Biotechnologija

3. Modulio dalykas “Biotechnologija”
Dr. Rolandas Meškys
Vilniaus Universitetas
Biochemijos institutas
Molekulinės mikrobiologijos ir biotechnologijos katedra
Bendrieji biotechnologiniai procesai
Biotechnologijose naudojami objektai
•
•
•
•
ląstelės komponentai (DNR, RNR, baltymai, polisacharidai, lipidai ir kitos mažos
molekulinės masės medžiagos),
mikroorganizmai,
augalų ir gyvūnų ląstelės,
daugialąsčiai organizmai (augalai ir gyvūnai).
Biotechnologijos
•
•
•
•
Baltoji (pramoninė),
Raudonoji,
Žalioji,
Mėlynoji.
Fermentacijos sistemos
• Pirmosios kartos procesai
– Fermentacijos naudojant natyvius (laukinio tipo) organizmus
• Vyno, alaus, sūrio ir kitos
• Tešlos gamyba ir kepimas
•Antrosios kartos procesai
– Natyvių ar genų inžinerijos metodais pakeistų fermentų,
genų, ląstelių naudojimas gerinant pirmosios kartos procesus
•Tekstilės pramonė
•Krakmolo pramonė
•Cheminė sintezė
•Trečiosios kartos procesai
– Rekombinantinės ir sukonstruotos sistemos
•Augalų ir gyvūnų ląstelių kultūros
•Augalai ir gyvūnai
Fermentacijos technologijos
Fermentacija – didelio ląstelių kiekio (biomasės)
auginimas aerobinėmis ar anaerobinėmis
sąlygomis, panaudojant tam tikrą įrangą –
fermentatorius (bioreaktorius)
Bioreaktoriai naudojami ir biotransformacijos
procesuose (laisvi ar imobilizuoti fermentai ir
ląstelės)
Fermentacijos būdai ir sistemos
• Skystoje ar kietoje terpėje
• Maišant, aeruojant, steriliomis sąlygomis arba nemaišant,
neaeruojant, nesteriliomis sąlygomis
• Gyvi fermentatoriai
Bioproceso stadijos ir operacijos
Proceso stadijos:
Žaliava (substratas)
Pradinis apdorojimas
Bioreakcijos
Produkto išskyrimas
Produktas
Operacijos:
Rūšiavimas
Sijojimas
Smulkinimas
Hidrolizė
Sterilinimas
Biomasės gamyba
Metabolitų biosintezė
Biotransformacijos
Filtracija
Centrifugavimas
Sedimentacija
Flokuliacija
Ląstelių ardymas
Išsodinimas, išgarinimas
Chromatografija
Fermentacijos/biotransformacijos proceso schema
Paruošimas ir fermentacija (up-stream processing)
Žaliava/substratas
Pasėjamoji medžiaga ar biokatalizatorius
Fermentacija/biotransformacija
Produkto išskyrimas (down-stream processing)
Produkto gryninimas
Produktas
Gamybos atliekos
Fermentatoriaus komponentai. Fermentacijos procesas, pvz.,
mikromicetų kultivavimo
Fermentacija skystoje terpėje
Periodinė (batch): uždara sistema, fiksuotas tūris, fiksuota trukmė,
pradinė komponentų koncentracija kinta
Periodinė su pamaitinimu (fed-batch): papildoma šviežia terpe,
tūris auga, fiksuota trukmė
Nepertraukiama (continuous): papildoma šviežia terpe, tūris
nekinta, perteklius pašalinamas/surenkamas
Periodinė fermentacija
1.
2.
3.
4.
5.
Pridedama terpė
Sterilizacija
Pasėjama
Fermentuojama
Surenkama
Substratas
Produktas
Biomasė
Laikas
Periodinė fermentacija su pamaitinimu
•
•
Siurblys
•
•
Papildoma
terpė
•
•
Paprasta
Sterilinimas galimas
reaktoriuje
Visi terpės
komponentai prieš
inokuliaciją (pasėjimą)
Maksimalios C ir N
koncentracijos
limituojamos ląstelių
sąvybių
Biomasės produkcija
nulemia C/N kiekis ir
toksiškų produktų
susidarymas
Procesas
nutraukiamas, kai
ląstelių/produkto
koncentracija
didžiausia
Periodinė fermentacija su pamaitinimu –
pagrindinės savybės
•
•
•
•
Pradinės medžiagų koncentracijos terpėje mažos (nėra inhibicijos)
Terpės komponentai (koncentruotas C ir/ar N šaltinis) pridedami
porcijomis ar nenutrūkstamai
Kontroliuojamas pamaitinimas – didesnės biomasės/produkto išeigos
Fermentaciją limituoja susidarantys toksiški produktai ar substrato
koncentracija
Periodinė su pamaitinimu
Periodinė
Substratas
Produktas
Biomasė
Produktas
Biomasė
Substratas
Nepertraukiama fermentacija
Tekėjimo greitis1 = Tekėjimo greitis 2
Siurblys 1
Siurblys 2
Terpės indas
Surinkimo indas
Rekombinantinių baltymų fermentacijos būdai
12
Pagal: Roldao et al. Expert Rev. Vaccines 2010; 9: 1149–76.
Pramoninė biotechnologija
Pramoninės biotechnologijos objektai:
• biokatalizatoriai,
• ląstelės su pakeistu metabolizmu,
• biokataliziniai procesai.
Biokatalizės kuriama pridėtinė vertė
Apdorojimas:
cheminis, fizinis ar
fermentais
Žemės ūkio
produktai ir
atliekos
Angliavandeniai
Lignino
monomerai
Biokatalizė ar
mikroorganizmai
Specialūs cheminiai
junginiai
Maisto priedai
Vaistinės medžiagos
Tiksliosios chemijos junginiai
Biomedžiagos
(biopolimerai)
Daugiatonažiai
cheminiai junginiai
(tirpikliai, monomerai
ir kiti)
Biokuras
Etanolis
Biodyzelinas
Vandenilis
Pramoninės biotechnologijos tyrimų sritys
1. Nauji fermentai ir
mikroorganizmai
4.Biokatalizatorių kūrimas
5. Biokatalizinių procesų
kūrimas
2. Mikroorganizmų
genomika ir
bioinformatika
3.Metabolizmo
inžinerija
6. Inovatyvios
fermentacijos ir
bioinžinerija
7. Produktų gryninimo technologijos
Nauji bioproduktai ir biopolimerai
Tikslingas fermentų (baltymų) konstravimas.
Principinė schema.
Fermentas
Substratas
Ne
Taip
Paieška arba
evoliucija
in vitro
Katalitiniai
antikūniai
Ne
Aktyvumas pakankamas
Taip
Ne
Stabilumas pakankamas
Taip
Ne
Lengvai gaunamas
GENAS
Taip
Panaudojimas
Modeliavimas
Baltymas
Struktūra
Rekombinantinės DNR technologijos rezultatai
• Galima gauti didelius baltymo kiekius
• Baltymai su specifinėmis mutacijomis
• Sulieti baltymai
Rekombinantinių baltymų raiška:
• Baltymų gryninimui ir tyrimui
• Biocheminių savybių analizei
• Struktūrinei analizei
– Kristalinimui
– BMR
• Baltymo sąveikų nustatymui
• Antikūnų gamybai
17
Raiškos sistemos
• Escherichia coli
– Prokariotinių baltymų raiškos “darbinis
arkliukas”
• Mielės
– Bakteriniams ir eukariotiniams baltymams
– Dideliems baltymo kiekiams
• Vabzdžių, augalų ląstelės
– Potransliacinės modifikacijos
• In vitro sistemos
– Kviečių gemalai, triušio retikulocitai
18
Raiškos sistemų charakteristikos
Charakteristika
E. coli
Mielės
Vabzdžių ląstelės
Žinduolių
ląstelės
Padvigubėjimo dažnis
didelis (30 min)
didelis(90 min)
mažas(18-24 val.)
mažas(24 val.)
Kultivavimo terpės
kaina
maža
maža
didelė
didelė
Raiškos lygis
aukštas
žemas– aukštas
žemas– aukštas
žemas-vidutinis
Baltymo tretinė
struktūra
kartais
reikalingas
“pervyniojimas”
kartais
reikalingas
“pervyniojimas”
teisingas
susivyniojimas
teisingas
susivyniojimas
N-glikozilinimas
nėra
daug manozių
paprastas
sudėtingas
O-glikozilinimas
nėra
yra
yra
yra
Fosforilinimas
nėra
yra
yra
yra
Acetilinimas
nėra
yra
yra
yra
Acilinimas
nėra
yra
yra
yra
γ-Karboksilinimas
nėra
nėra
nėra
yra
Bendra kaina
maža
maža
vidutinė
didelė
19
Reikalavimai rekombinantinių baltymų gavimui
Grynumo ir kiekybiniai; Biologinio aktyvumo išlaikymo;
Ekonominiai.
Reikalavimai rekombinantinių baltymų grynumui
Terapijai, in vivo tyrimams
Ypač gryni, >99%
Kristalografijai, daugeliui
fizikocheminių
charakteristikų metodų
Didelio grynumo 95-99 %
Antigenai antikūnų gamybai,
N-galo sekvenavimui
Vidutinio grynumo <95%
20
Baltymų “inkarai”
Privalumai:
– Gryninimas
• Inkarai naudojamos selektyviam baltymo atrinkimui
iš sudėtingų pavyzdžių
– Baltymų vizualizavimas/sekimas
• Fluorescuojantys baltymų inkarai, žymėti antikūnai
Problemos:
•Brangūs sorbentai;
•Gali būti agresyvios eliucijos sąlygos arba nukirpimas nuo kolonėlės;
• Ne visuomet gerina tirpumą;
• poliHis inkarų atveju grynintų baltymų tirpalai su metalo jonų
priemaišomis, netinka farmacijoje ir terapijoje naudojamiems baltymams;
•Apkrauna ląstelės-šeimininkės metabolizmą.
21
Populiarūs maži inkarai giminingumo chromatografijai
Inkaras
Sorbentas
Eliuentas
Ilgis,
aminor.
Seka
Pastabos
His
Ni2+-NTA,
kobaltas
Imidazolas ar
žemas pH
5-15
HHHHH
Natyvus arba
denatūruotas;
pigus sorbentas
FLAG
anti-FLAG
antikūnai
Rūgštinis pH
ar
EDTA/EGTA
8
DYKDDDDK
Didelio
specifiškumo;
žiaurios
eliucijos
sąlygos.
Strep II
modifikuotas
streptavidinas
destiobiotinas
8
WSHPQFEK
Brangus
sorbentas
S-peptidas
S-baltymas
Rūgštinis pH,
fermentinis
pašalinimas
15
KETAAAKFERHMDS
Galima
detekcija,
brangus
sorbentas
22
Populiarūs inkarai giminingumo chromatografijai
Uodega
Sorbentas
Eliuentas
Dydis
Pastabos
MBP
amilozė
maltozė
40 kDa
Didina tirpumą,
lemia sekreciją,
pigus sorbentas
GST
glutationas
redukuotas
glutationas
26 kDa
Nebrangus
sorbentas
Celiuliozę rišantys
domenai
celiuliozė
Gd•HCl
4-20 kDa
Didina sekreciją
Kalmoduliną rišantis
peptidas
kalmodulinas
EDTA/EGTA
4 kDa
Galima detekcija,
brangus sorbentas
His-patch
tioredoksinas
Ni2+-NTA, Talon
imidazolas
11.7 kDa
Didina tirpumą
23
Metabolinio kelio kūrimas
C. H. Martin et al. Chemistry & Biology, 2009,16: 277
Etanolio biosintezės kelio konstravimas. Nauji substratai
Dellomonaco et al. Microbial Cell Factories 2010, 9:3
Naujosios kartos biokuro metabolizmo konstravimas
Dellomonaco et al. Microbial Cell Factories 2010, 9:3
Poliketidų sintazių tikslinis perkonstravimas
Raudonoji biotechnologija
Raudonosios biotechnologijos objektai:
• terapiniai baltymai,
• antikūnai,
• ribozimai,
• hibridiniai baltymai
• siRNR;
• aptamerai.
Kai kurių rekombinantinių terapinių baltymų raiškos sistemos
Baltymas
Raiškos sistema
Produkcijos
lygis
Hirudinas
Saccharomyces
cerevisiae
60 mg/L
Interferonas alpha-2b
Hansenula
polymorpha
120 mg/L
Angiostatinas
Pichia pastoris
108 mg/L
Anti-HBs Fab
Pichia pastoris
50 mg/L
Žmogaus serumo
albuminas
Saccharomyces
cerevisiae
3 g/L
Pichia pastoris
10 g/L
Žmogaus interleukinas 6
Aspergillus niger
150 mg/L
Žmogaus
apolipoproteinas AI
CHO ląstelės
80 mg/L
Insulino pirmtakas
Pichia pastoris
3 g/L
Žmogaus tPA
CHO ląstelės
34 mg/L
Žmogaus
gonadotropinas
CHO ląstelės
3 g/L
Pagal: Martinez et al.
Current Opinion in
Biotechnology 2012,
23:1–7
Antikūnų dalys
Imunoterapijos - principinė schema
Antikūnas ar jo
fragmentas
Toksinas, vaistas, DNR,
siRNR, izotopas,
nanodalelė,
fermentas, citokinas
ar kita veiklioji
medžiaga
Ekspozicijos sistemos
a – peptidų ekspozicija, naudojant ribosomas; b – peptidų ekspozicija,
naudojant bakteriofagus; c – peptidų ekspozicija, naudojant ląsteles; d –
peptidų ekspozicija ląstelių viduje.
Atsitiktinių peptidų bibliotekos
Atsitiktinės DNR sekos:
oligonukleotidai koduojantys
6-12 aminorūgščių
Bakteriofago kapsidės baltymą
koduojantis genas
+
Hibridinis genas
Kiekvienas bakteriofagas
eksponuoja individualų peptidą
Tikslinių peptidų atranka
E. coli
Paviršius, pvz.,
mikroplokštelės šulinėlis,
modifikuojamas taikinio
molekulėmis.
Tinkamą peptidą
eksponuojantis bakteriofagas
yra pagaunamas
Atrinktų bakteriofagų
padauginimas
Peptidą
koduojančios
sekos nustatymas
Ribozimai
•
•
•
•
RNR molekulės su kataliziniu aktyvumu RNR perkerpama
Pasitaiko natūraliai, bet terapiniais tikslais kuriami in vitro
Gali nutildyti mRNR taikinį privalumas terapijoje
Labai atrankūs savo taikiniams
35
Ribozimai
1. Organizme geno/mRNR
mutacija lemia nenormalius
geno produktus Vėžys
2. Ribozimai sintetinami ir
modifikuojami in vitro, kad
atpažintų mutuotą mRNR.
3. Ribozimai perkeliami in vivo
hibridizuojasi prie
mutuotos mRNR.
4. Mutuota mRNR karpoma ir
degraduojama nelieka
nenormalių baltymų.
Ribozimų struktūros
Ribozimai ir vėžys
•
Dažna vėžio priežastis per didelė baltymų
raiška dėl mRNR mutacijų.
•
Pavyzdys: per didelė telomerazės raiška
– Telomerazė katalizuoja telomerų
sintezę prailgina vėžinių ląstelių
gyvenimą
– Leidžia vėžiui daugintis
– Sukurtas ribozimas – žmogaus
telomerazės atvirkštinės
transkriptazės taikinys hTERT (Kwon
et al.)
– Ribozimas turi citotoksinį regioną toksinis regionas įterptas į RNR
vietoje mutuoto hTERT = transgenas
– Citotoksinio regiono produktai
toksiški vėžinėms ląstelėms “savižudė” genų terapija
– Auglio augimo regresija
37
Ribozimų terapijos
privalumai
• Didelio atrankumo netoksiški sveikoms
ląstelėms.
• Didelio efektyvumo rišasi
prie mRNR taikinio ir ją
skaldo.
• Efektyviai slopina auglių
augimą, kai RNR vakcinos tik
prevenciniams tikslams.
Ribozimų trūkumai ir tolimesni
tyrimai
• Tinka tik tiems vėžio atvejams,
kurie kilo dėl per didelio
mRNR produktų kiekio.
• Naujas ribozimas kiekvieno
tipo vėžiui nėra
universalaus.
• Sudėtinga perkelti in vivo sisteminės injekcijos.
• Tolimesnių tyrimų taikiniai:
– Ląstelės taikinių, slopinančių
ribozimų aktyvumą, išaiškinimas
– RNR struktūros ir mobilumas
– Ribozimų mechanizmai
38
RNRi
RNR interferencija – tai potranskripcinis genų raiškos slopinimas,
dalyvaujant trumpoms dvigrandėms RNR grandinėlėms (siRNR
arba miRNR).
Small interfering (si)RNR - 21 – 23
nukleotidų visiškai komplementarios
dvigrandės RNR; turi 2 išsikišusius
nukleotidus 3′ gale; aktyvumui būtinas
5′ fosfatas.
AGO2 (Argonaute) – skaldo mRNR
taikinį tarp 11 ir 10 nukleotido siRNR
vadovaujančios grandinės 5′ galo
atžvilgiu.
RISC (RNA-induced silencing complex)
RNRi molekulinis mechanizmas
Tariq M. Rana. 2007, Nature Reviews Molecular Cell Biology (8): 23 – 36.
39
RNRi pritaikymas ir problemos
siRNR vaistų kūrimo strategija
siRNR atranka:
• Dizainas naudojant bioinformatinius metodus;
• In vitro atranka (siRNR biblioteka mRNR taikiniui).
siRNR stabilizavimas:
• Cheminės modifikacijos.
In vivo selektyvus pristatymas:
• Nuogos
• Konjuguotos
• Liposomos
• Peptidai/polimerai
• Antikūnai.
RNRi pritaikymas ir problemos
siRNR vaistų kūrimo strategijos problemos
Potencialumas
•
Efektyvaus taikinio radimas →
bioinformatika, siRNR biblioteka.
•
Vadovaujančios grandinės pakrovimas į
RISC → nekomplementarūs nukleoƟdai
vadovaujančios grandinės 5′ gale.
•
Virusų sugebėjimas pabėgti nuo RNRi
spaudimo (mutacijos, antrinės struktūros
ir dauginimosi ypatumai) →
bioinformatika - įvairių viruso kamienų
konservatyvių taikinių paieška, kelių
siRNR naudojimas vienu metu.
Antonin de Fougerolles et al. 2007, Nature Reviews Drug Discovery (6): 444 – 453.
Haasnoot J et al. 2007, Nature Biotechnology (12): 1435 – 1443.
RNRi pritaikymas ir problemos
siRNR vaistų kūrimo strategijos problemos
Specifiškumas
•
NeƟnkamų taikinių atpažinimas →
bioinformatika - paieška taikinių, kurių
sėklinis (seed) regionas būtų kuo mažiau
homoligiškas kitiems taikiniams; cheminės
modifikacijos – pvz., 2′-O-metilo grupės
įvedimas į 2’ nukleotidą sumažina sąveiką
su kitais taikiniais ir beveik nedaro įtakos
taikinio nutildymui.
•
Imuninės sistemos sužadinimas → 2′-Ometilo modifikacija; siRNR pristatymo būdai
nesąveikaujant su imunine sistema.
Antonin de Fougerolles et al. 2007, Nature Reviews Drug Discovery (6): 444 – 453.
Yang M, Mattes J. 2008, Pharmacology & Therapeutics (117): 94 – 104.
RNRi pritaikymas ir problemos
siRNR vaistų kūrimo strategijos problemos
Stabilumas
•
Endonukleazės → cheminės modifikacijos - ribozės 2′padėties modifikacijos (kaip 2′-Ometilo ar 2′-fluoro); pristatymo sistema.
•
Egzonukleazės → cheminės modifikacijos - fosfotionato (P=S) karkasas 3′ gale;
pristatymo sistema.
Antonin de Fougerolles et al. 2007, Nature Reviews Drug Discovery (6): 444 – 453.
RNRi pritaikymas ir problemos
siRNR vaistų in vivo pristatymo strategijos
Prikauso nuo virusinės infekcijos pobūdžio:
• Ūmioms virusinėms infekcijoms (pvz.: RSV, gripo virusas) gydyti naudojama
laikina transfekcija sintetine siRNR ar plazmide, koduojančia siRNR.
• Lėtines virusų (pvz.: ŽIV-1, HCV) infekcijas reikia gydyti ilgalaike RNRi. Šiuo
atveju reikia taikyti genų terapiją pastoviai shRNR viduląstelinei raiškai.
Naudoti įvairius virusinius vektorius (pvz., lentivirusus) pastovios shRNR
raiškos vektorių perdavimui.
RNRi pritaikymas ir problemos
siRNR vaistų in vivo pristatymo strategijos
Nuoga siRNR
•
•
•
Modifikuota ar nemodifikuota siRNR druskos ar kito paprasto adjuvanto, kaip 5%
dekstrozės (D5W), tirpale.
Gali būti tiesiogiai pristatoma į akis, plaučius ir CNS.
Teigiami rezultatai: RSV, SARS-CoV.
Konjugacija
•
•
Konjugatais naudojamos lipofilinės molekulės, baltymai, peptidai, aptamerai.
Konjuguojama prie 5′ ar 3′ prasminės grandinės galo, kartais įmanoma prijungti ir prie
priešingos prasmės grandinės 3′ galo.
Antonin de Fougerolles et al. 2007, Nature Reviews Drug Discovery (6): 444 – 453.
RNRi pritaikymas ir problemos
siRNR vaistų in vivo pristatymo strategijos
Liposomos ir lipopleksai
•
•
•
Pūslelės skirtos siRNR gabenimui in vivo yra
daugiakomponentės nanodalelės, dažniausiai
sudarytos iš daugybės lipidų, tarp kurių
katijoniniai ir/arba fuzogeniniai lipidai,
cholesterolis ir polietileno glikozilinti lipidai
siRNR galima pristatyti sistemiškai ir lokaliai.
Teigiami rezultatai: mirtinas Japonijos encefalito
virusas, Pietų Nilo virusas, papilomos virusas.
Peptidai ir polimerai
•
•
•
siRNR gali būti kompleksuojamos su katijoniniais peptidais ir polimerais joninės
sąveikos pagalba suformuojant nanodaleles.
Pvz.: polietileniminas (PEI), chitozano, ciklodekstrino ir atelokolageno (proteazėm
paveiktas kolagenas) nanodalelės.
Teigiami rezultatai: Ebolos E virusas, gripo virusas.
Antonin de Fougerolles et al. 2007, Nature Reviews Drug Discovery (6): 444 –
453.
RNRi pritaikymas ir problemos
siRNR vaistų in vivo pristatymo strategijos
Antikūnai
•
•
Sulietas protamino-antikūno baltymas in vitro
neša nekovalentiškai prijungtą siRNR į antikūno
receptorių turinčią ląstelę.
Teigiami rezultatai: ŽIV.
Vektoriai
•
•
•
•
Stabiliai ir indukuojamai RNRi.
Vektoriais gali būti plazmidės, virusiniai
vektoriai ar transpozonai.
Vektoriuose koduojamos siRNR, o jų
transkripciją valdo U6 ar H1 promotorius
(RNazės III promotoriai) ir daugiau nei 6
timidinų (T) terminatorius.
Virusinais vektoriais naudojami lentivirusai,
adenovirusai ir su adeno virusu susiję virusai
(AAV).
Antonin de Fougerolles et al. 2007, Nature Reviews Drug Discovery (6): 444 – 453.
Yang M, Mattes J. 2008, Pharmacology & Therapeutics (117): 94 – 104.
Kas yra aptamerai?
• 15-40 bazių porų
viengrandinės
oligonukleotidų sekos.
• Sudaro antrines ir
tretines struktūras.
• Pasižymi dideliu
giminingumu ir
atrankumu taikiniui.
SELEX metodo schema
SELEX yra evoliucinis
metodas kurio dėka kuriami
dideliu giminingumu
pasižymintys nukleorūgščių
ligandai.
Metodo esmė atrinkti dideliu
giminingumu ir specifiškumu
taikiniui pasižyminčius
aptamerus.
Tombelli S, Minunni M, Mascini M. Analytical applications of aptamers. Biosensors and Bioelectronics, 2005;20:2424:34.
-ominės technologijos
• Genomų analizės metodai.
• Greitaeigės sekoskaitos metodai (pirosekvenavimas, iSolid,
Illumina ir kiti).
• Transkriptomika. DNR gardelės. DNR (RNR) jutikliai.
• Proteomika - metodai ir problemos. Masių spektrometrija
(metodo principai, sužadinimo technologijos, panaudojimo sritys).
• Metabolomika.
• Signalomika ir interaktomika.
• Ominių technologijų vystymosi tendencijos.
• Biožymenys. Ominės technologijos ir vaistų paieška.
• Individualizuoto gydymo perspektyvos.
meta-duomenys
Genomika
Metabolomika
Transkriptomika
Proteomika
Funkcinė genomika
Integruotas tyrimas
Genomų
sekos,
Bioinformatika
Hipotezės
Rezultatų ir sistemos interpretacija
Vaizdinimas
AFM, EM,
Imuno-EM
Genų raiška:
transkripcija
Duomenų
integravimas
ir analizė
Genų raiška:
proteomika
Modeliavimas
▲
Procesas:
Kintančios sąlygos
Genų raiška:
metabolomika
Genomų sekų nustatymas panaudojant didelio tankio
pikolitrinius reaktorius
454 Life Sciences Corp., 20 Commercial
Street, Branford, Connecticut 06405,
USA.
Roche/454 — Pirosekvenavimas
M. L. Metzker Nat Rev Genet. 2010 11:31-46.
SOLiD
Sekoskaita
liguojant.
Keturių spalvų
kodavimas
M. L. Metzker Nat Rev Genet. 2010 11:31-46.
SOLiD
Sekoskaita
liguojant.
Keturių spalvų
kodavimas
M. L. Metzker Nat Rev Genet. 2010 11:31-46.
Illumina/Solexa technologija
Klasterinis DNR fragmentų pagauginimas PGR metodu
M. L. Metzker Nat Rev Genet. 2010 11:31-46.
Pacific Biosciences tikro laiko sekoskaita
DNR sekos nustatymas panaudojant vieną
polimerazės molekulę ir fluorescensijos detekciją.
M. L. Metzker Nat Rev Genet. 2010 11:31-46.
Transkriptomika. Pavyzdžio paruošimas DNR gardelių analizei
Ląstelės
TTTT---T7
AAAA
Poli (A)+
RNR
< 1% suminės
(Biotin-UTP
Biotin-CTP)
Žymėti transkriptai
L
L
L
L
kDNR
Plovimas
Skenavimas
Fragmentai
(temperatūra, Mg2+)
L
L
Hibridizacija
L
L
Žymėti fragmentai
DNR gardelių panaudojimas biožymenų ar taikinių paieškai
Kas yra masių spektrometrija?
M2
M1
M4
M3 M5
M6 M4
Jonų šaltinis
atm. slėgis
M2
+
M1 +
M4
+
M
+
5
M3
M6 +
Jonų filtras
Jonų detektorius
M2 +
vakuumas
Trys dažniausiai naudojami jonizacijos būdai
MALDI-MS
LC/ESI-MS
GC/EI-MS
Proteomas atspindi genų raišką
Proteolizė,
tripsinas
Pavyzdys
2D elektroforezė
Grynas baltymas
Baltymo fragmentai,
peptidai
MALDI-TOF
Masių spektrai
GCG
LC/MS/MS
Duomenų bazių analizė
Aminorūgščių sekos nustatymas
NJuang RH (2005) BCbasics
CE ar
HPLC
Nežinomo baltymo identfikavimas pagal masę
Nežinomas baltymas
Fragmentai
P1
P2
P3
P4
MALDI-TOF
Duomenų
bazės
Baltymas-kandidatas
Modeliavimas,
Skaidymas in silico
m/z
MW4 MW2 MW3
MW1
MW4 MW2 MW3
Fragmentų masių palyginimas, baltymo identifikavimas
Juang RH (2004) BCbasics
MW1
Genotipas
mRNA
DNR
gardelės
baltymai
masių
spektrometrija
metabolitai
Fenotipas
Metabolomika
Tikslumas
vienas ar keli metabolitai
2. Metabolitų grupė
keliolika ar keliasdešimt individualių metabolitų
3. Metabolomika
visi metabolitai
Metabolitų pirštų antspaudai
Comp.Funct. Genom. 2 (155-168) 2001;Plant Mol. Biol. 48 (155-171) 2002
Kompleksiškumas
1. Tikslinis metabolitas, pvz.
gliukozė
Metabolomika
Taikymas
Biožymenys ankstyvai
ligų diagnostikai
Farmakokinetika
Metabolizmo palyginimas:
mutantai ir laukinio tipo
augalų/gyvūnų veislės/hibridai
sveikas/ligonis
Fluksomika, metabolizmo
reguliavimas
Metabolinių kelių analizė
Metabolomika
Kompleksiškumo problema
>300000 gamtinių
junginių
Netiksli genomų
anotacija
Koncentracijų skirtumai >107
Įvairi chemija,
struktūrų ir grupių
įvairovė
Žinių trūkumas apie
metabolinius kelius
Ląstelių ir organizmų konstravimas
• Tikslinis augalų ir gyvūnų ląstelių konstravimas – metodai ir
problemos.
• Transgeniniai augalai (konstravimas, panaudojimo sritys,
problemos).
• Transgeniniai gyvūnai (konstravimas, panaudojimo sritys,
problemos).
• Žmogaus genų terapija (vektoriai, tikslinis genų nukreipimas,
manipuliacijos ex vivo).
Kai kurios datos
• 1973 – pirmasis sėkmingas skirtingų DNR kombinavimas
(rekombinantinė DNR)
• 1986 – jonvabalio liuciferazės geno įterpimas į tabako augalą.
• 1991 – sukurta avis, gaminanti piene vaistą prieš cistinę
fibrozę
• 1994 – leista naudoti pirmą transgeninį augalą (“Flavr Savr”
pomidorai) maistui
• 1996 – ožka modifikuota žmogaus genu gamino priešvėžinį
vaistą
• 1997 – Klonuota avis (“Dolly”)
Augalų genomai gali būti tikslingai keičiami
Augalų atsparumo ligoms
didinimas
Atsparumo didelėms druskų
koncentracijoms didinimas
Techninės kultūros žaliajai
chemijai
Augalų savybių gerinimas
Kaip kuriami genetiškai modifikuoti augalai
1. Kuriama bakterija
(Agrobacterium sp.) su
tiksliniu genu
2. Bakterija perneša geną
į augalo ląstelę
3. Tikslinis genas įsistato į
augalo genomą
4. Išauginamas
transgeninis augalas
Gyvūnų genomai irgi gali būti
tikslingai keičiami
Naujos savybės:
Augimo greitis,
Pieno kokybė,
Mėsos kokybė,
Vilnos kokybė
Ligų modeliai:
Išjungti tiksliniai genai
Papildomi genai
Vaistinių medžiagų ar audinių gamyba:
Rekombinantiniai baltymai terapijai (piene);
Ksenotransplantacija
Virusiniai vektoriai
Adenovirusai; Adenoasocijuoti virusai
Lentivirusai; Herpes virusai; Bakulovirusai
Adenovirusai
Adenoasocijuoti virusai
Privalumai
Trūkumai
Privalumai
Trūkumai
Infekuoja
nesidalinančias ir
besidalinančias
ląsteles
Netinka ilgalaikėms
terapijoms, veikia
trumpai
Infekuoja
nesidalinančias ir
besidalinančias
ląsteles
Lėta genų raiška
Rekombinantinių
vektorių
stabilumas
Sukelia humoralinį ir
ląstelinio imuniteto
atsakus
Platus ląsteliųšeimininkių ratas
Gali pernešti
trumpus DNR
fragmentus
Gali pernešti ilgus
DNR fragmentus
Neonkogeniški
Galima paruošti
dideliais titrais
Tinka ilgalaikėms
terapijoms, veikia ilgai
(metai)
Nepatogeniški
Genomų klonavimas
Šeimininkas
Klonuotas genomas
Literatūra
Bacillus subtilis, Escherichia
coli
pelės mitochondrija, 16-kb
1, 2, 3
Bacillus subtilis
ryžių
Chloroplastas, 135-kb
1
Bacillus subtilis
Synechocystis PCC6803, 3.5-Mb (trys fragmentai)
4
Escherichia coli
Haemophilus influenzae, 10% iš 1.8-Mb (kaip dvi
episomos)
5
Mielės
kukurūzų
Chloroplastas, 139-kb
6
Mycoplasma genitalium, Sintetinis 0.6-Mb
(žiedinė mielių centromerinė plazmidė, YCp)
7,8
Mycoplasma mycoides subspecies capri,1.1-Mb
(YCp)
9
1. Itaya et al. (2008) Nat. Methods, 5, 41–43; 2. Yoon,Y.G. and Koob,M.D. (2003). Nucleic Acids Res., 31, 1407; 3. Yonemura et al. (2007)
Gene, 391, 171; 4. Itaya et al. (2005) Proc. Natl Acad. Sci. USA, 102, 15971. 5. Smailus,D.E., Warren,R.L. and Holt,R.A. (2007)
Syst. Synth. Biol., 1, 139; 6. Gupta,M. and Hoo,B. (1991) Plant Mol. Biol., 17, 361; 7. Gibson et al. (2008) Science, 319, 1215; 8.
Gibson et al. (2008) Proc. Natl Acad. Sci. USA, 105, 20404; 9. Lartigue et al. (2009) Science, 325, 1693.
Trys mikoplazmų genomų klonavimo mielėse metodai
G. A. Benders et al. Nucleic Acids Research, 2010, 1–12 doi:10.1093/nar/gkq119
Nanobiotechnologijos ir vaizdinimo technologijos
• Biotechnologijos nanometriniame lygyje.
• Savitvarkės struktūros.
• Nanožymenys ir jų panaudojimas vaizdinimo in vivo
metoduose.
• Baltymų gardelės.
• Daugiaparametrinė analizė.
• Laboratorijos mikroschemose.
Kas yra biojutiklis (biosensorius)?
• Biojutiklis – tai cheminis jutiminis prietaisas, kuriame
biologiškai gautas atpažinimo atsakas yra sujungiamas su
keitikliu, tam, kad būtų atlikta sudėtingo biocheminio
parametro kiekybinė analizė.
• Biojutiklis – tai analitinis įrenginys, jungiantis savyje
apgalvotą ir artimą tam tikrą biologinio elemento (kuris
atpažįsta) kombinaciją ir fizikinį elementą (kuris
konvertuoja atpažinimo įvykį).
• Biojutiklis – tai analitinis įrenginys, kuris skirtas analitės
aptikimui ir kuriame tuo tikslu apjungiami biologinis ir
fizikocheminis atpažinimo komponentai.
DNR jutikliai
DNR hibridizacijos biosensoriai (dar žinomi kaip genosensoriai) yra analitiniai
įrenginiai specifinio DNR „taikinio“ sekos aptikimui tirpale vykstant šio taikinio
hibridizacijai su komplementariu „zondu“, imobilizuotu ant kieto paviršiaus.
• Molekuliniais metodais paremta detekcija:
– Optinė detekcija;
– Elektrocheminė detekcija;
• Nanodalelėmis paremta detekcija:
– Optinė detekcija;
– Elektrinė detekcija.
Pagrindiniai analizuojamų
pavyzdžių tipai remiantis
pavyzdžio sudėtingumo
laipsniu
•Atliekant detekciją tikruose
biologiniuose pavyzdžiuose pašaliniai
pavyzdžio komponentai turi įtakos genų
sensoriaus darbui (matrix effects).
• Aptikimui genų jutikliais tinka įvairių
tipų biologinė medžiaga.
•Schemoje aukščiau esantys yra mažiau
apdoroti ir sudėtingesni pavyzdžių tipai.
•Einant žemyn, silpnėja taikinio aptikimą
veikiantys veiksniai (didėja taikinio ir
trukdžių santykis).
(Tosar ir kiti, 2010)
Elektrocheminio DNR aptikimo strategijos
DNR hibridizacijos detekcija nenaudojant reagentų
(A) Galima sukurti
oligonukleotidinius
zondus be guanino jį
pakeičiant inozinu ir
taip sudarant sąlygas
registruoti tik taikinio
sekos guanino bazių
oksidaciją.
(Tosar ir kiti, 2010)
(B) Taikinys aptinkamas stebint
elektrocheminių savybių pokyčius
sąlyčio paviršiuje, nes įvykusi
hibridizacija pakeičia jonų
pasiskirstymą.
(C) Hibridizacija sukelia sau
komplementaraus zondo konformacinius
pokyčius, o šie savo ruožtu – redokso.
Elektrocheminio DNR aptikimo strategijos
Reagentais paremta DNR hibridizacijos detekcija
(A) Redokso fermentų
sukoncentravimas per
“sandwich” hibridizaciją
(žymėtas reporterinis
zondas nurodytas
mėlyna, o antikūnas su
prijungtu fermentu –
geltona spalva).
(C) Redokso
indikatoriai (pavaizduoti
elipsėmis),
pasižymintys
afiniškumu dvigrandei
DNR. Kai kurie iš jų
pasižymi
elektrokatalitinėmis
savybėmis.
(Tosar ir kiti, 2010)
(B) Redokso indikatoriai, pasižymintys
afiniškumu viengrandei DNR (parodyti
“suremtos gegnių poros” formos figūromis)
Nanodalelėmis paremti optinės ir elektrinės detekcijos
metodai
(Merkoçi , 2010)
Optinė detekcija. Šviesos absorbcijos detekcija
(Merkoçi , 2010)
Schemoje parodyta, kaip zondams
susijungus su taikinio molekulėmis, aukso
nanodalelės agreguoja viena su kita. Prie
Au dalelių heksanetiolio pagalba
pritvirtinamas oligonukleotidinis zondas.
Su taikiniu agregavusių (aggregated
Au nanoparticle probes) ir nesusijungusių
(unlinked Au nanoparticle probes) Au
nanodalelių matomos šviesos absorbcijos
spektras.
Optinė detekcija. Šviesos išsklaidymo detekcija
B) DNR
gardelės
nuotrauka,
kurioje matomi
skirtingi
spalviniai
hibridizacijos
signalai.
(A) Oligonukleotidais padengtas nanodalelių zondas, imobilizuotas
pagavimo zondas ir taikinys susijungia į trikomponentį “sumuštinį”.
(Taton ir kiti, 2001; Merkoçi, 2010)
(C) Hibridizacijos aptikimo metodas, paremtas
SERS (surface–enhanced Raman scattering).
Iš pradžių mikrogardelėje suformuojamas
trikomponentis “sumuštinis” (Au nanodalelė
yra papildomi pažymėta cianininiu dažu Cy3).
Po inkubacijos lustas paveikiamas signalą
sustiprinančiomis Ag nanodalelėmis. Dėl to
sužadinus lazeriu, įvyksta SERS efektas,
kuris išmatuojamas.
(Cao ir kiti, 2002; Merkoçi, 2010)
Optinė detekcija.Paviršinių plazmonų rezonansas
(A) Agregatų susiformavimas ant PPR lusto
paviršaus. PPR signalas ženkliai sustiprinamas,
jeigu hibridizacijoje dalyvauja Au nanodalelės
(C) Antikūno (IgG) prisijungimas ant Au
nanodalelės (AuNP) tarpininkaujamo
imunosensoriaus lusto (GBP–Protein A
– auksą prijungiančio baltymo (GBP) ir
baltymo A junginys).
(Ko ir kiti, 2009; Merkoçi, 2010)
(B) Atspindėtos
poliarizuotos šviesos
(PPR signalo) kreivės:
A kreivė atitinka Au
juostos, padengtos 12
bazių S1
oligonukleotidu,
signalą;
B kreivė atitinka
hibridizacijos su S2 24
bazių ilgio taikiniu
signalą;
C kreivė – signalą,
atsiradusį, taikiniui
hibridizavusis su Au
nanodalelės zondu.
Optinė detekcija. Fluorescencija
(A) Schematinis kvantinių optinių taškų kodavimas, paremtas bangos ilgiu ir
intensyvumu. Diddelės sferos vaizduoja polimerinius mikrorutuliukus,
kuriuose maži spalvoti rutuliukai (kvantiniai taškai) yra įterpti griežtais
santykiais. Biologinių taikinių (pvz., DNR) atpažinimą nulemia mikrorutuliukų
paviršiuje esantys molekuliniai zondai (A – E). Optiniai parodymai
registruojami matuojant vieno mikrorutuliuko fluorescencijos spektrą, todėl
kvantinių taškų santykiai yra atskiriami kodai.
(Han ir kiti, 2001; Merkoçi, 2010)
(B) ZnS
padengtų CdSe
kvantinių
rutuliukų
atskiriamos
emisijos spalvos
juos sužadinus
UV šviesa.
(C) ZnS/CdSe
kvantinių taškų,
spinduliuojančių
viename
konkrečiame
bangos ilgyje,
mikrofotografija.
Rutuliukai buvo
pritvirtinti ant
polilizinu dengtos
stiklo skaidrės,
sukėlusios kai
kuriose vietose jų
susigrupavimą.
Elektrinė detekcija. Elektrinis laidumas
Elektriniu laidumu
paremto
imunosensoriaus
veikimo schema.
Latekso ir ant jo
imobilizuoto baltymo
dalelės elektroforezės
dėka nutempiamos į
plyšį (AC – kintama
srovė). Susirišusios
su taikiniu (Ak, IgG),
jos sąveikauja su
aukso nanodalelėmis.
Šios siekiant
sustiprinti signalą
padengiamos sidabru.
Elektrinės DNR detekcijos, besiremiančios nanodalelių laidumu,
schema. Įvykus trinarei pagavimo oligonukleotido, Au zondo ir taikinio
hibridizacijai, komplekso skleidžiamas elektrinis signalas sustiprinamas jį
padengiant sidabru.
(Valev ir Kaler, 1999)
Elektrinė detekcija. Elektrokatalizinis metodas
Sidabro elektronusodinimo (electrodeposition) ant Au–DNR konjugato schema.
Neparodyti žingsniai: 2–aminobenzoinės rūgšties (ABA) elektropolimerizacija ant ITO
(indžio alavo oksido) elektrodo; kovalentinis avidino prijungimas prie ABA karboksilo
grupės; biotilinto pagavimo zondo imobilizacija per avidino–biotino sąveiką;
hibridizacija tarp pagavimo zondo ir biotilinto taikinio bei 5 nm aukso nanodalelės–
strepdavidino. Parodyti šie žingsniai: visų komponentų “sumuštinio” hibridizacija;
sidabro elektronusodinimas ant Au nanodalelės, kuris sukelia signalo sustiprinimą;
nusėdusio– ištirpusio sidabro potencialo matavimai (Lee ir kiti, 2005).
Elektrinė detekcija. Elektrokatalizinis metodas
(A) Auglio ląstelių linija HMy2 ekspresuoja paviršinį žymenį HLA–DR. (B) Tuo tarpu
sveikų ląstelių linija PC–3 šio molekulinio žymens neturi. Žingsniuose a, a’ ląstelės buvo
pritvirtintos prie elektrodų paviršiaus. b, b’ ląstelės inkubuotos su antikūno/AuNp
konjugatais. c, c’ sudaryta rūgštinė terpė ir d, d’ žingsniuose elektrochemiškai registruota
vandenilio gamyba (De la Escosura-Muniz ir kiti, 2009).
Nanodalelės – DNR žymenys
a) nanodalelės (strėlės) ir DNR fragmentai (trikampiai);
b) nanodalelėmis pažymėta DNR;
c) padidinta b).
Csaki et al., Single Mol., 2002
DNR jutiklis nanodalelių pagrindu
a) DNR gardelė;
b) DNR gardelės AFM vaizdas;
c-e) nuo analitės (aukso nanodalele žymėto DNR fragmento)
koncentracijos priklausomas paviršiaus padengimas
Csaki et al., Single Mol., 2002
Integruotos mikrofluidinės sistemos medicininei
diagnostikai
Detekcijos modulis
Automatinis pavyzdžio paruošimas
Paviršių
modifikacija,
Detektuojamos
analitės
koncentravimas
Reagentai
Skysčių transportas,
paskirstymas
Vakcinos
•
•
•
•
Tradicinės ir naujosios vakcinos.
Vakcinos prieš vėžį.
Rekombinantiniai baltymai vakcinų kūrimui.
DNR vakcinos.
Subvieneto vakcinos
• Rekombinantinė DNR
•Vienintelis genas (subvienetas)
Hepatito B vakcina
S-antigeno mRNR
Mielių raiškos sistemoje
kDNR
Raiškos vektorius
su kDNR
S-antigeno mRNR
baltymas
95
Subvieneto vakcinų problemos
• Rekombinantiniai paviršiaus glikoproteinai mažai tirpūs
• Mažai imunogeninės
• Potransliacinės modifikacijos
•Silpnas CTL atsakas
Nauji metodai
Chemiškai susintetinti peptidai
• maliarija
Mažas imunogeniškumas
96
Virusinės tuščiosios dalelės (VTD)
• 1986 m. pirma VTD pagrindu sukurta ir komerciškai prieinama
vakcina prieš HBV
• Šiuo metu vartotojams prieinamų VTD vakcinų pavyzdžiai:
– GlaxoSmithKline’s Engerix® (hepatito B virusas) ir Cervarix®
(žmonių papilomavirusas),
– Merck and Co., Inc.’s Recombivax HB® (hepatito B virusas)
ir Gardasil® (žmonių papilomavirusas)
97
Savaime susirenkantys ŽPV baltymai
• 1990 m. pastebėta,
kad rL1 in vitro
susirenka į 72 L1
pentamerų daleles.
• L1 VTD gali indukuoti
neutralizuojančius
antikūnus gyvūnuose
ir apsaugoti nuo
infekcijų.
98
Plotkin SA. Clin vaccine immunol 2009; 16: 1709-19
Tetravalentinė ŽPV vakcina
• Skirtingų tipų virusams buvo sukonstruoti rekombinantiniai
mielių kamienai ir panaudoti ląstelių banko kūrimui.
• Skirtingų tipų rL1 baltymai gaminti fermentuojant kamienus
atskirai specialioje mitybinėje terpėje.
• Ląstelės surenkamos ir lizuojamos.
• Nuosėdos pašalinamos, VTD gryninamos.
• VTD adsorbuojamos adjuvantu.
•
• Galutinė tetravalentinė vakcina – sterili suspensija, leidžiama į
raumenis: po 20 μg HPV-6 ir HPV-18 L1 baltymų, po 40 μg HPV11 ir HPV-16 L1 baltymų 0,5 ml dozėje.
99
ŽPV ir žmogaus hepatito B virusų kapsidės
100
Plummer and Manchester. WIREs nanomedicine and nanobiotechnology 2011; 3:174-196.
Bendros VTD charakteristikos
• VTD yra vieno ar kelių baltymų struktūros, mėgdžiojančios
natyvaus viruso organizaciją ir konformaciją, bet neturinčios
viruso genomo. Gaunami saugūs vakcinų kandidatai.
• Pašalinami baltymai, pasižymintys imunosupresiniu poveikiu.
• Nereikia silpninimo ar inaktyvavimo.
• Lyginant su individualiais baltymais ar peptidais VTD išreiškia
konformacinius epitopus panašiau į natyvų virusą; antikūnų
reaktingumas ar imuninės sistemos atsakas žymiai
padidinamas.
Bendros VTD charakteristikos
• Dėl pasikartojančio paviršiaus VTD indukuoja stiprų Bląstelių atsaką.
• Taikant molekulinės biologijos metodus galima gauti kelis
antigenus vienoj VTD platesnio specifiškumo ir
efektyvesnei apsaugai.
• Pakanka mažesnių antigeno dozių ir sumažėja kaina.
Problemos
Dideli epitopai ar baltymai
Skirtingas virusų kapsidžių paviršius (krūvis,
imunogeniškumas, prieinamumas)
102
Vakcinos, kuriamos VTD pagrindu
103
Plummer and Manchester. WIREs nanomedicine and nanobiotechnology 2011; 3:174-196.
Heterologinės antigenų sistemos VTD pagrindu
Multivalentinis heterologinis epitopų išreiškimas
104
Plummer and Manchester. WIREs nanomedicine and nanobiotechnology 2011; 3:174-196.
DNR vakcinos
1796 Jenner: gyvi pritaikyti gyvūnų virusai
1800 Pasteur: susilpninti virusai
1996 DNR vakcinos – trečia vakcinų revoliucija
Antigeną
koduojantis
genas
Plasmidinė DNR
Raumenų ląstelė
Raumenų ląstelėje
pasireiškia antigeną
koduojantis genas
Imuninis atsakas
105
DNR vakcinos
• Dideliais kiekiais lengvai pagaminamos plazmidės
• DNR labai stabili
•DNR nejautri temperatūros ekstremumams (laikymas, transportavimas)
• DNR sekos laboratorijos sąlygomis gali būti lengvai pakeistos.
• Vakcinose naudojant plazmides, koduojančias antigeno sintezę,
antigeninis baltymas pagaminamas tuo pačiu būdu kaip virusas.
•Gaunamas efektyvesnis antigenas.
•Gali būti kuriamos plataus spektro vakcinos: kelių
plazmidžių koduojančių skirtingus to paties ar kelių virusų
baltyminius fragmentus.
• Plazmidės nesireplikuoja ir koduoja tik tikslinius baltymus.
•Prieš patį vektorių nėra imuninio atsako, nėra baltyminių
komponentų.
• Sužadinamas CTL atsakas.
106
DNR vakcinos
Galimos problemos:
• plazmidžių integracija į šeimininko genomą – insercinė mutagenezė.
• autoimuninio atsako indukcija – anti-DNR antikūnai.
• imunologinis toleravimas (antigeno gamyba ląstelėje šeimininkėje
tampa be atsako).
107
Ląstelinės technologijos
• Autologinės ir embrioninės kamieninės ląstelės (išskyrimo
būdai, pagrindinės savybės).
• Indukuotos daugiagalės ląstelės.
• Audinių ir organų rekonstrukcija kamieninėmis ląstelėmis.
• Audinių ir organų inžinerija.
Ląstelių kultūrų panaudojimas
Ligų diagnostikai (genetinių ligų diagnozavimui, imuniteto
vertinimui, navikinio proceso analizei ir kt.),
Virusų auginimui ir paieškai,
Toksinių medžiagų veikimo tyrimui,
Vaistinių medžiagų aktyvumo vertinimui,
Ląstelių transplantavimui,
Audinių/organų konstravimui.
Kamieninės ląstelės
• Kamieninė ląstelė – save atgaminanti, nediferencijuota
ląstelė, galinti duoti pradžią specializuotoms audinių
ląstelėms.
• Kamieninė ląstelė nėra nulemta ir tokia lieka tol, kol gauna
signalą tapti specializuota ląstele;
• Kamieninių ląstelių pajėgumas daugintis kartu su jų savybe
tapti specializuotomis daro šias ląsteles unikaliomis.
Kamieninių ląstelių kilmė:
• Prenatalinės kamieninės ląstelės išskiriamos iš:
– embriono,
– embrioninės karcinomos,
– vaisiaus audinių,
• Suaugusio organizmo organų ir audinių.
Embriono kamieninės ląstelės: gavimas ir panaudojimo
galimybės
Moksliniuose tyrimuose naudojamos embriono
kamieninės ląstelės gaunamos iš mėgintuvėlyje
apvaisintos kiaušialąstės.
Etapas 1
Etapas 2
Etapas 3
Etapas 4
Kiaušinėlis apvaisinamas laboratoriniame indelyje.
Apvaisintas kiaušinėlis pradeda dalintis ir formuojasi
embrionas. Maždaug po 5 dienų susidaro blastocista
– gumulėlis, sudarytas iš maždaug 100 ląstelių.
Viduje esančios ląstelės vadinamos embrioninėmis
kamieninėmis ląstelėmis.
Kamieninės ląstelės surenkamos iš blastocistos ir
auginamos mėgintuvėlyje. Teoriškai jos turi daugintis
neribotai.
Pridedant arba pašalinant kai kurias medžiagas
ląstelės priverčiamos vystytis bet kuria reikalinga
gydymui linkme (širdies, kasos, kaulų čiulpų nervų ir
kt. ląstelėmis).
Embriono kamieninių ląstelių panaudojimas
Fundamentiniams vystymosi biologijos tyrimams –
embriono kamieninių ląstelių paskirties priežasties,
nukreipimo kontrolės ir diferenciacijos analizei.
Vaistinių medžiagų tyrimams – išvestos embrioninių
ląstelių linijos gali būti naudojamos vaistų paieškai ir jų
veikimo mechanizmų tyrimui.
Ląstelių ir audinių transplantavimui - embriono ląstelės
gali būti transplantuotos terapiniais tikslais: Parkinsono
ligos, diabeto, širdies, smegenų ir kitų ligų ar mechaninių
audinių pažeidimų gydymui.
Dirbtiniam apvaisinimui, atskirais atvejais – klonavimui.
Transgeninių organizmų gavimui.
Transgeniniai gyvūnai
Embriono kamieninių ląstelių metodas
• vykdoma kultūroje auginamų kamieninių ląstelių ir paruoštų DNR kontruktų
ekspozicija;
• transformuotos ląstelės atrenkamos ir injekuojamos į vidinę blastocistos
ląstelių masę;
• paruošiama surogatinė motina, blastocista perkeliama į paruoštą gimdą,
tikimasi sveikų palikuonių.
Mikroinjekcijų į probranduolius metodas
• surenkamos šviežiai apvaisintos kiaušialąstės, kol spermatozoido galvutė
netapo probranduoliu;
• į spermatozoido branduolį injekuojama paruošta DNR;
• kai probranduoliai susijungs, sudarydami diploidinę zigotą, laukiama kol ji
mitozės būdu pasidalins į 2 ląsteles;
• toks embrionas perkeliamas į paruoštos surogatinės motinos gimdą;
Indukuotos daugiagalės kamieninės ląstelės (iPSC)
•
•
•
Pirmos indukuotos daugiagalės kamieninės ląstelės iš suaugusios
pelės diferencijuotų odos ląsteliųbuvo gautos veikiant transkripcijos
faktoriais Oct3/4, Sox2, Klf4, and c-Myc.
2007 panaudojant tuos pačius transkripcijos faktorius, iš žmogaus
odos fibroblastų buvo gautos indukuotos daugiagalės žmogaus
kamieninės ląstelės, kurios nesiskyrė (morfologija, proliferacinis
aktyvumas, paviršiaus žymenys, genų raiškos ypatumai,
telomerazės aktyvumas ir kita) nuo žmogaus embrioninių kamieninių
ląstelių
Tokios ląstelės galėjo diferencijuotis į visų trijų gemalinių lapelių
kilmės audinių ląsteles tiek in vitro, tiek ir teratomoje in vivo.
Kai kurių ląstelių reprogramavimo (iPSC gavimo) palyginimas
Ląstelės
Šaltinis
Reprogramavimo
efektyvumas
Reprogramavimo
trukmė
Faktoriai
Odos
fibroblastai
Odos
biopsija
~0.01% (suaugusių
ląstelių)
>21 paros
OSKM, OSK,
OSNL
Keratinocitai Odos
biopsija
~1%
>10 parų
OSKM, OSK
Melanocitai
Odos
biopsija
~0.05%
>10 parų
OSKM, OKM
Virkštelės
kraujo
ląstelės
Virkštelė
~0.01%
>12–15 parų
OSKM,
OSNL, OSK,
OS
Naudoti transkripcijos faktoriai: O - Oct4; S - Sox2;
K - Klf4; M - c-MYC; N - Nanog; L - Lin-28
Indukuotų daugiagalių kamieninių ląstelių
panaudojimas terapijai. Principas.
SF – odos fibroblastai; Kera - keratinocitai; CD34+ - CD34+ ląstelės iš
periferinio kraujo; ASC – adipozės kamieninės ląstelės; CB – virkštelės
kraujo ląstelės; Endo - endoderma; Mezo - mezoderma; Ekto ektoderma.
Pagal: Sun et al. 2010 Cell Cycle 9:5, 880