Nanofilme de Dióxido de Silício como Inibidor do Crescimento

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Universidade do Brasil – UFRJ
Centro de Ciências da Saúde
Faculdade de Odontologia
NANOFILME DE DIÓXIDO DE SILÍCIO COMO INIBIDOR DO
CRESCIMENTO MICROBIANO EM SUPERFÍCIE PLÁSTICA
Rowan do Vale Vilar
CD
Dissertação
submetida
ao
corpo
docente
da
Faculdade de Odontologia da Universidade do Brasil - UFRJ,
como parte dos requisitos, para a obtenção do Título de
Mestre em Odontologia (Ortodontia).
Rio de Janeiro
2014
i
NANOFILME DE DIÓXIDO DE SILÍCIO COMO INIBIDOR DO
CRESCIMENTO MICROBIANO EM SUPERFÍCIE PLÁSTICA
ROWAN DO VALE VILAR, CD
Orientador: Prof. Dr. Antônio Carlos de Oliveira Ruellas
Dissertação
submetida
ao corpo docente
da
Faculdade de Odontologia da Universidade do Brasil UFRJ, como parte dos requisitos, para obtenção do Título
de Mestre em Odontologia (Ortodontia).
Comissão Examinadora:
____________________________________
Prof. Dr. Rogério Lacerda dos Santos, CD
____________________________________
Profª. Drª. Ana Maria Bolognese, CD
____________________________________
Profª. Drª. Margareth Maria Gomes de Souza, CD
Rio de Janeiro
2014
ii
Ficha Catalográfica
VILAR, Rowan do Vale
Nanofilme de dióxido de silício como inibidor do crescimento
microbiano em superfície plástica. Rio de Janeiro: UFRJ/Faculdade de
Odontologia, 2014.
xiii, 69 f.
Tese: Mestrado em Odontologia (Ortodontia) – Universidade do Brasil
– UFRJ, Faculdade de Odontologia, 2014.
1. Dióxido de silício
2. Citotoxicidade
3. Crescimento microbiano
4. Teses
I. Título
II. Dissertação (Mestrado – UFRJ/Faculdade de Odontologia)
iii
Ao autor da minha vida, Jesus Cristo.
Aos meus pais, Getúlio e Raquel.
Aos meus irmãos, Zander e Jaqueline.
"Porque Dele e por Ele, e para Ele, são todas as coisas; glória, pois, a Ele
eternamente. Amém." Romanos 11:36
DEDICO
iv
AGRADECIMENTOS
Ao meu amado Deus pela breve vida terrena e pela almejada vida
eterna, concedida através de Sua infinita misericórdia e sacrifício de Jesus, a
quem reconheço como único salvador da minha alma. Agradeço por conduzir
minha vida de acordo com Sua perfeita vontade, colocando em minha mente os
sonhos que nascem em Seu coração. Obrigado porque sei o quão imperfeito sou
e por ter me dado a maior referência de perfeição, à qual tento me aproximar a
cada dia.
Aos meus queridos pais, Getúlio e Raquel, por serem tão importantes para
mim que nenhuma palavra pode expressar o tamanho da minha gratidão.
Obrigado por cuidarem de mim de forma tão especial desde o momento que
souberam que eu estava sendo gerado. Obrigado por cada noite mal dormida
cuidando da minha saúde. Por todo investimento em educação formal e informal.
Pelas horas de conversas e broncas, em prol de me tornar um homem digno.
Obrigado mãe, porque seu cuidado, carinho e amor me tornaram quem sou hoje e
porque suas orações diárias, e incessantes, têm chegado aos ouvidos do nosso
Deus. Obrigado pai, por ser meu mais precioso orientador. Por ser meu maior
exemplo de professor, pesquisador e principalmente, por ser o melhor pai que
alguém poderia desejar.
v
Aos meus irmãos Zander e Jaqueline, por me apoiarem em minhas
decisões, torcerem pelo meu sucesso e estarem sempre dispostos a me ouvir e
aconselhar.
A minha namorada Juliane, por compreender meu cansaço e ausência
durante o curso. Obrigado por todas suas orações, pois através delas, Deus
renovou minhas forças e me permitiu chegar até aqui.
A todos meus tios, primos e avó, que têm acompanhado minha trajetória e
desenvolvimento pessoal e profissional, torcendo e orando por mim.
Aos meus amigos de graduação Rudá França Moreira e Vitor Hugo Silva
Nunes por toda amizade e por não permitirem que eu desistisse do meu sonho.
Aos Professores, Ana Maria Bolognese, Antônio Carlos de Oliveira
Ruellas, Eduardo Franzotti Sant’Anna, José Fernando Stangler Brazalle,
José Vinicius Bolognesi Maciel, Lincoln Issamu Nojima, Margareth Maria
Gomes de Souza, Maria Evangelina Monnerat, Matilde da Cunha Gonçalves
Nojima, Mônica Tirre de Souza Araújo e Teresa Cristina Moreira (in
memoriam), por me ensinarem muito mais do que Ortodontia. Os congratulo pelo
comprometimento com a qualidade e tradição desse curso e pela decência com
que o conduzem. Sinto-me honrado por ter feito parte dessa história. Obrigado
por tornarem possível a realização desse meu sonho.
Ao meu orientador, Antônio Carlos de Oliveira Ruellas, por ter acreditado
em mim e no meu trabalho desde a primeira apresentação. Obrigado por ser meu
exemplo profissional e pessoal. Seu comprometimento, dedicação e carinho são
exemplos para nossa geração.
vi
As professoras Daniela Sales Alviano e Maria Teresa Villela Romanos
por terem me ajudado de forma ímpar em seus laboratórios. A atenção
dispensada foi surpreendentemente positiva. Todos os resultados dos meus
experimentos só foram possíveis graças à dedicação e cuidado de vocês.
À professora Claudia Trindade Mattos, por todos os ensinamentos
transmitidos com segurança, competência e carinho.
Ao professor Julio Orrico de Aragão Pedra e Cal Neto, por orientar meus
primeiros passos em pesquisa e por ter sido minha primeira referência de
Ortodontista, a qual me serviu de inspiração para escolha da minha especialidade
e me vale como modelo para meus planejamentos futuros.
As professoras Kátia Regina Hostílio Cervantes Dias e Teresa Cristina
Ávila Berlinck por terem sido minhas tutoras no grupo PET-UERJ e grandes
incentivadoras para meu crescimento dentro e fora da universidade.
Aos meus colegas de turma, Amanda Carneiro da Cunha, Ana Paula
Tenório de Sá, Carolina Vieira Valadares, Cinthia Candemil Nuernberg e
Renata de Faria Santos, por cada segundo de convívio. A amizade e as
lembranças serão carregadas com muito carinho por toda minha vida. Obrigado
por tornarem mais suaves os dias difíceis e mais alegres os dias cinzentos. Tudo
foi bem mais fácil e divertido com a companhia de vocês.
Aos colegas da 47ª turma, Adriele Silveira Araújo, Ana Carolina Portes
Canongia, Júlia Sotero Vianna, Lara Carvalho de Freitas Sigilião, Leonardo
Koerich de Paula e Rodrigo Lopes Lima, pelo conhecimento transmitido e pela
convivência agradável.
vii
Aos colegas da 49ª turma Alice Spitz, Carla Juliane Lima, Fernanda
Blaudt Carvalho Marques, Fernando Cardoso Brito, Lilian Siqueira de Lima e
Nathalia Ferrare Pinto, por trazerem ainda mais alegria para nosso
departamento e pelas conversas sempre recheadas de bom-humor.
As alunas de doutorado, Dayane Lopes da Silva, Geórgia Wain Thi Lau e
Amanda Osório Ayres de Freitas, pela amizade e ajuda na elaboração e
condução dos experimentos realizados.
Aos demais alunos de doutorado, Alline Birra Nolasco Fernandes, Daniel
Paludo Brunetto, Hibernon Lopes Filho, Ligia Vieira Claudino, Lúcio
Henrique E.G. Maia, Sania Ornellas e Teresa Cristina Pereira de Oliveira, pelo
incentivo e compartilhamento de experiências.
Aos funcionários Diane Esteves de Souza Dores, Fernanda Ribeiro da
Silva, Laís Paiva Monteiro, Mônica Mello do Nascimento Gonçalves, Robson
Antônio de França (in memoriam), Vanilda Antônio Saturnino e Waltencir
Silva Ferreira pela dedicação e carinho.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior
(CAPES), pela bolsa de estudos concedida durante o primeiro ano de curso.
À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ)
pela bolsa de estudos concedida durante o segundo ano de curso.
viii
RESUMO
VILAR, Rowan do Vale. Nanofilme de dióxido de silício como inibidor do
crescimento microbiano em superfície plástica. Orientador: Dr. Antônio Carlos
de Oliveira Ruellas. Rio de Janeiro: UFRJ/Faculdade de Odontologia, 2014.
Dissertação (Mestrado em Odontologia - Ortodontia) xiii, 69f.
Os autores tiveram como objetivo verificar a citotoxicidade e o potencial de
inibição microbiana, sobre S. mutans, S. aureus e C. albicans, dos nanofilmes de
dióxido de silício, com e sem agentes antimicrobianos (Bacterlon® e NP Liquid
glass, respectivamente). Para testar a citotoxicidade dos produtos, foi utilizada a
técnica de "dye-uptake" em fibroblastos de camundongos. A fim de avaliar o
potencial antimicrobiano dos nanofilmes, foram utilizadas placas plásticas para
cultivo celular, agrupadas e revestidas com cada um dos nanofilmes e,
posteriormente, inoculadas com suspensões de cada microrganismo, com
diferentes concentrações iniciais. A densidade óptica foi obtida pela mensuração
em espectrofotômetro digital. Quanto à citotoxicidade, a análise de variância Oneway ANOVA apontou diferença estatisticamente significativa entre o Bacterlon ® e
o grupo controle celular não citotóxico (p<0,01), enquanto o NP Liquid glass não a
apresenta (p>0,01). Já os testes microbiológicos com Bacterlon® apresentaram
ix
diferença estatística para todas as espécies em comparação com seus grupos
controle sem revestimento (p<0,05), sendo seu maior efeito de inibição
encontrado nas menores concentrações iniciais de inóculo. Por outro lado, os
testes com NP Liquid glass apenas expressaram diferença estatisticamente
significante no grupo do S. aureus (p<0,05), provavelmente devido a sua
capacidade em formar uma superfície antiaderente. A partir dos resultados
obtidos pode-se concluir que: o nanofilme de SiO2 convencional (NP Liquid glass)
não é citotóxico, e tem potencial para inibir o crescimento de bactérias do tipo S.
aureus, enquanto o nanofilme de SiO2 enriquecido com antimicrobianos
(Bacterlon®) é citotóxico e têm grande potencial de inibir crescimento de bactérias
do tipo S.mutans e S.aureus, além de fungos do tipo C. albicans, principalmente
em concentrações abaixo de 106 UFC/mL.
x
SUMMARY
VILAR, Rowan do Vale. Nanofilme de dióxido de silício como inibidor do
crescimento microbiano em superfície plástica. Orientador: Dr. Antônio Carlos
de Oliveira Ruellas. Rio de Janeiro: UFRJ/Faculdade de Odontologia, 2014.
Dissertação (Mestrado em Odontologia - Ortodontia) xiii, 69f.
The authors aimed at verifying the cytotoxicity and the antimicrobial
potential against S. mutans, S. aureus and C. albicans, of silicon dioxide nanofilms
with and without antimicrobial agents (Bacterlon® and NP Liquid glass,
respectively). To assess the cytotoxicity of the products, the dye-uptake technique
on mouse fibroblasts was applied. In order to assess the antimicrobial potential of
the nanofilms, plastic plates for cell culture were coated, with each of nanofilms,
and, subsequently, inoculated with suspensions of each microorganism with
different initial concentrations. The evaluation parameters were obtained and
measured with digital spectrophotometer. For the cytotoxicity assay, the analysis
of variance statistical test (ANOVA) revealed a statistically significant difference
between the Bacterlon® and the non-cytotoxic control group (p<0.01), not seen in
the NP Liquid glass group (p>0.01). The microbiological assay revealed that, in the
group coated with Bacterlon®, there were statistically significant differences
between all species (p<0.05) compared to the non-coated control groups, with
xi
greatest inhibition effect in lower initial inoculum concentrations. On the other
hand, NP Liquid glass only interfered, in a statistically significant manner, in S.
aureus group (p<0.05), probably due to its ability to form a nonstick surface. From
the results, can be concluded that the conventional SiO2 nanofilm (NP Liquid
glass) is not cytotoxic, and has the potential to inhibit the growth of
Staphylococcus aureus, while SiO2 nanofilm, associated with antimicrobial agents
(Bacterlon®) is very cytotoxic and have great potential to inhibit the growth of S.
mutans, S. aureus and C. albicans, especially on concentrations below 106 CFU /
mL.
xii
ÍNDICE
1
INTRODUÇÃO…….………………………………….………………
1
2
PROPOSIÇÃO……………………………………….……………….
3
3
DELINEAMENTO DA PESQUISA………………………………….
4
3.1 ENSAIO PARA CITOTOXICIDADE……………………………
4
3.2 ANÁLISE DE INIBIÇÃO DO CRESCIMENTO MICROBIANO
7
3.3 ANÁLISE ESTATÍSTICA………………………………………..
12
DESENVOLVIMENTO DA PESQUISA...…………………………..
13
4
4.1 ARTIGO 1: Vilar RV, Romanos MTV, Lau GWT, Ruellas ACO.
Cytotoxicity of two silicon dioxide nanofilms used for multi-purpose surface
protection. A ser submetido para publicação no periódico "Nano Letters".
4.2 ARTIGO 2: Vilar RV, Alviano DS, Ruellas ACO. Antibacterial and
antifungal effect of two silicon dioxide nanofilms used for multi-purpose
xiii
surface protection. A ser submetido para publicação no periódico "Nano
Letters".
5
DISCUSSÃO .................................………………………………...
52
6
CONCLUSÕES…………….…………………………………………
60
7
RECOMENDAÇÕES......................................……...…………….
61
8
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS………………………………..
62
1
1 INTRODUÇÃO
Ao analisar a rotina de trabalho no ambiente odontológico observa-se que
todos os materiais e instrumentais utilizados, nas diversas especialidades, podem
apresentar limitações de natureza mecânica, química ou biológica (Anusavice et
al., 2012).
Quanto à limitação biológica, alguns destes podem ter alto potencial para
colonização de microrganismos patogênicos, necessitando então de algum tipo de
proteção antimicrobiana, a fim de evitar a disseminação desses microrganismos e
uma eventual contaminação cruzada.
Está claramente descrito na literatura que o acúmulo de biofilme
microbiano sobre as superfícies dentárias pode resultar no desenvolvimento de
doença periodontal e cárie (Leung, 1962; Gibbons, 1964). De forma semelhante, o
biofilme acumulado sobre placas acrílicas (próteses dentárias e aparelhos
ortodônticos removíveis) pode causar doenças da mucosa bucal, cujo maior
exemplo é a estomatite (Olsen e Birkeland, 1977).
Devido à grande dificuldade em realizar uma adequada higienização
desses aparatos (Budtz-Jørgensen, 1979) sem que haja prejuízo à sua
integridade superficial, diversas tentativas de se obter uma inibição da formação
2
inicial
de
biofilme
sobre
essas
superfícies
foram
testadas,
seja
com
antimicrobianos incorporados ao metacrilato (Compagnoni et al., 2012) como pela
aplicação de revestimentos ou substâncias glazeadoras (Sesma et al., 2005).
Porém, todas tentativas fracassaram em algum aspecto, seja pela rápida
depleção do agente antimicrobiano ou pela formação de rachaduras e falhas nos
revestimentos.
Visando solucionar estes problemas perenes, o autor propôs estudar uma
nova substância disponibilizada no mercado internacional cujas propriedades
ainda não foram descritas por quaisquer trabalhos indexados nas principais bases
de dados científicas, o nanofilme de dióxido de silício (Nanopool GmbH,
Schwalbach, Alemanha), também chamado de "NP Liquid glass" (NanopoolGmbh).
Como características de interesse tem-se a formação de uma superfície
altamente hidrofóbica e oleofóbica, resistente às variações extremas de
temperatura, às variações de pH e à abrasão. Tais características seriam
decorrentes da natureza ímpar do polímero formado, que além de invisível, possui
características antimicrobianas.
Tendo em vista o grande potencial do produto apresentado e a inexistência
de qualquer publicação científica, até a presente data, com o mesmo, urge a
necessidade de devida investigação científica.
Tal panorama torna os resultados aqui relatados, um prelúdio para outros
estudos, não só na Odontologia mas em outras áreas do conhecimento.
3
2 PROPOSIÇÃO
Os autores se propõem a:
2.1 avaliar a citotoxicidade do nanofilme de SiO2 convencional (NP Liquid glass)
e do nanofilme de SiO2 enriquecido com antimicrobianos (Bacterlon®);
2.2 avaliar se o NP Liquid glass apresenta potencial de redução no crescimento
do S. aureus e da C. albicans;
2.3 avaliar se o Bacterlon® apresenta potencial de redução no crescimento do S.
mutans, S. aureus e da C. albicans;
2.4 avaliar se há influência da concentração inicial de inóculo quanto ao potencial
antimicrobiano de cada revestimento.
4
3 DELINEAMENTO DA PESQUISA
3.1 ENSAIO PARA CITOTOXICIDADE
A metodologia utilizada para avaliar o grau de citotoxicidade dos
revestimentos testados está suportada por diversos trabalhos, publicados em
diferentes periódicos internacionais(Pithon et al., 2009; Pithon, M. M. et al., 2010;
Pithon, Matheus Melo et al., 2010; Santos, Pithon, Fernandes, et al., 2010;
Santos, Pithon, Martins, et al., 2010; Santos et al., 2011; Dos Santos et al., 2012).
3.1.1 CULTURA DE CÉLULAS
A linhagem celular utilizada foi L929 (fibroblasto de camundongo), obtida
do American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD) cultivada em meio
mínimo essencial de Eagle (MEM) (Cultilab, Campinas, São Paulo, Brasil)
suplementado com 2mM de L-glutamina (Sigma, St. Louis, Missouri, USA), 2,5
mg/mL de fungizona (Bristol-Myers-Squibb, New York, USA), 50 mg/mL de
gentamicina (Schering Plough, Kenilworth, New Jersey, USA), 10 mM de HEPES
(Sigma, St. Louis, Missouri, USA), 0,25mL solução de bicarbonato de sódio
(Merck, Darmstadt, Germany) e 10%
de soro fetal bovino (SFB) (Cultilab,
5
Campinas, São Paulo, Brasil) e mantida a 37°C , em ambiente contendo 5% de
CO2.
3.1.2 SUBSTÂNCIAS AVALIADAS
Foram testadas duas substâncias: o SiO2 para revestimento de superfícies
plásticas (NP PlasticProtect) e o SiO2 com agentes antimicrobianos (Bacterlon®),
ambos fabricados pela empresa Nanopool GmbH (Schwalbach, Alemanha).
3.1.3 CONTROLES
Para verificar a resposta celular perante os extremos, dois grupos-controle
foram avaliados: o controle celular (CC), onde as células não foram expostas a
nenhum material e o controle positivo (C+), constituído por um detergente celular
(Tween 80).
3.1.4 ENSAIO DE CITOTOXICIDADE DOS MATERIAIS
Inicialmente, foram utilizadas duas placas de cultivo celular com 24 poços,
ou seja, uma placa para cada substância. Em cada placa, três poços foram
revestidos com 50 µL da substância teste. As mesmas foram armazenadas em
temperatura ambiente durante 24 horas para completa secagem e cura, seguindo
as orientações do fabricante. Durante este tempo, as placas foram mantidas na
capela de fluxo laminar a fim de evitar qualquer contaminação. Em seguida, foi
colocado, em cada poço, meio de cultura (MEM, Cultilab, Campinas, São Paulo,
Brasil).
6
Para a placa de Bacterlon®, a cada 24 horas, o meio de cultura foi
substituído por meio novo e os sobrenadantes coletados após 24, 48, 72 horas, e
avaliados quanto à citotoxicidade para as células L929. Já na placa com NP
Liquid glass convencional, o meio não foi trocado, apenas completado, pois a
hipótese era que o produto não fosse citotóxico, logo, o objetivo foi desafiar o
produto e para isso, deixou-se o meio acumular substâncias citotóxicas que
porventura fossem liberadas durante 7 dias.
Os sobrenadantes foram colocados, em triplicata, em uma placa de 96
poços contendo uma monocamada confluente de L929 e, então, incubados por 24
horas a 37°C em ambiente contendo 5% de CO2.
Terminado o tempo de incubação, o efeito na viabilidade celular foi
determinado através da técnica “dye-uptake”, descrita por Neyndorff em 1990,
com pequenas modificações. Ou seja, após 24 horas de incubação, foram
adicionados 100µL de vermelho neutro a 0,01% (Sigma, St. Louis, Missouri,
USA), em meio de cultura, em cada poço das microplacas e estas foram
incubadas a 37°C por 3 horas para penetração do corante nas células vivas.
Passado esse período, após desprezar o corante, foram adicionados 100µL
de solução de formaldeído (Reagen) a 4% em PBS (NaCl 130 mM; KCl 2 mM;
Na2HPO4 2H2O 6 mM; K2HPO4 1mM, pH7,2) por 5 minutos, para promover a
fixação das células à superfície das placas. Em seguida, para a extração do
corante, foram adicionados 100µL de uma solução de ácido acético (Vetec, Rio de
Janeiro, Brasil) a 1% com metanol (Reagen, Rio de Janeiro, Brasil) a 50%. Após
20 minutos, a leitura foi realizada em espectrofotômetro (BioTek, Winooski,
Vermont, USA) em comprimento de onda de 492nm (µ = 492 nm).
7
3.2 ANÁLISE DE INIBIÇÃO DO CRESCIMENTO MICROBIANO
3.2.1 MICRORGANISMOS UTILIZADOS
Neste estudo, foram expostas aos nanofilmes as seguintes cepas: Candida
albicans (ATCC 10231), Staphylococcus aureus (MRSA BMB 9393) e
Streptococcus mutans (ATCC 25175). Todas estas cepas foram utilizadas em
outros trabalhos publicados na literatura (Söderling e Pihlanto‐Leppälä, 1989; Huh
et al., 1994; Melo et al., 2004).
3.2.2 PREPARAÇÃO E PADRONIZAÇÃO DOS INÓCULOS MICROBIANOS
As cepas das bactérias e levedura utilizadas no estudo foram reativadas de
suas culturas originais, separadamente, em uma placa de Petri contendo caldo
tríptico de soja (TSB), onde ficaram por 24 horas, quando foi realizada a troca da
placa contendo TSB, permitindo assim a proliferação dos microrganismos em
questão por mais 24 horas. Cabe ressaltar que em todas as etapas de incubação
do S. mutans, as placas foram mantidas em ambiente pobre em oxigênio, a fim de
prover as melhores condições possíveis para seu crescimento.
Depois da ativação, os microrganismos foram colocados em um volume
padronizado de caldo Gibbons e Nygaard (5mL) (Gibbons e Nygaard, 1968), para
que o experimento prosseguisse. O caldo foi obtido a partir dos ingredientes e
proporções citadas no Quadro 1.
8
Componentes
Quantidade
TSB
20g
NaCl
2g
K2HPO4
3g
KH2PO4
2g
K2CO3
1g
MgSO4
0,12g
MnSO4
0,015g
Sacarose
50g
Água Destilada
1000 mL
pH ajustado para 6,8
Quadro 1
Composição do caldo Gibbons e Nygaard.
As culturas foram, então, homogeneizadas por 30 segundos em um
agitador de tubos do tipo “Vortex” e, depois, a turbidez foi ajustada através do
espectrofotômetro
(DU®
530
Life
Science
UV/
Vis
Spectrophotometer,
BeckmanCoulter™) até que se obtivesse a densidade óptica de 5 x 107 UFC/mL
para C. albicans e 5 x 108 UFC/mL para o S. aureus e o S. mutans.
3.2.3 DIVISÃO E REVESTIMENTO DAS PLACAS DE CULTIVO
Foram utilizadas 16 placas de plástico (poliestireno) para cultivo celular
com 24 poços (TPP Techno PlasticProducts, Trasadingen, Suíça) as quais foram
divididas de forma que fosse testado o NP Liquid glass convencional com S.
9
aureus e C. albicans e o Bacterlon® com os mesmos dois microrganismos, além
do S. mutans.
Cada placa recebeu um microrganismo e foi revestida com um dos
produtos
testados.
Para
todos
os
experimentos,
foi
realizado
controle
microbiológico do meio de cultura e dos próprios revestimentos, a fim de excluir a
possibilidade de contaminação secundária.
Os testes foram replicados em um segundo tempo a fim de garantir a
reprodutibilidade do experimento.
Seguindo estes critérios, as placas foram divididas conforme a tabela a
seguir:
Tabela 1 Divisão das placas.
Tipo
Revestimento
Microrganismo
Quantidade
Teste
Bacterlon®
S.aureus
2 placas
Teste
Bacterlon®
C. albicans
2 placas
Teste
Bacterlon®
S. mutans
2 placas
Teste
NP Liquid glass
S.aureus
2 placas
Teste
NP Liquid glass
C. albicans
2 placas
Controle
Sem revestimento
S.aureus
2 placas
Controle
Sem revestimento
C. albicans
2 placas
Controle
Sem revestimento
S. mutans
2 placas
10
A fim de garantir que toda a parede do poço entrasse em contato com o
revestimento, cada poço foi completamente preenchido com 3 mL do respectivo
produto. Logo em seguida, todo o volume foi removido a fim de permitir a
secagem e cura do nanopolímero, a qual ocorre após 24 horas em temperatura
ambiente dentro da câmara de fluxo laminar.
3.2.4 DISTRIBUIÇÃO DAS SUSPENSÕES, DILUIÇÕES E ARMAZENAGEM
A fim de determinar qual seria a máxima concentração celular na qual o
suposto efeito antimicrobiano seria observado, foram realizadas sucessivas
diluições da suspensão inicial. Desta forma, cada uma das seis colunas da placa
de 24 poços correspondia a uma concentração (10², 10³, 104, 105,106 e 107), e
cada poço recebeu 0,5mL de suspensão com a respectiva concentração. Visto
que cada placa possui quatro linhas, obtiveram-se quatro poços para cada
diluição (n=4). As concentrações de 106 e 107, tiveram um poço substituído pelo
controle do meio.
Após a devida distribuição dos microrganismos, as placas foram mantidas
em estufa microbiológica a 37°C durante 48 horas. Cabe ressaltar que as placas
com S.mutans foram armazenadas em uma jarra de cultivo em anaerobiose. Após
48 horas, o biofilme foi, vigorosamente, ressuspenso para análise (Figura 1).
Uma alíquota de cada concentração foi removida dos poços revestidos com
Bacterlon® para cada tipo de microrganismo, a fim de verificar a viabilidade das
células presentes nestes meios (UFC).
11
Figura 1 Placa de 24 poços com biofilme ressuspenso para posterior distribuição em
..................uma placa de 96 poços.
3.2.5 PREPARO PARA ESPECTROFOTOMETRIA
Para análise no espectrofotômetro, cada poço teve sua suspensão dividida
em dois poços de uma placa com 96 poços (Figura 2), cada um com 0,1mL de
suspensão. Logo, obtiveram-se oito leituras, para cada diluição de cada tipo de
microrganismo que entrou em contato com cada revestimento (n=8). A
espectrofotometria das amostras foi realizada no comprimento de onda de 550nm.
12
Figura 2 Placa de 96 poços sendo preparada para análise em espectrofotômetro. A
...................suspensão de cada um dos 24 poços da placa anterior foi subdividida em
..................dois poços desta placa.
3.3 ANÁLISE ESTATÍSTICA
As análises estatísticas foram realizadas com auxílio do programa SPSS
13.0 (SPSS Inc.,Chicago, Illinois, EUA). Análise estatística descritiva, incluindo
média e desvio-padrão, foi calculada para todos os grupos avaliados.
Tanto para os testes de citotoxicidade, quanto para os testes de inibição,
os valores da quantidade de células viáveis foram submetidos à análise de
variância (One-way ANOVA) e ao teste de comparações múltiplas de Tukey, para
avaliar se havia diferenças estatísticas entre os grupos. Os resultados dos testes
de inibição também foram submetidos ao Two-way ANOVA a fim de determinar se
o tipo de revestimento, a concentração da suspensão ou uma combinação dos
dois, teria influência sobre a densidade óptica.
13
4 DESENVOLVIMENTO DA PESQUISA
4.1 ARTIGO 1
Vilar RV, Romanos MTV, Lau GWT, Ruellas ACO. Cytotoxicity of two silicon
dioxide nanofilms used for multi-purpose surface protection. A ser submetido para
publicação no periódico "Nano Letters" - Qualis A1 Odontologia (Fator de impacto
12,940).
4.2 ARTIGO 2
Vilar RV, Alviano DS, Ruellas ACO. Antibacterial and antifungal effect of two
silicon dioxide nanofilms used for multi-purpose surface protection. A ser
submetido para publicação no periódico "Nano Letters" - Qualis A1 Odontologia
(Fator de impacto 12,940).
14
ARTIGO 1
CYTOTOXICITY OF TWO SILICON DIOXIDE NANOFILMS USED FOR MULTIPURPOSE SURFACE PROTECTION
Rowan do Vale Vilara, , Maria Teresa Vilela Romanosbb, Geórgia Wain Thi Lauc
Antônio Carlos de Oliveira Ruellasd
.
a
Master Student, Department of Pedodontics and Orthodontics, Universidade
Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, Brazil
b
Professor, Department of Virology, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio
de Janeiro, Brazil
c
phD Student, Department of Pedodontics and Orthodontics, Universidade
d
Professor, Department of Pedodontics and Orthodontics, Universidade Federal
do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, Brazil. CNPq Researcher
Corresponding Author: Antônio Carlos de Oliveira Ruellas, Department of
Pedodontics and Orthodontics, Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ),
Avenida Professor Rodolpho Paulo Rocco, 325, Ilha do Fundão, Rio de Janeiro,
RJ, Brazil, 21941-617. Email: [email protected]
15
ABSTRACT
Long-lasting multi-purpose surface nanocoatings have emerged in the last
decade with the daring goal of solving major problems in any field where a surface
must be kept safe from physical, chemical or biological hazards. Even though the
manufacture's brochures are full of results of assumed laboratorial tests ensuring
their products safeness, questions about their potential cytotoxicity remain
unanswered by studies with no conflict of interest. The authors aimed at verifying
the cytotoxicity of silicon dioxide nanofilms with and without antimicrobial agents
(respectively, Bacterlon® and NP Liquid glass - Nanopool GmbH, Schwalbach,
Germany). To assess the cytotoxicity of the products, the dye-uptake technique on
mouse fibroblasts was applied. The analysis of variance statistical test (ANOVA)
revealed a statistically significant difference between the Bacterlon® and the noncytotoxic control groups (p<0.01), not seen in the NP Liquid glass group (p>0.01).
From the results, it can be concluded that NP Liquid glass is not cytotoxic, while
Bacterlon® is cytotoxic.
KEY WORDS: Silicon dioxide nanofilm, Liquid glass, Cytotoxicity
16
INTRODUCTION
Silicon dioxide (SiO2), also known as silica, is one of the most abundant
and complex families of materials, existing both in nature as being produced
synthetically (Iler, 1979; Sommers, 2007).
Several SiO2-based products have been applied in the most different ways
in medicine, engineering, agriculture, and industries of all kind(Ma e Hadzija,
2013). With a quick web search, it can be noticed that the SiO 2 nano coatings
have emerged in the last decade with the audacious promise of making, almost, all
surfaces easy-to-clean, dirt-repellent, hydrophobic, oleophobic, antimicrobial
protected, alkaline and acid resistant and proof against abrasion and corrosion
with a 50 nm to 500 nm thick invisible layer (Wolinsky, 2006; Edwards, 2010;
Richard, 2010).
If all those novel properties could be added to the coated surfaces, major
benefits would take place in major fields of human activities, bringing financial and
social deep changes. Through this prism, we can foresee one day when daily
problems such as corrosion, staining, wetting, moisture, biofilm formation and
agricultural plagues will be "overcome nightmares".
In spite of many studies that have been done in the last few years about the
biocompatibility of the silica nanoparticles (Napierska et al., 2010; Yang et al.,
2010; Ahmad et al., 2012), no study have already assessed the cytotoxicity of
silicon dioxide nanofilms which, supposedly, would be safe due to its particle-free
nature (Wolinsky, 2006).
Based on the absence of studies on this topic, the authors aimed at
verifying the cytotoxicity of two SiO2 nanofilms, which have high marketing appeal
17
on this niche market, the NP Liquid glass and the Bacterlon®, both produced by
Nanopool GmbH (Schwalbach, Germany) and distributed worldwide under many
different labels (NP plastic protect, Vetroliquido, etc).
MATERIALS AND METHODS
To accurately assess the cytotoxicity of these nanofilms, a heavily
supported methodology was chosen. (Pithon et al., 2009; Pithon, M. M. et al.,
2010; Pithon, Matheus Melo et al., 2010; Santos, Pithon, Fernandes, et al., 2010;
Santos, Pithon, Martins, et al., 2010; Santos et al., 2011; Dos Santos et al., 2012).
Cell line and culture
The cell line used for this study was mouse L929 fibroblasts (American
Type Culture Collection-TCC, Old Town, Maryland, USA). They were cultivated in
Eagle's minimum essential medium (MEM; Cultilab, Campinas, São Paulo, Brazil).
The cell culture was supplemented with 2-mM L-glutamine (Sigma, St. Louis,
Missouri, USA), 10-mM HEPES (Sigma), 50 μg mL−1 gentamicin (Schering
Plough, Kenilworth, New Jersey, USA), 2.5 μg mL−1 fungizone (Bristol-MyersSquib, New York, USA), 0.25-mM sodium bicarbonate solution (Merck, Darmstadt,
Hessen, Germany), and 10 per cent foetal bovine serum (Cultilab) and kept in a 5
per cent CO2 environment at 37°C.
18
Tested nanofilms and sample preparation
The tested nanofilms were: NP Liquid Glass for plastic protection and
Bacterlon®, which, according to patent description (Jürgens e Schwindt, 2009) has
embedded antimicrobial agents (Chitosan, Triclosan and quaternary ammonium
salts) in a not specified mix ratio. Both products are produced by Nanopool GmbH
(Schwalbach, Germany).
One 24-well culture plate was used for each coating nanofilm. In each plate,
three wells were filled with 50 µL of the respective nanofilm. Both plates were
stored under room temperature for 24 hours to guarantee that the product was
completely dried and cured, so the nanolayer was properly formed. The plates
were kept into a laminar flow cabinet to avoid any contamination.
Control groups
To verify the cell response to opposite extreme conditions, two control
groups were evaluated: Cell control group (CC) consisting of cells not exposed to
any material and group C+ (positive control), consisting of cells exposed to Tween
80 (polyoxyethylene 20 sorbitan), which is a well-known cytotoxic agent.
Cytotoxicity assessment
Each well was filled with culture medium (MEM, Cultilab, Campinas, São
Paulo, Brazil). The frequency of medium replacement, along the experiment, was
different for both groups.
19
In the Bacterlon group, every 24 hours, the culture medium was replaced by
new medium. The supernatants were collected after 24, 48 and 72 hours, and then
evaluated for toxicity to L929 cells.
In contrast, based on the hypothesis that the NP Liquid Glass was not
cytotoxic, the culture medium was not replaced in this group. The medium was,
only, filled up to compensate evaporation. That differentiation aimed to challenge
this tested sample, with the consequent accumulation of any cytotoxic substance
which could have been released during a 7 days period.
The supernatant were triplicated and placed into a 96-well culture plate
containing a confluent single layer of L929. The incubation was done into a 5 per
cent CO2 environment, at 37ºC, during 24 hours.
Following the incubation period, cell viability was assessed by the dyeuptake technique (Neyndorff et al., 1990) with minor modifications. After 24 hours,
100 μL of 0.01 per cent neutral-red staining solution (Sigma) was added to each
well, which were incubated for 3 hours at 37°C to allow the dye penetration into
the living cells. The cells fixation was achieved with 100 μL of 4 per cent
formaldehyde solution (Reagen, Rio de Janeiro, Brazil) in PBS (130 mM NaCl, 2
mM KCl, 6 mM Na2HPO4 2H2O, 1 mM K2HPO4, pH = 7.2) for 5 minutes. Finally,
the dye was removed with the addition of 100 μL of 1 per cent acetic acid solution
(Vetec, Rio de Janeiro, Brazil) with 50 per cent methanol (Reagen). Absorption
was measured after 20 minutes using a spectrophotometer (BioTek, Winooski,
Vermont, USA) at a wave length of 492 nm.
20
Statistical analysis
Statistical analysis was performed with the SPSS software (version 20,
SPSS Inc, Chicago, IL, USA). The descriptive statistics, including mean and
standard deviation, was calculated for all groups. Shapiro-Wilk test was applied to
verify the normality. Once the normal distribution of the results had been certified,
One-way ANOVA and Tukey multiple comparison tests (p<0.01) were used for
intergroup comparisons.
RESULTS
The descriptive (means and standard deviation) and statistical analyzes
(Tukey Post Hoc test) of the results regarding the cytotoxicity of NP Liquid glass
are described on Table 1 and Figure 1.
There were no statistically significant difference between the NP Liquid
glass and the cell control group in all evaluated period. The positive control group
presented, continuously, high cytotoxicity.
The descriptive and statistical analyses of the results regarding Bacterlon®
cytotoxicity are described on Table 2 and Figure 2.
There were statistically significant difference between the Bacterlon® and
the cell control group in all evaluated periods (p<0.01). In 24 hours there were no
statistically difference between Bacterlon® and the positive control, since both
exhibit high cytotoxic levels. In 48 and 72 hours, there were statistically significant
difference between all groups, and Bacterlon® was the most cytotoxic in 72 hours.
21
DISCUSSION
Biocompatibility is essential to ensure a safe interaction between a living
organism (human, animal, plant, etc.) and an inanimate material. Biocompatibility
assessments are common in all fields of science, as medicine (Boutrand, 2012),
dentistry (Schmalz e Bindslev, 2008), cosmetics (Tomankova et al., 2011), food
engineering (Das e Goyal, 2014), and others. In vitro cytotoxicity test is the firstchoice approach to evaluate the biocompatibility of any material for biomedical
use, as proposed by the International Standard Organization, ISO 10993.
The model used in this study to assess the cytotoxicity is the monolayer of
mouse
fibroblasts
associated
with
the
dye-uptake
technique
and
spectrophotometry (Neyndorff et al., 1990; Tomakidi et al., 2000).
In this technique, the vital stain is only incorporated by intact vital cells.
Then, the spectrophotometer reads the optical density of each sample, allowing
the comparison between the groups.
It is important to emphasize that this biocompatibility assessment,
with this particular technique and cell culture, gives an initial parameter of how
cytotoxic is this compound, but the obtained results cannot be interpreted as a
complete human (or any other living being) response. For the biocompatibility to
be proved, the material must be tested by experiments ranging from in vitro
assays to clinical trials (Schmalz e Bindslev, 2008; Boutrand, 2012; Isabel Cristina
Celerino De Moraes, 2012).
In the present study, it was observed that the NP Liquid glass for plastic
surfaces (NP PlasticProtect) is not cytotoxic.
22
According to some recent studies, nanoparticles of silica are cytotoxic
(Napierska et al., 2010; Ahmad et al., 2012; Passagne et al., 2012; Hassankhani
et al., 2014). The non-cytotoxicity of the SiO2 nanofilm must be better
investigated, but might corroborate the claim of the manufacturer that this product
is particle-free and biologically safe, which allowed the obtainment of ISO 10993
certification.
Being particle-free is of paramount importance because those studies point
that silica nanoparticles produce, in various tissues, toxic effects such as lipid
peroxidation, oxidative stress, oxidative DNA damage, disruption of cell
membrane, mitochondria damage and induction of apoptosis.
The non-cytotoxicity associated with the decreased strength of microbial
adhesion to the coated surface could drastically change the modus operandi of
how surfaces, of all types, are kept clean. According to the manufacturer, the
coated surfaces could be properly cleaned with hot water, with no need of
conventional cleaning chemicals (Nanopool-Gmbh; Edwards, 2010; Richard,
2010).
Through this prism, social, financial and environmental benefits would rise
with the application of the coating on public means of transportation, restaurants,
public facilities, hospitals and dental clinics, for example. Other applications could
include the prevention of biofilm formation on oil tubes, vascular and urinary
catheters, orthopedic and dental prostheses, dental appliances such as
orthodontic braces and wires, or even directly on tooth surface, to prevent caries
and periodontal disease.
23
In contrast, Bacterlon® showed high cytotoxic until the end of this
experiment (72 hours), presenting the same results as the positive control (Tween
80).
Possibly, the high cytotoxicity of Bacterlon® is one of the factors that could
make it a potent antimicrobial coating. Therefore, it will be important to know if,
when Bacterlon® ceases its cytotoxicity, it preserves its antimicrobial property in
some degree, which would make it eligible for application to surfaces that are in
direct contact to living tissues.
According to the product patent (Jürgens e Schwindt, 2007; 2009), the
antimicrobial agents in Bacterlon® would be chitosan, 'trichloro-2'-hydroxy-diphenyl
ether (Triclosan) and quaternary ammonium salts (QAS). However, confronting the
results of the present study, the low cytotoxicity of chitosan is well stablished on
the literature (Peluso et al., 1994; Singla e Chawla, 2001; Amaral, 2006; Isabel
Cristina Celerino De Moraes, 2012), as well as the biocompatibility of Triclosan
and QAS (Desalva, Kong e Lin, 1989; Bhargava e Leonard, 1996; Zuckerbraun et
al., 1998; Jones et al., 2000; Barbolt, 2002; Fang et al., 2010; Simoncic e Tomsic,
2010) .
Consequently, the hypotheses to explain the high cytotoxicity found might
be the presence of other (not specified) embedded substances, a too high
concentration of those antimicrobial agents that could cause cell damage or a
molecular structural change of those antimicrobial agents when they are
associated with the SiO2 nanofilm.
Despite being cytotoxic, Bacterlon® still might have a huge applicability on
improving infection control in the food industry and hospitals, for example.
24
Nevertheless, studies evaluating its real antimicrobial effect, and all the
other claimed properties, must be done prior to any recommendation.
CONCLUSION
Under these experimental conditions, NP Liquid glass was not cytotoxic up
to 7 days and Bacterlon® showed high cytotoxicity up to 72 hours.
ACKNOWLEDGEMENTS
The authors would like to thank Brazway S.T.E Ltda for the samples given
and CAPES and FAPERJ, Brazilian government entities, for the financial support
provided.
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28
Table 1 NP Liquid glass cytotoxicity test results.
Mean ± SD
NP Liquid
0 hour
24 hours
48 hours
72 hours
7 days
0.827±
0.465 ±
0.706 ±
0.709 ±
0.662 ±
A
0.05
A
0.08
A
0.04
A
0.08 A
glass
0.03
Cell
0.921 ±
0.449 ±
0.674 ±
0.623 ±
0.613 ±
control
0,03 A
0,03 A
0,07 A
0,03 A
0,09 A
Positive
0.066 ±
0.082 ±
0.081 ±
0.095 ±
0.094 ±
control
0.04B
0.00B
0.00 B
0.01 B
0.00 B
*Different letters (in the same column) represent statistically significant
difference (p-value < 0.01).
Table 2 Bacterlon® cytotoxic test results.
Mean ± SD
24 hours
48 hours
72 hours
Bacterlon®
0.163±0.03A
0.216±0.01 A
0.129±0.01 A
Cell control
1.120 ±0.14B
0.595±0.04B
0.659 ±0.04B
Positive control
0.083±0.01 A
0.086±0.01C
0.186±0.01C
*Different letters (in the same column) represent statistically significant
difference (p-value < 0.01).
29
1
0.921
0,9
0.827
Optical Dentisy
0,8
0.706
0,7
0.709
0.674
0.662
0.623
0.613
0,6
0.465 0.449
0,5
0,4
0,3
0,2
0.066
0,1
0.082
0.095
0.081
0.094
0
0 hours
24 hours
NP Liquid Glass
48 hours
Cell control (CC)
72 hours
7 days
Positive control (C+)
Figure 1 Representative graphic of the cell viability in each group (NP Liquid glass
…………..essay).
Bacterlon®
1,2
Cell control (CC)
Positive control (C+)
1.12
Optical density
1
0,8
0.659
0.595
0,6
0,4
0,2
0.216
0.163
0.083
0.129
0.186
0.086
0
24 hours
48 hours
72 hours
Figure 2 Representative graphic of the cell viability in each group (Bacterlon® essay).
30
ARTIGO 2
ANTIBACTERIAL AND ANTIFUNGAL EFFECT OF TWO SILICON DIOXIDE
NANOFILMS USED FOR MULTI-PURPOSE SURFACE PROTECTION.
Rowan do Vale Vilara, Daniela Sales Alvianob, Antônio Carlos de Oliveira Ruellasc
.
a
Master Student, Department of Pedodontics and Orthodontics, Universidade
b
Professor, Department of General Microbiology, Universidade Federal do Rio de
Janeiro, Rio de Janeiro, Brazil.
c
Professor, Department of Pedodontics and Orthodontics, Universidade Federal
do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, Brazil. CNPq Researcher.
Corresponding Author: Antônio Carlos de Oliveira Ruellas, Department of
Pedodontics and Orthodontics, Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ),
Avenida Professor Rodolpho Paulo Rocco, 325, Ilha do Fundão, Rio de Janeiro,
RJ, Brazil, 21941-617. Email: [email protected]
31
ABSTRACT
In the last ten years, long-lasting multi-purpose surface nanocoatings have
emerged to bring novel solutions for ancient problems. By means of its application,
supposedly, all surfaces could be protected from physical, chemical and biological
hazards. In spite of all those appealing advantages, there is no published paper
evaluating its antimicrobial potential. Thus, the authors aimed at verifying the
antimicrobial potential against S. mutans, S. aureus and C. albicans, of silicon
dioxide nanofilms with and without antimicrobial agents (Bacterlon® and NP Liquid
glass, respectively). Plastic plates for cell culture were coated and inoculated with
suspensions of each microorganism with different initial concentrations. The
evaluation parameters (optical density) were obtained and measured with digital
spectrophotometer. The group coated with Bacterlon®, presented statistically
significant differences of all species (p<0.05) compared with their control groups,
with greatest effect in lower initial inoculum concentrations. On the other hand, NP
Liquid glass only interfered, in a statistically significant manner, in S. aureus group
(p<0.05), probably due to its ability to form a nonstick surface. From the results,
can be concluded that the NP Liquid glass has the potential to inhibit the growth of
Staphylococcus aureus, while Bacterlon® have great potential to prevent the
growth of S. mutans, S. aureus and C. albicans, especially on concentrations
below 106 CFU / mL.
KEY WORDS: Silicon dioxide nanofilm, Liquid glass, Antimicrobial
32
INTRODUCTION
Contaminated surfaces and biofilm formation are two of the major problems
in all fields of human activity. Problems that range from the microbiologically
influenced corrosion in industries, hospital cross infection to diseases as caries,
periodontitis and denture-related stomatitis (Leung, 1962; Gibbons, 1964; Burnie
et al., 1985; Wilson, 1998; Hansen et al., 2010).
It is clear that it would be more advantageous to prevent rather than treat
biofilm formation. Therefore, several bacteria-resistant surfaces have been
proposed. Most attempts depend either on adhesion inhibition or on a release of
antimicrobial agents (Meyer, 2003; Genzer e Efimenko, 2006; Zhao et al., 2009;
Banerjee, Pangule e Kane, 2011).
In the first case, researches have focused on inhibiting protein adsorption
(consequently bacterial adhesion) using surface chemical functional groups,
including zwitterionic, mixed-charge, or amphiphilic materials that utilize surface
heterogeneities (e.g., hydrophobicity and charge) to prevent adhesion at the nano
to micrometer scales; weakly polarizable materials that reduce van der Waals
interactions (e.g. Teflon), (Callow e Callow, 2011); and hydrophilic polymeric
materials that inhibit protein adhesion through the formation of highly hydrated
surfaces (Harris, 1992). More recently, structured superhydrophobic surfaces
imitating the Lotus leaf have been suggested (Genzer e Efimenko, 2006; Fadeeva
et al., 2011).
In the second case, techniques usually involve one coating that release
agents such as silver ions, antibiotics (Triclosan, Chitosan, etc.) and quaternary
33
ammonium salts into the surrounding environment (Banerjee, Pangule e Kane,
2011).
In the last ten years, long-lasting multi-purpose surface nano coatings have
emerged to bring novel solutions for ancient problems. By means of its application,
supposedly, all surfaces could be protected from physical, chemical and biological
hazards (Edwards, 2010; Richard, 2010).
In spite of all those appealing advantages, there is no scientific information
about its antimicrobial potential. Thus, the authors aimed at verifying the
antimicrobial potential against S. mutans, S. aureus and C. albicans, of silicon
dioxide nanofilms with and without antimicrobial agents (Bacterlon® and NP Liquid
glass, respectively).
MATERIALS AND METHODS
Tested microorganisms
In this study, the following strains were exposed to nanofilms: Candida
albicans (ATCC 10231), Staphylococcus aureus (MRSA BMB 9393) and
Streptococcus mutans (ATCC 25175): all these strains were used in previous
published studies (Söderling e Pihlanto‐Leppälä, 1989; Huh et al., 1994; Melo et
al., 2004).
Preparation and standardization of microbial inoculum
34
The strains of bacteria and yeast used in the study were reactivated from
their original cultures, separately, in a Petri dish containing Tryptic Soy Broth
(TSB), during 48 hours. It is noteworthy that, in all stages of S. mutans incubation,
the plates were kept in oxygen-poor environment, in order to provide the best
growth conditions possible.
After activation, the microorganisms were added to a standard volume of
the broth Gibbons and Nygaard (5mL) (Gibbons e Nygaard, 1968).
The cultures were homogenized for 30 seconds and then the turbidity was
adjusted with a spectrophotometer (DU® 530 Life Science UV / Vis
Spectrophotometer, BeckmanCoulter™) to an optical density of 5 x 107 CFU / mL
for C. albicans and 5 x 108 CFU / mL for S. aureus and S. mutans.
Tested nanofilms and sample preparation
The tested nanofilms were: NP Liquid Glass for plastic protection and
Bacterlon®, which, according to patent description (Jürgens e Schwindt, 2009) has
embedded antimicrobial agents (Chitosan, Triclosan and quaternary ammonium
salts) in a not specified mix ratio. Both products are produced by Nanopool GmbH
(Schwalbach, Germany).
Sixteen 24-well culture plates (Techno PlasticProducts TPP, Trasadingen,
Switzerland) were used to evaluate both nanofilms and the three different
organisms. To ensure that the entire well wall was in contact with the coating,
each well was filled up with 3 mL of the respective nanofilm. Shortly thereafter, the
entire volume was completely removed. The plates were stored under room
35
temperature for 24 hours to guarantee that the product was completely dried and
cured, so the nanolayer was properly formed. The plates were kept into a laminar
flow cabinet to avoid any contamination.
For all experiments, a microbiological control of the medium and the
coatings was done, in order to exclude the possibility of secondary contamination.
The tests were replicated in a second time in order to ensure reproducibility
of the experiment.
Suspension distribution, dilution and storage
In order to determine which would be the maximum cell concentration at
which the presumed antimicrobial effect could be observed, successive dilutions of
the initial suspension were performed.
Each column of a 24-well plate received an aliquot of suspension with the
respective concentration (10², 10³, 104, 105,106 and 107). Since each plate has six
columns and four lines, there were obtained four wells for each dilution (n = 4).
However, a single well of 106 and 107 concentrations were substituted by control.
After microorganisms distribution, the plates were kept in microbiological
incubator at 37°C for 48 hours. Note that the S. mutans plates were stored in an
oxygen-poor environment. After 48 hours, all adhered biofilm was vigorously
resuspended for analysis
36
To verify cell viability (CFU), a 100µL suspension aliquot, for each
microorganism and each concentration, was removed from the Bacterlon® coated
wells.
Sample preparation for spectrophotometry
Prior to spectrophotometric analysis, each well had its suspension split into
two wells of a 96-well plate, each one with 0.1 mL of suspension. Thus, eight
readings were obtained for each dilution of each microorganism that was into
contact to each coating (n=8). The samples were evaluated by spectrophotometry
at a wavelength of 550nm.
Statistical analysis
Statistical analysis was performed with the SPSS software (version 20,
SPSS Inc, Chicago, IL, USA). The descriptive statistics, including mean and
standard deviation, was calculated for all groups. Shapiro-Wilk test was applied to
verify the normal distribution of the data.
Once the normal distribution of the results had been certified, One-way
ANOVA and Tukey multiple comparison tests were used for intergroup
comparisons.
The results of the inhibition tests were also subjected to two-way ANOVA to
determine if the coating type, the suspension concentration or a combination of
both, have influence on the optical density.
37
RESULTS
C. albicans
The descriptive and statistical analyses of the results regarding the OD
influence of the coating on each concentration are disclosed on Table 1 and
Figures 1 and 2.
For C. albicans, the one-way ANOVA and Tukey post hoc test showed
statistically difference between all the groups (p<0.05). Two-way ANOVA test
showed that both the concentration and the type of coating influence yeast growth.
In all concentrations, a lower (and statistically different) OD for the group
coated Bacterlon® was noticed.
CFU analysis showed that, even at the lowest concentration (10² CFU/mL),
the cells remain viable, regardless the coating nanofilm.
S. mutans
Figures 3 and 4.
For S. mutans, Bacterlon® group showed the lowest OD in all
concentrations, compared with the non-coated control. For the two lowest
concentrations, there was no statistically significant difference between groups.
The OD was similar to the control growth medium, i.e. there were a minimum
number of cells. From 104 CFU/mL onwards (higher concentrations), there was
38
statistical significant difference between the Bacterlon® coated group and the
control.
There was no statistical difference within Bacterlon® group from 102 to 106
CFU / mL, whereas, in the non-coated control group, from 104 CFU/mL onwards,
there was statistical difference between every following concentration (p<0.05).
CFU analysis showed that, even at the lowest concentration (10² CFU/mL),
the cells remain viable.
S. aureus
Figures 5 and 6.
For S. aureus, there was statistical significant difference between all groups
(Bacterlon®, NP Liquid Glass and control) in all concentrations (p<0.05). The
lowest OD for all concentrations was seen in Bacterlon® group. Besides, all values
were statistically indistinguishable from the lowest concentration (10 2 CFU/mL) to
the highest (107 CFU/mL). Moreover, until 106 CFU / mL, the OD means were
almost identical to medium control, which has minimal optical density.
CFU analysis indicated that there was no viable cell up to 104 CFU / mL
concentration, in Bacterlon® coated wells.
39
In NP Liquid glass group, there was no statistical difference between the
102, 103, 104 and 106 CFU / mL concentrations and there was no statistical
difference between the concentrations 104, 105, 106, 107 CFU / mL.
The highest values for OD were observed in the uncoated group (control).
A non-measurable outcome was observed. Whereas, in the control group,
cells were strongly adhered to the culture plate surface, in coated groups, bacteria
gave off easily at resuspension.
The optical microscopy observation (100x with oil immersion) of MRSA cells
incubated in contact to Bacterlon® indicates that the exposed lining cells did not
form the genus characteristic grape-like clusters, being restricted to the formation
of pairs, trios or small groups, which can be seen in Figure 7.
DISCUSSION
Given that it is extremely difficult to prevent bacteria and fungi from
colonizing surfaces, whether they are organic (like teeth, leaves and food) or
inorganic (such as prostheses, appliances, dental chairs, tables, doorknobs, etc.),
the technology tested in this study emerges as a great alternative for the effective
control of microbial colonization of most existing surfaces.
After an extensive literature search, in major databases (Web of
Knowledge, SCOPUS, Scifinder, PubMed, SciELO, Cochrane Library, EMBASE,
ScienceDirect) it was noticed that no independent research, testing the properties
of the silicon dioxide nanofilm, was conducted to date (November, 2014).
40
The adopted method allowed the evaluation of the coatings under the state
which they will be found when applied routinely on a plastic surface, i.e. in a
nanofilm, not in its liquid state.
To quantitatively evaluate the microbial growth on these surfaces, optical
density evaluation by spectrophotometry was the chosen method for being a
common and reliable procedure for many years (Gavin, 1957).
It was observed that, for the group of Candida albicans, the OD tends to
remain the same in lower concentrations (102, 103 and 104 CFU/mL) for any of the
coatings. A fungistatic effect of Bacterlon® was evident due to the statistical
significant difference at all concentrations, probably owing to the presence of the
antimicrobial agents, since the conventional NP Liquid glass failed to reduce yeast
growth.
In addition, it was noteworthy that the NP Liquid glass group showed the
highest OD at low concentrations for C. albicans, which might mean that there is a
growth stimulus to this fungus under these environmental conditions, perhaps due
to the electric charge of the nanocoating.
In the S. mutans group, it was observed that at 102 and 103 CFU/mL, there
was no OD difference between the three groups (test, coating control and medium
control). Possibly that was due to the slow growth of such bacteria in vitro.
However, in the Bacterlon® group, this OD behavior was maintained until the
concentration of 106 CFU/mL, indicating that the present amount of antimicrobial
agent was sufficient to inhibit the growth of this amount of cells. As the cell viability
analysis (CFU) revealed cell growth even at lower concentrations, the conclusion
is that the effect was bacteriostatic. Finally, it was observed that in 107 CFU/mL,
41
the cell growth was exuberant in all groups, probably due to the depletion of the
antimicrobial agent.
In S.aureus group, the most substantial differences were observed, both for
Bacterlon® and NP Liquid Glass groups. For Bacterlon®, the cell viability assay
(CFU) showed that there was no viable cell on all concentrations up to 104
CFU/mL, therefore, the effect was bactericidal.
Even though there were viable cells on higher concentrations (higher than
104 CFU/mL), no statistically significant difference was found between all
concentrations, i.e. the growth of viable cells was not sufficient to change the OD,
in 48 hours.
Microscopically (Figure 7), it can be observed that the cells that were in
contact with Bacterlon® did not form the characteristic 5 to 20-cell clusters of
Staphylococcus (Haaber et al., 2012), and that can be either the cause or the
consequence of the lower growth rate.
Another finding was the effect of NP Liquid Glass on S.aureus, also limiting
their growth, when compared to the control group. Possibly that was due to the
fact that SiO2 nanofilm creates a nonstick layer on the treated surface. Thus, the
cells did not form the strongly attached biofilm, which is characteristic of this genus
(Lowy e Hammer, 1983). Possibly, when these cells are planktonic its cell division
rate is reduced (Haaber et al., 2012).
The, alleged non-cytotoxicity of NP Liquid Glass associated with, the lower
adhesion strength of S. aureus to coated surfaces might bring important benefits
with the application of the coating on dental devices such as dentures, brackets,
wires, etc., in medical and hospital apparatus as endotracheal tube, vascular and
42
urinary catheters and orthopedic prostheses, which are responsible for half of all
nosocomial infections in the United States (Stickler, 2000).
Although some questions about both nanofilms have been elucidated,
others remain unanswered, waiting for further researchessuch as: are them noncytotoxic and resistant to all those physical, chemical and biological hazards, as
alleged? Do the treated surfaces really become superhydrophobic and easier-toclean? Which is the needed reapplication frequency? (Borkow, 2014)
Therefore, from the present study, numerous possibilities are revealed both
for further research and for practical application. We can predict that soon, all the
economic, environmental and social damage caused by the formation of biofilms
on various industrial and medical surfaces or even on organic tissues, such as
human teeth or plant's leaves and seeds (Schwindt, 2013), might remain as
memories from a not-so-distant past.
CONCLUSION

A decreased growth of S. aureus was observed in the culture plates coated
with NP Liquid glass. The same behavior was not observed when C.
albicans was inoculated.

In the samples coated with Bacterlon® there was a growth reduction of all
the three inoculated microorganisms;

There was a direct relationship between the initial concentration of the
suspension and the antimicrobial potential of the coatings, so that in higher
concentrations antimicrobial effect was reduced, when present.
43
ACKNOWLEDGEMENTS
The authors would like to thank Brazway S.T.E Ltda for the samples given, and
CAPES and FAPERJ, Brazilian government entities, for the financial support
provided.
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46
Table 1 Optical density of Bacterlon® and NP Liquid glass coated wells inoculated with C.
albicans.
Mean ± SD
Optical
10²
10³
104
105
106
107
0.913 ±
0.900 ±
0.903 ±
0.952 ±
1.060 ±
1.334 ±
.052A
.037A
.045A
.055A
.066B
.045F
1.128 ±
1.130 ±
1.155 ±
1.191 ±
1.237 ±
1.525 ±
DEF
CDE
CDE
Dentisity
Bacterlon®
Not coated
NP Liquid
glass
.057
1.234 ±
BC
.026
.047
1.200 ±
BCD
.012
.042
1.205 ±
BCDE
.019
EF
.039
1.235 ±
.031
CDE
F
.093
.058G
1.337 ±
1.454 ±
EF
.014
.015G
0.071 ± .004
Medium control
* Different letters (between columns and rows) show a statistical difference. p-value <0.05
Table 2 Optical density of Bacterlon® coated samples inoculated with S.mutans.
Mean ± SD
Optical
10²
10³
104
105
106
107
0.058 ±
0.056 ±
0.059 ±
0.063 ±
0.061 ±
0.283 ±
.002A
.001A
.002A
.004A
.004A
.016D
0.060 ±
0.062 ±
0.090 ±
0.151 ±
0.274 ±
0.498 ±
.001A
.004A
.016B
.010C
.017D
.018E
Dentisity
Bacterlon®
Not coated
Medium control
0.057 ± .003A
47
Table 3 Optical density of Bacterlon® and NP Liquid glass coated samples inoculated
…………..with S. aureus.
Mean ± SD
Optical
10²
10³
104
105
106
107
0.058 ±
0.058 ±
0.060 ±
0.058 ±
0.060 ±
0.102 ±
.002A
.002 A
.004 A
.001A
.003 A
.006 A
1.159 ±
1.161 ±
1.173 ±
1.207 ±
1.254 ±
1.288 ±
.103B
.024B
.081BC
.075C
.012BC
.028C
NP Liquid
0.681 ±
0.671 ±
0.708 ±
0.798 ±
0.756 ±
0.783 ±
glass
.061D
.031D
.052DE
.057DEF
.043EF
.052F
Dentisity
Bacterlon®
Not coated
Medium control
0.058 ± .003A
48
C. albicans
1,8
1,6
Optical density
1,4
Bacterlon
1,2
1
Not coated
0,8
NP Liquid
glass
0,6
0,4
Medium
control
0,2
0
10E2
10E3
10E4
10E5
10E6
10E7
Suspension concentration
Figure 1 Graph representing the optical density of the samples coated with Bacterlon®
…………..and NP Liquid Glass inoculated with C. albicans.
Figure 2 Representative plot of estimated marginal means of optical density for
……………C.albicans group.
49
S. mutans
0,6
Optical density
0,5
0,4
Bacterlon
0,3
Not coated
0,2
Medium
control
0,1
0
10E2
10E3
10E4
10E5
10E6
10E7
…….…….and NP Liquid Glass inoculated with C. albicans.
Figure 4 Representative plot of estimated marginal means of optical density for .............
………….S.mutans group.
50
S. aureus
1,4
Optical density
1,2
1
Bacterlon
0,8
Not coated
0,6
NP Liquid
glass
Medium
control
0,4
0,2
0
10E2
10E3
10E4
10E5
10E6
10E7
…………..and NP Liquid Glass inoculated with S. aureus. .
Figure 6 Representative plot of estimated marginal means of optical density for .............
………….S.aureus group.
51
Bacterlon®
Not coated
Figure 7 Optical microscopy magnification (100x) of Bacterlon® group (upper) and
…….……..Control group (lower) inoculated with the same initial concentration of
…….……..MRSA. Characteristic grape-like clusters can be noticed in control group, while
…….……..bacteria are isolated or in small groups on the coated one.
52
5 DISCUSSÃO
Bactérias e fungos estão presentes em, praticamente, todas as superfícies
existentes e são de crucial importância para a manutenção da vida de todos os
organismos do planeta, inclusive dos seres humanos (Casadevall e Pirofski, 2000;
Johnson e Versalovic, 2012).
Entretanto, o desequilíbrio na concentração ou na localização desses
microrganismos é responsável por diversas doenças infecciosas que podem, até
levar a óbito, como a infecção por Staphylococcus aureus resistente à meticilina
(MRSA), que têm gerado grande preocupação em ambientes hospitalares(Hansen
et al., 2010; Bertrand et al., 2012; Hughes, Tunney e Bradley, 2013; Sadsad et al.,
2013; Levitt, 2014) e no ambiente odontológico (Zimmerli et al., 2009).
A contaminação por MRSA representa problema de saúde pública grave.
Um estudo norte-americano, em 2005, apontou que o número estimado de 94.360
pacientes nos EUA tiveram infecções invasivas de MRSA, resultando na morte de
18.650 pessoas (Klevens et al., 2007), ultrapassando a morbidade da AIDS no
mesmo país.
Outras infecções que permeiam o campo de trabalho odontológico são: a
candidíase, causada por fungos como a C. albicans (Arendrup, 2013) e a cárie,
53
causada por bactérias bucais acidogênicas, incluindo o S.mutans (Gibbons,
1964).
Sabe-se que certos aparelhos e próteses comumente utilizados na rotina
da clínica odontológica podem servir de depósito para estes patógenos
(Uzunoglu et al., 2014) e que qualquer superfície contaminada pode dar origem a
uma infecção cruzada (Georgescu, Skaug e Patrascu, 2002). Logo, torna-se
necessária a pesquisa e o desenvolvimento de meios de controle dessas
populações microscópicas.
Tendo em vista que, com a tecnologia até hoje utilizada, é extremamente
difícil impedir que bactérias e fungos colonizem qualquer superfície, seja orgânica
(como dentes, folhas e alimentos) ou inorgânica (como próteses, aparelhos,
cadeiras odontológicas, mesas, maçanetas, portas, etc.), a tecnologia testada
neste estudo surge como grande esperança para o controle eficaz da colonização
bacteriana de quaisquer superfícies existentes.
Após extensa busca bibliográfica nas principais bases de dados (Web of
Knowledge, SCOPUS, Scifinder, PubMed, SciELO, Cochrane Library, EMBASE,
ScienceDirect), realizada em Novambro 2014, constatou-se que não há qualquer
relato na literatura científica do teste, ou uso, do nanofilme de dióxido de silício
com objetivo de aproveitar qualquer uma das propriedades asseguradas pelo
fabricante (Nanopool-Gmbh). Segundo o mesmo, a aplicação do produto produz
uma superfície lisa, de fácil limpeza, hidrofóbica, livre de bactérias, não agressiva
ao meio ambiente, ou ao ser humano, com longa durabilidade e com baixo custo
(Nanopool-Gmbh; Edwards, 2010)
54
Uma das características mais interessantes das superfícies tratadas seria
que as mesmas se tornariam bioestáticas, pois não permitiriam a aderência
microbiana e desestabilizariam a parede celular, devido à sua natureza catiônica,
criando então um ambiente que não suportaria o crescimento microbiano. Além
disso, a versão com maior efeito antimicrobiano, o Bacterlon®, eliminaria os
microrganismos enquanto a película do produto permanecesse na superfície, a
qual pode durar mais de 10 anos, dependendo do material tratado (NanopoolGmbh).
Através do presente estudo, parte dessas características pode ser
confirmada.
A utilização de materiais biocompatíveis é essencial para garantir um
tratamento biologicamente seguro (Montanaro et al., 2005) e o teste de
citotoxicidade in vitro é a primeira escolha para avaliar a biocompatibilidade de
qualquer material para uso biomédico, como propõe a International Standard
Organization, ISO 10993.
No teste de biocompatibilidade, observou-se que o NP Liquid glass para
superfícies plásticas (NP Plastic Protect) não é citotóxico, dentro das limitações
do presente estudo, podendo ser utilizado com segurança em contato direto com
tecidos de animais, o que corrobora com a alegação do fabricante de que seu
produto é livre de partículas e que possui a certificação ISO 10993.
O fato de ser livre de partículas é de suma importância, pois segundo
diversos estudos, as nanopartículas de sílica produzem, nos mais variados
tecidos, efeitos tóxicos como peroxidação lipídica, estresse oxidativo, dano
oxidativo ao DNA, desarranjo da membrana celular, dano mitocondrial, indução da
55
apoptose e ação antiproliferativa. (Napierska et al., 2010; Yang et al., 2010;
Ahmad et al., 2012; Passagne et al., 2012; Hassankhani et al., 2014).
A não-citotoxicidade, hipoteticamente associada à diminuição da força de
adesão do S. aureus à superfície revestida, pode trazer diversos benefícios com a
aplicação desse revestimento, tanto sobre dispositivos odontológicos como
próteses, bráquetes, fios, etc, e em aparatos médico-hospitalares como tubo
endotraqueais, cateteres vasculares e urinários e próteses ortopédicas, as quais
são responsáveis por metade das infecções nosocomiais nos EUA (Stickler,
2000).
Porém, cabe ressaltar que no teste com Candida albicans, o grupo do NP
Liquid glass apresentou a maior DO em baixas concentrações, o que pode
significar que há um estímulo ao crescimento desse fungo sob essas condições
ambientais, talvez devido à carga elétrica da superfície do nanorevestimento.
Sabe-se que a carga elétrica superficial está diretamente relacionada à
adesão fúngica em superfícies orgânicas e inorgânicas (Jones e O'shea, 1994;
Chung et al., 2010). Devido à escassez de informações sobre as características
da superfície do nanorevestimento, não é possível assegurar qual a carga da
superfície do mesmo, porém, relatórios técnicos não independentes sugerem que
a superfície seja catiônica (Nanopool-Gmbh; Nanopool-Gmbh; Hans-Jürgen,
Buschmann e Schwindt, 2009).
Por outro lado, o Bacterlon® pode ser considerado altamente citotóxico, no
mínimo até 72 horas, pois apresentou o mesmo comportamento do controle
positivo (Tween 80). Será interessante avaliar a substância a longo prazo a fim de
determinar o momento em que esta perde a citotoxicidade.
56
Possivelmente, a citotoxicidade do material é um dos fatores que o tornam
um potente revestimento antimicrobiano. Será importante saber se, quando o
Bacterlon® deixa de ser citotóxico, o mesmo tem sua propriedade antimicrobiana
preservada em algum grau, o que o tornaria elegível para aplicação em
superfícies de contato direto com tecidos vivos.
Esta elevada citotoxicidade contraindica seu uso em superfícies que
entrem em contato direto com tecidos orgânicos, porém o material estaria bem
indicado para a proteção das demais superfícies, principalmente onde se quer
limitar o desenvolvimento de bactérias como o S. aureus. Logo, sua aplicação
estaria indicada para a proteção de todos os equipamentos e ambientes em
hospitais, clínicas, restaurantes, transportes públicos, etc.
De acordo com a patente do produto, (Jürgens e Schwindt, 2007), os
agentes antimicrobianos presentes no Bacterlon® seriam a quitosana, o Triclosan
e sais quaternários de amônio, porém, a alta citotoxicidade encontrada não
corrobora com os achados da literatura sobre essas substâncias, que teriam baixo
potencial citotóxico, isoladamente (Peluso et al., 1994; Bhargava e Leonard, 1996;
Zuckerbraun et al., 1998; Singla e Chawla, 2001; Amaral, 2006; Simoncic e
Tomsic, 2010). Não foram encontrados dados científicos sobre uma possível
interação química entre os três compostos que os tornassem citotóxicos quando
associados.
A quitosana é um polissacarídeo exclusivo derivado da quitina e tem sido
proposta como um biomaterial devido a sua satisfatória biocompatibilidade
aparente (Peluso et al, 1994). É geralmente obtida pela desacetilação parcial de
quitina, o segundo polímero mais abundante. A quitosana compreende uma série
57
de polímeros que variam no seu grau de desacetilação, peso molecular,
viscosidade, pKa, etc. A presença de certo número de grupos amina, permite a
quitosana reagir quimicamente com sistemas aniônicos (não iônicos), resultando
assim na alteração de características físico-químicas das substâncias em
questão.
Apesar dos derivados quaternários da quitosana terem reconhecido efeito
antibacteriano e antifúngico (Allan e Hadwiger, 1979), são necessários mais
estudos para compreender os modos de ação. Acredita-se hoje que haja alguma
alteração morfológica na superfície do microrganismo (Tan et al., 2013).
Atualmente, três mecanismos têm sido propostos: a interação iônica na superfície
resultando na alteração da permeabilidade da membrana com consequente perda
de eletrólitos e micromoléculas; a inibição da síntese de proteínas e de RNA
mensageiro pela penetração da quitosana no núcleo celular; e/ou pela formação
de uma barreira externa que quelaria os metais, provocando a supressão de
elementos essenciais ao crescimento (Liu et al., 2004; Qi et al., 2004; Goy, Britto
e Assis, 2009).
É muito interessante observar que há controvérsias na literatura se o efeito
da quitosana seria bactericida ou bacteriostático (Coma et al., 2002). Já o
Triclosan e os sais quaternários de amônio, geralmente apresentam ação
bacteriostática, sendo bactericidas em altas dosagens. No presente estudo, o
Bacterlon®
foi
bactericida
para
S.aureus,
fungistático
para
Candida
e
bacteriostático para o S.mutans.
No teste microbiológico, observou-se que, para o grupo da Candida
albicans, a DO tende a se manter igual nas menores concentrações (10 2, 103 e
58
104) para qualquer um dos revestimentos. Porém, é evidente o efeito fungistático
do Bacterlon®, devido à diferença estatística em todas as concentrações,
provavelmente devido ao agente antimicrobiano, visto que o NP Liquid glass
convencional falhou em reduzir o crescimento biológico.
No grupo S.mutans, observou-se que em 102 e em 103, a DO, tanto do
grupo teste como do controle, permanecem iguais a do controle do meio.
Possivelmente, isso se deve ao lento crescimento deste tipo de bactéria in vitro.
Porém, no grupo revestido com Bacterlon®, esse efeito sobre a DO é mantido até
a concentração de 106, o que indica que a quantidade de agente ativo foi
suficiente para essa quantidade de células. Como, na análise de viabilidade
celular (UFC) observou-se que há crescimento celular mesmo na menor
concentração, concluiu-se que o efeito seja bacteriostático. Por fim, observa-se
que em 107, o crescimento passa a ser expressivo em todos os grupos,
provavelmente pela depleção do agente ativo.
No grupo S.aureus observou-se os resultados mais expressivos, tanto do
Bacterlon®, quanto do NP Liquid glass. Através do teste de viabilidade celular
(UFC) constatou-se que não havia células viáveis até a concentração de 104, ou
seja, um efeito bactericida foi observado.
Interessante notar também que, mesmo havendo células viáveis após 10 4,
estatisticamente não há diferença entre todas as concentrações dos poços
revestidos com Bacterlon®, ou seja, o crescimento das células viáveis não foi
suficiente em 48h para alterar a DO. Microscopicamente, também contatou-se
que as células que ficaram em contato com o Bacterlon ® não formaram grandes
59
aglomerados característicos do gênero Staphylococcus, e esta pode ser tanto
causa como consequência da menor taxa de crescimento.
Outro achado neste experimento foi o efeito do NP Liquid glass sobre o
S.aureus, limitando também seu crescimento, quando comparado ao grupo
controle. Possivelmente, isto foi devido ao fato do nanofilme de SiO2 criar uma
camada antiaderente na superfície tratada. Dessa forma, as células não formaram
o biofilme fortemente aderido, o qual é característico desse gênero (Lowy e
Hammer, 1983). Possivelmente, quando estas células estão planctônicas, sua
taxa de divisão celular é reduzida (Haaber et al., 2012).
Esse efeito antiaderente em superfícies plásticas é de notável importância,
visto que grande parte das bactérias tem afinidade por superfícies hidrofóbicas,
das quais os plásticos são alguns dos maiores exemplos (Cerca et al., 2005).
Cerca e colaboradores (2005), demostraram que cepas de Staphylococcus
epidermidis, responsáveis por grande parte das infecções nosocomiais, tem maior
adesão inicial e formam mais biofilme em superfícies acrílicas do que sobre vidro.
Visto que o maior fator de virulência associado à habilidade desse organismo em
causar infecções é dependente da aderência aos dispositivos médico-hospitalares
e a formação de biofilmes (Vuong e Otto, 2002), o uso de um material não
citotóxico, antiaderente, resistente, flexível e invisível como o NP Liquid glass, se
mostra promissor.
A partir do presente estudo, inúmeras possibilidades se descortinam, tanto
para pesquisa como para aplicação prática. Pode-se então prever que, em breve,
todo o prejuízo econômico, ambiental e social causado pela formação de biofilmes
indesejados sobre as mais diversas superfícies industriais, hospitalares e até
60
mesmo sobre tecidos orgânicos (como dentes humanos ou sementes e folhas)
serão apenas memórias de um passado não tão distante.
6 CONCLUSÕES
6.1 constatou-se que, sob as condições deste experimento, o nanofilme de
SiO2 convencional (NP Liquid glass) não é citotóxico, enquanto o nanofilme de
SiO2 enriquecido com antimicrobianos (Bacterlon®) é citotóxico, por prazo
indeterminado;
6.2 nas amostras revestidas com NP Liquid glass houve redução do
crescimento do S.aureus, o que não foi observado para a C.albicans.
6.3 nas amostras revestidas com Bacterlon® houve redução no crescimento
dos três microrganismos testados.
6.4 observou-se relação direta entre a concentração inicial da suspensão e
o potencial antimicrobiano dos revestimentos, de forma que nas maiores
concentrações, o efeito antimicrobiano, quando existente, foi reduzido.
61
7 RECOMENDAÇÕES
Para futuras pesquisas pretende-se determinar o tempo máximo de
citotoxicidade do Bacterlon® e se o mesmo ainda expressará atividade
antimicrobiana após este tempo.
Também é sugerido o estudo do potencial antimicrobiano dos dois
revestimentos sobre os mais diversos microrganismos de interesse médico,
agropecuário, industrial, etc.
Será importante avaliar também a resistência mecânica e química desses
materiais, a fim de determinar quanto tempo as superfícies tratadas manteriam
íntegro o revestimento submetido às diversas agressões ambientais.
Também se faz necessário o teste das demais versões do NP Liquid glass,
para revestimento de vidro, cerâmica, tecidos, pedras e madeira, observando o
comportamento de todos quando submetidos aos diversos tipos de testes físicos,
químicos e biológicos.
Por fim, da mesma forma que a malha de nanofilme de dióxido de silício é
utilizada como reservatório quitosana, outras substâncias antimicrobianas e até
medicamentos poderiam ser incorporados ao nanofilme, resultando em uma
tecnologia "time-release" inovadora.
62
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