Nachweis nicht zugelassener GVO 2005-2007

Transcription

Forschungsprogramm „Ernährung / Nahrungsmittelsicherheit“
der Landesstiftung Baden-Württemberg gGmbH
Molekularbiologische Verfahren zum
Nachweis von nicht-zugelassenen
gentechnisch veränderten Pflanzen
Abschlussbericht
Projekt: P-LS-E2/11
Zeitraum: 01.02.2005 - 31.01.2007
Chemisches und Veterinäruntersuchungsamt Freiburg
Bissierstrasse 5
79114 Freiburg
Projektleiter:
gez.Hans-Ulrich Waiblinger, gez. Dr. Klaus Pietsch
Durchführende:
Annette Anderson, Stefanie Meissner, Britta Ernst
Inhaltsverzeichnis
2 von 96 Seiten
Inhaltsverzeichnis
1
Einleitung ........................................................................................................................................ 4
1.1
Ziel des Forschungsprojektes.................................................................................................. 4
1.2
Gentechnisch veränderte Lebens- und Futtermittel ................................................................ 4
1.3
2
2.1
1.2.1
Aktuelle Situation.............................................................................................................. 4
1.2.2
Problematik der nicht zugelassenen gentechnisch veränderten Pflanzen ....................... 5
1.2.3
Stand der Technik beim Nachweis nicht zugelassener gv-Pflanzen ................................ 6
Projektteile/Arbeitsprogramm (siehe Kapitel 2 bis 4 des Berichts) .......................................... 7
Projektteil „Screening-Methoden“ ................................................................................................... 8
Einführung ............................................................................................................................... 8
2.1.1
Projekt „Screening Methoden“ - Ziele............................................................................... 8
2.1.2
Literaturrecherche und theoretische Vorarbeiten ............................................................. 9
2.1.3
Methodische Grundlagen des Nachweises gentechnisch veränderter Pflanzen in
Lebensmitteln mit der PCR und der Real-time PCR....................................................................... 9
2.1.4
2.2
2.3
Material und Methoden.......................................................................................................... 12
2.2.1
Teil A: Allgemeines Verfahren........................................................................................ 12
2.2.2
pat-Gen .......................................................................................................................... 21
2.2.3
bar-Gen .......................................................................................................................... 22
2.2.4
pat/bar-Duplex-System................................................................................................... 23
2.2.5
P35S/T-nos-Duplex-System ........................................................................................... 25
2.2.6
P35S/T-nos/hmga-Triplex-System ................................................................................. 27
Ergebnisse und Diskussion ................................................................................................... 29
2.3.1
Singleplex Real-time PCR: Auswahl weiterer Sequenzen für Screening ....................... 29
2.3.2
Singleplex-Real-time PCR: Validierung neuer Nachweissysteme.................................. 32
2.3.2.1
pat-Gen ................................................................................................................... 32
2.3.2.2
bar-System.............................................................................................................. 33
2.3.3
Duplex-Real-time PCR: Etablierung von Systemen ....................................................... 35
2.3.3.1
pat/bar-Duplex Real-time PCR-System .................................................................. 35
2.3.3.2
P35S/T-nos-Duplex Real-time PCR-System........................................................... 38
2.3.4
3
Vorbemerkungen zu den Optimierungsversuchen ........................................................... 9
Triplex-Real-time PCR: Erprobung und Optimierung eines Systems............................. 49
Projektteil „Microarrays“................................................................................................................ 55
3.1
Vorbemerkung ....................................................................................................................... 55
3.2
Eppendorf Dual Chip - Material und Methoden, Prinzip ..................................................... 56
3.3
Ergebnisse............................................................................................................................. 58
3.3.1
Konsequenzen für die Praxis ......................................................................................... 59
Forschungsvorhaben
Abschlussbericht
“Molekularbiologische Nachweisverfahren von nicht-zugelassenen gentechnisch veränderten Pflanzen“
Inhaltsverzeichnis
4
3 von 96 Seiten
Projektteil „Genomic walking“ ....................................................................................................... 61
4.1
Einführung ............................................................................................................................. 61
4.2
TAIL-PCR .............................................................................................................................. 62
4.3
Ligationsvermittelte PCR (Ligation-mediated PCR, LM-PCR)............................................... 64
4.4
SiteFinding-PCR.................................................................................................................... 65
4.5
Material und Methoden.......................................................................................................... 68
4.5.1
Pflanzenmaterial............................................................................................................. 68
4.5.2
DNA-Extraktion............................................................................................................... 68
4.5.3
TAIL-PCR ....................................................................................................................... 68
4.5.3.1
Oligonukleotide ....................................................................................................... 68
4.5.3.2
TAIL-PCR Lauf 1..................................................................................................... 69
4.5.3.3
TAIL-PCR Lauf 2 (nested PCR) .............................................................................. 70
4.5.3.4
TAIL-PCR Lauf 3 (second nested PCR) ................................................................. 71
4.5.3.5
Agarosegelelektrophorese und Aufreinigung der PCR-Produkte............................ 71
4.5.3.6
Sequenzierung ........................................................................................................ 72
4.5.4
4.5.4.1
Restriktionsverdau der genomischen DNA ............................................................. 72
4.5.4.2
Ligation der Adaptoren an die Restriktionsschnittstellen ........................................ 73
4.5.4.3
PCR-Amplifikation 1 der LM-PCR ........................................................................... 75
4.5.4.4
PCR-Amplifikation 2 der LM-PCR (nested PCR) .................................................... 76
4.5.4.5
Sequenzierung ........................................................................................................ 77
4.5.5
4.6
Ligation-mediated PCR (LM-PCR) ................................................................................. 72
SiteFinding-PCR............................................................................................................. 77
4.5.5.1
Oligonukleotide ....................................................................................................... 77
4.5.5.2
Site-Finding-Reaktion.............................................................................................. 77
4.5.5.3
SiteFinding-PCR 1 .................................................................................................. 78
4.5.5.4
SiteFinding-PCR 2 .................................................................................................. 79
4.5.5.5
Agarosegelelektrophorese und Aufreinigung der PCR-Produkte............................ 79
4.5.5.6
Sequenzierung ........................................................................................................ 80
Ergebnisse und Diskussion ................................................................................................... 81
4.6.1
TAIL-PCR ....................................................................................................................... 81
4.7
LM-PCR................................................................................................................................. 84
4.8
SiteFinding-PCR.................................................................................................................... 86
5 Zusammenfassung ....................................................................................................................... 89
5.1
Erreichen der Meilensteine.....................................................................................................91
6
Literaturverzeichnis....................................................................................................................... 92
7
Anhang ......................................................................................................................................... 95
7.1
Poster und Tagungsbeiträge ................................................................................................. 95
7.2
Abkürzungsverzeichnis.......................................................................................................... 96
Forschungsvorhaben
Abschlussbericht
Einleitung
1
4 von 96 Seiten
Einleitung
1.1
Ziel des Forschungsprojektes
Ziel des Forschungsprojekts ist es, molekularbiologische Methoden zum Nachweis nicht zugelassener bzw. in der EU nicht sicherheitsbewerteter gentechnisch veränderter Pflanzen (gv-Pflanzen, GVP)
zu etablieren. Die in Vergleichsuntersuchungen validierten Nachweisverfahren sollen dann in die
Routine der Lebensmittelüberwachung eingeführt werden. Dadurch werden Kontrollinstrumente in
diesem für den Täuschungsschutz sowie den vorbeugenden gesundheitlichen Verbraucherschutz
relevanten Bereich verfügbar gemacht. Anhand der Etablierung von Methoden zum Nachweis von in
der EU nicht zugelassenen bzw. nicht sicherheitsbewerteten gentechnisch veränderter Pflanzen soll
gerade derjenige Bereich der GVP abgedeckt werden, für den in absehbarer Zeit keine geeigneten
Nachweisinstrumente offiziell verfügbar sein werden. Während des Forschungsvorhabens (im Herbst
2006) wurde die Problematik am konkreten Fall des nicht zugelassenen Reis LL601 sehr deutlich. Die
Erfahrung zeigte, dass insbesondere die Verfügbarkeit leistungsfähiger Screeningverfahren für die
Praxis sehr wichtig ist. Die im Rahmen des Forschungsvorhabens bis dahin etablierten Methoden
konnten bereits in der Routine erfolgreich eingesetzt werden.
1.2
1.2.1
Gentechnisch veränderte Lebens- und Futtermittel
Aktuelle Situation
Seit April 2004 sind die neuen EU-Verordnungen für gentechnisch veränderte Lebens- und Futtermittel in Kraft [1]. Nach Absicht der EU-Kommission soll mit mehr Transparenz, klaren ZulassungsRegelungen und einer deutlich erweiterten Kennzeichnungspflicht die derzeitige Stagnationsphase
bei der grünen Gentechnik in der EU beendet werden. Allerdings haben 2006 die Funde von nicht
zugelassenem gv Reis die Diskussion um die Gentechnik in Lebensmitteln wieder entfacht. Auch die
Zulassungsverfahren für GVP in der EU sind ins Stocken geraten. Ende 2006 standen 30 Zulassungen bei Mais, Raps, Soja und Baumwolle mittlerweile 36 offene Zulassungsanträge gegenüber.
Während derzeit der Anbau von GVP (insbesondere Soja, Mais, Raps) weltweit weiter zunimmt, ist
die großflächige Einführung der grünen Gentechnik in der Europäischen Union auf Ebene des Anbaus weiterhin noch nicht abzusehen. Auf nationaler Ebene soll im Rahmen der Novellierung des
Gentechnikgesetzes mit der Einführung allgemeiner Haftungsregelungen beim Anbau von GVP die
Koexistenz konventioneller, ökologischer und gentechnisch veränderter Anbauformen ermöglicht
werden.
Die neuen EU-Regelungen für gentechnisch veränderte Lebens- und Futtermittel bringen für die Überwachung hinsichtlich der analytischen Überprüfung auf GVP deutliche Erleichterungen mit sich: Im
Rahmen des Zulassungsverfahrens müssen Antragsteller sowohl Kontrollproben als auch spezifische
Methoden zum Nachweis der jeweiligen GVP zur Verfügung stellen. Die Methoden werden im Rah-
Forschungsvorhaben
Abschlussbericht
Einleitung
5 von 96 Seiten
men eines neu gegründeten, Europäischen Netzwerkes für GMO-Laboratorien (ENGL) auf ihre Eignung überprüft und validiert. Nach erfolgter Zulassung werden die Methoden über das „Molecular
Register“ öffentlich zugänglich gemacht.
Weltweit sind mittlerweile über 100 gentechnisch veränderte Pflanzen, die überwiegend auch für Lebensmittelzwecke verwendet werden können, zugelassen [2-5]. Diese Zulassungen erstrecken sich
teilweise auf nur wenige Länder bzw. begrenzte Anwendungsbereiche.
Demgegenüber bestanden bis zum Inkrafttreten der neuen Regelungen für den europäischen Markt
lediglich Genehmigungen für Produkte aus 16 GVP [6].
1.2.2
Problematik der nicht zugelassenen gentechnisch veränderten Pflanzen
LL601-Reis
Einer der größten amerikanischen Reishersteller hatte bei Qualitätskontrollen Anfang 2006 Verunreinigungen durch nicht zugelassenen, gentechnisch veränderten herbizidresistenten „LibertyLink“-Reis
(LL601) festgestellt. Im August informierte die für die Entwicklung der Sorte LL601 verantwortliche
Firma Bayer Crop Science die Öffentlichkeit über mögliche Verunreinigungen in US-Langkornreis.
Noch fehlen genaue Informationen, doch sehr wahrscheinlich wurde US-Langkornreis über das Saatgut mit nicht zugelassenem LL601-Reis verunreinigt. Zwischen 1999 und 2001 wurde am Reisforschungsinstitut der Universität Louisiana mehrere herbizidresistente Reis-Sorten, so auch LL601, im
Auftrag der Firma Aventis Crop Science im Freiland getestet. Nach Übernahme durch Bayer Crop
Science wurden die Tests mit LL601 nicht weiter verfolgt. Dennoch muss es zu einer Verunreinigung
des dort hergestellten, konventionellen Basis-Saatguts gekommen sein, möglicherweise aufgrund von
Durchwuchs aus Reiskörnern, die nicht vollständig von dem ehemaligen Freisetzungsareal entfernt
worden sind. Bei der Vermehrung von Saatgut aus verunreinigtem Basis-Saatgut hat sich dann möglicherweise LL601-Reis großflächig ausgebreitet.
Sequenzinformationen, welche kurz nach Bekanntwerden des Falls verfügbar waren, bestätigten,
dass LL601 mit Screening-Verfahren erfasst werden kann.
Papaya, Bt10-Mais
Zuvor wurde ebenfalls im EU-Schnellinformationssystem über den Nachweis gentechnisch veränderter Papayas bei Proben aus dem deutschen Lebensmittelhandel berichtet. Entsprechende Früchte
sind in der EU nicht zugelassen, lediglich in den USA und Japan bestehen begrenzte Zulassungen.
Der Nachweis erfolgte anhand von Screening-Methoden und Datenbank-Recherchen. Geeignete Informationen für einen spezifischen Nachweis waren bis dato nicht verfügbar.
Im Jahr 2005 wurde aus den USA eine mögliche Verunreinigung von Maisprodukten (v.a. Maisgluten)
durch nicht zugelassenen Bt10-Mais bekannt, einem Transformationsevent, welcher dem zugelasse-
Forschungsvorhaben
Abschlussbericht
Einleitung
6 von 96 Seiten
nen Event Bt11 sehr ähnlich ist. Auch hier zeigte sich, dass beide Events von Screening-Verfahren
sicher erfasst werden können.
Vor wenigen Jahren mussten in den USA große Mengen an Lebensmitteln auf Maisbasis (TacoShells) zurückgerufen werden, weil darin eine lediglich für Futtermittel zugelassene gentechnisch veränderte Maissorte (Star Link) nachgewiesen wurde. Star Link - Mais war nicht für Lebensmittelzwecke
allgemein zugelassen, da ein Verdacht auf ein erhöhtes allergenes Potential vorlag. Die Maissorte ist
bis heute noch nicht für Lebensmittelzwecke zugelassen.
1.2.3
Stand der Technik beim Nachweis nicht zugelassener gv-Pflanzen
Zum Nachweis von gentechnisch veränderten Pflanzen werden überwiegend molekularbiologische
Verfahren, in erster Linie basierend auf der Polymerasekettenreaktion (PCR) eingesetzt. Mit dem
quantitativen Verfahren, der Real-time PCR können Anteile an genetisch veränderter DNA und somit
Anteile an Bestandteilen aus GVP in Lebensmitteln ermittelt werden [7 - 17].
Bei der Auswahl der DNA-Sequenzen für den Nachweis von GVP in Pflanzen werden derzeit folgende Strategien unterschieden [12, 17]:
Für einen Screening-Nachweis werden DNA-Sequenzen vervielfältigt, die in vielen verschiedenen
gv-Pflanzen enthalten sind und deren Nachweis ein starkes Indiz für vorhandene GVP darstellt (z.B.
Blumenkohlmosaikvirus-35 S Promotor (P35S), Nopalinsynthase-Terminationssequenz aus A. tumefaciens (T-nos), Phosphinotricin-Acetyltransferase-Gen (pat), Kanamycinresistenzgen npt II [7].
Dieses Verfahren kann auch wertvolle Hinweise auf nicht-zugelassene gv-Pflanzen liefern [10, 31] da
die nachgewiesenen Sequenzen bei der Entwicklung vieler gv-Pflanzen verwendet werden.
Für den konstrukt-spezifischen Nachweis werden Sequenzen aus DNA-Konstrukten (z.B. Teile aus
Plasmidvektoren) nachgewiesen, die zur Veränderung von gentechnisch veränderten Pflanzen eingesetzt werden. Durch die Amplifizierung von überlappenden Sequenzen (z.B. P35S in das pat-Gen)
wird eine für das jeweilige Konstrukt und somit eine für die jeweilige gentechnische Veränderung charakteristische Sequenz nachgewiesen.
Schließlich werden bei dem event-spezifischen Nachweis Sequenzen nachgewiesen, die für die
jeweilige Linie (Transformante) charakteristisch sind (z.B. Bt11-Mais). Durch die Amplifizierung von
Sequenzen im Bereich der Integrationsstelle des Transformationsvektors in das Pflanzengenom (z.B.
Maisgenom in das cry(I)a (b) -Gen) wird eine für das jeweilige Transformationsereignis (Event) charakteristische Sequenz nachgewiesen.
Forschungsvorhaben
Abschlussbericht
Einleitung
1.3
7 von 96 Seiten
Projektteile/Arbeitsprogramm (siehe Kapitel 2 bis 4 des Berichts)
-
Teil: “Screening-Methoden“ (Kapitel 2)
-
Teil: „Microarrays“ (Kapitel 3)
-
Teil: „Genomic walking“, Ermittlung Event-spezifischer Sequenzen (Kapitel 4)
Forschungsvorhaben
Abschlussbericht
Teil „Screening-Methoden“ - Einführung
2
8 von 96 Seiten
Projektteil „Screening-Methoden“
2.1
Einführung
Hinweise auf in der EU nicht zugelassene GVP können anhand von Screening-Methoden [7, 12] erhalten werden. Durch Auswahl geeigneter Sequenzen für den Nachweis kann mit Hilfe von Datenbanken [2-5] in vielen Fällen eine Eingrenzung der in Frage kommenden Events durchgeführt werden.
Derartige Screening-Methoden in Verbindung mit der Real-time PCR können auch zur semiquantitativen Bestimmung des Anteils an GVP eingesetzt werden. Dies ist insbesondere wertvoll beim Selektieren von Proben, die lediglich technisch unvermeidbare, minimale Spuren von GVP-Bestandteilen
enthalten und daher in der Regel verkehrsfähig sowie nicht kennzeichnungspflichtig sind.
Bisher werden in der Routineuntersuchung die Proben bzw. die daraus extrahierte DNA separat für
jede zu bestimmende Sequenz mittels Real time PCR (single-PCR) untersucht. Dies ist allerdings
Zeit- und insbesondere kostenaufwendig.
In den letzten Jahren wurde über die Anwendung von Multiplex-Verfahren zum Nachweis von GVP
basierend auf der Real-time PCR berichtet [20]. Entsprechende Verfahren basieren auf der Kombination verschiedener Primerpaare in einem Reaktionsansatz; die simultane Detektion kann z.B. durch
die Anwendung jeweils spezifischer Hybridisierungssonden erfolgen, die mit Fluoreszenzfarbstoffen
unterschiedlicher Emissionsmaxima gekoppelt sind. Eine gleichzeitige Detektion der unterschiedlichen PCR-Amplfikate bzw. der Fluoreszenz daran hybridisierender Sonden ist mit geeigneten Realtime PCR-Geräten möglich.
Hauptschwierigkeit bei der Verwendung von Duplex- oder Multiplex-Systemen ist die u.U. erhöhte
Störanfälligkeit und geringere Sensitivität solcher Verfahren. Insbesondere die Etablierung solcher
Verfahren erfordert einen erhöhten Aufwand und große Sorgfalt.
2.1.1
-
Projekt „Screening Methoden“ - Ziele
Single Real-time PCR: Auswahl weiterer für Screening-Methoden geeignete Sequenzen:
bar-Gen, pat-Gen; Etablierung, Validierung des Screenings
-
Duplex-Real-time PCR. Etablierung von Systemen mit ausreichender Sensitivität:
T-nos / P35S; Etablierung, Validierung des Screenings
einschließlich Ringversuch
bar-/pat-Duplex-Real-time PCR, Etablierung und Validierung des Screenings
-
Triplex-PCR: Erprobung der Kombination des Transgen-Nachweis mit artenspezifischem Referenz-Gen: T-nos / P35S/Mais-Referenzgen
Forschungsvorhaben
Abschlussbericht
2.1.2
9 von 96 Seiten
Literaturrecherche und theoretische Vorarbeiten
Im Rahmen des Forschungsprojekts wurde zunächst eine Bewertung der in der Fachliteratur publizierten Methoden für Duplex- bzw. Multiplex-Real-time PCR zum quantitativen Nachweis von GVP
vorgenommen. Mit Hilfe verschiedener Datenbanken [2-5] wurden aktuelle Entwicklungen der Zulassungen und Notifizierungen von GVP in der EU und die Charakteristika der jeweils verwendeten Konstrukte ermittelt.
Da bereits mittels Screening-Methoden Hinweise auf in der EU nicht zugelassene GVP erhalten werden, wurden weitere, für ein Screening-Verfahren geeignete Sequenzen ausgewählt. Vielfach können
durch den Nachweis der geeigneten Screening-Sequenzen in einer GVP bereits in Frage kommende
Events eingegrenzt werden.
Derartige Methoden in Verbindung mit der Real-time PCR können auch zur semiquantitativen Bestimmung des Anteils an GVP eingesetzt werden. Dies ist insbesondere wertvoll beim Selektieren von
Proben, die lediglich technisch unvermeidbare, minimale Spuren von GVP-Bestandteilen enthalten
und daher in der Regel verkehrsfähig sowie nicht kennzeichnungspflichtig sind.
2.1.3
Methodische Grundlagen des Nachweises gentechnisch veränderter Pflanzen in Lebensmitteln mit der PCR und der Real-time PCR
Der Nachweis von GVP mittels PCR-Methoden gliedert sich in vier aufeinanderfolgende Schritte:
DNA-Extraktion aus der Probe, Amplifikation charakteristischer Sequenzen in der PCR, Detektion und
Verifizierung der gesuchten Sequenzen. Die Detektion und Verifizierung erfolgen entweder über Agarose-Gelelektrophorese und anschließende Restriktion, Sequenzierung, Hybridisierung o.ä. oder simultan durch Hybridisierung mit spezifischen fluoreszenzmarkierten Sonden in der Real-time PCR.
Bei der Duplex bzw. Multiplex-PCR mit Real-time PCR werden parallel zwei bzw. mehrere DNASequenzen amplifiziert. Die gebildeten PCR-Produkte werden jeweils nach Anlagerung einer spezifischen, fluoreszenzmarkierten Sonde, die innerhalb des PCR-Produktes hybridisiert, durch Erzeugung
eines Fluoreszenz-Signals gemessen. Dabei werden für beide bzw. mehrere Sonden unterschiedliche
Fluoreszenzfarbstoffe verwendet, die in verschiedenen Kanälen des Real-time PCR-Gerätes gemessen werden können.
2.1.4
Vorbemerkungen zu den Optimierungsversuchen
Effizienz der PCR
Ziel der Optimierung eines Multiplex-Real-time PCR-Assays ist, dass alle Zielsequenzen möglichst
mit vergleichbarer guter Effizienz vervielfältigt werden und diese Effizienz auch mit derjenigen der
Singleplex-PCR-Assays vergleichbar ist.
Forschungsvorhaben
Abschlussbericht
10 von 96 Seiten
Bei optimaler Effizienz wird in jedem PCR-Zyklus die Zahl der PCR-Produkte verdoppelt:
y = x (1+E)n
mit
E=
PCR-Effizienz
x=
ursprüngliche Zahl der Targets (Kopien)
y=
Zahl der Targets im Zyklus n
Die Effizienz einer PCR kann aus der Steigung (slope) einer Standardreihe entnommen werden:
E = 10 (-1/slope) - 1
Wenn die Steigung -3,32 beträgt, ist die PCR-Effizienz optimal (=100%; E =1) [18].
Besonders beim Überschuss einer Zielsequenz in einem Multiplex-Assay kann die in geringerer Menge vorhandene Sequenz in ihrer Amplifikation durch kompetitive Effekte unterdrückt werden.
Um auch bei Anwesenheit mehrerer Targets für die PCR jeweils optimale PCR-Bedingungen zu erhalten, sind eine große Zahl von Parametern zu berücksichtigen, die die PCR-Effizienz beeinflussen
können, z.B. Konzentration der Taq-Polymerase, der Nukleotide, Zusammensetzung des Puffers einschließlich der Magnesiumsalzkonzentration.
Gegen Ende des Forschungsvorhabens war absehbar, dass immer mehr kommerzielle MultiplexReal-time PCR Kits angeboten werden, die speziell für diese Parameter universelle, optimale Bedingungen bieten. Da hier in der Zukunft eine breite Palette kommerzieller Kits zu erwarten ist, konzentrierte sich die Optimierung nicht auf diese Reagenzien.
Primer und Sonden
Für die Real-time Multiplex PCR sollten Primer-Sondensysteme verwendet werden, die ein möglichst
ähnliches Amplifikationsverhalten gewährleisten. Schmelzpunkte der Primer-/ Sondensysteme sollten
möglichst identisch sein, auch die Länge der Amplikons sollte ähnlich (ca. 80-100 bp) sein.
Im Rahmen des Forschungsvorhabens wurden Primer-Sonden-Systeme verwendet, die möglichst
diese Anforderungen erfüllen.
Die Optimierungsversuche der Duplex-Real-time PCR Assays erfolgten
a) durch Limitierung der Primer für das System der besseren PCR-Effizienz bzw. des ReferenzSystems (Überschuss an PCR-Targets), um mögliche kompetitive Effekte zu minimieren.
b) durch Optimierung der Sondenkonzentration: Möglichst hohe Sondenkonzentrationen (üblicher
Bereich der Optimierung = 50 bis 300 nM) können besonders bei niedrigen Targetkonzentrationen,
wie sie bei geringen GVO-Verunreinigungen möglich sind, eine Erhöhung der Fluoreszenz (gemessen als sogenannter ∆Rn-Wert) und damit auch der Sensitivität bewirken [18].
Forschungsvorhaben
Abschlussbericht
11 von 96 Seiten
Sensitivität der GVO-Analytik
Ziel der Optimierung von Screening-Methoden für den Nachweis von GVO ist neben einer ausreichenden Spezifität in erster Linie die Sensitivität der Methode: Ziel der Methodenoptimierung sollte
sein, Nachweisgrenzen im Bereich von 10 Genomkopien zu erreichen. Im Ringversuch validierte Methoden weisen derartige Sensitivitäten auf [15]. Bei pflanzlichen Rohstoffen entspricht dies etwa einer
relativen Nachweisgrenze von 0,02 bis 0,05% [11].
Das Ziel für die Optimierung der Sensitivität in der Real-time PCR lag daher zuerst bei folgenden Parametern:
Erfolgreiche Amplifikation niedriger Kopienzahlen bei möglichst niedrigen Ct-Werten und möglichst
starkem Anstieg der Fluoreszenz (großes ∆Rn).
Forschungsvorhaben
Abschlussbericht
Teil „Screening-Methoden“ - Material und Methoden
2.2
12 von 96 Seiten
Material und Methoden
Im folgenden Kapitel werden die erarbeiteten Screening-Methoden einschließlich der Validierungsdaten erläutert.
Die Beschreibung gliedert sich in
•
Teil A: Allgemeines Verfahren zur Durchführung der Real-time PCR
•
Teil B: Spezieller Teil mit jeweiligen methodenspezifischen Daten
Die modulare Beschreibung der Methoden mit Verweis auf ein allgemeines Verfahren wurde gewählt,
weil dies dem Konzept der Normen zur GVO-Analytik [14-17] sowie dem Aufbau des QM-Systems
des CVUA Freiburg entspricht. Die Methoden können deshalb direkt als Prüfverfahren für die amtliche
Überwachung eingesetzt werden.
2.2.1
Teil A: Allgemeines Verfahren
Diese Methode beschreibt ein allgemeines Verfahren zum semiquantitativen Screening auf Anteile an
gentechnisch veränderten Pflanzen (GVP) in Erzeugnissen mit Zutaten aus der entsprechenden
Pflanzenspezies (Lebensmittel, Futtermittel, Saatgut) mittels Real-time PCR (Polymerasenkettenreaktion).
Dieses Verfahren ist die Grundlage für die folgenden spezifischen Prüfverfahren und wird immer zusammen mit diesen verwendet:
• Quantifizierung von gentechnisch veränderten Pflanzen mittels Real-time PCR Teil B: Screening-PCR (s. nachfolgende Kapitel)
• Quantifizierung von gentechnisch veränderten Pflanzen mittels Real-time PCR Teil C: Spezies-spezifische PCR. Hierzu wird auf die bereits standardisierten [15] bzw. am CVUA
Freiburg etablierten Verfahren verwiesen (z.B. spezifische Verfahren zur Real-time PCRAmplifikation spezifischer DNA-Sequenzen aus Mais, Raps, Soja oder Reis).
Die Quantifizierung erfolgt, sofern Referenzmaterial und Methode vorhanden sind, mittels Eventspezifischer Verfahren. Wenn dies nicht der Fall ist (z.B. nicht zugelassene GVP) oder wenn der abgeschätzte Anteil bei zugelassenen GVP weniger als 0,1% beträgt, kann das Verfahren auch zur semiquantitativen Abschätzung des Anteils verwendet werden.
1. Kurzbeschreibung
In einer ersten PCR wird aus der Proben-DNA zunächst eine Pflanzenart-spezifische Sequenz amplifiziert. In einem weiteren PCR-System wird die für die jeweilige gentechnisch veränderte Pflanze charakteristische Sequenz (GVP-spezifische Sequenz) oder eine bei verschiedenen gentechnisch veränForschungsvorhaben
Abschlussbericht
13 von 96 Seiten
derten Pflanzen gemeinsam vorhandene Sequenz (GVP-Screening) amplifiziert. Die gebildeten
Amplikons werden nach Anlagerung sequenzspezifischer Sonden durch die Erzeugung eines Fluoreszenz-Signals gemessen. Zur Auswertung werden externe Standard-Reihen mit Verdünnungen von
Pflanzenspezies-DNA bzw. von DNA aus der jeweiligen gentechnisch veränderten Pflanze verwendet. Bei Proben und Standards wird die jeweiligen Zyklenzahl ermittelt, bei der das Fluoreszenzsignal
einen vorgegebenen Schwellenwert überschreitet (Ct-Wert). Zur Quantifizierung des relativen Anteils
an DNA aus GVP in der Gesamt-Pflanzenspezies-DNA der Probe werden die aus den jeweiligen CtWerten abgeleiteten Kopienzahlen herangezogen.
2. Chemikalien/Materialien/Referenzsubstanzen
2.1 PCR-Reagenzien (s. auch Anhang)
PCR-Primer
-
HPLC-gereinigt oder vergleichbare Qualität
-
Primersequenzen und Konzentrationen siehe jeweils Abschnitt 2 der jeweiligen spezifischen Prüfverfahren zur Quantifizierung von GVP:
Sonden
-
Sequenzen, Sondenmarkierung und Konzentrationen siehe Abschnitt 2 der jeweiligen spezifischen Prüfverfahren zur Quantifizierung von GVP.
-
Synthese von Sonden z.B. durch Firma TIB MolBiol, Berlin; Hermann GbR, Freiburg oder Eurogentec, Belgien.
a) Für Singleplex-Real-time PCR werden FAM/TAMRA-markierte Sonden, sogenannte „TaqManProbes“ verwendet (FAM: 6-carboxyfluorescein, TAMRA: 6-carboxytetramethylrhodamin).
b) Für Duplex- und Multiplex- Real-time PCR sollten Fluoreszenz-Farbstoffe verwendet werden,
deren Spektren möglichst geringe Überlappungen zeigen.
Tabelle 2-1: Absorption- und Emissionsmaxima ausgewählter Farbstoffe für TaqMan-Sonden
[20].
Farbstoff
Absorption (nm)
Emission
FAM
494
525
Yakima Yellow (YY)
526
548
VIC
528
554
TAMRA
565
580
CY5
643
667
Forschungsvorhaben
Abschlussbericht
14 von 96 Seiten
Weiterhin ist zu bedenken, dass der Quencher TAMRA auch Eigenfluoreszenz zeigt (s. Tabelle), was
zu einem schlechten Signal-Rausch-Verhalten führt. Sogenannte Dark-Quencher (z.B. Black Hole
Quencher BHQ geben die aufgenommene Energie nicht in Form von Licht, sondern von Wärme ab.
Durch das geringere Hintergrundrauschen (größeres ∆Rn) kann eine höhere Sensitivität in der Multiplex-PCR erreicht werden. Es wurden daher Sonden mit jeweils geeigneten Dark-Quenchern [20] für
die Multiplex-PCR eingesetzt.
Reagenzien für die Real-time PCR (GeneAmp 7500)
Es wird im Regelfall der „2xUniversal PCR Master Mix der Fa. ABI verwendet (z.B. Art. Nr. 430 4437).
Für die Triplex Real-time PCR wurde außerdem eingesetzt:
QIAGEN QuantiTect Multiplex PCR Kit, Cat. No. 204543 (QIAGEN, Hilden)
2.2 Standard-DNA für die Kalibrierung
Auswahl des Materials
DNA, isoliert aus zertifizierten Referenzmaterialien oder Vergleichsmaterialien:
Bevorzugt werden Materialien des IRMM, Geel (B) (z.B. erhältlich bei Fluka) mit definierten Anteilen
an GVP eingesetzt.
In Einzelfällen, soweit solche Materialien nicht verfügbar sind, können entsprechende Mischungen
aus Vergleichsmaterialien mit „100%“ -Anteil GVP und „0%“-GVP-Material hergestellt werden (Materialien (z.B. Körner) jeweils feinst mahlen, z.B. mit Waring Blender oder Thermomix, und Mischungen
in geeigneten Gewichtsanteilen (z.B. 5% GVP) herstellen).
Zur Herstellung von Kalibrierreihen (-Verdünnungen) sollte Material mit einem möglichst hohen GVPAnteil eingesetzt werden, z.B. Maismehl mit 5% Anteil Bt176-Mais.
DNA-Isolierung und photometrische Bestimmung
Die Isolierung der DNA sollte möglichst mit denselben Methoden erfolgen, welche zur DNA-Extraktion
aus den Proben angewendet wurde: Im Regelfall wird die DNA mit dem DNeasy Plant Mini Kit
(QIAGEN, Hilden) isoliert, zusätzlich kann eine Aufreinigung über Microspin Columns (Pharmacia)
oder QiAQuick Purification Columns erfolgen.
Die photometrische Bestimmung der DNA-Konzentration der Extrakte wird entsprechend der Schweizer Lebensmittelbuch-Methode [19] durchgeführt.
Der photometrisch bestimmte Gehalt der DNA wird gemäß folgendem Umrechnungsfaktor auf Kopienzahlen umgerechnet (Anm. die Kopienzahl stellt lediglich eine rechnerische Hilfsgröße dar, nur
das Verhältnis der Kopienzahlen von GVP-Zielsequenz-DNA zu Spezies-DNA, nicht aber ihr absoluter Wert ist für die Quantifizierung des GVP-Anteils von Bedeutung).
Forschungsvorhaben
Abschlussbericht
15 von 96 Seiten
Die Genomgewichte können dazu aus der Literatur entnommen werden. In der folgenden Tabelle
sind die daraus berechneten Durchschnittswerte pro haploidem Genom für die wichtigsten Pflanzen
aufgelistet [22]:
Tabelle 2-2: Genomgewichte für verschiedene Pflanzen
Pflanzenspezies
Durchschnittliches Gewicht pro haploidem Genom (pg)
Mais (Zea mays)
2,73
Soja (Glycine max)
1,13
Raps (Brassica napus)
1,15
Reis (Oryza sativa)
0,50
Bei single copy-Genen kann die Kopienzahl aus der gemessenen DNA-Konzentration wie folgt berechnet werden:
Kopienzahl Pflanzen-Spezies-DNA pro 5 µl =
DNA − Konz.[ng / µl ]∗5[µl ]∗1000
hapl. Genomgewicht[ pg ]
bzw. für Sequenzen aus GVP:
Kopienzahl GVP-DNA pro 5 µl =
DNA − Konz.[ng / µl ]∗% GVP∗5[µl ]∗1000
hapl. Genomgewicht[ pg ]
% GVP = prozentualer Anteil (Gew.%) des GVP im jeweiligen Vergleichsmaterial
Herstellung von DNA-Verdünnungen für die Kalibrierung
Aus DNA-Lösung (Stammlösung) werden geeignete Verdünnungen hergestellt (Verdünnung mit
0,2xTE).
2.3 Qualitäts-Kontroll-Proben
DNA, isoliert aus einer Probe mit bekanntem GVP-Anteil; z.B. Vergleichsmaterial IRMM (Fa. Fluka),
z.B.1% Bt11 Mais.
Die Isolierung der DNA sollte möglichst mit demselben Prüfverfahren erfolgen, welches zur DNAExtraktion aus den Proben angewendet wurde.
Geeignete DNA-Konzentrationen für die PCR: 10-50 ng/µl.
Forschungsvorhaben
Abschlussbericht
16 von 96 Seiten
3. Geräte/Hilfsmittel (s. auch Anhang)
• Real-Time PCR-System: GeneAmp 7500 (Applied Biosystems)
• Laborzentrifuge für Mikroreaktionsgefäße (2,0 ml; z.B. Eppendorf 5415 C)
• PCR-Platten (96-Well Optical Reaction Plate; z. B. PE, Art.Nr. 4306737)
• Deckfolie für PCR-Platten (Optical Adhesive Cover; z.B. Art.Nr. 4313663)
• Kolbenhubpipetten (diverse Volumina)
• Filter-Tips, steril (diverse Volumina)
4. Durchführung (s. auch Anhang)
Programmieren des PCR-Laufs
Die jeweiligen PCR-Ansätze des Laufs im „setup“ Modus benennen
(mindestens die Position der Standards und der unbekannten Proben)
Temperatur-Zeit-Programm für den PCR-Lauf ist im Gerät schon vorgegeben; es bleibt unverändert
für alle PCR.
Schritt
Zeit
Temperatur
UNG-Aktivität*
2 min
50°C
Aktivierung AmpliTaqGold Polymerase
10 min
95°C
Amplifikation (40 Zyklen)
15 s
95°C
60 s
60°C
*System zur Vermeidung von „carry-over“-Kontaminationen. Kontaminierende Amplikons werden vor der PCR
durch das Enzym Uracil-N-Glykosylase (UNG) abgebaut.
Herstellung des Mastermixes (Volumina pro 25 µl-Ansatz)
Der Mastermix wird durch Mischen der im Folgenden genannten Reagenzien hergestellt (genannte
Volumina mit der Zahl der PCR-Ansätze (einschließlich Kontrollen und Standards) multiplizieren),
dabei Pipettierreserve berücksichtigen):
⇒ bei Multiplex-PCR, ggf. auch bei Singleplex-PCR ggf. Abweichungen von folgendem Pipettierschema beachten: siehe jeweilige spezifische Methode zur Quantifizierung von GVP
Forschungsvorhaben
Abschlussbericht
17 von 96 Seiten
Reagenzien
Endkonzentration in
Volumen (µl)
PCR-Ansatz
Primer 1 (Pflanzen-Spezies-PCR bzw. GVP-PCR)
300 nM
2,5
Primer 2 (Pflanzen-Spezies-PCR bzw. GVP-PCR)
300 nM
2,5
TaqMan
-Sonden
100 nM
2,5
1x
12,5
(Pflanzen-Spezies-PCR bzw. GVP-PCR)
TaqMan Universal PCR Master Mix (2x)
-
jeweils 20 µl des Mastermixes werden in die entsprechenden Wells pipettiert.
Zugabe von DNA-haltiger Lösung und der Kontrollen (je 5 µl)
Standards
• i.d.R. 4 verschiedene DNA-Verdünnungen auswählen (siehe Abschnitt 6.2); je 5,0 µl zugeben
Auswahl der Standardverdünnungen je nach Fragestellung; Beispiel:
Tabelle 2-3: Auswahl der Standardverdünnungen bei der Real-time PCR
Produktkategorie
Pflanzen-Spezies-DNA-
GVP-Kopienzahlen
Kopienzahlen (z.B. Mais-
pro 5 µl
Invertase) pro 5 µl (erwartet)
(erwartet)
10.000- 100.000
200 - 1500
500 - 5.000
10 - 500
weitgehend unverarbeitetes Erzeugnis
aus einer Pflanzenart
(z.B. Sojamehl, Maisgrieß)
verarbeitetes Erzeugnis mit Zutaten aus
der jeweiligen Pflanzenart
(z.B. Müsli, Chips, Brot)
Proben-DNA
•
Proben-DNA aus der Aufarbeitung vortexen
•
ggf. weitere Verdünnung der Proben-DNA herstellen
günstige DNA-Konzentration: ca. 10-50 ng/µl
•
5,0 µl der unverdünnten bzw. verdünnten DNA-Lösung zugeben
Kontrollen (jeweils 1x pipettieren)
•
Negativkontrollen:
5,0 µl steriles Wasser sowie 5,0 µl Aufarbeitungsleerwert zugeben
Forschungsvorhaben
Abschlussbericht
18 von 96 Seiten
(steriles Wasser bei jedem PCR-Lauf, Aufarbeitungsleerwert mindestens 1x pro Serie mitlaufen
lassen)
•
Kontroll-Probe (s. o, 2.3):
5,0 µl DNA, isoliert aus Vergleichsmaterial (z.B. Mehle mit definierten GVP-Anteilen);
günstige DNA-Konzentration: ca. 10-50 ng/µl)
Vorbereitung des PCR-Laufs
•
Die PCR-Platte mit der Folie verschließen und die Flüssigkeit in den Wells herunterschütteln oder
zentrifugieren.
•
Platte im Heizblock des TaqMan (GeneAmp 7500) platzieren.
•
PCR-Lauf starten
Auswertung
Die Auswertung erfolgt gemäß den Anleitungen des Geräteherstellers [21].
•
Nulllinie in der linearen Darstellung festlegen (in der Regel zwischen dem 5. und 20. Zyklus).
•
Wahl eines geeigneten Thresholds in der logarithmischen Darstellung (in der Regel circa 0,1).
•
Die Menge vorhandener DNA wird durch den Ct-Wert definiert.
5. Validierung (Validierungsdaten der einzelnen Methoden siehe Abschnitt: Ergebnisse und
Diskussion)
Kalibrierung der einzelnen PCR-Systeme
Zunächst wird für das PCR-System eine Grundkalibrierung durchgeführt.
Unter Verwendung von Standard-DNA für die Kalibrierung (s. 2.2; S. 14) werden geeignete Verdünnungsstufen in jeweils 5 PCR-Ansätzen untersucht.
Arbeitsbereich des PCR-Verfahrens
Zur Bestimmung des Arbeitsbereiches (Kopienzahlen) werden ermittelt:
-
Ct-Werte (Mittelwerte) bei einzelnen Verdünnungsstufen;
absolute und relative Standardabweichungen (Variationskoeffizienten)
-
Regression 1. Grades (x = log Kopienzahl / y = CT-Werte (Zyklenzahl)):
Steigung möglichst zwischen -3,1 und -3,6
Korrelationskoeffizient r (möglichst > 0,95 in den gewählten Verdünnungsbereich)
Forschungsvorhaben
Abschlussbericht
19 von 96 Seiten
Vertrauensbereiche
Der Vertrauensbereich auf der jeweiligen Verdünnungsstufe wird wie folgt berechnet:
_
_
VB (rel., 95%) = x ± u/x
mit Ergebnisunsicherheit u =
s∗ t
n
_
x = Mittelwert Kopienzahlen
s = Standardabweichung Kopienzahlen
t = t- oder Studentfaktor (Tabellenwert), bei 5 -Bestimmungen: (P = 95%): t = 2,776
n = Anzahl der Messwerte (i.d.R. n = 5)
Nachweis- und Bestimmungsgrenze
-
Nachweisgrenze = niedrigste Verdünnungsstufe (Kopienzahl), bei der ein Vertrauensbereich (mit
vorgegebener Wahrscheinlichkeit von 95%) von ± 100% erreicht wird
(i.d.R. zwischen 5 und 10 Kopien)
-
Bestimmungsgrenze = niedrigste Verdünnungsstufe (Kopienzahl), bei der ein Vertrauensbereich
(mit vorgegebener Wahrscheinlichkeit von 95%) von ± 30% erreicht wird
(i.d.R. bei ca. 50 Kopien)
Ermittlung des GVP-Anteils in der Gesamt-Spezies-DNA
Die hier beschriebenen Methoden werden zum qualitativen bis semiquantitativen Screening verwendet. Sie können zur ersten Abschätzung der Größenordnung gentechnischer Verunreinigungen durch
GVP eingesetzt werden. Eine quantitative Untersuchung erfolgt mittels konstrukt- oder eventspezifischer Methoden. Sollten keine solchen Methoden zur Verfügung stehen (z.B. nicht zugelassene
GVP), kann mit dieser Methode bei Vorhandensein geeigneter Kontrollmaterialien auch eine Quantifizierung erfolgen. Die erhaltenen Daten zur Präzision, ggf. auch zur Richtigkeit, müssen dann jedoch
mit der probenbezogenen Dokumentation beschrieben werden.
In solchen Fällen sollte die Validierung möglichst mit zertifizierten Vergleichsmaterialien erfolgen, die
unterschiedliche Anteile an GVP aufweisen.
Jedes Kalibrierniveau sollte mindestens dreimal aufgearbeitet werden. Die in den Wiederholungsbestimmungen ermittelten Anteile von GVP-DNA, bezogen auf das pflanzenspezifische Gen, werden mit
den Prozentangaben bei den Referenzmaterialien verglichen.
Daraus können folgende Validierungskenndaten berechnet werden:
Forschungsvorhaben
Abschlussbericht
20 von 96 Seiten
• Mittelwerte der einzelnen Bestimmungen für jede GVP-Anteils-Stufe
• Vertrauensbereiche (95% Wahrscheinlichkeit) für jede GVP-Anteils-Stufe
• Nachweisgrenzen (NG) und Bestimmungsgrenzen (BG);
abhängig von der Kopienzahl an Pflanzenspezies-DNA, die aus der Probe extrahiert wurde:
NG (% GVP-DNA-Anteil) =
NG GVP-spezifische (bzw. Screening-) PCR/Kopien Pflanzenspezies-PCR in der Probe
BG (% GVP-DNA-Anteil) =
BG GVP-spezifische (bzw. Screening-) PCR/Kopien Pflanzenspezies-PCR in der Probe
Beispiel:
Tabelle 2-4: Nachweis- und Bestimmungsgrenzen beim GVP-Nachweis mit der Real-time PCR
Nachweis-
Bestimmungs-
grenze
grenze
spezifische PCR
[% GVP-
[% GVP-DNA-
bzw. Screening-
bzw. Screening-
DNA-Anteil]
Anteil]
Invertase)
PCR
PCR
in der Probe
(z.B. P35S) [Ko-
(z.B. P35S) [Ko-
pien]
pien]
10
50
0,02
0,1
mittlere Kopien-
Nachweisgrenze
Bestimmungs-
zahl Pflanzen-
GVP-spezifische
grenze GVP-
Spezies-PCR
PCR
(z.B. Mais-
50.000
Forschungsvorhaben
Abschlussbericht
21 von 96 Seiten
Teil B: Spezieller Teil
2.2.2
pat-Gen
1. Kurzbeschreibung
Aus der Proben-DNA wird eine 108 bp DNA-Sequenz aus dem synthetisch modifizierten Phosphinothricin-Acetyltransferase-Gens (pat) mittels Real-time PCR amplifiziert.
PCR-Primer [23]
pat-141F
5’- CgC ggT TTg TgA TAT CgT TAA C -3’
pat-248R
5’- TCT TgC AAC CTC TCT AgA TCA TCA A -3’
Primerkonzentration für die PCR jeweils 10 pmol/µl (10 µM)
Sonde (nur Singleplex) [23]
5’-VIC- Agg ACA gAg CCA CAA ACA CCA CAA gAg Tg – TAMRA- 3’
pat-193T-VIC
Sondenkonzentration für die PCR: 10 pmol/µl (10 µM)
Standard-DNA für die Kalibrierung
DNA, isoliert aus Vergleichsmaterial Falcon-GS 40/90 Raps (Labor Code G 205; 100 %);
eingestellt auf ca. 20 ng/µl (Picogreen)
3. Geräte/Hilfsmittel
Siehe Teil A, Allgemeines Verfahren
4. Durchführung
Pipettierschema:
Reagenzien
Endkonzentration in PCR-Ansatz
Volumen (µl)
1x
12,5
Primer pat-141F [10 µM]
300 nM
0,75
Primer pat-248R [10 µM]
300 nM
0,75
TaqMan
-Sonde pat-193T-VIC [10 µM]
200 nM
0,5
Jeweils 20 µl des Mastermixes wird in die entsprechenden Wells pipettiert.
Forschungsvorhaben
Abschlussbericht
2.2.3
22 von 96 Seiten
bar-Gen
1. Kurzbeschreibung
Aus der Proben-DNA wird eine 109 bp DNA-Sequenz des bar-Gens aus Streptomyces hygroscopicus
mittels Real-time PCR amplifiziert. Das bar-Gen codiert für eine Phosphinotricin-Acetyltransferase,
wobei die Ähnlichkeit zur pat-Gen-codierten Phosphinotricin-Acetyltransferase über 80% beträgt.
PCR-Primer [24]
bar-57 fw
5’- CTg CAC CAT CgT CAA CCA CTA C -3’
bar-166 re
5’- gAT AgC gCT CCC gCA gAC -3’
Primerkonzentration für die PCR jeweils 10 pmol/µl (10 µM)
Sonde [24]
bar-105 T
5’-FAM- CgA gCC gCA ggA ACC gC – TAMRA- 3’
Sondenkonzentration für die PCR: 10 pmol/µl (10 µM)
DNA, isoliert aus Vergleichsmaterial MS8xRF3 Raps, (100%) bzw. LL 62 Raps (100%);
eingestellt auf ca. 20 ng/µl (Picogreen).
Standard-DNA für die Qualitätskontrolle
gv-Reis-Screening:
•
LL62-DNA; 5 Kopien/5 µl; z.B. aus 100% LL 62-DNA durch Verdünnen mit Hintergrund-DNA hergestellt (10-20 ng Nicht-GVO Reis-DNA/µl) (entspricht ca. 0,01% LL 62);
•
LL 601-DNA; 5 Kopien/5 µl (z.B. aus 0,1% LL 601-DNA durch Verdünnen mit Hintergrund-DNA
hergestellt (10 ng Nicht-GVO Reis-DNA/µl) (entspricht ca. 0,01% LL 601).
gv-Raps-Screening:
•
MS8xRF3-DNA; 5 Kopien/5 µl; z.B. aus 100% MS8xRF3-DNA durch Verdünnen mit HintergrundDNA hergestellt (10-20 ng Nicht-GVO Raps-DNA/µl) (entspricht ca. 0,01% MS8xRF3).
Forschungsvorhaben
Abschlussbericht
23 von 96 Seiten
4. Durchführung
Pipettierschema:
Reagenzien
Volumen (µl)
1x
12,5
Primer bar-57 fw [10 µM]
500 nM
1,25
Primer bar-166 re [10 µM]
500 nM
1,25
TaqMan
-Sonde bar-105 T [10 µM]
200 nM
0,5
4,5
steriles Wasser
2.2.4
pat/bar-Duplex-System
1. Kurzbeschreibung
Aus der Proben-DNA wird eine DNA-Sequenz (Länge 109 bp) aus dem bar-Gen aus Streptomyces
hygroscopicus und parallel dazu eine DNA-Sequenz (Länge 108 bp) aus dem PhosphinothricinAcetyltransferase-Gens (pat) amplifiziert.
PCR-Primer [23,24]
Sequenz
Bezeichnung
Primer-/ Sondenkonzentration für die PCR:
2 pmol/µl (2 µM)
pat-141F
5’- CgC ggT TTg TgA TAT CgT TAA C-3’
pat-248R
5’- TCT TgC AAC CTC TCT AgA TCA TCA A-3’
bar-57 fw
5’- CTg CAC CAT CgT CAA CCA CTA C -3’
18 pmol/µl (10 µM)
bar-166 re
5’- gAT AgC gCT CCC gCA gAC -3’
2 pmol/µl (2 µM)
Sonden [24]
bar-105 T
5’-FAM- CgA gCC gCA ggA ACC gC – TAMRA- 3’
pat-193T-YY
5’-YY- Agg ACA gAg CCA CAA ACA CCA CAA gAg Tg TAMRA -3’
Forschungsvorhaben
5 pmol/µl (10 µM)
3 pmol/µl (3 µM)
Abschlussbericht
24 von 96 Seiten
für Mais: DNA isoliert aus 5% Bt176 (bar positiv) und 5% Bt11 (pat positiv), auf jeweils 500 Kopien/5µl
Bt176 bzw. Bt11 eingestellt, 1+1 miteinander verdünnt, Verdünnungsreihe.
für Raps: Referenz-DNA von Bayer Crop Science MS8 (bar positiv) und T45 (pat positiv), auf jeweils
500Kopien/5 µl MS8 bzw. T45 eingestellt, 1+1 miteinander verdünnt, Verdünnungsreihe
10 Kopien/5µl MS8 in 50000 Kopien/5 µl Raps-Kopien ⇒ bar positiv
10 Kopien/5µl T45 in 50000 Kopien/5 µl Raps-Kopien ⇒ pat positiv
4. Durchführung
Festlegung der Detektor-Kanäle
Es ist zu beachten, dass für die Duplex-PCR am GeneAmp7500 für jedes Well beide verwendeten
Fluoreszenzfarbstoffe (FAM und YY) für die Aufnahme der jeweiligen Sondensignale eingestellt sein
müssen. Beide Signale werden parallel in den zwei verschiedenen Kanälen erfasst:
Pipettierschema:
Reagenzien
Volumen (µl)
1x
12,5
Primer bar-57 fw [18 µM]
900 nM
1,25
Primer bar-166 re [18 µM]
900 nM
1,25
TaqMan
-Sonde bar-105 T [5 µM]
250 nM
1,25
Primer pat-141 F [2 µM]
100 nM
1,25
Primer pat-248 R [2 µM]
100 nM
1,25
TaqMan
-Sonde pat-193 T-YY [3 µM]
150 nM
1,25
Forschungsvorhaben
Abschlussbericht
2.2.5
25 von 96 Seiten
P35S/T-nos-Duplex-System
1. Kurzbeschreibung
Die verwendeten Primer amplifizieren ein 82 Basenpaar (bp) langes Fragment aus der CaMV 35SPromotor-Sequenz sowie ein 84 bp langes Fragment aus der Terminatorregion des Nopalin-Synthase
Gens aus Agrobacterium tumefaciens. Die PCR-Produkte werden in einer Duplex Real-time PCR
parallel mittels spezifischer Oligonukleotidsonden nachgewiesen, die jeweils mit zwei Fluoreszenzfarbstoffen (FAM bzw. Yakima Yellow als Reporterfarbstoff und jeweils Black Hole Quencher 1 als
Quencher) markiert sind.
PCR-Primer [15, 25]
Bezeichnung
Primer-/ Sonden-
Sequenz
konzentration für die PCR:
35S-FTM
5’- gCC TCT gCC gAC AgT ggT -3’
2 pmol/µl (2 µM)
35S-RTM
5’- AAg ACg Tgg TTg gAA CgT CTT C -3’
2 pmol/µl (2 µM)
180-F
5’- CATgTAATgCATgACgTTATTTATg-3’
180-R
5’- TTgTTTTCTATCgCgTATTAAATgT-3’
Sonden [15, 25]
35S-TMPFAM
5’-FAM- CAA AgA Tgg ACC CCC ACC CAC g –
Black Hole Quencher 1- 3’
2 pmol/µl (2 µM)
TM-180YY
5’-YY - ATgggTTTTTATgATTAgAgTCCCGCAA BHQ 1 - 3’
4 pmol/µl (4 µM)
DNA, isoliert aus Referenzmaterial Bt11 Mais (ERM-BF-412F-5% Bt11), eingestellt auf ca. 50 ng/µl.
DNA aus 0,1% Bt11 (Referenzmaterial, G 071) und 0,02% Bt11 (aus 0,1% Bt11-Referenzmaterial),
verdünnt mit Mais-Hintergrund-DNA (jeweils 50.000 Kopien /5 µl Mais-DNA)
Forschungsvorhaben
Abschlussbericht
26 von 96 Seiten
4. Durchführung
Für die Duplex-PCR müssen z.B. am GeneAmp 7500 für jedes Well beide verwendeten Fluoreszenzfarbstoffe (FAM und YY (VIC-Kanal)) für die Aufnahme der jeweiligen Sondensignale eingestellt sein.
Beide Signale werden parallel in den zwei verschiedenen Kanälen erfasst.
Pipettierschema:
Reagenzien
Volumen (µl)
1x
12,5
Primer 35S-F [2 µM]
100 nM
1,25
Primer 35S-R [2 µM]
100 nM
1,25
TaqMan
-Sonde 35S-TMP [2 µM]
100 nM
1,25
Primer 180-F [20 µM]
1000 nM
1,25
Primer 180-R [20 µM]
1000 nM
1,25
TaqMan
-Sonde TM-180YY [4 µM]
200 nM
1,25
Forschungsvorhaben
Abschlussbericht
2.2.6
27 von 96 Seiten
P35S/T-nos/hmga-Triplex-System
1. Kurzbeschreibung
Die verwendeten Primer amplifizieren ein 82 Basenpaar (bp) langes Fragment aus der CaMV 35SPromotor-Sequenz sowie ein 84 bp langes Fragment aus der Terminatorregion des Nopalin-Synthase
Gens aus Agrobacterium tumefaciens. Außerdem wird gleichzeitig ein Fragment (79 bp) aus dem
Mais-spezifischen Gen für das high-mobility group-Protein (hmga) [28] als Referenzgen amplifiziert.
Die PCR-Produkte werden in einer Triplex Real-time PCR parallel mittels spezifischer Oligonukleotidsonden nachgewiesen, die jeweils mit unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen (FAM, YY und Cy5
als Reporterfarbstoff und BHQ 1 bzw. Deep Dark Quencher) markiert sind.
PCR-Primer
35S-FTM
5’- gCC TCT gCC gAC AgT ggT -3’
35S-RTM
5’- AAg ACg Tgg TTg gAA CgT CTT C -3’
180-F
5’- CATgTAATgCATgACgTTATTTATg-3’
180-R
5’- TTgTTTTCTATCgCgTATTAAATgT-3’
ZM1-F
5’- TTg gAC TAg AAA TCT CgT gCT gA - 3’
ZM1-R
5’- gCT ACA TAG GGA gCC TTg TCC T - 3’
Sonden
35S-TMPFAM
5’-FAM- CAA AgA Tgg ACC CCC ACC CAC g – BHQ 1- 3’
TM-180YY
5’-YY - ATgggTTTTTATgATTAgAgTCCCGCAA - BHQ 1 - 3’
Probe ZM1 5’-Cy5 - CAA TCC ACA CAA ACg CAC gCg TA- Deep Dark Quencher - 3’
Reagenzien für die Real-time PCR:
QIAGEN QuantiTect Multiplex PCR Kit, Cat. No. 204543 (QIAGEN, Hilden)
DNA, isoliert aus Referenzmaterial Bt11 Mais (ERM-BF-412F-5% Bt 11), eingestellt auf ca. 50 ng/µl.
Forschungsvorhaben
Abschlussbericht
28 von 96 Seiten
DNA aus 0,1% Bt11 (Referenzmaterial, G 071) und 0,02% Bt11 (aus 0,1% Bt11-Referenzmaterial),
verdünnt mit Mais-Hintergrund-DNA (jeweils 50.000 Kopien/5 µl Mais-DNA)
4. Durchführung
Für die Triplex-PCR müssen z.B. am GeneAmp 7500 für jedes Well alle verwendeten Fluoreszenzfarbstoffe (FAM, YY (VIC-Kanal) und Cy5) für die Aufnahme der jeweiligen Sondensignale eingestellt
sein. Die Signale werden parallel in den drei verschiedenen Kanälen erfasst.
Pipettierschema:
Reagenzien
Volumen (µl)
QIAGEN QuantiTect Multiplex PCR Kit
1x
12,5
Primer 35S-F [10 µM]
200 nM
0,5
Primer 35S-R [10 µM]
200 nM
0,5
Primer 180-F [20 µM]
1000 nM
1,25
Primer 180-R [20 µM]
1000 nM
1,25
Primer ZM1-F [10 µM]
70 nM
0,175
Primer ZM1-R [10 µM]
70 nM
0,175
TaqMan
-Sonde 35S-TMP [10 µM]
100 nM
0,25
TaqMan
-Sonde TM-180-YY [10 µM]
200 nM
0,5
TaqMan
-Sonde Probe ZM1 [10 µM]
100 nM
0,25
Wasser
-
2,65
Forschungsvorhaben
Abschlussbericht
Teil „Screening-Methoden“ - Ergebnisse und Diskussion
2.3
29 von 96 Seiten
Ergebnisse und Diskussion
2.3.1
Singleplex Real-time PCR: Auswahl weiterer Sequenzen für Screening
Am CVUA Freiburg standen zu Beginn des Projekts bereits Real-time PCR Verfahren zum Screening
auf folgende DNA-Sequenzen zur Verfügung (und damit auf zugelassene und nicht zugelassene
GVP), welche besonders häufig in GVP vorhanden sind:
-
CaMV 35S-Promotor-Sequenz (P35S) [15]
-
Sequenz aus Terminatorregion des Nopalin-Synthase Gens aus Agrobacterium tumefaciens
(T-nos) [25]
-
Übergang CTP2- CP4 EPSPS-Sequenz (Chloroplasten-Transitpeptid-Signalsequenz bzw. EnolPyruvyl-Shikimat-Phosphat-Synthase aus Agrobacterium tumefaciens, ssp. strain 4) (CTP2CP4EPSPS) [26].
Anhand einer Literaturrecherche wurde mithilfe von Datenbanken [2-5] ermittelt, dass sich zur Ergänzung dieser Verfahren und damit zur Ausdehnung des Screening auf eine möglichst große Bandbreite
EU-weit zugelassener und nicht zugelassener GVP insbesondere folgende Sequenzen anbieten:
-
bar-Gen aus Streptomyces hygroscopicus (bar)
-
synthetisches Phosphinothricin-Acetyltransferase-Gen (pat)
In der Tabelle auf den nachfolgenden beiden Seiten ist dargestellt, welche in der EU zugelassenen
und nicht zugelassenen Pflanzen, gegliedert nach Pflanzenarten, die genannten fünf Sequenzen enthalten und damit von den entsprechenden Nachweisverfahren (theoretisch) erfasst werden.
In der Tabelle sind - mit Ausnahme der für Lebensmittel nicht relevanten Pflanzenart Baumwolle - alle
Events genannt, über die derzeit Sequenzinformationen aus Datenbanken verfügbar sind.
Es ist erkennbar, dass mindestens eine der fünf oben genannten Sequenzen immer vorhanden ist.
Nachweissysteme, welche diese Sequenzen beinhalten, erfassen somit alle in der Liste aufgeführten
gentechnisch veränderten Pflanzen.
Soweit Referenzmaterial verfügbar war, wurden die - theoretischen - Sequenzdaten analytisch bestätigt (in der Tabelle fett gedruckt; + = nachweisbar, - = nicht nachweisbar).
Forschungsvorhaben
Abschlussbericht
30 von 96 Seiten
Tabelle 2-5. Nachweis gentechnisch veränderter Pflanzen mit ausgewählten Screeningverfahren
+ = nachweisbar; - = nicht nachweisbar; + (fett) = anhand von Referenzmaterial analytisch bestätigt
Bezeichnung des
Events
Zulassung
EU
Enthaltene DNA-Sequenzen
P35S
T-nos
CTP2CP4EPSPS
bar
pat
Kartoffeln
ATBT04-X (New Leaf)
-
+
-
-
-
-
BT6, BT10, Bt12, BT16, BT17,
BT18, BT23 (New Leaf)
-
+
+
-
-
-
RBMT15-101, SEMT15-02,
SEMT15-15, HLMT15-46 (New
Leaf)
-
-
+
-
-
-
RBMT21-129, RBMT21-152,
RBMT21-350 (New Leaf)
-
-
+
-
-
-
RBMT22-082, RBMT22-186,
RBMT22-238, RBMT22-262
(New Leaf)
-
-
+
+
-
-
SPBT02-5, SPBT02-7
-
+
+
-
-
-
+
-
-
-
EH92-527-1
2
x
+ (schwach)
Mais
3272
x-
2
-
+
-
-
-
676, 678, 680
-
+
-
-
-
+
59122
x
Bt11
B16 (DLL25)
2
+
-
-
-
+
x
1
+
+
-
-
+
-
+
-
-
+
-
1
Bt176 (176; Maximizer)
x
+
-
-
+
-
CBH-351 (StarLink)
-
+
+
-
+
-
DAS-06275-8
-
-
-
-
+
-
DBT418 (Bt-Xtra)
-
+
-
-
+
-
GA 21 (Roundup Ready)
x
1
-
+
-
+
(schwach)
+ (schwach)
2
+
+
-
-
-
LY038
x
2
MIR604
x
-
+
-
-
+ (schwach)
MON 80100
-
+
+
+
-
-
MON 802
-
-
MON 809
x
MON 810
+
+
+
-
1
+
+
+
-
-
x
1
+
-
-
-
-
MON 832
-
MON 863 (YieldGard)
x
+
+
+
-
-
1
+
+
-
-
-
2
2
MON 88017
x
+
+
+
-
-
MON89034
x
+
+
-
-
-
MS3 (SeedLink)
-
+
+
-
+
-
MS6 (SeedLink)
-
+
+
-
+
-
NK 603 (Roundup Ready)
x
+
+
+
+ (schwach)
-
1
T14
-
T25
x
+
-
-
-
+
1
+
-
-
-
+
TC1507 (Herculex)
x
1
+
-
-
-
+
+
-
-
-
Papaya
55-1, 63-1 (Sunup)
Forschungsvorhaben
2
x
+
Abschlussbericht
Bezeichnung des
Events
31 von 96 Seiten
Zulassung
EU
Enthaltene DNA-Sequenzen
(fett = anhand von Vergleichsmaterialien bestätigt
P35S
T-nos
CTP2CP4EPSPS
bar
pat
-
-
-
-
Raps
23-198, 23-18-27 (Laurical)
1
+
-
-
-
+
1
-
-
+
-
-
1
-
+ (schwach)
+
+ (schwach)
-
1
+
+ (schwach)
-
-
+
1
+
-
-
-
+
1
-
+
-
+
-
Falcon GS40/90
x
GT200
x
GT73
+
x
HCN 10, HCN 92,
Topas19/2 (LibertyLink)
x
Liberator L62 (pHoe6/AC)
x
MS1, RF1, RF2; MS1xRF1 (PGS1)
MS1xRF2 (PGS2) (SeedLink)
x
MS8, RF3, MS8xRF3 (SeedLink)
x
-
+
-
+
-
OXY 235
-
+
+
-
-
-
1
PHY36
-
T45, HCN 28 (LibertyLink)
x
-
-
-
+
-
1
+
-
-
-
+
LL62 (LibertyLink)
x
2
+
-
-
+
-
LL06
-
+
-
-
+
-
LL601
-
+
-
-
+
-
Bt63
-
-
+
k.A.
k.A.
k.A.
-
-
-
+
Reis
Soja
A2704-12, A2704-21, A5547-35
(LibertyLink)
2
x
+
A5547-127 (LibertyLink)
-
+
-
-
-
+
G94-1, G94-19, G-168 (Optimum)
-
+
+
-
-
-
1
GTS 40-3-2 (Roundup Ready)
x
+
+
-
-
-
GU262 (LibertyLink)
-
+
-
-
-
+
MON 89788
x
-
-
+
-
-
W 62, W 98 (LibertyLink)
-
+
+
-
+
-
2
Tomate
1345-4 (Endless summer)
-
+
+
-
-
-
35 1 N
-
-
+
-
-
-
5345
-
+
+
-
-
-
8338
-
+
+
-
-
-
B, Da. F (Vegadura)
-
+
+
-
-
-
FlavrSavr
-
+
-
-
-
-
Zuckerrüben
2
GTSB77 (Roundup Ready)
x
+ (schwach)
+ (schwach)
+
-
-
T120-7 (LibertyLink)
-
+
-
-
-
+
H7-1 (Roundup Ready)
x
-
-
+
-
-
1
= zugelassen
2
= Zulassung beantragt
2
+ (schwach) = Amplifikationen bei Ct-Werten von 35 und höher
Forschungsvorhaben
Abschlussbericht
2.3.2
32 von 96 Seiten
Singleplex-Real-time PCR: Validierung neuer Nachweissysteme
2.3.2.1 pat-Gen
Als eine weitere, bisher nicht für das Screening in der Routine eingesetzte Sequenz wurde das patGen gewählt. Die synthetisch modifizierte Sequenz eines aus Streptomyces viridochromogenes
stammenden Gens codiert für die Phosphinothricin-Acetyltransferase. Dieses Enzym vermittelt den
gv-Pflanzen die Resistenz gegen den Herbizid-Wirkstoff Glufosinat.
Ein vor mehreren Jahren für ein anderes Real-time PCR-Gerät etabliertes Verfahren zum Nachweis
der pat - Sequenz [23] wurde validiert.
Zur Validierung wurde exemplarisch Material von gentechnisch verändertem Raps des Events Falcon
GS40/90 verwendet. Der Arbeitsbereich des PCR-Systems wurde anhand von Verdünnungsreihen
aus DNA-Extrakten von gv-Raps Falcon GS40/90 untersucht. Bei allen Verdünnungsstufen wurde der
Master-Mix vorgelegt und die DNA-Lösungen jeweils separat zupipettiert (n = 5) (s. Tabelle).
Tabelle 2-6:
Ergebnis der Validierung des Real-time PCR-Verfahrens zur Quantifizierung des pat-Gens mit
gv-Raps Falcon GS40/90 (Arbeitsbereich/Präzision/Sensitivität):
Soll:
Ist:
Mittelwert
Standard-
Vertrauensbereich
Verdünnungsstufe
Mittelwert
Ct-Werte
abweichung
(95%)
(Kopienzahl Fal-
gefundene
(Kopienzahl)
(Kopienzahl (rel; %))
con GS 40/90)
Kopien
50.000
55.565
21,5
4.277
9,5
10.000
10.631
24,0
682
8,0
2.000
2.116
26,4
165
9,7
400
454
28,7
18
5,0
100
119
30,7
17
17,7
20
19
33,5
4,6
40,4
• Regression 1. Grades
− Steigung (slope): ca. 3,45: Effizienz = ca. 95%
− Korrelationskoeffizient: -0,99
• Nachweisgrenze (VB95 <100%): ca. 10-20 Kopien
• Bestimmungsgrenze (VB95 < 30%): ca. 50 Kopien
Zusätzlich wurde die Nachweisgrenze, bezogen auf die jeweilige Menge an artspezifischer (Raps-)
DNA in der Probe anhand von DNA-Mischungen aus konventionellem Raps (Nicht-GVO) mit gv-Raps
Forschungsvorhaben
Abschlussbericht
33 von 96 Seiten
Falcon (GS40/90) ermittelt. Dazu wurden Mischungen mit GVO-Anteilen von 0,1% und 0,02% getestet (n=4).
Tabelle 2-7:
Ergebnis der Validierung des Real-time PCR-Verfahrens zur Quantifizierung des pat-Gens mit
Mischungen von gv-Raps Falcon GS40/90 und konventionellem Raps (Arbeitsbereich
/Präzision/Sensitivität):
Soll:
% Falcon
Ist:
Standardabweichung
Anteil positiver
Mittelwert pat-Gen/
pat-Gen/
Resultate
Raps-spezifisches
Raps-spezifisches Gen
Gen (pep) (%)
(pep) (%)
0,13
0,04
50%
nicht bestimmt
nicht bestimmt
GS40/90)
0,1
4/4
0,02
4/4
nicht bestimmt
Vertrauensbereich
(95%)
(rel; %)
(< Bestimmungsgrenze)
Die Ergebnisse zeigen, dass die Methode zum Screening geeignet ist und auch sehr geringe Anteile
an gv-Raps (0,02%) noch nachweisbar sind.
Die Ergebnisse der Spezifitätsuntersuchungen, d.h. der mit dem pat-Screening-Verfahren erfassbaren Events, sind in Tabelle S-1 zusammengefasst (fett gedruckt).
2.3.2.2 bar-System
Zum Screening auf gentechnisch veränderte Pflanzen bietet sich weiterhin das bar-Gen aus Streptomyces hygroscopicus an [2]. Transgene Pflanzen, die das bar-Gen enthalten, werden dadurch tolerant gegenüber Herbiziden, die Glufosinat als Wirkstoff enthalten. Auch hier wurde zunächst ein
Singleplex Real-time PCR-System etabliert. Primer-Sonden-Systeme, die spezifisch für die barSequenz (GenBank Acc. X17220) sind, wurden hinsichtlich der PCR-Effizienz und Fluoreszenzzunahme (∆Rn) verglichen und das im Methodenteil beschriebene System ausgewählt.
Zur Validierung wurde exemplarisch Material von gentechnisch verändertem Raps des Events
MS8xRF3 sowie von Reis des Events LL62 verwendet. Bei allen Verdünnungsstufen wurde der Master-Mix vorgelegt und die DNA-Lösungen jeweils separat zupipettiert (n = 5)
Forschungsvorhaben
Abschlussbericht
34 von 96 Seiten
Tabellen 2-8 und 2-9: Ergebnis der Validierung des Real-time PCR-Verfahrens zur Quantifizierung des pat-Gens (Arbeitsbereich/Präzision/Sensitivität):
a) MS8xRF3
Soll:
Ist:
Mittelwert
Standardabweichung
Vertrauensbereich
Verdünnungsstufe
Mittelwert
Ct-Werte
(Kopienzahl)
(95%)
(Kopienzahl)
gefundene
(Kopienzahl (rel; %)
Kopien
10.000
6.629
28,0
1149
22
2.000
1.833
30,0
230
16
500
580
31,7
78
17
100
99
34,2
11
14
50
48
35,4
9
22
10
10
38,1
6
79
− Steigung (slope): -3,0: Effizienz = ca. 115%
− Korrelationskoeffizient: -0,98
• Nachweisgrenze (VB95 <100%): ca. 10 Kopien (entspricht ca. 0,02% gv-Raps)
b) LL 62-Reis:
Soll:
Ist:
Mittelwert
Standardabweichung
Vertrauensbereich
Verdünnungsstufe
Mittelwert
Ct-Werte
(Kopienzahl)
(95%)
(Kopienzahl/5 µl)
gefundene
(Kopienzahl (rel; %)
Kopien
500
556
28,7
58
11,9
100
146
30,9
15
11,5
25
31
33,3
2,6
9,6
5
4,8
36,4
1,7
41,5
− Steigung (slope): -3,65; Effizienz = 88%
− Korrelationskoeffizient r: -0,99
Forschungsvorhaben
Abschlussbericht
35 von 96 Seiten
• Nachweisgrenze (VB95 <100%): ca. 5 Kopien (entspricht ca. 0,01% LL62-Reis)
Die Ergebnisse zeigen, dass die Methode in den getesteten Arbeitsbereichen eine ausreichende
PCR-Effizienz aufweist und zum Screening auch auf sehr geringe Anteile an gv-Raps (0,02%) bzw.
Reis (0,01%) geeignet ist. Die Ergebnisse der Spezifitätsuntersuchungen, d.h. der mit dem barScreening-Verfahren erfassbaren Events, sind in Tabelle 2-5 zusammengefasst (fett gedruckt).
2.3.3
Duplex-Real-time PCR: Etablierung von Systemen
Für die parallele Quantifizierung von DNA-Sequenzen mittels Duplex-Real-time PCR wurden die
Kombinationen
-
pat/bar sowie
-
p35S /T-nos
ausgewählt.
Es wurden jeweils die Primer-/Sonden-Systeme der vorhandenen Singleplex-Verfahren verwendet.
2.3.3.1 pat/bar-Duplex Real-time PCR-System
a) Optimierung:
In einem ersten Versuch wurden die Systeme mit den Primer-/Sonden-Konzentrationen der
Singleplex-Verfahren untersucht. Insbesondere bei dem BAR-System wurde eine unzureichende
Sensitivität (2500 Kopien) festgestellt. Mithilfe der faktoriellen Versuchsplanung wurden bei 5 verschiedenen Konzentrationslevels (10-10.000 Kopien gv-Raps/Ansatz) die optimalen Primer-SondenKonzentrationen ermittelt. Getestet wurden Primer-Konzentrationen von 100 bis zu 1000 nM sowie
Sonden-Konzentrationen von 50 bis 250 nM. In insgesamt 4 aufeinanderfolgenden Versuchen wurden die Konzentrationsbereiche immer weiter in Richtung der optimalen Konzentrationen eingegrenzt.
Wichtigstes Kriterium für die Optimierung war ein möglichst niedriger Ct-Wert.
Dabei zeigte sich, dass eine Limitierung der Primer und Sonden des etwas effizienteren pat-Systems
und eine Erhöhung der Konzentrationen bei dem bar-System tendenziell zu den besten Ergebnissen
führte. Das pat-System erwies sich dabei als relativ stabil gegenüber Veränderungen (Verringerungen) der Primer- und Sondenkonzentration.
Schließlich wurden die im Methodenteil beschriebenen Primer- und Sondenkonzentrationen ausgewählt und validiert.
b) Validierung:
Zur Validierung wurden DNA-Standards verwendet, welche das pat- bzw. das bar-Gen enthalten.
Exemplarisch wurden hierzu DNA-Mischungen von gv-Mais-Events bzw. gv-Raps-Events verwendet.
Da insbesondere die Sensitivität der Verfahren getestet werden sollte, wurden Konzentrationen (Ko-
Forschungsvorhaben
Abschlussbericht
36 von 96 Seiten
pienzahlen pro 5 µl) im unteren Bereich eingesetzt. Bei allen Verdünnungsstufen wurde der MasterMix vorgelegt und die DNA-Lösungen jeweils separat zupipettiert.
Tabelle 2-10 Validierung des Duplex-PCR-Systems für bar mit DNA aus Mais und Raps
Mais (Mischung Bt176 + Bt11)
Raps (Mischung MS8 + T45)
Arbeitsbereich
je 5 bis 250 Kopien /Ansatz
je 5 bis 250 Kopien /Ansatz
Slope/Effizienz
-3,5 / 93%
-4,0 / 78%
R2
0,96
0,97
Ungefähre Nachweisgrenze
ca. 5-10 Kopien /Ansatz
ca. 10 Kopien /Ansatz
Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Methode auch in den getesteten, niedrigen Arbeitsbereichen noch eine zufriedenstellende PCR-Effizienz und Sensitivität aufweist.
Zur Bestätigung, dass die Sensitivität tatsächlich ausreicht, wurden weitere Versuche durchgeführt:
Tabelle 2-11: Mischungen mit Hintergrund-DNA aus konventionellem Raps (50.000 Kopien/5 µl)
(n=5);
Verdünnungs- Anteil positiver
Mittelwert
Standardabweichung
Resultate
(Ct-Werte)
(Ct-Werte)
50
5/5
36,02
0,62
10
5/5
38,44
0,60
5
1/5
-
-
stufe
Kopienzahl
MS8/Ansatz
Die Nachweisgrenze beträgt somit ca. 10 Kopien des bar-Gens pro PCR-Ansatz und ist mit derjenigen des Singleplex-Verfahrens vergleichbar.
Forschungsvorhaben
Abschlussbericht
37 von 96 Seiten
Tabelle 2-12: Test des bar-Systems auf kompetitive Effekte: Mischungen mit hohem Hintergrund des pat-Gens (10.000 Kopien T45-Raps bzw. T25-Mais) (n=3)
Verdünnungs- Anteil positiver
stufe
Resultate
Mittelwert
Verdünnungs-
Anteil positi-
Mittelwert
(Ct-Werte)
stufe
ver Resultate
(Ct-Werte)
Kopienzahl
Kopienzahl
MS8-Raps/
Bt176-Mais/
Ansatz
Ansatz
250
3/3
37
250
3/3
31
50
0/3
-
50
3/3
34,5
10
0/3
-
10
2/3
-
Hier zeigen sich gewisse Limitierungen der Sensitivität. In Gegenwart von hohen Anteilen des im
Duplex-System kompetitierenden Gens pat sind geringe Anteile des bar-Gens z.T. nicht mehr nachweisbar. Die Nachweisgrenze erhöht sich bei Raps auf ca. 100 Kopien/Ansatz entsprechend ca. 0,2%
gv-Raps; bei Mais ist sie weiterhin zufriedenstellend und beträgt ca. 10-50 Kopien/Ansatz entsprechend ca. 0,02 bis 0,1% gv-Mais.
Diese Limitierung muss ggf. bei Rapsuntersuchungen berücksichtigt werden, sofern große Mengen
des pat-Gens vorhanden sind. Bei den bisherigen Untersuchungen von Rapsproben auf GVO sind
derartige Fälle jedoch noch nicht aufgetreten.
Tabelle 2-13: Validierung des PCR-Systems für pat mit DNA aus Mais und Raps
Mais (Mischung Bt176 + Bt11)
Raps (Mischung MS8 + T45)
Arbeitsbereich
je 5 bis 250 Kopien/Ansatz
je 5 bis 250 Kopien/Ansatz
Slope/Effizienz
-3,0 / 115%
-3,3 / 101%
R2
0,95
0,99
Ungefähre Nachweisgrenze
ca. 10 Kopien /Ansatz
ca.10 Kopien /Ansatz
Auch für das pat-System zeigen die Ergebnisse, dass die Methode in den getesteten, niedrigen Arbeitsbereichen noch eine zufriedenstellende PCR-Effizienz und Sensitivität aufweist. Wie für das barSystem wurde die Sensitivität zusätzlich anhand von Mischungen aus konventionellem Raps (NichtGVO) mit gv-Raps (Event T45) untersucht (n=5):
Forschungsvorhaben
Abschlussbericht
38 von 96 Seiten
Tabelle 2-14: Mischungen mit Hintergrund-DNA aus konventionellem Raps (50.000 Kopien /5
µl) (n=5);
Verdünnungs-
Anteil po-
Mittelwert
Standardabweichung
stufe
sitiver Re-
Ct-Werte
Ct-Werte
Kopienzahl
sultate
T45-Raps
50
5/5
32,0
0,2
10
5/5
35,8
1,0
5
5/5
36,8
0,5
Für das pat-Gen beträgt die Nachweisgrenze ca. 5-10 Kopien pro PCR-Ansatz und ist ebenfalls mit
derjenigen des Singleplex-Verfahrens vergleichbar.
Tabelle 2-15: Test des pat-Systems auf kompetitive Effekte: Mischungen mit hohem Hintergrund des bar-Gens (10.000 Kopien MS8-Raps bzw. T25-Mais pro 5 µl) (n=3):
Verdünnungs-stufe
Anteil positiver
Mittelwert
Kopienzahl MS8-Raps/
Resultate
(Ct-Werte)
50
3/3
31
10
3/3
36
Ansatz
Das pat-System zeigt auch in Gegenwart großer Mengen des im Duplex-System kompetitierenden
Gens bar keine Einschränkungen der Sensitivität; diese beträgt ca. 5 -10 Kopien des pat-Gens pro
Ansatz, d.h. entsprechend ca. 0,01 bis 0,02% gv-Raps.
2.3.3.2 P35S/T-nos-Duplex Real-time PCR-System
a) Optimierung:
Nach den Erfahrungen aus der pat/bar-Optimierung erwies sich eine Optimierung bei einer (möglichst) niedrigen Konzentrationsstufe als am zielführendsten und praktikabelsten. Es wurde daher
einheitlich mit 20 Kopien, später mit 10 Kopien gv-Mais (Bt11) gearbeitet. Getestet wurden PrimerKonzentrationen von 100 bis zu 1000nM sowie Sonden-Konzentrationen von 100 bis 300 nM. Dabei
zeigte sich bereits nach dem ersten Versuch, dass eine Limitierung der Primer und Sonden des effizienteren P35S-Systems und eine Optimierung der Konzentrationen bei dem T-nos-System am erfolgversprechendsten war.
Forschungsvorhaben
Abschlussbericht
39 von 96 Seiten
Im zweiten Schritt wurde mithilfe der faktoriellen Versuchsplanung eine Optimierung in folgendem
Bereich versucht:
Tabelle 2-16: Optimierung der Primer- und Sondenkonzentrationen für die P35S/T-nos DuplexPCR
System
P35S
T-nos
Primer 1 80-220 nM
200-1100 nM
Primer 2 80-220 nM
200-1100 nM
Sonde
175-325 nM
75-325 nM
Die Ergebnisse dieses Versuchs sind in Tabelle 2-16 dargestellt.
Es ist erkennbar, dass besonders niedrige Primerkonzentrationen für das P35S-System (100 nM) und
gleichzeitig hohe Primerkonzentrationen für das T-nos-System (1000 nM) die besten Resultate (niedrige Ct-Werte, hohes ∆Rn der Fluoreszenz) ergeben. Der Einfluss der Sondenkonzentration scheint
bei dem P35S-System eher gering zu sein, weshalb für künftige Versuche zur Vermeidung kompetitiver Effekte eine niedrige Konzentration gewählt wurde. Dagegen deuten die Ergebnisse darauf hin,
dass bei dem T-nos-System möglichst hohe Konzentrationen auch bessere Resultate liefern (s. insbesondere die Ansätze lfd. Nr. 17, 18 und 25, in der Tabelle 2-16 schattiert).
Forschungsvorhaben
Abschlussbericht
40 von 96 Seiten
Tab 2-16. Optimierung des P35S/T-nos-Duplex Real-time PCR Systems mittels faktorieller Versuchsplanung
Lfd.Nr.
Primer
P35S-f
Primer
P35S-r
Primer
T-nos-f
Primer
T-nos-r
Sonde
P35S
Sonde
T-nos
P35S
(Ct)
P35S
(∆
∆Rn)
t-nos
(Ct)
t-nos
(∆
∆Rn)
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
200
200
1000
1000
300
300
37.22
2,210
37.90
0,503
200
200
1000
1000
200
100
35.55
2,513
37.10
0,390
200
200
1000
200
300
100
35.35
3,075
negativ
0,032
200
200
1000
200
200
300
negativ
0,002
43.24
0,081
200
200
200
1000
300
100
35.73
3,190
36.94
0,450
200
200
200
1000
200
300
35.41
2,485
37.97
0,364
200
200
200
200
300
300
36.18
2,927
negativ
0,000
200
200
200
200
200
100
37.99
1,743
negativ
-0,002
200
100
1000
1000
300
100
36.15
2,187
37.28
0,501
200
100
1000
1000
200
300
38.00
1,366
36.77
0,894
200
100
1000
200
300
300
36.06
2,268
negativ
0,014
200
100
1000
200
200
100
35.92
1,726
42.72
0,087
200
100
200
1000
300
300
37.59
2,029
39.11
0,250
200
100
200
1000
200
100
36.34
2,503
37.00
0,476
200
100
200
200
300
100
37.57
2,168
39.51
0,231
200
100
200
200
200
300
37.52
1,739
negativ
0,033
100
200
1000
1000
300
100
35.43
3,208
36.99
0,516
100
200
1000
1000
200
300
35.57
2,056
36.07
0,994
100
200
1000
200
300
300
34.14
3,248
42.89
0,071
100
200
1000
200
200
100
36.60
1,890
41.22
0,115
100
200
200
1000
300
300
36.12
3,028
39.22
0,298
100
200
200
1000
200
100
negativ
0,001
negativ
0,002
100
200
200
200
300
100
35.03
3,220
41.29
0,108
100
200
200
200
200
300
35.67
2,102
negativ
0,030
100
100
1000
1000
300
300
35.70
2,466
36.10
1,229
100
100
1000
1000
200
100
39.36
1,039
38.83
0,332
100
100
1000
200
300
100
35.15
3,090
40.07
0,199
100
100
1000
200
200
300
36.27
1,962
38.71
0,402
100
100
200
1000
300
100
36.91
2,235
35.72
0,503
100
100
200
1000
200
300
36.59
1,878
37.69
0,653
100
100
200
200
300
300
36.18
2,260
44.09
0,065
100
100
200
200
200
100
37.95
1,552
40.30
0,209
220
150
600
600
250
200
39.35
1,293
38.15
0,661
80
150
600
600
250
200
37.56
1,960
38.21
0,603
150
220
600
600
250
200
37.10
1,874
37.73
0,525
150
80
600
600
250
200
41.00
0,512
37.29
0,869
150
150
1100
600
250
200
36.70
2,548
38.28
0,594
150
150
100
600
250
200
38.08
1,974
39.08
0,404
150
150
600
1100
250
200
35.96
2,520
36.19
1,042
150
150
600
100
250
200
40.63
0,909
negativ
0,015
150
150
600
600
325
200
36.36
2,722
37.08
0,803
150
150
600
600
175
200
37.29
1,599
38.78
0,527
150
150
600
600
250
325
negativ
0,034
40.40
0,402
150
150
600
600
250
75
34.61
3,307
36.64
0,298
150
150
600
600
250
200
negativ
0,061
39.08
0,753
150
150
600
600
250
200
44.46
0,091
35.55
1,483
Forschungsvorhaben
Abschlussbericht
41 von 96 Seiten
In einem dritten Versuch wurden die in Frage kommenden Konzentrationsbereiche in DuplikaAnsätzen nochmals getestet.
Tabelle 2-17: optimale Primer- und Sondenkonzentrationen in der P35S/T-nos-Duplex-PCR
System
P35S
getestet
T-nos
Ergebnis:
getestet
Ergebnis:
optimale
optimale Kon-
Konzentration
zentration
Primer 1
100 nM
100 nM
800-1000 nM
1000 nM
Primer 2
100 nM
100 nM
800-1000 nM
1000 nM
Sonde
100-300 nM 100 nM
100-300 nM
200 nM
Ausgewählt wurden die jeweils niedrigen Konzentrationen, die noch gute Resultate lieferten.
Schließlich wurde die Methode (s. auch Methodenteil) validiert.
b) Validierung
Zur Validierung wurde ein Bt11-Mais-Standard verwendet, da er sowohl die P35S- als auch die
T-nos-Sequenz enthält. Zunächst wurde eine Verdünnungsreihe in 4 Replika untersucht.
Tabelle 2-18: 1. Arbeitsbereich/Präzision/Sensitivität des P35S- und des T-nos-Systems
Verdünnungs-
Mittelwert Mittelwert
Standard-
Standard-
Vertrauens-
Vertrauens-
stufe
gefundene Ct-Werte
abweichung
abweichung
bereich (95%)
bereich (95%)
pienzahl
Kopien
Kopienzahl
Ct-Werte
Ct-Werte
Kopienzahl (rel;
(=Soll)
(=Ist)
Ko-
%)
P35S-System
2500
2468
28,6
421
0,27
1,5
27,2
500
470
31,3
50
0,17
0,9
16,9
250
249
32,3
43
0,3
1,5
27,5
50
56
34,7
9
0,27
1,2
25,4
10
16
36,7
5
0,52
2,3
47,8
T-nos-System
2500
2806
28,5
264
0,14
0,8
14,9
500
614
30,7
86
0,2
1,0
22,3
250
323
31,7
70
0,36
1,8
34,5
50
64
34,1
9
0,23
1,1
23,3
10
18
35,9
3
0,22
1,1
35,7
Forschungsvorhaben
Abschlussbericht
42 von 96 Seiten
Die Ergebnisse zeigen, dass beide Systeme auch in den niedrigen Arbeitsbereichen noch eine gute
Präzision und Sensitivität aufweisen.
Ein Vergleich mit den entsprechenden Validierungsdaten für die jeweiligen Singleplex-PCR-Verfahren
zeigt, dass die PCR-Effizienz und Präzision sich nicht verschlechtert haben und mit denen der
Singleplex-Methode vergleichbar sind:
Tabelle 2-19: Vergleich der P35S/ T-nos Singleplex und Duplex PCR-Systeme
P35S
P35S
T-nos
T-nos
(Singleplex)*
(Duplex)
(Singleplex)*
(Duplex)
je 10 bis 2500 Kopien/PCR-Ansatz
Arbeitsbereich
Slope/Effizienz
-3,88 / 81%
-3,41 / 97%
-3,17 / 106%
-3,42 / 96%
R2
> 0,995
0,99
0,98
0,96
10 Kopien
10 Kopien
10 Kopien
10 Kopien
Ungefähre
Nachweisgrenze
* Validierungsdaten CVUA Freiburg
2. Quantifizierung von gentechnisch verändertem Mais; Richtigkeit und Präzision
Im nächsten Schritt wurde anhand von Referenzmaterialien mit definierten Anteilen an gv-Mais (Gewichtsprozent) Richtigkeit und Präzision bei der Quantifizierung von gv-Mais überprüft. Hierzu wurde
zusätzlich jeweils die Menge an amplifizierbarer Mais-DNA in den Referenzproben quantifiziert (Invertase-Gen, Methode CVUA Freiburg). Die Validierung erfolgte mit DNA aus zertifizierten Vergleichsmaterialien (Maismehlen), die unterschiedliche Anteile an Bt11-Mais aufweisen (IRMM-412). Jedes
Konzentrationsniveau (% Bt11) wurde an 5 Replikaten untersucht (0,02% = DNA-Verdünnung aus
0,1%). Weiterhin wurde Referenzmaterial von MON810-Mais (P35S positiv, T-nos-negativ) sowie von
GA21-Mais (P35S negativ, T-nos-positiv) untersucht. Die Kalibrierung erfolgte jeweils mit DNA aus
Referenzmaterial, welches aus einer Mischung von Bt11-Mais (5 Gewichtsprozent) in konventionellem Mais hergestellt wurde.
Forschungsvorhaben
Abschlussbericht
43 von 96 Seiten
Tabelle 2-20: Sensitivität des P35S/T-nos Duplex-PCR-Systems
Sensitivität aus Verdünnungsreihe
Nachweisgrenze
Bt11-Mais (%)
Bt11-Mais (%)
P35S-System
T-nos-System
ca. 0,02%
ca. 0,02%
ca. 0,05 bis 0,1%
ca. 0,05 bis 0,1%
bei ca. 40.000 Kopien Mais-DNA
pro 5 µl DNA-Lösung
Bestimmungsgrenze
bei ca. 40.000 Kopien Mais-DNA
pro 5 µl DNA-Lösung
Tabelle 2-21: Richtigkeit und Präzision des P35S/T-nos Duplex-PCR-Systems anhand von gvMais-DNA von Bt11-Mais, MON810 und GA21
Referenzmaterial
% gv-Mais (Gew.%),
Soll
Ist:
Mittelwerte
(in %) (n=5)
Standardabweichung
(in %)
Vertrauensbereiche,
rel. (p=95%)
(bezogen auf Mittelwert, in %)
P35S
T-nos
P35S
T-nos
P35S
T-nos
0,02% Bt11
(P35S pos ; T-nos pos)
0,02
0,01
0,01
0,002
53
38
0,1% BT11
0,07
0,05
0,02
0,01
29
28
1,0% BT11
0,82
0,79
0,10
0,10
15
15
2,5% MON810
(P35S pos ; T-nos neg)
1,72
0
0,13
-
10
-
0,05% MON810
(0,06)
0
0,01
-
24
-
2,5% GA21
(P35S neg ; T-nos pos)
0*
(5,86)
-
0,97
-
20
0,05% GA21
0
(0,06)
-
0,01
-
19
0,05% MON810 +
2,5 % GA21
(0,09)
(8,85)
0,02
2,64
34
37
2,5% MON810 +
0,05 % GA21
(1,93)
(0,06)
0,21
0,01
13
22
*1 von 5 Replika positiv; < 10 Kopien
Werte in Klammern: Daten nur zur Information, Bewertung der Richtigkeit nicht möglich, da Quantifizierung über Bt11Standardreihe
Forschungsvorhaben
Abschlussbericht
44 von 96 Seiten
Sensitivität und Präzision
Die aus der Verdünnungsreihe abgeschätzte Sensitivität von 0,02% gv-Mais konnte auch mittels Referenzmaterialien bestätigt werden (DNA-Verdünnung aus 0,1% Bt11-Material). Die durch Mischung
von DNA aus Referenzmaterialien hergestellten Stufen 0,05% MON810 (Soll: P35S positiv) sowie
0,05% GA 21 (Soll: (T-nos positiv) ergaben ebenfalls die erwarteten, eindeutig positiven Resultate.
Ausgewählt wurden die Mischungen mit jeweils hohen Anteilen der konkurrierenden Sequenz, um auf
eventuelle Verluste der Sensitivität der Duplex-PCR durch kompetitive Effekte zu prüfen. Bereits in
diesen niedrigen Konzentrationsstufen von 0,05% gv-Mais waren die Präzisionsdaten so gut, dass die
Kriterien für die Quantifizierung nahezu erfüllt wären. Danach ist ab einem Vertrauensbereich von
±30% eine Quantifizierung möglich (s. S19, sowie [11, 17]). Ab Anteilen 0,1% und mehr waren diese
Anforderungen an die Präzision durchweg erfüllt.
Spezifität
Die Methode detektierte die getesteten Materialien sowie die weiteren in der Tabelle 2-5 genannten
Events entsprechend den erwarteten Vorgaben aus Datenbanken sowie Untersuchungen mittels
Singleplex-Methoden (fett gedruckt). Auch die getesteten Materialien, bei denen zumindest eine der
beiden Sequenzen nicht nachweisbar sein sollten (MON810; T-nos negativ; GA21: P35S negativ)
ergaben die erwarteten Resultate. Allerdings war bei der Untersuchung der DNA aus 2,5% GA21Mais im P35S-Nachweis eine von 5 Reaktionen ganz schwach positiv (< 10 Genomkopien).
Die Überprüfung mit der Singleplex-Methode ergab auch hier eine entsprechend schwache Reaktion.
Im Vorfeld der Herstellung der Negativ-Kontrollen hatte sich bereits gezeigt, dass alle getesteten
„0% -Referenzmaterialien“, z.B. „0% MON810“ oder „0% GA21“ Spuren der P35S bzw. T-nosSequenz enthielten. Die Materialien waren lediglich negativ bezüglich des zertifizierten Events, nicht
aber weiterer Kontaminationen durch GVO-Bestandteile. Deshalb wurden eigene Mischungen aus
Maismehl gestellt, welches in vorherigen Untersuchungen negativ war. Aber auch hier zeigte sich,
dass sehr schwach positive Resultate in einzelnen PCR-Reaktionen nicht ganz ausgeschlossen werden können (s. auch Ergebnis Ringversuch).
Es kann aus den Resultaten jedoch geschlossen werden, dass die festgestellten vereinzelten, ganz
schwach positiven Resultate in diesen Kontrollen nicht bedingt durch die Methode falsch-positiv, sondern materialbedingt sind.
Wiederfindung und Richtigkeit
Die am Ringversuch teilnehmenden Laboratorien erhielten DNA-Extrakte, die vorab auf 50.000 Kopien des Mais-Referenzgens pro Ansatz eingestellt waren. Die prozentualen Anteile der P35S- bzw.
T-nos-Sequenz, bezogen auf das Mais-Referenz-Gen sind in den letzten Spalten der Tabellen 2-22
und 2-23 dargestellt (Mittelwerte und Standardabweichung).
Forschungsvorhaben
Abschlussbericht
45 von 96 Seiten
Ab der Stufe 0,1% Bt11 für das P35S-System sowie bei 1% Bt11 für das T-nos System wurden gute
Wiederfindungen von ca. 80% erreicht.
Eine genaue Quantifizierung von MON810 oder GA21 ist mit der Methode in dem gewählten Versuchslayout nicht möglich, da Bt11 als Quantifizierungsstandard verwendet wurde. Faktoren wie unterschiedliche Integrationshäufigkeit der P35S- bzw. T-nos-Sequenz gegenüber der Bt11-Sequenz,
unterschiedliche Zygotie oder Ploidie in dem Material, welches der für die Herstellung der Referenzstandards verwendet wurde, können zu divergierenden Resultaten führen.
Die Validierungsdaten zeigen aber, dass die Methode den Zweck eines semiquantitativen Screenings
gut erfüllen kann.
Positive Screening-Befunde über ca. 0,05% - 0,1% sind danach zusätzlich mit einem konstrukt- bzw.
Event-spezifischen System - möglichst unter Verwendung der jeweils identifizierten Events als Quantifizierungsstandard - zu verifizieren und zu quantifizieren.
3. Ringversuch im Rahmen der § 64 AG Gentechnik in Lebensmitteln
Die Zuverlässigkeit der Methode wurde in einem Ringversuch mit insgesamt 10 Teilnehmern im
Rahmen der deutschen Arbeitsgruppe nach § 64 LFGB überprüft [27]. Es wurden die unter Punkt 2
genannten 9 DNA-Lösungen bzw. DNA-Mischungen aus zertifizierten Referenzmaterialien (Bt11,
MON810, GA21) sowie eine DNA aus zuvor negativ getestetem Maismehl verwendet.
Diese DNA-Lösungen wurden an die teilnehmenden Laboratorien in codierter Form versendet. Außerdem erhielt jedes Labor zur Quantifizierung der P35S- sowie der T-nos-Sequenz Standard-DNA,
isoliert aus Bt11-Referenzmaterial (5%). Die Konzentration dieser Standard-DNA wurde photometrisch bestimmt und die Kopienzahlen an Mais-Genomäquivalenten berechnet (haploides Genomgewicht Mais: 2,73 pg [22]). Die Labors erhielten folgende fünf Verdünnungsstufen: 10, 50, 250, 500 und
2500 Kopien gv-Mais-DNA pro 5 µl. Weiterhin erhielt jedes Labor Aliquots von Primern sowie den
Mastermix für die Real-time PCR (TaqMan Universal PCR Master Mix von Applied Biosystems, enthaltend Hot-Start Polymerase, Puffer und Nukleotide).
Jede DNA-Lösung musste in fünf Replika untersucht werden, sodass über alle Teilnehmer jeweils 50
Resultate vorlagen. Die Messung sollte an Geräten der Firma Applied Biosystems (bevorzugt ABI
GeneAMP Sequence Detection System 7500) erfolgen.
8 Labore verwendeten das ABI-Real-time PCR-Gerät ABI GeneAMP Sequence Detection System
7500, jeweils ein Labor die Real-time PCR-Systeme ABI GeneAMP Sequence Detection System
7900 bzw. Stratagene MX3005.
In den Tabellen 2-22 und 2-23 sind die Ergebnisse des Ringversuchs zusammengefasst.
Forschungsvorhaben
Abschlussbericht
46 von 96 Seiten
Tabelle 2-22: Ringversuch Duplex Real-time PCR P35S /T-nos; A: Ergebnisse P35S-System
Mittelwert Effizienz: 93 % (83-99 %)
P35S-System
Referenzmaterial
Anteil
% gv-Mais (Gew.%),
positiver
Soll
Ergebnisse1
Ct-Werte
Kopienzahlen
P35S
MW2
StAW3
MW
StAW
0,02% Bt11
(P35S pos )
50/50
36,4
1,0
13
4,8
RSDR5
(%)
38
0,1% BT11
(P35S pos )
50/50
34,1
0,5
56
15
1,0% BT11
(P35S pos )
50/50
30,8
0,6
470
72
2,5 % MON810
(P35S pos )
50/50
29,4
0,6
0,05 % MON810
(P35S pos)
50/50
34,4
0,8
(29)
2,5% GA21
(« P35S neg »)
7/50
-
0,05% GA21
(« P35S neg »)
10/50
0,05 % MON810 +
2,5 % GA21
(P35S pos)
50/50
Ct min
= 36)
Ct min
= 38)
34,5
2,5% MON810 +
0,05 % GA21
(P35S pos ; T-nos
pos)
50/50
29,4
0,6
0% GV-Mais
10/50
(Ct min
= 38)
-
% P35S
(bezogen auf
Kopienzahl Mais)4
MW
StAW
0,03
0.01
27
0,11
0,03
15
0,94
0,14
10
(2,3)
(0,23)
9,4
32
(0,06)
(0,02)
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
5,0
(43)
(18)
42
(0,09)
(0,04)
(1192) (152)
13
(2,4)
(0,3)
-
-
-
(1170) (116)
-
-
Legende s. Tabelle 2-22
Forschungsvorhaben
Abschlussbericht
47 von 96 Seiten
Tabelle 2-23. Ringversuch Duplex Real-time PCR P35S /T-nos; B: Ergebnisse T-nos-System
Mittelwert Effizienz: 102 % (66-120%)
T-nos-System
Referenzmaterial
Anteil
% gv-Mais (Gew.%),
positiver
Soll
Ergebnisse1
Ct-Werte
Kopienzahlen
T-nos
MW2
StAW3
MW
StAW
0,02% Bt11
(P35S pos )
49/50
37,6
1,4
5,7
3,5
RSDR5
(%)
61
0,1% BT11
(P35S pos )
50/50
34,7
0,9
37
13
1,0% BT11
(T-nos pos )
50/50
31.2
0,7
404
2,5% MON810
(T-nos neg)
0/50
-
-
0,05% MON810
(T-nos neg)
0/50
-
2,5% GA21
(T-nos pos)
50/50
0,05% GA21
(T-nos pos)
% T-nos
(bezogen auf
Kopienzahl Mais)4
MW
StAW
0,01
0,01
35
0,07
0,03
101
25
0,81
0,20
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
27,9
4,2
(4500)
(1722)
38
(9.0)
(3,5)
50/50
33,6
0,9
(81)
(23)
28
(0,16)
(0,05)
0,05% MON810 +
2,5 % GA21
(T-nos pos)
50/50
27,8
4,1
(4650)
(1850)
40
(9,3)
(3,7)
2,5% MON810 +
0,05 % GA21
(T-nos pos)
50/50
33,9
1,0
(69)
(27)
40
(0,1)
(0,06)
0% GV-Mais
5/50
(Ct min
= 39)
-
-
-
-
-
-
1
= Ergebnisse mit Ct-Werten < 40 wurden als negativ bewertet
= Mittelwert
3
= Standardabweichung
4
= 50.000 Kopien Mais-DNA
5
= relative Standardabweichung (unter Vergleichsbedingungen)
2
Werte in Klammern: Daten nur zur Information, Bewertung der Richtigkeit nicht möglich, da Quantifizierung über Bt11Standardreihe
Steigung der Kalibrierfunktion, Effizienz
Bei einer Reihe von Laboratorien zeigte die Verdünnungsreihe besonders im T-nos-System eine
leichte Inhibition, sodass der höchste Standard nicht für die Regressionsgerade herangezogen werden konnte. Dennoch ist die Steigung und damit die Effizienz der Systeme über alle Labore als ausreichend zu bezeichnen. Tendenziell zeigte das P35S-System die etwas bessere Effizienz.
Forschungsvorhaben
Abschlussbericht
48 von 96 Seiten
Die jeweils niedrigsten Effizienzen mit 66% für das T-nos-System sowie 83% für das P35S-System
wurden in demselben Labor erhalten. Für die Auswertung wurden dennoch die Daten aller Labors
berücksichtigt, Ausreißer wurden nicht eliminiert.
In den Tabellen 2-22 und 2-23 sind die Anteile positiver Resultate sowie die Präzisionsdaten für die
einzelnen Proben zusammengefasst. Demnach war ein Anteil von 0,02% Bt11 mit beiden Systemen
eindeutig detektierbar (50/50 bzw. 49/50 Reaktionen). Dies gilt ebenso für die Stufen 0,05% GA21
bzw. 0,05% MON810, einschließlich Mischungen mit hohen Anteilen der konkurrierenden Sequenz.
Für das T-nos-System waren die Präzisionsdaten (RSDR) allerdings bis auf die Stufe 1% Bt11 nicht
ausreichend, um den Anforderungen der Norm ISO 24276 [17] für die Quantifizierung zu entsprechen
(RSDR = 25 - 61%). Danach sollte bei quantitativen Verfahren RSDR maximal 25% betragen, zwischen Nachweis- und Bestimmungsgrenze maximal 33 %. Dagegen ist für das P35S-System das
Kriterium für die Bestimmungsgrenze bei allen Proben der Stufen 1,0% und mehr, sowie bei der Probe 0,1% Bt11 annähernd erfüllt (RSDR = 13 - 38%)
Hinsichtlich Sensitivität und Präzision sind die erzielten Daten jedoch als völlig ausreichend zu bezeichnen, um dem Zweck der Methode, dem eines semiquantitativen Screenings zu genügen.
Spezifität
Wie auch bei der laborinternen Validierung wurden besonders bei dem P35S-System in den als
„P35S-negativ“ vorgegebenen Proben positive Signale in sehr geringen Mengen erhalten (in einem
Fall Ct 36, ansonsten Ct 38 und höher), was durchweg weniger als 10 Kopien entspricht. Als Ursache
hierfür kommen minimale Kontaminationen des verwendeten „0%“-Maismehls durch P35S- und Tnos- enthaltende Materialien in Betracht, nicht jedoch methodenbedingte falsche positive Resultate
(s.o.). Außerdem ist anzumerken, dass die Amplifikationen in maximal 2 von 5 Reaktionen auftraten
und gemäß den Vorgaben der einschlägigen Normen [17] nicht als positiv zu werten wären. Ausführliche Nachuntersuchungen mittels Singleplex-PCR bestätigten, dass in den Materialien „0% gv-Mais“,
„0,05% GA21“, „2,5% GA21“ geringe Kontaminationen durch P35S-haltige Bestandteile, in der Probe
„0% gv-Mais“ zusätzlich durch T-nos enthaltende Bestandteile vorhanden waren.
Für die Stufen 0,1% und 1,0% Bt11 wurden bei dem P35S-System mit 110% bzw. 94% gute Wiederfindungen erreicht, auch für das T-nos-System sind diese mit 70% bzw. 81% noch als ausreichend zu
bezeichnen.
Forschungsvorhaben
Abschlussbericht
49 von 96 Seiten
Vorstellung der Ringversuchsergebnisse und Aufnahme in Amtliche Sammlung
Im Rahmen der Sitzung des §64 Arbeitskreises am 19. März 2007 in Berlin wurden die Ergebnisse
des Ringversuchs vorgestellt. Die Arbeitsgruppe votierte für eine Aufnahme der Methode in die Amtliche Sammlung von Untersuchungsverfahren nach § 64 LMBG.
Veröffentlichung
Die Ergebnisse sollen zusätzlich noch in einer englischsprachigen Publikation veröffentlicht werden
(Einreichung der Arbeit ca. Ende Mai 2007) [27].
2.3.4
Triplex-Real-time PCR: Erprobung und Optimierung eines Systems
Für die parallele Quantifizierung von DNA-Sequenzen mittels Triplex-Real-time PCR wurde die Kombination
-
P35S /T-nos zusammen mit dem
-
Mais-spezifischen Referenzgen aus dem high mobility group Protein hmga [29]
ausgewählt.
Es wurden jeweils die vorhandenen Primer-/Sonden-Systeme der vorhandenen Singleplex-Verfahren
verwendet. Das hmga-System wurde wie die vorgenannten Systeme im Ringversuch als SingleplexReal-time PCR-Verfahren erfolgreich erprobt [29].
Die GVO-Untersuchung beinhaltet, insbesondere bei verarbeiteten Produkten, immer auch eine
Überprüfung der Menge an amplifizierbarer DNA aus der jeweiligen Spezies. Das Ergebnis dieser
Untersuchung dient zum einen der Quantifizierung (Verhältnis Transgen-spezifische DNA zu DNA
aus dem Referenzgen), zum anderen zur Abschätzung der Proben-spezifischen Nachweisgrenze im
Falle negativer Befunde [11].
Da dieses Referenzgen gegenüber den Transgen-spezifischen Sequenzen in der Regel in großem
Überschuss in der Reaktion vorhanden, können bei der simultanen Amplifizierung kompetitive Effekte
auftreten und ggf. der Nachweis der in geringen Mengen vorhandenen Sequenzen ganz unterdrückt
werden. Dies sollte im Rahmen einer Methodenerprobung bewertet werden.
a) Optimierung:
Zunächst wurden die Primer-Sonden-Konzentrationen der zugrunde liegenden Duplex-PCR eingesetzt und die entsprechenden Parameter für das hmga-System aus der Singleplex-Methode entnommen.
Untersucht wurden 2 Konzentrationsbereiche:
-
0,02% Bt11 (je 50 Kopien P35S/T-nos/50.000 Kopien hmga)
Forschungsvorhaben
Abschlussbericht
-
50 von 96 Seiten
0,1% Bt11 (je 10 Kopien P35S/T-nos/50.000 Kopien hmga)
Dabei zeigte sich, dass unter Verwendung des Real-time PCR-Mastermixes (TaqMan Universal Realtime PCR Master Mix, ABI) keine Amplifikation bei T-nos mehr feststellbar war, während das MaisReferenz-System hmga noch eine gute Effizienz zeigte.
Daher wurden in einem nächsten Schritt folgende Optimierungsversuche unternommen:
a) Verwendung des QuantiTect Multiplex PCR Kits (optimiert für Multiplex Real-time PCR, allerdings
derzeit ca. doppelte Kosten pro Ansatz gegenüber dem herkömmlichen Mastermix)
b) Weitere Reduzierung der Primerkonzentrationen des hmga-Systems (zunächst schrittweise von
ursprünglich 300 über 200 auf 100 nM); dann erfolgte ein weiterer Versuch mit folgendem Layout:
Tabelle 2-24: Optimierung der Primerkonzentrationen für die Triplex PCR P35S/T-nos/hmga
System
P35S
T-nos
hmga
Primer 1
100 nM
1000 nM
40-100 nM
Primer 2
100 nM
1000 nM
40-100 nM
Sonde
100 nM
200 nM
100 nM
Bei einer Primerkonzentration von 70 nM für das hmga-System wurde eine sehr gute Sensitivität für
T-nos-System festgestellt; während das hmga -System selbst noch gute Signale zeigte (bei 40nM zu
geringes ∆Rn). Das P35S-System musste allerdings in einem letzten Versuch optimiert werden:
Die dabei getesteten und jeweils optimalen Konzentrationen sind in Tabelle 2-25 dargestellt:
Tabelle 2-25: Optimierung einer Triplex Real-time PCR zum Screening auf GVO, getestete
Konzentrationsbereiche:
System
P35S
getestet
T-nos
getestet
hmga (Mais)
Primer 1
100-300 nM
Ergebnis:
optimale Konzentration
200 nM
1000 nM
Ergebnis:
1000 nM
getestet
40-300 nM
Ergebnis:
70 nM
Primer 2
100-300 nM
200 nM
1000 nM
1000 nM
40-300 nM
70 nM
Sonde
100-200 nM
100 nM
200 nM
200 nM
160 -100nM
100 nM
Bei den optimierten Bedingungen wurden nun für bei GVO-Screening-Systeme eine gute Sensitivität
erreicht (niedrige Konzentrationen von 0,02% gv-Mais waren noch eindeutig nachweisbar).
Forschungsvorhaben
Abschlussbericht
51 von 96 Seiten
b) Validierung
Die Validierung erfolgte wie für das P35S/T-nos-Duplex-System mit einem Bt11-Mais-Standard.
Zunächst wurde eine Verdünnungsreihe in 4 Replika untersucht.
1. Arbeitsbereich/Präzision/Sensitivität:
Tabelle 2-26: Validierung P35S/T-nos/hmga-Triplex–PCR (Präzision und Sensitivität)
Verdünungs- Mittelwert
Mittel-
Standardab-
Standardab-
Vertrauens-
Vertrauens-
weichung
weichung
bereich
bereich
Ct-Werte
(95%)
(95%)
Ct-Werte
Kopienzahl
stufe
gefundene
wert
Kopienzahl
Kopien
Ct-Werte Kopienzahl
(=Soll)
(=Ist)
(rel; %)
P35S-System
2500
2303
29,13
81
0,06
0,3
5,6
500
503
31,54
26
0,08
0,4
8,3
250
251
32,65
29
0,18
0,9
18,7
50
40
35,58
5
0,22
1,0
21,6
10
14
37,37
6
0,70
3,0
70,4
T-Nos-System
2500
2310
28,82
317
0,21
1,1
21,8
500
478
31,10
21
0,07
0,3
6,9
250
271
31,93
23
0,12
0,6
13,3
50
43
34,63
9
0,34
1,6
33,7
10
17
36,11
9
0,86
3,8
82,3
Die Ergebnisse zeigen, dass die beiden Transgen-Nachweissysteme noch bis zu 50 Kopien eine akzeptable Präzision und eine dem Duplex-System vergleichbare Sensitivität aufweisen. Es waren alle
Verdünnungen mit 10 Kopien der T-nos bzw. P35S-Sequenz positiv (jeweils 6 von 6).
Ein Vergleich mit den entsprechenden Validierungsdaten für das Duplex-PCR-Verfahren (s.o.) zeigt,
dass sich die PCR-Effizienz und Präzision bei T-nos überhaupt nicht und bei dem P35S-System im
noch akzeptablen Rahmen verschlechtert haben.
Forschungsvorhaben
Abschlussbericht
52 von 96 Seiten
Tabelle 2-27: Vergleich der Validierungsdaten P35S/T-nos Duplex-PCR und P35S/T-nos/hmga
Triplex-PCR
P35S
P35S
NOS
NOS
(Triplex)
(Duplex)
(Triplex)
(Duplex)
je 10 bis 2500 Kopien/PCR-Ansatz
Arbeitsbereich
Slope/Effizienz
-3,57 / 91%
-3,41 / 97%
-3,20 / 105%
-3,42 / 96%
R2
0,98
0,99
0,97
0,98
10 Kopien
10 Kopien
10 Kopien
10 Kopien
Ungefähre
Nachweisgrenze
Forschungsvorhaben
Abschlussbericht
53 von 96 Seiten
2. Quantifizierung von gentechnisch verändertem Mais; Richtigkeit und Präzision
Da nun das Mais-Referenzsystem im Verfahren integriert ist, sind besonders die Ergebnisse zur relativen Quantifizierung (bezogen auf das Mais-Referenz-System) von Interesse. Diese Quantifizierung
erfolgte bisher in 2 separaten Real-time PCR-Reaktionen.
Die Validierung erfolgte mit ausgewählten, bereits für die Duplex-PCR verwendeten Materialien.
Jedes Konzentrationsniveau wurde an 6 Replikaten untersucht.
Tabelle 2-28: Richtigkeit und Präzision der Quantifizierung mit der P35S/T-nos/hmga TriplexPCR:
Referenzmaterial
% gv-Mais (Gew.%),
Soll
Ist:
Mittelwerte
(in %) (n=6)
Standardabweichung
(in %)
Vertrauensbereiche,
rel. (p=95%)
(bezogen auf Mittelwert, in %)
P35S
T-nos
P35S
T-nos
P35S
T-nos
0,02% Bt11
0,02
(0,02)
0,02
(0,01)
0,004
(0,01)
0,008
(0,002)
28
(53)
47
(38)
0,1% BT11
0,09
(0.07)
0,08
(0,05)
0,047
(0,02)
0,015
(0,01)
58
(29)
21
(28)
1,0% BT11
1,28
(0,82)
1,18
(0,79)
0,077
(0,10)
0,153
(0,10)
6,9
(15)
15
(15)
2,5% MON810
2,19
(1,72)
0
0,27
(0,13)
-
14
(10)
-
0,05% MON810
0,05
(0,06)
0
0,011
(0,01)
-
27
(24)
-
2,5% GA21
0
11,3
(5,86)
-
0,57
(0,97)
-
5,7
(20)
0,05% GA21
0*
0,21
(0,06)
-
0,04
(0,01)
-
21
(19)
0,05% MON810 +
2,5% GA21
0,05
(0,02)
12,0
(11,7)
0,04
(0,02)
0,42
(2,64)
79
(34)
4
(37)
2,5% MON810 +
0,05% GA21
2,28
(1,93)
0,27
(0,06)
0,26
(0,21)
0,06
(0,01)
13
(13)
24
(22)
Werte in Klammern: Daten für das Duplex-System (s.o.) zum Vergleich
kursiv: Daten nur zur Information, Bewertung der Richtigkeit nicht möglich, da Quantifizierung über Bt11-Standardreihe
* 2 von 6 Replika positiv (Ct >38)
Forschungsvorhaben
Abschlussbericht
54 von 96 Seiten
Auch hier konnte die aus der Verdünnungsreihe abgeschätzte Sensitivität von 0,02% gv-Mais mittels
Referenzmaterialien bestätigt werden. Auch Anteile von 0,05% gv-Mais in Mischungen mit jeweils
hohen Anteilen der konkurrierenden Sequenz waren in allen Reaktionen nachweisbar.
Die Präzision war mit derjenigen des Duplex-Systems vergleichbar (in der Tabelle Daten in Klammern) und erfüllte bei dem T-nos-System sogar ab ca. 0,05% gv-Mais die Anforderungen für quantitative Methoden.
Bei dem P35S-System wurden ebenfalls insgesamt ausreichende Präzisionsdaten erhalten, allerdings waren die Daten für die Stufe 0,1% Bt11 nicht ausreichend für die Quantifizierung (obwohl in
der Stufe 0,02% Bt11 das Kriterium für die Quantifizierung (Vertrauensbereich ca. ± 30%) bereits erfüllt war). Einzig bei hohen Anteilen der konkurrierenden T-nos-Sequenz (0,05% MON810, 2,5% GA
21) waren leichte kompetitive Effekte festzustellen, was sich in einer schlechteren Fluoreszenzzunahme und größerer Streuung der Daten (VB =79%) zeigte.
Spezifität
Proben, welche die P35S bzw. T-nos-Sequenz nicht enthielten, ergaben die erwarteten negativen
Resultate. So waren DNA-Lösungen aus MON810 negativ für T-nos, DNA-Lösungen aus GA21Material negativ für P35S. Die im verwendeten Vergleichsmaterial bei GA21 festgestellten schwachen
positiven Signale für P35S sind sehr wahrscheinlich materialbedingt (s. auch entsprechende Ergebnisse bei der Duplex-PCR).
Auch die relative Quantifizierung bezogen auf das Mais-Referenz-Gen, welche bei den Bt11-haltigen
Proben möglich war, lieferte gute Ergebnisse.
Bei allen untersuchten Stufen (0,02%, 0,1% und 1% Bt11) resultierten sowohl für das P35S-System
als auch für das T-nos-System ausreichende Wiederfindungen zwischen ca. 80 und 130% (Ist-Werte,
zweite Spalte in der Tabelle).
Eine genaue Quantifizierung von MON810 oder GA21 ist mit der Methode in dem gewählten Versuchslayout nicht möglich (s. Duplex-Verfahren).
Insgesamt zeigen die Validierungsdaten, dass die Methode den Zweck eines semiquantitativen
Screenings sehr gut erfüllen kann.
Forschungsvorhaben
Abschlussbericht
Teil „Microarrays“ – EInführung
3
3.1
55 von 96 Seiten
Projektteil „Microarrays“
Vorbemerkung
In einem früheren Forschungsvorhaben [30] hat das CVUA Freiburg die Eignung von MicroarraySystemen (DNA-Chips) für einen simultanen Nachweis mehrerer DNA-Sequenzen erprobt. Die Ergebnisse der Untersuchungen zeigten, dass Microarray-Systeme prinzipiell gut geeignet sind zur
schnellen, parallelen und auch routinemäßigen Untersuchung mehrerer Zielsequenzen aus DNAExtrakten (z.B. aus Lebensmitteln). Dem gegenüber standen jedoch eingeschränkte Differenzierungsmöglichkeiten bei Vorhandensein verschiedener GVO in einer Probe. Die Methoden zeigten
noch gewisse Schwächen bei der Reproduzier- und Standardisierbarkeit der Ergebnisse; entsprechende DNA-Chips waren nicht zuletzt deshalb vorerst nicht mehr kommerziell verfügbar. Ein weiterer Nachteil ist die derzeit noch fehlende Quantifizierungsmöglichkeit.
Ende 2006 hat die Firma Eppendorf nun ein neues Microarray-basierendes Nachweissystem für GVP
vorgestellt, den Eppendorf Dual Chip, welcher im Rahmen eines Europäischen Forschungsprojektes
entwickelt worden ist.
Am Ende des vorliegenden Forschungsvorhabens wurden deshalb kurzfristig mehrere Testläufe dieser Alternativtechnologie zum Screening auf GVO durchgeführt; Vor- und Nachteile sollten v.a. im
Vergleich mit den erarbeiteten Real-time PCR-Methoden (s. Kapitel 2) insbesondere auch im Hinblick
auf deren Praxistauglichkeit verglichen werden.
Forschungsvorhaben
Abschlussbericht
Teil „Microarrays“ – Material und Methoden
3.2
56 von 96 Seiten
Eppendorf Dual Chip
 - Material und Methoden, Prinzip
Unter DNA-Chips oder Microarrays versteht man miniaturisierte Träger, auf deren Oberflächen DNAMoleküle bekannter Sequenz als biomolekulare Sonden in einem geordneten Raster immobilisiert
oder synthetisiert sind. Die oberflächengebundenen DNA-Moleküle werden mit komplementären,
markierten Nukleinsäuren hybridisiert.
Die daraus resultierenden Signale erlauben eine rasche Aussage über mehr oder weniger komplexe
biologische Zustände, wie beispielsweise Mutationen oder Genaktivierung, oder auch den Nachweis
von in der hybridisierten Probe vorhandenen gentechnischen Veränderungen. Durch eine hohe Parallelität des Verfahrens kann ein großer Datendurchsatz in relativ kurzer Zeit erzielt werden.
Der Dual Chip der Fa. Eppendorf bedient sich genetischer Elemente, die häufig im Screening verwendet werden:
-
CaMV 35S Promoter (P35S)
-
Nopaline Synthase Terminator (T-nos)
-
Phosphinothricin N-Acetyltransferase (pat)
-
cry1Ab delta-Endotoxin (Cry1Ab)
-
5-Enolpyruvylshikimate-3-Phosphat Synthase (EPSPS)
-
Übergang von Nopaline Synthase Promotor und Neomycinphosphotransferase-Gen (P-nos-nptII)
Zur Kontrolle, ob amplifizierbare DNA in der Probe vorhanden ist, werden spezies-spezifische Sequenzen nachgewiesen:
-
Invertase (Mais)
-
Cruciferin (Raps)
-
Lectin (Soja)
-
BCL (Pflanzen allgemein)
Weiteres Kontrollelement
-
Cauliflower Mosaic Virus (CaMV)
Forschungsvorhaben
Abschlussbericht
Teil „Microarrays“ – Material und Methoden
57 von 96 Seiten
Abb. 3-1: Anordnung der Sequenzen auf dem Chip:
Aus der Proben-DNA werden die genannten Sequenzen zunächst in 4 separaten Multiplex-PCRReaktionen amplifiziert.
Da die Primer biotinyliert sind, können gebildete Biotin-Amplikons über eine Antigen-AntikörperReaktion nachgewiesen werden. Ein Anti-Biotin-Gold-Konjugat wird gebunden und bewirkt nach Silbernitrat/Reduktionsmittelzugabe eine spezifische, sensitive Silberfärbung derjenigen Spots, bei denen eine erfolgreiche Hybridisierung stattgefunden hat.
Die Methode wurde entsprechend dem Manual des Eppendorf Dual Chip durchgeführt.
Forschungsvorhaben
Abschlussbericht
Teil „Microarrays“ – Ergebnisse und Diskussion
3.3
58 von 96 Seiten
Ergebnisse
Es wurden insgesamt 28 DNA-Lösungen mit dem Dual-Chip-System getestet. Hauptaugenmerk wurde auf die Sensitivität der einzelnen Nachweisreaktionen gelegt, da diese bei Screening-Verfahren
entscheidende Bedeutung hat. Eine zu geringe Sensitivität könnte zu falsch negativen Ergebnissen
führen, die dann nicht weiter spezifisch untersucht würden.
Im Rahmen der Tests wurden für die Screening-Elemente in folgenden Konzentrationen (Kopienzahlen) noch positive Befunde erhalten:
Tabelle 3-1: Auswertung der Sensitivität des Eppendorf Dual-Chip - Vergleich mit Real-time
PCR
Sequenz
verwendetes Material
Sensitivität
Vergleich mit
Real-time PCR
Roundup Ready Soja
0,1%, tiefer nicht getestet
NK 603 Mais
50 Kopien, nicht tiefer getestet
Topas19/2-Raps
50 Kopien
Bt 11-Mais, LL 62 Reis
ca. 20 -25 Kopien
Bt 176-Mais, LL 601, Reis,
Ca. 10 Kopien
P35S
T45-Raps, MS 8 Raps
T-nos
Roundup Ready Soja
0,1%, tiefer nicht getestet
NK 603 Mais
Topas19/2-Raps
50 Kopien
LL 62 Reis
Ca. 20 -25 Kopien
Bt 11-Mais, Bt 176-Mais, LL
10 Kopien
je ca.
601-Reis, MS 8 Raps
Cry1-A b
pat
EPSPS
P-nos-nptII
Bt 176
0,1%
Bt-11-Mais
> 20 Kopien (nicht detektiert)
Bt-Reis
Bt-10-Mais
10 Kopien
Topas 19/2-Raps
50 Kopien
Bt-11-Mais, T45 Raps
10 Kopien
RR-Soja
0,1%, nicht tiefer getestet
NK 603-Mais
GT 73 Raps
GA 21 Mais
10 Kopien
Topas 19/2-Raps
50 Kopien
Sunup Papaya
10%
Forschungsvorhaben
Nachweisgrenze
5-10 Kopien
Abschlussbericht
59 von 96 Seiten
Zusammenfassend ergab sich aus den Tests eine durchschnittliche Sensitivität von 10 bis 50 Kopien.
Im Rahmen der durchgeführten Tests scheinen das T-nos- und das P35S-System tendenziell die
höchsten Sensitivitäten und das Cry1ab -System insgesamt die geringste Sensitivität aufzuweisen.
3.3.1
Konsequenzen für die Praxis
Die Ergebnisse der Untersuchungen zeigten, dass das getestete Microarray-System prinzipiell geeignet ist zur parallelen Untersuchung auf Sequenzen aus gentechnisch veränderten Organismen. Dennoch ist eine Routineeignung gegenüber der Real-time PCR insgesamt weniger gegeben:
Tabelle 3-2: Vor- und Nachteile des Eppendorf Microarray im Vergleich mit der Real-time PCR
Microarray-System
Real-time PCR (auch Duplex)
ca. 10 -50 Kopien
ca. 5-10 Kopien
Quantifizierung
nein
ja
Kosten
hoch
mittel (ca. 30 €/Probe)
Sensitivität
für
Verbrauchs-
material*
Arbeitsaufwand*
(ca. 90 €/Probe)
hoch (Messung von max. 8
mittel (Messung und Auswertung von
Proben/Tag)
mind. 20 Proben/Tag möglich)
* es wird davon ausgegangen, dass für ein Screening mittels Real-time PCR i.d.R. 6 Elemente (3 Duplex-Real-time PCRVerfahren) ausreichen.
Der Hauptvorteil der Real-time PCR ist die Möglichkeit zu quantitativen bzw. semiquantitativen Aussagen. Bei der Untersuchung von Lebensmitteln auf gentechnische Veränderungen handelt es sich
im Falle positiver Befunde fast ausschließlich um Spurenbefunde (< 0,1 %).
Bei minimalen Verunreinigungen kann daher oft eine weitere Spezifizierung unterbleiben. Diese Möglichkeit besteht beim Microarray-System aufgrund seines qualitativen Charakters nicht. Positive Befunde müssen mit Real-time PCR-Verfahren quantifiziert und ggf. spezifiziert werden.
Der scheinbare Vorteil des Microarray-Systems, auch bei komplexen Lebensmitteln, die aus verschiedenen relevanten Spezies bestehen (Soja, Mais, Raps), in einer einzigen Untersuchung eine
Fülle von Sequenzinformation zu erhalten, relativiert sich ebenfalls:
Komplexe Lebens- oder Futtermittel enthalten gegenüber den Rohstoffen bzw. den Monoprodukten
entsprechend weniger DNA der jeweiligen Spezies, daher reduziert sich auch die Sensitivität der Untersuchung mindestens um diesen Anteil. Für eine sensitive Screening-Untersuchung sind daher generell Monoprodukte (Maismehl, Rapsextraktionsschrot, Sojaschrot) zu empfehlen. Dementsprechend
werden hierbei nicht mehr alle Sequenzinformationen benötigt, die das Microarray-System bei jeder
Untersuchung liefert.
Forschungsvorhaben
Abschlussbericht
60 von 96 Seiten
So ist beispielsweise für ein erstes Screening auf gentechnisch veränderten Mais (auch auf nicht zugelassene Arten) derzeit folgende Strategie ausreichend:
-
Quantifizierung des Mais-Referenzgens zur probenbezogenen Abschätzung der Sensitivität des
Nachweises (dies ist mit dem Microarray-System nicht möglich)
-
Screening auf CaMV 35S-Promotor und nos-Terminator
Das gleiche gilt für andere Pflanzenarten, bei Raps ist auf maximal 4 Sequenzen im Screening zu
untersuchen, um alle weltweit bekannten bzw. in Datenbanken erfassten gv-Rapssorten nachweisen
zu können (s. Teil 2, Tabelle 2-5).
Bei geschickter Kombination von Real-time PCR-Verfahren und Verwendung von Duplex-Real-time
Systemen (z.B. P35S/T-nos bzw. pat/bar, wie im vorliegenden Forschungsvorhaben beschrieben),
kann mindestens gleichviel Information bei deutlich geringerem Kosten- und Arbeitsaufwand erhalten
werden.
Weiterhin erlauben Real-time PCR-Verfahren derzeit eine höhere Flexibilität; neu nachzuweisende
Sequenzen können schneller etabliert und validiert werden und es besteht keine Abhängigkeit von
kommerziellen Systemen.
Forschungsvorhaben
Abschlussbericht
Teil „Genomic walking“ – Einführung
4
4.1
61 von 96 Seiten
Projektteil „Genomic walking“
Einführung
Werden bei einer Untersuchung auf GVP mit Screening-Verfahren positive Befunde erhalten, ist eine
weitere Spezifizierung der GVP erforderlich. Dazu werden konstrukt- und/oder event-spezifische
Nachweisverfahren eingesetzt. Ohne Kenntnis der transgenen Sequenz und der flankierenden pflanzlichen Sequenz am Integrationsort ist die Entwicklung eines event-spezifischen Nachweises nicht
möglich.
In jüngster Zeit wurden mehrere Verfahren vorgestellt, die die Möglichkeiten der Etablierung Eventspezifischer Nachweisverfahren ohne Kenntnis solcher Sequenzen beschreiben. Voraussetzung für
die Etablierung solcher Verfahren ist allerdings die Verfügbarkeit entsprechender DNA des nachzuweisenden GVP mit bekannten Sequenzabschnitten wie z.B. aus dem CaMV 35S Promotor.
Beim „Genomic Walking“ wird genomische DNA meist mit Hilfe von Restriktionsenzymen verdaut und
anschließend - zur Identifizierung des Integrationsortes - amplifiziert. Dabei wird auf der einen Seite
ein genspezifischer Primer verwendet (z.B. P35S oder T-nos-Primer), auf der anderen Seite wird ein
Primer verwendet, der an einen Adaptor bindet, welcher an die Enden genomischer DNA-Fragmente
ligiert ist. Die auf diese Weise ligierte DNA wird dann als Template für die PCR unter Verwendung
von gen- und adaptorspezifischen Primern eingesetzt. In einer zweiten, sogenannten nested-PCR
kann unter Verwendung eines zusätzlichen genspezifischen Primers die „Wahrscheinlichkeit“ erhöht
werden, dass tatsächlich die flankierende Sequenz des Integrationsortes amplifiziert wird [31]. In den
letzten Jahren wurden mehrere Arbeiten veröffentlicht, die verschiedene Anwendungen der PCR mit
dem Genomic Walking verknüpfen: Invers-PCR [32], Ligations-vermittelte PCR (LM-PCR) [33], TAILPCR [34], SiteFinding PCR [35].
Drei dieser beschriebenen Verfahren wurden in diesem Forschungsprojekt ausgetestet. Dadurch
konnte auch der jeweilige Zeitaufwand und die Praxistauglichkeit der Methoden für weitere Ansätze
ermittelt werden.
Forschungsvorhaben
Abschlussbericht
4.2
62 von 96 Seiten
TAIL-PCR
Unter TAIL-PCR versteht man die Thermal asymmetric interlaced PCR (Abbildung 4-1). Diese beruht
auf der Verwendung von einem Satz spezifischer, überlappend versetzter (nested) Primer, die sich an
die bekannte, transgene Sequenz anlagern, und einem Satz kürzerer, degenerierter Primer mit niedrigerer Annealingtemperatur. Die Anlagerung der Primer an die zu amplifizierende DNA kann mit einer geeigneten Primerkombination so gestaltet werden, dass eine spezifische Amplifikation der gewünschten Zielsequenz möglich wird.
Eine PCR, in der ein spezifischer und ein unspezifischer, degenerierter Primer, eingesetzt werden,
bezeichnet man auch als hemispezifische PCR. In einer hemispezifischen PCR kann es zur Bildung
von drei Arten von Amplifikaten kommen: ein Amplifikat, das von beiden Primern generiert wurde (Typ
I), ein Amplifikat, das nur vom genspezifischen Primer generiert wurde (Typ II) und ein Amplifikat, das
vom unspezifischen, degenerierten Primer gebildet wurde (Typ III). Die Wahrscheinlichkeit für das
Auftreten unspezifischer Amplifikate nach Typ I und II wird über nachfolgende nested-PCRs minimiert. Die Bildung unspezifischer Amplifikate, die durch den degenerierten Primer gebildet werden
können (Typ III), wird durch die Verwendung von relativ langen spezifischen Primern und sehr kurzen
degenerierten Primern unterdrückt. Bei hoher Temperatur findet nur ein Annealing der spezifischen
Primer an das Template statt (hier: die transgene Sequenz) mit nachfolgender linearer Amplifikation
(Amplifikat Typ I). Die degenerierten Primer erzeugen bei dieser hohen Temperatur hingegen kein
oder nur ein schwaches unspezifisches Amplifikat (Amplifikat Typ III). In der anschließenden PCR mit
niedriger Temperatur („thermal asymmetry“) können beide Primer an die Template-DNA anlagern. In
dieser PCR wird nun die einzelsträngige DNA, die während der PCR mit hoher Temperatur gebildet
wurde, zur doppelsträngigen DNA repliziert. Diese dient nun in der nächsten PCR als Ausgangs-DNA
und wird linear amplifiziert. Durch Wiederholung der TAIL-PCR (TAIL-cycling) kommt es zu einer bevorzugten Amplifikation der Zielsequenz (z.B. der Sequenz am Integrationsort des Transgens). In der
TAIL-PCR wechseln sich also Zyklen mit hoher Stringenz (d.h. hohe Annealingtemperatur) und niedriger Stringenz ab („interlaced“ = verkettet). Der Vorteil der TAIL-PCR liegt in der hohen Sensitivität
und in ihrer Anwendbarkeit auf komplexe Genome. Ein vorhergehender Verdau der isolierten genomischen DNA sowie das anschließende aufwändige Screening der erhaltenen Amplifikate entfallen.
In der vorliegenden Arbeit wurde die Methode von Liu et al. modifiziert [34, 36] und mit drei genspezifischen Primern und je einem degenerierten Primer (AD-Primer) verwendet. Die Sequenz des ADPrimers wurde von Liu entwickelt und erprobt. Die genspezifischen Primer besitzen eine hohe
Schmelz- bzw. Annealingtemperatur und der degenerierte Primer eine niedrige Schmelztemperatur.
In der im Forschungsvorhaben durchgeführten TAIL-PCR werden drei aufeinanderfolgende nestedPCRs durchgeführt. Nach Aufreinigung und Klonierung können die Amplifikate anschließend sequenziert werden.
Forschungsvorhaben
Abschlussbericht
63 von 96 Seiten
Abbildung 4-1: Schematische Darstellung der TAIL-PCR [34]
Forschungsvorhaben
Abschlussbericht
4.3
64 von 96 Seiten
Ligationsvermittelte PCR (Ligation-mediated PCR, LM-PCR)
Nach einer Literaturrecherche zu den bisher publizierten Methoden wurde ein modifizierter Ansatz der
ligation-mediated PCR für gentechnisch veränderten Reis in Kooperation mit dem Hygiene-Institut
Hamburg durchgeführt [33].
Bei dieser Methode wird ein Restriktionsverdau der genomischen DNA kombiniert mit der Ligation
geeigneter Adaptoren an die entstehenden Restriktionsfragmente. Ein Adaptor stellt ein doppelsträngiges Oligonukleotid dar, dessen oberer Strang länger ist (z.B. 40 Basen) als der untere Strang (z.B.
12 Basen). Durch Annealing der beiden Einzelstränge entsteht der doppelsträngige Adaptor, bei dem
der untere, kurze Strang ein überhängendes Ende bildet, das an die Restriktionsschnittstelle ligieren
kann. Anschließend kann durch eine nested PCR mit genspezifischen und Adaptor-Primern eine
Amplifikation von Sequenzen des Integrationsorts erzielt werden, s. Abb. 4-2.
Abb. 4-2 Schematische Darstellung der LM-PCR
Restriktionsschnittstelle
1
bekannte gentechnische Veränderung
unbekannte flankierende Pflanzen-DNA
Restriktionsschnittstelle
2
unbekannte flankierende Pflanzen-DNA
Spezifischer-Primer 1
Spez-Prim er 1
Spezifischer-Prim er 2
Adaptor-Primer 1
unbekannte flankierende
Pflanzen-DNA
Adaptor-Prim er 2
unbekannte flankierende
Pflanzen-DNA
3
Adaptor (bzw.
vectorette)
Adaptor-Prim er 1
4
Adaptor (bzw.
vectorette)
1: Ausgangssituation; Restriktionsverdau der DNA
2: Ligation eines Adaptors (z.B. vectorette) an die generierten Restriktionsschnittstellen
3: Erste PCR mit spezifischem Primer 1 (Bindungsstelle auf bekannter gentechnischer Veränderung) und Adaptor-Primer 1
(Bindungsstelle auf dem ligierten Adaptor)
4: Durchführung einer nested PCR mit internem spezifischem Primer 2 und internem Adaptor-Primer 2. Erzielte Fragmente
können anschließend kloniert bzw. sequenziert werden
Forschungsvorhaben
Abschlussbericht
1: Ausgangssitu
4.4
65 von 96 Seiten
SiteFinding-PCR
Als weiteres Verfahren des Genomic walking wurde die SiteFinding-PCR, basierend auf der Publikation von Tan et al. [35] erprobt.
Bei diesem Verfahren wird zunächst ein „SiteFinder“ verwendet. Dieser sogenannte „SiteFinder“ ist
ein 60mer Oligonukleotid mit einem kurzen, vier Nukleotide langen Sequenzabschnitt am 3`-Ende,
gefolgt von einem Sequenzabschnitt (z.B. SiteFinder 1: 5`-NNNNNNNGCCT-3`), der eine WobbleSequenz enthält. Mit diesem SiteFinder sollen Sequenzabschnitte im Genom gesucht werden, die
ebenfalls über die Sequenz „-GCCT-„ verfügen. Bei erfolgreicher Hybridisierung (Annealing) an diese
Zielsequenz im Pflanzengenom wird die SiteFinding-Reaktion (Synthese eines DNA-Stranges) in einer ersten PCR bei niedrigen Temperaturen initiiert.
Im zweiten Schritt wird mit einem genspezifischen Primer, der auf der bekannten, transgenen Sequenz bindet (z.B. P35S, T-nos) und einem sogenannten „SiteFinder“-Primer eine PCR durchgeführt.
Anschließend wird eine nested-PCR mit je einem inneren, zweiten, genspezifischen und SiteFinderPrimer durchgeführt, um möglichst spezifische Produkte zu erhalten. In einer dritten, semi-nestedPCR unter Verwendung eines dritten genspezifischen Primer (bei gleichem SiteFinder-Primer) kann
die Spezifität der erhaltenen Produkte durch Größenunterscheidung der Amplifikate (die durch den
genspezifischen Primer 2 und 3 erzielt wurden) überprüft werden. Anschließend können die erzielten
PCR-Produkte kloniert und sequenziert werden. Die SiteFinder besitzen eine Restriktionsschnittstelle
für das Enzym Not I. Die in dieser PCR eingesetzte Taq-Polymerase bildet Amplifikate mit glatten
Enden (blunt ends). Nach der nested-PCR mit den inneren gen- und SiteFinder-spezifischen Primern
(GSP2, SFP2) kann das Amplifikat mit dem Enzym Not I geschnitten werden. Diese Restriktion führt
zu einem Produkt mit einem glatten und einem überhängenden Ende, das wiederum für die anschließende Sequenzierung in Plasmide kloniert werden kann (z.B. pBluescript SK (+)).
Durch Hybridisierung an eine Zielsequenz („Target“-Sequenz“) initiiert der genspezifische Primer in
der ersten PCR die Amplifizierung eines neuen DNA-Strangs, der auch die „SiteFinder“-Sequenz
(nur) am anderen Ende beinhaltet. Es kommt zu keiner Haarnadelstruktur der neusynthetisierten
DNA.
Die Amplifikation von nicht-spezifischen („non-target“) Fragmenten wird dadurch unterdrückt, dass in
der ersten SiteFinding-Reaktion die SiteFinder eng benachbart hybridisieren. In der anschließenden
SiteFinding-PCR (mit SiteFinder-Primer 1) bilden die komplementären SiteFinder-Sequenzen an beiden Enden der PCR-Produkte einen doppelsträngigen Abschnitt, der zu einer Haarnadelstruktur des
unspezifischen Amplifikats führt. Durch die Bildung dieser Haarnadelstruktur stehen die gebildeten
Amplifikate nicht weiter als Template zur Verfügung und die weitere Amplifikation wird unterdrückt
(Abbildung 4-3).
Forschungsvorhaben
Abschlussbericht
66 von 96 Seiten
Für eine erfolgreiche SiteFinding-PCR sind zwei Voraussetzungen erforderlich: die 4-6 Nukleotid lange SiteFinder-Sequenz initiiert erfolgreich die erste Reaktion und im Falle eines unspezifischen SiteFindings wird die Amplifikation durch Bildung einer Haarnadelstruktur unterdrückt.
Forschungsvorhaben
Abschlussbericht
67 von 96 Seiten
Abbildung 4-3: Schematische Darstellung der SiteFinding-PCR [35]
1. DNA mit bekannter transgener und „unbekannter“ Sequenz (Pflanzengenom)
2. „SiteFinding“-Reaktion: der „SiteFinder“ (5`-NNNNNNNGCCT-3`). bindet bei niedriger annealing
Temperatur an passende Bindungsstelle („site“) auf der unbekannten Sequenz der denaturierten DNA
3. Erste PCR und zweite, nested PCR mit genspezifischen Primern (GSP1 und GSP2) und SiteFinderPrimern (SFP1 und SFP2). Optional: Dritte, semi-nested PCR mit genspezifischem Primer (GSP3) und
SiteFinder Primer (SFP2)
4. Restriktionsschnitt und Klonierung der erzielten spezifischen PCR-Produkte
5. Screening relevanter Klone mit colony-PCR (GSP3 und Vektor-Primer) und Sequenzierung
Forschungsvorhaben
Abschlussbericht
Teil „Genomic walking“ – Material und Methoden
4.5
4.5.1
68 von 96 Seiten
Material und Methoden
Pflanzenmaterial
Die SiteFinding-PCR und die TAIL-PCR wurden mit zwei gentechnisch veränderte Reisproben (Nr.
7852/FR 0502519 und 7853/FR 0502520), mit Sequenzen aus dem actI-Promotor, CryIA(b) und CryIA(c)-Gen sowie dem nos-Terminator [7] durchgeführt. Für die LM-PCR wurde eine Probe von Bt63Reis verwendet.
4.5.2
DNA-Extraktion
Die DNA-Extraktion aus jeweils 10 mg der Reisproben wurde mit dem Qiagen DNeasy Plant Kit (Nr.
69106) entsprechend dem Kit beiliegenden Protokoll durchgeführt. Die Konzentration der extrahierten
DNA wurde mit dem Eppendorf BioPhotometer bestimmt.
4.5.3
TAIL-PCR
4.5.3.1 Oligonukleotide
Degenerierte (Arbitrary Degenerate, AD) Primer [34, 36]
AD1: 5’-NTCGASTWTSGWGTT-3’
64fach degeneriert [34]
AD2: 5’-NGTCGASWGANAWGAA-3’
AD3: 5’-WGTGNAGWANCANAGA-3’
AD4: 5’-AGWGNAGWANCAWAG-3’
Genspezifische Primer
RicAct-1 TAIL: 5’-GGATGCAAAGCTCCAAGCTC-3’
RicAct-nested TAIL: 5’-CCATGCACAGCCTGATGCT-3’
RicAct s nested TAIL: 5’-GGATGCAAAGCTCCAAGCTC-3’
NOS-1 TAIL: 5’-GAATCCTGTTGCCGGTCTTG-3’ [7]
NOS-3 rev TAIL: 5’-TAGCGCGCAAACTAGGATAA-3’ [7]
CryIA(b)F TAIL: 5’-ACCATCAACAGCCGCTACAACGACC-3’ [7]
Forschungsvorhaben
Abschlussbericht
69 von 96 Seiten
4.5.3.2 TAIL-PCR Lauf 1
In der ersten TAIL PCR werden ein genspezifischer Primer und ein kürzerer, degenerierter Primer mit
niedrigerer Annealingtemperatur verwendet. Die Anlagerung der Primer an die zu amplifizierende
DNA wird mit der geeigneten Primerkombination so gestaltet, dass ein spezifisches Amplifikat der
gewünschten Zielsequenz ermöglich wird.
Tabelle 4-1: Reaktionsmix der TAIL-PCR 1 (auf Eis pipettieren!):
Komponente
Menge
Endkonzentration
TaKaRa LA Taq-Puffer [10x]*
2 µl
1x
dNTP-Mix [2,5 mM jeweils]
2 µl
0,25 mM
0,4 µl
200 nM
6 µl
3000 nM
TaKaRa Taq-Polymerase [5 U/µl]*
0,5 µl
2,5 U
Aqua dest.
7,1 µl
genspezifischer Primer 1 (z.B. T-nos 1) [10 µM]
AD-Primer (z. B. AD1) [10 µM]
Template-DNA
2 µl
Gesamt
20 µl
*MoBiTec, Molecular Biotechnology, Göttingen
Tabelle 4-2: Temperaturprogramm für TAIL-PCR 1:
Zyklen
1
5
1
15
Temp [°C]
94
94
63
72
94
25
72
94
63
72
94
63
72
94
44
72
Forschungsvorhaben
Zeit
2 min
30 s
1 min
3 min
30 s
1 min
3 min
30 s
1 min
3 min
30 s
1 min
3 min
30 s
1 min
3 min
Abschlussbericht
70 von 96 Seiten
4.5.3.3 TAIL-PCR Lauf 2 (nested PCR)
Das Amplifikat aus der TAIL-PCR 1 wird in Aqua dest. 1:50, 1:200 und 1:1000 verdünnt. Aus diesen
Verdünnungen werden 2 µl als Template in der TAIL-PCR 2 eingesetzt.
Tabelle 4-3: Reaktionsmix der TAIL-PCR 2 (auf Eis pipettieren!)
Komponente
Menge
Endkonzentration
2 µl
1x
2 µl
0,25 mM
0,4 µl
200 nM
4 µl
2000 nM
0,5 µl
2,5 U
Aqua dest.
9,1 µl
genspezifischer Primer 2 [10 µM]
AD-Primer (z.B. AD 1) [10 µM]
Template-DNA
2 µl
gesamt
20 µl
Tabelle 4-4: Temperaturprogramm für TAIL-PCR 2 (nested PCR):
Zyklen
15
Temp [°C]
94
63
72
94
63
72
94
44
72
Forschungsvorhaben
Zeit
30 s
1 min
3 min
25 s
1 min
3 min
30 s
1 min
3 min
Abschlussbericht
71 von 96 Seiten
4.5.3.4 TAIL-PCR Lauf 3 (second nested PCR)
Das Amplifikat aus der TAIL-PCR 2 wird in Aqua dest. 1:20 und 1:200 verdünnt. Aus diesen Verdünnungen werden 2 µl als Template in der TAIL-PCR 3 eingesetzt.
Tabelle 4-5: Reaktionsmix der TAIL-PCR 3 (auf Eis pipettieren!)
Komponente
Menge
Endkonzentration
5 µl
1x
5 µl
0,25 mM
genspezifischer Primer 3 [10 µM]
1,5 µl
300 nM
AD-Primer (z.B. AD 1) [100 µM]
2,5 µl
5 µM
0,5 µl
2,5 U
Aqua dest.
33,5 µl
Template-DNA
2 µl
gesamt
50 µl
Tabelle 4-6: Temperaturprogramm für TAIL-PCR 3 (second nested PCR):
Zyklen
30
Temp [°C]
94
63
72
94
63
72
94
44
72
Zeit
30 s
1 min
3 min
25 s
1 min
3 min
30 s
1 min
3 min
4.5.3.5 Agarosegelelektrophorese und Aufreinigung der PCR-Produkte
Die Amplifikate aus der TAIL-PCR 2 bzw. 3 werden in einem 2%igen präparativen Agarosegel aufgetrennt und dokumentiert. Gut diskriminierbare Banden werden mit einem Skalpell aus dem Gel ausgeschnitten und anschließend mit einem Gel-Extraktionskit aufgereinigt (z.B. MinElute Gel Extraction
Kit, Qiagen, Hilden).
Forschungsvorhaben
Abschlussbericht
72 von 96 Seiten
4.5.3.6 Sequenzierung
Die aufgereinigten Amplifikate wurden zusammen mit den entsprechenden Primern (als Sequenzierprimer) an die Fa. GATC (GATC, Konstanz, www.gatc.de ) zur direkten Sequenzierung (SingleRun/Run24Supreme-Sequenzierung) geschickt.
4.5.4
Ligation-mediated PCR (LM-PCR)
4.5.4.1 Restriktionsverdau der genomischen DNA
Für den Restriktionsverdau der gvReis-DNA, die für die LM-PCR eingesetzt werden soll, wurden geeignete Restriktionsenzyme ausgewählt. Diese Restriktionsenzyme sollten nicht in der bekannten
integrierten Sequenz des Konstrukts schneiden und in der Lage sein, kleinere und größere Fragmente zu erzeugen. Daher wurden unterschiedliche Enzyme mit 4bp- und 6bp-Erkennungssequenzen
eingesetzt.
Der Restriktionsverdau wurde mit 5 Enzymen (Hersteller New England Biolabs, NEB) durchgeführt,
die folgende Erkennungssequenzen und Schnittstellen tragen:
Bgl II (10U/µl mit Puffer NEB3)
BamH I (20U/µl; mit Puffer BanHI und BSA, entspr. den Angaben d. Herstellers)
Bcl I (15U/µl mit Puffer NEB3)
BstY I (10U/µl) mit Puffer NEB2)
HinP I (10U/µl mit Puffer NEB2)
Forschungsvorhaben
Abschlussbericht
73 von 96 Seiten
Tabelle 4-7: Reaktionsansatz für Restriktionsverdau der LM-PCR:
Enzym
Volumen
Volumen
Volumen
Enzym
gvReis-DNA
Puffer
Aq. dest.
Gesamt-
Tempera-
volumen
tur
1
Bgl II
5 µl
15 µl
5 µl
25
50 µl
37°C
2
BamH I
5 µl
15 µl
5 µl
20 + 5 BSA
50 µl
37°C
3
Bcl I
5 µl
15 µl
5 µl
25
50 µl
50°C
4
BstY I
5 µl
15 µl
5 µl
25
50 µl
60°C
5
HinP I
5 µl
15 µl
5 µl
25
50 µl
37°C
Der Reaktionsansatz wurde bei der jeweiligen Temperatur im Heizblock bzw. Wasserbad über Nacht
inkubiert und anschließend mittels Agarosegelelektrophorese überprüft. Die verdaute DNA wurde mit
Chloroform aufgereinigt und gefällt.
4.5.4.2 Ligation der Adaptoren an die Restriktionsschnittstellen
Für die Ligation der Adaptoren an die Restriktionsschnittstellen wurden die Adaptor-Oligonucleotide
für die Adaptoren 1-4 [33], Sequenzen s.u. verwendet. Die Ligation wurde mit dem Quick-Ligation Kit
(M2200 S, New England Biolabs) durchgeführt.
Oligonucleotidsequenzen der Adaptoren:
Adaptor 1 (Sequenz modifiziert nach Spertini et al. [33]) für Restriktion mit HinP I:
a) Oberer Strang: 5’-CTA ATA CGA CTC ACT ATA GGG CTC GAG CGG CCG GGC AGG T- 3’
b) Unterer Strang: 5’-CGA CCT GCC CGG AA-3’
Adaptor 2 (Sequenz modifiziert nach Spertini et al. [17]) für Restriktion mit BamH I, Bcl I, Bgl II,
BstY I:
a) Oberer Strang: 5’-CTA ATA CGA CTC ACT ATA GGG CTC GAG CGG CCG GGC AGGT- 3’
b) Unterer Strang: 5’-GAT CAC CTG CCC GGA A -3’
Adaptor 3 für Restriktion mit HinP I:
a) Oberer Strang: 5’- GAG GAG GAT GAG TGT GGT AGT GAG TAG GGG CGC GGC GAG T-3’
b) Unterer Strang: 5’- CGA CTC GCC GCG CAA-3’
Adaptor 4 für Restriktion mit BamH I, Bcl I, Bgl II, BstY I:
a) Oberer Strang: 5’- GAG GAG GAT GAG TGT GGT AGT GAG TAG GGG CGC GGC GAG T-3’
b) Unterer Strang: 5’-GAT CAC TCG CCG CGC AA -3’
Forschungsvorhaben
Abschlussbericht
74 von 96 Seiten
Durch das Annealing der obigen Oligonucleotidsequenzen vor der Ligation wurden die folgenden
Adaptoren erhalten:
Adaptor 1
5’-CTA ATA CGA CTC ACT ATA GGG CTC GAG CGG CCG GGC AGG T- 3’
3’-AA GGC CCG TCC A GC -5’
Adaptor 2
5’-CTA ATA CGA CTC ACT ATA GGG CTC GAG CGG CCG GGC AGG T- 3’
3’-AA GGC CCG TCC ACT AG -5’
Adaptor 3
5’- GAG GAG GAT GAG TGT GGT AGT GAG TAG GGG CGC GGC GAG T-3’
3’- AAC GCG CCG CTC AGC -5’
Adaptor 4
5’- GAG GAG GAT GAG TGT GGT AGT GAG TAG GGG CGC GGC GAG T-3’
3’- AAC GCG CCG CTC ACT AG -5’
Tabelle 4-8: Ansatz für das Annealing und der Ligation der Adaptoren der LM-PCR [39]:
Komponente
Menge
Quick-LigasePuffer
50 µl
Adaptor- Oligo 1 (oberer Strang) [20 pMol/µl]
3,5 µl
Adaptor- Oligo 2 (unterer Strang) [20 pMol/µl]
3,5 µl
Aqua dest.
34 µl
DNA aus Restriktionsverdau (ca. 300-400 ng pro Ansatz)
8 µl
Inkubation zum Annealing der Adaptoren vor Zugabe der Ligase (s.u.)
QuickLigase
Gesamtvolumen
1 µl
100 µl
Das Annealing der einzelsträngigen Adaptor-Oligos zu den doppelsträngigen Adaptoren fand vor der
Zugabe der QuickLigase statt. Dazu wurden die Ansätze im Wasserbad, beginnend bei 50°C, langsam mit ca. 1°C/min auf 10°C abgekühlt. Dabei wurde entweder Eis zum Wasserbad zugegeben oder
der Vorgang im Thermocycler durchgeführt. Anschließend wurde 1µl QuickLigase zu jedem Ansatz
gegeben und bei Raumtemperatur für 5min inkubiert. Das Ligationsprodukt wurde bei -20°C aufbewahrt.
Forschungsvorhaben
Abschlussbericht
75 von 96 Seiten
4.5.4.3 PCR-Amplifikation 1 der LM-PCR
Die PCR-Amplifikation 1 der LM-PCR wurde mit Deep VentR-(exo-) DNA-Polymerase durchgeführt
(die für diese PCR verwendete DNA-Polymerase sollte keine 3’-5’-proofreading Exonucleaseaktivität
besitzen).
Verwendete Primer:
Für Adaptor 1,2: Primer 497: 5’- CTA ATA CGA CTC ACT ATA GGG CTG AGC -3’
Für Adaptor 3,4: Primer 505: 5’- GAG GAG GAT GAG TGT GGT AGT GAG T-3’
Sequenzspezifischer Primer: Primer 987: 5’-GAC TGC TGG AGT GAT TAT CGA CAG A-3’
Dieser Primer bindet auf der Sequenz für das Cry-Protein.
Tabelle 4-9: Ansatz für die PCR-Amplifikation 1 der LM-PCR
Komponente
Menge
Thermo-Pol Reaction buffer [10x], (New England Biolabs)
2,5 µl
Adaptor-Primer [20µM]
0,5 µl
Spezifischer Primer [20µM]
0,5 µl
dNTP-Mix [2mM je Nucleotid]
2,5 µl
Deep Vent Polymerase [2U/µl]
1 µl
Aqua dest.
13 µl
20 µl
Ligationsprodukt (Template)
5 µl
Gesamtvolumen
25 µl
Dieser Reaktionsansatz wurde folgendem Temperaturprogramm unterworfen:
Tabelle 4-10: Temperatur-Zeit-Programm für die PCR-Amplifikation 1 der LM-PCR:
Schritt
Zyklen
Temperatur [°C]
Zeit
94
2 min
95
30 s
Annealing
60
30 s
Extension
72
3 min
72
5 min
Initiale Denaturierung
Denaturierung
Forschungsvorhaben
35
Abschlussbericht
76 von 96 Seiten
4.5.4.4 PCR-Amplifikation 2 der LM-PCR (nested PCR)
Die PCR-Amplifikation 2 der LM-PCR (nested PCR) wurde mit Deep VentR-(exo-) DNA-Polymerase
und AmpliTaq Gold-DNA-Polymerase durchgeführt.
Verwendete Primer:
Für Adaptor 1,2: Primer 471: 5’- TAT AGG GCT GAG CGG CCG -3’
Für Adaptor 3,4: Primer 532: 5’- TAG TGA GTA GGG GCG CGG CGA -3’
Sequenzspezifische Primer:
Primer 987: 5’- GAC TGC TGG AGT GAT TAT CGA CAG A-3’ (semi-nested PCR)
Dieser Primer bindet auf der Sequenz für das Cry-Protein
Primer 992: 5’- AGA TGG GTT TTT ATG ATT AGA GTC CCG C -3’ (nested PCR)
Dieser Primer bindet auf der Sequenz des nos-Terminators
Primer 658: 5’- GCA TGA CGT TAT TTA TGA GAT GGG-3’
Dieser Primer bindet auf der Sequenz des nos-Terminators
Primer 455: 5’-ACC TCG CTC TGC TAA TCC TGT TAC-3’
Dieser Primer bindet auf der Sequenz für pUC
Primer 806: 5’-ACC CTG ATA AAT GCT TCA ATA ATA TTG A-3’
Dieser Primer bindet auf der Sequenz für pUC
Tabelle 4-11: Ansatz für die PCR-Amplifikation 2 der LM-PCR
Komponente
Menge
Thermo-Pol Reaction buffer [10x], (New England Biolabs) bzw.
2,5 µl
AmpliTaq Gold buffer [10x], (Applied Biosystems)
Adaptor-Primer [20 µM]
0,5 µl
Spezifischer Primer [20 µM]
0,5 µl
dNTP-Mix [2 mM je Nucleotid]
2,5 µl
Deep Vent Polymerase [2 U/µl] bzw. AmpliTaq Gold-Polymerase
[5U/µl] (Applied Biosystems)
1 µl (Deep V.) bzw. 0,2
µl Ampli Taq Gold
Aq. dest.
Ad 20 µl
20 µl
Template (PCR-Produkt aus PCR 1) 1:1000 verdünnt
5 µl
Gesamtvolumen
25 µl
Dieser Reaktionsansatz wurde folgendem Temperaturprogramm unterworfen:
Forschungsvorhaben
Abschlussbericht
77 von 96 Seiten
Tabelle 4-12: Temperatur-Zeit-Programm für die PCR-Amplifikation 1 der LM-PCR:
Schritt
Zyklen
Temperatur [°C]
Zeit
94
2 min
95
30 s
Annealing
60 bzw. 65
30 s
Extension
72
3 min
72
5 min
Initiale Denaturierung
Denaturierung
35
Die aufgereinigten Amplifikate wurden zusammen mit den entsprechenden Primern (als Sequenzierprimer) am Institut für Hygiene und Umwelt in Hamburg direkt sequenziert.
4.5.5
SiteFinding-PCR
4.5.5.1 Oligonukleotide
SiteFinder [35]
SiteFinder 1:
5’CACGACACGCTACTCAACACACCACCTCGCACAGCGTCCCAAGCGGCCGCNNNNNNGCCT-3’
SiteFinder 2:
5’-CACGACACGCTACTCAACACACCACCTCGCACAGCGTCCCAAGCGGCCGCNNNNNNGCGC-3’
SiteFinder-Primer (SFP) [35]
SFP1: 5’-CACGACACGCTACTCAACAC-3’
SFP2 : 5’-ACTCAACACACCACCTCGCACAGC-3’
Genspezifische Primer (GSP)
GSP-NOS1: 5’-GTAATGCATGACGTTATTTATGAGATGGG-3’
GSP-NOS2: 5’-AGATGGGTTTTTATGATTAGAGTCCCGC-3’
4.5.5.2 Site-Finding-Reaktion
Bei der SiteFinding-Reaktion wird zunächst bei niedriger Annealing-Temperatur die Bindung eines
sog. SiteFinders durchgeführt. Anschließend wird aus einem Strang der Ziel-DNA mit Hilfe einer TaqPolymerase ein doppelsträngiges Zielmolekül mit unterschiedlich langen Strängen gebildet (Abbildung 4-2).
Forschungsvorhaben
Abschlussbericht
78 von 96 Seiten
Tabelle 4-13: Ansatz für SiteFinding-Reaktion (auf Eis pipettieren!)
Komponente
Menge
Endkonzentration
2 µl
1x
2 µl
0,25 mM
SiteFinder 1 oder 2 [10 µM]
1 µl
500 nM
0,1 µl
0,5 U
Aqua dest.
13,9 µl
Template-DNA
1 µl
gesamt
20 µl
Tabelle 4-14: Temperaturprogramm für SiteFinding-Reaktion
Zeit
2 min
1 min
1 min
10 min
Temperatur [°C]
92
95
25
68
ramp-Rate von 0,24°C/s
4.5.5.3 SiteFinding-PCR 1
Für die SiteFinding-PCR1 wird der unten genannte Reaktionsmix direkt zum Ansatz der SiteFindingReaktion (4.5.2) gegeben.
Tabelle 4-15: Reaktionsmix für die SiteFinding-PCR 1 (auf Eis pipettieren!)
Komponente
Menge
Endkonzentration
Aqua dest.
1 µl
SFP1 [20 µM]
2,5 µl
2000 nM
GSP-NOS1 [10 µM]
1 µl
400 nM
0,5 µl
1x
Mix
5 µl
Forschungsvorhaben
Abschlussbericht
79 von 96 Seiten
Tabelle 4-16: Temperaturprogramm für SiteFinding-PCR1
Zyklen
1
30
Temperatur [°C]
94
95
68
72
1
Zeit
1 min
10 s
6 min
5 min
4.5.5.4 SiteFinding-PCR 2
Das Amplifikat aus der SiteFinding-PCR 1 wird in Aqua dest. 1:10, 1:100 und 1:1000 verdünnt. Aus
diesen Verdünnungen wird 1µl als Template in der SiteFinding-PCR 2 eingesetzt.
Tabelle 4-17: Reaktionsmix für SiteFinding-PCR 2 (auf Eis pipettieren!!)
Komponente
Menge
Endkonzentration
5 µl
1x
2 µl
0,1 mM
SFP2 [10 µM]
1 µl
400 nM
GSP-NOS2 [10 µM]
1 µl
400 nM
0,5 µl
2,5 U
Aqua dest.
39,5 µl
Template
1 µl
gesamt
50 µl
Tabelle 4-18: Temperaturprogramm für SiteFinding-PCR2
Zyklen
1
35
1
Temperatur [°C]
94
95
68
72
Zeit
1 min
10 s
6 min
5 min
4.5.5.5 Agarosegelelektrophorese und Aufreinigung der PCR-Produkte
Die Amplifikate aus der SiteFinding-PCR 2 werden in einem 2%igen präparativen Agarosegel aufgetrennt und dokumentiert. Gut diskriminierbare Banden werden mit einem Skalpell aus dem Gel ausgeschnitten und anschließend mit einem Gel-Extraktionskit aufgereinigt (z.B. MinElute Gel Extraction
Kit, Qiagen, Hilden).
Forschungsvorhaben
Abschlussbericht
80 von 96 Seiten
Die aufgereinigten Amplifikate wurden zusammen mit den entsprechenden Primern (als Sequenzierprimer) an die Fa. GATC ( GATC, Konstanz, www.gatc.de ) zur direkten Sequenzierung (SingleRun/Run24Supreme-Sequenzierung) geschickt.
Forschungsvorhaben
Abschlussbericht
Zusammenfassung
4.6
81 von 96 Seiten
Ergebnisse und Diskussion
Aus den gentechnisch veränderten Reisproben (Nr. 7852/FR 0502519 und 7853/FR 0502520) mit
Sequenzen aus dem actI-Promotor, CryIA(b) und CryIA(c)-Gen sowie dem nos-Terminator [7] wurde
DNA in einer Konzentration zwischen 3,5 und 5 ng/µl extrahiert.
4.6.1
TAIL-PCR
Die DNA-Proben wurden jeweils mit einem degenerierten Primer (AD1-4) sowie einem genspezifischen Primer (RicAct-1 TAIL oder NOS-1 TAIL) amplifiziert.
In Abbildung 4-4 sind die Ergebnisse der Amplifikation mit den beiden DNA-Proben und den Primerkombinationen AD1, AD3 und AD4 mit NOS-1 TAIL dargestellt. Dabei konnte nur mit der Probe 7853
ein deutlich diskriminierbares Amplifikat von ca. 550 bp erzielt werden. Das Amplifikat von 550 bp
wurde aus dem präparativen Gel ausgeschnitten, mit dem MinElute Gel Extraction Kit von Qiagen
aufgereinigt und in einer weiteren Bi-PCR mit den Primern NOS-1 TAIL und AD1 amplifiziert. Anschließend wurde eine seminested-PCR mit den Primern NOS-3 TAIL rev und AD1 durchgeführt.
Dabei konnten jedoch keine zufriedenstellenden Ergebnisse erzielt werden (Daten nicht gezeigt). Mit
den degenerierten Primern AD1, AD3 und AD4 in Kombination mit RicAct-1 TAIL konnten mit beiden
DNA-Proben keine Amplifikate erzielt werden (Daten nicht gezeigt).
M
1
2
3 4
N M
6 7
8 9
N M 11 12 13 14 N M
550 bp
Abbildung 4-4: Amplifikation der beiden Reisproben-DNAs mit unterschiedlichen
Primerkombinationen
M = 50bp-DNA-Marker 1,2 = Probe 7852 mit AD1 und NOS-1 TAIL;
3,4 = Probe 7853 mit AD1 und NOS-1 TAIL; 6,7 = Probe 7852 mit AD3 und NOS-1 TAIL;
8,9 = Probe 7853 mit AD3 und NOS-1 TAIL;
11,12 = Probe 7852 mit AD4 und NOS-1 TAIL; 13,14 = Probe 7853 mit AD4 und NOS-1
TAIL; N = Negativkontrolle (Wasser)
Mit dem degenerierten Primer AD2 in Kombination mit dem Primer NOS-1 TAIL konnten aus beiden
DNA-Proben diskriminierbare Amplifikate von ca. 310 bp (Probe 7852) und 480 bp (Probe 7853) gewonnen werden (Abbildung 4-5 A). Die Amplifikate wurden daraufhin aus dem präparativen Gel ausForschungsvorhaben
Abschlussbericht
Teil „Genomic walking“ – Ergebnisse und Diskussion
82 von 96 Seiten
geschnitten, mit dem MinElute Gel Extraction Kit von Qiagen aufgereinigt und in eine weitere Bi-PCR
mit den Primern NOS-1 TAIL und AD2 eingesetzt. Jedoch konnten die eluierten Amplifikate nicht
reamplifiziert werden (es waren keine diskriminierbaren Banden mehr vorhanden, siehe Abbildung 45 B). Der „Bandenschmier“ ist vermutlich auf eine Degradation der Amplifikate und eine dadurch bedingte multiple Amplifikation durch den degenerierten Primer zurückzuführen.
M 1 2
N 4 5 N M
M
1 2
3
4
5
6
7 8
N M
B
A
480 bp
310 bp
Abbildung 4-5: Amplifikation der beiden Reisproben-DNA mit den Primern AD2 und NOS-1 TAIL
M = 50bp-DNA-Marker, N = Negativkontrolle
A: 1, 2 = Reisprobe 7852 mit AD2 und NOS-1TAIL, 4, 5 = Reisprobe 7853 mit AD2 und NOS-1 TAIL
B: 1-4 = Reamplifikat Bi-PCR mit AD2 und NOS-1 TAIL Reisprobe 7852 (ausgeschnitten aus A: 1, 2), 5-8
= Reamplifikat Bi-PCR Reisprobe 7852 (ausgeschniten aus A: 3, 4) mit AD2 und NOS-1 TAIL
Die teilweise bei den Negativ-Kontrollen (Wasserwert) erkennbaren Banden bzw. der „Bandenschmier“ sind möglicherweise auf „False Priming“ der degenerierten AD-Primer untereinander
bzw. an die genspezifischen Primer zurückzuführen. Nicht auszuschließen sind auch Nukleinsäuresequenzen (z.B. von pBR322 abgeleitete Sequenzen), die noch an der Taq-Polymerase anhaften und
durch die AD-Primer amplifiziert wurden.
Mit den Primern AD2 und RicAct-1 TAIL konnten nur in der Probe 7852 mehrere diskriminierbare
Amplifikate erzielt werden. Aus diesem Reaktionsansatz wurden Verdünnungen (1:50, 1:200, 1:500
und 1:1000) hergestellt und in einer seminested-PCR mit AD2 und RicAct-nested TAIL amplifiziert. In
dieser PCR konnten drei gut voneinander diskriminierbare Amplifikate generiert werden. Die Amplifikate der 1:50-Verdünnung wurden 1:20 verdünnt und anschließend in einer zweiten seminested-PCR
eingesetzt (AD2 und RicAct sec nested TAIL). Aus dieser PCR wurde das Amplifikat von 650 bp ausgeschnitten, mit dem MinElute Gel Extraction Kit von Qiagen aufgereinigt und zur Sequenzierung an
die Fa. GATC geschickt (Abbildung 4-6).
Forschungsvorhaben
Abschlussbericht
M
1
2
83 von 96 Seiten
3
4
5
N
M
650 bp
Abbildung 4-6: Reamplifikation der Reisprobe 7852
M = 100bp-DNA-Marker, N = Negativkontrolle (Wasser);
1-5: Zweite seminested-PCR mit AD2 und RicAct sec
nested TAIL in der Verdünnung 1:20
Forschungsvorhaben
Abschlussbericht
84 von 96 Seiten
In Abbildung 4-7 ist das Chromatogramm der Sequenz des 650 bp Amplifikates dargestellt, die mit
dem Sequenzierprimer RicAct sec nested TAIL generiert wurde. Aufgrund der geringen Qualität des
Amplifikates konnte keine eindeutige Sequenz erzielt werden. Wie im Chromatogramm zu sehen, ist
durch zahlreiche Überlappungen der Peaks keine eindeutige Zuordnung zu einer Base möglich. Die
daraus resultierende Sequenz konnte daher nicht für weitere Datenbankanalysen genutzt werden.
Abbildung 4-7: Chromatogramm der Sequenzierung der Probe 7852 (www.gatc.de)
Sequenzierung des 650 bp Amplifikates, das mit den Primern AD2 und RicAct sec nested erhalten wurde
(mit RicAct sec nested als Sequenzierprimer)
4.7
LM-PCR
Für die LM-PCR wurde die aus der Bt63- Reisprobe extrahierte DNA zunächst einem Restriktionsverdau unterworfen. Anschließend wurden sogenannte Adaptoren an die entstandenen Restriktionsfragmente ligiert und jeweils mit einem genspezifischen Primer und einem Adaptor-Primer eine PCR
nested PCR durchgeführt. Auf diese Weise soll eine Amplifikation des Integrationsortes ermöglicht
werden.
Mit dem Adaptor 1 (für BamH I und Bcl I) und Adaptor 2 (für HinP I) wurden in der nested PCR (PCRAmplifikation 2) mit Deep VentR-(exo-) DNA-Polymerase in den Ansätzen mit dem sequenzspezifischen Primer 658 und dem Adaptor-Primer 471 deutlich diskriminierbare Amplifikate von über 1000bp
erzielt. Diese Amplifikate traten nur in den Ansätzen auf, die aus den Proben stammten, die mit den
Restriktionsenzymen BamH I, Bcl I und HinP I geschnitten worden waren.
In Abbildung 4-8 sind die Ergebnisse der Amplifikation dargestellt. Mit dem Adaptor 2 und den übrigen
Primern traten keine deutlichen Amplifikate auf, sondern in den meisten Fällen nur ein „Bandenschmier“ oder schwache multiple Amplifikate (Daten nicht gezeigt).
Forschungsvorhaben
Abschlussbericht
M
1
2
3
4
5
85 von 96 Seiten
6
7
8
9
10
M
800 bp
Abbildung 4-8: PCR-Amplifikation 2 der LM-PCR
M = 100bp-DNA-Marker,
1-5: Amplifikation der Ansätze mit Adaptor-Primer 471 und spezifischem Primer 658
aus Verdau der Proben mit 1: Bgl II, 2: BamH I, 3: Bcl I, 4 BstY I, 5 HinP I
6-10 Amplifikation der Ansätze mit Adaptorprimer 532 und spezifischem Primer 658
aus Verdau der Proben mit 6: Bgl II, 7: BamH I, 8: Bcl I, 9 BstY I, 10 HinP I
Die Amplifikate wurden ausgeschnitten und nach Aufreinigung im Institut für Hygiene und Umwelt in
Hamburg sequenziert.
Eine Datenbankanalyse der abgeleiteten Sequenz in der European Bioinformatics Institute Datenbank
mit dem Programm „Similarity & Homology > Fasta Nucleotide“ ergab eine Übereinstimmung mit Sequenzen aus dem Vektor pSP70 (PUC-Vektor). Mit der LM-PCR wurde darüber hinaus keine weitere
DNA-Sequenz gefunden, die einer Sequenzierung unterzogen werden konnte, d.h. eine Sequenz im
Bereich der Integrationsstelle des Transgens konnte mit den durchgeführten Ansätzen nicht erzielt
werden. Weitere „Walking-Schritte“ ausgehend von dieser ermittelten Sequenz könnten möglicherweise eine Übergangssequenz erzielen, da die Methode grundsätzlich geeignet ist, unbekannte Abschnitte zu amplifizieren und somit auch event-spezifische Nachweisverfahren ohne Kenntnis des
genauen Integrationsortes zu entwickeln.
Forschungsvorhaben
Abschlussbericht
4.8
86 von 96 Seiten
SiteFinding-PCR
Für die SiteFinding-Reaktion wurden die beiden DNA-Proben jeweils mit einem „SiteFinder“ gemischt
und amplifiziert. Die beiden „SiteFinder“ unterscheiden sich in einem kurzen, vier Nukleotide langen
Sequenzabschnitt am 3`-Ende gefolgt von einem Sequenzabschnitt mit einer Wobble-Sequenz (SiteFinder 1: 5`-NNNNNNNGCCT-3` und SiteFinder 2: 5`-NNNNNNGCGC-3’) [16]. Mit diesem SiteFinder
sollen Sequenzabschnitte im Genom gesucht werden, die ebenfalls über die Sequenz „-GCCT-" bzw.
„-GCGC-" verfügen. Bei erfolgreicher Hybridisierung (Annealing) an diese Zielsequenz im Pflanzengenom wird die SiteFinding-Reaktion (Synthese eines DNA-Stranges) in einer ersten PCR bei niedrigen Temperaturen initiiert. Im Anschluss an diese SiteFinding-Reaktion wird zu den Reaktionsansätzen direkt ein PCR-Mix, bestehend aus SiteFinder Primer 1 (SFP1) und einem genspezifischen Primer NOS 1 (GSP-NOS1) zugegeben und in einer weiteren SiteFinding PCR (Nr. 4.5.3, SiteFinderPCR 1) amplifiziert.
Die erhaltenen Amplifikate wurden 1:10, 1:100 und 1:1000 verdünnt und als Template in die SiteFinding-PCR 2 (Nr. 4.5.4) mit SiteFinder Primer 2 (SFP2) und genspezifischem Primer NOS2 (GSPNOS2) eingesetzt. Nach dieser PCR werden die Amplifikate in einer 2%igen präparativen Elektrophorese aufgetrennt und mit Ethidiumbromid angefärbt. Mit der DNA aus der Reisprobe 7852 konnte in
der SiteFinder-PCR eine deutliche Bande von ca. 330 bp und aus der Reisprobe 7853 zwei deutliche
Banden von 280 und ca. 1000 bp gewonnen werden (Abbildung 4-10). Aus der Reisprobe 7852 wurde nur die 330 bp Bande und aus der Reisprobe 7853 wurden die beiden Banden von 280 und ca.
1000 bp aus dem präparativen Gel ausgeschnitten, mit dem MinElute Gel Extraction Kit von Qiagen
aufgereinigt und zur Sequenzierung an die Fa. GATC geschickt.
M
1
2
3
4
5
6
N
M
1000 bp
330 bp
280 bp
Abbildung 4-10: SiteFinding-PCR: M = 50bp-DNA-Marker, N = Negativkontrolle
1-3 = Reisprobe 7852 in drei Verdünnungen (1=1:10, 2=1:100, 3=1:1000),
4-6 = Reisprobe 7853 in drei Verdünnungen (4=1:10, 5=1:100, 6=1:1000)
Forschungsvorhaben
Abschlussbericht
87 von 96 Seiten
Die Sequenzierung des 1000 bp und 280 bp Amplifikates (Probe 7853) mit jeweils GSP-NOS2 als
Sequenzierprimer ergab keine Sequenz. In Abbildung 4-11 ist das Chromatogramm der Sequenz
dargestellt, die mit dem 330 bp Amplifikat aus der Probe 7852 generiert wurde, sowie die daraus abgeleitete Sequenz.
Abbildung 4-11: Chromatogramm der Sequenzierung der Probe 7852 (www.gatc.de)
Sequenzierung des 330 bp Amplifikates aus der Probe 7852, das mit den Primern SFP2 und GSP-NOS2 erhalten wurde (mit GSP-NOS2 als Sequenzierprimer) und die daraus abgeleitete Sequenz (unten).
5`-GSP-NOS2-(...)AATATAGCGCGCAAACTAGGATAAATTATCGCGCGCGGTGTCATCTATGTTACTAGATCGGGAAT
TCATCGATGATATCAGATCTGCCGGTCTCCCTATAGTGAGTCGTATTAATTTCGATAAGCCAGGTTAACCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGAAAAAGCGGCCGCTTGAGGACGCTGTGCGAGGTGGTGTGTTGAAAAA-3`
Forschungsvorhaben
Abschlussbericht
88 von 96 Seiten
Die daraus abgeleitete Sequenz (Abbildung 4-11, unten) wurde anschließend in der Datenbank des
European Bioinformatics Institute mit dem Programm „Similarity & Homology > Fasta Nucleotide“ abgeglichen. Die Datenbankanalyse ergab, dass es sich bei der Sequenz um einen Abschnitt aus dem
Klonierungsvektor „Gene trapping vector pEU334AN“ (AY488510) handelt [38], der für genetische
Manipulationen in Pflanzengenomen wie Reis eingesetzt wird. Die Auswertung des Alignments zeigte, dass die mit der SiteFinding-PCR gefundene Sequenz komplett im Klonierungsvektor lokalisiert ist.
Eine Übergangssequenz im Bereich der Integrationsstelle des Transgens in das Reisgenom wurde in
diesem Versuchsansatz jedoch nicht gefunden. Dennoch stellt die SiteFinding-PCR eine geeignete
„Genomic Walking“-Methode für die Entwicklung insertionsspezifischer Nachweisverfahren dar. Die
mit dieser SiteFinder-PCR gefundene Sequenz deutet darauf hin, dass das Konstrukt im Bt-Reis Shanyou 63 (7852) möglicherweise noch einen längeren Sequenzabschnitt aus dem Klonierungsvektor
beinhaltet.
Forschungsvorhaben
Abschlussbericht
Zusammenfassung
89 von 96 Seiten
5 Zusammenfassung
Im Rahmen des vorliegenden Forschungsvorhabens wurden Screening-Methoden erarbeitet, die sich
zum universellen semiquantitativen Screening auf zugelassene und nicht zugelassene gentechnisch
veränderte Pflanzen eignen. Ausgewählt wurde die Kombination von Real-time PCR-Verfahren zum
Nachweis der P35S- Sequenz, der Sequenz aus der Terminatorregion des Nopalin-Synthase Gens
aus Agrobacterium tumefaciens, der Übergangssequenz CTP2-CP4 EPSPS, der bar-Sequenz aus
Streptomyces hygroscopicus sowie dem synthetischen Phosphinothricin-Acetyl-transferase-Gen
(pat). Etabliert und validiert wurden insbesondere zwei Duplex-Real-time PCR-Verfahren, die in Kombination mit einem bereits verfügbaren Singleplex-Verfahren zum Nachweis der CTP2-CP4EPSPSSequenz eine routinegeeignete, schnelle, kostengünstige und zielgerichtete Untersuchung erlauben.
Die Validierungsergebnisse zeigen, dass beispielsweise Verunreinigungen durch nicht zugelassenen
gentechnisch veränderten Reis in der zuletzt festgestellten sehr geringen Größenordnung durch die
Methoden eindeutig detektierbar sind.
Eine der beiden Duplex-Real-time PCR-Methoden wurde im Rahmen eines Ringversuchs mit 10 beteiligten Laboratorien validiert. Aufgrund der guten Ergebnisse soll die Methode in die Amtliche
Sammlung von Untersuchungsverfahren nach §64 LFGB aufgenommen werden.
Weiterhin wurde ein Triplex-Real-time PCR-System etabliert und validiert, welches in einem einzigen
PCR-Lauf Hinweis auf enthaltene gentechnisch veränderte Maislinien einschließlich einer semiquantitativen Abschätzung deren Anteile in einer Probe erlaubt. Bei dieser Methode wurde für die Optimierung auch erstmals die Verwendung spezieller Reagenzien für die Multiplex-Real-time PCR erforderlich.
Hier sind durch eine neue Generation entsprechender Real-time PCR-Geräte sowie spezifisch optimierter Reagenzien in naher Zukunft noch weitere Entwicklungsmöglichkeiten zu erwarten.
In einer vergleichenden Betrachtung wurde gezeigt, dass der gewählte Ansatz über Real-time PCRDuplex- oder Triplex-Screenings gegenüber aktuellen Microarraysystemen in der Praxis deutliche
Vorteile bietet.
Für eine eindeutige Identifizierung gentechnisch veränderter Pflanzen sind Event-spezifische Verfahren erforderlich. Im Falle nicht zugelassener GVP stehen hierfür keine Sequenzinformationen und
damit keine Methoden zur Verfügung. Im Forschungsvorhaben wurden Untersuchungsstrategien erarbeitet, um derartige Sequenzinformationen zu ermitteln. Anhand von Reismehl, welches im Screening auf nicht zugelassenen gv-Reis chinesischer Herkunft positiv getestet wurde, sind die TAIL-PCR,
die SiteFinding-PCR und die Ligation-mediated (LM)-PCR als „Genomic Walking“-Methoden erprobt
und auf ihre Praxistauglichkeit überprüft worden. Dabei zeigte sich, dass beide Verfahren für diese
Fragestellung geeignet sind. Insbesondere die Versuchsergebnisse mit der SiteFinding-PCR zeigten,
Forschungsvorhaben
Abschlussbericht
Zusammenfassung
90 von 96 Seiten
dass die gefundene Sequenz komplett im Klonierungsvektor lokalisiert ist und dass das Konstrukt im
Bt-Reis Shanyou 63 (7852) möglicherweise noch einen längeren Sequenzabschnitt aus dem Klonierungsvektor beinhaltet. Mit dieser Sequenz können neue Primer entwickelt und in einer weiteren SiteFinder-PCR eingesetzt werden. Eine Übergangssequenz im Bereich der Integrationsstelle des Transgens in das Reisgenom könnte somit in einem weiteren Versuchsansatz ermittelt werden.
Forschungsvorhaben
Abschlussbericht
Zusammenfassung
MeilenBeschreibung (Soll)
stein-Nr./
Monat
M1 / 6
M2 /12
M 4 / 24
Ist / Fundstelle im Abschlussbericht
(+ = zusätzlich zum Soll)
Die Einarbeitungsphase ist abgeschlossen.
o.k.
Die Literaturrecherche ist durchgeführt.
o.k.
Mindestens zwei bisher nicht für das Screening in der
Routine eingesetzte Sequenzen wurden ausgewählt und
entsprechende quantitative Real-time-PCR-Verfahren
etabliert.
o.k.: pat-Gen/bar-Gen
(Teil 2.2, S. 21-23)
Die Erprobungsphase für mindestens zwei quantitative
Duplex-Screening-Systeme auf der Basis der Real-time
PCR ist begonnen, insbesondere nos-Terminator/CaMV
35S-Promotor/Mais-spez. Gen
o.k.: pat/bar, P35S/T-nos
(Teil 2.2, S. 23-26)
Die laborinternen Validierungen für die im ersten Halbjahr o.k.
etablierten und begonnenen Verfahren sind fertiggestellt. (Teile 2.3.2 und 2.3.3;
S. 32-45)
In der Einarbeitung quantitativer Event-spezifischer PCR
sind pilotmäßige Verfahren durchgeführt.
o.k.
Vergleichsmaterialien von mindestens zwei bis dahin
(Ende 2005) nicht zugelassenen GVO-Pflanzen stehen
zur Verfügung bzw. wurden beschafft.
M3 /18
91 von 96 Seiten
o.k., Auswahl aus aktuellem Anlass modifiziert, s. M3
Ein erstes quantitatives, Integrationsort-spezifisches Verfahren für eine bis dahin nicht zugelassene GVO-Pflanze
ist etabliert.
bedingt erreicht (s. auch M4)
Derzeit soll es sich daher um die Events MON 809 bei
Mais sowie 23-198 bzw. 23-18-17 bei Raps handeln.
Auswahl von gentechnisch verändertem Reis
Erste Pilotmessungen mit den quantitativen MultiplexSystemen nos/CaMV35S/Mais-/Soja-spezifische Primer)
sind durchgeführt.
o.k.; P35S/T-nos/hmga-Triplex
(s. 2.2, S. 27-28)
Die Validierung von quantitativen und Integrationsortspezifischen Verfahren für mindestens zwei Events ist
abgeschlossen.
Integrationsort spezifische Sequenzen für gv
Reis konnten nur teilweise ermittelt werden;
dafür konnten
+ drei verschiedene Techniken des genomic
walking eingeführt und auf Praxistauglichkeit
getestet werden
Mindestens eines der etablierten, quantitativen Duplexreal-time PCR-Systeme wurde in einer Laborvergleichsuntersuchung überprüft.
o.k. ; P35S/T-nos-System
(S. 45-49)
+ Methode wurde erfolgreich im Ringversuch
getestet und soll als erste Duplex-Real-time
PCR in die Amtliche Sammlung von Untersuchungsverfahren aufgenommen werden
Mindestens ein quantitatives Multiplex-Screening
wurde laborintern validiert.
o.k. (s. 2.3.4 , S. 49-54)
+ vergleichende Bewertung von DuplexReal-time PCR und Microarray-Systemen (s.
Teil 3)
+ Strategie für Screening-Nachweis aller
derzeit bekannten gv Pflanzen beschrieben
(s. 2.3, Tabelle S. 30/31)
Forschungsvorhaben
Abschlussbericht
Literatur
92 von 96 Seiten
6 Literaturverzeichnis
1.
Verordnung (EG) Nr. 1829/2003 des Europäischen Parlaments und des Rates vom 22.09.2003
über genetisch veränderte Lebensmittel und Futtermittel (ABl. Nr. L 268/1 vom 18.10.2003), sowie Verordnung (EG) Nr. 1830/2003 des Europäischen Parlaments und des Rates vom
22.09.2003 über die Rückverfolgbarkeit und Kennzeichnung von genetisch veränderten Organismen und über die Rückverfolgbarkeit von aus genetisch veränderten Organismen hergestellten Lebensmitteln und Futtermitteln (ABl. Nr. L 268/24 vom 18.10.2003).
2.
BATS, Centre for biosafety and sustainability, Basel: Genetically Modified Crops: molecular and
regulatory details, BATS report, version 2 (06/2003).
3.
Datenbank AGBIOS: GM crop database. http://www.agbios.com/dbase.php?action=ShowForm
4.
International
Service
for
the
Acquisition
of
Agri-Biotech
Applications
(ISAAA):
http://www.isaaa.org/
5.
Datenbank “Transgen”: http://www.transgen.de
6.
European Commission: State of Play on GMO authorisation under EU law. MEMO/03/221 vom
07.11.2003.
7.
Pietsch K, Waiblinger HU, Brodmann P, Wurz A. Deutsche Lebensmittelrundschau (1997) 93 (2):
35-38: Screeningverfahren zur Identifizierung „gentechnisch veränderter“ pflanzlicher Lebensmittel.
8.
Lipp M, Brodmann P, Pietsch K, Pauwels J, Anklam E. Journal of AOAC International (1999), 82
(4):923-928: IUPAC Collaborative trial study of a method to detect the presence of genetically
modified soy beans and maize in food raw material.
9.
Hübner P, Waiblinger HU, Pietsch K, Brodmann P. Journal of AOAC International (2001). Vol. 84,
No.6: Validation of PCR methods for the quantification of genetically modified plants in food.
10. Pietsch, K, Waiblinger, HU (2000) Quantification of genetically modified soybeans in food with the
LightCyclerSystem, in: Meuer/Wittwer/Nakagawara (Edrs.): Rapid Cycle Real Time PCR - Methods and Applications. Heidelberg: Springer Verlag.
11. Waiblinger, HU, Gutmann M, Hädrich J, Pietsch K. Deutsche Lebensmittel-Rundschau (2001)
97:121-125: Validierung der Real-time PCR zur Quantifizierung von gentechnisch veränderter
Soja.
12. Anklam E, Gadani F, Heinze P, Pijnenburg H., Van den Eede G. Eur. Food Res. Technol. (2002)
214:3-26: Analytical methods for detection and determination of genetically modified organisms in
agricultural crops and plant-derived food products.
Forschungsvorhaben
Abschlussbericht
Literatur
93 von 96 Seiten
13. Waiblinger, H.U., Ohmenhäuser, M., Pietsch, K., Ritter, W., Steegmüller, J., Krech, A., Horn, P.
und Schroeder, A. Deutsche Lebensmittel-Rundschau (2005) 101 (12):543-549: Die Untersuchung von transgenem Rapspollen in Honigen mittels Real-time PCR.
14. DIN EN ISO 21569:2005: Lebensmittel - Verfahren zum Nachweis von gentechnisch modifizierten Organismen und ihren Produkten - Qualitative auf Nukleinsäuren basierende Verfahren (ISO
21569:2005).
15. DIN EN ISO 21570:2006: Lebensmittel - Verfahren zum Nachweis von gentechnisch modifizierten Organismen und ihren Produkten - Quantitative auf Nukleinsäuren basierende Verfahren
(ISO 21570:2005).
16. DIN EN ISO 21571:2005: Lebensmittel - Verfahren zum Nachweis von gentechnisch modifizierten Organismen und ihren Produkten - Nukleinsäureextraktion (ISO 21571:2005)
17. DIN EN ISO 24276:2006: Lebensmittel - Verfahren zum Nachweis von gentechnisch modifizierten Organismen und ihren Produkten - Allgemeine Anforderungen und Definitionen (ISO
24276:2006).
18. Applied Biosystems (2003): Sequence Detection Systems, Chemistry Guide.
19. SLMB (2004): Schweizerisches Lebensmittelbuch. Kapitel 52 B. Ed. Bundesamt für Gesundheit,
Bern, Schweiz.
20. Eurogentec 2004. www.eurogentec.com
21. Applied Biosystems (2004). ABI 7300/7500 Real Time PCR System. Absolute Quantification getting Started Guide.
22. Kew, Royal Botanic Gardens. Plant DNA C-values Database. http://www.rbgkew.org.uk/cval/
23. Zeitler R, Pietsch K, Waiblinger HU. Eur Food Res Technol (2002) 213:346-351: Validation of
real-time PCR methods for the quantification of transgenic contaminations in rape seed.
24. Zeitler R (2002). persönliche Mitteilung
25. Reiting, R., Waiblinger, H.-U., Grohmann, L. J. f. Verbraucherschutz (in Vorbereitung) (2007)
Collaborative study of a T-nos screening real-time PCR method to detect genetically modified organisms in food products.
26. Waiblinger, H.U., Ohmenhäuser, M., Pietsch, K., Ritter, W., Steegmüller, J., Krech, A., Horn, P.
und Schroeder, A. Deutsch Lebensmittel-Rundschau (2005) 101 (12): 543-549: Die Untersuchung von transgenem Rapspollen in Honigen mittels Real-time PCR.
Forschungsvorhaben
Abschlussbericht
Literatur
94 von 96 Seiten
27. Waiblinger, H.-U., Ernst, B., Anderson, A. und Pietsch K. J. f. Verbraucherschutz (in Vorbereitung) (2007). Validation and collaborative study of a P35S and T-nos screening duplex real-time
PCR screening method to detect genetically modified organisms in food products.
28. Hernandez, M. et al L. J. Agric. Food Chem. (2004) 52:4632-4637: Development and comparison
of four real-time PCR systems for specific detection and quantification of zea mays.
29. CRL der EU-Kommission, Internetseite http://gmo-crl.jrc.it/statusofdoss.htm
30. CVUA Freiburg (2003) Projektbericht zum Forschungsvorhaben Einführung der DNA-ChipTechnologie in der Lebensmittelanalytik“. Gefördert durch Ministerium für Ernährung und Ländlicher Raum, Projekt Nr. 0248/E.
31. Rishi et al. Journal of Biotechnology (2004) 111: 9-15: Genome Walking of large fragments: an
improved method.
32. Hess N et al. Bundesgesundheitsblatt Gesundheitsforschung Gesundheitsschutz (2002) 45:626633: Insertionsspezifische Nachweisverfahren für transgene Pflanzenlinien unter Anwendung der
inversen PCR.
33. Spertini et al. BioTechniques (1999) 27: 308-314: Screening of transgenic plants by amplification
of unknown genomic DNA flanking T-DNA.
34. Liu Y et al. Plant J (1995) 8(3):457-463: Efficient isolation and mapping of Arabidopsis thaliana TDNA insert junctions by thermal asymmetric interlaced PCR.
35. Tan G, Gao Y, Shi M et al. Nucleic Acids Res (2005) 33/13.e122: SiteFinding-PCR: a simple and
efficient PCR method for chromosome walking.
36. Liu Y et al. Plant Molecular Biology Reporter (1998) 16: 175-181: Efficient Amplification of Insert
End Sequences from Bacterial Artificial Chromosome Clones by thermal asymmetric interlaced
PCR.
37. Maede D, Degner C, Grohmann L. European Research and Technology (2006) 224 (2): Detection of genetically modified rice: a construct-specific real-time PCR method based on DNA sequences from transgenic Bt rice.
38. Eamens AL, Blanchard CL, Dennis ES, Upadhyaya NM. Plant Biotechnol. J. (2004) 2(5):367-380:
A bidirectional gene trap construct suitable for T-DNA and Ds-mediated insertional mutagenesis
in rice (Oryza sativa L.).
39. Tsoktouridis G, Merz CA, DelVecchio VG. BioTechniques (2005) Short Technical Reports.
38:885-888: Adaptor long-range PCR procedure for clone-specific characterization and chromosomal localization.
Forschungsvorhaben
Abschlussbericht
Anhang
95 von 96 Seiten
7 Anhang
7.1
Poster und Tagungsbeiträge
1. Molekularbiologische Verfahren zum Nachweis von nicht zugelassenen gentechnisch veränderten Pflanzen. Posterbeitrag auf dem Symposium der Landesstiftung Baden-Württemberg
am 12. Oktober 2005, Hohenheim.
2. Entwicklung Event-spezifischer Verfahren zum Nachweis nicht zugelassener gentechnisch
veränderter Pflanzen; Poster auf dem deutschen Lebensmittelchemikertag 2006 in Dresden,
Lebensmittelchemie 61, 1-24 (2007)
3. Waiblinger, H.-U., Ernst, B., Anderson, A. und Pietsch K. (in Vorbereitung) (2007). Validation
and collaborative study of a P35S and T-nos screening duplex real-time PCR screening method to detect genetically modified organisms in food products.
Forschungsvorhaben
Abschlussbericht
Anhang
7.2
96 von 96 Seiten
Abkürzungsverzeichnis
bp
Basenpaar(e)
BHQ
Black hole Quencher
°C
Grad Celsius
Ct
Schwellenwertzyklus (threshold cycle)
DNA
Desoxyribonucleinsäure (deoxyribonucleic acid)
EtBr
Ethidiumbromid
FAM
5,6-Carboxyfluorescein
g
Erdbeschleunigung oder Gramm
gv
gentechnisch verändert
GVP
gentechnisch veränderte Pflanze
GVO
gentechnisch veränderter Organismus
h
Stunde(n)
HEX
5,6-Carboxy-4,7,2’,4’,5’,7’-hexachlorofluorescein
l
Liter
m
Meter oder milli
M
Molar
min
Minute
n
nano
NCBI
National Center for Biotechnology Information
p
pico
PCR
Polymerase-Kettenreaktion (polymerase chain reaction)
rpm
Umdrehungen pro Minute
s
Sekunden
T
Temperatur
TAMRA
Tetramethyl-6-carboxyrhodamin
Taq
Thermus aquaticus
TE
Tris-HCl-EDTA-Puffer
Tm
Schmelztemperatur
Tris
Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan
Tris-HCl
Tris-(hydroxymethyl)-aminomethanhydrochlorid
U
Aktivitätseinheit für Enzyme (units)
µ
mikro
v
Volumen
YY
Yakima Yellow
Forschungsvorhaben
Abschlussbericht

Nachweis nicht zugelassener GVO 2005-2007

Transcription

Similar documents

Applied Biosystems StepOne™ Real

Stellungnahme zur Genotypisierung von transgenen Mäusen

nanoporöse membranmaterialien für die anwendung als 3d

Einfluss der Buckminsterfullerene auf Zellen des Immunsystems