PDF - Les thèses en ligne de l`INP

REMERCIEMENTS
Au terme de ces années de doctorat et au commencement d’une nouvelle étape de ma
vie, j’exprime ma sincère gratitude à tous ceux qui ont participé de près ou de loin à la
réalisation de mon travail et je tiens ici à les remercier.
J’adresse tout d’abord mes remerciements à Mesdames Françoise Corbineau et
Isabelle Debeaujon ainsi qu’à Monsieur Philippe Seguin qui ont accepté d’évaluer et de
juger ce manuscrit en qualité de rapporteur. Je remercie également Madame Vassilia
Théodorou-Bayle qui a accepté de participer à ce jury de thèse.
Bien évidemment, j’adresse mes remerciements à mon directeur de thèse, Monsieur
Jean Daydé, et à ma co-directrice, Madame Monique Berger, qui ont encadré mon travail de
thèse. J’ai beaucoup appris à leurs côtés pendant ces trois années et beaucoup apprécié notre
collaboration et l’autonomie qu’ils m’ont accordée.
J’adresse également mes chaleureux remerciements aux directeurs des laboratoires où
j’ai pu travailler, Madame Vassilia Théodorou-Bayle, directrice de l’équipe de NeuroGastroentérologie et Nutrition au sein de l’UMR Toxalim, à Madame Djamila Lekhal et
Monsieur Frédéric Violleau, respectivement directeurs du département d’Agronomie et du
laboratoire d’Agrophysiologie de l’E.I. Purpan, pour m’avoir permis d’intégrer leurs équipes
respectives et m’avoir soutenue tout au long de ma thèse.
Je remercie la Direction Générale de l’Enseignement et de la Recherche (DGER) ainsi
que la région Midi Pyrénées qui ont financé mon travail de thèse.
Je veux également remercier Christel, pour sa gentillesse, son apport technique si
précieux pour moi ainsi que les stagiaires Chloé, Daphné, Clémence et Mathieu qui ont
participé à ce sujet de thèse et m’ont aidée dans l’accomplissement de mon projet.
Ces années de doctorat ont été l’occasion de nombreuses rencontres qui ont
accompagné mon travail avec une dimension humaine que j’ai beaucoup appréciée.
J’ai une pensée particulière pour Joëlle, Christiane et Cécile M., pour leur écoute, leur
soutien, leurs encouragements et leur amitié.
Je tiens à adresser de sincères remerciements à Arnaud, Hervé, Pascal et Philippe pour
leur aide, leurs précieux conseils et leur amitié.
Egalement un grand grand merci à toute l’équipe des « Neugeuneu » - le girl power ! :
Céline, Marion, Guylène, Cathy, Valérie T., Cherryl, Sandrine, Muriel, Mathilde, Valérie
« Bé », Lara, Simona, Isa, Delphine, Maïwen, Nabila, Ambre, Valérie « Ba », Corinne,
Soraya, Afi, Viorica, Stéphanie, et Hélène – ainsi que les erreurs de casting ! : Laurent, Eric
H., Thomas et Eric G. – pour leur sympathie, leur soutien moral et tous ces bons moments
passés ensemble.
Je n’oublie pas non plus mes collègues de l’E.I. Purpan : Mireille, Anne, Dominique,
Cécile, Ophélie, Nathalie, Hélène, Alban et Michäel pour leur gentillesse et leurs conseils.
Ma sympathie et ma profonde amitié vont également à mes collègues thésards
purpanais – Khalid et Abder (mes « tic et tac » favoris), Marc, Jérôme et Virginie pour leur
joie de vivre, leur humour et les bons moments passés ensemble.
Je voudrais tout particulièrement remercier Isabelle et Olivier qui ont initié mon goût
pour la recherche. Ils m’ont encouragée et guidée vers l’aventure doctorale et m’ont toujours
soutenue. Leurs qualités professionnelles mais aussi humaines m’ont profondément aidée à
aller de l’avant dans la confiance et la reconnaissance.
Me voici donc au terme de cette thèse qui représente une étape très importante de ma
vie, avec des hauts et des bas, des rires mais parfois des larmes, des souffrances mais aussi
beaucoup de satisfactions. Ce chemin, jamais rectiligne, a été celui d’un apprentissage
professionnel mais surtout personnel. J’ai eu la chance d’avoir été accompagnée à chaque
étape de cette aventure et d’avoir avancé parmi les personnes que j’aime.
Je souhaite exprimer mes plus profonds remerciements à mes amis les plus chers, ils se
reconnaîtront, et dont l’amitié et le soutien n’ont jamais défailli.
Je dédie cette thèse à ma famille, à mes parents, pour leur amour et leur soutien
essentiel au cours de mes années d’études et sans lesquels je n’aurais pas pu réaliser ce long
parcours, à Lionel, mon futur époux, pour sa patience, ses encouragements permanents dans
mes moments de doute et pour le bonheur qu’il m’apporte chaque jour, à ma grand-mère,
pour son écoute, sa sensibilité et son soutien inconditionnel. Je remercie également
l’ensemble des membres de ma famille et belle-famille qu’il serait trop long de citer ici, et qui
ont, chacun à leur manière, embelli ces années.
Enfin, mes pensées vont également vers les belles étoiles qui veillent sur moi, que la vie
m’a arrachées bien trop vite, qui me manquent encore plus dans les moments importants de
ma vie et avec lesquelles j’aurai tant aimé partager ces instants présents.
TABLE DES MATIERES
INTRODUCTION GENERALE
................................................................................................... 13
CHAPITRE I : REVUE BIBLIOGRAHIQUE
......................................................................... 17
1- LE SOJA ET SA GRAINE .............................................................................................................. 18
1.1
Le soja ................................................................................................................................... 18
1.1.1
1.1.2
Description générale de la plante ............................................................................................. 18
Croissance et développement de la plante .............................................................................. 20
1.2
La graine de soja ................................................................................................................... 22
1.2.1 La physiologie de la graine ....................................................................................................... 22
1.2.2 Composition de la graine de soja ............................................................................................. 25
2- LES ISOFLAVONES ........................................................................................................................ 29
2.1
2.2
2.3
2.4
Structure, caractéristiques et effets santé ........................................................................ 29
Composition et teneur en isoflavones de la graine de soja et ses compartiments ...... 33
La cinétique d’accumulation des isoflavones dans la graine et ses compartiments .... 33
Facteurs influençant la teneur et la composition en isoflavones dans la graine .......... 36
2.4.1
2.4.2
Facteurs environnementaux ..................................................................................................... 36
Facteurs génétiques ................................................................................................................. 38
2.5
Rôles physiologiques des isoflavones dans la plante ...................................................... 40
2.5.1 Isoflavones et symbiose ........................................................................................................... 40
2.5.2 Isoflavones et défense contre les microorganismes ................................................................ 41
2.5.3 Isoflavones et stress environnementaux .................................................................................. 42
3- BIOSYNTHESE DES ISOFLAVONES DE SOJA ..................................................................... 42
3.1
Description générale de la voie de biosynthèse des isoflavones ................................... 42
3.1.1
3.1.2
3.1.3
3.1.4
Synthèse des composés phénoliques simples : voie des phénylpropanoïdes .......................... 42
La voie des flavonoïdes ............................................................................................................. 43
Variations du schéma de base chez les légumineuses ............................................................. 44
Les formes conjuguées des isoflavones .................................................................................... 45
3.2
Etat des connaissances sur les mécanismes de transport des isoflavones .................... 46
3.2.1 Les principales étapes du transport des isoflavones dans la cellule ........................................ 47
3.2.2 Mise en évidence de leur transport vers la vacuole ................................................................. 47
3.3
Les principales familles d’enzymes intervenant dans cette voie de biosynthèse ........ 48
3.3.1 La famille des lyases ................................................................................................................. 48
3.3.2 Les polykétides synthases (PKS) ............................................................................................... 49
3.3.3 Les cytochromes P450 .............................................................................................................. 52
3.3.4 Autres enzymes intervenant dans cette voie de biosynthèse .................................................. 57
3.3.5 Les enzymes de décoration des isoflavonoïdes ........................................................................ 59
3.4
Localisation et organisation subcellulaire des enzymes de cette voie .......................... 64
4- LA REGULATION DE LA SYNTHESE DES ISOFLAVONES .............................................. 65
4.1
La régulation de la transcription ........................................................................................ 65
4.1.1 ..Régulation de l’expression dans les différents tissus et selon les stades de développement de la
plante ............................................................................................................................................................. 68
4.1.2 Effet des facteurs abiotiques et biotiques ............................................................................... 71
4.2
La régulation post-transcriptionnelle ................................................................................. 75
5- OBJECTIFS DE LA THESE ........................................................................................................... 78
CHAPITRE II : MATERIEL ET METHODES ........................................................................ 81
1- MATERIEL VEGETAL UTILISE ................................................................................................. 82
1.1
1.2
Choix des variétés ................................................................................................................ 82
Les conditions de culture ..................................................................................................... 84
1.2.1
1.2.2
Culture en serre ........................................................................................................................ 84
Culture en phytotron ................................................................................................................ 84
2- METHODES GENERIQUES ....................................................................................................... 85
2.1
Les techniques de biologie moléculaire ............................................................................ 85
2.1.1
2.1.2
2.1.3
2.1.4
2.1.5
2.1.6
2.1.7
2.1.8
2.1.9
2.1.10
2.1.11
Extraction des ADN génomiques .............................................................................................. 85
Extraction des ARNs totaux ...................................................................................................... 85
Quantification et vérification de la pureté des ARNs ............................................................... 86
Elimination de l’ADN génomique des extraits d’ARNs totaux .................................................. 86
Transcription inverse (la reverse transcription RT) : ................................................................ 87
Amplification de l’ADN : Polymérase Chain Reaction (PCR) ..................................................... 88
Étude de l’expression par PCR quantitative en temps réel ...................................................... 89
Analyse des produits PCR sur gels d’agarose ........................................................................... 92
Purification des bandes d’ADN après électrophorèse .............................................................. 93
Clonage des fragments d’intérêt .............................................................................................. 93
Séquençage des plasmides et des produits PCR....................................................................... 95
2.2
Les techniques analytiques ................................................................................................. 95
2.2.1 Extraction des isoflavones ........................................................................................................ 95
2.2.2 Analyses HPLC: High Performance Liquid Chromatography ..................................................... 95
2.2.3 Quantification des isoflavones ................................................................................................. 97
2.3
Outils bioinformatiques et statistiques ............................................................................. 98
2.3.1 Traitement des séquences nucléiques et protéiques ............................................................... 98
2.3.2 Traitement statistique des données ......................................................................................... 98
3- LES DIFFERENTES EXPERIMENTATIONS ........................................................................... 99
3.1
Isolement et caractérisation des gènes IFS1 et IFS2 ....................................................... 99
3.1.1
3.1.2
Prélèvements et échantillonnage ............................................................................................. 99
Les différentes étapes de l’expérimentation ............................................................................ 99
3.2
Etude des cinétiques d’accumulation des isoflavones et d’expression des gènes cibles
dans les germes et les cotylédons .......................................................................................................... 101
3.2.1
3.2.2
Prélèvements et échantillonnage ........................................................................................... 101
Les différentes étapes de l’expérimentation .......................................................................... 102
3.3
Caractérisation des gènes F6Hs et tests d’expression ................................................... 104
3.3.1 Prélèvements et échantillonnage ........................................................................................... 104
3.3.2 Les différentes étapes de l’expérimentation .......................................................................... 106
CHAPITRE III : ETUDE DE L’EXPRESSION DES GENES DE LA VOIE DE
BIOSYNTHESE DES ISOFLAVONES DANS LES COMPARTIMENTS DE LA
GRAINE .............................................................................................................................................. 113
1- INTRODUCTION ......................................................................................................................... 114
2- PUBLICATION SCIENTIFIQUE ............................................................................................... 116
3- SYNTHESE ET CONCLUSION ................................................................................................. 143
CHAPITRE IV : ETUDE DE L’EXPRESSION DE GENES CANDIDATS
CODANT POUR LA FLAVONOÏDE 6-HYDROXYLASE, INTERVENANT
DANS LA BIOSYNTHESE DE LA GLYCITEINE ............................................................. 147
1- INTRODUCTION ......................................................................................................................... 148
2- PUBLICATION SCIENTIFIQUE ............................................................................................... 150
3- SYNTHESE ET CONCLUSION .................................................................................................. 177
CHAPITRE V: DISCUSSION ET CONCLUSION GENERALE
TABLE DES ILLUSTRATIONS
................................. 181
................................................................................................. 191
LISTE DES FIGURES........................................................................................................................ 192
LISTE DES TABLEAUX.................................................................................................................... 195
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
.................................................................................. 197
RESUME
Etude du déterminisme génétique des différences de teneurs et de profils en
isoflavones dans la graine de soja (Glycine max L. Merrill).
La graine de soja contient de grandes quantités d’isoflavones (génistéine, daidzéine et glycitéine). En
raison de leurs propriétés phytoestrogéniques, ces composés peuvent avoir des effets bénéfiques sur la
santé humaine, mais ils peuvent aussi être perçus comme perturbateurs endocriniens, en particulier
dans les laits pour nourrissons. La teneur et la composition en isoflavones de la graine diffèrent selon
la fraction considérée. Les cotylédons contiennent de la génistéine et de la daidzéine, tandis que les
germes, avec une teneur quatre à dix fois supérieure, contiennent majoritairement de la daidzéine et de
la glycitéine. Le génotype influence fortement la teneur en isoflavones totales. Le déterminisme du
pourcentage des isoflavones est essentiellement génétique. Ce travail porte sur l’étude du
déterminisme génétique à l’origine des variations de teneurs et de compositions en isoflavones dans
les germes et les cotylédons de la graine, en tenant compte également du net décalage de
l’accumulation entre ces deux compartiments, au cours du développement de la graine. Dans un
premier temps, les gènes des isoflavone synthases (IFS) de variétés très différenciées pour leurs
teneurs et profils d’isoflavones ont été séquencés, puis les expressions des gènes clefs de la
biosynthèse (neuf chalcone synthases (CHS), une chalcone réductase (CHR), quatre chalcone
isomérases (CHI) et les deux isoflavone synthases (IFS) ont été suivies par RT-PCR quantitative dans
les cotylédons et dans les germes, à trois stades critiques du développement de la graine (25, 40 et 60
jours après floraison). La seconde partie de ce travail a été consacrée à l’étude de l’expression de
différents gènes candidats de la flavonoïde 6-hydroxylase (F6H) catalysant la première étape de la
synthèse de la glycitéine. Le polymorphisme des séquences génomiques IFS1 et IFS2 des isoflavone
synthases n’a pas montré de lien avec les différences de teneurs en isoflavones entre les variétés.
L’activité transcriptionnelle des gènes de biosynthèse des isoflavones souligne l’existence d’une
régulation bien distincte de cette synthèse dans ces deux compartiments. Les taux d’expression des
gènes cibles ne sont pas toujours reliés avec les différences de teneurs ou de profils dans les germes et
les cotylédons, suggérant ainsi l’effet prépondérant des régulations post-traductionnelles, notamment
dans la formation du complexe multienzymatique de biosynthèse de ces composés. Nous avons aussi
mis en évidence une forte expression du gène CHS9 codant pour la chalcone synthase 9, avec un profil
correspondant plus à l’accumulation des isoflavones dans le germe que dans les cotylédons. Les gènes
CHS7 et CHS8 codant pour les chalcone synthases 7 et 8, déjà signalés comme fortement corrélés à la
synthèse des isoflavones, sont plus liés à l’accumulation dans les cotylédons que dans les germes. Ces
travaux montrent aussi que le gène F6H signalé dans la littérature ne s’exprime pas dans les germes.
En revanche, deux candidats dont la séquence est similaire à 79% ont été étudiés. Le gène F6H3 est le
seul à s’exprimer dans la graine, uniquement dans le germe. Son expression n’a pas été détectée dans
les germes d’une lignée mutante qui ne produit pas de glycitéine. Ce gène est donc un candidat
potentiel clef pour la synthèse de la glycitéine dans le germe. La structure particulière de l’enzyme
correspondante pourrait indiquer une forte implication de l’architecture du complexe enzymatique et
des contraintes qui en découlent dans l’utilisation préférentielle d’une voie ou d’une autre dans ce
schéma de biosynthèse.
Mots clés : graine de soja, isoflavones, glycitéine, biosynthèse des isoflavones, déterminisme
génétique, qRT-PCR.
ABSTRACT
Genetic determinism of isoflavones content and composition in hypocotyls
and cotyledons of the soybean seed (Glycine max, L.Merill).
The soybean seed contains large amounts of isoflavones (genistein, daidzein, and glycitein). Owing to
their phytoestrogenic properties, these compounds can have beneficial effects on human health, but
they can also be considered as endocrine disruptors, for example in infant formulas. The isoflavone
content and composition in the seed depend on the considered fraction. The cotyledons contain only
genistein and daidzein, while the hypocotyls are four to ten times more concentrated and contain three
isoflavones, mostly daidzein and glycitein. The genotype has a strong influence on total isoflavone
content, and even more on the percentage of individual isoflavones in cotyledons and hypocotyls. The
objective of this work is to investigate the genetic determinism that underlies such contrasted contents
and compositions between the two seed fractions, and the relation between main biosynthetic steps
and genotypic differences. First, the genes of isoflavone synthases (IFS) were sequenced in varieties
with highly contrasted content and composition. The expression of different keys genes of the
biosynthesis (nine chalcone synthases (CHS), a chalcone reductase (CHR), four chalcone isomerases
(CHI) and the two isoflavone synthases (IFS) have then been followed by quantitative RT - PCR in the
cotyledons and hypocotyls, at three critical stages of seed development (25, 40 and 60 days after
flowering). Second, the expression of different candidate genes for the flavonoid 6-hydroxylase (F6H)
which catalyzes the first step in the synthesis of the glycitein has been investigated. The polymorphism
of the genomic sequences IFS1 and IFS2 of isoflavone synthases was not correlated with differences
in isoflavone contents. The transcriptional activity of key genes of the biosynthesis of isoflavones
pointed out the existence of a distinct regulation of isoflavone biosynthesis between the two seed
fractions. The expression levels of target genes were not always related to differences in isoflavone
content or compositions in the hypocotyls and cotyledons. This suggests the overriding effect of posttranslational regulation, especially in the formation of multienzyme complex of biosynthesis of these
compounds. The chalcone synthase gene CHS9 was highly expressed, with a profile similar to the
accumulation of isoflavones in hypocotyls. The chalcone synthase genes CHS7 and CHS8 expressions,
already reported as highly correlated to the biosynthesis of isoflavones were more related to
accumulation in the cotyledons than in hypocotyls. This work has also shown that the F6H gene,
reported in the literature was not expressed in the hypocotyls. However, two candidates with as highly
similar coding sequence (79%) have been studied. The F6H3 gene is the only one expressed in the
seed, more precisely in the hypocotyls but it was not expressed in the cotyledons. Moreover, it was not
expressed in a mutant line which did not accumulate glycitein. This gene is therefore a key potential
candidate for the synthesis of the glycitein in hypocotyls. The particular structure of the corresponding
enzyme may indicate a strong involvement of the architecture of the multienzyme complex of
isoflavones biosynthesis and the constraints arising in the preferential use of a track or another in this
scheme of biosynthesis.
Keywords : soybean seed, isoflavones, glycitein, isoflavone biosynthetic pathway, genetic
determinism, qRT - PCR.
INTRODUCTION GENERALE
13
La graine de soja, [Glycine max (L.) Merrill], tient une grande place dans l'alimentation
humaine et animale. Introduit aux États-Unis au début du 19ème siècle, le soja s'y est fortement
développé. En 2010, la production mondiale s’est élevée à 259 millions de tonnes de graines
sur 103 millions d’hectares dont plus de 30% aux USA, 23% au Brésil, 17% en Argentine et
8% en Chine (Labalette et al., 2010). En France, les premiers semis ont été réalisés en 1740
par des missionnaires venant de Chine. La production européenne reste aujourd’hui
anecdotique à l’échelle mondiale.
L'intérêt économique du soja est lié à la qualité de sa graine, et particulièrement à sa
teneur élevée en protéines présentant un excellent profil d'acides aminés essentiels. La graine
contient également 20% d'huile riche en acide gras polyinsaturés. Les conditions
environnementales telles que la température et l'irrigation sont des facteurs importants pour la
production et leurs effets se répercutent directement sur le rendement (CETIOM, 2005). Une
inoculation des graines par des bactéries Bradyrhizobium japonicum avant le semis, est
souvent indispensable afin de maximiser la fixation symbiotique de l'azote par l'intermédiaire
des nodosités qui se développent au niveau de la racine de la plante (Broughton et al., 2003).
Dans le domaine de la santé, de nombreuses études épidémiologiques ont montré que la
population asiatique qui consomme régulièrement des produits à base de soja présente moins
de risques de développer des maladies chroniques (Setchell et Cassidy, 1999). La présence de
composés majeurs dans la graine de soja tels que les protéines ou d’autres molécules en
concentrations plus faibles, comme notamment les isoflavones, induit des effets préventifs et
protecteurs vis-à-vis de certaines maladies cardiovasculaires (Nagarajan, 2010), de cancers
hormonaux-dépendants (Messina et Wu, 2009), des troubles climactériques (Chedraui et al.,
2011), de l’ostéoporose (Castelo-Branco et Cancelo Hidalgo, 2011) ce qui confère au soja son
intérêt en alimentation humaine. Du fait de sa forte concentration en isoflavones, par rapport
aux autres compartiments de la graine, le germe de soja intéresse aujourd'hui particulièrement
les industries pharmaceutiques et agro-alimentaires. Aujourd’hui, les aliments ou
compléments alimentaires riches en isoflavones connaissent un fort développement. De
nombreuses études ont été réalisées sur les variétés afin de distinguer les plus riches et de
caractériser leurs profils en isoflavones.
Cependant, les isoflavones peuvent devenir indésirables dans certains produits à base de
soja couramment utilisés en alimentation, tels que les préparations infantiles de substitution
14
utilisées en cas d’intolérance au lactose, ou pour l’alimentation des femmes enceintes,
conduisant ainsi les autorités françaises à émettre des recommandations de dose maximale
quotidienne chez l’adulte et à préconiser de ne pas donner de soja aux enfants de moins de
3 ans (AFSSA et AFSSAPS, 2005). Actuellement, au même titre que des variétés de soja
riches en isoflavones, des variétés à faible concentration sont également demandées en
fonction des types de consommateurs auxquels les produits dérivés de la graine sont destinés,
ceci ayant conduit à considérer les isoflavones dans deux compartiments distincts de la graine:
les cotylédons, matière première susceptible d’être appauvrie et le germe qui peut renfermer
des teneurs très élevées. Ainsi au cours de ce travail de thèse, nous nous sommes intéressés à
l’étude du déterminisme génétique et physiologique à l’origine de la compartimentation des
isoflavones dans la graine de soja (germe et cotylédons) afin de permettre in fine une
meilleure maîtrise des teneurs et compositions de cette famille de molécules.
Cependant, même si les sélectionneurs parviennent à créer des variétés potentiellement
riches ou pauvres, le contenu en isoflavones de la graine de soja est sous forte dépendance des
facteurs environnementaux comme c’est le cas pour la plupart des molécules issues du
métabolisme secondaire des plantes (Daydé et Lacombe, 2000 ; Lozovaya et al., 2005). Le
laboratoire d'Agro-physiologie de l'EI Purpan travaille en partenariat avec une équipe de
l'Université d'Urbana-Champaign (Illinois, USA) afin d'étudier : les effets des facteurs de
régulation sur la teneur en isoflavones totales et leur composition dans le germe et dans les
cotylédons mais également l'accumulation des isoflavones dans les graines depuis le début de
leur formation jusqu'à leur maturation.
Les recherches ont désormais permis d’établir que :
l’environnement et les génotypes influencent le contenu en isoflavones de la graine
de soja mais que les différences entre les variétés sont généralement conservées;
la composition en isoflavones est caractéristique de la fraction de la graine
considérée (Rasolohery et al., 2008);
l’accumulation dans les cotylédons ne commence que quand celle-ci a déjà atteint
un plateau dans les germes (Berger et al., 2008), soulignant ainsi les deux voies
distinctes de régulation de la teneur en isoflavones et de leur composition dans les
cotylédons et les germes.
15
Après une présentation synthétique des données de la littérature qui sous-tendent notre
démarche (Chapitre I), nous décrirons le matériel végétal et les méthodes mises en œuvre pour
mener à bien nos travaux (Chapitre II).
Le Chapitre III fera l'objet d'une première étude valorisée par une publication
scientifique insérée dans le présent document, basée sur des expérimentations réalisées à
partir de variétés de soja très différentes pour leur contenu en isoflavones, dont les graines ont
été prélevées et disséquées à différents stades de développement. L’objectif de ce travail est
d’accéder à une meilleure connaissance du déterminisme génétique pouvant être à l’origine
des différences de teneurs et de compositions observées dans les germes et les cotylédons de
la graine de soja. Cette approche est réalisée grâce à la mise en œuvre d’une étude du
polymorphisme de séquence des isoflavones synthases puis à la caractérisation de la cinétique
d’expression des différents gènes cibles codant pour des enzymes clefs de la voie de
biosynthèse des isoflavones dans les germes et les cotylédons, depuis la période du début du
développement de la graine.
Dans le Chapitre IV, nous rendrons compte, également en insérant la publication
scientifique valorisant ces travaux, d'une étude réalisée à partir de six variétés de soja très
différentes pour leur teneur en glycitéine (une des trois familles d’isoflavones du soja) dans
les germes, dont les graines ont été prélevées et disséquées à trois stades différents de
développement. Le but de ces expérimentations est de permettre une meilleure compréhension
du processus régissant la synthèse de la glycitéine et de cibler un gène candidat codant pour
une flavonoïde 6-hydroxylase (F6H), potentiellement impliquée dans la synthèse de ce
composé.
Enfin, dans le cadre d'une discussion générale (Chapitre V), nous synthétiserons les
résultats acquis en considération de ceux de la littérature et nous envisagerons les perspectives
qu’ouvre notre travail. Ainsi, serons-nous en mesure d’établir un certain nombre de réponses
quant au déterminisme génétique et physiologique à l’origine de la compartimentation des
isoflavones dans la graine, dans l’objectif d’une maîtrise des contenus et compositions en
isoflavones dans la graine de soja.
16
CHAPITRE I :
REVUE BIBLIOGRAPHIQUE
17
Les graines de soja contiennent de nombreux composés bénéfiques pour la santé
humaine, notamment les isoflavones qui constituent l’objet de notre étude. Leur teneur et leur
composition sont très différentes entre les germes et les cotylédons. On assiste en effet à une
répartition des isoflavones dans la graine soit dans le compartiment cotylédons, soit dans le
compartiment germe. Nous verrons que plusieurs facteurs génétiques et environnementaux en
sont responsables.
Dans un premier temps, nous présenterons la plante et la graine puis les isoflavones en
précisant leurs rôles, les modalités de leur accumulation dans les compartiments de la graine
et les facteurs qui contrôlent leur accumulation au niveau phénotypique. Nous décrirons
ensuite leur voie de biosynthèse ainsi que leur mécanisme de transport au sein de la cellule
végétale. Nous présenterons ensuite les différentes familles d’enzymes structurales de cette
voie et nous préciserons l’organisation subcellulaire de ces dernières. Enfin, les différentes
régulations de cette synthèse seront abordées.
1 LE SOJA ET SA GRAINE
1.1 Le soja
1.1.1 Description générale de la plante
Le soja [Glycine max (L.) Merrill] est une plante appartenant à la famille des Fabacées,
sous-famille des Faboideae, tribu des Phaseoleae, genre Glycine, qui est largement cultivée
pour ses graines. Le soja est cultivé dans 47 pays à travers le monde mais la majorité des
cultures intensives reste localisée aux Etats-Unis, au Brésil, en Argentine et en Chine
(Labalette et al., 2010). Le terme soja sous-entend la plante mais également ses graines
oléagineuses qui fournissent la deuxième huile alimentaire la plus consommée dans le monde,
après l’huile de palme. Celles-ci constituent aussi l’un des aliments naturels les plus riches,
notamment en protéines. En effet, il est aujourd’hui reconnu qu’elles renferment de nombreux
composés bénéfiques pour la santé humaine (Kim et al., 2006c). Le génome de Glycine max
est à ce jour entièrement séquencé. Ce travail s’est terminé au début de l’année 2010
(Schmutz et al., 2010). Ce génome est déposé sur la base de données « Phytozome »
http://www.phytozome.net/soybean.php (Goodstein et al., 2012). Le soja possède un génome
18
allotétraploïde d’environ 975 Mb (taille totale deux fois plus importante que celui de la
légumineuse modèle Medicago truncatula) réparties sur 20 chromosomes, avec 66153 loci
codant pour des protéines. Environ 40 à 60% du génome est répétitif (Stacey et al., 2004).
Le soja est une plante herbacée annuelle connue seulement à l’état cultivé. Elle est
entièrement (feuilles, tiges, gousses) revêtue de poils gris ou bruns. Les tiges dressées ont une
longueur de 30 à 130 cm. Les feuilles sont de type trifoliolé, chaque foliole mesurant entre 6
et 15 cm de long et 2 à 7 cm de large. Celles-ci tombent avant que les gousses ne soient
arrivées à maturité. Les fleurs sont blanches ou mauves, de petite taille, et apparaissent à
l’aisselle des feuilles. Elles sont hermaphrodites et autogames, mais la pollinisation croisée est
parfaitement possible. Les gousses sont velues, de 3 à 8 cm, de couleur foncée à maturité, et
contiennent généralement 2 à 4 graines. Les graines sont de forme sphérique ou elliptique et
ont un diamètre variant généralement de 5 à 11 mm. Les feuilles représentent avec les racines
des organes clés dans la nutrition azotée de la plante. L’azote est le quatrième constituant des
plantes qui est utilisé dans l’élaboration de molécules importantes comme les protéines, les
acides nucléiques et la chlorophylle. Lorsque le grain grossit, chaque feuille à travers la
photosynthèse (de Veau et al., 1992) alimente préférentiellement les gousses situées au même
étage. Une défoliation va pouvoir provoquer ainsi une diminution de 50% de la production
pour certaines variétés (Li et al., 2005). En effet, la disponibilité en azote, notamment chez le
soja, est un facteur déterminant pour la production de graine (Kinugasa et al., 2011). Les
racines de soja jouent également un rôle important pour l’absorption de l’azote par la plante.
La spécificité du soja et des légumineuses en général est son aptitude à fixer l’azote en
symbiose avec les microorganismes du sol. Les racines assurent donc les deux voies de la
nutrition azotée : l’absorption des nitrates du sol et la fixation de l’azote atmosphérique par les
bactéries. En effet, la symbiose du soja avec la bactérie Bradyrhizobium japonicum permet à
la culture de couvrir les trois quarts de ses besoins en azote (Broughton et al., 2003). La
présence des isoflavones dans la racine favorise l’activité symbiotique entre le soja et les
bactéries (Rolfe, 1988 ; Sugiyama et al., 2007 ; Lang et al., 2008). La symbiose a lieu à
l’intérieur d’excroissances, encore appelées nodosités. En effet, la plante offre un micro
habitat favorable à la bactérie, tout en lui procurant des substrats carbonés provenant de la
photosynthèse et la bactérie quant à elle, fixe l’azote de l’air et du sol en le rendant disponible
pour le soja. Le processus de fixation consiste en la réduction de l’azote atmosphérique N2 par
le complexe enzymatique nitrogénase d’origine bactérienne (Milić et al., 1996 ; SameshimaSaito et al., 2006), sous forme ammoniacale. Ainsi, l’azote symbiotique est orienté vers les
graines : 80 à 90% de cet azote se retrouve dans les graines à maturité tandis que l’azote
19
minéral se localise davantage dans les feuilles et les tiges (Sattin et al., 1987). De plus ce
système racinaire très lignifié permet à la plante de puiser l’eau en profondeur et de bien
fissurer le sol pour favoriser sa croissance.
1.1.2 Croissance et développement de la plante
Tout au long de leur vie, les plantes montrent des changements progressifs et importants
de taille et d’aspect dont le rythme et l’amplitude sont très variables selon les espèces, les
variétés et les individus. La croissance de la plante correspond à l’ensemble des changements
quantitatifs irréversibles (taille, masse, volume) qui se produisent au cours du temps. Chez le
soja, la croissance peut être de type déterminé, indéterminé ou semi-déterminé selon la forme
de l’extrémité de la tige principale (Hartung et al., 1981). Ce caractère aurait un déterminisme
génétique fondé sur deux gènes majeurs épistatiques interagissant avec des gènes
modificateurs à effet quantitatifs (Bernard, 1972 ; Daydé, 1989). Le développement de la
plante est un processus cyclique qui commence de la germination de la graine jusqu’à la
floraison et la sénescence en passant par la croissance végétative et la maturation. Il est décrit
en séparant deux cycles : le cycle végétatif (Figure 1) et le cycle reproductif (Figure 2) (Fehr
et al., 1971 ; Fehr et Caviness, 1977).
Figure 1 : Principaux stades physiologiques du cycle végétatif du soja d’après le
CETIOM – http://www.cetiom.fr
20
Le cycle végétatif (Figure 1) débute à la phase d’émergence jusqu’à la terminaison du
développement des feuilles trifoliolées au nième nœud au-dessus du nœud cotylédonaire (stade
notés Vn). Le cycle reproductif (Figure 2) commence à partir de la floraison (stade R1)
jusqu’à la maturation des graines (stade R8). Chacun de ces cycles comprend donc plusieurs
stades. Un stade est atteint lorsque 50% des plantes sont à ce stade. La durée de la période
végétative dépend des caractéristiques de chaque variété en termes de précocité, de sensibilité
à la photopériode, de disponibilité thermique et hydrique. Pour les sojas de type indéterminés,
un chevauchement du cycle végétatif et reproductif est observé, et ceci, à l’échelle de la
planète entière.
Figure 2 : Principaux stades physiologiques du cycle reproductif du soja d’après le
CETIOM –http://www.cetiom.fr
Chez le soja la précocité correspond à la durée relative du cycle de développement de la
plante si l’on compare différentes variétés semées à la même date, dans un même lieu. La
durée du cycle de développement peut être exprimée en nombre de jours ou encore en unité
de chaleur (Ecochard et al., 1978). Les variétés sont classées dans des groupes de précocité
allant de 000, très précoces, dont les besoins photo et thermo-périodiques sont peu importants,
à des groupes de type X, très tardifs (zones subtropicales ou équatoriales). En France, on
cultive les variétés des groupes 00 à II.
21
1.2 La graine de soja
Les graines sont des moyens efficaces pour la plante de survivre à des périodes
défavorables à la croissance. Elles servent de réservoir de plantes potentielles capables de
reconstituer la population suite à une ou plusieurs catastrophes (maladies, infestation
d’insectes, incendie…). Pour de nombreuses espèces annuelles, la graine est l’unique vecteur
de propagation.
1.2.1 La physiologie de la graine
1.2.1.1 Structure et développement
La graine de soja (Figure 3) est divisée en trois fractions principales :
Les cotylédons qui deviendront les premières structures photosynthétiques de la
jeune plantule. Ce sont les principaux organes de réserve en protéines et en lipides.
Ils représentent 90% de la masse de la graine.
Les téguments (externe et interne) correspondent à l’enveloppe qui protège
l’embryon. Ils représentent 8% de la graine. Leur couleur noire, brune, jaune ou
verte est variable selon les variétés.
Le germe (axe embryonnaire), composé de l’épicotyle, de l’hypocotyle et de la
radicule. L’épicotyle donnera naissance aux futures feuilles et la radicule à la future
racine. Il représente seulement 2% de la matière sèche de la graine, mais il contient,
en proportions beaucoup plus grandes que les cotylédons, certains composés
mineurs, notamment les isoflavones.
Figure 3 : Structure de la graine de soja
22
Le développement de la graine se déroule en deux phases:
La première (I) est appelée « lag-phase » (Egli, 1989). C’est pendant celle-ci que les
divisions cellulaires ont lieu. Cette phase coïncide avec l’allongement de la gousse.
La deuxième phase (II) consiste en l’accumulation de la matière sèche de la graine.
La distinction de ces deux phases est basée sur la teneur en eau de la graine (Ney et al.,
1993). Des travaux ont montré que le début de la diminution de la teneur en eau coïncide avec
la phase de remplissage de la graine et se poursuit jusqu’à sa maturité physiologique (Le
Deunff et Rachidian, 1988). La graine entrée en maturation subira ensuite la phase de
quiescence. La croissance de l’embryon reprendra au moment de la germination.
1.2.1.2 Fécondation et morphogénèse
La graine est un ensemble complexe de tissus d’origines différentes. L’embryon et
l’albumen sont issus de la fécondation. Les téguments sont d’origine maternelle.
L’albumen qui entoure le zygote, commence à se développer en premier. Les noyaux se
divisent rapidement en l’absence de cytokinèse ce qui conduit à la formation d’un syncytium.
L’albumen prolifère formant une masse « gélatineuse » qui occupe la majeure partie du sac
embryonnaire et qui accumule transitoirement des substances nutritives pour l’embryon. Les
divisions successives à partir de l’oosphère fécondée sont à la base de la morphogénèse. Le
zygote (Figure 4) subit une division asymétrique qui donnera une grosse cellule basale à
l’origine du suspenseur, tandis que la petite cellule terminale donnera la plantule proprement
dite. Une seule cellule du suspenseur sera incluse dans l’embryon pour donner l’hypophyse, à
la pointe de la future radicelle, qui évoluera ensuite en méristème racinaire.
Figure 4 : Premiers stades de développement de l’embryon des angiospermes d’après
Goldberg et al. (1994)
23
L’embryon subit plusieurs cycles de divisions en conservant une forme globulaire, puis
la différenciation des cotylédons produit une déformation caractéristique en forme de cœur
(Figure 5).
Figure 5 : Représentation schématique du stade de développement « globulaire » et
du stade de développement « cœur » de l’embryon de soja (Goldberg et Harada, 2009)
Dès le début de la maturation, les différentes parties de l’embryon sont parfaitement
reconnaissables (Figure 6). Celui-ci comprend :
un axe embryonnaire, avec à sa base, le méristème racinaire, et à son apex, le
méristème apical qui développera les tissus aériens de la plante ;
deux cotylédons, sortes de feuilles primitives, qui se développent en stockant des
quantités importantes de carbone sous forme de glucides, de lipides et de protéines,
ainsi que des nutriments minéraux et des hormones qui permettent la croissance et le
développement des plantules, jusqu’à ce qu’elles acquièrent la capacité d’avoir une
photosynthèse active.
Une étude réalisée in vitro indique que le développement de l’albumen est indépendant
de celui de l’embryon (Kranz et al., 1998) mais il n’y a pas de réciprocité. L’embryon
principal est dépendant de l’albumen pour son apport en acides aminés (Hirner et al., 1998) et
pour le contrôle de son développement (Hong et al., 1996 ; Opsahl-Ferstad et al., 1997).
24
Figure 6 : Schéma du début de la maturation de l’embryon de soja
(Goldberg et Harada, 2009)
Chez la plupart des dicotylédones, l’albumen utilisé pour le développement de
l’embryon, occupe quasiment tout le volume de la graine puis, il peut régresser jusqu’à
disparaitre complètement à maturité. On parle alors de graine exalbuminée. C’est le cas des
légumineuses, plus précisément du soja, où l’albumen n’a qu’un rôle transitoire dans le
stockage des réserves de la graine. Celui-ci est absorbé par l’embryon au cours de son
développement. En effet, une fois la maturation terminée, l’albumen étant absent, les
cotylédons remplissent complètement l’intérieur de la graine (Goldberg et al., 1994). Il ne
reste donc plus que deux types de tissus : les téguments, enveloppes protectrices plus ou
moins résistantes qui dérivent des tissus de l’ovule, d’origine maternelle, et l’embryon
(cotylédons surmontant le germe) issu de la fécondation.
1.2.2 Composition de la graine de soja
1.2.2.1 Les composés majeurs de la graine de soja
La graine de soja est particulièrement riche en protéines (en moyenne 40%), en sucres
(35%) et en lipides (20%) avec également 5% de fibres : en % de matière sèche (Snyder et
Kwon, 1987). Ces composés présentent un grand intérêt pour les industries agroalimentaires.
25
 Les protéines : un élément-clé pour les utilisateurs de l’agroalimentaire
Les protéines de soja sont solubles dans l’eau et donc constituées surtout de globulines
(80 à 90%), en moindre part d’albumines (10 à 20%) et d’une fraction de glutélines
(Hymowitz et Collins, 1974). La qualité des protéines présentes dans la graine de soja est très
satisfaisante en terme de profil d’acides aminés. Ces protéines contiennent les huit acides
aminés essentiels et sont particulièrement riches en lysine. En revanche, les acides aminés
soufrés (méthionine et cystéine) sont limitants (Tableau 1).
Tableau 1 : Composition en acides aminés essentiels de la graine de soja (CETIOM, 2005)
Ce profil particulier met donc en évidence la remarquable complémentarité du soja avec
les céréales qui sont déficitaires en lysine mais riches en acides aminés soufrés. En plus de
leur valeur nutritionnelle, les protéines de soja ont également démontré plusieurs effets
bénéfiques sur la santé au point qu’en octobre 1999, la Food and Drug Administration (FDA)
aux États-Unis a autorisé l’industrie alimentaire à utiliser une allégation santé relative au soja
(FDA, 1999).
 Les lipides :
On définit la teneur en huile par le pourcentage de lipides contenus dans la graine,
généralement déterminé après extraction à l’hexane sous reflux. La teneur en huile de la
graine de soja est relativement faible (20,5%) par rapport à d’autres oléagineux, bien que
l’huile de soja soit la deuxième la plus produite au monde (Daydé et al., 2002) après l’huile de
palme. Le profil lipidique de la graine de soja est particulièrement intéressant puisqu’elle
présente peu d’acides gras saturés (15% des acides gras totaux) et une proportion élevée
d’acides gras polyinsaturés (63%), riches en acides linoléique et linolénique (Favier et al.,
26
1995). Cette variabilité de teneur est également dépendante de la fraction de la graine
(Yoshida et al., 2003 ; Hubert, 2006) (Tableau 2).
Tableau 2 : Profil des acides gras contenus dans les fractions de la graine de soja (en % des
acides gras totaux)
 Les glucides :
Les glucides sont des polysaccharides qui peuvent être classés en deux catégories : les
sucres solubles et les sucres insolubles. La graine de soja contient entre 30 et 35% de sucres.
Les sucres solubles représentent 10% de la matière sèche de la graine avec 5% de
saccharose, 1% de raffinose et 4% de stachyose (Snyder and Kwon, 1987). Le contenu de ces
deux derniers dans la graine de soja est génotype dépendant (Kumar et al., 2010). Le
stachyose et le raffinose peuvent provoquer chez l’homme des problèmes physiologiques tels
que la flatulence (Suarez et al., 1999).
Les sucres insolubles (cellulose, hémicellulose, pectine, amidon) représentent la
majorité des sucres (20 à 25% de la matière sèche de la graine). Ces sucres jouent un rôle de
structure mais également un rôle de réserve dans la graine (Andriotis et al., 2010 ; Zeeman et
al., 2010). En effet, les celluloses, les hémicelluloses et les pectines sont des constituants de la
paroi végétale alors que l’amidon est stocké dans les chloroplastes.
1.2.2.2 Les composés mineurs
La graine de soja contient également d’autres composés dits composés mineurs qui pour
certains peuvent avoir un effet bénéfique pour la santé. En revanche d’autres sont considérés
comme indésirables car ils altèrent la qualité nutritionnelle des dérivés de la graine utilisés par
les transformateurs (Mohamed et al., 1991).
Parmi ces composés mineurs on retrouve :
Des minéraux : la graine de soja contient environ 5% de minéraux dont les
principaux éléments sont le potassium, le phosphore, le magnésium et le calcium.
27
Les quantités de chacun d’eux dépendent des conditions de culture et du sol
(Jurgonski et al., 1997).
Des vitamines : les vitamines liposolubles A (β-carotène), E (α-tocophérol) sont de
puissants antioxydants grâce à leur capacité de capture des radicaux libres. On
trouve aussi les vitamines liposolubles D et K et des vitamines hydrosolubles,
essentiellement du groupe B avec notamment une forte quantité d’acide folique
(B9). Les concentrations de certaines d’entre elles, comme par exemple les
tocophérols, ont été montrées comme étant dépendantes de la gestion des cultures
(date des semis, espacements des rangs, lignée utilisée, fertilisation au phosphore et
au potassium), (Seguin et al., 2010). Dans des conditions de température chaude ou
de sécheresse pendant la phase de maturation de la graine de soja, la teneur en αtocophérol augmente de façon significative (Britz et Kremer, 2002).
De l’acide phytique, qui représente la principale réserve de phosphore des graines
de soja. Celui-ci se retrouve immergé sous forme de globoïdes cristallins dans le
réseau des protéines (Hamada, 1996).
De l’azote non protéique comprenant des acides aminés libres, des peptides, des
polyamines.
Des saponines, dont la structure se caractérise par la présence d’un noyau aglycone
nommé sapogénine et d’une ou plusieurs chaines latérales de glucides. Elles sont
divisées en deux groupes majeurs selon leur structure chimique : le groupe A et B.
Les saponines A ont la particularité d’être exclusivement présentes dans le germe,
alors que les saponines B sont présentes à la fois dans le germe et les cotylédons
(Rupasinghe et al., 2003 ; Berhow et al., 2006).
Des composés phénoliques, plus particulièrement les isoflavones, objet de notre
étude, qui jouent un rôle majeur tant dans la physiologie de la plante (mise en place
de la symbiose, défense contre certains pathogènes du sol) que dans le secteur de
l’alimentation-santé (effets œstrogéniques et antioxydants).
28
2 LES ISOFLAVONES
2.1 Structure, caractéristiques et effets santé
Les isoflavones font partie d’un groupe de composés phénoliques appelés flavonoïdes.
Ces composés sont caractérisés par la présence d’un squelette de base C6-C3-C6 comportant
deux noyaux aromatiques (A et B) et un noyau hétérocyclique (C) (Halbwirth, 2010). Les
premiers éléments formés dans cette catégorie sont les chalcones chez lesquelles le cycle C
n’est pas fermé (Figure 7-a). Les flavanones et flavones (Figure 7-b) ont un groupement
cétone en C4, les isoflavonoïdes sont caractérisés par le positionnement en C3 du groupement
aryl (cycle B). La plupart des flavonoïdes et isoflavonoïdes sont hydroxylés en 7 et 4’ (ce qui
correspond à la conservation des groupements hydroxyles 4’ et 4 des chalcones dont ils sont
issus. Les isoflavones caractéristiques des légumineuses, sont utilisées pour la biosynthèse des
phytoalexines (squelette ptérocarpane, Figure 7-c)
Figure 7 : Structure type et numérotation des cycles des chalconoïdes (a) des flavanoïdes
(b) et des pterocarpanes (c). La chalcone la plus souvent rencontrée est la 2',4, 4',6'tétrahydroxychalcone, ou naringénine chalcone. Les flavanones et flavones ont un
groupement cétone en C4 ; les isoflavonoïdes sont caractérisés par la position en C3 du
groupement aryl (cycle B). Les ptérocarpanes sont formées à partir des isoflavones (après
hydroxylation en 6’).
Les isoflavones sont les principaux composés phénoliques de la graine de soja.
L’isoflavone la plus simple est la daidzéine alors que la génistéine et la glycitéine présentent
des radicaux spécifiques sur les carbones 5 et 6 (Figure 8).
On retrouve les isoflavonoïdes dans un grand nombre de familles de végétaux (Mackova
et al., 2006). Cependant les légumineuses sont les producteurs les plus caractéristiques (Botta
et al., 2009 ; Veitch, 2009).
29
Figure 8 : Structure des isoflavones de soja
Dans la graine de soja, les isoflavones se divisent en 12 structures chimiques, réparties
en 3 familles dérivées des structures aglycones : daidzéine, génistéine et glycitéine dites
« formes simples ». Les formes β-glucosides (daidzine, génistine, glycitine), acétylglucosides
et malonylglucosides sont des formes conjuguées libérant après hydrolyse leur structure
aglycone correspondante (Gu et Gu, 2001 ; Hsieh et Graham, 2001) (Figure 9). Les formes
acétyles sont considérées comme des artéfacts, issus de la transformation spontanée des
malonyles après traitement thermique (Grün et al., 2001 ; Xu et al., 2002 ; Yin et al., 2005,
Yerramsetty et al., 2011).
Figure 9 : Structure et conjugaison des 3 familles d’isoflavones de soja
Les effets santé des isoflavones sont attribués à leurs propriétés phytoestrogéniques
(Vicas et Socaciu, 2003 ; Dixon, 2004). En effet, les isoflavones, en particulier la génistéine,
ont une structure très proche de celle de l’œstradiol, naturellement sécrété chez la femme au
niveau des ovaires jusqu’à la ménopause (Figure 10). On parle donc de phytoestrogènes non
stéroïdiens.
Les isoflavones se fixent aux récepteurs œstrogéniques avec une affinité particulière
pour les récepteurs ER-β, majoritaires dans certains tissus, entrant ainsi dans le circuit des
agents potentiellement actifs pour une thérapie œstrogénique chez la femme post-ménopausée
(Carusi, 2000 ; Cederroth et Nef, 2009). Cependant, la liaison des isoflavones aux récepteurs
de l’œstradiol s’établit avec une affinité relativement faible par rapport à l’œstradiol humain.
30
Il s’en suit des effets compétitifs avec l’œstradiol selon la cellule cible considérée (Kuiper et
al. ; 1998, Choi et al., 2008).
Figure 10: Comparaison structurale des isoflavones et du 17-β-estradiol
De par leurs propriétés phytoestrogéniques, les isoflavones ont suscité beaucoup
d’intérêt pour le soulagement des symptômes ménopausaux. Les résultats concernant l’action
précise des isoflavones vis-à-vis de ces symptômes sont encore très contrastés. Plusieurs
études montrent qu’une consommation d’isoflavones de soja régulière inhiberait les troubles
de la ménopause (Cheng et al., 2007 ; Ferrari, 2009 ; Chedraui et al., 2011 ; Hachul et al.,
2011). Cependant, certains travaux soulignent au contraire que la consommation
d’isoflavones n’entraînerait aucun changement significatif des symptômes climactériques des
femmes post-ménopausées (Kok et al., 2005).
Les effets concernant l’action des isoflavones sur l’ostéoporose sont également très
discutés. En effet, si l’expérimentation animale, majoritairement conduite chez la rate
ovariectomisée, a fourni les preuves d’une certaine efficacité pour la prévention de la perte
osseuse liée à la suppression de la synthèse des œstrogènes (Winzer et al., 2010), les
investigations chez l’homme sont moins consensuelles (Wong et al., 2009 ; Castelo-Branco et
Cancelo Hidalgo, 2011 ; Kuhnle et al., 2011).
Les isoflavones ont également une action antioxydante (Devi et al., 2009 ; Han et al.,
2009 ; Yue et al., 2010). Des différences de capacités antioxydantes sont observées entre des
extraits de germes et de cotylédons. En effet, les extraits de germes montrent une activité
antioxydante plus élevée que celle des extraits de cotylédons (Monje et al., 2006). Leur
pouvoir antioxydant leur permettrait d’agir directement contre l’hypertension et les
phénomènes de coagulation sanguine (Martin et al., 2008 ; Kelly et al., 2010).
Du fait de leur propriétés phytoestrogéniques et antioxydantes, les isoflavones sont aussi
au centre des intérêts pour la prévention de certains cancers hormonaux-dépendants, tels que
le cancer du sein, de la prostate, des ovaires et de l’endomètre. Bien que parfois les effets
soient controversés, les travaux les plus récents semblent s’accorder sur un effet protecteur
31
(Lof et Weiderpass, 2006 ; Messina et Hilakivi-Clarke, 2009). Le rôle préventif des
isoflavones vis-à-vis des cancers serait lié à leur pouvoir œstrogénique (Pfeiffer et al., 2006 ;
Taylor et al., 2009 ; Sakamoto et al., 2010) mais aussi à leur capacité d’inhibition de l’activité
d’enzymes spécifiques impliquées dans la prolifération cellulaire. C’est le cas de la génistéine
et de la daidzéine qui inhibent à la façon d’un puissant antioxydant la prolifération des
cellules cancéreuses via l’inhibition des tyrosine kinases (Yan et al., 2010 ; Yu et al., 2012).
Celles-ci inhiberaient également la production de peroxyde d’hydrogène et la propagation des
radicaux libres ou d’espèces oxygénées hautement réactives impliquées dans l’altération de
l’ADN (Tikkanen et al., 1998 ; Takahashi et al., 2005). La glycitéine aurait quant à elle un
effet inhibiteur sur la prolifération et l’invasion des cellules cancéreuses de la prostate et du
sein (Kim et al., 2002 ; Magee et al., 2004 ; Clubbs et Bomser, 2009).
De récentes études mettent également en évidence le potentiel thérapeutique des
isoflavones vis-à-vis d’autres types de cancers. La génistéine et de la daidzéine auraient un
effet protecteur vis-à-vis du cancer du côlon (Wang et Chen, 2010 ; Lee et al., 2011) et la
glycitéine vis-à-vis de la tumeur au cerveau (Lee et al., 2010a).
Des études réalisées chez l’homme et les rongeurs montrent également des effets
négatifs de la part des isoflavones. Celles-ci auraient des effets antithyroïdiens (Sathyapalan et
al., 2011). Elles provoqueraient également une augmentation de la pression sanguine et des
lésions au niveau de l’ADN (Ullah et al., 2009 ; Dong et Qin, 2011 ; Liu et al., 2012).
Les isoflavones peuvent également devenir indésirables dans certains produits à base de
soja couramment utilisés en alimentation, tels que les préparations infantiles de substitution
que l’on utilise dans les cas d’intolérance au lactose, ou pour l’alimentation des femmes
enceintes (Barrett, 2002 ; Chen et Rogan, 2004 ; Turck, 2007 ; Badger et al., 2009 ; Doerge,
2011 ; Vanhees et al., 2011). Ces risques potentiels ont donc conduit les autorités de plusieurs
pays à définir des doses maximales quotidiennes. En 2005 en France, l’Agence Française de
Sécurité Sanitaire des aliments (AFSSA et AFSSAPS, 2005) a émis une recommandation de
dose maximale chez l’adulte à 1mg d’isoflavones aglycones par kilogramme et par jour, et a
préconisé de ne pas donner de soja aux enfants de moins de 3 ans.
32
2.2 Composition et teneur en isoflavones de la graine de soja et ses
compartiments
Les différentes fractions de la graine de soja possèdent des teneurs et des profils
d’isoflavones caractéristiques. On observe une compartimentation des isoflavones au sein de
la graine de soja.
Plusieurs études montrent que les concentrations les plus faibles en isoflavones dans la
graine entière sont retrouvées pour les stades R4 et R5 au début du développement de la
graine (Kim et al., 2006b ; Chen et al., 2011) et qu’à l’inverse les stades les plus tardifs
présentent des concentrations élevées (Dhaubhadel et al., 2003). Les teneurs dans la graine
augmentent en effet au cours du développement de la graine (Berger et al., 2008).
Les différences de concentrations en isoflavones dans les fractions distinctes de la
graine (germe et cotylédons) sont très significatives. En effet, le germe de soja possède la plus
importante teneur en isoflavones, elles comptent généralement pour plus de 1,5 % de la masse
du germe. Bien que le germe ne représente que 2% du poids de la graine de soja entière, il
contient 4 à 10 fois plus d’isoflavones que les cotylédons, devenant ainsi un sous-produit
hautement valorisable pour le marché des suppléments santé (Tsukamoto et al., 1995 ;
Schryver, 2002 ; Hubert, 2006 ; Monje et al., 2006).
Les fractions germes et cotylédons présentent également des profils caractéristiques en
isoflavones. Dans le germe, les conjugués de la daidzéine et de la glycitéine représentent
respectivement 40-60 % et 25-40 % des isoflavones totales (Daydé et al., 2004). La daidzéine
et la glycitéine sont donc les deux formes majoritaires du germe. La glycitéine quant à elle se
trouve exclusivement dans le germe. Elle représente 5 à 10 % des isoflavones de la graine,
mais peut constituer plus de 50% des isoflavones totales du germe (Tsukamoto et al., 1995).
Dans les cotylédons, la génistéine largement majoritaire, représente 50-70 % des isoflavones
totales (Eldridge et Kwolek, 1983).
2.3 La cinétique d’accumulation des isoflavones dans la graine et ses
compartiments
Le développement de la graine depuis la fécondation jusqu’à la maturité se divise en
trois étapes : tout d’abord l’embryogénèse proprement dite, caractérisées par une division
cellulaire très active, suivie d’une phase d’expansion cellulaire qui correspond à la croissance
33
de l’embryon, accompagnée d’une intense activité de synthèse et d’accumulation des réserves
protéiques, lipidiques et glucidiques, puis enfin la phase de préparation à la dormance qui est
associée à la déshydratation de la graine (Figure 11).
Pendant la phase d’accumulation des réserves, l’embryon grandit en taille avec peu de
divisions cellulaires. La synthèse et l’accumulation des lipides et des protéines commencent
très tôt, et constituent la principale contribution à l’augmentation de la matière sèche. Ces
ressources seront utilisées par l’embryon pendant la germination avant la mise en place d’un
appareil photosynthétique fonctionnel. La dernière étape de développement correspond à
l’étape de dessiccation et d’entrée en dormance, pendant laquelle la graine peut perdre selon
les espèces de 40 à 90% d’eau. Le développement de la graine s’arrête, la paroi de l’ovule se
durcit et se différencie en téguments protecteurs, plus ou moins imperméables à l’eau et à
l’air.
Accumulation des isoflavones dans les cotylédons
Accumulation des isoflavones dans le germe
Figure 11 : Succession des stades physiologiques intervenant durant le développement de la
graine de soja – en pointillés rouge : variation de la matière sèche d’après
Goldberg, (2007) – http://estdb.biology.ucla.edu/seed/project#seed
Alors
que
les
composés
majeurs
(protéines,
lipides,
sucres)
s’accumulent
progressivement au cours du cycle de la plante, les composés mineurs (Acide phytique,
minéraux, saponines, isoflavones) présentent une grande diversité de cinétiques,
particulièrement l’accumulation des isoflavones dans la graine. Celle-ci semble en effet
34
différente selon le type d’isoflavone (Kudou et al., 1991). La génistéine et sa forme malonyle
s’accumulent un peu plus tard que la daidzéine et sa forme malonyle correspondante pendant
la période de développement de la graine, soit entre 35 JAF et 60 JAF. D’autres travaux ont
également montré que les glucosides, les malonyl-glucosides, la génistéine totale (la forme
aglycone et les formes conjuguées) et la daidzéine totale, sont hautement corrélées avec les
concentrations en isoflavones totales de la graine et constituent la majorité des isoflavones
totales du stade R5 jusqu’à maturité complète. Il y a ainsi généralement, une corrélation
positive entre la concentration en isoflavones totales et les stades de développement (Kim et
Chung, 2007 ; Kumar et al., 2009). En effet, pour l’accumulation des isoflavones totales dans
la graine, la période de croissance entre les stades R5 et R6 est la période la plus active avec
une augmentation de 117 % alors que la période entre le stade R7 et la maturité physiologique
complète est la plus léthargique avec seulement 40 % d’augmentation.
Imari (●) et Queen (○) sont représentés par un trait plein ; NSK(▼) par un trait en pointillé et NT (Δ)
par un trait en tiret
Figure 12 : Accumulation des isoflavones dans les cotylédons (A, B, C) et les germes (D, E,
F) chez 4 variétés de soja sous 3 conditions de cultures : en serre en 2003 (A,D), 2004 (B,E)
et au champ en 2005 (C,F) d’après Berger et al. (2008)
L’accumulation des isoflavones dans la graine est également très différente selon le
compartiment. Une grande différence de teneur et de composition est effectivement observée
35
entre les germes et les cotylédons. Les isoflavones s’accumulent d’abord dans le germe, et
ceci dès le stade R5 (20 JAF), c'est-à-dire au tout début du grossissement de la graine.
L’accumulation y est alors très rapide, pour atteindre la teneur finale en une dizaine de jours,
c'est-à-dire au stade R6. C’est à ce moment-là seulement que commence l’accumulation dans
les cotylédons (Berger et al., 2008). Ce phénomène a été observé chez les quatre génotypes
étudiés, et dans les trois conditions de cultures comparées. Lorsque les conditions sont
favorables à une forte accumulation des isoflavones dans les cotylédons, celle-ci se produit de
manière continue jusqu’à maturité physiologique complète. Dans tous les cas, la teneur finale
des cotylédons est bien inférieure à celle des germes. Ainsi, un net décalage de l’accumulation
des isoflavones dans les germes et les cotylédons est souligné, l’accumulation dans les
cotylédons est très tardive et ne commence que quand celle dans les germes a déjà atteint un
plateau (Figure 12).
2.4 Facteurs influençant la teneur et la composition en isoflavones dans la
graine de soja
De nombreux facteurs susceptibles de faire varier la teneur en isoflavones dans la graine
de soja ont été étudiés. En effet, l’environnement, les génotypes et leur interaction sont
largement reconnus pour leur influence sur le contenu en isoflavones de la graine (Lee et al.,
2003 ; Primomo et al., 2005 ; Rasolohery et al., 2008). Les concentrations en isoflavones
totales d’un cultivar donné peuvent varier pour plus de 325 % selon les environnements
(Seguin et al., 2004). De telles variations sont problématiques pour le développement
d’aliments fonctionnels, les concentrations étant grandement imprévisibles.
2.4.1 Facteurs environnementaux
L’impact de l’environnement sur les teneurs et les profils en isoflavones dans la graine
entière de soja a été largement étudié (Sun et Ding, 1998 ; Lee et al., 2003 ; Al-Tawaha et
Seguin, 2006 ; Carrera et al., 2011 ; Chennupati et al., 2011 ; Kim et al., 2011). Cependant,
les germe et cotylédons ne sont pas soumis de la même manière à l’influence des facteurs
environnementaux pendant la maturation de la graine (Rasolohery et al., 2008).
2.4.1.1 Effet du lieu
Les travaux pionniers dans ce domaine ont très vite établi de fortes variations des
variétés testées : de 460 à 1950 µg/g pour les mêmes variétés plantées dans quatre lieux
36
différents (Eldridge et Kwolek, 1983) ; de 1149 à 1176 µg/g pour une même variété dans
différents lieux de culture (Wang et Murphy, 1994b). L’effet lieu modifie également les
profils d’isoflavones dans la graine (Riedel et al., 2007). Une étude multilocale menée sur
deux variétés et 9 lieux a montré un écart du simple au double. Par contre, les pourcentages
des isoflavones sont restés remarquablement stables (Berger et al., 2002 ; Daydé et al., 2002).
2.4.1.2 Effet de la température et de l’irrigation
L’effet de la température lors du remplissage de la graine semble de loin le facteur
environnemental le plus influent sur la teneur en isoflavones totales. Les lieux de culture dont
la moyenne de température est plus élevée sont aussi ceux où l’on relève les plus faibles
teneurs en isoflavones. Cet effet est parfaitement documenté et démontré en conditions
contrôlées (Tsukamoto et al., 1995 ; Caldwell et al., 2005 ; Lozovaya et al., 2005). En effet,
ces travaux montrent pour la plupart qu’une augmentation de 5°C de la température de l’air
pendant le développement de la graine résulte en une réduction de 3 à 6 fois de la
concentration en isoflavones totales des graines matures. On constate également que les
températures anormalement fraîches en fin de remplissage induisent une très forte
accumulation des isoflavones dans la graine.
De plus, un stress périodique forte température (33°C jour / 25°C nuit) appliqué à des
stades antérieurs à la formation de la graine pendant le développement de la plante (comme
par exemple pendant les stades de pré-levée, les stades végétatifs ou encore les stades
reproductifs précoces (R1-R4)), peut aussi affecter les concentrations finales en isoflavones
dans la graine mature (Chennupati et al., 2011). En effet, un tel stress imposé du stade R1 à
R4 réduit les concentrations finales en isoflavones individuelles et totales, bien que l’ampleur
de la réponse dépende de la variété. Ce stress pendant les stades végétatifs réduit la
concentration de toutes les isoflavones chez certaines variétés alors qu’il ne réduit seulement
que celle de la génistéine chez d’autres (Chennupati et al., 2011). Néanmoins, ce stress
appliqué pendant la pré-levée peut aussi provoquer l’effet inverse, en augmentant la
concentration finale en isoflavones. Ces résultats démontrent ainsi que les variations des
concentrations en isoflavones dans la graine ne sont pas restreintes aux évènements ayant lieu
pendant le développement de la graine mais sont également dépendantes des évènements en
amont.
Les effets de la température sur les concentrations en isoflavones se sont révélés
différents dans les cotylédons et les germes. De faibles températures engendrent une
augmentation considérable (de 3 à 6 fois) des contenus en daidzéine et génistéine dans les
37
cotylédons en fonction des traitements alors que dans les germes, le facteur multiplicatif est
inférieur à 2 dans les mêmes situations (Rasolohery et al., 2008).
L’autre facteur qui est généralement très différent d’un lieu à l’autre est la disponibilité
en eau. Une irrigation tardive augmente fortement la teneur en isoflavones (Boscredon, 2001).
En conditions contrôlées, un stress hydrique après le stade de développement R6 de la graine
diminue significativement la teneur en isoflavones (Lozovaya et al., 2005). Le stress hydrique
induit la diminution du rendement et plus particulièrement celle du poids de mille grains
(PMG) (Masoumi et al., 2010).
La concentration en isoflavones dans les cotylédons augmente dans le cas d’une
irrigation tardive en champ, mais n’a pas d’effet significatif en serre. Une irrigation réduite en
serre n’a pas d’effet significatif sur les caractéristiques du germe. En revanche, une irrigation
tardive au champ induit une augmentation de 20% du contenu en isoflavones (13,91 vs
11,58 g.kg-1 pour irrigué vs non irrigué) avec une augmentation significative du contenu en
glycitéine pour certaines variétés et en daidzéine pour d’autres (Rasolohery et al., 2008).
2.4.2 Facteurs génétiques
L’effet génotype est prépondérant sur la composition en isoflavones, en effet les profils
sont toujours bien conservés (Whent et al., 2009). La teneur en isoflavones dans la graine peut
varier du simple au double entre deux variétés extrêmes dans un lieu donné. Il y a ainsi une
grande variabilité génotypique des teneurs dans l’espèce soja (Eldridge et Kwolek, 1983 ;
Tepavcević et al., 2010). Cependant, cet écart est généralement conservé d’un lieu à l’autre,
d’une année à l’autre (Daydé et al., 2002 ; Al-Tawaha et al., 2007). Cette variabilité
génotypique combinée à une bonne stabilité des variétés, se traduit par des estimations
élevées de l’héritabilité (>0,70) pour le contenu en isoflavones totales ou individuelles
(Meksem et al., 2001 ; Daydé et al., 2004 ; Kassem et al., 2004 ; Chiari et al., 2006 ;
Rasolohery et al., 2008).
Plusieurs QTLs (Quantative Trait Loci) permettant de mettre en évidence des régions
chromosomiques associées avec les concentrations en isoflavones totales ou individuelles
dans les graines de soja ont récemment été identifiés (Kassem et al., 2004 ; Primomo et al.,
2005 ; Gutierrez-Gonzalez et al., 2009 ; Zeng et al., 2009 ; Gutierrez-Gonzalez et al., 2011).
Toutes ces études ont en effet identifié plus de 50 QTLs avec de petits effets additifs, souvent
dépendants de l’environnement, avec une épistasie AA, démontrant ainsi un réseau très
38
complexe pour le contrôle des quantités d’isoflavones totales ou individuelles dans les
graines.
Ces QTLs sont généralement dépendants des lignées parentales utilisées. Cependant, un
locus majeur a été identifié dans différents croisements et environnements (GutierrezGonzalez et al., 2011). Il compte à lui seul pour plus de 10% de la variance phénotypique
pour la glycitéine, et de 35 à 37% pour la génistéine, la daidzéine et la somme des trois
isoflavones. Ce QTL est constamment associé à une augmentation de la concentration en
isoflavones à travers différents lieux, différentes années et différents croisements. Il s’agit du
plus important locus identifié et associé à une nette augmentation des quantités de toutes les
formes d’isoflavones dans la graine, suggérant ainsi que ce locus est un excellent candidat à
cibler pour la sélection assistée par marqueurs (Gutierrez-Gonzalez et al., 2011).
Des gènes codant pour des enzymes structurales de cette voie de biosynthèse des
isoflavones ont également été suggérés comme gènes candidats. C’est notamment le cas par
exemple des gènes IFS2 (isoflavone synthase) et CHI3 (chalcone isomérase) colocalisés avec
un QTL pour le contenu en génistéine sur le chromosome 13, ou encore des homologues des
chalcone synthases (CHS4, CHS3, CHS1, CHS9 et CHS5) qui sont colocalisés avec les QTLs
qDAI8 (teneur en daidzéine) et qTOT8 (teneur totale en isoflavones) sur le chromosome 8
(Gutierrez-Gonzalez et al., 2010b).
D’un autre côté, une étude de polymorphisme des gènes des isoflavones synthases (IFS1
et IFS2) à partir de différentes variétés chinoises a permis d’identifier 5 SNPs (Single
Nucleotide Polymorphism) comme étant associés avec les concentrations en isoflavones dans
les graines (Cheng et al., 2008). En effet, 3 SNPs ont été identifiés sur le gène IFS1, deux
d’entre eux étant sur la région promotrice et le troisième sur le premier exon. Pour le gène
IFS2, 2 SNPs ont été identifiés, chacun étant situé sur l’un des deux exons du gène.
Cependant, aucun de ces SNPs n’est retrouvé sur une zone promotrice conservée
(Subramanian et al., 2004).
L’identification de SNPs reliés au contenu en isoflavones dans ces deux séquences IFS1
et IFS2, tout comme les multiples QTLs dépendants des variétés et des effets épistatiques AA
trouvés dans ces différentes études soulignent ici la complexité de régulation de cette voie, qui
peut, de plus, varier avec les génotypes.
39
2.5 Rôles physiologiques des isoflavones dans la plante
Les isoflavones jouent différents rôles importants dans la plante. Elles interviennent
notamment dans la mise en place de la symbiose, et plus généralement au niveau des relations
plantes-microorganismes. Elles interviennent également dans la réponse aux stress abiotiques.
2.5.1 Isoflavones et symbiose
La plante sécrète des composés qui vont lui permettre d’interagir avec la microflore du
sol. Ce sont certains exsudats produits par les légumineuses qui sont spécifiquement reconnus
par les rhizobiums et qui induisent un changement de comportement chez ceux-ci. Cette
reconnaissance est effectuée par l’intermédiaire de signaux chimiques. Divers composés
déterminant une chimiotaxie positive sont émis par les racines des légumineuses-hôtes
(Pankhurst et Biggs, 1980 ; Paiva, 2000). Parmi ces composés, les flavonoïdes sont les plus
grands inducteurs de l’expression de gènes bactériens nécessaires pour la nodulation
(Broughton et al., 2000 ; Antunes et al., 2006 ; Subramanian et al., 2007 ; Zhang et al., 2009).
Chez le soja, la daidzéine et la génistéine sont les principaux constituants des exsudats
racinaires. Chacun de ces composés a été montré comme étant inducteur primaire de
l’expression des gènes de la nodulation de Bradyrhizobium japonicum, appelés « gènes nod »
(Kosslak et al., 1987 ; Rolfe, 1988 ; Smit et al., 1992 ; Napoles et al., 2009). Ces gènes sont
responsables de la synthèse des enzymes nécessaires à la production de « facteurs Nod »
(lipo-oligosaccharides complexes). Leur expression est contrôlée par des gènes régulateurs de
la famille NodD (Lerouge et al., 1990 ; Bec-Ferté et al., 1994 ; D'Haeze et Holsters, 2002).
Ces lipochito-oligomères sont sécrétés par les bactéries dans le milieu externe et vont
déclencher une série de modifications chez la plante (Dénarié et al., 1996 ; Duzan et al.,
2004). En effet, ils sont à l’origine de la différenciation et de la division cellulaire conduisant,
au niveau des racines des légumineuses hôtes, à l’organogénèse nodulaire (Cooper, 2007 ;
Oldroyd et Downie, 2008 ; Buer et al., 2010) (Figure 13).
40
Figure 13 : Processus global d’infection jusqu’à la formation du nodule fonctionnel chez
les légumineuses.
Les isoflavones, en tant qu’inducteurs des gènes nod, sont donc essentielles pour la
nodulation (Subramanian et al., 2006). La génistéine semble plus efficace à cette induction
que la daidzéine (Sutherland et al., 1990 ; Lang et al., 2008). La production endogène de
génistéine est suffisante pour soutenir la nodulation (Ip et al., 2001 ; Subramanian et al.,
2006) : Elle induit la nodulation de Bradyrhizobium japonicum en se liant aux protéines
NodD1 et NodV (Long, 1996) ou encore aux trois protéines : NopB, NopH et NopT (Hempel
et al., 2009). Elle est également capable d’accélérer le développement des nodules et
d’augmenter le taux de fixation de l’azote atmosphérique (Zhang et Smith, 1995).
2.5.2 Isoflavones et défense contre les microorganismes
Les isoflavones jouent aussi un rôle dans les défenses de la plante en cas d’attaques par
des agents pathogènes (virus, bactéries, champignons) ou par des ravageurs tels que les
nématodes et les insectes (Bednarek et Osbourn, 2009 ; Feng et al., 2010). Les isoflavones,
sont en effet des phytoalexines, qui contribuent à limiter l’extension des infections causées
dans les plantes (Bent, 2011). Les phytoalexines sont généralement présentes en très faible
concentration ou absentes mais sont rapidement synthétisées lors d’un envahissement par des
pathogènes viraux, bactériens et fongiques ou par des ravageurs (Veech, 1982 ; Dixon et al.,
1995 ; Modolo et al., 2002 ; Lozovaya et al., 2004 ; Naoumkina et al., 2007). Dans ce cas de
réponse inductible de défense de la plante, on parle de défense active. La génistéine ainsi
qu’une molécule dérivée de la daidzéine, la glycéolline, interviennent dans la lutte contre les
infections (Boué et al., 2000 ; Dixon et Ferreira, 2002 ; Lee et al., 2010b ; Lygin et al., 2010).
41
2.5.3 Isoflavones et stress environnementaux
Les isoflavones jouent aussi un rôle très important dans la défense contre les stress
abiotiques, tels que l’exposition aux UV (Graham et Graham, 1991 ; Graham et Graham,
1996). Dans les plantes exposées aux radiations UV, la teneur en flavonoïdes augmente,
suggérant qu’ils offrent une protection contre les radiations nocives de l’UV-B (propriétés
antiradicalaires et inhibition d’enzymes) (Wei et al., 1996 ; Caldwell et al., 2005 ; Jenkins,
2009).
3 BIOSYNTHESE DES ISOFLAVONES DE SOJA
3.1 Description générale de la voie de biosynthèse des isoflavones
L’intervention successive de deux voies distinctes est nécessaire pour mener à la
synthèse des isoflavones : la voie des phénylpropanoïdes et la voie des flavonoïdes.
3.1.1 Synthèse des composés phénoliques simples : voie des phénylpropanoïdes
Ces premières étapes sont communes à tous les composés phénoliques. Cette synthèse
commence par la désamination de la phénylalanine (acide aminé aromatique issu de la voie
des shikimates) en acide cinnamique, précurseur de nombreux phénylpropanoïdes (Figure
14). L’enzyme responsable de cette réaction est la phénylalanine ammonia lyase (PAL), qui
contrôle ainsi l’orientation du carbone vers la production de composés phénoliques plutôt que
vers la production de métabolites primaires comme les protéines. La cinnamate 4-hydroxylase
(C4H) convertit ensuite l’acide cinnamique en acide p-coumarique, puis ce dernier est
finalement activé en p-coumaroyl-CoA par la 4-Coumarate CoA-ligase (C4L).
Figure 14 : Etapes initiales de la biosynthèse des composés secondaires phénoliques
d’après Winkel-Shirley, (2001)
42
3.1.2 La voie des flavonoïdes
La chalcone synthase (CHS) a un rôle clef dans cette voie puisqu’elle catalyse la
première étape vers la voie de biosynthèse des flavonoïdes en provoquant la condensation
séquentielle d’une molécule de p-coumaroyl-CoA et de trois molécules de malonyl-CoA
(Figure 15), formant ainsi la naringénine chalcone (voir aussi Figure 7 page 29), premier
intermédiaire réactionnel des 3 types d’isoflavones présentes chez le soja.
À partir de ce premier intermédiaire chalcone, la voie de biosynthèse des isoflavones du
soja se scinde en deux branches : l’une menant à la synthèse de la génistéine et l’autre menant
à la synthèse de la daidzéine et de la glycitéine selon que ce précurseur soit réduit ou non par
la chalcone réductase (CHR). La fermeture du cycle C (Figure 7, page 29) par la chalcone
isomérase (CHI) produit la naringénine, intermédiaire de la génistéine. La chalcone réductase
(CHR) forme la 6’-deoxychalcone ou isoliquiritigénine (Welle et Grisebach, 1988), qui est
transformée en liquiritigénine, précurseur de la daidzéine et de la glycitéine, par la CHI. La
naringénine est aussi le point d'entrée dans la voie des anthocyanes. Ainsi, la F3H (Flavanone
3-hydroxylase) peut être en compétition avec la synthèse de la génistéine (Yu et al., 2003).
PAL : Phénylalanine Ammonia Lyase – CHS : Chalcone Synthase – CHR : Chalcone Réductase – CHI : Chalcone Isomérase
– F6H : Flavonoïde 6-Hydroxylase – 4’-IOMT : 4’-Isoflavanone-O-Méthyltransférase – 6-IOMT : 6-Isoflavanone-OMéthyltransférase – IFS : Isoflavone Synthase – HID : Hydroxyisoflavanone Déshydratase – F3H : Flavanone 3Hydroxylase.
Figure 15 : Voie de biosynthèse des isoflavones de soja d’après Yu et al. (2003) ; Du et al.
(2010) ; Wang, (2011)
43
À partir de la liquiritigénine, la voie se scinde à nouveau en deux branches distinctes :
celle menant à la daidzéine et celle menant à la glycitéine. La synthèse de cette dernière n’est
pas encore totalement élucidée. Il est admis que son intermédiaire flavanone (6,7,4’trihydroxyflavanone) est produit à partir de la liquiritigénine par une F6H ou flavonoïde 6hydroxylase (Latunde-Dada et al., 2001).
L’entrée dans la voie de synthèse des isoflavonoïdes proprement dits est marquée par la
migration du groupement aryl de C2 à C3. Cette étape clef est catalysée par une 2hydroxyisoflavanone synthase, plus communément appelée isoflavone synthase (IFS). Les 3
intermédiaires isoflavanones sont produits à partir de leurs précurseurs respectifs. Une
déshydratation de ces isoflavanones peut ensuite survenir spontanément ou plus probablement
à travers la catalyse réalisée par la 2- hydroxyisoflavanone déshydratase (HID) (Akashi et al.,
2005 ; Shimamura et al., 2007) qui génère les isoflavones correspondantes. Elle est aussi
capable de convertir des substrats méthylés (Du et al., 2010). Selon les intermédiaires
réactionnels observés chez le soja et chez Medicago truncatula, la synthèse de la glycitéine
pourrait faire intervenir une 6-isoflavanone-O-méthyltransférase (6-IOMT) pour former
l’intermédiaire méthylé de la glycitéine (Klus et Barz, 1995 ; Hirota et al., 2004), mais les
travaux récents sur cultures cellulaires de Medicago truncatula indiquent que la méthylation
en C6 pourrait avoir lieu plus tardivement sur l’isoflavone (Farag et al., 2008).
Outre le rôle clef de la CHS dans la production des isoflavones, on peut également noter
(Figure 15) que la CHR, tout comme la F3H peuvent jouer un rôle crucial dans la balance
entre la daidzéine et la génistéine ; tandis que le rapport glycitéine vs. daidzéine est
probablement déterminé par l’hydroxylation de la liquiritigénine, probablement par une F6H.
3.1.3 Variations du schéma de base chez les légumineuses
Chez certaines espèces de légumineuses, comme Medicago truncatula, ou le trèfle
rouge (Trifolium pratense L.), on observe d’autres formes d’isoflavones, les plus fréquentes
étant la biochanine A et la formononétine qui sont respectivement les formes méthylées en 4’
de la génistéine et de la daidzéine. Ces isoflavones sont généralement observées dans les
feuilles, et d’ailleurs, elles sont aussi produites dans les feuilles du soja (Akashi et al., 2000 ;
Akashi et al., 2003 ; Tsao et al., 2006 ; Farag et al., 2008).
Récemment, il a été montré que l’afrormosine (7-hydroxy-6,4’-diméthoxyisoflavone)
était une des isoflavones majoritaire secrétée par des cellules élicitées de Medicago truncatula
(Farag et al., 2008). Celle-ci correspond au dérivé méthylé en 4’de la glycitéine.
44
Figure 16 : Les isoflavones aglycones et leurs dérivés méthylés identifiés chez Trifolium
pratense et Medicago truncatula
Cette méthylation était supposée avoir lieu après la synthèse de l’isoflavone, mais la
4’IOMT n’accepte que les isoflavanones comme substrats. Elle agirait donc ainsi avant la
HID. De ce fait, on retrouve ainsi les équivalents méthylés (biochanine A, formononétine et
afrormosine) dont l’identification souligne ici la flexibilité métabolique dans cette voie de
biosynthèse des isoflavonoïdes (Figure 16).
3.1.4 Les formes conjuguées des isoflavones
Chez les légumineuses, notamment chez le soja, plusieurs enzymes assurent la
conjugaison des formes aglycones vers des structures de plus en plus complexes (glucosides,
acétyles et malonyles). Cette conversion à lieu au niveau du cytoplasme (Kudou et al., 1991 ;
Dixon et Paiva, 1995 ; Baggett et al., 2002).
Le phénomène de glucosylation est une modification clef des métabolites secondaires
des plantes avec différents sucres, améliorant leur solubilité et leur stabilité et facilitant aussi
leur accumulation et leur stockage dans les cellules végétales (Jones et Vogt, 2001). Ces
glucosylations représentent la première étape de conjugaison des isoflavones et sont
catalysées par des Uridine diphosphate Glucosyltransférases (UGTs, GT) (Dixon et Sumner,
2003 ; Noguchi et al., 2007 ; Dhaubhadel et al., 2008).
Les isoflavones glucosylées sont ensuite converties en leurs dérivés malonyles
respectifs par des malonyltransférases (MT). La malonylation des isoflavones prévient la
dégradation enzymatique des formes glucoconjuguées, change leur lipophilicité et agit comme
45
un signal de répartition des formes conjuguées dans des compartiments cellulaires
spécifiques. Les formes malonylées et acétylées sont généralement considérées comme des
formes de stockage s’accumulant dans la vacuole ou d’autres compartiments spécifiques
servant de réservoir à précurseurs de biosynthèse ou à formes inactives de phytoalexines
(Dixon et Steele, 1999 ; Suzuki et al., 2007 ; Dhaubhadel et al., 2008).
Les enzymes représentées sont : IFS : 2-hydroxyisoflavanone synthase ; IF7GT : isoflavone 7-Oglucosyltransférase ; IF7MaT : isoflavone 7-O-malonyltransférase ; et le dimère GmICHG (en rouge) : βglucosidase hydrolysant les formes conjuguées d’isoflavones
Figure 17 : Régulation enzymatique des formes conjuguées d’isoflavones chez le soja
(Suzuki et al., 2006). Les pointillés indiquent les possibles voies de translocation des isoflavones depuis le
cytoplasme, via la vacuole, jusqu’à l’apoplaste.
Ces formes conjuguées sont ensuite excrétées de la cellule. On les retrouve au niveau
des parois racinaires et des espaces intercellulaires où elles sont réactivées par des enzymes de
type β-glucosidases (ICHG : Isoflavone Conjugate-Hydrolyzing β-glucosidase) (Suzuki et al.,
2006). Cependant, les mécanismes de transport des formes conjuguées (mentionnés en
pointillés sur la Figure 17) n’ont pas encore été complètement élucidés.
3.2 Etat des connaissances sur les mécanismes de transport des isoflavones
Les isoflavonoïdes sont transportés et accumulés dans la vacuole pour atteindre des
concentrations suffisantes afin d’assurer des avantages écologiques et physiologiques tout en
évitant des effets toxiques pour la cellule. Le mécanisme de transport des isoflavonoïdes peut
être comparé aux mécanismes de transport de xénobiotiques dont l’objectif est de détoxifier la
cellule.
46
3.2.1 Les principales étapes du transport des isoflavones dans la cellule
Les isoflavones aglycones sont synthétisées à la surface du réticulum endoplasmique
(RE), par un complexe multienzymatique (Figure 18), via une série de réactions d’hydrolyses
et d'oxydations. Elles sont alors désactivées par des glucosyltransférases (UGT) cytosoliques
(par exemple UGTT73F2 chez le soja), qui forment les glucosides correspondantes (daidzine,
génistine et glycitine). Elles subissent ensuite une malonylation en position 6’’ catalysée par
des malonyltransférases (MT) cytosoliques (par exemple GmMT7 chez le soja), menant aux
malonyl-glucosides correspondantes : 6’’-O-malonyl- daidzine, génistine, et glycitine.
Vacuole
Cytoplasme
UGT
MT
lumen du
Réticulum endoplasmique
(1) Substrats isoflavones aglycones, (2) isoflavones glucosides, (3) isoflavones malonyl-glucosides
Figure 18 : Principales étapes du transport des isoflavones chez le soja
(Dhaubhadel et al., 2008)
3.2.2 Mise en évidence de leur transport vers la vacuole
Les premiers travaux portant sur le transport de flavonoïdes vers la vacuole chez les
légumineuses, ont suggéré l’implication de transporteurs secondaires appartenant à une
famille de transporteurs tonoplastiques, the Multidrug et Toxin extrusion family (MATE).
Une décoration glucosyl- de ces flavonoïdes s’est avérée nécessaire pour ce type de
transporteur. Des MATEs potentiellement impliqués dans le transport d’anthocyanes et de
proanthocyanidines ont en effet été identifiés chez Medicago truncatula (Peel et al., 2009 ;
Zhao et Dixon, 2009). Plus récemment, un transporteur de type MATE, nommé MATE2 a été
caractérisé (Zhao et al., 2011). Ce transporteur est exprimé dans différents tissus, notamment
la graine en développement. Celui-ci présente un large spectre de substrats flavonoïdes,
comme les anthocyanidines ou encore les isoflavones 7-O-glucosides ou les 7-O-malonyl47
glucosides. Cependant, MATE2 présente une plus grande affinité pour les substrats malonylglucosides (Farag et al., 2008).
Ceci montre ainsi que la malonylation et la glucosylation des flavonoïdes ou
isoflavonoïdes, facilite leur transport vers la vacuole, les formes aglycones n’étant pas prises
en charge. Le transporteur MATE2 semble donc lié aux modifications cytosoliques des
flavonoïdes (glucosylations et malonylations) pour le transport et le stockage des métabolites
correspondants dans la vacuole. En revanche, le transport des formes conjuguées vers
l’apoplaste reste encore à élucider.
3.3 Les principales familles d’enzymes intervenant dans la voie de
biosynthèse des isoflavones
Les différentes enzymes structurales de cette voie ont été largement étudiées avec
différentes approches biochimiques et génétiques, à l’exception de quelques-unes intervenant
dans la voie de biosynthèse de la glycitéine. Ces travaux ont ainsi permis une meilleure
compréhension de la voie des isoflavones et des mécanismes catalytiques des enzymes
individuelles, ouvrant aussi la voie à des applications en ingénierie métabolique.
3.3.1 La famille des lyases
La première enzyme intervenant dans la voie de biosynthèse des phénylpropanoïdes,
est la Phénylalanine Ammonia Lyase (PAL) qui appartient à la grande famille multigénique
des enzymes de type lyases. On regroupe sous le nom de lyases les enzymes qui cassent des
liaisons covalentes sans réaction oxydative ni hydrolyse. La PAL catalyse la désamination de
la L-Phénylalanine en acide cinnamique, premier précurseur des phénylpropanoïdes,
marquant ainsi le point de sortie du métabolisme primaire. C’est une enzyme soluble localisée
dans le cytoplasme, qui peut être présente sous forme de complexe-multienzymatique avec
d’autres enzymes de la voie des phénylpropanoïdes (Deshpande et al., 1993). À ce jour, deux
gènes : PAL1 (Frank et Vodkin, 1991) et PAL2 (Wang et al., 2009) ont été isolés chez le soja.
Le gène PAL1 s’exprime dans les différents tissus de la plante et son expression dans les
racines augmente significativement après inoculation avec Bradyrhizobium japonicum
(Pregelj et al., 2011).
48
3.3.2 Les polykétides synthases (PKS)
Les polyketides synthases catalysent une addition répétitive de malonyl-CoA sur un
accepteur CoA plus ou moins complexe (acetyl-CoA, feruloyl-CoA, caffeoyl-CoA, pcoumaroyl-CoA….). Cette réaction de condensation implique une série d’activités
complémentaires : ketoacyl synthase (KS), acyl transférase (AT), ketoacyl réductase (KR),
hydroxyacyl déshydratase (DH).
Ce type de métabolisme est très proche de la réaction d’initiation et d’élongation des
acides gras. En fait, les PKS ont probablement évolué à partir des FAS (fatty acid synthases).
La différence essentielle étant qu’à la suite de chaque étape d’élongation, les FAS réduisent et
déshydratent les cétones (kéto-carbones) alors que cette réaction n’est pas systématique chez
les PKS. Ainsi, il reste des multiples possibilités de cyclisations qui permettent de générer une
grande variété de composés.
Les FAS sont divisées en différents types selon que les domaines d’activités (KS, AT,
KR…) sont portés par plusieurs chaines intimement associées (Type I) ou une même chaine
polypeptidique (Type II). Les PKS sont ainsi classées en 3 grands types : Les PKS de type I
sont proches des FAS de type I, et les PKS de type II ont plus une structure multienzymatique
qui indiquerait une évolution depuis les FAS de type II. Les PKS de type III sont plus
simples : ce sont des homodimères de protéines multifonctionnelles présentant deux sites
actifs indépendants. Leur structure plus simple les fait ressembler à la ketoacyl synthase III
(KAS) responsable de la première condensation de la synthèse des acides gras (production de
l’intermédiaire C4). La chalcone synthase est une PKS de type III (Austin et Noel, 2003 ;
Flores-Sanchez et Verpoorte, 2009).
La chalcone synthase (CHS) réalise la condensation séquentielle de trois molécules de
malonyl-CoA et d’une molécule de p-coumaroyl-CoA pour former la naringénine chalcone
(Yu et Jez, 2008), étape clef dans la voie de biosynthèse des flavonoïdes et des isoflavones
(Figure 19). Ces enzymes sont des homodimères avec deux polypeptides de 42 KDa,
contenant ainsi deux sites actifs indépendants (Ferrer et al., 1999).
49
Figure 19 : Réactions catalysées par la chalcone synthase (Halbwirth, 2010). La réduction
par une chalcone réductase est spécifique des légumineuses et nécessite un type dédié de
chalcone isomérase (CHI) capable d’accepter l’isoliquiritigénine. * Toutes les CHIs
connues catalysent cette réaction, ** seulement des CHIs spécifiques catalysent cette
réaction.
La chalcone synthase est l’archétype des PKS de type III. Elle présente la structure
caractéristique des PKS de type III (Figure 20).
50
Figure 20 : Structure tridimensionnelle de la Chalcone synthase – (a) et (b) Construction
de l’homodimère et positionnment des sites actifs. Les deux sous-unités sont colorées
respectivement en jaune et en bleu - (c) comparaison avec la KAS III : La structure
typique αβαβα est mise en évidence avec les hélices α en jaune et les feuillets β en mauve.
L’étoile marque la position de la cystéine impliquée dans le site actif (Austin et Noel, 2003)
Depuis la première caractérisation de la CHS chez le persil en 1983, le nombre de
séquences CHS-like a explosé. On en comptait déjà 620 en 2002 (Austin et Noel, 2003). Chez
de nombreuses espèces où elles ont été étudiées, elles sont codées par une famille
multigénique. Seize copies de gènes codant pour des CHS ont été identifiées chez Glycine
max (Naoumkina et al., 2010). Cependant à l’heure actuelle seuls 9 homologues (CHS1 à
CHS9) ont été clonés et séquencés (Clough et al., 2004 ; Matsumura et al., 2005 ; Tuteja et
Vodkin, 2008 ; Tuteja et al., 2009). Cette famille de gènes présente une grande similarité de
séquences nucléotidiques dans les régions codantes, variant de 80 à 99% et joue un rôle
important pendant le développement de la plante ou en réponse à des stimuli
environnementaux (Shimizu et al., 1999 ; Zabala et al., 2006 ; Chen et al., 2009b ; Chen et
al., 2011). Les différents homologues codant pour les CHS sont exprimés dans tous les tissus
de la plante de soja mais à des niveaux différents selon les tissus considérés et les conditions
51
environnementales (Dhaubhadel et al., 2007 ; Gutierrez-Gonzalez et al., 2010a ; Chen et al.,
2011).
3.3.3 Les cytochromes P450
Les cytochromes P450 (P450) sont une superfamille multigénique d’hémoprotéines
présentant des activités enzymatiques très variées. Le nom de P450 découle de la capacité de
ces hémoprotéines à absorber à 450nm (Omura et Sato, 1964). On trouve les cytochromes
P450 chez la plupart des êtres vivants : archaebactéries, eubactéries, champignons
filamenteux, animaux et plantes (Nelson, 1999). Les P450 ont des activités enzymatiques très
variées telles que par exemple les oxygénations, N-oxydations, réductions, alkylations,
déalkylations, désaminations oxydatives.
3.3.3.1 Structure, Fonction et Classification
Ces enzymes P450 représentent l’élément majeur d’un système multienzymatique,
dénommé « monooxygénase P450-dépendante ». Quel que soit le type de P450 eucaryote,
l’architecture globale des enzymes est conservée (Werck-Reichhart et Feyereisen, 2000). Ces
protéines sont composées d’une majorité d’hélices α (annotées de A à L) et de quelques
feuillets β s’associant en deux domaines globulaires α et β. L'ancre membranaire présente sur
les P450 eucaryotes est une hélice hydrophobe composée d’une vingtaine de résidus à
l’extrémité N-terminale suivis de quelques résidus basiques qui la délimitent. Ils ont
également une séquence consensus riche en proline (P-P-G-P-X-P-X-P) qui permet aux P450
de s’accoler à la membrane (Kemper, 2004). L’hème est situé au cœur de l’enzyme dans un
environnement hydrophobe entre les hélices L et I (Hasemann et al., 1995). L’atome de fer
forme une liaison thio-ester avec une cystéine de la séquence consensus F-XX-G-X-R-X-CX-G en amont de l’hélice L. L’hélice I, qui compose une partie du site actif, contient une
autre séquence consensus (A/G-G-X-D/E-T-T/S) impliquée dans l’activation de l’oxygène.
Les régions SRS (Substrate Recognition Site) permettent l’entrée et le positionnement du
substrat à proximité de l’hème (Figure 21).
52
La protopophyrine IX (hème) est en orange, les sites de reconnaissance du substrat (SRS1–SRS6) sont
en rouge et les hélices I et L coordonnées à l'hème sont en vert
Figure 21 : Modèle d’une structure tertiaire de P450 monooxygénase d’après Urlacher et
Eiben (2006)
Les P450 catalysent l’incorporation directe d’un atome d’oxygène sur le substrat.
L’autre atome de la molécule d’oxygène est réduit en H2O grâce à l’oxydation d’une molécule
de NADPH [R-H + H+ + NADPH + O2  R-OH + H2O + NADP+]. L’ensemble de ce
processus catalytique se déroule selon une cascade d’évènements conduisant simultanément à
la libération du produit et à la régénération de l’enzyme. Un même P450 peut donc enchainer
plusieurs réactions enzymatiques sans interruption.
La nomenclature des P450 est basée sur la comparaison de séquences peptidiques. Les
P450 sont nommés à partir de la racine CYP (pour CYtochrome P450) suivi d’un chiffre pour
la famille, une lettre désignant la sous famille, et un nombre désignant l’ordre chronologique
de la découverte des gènes. Lorsque deux P450 présentent au moins 40% d’homologie de
séquence, ils appartiennent à la même famille. Au-delà de 55% d’homologie, ils appartiennent
à la même sous famille. Les séquences identiques à plus de 97 % sont considérées comme
variants alléliques. Une base de données regroupant la majorité des P450 est désormais
adoptée par la communauté scientifique. Elle permet un accès rapide aux données de tous les
P450 clonés et/ou caractérisés (Nelson et al., 1996 ; Nelson, 1999 ; Nelson, 2009).
53
clan 71
Figure 22 : Arbre phylogénétique représentant chacune des 127 familles de P450
identifiées chez les plantes d’après Nelson et Werck-Reichhart (2011)
Chez les plantes, les P450 sont regroupés en 127 familles elles-mêmes regroupées en
11 clans : 85,74, 710, 51, 727, 72, 746, 86, 97, 711, et 71 (Figure 22). Le clan est désigné par
le plus petit numéro de la famille représentée (Nelson, 2011). Parmi ces 11 clans, le clan 71
est de loin le plus important.
Les P450 se répartissent en 4 classes en fonction du mode de transfert des électrons
(Werck-Reichhart et Feyereisen, 2000). C’est dans la classe II que l’on retrouve la majorité
des P450 eucaryotes impliqués dans les réactions de biosynthèse des métabolites secondaires.
C’est notamment le cas pour les trois enzymes : C4H, F6H et IFS intervenant dans la voie
menant à la synthèse des isoflavones chez le soja. Ces P450 de classe II sont caractérisés par
la présence de motifs caractéristiques des P450 transmembranaires : le domaine
54
transmembranaire lui-même, la charnière permettant d’articuler la partie cytosolique à son
ancre et les trois sous-motifs caractéristiques du domaine globulaire (Steele et al., 1999).
3.3.3.2 Les P450 intervenant dans la synthèse des isoflavones
La C4H : cinnamate 4-hydroxylase
La cinnamate 4-hydroxylase est le P450 végétal le plus étudié à ce jour. L’activité C4H
a été décrite à la fin des années 60, dans des pousses de Pisum sativum (Russell et Conn,
1967). Cette enzyme catalyse la conversion du cinnamate en p-coumarate, première réaction
oxydative de la voie de biosynthèse des phénylpropanoïdes. Bien qu’elle ait une affinité
nettement supérieure pour le cinnamate (Pierrel et al., 1994), la C4H peut accepter d’autres
substrats, tels que des molécules planes, aromatiques, de petite taille possédant un site
anionique à l’opposé du site d’hydroxylation, et pouvant présenter des groupements en ortho
et meta (Chen et al., 2007). L’activité C4H a été détectée dans de très nombreuses plantes
supérieures et toutes ces enzymes appartiennent à la famille des CYP73 contenue dans le clan
71 (Nelson et Werck-Reichhart, 2011).
Les FH : flavonoïde – hydroxylases
Les flavonoïdes hydroxylases exercent toutes des fonctions similaires en introduisant un
hydroxyle à différentes positions sur les cycles A, B ou C des molécules flavonoïdes (Figure
7 page 29). Cependant, elles peuvent être soit des 2-oxoglutarate- dioxygénases - Fe(II) et
ascorbate- dépendantes, soit des cytochromes P450 monooxygénases dépendantes (Halbwirth,
2010). Ainsi, la flavanone 3-hydroxylase (F3H ou FHT) qui dirige la voie vers la synthèse
anthocyanes (Figure 15) est une 2-oxoglutarate- dioxygénase tandis que la flavanone 6hydroxylase (F6H) catalysant une hydroxylation en position 6 sur le cycle A est un
cytochrome P450 (Latunde-Dada et al., 2001).
La fonction F6H a été mise en évidence par l’expression hétérologue d’un cDNA
(Genbank Y10490.1) isolé à partir de cellules élicitées de soja (Schopfer et Ebel, 1998).
L’étude de la séquence a montré qu’il s’agissait d’un cytochrome P450 (Latunde-Dada et al.,
2001). Cette enzyme a été classée dans le clan 71 sous la référence CYP71D9 (Nelson, 2009 ;
Nelson et Werck-Reichhart, 2011).
En catalysant l’hydroxylation en position 6 du cycle A de la liquiritigénine, la F6H
permet la synthèse de l’intermédiaire flavanone de la glycitéine (6,7,4’-trihydroxyflavanone)
(Latunde-Dada et al., 2001). La F6H est capable d’accepter plusieurs substrats flavanones.
Cependant, l’enzyme étudiée par Latunde-Dada et al. (2001) présente une affinité plus élevée
55
pour la liquiritigénine que pour la naringénine dans la voie de biosynthèse des isoflavones
chez le soja.
L’IFS : isoflavone synthase
L’isoflavone synthase (IFS) est en fait une 2-hydroxyisoflavanone synthase (2-HIS).
Elle redirige les intermédiaires flavonoïdes vers la voie des isoflavonoïdes. De nombreux
travaux ont permis d’identifier et de caractériser les gènes codant pour ces IFS. Ces gènes
sont présents en faible nombre de copies dans les génomes des légumineuses (Sawada et al.,
2002).
L’IFS convertit les flavanones en isoflavanones par l’intermédiaire d’une migration aryl
inhabituelle (Hashim et al., 1990). Ce mécanisme (Figure 23) implique l’abstraction d’un
hydrogène en C3 suivi par la migration 1,2-aryl de C2 à C3, et la reliaison du radical hydroxy
en C2 (Mizutani et Sato, 2011). Cette enzyme appartient à la sous-famille des CYP93C
regroupées elles aussi dans le clan 71 (Nelson et Werck-Reichhart, 2011).
Figure 23 : Mécanisme proposé pour la migration aryl catalysée par le CYP93C (IFS) : la
migration aryl de la (2S)-flavanone pour former le produit 2-hydroxyisoflavanone d’après
Mizutani et Sato (2011)
Le premier gène codant pour une IFS a été caractérisé chez Glycine max, celui-ci
pouvant convertir la naringénine (5,7,4’-trihydroxyflavanone) et la liquiritigénine (7,4’dihydroxyflavanone) en génistéine et daidzéine respectivement (Steele et al., 1999). Chez le
soja, deux gènes : IFS1 et IFS2 ont été identifiées. Chacun contient un seul intron localisé à la
même position à l’intérieur de la région codante, la jonction d’épissage se trouvant dans le
codon 300. L’intron du gène IFS1 a une longueur de 218 pb et celui du gène IFS2 mesure 135
pb, ceux-ci ayant 46% de similarité de séquence (Jung et al., 2000). Les 2 gènes montrent de
nombreuses régions homologues, 92,5% au niveau nucléotidique et 96,7% au niveau acides
aminés. Les deux protéines IFS1 et IFS2 correspondantes ne diffèrent en effet l’une de l’autre
que par 14 acides aminés (Dhaubhadel et al., 2003).
56
Chacun de ces gènes peut convertir les substrats flavanones en isoflavanones avec
différentes efficacités. Des tests enzymatiques réalisés dans des microsomes de levure ont
montré la capacité de ces deux gènes IFS1 et IFS2 à convertir la liquiritigénine et la
naringénine en daidzéine et génistéine respectivement, et ce de façon NADPH-dépendante.
Cependant, l’un comme l’autre sont plus efficaces dans la transformation de la liquiritigénine
(Jung et al., 2000). L’intermédiaire putatif de la glycitéine serait quant à lui métabolisé en son
isoflavanone correspondante par l’IFS2 (Latunde-Dada et al., 2001). Ajoutons cependant que
cette équipe n’a pas testé la réaction avec l’IFS1.
L’expression des gènes IFS1 et IFS2 chez le soja a été largement étudiée. Ceux-ci sont
exprimés dans tous les tissus de la plante : les racines, les graines, les téguments, les germes,
les fleurs, ou encore les feuilles (Subramanian et al., 2004 ; Kim et al., 2005b). Cependant,
les quantités des transcrits IFS1 et IFS2 diffèrent selon les tissus mais aussi selon les
conditions environnementales (Gutierrez-Gonzalez et al., 2010b).
3.3.4 Autres enzymes intervenant dans cette voie de biosynthèse
3.3.4.1 Les aldo-kéto- réductases (AKR)
La chalcone réductase (CHR) appartient à la super famille des aldo-kéto-réductases
(AKR) (Bomati et al., 2005 ; Wang, 2011). Ce type d’enzymes a seulement été identifié chez
les légumineuses. Elles catalysent la réduction NAD(P) H-dépendante d’une grande variété de
composés carbonyles. Au sein de la voie des flavonoïdes, la CHR catalyse la synthèse de
l’isoliquiritigénine précurseur chalcone de la daidzéine et de la glycitéine. Elle constitue ainsi
une étape cruciale dans la détermination du ratio génistéine vs daidzéine dans cette voie (Yu
et al., 2000 ; Liu, 2009). Plusieurs travaux ont mis en évidence le rôle important des CHR
dans les mécanismes de défense de la plante (Graham, 2005 ; Alkharouf et al., 2006). Lorsque
le gène codant pour cette enzyme est éteint dans les racines de soja, de faibles quantités de
daidzéine sont détectées alors que les quantités de génistéine sont augmentées. Ceci
confirmant ainsi son rôle essentiel dans la détermination du ratio génistéine vs daidzéine
(Graham et al., 2007).
Ces enzymes CHR sont codées par une famille multigénique (Dixon et al., 2002). Sept
copies de gènes codant pour des CHR ont été identifiées chez Medicago truncatula et 11 chez
Glycine max (Naoumkina et al., 2010). Cependant, à l’heure actuelle, seuls deux d’entre eux
ont été clonés et entièrement séquencés chez le soja (Welle et Grisebach, 1989 ; Liu, 2009).
L’expression de ces gènes n’est pas trop variable selon les différents tissus de la plante. Ceux57
ci sont modérément voire faiblement exprimés dans tous les tissus, notamment la graine à
différents stades de développement (Liu, 2009 ; Chen et al., 2011).
3.3.4.2 Les chalcone isomérases (CHI)
Les chalcone isomérases sont des enzymes stables, stéréospécifiques, qui accélèrent
considérablement la cyclisation des chalcones. Dans la voie de biosynthèse des flavonoïdes
elles catalysent la cyclisation intramoléculaire des chalcones bicycliques : naringénine
chalcone et isoliquiritigénine, en leur 2S-flavanones tricycliques : naringénine et
liquiritigénine respectivement (Jez et Noel, 2002). L’analyse structurale de ces enzymes a
permis de mettre en évidence une liaison hydrogène entre le site actif et son substrat qui
s’avère être cruciale pour leur activité catalytique (Jez et al., 2002 ; Hur et al., 2004).
Ces enzymes ont été regroupées en classe I et classe II en fonction de leur spécificité de
substrat. Les gènes codant pour ces enzymes ont été clonés et isolés chez différentes espèces
dont le soja (Ralston et al., 2005). Les gènes codant pour les CHI de classe II sont
probablement ceux impliqués dans la voie de biosynthèse des isoflavones. Les CHI de classe I
peuvent seulement isomériser la naringénine chalcone en naringénine alors que les CHI de
classe II acceptent à la fois la naringénine chalcone et l’isoliquiritigénine pour les convertir en
naringénine et liquiritigénine respectivement (Kimura et al., 2001 ; Ralston et al., 2005). Chez
les légumineuses, la séquence en acides aminés d’un même type de CHI montre une similarité
de séquence supérieure à 70%, alors que le pourcentage de similarité entre le type I et le type
II n’est que de 50% (Shimada et al., 2003 ; Ralston et al., 2005).
Figure 24 : Classification des chalcones isomérases – les Gma (Glycine max) sont les
enzymes du soja correspondant aux CHI1A, CHI1B1, CHI1B2, CHI2, CHI3, CHI4A et
CHI4B (Ralston et al., 2005)
58
Chez le soja, six gènes codant pour des CHI ont été isolés : CHI1A, CHI1B1, CHI1B2,
appartenant à la classe II ainsi que CHI2 qui appartient à la classe I. Les gènes CHI3 et CHI4
ont été classés à part et ne semblent pas directement impliqués dans la conversion des
chalcones (Figure 24). Tous ces gènes sont exprimés dans les différents tissus de la plante :
feuilles, tiges, racines, fleurs, gousses et graines. Cependant, leurs profils d’expression sont
très différents à travers les tissus et les variétés étudiés (Dhaubhadel et al., 2003 ; Ralston et
al., 2005 ; Chen et al., 2011).
3.3.4.3 Les carboxylestérases
L’enzyme qui réalise l’étape finale dans la biosynthèse des isoflavones est une 2hydroxyisoflavanone
déshydratase
(HID)
appartenant
à
la
grande
famille
des
carboxylestérases. Elle catalyse la déshydratation de la 2-hydroxyisoflavanone en isoflavone.
Cependant, l’instabilité de son substrat, rend sa purification et sa caractérisation difficile.
L’analyse de l’activité de l’enzyme correspondante a montré que celle-ci pouvait à la
fois convertir efficacement la 2,5,7,4’-tetrahydroxyisoflavanone et la 2,7,4’-trihydroxyisoflavanone pour donner de la génistéine et de la daidzéine respectivement. La production
d’isoflavones par déshydratation spontanée des 2-hydroxyisoflavanones s’est avérée
négligeable comparée à la réaction catalysée par la HID, montrant ainsi que la déshydratation
menant à la formation des isoflavones est essentiellement enzyme dépendante (Akashi et al.,
2005). Cette enzyme se montre également efficace dans la prise en charge des substrats
méthoxy (Du et al., 2010).
3.3.5 Les enzymes de décoration des isoflavonoïdes
3.3.5.1 Les isoflavanone / isoflavone O-Methyltransférase (OMT)
Les O-méthyltransférases (OMT) jouent un rôle important dans le métabolisme
secondaire des plantes et constituent une large famille d’enzymes qui catalysent le transfert du
groupement méthyle à un groupement hydroxyle spécifique (Ibrahim et al., 1998). Différentes
OMT ont été clonées et caractérisées chez diverses plantes (Lam et al., 2007 ; Kim et al.,
2008 ; Zhou et al., 2009) notamment chez le soja (Kim et al., 2005a ; Kim et al., 2006a ; Kim
et al., 2009). Les OMT les plus étudiées sont celles qui utilisent les composés phénoliques
comme substrats. Les O-méthylations qui ont lieu dans les voies de biosynthèses des
flavonoïdes et des isoflavonoïdes ont un effet sur la solubilité et donc par conséquent sur
l’activité antimicrobienne de ces composés. Elles engendrent la diminution de la réactivité
59
chimique de leur groupement hydroxyle phénolique et l’augmentation de leur activité
microbienne.
Dans la voie de biosynthèse des isoflavonoïdes, les isoflavanones-O-méthyltransférases
(IOMT) identifiées chez différentes légumineuses sont abondantes. En effet, 17 gènes codant
pour des IOMT ont été identifiés dans le génome de Glycine max et 11 gènes dans celui de
Medicago truncatula
(He et al., 1998 ; Deavours et al., 2006). Ces enzymes sont des
méthyltransférases S-adénosyl-L-méthionine (SAM)-dépendantes. Deux types d’IOMTs sont
à ce jour isolées (Zubieta et al., 2001 ; Liu et al., 2006). La première, isolée chez Medicago
truncatula, est la 4’-hydroxyisoflavanone O-methyltransférase (4’HI-OMT). In vitro, elle est
capable de méthyler en position 4’ ou en position 3, ce qui rappelle sa proximité avec la
3 I-OMT (PsHMM) identifiée chez le pois, responsable de la dernière étape de la biosynthèse
de la pisatine (Deavours et al., 2006). La méthylation du groupement hydroxyle en C4’ de la
naringénine ou de la liquiritigénine donne une 2-hydroxy-4’-méthoxyisoflavanone qui suivie
d’une déshydratation donnera de la formononétine, intermédiaire essentiel à la synthèse de la
médicarpine chez certaines légumineuses (Figure 25) (Akashi et al., 1999 ; Akashi et al.,
2000 ; Akashi et al., 2003 ; Akashi et al., 2005). La co-localisation de cette 4’HI-OMT avec
l’IFS associée au réticulum endoplasmique permet la méthylation très rapide de la 2,4’,7trihydroxyisoflavanone, intermédiaire réactionnel très instable produit par l’IFS. L’autre type
d’IOMT connue est une 7-isoflavone O-methyltransférase (7 IOMT) isolée chez Medicago
truncatula. Celle-ci est responsable de la 7-O-méthylation des isoflavones vers la formation
de l’isoformononétine (7-O-méthyldaidzéine) dans la feuille de soja (Figure 25). Elle a
également été identifiée chez Pisum sativum (pois chiche) où elle méthyle la génistéine en
position 7 pour former de la prunetine (Edwards et Dixon, 1991 ; He et al., 1998). L’induction
des transcrits codants pour la 7 I-OMT et l’activité enzymatique détectée après élicitation ou
infection fongique chez Medicago sativa (luzerne) a permis de mettre en évidence son rôle
dans la biosynthèse des phytoalexines (Edwards et Dixon, 1991 ; Akashi et al., 2000).
60
Figure 25 : Les IOMT intervenant dans la voie de biosynthèse des isoflavonoïdes chez les
légumineuses
Selon le schéma de substitution 6,7,4’- trihydroxylé trouvé dans la molécule de
glycitéine chez le soja (Klus et Barz, 1995 ; Hirota et al., 2004) et dans la molécule
d’afrormosine chez Medicago truncatula (Farag et al., 2008), une isoflavanone 6-Ométhyltransférase (6-IOMT) putative devrait intervenir après l’isoflavone synthase (IFS)
(Figure 25) pour former l’intermédiaire méthylé de la glycitéine, dont la synthèse n’est pas
encore totalement élucidée. Cependant, aucune fonction 6-IOMT n’a été caractérisée à ce jour
chez les légumineuses.
3.3.5.2 Les glucosyltransférases et les malonyltransférases : menant aux formes
conjuguées d’isoflavones
Comme nous l’avons précédemment souligné, la conjugaison (glucosylation,
malonylation) des formes aglycones d’isoflavones, nécessaire pour leur stockage et leur
transport dans les cellules végétales, est réalisée par deux types d’enzymes (GT et MT). La
conjugaison est également très importante pour le contrôle des interactions des légumineuses
61
avec leurs microorganismes symbiotiques et pathogènes, tout comme les effets diététiques des
isoflavones sur la santé humaine.
Les glucosyltransférases (GT)
Les glucosylations sont catalysées par des Uridine diphosphate Glucosyltransférases
(UGT) qui utilisent les sucres uridine diphosphates comme donneurs, catalysant le transfert du
groupement glucosyle à des molécules acceptrices. Les GT jouent un rôle central dans la
détermination de la diversité de structures des isoflavonoïdes et dans la régulation de leurs
fonctions et de leurs activités. Les isoflavones sont toujours glucosylées en position 7, et plus
occasionnellement en position 4’ pour les composés n’ayant pas de groupement 7-hydroxyle
libre (Dixon et Sumner, 2003). Chez les légumineuses cette 7-O-glucosylation est la première
étape de conjugaison des isoflavones qui est spécifiquement catalysée par une isoflavone 7-Oglucosyltransférase.
Par exemple, les isoflavones prédominantes chez le soja sont la génistéine 7-Oglucoside, la daidzéine 7-O-glucoside et des formes malonyles conjuguées (Wang et Murphy,
1994a ; Fiechter et al., 2010). Les activités enzymatiques des isoflavones 7-Oglucosyltransférases (IF7GT) sont identifiées depuis une vingtaine d’années (Köster et Barz,
1981). Chez le soja, le premier ADNc codant pour une IF7GT (GmIF7GT) a été isolé à partir
de racines (Noguchi et al., 2007). Plus récemment, le gène UGT73F2 codant pour une IF7GT
a été isolé à partir de graines de soja par une approche de génomique fonctionnelle basée sur
l’analyse d’ESTs (Expressed Sequence Tag) (Dhaubhadel et al., 2008) (Figure 26).
Figure 26 : Les deux dernières étapes dans la biosynthèse des isoflavones conjuguées chez
le soja d’après Dhaubhadel et al. (2008)
Cette enzyme UGT73F2 est capable de glucosyler les formes aglycones, montrant une
plus grande activité envers la génistéine et la glycitéine. Une analyse de localisation
subcellulaire a également permis de montrer sa présence dans le cytoplasme. Cinq gènes
codant pour des UGTs ont également été isolés chez Medicago truncatula et ont montré leur
62
capacité à convertir les isoflavones en leur forme 7-O-glucoside correspondante (Li et al.,
2007 ; Modolo et al., 2007).
Les malonyltransférases (MT)
Chez les légumineuses, les isoflavones accumulées sont stockées sous forme de
conjugués glucosides, ou malonyles (Kudou et al., 1991 ; Baggett et al., 2002). Faisant suite à
la glucosylation dans la voie de biosynthèse, les isoflavones sont converties en leurs dérivés
malonyles respectifs par des malonyltransférases (MT). La malonylation des isoflavones
prévient la dégradation enzymatique des formes glucoconjuguées et permet leur stockage
vacuolaire (Dixon et Steele, 1999).
L’étape de malonylation des conjugués glucosides nécessite des acyltransférases acylCoA-dépendantes. L’implication des malonyl-CoA isoflavone 7-O-glucosides-6’’-Omalonyltransférases (IF7MaT) dans la voie de biosynthèse des isoflavones a été caractérisée
pour la première fois chez le pois-chiche. La caractérisation moléculaire du gène codant pour
une isoflavone 7-O-malonyltransférase et de l’enzyme correspondante chez le soja a été
réalisée à travers l’isolement du cDNA complet : GmIF7MaT (AB291058) à partir de racines
(Suzuki et al., 2007) et GmMT7 (EU192928) à partir de graines (Dhaubhadel et al., 2008),
(Figure 26). Ce gène montre une grande activité de malonylation envers les isoflavones
glucosides présentes chez le soja. Au total, deux gènes sont présents sur le génome du soja et
sont situés sur les chromosomes 13 et 19. L’accumulation du transcrit GmMT7 est plus
prononcée dans les embryons pendant leur développement que dans les autres tissus
(Dhaubhadel et al., 2008).
Les travaux de Dhaubhadel et al. (2008) réalisés à partir de graines de soja, permettent
ainsi de mettre en évidence l’action combinée de ces deux types d’enzymes :
glucosyltransférase (UGT) et malonyltransférase (MT), permettant la synthèse des formes
conjuguées d’isoflavones à partir des formes aglycones chez le soja (Figure 26). Les deux
transcrits correspondants UGT73F2 et GmMT7 sont très abondants dans les graines en
développement ce qui corrobore parfaitement l’accumulation des isoflavones de soja, qui a été
montrée comme étant la plus élevée dans des embryons matures en comparaison avec d’autres
tissus (Dhaubhadel et al., 2003 ; Dhaubhadel et al., 2007).
63
3.4 Localisation et organisation subcellulaire des enzymes intervenant
dans la voie de biosynthèse des isoflavones
Des travaux de localisation subcellulaire des différentes enzymes clefs de la voie de
biosynthèse des isoflavones ont permis la compréhension de l’organisation spatiale de la voie
de biosynthèse des isoflavones. En effet, les différentes enzymes de la voie des
phénylpropanoïdes (PAL, 4CL) ainsi que celles de la voie des flavonoïdes (CHS, CHR, CHI)
impliquées dans la synthèse des isoflavones chez le soja sont co-localisées avec les
cytochromes P450 : C4H et IFS ancrés dans la membrane du RE, pour former une structure
multienzymatique fonctionnelle (Winkel-Shirley, 1999) (Figure 27).
Les enzymes représentées en rouge et bleu participent à différentes branches métaboliques alors que ceux
représentés en violet sont spécifiques de la voie des isoflavones.
PAL : Phénylalanine Ammonia Lyase – C4H : Cinnamate 4- Hydroxylase – 4CL : 4-Coumarate CoA-Ligase –
CHS : Chalcone Synthase – CHI : Chalcone Isomérase – IFS : Isoflavone Synthase – HID :
Hydroxyisoflavanone Déshydratase – IOMT : Isoflavone-O-Méthyltransférase.
Figure 27 : Complexe multienzymatique et channeling dans la voie de biosynthèse des
isoflavones d’après Winkel-Shirley (1999)
Dans ces complexes, les différents intermédiaires métaboliques sont canalisés de
manière privilégiée d’une enzyme à l’autre. Par conséquent, les sites actifs étant tous à
proximité les uns des autres, une coopération enzymatique s’établit, permettant de réduire le
temps de transport des intermédiaires et d’éviter leur dispersion dans le milieu cellulaire
(Winkel-Shirley, 1999 ; Winkel-Shirley, 2001). On parle ainsi de phénomène de canalisation
métabolique encore appelée : « channeling » permettant de concentrer les substrats sur les
sites actifs. Par exemple chez le soja, la co-localisation de la 4’HI-OMT avec l’isoflavone
synthase, de type CYP450, associée à la membrane du réticulum endoplasmique assure la
méthylation rapide de la 2,4’,7-trihydroxyisoflavanone instable produite par l’IFS à partir de
la liquiritigénine. Dans la voie des flavonoïdes, le « channeling », au point d’entrée dans la
64
voie de biosynthèse des isoflavonoïdes protège les intermédiaires instables d’une conversion
métabolique non productive (Liu et Dixon, 2001).
4 LA REGULATION DE LA SYNTHESE DES ISOFLAVONES
L’accumulation des isoflavones dans les différents tissus de la plante de soja ne
coïncide pas toujours avec les taux de transcrits des gènes codant pour les différentes enzymes
structurales de cette voie de biosynthèse. Ceci reflète donc les différents mécanismes de
régulation probables intervenant dans cette voie. Cette régulation peut avoir lieu à différents
niveaux : soit au niveau de l’expression de ces gènes (transcription), soit au niveau des
différentes enzymes structurales, soit au niveau des interactions entre les protéines via la
formation des complexes enzymatiques, ou encore au niveau de certains rétrocontrôles dus à
un fort taux d’accumulation de métabolites. À ce jour, la régulation de la transcription est la
plus étudiée.
4.1 La régulation de la transcription
Chez les eucaryotes, l’expression d’un gène peut être constitutive ou au contraire
régulée par différents facteurs intrinsèques et environnementaux. Chez les plantes, ces
facteurs peuvent inclure le stade de développement ou un organe en particulier, les stress
abiotiques ou encore les agents infectieux.
Le contrôle transcriptionnel coordonné des gènes de biosynthèse émerge comme un
mécanisme majeur dictant les quantités finales de métabolites secondaires dans les cellules
végétales. En effet, la modification de l’expression d’un gène résulte d’une interaction entre le
complexe de transcription basal comprenant l’ARN polymérase II, et différentes protéines
« trans-régulatrices » appelées facteurs de transcription (FTs) codés par des gènes régulateurs.
Les plantes dévouent environ 7% de la séquence codante de leur génome aux facteurs
de transcription (FTs), ce qui atteste ainsi de l’importance et de la complexité de la régulation
transcriptionnelle de ces organismes (Riechmann et Ratcliffe, 2000). La plante modèle
Arabidopsis thaliana possède environ 1800 gènes codant pour des FTs, (Riechmann et al.,
2000 ; Guo et al., 2005) mais à l’heure actuelle seulement 1/10ème de ceux-ci sont caractérisés
génétiquement (Qu et Zhu, 2006). Le rôle des FTs dans les autres espèces de plantes,
notamment les légumineuses, est moins connu. Le séquençage complet des génomes de
Medicago truncatula ou de Glycine max ont permis une avancée considérable dans
65
l’identification des gènes codant pour ces FTs (environ 2000). Cependant, 1% seulement ont
été caractérisés.
Les familles de FTs sont généralement définies par leur type de domaine de liaison à
l’ADN. Les gènes putatifs codant pour ces FTs ont été identifiés principalement sur la base de
leur séquence d’ADN, contenant les motifs caractéristiques de ces domaines de liaison à
l’ADN (Riechmann et al., 2000 ; Guo et al., 2005).
Tableau 3 : Nombre de gènes codant pour des FTs impliqués dans la régulation de la
synthèse des (iso)flavonoïdes chez Medicago truncatula, Lotus japonicus et Glycine max
d’après Libault et al. (2009)
Famille de FTs
M. truncaluta
L. japonicus
G. max
AP2-EREBP
109
159
381
bHLH
71
84
393
b-ZIP
44
38
176
C2C2(Zn)CO-like
15
21
72
C2H2(Zn)
52
56
395
HD-ZIP
2
1
7
HSF
16
18
11
MYB
171
191
791
NAC
64
101
208
WRKY
59
68
197
ZF-HD
13
18
54
ZIM
11
6
24
Le nombre de gènes codant pour chaque famille de FTs varie au sein d’une même
espèce de légumineuses, mais également d’une espèce de légumineuse à l’autre (Tableau 3).
Selon leur mode de régulation, ces FTs peuvent être classés en activateurs (Hermann et al.,
2001 ; Qian et al., 2007) ou en inhibiteurs (répresseurs) de la transcription (Roberts, 2000 ;
Paolocci et al., 2011).
Les facteurs de transcriptions MYB et bHLH constituent respectivement la première et
la deuxième famille les plus importantes chez les plantes.
La particularité des protéines MYB est la présence d’un domaine « MYB » conservé en
N-terminal qui va permettre la fixation à l’ADN. Celui-ci se caractérise par deux (R2R3),
trois (R1R2R3), ou plus rarement une seule (R1) répétition(s) imparfaite(s) d’environ 50 à 53
66
acides aminés (Du et al., 2009). Selon leurs propriétés de liaison à l’ADN (MBS, MYB
Binding Site), les facteurs de transcription MYB de plantes sont subdivisés en 3 groupes A, B
et C. Le groupe C se lie préférentiellement à la séquence consensus MBSIIG :
T/CACCA/TAC/AC et regroupe la majorité des protéines MYB de plantes. Cette
classification n’est pas absolue, car certaines protéines MYB présentent une grande flexibilité
dans la reconnaissance d’éléments cis-régulateurs cibles (Romero et al., 1998 ; Jin et Martin,
1999). Cependant, les FTs MYB appartenant à différentes espèces et régulant la même voie
comme par exemple celle des flavonoïdes, semblent lier le même motif (Akagi et al., 2009).
Pour leur fixation à l’ADN, les protéines bHLH, encore connues sous le nom de MYC,
contiennent quant à elles le domaine bHLH qui est typiquement formé d’une soixantaine
d’acides aminés. Les bHLH se fixent en majorité sur une séquence consensus
hexanucléotidique de type 5’-CANNTG-3’ appelée E box. La séquence palindromique
dérivée, G box 5’-CACGTG-3’ est l’élément cis- régulateur le plus fréquemment reconnu par
les protéines bHLH (Li et al., 2006 ; Hichri et al., 2011)
Le mécanisme de régulation transcriptionnelle de la voie de biosynthèse des
flavonoïdes, plus particulièrement des anthocyanes, est largement étudié chez Arabidopsis
thaliana (Dubos et al., 2008). Un certain nombre de gènes de régulation de cette voie,
spécialement ceux codant pour des facteurs de transcription de type MYB et bHLH ont ainsi
été mis en évidence chez les légumineuses (Tableau 4). La plupart des facteurs MYB
caractérisés sont des régulateurs positifs de la transcription. Les données de caractérisation
des FTs bHLH restent cependant très minimes chez ces dernières. En revanche, la régulation
transcriptionnelle de la voie de biosynthèse des isoflavonoïdes est encore très peu comprise.
Les FTs endogènes aux légumineuses réalisant spécifiquement le contrôle de la synthèse des
isoflavones dans la graine, ne sont effectivement que très peu connus, un seul : GmMYB176
ayant été identifié à ce jour chez Glycine max (Yi et al., 2010b).
67
Tableau 4: Les facteurs de tanscription MYB et bHLH impliqués dans la régulation des
(iso)flavonoïdes chez les légumineuses
Nom du FT
Famille du FT
Rôle proposé
Espèce
Référence
G.max
Yang et al. (2009)
G.max
Shimizu et al. (2000)
L.japonicus
Miyake et al. (2003)
G.max
Miyake et al. (2003)
ACTIVATEURS TRANSCRIPTIONNELS
GmMYBJ6
R2R3-MYB
GmMYB29A1
R2R3-MYB
LjMYB101
R2R3-MYB
GmMYB101
R2R3-MYB
synthèse phénylpropanoïdes et
flavonoïdes
synthèse flavonoïdes
(induction UV)
synthèse (iso)flavonoïdes en
réponse à un stress abiotique
synthèse (iso)flavonoïdes en
réponse à un stress abiotique
MtMYB634
MtMYB636
R2R3-MYB
synthèse métabolites secondaires
de défense, stress abiotique
M.truncatula
Gruber et al. (2009) ;
Sanchez et al. (2008)
MtLAP1
R2R3-MYB
synthèse anthocyanes,
(iso)flavonoïdes, glycosylation
M.truncatula
Peel et al. (2009)
GmMYB176
R1-MYB
synthèse isoflavones
G.max
Yi et al. (2010)
PsGBF
bHLH
synthèse flavonoïdes, défense
pathogène
P.sativum
Qian et al. (2007)
bHLH
bHLH
stress abiotique
G.soja
Ge et al. (2011)
MtbHLH
bHLH
élicitation
M. truncatula
Naoumkina et al. (2008)
synthèse flavonoïdes
G.max
Du et al. (2009)
MtMYB119
MtMYB1070
REPRESSEURS TRANSCRIPTIONNELS
GmMYBZ2
R2R3-MYB
Cependant, des études moléculaires et transcriptomiques ou encore des expressions
ectopiques de certains gènes régulateurs identifiés intervenant dans des branches parallèles de
cette voie, permettent d’émettre des hypothèses quant aux rôles potentiels de certains facteurs
de transcription sur la synthèse de ces composés.
4.1.1 Régulation de l’expression dans les différents tissus et selon les stades de
développement de la plante
Le gène PAL1 qui ouvre la voie des phénylpropanoïdes s’exprime dans les racines, les
feuilles, les nodules, les germes ainsi que dans les graines en développement (Pregelj et al.,
2011). Le gène CHS1 est fortement exprimé dans les feuilles et les racines. C’est aussi le cas
pour CHS7 et CHS8, en revanche ceux-ci sont également fortement exprimés dans la graine.
L’expression des gènes CHS3 et CHS6 est faible à modérée dans les racines, les feuilles, les
téguments et les cotylédons alors que l’expression de CHS4 est très faible dans tous les tissus
68
(Tuteja et al., 2004 ; Chen et al., 2011). Récemment, l’expression des gènes CHS7 et CHS8 a
été reliée à l’accumulation des isoflavones dans la graine de soja (Gutierrez-Gonzalez et al.,
2010a ; Yi et al., 2010a). La quantité d’isoflavones dans la graine pourrait donc être la
résultante d’une expression différentielle de CHS7 et CHS8 pendant les stades tardifs de
développement de la graine (Dhaubhadel et al., 2007).
Généralement, l’expression relative des six gènes CHI est la plus élevée dans les feuilles
(Dhaubhadel et al., 2003 ; Ralston et al., 2005 ; Chen et al., 2011). Cependant, les résultats
obtenus pour les profils d’expression de ces gènes dans les autres tissus de la plante de soja
sont quelque peu divergents. En effet, les deux gènes CHI1A et CHI1B2 sont plus fortement
exprimés dans les racines et les graines que dans les tissus floraux. Les profils d’expression de
ces deux gènes codant pour des CHI de classe II permettent de mettre en évidence que leur
expression est en adéquation avec l’accumulation des isoflavones dans la graine (Ralston et
al., 2005). Chen et al. (2011) soulignent également que le gène CHI3 présente la plus forte
expression relative dans la graine au stade de développement R5 en comparaison avec les
autres tissus de la plante, son expression étant cependant la plus faible de tous les gènes CHI
étudiés (vs CHI1A, CHI1B1/B2, CHI2, et CHI4). Les gènes CHI1B1/B2 sont quant à eux
fortement exprimés dans les racines alors que leur expression n’est qu’à peine au-dessus de la
limite de détection dans la graine (Chen et al., 2011).
Les gènes IFS1 et IFS2 sont faiblement exprimés dans les fleurs et les feuilles, alors
qu’ils le sont fortement dans les racines et les graines (Gutierrez-Gonzalez et al., 2010a ;
Pregelj et al., 2011). Néanmoins, leur expression dans les graines est dix fois moindre que
celle détectée dans les racines (Subramanian et al., 2004). On note un maximum d’expression
pour IFS1 dans les racines, alors qu’IFS2 est plus exprimé dans la graine (Dhaubhadel et al.,
2003).
L’expression de ces différents gènes se montre également très contrastée en fonction du
stade de développement de la graine. Le stade ayant le maximum d’expression observée
dépend du gène étudié (Gutierrez-Gonzalez et al., 2010a). C’est notamment le cas des deux
gènes IFS1 et IFS2 qui sont tous deux plus exprimés dans les stades tardifs (R7-R8), excepté
les stades très tardifs (R8) où la graine est dure et où leur taux diminue (Gutierrez-Gonzalez et
al., 2010a). Une étude souligne aussi que l’expression de ces différents gènes varie entre les
différents tissus de la plante pour un même stade de développement R5. En effet, les taux
relatifs de transcrits sont en moyenne 8,6 fois plus élevés dans feuilles que dans les graines au
stade de remplissage R5 (Chen et al., 2011).
69
Quelques facteurs de transcription MYB régulant spatio-temporellement certains gènes
codant pour les enzymes structurales de la voie de biosynthèse des (iso)flavonoïdes chez les
légumineuses ont été mis en évidence. La plupart d’entre eux sont des régulateurs positifs de
ces différents gènes. Chez le soja, le FT GmMYBJ6, contrôle la voie de biosynthèse des
phénylpropanoïdes et des flavonoïdes, en activant positivement l’expression des gènes PAL,
C4H, 4CL, CHS et CHI. La surexpression de GmMYBJ6 (DQ902863) chez le tabac, résulte en
effet en une augmentation des quantités totales de flavonoïdes (Yang et al., 2009). Chez
Medicago truncatula, l’expression du gène MtLAP1 (FJ199998), codant pour un FT R2R3
MYB, nommé LAP1, induit la production constitutive de certains flavonoïdes tels que les
anthocyanes. C’est également le cas lorsque celui-ci est exprimé chez Medicago sativa ou
Trifolium repens (Peel et al., 2009). Sous l’effet de LAP1 de nombreux gènes codant
notamment pour les enzymes PAL, C4H, 4CL, CHS, CHI et UGT, sont induits. L’expression
du gène UGT78G1 (TC105632) codant pour une UGT chez M. truncatula est augmentée
quant à elle d’environ 140 fois. Ceci laisse donc à penser que LAP1 pourrait être un activateur
potentiel de l’UGT intervenant dans la biosynthèse des isoflavones chez le soja.
Une étude, réalisée chez le soja permet de mettre en évidence le premier FT de type
R1MYB : GmMYB176, directement impliqué dans la régulation positive de la voie de
biosynthèse des isoflavones (Yi et al., 2010b). En effet, le domaine R1 présent sur
GmMYB176 montre une forte homologie avec les domaines R1 de FTs MYB de plusieurs
espèces de plantes et inclue un motif SHAQKYF dans la troisième hélice α. Dans cette étude,
la présence de 12 motifs avec la séquence cœur TAGT (T/A) (A/T), parmi les 1662 pb du
promoteur CHS8, est soulignée. Des analyses de délétions du promoteur et de co-transfection,
démontrent cependant la nécessité d’un seul motif (23pb), localisé entre les bases -795 et 818, pour l’activité du gène CHS8, les délétions des autres motifs présents n’ayant pas d’effet
sur l’activité de ce dernier. Cette interaction de R1MYB avec l’élément cis spécifique présent
dans le promoteur de CHS8, permet en effet d’établir la base fonctionnelle dans l’activation
transcriptionnelle de CHS8.
L’analyse quantitative de GmMYB176 dans les différents tissus indique qu’il est
ubiquitairement exprimé dans tous les tissus accumulant des isoflavones mais que les niveaux
et les temps d’expression varient pendant le développement. Tenant compte de l’hypothèse
que l’expression d’un régulateur précède l’expression de son gène cible, le profil d’expression
de GmMYB176 corrobore bien l’accumulation des transcrits CHS8 dans la graine de soja.
70
Ainsi, comme l’accumulation des isoflavones dans la graine de soja résulte de la
synthèse, ceci permet d’émettre l’hypothèse que le taux de transcrits des gènes de biosynthèse
des isoflavones et de leurs régulateurs pourrait refléter la capacité de synthèse des métabolites
plutôt que les quantités de leur accumulation dans les différents tissus (Yi et al., 2010b).
Même si la plupart des MYB identifiés sont des activateurs de la transcription des gènes
cibles, tous ne fonctionnent pas ainsi, puisque certains répresseurs de la transcription ont été
caractérisés. Chez le soja, un seul a été isolé et identifié (Du et al., 2009). Il s’agit du gène
GmMYBZ2 (DQ902861). Des mutants KO pour ce gène ont permis de mettre en évidence son
rôle dans la régulation. Celui-ci réprime en effet l’expression de certains gènes de la voie des
flavonoïdes.
4.1.2 Effet des facteurs abiotiques et biotiques
L’expression des gènes codant pour les enzymes centrales de cette voie de biosynthèse
des isoflavones peut se trouver considérablement affectée par les facteurs environnementaux
(Gutierrez-Gonzalez et al., 2010a), par le statut azoté et/ou le statut de nodulation de la plante
(Ralston et al., 2005) mais aussi par des stress biotiques.
4.1.2.1 La lumière et la température
Le métabolisme des isoflavonoïdes est particulièrement sensible à l’action des facteurs
externes comme la lumière et la température. Concernant le facteur lumière, deux paramètres
interviennent : d’une part l’intensité du flux lumineux et d’autre part la nature des radiations
constitutives. La lumière agit directement par l’intermédiaire des radiations rouges, bleues et
UV qui sont perçues par différents photorécepteurs dont le phytochrome et différents
récepteurs aux UVA et aux UVB (Schäfer et al., 1997).
L’action de la lumière porte sur l’induction de la synthèse de plusieurs enzymes du
métabolisme des isoflavonoïdes et tout particulièrement de la PAL et de la C4H, qui ont été
très étudiées à ce point de vue (Dixon et Paiva, 1995). Dans ce cas, l’effet de la lumière est
d’activer par exemple les gènes PAL, ce qui conduit à la transcription des ARNm puis à la
formation de la protéine enzymatique (Figure 28) (Hahlbrock, 1981). Un effet similaire mais
légèrement décalé dans le temps est obtenu avec la CHS et les autres enzymes du
métabolisme des flavonoïdes, conduisant alors à l’accumulation de ces composés. L’état
d’oxydoréduction de la cellule et en particulier sa teneur en glutathion joue un rôle important
dans la mise en place de la voie de transduction intracellulaire depuis la perception du signal
lumineux jusqu’à l’expression du gène CHS (Loyall et al., 2000).
71
Un
FT
GmMYB29A1
régulant
positivement
la
synthèse
des
flavonoïdes,
principalement en contrôlant l’expression des gènes codant pour les CHS a été mis en
évidence en réponse à une exposition UV chez le soja (Shimizu et al., 2000).
Figure 28 : Influence de la lumière sur les ARNm de la PAL (mPAL), sur les activités
des enzymes PAL et CHS et sur la teneur en flavonoïdes de suspensions cellulaires de persil
d’après Hahlbrock (1981)
Le GMP cyclique (GMPc : guanosine monophosphate cyclique intracellulaire) est une
importante molécule de signalisation agissant comme un second messager chez tous les
eucaryotes (Newton et Smith, 2004). Son implication fonctionnelle dans de nombreux
processus physiologiques chez les végétaux supérieurs comme par exemple la transduction du
signal lumineux a été étudiée (Neuhaus et al., 1997). Une récente étude permet de mettre en
évidence l’implication de ce dernier dans le contrôle du métabolisme des isoflavonoïdes à
travers la régulation des différentes enzymes centrales constituant cette voie de biosynthèse
(PAL, C4H, 4CL, CHS, CHR, CHI, IFS,GT) chez le soja (Suita et al., 2009). L’expression de
tous les gènes étudiés est en effet fortement stimulée dans les cellules de soja traitées avec le
GMPc.
La température est également un facteur de régulation du métabolisme des
isoflavonoïdes. La régulation intervient au niveau de la PAL et de la CHS. Les activités
enzymatiques de ces deux enzymes augmentent quand la température diminue, et inversement
(Campos-Vargas et al., 2005 ; Posmyk et al., 2005).
72
4.1.2.2 Disponibilité en eau – stress hydrique
L’effet d’un déficit hydrique sur la régulation transcriptionnelle du métabolisme des
isoflavonoïdes vient d’être étudié à partir de graines de soja à différents stades de
développement (Gutierrez-Gonzalez et al., 2010a). Ce stress hydrique imposé tend en effet à
sous-réguler l’expression des gènes impliqués dans la biosynthèse des isoflavones.
Parmi les transcrits suivis codant pour les enzymes centrales de cette voie (PAL, CHS,
CHR, CHI, IFS), seule l’accumulation des transcrits codant pour la première enzyme PAL de
cette voie augmente immédiatement après un stress hydrique sévère, supportant ainsi
l’hypothèse que les graines nécessitent une plus longue période pour ajuster leur contenu en
isoflavones en cas de stress. En revanche, l’accumulation des autres transcrits diminue lors de
ce stress hydrique. L’accumulation des transcrits CHR est diminuée par trois en comparaison
avec celle obtenue en cas de bonne condition d’irrigation, ceci suggérant aussi qu’en
condition de stress le flux est dirigé du côté de la naringénine. L’expression du gène IFS2
dans les graines est fortement diminuée en condition de stress hydrique alors qu’au contraire
l’expression d’IFS1 reste constante. Cependant, l’expression de ce gène IFS2 se montre
parfaitement corrélée à la teneur en isoflavones dans les graines au cours de leur
développement et ce, quelles que soient les conditions d’irrigation. Ceci suggère ainsi
qu’IFS2 serait l’un des principaux gènes responsables de la différence d’accumulation des
quantités d’isoflavones dans la graine quelles que soient les conditions d’irrigation (GutierrezGonzalez et al., 2010a).
4.1.2.3 Les interactions plantes-microorganismes
L’expression des gènes codant pour les enzymes centrales de cette voie de biosynthèse
des isoflavones peut se trouver considérablement affectée par le statut azoté et/ou le statut de
nodulation de la plante (Ralston et al., 2005), mais également lors d’une infection par un
pathogène.
La plante sécrète via ses racines des composés qui vont lui permettre d’interagir avec la
microflore du sol. Parmi ces composés il y a les flavonoïdes qui sont les plus grands
inducteurs de l’expression des gènes bactériens nécessaires pour la nodulation (Broughton et
al., 2000 ; Zhang et al., 2009). Les isoflavones jouent aussi un rôle dans les défenses de la
plante en condition de stress biotique (Bednarek et Osbourn, 2009 ; Feng et al., 2010). Les
isoflavones, sont en effet des phytoalexines qui sont rapidement synthétisées lors d’un
envahissement par des pathogènes viraux, bactériens et fongiques ou par des ravageurs
73
(Dixon et al., 1995 ; Naoumkina et al., 2007) et qui contribuent à limiter l’extension des
infections causées dans les plantes (Bent, 2011).
L’apport d’un microorganisme pathogène ou de l’éliciteur qu’il produit peut être utilisé
pour stimuler la production d’isoflavonoïdes par la plante. D’une manière générale, l’infection
par un microorganisme ou l’apport d’un éliciteur d’origine biologique dans des suspensions
cellulaires végétales est très efficace pour déclencher la synthèse des enzymes du
métabolisme des flavonoïdes, comme par exemple la PAL, la C4H, la CHS (Ryder et al.,
1987 ; Liang et al., 1989 ; Dalkin et al., 1990 ; Ni et al., 1996). L’accumulation des ARNms
C4H dans des cellules soumises à un stress biotique (Mizutani et al., 1997) montre que la
régulation de cette activité est essentiellement de nature transcriptionnelle (Weisshaar et
Jenkins, 1998). L’expression du gène PAL1 augmente significativement après inoculation
avec B. japonicum. Elle est, en effet, significativement 8 fois plus importante dans les racines
de plantes inoculées que dans celles de plantes non-inoculées. En revanche aucune différence
significative n’est constatée dans les germes (Pregelj et al., 2011). Les gènes codant pour les
CHI sont différemment régulés après un traitement éliciteur (Shimada et al., 2003). Les CHI
de classe I sont régulées de façon coordonnée avec les autres enzymes de la voie de
biosynthèse des flavonoïdes, comme par exemple F3H, et sont surtout exprimées dans les
tissus floraux qui ne répondent pas à l’inoculation par Bradyrhizobium. Au contraire, les CHI
de classe II sont régulées de façon coordonnée avec les autres enzymes de la voie de
biosynthèse des isoflavonoïdes chez le soja, comme par exemple les IFS, pendant le
développement de la plante et les interactions plantes-microorganismes (Ralston et al., 2005 ;
Chen et al., 2009a). L’expression des deux gènes CHI1A et CHI1B2 est fortement induite par
les signaux de la nodulation dans les racines (Ralston et al., 2005).
Chez Lotus japonicus, trois gènes codant pour des FTs R2R3 MYB: LjMYB101,
LjMYB102, LjMYB103 ainsi que le candidat orthologue à LjMYB101 chez le soja, nommé
GmMYB101, ont été isolés en réponse à une carence en nutriments azotés. Lors d’une telle
carence, les profils d’expressions des deux gènes LjMYB101 et GmMYB101 sont similaires à
celui de CHS au niveau des racines. Ils sont en effet, tous régulés à la hausse et ce, de manière
dose-dépendante. Ceci suggère donc le rôle potentiel des FTs MYB101 dans la régulation de
la synthèse des isoflavonoïdes en réponse à un stress abiotique (Miyake et al., 2003).
Une étude réalisée chez le pois en condition d’élicitation a permis d’élucider le
mécanisme de régulation de la box G au niveau du promoteur du gène PsCHS1 et de
caractériser son facteur de transcription (Qian et al., 2007). Cette box G est également
74
retrouvée dans les promoteurs de la PAL et d’autres gènes induits de défense (Arias et al.,
1993 ; Hatton et al., 1995). L’ADNc complet PsGBF (Pisum sativum G-box Binding Factor)
obtenu présente une forte homologie de séquence avec la protéine de liaison à la box G (PG1)
de la phaséoline. Il appartient ainsi à la famille des FTs bHLH. Des essais d’expression
transitoire dans des feuilles de tabac indiquent que l’activation du gène PsCHS1 se fait via la
liaison avec l’élément cis régulatoire de la box G. La combinaison des éléments cis de la box I
(TCTACCTACCC) et de la box G (CACGTG) pour l’interaction avec PsGBF et la
stimulation du promoteur PsCHS1 est également mise en évidence. Cependant seule
l’interaction directe entre PsGBF et la box G a lieu. On parle ainsi de coordination box
spécifique (Qian et al., 2007). L’accumulation des transcrits PsGBF précède dans le temps
celle de PsCHS1, ce qui souligne ainsi le mécanisme de régulation transcriptionnelle du gène
CHS1 chez le pois: PsGBF interagit d’abord avec le promoteur PsCHS1 et active en suivant
l’expression du gène PsCHS1 en condition d’élicitation.
Le facteur de transcription PsGBF participe donc à la régulation des flavonoïdes chez
les légumineuses et joue un rôle important dans les interactions plantes-pathogènes (Qian et
al., 2007).
4.2 La régulation post-transcriptionnelle
Certains gènes codant pour des enzymes structurales de cette voie de biosynthèse sont
sujets à des contrôles post-transcriptionnels, mais cela n’a été étudié que pour très peu de
gènes.
L’expression spatiale des gènes UGT73F2 et GmMT7, codant respectivement pour deux
transférases impliquées dans la glucosylation et malonylation des isoflavones de soja et des
protéines correspondantes a été étudiée (Dhaubhadel et al., 2008). L’expression des transcrits
ne corrèle pas toujours avec l’accumulation des protéines. En effet, les transcrits UGT73F2
sont exprimés dans les gousses, l’embryon en développement et les fleurs. Cependant, la
protéine correspondante qui s’accumule également dans les gousses et l’embryon ne
s’accumule pas dans les fleurs. Les transcrits GmMT7, quant à eux, sont exprimés dans la
plupart des tissus mais leur expression est plus forte dans les embryons en développement et
les fleurs. En revanche, la protéine correspondante GmMT7 ne s’accumule pas dans les fleurs
(Dhaubhadel et al., 2008). Ces résultats suggèrent donc l’intervention d’une régulation posttranscriptionnelle tissu-spécifique de ces deux enzymes.
75
La régulation post-traductionnelle implique l’activation et l’inactivation des enzymes
(en général par phosphorylation) et semble être présente dans cette voie de biosynthèse, bien
que son importance générale ne soit pas encore bien comprise. Un tel mécanisme a été montré
pour la PAL qui peut être régulée à travers une phosphorylation par une protéine kinase
calcium dépendante (CDKP). Sur culture de cellules de Phaseolus vulgaris (haricot) élicitées,
la stimulation des protéines kinases peut mener à une phosphorylation accrue et à un turnover
de la PAL (Allwood et al., 1999). Très peu de données sur la régulation traductionnelle des
différentes enzymes structurales de la voie de biosynthèse des isoflavones sont ainsi
disponibles.
Un point ultime de la régulation de la synthèse des isoflavones pourrait avoir lieu au
niveau du contrôle et de la formation des complexes multienzymatiques (métabolon). Ces
complexes sont encore peu connus et d’autant plus difficiles à étudier qu’ils sont instables,
voire transitoires. Leur étude implique une méthodologie assez lourde. L’existence d’un
complexe spécifique de la synthèse de flavonoïdes a ainsi récemment été démontrée in vivo
chez Arabidopsis (Crosby et al., 2011) grâce à la microscopie FRET (Fluorescence
Resonance Energy Transfert) qui permet de détecter les variations de fluorescence induites
par des interactions entre protéines.
L’organisation en « métabolons » permettrait d’optimiser et de contrôler les
concentrations des enzymes et de leurs substrats dans des voies de biosynthèse où on trouve
de nombreux points de compétition pour des métabolites clefs (par exemple pour la
naringénine). Le positionnement des enzymes dans les complexes contrôlerait l’orientation
préférentielle des flux (Winkel, 2004). La plupart de ces enzymes peuvent accepter une
gamme assez large de substrats. Ainsi, une simple modification de positionnement de
l’enzyme dans le complexe peut avoir de grandes conséquences dans la voie (Jorgensen et al.,
2005). Il a ainsi été montré chez Nicotiana tabacum (tabac) que deux isoformes de la PAL
(PAL1 et PAL2) pouvaient interagir différemment avec la C4H, ce qui impliquerait un rôle
spécifique des isoformes dans la construction du complexe, et donc dans son efficience ou
dans les produits formés (Winkel, 2004). De même, la réduction de la naringénine chalcone
en isoliquiritigénine par la CHR nécessite une association intime entre les deux enzymes car
elle a probablement lieu avant la fermeture du cycle A. Le site actif de la CHS étant caché, les
intermédiaires CoA doivent diffuser entre les deux enzymes et selon leur positionnement, la
proportion de composés réduits ou non pourrait varier (Austin et Noël, 2003). La fonction
76
CHR est en fait à rapprocher de la fonction kétoacyl réductase trouvée lors de la synthèse des
acides gras. Les complexes FAS (Fatty Acid Synthase) de type I, réunissant de façon très
structurée un ensemble d’enzymes complémentaires peuvent être considérés comme une
forme particulièrement aboutie des complexes multienzymatiques (Winkel, 2004). Les FAS
sont d’ailleurs probablement les ancêtres des CHS.
De même, la polyvalence de certaines enzymes observées in vitro ne reflète pas toujours
leur rôle plus spécifique in vivo. Ainsi, la 4’IOMT, responsable de la méthylation des
isoflavanones en 4’ peut aussi méthyler efficacement les isoflavones en position 7. La
spécificité de la 4’IOMT n’est donc assurée que grâce à son intégration dans un complexe
enzymatique (Liu et al, 2006).
a
b
c
Figure 29 : Modèles d’organisation de différentes voies de biosynthèse de métabolites
secondaires utilisant les phénylpropanoïdes (les enzymes communes sont en gris foncé pour
les phénylpropanoïdes et en gris clair pour les flavonoïdes). Les cytochromes P450
permettent l’ancrage membranaire. a) synthèse de la lignine b) synthèse des flavonols c)
synthèse des anthocyanes (Winkel, 2004)
Les premières étapes de la biosynthèse des isoflavones sont communes à d’autres voies
qui s’expriment plus ou moins selon les tissus (Figure 29), mais qui peuvent aussi coexister.
Dans ces complexes, les P450 jouent un rôle peut être plus important qu’on ne le pensait
initialement, en structurant et fixant les ensembles sur la membrane du réticulum
endoplasmique.
77
Les différents exemples de régulations de cette voie de biosynthèses des isoflavonoïdes
présentés ici, laissent donc entrevoir la complexité de sa régulation, suggérant la mise en
place de rétrocontrôles positifs et négatifs soit au niveau transcriptionnel, soit au niveau posttranscriptionnel et traductionnel.
5 OBJECTIFS DE LA THESE
Les isoflavones sont fortement concentrées dans la graine de soja, plus particulièrement
dans le germe qui contient 4 à 10 fois plus d’isoflavones que les cotylédons devenant ainsi un
sous-produit hautement valorisable pour le marché des suppléments santé. De plus, la
composition en isoflavones est caractéristique du compartiment de la graine : la glycitéine et
la daidzéine sont les deux isoflavones les plus importantes du germe alors que dans les
cotylédons la génistéine et la daidzéine sont prédominantes. La glycitéine est exclusivement
présente en grande quantité dans les germes. Ces composés jouent un rôle majeur dans la
physiologie de la plante, notamment lors de la mise en place de la symbiose, mais également
dans le secteur de l’alimentaire-santé, du fait de leurs propriétés œstrogéniques et
antioxydantes. Cependant, les trois isoflavones (génistéine, daidzéine et glycitéine) peuvent
avoir des effets différents sur la santé. Elles peuvent également devenir indésirables dans
certains produits à base de soja qui sont couramment utilisés dans les préparations infantiles
de substitution en cas d’intolérance au lactose. Dans un tel contexte de controverse sur les
effets potentiellement délétères des phytoestrogènes, notamment chez l’enfant (AFSSA), on
assiste à deux types de demandes industrielles pour la matière première en fonction des types
de consommateurs auxquels les produits dérivés de la graine sont destinés: une demande de
variétés riches en isoflavones, donc de germes à forte concentration en isoflavones pour le
marché des nutraceutiques, et au contraire une demande de variétés appauvries, donc de
cotylédons à faible concentration pour le marché des « soyfoods ». Ceci ayant conduit à
considérer de manière distincte les deux compartiments (germes et cotylédons) de la graine
afin de permettre in fine une meilleure maîtrise des teneurs et des compositions de cette
famille de molécules dans les deux compartiments de la graine.
Ce travail de thèse s’inscrit dans la continuité d’une précédente approche physiologique
menée au laboratoire, visant à préciser les voies de synthèse des isoflavones dans les
78
cotylédons et le germe, en considérant les facteurs de variations génotypiques et
environnementaux potentiellement impliqués mais également l’accumulation des isoflavones
dans les graines depuis le début de leur formation jusqu’à leur maturation. Cette approche a
en effet tout d’abord permis de mettre en évidence l’influence de l’environnement et du
génotype sur le contenu en isoflavones de la graine de soja. Cependant, les différences entre
variétés sont généralement conservées, et la composition en isoflavones est caractéristique de
la fraction de la graine considérée. Un net décalage de l’accumulation des isoflavones entre
les germes et les cotylédons a également été souligné. L’accumulation dans les cotylédons ne
commence que quand celle-ci a déjà atteint un plateau dans les germes, soulignant ainsi les
deux voies distinctes de régulation de la teneur en isoflavones et de leur composition dans les
cotylédons et les germes.
La variabilité génotypique rencontrée pour le contenu en isoflavones chez le soja,
combinée à une bonne stabilité des variétés se traduit par des estimations élevées de
l’héritabilité pour le contenu en isoflavones totales ou individuelles. Plusieurs QTLs
démontrant un réseau très complexe pour le contrôle des quantités d’isoflavones totales ou
individuelles dans les graines ont été identifiés et une étude de polymorphisme des gènes IFS1
et IFS2 à partir de différentes variétés chinoises a permis l’identification de SNPs associés
avec les quantités d’isoflavones dans les graines. De par le rôle majeur de ces composés dans
la physiologie de la plante et la santé humaine, la voie de biosynthèse des isoflavones a été
largement étudiée et la quasi-totalité des enzymes a été isolée et fonctionnellement
caractérisée, à l’exception de quelques unes intervenant dans la voie de biosynthèse de la
glycitéine.
La démarche entreprise vise donc à faire se rencontrer, d’une part les résultats de la
précédente approche physiologique réalisée au laboratoire et, d’autre part le déterminisme
génétique pouvant être à l’origine de ces différences de teneurs et de compositions en
isoflavones observées dans les deux compartiments distincts de la graine (germes et
cotylédons) mais aussi du net décalage de leur accumulation observé au cours du temps entre
ces deux compartiments. Le déterminisme génétique constitue l’objectif du présent travail de
thèse qui inclut deux parties. Tout d’abord, une recherche sur le polymorphisme de séquence
de certains gènes codant pour des enzymes structurales de la voie de biosynthèse des
isoflavones, notamment la potentielle variabilité de séquences des isoflavones synthases (IFS)
79
mais également sur l’étude des cinétiques d’expression de certains gènes cibles de cette voie,
plus particulièrement l’éventuelle expression différentielle de ces gènes selon les différents
tissus de la graine (germes /cotylédons), le stade de développement et la variété étudiée.
Enfin, la deuxième partie de cette thèse s’intéresse à la compréhension du processus menant à
la synthèse de la glycitéine qui n’est pas complètement établi à ce jour, grâce à la mise en
œuvre de l’isolement d’un gène candidat potentiel codant pour une flavonoïde 6-hydroxylase
(F6H) qui participerait à sa synthèse dans la graine.
80
CHAPITRE II :
MATERIEL ET METHODES
81
1 MATERIEL VEGETAL UTILISE
1.1 Choix des variétés
Les variétés de soja (Glycine max) utilisées ont été choisies en raison de leurs teneurs ou
profils particuliers en isoflavones.
Imari et Queen, ont déjà fait l’objet de nombreuses études au laboratoire (Berger et al.,
2002 ; Daydé et al., 2002 ; Berger et al., 2008 ; Rasolohery et al., 2008). Elles présentent des
teneurs et des profils d’isoflavones extrêmement contrastés quelles que soient les conditions
environnementales (Figure 30).
Figure 30 : Concentrations en isoflavones totales (µmol.g-1 MS) dans des graines de soja à
différents stades de développements (JAF : Jours Après floraison) en serre et en champ
d’après Rasolohery et al. (2008)
Ces variétés sont bien adaptées aux conditions pédo-climatiques du Sud-Ouest de la
France. Elles ont d’ailleurs été parmi les plus cultivées dans cette région durant la seconde
moitié des années 1990 et longtemps été les témoins de référence de leur catégorie.
82
Imari (obtention Asgrow distribuée par Monsanto, inscrite en 1992), est une
variété à croissance semi-déterminée, à fleurs violettes, pilosité grise et gros
grains beiges à hile brun clair, riche en protéines.
Queen (obtention Dekalb distribuée par la RAGT inscrite en 1992), est à
croissance indéterminée, fleurs violettes, pilosité fauve, à petits grains parfois
tachetés de noir, au hile noir, de bonne teneur en protéines, cependant inférieure
à Imari.
Les teneurs en isoflavones de ces deux variétés représentent grosso modo les extrêmes
de ce que l’on peut trouver dans des comparaisons variétales : Queen présente
systématiquement environ le double de la teneur d’Imari. Ces phénotypes sont en réalité dus
aux teneurs dans les cotylédons. Dans les germes, ces variétés ont des teneurs moyennes,
Imari étant légèrement inférieure à Queen.
Ces variétés sont aussi remarquables pour leur composition en isoflavones : au niveau
des cotylédons, Imari est une des plus riches en génistéine (dépassant régulièrement les 60%)
tandis que Queen est une des plus riches en daidzéine (environ 50% en moyenne). Au niveau
des germes, Imari contient majoritairement de la daidzéine (55% daidzéine et 35% glycitéine)
tandis que Queen a le profil inverse (35% daidzéine et 55% glycitéine) ; les deux variétés ont
environ 10% de génistéine. Ces profils correspondent en fait à deux types (Gly+ et Gly –) entre
lesquels ségrégent la majorité des variétés de soja, les phénotypes intermédiaires étant des
hétérozygotes (Daydé et al., 2004).
D’autres variétés aux teneurs et aux compositions en isoflavones très caractéristiques,
notamment dans les germes, ont été utilisées :
NS Kasha « NSK », de type déterminé, à petits grains, est un extrême du type Gly+
(plus de 70% de glycitéine dans les germes), tout en ayant une teneur comparable à
Imari et Queen.
Noir de Toulouse « NT », semi-déterminée, à gros grains noirs, un peu plus précoce
qu’Imari et Queen (groupe I), présente une très forte teneur en isoflavone dans les
germes.
Dwight, variété américaine, a montré une ségrégation pour les types Gly+ et Gly –.
Les deux isolats ont été alors nommés Dwight+ et Dwight –
Les lignées mutantes, accessions PI567580A ou « PIA » et PI567417C ou « PIC »,
d’origine chinoise (Qi si mi pour « PIA » et Bai gun dou pour « PIC ») proviennent
83
de la collection de l’USDA (Urbana, Illinois). Le mutant PI567417C présente une
très faible teneur en isoflavones dans les graines comme dans les germes et
PI567580A est un mutant qui ne présente pas de glycitéine dans le germe (mutant
Gly0).
1.2 Les conditions de culture
1.2.1 Culture en serre
Pour les analyses de séquences des isoflavones synthases, les dosages des isoflavones et
le suivi de l’expression des différents gènes cibles de leur voie de biosynthèse, six variétés :
Imari, Queen, Noir de Toulouse, NS Kasha, PI567580A et PI567417C, ont été cultivées en
serre. Les graines ont été inoculées par Bradyrhizobium japonicum (souche G49, 109
bactéries.g-1) et semées dans des pots de 30 cm de diamètre (5L) dans un mélange à part
égales de terre, sable et tourbe. Après germination, seulement deux plantes par pot ont été
conservées. Au final, 12 plantes de chaque variété (6 pots par lignées) ont été utilisées. Les
conditions d’irrigation ont été bien contrôlées, et deux fois par semaine les plantes ont été
fertilisées avec 200 ml d’une solution de Hoagland modifiée à faible teneur en azote et d’oligo
éléments (Burias, 1991).
1.2.2 Culture en phytotron
Pour les tests d’expression des F6Hs, six variétés de soja : Imari, Queen, NS Kasha,
Dwight+, Dwight– et PI567580A ont été cultivées en phytotron. Deux séries de cultures
conduites à l’identique ont été réalisées : la série (1) en novembre 2010 et la série (2) en juillet
2011. Pour chaque série, 4 plantes de chaque variété ont été cultivées. Des graines de chaque
variété ont été inoculées par Bradyrhizobium japonicum et semées dans des pots de 20 cm de
diamètre (3L) dans du terreau universel. Après germination, seulement une plante par pot a
été conservée. Les plantes ont été cultivées en jours longs (16/8 h J/N), à température
optimale (23/18 °C J/N) sous un éclairement de 700 µmol.m–2.s–1 (PAR) à 50 cm des lampes
(HMI OSRAM), avec une hygrométrie élevée (65/85% J/N), irriguées de manière non
limitante, et fertilisées deux fois par semaine avec 200 ml de solution de Hoagland modifiée à
faible teneur en azote et d’oligo éléments.
84
2 METHODES GENERIQUES
2.1 Les techniques de biologie moléculaire
2.1.1 Extraction des ADN génomiques
Les ADN génomiques ont été extraits à partir de jeunes feuilles prélevées le jour même
sur les plants de soja et stockées à -80°C. Environ 100 mg de matériel végétal ont été broyés à
l’azote liquide dans un mortier à l’aide d’un pilon. L’extraction d’ADN a ensuite été réalisée
sur ce broyat (poudre très fine) en utilisant le Kit « DNeasy Plant Mini Kit » (Qiagen,
Courtaboeuf, France) et en suivant le protocole recommandé par le fournisseur. La
concentration finale des échantillons a été déterminée à 260nm à l’aide d’un
spectrophotomètre Nanodrop™ ND-1000 (Thermo Fisher Scientific, Wilmington, USA).
2.1.2 Extraction des ARNs totaux
Différents protocoles d’extraction des ARNs (acides ribonucléiques) ont été utilisés en
fonction des différents tissus étudiés.
Les ARNs totaux de cotylédons et de germes de différents stades de développement ont
été extraits à partir de 50 mg de matériel végétal (regroupement de plusieurs graines de même
stade). Ce matériel végétal a été broyé dans des matrices de lyse contenant des billes de
céramique de 1,4 mm de diamètre « Lysing matrix D » (MP Biomedicals, France) avec 1 mL
de réactif Qiazol® (Qiagen, Courtaboeuf, France) à l’aide d’un broyeur-homogénéisateur
« FastPrep®-24 » (MP Biomedicals, France) sur 2 cycles de 20 s à 6 m.s-1. Le Qiazol® est un
mélange de phénol et d’isothiocyanate de guanidine exploitant la méthode de Chomczynski et
Sacchi qui permet de solubiliser les composants cellulaires tout en préservant l’intégrité des
ARNs (Chomczynski et Sacchi, 1987). Les ARNs ont ensuite été séparés de l’ADN et des
protéines par l’addition de 200 µL de chloroforme. La solution a été alors homogénéisée 15 s
par inversion manuelle puis décantée 10 min à température ambiante. Après centrifugation à
4°C pendant 15 min à 14000 rpm, la phase aqueuse (surnageant) a été récupérée et complétée
par 500 µL d’isopropanol de façon à précipiter les ARNs durant 5 min à température
ambiante. Après une nouvelle centrifugation à 4°C pendant 5 min, le culot d’ARNs est rincé
dans 1mL d’éthanol 70%. Après une dernière centrifugation plus lente à 7000 rpm pendant
5 min à 4°C, les ARNs sont resuspendus dans 200 µL d’eau RNase-free.
85
Les ARNs totaux de feuilles élicitées et de cotylédons (issus d’une seule graine) ont été
extraits à l’aide du kit « RNeasy Plant Mini Kit » (Qiagen, Courtaboeuf, France). Après lyse
des cellules, les ARNs purifiés sur une membrane de silice grâce à une série de lavages, sont
élués dans de l’eau RNase free. Les rendements d’ARNs extraits sont maxima pour des
échantillons d’environ 50 mg.
L’extraction d’ARN sur germe isolé a été faite à l’aide du kit « NucleoSpin®RNA XS »
(Macherey-Nagel, Düren, Allemagne) en suivant les instructions du fournisseur. Ce kit est
destiné aux échantillons de tissus de 0,1 à 5 mg, ce qui correspond au poids d’un germe de la
graine de soja pour les stades de développement 25 JAF à 40 JAF. Dans ce kit, une étape de
traitement à la DNase est incluse, cependant celle-ci ne s’est pas avérée suffisante. Une étape
de traitement à la DNase a donc été ajoutée afin d’éviter toute contamination éventuelle par
des restes d’ADN génomique.
Tous les échantillons d’ARNs extraits ont été conservés à -80°C après mesure de leur
concentration et vérification de leur intégrité.
2.1.3 Quantification et vérification de la pureté des ARNs
La détermination de la concentration des différents ARNs extraits a été réalisée par
mesure de l’absorbance à 260 nm (1 unité d’absorbance = 40 µg d’ARN/ml), avec un
Nanodrop™ ND-1000 (Thermo Fisher Scientific, Wilmington, USA). Des mesures
d’absorbance à 230nm et 280nm sont également effectuées afin d’évaluer la pureté des
échantillons d’ARNs. Le ratio A260nm/A280nm évalue la contamination protéique et doit être
proche de 2 pour que les ARNs soient considérés comme purs. Le ratio A260nm/A230nm est un
indice de la présence de sucres et doit être compris entre 1,8 et 2.
2.1.4 Elimination de l’ADN génomique des extraits d’ARNs totaux
Les différents échantillons d’ARNs totaux extraits de cotylédons, de germes et de
feuilles élicitées ont tous été traités à la DNase afin d’éliminer l’ADN génomique. Pour ce
faire, deux kits ont été utilisés :
Pour les échantillons destinés aux mesures en PCR quantitative, un kit « RNase-Free
DNase Set» (Qiagen, Courtaboeuf, France) a été utilisé. Chaque échantillon d’ARN
(10 µL d’ARN à 200 ng/µL soit 2 µg d’ARN) a été traité par un mélange de 2 µL de
tampon RDD (pour RNase-free DNA Digest buffer : contenant du Tris-Cl 500 mM pH
8.0, du MgCl2 50 mM, et du DTT 10 mM), 0,2µL de DNase I, et 7,8 µL d’H2O (Vqsp
= 20 µL) puis a été incubé 30 min à 37°C. Après ajout de 2 µL d’EDTA 1 mM,
86
l’échantillon a été remis à incuber 5 min à 65°C afin d’inactiver l’enzyme DNase I.
Ainsi un volume final de 22 µL d’ARNs traités a été obtenu pour chaque échantillon.
Pour les échantillons d’ARNs destinés aux RT-PCR semi-quantitative, un
kit
« DNase I » (1 U/µL) (Fermentas, France) a été utilisé. Le volume maximum d’ARN
pouvant être traité avec ce kit est de 8 µL. Ainsi, afin d’obtenir des solutions de
concentrations équivalentes, 8 µL d’échantillon le moins concentré sont utilisés et le
volume des autres échantillons est ajusté avec de l’eau. Ensuite, à ces 8 µL (1,6 µg
d’ARNs) sont ajoutés 1 µL de Tampon 10X contenant le MgCl2 ainsi que 1 µL de
DNase I (1U). Le mix est incubé 30 min à 37°C, puis 1 µL d’EDTA 50 mM est ajouté
avant d’être remis à incuber 10 min à 65°C pour inactiver l’enzyme. Un volume final
de 11 µL de chaque échantillon d’ARN traité à la DNase I est obtenu.
2.1.5 Transcription inverse (la reverse transcription RT) :
Cette méthode permet d’obtenir des ADN complémentaires (ADNc) à partir d’une
préparation d’ARNs totaux. Cette réaction est réalisée par une enzyme rétrovirale appelée
Reverse transcriptase. Celle-ci est spécifique de la matrice ARN pour fonctionner et
synthétiser un ADN complémentaire au brin d’ARN. Elle a besoin d’amorces
oligonucléotidiques (amorces aléatoires ou hexamères) pour initier la synthèse du brin d’ADN
et utilise les dNTPs comme substrat. Pour réaliser cette technique, deux kits de Reverse
Transcription ont été utilisés pour obtenir les échantillons d’ADNc (RT+) :
Le kit « Maxima™ First Strand cDNA Synthesis » (Fermentas, France) qui a servi
à la rétro-transcription des ARNs traités destinés aux PCR semi-quantitatives.
Celui-ci contient le mix de réaction 5X contenant : le tampon de réaction, les
dNTPs, les oligo (dT)18 et les amorces hexamères aléatoires, ainsi que le mix
Maxima® enzyme contenant : l’enzyme reverse transcriptase ainsi qu’un
inhibiteur RNase qui va protéger les ARNs de dégradations par les RNases A, B, et
C à des températures supérieures à 55°C. Proportionnellement, la réaction de RT
est constituée de 4 µL de Mix 5X, 2 µL de mix Maxima et de 1,6 µg d’ARN pour
un volume final de 20 µL. L’ADNc obtenu est dilué au 1/5 ème.
Le kit « High Capacity cDNA Archive » (Applied Biosystems, Forster City, USA)
qui a quant à lui servi à la rétro-transcription des échantillons d’ARNs traités
destinés aux PCR quantitatives. La RT se fait dans un ratio maximum de 2 μg
d’ARN pour un volume réactionnel final de 20 μL. Un mix 2X est réalisé et
mélangé à l’ARN en volume équivalent puis incubé 10 min à 25°C, 2 h à 37°C et 5
87
min à 85°C pour synthétiser les ADNc. Le mix 2X est composé de tampon RT 2X,
de dNTP 8mM chacun, d’amorces aléatoires RT 2X et de MultiScribe Reverse
Transcriptase 50U. L’ADNc obtenu est dilué au 1/5 ème.
Pour toutes les réactions de RT des témoins de contrôle de la réaction ont été réalisés :
Des témoins négatifs (RT-) : cette réaction contrôle RT- contient chacun des
réactifs de la réaction de RT excepté la Reverse Transcriptase et permet ainsi de
s’assurer que l’ARN ne soit pas contaminé par de l’ADN génomique, autrement dit
que le traitement préliminaire à la DNase ait bien fonctionné.
Des témoins négatifs (NTC pour No Template Control) : cette réaction contient
tous les réactifs excepté l’ARN et permet ainsi de vérifier que les réactifs utilisés ne
sont pas contaminés.
2.1.6 Amplification de l’ADN : Polymérase Chain Reaction (PCR)
Les séquences des amorces spécifiques des gènes IFS1, IFS2, F6H1, F6H2 et F6H3
utilisées pour les différentes amplifications sont présentées dans chaque partie des
expérimentations. Les séquences de certaines amorces utilisées ont été extraites de la
littérature. Les différentes amorces ont été dessinées à l’aide du logiciel Primer3
http://frodo.wi.mit.edu/primer3/ (Rozen et Skaletsky, 2000). Toutes les amorces, sans
exception, ont été sélectionnées après détermination de la température de fusion et après
confrontation avec les bases de données GenBank et Phytozome, de telle sorte qu’elles n’aient
aucune homologie significative non spécifique prévisible. Les caractéristiques des
amorces (température de fusion Tm, % de GC) ont été calculées par le logiciel Primer 3. Ces
amorces ont été synthétisées par la société Invitrogen.
Toutes les réactions PCR requises pour ce travail ont été réalisées à l’aide d’un
thermocycleur GenAmp 9700 (Applied Biosystems, Forster City,USA). De façon générale, le
mélange réactionnel des PCR effectuées comprenait: 150 ng d’ADN, 1,25 µl d’une solution
de MgCl2 50 mM, 5 µL de tampon 10X, 1,5 µL de chaque amorce (diluée à 0,1µg/µL), 4 µL
de dNTPs 2,5 mM (Invitrogen, Carlsbad, USA), 2,5U de Taq polymérase (Invitrogen,
Carlsbad, USA) et de l’H2O (Vqsp = 50 µL). Certaines PCR ont également été réalisées à
l’aide du PCR Master mix 2X (Promega, France). Ce pré-mix PCR est prêt à l’emploi et
contient la Taq polymérase (50Units/ml), 400 µM de chaque dNTP, 3 mM de MgCl2, et le
tampon de réaction en concentration optimale pour l’amplification de l’ADN cible par PCR.
Les quantités de chaque constituant utilisées pour un volume réactionnel de 25 µL sont : 1 µL
d’ADN, 12,5 µL de master mix, 1 µL de chaque amorce (diluée à 10 µmol/L) et 9,5 µL
88
d’H2O (Vqsp = 25 µL). Ces deux Taq polymérases utilisées possèdent toutes deux une
activité Adénine terminal Transférase (présence d’une queue poly A sur l’amplicon).
Les conditions de PCR n’ont pas été identiques selon les fragments à amplifier. Le
nombre de cycles réactionnels effectués dépend de la matrice de départ. Si les PCR sont
réalisés à partir d’ADN génomique le nombre est fixé à 30 cycles et 40 cycles pour l’ADN
complémentaire. La durée de l’étape d’élongation a été modifiée selon la taille du fragment à
amplifier (1min par Kb). De même, la température d’hybridation varie en fonction de la
température de fusion (Tm) des amorces. Aussi, les conditions spécifiques de chaque PCR
seront rapportées dans les différentes parties d’expérimentations qui suivront (section 3).
2.1.7 Étude de l’expression par PCR quantitative en temps réel
Cette technique consiste à mesurer la quantité d’ADN polymérisé à chaque cycle grâce
à un marqueur fluorescent. La méthode choisie ici est celle du SYBR Green. Cet agent
intercalant, une fois lié à l'ADN double brin, émet une fluorescence qui est directement
mesurée dans le tube PCR à l'aide d'un fluorimètre couplé au thermocycleur. La fluorescence
augmente donc avec la quantité d’ADN double brin présente dans le tube.
2.1.7.1 Principe
Les données de fluorescence sont collectées à chaque cycle de la PCR et représentent la
quantité de produits amplifiés à cet instant. Plus l’échantillon est concentré en molécules
cibles à l’origine, moins il faudra de cycles pour atteindre un point pour lequel le signal
fluorescent est significativement supérieur au bruit de fond. Ce point est défini comme le Ct
pour « Threshold Cycle » ou « cycle seuil» et apparaît en début de phase exponentielle (Figure
31).
Figure 31 : Détermination du cycle seuil
Cette quantification n’étudie donc pas la fin de la PCR et n’est donc pas affectée par les
éléments limitants identifiés lors de la phase du plateau. Ce concept de Ct est à la base de la
89
précision et de la reproductibilité de la technique. Si l’on suit la fluorescence au cours du
temps d’une PCR en temps réel, on observe une augmentation de cette fluorescence et donc
du nombre de fragments PCR dont l’allure est sigmoïde. Celle-ci se scinde en 3 phases
distinctes (Figure 32):
1. La phase de bruit de fond : la quantité de fragment amplifié est insuffisante pour
générer un signal fluorescent supérieur au bruit de fond.
2. La phase exponentielle : la quantité de fragment amplifié génère un signal fluorescent
supérieur au seuil de détection de l’appareil. La quantité obtenue de produit PCR est
directement proportionnelle au nombre de copies initiales du fragment d’ADN
amplifié. Pendant cette phase, la quantité d’ADN (N) dépend de la concentration
initiale en ADN (N0), du nombre de cycle et de l’efficacité (E) : Nc = N0 x Ec
3. la phase de plateau (ou de saturation) : correspond à un ralentissement de
l’amplification qui est souvent dû à l’épuisement d’un des différents réactifs de la PCR
(en particulier le nombre de molécules de Taq disponible). Le système ne permet donc
plus une amplification exponentielle.
Figure 32 : exemple de courbes représentant l’augmentation de la fluorescence au cours
du temps obtenues lors des analyses
2.1.7.2 Protocole et réactifs utilisés
La matrice correspond à l’ADNc préalablement synthétisé selon la technique détaillée
dans la section 2.1.5 des méthodes génériques. Le choix des gènes cibles, le design des
amorces spécifiques utilisées et la vérification de la spécificité de chaque couple seront
détaillés dans la partie expérimentation de la section 3.2.2.
90
L’appareil utilisé nécéssite l’emploi d’un kit spécifique appelé « IQ SYBR Green
Supermix » (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) contenant un tampon de réaction (KCl 100 mM,
Tris-HCl 40 mM, pH=8,4), des désoxyribonucléotides : dATP, dTTP, dCTP, et dGTP
(400 μM de chaque), une iTaq DNA polymerase, du MgCl2 (6 mM), du SYBR Green I et de la
fluorescéine (20 nM).
Les réactions sont effectuées sur des plaques 96 puits, contenant chacun un volume final
de 25 µL avec 12,5 μl de « IQ SYBR Green Supermix », 7,5 μl du mix de primers (900 nM
final), 5 μl d’ADNc à 40 ng/µL. La plaque est centrifugée 30 s à 5000 rpm après avoir été
recouverte au préalable d’un film plastique, puis placée dans l’appareil de qPCR (CFX96
Real-Time PCR Detection System, Bio-Rad, Hercules, CA, USA).
Le cycle utilisé est constitué d’une dénaturation primaire à 95°C pendant 3 min, suivie
de 40 cycles d’amplification comportant chacun 2 étapes : une dénaturation du double brin
d’ADN à 95°C pendant 10 s et un appariement des amorces avec l’élongation des nouveaux
brins d’ADN à 60°C pendant 30 s. L’acquisition de la fluorescence a lieu à la fin de chaque
cycle, c'est-à-dire après chaque étape d’élongation. La réaction se termine par une courbe de
fusion (courbe de dissociation) réalisée par augmentation de la température de 60°C à 95°C
avec une incrémentation de 0,5°C toutes les secondes et mesure de la fluorescence à chaque
palier. Cette dernière permet de confirmer la spécificité de la séquence nucléique amplifiée :
l’ADN double brin est dénaturé très lentement jusqu’à ce que sa température de fusion
caractéristique soit atteinte. Le SYBR Green est alors libéré dans le milieu réactionnel, ce qui
se caractérise par une brusque chute de fluorescence sur le moniteur. La dérivée première de
la fluorescence permet d’obtenir un pic unique, garant de la spécificité d’amplification et de
l’absence de contamination.
Pour toutes les réactions, autrement dit pour chaque paire d’amorces testées, des
témoins négatifs (NTC pour No Template Control) ont été réalisés (Figure 33). Cette réaction
NTC contient tous les réactifs, excepté la matrice d’ADNc qui est remplacée par de l’eau
« nuclease-free » et permet ainsi de vérifier par l’absence d’amplification que les réactifs
utilisés ne sont pas contaminés. Au final, deux réplicats biologiques ont été analysés avec
pour chacun trois répétitions outils.
91
Figure 33 : Réactions contrôles NTC
La quantification des niveaux d’expression est effectuée avec le logiciel LinReg PCR
(v11.0, University of Amsterdam, Pays-Bas) selon les recommandations décrites par (Ruijter
et al., 2009). L’expression est normalisée par le gène de référence retenu (β-tubuline) et se
traduit par le ratio : N0 cible / N0 réf dans lequel : N0 est égal à la concentration initiale d’ADN
par échantillon, exprimé en unités arbitraires de fluorescence. Ce qui se traduit par
N0 = seuil fluo/(Efficacité de PCR)ct.
Avec :
Ct = nombre de cycles nécessaires pour atteindre le seuil de fluorescence
Efficacité de PCR = valeur comprise entre 1 et 2, calculée par le logiciel à partir
de la pente de la courbe d’amplification dans la phase exponentielle. Il est
communément admis qu’elle doit être comprise entre 1,8 et 2 (une efficacité de
2 correspond à une efficacité parfaite de 100% où la quantité d’amplicon est
doublée à chaque cycle).
L’efficacité de PCR pouvant fortement impacter les niveaux d’expression obtenus, un
nombre suffisant d’analyses doit être effectué pour assurer la validité des résultats. En
général, chaque gène est analysé deux fois en triplicats.
2.1.8 Analyse des produits PCR sur gels d’agarose
Les produits de PCR sont visualisés par électrophorèse sur gel d’agarose. Les gels sont
préparés à partir de tampon TAE (89 mM Tris Base, 89 mM Acide Acétique, 2 mM EDTA,
pH8). Selon la taille attendue du fragment amplifié, la concentration des gels a été adaptée :
2% pour les fragments inférieurs à 0,5 Kb, 1,2% pour les fragments de 0,5 à 2,5 Kb et enfin
0,8% pour les fragments de plus de 2,5 Kb. Les échantillons sont additionnés de 0,2 volumes
de tampon de charge (bleu de bromophénol 0,25% (p/v), xylène de cyanol FF 0,25% (p/v),
92
glycérol 30% (p/v) avant dépôt sur le gel. Les migrations ont été réalisées en tampon TAE à
100 V pendant 15min. Le gel est ensuite coloré 10 min dans un bain de bromure d’éthidium
(BET) à 0,1 µg/ml. Les fragments d’ADN sont visualisés avec un analyseur UV (300 nm) par
la fluorescence du BET (agent intercalant) contenu dans l’ADN. Les tailles des fragments
d’ADN séparés sur gel sont estimées grâce à un marqueur de taille migrant en parallèle des
échantillons. La taille du marqueur choisi varie en fonction de la taille des échantillons à
analyser : 50 pb, 100 pb, 200pb ou 1 Kb (DNA Ladder, Promega, France).
2.1.9 Purification des bandes d’ADN après électrophorèse
Dans certains cas, le produit PCR amplifié a été purifié directement à partir du gel à
l’aide de kits de type QIAquick gel (Qiagen, Courtaboeuf, France) en suivant les instructions
du fournisseur. Le principe consiste à fixer l’ADN amplifié sur une colonne de silice grâce un
tampon à forte salinité, les autres constituants du milieu n’étant pas retenus. Après lavage de
la colonne, l’ADN est récupéré par centrifugation 1 min à 15 000 g dans de l’eau nucleasefree.
2.1.10 Clonage des fragments d’intérêt
Le clonage des fragments amplifiés par PCR a été réalisé grâce aux Kits de clonage
TOPO TA® cloning (Invitrogen, Carlsbad, USA) ou pGEM-T® (Promega, France) et ceci en
mettant à profit l’activité Adénine Terminal Transférase de la Taq ADN polymérase, cette
enzyme a ajouté systématiquement une déoxyadénosine à l’extrémité 3’ des produits
amplifiés. Afin d’optimiser cette incorporation, les produits de PCR ont été incubés à 72°C
(Température optimale de la Taq DNA polymérase) pendant 10 minutes, juste après le dernier
cycle d’amplification.
Les plasmides PCR2.1 TOPO® et pGEM-T® (Figure 34) sont linéaires et portent un
résidu thymidine (dT) non apparié à leurs extrémités 3’. Une topoisomérase est fixée de façon
covalente à ces plasmides. Celle-ci permet une ligation entre le vecteur et le produit PCR
terminé en 3’ par un résidu adénine (dA). Les clonages ont été entrepris selon les
recommandations du fabriquant. Les plasmides PCR2.1 TOPO® et pGEM-T® ainsi
circularisés ont été ensuite introduits respectivement dans des cellules d’Escherichia coli
souche Top10F’et JM109, par choc thermique.
Les bactéries contenant ce plasmide portant le gène de résistance à l’ampicilline, ont été
sélectionnées par étalement sur milieu sélectif Luria Bertani (LB : tryptone10 g/l, Yeast
93
Extract 5 g/l, Nacl 5 g/l, agar 15 g/l) contenant 100 µg /ml d’ampicilline. Ce plasmide possède
également le gène LacZ, composant de l’opéron lactose, qui code pour la -galactosidase. Le
site d’insertion du fragment se trouve dans la séquence de ce gène. Les clones ont été détectés
en présence de l’inducteur IPTG (Isopropyl 1 thio -galactosidase ; 40 mg/ml de LB) et de
100 mM de réactif X-Gal (5 bromo-4-chloro-3-indolyl- -D-galactopyranoside). L’IPTG est
un métabolite du lactose qui active la transcription du gène LacZ et le X-Gal est un composé
incolore qui, hydrolysé par la -galactosidase, libère une indoline formant un composé bleu
insoluble dans l’eau qui ne diffusera donc pas dans la gélose. Ainsi les bactéries ayant intégré
le vecteur vide possèdent un LacZ actif, hydrolysent le X-Gal et apparaissent bleues sur la
gélose. En revanche, le lieu d’insertion de l’amplicon étant dans le gène LacZ, les bactéries
ayant intégré le vecteur avec l’amplicon restent blanches.
Afin de vérifier la taille du fragment inséré, un criblage par PCR des clones positifs
(colonies blanches) a été réalisé à l’aide des amorces M13F et M13R pour le vecteur PCR2.1
TOPO® ou à l’aide des amorces SP6 et T7 pour le vecteur pGEM-T®.
Les clones bactériens munis d’un insert de taille attendue ont été cultivés dans 4 ml de
bouillon de culture Luria Bertani supplémenté en ampicilline (100 µg/ ml de milieu).
L’isolement de l’ADN plasmidique a été réalisé à l’aide du GenElute Plasmid Miniprep kit
(Sigma-Aldrich) selon les recommandations du fabricant avant d’être envoyé à séquencer.
Figure 34 : Composition des plasmides PCR2.1 TOPO® et PGEM-T®
94
2.1.11 Séquençage des plasmides et des produits PCR
Le séquençage des plasmides et des produits PCR a été sous-traité auprès de la société
GATC Biotech (Konstanz, Allemagne) (http://www.gatc-biotech.com/fr/home.html). Les
séquençages ont été réalisés sur un séquenceur automatique ABI 3730 XL (Applied
Biosystems, Forster City, USA) qui utilise la méthode de Sanger et permet d’obtenir des
séquences propres de plus de 1000 pb. Pour chaque amplicon inséré dans un plasmide, les
deux côtés du plasmide sont séquencés à l’aide des amorces universelles M13F et M13R ou
SP6 et T7 en fonction du type de plasmide utilisé lors de l’étape de clonage. Ces amorces sont
suffisamment éloignées du début de l’insertion pour que le séquençage soit correct dès le
début de l’amplicon. Pour obtenir le séquençage plus en interne de l’amplicon inséré dans le
plasmide ou le séquençage de tout autre amplicon PCR, des amorces spécifiques (utilisées
lors des amplifications PCR initiales) sont utilisées.
2.2 Les techniques analytiques
2.2.1 Extraction des isoflavones
Les cotylédons et les germes préalablement lyophilisés et congelés (cf. section 3.2.1)
ont été finement broyés (particules de 0,1 g de Ø <0.200 mm) à l’aide d’un mortier et pilon en
céramique. Les échantillons ont été extraits pendant 2 heures à température ambiante avec du
méthanol 80%. Les proportions utilisées pour ces extractions sont de 50 mg de poudre de
cotylédons pour 1 ml de solvant d’extraction et de 2 mg de poudre de germes pour 100 µL de
solvant d’extraction. Les résidus ont ensuite été éliminés après centrifugation pendant 10 min
à 12000g et décantation du surnageant. Le surnageant a ensuite été filtré à l’aide d’une
seringue munie d’un filtre (0.2 μm, Acrodisc Syringe Filters, GHP membranes; St. Germainen-Laye, France) avant d’être analysé en chromatographie liquide haute performance couplée
à un détecteur ultraviolet (HPLC/UV) dont la longueur d’onde est fixée à 260nm.
2.2.2 Analyses HPLC: High Performance Liquid Chromatography
Le système chromatographique utilisé (Spectra Physics Analytical Inc., Fremont, CA,
USA) se compose d’un système de pompage « P4000 » avec un formeur de gradient, d’un
échantillonneur « AS3000 », d’une colonne, d’un injecteur et d’un détecteur U.V. à barrettes
de diodes (DAD) (UVD340, Dionex, Voisins Le Bretonneux, France) permettant d’établir un
spectre U.V. (200 à 600 nm, ici fixée à 260nm) pour chaque composé sorti de la colonne. Les
95
différents éléments sont reliés à un ordinateur sur lequel est installé le logiciel d’analyse
« Chromeleon » (Dionex, Voisins Le Bretonneux, France).
Les 12 structures d’isoflavones sont séparées sur colonne de silice (C18) greffée en
phase inverse 35 × 4.6mm (1.5 μm i.d.) Turbo80-ODS (Cluzeau, Sainte Foy La Grande,
France) maintenue à 30°C. La reproductibilité du volume injecté fixé à 2 μL est assurée par
une boucle d’injection. Les isoflavones sont éluées par une phase mobile : mélange eau
désionisée (Millipore, Saint Quentin Yvelines, France) - acide trifluoroacétique 0,05 %
(Peypin, France) (solvant A) et acétonitrile (Peypin, France) (solvant B). La séparation
complète des 12 isoflavones est réalisée sous un gradient d’élution de 12 min en plusieurs
étapes : Le débit de la pompe a été de 1,3 ml min-1. Le solvant B augmente de 0 à 16% en 2
min, puis à 24% en 4 min, à 32% en 3 min, et enfin à 100% en 1 min. Le programme du
gradient revient à son statut initial de 100% de solvant A en 2 minutes afin de rincer et
rééquilibrer la colonne.
Les chromatogrammes d’absorption UV sont collectés à 260 nm (Figure 35, Figure
36). D’une manière générale, l’ordre d’élution (i) daidzéine, ii) glycitéine ; iii) génistéine) est
respecté, quel que soit l’état de conjugaison de ces molécules. Les formes glucosylées
(daidzine, glycitine et genistine) étant les plus polaires, elles sont éluées en premier, entre la
4ème et la 5ème minute. Suivent les formes malonylées (M. Daidzine, M Glycitine et M
Genistine), éluées entre la 5ème et la 7ème minute), puis acétylées (A. Daidzine, A. Glycitine et
A. Genistine) entre la 5ème et la 9ème minute, et enfin, les formes aglycones (Daidzéine,
Glycitéine et Génistéine) entre la 6ème et la 10ème minute.
Figure 35 : Chromatogramme d’absorption UV à 260nm obtenu après séparation HPLC
sur colonne RP C18 d’un extrait de cotylédons à 40 JAF
96
Figure 36 : Chromatogramme d'absorption UV à 260 nm obtenu après séparation
HPLC sur colonne RP C18 d’un extrait de germes à 40JAF
2.2.3 Quantification des isoflavones
La quantification des isoflavones est basée sur une calibration externe. Cependant, les
formes malonyles et acétyles étant très instables en solution, seules les 6 isoflavones
aglycones (daidzéine, glycitéine et génistéine) et β-glucosides (daidzine, glycitine et
génistine) sont utilisées comme standards externes (Chromadex, Santa Ana, CA, USA).
Environ 3 mg de standards, peu solubles dans le méthanol, sont individuellement solubilisés
dans 0,5 mL de DMSO. Le volume des solutions mères est ajusté à 10 mL avec du méthanol.
Chaque solution mère est ensuite diluée en une gamme de dilution croissante (8, 25, 50, 80,
110 et 150 μg.mL-1). Les solutions mères sont dupliquées pour chaque standard, et 2 solutions
mères contenant un mélange de 3 standards sont préparées. À chaque solution mère
correspondent 2 gammes de dilutions.
L’identification des pics obtenus par une intégration numérique s’effectue en référence
aux molécules purifiées des isoflavones. Les coefficients de réponse des formes malonyles et
acétyles sont ensuite extrapôlés à partir de l'absorption des formes les plus stables. Les
groupements malonyle et acétyle ne possèdent pas de fonction chromophore sensible à
l'absorption des rayons UV. Par conséquent les propriétés d'absorption des isoflavones
malonylglucosides et acétylglucosides dans des régions de faible longueur d'onde sont
similaires à celles des formes β-glucosides. On a donc émis l'hypothèse qu’à λ=260 nm,
l'absorption des isoflavones malonylglucosides et acétylglucosides par rapport aux formes βglucosides dépend uniquement de leur poids moléculaire (MW). Les coefficients de réponse
97
(K) des formes malonyles et acétyles des 3 familles d’isoflavones (dérivés de la daidzéine, de
la génistéine et de la glycitéine) sont donc déterminés par le calcul suivant :
Kacétyle=MWglucoside×Kglucoside/MWacétyle et Kmalonyle=MWglucoside×Kglucoside/MWmalonyle. Les
concentrations des formes conjuguées et aglycones sont ensuite ajoutées pour chaque forme
aglycone pour obtenir la quantité de génistéine totale, de daidzéine et de glycitéine. Les
quantités d’isoflavones sont ainsi exprimées en µmol.g-1 de poids sec. Cette hypothèse a été
vérifiée expérimentalement au laboratoire et confirmée par d’autres équipes scientifiques
(Zhang et al., 2001).
2.3 Outils bioinformatiques et statistiques
2.3.1 Traitement des séquences nucléiques et protéiques
Les résultats des séquençages ont été analysés et à l’aide du logiciel BioEdit
(http://www.mbio.ncsu.edu/bioedit/bioedit.html) (Hall, 1999). Les fragments séquencés ont
ensuite été assemblés et alignés entre eux afin de reconstruire l’intégralité des séquences
consensus à l’aide du logiciel Multalin du site du laboratoire de Génétique Cellulaire de
l’INRA de Toulouse (http://multalin.toulouse.inra.fr/multalin/) (Corpet, 1988).
Les comparaisons de séquences avec la banque de séquences GenBank ont été réalisées
avec le logiciel BLAST du site NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).
Le logiciel de Traduction Expasy (http://web.expasy.org/translate/) a permis de réaliser
la traduction de nos séquences.
Les dendrogrammes et les profils d’hydrophobicité ont été réalisés à l’aide des outils
disponibles (Phylip 3.67 drawgram ; Toppred) sur le portail de l’institut Pasteur
(http://bioweb2.pasteur.fr).
2.3.2 Traitement statistique des données
Les traitements statistiques des concentrations d’isoflavones (en µmol.g-1) et de
l’expression relative normalisée des différents gènes dans les deux compartiments majeurs de
la graine ont été réalisés à l’aide du logiciel XLSTAT 2011 (Addinsoft, Paris, France). Les
moyennes des réplicats techniques ont été calculées puis une analyse de variance
multifactorielle (ANOVA) a été réalisée pour tester les effets variétés, compartiments, stades,
et les interactions de second ordre. Les comparaisons des moyennes ont été faites par Test de
Tukey.
98
3 LES DIFFERENTES EXPERIMENTATIONS
3.1 Isolement et caractérisation des gènes IFS1 et IFS2
3.1.1 Prélèvements et échantillonnage
Pour le séquençage des IFS1 et IFS2, des jeunes feuilles ont été prélevées sur 3 plantes
différentes pour chacune des six variétés : Imari, Queen, NSK, NT, PI567580A et PI567417C
ayant poussé en serre dans les conditions décrites dans la section 1.2.1. Celles-ci ont ensuite
été rapidement congelées à l’azote liquide avant d’être stockées et conservées à -80°C.
3.1.2 Les différentes étapes de l’expérimentation
3.1.2.1 Extraction des ADN génomiques
Les ADN génomiques des 6 variétés Imari, Queen, NS Khasha, Noir de Toulouse,
PI567580A et PI567417C ont été extraits à partir de jeunes feuilles selon le protocole présenté
dans la section 2.1.1 et ont été utilisés pour amplifier l’intégralité des 2 séquences génomiques
IFS1 et IFS2 de chacune des variétés étudiées.
3.1.2.2 Design des amorces
Les amorces spécifiques ont été dessinées selon la méthodologie présentée dans la
section 2.1.6. Les numéros d’accession GenBank des séquences publiées utilisées comme
référence pour les alignements sont : AF195798, EU391463, EU391470 et EU391490 pour le
gène IFS1 et AF195819, EU391505, EU391510, EU391513 pour le gène IFS2. La longueur
des séquences sélectionnées varie entre 2588 et 2877 pb afin d’être suffisamment en amont de
la partie 5’UTR (pour Untranslated Region) non traduite (environ 700 pb pour IFS1 et 1000
pb pour IFS2) et en aval de la partie 3’UTR non traduite (environ 100pb). Chacun de ces deux
gènes a été amplifié en une seule fois. Ainsi 2 couples d’amorces spécifiques ont été dessinés
(Tableau 5).
99
Tableau 5 : Amorces spécifiques utilisées pour amplifier l’intégralité des séquences
génomiques IFS1 et IFS2
Tm moyen du couple IFS1F/R : 61°C et IFS2F/R : 62°C
Amorce
Forward
Séquence 5’3’
Amorce
Séquence 5’3’
Reverse
Taille de
l’amplicon
IFS1-F
AACACAAGCAAGGGCTTTAGG
IFS1-R
CATAAAAAGCAACTGCGATGG
2589 pb
IFS2-F
GCAAAGAGAACCAAAACAAAATTTG
IFS2-R
GATGAACGAGACCTTATTGAAATGATG
2877 pb
3.1.2.3 Amplifications PCR
Le mélange réactionnel utilisé est décrit dans la section 2.1.6. Les amplifications PCR
de ces 2 gènes ont été réalisées dans les conditions suivantes : une dénaturation initiale à 95°C
pendant 5 min suivie de 30 cycles consistant en une dénaturation à 94°C pendant 45 s, une
hybridation à 61°C pendant 1 min pour IFS1 ou à 62°C pendant 1 min pour IFS2 et une
élongation à 72°C pendant 3 min pour IFS1 ou 4 min pour IFS2 (1min/Kb). Après les 30
cycles, la réaction de PCR se termine par une étape d’élongation à 72°C pendant 10 min. La
taille des fragments attendus a été vérifiée sur gel d’agarose selon le protocole détaillé dans la
section 2.1.8.
3.1.2.4 Clonage et séquençage des produits PCR
Les produits PCR obtenus ont ensuite été clonés dans des vecteurs PCR2.1 TOPO® et
séquencés avec les amorces universelles M13F et M13R (cf. sections 2.1.10 et 2.1.11). Etant
donné la longueur des séquences clonées, des amorces spécifiques ont également été
dessinées en interne (toujours à l’aide des séquences de référence publiées dans GenBank)
(Tableau 6).
Tableau 6 : Amorces internes utilisées pour les séquençages des gènes IFS1 et IFS2
Amorces internes
Séquences 5'-->3'
IFS1 vide0
GGTGATATATGGACATTTCCTGG
IFS1 vide1
GTAGACCCACAACACAAACATTG
Ifs1bR
GACGCCTCACTTACGACAACT
IFS1 vide2
GCTGAGGACGAGACCATG
IFS2 seq0
GTTGGCCGAATAATCTCATAG
IFS2 seq1
GGCTGGGTCACGAACGAG
IFS2 seq2
CCTCGTCTTCCCTTCATAGG
IFS2seq3Rc
CTCCTTCACGATTGCTCTAATG
100
Trois réplicats de chaque amplicon cloné et séquencé ont été réalisés pour chacune des
six variétés. Les différents fragments séquencés (6 au total pour chaque réplicat de chacun des
gènes) ont ensuite été analysés et alignés afin de reconstituer l’intégralité des deux séquences
génomiques consensus. Au final, pour chaque gène : 3 répétitions avec 6 fragments ont été
analysées, ce qui correspond à 18 fragments pour chacun des gènes. Ainsi, pour les deux
gènes IFS1 et IFS2, 36 fragments ont été analysés pour chacune des 6 variétés étudiées, soient
216 fragments au total.
Les séquences génomiques IFS1 et IFS2 des six variétés ont été déposées dans
GenBank. Les séquences IFS1 des lignées Queen, Imari, Noir de Toulouse, PI567580A, NS
Kasha et PI567417C sont respectivement référencées sous les numéros d’accession
JN133900, JN099682, JQ934954, JQ934955, JQ934956, JQ934957 et les séquences IFS2 des
variétés Queen, Imari, Noir de Toulouse, PI567580A, NS Kasha et PI567417C portent les
numéros d’accession respectifs JN133902, JN133901, JQ934958, JQ934959, JQ934960,
JQ934961.
3.2 Etude des cinétiques d’accumulation des isoflavones et d’expression
des gènes cibles dans les germes et les cotylédons
Une étude spatio-temporelle a été réalisée afin de pouvoir comparer les concentrations
en isoflavones et les profils d’expression des gènes cibles de leur voie de biosynthèse dans les
germes et des cotylédons de la graine.
3.2.1 Prélèvements et échantillonnage
Pour cette étude, les graines provenant de 6 plantes pour chacune des variétés Queen et
Imari cultivées en serre (conditions décrites dans la section 1.2.1), ont été prélevées à 6 stades
de développement allant de 25 JAF à 70 JAF (Jours Après Floraison (Figure 37). L’objectif
étant d’avoir pour chaque variété quatre répétitions biologiques de 10 graines par date de
prélèvement. Chaque jour, des séries synchrones de gousses de même stade de développement
ont été marquées individuellement au moyen d’étiquettes d’horloger datées et colorées de
pastilles de couleurs différentes. Le stade repère choisi était la longueur de la gousse à 1 cm,
qui correspond à Floraison + 7 jours (7 JAF).
101
Figure 37 : Les 6 stades de développement des graines de soja prélevées : de 25 à 70 JAF
À chaque prélèvement les graines ont été rapidement disséquées ; les germes ont été
isolés et séparés des cotylédons. Pour les analyses, 4 échantillons biologiques par stade de
développement ont été réalisés pour chacune des deux variétés. Chaque échantillon est
constitué de 10 graines collectées au même stade sur 6 plantes de la même variété, au même
moment et un duplicata (« un jumeau ») est fait avec 10 graines des mêmes gousses, et cela
est répliqué sur 6 autres plantes. Ce matériel végétal prélevé a ensuite été réparti pour les deux
types d’analyses. Pour chacun des stades, la moitié des échantillons, a été destinée au dosage
des isoflavones alors que l’autre moitié a été destinée au dosage d’expression des gènes
cibles. Deux échantillons pour le dosage des isoflavones ont été conservés à -20°C jusqu’à la
lyophilisation avant les analyses. En revanche les 2 échantillons « jumeaux » pour le dosage
d’expression des gènes ont été immédiatement congelés à l’azote liquide puis stockés et
conservés à -80°C.
3.2.2 Les différentes étapes de l’expérimentation
Le dosage HPLC des isoflavones et le dosage de l’expression des gènes cibles en PCR
quantitative en temps réel ont été menées en parallèle.
3.2.2.1 Dosage HPLC des isoflavones
Cette technique a été détaillée dans la section 2.2.
3.2.2.2 Dosage de l’expression des gènes cibles en RT-PCR quantitative
Le principe de cette technique, les conditions d’analyses utilisées ainsi que la
quantification du niveau d’expression des gènes cibles ont également été présentées dans la
section 2.1.7. En revanche, les étapes critiques et nécessaires à la réalisation de cette dernière
sont détaillées ci-dessous.
102
 Choix des gènes cibles de la voie de biosynthèse des isoflavones
Les expressions de seize gènes cibles ont été suivies en PCR quantitative en temps réel.
Parmi eux, deux gènes de ménage encore appelés gènes de référence : la β-tubuline et
l’actine, dont l’expression est connue pour être constitutive dans la graine (GutierrezGonzalez et al., 2010a ; Chen et al., 2011). Ceux-ci permettent ainsi de vérifier que la
concentration en ADNc est constante entre les échantillons à comparer. Le logiciel BestKeeper (Pfaffl et al., 2004) (http://gene-quantification.com/bestkeeper.html) a été utilisé pour
déterminer lequel de ces deux gènes de référence il était préférable d’utiliser pour la
normalisation de l’expression des gènes cibles. Comparés à l’actine, les taux de transcrits
obtenus pour la β-tubuline ont montré la plus faible variation, avec une variation standard
(VS) <1 et un coefficient de variation de 1,79. De par cette faible variation d’expression, le
gène codant la β-tubuline a été considéré stable et retenu comme gène de référence pour la
normalisation de l’expression des gènes cibles.
Les quatorze autres gènes dont l’expression a été suivie sont des gènes clefs de la voie
de biosynthèse des isoflavones. Ce sont les 9 gènes CHS1 à CHS9 codant pour des chalcone
synthases (CHS) identifiées chez le soja (Clough et al., 2004 ; Matsumura et al., 2005 ; Tuteja
et Vodkin, 2008), le gène CHR isolé (Welle et Grisebach, 1988) codant pour une chalcone
réductase (CHR), les 4 gènes : CHI1A, CHI2, CHI1B1 et CH1B2 codant pour des chalcone
isomérases (CHI) (Ralston et al., 2005) et les deux gènes IFS1 et IFS2 codant pour des
isoflavone synthases (IFS) (Jung et al., 2000).
 Design des primers spécifiques
Chacune des 16 paires d’amorces pour chacun des gènes correspondant a été dessinée
en se basant sur les séquences d’ARNm publiées dans GenBank. Pour les gènes IFS1 et IFS2,
les séquences codantes obtenues à partir des variétés Queen et Imari ont été utilisées. Afin
d’identifier les similarités et les variations de séquences (notamment pour les gènes d’une
même famille), les séquences nucléotidiques ont été alignées et les régions 5’UTR et 3’UTR
identifiées. Certains couples ont été dessinés au niveau des jonctions exon-exon afin d’exclure
toute amplification d’ADNg. En revanche pour certains gènes comme les CHS, les couples
ont été dessinés sur les régions 3’UTR ou 5’UTR du fait de leur trop forte homologie de
séquences.
Chaque couple d’amorces a été choisi à l’aide du logiciel Primer Express 2.0 (Applied
Biosystems, Forster City, USA). Elles ont été définies pour amplifier des fragments compris
entre 51 et 136 paires de bases, à une température d’hybridation optimale de 60°C pour
103
chacun des couples, leur taille étant comprise entre 17 et 31 bases, leur pourcentage en G/C
avoisinant les 50% et le maximum de bases auto-complémentaires en 3’ étant de trois. Ces
conditions sont imposées de façon à éviter la formation de dimères d’amorces qui fausseraient
la quantification.
 Vérification de la spécificité des amorces
La spécificité des amorces a été vérifiée de façon théorique en blastant chaque séquence
d’amorces contre les séquences du génome du soja sur la base de données Phytozome
(http://wwww.phyozome.net/). Celle-ci a également été vérifiée grâce aux températures de
fusion de chaque couple lors de la RT-qPCR (Figure 38). La dérivée première de la
fluorescence permet en effet d’obtenir un pic unique, garant de la spécificité d’amplification
et de l’absence de contamination. Les produits amplifiés ont ensuite été déposés sur gel
d’agarose 1,8 % afin de vérifier la présence d’une bande unique de taille attendue. Ces
produits ont ensuite été purifiés directement à partir des gels (cf. section 2.1.6) et séquencés
afin de confirmer que la réaction d’amplification n’a été spécifique que d’un seul ADNc.
Pour certains gènes, plusieurs couples ont dû être testés avant d’en trouver un correspondant à
ces critères.
Figure 38 : Obtention d’un pic unique garant de la spécificité d’un couple d’amorces
utilisé
3.3 Caractérisation des gènes F6Hs et tests d’expression
3.3.1 Prélèvements et échantillonnage
Afin d’isoler et de caractériser les séquences F6Hs des variétés Queen, Imari et
PI567580A, de jeunes feuilles ont été prélevées sur 2 plantes différentes pour chaque variété
104
ayant poussé en phytotron (cf. section 1.2.2) et ont été rapidement congelées à l’azote liquide
avant d’être stockées à -80°C.
Des élicitations sur deux feuilles d’âge différent (Feuille « 1 » plus âgée et Feuille
« 2 » plus jeune) correspondant à 6 folioles ont été réalisées afin de vérifier l’induction des
gènes cibles F6Hs. Donc pour chaque traitement éliciteur, il y a 6 répétitions : 2 feuilles
différentes (deux réplicats biologiques) soit 6 folioles (Figure 39). Pour chacune des variétés
Imari et Queen, différents échantillons ont été prélevés :
des témoins négatifs (non élicités) : avant infiltration nommés « T0 » et 7h après
l’élicitation nommé « T7h » (une foliole non traitée prélevée sur une feuille en face
des feuilles « 1 » et « 2 »)
les échantillons nommés « NT » correspondant à une zone non traitée sur les
folioles élicitées
les échantillons traités prélevés 7h après élicitation : « lam » pour laminarine,
« chit » pour chitosan et aussi des contrôles « H2O » pour l’effet « wounding ».
Figure 39 : Les feuilles d’âge différent prélevées pour chaque traitement éliciteur utilisé
L’expression des gènes F6Hs dans les graines a été analysée sur des échantillons
provenant de plantes cultivées en phytotron (cf. section 1.2.2). Les prélèvements ont été faits
à 3 stades de développement : 25 JAF, 40 JAF et 50 JAF. Au total, 4 échantillons biologiques
par stade et par variété ont été utilisés. Chacun est constitué d’une seule graine. Après chaque
prélèvement, chaque graine a été disséquée, les germes ont été isolés et séparés des
cotylédons. Ces échantillons ont ensuite été rapidement congelés à l’azote liquide avant d’être
stockés et conservés à -80°C.
105
Deux séries d’échantillons biologiques pour chaque stade de chaque variété ont été
effectuées et utilisées : la série (1) en novembre 2010 et la série (2) en juillet 2011. Ainsi les
réplicats biologiques ont été réalisés à la fois au travers d’une même série (4 fractions d’un
même stade issues de 4 plantes pour chaque variété) mais aussi au travers de deux séries bien
distinctes d’échantillons. Au final, 8 répétitions biologiques pour chaque compartiment de
chaque stade de chaque variété ont été réalisées.
3.3.2 Les différentes étapes de l’expérimentation
3.3.2.1 Choix des gènes cibles
Un seul transcrit F6H référencé sous le numéro d’accession Genbank Y10490.1 a été
isolé dans des cultures cellulaires de soja élicitées (Schopfer et Ebel, 1998) et participerait à la
synthèse de la glycitéine (Latunde-Dada et al., 2001).
En utilisant l’algorithme BLASTN sur la base de données du génome du soja Glyma 1.0
(http://www.phytozome.org/soybean.php), des séquences prédites ayant plus de 65%
d’homologie avec Y10490.1 ont été recherchées chez le soja (Glycine max), le haricot
(Phaseolus vulgaris) et la légumineuse modèle Medicago truncatula. Une comparaison de ces
séquences codantes a été réalisée et un dendrogramme a été construit (Figure 40).
F6H1
F6H2
F6H3
Figure 40 : Dendrogramme des séquences codantes prédites ayant plus de 65%
d’homologie avec Y10490.1
106
Ce dendrogramme représente les distances phylogénétiques des 19 séquences les plus
proches de la seule Flavonoïde 6-hydroxylase (Y10490.1) connue. La séquence Y10490.1
correspond à la séquence prédite Glyma18g08950. Les deux autres séquences prédites les plus
proches : Glyma18g08930 et Glyma08g43890 ayant un pourcentage d’homologie supérieur à
78% ont été retenues pour cette étude (Figure 40). Les trois gènes ont été nommés F6H1,
F6H2, et F6H3 respectivement.
Dans un premier temps les 3 séquences génomiques correspondantes (F6H1, F6H2 et
F6H3) ont été isolées et séquencées pour les variétés Imari, Queen et PI567580A. Puis
l’analyse de l’expression de ces trois gènes a été réalisée dans différents tissus par RT-PCR
semi-quantitative. Tout d’abord, dans des feuilles élicitées afin de vérifier leur induction, puis
dans deux fractions bien distinctes de la graine : le germe, compartiment de prédilection pour
l’étude de la glycitéine du fait de sa forte concentration en ce composé et les cotylédons qui
ont une faible teneur en glycitéine, ceci afin de détecter d’éventuelles expressions
différentielles de ces trois gènes F6H1, F6H2 et F6H3 dans ces deux fractions de la graine de
soja.
3.3.2.2 Isolement et caractérisation des gènes F6H1, F6H2 et F6H3
Les ADN génomiques des variétés Imari, Queen et PI567580A ont été extraits à partir
de jeunes feuilles (cf. section 2.1.1) et ont été utilisés pour amplifier l’intégralité des 3
séquences F6H1, F6H2 et F6H3 de chacune des variétés étudiées.
Pour cela, des amorces spécifiques ont été dessinées (cf. section 2.1.6). Pour les
alignements, les trois séquences génomiques Glyma18g08950 (F6H1), Glyma18g08930
(F6H2) et Glyma08g43890 (F6H3), et la seule séquence F6H isolée chez le soja et publiée
sous le numéro d’accession GenBank : Y10490.1 ont été utilisées. La longueur des séquences
sélectionnées varie entre 2950pb et 3640pb afin d’être suffisamment en amont de la partie
5’UTR (entre 200pb et 500pb) et en aval de la partie 3’UTR (entre 50pb et 500pb). Au vu de
la taille de ces trois gènes cibles, chacun d’eux a été amplifié en deux fois (partie A et partie
B). Ainsi 6 couples d’amorces spécifiques ont été dessinés (Tableau 7), de façon à ce que leur
Tm moyen soit identique (Tm moyen = 59°C).
107
Tableau 7 : Amorces utilisées pour amplifier les séquences génomiques F6H1, F6H2, et F6H3
Tm moyen de chaque couple : 59°C
Nom de
Amorce
l’amplicon
Forward
F6H1 partie A
F6H1 F1
AGTGTCCTCAAACCACTGCAT
F6H1 R3
GATTTTGACCGGCTATGTCC
1557 pb
F6H1 partie B
F6H1 F st2.1
GTATGCTTTACTGCCTTCACACTTTAG
F6H1 R st2.1
CAAATGGAGAGTAGGTCCACAGG
2370 pb
F6H2 partie A
F6H2 AF
TGGCTATGCTAACATCCTCGT
F6H2 R3
TTGGTGCTTTGGAAGTTGAA
1621 pb
F6H2 partie B
F6H2 BF
CAGGACCACGTACACAATGC
F6H2 R6
TGTCGATGCCTATCTTTTTCC
1407 pb
F6H3 partie A
F6H3 F1
GAGCCTAAATTCAGCGGATCT
F6H3 R4
GCAGAATCCACCAATAAGTGTAAG
1985 pb
F6H3 partie B
F6H3 BF
GGAACAGAACAAGCAAACCTG
F6H3 R7
TTGATGGAAATGATGGTGGA
1322 pb
Séquence 5’3’
Amorce
Reverse
Séquence 5’3’
Taille de
l’amplicon
Le mélange réactionnel utilisé est celui avec le Master mix de Promega (cf. section
2.1.6). Les amplifications PCR de ces 3 gènes ont été réalisées dans les conditions suivantes :
une dénaturation initiale à 94°C pendant 5 min suivie de 30 cycles consistant en une
dénaturation à 94°C pendant 1 min, une hybridation à 59°C pendant 1 min (Tm moyen du
couple utilisé) et une élongation à 72°C pendant 3 min (1 min /Kb). Après les 30 cycles, la
réaction de PCR se termine par une étape d’élongation à 72°C pendant 10 min. La taille des
fragments attendus a été vérifiée sur gel d’agarose (cf. section 2.1.8).
Les produits PCR obtenus ont ensuite été clonés dans des vecteurs pGEM-T® et
séquencés (cf. sections 2.1.10 et 2.1.11). Trois réplicats ont été réalisés pour chacune des
variétés Imari, Queen et PI567580A. Les différents fragments séquencés ont ensuite été
analysés et alignés (cf. section 2.3.1) afin de reconstituer l’intégralité des deux séquences
génomiques consensus. Au final, pour les trois gènes F6H1 et F6H2, et F6H3, 18 fragments
ont été analysés pour chacune des 3 lignées étudiées, soient 54 fragments au total.
Les séquences génomiques F6H1, F6H2 et F6H3 des 3 variétés ont été déposées dans
Genbank sous les numéros d’accession : JX127148 (Imari), JX127149 (Queen), JX127150
(PI567580A) pour F6H1; JX127151 (Imari), JX127152 (Queen), JX127153 (PI567580A)
pour F6H2; et JX127154 (Imari), JX127155 (Queen), JX127156 (PI567580A) pour F6H3.
3.3.2.3 Analyse de l’expression de F6H1, F6H2 et F6H3 par RT-PCR
 À partir de feuilles de soja élicitées
108
Le premier gène F6H (Y10490.1) a été isolé chez le soja après élicitation par des
extraits de levure (Schopfer et Ebel, 1998). Un traitement du même type a donc été adopté
pour tenter de détecter d’éventuels ARNm des trois gènes à partir de feuilles des variétés
Queen et Imari.
choix des éliciteurs :
Deux traitements éliciteurs capables d’activer les réactions naturelles de défense de la
plante en stimulant la voie des phénylpropanoïdes ont été retenus : la laminarine (SigmaAldrich) et le chitosan (Sigma-Aldrich) (Aziz et al., 2003 ; Khan et al., 2003 ; Rabea et al.,
2003). La laminarine, polymère de glucose (β-1,3 glucane) extrait de l’algue marine
Laminaria digitata, a été utilisée à une concentration de 200 mg.L-1 dans de l’eau. Après
dissolution complète, la solution a été stérilisée par filtration. Le chitosan est un
polysaccharide naturel extrait de l’exosquelette de crustacé. C’est une forme désacétylée de la
chitine qui est aussi un constituant de la paroi cellulaire de nombreux champignons
filamenteux. Le chitosan a été utilisé à une concentration de 20 mg.L-1 dans de l’acide
chlorhydrique 0,005N. Le pH de la solution a ensuite été ajusté à 5,5 avec de l’hydroxyde de
sodium (NaOH 1M).
infiltrations des folioles :
Les folioles ont été infiltrées à l’aide d’une aiguille. Un contrôle avec de l’H2O a
également été effectué pour évaluer le stress provoqué par l’infiltration en comparaison avec
la zone non traitée « NT ». Chacun des trois traitements a été effectué sur deux feuilles d’âge
différent en 5 points de piqûres (Figure 41).
Figure 41 : Points d’infiltration d’un traitement et les différentes zones de traitement d’une
foliole
109
suivi de l’expression par RT-PCR:
La RT-PCR est réalisée à partir des ADNc obtenus par rétro-transcription des ARNs
extraits à partir de folioles traitées des variétés Imari et Queen (cf. section 2.1.5). Pour obtenir
les résultats reflétant le niveau d’expression des gènes, les échantillons ont été ajustés à une
même concentration (1,6 µg d’ARN ont servi à la synthèse de 20µL d’ADNc).
Les PCR sur ADNc nouvellement synthétisés ont été effectuées sur les 3 gènes cibles
F6H1, F6H2 et F6H3, un gène de référence et 2 gènes de contrôles.
Le gène de l’ubiquitine considéré comme constitutif et ubiquitaire a été choisi
comme référence.
Les gènes PAL1 et IFS1 codant respectivement pour la phényl ammonia lyase
(PAL) et pour l’isoflavone synthase (IFS) ont été utilisés comme « contrôles».
Pour amplifier les séquences, des amorces spécifiques ont été dessinées (cf. section
2.1.6) pour PAL1 (référence Genbank X52953.1) et IFS1 (référence Genbank AF195798) et
un couple extrait de la littérature a été utilisé pour la séquence Ubi (Tableau 8). Ces dernières
permettent d’amplifier des fragments compris entre 132 et 531pb.
Tableau 8 : Amorces utilisées pour l’amplification des transcrits PAL1, IFS1 et Ubiquitine
Tm moyen de chaque couple: 56°C
Nom de
Amorce
l’amplicon
Forward
PAL1
PAL1-F
GCCAAAAGAGGTTGAAGGTG
PAL1-R
IFS1
IFS1-F
AAGTAGGAAGGGACCCCAAA
Ubi
Ubi-F
TCTGACACCATTGACAATGTG
Séquence 5’3’
Amorce
Reverse
Séquence 5’3’
Taille de
Référence
l'amplicon
AACCAAAGCTTCTGCAAACAA
Genbank X52953.1
422pb
IFS1-R
CGTACGAAACAAAGACAAATGG
Genbank AF195798
531pb
Ubi-R
CTTCTGGATGTTGTAGTCAGC
Subramanian et al.2005
132pb
Des amorces spécifiques ont été dessinées (cf. section 2.1.6) pour amplifier chacun des
trois gènes F6H1, F6H2 et F6H3 à partir des séquences génomiques. Ces amorces amplifient
des fragments courts (entre 227 et 442 pb) à la fin du dernier exon et la partie 3’UTR
(Tableau 9).
110
Tableau 9 : Amorces utilisées pour les amplifications des ARNm F6H1, F6H2 et F6H3
Tm moyen de chaque couple: 56°C
Nom de
Amorce
l’amplicon
Forward
Séquence 5’ 3’
Amorce
Reverse
Séquence 5’ 3’
Taille de
l’amplicon
F6H1
F6H1-F
GCGAAAAGCAGGGTCATAGT
F6H1-R
AGCAATGCTGGACATCCTTT
442pb
F6H2
F6H2-F
TTTGGGTTGACCAATGTTGA
F6H2-R
AAAGTTTTCTTTATTCTCAGCTCTTTT
227pb
F6H3
F6H3-F
TTTGGCTTGACCAATGTTGA
F6H3-R
GCCCCTGTCATGATATCCAA
322pb
Les PCR ont été réalisées avec le Master mix de Promega (cf. section 2.1.6) dans les
conditions suivantes : une dénaturation initiale à 94°C pendant 5 min suivie de 40 cycles
consistant en une dénaturation à 94°C pendant 1 min, une hybridation à 56°C pendant 1 min
(Tm moyen du couple utilisé) et une élongation à 72°C pendant 1 min. Après les 40 cycles, la
réaction de PCR se termine par une étape d’élongation à 72°C pendant 10 min. L’identité des
3 ARNm amplifiés a été contrôlée sur gel d’agarose et les fragments amplifiés ont été
séquencés.
 À partir de germes et de cotylédons
L’expression des trois gènes F6H1, F6H2 et F6H3 a également été suivie par RT-PCR
dans les germes à 25 JAF et 40 JAF et les cotylédons à 40 JAF et 50 JAF. Quatre réplicats
biologiques pour chacun des compartiments des variétés Queen, Imari, NS Kasha, Dwight+,
Dwight – et PI567580A ont été analysés.
La RT-PCR est réalisée à partir des ARNs totaux de germes et de cotylédons (cf. section
2.1.5). Pour obtenir les résultats reflétant le niveau de transcription des gènes, la même
méthodologie que pour les feuilles élicitées a été appliquée pour calibrer la quantité d’ARNs
totaux ainsi que pour les amplifications PCR (mêmes gènes, mêmes amorces, mêmes
conditions PCR).
111
112
CHAPITRE III :
Étude de l’expression des gènes de la voie de biosynthèse
des isoflavones dans les compartiments de la graine
113
1 INTRODUCTION
Les graines de soja contiennent de grandes quantités d’isoflavones (génistéine,
daidzéine et glycitéine). Selon de précédentes études réalisées au laboratoire, la teneur en
isoflavones et leur composition dans les graines de soja présentent une variabilité marquée si
l’on considère séparément les deux compartiments de la graine : les cotylédons et le germe.
La glycitéine et la daidzéine sont en effet les deux plus importantes isoflavones du germe
alors que dans les cotylédons la génistéine et la daidzéine prédominent. De plus, les
isoflavones sont quatre à dix fois plus concentrées dans les germes que dans les cotylédons
(Rasolohery et al., 2008). Un net décalage de leur accumulation est observé entre ces deux
compartiments au cours du développement de la graine. En effet, la teneur en isoflavones ne
commence à augmenter dans les cotylédons que lorsqu’elle a atteint son maximum dans les
germes (Berger et al., 2008).
La voie de biosynthèse des isoflavones est à ce jour bien caractérisée, de nombreux
gènes codant pour les principales enzymes de cette voie ont été clonés chez le soja (Dixon et
al., 2002 ; Yu et McGonigle, 2005) et la présence de SNPs (Single Nucleotide Polymorphism)
corrélés aux teneurs en isoflavones sur les séquences des isoflavone synthases a été soulignée
(Cheng et al., 2008).
Les expérimentations entreprises visent à lever une partie du voile sur le déterminisme
génétique à l’origine des différences rencontrées pour la teneur en isoflavones et leur
composition dans les germes et les cotylédons de la graine de soja au cours de son
développement. Une meilleure compréhension doit être en effet permise par l’étude du
polymorphisme de séquence des gènes IFS1 et IFS2 codant pour les isoflavone synthases,
enzymes clefs de la voie de biosynthèse des isoflavones. L’étude porte également sur le suivi
de l’expression de ces deux gènes IFS1 et IFS2 et d’autres gènes (CHS, CHR, CHI) situés en
amont dans cette voie de biosynthèse, à différents stades critiques de développement pendant
la maturation de la graine, dans des variétés très différentes pour leur teneur et leur
composition en isoflavones. Ceci doit conduire à une potentielle identification des relations
entre l’expression de ces gènes et le contenu et la composition en isoflavones dans les germes
et les cotylédons.
Ainsi, la problématique consistera-t-elle à évaluer si le polymorphisme de séquence
(présence de certains SNPs sur les isoflavone synthases) et/ou si les taux d’expression de
114
certains gènes clefs de cette voie, sont liés aux différences de teneur et composition en
isoflavones observées dans ces deux compartiments distincts de la graine de soja.
Afin de conforter les travaux antérieurs (Rasolohery et al., 2008) montrant les
différences de teneur et de composition en isoflavones ainsi que le net décalage de leur
accumulation dans les deux compartiments, les expérimentations ont porté sur deux variétés
aux comportements contrastés (Imari et Queen) cultivées en serre et dont les graines ont été
prélevées et disséquées à différents stades de développement : de 25 JAF (R5, début du
grossissement de la graine) jusqu’à 70 JAF (R8, maturité).
Les résultats obtenus ont fait l’objet d’une première publication scientifique insérée
dans ce document de thèse :
ARTIGOT M-P., DAYDÉ J., BERGER M., 2012.
Expression of key genes of the isoflavonoid pathway in hypocotyls and cotyledons during
soybean seed maturation.
Crop Science (accepté pour publication).
115
2 PUBLICATION SCIENTIFIQUE
116
EXPRESSION OF KEY GENES OF THE ISOFLAVONOID PATHWAY IN
HYPOCOTYLS AND COTYLEDONS DURING SOYBEAN SEED MATURATION
Marie-Pierre Artigot, Jean Daydé and Monique Berger*
Université de Toulouse, Ecole d’Ingénieurs Purpan, Toxalim UMR 1331 INRA/INP/UPS - 75, voie
du TOEC - BP 57611 – 31076 Toulouse cedex 3 – France
Received ________________________; Corresponding author ([email protected])
117
ABSTRACT
Soybean seeds accumulate large amounts of isoflavones, known for their phytoestrogenic activities.
Three isoflavones (genistein, daidzein and glycitein) are found in the seed. They are 4 to 10 time
more concentrated in hypocotyls than in cotyledons. Moreover, isoflavone composition markedly
diverges between these two seed parts and their accumulation kinetic begin in cotyledons at 40
Days After Flowering (DAF), once accumulation
in hypocotyls has plateaued. The relation
between the genes of the isoflavonoid pathway and the isoflavone content has been determined
through an investigation of
i) the variability of IFS genomic sequences in 6 cultivars with
contrasted isoflavone content and ii) the expression of key genes in 2 cultivars at 25, 40 and 60
DAF, in hypocotyls and cotyledons. Isoflavone synthases (IFS1 and IFS2) polymorphism was not
related to the isoflavone content. The CHS7 and CHS8 expression levels were only related to
isoflavone accumulation kinetics in the cotyledons, but not with the total content in the seed at
maturity. CHS9 was the most expressed CHS isoform, and the only one correlated with the
hypocotyl isoflavone accumulation kinetics. The CHR and CHI expression profiles were
significantly different between the two seed parts. These results indicate that isoflavone pathway is
under very different regulation control in cotyledons and hypocotyls during the seed maturation.
This discrepancy should be taken into account in the studies on genetic and environmental effects
on isoflavone contents.
118
INTRODUCTION
Isoflavonoids belong to a distinct group of secondary metabolites derived from the
phenylpropanoid pathway. These compounds are found predominantly in leguminous plants, and in
particularly high level in soybean seeds. They play essential roles in plant environment interactions
especially for plant- microbe interaction (Graham and Graham, 1996; Subramanian et al., 2005;
Subramanian et al., 2006; Naoumkina et al., 2010). Isoflavones are also extensively studied for
their potential role in human health (Messina et al., 2009; Taylor et al., 2009). However, even if
their health benefits are generally highlighted, due to their phytoestrogenic activity, it has also been
pointed out that they are potentially harmful (Wuttke et al., 2006; Turck, 2007). Moreover, given
their metabolism, all the isoflavones may not have the same effect on health (Ruefer et al., 2007;
Choi et al., 2008).
Three isoflavones (genistein, daidzein and glycitein) are found in the seed. They are four to ten
times more concentrated in hypocotyls (embryo axis) than in cotyledons. Additionnally, isoflavone
composition markedly diverges between these seed parts: glycitein and daidzein are the most
abundant isoflavones in hypocotyls while only genistein and daidzein are found in cotyledons
(Tsukamoto et al., 1995; Kim et al., 2007; Berger et al., 2008; Rasolohery et al., 2008).
The isoflavone pathway is well characterized, and many of the corresponding genes have been
cloned from soybean and other leguminous species (Dixon et al., 2002). The first key enzyme is
chalcone synthase (CHS) which produce naringenin chalcone (Yu and Jez, 2008). In soybean, nine
genes are known to encode CHS (Tuteja and Vodkin, 2008). These family members exhibit a large
similarity of nucleotide sequences in the coding regions (80 to 99%) and play an important role
during the plant development or in response to environmental stimuli (Shimizu et al., 1999; Chen et
al., 2009; Chen et al., 2011). Recently, CHS7 and CHS8 expressions have been correlated to
isoflavone accumulation in the seed (Yi et al., 2010a). Chalcone reductase (CHR) can then produce
isoliquiritigenin from naringenin chalcone. This enzyme activity is therefore a crucial step in the
119
determination of the genistein to daidzein ratio (Yu et al., 2000). In soybean, CHR is encoded by a
gene family comprising at least 11 putative members (Naoumkina et al., 2010), but only one has
been cloned and characterized (Welle and Grisebach, 1989).
The chalcone intermediates are converted in liquiritigenin and naringenin, the flavanone
precursors of daidzein and genistein, respectively, by chalcone isomerases (CHI). These enzymes
are grouped in two classes: the class II CHI genes are more probably those implicated in the
isoflavone pathway. The class I CHI can only transform naringenin chalcone whereas the class II
CHI also accept isoliquiritigenin (Ralston et al., 2005). The biosynthesis of glycitein is not
completely elucidated. However, it is admitted that its flavanone intermediate (6,7,4’trihydroxyflavanone) is produced from liquiritigenin (Latunde-Dada et al., 2001).
The isoflavone skeleton is constructed by a cytochrome P450, 2-hydroxyisoflavanone synthase
(IFS; isoflavone synthase) which catalyze the C-2 to C-3 aryl migration (Jung et al., 2000). Two
genes, IFS1 and IFS2, with a high sequence similarity (93%) have been identified in soybean. The
two isoforms can convert naringenin and liquiritigenin in their corresponding isoflavanone, both
with a better efficiency for liquiritigenin (Steele et al., 1999; Jung et al., 2000). The glycitein
putative intermediate is also converted in its corresponding isoflavanone by IFS2 (Latunde-Dada et
al., 2001). IFS1 and IFS2 are expressed in all the plant tissues, with a maximum for IFS1 in root
and seed coat, whereas IFS2 is most highly expressed in the seed or in response to elicitation
treatment (Dhaubhadel et al., 2003).
Environment, genotypes and their interaction are widely recognized for their influence on seed
isoflavone content (Lee et al., 2003; Primomo et al., 2005; Rasolohery et al., 2008). However,
despite large effects of environment, broad-sense heritability for total or individual isoflavone
content is generally found to be high (> 0.70). Several quantitative trait loci (QTL) for individual or
total isoflavone concentrations in soybean seeds have recently been discovered (Kassem et al.,
2004; Primomo et al., 2005; Zeng et al., 2009; Gutierrez-Gonzalez et al., 2011). All these studies
120
have found many QTL with small individual additive effects, often environment dependent and
with AA epistasis, demonstrating the complexity of isoflavone traits. These QTL are generally
dependent on the parental lines. Nevertheless, some major QTL have been found in different
crosses and environments and genes of the isoflavone pathway have been suggested as candidate
genes (Gutierrez-Gonzalez et al., 2010b). On the other hand, a polymorphism study of IFS1 and
IFS2 from different Chinese cultivars revealed some causative SNPs that are associated with
soybean seed isoflavone levels (Cheng et al., 2008).
Previous studies have shown differential expressions of isoflavone pathway key genes in diverse
soybean tissues but only a few studies have been conducted on the whole seed at different
development stages. These works were done without distinction of hypocotyls and cotyledons
(Dhaubhadel et al, 2003, 2007; Chen et al., 2009; Gutierrez-Gonzalez et al., 2009, Yi et al. 2010).
Even though it does not impact in a serious manner the seed weight (2.5 %), the hypocotyl can
provide up to 20% of the total seed isoflavone. It has been shown that these two seed parts are under
distinct control, with different accumulation times and quantities (Berger et al., 2008), different
environmental responses (Rasolohery et al., 2008), and weak genetic correlation between
cotyledons and hypocotyls contents and profiles (Daydé et al., 2004). Furthermore, their gene
expression patterns can widely differ during the seed development, as it has been shown for Kunitz
trypsin inhibitor genes (Perezgrau and Goldberg, 1989).
In this study, our aims are i) to evaluate IFS1 and IFS2 polymorphisms in cultivars highly
differentiated for isoflavone content, taking into account the differences between the seed parts, and
to identify potentially related SNPs or indels ii) to follow IFS1 and IFS2 expression in cotyledons
and hypocotyls at critical stages during the seed maturation in cultivars differing in their isoflavone
content and composition (Berger et al., 2008; Rasolohery et al., 2008) and iii) to investigate the
relationships between the expression of upstream key genes in the isoflavonoid pathway (CHS,
121
CHR, class I and II CHI multi-gene family members) and the contrasted isoflavone content and
composition of hypocotyls and cotyledons.
MATERIALS AND METHODS
Plant material and growth conditions
Six soybean cultivars have been used: Imari, Queen, Noir de Toulouse, NS Kasha and 2
accessions from the USDA, Soybean Germplasm Collection (Urbana, IL, USA), Qi si mi
(PI567580A) and Bai gun dou (PI567417C). Imari, Queen, Noir de Toulouse and NS Kasha were
already known for their highly contrasted isoflavone content and composition. The two USDA
accessions have been observed during the evaluation of the USDA Soybean Germplasm Collection
by R. Nelson (Nelson, personal communication). Plants were sown in March and grown in a
greenhouse with natural light at Toulouse, France (43°36'N; 1°24'E). Inoculated seeds with
Bradyrhizobium japonicum were planted in 30 cm diameter (5L) pots in a 1:1:1 soil: sand: peat
mixture. After germination, two plants per pot were maintained. The 36 pots (6 per cultivar) were
completely randomized. Irrigation was given as necessary to avoid water stress, and twice a week,
the plants were fertilized with 200mL of a solution of N:P:K and micro elements (modified
Hoagland solution with half strength N).
Sampling
Young leaves were harvested on three plants per cultivar. They were immediately flash frozen in
liquid nitrogen and stored at -80°C till genomic DNA extraction.
Seeds of Imari and Queen were regularly harvested during their maturation at six development
stages, from 20 DAF to the complete maturity (70 DAF). Each sample was made of 10 seeds
collected at the same stage on 6 different plants of the same cultivar, at the same time, a duplicate
(twin) was made with 10 seeds of the same pods and this was replicated on 6 other plants. Upon
harvest, cotyledons and hypocotyls were rapidly separated by hand and flash frozen with liquid
122
nitrogen. Two samples of dissected cotyledons and hypocotyls were freezed-dried, weighed, and
kept at -20°C until the isoflavone analysis. Their “twins” were stored at -80°C until further use for
gene expression analysis.
Isolation of IFS1 and IFS2 genomic sequences
Total genomic DNA was extracted from 100mg of leaf tissue, using the DNeasy Plant Mini Kit
(Qiagen, Courtaboeuf, France) according to the manufacturer’s recommendations. The
concentration of DNA was determined at 260nm with a NanoDrop ND-1000 UV-Vis
spectrophotometer (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE, USA). Specific primers were
designed using Primer3 software version 0.4.0 (http://frodo.wi.mit.edu/primer3/) (Rozen et Skaletsky,
2000). Two primer sets were designed. The forward primers were designed on 5’specific
untranslated region (UTR) (700bp upstream the start codon for IFS1 and 1000bp for IFS2) and the
reverse on 3’UTR (100bp downstream the stop codon) to amplify specifically the whole IFS1
(2588bp) and IFS2 (2877bp) genes and a significant fraction of the promoter. Primer sets were as
follows: (F: 5’-AACACAAGCAAGGGCTTTAGG-3’/ R: 5’-CATAAAAAGCAACTGCGATGG3’), annealing temperature 61°C, and (F:5’-GCAAAGAGAACCAAAACAAAATTTG-3’/ R: 5’GATGAACGAGACCTTATTGAAATGATG-3’), annealing temperature 62°C for IFS1 and IFS2,
respectively. PCR were conducted in a 50µl reaction volume by using 2.5 units of Taq DNA
polymerase (Invitrogen, Carlsbad, USA) following manufacturer’s recommendations with a
GeneAmp PCR System 9700 thermocycler (Applied Biosystems, Forster City, USA).
Thermocycling was performed as follows: an initial denaturation at 94°C for 5 min, 30 cycles
consisting of denaturation at 94°C for 45 s, annealing at 61°C (i.e., IFS1) or 62°C (i.e., IFS2) for
1min, and extension 72°C for 3 min. After the cycles the PCR reaction ended with an extension at
72°C for 10 min. The expected length of PCR products was checked on a 0.8% agarose gel under
UV light after SYBR Gold staining.
123
PCR products were ligated in the pCR2.1-TOPO vector (Invitrogen, Carlsbad, USA) for
amplification in TOP10F’ E.coli competent cells (Invitrogen, Carlsbad, USA). Plasmids were
purified by using the GenElute Plasmid Miniprep kit (Sigma-Aldrich). Miniprep-purified plasmids
were sequenced on both strands with M13F and M13R and internal specific primer sets on a 3130
XL automated DNA sequencer (Applied Biosystems, Forster City, USA). Three replicates based on
three different PCR were realized by gene and by cultivar. Sequenced fragments were analyzed on
BioEdit (Hall, 1999) and assembled using Multalin (http://multalin.toulouse.inra.fr/multalin/)
(Corpet, 1988).
Chemicals used in HPLC
HPLC grade acetonitrile and methanol were purchased from SDS (Peypin, France). Deionized
water was generated from a Milli-Q analytical deionization system (Millipore, Saint Quentin
Yvelines, France). Purified standards of genistein, daidzein, glycitein, and of their 7-Oglycoconjugates, genistin, daidzin and glycitin were purchased from Chromadex (Santa Ana, CA,
USA).
Isoflavone extraction and HPLC analysis
The harvested freeze-dried hypocotyls and cotyledons were ground in liquid nitrogen using
ceramic mortars and pestles. Duplicate aliquots of each finely powdered sample (0.1 g particles Ø
<0.200mm) were extracted with 80% aqueous methanol for 2h at room temperature (50mg powder
in 1ml for cotyledons and 2mg in 100 µL for hypocotyls). The residue was removed after
centrifugation 10 min at 12000g and decantation of the clear supernatant.
The supernatant was filtered (0.2 μm, Acrodisc Syringe Filters, GHP membranes) and analyzed
by HPLC with a P4000 pump controller, AS3000 autosampler (Spectra Physics Analytical Inc.,
Fremont, California, US) and an UV 340 detector (Dionex, Voisins Le Bretonneux, France). The
analytical C18 column, 35 x 4.6 mm i.d., 1.5 µm, Turbo80-ODS (Cluzeau, Sainte Foy La Grande,
France) was kept at 30°C. The mobile phases were 0.05% (v/v) trifluoroacetic acid in water (solvent
124
A) and acetonitrile (solvent B) with a 12 min multistep gradient elution. Solvent B increased from 0
to 16 % in 2 min, then to 24 % in 4 min, to 32% in 3 min, and finally increased to 100% in 1 min.
The gradient program recycled back to the initial state of 100% solvent A in 2min. UV absorbance
was monitored at 260 nm. The injection volume was 2 μL and the flow rate was 1.3 mL. min-1.
Identification and quantification of each isoflavone component were realized as previously
described in Hubert et al. (2005).
RNA isolation and cDNA synthesis
Each sample (50 mg of flash-frozen tissue) for gene expression analyses was ground using
Fastprep lysing matrix tubes (MP Biomedicals, France) with a FastPrep®-24 system (MP
Biomedicals, France). Total RNA was isolated from each sample with 1ml of QIAzol reagent
(Qiagen, Courtaboeuf, France) by standard isopropanol-chloroform precipitation. The resulting
RNA pellets were washed with 75% ethanol and resuspended in RNase free water. RNA
concentration was measured using a NanoDrop ND-1000 UV-Vis spectrophotometer (NanoDrop
Technologies, Wilmington, DE, USA). The quality and the integrity of RNA was determined with
the 260 : 280 nm and 260 : 230 nm absorbance ratios and checked on 1.2% agarose gel
electrophoresis (Sambrook et al., 1989), prior to DNase digestion. For each sample, 2µg of total
RNA was digested in a volume of 20 µL with RNase-Free DNase I (Qiagen, Courtaboeuf, France)
to remove genomic DNA contamination according to the manufacturer’s instructions. After DNase
I digestion, RNA concentration was determined again with the NanoDrop spectrophotometer, and
first-strand cDNA synthesis was performed using 2 µg of DNase-treated total RNA in a 20 µL
reaction using an High Capacity cDNA Archive Kit (Applied Biosystems, Forster City, USA),
following the manufacturer’s instructions. RT- controls were identical to cDNA reactions, except
that water was added to the solution instead of reverse transcriptase. All cDNA samples were
diluted 1:5.
125
Primer Design
The expression of 14 genes was followed: nine genes coding for chalcone synthases CHS,
(Clough et al., 2004; Tuteja and Vodkin, 2008) (i.e., CHS1, CHS2, CHS3, CHS4, CHS5, CHS6,
CHS7, CHS8, CHS9), four genes coding for chalcone isomerases CHI, (Ralston et al., 2005) (i.e.,
CHI1A, CHI2, CHI1B1, CHI1B2), the two isoflavone synthases IFS (Subramanian et al., 2004)
(i.e., IFS1, IFS2) and one for chalcone reductase CHR (Welle and Grisebach, 1989). Based on
soybean mRNA sequences published in National Center for Biotechnology Information (NCBI)
Genbank (Table 1), specific primer pairs for corresponding genes were designed using Primer
Express software Version 2.0.0 (Applied Biosystems, Forster City, USA). For IFS1 and IFS2
primer sets, mRNA sequences of Imari and Queen cultivars (i.e., JN133900, JN099682, JN133902,
and JN133901 GenBank accession numbers in this study) were used. Specific Primer pairs were
defined to amplify 51 bp to 136 bp fragments. Primer specificity was confirmed theoretically by
blasting
primer
sequence
against
soybean
genome
sequences
at
Phytozome
(http://www.phytozome.net/) using the BLASTN algorithm, and experimentally by obtaining
unique amplification products as evidenced by dissociation curve peaks. All products were
sequenced and compared with the target gene (Table1).
RT-qPCR
RT-qPCRs were performed in 96-well plates using the CFX96 real-time PCR detection system
(Bio-Rad, Hercules, CA, USA). IQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) was
used for real-time DNA quantification following the manufacturer’s recommendations. Each run
includes a negative control without cDNA template for each primer combination. Two biological
replicates and three technical replicates for each of them were performed. A 900 nM primer
concentration and 5µL of prepared cDNA (5-fold dilution) were used in a final volume of 25 µL
per well. PCR conditions for all genes were set up as follows: 95°C for 3 min, followed by 40
cycles of amplification at 95°C for 10 s for denaturing, 60°C for 30 s for a combined annealing/
126
extension step. Following amplification, a melting curve program (60 to 95°C with a heating rate
of 0.5°C s-1) was added.
Relative Gene Expression Analysis in RT-qPCR
Housekeeping genes were used for the normalization of the expression of the target genes.
According to a previous study, the soybean genes encoding actin and β-tubulin were selected
(Gutierrez-Gonzalez et al., 2010a). The software Best-Keeper (Pfaffl et al., 2004) (http://genequantification.com/bestkeeper.html) was used to determine which of the HKGs is most suitable and
can be used for the normalization of the target gene expressions. Compared with actin, transcripts
levels obtained for β-tubulin gene exhibited the lowest variation with a standard variation (SD) <1
and a coefficient of variation of 1.79 (vs 2.2 for actin). Thus, the relative transcript levels of the
target genes were estimated by normalizing them against β-tubulin.
Data was analyzed with the LinReg PCR software (v11.0, university of Amsterdam, Amsterdam,
Netherlands), (Ruijter et al., 2009).
Statistical Analyses
Isoflavone concentration (in µmol.g-1) and normalized relative gene expression were analyzed
following the general linear model with XLSTAT 2011 (Addinsoft, Paris, France) to identify
significant cultivar and stage main effects and their interaction. Tukey’s tests were made on cultivar
x stage interaction means.
127
RESULTS
Isoflavone synthase genomic sequences between contrasted cultivars
The two genomic sequences obtained for the 6 cultivars included a 5’ upstream flanking portion
of the promoter region, the 5’UTR, and terminated in the 3’UTR (as predicted in phytozome).
Despite their highly contrasted isoflavone contents (Table 2), the 6 cultivars did not display a great
variability in their genomic IFS1 and IFS2 sequences. They have been separated in two groups
(Table 3 and 4): on the one hand Imari, Queen, Noir de Toulouse and PI567580A (allele 1) and on
the other hand NS Kasha and PI567417C (allele 2). In the IFS1 sequence (Table 3), the allele 1 had
a higher similarity with Williams 82 (Glyma1 soybean reference sequence assembly in Phytozome,
(Schmutz et al., 2010)) than the allele 2. Most of the differences were in the promoter region. Only
three SNPs have been found in the coding region: in the first exon at position 1561 (Glu 265 Gly)
for the allele 1 and two SNP in the second exon for the allele 2 (synonymous mutations on Thr 309
and Thr 498 codons). The polymorphism was lower in IFS2 (Table 4). It has been exclusively found
in non-coding regions. The allele 1 had less similarity with Williams 82 than the allele 2. However,
the isoflavone content (Table 2) was not correlated with the allelic forms of the isoflavone
synthases. Queen, NS Kasha and Noir de Toulouse accumulated twice as much isoflavones as Imari
in their cotyledons whereas PI567417C had very low isoflavone content (10 times less than Imari).
In hypocotyls, the isoflavone content was between 2.53 and 15.09 µmol.g-1.
Accumulation of isoflavones in the seed fractions
The accumulation of total isoflavones has been monitored separately in the hypocotyls and
cotyledons in Imari and Queen from 25 to 70 DAF (Figure 2). In the cotyledons, the total isoflavone
content at maturity was significantly lower in Imari than in Queen (0.6 µmol.g-1 vs 1.5 µmol.g-1,
respectively). In the two cultivars, the isoflavone accumulation began in cotyledons after the 40 th
DAF. In contrast, the isoflavone accumulation began very early in the hypocotyls and the content
was very high. As soon as 25 DAF, the total isoflavone content has already reached 5.3 µmol.g-1
128
and 3.3 µmol.g-1 in Queen and Imari, respectively. Thus, it was quite stable from 32-40th day after
flowering and yielded values around 10 µmol.g-1 at maturity.
Expression of isoflavone synthase genes
Since these two genes have the same sequence in the two cultivars, they may be expressed
differently during the seed maturation. The dramatic differences between hypocotyls and cotyledons
were exploited to investigate the relation between isoflavone accumulation and the relative
expression of the two isoflavone synthase genes. According to the time course of the accumulation
(Figure 2) three critical stages of the seed development were selected for gene expression studies :
i) at 25 DAF, when isoflavone accumulation began in hypocotyls more than ten days before its
beginning in cotyledons; ii) at 40 DAF, when it reaches its maximum in hypocotyls and just began
in the cotyledons; and iii) at 60 DAF, when it reaches its maximum in the cotyledons.
Isoflavone synthase expression was correlated with the accumulation in the cotyledons and it was
slightly higher for IFS2 than IFS1 (Figure 3). In the cotyledons, according to the isoflavone
accumulation, the IFS1+IFS2 expression level had a 5-fold increase between 25 and 40 DAF, and
again a 5-fold increase between 40 and 60 DAF. However, the expression levels of the IFS were not
correlated with the total isoflavone content in the seed, neither at the seed fraction level (very low
expression in hypocotyls), nor at the cultivar level (the difference between IFS1+IFS2 relative
expression was not significant between Imari and Queen).
Expression of chalcone synthase genes
Beside their contrasting total isoflavone content, seed fractions as well as cultivars display
distinctive ratios of individual isoflavones (Table 5), in agreement with previous studies (Berger et
al., 2008; Rasolohery et al., 2008). There was only daidzein and genistein in cotyledons, with a
slightly higher proportion of genistein in Imari than in Queen. Glycitein was found only in the
hypocotyls, particularly in high levels in Queen, whereas genistein represented about 10% of the
total isoflavones.
129
The 9 genes coding for chalcone synthase have been followed (Figure 4). The CHS1 to CHS6
relative expression levels were very low compared to those of CHS7, CHS8 and CHS9. However,
CHS1, CHS2 and CHS3 were indubitably induced in the cotyledons of Imari (a 2.5-fold increase of
CHS3 at 40 DAF, and another 8-fold increase between 40 and 60 DAF, in contrast with the 3-fold
decrease observed in Queen). These 3 CHS genes were less expressed in the hypocotyls. The
relative expression of CHS4, CHS5 and CHS6 was low and equivalent in cotyledons and in
hypocotyls. The last three CHS genes were highly expressed: the relative expressions of CHS7 and
CHS8 were correlated with the accumulation of isoflavones in the cotyledons. However, this is not
the case for the hypocotyls. CHS9 was for far the most abundant transcript in the two seed parts,
and decreased from 25 DAF to the end of maturity. This profile is consistent with the isoflavone
accumulation in the hypocotyls. The difference between Queen and Imari was significant in
cotyledons at 25 DAF (p<0.05). The decrease was more pronounced in the hypocotyls (70 to 80%
decrease between 25 and 40 DAF for Queen and Imari, respectively) than in the cotyledons.
Expression of chalcone reductase
Chalcone reductase activity is necessary to the biosynthesis of daidzein and glycitein, which both
represent almost 90% of the isoflavones in hypocotyls, Accordingly, the highest expression of CHR
was observed in hypocotyls at 25 DAF (significantly different from the other stages and from the
expression in cotyledons at all the stages, p< 0.001) when the accumulation of isoflavones was very
active in this seed fraction (Figure 5). The CHR expression then decreased (90 % between 25 and
40 DAF). Strikingly, a significant difference was observed between Imari and Queen in cotyledons
at 60 DAF (p=0.044). However, this induction could not be related to daidzein accumulation (Table
5: 36.8% vs 43.6% of the total isoflavones for Imari and Queen, respectively).
130
Expression of chalcone isomerase genes
The chalcone isomerase is responsible for the formation of the two flavanones precursors of
genistein and daidzein. However, this enzyme competes with the chalcone reductase for naringenin
chalcone, and may therefore contribute to the genistein to daidzein ratio in a complex manner.
Three of the four CHI genes studied (CHI1A, CHI1B1 and CHI1B2) encode class II chalcone
isomerases, which accept naringenin chalcone and isoliquiritigenin, whereas CHI2 belong to the
class I, specific to naringenin chalcone (Ralston et al., 2005).
CHI1A had the highest level of expression. At 25 DAF, its relative expression in the hypocotyls
was very elevated in Imari, but not significantly different from that of Queen (p=0.056). The
difference with the cotyledons was not significant either (p=0.077 and p=0.156 with Queen and
Imari, respectively). However, there was a clear decrease in the hypocotyls during the maturation of
the seed, with a 95% and 50% decrease in Imari and Queen, respectively, between 25 and 40 DAF.
This decrease was also observed in the cotyledons of Imari (80%) at 40 DAF. Interestingly in
cotyledons, an induction of the gene was observed between 40 and 60 DAF, corresponding to the
highest activity of isoflavone accumulation in this seed part.
The expression of CHI1B1 paralleled that of CHI1A in hypocotyls, with a 80% decrease between
each stage in the two cultivars (significant for all, p<0.05), but in contrast to CHI1A, it did not
increase in cotyledons. The expression of CHI1B2 was induced in the cotyledons of Queen, with a
2-fold increase between 25 and 40 DAF, and a 5.7-fold increase between 40 and 60 DAF (highly
significant, p<0.01). At the same time, the expression decreases in the hypocotyls. CHI2 had a low
relative expression and a constant decrease in the two seed parts during the seed maturation.
131
DISCUSSION
The flavonoid pathway intermediates are common precursors of many secondary metabolites
(Winkel-Shirley, 2001; Yu and Jez, 2008). Thus, isoflavone synthase which catalyzes the first step
of the isoflavone pathway could be a bottleneck in the pathway. The polymorphism already found
in IFS1 and IFS2 coding sequences (Kim et al., 2005) has not been correlated with the isoflavone
content. However, another study on more contrasted cultivars including non-coding upstream
regions has found 5 SNPs correlated with isoflavone content (Cheng et al., 2008).
According to these previous studies, IFS2 displayed less polymorphism than IFS1 (Cheng et al.
2008). Interestingly, the specific mutations found in IFS1 allele 2 vs allele 1 were also found in 6 of
the 17 Chinese Glycine max cultivars studied by Cheng et al., (2008). Likewise, 4 of these 17
cultivars also had the IFS2 allele 2, and one of them had the IFS1 and IFS2 allele 2. Though the 18
Korean Glycine max cultivars studied by Kim et al. (2005) were only sequenced on their coding
regions, they also displayed the two IFS1 alleles: 3 of them had the 1561G>A SNP (allele 1) and 4
displayed the 1914T>A SNP (allele 2). In the same manner, we did not found any relation between
these two allelic forms and cultivar differences in isoflavone content. Furthermore, none of the 5
SNP previously found correlated with isoflavone content (Cheng et al., 2008) have been observed
in the 6 cultivars studied here.
The IFS2 gene is most expressed in the developing seed and related with isoflavone accumulation
(Dhaubhadel et al., 2003; Gutierrez-Gonzalez et al., 2010a). This is consistent with a colocalization
recently found of this gene with a QTL for isoflavone content (Gutierrez-Gonzalez et al., 2010b).
Despite their common IFS1 and IFS2 sequences, Imari and Queen displayed highly contrasted
phenotypes. However, while these differences cannot be related to the protein sequence, any nondetected variations in the genomic sequence may modulate the expression level of the transcripts. In
this study, the relative expression levels observed did not significantly differ between the two
cultivars. Moreover, the relative expression at 60 DAF in the cotyledons was in favor of Imari,
132
which had the lowest isoflavone content. Thus, neither the sequence, nor any transcriptional or post
transcriptional activity could explain any limiting effect of isoflavone synthase in this study. The
finding of SNP related to isoflavone content in these two genes, as well as the multiple cultivar
dependent QTLs and AA epistatic effects found in previous studies (Kassem et al., 2004; Primomo
et al., 2005; Zeng et al., 2009; Gutierrez-Gonzalez et al., 2011) indicate that the regulation of this
pathway is highly complex and can vary with the genotypes.
Strikingly, the expression profile of IFS1 and IFS2 in hypocotyls was rather low and followed
more the isoflavone accumulation in the cotyledons than in the hypocotyls. This corroborates the
hypothesis of a separated regulation of the isoflavone pathway in these two seed parts (Berger et al.,
2008) and probably a large part of post-translational regulations which could be related to the
integration of these enzymes in multienzymatic complexes.
As it has previously been reported, the chalcone synthases CHS7 and CHS8 expression are related
with total isoflavone content in the cotyledons which represent the major part of the seed
(Dhaubhadel et al., 2007; Yi et al., 2010a; Yi et al., 2010b). However, contrary to Chen et al.
(2011), we did not found any relation with the isoflavone content of the cultivars. Furthermore, the
expression of these genes was not correlated with the profile of the intensive isoflavone
accumulation in the hypocotyls. This suggests wide differences between these two seed parts. This
study was also the first to follow CHS9 expression. This gene was highly expressed in cotyledons
and in hypocotyls. Moreover, it was the only CHS gene correlated with the isoflavone content in the
hypocotyls. In the cotyledons, the decrease was less intense than in hypocotyls. Remarkably, it was
also more expressed in the cotyledons of Queen, which has the higher isoflavone content. Thus a
possible implication of CHS9 in the isoflavone pathway must be investigated.
The chalcone reductase activity is required for the biosynthesis of daidzein, and probably also for
glycitein (Latunde-Dada et al., 2001). Thus, in hypocotyls, 90% of the isoflavones may be
dependent on the CHR activity. Accordingly, in this study, the followed CHR expression was
133
correlated with isoflavone accumulation in the hypocotyls. The same gene displayed an early
expression in the whole seed in a recent study (Gutierrez-Gonzalez et al., 2010a). The differential
expression of this gene in the two seed fractions may be responsible for inconsistent results
previously observed (Dhaubhadel et al., 2003; Chen et al., 2011).
The chalcone isomerase genes studied here encompassed the two CHI gene classes. The class I
gene CHI2 was the less expressed, and had a decreasing expression during the seed maturation.
When heterologously expressed in yeast, this gene only converted naringenin chalcone whereas the
class II genes were able to convert isoliquiritigenin (Ralston et al., 2005). The three other CHI
genes studied here belong to the probably most involved group in the isoflavone pathway. CHI1A
was highly expressed in the two seed parts. In hypocotyls, its expression profile coincided with the
accumulation of isoflavones. In cotyledons, a decrease between 25 DAF and 40 DAF was followed
by an increase in the late maturation stage. This gene was induced in early seed maturation and was
stimulated by long term progressive water stress in Williams 82 (Gutierrez-Gonzalez et al., 2010a).
The two other forms, CHI1B1 and CHI1B2 had yet never been followed independently in the same
study. A transient induction of CHI1B1 in the late R5 stage has been observed in the cultivar
Williams 82 (Gutierrez-Gonzalez et al., 2010a). In this study, the expression of CHI1B1
corresponded to the hypocotyl activity while CHI1B2 was induced at 60 DAF in the cotyledons of
the cultivar having the highest isoflavone content. Therefore, the implication of these two chalcone
isomerases in the isoflavonoid pathway could be the result of a distinct regulation of the isoflavone
biosynthesis pathway in the two seed parts.
In conclusion, this study has highlighted the existence of two allelic forms of IFS1 and IFS2.
However, this polymorphism was not correlated with isoflavone content. The comparison of two
contrasted cultivars for total isoflavone contents carrying the same IFS1 and IFS2 alleles pointed
out that this phenotype is not correlated with a differential expression of the isoflavone synthase
genes. This first CHS9 expression report has revealed that it was the most expressed chalcone
134
synthase isoform in the seed. Moreover, the CHS9 expression coincided with the accumulation
profile of isoflavone in hypocotyl. Finally, hypocotyls and cotyledons appeared under highly
differentiated expression patterns. Thus, we could confirm that CHS7 and CHS8 expressions were
correlated with isoflavone accumulation in cotyledons, but it was not the case in hypocotyls. The
comparison of the two seed fractions in contrasted cultivars also supports the hypothesis that CHR
expression is related to the biosynthesis of daidzein. Besides, the class II CHI may also be involved
in the specific isoflavone profiles in cultivars and/or seed fractions.
Acknowledgements: This project was supported by research grants from the «Midi-Pyrénées
Région» and its health-food network. The authors thank Pr Randall Nelson, curator of the USDA
soybean germplasm collection (Urbana, IL), for the supply of the two accessions used in this study
and the French group Euralis Semences for the supply of their germplasm accessions NS Kasha and
Noir de Toulouse.
135
REFERENCES
Les références bibliographiques de cette publication sont citées dans la partie « Références
Bibliographiques » à la fin de ce manuscrit.
136
FIGURES
Figure1: Simplified representation of isoflavone biosynthesis in soybean showing key
intermediates and enzymes. CHS: Chalcone synthase; CHR: chalcone reductase; CHI:
chalcone isomerase; IFS: isoflavone synthase – actually a 2 hydroxyisoflavanone synthase;
HID: Hydroxyisoflavanone dehydratase producing the final isoflavone; F6H: flavanone 6
hydroxylase; IOMT: putative 2,6,7 trihydroxyisoflavanone 6 O-methyl transferase
Figure 2: Total isoflavone accumulation in seed fractions during maturation, from 25 to 70
days after flowering (DAF), for two French cultivars, Imari (○) and Queen (●). Means ±
Standard deviations (n=2 samples of 10 seeds).
137
Figure 3: Isoflavone synthase (IFS) isoforms expression in seed fractions during seed
maturation (at 25, 40 and 60 days after flowering) in two cultivars, Imari and Queen. Relative
transcript ratio represents number of target gene mRNA copies relative to β-tubulin. Means ±
Standard deviations
Figure 4: Chalcone synthase (CHS) isoforms expression in seed fractions (top = cotyledons
and bottom = hypocotyls) during seed maturation (at 25, 40 and 60 days after flowering) in
two cultivars, Imari and Queen (Left: CHS1 to CHS6 and right: CHS7 to CHS9). Relative
transcript ratio represents number of target gene mRNA copies relative to β-tubulin. Means ±
Standard deviations.
138
Figure 5: Chalcone reductase (CHR) expression in seed fractions during seed maturation (at
25, 40 and 60 days after flowering) in two cultivars, Imari and Queen. Relative transcript ratio
represents number of target gene mRNA copies relative to β-tubulin. Means ± Standard
deviations.
Figure 6: Chalcone isomerase (CHI) isoforms expression in seed fractions during seed
maturation (at 25, 40 and 60 days after flowering) in two cultivars, Imari and Queen. Relative
transcript ratio represents number of target gene mRNA copies relative to β-tubulin. Means ±
Standard deviations.
139
TABLES
Table 1: Primers designed and used in real-time quantitative reverse transcription-polymerase
chain reaction (RT-qPCR) for selectively amplifying genes of the isoflavone pathway and
housekeeping genes in soybean hypocotyls and cotyledons. CHS: chalcone synthase, CHI:
Chalcone isomerase, CHR: chalcone reductase, IFS: isoflavone synthase. CHS1, CHS2 and
CHS3 primer sets were extracted directly from literature (Tuteja et al. 2004)
GenBank
Target
Primer
accession number
gene(s)
name
for target gene
Forward and reverse primer sequences
(5’to 3’)
PCR product size Ampliand location of
con
primers
Tm (°C)
CHS1
DQ239918
CHS1-F
CHS1-R
GCAAGAGAACAAATCTTTCTTTTTTCATAT
CAGAAGCATTTGCAGGGCA
104bp
pos. 1166 to 1269
78
CHS2
X65636.1
CHS2-F
CHS2-R
ACAACAAATCTTTCTTTTTTCATATGTATTG
GAAGGCAGGGCAGGGAA
85bp
pos. 2060 to 2145
76
CHS3
X53958.1
CHS3-F
CHS3-R
CCAAGTCCTTTTCTTTCTTATTCATTC
AGAAGCATGTGAGGGAAGCAG
95bp
pos. 1544 to 1639
75.5
CHS4
X52097.1
CHS4-F
CHS4-R
CACTTTGCAACATCCATCCAAG
CTGGAGCAAAGGATGAAAGTGA
71bp
pos. 782 to 852
76.5
CHS5
L07647.1
CHS5-F
CHS5-R
TGAGCCACTTTGCCACATTC
GCACGAAAGAAAAGGGTATGAGG
51bp
pos. 444 to 494
76.5
CHS6
L03352.1
CHS6-F
CHS6-R
CATCGATCCCCATCATTCATATC
CCAAGAATTAATGAAACTCAAGTAGTAGTAGC
72bp
pos. 529 to 600
74
CHS7
M98871.1
CHS7-F
CHS7-R
CAAATCGCATTGGTATCTGAAATC
TGATCTCAGCTACGCTAACCATCT
53bp
pos. 767 to 819
74.5
CHS8
AY237728.1
CHS8-F
CHS8-R
TTCTGAATATCATCACTTAATTTGAAGGAA
TCTCAGCTACGCTCACCATCTTT
51bp
pos. 804 to 854
72
CHS9
EF623853.1
CHS9-F
CHS9-R
GAACCTACCCACCCTTTTCAGTTA
TGGAAAGTGTCTTGGAATGTTGG
58bp
pos. 1967 to 1755
75
CHR
X55730.1
CHR-F
CHR-R
CTGACTTCACATGCAAGAAAGACA
CTGTTTCACGGCCTCAATGAT
53bp
pos. 99 to 154
76
CHI1A
AY595413.1,
DQ835284.1
CHI1A-F
CHI1A-R
CTTAAAACGCAGTTTGGCTTCTC
CTATAATGCCGTGGCTCAATACC
56bp
pos. 849 to 904
79
CHI2
AY595415.1
CHI2-F
CHI2-R
TCCAGATTATCTCACTTATTCAAAGAGC
GAGTTCACTTATGAGATTGAGGGTCAC
64bp
pos. 627 to 690
75.5
CHI1B1
AY595414.1
CHI1B1-F
CHI1B1-R
AACATTGAAAACTGAGAGTTGCAGC
AGGTCTTCTAAAGATAGTTGGCAACTG
51bp
pos. 728 to 778
74
CHI1B2
AY595419.1
CHI1B2-F
CHI1B2-R
AAGAGTTAGAGGCCAATCCCAAC
GTCCCCTAAAGATTGTTCTCAGTTTT
53bp
pos. 650 to 702
74.5
IFS1
this study: JN099682,
JN133900
IFS1-F
IFS1-R
GCAAATCAAGGGCCTTGTTGT
GAGCCTTTTGCAACACCCTG
116bp
pos. 895 to 1010
83.5
IFS2
this study : JN133901,
JN133902
IFS2-F
IFS2-R
ACCAAGGACCACATCAAGGGT
ACGAGCCTTTTCCAACACCTTA
126bp
pos. 1969 to 2094
83
ATGTGTGCTGCTGATCCTCG
CCACCTCCTTTGTGCTCATCTT
82bp
pos. 989 to 1070
81.5
TTGTTGGCCGACCTCGAC
CAGTTGCTGACTATACCATGCTCAAT
136bp
pos. 107 to 242
80
β-tubulin X60216.1, M21296.1, β-tubulinF
M21297.1, U12286.1 β-tubulinR
Actin
V00450.1, J01298.1
Actin-F
Actin-R
140
Table 2: Isoflavone content in the seed parts and Genbank accession number for IFS1 and
IFS2 for the 6 cultivars used. The standard error of the means has been calculated with the
ANOVA residual square.
Total isoflavones (µmol.g-1)
Cultivar
Hypocotyl
Genbank accession
Cotyledons
IFS1
IFS2
PI567580A
8.81
0.94
JQ934955
JQ934959
PI567417C
2.53
0.05
JQ934957
JQ934961
Imari
10.01
0.61
JN099682
JN133901
Queen
11.05
1.49
JN133900
JN133902
Noir de Toulouse
15.09
1.89
JQ934954
JQ934958
NS Kasha
12.50
1.67
JQ934956
JQ934960
1.72
0.35
Standard Error
Table 3: Comparison of nucleotide sequences of IFS1 gene of 6 soybean cultivars with
Williams 82 (Glycine max sequence on Phytozome v8.0)
A A
T T T C G G C C
---------------------
A G A C G
TT
G
A A
PI567580A T T T C G G C C
Williams 82 T T - C G G C C
-----------------------------------------
A G A C G
- A A T G
TT
TT
G
A
A A
A A
NS Kasha
C C T A A A A T TAATAATTAATAACTAAAATA A A G C A
A-
A
T G
PI567417C
C C T A A A A T TAATAATTAATAACTAAAATA A A G C A
Gene
Structure
458
G
300
TT
256
A G A C G
254
---------------------
228
T T T C G G C C
183
Queen
Noir de
Toulouse
174
A A
165
G
141
TT
125
A G A C G
64
---------------------
61
T T T C G G C C
36
1914
614615
Imari
207-227
2481
Position
1561
Name
AA
T G
595- 770- 1886769 1667 2553
5’UTR Exon1 Exon2
141
Table 4: Comparison of nucleotide sequences of IFS2 gene of 6 soybean cultivars with
Williams 82 (Glycine max sequence on Phytozome v8.0)
2815-2823
2831
2880
Position
556
Name
A
---------
A
G
TT
A
---------
A
G
TT
A
---------
A
G
TT
A
---------
A
G
Williams 82
AG
-
GTCATCATC
G
A
NS Kasha
TT
-
GTCATCATC
G
G
PI567417C
TT
-
GTCATCATC
G
G
2-3
Imari
TT
Queen
Noir de
Toulouse
PI567580A
9721101
5’UTR
Gene
Structure
11021998
Exon1
19992134
Intron
21352803
Exon2
3’UTR
Table 5: Isoflavone composition of the seed fractions in the cultivars Imari and Queen. For
each isoflavone, the conjugated and aglycones form has been summed and expressed in % of
total isoflavones (µmol).
Seed part
Cultivar
Cotyledons
Hypocotyls
% Genistein
% Daidzein
% Glycitein
Imari
63.2%
36.8%
-
Queen
56.4%
43.6%
-
Imari
10.8%
51.0%
38.2%
Queen
10.5%
29.8%
59.7%
142
3 SYNTHESE ET CONCLUSION
Les résultats obtenus dans cette première partie des travaux de thèse permettent
d’accéder à une meilleure compréhension du déterminisme génétique de la compartimentation
des isoflavones dans la graine de soja. Ceci a tout d’abord été permis par l’étude du
polymorphisme des séquences génomiques des gènes IFS1 et IFS2 ainsi que leur suivi
d’expression dans les deux compartiments de la graine, germes et cotylédons, à différents
stades critiques pendant la maturation de la graine dans des variétés très différentes pour leur
contenu et leur composition en isoflavones. Puis, d’autres éléments ont été apportés par
l’étude des relations entre l’expression des gènes codant pour des enzymes clefs (CHS, CHR,
CHI) situées en amont dans la voie de biosynthèse et l’accumulation des isoflavones dans les
germes et les cotylédons.
Cette approche a effectivement mis en évidence l’existence de deux formes alléliques
des séquences IFS1 et IFS2. Cependant, conformément à Kim et al. (2005b) nous n’avons pas
trouvé de liaison entre ce polymorphisme et le contenu en isoflavones. De plus, aucun des 5
SNPs précédemment identifiés comme étant corrélés avec le contenu en isoflavones (Cheng et
al., 2008) n’ont été observés ici.
La comparaison des variétés Imari et Queen différenciées par leur contenu en
isoflavones totales, portant les mêmes allèles IFS1 et IFS2, démontre que ces deux
phénotypes ne sont pas dépendants d’une expression différentielle des gènes codant pour les
isoflavone synthases (IFS). En effet, l’expression relative des gènes IFS1 et IFS2 dans les
cotylédons à 60 JAF est en faveur de la variété Imari qui possède le plus faible contenu en
isoflavones. L’activité transcriptionnelle de ces deux gènes ne semble donc pas pouvoir
expliquer les différences de teneur en isoflavones de ces deux variétés.
D’autre part, la comparaison des deux compartiments (germes et cotylédons) montre
que les taux d’expression des gènes IFS1 et IFS2 sont assez faibles dans les germes. En
revanche, dans les cotylédons les taux d’expression suivent plutôt l’accumulation des
isoflavones. Ceci corrobore l’hypothèse d’une régulation séparée de la voie de biosynthèse
des isoflavones dans ces deux compartiments (Berger et al., 2008).
Les profils d’expression très différenciés des gènes codant pour des enzymes clefs en
amont dans cette voie de biosynthèse entre les deux compartiments de la graine ont également
143
permis de renforcer cette hypothèse. En effet, l’expression de trois gènes CHS7, CHS8 et
CHS9 codant pour les chalcone synthases qui contrôlent le flux de métabolites à l’entrée de la
voie de biosynthèse des flavonoïdes, se distingue entre les deux compartiments de la graine.
Comme cela a déjà été observé dans de précédentes études (Gutierrez-Gonzalez et al., 2010a ;
Yi et al., 2010a), l’expression des gènes CHS7 et CHS8 est reliée avec l’accumulation des
isoflavones dans les cotylédons qui représentent la majeure partie de la graine et pour lesquels
la teneur en isoflavones totales est maximale à 60 JAF. Le gène CHS9, nouveau membre du
cluster CHS1-CHS3-CHS4-CHS5-CHS9 (Groupe de liaison A2 situé sur le chromosome
Gm08) (Tuteja et Vodkin, 2008) est colocalisé avec deux QTLs associés respectivement à la
teneur en isoflavones totales et en daidzéine (Gutierrez-Gonzalez et al., 2010b). Son profil
d’expression qui n’avait jamais été observé jusqu’à maintenant, montre qu’il est le gène des
chalcone synthases le plus exprimé dans les germes et les cotylédons et qu’il est le seul à
présenter un profil d’expression en adéquation avec l’accumulation des isoflavones dans les
germes. L’expression de ces gènes CHS semble clairement en lien avec les différences
observées entre les deux compartiments de la graine de soja pour la synthèse des isoflavones.
La comparaison des deux compartiments de la graine des variétés Imari et Queen, souligne
également que le profil d’expression du gène codant pour la CHR, nécessaire à la synthèse de
90% des isoflavones dans le germe, est en adéquation avec l’accumulation des isoflavones
dans le germe. Par ailleurs, ce gène est également induit à 60 JAF dans les cotylédons d’Imari,
alors que la plus forte accumulation de daidzéine a lieu dans les cotylédons de Queen. Ce
comportement étonnant pourrait indiquer une différence de régulation post- transcriptionnelle
ou l’intégration de la chalcone réductase dans une autre voie de biosynthèse. En fait, il existe
plusieurs gènes codant pour des chalcone réductases et celui-ci semble plus impliqué dans la
synthèse des isoflavones des germes que dans celle des cotylédons. Plusieurs gènes codant
pour des chalcone isomérases ont été suivis. Conformément à la littérature (Ralston et al.,
2005), les chalcone isomérases de type II (CHI1A, CHI1B1 et CHI1B2), capables
d’isomériser la naringénine chalcone et l’isoliquiritigénine, semblent plus impliquées dans la
biosynthèse des isoflavones que celle de type I (CHI2). Le gène CHI1A présente une forte
expression dans les germes et les cotylédons, et son profil d’expression coïncide avec
l’accumulation des isoflavones dans les germes. L’expression de CHI1B1 correspond aussi à
l’activité dans le germe alors que CHI1B2 est induit dans les cotylédons à 60JAF dans la
variété Queen ayant le contenu en isoflavones le plus élevé. Ainsi, les chalcone isomérases
pourraient bien avoir un rôle spécifique dans l’expression des profils caractéristiques
d’isoflavones des variétés et/ ou des compartiments de la graine.
144
Cette étude démontre clairement que ni le polymorphisme de séquences des gènes IFS1
et IFS2 ni leurs expressions relatives ne sont liés aux teneurs en isoflavones des
compartiments de la graine. Cependant, les différents profils d’expression de ces gènes et de
ceux en amont dans la voie de biosynthèse confirment l’existence de deux voies de régulation
bien distinctes de la biosynthèse des isoflavones dans les germes et les cotylédons. Ces
résultats permettent ainsi de mieux définir les facteurs génétiques contribuant à la
compartimentation des isoflavones observée dans la graine de soja (Berger et al., 2008 ;
Rasolohery et al., 2008). Cependant, ces différences d’expression dans les deux
compartiments pourraient également refléter des variations dans les mécanismes de régulation
post-traductionnelle et conduire à de nouvelles hypothèses.
145
146
CHAPITRE IV :
Étude de l’expression de gènes candidats codant pour
la Flavonoïde 6-hydroxylase, intervenant dans la
biosynthèse de la glycitéine
147
1 INTRODUCTION
Comme nous l’avons confirmé dans la première partie de nos travaux de recherche, la
teneur et la composition en isoflavones (génistéine, daidzéine et glycitéine) dans la graine de
soja sont caractéristiques des deux compartiments de la graine et un net décalage de leur
accumulation est observé dans ces deux compartiments (Berger et al., 2008 ; Rasolohery et
al., 2008 ; Artigot et al., 2012). La teneur en isoflavones ne commence à augmenter dans les
cotylédons que lorsqu’elle a atteint son maximum dans les germes. Les isoflavones sont
particulièrement concentrées dans le germe qui peut contenir jusqu’à dix fois plus
d’isoflavones que les cotylédons, devenant ainsi un sous-produit hautement valorisable pour
le marché des suppléments santé. La daidzéine et la glycitéine sont les deux isoflavones les
plus abondantes du compartiment germe alors que, dans les cotylédons, ce sont la génistéine
et la daidzéine qui prédominent. La glycitéine est en effet exclusivement présente dans le
germe.
Ces trois molécules suscitent un grand intérêt en raison de leurs propriétés
phytoestrogéniques et antioxydantes (Cederroth et Nef, 2009). Cependant, chacune d’elles
peut avoir des effets bénéfiques différents sur la santé (Lee et al., 2010a ; Wang et Chen,
2010). Les isoflavones peuvent aussi avoir des effets délétères de perturbateurs endocriniens,
notamment chez l’enfant (AFSSA et AFSSAPS, 2005). Ainsi, la teneur en isoflavones de la
matière première ou des produits transformés nécessite d’être maîtrisée.
Considérée comme une isoflavone mineure dans la graine entière, la glycitéine a été très
peu étudiée et sa synthèse n’est pas encore complètement élucidée. Une seule fonction F6H
(Flavonoïde 6-hydroxylase) a été mise en évidence par expression hétérologue d’un cDNA
(Genbank Y10490.1) isolé à partir de cellules élicitées de soja (Schopfer et Ebel, 1998). Cette
enzyme F6H catalyse l’hydroxylation en position 6 du cycle A du précurseur liquiritigénine
pour permettre la synthèse de l’intermédiaire flavanone de la glycitéine (6,7,4’trihydroxyflavanone) dans la feuille de soja (Latunde-Dada et al., 2001). Cependant, même si
ce gène est exprimé dans la feuille élicitée (Schopfer et Ebel, 1998), il n’est pas détecté dans
les stades précoces de développement de la graine (de 5 à 23 JAF) (Goldberg et Harada,
2009). De plus, le génome du soja ayant subi plusieurs cycles de duplication et de
diploïdisation (Schmutz et al., 2010), nous avons émis l’hypothèse que la flavonoïde 6hydroxylase ne devait pas être codée par un gène unique.
148
Les expérimentations entreprises visent à mieux définir et caractériser la voie de
biosynthèse de la glycitéine dans la graine, plus particulièrement dans le germe qui est
fortement concentré en ce composé. Une meilleure compréhension du processus régissant la
synthèse de la glycitéine doit être en effet permise par l’étude d’autres gènes putatifs présents
sur le génome du soja (F6H2 et F6H3) ayant une forte homologie de séquence avec le seul
déjà isolé (F6H1) dans la feuille (Schopfer et Ebel, 1998). L’étude porte également sur le
suivi d’expression de ces trois gènes (F6H1, F6H2 et F6H3) dans les feuilles élicitées et dans
les deux compartiments de la graine (germe et cotylédons), à différents stades de
développement et dans des variétés très différenciées pour leur contenu en glycitéine dans le
germe.
Ainsi la problématique consistera-t-elle à évaluer si l’expression d’un de ces gènes est
spécifique du germe, s’il est le candidat potentiel dans la voie de biosynthèse de la glycitéine,
et /ou si le taux d’expression de l’un d’entre eux est lié aux variations de teneur en glycitéine
observées dans les différentes variétés.
Afin de prendre en compte la diversité génétique (Rasolohery et al., 2008), les
différences de teneur et de composition en isoflavones entre les germes et les cotylédons et le
net décalage de leur accumulation dans ces deux compartiments (Berger et al., 2008), les
expérimentations ont porté sur quatre variétés de soja, aux teneurs extrêmement variées en
glycitéine dans les germes, dont deux ayant déjà été étudiées dans le premier volet de nos
travaux (Imari et Queen), et dont les graines ont été prélevées à différents stades de
développement. Les expérimentations ont été conduites en phytotron, et les prélèvements et
les dissections se sont étalés du stade 25 JAF (R5, début du grossissement de la graine) à 50
JAF (R7, quasi maturité).
Les résultats obtenus ont fait l’objet de la seconde publication scientifique insérée dans
ce document de thèse :
ARTIGOT M-P., BAES M., DAYDÉ J., BERGER M., 2012.
Expression of flavonoid-6-hydroxylase candidate genes in normal and mutant soybean
genotypes for glycitein content.
Molecular Biology Reports (soumis pour publication).
149
2 PUBLICATION SCIENTIFIQUE
150
EXPRESSION OF FLAVONOID 6-HYDROXYLASE CANDIDATE GENES
IN NORMAL AND MUTANT SOYBEAN GENOTYPES FOR GLYCITEIN
CONTENT
Marie-Pierre Artigot, Mathieu Baes, Jean Daydé and Monique Berger*
Université de Toulouse, École d’Ingénieurs Purpan, Toxalim UMR 1331 INRA/INP/UPS 75, voie du TOEC - BP 57611 – 31076 Toulouse cedex 3 – France
*Corresponding author: mail [email protected]
Phone : +33 561 15 30 28
Fax: +33 561 15 30 60
151
ABSTRACT
Soybean (Glycine max L.) seeds accumulate large amounts of isoflavones (genistein, daidzein
and glycitein), secondary metabolites known for their phytoestrogenic activities. Isoflavone
composition depends on the seed part and glycitein is almost found exclusively in hypocotyls.
Moreover, two major phenotypes are encountered in soybean cultivars, with either low (35%)
or high (55%) levels of glycitein in their hypocotyls. This trait was under a quasi-mendelian
heredity, implicating almost one or two genes. A CYP71D9 cDNA displaying a flavonoid 6hydroxylase (F6H) activity had previously been isolated from elicitor-induced soybean cells.
This enzyme allows the synthesis of the glycitein flavanone intermediate (6,7,4’trihydroxyflavanone) by catalyzing the A-ring hydroxylation of liquiritigenin. In this study,
the CYP71D9 gene (F6H1) and two other candidates (F6H2 and F6H3) were studied using
contrasted soybean cultivars for glycitein content (0, 35%, 55% and 80%). Their expression
was observed in chitosan elicited leaves. They encode P450 proteins of 496, 469 and 481
amino acids respectively and were responsive to chitosan in elicitated leaves. The expression
patterns of these three genes were also determined in cotyledons and hypocotyls at different
developmental stages. F6H1 and F6H2 were not expressed in the developing seed. F6H3 was
only expressed in hypocotyls. Its expression levels did not correlate with hypocotyls glycitein
content, but it was not expressed in the null mutant for glycitein. Thus, this F6H3 gene is a
good potential candidate for glycitein biosynthesis in soybean seed.
152
INTRODUCTION
Isoflavonoids are a distinct group of secondary metabolites present predominantly in
leguminous plants. They are particularly abundant in soybean [Glycine max (L.)] seeds which
contain three isoflavones: genistein, daidzein and glycitein, mostly in conjugated forms (βglycosides and their malonyl derivatives). They provide a wide range of functions, playing an
important role in plant environment interactions (Subramanian et al., 2006) and serving as
precursors for the production of phytoalexins during plant-microbe interaction (Graham and
Graham, 1996; Naoumkina et al., 2006). Isoflavones are also known for their phytoestrogenic
activities and their potential role in human health (Ferrari, 2009; Messina et al., 2009),
including those of glycitein which have been described in a large variety of cell types (Song et
al., 1999; Gutierrez-Zepeda et al., 2005; Kang et al., 2007). Due to the presence of a methoxy
group in position C6, glycitein has a low affinity to estrogenic receptors (Chang et al., 2005;
Sakamoto et al., 2010) and generate 6 hydroxy or methoxy metabolites, with an unknown
activity (Ruefer et al., 2007). However, several studies have reported a potent inhibitory
effect on invasiveness of breast and prostate cancer cells (Kim et al., 2002; Magee et al.,
2004; Clubbs and Bomser, 2009) or, more recently, in the inhibition of glioma tumor cells
invasion (Lee et al., 2010a).
Total isoflavones concentration and composition are dependent on the seed part. They can
be up to 10 times more concentrated in hypocotyls (embryo axis) than in cotyledons and,
while it is considered as a minor isoflavone in the whole seed, glycitein is present exclusively
and in large amounts in hypocotyls (Kim and Chung, 2007; Berger et al., 2008; Rasolohery et
al., 2008). Previous studies on segregating populations and in a core collection have shown
the existence of two major phenotypes (their mean values were either 35% or 55% of
glycitein in their hypocotyls), with a quasi-mendelian heredity implicating one or two genes
153
(Daydé et al., 2004). Due to their role in plant microorganism relations, the isoflavone content
is responsive to elicitor treatment (Khan et al., 2003). Isoflavones are synthesized by a branch
of the phenylpropanoid pathway (Yu and McGonigle, 2005) and elicitor treatment acts
through the stimulation of the activity of the first steps of the biosynthetic pathway (Graham
and Graham, 1996; Khan et al., 2003; Naoumkina et al., 2010). The first critical enzymes are
phenylammonia-lyase (PAL) which directs phenylalanine into the phenylpropanoid pathway,
and chalcone synthase (CHS) which produce the first flavonoid, naringenin chalcone (Clough
et al., 2004; Tuteja and Vodkin, 2008). Then, depending on the subsequent reduction of this
precursor, genistein or daidzein can be produced. The chalcone intermediates, naringenin
chalcone or isoliquiritigenin, are changed in naringenin and liquiritigenin, respectively by a
chalcone isomerase (CHI) (Ralston et al., 2005).
The biosynthesis of glycitein has not been completely elucidated yet. However, it is
admitted that its flavanone intermediate is produced from liquiritigenin (Latunde-Dada et al.,
2001). As soybean produces isoflavonoid constituents possessing 6,7-dihydroxy substitution
patterns on ring A, the biosynthetic relationship of flavonoid 6-hydroxylase to isoflavonoid
biosynthesis has been investigated. A cDNA (GenBank accession number Y10490.1) isolated
from elicitor-induced soybean cells (Schopfer and Ebel, 1998), encodes a protein with a
flavonoid 6-hydroxylase (F6H) activity (Latunde-Dada et al., 2001). This enzyme is a
cytochrome P450 monooxygenase belonging to the CYP71D subfamily (Nelson, 2009),
which
allows
the
synthesis
of
the
glycitein
flavanone
intermediate
(6,7,4’-
trihydroxyflavanone) by catalyzing the A-ring hydroxylation of liquiritigenin (Figure 1). This
intermediate
can
be
metabolized
in
its
corresponding
isoflavanone
by
a
2-
hydroxyisoflavanone synthase (known as isoflavone synthase, IFS) (Latunde-Dada et al.,
2001), responsible for the 2,3 aryl ring migration (Akashi et al., 1999; Steele et al., 1999;
Jung et al., 2000). A putative 6-isoflavone-O-methyltransferase (6-IOMT), should occur after
154
the IFS to form the glycitein. This methylation can take place on the isoflavanone or
isoflavone intermediate. However, the 6-IOMT function has never been observed in soybean.
The flavonoid 6-hydroxylase encoding gene is expressed in soybean elicited leave (Schopfer
and Ebel, 1998), but not in developing seed at very early development stages (from 5 to 23
DAF) (Goldberg and Harada, 2009). As, soybean genome has undergone multiple rounds of
duplication and diploidization during its evolution (Schmutz et al., 2010), we hypothesized
that flavonoid 6-hydroxylase is not encoded by a unique gene. In this study, our aim was to
find a candidate for the F6H function in the soybean seed.
MATERIAL AND METHODS
Plant material and growth conditions
The soybean cultivars Imari, Queen, NS Kasha and Qi si mi (PI567580A), an accession
from the USDA Soybean Germplasm Collection (Urbana, IL, USA), have been selected for
their contrasted glycitein content in hypocotyls: around 35%; 55%, 80% for Imari, Queen and
NS Kasha, respectively, whereas PI567580A is a null mutant.
Plants were grown in a phytotron (Vötsch HGC 0714, Weiss Umweltechnik, Germany).
Inoculated seeds with Bradyrhizobium japonicum were planted in 20 cm diameter (3L) pots in
a 1:1:1 soil: sand: peat mixture. After germination, one plant per pot was maintained. The 16
pots (4 per cultivar) were completely randomized. Irrigation was given as necessary to avoid
water stress. Fertilization was given twice a week with 200 mL modified Hoagland solution
with half strength N. Light, temperatures and humidity conditions were set to 23/18°C
day/night temperatures, 16/8h day/night photoperiod and 65/85% relative humidity. This
experiment has been duplicated (autumn 2010 and spring 2011).
155
Preparation of elicitors
Two elicitor treatments: laminarin and chitosan (Sigma-Aldrich) were used. Laminarin was
dissolved in water at 200 mg.L-1 and sterilized by filtration. Chitosan was dissolved in a
0.005 N HCl solution at 20 mg.L-1 and the pH was adjusted to 5.5 with 1M NaOH. All elicitor
solutions were prepared on the day of use.
Elicitor treatment and sampling of soybean leaflets
Elicitor treatments (chitosan, laminarin and a water control) were applied at the V4 stage
(Fehr et al., 1971) , on two fully expanded trifoliated leaves per plant for each cultivar Imari
and Queen. Two plants were used per cultivar.
Four treatments (5 infiltration points each) were applied on the same leaflet divided in
quarters: 3 treated (chitosan, laminarin, and H2O) and a control zone without injection. The 3
leaflets of the leaf were treated and collected 7h after elicitation, partitioned according to the 4
treatments, flash-frozen in liquid nitrogen and stored at -80°C. Two negative controls were
also collected on the opposite leaves (“T0” just before the treatment and “T7h”, 7h after
elicitation).
Seed sampling
Seeds of Imari, Queen, NS Kasha, and PI567580A were regularly harvested during their
maturation at three development stages: 25, 40 and 50 DAF. Four biological samples (pods)
were collected for each stage on four different plants per cultivar. Upon harvest, each seed (2
or 3 per pod) was rapidly dissected; hypocotyl and cotyledons were separated by hand, flashfrozen with liquid nitrogen and stored at -80°C. A similar replicate was made in the duplicate
experiment.
Choice of putative target genes
A single transcript encoding a flavonoid 6-hydroxylase has been so far isolated in soybean
(GenBank accession Y10490.1) (Schopfer and Ebel, 1998). Homologous sequences have
been researched using BLASTN algorithm on the assembly of the soybean genome, Glyma
156
1.0 (http://www.phytozome.org/soybean.php). Alignments, trees and hydrophobic profiles
have
been
made
using
bioinformatics
tools
on
Mobyle
portal
(InstitutPasteur,http://bioweb2.pasteur.fr),and Multalin
(http://multalin.toulouse.inra.fr/multalin/) (Corpet, 1988).
Genomic sequences amplification and sequencing
Total genomic DNA was extracted from 100mg of leaf tissue (DNeasy Plant Mini Kit,
Qiagen, Courtaboeuf, France), according to the manufacturer’s recommendations. The
concentration of DNA was determined at 260nm (NanoDrop ND-1000 UV-Vis
spectrophotometer, NanoDrop Technologies, Wilmington, DE, USA). The totality [between
200bp and 450bp upstream the start codon in the 5' specific untranslated region (UTR) and
between 50bp and 500bp downstream the stop codon in the 3'UTR] of the target putative F6H
sequences genes (named F6H1 for Glyma18g08950.1 corresponding to Y10490.1, F6H2 for
Glyma18g08930.1 and F6H3 for Glyma08g43890.1) was amplified using specific primers
(Online resource 1) designed with Primer3 software (Rozen and Skaletsky, 2000).
PCR were conducted in a 25µL reaction volume (PCR master mix 2X, Promega, France)
following manufacturer’s recommendations. Thermocycling (GenAmp PCR System 9700
thermocycler; Applied Biosystems, Forster City, USA) was performed as follows: initial
denaturation (94°C for 5 min), 30 cycles (1 min at 94°C; 1 min at 59°C; 3 min at 72°C) and
final extension (72°C for 10 min). The expected length of PCR products was checked on a
0.8% agarose gel under UV light after ethidium bromide staining.
PCR products were then ligated in the pGEM-T vector (Promega, France) for amplification
in JM109 E.coli competent cells (Promega, France). Plasmids were purified (GenElute
Plasmid Miniprep kit, Sigma-Aldrich) and sequenced on both strands with SP6/T7 primer set
(GATC biotech AG, Konstanz, Germany). Three replicates based on three different PCR were
conducted by gene and by cultivar. Sequenced fragments were analysed on BioEdit (Hall,
157
1999). The resulting genomic sequences have been deposited to Genbank, under accession
numbers: JX127148 (Imari), JX127149 (Queen), JX127150 (PI567580A) for F6H1;
JX127151 (Imari), JX127152 (Queen), JX127153 (PI567580A) for F6H2; and JX127154
(Imari), JX127155 (Queen), JX127156 (PI567580A) for F6H3.
Expression profile analysis
RNA isolation and cDNA synthesis
Total RNA was extracted from 50 mg of flash-frozen elicited leaflets or cotyledons
(RNeasy Plant Mini kit Qiagen, Courtaboeuf, France) or from 5mg of single hypocotyl
(NucleoSpin RNA XS kit, Macherey-Nagel, Düren, Germany) following manufacturers’
recommendations. RNA concentration was measured using a NanoDrop ND-1000 UV-Vis
spectrophotometer (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE, USA). The quality and the
integrity of RNA was determined with the 260:280 nm and 260:230 nm absorbance ratios and
checked on 1.2% agarose gel electrophoresis (Sambrook and Fritsch, 1989), prior to DNase
digestion and cDNA synthesis
For each sample, 1.6 µg of total RNA was digested in a volume of 11 µL with RNase-Free
DNase I (Fermentas, France) according to the instructions provided by the manufacturer.
After DNase I digestion, RNA concentration was measured, and first-strand cDNA synthesis
was performed using 1,6 µg of DNase-treated total RNA in a 20 µL reaction (Maxima First
Strand cDNA Synthesis Kit, Fermentas, France), following the manufacturer’s instructions.
RT- controls were identical to cDNA reactions, but that reverse transcriptase was replaced by
water. All cDNA samples were diluted 1:5.
RT-PCR
The RT-PCR reactions were performed by using the housekeeping gene soybean ubiquitin
as the RNAs calibration control. Two other control genes PAL1 (Genbank X52953.1) and
IFS1 (Genbank AF195798) coding for phenyl ammonia lyase (PAL) and isoflavone synthase
(IFS) were used. Primer set used for ubiquitin has been extracted from literature
158
(Subramanian et al., 2005). Specific primers amplifying the end of the last exon and a part of
3'UTR (short fragments between 227 and 442bp) were designed. Primer sequences were :
IFS1, F 5’-AAGTAGGAAGGGACCCAAA-3’, R 5’-CGTACGAAACAAAGACAAATGG-3’;
PAL1, F 5’-GCCAAAAGAGGTTGAAGGTG-3’, R 5’-AACCAAAGCTTCTGCAAACAA-3’;
F6H1, F 5’-GCGAAAAGCAGGGTCATAGT-3’, R’- AGCAATGCTGGACATCCTTT-3’; F6H2, F
5’- TTTGGGTTGACCAATGTTGA -3’, R 5’- AAAGTTTTCTTTATTCTCAGCTCTTTT -3’and
F6H3, F 5’- TTTGGCTTGACCAATGTTGA -3’, R 5’- GCCCCTGTCATGATATCCAA -3’.
RT-PCR was conducted in a 25 µL reaction volume (PCR master mix 2X, Promega,
France) following manufacturer’s recommendations. Thermocycling (GenAmp PCR System
9700 thermocycler; Applied Biosystems, Forster City, USA) was performed as follows: initial
denaturation (94°C for 5 min), 40 cycles (94°C for 1 min; 56°C for 1 min, and 72°C for 1
min), and a final extension (72°C for 10 min).
To control F6H1, F6H2 and F6H3 transcripts identity, the samples were deposited on 1.8%
agarose gel and the unique fragments obtained to the expected size were purified directly
from the gels using the QIAquick gel kit (Qiagen, Courtaboeuf, France) following the
manufacturer's instructions and sequenced (GATC biotech AG, Konstanz, Germany).
159
RESULTS
F6H1, F6H2 and F6H3 isolation
The putative F6H sequences have been retrieved using BLASTN algorithm on the assembly
of the soybean genome, Glyma 1.0 (Phytozome). The previously characterized Y10490.1
sequence (Latunde-Dada et al., 2001) corresponds to the predicted gene Glyma18g08950.1.
Two other predicted coding sequences with a high level of homology: Glyma18g08930
(78.7%) and Glyma08g43890 (78.8%) have been identified (Figure 2). The three genes have
been named F6H1, F6H2 and F6H3, respectively. They were sequenced in three soybean
cultivars (Imari, Queen and PI567580A). A 3637bp sequence (including 239bp upstream in
5’UTR and 46bp downstream in 3’UTR) was obtained for F6H1, a 2946bp sequence
(including 195bp in 5’UTR and 465bp in 3’UTR) for F6H2 and a 3139bp sequence (including
440bp in 5’UTR and 382bp in 3’UTR) for F6H3.
The two genes F6H1 and F6H3 showed a similar structure with two exons of 878bp and
613bp for F6H1 and 832bp and 614 for F6H3, interrupted by one long intron of 1861bp for
F6H1 and a shorter one of 851bp for F6H3. The gene F6H2 had three exons (883bp, 101bp
and 426bp) interrupted by two introns of 789bp and 87bp.
Alignments of F6H1 genomic sequences from Imari and PI567580A cultivars revealed a
99.9% homology. In the genomic sequence of Queen, many differences were in the intron,
including a 90bp deletion (Online resource 2). The three sequences showed a final 3.6%
variation rate. Among these, only two SNPs have modified the 496 amino acid sequence
(Figure 3): in the first exon at position 732 (Thr 165 Ala) and in the second one at position
3473 (Asp 459 Tyr). The genomic sequence of F6H2 in Queen and PI567580A were identical
whereas Imari had 0.2% differences (Online Resource 3), the SNP at position 283 in the first
exon induce a modification of the amino acid sequence (Ala 30 Thr). Queen and PI567580A
160
had also identical F6H3 genomic sequences (Online Resource 4), while Imari had a SNP in
the second exon (2386C>T) without influence on the amino acid sequence.
The predicted proteins should have 496, 469 and 481 amino acids for F6H1, F6H2 and
F6H3, respectively. The shorter predicted peptide for F6H2 was due to the supplementary
intron inducing a 27 amino acid deletion (from V330 to E358, Figure 4). The three proteins
F6H1, F6H2 and F6H3 correspond to predicted sequences identified in the soybean P450
database as CYP71D9, CYP71D101 and CYP71D102, respectively (Nelson, 2009).
These three proteins showed therefore high sequence similarity and none of the transitions
mutations occurred in the P450s signatures and conserved domains (Werck-Reichhart and
Feyereisen, 2000): the central part of helix I containing the consensus sequence (Ala/Gly-GlyX-Asp/Glu-Thr-Thr/Ser), although Asp/Glu was replaced by Gln for F6H2 and F6H3; the
absolutely conserved (Glu-X-X-Arg) motif essential for locking the haem pocket and
stabilizing the core structure; and the haem-binding loop (Phe-X-X-Gly-X-Arg-X-Cys-X-Gly)
(Figure 4). The hydropathy plots (Kyte and Doolittle, 1982) of the three predicted proteins
were quite similar, excepted for F6H3, which have lost its N terminal transmembrane domain
(Figure 5).
Soybean leaflets elicitation
The F6H1, F6H2 and F6H3 genes were expressed in the leaves of cv ‘Imari’ and ‘Queen’.
Unique amplicons of expected size were obtained for each gene studied (Ubi : 132bp ; PAL1 :
422bp ; IFS1 : 531bp ; F6H1 : 442bp ; F6H2 : 227bp ; F6H3 : 322bp) (Figure 6). The
specificity of the primers was confirmed by the sequence of the amplified fragments for
F6H1, F6H2 and F6H3. The expression of housekeeping gene encoding ubiquitin is
constitutive and ubiquitous for all the samples. The two control genes: PAL1 and IFS1 and the
three target genes F6H1, F6H2 and F6H3 were all consistently expressed for all the control
samples: T0, T7h and NT. The expression of the five genes was increased in elicited samples
161
(laminarin or chitosan) and also in those treated with water, for both cultivars studied.
However, the intensity of obtained spots indicated that these five genes could to be more
responsive to chitosan elicitation than to laminarin.
Expression profiles in hypocotyl and cotyledons of developing seeds
Expression profile analysis in hypocotyls and cotyledons of four soybean cultivars with
very high contrasted glycitein content were carried out at three development stages of the seed
(25 DAF, 40 DAF and 50 DAF) (Figure 7). Previous experiments have shown the
accumulation of isoflavones begins at 25 DAF in the hypocotyls and reaches a maximum
around 40 DAF (Berger et al., 2008; Rasolohery et al., 2008). In cotyledons, the maximum
content of isoflavone is 4 to 10 fold lower than in hypocotyls. Isoflavones begin their
accumulation at 40 DAF and increase rapidly during the 7 next days. The cotyledons content
only genistein and daidzein. Therefore the expression profile has been analyzed at 25 and 40
DAF in hypocotyls and at 40 and 50 DAF in cotyledons.
The housekeeping gene encoding ubiquitin was consistently expressed at each development
stage (25, 40 and 50 DAF) whatever the cultivar and the seed part studied. The two controls
genes: PAL1 and IFS1 were consistently expressed in hypocotyls at 25 DAF and 40 DAF but
also in cotyledons at 40 and 50 DAF. However, the highest expression was observed in
cotyledons at 50 DAF. The F6H1 and F6H2 transcripts were not detected in any of the seed
parts, whatever the development stage and cultivar studied. In contrast, F6H3 transcript was
consistently expressed in hypocotyls at 25 DAF and 40 DAF for all contrasted cultivars
except for PI567580A which does not produce glycitein. Interestingly, these three genes were
not expressed in the cotyledons whatever the cultivar or the development stage considered.
162
DISCUSSION
The metabolism of glycitein was so far considered as a minor isoflavone in soybean. But
conversely, it is one of the major isoflavone in the hypocotyl, and this seed fraction is widely
used as raw material for dietary supplements. The biosynthesis of this isoflavone has not been
elucidated yet. It is generally admitted that it is derived from liquiritigenin which is
hydroxylated in position 6 of the A ring by a flavonoid 6-hydroxylase. The isoflavone
synthase converts this intermediate in 6, 7, 4’, trihydroxyisoflavanone (Latunde-Dada et al.,
2001) which is further methylated by a still unknown isoflavanone or isoflavone -6-O methyltransferase. However, the only F6H observed until now has been isolated from elicited leaves.
Our aim was to identify such an activity in hypocotyl. Two predicted genes in soybean
genomic sequence, F6H2 (Glyma18g08930) and F6H3 (Glyma08g43890), had a high coding
sequence homology (79%) with the already described F6H1 gene (Glyma18g08950)
(Schopfer and Ebel, 1998; Latunde-Dada et al., 2001). Their predicted protein revealed also
high homology and all of their P450s distinctive domains were strictly conserved [38]. Owing
to these sequence similarities, the two enzymes F6H2 and F6H3 may exert the same flavonoid
6-hydroxylase function as F6H1 in soybean (Latunde-Dada et al., 2001). Strikingly, the F6H3
sequence had lost its transmembrane helix domain which is reduced to 4 apolar amino acids.
However, this shortened peptide had a normal “hinge” of prolines preceded by basic and polar
residues. The hydropathic profile did not displayed subsequent abnormalities. Currently, such
P450 have not been described in plants, but the N-transmembrane helix has probably only a
passive role of anchor in the reticulum membrane (Gideon et al., 2012). Thus, the
functionality and the integration of this protein in a multienzymatic complex could be
unaffected by the absence of a transmembrane helix.
The induction of the phenylpropanoids biosynthetic genes in response to elicitors of
biological origin has been studied and documented for plant model systems (Dixon et al.,
163
2002). Among them, chitosan and laminarin originating from cell walls of fungi or from
marine organisms has been reported to elicit a variety of defense reactions in higher plants,
including the stimulation of PAL and the accumulation of phytoalexins (Aziz et al., 2003;
Khan et al., 2003). They have been used here to maximize the probability of detection of the
product of predicted genes F6H2 and F6H3. Clearly, these predicted genes are functional and
expressed as memberships of the phenylpropanoid group.
Hypocotyl has its proper pattern and determinism of isoflavone accumulation (Berger et al.,
2008) and is the only part of the seed storing glycitein (Kudou et al., 1991; Tsukamoto et al.,
1995). The specific activity of F6H3 in this compartment is consistent with this behavior.
Interestingly, while isoflavone synthase IFS1 and phenylamonia-lyase PAL1 mRNA are
detected in cotyledons at 40 and 50 DAF, in accordance with the active isoflavone
biosynthesis taking place during this period (Berger et al., 2008), not any mRNA of the
candidate genes for F6H function has been detected. In fact, the only gene F6H1 known to
encode the F6H function was not expressed in the hypocotyl. This is in agreement with the
data of early maturing soybean seed transcriptome analysis (Goldberg and Harada, 2009). In
this database, the expression data of F6H2 and F6H3 could not be separated. They gave a
weak and inconsistent signal at 5 and 15 DAF but they were not detected at 23 DAF in the
cultivar they used. However in our study, F6H3 was expressed in all the 3 cultivars but not in
the null mutant line PI567580A
In conclusion, the high sequence similarities and the strictly conserved P450 signatures
domains obtained for the two F6H2 and F6H3 putative proteins indicate that they may exert
the same flavonoid 6-hydroxylase function than F6H1 in soybean. Furthermore, as F6H1 is
probably not implicated in glycitein biosynthesis in the hypocotyls, F6H3 appeared here as a
very good potential candidate to assume this function.
164
Acknowledgements: We thank Christel Couderc and Daphné Puech for their help and
technical assistance. This project was supported by research grants from the Midi-Pyrénées
Région. The authors thank Pr Randall Nelson, curator of the USDA soybean germplasm
collection (Urbana, IL), for the supply of the accession used in this study and the French
group Euralis Semences for the supply of their germplasm accessions NS Kasha.
165
REFERENCES
Les références bibliographiques de cette publication sont citées dans la partie « Références
Bibliographiques » à la fin de ce manuscrit.
166
FIGURE LIST
Figure 1: Schematic representation of the general isoflavonoid pathway. CHS: chalcone
synthase; CHR: Chalcone reductase; CHI: Chalcone isomerase; putative F6H: Flavonoid 6hydroxylase; IFS: isoflavone synthase; IOMT; 6-isoflavone-O-methyltransferase
167
Figure 2: Rooted dendrogram of the predicted coding sequences having more than 65%
homology with the characterized flavonoid 6-hydroxylase (Y10490.1). Sequences have been
retrieved from soybean (Glycine max), common bean (Phaseolus vulgaris) and barrel medic
(Medicago truncatula). The tree has been generated with the aligned sequences using
ClustalW 2.0.12 multiple alignment and Phylip 3.67 drawgram
168
Figure 3: Alignments of the predicted protein sequences for F6H1 (a), F6H2 (b) and F6H3 (c)
in the 3 cultivars: Imari, Queen and PI567580A (PIA)
169
Figure 4: Comparison of the F6H1 (CYP71D9), F6H2 (CYP71D101) and F6H3
(CYP71D102) protein sequences. The conserved key motifs of P450 have been underlined.
Figure 5: Hydrophobic scores and detection of transmembrane domain in the three sequences
(Kyte-Doolittle scale, core window size = 10; hedge = 5; critical loop size = 60)
170
Figure 6: F6H1, F6H2 and F6H3 expression profiles in soybean elicited leaflets after
elicitation treatment. T0 and T7h: control treatment on independent leaflets at the beginning
and at the end of the treatment. NT, H2O, Lam and Chit: treatment on the four quarter of the
treated leaflet (non-treated, control H2O injection, laminarin and chitosan). The 3 leaflets have
been treated on 4 plants per cultivar
Figure 7: Expression profiles of the three genes F6H1, F6H2 and F6H3 in the hypocotyls and
cotyledons of four soybean cultivars (Imari, Queen, PI567580A and NS Kasha) during seed
development. Ubi: Ubiquitin; PAL: Phenylamonia-lyase; IFS: isoflavone synthase; F6H:
Flavonoid 6-hydroxylase
171
SUPPLEMENTARY MATERIAL
Online resource 1: Primers used to amplify F6H1, F6H2 and F6H3 genomic sequences
Average Tm of each primer sets : 59°C
Amplicon
Primer
name
Forward
F6H1 part A
F6H1 F1
AGTGTCCTCAAACCACTGCAT
F6H1 R3
GATTTTGACCGGCTATGTCC
1557 bp
F6H1 part B
F6H1 F st2.1
GTATGCTTTACTGCCTTCACACTTTAG
F6H1 R st2.1
CAAATGGAGAGTAGGTCCACAGG
2370 bp
F6H2 part A
F6H2 AF
TGGCTATGCTAACATCCTCGT
F6H2 R3
TTGGTGCTTTGGAAGTTGAA
1621 bp
F6H2 part B
F6H2 BF
CAGGACCACGTACACAATGC
F6H2 R6
TGTCGATGCCTATCTTTTTCC
1407 bp
F6H3 part A
F6H3 F1
GAGCCTAAATTCAGCGGATCT
F6H3 R4
GCAGAATCCACCAATAAGTGTAAG
1985 bp
F6H3 part B
F6H3 BF
GGAACAGAACAAGCAAACCTG
F6H3 R7
TTGATGGAAATGATGGTGGA
1322 bp
Sequence 5’3’
Amplicon
Reverse
Sequence 5’3’
Amplicon
size
172
Online resource 2: alignment of F6H1 genomic sequences (Glyma18g08950 for Imari,
Queen and PI567580A (boxes = exons)
173
Online resource 3: alignment of F6H2 genomic sequences (Glyma18g08930 for Imari,
Queen and PI567580A (boxes = exons)
174
Online resource 4: alignment of F6H3 genomic sequences (Glyma08g43890 for Imari,
Queen and PI567580A (boxes = exons)
175
176
3 SYNTHÈSE ET CONCLUSION
Les résultats obtenus dans cette deuxième partie des travaux de thèse concernent la
compréhension du processus régissant la biosynthèse de la glycitéine dans la graine de soja,
plus particulièrement dans le germe qui est fortement concentré en ce composé. Ceci a tout
d’abord été permis par l’étude de deux autres gènes putatifs : F6H2 (Glyma18g08930) et
F6H3 (Glyma08g43890) présents sur le génome du soja et ayant une forte homologie de
séquence avec le seul déjà isolé (F6H1) dans la feuille. Puis, d’autres éléments ont été
apportés par l’étude du suivi d’expression de ces trois gènes (F6H1, F6H2 et F6H3) dans les
feuilles élicitées ainsi que dans les deux compartiments de la graine (germes et cotylédons), à
différents stades de développement, dans des variétés très différentes pour leurs contenus en
isoflavones dans les germes.
Cette approche a permis de mettre en évidence le faible taux de variation des séquences
génomiques isolées pour un même gène entre les trois variétés étudiées (Imari, Queen et
PI567580A) très différenciées pour leur contenu en isoflavones dans les germes. Le taux de
variation obtenu entre les trois variétés est de 3,6% pour F6H1, 0,2% pour F6H2 et 0,04%
pour F6H3. Il en découle ainsi une très forte homologie des séquences protéiques F6H1 et
F6H2 correspondantes (99,6% et 99,8% respectivement) avec seulement quelques différences
mineures et une homologie parfaite de 100% pour F6H3. Ces faibles taux de variation obtenus
pour les séquences génomiques F6H1, F6H2 et F6H3 corroborent l’absence de
polymorphisme des séquences génomiques des isoflavone synthases déjà identifié pour ces
mêmes variétés (Imari, Queen et PI567580A) dans la première partie de ces travaux de
recherche (Artigot et al., 2012).
Les trois protéines F6H1, F6H2 et F6H3 correspondent respectivement aux
cytochromes P540 CYP71D9, CYP71D101 et CYP71D102 selon la classification de Nelson
(Nelson, 2009). Les deux séquences protéiques putatives F6H2 et F6H3 montrent une forte
similitude avec celle de F6H1, cytochrome P450 monooxygénase transmembranaire dont la
fonction d’hydroxylation en position 6 du substrat liquiritigénine est connue dans la feuille de
soja (Latunde-Dada et al., 2001). De plus, on note également la stricte conservation des
différents domaines caractéristiques des P450s membranaires sur ces deux séquences
protéiques putatives (Werck-Reichhart et Feyereisen, 2000). Cependant, la protéine putative
F6H3 présente un segment hydrophobe très court dans la région N-terminale.
177
Bien que la fonction biologique de ces deux enzymes putatives ne soit pas ici
démontrée, il est important de souligner que les deux gènes : Glyma18g08930 et
Glyma08g43890 initialement choisis, codant respectivement pour les enzymes putatives F6H2
et F6H3 sont ceux ayant les plus fortes homologies de séquences codantes : 78,7% pour
Glyma18g08930 et 78,8% pour Glyma08g43890, avec F6H1 sur le génome du soja.
L’expression des deux gènes putatifs F6H2 et F6H3 dans la feuille ainsi que l’induction
de leur expression par le stress de l’infiltration elle-même (traitement contrôle avec l’eau) et
par les traitements éliciteurs, avec une sensibilité marquée au chitosan, démontre que les
séquences prédites Glyma18g08930 et Glyma08g43890 correspondent bien à des ARN
messagers dans la feuille de soja.
D’autre part, le gène F6H1 qui est le seul caractérisé codant pour la fonction flavonoïde
6-hydroxylase dans la feuille, n’est pas le bon candidat pour la synthèse de la glycitéine dans
la graine. En effet, conformément à ce qu’avaient observé Goldberg et Harada, (2009) sur des
stades précoces de développement de la graine, allant de 5 à 23 JAF, nous n’avons pas détecté
d’expression de ce gène dans la graine même à des stades plus tardifs de développement (25
et 40JAF).
Aucun des trois gènes F6H1, F6H2 et F6H3 n’est exprimé dans les cotylédons, quel que
soit le stade de développement étudié (40 et 50 JAF). Dans les germes, seul le gène F6H3
s’exprime aux deux stades étudiés ici : 25 et 40 JAF. Cette expression s’avère être spécifique
du germe, ce qui corrobore parfaitement l’accumulation de la glycitéine présente en grande
quantité dans ce compartiment (Berger et al., 2008 ; Rasolohery et al., 2008 ; Artigot et al.,
2012). De plus, l’absence d’expression de F6H3 chez le mutant PI567580A ne produisant pas
de glycitéine dans les germes, met en évidence son rôle potentiel de gène clef dans la voie de
biosynthèse de la glycitéine.
L’expression du gène IFS1 n’apparaît pas plus importante dans les germes qui
contiennent 4 à 10 fois plus d’isoflavones que dans les cotylédons quelle que soit la variété et
le stade de développement étudié. Ces résultats sont en adéquation avec ceux obtenus dans la
première partie des travaux (Artigot et al., 2012), soulignant ainsi l’absence de liaison stricte
entre le taux d’expression du gène IFS1 et la teneur en isoflavones dans les compartiments de
la graine.
La comparaison des variétés Queen, Imari et NS Kasha différenciées pour leur contenu
en glycitéine dans les germes, ne montre pas de relation avec le taux d’expression de F6H3.
178
En effet, ce gène n’est pas plus exprimé dans les germes des variétés de forte teneur en
glycitéine (NS Kasha) que dans les variétés de plus faible teneur (Imari). Il en est de même
pour les lignées Dwight quasi isogéniques (Gly+: 35% daidzéine et 55% glycitéine dans les
germes et Gly– : 55% daidzéine et 35% de glycitéine) que nous avons également étudiées.
Ceci semble montrer que l’enzyme F6H3, si elle intervient bien dans sa biosynthèse, n’est pas
un facteur limitant pour l’accumulation de la glycitéine dans les germes.
Cette étude démontre ainsi que l’expression du gène F6H3 est spécifique du germe et
que son taux d’expression n’est pas relié aux variations de teneurs en glycitéine observées
dans les différentes variétés. Cette protéine semble présenter une partie hydrophobe
raccourcie de ses 17 premiers acides aminés. Il ne lui resterait donc qu’un court segment
hydrophobe avant la partie charnière constituée d’un segment d’acides aminés basiques et
d’un segment riche en prolines (Pro-Pro-X-Pro). Ces résultats ouvrent donc la voie à plusieurs
démarches expérimentales, qui permettraient de vérifier l’activité biologique de ce gène F6H3
in vivo et d’évaluer la capacité de l’enzyme correspondante à hydroxyler le substrat
liquiritigénine en position 6 dans la voie de biosynthèse de la glycitéine.
179
180
CHAPITRE V :
DISCUSSION GENERALE ET
CONCLUSION
181
La première partie de nos expérimentations a permis de souligner, en accord avec la
littérature (Eldridge et Kwolek, 1983 ; Tsukamoto et al., 1995) et la précédente approche
physiologique menée au laboratoire (Berger et al., 2008 ; Rasolohery et al., 2008), la grande
différence de teneur et de composition en isoflavones entre les germes et les cotylédons ainsi
que le net décalage de leur accumulation dans ces deux compartiments. Le fractionnement de
la graine permet de répondre à une demande industrielle très différenciée concernant les
teneurs en isoflavones (des germes à forte concentration en isoflavones pour le marché des
suppléments santé ou des cotylédons à faible concentration destinés au marché des
« soyfoods »). Le déterminisme génétique de telles différences n’est pas connu. Les avancées
sur la caractérisation des gènes codant pour les enzymes structurales de la voie de biosynthèse
des isoflavones (Latunde-Dada et al., 2001 ; Dixon et al., 2002 ; Hirota et al., 2004 ; Akashi
et al., 2005 ; Ralston et al., 2005 ; Yu et McGonigle, 2005), ont permis l’exploration de cette
problématique. Une meilleure compréhension de ce déterminisme ouvrant aussi la voie à une
maîtrise des profils des isoflavones dans les variétés est toutefois nécessaire et fait l’objet de
nos travaux.
L’étude des séquences génomiques des isoflavones synthases (IFS1 et IFS2), enzymes
clefs dans la voie de biosynthèse des isoflavones, a mis en évidence l’existence de deux
formes alléliques. Bien que 5 SNPs corrélés avec la teneur en isoflavones aient été identifiés
dans ces gènes ou leurs promoteurs (Cheng et al., 2008), aucun d’entre eux n’a été observé
ici. De plus, les formes alléliques que nous avons révélées sont indépendantes de la teneur en
isoflavones.
L’activité transcriptionnelle des gènes IFS1 et IFS2 n’explique pas non plus les
différences de teneurs entre les variétés Imari et Queen. Néanmoins, elle souligne
l’implication d’une régulation bien distincte de la synthèse des isoflavones entre les germes et
les cotylédons. Cette hypothèse est renforcée par les profils d’expression très différenciés de
certains gènes situés en amont dans cette voie de biosynthèse entre les deux compartiments de
la graine. En particulier, 3 gènes de chalcone synthase (CHS7, CHS8 et CHS9), enzyme
contrôlant le flux de métabolites à l’entrée de la voie de biosynthèse des flavonoïdes, ont
effectivement montré une expression en lien très étroit avec les différences de teneurs dans les
compartiments de la graine. Comme il a été observé récemment (Gutierrez-Gonzalez et al.,
2010a ; Yi et al., 2010a), l’induction des gènes CHS7 et CHS8 coïncide avec l’accumulation
des isoflavones. Toutefois, cette relation n’est vraie que dans le cas des cotylédons, et dans
182
notre étude, le taux d’expression de ces gènes n’est pas corrélé aux différences de teneur en
isoflavones entre les variétés Imari et Queen. En fait, le gène CHS9 est le plus fortement
exprimé des 9 homologues que nous avons suivis, et ceci autant pour les cotylédons que pour
les germes. Contrairement à CHS7 et CHS8, son profil d’expression est en adéquation avec
l’accumulation des isoflavones dans les germes. C’est également le cas du gène codant pour la
CHR nécessaire à la synthèse de 90% des isoflavones dans le germe. Conformément à la
littérature (Ralston et al., 2005), les chalcone isomérases de type II (CHI1A, CHI1B1 et
CHI1B2), capables d’isomériser la naringénine chalcone et l’isoliquiritigénine, semblent plus
impliquées dans la biosynthèse des isoflavones que celle de type I (CHI2). En effet, les profils
d’expression des gènes CHI1A et CHI1B1 correspondent à l’activité dans le germe alors que
le gène CHI1B2 est tardivement induit dans les cotylédons de la variété Queen ayant la teneur
en isoflavones la plus élevée. Ceci conduit à l’hypothèse d’un rôle spécifique des chalcone
isomérases dans l’expression des profils caractéristiques d’isoflavones des variétés et/ ou des
compartiments de la graine.
Nous avons ainsi pu montrer que le polymorphisme de séquences des gènes IFS1 et
IFS2 ainsi que leurs expressions relatives ne sont pas liés aux teneurs en isoflavones des
compartiments de la graine. Néanmoins, l’activité transcriptionnelle de ces deux gènes et de
certains gènes intervenant en amont dans ces biosynthèses, dans l’un ou l’autre des
compartiments, a permis de confirmer l’existence de deux voies de régulation bien distinctes
de la biosynthèse des isoflavones dans le germe et les cotylédons. Ces résultats permettant
ainsi de mieux appréhender le déterminisme génétique à l’origine des différences de teneurs et
de profils observés dans ces deux compartiments de la graine (Berger et al., 2008 ;
Rasolohery et al., 2008).
Nous avons également constaté que les différences d’expression des gènes clefs dans les
deux compartiments ne sont pas toujours reliées aux différences de teneurs observées, ce qui
pourrait refléter des variations dans les mécanismes de régulation transcriptionnelle. En effet,
un premier facteur de transcription nommé GmMYB176 directement impliqué dans la
régulation positive de la voie de biosynthèse des isoflavones a été mis en évidence (Yi et al.,
2010). Celui-ci se fixe sur l’élément cis-spécifique du promoteur du gène CHS8 intervenant
dans la voie de biosynthèse des isoflavones pour constituer la base d’activation de la
transcription de ce dernier (Figure 42). De plus, cet élément cis-spécifique est également
présent sur les promoteurs des gènes CHS7, IFS1 et IFS2 intervenant aussi dans cette voie de
biosynthèse des isoflavones.
183
Figure 42 : Représentation schématique de la base d’activation de la transcription du
gène CHS8 intervenant dans la voie de biosynthèse des isoflavones d’après Yi et al. (2010)
D’après nos résultats, nous avons pu mettre en évidence que les taux d’expression de
ces quatre gènes étaient concomitants avec l’accumulation des isoflavones dans les
cotylédons. Ainsi, nous pourrions supposer qu’un tél mécanisme d’activation soit présent au
niveau des cotylédons et pas au niveau du germe. Pour cela, il semblerait donc interressant
d’étudier si d’éventuelles différences d’expression de ce gène GmMYB176 au niveau de ces
deux compartiments permettraient d’expliquer les différences de teneurs en isoflavones.
Ces différences d’expression des gènes clefs dans les deux compartiments de la graine
qui ne sont pas toujours reliées aux différences de teneurs observées pourraient également
refléter des mécanismes de régulation post-traductionnelle. La régulation post-traductionnelle
s’exerce par exemple au niveau de l’activation et de l’inactivation des enzymes, généralement
provoquée par le niveau de leur phosphorylation. Un tel mécanisme semble présent dans cette
voie de biosynthèse des isoflavones. Il a été observé pour la PAL à partir de cultures
cellulaires élicitées de Phaseolus vulgaris dans lesquelles la stimulation des protéines kinases
calcium dépendantes (CDPK) peut effectivement mener à une phosphorylation accrue et à un
turnover de la PAL (Allwood et al., 1999). Cette régulation post-traductionnelle pourrait
également avoir lieu au niveau de l’intégration des différentes isoformes de ces enzymes dans
des complexes multienzymatiques (Dhaubhadel et Li, 2010 ; Yi et al., 2010b). Ces derniers
sont cependant très instables et ne peuvent être étudiés qu’in vivo ou de manière indirecte.
Néanmoins, l’existence d’un complexe spécifique à la voie des flavonoïdes vient récemment
d’être montrée in vivo chez Arabidopsis thaliana grâce à la microscopie FRET (Fluorescence
184
Resonance Energy Transfer) qui permet de détecter des variations de fluorescence induites
par les interactions entre protéines (Crosby et al., 2011). La spécificité d’une enzyme peut
également être dictée par son intégration dans le complexe. C’est notamment le cas de la
4’IOMT responsable de la méthylation des isoflavanones en position 4’. In vitro cette enzyme
peut aussi méthyler efficacement les isoflavones en position 7 alors qu’in vivo, elle ne produit
que des méthylations en 4’, probablement en raison d’une transmission orientée du substrat,
propre au phénomène de « channelling » induit par la construction du complexe
multienzymatique (Liu et al., 2006).
Cette organisation des enzymes en complexes soulève aussi la question de l’influence
des interactions enzymatiques dans les différences de profils exprimées par les génotypes et
dans les compartiments. Chez le tabac, il a été montré que deux isoformes de la PAL (PAL1
et PAL2) interagissaient différemment avec la C4H (P450 membranaire), cette dernière ayant
une plus grande affinité pour l’isoforme PAL1. Ceci impliquerait un rôle spécifique des
isoformes dans la construction du complexe, et donc dans son efficience ou encore dans les
produits formés (Winkel, 2004). En supposant que l’accumulation des messagers reflète
l’expression des protéines correspondantes, un mécanisme analogue pourrait faire intervenir
les différentes isoformes de la chalcone synthase et de la chalcone isomérase. On pourrait par
exemple imaginer des interventions différentes de CHS7, CHS8, CHS9, CHI1A, CHI1B1 et
CHI1B2 selon leurs quantités relatives au cours du temps, ou dans les compartiments de la
graine (Figure 43).
germes
CHS9
cotylédons
CHI1A
CHI1B1 / CHI1B2
CHS7 / CHS8
CHI1B2
Figure 43 : Schématisation des complexes multienzymatiques potentiellement
présents dans les cotylédons et le germe d’après Dhaubhadel et al. (2008)
185
De même, la réduction de la naringénine chalcone en isoliquiritigénine par la CHR
nécessite une association intime entre les deux enzymes CHS et CHR, car elle a probablement
lieu avant la fermeture du cycle A (Austin et Noel, 2003 ; Wang, 2011). Selon les isoformes
mises en jeu, la proportion de composés réduits pourrait ou non varier et ainsi mener in fine à
la synthèse d’une proportion plus ou moins élevée de daidzéine ou génistéine.
Ainsi, les résultats obtenus dans cette première partie de nos travaux et les différentes
hypothèses émises à partir des différents types de régulation rapportés par la littérature,
laissent entrevoir la complexité de régulation de cette voie de biosynthèse des isoflavones.
Les isoflavones sont particulièrement concentrées dans le germe qui peut en contenir
jusqu’à dix fois plus que les cotylédons, devenant ainsi un sous-produit hautement valorisable
pour le marché des suppléments santé. La glycitéine, exclusivement présente dans le germe,
dont la structure est la plus éloignée du 17β-œstradiol avec un groupement méthoxy en
position C6, lui confère une faible affinité envers les récepteurs œstrogéniques (Chang et al.,
2005 ; Sakamoto et al., 2010). Celle-ci est très peu métabolisée dans l’organisme et l’activité
des produits issus de sa déméthylation n’a pas encore été étudiée (Ruefer et al., 2007). Ainsi,
la teneur en isoflavones de la matière première ou des produits transformés nécessite d’être
maîtrisée. Le germe ne représentant que 2 à 3% de la masse totale de la graine, la glycitéine a
longtemps été considérée comme une isoflavone mineure et sa voie de biosynthèse n’est pas
encore complètement élucidée.
Ainsi, afin de mieux comprendre le processus régissant la synthèse de la glycitéine dans
la graine et plus particulièrement dans le germe, la deuxième partie des expérimentations a été
consacrée à l’étude d’autres gènes putatifs présents sur le génome du soja. L’étude et les tests
d’expression des gènes F6H2 et F6H3 et du seul déjà caractérisé (F6H1) codant pour une
flavonoïde 6-hydroxylase ont été réalisés dans différents tissus, notamment les germes à
différents stades de développement, dans des variétés très différenciées pour leur contenu en
glycitéine dans le germe.
Nous avons ainsi pu confirmer l’absence d’expression dans la graine du seul gène
caractérisé F6H1 codant pour une fonction flavonoïde 6-hydroxylase dans la feuille
(Goldberg et Harada, 2009). Les trois gènes F6H1, F6H2 et F6H3 ne s’expriment pas dans les
cotylédons et seul F6H3 est exprimé dans les germes, excepté pour la variété mutante ne
produisant pas de glycitéine. Son expression apparait donc en lien avec l’accumulation de la
glycitéine dans le germe. En revanche, comme pour les gènes étudiés dans la première partie
de ce travail, l’accumulation des transcrits n’est pas directement corrélée avec les différences
186
d’accumulation de la glycitéine dans les germes des variétés capables de synthétiser ce
composé. Ces différences d’expression entre les compartiments et les variétés ont ainsi permis
de mettre en évidence le rôle clef potentiel du gène F6H3 dans la synthèse de la glycitéine
dans le germe, permettant in fine de mieux définir sa voie de biosynthèse dans la graine.
De tels résultats ouvrent donc la voie à une démarche expérimentale complémentaire à
ce travail, qui permettrait de vérifier l’activité de ce gène in-vivo et d’évaluer la capacité de
l’enzyme F6H3 correspondante à hydroxyler correctement le substrat liquiritigénine. Pour ce
faire, la technique d’expression hétérologue dans la levure Saccharomyces cerevisiae,
technique de prédilection pour l’expression hétérologue de gènes codant pour des
cytochromes P450, est envisageable. L’efficacité d’un tel système pour la surexpression de
gènes codant pour des cytochromes P450 potentiellement impliqués dans les voies de
biosynthèse de métabolites secondaires chez les eucaryotes, n’est plus à démontrer. Plusieurs
travaux ont permis de montrer la fonctionnalité de cette technique (Artigot et al., 2009),
comme notamment, l’expression hétérologue de cytochromes P450 intervenant dans la voie
de biosynthèse des isoflavones chez le soja, celle des isoflavones synthases (Jung et al., 2000)
et de la flavonoïde 6-hydroxylase induite dans la feuille en condition d’élicitation (LatundeDada et al., 2001). Dans notre étude, l’identification de motifs conservés de P450s
membranaires de classe II dans cette protéine F6H3, permettrait de définir sa localisation au
niveau de la fraction microsomale. Cependant, le segment hydrophobe dans la région Nterminale semble très court et laisse donc à penser que cette protéine pourrait être
relativement soluble. L’extraction de cette protéine à partir du cytosol ou des microsomes des
cellules de levure pourrait être envisagée afin de définir sa localisation, de valider les résultats
des analyses bioinformatiques réalisées ici et d’enrichir les connaissances sur les P450
hydroxylases intervenant dans la voie de biosynthèse des isoflavones.
L’expression hétérologue de ce gène F6H3 dans la levure, permettrait d’illustrer pour la
première fois, comment la liquiritigénine est élaborée en 6,7,4’-trihydroxyflavanone dans la
graine, et conduirait à définir davantage la voie et les produits des gènes responsables de la
biosynthèse de la glycitéine dans la graine de soja.
L’ensemble de ces résultats permet ainsi d’accéder à une meilleure compréhension des
mécanismes intervenant à l’échelle moléculaire dans la compartimentation des isoflavones
observée dans la graine de soja. Ni le polymorphisme de séquence des gènes IFS1 et IFS2 ni
leurs expressions relatives ne sont liés aux teneurs en isoflavones totales des variétés.
187
Cependant, les profils d’expression de ces gènes et de ceux en amont dans la voie confirment
l’existence de deux voies de régulation bien distinctes de biosynthèse des isoflavones dans le
germe et les cotylédons. En effet, les profils d’expression des gènes CHS9, CHI1A, CHI1B1
et CHI1B2 se distinguent au niveau du germe alors que les profils des gènes CHS7, CHS8 et
CHI1B2 se distinguent au niveau des cotylédons. Les seules pistes restant à démontrer sont
l’implication de la chalcone synthase CHS9 et des chalcone isomérases CHI1A, CHI1B1 et
CHI1B2 qui pourraient jouer un rôle par une variation de leur affinité pour les substrats et/ou
une différence d’intégration dans le complexe multienzymatique de biosynthèse des
isoflavones.
Ces travaux ont également permis l’identification d’une nouvelle enzyme F6H3 que
nous proposons pour la synthèse de la glycitéine dans la graine de soja, plus particulièrement
au niveau du germe, bien que son analyse fonctionnelle reste à étudier. Finalement, la
structure particulière (segment hydrophobe raccourci en N-terminal) que semble montrer cette
enzyme candidate F6H3 pourrait ainsi indiquer une forte implication de l’architecture du
complexe enzymatique et des contraintes qui en découlent dans l’utilisation préférentielle
d’une voie ou d’une autre dans le schéma de biosynthèse des isoflavones. En effet, une telle
structure pourrait encore permettre une certaine interaction avec la membrane et participer au
positionnement de l’enzyme dans les complexes enzymatiques auxquels participent les autres
P450 intervenant dans cette voie de biosynthèse (C4H, IFS). Selon la voie de biosynthèse de
la glycitéine, la F6H devrait s’intégrer juste avant l’IFS (Figure 44) et le fait d’avoir un
domaine de fixation
membranaire incomplet pourrait faciliter son intégration dans le
complexe.
Figure 44 : Représentation schématique de F6H3 dans le complexe
multienzymatique potentiel de biosynthèse de la glycitéine d’après Dhaubhadel et al. (2008)
188
In fine, l’ensemble de ces résultats devrait permettre de lever une partie du voile sur le
déterminisme génétique de la composition et de proposer un modèle global de maîtrise de la
teneur et de la composition en isoflavones dans la graine, afin de répondre aux attentes et aux
besoins de l’ensemble des utilisateurs.
189
190
TABLE DES ILLUSTRATIONS
191
LISTE DES FIGURES
Figure 1 : Principaux stades physiologiques du cycle végétatif du soja d’après le
CETIOM – http://www.cetiom.fr ............................................................................................. 20
Figure 2 : Principaux stades physiologiques du cycle reproductif du soja d’après le
CETIOM –http://www.cetiom.fr .............................................................................................. 21
Figure 3 : Structure de la graine de soja ......................................................................... 22
Figure 4 : Premiers stades de développement de l’embryon des angiospermes d’après
Goldberg et al. (1994) .............................................................................................................. 23
Figure 5 : Représentation schématique du stade de développement « globulaire » et du
stade de développement « cœur » de l’embryon de soja (Goldberg et Harada, 2009)............. 24
Figure
6:
Schéma
du
début
de
la
maturation
de
l’embryon
de
soja
(Goldberg et Harada, 2009) ...................................................................................................... 25
Figure 7 : Structure type et numérotation des cycles des chalconoïdes (a) des
flavanoïdes (b) et des pterocarpanes (c). La chalcone la plus souvent rencontrée est la
2',4,4',6'-tétrahydroxychalcone, ou naringénine chalcone. Les flavanones et flavones ont un
groupement cétone en C4 ; les isoflavonoïdes sont caractérisés par la position en C3 du
groupement aryl (cycle B). Les ptérocarpanes sont formées à partir des isoflavones (après
hydroxylation en 6’). ................................................................................................................ 29
Figure 8 : Structure des isoflavones de soja ................................................................... 30
Figure 9 : Structure et conjugaison des 3 familles d’isoflavones de soja ....................... 30
Figure 10: Comparaison structurale des isoflavones et du 17-β-estradiol ...................... 31
Figure 11 : Succession des stades physiologiques intervenant durant le développement
de la graine de soja – en pointillés rouge : variation de la matière sèche d’après
Goldberg, (2007) – http://estdb.biology.ucla.edu/seed/project#seed ....................................... 34
Figure 12 : Accumulation des isoflavones dans les cotylédons (A, B, C) et les germes
(D, E, F) chez 4 variétés de soja sous 3 conditions de cultures : en serre en 2003 (A,D), 2004
(B,E) et au champ en 2005 (C,F) d’après Berger et al. (2008) ................................................ 35
Figure 13 : Processus global d’infection jusqu’à la formation du nodule fonctionnel chez
les légumineuses. ...................................................................................................................... 41
Figure 14 : Etapes initiales de la biosynthèse des composés secondaires phénoliques
d’après Winkel-Shirley, (2001) ................................................................................................ 42
192
Figure 15 : Voie de biosynthèse des isoflavones de soja d’après Yu et al. (2003) ; Du et
al. (2010) ; Wang, (2011) ......................................................................................................... 43
Figure 16 : Les isoflavones aglycones et leurs dérivés méthylés identifiés chez Trifolium
pratense et Medicago truncatula.............................................................................................. 45
Figure 17 : Régulation enzymatique des formes conjuguées d’isoflavones chez le soja
(Suzuki et al., 2006) ................................................................................................................. 46
Figure 18 : Principales étapes du transport des isoflavones chez le soja
(Dhaubhadel et al., 2008) ......................................................................................................... 47
Figure 19 : Réactions catalysées par la chalcone synthase (Halbwirth, 2010). La
réduction par une chalcone réductase est spécifique des légumineuses et nécessite un type
dédié de chalcone isomérase (CHI) capable d’accepter l’isoliquiritigénine ............................ 50
Figure 20 : Structure tridimensionnelle de la Chalcone synthase – (a) et (b) Construction
de l’homodimère et positionnment des sites actifs. Les deux sous-unités sont colorées
respectivement en jaune et en bleu - (c) comparaison avec la KAS III (Austin et Noel, 2003)
.................................................................................................................................................. 51
Figure 21 : Modèle d’une structure tertiaire de P450 monooxygénase d’après Urlacher
et Eiben (2006) ......................................................................................................................... 53
Figure 22 : Arbre phylogénétique représentant chacune des 127 familles de P450
identifiées chez les plantes d’après Nelson et Werck-Reichhart (2011) .................................. 54
Figure 23 : Mécanisme proposé pour la migration aryl catalysée par le CYP93C (IFS) :
la migration aryl de la (2S)-flavanone pour former le produit 2-hydroxyisoflavanone d’après
Mizutani et Sato (2011) ............................................................................................................ 56
Figure 24 : Classification des chalcones isomérases – les Gma (Glycine max) sont les
enzymes du soja correspondant aux CHI1A, CHI1B1, CHI1B2, CHI2, CHI3, CHI4A et
CHI4B (Ralston et al., 2005) ................................................................................................... 58
Figure 25 : Les IOMT intervenant dans la voie de biosynthèse des isoflavonoïdes chez
les légumineuses ....................................................................................................................... 61
Figure 26 : Les deux dernières étapes dans la biosynthèse des isoflavones conjuguées
chez le soja d’après Dhaubhadel et al. (2008).......................................................................... 62
Figure 27 : Complexe multienzymatique et channeling dans la voie de biosynthèse des
isoflavones d’après Winkel-Shirley (1999) .............................................................................. 64
Figure 28 : Influence de la lumière sur les ARNm de la PAL (mPAL), sur les activités
des enzymes PAL et CHS et sur la teneur en flavonoïdes de suspensions cellulaires de persil
d’après Hahlbrock (1981)......................................................................................................... 72
193
Figure 29 : Modèles d’organisation de différentes voies de biosynthèse de métabolites
secondaires utilisant les phénylpropanoïdes. Les cytochromes P450 permettent l’ancrage
membranaire. a) synthèse de la lignine b) synthèse des flavonols c) synthèse des anthocyanes
(Winkel, 2004) ......................................................................................................................... 77
Figure 30 : Concentrations en isoflavones totales (µmol.g-1 MS) dans des graines de
soja à différents stades de développements (JAF : Jours Après floraison) en serre et en champ
d’après Rasolohery et al. (2008) .............................................................................................. 82
Figure 31 : Détermination du cycle seuil ........................................................................ 89
Figure 32 : exemple de courbes représentant l’augmentation de la fluorescence au cours
du temps obtenues lors des analyses ........................................................................................ 90
Figure 33 : Réactions contrôles NTC ............................................................................. 92
Figure 34 : Composition des plasmides PCR2.1 TOPO® et PGEM-T® ....................... 94
Figure 35 : Chromatogramme d’absorption UV à 260 nm obtenu après séparation HPLC
sur colonne RP C18 d’un extrait de cotylédons à 40 JAF ........................................................ 96
Figure 36 : Chromatogramme d'absorption UV à 260 nm obtenu après séparation HPLC
sur colonne RP C18 d’un extrait de germes à 40JAF .............................................................. 97
Figure 37 : Les 6 stades de développement des graines de soja prélevées : de 25 à 70
JAF ......................................................................................................................................... 102
Figure 38 : Obtention d’un pic unique garant de la spécificité d’un couple d’amorces
utilisé ...................................................................................................................................... 104
Figure 39 : Les feuilles d’âge différent prélevées pour chaque traitement éliciteur utilisé
................................................................................................................................................ 105
Figure 40 : Dendrogramme des séquences codantes prédites ayant plus de 65%
d’homologie avec Y10490.1 .................................................................................................. 106
Figure 41 : Points d’infiltration d’un traitement et les différentes zones de traitement
d’une foliole ........................................................................................................................... 109
Figure 42 : Représentation schématique de la base d’activation de la transcription du
gène CHS8 intervenant dans la voie de biosynthèse des isoflavones d’après Yi et al. (2010)
................................................................................................................................................ 184
Figure 43 : Schématisation des complexes multienzymatiques potentiellement présents
dans les cotylédons et le germe d’après Dhaubhadel et al. (2008) ........................................ 185
Figure 44 : Représentation schématique de F6H3 dans le complexe multienzymatique
potentiel de biosynthèse de la glycitéine d’après Dhaubhadel et al. (2008) .......................... 188
194
LISTE DES TABLEAUX
Tableau 1 : Composition en acides aminés essentiels de la graine de soja (CETIOM,
2005)......................................................................................................................................... 26
Tableau 2 : Profil des acides gras contenus dans les fractions de la graine de soja (en %
des acides gras totaux).............................................................................................................. 27
Tableau 3 : Nombre de gènes codant pour des FTs impliqués dans la régulation de la
synthèse des (iso)flavonoïdes chez Medicago truncatula, Lotus japonicus et Glycine max
d’après Libault et al. (2009) ..................................................................................................... 66
Tableau 4: Les facteurs de transcription MYB et bHLH impliqués dans la régulation
des (iso)flavonoïdes chez les légumineuses ............................................................................. 68
Tableau 5 : Amorces spécifiques utilisées pour amplifier l’intégralité des séquences
génomiques IFS1 et IFS2 ....................................................................................................... 100
Tableau 6 : Amorces internes utilisées pour les séquençages des gènes IFS1 et IFS2 100
Tableau 7 : Amorces utilisées pour amplifier les séquences génomiques F6H1, F6H2,
et F6H3 ................................................................................................................................... 108
Tableau 8 : Amorces utilisées pour l’amplification des transcrits PAL1, IFS1 et
Ubiquitine ............................................................................................................................... 110
Tableau 9 : Amorces utilisées pour les amplifications des ARNm F6H1, F6H2 et F6H3
................................................................................................................................................ 111
195
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