Antikunu inzinerija - MolBio - Vytauto Didžiojo universitetas

Antikunu inzinerija - MolBio - Vytauto Didžiojo universitetas

VYTAUTO DIDŽIOJO UNIVERSITETAS
GAMTOS MOKSLŲ FAKULTETAS
Jolita Čiapaitė ir Gintautas Saulis
Naujausių mokslinių pasiekimų ir tyrimo metodų
biotechnologijos srityje taikymo medicinoje mokslinė studija
“Biotechnologija medicinoje”
KAUNAS, 2007
ii
TURINYS
I. Antikūnų inžinerija . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1
II. Priešprasminiai (antisensiniai) oligonukleotidai ir ju taikymas medicinoje . . . . . . . . 6
III. Genetinė imunizacija . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13
IV. Kamieninės ląstelės ir jų taikymas medicinoje . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16
V. Organų regeneravimas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22
VI. Vakcinų biotechnologija . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27
VII. Genų terapija . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31
VII.1. Genetinės kilmės ligos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32
VII.2. Genų terapijos pradžia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32
VII.3. Genų terapijos būdai . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33
VII.4. Genų įterpimo į pacientų organizmą metodai . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36
VII.5. Ligos, galinčios būti genų terapijos taikiniais . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43
VIII. Elektroporacijos panaudojimas navikų terapijoje . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46
IX. Genetiškai modifikuotų organizmų ir augalų biotechnologijos panaudojimas
medicinoje . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47
X. PRAKTINIAI DARBAI
Epiteliniu kamieniniu lasteliu identifikavimas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48
Elektrogenoterapija . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 56
XI. LITERATŪRA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59
ANTIKŪNŲ INŽINERIJA
Pagrindinių sąvokų apibrėžimai
Bakteriofagas – bakterijas infekuojantis virusas. Bakteriofagas λ yra nuosaikusis fagas, kuris
patekęs į bakteriją-šeimininką gali pasirinkti lizuojantį arba lizogeninį vystymosi kelią.
Bakteriofagui λ lizavus bakterijas, lėkštelėje, padengtoje augančiomis bakterijomis, toje vietoje
formuojasi skaidri dėmė. Infekcija filamentiniu fagu (pvz. M13) nėra letali, bakterijos nėra
lizuojamos. Tačiau infekuotų bakterijų augimo greitis sulėtėja, ir lėkštelėje, padengtoje augančiomis
bakterijomis formuojasi neskaidrios (drumstos) dėmės.
Domenas – baltymo struktūrinis vienetas.
Fab – monovalentinis antigeną prijungiantis antikūno fragmentas, kuris yra sudarytas iš vienos
lengvosios ir dalies sunkiosios grandinės (kintamos srities ir pirmo nekintamos srities domeno).
Tokie fragmentai susidaro antikūno molekulę paveikus proteolitiniu fermentu papainu arba
genetinių modifikacijų pagalba.
Fc – sąveikoje su antigenu nedalyvaujantis antikūno molekulės fragmentas, sudarytas iš abiejų
sunkiųjų grandinių karboksi galinių sekų. Tokie fragmentai susidaro antikūno molekules paveikus
papainu. Visa IgG antikūno molekulė yra sudaryta iš dviejų Fab ir vieno Fc fragmento.
Fv – monovalentinis antigeną prijungiantis antikūno fragmentas, sudarytas iš lengvosios ir
sunkiosios grandinių kintamų sričių.
Monokloniniai antikūnai – homogeniškų antikūnų populiacija, turinčių tą patį antigeninį
specifiškumą, ir kilusių iš vieno antikūnus gaminančių ląstelių klono.
Įvadas
Antikūno molekulė yra esminis imuninio atsako komponetas, nes jos geba: (i) atpažinti platų ratą
skirtingų šeimininko organizmui svetimų medžiagų bei (ii) sąveikauti bei aktyvinti šeimininko
organizmo efektorines sistemas. Antikūnų molekulinės struktūros ir jų vaidmens imuninio atsako
mechanizmuose išaiškinimas davė pradžią plačiam šių molekulių panaudojimui medicinos ir
mokslo problemoms spręsti. Medicinoje specifiniai antikūnai naudojimi: (i) ligų diagnostikai (pvz.
Laimo ligos, autoimuninių ir virusinių ligų diagnostikai); (ii) ligų gydymui (pvz. reumatoidinio
artrito, išsėtinės sklerozės, psoriazės (žvynelinės ligos), įvairių vėžio formų: ne Hodžkino limfomos,
storosios žarnos, galvos ir kaklo, krūties vėžio); (iii) vaisiaus (prenatalinei) terapijai (pvz. siekiant
išvengti motinos imuninės sistemos sensitizacijos, kai nesutampa motinos ir vaisiaus rezus
faktorius). Išgryninti specifiniai antikūnai taip pat plačiai taikomi mokslo tikslams: (i) viduląstelinių
ir ekstraląstelinių baltymų identifikavimui, lokalizavimui ir ekspresijos lygio įvertinimui
(imunohistochemija arba imunofluorescencija); (ii) ląstelių rūšiavimui pagal tai, kokius baltymus
jos ekspresuoja (tėkmės citometrija); (iii) baltymų atskyrimui (imunoprecipitacija) ir
identifikavimui po elektroforetinio išskyrstymo (Western’o blotas).
Antikūnų struktūra ir antikūnų inžinerija
Antikūnai yra sudaryti iš dviejų lengvūjų ir dviejų sunkiūjų polipeptidinių grandinių sujungtų
disulfidiniais tilteliais (Pav. 1). Sunkioji grandinė nulemia antikūno biologines savybes.
Žinduoliuose aptinkamos kelios antikūnų klasės (izotipai) su skirtingomis sunkiosiomis
grandinėmis. Sunkiosios ir lengvosios grandinės susilanksto į funkcinius domenus: lengvosios
grandinės į du, sunkiosios – į tris arba keturis (priklausomai nuo izotipo). Kiekvienos grandinės Ngalinis domenas suformuoja kintamas sritis, prie kurių jungiasi antigenas. Kiti domenai dalyvauja
šeimininko efektorinių mechanizmų aktyvacijoje. Domeninė antikūnų struktūra yra palanki baltymų
inžinerijai, nes tai supaprastina funkcinių domenų, atsakingų už antigeno prijungimą (Fab arba Fv
domenai) arba efektorinių domenų (Fc), mainus tarp skirtingų antikūnų molekulių. Domeninė
struktūra taip pat įgalina pagaminti antikūnus gebančius atpažinti specifinius antigenus bei
antikūnus sujungtus su įvairiom molekulėm, pvz. toksinais, limfokinais, augimo faktoriais. Tyrimai
parodė, kad antikūnų molekulės nepaprastai lengvai pasiduoda tokio pobūdžio modifikacijoms.
1
scFv
VL
Lengvoji (L) grandinė
Sunkioji (H) grandinė
CL
VH
s
s
A
CH1
CH2
CH3
CH2
CH3
s-s
s-s
Fv
CH1
VH
s
A
Fc
s
CL
VL
Fab
s
s
Fab
Pav. 1 Antikūno molekulės schema. Atskiri molekulės domenai pavaizduoti elipsėmis. Sunkiosios
grandinės nekintamos srities domenai, kurie lemia antikūno izotipą, yra pažymėti CH1, CH2, CH3, o
lengvosios grandinės nekintamos srities domenai yra pažymėti CL. Angliavandeniai (A) ant
sunkiosios grandinės CH2 domeno yra pavaizduoti juodu apskritimu. Kintamos antikūno srities
domenai, kurie dalyvauja antikūno atpažinime ir prijungime, yra pažymėti VH ir VL. funkciniai
antikūno fragmentai yra pavaizduoti ir intaktinėje antikūno molekulėje ir kaip atskiri fragmentai,
kokie jie būtų susintetinami bakterijose. Paveiksle taip pat pavaizduotos disulfidinės jungtys (s-s),
svarbios antikūno molekulės erdvinei struktūrai palaikyti.
Ekspresijos sistemos antikūnų gamybai
Šiuo metu antikūnų gamybai yra naudojamos kelios ekspresijos sistemos, kurios turi savų
privalumų it trūkumų: bakterijos, mielės, augalai, bakulovirusai ir žinduolių ląstelės.
Žinduolių ląstelių kultūros yra puiki sistema pilnai užbaigtų antikūnų molekulių gamybai, kadangi
jose vyksta: (i) teisingas molekulių brendimas, (ii) reikiamos po-transliacinės modifikacijos; (iii)
antikūnų sekrecija iš ląstelės. Bakterijos yra daugiausiai naudojamos gaminant antikūnų molekulių
fragmentus, kadangi pilnai užbaigtų antikūnų molekulių sintezė jose neįmanoma dėl to, kad
molekulės nėra glikozilinamos, nesusiformuoja disulfidiniai tilteliai ir todėl nevyksta pilnas
antikūno molekulės surinkimas. Ekspresuojant antikūnus E. coli citoplazmoje, susidaro netirpūs ir
neaktyvūs baltymų agregatai (intarpiniai kūneliai, angl., inclusion bodies), kuriuos norint paversti
funkciškai aktyviais antikūnais reikia atlikti papildomas baltymų perlankstymo ir renatūracijos
procedūras. Tuo tarpu daug sėkmingiau E. coli galima ekspresuoti antikūnų molekulių fragmentus
su ekstraląstelio transporto signalinėm sekomis, ko pasėkoje molekulių fragmentai yra sekretuojami
į terpę.
Nesenai tapo įmanoma užauginti peles, kurių organizme gaminasi tam tikram antigenui specifiniai
žmogaus antikūnai. Tai buvo pasiekta įjungiant lengvos ir sunkios žmogaus antikūno grandinės
lokuso sekas į pelės, kurios nuosavos lengvos ir sunkios grandinių sintezė yra sustabdyta, genomą.
Tokios pelės organizme gali gamintis antikūnai specifiški plačiam ratui antigenų, įskaitant žmogaus
antigenus. Taip pat tokios pelės gali būti panaudotos hibridomų, sintetinačių žmogaus antikūnus,
gamybai. Šiuo metu tokios pelės gali gaminti tik kai kuriuos žmogaus antikūnų izotipus, tačiau
tolesnių genetinių modifikacijų vykdymas be abejo padidins tokių pelių panaudojimo potencialą.
In vitro bibliotekos antikūnų idedentifikavimui
Antikūnų su norimu antigeniniu specifiškumu gamybai taip pat buvo išvystyti metodai pagrįsti
imunoglobulinų genų ekspresija bakteriofaguose. Tam kaip ekspresijos sistemos paprastai
2
naudojamas bakteriofagas λ ir filamentiniai fagai. Bakteriofaginės ekspresijos sistemos gali būti
sukonstruotos taip, kad galėtų susidaryti atsitiktinės sunkiosios ir lengvosios grandinių sekų
kombinacijos. Toliau yra nustatoma susidariusių kombinacijų gebėjimas juntis prie reikiamo
antigeno.
Bakteriofagas λ yra patogi ekspresijos sistema, nes: (i) galima pakeisti gana didelę jo genomo dalį
sveitima DNR, (ii) yra paprasta nustatyti baltymo ekspresiją vieno bakteriofago formuojamos
kolonijos lygmenyje. Bibliotekos sudarytos iš ~106 klonų gali būti efektyviai patikrintos ir yra
tinkamos specifinių antikūnų išskyrimui iš imunizuoto šeimininko. Tačiau tikrinimo procedūros
metu yra identifikuojami antikūnai tik turintys aukštą specifiškumą antigenui, todėl yra sunku
išskirti specifinius antikūnus iš imunizuotų donorų, jeigu didžioji dalis susidarančių antikūnų yra
mažo specifiškumo.
Norint gauti didesnes bibliotekas nesenai buvo sukurti metodai leidžiantys ekspresuoti Fv ir Fab
fragmentus filamentinių bakteriofagų (f1, M13 ir fd) paviršiuje. Priklausomai nuo to, koks fago
baltymas yra naudojamas suliejimui su antikūno fragmentu, yra įmanoma ekspresuoti vieną arba
keletą dominančio antikūno melekulių kopijų. Galimybė ekspresuoti keletą kopijų palengvina mažo
giminingumo antikūnų identifikavimą ir išskyrimą. Toks sukonstruotas fagas specifiškai jungiasi su
antigenu ir gali būti išskirtas iš fagų, ekspresuojančių skirtingo specifiškumo antikūnų molekules,
mišinio naudojant afininę chromatografiją. Yra įmanoma išskirti specifinį fagą, net jei toks fagas
pradinėje fagų bibliotekoje buvo tik 1 iš 106. Tam yra atliekama keletas ‘koncentravimo’ ciklų,
sudarytų iš prijungimo prie imobilizuoto antigeno ir prisijungusių fagų dauginimo. Taigi,
filamentiniai fagai yra ypač tinkama ekspresijos sistema jeigu norima patikrinti didelį kiekį klonų
arba norint išskirti fagus ekspresuojančius reto specifiškumo antikūnų molekules.
Sekos, lemiančios antigeninį specifiškumą, gali būti ekslpresuojamos Fab fragmentų arba vienos
grandinės sulietų fragmentų (scFv) forma. Fab fragmentų ekspresija yra pranšesnė, nes galima
nepriklausomai sukonstruoti lengvųjų ir sunkiųjų grandinių bibliotekas ir jas perrūšiuoti, kas savo
ruožtu leidžia sukonstruoti kombinatorines bibliotekas. Įvedus beprasmę (angl. amber) mutaciją
tarp antikūno grandinės ir viruso dengiamojo (angl. coating) baltymo sekos, panaudojus supresinių
bakterijų štamą yra įmanoma ekspresuoti antikūno molekulę fago paviršiuje, arba, panaudojus
nesupresinių bakterijų štamus gaminti tirpius antikūnų molekulių fragmentus. Taip pat fagus galima
panaudoti antikūnų mutavimui ir atrinkimui in vitro, tokiu būdu gaunant antikūnus su geresnėmis
antigeno prijungimo savybėmis.
Antikūnų gamyba in vitro
Kaip minėta, vienas iš metodų gaminant specifinius antikūnus yra panadojant imunizuotus donorus.
Nesenai tapo įmanoma gaminti specifinius antikūnus in vitro naudojant imunizuotų donorų
periferinio kraujo limfocitų kultūras. Tam donoras yra imunizuojamas norimu antigenu, surenkama
donoro periferinio kraujo, iš kurio išskiriami limfocitai, kurie yra palaikomi grynoje kultūroje in
vitro, kur jie sintetina ir sekretuoja į kultivavimo terpę reikiamus antikūnus.
Didelių kiekių reikiamo specifiškumo monokloninių antikūnų gamybai buvo sukurta tokių antikūnų
gamybos hibridomų ląstelių linijose tecnologija. Norint pagaminti monokloninius antikūnus,
specifinius tam tikram antigenui, donoras yra imunizuojamas tuo antigenu, ir iš donoro blužnies yra
izoliuojamos B ląstelės. Tada B ląstelės yra suliejamos su mielomos ląstelėm (t.y. vėžinėm B
ląstelės), kurios gali augti kultūroje neribotą laiką (t.y. yra nemirtingos). Dviejų ląstelių tipų
suliejimas yra atliekamas paveikus ląstelių membranas jų laidumą didinančia medžiaga (pvz.
polietilenglikoliu). Sulietos hibridinės ląstelės (hibridomos) yra vėžinės ląstelės, todėl dauginasi
greitai ir neribotą laiką, ir tuo pačiu dideliais kiekiais gamina reikiamus antikūnus. Naujai
susidariusios hibridomos ląstelės yra atrenkamos jas auginant selekcinėje terpėje ir po
identifikavimo yra klonuojamos naudojant ribinio atskiedimo metodą (t.y. ląstelių suspensija yra
atkiedžiama tiek, kad tam tikrame tūrio vienete yra 1 ląstelė). Išaugus naujiems hibridomos klonams
(t.y. ląstelių grupėms susidariusioms dalinantis vienai motininei ląstelei), naudojant
imunofermentinį ELISA metodą (angl. Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) yra patikrinama, ar
šie klonai tikrai gamina reikiamą antikūną.
3
Chimeriniai antikūnai
Nors klinikiai tyrimai su pelės monokloniniais antikūnais teikia vilčių, tačiau jų panaudojimas turi
keletą trūkumų: (i) pelės antikūnai yra greitai pašalinami iš žmogaus cirkuliacijos, (ii) jie
nesąveikauja su žmogaus imuninės sistemos efektoriais, (iii) daugeliu atvejų jie sukelia imuninį
atsaką į pelės baltymus (angl. human antimouse response, HAMA). Norint išspręsti šias problemas
buvo sukurti chimeriniai antikūnai sudaryti iš pelės antikūno kintamos srities domenų (Fv) ir
žmogaus antikūno nekintamos efektorinės srities domenų (Fc). Tokie sukonstruoti antikūnai išlaiko
specifiškumą reikiamam antigenui ir sukelia mažesnį HAMA atasaką.
Priklausomai nuo panaudojimo tikslo, antikūnai turi skirtingas biologines savybes. Pavyzdžiui,
pageidautinos savybės idealiam antikūnui, skirtam ligos diagnostikai, yra specifiškumas tam tikram
antigenui, greitas pašalinimas iš cirkuliacijos, radioaktyvios žymės buvimas. Tuo tarpu antikūnas,
skirtas ligos gydymui, gali būti sukonstruotas taip, kad dalyvautų imuniniame atsake tik tam tikroje
organizmo vietoje. Chimerinių antikūnų technologija leidžia pagaminti ir palyginti skirtingos
struktūros bei specifinės problemos sprendimui tinkamus antikūnus.
Genų inžinerija labai pravertė išskiriant ir apibūdinant imunoglobulinus iš gyvūnų rūšių, kurioms
dar nesukurtos mielomos ląstelių linijos. Pvz., buvo sukonstruoti antikūnai sudaryti iš pelės kintamų
sričių (Fv) ir triušio nekintamų efektorinių sričių (Fc). Genų inžinerija taip pat gali būti panaudota,
kai reikia pagaminti retų imunoglobulinų izotipus (pvz. IgD).
Žmogaus antikūnai su įterptomis pelės antikūnų sekomis
Chimeriniuose antikūnuose paprastai panaudojama visa pelės antikūno kintama sritis (Fv).
Domeninė antikūno struktūra leidžia pagaminti palyginamo su pelės specifiškumo Fv sritis
sudarytas iš žmogaus antikūno molekulių sekų. Antikūno dalis, kuri sąveikauja su antigenu yra
sudaryta iš 6 komplementarumą nulemiančių sričių (angl. complementarity-determining regions,
CDRs) esančių sunkiosios ir lengvosios grandinės kintamose srityse (VL ir VH). Kiekvienas
antikūno domenas yra sudarytas iš 7 antiparalelių β klosčių, sujungtų kilpomis, ir suformuojančių β
cilindrą. Tarp β klostes jungiančių kilpų ir yra CDR sritys. Techniškai yra įmanoma CDR sritis
(taigi ir jų nulemtą specifiškumą antigenui) perkelti iš vieno β cilindro į kitą. Tačiau paprastai
nepakanka tiesiog įjungti pelės CDR sritis į žmogaus antikūno molekulių karkasą. Paprastai pelės
antikūno molekulėje yra amino rūgštys, kurių sąveika su CDR sritimis yra labai svarbi normaliai
antikūno funcijai užtikrinti. Tokios amino rūgštys kartu su CDR sritimis turi būti perkeliamos į
žmogaus antikūno molekulių karkasą. Jei patikrinus yra nustatoma, kad tokio sukonstruoto antikūno
biologinis aktyvumas yra sumažėjęs arba visai išnykęs, perkeliama dagiau su CDR sritimis
sąveikaujančių amino rūgščių, kol atstatomas maksimalus antikūno aktyvumas. Pagrindinis akstinas
tokių hibridinių antikūnų gamybai yra antikūnų, pasižyminčių minimaliom imunogeninėm
savybėm, ir todėl galinčių efektyviau atlikti terapinę funkciją, poreikis.
Tačiau kadangi CDR sritys yra susijusios su antikūno molekulės idiotipu (t.y. konkrečios
imunoglobulino molekulės kintamai daliai būdingų epitopų (idiotopų) visuma), tokie ‘sužmoginti’
pelės antikūnai gali sukelti anti-idiotipinį atsaką.
Sulieti baltymai
Taip pat yra gaminamos sulietos tam tikro baltymo ir antikūno molekulės. Tai gali būti atliekama
keliais būdais. Antikūno kintamos sritys gali būti suliejamos su ne-antikūno baltymais ir tokia
molekulė turės antikūnui būdingą prisijungimo specifiškumą. Priklausomai nuo to, kuri antikūno
molekulės dalis bus pakeista, nauja molekulė išsaugos skirtingas antikūnui būdingas biologines
funkcijas. Pvz., trombolitinis baltymas, kuris susidaro suliejus audinio tipo plazminogeno
aktyvatoriaus katalitinę β grandinę (t-PA) su anti-fibrino antikūnu, pasižymi didesniu specifiškumu
ir stipresniu poveikiu, nei vienas t-PA. Taip pat molekulių, kurios pačios nėra imunoglobulinai
(pvz. CD4, interleukinas 2, auglio nekrozės faktoriaus receptorius), dalys gali būti pakeistos
kintamom antikūno molekulės sritim. Tokios molekulės buvo pavadintos ‘imunoadhezinais’,
kadangi jos yra sudarytos iš adhezinės molekulės prijungtos prie imunoglobulino efektorinės Fc
4
srities. Sulieta molekulė įgauna antikūnui būdingų savybių (pvz. gebėjimą aktyvinti šeimininko
efektorines sistemas) bei pasižymi geresnėm farmakokinetinėm savybėm.
Antikūnų fragmentai
Fab, Fv, ir vienos grandinės Fv (scFv) fragmentai su VH ir VL sritimis, prijungtomis polipeptidine
jungtimi, pasižymi intaktiniam monokloniniam antikūnui būdingu specifiškumu ir afiniškumu
(giminingumu) antigenui. scFv sulieti baltymai gali būti pagaminti prijungus prie amino arba
karboksi galo ne-antikūno molekulę. Tokiose molekulėse Fv sritis yra tam, kad užtikrintų prijungtos
molekulės pristatymą iki ląstelės, ekspresuojančios tam tikrą antigeną. Taip pat gali būti
sukonstruoti bifunkciniai antikūnai, kuriuose vienoje antikūno molekulėje yra įterptos sekos
nulemiančios specifiškumą dviem antigenams.
Kataliziniai antikūnai
Katalitinių antikūnų sukūrimas išplėtė klasikinį baltymų struktūros ir funkcijos supratimą. Ir
fermentai ir antikūnai pasižymi prijungimo specifiškumu (substratui arba antigenui, atitinkamai).
Nepaisant to, jų veikimo mechanizmas iš esmės skiriasi: fermentai destabilizuoja substratą,
sukeldami jo perėjimą į pereinamą būseną, tuo tarpu antikūnai suriša medžiagą ramybės būsenoje.
Teoriškai, antikūnas specifiškas pereinamąjai būsenai, turėtų greitinti reikciją. Tokie kataliziniai
antikūnai vadinami abzimais arba haptenais.
Kai kuriais atvejais abzimų katalizuojami reakcijos greičiai net 107 kartų didesni už
nekatalizuojamos reakcijos greitį. Šiuo metu pasisekė gauti abzimus, katalizuojančius keletą
reakcijų tipų – β-eliminaciją, oksidacijos-redukcijos reakcijas, Diels-Alder ciklų suliejimą, tritilą
apsaugančių grupių skilimą, stereoselektyvią alkilo esterių hidrolizę. Pagrindinis metodinis
sunkumas, kuriant savitus tam tikriems junginiams abzimus buvo tai, jog jų atrankai reikia naudoti
tam tikrų gyvūnų imuninę sistemą. Pastaruoju metu klonuoti atsitiktiniu būdu persitvarkę Fab
fragmentai, ir tai leido sukurti atrankos in vitro mišinius net tokiems junginiams, kurie in vivo
pasižymi stipriu toksiniu poveikiu. Kataliziniai antikūnai parankūs organinei sintezei, nes jie
stereosaviti.
Dauguma iki šiol aprašytų katalizinių antikūnų buvo pagaminti naudojant standartinę hibridumų
technologiją. Norint išplėsti katalizinių antikūnų ratą yra bandoma juos gaminti naudojant
bakteriofagą λ kaip ekspresijos sistemą. Pastarojo privalumas yra tas, kad katalizinių antikūnų
gamyba ir tikrinimas atliekama daug greičiau ir su daugiau kandidatų, negu įmanoma naudojant
hibridomas. Kaip anksčiau minėta, bakteriofago λ bibliotekų trūkumas yra tai, kad tikrinimo
sistemos gali identifikuoti tik tuos antikūnus, kurie stipriai riša antigeną. Tokie antikūnai nebūtų
geri katalizei atlikti, šiuo atveju silpnas surišimas yra privalumas. Galbūt filamentiniai fagai
pasirodys esantys geresnė ekspresijos sistema katalizinių antikūnų gamybai, bet tai paaiškės tik po
nuodugnių tyrimų.
Literatūra
1. Molecular Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference. (1995) Robert A.
Meyers (Editor), Wiley-VCH, ISBN: 978-0-471-18571-0
2. Graumann K, Premstaller A. (2006) Manufacturing of recombinant therapeutic proteins in
microbial systems. Biotechnol J. 1:164-186.
3. Presta LG. (2006) Engineering of therapeutic antibodies to minimize immunogenicity and
optimize function. Adv Drug Deliv Rev. 58:640-656.
4. Woycechowsky KJ, Vamvaca K, Hilvert D. (2007) Novel enzymes through design and
evolution. Adv Enzymol Relat Areas Mol Biol. 75:241-294.
5
PRIEŠPRASMINIAI (ANTISENSINIAI) OLIGONUKLEOTIDAI IR JŲ TAIKYMAS
MEDICINOJE
Pagrindinių sąvokų apibrėžimai
Priešprasminis (antisensinis) oligonukleotidas – sintetinė vienvijė nukleino rūgštis, sudaryta iš 1225 mononukleotidų, kuri komplementariai jungiasi su tam tikromis komplementariomis
(‘prasminėmis’) informacinės RNR sritimis ir slopina baltymo, koduojamo tos iRNR, sintezę.
Priešprasminis (antisensinis) oligonukleotido analogas – junginys, kurio cheminė sudėtis, lyginant
su gamtoje aptinkamais oligodeoksiribonukleotidais, buvo modifikuota taip, kad pagerėtų biofizinės
ir biologinės savybės.
Prisijungimo giminingumas – stiprumo, kuriuo oligonukleotidas prisijungia prie nukleino rūgštiestaikinio, matas. Paprastai jis nurodomas kaip eksperimentiškai nustatyta lydymosi temperatūra Tm,
t.y. temperatūra, esant kuriai 50 % dvivijų grandinių disocijuoja į vienvijas grandines.
Oligonukleotidų transportas į ląstelę – nuo laiko priklausomas procesas, kurio metu
oligonukleotidai patenka į ląsteles, auginamas ląstelių arba audinių kultūroje.
Nukleazinis stabilumas – oligonukleotido atsparumas įvairiems nukleino rūgštis ardantiems
fermentams, esantiems serume ir ląstelių viduje.
RNazė H – ląstelėje dažnai sutinkamas fermentas, kuris atpažįsta hetero dupleksą tarp DNR ir
RNR, ir perkerpa duplekso RNR grandinę.
Įvadas
Pastaraisiais metais buvo sukurta nauja klasė junginių, kurie pasižymi gebėjimu jungtis prie tam
tikrų nukleino rūgščių sekų. Šie junginiai yra vadinami priešprasminiais (antisensiniais)
oligonukleotidais. Jie yra nepaprastai įdomūs dėl to, kad prisijungdami prie savo taikinio, jie slopina
tos nukleino rūgšties sekos koduojamo geno raišką, todėl yra potencialiai naudingi genetinių ligų
gydymui. Lyginant su ląstelėje aptinkamais oligonukleotidais, sintetinių priešprasminių
oligonukleotidų cheminė struktūra yra pakeičiama taip, kad jie išliktų stabilūs in vivo sąlygomis, bei
gebėtų patekti į ląstelės vidų, kur jie atlieka savo vaidmenį. Šioje paskaitoje jūs suspiažinsite su
priešprasminių oligonukleotidų funkcijosmis, priešprasminių (antisensinių) oligonukleotidų analogų
struktūra, veikimo mechanizmu, įvairiomis strategijomis kaip sustiprinti jų biologinį poveikį, bei
sėkmingų priešprasminių oligonukleotidų pritaikymų in vitro ir in vivo pavyzdžiais.
Priešprasminių oligonukleotidų kūrimo principai
Racionalus vaistų kūrimas yra pirminis farmacijos pramonės tikslas. Nors dauguma šiuo metu
vartojamų vaistų veikia tiesiogiai slopindami fermentų ar kitų baltymų veikimą, tačiau tik keliems
yra žinomas tikslus veikimo mechanizmas. Lyginant su terapine intervencija baltymų lygyje,
intervencija DNR ar informacinės RNR (iRNR) lygyje būtų daug efektyvesnė, nes aktyvios
transkripcijos metu kiekvienas genas yra transkribuojamas į 102-104 kopijų iRNR molekulių, kurios
savo ruožtu transliuojamos į 104-106 kopijų baltymų molekulių.
Molekulės, inhibuojančios transkripciją arba transliaciją, gali būti sukurtos naudojantis labai
racionaliais principais. 1978m. P.C. Zamecnik ir M.L. Stephenson pirmieji pasiūlė panaudoti
oligonukleotidus, nukreiptus prieš komplementarias virusinių nukleino rūgščių sekas, viruso
replikacijos slopinimui. Nuo to laiko buvo atlikta nemažai tyrimų tobulinant šią terapijos priemonę.
Priešprasminiai oligunukleotidai yra sintetiniai oligonukleotidai, kurie pagal Watson-Crick bazių
poravimo principą jungiasi prie tam tikrų komplementarių iRNR sekų, ir tuo būdu inhibuoja
baltymo biosintezę. Tuo tarpu DNR transkripciją slopina trigubą grandinę formuojantys
oligonukleotidai, kurie pagal Hoogsteen bazių poravimo principą jungiasi su didžiojo griovelio
dvigrande DNR (Pav. 1).
Dėl bendrų bazių poravimo taisyklių oligonukleotidiniai antagonistai gali būti universalia priemone
daugelio ligų, sukeltų virusų, onkogenų, imunomoduliatorių, receptorių ar jonų kanalų, gydymui.
Tam, remiantis žinoma nukleino rūgšties-taikinio seka, yra susintetinamas tam tikrai jos daliai
komplementarus oligonukleotidas. Oligonukleotido specifiškumą nulemia taikinio sekos paplitimas
1
visoje nukleino rūgšties molekulės sekoje. Buvo paskaičiuota, kad oligonukleotidinė seka, sudaryta
iš 17 monomerų, pasitaiko tik 1 kartą visame žmogaus genome (4 × 109 bazių porų). Šis
pastebėjimas, kuris taip pat buvo patvirtintas naudojant in vitro hibridizacijos tyrimus, rodo, kad
oligonukleotidinių antagonistų poveikis turėtų būti labai specifinis. Taip pat reikia paminėti, kad
priešparsminis (antisensinis) principas veikia ir gamtoje (priešprasminės RNR reguliuoja genų
raišką).
T
R
C+
CH3
H
H
R
CH3
N
O
H
H
O
N
H
O
N
N
O
N
H
N
R
R
R
Hogsteen
N
R
Watson-Crick
O
H
N
N
A
N
O
N
O
Hogsteen
C
H
H
N
H
N
+
N
T
N
N
N
N
H
N
N
G
H
Watson-Crick
Pav. 1 Bazių tripletai TAT ir C+GC. Dvivijės grandinės formuojasi remiantis bendru Watson-Crick
bazių poravimo principu. Trivijės grandinės susidaro, kai pagal Hogsteen bazių poravimo principą
trečios grandinės bazės sudaro vandenilines jungtis su dvivijės grandinės didžiąjame griovelyje
esančiomis purino bazėmis. Dėl šios priežasties trivijės DNR grandinės formuojasi tik tose DNR
srityse, kuriose yra daug purino bazių.
Priešprasminių oligonukleotidų struktūra ir savybės
Priešprasminiai ir trigubą grandinę formuojantys oligonukleotidai gali būti panaudojami
mechanistiniams molekulinės biologijos tyrimams arba kaip genų raišką slopinantys medicininiai
preparatai. Tačiau šių junginių taikymas gydymo tikslams vis dar yra ankstyvoje stadijoje. Norint
paspartinti oligonukleotidų analogų praktinį taikymą turi būti sukurti oligonukleotidai turintys
tokias savybes:
1. Tam, kad pasireikštų genų raišką slopinantis poveikis, jie turi būti pakankamai stabilūs
serume ir ląstelės viduje.
2. Tam, kad pasiektų savo veikimo vietą, jie turi pereiti per ląstelės membranas, bei patekti į
įvairius kūno organus.
3. Būtina, kad fiziologinėm sąlygom jie suformuotų stabilius Watson-Crick ir Hoogsteen
junginius su komplementariomis taikinių sekomis.
4. Būtina, kad sintetinio oligonukleotido sąveika su taikinio seka būtų labai specifinė.
Oligonukleotidų ir jų analogų struktūra. Tam, kad būtų patenkintos keturios aukščiau paminėtos
sąlygos buvo atlikta daugybė ‘natūralių’ (gamtoje aptinkamų) oligonukleotidų cheminių
modifikacijų: (i) fosfodiesterio karkaso modifikacijos ir pakeitimas, (ii) bazių modifikacijos, (iii)
angliavandenių modifikacijos, (iv) konjugatų formavimas įvairiose oligonukleotido vietose.
Daugiausiai naudojamos ir geriausiai ištirtos yra fosfato karkaso modifikacijos, ypač panaudojant
fosforotioatus, fosforoamidatus, metilfosfonatus, bei 3’ galo modifikacijos pašalinant arba
blokuojant hidroksilo grupę (Pav. 2). Nesenai buvo aprašyti ‘defosfo’ oligonukleotidai, kuriouse
fosfodiesterio grupė yra pilnai pakeista, pvz. formacetaliai, tioformacetaliai, metilhidroksilaminai ir
kiti (Pav. 2-3). Dar drastiškesnių modifikacijų pavyzdžiai yra ‘peptidinių nukleino rūgščių’ arba
‘morfolino nukleozidų’ oligomerai (Pav. 3), kuriuose nukleino rūgšties karkasas, sudarytas iš
fosfato ir angliavandenio liekanų, yra pakeistas atitinkamai peptidine grandine arba karbamatu
sujungtų morfolinų grandine. Tačiau nors kai kurie iš šių ‘defosfo’ oligonukleotidų pasižymi labai
geromis hibridizacinėmis savybėmis ir nukleaziniu stabilumu, vis dar labai mažai yra žinoma apie
jų gebėjimą patekti į ląstelę ir biologinį aktyvumą.
2
cholesterolis
vitaminas E
psoralenas
5'-konjugatas
B
O
O
2,6-diamino purinas
5-metilcitozinas
O
-
B
O P O
O
O
O
-
S
O
P O
H3C
O
P
O
O
-
O
metilfosfonatas
fosforo tioatas
O
R
N P O
R
O
B
O P O
O
O
α -D-deoksiribozë
β -L-deoksiribozë
2'-O-metilribozë
O
H
C
O
O
3'-konjugatas
H
poli-L-lizinas
akridinas
formacetalis
fosforamidatas
Pav. 2 Oligonukleotidų modifikacijos
O
X
B
O
O
CH2
CH
CH2
CH2
O
X
Y
z
O
B
Y
CH2
CH2
N
CH3
N
N
CH3
SO2
Si(CH3)2
Z
Junginys
O
S
O
O
N
CH2
O
Formacetalis
Tioformacetalis
Metilhidroksilaminas
Oksimas
Metilenedimetilhidrazas
Dimetilenesulfonas
CH3
Sililas
O
B
O
O
B
N
O
O
N
NH
B
O
N
O
O
B
O
NH
N
Peptidinės nukleino rūgštys
Morfolino nukleozidų oligomerai
Pav. 3 “Defosfo” oligonukleotidų pavyzdžiai.
3
Oligonukleotidų atsparumas nukleazių poveikiui. Dėl 3’-ekzonukleazių poveikio nemodifikuoti
oligonukleotidai su įprastu fosfodiesterio karkasu serume yra suskaidomi per kelias valandas.
Oligonukleotido 3’ galo modifikacijos, kurių metu yra pašalinama arba blokuojama hidroksilo
grupė arba kelių 3’ galinių internukleozidinių fosfatinių jungčių modifikacija paprastai labai
padiddina oligonukleotido atsparumą 3’-ekzonukleazių poveikiui. Be to, kai kuriuose audiniuose
stebimas gana aukštas 5’ ekzonukleolitinis aktyvumas. Dėl šios priežasties gana dažnai pasitaikanti
modifikacija yra 2-5 fosfato liekanų, esančių 3’ ir 5’ oligonukleotido galuose, pakeitimas
fosforotioato arba metilfosfonato liekanomis. Tokie pakeitimai paprastai bent 10 kartų padidina
oligonukleotido nukleazinį satbilumą ir tuo pačiu yra išlaikomas oligonukleotido sekos
specifiškumas. Tačiau in vivo sąlygom tokie modifikuoti oligonukleotidai nėra visiškai stabilūs, nes
jie vis dar gali būti skaidomi endonukleozėmis. Tačiau viso oligonukleotido karkaso modifikacija
gali stipriai pakeisti ir kitas oligonukleotido savybes, pvz. lipofiliškumą, tirpumą arba prisijungimo
prie komplementarių sekų giminingumą. Oligonukleotidų skaidymas biologinėse sistemose gali būti
sulėtintas įvedant daugelį kitų pakeitimų, pvz. angliavandenių modifikacijas (α-deoksiribozė, 2’modifikuota ribozė) arba kai kurių bazių modifikacijas. Be to, oligonukleotidus galima apsaugoti
nuo nukleazių poveikio supakuojant juos į liposomas arba nano daleles, kurios taip pat yra patogūs
nešikliai in vivo.
Oligonukleotidų transportas į ląstelę. Panašiai kaip ir su nukleaziniu stabilumu, oligonukleotidų
transportas ir pasiskirstymas ląstelėje didžiąja dalimi priklauso nuo cheminių modifikacijų.
Nemodifikuoti oligonukleotidai paprastai būna sudaryti iš 12-25 nukleotidų ir yra labai hidrofiliški
anijoniniai junginiai. Nepaisant to, jie lengvai patenka į gyvą ląstelę endocitozės būdu, kuri
greičiausiai vyksta tarpininkaujant receptoriams. Tačiau laisvų oligonukleotidų koncentracija
citoplazmoje yra labai nedidelė, nes jie sukaupiami lizosomose ir endosomose. Įdomu tai, kad
išlaisvinus oligonukleotidus iš šių talpyklų arba mikrošvirkštu injekavus oligonukleotidus į
citoplazmą jie labai greitai prasiskverbia į ląstelės branduolį. Oligonukleotidų patekimas į ląstelę
gali būti pagerintas naudojant lipofilinę derivatizaciją (pvz. susintetinant lipofilinius konjugatus
oligonukleotido 5’ gale), konjuguojant oligonukleotidą su poli-L-lizinu, arba supakuojant
oligonukleotidus į liposomas, kurios nukreipiamos į reikiamą vietą naudojant specifinius antikūnus.
Vis dar neaišku, ar neturintys krūvio lipofiliniai metilfosfonatai patenka į ląstelę pasyvios difuzijos
ar aktyvaus transporto būdu. Fosforotioatai, esant aukštai jų koncentracijai, konkuruoja su įprastais
fosfodiesterio oligonukleotidais, bet jiems reikia daugiau laiko pasiekti viduląstelinę pusiausvyrą.
Peptidinės nukleino rūgštys į ląstelę beveik visai nepatenka. Apskritai, oligonukleotidų patekimas į
ląstelę priklauso nuo laiko, energijos, ir ląstelės tipo. Be to, oligonukleotidai yra pernešami ne tik į
ląstelę, bet ir iš jos. Norint įvertinti sintetinio oligonukleotido biologinį veiksmingumą yra būtina
įvertinti įvairių galimų jo modifikacijų poveikį transportui į ląstelę. Taip pat gali atsitikti taip, kad
oligonukleotidų transportas į ląstelę audinių kultūroje nekoreliuoja su jų farmakologiniu
veiksmingumu gyvame organizme.
Oligonukleotidų analogų prisijungimo giminingumas. Oligonukleotidų modifikavimas paprastai yra
susijęs su prisijungimo prie komplementarios sekos giminingumo pokyčiais. Krūvis, steriniai
faktoriai ir stereochemija yra pagrindiniai veiksniai nulemiantys modifikuoto oligonukleotido
giminingumą. Stereochemija yra ypač svarbi daugumai modifikacijų (pvz. fosfato liekanoje
pakeitus deguonies atomą siera, metilo arba alkilamino grupe ties fosforu susidaro chiralinis
centras). Taigi, jeigu oligonukleotide su n tarpnukleotidinių fosfato grupių jos visos yra
pakeičiamos metilfosfonato liekanomis, standartinės sisntezės metu susidarys 2n diastereomerų
mišinys. Dėl sumažėjusios krūvių stūmos sintetinių oligonukleotidų, kuriuose metilfosfonato
liekanos yra įjungtos atsitiktiniu principu, prisijungimo giminingumas yra panašus ar netgi šiek tiek
mažesnis nei nemodifikuotų oligonukleotidų. Tuo tarpu taisyklingos stereochemijos metilfosfonatai
(R konfigūracija ties fosforu) paprastai daug aukštesniu prisijungimo giminingumu. Fosforotioato
grupių (R, S mišinys) įvedimas į oligonukleotidą paprastai sumažina lydymosi temperatūrą ~0.41.0°C vienai pakeistai grupei. Lydymosi temperatūra Tm yra temeratūra esant kuriai 50% dvigubų
grandinių disocijuoja į viengubas grandines. Tm reikšmės dažnai labai skiriasi priklausomai nuo
komplementarios grandinės kilmės (RNR ar DNR). Deja, iki šiol dar nesukurtas streospecifinis
4
metilfosfonatų ir fosforotioatų sintezės metodas, nors fosforotioatams tai yra mažiau aktualu,
kadangi jų stereochemija turi mažesnę įtaką prisijungimo giminingumui. α-nukleotidų arba 2’-Oalkilribonukleotidų įvedimas į oligonukleotidą stipriai padidina jo prisijungimo prie RNR
giminingumą. Kitas būdas padidinti prisijungimo giminingumą yra konjuguoti oligonukleotidą su
interkaliujančiais arba susiuvančiais junginiais, pvz. akridinu arba psoralenu. Trigubą grandinę
sudarančių oligonukleotidų prisijungimo giminingumo padidinimui naudojami modifikuotos bazės,
pvz. 5’-metilcitozinas. Taip pat buvo sukurti trigubą grandinę formuojantys cikliniai
oligonukleotidai, kurie pasižymi dideliu nukleaziniu stabilumu bei dideliu prisijungimo
giminingumu. Tokiuose cikliniuose oligonukleotiduose priešprasminė oligonukleotido dalis sudaro
dvigubą grandinę pagal Watson-Crick bazių poravimo principą, o trigubą grandinę formuojanti
oligonukleotido dalis jungiasi pagal Hoogsteen bazių poravimo principą.
Oligonukleotidų sintezė
Mažos apimties oligonukleotidų sintezė paprastai atliekama pasitelkiant kietos fazės chemijos ir
fosforoamidito metodus. Šiuo metu prekyboje esančių įrenginių DNR sintezei išeiga yra 0.2 µM – 2
mM oligonukleotidų, taigi galima susintetinti keletą gramų oligonukleotidų. Toks kiekis yra
pakankamas tiriant jų poveikį gyvūnų organizme. Tačiau norint išplėsti oligonukleotidų taikymą
medicinoje yra būtina išplėsti jų sintezės mastus. Vis dar tęsiasi mokslinė diskusija, kokie chemijos
metodai (skystos ar kietos fazės sintezė, fosforoamidito, H-fosfonato ar fosfotriesterių chemija) yra
tinkamiausi šiam tikslui pasiekti. Naujausiuose metoduose dsidelių kiekių oligonukleotidų sintezei
naudojami skysti polimeriniai pagrindai (t.y. derinami kietos ir skystos chemijos pranašumai), arba
neapsaugoti monomeriniai oligonukleotidų komponentai, todėl sintezės procesas supaprastėja ir
atpinga. Gaminant oligonukleotidus farmacijos pramonei taip pat pradėti naudoti tokie metodai kaip
masių spektrometrija ir kapiliarinė elektroforezė.
Oligonukleotidų veikimo mechanizmas
Kaip minėta, trigubą grandinę sudarantys oligonukleotidai naudojami transkripcijos slopinimui, tuo
tarpu priešprasminiai oligonukleotidai – transliacijos slopinimui. Pastarųjų veikimo mechanizmas
daugiausiai priklauso nuo pasirinktos taikinio sekos. Priešprasminiai oligonukleotidai gali slopinti:
persiuvimą (splaisingą), poliadenilinimą, taisyklingą RNR susilankstymą, translokaciją, iRNR
transliacijos iniciaciją arba ribosomų judėjimą išilgai iRNR molekulės. Tačiau yra sunku nustatyti
priešprasminių oligonukleotidų poveikio mechanizmą organizme, kadangi jų poveikis gali būti
nulemtas iš esmės skirtingų mechanizmų, t.y. poveikis gali būti dėl ląstelės receptorių blokavimo
arba tiesioginio viruso fermentų (pvz. DNR polimerazės arba atvirkštinės transkriptazės) slopinimo.
Naudojant oligonukleotidus viruso sukeltos ligos gydymui yra sunku įvertinti kokia stebimo
biologinio poveikio dalis yra nulemta to, kad užblokuojam viruso adsorbcija ląstelės paviršiuje, o
kokia – interferoninės sistemos aktyvacijos. Taip pat vis dar nėra nustatyta, kiek iRNR karpymas
ląstelėje esančia RNaze H prisideda prie priešprasminių oligonukleotidų poveikio. RNazė H
atpažįsta hibridines DNR-RNR molekules ir perkerpa RNR grandinę. Manoma, kad RNazės H
substratas yra DNR-RNR molekulių hibridai, kurių ilgis yra tik kelios bazių poros, todėl RNazės H
poveikio pasekmė yra nespecifinis iRNR karpymas. Dėl šios priežasties, jeigu yra naudojami
natūralūs fosfodiesteriai arba fosforotioatai, RNazės H poveikis gali susilpninti priešprasminių
oligonukleotidų poveikį. Tačiau RNazė H nekerpa daugelio sintetinių oligonukleotidų darinių
(metilfosfonatų, α-anomerinių oligonukleotidų, junginių su 2’-O-alkilriboze, defosfooligonukleotidų analogų). Todėl hibridinės molekulės 3’ ir 5’ galuose turinčios RNazės H poveikiui
atsparias modifikacijas bei turinčios tik trumpas RNazę H indukuojančias sekas yra intensyviai
tiriamos kaip potencialūs padidinto specifiškumo inhibitoriai.
Oligonukleotidų taikymas
Oligonukleotidų aktyvumas in vitro. Pastaraisiais metais pasirodė nemažai publikacijų, kuriose
aprašomas įvairių priešprasminių oligonukleotidų veiksmingumas ląstelių kultūrose. 1 lentelėje yra
pateikti keli priešprasminių ir trigubą grandinę sudarančių oligonukleotidų, nukreiptų prieš įvairius
5
virusus, onkobaltymus, receptorius, citokinus, augimo veiksnius, aktyvumų in vitro pavyzdžiai.
Daugumoje atvejų efektyvi oligonukleotidų dozė, inhibuojanti ekspresiją, yra 0.1-50 µM.
Nemodifikuoti oligonukleotidai yra aktyvūs tik tada, jei ląstelių augimo terpėje nėra serumo. Tuo
tarpu fosforotioato oligonukleotidai turi stipresni poveikį nei metilfosfonato oligonukleotidai.
Pastarųjų konjugatai su psoralenu stipriai padidina oligonukleotido poveikį, jei jis derinamas su
radiacija. Apibendrinant, oligonukleotidų antagonistai pasižymi plačiu spektru specifinių aktyvumų
nukreiptų prieš įvairius taikinius: virusus, receptorius, fermentus, onkogenus, augimo veiksnius ir
kitus šeimininko genų produktus.
Oligonukleotidų aktyvumas in vivo, toksiškumas ir pasiskirstymas organuose. Nesenai buvo
įvertintas priešprasminių oligonukleotidų veiksmingumas in vivo. Buvo parodyta, kad ant pelės
odos užnešti metilfosfonato oligonukleotidai yra veiksmingi prieš herpes simlex virusą 1 (HSV-1).
Taip pat buvo pademonstruota, kad fosforotioato priešprasminiai nukleotidai užnešti ant HSV-1
užkrėstos pelės ragenos slopino virusų dauginimąsi ir visiškai išgydė nuo infekcijos. Šiame
eksperimentiniame modelyje priešprasminių oligonukleotidų antivirusinis aktyvumas buvo panašus
į trifluorotimidino, bei nebuvo vietinio ar sisteminio toksiško poveikio. Oligonukleotidai su
alkilinančiomis grupėmis buvo veiksmingi prieš erkinio encefalito virusą pelėje. Gydant
sistemingai, fosforotioato priešprasminiai oligonukleotidai sėkmingai slopino anties hepatito B
viruso replikaciją. Taip pat buvo parodyta, kad galima moduliuoti nerimo jausmą priešprasminiais
oligonukleotidais specifiškai slopinant neurotransmiterio receptoriaus raišką gyvose smegenyse.
Nesenai buvo parodyta, kad c-myb priešprasminiai nukleotidai suleisti į laboratorinės žiurkės
organizmą pluroniniame (t.y. nejoniniame detergente, pagamintame iš polioksipropileno glikolio,
etileno oksido ir etileno glikolio) tirpale slopina arterijų lygiojo raumens ląstelių kaupimąsi
pažeistose kaklo arterijose. Kitas tyrimas atliktas su laboratoriniais gyvūnais parodė, kad specifinio
geno raiškos slopinimas priešprasminių oligonukleotidų taikant vietinę nuolatinę perfuziją slopina
naviko augimą. Sėkmingas fosforotioato oligonukleotidų, nukreiptų prieš c-myb, taikymas pelių,
sergančių pirminiu imunodeficitu gydymui teikia vilčių, kad tokiu pat būdu bus galima gydyti
leukemija sergančius žmones. Be to, buvo parodyta, kad priešprasminis branduolio faktoriaus κB
slopininimas 3’galo fosforotioatų konjugatais (suleistasi į pelių pilvo ertmę) visiškai sunaikino
persodintus žmogaus T-ląstelių limfotropinio viruso 1 (HTVL-1) tax baltymu transformuotus
navikus.
Pirmas klinikinis tyrimas su žmonėmis buvo nesėkmingas, kadangi po 10 dienų infuzijos
fosforotioato priešprasminiu oligonukleotidu (0.05 mg.kg-1.val-1) nukreiptu prieš p53, ligonio,
sergančio leukemija, organizme nebuvo jokio atsako. Tačiau šis bandymas taip pat parodė, kad
ilgalaikis sistemingas priešprasminių oligonukleotidų vartojimas galimas be didesnių žalingų
pasekmių žmogaus organizmui. Tai patvirtina ir tyrimai laboratoriniuose gyvūnuose. Pvz.
suaugusių vyriškos lytie žiurkių kūno ir organų masė nepakito po ilgalaikės nuolatinės infuzijos
naudojant osmotinę pompą su 50-150 mg fosforotioato oligonukleotidu sudarytu iš 27 monomerų.
Kitas tyrimas parodė, kad suleidus (į veną arba pilvo ertmę) fosforotioato oligonukleotidų,
oligomeras išlieka organizme iki 48 val., ir yra aptinkamas daugumoje audinių. Taip pat nebuvo
pastebėta jokio toksiško poveikio pelei, kuri 14 dienų kas dieną gaudavo 100 mg oligonukleotidų
dozę. Tiriant 3’ gale modifikuotų oligonukleotidų pasiskirstymą pelės organuose po vienkartinės
intraperitoninės injekcijos buvo parodyta, kad po 4 val. oligonukleotidai aptinkami tirtuose
organuose tokia tvarka: inkstai > kepenys > blužnis > širdis, plaučiai > raumenys, ausys >>
smegenys.
Taigi priešprasminiai ir triviją grandinę formuojantys oligonukleotidai gali būti nepaprastai
naudingi įvairių ligų gydymui. Jau dabar yra pasiekta, kad sintetiniai oligonukleotidai išliktų
nesuskaidyti serume pakankamai ilgą laiką, kad spėtų pasireikšti jų farmakologinis poveikis.
Kuriami nauji modifikuoti oligonukleotidai, pasižymintys geresnėmis savybėmis. Eksperimentai
ląstelių kultūrose rodo, kad pakanka mikromolinių priešprasminių oligonukleotidų koncentracijų
norin pasiekti reikiamą poveikį. Ir galiausiai, eksperimentai su gyvūnais ir klinikiniai tyrimai su
žmonėmis parodė, kad net ilgalaikis oligonukleotidų vartojimas nėra toksiškas organizmui.
6
1 lentelė. Priešprasminių ir trigubą grandinę sudarančių oligonukleotidų aktyvumo in vitro pavyzdžiai.
ŽIV – žmogaus imunodeficito virusas, HSV – herpes simplex virusas, VSV – vezikulinio stomatito virusas,
SV – beždžionių virusas (angl. simian), P-O – fosfodiesteris, P-S – fosforotioatas, P-Me – metilfosfonatas, (psoralenas) – konjugatas su psoralenu, -(poli-L-Lys) – konjugatas su poli-L-lizinu, -(TF-poli-Lys) –
konjugatas su transferinu-poli-L-lizinu, -(akridinas) – konjugatas su akridinu, -(amino) –
amonopropandiolfosfatas, tfo – triviją grandinę formuojantis oligonukleotidas.
Taikiniai
Ląstelės
tipas
Oligomero tipas
Virusai
Rauso sarkoma Fibroblastai
P-O, P-S
ŽIV
H T ląstelės
P-S
HSV
Vero
P-Me
HSV
Vero
P-Me-(psoralenas)
VSV
L 929
P-O-(poli-L-Lys)
Gripo
MDK
P-S
Hepatito B
PLC/PRF/5
P-O, P-S
SV 40
CV-1
P-O-(akridinas) [tfo]
Branduolio onkobaltymai
c-myb
HL-60
P-O-(TF-poli-Lys)
c-myb
BC3H1
P-S
c-myc
HL-60
P-O, P-S
c-myc
Burkitt’o
P-O
ląstelės
c-myc
T limfocitai
P-O
Citoplazminiai ir membranos onkobaltymai
Ha-ras
T24
P-O-Acr
Bcl-2
Pre-B ALL
P-O, P-S
Ląstelės receptoriai
ICAM-1
A 549
P-S
IGF-1R
BALB/c3T3
P-O
PB limfocitai P-O-(amino) [tfo]
IL2Rα
Citokinai ir augimo veiksniai
IL-2
T ląstelės
P-O
Monocitai
P-S
IL-1β
Endotelinės
P-O
IL-1α
CSF-1
Monocitai
P-O
Efektyvi
dozė (µM)
Literatūros šaltinis
10
0.5
50-100
5
0.1
1.25
0.3-17
15-30
Zamecnik PC et al. (1978) Proc Natl Acad Sci U S A.
Matsukura M et al. (1987) Proc Natl Acad Sci U S A.
Smith CC et al. (1986) Proc Natl Acad Sci U S A.
Smith CC et al. (1986) Proc Natl Acad Sci U S A.
Lemaitre L et al. (1987) Proc Natl Acad Sci U S A.
Leiter L et al. (1990) Proc Natl Acad Sci U S A.
Goodarzi G et al. (1990) J Gen Vir.
Birg F. Et al. (1990) Nucleic Acids Res.
50
10-25
10
100
Citro G et al. (1992) Proc Natl Acad Sci U S A.
Simons M et al. (1992) Circ Res.
Wickstrom EL et al. (1989) Cell Dev. Biol.
McManaway ME et al. (1990) Lancet
30
Heikkila R et al. (1987) Nature
1-10
25-150
Wickstrom EL et al. (1989) Cell Dev. Biol.
Reed JC et al. (1990) Cancer Res.
0.5-1
15
10
Chiang M.-Y et al (1991) J. Biol. Chem.
Surmacz E et al. (1992) Exp. Cell. Res.
Orson FM et al. (1991) Nucleic Acids Res.
5
0.5-2.5
10
5-10
Harel-Bellan A et al. (1988) J. Exp. Med.
Manson J et al. (1990) Lymphokine Res.
Maier JA et al. (1990) Science
Birchenall RM et al. (1990) J. Immunol.
Literatūra
1. Molecular Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference. (1995) Robert A.
Meyers (Editor), Wiley-VCH, ISBN: 978-0-471-18571-0
2. Chan JH, Lim S, Wong WS. (2006) Antisense oligonucleotides: from design to therapeutic
application. Clin Exp Pharmacol Physiol. 33:533-40.
7
GENETINĖ IMUNIZACIJA
Pagrindinių sąvokų apibrėžimai
Biolistinis prietaisas – prietaisas, naudojamas tiesioginiam genetinės medžiagos įvedimui į gyvą
ląstelę ląstelių kultūroje arba gyvo organizmo ląstelę.
Ląstelinis imunitetas – citotoksinių T limfocitų ir/arba makrofagų aktyvacija prieš specifinius
antigenus.
Humoralinis imunitetas – antikūnų gamyba antigenais aktyvuotuose B limfocituose.
Imunizacija – humoralinio ir ląstelinio imuniteto prieš specifinį antigeną susidarymas, kai imuninė
sistema vienokiu ar kitokiu būdu susiduria su tuo antigenu.
Virusų ar bakterijų vektoriai – modifikuoti virusų ar bakterijų genomai, į kuriuos įvesiti virusui ar
bakterijai svetimi genai, kurie užtikrina svetimo geno produkto patekimą į ląstelę taikinį.
Įvadas
Genetinė imunizacija (GI) yra priemonė sukelti imuninį atsaką prieš specifinius baltymus, gyvūno
ląstelėje ekspresuojant genus, koduojančius tuos baltymus. Ilgalaikis antigeno buvimas in vivo
sąlygom sukelia žymią antigeno amplifikaciją ir imuninės sitemos stimuliaciją, ir galiausiai sukelia
imuninį atsaką prieš tą antigeną. Buvo sukurti įvairūs biologiniai ir fiziniai metodai, kurių pagalba
aktyvūs genai yra pernešami į gyvūnų ląsteles. Genetinė imunizacija reikalauja mažiau laiko, pinigų
ir darbo sąnaudų lyginant su baltyminių vakcinų paruošimu, kadangi DNR manipuliacijos yra
paprastos ir įvairios, ir DNR gali būti išgryninta iki homogeniškumo be jokių sunkumų. Genetinė
imunizacija imituoja natūralių interferonų poveikį, nes jos dėka vyksta ilgalaikė geno raiška tik tam
tikroje to paties tipo ląstelių populiacijoje. Dėl to gali gamintis didesni kiekiai antikūnų ir pailgėti jų
gamybos trukmė lyginant su antikūnų gamybos stimuliacija įprastomis priemonėmis. Be to,
genetinė imunizacija gali sukelti specifinį T ląstelių atsaką, kurio nesukelia baltyminių imunogenų
inokuliacija.
Vakcinacija yra svarbiausia medicininė priemonė ligų prevencijai. Be to, tai nepakeičiamas įrankis
šiuolaikiniuse biologiniuse tyrimuose. Nors kiekvienais metais didelis skaičius žmonių ir gyvūnų
gyvybių yra apsaugomos imunizacijos dėka, tačiau dabartinių imunizacijos metodų taikymas yra
apribotas dėl tam tikrų sunkumų (pvz. didelės išlaidos ir būtinybė vakcinas laikyti šaltai). Todėl vis
dar neįmanoma kovoti su daugelių ligų, kadangi vakcinos arba nepakankamai veiksmingos, arba jų
iš viso nėra. Pastaraisiais metais iš esmės pasikeitė požiūris į vakcinų kūrimą. Tradicinis būdas
sukelti imuninį atsaką yra inokuliuoti žmogų arba gyvūną negyvais arba gyvais susilpnintais
patogenais, arba išgrynintais baltyminiais antigenais. Negyvų ar gyvų susilpnintų patogenų
nadojimas yra rizikingas, kadangi visda išlieka galimybė, kad dalis patogenų gali būti nenužudyta ar
nepakankamai susilpninta. Baltymų gryninimas reikalauja didelių laiko sąnaudų, yra brangus, o
kartais sunkus ar neįmanomas. Biotechnologijų pažanga leido klonuoti genus, koduojančius
specifinius baltymus, bei įvesti tuos genus į gyvūnų organizmą, kad baltymas būtų sintetinamas
organizmo ląstelėse. DNR manipuliacijos yra paprastesnės, įvairesnės ir pigesnės nei baltymų
manipuliacijos. Specifinių genų įvedimas į gyvūno organizmą, kad vyktų imunogenų sintezė in vivo
bovo pavadintas “genetine imunizacija”. Pirmoji aprašyta vakcina prieš raupus pagaminta naudojant
vaccinia virusą iš esmės yra gnetinės imunizacijos pirmtakė. Skirtumas yra tas, kad genetinėje
imunizacijoje specifiniai genai atsakingi už imunizaciją yra gerai ištirti ir gali būti įjungti į įvairius
ekspresijos vektorius.
Ideali imunizacijos procedūra: (i) turi turėti kuo mažiau šalutinių poveikių, įskaitant individus su
imuninės sitemos sutrikimais, (ii) negali būti toksiška ar stimuliuoti navikų formafimąsi, (iii) negali
sklisti nuo vakcinuoto individo nevakcinuotam bei teršti aplinkos. Taip pat svarbu, kad imunizacijos
pasekmė būtų veiksmingas ir ilgalaikis humoralinis ir ląstelinis imunitetas. Vakcinos gamybos
kaina turėtų būti žema, o vakcinacijos procedūra – paprasta. Kol tokia ‘ideali’ vakcina dar
nesukurta, kaip minėta anksčiau, genetinė imunizacija turi privalumų lyginant su įprastom
vakcinom.
1
Sėkmingai genetinei imunizacijai yra nepaprastai svarbu, kad genetinė medžiaga būtų saugiai
pernešta į ląstelę taikinį, ir, kad pernešto geno raiška užtikrintų pakankamo kiekio baltymo-antigeno
sintezę, kuris sukeltų imunininį atsaką. Yra keletas būdų atlikti genetinę imunizaciją: (i) įvedus
antigeną koduojantį geną į infekcinį, bet nepatogeninį nešiklį, arba (ii) DNR gali būti įterpta į
šeimininko ląstelę fiziškai. Bet kuriuo atveju, tam, kad vyktų imunogeninio geno raiška, įvedama
DNR turi pereiti viduląstelines membranas ir atsidurti reikiamo vietoje. Metodai, naudojami šiam
tikslui pasiekti yra aprašyti sekančiuose skyreliuose.
DNR įvedimo į ląstelę metodai
Aktyvių genų įvedimas į ląsteles naudojant virusų ir bakterijų vektorius. Pastaraisiais metais buvo
sukurta keletas virusinių ir bakterinių gyvų rekombinantinių vakcinų nešiklių. Evoliucijos eigoje šie
mikroorganizmai įgijo mechanizmus, kurių pagalba gali pernešti savo genetinę medžiagą į
šeimininko ląstelę. Šiuolaikiniai biotechnologijos metodai leidžia mus dominančius genus įvesti į
viruso ar bakterijos genomą, o infekcijos pasėkoje mus dominantis genas yra sėkmingai
ekspresuojamas šeimininko ląstelėje. Tinkamiausi vektoriai rekombinantinių vakcinų gamybai yra:
vaccinia virusas, adenovirusai, retrovirusai, BCG (bacillus Calmette-Guerin), Escherichia coli,
Salmonella typhimurium, kiti pox virusai, herpesvirusai ir poliovirusai.
Tačiau padėtis gali komplikuotis dėl imuninio atsako į vektorių suaugusiuose individuose, kurie
anksčiau buvo imunizuoti prieš virusą/bakteriją vektorių, arba buvo infekuoti tuo virusu ar
bakterija. Neaišku kaip jau esantis imunitetas bet kuriam adenovirusų serotipui paveiktų pirminę ar
antrinę imunizaciją adenoviruso rekombinantiniu vektoriumi. Vaccinia viruso rekombinantų
veiksmingumas taip pat yra abejotinas individuose, kurie buvo anksčiau imunizuoti vaccinia virusu.
Kadangi oraganizme jau yra imunitetas šiems virusasms, imuninis atsakas į šių virusų
rekombinantinius baltymus gali būti labai mažas. Kai kurie retrovirusai yra šiek tiek imunogeniški,
tačiau dauguma yra imunosupresoriai.
Antigeną ekspresuojančių autologinių ląstelių reinplantacija. Vienas iš galimų būdų sukelti imuninį
atsaką yra ex vivo modifikuotų autologinių (t.y. paimtų iš to paties individo) ląstelių reinplantacija į
organizmą. Tokios procedūros metu ląstelės yra pirmiausiai paimamos iš organizmo. Tada in vitro į
ląstelę įvedamas antigeną koduojantis genas ir ląstelė grąžinama į organizmą (gali būti infuzuojama,
implantuojama arba įvedama pirmiausiai ląstelę patalpinus į porėtos membranos kapsulę). Nors
metodas yra daug sudėtingesnis, nei tiesioginis genų įvedimas in vivo, tačiau įvedant genus ex vivo
išvengiama kai kurių su saugumu susijusių problemų.
DNR injekcijos į raumens audinį. Aukštą heterologinių genų raiškos lygį raumens ląstelėse galima
pasiekti tiesiogiai į skeleto raumens audinį injekuojant gryną RNR ar DNR. Tikslus mechanizmas,
kaip polinukleotidai patenka į raumens ląstelę yra nežinomas, tačiau įmanoma, kad ląstelės išorėje
esanti DNR ar RNR gali patekti į vidų, kai fizinio aktyvumo metu raumens ląstelės išsitempia ir jų
plazminėje membranoje atsiranda plyšiai. Buvo parodyta, kad naudojant šį metodą taip pat galima
sukelti imuninį atsaką.
Biolistinis DNR įvedimas į odos ląsteles. Biolistika (biologinė balistika) yra ląstelių transfekcijos
metodas, kuriame DNR įvedimas į ląstelę atliekamas apšaudant ląstelę DNR padengtomis
mikrodalelėmis. Buvo parodyta, kad inokuliavus aukso mikrodaleles, padengtas plazmidėmis
ekspresuojančiomis žmogaus baltymus, į pelės odą galima sukelti humoralinį imuninį atsaką į
keletą antigenų. Naudojant šį metodą pirminė imunizacija gali būti stimuliuojama pakartotinai
įvedant DNR. Naudojant tradicinius imunizacijos baltymais metodus imuninis atsakas pasireiškia
po kelių savaičių ir tada nuslopsta, tuo tarpu po DNR injekcijos didelis antikūnų kiekis išlieka
praėjus keliems menesiams po inokuliacijos. Nors ląstelinis imunitetas po tokios procedūros nebuvo
kruoščiai tiriamas, tačiau tikimybė, kad jis neišsivystė yra maža, kadangi procedūra buvo labai
panaši į natūralią infekciją in vivo sąlygomis. Priešingai nei biologiniai vektoriai išgryninta DNR
nepasižymi infekcinėmis savybėmis, taigi yra daud saugesnė. Be to, padidinti procedūros saugumą
galima inokuliuojant ląsteles tik į viršutinį odos ląstelių sluoksnį, kurios po kelių dienų apmišta ir
yra pašalinamos. Tokiu būdu galima išvengti ilgalaikio modifikuotų ląstelių poveikio. Plazmidinės
DNR panaudojimas imunizacijai turi ir kitų privalumų: (i) jos yra mažesnės nei virusų/bakterijų
2
vektoriai, (ii) jas lengva modifikuoti pridedant signalines sekas, ko pasėkoje baltymas bus
nukreiptas į pageidaujamą ląstelės vietą (į membraną, arba, kad baltymas būtų sekretuojamas iš
ląstelės), ir (iii) plazmidinė DNR yra termostabilesnė.
Genetinės imunizacijos taikymo perspektyvos
Pagrindinis tikslas kuriant vakcinas yra naudojant minimalų inokuliacijų skaičių gauti didžiausią
serumą neutralizuojančių antikūnų titrą ir ilgai trunkantį imunitetą prieš tam tikrą ligą sukelentį
patogeną. Genetinės imunizacijos pranašumas yra tai, kad in vivo antigeną gaminančios ląstelės
išlieka ilgai, todėl gali užtikrinti ilgai trunkančią imunizaciją. Kaip minėta, genetinės imunizacijos
privalumas yra it tas, kad nereikia atlikti techniškai sudėtingo baltymų gryninimo ir adjuvanto
parinkimo, kas yra būtina kuriant tradicines vakcinas. Be to, išskyrimo gryninimo procedūros metu
gali įvykti konformaciniai baltymų pokyčiai, kas gali neigiamai paveikti jų antigenines savybes.
Šios problemos galima išvengti naudojant genetinę imunizaciją. Genetinė imunizacija jau yra
sėkmingai pritaikyta laboratorinių ir kai kurių naminių gyvūnų imunizacijai, bei perspektyvoje gali
būti taikoma ir žmonių imunizacijai.
Genetinė imunizacija yra nauja vakcinų technologijų kryptis. Dabar jau yra įmanoma ekspresuoti
dominantį antigeną autentiškoje audinio aplinkoje gyvame organizme, ko pasėkoje audinyje yra
sintetinamas natyvios kofigūracijos antigenas, kuris sukelia humoralinį ir ląstelinį imuninį atsaką.
Genetinės imunizacijos saugumas yra didžiausia problema, kurią reikia išspręsti prieš pradedant šį
metodą naudoti žmonių imunizacijai. Šiuo metu surinktas didelis kiekis informacijos apie
vakcinoms naudojamus virusų ir bakterijų vektorius. Biotechnoligijų pažanga leidžia sumažintį jų
patogeniškumą modifikuojant jų genomus. Patogeniškumas gali būti susilpnintas į genomą įvedant
limfokinų genus. Tačiau potencialus jų onkogeniškumas ir patogeniškumas (ypač kūdikiams ir
individams su imuninės sistemos sutrikimais) nusveria jų takymo visai žmonių populiacijai poreikį.
Perspektyvoje genetinė imunizacija galėtų būti taikoma vėžio gydymui. Vienas iš dabartinių navikų
imunobiologijos tikslų yra surasti būdus sukelti antinavikinį imunitetą ekspresuojant įvairių citokinų
genų derinius navikinėse ląstelėse. Nuolatinė citokinų gamyba navikinėse ląstelėse galėtų veikti
kaip adjuvantai, pritraukiantys limfocitus prie navikinių ląstelių sankaupų ir stimuliuojantys šių
ląstelių sunaikinimą. Yra tikrinama, kuris iš aukčiau aprašytų DNR įvedimo į ląstelę metodų yra
veiksmingiausias norint pasiekti specifinę genų ekspresiją išimtinai navikinėse ląstelėse.
3
KAMIENINĖS LĄSTELĖS IR JŲ TAIKYMAS MEDICINOJE
Pagrindinių sąvokų apibrėžimai
Kamieninė ląstelė – nediferencijuota ląstelė, kuri turi neribotą gebėjimą atsinaujinti dalindamasi,
bei gali diferencijuotis į specializuotą audinio ar organo ląstelę.
Gemalo (embrioninės) kamieninė ląstelė – nediferencijuotos trijų gemalinių sluoksnių
(endodermos, ektodermos ir mezodermos) ląstelės, kurių pagrindinė savybė yra pluripotencija, t.y.
gebėjimas diferencijuotis į daugiau nei vieną specializuotų ląstelių tipą.
Suaugusio organizmo kamieninės ląstelės (arba somatinės kamieninės ląstelės) –
nediferencijuotos ląstelės aptinkamos tarp diferencijuotų audinių ar organų ląstelių suagusių ir
vaikų organizme, ir galinčios diferencijuotis į pagrindinius tą audinį ar organą sudarančių ląstelių
tipus. Pagrindinė šių ląstelių funkcija yra žuvusių to audinio ar organo ląstelių pakeitimas.
Įvadas
Kamieninės ląstelės yra svarbios gyvo organizmo funkcionavimui dėl daugelio priežasčių.
Ankstyvoje embriono vystymosi stadijoje (3-5 dienos po apvaisinimo), vadinamoje blastocista,
kamieninės ląstelės intensyviai dalinasi suformuodamos daugybę specializuotų ląstelių tipų, kurios
savo ruožtu suformuoja organizmo audinius ir organus. Kai kuriuose suaugusio organizmo
audiniuose (kaulų čiulpuose, raumenyse, smegenyse) aptinkamos suaugusio organizmo kamieninių
ląstelių populiacijos, kurių dėka pasenusios, pažeistos ar ligotos ląstelės yra pakeičiamos naujomis.
Abiejų tipų kamieninės ląstelės pasižymi ypatingu gebėjimu atsinaujinti bei diferencijuotis
praktiškai į bet kurią suaugusio organizmo ląstelę (Pav. 1).
Kamieninių ląstelių atsinaujinimas vyksta dėl šių ląstelių gebejimo dalintis dviem skirtingais
būdais: simetriškai ir asimetriškai. Ląstelei dalinantis simetriškai susidaro dvi identiškos dukterinės
ląstelės pasižyminčios kamieninių ląstelių savybėmis. Ląstelei dalinantis asimetriškai susidaro viena
kamieninė ląstelė ir ląstelė, turinti ribotą atsinaujinimo potencialą. Tokia ląstelė pasidalina keletą
kartų prieš galutinai diferencijuodamasi į specifinio tipo ląstelę. Manoma, nors ir eksperimentiškai
neįrodyta, kad galbūt molekuliniai skirtumai tarp simetriško ir asimetriško dalinimosi gali būti
nulemti skirtingos membraninių baltymų (pvz. membranos receptorių) segregacijos dukterinėse
ląstelėse.
Kamieninė
ląstelė
Atsinaujinimas
Proliferacija
Diferenciacija
Diferencijuotos ląstelės
Pav 1. Kamieninių ląstelių proliferacija. Dalinantis kamieninei
ląstelei susidaro dukterinė ląstelė, kuri išlaiko kamieninės ląstelės
savybes, ir antra ląstelė, kuri toliau proliferuoja (dalinasi) ir
diferencijuojasi į specializuotas ląsteles.
Taip pat yra tiriamos signalinės molekulės, kurios perprogramuotų diferencijuotą ląstelę į ląstelę,
panašią į kamieninę. Tokios molekulės paprastai yra transkripcijos faktoriai, taip pat onkogenas cmyc. Pradiniai tyrimai parodė, kad paveikus pelės ląsteles tokių anti-diferenciacijos signalinių
molekulių mišiniu diferencijuotos ląstelės tampa pluripotentinėmis. Tačiau tokio metodo taikymas
ligų terapijai yra nepriimtinas, kadangi procedūros metu ląstelės yra transformuojamos onkogenais.
1
Kamieninių ląstelių tyrimai suteikia naujų žinių apie tai, kaip organizmas vystosi iš vienos ląstelės
ir padeda išaiškinti mechanizmus, kaip suaugusiame organizme pažeistos ląstelės yra pakeičiamos
naujomis sveikomis ląstelėmis. Taip pat yra intesyviai tiriamos galimybės panaudoti kamienines
ląsteles ligų gydymui. Pastaroji tyrimų sritis vadinama regeneracine medicina. Šioje paskaitoje bus
aptarti kamieninių ląstelių tipai ir jų funkcijos, bei jų taikymo medicinoje perspektyvos.
Suaugusio organizmo kamieninės ląstelės
Ankstyvojoje gemalo vystymosi stadijoje gemalinės ląstelės dalinasi labai gretai. Pasidalinusios
ląstelės diferencijuojasi į specializuotas audinių ir organų ląsteles. Ląstelėms diferencijuojantis jų
dalinimosi greitis ilgainiui sulėtėja ir dauguma suaugusių gyvūnų ląstelių nustoja dalintis ir išlieka
G0 ląstelės ciklo stadijoje visą jų gyvavimo trukmę. Tačiau daugelio ląstelių gyvavimo trukmė yra
ribota dėl programuotos ląstelės mirties (apoptozės) arba dėl įvairių pažaidų. Todėl, norint palaikyti
pastovų ląstelių skaičių suaugusiuose audiniuose ir organuose, mirusios ląstelės turi būti pakeistos
naujomis. Balanso palaikymui kai kuriuose audiniuose yra diferencijuotų ląstelių subpopuliacijos,
kurios gali dalintis visą gyvūno gyvenimą, taip pakeisdamos mirusias ląsteles (pvz. jungiamąjame
audinyje esantys fibroblastai, vidinį kraujagyslių paviršių išklojančios epitelinės ląstelės, kai kurių
vidaus organų (kepenų, kasos) epitelinės ląstelės). Tačiau dauguma diferencijuotų ląstelių suaugusių
gyvūnų audiniuose nebegali dalintis. Jei tokios ląstelės žūsta, jos yra pakeičiamos dalinantis mažiau
diferencijuotoms, gebančioms atsinaujinti ląstelėmis, vadinamos kamieninėmis ląstelėmis, kurios
aptinkamos daugumoje suaugusių audinių. Esminė kamieninių ląstelių savybė yra ta, kad joms
dalinantis susidaro viena dukterinė ląstelė, kuri išsaugo kamieninės ląstelės savybes ir antra, kuri
toliau dalindamasi geba diferencijuotis (Pav. 1). Kamieninės ląstelės yra nepaprastai svarbios
audinių ir organų struktūros palaikymui, nes visą gyvūno gyvenimą jos išsaugo gebėjimą dalintis ir
pakeisti mirusias diferencijuotas ląsteles. Jos yra ypač svarbios audinių, kurių ląstelės turi trumpą
gyvavimo trukmę, atsinaujinimui (pvz. kraujo, epitelinės odos, epitelinės virškinamojo trakto
ląstelės). Kamieninės ląstelės taip pat buvo identifikuotos kituose suagusio organizmo audiniuose,
įskaitant skeleto raumens ir nervų sistemos audinius, kur jų funkcija yra pažeistų audinio ląstelių
pakeitimas.
1961m. E. McCulloch ir J. Till eksperimentiškai pademonstravo, kad viena pelės kaulų čiulpų
ląstelė gali dalintis ir diferencijuotis į bet kurią kraujo ląstelę. Taip buvo identifikuota pirmoji
kamieninių ląstelių grupė, dalyvaujanti kraujo ląstelių susidaryme (hemopoezėje). Šiuo metu
hemopoetinės kamieninės ląstelės yra gerai ištirtos ir puikiai iliustruoja kamieninių ląstelių
vaidmenį palaikant diferencijuotų ląstelių populiaciją.
Yra keli kraujo ląstelių tipai, kurie turi specializuotas funkcijas: eritrocitai (raudonosios kraujo
ląstelės), kurios transportuoja O2 ir CO2, granuliocitai ir makrofagai (fagocitinės ląstelės), kraujo
plokštelės (trombocitai), kurios susidaro iš megakariotų dalyvauja kraujo krešėjime, ir limfocitai,
kurie dalyvauja imuniniame atsake. Visų šių ląstelių gyvavimo trukmė yra ribota (diapazonas nuo
mažiau nei vienos dienos iki kelių mėnesių) ir jos visos yra kilusios iš tos pačios hemopoetinių
kamieninių ląstelių populiacijos. Kiekvieną dieną žmogaus organizme žūsta daugiau nei 100
milijonų kraujo ląstelių, ir toks pats kiekis naujų ląstelių susidaro iš hemopoetinių ląstelių kaulų
čiulpuose. Hemopoetinių ląstelių palikuonys paprastai kelis kartus pasidalina prieš pasirinkdamos
specifinį diferenciacijos kelią, kurį savo ruožtu nulemia specifiniai augimo faktoriai. Pilnai
diferencijavusios kraujo ląstelės nustoja dalintis. Taigi hemopoetinių kamieninių ląstelių
proliferacija užtikrina pastovaus diferencijuotų ląstelių skaičiaus palaikymą.
Žarnyno epitelinių ląstelių atsinaujinimo procesas iliustruoja, kaip atsinaujina epitelinis audinys.
Žarnyno vidus yra išklotas vienu sluoksniu epitelinių ląstelių, kurių funkcija yra maisto virškinimas
ir maisto medžiagų sugėrimas. Kadangi epitelinės ląstelės nuolat yra nepalankioje aplinkoje, jų
gyvavimo trukmė yra tik kelios dienos. Taigi epitelio atsinaujinimas vyksta visą organizmo
gyvenimą. Naujos ląstelės susidaro žarnų kriptų dugne nuolat dalinantis kamieninėms ląstelėms.
Dalinantis kamienėms ląstelėms susidaro pereinamų-amplifikuojančių ląstelių (angl. transitamplifying cells) populiacija, kurios savo ruožtu greitai dalinasi ir užima apie du trečdalius kriptos.
Pereinamos-amplifikuojančios ląstelės dalinasi 3-4 kartus ir tada diferencijuojasi į tris epitelinių
2
ląstelių tipus: absorbcines epitelines ląsteles ir du tipus sekretuojančių ląstelių vadinamas gobleto
ląsteles ir enteroendokrinines ląsteles. Plonosiose žarnose taip pat susidaro ketvirtas ląstelių tipas,
vadinamos Peneth’o ląstelės, kurios sekretuoja antibakterines medžiagas.
Taip pat yra aprašytos kamieninės ląstelės dalyvaujančios odos ir plaukų atsinaujinimo procese.
Odos ir plaukų ląstelės nuolat susidaria su nepalankiom aplinkos sąlygom (pvz. saulės ultravioletinė
spinduliuotė) ir lygiai kaip ir žarnyno epitelinės ląstelės atsinaujina visą organizmo gyvenimą.
Žmogaus epidermis pasikeičia kas dvi savaites, nusineriant paviršiuje esančioms ląstelėms.
Epidermis yra daugiasluoksnis epitelis. Pamatinemia epidermio sluoksnyje yra vienos ląstelės storio
kamieninių ląstelių sluoksnis. Dalinantis epidermio kamieninėms ląstelėms susidaro pereinamosamplifikuojančios ląstelės, kurios pasidalina 3-6 kartus ir juda link išorinio epidermio sluoksnio.
Plaukas yra odos darinys sudarytas iš sukietėjusių epidermio ląstelių. Plauko folikulo sienelėje yra
kamieninių ląstelių sankaupa, kurių dalinimasis lemia plauko augimą. Dalinantis kamieninėms
ląstelėms susidaro pereinamos-amplifikuojančios matrikso ląstelės, kurios proliferuoja ir
diferencijuojasi suformuodamos plauko stiebą. Pažeidus galvos odą plauko kamieninės ląstelės gali
diferencijuotis į epidermį. Tai rodo, kad tai multipotentinės kamieninės ląstelės iš kurių gali
susidaryti ir oda ir plaukas.
Skirtingai nei hematopoetinių, žarnyno epitelio ir odos epidermio kamieninių ląstelių, skeleto
raumens kamieninių ląstelių funkcija yra ne nuolatinis atsinaujinimas, o pažaidų taisymas. Skeleto
raumuo yra sudarytas iš didelių daugiabranduolinių ląstelių (raumens skaidulų), kurios susidaro
susiliejant ląstelėms organizmo vystymosi metu. Paprastai skeleto raumuo yra stabilus audinys,
kuriame ląstelių kaita yra labai maža. Tačiau sužeidus arba po fizinio aktyvumo raumuo gali greitai
regeneruoti dėl raumens kamieninių ląstelių, kurios vadinamos satelitinėmis, proliferacijos.
Satelitinės ląstelės yra išsidėstę tarp raumens skaidulos plazminės membranos ir sarkolemos (angl.
basal lamina). Paprastai jos būna neaktyvios, sustoję G0 ląstelės ciklo fazėje. Sužeidimas arba
fizinis aktyvumas gali aktyvuoti šias ląsteles, jos pradeda dalintis, naujos ląstelės susilieja ir
suformuoja naują raumens skaidulą.
Kamieninės ląstelės taip pat buvo identifikuotos ir kituose suagusiuose audiniuose: smegenyse,
akies tinklainėje, širdyje, plaučiuose, inkstuose, kepenyse, kasoje. Manoma, kad daugumoje, o
galbūt netgi visuose audiniuose yra kamieninių ląstelių. Taip pat tikėtina, kad kamieninės iš vieno
tipo audinio gali diferencijuotis į kito tipo audinį. Toks reiškinys buvo pavadintas “vystymosi
plastiškumu”. Pavyzdžiui buvo atlikti eksperimentai, kuriuose iš kaulų čiulpų izoliuotos
hematoetinės kamieninės ląstelės buvo paveiktos taip, kad diferencijavosi į plaučių ląsteles. Tačiau
suaugusių kamieninių ląstelių vystymosi plastiškomo ribos išlieka kontraversišku klausimu.
Suaugusių kamieninių ląstelių taikymas medicinoje
Suaugusių kamieninių ląstelių gebėjimas regeneruoti pažeistą audinį neabejotinai gali būti
naudingas klinikinėje medicinoje. Jei būtų įmanoma tokias ląsteles izoliuoti ir dauginti auginant
ląstelių kultūroje, jos galėtų būti panaudotos pažeisto audinio pakeitimui ir įvairių ligų gydymui,
pvz. diabeto arba tokių neurodegeneracinių ligų kaip Parkinsono arba Alchaimerio liga.
Kaulų čiulpų transplantacija kai kurių vėžinių susirgimų gydymui yra vienas iš šiuo metu plačiai
taikomų suaugusių kamieninių ląstelių panaudojimo pavyzdžių. Tradiciškai vėžiniai susirgimai yra
gydomi chemoterapija, t.y. panaudojant vaistus, kurie nužudo greitai besidalinančias vėžines
ląsteles pažeisdami DNR ir inhibuodami DNR replikaciją. Tokio gydymo trūkumas yra tas, kad šie
vaistai yra nespecifiniai ir pažeidžia ne tik vėžines, bet ir normalių audinių ląsteles (pvz. kraujo,
odos, plaukų, virškinamojo epitelio), kurių atsinaujinimas priklauso nuo pastovaus kamieninių
ląstelių atsinaujinimo. Hemopoetinės kamieninės ląstelės yra vienos iš greičiausiai besidalinančių
kūno ląstelių, todėl toksiškas antivėžinių vaistų poveikis šioms ląstelėms dažnai apriboja
chemoterapijos efektyvumą. Kaulų čiulpų transplantacija suteikia galimybę ištaisyti vėžinių vaistų
toksiškumo padarinius ir leidžia gydymui naudoti didesnes vaistų dozes, ko pasėkoje gydymas
tampa efektyvesnis. Pirmąjame tokio gydymo etape pacientui yra paskiriama intensyvesnė
chemoterapija, nei įprastom sąlygom ligonis galėtų ištverti dėl toksiško vaistų poveikio kraujodaros
sistemai. Antrąjame etape, pabaigus chemoterapiją, ligoniui yra transplantuojamos naujos
3
hemopoetinės kamieninės ląstelės (izoliuotos iš kaulų čiulpų arba periferinio kraujo) ir taip yra
išvengiama potencialiai mirtinų vaistų sukeltų pažeidimų ir atstatoma normali kraujodaros sistemos
funkcija. Kai kuriais atvejais kamieninės ląstelės yra izoliuojamos iš paciento audinių prieš
chemoterapiją, saugomos iki chemoterapijos pabaigos, o tada transplantuojamos atgal ligoniui.
Tačiau tokiu atveju yra ypač svarbu, kad izoliuotų ląstelių populiacijoje nebūtį vėžinių ląstelių. Kita
galimybė yra ląsteles transplantacijai gauti iš sveiko donoro (paprastai artimo giminaičio), turintčio
su ligonio suderinamo tipo audinius. Taip pat hemopoetinės kamieninės ląstelės gali būti
izoliuojamos iš su ligoniu giminystės ryšiais nesusijusio donoro virkštelės kraujo. Be vėžio gydymo
hemopoetinės kamieninės ląstelės taip pat yra naudojamos ligonių, sergančių kraujodaros sistemos
ligomis, pvz. aplastinei anemijai, su hemoglobino defektais ar imunodeficitu susijusioms ligoms.
Klinikinį pritaikymą taip pat turi ir epitelinės kamieninės ląstelės: jos gali būti naudojamos odos
persodinimui ligoniams su nudegimais, žaizdom ir opom. Tam epiderminės odos ląstelės yra
auginamos in vitro, kol sudaro reikiamo ploto epitelio lakštą, kuris yra persodinamas ligoniui.
Kadangi paties ligonio oda gali būti panaudota tokiai procedūrai, yra išvengiama komplikacijų
susijusių su audinio atmetimu dėl imuninės sistemos poveikio.
Šiuo metu intensyviai vykdomi suaugusių kamieninių ląstelių eksperimentiniai ir klinikiniai
tyrimai, siekiant jas pritaikyti kuo plastesnio ligų rato gydymui. Suaugusio organizmo kamieninių
ląstelių klinikinis taikymas yra ribotas dėl sunkumų, susijusių su reikiamų kamieninių ląstelių
populiacijų izoliavimu ir kultivavimu. Be to, daugelyje suaugusių audinių kamieninės ląstelės iki
šiol dar nėra identifikuotos. Nepaisant to, suaugusio organizmo kamieminės ląstelės jau sėkmingai
naudojamos kai kurių ligų gydymui (Parkinsono ligos, pirmo tipo diabeto ir nugaros smegenų
sužeimų), kai tuo tarpu gemalo kamieninių ląstelių panaudojimas medicinoje išlieka teorinis.
Kadangi suagusio organizmo kamieninių ląstelių naudojimas medicinos tikslams yra etiškai
priimtinesnis nei gemalo kamieninių ląstelių (t.y. nereikia sunaikinti gemalo norint jas izoliuoti) ir
jos sukelia mažiau pavojų paciento sveikatai, jų taikymo galimybių plėtojimas yra labiau
skatinamas.
Gemalo kamieninės ląstelės
Kaip minėta, suaugusio organizmo (somatines) kamienines ląsteles yra sunku izoliuoti ir auginti
kultūroje. Tuo tarpu palyginti paprasta yra izoliuoti ir dauginti kamienines ląsteles iš ankstyvos
stadijos gemalo. Šios ląstelės vadinamos gemalo kamieninėmis ląstelėmis (GKL). GKL gali būti
neribotai auginamos grynose kamieninių ląstelių populiacijose, kur jos išsaugo gebėjimą dalintis ir
diferencijuotis į bet kurio tipo specializuotą suaugusio organizmo ląstelę, t.y. yra pluripotentinės.
Dėl šios priežasties susidomėjimas embrioninių kamieninių ląstelių taikymo galimybe
fundamentaliojo mokslo ir klinikiniuose tyrimuose yra nepaprastai didelis.
GKL iš pelės blastocistų vidinių ląstelių masės buvo izoliuotos ir pradėtos kultivuoti 1981m. (Evans
& Kaufman, 1981). Šios ląstlės gebėjo neribotai daugintis in vitro, o įvestos atgal į ankstyvos
stadijos embrioną jos diferencijavosi į visų pelės audinių ląsteles. Žmogaus GKL buvo izoliuotos iš
žmogaus balstocistos (3-5 dienų amžiaus gemalų) vidinių ląstelių masės (sudaryta iš 50-150
ląstelių) ir pradėtos kultivuoti 1998m. (Thomson et al., 1998). Dėl jau minėto neriboto GKL
gebėjimo atsinaujinti ir pluripotencijos, šios ląstelės yra potencialiai naudingos regeneracinėje
medicinoje (kaip ląstelių šaltinis pakeičiant pažeistą audinį). Šiuo metu daug pastangų yra
dedadama atrenkant optimalias kultivavimo sąlygas, kuriant naujas GKL linijas tinkamas
klinikiniam taikymui, bei ieškant efektyvių metodų įgalinančių kryptingą diferenciacijos
stimuliaciją. Tačiau norint panaudoti terapinį GKL potencialą pirmiausiai yra būtina suprasti
molekulinius mechanizmus nulemiančius specifines šių ląstelių savybes. Iki šiol mechanizmai
nulemiantys GKL atsinaujinimą ir pluripotenciją yra nepilnai išaiškinti.
Nors žmogaus GKL turi kanoninį ląstelės ciklą sudarytą iš G1, S, G2 ir M fazių, tačiau dėl gerokai
trumpesnės G1 fazės bendra ciklo trukmė yra gerokai trumpesnė, nei somatinių ląstelių (trunka 1516 val.), ir tai bent jau iš dalies nulemia greitą GKL dalinimąsi. Buvo nustatyta, kad GKL
transkriptoma (t.y. tam tikrame audinyje ir tam tikrom sąlygom esantis aktyvuotų genų, mRNR, ar
4
transkriptų rinkinys) yra daug paprastesnė nei specializuotų ląstelių. Todėl tikėtina, kad
reguliaciniai veiksniai susiję su specifiniais audinių fenotipais neturi įtakos GKL proliferacijai.
In vivo pluripotencija ir greitas GKL dauginimasis yra laikinas reiškinys. Gemalui vystantis, ląstelių
dauginimasis lėtėja, ir tuo pačiu yra aktyvinama ląstelių diferenciacija į specifinius ląstelių tipus.
Pastarieji reiškiniai yra susiję su mechanizmų, reguliuojančių tam tikrą fenotipą nulemiančių genų
raišką, įjungimu. Šiuo metu jau nustatyti keli GKL dalinimąsi ir pluripotenciją reguliuojantys
veiksniai: transkripcijos faktoriai, ląstelės ciklo reguliatoriai, mikro RNR, genai, susiję su
chromosomų stabilumu ir DNR metilinimu. Tikslūs GKL atsinaujinimą ir pluripotenciją
nulemiantys molekuliniai mechanizmai yra intensyviai tiriami, kadangi šios žinios padėtų tobulinti
GKL auginimo ląstelių kultūroje metodus ir leistų sukurti ląstelių diferenciacijos valdymo
strategijas, kas savo ruožtu labai svarbu, norint panaudoti šias ląsteles ligų terapijai.
In vitro sąlygom pelės gemalo kamieninės ląstelės yra auginamos terpėje su LIF (angl. Leukemia
Inhibitory Factor, leukemiją slopinantis veiksnys), kuris yra būtinas, norint išlaikyti ląsteles
nediferencijuotoje būsenoje. LIF signalas yra perduodamas JAK-STAT signalo perdavimo keliu.
LIF sąveika su ląstelės plazminėje membranoje esančiu citokinų receptoriumi aktyvuoja Janus
kinazę (JAK), kuri fosforilina citokinų receptorių. Receptoriaus fosforilinimas skatina STAT (angl.
Signal Transducers and Activators of Transcription, signalo perdavėjai ir transkripcijos
aktyvatoriai) prisijungimą prie receptoriaus. JAK fosforilina prisijungusį STAT, kas stimuliuoja
STAT hetero ir homodimerų susidarymą. STAT dimerai kaupiasi ląstelės branduolyje ir aktyvina
tam tikrų genų raišką. Jeigu LIF yra pašalinamas iš terpės ląstelės susikaupia į struktūras, panašias į
gemalą (embrioidinius kūnus) ir diferrencijuojasi į įvairius ląstelių tipus: neuronus, adipocitus,
kraujo ląsteles, epitelines ląsteles, lygiojo raumens ląsteles, ir netgi gali suformuoti plakančią širdį.
Žmogaus GKL kultivavimui nereikia LIF, tačiau norint jas išlaikyti nediferencijuotas naudojami kiti
augimo faktoriai, kurių prigimtis dar nevisai išaiškinta.
Svarbu yra tai, kad į kultivavimo terpę pridėjus reikiamų augimo faktorių galima stimuliuoti GKM
diferenciaciją į norimo tipo ląsteles. Tokiu būdu galima pagaminti nemažą kiekį vieno tipo ląstelių
(pvz. širdies arba nervinių ląstelių), kurios gali būti panaudotos transplantacijai. Pvz. jau yra sukurti
pelės GKL diferecijavimo į neuronus metodai. Tokie neuronai buvo panaudoti transplantacijai į
mielino ir Parkinsono liga sergančius graužikus. Šiuo metu daug tyrimimų yra atliekama siekiant
atrinkti GKL kultivavimo sąlygas, kurios skatintų GKL diferenciaciją į tam tikro tipo ląsteles.
Gemalo kamieninių ląstelių panaudojimo medicinoje perspektyvos
Nepaisant to, kad GKL buvo pradėtos kultivuoti 1981m., vis dar nėra patvirtintų žmogaus gydymo
metodų naudojant GKL. GKL yra linkę suformuoti auglius ir piktybines karcinoma, dėl to GKL
transplantai dažnai atmetami organizmo. Daugelyje šalių paskelbti moratoriumai moksliniams GKL
tyrimams arba naujų GKL ląstelių linijų kūrimui. Teoriškai išlieka galimybė, kad GKL ateityje bus
panaudotos regeneracinėje medicinoje (kaip minėta, suaugusio organizmo kamieninės ląstelės jau
naudojamos) kaip ląstelių šaltinis fiziškai ar ligos pažeistų audinių regeneracijai.
1997 metais I. Wilmut su kolegomis pirmą kartą klonavo avį, taip pradėdami naują regeneracinės
medicinos erą. Avis Dolly išsivystė iš neapvaisinto kiaušinėlio, į kurį vietoj normalaus kiaušinėlio
baranduolio buvo įvestas pieno liaukos epitelinės ląstelės branduolys. Tokia procedūra vadinama
somatinės ląstelės branduolio pernešimu. Somatinių ląstelių branduolio pernešimas iš somatinės
ląstelės į kiaušialąstę su pašalintu branduoliu buvo panaudotas kuriant įvairių žinduolių rūšių
klonus: avies, pelės, kiaulių, galvijų, ožkų, triušių ir kačių. Tačiau klonavimas naudojant somatinių
ląstelių branduolio pernešimo procedūrą yra labai neefektyvus: gyvibingas palikuonis išsivysto tik
iš 1-2% embrionų.
Apjungus gyvūnų klonavimą naudojant somatinių ląstelių branduolio pernešimo procedūrą su GKL
savybėmis atsiranada terapinio klonavimo galimybė. Terapinio klonavimo proceso metu
branduolys iš suagusio organizmo ląstelės pernešimas į kiaušialąstę su pašalintu branduolio. Iš
gautos ląstelės in vitro sąlygom užauginamas ankstyvos stadijos gemalas. Iš gemalo izoliuojamos
GKL ir auginamos kultūroje, kur gali būti dirbtinai stimuliuojama jų diferenciacija į reikiamo tipo
specializuotas ląsteles, kurios savo ruožtu gali būti panaudotos transplantacijai tam pačiam
5
somatinio branduolio donorui. Pagrindinis terapinio klonavimo privalumas yra tas, kad susidariusio
gemalo ląstelės yra genetiškai identiškos ląstelėms individo, kuriam GKL bus transplantuojamos,
tokiu būdu išvengiant problemų susijusių su transplantuoto audinio atmetimu dėl imuninės
reakcijos.
Terapinio klonavimo derinimo su genų pernešimu efektyvumas buvo pademonstruotas gydant
įgimtu imunodeficitu sergančią pelę. Šia imunodeficito forma pelės serga dėl geno, koduojančio
RAG2 baltymą, mutacijos. RAG2 reguliuoja genų, susijusių su funkciškai aktyvių antikūnų ir T
ląstelių receptorių susidarymu, rašką limfocituose. Sergančių pelių fibroblastų branduoliai buvo
įvesti į pelės kiaušialąstę, iš kurios buvo pašalintas branduolys. Iš gauto gemalo buvo izoliuotos
GKL, kurios buvo auginamos kultūroje. RAG2 geno defektas buvo ištaisytas į GKL įvedant
plazmidinį vektorių su funkciškai aktyviu RAG2 genu. Toliau buvo stimuliuojama gautų GKL
diferenciacija į hematopoetines kamienines ląsteles, o pastarosios buvo transplantuotos sergančiai
pelei. Buvo parodyta, kad toks gydymas bent iš dalies pagydo pelių imunodeficitą.
Iš esmės terapinis klonavimas galėtų būti vienu iš geriausiu būdų gydyti tokioms sunkioms ligoms
kaip Parkinsono liga, Alchaimerio liga, diabetas ir nugaros smegenų pažaidos. Nors tyrimai, atlikti
su gyvūnais, teikia vilčių, dar nemažai problemų turi būti išspręsta prieš pradedant taikyti terapinį
klonavimą žmonių gydymui. Pagrindinės problemos: (i) etinės (ypač dėl gemalo sunaikinimo ir
reprodukcinio klonavimo galimybės), (ii) poreikis tobulinti gemalų kūrimo metodus, (iii) poreikis
tobulinti kryptingos GKL direfenciacijos stimuliacijos metodus.
Literatūra
1. Cooper GM, Hausman RE. The Cell: A Molecular Approach (4th edition). (2007) ASM press,
Washington, D.C ir Sinauer Associates Inc., Sunderland, Massachucettes, ISBN-13 978-087893-220-7.
2. Animal cell culture: a practical approach (3rd edition). (2000) Masters JR, ed, Oxford University
Press, New York, ISBN 0-19-963797-0.
3. Becker KA, Ghule PN, Therrien JA, Lian JB, Stein JL, van Wijnen AJ, Stein GS. (2006) Selfrenewal of human embryonic stem cells is supported by a shortened G1 cell cycle phase. J Cell
Physiol. 209:883-893.
4. Liu N, Lu M, Tian X, Han Z. (2007) Molecular mechanisms involved in self-renewal and
pluripotency of embryonic stem cells. J Cell Physiol. 211:279-286.
5. Serakinci N, Keith WN. (2006) Therapeutic potential of adult stem cells. Eur J Cancer.
42:1243-1246.
6. Perin EC, Geng YJ, Willerson JT. (2003) Adult stem cell therapy in perspective. Circulation.
107:935-938.
7. Alison MR, Lovell MJ, Direkze NC, Wright NA, Poulsom R. (2006) Stem cell plasticity and
tumour formation. Eur J Cancer. 42:1247-1256.
6
ORGANŲ REGENERAVIMAS
Pagrindinių sąvokų apibrėžimai
Alogeninis – iš tos pačios rūšies organizmo, bet genetiškai skiriasi.
Angiogenezė – naujų kraujagyslių susidarymas, vaskuliarizacija.
Autogeninis – iš to paties organizmo.
Makrokapsuliacija – didelės ląstelių masės ar audinio patalpinimas į biopolimerinę membraną,
norint išvengti imuninės sistemos atsako.
Mikrokapsuliacija – vienos ar kelių ląstelių patalpinimas į biopolimerinę membraną, norint išvengti
imuninės sistemos atsako.
Ksenogeninis – iš skirtingų rūšių organizmų.
Įvadas
Dirbtinių organų panaudojimas gali turėti labai didelį poveikį medicinos praktikai gydant įvairias
įgytas ir paveldėtas ligas. Tikimasi, kad ateityje ląstelių persodinimas gali tapti alternatyviu metodu
donorų organų persodinimui. Kadangi daugelis ląstelių populiacijų gali būti padaugintos auginant
jas ląstelių kultūroje, tereikia nedidelio kiekio donoro ląstelių implantui paruošti. Dėl to nebereikėtų
viso donoro organo, ko pasėkoje padidėtų potencialių donorų skaičius. Kuriamos naujos, organizme
lengvai suįrančios polimerinės medžiagos, kurios galėtų būti panaudojamos kaip laikina,
persodintas ląsteles palaikanti, platforma. Į tokių biopolimerų sudėtį įjungiami ląstelių adheziją ir
augimą skatinantys specifiniai peptidai, augimo ir angiogeniniai veiksniai, ir kitos bioaktyvios
molekulės, kurių bendras poveikis yra ekstraląstelinio matrikso sekrecijos ir natūralaus audinio
regeneracijos stimuliacija. Didžiausia su tokių medžiagų panaudojimu susijusi problema yra
neigiamos organizmo reakcijos į jų buvimą, pvz. kraujo, kontaktuojančio su implantu, krešėjimas,
fibrilinė implantų kapsuliacija. Dėl šios priežasties, norint sumažinti organizmo reakcijas, didelė
dalis tyrimų šioje srityje yra skirta sąveikų tarp polimerų ir biologinių audinių išaiškinimui.
Bendri dirbtinių organų gamybos principai
Žmogaus kūnas yra sudėtinga biologinė mašina sudaryta iš hierarchiškai išsidėsčiusių komponetų
(ląstelės sudaro audinius, audiniai sudaro organus, o organai – organizmą). Normalus organizmo
funkcionavimas yra nulemtas koordinuotos jo dalių veiklos. Tačiau jei kažkuris organizmo
komponentas nustoja normaliai funkcionuoti (dėl ligos ar fizinio pažeidimo), sutrinka viso
organizmo veikla. Dažnai vienintelis būdas norint atstatyti normalią organizmo veiklą yra viso
organo transplantacija. Daugelis gyvybių buvo išgelbėtos tokiu būdu, tačiau dar daugiau buvo
prarasta dėl nepaprastai mažo donorų skaičiaus.
Persodinamų organų trūkumas ir kitos problemos susijusios su organų persodinimu (pvz. organų
atmetimas dėl imuninės sistemos atsako, būtinumas nuolat vartoti imunosupresinius vaistus, donorų
organų išsaugojimas ir transportavimas, techniškai sudėtingos persodinimo operacijos) paskatino
mokslininkus ieškoti alternatyvių metodų nefunkcionuojančių organų pakeitimui. Paaiškėjo, kad kai
kurios medžiagos gali būti panaudotos audinio funkcijos atstatymui ar pakeitimui. Šiam tikslui gali
būti panaudotos nesuardomos ir biologinėse sistemose suardomos sintetinės medžiagos, o taip pat ir
organizmo audiniai.
Medžiagos, naudojamos dirbtinių organų gamybai (pvz. plastmasė gaminat širdį, įvairūs metalai
gaminat vinis, naudojamas sulūžusių kaulų sujungimui), yra pasirenkamos taip, kad ilgai galėtų būti
organizme. Kadangi šios medžiagos yra svetimos organizmui, dažnai atsiranda problemų su
biosuderinamumu, pvz. vyksta atmetimas arba medžiaga suįra, ir galiausiai seną implantą reikia
pakeisti nauju. Vienas iš pavyzdžių yra kartais plyštantys silikoniniai krūtų implantai.
Kadangi daugumos organų funkcija yra atliekama parenchiminių ląstelių, kai kurie organų funkcijos
regeneravimo metodai yra pagrįsti šių ląstelių panaudojimu. Lyginant su viso organo ar jo dalies
persodinimu, šis metodas sumažina atmetimo riziką. Kadangi naudojamos tik parenchiminės ląstlės,
eliminuojant kitas organo ląsteles, kurios prisideda prie imuninio atsako sukėlimo, po persodinimo
stebimas mažesnis imuninis atsakas. Paėmus nedidelę organo audionio biopsiją, in vitro galima
1
užauginti gana didelius ląstelių kiekius, kurie gali būti panaudoti persodinimui. Audinio biopsija
gali būti paimta iš ligonio arba iš artimo giminaičio. Tokio metodo taikymas labai padidintų donorų
skaičių, sumažintų poreikį laukti organų iš mirusių donorų, pacientas būtų mažiau traumuojamas
operacijos metu, bei sumažėtų gydymo išlaidos.
Viliantis, kad atskiros parenchiminės ląstelės organizme galėtų suformuoti funkcionalų organą,
parenchiminės ląstelės buvo injekuotos į organizmo ertmes. Toks bandymas buvo atliktas su įvairių
tipų ląstelėmis, tačiau be rezultatų, nesusiformavo jokios organą primenančios struktūros. Tam, kad
išgyventų, proliferuotų ir normaliai funkcionuotų dauguma ląstelių turi būti prisitvirtinę prie kokio
nors pagrindo. Todėl buvo sukurtas metodas, kuriame ląstelės yra pritvirtinamos prie tam tikros
polimerinės matricos ir tik tada implantuojamos į norimą organizmo vietą. Buvo nustatyta, kad
norint, kad ląstelės sąveikautų ir funkcionuotų kaip audinys, jos turi būti arti viena kitos. Taip pat
normaliam ląstelių funkcionavimui yra svarbu, kad jos gautų maisto medžiagų ir iš jų būtų
pašalinamos susidarančios kenksmingos medžiagos, o tam ląstelės turi būti arti kraujagyslės.
Atsižvelgiant į šiuos veiksnius buvo pagamintos matricos iš organizmo ekstraląstelinės matricos
baltymų (pvz. kolageno ir glikozamonoglikanų). Tokios matricos buvo įvestos į organizmą tikintis,
kad jos pritrauks ląsteles iš svekų audinių ir taip skatins pazeisto audinio regeneraciją. Taip pat šios
matricos yra naudojamos kaip šablonas, pagal kurį persodintos ląstelės regeneruoja nervus, odą,
kraujagysles, dantenų audinį, kremzlę ir kaulus. Tačiau vis dar yra techniškai sunku pagaminti
baltymines matricas, kurios yra reikiamų formų ir pasižymi pageidaujamomis mechaninėmis
savybėmis. Be to, buvo pastebėta, kad jų įvedimas į organizmą gali skatinti visai kitų nei
pageidaujama ląstelių tipų proliferaciją.
Organų regeneracijai taip pat pradėti naudoti sintetiniai polimerai kurie organizme yra suardomi.
Šios medžiagos naudojamos kaip platforma persodintoms ląstelėms, kuri joms dalinantis skatina
tam tikrą ląstelių išsidėstymą. Parenchiminės ląstelės yra izoliuojamos iš audinio, pasėjamos
polimerinėje matricoje ir persodinamos į organizmą. Ląstelėms dalinantis organizme jos sekretuoja
ektraląstelinės matricos baltymus, kas skatina polimerinės matricos irimą. Augančios ląstelės,
ekstraląstelinė matrica ir besiformuojančios kraujagyslės palaipsniui užpildo dėl matricos irimo
atsirandančias ertmes.
Biodegraduojami sintetiniai polimerai turi būti pagaminti taip, kad ląstelės galėtų prie jų
prisitvirtinti, ląstelės neprarastų savo funkcijų ir stimuliuotų ląstelių augimą. Dauguma polimerų
naudojamų ląstelių persodinimui yra poliesteriai ir polianhidridai. Jie gaminami lakštų, porėtų
struktūrų ir fibrilinių grandinių, kurios savo ruožtu gali būti sumegztos į tinklą, forma. Šių
medžiagų irimas organizme gali vykti dėl visos matricos degradacijos, visos matricos erozijos arba
matricos paviršiaus erozijos. Visos matricos degradacijos metu, polimero grandinės yra tolygiai
sukarpomos visame matricos tūryje. Polimero molekulinė masė nuolat mažėja, kol polimero
grandinių fragmentai tiek sumažėja, kad ištirpsta. Visos matricos erozijos metu matrica yra
netolygiai suskaidoma, o susidarę fragmentai palaipsniui ištirpsta. Vykstant matricos paviršiaus
erozijai polimero grandinės yra nukerpamos tik ties paviršiumi, todėl matriza mažėja pamažu.
Svarbi organizme suįrančių biopolimerų grupė, kuri yra patvirtintinta naudojimui žmogaus
organizme, yra poli pieno rūgštis (poli laktatas), poli glikolinė rūgštis (poli hidroksiacetinė rūgštis)
ir jų kopolimerai. Šių polimerų degradacijos organizme metu susidaro mažos molekulinės masės
junginiai, pieno rūgštis ir glikolinė rūgštis, kurios yra įprasti ląstelės metabolitai. Sintetiniai
polimerai gali būti pagaminti specifinės formos (kokios reikia implantui paruošti), jų porų dydis ir
paviršiaus plotas gali būti pritaikytas maksimaliai ląstelių adhezijai, o polimero degradacijos greitis
gali kisti nuo kelių dienų iki kelių metų. Polimerinės matricos iš poli pieno ir poli glikolinės rūgšties
degraduoja organizme vykstant jų irimui visame matricos tūryje. Irimo greitis priklauso nuo
kopolimerų santykio, pH ir tempertūros, ir vyksta dėl esterinės jungties hidrolizės (Pav 1).
homopolimero (pieno rūgšties ar glikolio rūgšties) hidrolizės greitis yra minimalus, tuo tarpu
poli(pieno-ko-glikolio rūgšties) polimerų, sudarytuose iš skirtingų monomerų santykiu 50:50
hidrolizės greitis yra maksimalus. Hidrolizės greitis didėja didėjant temperatūrai ir šarmėjant arba
rūgštėjant terpės pH.
2
H
O
H
O
O
H
O
H
O
O
O H3C H
O H3C H
Poli(pieno-ko-glikolio rugstis)
+H2O
H
O
H
O
H
OH
O
H
O
HO
O H3C H
O H3C H
+H2O
O
HO
O
OH
H3C H
Pieno rugstis
+
HO
OH
H H
Glikolio rugstis
Pav. 1 Poli(pieno-ko-glikolio rūgšties) kopolimerų hidrolizės
schema.
Biodegraduojami polimerai gali būti prieš persodinimą vaskuliarizuoti. Tai ypač svarbu, kai
persodinto tipo ląstelių išlikimas ir normalus funkcionavimas priklauso nuo optimalaus maisto
medžiagų tiekimo. Į polimerų matricas gali būti įterptos įvairios biologiškai aktyvios molekulės,
inhibuojančios imuninį atsaką ar skatinančios ląstelių adheziją, pvz. augimo faktoriai, augimo
slopikliai, angiogeniniai, imunosupresiniai ir diferenciaciją skatinantys veiksniai. Matricai
palaipsnui degraduojan, šie veiksniai yra lėtai atpalaiduojami į implanto aplinką, kur jie skatina
audinio regeneraciją. Biomolekulės gali būti prijungiamos kovalentiškai arba fiziškai įterpiamos į
polimero matricą.
Kai kurių organų atveju neįmanoma in vivo užauginti persodinimui reikiamo kiekio ląstelių. Tada
audinys gali būti pesodintas iš kitos rūšies organizmo. Kai pagrindinė persodintų ląstelių
populiacijos funkcija yra metabolinė reguliacija ir aktyvumas, gali būti persodinami į membraninę
kapsulę patalpintos ksenogeninės (iš kitos rūšies organizmo) ląstelės arba audiniai. Membranos yra
sukonstruojamos taip, kad kapsulės viduje esančios ląstelės ar audiniai yra apsaugoti nuo kontakto
su organizmo, taip išvengiant imuninio atsako. Tačiau per membranas gali vykti medžiagų apykaita:
ląstelių gaminami metabolitai tampa prienami visam organizmui (pvz. insulinas), o maisto
medžiagos iš aplinkos patenka į kapsuliuotas ląsteles (pvz. gliukozė).
Kiekvieną organą sudarančios ląstelės turi unikalias funkcijas. Todėl skirtingų organų regeneracijai
dažnai reikia skirtingų polimerinių matricų. Sekančiuose skyreliuose bus aptartos kasos ir kepenų
regeneravimo strategijos.
Kasa. Vis daugiau žmonių pasaulyje serga diabetu. Daugelyje valstybių sergančių diabetu skaičius
sudaro 5-10% visos populiacijos. Prognozuojama, kad suaugusių žmonių, sergančių diabetu
skaičius pasaulyje padidės nuo 171 milijono 2000 metais iki 300 milijon 2030. Diabetas (pirmo ir
antro tipo) yra liga, kuria susergama dėl gliukozės homeostazės sutrikimų. Pirmo tipo diabetu
susergama dėl to, kad dėl įvairių priežasčių (imuninių, infekcijos) organizme yra sunaikinamos
insuliną sistetinančios kasos β ląstelės. Antro tipo diabetu susergama dėl to, kad raumens ir
riebalinis audinys tampa atsparus insulino poveikiui ir sutrinka insuliną sistetinančių kasos β
ląstelių funkcija. Ligoniai, sergantys pirmo tipo diabetu ir vėlesnėse antro tipo diabeto stadijose,
paprastai yra gydomi insulino injekcijomis. Alternatyvus metodas diabetui gydyti yra kasos
persodinimas, tačiau donorų yra daug mažiau, nei ligonių.
2000 metais buvo sukurtas modifikuotas žmogaus kasos (Langerhanso) salelių izoliavimo ir
imunosupresijos protokolas, kuris stipriai pagerino persodintų salelių prigijimą ir paspartino salelių
izoliavimo ir persodinimo tyrimus. 1999-2005 metais daugiau nei 350 ligonių buvo atliktos salelių
persodinimo operacijos. Apie 70–80% ligonių praėjus metams nuo transplantacijos tapo
nepriklausomi nuo insulino injekcijų, tačiau tik 10% išliko visiškai nepriklausomi praėjus penkiems
metams po persodinimo operacijos. Paprastai persodinimui reikia 6000–9000 salelių vienam ligonio
3
kūno masės kilogramui, t.y. reikia apie 0.5-1 milijono salelių vienam persodinimui. Normalaus
žmogaus kasoje yra apie apie milijonas salelių, tačiau izoliavimo procedūros metu geriausiu atveju
galima gauti 400000 ar netgi daug mažiau. Tai reiškia, kad transplantacijai reikia 2–4 donorų, kas
dažnai yra sunkiai pasiekiama. Taigi šioje srityje didžiausias dėmesys yra skiriamas salelių
izoliavimo ir konservavimo metodų tobulinimui.
Ksenogeninių kasos ląstelių persodinimas gali stipriai padidinti prieinamų donorų skaičių. Tačiau
tai taip pat reiškia, kad norint išvengti implanto atmetimo, reikės panaudoti medžiagas persodintų
salelių izoliavimui nuo ligonio imuninės sistemos. Kasos salelės gali būti patalpinamos į
polimerinių membranų kapsules, per kurias gali vykti mažų molekulių apykaita, būtina normaliam
salelių funkcionacimui (t.y. insulino, gliukozės, deguonies), tačiau per membranas negalėtų pereiti
didesnės imuninės sistemos molekulės (imunoglobulinai).
Vienas iš plačiai ištirtų metodų yra žiurkės kasos salelių mikrokapsuliacija hidrofiliniame alginato
gelyje su papildomu polimeriniu apvalkalu, kuris praleidžia tik tam tikro dydžio molekules. Buvo
parodyta, kad persodinus tokias kapsuliuotas saleles diabetikių žiurkių kraujyje atstatomas normalus
gliukozės lygis, kuris išlieka normalus ilgus laiko tarpus (mėnesiais). Mikrokapsuliacijai taip pat
gali būti naudojami polielektrilitų kompleksai, kurie yra ypač patrauklūs dėl to, kad salelių
kapsuliacijos procesas yra paprastas. Mikrokapsuliuotų salelių persodinimo privalumas yra tas, kad
labai padidėja implantų sąlyčio su ligonio organizmu paviršiaus plotas. Pagrindinė problema
susijusi su mikrokapsuliuotų sąlelių panaudojimu yra neoptimali svarbiausių metabolitų (gliukozės
ir insulino) difuzija per membranas.
Normalioj kasoj yra kapiliarų tinklas, kuris išraizgo visą organą ir netgi į kasos saleles, ir aprūpina
kiekvieną kasos ląstelę deguonimi. Tai reiškia, kad difuzijos atstumas tarp ląstelės ir kraujagyslės
yra labai mažas. Mikrokapsuliuotų salelių atveju netgi optimaliom vaskuliarizacijos sąlygom
medžiagų difuzija bus apsunkita dėl alginato gelio ir išorinės kapsulės membranos. Tai reiškia, kad
stimuliuojant kapsuliuotas ląsteles gliukoze, insulino sekrecija bus uždelsta. Taip pat, dėl salelėje
vykstančių oksidacinių procesų, gali susidaryti deguonies koncentracijos gradientas, kadangi dėl
lėtesnės difuzijos deguonis iš kraujotakos lėčiau pateks į ląsteles, esančias saleles centre. Šiuo metu
intensyviai ieškoma būdų išspręsti su difuzija susijusias problemas.
Didelio skaičiaus kasos salelių kapsuliacijai naudojamas metodas vadinamas makrokapsuliacija.
Makrokapsulės gali būti intravaskuliarinės ir ekstravakuliarinės ir yra gaminamos iš tokių pačių
pusiau pralaidžių membranų kaip ir mikrokapsulės. Intravaskuliarinė kapsulė yra sudaryta iš
vamzdelio su dviguba sienele, kuris yra tiesiogiai prijungtas prie ligonio kraujotakos sistemos.
Kraujas teka vamzdelio viduriu, o mažos molekulės difunduoja per membraną į kapsulės skyrių,
kuriame supakuotos kasos salelės (t.y. tarp vamzdelio membranų). Didžiausiasi tokio aparato
trūkumai yra: (i) daug mažesnis paviršiaus plotas lyginant su mikrokapsulėm, (ii) storesnės
makrokapsulės membranos dar labiau apriboja medžiagų difuziją. Paviršiaus plotas gali būti
padidintas naudojant mažo diametro vamzdelių pluoštus, tačiau tokių darinių panaudojimas skatina
kraujo krešėjimą. Ekstravaskuliarinių kapsulių konstrukcija yra tokia pati, kaip ir mikrokapsulių, bet
jos yra didesnės. Naudojant ekstravaskuliarines kapsules susiduriama su tom pačiom difuzijos
problemom, kaip ir su intravaskuliarinėm kapsulėm. Atskirų kasos ląstelių makrokapsuliacija gali
padėti išspręsti problemą, susijusią su mažu paviršiaus plotu ir medžiagų difuzija tarp atskirų
ląstelių.
Kepenys. Hepatocitai yra lengvai auginami in vitro ląstelių kultūroje. Todėl persodinimui gali būti
naudojamos ir autogeninės ir alogeninės ląstelės. Pirmasis polimeras panaudotas kepenų
regeneracijai buvo notūralus organizmo ekstraląstelinės matricos baltymas lamininas. Šių baltymų
pagalba persodintoms ląstelėms sukuriama aplinka, kuri imituoja sąlygas kepenyse. Paaiškėjo, kad
jie nepaprastai svarbūs ilgalaikiam persodintų ląstelių funkcionalumui. Pagrindinis ekstraląstelės
matricos baltymų trūkumas yra tas, kad jie yra nepakankamai kietos struktūros, kad iš jų būtų
galima pagaminti matricą implantavimui. Dėl to buvo susintetintos medžiagos savo erdvine
struktūra panašios į ekstraląstelinės matricos baltymų, tačiau tvirtesnės. Kepenys yra labai
vaskuliarizuotas organas, kurio ląstelės yra išsidėstę tam tikra tvarka. Todėl dirbtinės matricos
4
panaudojimas galėtų palengvinti struktūrizuotą persodintų ląstelių išsidėstimą ir organo
regeneraciją.
Kolagenu padengti dekstrano mikro nešikliai buvo sėkmingai panaudoti kaip substratai hepatocitų
prisitvirtinimui. Kolagenas palengvina ląstelių prisitvirtinimą, o dekstranas suteikia tvirtą pagrindą
ir užtikrina didelį paviršiaus sąlyčio su aplinka plotą. Buvo parodyta, kad žiurkėms persodinti
mikronešikliai sudaro agregatus, kurie yra kaip šablonas formuojantis naujam audiniui ir susidarant
naujoms kraujagyslėms. Šis metodas buvo sėkmingai panaudotas žiurkės kepenų funkcijų
palaikymui, kai dalis organo buvo pašalinta.
Biodegraduojami polimerai, pvz. poligalaktinas, poliortoesteriai, polianhidridai ir poli(α-hidroksi
esteriai), bei nedegraduojami polimerai (pvz. polivinilo alkoholis) buvo panaudoti kaip matricos
persodintiems hepatocitams. Šių medžiagų panaudojimo privalumas yra tas, kad jų savybės gali būti
lengvai modifikuojamos. Pvz. prieš ląstelių implantaciją į matricą, ji gali būti apdorota tai, kad
susidarančių porų dydis skatintų maksimalią vaskuliarizaciją.
Apibendrinant, sėkmingam kepenų ląstelių persodinimui yra būtina paruošti jau vaskuliarizuotą
polimerinę matricą, parinkti matricos komponentus, kurie skatina ląstelių adheziją, diferencijuotų
ląstelių funkciją, bei erdvinę matricos struktūrą, kuri skatina ir tvarkingą ląstelių ir susidarančių
kapiliarų išsidėstymą besiformuojančiame audinyje.
Literatūra
1. Molecular Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference. (1995) Robert A.
Meyers (Editor), Wiley-VCH, ISBN: 978-0-471-18571-0
2. Animal cell culture: a practical approach (3rd edition). (2000) Masters JR, ed, Oxford University
Press, New York, ISBN 0-19-963797-0.
3. Paget M, Murray H, Bailey CJ, Downing R. (2007) Human islet isolation: semi-automated and
manual methods. Diab Vasc Dis Res. 4:7-12.
5
VAKCINŲ BIOTECHNOLOGIJA
Pagrindinių sąvokų apibrėžimai
Adjuvantiniai (papildomi, pagalbiniai) genai – tai genai (paprastai limfokinų), kurie yra dažnai
naudojami rekombinatinių vakcinų veiksmingumui padidinti.
Bakulovirusas – tai DNR virusas infekuojantis vabzdžius, kuris yra plačiai naudojamas pigiai ir
didelės išeigos rekombinatinių baltymų gamybai vabzdžių ląstelėse arba lervose.
Chimerinis – terminas taikomas apibūdinti dviejų ar daugiau nukleino rūgščių ar baltymų suliejimo
produktą.
Rekombinantinis – organizmas, nukleino rūgštis arba baltymas pagamintas naudojant genų
inžineriją.
Vaccinia virusas – virusas priklausantis Orthopoxvirus genčiai, kuris suteikia imunitetą prieš keletą
orthopox virusų (pvz. raupus).
Vektorius – bakterija, virusas arba plazmidė, kuri yra panaudojama DNR molekulės įvedimui
kuriant rekombinantus.
Įvadas
Problemų, susijusių su įprastomis vakcinomis, sprendimui šiuo metu pasitelkiami inovatyvūs
molekulinės biologijos metodai. Biotecnologijų pažanga leido sukurti naują kartą vakcinų, kurių
gamybai panaudojami netradiciniai metodai. Tai vakcinos, pagamintos iš patogenų subvienetų arba
sintetinių peptidų bei gyvos rekombinantinės vakcinos. Daugiausiai vilčių teikia gyvos
rekombinantinės vakcinos, pagamintos izoliavus imunizuojantį geną iš sergančio organizmo ir
įvedant jį į vektorių. Tokios vakcinos gali suteikti imunitetą prieš patogeninus, kurių patogeniškumo
neįmanoma susilpninti ar inaktyvuoti tuo pačiu nesunaikinant ir imunogeniškumo.
Rekombinantinės vakcinos
Gyvų rekombinatinių vakcinų naudojimo privalumas, lyginant su tradicinėmis gyvomis vakcinomis,
yra tai, kad sumažėja rizika saugumui ir transportavimo nepatogumai. Rekombinatinių vakcinų
kūrimui jau panaudoti genai iš keleto virusų, pvz. beždžionių viruso 40, jaučio papilomos viruso,
adenovirusų, herpes virusų ir retrovirusų. Ypač parankus vektorius rekombinantinių vakcinų prieš
gyvūnų ir žmogaus patogenus kūrimui yra Vaccinia virusas (VV). VV yra didelis, sudėtingą
apvalkalą turintis, dvivijės DNR virusas, priklausantis Poxviridae šeimai, Orthopoxvirus genčiai.
VV genomas yra apie 190 kbp ilgio, koduoja ~250 genų, o viriono išmatavimai yra apie 360 × 270
× 250 nm. VV pagrindu buvo sukurta vakcina padėjusi išnaikinti raupus. Kai VV pagrindu sukurtos
vakcinos sudėtyje yra rekombinantinis komponentas, po vakcinacijos vyksta ir VV, ir į VV genomą
įjungto svetimo geno replikacija ir raiška, ko pasėkoje vakcinuotas individas įgyja imunitetą prieš
abu patogenus. VV genome yra 19 galimų svetimų genų įjungimo vietų. Be to, rekombinantų
identifikavimą palengvina galimybė panaudoti visą eilę genų-žymenų (t.y. genas, nulemiantis
atsparumą antibiotikui) ir reporterinių genų (t.y. genas, kurio produktas (baltymas) yra lengvai
nustatomas). Kadangi VV rekombinatų gamyba yra nesudėtinga, atsirado galimybė pagaminti
vakcinas, kurios imunizuotų prieš keletą patogenų iš karto.
Vaccinia viruso rekombinantai
Pirmas žingsnis kuriant vakciną Vaccinia viruso pagrindu yra plazmidės, su jos sekoje įterptu
chimeriniu genu, sukonstravimas. Tam VV promotoriaus seka yra suliejama su svetimą baltymą
koduojančia seka, kurios galuose yra prijungtos DNR sekos iš ne esminių VV genomo sričių. Toks
chimerinis genas yra įjungiamas į VV genomą naudojant homologinę rekombinaciją audinių
kultūros ląstelėse, kurios buvo užkrėstos laukinio tipo VV ir tada transfekuotos plazmide. Iš esmės
chimerinis genas gali būti įjungtas bet kurioje ne esminėje VV genomo srityje, tačiau geno
įjungimas timidino kinazės (TK) geno lokuse turi privalumų, nes susidarantys rekombinantai yra
TK−. TK− fenotipo rekombinantiniai virusai yra mažiau patogeniški, o be to juos lengva atskirti nuo
laukinio tipo TK+ virusų auginant su 5-bromodeoksiuridinu (timidino analogas). Naujų
1
rekombinantų patikrinimo procesas gali būti pagreitintas jei į VV genomą yra įvedami ne tik
imunizuojantys, bet ir reporteriniai genai, pvz. E.coli β-galaktozidazės (LacZ) genas. Jei vyksta
LacZ geno raiška, terpėje su 5-bromo-4-chloro-3-indolil-β-D-galaktozidaze (Xgal) susidaro
mėlynos viruso kolonijos.
Čia mes aptarsime tris vaccinia viruso rekombinantus, kurie buvo panaudoti kaip vakcinos prieš: (i)
galvijų marą (angl. rinderpest) (GM), (ii) vezikulinį stomatitą (VS), (iii) beždžionių imunodeficito
virusą (BIV), ir (iv) žmogaus imunodeficito virusą (ŽIV).
Vaccinia viruso rekombinantinė vakcina prieš galvijų marą. Galvijų maras yra staigi, karščiavimą
sukelianti ir labai užkrečiama liga, kuria serga Atrajotojų (Ruminantia) pošeimio atstovai (ypač
naminiai raguočiai ir buivolai Afrikoje ir Azijoje). Sergant šia liga mirtingumas yra 90%. Šiuo metu
yra naudojamos trijų tipų vakcinos prieš GM: (i) kaprinizuotos (pagaminamos po serijinių laukinio
tipo viruso pasažų per ožkos organizmą), (ii) lapinizuotos (pagaminamos po serijinių laukinio tipo
viruso pasažų per triušio organizmą), (iii) Plowright’o audinių kultūrų. Tai gyvos vakcinos, kuriose
viruso patogeniškumas yra susilpnintas. Visoms gyvoms vakcinoms būdingi trūkumai yra:
nestabilumas kaitinant, specializuotų audinių kultivavimo laboratorijų ir šalto transportavimo
infrastruktūros (angl. cold chain) būtinumas (pastaroji sąlyga ypač svarbi šilto klimato šalyse), bei
nevienodas vakcinų patogeniškumo laipsnis. Tuo tarpu liofilizuotas VV yra atsparus karščiui,
lengvai pagaminamas, sandėliuojamas ir transportuojamas. Be to, vakcinaciją gali atlikti minimaliai
apmokytas personalas.
Galvijų marą sukelia apvalkalą turintis vienvijės RNR virusas, kuris priklauso Morbillivirus
genčiai, Paramyxoviridae šeimai (šiai šeimai taip pat priklauso žmogaus tymus, šunų marą, bei
smulkių atrajotojų (ožkų, avių) marą (peste des petits ruminants, PPR) sukeliantys virusai). Tyrimai
parodė, kad Paramyxoviridae šeimos virusų paviršiaus baltymai hemagliutininas (H) ir susiliejimo
baltymas (F) suteikia imunitetą prieš šiuos virusus. Naudojant labai virulentišką galvijų maro viruso
Kebete ‘O’ štamą buvo ištirti 8 viruso baltymai. Genams, koduojantiems 5 baltymus (fosfobaltymą
(P), H, F, nukleobaltymą (N), matriksą (M)) buvo susintetintos DNR kopijos (cDNR) ir nustatyta
nukleotidų seka. Naudojant standartines procedūras buvo sukonstruoti viengubi VV rekombinantai
ekspresuojantys H geną (vRVH) ir F geną (vRVF), ir dvigubas rekombinantas ekspresuojantis abu
genus (vRVFH). VV genai koduojantys timidino kinazę ir hemagliutininą buvo tikslingai
inaktyvuoti į jų seką įterpiant H ir F genus, ko pasėkoje VV virulentiškumas buvo dar labiau
susilpnintas.
vRVH, vRVF ir vRVFH gebėjimas sukelti imuninį atsaką buvo tirtas su naminiais raguočiais.
Visuose viengubais rekombinantais vakcinuotuose gyvūnuose inokuliacijos vietoje jau po 4 dienų
atsirado raupų žaizdos, kurios visiškai užgijo po 2 savaičių. Galvijuose, vakcinuotuose dvigubu
rekombinantu, raupų inokuliacijos vietoje neatsirado, o tai rodo, kad šios vakcinos virulentiškumas
yra labai sumažėjęs. Visų rekombinantais vakcinuotų galvijų organizme gaminosi serumą
neutralizuojančius antikūnus prieš galvijų maro virusą. Kartu su vakcinuotais galvijais laikant
nevakcinuotus buvo nustatyta, kad VV rekombinatų perdavimas nevyksta galvijams kontaktuojant.
Norint įvertinti vakcinos suteiktą imunitetą, visiems tirtiems gyvūnams praėjus 35 dienoms nuo
imunizacijos į kaklo limfmazgį buvo suleista didelė dozė galvijų maro virusų, kuri audinių kultūroje
infekuotų 50% populiacijos, o gyvame organizme sukelia gyvulių marą ir 100% mirtingumą.
Vakcinuoti galvijai buvo pilnai apsaugoti nuo ligos, nors kai kurių galvijų, vakcinuotų vRVF,
organizme pasireiškė anamnezinis atsakas, kas rodo, kad vyksta galvijų maro viruso replikacija.
Taip pat tyrimai parodė, kad vRVFH yra nepatogeniškas ir kitiems gyvūnams, pvz. pelėms,
sveikoms ir beždžionių imunodeficito virusu infekuotoms rezus makakoms. Taigi apibendrinant,
tyrimų rezultatai rodo, kad VV rekombinatinės vakcinos gali būti veiksminga priemonė prieš
galvijų ir smulkių atrajotojų marą.
Vaccinia viruso rekombinantinė vakcina prieš vezikulinį stomatitą. Viena iš pirmųjų VV
rekombinatinių vakcinų buvo prieš vezikulinį stomatitą (VS) (ligą sukelia VS virusas priklausantis
Rhabdoviridae šeimai, Vesiculovirus genčiai). VS yra užkrečiama liga paplitusi išimtinai Šiaurės ir
Pietų Amerikoje, kuria serga arkliai, raguočiai ir kiaulės, ir kurios charakteringi simptomai yra
vezikuliniai pažeidimai ant liežuvio ir burnos gleivinės. Kaip modelinis organizmas VS tyrimams
2
naudojama pelė, kurioje ši liga sukelia neuropatiją ir 100% mirtingumą. VS yra ypatinga tuo, kad
diagnozuojant ligą, dėl identiškų simptomų, ji dažnai sumaišomas su snukio ir nagų liga.
Vakcinacija prieš VS yra uždrausta JAV, kadangi yra neįmanoma atskirti vakcinuotų nuo natųraliai
infekuotų gyvūnų. Nepaisant to, naudojant serologinius metodus yra įmanoma atskirti gyvūnus,
vakcinuotus preparatais, pagamintais iš imunogeninių baltymų subvienetų. Realiai, vakcinų,
pagamintų iš subvienetų ir gyvų vakcinų privalumai gali būti apjungti sukūrus VV rekombinatinę
vakciną ekspresuojančią specifinius VS viruso (VSV) baltymus. VSV rekombinantai buvo
sukonstruoti remiantis tais pačiais principais kaip ir galvijų maro virusui. Vakcinos kūrimui buvo
pasirinktas VSV paviršiaus glikobaltymas G, kadangi eksperimentai su pelėmis parodė, kad šis
imunogenas sukelia apsauginį imuninį atsaką. Naudojant glikobaltymo G mRNR buvo sussintetinta
cDNR, kuri buvo sulieta su VV promotorium ir įjungta į VV genomą. Gauti rekombinantai
išsaugojo gebėjimą infekuoti šeimininko ląsteles ir sintetino panašaus ar identiško, kaip ir natūralūs
VSV baltymai, dydžio ir antigeniškumo polipeptidus. Vakcinuotų pelių organizme VSV serumą
neutralizuojantys antikūnai pradėjo gamintis po 14 dienų ir jų sintezė nuolat didėjo iki 42 dienos po
vakcinacijos. Papildoma vakcinacija po 28 dienų 7-8 kartus padidino serumą neutralizuojančių
antikūnų titrą. Infekavus VS virusu vakcinuotas peles, visos buvo apsaugotos nuo viruso poveikio,
tuo tarpu kontrolinių pelių mirtingumas buvo 100%. Panaudojus šią rekombinantinę VV vakciną
prieš VSV galvijų vakcinacijai du trečdaliai paskiepytų galvijų buvo apsaugoti nuo VSV infekcijos.
Tai, kad ne visi galvijai įgijo imunitetą prieš VSV po vakcinacijos rodo, kad pilnai apsaugai nuo
viruso taip pat būtinas gyvūno organizmo imuninės sistemos ląstelių atsakas, kurio ši vakcina
nestimuliuoja. Viena iš galimybių padidinti apsauginį vakcinos poveikį yra sukonstruoti
rekombinantus, kurie sintetintų daug didesnius glikobaltymo G kiekius.
Bakoloviruso ekspresijos vektoriai
Bakuloviruso rekombinantinės sistemos pasižymi gebėjimu sintetinti didelius kiekius baltymų,
kurie savo ruožtu gali būti panaudojami vakcinų, pagamintų iš antigenų subvienetų, gamybai. Iki
68% baltymų, sintetinamų rekombinantiniu bakulovirusu infekuotų Spodoptera exigua lervų, yra
rekombinantinis baltymas. Naudojant imunofermentinį ELISA metodą (angl. Enzyme-Linked
ImmunoSorbent Assay) buvo parodyta, kad kai sintetinamas toks kiekis rekombinantinio baltymo,
jį galima naudoti diagnostiniuose tyrimuose neišgrynintą, nes jautrumas nuo to nė kiek nesumažėja
bei nepastimas kitų baltymų poveikis.
Bakulovirusų ekspresijos vektorių panaudojimas buvo įdiegtas gaminant monokloninius antikūnus
prieš vieną specifinį viruso baltymą ar potogeną, sudarytą iš kelių baltymų, kai imunizacijos ar
tikrinimo (skriningo) procedūrai nebūtinas išgrynintas antigenas. Š sistema buvo efektyvi gaminant
monokloninius antikūnus neįprastiems antigenams (pvz. Alcheimerio baltymas) ar antigenams,
kurių biologinį aktyvumą ( hemagliutinaciją ar neutralizaciją) yra sudėtinga patikrinti (pvz. VSV N
baltymas).
Rekombinantinės VV ir bakuloviruso vakcinos prieš bežbdionių imunodeficito virusą (BIV).
Makakos, užkrėstos BIV, yra veritngas eksperimentinis modelis, bandant sukurti vakciną prieš
žmogaus imunodeficito virusą (ŽIV). Nors vis dar abejotina, ar kada nors bus pagamintos gyvos
retrovirusinės vakcinos, kurios patenkins saugumo reikalavimus, keliamus žmogaus vakcinoms,
tačiau neseni eksperimentiniai rezultatai teikia vilčių. Rezus makakose buvo atliekti tyrimai su gyva
rekombinantine VV vakcina ekspresuojančia BIV glikobaltymus. Vakcinos poveikui sustiprinti
gyvūnai yra papildomai vakcinuojami tuo pačiu rekombinatiniu subvienetiniu antigenu
ekspresuojamu žinduolių ląstelėse, Kinijos žiurkėno kiašialąstėse, ar bakuloviruso ekspresijos
vektoriuje. Gauti rezultatai rodo, kad šiek tiek didesnė apsauga nuo BIV yra pasiekiama atlikus
dvigubą vakcinaciją su VV ir bakuloviruso rekombinantinėm vakcinom, negu tik su VV.
Rekombinantinių VV ir bakulovirusų vakcinų panaudojimo perspektyvos. Nors nei VV, nei
bakulovirusų rekombinantinės vakcinos neapsaugo nuo BIV ifekcijos, tačiau in vitro tyrimai
parodė, kad po 2 savaičių po vakcinacijos viruso replikacija yra slopinama, o virusų kiekis plazmoje
(viremija) yra daug mažesnis makakose, vakcinuotose naudojant rekombinantinę vakciną prieš
vieną iš BIV paviršiaus glikobaltymų. Šie tyrimai rodo, kad imunizacija BIV paviršiaus
3
glikobaltymu yra toli gražu nepakankama apsaugai nuo viruso, nors ji gali šiek tiek pristabdyti
virusų dauginimąsi ir nutolinti ligos pradžią.
Rekombinantinės vakcinos prieš ŽIV
Keletoje laboratorijų yra tiriama galimybė panaudoti VV rekombinantus kaip vakcinas prieš ŽIV
infekciją. Tyrimai parodė, kad kai kuriuose VV rekombinantuose ekspresuojančiuose ŽIV antigenus
pastarieji yra teisingai apdorojami ir transportuojami, o eksperimentinių gyvūnų ir savanorių
žmonių organizme šios vakcinos sukėlė organizmo imuninės sistemos ląstelių atsaką į
ekspresuojamus ŽIV baltymus. Tačiau tokių vakcinų panaudojimas žmonių vakcinacijai yra
potecialiai pavojingas, todėl intensyviai ieškoma būdų VV rekombinantines vakcinas padaryti
saugesnes. Kaip minėta, svetimų DNR sekų įterpimas į timidino kinazės geną susilpnina VV
virulentiškumą. Be to, eksperimentai parodė, kad interleukiną 2 (IL-2) ir pelės interferoną γ (INF-γ)
koduojančių genų įvedimas į VV genomą ir šių genų raiška apsaugojo pliką pelę nuo VV infekcijos.
Buvo sukonstruoti VV rekombinantai ekspresuojantys INF-γ koduojančius chimerinius genus ir
ŽIV-1 struktūrinius baltymus koduojančius genus. Šie sulieti baltymai išlaiko antigenines INF-γ ir
ŽIV savybes. Tačiau buvo pastebėta, kad įvairūs sulietų INF-γ baltymų variantai pasižymi
nevienodu biologiniu antivirusiniu aktyvumu, nors visais atvejais bent šiek tiek sumažina
patogeniškumą eksperimentinėse plikose pelėse.
Gyvų rekombinantinių vakcinų veiksmingumas ir naudojimo saugumas
Vaccinia viruso (VV) rekombinantinių vakcinų naudojimo saugumas buvo patvirtintas
eksperimentais, rodančiais, kad nevyksta VV perdavimas iš vakcinuotų gyvūnų kontaktiniams (t.y.
gyvūnams, kurie nebuvo vakcinuoti, bet buvo laikomi kartu su vakcinuotais). Tiriama galimybė dar
labiau susilpninti VV rekombinantinių vakcinų virulentiškumą į VV genomą įvedant limfrokinų
genus (pvz. interleukiną 2 (IL-2) ir interferoną γ (INF-γ)). Buvo sukonstruoti sulieti baltymai,
kuriuose INF-γ (iš žmogaus arba pelės) yra sujungtas su įvairiais imunogenais. VV rekombinantai,
ekspresuojantys tokius sulietus baltymus, pasirodė besą mažiau patogeniški imudeficitu sergančiai
(plikai) pelei.
Tolesniam bendram rekombinantinių VV vakcinų veiksmingumo didinimui labai svabus yra
adjuvantinių sistemų kūrimas. Imunologijoje adjuvantas yra veiksnys, kuris pats neturi jokio
specifinio antigeninio poveikio, tačiau gali stimuliuoti imuninę sistemą sustiprindamas atsaką į
vakciną. Vakcinose adjuvantai paprastai yra aliuminio hidrochlorido arba kalcio fosfato gelis.
Freundo pilnasis adjuvantas yra aliejų, emulsiklių, negyvų bakterijų (paprastai mikobakterijų
Mycobacterium tuberculosis) mišinys. Buvo parodyta, kad INF-γ ir VSV glikobaltymo G mišinys
padvigubina Freundo pilno adjuvanto poveikį ir sustiprina imuninį atsaką po pakartotinos
vakcinacijos. Taip pat buvo parodyta, kad IL-2 pasižymi adjuvantinėmis savybėmis. Tačiau
imunoreguliacinių IL-2 ir INF-γ genų panaudojimas polivalentinėse rekombinantinėse VV
vakcinose vis dar turi būti galutinai įveritntas. Jei paiaiškės, kad šie limfokinai veikia kaip
adjuvantai padidindami imuninį atsaką, šis atradimas visiškai pakeis vakcinacijos sąvoką. Žmogaus
INF-γ genas galėtų būti įvestas į Vaccinia viruso vektorius prieš žmogaus patogenus, o taip pat
panašūs vektoriai gali būti sukonstruojami naminių gyvūnų rūšims, kas savo ruožtu padidintų tokių
vakcinų veiksmingumą.
4
VII. GENŲ TERAPIJA
Kiekvienas mūsų, dažniausiai to net neįtardami, turime apie 5-6 defektyvius genus.
Tai paaiškėja jei mes, ar vienas iš mūsų artimų giminaičių kenčia nuo genetinių ligų. Tokių
žmonių pasaulyje yra milijonai. Maždaug 10% žmonių turi, ar jam išsivystys vėliau
paveldėtas genetinis sutrikimas. Žinoma apie 4000 ligų, kurios kyla dėl vieno geno sutrikimo,
ir dauguma kol kas nepagydomos. Kai kurie pavienių genų sutrikimai yra gana dažni – cistinė
fibrozė randama viename iš 2500 kūdikių gimusių Vakarų pasaulyje. Tačiau monogeninės
ligos yra palyginti retos, todėl šiuo metu daugiausia dėmesio ir lėšų skiriama plačiai paplitusių
ligų, tokių kaip vėžys, širdies ir kraujagyslių, AIDS genų terapijos tyrimams.
Žinios apie žmogaus genomą, genetinį ligų pagrindą, bei molekulinės biologijos
pasiekimai atveria naujas galimybes gydyti įvairiausias ligas. Vienas labiausiai viliojančių
ateities gydymo būdų yra genų terapija – gydymo būdas, pagrįstas individo ląstelėse esančios
genetinės informacijos ar genų veiklos pakeitimu. Taigi, genų terapija yra vienas iš būdų
gydyti genetinius sutrikimus. Šis metodas ypatingas tuo, kad ligos gydomos ten, kur jos
prasideda, t.y. taisomi “negeri”, defektyvūs genai. Sutrikęs genas pakeičiamas veikiančiu
genu taip, kad organizmas galėtų gamintis gerą fermentą ar baltymą. Daug dėmesio taip pat
skiriama vadinamosioms genetinėms metabolinėms ligoms, kurias sukelia sutrikęs genas,
negaminantis konkrečią metabolinę reakciją katalizuojančio fermento arba gaminantis
neefektyvų ar nepakankamai efektyvų. Genų terapija gali būti pritaikyta genetinėms,
infekcinėms bei kitoms ligoms gydyti. Dauguma genetinių ligų yra poligeninės
(aterosklerozė, vėžys, artritas ir kt.), todėl tikslinga ne tik taisyti genetinius defektus, bet
įterpti genus, sumažinančius genetinių defektų pasireiškimą.
Pirmi genų terapijos tyrimai buvo skirti paveldimoms ligoms, susijusioms su vieno
geno sutrikimais, tokioms kaip SCID, cistinė fibrozė, gydyti. Tokios ligos yra idealus genų
terapijos objektas, nes pakeitus defektyvųjį geną sveiku gali būti pasiektas pageidaujamas
efektas. Tačiau monogeninės ligos yra palyginti retos, todėl šiuo metu daugiausia dėmesio ir
lėšų skiriama plačiai paplitusių ligų, tokių kaip vėžys, širdies ir kraujagyslių, AIDS genų
terapijos tyrimams. Apie du trečdaliai dabartiniu metu atliekamų genų terapijos tyrimų skirti
vėžiui gydyti ir tik aštuntoji visų tyrimų dalis skirta paveldimoms genetinėms ligoms.
Klinikiniai genų terapijos tyrimai skirstomi į tris stadijas. Amerikos Nacionaliniame
Sveikatos institute, koordinuojančiame genų terapijos tyrimus, 89% užregistruotų genų
terapijos tyrimų yra pradinės I stadijos, 10% - II ir tik 1% - III, t.y. galutinės stadijos. Genų
terapijos sėkmę įrodo tik III stadijos klinikiniai tyrimai. Šiuo metu daugiausiai vilčių teikia
odos ir inkstų vėžio, SCID bei hemofilijos gydymas genų terapijos būdu.
VII.1. Genetinės kilmės ligos
Dauguma mūsų nepatiriame sunkių pasekmių dėl defektyvių genų, nes mes turime po
dvi kopijas beveik visų genų, vieną gautą iš motinos, kitą iš tėvo. Vienintelė išimtis yra genai,
kurie yra vyrų lytinėse chromosomose. Daugumoje atvejų vieno normalaus geno užtenka
išvengti ligos simptomų. Jei defektyvus genas yra recesyvinis, tai normalus genas atliks
užprogramuotas funkcijas už juos abu. Tik turint dvi to pačio recesyvinio geno kopijas
pasireikš liga. Kita vertus, jei defektyvus genas dominantinis, jis vienas gali sukelti ligą, net
jei yra kartu su normaliu. Žinoma, pastaruoju atveju tik sergančio tėvo vaikai sirgs šio
dominantinio defektyvaus geno sąlygojama liga, ir tikimybė, kad vaikai paveldės šią ligą yra
50%. Hantingtono chorėja, sunki nervų sistemos liga, kuri pasireiškia tik suaugusiems, yra
dominantinės genetinės ligos pavyzdys.
Yra su X chromosoma susijusių genetinių ligų. Kadangi vyrai turi tik vieną X
chromosomą, šioje chromosomoje esančio defektyvaus geno funkcijos nekompensuojamos.
Tokių ligų pavyzdžiai yra Duchenne raumenų distrofija ir hemofilija. Karalienė Viktorija
turėjo geną atsakingą už hemofiliją, ir per ją jis paplito tarp karališkųjų Rusijos, Ispanijos ir
- 33 Prūsijos šeimų. Hemofilija sergantiems žmonėms trūksta krešėjimo faktorių. Prieš genetinei
inžinerijai imant juos gaminti, hemofilikai buvo gydomi su atitinkamais baltymais išskirtais iš
žmonių kraujo, kuris kartais būdavo užkrėstas AIDS.
Ne visi defektyvūs genai sukelia neigiamą poveikį, nes aplinka, kurioje genas
funkcionuoja taip pat yra svarbi. Klasikinis to pavyzdys yra siklemija ir maliarija. Tik
homozigotoms pagal šį gena pasireiškia siklemijos liga, o heterozigotos ja neserga. Kraštuose
kur paplitusi maliarija siklemijos genas yra gana paplitęs, nes heterozigotos su šiuo genu yra
atsparūs maliarijai. Kai maliarijos parazitas patenka į jų eritrocitus, šie virsta pjautuviškais ir
praranda kalio jonus, o tai nužudo maliarijos sukėlėją.
VII.2. Genų terapijos pradžia
1990 m. ketverių metukų amerikietė mergaitė buvo pirmoji pacientė, gydyta genų
terapijos būdu. Ji sirgo sunkia kombinuoto imunodeficito liga (SCID – angl. severe combined
immunodeficiency disease) dėl įgimto fermento adenozino deaminazės (ADA) trūkumo.
ADA svarbus purinų apykaitoje. Trūkstant šio fermento kaupiasi ADA substratas
deoksiadenozinas, kurio toksiniai kiekiai užmuša kai kurias jautrias ląsteles, tarp jų ir Tlimfocitus, nulemiančius ląstelinį imunitetą. Siekdami išvengti infekcijų sergantieji SCID
privalėjo gyventi steriliomis sąlygomis, o vienintelis gydymo būdas buvo kaulų čiulpų
persodinimas. Genų terapijos būdu gydytai pacientei buvo perpilti jos pačios genetiškai
modifikuoti limfocitai. Tuo tikslu iš periferinio kraujo buvo išskiriami limfocitai, į juos
įterpiamas ADA genas ir modifikuotos ląstelės grąžinamos į kraujotaką. Gydymas buvo
sėkmingas – genetiškai modifikuotos ląstelės gamino reikiamą fermentą, ir mergaitė galėjo
gyventi normalų gyvenimą. Tačiau limfocitų gyvavimas nėra ilgas (tik keli mėnesiai), todėl
procedūros turi būti periodiškai kartojamos. Vėliau buvo panaudotos ilgaamžės kaulų čiulpų
ląstelės, iš kurių buvo atskiriamos kamieninės ląstelės, o į šias įterpiami normalūs ADA genai.
VII.3. Genų terapijos būdai
Žinomi du pagrindiniai – lytinių ląstelių bei somatinių ląstelių genų terapijos būdai.
Lytinių ląstelių genų terapija - tai lytinių ląstelių (kiaušialąsčių, spermatozoidų, bei ląstelių iš
kurių jos atsiranda) manipuliacija siekiant pakeisti jų genetinę informaciją. Jai tai pat gali
būti priskiriama manipuliacijos su zigota. Lytinių ląstelių genų terapijos sukelti genetinės
informacijos pakeitimai gali būti paveldimi. Tuo tarpu somatinių ląstelių genų terapijos metu
keičiama genų veikla paciento ląstelėse; būsimos kartos šių genų veiklos pokyčių nepaveldi.
Lytinių ląstelių genų terapija
Pastaruoju metu gemalinių lytinių ląstelių genų terapija etiškai laikoma nepriimtina,
nors turi realių potencinių galimybių iš esmės išgydyti daugelį įgimtų ligų taip, kad ši liga
nebūtų perduodama tolesnėms generacijoms. Tuo pačiu taip būtų išvengta brangiai
kainuojančių somatinių ligų gydymo. Etiškai šis gydymo būdas nepriimtinas dėl to, kad
visuomet išlieka rizika pasireikšti nepageidaujamiems ir ilgalaikiams šalutiniams reiškiniams,
kurie gali paveikti pacientą bei jo palikuonis. Lytinių ląstelių genų terapijos technologija yra
santykinai paprasta, nes nereikalauja specifiškumo terapijos taikiniams ir genetiniai
sutrikimai gali būti koreguojami tiesioginėmis manipuliacijomis.
Vaisiaus genų veiklos pakeitimai jau atliekami su gyvūnais. Tokie tyrimai padeda
sukurti produktyvesnes gyvūnų rūšis, leidžia geriau suprasti genų veiklos reguliavimo
mechanizmus, įvertinti atskirų genų produktų paskirtį, genetiškai modifikuoti gyvūnai
kuriami mokslinių tyrimų bei medicinos tikslais.
- 34 Pirmasis pasaulyje transgeninis primatas, kiekvienoje savo kūno ląstelėje turintis
medūzos geną (fluorescuojančio žaliojo baltymo geną) buvo bezdžionėlė, kurios vardas
ANDi atspindi jos atsiradimo priežastį – tai atvirkščiai skaitoma deoksiribonukleorūgšties
(angl. deoxyribonucleic acid – DNA) santrumpa. Per kelias 2001 metų sausio dienas jauna
rhesus beždžionėlė ANDi tapo vienu iš žymiausių gyvūnėlių planetoje. Šis eksperimentas
parodė ne tik artimą, bet ir tolimą “transgeninių” žmonių ateitį – pasaulį išvydusios
beždžionėlės genas buvo neveiklus (tylus), tuo tarpu kiti du embrionai, kuriuose vyko geno
ekspresija, žuvo. Atliekant panašius tyrimus su transgeninėmis pelėmis nustatyta, kad iš šimto
išgyvenusių embrionų tik viename vyko perkelto geno ekspresija. Embrioninės genų terapijos
metu susiduriama ir su kitais sunkumais, nes įterpiamas genas gali atsirasti bet kurioje
genomo vietoje: šalia reguliacinių sekų, kurios aktyvina ar slopina normaliai veikiančių genų
veiklą; naujasis genas gali įsiterpti į funkcionuojančius genus ir nutraukti jų veiklą.
Vis tik žvelgiant keletą dešimtmečių į ateitį, daugelis tyrėjų mano, kad embrioninė
genų terapija gali būti viena iš pagrindinių medicinos šakų. Tuo tarpu kiti mokslininkai
baiminasi, kad noras įveikti paveldimas ligas gali pavirsti “žmonių tobulinimo programa”, o
patys “pagerintieji” vaikai galbūt jausis lyg specifiniams tikslams sukurtos mašinos. Tačiau
manoma, kad saugūs metodai, kruopšti priežiūra bei viešumas gali padėti šiai genų terapijos
rūšiai tapti realybe.
Somatinių ląstelių genų terapija
Visame pasaulyje labiausiai plėtojamas somatinių ląstelių genų terapijos būdas.
Kadangi genai lemia kiekvienos kūno ląstelės veiklą, ligas galima išgydyti į paciento ląsteles
įterpus reikiamus genus. Būtina, kad tokie gydymo tikslams vartojami genai saugiai,
specifiškai ir efektyviai pasiektų tinkamas paciento ląsteles. Genai į organizmą gali būti
įterpiami ex vivo (už gyvo organizmo ribų) ir in vivo (gyvo organizmo viduje) būdu.
Ex vivo genų terapija
Ex vivo terapijos metu iš paciento organizmo paimtos ląstelės in vitro genetiškai
modifikuojamos, kultivuojamos, atrenkamos ir po to grąžinamos į organizmą. Tačiau tokių
ląstelių nėra daug: fibroblastai, limfocitai, hepatocitai, keratinocitai, endotelio ir raumenų
ląstelės bei kamieninės kaulų čiulpų ląstelės. Šiuo ex vivo būdu buvo gydyti vaikai, sergantys
SCID. Sėkmingai ex vivo genų terapija buvo pritaikyta ir šeiminei hipercholesterolemijai
gydyti. Pernelyg didelį cholesterolio kiekį kraujyje lemia mažo tankio lipoproteinų (MTL)
receptorių, būtinų iš kraujo cholesteroliui pašalinti, stoka kepenų ląstelėse. Genų terapijos
tikslams biopsijos metu paimamas kepenų gabalėlis ir hepatocitai užkrečiami retrovirusais, į
kuriuos įterpti MTL receptorius koduojantys genai. Genetiškai modifikuotos ląstelės
kultivuojamos ir po to grąžinamos į organizmą. Pažymėtina, kad reikalingi “sveikieji” genai
nebūtinai turi būti įterpiami į tas ląsteles, kuriose normaliai vyksta jų ekspresija. Genų
terapijai gali būti panaudotos kitos “patogios” ląstelės, pavyzdžiui, kraujo krešėjimo veiksniai
VIII ir IX yra sintetinami hepatocituose, tačiau gydymo tikslams jie yra įterpiami į
fibroblastus.
Genų įterpimą į organizmą ir jų ekspresiją sunkina kai kurios aplinkybės, pavyzdžiui,
netgi monogeninės paveldimos ligos pasireiškia keliuose audiniuose, tuo tarpu ex vivo genų
terapiją galima taikyti ne visuose audiniuose. Be to, “sveikasis” genas ne visada normalizuoja
koordinuotą bendrame procese dalyvaujančių genų ekspresiją. Pavyzdžiui, bb globino geną
galima sėkmingai įterpti į eritroblastus, o šie gali būti reimplantuoti į kaulų čiulpus, tačiau
funkcionalus hemoglobino molekulės tetrameras nesusidaro, nes neegzistuoja bb globino ir aa
globino grandinių sintezės koordinacijos.
- 35 -
In vivo genų terapija
In vivo genų terapijos metu genus tiesiai į organizmą įterpia virusai, sintetiniai
pernešėjai ar kiti vektoriai. Šiuo atveju nereikia paimti organizmo ląstelių ir jų genetiškai
modifikuoti bei kultivuoti – šį darbą atlieka vektoriai ir pats organizmas. Matyt, in vivo
metodas bus naudojamas ir ypatingos skubos atvejais, kai ex vivo metodams panaudoti
pritrūksta laiko. Pirmą kartą in vivo genų terapija buvo taikyta gydant dažniausią baltųjų rasės
monogeninę ligą - cistinę fibrozę.
Šis metodas gali pats efektyviausias, tačiau kol kas yra mažiausiai išvystytas. Tai
susiję su žemu genetinių vektorių specifiškumu, siekiant koreguoti tik tam tikras organizmo
sritis. Be to, kepenys sąlygoja greitą vektorių (adenovirusų, DNR/lipidų kompleksų)
išvalymą iš organizmo. Dar vienas in vivo genų terapijos trūkumas yra tai, kad pakartotinės
vektorių injekcijos gali sukelti stiprias imunines reakcijas.
In situ genų terapija
Kadangi šiuo metu genų terapijos vektoriai nepasižymi dideliu specifiškumu, dažnai
renkamasi genetinį vektorių injekuoti į gydomą audinį. Šis metodas taikomas cistinės
fibrozės gydymui, kurio siekiama genetiškai modifikuoti kvėpavimo takų epitelio ląsteles.
Cistinės fibrozės priežastis yra geno (CFTR) mutacija, dėl ko pakinta endotelio ląstelių
membranos pralaidumas. In situ genų terapija taikoma ir vėžio gydymui. Pagrindinis in situ
genų terapijos trūkumas yra žemas efektyvumas.
Genų „nutildymas“
Kartais reikia ne pakeisti mutavusį gena normaliu, o tiesiog blokuoti geno raišką.
Žinome, kad RNR sintezė prasideda, kai transkripcijos faktoriai (TF) patenka ant geno
promotoriaus srities DNR sekos ir slenka išilgai geno. Taip nuo DNR į iRNR nurašoma
informacija apie būsimo baltymo struktūrą. Nustatyta, kad paveikus ląstelės promotoriaus
srities „melagingomis“ kopijomis, galima nukreipti transkripcijos faktorius nuo tikrojo geno ir
taip sustabdyti iRNR sintezę. Šis metodas turėtų būti greitai pritaikytas klinikoje.
Jei neįmanoma sustabdyti iRNR sintezės, kartais galima „pristabdyti“ jau susintetintos
iRNR veiklą. Tuo tikslu iRNR veikiama mažomis RNR molekulėmis, kurių nukleotidų seka
komplementari iRNR molekulės sričiai. Tokiu būdu blokuojama iRNR transliacija ir žalingas
baltymas nesintetinamas. Be šių metodų galima neleisti veikti jau pagamintam baltymui. Kaip
pavyzdį galima paminėti epidermio augimo faktoriaus receptorių – krūties ląstelėse esantį
baltymą HER-2, prie kurio jungiasi augimo signalai. HER-2 yra receptorius, priklausantis
tirozinkinazių klasei. HER-2 kartu su kitu epidermio augimo faktoriaus receptoriumi sudaro
aktyvų dimerinį receptorių, o dėl to įvykstantis aminorūgšties tirozino fosforilinimas
inicijuoja kompleksinę reakciją, pasibaigiančią ląstelės dalijimusi. Daugelis moterų turi dvi
baltymą HER-2 koduojančio geno kopijas, bet apie trečdalis krūties vėžiu sergančių moterų
17-oje chromosomoje turi papildomą šio geno kopiją. Todėl jų ląstelėse yra apie 100 kartų
daugiau šių augimo signalo receptorių. Tokia receptorių gausa ypač nepageidaujama, kai
ląstelės tampa piktybinėmis. Baltymo (receptoriaus) užblokavimo būdas buvo pritaikytas
gydant moteris, sergančias krūties vėžiu (I ir II klinikinių tyrimų stadija). Pacientės buvo
gydomos genų inžinerijos būdu sukurtais monokloniniais antikūnais (Trastuzumab),
blokuojančiais receptorius HER-2. Iš 222 moterų, dalyvaujančių I ir II genų terapijos tyrimų
stadijose, 34 pacientėms (15%) pasireiškė teigiamas preparato poveikis.
- 36 VII.4. Genų įterpimo į pacientų organizmą metodai
Genų terapijos sėkmė labai priklauso nuo genų pernešimo technologijų pritaikymo
medicinoje. Todėl labai svarbu parinkti tinkamas genų pernešimo sistemas. Genų terapijos
tikslams reikiamas genas įterpiamas į daleles, galinčias patekti į organizmo ląsteles. Šios geną
pernešančios dalelės vadinamos vektoriais. Vektoriai gali būti virusiniai, nevirusiniai ir
fiziniai. Nesvarbu, kokia vektoriaus prigimtis, visi jie turi būti specifiški taikiniams (ląstelėms
ar audiniams), genų ekspresijos trukmė turi būti pakankama, o svarbiausia, genų pernešimas ir
ekspresija turi būti saugūs. Kartu su reikiamais terapiniais genais į vektorius gali būti įterpti ir
indukuojami promotoriai, leidžiantys reguliuoti įterptų genų ekspresiją. Naudojant audiniams
specifinius promotorius galima pasiekti, kad terapinių genų ekspresija vyktų tik specifinėse
ląstelėse.
Virusiniai vektoriai
Šiuo metu plačiausiai naudojami virusiniai vektoriai. Iš virusų pašalinami ligas
sukeliantys komponentai ir į juos įterpiami rekombinantiniai genai – taip gaunami “genetiniai
vaistai”, galintys į šeimininko ląsteles pernešti reikalingus genus. Dažniausiai naudojami
vektoriai yra šie:
Retrovirusai
Retrovirusų genomą sudaro RNR. Šie virusai gali sukurti savo RNR genomo
dvigrandes DNR kopijas, kurios gali būti integruotos į ląstelių šeimininkių chromosomas
(pvz. ŽIV). O integruotos į ląstelės šeimininkės genomą genetinės madžiagos ekspresija gali
būti ilgalaikė. Tačiau šie svetimi genai įsiterpia nespecifiškai ir gali įsiterpti į svarbų geną ir
taip sukelti jo mutaciją arba „išjungimą“. Retrovirusai negali patekti į ląstelės branduolį pro
intaktinę branduolio membraną, todėl jie infekuoja tik aktyviai besidalijančias ląsteles
(dalindamasi ląstelė laikinai praranda branduolį supančią membraną). Todėl jie negali būti
naudojami kaip vektoriai nesidalijančiose, pavyzdžiui, nervų ar raumenų ląstelėse. Tačiau
gebėjimas infekuoti tik besidalijančias ląsteles, gali būti panaudotas kovai su vėžinėmis
ląstelėmis – į greitai besidalijančias vėžines ląsteles gali būti įterpti “genai savižudžiai”, kurie
sukelia šių lastelių mirtį, taip pat kitokie genai, koduojantys vaistus nuo vėžio.
Adenovirusai
Adenovirusų genomą sudaro linijinė dvigrandė DNR. Šie virusai žmonėms sukelia
kvėpavimo, žarnyno ir akių infekcijas. Peršalimo virusas yra adenovirusas. Adenovirusai
patenka į ląsteles endocitozės būdu ir lieka citoplazmoje, t.y. šie virusai neįterpia savo
genomo į ląstelės šeimininkės DNR (ekstrachromosominis gyvybės ciklas), todėl jie gali būti
naudojami nesidalijančioms ląstelėms infekuoti. Ši adenovirusų savybė sumažina įterptinės
mutagenezės pavojų, tačiau dėl tos pačios priežasties terapinių genų ekspresija ląstelėse yra
trumpalaikė.
Adeno-asocijuoti virusai (Adeno-associated viruses).
Tai mažų, viengrandės DNR genomo virusai, galintys įterpti savo genetinę medžiagą
19-os chromosomos specifinėje vietoje, nesukeldamas jokių pastebimų šalutinių reiškinių.
Adenoasocijuotų virusų (AAV) vektoriai yra veiksmingesni bei sukelia mažiau
nepageidaujamų poveikių. Šie virusai stabiliai integruojami į ląstelės genomą, jie infekuoja
įvairiausias – tiek nesidalijančias, tiek ir besidalijančias šeimininko ląsteles, be to, išlaikomas
aukštas genų ekspresijos lygis bei mažas toksiškumas. Į AAV galima įterpti gana didelį
svetimos DNR kiekį, todėl kartu su reikiamu genu gali būti įterptas ir indukuojamas
promotorius, galintis reguliuoti pernešto geno ekspresiją.
- 37 AAV nepasižymi jokiais žinomais patogeniniais reiškiniais. Manoma, kad apie 80%
populiacijos šiems virusams turi antikūnų. AAV vektoriai pasižymi žemu imunogeniškumu.
Pagrindinis jų trūkumas yra tas, kad jų gamyba yra sudėtinga (dauguma AAV sistemų turi
būti naudojamos kartu su adenovirusais, kurie atlieka pagalbininko funkcijas). Integruoto
geno ekspresijos lygis būna žemas. Be to, AAV talpina tik iki 4,8 kb svetimos genetinės
medžiagos.
Herpes simplex virusai.
Tai virusų klasė su dvigrandės DNR genomu, infekuojanti tam tikro tipo ląsteles,
neuronus. Pirmo tipo Herpes simplex virusas sukelia pūslelinę. HSV gali transfekuoti tiek
besidalijančias, tiek ir nesidalijančias ląsteles. HSV ypač gerai transfekuoja nervų sistemos
ląsteles, todėl manoma, kad ateityje gali būti sėkmingai pritaikyti nervų sistemos genų
terapijai.
HSV vektoriai gali talpinti didžiulį kiekį (iki 150 kb) svetimos genetinės medžiagos.
Pagrindiniai HSV trūkumai yra didelis virusinių dalelių imunogeniškumas ir ilgalaikis
genetinės medžiagos išlaikymas virusinėje dalelėje.
Virusinių vektorių trūkumai
Vienas iš pagrindinių virusinių vektorių trūkumų yra tai, kad visi virusai gali sukelti
uždegimą, taigi ir imuninę reakciją, suardančią įterptą geną. Netgi modifikuoti virusai gali
sukelti pavojų pacientui. Pirmoji genų terapijos auka – Pensilvanijos universiteto savanoris
18-metis Jesse Gelsinger mirė 1999 m. rugsėjo mėnesį. Naudoti adenovirusai sukėlė labai
stiprią imuninės sistemos reakciją, nulėmusią daugelio organų pažeidimus ir mirtį.
Imuninė organizmo reakcija gali riboti pakartotiną to pačio vektoriaus naudojimą. Tai
gali būti viena iš problemų platesniam naudojimui, kadangi dalis žmonių populiacijos gali
būti jau anksčiau susidūrusi su tuo virusu ir todėl turėti neutralizuojančius antikūnius.
Be to, tarp genų terapijoje naudojamų virusinių dalelių ir aplinkoje ar jau pačioje
ląstelėje ar organizme esančių virusų, gali įvykti genetinės medžiagos mainai ir tuomet
susidaryti žalingi, pavojingi ir galintys replikuotis ląstelėje nauji virusai.
Virusinių vektorių naudojimą riboja ir tai, kad į virusinę dalelę (išskyrus HSV)
galima įterpti tik iki 9-10 kb dydžio svetimą geną (terapinį ar geną markerį). Daugelio
genetinių ligų gydymui tai nepakankamas dydis. Kita svarbi ir kol kas neišspręsta
problema yra tai, kad retrovirusiniai vektoriai į šeimininko genomą nešamus genus
integruoja atsitiktinai. Kartais tai gali modifikuoti gyvybiškai svarbių genų veiklą.
Nevirusiniai vektoriai
Šiuo metu plačiai tiriami ne tik virusiniai, bet ir kitokio tipo vektoriai. Jie skirstomi į
dvi pagrindines grupes: cheminiai ir fiziniai nevirusiniai vektoriai.
Cheminiai nevirusiniai vektoriai
Didžioji dauguma nevirusinių vektorių sistemų yra susijusios su polikatijoniniais
dariniais, kuriems priklauso dvi pagrindinės klasės: katijoninių liposomų/micelių-DNR
kompleksai, vadinami lipopleksais (angl. lypoplex), ir katijoninių polimerų-DNR kompleksai
- polipleksai (angl. polyplex). Šių kompleksų pagrindinė sudedamoji dalis yra katijoniniai
polimerai. Todėl jie, kartu su neigiamą krūvį turinčiomis DNR molekulėmis, sudaro
pakankamai stabilius nanometrinius kompleksus. Manoma, kad jie į ląstelę patenka
endocitozės būdu. Kuomet toks kompleksas patenka į ląstelės vidų, genetinė medžiaga turi
išsilaisvinti iš šio komplekso bei iš ankstyvosios endosomos. Jei perkelta genetinė medžiaga
yra iRNR, citoplazmoje ji gali būti transliuojama iš karto, jei tai DNR - tai ji dar turi patekti į
branduolį.
- 38 Pagrindinės nevirusinių cheminių vektorių problemos yra šios: fiziologinėmis
sąlygomis lipopleksai ir polipleksai pasižymi nestabilumu ir dažnai agreguojasi. Be to, ir
lipopleksai ir polipleksai pasižymi heterogeniškumu. Pagrindinis cheminių vektorių trukumas
yra palyginti žemas jų efektyvumas, t.y. jie transfekuoja palyginti nedaug ląstelių.
Fiziniai nevirusiniai vektoriai
Fiziniams nevirusiniams vektoriams priskiriami tokie metodai kaip genų šautuvas
(gene gun), mikroinjekcijos, nuogos DNR injekcijos ir elektroporacija bei lazerių, magnetinių
laukų ar ultragarso (sonoporacija) panaudojimas.
Genų šautuvas
Jo panaudojimo principas pagristas tuo, kad metalų (aukso, volframo) dalelės (~1.2
µm), padengtos genetine medžiaga, specialių šautuvų pagalba yra pagreitinamos iki tiek, kad
susidūrusios su ląstelėmis ar audiniais gali prasiskverbti į jų vidų. Tokiu būdu, nutaikius į
atitinkamą audinį (dažniausiai išorinį) genų įvedimas gali būti atliktas lokaliai. Vienas iš
pagrindinių šio metodo trūkumų yra tai, kad dėl didelio 1,2 µm dalelių greičio sužalojama
daug ląstelių.
DNR injekcijos
Genetinės medžiagos mikroinjekcijos yra genų terapijos metodas, kuomet genetinė
medžiaga suleidžiama į kiekvieną atskirą ląstelę. Tam naudojamas mikromanipuliatorius ir
stiklinė mikropipetė, kurių pagalba DNR injekuojama tiesiai į branduolį. Tai yra preciziškas
metodas, tačiau neefektyvus, norint transfekuoti dideles ląstelių populiacijas ir patogesnis
lytinių ląstelių genų terapijai.
Galima injekuoti DNR tiesiogiai į audinį. Žinoma, kad nuogos plazmidinės DNR
injekcijos į audinį gali transfekuoti kai kurių audinių ląsteles (kepenų, raumenų). Kokiu būdu
nuoga plazmidinė DNR patenka į audinių ląsteles tiksliai nėra žinoma. Manoma, kad tai gali
būti susiję su i) audinio ir ląstelių pažeidimais injekcijos metu. Šie pažeidimai, gali
palengvinti plazmidės patekimą į ląsteles; ii) padidėjusiu hidrodinaminiu slėgiu audinyje. Į
audinį dideliu greičiu injekuojamas tirpalas su plazmide gali palengvinti jos patekimą per
ląstelių membraną; ii) endocitoze, tarpininkaujant nespecifiniams receptoriams.
Elektroporacija
Ląsteles paveikus trumpais, stipraus elektrinio lauko impulsais, laikinai pakinta
membranos pralaidumas įvairiems cheminiams junginiams, pradedant mažomis hidrofilinėmis
molekulėmis (įvairūs jonai, žymėtos molekulės, vaistai) baigiant makromolekulėmis,
tokiomis kaip RNR ir DNR (Saulis ir Satkauskas, 2004). Tinkamai parinkus elektrinio
impulso parametrus, elektropermeabilizacija gali būti grįžtama. Šis reiškinys dar vadinamas
elektroporacija (Saulis ir Satkauskas, 2004).
Pirmą kartą genų įvedimui į ląsteles elektroporacija buvo panaudota 1976 m. (Auer ir
kt., 1976) – žmogaus eritrocitai buvo įkrauti viruso SV-40 DNR bei žinduolių ląstelių RNR.
Nukleino rūgšties koncentracija ląstelių viduje siekė 35% išorinio tirpalo koncentracijos.
Viruso SV-40 DNR žymiai geriau prasiskverbdavo į ląsteles, jeigu ją prieš tai apdorodavo E.
coli endonukleaze, pervedančia nukleininę rūgštį iš superspiralinės į tiesinę formą.
1982 m. Neumann ir kt. pirmieji transformavo ląsteles naudojant elektroporaciją
(Neumann ir kt., 1982). Jie pelių L-ląsteles, turinčias defektinį timidinkinazės geną,
patalpintas į tirpalą su plazmidėmis pTK2E, turinčiomis viruso timidinkinazės geną, paveikė
elektriniais impulsais. Po to ląstelės buvo auginamos selektyvioje terpėje, kurioje
išgyvendavo ir sudarydavo kolonijas tik tos ląstelės, į kurias pateko plazmidė su
- 39 timidinkinazės genu. Tokiu būdu, iš susidariusių kolonijų skaičiaus, buvo galima spręsti apie
transformacijos efektyvumą.
Elektroporacija jau yra tapusi įprastu biotechnologiniu metodu ląstelių transformacijai.
Naudojant elektroporaciją, įmanoma transformuoti praktiškai bet kokio tipo prokariotų ir
eukariotų ląsteles. Tai jau yra atlikta su įvairiomis žinduolių (Chu ir kt., 1987), žuvų,
vabzdžių (Mann ir King, 1989), augalų, mielių ląstelėmis (Meilhoc ir kt., 1990) ar
bakterijomis (Satoh ir kt., 1990). Daugeliu atvejų, naudojant elektroporaciją, genų ekspresija
padidėja nuo 100 iki 1000 kartų. Tiesa, DNR patekimo į ląsteles mechanizmas iki galo
neišaiškintas.
Pirmieji DNR įvedimo į audinius tyrimai pasirodė 1991 m., kai ši technologija buvo
panaudota genų įterpimui į odą (Titomirov ir kt., 1991). Tačiau intensyvūs tyrimai prasidėjo
tik nuo 1998 m. Šiuo metu elektroporacija jau yra pritaikyta in vivo efektyviam genų įvedimui
į įvairius audinius (raumenis, kepenis, plaučius, odą, sąnarius, navikus, pelių sėklides, stuburo
smegenis, blužnį, kraujagysles, nervinį audinį, tinklainę) (2000; Hanna ir kt., 2001; Heller ir
kt., 1996).
Daugiausia tyrimų atliekama su raumenimis. Pirmiausia raumenys yra lengvai
prieinamas audinys, antra, raumenų ląstelės nesidalina, todėl elektroporacijos būdu įvesta
DNR gali būti ekspresuojama ilgesnį laiką. Trečia, raumeninis audinys yra gausiai
vaskuliarizuotas. Tai leidžia tikėtis, kad sėkmingai atlikus raumens transfekciją, terapinio
geno produktas lengvai galės patekti į kraujotaką ir daryti terapinį poveikį. Šiuo atveju į
raumenį būtų žiūrima, kaip į terapinių baltymų sekrecijos organą. Be to, raumenų genų
terapija gali būti panaudojama ir vakcinacijai. Raumuo, kaip elektrogenoterapijos taikinys
pasirinktas ir todėl, kad yra genetinių raumens ligų (pvz. Duchene distrofija), kurios gali būti
genų terapijos taikiniu. Duchene distrofija pasireiškia dažniausiai berniukams 3-5 gyvenimo
metais. Jos dažnis 1 atvejis iš 3500. Liga yra susijusiu su pakitusiu recesyviniu X
chromosomos genu, atsakingu už distrofino baltymo gamybą. Genas yra labai didelis (apie 14
kb), todėl jo pernešimas standartiniais virusiniais vektoriais yra neįmanomas. Dėl šio
pakitusio baltymo raumenų vystymasis sutrinka, jie pradeda atrofuotis ir vaikas žūva.
Elektroporacija taip pat gali būti panaudota ir plazmidinės DNR įvedimui į odos ląsteles
in vivo. Dviejų superspiralizuotų plazmidžių DNR mišinys buvo įšvirkštas ką tik gimusiems
peliukams po oda. Po 10-60 min, jų odos klostė buvo paveikta dviem aukštos įtampos
impulsais. Nuo paveiktos odos buvo pašalintos fibroblastinės ląstelės, ir po 2-3 savaičių
kultūroje buvo aptikti transformuotų fibroblastų klonai (Prausnitz ir Banga, 1998). Tai
parodo, kad elektroporacija galėtų būti pritaikoma ir DNR vakcinacijoje.
Pagrindiniai elektrogenoterapijos privalumai: i) metodas yra paprastas ir saugus; ii)
plazmidės paruošimas yra daug paprastesnis ir pigesnis lyginant su kitų vektorių paruošimu;
iii) audinių transfekcija gali būti atliekama lokaliai, tiksliai norimose vietose; iv) praktiškai
nėra apribojimų dėl geno ar genų dydžio.
Pagrindiniai elektrogenoterapijos trūkumai: i) lyginant su virusiniais vektoriais
elektrogenoterapijos efektyvumas yra palyginti mažas; ii) elektroporacijos būdu įvesta DNR
nesiintegruoja į ląstelių genomą, todėl geno ekspresija nėra ilgalaikė.
Kiti fiziniai metodai
Kiti fiziniai metodai, tokie kaip lazeriai, magnetiniai laukai ar ultragarsas
(sonoporacija) taip pat gali būti naudojami genų įterpimui, tačiau kol kas jie yra mažiau
efektyvūs (Wells, 2004).
Nors šiuo metu efektyviai genų terapijai pasiekti panaudojami įvairūs metodai, tačiau
kol kas populiariausi yra metodai, kuriuose naudojami virusiniai vektoriai (Satkauskas ir
Saulis, 2004).
- 40 VII.5. Ligos, galinčios būti genų terapijos taikiniais
Šiuo metu ligos, kurioms gali būti taikoma genų terapija, turi pasižymėti keliomis
savybėmis. 1) Žinant, kad genų terapija gali turėti šalutinių efektų gydomos tik gyvybei
pavojų keliančios ligos. 2) Genai, atsakingi už ligos atsiradimą, turi būti pilnai
charakterizuoti. 3) Turi būti rasti efektyvūs vektoriai galintys specifiškai atakuoti gydomos
srities ląsteles.
Genetines ligas galima suskirstyti į dvi grupes: monogenines ir poligenines ligas.
Monogeninės ligos
Ligos, kurias lemia vieno geno sutrikimai, vadinamos monogeninėmis. Daugiau kaip
4000 ligų kyla dėl vieno geno sutrikimo. Dauguma monogeninių ligų kyla dėl mutacijų DNR
grandinėje, dėl ko genas koduoja defektyvų baltymą, negalintį atlikti savo specifinės
funkcijos. Kai kuriais atvejais, jei gaminamas smarkiai pakitęs baltymas, jis gali būti
neatpažįstamas ir sukelti imuninį atsaką.
Ištirta tik nedidelė monogeninių ligų dalis, kurioms gali būti taikoma genų terapija
(šeimyninė hipercholesterolemija, policistinė inkstų liga, Huntingtono chorėja, cistinė fibrozė,
hemofilija, fenilketonurija, Duchenne raumenų distrofija). Šiuo metu, naudojant esamus
vektorius, šių ligų gydymui reiktų dažno genų terapijos pakartojimo. Ateityje tikimasi
sukurti tokius vektorius, kad ligos eiga būtų kontroliuojama tik retais (vienas ar du kartai per
metus) genų terapijos taikymais. Tai ne tik pagerintų pacientų gyvenimo kokybę, bet taip
pat leistų žymiai sumažinti gydymo išlaidas.
Hemofilija A yra viena iš paveldimų ligų (ja serga vienas iš 5000 vyrų), kuriai gali
būti taikoma genų terapija. Geną, koduojantį VIII krešėjimo faktorių, į organizmą galima
įterpti tiek in vivo (pasitelkiant virusinius vektorius), tiek ex vivo būdais. Ex vivo reikiamas
genas įterpiamas į odos fibroblastus, o genetiškai modifikuotos ląstelės implantuojamos į
paciento pilvo ertmę. Tokia procedūra leidžia išvengti tradicinių virusinių vektorių sukeliamų
šalutinių poveikių. Pirmoje klinikinių tyrimų stadijoje buvo gydomi šeši pacientai ir po
dešimties mėnesių keli sunkiai sergantieji hemofilija išvengė savaiminių kraujavimų.
Poligeninės ligos
Ligos, kurias lemia ne vieno geno sutrikimai, vadinamos poligeninėmis. Nors genų
terapija geriausiai tinka monogenetinėms ligoms gydyti, tačiau ji gali būti taikoma siekiant
palengvinti ir poligenines ligas, tokias kaip vėžys, širdies ligos, Alzhaimerio liga ar artritai.
Didžiausia genų terapijos tyrimų dalis skirta onkologinėms ligoms gydyti, nes vėžys
yra viena iš pagrindinių ligų, sukelianti didelį pacientų mirtingumą. Nepaisant progreso
chirurginiame gydyme, radioterapijoje bei chemoterapijoje, liga dažnai yra neišgydoma.
Viena iš pagrindinių problemų yra atskirti sveikas ląsteles nuo vėžinių. Daugėjant žinių apie
molekulinius vėžio vystymosi mechanizmus, atsiranda daugiau galimybių vėžio gydymui
panaudoti genų terapiją. Genų terapijos, kaip ir kitų vėžio gydymo metodų, pagrindinis
sunkumas yra tai, kad sunku paveikti visas vėžio ląsteles. Šiuo metu yra keletas pagrindinių
vėžio genų terapijos strategijų. Tai p53 ir Rb genų pakeitimas, antisensoriai, „savižudė“
genų terapija, imunoterapija bei vaistų atsparumo genai (multidrug resistance genes).
Vienas iš perspektyviausių vėžio genų terapijos būdas yra „savižudė“ genų terapija.
Šis būdas išnaudoja sveikų ir vėžinių ląstelių metabolinius skirtumus. Navikas
transfekuojamas suicidiniu genu, kurio ekspresijos produktai suaktyvina provaistą. Kaip
suicidiniai genai dažniausiai naudojami bakterijų ir virusų genai, pvz. timidino kinazės
genas, gaunamas iš herpes simplex virusų. Šio geno produktas gali metabolizuoti
provaistą "gancilovir" į citotoksiką, sukeliantį ląstelės mirtį. Jei šiuo genu bus
transfekuotos vėžinės ląstelės, tai tik jos ir taps sensitizuotos provaistui.
- 41 Kaip nauja navikų gydymo metodika pradeda įsitvirtinti aukščiau minėta
elektrogenoterapija, kai DNR suleidžiama tiesiogiai į naviką ir po to jis paveikiamas stipriu
elektriniu impulsu, palengvinančiu DNR patekimą į ląstelių vidų. Šis metodas buvo
panaudotas B16 melanomos, storosios žarnos karcinomos bei žiurkių gliomai gydyti
(Satkauskas ir Saulis, 2004).
Sergantieji neurodegeneracinėmis ligomis taip pat gali sulaukti sėkmingo gydymo
genų terapijos būdu. 2000 metais Kalifornijos universitete pradėti pirmieji šių ligų genų
terapijos klinikiniai tyrimai. Į pacientės, sergančios Alzheimerio liga, smegenis buvo
implantuotos genetiškai modifikuotos odos ląstelės, galinčios sintetinti nervų augimo faktorių.
Atliekami tyrimai siekiant pritaikyti genų terapiją sergantiesiems Parkinsono liga gydyti.
Gydymo tikslams panaudotos dopaminą gaminančios vaisiaus smegenų ląstelės. Kalifornijos
universitete genai buvo sėkmingai įterpti į smegenis panaudojant liposomas, padengtas
polimeru polietilenglikoliu (PEG).
Pastaruoju metu intensyviai tiriamos DNR įterpimo į raumeninį audinį galimybės.
Elektropermeabilizacijos būdu įterpus DNR į raumeninus skeleto bei širdies audinius, buvo
nustatyta efektyvi genų transfekcija. Skeleto raumuo turi keletą privalumų: jis yra tinkamas
audinys somatinei baltymų sintezei, plazmides galima lengvai suleisti tiesiog į raumenį, DNR
gali būti episomatinėje būklėje keletą mėnesių, be to raumuo gali sekretuoti baltymus. Šios
skeleto raumenų savybės panaudojamos raumenų distrofijai gydyti, DNR vakcinacijai,
terapinių baltymų sisteminei sekrecijai įvairių ligų – pavyzdžiui, hemofilijai, eritropoetinei
anemijai, virusiniam miokarditui, diabetui ar glomerulonefritui – bei navikų gydymui.
Sisteminis genų įterpimas navikų gydymui gali būti tinkamesnis nei aukščiau minėtas
tiesioginis DNR įterpimas į naviką, nes tokiu būdu galima gydyti ir metastazes bei navikų
likučius po operacijų.
Vienas iš genų terapijos taikinių yra labai paplitusios širdies ir kraujagyslių ligos.
Šioms ligoms gydyti gali būti taikoma laikina įterptų genų ekspresija. Pavyzdžiui, įterpus
kraujagyslių endotelio augimo faktoriaus (KEAF) (angl. VEGF – vascular endothelial growth
factor) geną į kiaulės širdies raumenį, buvo stimuliuojamas naujų kraujagyslių susidarymas
aplink užblokuotas vainikines arterijas. Kadangi genams įterpti buvo naudojami adenovirusai,
imininė sistema juos greitai atpažino ir suardė, t.y. įterptų genų ekspresija buvo trumpalaikė,
tačiau pakankama, kad susidarytų naujos kraujagyslės. Jau atliekami klinikiniai I stadijos
tyrimai: pacientams, sergantiems širdies ir kraujagyslių ligomis, įterpiamas KEAF genas.
Toks gydymo būdas taip pat gali būti taikomas ligoniams, kurių periferinė kraujotaka yra
sutrikusi, pavyzdžiui, sergantiems cukriniu diabetu (Yin ir Tang, 2001).
Genų terapija, naudojant įvairius augimo faktorių genus, gali būti plačiai pritaikyta ne
tik širdies ir kraujagyslių, bet ir kitoms ligoms gydyti. Augimo faktoriams būdingas labai
platus fiziologinio aktyvumo spektras, jie dalyvauja daugelio organų (širdies, inkstų, kepenų,
skeleto, lytinių liaukų, sausgyslių, odos) augimo ir vystymosi procese. Taigi įterpiant šių
faktorių genus į pacientų organizmą, gali būti pasiektas pageidautinas ilgalaikis klinikinis
poveikis. Genų, koduojančių augimo faktorius, pavyzdžiui, kaulų morfogenezės baltymus
(KMB) (angl. BMP – bone morphogenetic proteins), transformuojantį augimo faktorių-b
(angl. transforming growth factor-β – TGF-β), trombocitų augimo faktorių (angl. plateletderived growth factor – PDGF), įterpimas ex vivo ar in vivo būdais gali būti panaudotas
osteogenezei skatinti, pavyzdžiui, kaulų suaugimui po įvairių chirurginių intervencijų, stuburo
sugijimui, kremzlinio audinio regeneracijai ir kt. (Nakamura ir kt., 2001).
- 42 VIII. Elektroporacijos panaudojimas navikų terapijoje
Ląstelė yra atvira sistema ir nuolat keičiasi medžiagomis su aplinka. Ląstelės turinį
nuo išorės skiria plazminė membrana, atliekanti daugybę fiziologinių funkcijų. Viena iš jų yra
barjerinė: membrana suformuoja barjerą apie ląstelę, trukdantį molekulėms ir jonams laisvai
judėti į ląstelę ar iš jos. Stipraus elektrinio lauko poveikis padidina membranos pralaidumą
jonams ir įvairioms molekulėms. Šis reiškinys vadinamas elektroporacija (Neumann ir
Rosenheck, 1972; Weaver ir Chizmadzhev, 1996).
Šiuo metu ląstelių elektroporacija plačiai naudojama ląstelės biologijoje,
biotechnologijoje ir medicinoje (Gehl, 2003). Vienas iš svarbių ir šiuo metu intensyviai
tyrinėjamų elektroporacijos taikymų yra navikų elektrochemoterapija (Mir ir kt., 1991b). Tai
lokalus standžių navikų gydymo metodas, susidedantis iš citotoksinio vaisto ir elektrinio
impulsinio lauko naudojimo. Elektrinio lauko poveikyje dėl elektroporacijos padidėja
navikinių ląstelių membranų pralaidumas, todėl į ląstelių vidų patenka daugiau citotoksinio
vaisto molekulių ir taip ženkliai padidinamas jo veiksmingumas (Gehl, 2003; Gothelf ir kt.,
2003; Mir ir Orlowski, 1999).
Taikant klasikinius chemoterapijos metodus naudojamos labai didelės vaistų dozės,
kurios sukelia šalutinius sisteminius efektus (Limper, 2004). Dėl padidėjusio ląstelių
membranų pralaidumo kai kurių vaistų dozės gali būti žymiai (iki 1000 ir daugiau kartų)
sumažintos, todėl elektrochemoterapija laikoma efektyviu gydymo metodu, tinkamu visiems
navikų kamienams (Gehl, 2003). Šiuo metu šis metodas, pirmą kartą pasiūlytas 1991 metais
(Mir ir kt., 1991a), yra labai intensyviai tiriamas. Klinikiniai bandymai jau yra atlikti JAV,
Prancūzijoje, Slovėnijoje, Danijoje, Japonijoje bei Australijoje. Tikimasi, kad Lietuvoje
pirmieji elektrochemoterapijos metodo klinikiniai bandymai bus atlikti 2008 metais.
Dažniausiai elektrochemoterapijoje naudojamas citotoksinis vaistas yra bleomicinas,
kuriuo gydoma dauguma kietų navikų ir piktybinių limfomų. Šio vaisto citotoksiškumas
pasireiškia tik jam patekus į ląstelės vidų. Jis veikia kaip mini endonukleazė – bleomicinui
patekus į ląstelės branduolį, vyksta cheminė reakcija, kurios metu skaldoma DNR.
Bleomicinas, kaip ir dauguma kitų antivėžinių vaistų, sukelia sunkius pašalinius
poveikus, pvz.: yra toksiškas plaučiams (Chandler, 1990). Netoksinis antivėžinių vaistų DNR
skaldymo aktyvumo padidinimas įgalintų sumažinti vaisto dozę ir sukeliamus pašalinius
efektus. Tai sąlygotų efektyvios chemoterapijos išsivystymą.
Bleomicinas pasižymi labai dideliu citotoksiškumu – in vitro nustatyta, kad 200 vaisto
molekulių gali nužudyti ląstelę (Tounekti ir kt., 1993). Tačiau jis labai sunkiai praeina pro
ląstelių membraną. Elektroporacijos panaudojimas sudaro sąlygas šiam vaistui patekti į
citozolį pro membranoje susidariusias poras. Tokiu būdu, bleomicino dozės, reikalingos
tokiam pat terapiniam efektyvumui pasiekti, gali būti sumažinamos iki kelių tūkstančių kartų
(Mir ir kt., 1991a).
Yra daug veiksnių, įtakojančių jos efektyvumą: cheminiai (antinavikinio vaisto cheminė
struktūra, jo koncentracija, injekcijos tipas), biologiniai (naviko kamienas, imuninės sistemos
įtaka), fizikiniai (elektrinio lauko stipris, impulso trukmė, impulsų kiekis, elektrodų
konstrukcija bei jų padėtis naviko atžvilgiu) (Cemazar ir kt., 1998; Mir ir kt., 1998; Ogihara ir
Yamaguchi, 2000; Satkauskas ir kt., 2005).
Kombinuotas elektrochemoterapinis gydymas gali būti derinamas su imunoterapija, kuri
yra pagrįsta modifikatorių, turinčių biologinį atsaką (pvz., interleukinas), naudojimu siekiant
padidinti ląstelės šeimininkės imuninį atsaką.
Intensyvūs elektroporacijos mechanizmo tyrimai leido VDU Gamtos mokslų fakulteto,
biologijos katedros, biofizikinių tyrimų grupės mokslininkams, pradėti elektroporacijos
taikymo navikų elektrochemoterapijoje tyrimus (Satkauskas ir kt., 2005). Šie tyrimai
atliekami bendradarbiaujant su Genų vektorologijos grupe iš Paryžiaus Gustave-Roussy
instituto, vadovaujama dr. L.M. Mir. Pastaroji grupė yra viena iš vedančių laboratorijų Europoje,
- 43 tiriant ląstelių elektroporaciją bei taikant ją praktikoje genų terapijoje ir navikų
elektrochemoterapijoje.
IX. Genetiškai modifikuotų organizmų ir augalų biotechnologijos panaudojimas
medicinoje
Genetiškai modifikuoti mikroorganizmai, augalai ir gyvūnai (ar jų ląstelės) naudojami
gaminant žmogaus insuliną, interferoną, serumo albuminą, antikūnus, augimo faktorius,
krešėjimo faktorius, eritropoetiną, interleukiną-2, hormonus, Žmogaus α1- antitripsiną, kitus
baltymus ar medžiagas (antrinius metabolitus). Didžioji dalis insulino naudojamo diabeto
gydymui yra pagaminama E. coli bakterijų į kurias įkeltas žmogaus insulino genas. Bakterijos
yra labai patogus baltymų šaltinis, kadangi jas pigu ir paprasta auginti, jos gali gaminti
didelius kiekius svetimo baltymo. Tačiau, bakterijų genetinis kodas, transkripcija ir
transliacija skiriasi nuo eukariotinių ląstelių. Bakterijos neturi intronų, neatlieka
potransliacinių modifikacijų ir t.t. Todėl dažnai reikalingi žmogui baltymai sintezuojami
genetiškai modifikavus būtent eukariotines ląsteles, ar visą organizmą. Tokiu būdu gauti ir
gyvūnai – fermentatoriai, kurie reikalingus baltyminius preparatus išskiria su pienu, šlapimu,
sperma, į kraują ar audinių ląsteles.
Genetiškai modifikuoti gyvūnai gali būti naudijami tiriant įvairias ligas ar jų
priežastis. Pavyzdžiui, nustatyta, kad c-Src (tirozinkinazės), katepsino-K (cisteino prroteazės),
osteoprotegerino genų delecijos pelėse sukelia osteoporozę. Sukurtos genetiškai modifikuotos
pelės, vadinamos onkopelėmis, kurios labiau linkusios sirgti krūties ir limfos vėžiu bei yra
naugojamos vaistų ir terapijos tyrimams gydant šiuos du vėžio tipus.
Šiuo metu vystoma idėja kurti valgomas vakcinas. Tikimasi sukurti tokius genetiškai
modifikuotus augalus, kurie gamintų patogenų baltymus, sukeliančius imuninę reakciją ir tuo
pačiu sąlygotų imuniteto susidarymą. Suvalgius tokį modifikuotą vaisių ar daržovę, žmogaus
organizme susidarytų imunitetas prieš tam tikras ligas. Taip būtų išvengta skausmingos
injekcinės vakcinacijos.
Medicininiais tikslais bioreaktoriuose auginamos ir genetiškai nemodifikuotų augalų
audinių ar organų kultūros (pavyzdžiui ženšenio šaknys). Šios augalų kultūros gali dideliais
kiekiais gaminti antrinius metabolitus, tokius kaip flavanoidai ar karotenoidai, kurie
naudojami kaip antioksidantai.
Laboratorinis darbas
EPITELINIŲ KAMIENINIŲ LĄSTELIŲ IDENTIFIKAVIMAS
Teorija
Visų epitelinių audinių (pvz. odos epidermio ir epitelinių ląstelių, išklojančių vidinį žarnyno
paviršių) bendra savybė yra ta, kad paviršiuje esančios ląstelės nuolat apmiršta, yra pašalinamos ir
tada pakeičiamos naujomis. Žmogaus odos viršutinis paviršius yra pašalinamas kiekvieną dieną, o
žarnyno epitelio paviršius atsinaujina kas 3-4 dienas. Šis procesas vyksta dėl to, kad epiteliniuose
audiniuose yra grupė mažiau diferencijuotų ląstelių (suagusio organizmo kamieninių ląstelių),
kurios visą organizmo gyvenimą išsaugo gebėjimą dalintis ir diferencijuotis į specializuotas
epitelinių audinių ląsteles. Buvo nustatyta, kad dalinantis kamieninėms epitelinėms ląstelėms
susidaro vadinama pereinamų-amplifikuojančių (angl. transit-amplifying) ląstelių grupė, kurios turi
didelį proliferacijos potencialą, tačiau pasidalinę tam tikrą kartų skaičių galiausiai diferencijuojasi,
suformuodamos specializuotas epitelines ląsteles.
Norint nustatyti ar audinyje yra kamieninių ląstelių populiacija, pirmiausiai būtina nustatyti ar tą
audinį sudarančios ląstelės pasižymi skirtingu proliferacijos potencialu. Yra trys galimybės: (i)
visos ląstelės dalinasi vienodu greičiu, (ii) dalinasi tik nediferencijuotų ląstelių subpopuliacija, arba
(iii) audinyje yra du tipai besidalinančių ląstelių: kamieninės ir pereinamos-amplifikuojančios.
Populiacijos viduje pastarosios ląstelės gali pasižymėti labai nevienodu proliferacijos pajėgumu,
kuris kinta nuo labai didelio iki gebėjimo pasidalinti tik vieną kartą. Dar viena galimybė yra ta, kad
populiacijos viduje bus dvi subpopuliacijos su skirtingu proliferacijos pajėgumu, kurias galima
atskirti vizualiai pagal susidarančių kolonijų morfologiją.
Šiame laboratoriniame darbe jūs izoliuosite pirmines epitelines ląsteles iš pelės pieno liaukų ir
nustatysite ar izoliuotų ląstelių populiacijoje yra ląstelių, pasižyminčiu skirtingu proliferacijos
pajėgumu.
I DALIS: PIRMINIŲ EPITELINIŲ LĄSTELIŲ IZOLIAVIMAS
Medžiagos ir tirpalai
Terpė audinio suardymui:
1. Sumaišyti (gali būti paruošta prieš dieną):
5µg/ml Insulino (Sigma)
Antibiotikai:
600U/ml Nistatino (Sigma),
100U/ml Penicilino/streptomicino (Gibco)
5 µg/ml Gentamicino (Gibco)
1
DMEM-F12 terpė (Sigma)
2. Pridėti 2mg/ml kolagenazės A (Boehringer), 10minučių maišyti šiltoje vandens vonioje (37°C).
Steriliai perfiltruoti.
DNazės tirpalas:
4 ml DMEM-F12 terpės
2 U/ml DNazės (Sigma)
PBS tirpalas (gali būti paruošta prieš dieną):
PBS
5% Suagusio jaučio serumas
Augimo terpė (gali būti paruošta prieš dieną; ruošiama steriliai laminare):
5 ng/ml Epidermio augimo faktorius (Becton Dickinson)
10 µg/ml Insulinas
5 mg/ml Jaučio serumo albuminas (frakcija V) (Sigma)
5 µg/ml Linoleinės rūgšties komleksas (Sigma)
50 µg/ml Gentamycinas
20U/ml Nistatinas
DMEM-F12 terpė
5-10% Kolageno I (pasirinktinai). Pridėjus palikti nemaišant 1 valandą prie 37°C. Privesti pH 7.4
Linoleinės rūgšties komleksas:
1. PBS ištirpinti 5g linoleinės rūgšties-albumino (Sigma L8384) ir 95g jaučio serumo albumino, kad
llinoleinės rūgšties koncentracija būtų 2.5 mg/ml.
2. Tirpalą perfiltruoti. Išpilstyti 2ml porcijom ir laikyti prie -20°C. Saugoti nuo šviesos.
Jaučio serumo albuminas (JSA) be riebalų rūgščių:
1. Į 250ml standartinės terpės įdėti 50 mg JSA be riebalų rūgščių.
2. 30 min lėtai maišyti (kad neputotų) kambario temperatūroje.
3. Nufiltuoti ir laikyti 40ml porcijom prie -20°C.
Dispazės tirpalas:
Galima nusipirkti paruoštą naudojimui 1× (Boehringer, kat # 295-825)
2
Tripsino tirpalas:
0.05% tripsino ištirpinto DMEM X2.
Lėkštelių padengimas kolagenu (tik ląstelių linijai):
1. 1 ml kolageno tirpalo (2 mg/ml) sumaišyti su 39 ml 0.02 N acto rūgšties (1ml ledinės acto
rūgšties ištirpinti 870 ml distiliuoto H2O).
2. Atskietą kolageno tirpalą (50 µg/ml) išpilstykite į lėkšteles. Naudokite bent jau 5 µg/cm2. Taigi
60 mm lėkštelei padengti reikia 3 ml, o 100 mm reikia 8 ml kolageno tirpalo.
3. Inkubuoti 1 valandą kambario temperatūroje. Po to nusiurbti tirpalo perteklių. Perplauti su PBS.
Darbo eiga:
Ląstelių izoliavimas
1. Pelė patalpinama į CO2 indą arba jai nutraukiamas stuburas.
2. Visa pelė pamerkiama į 70% eatnolį.
3. Steriliais instrumentais išpjaunama trečia, ketvirta ir penkta pieno liakų (PL) poros (pjaunant
stengtis kartu neišpjauti raumens ir sausgyslių gabalėlių). Iš ketvirtos liaukų poros pašalinti
limfmazgius.
4. PL pamerkiamos į šiltą (37°C) DMEM-F12 terpę.
5. Norint izoliuoti pakankamai ląstelių reikia 5-6 pelių. Išpjovus visas PL jos paguldomos ant
plokščio, sterilaus paviršiaus.
6. Naudojant du sterilius skalpelius visos PL yra smulkiai pjaustomos 10-15 minučių.
7. PL homogenates supilamas į 50ml sterilų užsukamą buteliuką (falcon tipo) su šiltu kolagenazės
tirpalu. Naudoti 50 ml tirpalo izoliuojant ląsteles iš 6-7 pelių. Jei izoliuojama iš >8 pelių
paruošiami du 50 ml kolagenazės tirpalo buteliukai.
8. Inkubuojama 3 valandas prie 37°C nuolat purtant (purtymo dažnis 100 rpm).
Ląstelių gryninimas
**(tam, kad proceso eigoje būtų prarandama kuo mažiau ląstelių dėl jų prilipimo prie indų ir
pipečių sienelių, prieš pradedant sekančius žingsnius rekomenduojama Indus ir pipetes praplauti
steriliu PBS + 5% suaugusio jaučio serumo).
1. Po inkubacijos buteliukus su PM homegenatu kolagenazės tirpale centrifuguoti 5min prie 1000
rpm, kambario temperatūroje.
2. Nuosėdas resuspenduoti 4ml DMEM-F12 (2-7 žingsniams naudoti sterilius 50 ml falcon tipo
buteliukus).
3. Centrifuguoti 5min prie 800 rpm, kambario temperatūroje.
3
4. Nuosėdas resuspenduoti 4ml DMEM-F12 su 2U/ml DNazės.
5. Švelniai maišyti 2 minutes.
6. Pridėti 4ml DMEM-F12 su 4% naujagimio jaučio serumo (NJS), kad būtų nuslopintas DNazės
aktyvumas.
7. Centrifuguoti 10min prie 1000 rpm, kambario temperatūroje.
8. Supernatantą nupilti ir nuosėdas resuspenduoti 7-10ml sterilaus PBS + 5% suaugusio jaučio
serumo (SJS).
9. Centrifuguoti 15 sekundžių prie 1500 rpm (spausti “quick spin” mygtuką). Supernatantą nupilti,
nuosėdas resuspenduoti 7-10ml sterilaus PBS+ 5% SJS (9-10 žingsniams naudoti sterilius 15 ml
buteliukus).
10. Norint gauti gryną ląstelių preparatą 9 žingsnį kartoti 7-8 kartus (turi būti bent 90% epitelinių
ląstelių (arba vadinamų ‘organoidų’ sudarytų iš 100 ląstelių), neužterštų eritrocitais ir
fibroblastais). Grynumą tikrinti mikroskopu. Tam po 5-6 pakartojimo paimti 10 µl supernatanto
ir patikrinti ar supernatante nebeliko ‘organoidų’. Jei nebeliko, galima ląsteles užsėti.
Ląstelių auginimas kultūroje
1. Ląstelių koncentracijo suspensijoje skaičiavimas. Išanksto paruošiamas kristalo violeto tirpalas
1:10. Mažame ependorfe lygiais tūriais sumaišomas kristalo violeto tirpalas ir ląstelių
suspensija. Ląstelių membranos suardomos vorteksuojant 15-20 sekundžių. Hemocitometru
suskaičiuojami branduoliai. Atsižvelgiant į praskiedimą kristalo violetu paskaičiuojama ląstelių
koncentracija suspensijoje.
2. Ląstelių užsėjimas. Rekomenduojamas ląstelių užsėjimo tankis yra 50 000 ląstelių/cm2 (pvz.
2×106 ląstelių/100 mm lėkštelėje, 12 šulinėlių lėkštelės su 5-10 ‘organoidais’ šulinėlyje su 1 ml
augimo terpės). Pridėti 2% SJS ir 5-10% kolageno I (pastarojo galima ir nedėti, nes sunku
pašalinti kolageną persėjant ląsteles) ir leisti ląstelėms prisitvirtinti prie lėkštelės dugno. Po 1-2
dienų nupilti terpę su SJS ir pridėti terpės be serumo. Jeigu lėkštelėje vis dar yra daug
fibroblastų galima 5-10 min pridėti dispazės (Boehringer) ir tik tada terpės be serumo. Ląstelės
išgyvena 8-9 dienas, bet terpė turi būti keičiama kas 2-3 dienos.
3. Ląstelių diferenciacijos stimuliavimas. Norint stimuliuoti epitelinių ląstelių diferenciaciją
naudoti keratinus (keratiną 8, 18, 19 epitelinėms ląstelėms ir keratiną 5, 14 mioepitelinėms).
Audinio saugojimas:
1. Audinys turi būti švarus, limfmazgiai pašalinti.
2. Audinys sukarpomas į 1mm dydžio gabalėlius.
4
3. Audinys pamerkiamas į tirpalą sudarytą iš: 10% DMSO ir 90% NJS (arba DMEM-F12 terpėje
su 7% DMSO ir 2% SJS). Išpilstyti į kriogeninius ependorfinius mėgintuvėlius.
4. Audinio ruošinius užšaldyti 1°C/min greičiu naudojant Nalgene šaldymo įrenginį (kat# 51000001) pripildytą izopropanolio. Saugoti prie -70°C kelis mėnesius.
5. Audinys atšildomas greitai pamerkiant ependorfinius mėgintuvėlius su audiniu į 37°C vandens
vonią. Vienam mililitrui audinio ruošinio pridėti 9ml augimo terpės DMEM + 2% NJS.
Ląstelių saugojimas:
1. Ląstelėms padengus visą lėkštelės dugną jas atskirti nuo dugno naudojant dispazę.
2. Ląstelių suspensiją sumaišyti su DMEM-F12 + 2% serumo. Centrifuguoti 5min. prie 1000 rpm,
supernatantą nupilti.
3. Resuspenduoti nuosėdas terpėje su 10% DMSO, 90% NJS (arba DMEM-F12 terpėje su 7%
DMSO ir 2% SJS). Išpilstyti į kriogeninius ependorfinius mėgintuvėlius.
4. Ląstelių ruošinius užšaldyti 1°C/min greičiu naudojant Nalgene šaldymo įrenginį (kat# 51000001) pripildytą izopropanolio. Saugoti prie -80°C.
5. Ląstelių suspensija atšildoma greitai pamerkiant ependorfinius mėgintuvėlius su audiniu į 37°C
vandens vonią. Ląstelių suspensiją atskiesti pridedant iki 6 tūrių augimo terpės. Centrifuguoti 5
min prie 100 rpm. Supernatantą nupilti, resuspenduoti augimo terpėje ir ląsteles pasėti (ląsteles
iš vieno ependorfo į 100 mm diametro lėkštelę.
II DALIS: PROLIFERACIJOS HETEROGENIŠKUMO IR KOLONIJŲ
FORMAVIMO EFEKTYVUMO NUSTATYMAS
Įranga, medžiagos ir tirpalai
Lėkštelės ląstelių kultivavimui (6 cm diametro)
10 mg/ml Jaučio serumo albumino (frakcija V) tirpalas PBS, steriliai perfiltruotas
Ekstraląstelinės matricos baltymų tirpalai PBS lėkštelių padengimui (pasirinktinai):
100 µg/ml Fibronektinas
20 µg/ml Kolagenas I
100 µg/ml kolagenas IV
25 µg/ml lamininas (iš Engelbreth-Holm-Swarm sarkomos (Sigma))
Augimo terpė (žr. aukščiau)
Šviežiai izoliuotos epitelinės ląstelės arba subkonfluentinės epitelinių ląstelių kultūros
0.05% (s/t) Tripsino + 0.02% (s/t) EDTA tirpalas (Gibco)
5
1% Rodanilo mėlio tirpalas: atskirai ištirpinti 2g rodamino ir 2g Nilo mėlio 50 ml distiliuoto
vandens, perfiltruoti per Whatman filtrą ir sumaišyti.
Darbo eiga:
Lėkštelių padengimas ekstraląstelinės matricos baltymais
1. Lėkštelės yra padengiamos pridedant 3 ml ekstraląstelinės matricos baltymų tirpalo. Stengtis,
kad tirpalas padengtų visą lėkštelės paviršių. Inkubuojama per naktį prie 4°C drėgnoje
aplinkoje, arba 1 valandą prie 37°C.
2. Jaučio serumo albumino tirpalą denatūruoti karščiu, pakaitinant 0.5 ml tirpalo porciją 3 min.
prie 80°C. Atšaldyti ant ledų ir atskiesti su PBS iki 0.5 mg/ml jaučio serumo albumino.
3. Pasibaigus inkubacijai, ekstraląstelinės matricos baltymų tirpalo perteklių nusiurbti iš lėkštelių.
Perplauti 3 kartus su PBS.
4. Nespecifinę adheziją užblokuoti pridedant 0.5 mg/ml jaučio serumo albumino tirpalo ir
inkubuojant 1 valandą prie 37°C.
5. Perplauti 2 kartus su PBS. Pridėti 2 ml terpės be serumo (pvz. DMEM) ir padėti šiltai (37°C).
Proliferacijos heterogeniškumo ir kolonijų formavimo efektyvumo (KFE) nustatymas
1. Nusiurbti terpę iš lėkštelių su subkonfluentinėm epitelinių ląstelių kultūrom. Nuplauti 2 kartus
su PBS ir inkubuoti su tripsinu/EDTA 5-15 min. prie 37°C. Mikroskopu tikrinti ląsteles kas 5
min., kol ląstelės pilnai atsiskiria nuo lėkštelės dugno.
2. Tripsinizuotas ląsteles (arba šviežiai izoliuotas ląsteles), supilti į 15 ml centrifuginį mėgintuvėlį.
3. Tripsiną inhibuoti pridedant tripsino inhibitoriaus iš sojos pupelių (1 mg/ml, Sigma).
Centrifuguoti 5 min prie 170 g.
4. Supernatantą nupilti, nuosėdas resuspenduoti 5 ml epitelinių ląstelių augimo terpėje.
Suskaičiuoti ląsteles hemocitometru.
5. Lėkštelėje pasėti 103-104 ląstelių, bent po 3 lėkšteles kiekvienai pasirinktai ląstelių
koncentracijai. Auginti 14 dienų prie 37°C, augimo terpę keisti 3 kartus per savaitę.
6. Po 14 dienų ląsteles nuplauti PBS ir fiksuoti 3.7% formalfehidu 10 min. kambario
temperatūroje.
7. Lėkštelės nuplauti distiliuotu H2O ir dažyti 30 min. pridėjus 3 ml rodanilo mėlio.
8. Lėkštelės nuplauti tekančiu H2O ir išdžiovinti.
9. Naudojantis mikroskopu suskaičiuoti kolonijas, kuriose yra ≥32 ląstelės. KFE paskaičiuojamas
pagal formulę:
6
KFE =
LT
⋅ 100%
LK
kur LT – užsėtų ląstelių skaičius, LK – suformuotų kolonijų skaičius.
10. Paskaičiuojama, kiek skirtingų tipų kolonijų susidarė, jeigu aiškiai matomi morfologiniai
skirtumai. Galimi trys kolonijų tipai: didelės (sudarytos iš kamieninių ląstelių), mažos
(sudarytos
iš
pereinamų-amplifikuojančių ląstelių), ir
labai mažos
(dar
vadinamos
abortyvinėmis, kurios yra sudarytos iš pilnai diferencijuotų ląstelių, turinčių labai ribotą
potencialą dalintis). Sub-klonuojant dideles kolonijas susidaro daug didelių kolonijų, kelios
mažos ir kelios abortyvinės kolonijos, sub-klonuojant mažas – susidaro dauguma tokių pat
mažų ir kelio abortyvinės, sub-klonuojant abortyvines kolonijas naujų kolonijų visai nesusidaro.
7
- 51 -
X. PRAKTINIS DARBAS
Elektrogenoterapija
TIKSLAS
Susipažinti su elektrogenoterapijos principais bei metodika.
UŽDUOTIS
Ištirti fluorescentinių dažų patekimą į pelių hepatomos MH-A22 ir Kinijos žiurkėno
kiaušidžių ląsteles pro poras, suformuotas jų membranoje stipraus elektrinio lauko impulsu.
Įvertinti susiformavusių nanoporų dydį.
DARBO PRIEMONĖS:
1. Elektroporatorius,
2. Eksperimetinė kamera,
3. Fluorescentinis mikroskopas.
REAGENTAI, LĄSTELĖS:
Tirpalai ir reagentai
Fiziologinis tirpalas (0,9% NaCl) (Balkanpharma-Troyan AD, Troyan, Bulgarija).
Augimo terpė pelių hepatomos ir Kinijos žiurkėno kiaušidžių (CHO) ląstelėms ruošiama iš:
Dulbecco‘s modifikuotos Eagle‘s terpės - DMEM (Produktas Nr. D5546, Sigma-Aldrich,
Chemie GmbH, Steinheim, Vokietija), 10% embrioninio jaučio serumo - FBS (F7524, SigmaAldrich, Chemie GmbH, Steinheim, Vokietija), 1% L – Glutamino tirpalo (G7513, SigmaAldrich, Chemie GmbH, Steinheim, Vokietija), 100 U/ml penicilino ir 100 µl streptomicino
antibiotikų (P0781, Sigma-Aldrich, Chemie GmbH, Steinheim, Vokietija). Ląstelių
elektroporacijos terpės: Minimum essential medium Eagle (M8167, Sigma-Aldrich, Chemie
GmbH, Steinheim, Vokietija).
Pelių hepatomos ląstelių MH-A22 linijos bei Kinijos žiurkėno kiaušidžių (CHO)
ląstelės auginamos monosluoksniu steriliuose 25 cm2 (60-75 ml tūrio) flakonuose (Greiner
Bio-One, GmbH, Frickenhausen, Vokietija) su 5 ml augimo terpės. Flakonėliai su ląstelių
kultūra laikomi inkubatoriuje su vandens marškinėliais IR AutoFlow Water-Jacketed
Incubator NU-2500E (NuAire, Inc., Plymouth, JAV), kurio pagalba sudaryta 37 oC drėgna,
5% CO2 aplinka. Flakonėlio dangtelis paliekamas prasuktas tam, kad į flakonėlio vidų galėtų
patekti CO2, reikalingas augimo terpės pH pusiausvyros palaikymui. Augimo terpėje yra visos
pagrindinės medžiagos, reikalingos ląstelių kultūros augimui: amino rūgščių, vitaminų,
druskų, hormonų ir augimo faktorių (FBS), energijos šaltinis (L–glutaminas) ir antibiotikų
- 52 (penicilinas ir streptomicinas) infekcijos profilaktikai. Siekiant apsaugoti auginamą ląstelių
kultūrą nuo infekcijos, dirbama steriliomis sąlygomis vertikalaus srauto laminare Aura
Vertical S.D.4 (Bioair Instruments, S.r.l., Siziano, Italija) ir naudojamos sterilios priemonės
(antgaliai automatinėms pipetėms, mėgintuvėliai ir kt.).
Prieš eksperimentą įvertinamas užaugęs ląstelių monosluoksnis, terpės spalva ir
drumstumas. Augant ląstelių kultūrai, gali būti stebimas terpės spalvos pasikeitimas iš rausvos
į geltoną, nes reaguoja terpėje esantis indikatorius – fenolio raudonasis, parodantis terpės
parūgštėjimą. Ląstelių monosluoksnis, esantis flakonėlyje, apžiūrimas invertuotu mikroskopu
(Nikon Eclipse TS 100, Tokijus, Japonija).
Pelių hepatomos MH-A22 ir Kinijos žiurkėno kiaušidžių ląstelių suspensijos paruošimas
Ląstelių suspensija ruošiama iš užaugusių ląstelių monosluoksnio. Nupilama augimo
terpė. Ląstelių sluoksnis užpilamas 1 ml 0.25% tripsino-0.02% EDTA tirpalo (Produktas Nr.
T4049, Sigma-Aldrich, Chemie GmbH, Steinheim, Vokietija), kad nuplauti seną terpę ir
žuvusias ląsteles. Jis iš karto išpilamas. Tada ląstelių sluoksnis užpilamas 2 ml (60-75 ml tūrio
flakonui) tripsino/EDTA tirpalu ir paliekamas 2 – 10 min kol ląstelių monosluoksnis pilnai
atsiskirs nuo flakonėlio sienelės. Po to ląstelių suspensija papildoma 4 ml augimo terpės tam,
kad sustabdytų tripsino veiklą. Viskas buvo perpilama į 15 ml talpos mėgintuvėlį ir
centrifuguojama 5 min 1000 aps/min greičiu centrifugoje (OPN-3YXL4, Rusija).
Supernatantas nupilamas, o iš nusėdusių ląstelių ruošiama suspensija elektroporacijai (Saulis
ir kt., 2007), ląsteles suspenduojant Minimum essential medium Eagle terpėje (M8167,
Sigma-Aldrich, Chemie GmbH, Steinheim, Vokietija). Paruošta 1,2·106 ląstelių/ml suspensija
elektroporuojama 20-30 min. bėgyje.
Ląstelių tankis apskaičiuojamas Neubauerio hemocitometro (Neubauer improved,
Heinz Herenz Medizinalbedarf, Hamburgas, Vokietija) pagalba, nudažant jas tripano mėliu.
Tam, 10 µl terpės su ląstelėmis įlašinama į 90 µl 0,4% tripano mėlio dažų tirpalą (T-8154,
Sigma-Aldrich co Ltd., Irvine, UK) ir gerai sumaišoma. Paruošus Neubauer kamerą ir įdėjus
lašą nudažytos ląstelių suspensijos, ląstelės suskaičiuojamos naudojant invertuotą mikroskopą
Eclipse TS 100 (Nikon, Tokijus, Japonija).
- 53 TYRIMO METODIKA
Formuojant
membranose,
jų
nanoporas
ląstelių
suspensija
veikiama
stačiakampiais stipraus elektrinio lauko impulsais
(2 pav.). Tam naudojamas elektroporatorius,
sukonstruotas
VDU
Biologijos
katedros
Biofizikinių tyrimų laboratorijoje. Šis įrenginys yra
pritaikytas
elektroporacijos
in
vitro
ir
elektrochemoterapijos
in
vivo
tiriamiesiems
darbams.
generuoti
stačiakampius
Jis
gali
impulsus, kurių skaičius gali kisti nuo 1 iki 1000,
2 pav. Įrenginio nanoporų formavimui ląstelių membranose scema.
impulsų amplitudė – iki 1200 V, trukmė – nuo 20
µs iki 2 ms.
Naudojami plokšteliniai nerūdijančio plieno elektrodai. Jų ilgis 20 mm o plotis – 8
mm. Atstumas tarp elektrodų – 2 mm. Elektroporuojant tarp šių elektrodų įdedamas 50 µl
ląstelių suspensijos lašelis. Eksperimentai atliekami kambario temperatūroje.
Genų patekimą į ląsteles galima stebėti tiriant baltymo, koduojamo įvedamu genu,
ekspresiją. Tam labai gerai tinka fluorescuojantį baltymą – green-fluorescent protein –
koduojantis genas (Dujardin ir kt., 2001). Tačiau baltymo ekspresija užtrunka. Metodo esmę
galima pademonstruoti stebint kitokių molekulių patekimą į ląsteles, pavyzdžiui savaime
fluorescuojančių molekulių (pvz. liuciferio geltonojo (Elia ir kt., 1991)) ar tokių, kurių
fluorescencija smarkiai padidėja, joms prisijungus prie DNR ar RNR (pvz. propido jodido
(Wouters ir kt., 2001)). Stebėjimai atliekami fluorescentiniu mikroskopu. Ląstelių
membranose susiformavusių porų dydį galima įvertinti palyginant duomenis gautus naudojant
skirtingo dydžio molekules. Naudojama dažai: propido jodidas (Mr = 660 Da) ir liuciferio
geltonasis (Mr = 570).
- 54 Literatūra
1.
(2000) Electrochemotherapy, Electrogenetherapy, and Transdermal Drug Delivery,
Humana Press Inc., Totowa, NJ.
2.
Auer D., Brandner G., and Bodemer W. Dielectric breakdown of the red blood cell
membrane and uptake of SV 40 DNA and mammalian cell RNA, Naturwissenschaften,
63 (1976) 391.
3.
Batiuškaitė D (2003) 'Standžių navikų elektrochemoterapinio efektyvumo
priklausomybės nuo elektrinio lauko charakteristikų tyrimas.' 2003. Kaunas, VDU.
4.
Cemazar M., Miklavcic D., and Sersa G. Intrinsic sensitivity of tumor cells to
bleomycin as an indicator of tumor response to electrochemotherapy, Jpn. J. Cancer
Res., 89 (1998) 328-333.
5.
Chandler D.B. Possible mechanisms of bleomycin-induced fibrosis, Clin. Chest. Med.,
11 (1990) 21-30.
6.
Chu G., Hayakawa H., and Berg P. Electroporation for the efficient transfection of
mammalian cells with DNA, Nucleic Acids Res., 15 (1987) 1311-1326.
7.
Dujardin N., Van Der S.P., and Preat V. Topical gene transfer into rat skin using
electroporation, Pharm. Res., 18 (2001) 61-66.
8.
Elia M.C., Motyka L.E., and Stamato T.D. Electrotransfer of [32P]NAD allows labeling
of ADP-ribosylated proteins in intact Chinese hamster ovary cells, Anal. Biochem., 192
(1991) 329-333.
9.
Gehl J. Electroporation: theory and methods, perspectives for drug delivery, gene
therapy and research, Acta Physiol. Scand., 177 (2003) 437-447.
10.
Gothelf A., Mir L.M., and Gehl J. Electrochemotherapy: results of cancer treatment
using enhanced delivery of bleomycin by electroporation, Cancer Treat Rev, 29 (2003)
371-387.
11.
Hanna E., Zhang X., Woodlis J., Breau R., Suen J., and Li S. Intramuscular
electroporation delivery of IL-12 gene for treatment of squamous cell carcinoma located
at distant site, Cancer Gene Ther., 8 (2001) 151-157.
12.
Heller R., Jaroszeski M., Atkin A., Moradpour D., Gilbert R., Wands J., and Nicolau C.
In vivo gene electroinjection and expression in rat liver, FEBS Lett., 389 (1996) 225228.
- 55 13. Kuriyama S., Mitoro A., Tsujinoue H., Nakatani T., Yoshiji H., Tsujimoto T., Yamazaki
M., and Fukui H. Particle-mediated gene transfer into murine livers using a newly
developed gene gun, Gene Ther., 7 (2000) 1132-1136.
14.
Limper A.H. Chemotherapy-induced lung disease, Clin. Chest Med., 25 (2004) 53-64.
15.
Mann S.G. and King L.A. Efficient transfection of insect cells with baculovirus DNA
using electroporation, J. Gen. Virol., 70 ( Pt 12) (1989) 3501-3505.
16.
Meilhoc E., Masson J.M., and Teissie J. High efficiency transformation of intact yeast
cells by electric field pulses, Biotechnology (N Y), 8 (1990) 223-227.
17.
Mir L.M., Belehradek M., Domenge C., Orlowski S., Poddevin B., Belehradek J.,
Schwaab G., Luboinski B., and Paoletti C. [Electrochemotherapy, a new antitumor
treatment: first clinical trial], C R Acad Sci III, 313 (1991a) 613-618.
18.
Mir L.M., Glass L.F., Sersa G., Teissie J., Domenge C., Miklavcic D., Jaroszeski M.J.,
Orlowski S., Reintgen D.S., Rudolf Z., Belehradek M., Gilbert R., Rols M.P.,
Belehradek J., Bachaud J.M., DeConti R., Stabuc B., Cemazar M., Coninx P., and
Heller R. Effective treatment of cutaneous and subcutaneous malignant tumours by
electrochemotherapy, Br J Cancer, 77 (1998) 2336-2342.
19. Mir L.M. and Orlowski S. Mechanisms of electrochemotherapy, Advanced Drug
Delivery Reviews, 35 (1999) 107-118.
20. Mir L.M., Orlowski S., Belehradek J., and Paoletti C. Electrochemotherapy:
potentiation of antitumor effect of bleomycin by local electric pulses, Eur. J. Cancer, 27
(1991b) 68-72.
21. Nakamura H., Isaka Y., Tsujie M., Akagi Y., Sudo T., Ohno N., Imai E., and Hori M.
Electroporation-mediated PDGF receptor-IgG chimera gene transfer ameliorates
experimental glomerulonephritis, Kidney Int., 59 (2001) 2134-2145.
22.
Neumann E. and Rosenheck K. Permeability changes induced by electric impulses in
vesicular membranes, J. Membr. Biol., 10 (1972) 279-290.
23.
Neumann E., Schaefer-Ridder M., Wang Y., and Hofschneider P.H. Gene transfer into
mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields, EMBO J., 1 (1982) 841845.
24. Ogihara M. and Yamaguchi O. Potentiation of effects of anticancer agents by local
electric pulses in murine bladder cancer, Urol. Res., 28 (2000) 391-397.
25.
Prausnitz M.R. and Banga A.K. Assesing the potential of skin electroporation for the
delivery of protein- and gene-based drugs, TibTech., 177 (1998) 408-412.
- 56 26. Satkauskas S., Batiuskaite D., Salomskaite-Davalgiene S., and Venslauskas M.S.
Effectiveness of tumor electrochemotherapy as a function of electric pulse strength and
duration, Bioelectrochemistry, 65 (2005) 105-111.
27. Satkauskas S. and Saulis G. Electroporation as a tool for biotechnology and medicine
with specific emphasize on its application for drug and gene delivery. Review,
Veterinarija ir zootechnika, 28 (2004) 74-81.
28.
Satoh Y., Hatakeyama K., Kohama K., Kobayashi M., Kurusu Y., and Yukawa H.
Electrotransformation of intact cells of Brevibacterium flavum MJ-233, J. Ind.
Microbiol., 5 (1990) 159-165.
29. Saulis G. and Satkauskas S. Electroporation of biological membranes, Veterinarija ir
zootechnika, 28 (2004) 82-88.
30.
Saulis G., Satkauskas S., and Praneviciute R. Determination of cell electroporation
from the release of intracellular potassium ions, Anal. Biochem., 360 (2007) 273-281.
31.
Titomirov A.V., Sukharev S., and Kistanova E. In vivo electroporation and stable
transformation of skin cells of newborn mice by plasmid DNA, Biochim. Biophys. Acta,
1088 (1991) 131-134.
32. Tounekti O., Pron G., Belehradek J., Jr., and Mir L.M. Bleomycin, an apoptosismimetic drug that induces two types of cell death depending on the number of
molecules internalized, Cancer Res., 53 (1993) 5462-5469.
33.
Vieželienė D. Genų terapija, Biomedicina, 76 (2001) 67-69.
34.
Vieželienė D. Genų terapija, Biomedicina, 77 (2002) 78-80.
35. Weaver J.C. and Chizmadzhev Y.A. Theory of electroporation: A review,
Bioelectrochem. Bioenerg., 41 (1996) 135-160.
36. Wells D.J. Gene therapy progress and prospects: electroporation and other physical
methods, Gene Ther., 11 (2004) 1363-1369.
37.
Wouters P.C., Bos A.P., and Ueckert J. Membrane permeabilization in relation to
inactivation kinetics of Lactobacillus species due to pulsed electric fields, Appl.
Environ. Microbiol., 67 (2001) 3092-3101.
38.
Yin D. and Tang J.G. Gene therapy for streptozotocin-induced diabetic mice by
electroporational transfer of naked human insulin precursor DNA into skeletal muscle in
vivo, FEBS Lett., 495 (2001) 16-20.