animais silvestres

Transcription

animais silvestres

Acompanhamento de ovipostura de uma jabutitinga (Chelonoidis denticulata)
Monitoring of yellow-footed tortoise (Chelonoidis denticulata) in ovoposition
Maria do Livramento de Barros Oliveira1*, Laíza de Queiroz Viana Braga1, Francisco
Lúcio Mendes Maia Filho2, Leandro Rodrigues Ribeiro2, Ana Carolina Cunha de
Oliveira3, Andressa Rocha Fraga4.
1-
Graduanda no curso de Medicina Veterinária da UECE; 2-Médico Veterinário de
Animais Selvagens; 3-Graduanda no curso de Medicina Veterinária da University of
Nottingham; 4-Graduanda em Ciências Biológicas pela UECE.
*E-mail: [email protected]
ABSTRACT
The reproductive physiology and biology of testudines are not completely known. There
is, however, a large amount of research on reproductive behaviour of the species. In this
study we present an adult tortoise which copulated and had delayed ovoposition.
Dystocia was suspected and radiography was used as a diagnostic test. There was a lack
of clinical signs of retention and dystocia was not observed in the x-ray images. In
addition to that, the lack of information about the fecundation and ovoposition periods
didn´t allow a conclusive diagnosis. 279 days following copulation, the eggs were
located in an inadequate ovoposition and morphologically unviable.
Key words: testudines, reproduction, ovoposition.
Palavras-chave: quelônios, reprodução, ovoposição.
INTRODUÇÃO
O interesse por estudo de reprodução em répteis vem crescendo no Brasil,
devido às necessidades conservacionistas. Os jabutis pertencem à ordem Testudinata,
com ocorrência natural no Brasil do gênero Chelonoidis com duas espécies: C.
carbonaria (Spix, 1824) e C. denticulata (Linnaeus, 1766) (Bérnils, 2010).
Os quelônios são animais ovíparos, com reprodução sazonal e eclosão dos
filhotes em condições ambientais favoráveis. Muitos fatores influenciam na reprodução,
mas o principal é a temperatura (Denardo, 1996). Os C. denticulata atingem a
maturidade sexual entre seis e dez anos, com postura de oito a 18 ovos, tendo um
período de incubação de 60 a 90 dias, a uma temperatura ideal de 28 a 31 ºC (Cubas &
Baptistotte, 2006).
Ciência Animal - Suplemento, 2012
Trabalho apresentado no VI Congresso Norte Nordeste de Reprodução Animal
7
O comportamento de nidificação é estereotipado nas diferentes espécies,
ocorrendo cinco etapas básicas: deambulação, abertura da cova, postura dos ovos,
fechamento da cova e abandono do ninho (Molina, 1992).
Alguns problemas reprodutivos são comuns em animais de cativeiro, como as
distocias nas fêmeas e o prolapso peniano nos machos, sendo os mesmos relacionados a
erros de manejos ambientais e/ ou alimentares (Matias et al., 2006).
O objetivo do trabalho é relatar o tempo decorrido da cópula à ovipostura em um
exemplar de C. denticulata.
MATERIAL E MÉTODOS
Um animal da espécie Chelonoidis denticulata (jabutitinga), fêmea, com sete
anos e pesando cinco quilos, foi atendido em domicílio, no mês de maio, na cidade de
Fortaleza, Ceará, com relato de cópula por cinco dias, não sendo observada ovipostura
em dois meses após este evento. Após análise clínica, foram solicitados exames
radiográficos em posição dorsoventral, os quais foram realizados no setor de Radiologia
da Faculdade de Veterinária da Universidade Estadual do Ceará (FAVET/UECE), sendo
o primeiro exame realizado no dia da consulta, e o segundo 53 dias após o primeiro
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Na primeira radiografia foram observados quatro ovos no oviduto, de formatos e
tamanhos diferentes, e pelve com passagem conveniente. Para melhor avaliação, o
exame foi repetido após 53 dias, não sendo observada neste intervalo nenhuma mudança
comportamental do animal. No novo exame foram observados dez ovos no oviduto,
sendo que os seis novos ovos apresentavam-se semelhantes aos antigos.
As distocias são comuns em répteis e são acompanhadas de sinais clínicos como
apatia, inquietação e comportamento de cavar para fazer ninhos (Cubas & Baptistotte,
2006), não sendo nenhum destes observado na jabota em questão. Sabendo-se que os
répteis podem estocar sêmen por cerca de seis meses após a cópula (Denardo, 1996) e
não dispondo em literatura do tempo para ovoposição após a fecundação, os dados
foram insuficientes para o diagnóstico de distocia. Os tratamentos indicados para
distocia não são isentos de riscos à vida do animal, conforme os resultados do trabalho
de Matias et al. (2006), portanto, optou-se pelo tratamento conservador, sendo indicado
8
alimentação adequada, fornecimento de local onde a mesma pudesse exercer os hábitos
da espécie e acompanhamento comportamental.
Segundo relato do proprietário, animal foi observado escavando buracos no mês
de setembro, mas não foram depositados ovos. Em dezembro (279 dias após a cópula e
218 dias após o primeiro exame radiográfico), a jabota realizou duas oviposturas com
intervalo de 15 dias, no entanto, os ovos apresentavam-se mal-formados e de vários
tamanhos, sendo relatado pela proprietária que os mesmos foram deixados expostos no
jardim, e que a jabota apresentava o comportamento de proteção dos ovos. O insucesso
reprodutivo deste relato de caso pode ser atribuído tanto pela morfologia inadequada
dos ovos como pelas condições de ovipostura, visto que o animal não apresentou as
fases comportamentais de nidificação conforme descritas por Molina (1992).
CONCLUSÕES
Devido à falta de informações sobre a fisiologia reprodutiva básica dos
testudinatas, como o tempo de formação do ovo e ovipostura dos mesmos, torna-se
evidente a necessidade de pesquisas na área para fundamentar os tratamentos clínicos e
fornecer subsídios para fins conservacionistas.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
BÉRNILIS, R. S. 2010. Brazilian reptiles – List of species. Accessiblea
thttp://www.sbherpetologia.org.br/. Sociedade Brasileira de Herpetologia. Visualizada
30/04/12.
CUBAS, P. H; BAPTISTOTTE, C. Chelonia (Tartaruga, Cágado, Jabuti). In CUBAS,
Z. S.; SILVA, J. C. R.; CATÃO-DIAS, J. L. Tratado de Animais Selvagens, 2006. p.
86, 119.
DENARDO, D. Reproductive biology. In: MADER, D. R. Reptile Medicine and
Surgery, Ed.2º, 1996, .p. 376 - 390.
MATIAS, C. A. R.; ROMÃO, M. A. P.; TORTELLY, R.; BRUNO, S. F. Aspectos
fisiopatológicos em Jabutipiranga (Geochelonia carbonaria Spix 1824). Ciência Rural.
V.36, n 5, p. 1494-1500, 2006.
MOLINA, F. B., Comportamento Reprodutivo de Quelônios. Biotemas, 1992. p. 61 70.
9
Aspectos histomorfométricos dos ovários de cutias (Dasyprocta agouti) criadas no
semi-árido nordestino do Brasil
Histologic and morphometric aspects of the ovaries from agoutis (Dasyprocta agouti)
bred under captivity in northeast Brazilian semiarid
Erika Aparecida Araújo dos Santos*1; Gabriela Liberalino Lima1; Ana Paula Ribeiro
Rodrigues2; Bruno Rodrigo Simão3; Moacir Franco de Oliveira4; Alexandre Rodrigues
Silva1
1
2
Laboratório de Conservação de Germoplasma Animal (LCGA) – UFERSA;
Laboratório de manipulação de folículos ovarianos pré-antrais (LAMOFOPA) - UECE;
3
Departamento de Ciência Ambientais e Tecnológicas – UFERSA;
4
Departamento de Ciências Animais – UFERSA;
*email: [email protected];
ABSTRACT
The histological and morphometric features of the ovaries from six female agoutis were
described. The cell components, as well as the histologic structure of the ovary were
very similar as described in other rodent species. The diameters for follicles, oocyte and
nuclei, respectively, were: 18.62 ± 3.40µm, 12.28 ± 2.37µm and 6.10 ± 0.93µm for
primordial, 23.75 ± 5.70µm, 14.22 ± 3.00µm and 6.70 ± 1.24µm for primary and 88.55
± 17.61µm, 52.85 ± 17.56µm and 22.33 ± 17.61µm for secondary follicles.
Additionally, polyovular follicles were observed in all the animals and they represented
7.51% of the total follicles counted.
Key words: Agouti, ovary, preantral follicles
Palavras-chave: Cutias, ovário, folículos pré-antrais
INTRODUÇÃO
A cutia é um importante roedor silvestre da fauna brasileira, cujo interesse pelo
comércio de sua carne tem sido crescentemente despertado (Mathias, 2012). Dessa
forma, surge a motivação em estudar seus aspectos reprodutivos, no intuito de elucidar
eventuais problemas na sua criação, produção e reprodução, bem como, otimizar a
construção de um modelo biológico para outras espécies de roedores que estejam em
extinção. Este trabalho objetivou descrever as características histológicas e
10
morfométricas dos ovários de cutias, apresentando os diâmetros dos folículos ovarianos
pré-antrais nas suas diversas categorias (primordial, primário e secundário).
MATERIAL E MÉTODOS
Os animais usados neste trabalho são provenientes do Centro da Multiplicação
dos Animais Silvestres (CEMAS) - UFERSA. Foram utilizadas seis fêmeas, com idade
de 2 a 6 anos, pesando 2,42 ± 0,19 kg. Os animais foram mantidos em baias coletivas e
alimentados com frutas e ração balanceada produzida na própria universidade,
recebendo água à vontade. A eutanásia dos animais seguiu os preceitos éticos
internacionais. Foram coletados seis pares de ovários, os quais foram submetidos ao
processamento de histologia clássica e avaliados através de microscópio óptico com
aumento de 40x (Carl Zeiss Ótico Inc., Chester, EUA). Os dados foram expressos em
média e desvio padrão e analisados pelo ANOVA (P < 0,05).
Os ovários apresentaram-se como corpos ovoides e simétricos (P < 0,05). A
média do comprimento dos ovários esquerdo e direito foram 1,05 ± 0,09 e 1,04 ± 0,07
cm, respectivamente. Na análise histológica, o epitélio germinativo foi caracterizado
externamente por uma camada de células cubóides e imediatamente abaixo, uma região
formada por tecido denso com poucos vasos sanguíneos. A túnica albugínea foi
observada e, abaixo desta, havia uma camada de tecido conjuntivo formando o estroma,
o qual continha os folículos. Fibras musculares lisas foram observadas no estroma,
circundando os folículos. Essa estrutura (Figura 1) se assemelha ao que foi descrito em
outras espécies de roedores (Celestino, et al. 2004). Apesar do diâmetro folicular
(Tabela 1) variar de acordo com a espécie (Martins, 2004), os valores obtidos para as
cutias assemelham-se àqueles descritos para camundongos e hamsters (Griffin, 2006).
Folículos pluriovulares foram observados em todos os animais, sendo mais frequentes
em folículos primordiais, representando um total de 7,51% dos folículos contados.
11
Figura 1 – Análise histológica do ovário de cutias (Dasyprocta agouti). Epitélio germinativo
(seta), túnica albugínea (*), estroma (S) e folículos (setas cheias). (40x)
Tabela 1 – Diâmetros (µm) dos folículos ovarianos, oócitos e núcleos de cutias (Dasyprocta
aguti), distribuídos por categoria (média ± desvio padrão).
A,B,C
Categoria
Folículo
Oócito
Núcleo
Primordial
18,62 ± 3,40B
12,28 ± 2,37C
6,10 ± 0,93C
Primário
23,75 ± 5,70B
14,22 ± 3,00B
6,70 ± 1,24B
Secundário
88,55 ± 17,61A
52,85 ± 17,56A
22,33 ± 17,61A
Letras diferentes na mesma coluna indicam diferenças significativas (P<0,05).
CONCLUSÃO
Importantes características dos ovários de cutias foram aqui descritas, denotando
diversas semelhanças com outras espécies roedoras. Tais informações são importantes
para o conhecimento da morfofisiologia reprodutiva das fêmeas desta espécie.
CELESTINO, J. J. H.; FIGUEIREDO, J. R. Morphological and ultrastructural analysis
of sheep primordial follicles preserved in 0.9% saline solution and TCM 199
Theriogenology. v. 62. p. 65-80, 2004.
GRIFFIN, J.; EMERY, B. R.; HUANG, I.; PETERSON, C. M.; CARRELL, D. T.
Comparative analysis of follicle morphology and oocyte diameter in four mammalian
species (mousa, hamster, pig and human). Journal of experimental & Clinical Assisted
Reproduction. v. 3. p. 9, 2006.
MARTINS, F. S. Efeito da solução à base de água de coco e do meio essencial mínimo
sobre a ativação e crescimento in vitro de folículos primordiais caprinos. 82f. 2004.
12
Dissertação (Mestrado em Ciências Veterinárias) – Universidade Estadual do Ceará.
Faculdade de Veterinária, Fortaleza, 2004.
MATHIAS, J. Paca, tatu, cutia sim. Com o hábito de comer grãos, tubérculos, verduras,
legumes e frutas, a alimentação na prática pesa pouco no bolso do criador. Acesso em:
16
de
abril
de
2012.
Disponível
em:
http://revistagloborural.globo.com/GloboRural/0,6993,EEC1172966-4530-1,00.html
13
Ativação partenogenética de oócitos maturados in vitro em macaco de cheiro
(Saimiri sciureus)
Parthenogenetic activation of oocytes matured in vitro in squirrel monkey (Saimiri
sciureus)
Julianne Silva de Lima1,2; Sarah Raphaella Rocha de Azevedo Scalercio1,2; Nathália
Nogueira da Costa3; Adriel Behn Brito*1,2; Elizabete Nikolak1,2; Sheyla Farhayldes
Souza Domingues1,2
1
Laboratório de Biologia e Medicina de Animais da Amazônia, UFPA, Brasil
2
Programa de Pós-graduação em Ciência Animal, UFPA, Brasil
3
Laboratório de Fertilização in vitro, UFPA, Brasil
* Email: [email protected]
ABSTRACT
The aim this study was develop a protocol of in vitro embryo production (IVEP) in
Saimiri sciureus, performing maturation in vitro (IVM) and following parthenogenetic
activation (PA). Oocytes was subjected to PA by applying ionomycin combined with 6DMAP. In total, 89% of oocytes reached metaphase II, observing 85% cleavage rate and
33% of blastocist rate. This study is first to describe PIVE in S. sciureus using oocytes
in vitro matured. This study will improve in developing biotechnologies of reproduction
in primates.
Key words: In vitro embryo production; in vitro maturation; Parthenogenesis.
Palavras-chave: Produção in vitro de embrião; Maturação in vitro; Partenogênese.
INTRODUÇÃO
Entre os primatas neotropicais, a espécie Saimiri sciureus, conhecida
popularmente por macaco de cheiro, destaca-se como um importante modelo
experimental para pesquisas biomédicas. Apesar desse relato, as biotecnologias da
reprodução (BR) ainda são pouco estudadas nessa espécie (Domingues & CaldasBussiere, 2006). Um dos fatores limitantes para a eficácia das BR é a obtenção de
oócitos viáveis. Diversos trabalhos envolveram protocolos de obtenção oocitária pela
indução da ovulação (Kuehl & Dukelow, 1979) e estimulação hormonal ovariana
(Asakawa & Dukelow, 1982). No entanto, a obtenção de oócitos imaturos, sem o uso de
14
estimulação hormonal e destinados posteriormente à maturação oocitária in vitro (MIV),
ainda não foi descrita. Estudos básicos sobre as BR são indispensáveis para obter a
produção in vitro de embriões (PIVE). Neste contexto, o objetivo do presente trabalho
foi desenvolver um protocolo de PIVE em S. sciureus, realizando a MIV, seguida da
ativação partenogenética (AP).
MATERIAL E MÉTODOS
Todos os procedimentos experimentais foram aprovados pelo Comitê de Ética
em Pesquisa Animal do Instituto Evandro Chagas (CEPAN-0009/2011). Foram
utilizadas 3 fêmeas adultas de S. sciureus, pertencentes ao plantel reprodutivo do Centro
Nacional de Primatas. Os animais foram contidos com Cloridrato de Ketamina
(10mg/PV) e Xilazina (1mg/PV), e para a técnica de laparotomia permaneceram sob
anestesia inalatória (Halotano à 2%). Os oócitos puncionados por aspiração folicular
foram lavados em meio Hepes-TCM 199 e destinados à MIV, de acordo com o
protocolo de Lima et al. (2012) por 44 h, a 37º C, em atmosfera de 5% de CO2. Após a
MIV, os oócitos foram desnudados após sucessivas pipetagens para constatação da
maturação nuclear (aparecimento do primeiro corpúsculo polar) e submetidos ao
protocolo de AP utilizando 5 µM de ionomicina por 5 minutos em associação com 100
µM de 6-DMAP por 3 h. Os possíveis partenotos foram cultivados em meio SOF à 37º
C em atmosfera com 5% de CO2 por 7 dias. Os dados estão apresentados em M ± DPM.
Foram obtidos 12 oócitos pela aspiração folicular, sendo 3 encontrados em
degeneração e 9 submetidos a MIV. Os oócitos considerados degenerados apresentaram
aspecto escuro, retração e/ou divisão desigual do ooplasma. Dessa forma, células com
essas características foram retiradas da MIV, pois é sabido que oócitos de boa qualidade,
com boas características morfológicas é um dos primeiros requisitos para o sucesso da
PIVE (Seneda et al., 2002). Após a MIV, 7 oócitos foram considerados maturados. A
taxa de maturação oocitária foi similar à encontrada em outra espécie de primata
neotropical (89% versus 87%) após a utilização do mesmo protocolo de cultivo in vitro
(Lima et al., 2012). Esses dados ratificam a eficiência da MIV em primatas, podendo
desta forma ser utilizada em outras espécies. Após a AP, a avaliação do
desenvolvimento embrionário ocorreu pela taxa de clivagem (dia 3) com a observação
15
de 85%; e pela taxa de blastocistos (dia 7), com 33%. Este é o primeiro trabalho a
descrever a PIVE em S. sciureus a partir da MIV. A ausência de estimulação hormonal
exógena para o crescimento folicular in vivo está sendo frequentemente questionada
devido aos danos que o excesso de hormônios pode causar nas fêmeas (Zheng, 2007). A
MIV disponibiliza uma oportunidade na sua aplicação devido à redução dos seus
elevados custos. Além desta técnica surgir como uma alternativa para mulheres que
passaram por tratamentos de quimioterapia, promovendo oportunidades reprodutivas
(Zheng, 2007).
CONCLUSÕES
Este estudo auxiliará no aperfeiçoamento de BR em primatas do gênero Saimiri e
melhor compreensão dos aspectos da embriologia desta espécie, além de servir como
um modelo experimental para humanos e outros primatas ameaçados de extinção.
ASAKAWA, W.; DUKELOW, R. Chromosomal analyses after in vitro fertilization of
squirrel monkey (Saimiri sciureus) oocytes. Biology of Reproduction, v. 26, p. 579-583,
1982.
DOMINGUES, S. F. S.; CALDAS-BUSSIERE, M. C. Fisiologia e biotécnicas da
reprodução desenvolvidas em fêmeas de Primatas Neotropicais importantes para a
pesquisa biomédica. Revista Brasileira de Reprodução Animal, v. 30, p. 57-71, 2006.
KUEHL, T. J.; DUKELOW, W. R. Maturation and in vitro fertilization of follicular
oocytes of the squirrel monkey (Saimiri sciureus). Biology of Reproduction, v. 21, p.
545-556, 1979.
LIMA, J. S.; LEÃO, D. L.; SAMPAIO, R. V.; BRITO, A. B.; SANTOS, R. R.;
MIRANDA, M. S.; OHASHI, O. M.; DOMINGUES, S. F. S. Embryo production by
parthenogenetic activation and fertilization of in vitro matured oocytes from Cebus
apella. Zygote, Cambridge University Press, p. 1-5, 2012.
SENEDA, M. M.; ESPER, C. R.; GARCIA, J. M.; ANDRADE, E. R. Aspectos técnicos
e biológicos da obtenção de oócitos bovinos: revisão de literatura. Semina: Ciências
Agrárias, Londrina, v. 23, n. 1, p. 101-110, 2002.
ZHENG, P. Effects of in vitro maturation of monkey oocytes on their developmental
capacity. Animal Reproduction Science, v. 98, p. 56-71, 2007.
16
Avaliação do auto-transplante intraperitonial de fragmentos de córtex ovariano de
macaco de cheiro
Evaluation of intraperitoneal autotransplantation of fragments of ovarian cortex of
squirrel monkey
Sarah Raphaella Rocha de Azevedo Scalercio1,2; Elizabeth Nikolak1,2 ;Marcia Cristina
Miranda1,2; Adriel Behn Brito*1, 2; Sheyla Farhayldes Souza Domingues1,2 Regiane
Rodrigues dos Santos1,2,3
1
Laboratório de Biologia e Medicina de Animais da Amazônia, UFPA, Brasil
2
3
Programa de Pós-graduação em Ciência Animal, UFPA, Brasil
Faculty of Veterinary Medicine, Utrecht University, Utrecht, The Netherlands
*Email: [email protected]
ABSTRACT
The main objective of this study is evaluate the intraperitoneal autotransplantation of
fresh ovarian cortex fragments of Saimiri sciureus. Therefore, we used classic histology
to evaluate the follicular morfology, after autotransplantation to ensure the quality of
tissue cultured in vivo. This preliminary study demonstrates that intraperitoneal
autotransplantation is appropriate and can be used as a tool to evaluate the follicular
quality of ovarian cortex fragments in the squirrel monkey, and additionally serve as an
experimental model to test autotransplantation in humans and other primates threatened
with extinction.
Key words: Auto-transplantation, ovarian tissue, squirrel monkey.
Palavras-chave: Auto-transplante, tecido ovariano, macaco-de-cheiro.
INTRODUÇÃO
O transplante do tecido cortical ovariano é um procedimento utilizado para
avaliar a sobrevivência e o desenvolvimento folicular após criopreservação, com
importantes aplicações para mulheres submetidas a tratamentos de radio ou
quimioterápicos, uma vez que o transplante após a terapia possibilita o retorno das
funções ovarianas (Donnez & Dolmans, 2010). Esta também é uma alternativa
promissora para a preservação de patrimônios genéticos de animais em perigo de
extinção, possibilitando a posterior utilização em programas de reprodução assistida;
17
viabilizando o sucesso de pesquisas com animais que apresentam dificuldades
reprodutivas ou aqueles utilizados como modelo de estudos na experimentação (Santos
et al., 2010). A espécie Saimiri sciureus, conhecida como macaco de cheiro tem ampla
distribuição geográfica na região amazônica e destaca-se como modelo experimental,
para pesquisas biomédicas incluindo a reprodução humana (Walker et al., 2009). Apesar
de alguns estudos de reprodução com primatas não humanos (PNH), somente
Schonfeldt et al (2010), obteve desenvolvimento folicular, utilizando xeno-transplante,
de tecido ovariano de Callitrhix jacchus, após congelação lenta. Contudo, informações
acerca do transplante de tecido ovariano em PNH neotropicais da Amazônia precisam
ser conhecidas, com objetivo de avaliar a utilização destes, como modelo para cultivo in
vivo, de tecido ovariano, após criopreservação. Neste contexto, este estudo teve com
objetivo avaliar o autotransplante intraperitoneal a fresco de tecido cortical na espécie
de S. Sciureus.
MATERIAL E MÉTODOS
Todos os procedimentos experimentais deste estudo foram aprovados pelo
Comitê de Ética em Pesquisa Animal do Instituto Evandro Chagas (CEPAN-IEC Nº
0009/2011) e seguiram as orientações do Conselho Nacional de Controle de
Experimentação Animal. Foi utilizada uma fêmea adulta (~11 anos) da espécie S.
Sciureus, com características fenotípicas normais para a espécie, pertencentes ao plantel
reprodutivo do Centro Nacional de Primatas, com histórico reprodutivo e bom estado de
saúde comprovado. Para o experimento, o animal foi contido com Cloridrato de
Ketamina (10mg/PV) e Xilazina (1mg/PV), permanecendo sob anestesia inalatória
(Halotano a 2%) e por meio de laparotomia exploratória, um ovário foi trazidos ao nível
da superfície abdominal, para a retirada da biopsia, utilizando uma técnica já descrita
(Santana et al., 2012). A biópsia do tecido cortical ovariano teve aproximadamente 3
mm3. O tecido foi coletado e fragmentado e logo em seguida, coletada a amostra
controle (T0) e posteriormente, os fragmentos restantes foram suturados entre si, com
fio reabsorvível de Ácido Poliglicólico (número 2.0), utilizando agulha cilíndrica, sem
bisel. Após sutura, os fragmentos foram auto-enxertados em uma loja intraperitonial, a 3
cm de distancia a partir da linha alba, e 4 cm a partir da crista do osso ilíaco. Os
enxertos foram coletados e avaliado após 6 meses (T1) e sete meses e meio (T2). Todo
material foi fixado (formaldeido 10%), desidratado, embebido em parafina, seccionado
18
a 4μm e montado em lâmina, para coloração com hematoxilina-eosina (HE) e PAS
(Periodic acid-Schiff). Os Folículos Pré-Antrais (FOPA's) foram contados, por secções
e classificados, de acordo com Domingues et al. (2003). Ou seja, foram considerados
folículos primordiais, aqueles com um oócito rodeado por uma camada de células da
pré-granulosa de forma achatada; transição aqueles que apresentavam uma única
camada de célula mista (achatada e cúbica); primário com uma única camada composta
apenas de células da granulosa de formato cubóide; ou secundário com duas ou mais
camadas de células da granulosa de formato cubóide. Em seguida os FOPA's foram
fotografados utilizando uma câmera (Canon, USA) acoplada ao microscópio (Leica,
Wetzlar, Germany), para captura das imagens (400x). Os folículos foram caracterizados
como morfologicamente normais ou degenerados, de acordo com Santos et al. (2006).
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Foi observado em T0, FOPA’s e numerosos aglomerados de células da
granulosa, encapsulado por uma concha de tecido conjuntivo, distribuídos ao longo do
tecido analisado, corroborando, com dados de Walker et al. (2009), podendo este, ser
um sinal que o animal está iniciando a menopausa. A Tabela 1 resume o número de
FOPA’s observados e distribuídos pela classe folicular. Destes, a maioria eram folículos
primordiais com 33,4% (6/18), primários com 16,6 (3/18) e 27,8% de secundários
(5/18). Com relação a morfologia, 55,6% (10/18) do total de folículos estavam com
aparência normal, dos quais, folículos primordiais, de transição e secundários
apresentaram 30% (3/10) de morfologia normal, seguido dos folículos secundários, com
10% (1/10). Seis meses após o auto-transplante, foi observada uma remodelagem do
tecido ovariano enxertado, notória vascularização local, mostrando uma boa irrigação
tecidual, onde 12 FOPA’s foram identificados, destes, 53,8% (7/13) eram folículos
primordiais e 23,1% (3/13) eram primários. Quando avaliada a morfologia, os folículos
primordiais se mostraram 85,7% (6/7) normais, seguido de folículos primários, com
14,3% (1/7) normais. Em contra partida, cerca de sete meses e meio depois, foi
observado no momento da cirurgia, uma possível absorção do enxerto, uma vez que,
pouco material estava visível, com intenso edema local e reação inflamatória aparente
no peritônio. Esta resposta imunológica não seria esperada, acredita-se que esta
inflamação pode ter sido causada pelo procedimento cirúrgico, no momento da cirurgia
de 6 meses, que pode ter provocado uma infecção, ou, simplesmente porque os
19
fragmentos teciduais eram insuficientes para manter um número mínimo de reserva
folicular por um longo período de tempo.
Tabela. 1: Percentual da população e da morfologia normal de folículos primordiais, primários
e secundários, antes (T0) e 6 meses após auto-transplante (T1).
Classe Folicular
Primordial
Transição
Primário
Secundário
Total
População Folicular
% Classe
T0
T1
33,4
53,8
22,2
15,4
16,6
23,1
27,8
7,7
100
100
Morfologia Normal
% Classe
% Total
T0
T1
T0
T1
30
85,7
50
85.7
30
0,0
75
0,0
10
14.3
33.3
33.3
30
0,0
60
0,0
100
100
10/18
7/13
CONSIDERAÇÕES FINAIS
Foi possível observar FOPA's após 6 meses de autotransplante (T1), sendo este
tempo ideal para o cultivo in vivo, já que com sete meses e meio de transplante, os
FOPA's não estão mais presentes. Desta forma, este estudo preliminar pode sugerir o
autotransplante intraperitoneal do tecido ovariano, como um local apropriado, para
manutenção de folículos, para posterior avaliação do desenvolvimento folicular após a
criopreservação de tecido cortical ovariano, por um período máximo de seis meses.
Ainda é necessário melhorar a técnica de transplante para permitir a sobrevivência
folicular e funcionalidade ovariana por longos períodos.
RE ER NCIAS BIBLIO R
ICAS
DOMINGUES, S. F. S.; FERREIRA, H. S.; MUNIZ, J. A. P. C.; LIMA, A. K. F.;
OHASHI, O. M.; FIGUEIREDO, J. R.; SILVA L. D. M. Mechanical isolation of
capuchin monkey (Cebus apella) preantral ovarian follicles. Arquivo Brasileiro de
Medicina Veterinária e Zootecnia. v. 55, p. 301-308, 2003.
DONNEZ, J. & DOLMANS, M. M. Cryopreservation and transplantation of ovarian
tissue. Clinical Obstetrics & Gynecology, v. 53, n. 4, p.787-796, 2010.
SANTANA, L. N.; BRITO, A. B.; BRITO, D. C.; LIMA, J. S.; DOMINGUES, S. F.;
SANTOS, R. R. Adaptation of a trap door technique for the recovery of ovariancortical
biopsies from Cebus apella (capuchin monkey) Zygote, v. 5 p. 1–4, 2012.
20
SANTOS, R. R.; RODRIGUES, A.P.; COSTA, S. H.;SILVA, J. R.; MATOS, M. H.;
LUCCI, C. M.; BÁO, S. N.; VAN DEN HURK, R.; FIGUEIREDO, J. R. Histological
and ultrastructural analysis of cryopreserved sheep preantral follicles. Animal
Reproduction Science, v. 91, p. 249-263, 2006.
SANTOS, R. R.; AMORIM, C.; CECCONI, S.; FASSBENDER, M.; IMHOF, M.;
LORNAGE, J.; PARIS, M.; SCHOENFELDT, V.; MARTINEZ-MADRID, B.
Cryopreservation of ovarian tissue: An emerging technology for female germline
preservation of endangered species and breeds. Animal Reproduction Science. Aug 18,
2010.
VON SCHÖNFELDT, V.; CHANDOLIA, R.; KIESEL, L.; NIESCHLAG, E.;
SCHLATT, S.; SONNTAG, B. Advanced follicle development in xenografted
prepubertal ovarian tissue: the common marmoset as a nonhuman primate model for
ovarian tissue transplantation, Fertility and Sterility, v. 95, p. 1428-1434, 2010.
WALKER, M. L.; ANDERSON, D. C.; HERNDON, J. G.; WALKER, L. C. Ovarian
aging in squirrel monkeys (Saimiri sciureus). Reproduction, v. 138, n. 5, p.793-799.
2009.
21
Características ultrassonográficas das estruturas ovarianas encontradas durante o
ciclo estral de catetos (Tayassu tajacu)
Ultrasonographic characteristics of the ovarian structures found during the estral cycle
in collared peccaries (Tayassu tajacu)
Keilla Moreira Maia1*; Gislayne Christianne Xavier Peixoto1; Mariana Araújo Silva1;
Aracely Rafaelle Fernandes Ricarte1; Moacir Oliveira Franco1; Alexandre Rodrigues
Silva1
1
Laboratório de Conservação de Germoplasma Animal – LCGA, Universidade Federal
Rural do Semi-Árido – UFERSA, Mossoró, RN, Brasil
ABSTRACT
The objective of the present study was to describe the ultrasonographic characteristics
of the ovarian structures found during the estrous cycle in collared peccaries. The
estrous cycles of four sexually mature female collared peccaries were monitored.
Through ultrasonography, an ovary detection rate of 100% was achieved. The diameter
of the ovarian follicles was 0.23 ± 0.1 cm during the estrogen peak. Corpora lutea were
the hyperechoic ovoid bodies presenting 0.36 ± 0.2 cm identified during the
progesterone phase. To the best of our knowledge, the ultrasonographic characteristics
of the ovarian structures were for the first time described in collared peccaries.
Key words: ovarian morphology; imaging techniques; Collared peccary.
Palavras-chave: morfologia ovariana; técnicas de imagem; cateto.
INTRODUÇÃO
Os catetos (Tayassu tajacu) estão constantemente expostos às ações do
desmatamento e da caça predatória. Como consequência, foram recentemente
classificados como vulneráveis a extinção no Brasil, especialmente nos biomas Caatinga
e Mata Atlântica (ICMBio, 2011). Na tentativa de ampliar os conhecimentos acerca da
espécie, sugere-se a utilização da ultrassonografia como um método de estudo de seus
parâmetros reprodutivos, haja vista que até o presente momento, tal recurso foi apenas
utilizado para diagnóstico de gestação (Mayor et al., 2005). Desse modo, o objetivo do
presente estudo foi descrever as características ultrassonográficas das estruturas
ovarianas encontradas durante o ciclo estral de catetos.
MATERIAIS E MÉTODOS
22
No Centro de Multiplicação de Animais Silvestres (CEMAS/UFERSA), foram
selecionadas quatro fêmeas de cateto com idade média de 16 ± 0,4 meses e pesando
20,6 ± 1,1 Kg. Estas foram monitoradas ao longo de pelo menos um ciclo estral
completo, a cada três dias, utilizando-se um aparelho portátil de ultrassonografia
(Aquila vet, Pie Medical®, Nutricell, Campinas, SP, Brasil), com transdutor
microconvexo em modo B, de 5-7,5 MHz. Os ovários foram identificados e avaliados
quanto à aparência, ecogenicidade e ecotextura, e presença de estruturas, durante as
fases folicular e luteal do ciclo estral. Comparações referentes à morfometria ovariana
foram realizadas utilizando-se ANOVA seguida do teste t de Student (P<0,05).
Ao exame ultrassonográfico, os ovários foram definidos como estruturas ovais,
levemente hipoecóicas em relação ao tecido circundante, e simétricas (P > 0,05). Os
mesmos se mostraram com ecotextura heterogênea, quando da presença de folículo ou
corpo lúteo. As dimensões ovarianas encontradas por ultrassonografia no presente
trabalho foram de 1,05 ± 0,1cm de comprimento, 0,92 ± 0,1cm de largura, semelhantes
às descritas por exame, após necropsia, em animais que viviam sob as mesmas
condições do presente estudo (Lima, 2011). Entretanto, os mesmos valores foram
maiores que os verificados em animais capturados da Floresta Amazônica (Mayor et al.,
2006). Tais diferenças podem ser devido ao fato de que os animais deste estudo foram
criados em cativeiro desde o nascimento, com melhores condições de alimentação,
apresentando um peso corporal maior do que os recém capturados da Floresta
Amazônica. Quanto à avaliação de estruturas ovarianas na fase folicular, os folículos
ovarianos foram identificados em todos os animais deste estudo durante o pico de
estrógeno, apresentando-se como uma estrutura circular, regular, contendo líquido
anecóico. O diâmetro encontrado para o folículo pré-ovulatório foi 0,23 ± 0,1 cm
(Figura 1A). No auge da fase luteal, o corpo lúteo se mostrou como uma estrutura
ovóide, protuberante, projetado na superfície do ovário, com dimensão de 0,36 ± 0,2
cm, atingindo valores máximos de 1,02 cm (Figura 1B). As dimensões encontradas para
estruturas foliculares durante o pico estrogênico correspondem aos descritos
anteriormente para os grandes folículos antrais (~0,23 cm), através de análise
histológica, para a mesma espécie (Mayor et al., 2006). O diâmetro do corpo lúteo
23
encontrado neste mesmo estudo (~0,7 cm) está dentro da variação dos dados
encontrados por ultrassonografia.
Figura 1. Imagens ultrassonográficas dos ovários (setas brancas) de fêmeas de cateto
durante a fase folicular (A) com um grande folículo antral (círculo) projetado na
superfície, e durante a fase luteal (B), mostrando a presença de um corpo lúteo (elipse).
CONCLUSÃO
Ao nosso conhecimento, este estudo descreveu, pela primeira vez, os aspectos
ultrassonográficos das estruturas ovarianas encontradas durante o ciclo estral de catetos.
Constatou-se a eficiência da ultrassonografia quanto a identificação e a caracterização
das referidas estruturas.
ICMBio – Instituto Chico Mendes de Conservação da Biodiversidade. Seis espécies de
mamíferos ungulados estão ameaçadas de extinção no Brasil. Acesso em: 22 de novembro
de 2011. Disponível em: http://www.icmbio.org.br.
LIMA, G. Caracterização e conservação da população de folículos ovarianos pré antrais de
catetos (Tayassu tajacu, Linnaeus, 1758). 2011. 132 p. Dissertação – Curso de Pós
Graduação em Ciência Animal, Universidade Federal Rural do Semi-árido.
MAYOR, P.; LOPEZ-GATIUS, F.; LOPEZ-BEJAR, M. Integrating ultrasonography within
the reproductive management of the collared peccary (Tayassu tajacu). Theriogenology v.
63, p. 1832–1843, 2005.
MAYOR, P.; FENECH, M.; BODMER, R.; LOPEZ-BEJAR, M. Ovarian features of the
wild collared peccary (Tayassu tajacu) from the northeast Peruvian Amazon. Gen Comp
Endocrinol v. 147, p. 268–275, 2006.
24
Caracterização da população de folículos ovarianos pré-antrais de cutias
(Dasyprocta agouti) criadas no semi-árido nordestino do Brasil
Characterization of the ovarian follicle population of agoutis (Dasyprocta agouti) bred
under captivity in the northeastern Brazilian semiarid
Erika Aparecida Araújo dos Santos*1; Gabriela Liberalino Lima1; Patrícia da Cunha
Sousa1; Lizandra de Souza Cordeiro1; Pedro Augusto Cordeiro Borges1; Alexandre
Rodrigues Silva1
1
Laboratório de Conservação de Germoplasma Animal – LCGA,
Universidade Federal Rural do Semi-Árido – UFERSA, Mossoró, RN, Brasil
*[email protected]
ABSTRACT
The aim of this research was to estimate the ovarian follicular population in agoutis. A
total of 6 female were used and their ovaries were submitted to classical histology.
Preantral ovarian follicles were defined as those presenting an oocyte surrounded by one
or more layers or granulose cells, with absence of the antrum, classified as primordial,
primary and secondary. The estimative of the follicular population was found by the
formula: Follicular population = [(Nº of follicles X Nº of sections X Thickness of the
cut)/(Nº of observed sections X means of the diameter of the nucleus)]. Comparison on
the follicular categories was conducted by the ANOVA. A total of 2550.3 ± 3000.7 e
2880.9 ± 2992.7 follicles were found for right and left ovary, respectively, without
significant differences between them. From those, proportions of 84.89% primordial,
14.94% primary and 0.17% secondary follicles were found.
Key words: Agouti, ovary, preantral follicles
Palavras-chave: Cutias, ovário, folículo pre antral
INTRODUÇÂO
A cutia (Dasyprocta agouti) é um roedor pertencente à família Dasyproctidae,
que apresenta um importante papel na propagação de muitas espécies de plantas. Sua
carne representa uma importante fonte de proteína alternativa, com potencial exploração
econômica (Mollineu et al., 2011). Embora esta espécie não esteja em risco de extinção,
sua população tem sofrido uma redução significativa no Brasil, devido à caça
indiscriminada e à destruição de seu habitat (Hosken & Silveira, 2001).
25
A obtenção de informações sobre seus aspectos reprodutivos básicos são
requeridos para o auxílio da sua produção racional e consequente preservação
(Conceição et al., 2008). Nesse sentido, o estudo da população de folículos ovarianos
pré antrais forneceria informações que poderiam contribuir para o aumento da eficiência
de biotécnicas aplicadas a reprodução nesta espécie.
Assim, o objetivo deste trabalho foi estimar a população de folículos ovarianos
pré antrais de cutias, no total e por categoria folicular.
MATERIAL E MÉTODOS
Os animais usados neste trabalho foram provenientes do Centro da
Multiplicação dos Animais Silvestres (CEMAS) - UFERSA. Foram utilizadas seis
fêmeas, com idade de 2 a 6 anos, pesando 2,42 ± 0,19 kg. Os animais foram mantidos
em baias coletivas e alimentados com frutas e ração balanceada produzida na própria
universidade, recebendo água à vontade.
A eutanásia dos animais seguiu os preceitos éticos internacionais. Foram
coletados seis pares de ovários, os quais foram submetidos ao processamento de
histologia clássica e avaliada através de microscópio de luz com aumento de 40x (Carl
Zeiss Ótico Inc., Chester, EUA).
A estimativa da população folicular se deu através da seguinte fórmula
recomendada por Carrijo Jr. (2010):
População Folicular =
Nº de folículos X Nº de seções obtidas X Espessura do corte
Nº de seções observadas X Medida do diâmetro do núcleo do oócito
Os dados foram expressos em média e desvio padrão. A comparação da
população folicular entre as classes foliculares foi executada pelo ANOVA. Os valores
foram considerados estatisticamente significativos quando p< 0,05.
Um total 2550,3 ± 3000,7 e 2880,9 ± 2992,7 folículos foram encontrados nos
ovário direito e esquerdo, respectivamente, não sendo observada diferença estatística
entre eles (P > 0,05). Estes resultados apresentam-se superiores à população folicular
total descrita para camundongas, as quais apresentam uma média de 1.500 folículos por
26
ovário (Shaw et al., 2000). A maioria dos folículos encontrados pertencia à categoria
primordial (84,89%), seguida dos primários (14,94%) e apenas 0,17% representavam os
folículos secundários.
CONCLUSÃO
Este resumo mostra, pela primeira vez, a estimativa da população de folículos
pré antrais no total e por categorias em ovários de cutias. No momento da contagem,
pôde ser observado que existe uma grande variação da população folicular ovariana
entre os indivíduos, o que parece ser uma característica comum entre os roedores.
CARRIJO JR, O. A.; MARINHO, A. P. S.; CAMPOS, A. A.; AMORIM, C. A.; BÁO,
S. N.; LUCCI, C. M.. Morphometry, Estimation and Ultrastructure of Ovarian Preantral
Follicle Population in Queens. Cells Tissues Organs, v. 191, p. 152–160, 2010.
CONCEIÇÃO, R. A.; AMBRÓSIO, C. E.; MARTINS, D. S.; CARVALHO, A. F.;
FRANCIOLLI, A. L. R.; MACHADO, M. R. F.; OLIVEIRA, M. F.; MIGLINO, M. A.
Aspectos morfológicos do saco vitelino em roedores da subordem Hystricomorpha:
paca (Agouti paca) e cutia (Dasyprocta aguti). Pesq Vet Bras. v. 28, p. 253–259, 2008.
HOSKEN, F. M.; SILVEIRA, A. C. Criação de cutias. Ed. Aprenda fácil, 2001.
MOLLINEAU, W. M.; ADOGWA, A. O.; GARCIA, G. W. Liquid and frozen storage
of agouti (Dasyprocta leporina) semen extended with UHT milk, unpasteurized coconut
water, and pasteurized coconut water. Veterinary Medicine international. 2011.
SHAW, J. M.; ORANRATNACHAI, A.; TROUNSON, A. O. Fundamental cryobiology
of mammalian oocytes and ovarian tissue. Theriogenology, v.53, p.59-72, 2000.
27
Caracterização dos padrões de temperatura da bolsa escrotal em catetos (Tayassu
tajacu Linnaeus, 1758) por termografia infravermelha
Characterization of patterns of temperature scrotum in collared peccary (Tayassu
tajacu Linnaeus, 1758) by infrared thermography
Luanda Rêgo de Lima1*, João Batista Freire de Souza Junior², Érika Aparecida Araújo
dos Santos3, Leonardo Lélis de Macedo Costa4, Moacir Franco de Oliveira4, Aracely
Rafaelle Fernandes Ricarte4
¹Mestranda da Universidade Federal do Ceará – UFC;
²Doutorando da Universidade Federal Rural do Semi árido – UFERSA;
3
Mestranda da Universidade Federal Rural do Semi árido – UFERSA;
4
Docente da Universidade Federal Rural do Semi árido – UFERSA
ABSTRACT
The objective of this study was to evaluate the use of infrared thermography in the
evaluation of scrotal temperature of collared peccary, listing the seminal parameters and
standards thermography of the scrotum. For this we used 12 male adults were first
collected the semen and then held thermography of the scrotum. However, it was
observed through the data that there was no relationship between semen quality and
thermographic patterns and that these animals present thermographic patterns of the
scrotum (31.5°C) than most mammals. Is it still necessary to carry out further studies
with larger numbers of animals and use of animals with testicular changes in order to
certify the use of thermography for the selection of breeding collared peccary.
Key words: electroejaculation; scrotal temperature; infrared thermography
Palavras-chave: eletroejaculação; temperatura escrotal; termografia infravermelha
INTRODUÇÃO
Os catetos (Tayassu tajacu) são animais rústicos que produzem carne e couro de
excelente qualidade e atingem a maturidade sexual entre 8 e 11 meses. A técnica de
termografia infravermelha vem sendo testada e utilizada em diversas espécies para
várias finalidades, pois é um método não-invasivo de avaliação da temperatura
superficial da pele. De acordo com Kastelic et al. (1997), os mamíferos possuem
padrões e simetria da temperatura testicular, qualquer alteração destas variáveis pode
28
resultar em queda da qualidade espermática. A termografia foi utilizada para determinar
a temperatura da bolsa escrotal e relacioná-la com os parâmetros seminais.
MATERIAL E MÉTODOS
O experimento foi realizado no Centro de Multiplicação de Animais Silvestres
(CEMAS) da Universidade Federal Rural do Semiárido (UFERSA), Mossoró-RN.
Utilizou-se 12 catetos machos adultos, criados em cativeiros e selecionados através de
exame clínico-geral. Através de um puçá os animais foram contidos para obtenção de
duas imagens testiculares. Utilizou-se câmera termográfica infravermelha, a um metro
de distância, para avaliar as alterações dos padrões e simetria testicular e relacioná-los à
qualidade seminal. Apenas dados com alterações dos padrões termográficos seriam
comparados com os parâmetros seminais. As imagens foram analisadas pelo software
Flir Quickeport 1.2, considerando o padrão de calor oriundo da circulação sanguínea da
bolsa escrotal nas porções média, cranial e caudal. Para a realização da coleta seminal,
os animais foram contidos quimicamente com Propofol (IV) 5 mg/kg (Souza et al.,
2008). Foi utilizado um eletroejaculador e tubos plásticos de 50mL para coleta do
ejaculado, o qual foi imediatamente submetido à avaliação quanto ao aspecto e
coloração, parâmetros seminais, concentração espermática, viabilidade, integridade da
membrana, motilidade e vigor. Foram feitas 2 coletas de sêmen em cada animal, com
intervalos de 15 dias. A análise estatística foi realizada através do software estatístico
SAS. Os dados referentes às características seminais foram expressos na forma de
média e desvio padrão. O teste Shapiro-Wilk verificou as condições de normalidade dos
dados. Foram obtidos coeficientes de correlação de Pearson para temperatura da bolsa
escrotal e parâmetros seminais. As médias da temperatura da bolsa escrotal foram
comparadas pelo teste de Tukey-Kramer e considerado significativo quando p < 0,05.
A temperatura da superfície da bolsa escrotal não apresentou diferenças
significativas, sendo a temperatura média de 31,5°C para as três porções investigadas.
Todos os animais apresentaram o mesmo padrão e simetria da temperatura ao longo do
testículo. A temperatura superficial do abdômen ficou em torno dos 32°C, apenas 0,5°C
acima da temperatura da bolsa escrotal, este dado pode ser característico da espécie ou
pode ter sido ocasionado pelo estresse da contenção física, porém de acordo com
29
Gabaldi e Wolf (2002) é um dado discrepante quando comparado com outros mamíferos
que pode variar de 2°C a 6°C. Esse decréscimo da temperatura testicular é importante
para manutenção da espermatogênese. Os parâmetros seminais estão apresentados na
(Tab.1). Não foi observado nenhum tipo de relação entre os padrões de temperatura
testicular e os parâmetros seminais. Os resultados mostram que a concentração
espermática, assim como o volume do sêmen, obteve desvio padrão superior a média.
Este resultado não se encontra em abordagem na literatura, mas pode ser atribuído à
possível ejaculação retrógrada, já que não foi observado alterações nos padrões
termográficos nestes animais. De acordo com Fagundes et al. (2011), a presença de
espermatozóides no ejaculado de felinos, nem sempre é observada, embora seja
realizada a obtenção do ejaculado com freqüência, é atribuído à ejaculação retrógrada o
motivo para a diminuição de qualidade e quantidade de parâmetros seminais como a
concentração espermática e volume. Apesar disto, este é o método de eleição para
coleta de sêmen na espécie Tayassu tajacu principalmente pela segurança que oferece
aos manipuladores.
Tabela 1 – Valores médios das variáveis ambientais e parâmetros seminais de catetos em
ambiente semiárido.
Variáveis e Parâmetros
Temperatura de ar (ºC)
Umidade Relativa do ar (%)
Motilidade (%)
Vigor (0-5)
Concentração (x 106/mL-1)
Vivos (%)
Hiposmótico (%)
Volume (µL)
Média ±DP
26,64 ±0,82
58,58±4,62
86,25±14,92
4,50±0,68
149,63 ±189,63
66,09 ±16,93
84,22 ±17,05
2045,75 ±2519,23
Os catetos apresentam padrões de temperatura da bolsa escrotal diferente da
maioria dos mamíferos já estudados e não há relação entre os padrões termográficos e a
qualidade seminal. Serão necessários estudos posteriores com maior número de animais
com alterações testiculares para poder atestar se a termografia pode ser empregada na
seleção de reprodutores catetos.
30
FAGUNDES, A.K.F., MOURA, M.R.P., OLIVEIRA, E.C.S., SILVA JR., V.A.
Colheita de sêmen de gatos domésticos por meio de eletroejaculação... Peculiaridades e
desafios. 2011.
GABALDI, S. H., WOLF, A. A importância da termorregulação testicular na qualidade
do sêmen em touros. Ciências Agrárias. FEA, adrenalina, v. 2, n. 2, jul-dez, p 66-70.
2002.
KASTELIC, J.P., SILVA, A.E.D.F., BARBOSA, R.T., MACHADO, R. Novos métodos
de avaliação da capacidade reprodutiva de touros. In Convenção Nacional da Raça
Canchim, p.35-45. 1997.
SOUZA, A.L.P.; CASTELO, T.S.; QUEIROZ, J.P.A.F.; BARROS, I.O.; PAULA,
V.V.; OLIVEIRA, M.F.; SILVA, A.R. Evaluation of anesthetic protocol for the
collection of semen
from
captive
collared peccaries
(Tayassu
tajacu) by
eletroejaculation. Anim Reprod Sci, v.116, p.370–375, 2009.
31
Comparação entre diferentes curvas de resfriamento utilizadas para a congelação
do sêmen de catetos (Tayassu tajacu)
Comparison between different chilling curves used for the cryopreservation of collared
peccaries (Tayassu tajacu) semen
Mariana Araújo Silva1; Gabriela Liberalino Lima1*; Gislayne Christianne Xavier
Peixoto1; Thibério de Souza Castelo1; Valéria Veras de Paula1; Alexandre Rodrigues
Silva1
1
*E mail: [email protected]
ABSTRACT
The objective of the study was to verify the interaction between freezing rates and the
cryopreservation of collared peccary (Tayassu tajacu) semen. Ejaculates from eight
animals were obtained using electroejaculation procedure and evaluated for motility,
vigor, viability, functional membrane integrity and morphology. After dilution in
coconut powdered water (ACP® - 116C) based extender, samples were divided into two
aliquots and submitted to a slow (A) or a fast (B) chilling curve, using a final
concentration of 20% of egg yolk and 3% of glycerol. Samples were packed in straws of
0.25 ml and stored at -196 oC during one week. After thawing, the freezing-thawed
procedures significantly reduced the sperm parameters, but no differences were
observed between the curves (p > 0,05). In conclusion, we recommend cryopreservation
of collared peccary semen from ACP ® 116C, using the fast freezing curve, which
allows maximizing the time during the process.
Key words: freezing curves; powdered coconut water; cryopreservation
Palavras-chave: curvas de congelação; água de coco em pó; criopreservação
INTRODUÇÃO
A criopreservação de gametas é uma importante ferramenta na preservação de
animais silvestres, permitindo a manutenção da viabilidade durante longos períodos, de
recursos genéticos de várias espécies (Fickel et al., 2007), como o cateto (Tayassu
tajacu).
Recentemente, foi demonstrado que o sêmen de catetos pode ser
criopreservado com o uso do diluente à base de água de coco em pó, utilizando uma
32
curva de resfriamento e congelação lenta, descrita para suínos domésticos e adaptada a
esta espécie (Silva, 2012). No entanto, as variações de temperatura envolvidas na
congelação do sêmen reduzem inevitavelmente a proporção de espermatozoides móveis
e causa danos estruturais, bioquímicos e funcionais (Salomon & Maxwel, 1995), por
isso a importância de adequar, para o sêmen das diferentes espécies, uma curva ideal, a
fim de minimizar esses danos. Assim, o objetivo deste estudo foi comparar diferentes
curvas de resfriamento na criopreservação do sêmen de catetos (Tayassu tajacu).
MATERIAL E MÉTODOS
Foram utilizados oito catetos sexualmente maduros provenientes do Centro de
Multiplicação de Animais Silvestres (CEMAS) da UFERSA. Foram obtidos 12
ejaculados obtidos através de eletroejaculação, os quais foram avaliados quanto a
motilidade espermática, vigor, viabilidade, morfologia e funcionalidade e integridade da
membrana acrossomal. Após a diluição em água de coco em pó (ACP-116c®) acrescido
de 20% de gema de ovo, as amostras foram divididas em duas alíquotas, sendo uma
delas submetida à curva de resfriamento lenta (0,092 oC/min) durante 240 min,
previamente descrita para os catetos (Castelo et al., 2010); a segunda alíquota (B) foi
submetida a uma curva de resfriamento rápida (0,3 oC/min) durante 70 min,
previamente descrita para cães (Silva et al, 2006). Após atingirem 5 oC, em ambas as
curvas, as amostras receberam uma concentração final de 3% de glicerol. Em seguida,
foram acondicionadas em palhetas de 0,25 mL, expostas ao vapor de nitrogênio, e
armazenadas em botijão criobiológico. Após uma semana, foram descongeladas em
banho-maria a 37 oC/ 60s, e reavaliadas. Os resultados foram expressos em médias e
erro padrão e submetidos a ANOVA seguida do teste t de Student (P < 0,05), exceto o
vigor que foi avaliado pelo teste de Mann-Whitney (P < 0,05).
RESULTADOS
O processo de congelação e descongelação provocou uma redução nos valores
para todas as características espermáticas avaliadas (P<0,05). Em relação à comparação
das curvas de resfriamento, não foram verificadas diferenças entre as mesmas (P> 0,05),
conforme demonstrado na tabela 1.
33
Tabela 1. Características do sêmen de catetos (n=12) a fresco e após criopreservação, utilizando
diluente à base de água de coco em pó (ACP-116c®), submetido a diferentes curvas de
resfriamento (lenta e rápida).
Características
Fresco
Motilidade (%)
Pós-criopreservação
Curva Rápida
Curva Lenta
91,3 ± 1,9 a
35,8 ± 6,3 b
42,1 ± 8,1 b
Vigor (0 – 5)
4,7 ± 0,1 a
2,7 ± 0,3 b
2,8 ± 0,3 b
Viabilidade (%)
89,7 ± 1, a
42,9 ± 4,7 b
35,6 ± 5,4 b
Int. funcional de membrana (%)
79,2 ± 3,4a
29,7 ± 1,8 b
29,8 ± 3,68 b
77 ± 4,7 a
53,9 ± 7,7 b
58,2 ± 8,1 b
23,0 ± 4,7 b
46,1 ± 7,7 a
41,8 ± 8,1 a
Morfologia Normal (%)
Defeitos Totais (%)
a,b
Na mesma linha, sobrescritos diferentes correspondem a diferença estatística significativa (p
< 0,05).
CONCLUSÃO
Recomenda-se a criopreservação do sêmen de catetos em ACP®-116C,
utilizando a curva de resfriamento rápida, que permite a maximização do tempo durante
o processo.
CASTELO, T.S.; BEZERRA, F.S.B.; LIMA, G.L.; ALVES, H.M.; OLIVEIRA, I.R.S.;
SANTOS, E.A.A.; PEIXOTO, G.C.X.; SILVA, A.R. Effect of centrifugation and sugar
supplementation on the semen cryopreservation of captive collared peccaries (Tayassu
tajacu). Cryobiology. v. 61, n. 3, p. 275-9, 2010.
FICKEL, J.; WAGENER, A.; LUDWIG, A. Semen cryopreservation and the
conservation of endangered species. Eur. J Wildl. Res. v. 53, p. 81–89, 2007.
SALOMON, S; MAXWELL, W. M. C. Storage of ram semen. Animal Reproduction
Science 62, 77-111, 2000.
SILVA, M. A. Criopreservação de sêmen de catetos (Tayassu Tajacu, Linneaus 1758)
em diluente a base de água de coco em pó (ACP -116C). 2011. Dissertação – Mestrado;
Curso de Pós Graduação em Medicina Veterinária, Universidade Federal Rural do Semi
Árido (UFERSA).
34
SILVA, A. R.; CARDOSO, R. C. S.; SILVA, L. D. M.; CHIRINEA, V. H.; LOPES, M.
D.; SOUZA, F. F. Prognostic value of canine frozen-thawed semen parameters on in
vitro sperm oocyte interactions. Theriogenology, v. 66, p.456–62, 2006.
35
Correlação entre as características seminais e dimensões testiculares em catetos
(Tayassu tajacu Linnaeus, 1758)
Correlation between semen characteristics and testicular morphometry in collared
peccaries (Tayassu Tajacu Linnaeus, 1758)
Gislayne C.X. Peixoto1*; Mariana A. Silva1; Andreia M. Silva1; Thiberio S. Castelo1;
Ana Liza P. Souza1; Moacir F. Oliveira1; Alexandre R. Silva1
1
Rural do Semi Árido – UFERSA, Mossoró, RN
ABSTRACT
This research verified the existence of relations between semen characteristics and
testicular morphometry determined by ultrasonography in collared peccaries. A total of
52 ejaculates were obtained from ten adult specimens that had been restrained by
anesthesia. The testicular measurements (length, height, and width) were verified
by ultrasonography, and the testicular volume was calculated according to
Lambert‟s formula. The semen was collected by electroejaculation. No significant
correlations were obtained between the testicular measurements and the semen
producing
characteristics. Results showed that
the
measurement
of testicular
dimensions does not serve as an indicative of fertility in collared peccaries, as there is
no correlation between testicular morphometry and semen characteristics in this species.
Key words: collared peccary; semen; testicular morphometry
Palavras-chave: cateto; sêmen; morfometria testicular
INTRODUÇÃO
A determinação do volume testicular em mamíferos pode refletir a
espermatogênese, pois cerca de 70-80% da massa testicular em algumas espécies
consiste de túbulos seminíferos, que por sua vez pode estar correlacionada com a
contagem total, motilidade, morfologia e produção diária de espermatozoides
(Gouletsou et al., 2008). Assim, é reportado que os testículos maiores sem qualquer
anormalidade produzem mais espermatozoides quando comparados com testículos
menores (Oyeyemi & Okediran, 2007). Conhecimentos acerca da morfologia testicular
de catetos são escassos, limitados somente à descrição da biometria testicular. Dessa
36
forma, o presente trabalho objetivou verificar a existência de correlações entre as
medições testiculares e os parâmetros seminais em catetos.
MATERIAL E MÉTODOS
Um total de 10 machos catetos sexualmente maduros (3,3 ± 1,6 anos),
pertencentes ao Centro de Multiplicação de Animais Silvestres (CEMAS-UFERSA), foi
utilizado neste estudo. Os animais foram contidos quimicamente com propofol, e
submetidos de 4 a 7 sessões de eletroejaculação.
As mensurações da biometria
testicular (comprimento, altura e largura) foram realizadas por ultrassonografia e
aplicadas na fórmula de Lambert (volume = altura x largura x comprimento x 0,71) para
determinação do volume testicular. A circunferência escrotal foi mensurada com auxílio
de uma fita nylon graduada circundando a parte mais espessa do testículo.
Após coleta, o sêmen foi imediatamente avaliado segundo Castelo et al. (2010).
A análise estatística foi realizada pelo programa Statview 5.0, cujos dados foram
expressos em média e desvio padrão. A existência de correlações entre os dados
morfométricos (circunferência escrotal e volume testicular) e as características seminais
(volume, concentração espermática e número de espermatozoides/ml de ejaculado)
foram verificadas pelo teste de correlação de Spearman (p<0,05).
O perímetro escrotal dos catetos apresentou média de 19,4 ± 1,4 cm. Foi
determinada uma baixa correlação não significativa (r = 1,8%; P = 0,892) entre a
circunferência escrotal e a concentração espermática. Na tabela 1, são apresentadas as
correlações entre as características seminais e volumes testiculares, onde nenhuma
correlação significativa foi detectada. Resultados semelhantes foram anteriormente
descritos para suínos domésticos, que apresentaram baixa correlação (r = 0,24) entre a
morfometria testicular, também determinada por ultrassonografia, e contagem de
espermatozoides no ejaculado (Clark et al., 2003), assim como também observado em
onças pintadas (Morato et al., 1999).
37
Tabela. 1: Correlação de Spearman (r) entre as características seminais e a morfometria testicular de
adultos da espécie Tayassu tajacu.
Características Seminais
Morfometria Testicular
Volume
Volume
Volume Total
Testicular
Testicular
Direito
Esquerdo
0,11
-0,13
-0,01
-0,06
-0,06
-0,06
0,11
-0,08
0,04
Volume
Concentração
o
N espermatozoides/ ml de
ejaculado
Correlações não significativas foram verificadas entre os parâmetros avaliados (P > 0.05; n
= 52).
CONCLUSÃO
Em conclusão, as medições das dimensões testiculares não podem ser utilizadas
como indicativo de fertilidade em catetos machos, uma vez que não existe correlação
entre a morfometria testicular e características seminais nessa espécie.
CASTELO, T.S.; BEZERRA, F.S.B.; SOUZA, A.L.P.; MOREIRA, M.A.P.;
PAULA, V.V.; OLIVEIRA, M.F.; SILVA, A.R. Influence of the thawing rate on
the cryopreservation of semen from collared peccaries (Tayassu tajacu) using Trisbased extenders. Theriogenology, v. 74, p.1060–1065, 2010.
CLARK, S.G.; SCHAEFER, D.J.; ALTHOUSE, G.C. B-Mode ultrasonographic
evaluation of paired testicular diameter of mature boars in relation to average total
sperm numbers.Theriogenology, v.60, p.1011–1023, 2003.
GOULETSOU, P.G.; GALATOS, A.D.; LEONTIDES, L.S. Comparison between
ultrasonografic and caliper measurements of testicular volume in the dog. Anim Reprod
Sci., v.108, p.1–12, 2008.
MORATO, R.G.; GUIMARÃES, M.A.B.V.; FERREIRA, F.; BARNABE, R.C.
Reproductive characteristics of captive male jaguars (Panthera onca). Braz J Vet Res
Anim Sci, v.36, p.262–266, 1999.
OYEYEMI,
M.O.;
OKEDIRAN,
B.S.
Testicular
parameters
and
sperm
morphology of chinchilla rabbits fed with different planes of soybean meal. Int J
Morphol., v.25, p.139-144, 2007.
38
Criopreservação de espermatozoides epididimários de catetos (Tayassu tajacu)
utilizando diluente à base de água de coco em pó (ACP®-116c)
Cryopreservation of epididymal sperm from collared peccaries (Tayassu tajacu) using
powdered coconut water (ACP®- 116c) extender
Gabriela Liberalino Lima1*; José Artur Brilhante Bezerra1; Andréia Maria Silva1; Lívia
Batista Campos1; Moacir Franco de Oliveira1; Alexandre Rodrigues Silva1
1
*E mail: [email protected]
ABSTRACT
The objective of the study was to assess the cryopreservation of epididymal sperm from
collared peccaries (Tayassu tajacu) using powdered coconut water (ACP®- 116c)
extender. The epididymis from ten animals was used and processed by the flotation
method using ACP® extender. After recovery, sperm were evaluated for motility, vigor,
viability, functional membrane integrity and morphology. Samples were cryopreserved
by using a protocol previously described for the species, using a final concentration of
20% of egg yolk and 6% of glycerol, being stored for 2 weeks in liquid nitrogen (196ºC). After thawing, it was observed a motility of 35,0 ± 5,6%, vigor of 2,0 ± 0,2,
viability of 36,83 ± 3,1%, 52,2 ± 5,4% of membrane functionality and 55,2 ± 66% of
morphological integrity. In conclusion, the cryopreservation of epididymal sperm from
collared peccaries is an alternative method for gamete preservation in this species.
Key words: epididymal sperm; powdered coconut water; cryopreservation
Palavras-chave: espermatozóides epididimários; água de coco em pó; criopreservação
INTRODUÇÃO
A caça predatória e a destruição de seus habitas tem colocado os catetos
(Tayassu tajacu) entre as principais espécies mamíferas vulneráveis à extinção no
Brasil, sendo considerados criticamente ameaçados na Caatinga e na Mata Atlântica
(ICMBIO, 2011). Trabalhos iniciais relatam a coleta e preservação de sêmen destes
mamíferos (Silva, 2012), porém, a recuperação e conservação de espermatozoides
provenientes da cauda do epidídimo dos mesmos ainda não foram descrita. Salienta-se
que esta técnica aparece como uma importante ferramenta na conservação de gametas
39
de animais silvestres mortos acidentalmente (Anel et al., 2011). Objetivou-se avaliar a
criopreservação de espermatozóides epididimários de catetos utilizando diluente à base
de água de coco em pó (ACP®-116c).
MATERIAL E MÉTODOS
Os procedimentos foram realizados mediante aprovação pelo Comitê de Ética da
UFERSA. Foram usados seis catetos sexualmente maduros provenientes do Centro de
Multiplicação de Animais Silvestres (CEMAS) da UFERSA. Os epidídimos foram
coletados e submetidos à lavagem retrógrada utilizando 5 mL de diluente à base de
ACP®, aquecido à 37º C. Após a coleta, o número total de espermatozoides foi estimado
(concentração obtida na câmara de Neubauer × volume recuperado), e estes foram
avaliados quanto à motilidade, vigor, viabilidade, integridade funcional de membrana e
morfologia. Posteriormente, as amostras foram submetidas à centrifugação seguida de
um protocolo de criopreservação de suínos, adaptado aos catetos (Silva, 2012). Foi feito
o envase em palhetas de 0,25 mL, com uma concentração final de 20% de gema de ovo
e 6% de glicerol, sendo estas armazenadas, ao final do processo, em nitrogênio líquido
(-196ºC). Após duas semanas, as amostras foram descongeladas em banho-maria à uma
temperatura de 37ºC durante 60 segundos e submetidas à avaliação das características
citadas previamente para as amostras frescas. Os resultados foram expressos em médias
e erro padrão. Os dados de motilidade, viabilidade, integridade de membrana e
morfologia sofreram transformação angular em Arcoseno e análise pela ANOVA
seguida do teste t de Student (P < 0,05). O vigor foi avaliado pelo teste não paramétrico
de Mann-Whitney (P < 0.05).
Utilizando a técnica de lavagem retrógrada com o diluente ACP®, foram
recuperados em média 1023 (± 251,5) × 106 espermatozoides de catetos. Apesar do
processo de congelação e descongelação ter induzido uma diminuição significativa nas
características espermáticas (Tab. 1), os resultados obtidos foram similares aos descritos
para a congelação de sêmen obtido por eletroejaculação desta espécie, utilizando o
mesmo diluente (Silva, 2011).
40
Tabela 1. Características microscópicas de espermatozóides de catetos (Tayassu tajacu),
recuperados por lavagem retrógrada utilizando (fresco) e após descongelação, utilizando-se
diluente a base de água de coco em pó (ACP® - 116c).
Características
Fresco
Descongelado
Motilidade (%)
87,5 ± 5,3a
35,0 ± 5,6b
Vigor (0 – 5)
4,0 ± 0,4a
2,0 ± 0,2b
Viabilidade (%)
79,2 ± 2,3a
36,83 ± 3,10b
Integridade funcional de membrana (%)
74,3 ± 4,8a
52,2 ± 5,4b
Normal (%)
79,8 ± 2,3a
55,2 ± 6,6b
Defeitos Totais (%)
20,1 ± 2,3b
44,8 ± 6,6a
a,b
Na mesma linha, sobrescritos diferentes correspondem a diferença estatística significativa (p
< 0,05).
CONCLUSÃO
A criopreservação de espermatozóides epididimários de catetos, recuperados
através da lavagem retrógrada, utilizando diluente a base de ACP® representa uma
alternativa na preservação dos gametas desta espécie.
ANEL, L.; ALVAREZ, M.; ANEL, E.; MARTINEZ-PASTOR, F.; MARTINEZ, F.;
CHAMORRO, C.; PAZ, P. Evaluation of Three Diﬀerent Extenders for Use in
Emergency Salvaging of Epididymal Spermatozoa from a Cantabric Brown Bear.
Reprodoction in Domestic Animals. v. 46, p. 85–90, 2011.
Instituto Chico Mendes de Conservação da Biodiversidade (ICMBIO). Seis espécies de
mamíferos dotados de casco correm risco de extinção no Brasil. Acesso em: 03 de Abril
de 2012. Disponível em: htt://www.icmbio.org.br
SILVA, M. A. Criopreservação de sêmen de catetos (Tayassu Tajacu, Linneaus 1758)
em diluente a base de água de coco em pó (ACP -116C). 2011. Dissertação – Mestrado;
Curso de Pós Graduação em Medicina Veterinária, Universidade Federal Rural do Semi
Árido (UFERSA).
41
Criopreservação de folículos pré-antrais de macaca-prego, Cebus (Sapajus) apella
Cryopreservation of preantral follicles from capuchin monkeys, Cebus (Sapajus) paella
Danielle Cristina Calado de Brito¹*; Adriel Behn de Brito¹; Julianne Silva de Lima¹;
Sarah Rafaella Scalercio¹; Sheyla Farhayldes Souza Domingues¹; Regiane Rodrigues
dos Santos¹,².
¹Laboratório de Biotecnologia e Medicina de Animais da Amazônia, UFPA, Brasil.
² Faculdade de Medicina Veterinária, Universidade Utrecht, Holanda.
ABSTRACT
Ovarian tissue from nine female capuchin monkeys were exposed to cryoprotectant
solutions, added or not by selenium or trolox, frozen and in vitro cultured (IVC) for 24
hrs. Viability, morphology, ultrastructure, oxidative stress and gene expression were
measured by qRT-PCR. Follicular morphology and ultrastructure were preserved when
ovarian tissue was exposed to a solution containing 50 µM trolox, and gene expression
was not affected. Cryopreservation in the presence of 50 µM trolox kept follicular
viability similar to control. Although IVC of frozen tissue did not result in increased
expression of GDF9 and BMP15, 50 µM trolox maintained gene expression similar to
control. Total equivalent antioxidant capacity of the tissue was decreased when
cryopreservation was performed in the absence of trolox. Trolox improves cell survival
and follicular ultrastructure during freezing, but improvements in the protocol are need.
Key words: morphology; viability; ultrastructure; oxidative stress; qRT-PCR.
Palavras-chave: morfologia; viabilidade; ultra-estrutura; estresse oxidativo; qRT-PCR.
INTRODUÇÃO
Apesar da criopreservação de tecido ovariano permitir a preservação de folículos
pré-antrais (FOPA), crioprotetores podem causar estresse oxidativo (Fahy, 2010). A
adição de antioxidantes ao meio de criopreservação pode manter a viabilidade folicular.
Para avaliar a qualidade e funcionalidade folicular pós-criopreservação, uma análise
morfológica é insuficiente. No presente estudo, além de avaliar a suplementação do
meio de criopreservação com dois antioxidantes (selênio ou trolox), foi analisada a
morfologia, ultra-estrutura, viabilidade, a total equivalente capacidade antioxidante
(TECA), expressão gênica e sobrevivênia folicular após cultivo in vitro (CIV) por 24 h.
42
MATERIAL E MÉTODOS
Biópsias ovarianas (1 mm3) de nove macacas-prego foram expostas a diferentes
crioprotetores, seguido ou não de criopreservação. Para exposição, três fragmentos
controle foram separados para análise morfológica, ultraestrutural e qRT-PCR. Os
demais 24 fragmentos foram expostos à 20 °C por 20min a TCM199, ou TCM199 + 1M
etilenoglicol + 0.5 M sacarose (SC), adicionado ou não de selênio (2,5, 5 ou 10 ng/ml)
ou trolox (25, 50 ou 100 µM). Após exposição, o crioprotetor foi removido (Santos et
al., 2006) e os fragmentos foram submetidos a análise morfológica, ultra-estrutural e de
genes envolvidos no estresse oxidativo tais como SOD1, HSp70, ERp29 e ERp60. Seis
fragmentos controle foram separados para análise da viabilidade folicular (iodeto de
propídeo e Hoechst), TEAC e expressão gênica antes e após CIV de 24 h. Os demais
doze fragmentos foram expostos a SC adicionada ou não 50 µM trolox, de acordo com
os resultados da exposição. A criopreservação foi realizada como descrito por Santos et
al. (2006) e o CIV de acordo com Brito (2011). Fragmentos criopreservados, bem como
cultivados, foram submetidos à análise de viabilidade, TEAC, e expressão gênica dos
mesmos genes relacionados ao estresse e à funcionalidade folicular (AMH, BMP4,
BMP15, CTGF, GDF9 e KL). Estatística utiliza foram ANOVA e teste t com P < 0.05.
A percentagem de folículos normais em fragmentos controle (84,10%) foi
similar (P>0.05) à observada após a exposição somente quando a exposição a SC+50Tr
(79,22%) ou SC+100Tr (61,29%) foi realizada. FOPA degenerados expostos à SC
apresentavam oócitos e células estromais vacuolizadas, enquanto FOPA degenerados do
grupo controle ou expostos a SC+50Tr apresentavam oócitos retraídos. A vacuolização
oocitária resulta de danos no retículo endoplasmático (RE) (Silva et al., 2000), mas não
afetou a expressão de genes relacionados a essa organela (ERp29 e ERp60) nem ao
estresse oxidativo (HSp70 e SOD1). Oócitos vacuolizados têm sido relatados após a
criopreservação de tecido ovariano (Oskam et al., 2010). Entretanto, o estudo mostrou
que o selênio pode ser tóxico, dependendo da concentração, pois SOD1 (P<0.05)
apresentou
maior
expressão em
SC+10ng/ml
Sel.
Diferente da exposição,
criopreservação de tecido ovariano resultou numa reduzida (P<0.05) taxa de FOPA
viáveis quando comparado ao controle (89%). Contudo, a presença de trolox no meio
elevou (P<0.05) as taxas de FOPAS viávies (67%) em relação ao meio sem trolox
43
(33%). CIV não afetou as taxas de FOPA viáveis criopreservadas. Quando o tecido
ovariano foi congelado na ausência de trolox, os níveis de TEAC foram reduzidos
(P<0.05) em três vezes, enquanto apresentaram-se inalterados em tecido criopreservado
na presença de trolox. Após o CIV, diferenças não foram observadas. A expressão do
mRNA de HSp70 e SOD1 não apresentou diferença significativa quando comparado
fragmentos criopreservados e cultivados in vitro na presença de trolox. Diferentemente,
a expressão de ERp29 e ERp60 foi aumentada (P<0.05) durante o cultivo de tecido
fresco e criopreservado, indicando estresse no RE (Xu et al., 2005). BMP15 e GDF9
apresentaram uma maior expressão (P<0.05) no tecido cultivado fresco, ambos genes
são expressos no oócito e um aumento na sua expressão indica desenvolvimento
folicular, o qual não foi observado nos FOPA previamente criopreservadas. Contudo,
FOPA criopreservados na presença de trolox apresentaram níveis de BMP15 e GDF9
similar ao controle, enquanto na ausêcia de trolox foi observada uma redução (P<0.05)
na expressão dessas proteínas, indicando a importância desse antioxidante.
CONCLUSÕES
Agentes crioprotetores podem causar estresse celular, o qual é observado através
da vacuolização do ooplasma, i.e. danos no RE. O estresse oxidativo é acentuado
durante a criopreservação e resulta na redução da TEAC, indução de chaperonas do RE
(ERp29 e Erp60), resultando na perda da viabilidade e funcionalidade folicular. Adição
de 50µM trolox, apesar de não suprimir, reduz o estresse oxidativo e seus danos.
BRITO, A.B. Expressão gênica e viabilidade de folículos pré-antrais inclusos em
fragmentos de córtex ovarianos cultivados in vitro de macaca-prego (Cebus apella).
2011. 66p. Dissertação (Mestrado em Ciência Animal) – Programa de Pós-Graduação
em Ciência Animal, Universidade Federal do Pará.
FAHY, G.M. Cryoprotectant toxicity neutralization. Cryobiology, v. 60, p.45–53, 2010.
OSKAM, I.C.; ASADI, B.A.; SANTOS, R.R. Histologic and ultrastructural features of
cryopreserved ovine ovarian tissue: deleterious effect of 1,2-propanediol applying
different thawing protocols. Fertility and Sterility, v. 93, p. 2764-2766, 2010.
SANTOS, R.R.; THARASANIT, T.; FIGUEIREDO, J.R.; VAN HAEFTEN, T.; VAN
DEN
HURK,
R.
Preservation
of
caprine
preantral
follicle
viability after
44
cryopreservation in sucrose and ethylene glycol. Cell and Tissue Research, v. 325, p.
523-531, 2006.
SILVA, J.R.; LUCCI, C.M.; CARVALHO, F.C.; BÁO, S.N.; COSTA, S.H.; SANTOS,
R.R.; FIGUEIREDO, J.R. Effect of coconut water and Braun-Collins solutions at
different temperatures and incubation times on the morphology of goat preantral
follicles preserved in vitro. Theriogenology, v. 54, p. 809-822, 2000.
XU, C.; BAILLY-MAITRE, B.; REED, J.C. Endoplasmic reticulum stress: cell life and
death decision. Journal of Clinical investigation, v. 115, p. 2656-2664, 2005.
45
Criopreservação do sêmen de Sapajus apella em diluidor ACP® 118 a 3% de
glicerol
Semen cryopreservation of Sapajus apella in extender ACP® 118 plus 3% glycerol
Danuza Leite Leão1, Stefânia Araújo Miranda1, *Yago Pinto da Silva1, Elizabete
Nikolak1, Débora da Vera Cruz Almeida1, Sheyla Farhayldes Souza Domingues1
1
Laboratório de Biotecnologia e Medicina de Animais da Amazônia- UFPA
ABSTRACT
The objective was to evaluate the semen freezing for Sapajus apella using ACP® -118
and 3% of glycerol. Semen samples were collected from three males by electroejaculation. Semen was extended in A-fraction of ACP® -118 and incubated at 37 °C.
After coagulum dissolution, was added the B-fraction of the extender. Semen was
packaged, cooled and freezing in liquid nitrogen. Motility, vigor, live sperm percentage
and sperm morphology were evaluated before and after cryopreservation. Results were
expressed as mean ± standard deviation and mode. Motility, vigor, live sperm
percentage before freezing was 70±19%; 4 ; 79±12%, and after freezing was 38±25%,
4 e 57±17% respectively. The primary and secondary abnormalities before freezing was
10±6; 10±8 and after was 5±4; 3±1 respectively. The ACP®-118 extender was possible
to maintain sperm viability after cryopreservation.
Keywords: Sapajus apella, cryopreservation, glycerol, sperm
Palavras–chave: Sapajus apella, criopreservação, glicerol, sêmen
INTRODUÇÃO
A criopreservação de sêmen possui como princípio congelar o espermatozóide,
reduzindo reversivelmente a sua atividade metabólica, diminuindo a produção de
catabólitos e a peroxidação de lipídeos da membrana espermática (Amman & Graham,
1993), o qual poderá ser armazenamento por tempo indeterminado (England, 1993). Na
congelação de sêmen de primatas não humanos, diversos tipos de diluidores e seus
efeitos crioprotetores têm sido testados de acordo com a espécie estudada, com a
finalidade de buscar o melhor protocolo para a manutenção da viabilidade espermática.
Em Sapajus apella, somente um trabalho relatou a criopreservação de sêmen
46
utilizando água de coco in natura e TES-TRIS a 2,5 e 3,5% de glicerol, respectivamente
(Oliveira et al., 2011). No entanto, este protocolo exige melhorias que permitam a
recuperação da motilidade espermática após o descongelamento. O objetivo do presente
trabalho foi avaliar a criopreservação do sêmen de Sapajus apella em diluidor a base de
água de coco em pó (ACP® 118) a 3% de glicerol.
MATERIAL E MÉTODOS
O experimento foi conduzido no Centro Nacional de Primatas e previamente
aprovado pelo Comitê de Ética (CEPAN 055/2009/CEPAN/IEC/SVS/MS). Foram
utilizados dois machos adultos da espécie Sapajus apella. As coletas (n=3) do sêmen
foram realizadas por eletroejaculação com probe retal, após a contenção química dos
animais com Cloridrato de Ketamina (12mg/kg) e Cloridrato de Xilazina (1mg/kg). O
sêmen obtido foi diluído na fração A do ACP®-118 (5,84 g de ACP®-118 e 50 ml de
água ultrapura) e mantido em banho-maria a 37 °C. Após dissolução do coágulo foi
acrescentado à fração B do diluidor (80 mL da fração A, 20 ml de gema de ovo e 3% de
glicerol). O sêmen foi então envasado em palhetas, resfriado a 4°C e congelado (196°C) em nitrogênio líquido. As palhetas foram descongeladas a 37°C por 30
segundos. A motilidade, o vigor, o percentual de espermatozoides vivos e morfologia
espermática foram analisados antes e após a criopreservação. O vigor e a motilidade
foram avaliados de forma subjetiva, já o percentual de espermatozóides vivos e
morfologia espermática foram avaliados por meio da coloração eosina-nigrosina. Foram
contados 100 espermatozóides em microscópio óptico, sendo estes classificados como
normais ou apresentando anomalias primárias ou secundárias. A motilidade, o
percentual de espermatozoides vivos e morfologia espermática foram expressos em
média ± desvio-padrão, enquanto que o vigor foi expresso em moda.
A análise imediata do sêmen antes do banho-maria, e durante a dissolução do
coágulo seminal estão representados na Tabela 1. A motilidade, o vigor, e o percentual
de espermatozóides vivos após a criopreservação foram 38 ± 25, 4 e 57 ± 17,
respectivamente. A morfologia espermática antes e após a congelação está representada
na Tabela 2.
47
Tabela 1: Média ± desvio-padrão da motilidade e do percentual de espermatozóides (SPTZ)
vivos, e moda do vigor de sêmen de Sapajus apella, imediatamente após a eletroejaculação (T1)
e após a liquefação do coágulo seminal (T2).
T1
Motilidade
88 ± 7
Vigor (1-4)
4
% SPTZ Vivos
86 ± 7
T2
70 ± 19
4
79 ± 12
Tabela 2: Média ± desvio-padrão da morfologia espermática de sêmen de Sapajus apella antes
(AI) e após a criopreservação (AII).
Morfologia espermática
Espermatozóides normais
AI
60 ± 26
A II
92 ± 4
10 ± 6
5±4
Cauda dobrada
13 ± 12
1±1
Cauda enrolada
7±6
2±2
Total
10 ± 8
3±1
Anormalidades Primárias
Cauda fortemente enrolada
Anormalidades Secundárias
Desta forma, o diluidor ACP®118 a 3% glicerol foi capaz de manter viabilidade
espermática, obtendo assim melhores resultados na criopreservação do sêmen de
Sapajus apella quando comparado aos resultados obtidos por Oliveira et al., 2011, que
não obteve motilidade após a descongelação do sêmen.
CONCLUSÃO
A criopreservação de sêmen de Sapajus apella em diluidor ACP®118 a 3% de
glicerol foi capaz de manter espermatozóides vivos e com motilidade.
AMMAN, R.P.; GRAHAM, Spermatozoal function. In: McKinnon, A.O.; VOSS,
J.L.(Eds.).Equine Reproduction. Philadelphia, London: Lea & Febiger, p.715-45, 1993
ENGLAND, G.C.W. Cryopreservation of dog semen: a review. Journal Reproduction
Fertility Suppl. v. 47, p. 243-255, 1993.
OLIVEIRA, K. G; MIRANDA, S. A; LEÃO, D. L; BRITO, A. B; SANTOS, R. R;
DOMINGUES, S. F.S. Semen coagulum liquefaction, sperm activation and
48
cryopreservation of capuchin monkey (Cebus apella) semen in coconut water solution
(CWS) and TES–TRIS. Animal Reproduction Science, v. 123, p.75–80, 2011.
49
Desenvolvimento fetal em Sapajus apella por meio da ultrassonografia
Fetal development in Sapajus apella by ultrasonography
Stefânia Araújo Miranda1,2, Karol Guimarães Oliveira1,2, Danuza Leite Leão1,3, Danielle
Cristina Calado de Brito1*, Elizabete Nikolak 1,2, Sheyla Farhayldes Souza
Domingues1,2,3
1
Laboratório de Biotecnologia e Medicina de Animais da Amazônia, UFPA;
2
Programa de Pós-graduação em Ciência Animal, UFPA;
3
Faculdade de Medicina Veterinária, UFPA;
ABSTRACT
The objectives were to perform fetal ecobiometry for determine the gestational age,
assessment fetal growth and viability in Sapajus apella. Seven pregnant females were
selected. The week of the examination relative to whelping was calculated in retrospect
(whelping = Week 0). The B-mode ultrasonography was used to measure the biparietal
diameter, occipito-frontal diameter, head circumference, abdominal circumference and
femurs length. Linear regression equations for relationships between week before
whelping and various fetal measures were obtained. For each equation, both the
intercept and slope were significant. The current study enabled to determine the
gestational age and to assess the fetal anatomical growth. These were important end
points to assess fetal vitality in S. apella.
Key words: ecobiometry; capuchin monkey; fetal growth; fetal viability.
Palavras-chave: ecobiometria; macaco-prego; crescimento fetal; vitalidade fetal.
INTRODUÇÃO
Segundo Seier et al. (2000), a ultrassonografia (US) ginecológica e obstétrica
tem se tornado uma ferramenta indispensável na rotina de manejo, avaliação da saúde e
pesquisa em primatas não-humanos em cativeiro. O uso crescente de primatas nãohumanos gestantes e de seus fetos nas pesquisas científicas torna importante o estudo do
desenvolvimento fetal durante gestações normais, como base para se avaliar futuras
gestações experimentais (Corradini et al., 1998) ou avaliar a eficácia biotecnologias
utilizadas em programas de reprodução assistida, como a produção in vitro e
transferência de embrião, inseminação artificial, entre outros. No entanto, em Sapajus
50
apella, o desenvolvimento do concepto foi estudado somente por meio da ecobiometria
do saco gestacional (SG), do comprimento cabeça-nádegas (CCN), do diâmetro
biparietal (DBP), altura do tórax e comprimento do fêmur (CF). Alguns parâmetros,
como o diâmetro fronto-occiptal (DFO), circunferência da cabeça (CC) e circunferência
abdominal (CA) ainda não foram descritos para esta espécie. O objetivo do trabalho foi
realizar a ecobiometria do feto para determinar a idade gestacional, avaliar o
crescimento e a vitalidade fetal em Sapajus apella.
MATERIAL E MÉTODOS
Todos os procedimentos experimentais foram aprovados pelo Comitê de Ética
em Pesquisa Animal (N° 055/2009/CEPAN/IEC/SVS/MS). Foram selecionadas sete
fêmeas (n=7) gestantes da espécie Sapajus apella. As fêmeas fazem parte do plantel
reprodutivo do Centro Nacional de Primatas e permanecem em gaiolas coletivas
(dimensões 3,85 x 2,30 x 2,55 m) com um (1) macho e três (3) fêmeas. A semana de
cada exame em relação ao parto foi contada em retrospecto (nascimento = semana 0).
Para cada exame, a fêmea era contida fisicamente com puçá e sedada com a associação
de cloridrato de tiletamina e zolazepam (Zoletil® 50) na dose de 4,4 mg/kg,
administrada por via intramuscular. Os exames ultrassonográficos foram conduzidos
com o ultrassom Modelo HDI 4000 da PHILIPS (Philips Medical Systems) Inicialmente,
o útero era localizado utilizando-se a US bidimensional em modo B. A avaliação do
desenvolvimento fetal era feita a partir da ecobiometria do concepto de cada fêmea,
mensurando-se: os DBP, DFO e CC na secção transversal da cabeça, ao nível do tálamo
posicionado equidistante a linha média têmporo-parietal; a CA na secção transversal do
abdômen ao nível do estômago; e CF a partir da distância externa entre cada metáfise.
Todas as mensurações ecobiométricas do feto foram aferidas em centímetros. A análise
de regressão foi utilizada para fornecer equações representando as relações entre as
semanas antes do parto com a ecobiometria fetal (P<0,05).
Os fetos foram visualizados por meio da ultrassonografia a partir da semana -17,
dando início as mensurações dos DBP, DFO, CC e CA da semana -16 a -1; e CF da
semana -13 to -1. Com a análise de regressão foi possível observar a relação das
semanas antes do parto (SAP) com as mensurações fetais, obtendo-se as seguintes
51
equações: DBP = 4,46 + 0,20SAP (R2=0,95); DFO = 5,84 + 0,27SAP (R2=0,86); CC =
16,68 + 0,80SAP (R2=0,92); CA = 13,46 + 0,67SAP (R2=0,96); CF = 3,62 + 0,22SAP
(R2=0,98), onde os interceptos e coeficientes de regressões foram <0,01 em todas as
equações. As equações da reta demonstram que os diâmetros aumentam com o avanço
da gestação e permitem determinar a idade gestacional para avaliar o desenvolvimento
do feto, sendo extremamente importantes no diagnóstico de restrição do crescimento
intrauterino ou crescimento acelerado do feto. Por exemplo, uma CA pequena para a
idade gestacional é um marcador preciso para restrição do crescimento intrauterino e
pode refletir na redução do tamanho do fígado e de outros órgãos abdominais. Além
disso, o DBP, DFO e CC fornecem o tamanho da cabeça, que por sua vez, reflete o
tamanho do cérebro. A microcefalia, por exemplo, é diagnosticada quando a CC está
abaixo da média para a idade gestacional (Miranda & Domingues, 2010).
CONCLUSÃO
As equações relacionando as SAP com os parâmetros mensurados durante a
gestação (DBP, DFO, CC, CA e CF), permitiram determinar a idade gestacional para
avaliar o crescimento anatômico do feto durante a gestação de S. apella.
CORRADINI, P.; RECABARREN, M.; SERÓN-FERRÉ, M.; PARRAGUEZ, V.H.
Study of prenatal growth in the capuchin monkey (Cebus apella) by ultrasound. Journal
of Medical Primatology, v.27, n.6, p.287-92, 1998.
MIRANDA, S.A.; DOMINGUES, S.F.S. Conceptus ecobiometry and Triplex Doppler
ultrasonography of uterine and umbilical arteries for assessment of fetal viability in
dogs. Theriogenology, v.74, p.608-17, 2010.
SEIER, J.V.; VAN DER HORST G.; DE KOCK M.; CHWALISZ K. The detection and
monitoring of early pregnancy in the vervet monkey (Cercopithecus aethiops) with the
use of ultrasound and correlation with reproductive steroid hormones. Journal of
Medical Primatology, v.29, p.70-5, 2000.
52
Dosagem de esteróides sexuais no extrato fecal durante o ciclo ovariano de macaco
de cheiro (Saimiri Sciureus) por meio da eletroquimioluminescência
Dosage of sex steroids in the fecal extract during the ovarian cycle of squirrel monkey
(Saimiri sciureus) by electrochemiluminescence
Elizabete Nikolak*¹,Juliane Silva de Lima¹, Sarah Raphaella Rocha de Azevedo
Scalercio1, Ingrid Schunlaus Nikolak Jacometto², Karol Guimarães Oliveira¹, Sheyla
Farhayldes Souza Domingues¹²
1
2
- Universidade Federal do Pará (UFPA), Castanhal, PA, Brasil
- Laboratório de Biotecnologia e Medicina de Animais da Amazônia
ABSTRACT
Among neotropical primates, the species Saimiri sciureus stands out as one of the
species most used as experimental models in biomedical research. However, the
reproductive endocrinology of these animals is still poorly studied. Therefore this study
aimed to analyze sexual fecal stereoids end ultrasound examinations from five (n = 5)
female squirrel monkeys for 15 days. The samples were processed in the Elecsys 2010
automatic analyzer (Roche Diagnostics ®) using electrochemiluminescence (EQL)
immunoassay reactions. The results were expressed as mean ± standard deviation. The
estrous cycles in the Saimiri sciureus female was 8 ± 1 days and mean peak
concentration of 17β-estradiol was 269.13 ± 388.44 occurring on day 4 ± 1. Thus
proving the efficiency and practicality of the electrochemiluminescence technique
sexual fecal steroids.
Key words: stereoids, Saimiri sciureus, electrochemiluminescence
Palavras-chave: Esteróides, Saimiri sciureus, eletroquimioluminescência.
INTRODUÇÃO
O monitoramento endócrino-reprodutivo através da mensuração de esteroides
sexuais tem mostrado ser fundamental para o entendimento da fisiologia reprodutiva de
primatas não humanos (Smith et al., 2004; Palmer, 2005). Os produtos metabólicos
destes esteróides sexuais podem fornecer dados fundamentais em tópicos como:
diagnóstico de gestação, caracterização de ciclos estrais e períodos gestacionais
normais, investigação de anormalidades dos ciclos reprodutivos, detecção de ovulação,
53
sazonalidade reprodutiva, correlações entre reprodução e comportamento social, etc
(Guimarães et al., 2003, Peter et al., 1996). Estudos têm proposto técnicas pouco
invasivas na coleta de material biológico para dosagens hormonais, como material fecal,
cuja escolha decorre da facilidade de coleta e redução do estresse para o animal,
descartando métodos de contenção física ou química, em animais silvestres cativos. O
monitoramento hormonal, é de extrema importância para o sucesso reprodutivo da
espécie, e pode ser utilizado como estratégias de conservação destes animais in situ e ex
situ. A eletroquimioluminescência (EQL) constitui um ensaio vantajoso para dosagens
dos esteróides fecais em primatas não humanos, reduzindo os riscos químicos oriundos
da manipulação do equipamento, pois nesta técnica não se utiliza marcadores
radioativos. Portanto, o objetivo do presente trabalho foi descrever os níveis fecais de
17β-estradiol durante o ciclo reprodutivo de Saimiri sciureus cativos por meio da
técnica de eletroquimioluminescência (EQL).
MATERIAL E MÉTODOS
O estudo foi realizado no Centro nacional de primatas – CENP, utilizando cinco
fêmeas (n=6) adultas da espécie Saimiri sciureus, pertencentes ao seu plantel
reprodutivo. A escolha do dia para iniciar a colheita das fezes foi feita de forma
aleatória, durante o período de estação reprodutiva para a espécie (julho a setembro),
sendo que o monitoramento da ovulação foi feito por meio de exames
ultrassonográficos (HDI 4000, Philips) durante 15 dias consecutivos. Logo após a
coleta, as fezes eram encaminhadas para o laboratório em frascos plásticos
identificados. O método empregado para a extração dos hormônios foi conforme
descrita por Grahan et al. (2001). Os testes foram realizados pelo analisador automático
Elecsys 2010 (Roche® Diagnostics), utilizando reações de imunoensaio EQL para a
obtenção das concentrações hormonais, seguindo o protocolo do fabricante.
RESULTADOS
O ciclo ovariano das fêmeas de Saimiri sciureus teve duração média de 8±1 dias.
O pico médio de concentração de 17β-estradiol foi de 269,13±388,44 e ocorreu no dia
6±1,1 (Figura 1), ou seja, aproximadamente dois dias após a ovulação, cobservada
conforme monitoramento ultrassonográfico. Este resultado sugere um atraso de
54
aproximadamente dois dias em relação à ovulação para a detecção do pico dos
Concentração de 17 ß-Estradiol
(pg/ml)
metabólitos fecais de E2 na espécie Saimiri sciureus.
18
15
12
9
6
3
0
1
2
3
4
5
6
7
8
Dias do ciclo
Figura 1. Concentração de 17β-estradiol (pg ml) no extrato fecal durante o ciclo ovariano de
Saimiri sciureus.
Os dados obtidos neste estudo mostraram que a Eletroquimioluminescência
(EQL), é uma técnica importante para o monitoramento hormonal, pois não emprega
reagente radioativos e possibilita a dosagem de esteróides sexuais em extrato fecal, o
que evita estresse em razão da coleta de amostras para a dosagem hormonal.
GUIMARÃES, M. A. B. V.; OLIVEIRA, C.A.; RIBEIRO, E .A. A. et al. Monitoring
ovarian function in the capuchin monkey (Cebus apella) using fecal and urinary
hormone analyses. In: THE SECOND INTERNATIONAL SYMPOSIUM ON
ASSISTED REPRODUCTIVE TECNOLOGY FOR THE CONSERVATION AND
GENETIC MANAGEMENT OF WILDLIFE, Omaha, Proceedings… 2002, p. 290.
PALME, R. Measuring fecal steroids: Guiderlines for practical application. Annals of
the New York Academy of Sciences, v. 1046, p. 75-80, 2005.
PETER, A. T.; KASPUTIN N.; CRISTER J. K. Analysis of sex steroid metabolites
excreted in feces and urine of non domesticated animals. The Compedium, v.18,
n.7,p.781-791, 1996.
SMITH, T. E. et al. Quantitative data on training new world primates to urinate.
American Journal of Primatology, v.64, p. 83-93, 2004.
55
Ecobiometria Bidimencional (Modo B) do trato reprodutivo de fêmeas de macaco
de cheiro (Saimiri Sciureus).
Bidimencional Echobiometry (Mode B) of the reproductive tract of squirrel monkey
(Saimiri sciureus) females.
Elizabete Nikolak1; Márcia Cristina de Miranda Lima*1; Sarah Raphaella Rocha de
Azevedo Scalercio1; Ingrid Schunlauss Nikolak Jacometto²; Stefania de Araújo
Miranda¹; Sheyla Farhayldes Souza Domingues1
1
2
-Universidade Federal do Pará (UFPA), Castanhal, PA, Brasil
- Laboratório de Biologia e Medicina de Animais Silvestres – UFPA – Castanhal PA
ABSTRACT
The objective was to evaluate by ultrasound examinations (U.S.) the anatomy of the
uterus, cervix and ovaries and to determine its dimensions. It’s was evaluated by U.S.,
the reproductive tract of 6 squirrel monkey (Saimiri sciureus) adult, healthy, provided
by the National Primate Center
(CENP). The transabdominal examinations were
conducted with an HDI 4000 PHILIPS scanner and the results were presented as mean ±
standard deviation. On uterus, were performed measurements of the length, height,
width and volume; in the Cervix were measured the length and width, while the ovaries,
were measured length, height, volume and area. The technique of B-mode
ultrasonography has facilitated access to the reproductive tract of animals and was
considered efficient end accurate.
Key words: primate, Saimiri sciureus, echobiometry, uterus, ovary
Palavras-chave: primatas, Saimiri sciureus, ecobiometria, útero e ovário.
INTRODUÇÃO
A espécie Saimiri sciureus, conhecida vulgarmente como macaco de cheiro, tem
ampla distribuição geográfica na região amazônica, possui ciclo estral sazonal de 8-9
dias, se reproduzindo de julho a setembro (Dukelow, 1985). É bastante utilizado em
pesquisas biomédicas, mas pouco se sabe sobre a fisiologia reprodutiva e sobre a
morfologia dos órgãos reprodutores. Sendo que o conhecimento detalhado de sua
anatomia reprodutiva pode representar um fator primordial para sua preservação, visto
56
que tais informações podem ajudar em programas de reprodução assistida visando a
conservação da espécie (Teixeira, 2005), assim a ultrassonografia bidimensional em
modo B, por ser prática, segura (Domingues et al., 2007), pouco invasiva e de fácil
repetição, tem mostrado ser uma ferramenta eficiente e precisa para descrever a
anatomia do aparelho reprodutivo de primatas.
Desta forma o objetivo deste estudo, foi avaliar por meio de exames
ultrassonográficos (US) a anatomia do útero, da cervix e dos ovários, determinando suas
dimensões.
MATERIAL E MÉTODOS
Foram utilizadas seis fêmeas (n=6) adultas da espécie Saimiri sciureus. Para o
exame ultrassonográfico (US), os animais eram submetidos a jejum alimentar prévio de
12 horas, meia hora antes destes, foi oferecido suco de frutas instantâneo ad libitum. Os
animais foram contidos com Cloridrato de ketamina (14mg/kg) e Xilazina (1mg/kg).
Em seguida, foi realizada a tricotomia da região pélvica, e aplicado o gel acústico à
pele. Os US foram realizados no período da manhã, usando o aparelho Philips HDI
4000 (Philips Medical Systems, Bothel, WA, EUA), em modo Brightness (B), com um
transdutor linear multifatorial (3,5 a 7,5MHz), possibilitando uma varredura completa
da região pélvica.
As fêmeas eram posicionadas em decúbito dorsal. O útero era localizado usandose a bexiga como referência. A ecobiometria 2D em modo B do corpo uterino foi
realizada por meio da mensuração dos diâmetros longitudinais (comprimento) e
dorsoventrais (altura) na secção sagital e o diâmetro transversal (largura) no plano
transversal. O comprimento, altura e a área dos ovários foram mensurados de forma
similar. O volume de útero foi calculado usando-se a fórmula de elipsoide (π/ 6
comprimento x altura x largura) e o volume do ovário, com a fórmula (π/ 6 altura³). A
análise estatística descritiva a 5% de probabilidade, foi realizada com o auxílio do
pacote estatístico Stat View (SAS Institute Inc., Cary, NC, USA) e todos os resultados
foram apresentados em média ± desvio padrão.
RESULTADOS
O útero de todos os animais apresentava aparência homogênea, com região
central hiperecóica (endométrio). Deslocando-se o transdutor cerca de 2,0 centímetros
57
crânio-lateralmente ao útero, encontravam-se os ovários, estruturas de formato elíptico
isoecogênico ao tecido uterino. A cervix apresenta uma ecotextura irregular
apresentando pregueamento cervical longitudinal hiperecóica, e o restante é
isoecogênicas ao útero.
Não foi encontrada diferença estatística entre as medidas do
ovário direito e esquerdo. Os resultados da ecobiometria estão descritos na Tabela 1.
Tab. 1 Resultados da estatística descritiva, apresentados em Média ± desvio padrão, da
ecobiometria 2D em modo B do útero, cervix e ovários de Saimiri sciureus adultas.
Útero
Cervix
Ovários
Comprimento (cm)
0,78±0,14
1,19±0,16
0,75 ± 0,13
Largura (cm)
0,57±0,10
0,61±0,07
-
Altura (cm)
0,49±0,11
-
0,38 ± 0,08
Volume (ml)
0,12±0,05
-
0,03 ± 0,01
-
-
0,23 ± 0,05
Área (cm²)
A ultrassonografia em Modo B permitiu que fosse realizado com sucesso a
ecobiometria em Saimiri sciureus, facilitando a compreensão e conhecimento maior do
trato reprodutivo nesta espécie.
DOMINGUES, S. F. S. et al.. Ultrasonographic imaging of the reproductive tract and
surgical recovery of oocytes in Cebus apella (capuchin monkeys). Theriogenology, v.
68, p. 1251-1259, 2007.
DUKELOW, W. R. Reproductive cyclicity and breeding in the squirrel monkey. In:
Rosenblum L. A., Coe C. L. (eds). Handbook of squirrel monkey research. Plenum,
New York, p. 169-190, 1985.
TEIXEIRA, D. G. Estudo anatômico descritivo dos órgãos genitais masculinos do
macaco-prego (Cebus apella Linnaeus, 1758). 2005. 191f. Tese (Doutorado em
Ciências) - Universidade de São Paulo, SP.
58
Efeito da centrifugação sobre a qualidade dos espermatozoides epididimários de
catetos (Tayassu tajacu)
Effect of centrifugation on the quality of collared peccary (Tayassu tajacu) epididymal
sperm
José Artur Brilhante Bezerra1; Ana Liza Paz Souza1*;Andréia Maria da Silva1; Thibério
de Souza Castelo1; Moacir Franco de Oliveira1; Alexandre Rodrigues Silva1
1
*e-mail: [email protected]
ABSTRACT
The aim of this study was to evaluate the effect of centrifugation on the quality of
collared peccary (Tayassu tajacu) epididymal sperm. The pair of testis from nine
animals was used. From each animal, one testis-epididymis complex was randomly
selected, dissected and the sperm were recovered by the retrograde flushing. After the
recovery, the sperm were evaluated for motility, vigor, viability, functional membrane
integrity and morphology. Then, a 1 mL aliquot of each sample was centrifuged, the
supernatant was removed and the pellet was suspended and evaluated as the fresh
samples. The centrifugation improved the number of sperm with normal morphology
and decreased the number of total defects (P < 0.05). This was due to the detachment of
large number of cytoplasmic droplets. The other parameters assessed were not affected
by centrifugation. In conclusion, centrifugation can be used in the collared peccary
epididymal sperm processing without compromising the quality of the gametes.
Keywords: collared peccary; sperm; epididymis; centrifugation
Palavras-chave: cateto; espermatozoide; epidídimo; centrifugação
INTRODUÇÃO
O conhecimento dos aspectos reprodutivos e o domínio das biotécnicas são
fundamentais para a implantação de programas de conservação de espécies silvestres,
tais como o cateto (Tayassu tajacu). Neste contexto, a utilização de espermatozoides
obtidos a partir da cauda do epidídimo mostra-se como uma fonte alternativa de
material genético. A centrifugação é necessária para a lavagem espermática por
possibilitar a remoção do plasma seminal e dos diluentes, bem como no intuito de
59
aumentar a concentração de células (Varisli et al., 2009). Em relação a espermatozoides
epididimários, a centrifugação possivelmente reduziria a contaminação que ocorre
durante a coleta das amostras, principalmente por células sanguíneas e debris celulares,
levando a uma melhoria na qualidade espermática. No entanto, as forças centrífugas
exercem estresse mecânico no espermatozoide, o que poderia refletir em uma qualidade
mais baixa ou uma diminuição da capacidade de sustentar outros tipos de estresse
(Varisli et al., 2009). Diante do exposto, objetivou-se avaliar o efeito da centrifugação
sobre a qualidade dos espermatozoides epididimários de catetos.
MATERIAL E MÉTODOS
Foram utilizados nove catetos machos adultos, submetidos ao abate para
controle
populacional
no
Centro
de
Multiplicação
de
Animais
Silvestres
(CEMAS/UFESA). Os complexos testículos-epidídimos foram coletados, envoltos em
gaze umedecida com solução fisiológica e transportados para o laboratório. De cada
animal, um complexo foi escolhido, e a cauda epididimária foi dissecada e submetida à
lavagem retrógrada através da injeção no ducto deferente de 5 mL de diluente à base de
Tris, aquecido à 37º C. Após a coleta, foi mensurado o número total de espermatozoides
(concentração obtida na câmara de Neubauer × volume recuperado). As amostras foram
avaliadas de acordo com o CBRA (1998). Posteriormente, 1 mL de cada amostra foi
submetido à centrifugação à 3G durante 10 minutos. O sobrenadante foi removido, o
pellet re-diluído em 1 mL de Tris e realizadas mesmas avaliações para as amostras logo
após a coleta. Os resultados foram expressos em médias e erro padrão. Os dados
sofreram transformação angular em Arcoseno e análise pela ANOVA seguida do teste t
de Student (P < 0,05). O vigor foi avaliado pelo teste não paramétrico de MannWhitney.
Dos epidídimos dos catetos, foram recuperados em média 635,9 ± 188,6 × 106
espermatozoides. Os parâmetros avaliados estão representados na Tabela 1. A
centrifugação afetou somente a morfologia espermática, aumentando o número de
células normais e reduzindo os defeitos totais. Isso ocorreu, provavelmente, devido às
forças centrífugas terem provocado o desacoplamento das gotas citoplasmáticas distais,
reduzindo seu número, que passou de 61,24% (± 6,2) dos defeitos totais nas amostras
60
após a coleta para 20,6% (± 6,1) nas amostras centrifugadas. Por outro lado, houve um
aumento nos defeitos de cabeça e de cauda nas amostras centrifugadas, que passaram de
2,1% (± 0,6) e 20,5% (± 3,3) dos defeitos totais para 16,2% (± 5,7) e 53,6% (± 7,7),
respectivamente.
Tabela 1. Médias (± erro padrão) dos valores para as características dos espermatozoides
epididimários de catetos (Tayassu tajacu) recuperados por lavagem retrógrada, logo após a
coleta e após a centrifugação e diluição em Tris (n=9)
Após coleta
Após centrifugação
e diluição
Motilidade (%)
57,8 ± 13,2a
40 ± 10,8a
Vigor (0 - 5)
2,9 ± 0,3a
2,2 ± 0,4a
Viabilidade (%)
68,2 ± 5,7a
53,8 ± 3,8ª
Integridade funcional de membrana (%)
60,3 ± 7,3a
56,2 ± 4,9ª
Morfologia normal (%)
52,3 ± 3,1a
63,7 ± 3,9b
Defeitos Totais (%)
47,7 ± 4,4a
36,3 ± 3,9b
a,b
Letras diferentes na mesma linha representam diferença estatística (P < 0,05).
CONCLUSÕES
Os resultados sugerem que a centrifugação exerce pouco efeito deletério sobre
os espermatozoides epididimários de catetos, podendo ser realizada no processamento
sem comprometer a qualidade desses gametas.
CBRA – Colégio Brasileiro de Reprodução Animal. Manual para exame andrológico e
avaliação de sêmen animal. Belo Horizonte: CBRA. 53p, 1998.
VARISLI, O.; UGUZ, C.; AGCA, C.; AGCA, Y. Various Physical Stress Factors on
Rat Sperm Motility, Integrity of Acrosome, and Plasma Membrane. J Androl,30:75–86,
2009.
61
Efeito da re-diluição pós-descongelação sobre a longevidade espermática de catetos
(Tayassu tajacu)
Effect of post-thawing re-dilution on the sperm longevity of collared peccaries (Tayassu
tajacu)
Ana Liza Paz Souza1*, Lívia Batista Campos1, Mariana Araújo Silva1, José Artur
Brilhante Bezerra1, Moacir Franco de Oliveira1, Alexandre Rodrigues Silva1
1
Laboratório de Conservação e Germoplasma Animal – LCGA, Universidade Federal
ABSTRACT
The aim was to investigate the effect of centrifugation and re-dilution in Tris on thawed
semen of collared peccaries. A total of eight ejaculates obtained from eight adult males by
electroejaculation were diluted in Tris plus 10% of egg yolk and 3% glycerol, bottled in 0.25
ml straws and stored in liquid nitrogen. After one week, samples were thawed and divided
into two aliquots: one immediately re-diluted in Tris and the other first centrifuged and then
re-diluted in Tris. Sperm motility and vigor were evaluated for 60 min after thawing. A
significant reduction on sperm motility and vigor was verified at 15 min after thawing
for all the samples (P < 0.05). Also, no statistical difference was verified among sperm
characteristics related to the samples centrifuged or not (P> 0.05). In conclusion, collared
peccaries semen presents a low longevity after thawing and the centrifugation does not increase
the sperm quality after thawing.
Kewyord: collared peccary, thawing, centrifugation, Tris.
Palavras-chave: cateto, descongelação, centrifugação, Tris.
INTRODUÇÃO
Sabe-se que o desenvolvimento de biotécnicas, como a criopreservação de
gametas, é essencial à preservação da biodiversidade e desenvolvimento de pesquisas
básicas. Todavia, para a implantação desta biotécnica uma alternativa é à utilização de
sêmen congelado, que apesar de conservar a capacidade fecundante do sêmen por
longos períodos de armazenamento (Oliveira et al., 2009), muitas vezes provocam
mudanças deletérias na estrutura e integridade das membranas (plasmáticas,
62
acrossomais ou mitocondriais), causando assim uma redução da fertilidade. Diante
disso, devem-se buscar protocolos que permitam a sobrevivência dos espermatozoides
em todo o processo de congelação/descongelação, aumentando assim, a taxa de
fertilização. A centrifugação também pode influenciar a qualidade seminal, pela
remoção de substâncias nocivas presentes no sêmen. Porém apresenta efeitos
controversos nas diversas espécies (Castelo et al, 2010). Neste sentido, testes têm sido
desenvolvidos para avaliar a capacidade de sobrevivência após a descongelação dos
espermatozoides, como o teste de termorresistência. Assim, o objetivo deste estudo foi
verificar o efeito da centrifugação e da re-diluição em Tris após a descongelação, sobre
a qualidade dos espermatozóides de catetos.
MATERIAL E MÉTODOS
Foram utilizados oito catetos machos adultos, criados no Centro de
Multiplicação de Animais Silvestres (CEMAS). Os animais foram inicialmente
submetidos à contenção mecânica utilizando-se um puçá seguido pela contenção
química (Propofol - 5mg/kg/IV).
A coleta do sêmen foi realizada por eletroejaculação e o sêmen foi
imediatamente avaliado de acordo com o CBRA (1998). Em seguida, procedeu-se a
diluição em Tris, acrescido de 10% de gema de ovo e 3% de glicerol, a uma
concentração final de 100 x 106 espermatozoides/mL, e a criopreservação segundo o
método descrito para sêmen de catetos (Castelo et al., 2010). Após uma semana, as
amostras foram descongeladas em banho-maria a 37ºC/min e divididas em duas
alíquotas: uma submetida à centrifugação (300 g/10 min) e outra sem centrifugação,
ambas re-diluídas em Tris. As amostras foram avaliadas imediatamente após a rediluição e ao longo de 15, 30, 45, 60 minutos após a descongelação. Os resultados
foram expressos na forma de média e erro padrão e analisados pelo programa Statview
5.0 (SAS Institute Inc. Cary, NY, USA). A comparação entre as médias foi realizada
pelo teste t (P < 0,05).
Os resultados de motilidade e vigor para cada tratamento são apresentados na
Figura 1. De modo geral, verificou-se que os espermatozoides de catetos apresentaram
baixa longevidade pós-descongelação, com uma redução significativa da motilidade e
63
do vigor espermático já aos 15 minutos após a descongelação. Não foi observada
diferença estatística entre as amostras submetidas ou não à centrifugação (P>0,05).
Figura 1: Motilidade e vigor do sêmen de catetos (Tayassu tajacu) descongelado (D) e rediluído em Tris, sendo mantido íntegro (Tris) ou submetido a centrifugação (TC) por até 60
minutos (n = 8 ejaculados).
CONCLUSÕES
Conclui-se que a re-diluição do sêmen de catetos em Tris pode ser realizada
apenas visando um aumento no volume seminal, haja vista que não determina um
incremento na longevidade espermática. Além disso, não há a necessidade de se
centrifugar as amostras de sêmen de cateto após a descongelação.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRAFICAS
OLIVEIRA, R. V.; NUNES, J. F.; SALGUEIRO, C. C. M.; CAVALCANTE, J. M. M.;
MOURA, A. A. A. M.; ARAÚJO, A. A. Avaliação morfológica de espermatozoides
caprinos diluídos e congelados em meio à base de água de coco em pó (ACP-101) ou
TRIS, corados por eosina-nigrosina e azul de bromofenol. Ciência Animal Brasileira, v.
10, n. 3, p. 862- 869. 2009.
CASTELO, T.S.; BEZERRA, F.S.B.; SOUZA, A.L.P.; MOREIRA, M.A.P.; PAULA,
V.V.; OLIVEIRA, M.F.; SILVA, A.R. Influence of the thawing rate on the
cryopreservation of semen from collared peccaries (Tayassu tajacu) using Tris-based
extenders. Theriogenology. V. 74 1060-1065, 2010.
CBRA – Colégio Brasileiro de Reprodução Animal. Manual para exame andrológico e
avaliação de sêmen animal. Belo Horizonte: CBRA. 53p, 1998.
64
Monitoramento de esteroides sexuais no plasma sanguíneo durante o ciclo
ovariano de Sapajus apella e Sapajus libidinosus (macaco-prego) mantidos em
cativeiro
Monitoring in plasma sanguineous sex steroids during the cycle ovarian Sapajus apella
and Sapajus libidinosus (capuchin monkey) kept in captivity
Márcia Cristina de Miranda Lima1*; Elizabete Nikolak1; Sarah Raphaella Rocha de
Azevedo Scalercio1; Ingrid Schunlaus Nikolak Jacometto2; Maria Clara Caldas
Bussiere3; Sheyla Farhayldes Souza Domingues1
¹Universidade Federal do Pará (UFPA), Castanhal, PA, Brasil
2
Laboratório de Biologia e Medicina de Animais Silvestres – UFPA – Castanhal PA
3
Universidade Estadual do Norte Fluminense
ABSTRACT
This work aims to describe the plasma sanguineous concentrations of 17β-estradiol
during the menstrual cycle of Sapajus apella e Sapajus libidinosus bred in captivity by
electrochemiluminescence technique (ECL) aiming to monitor the ovarian cycle. The
ovarian cycles for Sapajus apella e Sapajus libidinosus were 22.0±1.0 and 21.0±1.7
days, respectively. The peak 17β-estradiol in sanguineous plasm were 701.7 116.4 pg
ml and 972.2 692.7 pg ml for S. apella and S. libidinosus. The day of maximun 17βestradiol plasmatic concentration ocurred on days 9.5±1.3 and 6.0 ±1.7 of menstrual
cycle. The electrochemiluminescence technique is suitable to monitor the ovarian cycle
in S. apella and S. libidinosus.
Key Words: Genus Sapajus; Electrochemiluminescence; noninvasive methods
Palavras-chave: Gênero Sapajus; Eletroquimioluninescência; métodos não invasivos
INTRODUÇÃO
O monitoramento endócrino-reprodutivo por meio da mensuração de esteroides
sexuais tem se mostrado de grande importância para o entendimento da fisiologia
reprodutiva de primatas não-humanos (Smith et al., 2004; Palme, 2005). A espécie
Sapajus apella é amplamente estudada em pesquisas biomédicas devido sua
similaridade filogenética com a espécie Homo sapiens (Wolf et al., 2004), enquanto que
Sapajus libidinosus os estudos estão mais relacionados com suas características físicas,
65
suas demografias dentro dos grupos, além das correlações com fatores físicos do
ambiente e tradições comportamentais no uso de ferramentas (Falotico, 2011), sendo
que pouco se sabe sobre a fisiologia da reprodução nessa espécie. Neste sentido, o
presente trabalho teve como objetivo descrever os níveis plasmáticos de 17β-estradiol
durante o ciclo reprodutivo de Sapajus apella e Sapajus libidinosus cativos por meio da
técnica de eletroquimioluminescência (EQL).
MATERIAL E MÉTODOS
O estudo foi realizado no Centro Nacional de Primatas – CENP, órgão da
secretaria de Vigil ncia em Saúde, pertencente ao Ministério da Saúde (CENP SVS
MS), localizado na cidade de Ananindeua, Pará, Brasil (latitude: 1º22’52’’S,
48º22’52’’W). Os procedimentos experimentais foram aprovados pelo Comitê de Ética
do Instituro Evando Chagas.
Foram selecionadas quatro fêmeas adultas da espécie Sapajus apella (n = 4) e três
fêmeas adultas da espécie Sapajus libidinosus (n = 3), com características fenotípicas
normais para cada espécie, pertencentes ao plantel reprodutivo do CENP.
Para os procedimentos de coleta sanguínea, as fêmeas foram contidas com a
associação de Cloridrato de Ketamina (10mg kg) e Cloridrato de Xilazina (1mg kg)
por via intramuscular e o primeiro dia do ciclo mesntrual foi determinado pela
colpocitologia. O sangue colhido foi centrifugado e, em seguida armazenado em freezer
a – 70ºC para posterior processamento. As dosagens hormonais foram realizadas pelo
analisador automático Elecsys 2010 (Roche® Diagnostics), por reações de
eletroquimiluminescência (EQL), seguindo o protocolo do fabricante.
RESULTADOS
O ciclo ovariano das fêmeas de Sapajus apella e Sapajus libidinosus tiveram
duração média de 22,0±1,0 e 21,0±1,7 dias, respectivamente. Os picos médios das
concentrações plasmáticas de 17β-estradiol nas fêmeas de Sapajus apella e Sapajus
libidinosus foram 701,7 116,4 pg ml e 972,2 692,7 pg ml, sendo que ocorreram nos
dias 9,5±1,3 e 6±1,7 (Figuras 1A e 1B).
66
(A)
1
1
2
2
3
3
4
4
5
5
6
6
(B)
Figura 1 – Concentrações plasmáticas de 17β-estradiol (pg ml) durante o ciclo ovariano de
Sapajus apella (A) e Sapajus libidinosus (B).
O presente estudo demonstrou que a técnica de eletroquimioluminescência é
adequada para o monitoramento do perfil plasmático de 17β-estradiol em fêmeas de
Sapajus apella e Sapajus libidinosus. Os resultados obtidos para Sapajus apella são
compatíveis com os descritos para a espécie, por outro lado, em Sapajus libidinosus,
os trabalhos realizados estão voltados para o comportamento animal e uso de
ferramentas; para esta espécie ainda não há trabalhos com dosagem de hormônios
esteroidais sexuais.
FALOTICO, T. Uso de ferramentas por macacos-prego (Sapajus libidinosus) do parque
nacional Serra da Capivara-Pi. Acesso em 26 de abril de 2012. Disponível em:
http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/47/47132/tde-04112011-171428/en.php.
PALME, R. Measuring fecal steroids: Guiderlines for practical application. Annals of
the New York Academy of Sciences, v. 1046, p. 75-80, 2005.
SMITH, T. E. et al. Quantitative data on training new world primates to urinate.
American Journal of Primatology, v.64, p. 83-93, 2004.
WOLF, D.P.; THORMAHLEN, S.; RAMSEY, C.; YEOMAN, R.R; FANTON, J.;
MITALIPOV, S. Use of Assisted Reproductive Technologies in the Propagation of
RhesusMacaque Offspring. Biology Reproduction, v.71, p. 486-493, 2004.
67
Triplex Doppler da artéria uterina de macaco de cheiro (Saimiri Sciureus)
Triplex Doppler uterine artery of squirrel monkey (Saimiri sciureus) females.
Elizabete Nikolak1*, Danuza Leite Leão¹, Sarah Raphaella Rocha de Azevedo
Scalercio1, Ingrid Schunlaus Nikolak Jacometto², Débora da Vera Cruz Almeida¹,
Sheyla Farhayldes Souza Domingues¹ ²
1
2
- Universidade Federal do Pará (UFPA), Castanhal, PA, Brasil
- Laboratório de Biologia e Medicina de Animais Silvestres – UFPA – Castanhal PA
ABSTRAT
The study aimed to evaluate the resistivity (IR) and pulsatility (IP) indexes of
the uterine artery in six Saimiri sciureus females (n = 6) by ultrasound examinations
using Triplex Doppler mode. The transabdominal examinations were conducted with an
PHILIPS HDI 4000 scanner and results were presented the mean ± standard deviation.
The comparison of uterine artery IR and IP between ovulatory and nonovulatotory sides
were performed by Student's test T (P<0.05). The sonographic patterns of uterine artery
Triplex Doppler in neotropical primates may provide the normal standards wich will
sort and distinguish them from changes that occur during the reproductive period.
Measurements have proved that there was a greater flow of blood in the uterine arteries
during ovulatory period.
Key words: Triplex Doppler, uterine artery, females.
Palavras-chaves: Tríplex Doppler, artéria uterina, fêmeas.
INTRODUÇÃO
A espécie Saimiri sciureus é um primata neotropical existente na região
Amazônica conhecida vulgarmente como macaco de cheiro (Dukelow, 1985), sendo
uma das espécies mais utilizadas em pesquisas biomédicas, pois são grandes as
semelhanças anatomofisiológicas com os seres humanos, podendo ser usados em
técnicas de reprodução assistida. Este fato torna de grande relevância o conhecimento
dos padrões ultrassonográficos de Doppler colorido e de fluxo (Tríplex Doppler) do
trato reprodutivo destes animais. O Tríplex Doppler é fundamental neste caso, pois nos
permite diferenciar os padrões de normalidade das mudanças fisiológicas ou possíveis
68
patologias que podem acontecer durante o período reprodutivo. É necessário melhorar
as técnicas reprodução assistida destes animais, a priori para o bem estar dos animais e
também reproduzi-los em maior número para serem usados como sujeitos experimentais
nas pesquisas acima citadas. Desta forma eles podem servir como bancos genéticos
vivos para as gerações futuras.
Dentro deste contexto os modernos softwares dos aparelhos de ultrassonografia
(US), permitem mensurações não só das estruturas anatômicas, mas também do fluxo
sanguíneo por meio dos Modos Doppler colorido e de fluxo, tanto qualitativamente
como quantitativamente, permitindo o conhecimento também da perfusão sanguínea
(Szatmari, 2001) de útero e ovários, bem como estes se comportam durante o ciclo
estral. Portanto o objetivo deste trabalho foi avaliar por meio do tríplex Doppler (Modo
B + Doppler colorido + Doppler de fluxo) as variações dos índices de resistividade (IR)
e pulsatilidade (IP) da artéria uterina (AU) durante o ciclo estral, de fêmeas de Saimiri
sciureus, que ovularam e as que não ovularam.
MATERIAL E MÉTODOS
O estudo foi realizado no Centro nacional de primatas – CENP, órgão da
secretaria de Vigil ncia em Saúde, pertencente ao Ministério da Saúde (CENP SVS
MS), localizado na cidade de Ananindeua, Pará, Brasil. Foram utilizadas seis fêmeas
(n=6) adultas da espécie Saimiri sciureus. Para o exame ultrassonográfico (US), os
animais eram submetidos a jejum alimentar prévio de 12 horas, meia hora antes destes,
foi oferecido suco de frutas instantâneo ad libitum.
Os animais foram contidos com Cloridrato de ketamina (14mg/PV) e Xilazina
(1mg/PV), foi feita uma tricotomia da região pélvica, e aplicado o gel acústico à pele.
As US foram realizadas no período da manhã, usando o aparelho Philips HDI 4000
(Philips Medical Systems, Bothel, WA, EUA), em TriplexDoppler, com um transdutor
linear multifatorial (3,5 a 7,5MHz), possibilitando uma varredura completa da região
pélvica.
RESULTADOS
Os resultados dos índices de resistividade e pulsatilidade das artérias uterinas,
direita e esquerda, estão descritos na Tabela 1. As análises somente eram consideradas
corretas quando se obtinham três ondas consecutivas com velocidades iguais. Ao todo,
69
procedeu-se a 288 análises de tríplex Doppler, distribuídas nos seis animais do
experimento, durante 15 dias de exames. Foi possível a realização das mensurações da
variação do fluxo sanguíneo da AU durante o período de ciclo estral, e a variação dos
valores de IR e IP comprovaram que o fluxo sanguíneo foi maior na AU das macacas
que ovularam.
Tabela 01. Valores (Média + Desvio Padrão) dos índices de resistividade (RI) e pulsatilidade
(PI) durante o ciclo estral de fêmeas adultas de Saimiri sciureus em ciclos ovulatórios e não
ovulatórios.
Ciclo ovulatório
RI
1,91 + 1,14
Ciclo não ovulatório
PI
a
RI
0,90 + 0,30
A
2,63 + 0,59
PI
b
0,93 + 0,08B
a-b.Comparações dos RI entre os ciclos ovulatórios e não ovulatórios.
A-B. Comparações dos PI entre os ciclos ovulatórios e não ovulatórios.
CONSIDERAÇ ES INAIS
No presente trabalho, o uso do modo tríplex Doppler, para avaliar as variações
dos índices de resistividade e pulsatilidade da AU em fêmeas adultas saudáveis,
mostrou ser um método prático, eficiente e preciso.
RE ERENCIAS BIBLIO R
ICAS
DUKELOW, W. R. Reproductive cyclicity and breeding in the squirrel monkey. In:
Rosenblum L. A., Coe C. L. (eds). Handbook of squirrel monkey research. Plenum,
New York, p. 169-190, 1985.
POURCELOT, L. Applications clinique de léxamen Doppler transcutane. In:
Peronneau, P., (Ed.). Velocimetrie ultrasonore Doppler. Inserm, Paris, p. 213-240, 1974.
SZATMÁRI, V.; SÓTONYI P.; VÖRÖS, K. Normal duplex doppler waveforms of
major abdominal blood vessels in dogs: a review. Veterinary Radiology & Ultrasound,
v. 42, p. 93-107, 2001.
70
Validação de um protocolo para avaliação espermática em macaco-de-cheiro
(Saimiri sciureus) utilizando sondas fluorescentes
Protocol Validation for Sperm Evaluation in Squirrel Monkey
(Saimiri sciureus) by Fluorescent Probes
1
1
1
Débora da Vera Cruz Almeida, 1Karol Guimarães Oliveira, 1Danuza Leite Leão,
Elizabete Nikolak Nikolak, 1Yago Pinto da Silva*, 1Sheyla Farhayldes S. Domingues
Laboratório de Biotecnologia e Medicina de Animais Silvestre da Amazônia – UFPA
*e-mail: [email protected]
ABSTRACT
Semen was collected by electroejaculation, extended in ACP®-118, divided in three
groups: T0 (100% dead sperm), T50 (50% live and 50% dead sperm), and T100 (100%
live sperm) and stained with H342 and PI (evaluation of plasma membrane integrityPMI), FITC-PSA (acrosomal membrane integrity-AMI) and JC-1 (mitochondrial
membrane potential-MMP). All variables were analyzed as mean ± SD and compared
among treatments by ANOVA. Individual means were compared by Fisher's test
(P<0.05). Data obtained in T0, T50 and T100 were submitted to linear regression
analysis. Means ± SD were: PMI (T0: 0 ± 0, T50: 42 ± 4.69; T100: 82.5 ± 10.78), AMI
(T0: 62.2 ± 8.04, T50: 78 ± 10.04; T100: 97.6 ± 3.57) and MMP (T0: 0 ± 0, T50: 2.2 ±
5.5, T100: 34 ± 15.9) with significant difference between treatments. Thus, the
combination of fluorescent probes proved to be efficient for the S. sciureus sperm
evaluation.
Keywords: Fluorescent probes, semen, Saimiri sciureus
Palavras–chave: Sondas fluorescentes, sêmen, Saimiri sciureus
INTRODUÇÃO
Os parâmetros espermáticos: morfologia, concentração, motilidade e vigor
rotineiramente avaliados são bastante subjetivos, visto que há uma alta variação entre
observações e observadores (Arruda et al., 2011). As sondas fluorescentes podem
viabilizar uma análise mais criteriosa e objetiva tanto do sêmen fresco como ao
submetido aos processos de resfriamento, congelação e descongelação, marcando danos
espermáticos, auxiliando na escolha do sêmen viável para ser aplicado em programas de
71
reprodução
assistida
(Celeghini,
2005).
Alguns
trabalhos
utilizaram
sondas
fluorescentes para avaliar a viabilidade espermática de primatas do velho mundo como
Macaca mulata (Cai et al., 2005) e Macaca fasciculares (Cross et al., 1989), bem como
em primatas neotropicais, Callithrix jacchus (Valle, 2007). O objetivo do presente
trabalho foi testar a eficiência da associação de sondas fluorescentes em avaliar
simultaneamente a integridade das membranas plasmáticas e acrossomal, bem como a
função mitocondrial de espermatozóides de Saimiri sciureus.
MATERIAL E MÉTODOS
O experimento foi conduzido no Centro Nacional de Primatas e previamente
aprovado pelo Comitê de Ética (CEPAN 0010/2011/CEPAN/IEC/SVS/MS). Foram
realizadas 12 coletas de sêmen de 6 machos adultos de S. sciureus por eletroejaculação
com probe retal após sedação com Cloridrato de Ketamina (12 mg/kg) e Xilazina (1
mg/kg). Não foi possível validar o protocolo de associação de sondas fluorescentes em
sêmen fresco, pois o mesmo apresentou rápida perda dos parâmetros vigor e motilidade
espermática, logo o experimento foi realizado utilizando sêmen diluído em água de coco
em pó (ACP®-118), a qual manteve os parâmetros espermáticos necessários (motilidade
≥ 80% e vigor ≥ 4) para a padronização das sondas. Foram formados três tratamentos:
com espermatozóides 100% mortos (T0); 50% vivos e 50% mortos (T50) e 100% vivos
(T100). Todos os tratamentos foram submetidos à coloração com fluorocromos para a
avaliação da integridade de membrana plasmática (Iodeto de Propídio e Hoechst
33342), integridade acrossomal (FITC-PSA) e função mitocondrial (JC-1). A avaliação
espermática foi feita em lâmina e lamínula, em microscópio de epifluorescência. Todas
as variáveis foram analisadas em média ± DP. As porcentagens encontradas para as
variáveis foram comparadas entre os três tratamentos por análise de variância
(ANOVA). As médias individuais foram comparadas pelo teste de Fisher (P<0,05).
Foram observadas diferenças significativas (P<0,05) entre os três tratamentos.
As médias ± DP dos parâmetros avaliados são: integridade da membrana plasmática
(T0: 0 ± 0; T50: 42 ± 4,69; T100: 82,5 ± 10,78), integridade acrossomal (T0: 62,2 ±
8,04; T50: 78 ± 10,04; T100: 97,6 ± 3,57) e função mitocondrial (T0: 0 ± 0; T50: 2,2 ±
5,5; T100: 34 ± 15,9). Como esperado, foi observado um decréscimo dos percentuais
72
das variáveis analisadas desde o tratamento T100, passando pelo T50 até o T0. No
tratamento T0, praticamente 100% dos espermatozóides apresentaram a membrana
plasmática lesionada, como era de se esperar para uma amostra que foi submetida à
crioinjúria. No entanto, 65% dos espermatozóides apresentaram acrossoma íntegro,
diferente do resultado encontrado por Celeghini (2005) que ao utilizar o mesmo
protocolo para avaliar o sêmen de bovinos observou somente 3,82% de espermatozóides
com acrossoma íntegro. O resultado encontrado pode estar associado ao menor tempo
de exposição dos espermatozóides ao nitrogênio líquido durante a crioinjúria, ou
possivelmente o efeito crioprotetor conferido ao diluidor ACP®-118.
CONCLUSÃO
A avaliação simultânea da integridade da membrana plasmática e acrossomal e
função mitocondrial de espermatozóides de S. sciureus pode ser realizada por técnicas
simples e de alta repetibilidade pela associação das sondas fluorescentes H342, PI,
FITC-PSA e JC-1.
ARRUDA, R. P.; CELEGHINI, E. C. C.; ALONSO, M. A.; CARVALHO, H. F.;
OLIVEIRA, L. Z.; NASCIMENTO, J.; SILVA, D. F.; AFFONSO, F. J.; LEMES, K.
M.; JAIMES, J. D.; Métodos de avaliação da morfologia e função espermática:
momento atual e desafios futures. Revista Brasileira de Reprodução Animal, v.35, n.2,
p.145-151, 2011
CAI, K.; YANG, J.; GUAN, M.; LI, Y.; RENS,W. Single UV excitation of Hoechst
33342 and propidium iodide for viability assessment of rhesus monkey spermatozoa
using flow cytometry. . Archives of Andrology. v. 55, n. 5, p 371-383, 2005.
CELEGHINI, E. C. C. Efeitos da criopreservação do sêmen bovino sobre as membranas
plasmáticas, acrossomal e mitocondrial e estrutura da cromatina dos espermatozóides
utilizando sondas fluorescentes. 2005, 186p. Tese (Doutorado em Reprodução Animal)
- Faculdade de medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo.
CROSS, N. L. ; MORALES, P. ; FUKUDA, M.; BEHBOODI, E. Determining
acrossomal status of cynomolgus monkey(Macaca fasciculares) sperm by fluorescence
microscopy. American Jornal of Primatology, v. 17, p. 157-163, 1989.
73
VALLE, R. R. Colheita, análise e criopreservação de Sêmen de uma espécie modelo de
primata neotropical, Sagui-de-tufo-branco (Callithrix jacchus). 2007. 535p Tese
(Doutorado em Reprodução Animal) - Curso de Pós-graduação em Reprodução Animal,
Universidade de São Paulo.
74
Variação individual relativa às características seminais de catetos (Tayassu tajacu
Linnaeus, 1758)
Individual Variation Related to the Semen Characteristics of Collared Peccaries
(Tayassu Tajacu Linnaeus, 1758)
Gislayne Christianne Xavier Peixoto*1; Mariana Araújo Silva1; Gabriela Liberalino
Lima1; Ariana Lopes Correia de Paiva2; Valéria Veras de Paula2; Alexandre Rodrigues
Silva1
1
2
Laboratório de Conservação de Germoplasma Animal – LCGA;
Laboratório de Anestesiologia Veterinária, Universidade Federal Rural do Semi Árido
– UFERSA, Mossoró, RN
ABSTRACT
This research studied the effect of individual variation on the semen characteristics in
collared peccaries. A total of 52 ejaculates were obtained from ten adult specimens that
had been restrained by anesthesia. Semen was collected by electroejaculation and
immediately evaluated. To evaluate the individual effect of the collared peccary on the
semen characteristics, data were analyzed by Fisher’s protected least significant
difference test (P < 0.05). The animals presented a great individual variation in all the
semen characteristics, although these possess the same age and undergo the same
management.
Key words: collared peccary, semen, individual variation
Palavras-chave: cateto, sêmen, variação individual
INTRODUÇÃO
O conhecimento das características seminais de espécies silvestres é
fundamental na rotina de reprodução assistida, pois permite a utilização do uso racional
de gametas, bem como do número de reprodutores, assumindo decisivo papel na
determinação da fertilidade animal. Além disso, pode compreender requisitos básicos
para a resolução de problemas que afetam a função reprodutiva desses animais.
Contudo, os parâmetros seminais podem ser influenciados por fatores como idade,
fotoperíodo, nutrição e temperatura, que poderiam causar diminuição da eficiência da
espermatogênese e produção total de espermatozoides/ejaculado, bem como pela
75
variabilidade individual (Guerra et al., 2009), que consiste em um quesito essencial para
selecionar e classificar previamente os animais de alta fertilidade (Gouletsou et al.,
2008). Dessa forma, o presente trabalho objetivou determinar a existência de variações
individuais com relação aos parâmetros seminais de um grupo de catetos submetidos a
um manejo similar.
MATERIAL E MÉTODOS
Um total de 10 catetos machos sexualmente maduros, com idade média de 3,3 ±
1,6 anos e peso médio de 20,5 ± 1,26kg, pertencentes ao Centro de Multiplicação de
Animais Silvestres (CEMAS-UFERSA) foi utilizado neste estudo. Os animais foram
mantidos em iluminação natural, e antes da realização do experimento separados das
fêmeas de catetos e mantidos ao ar livre em piquetes, sendo fornecido ração para suínos,
complementada com frutas tropicais. A água foi fornecida ad libitum. Foram contidos
quimicamente com propofol na dose 5mg/kg, e submetidos de 4 a 7 sessões de
eletroejaculação com intervalos quinzenais entre cada sessão, sendo todo o experimento
realizado durante a estação seca. Após a coleta, o sêmen foi imediatamente avaliado. A
análise estatística foi realizada pelo programa Statview 5.0, cujos dados foram
expressos em média e desvio padrão, tendo o efeito individual com relação às
características seminais, verificado pelo teste PSLD de Fisher (p<0,05).
Foram obtidos 52 ejaculados por meio de eletroejaculação. Observaram-se
diferenças significativas entre os indivíduos com relação a todos os parâmetros seminais
(p<0,05) (Tab. 1 e 2). A influência dessas diferenças, possivelmente, pode ser atribuída
principalmente à variação genética individual de cada reprodutor, visto que o grupo de
animais era homogêneo em relação à idade e ao peso, e nenhuma diversidade de
manejo, tanto reprodutivo quanto sanitário, foi realizada durante todo o período
experimental. Tais medidas foram adotadas, devido o manejo ser considerado um
aspecto importante no estudo da relação entre fertilidade e qualidade seminais em
mamíferos (Devkota et al., 2008). Além disso, a ocorrência de variabilidade nas
características seminais consiste em um bom indicativo de uma população bastante
heterogênea, o que torna possível a seleção de indivíduos, cujo sêmen apresenta
melhores características para posterior conservação (Karagiannidis et al., 2000).
76
Tab 1: Valores médios ± EP das características do sêmen de animais adultos da espécie Tayassu tajacu coletados
por eletroejaculação (n = 52 ejaculados).
Animal
Ejaculados
Volume (ml)
Concentração (x106⁄ml)
No esperm./ml (x106)
a
ad
1
7
8,9 ±4,3
870 ±573,8
8117,9 ±6877,5ac
b
acd
2
4
0,9 ±0,4
1247,5 ±779,6
1128,0 ±958,1b
bc
ab
3
5
2,8 ±1,0
320 ±257,6
875,2 ±881,8b
ac
b
4
5
3,2 ±2,8
496 ±205
1812,2 ±2257,5b
bc
cd
5
5
1,5 ±0,9
1276 ±1622,4
1557,8 ±1968,0b
bc
d
6
6
1,1 ±0,8
1048,3 ±850,2
1469,0 ±2187,4b
ad
b
7
6
4,4 ±6,8
241,7 ±158,4
904,8 ±1278,4b
ac
abd
8
3
5,4 ±2,8
453,3 ±435,5
2941,0 ±2689,4bc
bc
ad
9
6
2,2 ±0,9
843,3 ±442,8
1952,3 ±1430,7b
ac
ad
10
5
3,1 ±2,2
630 ±455,4
2239,6 ±2462,6b
Média
3,5 ±3,8
747,1 ±726,0
2471,9 ±3649,6
a,b,c,d
Sobrescritos diferentes na mesma coluna denotam diferença significativa (P<0,05)
Vigor (0-5)
4,7 ±0,4ab
3,5 ±0,6ab
2,7 ±0,7ab
4,9 ±0,2a
4,6 ±0,9b
4,8 ±0,4ab
3,4 ±0,5ab
4,3 ±1,2b
4,5 ±0,5ab
4,4 ±0,5ab
4,2 ±0,9
Tab 2: Valores médios ± EP das características do sêmen de animais adultos da espécie Tayassu tajacu coletados
por eletroejaculação (n = 52 ejaculados).
Animal
Ejaculados
Motilidade (%)
Viabilidade (%)
Integridade membrana (%)
1
7
92,9 ±2,7a
89,1 ±4,5ade
89,1 ±4,5a
b
abce
2
4
72,5 ±16,6
79,5 ±11,4
67,8 ±21,2b
bc
abce
3
5
70,0 ±10,4
85,0 ±9,4
69,2 ±5,9c
ac
abde
4
5
92,0 ±4,5
90,2 ±6,2
73,2 ±7,3abc
bc
ad
5
5
90,0 ±8,7
95,2 ±3,4
73,8 ±10,5abc
a
bce
6
6
93,3 ±2,6
82,8 ±16,8
81,0 ±6,4ac
bc
bce
7
6
75,8 ±8,0
81,8 ±15,1
73,8 ±16,2bc
bc
ce
8
3
78,3 ±10,4
70,7 ±38,7
77,0 ±6,6abc
ac
d
9
6
88,3 ±5,2
92,8 ±2,7
78,2 ±15,2bc
a
e
10
5
97,0 ±2,7
87,2 ±11,0
79,2 ±21,8b
Média
85,1 ±10,7
86,3 ±13,3
76,9 ±13,2
a,b,c,d
Sobrescritos diferentes na mesma coluna denotam diferença significativa (P<0,05)
Morfologia (%)
77,5 ±8,0abcd
62,5 ±2,9bd
84,6 ±12,5c
83,0 ±5,8acd
84,6 ±7,0acd
71,5 ±17,2c
72,3 ±8,7acd
65,7 ±11,1acd
89,1 ±9,6acd
87,6 ±8,8acd
79,9 ±12,8
CONCLUSÃO
Em conclusão, os catetos machos apresentaram uma grande variação individual no
tocante às suas características seminais, mesmo possuindo idades semelhantes, e serem
submetidos ao mesmo manejo sanitário e reprodutivo.
DEVKOTA, B.; KOSEKI, T.; MATSUI, M.; SASAKI, M.; KANEKO, E.;
MIYAMOTO, A.; AMAYA-MONTOYA, C.; MIYAKE, Y. Relationship among age,
body weight scrotal circumference, semen quality and peripheral testosterone and
estradiol concentrations in pubertal and postpubertal Holstein bulls. J Vet Med Sci.,
v.70, p.119–121, 2008.
77
GOULETSOU, P.G.; GALATOS, A.D.; LEONTIDES, L.S. Comparison between
ultrasonografic and caliper measurements of testicular volume in the dog. Anim Reprod
Sci., v.108, p.1–12, 2008.
GUERRA,M.M.P.; SOUZA, A.F.; SOARES, A.T.; CÉSAR, C.N.R.; SILVA, S.V.;
BATISTA, A.M. Aspectos críticos da congelação do sêmen caprino. Rev Bras Reprod
Anim, n.6, p.42-49, 2009.
KARAGIANNIDIS, A.; VARSAKELI, S.; KARATZAS, G. Characteristics and
seasonal variations in the semen of Alpine, Saanen and Damascus goat bucks born and
raised in Greece. Theriogenology, v.53, p.1285-1293, 2000.
78

animais silvestres

Transcription

Similar documents

Anormalidades em espermatozoides de carpa comum, Cyprinus

bovinos e bubalinos