EFEITO ANTINOCICEPTIVO E ANTI

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO VALE DO SÃO FRANCISCO
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM RECURSOS NATURAIS DO
SEMIÁRIDO
JULIANE CABRAL SILVA
EFEITO ANTINOCICEPTIVO E ANTI-INFLAMATÓRIO DE Annona
vepretorum Mart. (ANNONACEAE) EM ROEDORES
PETROLINA
2013
1
JULIANE CABRAL SILVA
EFEITO ANTINOCICEPTIVO E ANTI-INFLAMATÓRIO DE Annona
vepretorum Mart. (ANNONACEAE) EM ROEDORES
Dissertação apresentada à Universidade
Federal do Vale do São Franciso, como
parte das exigências do Programa de
Pós-graduação em Recursos Naturais
do Semiárido, para obtenção do título de
Mestre em Recursos Naturais.
Orientador: Prof. Dr. Jackson Roberto
Guedes da Silva Almeida
Co-orientadora:
Luciane Mendes
PETROLINA
2013
Prof.
Dr.ª
Rosemairy
2
Silva, Juliane Cabral
S587e
Efeito antinociceptivo e anti-inflamatório de Annona vepretorum
Mart. (Annonaceae) em roedores / Juliane Cabral Silva. – Petrolina,
2013.
183f.
Dissertação (mestrado)- Universidade Federal do Vale do São
Francisco. Recursos Naturais do Semiárido, Petrolina, 2013.
Orientador: Prof. Dr. Jackson Roberto Guedes da Silva Almeida.
1. Atividade Antinociceptiva.
2. Atividade Anti-inflamatória.
3. Annonaceae. I. Título. II. Universidade Federal Vale do São
Francisco.
CDD 615.1
Ficha elaborada pelo Sistema Integrado de Bibliotecas da Univasf. CRB/04-1747.
4
Dedico este trabalho a Deus, aos meus pais José
Aparecido da Silva e Verônica Vilar Cabral Silva, ao
meu irmão Josielson Cabral Silva, aos meus
familiares,
amigos e
ao
meu orientador
que
acreditaram em mim e me apoiaram em todos os
momentos.
5
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus e à Nossa Senhora, por guiarem sempre os meus passos
e me darem fortaleza, tornando possível o que era impossível.
Ao meu orientador, Prof. Dr. Jackson Roberto Guedes da Silva Almeida,
escolha perfeita e pelo qual tive a sorte de, imediatamente, me aceitar como
orientanda. Mais do que orientador e amigo você é um exemplo a ser seguido, um
Pesquisador que apesar das adversidades, tudo supera e contribui cientificamente,
“uma verdadeira MÁQUINA”. Obrigada por toda dedicação e ensinamentos.
À minha co-orientadora Rosemairy Luciane Mendes, pela qual tenho um
imenso afeto e admiração, sinônimo de sinceridade e honestidade. Obrigada por
todas as contribuições científicas, por suas horas dedicadas e por toda amizade
construída, a qual quero levar para sempre.
Ao Programa de Pós-graduação em Recursos Naturais do Semiárido, e a
todos os professores pelos conhecimentos compartilhados, contribuindo na minha
formação.
A todos do Núcleo de Estudos e Pesquisas de Plantas Medicinais
(NEPLAME) e aos meus colegas de laboratório, em especial, Amanda, Ana Paula,
Sarah Raquel, Camila Araújo, Tâmara Diniz, Grasielly Rocha, Raimundo Júnior,
Suzana Rabêlo, Alessandra Pacheco, Larissa Macêdo, Leandra Macêdo e
Viviane Araújo, pelo apoio e amizade.
A Henrique Saraiva, Carlos Wagner, Keidy Costa, Camila Meirelles, Érica
Lavor, Mariana Gama, Heloisa Stefanin, Angelo Amorim, José Roberto Rocha e
Larissa Silveira pela parceria na realização dos meus experimentos.
Ao Professor Dr. Lucindo José Quintans-Júnior, pela oportunidade de
aprender novas técnicas em seu laboratório, ao Professor Dr. Leonardo Bonjardim
pela atenção, e aos colegas pela paciência e técnicas ensinadas.
Ao CRAD/UNIVASF na pessoa do Professor Dr. José Alves de Siqueira
Filho.
Ao pessoal do biotério Leonardo, Euda, Helenildo e Jean, por toda atenção
e compreensão, me recebendo sempre com um sorriso no rosto.
Aos Técnicos: Ana Paula, Amanda, Silvio Alan, Roniere A. Oliveira e
Fernando pela ajuda e compreensão.
Ao Prof. Dr. Fabrício Souza Silva pela ajuda nos ensaios de toxicidade.
6
À Aline Braga pela imensa compreensão.
A todos os servidores da UNIVASF, em especial Francisca, João Paulo, Sr.
Cícero, Geralda, Juliana, Maria e Neide por toda atenção a mim dedicada, na
realização das suas funções.
Aos colegas de Turma, em especial Fernanda Ribeiro, Camila Araújo e
Tâmara Diniz, pelos momentos de estudo juntas e por toda amizade.
A José Aparecido da Silva e Verônica Vilar Cabral Silva, meus pais, por
todo amor incondicional e valores ensinados. Por me lembrarem sempre que “Deus
me ama, que não estou só, que Deus cuida de mim quando fala por tuas vozes que
me diz: Coragem” (Amor Humano de Deus – Adriana).
Ao meu irmão Josielson Cabral Silva, a quem nem tenho palavras para
expressar o meu amor, apenas agradeço por sua vida, pelas preocupações,
renúncias e sacrifícios que fez para que hoje eu estivesse aqui.
Agradeço às Irmãs Carmelitas e à minha avó pelas orações e atenção, ao
meu avô por me fazer sentir tão importante, à minha cunhada, às minhas madrinhas,
padrinhos, tias, tios, primas e primos por todo apoio.
Aos meus amigos, Mestres e eternos orientadores: Rodrigo Cappato, Ana
Carolina, Antonieta Albuquerque e meus docentes da UPE por sempre me
lembrarem dos meus objetivos e dando forças para que eu jamais desista!
A todos os meus amigos, impossível citar os nomes, pois graças a Deus,
são muitos. Obrigada por todo apoio e compreensão pela minha ausência. Obrigada
por me doarem um pouco de suas famílias. Com vocês tudo se torna mais fácil.
À Comunidade dos Viventes e ao meu Vínculo, pelas orações e partilhas.
Juntos! N’Ele Até o fim!
À Coordenacão de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior
(CAPES), pela bolsa de mestrado.
Por último, para serem destacados por sua total doação, a vocês
camundongos e ratos, sem vocês nada disso teria se concretizado.
Muito obrigada!
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“Posso, tudo posso Naquele que me
fortalece
Nada e ninguém no mundo vai me
fazer desistir
Quero, tudo quero, sem medo
entregar meus projetos
Deixar-me guiar nos caminhos que
Deus desejou pra mim”
(Celina Borges)
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RESUMO
Para esse estudo, foi selecionada a espécie Annona vepretorum Mart., conhecida
popularmente como araticum, e utilizada na medicina popular para o tratamento de
processos inflamatórios. O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito antinociceptivo e
anti-inflamatório do extrato etanólico bruto (Av-EtOH – 25, 50 e 100 mg/kg, v.o.) e do
óleo essencial (Av-OE – 25, 50 e 100 mg/kg, i.p.) das folhas de A. vepretorum em
roedores, utilizando diferentes modelos experimentais, bem como avaliar a
toxicidade subcrônica de Av-EtOH. Para avaliação da atividade antinociceptiva,
foram realizados os seguintes ensaios: teste de contorções abdominais induzidas
por ácido acético, teste da formalina, testa da placa quente e teste de retirada da
cauda. Para avaliar o efeito anti-inflamatório, foram realizados dois modelos: edema
de pata induzido por carragenina e histamina, e peritonite induzida por carragenina.
Além disso, foi avaliado o efeito antinociceptivo de Av-EtOH em modelos de dor
orofacial induzida por formalina, glutamato e capsaicina. O estudo toxicológico foi
conduzido durante 30 dias, realizando administração diária de Av-EtOH nas doses
de 100 e 400 mg/kg. Ao final do estudo, os animais foram eutanasiados para
avaliação de parâmetros bioquímicos, hematológicos e histopatológicos. Em relação
à atividade antinociceptiva, Av-EtOH e Av-OE demonstraram efeito em todos os
ensaios experimentais e tiveram seus efeitos revertidos quando administrados
juntamente com a naloxona nos testes de formalina e placa quente. Nos modelos de
dor orofacial, Av-EtOH reduziu o comportamento nociceptivo induzido por formalina,
capsaicina e glutamato. Em relação à avaliação da atividade anti-inflamatória,
Av-EtOH e Av-OE também apresentaram resultados satisfatórios em todos os testes.
Com o intuito de mensurar o perfil de segurança de Av-EtOH, foi realizado o estudo
toxicológico subcrônico pré-clínico. A administração diária de Av-EtOH (100 e 400
mg/kg) durante 30 dias não provocou morte em nenhum dos grupos tratados,
indicando baixa toxicidade do extrato. Conclui-se que Annona vepretorum possui
atividades antinociceptiva e anti-inflamatória, corroborando com seu uso na medicina
popular. Além disso, o estudo de toxicidade demonstrou que a espécie apresenta
um perfil de segurança aceitável, o que respalda o desenvolvimento de estudos
farmacológicos e toxicológicos posteriores.
Palavras-chave: Annona vepretorum, Annonaceae, atividade antinociceptiva,
atividade anti-inflamatória, dor orofacial, toxicidade subcrônica.
9
ABSTRACT
For this study, we selected the species Annona vepretorum Mart., commonly known
in Brazil as araticum, and used in folk medicine for the treatment of inflammatory
processes. The aim of this study was to evaluate the antinociceptive and antiinflammatory effects in rodents of crude ethanolic extract (Av - EtOH 25, 50 and 100
mg / kg, p.o.) and essential oil (Av-OE 25, 50 and 100 mg / kg, i.p.) from the leaves
of A. vepretorum, using different experimental models, as well as evaluate the
subchronic toxicity of Av-EtOH. To evaluate the antinociceptive activity were carried
out the tests: acetic acid-induced writhing, formalin, hot plate and tail flick. To assess
the anti-inflammatory effect were performed two models: histamine and carrageenaninduced hind paw edema, and carrageenan induced peritonitis. Furthermore, we
evaluated the antinociceptive effect of Av-EtOH in models of formalin, capsaicin and
glutamate- induced orofacial nociception. The toxicological study was conducted
during 30 days, performing daily administration of Av-EtOH at doses of 100 and 400
mg/kg. At the end of the study, the animals were euthanized for assessment of
biochemical,
hematological
and
histopathological
findings.
Regarding
the
antinociceptive activity, Av-EtOH and Av-OE showed effects in all experimental tests
and had its effect reversed when administered with naloxone in formalin test and hot
plate. In models of orofacial pain, Av-EtOH reduced the nociceptive behavior induced
by formalin, capsaicin and glutamate. Regarding the assessment of anti-inflammatory
activity, Av-EtOH and Av-OE also obtained satisfactory results in all tests. In order to
measure the safety profile of Av-EtOH, the subchronic toxicology preclinical study
was conducted. The daily administration of Av-EtOH (100 and 400 mg/kg) during 30
days did not cause any death in treated groups, indicating low toxicity of the extract.
In summary, we concluded that Annona vepretorum have antinociceptive and antiinflammatory properties, supporting its use in folk medicine. Moreover, the toxicity
study showed that the species has a safety acceptable profile, which supports the
development of pharmacological and toxicological studies later.
Keywords:
Annona
vepretorum,
Annonaceae,
inflammatory activity, orofacial pain, subchronic toxicity.
antinociceptive
activity,anti-
10
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Foto de Annona vepretorum......................................................................33
Figura 2 - Distribuição fitogeográfica de Annona vepretorum....................................34
Figura 3 - Exsicata de Annona vepretorum coletada em Jaguarari- BA....................55
Figura 4 - Exsicata de Annona vepretorum coletada em Petrolina- PE.....................56
Figura 5 - Camundongo observado no teste de contorções abdominais………........61
Figura 6 - Camundongo observado no teste da formalina. .......................................62
Figura 7 - Animal observado no teste da placa quente. ............................................63
Figura 8 - Animal observado no teste de retirada da cauda......................................64
Figura 9 - Teste de dor orofacial induzida por formalina............................................65
Figura 10 - Volume da pata mensurado utilizando o aparelho pletismômetro no
modelo do edema de pata induzido por carragenina.................................................67
Figura 11 – Efeito antinociceptivo do extrato etanólico bruto de Annona vepretorum,
indometacina e morfina no teste de contorções induzidas por ácido acético em
camundongos.............................................................................................................73
Figura 12 - Efeito antinociceptivo do extrato etanólico bruto de Annona vepretorum,
indometacina e morfina na primeira e segunda fase do teste da formalina...............74
Figura 13 - Efeito antinociceptivo do extrato etanólico bruto de Annona vepretorum e
morfina no teste da placa quente em 30, 60, 90 e 120 minutos após sua
administração.............................................................................................................75
Figura 14 - Efeito antinociceptivo do extrato etanólico bruto de Annona vepretorum e
morfina no teste de retirada da cauda em 30, 60, 90 e 120 minutos após sua
administração.............................................................................................................76
11
Figura 15 – Efeito antinociceptivo do extrato etanólico bruto de Annona vepretorum e
morfina na primeira e segunda fase do teste de dor orofacial induzida por
formalina.....................................................................................................................77
Figura 16 – Efeito antinociceptivo do extrato etanólico bruto de Annona vepretorum e
morfina no teste de dor orofacial induzido por capsaicina.........................................78
Figura 17 – Efeito antinociceptivo do extrato etanólico bruto de Annona vepretorum,
morfina no comportamento nociceptivo orofacial induzido por glutamato.................79
Figura 18 - Efeito anti-inflamatório do extrato etanólico bruto de Annona vepretorum
e
indometacina
no
edema
de
pata
induzida
por
carragenina
em
camundongos.............................................................................................................80
Figura 19 – Efeito anti-inflamatório do extrato etanólico bruto de Annona vepretorum
e
indometacina
no
edema
de
pata
induzida
por
histamina
em
camundongos.............................................................................................................81
Figura 20 - Histologia das patas de camundongos após indução de edema por
carragenina e histamina após tratamentos................................................................82
Figura 21 - Efeito anti-inflamatório do extrato etanólico bruto de Anonna vepretorum
e dexametasona na migração leucocitária na cavidade peritoneal induzida por
carragenina em camundongos...................................................................................84
Figura 22 - Dados de peso dos animais tratados com extrato etanólico bruto de
Anonna vepretorum durante 30 dias .........................................................................85
Figura 23 - Efeito antinociceptivo do óleo essencial de Annona vepretorum,
indometacina e morfina no teste de contorções induzidas por ácido acético em
camundongos.............................................................................................................89
Figura 24 - Atividade antinociceptiva do óleo essencial de Annona vepretorum,
indometacina e morfina na primeira e segunda fase do teste da formalina...............90
Figura 25 - Atividade antinociceptiva do óleo essencial de Annona vepretorum e
morfina, no teste da placa quente em 30, 60, 90 e 120 minutos após sua
administração.............................................................................................................91
12
Figura 26 - Efeito do óleo essencial de Annona vepretorum e dexametasona na
migração leucocitária na cavidade peritoneal induzida por carragenina em
camundongos.............................................................................................................92
13
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Sistemas de eluição e reveladores utilizados para caracterizar os
principais
metabólitos
secundários
da
espécie
Annona
vepretorum
(Annonaceae).............................................................................................................58
Tabela 2 - Identificação das principais classes de constituintes químicos presentes
no
extrato
etanólico
bruto
das
folhas
de
Annona
vepretorum
(Annonaceae).............................................................................................................71
Tabela 3 Constituintes químicos identificados no óleo essencial das folhas de
Annona vepretorum (Annonaceae)............................................................................72
Tabela 4 - Parâmetros hematológicos do sangue de camundongos tratados com
extrato etanólico bruto de Anonna vepretorum durante 30 dias (n= 10 por
grupo).........................................................................................................................86
Tabela 5 - Parâmetros bioquímicos obtidos do soro de camundongos tratados com
extrato etanólico bruto de Anonna vepretorum durante 30 dias (n= 10 por
grupo).........................................................................................................................87
Tabela 6 - Peso dos órgãos de camundongos tratados com extrato etanólico bruto
de Anonna vepretorum durante 30 dias (n= 10 por grupo)........................................88
14
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
Aα
Fibras do tipo A- alfa
Aβ
Fibras do tipo A- beta
Aδ
Fibras do Tipo A- delta
AA
Ácido araquidônico
AAS
Ácido acetilsalicílico
ACTH
Corticotropina
AINES
Anti-inflamatórios não esteroidais
ALT
Alanina aminotrasnferase
AMPc
Adenosina monofosfato cíclico
ANOVA
Análise de variância
AST
Aspartato aminotransferase
ATP
Adenosina trifosfato
Av-EtOH
Extrato etanólico das folhas de Annona vepretorum
Av-OE
Óleo essencial das folhas de Annona vepretorum
CEUA
Comissão de Ética no Uso de Animais
CHCM
Concentração de hemoglobina corpuscular média
COX
Enzima cicloxigenase
CT
Corticosteróides
CRAD
Centro de Recuperação de Áreas Degradadas da Caatinga
EDTA
Ácido etileno diamino tetra-acético
GC
Glicocorticoides
15
HCM
Hemoglobina corpuscular média
HVASF
Herbário Vale do São Francisco
IASP
International Association for the Study of Pain
ICAM
moléculas de adesão intercelular
IFNʏ
Interferon Gama
IL
Interleucina
iNOS
Sintase Induzida pelo Óxido Nítrico
LNRP
Limiar Nociceptivo de Retirada da Pata
LOX
Enzima lipoxigenase
MORF
Morfina
OMS
Organização Mundial da Saúde
NLX
Naloxona
NMDA
N-metil-D-aspartato
NO
Óxido nítrico
PAF
Fator de ativação plaquetária
PG
Prostaglandina
PGE2
Prostaglandina E2
PGF2α
Prostaglandina F2α
PI
Prostaciclina
PKA
Proteína quinase A
PKC
Proteína quinase C
PLA2
Fosfolipase A2
PNPIC
Política Nacional de Práticas Integrativas e Complementares
16
RENISUS
Relação Nacional de Plantas Medicinais de Interesse ao
SUS
RGC
Receptores de Glicocorticoides Citosólicos
SG
Substância Gelatinosa
SUS
Sistema Único de Saúde
TGO
Transaminase glutâmico oxalacética
TGP
Transaminase glutâmico pirúvica
TNF
Fator de necrose tumoral
TNF-α
Fator de necrose tumoral-α
TRVP-1
Receptor de potencial transitório vaniloide
TX
Tromboxano
UNIVASF
Universidade Federal do Vale do São Francisco
VCAM-1
Moléculas de Adesão Vascular
VCM
Volume corpuscular médio
VR
Receptor vaniloide
17
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ………….…………..........…………….…………………….…..........21
2. OBJETIVOS .…….………………………..........……………………………….…...... 24
2.1. Objetivo geral ..……………….………….……........……………………….…....... .25
2.2. Objetivos específicos .…………………...........……………………..…….…..........25
3. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA .…………………..........……………………….......26
3.1. Produtos naturais ...............……………….….………..........………………...........27
3.2. Considerações sobre família Annonaceae e o gênero Annona .........................29
3.3.
Considerações
sobre
espécies
do
gênero
Annona
com
atividades
antinociceptiva e anti-inflamatória..............................................................................30
3.4. Considerações sobre a espécie Annona vepretorum .............…………..…........32
3.5. Considerações sobre dor ...................................................................................34
3.5.1 Dor e nocicepção ................……………….….……………….........………........ 34
3.5.2 Nociceptores .......................……………….….……………………..........…....... 36
3.5.3 Vias nociceptivas ...............……………….….……………………….................. 36
3.5.4 Mecanismo da dor central .....………….........……………………………..….......38
3.5.5 Mecanismo da dor periférica: dor inflamatória .................................................39
3.6. Drogas analgésicas ............................................................................................39
3. 7. Modelos experimentais para avaliação da atividade antinociceptiva.................40
3.7.1. Contorções abdominais induzidas por ácido acético ......................................40
3.7.2. Teste da formalina ………………………………………………………………....41
3.7.3. Teste de Randall-Selitto …………………………………………………………...42
3.7.4. Teste de von Frey ............................................................................................42
3.7.5. Dor orofacial induzida por formalina ................................................................43
18
3.7.6. Teste da placa quente ……………………………………………………….........44
3.7.7. Teste de retirada da cauda ..............................................................................45
3.8. Considerações sobre inflamação …………………………………………..............45
3.8.1. Eventos vasculares …………………………………………………………..........46
3.8.2. Eventos celulares …………………………………………………………….........47
3.8.3. Mediadores químicos ………………………………………………………...........48
3.9. Drogas anti-inflamatórias ....................................................................................49
3.9.1. Anti-inflamatórios não esteroidais ...................................................................49
3.9.2 Anti-inflamatórios esteroidais............................................................................50
3.10. Modelos experimentais ……………………………………………………….........51
3.10.1. Edema de pata induzido por carragenina .....................................................51
3.10.2. Edema de orelha induzido por óleo de cróton ...............................................52
3.10.3. Peritonite induzida por carragenina ……………………………………….........53
4. PARTE EXPERIMENTAL ……………………………………………….......…..........54
4.1. Material vegetal ..................................................................................................55
4.1.1 Coleta de Annona vepretorum para obtenção do extrato etanólico bruto ........55
4.1.2 Coleta de Annona vepretorum para extração do óleo essencial.......................56
4.2. Obtenção do extrato etanólico bruto das folhas de Annona vepretorum............57
4.3. Avaliação fitoquímica preliminar dos constituintes químicos de Av-EtOH..........57
4.4. Obtenção do óleo essencial das folhas de Annona vepretorum.........................59
4.5. Animais …………………………………………………………………………….…..59
4.6. Testes de atividade antinociceptiva ....................................................................60
4.6.1. Teste das contorções abdominais induzidas por ácido acético ......................60
4.6.2. Teste da formalina ………………………………………………………………....61
19
4.6.3. Teste da placa quente .....................................................................................62
4.6.4. Teste de retirada da cauda ..............................................................................63
4.6.5. Teste de dor orofacial induzida por formalina .................................................64
4.6.6. Teste de dor orofacial induzida por capsaicina ...............................................65
4.6.7. Teste de dor orofacial induzida por glutamato ................................................65
4.7. Testes de atividade anti-inflamatória …………………………………………........66
4.7.1. Edema de pata induzido por carragenina .......................................................66
4.7.2. Edema de pata induzido por histamina ...........................................................67
4.7.3. Migração de leucócitos na cavidade peritoneal ..............................................67
4.8. Toxicidade subcrônica ………………………………………………………….........68
4.8.1. Análise comportamental ………………………………………………………......68
4.8.2. Análises de parâmetros hematológicos e bioquímicos ...................................69
4.9. Análise estatística ………………………………………………………………….....69
5. RESULTADOS ......................................................................................................70
5.1. Triagem fitoquímica ............................................................................................71
5.2. Composição do óleo essencial ...........................................................................71
5.3. Resultados do extrato de Annona vepretorum ...................................................72
5.3.1 Atividade antinociceptiva do extrato de Annona vepretorum............................72
5.3.1.1 Teste das contorções abdominais induzidas por ácido acético ....................72
5.3.1.2 Teste da formalina .........................................................................................73
5.3.1.3 Teste da placa quente ....................... ...........................................................75
5.3.1.4 Teste de retirada da cauda ............................................................................75
5.3.1.5 Teste de dor orofacial induzida por formalina ...............................................76
5.3.1.6 Teste de dor orofacial induzida por capsaicina .............................................77
20
5.3.1.7 Teste de dor orofacial induzida por glutamato ..............................................78
5.3.2 Atividade anti-inflamatória do extrato de Annona vepretorum..........................79
5.3.2.1 Edema de pata induzido por carragenina .....................................................79
5.3.2.2 Edema de pata induzido por histamina .........................................................80
5.3.2.3 Análise histológica .........................................................................................81
5.3.2.4 Migração de leucócitos na cavidade peritoneal ............................................84
5.3.3. Toxicidade subcrônica do extrato de Annona vepretorum...............................84
5.3.3.1. Avaliação comportamental dos camundongos .............................................85
5.3.3.2. Parâmetros hematológicos ...........................................................................85
5.3.3.3. Parâmetros bioquímicos ...............................................................................86
5.3.3.4. Análise macroscópica e peso dos órgãos ....................................................87
5.4. Resultados do óleo essencial de Annona vepretorum .......................................88
5.4.1. Atividade antinociceptiva do óleo essencial de Annona vepretorum...............88
5.4.1.1 Teste das contorções abdominais induzidas por ácido acético.....................88
5.4.1.2 Teste da formalina .........................................................................................89
5.4.1.3 Teste da placa quente ..................................................................................90
5.4.2. Atividade anti-inflamatória do óleo essencial de Annona vepretorum..............91
5.4.2.1 Migração de leucócitos na cavidade peritoneal ............................................91
6. DISCUSSÃO..........................................................................................................93
7. CONCLUSÕES....................................................................................................102
REFERÊNCIAS .......................................................................................................104
APÊNDICES ............................................................................................................129
ANEXOS..................................................................................................................181
21
1. INTRODUÇÃO
SILVA, J.C. Efeito antinociceptivo e anti-inflamatório de Annona vepretorum Mart. (Annonaceae)
em roedores.
22
1. INTRODUÇÃO
A dor corresponde a uma resposta subjetiva que o organismo apresenta
quando é submetido a algum estímulo potencialmente nocivo. Em tecidos normais,
esse estímulo ativa reações fisiológicas adequadas para evitar uma possível lesão.
Em tecidos ou órgãos que sofreram lesão, a instalação de um processo inflamatório
provoca sensibilização de nociceptores a responderem a estímulos que são inócuos
ou não provocam sensação dolorosa normalmente (SCHAIBLE et al., 2011). Na
maioria das vezes esse tipo de reação configura-se como uma função protetora,
representando, em muitos casos, o único sintoma para o diagnóstico de várias
doenças (OLIVEIRA et al., 2009), porém quando persistente provoca reações
emocionais negativas, tornando-se debilitante e causadora de sofrimento (GRIFFIS
et al., 2006).
Quando se trata de fármacos para o tratamento da dor, abre-se uma lacuna
no que diz respeito ao regime medicamentoso que pode ser estabelecido, tendo em
vista que ainda não dispomos de um analgésico e/ou anti-inflamatório ideal, ou seja,
que não promovam efeitos colaterais potenciais. Embora sejam altamente eficazes,
os analgésicos de ação central geralmente não estão dissociados de efeitos
adversos importantes e os analgésicos de ação periférica também apresentam
efeitos indesejáveis, tais como lesões do trato gastrointestinal e renal (RANG et al.,
2012). Assim, tem-se a necessidade de buscar medidas alternativas para o
desenvolvimento de medicamentos para o combate da dor. Nessa perspectiva, os
produtos naturais são considerados como uma fonte promissora na pesquisa de
moléculas com potencial atividade analgésica e anti-inflamatória.
Uma região com uma rica diversidade de plantas é o Nordeste, cujo bioma é a
Caatinga, estende-se o domínio do semiárido em uma área de 73.683.649 hectares
(BRASIL, 2008). Embora seja a área menos estudada dentre as regiões brasileiras,
merece destaque, pois é o único bioma exclusivamente brasileiro, cujos limites estão
inteiramente restritos ao território nacional. Além disso, possui uma proporção
expressiva de plantas endêmicas, comumente utilizadas pela população por suas
propriedades terapêuticas e possuindo, assim, uma importante fonte de recursos
naturais (LEAL et al., 2005).
em roedores.
23
Tendo em vista a riqueza do bioma Caatinga, a ampla utilização de plantas
como medicamentos e, na maioria das vezes, a falta de conhecimento científico
sobre os efeitos biológicos de determinadas espécies, torna-se imprescindível
estudos sobre potencialidades terapêuticas das plantas encontradas nessa região.
Uma das plantas encontradas na região e que não possui estudos na
literatura é Annona vepretorum, espécie encontrada no Vale do São Francisco,
pertencente ao gênero Annona, cujas espécies, Annona diversifolia (CARBALLO et
al., 2010) e Annona squamosa (CHAVAN et al., 2010) possuem substâncias
biologicamente ativas com potenciais analgésico e anti-inflamatório.
Portanto, a relevância desse estudo é para a pesquisa na área de recursos
naturais do semiárido, no conhecimento de espécies da família Annonaceae, em
especial do gênero Annona; bem como na descoberta de novas espécies com
potenciais farmacológicos, em especial no tratamento da dor e inflamação.
Assim, o objetivo do presente trabalho foi estudar o efeito antinociceptivo e
anti-inflamatório do extrato etanólico bruto e do óleo essencial de Annona
vepretorum, além de avaliar o perfil de segurança dessa espécie. Para isso, foi
realizado ensaio toxicidadede subcrônica do extrato e testes farmacológicos que
avaliam atividades antinociceptiva e anti-inflamatória.
Em levantamento bibliográfico realizado nos principais bancos de dados sobre
estudos com plantas medicinais, não foram encontrados registros de estudos
farmacológicos com essa espécie, sendo este estudo pioneiro na busca e
comprovação da atividade antinociceptiva e anti-inflamatória de Annona vepretorum,
visando assegurar sua utilização e servir de parâmetros para o desenvolvimento de
novos medicamentos fitoterápicos.
24
2. OBJETIVOS
SILVA, J.C. Efeito antinociceptivo e anti-inflamatório de Annona vepretorum Mart. (Annonaceae) 25
em roedores.
2. OBJETIVOS
2.1. Objetivo geral
Investigar a possível atividade antinociceptiva e/ou anti-inflamatória do extrato
etanólico bruto e do óleo essencial de Annona vepretorum Mart. (Annonaceae) em
roedores e avaliar possíveis mecanismos de ação envolvidos nos efeitos
evidenciados.
2.2. Objetivos específicos
- Estudar os aspectos farmacológicos de Annona vepretorum;
- Avaliar o potencial antinociceptivo e anti-inflamatório da espécie Annona
vepretorum;
- Avaliar os possíveis mecanismos de ação envolvidos e a participação dos sistemas
de neurotransmissão;
- Avaliar o perfil de segurança, através do estudo de toxicidade subcrônica do
extrato etanólico bruto da espécie;
- Contribuir para o estudo farmacológico da espécie de Annonaceae.
26
3. FUNDAMENTAÇÃO
TEÓRICA
em roedores.
27
3. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA
3.1. Produtos naturais
O reino vegetal é o que tem contribuído de forma mais significativa para o
fornecimento de metabólitos secundários, muitos destes de grande valor agregado
devido às suas aplicações como medicamentos, cosméticos, alimentos e
agroquímicos (PINTO et al., 2002). Plantas medicinais constituem uma das mais
importantes fontes de substâncias ativas com potencial terapêutico e são
frequentemente usadas nos países em desenvolvimento (SCHULZ et al., 2002).
O uso de produtos naturais no combate a diversas enfermidades é prática
antiga. A busca por alívio e cura de doenças pela ingestão de ervas e folhas talvez
tenham sido uma das primeiras formas de utilização destes produtos (VIEGASJÚNIOR et al., 2006).
Evidências arqueológicas mostram que o uso de drogas era amplo em
culturas antigas. No mundo moderno, as grandes navegações trouxeram a
descoberta de novos continentes, legando um grande arsenal terapêutico de origem
vegetal (PINTO et al., 2002), enquanto a convivência e o aprendizado com os mais
diferentes grupos étnicos trouxeram valiosas contribuições para o desenvolvimento
da pesquisa em produtos naturais, do conhecimento da relação íntima entre a
estrutura química de um determinado composto e suas propriedades biológicas
(VIEGAS-JÚNIOR et al., 2006).
Constituindo-se muitas vezes o único recurso terapêutico de muitas
comunidades e grupos étnicos, ainda hoje plantas medicinais são comercializadas
em feiras livres, mercados populares e encontradas em quintais residenciais nas
regiões mais pobres do país e até mesmo nas grandes cidades brasileiras (MACIEL
et al., 2002).
É importante mencionar que as plantas, além de seu uso na medicina popular
com finalidades terapêuticas, têm contribuído ao longo dos anos para a obtenção de
vários fármacos, até hoje amplamente utilizados na clínica (CECHINEL-FILHO,
YUNES, 1998); como a morfina e a codeína, obtidas a partir da Papaver somniferum
que promovem analgesia e alterações no humor por atuar, principalmente, nos
receptores opioides μ (HUANG; KUTCHAN, 2000).
em roedores.
28
A maioria dos princípios ativos de importância farmacológica encontrada nos
extratos vegetais, de modo geral, é oriunda de uma variedade de metabólitos
secundários que são produzidos para modular seus próprios metabolismos,
possuem uma constituição complexa e podem alcançar alvos terapêuticos de
doenças humanas (FERREIRA; PINTO, 2010).
Enquanto os medicamentos apresentam, em sua quase totalidade, um único
princípio ativo que é responsável pelo seu efeito farmacológico, os extratos vegetais
são constituídos por misturas multicomponentes de substâncias ativas, parcialmente
ativas e inativas, que, muitas vezes, atuam em alvos farmacológicos diferentes
(FERREIRA; PINTO, 2010; ULRICH-MERZENICH et al., 2010).
Os extratos servem ainda como ponto de partida para a obtenção de
compostos sintéticos ou biossintéticos. Existem aqueles que exibem uma atividade
biológica maior ou diferente de seus componentes isolados (VILLAS-BÔAS,
GADELHA, 2007).
Cabe mencionar que cerca de 25% de todas as prescrições médicas nos
Estados Unidos incluem substâncias naturais como princípio ativo, obtidas de
plantas de regiões temperadas e tropicais, o que corresponde ao valor estimado de
900 milhões de dólares na circulação comercial (BRAZ-FILHO, 2010). Em 2000 o
setor faturou US$ 6,6 bilhões nos EUA e US$ 8,5 bilhões na Europa. No Brasil
estima-se que o comércio de fitoterápicos seja da ordem de 5% do mercado total de
medicamentos, avaliado em mais de US$ 400 milhões (PINTO et al., 2002).
O Brasil destaca-se no ranking mundial de países “megadiversos” e é
considerado o país de maior diversidade biológica (PEIXOTO; MORIM, 2003). Abriga
cerca de 19% do total terrestre da diversidade (GIULIETTI et al., 2005), e estima-se
em 49 mil o número de espécies de plantas descritas (SHEPHERD, 2002).
Esse cenário favorece a pesquisa e o desenvolvimento de fitoterápicos no
país. Um grande avanço nesse sentido é a Portaria do Ministério da Saúde de nº
971 de 03 de maio de 2006, que aprova a Política Nacional de Práticas Integrativas
e Complementares (PNPIC) no Sistema Único de Saúde (SUS). Essa política traz
em suas diretrizes a elaboração da Relação Nacional de Plantas Medicinais de
Interesse ao SUS (RENISUS). Ainda em 2006, o Decreto Federal de nº 5.813 de 22
de junho de 2006 instituiu a Política Nacional de Plantas Medicinais e Fitoterápicos,
que incentiva as pesquisas e dá diretrizes para implantação de serviços em caráter
em roedores.
29
nacional pelas Secretarias de Saúde dos Estados, Distrito Federal e dos Municípios
(BRASIL, 2006).
Uma região brasileira com uma rica diversidade de plantas é o Nordeste e o
estudo dos usos tradicionais de plantas e seus produtos nessa região têm
aumentado gradualmente. Durante os últimos anos (AGRA et al., 2007;
ALBUQUERQUE et al., 2006). Foi realizada uma investigação etnomedicinal das
plantas conhecidas como medicinais e venenosas no Nordeste do Brasil. De um total
de 483 espécies pertencentes a cerca de 79 famílias, 466 espécies, cerca de 96,5%
são registrados pelo seu uso medicinal (AGRA et al., 2008;2007).
O bioma Caatinga é o principal ecossistema dessa região brasileira, ocupando
os estados da Bahia, Ceará, Piauí, Pernambuco, Rio Grande do Norte, Paraíba,
Sergipe, Alagoas, Maranhão e Minas Gerais (BRASIL, 2008). Algumas espécies
endêmicas desse bioma possuem atividade antinociceptiva, como Neoglaziovia
variegata (LIMA-SARAIVA et al., 2012) e Amburana cearensis (OLIVEIRA et al.,
2009).Além disso, outras espécies coletadas na região Nordeste também possuem
efeito antinociceptivo e anti-inflamatório (ANDRADE et al., 2012; LIMA et al., 2012).
3.2. Considerações sobre a família Annonaceae e o gênero Annona
Plantas da família Annonaceae estão amplamente distribuídas pelo mundo
todo, mas são predominantes em zonas tropicais (SIQUEIRA et al., 2011). Algumas
espécies dessa família são conhecidas por produzirem diversos derivados
alcaloídicos isoquinolínicos (FECHINE et al., 2002), outras são fragrantes devido à
presença
de
óleos
essenciais
que,
normalmente,
são
constituídos
de
monoterpenoides, sesquiterpenoides e/ou substâncias aromáticas; algumas têm
importância comercial como o óleo de Cananga (Cananga odorata Hook var.
macrophylla) e o óleo de Ylang-Ylang (Cananga odorata Hook var. genuina) que são
usados em perfumaria (SOUSA et al., 2004). Uma nova classe de substâncias
naturais bioativas, conhecidas como “acetogeninas de anonáceas”, deram um novo
estímulo para o estudo fitoquímico desta família, por apresentarem uma gama de
importantes atividades biológicas tais como: citotóxica, antitumoral, pesticida,
vermicida, abortiva, antimicrobiana, imunossupressora, antiemética, inibidora do
apetite e antimalárica (NASCIMENTO et al., 2003)
em roedores.
30
A família Annonaceae é constituída por árvores, arbustos, e raramente por
arbustos escandentes, que se caracterizam por apresentar flores vistosas,
andróginas, solitárias, ou em inflorescências, axilares ou terminais (PONTES et al.,
2004). Esta é a maior família da ordem Magnoliales, possuindo de 2300-2500
espécies e mais de 130 gêneros. Apenas os gêneros Annona, Rollinia, Uvaria e
Asimina produzem frutos comestíveis (CARBALLO et al., 2010).
Siebra (2009) ao comentar sobre os gêneros da família Annonaceae no Brasil,
baseia-se em Barroso, na obra Annonaceae, esclarecendo que neste país já foram
registrados 29 gêneros, com cerca de 260 espécies, destacando-se o Annona.
O gênero Annona, possui 250 espécies encontradas em território brasileiro
(SIQUEIRA et al., 2011). As quais geralmente são consumidas como fruta fresca, e
também são amplamente utilizadas na medicina popular. Isto, devido à presença de
diferentes classes de metabólitos ativos, como alcaloides isoquinolinicos (SILVA et
al., 2007), acetogeninas (YANG et al., 2009; SANTOS-LIMA et al., 2010), lectinas
(COELHO et al., 2003) e óleos voláteis (SOUSA et al., 2004; SIQUEIRA et al., 2011;
COSTA et al., 2012 ) e flavonoides encontrados nas raízes, folhas, cascas, sementes
e frutos (CARBALLO et al., 2010).
Algumas atividades biológicas descritas de plantas pertencentes a este
gênero são: capacidade anti-oxidante (LIMA et al., 2010; JULIÁN-LOAEZA et al.,
2010), efeito hipotensor (MORITA et al., 2006), hipoglicemiante (GUPTA et al., 2005),
antibacteriano (RAHMAN et al., 2005; VIEIRA et al., 2010), antileishmania
(JARAMILLO et al., 2000), anticonvulsivante (GONZÁLEZ-TRUJANO et al., 2006),
atividade ansiolítica (LÓPEZ-RUBALCAVA et al., 2005), anti-inflamatória (ADZU et
al., 2003a) e analgésica (SOUSA et al., 2007; CARBALLO et al., 2010).
3.3. Considerações sobre espécies do gênero Annona com atividades
antinociceptiva e anti-inflamatória
Ao longo da história o homem tem utilizado diversas formas de tratamento
para o alívio da dor, entre elas, as ervas medicinais são destaque devido ao seu
amplo uso popular (ALMEIDA et al., 2001). Os mais potentes e eficazes fármacos
analgésicos são derivados de plantas, a exemplo da salicinina extraída de Salix alba
e a morfina obtida da Papaver somniferum (VEIGA-JUNIOR et al., 2005).
em roedores.
31
Algumas espécies do gênero Annona possuem atividade antinociceptiva e
anti-inflamatória, dentre elas, Annona squamosa L., cujas folhas são usadas para o
tratamento de reumatismo e dor no baço. O extrato de éter de petróleo bruto não
saponificado e o óxido de cariofileno isolados do extrato da casca exibiram
atividades analgésicas e anti-inflamatórias significativas (CHAVAN et al., 2010).
O extrato das folhas frescas dessa espécie também é relatado por tais
propriedades. O estudo fitoquímico preliminar mostrou diferença entre os metabólitos
secundários presentes na decocção de folhas frescas e no extrato das folhas secas.
Na decocção foram encontrados compostos fenólicos, cumarinas, compostos
lactônicos, aminoácidos e açúcares redutores, enquanto no extrato foram
encontrados flavonoides, compostos fenólicos, alcaloides, quinonas, cumarinas,
compostos lactônicos, aminoácidos, antocianidinas e açúcares redutores, porém,
neste não houve resultados de atividade analgésica e anti-inflamatória. Os
resultados obtidos com a decocção das folhas frescas permitem a validação do uso
popular (AMADOR et al., 2006).
Annona diversifolia Saff., conhecida no México por muitos nomes locais como
"Ilama" e "Ilama zapote", seus frutos são utilizadas como alimento, mas as suas
folhas são empregadas como anticonvulsivante e analgésico, bem como um agente
anti-inflamatório na medicina tradicional mexicana. Carballo et al. (2010), em seu
estudo reforça a utilização das folhas de A. diversifolia no tratamento da dor e da
inflamação, visto que seus resultados demonstraram capacidade de produzir total
antinocicepção no modelo de dor visceral, e redução parcial da nocicepção artrítica.
As análises indicaram a presença de flavonoides e a participação da palmitona na
sua atividade antinociceptiva.
Annona muricata L., vulgarmente conhecida como graviola, é encontrada na
América Central, América do Sul, incluindo as regiões Norte, Nordeste e Sudeste do
Brasil. Tradicionalmente, as folhas são usadas para dores de cabeça, insônia, cistite,
problemas de fígado, diabetes, hipertensão e como anti-inflamatório. Entre os
constituintes químicos encontrados nessa espécie, os alcaloides e os óleos
essenciais se destacam. Quando realizados testes pré-clínicos através dos modelos
de nocicepção e inflamação, os resultados foram significantes em relação ao
controle, especialmente na dose de 400 mg/kg, confirmando o uso popular (SOUSA
et al., 2010).
em roedores.
32
Annona glabra, popularmente conhecida no Brasil como araticum-do-brejo e
araticum-bravo, têm demonstrado grande quantidade de compostos químicos, como
alcaloides, acetogeninas e diterpenos em extratos preparados de cascas, caules,
folhas e frutos. Siebra et al. (2009) em sua pesquisa demonstra que o extrato de A.
glabra inibe a migração natural de granulócitos, de forma dependente da dose,
sugerindo potencial anti-inflamatório.
Annona coriacea Mart., popularmente conhecida como araticum, é encontrada
nas regiões Sudeste, Norte e Nordeste do Brasil, especialmente no estado do Ceará.
As folhas são usadas na medicina popular por via oral como carminativa,
estomáquica, anti-reumática e anti-helmíntica e, externamente, em compressas e
bochechos, no tratamento de estomatite, nevralgias e cefaleias. A pesquisa realizada
com o extrato metanólico das folhas desta espécie demonstrou propriedades
analgésica e anti-inflamatória, através dos modelos pré-clínicos de contorções
abdominais, formalina, placa quente, edema de pata e pleurisia induzida por
carragenina (SOUSA et al., 2007).
A raiz e as folhas de Annona senegalensis são vendidas na Nigéria para alívio
da dor, tratamento do câncer e artrite. O extrato metanólico da raiz tem propriedades
anti-inflamatórias e antinociceptiva comprovados através de modelos de nocicepção
e inflamação, podendo justificar o uso tradicional da planta na Nigéria para o
tratamento de reumatismo e outras doenças relacionadas com a dor ( ADZU et al.,
2003b).
3.4. Considerações sobre a espécie Annona vepretorum Mart.
Annona vepretorum Mart. (Annonaceae), é uma espécie predominantemente
tropical, é endêmica do Brasil e com distribuição na Caatinga (Figura 1) (SANTOS et
al., 2012; MAAS et al., 2013).
em roedores.
33
Figura 1. Foto de Annona vepretorum Mart. (Autor: NEPLAME - Núcleo de Estudos
e Pesquisas de Plantas Medicinais)
Há registro da ocorrência dessa espécie no município de Poço Redondo –
Sergipe, que é totalmente inserido no bioma Caatinga. Nessa região é conhecida
como “Bruteira” (SANTOS et al., 2012), "Araticum" e "Pinha da Caatinga", sendo
amplamente utilizada na nutrição humana. Seus frutos normalmente são
consumidos "in natura" ou utilizados em sucos (COSTA et al., 2012). Além disso,
segundo a população local, as raízes quando maceradas apresentam indicação
contra picada de abelhas, além do emprego como um anti-inflamatório natural
(COSTA et al., 2011). Esta espécie também é encontrada em Jaguarari – Bahia,
Petrolina e Lagoa Grande, cidades do estado de Pernambuco, inseridas no bioma
caatinga (Figura 2).
Estudos prévios realizados com esta espécie descrevem a composição
química e atividade antimicrobiana, antioxidante, tripanozomicida e citotóxica do óleo
essencial das folhas coletadas em Poço Redondo, estado de Sergipe, Nordeste do
Brasil (COSTA et al., 2012; PINTO et al., 2012), porém, não há relatos na literatura
de estudos farmacológicos referentes a esta espécie.
em roedores.
34
Figura 2. Distribuição fitogeográfica de Annona vepretorum (Disponível em
http://floradobrasil.jbrj.gov.br/2013).
3.5. Considerações sobre dor
3.5.1. Dor e Nocicepção
A palavra “dor”, na língua portuguesa, vem do latim: dolore, que significa
sofrimento; e “pain” na língua inglesa, do grego: poiné, pena (FEIN, 2011). A dor é
uma das principais causas do sofrimento humano, levando a incapacidades,
comprometimento da qualidade de vida e repercussões psicossociais e econômicas
que a torna um problema de saúde pública (BOTTEGA; FONTANA, 2010). Gerrits et
al. (2012) mostra que transtornos depressivos e de ansiedade são maiores quando a
dor está presente.
De acordo com a Associação Internacional para o Estudo da Dor (IASP), o
termo dor conceitua-se como uma experiência sensorial e emocional desagradável,
relacionado à lesão tecidual real ou potencial, ou descritas em termos desse tipo de
dano. Assim, a dor caracteriza-se como uma experiência complexa que envolve
além de transdução de estímulos nocivos ambientais, o processamento emocional
pelo cérebro (JULIUS; BASBAUM, 2001). É uma consequência fisiopatológica de
diversas morbidades e de suas repercussões, mas que na maioria das vezes
configura-se como uma função protetora, representando, em muitos casos, o único
sintoma para o diagnóstico de várias doenças (OLIVEIRA et al., 2009).
em roedores.
35
Tendo em vista que a dor é um sintoma clinicamente importante de precaução
e, consequentemente, limitação de possíveis danos (WOOLF, 2000), a Agência
Americana de Pesquisa e Qualidade em Saúde Pública e a Sociedade Americana de
Dor a descrevem como o quinto sinal vital, devendo ser avaliado indispensavelmente
junto aos outros sinais vitais: temperatura, pulso, respiração e pressão arterial
(SOUSA, 2002).
Diferente de nocicepção, a dor é mais que uma sensação, é uma experiência,
podendo incorporar componentes sensoriais com influências pessoais e ambientais
importantes. Enquanto, o termo nocicepção refere-se ao estímulo doloroso
propriamente dito, sem levar em consideração o componente emocional, ou seja,
engloba as vias neuroanatômicas, bem como os mecanismos neurológicos e os
receptores específicos que detectam o estímulo lesivo. Sendo assim, uma vez que
os animais não são capazes de expressar verbalmente os componentes subjetivos
da dor, neles não se avalia dor, e sim nocicepção. Logo, termos como dor e
analgesia são empregados para estudos em humanos, enquanto que nocicepção e
antinocicepção são mais utilizados para estudos pré-clínicos, envolvendo animais de
laboratório (KANDEL et al., 2003).
A dor pode ser classificada de acordo com o tipo de lesão e com os
mediadores envolvidos, recebendo as seguintes denominações: neurogênica,
quando ocorre lesão do tecido neuronal; neuropática, quando ocorre a disfunção de
um nervo; psicogênica, que ocorre por fatores psicológicos; ou nociceptiva, quando
ocorre por estimulação excessiva dos nociceptores. Em termos de duração, um
episódio de dor pode ser agudo ou crônico. A dor aguda corresponde à ativação
local de nociceptores induzida por um dano tecidual, sendo que a dor desaparece
até mesmo antes do restabelecimento do tecido lesado (MILLAN, 2002). Já a dor
crônica é aquela que persiste mesmo tendo passado a fase de cura de uma lesão ou
injúria, passando a se repetir ou sustentar-se por período prolongado e não tem
aparentemente nenhuma função fisiológica ou protetora (APKARIAN et al., 2009).
em roedores.
36
3.5.2. Nociceptores
Os nociceptores são terminações nervosas livres que respondem a estímulos
nociceptivos, detectando, desse modo, lesão nos tecidos, onde os estímulos
desencadeantes podem ser mecânicos, térmicos ou químicos (MILLAN, 2002).
A função básica dos nociceptores é de transmitir informações aos neurônios
de ordem superior sobre a lesão tecidual ocasionada por estímulos nocivos (FEIN,
2011), e se encontram dispersos por todo o corpo, inervando a pele, músculos,
articulações e órgãos internos (JULIUS; BASBAUM, 2001).
Alguns nociceptores são sensíveis a um estímulo específico, enquanto outros
são sensíveis a vários tipos de estímulos. Estas estruturas são descritas em quatro
classes: mecânicos, térmicos, polimodais e silenciosos. Os nociceptores mecânicos
respondem à pressão intensa, os térmicos respondem às temperaturas extremas,
quentes (> 45 °C) ou frias (< 5 °C) e possuem fibras A mielinizadas. Em conjunto,
esses nociceptores de fibra A δ-β são denominados nociceptores mecanotérmicos.
Os nociceptores polimodais respondem aos estímulos nocivos mecânicos, térmicos
ou químicos, e os nociceptores silenciosos são ativados por estímulos químicos,
mediadores inflamatórios, respondendo a estímulos mecânicos e térmicos somente
depois de serem ativados (FEIN, 2011).
A estimulação destes nociceptores promove uma liberação local de
mediadores químicos, que por sua vez, irão interagir com nociceptores específicos
conduzindo à propagação do sinal doloroso por alteração na permeabilidade da
membrana da fibra nervosa gerando o potencial de ação (JULIUS; BASBAUM, 2001;
GRIFFIS et al., 2006).
3.5.3. Vias nociceptivas
A transmissão do sinal nociceptivo está sujeita a uma variedade de
moduladores que podem atuar de forma facilitatória ou inibitória, desde os
nociceptores até as estruturas cerebrais responsáveis pela percepção da dor
(GEBHART, 2004).
A cascata de eventos que levam à integração dos sinais dolorosos envolve
receptores (nociceptores periféricos), vias ascendentes na medula espinhal, áreas
em roedores.
37
de integração no cérebro (localizadas principalmente no tálamo) e projeções
corticais (para áreas do córtex somatossensorial primário e secundário, bem como
para o córtex insular e cingular) (CALVINO; GRILO, 2006).
Os nociceptores estão associados a fibras aferentes de pequeno diâmetro,
que podem ser mielinizadas (fibras tipo A) ou amielinizadas (fibras tipo C). As fibras
aferentes de primeira ordem, relacionadas com a condução de estímulos dolorosos,
são classificadas de acordo com sua estrutura, diâmetro e velocidade de condução
em três tipos: fibras C, fibras A-beta e fibras A-delta (RANG et al., 2012).
Na percepção da dor, os neurônios aferentes primários que participam da
transmissão da sensação dolorosa envolvem fibras intensamente mielinizadas, de
maior diâmetro (10 μm) e que apresentam maior velocidade de condução (30-100
m/s), caracterizadas como fibras Aβ. Entretanto, a maioria dos nociceptores está
inclusa nas fibras de pequeno (0,4-1,2 μm) e médio diâmetro (2-6 μm), que
constituem respectivamente as fibras C, não mielinizadas, e as fibras Aδ, pouco
mielinizadas (JULIUS; BASBAUM, 2001).
Na
medula
espinhal,
estas
fibras
nervosas
sensoriais
liberam
neurotransmissores, tais como aminoácidos (glutamato) e neuropeptídeos. Além
disso, ocorre a liberação de uma variedade de agentes (bradicinina, citocinas,
eicosanóides, serotonina e histaminas), que, agindo sobre os seus próprios
receptores, contribuem para alterar o limiar nociceptivo dessas fibras (CURY et al.,
2011).
Todas as fibras nociceptivas sensoriais primárias fazem conexões sinápticas
com neurônios secundários na substância cinzenta do corno dorsal da medula
espinhal. Os neurônios do corno dorsal, por sua vez, projetam seus axônios e
transmitem a informação nociceptiva para os centros encefálicos, incluindo a
formação reticular, hipotálamo e tálamo que através de neurônios terciários, enviam
o sinal ao córtex cerebral (ALMEIDA et al., 2004).
A informação nociceptiva é transmitida da medula espinhal para o tálamo e
para o córtex por cinco vias ascendentes: os tratos espinotalâmico, espinoreticular,
espinomesencefálico, cervicotalâmico, espinohipotalâmico (PINTO, 2000). Os pontos
de projeções para os neurônios nociceptivos são divididos em quatro categorias. A
categoria principal é composta pelos núcleos localizados no tálamo ventrolateral, o
qual é específico para o toque e nocicepção; estes neurônios convergem pelos
em roedores.
38
axônios do trato espinotalâmico, os quais possuem seus corpos celulares nas
lâminas I, IV e V do corno dorsal (HUNT; MANTYH, 2001).
A segunda categoria inclui pontos de projeções do bulbo e mesencéfalo, estas
áreas recebem informações que convergem através dos tratos espinoreticular e
espinotalâmico. A terceira categoria é composta pelo hipotálamo que recebe
terminações axônicas provenientes tanto diretamente do trato espinotalâmico,
quanto indiretamente do trato espinobraquial-hipotalâmico. Finalmente, a quarta
categoria envolve o complexo amigdaloide, que faz parte da estrutura límbica, este
recebe informações do núcleo parabraquial lateral (CALVINO; GRILO, 2006).
A regulação da dor é explicada pela Teoria da Comporta da Dor, desenvolvida
por Melzak & Wall na década de 60. Constitui-se em um modelo de percepção da
dor no qual há uma regulação da passagem dos impulsos das fibras aferentes
periféricas para o tálamo através dos neurônios de transmissão no corno dorsal. Ela
funciona como uma estação regulatória para a transmissão da dor. Assim, a
percepção da dor se dá pelo somatório da estimulação sensorial e um intenso
controle central. Neurônios inibitórios descendentes ou influxo aferente nãonociceptivo ativam os neurônios da substância gelatinosa (SG) os quais, por sua
vez, inibem as células transmissoras da dor dificultando a passagem do impulso
doloroso para os centros superiores. Já a estimulação das fibras C, inibe os
neurônios inibitórios da SG permitindo a passagem do impulso doloroso para o
tálamo, constituindo-se então o processo de regulação da passagem do impulso
doloroso para os centros superiores (VITOR et al., 2008).
3.5.4. Mecanismo da dor central
Um dos mecanismos centrais de grande importância na fisiopatologia da dor é
o da transmissão facilitada no corno dorsal e consequentemente para as vias
nociceptivas superiores (CARVALHO; LEMÔNICA, 1998).
Após a lesão tecidual ou estímulo doloroso, canais iônicos na membrana
plasmática do nociceptor originam um potencial de ação do receptor (FEIN, 2011).
Em seguida, há liberação de neurotransmissores, como substância P, somatotastina,
neurocinina-A, glutamato e aspartato. Essas substâncias estão relacionadas com a
em roedores.
39
ativação de potenciais pós-sinápticos excitatórios e dos receptores N-metil-Daspartato (NMDA).
3.5.5. Mecanismo da dor periférica: dor inflamatória
A dor inflamatória ocorre devido à sensibilização dos neurônios nociceptivos
sensoriais primários (CUNHA et al., 2005). Após uma lesão tecidual ou inflamação,
os nociceptores são ativados pela ação de mediadores químicos (VERRI et al.,
2006). Esses mediadores ativam cascatas de segundos mensageiros, influenciando
canais iônicos, enzimas e proteínas de sinalização intracelular nos nociceptores,
levando ao aumento da excitabilidade do neurônio, diminuindo o limiar de disparo e
aumentando a frequência de potenciais de ação produzidos durante uma
estimulação supralimiar (BASBAUM; WOOLF, 1999).
A lesão tecidual inicial resulta na liberação de mediadores pelas células
lesadas, incluindo os prótons H+, serotonina, bradicinina, histamina e óxido nítrico
(NO). Posteriormente, a ativação do processo inflamatório induz a via do ácido
araquidônico, resultando na produção de prostaglandinas e leucotrienos e, por fim,
as células do sistema imune são recrutadas, liberando ainda outros mediadores,
incluindo fatores de crescimento e citocinas como interleucina-1 (IL-1) e fator de
necrose tumoral-α (TNF-α) (KIDD; URBAN, 2001).
3.6. Drogas analgésicas
O alívio ou o cessar da dor é obtido pelo uso de analgésicos.
A ação
analgésica central pode ser mediada através da inibição dos receptores da dor
central, enquanto o efeito analgésico periférico pode ser mediado através da inibição
da cicloxigenase (COX) e/ou lipoxigenase, além de outros mediadores inflamatórios
(CHAVAN et al., 2010).
Os analgésicos de ação central, opioides, a exemplo da morfina, incluem
fármacos capazes de aliviar a dor por atuarem em receptores de superfície celular
denominados
de
receptores
opioides
(QUINTÃO
et
al.,
2011).
Estudos
farmacológicos confirmaram, por clonagem dos receptores, que existem três tipos
principais de receptores de opioides, chamados de μ, κ e δ que medeiam os
em roedores.
40
principais efeitos farmacológicos dos opiáceos (STEIN et al., 2009). A morfina e a
maioria de seus análogos exercem seus efeitos analgésicos atuando principalmente
nos receptores μ (MERRER et al., 2009).
Os opioides, como a morfina, são os fármacos usados para o tratamento mais
eficaz para a maioria dos tipos de dor. Infelizmente, o uso de opioides é limitado
pelos seus efeitos secundários, o potencial de dependência e o desenvolvimento de
tolerância (MORGAN; CHRISTIE, 2011). Alguns dos efeitos secundários são:
constipação, náusea, vômito, sedação, depressão respiratória e retenção urinária
(QUINTÃO et al., 2011).
Em geral, os anti-inflamatórios não-esteroidais inibem, de forma variável,
ambas as isoformas da COX em suas doses terapêuticas. Deste modo, passaram a
ser caracterizados de acordo com sua capacidade de inibição da COX-1 e 2
(KUMMER; COELHO, 2002). Apesar de sua eficácia em uma ampla gama de
condições de dor e inflamação, a administração de AINES em longo prazo pode
induzir úlceras gastrointestinais, sangramentos e desordens renais devido à inibição
não seletiva das isoformas constitutiva (COX-1) e induzível (COX-2) da enzima
cicloxigenase (COX) (TAPIERO et al., 2002). A COX é a enzima responsável pela
metabolização do ácido araquidônico em precursores das prostaglandinas. Estes
são depois processados em prostaglandinas biologicamente ativas, sendo a
prostaglandina E2 (PGE2) a mais relevante para a indução da dor inflamatória
(CHOPADE; MULLA, 2010).
Por outro lado, os coxibes, inibidores seletivos de COX-2, apesar da reduzida
toxicidade gastrointestinal, têm sido associados a efeitos cardiovasculares adversos,
como aumento da ocorrência de infarto do miocárdio e acidentes vasculares
encefálicos (DOGNÉ et al., 2005), devido ao desequilíbrio de fatores prótrombóticos, podendo levar à agregação plaquetária e vasoconstrição (KUMMER;
COELHO, 2002).
3. 7. Modelos experimentais para avaliação da atividade antinociceptiva
3.7.1. Contorções abdominais induzidas por ácido acético
O teste de contorções abdominais é um modelo químico de nocicepção que
em roedores.
41
se baseia na contagem das contorções da parede abdominal seguidas de torção do
tronco e extensão dos membros posteriores, como resposta reflexa à irritação
peritoneal e à peritonite produzidas pela injeção intraperitoneal de uma solução de
ácido acético 0,9% (WHITTLE, 1964).
Este teste é sensível à avaliação de drogas analgésicas, no entanto, pode ser
visto como um modelo geral, não seletivo, para estudos de drogas antinociceptivas
(COUTO et al., 2011), uma vez que a irritação local produzida pela injeção
intraperitoneal do ácido acético provoca a liberação de uma variedade de
mediadores, tais como a substância P, bradicininas, prostaglandinas, bem como das
citocinas pró-inflamatórias tais como IL-1, IL-6, IL-8 e TNF-α (PINHEIRO et al.,
2011). Alguns investigadores têm associado este método com a liberação de
prostanoides, em geral, níveis elevados de PGE 2 e PGF2α, bem como produtos da
lipoxigenase em fluidos peritoneais (VERMA et al., 2005).
3.7.2. Teste da formalina
O teste da formalina é um método de avaliação comportamental utilizado para
medir a efetividade de agentes antinociceptivos (HUNSKAAR; HOLE, 1987;
RANDOLPH; PETERS, 1997). Este modelo de dor está associado à lesão tecidual,
no qual se quantifica a resposta comportamental provocada pela injeção subcutânea
de formalina diluída na pata traseira do animal (DUBUISSON; DENNIS, 1977;
MARTINS et al., 2006).
A vantagem deste teste sobre outros métodos de nocicepção é a possibilidade
de avaliar dois tipos diferentes de dor ao longo de um período prolongado de tempo
e, assim, permite o teste de analgésicos com diferentes mecanismos de ação
(RANDOLPH; PETERS, 1997).
As respostas comportamentais à formalina seguem um padrão bifásico
composto de uma fase inicial aguda (primeira fase), e por um período mais
prolongado (segunda fase) de atividade comportamental aumentada, que pode durar
até cerca de uma hora. O período entre as fases é denominado intervalo de
quiescência (DUBUISSON; DENNIS, 1977, MARTINS et al., 2006).
A primeira fase inicia-se imediatamente após a injeção de formalina e se
estende pelos primeiros 5 minutos (dor neurogênica ou aguda), estando relacionada
em roedores.
42
com a estimulação química direta dos nociceptores das fibras aferentes do tipo C e,
em parte, das fibras do tipo Aδ e está associada à liberação de aminoácidos
excitatórios, óxido nítrico e substância P. A segunda fase ocorre entre 15 e 30
minutos após a injeção de formalina e está relacionada com a liberação de vários
mediadores pró-inflamatórios, como bradicinina, prostaglandinas e serotonina, entre
outros. O intervalo de quiescência entre a primeira e a segunda fase é resultado de
uma inibição da transmissão nociceptiva através de circuitos supra-espinhais e
espinhais (HUNSKAAR; HOLE, 1987).
3.7.3. Teste de Randall-Selitto
O modelo experimental desenvolvido por Randall & Selitto (1957) é um
método para avaliação da hipernocicepção bastante utilizado, que se fundamenta na
indução de hiperalgesia através de pressão crescente na pata do animal. Este teste
é baseado no princípio de que a inflamação diminui o limiar de reação à dor e que
essa redução pode ser modificada por analgésicos narcóticos e não-narcóticos.
Neste ensaio experimental, um agente flogístico é injetado no tecido
subplantar de uma das patas traseiras, e é medido o tempo de latência da retirada
da pata a partir da pressão exercida. O reflexo de retirada da pata é considerado
representativo do limiar hipernociceptivo, ou seja, a força necessária aplicada à pata
para que induza uma resposta aversiva a um estímulo nocivo (Limiar Nociceptivo de
Retirada da Pata - LNRP). A força necessária para que esse animal exiba tal
resposta é registrada em gramas. O LNRP é avaliado antes e após a administração
dos estímulos hiperalgésicos ou inflamatórios, que variam de acordo com o
experimento (RANDALL; SELITTO, 1957).
3.7.4. Teste de von Frey
O uso de filamentos de von Frey é um método utilizado para avaliar a
sensibilidade tecidual ao estímulo mecânico, sendo bastante utilizado clinicamente.
Entretanto, tal método passou a ser utilizado também para experimentos
laboratoriais, no sentido de avaliar a influência de drogas sobre a sensibilidade
nociceptiva em animais. Além disso, essa técnica foi transformada em um método
em roedores.
43
eletrônico, usado primeiramente em humanos (JENSEN et al., 1986), e
posteriormente em ratos e camundongos (CUNHA et al., 2004).
Os experimentos são realizados com um anestesiômetro eletrônico, que
consiste em um transdutor de pressão adaptado a um contador digital de força
expressa em gramas (g). O contato do transdutor de pressão com a pata é realizado
através de uma ponta descartável de polipropileno. Os animais são colocados em
caixas de acrílico durante 15-30 minutos para adaptação. O assoalho da caixa é feito
de arame não maleável na forma de rede. As alterações nos limiares nociceptivos
são avaliadas exercendo-se uma pressão linearmente crescente no centro da planta
da pata do animal até a produção de uma resposta caracterizada como sacudida
(flinches) da pata estimulada. Os estímulos são repetidos por até seis vezes, em
geral até o animal apresentar três medidas similares com uma clara resposta de
flinch após a retirada da pata. A intensidade de hipernocicepção é quantificada como
a variação na pressão obtida subtraindo-se a média de três valores, expressos em
gramas (força), observada antes do procedimento experimental (0 hora) da média de
três valores, em gramas (força), após a administração dos estímulos, que variam de
acordo com o experimento (JENSEN et al., 1986).
Os modelos experimentais baseados em testes mecânicos permitem a
avaliação do aumento da sensibilidade do nociceptor a estímulos inócuos (alodinia)
ou nocivos (hiperalgesia). Porém, além de estímulo de nociceptores de fibras Aδ e
nociceptores de fibras C, também podem ser ativados mecanorreceptores,
resultando em estímulos inespecíficos que nem sempre refletem a neurofisiologia da
nocicepção. Particularmente, o teste de von Frey, é usado para avaliar através do
estímulo mecânico inócuo e crescente (alodinia mecânica) a sensibilidade tecidual
provocada pela incisão (LE BARS et al., 2001).
3.7.5. Dor orofacial induzida por formalina
A região orofacial é uma área densamente ocupada pelo nervo trigêmeo e,
muitas vezes, é sítio frequente de dores referida e crônica. Alterações clínicas no
território trigeminal, como aumento de sensibilidade cutânea e hiperalgesia,
observadas em cefaleias primárias e dores orofaciais em geral, são muito sugestivas
de anormalidades no sistema nociceptivo trigeminal (PERLA, 2007).
em roedores.
44
Entre os modelos nociceptivos experimentais de dores orofaciais e cefálicas,
o teste da formalina é um dos mais relevantes em termos de aplicabilidade
experimental e clínica, quando se estuda dores agudas (PERLA, 2007). Ele avalia a
nocicepção trigeminal por meio da aplicação de estímulo químico (administração
subcutânea de uma solução de formalina) na região orofacial. Este modelo constitui
uma adaptação do teste da formalina administrada na superfície plantar de animais
(DUBUISSON; DENNIS, 1977, RABOISSON; DALLEL, 2004). Contudo, vale
ressaltar que para uma avaliação mais detalhada dos receptores envolvidos no
mecanismo de ação do produto natural a ser testado, este ensaio experimental pode
ser realizado com a aplicação de outros agentes químicos, como por exemplo,
glutamato e capsaicina (SILVA, 2011). As principais respostas comportamentais que
caracterizam a dor e que são observadas nesse modelo experimental são: medida
do tempo ou do número de reflexos de autolimpeza (grooming) dirigidos ao local da
injeção de formalina; vocalização espontânea; tremores vigorosos do corpo
(shaking) associados ao ato de lamber as patas dianteiras e proteger vigorosamente
a face; e trismo (PERLA, 2007).
Assim como no teste da aplicação de formalina subplantar, os parâmetros
indicativos de dor para este modelo também podem ser observados imediatamente
após a aplicação do agente químico e, posteriormente, após o período de
quiescência. Segundo Dubuisson & Dennis (1977), a dor, no modelo nociceptivo
trigeminal, é inicialmente resultante da reação inflamatória gerada pela ligação da
formalina às proteínas teciduais, por meio da formação de pontes primárias de
carbono (propriedade fixadora do tecido). Tal reação inflamatória na área de injeção
persiste por período relativamente longo. A resposta inicial (primeira fase)
possivelmente decorre da estimulação direta dos nociceptores, enquanto que a
segunda fase do teste deve-se à inflamação e sensibilização central.
3.7.6. Teste da placa quente
O teste da placa quente (hot plate) avalia o tempo em que os animais
permanecem sobre uma chapa metálica aquecida (55 ± 0,5 ºC) até reagirem ao
estímulo térmico com o comportamento de levantar ou lamber as patas (TITA et al.,
em roedores.
45
2011). As aferições são realizadas nos tempos de 30, 60, 90 e 120 minutos após a
administração das substâncias a serem analisadas.
O modelo experimental foi inicialmente descrito por Woolfe & Macdonald
(1944) como modelo específico para a detecção de substâncias analgésicas de
efeito central. Embora o uso de analgésico central e periférico responda pela inibição
do número de contrações provocadas por estímulos químicos que levam à dor,
apenas os analgésicos centrais aumentam o tempo de resposta no teste da placa
quente. Este modelo utiliza a temperatura como estímulo nociceptivo. Dessa forma,
os nociceptores (fibras C e Aδ, principalmente) são estimulados após a ativação dos
receptores vaniloides, especificamente os receptores do tipo VR-1, que possuem
limiar de ativação em 43 ºC, e os receptores do tipo VRL-1, que possuem limiar de
ativação em 52 ºC. Estes últimos são importantes na avaliação da resposta a
estímulos térmicos nocivos, pois são responsáveis pela resposta em decorrência do
aumento da temperatura (JULIUS; BASBAUM, 2001; BENEDITO, 2009).
3.7.7. Teste de retirada da cauda
O teste de retirada da cauda (tail-flick) é sensível para identificar a atividade
de compostos presentes em extratos vegetais ou isolados a partir desses, além de
sintéticos, cujos mecanismos sejam semelhantes aos promovidos pelos analgésicos
opioides (OLIVEIRA et al., 2008).
Este ensaio experimental consiste na aplicação de uma fonte radiante de
calor na cauda do animal como estimulo nociceptivo térmico, provocando seu
movimento de retirada (OLIVEIRA et al., 2009). Um aumento no tempo de reação é
geralmente considerado como um parâmetro importante para avaliar a atividade
antinociceptiva
central,
caracterizando-se por
uma
nocicepção
aguda
não
inflamatória. Sendo assim, substâncias que atuam em nível central, como a morfina,
são capazes de suprimirem respostas de neurônios espinhais ao estímulo térmico
nocivo na cauda, aumentando o tempo de latência (FISCHER et al., 2008).
3.8. Considerações sobre inflamação
O conceito de inflamação ou flogose é originado do grego phologosis e do
em roedores.
46
latim flamma, cujo significado é oriundo das características morfofisiológicas,
significando assim área em chamas. Na clínica, quatro sinais principais da
inflamação são conhecidos: rubor, dor, calor e tumor.
A perda de função, quinto
sinal clínico, foi posteriormente adicionada por Virchow. Estes sinais são tipicamente
mais proeminentes na inflamação aguda do que na crônica (COTRAN, 2006).
A inflamação é uma reação do tecido vascularizado a estímulos endógenos
ou exógenos que podem provocar dano celular, podendo haver a prevenção ou
progressão da mesma pelo isolamento ou destruição do agente lesivo. O processo
inflamatório abrange uma série de fenômenos que se originam não só por agentes
infecciosos, como também por agentes físicos, químicos, isquemia e interações
antígeno – anticorpo (FLOWER et al., 2005).
A resposta inflamatória pode ser dividida em aguda e crônica, divisão essa
baseada na duração e características patológicas da reação inflamatória. A
inflamação
aguda
apresenta
relativamente,
rápido
início
e
uma
duração
relativamente curta (horas a dias) caracterizando-se por vasodilatação, exsudação
de fluido ou exsudato rico em proteínas com formação de edema, migração de
células (primariamente neutrófilos) para o sítio lesado e, em alguns casos, ativação
da cascata de coagulação (SHERWOOD; TOLIVER-KINSKY, 2004).
Já a inflamação crônica tem longa duração e está associada com a presença
de linfócitos e macrófagos, proliferação de vasos sanguíneos, fibroses e tecidos
necrosados. O processo inflamatório compreende dois eventos que ocorrem
simultaneamente durante o curso evolutivo (eventos vasculares e celulares)
(BRASILEIRO-FILHO, 2007).
3.8.1. Eventos vasculares
Ao iniciar o processo inflamatório, os vasos sanguíneos sofrem alterações,
que promovem a passagem de proteínas plasmáticas e células da circulação para o
local da lesão ou da infecção (KUMAR et al., 2005).
Os sinais da inflamação se desenvolvem rapidamente logo após a lesão,
resultando na vasodilatação e extravasamento de células (ALLER et al., 2007;
SHERWOOD; TOLIVER-KINSKY, 2004). A vasoconstricção é um contribuinte
primário e é iniciada através da liberação de catecolaminas, contudo, células
em roedores.
47
lesadas que secretam prostaglandinas também contribuem para essa redução no
calibre dos vasos (ALLER et al., 2007). A vasodilatação segue a vasoconstricção
inicial sendo revertida após 10 a 15 minutos da lesão, sendo mediada por produtos
endoteliais e fatores derivados de mastócitos como leucotrienos, prostaglandinas e,
particularmente, histamina (ALLER et al., 2007). O edema é provocado pelo
aumento da permeabilidade vascular, que promove extravasamento de fluido rico em
proteínas, de alto peso molecular, do compartimento intravascular para o interstício
(ALLER et al., 2007; KUMAR et al., 2005).
3.8.2. Eventos celulares
A vasodilatação e a exsudação plasmática são acompanhadas pela
marginação, adesão e migração de leucócitos para sítios de inflamação, processo
esse crucial para as funções destas células tanto na imunidade inata quanto na
adaptativa (VAN MIERT, 2002).
A migração de neutrófilos, monócitos e células “natural killer” é, comumente,
iniciada em respostas inatas, a partir da geração local de mediadores inflamatórios,
como quimiocinas e algumas citocinas específicas (NOURSHARGH; MARELLIBERG, 2005). A migração dos leucócitos do compartimento vascular para o tecido
extravascular é mediada por interações adesivas específicas entre os leucócitos e
as células endoteliais. A sequência de eventos neste processo envolve marginação e
captura dos leucócitos livres circulantes do lúmen vascular; rolamento, ativação,
adesão firme e extensão na superfície do endotélio; passagem através da barreira
das células endoteliais ou diapedese e transmigração (WAGNER; ROTH, 2000).
Os grupos de moléculas de adesão de maior importância são as selectinas
(E, P e L- selectinas), uma vez que medeiam à adesão fraca, acompanhada do
rolamento e, em seguida, a adesão firme dos leucócitos, fenômeno intercedido por
imunoglobulinas e integrinas β-2 presentes na superfície dos leucócitos, cuja
expressão pode ser aumentada após a ativação do leucócito por mediadores
inflamatórios como as citocinas. Seguida a adesão firme, ocorre ligação estável
mediada por imunoglobulinas, principalmente molécula de adesão intercelular-1,
moléculas de adesão intercelular-2, molécula de adesão de célula endotelial e
plaquetas que estão presentes no endotélio, denominadas de integrinas β-2
em roedores.
48
(WAGNER; ROTH, 2000).
O recrutamento das células inflamatórias para os locais da lesão envolve,
além das moléculas de adesão celular descritas, interações combinadas de diversos
tipos de mediadores solúveis que parecem desempenhar um papel essencial na
coordenação do processo inflamatório (ROBERTSII; MORROW, 2003).
3.8.3. Mediadores químicos
Para que ocorra este processo, muitos mediadores químicos apresentam-se
envolvidos, podendo ser de origem tissular, como as aminas vasoativas, fator de
ativação plaquetária (PAF), eicosanoides, citocinas, radicais livres superóxidos,
óxido nítrico (NO) e neuropeptídeos; ou ainda de origem plasmática, como os
sistemas de coagulação, do complemento, das cininas e fibrinolítica (RANG et al.,
2012).
Estes por sua vez, são responsáveis pelos eventos vasculares, permitindo
assim a vasodilatação, a estase vascular e o aumento da permeabilidade capilar;
garantindo ainda a migração de leucócitos da circulação para o tecido inflamado e
coordenando as múltiplas respostas de defesa local. Alguns desses mediadores
apresentam a capacidade de estimular neurônios sensoriais locais, contribuindo para
o surgimento da nocicepção (ROTH et al., 2009).
Contudo, é possível que a inflamação ultrapasse certos níveis, sendo assim,
permite que quantidades suficientes de mediadores endógenos entrem na circulação
sistêmica, se disseminando na corrente sanguínea e provocando múltiplas reações,
chamadas de resposta de fase aguda que incluem o desenvolvimento da febre, a
perda do apetite, aumento do ciclo de sono, diminuição da atividade motora, a
redução da libido e a diminuição do comportamento de alerta (ROTH et al., 2009).
Dentre as citocinas liberadas no momento do trauma, destaca-se o fator de
necrose tumoral (TNF-α) que promove a liberação de outras citocinas, destacandose a interleucina 1-beta (IL-1β) e a interleucina 8 (IL-8). A IL-1β, por sua vez,
promove a ativação da enzima cicloxigenase (COX) responsável pela produção de
prostaglandinas - PGs, prostaciclinas - PIs e tromboxanos – TXs, enquanto a IL-8
atua na liberação local de aminas simpatomiméticas (BASBAUM; JULIUS, 2006;
VERRI et al., 2006).
em roedores.
49
3.9. Drogas anti-inflamatórias
3.9.1. Anti-inflamatórios não esteroidais
Os anti-inflamatórios não esteroidais (AINES) são as drogas mais comumente
prescritas no mundo todo, apresentam atividade analgésica, antipirética e antiinflamatória, apresentam-se como um grupo heterogêneo de compostos que embora
não estejam relacionados quimicamente compartilham de ações terapêuticas e
efeitos colaterais (GILMAN et al., 2006).
Os fármacos inclusos nessa classe são classificados de acordo com sua
origem química, em sete grandes grupos: os salicilatos; derivados do paraminofenol
(paracetamol); derivados do ácido acético; fenamatos; derivados do ácido
propiônico; ácidos enólicos (oxicans); e derivados da pirazolona. Cada um deles
apresenta subgrupos que proporcionam uma variedade de produtos no mercado
farmacêutico (GILMAN et al., 2006).
Apesar do mecanismo de ação dos AINEs não ser completamente elucidado,
sabe-se que seu principal mecanismo de ação é inibir a síntese de prostaglandinas,
fato esse importante, contudo, não único no fenômeno da inflamação (RANG et al.,
2012).
Estes fármacos inibem o sítio ativo da enzima cicloxigenase, levando a não
formação de prostanoides, combatendo assim a inflamação, a dor e a febre.
Contudo, apresentam efeitos adversos principalmente no trato gastrointestinal, na
função renal e na agregação plaquetária, que tornam limitados o uso dessas drogas
(RANG et al., 2012). A maior parte desses fármacos não inibe a atividade das
lipoxigenases podendo levar ao desvio do catabolismo do ácido araquidônico para
esta via, promovendo a formação de leucotrienos e levando à continuidade do
processo inflamatório por outros mecanismos (BASBAUM; JULIUS, 2006).
Apesar da inibição da COX ser o principal mecanismo de ação dos AINES,
essa classe de drogas pode ainda exercer outros efeitos, justificando assim, a
eficiente ação de alguns fármacos, com fraca ação antiprostaglandinas. Entretanto, a
extensão na qual esses mecanismos adicionais são importantes, varia de droga para
droga e seus efeitos terapêuticos ainda são incertos (LEES et al., 2004).
Em geral, esses fármacos inibem de forma variável as isoformas COX-1 e
em roedores.
50
COX-2 em suas doses terapêuticas, sendo então caracterizados de acordo com sua
capacidade de inibição dessas respectivas enzimas. Se em sua dose terapêutica, o
agente inibe apenas a isoforma COX-2, sem interferência na atividade COX-1,
denominam-se agente inibidor específico COX-2, os coxibes, como por exemplo, o
firocoxibe. Os fármacos que tem especificidade parcial para COX-2 são chamados
seletivos COX-2, e são exemplos o carprofeno e o meloxicam (LEES et al., 2004).
A partir de descobertas denominaram a COX-1 como fisiologicamente
constitutiva, agindo como citoprotetora gástrica e mantenedora da homeostase renal
e plaquetária e, a COX-2 ou indutiva, a qual expressava-se apenas em situações de
trauma tissular e inflamação (YAKSH et al., 2001; PERAZELLA et al., 2001;). Surge
então, a ideia de que inibidores específicos da COX-2 impediriam o processo
inflamatório sem os efeitos colaterais indesejáveis. No entanto, evidências da
presença de COX-2 em determinados tecidos humanos e de animais também
envolvidas com a homeostase, pôs em discussão a segurança e até que ponto o uso
de agentes anti-inflamatórios com inibição específica desta isoforma apresentaria
realmente vantagens sobre os não seletivos (DOGNÉ et al., 2005).
3.9.2. Anti-inflamatórios esteroidais
Os corticoesteroides (CT) são fármacos amplamente utilizados pelas suas
conhecidas propriedades anti-inflamatórias e imunossupressoras, no tratamento de
diversas
patologias,
tais
como
as
doenças
reumatológicas,
auto-imunes,
respiratórias e no processo de transplantação de órgãos (PATRICIO et al., 2006).
São agentes que simulam os esteroides hormonais endógenos produzidos no córtex
adrenal: o cortisol (glicocorticoide) e a aldosterona (mineralocorticoide). Os
glicocorticoides são regulados primariamente pela corticotropina (ACTH), enquanto
que os mineralocorticoides são regulado pelo sistema renina-angiotensina e
possuem propriedades de retenção de sal (FINAMOR et al., 2002).
Glicocorticoides (GC) são os mais eficazes anti-inflamatórios disponíveis,
suplantando os não-esteroides. Empregam-se em doses equipotentes e são
clinicamente classificados conforme sua duração de ação. A menor atividade
mineralocorticoide é vantajosa por evitar retenção de fluido. Os glicocorticoides são
capazes de induzir a maturação celular (pneumócito tipo II), diferenciação celular
em roedores.
51
(linhagens da crista neural) ou mesmo a morte celular por apoptose, o que permite
seu uso no tratamento de tumores, especialmente os de linhagem hematopoiética
(LONGUI, 2007).
A maioria dos efeitos anti-inflamatórios dos glicocorticoides é mediada via
receptores de glicocorticoides citosólicos (RGC), que são encontrados em cada
célula do corpo e exercem uma variedade de ações fisiológicas afetando cada
sistema do organismo (KIM et al., 2009). Os glicocorticoides são capazes de inibir
citocinas pró-inflamatórias, como as interleucinas IL-2 e IL-12, o interferon gama
(IFN-γ) e o fator de necrose tumoral (TNF-α), bem como moléculas de adesão, como
a lipocortina-1, moléculas de adesão vascular (VCAM-1) e moléculas de adesão
intercelular (ICAM), ou ainda enzimas, como a sintase induzida pelo óxido nítrico
(iNOS), a ciclooxigenase (COX-2) e a fosfolipase A2 (PLA2) (LONGUI, 2007).
Seus
excelentes
efeitos
terapêuticos
como
anti-inflamatório
e
imunossupressor são, frequentemente, acompanhados por graves e, algumas vezes,
irreversíveis efeitos colaterais, como diabetes mellitus, úlcera péptica, síndrome de
Cushing com supressão do eixo hipotálamo-hipófise-adrenal, osteoporose, atrofia
cutânea, psicose, glaucoma, entre outras, ficando o uso dos GC limitado por estes
efeitos colaterais (SCHACKE et al., 2002).
3.10. Modelos experimentais
3.10.1. Edema de pata induzido por carragenina
A injeção subcutânea de carragenina na pata de ratos ou camundongos induz
aumento agudo e progressivo do volume da pata injetada. Este edema é
proporcional à intensidade da resposta inflamatória, constituindo um parâmetro útil
na avaliação da atividade anti-inflamatória de novos compostos.
Após a medida do volume basal de ambas as patas traseiras, os animais são
tratados com o extrato da planta medicinal nas doses escolhidas em testes
preliminares; com o veículo ou com a droga padrão. Após uma hora dos tratamentos,
os animais recebem uma injeção s.pl. de carragenina (1-2 %) em uma das patas
traseiras. Após a injeção, mede-se o volume das patas e repete-se a medida a cada
hora até completar 5 h da injeção de carragenina.
em roedores.
52
Para a medida do volume das patas, imerge-se a pata até o maléolo lateral
em um hidropletismômetro elétrico. Este aparelho mede o volume de líquido
deslocado e o traduz de forma digital. O valor do edema é obtido pela subtração do
volume da pata injetada com salina do volume da pata injetada com o estímulo
inflamatório (LAPA et al., 2003).
O modelo experimental demonstra um elevado grau de reprodutibilidade. A
resposta inflamatória induzida pela carragenina é caracterizada por uma resposta
bifásica com formação de edema acentuado resultante da produção rápida de vários
mediadores inflamatórios, tais como histamina, serotonina e bradicinina (primeira
fase), e subsequentemente liberação de prostaglandinas e óxido nítrico (segunda
fase), com pico em 3 h, produzido por isoformas indutíveis de COX-2 e de óxido
nítrico sintase (iNOS), respectivamente (THOMAZZI et al., 2010).
3.10.2. Edema de orelha induzido por óleo de cróton
O modelo de edema induzido na orelha de camundongos por óleo de cróton
pesquisa a atividade de agentes anti-inflamatórios de uso tópico, mas também a
administração sistêmica de anti-inflamatórios esteroidais. O anti-inflamatório e o
extrato são aplicados topicamente nas orelhas direitas de camundongos e, após 1
hora, período de absorção, aplica-se topicamente na mesma orelha cróton diluído
em acetona, enquanto a outra orelha é tratada apenas com o veículo. Após 4 horas,
sacrifica-se os animais por deslocamento cervical, retira-se fragmentos de cada
orelha e pesa-se os fragmentos em balança analítica. O edema induzido é medido
pela diferença de peso entre as orelhas (LAPA et al., 2003).
O edema de orelha induzido por aplicação tópica de óleo de cróton envolve a
ativação da fosfolipase A2, com consequente biosíntese de prostaglandinas e
leucotrienos (FURSTENBERGER; MARKS, et al., 1980). O efeito edematogênico
deste agente flogístico é determinado pela presença, no óleo, de ésteres de forbol
que estimulam diretamente proteínas quinase C, ativando as vias de sinalização
celular por elas controladas (HARA et al., 1992).
em roedores.
53
3.10.3. Peritonite induzida por carragenina
A peritonite induzida pela injeção i.p de carragenina é um modelo de
inflamação amplamente utilizado na pesquisa de drogas anti-inflamatórias (LAPA et
al., 2003). A injeção intraperitoneal de carragenina leva à migração de leucócitos
para o local da inflamação (ZHANG et al., 2011).
A quantificação dos leucócitos através de uma câmara de Neubauer permite
avaliar a influência de drogas neste parâmetro da resposta inflamatória, sendo
particularmente sensíveis+9 a anti-inflamatórios esteroidais. A presença dos
mediadores inflamatórios também podem ser avaliados e dosados no exsudato
inflamatório obtido do peritônio (LAPA et al., 2003).
Considerando a ascensão da fitoterapia no Brasil nas últimas décadas e a
necessidade da busca de moléculas com atividade analgésica e/ou anti-inflamatória
que garantam uma terapia eficaz e segura para o tratamento da dor e inflamação, o
presente trabalho realizou a avaliação da atividade farmacológica do extrato da
espécie Annona vepretorum Mart., abordando aspectos de atividade antinociceptiva
e anti-inflamatória.
54
4. PARTE EXPERIMENTAL
em roedores.
55
4. PARTE EXPERIMENTAL
4.1. Material vegetal
4.1.1 Coleta de Annona vepretorum Mart. para obtenção do extrato etanólico bruto
As folhas de Annona vepretorum Mart. foram coletadas no município de
Jaguarari, estado da Bahia, em junho de 2008, cujas coordenadas geográficas são:
latitude 10º03’00,00’’’ longitude 040º06’33,60’’ e altitude 689 m. O material botânico
foi identificado pelo biólogo Dr. José Alves de Siqueira Filho do Centro de Referência
para Recuperação de Áreas Degradadas da Caatinga (CRAD). Uma exsicata da
espécie está depositada no Herbário Vale do São Francisco (HVASF) da
Universidade Federal do Vale do São Francisco (UNIVASF) sob o código #946
(Figura.3).
Figura 3. Exsicata de Annona vepretorum coletada em Jaguarari-BA.
em roedores.
56
4.1.2 Coleta de Annona vepretorum para extração do óleo essencial
As folhas de Annona vepretorum foram coletadas no município de Petrolina,
estado de Pernambuco, em março de 2012, cujas coordenadas geográficas são:
latitude 09º19’37,50’’’ longitude 040º33’01,40’’ e altitude 385 m. O material botânico
foi identificado pelo biólogo Dr. José Alves De Siqueira Filho do Centro de
Referência para Recuperação de Áreas Degradadas da Caatinga (CRAD). A
exsicata da espécie está depositada no Herbário Vale do São Francisco (HVASF) na
Universidade Federal do Vale do São Francisco (UNIVASF) com o código #18350
(Figura 4).
Figura 4. Exsicata de Annona vepretorum coletada em Petrolina-PE.
em roedores.
57
4.2. Obtenção do extrato etanólico bruto das folhas de Annona vepretorum
O material vegetal foi dessecado em estufa com ar circulante à temperatura
média de 40 ºC durante três dias. Após a secagem e completa estabilização
(eliminação de água, inativação de enzimas, etc.) o material foi pulverizado em
moinho, obtendo-se um material vegetal seco e pulverizado (1400 g).
Este material seco e pulverizado foi submetido à maceração exaustiva com
etanol 95% em um percolador. Foram realizadas várias extrações com intervalos de
72 horas entre cada extração. A solução foi filtrada e concentrada no evaporador
rotatório a uma temperatura de 50 ºC sob vácuo.
Após evaporação do solvente em rotavapor, obteve-se o extrato etanólico
bruto de Annona vepretorum (Av- EtOH). A partir de 1.400 g do pó seco das folhas
foi obtido 600 g do extrato etanólico bruto (42,86% de rendimento em relação ao
peso seco da planta).
4.3. Avaliação fitoquímica preliminar dos constituintes químicos de Av-EtOH
Esta triagem procura sistematizar ou rastrear os principais grupos de
constituintes químicos que compõem um extrato vegetal. É um exame rápido e
superficial através de reagentes de coloração ou precipitação que revela a presença
de metabólitos secundários em um extrato. A triagem fitoquímica preliminar, com
vistas ao estabelecimento da possível natureza química dos compostos existentes
foi realizada com o extrato etanólico bruto. Os metabólitos secundários foram
testados baseados nos já encontrados em outras espécies do mesmo gênero.
Foram realizados testes para as classes específicas de constituintes
químicos, tais como saponinas, esteroides, alcaloides, flavonoides e taninos. Os
extratos foram avaliados em placas cromatográficas de sílica gel com suporte de
alumínio, aplicados com micropipeta e eluídos em diferentes sistemas de solventes,
conforme descrito por Wagner e Bladt (1996), procurando-se evidenciar os principais
grupos do metabolismo secundário (Tabela 1).
em roedores.
58
Tabela 1. Sistemas de eluição e reveladores utilizados para caracterizar os
principais metabólitos secundários da espécie Annona vepretorum (Annonaceae).
Classe química
Sistema eluente
Tolueno:acetato de
Alcaloides gerais
etila:dietilamina
(70:20:10)
Padrão
Revelador
Yoimbina
Dragendorff
Quinina
Acetato de etila:ácido
Antocianinas
fórmico:ácido acético
glacial:água
Azul de metileno
Anisaldeído sulfúrico
(100:11:11:26)
Antraquinonas
Éter de Petróleo:acetato
agliconas
de etila:ácido fórmico
Ácido
Antraquinona
(75:25:1)
fosfomolíbdico/
H2SO4 etanólico
10%
Flavonoides
fórmico:ácido acético
Rutina
glacial:água
Quercetina
NEU
(100:11:11:26)
Tolueno:éter etílico
Cumarinas
(1:1 saturado com ácido
Escopoletina
KOH etanólico 10%
Aloína
KOH etanólico 10%
Estrato de linhaça
Vanilina fosfórica
acético 10%)
Derivados
antracênicos
Lignanas
Naftoquinonas
Acetato de
etila:metanol:água
(100:13,5:10)
Clorofórmio:metanol:água
(70:30:4)
Tolueno:ácido fórmico
Biflorina
(99:1)
Lapachol
Clorofórmio:ácido
Saponinas
acético:metanol:água
(64:32:12:8)
Saponina
KOH etanólico 10%
Anisaldeído
sulfúrico
(WAGNER; BLADT, 1996).
em roedores.
59
Continuação
Classe química
Sistema eluente
Padrão
Revelador
Taninos
acético glacial:ácido
Catequina
Vanilina
condensados
fórmico:água
Epicatequina
clorídrica
Ácido gálico
Sulfato de ferro
Ácido tânico
amoniacal ( 1%)
(100:11:11:26)
Taninos
n-Butanol:acetona:tampão
fosfato
hidrolisáveis
(40:50:10)
Triterpenos e
Tolueno:clorofórmio:etanol
Lupeol
Lieberman-
esteroides
(40:40:10)
Sitosterol
Burchard
Cafeína
Iodo- KI-HCl
Acetato de
Xantinas
etila:Metanol:água
(100: 13,5: 10)
Adaptado de Wagner; Bladt, 1996.
4.4. Obtenção do óleo essencial das folhas de Annona vepretorum
Para obtenção do óleo essencial, as folhas frescas de Annona vepretorum
(549,0 g) foram cortadas e submetidas à hidrodestilação durante 2 h num aparelho
tipo Clevenger. Obteve-se o óleo essencial das folhas (Av-OE), com percentual de
rendimento de 0,3664%.
A análise do óleo foi feita em espectrômetro de massa (QP-5050) equipado
com um cromatógrafo em fase gasosa (GC-17A), para a identificação e
quantificação do óleo essencial estudado. Os dados foram obtidos e processados
com um software específico.
4.5. Animais
Foram utilizados camundongos albinos Swiss (Mus musculus) de ambos os
sexos, pesando entre 30-40 g e ratos (Rattus novergicus) Wistar machos, albinos,
pesando entre 200-250 g, todos procedentes do Biotério Setorial da UNIVASF,
Campus
Petrolina.
Antes
dos
experimentos,
todos
os
animais
foram
randomicamente mantidos em gaiolas de polipropileno com ventilação e temperatura
(22 ± 2 °C) controladas, em um ciclo claro-escuro de 12 horas, com a fase de luz
em roedores.
60
iniciando às 6:00 e terminando às 18:00 horas, com livre acesso à ração tipo
“pellets” (Labina®) e água (disponível em frascos de plástico com bicos apropriados).
Os animais foram privados de alimento 12 horas antes dos experimentos e
para adaptação, eles foram transferidos do Biotério para o laboratório de fisiologia 48
horas antes do experimento. Durante este período, os animais foram manipulados
apenas para limpeza das caixas. Todos os procedimentos foram conduzidos de
acordo com os princípios éticos na experimentação animal, sendo aprovados pela
Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA) da Universidade Federal do Vale do
São Francisco - UNIVASF sob o número 0004/261011.
4.6. Testes de atividade antinociceptiva
4.6.1. Teste das contorções abdominais induzidas por ácido acético
Este teste foi realizado de acordo com o método descrito por Collier et al.
(1968) com modificações. Os camundongos foram divididos em seis grupos com
seis animais cada. A nocicepção foi induzida por ácido acético via intraperitoneal
(i.p.) em um volume de 0,1 mL/10 g.
Os animais foram tratados com Av-EtOH (25, 50 e 100 mg/kg), ou com
veículo (Salina) administrados por via oral (v.o.) 1 hora antes do agente nociceptivo.
Para o óleo essencial, os animais foram tratados com Av-OE (25, 50 e 100
mg/kg) administrados por via intraperitoneal (i.p.) 30 minutos antes do agente
nociceptivo.
Indometacina (20 mg/kg) e morfina (10 mg/kg) foram usados como drogas
padrões, sendo administradas por i.p. 30 minutos antes do agente indutor da dor.
Após a injeção do ácido acético, o número de contorções abdominais (Figura
5) (uma resposta consistindo de contração da parede abdominal, rotação pélvica,
seguida de extensão dos membros posteriores) foi registrado entre 5 - 15 minutos
após administração (QUEIROZ et al., 2010).
em roedores.
61
Figura 5. Camundongo observado no teste de contorções abdominais após a
injeção do ácido acético. (Autor: NEPLAME)
4.6.2. Teste da formalina
O método usado foi similar ao descrito por Hunskaar & Hole (1987). A solução
de formalina (2,5% em salina 0,9%) foi administrada por via subplantar na pata
posterior direita, em um volume de 20 μL/pata (SANTOS et al., 2010).
Os camundongos foram observados em uma câmara com um espelho
montado em três lados para permitir a visão das patas, e o tempo (em segundos)
gasto lambendo e mordendo a pata injetada foi medido como um indicador de dor
(Figura 6). Esta resposta foi mensurada durante 5 minutos (primeira fase, dor
neurogênica) e entre 15 - 30 minutos após a injeção da formalina (segunda fase, dor
inflamatória) (ALMEIDA et al., 2011).
Os animais receberam veículo (salina, v.o.), Av-EtOH (25, 50 e 100 mg/kg,
v.o.) e Av-OE (25, 50 e 100 mg/kg, i.p.), indometacina (20 mg/kg, i.p.) e morfina (10
mg/kg, i.p.), administrados 1 hora antes da injeção de formalina (n= 6 por grupo).
Para avaliação do envolvimento de receptores opioides no efeito do extrato e
do óleo essencial foi administrado um antagonista do receptor opioide, a naloxona
(1,5 mg/kg, i.p), trinta minutos antes da administração do extrato (100 mg/kg), óleo
essencial (100 mg/kg) ou morfina (10 mg/kg).
em roedores.
62
Figura 6. Camundongo observado no teste da formalina. (Autor: NEPLAME)
4.6.3. Teste da placa quente
Os camundongos foram divididos em cinco grupos (n=6). Esses foram préselecionados no aparelho de placa quente (Insight, Brasil), na temperatura de 55 ±
0,5 °C. Animais que apresentaram um tempo de reação (definido como latência para
levantar ou lamber as patas) maior que vinte segundos foram excluídos. Os
camundongos selecionados foram pré tratados com veículo (v.o.), Av-EtOH (25, 50,
100 mg/kg, v.o.), Av-OE (25, 50 e 100 mg/kg, i.p.) ou morfina (10 mg/kg, i.p.).
Cada animal foi colocado sobre a placa quente mantida a 55 ºC (Figura 7) e a
latência foi medida em 30, 60, 90 e 120 min após a administração do veículo,
extrato, óleo essencial ou morfina (ALMEIDA et al., 2011). Um tempo de corte de 20
s foi escolhido para indicar completa analgesia e para proteger o animal de lesão
tecidual. A latência foi medida para cada animal. Para avaliação do envolvimento de
receptores opioides no efeito do extrato, naloxona (1,5 mg/kg, i.p.) foi administrada
30 minutos antes do extrato (100 mg/kg) e morfina (10 mg/kg).
em roedores.
63
Figura 7. Animal observado no teste da placa quente. (Autor: NEPLAME)
4.6.4. Teste de retirada da cauda
A resposta antinociceptiva a estímulos térmicos foi avaliada com o teste de
retirada da cauda (Analgesímetro Tail Flick, Insight, Brasil) (D’AMOUR, SMITH,
1941). Ratos foram divididos em cinco grupos de seis animais cada, e cada animal
foi colocado em um contensor (tubo de acrílico, com ventilação) apropriado, com a
superfície dorsal da cauda posicionada no estímulo térmico (Figura 8).
O aquecimento foi aplicado no terço distal da cauda e consistiu em focar um
feixe de luz, a 50 °C na cauda destes ratos. O tempo, em segundos, para remover a
cauda do feixe é considerado como o tempo de latência, que é medido
automaticamente por um registrador ligado ao aparelho. Cada ensaio foi encerrado
após 7 segundos para minimizar a probabilidade de danos à pele. A latência de
retirada da cauda foi medida antes e 30, 60, 90 e 120 minutos após a administração
do veículo (v.o.), Av-EtOH (25, 50 e 100 mg/kg, v.o.) ou de morfina (10 mg/kg, i.p.)
(NAKAMOTO et al., 2010). Portanto, quanto mais tempo ficar a cauda do animal sob
o feixe de luz, maior a atividade analgésica da substância em estudo.
em roedores.
64
Figura 8. Animal observado no teste de retirada da cauda. (Autor: NEPLAME)
4.6.5. Teste de dor orofacial induzida por formalina
O método usado foi similar ao descrito por Luccarini et al. (2006), com
modificações. A solução de formalina (2,0% em salina 0,9%) foi administrada no
lábio superior direito (área perinasal), em um volume de 20 μL (s.c.) (QUINTANSJÚNIOR et al., 2010).
Os camundongos foram observados em uma câmara com um espelho
montado em três lados, e o tempo (em segundos) gasto friccionando a área injetada
com as patas posteriores e/ou anteriores foi medido como um indicador de
nocicepção (Figura 9). Esta resposta foi mensurada durante 5 minutos (primeira
fase, dor neurogênica) e entre 15 - 30 minutos após a injeção da formalina (segunda
fase, dor inflamatória).
Tratamentos com veículo (salina, v.o.), Av-EtOH (25, 50 e 100 mg/kg, v.o.) e
morfina (10 mg/kg, i.p.) foram realizados 1 hora antes da injeção de formalina (n= 6
por grupo).
Para avaliação do envolvimento de receptores opioides no efeito do extrato foi
administrado um antagonista do receptor opioide, a naloxona (1,5 mg/kg, i.p.), trinta
minutos antes da administração do extrato (100 mg/kg) ou morfina (10 mg/kg).
em roedores.
65
Figura 9. Teste de dor orofacial induzida por formalina. (Autor: NEPLAME)
4.6.6. Teste de dor orofacial induzida por capsaicina
Os camundongos foram divididos em cinco grupos (n = 6). Tratamentos com
veículo (etanol, dimetilsulfóxido, água destilada 1:1:8, v.o.), Av-EtOH (25, 50 e 100
mg/kg, v.o.) e morfina (10 mg/kg, i.p.) foram realizados 1 hora antes da injeção de
capsaicina.
A capsaicina foi dissolvida no veículo e injetada (20 µL, 2,5 µg, s.c) no lábio
superior direito (área perinasal). Os camundongos foram colocados em uma câmara
com um espelho montado em três lados, e o tempo (em segundos) gasto
friccionando a área injetada com as patas posteriores e/ou anteriores foi medido
entre 10 – 20 minutos após a injeção da capsaicina (QUINTANS-JÚNIOR et al.,
2010).
4.6.7. Teste de dor orofacial induzida por glutamato
Os camundongos foram divididos em cinco grupos (n = 6). Tratamentos com
veículo (salina, v.o.), Av-EtOH (25, 50 e 100 mg/kg, v.o.) e morfina (10 mg/kg, i.p.)
foram realizados 1 hora antes da injeção de glutamato.
O glutamato foi administrado (20 µL, 25 µM, s.c) no lábio superior direito (área
perinasal). Os camundongos foram observados em uma câmara com um espelho
montado em três lados, e o tempo (em segundos) gasto friccionando a área injetada
em roedores.
66
com as patas posteriores e/ou anteriores foi medido durante 15 minutos após a
injeção do glutamato (QUINTANS JÚNIOR et al., 2010).
4.7. Testes de atividade anti-inflamatória
4.7.1. Edema de pata induzido por carragenina
A atividade anti-inflamatória foi estudada usando o modelo de edema de pata
induzido por carragenina 2%, injetada em um volume de 20 µL/animal na região
subplantar da pata direita do camundongo (WINTER et al., 1962).
Camundongos foram divididos em seis grupos de seis animais cada. Os
animais foram pré-tratados com Av-EtOH (25, 50 e 100 mg/kg, v.o.), salina (veículo,
v.o.) ou indometacina (20 mg/kg, i.p.) 1 h antes da injeção da carragenina ou salina.
O volume da pata foi mensurado imergindo-a até a altura do tornozelo,
utilizando o aparelho pletismômetro (PanLab LE 7500, Espanha) antes (VA, basal)
da administração intraplantar da carragenina e 1, 2, 3, 4 e 5 h após (VB) (Figura 10),
como descrito anteriormente (HUANG et al., 2012). A inibição do edema foi
calculado por (VB-VA)/VA, onde VA é o volume da pata direita anterior à injeção da
carragenina, e VB é o volume da pata direita após a injeção da carragenina.
Finalmente, os animais foram sacrificados e todas as patas direitas foram
dissecadas. Cada amostra foi colocada em parafina, seccionada a 5 μm e corados
com hematoxilina e eosina para análise histológica.
em roedores.
67
Figura 10. Volume da pata mensurado utilizando o aparelho pletismômetro no
modelo do edema de pata induzido por carragenina. (Autor: NEPLAME)
4.7.2. Edema de pata induzido por histamina
O edema no camundongo foi induzido por injeção de 100 μg/pata de
histamina (CAVALHER-MACHADO et al., 2008). Camundongos foram divididos em
três grupos de seis animais cada. Os animais foram pré-tratados com Av- EtOH (100
mg/kg, v.o.), veículo (salina, v.o.) 1 h antes da injeção de histamina ou salina. O
volume foi mensurado antes da injeção intraplantar de histamina ou salina (VA,
basal) e 30, 60, 90 e 120 min após (VB) (SULEYMAN et al., 1999). A inibição do
edema de pata foi calculada como descrito no teste do edema de pata induzido por
carragenina. Os animais foram sacrificados e todas as patas direitas foram
dissecadas para análise histológica.
4.7.3. Migração de leucócitos na cavidade peritoneal
Camundongos foram divididos em cinco grupos de seis animais cada. A
migração de leucócitos foi induzida por injeção de carragenina (1%, i.p., 0,25 mL)
(ANDRADE et al., 2012) na cavidade intraperitoneal 1 hora depois da administração
de Av-EtOH (25, 50 e 100 mg/kg, v.o.), veículo (salina, v.o.). Para a dexametasona
(2 mg/kg, i.p.) e Av-OE (25, 50 e 100 mg/kg, i.p.) a solução de carragenina foi
administrada 30 minutos depois (BASTOS et al., 2007). A migração de leucócitos foi
em roedores.
68
avaliada 4 horas após o estímulo, sendo os animais eutanasiados e as células da
cavidade peritoneal foram colhidas com 3 mL de solução salina contendo 1 mM de
EDTA. Imediatamente, uma breve massagem foi realizada, e em seguida foi
coletado o fluido peritoneal, que foi centrifugado (3000 rpm por 6 min) em
temperatura ambiente. O sobrenadante foi descartado e 300 µL de EDTA foi
adicionado ao precipitado, do qual foi retirado uma alíquota de 10 µL. Foi adicionado
200 µL de solução de Turk à alíquota e o total de células foi contado em uma
câmara de Neubauer, em um microscópio óptico. Os resultados foram expressos
como número de leucócitos/mL (MELO et al., 2011).
4.8. Toxicidade subcrônica
Na investigação da toxicidade subcrônica, os camundongos foram divididos
em três grupos de 5 machos e 5 fêmeas (n = 10). O grupo controle recebeu veículo
(salina). Os demais receberam doses diárias de Av-EtOH de 100 mg/kg e 400 mg/kg
por via oral. Os animais foram observados durante 30 dias para avaliar a presença
de morte e sinais de toxicidade. Outros parâmetros tais como: peso corporal,
consumo de alimento e água foram avaliados diariamente, durante todo o estudo.
4.8.1. Análise comportamental
Para a realização da análise comportamental foram avaliados alguns
parâmetros específicos (piloereção, ptose palpebral, contorções abdominais,
convulsões, catatonia, tremores, paralisia das patas dianteiras, sedação, ambulação
aumentada, resposta ao toque diminuída, movimentação intensa das vibrissas,
agressividade, estereotipia e analgesia), após a administração de Av-EtOH. No
primeiro dia, tais parâmetros foram avaliados nos tempos de 0,5, 1, 2, 3 e 4 h após
administração do extrato. Nos demais dias, a avaliação comportamental foi feita
diariamente até o último dia da toxicidade subcrônica seguindo metodologia descrita
por Almeida et al. (1999).
em roedores.
69
4.8.2. Análises de parâmetros hematológicos e bioquímicos
Para a avaliação dos parâmetros hematológicos e bioquímicos do sangue, foi
utilizada a metodologia descrita por Vasconcelos et al. (2007) e Araújo et al. (2008)
com modificações. O sangue foi retirado através do plexo braquial para análise
laboratorial dos parâmetros hematológicos: contagem de eritrócitos (10 6/mm3),
hemoglobina (g/dL), hematócrito (%), volume corpuscular médio (VCM, μ3),
hemoglobina
corpuscular
média
(HCM,
g),
concentração
de
hemoglobina
corpuscular média (CHCM,%), leucócitos (103/mm3), linfócitos (%), monócitos (%) e
plaquetas (103/mm3). Os parâmetros bioquímicos analisados em amostras de soro
foram glicose (mg/dL), colesterol (mg/dL), triglicérides (mg/dL), AST/TGO (U/L),
ALT/TGP (U/L), uréia (mg/dL) e creatinina (mg/dL). Para a determinação dos
parâmetros hematológicos foi utilizado analisador de hematologia Horiba ABXPentra 60, já para os parâmetros bioquímicos foi utilizado um analisador semiautomático Bioplus (BIO-200).
4.9. Análise estatística
Os dados obtidos foram analisados através do programa GraphPad Prism,
versão 5.0, e expressos como média ± erro padrão da média (e.p.m). Diferenças
estatisticamente significativas entre os grupos foram calculadas pela aplicação de
uma análise de variância (ANOVA) one-way seguido do teste de Tukey ou Dunnett,
ou pelo teste t de Student não pareado, conforme exigido pelo protocolo
experimental. Foram considerados significativos valores de p < 0,05.
70
5. RESULTADOS
em roedores.
71
5. RESULTADOS
5.1. Triagem fitoquímica
A análise fitoquímica preliminar (Tabela 2) demonstrou reação positiva para a
presença de fenóis, esteroides, terpenos e flavonoides. No entanto, o extrato
etanólico apresentou reação negativa para a presença de alcaloides.
Tabela 2. Identificação das principais classes de constituintes químicos presentes no
extrato etanólico bruto das folhas de Annona vepretorum (Annonaceae).
Classe química
Av-EtOH
Alcaloides
-
Cumarinas
+
Derivados antracênicos
+
Flavonoides e taninos
+
Lignanas
+
Mono e diterpenos
+++
Naftoquinonas
+
Triterpenos e esteroides
++
(-): ausência do constituinte, (+) leve presença do constituinte, (++): moderada presença do
constituinte, (+++): intensa presença do constituinte.
5.2. Composição do óleo essencial
A caracterização química do óleo essencial das folhas de A. vepretorum
(Tabela 3) permitiu identificar 93,67% dos constituintes que compõem a amostra.
Dentre os compostos identificados, 53,7% trata-se de monoterpenos, enquanto que
46,3% correspondem a sesquiterpenos. E-ocimeno, biciclogermacreno, germacreno
D, limoneno, espatulenol e α-pineno configuram-se como sendo os constituintes
majoritários de Av-OE, representando 83,55% da composição química total do óleo
essencial.
em roedores.
72
Tabela 3. Constituintes químicos identificados no óleo essencial das folhas de
Annona vepretorum (Annonaceae).
tR (min)
IR
Constituintes químicos
(%)
5,80
933
α-Pineno
8,92
6,20
948
Canfeno
1,68
6,97
977
β-Pineno
0,88
7,34
990
β-Mirceno
1,22
7,79
1006
α-Felandreno
0,73
8,45
1024
p-Cimeno
0,62
8,59
1028
Limoneno
9,65
8,87
1036
Z-Ocimeno
1,07
9,27
1047
E-Ocimeno
25,56
15,66
1210
M = 152 (não identificado)
4,01
23,08
1387
1,21
24,37
1418
E-Cariofileno
1,97
26,89
1481
Germacreno D
14,61
27,50
1496
Biciclogermacreno
15,63
28,55
1523
δ-Cadineno
0,80
30,69
1579
Espatulenol
9,18
32,97
1639
1,11
33,55
1655
α-Cadinol
1,15
tR: tempo de retenção, IR: índice de retenção, (%): composição relativa.
5.3. Resultados da atividade farmacológica do extrato de Annona vepretorum
5.3.1 Atividade antinociceptiva do extrato de Annona vepretorum
5.3.1.1 Teste das contorções abdominais induzidas por ácido acético
Os resultados mostrados na Figura 11 demonstram que o pré-tratamento com
Av-EtOH (25, 50 e 100 mg/kg, v.o.) foi capaz de inibir as contorções induzidas por
ácido acético quando comparados com grupo controle (p<0,01). As porcentagens de
inibição foram de 61,75%, 81,08% e 91,89%, respectivamente. Indometacina e
em roedores.
73
morfina apresentaram 92,90% e 100%, respectivamente, de redução de contorções
quando comparados com o controle. Não houve diferença estatística entre as doses
de Av-EtOH quando comparadas entre si (p>0,05).
Número de contorções
20
Controle
Av-EtOH 25 mg/kg
Av-EtOH 50 mg/kg
Av-EtOH 100 mg/kg
Indometacina 20 mg/kg
Morfina 10 mg/kg
15
10
*
5
*
*
0
*
*
Figura 11. Efeito antinociceptivo do extrato etanólico bruto de Annona vepretorum
(Av-EtOH 25, 50 e 100 mg/kg), indometacina (20 mg/kg), morfina (10 mg/kg), no
teste de contorções abdominais. Valores são expressos em média ± erro padrão da
média, n = 6. * p < 0,05 significativamente diferente do grupo controle (ANOVA
seguido pelo teste de Tukey).
5.3.1.2 Teste da formalina
O tratamento com Av-EtOH nas doses de 25 e 100 mg/kg (v.o.) produziu uma
atividade antinociceptiva significante comparada ao grupo controle em ambas as
fases (p<0,05) (Figura 12). Av-EtOH (25, 50 e 100 mg/kg, v.o.) reduziu em 55,22%;
64,18% e 65,30%, respectivamente, o tempo de lambida da pata na primeira fase,
bem como em 66,36%; 3,98% e 82,27%, respectivamente, na segunda fase do teste
da formalina. A droga de referência indometacina reduziu somente na segunda fase
do teste, enquanto que a morfina inibe ambas as fases do estímulo da dor (p<0,05).
Não houve diferença significativa (p>0,05) entre as doses de Av-EtOH na primeira
fase, enquanto na segunda fase apresentou diferença estatística (p<0,05) entre as
doses de 25 e 100 mg/kg de Av-EtOH quando compradas a dose de 50 mg/kg de
Av-EtOH, tendo em vista que esta dose não apresentou efeito antinociceptivo na
segunda fase.
em roedores.
74
O pré-tratamento com a naloxona (1,5 mg/kg, i.p.) reverteu a atividade
antinociceptiva do extrato, na dose de 100 mg/kg e da morfina (10 mg/kg) na
primeira fase deste ensaio, desta forma não houve diferença estatística quando
comprados ao controle e entre si (p>0,05).
a)
Primeira fase
Tempo de lambida (s)
60
Controle
Av-EtOH 25 mg/kg
Av-EtOH 50 mg/kg
Av-EtOH 100 mg/kg
Morfina 10 mg/kg
Morfina + Naloxona
Av-EtOH + Naloxona
50
40
30
*
20
*
*
*
10
0
b)
Segunda fase
70
60
50
40
*
30
20
10
*
*
*
*
*
Controle
Av-EtOH 25 mg/kg
Av-EtOH 50 mg/kg
Av-EtOH 100 mg/kg
Morfina 10 mg/kg
Morfina + Naloxona
Av-EtOH + Naloxona
0
(Av-EtOH 25, 50 e 100 mg/kg), indometacina (20 mg/kg), morfina (10 mg/kg), AvEtOH (100 mg/kg) + naloxona (NLX 1,5 mg/kg) e morfina (10 mg/kg) + naloxona (1,5
mg/kg) na primeira e segunda fase do teste da formalina. Valores são expressos em
média ± erro padrão da média, n = 6. * p < 0,05 significativamente diferente do grupo
controle (ANOVA seguido pelo teste de Tukey).
em roedores.
75
5.3.1.3 Teste da placa quente
No teste da placa quente, os animais tratados com morfina (10 mg/kg, i.p.)
demonstraram um aumento evidente no tempo de latência em 30, 60, 90 e 120 min
(p<0,05). Os grupos tratados com Av-EtOH (25 e 100 mg/kg, v.o.) mostraram um
aumento na latência em 90 min. O grupo tratado com Av-EtOH (50 mg/kg, v.o.) não
mostrou aumento significativo no tempo de latência. O efeito da morfina e Av-EtOH
100 mg/kg foram revertidos pela naloxona (Figura 13).
Latência (s)
20
*
15
10
* **
*
*
5
Controle
Av-EtOH 25 mg/kg
Av-EtOH 50 mg/kg
Av-EtOH 100 mg/kg
Morfina 10 mg/kg
Morfina + Naloxona
Av-EtOH + Naloxona
0
30
60
90
120
Tempo (min)
(Av-EtOH 25, 50 e 100 mg/kg), morfina (10 mg/kg), Av-EtOH (100 mg/kg) + naloxona
(NLX 1,5 mg/kg) e morfina (10 mg/kg) + naloxona (1,5 mg/kg) no teste da placa
quente em 30, 60, 90 e 120 minutos após sua administração. Valores são expressos
em média ± erro padrão da média, n = 6. *p < 0,05 significativamente diferente do
grupo controle (ANOVA seguido pelo teste de Tukey).
5.3.1.4 Teste de retirada da cauda
Av-EtOH administrado na dose de 50 mg/kg (v.o) induziu um aumento
significativo (p<0,05) no tempo de reação estímulo térmico na cauda quando
comparado ao grupo controle, nos tempos de 30 e 60 min após sua administração.
O grupo tratado com morfina (10 mg/kg, i.p.) apresentou um aumento significativo na
resposta de latência em 30, 60, 90 e 120 min (Figura 14).
em roedores.
6
Latência (s)
5
* *
Controle
Av-EtOH 25 mg/kg
Av-EtOH 50 mg/kg
Av-EtOH 100 mg/kg
Morfina 10 mg/kg
*
* *
76
4
3
2
1
0
30
60
90
120
Tempo
(Av-EtOH 25, 50 e 100 mg/kg) e morfina (10 mg/kg) no teste de retirada da cauda
em 30, 60, 90 e 120 minutos após sua administração. Valores são expressos em
controle (ANOVA seguido pelo teste de Dunnett).
5.3.1.5 Teste de dor orofacial induzida por formalina
O tratamento com Av-EtOH nas doses de 25, 50 e 100 mg/kg (v.o.) produziu
uma atividade antinociceptiva significante comparada ao grupo controle em ambas
as fases (p<0,05) (Figura 15). Av-EtOH (25, 50 e 100 mg/kg, v.o.) reduziu em
47,89%; 47,53% e 47,28 %, respectivamente, o tempo de fricção com as patas
posteriores e/ou anteriores na área injetada, bem como 22,09%; 44,75% e 40,14%,
respectivamente, na segunda fase do teste de dor orofacial induzida por formalina.
A droga de referência morfina reduziu em ambas as fases o estímulo da dor
(p<0,05). As doses de Av-EtOH quando comparadas entre si não houve diferença
siginificativa (p>0,05).
O pré-tratamento com a naloxona (1,5 mg/kg, i.p.) reverteu parcialmente a
atividade antinociceptiva do extrato, na dose de 100 mg/kg na primeira fase do
presente ensaio. O efeito da morfina (10 mg/kg) também foi revertido pela naloxona
em ambas as fases.
em roedores.
77
Primeira fase
100
75
50
*
*
*
*
*
Controle
Av-EtOH 25 mg/kg
Av-EtOH 50 mg/kg
Av-EtOH 100 mg/kg
Morfina 10 mg/kg
Morfina+ Naloxona
Av-EtOH + Naloxona
25
0
Segunda fase
125
100
75
50
*
*
*
*
25
Controle
Av-EtOH 25 mg/kg
Av-EtOH 50 mg/kg
Av-EtOH 100 mg/kg
Morfina 10 mg/kg
Morfina + Naloxona
Av-EtOH+ Naloxona
0
(Av-EtOH 25, 50 e 100 mg/kg), morfina (10 mg/kg), Av-EtOH (100 mg/kg) + naloxona
(NLX 1,5 mg/kg) e morfina (10 mg/kg) + naloxona (1,5 mg/kg) na primeira e segunda
fase do teste de dor orofacial induzida por formalina. Valores são expressos em
controle (ANOVA seguido pelo teste de Tukey).
5.3.1.6 Teste de dor orofacial induzida por capsaicina
uma atividade antinociceptiva significante comparado ao grupo controle (p<0,05),
reduzindo em 60,67%; 77,62% e 82,77% respectivamente, o tempo de fricção com
as patas posteriores e/ou anteriores na área injetada (Figura 16).
As doses de
em roedores.
78
Av-EtOH quando comparadas entre si não houve diferença siginificativa (p>0,05). A
droga de referência morfina reduziu o estímulo da dor (p<0,05), inibindo em 86,44%
a nocicepção.
70
Controle
Av-EtOH 25 mg/kg
Av-EtOH 50 mg/kg
Av-EtOH 100 mg/kg
Morfina 10 mg/kg
60
50
40
30
20
10
*
*
*
*
0
(Av-EtOH 25, 50 e 100 mg/kg) e morfina (10 mg/kg) no teste de dor orofacial
induzida por capsaicina. Valores são expressos em média ± erro padrão da média, n
= 6. * p<0,05 significativamente diferente do grupo controle (ANOVA seguido pelo
teste de Tukey).
5.3.1.7 Teste de dor orofacial induzida por glutamato
uma atividade antinociceptiva significante comparada ao grupo controle (p<0,05),
reduzindo em 31,15%; 29,60% e 39,99% respectivamente, o tempo de fricção com
as patas posteriores e/ou anteriores na área injetada (Figura 17). As doses de AvEtOH quando comparadas entre si não houve diferença siginificativa (p>0,05). A
droga de referência morfina reduziu o estímulo da dor (p<0,05), inibindo em 79,62%
a nocicepção.
em roedores.
50
Controle
Av-EtOH 25 mg/kg
Av-EtOH 50 mg/kg
Av-EtOH 100 mg/kg
Morfina 10 mg/kg
40
30
*
*
*
20
10
79
*
0
(Av-EtOH 25, 50 e 100 mg/kg) e morfina (10 mg/kg) no teste de dor orofacial
induzida por glutamato. Valores são expressos em média ± erro padrão da média,
n = 6. * p<0,05 significativamente diferente do grupo controle (ANOVA seguido pelo
teste de Tukey).
5.3.2 Atividade anti-inflamatória do extrato de Annona vepretorum
5.3.2.1 Edema de pata induzido por carragenina
Para determinar o possível efeito anti-inflamatório de Av-EtOH, o modelo de
edema de pata induzido por carragenina em camundongos foi realizado. Quando a
carragenina foi usada como indutor de edema (Figura 18), Av-EtOH (25, 50 e 100
mg/kg, v.o.) inibiu significativamente (p<0,05) o edema de pata em 1 e 2 h, mas
não foi significativo em 3, 4 e 5 h após o estímulo. Além disso, a droga controle,
indometacina (20 mg/kg, i.p.), mostrou inibição do edema (p<0,05) durante as 5 h de
realização do experimento.
em roedores.
Volume do edema (mL)
0.8
Salina
Salina + Carr
Av-EtOH 25 mg/kg
Av-EtOH 50 mg/kg
Av-EtOH 100 mg/kg
Indometacina
0.7
0.6
0.5
0.4
*
0.3
*
0.2
0.1
0.0
0
1
80
*
*
*
2
3
*
4
*
5
Tempo (horas)
Figura 18. Efeito anti-inflamatório do extrato etanólico bruto de Annona vepretorum
(Av-EtOH 25, 50 e 100 mg/kg) e Indometacina (20 mg/kg) sobre o edema de pata
induzida por carragenina. Valores são expressos em média ± erro padrão da média,
n = 6. * p<0,05 significativamente diferente do grupo controle (salina+ histamina)
(ANOVA seguido pelo teste de Dunnett).
5.3.2.2 Edema de pata induzido por histamina
O edema inflamatório induzido por histamina foi significativamente reduzido
por Av-EtOH 100 mg/kg, v.o. em 30 e 60 min (p<0,05), como mostrado na Figura
19.
em roedores.
Volume do edema (mL)
0.5
81
Salina
Salina + Histamina
Av-EtOH 100 mg/kg
0.4
0.3
0.2
*
*
0.1
0.0
0
30
60
90
120
Tempo (min)
(Av-EtOH 100 mg/kg) sobre o edema de pata induzida por histamina. Valores são
expressos em média ± erro padrão da média, n = 6. * p<0,05 significativamente
diferente do grupo controle (salina+ histamina) (ANOVA seguido pelo teste de
Dunnett).
5.3.2.3 Análise histológica
A análise histológica mostrou a presença de infiltrado com edema subcutâneo
nos grupos onde a inflamação foi induzida por carragenina. Entretanto, no grupo
tratado com 25 mg/kg de Av-EtOH e Indometacina (20 mg/kg) o infiltrado foi menos
intenso quando comparados aos demais grupos.
No grupo onde a inflamação foi induzida por histamina e tratados com 100
mg/kg de Av-EtOH, o processo inflamatório foi menos intenso do que no grupo
controle (Figura 20).
em roedores.
82
em roedores.
83
Figura 20. Histologia das patas de camundongos após indução de edema por
carragenina e histamina após tratamentos. A) Grupo controle (salina + carragenina);
B) Av-EtOH 25 mg/kg + carragenina; C) Av-EtOH 50 mg/kg + carragenina; D) AvEtOH 100 mg/kg + carragenina; E) Indometacina + carragenina; F) Histamina +
salina; G) Histamina + Av-EtOH 100 mg/kg. As setas mostram infiltração de
neutrófilos nos tecidos das patas, aumento original, 100x (A-C; E-G) e 400x (D).
em roedores.
84
5.3.2.4 Migração de leucócitos na cavidade peritoneal
Av-EtOH (25, 50 e 100 mg/kg, v.o) administrado 1 h antes da injeção de
carragenina (1%, i.p., 0.25 mL) inibiu a migração de leucócitos (p<0,05) quando
comparado ao grupo controle (Figura 21). As doses de Av-EtOH quando compradas
entre si apresentou diferença estatística (p<0,05) entre as doses de 25 e 100 mg/kg.
A droga de referência dexametasona (2 mg/kg, i.p.) também promoveu redução
significante na migração de leucócitos (p<0,05).
Leucócitos x 106 / ml
35
Controle
Av-EtOH 25 mg/kg
Av-EtOH 50 mg/kg
Av-EtOH 100 mg/kg
Dexametasona 2 mg/kg
30
25
20
15
*
10
5
*
*
*
0
(Av-EtOH 25, 50 e 100 mg/kg) e morfina (10 mg/kg) no ensaio migração de
leucócitos na cavidade peritoneal. Valores são expressos em média ± erro padrão da
média, n = 6. * p<0,05 significativamente diferente do grupo controle (ANOVA
seguido pelo teste de Tukey).
5.3.3. Toxicidade subcrônica do extrato de Annona vepretorum
A administração do extrato etanólico de Annona vepretorum nas doses de 100
e 400 mg/kg, por via oral, durante 30 dias de tratamento não ocasionou mortes,
indicando baixa toxicidade do extrato. Em relação ao peso corporal (Figura 22),
consumo de água e ração, não houve diferença estatística quando comparados com
o grupo controle.
em roedores.
Peso corporal (g)
40
85
Controle
Av-EtOH 100 mg/kg v.o.
Av-EtOH 400 mg/kg v.o.
35
30
25
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30
Dias
Figura 22. Dados de peso dos animais tratados com extrato etanólico bruto de
Anonna vepretorum (Av-EtOH 100 e 400 mg/kg, v.o) e solução salina 0,9% durante
30 dias (n= 10 por grupo).
5.3.3.1. Avaliação comportamental dos camundongos
Na avaliação comportamental foi observado piloereção, movimento intenso
das vibrissas, analgesia, resposta ao toque diminuído, respiração forçada e
diminuição da força para agarrar na dose de 400 mg/kg, comportamentos não
observados nos demais grupos.
5.3.3.2. Parâmetros hematológicos
É possível observar que os resultados dos parâmetros hematológicos
(eritrócitos, hemoglobina, hematócritos, concentração de hemoglobina corpuscular
média (CHCM), basófilos, eosinófilos, leucócitos, linfócitos, monócitos, neutrófilos e
plaquetas) após a administração de 100 mg/kg e 400 mg/kg v.o, de Av-EtOH não
apresentaram diferença significativa, exceto no volume corpuscular médio (VCM) e
em roedores.
86
hemoglobina corpuscular média (HCM) que apresentaram diferença estatística
(p<0,05) na dose de 400 mg/kg, cujo significado clínico deste aumento está sendo
investigado. Os resultados estão expressos na Tabela 4 abaixo.
Tabela 4. Parâmetros hematológicos do sangue de camundongos tratados com
extrato etanólico bruto de Anonna vepretorum (Av-EtOH 100 e 400 mg/kg, v.o) e
solução salina 0,9% durante 30 dias (n= 10 por grupo).
Parâmetros
Grupos
Controle
100 mg/kg
400 mg/kg
Eritrocitos(106/mm3)
8,72 ± 0,17
8,66 ± 0,16
9,03 ± 0,15
Hemoglobina (g/dL)
13,93 ± 0,23
13,68 ± 0,35
13,98 ± 0,20
Hematocrito (%)
41,90 ± 0,71
41,55 ± 1,20
41,94 ± 0,80
VCM (μ3)
48,00 ± 0,26
47,80 ± 0,72
46,40 ± 0,30*
HCM (μg)
15,99 ± 0,17
15,77 ± 0,19
15,50 ± 0,14*
CHCM (%)
33,23 ± 0,30
32,96 ± 0,26
33,47 ± 0,31
Basófilos (%)
40,00 ± 0,40
38,64 ± 0,24
35,13 ± 0,24
Eosinófilos (%)
0,26 ± 0,10
0,84 ± 0,33
0,30 ± 0,09
Leucócitos(103/mm3)
4,88 ± 1,02
6,86 ± 1,09
6,92 ± 0,92
Linfócitos (%)
82,55 ± 2,23
82,10 ± 0,88
84,24 ± 1,00
Monócitos(%)
2,70 ± 0,48
4,43 ± 0,51
3,42 ± 0,46
Neutrofilos (%)
14,10 ± 2,09
12,17 ± 0,60
11,61 ± 0,73
Plaquetas(103/mm3)
569,30 ± 41,57
608,70 ± 32,90
562,60 ± 30,78
Valores são expressos em média ± erro padrão da média. Teste t de Student
p< 0,05, comparado ao controle.
5.3.3.3. Parâmetros bioquímicos
Em relação aos parâmetros bioquímicos, os resultados não mostraram
diferenças significativas entre o grupo controle e o grupo experimental na dose de
100 mg/kg, v.o de Av-EtOH. O grupo de 400 mg/kg, v.o. apresentou diferença
em roedores.
87
estatística apenas nos valores dos triglicerídeos (p<0,05). Os resultados estão
expressos na Tabela 5 abaixo.
Tabela 5. Parâmetros bioquímicos obtidos do soro de camundongos tratados com
extrato etanólico bruto de Anonna vepretorum (Av-EtOH 100 e 400 mg/kg, v.o) e
solução salina 0,9% durante 30 dias (n= 10 por grupo).
Grupos
Parâmetros
Controle
100 mg/kg
400 mg/kg
Glicose (mg/dL)
198,30 ± 11,21
193,30 ± 11,11
173,00 ± 10,39
Colesterol (mg/dL)
93,13 ± 5,16
87,50 ± 3,66
112,60 ± 20,27
Triglicerídeos (mg/dL)
177,50 ± 9,25
189,80 ± 8,51
268,40 ± 33,34*
AST/TGO (U/L)
136,10 ± 76,71
197,00 ± 22,07
178,70 ± 32,42
ALT/TGP (U/L)
49,98 ± 10,14
58,26 ± 14,66
88,08 ± 33,37
Albumina (g/dL)
2,55 ± 0,36
2,23 ± 0,06
2,27 ± 0,22
Ureia (mg/dL)
60,25 ± 2,63
58,20 ± 2,44
55,30 ± 5,49
Creatinina(mg/dL)
0,96 ± 0,10
1,39 ± 0,37
1,03 ± 0,28
Valores são expressos em média ± erro padrão da média. Teste t de Student
p< 0,05, comparado ao controle.
5.3.3.4. Análise macroscópica e peso dos órgãos
Na análise macroscópica dos órgãos, apenas um animal tratado com Av-EtOH
400 mg/kg, apresentou o pulmão com aspecto mais pálido e enrijecido. Nos demais,
não houve alterações. Não houve diferença significativa nos pesos dos órgãos
quando comparados ao controle (Tabela 6).
em roedores.
88
Tabela 6. Peso dos órgãos de camundongos tratados com extrato etanólico bruto de
Anonna vepretorum (Av-EtOH 100 e 400 mg/kg, v.o) e solução salina 0,9% durante
30 dias (n= 10 por grupo).
Parâmetros
Grupos
Controle
Após 100 mg/kg
Após 400 mg/kg
Coração (g)
0,14 ± 0,01
0,13 ± 0,00
0,14 ± 0,01
Pulmão (g)
0,19 ± 0,01
0,19 ± 0,00
0,24 ± 0,03
Fígado (g)
1,36 ± 0,10
1,41 ± 0,06
1,44 ± 0,06
Estômago (g)
0,45 ± 0,03
0,42 ± 0,04
0,44 ± 0,03
Rim (g)
0,30 ± 0,02
0,37 ± 0,02
0,35 ± 0,02
Baço (g)
0,10 ± 0,00
0,11 ± 0,01
0,10 ± 0,00
Pâncreas (g)
0,16 ± 0,01
0,19 ± 0,01
0,21 ± 0,01
Ovário (g)
0,03 ± 0,00
0,06 ± 0,02
0,01 ± 0,00
Testículo (g)
0,13 ± 0,02
0,16 ± 0,00
0,17 ± 0,01
Valores são expressos em média ± erro padrão da média. Teste t de Student p<
0,05.
5.4. Resultados da atividade farmacológica do óleo essencial de Annona
vepretorum
5.4.1. Atividade antinociceptiva do óleo essencial de Annona vepretorum
5.4.1.1 Teste das contorções abdominais induzidas por ácido acético
Os resultados mostrados na Figura 23 demonstram que o pré-tratamento com
Av-OE (25, 50 e 100 mg/kg, v.o.) 1 h antes, foi capaz de inibir as contorções
induzidas por ácido acético quando comparados com grupo controle (p<0,05). As
porcentagens de inibição foram de 88,75%; 88,15% e 99,40%, respectivamente. Não
houve diferença estatística entre as doses de Av-EtOH quando comparadas entre si
(p>0,05). Indometacina e morfina apresentaram 91,26% e 100%, respectivamente,
de redução de contorções quando comparados com o controle.
em roedores.
Número de contorções
30
89
Controle
Av-EO 25 mg/kg
Av-EO 50 mg/kg
Av-EO 100 mg/kg
Morfina 10 mg/kg
20
10
*
*
0
*
*
*
Figura 23. Efeito antinociceptivo do óleo essencial de Annona vepretorum (Av-OE
25, 50 e 100 mg/kg), indometacina (20 mg/kg), morfina (10 mg/kg), no teste de
contorções abdominais. Valores são expressos em média ± erro padrão da média,
n = 6. * p < 0,05 significativamente diferente do grupo controle (ANOVA seguido pelo
teste de Tukey).
5.4.1.2 Teste da formalina
O tratamento com Av-OE nas doses de 25, 50 e 100 mg/kg (i.p.) produziu
uma atividade antinociceptiva significante comparada ao grupo controle em ambas
as fases (p<0,05) (Figura 24). Av-OE (25, 50 e 100 mg/kg, i.p.) reduziu em 39,83%;
25,50% e 20,50%, respectivamente, o tempo de lambida da pata na primeira fase,
bem como 92,8%; 82,00% e 91,00%, respectivamente, na segunda fase do teste da
formalina. As doses de Av-EtOH quando comparadas entre si, não houve diferença
estatística entre 50 mg/kg e 100 mg/kg (p>0,05) em ambas as fases.
As drogas de referência indometacina e morfina inibiram ambas as fases do
teste de formalina (p<0,05).
O pré-tratamento com a naloxona (1,5 mg/kg, i.p.) reverteu a atividade
antinociceptiva do extrato, na dose de 100 mg/kg e da morfina (10mg/kg) na primeira
fase do presente ensaio.
em roedores.
90
Primeira Fase
70
60
50
40
*
*
30
*
20
*
*
*
10
Controle
Av-OE 25 mg/kg
Av-OE 50 mg/kg
Av-OE 100 mg/kg
Morfina 10 mg/kg
Morf + Nal
Av-OE+ Nal
0
Segunda fase
125
100
*
75
*
50
*
25
0
*
*
*
*
Controle
Av-OE 25 mg/kg
Av-OE 50 mg/kg
Av-OE 100 mg/kg
Morfina 10 mg/kg
Morf + Nal
OE + Nal
25, 50 e 100 mg/kg), indometacina (20 mg/kg), morfina (10 mg/kg), Av-EtOH (100
mg/kg) + naloxona (NLX 1,5 mg/kg) e morfina (10 mg/kg) + naloxona (1,5 mg/kg) na
primeira e segunda fase do teste da formalina. Valores são expressos em média ±
erro padrão da média, n = 6. * p < 0,05 significativamente diferente do grupo controle
(ANOVA seguido pelo teste de Tukey).
5.4.1.3 Teste da placa quente
No teste da placa quente (Figura 25), os animais tratados com morfina
(10 mg/kg, i.p.) demonstraram um aumento evidente no tempo de latência em 30,
60, 90 e 120 min. O grupo tratado com Av-OE (50 mg/kg, i.p.) mostrou aumento no
tempo de latência em 30, 90 e 120 min, já o grupo tratado com Av-OE (100 mg/kg,
em roedores.
91
i.p.) mostrou aumento no tempo de latência em 60 e 90 min. O grupo tratado com
Av-OE (25 mg/kg, i.p.) não mostrou aumento significativo do tempo de latência.
Tempo de latência (s)
20
*
15
10
* *
*
30
60
*
**
* *
5
Controle
Av-OE 25 mg/kg
Av-OE 50 mg/kg
Av-OE 100 mg/kg
Morfina 10 mg/kg
Morfina + NLX
Av-OE + NLX
0
90
120
Tempo (min)
25, 50 e 100 mg/kg), morfina (10 mg/kg), Av-OE (100 mg/kg) + naloxona (NLX 1,5
mg/kg) e morfina (10 mg/kg) + naloxona (1,5 mg/kg) no teste da placa quente em 30,
60, 90 e 120 minutos após sua administração. Valores são expressos em média ±
erro padrão da média, n = 6. *p < 0,05 significativamente diferente do grupo controle
(ANOVA seguido pelo teste de Tukey).
5.4.2. Atividade anti-inflamatória do óleo essencial de Annona vepretorum
5.4.2.1 Migração de leucócitos na cavidade peritoneal
Av-OE (25, 50 e 100 mg/kg, v.o) administrado 1 h antes da injeção de
carragenina (1%, i.p., 0.25 mL) inibiu a migração de leucócitos (p<0,05) quando
comparado ao grupo controle (Figura 26). As doses de Av-OE quando comparadas
entre si, houve diferença estatística (p<0,05) entre as doses de 25 mg/kg e 50
mg/kg, bem como entre 25 mg/kg e 100 mg/kg; entretanto não houve diferença
estatística entre as doses de 50 mg/kg e 100 mg/kg.
A droga de referência dexametasona (2 mg/kg, i.p.) também promoveu
redução significante na migração de leucócitos (p< 0,05).
em roedores.
Leucócitos x 106 / ml
35
Control
Av-OE 25 mg/kg
Av-OE 50 mg/kg
Av-OE 100 mg/kg
Dexametasona 2 mg/kg
30
25
20
*
15
10
5
92
*
*
*
0
Figura 26. Efeito anti-inflamatório do óleo essencial de Annona vepretorum (Av-OE
25, 50 e 100 mg/kg) e morfina (10 mg/kg) no ensaio migração de leucócitos na
cavidade peritoneal. Valores são expressos em média ± erro padrão da média, n = 6.
* p<0,05 significativamente diferente do grupo controle (ANOVA seguido pelo teste
de Tukey).
6. DISCUSSÃO
em roedores.
94
6. DISCUSSÃO
Pela primeira vez na literatura, os dados reportados nesse estudo indicam
que o extrato etanólico bruto de Annona vepretorum (Av-EtOH), bem como o óleo
essencial das folhas dessa espécie (Av-OE), apresenta perfis de resposta
antinociceptiva e anti-inflamatória frente a diferentes modelos que utilizam estímulos
químicos e térmicos. Esse padrão de atividade provavelmente está relacionado com
a diversidade de constituintes químicos que foram identificados na análise
fitoquímica preliminar do extrato (Tabela 2) e na composição do óleo (Tabela 3).
Dentre
estes
constituintes,
as
atividades
farmacológicas
estão
correlacionadas à presença de flavonoides no extrato, que podem inibir certos
estágios da inflamação, incluindo a formação de granulação e aumento da
permeabilidade capilar observado no início do processo inflamatório. Além disso,
não produz ulcerogenicidade, efeito colateral observado nas drogas antiinflamatórias clássicas. No óleo essencial, há presença de sesquiterpenos que
exercem seus efeitos antiflogísticos por intervirem em mecanismos da reação
imunológica, como o sistema complemento (CARVALHO, 2004).
O teste de contorções abdominais induzidas por ácido acético tem sido
utilizado como um modelo clássico para avaliar o potencial antinociceptivo e antiinflamatório de novos agentes analgésicos e anti-inflamatórios (MOHAMAD et al.,
2010). De fato, esse ensaio configura-se como sendo um modelo não seletivo para
avaliação do efeito antinociceptivo de substâncias, extratos vegetais ou outros
produtos de origem natural. Isso porque a aplicação intraperitoneal de uma solução
de ácido acético induz à produção e/ou liberação de vários mediadores envolvidos
com o processo inflamatório e de neurotransmissão álgica, podendo ser citados:
substância P, bradicinina, prostaglandinas (em especial, PGI 2), citocinas próinflamatórias (IL-1, IL-6, IL-8 e TNF-α), entre outros. Por sua vez, esses
neurotransmissores acabam estimulando os nociceptores periféricos e os neurônios
sensitivos, possibilitando a transmissão do potencial de ação de uma célula para
outra, caracterizando a sensação dolorosa (LE BARS et al., 2001).
O extrato etanólico (Av-EtOH) reduziu significativamente o número de
contorções abdominais provocadas pela aplicação do ácido acético na região
intraperitoneal. Os resultados apresentados na figura 11 demonstraram que o grupo
controle apresentou 14,80 ± 2,08 contorções, 10 minutos após a aplicação do ácido
em roedores.
95
acético. Quando os animais foram previamente tratados com 25, 50 e 100 mg/kg de
Av-EtOH, o número de contorções foi reduzido de maneira estatisticamente
significante. Quando tratados com Av-OE (25, 50 e 100 mg/kg, i.p.) as porcentagens
de inibição foram de 88,75; 88,15 e 99,40%, respectivamente, sugerindo que AvEtOH e Av-OE provavelmente apresentem agentes antinociceptivos por esse ensaio
experimental.
O teste da formalina é um método de avaliação utilizado para mensurar a
efetividade comportamental de agentes antinociceptivos (HUNSKAAR; HOLE, 1987;
RANDOLPH, PETERS 1997). A vantagem desse método em relação aos outros é a
possibilidade de avaliar dois tipos diferentes de dor ao longo de um período
prolongado de tempo e, assim, permite avaliar agentes antinociceptivos com
diferentes mecanismos de ação (LE BARS et al., 2001; RANDOLPH, 1997). As
respostas comportamentais à formalina seguem um padrão bifásico composto de
uma fase inicial aguda (primeira fase) que dura alguns minutos e reflete o
componente neurogênico de nocicepção, sendo produzida principalmente pelo uso
de analgésicos opióides, e por um período mais prolongado (segunda fase), que
pode durar até cerca de uma hora. O período entre as fases é denominado intervalo
de quiescência (MARTINS et al., 2006). Substâncias que atuam eminentemente por
mecanismos centrais, como os analgésicos opioides, reduzem a nocicepção em
ambas as fases. Por outro lado, substâncias que atuam por mecanismos periféricos,
como os anti-inflamatórios não esteroidais, reduzem em geral a nocicepção durante
a segunda fase do teste. Sendo assim, Av-EtOH e Av-OE foram capazes de diminuir
a nocicepção em ambas as fases no teste da formalina, embora esse efeito tenha
sido mais proeminente na segunda fase do teste.
Com o intuito de comprovar o envolvimento de mecanismos centrais no efeito
antinociceptivo de Av-EtOH e Av-OE, o teste da placa quente foi realizado. Assim,
analisando os resultados apresentados nas figuras 12 e 24, foi observado que AvEtOH (25 e 100 mg/kg, v.o.) e Av-OE (50 e 100 mg/kg, i.p.) aumentaram o tempo de
permanência dos animais sobre a placa metálica previamente aquecida, fornecendo
evidências de ação central, uma vez que esse padrão de resposta trata-se de um
reflexo predominantemente espinal, sendo considerado, portanto, um modelo de
avaliação da ação central de drogas analgésicas (NEMIROVSKY et al., 2001). Este
teste associa a estimulação térmica com a neurotransmissão central, em que o calor
fornecido desencadeia a ativação dos nociceptores (fibras Aδ e C) pela condução do
em roedores.
96
impulso ao longo do corno dorsal da medula espinhal e, posteriormente, aos centros
corticais (PINHEIRO et al., 2011).
O teste de retirada da cauda foi realizado com Av-EtOH. Este, quando
administrado na dose de 50 mg/kg (p.o.) promoveu um aumento significativo do
tempo de reação ao estímulo térmico, em comparação com o grupo controle, nos
tempos de 30 e 60 minutos. Por envolver estímulo térmico, um aumento no tempo
de reação durante o teste é considerado um parâmetro para avaliar a atividade
antinociceptiva central (RUJJANAWATE et al., 2003). Portanto, a ponta da cauda é
caracterizada como sendo uma região de nocicepção aguda e não inflamatória.
Substâncias que agem em nível central, como a morfina, são capazes de suprimir
respostas dos neurônios da coluna vertebral ao estímulo térmico nocivo na cauda,
aumentando o tempo de latência (FISCHER et al., 2008).
Para confirmar o envolvimento de receptores opioides no efeito do extrato e
do óleo essencial, a naloxona (1,5 mg/kg, i.p.) foi administrada 15 minutos antes da
administração de Av-EtOH e Av-OE (100 mg/kg) e morfina (10 mg/kg), sendo o
efeito da morfina e Av-EtOH revertido na primeira fase do teste da formalina,
enquanto o efeito de Av-OE foi revertido parcialmente na primeira fase deste teste.
No teste de placa quente, o efeito da morfina, Av-EtOH e Av-OE foram revertidos. A
naloxona é um antagonista não seletivo de receptores opioides. Dessa forma,
sugere-se que o efeito antinociceptivo do extrato e do óleo pode estar sendo
mediado pela ativação desses receptores.
Ainda investigando o efeito antinociceptivo do extrato, foi realizado o modelo
de dor orofacial, termo definido pela Academia Americana de Dor Orofacial como
condições de dor que estão associadas com os tecidos duros e moles da cabeça,
face, pescoço, e todas as estruturas intra-orais. A sensação de dor orofacial das
estruturas intra-orais e da cabeça e face é transmitida para o sistema nervoso
centra, pelo nervo trigêmeo (FAN et al., 2012). Dessa forma, o modelo de dor
orofacial induzido por formalina, capsaicina e glutamato é ferramenta útil para o
estudo dos processos nociceptivos na região trigeminal (RABOISSON; DALLEL,
2004).
O uso de formalina na região orofacial (lábio superior direito) induz uma
resposta nociceptiva bifásica (LUCCARINI et al., 2006). A primeira fase ou aguda (05 min) corresponde à ativação direta dos nociceptores, predominatemente fibras do
tipo C, liberando neuropeptídeos como a substância P, bradicinina e glutamato
em roedores.
97
(SHIBATA et al., 1989, TJOLSEN et al., 1992). A segunda fase, inflamatória (15-30
min) é caracterizada pela sensiblização central dos nociceptores e neurônios de
segunda ordem e liberação de óxido nítrico, aminoácidos excitatórios (glutamato e
aspartato), prostaciclinas e prostaglandinas (PGE2), e leucotrienos, que mais tarde
irão estimular a medula espinhal (HENRY et al., 1999, BONJARDIM et al., 2011). A
primeira e segunda fase são inibidas por drogas de ação central, como opiáceos,
enquanto a segunda fase deveria ser inibida também por fármacos anti-inflamatórios
não-esteroidais, os quais não são eficazes na inibição dos mediadores inflamatórios,
como leucotrienos, na dor orofacial (LINDENMEYER et al., 2010).
Os resultados do presente estudo mostraram que AV-EtOH reduziu o tempo
de fricção com as patas posteriores e/ou anteriores na área injetada em ambas as
fases, sugerindo que o extrato tem atividade antinociceptiva central e periférica, de
forma semelhante à morfina, droga padrão utilizada neste modelo. Para confirmar o
envolvimento de receptores opioides nesse efeito, a naloxona também foi utilizada,
revertendo parcialmente a atividade antinociceptiva do extrato na dose de 100 mg/kg
na primeira fase do presente ensaio, enquanto o efeito da morfina (10 mg/kg) foi
revertido pela naloxona em ambas as fases.
Como os receptores vaniloides (TRPV1) também estão envolvidos na
nocicepção orofacial, contribuindo na integração e detecção dos estímulos térmicos
e químicos nos neurônios sensoriais periféricos, tais como fibras do tipo C e Aδ
(CATERINA; JULIUS, 2001), o modelo de dor orofacial induzida por capsaicina foi
utilizado.
A capsaicina, responsável pela característica picante da pimenta, se
assemelha a sensação de calor excitando seletivamente terminações nervosas
nociceptivas, causando intensa dor se injetada (CATERINA; JULIUS, 2001, RANG et
al., 2012). Com a ativação de TRPV1 pela capsaicina há um influxo de Ca2+ (VOGTEISELE et al., 2007) e liberação de neuropeptídeos, tais como taquicininas,
substância P, calcitonina, aminoácidos excitatórios (glutamato e aspartato), óxido
nítrico e outras substâncias pró-inflamatórias a partir de terminais periféricos para
transferir o estímulo doloroso através do nervo trigêmeo (HONDA et al, 2008).
Av-EtOH foi capaz de reduzir o efeito nociceptivo da capsaicina, sugerindo
sua ação antagonista dos receptores vaniloides.
A nocicepção orofacial ainda foi induzida por glutamato, um aminoácido
excitatório encontrado tanto nos terminais centrais e periféricos do trigêmeo, como
em roedores.
98
também nos neurônios do gânglio da raiz dorsal (QUINTANS-JUNIOR et al., 2010).
O glutamato é liberado a partir de fibras aferentes sensibilizadas pelo nervo ou lesão
do tecido ou pela resposta a estímulos nocivos (LAM et al., 2005). Os principais
mecanismos utilizados pelos agonistas dos receptores de glutamato para provocar
dor incluem a liberação intracelular de Ca 2+, a ativação de mediadores celulares, e a
abertura de canais iônicos (MILLAN et al., 1999). Além disso, o glutamato
combinado com outros mediadores e citocinas pró-inflamatórias (TNF-α e IL-1β)
atuam sinergicamente na excitabilidade neuronal (MILLAN, 1999;. BERNARDINO et
al., 2005). Os resultados do presente estudo mostraram que Av-EtOH inibiu a
nocicepção causada pelo glutamato.
O efeito antinociceptivo de Av-EtOH observado na segunda fase do teste da
formalina (nocicepção inflamatória) e no teste de dor orofacial induzida por formalina
tornou-se um indicativo de que Av-EtOH pode produzir efeito antinociceptivo através
de mecanismos periféricos, possivelmente por meio da inibição da síntese ou
liberação de prostaglandinas, mediado pela inibição da cicloxigenase (COX), ou por
outra via inflamatória. Para confirmar a possível atividade anti-inflamatória de AvEtOH, foram realizados os modelos de edema da pata induzido por carragenina e
histamina e o teste de peritonite induzida por carragenina. O óleo essencial também
apresentou efeito na segunda fase do teste da formalina, para confirmação da sua
possível atividade anti-inflamatória foi realizado o teste de peritonite.
O teste de edema de pata induzido por carragenina é um modelo
experimental amplamente utilizado para triagem de substâncias ou extratos vegetais
de caráter anti-inflamatório e tem sido frequentemente utilizado para avaliar o efeito
antiedematogênico de produtos naturais, como plantas medicinais, exibindo um
elevado grau de reprodutibilidade (THOMAZZI et al., 2010).
A formação do edema produzido pela administração intraplantar da
carragenina é um evento bifásico, que é avaliado durante 1-5 horas. A primeira fase
(1 ou 1,5 horas) é predominantemente caracterizada pela formação de um edema
não fagocítico, enquanto que a segunda fase (2-5 horas) é caracterizada por um
aumento da formação do edema, que permanece por até 5 horas (KHAN et al.,
2009). Av-EtOH administrado 1 h antes da injeção de carragenina, inibiu
significativamente o edema em 1 e 2 h, ou seja, na fase inicial do teste. Esta fase
normalmente é ocasionada pela ação de mediadores pró-inflamatórios, tais como
histamina, serotonina e bradicinina, sobre a permeabilidade vascular (ZHU et al.,
em roedores.
99
2011), que é subsequentemente mantida pela liberação de prostaglandinas e de
óxido nítrico (segunda fase), com pico máximo no tempo de 3 horas. Para confirmar
a ação anti-inflamatória, também foi induzido o edema de pata por histamina na fase
inicial do teste. Os resultados mostraram que o edema induzido por histamina foi
significativamente reduzido pela administração de Av-EtOH.
A resposta inflamatória induzida por carragenina tem sido associada à
infiltração de neutrófilos (DAWSON et al., 1991). O estudo histológico mostrou a
presença de infiltrado com edema subcutâneo, inclusive nos grupos tratados com
Av-EtOH, porém, estes sinais foram menos intensos quando comparados ao
controle. Esta infiltração de neutrófilos provavelmente tenha ocorrido entre 2-5
horas, onde o efeito do extrato não foi significativo.
Para melhor caracterizar o efeito anti-inflamatório de Av-EtOH, foi realizado o
teste de peritonite induzida por carragenina, que objetiva investigar a migração dos
leucócitos para a cavidade peritoneal. A inflamação produzida por este modelo é
lenta e prolongada, o que torna possível avaliar a saída de líquido intersticial, bem
como migração de células, além da presença de citocinas, enzimas e mediadores
químicos, tal como o NO, PGE2, IL-1β, IL-6 e TNF-α, utilizando diferentes agentes
flogísticos (LORAM et al., 2007). Estes mediadores são capazes de recrutar
leucócitos, tais como neutrófilos, em vários modelos experimentais.
Sendo assim, Av-EtOH e Av-OE inibiram a migração de leucócitos. Esse
efeito provavelmente se dá pelo envolvimento de mecanismos de inibição da síntese
de mediadores inflamatórios, cujo envolvimento na migração celular está bem
estabelecido.
Embora seja amplo o uso de plantas medicinais para o tratamento de várias
doenças, pouco é conhecido sobre a toxicidade e segurança (JOTHY et al., 2011).
Para determinar a segurança dos medicamentos e dos produtos vegetais para uso
humano, a avaliação toxicológica é realizada em vários modelos experimentais para
prever a toxicidade e fornecer diretrizes para a seleção de uma dose segura. A
maior concordância geral de toxicidade em animais, com o ser humano, são
alterações hematológicas, gastrointestinais e cardiovasculares (OLSON et al., 2000).
O presente estudo mostra que o extrato etanólico bruto de Annona
vepretorum administrado por via oral na dose de 100 mg/kg durante 30 dias não
provocou sinais de toxicidade nos animais, enquanto na dose de 400 mg/kg houve
pequenas alterações de comportamento, nos parâmetros hematológicos e
em roedores.
100
bioquímicos. Ambas as doses não ocasionaram mortes após os 30 dias de
tratamento, indicando baixa toxicidade do extrato.
Uma vez que as alterações no peso corporal têm sido utilizadas como um
indicador de efeitos adversos de fármacos e produtos químicos (TOFOVIC,
JACKSON, 1999; RAZA et al., 2002, TEO et al., 2002), todos os dias foi realizada a
verificação do peso corporal, não havendo diferença estatística quando comparados
com o grupo controle. Além disso, não houve alterações significativas no consumo
de água e ração nos grupos tratados quando comparados ao controle.
Nos ensaios de toxicidade também são observados os efeitos sobre o
comportamento, tais como: agressividade, ambulação aumentada, contorções
abdominais,
convulsões,
estereotipia,
movimentação
intensa
das
vibrissas,
piloereção, defecação, paralisia das patas dianteiras, analgesia, tremores, catatonia,
ptose palpebral, resposta ao toque diminuída e sedação, como possíveis sinais de
toxicidade (ALMEIDA, 2006). No presente estudo foi observado piloereção,
movimento intenso das vibrissas, analgesia, resposta ao toque diminuída, respiração
forçada e diminuição da força para agarrar, comportamentos não observados nos
demais grupos.
O sistema hematopoiético é um dos sistemas mais sensíveis para avaliar a
toxicidade das drogas em seres humanos e animais (RAHMAN et al., 2001). É
possível observar que os resultados dos parâmetros hematológicos (eritrócitos,
hemoglobina, hematócritos, CHCM, basófilos, eosinófilos, leucócitos, linfócitos,
monócitos, neutrófilos e plaquetas) após a administração de Av-EtOH não
apresentaram variação significativa, exceto no volume corpuscular médio e
hemoglobina corpuscular média que apresentou diferença estatística, cujo
significado clínico deste aumento está sendo investigado.
Em relação aos parâmetros bioquímicos, os resultados não mostraram
diferenças significativas em relação ao grupo controle e o grupo experimental na
dose de Av-EtOH. O grupo de 400 mg/kg, v.o. apresentou diferença estatística
apenas nos valores dos triglicerídeos (p < 0,05). Porém, embora a alteração nos
níveis de ALT e AST não tenham sido estatisticamente significativas nos grupos
tratados, esse perfil de resposta pode ser fisiologicamente relevante. Esses
parâmetros são importantes, visto que os resultados elevados de ALT e AST no
sangue indicam alterações nas funções hepáticas, sendo a concentração de ALT
alta do soro o primeiro sinal de lesões no fígado (HILALY et al., 2004). A creatinina é
em roedores.
101
conhecida como um bom indicador da função renal, seu aumento significa que há
dano nos néfrons (LAMEIRE et al., 2005).
Na análise macroscópica dos órgãos, apenas um animal tratado com AvEtOH, apresentou o pulmão com aspecto mais pálido e enrijecido. Não houve
diferença significativa nos pesos dos órgãos quando comprados ao controle.
Sendo assim, o estudo de toxicidade subcrônica indica baixa toxicidade do
extrato etanólico bruto de Annona vepretorum, porém, estudos posteriores com
diferentes metodologias são necessários para determinar um melhor perfil de
segurança desse extrato.
102
7. CONCLUSÕES
em roedores.
103
7. CONCLUSÕES
Diante dos resultados obtidos no presente estudo, pode-se concluir que o
extrato etanólico bruto e o óleo essencial obtidos das folhas de Annona vepretorum
apresentaram efeitos antinociceptivo e anti-inflamatório relevantes. Av-EtOH
demonstrou efeito antinociceptivo envolvendo mecanismos centrais e periféricos,
provavelmente relacionados aos receptores opioides. Além disso, a redução da
migração leucocitária provocada pela administração de Av-EtOH comprova o efeito
anti-inflamatório dessa espécie, onde este efeito pode também estar envolvido com
mecanismos que inibem a síntese ou liberação de mediadores pró-inflamatórios. AvOE também demonstrou esse padrão de resposta.
No que diz respeito à investigação do potencial antinociceptivo de Av-EtOH
em modelos de dor orofacial, a espécie em estudo mostrou-se promissora, uma vez
que apresentou efeito significativo em todos os testes realizados, especialmente no
modelo de nocicepção orofacial induzida por capsaicina. Esses resultados
demonstram que Av-EtOH pode estar atuando através de receptores opioides, via
glutamatérgica e, principalmente, sobre receptores vaniloides.
Em relação ao perfil de segurança de A. vepretorum, pode-se observar
que Av-EtOH não foi capaz de provocar mortes nos animais submetidos ao ensaio
de toxicidade subcrônica. Além disso, apenas algumas alterações hematológicas e
bioquímicas foram verificadas ao final do estudo, sendo que a importância clínica
dessas alterações ainda está sendo investigada. Dessa forma, essa espécie pode
ser considerada, a priori, de baixa toxicidade, o que respalda a continuidade de
estudos farmacológicos, toxicológicos e fitoquímicos.
Todos os resultados apresentados nesse trabalho são inéditos para a espécie
em estudo, destacando-se a contribuição do mesmo para o estudo farmacológico e
toxicológico de plantas do bioma caatinga, em especial às espécies da família
Annonaceae. Além disso, os resultados apresentados nesse estudo corroboram com
a utilização da espécie na medicina popular, estimulando o desenvolvimento de
novas pesquisas com valor tecnológico agregado, objetivando o desenvolvimento de
produtos tecnologicamente obtidos e elaborados para utilização na prática clínica.
104
REFERÊNCIAS
em roedores.
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129
APÊNDICES
130
APENDICE A – Artigo I
Artigo I:
MODELOS EXPERIMENTAIS PARA AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE
ANTINOCICEPTIVA DE PRODUTOS NATURAIS: UMA REVISÃO
131
RESUMO
O interesse em investigar plantas com atividade analgésica reside no fato de que as
mesmas têm uma vasta aplicação em vários processos patológicos. Devido à baixa
eficácia e expressivos efeitos adversos apresentados pela maioria dos fármacos
disponíveis no mercado farmacêutico para este fim, surge o grande interesse dos
pesquisadores na descoberta de novos protótipos de fármacos provenientes de
plantas da flora brasileira. Vários modelos in vivo são utilizados na pesquisa de
compostos com atividade analgésica. Várias das técnicas descritas, utilizadas para
um screening da atividade antinociceptiva são gerais e independem do composto a
ser ensaiado. O objetivo desta revisão é apresentar os fundamentos dos principais
métodos de avaliação da atividade antinociceptiva de uma substância ou extrato
vegetal. A pesquisa foi realizada nas bases de dados PubMed, Scopus, Web of
Science e Science Direct, usando diferentes combinações das seguintes palavras
chave:
experimental
models,
pain,
medicinal
plants,
natural
products
e
antinociceptive activity. Apesar de, na maioria das vezes, não se chegar ao
132
mecanismo de ação definitivo da substância ou extrato da planta em estudo, esses
modelos experimentais são de grande importância e representam o ponto de partida
para a caracterização farmacológica de novos compostos capazes de interferir com
o curso da dor.
PALAVRAS-CHAVE: Plantas medicinais, Dor, Nocicepção, Modelos experimentais,
Revisão.
ABSTRACT
The interest in investigating plants with analgesic activity resides in the fact that they
have a wide application in various pathological processes. Because of low efficacy
and significant side effects produced by the majority of drugs available on the
pharmaceutical market for this purpose, there is the great interest of researchers in
discovering new prototype drugs from plants of the Brazilian flora. Several in vivo
models are used in the search for compounds with analgesic activity. Several of the
techniques described, used for a screening of antinociceptive activity are general and
independent of the compound being tested. The aim of this review is to present the
fundamentals of the main methods for assessing the antinociceptive activity of a
substance or plant extracts. This literature search was performed through specialized
search databases PubMed, Scopus, Web of Science and Science Direct using
different combinations of the following keywords: experimental models, pain,
medicinal plants, natural products and antinociceptive activity. Although in most
cases not reach the definitive mechanism of action of the substance or plant extract
under study, these experimental models is of great importance and represents the
133
starting point for the pharmacological characterization of new compounds capable of
interfering with the course of pain.
KEYWORDS: Medicinal plants, Pain, Nociception, Experimental models, Review.
INTRODUÇÃO
A dor crônica é um sério problema de saúde pública, não somente em termos
do sofrimento humano, mas também por causa de seu grande impacto
socioeconômico. A prevalência da dor crônica pode variar de 12 a 55% da
população. Essas variações são atribuídas a diferentes definições de dor crônica, o
tipo de população estudada e a metodologia usada na pesquisa (Vieira et al., 2012).
Quando se trata de fármacos para o tratamento da dor, abre-se uma lacuna
no que diz respeito ao regime medicamentoso que pode ser estabelecido, tendo em
vista que ainda não dispomos de um fármaco analgésico e/ou antiinflamatório ideal,
ou seja, que não promovam efeitos colaterais potenciais. Embora sejam altamente
eficazes, os analgésicos de ação central geralmente não estão dissociados de
efeitos adversos importantes. Adicionalmente, os analgésicos de ação periférica
também apresentam efeitos indesejáveis, tais como lesões do trato gastrointestinal e
renal (Rang et al., 2012). Assim, tem-se a necessidade de buscar medidas
alternativas para o desenvolvimento de medicamentos para o combate da dor.
Nessa perspectiva, os produtos naturais encaixam-se como uma fonte promissora
na pesquisa de moléculas com potencial atividade analgésica.
Há um crescente interesse mundial por produtos derivados da biodiversidade
e, nesse aspecto, o Brasil é privilegiado, sendo detentor de grande diversidade
134
biológica, com inúmeras espécies vegetais com potencial medicinal (Dutra, 2009).
Esse cenário favorece a pesquisa e o desenvolvimento de fitoterápicos no país. Um
grande avanço nesse sentido é a Portaria do Ministério da Saúde de nº 971 de 03 de
maio de 2006, que aprova a Política Nacional de Práticas Integrativas e
Complementares (PNPIC) no Sistema Único de Saúde (SUS). Essa política traz em
suas diretrizes a elaboração da Relação Nacional de Plantas Medicinais de
Interesse ao SUS (RENISUS). Ainda em 2006, o Decreto Federal de nº 5.813 de 22
de junho de 2006 instituiu a Política Nacional de Plantas Medicinais e Fitoterápicos,
que incentiva as pesquisas e dá diretrizes para implantação de serviços em caráter
nacional pelas Secretarias de Saúde dos Estados, Distrito Federal e dos Municípios
(Brasil, 2006).
Considerando a ascensão da fitoterapia no Brasil nas últimas décadas e a
necessidade da busca de moléculas com atividade analgésica que garantam uma
terapia eficaz e segura para o tratamento da dor, o objetivo deste trabalho foi
demonstrar, através de uma revisão bibliográfica, os mecanismos envolvidos com o
processo da dor, bem como os ensaios experimentais comumente empregados para
avaliação da atividade antinociceptiva de produtos naturais.
Mecanismos Fisiopatológicos da Dor
De acordo com a Associação Internacional para o Estudo da Dor (IASP), o
termo dor conceitua-se como uma experiência sensorial e emocional desagradável,
relacionado à lesão tecidual real ou potencial, ou descritas em termos desse tipo de
dano. Assim, a dor caracteriza-se como uma experiência complexa que envolve
além de transdução de estímulos nocivos ambientais, o processamento emocional
135
pelo cérebro (Julius & Basbaum, 2001). É uma consequência fisiopatológica de
diversas morbidades e de suas repercussões, mas que na maioria das vezes
configura-se como uma função protetora, representando, em muitos casos, o único
sintoma para o diagnóstico de várias doenças (Oliveira et al., 2009).
Diferente de nocicepção, a dor é mais que uma sensação, é uma experiência,
podendo incorporar componentes sensoriais com influências pessoais e ambientais
importantes. Enquanto isso, o termo nocicepção refere-se ao estímulo doloroso
propriamente dito, sem levar em consideração o componente emocional, ou seja,
engloba as vias neuroanatômicas, bem como os mecanismos neurológicos e os
receptores específicos que detectam o estímulo lesivo. Sendo assim, uma vez que
os animais não são capazes de expressar verbalmente os componentes subjetivos
da dor, neles não se avalia dor, e sim nocicepção. Logo, termos como dor e
analgesia são empregados para estudos em humanos, enquanto que nocicepção e
antinocicepção são mais utilizados para estudos pré-clínicos, envolvendo animais de
laboratório (Kandel et al., 2003).
A dor pode ser classificada de acordo com o tipo de lesão e com os
mediadores envolvidos, recebendo as seguintes denominações: neurogênica,
quando ocorre lesão do tecido neuronal; neuropática, quando ocorre a disfunção de
um nervo; psicogênica, que ocorre por fatores psicológicos; ou nociceptiva, quando
ocorre por estimulação excessiva dos nociceptores. Em termos de duração, um
episódio de dor pode ser agudo ou crônico. A dor aguda corresponde à ativação
local de nociceptores induzida por um dano tecidual, sendo que a dor desaparece
até mesmo antes do restabelecimento do tecido lesado. Já a dor crônica provocada
por uma lesão tecidual ou doença, geralmente ultrapassa o tempo de recuperação
136
do organismo, sendo um importante fator de incapacidade e sofrimento (Millan,
2002).
Os nociceptores são terminações nervosas livres, não especializadas, que
respondem a estímulos nociceptivos, detectando, desse modo, lesão nos tecidos,
onde os estímulos desencadeantes podem ser mecânicos, térmicos ou químicos
(Millan, 2002). Assim, o potencial antinociceptivo de um produto natural, por
exemplo, pode ser medido pelo seu poder de aumentar o limiar de excitação dessas
terminações nervosas ao estímulo doloroso, ou então, fazer com que os
nociceptores não percebam ou não respondam ao estímulo doloroso promovido.
Na percepção da dor, os neurônios aferentes primários que participam da
transmissão da sensação dolorosa envolvem fibras intensamente mielinizadas, de
maior diâmetro (10 µm) e que apresentam maior velocidade de condução (30-100
m/s), caracterizadas como fibras Aβ. Entretanto, a maioria dos nociceptores está
inclusa nas fibras de pequeno (0,4-1,2 µm) e médio diâmetro (2-6 µm), que
constituem respectivamente as fibras C, não mielinizadas, e as fibras Aδ, pouco
mielinizadas (Julius & Basbaum, 2001).
O principal neurotransmissor excitatório em todos os nociceptores é o
glutamato, embora as fibras sejam também sensibilizadas por outras substâncias
químicas endógenas liberadas no ambiente tecidual em condições anormais. Dentre
elas destacam-se a acetilcolina, bradicinina, histamina, serotonina, leucotrienos,
substância P, neuropeptídeo Y, purinas, íons K +, prostaglandinas, tromboxano,
citocinas (interleucinas e TNF-α) e prótons (H+). Neste sentido, grande parte da
ativação das fibras nociceptivas se dá por receptores específicos acoplados à
cascata de segundos mensageiros intracelulares e canais iônicos (Luiz, 2007).
137
Considerando o envolvimento de diferentes vias de sinalização no processo
da dor, faz-se necessário a utilização de modelos experimentais que diferenciem
uma possível atividade antinociceptiva de um produto natural por mecanismos
centrais, envolvendo mediadores imediatos; ou por mecanismos periféricos,
envolvendo mediadores produzidos mais tardiamente, principalmente aqueles que
são liberados durante o processo inflamatório.
METODOLOGIA
A pesquisa bibliográfica foi realizada em agosto de 2012 através de consultas
a artigos científicos publicados em periódicos especializados na área de produtos
naturais. Esta pesquisa na literatura foi realizada nas bases de dados PubMed,
Scopus, Web of Science e Science Direct, usando diferentes combinações das
seguintes palavras chave: experimental models, pain, medicinal plants, natural
products e antinociceptive activity. Para a elaboração deste artigo, as referências
encontradas na pesquisa foram estudadas em detalhe.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Nesta seção nós apresentamos algumas considerações sobre os principais
métodos utilizados para avaliação da atividade antinociceptiva de produtos naturais,
seus fundamentos, vantagens e desvantagens de cada método. Para detalhes dos
modelos experimentais mais utilizados, as referências originais devem ser
consultadas. Abaixo, são apresentados os principais modelos experimentais
estudados: contorções abdominais induzidas por ácido acético, teste da formalina,
138
teste de Randall-Selitto, teste de Von Frey, dor orofacial induzida pela formalina,
teste da placa quente e teste de retirada da cauda.
Contorções abdominais induzidas por ácido acético
O teste de contorções abdominais é um modelo químico de nocicepção que
se baseia na contagem das contorções da parede abdominal seguidas de torção do
tronco e extensão dos membros posteriores, como resposta reflexa à irritação
peritoneal e à peritonite produzidas pela injeção intraperitoneal de uma solução de
ácido acético 0,9% (Whittle, 1964).
Este teste é sensível à avaliação de drogas analgésicas, no entanto, pode ser
visto como um modelo geral, não seletivo, para estudos de drogas antinociceptivas
(Couto et al., 2011). Uma vez que o ácido acético induz indiretamente a liberação de
mediadores endógenos, tais como bradicinina, serotonina e capsaicina, estimulando
neurônios periféricos, representados principalmente por fibras C, que são sensíveis
aos mediadores inflamatórios (Deraedt et al., 1980; Marchioro et al., 2005).
A liberação de prostaglandina via ação da ciclooxigenase sobre o ácido
araquidônico também está envolvida. O grupo de pesquisa de Deraedt et al. (1980)
descreveu a quantificação de prostaglandinas por radioimunoensaio no exsudato
peritoneal, obtidos após injeção intraperitoneal de ácido acético, observando-se altos
níveis de prostaglandinas PGE2 e PGF2 durante os primeiros 30 minutos após sua
administração.
139
Teste da formalina
O teste da formalina é um método de avaliação comportamental utilizado para
medir a efetividade de agentes antinociceptivos (Hunskaar & Hole, 1987; Randolph,
1997). Este modelo de dor está associada à lesão tecidual, no qual se quantifica a
resposta comportamental provocada pela injeção subcutânea de formalina diluída na
pata traseira do animal (Dubuisson & Dennis, 1977; Martins et al., 2006).
A vantagem deste teste sobre outros métodos de nocicepção é a
possibilidade de avaliar dois tipos diferentes de dor ao longo de um período
prolongado de tempo e, assim, permite o teste de analgésicos com diferentes
mecanismos de ação (Randolph, 1997).
As respostas comportamentais à formalina seguem um padrão bifásico
composto de uma fase inicial aguda (primeira fase), e por um período mais
prolongado (segunda fase) de atividade comportamental aumentada, que pode durar
até cerca de uma hora. O período entre as fases é denominado intervalo de
quiescência (Dubuisson & Dennis, 1977, Martins et al., 2006).
A primeira fase inicia-se imediatamente após a injeção de formalina e se
estende pelos primeiros 5 minutos (dor neurogênica ou aguda), estando relacionada
com a estimulação química direta dos nociceptores das fibras aferentes do tipo C e,
em parte, das fibras do tipo Aδ e está associada à liberação de aminoácidos
excitatórios, óxido nítrico e substância P. A segunda fase ocorre entre 15 e 30
minutos após a injeção de formalina e está relacionada com a liberação de vários
mediadores pró-inflamatórios, como bradicinina, prostaglandinas e serotonina, entre
outros. O intervalo de quiescência entre a primeira e a segunda fase é resultado de
140
uma inibição da transmissão nociceptiva através de circuitos supra-espinhais e
espinhais (Hunskaar & Hole, 1987).
Teste de Randall-Selitto
O modelo experimental desenvolvido por Randall & Selitto (1957) é um
método para avaliação da hipernocicepção bastante utilizado, que se fundamenta na
indução de hiperalgesia através de pressão crescente na pata do animal. Este teste
é baseado no princípio de que a inflamação diminui o limiar de reação à dor e que
essa redução pode ser modificada por analgésicos narcóticos e não-narcóticos.
Neste ensaio experimental, um agente flogístico é injetado no tecido
subplantar de uma das patas traseiras, e é medido o tempo de latência da retirada
da pata a partir da pressão exercida. O reflexo de retirada da pata é considerado
representativo do limiar hipernociceptivo, ou seja, a força necessária aplicada à pata
para que induza uma resposta aversiva a um estímulo nocivo (Limiar Nociceptivo de
Retirada da Pata - LNRP). A força necessária para que esse animal exiba tal
resposta é registrada em gramas. O LNRP é avaliado antes e após a administração
dos estímulos hiperalgésicos ou inflamatórios, que variam de acordo com o
experimento (Randall & Selitto, 1957).
Teste de von Frey
O uso de filamentos de von Frey é um método utilizado para avaliar a
sensibilidade tecidual ao estímulo mecânico, sendo bastante utilizado clinicamente.
Entretanto, tal método passou a ser utilizado também para experimentos
laboratoriais, no sentido de avaliar a influência de drogas sobre a sensibilidade
nociceptiva em animais. Além disso, essa técnica foi transformada em um método
141
eletrônico,
usado
primeiramente
em
humanos
(Jensen
et
al.,
1986),
e
posteriormente em ratos e camundongos (Cunha et al., 2004).
Os experimentos são realizados com um anestesiômetro eletrônico, que
consiste em um transdutor de pressão adaptado a um contador digital de força
expressa em gramas (g). O contato do transdutor de pressão com a pata é realizado
através de uma ponta descartável de polipropileno. Os animais são colocados em
caixas de acrílico durante 15-30 minutos para adaptação. O assoalho da caixa é
feito de arame não maleável na forma de rede. As alterações nos limiares
nociceptivos são avaliadas exercendo-se uma pressão linearmente crescente no
centro da planta da pata do animal até a produção de uma resposta caracterizada
como sacudida (flinches) da pata estimulada. Os estímulos são repetidos por até
seis vezes, em geral até o animal apresentar três medidas similares com uma clara
resposta de flinch após a retirada da pata. A intensidade de hipernocicepção é
quantificada como a variação na pressão obtida subtraindo-se a média de três
valores
expressos em gramas
(força)
observada
antes
do
procedimento
experimental (0 hora) da média de três valores em gramas (força) após a
administração dos estímulos, que variam de acordo com o experimento (Jensen et
al., 1986).
Os modelos experimentais baseados em testes mecânicos permitem a
avaliação do aumento da sensibilidade do nociceptor a estímulos inócuos (alodinia)
ou nocivos (hiperalgesia). Porém, além de estímulo de nociceptores de fibras Aδ e
nociceptores de fibras C, também podem ser ativados mecanorreceptores,
resultando em estímulos inespecíficos que nem sempre refletem a neurofisiologia da
nocicepção. Particularmente, o teste de von Frey, é usado para avaliar através do
142
estímulo mecânico inócuo e crescente (alodinia mecânica) a sensibilidade tecidual
provocada pela incisão (Le Bars et al., 2001).
Dor orofacial induzida por formalina
A região orofacial é uma área densamente ocupada pelo nervo trigêmeo e,
muitas vezes, é sítio frequente de dores referida e crônica. Alterações clínicas no
território trigeminal, como aumento de sensibilidade cutânea e hiperalgesia,
observadas em cefaleias primárias e dores orofaciais em geral, são muito sugestivas
de anormalidades no sistema nociceptivo trigeminal. (Perla, 2007).
Entre os modelos nociceptivos experimentais de dores orofacial e cefálicas, o
teste da formalina é um dos mais relevantes em termos de aplicabilidade
experimental e clínica, quando se estuda dores agudas (Perla, 2007). Ele avalia a
nocicepção trigeminal por meio da aplicação de estímulo químico (administração
subcutânea de uma solução de formalina) na região orofacial. Este modelo constitui
uma adaptação do teste da formalina administrada na superfície plantar de animais
(Dubuisson & Dennis, 1977; Raboisson & Dallel, 2004). Contudo, vale ressaltar que
para uma avaliação mais detalhada dos receptores envolvidos no mecanismo de
ação do produto natural a ser testado, este ensaio experimental pode ser realizado
com a aplicação de outros agentes químicos, como por exemplo, glutamato e
capsaicina (Silva, 2011).
As principais respostas comportamentais que caracterizam a dor e que são
observadas nesse modelo experimental são: medida do tempo ou do número de
reflexos de autolimpeza (grooming) dirigidos ao local da injeção de formalina;
vocalização espontânea; tremores vigorosos do corpo (shaking) associados ao ato
143
de lamber as patas dianteiras e proteger vigorosamente a face; e trismo (Perla,
2007).
Assim como no teste da aplicação de formalina subplantar, os parâmetros
indicativos de dor para este modelo também podem ser observados imediatamente
após a aplicação do agente químico e, posteriormente, após o período de
quiescência. Segundo Dubuisson & Dennis (1977), a dor, no modelo nociceptivo
trigeminal, é inicialmente resultante da reação inflamatória gerada pela ligação da
formalina às proteínas teciduais, por meio da formação de pontes primárias de
carbono (propriedade fixadora do tecido). Tal reação inflamatória na área de injeção
persiste por período relativamente longo. A resposta inicial (primeira fase)
possivelmente decorre da estimulação direta dos nociceptores, enquanto que a
segunda fase do teste deve-se à inflamação e sensibilização central.
Teste da placa quente
O teste da placa quente (hot plate) avalia o tempo em que os animais
permanecem sobre uma chapa metálica aquecida (55 ± 0,5 ºC) até reagirem ao
estímulo térmico com o comportamento de levantar ou lamber as patas (Tita et al.,
2011). As aferições são realizadas nos tempos de 30, 60, 90 e 120 minutos após a
administração das substâncias a serem analisadas.
O modelo experimental foi inicialmente descrito por Woolfe & Macdonald
(1944) como modelo específico para a detecção de sustâncias analgésicas de efeito
central. Embora o uso de analgésico central e periférico responda pela inibição do
número de contrações provocadas por estímulos químicos que levam à dor, apenas
os analgésicos centrais aumentam o tempo de resposta no teste da placa quente.
Este modelo utiliza a temperatura como estímulo nociceptivo. Dessa forma, os
144
nociceptores (fibras C e Aδ, principalmente) são estimulados após a ativação dos
receptores vaniloides, especificamente os receptores do tipo VR-1, que possuem
limiar de ativação em 43 ºC, e os receptores do tipo VRL-1, que possuem limiar de
ativação em 52 ºC. Estes últimos são importantes na avaliação da resposta a
estímulos térmicos nocivos, pois são responsáveis pela resposta em decorrência do
aumento da temperatura (Julius & Basbaum, 2001; Benedito, 2009).
Teste de retirada da cauda
O teste de retirada da cauda (tail-flick) é sensível para identificar a atividade
de compostos presentes em extratos vegetais ou isolados a partir desses, além de
sintéticos, cujos mecanismos sejam semelhantes aos promovidos pelos analgésicos
opióides (Oliveira et al., 2008).
Este ensaio experimental consiste na aplicação de uma fonte radiante de
calor na cauda do animal como estimulo nociceptivo térmico, provocando seu
movimento de retirada (Oliveira et al., 2009). Um aumento no tempo de reação é
geralmente considerado como um parâmetro importante para avaliar a atividade
antinociceptiva central, caracterizando-se por uma nocicepção aguda nãoinflamatória. Sendo assim, substâncias que atuam em nível central, como a morfina,
são capazes de suprimir respostas de neurônios espinhais ao estímulo térmico
nocivo na cauda, aumentando o tempo de latência (Fischer et al., 2008).
CONSIDERAÇÕES FINAIS
A utilização de modelos experimentais como os que foram demonstrados
neste trabalho é de fundamental importância para a descoberta de novos fármacos,
particularmente de analgésicos, visto que estes só podem ser comercializados após
a realização de ensaios farmacológicos pré-clínicos que atestem sua eficácia e
145
segurança. Esses testes representam o início para a caracterização de novas
drogas, capazes de interagir com os mediadores da dor e/ou inflamação, fornecendo
assim um ponto de partida para a elucidação das vias de efeito antinociceptivo
envolvidas, atendendo às necessidades da terapia farmacológica para este tipo de
agravo à saúde.
AGRADECIMENTOS
Os autores agradecem à Fundação de Amparo à Ciência e Tecnologia do
Estado de Pernambuco (FACEPE) e ao Conselho Nacional de Desenvolvimento
Científico e Tecnológico (CNPq) pelo apoio financeiro, bem como à Coordenação de
Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pelas bolsas de mestrado
concedidas.
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150
APENDICE B – Artigo II
Artigo II:
ANTINOCICEPTIVE AND ANTI-INFLAMMATORY ACTIVITIES OF THE
ETHANOLIC EXTRACT OF ANNONA VEPRETORUM MART.
(ANNONACEAE)
151
ARTIGO II
Artigo submetido à:
Revista: Phytotherapy Research
Título: Antinociceptive and Anti-inflammatory Activities of the Ethanolic
Extract of Annona vepretorum Mart. (Annonaceae) in Rodents
Autores: Juliane Cabral Silva, Camila de Souza Araújo, Sarah Raquel Gomes de LimaSaraiva, Raimundo Gonçalves de Oliveira-Junior, Tâmara Coimbra Diniz, Carlos Wagner de
Souza Wanderley, Raimundo Campos Palheta Júnior, Rosemairy Luciane Mendes, Adriana
Gibara Guimarães, Lucindo José Quintans Júnior e Jackson Roberto Guedes da Silva
Almeida.
152
Antinociceptive and Anti-inflammatory Activities of the Ethanolic
Extract of Annona vepretorum Mart. (Annonaceae) in Rodents
Juliane Cabral Silva,1 Camila de Souza Araújo,1 Sarah Raquel Gomes de LimaSaraiva,1 Raimundo Gonçalves de Oliveira-Junior,1 Tâmara Coimbra Diniz,1 Carlos
Wagner de Souza Wanderley,1 Raimundo Campos Palheta Júnior,1 Rosemairy Luciane
Mendes,1 Adriana Gibara Guimarães,2 Lucindo José Quintans Júnior2 and Jackson
Roberto Guedes da Silva Almeida1,1
1
Center for Studies and Research of Medicinal Plants, Federal University of San Francisco
Valley, Postal Code 56.304-205, Petrolina, Pernambuco, Brazil
2
Department of Physiology, Federal University of Sergipe (DFS/UFS), Postal Code 49.100000, São Cristóvão, Sergipe, Brazil
Short title: Biological properties of Annona vepretorum
1
Correspondence to: Jackson Roberto Guedes da Silva Almeida, Núcleo de Estudos e Pesquisas de
Plantas Medicinais, Universidade Federal do Vale do São Francisco, 56.304-205, Petrolina,
Pernambuco, Brazil. Tel/fax + 55-87-21016862. E-mail: [email protected]
153
Annona vepretorum Mart. (Annonaceae) is a native tree from Caatinga biome, popularly
known as “araticum” and “pinha da Caatinga”. In this study, we investigated the effects
of the crude ethanolic extract (Av-EtOH) in models of pain and inflammation in rodents.
The evaluation of antinociceptive activity was carried out by the acetic acid-induced
writhing, formalin, hot plate and tail flick tests, while paw edema induced by
carrageenan or histamine, and leukocyte migration to the peritoneal cavity were used
for anti-inflammatory profile. Av-EtOH (25, 50 and 100 mg/kg, p.o) significantly
reduced the number of writhing (p < 0.01) and decreased (p < 0.01) the paw licking time
in both phases of the formalin test. In the hot plate and tail flick tests, this extract
increased the reaction time, consequently reduced painful behavior. The effects in the
formalin and hot plate tests were antagonized by naloxone. Av-EtOH inhibited
significantly (p < 0.01) the increase in the edema volume after administration of
carrageenan and histamine. In the peritonitis test, acute pre-treatment with Av-EtOH
inhibited leukocyte migration. Thus, Av-EtOH has significant antinociceptive and antiinflammatory properties, which are related probably with the activation of opioid
receptors and inhibition of release of mediators of the inflammatory process.
Keywords: antinociceptive effect; anti-inflammatory effect; pain, inflammation, Annonaceae;
Annona vepretorum
154
INTRODUCTION
The Caatinga biome (semi-arid vegetation) is a highly threatened biome covering a vast area
in Northeastern Brazil and is the source of many few studied natural resources (Albuquerque
and Andrade, 2002). Many medicinal plants species from the Caatinga are widely known and
used in folk medicine and for commercial manufacturing of phytotherapeutic products. Few
ethnobotanical and pharmacological studies have been undertaken in this region, however, in
spite of the great cultural and biological diversity to be found there (Albuquerque et al.,
2007). In the Brazilian Northeastern, the Caatinga has fundamental importance in the lives of
people that inhabit this region because it offers a wide variety of animals and plants that are
used for food, fuel, building materials and medicinal purposes (Almeida et al., 2010).
Plants of the family Annonaceae are formed by trees and shrubs and can be found in
tropical and subtropical regions (Fechine et al., 2002). It is the largest family of the
Magnoliales order, having about 2300-2500 species and over 130 genera (Carballo et al.,
2010). Many species of Annonaceae are usually consumed as fresh fruits, they are also widely
used in folk medicine for antiparasitic, antitumoral and treatment of intestinal diseases (Habib
and Waheed 2013; Araya et al., 2004). Several reports have characterized the
pharmacological activity of these plants because of their bioactive compounds (mainly
alkaloids and flavonoids) found in roots, leaves, bark, seeds and fruits (Carballo et al., 2010).
Annona L. belongs to the Annonaceae family and comprises approximately 175
species of trees and shrubs. Economically, this genus is the most important of the Annonaceae
family due to its edible fruits and medicinal properties (Dutra et al., 2012). Some studies have
demonstrated that species of the genus Annona have pharmacological properties mainly
antinociceptive (Hamid et al., 2012; Carballo et al., 2010) and anti-inflammatory activities
(Foong and Hamid, 2012).
155
Annona vepretorum is endemic of Brazil (Caatinga biome), popularly known as
“araticum” and “pinha da Caatinga” and is widely used in the human nutrition. The fruits are
usually consumed “in natura” or used in juices. Previous study of this species described the
chemical composition and bioactivity of the essential oil from the leaves collected in Poço
Redondo, state of Sergipe, Northeastern Brazil (Costa et al., 2012).
Considering the large consumption in our region and scarcity of chemical and
pharmacological studies about this species, this study evaluated the antinociceptive and antiinflammatory properties of the ethanolic extract from Annona vepretorum in experimental
models of pain and inflammation.
MATERIALS AND METHODS
Plant Material. The leaves of A. vepretorum were collected in Jaguarari, Bahia, Brazil, in
October of 2010. The plant was identified by R. Mello Silva, a botanist from Centro de
Referência para Recuperação de Áreas Degradadas (CRAD). The voucher sample (#946) was
deposited in the Herbarium Vale do São Francisco (HVASF) from Federal University of San
Francisco Valley.
Preparation of the plant extract. The leaves of A. vepretorum were dried in an oven at 40 ◦C
for three days. The material dried and pulverized (1400 g) was macerated with ethanol
(EtOH) 95% at room temperature for 72 h. The EtOH solution was concentrated under
vacuum yielding 600 g of crude ethanol extract of Annona vepretorum (Av-EtOH).
156
Animals. Adult male Swiss mice (30-40 g) and rats (200-250 g), were randomly housed in
appropriate cages at 22 ± 2 °C on a 12 h light/dark cycle (lights on at 6:00 a.m.) with access to
food and water ad libitum. Animals were allowed to have a period of acclimation before any
experimentation. They were used in groups of six animals each. All nociception tests were
carried out by the same visual observer. Experimental protocols and procedures were
approved by the Federal University of San Francisco Valley Animal Care and Use Committee
by number 0004/261011.
Acetic acid-induced writhing in mice. This test was performed using the method described
by Collier et al. (1968) with modifications. Mice were divided into six groups of six animals
each. Nociception was induced by intraperitoneal (i.p.) injection of acetic acid (0.9% v/v) in a
volume of 0.1 ml/10 g. Animals were treated with the Av-EtOH (25, 50 and 100 mg/kg), or
with vehicle (saline) given by orally administered (p.o.) 1 h before the nociceptive agent.
Indomethacin (20 mg/kg) and morphine (10 mg/kg) in vehicle were used as reference drugs
and given by i.p. 30 min before algogen agent. Following the injection of acetic acid, the
number of abdominal constrictions (a response consisting of contraction of the abdominal
wall, pelvic rotation followed by hind limb extension) occurring between 5 and 15 min after
injection (Queiroz et al., 2010).
Formalin test. The method used was similar to that described by Hunskaar and Hole (1987).
A formalin solution (2.5% in 0.9% sterile saline; 20 µl/paw subplantar) was injected into the
right hind paw of the mice (Santos et al., 2010). Mice were observed in the chambers with a
mirror and the amount of time (in seconds) spent licking and biting the injected paw was
157
measured as an indicator of pain. Responses were measured for 5 min after formalin injection
(first phase, neurogenic) and 15-30 min after formalin injection (second phase, inflammatory)
(Almeida et al., 2011). Treatments with vehicle (saline, p.o.), Av-EtOH (25, 50 and 100
mg/kg, p.o.), indomethacin (20 mg/kg, i.p.) and morphine (10 mg/kg, i.p.) were given 1 h
prior to formalin injection (n= 6 per group). For evaluation of the involvement of opioid
receptors in the effect of the extract, naloxone (1.5 mg/kg, i.p.), an opioid receptor antagonist,
was administered 30 minutes before administration of the extract (100 mg/kg) or morphine.
Hot plate test. Mice were divided into six groups of six mice each. Mice were pre-selected on
the hot plate apparatus (Insight, Brazil) at 55 ± 0.5 °C. Animals showing a reaction time
(defined as the latency for licking the hind feet or jumping) greater than 20 s were discarded.
Selected mice were pre-treated with vehicle (p.o.), Av-EtOH (25, 50 and 100 mg/kg, p.o.), or
morphine (10 mg/kg, i.p.). Each animal was placed on the heated surface of the plate
maintained at 55 ◦C and the latency to a discomfort reaction (licking of the paws or jumping)
was recorded at 30, 60, 90 and 120 min after the administration of the vehicle, extract and
morphine (Almeida et al., 2011). A cut-off time of 20 s was chosen to indicate complete
analgesia and to avoid tissue injury. The latencies for paw licking or jumping were recorded
for each animal. For evaluation of the involvement of opioid receptors in the effect of the
extract, naloxone (1.5 mg/kg, i.p.) was administered 30 minutes before administration of the
extract (100 mg/kg) and morphine.
Tail Flick. The antinociceptive response against thermal stimuli was assessed with the tailflick test (Analgesiometer, Insight, Brazil) (D’Amour and Smith, 1941). Rats were divided
into five groups of six rats each and each rat was placed in a ventilated tube with the tail
158
positioned in radiant thermal stimulation of the dorsal surface of the tail. The heating was
applied to distal third of the tail and consist focus a beam of light at 50 °C in the tail of rats.
The time, in seconds, taken to remove the tail of the beam is regarded as the reaction time,
which is measured automatically by a recorder coupled to the apparatus. Each trial was
terminated after 7 s to minimize the probability of skin damage. The tail-flick latency was
measured before and 30, 60, 90 and 120 min after administration of vehicle (p.o.), Av-EtOH
(25, 50 and 100 mg/kg, p.o.), or morphine (10 mg/kg, i.p.) (Nakamoto et al., 2010).
Therefore, the longer delay with the animal's tail under the effect of beam higher analgesic
activity.
Carrageenan-induced hind paw edema in mice. The anti-inflammatory activity was studied
using the paw edema model induced by 2% carrageenan, injected at volume of 20 µl/animal
into the subplantar region of the right hind paw of the mice (Winter et al., 1962). Mice were
divided into six groups of six animals each. Mice were pre-treated with Av-EtOH (25, 50 and
100 mg/kg, p.o.), saline (vehicle, p.o.) or indomethacin (20 mg/kg, i.p.) 1 h before
carrageenan injection or saline injection. The mice pedal volume up to the ankle joint was
measured using plethysmometer (PanLab LE 7500, Spain) before (VA, baseline) the
intraplantar administration of carrageenan and 1, 2, 3, 4 and 5 h after (VB), as described
previously (Huang et al., 2012). The inhibition of the edema paw was calculated by (VBVA)/VA, where VA is the volume of the right hind paw before carrageenan injection, and VB
is the volume of the right hind paw after carrageenan injection. Finally, the animals were
sacrificed and all of right hind paw were dissected. Each sample was embedded in paraffin
wax, sectioned at 5 µm and stained with hematoxylin–eosin for histological analysis.
159
Histamine-induced hind paw edema in mice. The edema in mice was induced by injecting
100 µg/paw of histamine (Cavalher-Machado et al., 2008). Mice were divided into three
groups of six animals each. Animals were pre-treated with Av-EtOH (100 mg/kg, p.o.),
vehicle (saline, p.o.) 1 h before histamine injection or saline. The volume was measured
before the intraplantar injection of histamine or saline (VA, baseline) and 30, 60, 90 and 120
min after (VB) (Suleyman et al., 1999). The inhibition of paw edema was calculated as
described in carrageenan induced paw test. The animals were also sacrificed and all of right
hind paw were dissected for histological analysis.
Leukocyte migration to the peritoneal cavity. Mice were divided into five groups of six
animals each. The leukocyte migration was induced by injection of carrageenan (1%, i.p.,
0.25 ml) (Andrade et al., 2012) into the peritoneal cavity of mice 1 h after administration of
Av-EtOH (25, 50 and 100 mg/kg, p.o.), or with vehicle (saline, p.o.) 0.5 h after injection of
dexamethasone (2 mg/kg, i.p.) (Bastos et al., 2007). The leukocyte migration was evaluated 4
h after stimulus, when the animals were euthanized and the peritoneal cavity cells were
harvested with 3 ml saline containing 1 mM EDTA. Immediately, a brief massage was done
for further fluid collection, which was centrifuged (3000 rpm for 6 min) at room temperature.
The supernatant was disposed and saline was added to the precipitate. An aliquot of 10 μl
from this suspension was dissolved in 200 μl of Turk solution and the total cells were counted
in a Neubauer chamber, under optic microscopy. The results were expressed as the number of
leukocytes/ml (Melo et al., 2011).
Statistical analysis. The results were presented as the mean ± standard error of the mean
(SEM) and the statistical significance was determined using an analysis of variance
160
(ANOVA) followed by Dunnett’s test. Groups of data of histamine-induced hind paw edema
in mice were analyzed using unpaired Student’s t-test. Values were considered significantly
different at p < 0.05. All analysis was performed using by GraphPad Prism 5.0 program
(Graph Pad Prism Software Inc., San Diego, CA, USA).
RESULTS
Acetic acid-induced writhing in mice
The results shown in Fig. 1 demonstrated that the pre-treatment with Av-EtOH (25, 50 e 100
mg/kg, p.o.) 1 h before, was capable of inhibiting the abdominal writhing induced by the
intraperitoneal administration of the acetic acid when compared with control group (p < 0.01).
The inhibitions of writhes in percentage were 61.75, 81.08 and 91.89. Indomethacin and
morphine produced a 92.90% and 100%, respectively, of reduction in acetic acid-induced
writhing when compared to the control.
INSERT FIGURE 1
Formalin test
The treatment with Av-EtOH at doses of 25 and 100 mg/kg (p.o.) produced a significant
antinociceptive activity compared to the control group in both the early and late phases (p <
0.05) (Fig.2). Av-EtOH (25, 50 and 100 mg/kg, p.o.) decreased by 55.22, 64.18 and 65.30%,
respectively, the paw licking time in the first phase, as well as 66.36, 3.98 and 82.27%,
respectively, in the second phase of the formalin test. The reference drug indomethacin
161
suppressed only the second phase of the formalin test, while morphine inhibited both phases
of the pain stimulus (p < 0.05). The pre-treatment with naloxone (1.5 mg/kg, i.p.) reversed the
antinociceptive activity of the extract at dose of 100 mg/kg in the first phase of this test. The
effect of morphine (10 mg/kg) was also reversed by naloxone.
INSERT FIGURE 2
Hot plate test
In the hot plate test (Fig. 3), the animals treated with morphine (10 mg/kg, i.p.) demonstrated
a marked increase in latency at 30, 60, 90 and 120 min. The ones treated with the Av-EtOH
(25 and 100 mg/kg, p.o.) showed a marked increase in latency at 60 and 90 min. The one
treated with Av-EtOH (50 mg/kg, p.o.) did not shown significantly behavioral changes. The
effect of morphine and Av-EtOH was reverted by naloxone.
INSERT FIGURE 3
Tail Flick
The Av-EtOH administrated at dose of 50 mg/kg (p.o) induced a significant increase in the
reaction time to thermal stimuli when compared to the control group at 30 and 60 min. The
group treated with morphine (10 mg/kg, i.p.) caused a significant increase in the response
latency time at 30, 60, 90 and 120 min (Fig. 4).
162
INSERT FIGURE 4
Carrageenan-induced hind paw edema in mice
To determine the possible anti-inflammatory effects of Av-EtOH, carrageenan-induced hind
paw edema models were performed in mice. When carrageenan was used as inductor of
edema (Fig. 5), Av-EtOH (25, 50 and 100 mg/kg, p.o) administered 1 h before carrageenan
injection, inhibited significantly (p < 0.01) the increase in the edema volume at 1 and 2 h, but
not in 3, 4 and 5 h after stimuli. Moreover, control drug, indomethacin (20 mg/kg, i.p.),
showed the highest inhibition of edema volume (p < 0.01) during 5 h.
INSERT FIGURE 5
Histamine-induced hind paw edema in mice
The inflammatory edema induced by histamine was significantly attenuated by Av-EtOH 100
mg/kg, p.o. in 30 min and 60 min (p < 0.05), as shown in Fig. 6.
INSERT FIGURE 6
Histological examination
163
Histological analysis showed the presence of intense inflammatory infiltrate with
subcutaneous edema in the groups where inflammation was induced by carrageenan and
treated with 50 and 100 mg/kg of Av-EtOH. However, the group treated with 25 mg/kg of
Av-EtOH the infiltrate was less intense. In the group where inflammation was induced by
histamine and treated with 100 mg/kg of Av-EtOH the inflammatory process was less intense
than in the control group (Fig. 7).
INSERT FIGURE 7
Leukocyte migration to the peritoneal cavity
Av-EtOH (25, 50 and 100 mg/kg, p.o) administered 1 h before injection of carrageenan (1%,
i.p., 0.25 ml) inhibited leukocyte migration (p < 0.01) when compared to control group (Fig.
8). The reference drug dexamethasone (2 mg/kg, i.p.) promoted significant reduction in
leukocyte migration (p < 0.01).
INSERT FIGURE 8
DISCUSSION
For the first time in the literature, our data indicate that crude ethanolic extract (Av-EtOH)
obtained from the leaves of Annona vepretorum possess antinociceptive and antiinflammatory profiles in different nociceptive responses generated by a chemical or thermal
noxious stimulus.
164
The acetic acid-induced writhing test in mice has long been used as a classic model for
the assessment of analgesic or anti-inflammatory properties of new agents (Mohamad et al.,
2010). In fact, it is a non-selective model for antinociceptive studies, since an intraperitoneal
injection of acetic acid triggers the release of a variety of mediators such as substance P,
bradykinins, prostaglandins especially PGI2 as well as pro-inflammatory cytokines such as IL1, IL-6, IL-8 and TNF-α, stimulating the peripheral nociceptor and sensitive neurons that were
responsive to the inflammatory mediators (Le Bars et al., 2001).
The ethanolic extract (Av-EtOH) significantly reduced the acetic acid-induced
writhing in mice. The acetic acid produced 14.80 ± 2.08 writhes in the control group for 10
min after the injection. The groups previously treated with 25, 50 and 100 mg/kg of Av-EtOH
exhibited a significant reduction in the number of writhings of 61.75, 81.08 and 91.89%,
respectively. Our results have shown that Av-EtOH possess a potent antinociceptive activity
in this method.
The formalin test is an evaluation method used to measure the behavioral effectiveness
of antinociceptive agents (Hunskaar and Hole, 1987; Randolph, 1997). The advantage of this
assay over other methods of nociception is the possibility to evaluate two different types of
pain over a prolonged period of time and thus allows the testing of analgesics with different
mechanisms of action (Le Bars et al., 2001; Randolph, 1997). The behavioral response to
formalin followed a biphasic pattern composed of an initial acute phase (first phase), and for a
longer period (second phase) and the period between phases is called the quiescent interval
(Martins et al. 2006). Drugs which act mainly centrally, such as narcotic analgesics, inhibit
both phases, while peripherally acting drugs, such as indomethacin, only inhibit the late
phase. Av-EtOH inhibited both phases of the formalin-induced nociception, but its effect was
more prominent in the second phase.
165
Seeking a possible central involvement in the antinociceptive effect of Av-EtOH, hot
plate and tail flick assays were conducted. The increase in latency of Av-EtOH on hot plate
show provide evidences of its central effect since this is predominantly a spinal reflex and
considered as central model for centrally-acting analgesic drugs (Nemirovsky et al., 2001).
This test, on thermal stimulation is associated with central neurotransmission in what the heat
activates nociceptors (Aδ and C fibers) by driving the momentum of the dorsal horn of the
spinal cord and subsequently to cortical centers (Pinheiro et al., 2011).
In tail flick test, the Av-EtOH administrated at dose of 50 mg/kg (p.o) caused a
significant increase in the reaction time to thermal stimuli as compared to the control group at
30 and 60 min. This test consists of a thermal stimulus, an increase in the reaction time is
considered to be a parameter for evaluating central antinociceptive activity (Rujjanawate et
al., 2003). Therefore, tail flick is characterized by an acute nociception and noninflammatory. Substances which act at central level, such as morphine, are able to suppress
responses of spinal neurons to noxious thermal stimulus in the tail, increasing the latency time
(Fischer et al., 2008).
To confirm of the involvement of opioid receptors in the effect of the extract,
naloxone (1.5 mg/kg, i.p.) was administered 30 minutes before administration of the extract
(100 mg/kg) and morphine, being the effect of morphine and Av-EtOH reverted in the
formalin and hot plate tests. As naloxone is a non-selective opioid receptor antagonist, it is
suggested that this antinociceptive effect of the extract is mediated by activation of opioid
receptors (Lewanowitsch et al., 2006).
The inhibition on the second-phase (inflammatory nociception) of the formalin test in
mice, suggested that Av-EtOH can produce antinociceptive action through the inhibition of
COX and consequently prostaglandin synthesis, or other inflammatory pathway. To confirm
166
the possible anti-inflammatory activity of Av-EtOH, the carrageenan-induced paw edema
model in mice was performed.
The carrageenan-induced paw edema is an animal model widely employed for the
screening of anti-inflammatory compounds or extracts and has frequently been used to assess
the anti-edematogenic effect of natural products, as medicinal plants, and exhibits a high
degree of reproducibility (Thomazzi et al., 2010).
Edema formation produced by carrageenan administration in paw is a biphasic event,
during 1-5 h. The initial phase (1 or 1.5 h) is predominantly a non-phagocytic edema followed
by a second phase (2-5 h) with increased edema formation that remained up to 5 h (Khan et
al., 2009). Av-EtOH (25, 50 and 100 mg/kg, p.o) administered 1 h before carrageenan
injection, inhibited significantly (p < 0.01) the increase in the edema volume at 1 and 2 h,
initial phase. This phase has been induced due to the action of mediators such as histamine,
serotonin and bradykinin on vascular permeability (Zhu et al., 2010), which is subsequently
sustained by the release of prostaglandins and nitric oxide (second-phase) with peak at 3 h. To
confirm the anti-inflammatory action in the initial phase, histamine-induced paw edema was
conducted. Our results showed that the edema induced by histamine was significantly
inhibited by Av-EtOH 100 mg/kg, p.o. in 30 min and 60 min (p < 0.05).
Then, the method of leukocyte migration to the peritoneal cavity was performed
seeking a best characterization of the anti-inflammatory effect of Av-EtOH. The inflammation
produced by this model is slow and prolonged, making it possible to evaluate the leakage of
liquid, as well as cell migration, besides the participation of cytokines, enzymes, and chemical
mediators, such as nitric oxide, prostaglandin E2, IL-1β, IL-6 and TNF-α,
by utilizing
different phlogistic agents (Loram et al., 2007). These mediators are able to recruit
leukocytes, such as neutrophils, in several experimental models. Av-EtOH (25, 50 and 100
167
mg/kg, p.o) administered 1 h before injection of carrageenan (1%, i.p., 0.25 ml) inhibited the
leukocyte migration (p < 0.01). A possible mechanism is an inhibition of the synthesis of
many inflammatory mediators whose involvement in the cell migration is well-established.
In summary, the present study has demonstrated that crude ethanolic extract of A.
vepretorum has significant antinociceptive and anti-inflammatory properties, which are
related probably with the activation of opioid receptors and inhibition of release of mediators
of the inflammatory process, such as prostaglandins, histamine and neutrophils.
ACKNOWLEDGEMENTS
This work was supported by grants from the Brazilian agencies CAPES, CNPq and
FACEPE. The authors wish to express their thanks to R. Mello Silva of Centro de Referência
para Recuperação de Áreas Degradadas (CRAD) for botanical identification of the plant
material.
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Number of writhings
20
Control
Av-EtOH 25 mg/kg
Av-EtOH 50 mg/kg
Av-EtOH 100 mg/kg
Indomethacin 20 mg/kg
Morphine 10 mg/kg
15
10
**
5
**
**
0
**
**
173
Figure 1. Effect of ethanol extract of A. vepretorum (Av-EtOH), indomethacin and morphine on acetic acid
induced writhing test in mice. Values are mean ± S.E.M. **p < 0.01, significantly different from control; ANOVA
followed Dunnett’s test (n = 6, per group).
a)
First phase
Licking time (s)
60
Control
Av-EtOH 25 mg/kg
Av-EtOH 50 mg/kg
Av-EtOH 100 mg/kg
Morphine 10 mg/kg
Morph + NLX
Av-EtOH + NLX
50
40
30
**
20
**
**
**
10
0
b)
Second phase
70
Licking time (s)
60
50
40
**
30
20
10
**
**
**
**
**
Control
Av-EtOH 25 mg/kg
Av-EtOH 50 mg/kg
Av-EtOH 100 mg/kg
Morphine 10 mg/kg
Morph + NLX
Av-EtOH + NLX
0
Figure 2. Effect of ethanolic extract of A. vepretorum (Av-EtOH), indomethacin, morphine, morphine +
naloxone (Morph + NLX; 10 mg + 1.5 mg/kg) and Av-EtOH + NLX (100 mg + 1.5 mg/kg) on formalin test in mice.
Values are mean ± S.E.M.; **p < 0.01, significantly different from control; ANOVA followed Dunnett’s test (n =
6, per group).
174
Latency time (s)
20
**
15
**
* *
**
10
** ***
5
Control
Av-EtOH 25 mg/kg
Av-EtOH 50 mg/kg
Av-EtOH 100 mg/kg
Morphine 10 mg/kg
Morph + NLX
Av-EtOH + NLX
0
30
60
90
120
Time (min)
Figure 3. Effect of ethanolic extract of A. vepretorum (Av-EtOH), morphine, morphine + naloxone (Morph +
NLX; 10 mg + 1.5 mg/kg) and Av-EtOH + NLX (100 mg + 1.5 mg/kg) on hot plate test in mice. Values are mean ±
S.E.M.; *p < 0.05, **p < 0.01, significantly different from control; ANOVA followed Dunnett’s test (n = 6, per
group).
Latency time (s)
6
5
*
*
Control
Av-EtOH 25 mg/kg
Av-EtOH 50 mg/kg
Av-EtOH 100 mg/kg
Morphine
*
* *
4
3
2
1
0
30
60
90
120
Time
Figure 4. Effect of ethanolic extract of A. vepretorum (Av-EtOH) and morphine (10 mg/kg) on tail flick test in
rats. Values are mean ± S.E.M.; *p < 0.05, significantly different from control; ANOVA followed Dunnett’s test
(n = 6, per group).
175
Volume of edema (ml)
0.8
Saline
Saline + Carr
Av-EtOH 25 mg/kg
Av-EtOH 50 mg/kg
Av-EtOH 100 mg/kg
Indomethacin
0.7
0.6
0.5
0.4
*
0.3
**
0.2
0.1
0.0
0
1
**
**
**
2
3
**
**
4
5
Hours
Figure 5. Effect of ethanolic extract of A. vepretorum (Av-EtOH) and indomethacin (20 mg/kg) on carrageenaninduced hind paw edema in mice. Values are mean ± S.E.M.; *p < 0.05, **p < 0.01, significantly different from
Volume of edema (ml)
control; ANOVA followed Dunnett’s test (n = 6, per group).
0.45
0.40
0.35
0.30
0.25
0.20
0.15
0.10
0.05
0.00
Saline
Saline + Histamine
Av-EtOH 100 mg/kg
*
0
30
*
60
90
120
Time (min)
Figure 6. Effect of ethanolic extract of A. vepretorum (Av-EtOH) on histamine-induced hind paw edema in mice.
Values are mean ± S.E.M.; *p < 0.05, significantly different from control; unpaired Student’s t-test (n = 6, per
group).
176
Figure 7. Histology of rat paw edema induced by carrageenan after treatments. (A) control group (saline +
carrageenan), (B) Av-EtOH 25 mg/kg + carrageenan, (C) Av-EtOH 50 mg/kg + carrageenan, (D) Av-EtOH 100
mg/kg + carrageenan, (E) Indomethacin + carrageenan, (F) Histamine + saline, (G) Histamine + Av-EtOH 100
mg/kg. ) The arrows head shows neutrophil inﬁltration of paw tissues (Original magnification, 100X (A-C; D-G)
and 400X (D).
177
Leucocytes x 106 / ml
35
Control
Av-EtOH 25 mg/kg
Av-EtOH 50 mg/kg
Av-EtOH 100 mg/kg
Dexamethasone 2 mg/kg
30
25
20
15
10
5
**
**
**
**
0
Figure 8. Effect of ethanolic extract of A. vepretorum (Av-EtOH) and dexamethasone on leukocytes migration
into the peritoneal cavity induced by carrageenan in mice. Values are mean ± S.E.M.; **p < 0.01, significantly
different from control; ANOVA followed Dunnett’s test (n = 6, per group).
178
APENDICE C – Carta de submissão
179
APENDICE D – Certificado
180
APENDICE E – Resumo
AVALIAÇÃO DA TOXICIDADE ORAL SUBCRÔNICA DO EXTRATO ETANÓLICO
DAS FOLHAS DE Annona vepretorum (ANNONACEAE) EM CAMUNDONGOS
Silva. J.C1, Lavor. E.M1, Silva. M.G1, Lima-Saraiva. S.R.G2, Oliveira-Junior. R.G1, Vieira. H.S1, Diniz.
1
1
1
1
T.S , Silva. F.S , Mendes. R.L , Almeida. J.R.G.S
1: Universidade Federal do Vale do São Francisco, 56.304-205, Petrolina-PE, Brasil.
2: Universidade Federal de Pernambuco, 50.740-521, Recife-PE, Brasil.
Introdução: Annona vepretorum é uma espécie pertencente à família Annonaceae, popularmente
conhecida na região Nordeste do Brasil como araticum ou pinha da Caatinga. A avaliação da
toxicidade possibilita caracterizar os efeitos sobre funções orgânicas importantes, tais como:
locomoção, comportamento, sistema respiratório, dentre outros. Assim, o objetivo deste trabalho foi
investigar a toxicidade subcrônica do extrato etanólico de A. vepretorum (Av-EtOH) visando à
obtenção de parâmetros de segurança. Metodologia: A planta foi coletada no município de JaguarariBA, e uma exsicata (#946) foi depositada no Herbário HVASF. Foram utilizados 30 camundongos
subdivididos em 3 grupos (n=10), que receberam solução salina e o extrato nas doses de 100 e 400
mg/kg, via oral, respectivamente, diariamente, durante 30 dias. Todos os animais foram observados
em relação ao aparecimento de efeitos tóxicos, e diariamente foram medidos o consumo de ração e
água. Posteriormente, os animais foram anestesiados com quetamina e xilazina, e o sangue foi
coletado pelo plexo braquial para a avaliação de parâmetros hematológicos e bioquímicos [1]. Em
seguida, os órgãos (coração, pulmão, fígado, estômago, rins, pâncreas, baço, ovário e testículo)
foram coletados, pesados e analisados macroscopicamente [2]. O protocolo experimental foi
aprovado pelo Comitê de Ética da UNIVASF (Protocolo 0004/261011). Resultados: após 30 dias de
tratamento, não houve morte dos animais nos grupos tratados com o extrato nas doses de 100 e 400
mg/kg, via oral. Na triagem toxicológica foi observado piloereção, movimento intenso das vibrissas,
analgesia, resposta ao toque diminuído, respiração forçada e diminuição da força para agarrar na
dose de 400 mg/kg, comportamentos não observados nos demais grupos. Não houve diferença
significativa quanto ao peso corporal, consumo de líquido e ração, nem peso dos órgãos quando
comparados ao grupo controle. Os exames hematológicos mostraram redução significativa (p< 0.05)
de MCV, MCH no grupo tratado com Av-EtOH na dose de 400 mg/kg. Quanto aos exames
bioquímicos, houve aumento significativo (p< 0.05) do nível de triglicerídeos no grupo tratado com AvEtOH 400 mg/kg. Na avaliação macroscópica dos órgãos, apenas um animal tratado com Av-EtOH
400 mg/kg, apresentou o pulmão com aspecto mais pálido e enrijecido. Nos demais, não houve
alterações. Conclusão: Os dados mostram que não houve sobrecarga hepática ou renal, e que AvEtOH na dose de 100 mg/kg, via oral, apresentou-se seguro, não havendo nenhum indício de
toxicidade quando ingerido diariamente, por 30 dias. Estudos histopatológicos deverão ser realizados
posteriormente para avaliação de alterações microscópicas nos órgãos.
Agradecimentos: CAPES, CNPq, FACEPE
Referências:
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2. Okoye, T.C., et al. (2012). Asian Pacific Journal of Tropical Medicine. 5: 277-282.
Sessão Científica: etnofarmacologia, farmacologia e toxicologia.
181
ANEXOS
182
ANEXO A – Aprovação do comitê de ética
183
ANEXO B – Tabela de triagem comportamental
Triagem Farmacológica
(Modelo retirado de Almeida et al., 1999)
PLANTA UTILIZADA:_______________________ DOSES:_____________DATA:____/_____/_____
VIA DE ADMINISTRAÇÃO:_____________________ANIMAIS:______________________________
RESPONSÁVEL TÉCN.:_______________________________ GRUPOS:________________________
ATIVIDADE FARMACOLÓGICA
Quantificação dos efeitos
(0) sem efeito, (-) efeito diminuído, (+) efeito presente, (++) efeito intenso
até 30`
1h
2h
3h
4h
1 - SNC
a - Estimulante
Hiperatividade
Irritabilidade
Agressividade
Tremores
Convulsões
Piloereção
Movimento intenso das vibrissas
Outras_____________________
b - Depressora
Hipnose
Ptose
Sedação
Anestesia
Ataxia
Reflexo do endireitamento
Catatonia
Analgesia
Resposta ao toque diminuído
Perda do reflexo corneal
Perda do reflexo auricular
c - Outros comportamentos
Ambulação
Bocejo excessivo
Groming
Rearing
Escalar
Vocalizar
Sacudir a cabeça
Contorções abdominais
Abdução das patas do trem posterior
Pedalar
Estereotipia
2 - SN AUTÔNOMO
Diarréia
Constirpação
Defecação aumentada
Respiração forçada
Lacrimejamento
Micção
Salivação
Cianose
Tono muscular
Força para agarrar
3 - MORTE
obs.:_________________________________________________________________________________________________
______________________________________________________________________ ___________

EFEITO ANTINOCICEPTIVO E ANTI

Transcription

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