durch
Verlaufskontrollen bei Athleten individuelle Blutprofile erstellt werden, die eine Möglichkeit zur Beurteilung einer Dopingmanipulation mit EPO ermöglichen. Eine solche Multivariantenmethode wurde von einer australischen Arbeitsgruppe kürzlich publiziert (10).
Wachstumshormon
Wie bei EPO besteht beim Wachstumshormon (HGH) die
Schwierigkeit zwischen dem HGH, das der Körper selber produziert und dem HGH; das von außen, zwecks Doping, zugeführt wurde, zu unterscheiden. Das humane sowie das
gentechnisch hergestellt HGH sind in ihrer Peptidstruktur,
der Aminosäuresequenz, 100% identisch. Im Gegensatz zum
EPO besitzt HGH keine Kohlenhydratanteile, wo Unterschiede theoretisch möglich wären.
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Dopingnachweis
Zur Zeit werden Nachweisverfahren für HGH entwickelt,
wobei Änderungen verschiedener HGH-abhängiger Blutparameter individuell erfasst werden. Nach HGH-Anwendung
kommt es zu einer Erhöhung des Insulinähnlichen Wachstumsfaktors 1 (IGF-1) sowie des Knochenwachstums-faktors
(Präcollagen III) (11,12). Weitere Methoden bestimmen die
Konzentration an 22 kD Wachstumshormon (Molekular-gewicht 22.000) zu einem 20 kD Wachstumshormonanalogen
(Molekulargewicht 20.000) (13) oder einem 17 kD Wachstumshormon (Molekulargewicht 17.000). Da das gentechnische HGH ein Molekulargewicht von 22 kD aufweist, erhöht
sich nach HGH-Applikation nur die 22 KD-Anteil, während
der 20 kD und 17 kD-Anteil relativ konstant bleiben soll. Eine Differenzierung zwischen Dopinganwendung und Körperproduktion wäre demnach möglich, da bei einer natürlichen Stimulation der HGH-Produktion, wie nach körperlicher Belastung, alle HGH-Varianten erhöht produziert
werden, ihre Verhältnisse aber keiner großen Änderung unterliegen. Dieses wäre eine ähnliche Methode wie die T/EQuotienten Methode.
6.
7.
8.
9.
1o.
11.
12.
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DEUTSCHE ZEITSCHRIFT FÜR SPORTMEDIZIN
Anschrift für die Autoren:
Prof. Dr. Wilhelm Schänzer
Institut für Biochemie
Deutsche Sporthochschule
Carl-Diem-Weg
50933 Köln
Jahrgang 51, Nr. 7+8 (2000)