Rapport final - Polytechnique Montréal

STAGE DE FIN D’ETUDES
ISIFC 3éme année
Année universitaire 2012-2013
Étude de l’effet d’un champ magnétique sur des
cellules couplées aux nanoparticules magnétiques
Hakima EL GAMAH
Tuteur: Pr L’Hocine YAHIA
Référent: Pr Thérèse LEBLOIS
Laboratoire d’innovation et
d’Analyse de Bioperformances
Institut Supérieur d’Ingénieurs
de Franche-Comté
2500, chemin de Polytechnique
Montréal (Québec) H3T 1J4
Tel: (514) 340 4711
Fax: (514) 340 4611
23, rue Alain Savary
25000 Besançon
Tél: 03 81 66 66 90
Fax: 03 81 66 60 93
http://www.polymtl.ca/en/
http://isifc.univ-fcomte.fr
ii
REMERCIEMENTS
Je voudrais tout d’abord exprimer ma profonde reconnaissance au Professeur L’Hocine
YAHIA, mon tuteur de stage, pour m’avoir permis d’intégrer son équipe et pour avoir
dirigé et suivi mes travaux tout au long de ce stage. Je le remercie pour la confiance qu’il
m’a accordée et pour m’avoir laissé une grande autonomie de travail.
Je souhaite remercier tous les membres du LIAB, pour leur gentillesse et leur accueil. Je
pense particulièrement à Doris Antoinette MBEH, doctorante en biomédecine, qui m’a
permis de mener à bien ce projet. Je la remercie pour sa sympathie, ses idées constructives
et le temps qu’elle m’a consacré.
Je souhaite également exprimer mes remerciements sincères aux chercheurs Mahmood
MOHAMMADI et Abderrazak MERZOUKI qui m’ont autorisé à travailler dans leurs
laboratoires, à savoir le laboratoire de microbiologie et le laboratoire de culture cellulaire.
J’adresse ma reconnaissance à l’agent de recherche en biochimie, Benoit BESSETTE, et au
thésard en biomedical, Nasr TABATABAEI, qui m’ont permis l’accès à certaines de leurs
installations.
Et enfin je remercie Madame Thérèse LEBLOIS, ma référente de stage, pour son suivi.
Je garderais un très bon souvenir de ce stage où chaque personne m’a accordé un peu de
son temps et a bien voulu me transmettre une partie de son savoir.
iii
SOMMAIRE
REMERCIEMENTS ............................................................................................................ iii
SOMMAIRE ......................................................................................................................... iv
ABREVIATIONS ET ACRONYMES.................................................................................. v
TABLE DES ILLUSTRATIONS ......................................................................................... vi
INTRODUCTION ................................................................................................................. 1
I. STRUCTURE D’ACCUEIL .......................................................................................... 2
1. Ecole Polytechnique de Montréal ............................................................................... 2
2. Laboratoire d’Innovation et d’Analyse de Bioperformances ..................................... 2
II.
CONTEXTE DE L’ETUDE ....................................................................................... 3
1. Lignée cellulaire A549 ............................................................................................... 3
2. Nanoparticules ............................................................................................................ 4
3. Champ magnétique ..................................................................................................... 7
III.
PROTOCOLES EXPERIMENTAUX ..................................................................... 10
1. Extraction des magnétosomes .................................................................................. 10
2. Culture cellulaire A549 ............................................................................................ 13
3. Tests de viabilité ....................................................................................................... 19
IV. RESULTATS ET DISCUSSION ............................................................................. 23
CONCLUSION ................................................................................................................... 34
BIBLIOGRAPHIE ............................................................................................................... vi
GLOSSAIRE ...................................................................................................................... viii
TABLE DES ANNEXES ..................................................................................................... ix
RESUME ............................................................................................................................ xiv
ABSTRACT ....................................................................................................................... xiv
Les mots marqués d’un astérisque (*) sont définis dans le glossaire.
Les références sont notées entre crochets [ ].
iv
ABREVIATIONS ET ACRONYMES
ATCC : American Type Culture Collection
ATP : Adénosine triphosphate
BMT : Bactéries magnétotactiques
cf. : confer
CHUM : Centre Hospitalier de l'Université de Montréal
CM : Champ magnétique
CO2 :: dioxyde de carbone
DMSO : Diméthylsulfoxyde
EDTA : Acide éthylène diamine tétraacétique
EPM : École polytechnique de Montréal
h : heure(s)
HCl : Chlorure d’hydrogène
HEPES : Acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazine éthane sulfonique
ICM : Institut de Cardiologie de Montréal
IRM : Imagerie par Résonnance Magnétique
KPSI : Knots Per Square Inch
LIAB : Laboratoire d'Innovation et d'Analyse de Bioperformance
min : minutes
mL : millilitres
mT : militesla
NaOH : Hydroxyde de sodium
NPM : Nanoparticules Magnétiques
rpm : rotation par minute
PBS : Tampon phosphate salin
SDS : Sodium dodecyl sulfate
SP : Source Personnelle
SVF : Sérum de Veau Fœtal
µL : microlitres
µg/mL : microgrammes par millilitre
M : micromolaire
o
C : degrés Celsius
v
TABLE DES ILLUSTRATIONS
FIGURES
Figure 1 : Blason de l’EPM. [1] ............................................................................................ 2
Figure 2 : Cellules A549 en croissance normale vues au microscope. [8] ............................ 4
Figure 3 : Echelle du nanomètre. [SP]................................................................................... 5
Figure 4 : Bactéries magnétotactiques attirées par un aimant. [9]......................................... 5
Figure 5 : Bactérie magnétotactique vue au microscope électronique à transmission. [10] . 6
Figure 6 : Schéma du dispositif induisant un CM. [SP] ........................................................ 7
Figure 7 : Solénoïde utilisé. [SP] ........................................................................................... 8
Figure 8 : Représentation schématique du solénoïde utilisé, d'axe central z. [SP] ............... 9
Figure 9 : Culture bactérienne. [SP] .................................................................................... 10
Figure 10 : Cell Disruptor. [14] ........................................................................................... 12
Figure 11 : Schéma du dispositif aimanté. [SP] .................................................................. 12
Figure 12 : Hotte avec matériel nettoyé. [SP] ..................................................................... 13
Figure 13 : Flasque de 25 cm2 contenant cellules et milieu de culture. [SP] ...................... 14
Figure 14 : Microscope inverse. [SP] .................................................................................. 15
Figure 15 : Comptage cellulaire, d'un point de vue statistique. [SP] .................................. 17
Figure 16 : Hématimètre de Neubauer. [SP] ....................................................................... 18
Figure 17 : Tubes avec ou sans NP. [SP] ............................................................................ 19
Figure 18 : Schéma du dispositif magnétique. [SP] ............................................................ 21
Figure 19 : Flasques présentes dans l'incubateur pour le traitement de 24h. [SP] .............. 21
Figure 20 : Récapitulatif de toutes les expériences pour les tests de viabilité. [SP] ........... 22
Figure 21 : Schéma du dispositif magnétique pour vérifier l'évolution de la température. . 23
Figure 22 : Diagramme des tests sans NPM à 4.60 mT. [SP] ............................................. 25
Figure 23 : Diagramme des tests avec 10 µg/mL NPM à 4.60 mT. [SP] ............................ 26
Figure 24 : Diagramme des tests avec 100 µg/mL NPM à 4.60 mT. [SP] .......................... 27
Figure 25 : Diagramme des tests sans NPM à 8.74 mT. [SP] ............................................. 28
Figure 26 : Diagramme des tests avec 10 µg/mL NPM à 8.74 mT. [SP] ............................ 29
Figure 27 : Diagramme des tests avec 100 µg/mL NPM à 8.74 mT. [SP] .......................... 30
TABLEAUX
Tableau 1 : Masses d'HEPES et d'EDTA à peser. [SP] ....................................................... 11
Tableau 2 : Composition du milieu de culture. [SP] ........................................................... 14
Tableau 3 : Détermination du facteur multiplicatif. [SP] .................................................... 18
Tableau 4 : Dénombrement de tous les témoins. [SP]......................................................... 20
Tableau 5 : Dénombrement de tous les traitements imposés aux échantillons. [SP] .......... 21
Tableau 6 : Résultats des tests sans NPM à 4.60 mT. [SP] ................................................. 24
Tableau 7 : Résultats des tests avec 10 µg/mL NPM à 4.60 mT. [SP] ................................ 25
Tableau 8: Résultats des tests avec 100 µg/mL NPM à 4.60 mT. [SP] ............................... 26
Tableau 9 : Résultats tests sans NPM à 8.74 mT. [SP] ....................................................... 27
Tableau 10 : Résultats des tests avec 10 µg/mL NPM à 8.74 mT. [SP] .............................. 28
Tableau 11 : Résultats des tests avec 100 µg/mL NPM à 8.74 mT. [SP] ............................ 29
Tableau 12 : Evolution de la température à 4.60 mT. [SP] ................................................. 32
Tableau 13 : Evolution de la température à 8.74 mT. [SP] ................................................. 32
vi
INTRODUCTION
Dans l’ensemble des pays industrialisés, on assiste à un essor considérable des
nanosciences et des nanotechnologies. Utilisées dans tous les domaines depuis les années
90, les nanoparticules sont de plus en plus présentes dans notre quotidien (électronique,
cosmétique...). Aujourd’hui, les principaux champs d’investigation concernent la recherche
médicale et pharmaceutique.
Les projets d’utilisation de nanoparticules magnétiques dans le corps humain s’accroissent
et supposent que des cellules vivantes soient exposées, à la fois, à des ondes magnétiques
et à des particules nanométriques. La maîtrise du magnétisme au cœur du vivant et des
nanoparticules multifonctions permet d’inventer de nouvelles solutions diagnostiques,
thérapeutiques et réparatrices. Bien que cette nouvelle technologie promette des progrès
remarquables dans le domaine médical, elle soulève aussi de nombreuses inquiétudes en
particulier au sujet des éventuels effets sur la santé humaine. Actuellement, nos
connaissances sur la toxicité des nanoparticules manufacturées activées à distance grâce à
un champ magnétique externe demeurent assez limitées du fait du faible nombre d’études
toxicologiques, des résultats souvent contradictoires qu’elles exposent et du manque de
recul que l’on a sur cette technologie naissante. C’est pourquoi, il est indispensable
d’étudier, en parallèle avec les recherches fondamentales portant sur les propriétés et les
applications des nanotechnologies, l’impact éventuel de ces nouveaux objets. De ce fait,
mon projet est consacré à l’étude de l’effet d’un champ magnétique sur des cellules
humaines, exposées ou non à des nanoparticules magnétiques manufacturées.
La première partie de ce rapport a pour objet de décrire le matériel choisi pour cette étude.
La technique d’exposition des cellules humaines, avec ou sans nanoparticules, au champ
magnétique sera présentée. Les tests de viabilité cellulaire mis en œuvre seront expliqués.
Ainsi, les résultats obtenus seront présentés et une conclusion pourra en être tirée quant à la
nocivité du champ. Une attention toute particulière sera portée sur le principe du comptage
cellulaire. En parallèle, la méthode pour extraire des nanoparticules d’origine
bactériologique sera exposée.
1
I.
STRUCTURE D’ACCUEIL
1. Ecole Polytechnique de Montréal
L'École polytechnique de Montréal (EPM) est un
établissement d'enseignement d’ingénierie situé
sur le campus de l’Université de Montréal, sur la
Figure 1 : Blason de l’EPM. [1]
face nord du Mont Royal, et fondé en 1873.
Sous la direction de Christophe GUY, l’EPM dispense son enseignement dans plusieurs
disciplines de l'ingénierie tel que l’aérospatial, la mécanique ou encore le biomédical. De
plus, cette structure réalise près du quart de la recherche universitaire dans ces domaines au
Québec, plus de 10 000 publications scientifiques et techniques publiées par des
professeurs et des chercheurs de Polytechnique depuis 10 ans.
Avec plus de 40 000 diplômés depuis 1873, cet établissement totalise aujourd’hui 242
professeurs et plus de 7100 étudiants. Son budget annuel de fonctionnement s’élève à plus
de 200 millions de dollars, dont un budget de recherche de 72 millions de dollars. [1]
2. Laboratoire d’Innovation et d’Analyse de Bioperformances
Mon stage s’est effectué au Laboratoire d'Innovation et d'Analyse de Bioperformances
(LIAB) de l’EPM, à l’institut de génie biomédical/génie mécanique situé dans l’aile A du
pavillon principal. Les manipulations se sont déroulées principalement dans le pavillon
Bombardier, inauguré en 2004.
Depuis sa création, en juin 1999, le LIAB est dirigé par le Professeur L’Hocine YAHIA et
est composé de deux associés de recherche : le Docteur Edward SACHER ainsi que le
Docteur Taraneh DJAVANBAKHT SAMANI. On y trouve également des post-doctorants,
des étudiants en deuxième et troisième cycles et des stagiaires (cf. Annexe 1).
Le LIAB est un laboratoire multifonctionnel qui rassemble des chercheurs de l’EPM, de
l'institut de cardiologie de Montréal (ICM) et du Centre Hospitalier de l'Université de
Montréal (CHUM). Les principales recherches effectuées au sein du LIAB portent sur la
nanomédecine, les nanotechnologies, la médecine régénérative et la biocompatibilité des
technologies médicales.
2
II.
CONTEXTE DE L’ETUDE
Au sein de l’environnement biologique, les nanoparticules magnétiques (NPM) peuvent
répondre à des stimuli physiques externes, comme par exemple un champ magnétique. Ces
nano-objets peuvent être injectés dans l’organisme afin d’interagir avec les constituants du
vivant. C’est ainsi qu'ils peuvent servir de traceurs pour l’imagerie médicale en créant
localement une inhomogénéité de champ, qui perturbe la dynamique magnétique des
protons environnants et engendre un contraste sur l’image. [2][3] Ils peuvent également
être utilisés comme vecteurs pour transporter un médicament jusqu’à sa cible. En effet, une
cellule ou tout objet biologique contenant un nombre suffisant de NPM peut être manipulé
par attraction magnétique. [4] Enfin, dans un champ magnétique dépendant du temps (à
des fréquences de quelques centaines de kHz), les NPM oscillent en échauffant leur
environnement. L’hyperthermie locale qui en résulte peut affecter des cellules malignes.
[5][6] Ces multiples fonctionnalités des nanoparticules magnétiques vont de pair avec une
innocuité biologique remarquable. En effet, les nanoparticules composées d’oxyde de fer
peuvent être à terme être assimilées par l’organisme, grâce au métabolisme régulant la
quantité du fer dans nos organes. [7] Cependant, il est nécessaire d’effectuer des tests de
viabilité cellulaire pour vérifier le couplage nanoparticules/champ magnétique. Les sousparties suivantes présentent les cellules humaines, les nanoparticules ainsi que le champ
magnétique choisis pour cette étude. L’étude de l’impact biologique du champ magnétique
et des nanoparticules manufacturées a été menée en condition in vitro.
1. Lignée cellulaire A549
Pour cette étude, la lignée cellulaire A549, communément utilisée par les laboratoires de
recherche, a été choisie de part sa facilité à être cultiver. Cette lignée est issue d’un
adénocarcinome d’épithélium pulmonaire prélevé chez un patient de type caucasien, âgé de
58 ans. Elle est distribuée par l’American Type Culture Collection (ATCC), société privée
américaine, dont la mission est axée sur l'acquisition, l'authentification, la production, la
conservation, le développement et la distribution de micro-organismes, de lignées
cellulaires et d'autres matériaux pour la recherche en sciences de la vie. [8]
3
Figure 2 : Cellules A549 en croissance normale vues au microscope. [8]
Les cellules ont été conservées tel que recommandé par le fournisseur, c’est-à-dire dans
une solution contenant du sérum de veau fœtal (SVF) à une concentration finale de 10% et
du diméthylsulfoxyde (DMSO) à 5%, complété par un milieu de culture F-12K. Le DMSO
est un solvant polaire organique utilisé comme agent cryoprotecteur. Il permet d'éviter une
trop grande mortalité lors de la congélation. Le tube utilisé a un volume total de 1 mL et
contient 1.106 cellules.
A l’EPM, ce type de cellules est stocké à l’azote liquide en phase vapeur dans la chaire de
recherche du Canada en génie tissulaire du cartilage. C’est donc dans ce laboratoire qu’une
partie de mes manipulations a eu lieu.
Les cellules A549 seront soumises au champ magnétique (CM), en présence ou non de
nanoparticules (NP). La prochaine partie va donc permettre de mieux comprendre la notion
de nanoparticules et de présenter celles utilisées pour ce projet.
2. Nanoparticules
Les NP sont des éléments ayant une taille nanométrique, entre 1 et 100 nanomètres. Cette
petite taille leur permet d’interagir facilement avec les composants biologiques. Elles sont
composées de quelques centaines à quelques milliers d’atomes. Du fait de leur taille, les
propriétés physiques et chimiques de ces nano-objets* sont différentes de celles des
matériaux classiques. Leur champ de développement est extrêmement vaste et inclut la
4
recherche médicale. On peut différencier deux grands types de nanoparticules, les NP
naturelles, présentes dans l'environnement et les NP manufacturées, produites par l'Homme
dans un but industriel ou de recherche.
Figure 3 : Echelle du nanomètre. [SP]
 NP naturelles
Une partie de cette étude a consisté en l’extraction de nanoparticules naturelles provenant
de bactéries magnétotactiques (BMT). Ces bactéries sont des micro-organismes présents
principalement dans les sédiments marins, enfouis à l'interface oxique/anoxique*. Les
BMT peuvent se déplacer grâce au magnétotactisme, c'est-à-dire qu'elles se dirigent selon
les lignes du champ magnétique terrestre pour atteindre des milieux favorables à leur
croissance. Les BMT vont donc réagir sous l’action d’un aimant comme l’atteste la figure
suivante.
Figure 4 : Bactéries magnétotactiques attirées par un aimant. [9]
En microscopie électronique, elles sont facilement identifiables : leur cytoplasme contient
des chaînes de granules d’oxydes métalliques opaques aux électrons appelés
magnétosomes. Généralement de taille uniforme, ces derniers sont alignés le long de l’axe
de la cellule. Ce sont ces organites qui sont à l'origine des propriétés magnétiques des
BMT.
5
Figure 5 : Bactérie magnétotactique vue au microscope électronique à transmission. [10]
Les magnétosomes sont constitués de cristaux entourés par une biomembrane lipidique.
Ces cristaux sont formés de magnétite (Fe3O4) et dans quelques cas, de greigite (Fe3S4). [9]
A l’EPM, Monsieur MOHAMMADI, chercheur en microbiologie, travaille actuellement
sur une bactérie magnétotactique appelée Magnetococcus espèce MC-1. Cette bactérie
micro-aérophile*, d’une taille comprise entre 30 et 80 nm, est composée de deux flagelles
lui permettant de se déplacer. Cette espèce de BMT produit des nanoparticules de
magnétite qui sont assemblées en chaine. C’est donc cette bactérie qui a été utilisée pour
l’extraction des magnétosomes dont le protocole sera présenté par la suite. [11]
 NP manufacturées
Les nanoparticules peuvent également être produites par toute une série de procédés
chimiques, physiques ou biologiques. Les nouvelles nanoparticules sont principalement
synthétisées en phase gazeuse, par déposition de vapeurs, par chimie des solutions et par
broyage. [12]
Avec la diversité des NP manufacturées existantes, notre étude s’est restreinte aux
nanoparticules magnétiques d’oxyde de fer Fe3O4 pour leur importance dans le
développement actuel des applications biomédicales. De plus, ces NP sont approuvées par
la F. D. A. grâce à leur qualité d’agent de contraste pour l’imagerie par résonnance
magnétique (IRM). [13] Les NPM ont été fournies par Sophie LAURENT, chercheuse en
chimie à l’Université de MONS en Belgique. Elle a utilisé le procédé de chimie des
solutions pour synthétiser les NPM. En effet, Madame LAURENT a mélangé 5 mL d'une
solution aqueuse de FeCl2.4H2O (0,045 M) et FeCl3.6H2O (0,0375 M) ainsi que 250 mL de
diéthylène-glycol. Le mélange a ensuite été chauffé à 170 °C et maintenu à cette
température pendant 15 min avant l'addition de la base NaOH solide jusqu'à une
6
concentration finale de 0,375 M. La température est maintenue à 170 °C pendant 1 h puis
refroidissement à 60 °C est réalisé. Enfin les nanoparticules synthétisés ont été recueillies
avec un aimant et ont été lavé avec 100 mL d'une solution HNO3 (1 M).
3. Champ magnétique
Un champ magnétique est caractérisé par des forces électriques liées à l'intensité d’un
courant. Il représente donc les forces qu'une charge en mouvement exerce sur d'autres
charges également en mouvement et n'existe que lorsqu'il y a circulation de courant.
Le dispositif induisant un CM provient du laboratoire de NanoRobotique du Pr. Sylvain
Martel, à l’École Polytechnique de Montréal. Il est composé d’une machine à induction
reliée à une station de chaleur ainsi qu’à un solénoïde (cf. Annexe 2). [14] De plus, pour
éviter que la machine à induction ne chauffe, celle-ci est associée à un système de
refroidissement hydraulique externe.
L’étudiant doctorant
en biomedical, Nasr
TABATABAEI, m’a permis d’utiliser ce dispositif dont il se servait pour la réalisation de
ses travaux de thèse.
Figure 6 : Schéma du dispositif induisant un CM. [SP]
7
 Caractéristiques du solénoïde
Un solénoïde est un dispositif constitué d'un fil électrique enroulé régulièrement formant
ainsi N spires parallèles. Parcouru par un courant, il produit un champ magnétique dans
son voisinage, et plus particulièrement à l'intérieur de l'hélice où ce champ est quasiment
uniforme.
Le solénoïde étudié a une longueur L de 30 mm et un rayon R de 38 mm; et est formé de 3
spires N.
Figure 7 : Solénoïde utilisé. [SP]
 Calcul du champ magnétique induit par le dispositif
Le CM généré sur l’axe central d’un solénoïde dépend du courant I circulant dans le
solénoïde et de la densité de spires n. De plus, le CM induit dépend de la distance entre le
point P et le solénoïde et la taille du solénoïde le tout représenté à l’aide de deux angle α1
et α2 (cf. Figure 8) :
(1)
Avec B : Champ magnétique sur l’axe central au point P
n : Nombre de spires par unité de longueur (
)
I : Courant électrique (A)
α1 : Angle pour positionner le côté 1 par rapport au point P
α2 : Angle pour positionner le côté 2 par rapport au point P
µ0: Constante magnétique, µ0
/
[15]
Dans notre cas, on considère que le point P est situé au centre du solénoïde, de sorte que :
.
8
Figure 8 : Représentation schématique du solénoïde utilisé, d'axe central z. [SP]
Sur la figure ci-dessus, on peut voir que l’angle α2 correspond à la soustraction de l’angle
plat de 180° et de l’angle α1.
L’équation (1) devient alors :
D’après les fonctions trigonométriques, on a :
Le champ magnétique induit peut alors s’exprimer comme ci-dessous :
Avec
9
Selon les intensités choisies, la valeur du champ magnétique induite se calculera avec cette
formule :
III.
PROTOCOLES EXPERIMENTAUX
1. Extraction des magnétosomes
Les bactéries magnétotactiques ont été cultivées dans le laboratoire de Monsieur
MOHAMMADI afin de pouvoir en extraire les magnétosomes. La méthode d’extraction
est expliquée ci-dessous.
 Culture bactérienne
Les bactéries Magnetococcus MC-1 ont été cultivées dans un milieu de culture enrichi en
fer sous des conditions de micro-aérobie. Le milieu a été effectué avec 50 M de sulfate
ferreux heptahydraté pour permettre la formation des magnétosomes. [11]
Figure 9 : Culture bactérienne. [SP]
10
Apres avoir isolé les BMT de leur milieu de culture, elles ont été introduites dans une
solution tampon dont la préparation est expliquée ci-dessous.
 Préparation de la solution tampon
La solution tampon a été préparé avec de l'HEPES (ou acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1pipérazine éthane sulfonique), dont la formule brute est C8H18N2O4S et de l’EDTA (ou
acide éthylène diamine tétra acétique), de formule C10H16N2O8.
Cette solution, à pH 7.4, doit avoir un volume total de 100mL et doit contenir 50mM
HEPES et 4mM EDTA. Les masses de ces substances ont été calculées comme indiqué cidessous.
Données :
- MHEPES= 238,3 g.mol-1
- MEDTA= 292.2 ou 372,2 g.mol-1
Formules utilisées :
Avec
n : quantité de matière en mol
C : concentration molaire en mol.L-1
V : volume de la solution en L
Avec n : quantité de matière en mol
m : masse du composé en g
M : masse molaire du composé en g.mol-1
HEPES
EDTA
nHEPES = 50.10-3 * 100. 10-3 = 5.10-3 mol
nEDTA = 4.10-3 * 0,100 = 0,4.10-3 mol
mHEPES = 5.10-3 * 238,3 = 1,192 g
mEDTA = 4.10-3 * 292.2 = 116,9 mg
Tableau 1 : Masses d'HEPES et d'EDTA à peser. [SP]
Pour obtenir la solution tampon voulue, il faut donc dissoudre 1.192 g d’HEPES et 116.9
mg d’EDTA dans 100 mL d’eau puis ajuster le pH a 7.4 à l’aide d’un acide (HCl) ou d’une
base (NaOH).
Une fois la solution tampon prête, il faut procéder à l’extraction des magnétosomes.
11
 Isolation des magnétosomes
Les bactéries ont été extraites du milieu de culture par centrifugation (15000 rpm pendant
15 min à 4oC). Après extraction de tout le milieu de culture, elles ont été pesées puis
resuspendus dans la solution tampon avec un ratio de 1g de bactéries pour 10 mL de
tampon. Elles ont ensuite été introduites dans un système conçu pour briser la paroi
cellulaire : le “Cell Disruptor”. Ce dernier permet de libérer et récolter les composants
intracellulaires grâce à l'utilisation d'une pression élevée. Trois passages au “Cell
Disruptor” ont été effectués à une pression de 35 000 KPSI (cf. Annexe 3). [16]
Figure 10 : Cell Disruptor. [14]
A l’aide d’un dispositif aimanté, les magnétosomes ont pu être isolés. En effet, ces NPM
ont été attirées par l’aimant et sont restées accolé à la paroi du tube. Le reste des
constituants des BMT et la solution tampon ont été éliminés par aspiration.
Figure 11 : Schéma du dispositif aimanté. [SP]
Les magnétosomes ont été lavé trois fois avec 10mM HEPES. Ils ont été ensuite immergés
dans une solution contenant 20% de SDS pendant 60min dans un agitateur, afin de détruire
toutes les protéines potentiellement retrouvées à la surface des magnétosomes. La même
méthode utilisant l’aimant et l’aspiration du milieu a été effectuée pour récupérer les
12
magnétosomes dépourvues de protéines. Pour la conservation, les magnétosomes ont été
mis en suspension dans de l’eau. [17]
2. Culture cellulaire A549
 Conditions de la culture cellulaire
- Stérilité
La distinction entre un laboratoire classique et un laboratoire de culture cellulaire est le fait
que dans la salle de culture, il faut maintenir un degré d’asepsie afin d'éviter toute
contamination par des micro-organismes (bactéries, champignons...). Ces contaminants
sont introduits par plusieurs sources tel que l'opérateur ou les solutions utilisées, c'est
pourquoi des règles de conduite strictes ont été établies. A l’entrée du laboratoire, le port
d’un sarreau et de gants est obligatoire. La culture cellulaire impose l’utilisation d’une
hotte à flux laminaire afin de travailler stérilement. A chaque utilisation de la hotte, il est
nécessaire de la nettoyer avant et après les manipulations. Pour cela, il faut allumer la
lampe UV de la hotte pendant 30 minutes et laver la paillasse à l’isopropanol à 70 %.
Après le nettoyage, le ventilateur et la lumière visible peuvent être allumés. Le matériel
utilisé sous l’enceinte stérile doit être nettoyé a l’isopropanol également (béchers, pipettes,
tubes…).
Figure 12 : Hotte avec matériel nettoyé. [SP]
13
- Milieu de culture
Les cellules ont été cultivées dans un milieu de culture constitué de F-12K, de 10 % de
sérum de veau fœtal ainsi que de 0.5 % d’antibiotiques (pénicilline et streptomycine) afin
d’éviter une éventuelle contamination bactérienne. L'importante variété de protéines
contenues dans le SVF maintient les cellules en culture dans un milieu où elles peuvent
survivre, grandir et se multiplier. Ceci fait de lui le sérum le plus utilisé en culture
cellulaire.
Pour un volume total de 500 mL de milieu de culture, les quantités des différents
constituants sont indiquées sue le tableau suivant.
Produit
Quantité (en mL)
Concentration final
Milieu F-12K
447.5
1X
Sérum de veau fœtal
50
10 %
Pénicilline et streptomycine
2.5
0.5 %
Tableau 2 : Composition du milieu de culture. [SP]
- Matériels spécifiques
Les cultures ont été conservées dans un incubateur à CO2. Ainsi, la température, la quantité
de dioxyde de carbone et l’hygrométrie* ont pu être contrôlées. Le taux d'humidité requis
est apporté par un bac d'humidification situé dans le bas de l'incubateur. Les cellules
étaient alors à 37 °C sous une atmosphère contrôlée à 5 % de CO2 et 95 % d’humidité.
Des flasques de culture à bouchon filtrant de 25 cm2 ont été utilisées pour la culture
cellulaire. En théorie, le volume de milieu recommandé est de 0.2 mL/cm 2 de surface de
culture pour les cellules adhérentes soit 5 mL pour le type de flasque utilisé.
Figure 13 : Flasque de 25 cm2 contenant cellules et milieu de culture. [SP]
14
La présence et l’évolution des cellules dans les flasques ont été vérifiée à l’aide d’un
microscope inversé. À l’inverse de la configuration standard d'un microscope optique où la
lumière arrive sur l’échantillon par le bas et où l’observation se fait par le dessus, pour le
microscope inversé la source de lumière est placée au-dessus de l’échantillon et les
objectifs en dessous. Ainsi, les cellules présentes dans les flasques peuvent être visualisées.
Figure 14 : Microscope inverse. [SP]
Les différentes solutions (milieu de culture, PBS, trypsine…) ont été conservées au
réfrigérateur à 4 °C et chauffées au bain-marie à 37 °C pour pouvoir être utilisées.
 Mise en culture des cellules
Le tube de 1 ml contenant les cellules A549 congelées a été mis au bain-marie à 37 °C.
Après décongélation, les cellules sont reprises dans un volume de 9 ml de milieu nutritif
pour être ensuite centrifugés à 1200 rpm pendant 5 min, à 4 °C. Notons qu’il ne faut pas
oublier d’équilibrer la centrifugeuse.
Apres centrifugation, le surnageant a été vidé dans la poubelle de déchets biologiques car il
contient le DMSO, toxique pour les cellules. Le tube a été gratté pour resuspendre le culot
et 10 mL de milieu complet a été ajouté. Afin d’obtenir les cellules en suspension, la
solution a été homogénéisé.
15
Etant donné que le nombre de cellules de départ était très important, une partie des cellules
a été congelés pour conserver la lignée et avoir à disposition un stock de cellules. Pour
cela, cinq tubes de 1 mL ont été remplis à raison de 5.105 cellules par tube complété avec
du milieu de culture contenant 15% de DMSO. Ces tubes ont été placés au congélateur à 80 °C avant d’être stocké à l’azote liquide, 24h plus tard. Le reste de la suspension
cellulaire a été rempli dans des flasques pour être incubé.
 Croissance des cellules
- Changement du milieu de culture
Les cellules consomment les nutriments du milieu et produisent des métabolites. Il faut
donc renouveler le milieu de culture régulièrement, en général, tous les deux jours. Si ce
dernier n’est pas effectué, la nourriture se fait de plus en plus rare entrainant la mort des
cellules.
- Passage secondaire
Par ailleurs, en condition in vitro, les cellules A549 prolifèrent dans des flasques sur
lesquels elles adhèrent fortement aux parois grâce aux protéines d’adhérence qu’elles
secrètent. Les cellules A549 en culture sont adhérentes et vont alors croître jusqu'à tapisser
entièrement le fond de la flasque. Dès lors qu’elles recouvrent 80% de la surface de culture
(équivaut à 80% de confluence), il faut procéder au passage cellulaire.
A 80% de confluence, les cellules ont donc été repiquées dans une nouvelle flasque avec
du milieu de culture neuf. Pour ce faire, le milieu appauvri a été retiré par aspiration à
l’aide d’une pipette pasteur. Les cellules ont été rincées avec du tampon phosphate salin
(PBS) qui permet d’enlever toute trace de milieu. Une solution de trypsine a ensuite été
ajoutée pendant 2 min à l’incubateur afin de décoller les cellules du fond de la flasque.
Cette enzyme permet l’hydrolyse des liaisons peptidiques responsables de l’adhérence
cellulaire. On appelle cette technique de décollement des cellules : la trypsination. La
réaction enzymatique a été arrêtée par l'ajout du milieu complet. En effet, le SVF contenu
dans le milieu inactive la trypsine. Après l'incubation, les échantillons sont agités
vigoureusement au Vortex et centrifugés à 1200 rpm pendant 5 minutes, à 4 °C. Le culot
16
de cellules a été resuspendu par grattage, après avoir vidé le surnageant, et homogénéisées
dans 1.5 mL de milieu de culture.
Dans un tube Eppendorf, un prélèvement de 100 µL de la suspension cellulaire et 20 µL de
bleu de trypan ont été mélangés afin de procéder à la numération cellulaire, expliquée plus
en détail ci-dessous. Grâce à cette technique, une dilution est ainsi effectuée pour qu’il y
ait un nombre moins important de cellules dans la flasque. En fonction du nombre de
cellules voulues, il faut donc calculer le volume à prélever à partir de la concentration
calculée.
 Comptage cellulaire
On peut considérer que les cellules sont réparties de
façon homogène dans un échantillon. D’un point de
vue statistique, le comptage cellulaire se base sur la
numération d’un prélèvement de cet échantillon,
dans le but d’estimer la taille globale de
l’échantillon.
Figure 15 : Comptage cellulaire, d'un
point de vue statistique. [SP]
Le comptage cellulaire a été effectué à l’aide du bleu de trypan. La coloration au bleu de
trypan est une méthode de coloration des cellules mortes. En effet, ce réactif a tendance à
entrer dans les cellules qu'il rencontre. Une fois dans la cellule, la molécule en question
entraîne un mécanisme d’exclusion qui va éjecter cette molécule dans le milieu extérieur.
Ce mécanisme nécessitant de l’énergie, seules les cellules possédant une source d’ATP
peuvent le mettre en place. Ainsi, une cellule vivante expulsera la molécule et restera
incolore au microscope, au contraire une cellule morte n’aura pas les moyens de la rejeter
et deviendra bleue. Le comptage cellulaire au bleu de trypan permet ainsi de déterminer la
viabilité d’un échantillon. Cette méthode est peu coûteuse et rapide à mettre en place.
Une fois que l’eppendorf contenant les cellules et le bleu de trypan a bien été mélangé, 10
µL du mélange ont été ajouté dans le sillon de chargement d’une chambre de
l’hématimètre de Neubauer, recouverte d’une lamelle (Figure 16).
17
Figure 16 : Hématimètre de Neubauer. [SP]
D’abord, il faut compter le nombre de cellules vivantes présentent sur la première ligne
d’un des quadrillages de l’hématimètre. Cette ligne correspond aux 4 carreaux en haut à
gauche et aux 4 en bas à droite, comme indiqué sur la figure ci-dessus en bleu.
En fonction du nombre de cellules que celle-ci contient, il faut se référer au tableau
suivant. Ainsi, selon le nombre de lignes comptées, il faut déterminer le facteur
multiplicatif.
Si la 1ère ligne contient
Plus de 40 cellules
Environ 20 cellules
Moins de 20 cellules
Nombre de lignes à compter
1
2
4
Facteur multiplicatif
8
4
1
Tableau 3 : Détermination du facteur multiplicatif. [SP]
Une fois le facteur multiplicatif déterminé, le nombre de cellule contenu dans l’échantillon
peut être calculé grâce à la formule ci-dessous :
18
Nombre de cellules vivantes dans l’échantillon = 3000 * d * n * f * v
Avec d : facteur de dilution
n : nombre de cellules vivantes comptées
f : facteur multiplicatif
v : volume de l’échantillon
3. Tests de viabilité
Dans notre expérimentation, différents facteurs sont entrés en jeu. Certains sont restés
constants tel que le milieu de culture des cellules alvéolaires, la taille des nanoparticules
d’oxyde de fer et la fréquence des ondes magnétiques; et d’autres ont été modifiés comme
la valeur du CM appliqué sur les cellules, elle-même conditionnée par l’intensité du
courant circulant dans le solénoïde, la durée de l’exposition ou encore la concentration des
NPM. Par la suite, des tests pour évaluer l’évolution de la température en présence des
NPM seront mises en œuvre.
Le but étant de vérifier s’il existe un lien entre la valeur du CM, la durée d’exposition, la
concentration de NPM et la toxicité sur les cellules A549.
 Tests de viabilité cellulaire
Pour ces tests de viabilité, un protocole a été mis en place, faisant intervenir des témoins et
des échantillons qui ont été exposés à un CM. Notons que les nanoparticules d’oxyde de
fer synthétiques ont une taille comprise entre 20 et 40 nm. Deux concentrations ont été
utilisées pour ces tests : 10 et 100 μg/mL de NPM (cf. Figure 17). De plus, chaque
contenant a été rempli à raison de 20 000 cellules A549, complété par le milieu de culture
et, en fonction du test, les NPM.
Figure 17 : Tubes avec ou sans NP. [SP]
19
- Témoins
Pour toute étude de cytotoxicité, il est nécessaire de garder un témoin. Dans notre cas,
chaque expérience comporte deux témoins, un premier témoin T1 qui a été incubé et un
second T2, qui a été transporté. En effet, les échantillons ont été exposés au CM dans un
laboratoire situé à 15 min à pied du laboratoire de culture cellulaire. C’est pourquoi il a
fallu prendre en considération le déplacement des échantillons. Le témoin T2 va donc
permettre de vérifier si les cellules ont été affectées par ce déplacement. Tous les témoins
utilisés pour cette étude sont dénombrés sur le tableau ci-dessous.
Témoins
T1.1
T2.1
Sans NPM
X
X
T1.2
T2.2
X
X
10 µg/mL
T1.3
T2.3
X
X
Avec NPM
100 µg/mL
X
Incubé
X
X
X
Transporté
X
X
Tableau 4 : Dénombrement de tous les témoins. [SP]
- Echantillons exposés au champ magnétique
Quant aux différents traitements imposés aux échantillons, ils sont présentés ci-dessous.
Les échantillons ont été exposés 30 et 60 min à deux valeurs de champ magnétique : 8.74
mT (valeur maximal du dispositif utilisé) et 4.60 mT., soit des intensités valant 190 A et
100 A. A savoir, le champ magnétique terrestre est de l'ordre de 50 µT. En revanche, la
fréquence des ondes magnétiques est restée constante, à 157 KHz.
Traitements
A
B
Sans NPM
X
X
C
X
10 µg/mL
D
E
F
G
H
X
X
X
I
J
X
X
K
L
X
X
X
X
Avec NPM
100 µg/mL
Champ
4.60 mT
magnétique
8.74 mT
Durée
30 min
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
20
d’exposition
60 min
X
X
X
X
X
X
Tableau 5 : Dénombrement de tous les traitements imposés aux échantillons. [SP]
Les tubes ont été insérés dans une mousse isolante en polystyrène et placés au centre du
solénoïde comme le montre la figure suivante.
Figure 18 : Schéma du dispositif magnétique. [SP]
- Comptage cellulaire
Le comptage cellulaire a été effectué une première fois, une heure après l’exposition au
CM. Vingt-quatre heures après les traitements, les cellules ont été repiquées de leur
support (cf. Figure 19) par trypsination puis comptées à l’aide de l’hématimètre de
Neubauer. Les témoins on été comptés en même temps que les échantillons soumis au CM.
Figure 19 : Flasques présentes dans l'incubateur pour le traitement de 24h. [SP]
21
Figure 20 : Récapitulatif de toutes les expériences pour les tests de viabilité. [SP]
22
 Tests d’évolution de la température
Comme mentionné précédemment, les NPM soumises à un CM peuvent osciller et
échauffer l’environnement dans lequel elles se trouvent. Or, si la température augmente audessus de 37 °C, la croissance cellulaire ralentit, provoquant la mort cellulaire. En
revanche, si la température diminue, la croissance cellulaire ralentit, mais les cellules
restent viables.
C’est pourquoi il est très important de surveiller l’évolution de la température dans les
échantillons exposés au CM. Pour ce fait, la température a été vérifiée aux deux valeurs de
CM utilisées pour les tests de viabilité avec :
-
le milieu de culture seul
-
la suspension cellulaire sans NPM
-
la suspension cellulaire avec 10 µg/mL de NPM
-
la suspension cellulaire avec 100 µg/mL de NPM
Figure 21 : Schéma du dispositif magnétique pour vérifier l'évolution de la température.
IV.
RESULTATS ET DISCUSSION
La première question à se poser quand on veut étudier les effets biologiques d’une
substance, est de savoir quels sont ses effets cytotoxiques, c’est-à-dire, entre autres, ses
effets sur la viabilité cellulaire. On entend par viabilité cellulaire la capacité d’une cellule à
vivre et la capacité à se reproduire. Ainsi, les effets cytotoxiques des nanoparticules
d’oxyde métallique couplées à un champ magnétique ont été évalués au moyen de tests
23
biologiques évaluant la viabilité cellulaire. Les résultats obtenus sont présentés puis
discutés dans cette partie.
 Tests sans NPM à 4.60 mT
Pour calculer le nombre de cellules dans un échantillon, la formule expliquée auparavant
est utilisée : Nombre de cellules vivantes dans l’échantillon = 3000 * d * n * f * v
Pour accroitre la fiabilité des résultats, le comptage cellulaire a été renouvelé 3 fois. Une
moyenne a donc été faite. Elle est indiquée en violet sur le tableau ci-dessous. Dans notre
cas, 100 μL de suspension cellulaire et 20 μL de bleu trypan ont été mélangé. Le facteur de
dilution est alors de 1.2. Par exemple, pour le témoin T1 après 1h de traitement, on a
compté 4 cellules au premier comptage, 3 au deuxième et 4 au dernier. Etant donné que ces
resultats ont été obtenus en comptant 4 lignes, le facteur multiplicatif f est alors égal à 1.
De plus, le culot de cellules a été resuspendu dans 1.5 ml de milieu suite à la
centrifugation. On a alors :
Nombre de cellules dans l’échantillon = 3000 * 1.2 * 4 * 1 * 1.5 = 21600 cellules vivantes
Nombre de cellules dans l’échantillon = 3000 * 1.2 * 3 * 1 * 1.5 = 16200 cellules vivantes
Nombre de cellules dans l’échantillon = 3000 * 1.2 * 3 * 1 * 1.5 = 16200 cellules vivantes
Comptage cellulaire (nombre de cellules vivantes)
Après 1h
Après 24h
Témoin incubé
(T1)
21600
16200
16200
18000
28800
25200
28800 27600
Témoin
transporté (T2)
21600
10800
16200
16200
25200
21600
18000 21600
Exposition
30min (E30)
10800
16200
16200
14400
10800
10800
10800 10800
Exposition
60min (E60)
21600
21600
21600
21600
18000
18000
21600 19200
Tableau 6 : Résultats des tests sans NPM à 4.60 mT. [SP]
24
Nombre de cellules vivantes
Tests sans NPM à 4.60 mT
35000
30000
25000
20000
1h
15000
24h
10000
5000
0
T1
T2
E30
E60
Figure 22 : Diagramme des tests sans NPM à 4.60 mT. [SP]
Une heure après le traitement, une augmentation des cellules est visible pour l’échantillon
exposé 60 min alors que celui exposé 30 min présente une réduction importante du nombre
de cellules. Au vue du nombre de cellules après le comptage d’une heure, on peut supposer
qu’une exposition brève à un champ magnétique de 4.60 mT a une influence négative sur
les cellules alors qu’une exposition plus prolongée semble bénéfique. De plus, il semblerait
que le témoin T2 soit affecté par le déplacement parce que l’on aperçoit une légère
diminution du nombre de cellules 1h après le traitement (le nombre de cellules initial étant
de 20000). Sur du long terme, les échantillons exposés montrent une diminution de la
quantité de cellules vivantes contrairement aux cellules des témoins qui n’ont pas cessé de
proliférer.
 Tests avec 10 µg/mL NPM à 4.60 mT
Comptage cellulaire (nombre de cellules vivantes)
Après 1h
Après 24h
Témoin incubé
(T1)
16200
21600
16200
18000
25200
25200
25200 25200
Témoin
transporté (T2)
21600
16200
16200
18000
21600
25200
21600 22800
Exposition
30min (E30)
16200
16200
16200
16200
21600
21600
18000 20400
Exposition
60min (E60)
16200
10800
10800
12600
14400
18000
21600 18000
Tableau 7 : Résultats des tests avec 10 µg/mL NPM à 4.60 mT. [SP]
25
Nombre de cellules vivantes
Tests avec 10 µg/mL NPM à 4.60 mT
30000
25000
20000
1h
15000
24h
10000
5000
0
T1
T2
E30
E60
Figure 23 : Diagramme des tests avec 10 µg/mL NPM à 4.60 mT. [SP]
Pour ces tests, les tubes exposés aux NPM et au CM ont été affectés 1 h après le traitement
mais 24h plus tard cet effet n’est plus présent et la quantité des cellules a augmentée
comme pour les témoins. Néanmoins, suite au premier comptage cellulaire, l’échantillon
exposé plus longtemps est plus marqué par la diminution des cellules. Il semblerait donc
que l’ajout de 10µg/mL de nanoparticules magnétiques et la durée d’exposition influent sur
la nocivité du champ.
 Tests avec 100 µg/mL NPM à 4.60 mT
Comptage cellulaire (nombre de cellules vivantes)
Après 1h
Après 24h
Témoin incubé
(T1)
16200
21600
21600
19800
25200
21600
25200 24000
Témoin
transporté (T2)
16200
21600
16200
18000
18000
21600
21600 20400
Exposition
30min (E30)
16200
21600
10800
16200
10800
7200
7200
Exposition
60min (E60)
21600
21600
21600
21600
14400
14400
14400 14400
8400
Tableau 8: Résultats des tests avec 100 µg/mL NPM à 4.60 mT. [SP]
26
Nombre de cellules vivantes
Tests avec 100 µg/mL NPM à 4.60 mT
30000
25000
20000
1h
15000
24h
10000
5000
0
T1
T1
E30
E60
Figure 24 : Diagramme des tests avec 100 µg/mL NPM à 4.60 mT. [SP]
A une concentration de 100 µg/mL de NPM, des chutes très nettes sont observées pour les
échantillons exposées au CM après 24h. Le fait d’augmenter la concentration de
nanoparticules présentes dans l’échantillon semble augmenter la nocivité du CM sur du
long terme. Par contre, le comptage cellulaire d’une heure montre un petit accroissement
des cellules pour l’échantillon exposé 60 min. Les témoins quant à eux semblent ne pas
être affectés énormément par la présence des nanoparticules magnétiques.
 Tests sans NPM à 8.74 mT
Comptage cellulaire (nombre de cellules vivantes)
Après 1h
Après 24h
Témoin incubé
(T1)
21600
16200
21600
19800
27000
37800
32400 32400
Témoin
transporté (T2)
21600
16200
16200
18000
27000
27000
21600 25200
Exposition
30min (E30)
21600
27000
27000
25200
27000
21600
10800 19800
Exposition
60min (E60)
21600
10800
16200
16200
10800
16200
5400
10800
Tableau 9 : Résultats tests sans NPM à 8.74 mT. [SP]
27
Tests sans NPM à 8.74 mT
Nombre de cellules vivantes
40000
35000
30000
25000
20000
1h
15000
24h
10000
5000
0
T1
T2
E30
E60
Figure 25 : Diagramme des tests sans NPM à 8.74 mT. [SP]
Tout comme pour les traitements sans NP à un CM de 4.60 mT, une augmentation est
visible une heure après le traitement mais cette fois-ci pour l’échantillon exposé pendant
30 min et non 60 min. Après le comptage d’une heure, on peut émettre l’hypothèse qu’une
exposition brève à un champ magnétique de 8.74 mT a une influence positive sur les
cellules alors qu’une exposition plus prolongée semble nocive. Contrairement aux
échantillons exposés au CM, les cellules présentent dans les témoins ont proliférés.
 Tests avec 10 µg/mL NPM à 8.74 mT
Comptage cellulaire (nombre de cellules vivantes)
Après 1h
Après 24h
Témoin incubé
(T1)
21600
16200
16200
18000
21600
18000
18000 19200
Témoin
transporté (T2)
16200
16200
16200
16200
10800
14400
14400 13200
Exposition
30min (E30)
10800
16200
10800
12600
10800
7200
14400 10800
Exposition
60min (E60)
5400
16200
10800
10800
7200
10800
10800
9600
Tableau 10 : Résultats des tests avec 10 µg/mL NPM à 8.74 mT. [SP]
28
Nombre de cellules vivantes
Tests avec 10 µg/mL NPM à 8.74 mT
25000
20000
15000
1h
10000
24h
5000
0
T1
T2
E30
E60
Figure 26 : Diagramme des tests avec 10 µg/mL NPM à 8.74 mT. [SP]
Comparés aux tests avec 10 µg/mL de NPM à 4.60 mT, les échantillons montrent une
baisse importante du nombre de cellules vivantes que ce soit 1h ou 24h après le traitement,
exceptes pour le témoin T1 qui voit sa quantité de cellules s’amplifier 24h après l’ajout de
10 µg/mL de NPM. Un champ magnétique de 8.74 mT en présence de 10 µg/mL de NPM
accentue la toxicité sur les cellules.
 Tests avec 100 µg/mL NPM à 8.74 mT
Comptage cellulaire (nombre de cellules vivantes)
Après 1h
Après 24h
Témoin incubé
(T1)
21600
21600
21600
21600
25200
32400
36000 31200
Témoin
transporté (T2)
27000
21600
16200
21600
21600
28800
25200 25200
Exposition
30min (E30)
27000
21600
21600
23400
21600
25200
21600 22800
Exposition
60min (E60)
21600
21600
16200
19800
21600
21600
21600 21600
Tableau 11 : Résultats des tests avec 100 µg/mL NPM à 8.74 mT. [SP]
29
Nombre de cellules vivantes
Tests avec 100 µg/mL NPM à 8.74 mT
40000
35000
30000
25000
20000
1h
15000
24h
10000
5000
0
T1
T2
E30
E60
Figure 27 : Diagramme des tests avec 100 µg/mL NPM à 8.74 mT. [SP]
A une concentration de 100 µg/mL, une multiplication des cellules est visible dans
l’échantillon E30 après 1h alors qu’après 24h, une légère diminution se fait ressentir. Les
résultats de ces tests présentes très peu de variations et ne sont donc pas représentatifs.
 Discussion sur les tests de viabilité
- Sans nanoparticules Fe3O4
Au vue des résultats obtenus, on peut affirmer qu’un CM peut avoir tantôt un effet
bénéfique et tantôt un effet nocif sur les cellules alvéolaires A549.
Alors que nos échantillons-témoins ne présentent aucune variation significative du nombre
de cellules, à faible densité magnétique (4.60 mT), on constate une augmentation des
cellules humaines dans l’échantillon exposé 60 min. Cette influence positive est également
observée si on multiplie environ par deux la valeur du champ magnétique (8.74 mT) mais
cette fois-ci pour une exposition de seulement 30 min. On remarque une certaine
proportionnalité dans le sens où si l’on double l’intensité du CM, une durée d’exposition
deux fois moins importante est nécessaire afin d’obtenir les mêmes résultats.
En revanche, à faible densité magnétique (4.60 mT) et à courte durée d’exposition (30 min)
ainsi qu’à forte densité magnétique (8.74 mT) et à longue durée d’exposition (60 min), les
effets des ondes s’avèrent nocifs et entrainent la mort de nombreuses cellules.
30
- Avec nanoparticules Fe3O4
Les concentrations 10 et 100 μg/mL ont été testées sur des témoins. Aucun effet
cytotoxique significatif n’a été observé sur les cellules alvéolaires. Pourtant en soumettant
les cellules avec 10 μg/mL NPM au champ magnétique, on note une influence négative très
prononcée à une valeur de CM valant 8.74 mT 1h après le traitement. De même, un jour
après l’exposition de 60 min, les cellules A549 survivantes ont été passées par trypsination
et seulement quelques cellules ont adhéré à la flasque de culture. Les cellules adhérentes
étaient incapables de proliférer et ont progressé graduellement vers un état apoptotique.
Cette observation est également valable pour l’exposition de 30 min et suggère que les
effets d’un champ magnétique de 8.74 mT sur les cellules demeurent, mêmes après un
jour de traitement. Dans ce cas, la toxicité des nanoparticules est additive, en ce sens
qu’elle complète et intensifie celle exprimée par le champ magnétique.
La viabilité des cellules A549, en présence de 100 μg/mL de NPM, exposées à un CM de
4.60 mT a été évaluée. Suite à une exposition de 30 min, les résultats montrent un fort effet
cytotoxique avec un plateau à 50 % de mortalité 24h après le traitement. A l’inverse, les
variations sont peu significatives à 8.74 mT. De plus, le dénombrement des cellules
vivantes a été réalisé par la technique au bleu trypan. Il s’avère que cette technique de
comptage semble mal adaptée aux fortes concentrations en nanoparticules. En effet des
agglomérats de cellules avec les NPM ont parfois été observés dans l`hématimètre de
Neubauer au microscope, rendant difficile le comptage des cellules. Cela est probablement
dû à une mauvaise trypsination en présence de nanoparticules.
31
 Evolution de la température
- Champ magnétique de 4.60 mT
Température (en °C)
Temps
(en min)
Milieu
23
Suspension
cellulaire sans NP
23
Suspension cellulaire
avec 10 µg/ml NP
23.5
Suspension cellulaire
avec 100 µg/ml NP
23.5
T=0
T = 10
23
23
23.5
23.5
T = 20
23
23
24
24
T = 30
23
23
24
24
T = 40
23.5
23.5
24.5
24.5
T = 50
23.5
23.5
24.5
24.5
T = 60
23.5
23.5
25
25
Tableau 12 : Evolution de la température à 4.60 mT. [SP]
Pour les échantillons contenant ou non les cellules, une élévation de 0.5 degrés Celsius est
perceptible après 60 min d’exposition à un CM de 4.60 mT. Aucune différence n’est
observée entre les différentes concentrations de nanoparticules d’oxyde de fer ou là, la
température passe de 23.5 à 25 °C.
- Champ magnétique de 8.74 mT
Température (en °C)
Temps
(en min)
Milieu
23
Suspension
cellulaire sans NP
23
Suspension cellulaire
avec 10 µg/ml NP
23.5
Suspension cellulaire
avec 100 µg/ml NP
23.5
T=0
T = 10
23.5
23.5
24
24
T = 20
24
24
25
25
T = 30
25
25
25.5
25.5
T = 40
25.5
25.5
26
26
T = 50
26
26
27
27
T = 60
26.5
26.5
28
28
Tableau 13 : Evolution de la température à 8.74 mT. [SP]
32
Quand le champ magnétique est environ multiplié par deux, la hausse de température est
beaucoup plus importante que ce soit pour les échantillons sans NPM (3.5 °C en 60 min)
ou avec NPM (4.5 °C en 60 min).
Les augmentations de température observées ne sont pas significatives puisqu’en temps
normal les cellules humaines vivent dans un environnement à 37 °C alors que la
température maximum constatée est de 28 °C à un CM de 8.74 mT. Cependant, on peut
supposer que les variations de température peuvent influer sur l’efficacité du mécanisme de
prolifération des cellules.
33
CONCLUSION
Ce travail a eu pour but d’enrichir les connaissances sur les effets biologiques des
nanoparticules couplées au champ magnétique sur des cellules humaines. Nous avons
confirmé, que les nanoparticules Fe3O4 et le champ magnétique ne sont pas inertes pour les
pneumocytes A549. En effet, l`intensité du champ magnétique et la durée d’exposition,
accentués par la concentration des NPM, sont des paramètres influençant l’effet
cytotoxique des pneumocytes cancéreux. Ces résultats permettent donc de mettre en garde
sur un effet néfaste de l’association champ magnétique/nanoparticules pour la santé
humaine, qui doit être confirmé par des études in vitro plus poussées.
Cependant, une influence positive a parfois été observée. C’est pourquoi, il serait
intéressant de faire d’autres études afin de déterminer le seuil de toxicité pour les cellules.
De plus, étudier les possibles modifications morphologiques des cellules ou encore
l’interaction des nanoparticules avec les organites de la cellule avant et après avoir été
exposé au CM aiderait à mieux comprendre le phénomène biologique engendré. Enfin,
étendre cette étude en faisant des tests de viabilité cellulaire avec des magnétosomes
permettrait de comparer les effets du CM avec les nanoparticules naturelles et avec les
nanoparticules manufacturées.
Ce projet a nécessité une approche multidisciplinaire associant physico-chimie,
microbiologie et toxicologie humaine. Il m’a permis de mettre en pratique mes
connaissances théoriques acquises durant ma formation. Cela a été très formateur, et m’a
permis de réaliser l’importance de prendre en considération le facteur humain, mais aussi
de me rendre compte de la difficulté de mise au point des protocoles et du suivi de la
culture cellulaire.
Le sujet abordé était particulièrement intéressant et a renforcé mes connaissances ainsi que
mon expérience dans le domaine biomédical. J’ai pu être en contact avec différents corps
de métiers tels que des chercheurs, des microbiologistes ou encore des chimistes.
.
34
BIBLIOGRAPHIE
[1]. École Polytechnique de Montréal. Polytechnique Montréal - Le génie en première
classe. [en ligne]. École Polytechnique de Montréal. [réf. du 16 janvier 2013]. Disponible
sur : <http://www.polymtl.ca/>
[2]. CROMER BERMAN, Stacey M. ; WALCZAK, Piotr ; BULTE, Jeff W.M. Tracking
stem cells using magnetic nanoparticles. Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine
and Nanobiotechnology, 2011, vol.3, n° 4, 343-355 p.
[3]. COROT, Claire ; ROBERT, Philippe ; IDEE, Jean-Marc et al. Recent advances in iron
oxide nanocrystal technology for medical imaging. Advanced Drug Delivery Reviews,
2006, vol.58, n° 14, 1471-1504 p.
[4]. HOFMANN, Andreas ; WENZEL, Daniela ; BECHER, Ulrich M. Combined targeting
of lentiviral vectors and positioning of transduced cells by magnetic nanoparticles.
Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2009,
vol.106, n° 1, 44-49 p.
[5]. FORTIN, Jean-Paul ; WILHEM, Claire ; SERVAIS, Jacques et al. Size-sorted anionic
iron oxide nanomagnets as colloidal mediators for magnetic hyperthermia. Journal of the
American Chemical Society, 2007, vol.129, n° 9, 2628-2635 p.
[6]. MAIER-HAUFF, Klaus ; ULRICH, Frank ; NESTLER, Dirk et al. Efficacy and safety
of intratumoral thermotherapy using magnetic iron-oxide nanoparticles combined with
external beam radiotherapy on patients with recurrent glioblastoma multiforme. Journal of
Neuro-Oncology, 2011, vol.103, n° 2, 317-324 p.
[7]. LEVY, Michael ; LUCIANI, Nathalie ; ALLOYEAU Damien et al. Long term in vivo
biotransformation of iron oxide nanoparticles. Biomaterials, 2011, vol.32, n° 16, 39883999 p.
[8]. ATCC (American Type Culture Collection).The essentials of life science research.
[en ligne]. American Type Culture Collection [réf. du 04 février 2013]. Disponible sur :
<http://www.atcc.org/>
[9]. SHIN, Jaeha ; YOO, Chang-Hyuk ; LEE, Junghoon et al. Cell response induced by
internalized bacterial magnetic nanoparticles under an external static magnetic field.
Biomaterials, 2012, vol.33, n° 22, 5650-5657 p.
vi
[10]. FAIVRE, Damien ; SCHULER, Dirk. Magnetotactic Bacteria and Magnetosomes.
Chemical Reviews, 2008, vol 108, 4875-4898 p.
[11]. FELFOUL Ouajdi, MOKRANI Nisryn, MOHAMMADI Mahmood, et al. Effect of
the Chain of Magnetosomes Embedded in Magnetotactic Bacteria and their Motility on
Magnetic Resonance Imaging. Engineering in Medicine and Biology Society (EMBC),
2010 Annual International Conference of the IEEE, 2010, 4367-4370 p.
[12]. OSTIGUY, Claude ; LAPOINTE, Gilles ; MENARD, Luc et al. Les nanoparticules :
connaissances actuelles sur les risques et les mesure de prévention en santé et en sécurité du
travail. Études et recherches, Institut de recherche Robert-Sauve en sante et en securite du
travail, 2006, 79 p.
[13]. WINER, Jesse L. ; LIU, Charles Y. ; APUZZO Michael L.J. The Use of
Nanoparticles as Contrast Media in Neuroimaging: A Statement on Toxicity. World
Neurosurgery, 2012, vol.78, n° 6, 709-711 p.
[14]. AMBRELL an Ameritherm Company. Ambrell Induction Heating. [en ligne].
AMBRELL an Ameritherm Company [réf. du 13 février 2013]. Disponible sur :
<http://www.ameritherm.com/>
[15]. VEZINA, Simon. Le champ magnétique généré par un solénoïde. [en ligne]. Chapitre
4.9 en Physique, 8 p. Disponible sur :
<http://profs.cmaisonneuve.qc.ca/svezina/nyb/note_nyb/NYB_XXI_Chap%204.9.pdf>
[16]. Cell Disruptor User Manual. Constant Systems Limited, 2010, 75 p.
[17]. XIE, Jianping ; LIU, Xinxing ; LIU, Wenbin et al. Extraction of Magnetosomes from
Acidthiobacillus ferrooxidans. Journal of Biology, 2005, vol.1, n° 3, 36-38 p.
vii
GLOSSAIRE
A
Apoptose : mort cellulaire programmée.
ATP : molécule qui, dans la biochimie de tous les organismes vivants connus, fournit par
hydrolyse l'énergie nécessaire aux réactions chimiques du métabolisme.
C
Cytotoxicité : propriété qu’a un agent chimique ou biologique d’altérer les cellules,
éventuellement jusqu’à les détruire.
H
Hygrométrie : caractérise la quantité d'eau sous forme gazeuse présente dans l'air humide.
I
Interface oxique/anoxique : frontière entre le milieu riche en oxygène et celui dépourvu
d'oxygène.
M
Micro-aérophile : organisme dont la croissance est optimale dans un milieu où la
concentration en oxygène est inférieure à la concentration atmosphérique.
N
Nano-objet : objet dont toutes les dimensions dans l'espace sont de l'ordre du nanomètre
(comprises entre 1 et 100 nanomètres).
V
Viabilité cellulaire : capacité d’une cellule à vivre et à se reproduire.
viii
TABLE DES ANNEXES
Annexe 1 : Hiérarchie au sein du LIAB. [SP] ....................................................................... x
Annexe 2 : Spécifications du dispositif induisant un CM. [14]............................................ xi
Annexe 3 : Spécifications du Cell Disruptor. [16] .............................................................. xii
Annexe 4 : Diagramme de Gantt. [SP] ............................................................................... xiii
ix
Annexe 1 : Hiérarchie au sein du LIAB. [SP]
x
Annexe 2 : Spécifications du dispositif induisant un CM. [14]
xi
Annexe 3 : Spécifications du Cell Disruptor. [16]
xii
Annexe 4 : Diagramme de Gantt. [SP]
xiii
RESUME
Les connaissances et les pratiques dans le domaine de la santé sont en constante évolution
grâce aux technologies nouvelles et émergentes, qui améliorent la qualité du diagnostic et
des soins aux patients. Face à l’engouement de la médecine pour l’utilisation de
nanoparticules magnétiques dirigées par un champ magnétique extérieur, il est
indispensable d’étudier l’impact éventuel de cette nouvelle technologie. Pour cela, des
études in vitro ont été réalisées sur des cellules humaines alvéolaires cancéreuses
permettant de se placer dans un contexte d’exposition de l’Homme. Ainsi des
nanoparticules d’oxyde de fer Fe3O4 ont été étudiées et des tests de viabilité ont été mis en
place. L’objectif final était d’évaluer et de comprendre l’influence d’un champ magnétique
couplé aux nanoparticules sur les cellules biologiques, proportionnelle aux paramètres
variables de nos expériences. Les résultats obtenus montrent une influence tantôt positive
tantôt négative sur les cellules cancéreuses.
Mots clés : nanoparticules, champ magnétique extérieur, in vitro, cellules humaines
alvéolaires, oxyde de fer
ABSTRACT
Knowledge and practices in the field of health are constantly changing due to new and
emerging technologies that improve the quality of diagnosis and care of patients. Given the
enthusiasm of medicine to use magnetic nanoparticles directed by an external magnetic
field, it is necessary to consider the potential impact of this new technology. That’s why in
vitro studies were performed on human alveolar cells to be placed in the context of human
exposure. And iron oxide nanoparticles Fe3O4 were studied and viability tests were
implemented. The ultimate target was to evaluate and understand the influence of a
magnetic field coupled to nanoparticles on biological cells, proportional to the variable
parameters of our experiences. The results show an influence sometimes positive and
sometimes negative on cancer cells.
Keywords : nanoparticles, external magnetic field, in vitro, human alveolar cell, iron oxide
xiv