PARTIE I : BK ET REIN - thèse - Université Toulouse III
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PARTIE I : BK ET REIN - thèse - Université Toulouse III
THÈSE En vue de l'obtention du DOCTORAT DE L’UNIVERSITÉ DE TOULOUSE Délivré par l'Université Toulouse III - Paul Sabatier Discipline ou spécialité : Physiopathologie expérimentale Présentée et soutenue par Marie Buléon Le 24 avril 2008 Titre : Physiologie rénale du récepteur B2 de la bradykinine : de la néphropathie diabétique au choc septique JURY Mr François Alhenc-Gelas (DR1 INSERM UMRS 872, Paris), Rapporteur Mr Christos Chatziantoniou (DR1 INSERM U702, Paris), Rapporteur Mr Jean-Jacques Helwig (DR1 INSERM UMRS 727, Strasbourg) Examinateur Mme Hélène Hannaire (PU-PH, Toulouse), Examinateur Mr Jean-Pierre Girolami (DR1 INSERM U858, Toulouse), Co-directeur de thèse Mr Ivan Tack (PU-PH, Toulouse), Co-directeur de thèse Ecole doctorale : Biologie - Santé - Biotechnologies Unité de recherche : Laboratoire de Physiologie et INSERM U858 Directeur(s) de Thèse : Dr Jean-Pierre Girolami et Pr Ivan Tack Rapporteurs : Mr François Alhenc-Gelas et Mr Christos Chatziantoniou UNIVERSITE PAUL SABATIER – TOULOUSE III Ecole Doctorale Biologie - Santé - Biotechnologie THESE Présentée et soutenue en vue de l’obtention du grade de DOCTEUR DE L’UNIVERSITE TOULOUSE III Discipline : Physiopathologie expérimentale par Marie BULEON Physiopathologie rénale du récepteur B2 de la bradykinine : de la néphropathie diabétique au choc septique Directeurs de thèse : Dr Jean-Pierre Girolami et Pr Ivan Tack Soutenue le : 24 avril 2008 Devant le jury composé de : Mr François Alhenc-Gelas, DR1 INSERM UMRS 872, Paris Rapporteur Mr Christos Chatziantoniou DR1 INSERM U702, Paris Rapporteur Mr Jean-Jacques Helwig DR1 INSERM UMRS 727, Strasbourg Examinateur Mme Hélène Hannaire Professeur, Toulouse Examinateur Mr Jean-Pierre Girolami DR1 INSERM U858, Toulouse Co-directeur de thèse Mr Ivan Tack PU-PH, Toulouse Co-directeur de thèse 1 Remerciements Tout d’abord, je tiens à remercier les membres du jury, les Dr François AlhencGelas, Christos Chatziantoniou et Jean-Jacques Helwig, pour l’intérêt qu’ils ont porté à mon travail, le temps qu’ils ont consacré à l’examiner et pour les remarques et suggestions qu’ils m’ont apportées. Je souhaite remercier avec beaucoup de reconnaissance mes 2 directeurs de thèse pour m’avoir permis de réaliser ce travail. Pr Ivan Tack qui m’a accueilli dans son équipe et m’a accordé sa confiance il y a déjà plus de 5 ans et qui m’a permis d’arriver jusque là. Merci pour toutes les connaissances que tu m’as apportées, pour ton soutien et ta confiance. Dr Jean-Pierre Girolami qui m’a soutenue depuis le DEA, pour tout ce qu ‘il m’a appris sur les kinines. Merci de ton aide et de ta disponibilité au cours de ces années et particulier pour la rédaction de la thèse et la préparation de la soutenance. Ce travail a été réalisé principalement dans le Laboratoire de Physiologie de la Faculté de Médecine, je remercie le Pr Jean-Louis Ader d’avoir accepter de m’y accueillir. Je remercie les membres de l’équipe sans qui ce travail n’aurait pas été possible et qui ont partagé mon quotidien au labo pendant ces 5 années Françoise Praddaude pour tout ce qu’elle m’a appris, pour son aide et sa gentillesse. Merci de ton soutien qui m’a été précieux tout le long de mon séjour au labo et surtout à certains moments difficiles. J’ai apprécié les longues discussions autour des repas de midi partagés au labo. Julien Allard qui est arrivé dans le labo en même temps que moi, avec qui j’ai partagé plusieurs années de manip. Merci pour ton aide, tes conseils et tes encouragements, j’ai beaucoup apprécié de travailler avec toi. Aux autres personnes qui font le quotidien du Laboratoire de Physiologie, Maïtée Ranera, Mohamed Khetta, Marie-Pierre Groussous, Marie-José Fouque, Marie-Claire Mbongo, vous avez tous participé d’une façon ou d’une autre à mon travail. Merci de votre aide, de votre bonne humeur et pour tous les bons moments passés ensemble. Acil Jaafar pour le travail sur l’Irbésartan que j’ai apprécié de partagé avec toi. Bon courage pour ta thèse et la suite. Thierry Seguin pour tout le travail sur le choc septique. Même si on se voit moins souvent, je n’oublie pas Christiane Pecher pour sa disponibilité, son aide et les dépannages en tout genre pour les manip ; et Nelly Blaes arrivée récemment dans l’équipe, merci pour ton soutien et tes conseils pendant les dernières étapes de la thèse. 2 A tous les étudiants passés au laboratoire pendant que j’y étais et en particulier Séverine qui a passé plus d’un an avec nous. Merci pour les bons moments, et bonne chance pour la suite. A toutes les personnes de l’ INSERM pour leur sympathie et les coups de mains qu’ils m’ont donné.. Enfin, merci à tous ceux qui partagent ma vie. Ma famille, qui m’entoure et me soutient (merci à mes parents de m’avoir permis de faire de si longues études). Mes amis pour tous les bons moments qui permettent de décompresser et se changer les idées. A Matthieu, simplement pour être là, merci pour ton soutien et ton écoute, ces années ont été beaucoup plus faciles en étant à tes côtés. Et bien sûr à Maël, qui a pointé son petit nez pendant ma thèse, pour l’immense bonheur qu’il m’apporte. 3 Table des matières Table des matières INTRODUCTION................................................................................................................................. 10 PARTIE I : BRADYKININE ET REIN.............................................................................................. 14 I. ORGANISATION DU SYSTEME KALLICREINE-KININE................................................................... 15 I.1. Composants de la cascade paracrine ............................................................................. 15 I.1.a. Composants du système kallicréine-kinine.................................................................................. 15 I.1.b. Interactions entre le système rénine-angiotensine et le système kallicréine-kinine ..................... 16 I.2. II. Des récepteurs des kinines aux actions physiologiques.................................................. 18 I.2.a. Récepteurs B1 et B2 .................................................................................................................... 18 I.2.b. Localisation et régulation des récepteurs B1 et B2...................................................................... 19 I.2.c. Signalisation et effets................................................................................................................... 20 UNE VISION FONCTIONNELLE ET INTEGREE DU SYSTEME KALLICREINE-KININE ........................ 22 II.1. Régulation de la pression artérielle................................................................................ 23 II.2. Inflammation et douleur.................................................................................................. 24 II.3. Physiopathologie cardiovasculaire................................................................................. 25 II.4. Effets sur la prolifération et la fibrose............................................................................ 25 III. SYSTEME KALLICREINE-KININE : DE LA PHYSIOLOGIE A LA PATHOLOGIE RENALE ..................... 27 III.1. Localisation et actions physiologiques de la bradykinine............................................... 27 III.1.a. Localisation rénale des composants du système kallicréine-kinine........................................... 27 III.1.b. Actions rénales de la bradykinine ............................................................................................. 28 III.2. Modifications expérimentales du système kallicréine-kinine .......................................... 29 III.2.a. Transfert du gène de la kallicréine ............................................................................................ 29 III.2.b. Invalidation du gène de la kallicréine ....................................................................................... 31 III.2.c. Surexpression/invalidation génétique du récepteur B2 ............................................................. 31 III.2.d. Invalidation du récepteur B1..................................................................................................... 33 III.2.e. Invalidation des récepteurs B1 et B2........................................................................................ 33 III.2.f. Inhibition pharmacologique du système kallicréine-kinine ....................................................... 34 III.3. Contribution personnelle : Profil fonctionnel rénal chez les souris KOB2, évidence d’un rôle tonique du Récepteur B1 surexprimé ................................................................................................... 35 4 Table des matières III.4. Place de la bradykinine dans les effets du blocage du système rénine-angiotensine...... 38 III.4.a. Inhibiteurs de l’Enzyme de Conversion .................................................................................... 38 III.4.b. Antagonistes du récepteur AT1 de l’angiotensine II (ARA2) ................................................... 41 IV. CONCLUSION ........................................................................................................................ 43 PARTIE II – NEPHROPATHIE DIABETIQUE ET SYSTEME KALLICREINE-KININE ....... 44 I. UN CHALLENGE SANITAIRE ....................................................................................................... 44 II. DE LA PHYSIOPATHOLOGIE A LA THERAPEUTIQUE .................................................................... 45 II.1. Les médiateurs à l’échelon cellulaire ............................................................................. 46 II.1.a. Rôle de l’hyperglycémie / AGE ................................................................................................. 46 II.1.b. Rôle du stress oxydant ............................................................................................................... 48 II.1.c. Facteurs de croissance ................................................................................................................ 48 II.2. Intérêt et apport des modèles animaux ........................................................................... 52 II.3. Thérapeutiques actuelles et perspectives ........................................................................ 56 III. II.3.a. Définir une stratégie ................................................................................................................... 56 II.3.b. La fibrose rénale est-elle réversible ?......................................................................................... 57 II.3.c. Les approches pharmacologiques............................................................................................... 58 II.3.d. Autres cibles thérapeutiques potentielles ................................................................................... 60 II.3.e. De l’approche protéomique à la thérapie génique / cellulaire..................................................... 61 TRAITEMENTS ET PROTECTION RENALE : DU BLOCAGE DU SRA A LA MISE EN JEU DU SKK...... 63 III.1. Blocage du système rénine-angiotensine ........................................................................ 63 III.2. Effets collatéraux du blocage du SRA : mise en jeu du SKK et autres............................ 63 III.3. Activation du récepteur B2 : une nouvelle perspective de néphroprotection.................. 65 III.3.a. Arguments pour le rôle protecteur de la bradykinine ................................................................ 65 III.3.b. Mécanismes potentiels de l’effet néphroprotecteur................................................................... 67 III.4. IV. Quelle place pour le récepteur B1 ? ............................................................................... 71 CONTRIBUTION PERSONNELLE : PLACE DU RECEPTEUR B2 DANS LES EFFETS DU BLOCAGE DU SRA AU COURS DE LA NEPHROPATHIE DIABETIQUE EXPERIMENTALE ............................................................... 72 PARTIE III – CHOC ENDOTOXINIQUE ET SYSTEME KALLICREINE-KININE................. 84 I. COMPRENDRE POUR AMELIORER LE PRONOSTIC ........................................................................ 84 I.1. Epidémiologie ................................................................................................................. 84 5 Table des matières I.2. Mécanismes généraux..................................................................................................... 85 I.3. Options thérapeutiques actuelles .................................................................................... 88 II. QUELLE EST LA PLACE DU SYSTEME KALLICREINE-KININE ? ..................................................... 90 II.1. Rôle du recepteur B1 ...................................................................................................... 91 II.2. Rôle du recepteur B2 ...................................................................................................... 93 II.3. Différences entre les actions des deux récepteurs .......................................................... 94 III. SYSTEME KALLICREINE-KININE ET HEMODYNAMIQUE RENALE AU COURS DU CHOC ENDOTOXINIQUE. .............................................................................................................................................. 95 IV. CONTRIBUTION PERSONELLE : IMPLICATION DES RECEPTEURS B1 ET B2 DANS L’HEMODYNAMIQUE SYSTEMIQUE ET RENALE AU COURS DU CHOC ENDOTOXINIQUE EXPERIMENTAL ............... 97 V. SYSTEME KALLICREINE-KININE ET CHOC SEPTIQUE, NOUVEAU MODELE, NOUVEAUX OUTILS ET NOUVELLES PERSPECTIVES ................................................................................................................................ 98 CONCLUSIONS - PERSPECTIVES.................................................................................................. 99 REFERENCES.................................................................................................................................... 104 6 Table des figures et tableaux Table des figures et tableaux FIGURE 1 : ORGANISATION DES SYSTEMES RENINE-ANGIOTENSINE ET KALLICREINE-KININE ................................. 17 FIGURE 2 : EFFETS SUR LES PARAMETRES GENERAUX ............................................................................................ 36 FIGURE 3 : PARAMETRES FONCTIONNELS RENAUX................................................................................................. 37 FIGURE 4 : POSSIBILITES D’ACTIVATION DU RB2 DURANT UN TRAITEMENT PAR UN IEC OU UN ARA2 ............... 41 FIGURE 5 : EVOLUTION DE LA GLOMERULOSCLEROSE. GLOMERULES HUMAINS EN MICROSCOPIE OPTIQUE A DIFFERENTS STADES DE NEPHROPATHIE DIABETIQUE .......................................................................... 45 FIGURE 6 : EVOLUTION DE LA NEPHROPATHIE DIABETIQUE CHEZ L’HOMME .......................................................... 46 FIGURE 7 : PRINCIPAUX MECANISMES PHYSIOPATHOLOGIQUES DE LA NEPHROPATHIE DIABETIQUE ..................... 51 FIGURE 8 : EXEMPLES DE MODELES EXPERIMENTAUX DE DIABETE CHEZ LE RAT ET LA SOURIS ............................. 52 FIGURE 9 : DIFFERENTS MECANISMES POSSIBLES DE NEPHROPROTECTION ASSOCIES A L’ACTIVATION DU RECEPTEUR DE LA BRADYKININE ......................................................................................................... 70 FIGURE 10 : DEFAILLANCE RENALE AU COURS DU SEPSIS ...................................................................................... 88 TABLEAU 1: PRINCIPAUX TRAVAUX IN VITRO SUR L'EFFET PROLIFERATIF OU ANTIPROLIFERATIF DE LA BK ......... 26 TABLEAU 2 : APPORT DES QUELQUES MODELES GENETIQUEMENT MODIFIES DANS LA CONNAISSANCE DE LA GLOMERULOSCLEROSE DIABETIQUE ................................................................................................. 55 TABLEAU 3 : AGONISTES EXISTANTS DU RECEPTEURS B2 DE LA BRADYKININE ET UTILISATION ......................... 100 7 Abréviations utilisées Abréviations utilisées AGE Advanced Glycation End-Product AMPc Adénosine Mono-Phosphate cyclique APC Activated Protein C ARA2 Antagonistes des Récepteurs AT1 de l’Angiotensine II AT1 Récepteur de type I de l’Angiotensine II AT2 Récepteur de type II de l’Angiotensine II BK Bradykinine BMP7 Bone Morphogenic Protein 7 CTGF Connective Tissue Growth Factor DAG Diacylglycérol DFG Débit de Filtration Glomérulaire DID Diabète Insulino-Dépendant DNID Diabète Non Insulino-Dépendant ECA Enzyme de Conversion de l’Angiotensine ECA 2 Enzyme de Conversion 2 de l’Angiotensine 2 EGF Epithelial Growth Factor ENaC Epithelial Na2+ Channel FGF Fibroblast Growth Factor GMPc Guanosine Mono-Phosphate cyclique HGF Hepatocyte Growth Factor HDAC Histone Desacethylases HIF Hypoxia Inducible Factor HOPE Heart Outcomes Prevention Evaluation IEC Inhibiteurs de l’Enzyme de Conversion IGF1 Insulin Growth Factor 1 IL Interleukine IP3 Inositol 1,4,5-triphosphate JNK Jun-N-terminal Kinase KOB1 Souris invalidées pour le récepteur B1 de la bradykinine KOB2 Souris invalidées pour le récepteur B2 de la bradykinine L-NAME N(G)-nitro-l-Arginine Methyl Ester, inhibiteur de la NOS LPS Lipopolysaccharide MAPK Mitogen Activated Protein Kinases ND Néphropathie Diabétique 8 Abréviations utilisées NFκB Nuclear Factor κB NOD Non Obese Diabetic NO Monoxyde d’azote NOSe NO-Synthase endothéliale NOSi NO-Synthase inductible NOSn NO-Synthase neuronale p27kip1 Inhibiteur des Cyclin Dependant Kinases PAF Platelet-Activating Factor PAI-1 Plasminogen Activator Inhibitor-1 PDGF Platelet-Derivated Growth factor PGE2 Prostaglandine E2 PIP2 Phosphatidylinositol 4,5-biphosphate PKC Protéine Kinase C PLA2 Phospholipase A2 PLC Phospholipase C RAGE Receptor for Advanced Glycation End-Product RB1 Récepteur B1 de la bradykinine RB2 Récepteur B2 de la bradykinine RCPG Récepteur Couplé aux Protéines G REIN The Ramipril Efficacy In Nephropathy RLO Radicaux Libres Oxygénés SDKP Peptide N-acetyl-seryl-aspartyl-lysyl-proline SHR-SP Stroke-prone spontaneously hypertensive rats SKK Système Kallicréine-Kinine SOD Super Oxyde Dismutase SRA Système Rénine Angiotensine STZ Streptozotocine TGFβ Transforming Growth Factor β TGFβ RII Récepteur de type II du TGFβ TNF Tumor Necrosis Factor TZD Thiazolidinediones VEGF Vascular Endothelial Growth Factor 9 Introduction INTRODUCTION Le diabète, de type I comme de type II, se complique fréquemment d’une atteinte rénale (prévalence ≥ 15 %), caractérisée principalement par une atteinte glomérulaire avec une protéinurie qui évolue vers l’insuffisance rénale. En dépit des efforts de contrôle de la glycémie, 50 % des diabétiques de type I développent une néphropathie après 20 ans de maladie. Ce problème est encore plus critique au cours du diabète de type II puisque, même si la durée de la maladie est souvent inférieure, il est pratiquement impossible d’obtenir un équilibre glycémique optimal. L’espérance de vie croissante dans ce cas explique l’incidence croissante des néphropathies diabétiques (ND) au cours du diabète de type II. Aujourd’hui, seul le blocage du Système Rénine Angiotensine (SRA) par les Inhibiteurs de l’Enzyme de Conversion (IEC) ou par les antagonistes du récepteur AT1 de l’angiotensine II, a montré une efficacité clinique pour ralentir la progression de la néphropathie diabétique. L’effet protecteur des IEC a longtemps été attribué exclusivement au blocage de la synthèse d’angiotensine II. Toutefois, un nombre croissant d’arguments expérimentaux suggère que la mise en jeu du Système Kallicréine-Kinine (SKK) contribue aussi à l’action bénéfique des IEC. La bradykinine (principale molécule du SKK) est un nonapeptide qui agit sur deux récepteurs couplés aux protéines G : les récepteurs B1 et B2. Le rôle du récepteur B2 (RB2) a été le plus étudié et sa contribution aux mécanismes d’action des IEC semble la plus importante. Bien avant la mise en évidence de son action trophique au cours des néphropathies chroniques, la BK a été impliquée dans des dysfonctionnements aigus du rein, 10 Introduction comme le choc septique dont l’incidence est d’ailleurs augmentée par la présence d’un diabète. Le système kallicréine-kinine occupe une place notable dans la physiopathologie du choc endotoxinique. Cependant son impact global, délétère ou protecteur, ainsi que les actions respectives des récepteurs B1 et B2 sont encore mal déterminés. Nos travaux avaient pour but de préciser le rôle du récepteur B2 de la bradykinine au cours de l’insuffisance rénale chronique (néphropathie diabétique) ou aiguë (choc endotoxinique). L’idée principale était de rechercher de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles pour protéger le rein dans ces deux pathologies. Initialement, nous avons étudié l’effet du blocage du RB2 sur l’expression et l’activation de plusieurs facteurs de croissance au cours d’un traitement par un IEC chez le rat diabétique (Streptozotocine) (Allard J, Buléon M, Cellier E, Renaud I, Pecher C, Praddaude F, Conti M, Tack I and JP Girolami.ACE inhibitor reduces growth factor receptor expression and signalling but also albuminuria through B2-kinin glomerular receptor activation in diabetic rats. Am J Physiol Renal Physiol. 2007 ; 293(4) : F1083-92). Ensuite, nous avons développé dans le Laboratoire le modèle des souris obèses et diabétiques de type II, C57BlKs db/db, qui développent des lésions rénales plus progressives et plus proches de celles observées chez l’Homme que le rat. Comme la néphropathie diabétique est avant tout une glomérulopathie, la première étape a consisté en l’adaptation chez la souris d’une méthode d’isolement glomérulaire par tri magnétique sélectif. Ce travail a fait l’objet d’une communication internationale (Buleon M, Allard J, Praddaude F, Ader JL, Tack I: Glomerular expression and activation of IGF-I pathway in type I and type II diabetes in mice. (poster) ASN 37th Annual Meeting & Scientific Exposition, St Louis, Missouri, october 2004) et le manuscrit, en préparation, sera soumis prochainement à la revue European Journal of Physiology. Nous avons ensuite étudié le rôle du récepteur B2 de la bradykinine (RB2) dans l’effet des IEC au cours de la néphropathie diabétique chez la souris db/db. (Marie Buléon, Julien Allard, Acil Jaafar, Françoise Praddaude, Marie-Thérèse Ranera, 11 Introduction Christiane Pecher, Jean-Pierre Girolami and Ivan Tack. Pharmacological blockade of B2-kinin receptor reduces renal protective effect of Angiotensin-Converting Enzyme Inhibition in db/db mice model. Am J Physiol Renal Physiol. 2008). Enfin, nous avons étudié dans le même modèle, l’effet du blocage du RB2 au cours d’un traitement cette fois par un antagoniste du récepteur AT1 de l’angiotensine II (ARA2) (Acil Jaafar, manuscrit en cours de rédaction). L’extrême sensibilité des animaux diabétiques à l’action des IEC et au blocage du RB2 nous a amené à nous interroger sur les actions rénales du RB2 en conditions physiologiques et au cours du diabète. L’invalidation du RB2 a pour principale conséquence une diminution du débit de filtration glomérulaire. Nous avons surtout été frappés par le fait que les souris invalidées pour le RB2 surexpriment sensiblement le RB1 (la réciproque pour le KOB1 étant aussi exacte). Les conséquences observées dans le modèle KOB2 pourraient aussi résulter de la surexpression du RB1. L’utilisation d’antagonistes du RB1 et du RB2 dans les deux modèles de KO est en cours et fera prochainement l’objet d’une publication. Le choc endotoxinique est une circonstance dramatique mais malheureusement assez fréquente (entre autre chez le diabétique), au cours de laquelle l’altération des fonctions rénales détermine largement le pronostic global du patient. Nous avons étudié les conséquences fonctionnelles rénales d’un choc endotoxinique induit par le lipopolysaccharide (LPS) chez des souris sauvages, KOB1 ou KOB2. (Seguin T, Buleon M, Destrube M, Ranera MT, Couture R, Girolami JP, Tack I. Hemodynamic and renal involvement of B(1) and B(2) kinin receptors during the acute phase of endotoxin shock in mice. Int Immunopharmacol. 2008 ; 8(2) : 217-21). Des travaux complémentaires sont en cours dans un modèle expérimental de choc septique par ponction caecale. Ceux-ci concernent l’implication des récepteurs de la bradykinine dans l’augmentation de la perméabilité capillaire, qui contribue à altérer le pronostic du choc septique. 12 Introduction La synthèse des résultats de nos travaux montre que le blocage du récepteur B2 de la bradykinine détermine une perte sensible d’efficacité des IEC. Plus encore, cela nous a permis d’étayer avec des arguments de plus en plus directs le concept de l’effet néphroprotecteur de l’activation du RB2. Cette réflexion a fait l’objet d’une revue faisant le point sur l’état des connaissances actuelles concernant le rôle potentiellement néphroprotecteur du RB2 (Bradykinine et néphroprotection, Pourquoi ? Comment ? Perspectives. Marie Buléon, Marion Merhenberger, Christiane Pécher, Françoise Praddaude, Réjean Couture, Ivan Tack, Jean-Pierre Girolami. MEDECINE/SCIENCES 2007 ; 23 : 1141-7). Finalement, il reste à vérifier cette hypothèse par l’étude des effets directs d’un agoniste stable de la bradykinine. Nous disposons d’un des premiers agonistes non peptidiques (donc résistant à la dégradation endogène) de la bradykinine utilisable in vivo. Nous avons commencé à tester l’effet de cet agoniste, en priorité dans le modèle de la néphropathie diabétique. 13 Partie I : bradykinine et rein PARTIE I : BRADYKININE ET REIN Les kinines sont des médiateurs paracrines appartenant à une famille de peptides endogènes constitués de 9 à 11 acides aminés. Ce sont les peptides actifs du système kallicréine-kinine (SKK), dont le plus connu est la bradykinine (BK). Le SKK est un système protéique impliqué dans de nombreuses fonctions physiologiques telles que la régulation locale et systémique de la pression artérielle, la volémie, la perméabilité vasculaire, les réponses inflammatoires, la médiation de la douleur et le phénomène de coagulation. Le système comprend des substrats (les kininogènes), des enzymes (les kallicréines) et des peptides vasoactifs (les kinines), qui agissent sur deux récepteurs à sept domaines transmembranaires (les récepteurs B1 et B2), associés à l’activation d’un réseau de signalisation complexe. La reconnaissance de ce système remonte aux travaux d’Abelous et Bardier (1909) [1] qui ont observé que l’injection intraveineuse d’urine humaine chez le chien provoquait une importante chute de la pression artérielle. Plus tard, en 1930 le groupe de E. Werle isola cette substance hypotensive, à partir d’extraits de pancréas et la désigna du nom de « kallicréine » [2]. La bradykinine a, quant à elle, été découverte 20 ans plus tard par le groupe de Rocha e Silva. L’organisation du système kallicréine-kinine est à la fois complexe et classique pour un système de communication paracrine relativement ubiquitaire : un propeptide, une enzyme activatrice, 2 récepteurs de type RCPG et un catabolisme enzymatique très particulier. 14 Partie I : bradykinine et rein I. ORGANISATION DU SYSTEME KALLICREINE-KININE I.1. COMPOSANTS DE LA CASCADE PARACRINE I.1.a. Composants du système kallicréine-kinine Les kinines sont libérées lors de l’hydrolyse enzymatique des kininogènes (substrats hépatiques circulants) par des sérine-protéases : les kallicréines. Il existe au moins deux types d’enzymes kallicréines : la kallicréine plasmatique et la kallicréine tissulaire. Elles diffèrent par leurs propriétés physico-chimiques et fonctionnelles, leurs substrats et leurs localisations [3]. Les deux hydrolysent, avec des affinités différentes, les kininogènes de haut et de bas poids moléculaire. La kallicréine plasmatique (PM : 60 kDa) est codée par un seul gène, elle est synthétisée au niveau du foie sous la forme d’un précurseur inactif, la prékallicréine, qui est la forme circulante. Après activation, elle hydrolyse essentiellement le kininogène de haut poids moléculaire (glycoprotéine synthétisée au niveau du foie) pour former la bradykinine. Les kallicréines tissulaires, codées par plusieurs gènes localisés chez l’Homme sur le chromosome 19 (PM entre 24 et 48 kDa), sont synthétisées dans de nombreux tissus, principalement le pancréas, le rein, l’intestin et le cerveau. Leur substrat préférentiel est le kininogène de bas poids moléculaire, à partir duquel elles vont libérer selon les espèces la bradykinine (Rat et Souris) ou la lys-bradykinine (ou kallidine chez l’Homme). Les kininogènes de haut et de bas poids moléculaire sont produits dans le foie, ils résultent de l’épissage alternatif d’un seul gène [4]. Ils présentent des variations de séquence en fonctions des espèces, il existe en conséquence des différences entre espèces dans la séquence peptidique des kinines. La principale kinine, la bradykinine, est un nonapeptide de séquence : arg–pro–pro–gly–phe–ser–pro–phe–arg. Chez l’Homme, il existe deux autres 15 Partie I : bradykinine et rein principales kinines : la kallidine ou lys-bradykinine (Lys-BK) qui est un décapeptide, et un nonapeptide, la des-Arg10-kallidine. Chez le Rat, il existe uniquement la BK et la des-Arg9BK ainsi qu’une kinine spécifique du rat : la T-kinine (ou Ile-Ser-BK), libérée essentiellement par l’action de la trypsine [5]. Toutes ces kinines agissent sur deux récepteurs couplés aux protéines G, nommés B1 et B2. I.1.b. Interactions entre le système rénine-angiotensine et le système kallicréine-kinine In vivo, la BK est rapidement inactivée par deux voies enzymatiques principales impliquant les kininases I et II. Sa demi-vie plasmatique est estimée à moins de 30 secondes. La kininase I, également connue sous le nom de carboxypeptidase N (CPN) dans le plasma ou carboxypeptidase M (CPM) sur la membrane plasmique des cellules vasculaires, génère la des-Arg9-BK. Celle-ci, agoniste préférentiel du récepteur B1, est responsable d’effets biologiques bien distincts de ceux de la BK. La kininase II, plus connue sous le nom d’Enzyme de Conversion de l’Angiotensine II (ECA), est la cible des Inhibiteurs de l’Enzyme de Conversion (IEC). C’est une métalloprotéase à doigts de zinc capable, d’une part de générer l’angiotensine II à partir d’angiotensine I et, d’autre part, de dégrader la BK en fragments BK1-5 et BK1-7 inactifs. L’ECA présente une plus grande affinité pour la BK que pour l’angiotensine I [6]. Ce double rôle de l’enzyme de conversion, synthèse de l’angiotensine II et dégradation de la bradykinine, constitue un lien étroit entre ces 2 puissants systèmes vasomoteurs (Systèmes Rénine-Angiotensine, et SKK). L’organisation et l’intersection de ces deux systèmes sont représentées sur la Figure 1. 16 Partie I : bradykinine et rein La bradykinine peut également être dégradée en BK1-7 par l’endopeptidase neutre. Les inhibiteurs de vasopeptidases inhibent à la fois l’endopeptidase neutre et l’enzyme de conversion. La très courte durée de vie de la BK laisse supposer qu’elle aurait plutôt une action locale, de type autocrine ou paracrine. En effet, les concentrations de BK tissulaires sont plus élevées que les concentrations plasmatiques [7]. De plus, les différents éléments nécessaires à la synthèse de BK sont présents dans la paroi de certaines artères [8, 9]. Figure 1 : Organisation des systèmes rénine-angiotensine et kallicréine-kinine IEC : inhibiteurs de l’enzyme de conversion, ARA2 : antagonistes du récepteur AT1 de l’angiotensine II et IVP : inhibiteurs des vasopeptidases 17 Partie I : bradykinine et rein I.2. DES RECEPTEURS DES KININES AUX ACTIONS PHYSIOLOGIQUES I.2.a. Récepteurs B1 et B2 Les kinines agissent sur 2 récepteurs à 7 domaines transmembranaires (appartenant à la famille des récepteurs couplés aux protéines G), les récepteurs B1 et B2. Le récepteur B2 (RB2) a été cloné en 1991 par le groupe de Jarnagin [10], et le récepteur B1 l’a été quelques années plus tard [11]. La structure de ces 2 récepteurs est typique des récepteurs couplés aux protéines G, avec 7 domaines transmembranaires, un domaine N-terminal extracellulaire et un domaine C-terminal intracellulaire. Chez l’Homme, les gènes de ces deux récepteurs, localisés sur le chromosome 14 sont séparés par seulement 12 kb [12]. L’homologie de structure entre les récepteurs B1 et B2 n’est que de 36% chez l’Homme, et de 30% chez la Souris. Initialement ces deux récepteurs ont été distingués et classés selon leurs propriétés pharmacologiques, en particulier selon leur affinité pour 2 différents ligands : la des-Arg9 BK et la BK [13]. Le RB1 est activé préférentiellement par la des-Arg9-BK et la des-arg10-lys-BK, métabolites endogènes de la bradykinine et de la lys-bradykinine respectivement après action de la kininase I. Il peut également être activé par la BK avec une moindre efficacité. Le récepteur B2 (RB2), responsable de la majorité des effets physiologiques décrits de la BK [3], est quand à lui activé exclusivement par la BK et la lys-BK [14]. 18 Partie I : bradykinine et rein I.2.b. Localisation et régulation des récepteurs B1 et B2 Le récepteur B2 (RB2) est constitutivement exprimé à la surface de nombreux types cellulaires, notamment les cellules endothéliales et musculaires lisses [15], les fibroblastes, les cellules mésangiales et épithéliales. Après liaison de la BK avec le récepteur et activation de la protéine G, le ligand est dissocié et le complexe récepteur/protéine G est rapidement internalisé. Ce processus implique la phosphorylation de plusieurs résidus sérine et thréonine dans le domaine C-terminal du récepteur [16]. Ce phénomène de désensibilisation permet d’éviter la suractivation des récepteurs B2 qui pourrait avoir des conséquences délétères au cours de la réponse inflammatoire, de la douleur ou bien pour le contrôle de la pression sanguine artérielle. De plus ce mécanisme d’endocytose permet secondairement le recyclage des RB2 à la membrane. Contrairement au RB2, le RB1 est un récepteur essentiellement inductible. De ce fait, il est peu détectable dans les conditions physiologiques mais fortement exprimé au cours de certaines situations pathologiques [17]. Son expression est induite en cas de lésions tissulaires, en présence d’endotoxines bactériennes [18], et au cours de certaines pathologies comme le diabète. Cette induction se fait au niveau transcriptionnel et implique des cytokines inflammatoires telles que l’interleukine-1β et le TNFα [19, 20], ou encore l’activation des MAP-kinases, la mise en jeu du facteur de transcription nucléaire NFκB et la protéine kinase p38 [21-23]. A la différence du RB2, le RB1 est associé à une lente dissociation du ligand, il n’est ni désensibilisé ni internalisé [24, 25]. 19 Partie I : bradykinine et rein I.2.c. Signalisation et effets Les récepteurs B1 et B2 sont associés à de multiples systèmes de signalisation complexes. Ainsi, le RB2 active les voies de signalisation classiquement associées aux RCPG, impliquant le recrutement des protéines Gαq et Gαi, l’activation des phospholipases C et A2 et la formation des seconds messagers correspondants. Ces cascades de signalisation diffèrent suivant le type cellulaire concerné. La phospholipase C hydrolyse le phosphatidylinositol 4,5biphosphate (PIP2) pour former les seconds messagers inositol 1,4,5-triphosphate (IP3) et diacylglycérol (DAG). L’IP3 provoque une augmentation rapide des concentrations intracellulaires en Ca2+, et est par exemple responsable de l’activation de la NO-synthase endothéliale et donc de la synthèse et de la libération de monoxyde d’azote (NO) [26]. Le NO ainsi produit diffuse jusqu’aux cellules cibles où il détermine la formation de guanosine monophosphate cyclase (GMPc). De nombreux travaux montrent que le NO et le GMPc sont les facteurs vasodilatateurs responsables des effets des kinines sur le tonus vasculaire. Tout d’abord, une accumulation de GMPc dépendante du NO a été montrée dans les cellules du muscle lisse vasculaire [27]. L’administration d’un antagoniste non peptidique du récepteur B2 (HOE-140 ou Icatibant) provoque une réduction des taux de GMPc dans le liquide interstitiel rénal [28]. L’inhibition de la NO-synthase par le L-NAME induit une augmentation de pression artérielle plus faible chez les souris KOB2 que chez les souris contrôles [29]. Enfin, les souris transgéniques surexprimant le RB2 présentent une élévation des concentrations rénales et urinaires d’adénosine monophosphate cyclase (AMPc) et de GMPc ainsi qu’une augmentation des taux urinaires de NO [30], alors que les souris n’exprimant plus le RB2 excrètent moins de nitrites et ont une concentration urinaire de 20 Partie I : bradykinine et rein GMPc plus faible [31]. Tous ces arguments plaident en faveur d’un effet vasodilatateur de la bradykinine via la production de NO et de GMPc. L’activation du RB2 peut également stimuler la phospholipase A2 (PLA2) et induire la synthèse d’acide arachidonique, précurseur de la prostacycline [32]. Celle-ci stimule la production d’AMPc, un autre puissant vasodilatateur. La BK est également capable d’activer des voies de signalisation moins classiques. En effet, une interaction directe a été démontrée entre le RB2 et des enzymes telles que la phospholipase Cγ, la NO-synthase neuronale (NOSn), la NO-synthase endothéliale (NOSe) [33]. Cette interaction entre le RB2 et la NOSe permet le recrutement de la protéine kinase Akt et permet ainsi le contrôle de la phosphorylation de la NOSe et de la production de NO. Le RB2 pourrait également interagir avec la tyrosine phosphatase SHP2 [34], cette interaction serait impliquée dans l’effet antiprolifératif de la BK. Cette complexité des voies de signalisation activées par la BK fournit une explication à ses effets parfois contradictoires au cours des phénomènes de prolifération cellulaire et de fibrose. En effet, selon les conditions, la BK pourrait avoir une action proliférative ou anti-proliférative (Tableau 1 p26). Dans la cellule mésangiale, par exemple, la BK serait capable de stimuler ou d’inhiber la phosphorylation des MAP-kinases ERK1 et 2 en fonction de l’état d’activation cellulaire en réponse à divers facteurs de croissance [35]. Le RB1 interagit aussi directement avec les protéines Gq et Gi [36] et active la plupart des voies de signalisation mises en jeu par le RB2, dont l’hydrolyse de PIP2, l’augmentation de Ca2+ intracellulaire, la libération d’acide arachidonique et l’activation de la NOSe. Le RB1 exerce un rôle important dans les processus d’inflammation. A l’instar du RB2, l’activation du RB1 peut entraîner des effets prolifératifs [37] ou anti-prolifératifs [38]. L’effet prolifératif impliquerait une activation des MAP-kinases. Inversement, Dixon et al [38] ont montré que 21 Partie I : bradykinine et rein un effet anti-prolifératif du RB1 dans les cellules musculaires lisses. Il serait dû à l’activation prolongée des MAP-kinases qui activeraient secondairement l’inhibiteur de cycle cellulaire p27kip1. Les deux récepteurs empruntent donc des voies de signalisation similaires pour induire des effets différents en fonction des tissus et de leur régulation à court terme (internalisation, désensibilisation). Puisque ces récepteurs activent de façon générale le même ensemble de voies de signalisation, ils ne peuvent être distingués sur la base de leurs effets biologiques. Par contre, leur blocage par des antagonistes pharmacologiques spécifiques permet de bien distinguer les effets B1 des effets B2. II. UNE VISION FONCTIONNELLE ET INTEGREE DU SYSTEME KALLICREINE-KININE Les rôles biologiques des kinines sont nombreux et comprennent : 1) la contraction ou relaxation des muscles lisses des tractus intestinal, urogénital et respiratoire ; 2) la régulation des transports ioniques épithéliaux, de l’hémodynamique systémique et de la pression artérielle [39] ; 3) un rôle de neurotransmetteur dans le système nerveux central et 4) un rôle modulateur de certaines fonctions cellulaires, telles que la prolifération (mitogénèse) et, plus récemment, des phénomènes de fibrose [40-43]. En pratique, leurs rôles prédominants semblent, dans l’état actuel des connaissances, la médiation de l’inflammation et de la douleur ainsi que le contrôle de la pression artérielle [44]. 22 Partie I : bradykinine et rein II.1. REGULATION DE LA PRESSION ARTERIELLE La bradykinine, via la libération de NO et de GMPc, est un puissant vasodilatateur. Des travaux effectués chez l’Homme et dans plusieurs modèles expérimentaux, suggèrent qu’une diminution de la synthèse de BK favoriserait le développement de l’hypertension artérielle. Des études épidémiologiques [45, 46] ont montré une relation inverse entre les taux urinaire et rénal de kallicréine et la sévérité de l’hypertension. De même, les études expérimentales ont rapporté une réduction de l’excrétion urinaire de kallicréine chez des rats hypertendus [47]. Ces observations supportent l’idée d’une relation entre le SKK et la régulation de la pression artérielle. Cependant la BK n’apparaît pas comme un déterminant important de la pression artérielle en conditions physiologiques. Elle jouerait plutôt un rôle protecteur contre les facteurs qui tendent à la modifier, en particulier à l’augmenter. En effet les souris invalidées pour le RB2 ne semblent pas spontanément hypertendues [48, 49], bien que quelques travaux [29, 50-52] du groupe de Maddedu indiquent que les souris KOB2 développent une augmentation modérée de la pression artérielle. Cependant ces résultats n'ont pas été confirmés par les travaux d’autres groupes. Par contre, ces souris déficientes en RB2 présentent une hypersensibilité à certains facteurs tenseurs, en particulier un régime hypersodé [29, 53, 54]. Cela suggère que l’activation du RB2 participerait essentiellement à la régulation de la pression artérielle en condition de « stress ». La BK pourrait donc jouer un rôle protecteur en maintenant normale la pression artérielle en cas de surcharge sodée, certainement par son effet vasodilatateur NO-dépendant, mais peut être aussi via son effet natriurétique. Lorsque l’hypertension artérielle se développe tout de même, la BK pourrait également limiter ses complications : hypertrophie cardiaque, lésions rénales… 23 Partie I : bradykinine et rein II.2. INFLAMMATION ET DOULEUR Contrairement aux situations précédemment évoquées, une surproduction de bradykinine est observée au cours des états inflammatoires. Dans ce cas, le blocage de ses récepteurs permettrait de réduire l’intensité de la réaction inflammatoire et de la douleur [5561]. Les kinines sont des puissants agents vasoactifs. En condition inflammatoire ou lors de lésions tissulaires, elles sont responsables d’une vasodilatation artériolaire mais aussi d’une extravasation plasmatique par augmentation de la perméabilité plasmatique [39]. Les deux récepteurs, B1 et B2, ont été impliqués dans le développement de réponses inflammatoires locales dans des modèles d’arthrites aiguës et chroniques chez le rat [62-65]. Le récepteur B1, ainsi que son ligand endogène, sont produits de novo sur les sites d’inflammation ou de lésions tissulaires. Ce récepteur a été impliqué dans de nombreuses pathologies inflammatoires chroniques dont certaines formes d’hyperalgésie chronique [66]. Les kinines sont également capables de stimuler directement les terminaisons nerveuses sensorielles et ainsi de générer la douleur et l’inflammation neurogène [66, 67]. De plus, les composantes du SKK sont exprimées au niveau du système nerveux central. Le RB2 jouerait, à ce niveau là, un rôle dans la modulation de la douleur [68, 69]. Les deux récepteurs des kinines jouent donc un rôle important dans le développement des réponses inflammatoires et de la douleur, avec toutefois des effets bien distincts : le RB2 interviendrait plutôt dans les phases aiguës de l’inflammation et de la douleur, tandis que le RB1 serait plutôt mis en jeu dans leurs phases chroniques. 24 Partie I : bradykinine et rein II.3. Les PHYSIOPATHOLOGIE CARDIOVASCULAIRE kinines exercent également un rôle important en physiopathologie cardiovasculaire. La bradykinine, via le RB2, aurait une action cardioprotectrice, indépendante de son effet vasodilatateur. En effet, les animaux surexprimant la kallicréine sont plus résistants à l’ischémie-reperfusion cardiaque [70]. Dans la même situation, les souris invalidées pour le RB2 développent des lésions myocardiques et des arythmies plus sévères [71]. L’effet anti-hypertrophique du RB2 a également été décrit au cours d’une étude clinique chez l’Homme [72]. II.4. EFFETS SUR LA PROLIFERATION ET LA FIBROSE La littérature récente propose de « nouveaux effets » de la bradykinine, en particulier dans le contrôle de la prolifération cellulaire et la synthèse de protéines matricielles. Ces effets, parfois contradictoires, pourraient mettre en jeu l’activation de voies de signalisations différentes des voies classiques et n’impliquant pas le recrutement d’une protéine G. Il a été rapporté à la fois des effets mitotiques et des effets anti-mitotiques de la bradykinine. En effet, la BK, via l’activation de la PKC a un effet inducteur de la prolifération de faible intensité sur de nombreux types cellulaires [73-77]. A l’inverse, d’autres travaux montrent une inhibition de la prolifération de cellules cancéreuses mammaires [78] et des cellules musculaires lisses [79]. Ces effets apparemment contradictoires suggèrent l’existence d’une double voie de signalisation. En fait, l’effet prolifératif ou anti-prolifératif de la BK semble dépendre de l’état d’activation préalable des cellules par les facteurs de croissance. Le Tableau 1 regroupe plusieurs travaux qui montrent que les effets prolifératifs sont observés 25 Partie I : bradykinine et rein sur les cellules quiescentes alors que les effets anti-prolifératifs l’ont été sur des cellules en prolifération. Tableau 1: Principaux travaux in vitro sur l'effet prolifératif ou antiprolifératif de la BK Type cellulaire Mésangial Muscle lisse Epithélial Mésangial Endothélial Muscle lisse Epithélial Fibroblaste Etat d’activation Quiescent Quiescent Quiescent IGF-1 Glucose PDGF EGF, IGF-1 EGF, PDGF Type de récepteur BK B2 B2 B2 B2 B2 B2 B2 B2 Effet Prolifération Prolifération Prolifération Anti-prolifératif Anti-prolifératif Anti-prolifératif Anti-prolifératif Anti-prolifératif Référence [73, 74] [75] [76, 77] [35] [80] [38, 79] [78] [81] De la même façon, la bradykinine pourrait exercer, selon les types cellulaires, des effets fibrosants ou anti-fibrosants. En effet, in vitro, l’activation du RB1 stimule la synthèse de collagène par les fibroblastes pulmonaires [82]. A l’inverse, la BK réduit la synthèse de fibronectine et de collagène par les fibroblastes cardiaques [83]. In vivo, la BK aurait plutôt un rôle anti-fibrosant, en inhibant l’accumulation cardiaque de collagène après un infarctus chez le rat [84]. La surexpression de la kallicréine chez le rat, permet également de réduire la fibrose consécutive à une hypertrophie cardiaque [85], un effet dépendant du RB2. Enfin, après obstruction urétérale, les souris invalidées pour le RB2 présentent une fibrose rénale tubulo-interstitielle deux fois plus sévère [42]. De plus, l’effet anti-fibrosant des IEC sur les cellules mésangiales humaines semble être dépendant au moins en partie du RB2 [86]. Cet effet anti-fibrosant de la BK reposerait sur la mise en jeu de la stimulation des activateurs du plasminogène, ce qui provoquerait une activation des métalloprotéases responsables de la dégradation de la matrice extracellulaire [42]. 26 Partie I : bradykinine et rein III. SYSTEME KALLICREINE-KININE : DE LA PHYSIOLOGIE A LA PATHOLOGIE RENALE III.1. LOCALISATION ET ACTIONS PHYSIOLOGIQUES DE LA BRADYKININE III.1.a. Localisation rénale des composants du système kallicréinekinine Tous les éléments du système kallicréine-kinine sont exprimés au niveau du rein. Un premier travail a montré l’existence de sites de liaison pour 3H-BK le long du néphron [87]. Ensuite, l’utilisation de la technique de microdissection couplée à des tests fonctionnels (calcium, sécrétion de prostaglandines) a permis de décrire la localisation très précise des récepteurs B1 et B2 le long du néphron [88, 89]. Les récepteurs B1 et B2 ont été étudiés au niveau glomérulaire tant in vivo [73] que sur des cellules mésangiales en culture [90, 91]. L’ARN messager de la kallicréine a été détecté au niveau glomérulaire et au niveau du tubule contourné distal [92]. Le kininogène de bas poids moléculaire, substrat utilisé par la kallicréine rénale, a d’abord été localisé dans le rein par immunofluorescence au niveau du tubule contourné distal et du canal collecteur chez l’Homme et le Rat [93]. Depuis, chez l’Homme, l’expression de l’ARN messager du kininogène de bas poids moléculaire et du récepteur B2 ont été détectés dans les cellules juxtaglomerulaires, les cellules mésangiales, l’épithélium de la capsule de Bowman, les tubules proximaux et distaux, l’anse de Henlé, le canal collecteur et au niveau des cellules endothéliales des vaisseaux sanguins [94]. 27 Partie I : bradykinine et rein L’expression, au niveau rénal, de tous les composants du SKK suggère une production locale de BK et l’implication du système dans la physiologie rénale et les phénomènes d’homéostasie afférents. III.1.b. Actions rénales de la bradykinine Les premiers travaux sur les actions de la bradykinine au niveau rénal ont décrit ses effets vasodilatateurs, diurétiques et natriurétiques. En plus de ses actions vasodilatatrices déjà détaillées, la BK exerce, principalement via le RB2, d’autres effets indépendants, en particulier diurétiques et natriurétiques qui impliquent soit l’inhibition de la synthèse d’AMPc [95, 96] soit la synthèse de NO [96-98]. Ces études suggèrent que l’inactivation du SKK favorise l’hypertension artérielle et le développement de ses complications rénales. Le SKK est donc rapidement apparu comme un système de défense contre le SRA vasoconstricteur. De nombreux arguments suggèrent que la BK exerce un rôle néphroprotecteur, indépendant de son effet sur l’hypertension. Ainsi, la perfusion de kallicréine chez le rat Dahl hypertendu, à une dose qui n’a pas d’effet sur la pression artérielle systémique, réduit la protéinurie, augmente le débit de filtration glomérulaire, et prévient le développement de la fibrose glomérulaire et tubulaire [99, 100]. Ces effets bénéfiques sont accompagnés d’une augmentation de l’excrétion urinaire de BK et de GMPc, ce qui confirme que l’effet de l’administration de kallicréine agit via l’augmentation de la synthèse de bradykinine [100]. De plus, ces effets étaient dépendants de l’activation de son récepteur B2 puisqu’ils étaient supprimés par la co-administration d’HOE-140 (antagoniste du RB2) [99]. Plus récemment, un travail utilisant le même modèle, a montré que l’administration directe de BK protège de l’atteinte rénale induite par un excès de sel [40]. Ce traitement a permis en effet de limiter la 28 Partie I : bradykinine et rein protéinurie, la glomérulosclérose et la dilatation tubulaire, mais aussi de réduire l’accumulation de collagène, l’inflammation et l’apoptose dans le rein. Ces effets de la perfusion de BK étaient associés à une augmentation de la synthèse de NO, ainsi qu’à une diminution du stress oxydant, de l’expression du TGFβ et de l’activation des MAP-kinases. Actuellement, de nombreuses études suggèrent un rôle néphroprotecteur de la BK. D’une part, elle occupe une place sensible dans l’effet protecteur rénal des IEC. D’autre part, sa capacité à réduire le développement de la fibrose suggère qu’elle pourrait avoir une action bénéfique directe au cours des pathologies rénales fibrosantes. Le développement de modèles de souris transgéniques pour les différents constituants du SKK, en particulier les souris invalidées pour le RB2, a permis d’apporter des preuves expérimentales très fortes en faveur du rôle néphroprotecteur de la BK dans différentes situations pathologiques. III.2. MODIFICATIONS EXPERIMENTALES DU SYSTEME KALLICREINEKININE III.2.a. Transfert du gène de la kallicréine La kallicréine, enzyme nécessaire à la synthèse des kinines, occupe une place essentielle dans le SKK. De façon intéressante, le débit d’excrétion urinaire de kallicréine urinaire chez l’homme est inversement corrélé à la sévérité des pathologies rénales [101]. Agir sur la disponibilité rénale de la kallicréine représente donc un moyen d’étudier les effets potentiellement néphroprotecteurs de la BK. Le groupe de Chao a fait de nombreux travaux de thérapie génique expérimentale en transférant dans plusieurs modèles de néphropathie chez le rat, le gène de la kallicréine tissulaire humaine. Tout d’abord, dans un modèle de néphropathie induite par la gentamycine 29 Partie I : bradykinine et rein [102], le transfert du gène de la kallicréine apportait un bénéfice fonctionnel (moindre diminution du DFG), et structural (ralentissement des lésions tubulaires et de la nécrose cellulaire épithéliale). Dans un modèle de néphrectomie 5/6 [103], ce même traitement réduisait la protéinurie et l’albuminurie et prévenait aussi le développement de lésions de sclérose glomérulaire et tubulaire. Cette méthode de thérapie génique par le gène de la kallicréine a montré les mêmes effets bénéfiques dans différents modèles de rats hypertendus développant des dommages cardio-vasculaires et rénaux [104-106]. Cet effet protecteur était accompagné d’une augmentation de la synthèse de NO et de GMPc, d’une diminution d’expression du TGFβ, de p27kip1, de la phosphorylation de la JNK et de ERK, mais aussi de la production d’ion superoxide. La kallicréine tissulaire protège donc du développement des complications rénales chez le rat hypertendu via une augmentation de la biodisponibilité du NO, la réduction du stress oxydant et de l’expression du TGFβ. Dans un travail récent, le même groupe a montré que le traitement par le gène de la kallicréine était capable non seulement de prévenir mais également de reverser la fibrose rénale en restaurant la production de NO et en inhibant celle d’ion superoxide [107, 108]. Il est intéressant de noter que, de façon inattendue et presque paradoxale, l’administration prolongée de kallicréine ne semble pas induire d’effets hypotenseurs. 30 Partie I : bradykinine et rein III.2.b. Invalidation du gène de la kallicréine L’invalidation du gène de la kallicréine glandulaire a été réalisée par le groupe de F. Alhenc-Gelas [109-111]. Chez ces animaux, la BK n’est plus détectable, ce qui indique que la kallicréine glandulaire est indispensable pour la synthèse de BK circulante. Ces souris sont normotendues et présentent une hémodynamique cardiaque et rénale normales [109]. Au niveau rénal, l’invalidation de la kallicréine tissulaire provoque une diminution de la réabsorption tubulaire du calcium [112], qui n’est pas retrouvée chez les souris invalidées pour le RB2, même en présence d’un antagoniste du RB1. Cela suggère un effet indépendant des kinines. Plus récemment, le même groupe a montré que les souris déficientes en kallicréine présentent un défaut d’activité du canal ENaC [113], suggérant un effet antinatriurétique potentiel de la kallicréine via l’activation de ce canal sodé du néphron distal. III.2.c. Surexpression/invalidation génétique du récepteur B2 Les souris transgéniques surexprimant le RB2 sont hypotendues [114], et présentent une augmentation du débit de filtration glomérulaire associée à une activation de la voie NOGMPc/AMPc [30]. Par contraste, les souris déficientes en RB2 (KOB2), elles, ne sont pas hypertendues, et leur fonction rénale est normale [48]. D’autres travaux, contradictoires, ont montré que le KOB2 serait associé à une augmentation de la pression artérielle et de la fréquence cardiaque [29, 50-52]. Toutefois, cette observation n’a pas été confirmée par les travaux plus récents, il pourrait s’agir d’une simple variation des conditions expérimentales. Par contre l’absence de RB2 a un impact sensible dans certaines conditions pathologiques, ce qui étaye son rôle « protecteur » en terme d’équilibre homéostatique et d’hémodynamique rénale dans de telles situations pathologiques. Par exemple, les souris KOB2 présentent une hypersensibilité aux 31 Partie I : bradykinine et rein régimes hypersodés [29, 53, 54]. En effet, un apport excessif de NaCl ainsi qu’un excès de minéralocorticoïdes [115] provoque une hypertension plus importante chez les souris KOB2 que chez des souris sauvages. Dans un autre cadre pathologique, les souris n’exprimant plus le RB2 développent une néphropathie diabétique plus sévère que la souche sauvage [116]. Cette observation est à rapprocher de l’observation selon laquelle les souris exprimant des copies multiples de l’enzyme de conversion (état associé à une forte dégradation de la BK et ainsi à une très faible activation du RB2) développent également une néphropathie diabétique plus sévère [117]. Enfin, la fibrose interstitielle après obstruction urétérale semble aggravée chez la souris n’exprimant plus le RB2 [42]. Ces résultats montrent que l’absence d’expression du RB2 ou sa faible activation aggrave le développement de lésions rénales. Cependant, l’utilisation de modèles de souris KO pour l’un des récepteurs de la BK présente une limite. En effet, plusieurs travaux ont montré que le récepteur non invalidé (RB1 chez les animaux KOB2 et inversement) est surexprimé [118, 119]. Cette surexpression pourrait correspondre à une adaptation physiologique destinée à compenser l’absence de l’autre récepteur. Duka et al [118] ont montré cette surexpression du RB1 chez les souris KOB2, le RB1 pouvant alors compenser la perte du RB2 en exerçant à sa place des effets vasodilatateurs. 32 Partie I : bradykinine et rein III.2.d. Invalidation du récepteur B1 Les souris invalidées pour le RB1 sont normotendues [120]. L’effet de l’invalidation du RB1 a été étudié au niveau cardiaque [120, 121], dans les phénomènes de douleur [122, 123] et au cours du choc septique (cf Partie III) mais aucun effet sur les fonctions et la structure du rein n’a à ce jour été rapporté. III.2.e. Invalidation des récepteurs B1 et B2 Le groupe de O. Smithies a développé un modèle de souris déficientes pour les 2 récepteurs des kinines, et a étudié leur susceptibilité à l’ischémie-reperfusion rénale [124]. Ils ont observé que les souris invalidées pour le RB2 (KOB2) présentaient des lésions consécutives à l’ischémie-reperfusion (lésions histologiques, apoptose, insuffisance rénale) plus importantes que les souris sauvages. De plus, les souris invalidées pour les 2 récepteurs (KOB1B2) développent des lésions encore plus importantes, ce qui suggère un rôle également protecteur du RB1. Le stress oxydant, ainsi que l’expression des ARNm du TGFβ, du CTGF et de l’endothéline 1, trois gènes impliqués dans le développement des lésions consécutives à l’ischémie-reperfusion, ont été recrutés de façon concomitante avec des amplitudes variables : WT < KOB2 < KOB1B2. Le développement de ce double KO a permis de montrer que les deux récepteurs des kinines peuvent exerçer un rôle néphroprotecteur dans le modèle d’ischémie-reperfusion [124]. Cependant, une autre équipe qui a également développé ce double KO ne confirme pas les effets aggravants de l’absence conjointe du RB1 et du RB2, du moins dans un autre modèle expérimental, celui du choc septique [125]. 33 Partie I : bradykinine et rein III.2.f. Inhibition pharmacologique du système kallicréine-kinine Comme l’invalidation génétique du RB2, le blocage pharmacologique du SKK, par l’aprotinine qui inhibe la kallicréine, ou par un antagoniste du RB2, ne modifie pas la pression sanguine que ce soit chez l’Homme ou chez le Rat [126, 127]. Par contre, elle augmente les effets vasopresseurs de la deoxycorticostérone et de l’angiotensine II [128-130]. Chez le rat SHR-SP, spontanément hypertendu, le RB1 est fortement induit [131]. L’inhibition pharmacologique du RB1 provoque une augmentation de la pression sanguine artérielle et de l’excrétion urinaire d’albumine, parallèlement à une augmentation de l’expression du TGFβ et du collagène de type II. L’induction du RB1 au cours de l’hypertension dans ce modèle permettrait donc, via ses effets vasodilatateurs et anti-fibrosants, de protéger le rein des conséquences délétères de cette hypertension. Par contre, l’induction du RB1 lors du choc septique a un effet presseur qui pourrait limiter l’hypotension dans la phase aiguë [132, 133]. Ces observations doivent être prises en considération avant d’envisager le blocage pharmacologique systématique du RB1 comme perspective thérapeutique. 34 Partie I : bradykinine et rein III.3. CONTRIBUTION PERSONNELLE : PROFIL FONCTIONNEL RENAL CHEZ LES SOURIS KOB2, EVIDENCE D’UN ROLE TONIQUE DU RECEPTEUR B1 SUREXPRIME Comme nous l’avons détaillé plus haut, les souris invalidées pour le RB2 surexpriment le RB1. Bien que cette surexpression ait été rapportée par plusieurs autres groupes, les conséquences fonctionnelles et physiopathologiques de ces observations n’ont jamais été envisagées. Les conséquences observées chez les animaux KOB2 pourraient donc ne pas résulter uniquement de l’absence du RB2 mais également de la surexpression du RB1. L’expression du RB1 est toujours associée à des situations de stress, et n’a jamais été rapportée en situation physiologique. Le modèle de la souris invalidée pour le RB2 permet l’étude des effets de l’expression spontanée du RB1 en situation physiologique en absence de stress. Afin d’étudier l’implication potentielle de la surexpression du RB1 sur la fonction rénale chez les souris KOB2, nous avons exploré les fonctions rénales de 5 groupes de souris : 1) souris C57 Bl6 sauvages (WT) ; 2) souris C57 Bl6 sauvages traitées par un antagoniste du RB2 (WT HOE) ; 3) souris C57 Bl6 invalidées pour le RB2 (KOB2) et 4) souris KOB2 traitées par un antagoniste du RB1. Les animaux du groupe 2 ont reçu une injection souscutanée quotidienne de 250 µg/kg/jour d’HOE-140 pendant les 4 jours précédent l’exploration des fonctions rénales. L’antagoniste du RB1 (SSR2406120 Sanofi-Aventis) a été administré quotidiennement par gavage, à la dose de 10 mg/kg pendant les 4 jours précédent l’exploration des fonctions rénales. 35 Partie I : bradykinine et rein Phénotype des animaux (Figure 2) 0.35 30 Poids des reins (g) 25 20 15 10 5 0 0.30 0.25 0.20 0.15 0.10 0.05 B 1 O B 2K O W T B 100 2.0 PSA (mmHg) 1.5 1.0 0.5 0.0 75 50 25 B 1 O g nt a O A A nt ag B 2K B 2 T W T B 1 A nt ag B 2K O B 2K O W T A nt ag B 2 W T 0 W Glycémie (g/L) 2.5 A nt ag A nt ag A 2K O T W B 2K W T B 1 nt ag B 2K O A nt ag W T B 2 0.00 B 2K Poids corporel (g) 35 B 2 • Figure 2 : Phénotype des animaux PSA : Pression sanguine artérielle ; WT : souris sauvages ; Antag B2 : antagoniste du RB2 (HOE-140) ; Antag B1 antagoniste du RB1 (SSR2406120) ; B2KO : souris invalidées pour le RB2. L’invalidation ou le blocage pharmacologique du RB2 n’ont pas d’effets significatifs sur le poids corporel, le poids des reins, la glycémie et la pression sanguine artérielle. La glycémie tend à être légèrement réduite chez les souris KOB2 et réaugmentée en présence de l’antagoniste du RB1, mais ce résultat n’est pas significatif. 36 Partie I : bradykinine et rein Effets sur les paramètres fonctionnels rénaux (Figure 3) * * 1500 DPR (µl/min/65cm2) 200 100 * 1000 500 B g 2K O B 2K W T B 2K O A A nt a B nt a A A O 2 T g W B 1 O 2K B nt ag B 2 W T W T 1 0 0 B DFG (µl/min/65cm2) 300 nt ag • ** B 1 O nt ag 2K O A A nt a A B 2K O T W 0 B 1 g B 2K O B A nt ag B W T 2 0 25 2K 5 B 10 50 2 15 75 B 20 W T FF (%) 25 100 nt ag RVR (mmHg/ml/min/cm2) *** * 30 W T 35 Figure 3 : Paramètres fonctionnels rénaux DFG : Débit de Filtration Glomérulaire ; DPR : Débit Plasmatique Rénal ; FF : Fraction Filtrée ; RVR : Résistances Vasculaires Rénales. L’invalidation du RB2 a pour principale conséquence une réduction du Débit de Filtration Glomérulaire (DFG), avec un Débit Plasmatique Rénal inchangé (DPR), et par conséquent une réduction de la Fraction Filtrée (FF). Ces effets ne sont pas observés chez les souris traitées par l’antagoniste du RB2 (qui n’expriment pas le B1), et sont annulés chez les souris KOB2 traitées par l’antagoniste du RB1, suggérant qu’ils résultent de la surexpression du RB1. Le même travail est en cours chez les animaux invalidés pour le RB1 et traités ou non par un antagoniste du RB2. Deux groupes supplémentaires de souris sauvages sont en cours d’étude : l’un traité par l’antagoniste du RB1, et l’autre traité simultanément par les deux antagonistes (RB1 et RB2). 37 Partie I : bradykinine et rein III.4. PLACE DE LA BRADYKININE DANS LES EFFETS DU BLOCAGE DU SYSTEME RENINE-ANGIOTENSINE Les premiers arguments en faveur du rôle néphroprotecteur de la BK sont indirects et reposent sur les effets bénéfiques du blocage du système rénine-angiotensine au cours des néphropathies hypertensives et diabétiques. Ces deux néphropathies se caractérisent par une atteinte glomérulaire précoce avec accumulation de matrice mésangiale, une glomérulosclérose progressive et des lésions de fibrose tubulo-interstitielle qui évoluent vers l’IRC. En effet, ces pathologies sont souvent associées à des complications au niveau rénal, caractérisées par une hyperplasie, une hypertrophie cellulaire et une accumulation de matrice extracellulaire initialement localisée dans le glomérule. Elles aboutissent à la fibrose du glomérule (ou glomérulosclérose), à la fibrose interstitielle et à l’insuffisance rénale. Actuellement, le blocage du système rénine-angiotensine (SRA) par les inhibiteurs de l’enzyme de conversion (IEC) ou par les antagonistes du récepteur AT1 de l’angiotensine II (ARA2) s’avère la meilleure stratégie thérapeutique [134] pour ralentir l’évolution et la sévérité de la glomérulosclérose. III.4.a. Inhibiteurs de l’Enzyme de Conversion L’effet protecteur cardiovasculaire et rénal des IEC a été démontré dans plusieurs grandes études cliniques. Par exemple, l’étude REIN (The Ramipril Efficacy In Nephropathy, [135] a montré que le traitement de patients protéinuriques par un IEC (ramipril), permet malgré une pression artérielle identique, de ralentir le déclin du débit de filtration glomérulaire, et de réduire le risque de développer une insuffisance rénale terminale. L’effet protecteur rénal des IEC serait supérieur à celui des autres molécules anti-hypertensives. L’étude HOPE (Heart Outcomes Prevention Evaluation [136]) a montré que le traitement par 38 Partie I : bradykinine et rein le ramipril est associé à une réduction de la mortalité et de la morbidité cardio-vasculaire chez les patients à haut risque cardio-vasculaire. Ce bénéfice est encore plus grand chez les patients présentant des pathologies rénales, ce qui suggère un effet spécifique des IEC sur la protéinurie, indépendamment de leur effet hypotenseur [137]. Les IEC agissent à la fois sur le SRA vasoconstricteur et le SKK vasodilatateur. Leurs effets bénéfiques ont longtemps été rapportés uniquement à l’inhibition du système rénineangiotensine. Pourtant, actuellement de plus en plus d’arguments suggèrent que l’accumulation de BK joue un rôle aussi important. Tout d’abord, la biodisponibilité d’angiotensine II n’est pas toujours modifiée lors d’un traitement par des IEC [138, 139], probablement en raison de la possibilité d’une synthèse d’angiotensine II indépendante de l’ECA, par exemple via les chymases [140]. La concentration d’angiotensine II est également dépendante de sa dégradation par l’enzyme de conversion 2 de l’angiotensine II (ECA 2). Ce résultat suggère que le blocage de la synthèse d’angiotensine II n’est pas à lui seul responsable de tous les effets des IEC. L’utilisation d’antagonistes du récepteur B2 a permis d’apporter des preuves expérimentales en faveur du rôle de ce récepteur dans l’action protectrice des IEC. Les effets bénéfiques des IEC sont en effet souvent atténués par le blocage du RB2. Les IEC exercent leur effet anti-fibrosant d’une part en inhibant la synthèse de composants de la matrice extracellulaire (collagène et fibronectine) et d’autre part en stimulant sa dégradation (via l’inhibition de l’expression de la protéine PAI-1 (Plasminogen Activator Inhibitor-1). Ces deux actions des IEC sont supprimées par l’administration d’un antagoniste du RB2 [86, 141]. L’effet anti-fibrosant des IEC est donc largement dépendant de la bradykinine et de la mise en jeu de son récepteur B2. De la même façon, l’effet antiprotéinurique des IEC au cours de néphropathies expérimentales chez le rat, est en partie dépendant des kinines [142, 143]. 39 Partie I : bradykinine et rein L’activation du RB2 par les IEC peut se faire par plusieurs mécanismes intriqués et additionnels (Figure 4). Le premier d’entre eux est, bien sûr, l’inhibition de la dégradation de la BK, mais de nouveaux mécanismes ont été proposés. Tout d’abord, l’enzyme de conversion de l’angiotensine (ECA) et le RB2 pourraient former un complexe (complexe ECA/RB2), qui augmenterait la sensibilité du RB2 pour la bradykinine [144]. Par ailleurs, l’inhibition de l’ECA entraîne l’accumulation d’angiotensine I, qui est dégradée en angiotensine 1-7 par plusieurs enzymes dont l’ECA2 (Figure 4). L’angiotensine 1-7 agit en activant un récepteur spécifique encore imparfaitement identifié [145, 146], mais qui pourrait être associé à l’oncogène Mas [147]. Les effets de l’angiotensine 1-7, hypotenseurs et vasodilatateurs, sont opposés à ceux de l’angiotensine II. Par ailleurs, certains de ces effets sont inhibés par les antagonistes du RB2 [148, 149]. L’angiotensine 1-7, peut se comporter comme un inhibiteur de l’ECA et donc augmenter la biodisponibilité de la BK mais également agir sur le complexe ECA/RB2 et diminuer la désensibilisation du RB2 [150]. Bien que tous les mécanismes d’action de l’angiotensine 1-7 ne soient pas encore identifiés, les voies de formation associées à la stimulation potentielle du RB2 peuvent permettre de définir de nouvelles voies thérapeutiques. 40 Partie I : bradykinine et rein Figure 4 : Possibilités d’activation du RB2 durant un traitement par un IEC ou un ARA2 ECA : enzyme de conversion de l’angiotensine II ; IEC : inhibiteurs de l’enzyme de conversion ; ARA2 : antagonistes du récepteur AT1 de l’angiotensine II ; ECA2 : enzyme de conversion de l’angiotensine II de type 2 ; EPN : endopeptidase neutre ; PCP : prolyl carboxypeptidase ; PEP : prolyl endopeptidase. Au cours d’un traitement par les IEC : (a) l’IEC bloque la formation d’angiotensine II et inhibe la dégradation de la bradykinine favorisant ainsi l’activation du RB2, (b) certains IEC pourraient avoir une action directe sur l’activation du RB2 en formant un complexe. En l’absence de formation d’angiotensine II, il y a formation directe d’angiotensine 1-7 qui peut diminuer la dégradation de bradykinine (c), mais aussi stimuler directement le RB2 (d). Au cours d’un traitement par un ARA2, le blocage du récepteur AT1 va révéler l’action de l’angiotensine II sur le récepteur AT2, dont l’activation est associée à celle de la kallicréine, entraînant la formation de bradykinine. Suite à l’accumulation d’angiotensine II (dont la formation n’est pas bloquée comme c’est le cas en présence d’un IEC), on va observer une formation accrue d’angiotensine 1-7 qui va aussi renforcer la stimulation du RB2 (c et d). III.4.b. Antagonistes du récepteur AT1 de l’angiotensine II (ARA2) L’activité du système rénine-angiotensine peut aussi être bloquée par l’administration d’ARA2. Leur bénéfice au niveau du rein a été montré dans plusieurs études [151-156]. Là encore, des travaux suggèrent des interactions possibles entre les ARA2 et la BK [157]. En effet, alors que les IEC inhibent la formation d’angiotensine II et la dégradation de la BK, les ARA2 bloquent l’action de l’angiotensine II sur le récepteur AT1 laissant persister les effets du récepteur AT2 (Figure 4). Si on a longtemps pensé que l’angiotensine II était uniquement 41 Partie I : bradykinine et rein vasoconstrictrice, des travaux récents montrent que l’activation du récepteur AT2 par l’angiotensine II induit des effets vasodilatateurs en mettant en jeu une signalisation impliquant une synthèse accrue de BK et une activation du RB2 [158]. Cette relation entre l’activation du récepteur AT2 et la production de BK a été confirmée chez la souris surexprimant le récepteur AT2, la stimulation du récepteur AT2 activerait la kallicréine (et ainsi la production de BK) via une diminution du pH intracellulaire [159]. Il a été démontré dans plusieurs modèles que les antagonistes du RB2 réduisaient fortement la vasodilatation dépendante de l’endothélium, induite par l’angiotensine II [160]. De même, la surexpression du récepteur AT2 réduit la fibrose périvasculaire cardiaque induite par la perfusion d’angiotensine II. Cet effet est également dépendant du RB2 [161]. L’activation du récepteur AT2 est donc capable de s’opposer à certains effets de l’AT1 probablement en stimulant la production de GMPc, via un mécanisme partiellement dépendant des kinines et du RB2. Cette activité anti-fibrosante du récepteur AT2 ne repose toutefois pas exclusivement sur l’activation du RB2 car une stimulation de la formation de NO par le récepteur AT2 a été démontrée chez les souris n’exprimant pas le RB2 [162]. 42 Partie I : bradykinine et rein IV. CONCLUSION La bradykinine ne semble donc pas occuper une place prépondérante dans les phénomènes d’homéostasie rénale en situation physiologique, par contre, elle agirait comme un mécanisme de défense en cas d’agression rénale (excès de sodium, hypertension, néphropathies…). Elle permettrait alors, grâce à ses effets vasodilatateurs, anti-fibrosants et natriurétiques de maintenir les fonctions d’homéostasie rénale et de prévenir le développement de lésions de sclérose glomérulaire et tubulaire. Le SKK agirait donc comme un système protecteur permanent, important dans les phénomènes d’adaptation en cas d’agression. Son inactivation, en induisant une perte de protection fragilise le rein et réduit les capacités d’adaptation. Le RB2 est responsable de la majorié des effets protecteurs des kinines, cependant, dans les situations où il est induit, le RB1 peut aussi exercer un rôle vasodilatateur et protecteur ; son rôle protecteur a d’ailleurs été montré par l’utilisation de souris déficientes pour les 2 récepteurs [124]. L’ensemble de ces résultats suggère une action bénéfique, « néphroprotectrice », de la BK et encourage la recherche et le développement d’agonistes des récepteurs de la BK en particulier du B2. De telles substances pourraient avoir une implication thérapeutique, en particulier pour la protection rénale au cours de diverses pathologies [163, 164]. Récemment, un agoniste du RB2 a été testé in vivo, dans le traitement de l’hypertension pulmonaire et a mis en évidence un effet bénéfique sur la fibrose cardiaque [165]. 43 Partie II : néphropathie diabétique et système kallicréine-kinine PARTIE II – NEPHROPATHIE DIABETIQUE ET SYSTEME KALLICREINE-KININE I. UN CHALLENGE SANITAIRE La néphropathie diabétique (ND) représente une des complications à long terme les plus graves du diabète. La néphropathie associée au diabète de type II est actuellement la cause la plus fréquente d'insuffisance rénale terminale en Europe, mais aussi celle dont l’incidence augmente le plus [154, 166, 167]. En effet, la multiplication des cas d’obésité liée au mode de vie occidental, ainsi que le vieillissement de la population dans ces même pays, s’accompagnent d’une augmentation majeure de l’incidence du diabète de type II. De plus, l’allongement de la survie - notamment cardiovasculaire – permet à la néphropathie diabétique de s’exprimer cliniquement. Aux Etats-Unis, les diabétiques représentent plus de la moitié des nouveaux dialysés, et parmi eux, plus de la moitié sont des diabétiques de type II [168]. En Europe, la tendance est similaire avec une ou deux décennies de retard [169]. On estime à 2 millions le nombre de personnes diabétiques en France, dont 85 % sont des diabétiques de type II. Cette pathologie constitue donc un problème majeur de santé publique (par exemple le coût annuel des dépenses de santé liées à la ND aux Etats-Unis est estimé à 20 milliards de dollars [168]) ce qui justifie d’y consacrer un effort de recherche important. 44 Partie II : néphropathie diabétique et système kallicréine-kinine II. DE LA PHYSIOPATHOLOGIE A LA THERAPEUTIQUE L’atteinte rénale du diabète, qu'il s'agisse de la forme insulino-dépendante (DID) ou non insulino-dépendante (DNID), est caractérisée par des altérations fonctionnelles et morphologiques qui évoluent en deux phases (Figure 6). L’étape initiale, réversible, est caractérisée par une hypertrophie des reins et des glomérules associée à une hyperfiltration glomérulaire et une augmentation de l’excrétion urinaire d’albumine. Plus tard, se développe une sclérose glomérulaire caractérisée par un épaississement des membranes basales et une expansion mésangiale avec accumulation de protéines de la matrice extracellulaire (collagène de type I et IV) (Figure 5). Cette glomérulosclérose est accompagnée d’une fibrose interstitielle. Ces lésions, associées à une protéinurie abondante, s’accompagnent d’un déclin de la fonction de filtration glomérulaire évoluant vers une insuffisance rénale progressive et irréversible. ND précoce ND avancée ND terminale Figure 5 : Evolution de la glomérulosclérose. Glomérules humains en microscopie optique à différents stades de néphropathie diabétique (coloration à l’acide périodique de Schiff, PAS, Grossissement x400) 45 Partie II : néphropathie diabétique et système kallicréine-kinine Figure 6 : Evolution de la néphropathie diabétique chez l’Homme II.1. LES MEDIATEURS A L’ECHELON CELLULAIRE II.1.a. Rôle de l’hyperglycémie / AGE Les études cliniques ont montré une relation étroite entre la glycémie et les complications microvasculaires du diabète [170]. L’hyperglycémie chronique induit des altérations protéiques, lipidiques et nucléiques qui seraient à l’origine de la cascade d’évènements responsable d’une augmentation du stress oxydant et conduisant au développement de la ND [171, 172]. Une conséquence importante de l’hyperglycémie chronique est la formation de produits avancés de glycation (AGEs, Advanced Glycation End Product), qui résultent d’une réaction non-enzymatique entre le glucose sanguin et les protéines. Les protéines glyquées (AGE) circulantes interagissent avec des récepteurs spécifiques, les récepteurs RAGE 46 Partie II : néphropathie diabétique et système kallicréine-kinine (appartenant à la famille des immunoglobulines), pour induire une cascade d’effets nocifs [173]. En particulier, l’activation des récepteurs des AGEs provoque une forte augmentation de la production intracellulaire de Radicaux Libres Oxygénés (RLO), en particulier suite à l’activation de la NADPH-oxydase [174]. A leur tour, ces radicaux déclenchent des cascades d'effets cellulaires conduisant à la stimulation de facteurs de transcription tel que NFκB et à la synthèse de cytokines et de facteurs de croissance, dont l’effet global profibrosant contribue largement au développement de la glomérulopathie diabétique [175, 176]. L’accumulation d’AGEs, au niveau rénal au cours de la ND, a été montrée par plusieurs équipes [177-180]. Le rôle central joué par ces composants dans le développement de la ND en font une cible attractive pour la néphroprotection. Un traitement par des composants inhibant la formation des AGEs [181, 182], par un anticorps anti-RAGE [183] ou plus subtilement par un RAGE recombinant soluble [184] protège contre le développement de la néphropathie diabétique. Les molécules capables de dégrader les AGE préformés (comme l’alagebrium), réduisent l’expression du TGFβ, l’activation de la PKC et l’accumulation de collagène de type IV [185]. L’effet protecteur de ces molécules a été montré dans le modèle de la souris invalidée pour l’apolipoprotéine E traitée par la streptozotocine (STZ) [181], et chez la souris db/db [186]. Dans le modèle de la souris db/db, les auteurs ont montré que l’alagebrium était capable de prévenir mais également de réverser l’évolution de la ND. Cette substance a déjà été testée en clinique [187] dans le cadre de pathologies cardiovasculaires mais pas encore dans celui de pathologies rénales. En plus de la formation des AGEs, le glucose exerce un effet intracellulaire direct. En effet, le glucose sanguin étant transporté à l’intérieur des cellules par les transporteurs GLUT, l’hyperglycémie est responsable d’une augmentation de la concentration intracellulaire de glucose. Ce glucose intracellulaire exerce plusieurs effets : activation de la voie de l’aldose réductase (voie des polyols), activation de la PKC (protéine kinase C), et de la voie des 47 Partie II : néphropathie diabétique et système kallicréine-kinine hexosamines [170]. L’activation de ces différentes voies est à l’origine d’une augmentation de la production de RLO et de la formation intracellulaire d’AGE. II.1.b. Rôle du stress oxydant Le rôle du stress oxydant dans le développement de la glomérulosclérose diabétique fait l’objet d’une attention croissante [188]. Celui-ci semble jouer un rôle majeur dans l’expansion mésangiale observée dans le rein diabétique. En effet, la synthèse de collagène par les cellules mésangiales en situation hyperglycémique, est inhibée par les anti-oxydants [189, 190]. Les souris transgéniques surexprimant la Cu2+/Zn2+ SOD (Super Oxyde Dismutase), une des enzymes permettant de réduire l’accumulation de RLO, rendues diabétiques par la streptozotocine développent une microalbuminurie, une hypertrophie glomérulaire, une accumulation de collagène et un volume mésangial fractionnel moins importants que les souris sauvages [191]. Les résultats de l’utilisation expérimentale d’antioxydants a montré des effets protecteurs prometteurs [191, 192]. Toutefois, les résultats des études cliniques portant sur des traitements chroniques par des vitamines antioxydantes chez l’Homme ne confirment pas les résultats expérimentaux [193]. II.1.c. Facteurs de croissance L’accumulation d’AGEs et l’augmentation du stress oxydant déclenchent une cascade de signalisation aboutissant à la synthèse de cytokines et de facteurs de croissance, participant à l’évolution de la ND. Parmi eux, le TGFβ, par son action pro-fibrosante [194, 195] est désormais considéré comme un facteur délétère majeur. Il a été récemment mis en évidence, dans le modèle des souris db/db, une surexpression glomérulaire et tubulaire des ARNm et des protéines TGFβ1 48 Partie II : néphropathie diabétique et système kallicréine-kinine et du TGFβ RII [196], alors que celle-ci n’avait pas été retrouvée dans une étude antérieure effectuée à partir du cortex rénal [197, 198]. Cependant, le TGFβ n’apparaît pas comme un médiateur précoce mais semble correspondre à une réponse en aval de plusieurs cascades de signalisation préalables. Dès lors, il est évident que le blocage de TGFβ peut être efficace pour réduire la néphropathie diabétique. Plusieurs approches expérimentales utilisant des inhibiteurs, des anticorps neutralisants ou des récepteurs solubles ont montré que le blocage du TGFβ prévenait le développement de la fibrose rénale. Par exemple, l’administration d’un anticorps monoclonal anti-TGFβ, chez la souris diabétique db/db (obèse et diabétique de type II), permet de prévenir à long terme l’expansion mésangiale et l’insuffisance rénale [199]. Cependant, chez l’Homme, l’inhibition chronique de l’action d’un facteur de croissance pourrait avoir des effets délétères. Il serait peut être plus intéressant d’agir sur des cibles en aval du TGFβ. Parmi ces cibles potentielles, la protéine BMP-7 (Bone Morphogenic Protein 7) qui inhibe l’action pro-fibrosante du TGFβ, pourrait être recrutée et exercer un effet protecteur au cours de la ND. Cette hypothèse est étayée par plusieurs travaux expérimentaux [200-202]. L’IGF-1 est un facteur de croissance local particulièrement actif au niveau du rein, où il est principalement exprimé dans les cellules mésangiales [203]. Les cellules mésangiales de souris diabétiques NOD présentent une activation de la voie de l’IGF-1 [204]. L’IGF-1 participerait au développement de la ND par plusieurs mécanismes. Tout d’abord, l’IGF-1 stimule l’expression du transporteur GLUT-1 par les cellules mésangiales, augmentant ainsi l’uptake de glucose [205]. In vitro, l’IGF-1 stimule la synthèse de matrice extracellulaire tout en altérant les capacités de résorption de la matrice [203, 206, 207]. Par ailleurs, le blocage du récepteur de l’IGF-1 in vivo, au cours du diabète expérimental chez le rat, prévient l’hypertrophie rénale et l’hyperfiltration glomérulaire [208]. Son impact délétère à long terme demeure toutefois l’objet d’un débat. 49 Partie II : néphropathie diabétique et système kallicréine-kinine Parmi les facteurs de croissance, le PDGF et le FGF ont également été mis en cause au cours du développement de la glomérulosclérose. Le PDGF est synthétisé au niveau glomérulaire où il exerce un effet mitogène puissant sur les cellules mésangiales [209]. Il serait également impliqué dans l’accumulation de collagène IV et de fibronectine induite par le TGFβ [210]. Le FGF a lui aussi un effet prolifératif sur les cellules mésangiales [211, 212]. Le VEGF est un facteur angiogénique qui augmente la perméabilité vasculaire [213]. Au niveau du glomérule, il est exprimé par les podocytes ; l’induction d’un diabète expérimental s’accompagne d’une augmentation de son expression et de celle de son récepteur de type II [214], peut-être via l’activation du RAGE. De même, la synthèse de VEGF par des podocytes en culture est induite par un milieu riche en glucose ou contenant du TGFβ1 [215]. Cette induction de l’expression du VEGF dans les situations d’hyperglycémie semble impliquée de façon ambiguë dans le développement de la ND. En effet, l’utilisation d’un anticorps neutralisant anti-VEGF au cours du diabète de type I, chez le rat, [216] et du diabète de type II, chez la souris db/db, [217] permet de réduire de façon importante la microalbuminurie. Par contre, l’induction du VEGF peut aussi apparaître comme un facteur de survie pour les cellules endothéliales [218] sous contrôle du facteur de transduction activé par l’hypoxie (HIF). Bien que de très nombreux travaux concernent les mécanismes impliqués dans la ND, il reste difficile de proposer un mécanisme univoque. En effet, les dysfonctions d’un grand nombre de systèmes s’associent progressivement pour aboutir à l’instauration de la sclérose du glomérule. La plupart des travaux ont initialement désigné la cellule mésangiale comme « cellule cible initiale ». Ce concept est en train d’évoluer avec l’observation de transitions phénotypiques [219]. Une des perturbations très précoces de la ND est l’hyperfiltration glomérulaire et l’apparition d’une microalbuminurie. Ces deux caractéristiques de la ND ont 50 Partie II : néphropathie diabétique et système kallicréine-kinine attiré l’attention sur un autre type cellulaire : les podocytes. La Figure 7 tente de résumer l’état actuel des connaissances sur les principaux mécanismes physiopathologiques impliqués dans le développement de la ND. Figure 7 : Principaux mécanismes physiopathologiques impliqués dans le développement de l’atteinte glomérulaire au cours de la néphropathie diabétique 51 Partie II : néphropathie diabétique et système kallicréine-kinine II.2. INTERET ET APPORT DES MODELES ANIMAUX Il existe de nombreux modèles de diabète expérimental de type I ou de type II chez le rat et la souris (Figure 8). Certains d’entre eux sont des modèles de diabète spontané développés par certaines souches, d’autres sont induits par une substance chimique comme la streptozotocine, par une alimentation riche en graisses et/ou en sucre, ou encore par une modification génétique. La difficulté est de trouver un modèle qui développe une réelle ND, reproduisant le plus fidèlement possible la pathologie humaine. DIABETE Type I : Type II : MODELES ANIMAUX Induit Spontané Souris NOD Non obese diabetic Souche Ltj [220] Par destruction des cellules sécrétrices d’insuline : - substances chimiques [222] (alloxane ou streptozotocine) - pancréatectomie, - inoculation de virus [223] (virus Encephalomyocarditis) Rat Wistar Bio Breeding [221] Par modification génétique : gène insuline (Souris Akita) [224] Spontané Souris db/db (mutation du récepteur de la leptine) [225] Souris ob/ob (d déficientes en leptine) [226] Rats Zuckers Rats fa/fa (Wistar fatty) [227] Rats GK (Goto & Kakizaki) [228] Induit Par modification génétique (ex : KO GLUT-4) [229] Par l’alimentation (régime hyperglucidique et/ou hyperlipidique) [230] Figure 8 : Exemples de modèles expérimentaux de diabète chez le rat et la souris 52 Partie II : néphropathie diabétique et système kallicréine-kinine Dans le laboratoire nous utilisons en particulier 2 modèles de diabète chez la souris : un modèle de diabète de type I qui est induit par la streptozotocine dans la souche C57BL6, et un modèle de diabète de type II, la souris db/db. La streptozotocine pénètre dans les cellules β-pancréatiques par le transporteur de glucose GLUT-2, elle exerce dans ces cellules un effet cytotoxique en particulier via une alkylation de l’ADN et une induction du stress oxydant [231-233]. Ce modèle a l’avantage d’être facile à utiliser et reproductible. Cependant, la STZ peut exercer une toxicité non spécifique, en particulier au niveau rénal. De plus, de nombreux modèles de souris transgéniques ont été développés à partir de la souche C57Bl6. Ces modèles d’invalidation génétique ont permis le démembrement des mécanismes physiopathologiques impliqués dans le développement de la ND. Par contre, le choix de la souche C57Bl6 représente un facteur limitant expérimental puisque cette souche est connue pour sa résistance à la glomérulosclérose [234, 235]. Un grand nombre de ces modèles sont résumés dans le Tableau 2. Le diabète de type II est aujourd’hui celui qui concerne le plus de patients et représente l’enjeu sanitaire le plus important, ce qui nous a incité à utiliser un modèle de diabète de type II. Nous disposons et avons acquis l’expérience d’un modèle murin de diabète de type II avec obésité, la souche C57 BLKs db. La mutation spontanée db provoque une délétion de la partie cytoplasmique du récepteur B de la leptine [188, 225]. Les souris C57BLKs homozygotes pour cette mutation (db/db) deviennent insensibles à la leptine et développent un hyperinsulinisme et une obésité dès la cinq/sixième semaine de vie, et un diabète insulino-résistant une semaine plus tard environ [226]. Les souris hétérozygotes pour la mutation db ne sont ni obèses ni diabétiques et fournissent la population contrôle naturelle. Le diabète développé par les souris db/db mime en de nombreux points le diabète de type II humain. En effet, son évolution se complique, comme chez l’humain, d’une cataracte, de 53 Partie II : néphropathie diabétique et système kallicréine-kinine lésions de microangiopathie rétinienne, et surtout d’une néphropathie. Au niveau rénal, ce modèle présente l’avantage de développer d’importantes modifications structurales glomérulaires, incluant un épaississement des membranes basales et une expansion mésangiale proches de celles observées chez l’homme, après seulement 2 mois d’évolution diabétique [236, 237]. Cependant, nous ne disposons pas de l’association de KO pour les éléments du SKK (en particulier pour les récepteurs B1 et B2 de la bradykinine) et de la mutation db. Pour cette raison, nous avons choisi de recourir au blocage pharmacologique du RB2 dans le modèle db/db et d’étudier les conséquences de l’invalidation du RB1 et du RB2 sur le développement de l’atteinte rénale du diabète en utilisant le modèle de type I induit par la STZ (travail en cours). 54 Partie II : néphropathie diabétique et système kallicréine-kinine Tableau 2 : Apport des quelques modèles génétiquement modifiés dans la connaissance de la glomérulosclérose diabétique Gravité de la ND Ref GH (Growth Hormone) ↓ [238] PPARα (Peroxysome proliferator-activated receptor α) SMAD 3 ↓ [240] Récepteur AT1 PKC-β (Protein kinase C) ↓ [242] PKC-α (Protein kinase C) ↓ [243] P27(Kip1) ↓ [245] PAI-1 (Plasminogen Activator Inhibitor-1) ICAM-1 (intercellular adhesion molecule-1) ↓ [247] ↓ [249] TSP-1 (Thrombospondine-1) ↓ [251] P66hc ↓ SPARC (Secreted Protein Acid and Rich Cysteine) SR-A (Macrophage Scavenger receptor) Cible invalidée Gravité de la ND Ref ↑ [239] Effet modeste ? [241] Récepteur B2 de la bradykinine Récepteur B2 de la bradykinine ACE-2 (Angiotensin converting enzyme 2) PGD2 (Prostaglandine D2) synthase SOD (Super oxide dismutase) eNOS (NO-synthase endothéliale) ↑ [116] ↓ [244] ↑ [246] ↑ [248] ↑ [250] ↑ [252] [253] Galectin-3/AGE receptor 3 ↑ [254] ↓ [255] ApoE (Apolipoprotéine E) ↑ [181] ↓ [256] ENTPD1 (CD39) ↑ [257] [258] Integrin Alpha-1 ↑ [259] Midkine ↑ ↑ [260] ↓ légèrement ERα (Œstrogen Receptor alpha) chez la femelle uniquement Decorin ↑ [261] Cible invalidée Récepteur de la Vitamine D [262] 55 Partie II : néphropathie diabétique et système kallicréine-kinine II.3. THERAPEUTIQUES ACTUELLES ET PERSPECTIVES II.3.a. Définir une stratégie Les études cliniques ont montré une relation étroite entre la glycémie et les complications micro-vasculaires du diabète [170]. Ainsi, un contrôle strict de la glycémie préviendrait ou au moins ralentirait la progression de la ND. Une étude clinique (The Diabetes Control and Complications Trial Research Group, [263]) a montré qu’un traitement intensif par de l’insuline (3 injections par jour) améliorait l’équilibre glycémique. Dans cette étude, les patients présentaient un taux d’hémoglobine glyquée et une excrétion urinaire d’albumine inférieurs à ceux des patients suivant un traitement standard. Cependant malgré les efforts pour maintenir un équilibre glycémique correct chez les patients diabétiques, plus de 40% d’entre eux (DID et DNID confondus), développent une néphropathie après 25 ans de diabète [264]. Les progrès réalisés dans les techniques d’insulinothérapie devraient permettre de réduire l’incidence de la ND chez les patients diabétiques de type 1. En effet, de nouvelles techniques telles que la mise en place des pompes à insuline ou même de pancréas artificiels permettent un meilleur contrôle glycémique et devraient donc limiter le développement des complications. Cependant, le problème subsiste pour les diabétiques de types II, qui représentent actuellement 85% des diabétiques et chez qui, contrairement au diabète de type I, la normalisation glycémique n'est pratiquement jamais obtenue en raison de l'insulino-résistance. Il existe différents traitements hypoglycémiants, ces traitements ne permettent souvent pas toujours de normaliser totalement le profil glycémique. Le seul recours est alors la prévention du développement des complications micro-vasculaires, en particulier de la 56 Partie II : néphropathie diabétique et système kallicréine-kinine glomérulopathie, avec des traitements agissant sur des mécanismes indépendants de la glycémie. La majorité des pathologies chroniques rénales sont associées à une accumulation excessive de matrice extra-cellulaire, avec pour conséquence pratiquement inéluctable le développement d’une fibrose rénale [265]. La fibrose rénale qu’elle soit interstitielle ou glomérulaire, résulte de mécanismes physiopathologiques complexes, parfois distincts dont les impacts respectifs convergent pour aboutir finalement à une insuffisance rénale terminale. Le contrôle de cette évolution progressive vers la fibrose devient un enjeu thérapeutique majeur, car les stratégies thérapeutiques disponibles à ce jour n’ont qu’une efficacité modeste. II.3.b. La fibrose rénale est-elle réversible ? La réversibilité de cette évolution reste une question importante et non résolue. Un ensemble de travaux récents indique que la fibrose rénale pourrait régresser, au moins dans des modèles expérimentaux [266-268]. Tout d’abord, la fibrose rénale induite par le blocage de la voie du NO, chez le rat, peut être prévenue par inhibition de l’activité tyrosine kinase du récepteur de l’EGF [269]. Une régression de la fibrose rénale a ensuite été montrée lors du blocage du SRA, dans deux modèles. Chez des rats hypertendus déficients en NO [270], un traitement par des ARA2 débuté après l’apparition de la glomérulosclérose et le déclin de la fonction rénale, a permis de normaliser les paramètres fonctionnels et morphologiques. Le traitement détermine une réduction des expressions du collagène de type I et IV et du TGFβ, mais ne réduit pas l’activation des métalloprotéinases, contribuant ainsi à dégrader l’excès de matrice extra-cellulaire. Dans le modèle de néphrectomie subtotale chez le rat, une autre équipe a montré qu’un traitement par un IEC, permettait de réduire les lésions préexistantes de fibrose glomérulaire et tubulo-interstitielle [271]. Plus récemment, il a été montré que les lésions rénales consécutives à une hypertension induite par l’inhibition de la synthèse de NO, 57 Partie II : néphropathie diabétique et système kallicréine-kinine pouvaient régresser après l’arrêt de cette inhibition [272]. Enfin, l’équipe de J. Chao a montré une régression de la glomérulosclérose chez le rat hypertendu grâce au transfert du gène de la kallicréine [108]. Chez l’Homme, la réversibilité de la fibrose rénale a été étudiée essentiellement dans le diabète de type I, au cours duquel la transplantation de pancréas est apparement associée à la régression des lésions tubulaires [273] et glomérulaires [274] sur des biopsies de contrôles. II.3.c. Les approches pharmacologiques Le blocage du système rénine-angiotensine est à ce jour, le traitement le plus utilisé car il a fait preuve d’une efficacité clinique sensible au cours du DID, mais aussi du DNID [275, 276]. Les principales molécules utilisées pour bloquer le SRA sont : - les inhibiteurs de l'enzyme de conversion (IEC). Leur efficacité a été montrée au cours du diabète. Utilisés couramment en pratique clinique [276], ils sont capables de ralentir la progression de la ND par un mécanisme indépendant de leur effet hypotenseur [277], - les antagonistes du récepteur AT1 de l’angiotensine II (ARA2). Plusieurs études cliniques [155, 156, 278] ont établi qu’ils étaient également capables de prévenir ou ralentir la progression de la néphropathie au cours du diabète de type II. Le blocage de la PKCβ est envisagé comme outil thérapeutique néphroprotecteur puisque cette protéine, en particulier l’isoforme β, est induite et fortement activée par l’hyperglycémie et participe au développement de la ND [279]. L’invalidation de la PKC limite la microalbuminurie et l’expression de plusieurs facteurs de croissance pro-fibrosants [243, 280]. Un inhibiteur spécifique de la PKCβ (Ruboxistaurine LY333531), a été testé cliniquement [281] et s’avère bénéfique en limitant la perte de réponse vasodilatatrice dépendante de l’endothélium, chez des sujets sains exposés à une hyperglycémie. Cet 58 Partie II : néphropathie diabétique et système kallicréine-kinine inhibiteur est en phase d’études cliniques depuis 4 ans avec une bonne tolérance, les résultats ne montrent pas d’effets secondaires différents de ceux du traitement placebo [282]. Les thiazolidinediones (TZD) sont des agonistes de PPARγ déjà utilisées en clinique pour leur action sur la sensibilité à l’insuline. Il a récemment été montré lors d’une étude chez des patients diabétiques de type II, que ces molécules réduisaient également la microalbuminurie et pouvaient ralentir l’évolution de la ND [283, 284]. Le facteur de croissance hépatocytaire (HGF) est un facteur de croissance endogène qui protège le rein contre le développement de fibrose en inhibant l’action délétère du TGFβ. Au niveau du rein, l’HGF inhibe la surproduction de matrice extra-cellulaire et l’apoptose, il active la dégradation de matrice et peut moduler la prolifération et la différenciation cellulaire [285]. L’administration intraveineuse d’HGF améliore la ND diabétique chez la souris [286, 287], en s’opposant aux effets fibrosants du TGFβ [286, 288]. Le transfert de gène de l’HGF réduit également la sévérité de la ND chez le rat [289]. L’administration d’HGF exogène pourrait donc constituer un outil thérapeutique interessant. Les Inhibiteurs des Histone desacethylases (HDAC), dont l’utilisation anticancéreuse est en cours d’étude clinique, exerceraient également un rôle antifibrosant et pourraient donc être considérés comme des agents thérapeutiques potentiels au cours de la ND [290]. Le traitement par un inhibiteur de HDAC empêche l’expression de collagène I par des cellules épithéliales rénales humaines, exposées au TGFβ. Il supprime également la transition épithelio-mésenchymateuse qui est une des étapes importantes dans l’évolution vers la fibrose [291]. Par ailleurs, ces inhibiteurs permettraient la sélection des cellules endogènes à fort pouvoir de restauration (cellules SP : Side Population) [292]. 59 Partie II : néphropathie diabétique et système kallicréine-kinine II.3.d. Autres cibles thérapeutiques potentielles Le maintien de l’intégrité des podocytes pourrait aussi être déterminant dans la protection contre le développement de la ND. En effet, la ND s’accompagne d’une altération et d’une perte de podocytes, responsables d’une dégradation du filtre glomérulaire et de l’apparition d’une protéinurie, et participant à l’évolution de la glomérulosclérose [293]. Certaines protéines, en particulier la néphrine, sont importantes pour assurer la cohésion des podocytes et maintenir l’intégrité fonctionnelle de la barrière glomérulaire [294]. L’expression de la néphrine est réduite au cours du diabète et inhibée par l’angiotensine II [295, 296], ce qui pourrait contribuer à la perte des podocytes. La survie podocytaire pourrait par conséquent constituer un nouvel objectif thérapeutique. L’activation de la protéine C (APC : Activated Protein C) est une nouvelle cible très prometteuse qui pourrait être impliquée dans la survie des podocytes. Cette protéine antiapoptotique est inhibée par l’hyperglycémie. Cette inhibition pourrait être responsable de l’augmentation de l’apoptose des podocytes et des cellules endothéliales glomérulaires au cours de la ND. Isermann et al [297, 298] ont étudié différents paramètres de la ND dans 2 modèles de souris transgéniques : l’un déficient en protéine C activée et l’autre surexprimant la protéine C activée. Ils ont observé que les souris déficientes en APC développaient une ND plus sévère, et inversement, que les souris surexprimant l’APC étaient protégées. Cet effet protecteur de l’activation de la protéine C est associé à une réduction de l’apoptose des podocytes et des cellules endothéliales glomérulaires. 60 Partie II : néphropathie diabétique et système kallicréine-kinine II.3.e. De l’approche protéomique à la thérapie génique / cellulaire L’identification de marqueurs physiopathologiques pertinents est essentielle pour le diagnostic, le pronostic et le suivi de la ND. L’application des nouvelles techniques de protéomique est trop récente pour fournir déjà des informations pertinentes dans le domaine de la ND. En fait, le protéome urinaire actuellement identifié concerne plus de 1500 protéines [299]. Or, au cours de la ND, un grand nombre de protéines spécifiques résultent de modifications post-traductionnelles (notamment suite à des réactions de glycation). Le travail d’identification à accomplir reste donc très important. Les résultats actuels fournis par les études de protéomique ont identifié des protéines dont l’implication avait déjà été montrée par des approches protéomiques ciblées utilisant des modèles expérimentaux : constituants de systèmes fibrosants (élastase, [300]), du stress oxydant, des AGEs, et des systèmes sensibles à l’hypoxie (expression de la protéine HIF) [301]. Les approches de thérapie génique ont été envisagées d’abord au niveau rénal dans le cadre des situations ischémiques. Le rôle protecteur de transfert du gène de l’hème oxydase 1 a ainsi été mis en évidence [302]. Les situations d’ischémie-reperfusion sont certainement celles qui font l’objet des études les plus nombreuses, tant par les approches de thérapie génique, que maintenant, par des approches de thérapie cellulaire. Certaines tentatives d’infusion de cellules souches mésenchymateuses montrent des résultats néphroprotecteurs intéressants bien que modestes [303]. Ces cellules sont rapidement détectées dans le rein, au niveau vasculaire ou glomérulaire, avec des effets bénéfiques significatifs tels que la stabilisation de la protéinurie et une amélioration des fonctions rénales [303] ou encore une réduction de l’apoptose des cellules vasculaires [304]. Cependant, ces cellules soit disparaissent rapidement [304], soit se différencient en adipocytes [303]. 61 Partie II : néphropathie diabétique et système kallicréine-kinine Des approches de thérapie cellulaires sont en cours de développement. L’amélioration de l’insuffisance rénale aiguë, chez la souris, a été aussi obtenue après injection de cellules souches mésenchymateuses [305]. L’existence de cellules progénitrices mésangiales issues de moelle osseuse a en effet été montrée, rendant possible une telle application. Ces cellules, issues de souris diabétiques (type II) pouvaient transmettre un phénotype de ND (albuminurie et glomérulosclérose) à des souris normales, sans qu’il y ait pour autant apparition de diabète [306]. Le même groupe a aussi montré que les lésions glomérulaires de la ND pouvaient ainsi être perpétuées et aggravées par des progéniteurs ayant le phénotype pathologique [307]. Ainsi, l’existence de ces progéniteurs à fort potentiel pathogène peut être un obstacle important à un tel type de traitement. Ce phénomène est donc à prendre en compte dans le développement des approches de thérapie cellulaire et/ou génique contre la ND. Des travaux concernant la recherche et l’amélioration des cellules souches ont récemment été publiés. Ainsi, l’inhibition des histones déacéthylases semble activer l’expression de gènes néphroprotecteurs (BMP-7 et HGF) dans certaines populations de cellules rénales, dont l’identification plus précise est en cours [292]. Des cellules embryonnaires rénales humaines, à fort potentiel de restauration, ont été récemment isolées [308]. Ces cellules sont capables de restaurer des lésions tubulaires dans un modèle d’insuffisance rénale aiguë et ne présentent pas d’effet de tumorigénicité. 62 Partie II : néphropathie diabétique et système kallicréine-kinine III. TRAITEMENTS ET PROTECTION RENALE : DU BLOCAGE DU SRA A LA MISE EN JEU DU SKK III.1. BLOCAGE DU SYSTEME RENINE-ANGIOTENSINE Les deux agents pharmacologiques IEC et ARA2 agissent à la fois par des mécanismes communs et complémentaires, qui ont permis d’identifier des interactions importantes entre les récepteurs de l’angiotensine II et ceux de la BK. Ces interactions sont représentées sur la Figure 4. Comme les études cliniques, les travaux expérimentaux dans des modèles de rat ou de souris diabétiques montrent un effet néphroprotecteur des IEC. Les IEC augmentent la sensibilité à l’insuline [309-312], et inhibent in vivo la formation d’AGE [313, 314]. Plusieurs travaux, dans des modèles de diabète chez le rat [315-317], ont rapporté que les IEC réduisaient la protéinurie ainsi que la sclérose glomérulaire et tubulo-interstitielle. III.2. EFFETS COLLATERAUX DU BLOCAGE DU SRA : MISE EN JEU DU SKK ET AUTRES La BK semble occuper une place importante dans les effets néphroprotecteurs des IEC et des ARA 2 au cours de la néphropathie diabétique. En effet, les IEC ont un effet antiprotéinurique qui est partiellement supprimé par un antagoniste du RB2 et donc en partie dépendant de la bradykinine [143]. De plus, il a été montré que les IEC amélioraient la sensibilité à l’insuline chez des rats spontanément hypertendus ; cet effet bénéfique étant supprimé par un antagoniste du RB2 (HOE-140). Enfin, la perfusion de BK est capable de reproduire les mêmes effets que les IEC [309]. Cette amélioration de la sensibilité à l’insuline a été également étudiée par plusieurs équipes, chez le rat Zucker obèse et insulino-résistant 63 Partie II : néphropathie diabétique et système kallicréine-kinine [318-320]. Ces études ont établi qu’un traitement par l’omapatrilat, inhibant simultanément l’enzyme de conversion et l’endopeptidase neutre, permet une amélioration de la sensibilité à l’insuline plus efficace que l’inhibition de l’ECA seule [318-320]. Cet effet de l’omapatrilat est bloqué par un antagoniste du B2R ou un inhibiteur de la NO-synthase, ce qui suggère l’implication du RB2 et de la production de NO. Ce traitement réduit également l’albuminurie ainsi que les lésions glomérulaires et tubulo-interstitielles, chez les rats Zucker ; cet effet étant également en partie médié par l’activation du RB2. [321]. Nos travaux sont en accords avec ces résultats puisque nous avons observé que le blocage du RB2 annulait les effets bénéfiques des IEC sur l’expression et l’activation de plusieurs facteurs de croissance chez le rat [322], et sur la glomérulosclérose et l’albuminurie chez la souris db/db (Manuscrit n°4). La suppression des effets protecteurs des IEC par un antagoniste du RB2 est un argument important en faveur d’un rôle néphroprotecteur de l’activation du RB2. En plus de l’inhibition de la dégradation de la BK, une autre conséquence d’un traitement par les IEC est l’accumulation d’angiotensine I. Sous l’action de plusieurs enzymes, l’angiotensine I est dégradée en angiotensine 1-7 qui induit des effets hypotenseurs et vasodilatateurs qui s’opposent à ceux de l’angiotensine II. Certains des effets de l’angiotensine 1-7 sont inhibés par des antagonistes du RB2. Ils impliquent donc l’activation du RB2 [148]. L’angiotensine 1-7, peut se comporter comme un inhibiteur de l’ECA et donc augmenter la biodisponibilité de la BK mais également agir sur le complexe ECA/RB2 et ainsi diminuer la désensibilisation du RB2 [150]. Ces voies de formation de l’angiotensine 17, associées à la stimulation potentielle du RB2, peuvent permettre de définir de nouvelles voies thérapeutiques. Un nouveau mécanisme, qui pourrait expliquer les effets anti-fibrosants des IEC, impliquant le tétrapeptide Ac-SDKP (N-acetyl-seryl-aspartyl-lysyl-proline) a été proposé. Ce 64 Partie II : néphropathie diabétique et système kallicréine-kinine tétrapeptide, inhibiteur endogène des cellules hématopoïétiques, est hydrolysé exclusivement par l’ACE ; sa concentration plasmatique est par conséquent fortement augmentée par un traitement par les IEC [323]. Il a été montré que le SDKP inhibe les expressions de la protéine PAI-1 et du collagène de type I induites par le TGFβ [324], via la suppression de l’activation de Smad 7. Un traitement de souris db/db par le SDKP prévient l’accumulation de matrice extracellulaire, l’hypertrophie glomérulaire et l’augmentation de la créatininémie, cependant sans réduire de façon significative l’albuminurie [325]. L’effet bénéfique anti-fibrosant du SDKP a été montré dans plusieurs modèles de fibrose rénale [326] et cardiaque [327-329], suggérant l’utilisation thérapeutique possible de ce peptide au cours des pathologies caractérisées par un excès de fibrose telle que la ND. III.3. ACTIVATION DU RECEPTEUR B2 : UNE NOUVELLE PERSPECTIVE DE NEPHROPROTECTION III.3.a. Arguments pour le rôle protecteur de la bradykinine Outre l’implication de la BK dans les effets protecteurs des IEC, de nombreux autres arguments expérimentaux suggèrent un rôle protecteur de la BK au cours de la ND. Chez les rats rendus diabétiques par la STZ, l’excrétion urinaire de BK ainsi que l’expression rénale des kininogènes et du B2R sont augmentés, alors qu’au contraire, l’expression des kininases est réduite [330]. Le diabète est donc associé à une activation globale du SKK, peut être comme mécanisme d’adaptation pour maintenir la filtration glomérulaire malgré l’atteinte rénale. Dans ce même modèle, un traitement par transfert du gène de la kallicréine permet de réduire la glycémie, un effet dépendant de l’activation du RB2 [331], mais également de diminuer l’albuminurie et d’améliorer la filtration glomérulaire [332]. 65 Partie II : néphropathie diabétique et système kallicréine-kinine Les souris génétiquement modifiées ont apporté des arguments supplémentaires quant au rôle bénéfique de la BK au cours de la ND. En effet, les souris exprimant plusieurs copies de l’enzyme de conversion, donc capables de dégrader de façon accrue la BK [117], ainsi que les souris invalidées pour le RB2 [116], présentent une aggravation de la ND. Dans le premier modèle, les auteurs ont observé que les souris exprimant 3 copies du gène de l’ECA développent une protéinurie plus importante, quand on induit un diabète avec de la STZ, que les souris n’exprimant qu’une ou 2 copies de ce gène. La seconde équipe a étudié l’impact sur le développement de la néphropathie diabétique, de la délétion du gène du RB2 chez des souris diabétiques Akita. Ils ont observé une très forte augmentation de l’albuminurie, ainsi qu’une aggravation des lésions de glomérulosclérose. Ce concept de l’effet protecteur de l’activation du RB2 reste toutefois controversé par une équipe qui a en effet décrit que la BK, via l’activation du RB2 et la voie des MAPkinases, stimulerait l’expression de certains facteurs de croissances et cytokines (CTGF, TGFβ) ainsi que la synthèse de collagène de type I [333] et contribuerait ainsi à l’aggravation de la ND. Plus tard, la même équipe a observé, chez les souris invalidées pour le RB2, une diminution de l’excrétion urinaire d’albumine et une réduction de la sclérose glomérulaire et tubulo-interstitielle, par rapport à des souris sauvages [244]. Ils en ont déduit que l’activation RB2 participerait au développement de la néphropathie diabétique. Cependant, ces travaux sont en contradiction avec ceux de nombreux groupes, dont les notres, qui montrent un effet protecteur de la BK et en particulier de son récepteur B2 dans différents modèles de néphropathie diabétique. 66 Partie II : néphropathie diabétique et système kallicréine-kinine III.3.b. Mécanismes potentiels de l’effet néphroprotecteur Les différents mécanismes possibles de l’effet néphroprotecteur associé à l’activation du RB2 sont représentés sur la Figure 9. Un premier mécanisme reposerait sur une action directe de la BK sur la régulation de la glycémie, par ce biais, la BK serait capable de prévenir ou au moins ralentir l’évolution des complications liées à l’hyperglycémie, en particulier la ND. En effet, la BK est capable de stimuler la translocation du transporteur de glucose GLUT-4 et donc d’améliorer l’utilisation du glucose [310-312]. La sensibilité à l’insuline des rats déficients en kininogène [334] ainsi que celle des souris KOB2 [335] sont moins bonnes que celles de leurs contrôles respectifs. De la même façon, la sensibilité à l’insuline, est réduite par l’administration d’un antagoniste du RB2 [336], par un mécanisme indépendant du NO et des prostaglandines. De plus, la BK serait capable de stimuler la libération d’insuline par le pancréas [71, 337]. La BK réduit également la quantité plasmatique d’AGE, ce qui peut être associé à l’amélioration de l’action de l’insuline sur le transport de glucose dans le muscle squelettique [338, 339]. En plus de cette action sur le contrôle de la glycémie, la BK exercerait également une action protectrice directe et indépendante de la glycémie contre le développement de la ND. Cet effet néphroprotecteur pourrait faire intervenir différents mécanismes : - Tout d’abord, la BK réduirait le stress oxydant consécutif à l’hyperglycémie [170]. En effet, l’administration de BK chez des rats STZ, réduit la formation de certains paramètres du stress oxydant (peroxyde d’hydrogène et malondialdéhyde), et augmente l’activité d’enzymes anti-oxydantes (Super Oxyde Dismutase, catalase et glutathion peroxydase) [340]. 67 Partie II : néphropathie diabétique et système kallicréine-kinine Une réduction de la formation de radical super oxyde et des concentrations sériques en triglycérides et cholestérol a été démontrée après transfert du gène de la kallicréine [105, 108, 331]. Inversement, une majoration du profil du stress oxydant a été décrite chez les souris n’exprimant pas le RB2 [341]. Enfin, chez le rat diabétique, notre groupe a décrit une augmentation de l’accumulation de protéines complexées à des dérivés 4-HNE (index de la peroxidation lipidique) lors du blocage du RB2 [342]. L’activation du RB2 pourrait donc contrôler en partie le stress oxydant, vraisemblablement par la production de NO. - La BK exerce également un rôle anti-fibrosant via l’activation du RB2. Elle diminue la synthèse d’inhibiteur-1 des activateurs du plasminogène (PAI-1), ce qui a pour conséquence une augmentation d’activité des métalloprotéases, et favorise donc la dégradation de la matrice [141]. De plus, la BK module l’expression et la signalisation des récepteurs des cytokines et des facteurs de croissance. Sur la cellule mésangiale, l’administration de BK réduit l’autophosphorylation du récepteur de l’EGF [343]. Chez le rat diabétique, l’expression glomérulaire des récepteurs de certaines cytokines (IGF-1, TGF-β) est augmentée lors du blocage du RB2 [342]. L’activation du RB2, sur des glomérules isolés de rats, inhibe l’activation des MAP-kinases induite par les facteurs de croissance (IGF-1, PDGF, VEGF, FGF), et par l’hyperglycémie [35, 342, 344]. Ces travaux sont par ailleurs en accord avec une observation récente indiquant que la surexpression du récepteur du TGF- β est augmentée chez les souris n’exprimant plus le RB2 [341]. - L’effet protecteur de la BK pourrait également impliquer son effet anti-prolifératif. En effet, en fonction de l’état d’activation cellulaire, la BK peut activer ou inhiber la prolifération et l’hypertrophie cellulaire, probablement via le recrutement de voies de signalisation distinctes (Tableau 1). L’effet prolifératif semble faire intervenir les activations de la phospholipase C et de la protéine kinase C (PKC). Plusieurs mécanismes ont été 68 Partie II : néphropathie diabétique et système kallicréine-kinine évoqués pour expliquer l’effet anti-prolifératif : une augmentation de la production de PGE2 dans des fibroblastes [343], l’activation d’une tyrosine phosphatase capable de déphosphoryler les MAP kinases Erk1/2 dans les cellules mésangiales [345], l’activation de la phosphatase PTP responsable de la trans-inactivation du récepteur de l’EGF dans des cellules épithéliales et enfin la désensibilisation du récepteur de l’EGF par un mécanisme impliquant la PKC [346]. - La néphrine et la megsine sont deux protéines importantes pour la stabilité du filtre glomérulaire. Elles pourraient intervenir dans l’effet protecteur du RB2. L’invalidation du RB2 est en effet associée à une augmentation importante de l’expression de ces deux protéines lors de l’apparition du diabète [116]. Une augmentation de l’expression de la néphrine a aussi été démontrée lors de l’instauration d’un diabète de type I chez le rat [347]. La néphrine mutée est associée à un détachement des podocytes pouvant conduire à une altération précoce du filtre glomérulaire [348, 349]. La megsine est un inhibiteur de métalloprotéases et donc de la dégradation de protéines matricielles. L’accumulation de megsine en absence du RB2 pourrait aboutir à l’accumulation de matrice, et être ainsi en partie responsable de l’instauration de la fibrose glomérulaire [350]. 69 Partie II : néphropathie diabétique et système kallicréine-kinine Figure 9 : Différents mécanismes possibles de néphroprotection associés à l’activation du récepteur de la bradykinine 70 Partie II : néphropathie diabétique et système kallicréine-kinine III.4. QUELLE PLACE POUR LE RECEPTEUR B1 ? L’expression du récepteur B1 est induite au cours du diabète dans plusieurs organes tels que les vaisseaux rétiniens [351], le rein [352-355] et la moelle épinière [356-359]. Par contre, le RB1 n’est pas détectable dans le myocarde [360] alors que la fibrose cardiaque associée à la cardiomyopathie diabétique est réduite par l’activation du RB2. Toutefois, l’effet de l’activation du RB1 au cours de la néphropathie diabétique reste incertain. Un seul travail est en faveur d’un rôle néphroprotecteur du RB1, montrant que le blocage pharmacologique de ce récepteur aggrave la fibrose rénale dans un modèle d’hypertension [131]. Le RB1 peut aussi avoir des effets anti-prolifératifs car il réduit l’hyperplasie de la média lors de lésions de la carotide chez le rat [361]. Cependant, l’hypothèse actuelle privilégie plutôt le potentiel délétère de son activation et place le blocage du RB1 comme une perspective thérapeutique, comme cela à été observé avec bénéfice dans les syndromes douloureux, en particulier au cours de la neuropathie diabétique [60, 362-364]. Le concept d’un rôle protecteur de l’activation du RB2 par la BK émerge donc des travaux de plusieurs groupes indépendants. L’utilisation d’agonistes du RB2 devrait nous permettre de vérifier l’hypothèse de l’effet protecteur de l’activation du RB2, au cours de la néphropathie diabétique, et d’envisager l’usage du SKK comme outil thérapeutique. 71 Partie II : néphropathie diabétique et système kallicréine-kinine IV. CONTRIBUTION PERSONNELLE : PLACE DU RECEPTEUR B2 DANS LES EFFETS DU BLOCAGE DU SRA AU COURS DE LA NEPHROPATHIE DIABETIQUE EXPERIMENTALE Avec l’idée de rechercher de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles pour protéger le rein contre le développement de l’insuffisance rénale chronique (néphropathie diabétique) ou aiguë (choc endotoxinique), nos travaux avaient pour but de préciser le rôle du récepteur B2 de la bradykinine au cours de ces deux pathologies. Dans un premier travail (Allard J, Buléon M, Cellier E, Renaud I, Pecher C, Praddaude F, Conti M, Tack I and JP Girolami. ACE inhibitor reduces growth factor receptor expression and signalling but also albuminuria through B2-kinin glomerular receptor activation in diabetic rats. Am J Physiol Renal Physiol. 2007 ; 293(4) : F1083-92), nous avons étudié, chez le rat rendu diabétique par la streptozotocine, l’effet du blocage du récepteur B2 sur l’expression et l’activation des récepteurs du TGFβ et de 2 facteurs de croissance (IGF1 et PDGF) lors d’un traitement par un IEC. Dans cette situation, le blocage du RB2 annule les effets inhibiteurs bénéfiques de l’IEC sur ces voies de signalisation. Cette observation apporte un argument indirect pour considérer que l’activation du RB2 est bénéfique en inhibant l’expression et l’activation de facteurs de croissance et de cytokines impliqués dans le développement de la glomérulosclérose diabétique. Toutefois, ce modèle de diabète chez le rat correspond à une situation catabolique extrême, fort éloignée de celle des patients diabétiques. De plus, les lésions rénales observées dans ce modèle sont modérées et pas tout à fait caractéristiques de la néphropathie diabétique (ND) humaine. Suite à ce travail, et afin d’étudier directement les conséquences des traitements pharmacologiques dans un modèle plus proche de la situation humaine, nous avons développé le nouveau modèle de diabète des souris obèses diabétiques C57BlKs db/db. Ces animaux 72 Partie II : néphropathie diabétique et système kallicréine-kinine développent des lésions rénales plus progressives et plus proches de celles observées chez l’Homme que le modèle précédent. La néphropathie diabétique touchant d’abord les glomérules, la première étape a été d’adapter chez la souris et de valider une méthode d’isolement glomérulaire par tri magnétique sélectif. Cette méthode dérivée de celle décrite par Cook et Pickering (1958) chez le lapin, a été largement modifiée pour devenir utilisable chez la souris. Nous l’avons ensuite validée par l’étude, au niveau glomérulaire, de la voie de l’IGF1 (impliquée dans la phase précoce de développement de la néphropathie diabétique) dans 3 modèles de diabète chez la souris : la souris NOD (diabète de type I spontané), le diabète induit par la streptozotocine chez la souris C57 (diabète de type I), et la souris C57 BLKs db/db (diabète de type II). Ce travail a fait l’objet d’une communication internationale (Buleon M, Allard J, Praddaude F, Ader JL, Tack I: Glomerular expression and activation of IGF-I pathway in type I and type II diabetes in mice. (poster) ASN 37th Annual Meeting & Scientific Exposition, St Louis, Missouri, october 2004) et le manuscrit, en préparation, sera soumis prochainement à la revue European Journal of Physiology. Nous avons ensuite étudié le rôle du récepteur B2 de la bradykinine (RB2) dans l’effet des IEC au cours de la néphropathie diabétique et ce dans le modèle de diabète de type II avec obésité (la souris db/db). Des souris db/db ont été soumises pendant 20 semaines à un traitement par du ramipril, seul ou associé à un antagoniste du récepteur B2 de la bradykinine. A la fin du traitement, nous avons étudié les paramètres fonctionnels (microalbuminurie, débit de filtration glomérulaire…) et structuraux (volume glomérulaire et glomérulosclérose par histomorphométrie), caractérisant la néphropathie diabétique. L’impact des différents traitements sur certaines voies de signalisation (IGF1, TGFβ, RAGE, stress oxydant), connues pour être impliquées dans le développement de la néphropathie diabétique, a également été 73 Partie II : néphropathie diabétique et système kallicréine-kinine étudié à l’échelon glomérulaire. Comme on pouvait s’y attendre, nous avons observé un bénéfice structural important ainsi qu’une réduction de l’excrétion urinaire d’albumine chez les souris traitées par les IEC. Mais surtout, cet effet néphroprotecteur des IEC était en grande partie aboli par la co-administration de l’antagoniste du RB2. L’effet protecteur des IEC passe donc largement par l’action directe de la bradykinine sur le RB2. Le manuscrit a été accepté à l’American Journal of Physiology : Pharmacological blockade of B2-kinin receptor reduces renal protective effect of Angiotensin-Converting Enzyme Inhibition in db/db mice model. Marie Buléon, Julien Allard, Acil Jaafar, Françoise Praddaude, Marie-Thérèse Ranera, Christiane Pecher, Jean-Pierre Girolami and Ivan Tack. Suite à ce travail, nous avons étudié dans le même modèle, l’effet du blocage du RB2 au cours d’un traitement cette fois par un antagoniste du récepteur AT1 de l’angiotensine II (ARA2). Des souris db/db ont donc été soumises à un traitement par un ARA2 (Irbésartan), seul ou associé à un antagoniste du récepteur B2 de la bradykinine (HOE-140). Les mêmes paramètres ont été étudiés. Nous avons observé un bénéfice structural des ARA2, cependant moins important que celui observé lors du traitement par les IEC. Les ARA2 n’avaient pas d’action anti-protéinurique mais amélioraient discrètement l’équilibre glycémique. Les bénéfices structuraux et métaboliques apportés par les ARA2 impliquaient largement l’activation du RB2. 74 Partie II : néphropathie diabétique et système kallicréine-kinine Manuscrit n°1 ACE inhibitor reduces growth factor receptor expression and signaling but also albuminuria through B2-kinin glomerular receptor activation in diabetic rats. Allard J, Buléon M, Cellier E, Renaud I, Pecher C, Praddaude F, Conti M, Tack I, Girolami JP. Am J Physiol Renal Physiol. 2007 Oct;293(4):F1083-92. Epub 2007 Jun 27. 75 Am J Physiol Renal Physiol 293: F1083–F1092, 2007. First published June 27, 2007; doi:10.1152/ajprenal.00401.2006. ACE inhibitor reduces growth factor receptor expression and signaling but also albuminuria through B2-kinin glomerular receptor activation in diabetic rats Julien Allard,1 Marie Buléon,1 Eric Cellier,1 Isabelle Renaud,2 Christiane Pecher,1 Françoise Praddaude,1 Marc Conti,2 Ivan Tack,1 and Jean-Pierre Girolami1 1 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale U858 eq 5 and Physiology Department, Louis Bugnard Institute, Toulouse Cedex 4; and 2Laboratoire de Biochimie 1, CHU de Bicêtre, Le Kremlin-Bicêtre, France Submitted 11 October 2006; accepted in final form 24 June 2007 Allard J, Buléon M, Cellier E, Renaud I, Pecher C, Praddaude F, Conti M, Tack I, Girolami J-P. ACE inhibitor reduces growth factor receptor expression and signaling but also albuminuria through B2-kinin glomerular receptor activation in diabetic rats. Am J Physiol Renal Physiol 293: F1083–F1092, 2007. First published June 27, 2007; doi:10.1152/ajprenal.00401.2006.—Diabetic nephropathy (DN) is associated with increased oxidative stress, overexpression and activation of growth factor receptors, including those for transforming growth factor-1 (TGF--RII), platelet-derived growth factor (PDGFR), and insulin-like growth factor (IGF1-R). These pathways are believed to represent pathophysiological determinants of DN. Beyond perfect glycemic control, angiotensin-converting enzyme inhibitors (ACEI) are the most efficient treatment to delay glomerulosclerosis. Since their mechanisms of action remain uncertain, we investigated the effect of ACEI on the glomerular expression of these growth factor pathways in a model of streptozotocin-induced diabetes in rats. The early phase of diabetes was found to be associated with an increase in glomerular expression of IGF1-R, PDGF-R, and TGF-RII and activation of IRS1, Erk 1/2, and Smad 2/3. These changes were significantly reduced by ACEI treatment. Furthermore, ACEI stimulated glutathione peroxidase activity, suggesting a protective role against oxidative stress. ACEI decreased ANG II production but also increased bradykinin bioavailability by reducing its degradation. Thus the involvement of the bradykinin pathway was investigated using coadministration of HOE-140, a highly specific nonpeptidic B2-kinin receptor antagonist. Almost all the previously described effects of ACEI were abolished by HOE-140, as was the increase in glutathione peroxidase activity. Moreover, the well-established ability of ACEI to reduce albuminuria was also prevented by HOE-140. Taken together, these data demonstrate that, in the early phase of diabetes, ACEI reverse glomerular overexpression and activation of some critical growth factor pathways and increase protection against oxidative stress and that these effects involve B2-kinin receptor activation. DIABETIC NEPHROPATHY (DN) causes the majority of end-stage renal diseases throughout the world (54). It was initially believed that elevated blood glucose was the major cause of renal damage in both type 1 and 2 diabetes. However, several clinical studies have demonstrated that strict glycemic control is not sufficient to prevent the progression of renal dysfunction and the development of glomerular lesions. The mechanisms underlying the progression of diabetic kidney disease are intricate and still not completely understood. Among the many pathophysiological mechanisms possible, several growth factors and cytokines have been put forward to account for the onset of DN. This is particularly the case for the paracrine expression of insulin-like growth factor-1 (IGF-1), transforming growth factor- (TGF-) (20), and platelet-derived growth factor (PDGF) that are involved in the early onset of diabetesinduced renal changes. In addition to the upregulation and activation of growth factor and cytokine receptors, the activation of the renal renin-angiotensin system (RAS) and oxidative stress have been identified as critical events that largely contribute to worsening DN (7). These observations are consistent with the importance of blood pressure (BP) reduction and the efficiency of the blockade of the RAS (2, 38) in preserving renal functions in diabetic states. Consistently, blockade of the RAS with angiotensin-converting enzyme inhibitor (ACEI) or ANG II type I receptor blockers (ATB) has become one of the most successful therapeutic approaches to prevent diabetic kidney disease. However, the efficiency of the RAS blockers may not rely on the blockade of angiotensin receptors only, since discrepancies in the level of activation of the RAS and in the efficacy of RAS blockers have been reported suggesting additional mechanisms. In fact, ACE exhibits at least a dual activity; in addition to the generation of the potent vasoconstrictor peptide ANG II, ACE is also able to hydrolyze the COOH-terminus dipeptide of the nonapeptide bradykinin (BK) leading to inactive BK fragments. Therefore, ACE inhibitors not only decrease ANG II synthesis, they also increase the bioavailability of BK. Several recent reports suggest that activation of the B2-kinin receptors (B2R) could reduce the proliferative effect of several growth factors in cultured cell lines (15, 45, 50) and in mesangial cells (1, 18). B2-kinin receptor is involved in the antihypertrophic effect of BK documented in cultured cardiomyocytes (30, 52, 53, 55) but also in vivo, mainly in the heart (24, 25, 40, 56). Moreover, the antihypertrophic effect of BK in vivo on the renal vasculature in mice has been also reported (67). Therefore, the present study was designed to investigate the effect ACEI as well as the involvement of B2-kinin receptor inhibition on the expression of several growth factor receptors involved in the development of diabetic glomerulosclerosis (20). Address for reprint requests and other correspondence: J. P. Girolami, Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale U388 Louis Bugnard Institute, BP 84225, 31432 Toulouse Cedex 4, France (e-mail: girolami @toulouse.inserm.fr). The costs of publication of this article were defrayed in part by the payment of page charges. The article must therefore be hereby marked “advertisement” in accordance with 18 U.S.C. Section 1734 solely to indicate this fact. angiotensin-converting enzyme inhibitor; oxidative stress; glutathione peroxidase activity; diabetes http://www.ajprenal.org 0363-6127/07 $8.00 Copyright © 2007 the American Physiological Society F1083 F1084 BRADYKININ AND GROWTH FACTOR IN DIABETIC GLOMERULI The experimental protocol consisted of a prolonged treatment of streptozotocin-induced diabetic rats with ACEI alone or combined with a B2R nonpeptide antagonist. We investigated the effect of this treatment on glomerular expressions of IGF-1, PDGF B, and TGF-1 receptors. In addition, we also assessed whether ACE inhibition induced changes in the major activated signaling pathways of these receptors and in the activity of several anti-oxidant enzymes in parallel with microalbuminuria. MATERIALS AND METHODS Drugs and compounds. Rabbit polyclonal IgG anti-PDGF receptor type B, rabbit-purified IgG anti-IRS-1, and antiphospho-Smad 2 were purchased from Upstate Biotechnology (Euromedex Munddolsheim France). Goat-purified IgG anti-Smad 2/3, rabbit-purified IgG antiTGF- receptor II, and rabbit-purified IgG anti-total form of Erk 2 were from Santa Cruz Biotechnology (Tebu, Le Perray, France). Rabbit-purified IgG anti-phospho-Erk 1 and 2 were purchased from Promega (Madison, WI). The commercial sources of products were otherwise as follows: orthovanadate, NG-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME), ouabain, EGTA, SDS, glycerol, PMSF, soybean trypsin inhibitor (SBTI), aprotinin, leupeptin, -mercaptoethanol, bacitracine, BSA, genistein, DTT, TCA, ammonium molybdate, isobutanol, and toluene were from Sigma (St. Quentin Fallavier, France). NaCl, RPMI 1640, and bromophenol blue were from Merck Eurolab (Strasbourg, France). Tris and glycine were from GIBCO BRL (Cergy-Pontoise, France). PBS was from Biochrom (Berlin, Germany), EDTA was from ICN, and Zanozar (streptozotocin) was from Pharmacia and Upjohn (St. Quentin Yvelines, France). Ramipril and HOE-140 were generously provided by Aventis Pharma (Frankfurt, Germany). Animal and study design. Male Sprague-Dawley rats (12 wk old, Harlan) were housed under controlled conditions in a room with a 12:12-h light-dark cycle and standard rat chow and tap water available ad libitum. Experimental procedures and protocols were conducted in compliance with the guiding principles for animal research (US) and has been approved by the IFR31 Institutional Animal Care and Use Committee as recently described (3). Diabetes was induced by an intravenous injection of 65 mg/kg streptozotocin (Zanosar, freshly reconstituted in sterile water). Age-matched control rats received the vehicle only. Once diabetes was established (4 –5 days afterward), diabetic rats were randomly divided into five groups (n ⫽ 12 each). Animals of the first group received no other treatment. Subcutaneous insulin implants delivering 2 U/24 h (Linshin, Scarborough, ON, Canada) were given to the rats in the second group. Rats from group 3 received 1 mg 䡠 kg⫺1 䡠 day⫺1 of the ACE inhibitor ramipril in their drinking water. Rats from group 4 received ramipril and in addition were subcutaneously injected daily with 0.25 mg/kg of the B2Rselective antagonist HOE-140. Rats from group 5 received 0.25 mg/kg of HOE-140 only. The selected doses of ramipril (1 mg 䡠 kg⫺1 䡠 day⫺1) had been previously demonstrated to reverse many functional and morphological events of DN. The dose of HOE-140 used (0.25 mg/kg) was twofold that of a dose sufficient to inhibit the hypotensive effects of 100 nM BK. Biological parameters. Conscious systemic BP was measured by the tail-cuff method (Power lab 400, Phymed, Paris, France). Three days before the end of the study, the rats were housed in metabolic cages, and 24-h urine samples were collected. Aliquots were frozen at ⫺20°C until measurements. Microalbuminuria was determined using the Cayman EIA kit and expressed by the ratio albuminuria to creatininuria. Glomerular filtration rate was estimated by using the creatinine clearance method. At the end of the study, i.e., 14 days after the initiation of the treatments, the glycemia was measured with a Euro Flash LifeScan glycometer (Issy-les Moulineaux, France). The rats were anesthetized intraperitoneally with 65 mg/kg pentobarbital sodium (Sanofi, Montpellier, France). After complete exsanguination, AJP-Renal Physiol • VOL the kidneys were quickly removed and the glomeruli were isolated as routinely performed in the laboratory by graded sieving (3). Briefly, the cortex was forced through three consecutive steel sieves with decreasing mesh sizes (180, 125, and 75 m) to harvest ⬃12,000 glomeruli/kidney. Under light microscopy, ⬎90% of the glomeruli appeared to be decapsulated and free of surrounding tubules and arterioles. The suspension was centrifuged (15,000 rpm, 4°C, 2 min), and the supernatant was discarded. The pellet containing the glomeruli was resuspended in 100 l of lysis buffer (10 mM Tris, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 2 mM orthovanadate, 0.36 mg/ml PMSF, 10 g/ml SBTI, 1 g/ml aprotinin, 1 g/ml leupeptin, 0.1% SDS, pH 7.5), sonicated for 10 s, and centrifuged (15,000 rpm, 4°C, 15 min). Insoluble material was discarded, and the proteins of the soluble extract were boiled in Laemmli buffer (32 mM Tris, 1% SDS, 5% glycerol, 0.05% bromophenol blue, 2.5% -mercaptoethanol, pH 6.8) for 6 min and stored frozen until SDS-PAGE. Protein concentration was determined by the Bradford protein assay. Western blotting. Equal amounts of proteins (25 g) were separated by SDS-PAGE in Tris-glycine buffer under a 150-V, 30-mA current in a Bio-Rad miniature transfer gel apparatus (Mini-Protean, Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA) on a 10% SDS-polyacrylamide gel as routinely performed in the laboratory and recently described (3). Proteins were then transferred to a nitrocellulose membrane (Amersham, Orsay, France) in Tris-glycine-methanol buffer under a 100-V, 300-mA current in a Bio-Rad miniature transfer gel apparatus (Mini-Protean, Bio-Rad Laboratories). The membrane was blotted with the appropriate antibody. Proteins were visualized using a horseradish peroxidase-conjugated goat anti-rabbit immunoglobulin (Amersham) and an enhanced chemiluminescence (ECL) kit (Amersham). Oxidative stress parameters. Small fragments of cortical tissue (250 mg) were rinsed with 0.15 M NaCl containing 1 mM EDTA, frozen, and stored in liquid nitrogen. The tissues were homogenized in an ice-bath for 30 s with 0.3 M perchloric acid (HClO4) using an Ultra Turax homogenizer (Janken Kunkel Ika-Werk, Staufen, Germany). The homogenate was centrifuged at 2,300 g for 15 min at 4°C. After neutralization with trioctylamine (0.2 vol) and trichlorofluoromethane (0.8 vol), the supernatant was used for determination of malonydialdehyde (MDA) after its conjugation to thiobarbituric acid (TBA) and determination of the antioxidant activities of Cu/Zn- and Mn-SOD (super oxide dismutase), catalase, and GPx (glutathione peroxidase); MDA was also measured directly in plasma sample as recently described in detail (6). Tissue kallikrein-kinin system parameters. The expression of B2 receptor in glomerular extract was evaluated by Western blot as previously described (19). The activity of kallikrein in cortical extracts was measured by radioimmunoassay of generated BK after incubation as described below for tissue BK content. To measure BK tissue content, fragments of cortical tissue were rapidly removed and rinsed in PBS containing 0.3 mM orthophenanthroline and 0.3 mM EDTA as kininase inhibitors. They were homogenized in the smallest possible volume of extraction buffer (0.5 ml/100 g). Then, the homogenates were stored frozen at ⫺80°C until measurement. BK concentration was measured using a radioimmunoassay as previously described in our laboratory (19). The experimental conditions allowed the minimal detection of 1.5 fmol BK with less than 10% crossreactivity with either Des-Arg9-BK or kininogen. Results are expressed as femtomoles per milligram of protein. ACE activity was measured as previously described and currently performed in laboratory (42). Statistical analysis. Data are expressed as means ⫾ SE of at least five independent experiments. Body weight, glycemia, and tyrosine phosphatase activity results were analyzed using one-way ANOVA followed by either Student’s t-test for paired data or Dunnett’s test for multiple comparisons. A Kruskal-Wallis test and post hoc WilcoxonMann-Whitney U-test were used for Western blot densitometric 293 • OCTOBER 2007 • www.ajprenal.org F1085 BRADYKININ AND GROWTH FACTOR IN DIABETIC GLOMERULI Table 1. Characteristics of control and STZ-diabetic rats without and with treatment by Ins, ACEI, ACEI ⫹ HOE, HOE, Ins ⫹ ACEI, or Ins ⫹ ACEI ⫹ HOE Diabetic Parameters Control No Treatment Ins ACEI ACEI ⫹ HOE HOE Ins ⫹ ACEI Ins ⫹ ACEI ⫹ HOE Body wt, g Glucose, mmol/l Urine volume, ml/24 h Creatinine clearance, ml/min Blood pressure, mmHg 354⫾22 5.3⫾0.2 12.8⫾1.6 2.53⫾0.13 132⫾6 238⫾29* 30⫾6.8* 150⫾31.2* 1.32⫾0.27* 141⫾7 292⫾22* 5.2⫾0.4 13.6⫾3.4 2.68⫾0.28 128⫾5 229⫾37* 26.8⫾8.8* 116.7⫾31* 1.29⫾0.25* 125⫾9 241⫾34* 22.1⫾8.1* 166⫾21*† 1.50⫾0.26* 144⫾14 232⫾33* 22.9⫾5.2* 137⫾22* 1.70⫾0.41* 142⫾11 242⫾28* 4.9⫾0.6 11.4⫾4.1 2.72⫾0.22 125⫾6 247⫾22* 5.3⫾0.4 13.2⫾2.7 2.61⫾0.26 129⫾5 Values are means ⫾ SE of at least 8 independent experiments. GFR, glomerular filtration rate; STZ, streptozotocin; Ins, insulin; ACEI, angiotensin-converting enzyme inhibitor; ACEI⫹HOE, ACEI combined with B2-kinin receptor antagonist HOE-140; HOE, HOE-140 alone; Ins⫹ACEI, Ins combined with ACEI; Ins⫹ACEI⫹HOE, Ins combined with ACEI and HOE. *P ⬍ 0.05 when compared with nondiabetic control rats. †P ⬍ 0.05 when compared with ACEI-treated rats. analysis. P ⬍ 0.05 was considered to be significant. All analyses were performed with Prism 3 software (Graphpad). RESULTS Induction of diabetes and effect of treatments. Table 1 and Fig. 1 summarize several physiological parameters of the experimental groups. A single administration of STZ induced significant hyperglycemia, detected 5 days after injection, which was normalized by insulin only but remained unchanged during the other treatments. Induction of diabetes was associated with a large increase in diuresis (150 ⫾ 31.2 vs. 12.8 ⫾ 1.6 ml/24 h for diabetic untreated rats) which was slightly reduced by ACEI treatment via activation of the B2 receptor. Using the tail-cuff method, BP did not significantly vary between the groups. The diabetic untreated group showed a marked reduction of glomerular filtration rate, which was prevented by insulin treatment only. Urinary albumine excretion, shown in Fig. 1, increased significantly from 11.1 ⫾ 1 (control group) to 31.8 ⫾ 3.7 mg/100 mg creatinine (diabetic group); this increase was reversed by insulin or by the ACEI treatment. Interestingly, this effect of the ACEI was abolished when the B2R antagonist HOE-140 was coadministered. Fig. 1. Urinary albumin excretion from diabetic rats (filled bars) treated with insulin (Ins), angiotensin-converting enzyme inhibitor (ACEI), ACEI and the B2-kinin receptor antagonist HOE-140, HOE-140 alone (HOE), Ins combined with ACEI (Ins ⫹ ACEI), or Ins combined with ACEI and HOE (Ins ⫹ ACEI ⫹ HOE). Values are means ⫾ SE of at least 6 independent experiments. *P ⬍ 0.05, compared with nondiabetic control rats (open bar). †P ⬍ 0.05 compared with untreated diabetic rats (D). AJP-Renal Physiol • VOL Interestingly, the B2R antagonist alone had no effect per se on any of the parameters tested. Moreover, combining either insulin⫹ACEI or insulin⫹ACEI⫹HOE had no further effect compared with insulin or ACEI given alone. Effect of treatment with ACEI and B2R antagonist on the glomerular expression of IGF-1, PDGF-B, and TGF-1 receptors. As shown in Fig. 2, glomerular expression of PDGF-R, IGF1-R, and TGF- RII was increased in untreated diabetic rats. Treatment with insulin (given after the onset of diabetes) resulted in normalization of glycemia within 3 days but also prevented overexpression of the growth factor receptors. More interestingly, ACEI treatment exhibited similar preventive action despite its lack of effect on hyperglycemia. This effect of ACEI treatment was abolished by coadministration of the B2R antagonist HOE-140. Administration of HOE-140 alone had no significant effect. Moreover, combining either insulin⫹ACEI or insulin⫹ACEI⫹HOE had no further effect compared with insulin or ACEI given alone. Effect of treatments with ACEI and B2R antagonist on glomerular signaling pathways. Induction of diabetes not only increased some growth factor and cytokine receptors expression, but it also resulted in activation of several signaling pathways as demonstrated by increased phosphorylation of IRS-1, Erk1/2, and Smad 2/3 shown in Fig. 3. Normalization of hyperglycemia with insulin treatment resulted in decreased phosphorylation of these signaling molecules. Treatment with ACEI for 2 wk also partly prevented phosphorylation of IRS-1, Erk1/2, and Smad 2/3. Finaly, the ACEI-induced reduction of phosphorylation was blunted by coadministration of the B2R antagonist HOE-140 that did not exhibit any significant effects alone. Moreover, combining either insulin⫹ACEI or insulin⫹ACEI⫹HOE had no further effect compared with insulin or ACEI given alone. Effect of treatment with ACEI and B2R antagonist on enzymatic antioxidant defense. In a previous report (3), we showed that ACEI reduced lipid peroxidation suggesting a decrease in oxidative stress. Thus, here, we investigated the effect of the various treatments on the enzymatic activities involved in antioxidative defense. Serum MDA was found increased in diabetic rats. This effect was corrected as expected by insulin administration but also by ACEI, an effect that was abolished by HOE. No changes in activities of catalase, SOD Cu/Zn, or SOD were detected in any of the experimental groups (Table 2). In contrast, a significant increase in glutathione peroxidase activity (GPx) was observed in diabetic rats (Fig. 4). Interest- 293 • OCTOBER 2007 • www.ajprenal.org F1086 BRADYKININ AND GROWTH FACTOR IN DIABETIC GLOMERULI Fig. 2. Top: representative Western blot analysis of glomerular expression of platelet-derived growth factor (PDGF), insulin-like growth factor (IGF-1), and transforming growth factor- (TGF-) receptors. Protein extracts of freshly isolated glomeruli from control (C) and diabetic rats (D) were incubated with specific antibodies as described in detail in MATERIALS AND METHODS. Diabetic rats were either untreated (D) or treated with Ins, ACEI, ACEI combined with B2-kinin receptor antagonist HOE-140 (ACEI ⫹ HOE), HOE-140 alone (HOE), Ins combined with ACEI (Ins ⫹ ACEI), or Ins combined with ACEI and HOE (Ins ⫹ ACEI ⫹ HOE). Bottom: relative densitometric values of glomerular protein expression factored for the total form of -actine. A: PDGF R. B: IGF1 R. C: TGF--RII. Control lane (open bars) were obtained with glomerular extracts from nondiabetic rats. Filled bars: values from diabetic rats of the different groups described above. Values are means ⫾ SE of at least 5 independent experiments. *P ⬍ 0.05; **P ⬍ 0.01, compared with controls. †P ⬍ 0.05; ††P ⬍ 0.01, for the indicated comparison. ingly, ACEI treatment was associated with an additional increase in GPx activity that was completely prevented by coadministration of the B2R antagonist HOE-140 suggesting that activation of the B2R mediates the stimulation of GPx during ACEI treatment. Effect of treatment with ACEI and B2R antagonist on tissue kinin content, tissue kallikrein, and ACE activities. As shown in Fig. 5, the cortical BK content was significantly reduced in diabetic rats. Normalization of ACEI administration partly prevented the decrease in renal cortex BK content which, nevertheless, remained lower than that of control. Coadministration of the B2R antagonist alone or with ACEI was not associated with any specific effects. Moreover, combining either insulin⫹ACEI or insulin⫹ACEI⫹HOE had no further effect compared with insulin or ACEI given alone. Glomerular expression of the B2-kinin receptor assessed by Western blot, shown in Fig. 5A, remained unchanged in diabetic rats and was not affected whatever the treatment. Conversely, a significant reduction of tissue kallikrein activity was observed in cortical AJP-Renal Physiol • VOL extracts of diabetic rats, an effect that was prevented in all the groups receiving insulin, but that was insensitive to any other treatment. ACE activity was significantly reduced in diabetic rats, an effect that was also prevented by insulin. Treatment with ACEI resulted in complete inhibition of ACE activity. Interestingly, no kallikrein and ACE activities could be detected in glomerular extracts. DISCUSSION The aim of the present study was to clarify the role of B2-kinin receptor activation in the renoprotective effect of ACEI treatment in a type 1 diabetic rat. For this purpose, glomerular activation of some growth factors pathways critically involved in the development of DN was screened. Indeed, an increasing number of reports support the involvement of cytokines and growth factors in the onset and progression of DN (20, 37, 59, 60). Recruitment of these cytokines leads to overexpression of their receptors and activation of their corre- 293 • OCTOBER 2007 • www.ajprenal.org BRADYKININ AND GROWTH FACTOR IN DIABETIC GLOMERULI F1087 Fig. 3. Top: representative Western blot analysis of glomerular expression of the phosphorylated (P⫺) and the total form of IRS, Smad 2, and Erk 1/2. Protein extracts of freshly isolated glomeruli from control (C) and diabetic rats (D) were incubated with specific antibodies as described in detail in MATERIALS AND METHODS. Diabetic rats were either untreated (D) or treated with Ins, ACEI, ACEI ⫹ HOE, HOE, Ins ⫹ ACEI, or Ins ⫹ ACEI ⫹ HOE. Bottom: relative densitometric values of glomerular protein expression of the phosphorylated form factored to the total form of the protein of interest shown above. A: P-IRS-1. B: P-Smad. C: P-Erk. The ratio of control group was used as 100% value. Values are means ⫾ SE of at least 5 independent experiments. *P ⬍ 0.05; **P ⬍ 0.01, compared with controls. †P ⬍ 0.05; ††P ⬍ 0.01, for the indicated comparison. sponding signaling pathways, such as phosphorylation of IRS-1 and Erk1/2 for IGF-1 and of Smad for TGF-1. These phenomena are paralleled by the progression of glomerulosclerosis strongly suggesting a link of causality that is sustained by the beneficial effects of their blockades (20, 60, 69). Reducing hyperglycemia with insulin not only reverses both receptor overexpression and activation of these signaling pathways, but it also delays formation of renal lesions. Unfortunately, perAJP-Renal Physiol • VOL manent normoglycemia is hard, if not impossible, to achieve in most diabetic patients. This provides a rationale to resort to a long-term renoprotective treatment independent of glycemic equilibrium. Until now, blockade of the RAS (using ACEI or AT1 receptor antagonists) is the only therapy whose benefit has been clearly demonstrated in humans. The certainty of their protective effects contrasts with the vagueness of their intimate mechanisms of action. It is now clear that the blockade of the 293 • OCTOBER 2007 • www.ajprenal.org F1088 BRADYKININ AND GROWTH FACTOR IN DIABETIC GLOMERULI Table 2. Oxidative stress parameters in control and STZ-diabetic rats without and with treatment by Ins, ACEI, ACEI ⫹ HOE, HOE, Ins ⫹ ACEI, or Ins ⫹ ACEI ⫹ HOE Diabetic Parameters Control No Treatment Ins ACEI ACEI ⫹ HOE HOE Ins ⫹ ACEI Ins ⫹ ACEI ⫹ HOE Catalase, U/mg protein SOD Cu/Zn, U/mg protein SOD Mn, U/mg protein Tissue MDA, U/mg protein 39⫾6.2 13.8⫾2.0 4.1⫾0,6 0.74⫾0.10 38⫾7.3 14⫾2.2 3.9⫾0.6 0.73⫾0.14 39⫾4.5 14.2⫾2.4 4.4⫾0.4 0.68⫾0.11 38⫾7.0 15⫾2.4 3.8⫾0.5 0.67⫾0.07 42⫾5.5 14.8⫾2.3 4.7⫾0.5 0.72⫾0.11 40⫾5,0 13.9⫾2.2 4⫾0.8 0.69⫾0.12 37⫾3.3 12.2⫾2.7 3.9⫾0.4 0.71⫾0.20 41⫾2.9 13.2⫾2.5 4.1⫾0.3 0.69⫾0.40 Values are means ⫾ SE of at least 6 independent experiments. SOD Cu/Zn, Cu/Zn-superoxide dismutase; Mn SOD, Mn-superoxide dismutase; MDA, Malondialdehyde. angiotensin pathway by itself is not the only mechanism involved in ACEI-related vascular and renal protection. Downregulation of some critical cytokines, growth factor pathways, and reduction of oxidative stress appear as additional, but main, actions of ACEI treatment (46). The deleterious effects of these cytokines and growth factors on the kidney result from Fig. 4. A: plasma malondialdehyde (MDA) levels. B: glutathione peroxidase activity in glomerular extracts of freshly isolated glomeruli from diabetic rats (filled bars) treated with Ins, ACEI, ACEI ⫹ HOE, HOE, Ins ⫹ ACEI, or Ins ⫹ ACEI ⫹ HOE. Values are means ⫾ SE of at least 6 independent experiments. *P ⬍ 0.05; **P ⬍ 0.01, compared with nondiabetic control rats (open bar). †P ⬍ 0.05 compared with D. AJP-Renal Physiol • VOL multiple interactions and the identification of a common early step controlling their activation may provide a breakthrough toward a more efficient way to interrupt the cellular mechanisms of glomerular fibrogenesis. The present study established that, at the critical level of the glomerulus, the renal protective effect of chronic ACEI treatment during diabetes is in fact associated with the downregulation of the glomerular expression of IGF-1, PDGF, and TGF-1 receptors as well as inhibition of some of their signalings. Although we failed to identify directly the cellular localization of these receptors, it can be suggested that mesangial cells are critically involved in these changes. This suggestion is consistent with numerous previous studies reporting the expression of B2R in cultured mesangial cells (1, 18, 63), whereas the presence of B2R elsewhere in the glomerulus is poorly documented. Less expectedly, our results indicate that these changes critically involve B2R activation since they are largely abolished by coadministration of HOE-140, a specific B2R antagonist. Among the several growth factors involved in the progression of diabetic glomerulosclerosis, IGF-1 was one of the first and most extensively studied. Several works from Striker’s group (16, 17, 41, 62) indicate that diabetes could be responsible for prolonged activation of the glomerular IGF-1 pathway accounting for the accumulation of extracellular matrix, as a result of an increase in collagen synthesis alongside decreased degradation. An increasing number of reports indicate that blockade of the IGF-1/GH axis is able to prevent or attenuate nephropathy in various experimental models of diabetes. Activation of IGF-1 receptor is likely involved in diabetesinduced glomerular hypertrophy since an IGF-1 receptor antagonist inhibits early renal growth in diabetes (27). Furthermore, somatostatin analogs, which prevent renal IGF-I accumulation, protect the kidney in both type I and type II experimental models of diabetes (26). Finally, the involvement of IGF-1 in the worsening of DN is well accepted but the effects of chronic ACEI treatment on glomerular expression of IGF1-R protein and IGF-1 pathway have not yet been studied. TGF-1, which couples the functions of growth factor and inflammatory cytokine, has emerged as a major mediator of renal fibrogenesis (70) playing a central role in the deleterious renal effects of chronic hyperglycemia. In mesangial cells cultured in a high-glucose medium, inhibition of the JAK/ STAT signaling pathway, which mediates several TGF-1 cellular actions, also reduces TGF- and fibronectin synthesis (70). A new therapeutic approach to control the fibrotic process is based on the inhibition of either the expression or the action of the renal TGF- pathway (5, 23, 59, 69). Neutralization of 293 • OCTOBER 2007 • www.ajprenal.org BRADYKININ AND GROWTH FACTOR IN DIABETIC GLOMERULI F1089 Fig. 5. Status of the main components of renal kallikrein kinin system. A: representative Western blot analysis of glomerular expression of B2 receptor. B: relative densitometric values of glomrular protein expression factored for the total form of -actine. C: bradykinin concentration in cortical extracts. D: kallikrein activity from cortical extract. E: ACE activity from cortical extract from diabetic rats (filled bars) treated with Ins, ACEI, ACEI ⫹ HOE, HOE, Ins ⫹ ACEI, or Ins ⫹ ACEI ⫹ HOE. Bradykinin concentration, kallikrein activity, and ACE activity were determined as described in detail in MATERIALS AND METHODS. Values are means ⫾ SE of at least 6 independent extracts. *P ⬍ 0.05; **P ⬍ 0.01, compared with nondiabetic control rats (open bars). secreted TGF- with specific antibodies prevents glomerulosclerosis and renal failure in a model of type 2 diabetes (db/db mice) (5, 70). Interestingly, ACEI treatment decreases renal TGF- synthesis in several experimental models of diabetes (28) but also in diabetic patients (61). The pathophysiological role of PDGF-B in the progression of DN is less clear but is under recent evaluation. It has been known for a long time that PDGF is a necessary factor for the normal development of mesangial cells and that knockout mice for PDGF-B receptor lack mesangial cells (39). During diabetes, hyperglycemia is associated with glomerular upregulation of PDGF-B receptor (22, 35) and its activation is likely involved in the progressive development of fibrosis via activation of the TGF-1 pathway (22). Reversing established diabetic glomerulopathy remains a fascinating but unsolved therapeutic challenge. With respect to all these previous strategies designed to separately reduce the activation of proliferative and hypertrophic pathways of growth factors, treatment with ACEI shows a considerable advantage because it acts efficiently on all the upstream cytokine/growth factor receptors and pathways suggesting an action on a common very early step, which remains to be AJP-Renal Physiol • VOL identified. It is also interesting to note that ACEI demonstrates an effect similar to that of insulin on the reduction of growth factor expression and signaling activation. However, in contrast to insulin, ACEI has no significant effect on hyperglycemia. Therefore, ACEI acts at a different level than insulin but close to an early effect of hyerglycemia. Early effects of hyperglycemia are 1) activation of protein kinase C and 2) production of glucoxidative products such as Amadori and advance glycated end products (21) that lead to formation of reactive oxygen species (ROS). The accumulation of ROS in renal tissue in turn activates several signaling pathways associated with fibrogenesis (36). An increasing number of reports now indicate that ACEI also induce antioxidative effects. The attenuation of oxidative stress by ACEI is mainly interpreted as resulting from the inhibition of the RAS (14). It is true that ANG II is a potent stimulus for superoxide production by activating NAD(P)H oxidases, but surprisingly, the effect of antagonists of ANG II receptor has not yet been as widely tested as ACEI. Based on the current findings, ACEI may act as a “Magic Bullet” against oxidative stress (49) through an additional but unknown mechanism that is independent of their action on BP. Interestingly, 293 • OCTOBER 2007 • www.ajprenal.org F1090 BRADYKININ AND GROWTH FACTOR IN DIABETIC GLOMERULI the activation of B2R has never been evoked to account for the antioxidative effect of ACEI. Clearly, in the present study, the effect of ACEI is dependent on activation of the B2-kinin receptor. Although the precise mechanism remains to be elucidated, our report proposes a hypothesis based on an association between activation of the B2R and reduction of oxidative stress. Treatment with ACEI enhanced GPx activity, a wellestablished anti-oxidant enzymatic system. Moreover, the ACEI-induced increase in GPx activity is significantly blunted by coadministration of the B2R antagonist. Such stimulation or protection of anti-oxidant systems by ACEI inhibitors has been previously documented in various tissues in aging mice and rats (9, 11, 13), in hemodialysis patients (10), and in diabetic rats (12). How can BK reduce oxidative stress? Activation of B2R results in the formation of nitric oxide (NO), a potent scavenger molecule, which could reduce the accumulation of ROS. However, such a combination of NO and ROS will, in turn, result in a fall in NO availability which may end up in an elevation of BP (51) not observed in our study. We also recently demonstrated that B2R knockout mice exhibit a reduced glomerular capillary surface area and reduced urinary excretion of NO, indicating a tonic effect of B2R in the control of glomerular morphology (57). Finally, a direct effect of BK reducing the oxidative state of rats with acute hyperglycemia (47) has also been reported but to our knowledge no precise mechanism has been demonstrated. A second interesting observation in our experiment is that ACEI-induced reduction of albuminuria is also mediated by activation of the B2R. Until now, only one study has suggested the involvement of BK in the antiproteinuric effect of ACEI in DN (65), whereas absence of B2R is associated with higher microalbuminuria in diabetes mice (34). It has been demonstrated that DN is markedly enhanced in mice expressing high ACE activity, a situation associated with low levels of kinin and thereby low B2R activation (29). Similar observations have been reported in mice lacking the B2R (34). We also showed that renal fibrosis is increased in B2R null mice in response to unilateral obstruction (58). These three recent reports indicate that absence of B2R worsen DN, thereby suggesting that BK, through activation of the B2R, could exert potent nephroprotective effects. Several BK-dependent mechanisms could account for a reduction of albuminuria. First, it could be through a hemodynamic effect leading to reduction of filtration pressure. It has been reported (34) that induction of diabetes in mice lacking the B2R is associated with increased nephrin and megsin expressions and thereby glomerular hypertrophy. Therefore, BK could protect the steady expression of glomerular proteins such as nephrin, an essential component of the slit diaphragms necessary to maintain selective glomerular filtration, and megsin an inhibitor of matrix protein degradation. Expression of nephrin is increased in early stages of DN and favors loss of functional podocytes. Increasing the level of megsin, an inhibitor of matrix protein degradation, will result in extracellular matrix accumulation. Whereas the role of the B2R has been poorly studied, the changes in the kallikrein-kinin system (KKS) have been extensively investigated during diabetes, both in humans and in rats. Initial works suggested that renal KKS function is abnormal during diabetes mellitus in patients, an effect related to poor glycemic control (43). Later on, regulation of the renal AJP-Renal Physiol • VOL KKS was extensively investigated in STZ diabetic rats. We found that, whereas B2R renal expression remains stable during diabetes in our model, renal cortex tissue kallikrein activity decreases. This observation is consistent with the fact that in severely hyperglycemic diabetic animals, urinary excretion of kallikrein is reduced, a phenomenon that worsens with time (44). As a consequence, one could predict that during diabetes, renal kinin production in the cortex will be decreased, what we actually documented in renal cortex extract. The observation that tissue kinin content is increased by ACEI is explained by a decrease in kinin degradation rather by an increase in kinin synthesis since we found that ACEI had no effect of tissue kallikrein activity. It was then further suggested that insulin treatment modulates renal kallikrein production, activation, and secretion (31). Several other works from the same group put forward the hypothesis that increased renal production of kinins contributes to diabetes-induced glomerular hyperfiltration (32). More recently, the same group suggested that BK could promote glomerular injury in diabetes (63), an hypothesis which at first could appear opposite to our results but also to those observed in B2R knockout mice (34). However, the conclusion that BK can promote glomerular injury in diabetes was established on the fact that TGF-1 mRNA, TGF- RII, CTGF, and B2R expression and levels in renal cortex of diabetic rats increased simultaneously. However, this observation does not establish any causal relationships between these changes. To achieve this point, it should have been interesting to assess the effect of B2R blockade on TGF-1 mRNA, TGF- RII, and CTGF. Our present work adds new information indicating that B2-kinin receptor can also exert beneficial effects during the course of DN. We established that a large part of the effects of ACEI, both on the reduction of growth factor receptor expression and signaling but also on albuminuria, is mediated via activation of the B2R receptor because 1) specific pharmacological inhibition of the B2R reduces the effects of ACEI and 2) ACEI largely restored BK generation in cortical tissue. One may question why 50 to 75% restoration of renal cortical BK content during ACEI could be enough to achieve effects similar to those observed normally in rats. In fact, since ACEI clearly blocks ANG II generation, the beneficial action of BK is no longer counterbalanced by the deleterious effects of ANG II. Thus it can be hypothesized that less BK could achieve similar effects to those observed in normal animals with intact ANG II formation capability. With respect to the beneficial effects of the KKS, it has also been shown that diabetes suppresses kallikrein and renin mRNA gene expression and that these abnormalities are reversed by insulin or IGF-I (33). More recently, the role of the KKS in the physiopathological mechanism of diabetic complications, either nephropathy or cardiomyopathy, has been revisited and new direct mechanisms have been suggested. In this context, BK has been found to be involved in the antiproteinuric effect of ACE inhibition (64). Finally, kallikrein gene delivery in the rat (48, 60) protects against experimental diabetic cardiopathy. Besides the cardioprotective effect of kinins, the hypothesis of a nephroprotective action of BK via activation of the B2R is also emerging from several works also discussed in this paper. It has been reported that B9972, a new B2R agonist, demonstrates the capacity to reduce both severe pulmonary hypertension and right ventricular hypertrophy but can also induce apoptosis of hyperprolif- 293 • OCTOBER 2007 • www.ajprenal.org BRADYKININ AND GROWTH FACTOR IN DIABETIC GLOMERULI erative cells in precapillary pulmonary arterioles (64). Finally, it has been very recently shown (4) that kinin infusion prevents renal inflammation, apoptosis, and fibrosis via inhibition of oxidative stress and mitogen-activated protein kinase activity in high salt-induced renal lesion in rats. In summary, we describe a new chronic and potentially beneficial effect of ACEI resulting in the inhibition of glomerular expression of some growth factor receptors and their signaling during the early steps of type 1 diabetes. A critical observation is that almost all the benefits of ACEI are blunted by concomitant and specific B2R blockage. Thus it is likely that BK mediates these effects through B2R activation. The potential protective role of B2-kinin receptor activation during diabetes has been recently reviewed (8) and it is suggested that B2R-specific agonists now merit consideration as a possible new therapeutic approach to protect against DN, an idea consistent with the works of different groups and not solely those involved in the field of DN. The present work suggests that the protective mechanism of B2R activation could be partly mediated by the stimulation of antioxidant defense and by maintaining steady expression of glomerular structural proteins. Moreover, downregulation of several deleterious growth factor pathways is also dependant on B2R activation. These observations and our results finally strengthen the concept of developing B2R agonists to protect the kidney during diabetes and support the evaluation of the renoprotective effect of B2R activation during diabetes, using a specific agonist, independently of ACEI blockade. ACKNOWLEDGMENTS We thank Dr. P. Winterton for reviewing the manuscript. GRANTS This work was supported by funds from Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale. The authors thank Sanofi Aventis Laboratories for the generous gift of ramipril and HOE-140. E. Cellier was a postdoctoral fellow supported by funding from Fonds de la Recherche en Santé du Québec. REFERENCES 1. Alric C, Pecher C, Cellier E, Schanstra JP, Poirier B, Chevalier J, Bascands JL, Girolami JP. Inhibition of IGF-I-induced Erk 1 and 2 activation and mitogenesis in mesangial cells by bradykinin. Kidney Int 62: 412– 421, 2002. 2. Bakris GL, William M, Dworkin L, Elliot WJ, Epstein M, Toto R, Tuttle K, Douglas J, Hsuech W, Sowers J. Preserving renal function in adults with hypertension and diabetes a consensus approach. National Kidney Foundation Hypertension and Diabetes Executive Committees Working Group. Am J Kidney Dis 36: 646 – 661, 2000. 3. Cellier E, Mage M, Duchene J, Pecher C, Couture R, Bascands JL, Girolami JP. Bradykinin reduces growth factor-induced glomerular ERK1/2 phosphorylation. Am J Physiol Renal Physiol 284: F282–F292, 2003. 4. Chao J, Li HJ, Yao YY, Shen B, Gao L, Bledsoe G, Chao L. Kinin infusion prevents renal inflammation, apoptosis and fibrosis via inhibition of oxidative stress and mitogen-activated protein kinase activity. Hypertension 49: 490 – 497, 2007. 5. Chen S, Iglesias de la Cruz C, Jim B, Hong SW, Isono M, Ziyadeh FN. Reversibility of established glomerulopathy by anti-TGF- antibodies in db/db mice. Biochem Biophys Res Commun 300: 16 –23, 2003. 6. Conti M, Renaud IM, Poirier B, Michel O, Belair MF, Mandet C, Bruneval P, Myara I, Chevalier J. High levels of myocardial antioxidant defense in aging nondiabetic normotensive Zucker obese rats. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 286: R793–R800, 2004. 7. Cooper ME. Interaction of metabolic and hemodynamic factors in mediating experimental diabetic nephropathy. Diabetologia 44: 1957–1972, 2001. AJP-Renal Physiol • VOL F1091 8. Couture R, Girolami JP. Putative roles of kinin receptors in the therapeutic effects of angiotensin 1-converting enzyme inhibitors in diabetes mellitus. Eur J Pharmacol 500: 467– 485, 2004. 9. De Cavanagh EM, Fraga CG, Ferder L, Inserra F. Enalapril and captopril enhance antioxidant defenses in mouse tissues. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 272: R514 –R518, 1997. 10. De Cavanagh EM, Ferder L, Carrasquedo F, Scrivo D, Wassermann A, Fraga CG, Inserra F. Higher levels of antioxidant defenses in enalapril-treated versus nonenalapril-treated hemodialysis patients. Am J Kidney Dis 34: 445– 455, 1999. 11. De Cavanagh EM, Inserra F, Ferder L, Fraga CG. Enalapril and captopril enhance glutathione-dependent antioxidant defenses in mouse tissues. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 278: R572–R577, 2000. 12. De Cavanagh EM, Inserra F, Toblli J, Stella I, Fraga CG, Ferder L. Enalapril attenuates oxidative stress in diabetic rats. Hypertension 38: 1130 –1136, 2001. 13. De Cavanagh EM, Piotrkowski B, Basso N, Stella I, Inserra F, Ferder L, Fraga CG. Enalapril and losartan attenuate mitochondrial dysfunction in aged rats. FASEB J 17: 1096 –1098, 2003. 14. De Cavanagh EM, Piotrkowski B, Fraga CG. Concerted action of the renin-angiotensin system, mitochondria, and antioxidant defenses in aging. Mol Aspects Med 25: 27–36, 2004. 15. Dixon BS, Dennis MJ. Regulation of mitogenesis by kinins in arterial smooth muscle cells. Am J Physiol Cell Physiol 273: C7–C20, 1997. 16. Doi T, Striker LJ, Quaife C, Conti FG, Palmiter R, Behringer R, Brinster R, Striker GE. Progressive glomerulosclerosis develops in transgenic mice chronically expressing growth hormone and growth hormone releasing factor but not in those expressing insulin like growth factor-1. Am J Pathol 131: 398 – 403, 1988. 17. Doi T, Striker LJ, Gibson CC, Agodoa LY, Brinster RL, Striker GE. Glomerular lesions in mice transgenic for growth hormone and insulinlike growth factor-I. I. Relationship between increased glomerular size and mesangial sclerosis. Am J Pathol 137: 541–552, 1990. 18. Duchene J, Schanstra JP, Pecher C, Pizard A, Susini C, Esteve JP, Bascands JL, Girolami JP. A novel protein-protein interaction between a G-protein coupled receptor and the phosphatase SHP-2 is involved in bradykinin-induced inhibition of cell proliferation. J Biol Chem 277: 40375– 40383, 2002. 19. Emond C, Bascands JL, Cabos-Boutot G, Pecher C, Girolami JP. Effect of changes in sodium or water intake on glomerular B2-kinin binding sites. Am J Physiol Renal Fluid Electrolyte Physiol 257: F353– F358, 1989. 20. Flyvbjerg A. Putative pathophysiological role of growth factors and cytokines in experimental diabetic kidney disease. Diabetologia 43: 1205– 1223, 2000. 21. Forbes JM, Cooper ME, Oldfield MD, Thomas MC. Role of advanced glycation end products in diabetic nephropathy. J Am Soc Nephrol 8,Suppl3: S254 –S258, 2003. 22. Fraser D, Brunskill N, Ito T, Phillips A. Long-term exposure of proximal tubular epithelial cells to glucose induces transforming growth factor-beta 1 synthesis via an autocrine PDGF loop. Am J Pathol 163: 2565–2574, 2003. 23. Fukasawa H, Yamamoto T, Suzuki H, Togawa A, Ohashi N, Fujigaki Y, Uchida C, Aoki M, Hosono M, Kitagawa M, Hishida A. Treatment with anti-TGF-beta antibody ameliorates chronic progressive nephritis by inhibiting Smad/TGF-beta signaling. Kidney Int 65: 63–74, 2004. 24. Gohlke P, Linz W, Scholkens BA, Kuwer I, Bartenbach S, Schnell A, Unger T. Angiotensin-converting enzyme inhibition improves cardiac function. Role of bradykinin. Hypertension 23: 411– 418, 1994. 25. Gohlke P, Unger T. Chronic low-dose treatment with perindopril improves cardiac function in stroke-prone spontaneously hypertensive rats by potentiation of endogenous bradykinin. Am J Cardiol 76: 41E– 45E, 1995. 26. Gronbaek H, Nielsen B, Frystyk J, Orskov H, Flyvberg A. Effect of Octreotide on experimental diabetic renal and glomerular growth: importance of early intervention. J Endocrinol 147: 95–102, 1995. 27. Haylor J, Hickling H, El Eter E, Moir A, Oldroyd S, Hardisty C, El Nahas AM. JB3, an IGF-I receptor antagonist, inhibits early renal growth in diabetic and uninephrectomized rats. J Am Soc Nephrol 11: 2027–2035, 2000. 28. Hill C, Logan A, Smith C, Gronbaek H, Flyvbjerg A. Angiotensin converting enzyme inhibitor suppresses glomerular transforming growth factor beta receptor expression in experimental diabetes in rats. Diabetologia 44: 495–500, 2001. 293 • OCTOBER 2007 • www.ajprenal.org F1092 BRADYKININ AND GROWTH FACTOR IN DIABETIC GLOMERULI 29. Huang W, Gallois Y, Bouby N, Bruneval P, Heudes D, Belair MF, Krege JH, Meneton P, Marre M, Smithies O, Alhenc-Gelas F. Genetically increased angiotensin I-converting enzyme level and renal complications in the diabetic mouse. Proc Natl Acad Sci USA 98: 13330 –13334, 2001. 30. Ishigai Y, Mori T, Ikeda T, Fukuzawa A, Shibano T. Role of bradykinin-NO pathway in prevention of cardiac hypertrophy by ACE inhibitor in rat cardiomyocytes. Am J Physiol Heart Circ Physiol 273: H2659 – H2663, 1997. 31. Jaffa AA, Miller DH, Bailey GS, Chao J, Margolius HS, Mayfield RK. Abnormal regulation of renal kallikrein in experimental diabetes. Effects of insulin on prokallikrein synthesis and activation. J Clin Invest 80: 1651–1659, 1987. 32. Jaffa AA, Rust PF, Mayfield RK. Kinin, a mediator of diabetes-induced glomerular hyperfiltration. Diabetes 44: 156 –160, 1995. 33. Jaffa AA, Vio C, Velarde V, LeRoith D, Mayfield RK. Induction of renal kallikrein and renin gene expression by insulin and IGF-I in the diabetic rat. Diabetes 46: 2049 –2056, 1997. 34. Kakoki M, Takahashi N, Jennette JC, Smithies O. Diabetic nephropathy is markedly enhanced in mice lacking the bradykinin B2 receptor. Proc Natl Acad Sci USA 104: 13302–13305, 2004. 35. Langham RG, Kelly DJ, Maguire J, Dowling JP, Gilbert RE, Thomson NM. Overexpression of platelet-derived growth factor in human diabetic nephropathy. Nephrol Dial Transplant 18: 1392–1396, 2003. 36. Lee HB, Yu MR, Yang Y, Jiang Z, Ha H. Reactive oxygen speciesregulated signaling pathways in diabetic nephropathy. J Am Soc Nephrol 8, Suppl 3: S241–S245, 2003. 37. LeRoith D, Werner H, Phillip M, Roberts CT Jr. The role of insulinlike growth factors in diabetic kidney disease. Am J Kidney Dis 22: 722–726, 2000. 38. Lewis EJ, Hunsicker LG, Clarke WR, Berl T, Pohl MA, Lewis JB, Ritz E, Atkins RC, Rohde R, Raz I for the Collaborative Study Group. Collaborative Study Group. Renoprotective effect of the angiotensinreceptor antagonist irbesartan in patients with nephropathy due to type 2 diabetes. N Engl J Med 345: 851– 860, 2001. 39. Lindahl P, Hellstrom M, Kalen M, Karlsson L, Pekny M, Pekna M, Soriano P, Betsholtz C. Paracrine PDGF-B/PDGF-Rbeta signaling controls mesangial cell development in kidney glomeruli. Development 125: 3313–3322, 1998. 40. Linz W, Scholkens BA. A specific B2-bradykinin receptor antagonist HOE 140 abolishes the antihypertrophic effect of ramipril. Br J Pharmacol 105: 771–772, 1992. 41. Lupia E, Elliot SJ, Lenz O, Zheng F, Hattori M, Striker GE, Striker LJ. IGF-1 decreases collagen degradation in diabetic NOD mesangial cells: implications for diabetic nephropathy. Diabetes 48: 1638 –1644, 1999. 42. Marin-Castano ME, Schanstra JP, Neau E, Praddaude F, Pecher C, Ader JL, Girolami JP, Bascands JL. Induction of functional bradykinin b(1)-receptors in normotensive rats and mice under chronic Angiotensinconverting enzyme inhibitor treatment. Circulation 105: 627– 632, 2002. 43. Mayfield RK, Margolius HS, Levine JH, Wohltmann HJ, Loadholt CB, Colwell JA. Urinary kallikrein excretion in insulin-dependent diabetes mellitus and its relationship to glycemic control. J Clin Endocrinol Metab 59: 278 –286, 1984. 44. Mayfield RK, Margolius HS, Bailey GS, Miller DH, Sens DA, Squires J, Namm DH. Urinary and renal tissue kallikrein in the streptozocindiabetic rat. Diabetes 34: 22–28, 1985. 45. McAllister BS, Leeb-Lundberg F, Olson MS. Bradykinin inhibition of EGF- and PDGF-induced DNA synthesis in human fibroblasts. Am J Physiol Cell Physiol 265: C477–C484, 1993. 46. McFarlane SI, Kumar A, Sowers JR. Mechanisms by which angiotensin-converting enzyme inhibitors prevent diabetes and cardiovascular disease. Am J Cardiol 91: 30H–37H, 2003. 47. Mikrut K, Paluszak J, Kozlik J, Sosnowski P, Krauss H, Grzeskowiak E. The effect of bradykinin on the oxidative state of rats with acute hyperglycemia. Diabetes Res Clin Pract 51: 79 – 85, 2001. 48. Montanari D, Yin H, Dobrzynski E, Agata J, Yoshida H, Chao J, Chao L. Kallikrein gene delivery improves serum glucose and lipid profiles and cardiac function in streptozotocin-induced diabetic rats. Diabetes 54: 1573–1580, 2005. 49. Munzel T, Keaney JF Jr. Are ACE inhibitors a “magic bullet” against oxidative stress? Circulation 104: 1571–1574, 2001. 50. Patel KV, Schrey MP. Inhibition of DNA synthesis and growth in human breast stromal cells by bradykinin: evidence for independent roles of B1 and B2 receptors in the respective control of cell growth and phospholipid hydrolysis. Cancer Res 52: 334 –340, 1992. AJP-Renal Physiol • VOL 51. Reckelhoff JF, Romero JC. Role of oxidative stress in angiotensininduced hypertension. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 284: R893–R912, 2003. 52. Ritchie RH, Marsh JD, Lancaster WD, Diglio CA, Schiebinger RJ. Bradykinin blocks angiotensin II-induced hypertrophy in the presence of endothelial cells. Hypertension 31: 39 – 44, 1998. 53. Ritchie RH, Schiebinger RJ, LaPointe MC, Marsh JD. Angiotensin II-induced hypertrophy of adult rat cardiomyocytes is blocked by nitric oxide. Am J Physiol Heart Circ Physiol 275: H1370 –H1374, 1998. 54. Ritz E, Rychlik I, Locatelli F, Halimi S. End-stage renal failure in type 2 diabetes medical catastrophe of world wide dimensions. Am J Kidney Dis 34: 795– 805, 1999. 55. Rosenkranz AC, Hood SG, Woods RL, Dusting GJ, Ritchie RH. Acute antihypertrophic actions of bradykinin in the rat heart: importance of cyclic GMP. Hypertension 40: 498 –503, 2002. 56. Rosenkranz AC, Hood SG, Woods RL, Dusting GJ, Ritchie RH. B-type natriuretic peptide prevents acute hypertrophic responses in the diabetic rat heart: importance of cyclic GMP. Diabetes 52: 2389 –2395, 2003. 57. Schanstra JP, Duchene J, Praddaude F, Bruneval P, Tack I, Chevalier J, Girolami JP, Bascands JL. Decreased renal NO excretion and reduced glomerular tuft area in mice lacking the bradykinin B2 receptor. Am J Physiol Heart Circ Physiol 284: H1904 –H1908, 2003. 58. Schanstra JP, Neau E, Drogoz P, Arevalo Gomez MA, Lopez Novoa JM, Calise D, Pecher C, Bader M, Girolami JP, Bascands JL. In vivo bradykinin B2 receptor activation reduces renal fibrosis. J Clin Invest 110: 371–379, 2002. 59. Schapper HW, Hayashida T, Huchak SC, Poncelet AC. TGF- signal transduction and mesangial cell fibrogenesis. Am J Physiol Renal Physiol 284: F243–F252, 2003. 60. Sharma K, Ziyadeh FN. Hyperglycemia and diabetic kidney disease. The case for transforming growth factor-beta as a key mediator. Diabetes 44: 1139 –1146, 1995. 61. Sharma K, Eltayeb BO, McGowan TA, Dunn SR, Alzahabi B, Rohde R, Ziyadeh FN, Lewis EJ. Captopril-induced reduction of serum levels of transforming growth factor-beta1 correlates with long-term renoprotection in insulin-dependent diabetic patients. Am J Kidney Dis 34: 818 – 823, 1999. 62. Tack I, Elliot SJ, Potier M, Rivera A, Striker GE, Striker LJ. Autocrine activation of the IGF-I signaling pathway in mesangial cells isolated from diabetic NOD mice. Diabetes 51: 182–188, 2002. 63. Tan Y, Wang B, Keum JS, Jaffa AA. Mechanism through which bradykinin promotes glomerular injury in diabetes. Am J Physiol Renal Physiol 288: F483–F492, 2005. 64. Taraseviciene-Stewart L, Scerbavicius R, Stewart JM, Gera L, Demura Y, Cool C, Kasper M, Voelkel NF. Treatment of severe pulmonary hypertension: a bradykinin receptor 2 agonist B9972 causes reduction of pulmonary artery pressure and right ventricular hypertrophy. Peptides 26: 1292–1300, 2005. 65. Tschope C, Seidl U, Reinecke A, Riester U, Graf K, Schultheiss HP, Hilgenfeldt U, Unger T. Kinins are involved in the antiproteinuric effect of angiotensin-converting enzyme inhibition in experimental diabetic nephropathy. Int Immunopharmacol 3: 335–344, 2003. 66. Tschope C, Walther T, Escher F, Spillmann F, Du J, Altmann C, Schimke I, Bader M, Sanchez-Ferrer CF, Schultheiss HP, Noutsias M. Transgenic activation of the kallikrein-kinin system inhibits intramyocardial inflammation, endothelial dysfunction and oxidative stress in experimental diabetic cardiomyopathy. FASEB J 19: 2057–2059, 2005. 67. Tschope C, Reinecke A, Seidl U, Yu M, Gavriluk V, Riester U, Golke P, Graf K, Bader M, Hilgenfeldt U, Pesquero JB, Ritz E, Unger T. Functional, biochemical, and molecular investigations of renal kallikreinkinin system in diabetric rats. Am J Physiol 27: H2333–H2340, 1999. 68. Tsuchida S, Miyazaki Y, Matsusaka T, Hunley TE, Inagami T, Fogo A, Ichikawa I. Potent antihypertrophic effect of the bradykinin B2 receptor system on the renal vasculature. Kidney Int 56: 509 –516, 1999. 69. Wang X, Shaw S, Amiri F, Eaton DC, Marrero MB. Inhibition of the Jak/STAT signaling pathway prevents the high glucose-induced increase in TGF-beta and fibronectin synthesis in mesangial cells. Diabetes 51: 3505–3509, 2002. 70. Ziyadeh FN, Hoffman BB, Han DC, Iglesias-De La Cruz MC, Hong SW, Isono M, Chen S, McGowan TA, Sharma K. Long-term prevention of renal insufficiency, excess matrix gene expression, and glomerular mesangial matrix expansion by treatment with monoclonal anti-transforming growth factor-beta antibody in db/db diabetic mice. Proc Natl Acad Sci USA 97: 8015– 8020, 2000. 293 • OCTOBER 2007 • www.ajprenal.org Partie II : néphropathie diabétique et système kallicréine-kinine Manuscrit n°2 (en cours de rédaction) Rapid large scale isolation of glomeruli in mice applied to the study of IGF1 system in three experimental models of diabetes. Marie Buléon, Julien Allard, Françoise Praddaude, Marie-Thérèse Ranera, JeanPierre Girolami, and Ivan Tack 76 1 Glomerular IGF1 and diabetic nephropathy Rapid large scale isolation of glomeruli in mice applied to the study of IGF1 system in three experimental models of diabetes Marie Buléon, 1,2,3 Julien Allard, 1,2,3 Françoise Praddaude, 1,2,3 Marie-Thérèse Ranera, 1,2,3 Jean-Pierre Girolami,2,3 and Ivan Tack1,2,3 From the 1 Laboratoire de Physiologie, Faculté de Médecine Rangueil, Toulouse, France; 2 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM), U858, Toulouse, France 3 Université Toulouse III Paul-Sabatier, Institut de Médecine Moléculaire de Rangueil, Equipe n°5, IFR31, Toulouse, France Address for correspondence: Ivan Tack, INSERM U 858 Equipe 5 BP 84, Institut Louis Bugnard, BP 84225, 31432 Toulouse Cedex 4 e-mail: [email protected] Glomerular IGF1 and diabetic nephropathy 2 Summary To investigate the signalling pathways at the glomerular protein level, we developed a rapid, simple and costless method of large scale glomeruli isolation in mice. Mice kidneys perfused with an iron oxide solution and after graded sieving, glomeruli were separated by magnetization. This provided a pure suspension of 7200 ±1600 glomeruli from the 2 kidneys, allowing protein extraction of 302 ± 12 µg. Isolated glomeruli showed intact structure and ultrastructure and were able to produce NO-dependant cGMP. Combining such methodology to western blot analysis allowed us to compare the glomerular expression of insulin like receptor (IGF-1R), insulin receptor substrate (IRS1) and their phosphorylated forms. In preparations obtained from 3 different models of diabetic mice: streptozotocine-induced diabetes, NOD mice and db/db mice. The expression of IGF1-1R and IRS1 was significantly increased in all diabetic models. However, using the NOD mice model, activation of IGF-1R was only detected during the onset of diabetes whereas expression of the total form remains steadily increased. Interestingly, IGF-1R could still be stimulated by exogenously given IGF1. In this model, data sustain the hypothesis of an early but transient role of IGF-1 in the onset of DN, but does not rule out its later re-activation. Interestingly, such new information could only be obtained by investigating activation of this system at the glomerular protein level emphasizing the benefit of the methodology developed here. Glomerular IGF1 and diabetic nephropathy 3 Diabetic nephropathy (DN) is a major complication of diabetes characterized by the development of glomerulosclerosis (GS) associated with progression of both type 1 and type 2 diabetes. The major features of DN include an initial transient phase of hyperfiltration followed by a progressive reduction of glomerular filtration, onset of albuminuria, and development of renal injuries leading to an irreversible pathological state defined as GS. However before reaching the irreversible state of GS, glomerular changes are associated with the up-regulation of several vasoactive, cytokine and growth factor systems that are believed to be responsible for the pathogenesis of DN. Because a strict glycemic control is not always reachable, and despite the powerful renal protective effect of renin angiotensin system blockade, at least 20% of diabetic patient will develop a DN. This provides the rational to go into the pathophysiological mechanisms of DN. Among the possible early mechanisms, activation of the glomerular Insulin-like Growth Factor-1 (IGF-1) pathway has been involved in renal hypertrophy and glomerular hyperfiltration and thereby could participate in the onset of diabetic nephropathy [1]. The mains arguments for such an hypothesis are: 1) In the kidney, its receptor is expressed in the glomerulus, mainly in the mesangial cells [2]; 2) in vitro it stimulates the synthesis of extra-cellular matrix by the mesangial cells and, in parallel, reduces their proteolytic activity [3]; 3) transgenic mice that over-express the growth hormone and have a high plasmatic concentration of IGF-1 develop, in the absence of any hyperglycemia, a glomerulosclerosis similar to that of the diabetic nephropathy [4]. Diabetes is accompanied by an initial, but temporary, activation of the somatotropic axis whereas the renal bioavailability of IGF-1 and of mRNA encoding for its receptor (IGF-1 R) are durably increased. These abnormalities play an important role in the renal hypertrophy and glomerular hyperfiltration observed at the beginning of the disease [5]. Later, the persistence of an in vivo activation of the glomerular pathway of IGF-1 and its harmful role remains to be demonstrated. However, Insulin-like Growth Factor-1 (IGF-1) is above all the main peripheral mediator of the somatotropic axis. Thus studying its local growth factor involvement during DN requires to specifically focus on the glomerular components of this growth factor. In most of the previous studies, glomerular IGF-1 pathway has been investigated either at the mRNA level or, in vivo, by blocking the somatotropic axis or by directly blocking IGF1 receptor using the pharmacological antagonist JB3 [1]. For these reasons, only few data are available regarding glomerular expression and activation of the IGF-1 pathway in vivo, at the protein level [6]. Because overall glomerular volume is less than 5 % of cortical volume, a major challenge for studying glomerular signaling pathways at the protein level is the availability of 4 Glomerular IGF1 and diabetic nephropathy a large number of pure isolated glomeruli, especially when small animal models, such as mice, are used. We have modified and optimized a method previously described for glomerular extraction in rabbit (ref) in order to make it usable for mice. This simple method of glomerular isolation is based on selective magnetic sorting of ferrous oxide loaded glomeruli. After validation of the isolation protocol, it was applied to compare the expression and activation state of the IGF-1 glomerular signaling pathway at the protein level, in 3 different experimental models of diabetes in mice. Research Design and Methods Experimental animals All procedures involving experimental animals were performed in accordance with the recommendations of the French Accreditation of Laboratory Animal Care. Three different models of diabetes in mice have been used: NOD/LTJ and C57/BLKs-db/db mice were purchased from Jackson Laboratories and C57 BL/6 from Charles River Laboratories. All mice were kept in a temperature-controlled room on a 12 hours light-dark cycle. Animals were allowed free access to standard laboratory mouse diet (Global Rodent Breeding, Harlan, United Kingdom) and tap water. Insulin-dependent models of diabetes: 1) NOD/Ltj (Non-Obese Diabetic) develop spontaneously an insulin-dependent diabetes. The incidence of diabetes is over 80 % in female mice between 12 and 20 weeks of life. Six weeks only after the onset of diabetes, NOD mice exhibit typical lesions of diabetic nephropathy with progressive glomerulosclerosis very similar to that found in humans. Normoglycemic age-matched female NOD mice were used as controls (diabetic, n=11; controls, n=12); 2) Pharmacological insulindependent diabetes was induced in C57BL/6 female mice (n=10), at the age of 8 weeks, by intraperitoneal injection of 80 mg/kg/day streptozotocine, diluted in citrate buffer (0.05 M, pH 4.5), during 3 days. Age-matched non-diabetic control mice (n=13) were injected with an equal volume of vehicle. Conversely to the previous model, these mice only develop light to mild lesions of diabetic nephropathy. Non-Insulin-dependent model of diabetes: C57/BLKs-db mice spontaneously lack type B leptin receptor. At 6 weeks of life, homozygotes db/db mice develop obesity and severe type 2 diabetes (glycemia: 0.6-0.9 g/dL). After 3 months of hyperglycemia, they exhibit mild to severe glomerular lesions. Heterozygote db/m mice are asymptomatic and provided the control. Glomerular IGF1 and diabetic nephropathy 5 Isolation of glomeruli Isolation of glomeruli was based on the selective magnetic sorting method described in rabbit by Cook and Pickering [4]. Due to structural characteristics of glomeruli, perfusion of colloidal iron oxide (FeOx) allows saturation of capillaries with magnetic particles. After this, the renal cortex was dissected and mechanically broken up. Then, the glomeruli were isolated from other renal structures (mainly renal tubules) by magnetic isolation. Colloidal iron oxide mixture: solution A (2.6 g NaOH, 20 g KNO3, made up to 100 mL with water) was mixed with solution B (9 g FeSO4 made up to 100 mL with water) to form a black iron oxide precipitate. This precipitate was boiled, decanted, washed and dried to obtain a thick paste. Before injection, this FeOx paste was diluted in PBS with 3% of Gum Arabic in order to obtain a stable colloidal suspension. Operative procedure for FeOx injection and glomerular isolation. Mice were anaesthetized with thiobutabarbital (150 mg/kg). After laparotomy, aorta and vena cava were ligated above the iliac artery with nylon tread (Ethilon 5-0); a catheter (22G) was introduced into the aorta below the renal arteries. Abdominal aorta was ligated above the renal artery. The vena cava was partly sectioned under the renal artery to allow exit for perfusion fluid. Infusion of 10 mL PBS was performed at a flow rate of 5 mM/min immediately followed by the perfusion of colloidal FeOx. Both kidneys were excised after the perfusion period and quickly decapsulated, then the cortex was manually dissected and sliced into 4 to 5 mm3 fragments. 2 Cortical tissue was mechanically disrupted by passing through a metal sieve (125 µm mesh) and washed with cold PBS. Glomerular capsule was removed by passing the suspension through a 27-gauges needle. After 45 min of decantation, the supernatant was removed and pelleted glomeruli were resuspended in PBS. The suspension was magnetized with a neodym magnetic ring (Magnet, France) to separate structures containing iron oxide (glomeruli) from other (non-magnetic) structures (mainly renal tubules). Glomeruli fraction was washed with PBS and again magnetized three additional times to obtain an almost pure population of glomeruli. The remaining sediment was resuspended in 60 to 120 µL of lysis buffer (10% glycerol, 20 mM Tris, 140 mM NaCl, 10 mM Sodium Pyrophosphate, 10 mM Sodium Fluoride, 2 mM Sodium Orthovanadate, 3 mM EDTA, 10 µg/mL Aprotinin, 1.5 µM Benzamidine, 50 µM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF), 10 µg/mL Leupeptin, 1 % Phosphatase Inhibitor Cocktail 2® (Sigma, Missouri, USA) and 1% Triton X-100). All procedures were performed at 4°C. Glomerular IGF1 and diabetic nephropathy 6 Intra-aortic perfusion pressure control. Because a high perfusion pressure, above the autoregulation range, could induce severe structural damages, intra aortic pressure was continuously measured during the infusion (flow rate: 5 ml/min) of both the PBS and the colloidal iron oxide. A catheter was introduced in the thoracic aorta and connected to a pressure sensor (Statham, P10 EZ, USA) and a recorder (TA 4000 Gould, Gould Electronics, Arizona, USA). Perfusion pressure was recorded during five independent experiments using 8 weeks old C57BL/6 mice. Light Microscopy. Three independent assays were performed. 1) Sagittal sections of iron oxide infused kidneys were studied by trans-illumination. 2) Suspensions of isolated glomeruli were examined by light microscopy with and without methylene blue (0.01%) to check the disruption of glomeruli capsule. 3) a histological study was performed. Kidneys were successively perfused with 10 mL of PBS and 10 mL of paraformaldehyde (at 10%). Sagittal kidney sections were embedded in methyl-methacrylate. Sections of 3 µm were stained with periodic acid Schiff (PAS) for histological analyze. Electron Microscopy. For scanning electron microscopy (SEM), isolated glomeruli were fixed in 2% glutaraldehyde in Sorensen buffer (0.1 M, pH 7.4) for 4 hours. After 2 washes in the same buffer, the glomeruli were removed, dehydrated in a graded ethanol series, dried by critical point drying with Emscope CPD 750 and coated with gold-palladium for 3 min at 100 Å.min-1, and observed with a S450 scanning electron microscope (Hitachi, Japan) at an accelerating voltage of 15 kV. For transmission electron microscopy (TEM), glomeruli were fixed in 2 % glutaraldehyde in Sorensen buffer (0.1 M, pH 7.4) for 1 hour, and washed with the same buffer for 12 hours. Then, they were postfixed in 1% of OsO4 in Sorensen buffer 0.05 M and saccharose 0.25 M for 1 hour. The samples were dehydrated and embedded in an Epon-araldite resin (Epon 812, Electron Microscopy Sciences, USA). Thin sections of 0.5 µm (Ultracut Reichert Jung) of the resin-embedded glomeruli were stained with 3% uranyl acetate and with 8.5% lead citrate and observed under a HU12A transmission electron microscope (Hitachi, Japan) at an accelerating voltage 75 kV. Protein extraction The suspension of glomeruli (in lysis buffer) was sonicated for 1 min and centrifuged (15 000 rpm for 45 min, 4°C). The supernatant was completed at 20 % with Laemmli Blue solution (0.16 M Tris-HCl, 5% Lauryl Sulfate (SDS), 25% Glycerol, 0.025% Bromophenol Blue) with 13% of β-mercapto-ethanol. This solution of proteins was heated at 100°C for 5 min, and stored at -80°C until western blot analysis. Protein concentration was determined by a Glomerular IGF1 and diabetic nephropathy 7 colorimetric method on microplates (Bio-rad DC Protein Assay®, Richmond, USA). Optic density was measured by a microplates reader (Multiskan EX, Thermo Labsystem, Finland). Bovine albumin was used for standard. Stimulation of mouse isolated glomeruli by IGF-1 and immunoprecipitation For each experimental condition, glomeruli from pooled kidneys of 4 mice were isolated, collected in PBS, and incubated at 37°C for 10 min. IGF-1 (100 nM) was added in the tubes and incubated for 2 minutes. Then glomeruli were quickly magnetized and the supernatant was removed. Glomeruli were resuspended in 200 µL of lysis buffer and proteins were extracted as described above. Protein samples were incubated with anti-IGF-1 antibody (10 µL/mL) diluted in an immunoprecipitation (IP) buffer (Tris 10 mM, 150 mM NaCl, 0.2 mM Na Orthovanadate, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 0.5 mM PMSF, 0.2% Phosphatase Inhibitor Cocktail 2® (Sigma), 1% Triton X100, 0.5% Nonidet P-40, pH=7.4) for twelve hours at 4°C. Then, 20 µL of a sepharose-protein-A suspension were added to each sample and they were incubated for 5 hours at 4°C. After centrifugation (1000 g, 5 min), the pellet was successively washed with IP buffer and centrifuged 3 times. Supernatant was removed and 50 µL of Tris buffer (50 mM Tris, pH 6.7) and 12.5 µL of Laemmli Blue with 13% of β-mercapto-ethanol were added to the pellet. The samples were boiled for 5 minutes and stored at –80°C. Western blot analysis Proteins (20 to 25 µg) were separated by electrophoresis in polyacrylamid gels (6% or 10%) and electro-transferred on nitrocellulose membranes (Hybond-ECL®, Amersham, USA). After 1h incubation at room temperature in Tris-buffered saline, 5% milk, or 1% milk plus 1% BSA, and 0.05% Tween-20, the blots were exposed to antibodies recognizing either IGF-IRβ, IRS-1, ERK-1/2, phospho-ERK-1/2, and β-actin. The primary antibodies were revealed using the corresponding rabbit or donkey peroxidase–conjugated secondary antibodies for 1 h at room temperature. Peroxidase activity was detected using a Pierce chemiluminescence substrate (Super Signal® West Pico Chemiluminescence Substrate, Pierce, USA) and Kodak Biomax Light Film. Primary and secondary antibodies were purchased from Santa Cruz Laboratories (Santa Cruz Biotechnology, USA), except anti-β-Actin (Sigma, USA). Glomerular IGF1 and diabetic nephropathy 8 Results Perfusion pressure recording To ensure that the kidney was kept in perfusion pressure (pp)in the autoregulation range, the intra-aortic pressure was monitored through out the whole period of perfusion and reached 92.6 ± 19.5 mmHg during PBS administration and 197 ± 27 mmHg at the end of FeOx injection. Injection of FeOx diluted in PBS alone, without Arabic Gum, leads to pp > 300 mmHg which damages the glomerular tuft (data not shown). Characteristics of the isolated glomeruli The observation of a trans-illuminated sagittal section of kidney after FeOx perfusion showed that FeOx accumulate electively in glomeruli that appear as dark gray dots in renal cortex. In optic microscopy, FeOx was principally deposited in capillary loops and was present neither in tubular lumen nor in the Bowman space. (Fig 1A&B). After magnetic sorting, a suspension containing 93.0 ± 1.3 % of glomeruli, 5.3 ± 1.4 % of tubular fragments, and 1.7 ± 0.4 % of arterioles was obtained (mean ± SEM of 6 independent experiments). More than 95 % of the glomeruli were completely decapsulated (Fig 1C&D). When glomerular suspension was not passed through a 27-gauges needle, more than 40 % of glomeruli were not decapsulated. Observation of glomeruli at higher magnification (x 400, Fig 1D) showed that glomerular structure remained intact after FeOx perfusion. Ultra structure of glomerular filtration membrane The integrity of glomerular ultrastructure after perfusion has been also studied using electronic microscopy (Fig 2). As observed in transmission electronic microscopy, the components of glomerular filtration membrane (fenestrated endothelial lining of the capillary loop, basement membrane and pedicels) remained intact after FeOx injection (Fig 3). FeOx perfusion did not induce any lesion or desquamation of the endothelium and there was no leak of FeOx outside of the capillary. FeOx particles size ranged between 25 and 100 Å (Fig 3D). Functional integrity of glomeruli In order to determine if the process of magnetic sorting isolation of glomeruli was detrimental for endothelial cells functional integrity, we studied glomerular production of cyclic-GMP following stimulation of the endothelial nitric oxide-synthase. As shown in Fig 4, in isolated glomeruli from control mice, calcium ionophore A23187 was able to stimulate cGMP accumulation in a NO-dependant way (as inhibited by L-NAME), from 6.0 ± 0.5 fmol/μg of proteins to 16.5 ± 2.6 fmol/μg of proteins (P< 0.01). Glomerular IGF1 and diabetic nephropathy 9 Glomerular and proteic yield In our experimental conditions, we were able to collect 7200 ± 1600 glomeruli (n= 6) using the 2 kidneys from the same mice, as estimated using a Nageotte cell. The average protein content after extraction by a Tris-glycine buffer reached 301 ± 12 µg, giving an average ratio of 1 µg / 24 glomeruli. No difference was found between glomeruli from diabetic and non diabetic mice regarding the quality and the rendition of isolation. Effect of Diabetes on glomerular IFG-1 signaling pathway In the 3 experimental models of diabetes, expression of IGF-1 Rβ and IRS-1 was strongly increased when compared to the corresponding non diabetic control mice. Expression of MAP-kinases ERK1/2 was not changed in diabetic animals, however, their tyrosinephosphorylated forms were increased (Fig 5). For practical reason, further experiments regarding activation of the IGF-1 pathway was focused in the NOD/Ltj mice. In this model, over-expression of IGF1-Rβ was already observed since the 3rd day of diabetes and remained increased until the end of the study. Phosphorylated IGF1-Rβ was not detected in non diabetic mice whereas it was present 3 days after the onset of diabetes, and remained detectable for 2 weeks progressively decreasing thereafter (Fig 6a). Phosphorylated form of IGF1-R was not detectable anymore after 3 and 6 weeks of diabetes whereas expression of the total protein remains steadily increased. Nevertheless, stimulation by exogenous IGF-1 at 3 days, but also at 14 days, led to an increased in IGF-1 Rβ and IRS-1 phosphorylation in glomeruli from diabetic mice (Fig 6b), suggesting that IGF-1 pathway could be re-activated after the first 2 weeks of diabetes. Discussion The onset of diabetic nephropathy is mainly a glomerular disease. Because of the large availability of genetic modified strains, the mice models start being widely used to investigate the potential physiological role of various systems in the onset and progression of diabetic nephropathy. Therefore, studying pathophysiological events at the glomerular protein level in mouse models requires the availability of large preparations of intact and functional glomeruli. Several methods have been previously reported. Microscopic dissection of the renal cortex allows a few dozen glomeruli to be isolated within a few hours [5], a yield that does not provide enough tissue for protein extraction and subsequent investigations. Another method, based on graded sieving [7], has been successfully used in rat but is disappointing when applied to mice because the purity of the tissue extract is too low (≈ 50%). Indeed glomeruli and tubules exhibit very close sizes which does not allow separation by a graded Glomerular IGF1 and diabetic nephropathy 10 sieving method only. Although, the method of magnetic sorting described by Cook and Pickering had already been applied to mice [8, 9], it has only been used to isolate and characterize glomerular basement membrane, and to screen mRNA expression [10]. Furthermore, whereas the functional integrity of glomeruli was investigates in the work of Cook and Pickering, later papers only focused on purification yield and did not used their preparation for further purpose. To our knowledge, the functional characteristics of isolated mice glomeruli have never been reported until now. In the present work, we characterized our preparation both at the structural and functional level by using electronic microscopy and by measuring NO-dependant cGMP production in isolated glomeruli. Moreover, we were able to use these preparations to study the activation of IGF1 pathway at the glomerular level during experimental diabetes. All these experiments provide convergent data indicating that isolated glomeruli are similar to their native structure with intact functional properties. In fact, the efficiency and yield of glomerular isolation largely depends on small but critical technical details: 1- The use of Arabic Gum in the FeOx suspension (to obtain a colloidal rather than a crystalloid suspension) avoids reaching high perfusion pressures which would cause structural damages. 2- Passing the glomerular suspension through a 22G needle to remove glomerular capsule is critical for the purity of the preparation (particularly since epithelial cells of mouse Bowman’s capsule are cuboidal and can represent up to 40% of the cell volume of a nondecapsulated glomerulus). When rigorously applied, the present method gives an almost pure suspension of decapsulated and structurally intact glomeruli with a reproducible yield of 25 to 30 %. This corresponds, after extraction, to a protein yield of approximately 300 µg per mouse. This allows to perform 5 to 10 Western-Blots or one immunoprecipitation. Therefore, this method can be used to study glomerular signaling pathways at the protein level. Diabetes and glomerular IFG-1 signaling pathway: The role of IGF-1 in the development of diabetic nephropathy has long been suspected since it has been shown that disruption of the GH-IGF-1 pathway can delay the progression of diabetic nephropathy (ref). Based on in vivo studies, very early activation of renal IGF-1 pathway during diabetes is now emerging as an evidence [1]. Several initial works from Stricker’s group (16, 17, 41, 62) indicate that, during diabetes, activation of IGF-1 pathways could be responsible for the accumulation of extracellular matrix resulting from both increased synthesis and blunted degradation. Glomerular IGF1 and diabetic nephropathy 11 Consistently, blockade of IGF-1 pathway either with a receptor antagonist [1] or with inhibitor such as somatostatin analog [11] is able to attenuate nephropathy in various models of diabetes. Although there is some evidence for the involvement of IGF-1 in the development of DN, its detrimental impact remains under controversy. Indeed, as some changes the status of IGF-1 pathway status change may occur during the progression of diabetes and may vary depending on the model of diabetes. These remarks provide the rationale of our study to document i) the status of the glomerular IGF-1 in 3 different models of diabetes ii) the time course status of the system in the NOD model mice. Several previous works tend to indicate that inhibition of IGF-1 pathway result in salutary effects on DN markers. However, some recent works raised a query about this hypothesis. It has been recently reported in obese db/db mice that circulating IGF-1 is decreased whereas renal immunostainable IGF-1 did not significantly vary. This decrease in circulating IGF-1 is associated with an increased expression of IGF-1 binding proteins. Finally these changes mostly suggest that it could result in a decreased activation of IGF-1R [12]. These last data finally suggest that inhibition of IGF-1R would not be contributive to prevent or care DN. However, a more direct demonstration at the receptor level is still lacking. In the three models of diabetes that we have studied, the expressions of the main components of the IGF-1 signaling pathway (IGF1-R and its substrate, IRS-1) are precociously and strongly increased from the 3rd day of diabetes and until at least 10 weeks. Furthermore, the phosphorylated forms of ERK1/2 MAP-kinases were also increased at the same time. In order to determine whether IGF-1R over-expression was associated with its activation, we secondary focused on the type 1 diabetes in NOD mice only since it provided a model of rapidly progressive nephropathy (ref). In this strain of mice, we were able to demonstrate that IGF-1R was activated very early but transiently (between the 3rd and the14th day) after the onset of diabetes. Later on, whereas over-expression of glomerular IGF1 pathway components was persisting, their activation, assessed by protein phosphorylation was not anymore detectable, even is still stimulable. Interestingly, even when the upstream events of IGF-1R pathway activation were not anymore detectable in glomeruli, MAP-kinases remained activated at 21 days (Fig 5) and up to at least 42 days (not shown). It is likely that at that time, MAP-kinases activation resulted from other mechanisms that could involve polyols, PKC and TGFβ pathways. Experimental diabetes of type 1 or type 2 results in an early and prolonged overexpression of the glomerular IGF-1 pathway. Nevertheless, the activation of this pathway, if early, is just transient. Our results sustain the involvement of glomerular IGF-1 pathway in the early renal Glomerular IGF1 and diabetic nephropathy 12 events during diabetes but the present work does not sustain the hypothesis of a permanent and prolonged activation in the late progression of diabetic nephropathy, i.e. in the development of glomerulosclerosis. However, exogenous administration of IGF-1 or any circumstance that will increases its renal availability can re-activate the still over-expressed glomerular IGF-1 pathway and potentially aggravate the glomerular disease. Acknowledgments Marie Buleon was supported by a MRT grant. This work was also supported by funds from Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale, and from Toulouse Paul Sabatier University. References 1. Haylor, J., et al., JB3, an IGF-I receptor antagonist, inhibits early renal growth in diabetic and uninephrectomized rats. J Am Soc Nephrol, 2000. 11(11): p. 2027-35. 2. Tack, I., et al., Autocrine activation of the IGF-I signaling pathway in mesangial cells isolated from diabetic NOD mice. Diabetes, 2002. 51(1): p. 182-8. 3. Flyvbjerg, A., Role of growth hormone, insulin-like growth factors (IGFs) and IGFbinding proteins in the renal complications of diabetes. Kidney Int Suppl, 1997. 60: p. S12-9. 4. Cook, W.F. and G.W. Pickering, A rapid method for separating glomeruli from rabbit kidney. Nature, 1958. 182: p. 1103-4. 5. Lebrun, F., et al., Cholinergic effects on intracellular free calcium concentration in renal corpuscle: role of parietal sheet. Am J Physiol, 1992. 262(2 Pt 2): p. F248-55. 6. Segev, Y., et al., Growth hormone receptor antagonism prevents early renal changes in nonobese diabetic mice. J Am Soc Nephrol, 1999. 10(11): p. 2374-81. 7. Boswell, J.M., et al., Novel and enhanced IL-1 gene expression in autoimmune mice with lupus. J Immunol, 1988. 141(1): p. 118-24. 8. Baelde, H.J., E.C. Bergijk, and J.A. Bruijn, Isolation and characterization of mouse glomerular basement membrane. J Clin Lab Immunol, 1990. 33(1): p. 17-20. 9. Schrijver, G., et al., Anti-GBM nephritis in the mouse : role of granulocytes in the heterologous phase. Kidney Int, 1990. 38(1): p. 86-95. 10. Takemoto, M., et al., A new method for large scale isolation of kidney glomeruli from mice. Am J Pathol, 2002. 161(3): p. 799-805. 11. Gronbaek, H., et al., Effect of octreotide on experimental diabetic renal and glomerular growth: importance of early intervention. J Endocrinol, 1995. 147(1): p. 95-102. 12. Segev, Y., et al., Systemic and renal growth hormone-IGF1 axis involvement in a mouse model of type 2 diabetes. Diabetologia, 2007. 50(6): p. 1327-34. 13 Glomerular IGF1 and diabetic nephropathy a b C M c d Gid A Figure 1. a) Sagittal section of a kidney after injection of FeOx in vivo; Glomeruli saturated with FeOx (G), appear like dark gray dots in renal cortex (C). Renal medulla (M) does not contain FeOx. (Trans-illumination, x1). b) Renal cortex after injection of FeOx; (G) Glomerulus; FeOx deposits (arrows) in glomerular capillary loops and in an arteriole (A). FeOx was present neither in tubular lumen (T) nor in the Bowman space. (O.M. PAS staining, x 250). c) Isolated and decapsulated glomeruli suspension. Purity of glomerular suspension is 93 % (there is no tubular fragments on the picture). Less than 5 % of the glomeruli are not completely decapsulated (Gid). (O.M. x 100). d) Isolated glomerulus. The Bowman capsule is removed and glomerular structure is intact. Half of impurities of preparation are fragments of peri-glomerular arterioles (A) connected to the glomerular basis. (O.M, methylene blue, x 400). 14 Glomerular IGF1 and diabetic nephropathy Figure 2. Isolated glomerulus. The capillar network of a mouse glomerulus isolated by magnetic sorting is intact after injection of iron oxide and decapsulation. B.E.M., x 1100. a c Fe Ox Ca b d P BM E Figure 3. Ultra structure of glomerular filtration membrane. a) Normal appearance of capillaries (Ca) after perfusion of PBS; b) Distinct and intact components of the glomerular filtration membrane: fenestrated endothelial lining of the capillary loop (E), basement membrane (BM) and pedicels (P); c and d) FeOx perfusion did not induce any lesion or desquamation of the endothelium. The other components of the glomerular filter were intact. There was no leak of FeOx outside of the capillary. Particle size was 25-100 Å. T.E.M., x 6000 (A, B) x 80 000 (C, D)). 15 Glomerular IGF1 and diabetic nephropathy ** * 2000 cGMP release 1500 1000 500 M E C +A 23 18 +L -N A C +A 23 18 C 0 Figure 4. cyclic-GMP production by isolated glomeruli following stimulation of the endothelial nitric oxide-synthase. A23187 : calcium ionophore ; L-NAME : endothelial nitric oxide-synthase inhibitor. IGF-1 Rβ Standard C 0.5 1 1.5 2 IRS-1 C D kDa ERK 1/2 D C kDa D pERK 1/2 C kDa D kDa 100 150 44 42 44 42 NOD/Ltj 100 150 44 42 44 42 C57BL/Ks db 100 150 44 42 44 42 1 0 ** * 1 0 db /m db /d b 0 Densitometric analysis 1 2 2 C 57 C C 57 D N O D N C O D D * db /m db /d b 2 3 C C 57 D N O D N C O D D db /m db /d b 0 * Densitometric analysis * ** C 57 * 1 3 db /m db /d b 2 Densitometric analysis ** C 57 C C 57 D N O D N C O D D 3 C 57 C C 57 D N O D N C O D D Densitometric analysis C57 Figure 5. Western blot analysis of different proteins of IGF1 glomerular signaling pathway at 3 weeks of diabetes. Glomerular extracts from NOD/Ltj; C57 BL/6 and C57 BL/Ks db mice. β subunit of IGF1 receptor (IGF1-R β), Insulin Receptor Substrate-1 (IRS-1), MAP-Kinases ERK1, ERK2 and their tyrosine phosphorylated forms pERK1 and pERK2. C: non-diabetic control mice; D: diabetic mice. Representative Western-Blot and densitometric analysis. The ratio of standard 1µg was used as 100% value. Results represent mean ± SEM of at least five separate experiments. * P<0.05; ** P<0.01 for the indicated comparison. 16 Glomerular IGF1 and diabetic nephropathy b. IGF-1Rβ a. C D IGF-1 - + pIGF-1Rβ C pIGF-1Rβ D D3 D3 100 kDa pIRS1 D7 IGF-1 D14 + pIGF-1Rβ D14 D21 pIRS1 D42 Figure 6. IGF1 receptor phosphorylation. a) Time-course from day 3 to day 42. b) After stimulation of isolated glomeruli with exogenous IGF1. Glomerular extracts from NOD/Ltj mice were incubated with an anti-IGF1-Rβ or anti-IRS1 antibodies. Precipitation products were separated by Western Blot, and exposed to an antibody against phosphotyrosine residue (PY20). C: control mice; D: diabetic mice. Partie II : néphropathie diabétique et système kallicréine-kinine Manuscrit n° 3 Pharmacological blockade of B2-kinin receptor reduces renal protective effect of Angiotensin-Converting Enzyme Inhibition in db/db mice model. Marie Buléon, Julien Allard, Acil Jaafar, Françoise Praddaude, Marie-Thérèse Ranera, Christiane Pecher, Jean-Pierre Girolami and Ivan Tack. Am J Physiol Renal Physiol. 2008 Mar 26 77 Am J Physiol Renal Physiol 294: F1249–F1256, 2008. First published March 26, 2008; doi:10.1152/ajprenal.00501.2007. Pharmacological blockade of B2-kinin receptor reduces renal protective effect of angiotensin-converting enzyme inhibition in db/db mice model Marie Buléon,1,2,3 Julien Allard,1,2,3 Acil Jaafar,1,2,3 Françoise Praddaude,1,2,3 Zara Dickson,1,3 Marie-Thérèse Ranera,1,2,3 Christiane Pecher,2,3 Jean-Pierre Girolami,2,3 and Ivan Tack1,2,3 1 Laboratoire de Physiologie, Faculté de Médecine Rangueil, Toulouse; 2Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, Unité 858, Toulouse; and 3Université Toulouse III Paul-Sabatier, Institut de Médecine Moléculaire de Rangueil, Equipe 5, IFR31, Toulouse, France Submitted 25 October 2007; accepted in final form 12 March 2008 Buléon M, Allard J, Jaafar A, Praddaude F, Dickson Z, Ranera M-T, Pecher C, Girolami J-P, Tack I. Pharmacological blockade of B2-kinin receptor reduces renal protective effect of angiotensinconverting enzyme inhibition in db/db mice model. Am J Physiol Renal Physiol 294: F1249–F1256, 2008. First published March 26, 2008; doi:10.1152/ajprenal.00501.2007.—Diabetic nephropathy (DN) can be delayed by the use of angiotensin-converting enzyme inhibitors (ACEi). The mechanisms of ACEi renal protection are not univocal. To investigate the impact of bradykinin B2 receptor (B2R) activation during ACE inhibition, type II diabetic mice (C57BLKS db/db) received for 20 wk: 1) ACEi (ramipril) alone, 2) ACEi ⫹ HOE-140 (a specific B2R antagonist), 3) HOE-140 alone, or 4) no treatment. The development of DN, defined by an increase in albuminuria and glomerulosclerosis, was largely prevented by ACEi treatment (albuminuria: 980 ⫾ 130 vs. 2,160 ⫾ 330 mg/g creatinine; mesangial area: 22.5 ⫾ 0.5 vs. 27.6 ⫾ 0.3%). The protective effect of ramipril was markedly attenuated by B2R blockade (albuminuria: 2,790 ⫾ 680 mg/g creatinine; mesangial area: 30.4 ⫾ 1.1%), whereas HOE-140 alone significantly increased albuminuria. Despite such benefits, glomerular filtration rate remained unchanged, probably because of the combination of the hypotensive effect of diabetes in this model and the renal hemodynamic action of ramipril. Finally, the renal protective effect of ACEi was associated with a marked decrease in glomerular overexpression of insulin-like growth factor-1 (IGF-1) and transforming growth factor- pathways, but also in advanced glycation end product receptors and lipid peroxidation assessed by 4-hydroxy-2nonenal (4-HNE) adducts. Concomitant blockade of B2R partly restored glomerular overexpression of IGF-1 receptor  and 4-HNE complexes. These results support the critical role of B2R activation in the mediation of ACEi renal protection against DN and provide the rationale to examine the benefit of B2R activation by itself as a new therapeutic approach for DN. (DN) is a major complication associated with the progression of both type 1 and type 2 diabetes. Optimization of glycemic control helps to reduce its onset. However, despite such efforts, DN is present in more than 40% of patients in both types of diabetes after 25 years of evolution (20). In type 2 diabetes, the future appears even worse, since the prevalence of the disease is still growing and the faint hope of reaching euglycemia is far less than in type 1 diabetes. For these reasons the research of new therapeutic strategies to protect against the development of DN is essential. Until now, the blockade of the renin angiotensin system, mainly with angiotensin-converting enzyme inhibitors (ACEi) but also with antagonists of the AT1 receptor for angiotensin II, was the only efficient treatment able to slow down the progression of DN (12, 25). It is usually considered that both families of drugs act through either inhibition of angiotensin II generation or blockade of its receptor (30, 31). Indeed, angiotensin II is a potent vasoconstrictor that promotes the synthesis of the highly fibrotic cytokine transforming growth factor- (TGF-) and stimulates the production of reactive oxygen species (8), leading to a globally profibrotic effect. However, some works suggest that this might not be their only mechanism of action. Indeed, in addition to the blockade of angiotensin II synthesis, ACEi also inhibit degradation of bradykinin (BK) by the ACE. As a result, bradykinin bioavailability increases, enabling the activation of its receptors. BK acts via two distinct G proteincoupled receptors named B1-kinin (B1R) and B2-kinin receptors (B2R). (11). Activation of the B2R induces powerful physiological actions that, on the whole, oppose those of angiotensin II. This raises the question of a potential direct renal protective effect of BK during ACEi treatment (11, 14). Most of the recent data obtained with genetically modified mice sustain such a hypothesis. Diabetic nephropathy is markedly enhanced in mice lacking the B2R (23) and in mice with genetically increased angiotensin I-converting enzyme expression (22), where B2R activation by endogenous kinin is abolished, suggesting that this receptor is involved in the renal protective effect of BK during DN. As further support of this hypothesis, our group has shown that in vivo, B2R activation reduces renal fibrosis following unilateral ureteral obstruction in mice, an effect associated with increased matrix degradation and increased synthesis of plasminogen activators (34). We also recently observed that in a model of streptozotocin (STZ)induced diabetes in rats, the blockade of B2R blunted the beneficial effect of ACEi treatment on albuminuria (2). In contrast, a recent publication has provided contradictory information suggesting that B2R knockout in mice protects against the development of diabetic nephropathy (40). Thus it appears critical 1) to establish the contribution of B2R activation in the renal protective action of ACEi treatment during diabetic nephropathy and 2) to clarify the pathophysiological mechanisms affected. The aim of the present study was to investigate, using the db/db mouse model of type 2 diabetes, the consequences of the chronic blockade of B2R during ACEi treatment of diabetic Address for reprint requests and other correspondence: I. Tack, INSERM U858 eq 5 BP 84, Institut Louis Bugnard, BP 84225, 31432 Toulouse Cedex 4, France (e-mail: [email protected]). The costs of publication of this article were defrayed in part by the payment of page charges. The article must therefore be hereby marked “advertisement” in accordance with 18 U.S.C. Section 1734 solely to indicate this fact. angiotensin-converting enzyme inhibitors; bradykinin; glomerulopathy DIABETIC NEPHROPATHY http://www.ajprenal.org 0363-6127/08 $8.00 Copyright © 2008 the American Physiological Society F1249 F1250 INHIBITION OF B2-KININ RECEPTOR AND DIABETIC NEPHROPATHY nephropathy. To achieve this goal, diabetic mice received treatment with ramipril, a molecule that has shown its efficacy in this circumstance (2, 29), either alone or in association with HOE-140, a specific and poorly reversible B2R antagonist (43). The consequences of this treatment on the development of DN (i.e., albuminuria, renal failure, and glomerulosclerosis) and on some of the main pathogenic mechanisms of diabetic glomerulopathy were studied after 20 wk of treatment. We found that the pharmacological blockade of the B2R markedly reduces the renal protective action of ACEi in this model of diabetic nephropathy. Furthermore, some of the crossover signaling pathways between B2R and ACEi renal protective effects were identified. METHODS Animal model. Obese diabetic C57BLKS db/db mice and heterozygote C57BLKS db/m mice were purchased from the Jackson Laboratories and kept in a temperature-controlled room on a 12:12-h light-dark cycle. To avoid a sex-related discrepancy in the results, only female mice were used. Animals were allowed free access to standard diet and tap water. Experiments were performed using 7-wk-old mice randomly assigned to four groups: either 1) untreated, or treated for 20 wk with 2) ACEi (ramipril, Aventis Pharma Germany; 1 mg 䡠 kg⫺1 䡠 day⫺1 in drinking water), 3) ACEi and B2R selective antagonist HOE-140 (Icatibant HOE-140, Aventis Pharma Germany; 250 g 䡠 kg⫺1 䡠 48 h⫺1 subcutaneously), or 4) HOE-140 alone (250 g 䡠 kg⫺1 䡠 48 h⫺1 subcutaneously). This dose was able to prevent the hypotensive effect of a single 100-l intravenous bolus of 2 ⫻ 10⫺5 M BK (see RESULTS). Based on pilot experiments, this protocol of administration avoided the implantation of minipumps in these diabetic and obese mice, which are sensitive to infections and healing complications. In each group, age-matched heterozygote C57BLKS db/m mice were used as nondiabetic controls. Every other week, the mice were weighed and blood samples were collected from the tail in 12-h fasted mice to measure glucose concentration using Glucose RTU (BioMérieux, France). The mice were placed in metabolic cages to collect 24-h urine, and urinary albumin excretion was determined with a specific ELISA (Bethyl). Renal function, histology, and glomerular protein extraction were performed 20 wk later. Serum fructosamine, an index of glucose exposure, was dosed by a colorimetric method based on the reduction of nitrotetrazolium blue by ketoamines. All procedures involving experimental animals were approved by the French Accreditation of Laboratory Animal Care and performed in accordance with the guiding principles for animal research. Renal function studies. For surgical procedures, mice were anesthetized with an intraperitoneal injection of 30 mg/kg of Etomidate Lipuro (Braun Medical). After tracheotomy, the left jugular vein was cannulated to perfuse inulin, and the left femoral artery was cannulated to monitor arterial blood pressure and to obtain blood samples. Urine was collected through an intravesical catheter. After surgery, mice were allowed to recover for 30 min. Renal function was evaluated for a 60-min clearance period. Glomerular filtration rate (GFR) was assessed by inulin clearance and expressed per gram of kidney weight. At the end of the study, a catheter was introduced into the abdominal aorta. The left kidney was excised and weighed. The right kidney was washed with 10 ml of PBS, fixed by an infusion of 10 ml of 10% formalin (pH 7.40), removed, and stored in formalin. Glomerular histology and morphology. Formalin-fixed right kidneys were embedded in methyl methacrylate. Sections of 3-m thickness were stained with periodic acid Schiff (PAS). Pictures were captured using a digital camera Nikon D1 (Nikon, Japan) connected to a light microscope. For each animal, pictures from 50 randomly chosen glomeruli were taken at magnification ⫻400 and analyzed using Photoshop software (Adobe System, San Jose, CA) and a public AJP-Renal Physiol • VOL domain NIH Image program (http://rsb.info.nih.gov/nih-image/). Briefly, the total cortical area was examined. A total of 50 glomerular images were randomly recorded by moving the slide from the outer to the inner cortex to obtain noncrossing sample fields. Images were processed using Photoshop software. Glomerular tufts (including all the cellular and interstitial components of the glomerulus, including podocytes and capillaries) were encircled, and the enclosed area was copied to create a new picture (5). The number of pixels (independent of their individual density) of this picture gave the surface area density of the tuft. According to DeHoff’s equation for the measurement of spheroids of differing size, the harmonic mean of glomerular areas (Svm) was used to calculate the mean glomerular volume (GlmVm) for each animal, using the formula GlmVm ⫽ 4/3(Svm)(3/2). From the glomerular picture, the entire amount of PAS-positive material, except for the peripheral basement membranes, was selected automatically using the properties of color recognition of the software and was manually completed by the inclusion of nuclei. The number of pixels in this area was considered to represent the mesangial area (i.e., mesangial cells and extracellular matrix areas) and was expressed as a fraction of the tuft surface area (5). Glomerular isolation by magnetic sorting. Colloidal iron oxide suspension was prepared as described by Cook and Pickering (9) for rabbits and modified in our laboratory. Briefly, mice from the different experimental groups described above were anesthetized by intraperitoneal injection of 150 mg/kg Inactin. Ten milliliters of colloidal iron oxide suspension were injected through the abdominal aorta following a 10-ml PBS rinse. Kidneys were removed, and renal cortex was sliced and pressed through a 125-m2 graded sieve. The glomeruli were then magnetized and washed three times in PBS to obtain a 93% purity suspension. Proteins were extracted using a lysis buffer [10% glycerol, 20 mM Tris, 140 mM NaCl, 10 mM sodium pyrophosphate, 10 mM sodium fluoride, 2 mM sodium orthovanadate, 3 mM EDTA, 10 g/ml aprotinin, 1.5 M benzamidine, 50 M PMSF, 10 g/ml leupeptin, 1% phosphatase inhibitor cocktail 2 (Sigma), and 1% Triton X-100] added to the last sediment of glomeruli. All procedures were performed at 4°C. The suspension of glomeruli was sonicated for 1 min and centrifuged (15,000 rpm for 45 min at 4°C). The supernatant was stored at ⫺80°C until Western blot analysis was performed. Protein concentration was determined using a colorimetric method (Bio-Rad DC protein assay). Western blot analysis. Proteins (20 –25 g) were separated by electrophoresis in polyacrylamide gels (NuPage 4 –12% Bis-Tris precast gels; Invitrogen) and electrophoretically transferred to nitrocellulose membranes (Hybond-ECL; Amersham). After 1-h incubation at room temperature in Tris-buffered saline, 5% milk, or 1% milk plus 1% BSA and 0.05% Tween-20, the blots were exposed to antibodies recognizing either insulin-like growth factor-1 receptor (IGF-1R), insulin receptor substrate-1 (IRS-1), ERK1/2, phospho-ERK1/2, AGE receptor (RAGE), TGF- type II receptor (TGF-RII), B2R, and 4-hydroxy-2-nonenal (4-HNE) for 1 night at 4°C. The primary antibodies were revealed using the corresponding rabbit or donkey peroxidase-conjugated secondary antibodies for 1 h at room temperature. Peroxidase activity was detected using a chemiluminescence substrate (Super Signal West Pico chemiluminescence substrate; Pierce) and Kodak Biomax Light film. Primary and secondary antibodies were all purchased from Santa Cruz Biotechnology, except for anti-RAGE (Chemicon International), anti-B2R (BD Transduction Laboratory), and anti--actin (Sigma). Statistical analysis. Since the number of animals did not always allow us to assume a Gaussian distribution, comparisons among experimental groups were performed using the nonparametric Kruskal-Wallis test. When this test indicated a significant difference, a post hoc test (Dunn’s multiple comparison test) was performed using GraphPad Prism 4.0 (GraphPad Software). P ⬍ 0.05 was considered statistically significant. 294 • MAY 2008 • www.ajprenal.org INHIBITION OF B2-KININ RECEPTOR AND DIABETIC NEPHROPATHY RESULTS Efficiency of B2R blockade in vivo. The first step was to determine the time course of HOE-140 administration that allowed in vivo blockade of B2 receptors. The efficiency of this treatment with the B2R antagonist was studied by blood pressure responsiveness to an intravenous bolus of BK (2 ⫻ 10⫺5 M, 100 l). In db/db mice treated with HOE-140 alone at the dose of 250 g䡠kg⫺1 䡠48 h⫺1 for 1 wk, the hypotensive response to BK was almost completely blunted (Fig. 1). The maximum decrease of mean arterial blood pressure (MABP) following the bolus of BK was 36.0 ⫾ 13.4 mmHg (n ⫽ 6) for control db/db mice and 13.3 ⫾ 7.0 mmHg for db/db mice treated with HOE-140 (n ⫽ 5, P ⬍ 0.05). In HOE-treated mice, BK induced a transient hypertensive effect that may result from the consequences of prolonged B2R blockade of vasoconstrictor tone. General characteristics. The characteristics of the five groups of mice at the end of the experimental period are presented in Table 1. The body and kidneys of db/db mice were significantly heavier (P ⬍ 0.05) than those of db/m mice. All the db/db mice showed substantial hyperglycemia (P ⬍ 0.001) and a significant increase in the fructosamine level (P ⬍ 0.05) compared with db/m mice. Treatment with ACEi had no effect on the increases in body and kidney weight or on blood glucose and fructosamine levels at the end of the experimental period. MABP in db/db mice was significantly (P ⬍ 0.05) decreased compared with nondiabetic db/m mice, MABP was slightly but significantly (P ⬍ 0.05) lower in ACEi-treated mice than in untreated diabetic mice. This effect of ACEi was completely reversed in the presence of HOE-140. Urinary albumin excretion. As shown in Fig. 2A, urinary albumin excretion at the end of the study was significantly higher in db/db mice than in db/m mice. ACEi treatment Fig. 1. Effect of B2-kinin receptor (B2R) blockade by HOE-140 on the acute hypotensive effect of bradykinin (BK). Db/db mice were treated with a subcutaneous injection of HOE-140 (250 g 䡠 kg⫺1 䡠 48 h⫺1), mean arterial blood pressure was measured 48 h after the last injection with HOE-40. Control db/db mice (n ⫽ 6) and db/db mice treated by HOE-140 (n ⫽ 5) received an intravenous bolus of 100 l of saline followed by 2 boluses of BK (2 ⫻ 10⫺5 M, 100 l), and mean arterial blood pressure was measured intrafemorally. AJP-Renal Physiol • VOL F1251 prevented this increase, and coadministration of HOE-140 blunted the benefit of ACEi on urinary albumin excretion. Unexpectedly, db/db mice that received HOE-140 alone exhibited a significant increase in urinary albumin excretion compared with untreated db/db mice. Glomerular filtration. In diabetic db/db untreated mice, GFR was significantly (P ⬍ 0.05) lower than in the nondiabetic db/m mice (Fig. 2B). GFR was not significantly different among the three groups of db/db mice despite a tendency to be slightly higher in ACEi ⫹HOE-140-treated mice. Glomerular histology and morphology. As illustrated in Fig. 3, all db/db mice presented a significant increase in glomerular volume (P ⬍ 0.001) compared with the nondiabetic db/m mice. Treatment with ACEi, the B2R antagonist alone, or both drugs failed to induce any significant changes in glomerular volume. Glomerulosclerosis was assessed by the determination of mesangial volume. In db/db control mice, mesangial volume was significantly higher (P ⬍ 0.05) than in the nondiabetic db/m mice. Interestingly, treatment with ACEi significantly prevented (P ⬍ 0.05) this increase in mesangial volume, leading to a volume similar to that of the nondiabetic mice. Concomitant treatment with HOE-140 abolished (P ⬍ 0.01) the effect of ACEi treatment, whereas HOE-140 alone had no significant effect on mesangial expansion. Glomerular protein expression. The B2R was spontaneously expressed in the glomeruli of both db/m and db/db mice (Fig. 4A). Although the statistical difference was not significant, B2R tended to increase in diabetic mice and remained closer to that of the db/m group in the glomeruli of animals treated with ACEi alone or with HOE-140 (Fig. 4A). Glomerular protein expression of IGF-1R, IRS-1, RAGE, and TGF-RII were increased in diabetic db/db mice compared with nondiabetic db/m mice (Fig. 4, B, C, E, and F). Treatment with ACEi reduced overexpression of all these signaling proteins, particularly for TGF-RII. The changes associated with ACEi treatment on IGF-1R expression were attenuated by coadministration of HOE-140. Although diabetes had no significant impact on total ERK1/2 glomerular expression, activated forms of these MAP kinases, assessed by the expression of their tyrosine phosphorylated forms, were strongly increased in diabetes (Fig. 4D). The band corresponding in particular to phospho-ERK1 was reduced when db/db mice were treated with ACEi alone or in combination with HOE-140. Figure 4G shows glomerular expression of 4-HNE adducts, an index of protein peroxidation. Formation of 4-HNE occurs endogenously during lipid peroxidation of polyunsaturated fatty acids that can act as a “toxic second mediator” exhibiting a wide range of biological activities. Compared with the pattern observed in db/m mice, 4-HNE-protein conjugates were significantly increased in db/db C mice, showing major bands at 250, 100, 75, 70, and 45 kDa. In the diabetic ACEi-treated group, the 4-HNE-protein profile was noticeably modified, especially the 100- and 70-kDa bands. These bands were suppressed, exhibiting a pattern very close to that of nondiabetic db/m mice, except for a more pronounced accumulation of 4-HNE on the same proteins. Interestingly, this restoration of a near-normal glomerular pattern of 4-HNE-protein conjugates was partly prevented when HOE-140 was coadministered with ACEi, thus going back to a profile close to that of diabetic mice untreated or treated with HOE-140 alone (not shown). 294 • MAY 2008 • www.ajprenal.org F1252 INHIBITION OF B2-KININ RECEPTOR AND DIABETIC NEPHROPATHY Table 1. Characteristics of experimental groups of mice Body weight, g Kidney weight, mg Blood glucose, g/l Fructosamine, mol/l Blood pressure, mmHg db/m C db/db C db/db ACEi db/db ACEi⫹HOE db/db HOE 29.1⫾1.5 305⫾21 2.05⫾0.11 211⫾8 89.9⫾3.3 39.0⫾2.9a 401⫾26a 9.64⫾0.83c 280⫾16b 78.0⫾2.0b 37.7⫾3.8a 389⫾8a 8.55⫾0.71c 306⫾24b 64.8⫾2.9c,d 41.9⫾2.1b 412⫾16b 8.10⫾0.44c 279⫾15b 78.8⫾3.4a,e 50.8⫾3.6b 416⫾20b 7.69⫾0.62b 282⫾12b 74.7⫾2.6b Values are means ⫾ SE. db/m C, nondiabetic control db/m mice; db/db C, diabetic control mice; db/db ACEi, diabetic db/db mice treated with angiotensin-converting enzyme inhibitors; db/db ACEi⫹HOE, diabetic db/db mice treated with ACEi and B2R antagonist HOE-140; db/db HOE, diabetic db/db mice treated with HOE-140 alone. a P ⬍ 0.05; b P ⬍ 0.01; c P ⬍ 0.001 vs. db/m C. d P ⬍ 0.05 vs. db/db C. e P ⬍ 0.05 vs. db/db ACEi. When results were not significant for any comparison, no symbol was added. DISCUSSION Until now, the most efficient approach delaying the progression of DN relied on the blockade of the renin angiotensin system, particularly with ACE inhibitors. This pharmacological strategy is multifaceted, since it includes control of blood pressure, decrease in proteinuria, inhibition of fibrosing cytokines, vasopeptidase inhibition, and oxidative stress modulation. Which of these events occurs first and is the most important remains an unanswered question. It also creates a space for optimization of the therapeutic approach of blocking or even reversing diabetic nephropathy. The dual action of ACEi, namely, angiotensin II synthesis inhibition and BK Fig. 2. Urinary albumin excretion (mg albumin/g creatinine; A) and glomerular filtration rate (GFR; l 䡠 min⫺1 䡠 g kidney⫺1; B) measured in nondiabetic control db/m mice (dbm C; n ⫽ 12), diabetic control mice (dbdb C; n ⫽ 8), diabetic db/db mice treated with angiotensin-converting enzyme inhibitors (dbdb ACEi; n ⫽ 9), diabetic db/db mice treated with ACEi and B2R antagonist HOE-140 (dbdb ACEi/HOE; n ⫽ 12), and diabetic db/db mice treated with HOE-140 alone (dbdb HOE; n ⫽ 8). Values are means ⫾ SE. *P ⬍ 0.05; **P ⬍ 0.01 (pairwise comparison of the groups). AJP-Renal Physiol • VOL degradation prevention, already leads to unanswered questions about the mechanism(s) of their renal protective effect. As recently reviewed (11, 14), BK by itself exerts some renal protective effects that involve activation of the type 2 receptor (B2R). Two of the most convincing arguments are that 1) B2R knockout in mice is associated with the worsening of renal lesions in various models of nephropathy, including DN (23, 33), and 2) direct B2R activation using kinin infusion prevents renal inflammation and glomerulosclerosis via inhibition of oxidative stress in Dahl salt-sensitive rat (7). In a recent study (2), we observed that the blockade of the B2R in a model of STZ-induced diabetes in rats blunted the beneficial effects of ACEi treatment on urinary albumin excretion. However, another recent publication (40) provides a contradictory conclusion regarding the protective action of B2R activation in diabetes, thus reopening the debate on this critical point. In this study, B2R⫺/⫺ knockout mice were protected against the increase in urinary albumin excretion and glomerular lesions resulting from STZ-induced diabetes. This discrepancy could be explained by the fact that, compared with B2R⫹/⫹ animals, B2R⫺/⫺ mice also exhibit spontaneous upregulation of the B1R (15) that was even reinforced by diabetes. This is the reason why we chose the pharmacological blockade of the B2R rather than its genetic knockout model. Furthermore, we focused on the renal effects of direct inhibition of the B2R in db/db mice, a model of spontaneous type 2 diabetes that exhibits delayed glomerulosclerosis far closer to the human disease than the rapidly evolving nephropathy observed in the acutely catabolic STZ-induced type 1 diabetes. Finally, in the report by Tan et al. (40), the lack of the B2R during diabetes was rather protective. Such a result is in contradiction with those of Smithies’s group and many others (7, 22, 23, 27) and with the present study, in which blockade of the B2R induced some deleterious effects such as increased albuminuria. However, when the B2R was recruited by ACEi treatment, it then led to a marked protective effect against glomerulosclerosis. This suggests that there is a tonic and protective activation of the B2R in DN that is significantly enhanced by ACEi-treatment. Tan et al. were not able to study this effect, since their mice did not express the B2R. The concomitant involvement of the B1R cannot be ruled out even if its role in DN remains uncertain. Expression of the B1R has been reported to be increased in various tissues of diabetic models but has not yet been reported in db/db mice. A recent study (1) investigated the expression of the B1R in ob/ob obese diabetic mice, a model close to the db/db model. Although the expression of the B1R in the kidney was not shown, the overall expression of the B1R in other tissues was much weaker than that of the B2R, 294 • MAY 2008 • www.ajprenal.org INHIBITION OF B2-KININ RECEPTOR AND DIABETIC NEPHROPATHY F1253 Fig. 3. Pathological changes in the kidneys of the experimental groups. A: representative photomicrographs (magnification ⫻400) of periodic acid Schiff (PAS)-stained kidney sections. The glomeruli of db/db mice treated with HOE are not shown, since they were similar to those of control db/db mice. B: quantitative analysis of the histomorphological parameters mean glomerular volume (B1) and relative mesangial volume (B2) measured in dbm C (n ⫽ 6), dbdb C (n ⫽ 6), dbdb ACEi (n ⫽ 6), dbdb ACEi/HOE (n ⫽ 60), and dbdb HOE (n ⫽ 6). Values are means ⫾ SE. ns, Nonsignificant. *P ⬍ 0.05; **P ⬍ 0.01; ***P ⬍ 0.001 (pairwise comparison of the groups). which is consistent with some of our preliminary results (Buléon M, personnel communication; not shown). However, because B2R blockade demonstrated very significant effects compared with those of ACEi, we focused in this study on the role of the B2R only. The reduction of glomerulosclerosis by ACEi has been well demonstrated by several independent groups (4, 37). However, until now, most of the conclusions suggested that ACEi acts via suppression of angiotensin II generation, tending to disprove any noticeable role for BK. Using a model of STZinduced diabetes in rats, Allen et al. (3) showed that HOE-140 treatment had no effect on albuminuria or glomerulosclerosis in ACEi -treated animals. In contrast, we found that direct B2R blockade severely reduced the protective effect of ACEi on morphological renal changes, which strongly supports the critical involvement of the BK pathway. One difference could well be reduced intrarenal ACE activity associated with high ACE2 expression in db/db mice (45). Another possible difference is that B2R glomerular expression tends to increase in db/db mice (Fig. 4), leading to an increased sensitivity to BK. ACEi exert important systemic and renal hemodynamic effects. The decrease in systemic blood pressure (Table 1), which is believed to partly mediate the renal protective effect of ACEi (10), is completely prevented by concomitant HOE-140 treatment in our model. A critical difference between the db/db model and human type 2 diabetes is that the former develops a decrease in blood pressure, whereas the latter is commonly associated with hypertension. The low blood pressure observed in db/db mice could be explained by the low ACE activity and increased ACE2 expression (45). Such a pattern results in low angiotensin II availability, possibly associated with angiotensin 1–7 generation and thereby with B2R activation (35, 41). AJP-Renal Physiol • VOL Although this increased sensitivity of db/db mice to BK has not been investigated per se, this point is consistent with 1) the lower MABP of db/db mice, 2) the correction of the ACEi hypotensive effect by HOE, and 3) the effect of HOE alone, especially on microalbuminuria. This difference could explain the prominent impact of BK during ACEi treatment in our model, whereas the role of angiotensin II in its human counterpart is probably more prominent. Another difference between humans and db/db mice is the apparent lack of improvement of the GFR in anesthetized animals under the influence of ACEi. It is likely that the hypersensitivity of db/db mice to BK accounts for such a result, comparable in a way to the temporary worsening of chronic renal failure in some patients after the introduction of ACEi (19). Our study provides more information regarding the mechanisms of the renoprotective effect of B2R activation during ACEi treatment. In addition to its beneficial effect on the diabetic kidney structure, certain critical signaling pathways involved in the pathophysiology of DN are also affected. On the basis of previous results (2, 6, 26, 27, 36), B2R activation could contribute to the reduction of growth factor/cytokine glomerular pathways recruitment and a reduction of oxidative stress indexes. It is beyond the scope of this report to review the involvement of these numerous factors in the pathogenesis of DN. On the basis of a previous study (2), we chose to focus on IGF-1, TGF-, and RAGE pathways, whose contributions to DN appear to be modulated by B2R activation. The role of the renal IGF-1 pathway during the early phase of DN has been suggested (16, 21, 39). More recently, TGF- has emerged as a major deleterious cytokine that largely contributes to the progression of DN, since long-term prevention of mesangial 294 • MAY 2008 • www.ajprenal.org F1254 INHIBITION OF B2-KININ RECEPTOR AND DIABETIC NEPHROPATHY Fig. 4. A–G, left: representative Western blots of glomerular protein expression of B2R (A), -subunit of insulin-like growth factor-1 receptor (IGF-1R; B), and insulin receptor substrate-1 (IRS-1; C), MAP kinases ERK1 and ERK2 and tyrosine-phosphorylated forms pERK1 and ERK2 (D), transforming growth factor- type II receptor (TGF-RII; E), AGE receptor (RAGE; F), and 4-hydroxy-2-nonenal (4-HNE; G). A–F, right: densitometric analysis of glomerular protein expression of B2R (A), IFG-1R (B), IRS-1 (C), pERK (D), TGF-RII (E), and RAGE (F). Values are factored to the total form of ERK for pERK and to -actin expression for B2R, IGF-1R, IRS-1, TGF-RII, and RAGE. The ratio of control db/m group was used as 100% value. Results are means ⫾ SE of at least 5 separate experiments. *P ⬍ 0.05; **P ⬍ 0.01 compared with db/m mice. †P ⬍ 0.05; ††P ⬍ 0.01 for the indicated comparison. Group identification is similar to that of Fig. 3. matrix expansion and renal insufficiency can be achieved by the administration of a monoclonal anti-TGF- antibody in db/db diabetic mice (46). Not surprisingly, protein glomerular expression of IGF-1R, IRS-1, and TGF-RII as well as ERK1/2 activation were significantly increased in untreated diabetic mice. ACEi treatment partly prevented the increase in TGF-RII, IGF-1R, and the activation of ERK1/2 MAP kinases. The decrease in IRS-1 overexpression could result not only from a decreased recruitment of IGF-1 pathway but also from the improvement of insulin sensitivity. In this respect, it is well documented that ACEi improve insulin resistance (11, 17, 25, 30, 31, 36, 37). As expected, ACEi-treated mice showed a reduced expression of both IGF-1R and IRS-1. Furthermore, cotreatment with HOE-140 blunted the beneficial effect of ACEi treatment regarding IGF-1 receptor expression. Oxidative stress is a major contributor to the development of DN. Among the mechanisms that induce an increase in cellular oxidative stress, the involvement of AGE/RAGE pathway plays a pivotal role in diabetes, since it is highly stimulated (32). RAGE-overexpressing mice are partly protected against DN (44), but conversely, the administration of anti-RAGE antibodies was able to prevent upregulation of the TGF- AJP-Renal Physiol • VOL pathway and to attenuate DN (13). It has been shown in vitro that ACEi stimulate the expression of soluble RAGE and thereby prevent AGE accumulation in experimental diabetes (17, 18). In our work, ACEi treatment largely prevented the upregulation of RAGE glomerular expression, an effect that appears to be independent of B2 receptor activation. However, AGE/RAGE is not the only pathway involved in increase oxidative stress in diabetes. Since one of the final effects of oxidation can be biochemical modification of proteins, we chose to focus on the glomerular accumulation of HNE-protein complexes that reflect lipid peroxidation. HNE-protein complexes are relatively stable molecules that can pass among subcellular compartments (42) and have the capacity to interact with many cell proteins and thereby impair their functions. It is now widely recognized that 4-HNE adducts are major cytotoxic products playing a role in the progression of atherogenesis (24), ischemic acute renal failure (28), and human diabetic nephropathy (38). Therefore, controlling 4-HNE adduct accumulation could contribute to renal protection in diabetes. Our results indicate that in the db/db model as well, 4-HNE adducts were increased at the glomerular level. Most of these changes were prevented by ACEi treatment. This benefit was mostly 294 • MAY 2008 • www.ajprenal.org INHIBITION OF B2-KININ RECEPTOR AND DIABETIC NEPHROPATHY dependent on B2R activation, since the 4-HNE profile almost returned to that of diabetic untreated mice when HOE-140 was coadministered with ACEi. This strongly suggests that BK contributes to protecting against cellular oxidative stress in diabetes, an observation that fits with previous studies by ourselves and others (2, 6, 23). Further investigation into the mechanisms of BK-mediated reduction of oxidative stress in diabetes is needed. In conclusion, ACEi (i.e., ramipril) are able to attenuate the development of diabetic nephropathy in this model of spontaneous type 2 diabetes in mice and are associated with a beneficial impact on several critical glomerular signaling pathways such as those involving IGF-1, TGF-, and RAGE but also oxidative stress. This effect is partly mediated by B2R activation. Through in vivo B2R blockade, the present study finally provide a critical but not exclusive contradiction to the common belief that ACEi renal protective effect is mostly mediated by their ability to decrease angiotensin II production. This now provides the rationale to examine whether B2R activation by itself could represent a new and complementary therapeutic approach for diabetic nephropathy. ACKNOWLEDGMENTS We thank Jerini Laboratories for the generous gift of ramipril and HOE-140. GRANTS Marie Buléon was supported by a Ministère Recherche et Technologies grant. This work was also supported by funds from the Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale. REFERENCES 1. Abe KC, Mori MA, Pesquero JB. Leptin deficiency leads to the regulation of kinin receptors expression in mice. Regul Pept 138: 56 –58, 2007. 2. Allard J, Buléon M, Cellier E, Renaud I, Pecher C, Praddaude F, Conti M, Tack I, Girolami JP. ACE inhibitor reduces growth factor receptor expression and signaling but also albuminuria through B2-kinin glomerular receptor activation in diabetic rats. Am J Physiol Renal Physiol 293: F1083–F1092, 2007. 3. Allen TJ, Cao Z, Youssef S, Hulthen UL, Cooper ME. Role of angiotensin II and bradykinin in experimental diabetic nephropathy. Functional and structural studies. Diabetes 46: 1612–1618, 1997. 4. Berl T. Angiotensin-converting enzyme inhibitors versus AT1 receptor antagonist in cardiovascular and renal protection: the case for AT1 receptor antagonist. J Am Soc Nephrol 15, Suppl 1: S71–S76, 2004. 5. Bobadilla NA, Tack I, Tapia E, Sanchez-Lozada LG, Santamaria J, Jimenez F, Striker LJ, Striker GE, Herrera-Acosta J. Pentosan polysulfate prevents glomerular hypertension and structural injury despite persisting hypertension in 5/6 nephrectomy rats. J Am Soc Nephrol 12: 2080 –2087, 2001. 6. Cellier E, Mage M, Duchene J, Pecher C, Couture R, Bascands JL, Girolami JP. Bradykinin reduces growth factor-induced glomerular ERK1/2 phosphorylation. Am J Physiol Renal Physiol 284: F282–F292, 2003. 7. Chao J, Li HJ, Yao YY, Shen B, Gao L, Bledsoe G, Chao L. Kinin infusion prevents renal inflammation, apoptosis, and fibrosis via inhibition of oxidative stress and mitogen-activated protein kinase activity. Hypertension 49: 490 – 497, 2007. 8. Chatziantoniou C, Dussaule JC. Insights into the mechanisms of renal fibrosis: is it possible to achieve regression? Am J Physiol Renal Physiol 289: F227–F234, 2005. 9. Cook WF, Pickering GW. A rapid method for separating glomeruli from rabbit kidney. Nature 182: 1103–1104, 1958. 10. Cooper ME, Allen TJ, O’Brien RC, Papazoglou D, Clarke BE, Jerums G, Doyle AE. Nephropathy in model combining genetic hypertension with experimental diabetes. Enalapril versus hydralazine and metoprolol therapy. Diabetes 39: 1575–1579, 1990. 11. Couture R, Girolami JP. Putative roles of kinin receptors in the therapeutic effects of angiotensin 1-converting enzyme inhibitors in diabetes mellitus. Eur J Pharmacol 500: 467– 485, 2004. AJP-Renal Physiol • VOL F1255 12. Danilczyk U, Penninger JM. Angiotensin-converting enzyme II in the heart and the kidney. Circ Res 98: 463– 471, 2006. 13. De Vriese AS, Flyvbjerg A, Mortier S, Tilton RG, Lameire NH. Inhibition of the interaction of AGE-RAGE prevents hyperglycemiainduced fibrosis of the peritoneal membrane. J Am Soc Nephrol 14: 2109 –2118, 2003. 14. Doggrell SA. Bradykinin B2 receptors—a target in diabetic nephropathy. Expert Opin Ther Targets 9: 411– 414, 2005. 15. Duka I, Kintsurashvili E, Gavras I, Johns C, Bresnahan M, Gavras H. Vasoactive potential of the B1 bradykinin receptor in normotension and hypertension. Circ Res 88: 275–281, 2001. 16. Flyvbjerg A, Khatir DS, Jensen LJ, Dagnaes-Hansen F, Gronbaek H, Rasch R. The involvement of growth hormone (GH), insulin-like growth factors (IGFs) and vascular endothelial growth factor (VEGF) in diabetic kidney disease. Curr Pharm Des 10: 3385–3394, 2004. 17. Forbes JM, Cooper ME, Thallas V, Burns WC, Thomas MC, Brammar GC, Lee F, Grant SL, Burrell LA, Jerums G, Osicka TM. Reduction of the accumulation of advanced glycation end products by ACE inhibition in experimental diabetic nephropathy. Diabetes 51: 3274 – 3282, 2002. 18. Forbes JM, Thorpe SR, Thallas-Bonke V, Pete J, Thomas MC, Deemer ER, Bassal S, El-Osta A, Long DM, Panagiotopoulos S, Jerums G, Osicka TM, Cooper ME. Modulation of soluble receptor for advanced glycation end products by angiotensin-converting enzyme-1 inhibition in diabetic nephropathy. J Am Soc Nephrol 16: 2363–2372, 2005. 19. Hansen HP, Nielsen FS, Rossing P, Jacobsen P, Jensen BR, Parving HH. Kidney function after withdrawal of long-term antihypertensive treatment in diabetic nephropathy. Kidney Int Suppl 63: S49 –S53, 1997. 20. Hasslacher C, Ritz E, Wahl P, Michael C. Similar risks of nephropathy in patients with type I or type II diabetes mellitus. Nephrol Dial Transplant 4: 859 – 863, 1989. 21. Haylor J, Hickling H, El Eter E, Moir A, Oldroyd S, Hardisty C, El Nahas AM. JB3, an IGF-I receptor antagonist, inhibits early renal growth in diabetic and uninephrectomized rats. J Am Soc Nephrol 11: 2027–2035, 2000. 22. Huang W, Gallois Y, Bouby N, Bruneval P, Heudes D, Belair MF, Krege JH, Meneton P, Marre M, Smithies O, Alhenc-Gelas F. Genetically increased angiotensin I-converting enzyme level and renal complications in the diabetic mouse. Proc Natl Acad Sci USA 98: 13330 –13334, 2001. 23. Kakoki M, Takahashi N, Jennette JC, Smithies O. Diabetic nephropathy is markedly enhanced in mice lacking the bradykinin B2 receptor. Proc Natl Acad Sci USA 101: 13302–13305, 2004. 24. Kumagai T, Matsukawa N, Kaneko Y, Kusumi Y, Mitsumata M, Uchida K. A lipid peroxidation-derived inflammatory mediator: identification of 4-hydroxy-2-nonenal as a potential inducer of cyclooxygenase-2 in macrophages. J Biol Chem 279: 48389 – 48396, 2004. 25. McFarlane SI, Kumar A, Sowers JR. Mechanisms by which angiotensin-converting enzyme inhibitors prevent diabetes and cardiovascular disease. Am J Cardiol 91: 30H–37H, 2003. 26. Mikrut K, Paluszak J, Kozlik J, Sosnowski P, Krauss H, Grzeskowiak E. The effect of bradykinin on the oxidative state of rats with acute hyperglycaemia. Diabetes Res Clin Pract 51: 79 – 85, 2001. 27. Montanari D, Yin H, Dobrzynski E, Agata J, Yoshida H, Chao J, Chao L. Kallikrein gene delivery improves serum glucose and lipid profiles and cardiac function in streptozotocin-induced diabetic rats. Diabetes 54: 1573–1580, 2005. 28. Noiri E, Nakao A, Uchida K, Tsukahara H, Ohno M, Fujita T, Brodsky S, Goligorsky MS. Oxidative and nitrosative stress in acute renal ischemia. Am J Physiol Renal Physiol 281: F948 –F957, 2001. 29. O’Hare P, Bilbous R, Mitchell T, CJOC, Viberti GC. Low-dose ramipril reduces microalbuminuria in type 1 diabetic patients without hypertension: results of a randomized controlled trial. Diabetes Care 23: 1823–1829, 2000. 30. Perico N, Codreanu I, Schieppati A, Remuzzi G. Prevention of progression and remission/regression strategies for chronic renal diseases: can we do better now than five years ago? Kidney Int Suppl: S21–S24, 2005. 31. Remuzzi G, Schieppati A, Ruggenenti Clinical practice P. Nephropathy in patients with type 2 diabetes. N Engl J Med 346: 1145–1151, 2002. 32. Sakurai S, Yonekura H, Yamamoto Y, Watanabe T, Tanaka N, Li H, Rahman AK, Myint KM, Kim CH, Yamamoto H. The AGE-RAGE system and diabetic nephropathy. J Am Soc Nephrol 14: S259 –S263, 2003. 294 • MAY 2008 • www.ajprenal.org F1256 INHIBITION OF B2-KININ RECEPTOR AND DIABETIC NEPHROPATHY 33. Schanstra JP, Duchene J, Praddaude F, Bruneval P, Tack I, Chevalier J, Girolami JP, Bascands JL. Decreased renal NO excretion and reduced glomerular tuft area in mice lacking the bradykinin B2 receptor. Am J Physiol Heart Circ Physiol 284: H1904 –H1908, 2003. 34. Schanstra JP, Neau E, Drogoz P, Arevalo Gomez MA, Lopez Novoa JM, Calise D, Pecher C, Bader M, Girolami JP, Bascands JL. In vivo bradykinin B2 receptor activation reduces renal fibrosis. J Clin Invest 110: 371–379, 2002. 35. Schmaier AH. The kallikrein-kinin and the renin-angiotensin systems have a multilayered interaction. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 285: R1–R13, 2003. 36. Shiuchi T, Cui TX, Wu L, Nakagami H, Takeda-Matsubara Y, Iwai M, Horiuchi M. ACE inhibitor improves insulin resistance in diabetic mouse via bradykinin and NO. Hypertension 40: 329 –334, 2002. 37. Strippoli GF, Craig M, Schena FP, Craig JC. Antihypertensive agents for primary prevention of diabetic nephropathy. J Am Soc Nephrol 16: 3081–3091, 2005. 38. Suzuki D, Miyata T, Saotome N, Horie K, Inagi R, Yasuda Y, Uchida K, Izuhara Y, Yagame M, Sakai H, Kurokawa K. Immunohistochemical evidence for an increased oxidative stress and carbonyl modification of proteins in diabetic glomerular lesions. J Am Soc Nephrol 10: 822– 832, 1999. 39. Tack I, Elliot SJ, Potier M, Rivera A, Striker GE, Striker LJ. Autocrine activation of the IGF-I signaling pathway in mesangial cells isolated from diabetic NOD mice. Diabetes 51: 182–188, 2002. 40. Tan Y, Keum JS, Wang B, McHenry MB, Lipsitz SR, Jaffa AA. Targeted deletion of B2-kinin receptors protects against the development AJP-Renal Physiol • VOL 41. 42. 43. 44. 45. 46. of diabetic nephropathy. Am J Physiol Renal Physiol 293: F1026 –F1035, 2007. Tschope C, Schultheiss HP, Walther T. Multiple interactions between the renin-angiotensin and the kallikrein-kinin systems: role of ACE inhibition and AT1 receptor blockade. J Cardiovasc Pharmacol 39: 478 – 487, 2002. Uchida K. 4-Hydroxy-2-nonenal: a product and mediator of oxidative stress. Prog Lipid Res 42: 318 –343, 2003. Wirth K, Hock FJ, Albus U, Linz W, Alpermann HG, Anagnostopoulos H, Henk S, Breipohl G, König W, Knolle J, Schölkens BA. Hoe 140 a new potent and long acting bradykinin-antagonist: in vivo studies. Br J Pharmacol 102: 774 –777, 1991. Yamamoto Y, Kato I, Doi T, Yonekura H, Ohashi S, Takeuchi M, Watanabe T, Yamagishi S, Sakurai S, Takasawa S, Okamoto H, Yamamoto H. Development and prevention of advanced diabetic nephropathy in RAGE-overexpressing mice. J Clin Invest 108: 261–268, 2001. Ye M, Wysocki J, Naaz P, Salabat MR, LaPointe MS, Batlle D. Increased ACE 2 and decreased ACE protein in renal tubules from diabetic mice: a renoprotective combination? Hypertension 43: 1120 –1125, 2004. Ziyadeh FN, Hoffman BB, Han DC, Iglesias-De La Cruz MC, Hong SW, Isono M, Chen S, McGowan TA, Sharma K. Long-term prevention of renal insufficiency, excess matrix gene expression, and glomerular mesangial matrix expansion by treatment with monoclonal antitransforming growth factor-beta antibody in db/db diabetic mice. Proc Natl Acad Sci USA 97: 8015– 8020, 2000. 294 • MAY 2008 • www.ajprenal.org Partie II : néphropathie diabétique et système kallicréine-kinine Travail en cours Effets néphroprotecteurs de l’Irbésartan au cours du diabète expérimental de type II : rôle du récepteur B2 de la bradykinine En collaboration avec Acil Jaafar pendant son Master 2 (2006-2007) 78 Partie II : néphropathie diabétique et système kallicréine-kinine INTRODUCTION Les interactions existant entre le métabolisme des kinines et l’enzyme de conversion ont généré un grand nombre de travaux afin de préciser le rôle de l’activation des récepteurs de la bradykinine, tant le récepteur B1 que le récepteur B2, lors d’un traitement par un inhibiteur de l’enzyme de conversion. Il a été suggéré que certains effets secondaires délétères tels que la toux et le micro-angiodèmes soient associés à la potentialisation des effets des kinines. Afin de limiter les effets bradykinine-dépendants, le développement d’antagonistes du récepteur AT1 de l’angiotensine a été entrepris. Si pendant de nombreuses années on a pensé que les mécanismes d’actions des IEC et des antagonistes du récepteur AT1 étaient différents, des travaux récents (REFERENCES) indiquent que ces mécanismes reposent sur l’activation de voies de signalisation assez redondantes qui peuvent impliquer l’activation du RB2 de la bradykinine. Nous avons donc étudié l’effet néphroprotecteur potentiel d’un antagoniste du récepteur AT1 de l’angiotensine II (ARA2) au cours de la néphropathie diabétique chez la souris db/db, ainsi que la le rôle éventuel du RB2 dans ces effets. MATERIEL et METHODES Les souris C57 BLKs db/db ont été séparées en 4 groupes : 1) contrôle (dbC), 2) traité (10 semaines) par l’Irbésartan 4 mg/kg incorporé dans l’alimentation (dbLI), 3) traité (10 semaines) par l’Irbésartan 10 mg/kg incorporé dans l’alimentation (dbHI), cette dose de 10 mg, 4) traité (10 semaines) par Irbésartan 10 mg/kg et un antagoniste du récepteur B2 de la bradykinine HOE-140 (Icatibant, Aventis Pharma Deutshland) 250 µg/kg, en injections souscutanées, 3 fois par semaine (dbHI+HOE). Les souris hétérozygotes db/m ont été utilisées comme contrôles non diabétiques (mC). 79 Partie II : néphropathie diabétique et système kallicréine-kinine La glycémie et la microalbuminurie ont été mesurées régulièrement pendant la durée du traitement. A l’issue du traitement, des explorations fonctionnelles rénales ont été réalisées chez la souris anesthésiée. La glomérulosclérose a été évaluée par une analyse histomorphométrique. Les techniques utilisées dans ce travail ont été décrites pour le protocole précédent (Buleon M et al, Pharmacological blockade of B2-kinin receptor reduces renal protective effect of Angiotensin-Converting Enzyme Inhibition in db/db mice model. Am J Physiol Renal Physiol. 2008 Mar 26) RESULTATS Equilibre glycémique Les souris db/db présentent une hyperglycémie très importante (7,9 ± 0,3 g/L pour les db/db non traitées versus 1,7 ± 0,1 g/L pour les db/m). Les différents traitements n’ont pas d’effet significatif sur l’équilibre glycémique. Alb/Creat urine (µg/mg) Microalbuminurie 3000 † †† † 2000 † 1000 E I+ H O I db H db H db LI db C m C 0 L’excrétion urinaire d’albumine est augmentée chez les souris db/db (1390 ± 204 µg/mg de créatinine pour les db/db, versus 452 ± 55 µg/mg de créatinine pour les db/m), mais n’est pas modifiée par les traitements. 80 Partie II : néphropathie diabétique et système kallicréine-kinine Fonction rénale La pression sanguine artérielle n’est pas significativement différente entre les groupes. * 1000 † † 200 † 100 DPR (µl/min/65cm2) ** 750 ††† 500 250 H I+ H O E H I db /d b db /d b C LI db /d b db /d b H I+ H O E H I db /d b db /d b C LI db /d b db /d b C db /m C 0 0 db /m DFG (µl/min/65cm2) 300 Le Débit de Filtration Glomérulaire (DFG) et le Débit Plasmatique Rénal (DPR) sont diminués chez les souris db/db par rapport aux souris db/m. Le traitement par la faible dose d’Irbésartan n’a pas d’effet sur ces deux paramètres, par contre, la forte dose d’Irbésartan a provoqué une réduction encore plus marquée du DFG et du DPR. Cet effet de l’Irbésartan à forte dose semble atténué par le blocage du RB2 mais ce résultat n’est pas significatif. 81 Partie II : néphropathie diabétique et système kallicréine-kinine 3.0 0.6 Poids des reins (g) † † †† 2.5 † 2.0 1.5 1.0 †† 0.4 0.2 O E H I I+ H /d b db db /d /d b H db /d b LI C db b db /d db /m C I+ H O E b H db /d b /d b H I LI C db C /m db * 40 * * Aire mésangiale (%) ††† ††† ††† 0.0 db /d b Volume glomérulaire (106 µm3) Etude histo-morphométrique ††† ††† 35 †† † 30 25 db /d b H I+ H O E H I db /d b LI db /d b C db /d b db /m C 20 Les souris db/db non traitées présentent une hypertrophie rénale et glomérulaire, ainsi qu’une augmentation de l’aire mésangiale relative par rapport aux souris non diabétiques db/m. Ces animaux ont donc développé une glomérulosclérose. L’Irbésartan ne modifie ni le poids des reins, ni le volume glomérulaire, mais permet de réduire l’aire mésangiale relative, aux deux doses testées. Cet effet sur l’aire mésangiale est supprimé par l’antagoniste du RB2. 82 Partie II : néphropathie diabétique et système kallicréine-kinine CONCLUSION / DISCUSSION L’Irbésartan n’a pas permis de réduire la microalbuminurie, ni d’améliorer le DFG dans notre modèle. Cependant, ce traitement exerce un effet protecteur contre le développement de la glomérulosclérose en réduisant l’aire mésangiale relative. Cet effet semble dépendant du RB2 puisqu’il est supprimé par le blocage de ce récepteur. De plus, ce bénéfice structural a été observé même à la dose la plus faible utilisée (4 mg/kg), dose qui n’a pas d’effet hémodynamique, cette observation suggère que les effets néphroprotecteurs de l’Irbésartan sur la glomérulosclérose sont indépendants de leur effet hémodynamique. 83 Partie III : choc endotoxinique et système kallicréine-kinine PARTIE III – CHOC ENDOTOXINIQUE ET SYSTEME KALLICREINE-KININE Le choc septique est une réaction inflammatoire majeure en réponse à une infection bactérienne. Il s’accompagne d’une hypotension sévère dont l’impact met en jeu des dysfonctionnements d’organes vitaux. Le dysfonctionnement rénal est un des plus précoces et celui pour lequel la valeur pronostique est la plus mauvaise. L’association d’un choc septique et d’une défaillance rénale aiguë augmente considérablement la mortalité des patients. I. COMPRENDRE POUR AMELIORER LE PRONOSTIC I.1. EPIDEMIOLOGIE Malgré les progrès des antibiothérapies et des techniques de soins intensifs, le choc septique reste une pathologique fréquente et associée à un fort taux de mortalité (environ 50 %). Le choc septique représente 8.2 % des admissions dans les services de réanimation en France avec un risque de mortalité multiplié par 3,9 par rapport aux autres causes d’admission en réanimation. [365, 366]. Aux Etats-Unis, on compte entre 50 et 95 cas de choc septique pour 100 000 habitants chaque année [367]. Ce chiffre augmente de 9% par an, ce phénomène étant expliqué par l’augmentation de l’utilisation de techniques invasives, des médicaments immunodépresseurs, 84 Partie III : choc endotoxinique et système kallicréine-kinine de la chimiothérapie et de la transplantation, l’émergence du virus HIV et l’augmentation de résistances microbiennes. Dans ce pays le choc septique représente un coût annuel de 17 milliards de dollars [367]. La mortalité du choc septique est d’environ 50 %, et augmente considérablement (70 % à 80 %) lorsque celui-ci est associé à une défaillance rénale. La fréquence et la gravité du choc septique en font donc un problème majeur de santé publique qui justifie les efforts de recherche physiopathologique importants mis en oeuvre. I.2. MECANISMES GENERAUX Le sepsis se définit comme un syndrome de réponse inflammatoire systémique résultant de l'action d’agents infectieux. Ceux-ci vont entraîner des troubles de la microcirculation caractérisés par une vasodilatation artérielle et veineuse et une augmentation de la perméabilité plasmatique (lésions de l’endothélium). On parle de sepsis grave lorsque le syndrome de réponse inflammatoire systémique est associé à une anomalie de perfusion tissulaire [368]. Ce trouble de la distribution sanguine dans les tissus et les organes s’accompagne d’une perturbation des échanges gazeux provoquant une hypoxie cellulaire, et peut aboutir à un dysfonctionnement d’organes. Un sepsis grave peut évoluer vers une défaillance circulatoire aiguë : le choc septique, caractérisé par une hypotension sévère et persistante malgré une correction volémique adéquate. Cette hypotension est associée à une hypovolémie par fuite de liquide plasmatique. Le choc septique est responsable de désordres hémodynamiques, métaboliques et viscéraux. Cette cascade d'événements peut être initiée aussi bien par des bactéries à Gram positif ou des éléments fungiques que par les endotoxines (par exemple le lipopolysaccharide ou LPS) libérées par les bactéries à Gram négatif. Le LPS est un des composants majeurs de la 85 Partie III : choc endotoxinique et système kallicréine-kinine membrane externe de la paroi des bactéries à Gram négatif, libéré lors de la lyse bactérienne. Ces agents infectieux vont provoquer l’activation de cascades d’évènements impliquant des cellules immunitaires, la sécrétion de cytokines (TNF, interleukine-1), la sécrétion de prostaglandines et de NO et l’activation de cascades humorales. Le sepsis est associé à la migration de leucocytes activés depuis la circulation sanguine jusqu’aux tissus inflammatoires, mais aussi à une production accrue de leucocytes par la moelle osseuse [369]. Les leucocytes libèrent de nombreuses protéases essentielles pour lutter contre l’infection [365]. Les cytokines pro-inflammatoires, dont les plus importantes semblent être le TNFα et l’interleukine-1 sont libérées en grande quantité au cours du sepsis [370]. L’induction de l’expression de ces cytokines est régulée par le facteur de transcription NFκB [371]. Ces cytokines contribuent à la synthèse d’eicosanoïdes (prostaglandines et leucotriènes) et de Platelet-Activating Factor (PAF), qui en plus de leur effet inflammatoire, diminuent le tonus vasculaire et augmentent le flux sanguin et la perméabilité vasculaire. La libération massive du monoxyde d’azote (NO) par la NO-synthase inductible (NOSi) joue probablement un rôle essentiel dans la physiopathologie du sepsis [372, 373]. La NOSi est synthétisée en réponse à différents médiateurs inflammatoires en particulier le TNFα, l'interféron-γ et l'interleukine-1β. La production de NO par la NOSi est plus massive et prolongée que celle de la NOSe [374]. Le NO exerce un effet vasodilatateur puissant qui provoque une hyporéactivité aux agents vasoconstricteurs, entraînant donc une hypotension majeure [375-377]. Le NO produit par la NOSi participe aux atteintes micro-vasculaires et tissulaires du choc septique [372, 378, 379]. Des cytokines anti-inflammatoires (les interleukines-10, 4, 6 et 13, le TGFβ, et l’interferon-γ, sont aussi sécrétées en grande quantité lors du sepsis [365]. Ces cytokines 86 Partie III : choc endotoxinique et système kallicréine-kinine contribuent à limiter la production de cytokines pro-inflammatoires et à atténuer l’amplitude de la réponse inflammatoire du sepsis. Au cours du choc septique, l’organisme met en place un ensemble de mécanismes visant à maintenir la circulation artérielle : activation du système nerveux sympathique, du système rénine-angiotensine-aldostérone, libération de vasopressine et augmentation du débit cardiaque. Ces mécanismes sont essentiels pour tenter de maintenir une hémodynamique systémique correcte ; cependant ils contribuent aussi au développement de la défaillance rénale [380, 381]. La physiopathologie du sepsis est donc complexe et fait intervenir de nombreux médiateurs. La compréhension des processus biologiques responsables du choc septique a cependant permis d’identifier des cibles thérapeutiques potentielles. 87 Partie III : choc endotoxinique et système kallicréine-kinine Figure 10 : Défaillance rénale au cours du sepsis [374] I.3. OPTIONS THERAPEUTIQUES ACTUELLES Le traitement du choc septique repose d’une part sur le traitement de l’infection et d’autre part sur la restauration d’un état hémodynamique satisfaisant. L’infection doit être éradiquée le plus précocément possible, elle est traitée par une antibiothérapie associée à la recherche d’un foyer infectieux pouvant nécessiter une élimination chirurgicale. Le traitement de la défaillance cardio-circulatoire repose tout d’abord sur un remplissage vasculaire, pour corriger l’hypovolémie et l’hypotension. La restauration d’une volémie efficace permet d’augmenter le débit cardiaque, d’optimiser le transfert d’oxygène et d’améliorer la micro88 Partie III : choc endotoxinique et système kallicréine-kinine circulation. Le remplissage vasculaire peut être associé, s’il ne suffit pas à restaurer un état hémodynamique satisfaisant, à l’utilisation de catécholamines afin de rétablir un tonus vasomoteur correct. L’administration de vasopressine peut également aider à maintenir une pression artérielle satisfaisante [382, 383]. En plus de son effet vasoconstricteur propre, la vasopressine inhibe la synthèse de NO en réduisant l’expression de la NOSi [384]. L’utilisation d’anticorps dirigés contre le LPS a été testé cliniquement, mais leur efficacité n’a pas été démontrée [385-387]. D’autres stratégies ciblant le LPS ont été envisagées. L’utilisation d’un peptide synthétique contenant un domaine de liaison au LPS et une immunoglobuline a montré un effet protecteur dans un modèle de ponction coecale [388]. Un analogue synthétique du lipide A, composant du LPS, bloque les effets du LPS chez l’Homme [389]. Les lipoprotéines HDL (High density lipoproteins) exercent un effet antiinflammatoire (en neutralisant le LPS et en inhibant l’expression des molécules d’adhésion et la libération des cytokines pro-inflammatoires) et constituent donc un outil thérapeutique potentiel [390]. Des anticorps anti-CD14 pourraient également exercer un effet protecteur en inhibant la production de cytokines pro-inflammatoires, leur efficacité clinique reste à démontrer [391]. Une seconde possibilité est de bloquer l’un des médiateurs de la cascade inflammatoire. Parmi eux, le TNF est un médiateur crucial impliqué précocement au cours du choc endotoxinique, ce qui en fait une cible thérapeutique attractive. Plusieurs stratégies ont été utilisées pour bloquer l’activité du TNF, parmi elles, seule l’utilisation d’anticorps neutralisants a montré une efficacité clinique [392-394]. Cependant, la réduction de la mortalité par ce traitement était faible. De la même façon, l’inhibition de l’interleukine-1 permet une réduction peu importante de la mortalité [392]. 89 Partie III : choc endotoxinique et système kallicréine-kinine Le NO étant également un médiateur essentiel au cours du sepsis, l’inhibition de la NO-synthase comme outil thérapeutique a également été envisagée. Cependant l’inhibition non sélective des NO-synthases provoque, en fait, une augmentation de la mortalité [395] car les NO-synthases constitutives sont essentielles au maintien de l’hémodynamique microcirculatoire. L’inhibition sélective de la NO-synthase inductible dont l’expression est induite au cours du sepsis et l’activité restreinte aux tissus inflammatoires, serait plus appropriée. Des souris invalidées pour la NO-synthase inductible ont été développées et leur susceptibilité au sepsis a été étudiée [375, 396-398]. Ces travaux ont montré une réduction de la sévérité du choc septique chez les animaux invalidés pour la NOSi, mais les résultats semblent variables selon la souche de souris utilisée ainsi que le pathogène administré. D’autres outils thérapeutiques potentiels (injection d’immunoglobulines, interféron-γ, stimulation des macrophages, inhibition de la coagulation…) ont été testés sans montrer de véritable efficacité clinique [392]. II. QUELLE EST LA PLACE DU SYSTEME KALLICREINEKININE ? En plus de la libération de nombreux médiateurs inflammatoires, les endotoxines activent le système kallicréine-kinine stimulant ainsi la synthèse de kinines [399, 400]. Tous les composants du SKK semblent en effet être fortement exprimés dans les tissus inflammatoires. Les cytokines pro-inflammatoires augmentent la quantité de kininogène de bas poids moléculaire [401], et la production de kallicréine tissulaire est induite en situation d’inflammation [402]. Celle-ci est d’ailleurs sécrétée par les leucocytes [17, 403]. L’expression de la des-Arg9-BK, ligand endogène du RB1 est également augmentée au cours du sepsis [404, 405]. 90 Partie III : choc endotoxinique et système kallicréine-kinine Cette surexpression des éléments du SKK au cours des processus inflammatoires suggère que le système occupe une place importante dans la physiopathologie du sepsis. En fait, les kinines occupent une place particulièrement notable dans la physiopathologie du sepsis quand le pathogène est une endotoxine [406]. II.1. ROLE DU RECEPTEUR B1 Le récepteur B1 est un récepteur inductible, peu exprimé en situation physiologique. Son expression est fortement induite au cours de l’inflammation, sous l’action du LPS et des cytokines pro-inflammatoires telles que le TNF et l’IL1β [19, 20]. Cette induction semble être régulée par le facteur de transcription NFκB [371, 407]. L’expression du RB1 pourrait également être induite par son propre agoniste, via la PKC et le NFκB [408]. Il parait en fait exister une synergie entre le ligand du récepteur B1 (des-Arg9-BK), et l’interleukine-1β pour augmenter l’expression du RB1 [409]. L’activation du RB2 peut également induire l’expression du RB1 probablement via les cytokines et le NFκB [408, 409]. Cependant, l’existence d’un tel mécanisme d’autorégulation entre le RB1 et le RB2 n’est pas admise de façon consensuelle. La forte induction de l’expression du RB1 dans les situations d’inflammation suggère qu’il puisse jouer un rôle important au cours du choc septique. Ce récepteur semble en effet impliqué dans la plupart des processus associés à l’évolution du sepsis. Une réponse hypotensive médiée par le B1 a été montrée dans plusieurs modèles d’endotoxémie [18, 410]. Le RB1 est impliqué dans la vasodilatation, l’augmentation du flux sanguin [411] et l’extravasation plasmatique [62, 412], mais également dans la composante cellulaire de la réponse inflammatoire. En effet, le RB1 participerait au recrutement et à l’activation des leucocytes [399, 412-414]. Le RB1 est exprimé à la surface des neutrophiles où il participerait 91 Partie III : choc endotoxinique et système kallicréine-kinine à la libération d’élastase et donc à l’augmentation de la perméabilité vasculaire [415]. Il est également exprimé sur les lymphocytes T [416, 417] et participe à leur migration [416]. De plus le RB1 intervient dans la libération de plusieurs interleukines, de peptides chemoattractants et de leucotriènes par les macrophages [418, 419] et les fibroblastes pulmonaires [420]. Par contre, l’effet de l’inhibition pharmacologique du RB1 au cours du choc endotoxinique reste mal évalué. McLean et al. ont montré qu’un antagoniste du RB1 réduisait légèrement l’hypotension induite par le LPS chez le rat [421]. Chez le cochon d’Inde, Siebeck et al. ont montré que le blocage du RB2 limitait la mortalité induite par le LPS, mais que le blocage supplémentaire du RB1 supprimait cet effet bénéfique [422]. Dans ce travail, le blocage du RB1 seul n’a pas été étudié. Peu de travaux ont été effectués sur le choc septique dans le modèle d’invalidation génétique du RB1. L’équipe de JB Pesquero a observé que l’administration de LPS chez des souris déficientes en RB2 induisait une hypotension moins sévère que chez les souris sauvages [61, 125], ainsi qu’une accumulation moins massive de leucocytes dans les tissus inflammatoires. La même équipe a observé que les souris invalidées pour les 2 récepteurs étaient totalement protégées de l’hypotension induite par le LPS [125] sans pour autant réduire la mortalité à 3h après l’administration de LPS. Nos résultats, chez la souris invalidée pour le RB1, sont en contradiction avec ceux de Pesquero et al. En effet, nous avons observé, dans ce modèle, une hypotension plus sévère et une mortalité plus importante par rapport aux souris sauvages. Ainsi, l’activation du RB1 serait plutôt protectrice contre l’hypotension précoce induite par le LPS. Ces résultats contradictoires pourraient être expliqués par d’importantes différences dans les conditions expérimentales, le groupe de Pesquero n’a mesuré l’hypotension que 35 min après une injection intraveineuse de LPS, tandis que dans notre travail, le LPS a été administré par voie intrapéritonéale et la pression artérielle mesurée 24h après. Cependant nos résultats sont cohérents avec le travail de Siebeck 92 Partie III : choc endotoxinique et système kallicréine-kinine et al [422], qui avaient montré que le blocage concomitant du RB1 annulait les effets protecteurs du blocage du RB2. Ils avaient alors suggéré que l’induction de l’expression du RB1 était un mécanisme de défense et que ce récepteur n’avait pas du tout le même rôle que le RB2. De la même façon, le groupe de Smithies a montré que la double invalidation des récepteurs de la bradykinine était délétère [124]. II.2. ROLE DU RECEPTEUR B2 Le RB2 est impliqué dans la plupart des conséquences de l’inflammation, notamment l’augmentation de la perméabilité vasculaire, la veinoconstriction, la dilatation artérielle et la douleur. Par contre, le RB2 semble avoir un rôle limité dans la composante cellulaire de la réponse inflammatoire [423]. Plusieurs travaux ont montré que le blocage du RB2 au cours du choc septique était bénéfique. Le premier d’entre eux a montré qu’un antagoniste du RB2 permettait de réduire de 50 % la mortalité consécutive à l’administration de LPS chez le rat [400]. Cet effet bénéfique du blocage pharmacologique du RB2 a ensuite été confirmé par d’autres travaux. Le blocage du RB1 au cours du choc endotoxinique chez le porc réduit la mortalité [422]. Une autre équipe a montré chez le rat que l’invalidation génétique du kininogène ou le blocage pharmacologique du RB2 (par l’HOE-140) réduisait l’hypotension et l’augmentation de la perméabilité vasculaire induites par le LPS [424, 425]. Cependant une équipe n’a pas retrouvé d’effet protecteur du blocage pharmacologique du RB2 dans certaines des espèces (lapin et souris) qu’ils ont étudié [426]. Nous avons étudié l’effet de l’administration de LPS chez des souris invalidées pour le RB2. Nous avons observé que l’hypotension induite par le LPS était légèrement moins importante que chez les souris sauvages, pourtant l’invalidation du RB2 était associée à une 93 Partie III : choc endotoxinique et système kallicréine-kinine mortalité plus importante. Cette observation rappelle ce qui fut observé lors du blocage non spécifique des NO-synthases au cours du choc septique. II.3. DIFFERENCES ENTRE LES ACTIONS DES DEUX RECEPTEURS L’injection d’endotoxine provoque un état de choc en 2 phases successives : une phase précoce et brève purement hypotensive suivie d’une phase prolongée au cours de laquelle apparaissent les autres signes cliniques. La phase initiale serait sensible au blocage du RB2 et non du RB1 [400, 427]. L’hypotension de la phase chronique, en grande partie dépendante de la production de NO par la NOSi [428], est partiellement reversée par des antagonistes du RB1 [421]. Le RB2 serait donc plutôt impliqué dans la phase aiguë du sepsis, alors que le RB1 interviendrait plutôt au cours de la phase chronique [66, 69]. Ce phénomène serait cohérent avec la différence de régulation des 2 récepteurs. L’activation du RB2 est en effet contrôlée par des mécanismes rapides de dissociation du ligand, de désensibilisation et d’internalisation du récepteur. Celle du RB1 est au contraire associée à une très lente dissociation du ligand et une internalisation très limitée. De plus, l’expression du RB1 est augmentée suite à une exposition prolongée à son agoniste [24, 36, 429]. L’activation chronique des RB1 semble être amplifiée par l’accumulation de des-Arg9-BK sur le site de l’inflammation, en effet, la demi-vie de la des-Arg9-BK est 4 à 12 fois plus longue que celle de la BK [17]. L’ensemble de ces mécanismes explique que le RB1 entraîne une réponse plus persistante que le RB2. 94 Partie III : choc endotoxinique et système kallicréine-kinine III. SYSTEME KALLICREINE-KININE ET HEMODYNAMIQUE RENALE AU COURS DU CHOC ENDOTOXINIQUE. La défaillance rénale aiguë est une complication fréquente de l’endotoxémie. Les mécanismes mis en place par l’organisme pour maintenir la pression artérielle (activation du SRA, libération de vasopressine, activation du système nerveux sympathique) sont bien sûr essentiels mais ils contribuent sans doute aussi à l’apparition de la défaillance rénale en provoquant une vasoconstriction au niveau rénal. Le LPS induit la synthèse de TNF par les cellules mésangiales, cette induction est inhibée par la prostaglandine PGE2 [430]. Le TNFα peut également participer à l’atteinte rénale via le recrutement de leucocytes, l’accumulation de fibrine, la stimulation de lyse cellulaire, la stimulation de libération de substances vasoconstrictrices telles que l’endothéline [431, 432]. L’endothéline est un puissant vasoconstricteur, sa libération, très augmentée au cours du sepsis, semble être en partie responsable de l’hypertension glomérulaire parfois observée lors du choc septique [431, 433, 434] et contribue un temps au maintien de la filtration glomérulaire. Plusieurs travaux ont montré que le blocage pharmacologique des récepteurs de l’endothéline protége contre les lésions rénales associées au choc septique [435437]. La libération de NO par la NO-synthase inductible participe à l’altération de l’hémodynamique systémique. Cependant, au niveau rénal, le NO produit par la NOSi (stimulée au cours du sepsis) inhibe l’expression de la NOSe et la libération de NO « constitutif », et surtout régulé, au niveau rénal [438]. Cependant, l’administration d’endotoxine chez des souris invalidées pour la NOSi provoque quand même une réduction du DFG [439]. Cela suggère que ce phénomène n’est pas seul responsable de la 95 Partie III : choc endotoxinique et système kallicréine-kinine vasoconstriction à l’origine de la défaillance rénale. Le sepsis s’accompagne de lésions endothéliales qui peuvent réduire la capacité de la NOSe à contrecarrer les effets des agents vasoconstricteurs tels que la noradrénaline, l’endothéline ou l’angiotensine II. L’ensemble de ces observations démontre le rôle plutôt bénéfique de la NOSe au niveau rénal au cours du sepsis. Cette hypothèse a été confirmée par l’utilisation de souris transgéniques invalidées pour la NOSe. Dans ce modèle, une faible dose d’endotoxine, sans effet sur la fonction rénale de souris contrôles, provoque une diminution importante du DFG [440]. L’endotoxémie affecte les phénomènes de coagulation en provoquant un état procoagulant aggravé par le déficit d’activité de la eNOS. Cet état procoagulant au niveau glomérulaire, souvent associé à des microthromboses, participe à l’insuffisance rénale [441, 442]. Le sepsis s’accompagne également d’une augmentation du stress oxydant qui pourrait participer à la phase vasoconstrictrice de la défaillance rénale. En effet, bien que les taux d’enzymes anti-oxydantes endogènes ne varient pas ou même diminuent, l’apport d’antioxydants exogènes protège de la défaillance rénale et réduit la mortalité dans des modèles d’endotoxémie chez la souris [374]. 96 Partie III : choc endotoxinique et système kallicréine-kinine IV. CONTRIBUTION RECEPTEURS B1 SYSTEMIQUE ET PERSONELLE : ET B2 RENALE DANS AU IMPLICATION DES L’HEMODYNAMIQUE COURS DU CHOC ENDOTOXINIQUE EXPERIMENTAL Manuscrit n°4 Hemodynamic and renal involvement of B1 and B2 kinin receptors during the acute phase of endotoxin shock in mice. Seguin T, Buleon M, Destrube M, Ranera MT, Couture R, Girolami JP, Tack I. Int Immunopharmacol. 2008 Feb;8(2):217-21. Epub 2007 Aug 31. Le choc endotoxinique est une circonstance dramatique mais fréquente, surtout chez le diabétique, au cours de laquelle l’altération des fonctions rénales détermine largement le pronostic global du patient. Nous avons étudié les conséquences fonctionnelles rénales d’un choc endotoxinique induit par le lipopolysaccharide (LPS) chez des souris sauvages ainsi que des souris KOB1 ou KOB2. Chez les souris KOB1, l’hypotension, l’hypoglycémie, la diminution du débit de filtration glomérulaire ainsi que la mortalité consécutives à l’administration de LPS sont aggravées par rapport aux souris sauvages. L’induction de l’expression du RB1 au cours du choc endotoxinique aurait donc probablement un rôle bénéfique, du moins pendant les premières heures. Par ailleurs, nous n’avons pas mis en évidence de rôle protecteur du RB2 au cours du choc endotoxinique induit par le LPS, contrairement à ce que certains auteurs avaient proposé. 97 Hemodynamic and renal involvement of B1 and B2 kinin receptors during the acute phase of endotoxin shock in mice Th. Seguin a,b,1 , M. Buleon a,b,1 , M. Destrube a , M.T. Ranera a,b , R. Couture c , J.P. Girolami b,⁎, I. Tack a,b a Laboratoire de Physiologie, Faculté de Médecine, Rangueil, Toulouse, France INSERM U858, BP 84225, 313432 Toulouse Cedex 4, France c Département de Physiologie, Faculté de Médecine, Université de Montréal, Montréal, Québec, Canada H3CJ b Received 29 June 2007; received in revised form 9 August 2007; accepted 12 August 2007 KEYWORDS Septic shock; B1 kinin receptor; B1-kinin receptor null mice; Kidney function Abstract B1 kinin receptor (B1R) is up-regulated by endotoxins and thus may represent a therapeutic target in sepsis. We investigated the expression and role of B1R and B2R in the acute phase of lipopolysaccharide (LPS)-induced endotoxin shock in C57BL/6 mice (WT) and B1R and B2R knock out mice (B1KO, B2KO). B1R mRNA was enhanced from 6 to 48 h after LPS while B2R mRNA was further increased in B1KO. Maximal hypotension was found 24 h after LPS, and was more pronounced in B1KO, but was reduced in B2KO. Glomerular filtration rate was more reduced by LPS in B1KO than in WT and B2KO. Glycemia was reduced by LPS and particularly in B1KO and B2KO mice. Mortality was increased by LPS in B1KO. These data suggest that the up-regulated B1R plays, at least transiently, a significant beneficial role in acute LPS-induced hypotension. Conversely, supra activation of B2R could be also involved in the increased mortality observed in B1KO mice. © 2007 Elsevier B.V. All rights reserved. Sepsis is a major inflammatory reaction associated with a severe hypotension which is often responsible of acute renal failure [1]. Combination of sepsis and acute renal failure results in increase in mortality, reaching 70 to 80%. Therefore management of sepsis is a major clinical challenge in human diseases. Although the precise mechanism is still under investigation, it is well established that endotoxin production plays a ⁎ Corresponding author. E-mail address: [email protected] (J.P. Girolami). 1 Both authors contribute equally to this work. 1567-5769/$ - see front matter © 2007 Elsevier B.V. All rights reserved. doi:10.1016/j.intimp.2007.08.008 crucial role in the onset of sepsis. The hemodynamic hallmark of septic shock is a generalized arterial vasodilatation and a decreased perfusion pressure resulting in a detrimental drop in tissue perfusion. The arterial vasodilatation that characterizes sepsis results at least in part from the induction of nitric oxide synthase (iNOS) and thereby to the massive synthesis of nitric oxide. The hypotension leads to baroreceptor activation, increase in sympathetic outflow, release of arginine vasopressin and activation of the vasoconstrictor renin angiotensin system [2]. Although, these events are essential in maintaining the arterial perfusion pressure, they can exceed the initial target 218 Th. Seguin et al. a TA4000 Gould recorder), and to obtain blood samples. Urine was collected via an intra-vesical catheter. After surgery, a 30-min stabilization period was observed followed by a 60-min clearance period. Glomerular filtration rate (GFR) was measured by the inulin clearance and normalized for the body surface area, i.e.: 65 cm2 (Buleon personal communication). Effective renal plasma flow (RPF) was assessed by the PAH clearance. 1.4. Renal expression of B1 and B2 receptors Figure 1 Mortality 24 h after LPS injection in WT (n = 10), B1KO (n = 9) and B2KO (n = 9) mice. ⁎P b 0.05 versus wild-type group. and the resulting exaggerated distal vasoconstriction paradoxically favors acute renal failure. Another effect of endotoxins such as lipopolysaccharide (LPS) or interleukin-1β, is activation of the kallikrein–kinin system [3]. In this respect, it has been reported that blockade of B1 receptor [4] or the absence of B1 receptor [3,5] could attenuate LPS-induced hypotension. From these previous studies it can be hypothesized that the lack of B1 receptor activation may reduce hypotension and its consequences on renal functions during sepsis. Therefore, the aim of the present study was to investigate the role of B1 receptor during the early phase of LPS-induced endotoxin shock in a mice model. To achieve this goal, we have compared the decrease in blood pressure and the impact on renal function in wild type and B1- or B2-kinin receptor knock-out mice, following intra-peritoneal LPS administration. Renal tissue samples were taken under sterile condition, immediately stored at − 20 °C in appropriate buffer (RNAlater, QUIAGEN, S. A). mRNA were extracted using RNeasy kit (QUIAGEN) and further quantified by real time RT-PCR (Tacquam 7200 Applied Biosystem) as routinely processed in the laboratory [6], 18s RNA were used as internal control. Results are expressed as arbitrary units compared to values obtained with the wild type group. 2. Results 2.1. Mortality Twenty four hours after induction of endotoxin shock, mortality was 14.3% in B2KO mice (not significantly different from control) and 1. Materials and methods 1.1. Animals Male mice C57BL/6J, B1-kinin receptor null mice (B1KO), B2-kinin receptor null mice (B2KO) from Jackson Laboratories (USA) were used and housed in a temperature-controlled room on a 12 hour light–dark cycle. All procedures involving experimental animals were performed in accordance with the guiding principles for animal research. 18-week old mice were divided in three groups: 1) wild type strain (WT); 2) B1KO; 3) B2KO. Each group was divided in 2 subgroups: with and without an endotoxin shock, induced by a single i.p. administration of LPS (lipopolysaccharide E Coli type 0127B8; 1 mg/ kg body weight in saline). Blood pressure and renal expression of B1 and B2 receptors were determined at different intervals of time (6, 12, 24 and 48 h) after LPS administration, yet renal functions were studied at 24 h. 1.2. Mortality study Mice received an intraperitoneal injection of 10 mg/kg LPS. The number of death mice was determined 24 h after LPS injection. 1.3. Blood pressure and renal function Mean arterial blood pressure (MABP) and renal functions were measured under anesthesia (Inactin 150 mg/kg i.p.). Mice were tracheotomized, the jugular vein and the femoral artery were catheterized to ensure perfusion (Para-amino-hippuric acid 10 mg/ mL and Inutest 250 mg/mL in saline, at a flow rate of 0.1 ml/h), to monitor arterial blood pressure (via a Statham transducer coupled to Figure 2 Renal expression of B1 and B2 receptors. A) Time course expression of B1R mRNA after LPS administration in WT mice; B) expression of B2R mRNA 12 h after LPS administration (grey bars: without LPS, black bars: 12 h after LPS injection). Bars correspond to means ± SEM. Pair wise comparison of the groups (Bonferroni): ⁎P b 0.05 versus wild-type mice, †P b 0.05 versus same group before LPS administration, nd not detectable. Hemodynamic and renal involvement of B1 and B2 kinin receptors 219 induced a significantly more severe hypotension in B1KO than in WT (62.3 ± 1.7 mmHg versus 68.5 ± 2.2 mmHg, P b 0.05). Interestingly, LPS administration in B2KO mice had only a slight effect on blood pressure, leading to a significantly higher blood pressure than in WT mice with LPS (Fig. 3B). 2.4. Hematocrit and glycemia Hematocrit was not significantly different between the 3 groups (42.2 ± 2.1%) and not significantly impacted by LPS administration (Fig. 4A). At baseline, glycemia was significantly lower in B1KO mice than in WT mice (Fig. 4B). LPS administration induced a significant decrease in glycemia in all groups. This hypoglycemia was further reduced in B1KO (0.44 ± 0.04 g/L) and B2KO (0.83 ± 0.06 g/L) mice when compared to WT mice (1.35 ± 0.04 g/L). 2.5. Renal hemodynamic Figure 3 Blood pressure after LPS administration. A) Time course evolution of Mean arterial blood pressure in WT mice (n = 5); B) Mean arterial blood pressure in WT (n = 6), B1KO (n = 6) and B2KO (n = 6) mice 24 h after LPS administration. Bars correspond to means ± SEM. Pair wise comparison of the groups (Bonferroni): ⁎P b 0.05, ⁎⁎P b 0.01 versus wild-type mice; †P b 0.05, ††P b 0.01 versus same group before LPS administration. There was no difference between the different genotypes for blood pressure before LPS administration (ANOVA= ns). There was not significant difference between WT, B1KO and B2KO mice for the GFR and the RPF. In WT mice, LPS induced a significant decrease in GFR (133.4 ± 18.3 versus 229 ± 18 μL/min/65 cm2 in control, P b 0.05), RPF (616.8 ±128.7 versus 928 ± 84 μL/min/65 cm2 in WT, P b 0.05), and FF (17.8 ± 1.5 versus 22.1 ± 0.7% in WT, P b 0.05) (Fig. 5). However, in B1KO, the decrease in GFR after LPS was significantly greater (75.2 ± 10.7 μL/min/65 cm2) than in WT mice, whereas the decrease in RPF and FF was similar. B2KO mice showed a similar decrease in GFR and RPF than that of WT mice. At baseline, FF was slightly lower in B2KO than in the 2 other groups reached 44.4% in B1KO mice compared to WT group which did not show any lethality at the dose of LPS used (Fig. 1). 2.2. Renal expression of B1 and B2 receptors In WT mice, renal expression of B1R mRNA increased as soon as 6 h after LPS administration, reached a maximum (2.5 times basal level) at 12 h and remained at this level up to 48 h (Fig. 2A). LPS administration also induced an increase in B2R mRNA expression in WT and B1KO mice which was proportionally higher than that of the B1R. Invalidation of B1R resulted in a spontaneous over-expression of B2R mRNA under basal conditions and subsequently showed a stronger increase in B2R mRNA during endotoxin shock than in WT (Fig. 2B). 2.3. Blood pressure Without LPS, MABP in B1KO and B2KO mice was not significantly different from WT (85.4 ± 2.2 mmHg, data not shown). In WT mice, MABP decreased from 12 to 24 h after LPS administration (64.1 ± 2.9 versus 79.0 ± 3.3 mmHg) (Fig. 3A). Indeed MABP has been measured at 6, 12, 24 and 48 h for all genotype but we observed that the more pronounced difference versus respective controls was found 24 h after LPS in all groups, as shown in Fig. 3B. Administration of LPS Figure 4 Hematocrit and glycemia 24 h after LPS administration in WT (n = 6), B1KO (n = 6) and B2KO (n = 6) mice. A) Hematocrit; B) glycemia. Grey bars: without LPS; black bars: 24 h after LPS administration. Bars correspond to means ± SEM. Pair wise comparison of the groups (Bonferroni): ⁎P b 0.05, ⁎⁎P b 0.01 versus wild-type mice; †P b 0.05, ††P b 0.01 versus same group before LPS administration. 220 Figure 5 Renal functions and hemodynamic parameters after LPS administration WT (n = 6), B1KO (n = 6) and B2KO (n = 6). A) Glomerular filtration rate; B) renal plasmatic flow; C) filtration fraction. Grey bars: without LPS; black bars: 24 h after LPS administration. Bars correspond to means ± SEM. Pair wise comparison of the groups (Bonferroni): ⁎P b 0.05, ⁎⁎P b 0.01 versus wild-type mice; †P b 0.05, ††P b 0.01 versus same group before LPS administration. There was no difference for GFR and RPF between the different genotypes before LPS administration, but there was a slight difference between WT and B2KO mice for the filtration fraction (ANOVA and post-hoc test P b 0.01). (21.2 ± 0.7% versus 25.2 ± 0.9% in WT, P b 0.05) whereas after LPS it appeared significantly higher (27.9 ± 3.1% versus 17.8 ± 1.5% in WT after LPS, P b 0.01). 3. Conclusions Several genes encoding for cytokines, cell adhesion molecules and also kinin receptors are quickly up-regulated during sepsis [7]. However the functional relevance of this up-regulation in the physiopathological mechanism of sepsis remains to be clarified. Whether blockade or activation of kinin B1R and/or B2R can modulate the severity of LPSinduced septic shock in relation with effects on renal functions remains unclear. Th. Seguin et al. Our results clearly show that B1R is strongly up-regulated by LPS in WT mice, an effect associated with a decrease in blood pressure. Because the B1R is strongly up-regulated in inflammatory processes and after LPS administration, it has been suggested that blockade of B1R may exert protective effect in the treatment of the septic shock [5]. Indeed, the same group observed that the initial hypotension following LPS was reduced in mice lacking the B1R [8]. However, this observation was contradicted by a recent study [9] showing a worsening of LPS-induced hypotension in the same model. Finally, our results support the hypothesis that B1R activation is associated initially with a protective effect against LPSinduced hypotension. Such discrepancy can be explained by important differences in experimental conditions. The group of Pesquero had observed a reduction in LPS-induced hypotension in B1R deficient mice only 35 min after a bolus of LPS given intravenously whereas our observation was performed 24 h after intraperitoneous injection of LPS. Recently the group of Pesquero [8] has revisited this point by using mice deficient for both kinin receptors and they still concluded that these mice were protected from endotoxin hypotension. Indeed other previous works using only WT mice have suggested that up-regulation of B1R during LPS shock may be an important mechanism of host defense and may not serve the same purpose as the B2R [10]. Therefore, if the B1R protects against acute hypotension, that conclusion suggests that B1R activation is associated with vasoconstriction, at least during the initial phase. In this respect, it was reported that BK-induced vasoconstriction was increased in lungs after LPS exposure [11] and that effect was blunted by cyclooxygenase inhibitor and B2R antagonist. Nevertheless, investigating the respective role of B1R and B2R using genetically modified animals must be interpreted with caution since it does not simply reflect the absence of a given receptor. From our work, it is obvious that the B2R is up-regulated in B1KO mice. Thus the functional effects that we observed result from both the absence of B1R and the over-expression of the B2R. This could provides an additional explanation for the worsening of renal failure and hypoglycemia in the B1KO group after LPS. Finally, the renal hemodynamic impact of LPS in B1KO and B2KO mice need some comments. The decrease in GFR was worsened in B1KO mice compared to WT. In a previous report in rats [12,13] we have demonstrated that LPS-induced B1R expression in afferent and efferent arterioles and along the nephron could influence renal hemodynamic. In this respect, it has been reported that B1R activation causes renal vasoconstriction [14,15] potentially decreasing the GFR. Thus, one could have expected the lack of B1R to be rather protective against renal failure. However, the deeper decrease in MABP observed in B1KO mice is sufficient to explain the worsening of renal failure in B1KO mice after LPS. In B2KO mice, LPS only tend to decrease the GFR despite a significant decrease in RPF, leading to an increase in FF. This effect could be explained by both the lack of B2R vasodilatory effect on efferent arterioles and an increase in efferent vascular tone as a result of B1R overexpression, an effect consistent with the increase in FF observed in this group. In conclusion, the present work underlines that, in the model of LPS-induced endotoxin shock, the absence of B1R is associated with a marked hypotension and a subsequent Hemodynamic and renal involvement of B1 and B2 kinin receptors worsening of renal failure, hypoglycemia and mortality. This claims against the blockade of B1R at the early phase of the septic shock. References [1] Schrier RW. Acute renal failure and sepsis. N Engl J Med Jul 8 2004;351(2):159–69 [Review]. [2] Chen P. Vasopressin: new uses in critical care. Am J Med Sci Sep 2002;324(3):146–54 [Review]. [3] McLean PG, Perretti M, Ahluwalia A. Kinin B1 receptors and the cardiovascular system: regulation of expression and function. Cardiovasc Res 2000;48:194–210. [4] McLean PG, Perretti M, Ahluwalia A. Inducible expression of the kinin B1 receptor in the endotoxemic heart: mechanisms of des-Arg9bradykinin-induced coronary vasodilation. Br J Pharmacol 1999;128:275–82. [5] Pesquero JB, Araujo RC, Heppenstall PA, Stucky CL, Silva JA, Walther T, et al. Hypoalgesia and altered inflammatory responses in mice lacking kinin B1 receptors. Proc Natl Acad Sci U S A 2000;97:8140–5. [6] Schanstra JP, Duchene J, Praddaude F, Bruneval P, Tack I, Chevalier J, et al. Decreased renal NO excretion and reduced glomerular tuft area in mice lacking the bradykinin B2 receptor. Am J Physiol Heart Circ Physiol 2003;284:H1904–8. [7] Sharif O, Bolshakov VN, Raines S, Newham P, Perkins ND. Transcriptional profiling of the LPS induced NF-kappaB response in macrophages. BMC Immunol 2007;12(8):1. 221 [8] Cayla C, Todiras M, Iliescu R, Saul VV, Gross V, Pilz B, et al. Mice deficient for both kinin receptors are normotensive and protected from endotoxin-induced hypotension. FASEB J 2007;21:1689–98. [9] Kakoki M, McGarrah RW, Kim HS, Smithies O. Bradykinin B1 and B2 receptors both have protective roles in renal ischemia/ reperfusion injury. Proc Natl Acad Sci U S A 2007;104:7576–81. [10] Siebeck M, Spannagl E, Schorr M, Stumpf B, Fritz H, Whalley ET, et al. Effect of combined B1 and B2 kinin receptor blockade in porcine endotoxin shock. Immunopharmacology 1996;33:81–4. [11] Fischer LG, Hollmann MW, Horstman DJ, Rich GF. Cyclooxygenase inhibitors attenuate bradykinin-induced vasoconstriction in septic isolated rat lungs. Anesth Analg 2000;90:625–31. [12] Marin-Castano ME, Schanstra JP, Praddaude F, Pesquero JB, Ader JL, Girolami JP, et al. Differential induction of functional B1-bradykinin receptors along the rat nephron in endotoxin induced inflammation. Kidney Int 1998;54:1888–98. [13] Schanstra JP, Marin-Castano ME, Praddaude F, Tack I, Ader JL, Girolami JP, et al. Bradykinin B(1) receptor-mediated changes in renal hemodynamics during endotoxin-induced inflammation. J Am Soc Nephrol 2000;11:1208–15. [14] Guimaraes JE, Francis GE, Berney JJ, Wing MA, Hoffbrand AV. Differentiation of human acute myeloid leukaemia cells in response to exogenous and endogenous stimuli: different patterns of response suggested by a bioassay system. Leuk Res 1985;9:869–78. [15] Yu H, Carretero OA, Juncos LA, Garvin JL. Biphasic effect of bradykinin on rabbit afferent arterioles. Hypertension 1998;32: 287–92. Partie III : choc endotoxinique et système kallicréine-kinine V. SYSTEME KALLICREINE-KININE ET CHOC SEPTIQUE, NOUVEAU MODELE, NOUVEAUX OUTILS ET NOUVELLES PERSPECTIVES Le LPS est une endotoxine libérée par les bactéries à Gram négatif. L’administration de LPS chez la souris correspond donc à un modèle de choc endotoxinique. Or les pathogènes les plus fréquemment à l’origine de chocs septiques chez l’homme sont en fait souvent les bactéries à Gram positif (celles-ci sont à l’origine d’environ 52 % des chocs septiques contre 36% pour les bactéries à Gram négatif) [367]. De plus, l’absence de virulence bactérienne ne correspond pas à la situation réelle du choc septique. C’est pourquoi nous développons actuellement dans le laboratoire le modèle de choc septique par ponction cæcale qui se rapproche plus de la situation observée chez l’homme. L’utilisation d’antagonistes, et d’agonistes des récepteurs B1 et B2, conjointement aux modèles d’invalidation génétique de l’un ou l’autre des récepteurs, devrait permettre d’approfondir l’étude de l’implication du SKK dans la défaillance rénale associée au sepsis. L’implication des récepteurs de la bradykinine dans l’hyperperméabilité capillaire, qui altère le pronostic du choc septique, sera étudiée par l’utilisation du bleu d’Evan dans le modèle du choc septique par ponction caecale. 98 Conclusions - Perspectives CONCLUSIONS - PERSPECTIVES La synthèse des résultats de nos travaux montre que le blocage du récepteur B2 de la bradykinine réduit sensiblement les effets protecteurs des IEC au cours de la néphropathie diabétique expérimentale. Ces résultats et ceux de la littérature apportent des arguments de plus en plus convaincants en faveur d’un effet néphroprotecteur de l’activation du RB2. Cette réflexion a fait l’objet d’une revue plus approfondie faisant le point sur l’état des connaissances actuelles concernant le rôle potentiellement néphroprotecteur du RB2 (Manuscrit n°5, [164]). Cependant, l’hypothèse d’un rôle néphroprotecteur du RB2 repose essentiellement, à ce jour, sur l’observation d’une aggravation lors de l’absence du RB2 ou de son blocage pharmacologique. Il est donc nécessaire de démontrer directement que l’activation du RB2 peut avoir les effets bénéfiques supposés. Plusieurs agonistes du RB2 ont été développés. Ces agonistes et les indications pour lesquelles ils ont été testés sont résumés dans le Tableau 3. Certains d’entre eux, en particulier le RMP-7 ont déjà fait l’objet d’études approfondies. Cette molécule est utilisée en clinique (Cereport), co-administrée avec des agents anti-cancéreux, elle facilite leur passage de la barrière hémato-encéphalique et donc leur action au niveau du cerveau [443, 444]. 99 Conclusions - Perspectives Tableau 3 : Agonistes existants du récepteurs B2 de la bradykinine et utilisation Agoniste Indications testées Références RMP-7 (Cereport) Aide à la chimiothérapie des gliomes [443, 444] B9870 Agoniste partiel B1/B2 : anticancéreux ? [445, 446] FR 190 997 Caractérisation in vitro Peu efficace in vivo [447] LF 15-0943 Caractérisation in vitro Pas testé in vivo [448] B9972 Hypertension pulmonaire, hypertrophie cardiaque [165] Phe8-Ψ(CH2-NH)-Arg9-BK En cours de test …… Agoniste B2 : effets bénéfiques, effets délétères ? Actuellement, l’utilisation d’agoniste B2 comme agent thérapeutique au cours de la néphropathie diabétique n’a pas encore été testée. Cependant, un travail récent [40] a montré que l’administration chronique de BK réduit la fibrose rénale dans un modèle d’hypertension artérielle chez le rat Dahl sensible au sel. Des accords avec un groupe de chimistes peptidiques nous ont permis d’obtenir un des premiers agonistes non peptidiques (donc résistant à la dégradation endogène) de la bradykinine utilisable in vivo : la Phe8-Ψ(CH2-NH)-Arg9-BK. Nous avons prévu de tester cet agoniste dans le cadre de la néphropathie diabétique expérimentale que développe la souris db/db. Du fait des propriétés physiologiques de la bradykinine, l’administration d’un agoniste de son récepteur B2 pourrait être responsable des effets secondaires tels qu’une vasodilatation systémique prolongée, une hyperalgie, voire même la perturbation de l’état d’oxydo-réduction avec des effets pro-oxydants [449-451]. Ces effets sont en cours d’évaluation dans le 100 Conclusions - Perspectives laboratoire avant d’envisager l’utilisation de cet agoniste pour un traitement chronique au cours de la néphropathie diabétique chez la souris db/db. Ce modèle présente toutefois une vaso-réactivité persistante inhabituelle au cours du diabète chez l’Homme. Afin de s’affranchir de l’impact hémodynamique potentiel du RB2 et de vérifier l’effet anti-fibrosant direct de son agoniste, il sera intéressant de pouvoir étudier son efficacité finale dans des modèles présentant une perte des capacités de vaso-relaxation identiques au diabète humain. Une autre possibilité d’activation de ce système pourrait être envisagée en utilisant l’angiotensine 1-7 qui induit des effets opposés à ceux de l’angiotensine II (Figure 4). Bien que les voies de signalisation de l’angiotensine 1-7 soient encore mal identifiées [145, 146], la participation du RB2 est bien établie car plusieurs effets de l’angiotensine 1-7 sont abolis par l’antagoniste du RB2 [148, 149]. L’importance de la prévention des effets bénéfiques du traitement par les IEC par le blocage du RB2 chez la souris db/db, suggère une forte réactivité de ce modèle à la bradykinine. On peut donc s’interroger quant à l’origine de cette possible augmentation de réactivité à la bradykinine dans les tissus diabétiques et en particulier au niveau rénal. Il reste à savoir si cet effet est spécifique du modèle de la souris db/db qui présente une faible activité de l’ECA et une forte activité de l’ECA2 [452] ou s’il est généralisable. Cette possibilité mérite d’être explorée car elle pourrait bien sûr avoir des conséquences cliniques importantes. Des études récentes ont révélé l’existence chez l’Homme d’un polymorphisme du RB2. Ce polymorphisme dit BE1 [453] est associé avec la présence (+9) ou l’absence (-9) d’une séquence de 9 pb. Ce polymorphisme apparaît associé à l’importance de la vasodilatation en réponse à la bradykinine mais non à des agonistes non spécifiques du RB2 [454]. Le phénotype BE1 +9/+9 est associé à une augmentation des résistances vasculaires et 101 Conclusions - Perspectives des risques cardiovasculaires [455]. Par contre, le phénotype BE1 +9/-9 augmente la réponse vasodilatatrice médiée par le RB2. La survenue d’un phénotype diabétique sur un terrain génétique comportant un tel polymorphisme pourrait constituer une circonstance favorable en déterminant une plus grande susceptibilité des sujets à l’effet néphroprotecteur de la bradykinine. 102 Conclusions - Perspectives Manuscrit n° 5 Bradykinine et néphroprotection : pourquoi, comment, perspectives. Marie Buléon, Marion Mehrenberger, Christiane Pécher, Réjean Couture, Ivan Tack et Jean-Pierre Girolami. Med Sci (Paris). 2007 Dec;23(12):1141-7. Review. French. De nombreuses maladies comme l’hypertension artérielle, le diabète et l’obésité aboutissent à des complications rénales généralement irréversibles soulignant l’intérêt d’améliorer les stratégies de néphroprotection disponibles. En plus du contrôle de la glycémie chez le patient diabétique, seul le blocage du système rénine angiotensine (SRA) s’avère capable de retarder l’aggravation de la glomérulosclérose et l’évolution vers l’insuffisance rénale terminale. L’inhibition du SRA repose sur l’utilisation d’inhibiteurs de l’enzyme de conversion de l’angiotensine II (IEC) et d’antagonistes du récepteur AT1 de l’angiotensine II (ARA2). Pendant très longtemps, les effets de ces deux classes de médicaments ont été attribués principalement au blocage de la synthèse ou des effets de l’angiotensine II. Un grand nombre de travaux récents tant in vitro que in vivo s’accordent pour attribuer également une part de leurs effets néphroprotecteurs à l’activation du récepteur B2 de la bradykinine (RB2). Un argument convaincant est le développement d’une glomérulosclérose plus sévère chez les souris n’exprimant plus le RB2. Ces effets néphroprotecteurs du RB2 pourraient résulter d’une réduction de la protéinurie, de la fibrose initialement glomérulaire puis interstitielle, de la prolifération cellulaire ainsi que du stress oxydant par plusieurs mécanismes déjà bien documentés. Ces données suggèrent que l’activation directe et/ou indirecte du RB2 peut désormais représenter un nouveau concept thérapeutique dans le traitement des néphropathies. 103 MEDECINE/SCIENCES 2007 ; 23 : •••-••• Bradykinine et néphroprotection Pourquoi ? Comment ? Perspectives Les lésions rénales sont souvent associées à la progression de maladies comme l’hypertension artérielle ou le diabète. Elles sont caractérisées par une hyperplasie, une hypertrophie cellulaire et une accumulation de matrice extracellulaire initialement localisée dans le glomérule. Ces lésions aboutissent à la fibrose du glomérule ou glomérulosclérose, la fibrose interstiM/S n° 12, vol. 23, décembre 2007 REVUES Marie Buléon, Marion Mehrenberger, Christiane Pécher, Françoise Praddaude, Réjean Couture, Ivan Tack, Jean-Pierre Girolami M. Buléon, M. Mehrenberger, C. Pécher, F. Praddaude, I. Tack, J.P. Girolami : Inserm, U858/I2MR, Remodelage rénal et cardiaque, 1, avenue Jean Poulhes, BP 84225, 31432 Toulouse Cedex 4, France. Université de Toulouse III Paul Sabatier, Institut de Médecine Moléculaire de Rangueil, 31000 Toulouse, France. Jean-Pierre.Girolami@ toulouse.inserm.fr R. Couture : Département de Physiologie, Faculté de médecine, Université de Montréal, CP 6128, Succursale Centre-ville, Montréal, Québec, H3C 3J7 Canada. SYNTHÈSE > De nombreuses maladies comme l’hypertension artérielle, le diabète et l’obésité aboutissent à des complications rénales généralement irréversibles soulignant l’intérêt d’améliorer les stratégies de néphroprotection disponibles. Outre le contrôle de la glycémie chez le patient diabétique, seul le blocage du système rénine angiotensine (SRA) s’avère capable de retarder l’aggravation de la glomérulosclérose et l’évolution vers l’insuffisance rénale terminale. L’inhibition du SRA repose sur l’utilisation d’inhibiteurs de l’enzyme de conversion de l’angiotensine II (IEC) et d’antagonistes du récepteur AT1 de l’angiotensine II (ARA2). Pendant très longtemps, les effets de ces deux classes de médicaments ont été attribués principalement au blocage de la synthèse ou des effets de l’angiotensine II. Un grand nombre de travaux récents tant in vitro qu’in vivo s’accordent pour attribuer également une part de leurs effets néphroprotecteurs à l’activation du récepteur B2 de la bradykinine (RB2). Un argument convaincant est le développement d’une glomérulosclérose plus sévère chez les souris n’exprimant plus le RB2. Ces effets néphroprotecteurs du RB2 pourraient résulter d’une réduction de la protéinurie, de la fibrose initialement glomérulaire puis interstitielle, de la prolifération cellulaire ainsi que du stress oxydant par plusieurs mécanismes déjà bien documentés. Ces données suggèrent que l’activation directe et/ou indirecte du RB2 peut désormais représenter un nouveau concept thérapeutique dans le traitement des néphropathies. < tielle et l’insuffisance rénale. Le blocage du système rénine-angiotensine (SRA) par les inhibiteurs de l’enzyme de conversion (IEC) ou par les antagonistes du récepteur AT1 de l’angiotensine II (ARA2) s’avère la meilleure stratégie thérapeutique [1] pour ralentir l’évolution et la sévérité de la glomérulosclérose. Cette revue analyse les dernières données relatives aux mécanismes de ces effets protecteurs ainsi que de nouvelles interconnexions entre le SRA et le système kallicréine-kinines (SKK), afin de mieux situer un rôle du SKK en physiopathologie rénale. Pourquoi les kinines seraient-elles néphroprotectrices ? Les travaux initiaux décrivant les actions vasodilatatrice, diurétique et natriurétique de la bradykinine (BK) ont suggéré que l’inactivation du SKK favoriserait l’hypertension artérielle. Le SKK est donc apparu comme un système de défense contre le SRA dont l’activation reconnue est à l’origine de nombreuses maladies rénales et vasculaires. Toutefois, la démonstration d’un rôle pathogénique et surtout le concept d’une stratégie thérapeutique s’appuyant sur le SKK ont mis du temps à s’établir. 1 de substrats hépatiques circulants, les kininogènes, par des sérine protéases, les kalliKininogènes Angiotensinogène créines tissulaires. La synthèse de kallicréine tissulaire a été démontrée dans la paroi de Kallicréines Rénine certaines artères. In vivo, la BK est rapideIVP ment inactivée par deux voies enzymatiques Angiotensine I Bradykinine 1-9 Endopeptidase neutre principales, impliquant les kininases I et II. Enzyme de conversion La kininase I génère la des-Arg9-BK qui est Kininase I l’agoniste sélectif du récepteur B1 (RB1), IEC alors que la BK est l’agoniste préférentiel Angiotensine II Bradykinine 1-8 (des-Arg9-BK) du récepteur B2 (RB2). Les deux récepteurs Bradykinine 1-7 ARA2 sont des récepteurs à sept domaines transinactive membranaires, couplés à une protéine G et vasoconstriction AT1 AT2 associés à l’activation d’un réseau de signaB2 B1 lisation complexe [2]. La kininase II, plus vasodilatation connue sous le nom d’enzyme de conversion de l’angiotensine II, et sur laquelle vont agir prolifération, apoptose, trophicité, perméabilité les IEC, est une métalloprotéase à doigts de maladies cardiaques, vasculaires, et rénales zinc capable d’engendrer l’angiotensine II inflammation, douleur et/ou de dégrader la BK. L’implication de la BK dans l’effet des IEC reste une source de Figure 1. Organisation des systèmes rénine-angiotensine et kallicréine-kinines. Les principales cibles débats contradictoires, souvent explicables d’actions pharmacologiques des inhibiteurs de l’enzyme de conversion (IEC), des antagonistes du réceppar les méthodologies de mesure de la BK, teurs AT1 de l’angiotensine II (ARA2) et des inhibiteurs des vasopeptidases (IVP) sont indiquées. celles des prélèvements sanguins, ainsi que par les conditions physiopathologiques et expérimentales (âge, régimes alimentaires, imprégnation Rôle de la bradykinine dans le mécanisme d’action des IEC hormonale, hypertension) qui induisent un niveau d’activité Les premiers arguments en faveur du rôle néphroprotecteur de la BK sont variable du SKK. indirects et reposent sur les effets bénéfiques des traitements par les IEC Un nouveau mécanisme additionnel d’action des IEC dans l’hypertension artérielle et la néphropathie diabétique. Les IEC agissent reposerait sur la formation d’un complexe membranaire à la fois sur le SRA vasoconstricteur et le SKK vasodilatateur. L’organisation entre l’enzyme de conversion de l’nangiotensine (ECA) de ces systèmes est représentée dans la Figure 1. L’inhibition de l’enzyme de et le RB2 (complexe ECA/RB2) qui augmenterait la senconversion a pour conséquences d’inhiber la production d’angiotensine II sibilité du RB2 pour la bradykinine [3]. vasoconstrictrice mais également de réduire la dégradation de BK vasodila- Par ailleurs, le traitement par les IEC entraîne l’accumutatrice (Figure 1). La BK est un nonapeptide issu de l’hydrolyse enzymatique lation d’angiotensine I dégradée en angiotensine 1-7 par plusieurs enzymes. L’angiotensine 1-7 induit des effets hypotenseurs et vasodilatateurs Type État Type de Effet Références cellulaire d’activation récepteur BK qui s’opposent à ceux de l’angiotensine II par des mécanismes inhibés par des antagoMésangial Quiescence B2 prolifération [65-67] nistes du RB2, impliquant donc l’activation Muscle lisse Quiescence B2 prolifération [68] du RB2 [4]. L’angiotensine 1-7 peut se comporter comme un inhibiteur de l’ECA et donc Épithelial Quiescence B2 prolifération [69,70] augmenter la biodisponibilité de la BK mais Mésangial IGF B2 anti-prolifératif [71] également agir sur le complexe ECA/RB2 et diminuer la désensibilisation du RB2 [5]. Endothelial Glucose B2 anti-prolifératif [72] Ces voies de formation de l’angiotensine Muscle lisse PDGF B2 anti-prolifératif [73,74] 1-7, associées à la stimulation potentielle du RB2, peuvent permettre de définir de Épithélial EGF, IGF-I B2 anti-prolifératif [75] nouvelles voies thérapeutiques (Figure 2). Fibroblaste EGF, PDGF B2 anti-prolifératif [37] Bien que le mécanisme d’action des IEC soit Tableau I. Principaux travaux in vitro sur l’effet prolifératif ou antiprolifératif de la bradykinine. complexe, l’implication des récepteurs de IGF : insulin growth factor ; PDGF : platelet derived growth factor ; EGF : epidermal growth factor la BK ne peut plus être mise en doute. Les 2 M/S n° 12, vol. 23, décembre 2007 Alors que l’on savait que la BK pouvait intervenir dans le mécanisme d’action des IEC, les ARA2 apparaissaient comme une alternative s’affranchissant d’effets dépendants de la BK. Cette affirmation n’est plus absolue car des travaux démontrent des interactions possibles et suggèrent de fortes similitudes entre leurs mécanismes d’action (Figure 2). En effet, alors que les IEC inhibent la formation d’angiotensine II et la dégradation de la BK, favorisant ainsi l’activation du RB2, les ARA2 bloquent l’action de l’angiotensine II sur le récepteur AT1 et révèlent les effets du récepteur AT2. Si Possibilités d’activation du RB2 durant un traitement par un IEC ou un ARA2 Angiotensinogène Kininogènes Angiotensine I EPN,PEP ECA IEC Angiotensine II ARA2 a Bradykinine e c AT1 AT2 b PCP,PEP,ECA2 Angiotensine 1-7 d B2 B2 Figure 2. Possibilités d’interactions entre les récepteurs de l’angiotensine II et l’activation du RB2. 1. Durant un traitement par un IEC : (A) l’IEC bloque la formation d’angiotensine II et inhibe la dégradation de la BK favorisant l’activation du RB2, (B) certains IEC pourraient avoir une action directe sur l’activation du RB2 en formant un complexe. En l’absence de formation d’angiotensine II, il y a formation directe d’angiotensine 1-7 qui peut diminuer la dégradation de la bradykinine (C), mais aussi stimuler directement le RB2 (D). 2. Durant un traitement par un ARA2. Le blocage du récepteur AT1 va révéler l’action de l’angiotensine II sur le récepteur AT2 dont l’activation est associée à celle de la kallicréine (E) entraînant la formation de bradykinine et l’activation du RB2. Suite à l’accumulation d’angiotensine II dont la formation n’est pas bloquée comme c’est le cas en présence d’un IEC, on va observer une formation accrue d’angiotensine 1-7 qui va aussi renforcer la stimulation du RB2 (C et D). M/S n° 12, vol. 23, décembre 2007 REVUES Rôle de la BK dans le mécanisme d’action des antagonistes du récepteur AT1 de l’angiotensine : relations entre récepteur AT2 et BK l’on a longtemps pensé que l’angiotensine II était uniquement vasoconstrictrice, des travaux récents montrent que l’activation du récepteur AT2 par l’angiotensine II induit des effets vasodilatateurs en mettant en jeu une signalisation impliquant une synthèse accrue de BK et une activation du RB2 [7]. La relation entre l’activation du récepteur AT2 et la production de BK a été confirmée chez la souris surexprimant le récepteur AT2. L’activation du récepteur AT2 entraîne une diminution du pH intracellulaire qui active la kallicréine, induisant ainsi une production accrue de bradykinine aboutissant à la stimulation du RB2 [8]. Enfin, le récepteur AT2 peut être aussi stimulé par l’angiotensine 1-7 [9]. Il a été démontré dans plusieurs modèles que la vasodilatation, dépendante de l’endothélium et induite par l’angiotensine II est fortement réduite par un antagoniste du RB2 [10]. De même, la surexpression du récepteur AT2 réduit la fibrose périvasculaire cardiaque induite par la perfusion d’angiotensine II, un effet dépendant du RB2 supprimé par un antagoniste du RB2 [11]. L’activité anti-fibrosante du récepteur AT2 ne repose toutefois pas exclusivement sur l’activation du RB2 car une stimulation de la formation de NO par le récepteur AT2 a été démontrée chez les souris n’exprimant pas le RB2 [12]. L’activation du récepteur AT2 est capable de s’opposer à certains effets de l’AT1 en stimulant la production de GMP cyclique via un mécanisme partiellement dépendant des kinines. A l’instar des IEC, les ARA2 peuvent donc activer également le RB2. Ces interactions sont schématisées dans la Figure 2. SYNTHÈSE effets bénéfiques des IEC sont souvent atténués par le blocage du RB2 par des antagonistes [6]. L’activation du RB2 par les IEC peut se faire par plusieurs mécanismes intriqués et additionnels : inhibition de la dégradation de la BK, mais également formation d’angiotensine 1-7 et formation d’un complexe protéique ECA/RB2. Bradykinine et néphro-protection : des arguments récents encore plus convaincants Des preuves expérimentales très fortes en faveur d’un rôle néphroprotecteur de la BK ont été apportées par des études faites chez des souris génétiquement modifiées. Les souris exprimant de multiples copies de l’ECA, c’est-à-dire capables de dégrader de façon accrue la BK et d’aboutir ainsi à une très faible activation du RB2 [13], ainsi que les souris n’exprimant plus le RB2 [14], développent une néphropathie diabétique plus sévère que la souche sauvage. De même, la fibrose interstitielle se développant après une obstruction urétérale est aggravée chez la souris n’exprimant plus le RB2 [15]. Ces résultats suggèrent que l’absence d’expression du RB2 favorise l’aggravation des lésions rénales. La démonstration définitive d’un effet néphroprotecteur de la BK devra établir que le blocage pharmacologique du RB2 aggrave la néphropathie diabétique et, inversement, que l’activation du RB2 est capable de réduire l’évolution de cette pathologie. Nous avons récemment documenté le premier aspect chez la souris NOD (non 3 obese diabetic) qui développe une glomérulosclérose accélérée au cours du vieillissement (Marie Buléon, communication personnelle). Dans cette A étude, la glomérulosclérose est prévenue par un traitement chronique de 3 mois avec un IEC, impliquant l’activation du RB2 (Figure 3). Ces résultats sur le blocage pharmacologique du RB2 sont parfaitement cohérents avec ceux obtenus chez les Effet du blocage du récepteur B2 sur la glomérulosclérose de la souris NOD souris qui n’expriment plus le RB2. 23 semaines 8 semaines Comment la BK pourrait-elle exercer des effets néphroprotecteurs ? Principalement via le récepteur B2 ? 23 semaines + IEC 23 semaines + IEC + antag B2 B * Volume mésangial ( % du volume glomérulaire) * * 14 10 IEC Antag B2 8 23 23 23 âge (semaines) - - + + - - - + Figure 3. Effet du blocage du récepteur B2 dans l’apparition de la glomérulosclérose (GS) diabétique chez la souris NOD. Cette glomérulosclérose est évaluée par l’augmentation de l’aire mésangiale révélée par la coloration à l’acide périodique de Schiff (A) et quantifiée par analyse de surface (B). Par rapport aux souris NOD jeunes, âgées de 8 semaines (1), le volume du mésangium est plus abondant chez les souris adultes de 23 semaines (2). Chez les souris adultes traitées depuis l’âge de 8 semaines par un inhibiteur de l’enzyme de conversion (IEC), le volume mésangial reste sensiblement identique à celui des souris jeunes (3). En revanche, le traitement simultané IEC + antagoniste du récepteur B2 empêche l’inhibition de l’expansion mésangiale par l’IEC (4). La GS apparaît chez la souris adulte de 23 semaines. Elle est très significativement ralentie par un traitement chronique entre la 8è et la 23è semaine avec un IEC. L’action bénéfique de l’IEC est très significativement réduite en présence d’antagoniste du RB2 indiquant que l’action du RB2 est très impliquée dans l’effet anti-GS de l’IEC. 4 M/S n° 12, vol. 23, décembre 2007 La BK participerait à la réduction de la protéinurie L’apparition de traces d’albumine (microalbuminurie) dans les urines est un signe précoce d’altération de la filtration glomérulaire. La réduction de cette micro-albuminurie est considérée comme un index d’efficacité de traitements néphroprotecteurs. Les IEC réduisent la protéinurie dans plusieurs situations. Bien que les premiers travaux dans un modèle de néphrose toxique aient montré une absence de participation de la BK, chez le rat diabétique, la réduction de la protéinurie par un IEC est atténuée par le blocage pharmacologique du RB2 [16]. Comment la protéinurie pourrait-elle être réduite par la BK ? Le polymorphisme du gène de RB2 apparaît comme un marqueur de susceptibilité de progression de la néphropathie diabétique ; le polymorphisme +/+ de l’exon 1 du RB2 serait associé à une faible excrétion d’albumine, alors qu’une élévation du rapport albumine/créatinine est observée dans le polymorphisme +/- [17]. L’absence d’expression du RB2 est associée à une augmentation importante de l’expression de la néphrine et de la megsine lors de l’apparition du diabète [14]. L’expression de ces deux protéines est importante pour la stabilité du filtre glomérulaire. Une modification de l’expression de la néphrine est observée dans le syndrome néphrotique finlandais caractérisé par une très forte protéinurie en rapport avec une mutation homozygote du gène NPHS1. La néphrine mutée est associée à un détachement des podocytes pouvant conduire à une altération précoce du filtre glomérulaire. Par ailleurs, une augmentation de la néphrine a été aussi démontrée lors de l’instauration La BK active ou inhibe la prolifération et l’hypertrophie cellulaire Les premiers travaux effectués sur plusieurs types cellulaires cultivés en l’absence de facteurs de croissance ont montré un effet prolifératif de la BK. Des travaux plus récents, réalisés cette fois sur des cellules proliférantes, ont démontré un effet inverse. Les principaux résultats, résumés dans le Tableau I, ne sont nullement contradictoires, mais indiquent qu’en fonction de l’état d’activation cellulaire, la BK peut exercer des effets opposés. Cela suggère le recrutement de voies de signalisation distinctes. Les activations de la phospholipase C et de la protéine kinase C (PKC) semblent associées à l’effet prolifératif. En revanche, plusieurs mécanismes ont été évoqués pour expliquer l’effet anti-prolifératif : une augmentation de la production de PGE2 (prostaglandin E2) dans des fibroblastes [21], l’activation d’une tyrosine phosphatase capable de déphosphoryler les MAP kinases Erk1/2 dans les cellules mésangiales [22], et l’activation de la phosphatase PTP responsable de la transinactivation du récepteur de l’EGF (epidermal growth factor) dans des cellules épithéliales. Par ailleurs, le récepteur EGF peut être désensibilisé par l’activation de plusieurs récepteurs, dont le RB2, par un autre mécanisme impliquant la PKC [23]. M/S n° 12, vol. 23, décembre 2007 REVUES Outre son effet anti-prolifératif, la BK peut exercer des effets anti- hypertrophiques dans le cœur et les reins [24]. La BK est capable d’inhiber l’hypertrophie de cardiomyocytes induite par l’angiotensine II. Cet effet nécessite la présence de cellules endothéliales et implique la production de NO et de GMP cyclique [25]. La BK module l’expression et la signalisation des récepteurs des cytokines et des facteurs de croissance Plusieurs travaux indiquent que l’activation du RB2 peut moduler de façon positive ou négative l’activation des récepteurs des cytokines et des facteurs de croissance. Les premiers travaux ont montré que l’activation du RB2 restaure la sensibilité musculaire à l’insuline en stimulant à la fois la phosphorylation du résidu tyrosine du récepteur de l’insuline et celle de son substrat IRS-1 [30]. La BK est capable d’améliorer l’insulinorésistance dans les muscles en induisant la translocation du transporteur insulino-dépendant GLUT-4 via le RB2 [27]. Cet effet est d’ailleurs confirmé chez la souris invalidée pour le gène du RB2 qui présente un état d’insulino-résistance. Cette participation du RB2 au contrôle de la glycémie, via la stimulation de l’utilisation musculaire du glucose, peut aussi contribuer aux effets néphroprotecteurs. Par ailleurs, la BK est capable SYNTHÈSE d’un diabète de type I chez le rat [18]. La megsine est un inhibiteur de métalloprotéases et donc de la dégradation de protéines matricielles. L’accumulation de megsine en l’absence du RB2 pourrait aboutir à l’accumulation de matrice, et être ainsi en partie responsable de l’instauration de la fibrose glomérulaire [19]. La BK inhibe l’inhibiteur-1 des activateurs du plasminogène (PAI-1) et active la dégradation de la matrice Un grand nombre d’observations cliniques et expérimentales démontrent une atténuation de la fibrose rénale par les IEC et les ARA2. Cependant, la réduction de l’expression du PAI-1 (plasminogen activator inhibitor-1), comme mécanisme de l’effet anti-fibrosant des IEC, via l’activation du RB2, n’a été évoquée que récemment [20]. La diminution de la synthèse de PAI-1 a pour conséquence une moindre inhibition des métalloprotéases, ce qui favorise la dégradation de la matrice dans un modèle de fibrose interstitielle. Différents mécanismes de néphroprotection possibles, associés àl’activation du RB2 IEC, ARA2 Bradykinine des-Arg9Bradykinine Récepteur B2 Récepteur B1 angio1-7 agoniste B2 ↑ PKC Translocation Translocation GLUT4 GLUT4 ↓ protéinurie ↑ NO ↓ PAI-1 ↑ activité phosphatase ↓ stress stress oxydant oxydant ↑ activité activité métalloprotéase métalloprotéase ↓ insulino- Anti-prolifération Anti-apoptose résistance ↑ PLC, PLA2 ↓ activité activitéfacteurs facteurs de de croissance croissance Anti-fibrosant Figure 4. Différents mécanismes possibles de néphroprotection associés à l’activation du récepteur de la bradykinine. Les effets potentiellement néphroprotecteurs peuvent résulter de l’activation de plusieurs voies de signalisations telles que : les phospholipases C et A2, la protéine kinase C mais aussi des voies moins classiques comme la tyrosine phosphate SHP2, l’inhibition des inhibiteurs d’activateurs du plasminogène (PAI), la formation de monoxyde d’azote NO. L’activation de ces voies peut induire plusieurs réponses telles que : l’augmentation d’activité des métalloprotéases, la diminution du stress oxydant et de l’activité de plusieurs facteurs de croissance, ou encore la translocation de GLUT 4 dans certains types cellulaires. L’ensemble de ces actions va être associée à une diminution des mécanismes de fibrose, d’apoptose, de prolifération et de la protéinurie. 5 de réduire l’auto-phosphorylation du récepteur de l’EGF sur la cellule mésangiale [23]. Nous avons montré, chez le rat diabétique, que l’expression des récepteurs glomérulaires de certaines cytokines (IGF-1, insulin growth factor -1, TGF-β, transforming growth factor) est augmentée lors du blocage du RB2 [28]. Ces travaux sont par ailleurs en accord avec une observation récente indiquant que la surexpression du récepteur du TGF- β est augmentée chez les souris n’exprimant plus le RB2 [29]. La BK pourrait limiter le stress-oxydant et améliorer le profil lipidique Il est maintenant bien établi que l’état d’hyperglycémie chronique entraîne la formation de produits avancés de glycation (AGE) fortement toxiques pour la cellule [30]. Plusieurs travaux montrent une diminution de la formation des AGE par les IEC et les ARA2, si bien qu’une réduction du stress oxydant semble un dénominateur commun aux mécanismes d’action de ces médicaments. Si la suppression des propriétés pro-oxydantes de l’angiotensine II est responsable d’une grande partie de ces effets, une action « anti-oxydante » supplémentaire pourrait résulter du recrutement du RB2. Un des premiers travaux rapporte la réduction de certains paramètres du stress oxydant par la BK chez le rat diabétique de type 1 [31]. Une réduction de la formation de radical superoxyde et des concentrations sériques en triglycérides et cholestérol a été démontrée après transfert du gène de la kallicréine [32-34]. Inversement, une aggravation du profil du stress oxydant a été décrite chez les souris n’exprimant pas le RB2 [29]. Enfin, chez le rat diabétique, notre groupe a décrit une augmentation de l’accumulation de protéines complexées à des dérivés 4-HNE (index de la peroxidation lipidique) lors du blocage du RB2 [28]. L’activation du RB2 pourrait donc contrôler en partie le stress oxydant, vraisemblablement par la production tonique de NO. Et le récepteur B1 ? Un seul travail est en faveur d’un rôle néphroprotecteur du RB1, montrant que le blocage pharmacologique de ce récepteur aggrave la fibrose rénale [35]. Le RB1 peut aussi avoir des effets anti-prolifératifs car il réduit l’hyperplasie de la média lors de lésions de la carotide chez le rat [36]. Cependant, l’hypothèse actuelle est celle d’un effet délétère de l’activation du RB1 avec le blocage du RB1 comme perspective thérapeutique, ce qui s’avère bénéfique dans les syndromes douloureux, en particulier dans les neuropathies diabétiques [37]. Perspectives Bien que l’idée qu’une stimulation du RB2 de la BK puisse induire des effets thérapeutiques bénéfiques reste encore novatrice, ce concept émerge finalements des travaux de plusieurs groupes indépendants [28, 29, 3234]. Plusieurs agonistes non peptidiques sont disponibles et ont été testés dans des modèles différents [38-40]. Par ailleurs, si l’on peut imaginer que les propriétés pro-inflammatoires de la BK constituent une limitation à l’administration d’agonistes B2, on peut aussi émettre quelques hypothèses pour limiter ces effets secondaires prévisibles : (1) la réponse vasodilatatrice de la BK pourrait être réduite chez un animal diabétique 6 M/S n° 12, vol. 23, décembre 2007 comme c’est déjà documenté pour l’acétylcholine ; (2) certaines voies de signalisation du RB2 ne seraient stimulables qu’en situation pathologique ou en fonction de l’état d’activation cellulaire, ce qui pourrait expliquer le paradoxe effet prolifératif/anti-prolifératif ; (3) l’état du récepteur est variable selon la maladie. Un travail récent montre que le traitement avec un agoniste du RB2 réduit l’hypertension pulmonaire et l’hypertrophie ventriculaire dans un modèle d’hypertension pulmonaire chez le rat, sans modification de la pression sanguine artérielle systémique [40]. Tout récemment, un travail très démonstratif montre que l’infusion directe de bradykinine empêche l’inflammation et la fibrose rénale chez le rat Dahl soumis à une surcharge sodée, en inhibant la stimulation du stress oxydant et l’activation des MAP-kinases [41]. Une autre approche d’activation du SKK repose sur le traitement par injection de gènes codant pour la kallicréine avec comme résultat attendu l’augmentation de synthèse de BK et donc l’activation du RB2. Le transfert du gène de la kallicréine réduit la glycémie, restaure le profil lipidique et protège la fonction cardiaque chez le rat diabétique de type I [32]. Cette approche montre aussi des effets bénéfiques en améliorant la fibrose rénale chez le rat hypertendu [33, 34]. La manipulation pharmacologique du SSK apparaît complexe car elle ne peut obéir à un schéma général directeur mais doit être évaluée en fonction des maladies (hypertension, diabète, inflammation…) et des organes cibles. Les résultats obtenus dans plusieurs modèles expérimentaux, dont les animaux génétiquement modifiés, montrent, sans trop de doute, que l’activation directe (agonistes) et/ou indirecte (via angiotensine 1-7, récepteur AT2, IEC) du RB2 de la BK peut désormais représenter un nouveau concept thérapeutique dans le traitement de la néphropathie diabétique ou d’autre origine. ‡ SUMMARY New perspectives for bradykinin B2 receptor in nephroprotection Various diseases such as arterial hypertension, diabetes and obesity result in renal diseases which are often irreversible and resistant to currently available therapies. Beside the control of glycaemia in diabetic patients, only the blockade of the reninangiotensin system is effective in reducing the occurrence of glomerulosclerosis and its development towards terminal renal failure. Inhibition of this system is based on the use of angiotensin-1 converting enzyme inhibitors (ACEI) and angiotensin AT1 receptor antagonists. For many years, the beneficial effects of these two classes of drugs were attributed mainly to their interference with angiotensin II. However, recent in vitro and in vivo evidences strongly suggest that bradykinin B2 receptor is also involved in the nephroprotective effects of these drugs. A compelling evidence is the finding that the development of glomerulosclerosis is more severe in knock-out B2 receptor mice. The nephroprotective effect of B2 receptor could be the 1. Cattran DC, Greenwood C, Ritchie S. Long-term benefits of angiotensinconverting enzyme inhibitor therapy in patients with severe immunoglobulin a nephropathy: a comparison to patients receiving treatment with other antihypertensive agents and to patients receiving no therapy. Am J Kidney Dis 1994 ; 23 : 247-54. 2. Bascands JL, Schanstra JP, Couture R, Girolami JP. Bradykinin receptors: towards new pathophysiological roles. Med Sci (Paris) 2003 ; 19 : 1093-100. 3. Chen Z, Deddish PA, Minshall RG, et al. Human ACE and bradykinin B2 receptors for a complex at the plasma membrane. FASEB J 2006 ; 20 : 2611-70. 4. Li P, Chappell MC, Ferrario CM, Brosnihan KB. Angiotensin-(1-7) augments bradykinin-induced vasodilation by competing with ACE and releasing nitric oxide. Hypertension 1997 ; 29 : 394-400. 5. Chen Z, Tan F, Erdos EG, Deddish PA. Hydrolysis of angiotensin peptides by human angiotensin I-converting enzymes and the resensitization of B2 receptors. Hypertension 2005 ; 46 : 1368-73. 6. MacLaughlin M, Monserrat AJ, Muller A, Matoso M, Amorena C. Role of kinins in the renoprotective effect of angiotensin-converting enzyme inhibitors in experimental chronic renal failure. Kidney Blood Press Res 1998 ; 21 : 329-34. 7. Liu YH, Yang XP, Sharov VG, et al. Effects of angiotensin-converting enzyme inhibitors and angiotensin II type 1 receptor antagonists in rats with heart failure. Role of kinins and angiotensin II type 2 receptors. J Clin Invest 1997 ; 99 : 1926-35. 8. Tsutsumi Y, Matsubara H, Masaki H, et al. Angiotensin II type 2 receptor overexpression activates the vascular kinin system and causes vasodilation. J Clin Invest 1999 ; 104 : 925-35. 9. Walters PE, Gaspari TA, Widdop RE. Angiotensin-(1-7) acts as a vasodepressor agent via angiotensin II type 2 receptors in conscious rats. Hypertension 2005 ; 45 : 960-6. 10. Hannan RE, Davis EA, Widdop RE. Functional role of angiotensin II AT2 receptor in modulation of AT1 receptor-mediated contraction in rat uterine artery: involvement of bradykinin and nitric oxide. Br J Pharmacol 2003 ; 140 : 987-95. 11. Kurisu S, Ozono R, Oshima T, et al. Cardiac angiotensin II type 2 receptor activates the kinin/NO system and inhibits fibrosis. Hypertension 2003 ; 41 : 99-107. 12. Abadir PM, Carey RM, Siragy HM. Angiotensin AT2 receptors directly stimulate renal nitric oxide in bradykinin B2-receptor-null mice. Hypertension 2003 ; 42 : 600-4. 13. Huang W, Gallois Y, Bouby N, et al. Genetically increased angiotensin Iconverting enzyme level and renal complications in the diabetic mouse. Proc Natl Acad Sci USA 2001 ; 98 : 13330-4. 14. Kakoki M, Takahashi N, Jennette JC, Smithies O. Diabetic nephropathy is markedly enhanced in mice lacking the bradykinin B2 receptor. Proc Natl Acad Sci USA 2004 ; 101 : 13302-5. 15. Schanstra JP, Neau E, Drogoz P, et al. In vivo bradykinin B2 receptor activation reduces renal fibrosis. J Clin Invest 2002 ; 110 : 371-9. 16. Tschope C, Seidl U, Reinecke A, et al. Kinins are involved in the antiproteinuric effect of angiotensin-converting enzyme inhibition in experimental diabetic nephropathy. Int Immunopharmacol 2003 ; 3 : 335-44. 17. Maltais I, Bachvarova M, Maheux P, et al. Bradykinin B2 receptor gene polymorphism is associated with altered urinary albumin/creatinine values in diabetic patients. Can J Physiol Pharmacol 2002 ; 80 : 323-7. 18. Aaltonen P, Luimula P, Astrom E, et al. Changes in the expression of nephrin gene and protein in experimental diabetic nephropathy. Lab Invest 2001 ; 81 : 1185-90. 19. Miyata T, Inagi R, Nangaku M, et al. Overexpression of the serpin megsin induces progressive mesangial cell proliferation and expansion. J Clin Invest 2002 ; 109 : 585-93. M/S n° 12, vol. 23, décembre 2007 REVUES RÉFÉRENCES 20. Okada H, Watanabe Y, Kikuta T, et al. Bradykinin decreases plasminogen activator inhibitor-1 expression and facilitates matrix degradation in the renal tubulointerstitium under angiotensinconverting enzyme blockade. J Am Soc Nephrol 2004 ; 15 : 2404-13. 21. McAllister BS, Leeb-Lundberg F, Olson MS. Bradykinin inhibition of EGF- and PDGF-induced DNA synthesis in human fibroblasts. Am J Physiol 1993 ; 265 : C477-84. 22. Duchene J, Schanstra JP, Pecher C, et al. A novel protein-protein interaction between a G proteincoupled receptor and the phosphatase SHP-2 is involved in bradykinin-induced inhibition of cell proliferation. J Biol Chem 2002 ; 277 : 40375-83. 23. Grewal JS, Luttrell LM, Raymond JR. G protein-coupled receptors desensitize and down-regulate epidermal growth factor receptors in renal mesangial cells. J Biol Chem 2001 ; 276 : 27335-44. 24. Tsuchida S, Miyazaki Y, Matsusaka T, et al. Potent antihypertrophic effect of the bradykinin B2 receptor system on the renal vasculature. Kidney Int 1999 ; 56 : 509-16. 25. Ritchie RH, Marsh JD, Lancaster WD, et al. Bradykinin blocks angiotensin II-induced hypertrophy in the presence of endothelial cells. Hypertension 1998 ; 31 : 39-44. 26. Carvalho CR, Thirone AC, Gontijo JA, et al. Effect of captopril, losartan, and bradykinin on early steps of insulin action. Diabetes 1997 ; 46 : 1950-7. 27. Kishi K, Muromoto N, Nakaya Y, et al. Bradykinin directly triggers GLUT4 translocation via an insulin-independent pathway. Diabetes 1998 ; 47 : 550-8. 28. Cellier E, Mage M, Duchene J, et al. Bradykinin reduces growth factor-induced glomerular ERK1/2 phosphorylation. Am J Physiol Renal Physiol 2003 ; 284 : F282-92. 29. Kakoki M, Kizer CM, Yi X, et al. Senescence-associated phenotypes in Akita diabetic mice are enhanced by absence of bradykinin B2 receptors. J Clin Invest, 2006 ; 116 : 1302-9. 30. Brownlee M. Biochemistry and molecular cell biology of diabetic complications. Nature 2001 ; 414 : 813-20. 31. Mikrut K, Paluszak J, Kozlik J, et al. The effect of bradykinin on the oxidative state of rats with acute hyperglycaemia. Diabetes Res Clin Pract 2001 ; 51 : 79-85. 32. Montanari D, Yin H, Dobrzynski E, et al. Kallikrein gene delivery improves serum glucose and lipid profiles and cardiac function in streptozotocin-induced diabetic rats. Diabetes 2005 ; 54 : 1573-80. 33. Xia CF, Bledsoe G, Chao L, Chao J. Kallikrein gene transfer reduces renal fibrosis, hypertrophy, and proliferation in DOCA-salt hypertensive rats. Am J Physiol Renal Physiol 2005 ; 289 : F622-31. 34. Bledsoe G, Shen B, Yao Y, et al. Reversal of renal fibrosis, inflammation, and glomerular hypertrophy by kallikrein gene delivery. Hum Gene Ther 2006 ; 17 : 545-55. 35. Hagiwara M, Murakami H, Ura N, et al. Renal protective role of bradykinin B1 receptor in strokeprone spontaneously hypertensive rats. Hypertens Res 2004 ; 27 : 399-408. 36. Agata J, Miao RQ, Yayama K, et al. Bradykinin B(1) receptor mediates inhibition of neointima formation in rat artery after balloon angioplasty. Hypertension 2000 ; 36 : 364-70. 37. Couture R, Girolami JP. Puitative roles of kinin receptor in the therapeutic effects of angiotensin 1-converting enzyme inhibitors in diabetes mellitus. Eur J Pharmacol 2004 ; 500 : 467-85. 38. Borlongan CV, Emerich DF. Facilitation of drug entry into the CNS via transient permeation of blood brain barrier: laboratory and preliminary clinical evidence from bradykinin receptor agonist, Cereport. Brain Res Bull 2003 ; 60 : 297-306. 39. Asano M, Hatori C, Sawai H, et al. Pharmacological characterization of a nonpeptide bradykinin B2 receptor antagonist, FR165649, and agonist, FR190997. Br J Pharmacol 1998 ; 124 : 441-6. 40. Taraseviciene-Stewart L, Scerbavicius R, Stewart JM, et al. Treatment of severe pulmonary hypertension: a bradykinin receptor 2 agonist B9972 causes reduction of pulmonary artery pressure and right ventricular hypertrophy. Peptides 2005 ; 26 : 1292-300. 41. Chao J, Li HJ, Yao Y, et al. Kinin infusion prevents renal inflammation, apoptosis and fibrosis via inhibition of oxidative stress and mitogen-activated protein kinase activity. Hypertension 2007 ; 49 : 490-7. 42. Bascands JL, Pecher C, Rouaud S, et al. Evidence for existence of two distinct bradykinin receptors on rat mesangial cells. Am J Physiol 1993 ; 264 : F548-56. 43. Velarde V, de la Cerda PM, Duarte C, et al. Role of reactive oxygen species in bradykinin-induced proliferation of vascular smooth muscle cells. Biol Res 2004 ; 37 : 419-30. 44. Greco S, Elia MG, Muscella A, et al. Bradykinin stimulates cell proliferation through an extracellular-regulated kinase 1 and 2-dependent mechanism in breast cancer cells in primary culture. J Endocrinol 2005 ; 186 : 291-301. 45. Alric C, Pecher C, Cellier E, et al. Inhibition of IGF-I-induced Erk 1 and 2 activation and mitogenesis in mesangial cells by bradykinin. Kidney Int 2002 ; 62 : 412-21. 46. Yasunari K, Maeda K, Watanabe T, et al. Converting enzyme inhibitor temocaprilat prevents high glucose-mediated suppression of human aortic endothelial cell proliferation. J Cardiovasc Pharmacol 2003 ; 42 (suppl 1) : S55-60. 47. Dixon BS, Evanoff D, Fang WB, Dennis MJ. Bradykinin B1 receptor blocks PDGF-induced mitogenesis by prolonging ERK activation and increasing p27Kip1. Am J Physiol Cell Physiol 2002 ; 283 : C193-203. 48. Patel KV, Schrey MP. Inhibition of DNA synthesis and growth in human breast stromal cells by bradykinin: evidence for independent roles of B1 and B2 receptors in the respective control of cell growth and phospholipid hydrolysis. Cancer Res 1992 ; 52 : 334-40. SYNTHÈSE consequence of a reduction of proteinuria, glomerular and interstitial fibrosis, cell proliferation and of the oxidative stress through the contribution of several well identified mechanisms. It is proposed that B2 receptor agonists can offer a novel therapeutic avenue in the treatment of nephropathies associated with diabetes or other vascular diseases. ‡ TIRÉS À PART M. Buléon 7 Références REFERENCES 1. Abelous, J. and E. Bardier, Les substances hypotensives de l'urine humaine normale. CR Soc Biol, 1909. 66: p. 511-2. 2. Kraut, H., F. EK, and W. E, Der Nachweis eines Kreislauf Hormons in der Pankreasdrüse. Hoppe-Seyler's Z Physiol Chem, 1930. 189: p. 97-106. 3. Bhoola, K.D., C.D. Figueroa, and K. Worthy, Bioregulation of kinins: kallikreins, kininogens, and kininases. Pharmacol Rev, 1992. 44(1): p. 1-80. 4. Nakanishi, S., Substance P precursor and kininogen: their structures, gene organizations, and regulation. Physiol Rev, 1987. 67(4): p. 1117-42. 5. Okamoto, H. and L.M. Greenbaum, Isolation and structure of T-kinin. Biochem Biophys Res Commun, 1983. 112(2): p. 701-8. 6. Jaspard, E., L. Wei, and F. Alhenc-Gelas, Differences in the properties and enzymatic specificities of the two active sites of angiotensin I-converting enzyme (kininase II). Studies with bradykinin and other natural peptides. J Biol Chem, 1993. 268(13): p. 9496-503. 7. Campbell, D.J., A. Kladis, and A.M. Duncan, Bradykinin peptides in kidney, blood, and other tissues of the rat. Hypertension, 1993. 21(2): p. 155-65. 8. Nolly, H., et al., A local kallikrein-kinin system is present in rat hearts. Hypertension, 1994. 23(6 Pt 2): p. 919-23. 9. Nolly, H.L., et al., The kallikrein--kinin system in blood vessels. Agents Actions Suppl, 1992. 38 ( Pt 3): p. 1-9. 10. McEachern, A.E., et al., Expression cloning of a rat B2 bradykinin receptor. Proc Natl Acad Sci U S A, 1991. 88(17): p. 7724-8. 11. Menke, J.G., et al., Expression cloning of a human B1 bradykinin receptor. J Biol Chem, 1994. 269(34): p. 21583-6. 12. Cayla, C., et al., Structure of the mammalian kinin receptor gene locus. Int Immunopharmacol, 2002. 2(13-14): p. 1721-7. 13. Regoli, D., et al., [Vasoactive polypeptide receptors]. Union Med Can, 1980. 109(9): p. 1315-22. 104 Références 14. Leeb-Lundberg, L.M., et al., International union of pharmacology. XLV. Classification of the kinin receptor family: from molecular mechanisms to pathophysiological consequences. Pharmacol Rev, 2005. 57(1): p. 27-77. 15. Raidoo, D.M., et al., Kinin receptors in human vascular tissue: their role in atheromatous disease. Immunopharmacology, 1997. 36(2-3): p. 153-60. 16. Pizard, A., et al., Bradykinin-induced internalization of the human B2 receptor requires phosphorylation of three serine and two threonine residues at its carboxyl tail. J Biol Chem, 1999. 274(18): p. 12738-47. 17. Marceau, F., J.F. Hess, and D.R. Bachvarov, The B1 receptors for kinins. Pharmacol Rev, 1998. 50(3): p. 357-86. 18. Regoli, D.C., F. Marceau, and J. Lavigne, Induction of beta 1-receptors for kinins in the rabbit by a bacterial lipopolysaccharide. Eur J Pharmacol, 1981. 71(1): p. 105-15. 19. Schneck, K.A., et al., Bradykinin B1 receptors in rabbit aorta smooth muscle cells in culture. Eur J Pharmacol, 1994. 266(3): p. 277-82. 20. Haddad, E.B., et al., Post-transcriptional regulation of bradykinin B1 and B2 receptor gene expression in human lung fibroblasts by tumor necrosis factor-alpha: modulation by dexamethasone. Mol Pharmacol, 2000. 57(6): p. 1123-31. 21. Ganju, P., et al., p38 stress-activated protein kinase inhibitor reverses bradykinin B(1) receptor-mediated component of inflammatory hyperalgesia. Eur J Pharmacol, 2001. 421(3): p. 191-9. 22. Campos, M.M., G.E. Souza, and J.B. Calixto, In vivo B1 kinin-receptor upregulation. Evidence for involvement of protein kinases and nuclear factor kappaB pathways. Br J Pharmacol, 1999. 127(8): p. 1851-9. 23. Larrivee, J.F., et al., Role of the mitogen-activated protein kinases in the expression of the kinin B1 receptors induced by tissue injury. J Immunol, 1998. 160(3): p. 1419-26. 24. Faussner, A., J.M. Bathon, and D. Proud, Comparison of the responses of B1 and B2 kinin receptors to agonist stimulation. Immunopharmacology, 1999. 45(1-3): p. 13-20. 25. Marceau, F., et al., Ligand-mediated regulation of kinin receptors in the rabbit. Biol Chem, 2001. 382(1): p. 131-3. 26. Busse, R. and I. Fleming, Molecular responses of endothelial tissue to kinins. Diabetes, 1996. 45 Suppl 1: p. S8-13. 27. Cosentino, F. and T.F. Luscher, Maintenance of vascular integrity: role of nitric oxide and other bradykinin mediators. Eur Heart J, 1995. 16 Suppl K: p. 4-12. 28. Siragy, H.M., A.A. Jaffa, and H.S. Margolius, Bradykinin B2 receptor modulates renal prostaglandin E2 and nitric oxide. Hypertension, 1997. 29(3): p. 757-62. 29. Madeddu, P., et al., Cardiovascular phenotype of a mouse strain with disruption of bradykinin B2-receptor gene. Circulation, 1997. 96(10): p. 3570-8. 105 Références 30. Wang, D., et al., Enhanced renal function in bradykinin B(2) receptor transgenic mice. Am J Physiol Renal Physiol, 2000. 278(3): p. F484-91. 31. Schanstra, J.P., et al., Decreased renal NO excretion and reduced glomerular tuft area in mice lacking the bradykinin B2 receptor. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2003. 284(6): p. H1904-8. 32. Pyne, N.J., D. Tolan, and S. Pyne, Bradykinin stimulates cAMP synthesis via mitogenactivated protein kinase-dependent regulation of cytosolic phospholipase A2 and prostaglandin E2 release in airway smooth muscle. Biochem J, 1997. 328 ( Pt 2): p. 689-94. 33. Harris, M.B., et al., Reciprocal phosphorylation and regulation of endothelial nitricoxide synthase in response to bradykinin stimulation. J Biol Chem, 2001. 276(19): p. 16587-91. 34. Duchene, J., et al., A novel protein-protein interaction between a G protein-coupled receptor and the phosphatase SHP-2 is involved in bradykinin-induced inhibition of cell proliferation. J Biol Chem, 2002. 277(43): p. 40375-83. 35. Alric, C., et al., Inhibition of IGF-I-induced Erk 1 and 2 activation and mitogenesis in mesangial cells by bradykinin. Kidney Int, 2002. 62(2): p. 412-21. 36. Austin, C.E., et al., Stable expression of the human kinin B1 receptor in Chinese hamster ovary cells. Characterization of ligand binding and effector pathways. J Biol Chem, 1997. 272(17): p. 11420-5. 37. Marceau, F. and B. Tremblay, Mitogenic effect of bradykinin and of des-Arg9bradykinin on cultured fibroblasts. Life Sci, 1986. 39(24): p. 2351-8. 38. Dixon, B.S., et al., Bradykinin B1 receptor blocks PDGF-induced mitogenesis by prolonging ERK activation and increasing p27Kip1. Am J Physiol Cell Physiol, 2002. 283(1): p. C193-203. 39. Hall, J.M., Bradykinin receptors: pharmacological properties and biological roles. Pharmacol Ther, 1992. 56(2): p. 131-90. 40. Chao, J., et al., Kinin infusion prevents renal inflammation, apoptosis, and fibrosis via inhibition of oxidative stress and mitogen-activated protein kinase activity. Hypertension, 2007. 49(3): p. 490-7. 41. Pawluczyk, I.Z., S.R. Patel, and K.P. Harris, Pharmacological enhancement of the kallikrein-kinin system promotes anti-fibrotic responses in human mesangial cells. Cell Physiol Biochem, 2006. 18(6): p. 327-36. 42. Schanstra, J.P., et al., In vivo bradykinin B2 receptor activation reduces renal fibrosis. J Clin Invest, 2002. 110(3): p. 371-9. 43. Tschope, C., et al., Prevention of cardiac fibrosis and left ventricular dysfunction in diabetic cardiomyopathy in rats by transgenic expression of the human tissue kallikrein gene. Faseb J, 2004. 18(7): p. 828-35. 106 Références 44. Chao, J. and L. Chao, New experimental evidence for a role of tissue kallikrein in hypertension. Nephrol Dial Transplant, 1997. 12(8): p. 1569-74. 45. Margolius, H.S., Tissue kallikreins and kinins: regulation and roles in hypertensive and diabetic diseases. Annu Rev Pharmacol Toxicol, 1989. 29: p. 343-64. 46. Zinner, S.H., et al., Stability of blood pressure rank and urinary kallikrein concentration in childhood: an eight-year follow-up. Circulation, 1978. 58(5): p. 90815. 47. Favaro, S., et al., Renal kallikrein content of spontaneously hypertensive rats. Clin Sci Mol Med, 1975. 49(1): p. 69-71. 48. Milia, A.F., et al., Normal blood pressure and renal function in mice lacking the bradykinin B(2) receptor. Hypertension, 2001. 37(6): p. 1473-9. 49. Yang, X.P., et al., Diminished cardioprotective response to inhibition of angiotensinconverting enzyme and angiotensin II type 1 receptor in B(2) kinin receptor gene knockout mice. Circ Res, 2001. 88(10): p. 1072-9. 50. Madeddu, P., et al., Angiotensin II type 1 receptor blockade prevents cardiac remodeling in bradykinin B(2) receptor knockout mice. Hypertension, 2000. 35(1 Pt 2): p. 391-6. 51. Madeddu, P., et al., Renovascular hypertension in bradykinin B2-receptor knockout mice. Hypertension, 1998. 32(3): p. 503-9. 52. Maestri, R., et al., Cardiac hypertrophy and microvascular deficit in kinin B2 receptor knockout mice. Hypertension, 2003. 41(5): p. 1151-5. 53. Alfie, M.E., et al., Salt-sensitive hypertension in bradykinin B2 receptor knockout mice. Biochem Biophys Res Commun, 1996. 224(3): p. 625-30. 54. Alfie, M.E., et al., Effect of high salt intake in mutant mice lacking bradykinin-B2 receptors. Hypertension, 1997. 29(1 Pt 2): p. 483-7. 55. Perkins, M.N., E. Campbell, and A. Dray, Antinociceptive activity of the bradykinin B1 and B2 receptor antagonists, des-Arg9, [Leu8]-BK and HOE 140, in two models of persistent hyperalgesia in the rat. Pain, 1993. 53(2): p. 191-7. 56. Sufka, K.J. and J.T. Roach, Stimulus properties and antinociceptive effects of selective bradykinin B1 and B2 receptor antagonists in rats. Pain, 1996. 66(1): p. 99-103. 57. Rupniak, N.M., et al., Effects of the bradykinin B1 receptor antagonist desArg9[Leu8]bradykinin and genetic disruption of the B2 receptor on nociception in rats and mice. Pain, 1997. 71(1): p. 89-97. 58. Calixto, J.B., et al., Kinins in pain and inflammation. Pain, 2000. 87(1): p. 1-5. 59. Boyce, S., et al., Nociception and inflammatory hyperalgesia in B2 bradykinin receptor knockout mice. Immunopharmacology, 1996. 33(1-3): p. 333-5. 107 Références 60. Dias, J.P., et al., The kinin B1 receptor antagonist SSR240612 reverses tactile and cold allodynia in an experimental rat model of insulin resistance. Br J Pharmacol, 2007. 152(2): p. 280-7. 61. Pesquero, J.B., et al., Hypoalgesia and altered inflammatory responses in mice lacking kinin B1 receptors. Proc Natl Acad Sci U S A, 2000. 97(14): p. 8140-5. 62. Cruwys, S.C., et al., The role of bradykinin B1 receptors in the maintenance of intraarticular plasma extravasation in chronic antigen-induced arthritis. Br J Pharmacol, 1994. 113(3): p. 940-4. 63. Uknis, A.B., et al., Bradykinin receptor antagonists type 2 attenuate the inflammatory changes in peptidoglycan-induced acute arthritis in the Lewis rat. Inflamm Res, 2001. 50(3): p. 149-55. 64. Blais, C., Jr., et al., Involvement of endogenous kinins in the pathogenesis of peptidoglycan-induced arthritis in the Lewis rat. Arthritis Rheum, 1997. 40(7): p. 1327-33. 65. Bhoola, K., et al., Kallikrein and kinin receptor expression in inflammation and cancer. Biol Chem, 2001. 382(1): p. 77-89. 66. Dray, A. and M. Perkins, Bradykinin and inflammatory pain. Trends Neurosci, 1993. 16(3): p. 99-104. 67. Geppetti, P., Sensory neuropeptide release by bradykinin: mechanisms and pathophysiological implications. Regul Pept, 1993. 47(1): p. 1-23. 68. Couture, R., et al., Kinin receptors in pain and inflammation. Eur J Pharmacol, 2001. 429(1-3): p. 161-76. 69. Dray, A., Kinins and their receptors in hyperalgesia. Can J Physiol Pharmacol, 1997. 75(6): p. 704-12. 70. Pinto, Y.M., et al., Increased kallikrein expression protects against cardiac ischemia. Faseb J, 2000. 14(13): p. 1861-3. 71. Yang, X.P., et al., Role of kinins in the cardioprotective effect of preconditioning: study of myocardial ischemia/reperfusion injury in B2 kinin receptor knockout mice and kininogen-deficient rats. Hypertension, 1997. 30(3 Pt 2): p. 735-40. 72. Brull, D., et al., Bradykinin B2BKR receptor polymorphism and left-ventricular growth response. Lancet, 2001. 358(9288): p. 1155-6. 73. Bascands, J.L., et al., Evidence for existence of two distinct bradykinin receptors on rat mesangial cells. Am J Physiol, 1993. 264(3 Pt 2): p. F548-56. 74. El-Dahr, S.S., S. Dipp, and W.H. Baricos, Bradykinin stimulates the ERK-->Elk-1->Fos/AP-1 pathway in mesangial cells. Am J Physiol, 1998. 275(3 Pt 2): p. F343-52. 75. Velarde, V., et al., Role of reactive oxygen species in bradykinin-induced proliferation of vascular smooth muscle cells. Biol Res, 2004. 37(3): p. 419-30. 108 Références 76. Greco, S., et al., Bradykinin stimulates cell proliferation through an extracellularregulated kinase 1 and 2-dependent mechanism in breast cancer cells in primary culture. J Endocrinol, 2005. 186(2): p. 291-301. 77. Greco, S., et al., Mitogenic signalling by B2 bradykinin receptor in epithelial breast cells. J Cell Physiol, 2004. 201(1): p. 84-96. 78. Patel, K.V. and M.P. Schrey, Inhibition of DNA synthesis and growth in human breast stromal cells by bradykinin: evidence for independent roles of B1 and B2 receptors in the respective control of cell growth and phospholipid hydrolysis. Cancer Res, 1992. 52(2): p. 334-40. 79. Dixon, B.S. and M.J. Dennis, Regulation of mitogenesis by kinins in arterial smooth muscle cells. Am J Physiol, 1997. 273(1 Pt 1): p. C7-20. 80. Yasunari, K., et al., Converting enzyme inhibitor temocaprilat prevents high glucosemediated suppression of human aortic endothelial cell proliferation. J Cardiovasc Pharmacol, 2003. 42 Suppl 1: p. S55-60. 81. McAllister, B.S., F. Leeb-Lundberg, and M.S. Olson, Bradykinin inhibition of EGFand PDGF-induced DNA synthesis in human fibroblasts. Am J Physiol, 1993. 265(2 Pt 1): p. C477-84. 82. Ricupero, D.A., et al., Des-Arg(10)-kallidin engagement of the B1 receptor stimulates type I collagen synthesis via stabilization of connective tissue growth factor mRNA. J Biol Chem, 2000. 275(17): p. 12475-80. 83. Gallagher, A.M., H. Yu, and M.P. Printz, Bradykinin-induced reductions in collagen gene expression involve prostacyclin. Hypertension, 1998. 32(1): p. 84-8. 84. Wollert, K.C., et al., Differential effects of kinins on cardiomyocyte hypertrophy and interstitial collagen matrix in the surviving myocardium after myocardial infarction in the rat. Circulation, 1997. 95(7): p. 1910-7. 85. Silva, J.A., Jr., et al., Reduced cardiac hypertrophy and altered blood pressure control in transgenic rats with the human tissue kallikrein gene. Faseb J, 2000. 14(13): p. 1858-60. 86. Pawluczyk, I.Z., S.R. Patel, and K.P. Harris, The role of bradykinin in the antifibrotic actions of perindoprilat on human mesangial cells. Kidney Int, 2004. 65(4): p. 124051. 87. Tomita, K. and J.J. Pisano, Binding of [3H]bradykinin in isolated nephron segments of the rabbit. Am J Physiol, 1984. 246(5 Pt 2): p. F732-7. 88. Marin-Castano, M.E., et al., Differential induction of functional B1-bradykinin receptors along the rat nephron in endotoxin induced inflammation. Kidney Int, 1998. 54(6): p. 1888-98. 89. Marin Castano, M.E., et al., RT-PCR microlocalization of bradykinin B2 receptor mRNA in microdissected rat nephron segments. Immunopharmacology, 1996. 33(1-3): p. 171-3. 109 Références 90. Ardaillou, N., et al., Characterization of a B2-bradykinin receptor in human glomerular podocytes. Am J Physiol, 1996. 271(3 Pt 2): p. F754-61. 91. Emond, C., et al., Characterization of a B2-bradykinin receptor in rat renal mesangial cells. Eur J Pharmacol, 1990. 190(3): p. 381-92. 92. Xiong, W., L. Chao, and J. Chao, Renal kallikrein mRNA localization by in situ hybridization. Kidney Int, 1989. 35(6): p. 1324-9. 93. Proud, D., et al., Characterization and localization of human renal kininogen. J Biol Chem, 1981. 256(20): p. 10634-9. 94. Song, Q., et al., Cellular localization of low-molecular-weight kininogen and bradykinin B2 receptor mRNAs in human kidney. Am J Physiol, 1996. 270(6 Pt 2): p. F919-26. 95. Dixon, B.S., et al., Bradykinin activates protein kinase C in cultured cortical collecting tubular cells. Am J Physiol, 1989. 257(5 Pt 2): p. F808-17. 96. Hebert, R.L., et al., Bradykinin B2 type receptor activation regulates fluid and electrolyte transport in the rabbit kidney. Peptides, 2005. 26(8): p. 1308-16. 97. Matsumura, Y., K. Tadano, and T. Yamasaki, Renal haemodynamic and excretory responses to bradykinin in anaesthetized dogs. Clin Exp Pharmacol Physiol, 1999. 26(8): p. 645-50. 98. Lortie, M., et al., The role of B1- and B2-kinin receptors in the renal tubular and hemodynamic response to bradykinin. Am J Physiol, 1992. 262(1 Pt 2): p. R72-6. 99. Hirawa, N., et al., Regression of glomerular injury by kallikrein infusion in Dahl saltsensitive rats is a bradykinin B2-receptor-mediated event. Nephron, 1999. 81(2): p. 183-93. 100. Uehara, Y., et al., Long-term infusion of kallikrein attenuates renal injury in Dahl saltsensitive rats. Am J Hypertens, 1997. 10(5 Pt 2): p. 83S-88S. 101. Naicker, S., et al., Tissue kallikrein and Immunopharmacology, 1999. 44(1-2): p. 183-92. 102. Murakami, H., et al., Human kallikrein gene delivery protects against gentamycininduced nephrotoxicity in rats. Kidney Int, 1998. 53(5): p. 1305-13. 103. Wolf, W.C., et al., Human tissue kallikrein gene delivery attenuates hypertension, renal injury, and cardiac remodeling in chronic renal failure. Kidney Int, 2000. 58(2): p. 730-9. 104. Yayama, K., et al., Kallikrein gene delivery attenuates hypertension and cardiac hypertrophy and enhances renal function in Goldblatt hypertensive rats. Hypertension, 1998. 31(5): p. 1104-10. kinins in renal disease. 110 Références 105. Xia, C.F., et al., Kallikrein gene transfer reduces renal fibrosis, hypertrophy, and proliferation in DOCA-salt hypertensive rats. Am J Physiol Renal Physiol, 2005. 289(3): p. F622-31. 106. Chao, J., et al., Human kallikrein gene delivery attenuates hypertension, cardiac hypertrophy, and renal injury in Dahl salt-sensitive rats. Hum Gene Ther, 1998. 9(1): p. 21-31. 107. Bledsoe, G., et al., Role of Tissue Kallikrein in Prevention and Recovery of Gentamicin-induced Renal Injury. Toxicol Sci, 2008. 108. Bledsoe, G., et al., Reversal of renal fibrosis, inflammation, and glomerular hypertrophy by kallikrein gene delivery. Hum Gene Ther, 2006. 17(5): p. 545-55. 109. Trabold, F., et al., Cardiovascular phenotypes of kinin B2 receptor- and tissue kallikrein-deficient mice. Hypertension, 2002. 40(1): p. 90-5. 110. Messadi-Laribi, E., et al., Tissue kallikrein is involved in the cardioprotective effect of AT1-receptor blockade in acute myocardial ischemia. J Pharmacol Exp Ther, 2007. 323(1): p. 210-6. 111. Bergaya, S., et al., Decreased flow-dependent dilation in carotid arteries of tissue kallikrein-knockout mice. Circ Res, 2001. 88(6): p. 593-9. 112. Picard, N., et al., Tissue kallikrein-deficient mice display a defect in renal tubular calcium absorption. J Am Soc Nephrol, 2005. 16(12): p. 3602-10. 113. Picard, N., et al., Defective ENaC Processing and Function in Tissue Kallikreindeficient Mice. J Biol Chem, 2008. 283(8): p. 4602-4611. 114. Wang, D.Z., L. Chao, and J. Chao, Hypotension in transgenic mice overexpressing human bradykinin B2 receptor. Hypertension, 1997. 29(1 Pt 2): p. 488-93. 115. Emanueli, C., et al., Enhanced blood pressure sensitivity to deoxycorticosterone in mice with disruption of bradykinin B2 receptor gene. Hypertension, 1998. 31(6): p. 1278-83. 116. Kakoki, M., et al., Diabetic nephropathy is markedly enhanced in mice lacking the bradykinin B2 receptor. Proc Natl Acad Sci U S A, 2004. 101(36): p. 13302-5. 117. Huang, W., et al., Genetically increased angiotensin I-converting enzyme level and renal complications in the diabetic mouse. Proc Natl Acad Sci U S A, 2001. 98(23): p. 13330-4. 118. Duka, I., et al., Vasoactive potential of the b(1) bradykinin receptor in normotension and hypertension. Circ Res, 2001. 88(3): p. 275-81. 119. Duka, I., et al., Mechanisms mediating the vasoactive effects of the B1 receptors of bradykinin. Hypertension, 2003. 42(5): p. 1021-5. 120. Xu, J., et al., Role of the B1 kinin receptor in the regulation of cardiac function and remodeling after myocardial infarction. Hypertension, 2005. 45(4): p. 747-53. 111 Références 121. Lauton-Santos, S., et al., Kinin B1 receptor participates in the control of cardiac function in mice. Life Sci, 2007. 81(10): p. 814-22. 122. Ferreira, J., et al., Reduced nerve injury-induced neuropathic pain in kinin B1 receptor knock-out mice. J Neurosci, 2005. 25(9): p. 2405-12. 123. Gabra, B.H., et al., Absence of diabetic hyperalgesia in bradykinin B1 receptorknockout mice. Regul Pept, 2005. 127(1-3): p. 245-8. 124. Kakoki, M., et al., Bradykinin B1 and B2 receptors both have protective roles in renal ischemia/reperfusion injury. Proc Natl Acad Sci U S A, 2007. 104(18): p. 7576-81. 125. Cayla, C., et al., Mice deficient for both kinin receptors are normotensive and protected from endotoxin-induced hypotension. Faseb J, 2007. 21(8): p. 1689-98. 126. Madeddu, P., et al., Role of renal kallikrein in modulating the antihypertensive effect of a single oral dose of captopril in normal- and low-renin essential hypertensives. J Hypertens, 1987. 5(6): p. 645-8. 127. Madeddu, P., et al., Effects of Hoe 140, a bradykinin B2-receptor antagonist, on renal function in conscious normotensive rats. Br J Pharmacol, 1992. 106(2): p. 380-6. 128. Madeddu, P., et al., Chronic kinin receptor blockade induces hypertension in deoxycorticosterone-treated rats. Br J Pharmacol, 1993. 108(3): p. 651-7. 129. Madeddu, P., et al., Bradykinin B2-receptor blockade facilitates deoxycorticosteronesalt hypertension. Hypertension, 1993. 21(6 Pt 2): p. 980-4. 130. el-Dahr, S.S. and J. Chao, Spatial and temporal expression of kallikrein and its mRNA during nephron maturation. Am J Physiol, 1992. 262(5 Pt 2): p. F705-11. 131. Hagiwara, M., et al., Renal protective role of bradykinin B1 receptor in stroke-prone spontaneously hypertensive rats. Hypertens Res, 2004. 27(6): p. 399-408. 132. Seguin, T., et al., Hemodynamic and renal involvement of B(1) and B(2) kinin receptors during the acute phase of endotoxin shock in mice. Int Immunopharmacol, 2008. 8(2): p. 217-21. 133. Ni, A., et al., Overexpression of kinin B1 receptors induces hypertensive response to des-Arg9-bradykinin and susceptibility to inflammation. J Biol Chem, 2003. 278(1): p. 219-25. 134. Cattran, D.C., C. Greenwood, and S. Ritchie, Long-term benefits of angiotensinconverting enzyme inhibitor therapy in patients with severe immunoglobulin a nephropathy: a comparison to patients receiving treatment with other antihypertensive agents and to patients receiving no therapy. Am J Kidney Dis, 1994. 23(2): p. 247-54. 135. Remuzzi, G., C. Chiurchiu, and P. Ruggenenti, Proteinuria predicting outcome in renal disease: nondiabetic nephropathies (REIN). Kidney Int Suppl, 2004(92): p. S906. 112 Références 136. Effects of ramipril on cardiovascular and microvascular outcomes in people with diabetes mellitus: results of the HOPE study and MICRO-HOPE substudy. Heart Outcomes Prevention Evaluation Study Investigators. Lancet, 2000. 355(9200): p. 253-9. 137. Yusuf, S., et al., Effects of an angiotensin-converting-enzyme inhibitor, ramipril, on cardiovascular events in high-risk patients. The Heart Outcomes Prevention Evaluation Study Investigators. N Engl J Med, 2000. 342(3): p. 145-53. 138. Lakkis, J., W.X. Lu, and M.R. Weir, RAAS escape: a real clinical entity that may be important in the progression of cardiovascular and renal disease. Curr Hypertens Rep, 2003. 5(5): p. 408-17. 139. Murakami, M., et al., Role of angiotensin II generated by angiotensin converting enzyme-independent pathways in canine kidney. Kidney Int Suppl, 1997. 63: p. S1325. 140. Tom, B., et al., ACE-versus chymase-dependent angiotensin II generation in human coronary arteries: a matter of efficiency? Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2003. 23(2): p. 251-6. 141. Okada, H., et al., Bradykinin decreases plasminogen activator inhibitor-1 expression and facilitates matrix degradation in the renal tubulointerstitium under angiotensinconverting enzyme blockade. J Am Soc Nephrol, 2004. 15(9): p. 2404-13. 142. MacLaughlin, M., et al., Role of kinins in the renoprotective effect of angiotensinconverting enzyme inhibitors in experimental chronic renal failure. Kidney Blood Press Res, 1998. 21(5): p. 329-34. 143. Tschope, C., et al., Kinins are involved in the antiproteinuric effect of angiotensinconverting enzyme inhibition in experimental diabetic nephropathy. Int Immunopharmacol, 2003. 3(3): p. 335-44. 144. Chen, Z., et al., Human ACE and bradykinin B2 receptors form a complex at the plasma membrane. Faseb J, 2006. 20(13): p. 2261-70. 145. Gurzu, B., et al., Are multiple angiotensin receptor types involved in angiotensin (1-7) actions on isolated rat portal vein. J Renin Angiotensin Aldosterone Syst, 2005. 6(2): p. 90-5. 146. Rebas, E., J. Zabczynska, and A. Lachowicz, The effect of angiotensin 1-7 on tyrosine kinases activity in rat anterior pituitary. Biochem Biophys Res Commun, 2006. 347(3): p. 581-5. 147. Xu, P., et al., Alterations in gene expression in the testis of angiotensin-(1-7)-receptor Mas-deficient mice. Regul Pept, 2007. 138(2-3): p. 51-5. 148. Li, P., et al., Angiotensin-(1-7) augments bradykinin-induced vasodilation by competing with ACE and releasing nitric oxide. Hypertension, 1997. 29(1 Pt 2): p. 394-400. 113 Références 149. Tom, B., A. Dendorfer, and A.H. Danser, Bradykinin, angiotensin-(1-7), and ACE inhibitors: how do they interact? Int J Biochem Cell Biol, 2003. 35(6): p. 792-801. 150. Chen, Z., et al., Hydrolysis of angiotensin peptides by human angiotensin I-converting enzyme and the resensitization of B2 kinin receptors. Hypertension, 2005. 46(6): p. 1368-73. 151. Ribeiro, A.B. and H. Gavras, Angiotensin II antagonists: clinical experience in the treatment of hypertension, prevention of cardiovascular outcomes and renal protection in diabetic nephropathy and proteinuria. Arq Bras Endocrinol Metabol, 2006. 50(2): p. 327-33. 152. Nickenig, G., J. Ostergren, and H. Struijker-Boudier, Clinical evidence for the cardiovascular benefits of angiotensin receptor blockers. J Renin Angiotensin Aldosterone Syst, 2006. 7 Suppl 1: p. S1-7. 153. Mackenzie, H.S., et al., Angiotensin receptor blockers in chronic renal disease: the promise of a bright clinical future. J Am Soc Nephrol, 1999. 10 Suppl 12: p. S283-6. 154. Parving, H.H., Diabetic nephropathy: prevention and treatment. Kidney Int, 2001. 60(5): p. 2041-55. 155. Lewis, E.J., et al., Renoprotective effect of the angiotensin-receptor antagonist irbesartan in patients with nephropathy due to type 2 diabetes. N Engl J Med, 2001. 345(12): p. 851-60. 156. Brenner, B.M., et al., Effects of losartan on renal and cardiovascular outcomes in patients with type 2 diabetes and nephropathy. N Engl J Med, 2001. 345(12): p. 8619. 157. Tschope, C., H.P. Schultheiss, and T. Walther, Multiple interactions between the renin-angiotensin and the kallikrein-kinin systems: role of ACE inhibition and AT1 receptor blockade. J Cardiovasc Pharmacol, 2002. 39(4): p. 478-87. 158. Liu, Y.H., et al., Effects of angiotensin-converting enzyme inhibitors and angiotensin II type 1 receptor antagonists in rats with heart failure. Role of kinins and angiotensin II type 2 receptors. J Clin Invest, 1997. 99(8): p. 1926-35. 159. Tsutsumi, Y., et al., Angiotensin II type 2 receptor overexpression activates the vascular kinin system and causes vasodilation. J Clin Invest, 1999. 104(7): p. 925-35. 160. Hannan, R.E., E.A. Davis, and R.E. Widdop, Functional role of angiotensin II AT2 receptor in modulation of AT1 receptor-mediated contraction in rat uterine artery: involvement of bradykinin and nitric oxide. Br J Pharmacol, 2003. 140(5): p. 987-95. 161. Kurisu, S., et al., Cardiac angiotensin II type 2 receptor activates the kinin/NO system and inhibits fibrosis. Hypertension, 2003. 41(1): p. 99-107. 162. Abadir, P.M., R.M. Carey, and H.M. Siragy, Angiotensin AT2 receptors directly stimulate renal nitric oxide in bradykinin B2-receptor-null mice. Hypertension, 2003. 42(4): p. 600-4. 114 Références 163. Riad, A., et al., The role of the renal kallikrein-kinin system in diabetic nephropathy. Curr Opin Nephrol Hypertens, 2007. 16(1): p. 22-6. 164. Buleon, M., et al., [New perspectives for bradykinin B2 receptor in nephroprotection]. Med Sci (Paris), 2007. 23(12): p. 1141-7. 165. Taraseviciene-Stewart, L., et al., Treatment of severe pulmonary hypertension: a bradykinin receptor 2 agonist B9972 causes reduction of pulmonary artery pressure and right ventricular hypertrophy. Peptides, 2005. 26(8): p. 1292-300. 166. Ritz, E., et al., End-stage renal failure in type 2 diabetes: A medical catastrophe of worldwide dimensions. Am J Kidney Dis, 1999. 34(5): p. 795-808. 167. Remuzzi, G., A. Schieppati, and P. Ruggenenti, Clinical practice. Nephropathy in patients with type 2 diabetes. N Engl J Med, 2002. 346(15): p. 1145-51. 168. Foley, R.N. and A.J. Collins, End-stage renal disease in the United States: an update from the United States Renal Data System. J Am Soc Nephrol, 2007. 18(10): p. 26448. 169. van Dijk, P.C., et al., Renal replacement therapy in Europe: the results of a collaborative effort by the ERA-EDTA registry and six national or regional registries. Nephrol Dial Transplant, 2001. 16(6): p. 1120-9. 170. Brownlee, M., Biochemistry and molecular cell biology of diabetic complications. Nature, 2001. 414(6865): p. 813-20. 171. Forbes, J.M., et al., Advanced glycation: how are we progressing to combat this web of sugar anomalies in diabetic nephropathy. Curr Pharm Des, 2004. 10(27): p. 336172. 172. Wolf, G., New insights into the pathophysiology of diabetic nephropathy: from haemodynamics to molecular pathology. Eur J Clin Invest, 2004. 34(12): p. 785-96. 173. Boulanger, E., P. Dequiedt, and J.L. Wautier, [Advanced glycosylation end products (AGE): new toxins?]. Nephrologie, 2002. 23(7): p. 351-9. 174. Shi, X.Y., et al., Advanced oxidation protein products promote inflammation in diabetic kidney through activation of renal NADPH oxidase. Endocrinology, 2008. 175. Flyvbjerg, A., Putative pathophysiological role of growth factors and cytokines in experimental diabetic kidney disease. Diabetologia, 2000. 43(10): p. 1205-23. 176. Vlassara, H., The AGE-receptor in the pathogenesis of diabetic complications. Diabetes Metab Res Rev, 2001. 17(6): p. 436-43. 177. Nangaku, M., et al., Anti-hypertensive agents inhibit in vivo the formation of advanced glycation end products and improve renal damage in a type 2 diabetic nephropathy rat model. J Am Soc Nephrol, 2003. 14(5): p. 1212-22. 115 Références 178. Forbes, J.M., et al., Reduction of the accumulation of advanced glycation end products by ACE inhibition in experimental diabetic nephropathy. Diabetes, 2002. 51(11): p. 3274-82. 179. Suzuki, D., et al., Immunohistochemical evidence for an increased oxidative stress and carbonyl modification of proteins in diabetic glomerular lesions. J Am Soc Nephrol, 1999. 10(4): p. 822-32. 180. Tanji, N., et al., Expression of advanced glycation end products and their cellular receptor RAGE in diabetic nephropathy and nondiabetic renal disease. J Am Soc Nephrol, 2000. 11(9): p. 1656-66. 181. Lassila, M., et al., Accelerated nephropathy in diabetic apolipoprotein e-knockout mouse: role of advanced glycation end products. J Am Soc Nephrol, 2004. 15(8): p. 2125-38. 182. Cohen, M.P., et al., Inhibiting albumin glycation ameliorates diabetic nephropathy in the db/db mouse. Exp Nephrol, 2000. 8(3): p. 135-43. 183. Flyvbjerg, A., et al., Long-term renal effects of a neutralizing RAGE antibody in obese type 2 diabetic mice. Diabetes, 2004. 53(1): p. 166-72. 184. Wendt, T.M., et al., RAGE drives the development of glomerulosclerosis and implicates podocyte activation in the pathogenesis of diabetic nephropathy. Am J Pathol, 2003. 162(4): p. 1123-37. 185. Coughlan, M.T., J.M. Forbes, and M.E. Cooper, Role of the AGE crosslink breaker, alagebrium, as a renoprotective agent in diabetes. Kidney Int Suppl, 2007(106): p. S54-60. 186. Peppa, M., et al., Prevention and reversal of diabetic nephropathy in db/db mice treated with alagebrium (ALT-711). Am J Nephrol, 2006. 26(5): p. 430-6. 187. Bakris, G.L., et al., Advanced glycation end-product cross-link breakers. A novel approach to cardiovascular pathologies related to the aging process. Am J Hypertens, 2004. 17(12 Pt 2): p. 23S-30S. 188. Lee, H.B., et al., Reactive oxygen species-regulated signaling pathways in diabetic nephropathy. J Am Soc Nephrol, 2003. 14(8 Suppl 3): p. S241-5. 189. Trachtman, H., Vitamin E prevents glucose-induced lipid peroxidation and increased collagen production in cultured rat mesangial cells. Microvasc Res, 1994. 47(2): p. 232-9. 190. Trachtman, H., S. Futterweit, and R.S. Bienkowski, Taurine prevents glucose-induced lipid peroxidation and increased collagen production in cultured rat mesangial cells. Biochem Biophys Res Commun, 1993. 191(2): p. 759-65. 191. Craven, P.A., et al., Overexpression of Cu2+/Zn2+ superoxide dismutase protects against early diabetic glomerular injury in transgenic mice. Diabetes, 2001. 50(9): p. 2114-25. 116 Références 192. Lee, E.A., et al., Reactive oxygen species mediate high glucose-induced plasminogen activator inhibitor-1 up-regulation in mesangial cells and in diabetic kidney. Kidney Int, 2005. 67(5): p. 1762-71. 193. Yusuf, S., et al., Vitamin E supplementation and cardiovascular events in high-risk patients. The Heart Outcomes Prevention Evaluation Study Investigators. N Engl J Med, 2000. 342(3): p. 154-60. 194. Chen, S., B. Jim, and F.N. Ziyadeh, Diabetic nephropathy and transforming growth factor-beta: transforming our view of glomerulosclerosis and fibrosis build-up. Semin Nephrol, 2003. 23(6): p. 532-43. 195. Yu, L., et al., TGF-beta isoforms in renal fibrogenesis. Kidney Int, 2003. 64(3): p. 844-56. 196. Hong, S.W., et al., Increased glomerular and tubular expression of transforming growth factor-beta1, its type II receptor, and activation of the Smad signaling pathway in the db/db mouse. Am J Pathol, 2001. 158(5): p. 1653-63. 197. Ziyadeh, F.N., Mediators of diabetic renal disease: the case for tgf-Beta as the major mediator. J Am Soc Nephrol, 2004. 15 Suppl 1: p. S55-7. 198. Cohen, M.P., et al., The renal TGF-beta system in the db/db mouse model of diabetic nephropathy. Exp Nephrol, 1998. 6(3): p. 226-33. 199. Ziyadeh, F.N., et al., Long-term prevention of renal insufficiency, excess matrix gene expression, and glomerular mesangial matrix expansion by treatment with monoclonal antitransforming growth factor-beta antibody in db/db diabetic mice. Proc Natl Acad Sci U S A, 2000. 97(14): p. 8015-20. 200. Wang, S., et al., Renal bone morphogenetic protein-7 protects against diabetic nephropathy. J Am Soc Nephrol, 2006. 17(9): p. 2504-12. 201. Wang, S., et al., Bone morphogenic protein-7 (BMP-7), a novel therapy for diabetic nephropathy. Kidney Int, 2003. 63(6): p. 2037-49. 202. Sugimoto, H., et al., Renal fibrosis and glomerulosclerosis in a new mouse model of diabetic nephropathy and its regression by bone morphogenic protein-7 and advanced glycation end product inhibitors. Diabetes, 2007. 56(7): p. 1825-33. 203. Oemar, B.S., et al., Regulation of insulin-like growth factor I receptors in diabetic mesangial cells. J Biol Chem, 1991. 266(4): p. 2369-73. 204. Tack, I., et al., Autocrine activation of the IGF-I signaling pathway in mesangial cells isolated from diabetic NOD mice. Diabetes, 2002. 51(1): p. 182-8. 205. Heilig, C.W., et al., D-glucose stimulates mesangial cell GLUT1 expression and basal and IGF-I-sensitive glucose uptake in rat mesangial cells: implications for diabetic nephropathy. Diabetes, 1997. 46(6): p. 1030-9. 117 Références 206. Schreiber, B.D., M.L. Hughes, and G.C. Groggel, Insulin-like growth factor-1 stimulates production of mesangial cell matrix components. Clin Nephrol, 1995. 43(6): p. 368-74. 207. Feld, S.M., et al., Insulin-like growth factor I induces mesangial proliferation and increases mRNA and secretion of collagen. Kidney Int, 1995. 48(1): p. 45-51. 208. Haylor, J., et al., JB3, an IGF-I receptor antagonist, inhibits early renal growth in diabetic and uninephrectomized rats. J Am Soc Nephrol, 2000. 11(11): p. 2027-35. 209. Johnson, R., et al., Platelet-derived growth factor: a potentially important cytokine in glomerular disease. Kidney Int, 1992. 41(3): p. 590-4. 210. Hansch, G.M., et al., Matrix protein synthesis by glomerular mesangial cells in culture: effects of transforming growth factor beta (TGF beta) and platelet-derived growth factor (PDGF) on fibronectin and collagen type IV mRNA. J Cell Physiol, 1995. 163(3): p. 451-7. 211. Shankland, S.J., et al., Mesangial cell proliferation mediated by PDGF and bFGF is determined by levels of the cyclin kinase inhibitor p27Kip1. Kidney Int, 1997. 51(4): p. 1088-99. 212. Strutz, F., et al., Basic fibroblast growth factor expression is increased in human renal fibrogenesis and may mediate autocrine fibroblast proliferation. Kidney Int, 2000. 57(4): p. 1521-38. 213. Neufeld, G., et al., Vascular endothelial growth factor (VEGF) and its receptors. Faseb J, 1999. 13(1): p. 9-22. 214. Cooper, M.E., et al., Increased renal expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) and its receptor VEGFR-2 in experimental diabetes. Diabetes, 1999. 48(11): p. 2229-39. 215. Iglesias-de la Cruz, M.C., et al., Effects of high glucose and TGF-beta1 on the expression of collagen IV and vascular endothelial growth factor in mouse podocytes. Kidney Int, 2002. 62(3): p. 901-13. 216. de Vriese, A.S., et al., Antibodies against vascular endothelial growth factor improve early renal dysfunction in experimental diabetes. J Am Soc Nephrol, 2001. 12(5): p. 993-1000. 217. Flyvbjerg, A., et al., Amelioration of long-term renal changes in obese type 2 diabetic mice by a neutralizing vascular endothelial growth factor antibody. Diabetes, 2002. 51(10): p. 3090-4. 218. Katavetin, P., et al., High glucose blunts vascular endothelial growth factor response to hypoxia via the oxidative stress-regulated hypoxia-inducible factor/hypoxiaresponsible element pathway. J Am Soc Nephrol, 2006. 17(5): p. 1405-13. 219. Simonson, M.S., Phenotypic transitions and fibrosis in diabetic nephropathy. Kidney Int, 2007. 71(9): p. 846-54. 118 Références 220. Kikutani, H. and S. Makino, The murine autoimmune diabetes model: NOD and related strains. Adv Immunol, 1992. 51: p. 285-322. 221. Yale, J.F. and E.B. Marliss, Altered immunity and diabetes in the BB rat. Clin Exp Immunol, 1984. 57(1): p. 1-11. 222. Tesch, G.H. and T.J. Allen, Rodent models of streptozotocin-induced diabetic nephropathy. Nephrology (Carlton), 2007. 12(3): p. 261-6. 223. Craighead, J.E. and M.F. McLane, Diabetes mellitus: induction in mice by encephalomyocarditis virus. Science, 1968. 162(856): p. 913-4. 224. Barber, A.J., et al., The Ins2Akita mouse as a model of early retinal complications in diabetes. Invest Ophthalmol Vis Sci, 2005. 46(6): p. 2210-8. 225. Hummel, K.P., M.M. Dickie, and D.L. Coleman, Diabetes, a new mutation in the mouse. Science, 1966. 153(740): p. 1127-8. 226. Coleman, D.L. and K.P. Hummel, The influence of genetic background on the expression of the obese (Ob) gene in the mouse. Diabetologia, 1973. 9(4): p. 287-93. 227. Etgen, G.J. and B.A. Oldham, Profiling of Zucker diabetic fatty rats in their progression to the overt diabetic state. Metabolism, 2000. 49(5): p. 684-8. 228. Janssen, U., et al., The quest for a model of type II diabetes with nephropathy: the Goto Kakizaki rat. J Nephrol, 2004. 17(6): p. 769-73. 229. Baudry, A., et al., Genetic manipulation of insulin signaling, action and secretion in mice. Insights into glucose homeostasis and pathogenesis of type 2 diabetes. EMBO Rep, 2002. 3(4): p. 323-8. 230. Luo, J., et al., Nongenetic mouse models of non-insulin-dependent diabetes mellitus. Metabolism, 1998. 47(6): p. 663-8. 231. Elsner, M., et al., Relative importance of transport and alkylation for pancreatic betacell toxicity of streptozotocin. Diabetologia, 2000. 43(12): p. 1528-33. 232. Yamamoto, H., Y. Uchigata, and H. Okamoto, DNA strand breaks in pancreatic islets by in vivo administration of alloxan or streptozotocin. Biochem Biophys Res Commun, 1981. 103(3): p. 1014-20. 233. Yamamoto, H., Y. Uchigata, and H. Okamoto, Streptozotocin and alloxan induce DNA strand breaks and poly(ADP-ribose) synthetase in pancreatic islets. Nature, 1981. 294(5838): p. 284-6. 234. Gurley, S.B., et al., Impact of genetic background on nephropathy in diabetic mice. Am J Physiol Renal Physiol, 2006. 290(1): p. F214-22. 235. Qi, Z., et al., Characterization of susceptibility of inbred mouse strains to diabetic nephropathy. Diabetes, 2005. 54(9): p. 2628-37. 119 Références 236. Like, A.A., et al., Studies in the diabetic mutant mouse. VI. Evolution of glomerular lesions and associated proteinuria. Am J Pathol, 1972. 66(2): p. 193-224. 237. Sharma, K., P. McCue, and S.R. Dunn, Diabetic kidney disease in the db/db mouse. Am J Physiol Renal Physiol, 2003. 284(6): p. F1138-44. 238. Bellush, L.L., et al., Protection against diabetes-induced nephropathy in growth hormone receptor/binding protein gene-disrupted mice. Endocrinology, 2000. 141(1): p. 163-8. 239. Park, C.W., et al., Accelerated diabetic nephropathy in mice lacking the peroxisome proliferator-activated receptor alpha. Diabetes, 2006. 55(4): p. 885-93. 240. Fujimoto, M., et al., Mice lacking Smad3 are protected against streptozotocin-induced diabetic glomerulopathy. Biochem Biophys Res Commun, 2003. 305(4): p. 1002-7. 241. Okazaki, Y., et al., Enhanced TGF-beta/Smad signaling in the early stage of diabetic nephropathy is independent of the AT1a receptor. Clin Exp Nephrol, 2007. 11(1): p. 77-87. 242. Meier, M., et al., Deletion of protein kinase C-beta isoform in vivo reduces renal hypertrophy but not albuminuria in the streptozotocin-induced diabetic mouse model. Diabetes, 2007. 56(2): p. 346-54. 243. Menne, J., et al., Diminished loss of proteoglycans and lack of albuminuria in protein kinase C-alpha-deficient diabetic mice. Diabetes, 2004. 53(8): p. 2101-9. 244. Tan, Y., et al., Targeted deletion of B2-kinin receptors protects against the development of diabetic nephropathy. Am J Physiol Renal Physiol, 2007. 293(4): p. F1026-35. 245. Wolf, G., et al., p27(Kip1) Knockout mice are protected from diabetic nephropathy: evidence for p27(Kip1) haplotype insufficiency. Kidney Int, 2005. 68(4): p. 1583-9. 246. Wong, D.W., et al., Loss of angiotensin-converting enzyme-2 (Ace2) accelerates diabetic kidney injury. Am J Pathol, 2007. 171(2): p. 438-51. 247. Lassila, M., et al., Plasminogen activator inhibitor-1 production is pathogenetic in experimental murine diabetic renal disease. Diabetologia, 2007. 50(6): p. 1315-26. 248. Ragolia, L., et al., Accelerated glucose intolerance, nephropathy, and atherosclerosis in prostaglandin D2 synthase knock-out mice. J Biol Chem, 2005. 280(33): p. 2994655. 249. Okada, S., et al., Intercellular adhesion molecule-1-deficient mice are resistant against renal injury after induction of diabetes. Diabetes, 2003. 52(10): p. 2586-93. 250. DeRubertis, F.R., P.A. Craven, and M.F. Melhem, Acceleration of diabetic renal injury in the superoxide dismutase knockout mouse: effects of tempol. Metabolism, 2007. 56(9): p. 1256-64. 120 Références 251. Daniel, C., et al., Thrombospondin-1 is an endogenous activator of TGF-beta in experimental diabetic nephropathy in vivo. Diabetes, 2007. 56(12): p. 2982-9. 252. Kanetsuna, Y., et al., Deficiency of endothelial nitric-oxide synthase confers susceptibility to diabetic nephropathy in nephropathy-resistant inbred mice. Am J Pathol, 2007. 170(5): p. 1473-84. 253. Menini, S., et al., Deletion of p66Shc longevity gene protects against experimental diabetic glomerulopathy by preventing diabetes-induced oxidative stress. Diabetes, 2006. 55(6): p. 1642-50. 254. Iacobini, C., et al., Galectin-3/AGE-receptor 3 knockout mice show accelerated AGEinduced glomerular injury: evidence for a protective role of galectin-3 as an AGE receptor. Faseb J, 2004. 18(14): p. 1773-5. 255. Taneda, S., et al., Amelioration of diabetic nephropathy in SPARC-null mice. J Am Soc Nephrol, 2003. 14(4): p. 968-80. 256. Usui, H.K., et al., Macrophage scavenger receptor-a-deficient mice are resistant against diabetic nephropathy through amelioration of microinflammation. Diabetes, 2007. 56(2): p. 363-72. 257. Friedman, D.J., et al., The vascular ectonucleotidase ENTPD1 is a novel renoprotective factor in diabetic nephropathy. Diabetes, 2007. 56(9): p. 2371-9. 258. Lovegrove, A.S., et al., Estrogen receptor alpha-mediated events promote sex-specific diabetic glomerular hypertrophy. Am J Physiol Renal Physiol, 2004. 287(3): p. F58691. 259. Zent, R., et al., Glomerular injury is exacerbated in diabetic integrin alpha1-null mice. Kidney Int, 2006. 70(3): p. 460-70. 260. Kosugi, T., et al., Midkine is involved in tubulointerstitial inflammation associated with diabetic nephropathy. Lab Invest, 2007. 87(9): p. 903-13. 261. Williams, K.J., et al., Decorin deficiency enhances progressive nephropathy in diabetic mice. Am J Pathol, 2007. 171(5): p. 1441-50. 262. Zhang, Z., et al., Renoprotective role of the vitamin D receptor in diabetic nephropathy. Kidney Int, 2008. 73(2): p. 163-71. 263. The effect of intensive treatment of diabetes on the development and progression of long-term complications in insulin-dependent diabetes mellitus. The Diabetes Control and Complications Trial Research Group. N Engl J Med, 1993. 329(14): p. 977-86. 264. Hasslacher, C., et al., Similar risks of nephropathy in patients with type I or type II diabetes mellitus. Nephrol Dial Transplant, 1989. 4(10): p. 859-63. 265. Liu, Y., Renal fibrosis: new insights into the pathogenesis and therapeutics. Kidney Int, 2006. 69(2): p. 213-7. 121 Références 266. Chatziantoniou, C. and J.C. Dussaule, Insights into the mechanisms of renal fibrosis: is it possible to achieve regression? Am J Physiol Renal Physiol, 2005. 289(2): p. F227-34. 267. Chatziantoniou, C. and J.C. Dussaule, Is kidney injury a reversible process? Curr Opin Nephrol Hypertens, 2008. 17(1): p. 76-81. 268. Eddy, A.A., Can renal fibrosis be reversed? Pediatr Nephrol, 2005. 20(10): p. 136975. 269. Francois, H., et al., Prevention of renal vascular and glomerular fibrosis by epidermal growth factor receptor inhibition. Faseb J, 2004. 18(7): p. 926-8. 270. Boffa, J.J., et al., Regression of renal vascular and glomerular fibrosis: role of angiotensin II receptor antagonism and matrix metalloproteinases. J Am Soc Nephrol, 2003. 14(5): p. 1132-44. 271. Adamczak, M., et al., Reversal of glomerulosclerosis after high-dose enalapril treatment in subtotally nephrectomized rats. J Am Soc Nephrol, 2003. 14(11): p. 2833-42. 272. Placier, S., et al., Reversal of renal lesions following interruption of nitric oxide synthesis inhibition in transgenic mice. Nephrol Dial Transplant, 2006. 21(4): p. 8818. 273. Fioretto, P., et al., Remodeling of renal interstitial and tubular lesions in pancreas transplant recipients. Kidney Int, 2006. 69(5): p. 907-12. 274. Fioretto, P., et al., Reversal of lesions of diabetic nephropathy after pancreas transplantation. N Engl J Med, 1998. 339(2): p. 69-75. 275. Danilczyk, U. and J.M. Penninger, Angiotensin-converting enzyme II in the heart and the kidney. Circ Res, 2006. 98(4): p. 463-71. 276. McFarlane, S.I., A. Kumar, and J.R. Sowers, Mechanisms by which angiotensinconverting enzyme inhibitors prevent diabetes and cardiovascular disease. Am J Cardiol, 2003. 91(12A): p. 30H-37H. 277. Lewis, E.J., et al., The effect of angiotensin-converting-enzyme inhibition on diabetic nephropathy. The Collaborative Study Group. N Engl J Med, 1993. 329(20): p. 145662. 278. Parving, H.H., et al., The effect of irbesartan on the development of diabetic nephropathy in patients with type 2 diabetes. N Engl J Med, 2001. 345(12): p. 870-8. 279. Noh, H. and G.L. King, The role of protein kinase C activation in diabetic nephropathy. Kidney Int Suppl, 2007(106): p. S49-53. 280. Ohshiro, Y., et al., Reduction of diabetes-induced oxidative stress, fibrotic cytokine expression, and renal dysfunction in protein kinase Cbeta-null mice. Diabetes, 2006. 55(11): p. 3112-20. 122 Références 281. Beckman, J.A., et al., Inhibition of protein kinase Cbeta prevents impaired endothelium-dependent vasodilation caused by hyperglycemia in humans. Circ Res, 2002. 90(1): p. 107-11. 282. McGill, J.B., et al., Clinical safety of the selective PKC-beta inhibitor, ruboxistaurin. Expert Opin Drug Saf, 2006. 5(6): p. 835-45. 283. Zheng, F. and Y. Guan, Thiazolidinediones: a novel class of drugs for the prevention of diabetic nephropathy? Kidney Int, 2007. 72(11): p. 1301-3. 284. Miyazaki, Y., et al., Rosiglitazone decreases albuminuria in type 2 diabetic patients. Kidney Int, 2007. 72(11): p. 1367-73. 285. Liu, Y., Hepatocyte growth factor in kidney fibrosis: therapeutic potential and mechanisms of action. Am J Physiol Renal Physiol, 2004. 287(1): p. F7-16. 286. Dai, C. and Y. Liu, Hepatocyte growth factor antagonizes the profibrotic action of TGF-beta1 in mesangial cells by stabilizing Smad transcriptional corepressor TGIF. J Am Soc Nephrol, 2004. 15(6): p. 1402-12. 287. Dai, C., et al., Intravenous administration of hepatocyte growth factor gene ameliorates diabetic nephropathy in mice. J Am Soc Nephrol, 2004. 15(10): p. 263747. 288. Yang, J., C. Dai, and Y. Liu, A novel mechanism by which hepatocyte growth factor blocks tubular epithelial to mesenchymal transition. J Am Soc Nephrol, 2005. 16(1): p. 68-78. 289. Cruzado, J.M., et al., Regression of advanced diabetic nephropathy by hepatocyte growth factor gene therapy in rats. Diabetes, 2004. 53(4): p. 1119-27. 290. Lee, H.B., et al., Histone deacetylase inhibitors: a novel class of therapeutic agents in diabetic nephropathy. Kidney Int Suppl, 2007(106): p. S61-6. 291. Yoshikawa, M., et al., Inhibition of histone deacetylase activity suppresses epithelialto-mesenchymal transition induced by TGF-beta1 in human renal epithelial cells. J Am Soc Nephrol, 2007. 18(1): p. 58-65. 292. Imai, N., et al., Inhibition of histone deacetylase activates side population cells in kidney and partially reverses chronic renal injury. Stem Cells, 2007. 25(10): p. 246975. 293. Li, J.J., et al., Podocyte biology in diabetic nephropathy. Kidney Int Suppl, 2007(106): p. S36-42. 294. Mitu, G.M., S. Wang, and R. Hirschberg, BMP7 is a podocyte survival factor and rescues podocytes from diabetic injury. Am J Physiol Renal Physiol, 2007. 293(5): p. F1641-8. 295. Cohen, M.P., et al., Evidence linking glycated albumin to altered glomerular nephrin and VEGF expression, proteinuria, and diabetic nephropathy. Kidney Int, 2005. 68(4): p. 1554-61. 123 Références 296. Wolf, G., S. Chen, and F.N. Ziyadeh, From the periphery of the glomerular capillary wall toward the center of disease: podocyte injury comes of age in diabetic nephropathy. Diabetes, 2005. 54(6): p. 1626-34. 297. Isermann, B., et al., Activated protein C protects against diabetic nephropathy by inhibiting endothelial and podocyte apoptosis. Nat Med, 2007. 13(11): p. 1349-58. 298. Brownlee, M., Preventing kidney cell suicide. Nat Med, 2007. 13(11): p. 1284-5. 299. Merchant, M.L. and J.B. Klein, Proteomics and diabetic nephropathy. Semin Nephrol, 2007. 27(6): p. 627-36. 300. Thongboonkerd, V., et al., Alterations in the renal elastin-elastase system in type 1 diabetic nephropathy identified by proteomic analysis. J Am Soc Nephrol, 2004. 15(3): p. 650-62. 301. Makino, H., et al., Altered gene expression related to glomerulogenesis and podocyte structure in early diabetic nephropathy of db/db mice and its restoration by pioglitazone. Diabetes, 2006. 55(10): p. 2747-56. 302. Takahashi, T., et al., Protective role of heme oxygenase-1 in renal ischemia. Antioxid Redox Signal, 2004. 6(5): p. 867-77. 303. Kunter, U., et al., Mesenchymal stem cells prevent progressive experimental renal failure but maldifferentiate into glomerular adipocytes. J Am Soc Nephrol, 2007. 18(6): p. 1754-64. 304. Togel, F., et al., Vasculotropic, paracrine actions of infused mesenchymal stem cells are important to the recovery from acute kidney injury. Am J Physiol Renal Physiol, 2007. 292(5): p. F1626-35. 305. Morigi, M., et al., Mesenchymal stem cells are renotropic, helping to repair the kidney and improve function in acute renal failure. J Am Soc Nephrol, 2004. 15(7): p. 1794804. 306. Zheng, F., et al., Development of albuminuria and glomerular lesions in normoglycemic B6 recipients of db/db mice bone marrow: the role of mesangial cell progenitors. Diabetes, 2004. 53(9): p. 2420-7. 307. Cornacchia, F., et al., Glomerulosclerosis is transmitted by bone marrow-derived mesangial cell progenitors. J Clin Invest, 2001. 108(11): p. 1649-56. 308. Lazzeri, E., et al., Regenerative potential of embryonic renal multipotent progenitors in acute renal failure. J Am Soc Nephrol, 2007. 18(12): p. 3128-38. 309. Tomiyama, H., et al., Kinins contribute to the improvement of insulin sensitivity during treatment with angiotensin converting enzyme inhibitor. Hypertension, 1994. 23(4): p. 450-5. 310. Isami, S., et al., Bradykinin enhances GLUT4 translocation through the increase of insulin receptor tyrosine kinase in primary adipocytes: evidence that bradykinin stimulates the insulin signalling pathway. Diabetologia, 1996. 39(4): p. 412-20. 124 Références 311. Kishi, K., et al., Bradykinin directly triggers GLUT4 translocation via an insulinindependent pathway. Diabetes, 1998. 47(4): p. 550-8. 312. Rett, K., et al., Insulin-induced glucose transporter (GLUT1 and GLUT4) translocation in cardiac muscle tissue is mimicked by bradykinin. Diabetes, 1996. 45 Suppl 1: p. S66-9. 313. Wihler, C., et al., Renal accumulation and clearance of advanced glycation endproducts in type 2 diabetic nephropathy: effect of angiotensin-converting enzyme and vasopeptidase inhibition. Diabetologia, 2005. 48(8): p. 1645-53. 314. Forbes, J.M., et al., Modulation of soluble receptor for advanced glycation end products by angiotensin-converting enzyme-1 inhibition in diabetic nephropathy. J Am Soc Nephrol, 2005. 16(8): p. 2363-72. 315. Cooper, M.E., et al., Nephropathy in model combining genetic hypertension with experimental diabetes. Enalapril versus hydralazine and metoprolol therapy. Diabetes, 1990. 39(12): p. 1575-9. 316. Anderson, S., et al., Short and long term effects of antihypertensive therapy in the diabetic rat. Kidney Int, 1989. 36(4): p. 526-36. 317. Velasquez, M.T., et al., Perindopril ameliorates glomerular and renal tubulointerstitial injury in the SHR/N-corpulent rat. Hypertension, 1997. 30(5): p. 1232-7. 318. Arbin, V., et al., Acute effect of the dual angiotensin-converting enzyme and neutral endopeptidase 24-11 inhibitor mixanpril on insulin sensitivity in obese Zucker rat. Br J Pharmacol, 2001. 133(4): p. 495-502. 319. Arbin, V., et al., Effects of dual angiotensin-converting enzyme and neutral endopeptidase 24-11 chronic inhibition by mixanpril on insulin sensitivity in lean and obese Zucker rats. J Cardiovasc Pharmacol, 2003. 41(2): p. 254-64. 320. Wang, C.H., et al., Vasopeptidase inhibitor omapatrilat induces profound insulin sensitization and increases myocardial glucose uptake in Zucker fatty rats: Studies comparing a vasopeptidase inhibitor, angiotensin-converting enzyme inhibitor, and angiotensin II type I receptor blocker. Circulation, 2003. 107(14): p. 1923-9. 321. Schafer, S., et al., Nephroprotection in Zucker diabetic fatty rats by vasopeptidase inhibition is partly bradykinin B2 receptor dependent. Br J Pharmacol, 2004. 143(1): p. 27-32. 322. Allard, J., et al., ACE inhibitor reduces growth factor receptor expression and signaling but also albuminuria through B2-kinin glomerular receptor activation in diabetic rats. Am J Physiol Renal Physiol, 2007. 293(4): p. F1083-92. 323. Azizi, M., et al., Acute angiotensin-converting enzyme inhibition increases the plasma level of the natural stem cell regulator N-acetyl-seryl-aspartyl-lysyl-proline. J Clin Invest, 1996. 97(3): p. 839-44. 125 Références 324. Kanasaki, K., et al., N-Acetyl-seryl-aspartyl-lysyl-proline inhibits TGF-beta-mediated plasminogen activator inhibitor-1 expression via inhibition of Smad pathway in human mesangial cells. J Am Soc Nephrol, 2003. 14(4): p. 863-72. 325. Shibuya, K., et al., N-acetyl-seryl-aspartyl-lysyl-proline prevents renal insufficiency and mesangial matrix expansion in diabetic db/db mice. Diabetes, 2005. 54(3): p. 83845. 326. Omata, M., et al., N-acetyl-seryl-aspartyl-lysyl-proline ameliorates the progression of renal dysfunction and fibrosis in WKY rats with established anti-glomerular basement membrane nephritis. J Am Soc Nephrol, 2006. 17(3): p. 674-85. 327. Rhaleb, N.E., et al., Long-term effect of N-acetyl-seryl-aspartyl-lysyl-proline on left ventricular collagen deposition in rats with 2-kidney, 1-clip hypertension. Circulation, 2001. 103(25): p. 3136-41. 328. Rasoul, S., et al., Antifibrotic effect of Ac-SDKP and angiotensin-converting enzyme inhibition in hypertension. J Hypertens, 2004. 22(3): p. 593-603. 329. Peng, H., et al., Angiotensin-converting enzyme inhibitors: a new mechanism of action. Circulation, 2005. 112(16): p. 2436-45. 330. Tschope, C., et al., Functional, biochemical, and molecular investigations of renal kallikrein-kinin system in diabetic rats. Am J Physiol, 1999. 277(6 Pt 2): p. H2333-40. 331. Montanari, D., et al., Kallikrein gene delivery improves serum glucose and lipid profiles and cardiac function in streptozotocin-induced diabetic rats. Diabetes, 2005. 54(5): p. 1573-80. 332. Yuan, G., et al., Tissue kallikrein reverses insulin resistance and attenuates nephropathy in diabetic rats by activation of phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B and adenosine 5'-monophosphate-activated protein kinase signaling pathways. Endocrinology, 2007. 148(5): p. 2016-26. 333. Tan, Y., et al., Mechanisms through which bradykinin promotes glomerular injury in diabetes. Am J Physiol Renal Physiol, 2005. 288(3): p. F483-92. 334. Damas, J., V. Bourdon, and P.J. Lefebvre, Insulin sensitivity, clearance and release in kininogen-deficient rats. Exp Physiol, 1999. 84(3): p. 549-57. 335. Duka, I., et al., Role of the B(2) receptor of bradykinin in insulin sensitivity. Hypertension, 2001. 38(6): p. 1355-60. 336. Kohlman, O., Jr., et al., Role of bradykinin in insulin sensitivity and blood pressure regulation during hyperinsulinemia. Hypertension, 1995. 25(5): p. 1003-7. 337. Yang, C. and W.H. Hsu, Glucose-dependency of bradykinin-induced insulin secretion from the perfused rat pancreas. Regul Pept, 1997. 71(1): p. 23-8. 338. Henriksen, E.J., et al., Effect of chronic bradykinin administration on insulin action in an animal model of insulin resistance. Am J Physiol, 1998. 275(1 Pt 2): p. R40-5. 126 Références 339. Cahova, M., et al., Captopril enhanced insulin-stimulated glycogen synthesis in skeletal muscle but not fatty acid synthesis in adipose tissue of hereditary hypertriglyceridemic rats. Metabolism, 2003. 52(11): p. 1406-12. 340. Mikrut, K., et al., The effect of bradykinin on the oxidative state of rats with acute hyperglycaemia. Diabetes Res Clin Pract, 2001. 51(2): p. 79-85. 341. Kakoki, M., et al., Senescence-associated phenotypes in Akita diabetic mice are enhanced by absence of bradykinin B2 receptors. J Clin Invest, 2006. 116(5): p. 13029. 342. Cellier, E., et al., Bradykinin reduces growth factor-induced glomerular ERK1/2 phosphorylation. Am J Physiol Renal Physiol, 2003. 284(2): p. F282-92. 343. Grewal, J.S., L.M. Luttrell, and J.R. Raymond, G protein-coupled receptors desensitize and down-regulate epidermal growth factor receptors in renal mesangial cells. J Biol Chem, 2001. 276(29): p. 27335-44. 344. Cellier, E., et al., B2 receptor activation reduces Erk1 and Erk2 phosphorylation induced by insulin-like growth factor-1, platelet-derived growth factor-BB, and high glucose in rat isolated glomeruli. Can J Physiol Pharmacol, 2002. 80(4): p. 341-5. 345. Tsuchida, S., et al., Potent antihypertrophic effect of the bradykinin B2 receptor system on the renal vasculature. Kidney Int, 1999. 56(2): p. 509-16. 346. Ritchie, R.H., et al., Bradykinin blocks angiotensin II-induced hypertrophy in the presence of endothelial cells. Hypertension, 1998. 31(1): p. 39-44. 347. Aaltonen, P., et al., Changes in the expression of nephrin gene and protein in experimental diabetic nephropathy. Lab Invest, 2001. 81(9): p. 1185-90. 348. Huber, T.B., et al., Molecular basis of the functional podocin-nephrin complex: mutations in the NPHS2 gene disrupt nephrin targeting to lipid raft microdomains. Hum Mol Genet, 2003. 12(24): p. 3397-405. 349. Holzman, L.B., et al., Nephrin localizes to the slit pore of the glomerular epithelial cell. Kidney Int, 1999. 56(4): p. 1481-91. 350. Miyata, T., et al., Overexpression of the serpin megsin induces progressive mesangial cell proliferation and expansion. J Clin Invest, 2002. 109(5): p. 585-93. 351. Abdouh, M., et al., Early upregulation of kinin B1 receptors in retinal microvessels of the streptozotocin-diabetic rat. Br J Pharmacol, 2003. 140(1): p. 33-40. 352. Mage, M., et al., Induction of B1 receptors in streptozotocin diabetic rats: possible involvement in the control of hyperglycemia-induced glomerular Erk 1 and 2 phosphorylation. Can J Physiol Pharmacol, 2002. 80(4): p. 328-33. 353. Christopher, J. and A.A. Jaffa, Diabetes modulates the expression of glomerular kinin receptors. Int Immunopharmacol, 2002. 2(13-14): p. 1771-9. 127 Références 354. Simard, B., B.H. Gabra, and P. Sirois, Inhibitory effect of a novel bradykinin B1 receptor antagonist, R-954, on enhanced vascular permeability in type 1 diabetic mice. Can J Physiol Pharmacol, 2002. 80(12): p. 1203-7. 355. Lawson, S.R., et al., Effects of a selective bradykinin B1 receptor antagonist on increased plasma extravasation in streptozotocin-induced diabetic rats: distinct vasculopathic profile of major key organs. Eur J Pharmacol, 2005. 514(1): p. 69-78. 356. Cloutier, F. and R. Couture, Pharmacological characterization of the cardiovascular responses elicited by kinin B(1) and B(2) receptor agonists in the spinal cord of streptozotocin-diabetic rats. Br J Pharmacol, 2000. 130(2): p. 375-85. 357. de Sousa Buck, H., et al., Autoradiographic detection of kinin receptors in the human medulla of control, hypertensive, and diabetic donors. Can J Physiol Pharmacol, 2002. 80(4): p. 249-57. 358. Ongali, B., et al., Expression of kinin B1 receptors in the spinal cord of streptozotocindiabetic rat. Neuroreport, 2004. 15(16): p. 2463-6. 359. Qadri, F., et al., Expression of kinin receptor mRNA in the HPA axis of type 1 and type 2 diabetic rats. Int Immunopharmacol, 2004. 4(4): p. 571-6. 360. Tschope, C., et al., Myocardial expression of rat bradykinin receptors and two tissue kallikrein genes in experimental diabetes. Immunopharmacology, 1999. 44(1-2): p. 35-42. 361. Agata, J., et al., Bradykinin B(1) receptor mediates inhibition of neointima formation in rat artery after balloon angioplasty. Hypertension, 2000. 36(3): p. 364-70. 362. Couture, R. and J.P. Girolami, Putative roles of kinin receptors in the therapeutic effects of angiotensin 1-converting enzyme inhibitors in diabetes mellitus. Eur J Pharmacol, 2004. 500(1-3): p. 467-85. 363. Lungu, C., et al., Involvement of kinin B1 receptor and oxidative stress in sensory abnormalities and arterial hypertension in an experimental rat model of insulin resistance. Neuropeptides, 2007. 41(6): p. 375-87. 364. Gabra, B.H., et al., The kinin system mediates hyperalgesia through the inducible bradykinin B1 receptor subtype: evidence in various experimental animal models of type 1 and type 2 diabetic neuropathy. Biol Chem, 2006. 387(2): p. 127-43. 365. Annane, D., E. Bellissant, and J.M. Cavaillon, Septic shock. Lancet, 2005. 365(9453): p. 63-78. 366. Annane, D., et al., Current epidemiology of septic shock: the CUB-Rea Network. Am J Respir Crit Care Med, 2003. 168(2): p. 165-72. 367. Martin, G.S., et al., The epidemiology of sepsis in the United States from 1979 through 2000. N Engl J Med, 2003. 348(16): p. 1546-54. 128 Références 368. American College of Chest Physicians/Society of Critical Care Medicine Consensus Conference: definitions for sepsis and organ failure and guidelines for the use of innovative therapies in sepsis. Crit Care Med, 1992. 20(6): p. 864-74. 369. Geissmann, F., S. Jung, and D.R. Littman, Blood monocytes consist of two principal subsets with distinct migratory properties. Immunity, 2003. 19(1): p. 71-82. 370. Cavaillon, J.M., et al., Cytokine cascade in sepsis. Scand J Infect Dis, 2003. 35(9): p. 535-44. 371. Ni, A., L. Chao, and J. Chao, Transcription factor nuclear factor kappaB regulates the inducible expression of the human B1 receptor gene in inflammation. J Biol Chem, 1998. 273(5): p. 2784-91. 372. Sharshar, T., et al., Apoptosis of neurons in cardiovascular autonomic centres triggered by inducible nitric oxide synthase after death from septic shock. Lancet, 2003. 362(9398): p. 1799-805. 373. Goode, H.F., et al., Nitric oxide synthase activity is increased in patients with sepsis syndrome. Clin Sci (Lond), 1995. 88(2): p. 131-3. 374. Schrier, R.W. and W. Wang, Acute renal failure and sepsis. N Engl J Med, 2004. 351(2): p. 159-69. 375. Hollenberg, S.M., et al., Increased microvascular reactivity and improved mortality in septic mice lacking inducible nitric oxide synthase. Circ Res, 2000. 86(7): p. 774-8. 376. Hollenberg, S.M., J.H. Shelhamer, and R.E. Cunnion, Tachyphylaxis to the vasopressor effects of endothelin in rat aortic rings. Am J Physiol, 1993. 264(2 Pt 2): p. H352-6. 377. Thiemermann, C., et al., Vascular hyporeactivity to vasoconstrictor agents and hemodynamic decompensation in hemorrhagic shock is mediated by nitric oxide. Proc Natl Acad Sci U S A, 1993. 90(1): p. 267-71. 378. Kilbourn, R.G., et al., Reversal of endotoxin-mediated shock by NG-methyl-Larginine, an inhibitor of nitric oxide synthesis. Biochem Biophys Res Commun, 1990. 172(3): p. 1132-8. 379. Wright, C.E., D.D. Rees, and S. Moncada, Protective and pathological roles of nitric oxide in endotoxin shock. Cardiovasc Res, 1992. 26(1): p. 48-57. 380. Cumming, A.D., et al., Vasoactive hormones in the renal response to systemic sepsis. Am J Kidney Dis, 1988. 11(1): p. 23-32. 381. Schrier, R.W. and W.T. Abraham, Hormones and hemodynamics in heart failure. N Engl J Med, 1999. 341(8): p. 577-85. 382. Landry, D.W., et al., Vasopressin deficiency contributes to the vasodilation of septic shock. Circulation, 1997. 95(5): p. 1122-5. 129 Références 383. Morales, D., et al., Reversal by vasopressin of intractable hypotension in the late phase of hemorrhagic shock. Circulation, 1999. 100(3): p. 226-9. 384. Umino, T., et al., AVP inhibits LPS- and IL-1beta-stimulated NO and cGMP via V1 receptor in cultured rat mesangial cells. Am J Physiol, 1999. 276(3 Pt 2): p. F433-41. 385. Ziegler, E.J., et al., Treatment of gram-negative bacteremia and septic shock with HA1A human monoclonal antibody against endotoxin. A randomized, double-blind, placebo-controlled trial. The HA-1A Sepsis Study Group. N Engl J Med, 1991. 324(7): p. 429-36. 386. Warren, H.S., et al., Assessment of ability of murine and human anti-lipid A monoclonal antibodies to bind and neutralize lipopolysaccharide. J Exp Med, 1993. 177(1): p. 89-97. 387. Greenberg, R.N., et al., Randomized, double-blind phase II study of anti-endotoxin antibody (E5) as adjuvant therapy in humans with serious gram-negative infections. Prog Clin Biol Res, 1991. 367: p. 179-86. 388. Warren, H.S., et al., Protective efficacy of CAP18106-138-immunoglobulin G in sepsis. J Infect Dis, 2003. 188(9): p. 1382-93. 389. Lynn, M., et al., Blocking of responses to endotoxin by E5564 in healthy volunteers with experimental endotoxemia. J Infect Dis, 2003. 187(4): p. 631-9. 390. Wu, A., C.J. Hinds, and C. Thiemermann, High-density lipoproteins in sepsis and septic shock: metabolism, actions, and therapeutic applications. Shock, 2004. 21(3): p. 210-21. 391. Reinhart, K., et al., CD14 receptor occupancy in severe sepsis: results of a phase I clinical trial with a recombinant chimeric CD14 monoclonal antibody (IC14). Crit Care Med, 2004. 32(5): p. 1100-8. 392. Marshall, J.C., Such stuff as dreams are made on: mediator-directed therapy in sepsis. Nat Rev Drug Discov, 2003. 2(5): p. 391-405. 393. Lorente, J.A. and J.C. Marshall, Neutralization of tumor necrosis factor in preclinical models of sepsis. Shock, 2005. 24 Suppl 1: p. 107-19. 394. Hinshaw, L.B., et al., Survival of primates in LD100 septic shock following therapy with antibody to tumor necrosis factor (TNF alpha). Circ Shock, 1990. 30(3): p. 27992. 395. Lopez, A., et al., Multiple-center, randomized, placebo-controlled, double-blind study of the nitric oxide synthase inhibitor 546C88: effect on survival in patients with septic shock. Crit Care Med, 2004. 32(1): p. 21-30. 396. Hollenberg, S.M., M.J. Piotrowski, and J.E. Parrillo, Nitric oxide synthase inhibition reverses arteriolar hyporesponsiveness to endothelin-1 in septic rats. Am J Physiol, 1997. 272(3 Pt 2): p. R969-74. 130 Références 397. Laubach, V.E., et al., Mice lacking inducible nitric oxide synthase are not resistant to lipopolysaccharide-induced death. Proc Natl Acad Sci U S A, 1995. 92(23): p. 1068892. 398. Wei, X.Q., et al., Altered immune responses in mice lacking inducible nitric oxide synthase. Nature, 1995. 375(6530): p. 408-11. 399. McLean, P.G., A. Ahluwalia, and M. Perretti, Association between kinin B(1) receptor expression and leukocyte trafficking across mouse mesenteric postcapillary venules. J Exp Med, 2000. 192(3): p. 367-80. 400. Wilson, D.D., et al., D-Arg-[Hyp3-D-Phe7]-bradykinin, a bradykinin antagonist, reduces mortality in a rat model of endotoxic shock. Circ Shock, 1989. 27(2): p. 93101. 401. Takano, M., et al., Murine fibroblasts synthesize and secrete kininogen in response to cyclic-AMP, prostaglandin E2 and tumor necrosis factor. Biochim Biophys Acta, 1995. 1265(2-3): p. 189-95. 402. Cumming, A.D., et al., Expression of tissue kallikrein in human kidney. Clin Sci (Lond), 1994. 87(1): p. 5-11. 403. Wu, H.F., et al., Identification of tissue kallikrein messenger RNA in human neutrophils. Agents Actions, 1993. 38(1-2): p. 27-31. 404. Raymond, P., et al., Quantification of des-Arg9-bradykinin using a chemiluminescence enzyme immunoassay: application to its kinetic profile during plasma activation. J Immunol Methods, 1995. 180(2): p. 247-57. 405. Schremmer-Danninger, E., et al., B1 bradykinin receptors and carboxypeptidase M are both upregulated in the aorta of pigs after LPS infusion. Biochem Biophys Res Commun, 1998. 243(1): p. 246-52. 406. Danner, R.L., et al., Endotoxemia in human septic shock. Chest, 1991. 99(1): p. 16975. 407. Sabourin, T., et al., Expression of kinin B(1) receptor in fresh or cultured rabbit aortic smooth muscle: role of NF-kappa B. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2002. 283(1): p. H227-37. 408. Schanstra, J.P., et al., The B1-agonist [des-Arg10]-kallidin activates transcription factor NF-kappaB and induces homologous upregulation of the bradykinin B1receptor in cultured human lung fibroblasts. J Clin Invest, 1998. 101(10): p. 2080-91. 409. Phagoo, S.B., S. Poole, and L.M. Leeb-Lundberg, Autoregulation of bradykinin receptors: agonists in the presence of interleukin-1beta shift the repertoire of receptor subtypes from B2 to B1 in human lung fibroblasts. Mol Pharmacol, 1999. 56(2): p. 325-33. 410. Siebeck, M., et al., The hypotensive response to des-Arg9-bradykinin increases during E. coli septicemia in the pig. Adv Exp Med Biol, 1989. 247B: p. 389-93. 131 Références 411. Audet, R., et al., Cardiovascular effects of Sar-[D-Phe8]des-Arg9-bradykinin, a metabolically protected agonist of B1 receptor for kinins, in the anesthetized rabbit pretreated with a sublethal dose of bacterial lipopolysaccharide. J Pharmacol Exp Ther, 1997. 280(1): p. 6-15. 412. Vianna, R.M. and J.B. Calixto, Characterization of the receptor and the mechanisms underlying the inflammatory response induced by des-Arg9-BK in mouse pleurisy. Br J Pharmacol, 1998. 123(2): p. 281-91. 413. Ahluwalia, A. and M. Perretti, Involvement of bradykinin B1 receptors in the polymorphonuclear leukocyte accumulation induced by IL-1 beta in vivo in the mouse. J Immunol, 1996. 156(1): p. 269-74. 414. Perron, M.S., et al., Involvement of bradykinin B1 and B2 receptors in pulmonary leukocyte accumulation induced by Sephadex beads in guinea pigs. Eur J Pharmacol, 1999. 376(1-2): p. 83-9. 415. Carl, V.S., et al., Involvement of bradykinin B1 and B2 receptors in human PMN elastase release and increase in endothelial cell monolayer permeability. Immunopharmacology, 1996. 33(1-3): p. 325-9. 416. McFadden, R.G. and K.E. Vickers, Bradykinin augments the in vitro migration of nonsensitized lymphocytes. Clin Invest Med, 1989. 12(4): p. 247-53. 417. Prat, A., et al., Bradykinin B1 receptor expression and function on T lymphocytes in active multiple sclerosis. Neurology, 1999. 53(9): p. 2087-92. 418. Tiffany, C.W. and R.M. Burch, Bradykinin stimulates tumor necrosis factor and interleukin-1 release from macrophages. FEBS Lett, 1989. 247(2): p. 189-92. 419. Sato, E., et al., Bradykinin stimulates alveolar macrophages to release neutrophil, monocyte, and eosinophil chemotactic activity. J Immunol, 1996. 157(7): p. 3122-9. 420. Koyama, S., et al., Bradykinin stimulates lung fibroblasts to release neutrophil and monocyte chemotactic activity. Am J Respir Cell Mol Biol, 2000. 22(1): p. 75-84. 421. McLean, P.G., M. Perretti, and A. Ahluwalia, Inducible expression of the kinin B1 receptor in the endotoxemic heart: mechanisms of des-Arg9bradykinin-induced coronary vasodilation. Br J Pharmacol, 1999. 128(2): p. 275-82. 422. Siebeck, M., et al., Effect of combined B1 and B2 kinin receptor blockade in porcine endotoxin shock. Immunopharmacology, 1996. 33(1-3): p. 81-4. 423. McLean, P.G., M. Perretti, and A. Ahluwalia, Kinin B(1) receptors and the cardiovascular system: regulation of expression and function. Cardiovasc Res, 2000. 48(2): p. 194-210. 424. Ueno, A., et al., Involvement of bradykinin in endotoxin-induced vascular permeability increase in the skin of rats. Eur J Pharmacol, 1995. 284(1-2): p. 211-4. 132 Références 425. Ueno, A., H. Ishida, and S. Oh-ishi, Comparative study of endotoxin-induced hypotension in kininogen-deficient rats with that in normal rats. Br J Pharmacol, 1995. 114(6): p. 1250-6. 426. Feletou, M., et al., Effects of the bradykinin B2 receptor antagonist S 16118 (pguanidobenzoyl-[Hyp3,Thi5,D-Tic7,Oic8]bradykinin) in different in vivo animal models of inflammation. J Pharmacol Exp Ther, 1995. 273(3): p. 1078-84. 427. Whalley, E.T., et al., CP-0127, a novel potent bradykinin antagonist, increases survival in rat and rabbit models of endotoxin shock. Agents Actions Suppl, 1992. 38 ( Pt 3): p. 413-20. 428. Vallance, P., Nitric oxide synthesised from L-arginine mediates endothelium dependent dilatation in human veins in vivo. Cardiovasc Res, 2000. 45(1): p. 143-7. 429. Mathis, S.A., N.L. Criscimagna, and L.M. Leeb-Lundberg, B1 and B2 kinin receptors mediate distinct patterns of intracellular Ca2+ signaling in single cultured vascular smooth muscle cells. Mol Pharmacol, 1996. 50(1): p. 128-39. 430. Baud, L., et al., Production of tumor necrosis factor by rat mesangial cells in response to bacterial lipopolysaccharide. Kidney Int, 1989. 35(5): p. 1111-8. 431. Kohan, D.E., Role of endothelin and tumour necrosis factor in the renal response to sepsis. Nephrol Dial Transplant, 1994. 9 Suppl 4: p. 73-7. 432. Hohlfeld, T., et al., The contribution of tumour necrosis factor-alpha and endothelin-1 to the increase of coronary resistance in hearts from rats treated with endotoxin. Br J Pharmacol, 1995. 116(8): p. 3309-15. 433. Filep, J.G., Role for endogenous endothelin in the regulation of plasma volume and albumin escape during endotoxin shock in conscious rats. Br J Pharmacol, 2000. 129(5): p. 975-83. 434. Kon, V. and K.F. Badr, Biological actions and pathophysiologic significance of endothelin in the kidney. Kidney Int, 1991. 40(1): p. 1-12. 435. Albertini, M., M.G. Clement, and S.N. Hussain, Role of endothelin ETA receptors in sepsis-induced mortality, vascular leakage, and tissue injury in rats. Eur J Pharmacol, 2003. 474(1): p. 129-35. 436. He, H.B., D.Z. Dai, and Y. Dai, CPU0213, a novel endothelin receptor antagonist, ameliorates septic renal lesion by suppressing ET system and NF-kappaB in rats. Acta Pharmacol Sin, 2006. 27(9): p. 1213-21. 437. Iskit, A.B., et al., Endothelin receptor antagonist bosentan improves survival in a murine caecal ligation and puncture model of septic shock. Eur J Pharmacol, 2004. 506(1): p. 83-8. 438. Schwartz, D., et al., Inhibition of constitutive nitric oxide synthase (NOS) by nitric oxide generated by inducible NOS after lipopolysaccharide administration provokes renal dysfunction in rats. J Clin Invest, 1997. 100(2): p. 439-48. 133 Références 439. Knotek, M., et al., Endotoxemic renal failure in mice: Role of tumor necrosis factor independent of inducible nitric oxide synthase. Kidney Int, 2001. 59(6): p. 2243-9. 440. Wang, W., et al., Role of leptin deficiency in early acute renal failure during endotoxemia in ob/ob mice. J Am Soc Nephrol, 2004. 15(3): p. 645-9. 441. Reinhart, K., et al., Markers of endothelial damage in organ dysfunction and sepsis. Crit Care Med, 2002. 30(5 Suppl): p. S302-12. 442. Shimamura, K., et al., Distribution patterns of microthrombi in disseminated intravascular coagulation. Arch Pathol Lab Med, 1983. 107(10): p. 543-7. 443. Borlongan, C.V. and D.F. Emerich, Facilitation of drug entry into the CNS via transient permeation of blood brain barrier: laboratory and preliminary clinical evidence from bradykinin receptor agonist, Cereport. Brain Res Bull, 2003. 60(3): p. 297-306. 444. Borlongan, C.V., et al., Bradykinin receptor agonist facilitates low-dose cyclosporineA protection against 6-hydroxydopamine neurotoxicity. Brain Res, 2002. 956(2): p. 211-20. 445. Morissette, G., et al., Antagonist, partial agonist and antiproliferative actions of B9870 (CU201) as a function of the expression and density of the bradykinin B1 and B2 receptors. Br J Pharmacol, 2007. 150(3): p. 369-79. 446. Stewart, J.M., et al., Combination cancer chemotherapy with one compound: pluripotent bradykinin antagonists. Peptides, 2005. 26(8): p. 1288-91. 447. Bellucci, F., et al., A different molecular interaction of bradykinin and the synthetic agonist FR190997 with the human B2 receptor: evidence from mutational analysis. Br J Pharmacol, 2003. 140(3): p. 500-6. 448. Amblard, M., et al., Synthesis and characterization of bradykinin B(2) receptor agonists containing constrained dipeptide mimics. J Med Chem, 1999. 42(20): p. 4193-201. 449. Chiang, W.C., et al., Early activation of bradykinin B2 receptor aggravates reactive oxygen species generation and renal damage in ischemia/reperfusion injury. Free Radic Biol Med, 2006. 41(8): p. 1304-14. 450. Chiang, W.C., et al., Bradykinin enhances reactive oxygen species generation, mitochondrial injury, and cell death induced by ATP depletion--a role of the phospholipase C-Ca(2+) pathway. Free Radic Biol Med, 2007. 43(5): p. 702-10. 451. Shimizu, S., et al., Bradykinin induces generation of reactive oxygen species in bovine aortic endothelial cells. Res Commun Chem Pathol Pharmacol, 1994. 84(3): p. 30114. 452. Ye, M., et al., Increased ACE 2 and decreased ACE protein in renal tubules from diabetic mice: a renoprotective combination? Hypertension, 2004. 43(5): p. 1120-5. 134 Références 453. Pretorius, M.M., et al., The bradykinin type 2 receptor BE1 polymorphism and ethnicity influence systolic blood pressure and vascular resistance. Clin Pharmacol Ther, 2008. 83(1): p. 122-9. 454. Van Guilder, G.P., et al., Bradykinin type 2 receptor BE1 genotype influences bradykinin-dependent vasodilation during angiotensin-converting enzyme inhibition. Hypertension, 2008. 51(2): p. 454-9. 455. Dhamrait, S.S., et al., Variation in bradykinin receptor genes increases the cardiovascular risk associated with hypertension. Eur Heart J, 2003. 24(18): p. 167280. 135 TITLE: Renal pathophysiology of bradykinin B2-receptor: from diabetic nephropathy to endotoxin shock ABSTRACT Nephroprotection has become a critical challenge during chronic or acute renal disease management. In order to enlight new therapeutic targets, we have documented the role of bradykinin B1 and B2 receptors (B1R, B2R) during diabetic nephropathy and endotoxin shock. During diabetic nephropathy, renin-angiotensin system blockade slows the progression of the disease. Using two models of diabetes in rat and mice, we have observed that B2R activation is largely involved in this protective effect. We next investigated the role of B1R and B2R in the development of renal failure during lipopolysaccharide (LPS)-induced endotoxin shock in wild-type or mice deficient for either the B1R or the B2R. Even if further investigations are needed, B2R activation contributes to the initial decrease in blood pressure, whereas the inactivation of B1R appears detrimental. Our results support the hypothesis of a protective role of B2R activation, particularly in chronic situation. 136 AUTEUR : Marie Buléon TITRE : Physiopathologie rénale du récepteur B2 de la bradykinine : de la néphropathie diabétique au choc septique DIRECTEUR DE THESE : Dr Jean-Pierre Girolami et Pr Ivan Tack LIEU ET DATE DE SOUTENANCE : le 24 avril 2008 à Toulouse RESUME La néphroprotection devient un enjeu majeur dans le cadre des maladies rénales chroniques et aiguës. Nos travaux ont étudié le rôle du récepteur B2 de la bradykinine (RB2) au cours de la néphropathie diabétique (ND) et du choc endotoxinique, dans l’optique de définir de nouvelles cibles thérapeutiques. Le blocage du système rénine angiotensine présente une efficacité clinique pour ralentir la progression de la ND. Nous montrons que le RB2 contribue de façon importante à cet effet protecteur chez le rat et la souris diabétiques. De même, au cours du choc septique, les récepteurs de la BK (RB1 et RB2) jouent un rôle important dans le dysfonctionnement rénal. Le mécanisme de cet effet, qui reste mal connu, a donc été étudié pendant un choc endotoxinique chez des souris sauvages ou invalidées pour RB1 et RB2. Nos résultats étayent l’hypothèse d’un effet néphroprotecteur de l’activation du RB2, en particulier en situation chronique. MOTS-CLES : bradykinine, glomerulosclérose, néphroprotection, fonction rénale, diabète, choc endotoxinique. DISCIPLINE ADMINISTRATIVE : Physiopathologie expérimentale _ INTITULE ET ADRESSE DU LABORATOIRE : Laboratoire de Physiologie (Faculté de Médecine Rangueil) et INSERM U858, Equipe n°5, Institut Louis Bugnard, BP 84225, 31432 Toulouse Cedex 4
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