Alimentos funcionais - REPOSITORIO INSTITUCIONAL DA UFOP

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO
NÚCLEO DE PESQUISAS EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
LABORATÓRIO DE NUTRIÇÃO EXPERIMENTAL
ALINE MAYRINK DE MIRANDA
ESTUDO DO POTENCIAL HIPOCOLESTEROLÊMICO E ANTIOXIDANTE DO
Agaricus blazei (COGUMELO DO SOL) EM MODELO DE
HIPERCOLESTEROLEMIA INDUZIDA POR DIETA EM RATOS
Ouro Preto
2011
ALINE MAYRINK DE MIRANDA
ESTUDO DO POTENCIAL HIPOCOLESTEROLÊMICO E ANTIOXIDANTE DO
Agaricus blazei (COGUMELO DO SOL) EM MODELO DE
HIPERCOLESTEROLEMIA INDUZIDA POR DIETA EM RATOS
Dissertação apresentada ao Programa de Pós Graduação do Núcleo de Pesquisas em Ciências
Biológicas da Universidade Federal de Ouro Preto,
como requisito parcial para a obtenção do título de
Mestre em Ciências Biológicas, área de
concentração: Bioquímica Estrutural e Fisiológica.
Orientador: Prof. Dr. Marcelo Eustáquio Silva
Co-orientador: Prof. Dr. Rinaldo Cardoso dos Santos
Ouro Preto
2011
M672e
Miranda, Aline Mayrink de.
Estudo do potencial hipocolesterolêmico e antioxidante do Agaricus blazei
(cogumelo do sol) em modelo de hipercolesterolemia induzida por dieta em ratos
[manuscrito] / Aline Mayrink de Miranda. - 2011.
xvi, 119f.: il. color; tabs.
Orientador: Prof. Dr. Marcelo Eustáquio Silva.
Co-orientador: Prof. Dr. Rinaldo Cardoso dos Santos.
Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal de Ouro Preto.
Instituto de Ciências Exatas e Biológicas. Núcleo de Pesquisas em Ciências
Biológicas.
Área de concentração: Bioquímica Estrutural e Fisiológica.
1. Hipercolesterolemia - Teses. 2. Estresse oxidativo - Teses. 3. Alimentos
funcionais - Teses. 4. Cogumelos – Agaricus blazei - Teses. I. Universidade
Federal de Ouro Preto. II. Título.
CDU: 612.395.6:612.397
Catalogação: [email protected]
MIRANDA, A. M.
Apoio Financeiro
Este trabalho foi realizado no Laboratório de Nutrição Experimental e no
Laboratório de Bioquímica Metabólica do Núcleo de Pesquisas em
Ciências Biológicas da Universidade Federal de Ouro Preto, com auxílio da
CAPES, FAPEMIG e UFOP.
III
MIRANDA, A. M.
Dedicatória
DEDICATÓRIA
...aos meus pais José Zaidan e Maria Claret
e às minhas irmãs Priscila e Danielly
por TUDO que representam em minha vida....
IV
MIRANDA, A. M.
Agradecimento Especial
AGRADECIMENTO ESPECIAL
Ao Prof. Dr. Marcelo Eustáquio Silva e ao Prof. Dr. Rinaldo Cardoso dos Santos à
orientação e aos ensinamentos imprescindíveis para a realização deste trabalho, sobretudo
pela atenção, carinho, paciência e por acreditarem em mim. Muito obrigada por todo
aprendizado e confiança. Tenho vocês como exemplo a seguir durante minha vida
profissional.
Ao Laboratório de Cogumelos Comestíveis da Universidade Federal de Lavras, em
especial ao Prof. Dr. Eustáquio Souza Dias que gentilmente forneceu os cogumelos,
fundamentais à realização desse trabalho.
Ao Laboratório de Bromatologia da Universidade Federal de Ouro Preto, em especial ao
Prof. MSc. Aureliano Claret da Cunha por ceder o laboratório e nos auxiliar na análise da
composição centesimal do Agaricus blazei.
V
MIRANDA, A. M.
Agradecimentos
AGRADECIMENTOS
A Deus, por estar sempre ao meu lado guiando meus passos.
Aos meus Pais pelo exemplo de vida e às minhas irmãs Pril e Dão pelo apoio e carinho.
Muito obrigada por compreenderem minha ausência...
À minha amiga-irmã Bakura (Lídia), pelos vários momentos que pudemos compartilhar,
tanto os cômicos como os “trágicos”, principalmente pelo carinho, compreensão e pelas
incansáveis revisões de meus textos, sempre com muita atenção e dedicação. Uma amizade
singular!
Ao Marcos pelo carinho e amizade incondicional.
Às Partners Pituk (Melina) e Flor (Emanuela), por todas as risadas, conselhos, puxões de
orelha...
Ao Bibo por todo o carinho, paciência e pela confiança depositada em mim desde o
primeiro momento.
À Simone e ao Aureliano (Mami’s and Papi’s), pelo carinho, apoio e pelo exemplo de
profissionais que são... enfim, por realmente me acolherem na família “Cunha”. Muito
obrigada!
À Mana (Glaucy), ao Tico (Joamyr), à Marida (Lorena) e ao Hermano Hermoso (Bruno)
por tornarem inesquecíveis e maravilhosos TODOS os momentos que passamos juntos.
Vocês foram inexplicáveis, muito obrigada por tudo.
Aos demais colegas do Laboratório de Nutrição Experimental e Bioquímica Metabólica,
em especial à Walesca, Ana Flávia, Melina, Danielle, Fabiano, Emerson, Sandra, Maísa,
Rogério, Joyce e Larissa por toda ajuda e pela enriquecedora convivência.
Aos professores e amigos do NUPEB pelo convívio e auxílio nos estudos, sem os quais
seria muito difícil atingir meu objetivo.
Ao Jair e ao Clodoaldo pelo carinho e dedicação que sempre me atenderam.
À Cida, sempre resolvendo nossos problemas com dedicação e muita boa vontade.
Aos funcionários da Escola de Nutrição e do Instituto de Ciências Exatas e Biológicas,
sempre empenhados em nos proporcionar o melhor ambiente de trabalho possível.
A todos os meus sinceros agradecimentos e tenham a certeza de que sem VOCÊS a
realização desse trabalho não seria possível
VI
MIRANDA, A. M.
Resumo
RESUMO
Diversas espécies de cogumelos têm sido relacionadas ao controle da hiperlipidemia. Os
cogumelos comestíveis são considerados ainda um alimento ideal para a prevenção da
aterosclerose, na medida em que possuem um alto conteúdo em fibras aliado ao seu baixo
teor em lipídios. Contudo, os efeitos medicinais destes cogumelos são, muitas vezes,
promovidos sem evidências científicas, baseados apenas na crença popular. Nesta
perspectiva e mediante o grande interesse que vem despertando não somente à comunidade
científica, mas também à população como um todo, o presente estudo refere-se ao
Agaricus blazei, popularmente conhecido como Cogumelo do Sol. O Agaricus blazei,
nativo do Brasil, tem gerado inúmeras dúvidas que vão desde a classificação taxonômica
até o tipo de comercialização e utilização pela população. Desta forma, o objetivo desse
trabalho foi avaliar algumas propriedades funcionais do A. blazei especialmente com
relação aos efeitos hipocolesterolemiante e antioxidante. Foram utilizados 32 ratos Fischer
(fêmeas), distribuídos em quatro grupos (8 animais/grupo): grupo C recebeu dieta padrão
AIN-93M (4% óleo de soja); grupo H recebeu dieta hipercolesterolemiante (25% de óleo
de soja e 1% de colesterol); grupo CAb recebeu dieta padrão suplementada com 1% de
Agaricus blazei e grupo HAb recebeu dieta hipercolesterolemiante suplementada com 1%
de Agaricus blazei. Dieta e água foram oferecidas ad libitum aos animais durante todo
período experimental. Ao final desse período (8 semanas) amostras de sangue e do tecido
hepático foram coletadas para as análises bioquímicas. Os dados foram avaliados através
da análise de variância bivariada (Two-way ANOVA). As diferenças foram consideradas
significativas quando o valor de p foi menor do que 0,05. A análise da composição
centesimal mostrou que esse cogumelo constitui uma importante fonte de nutrientes, sendo
considerado fonte de fibras e com alto teor em proteínas. Como esperado, a dieta
hipercolesterolemiante promoveu um aumento nos níveis séricos do colesterol total e da
fração não-HDL, concomitante a uma diminuição do colesterol HDL. A adição do
Agaricus blazei a 1% na dieta hipercolesterolemiante promoveu um significativo efeito
hipolipidêmico, reduzindo substancialmente os níveis séricos do colesterol total, colesterol
não HDL e triacilgliceróis. O mesmo também mostrou-se efetivo em reduzir o peso da
gordura abdominal a valores próximos à normalidade. Ao mesmo tempo, uma redução foi
observada quando esse cogumelo foi adicionado à dieta controle, reduzindo
significativamente os níveis de triacilgliceróis, indicando que, aliado a uma dieta saudável,
o Agaricus blazei pode ser benéfico à saúde. Ao contrário do encontrado na literatura, o
Agaricus blazei, na concentração e na forma de administração utilizadas, não exerceu
efeito antioxidante. Nossos resultados sugerem que o Agaricus blazei, adicionado à dieta,
possa atuar como um importante agente hipolipidêmico, fornecendo benefícios à saúde,
principalmente, nas condições impostas pela hipercolesterolemia.
Palavras-chave: Agaricus blazei. Hipercolesterolemia. Alimentos funcionais. Estresse
oxidativo.
VII
MIRANDA, A. M.
Abstract
ABSTRACT
Several species of mushrooms have been related to the control of hyperlipidemia. Edible
mushrooms are considered an ideal food for the prevention of atherosclerosis, as they have
a high content of fiber, together with its low fat content. However, the effects of these
medicinal mushrooms are often promoted without scientific evidence, based only in
popular belief. In this perspective and due to the great interest that it is attracting not only
within the scientific community, but also in the population as a whole, this study refers to
Agaricus blazei, popularly known as of the Sun Mushroom. Agaricus blazei, native of
Brazil, has raised numerous questions ranging from the taxonomic classification to the type
of marketing and use by the population. Thus, the aim of this study was to evaluate some
functional properties of this mushroom especially regarding hypocholesterolemic and
antioxidant effects. Thirty two female Fischer rats were used which were divided into four
groups (8 animals / group): group C received the standard AIN-93M diet (4% soybean oil),
group H received a hypercholesterolemic diet (25% soybean oil and 1 % cholesterol);
group CAb was given the standard diet supplemented with 1% of Agaricus blazei and
group HAb which received the hypercholesterolemic diet supplemented with 1% of
Agaricus blazei. Diet and water were offered ad libitum to animals throughout the
experimental period. At the end of this period (8 weeks) blood samples and liver tissue
were collected for biochemical analysis. Data were analysed by two-way ANOVA.
Differences were considered significant when the p value was less than 0.05. Analysis of
the chemical composition showed that the mushroom is an important source of nutrients
and is considered a source of fiber besides having a high protein content. As expected, the
hypercholesterolemic diet promoted an increase in serum total cholesterol and non-HDL
fraction, concurrent with a decrease in HDL cholesterol. The addition of 1% Agaricus
blazei in the hypercholesterolemic diet promoted a significant hypolipidemic effect,
substantially reducing the serum levels of total cholesterol, triglycerides and non-HDL
cholesterol fractions. It also proved to be effective in reducing abdominal fat weight to
values close to the normal. At the same time, a decrease was observed when the fungus
was added to the control diet, significantly reducing the levels of triacylglycerols,
indicating that a healthy diet combined with Agaricus blazei may be beneficial to health.
Unlike other studies, Agaricus blazei, in the concentration used and in the form
administration did not exert an antioxidant effect. Our results suggest that Agaricus blazei,
added to the diet may act as an important hypolipidemic agent, providing health benefits,
especially under the conditions imposed by hypercholesterolemia.
Keywords: Agaricus blazei. Hypercholesterolemia. Functional food. Oxidative stress.
VIII
MIRANDA, A. M.
Lista de Figuras
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1: Cogumelos comestíveis mais conhecidos no Brasil ...............................
9
FIGURA 2: Estrutura química da Lovastatina e da Eritadenina ................................
13
FIGURA 3: Cultivo do Agaricus blazei em canteiro protegido e por fermentação
submersa. Tibicos .........................................................................................................
FIGURA 4: Corpos de frutificação do Agaricus blazei ...............................................
FIGURA 5: Biossíntese do Colesterol a partir do acetil-CoA ....................................
IX
16
17
23
MIRANDA, A. M.
Lista de Quadros
LISTA DE QUADROS
QUADRO I: Principais glucanas encontradas nas frutificações do A. blazei e suas
respectivas atividades e mecanismo de ação .............................................................
X
21
MIRANDA, A. M.
Lista de Tabelas
LISTA DE TABELAS
TABELA I: Composição dos nutrientes das dietas em gramas para cada 1000g de dieta
30
..............................................................................................................................................
TABELA II: Composição centesimal em 100g do Agaricus blazei .................................. 46
TABELA III: Crescimento corporal, ingestão alimentar e excreção fecal de grupos de
animais alimentados com dieta padrão (C), dieta padrão + A. blazei a 1% (CAb), dieta 47
hipercolesterolemiante (H) e dieta hipercolesterolemiante + A. blazei a 1% (HAb) ..........
TABELA IV: Peso total e peso relativo (peso total do órgão / peso do animal x 100) do
fígado, da gordura abdominal e dos rins de grupos de animais alimentados com dieta
padrão (C), dieta padrão + A. blazei a 1% (CAb), dieta hipercolesterolemiante (H) e dieta 48
hipercolesterolemiante + A. blazei a 1% (HAb) ...................................................................
TABELA V: Concentração sérica de proteínas totais, albumina e glicose de grupos de
animais alimentados com dieta padrão (C), dieta padrão + A. blazei a 1% (CAb), dieta
hipercolesterolemiante (H) e dieta hipercolesterolemiante + A. blazei a 1% (HAb) 49
...............................................................................................................................................
TABELA VI: Atividade das enzimas séricas aspartato aminotransferase, alanina
aminotransferase e fosfatase alcalina de grupos de animais alimentados com dieta padrão
(C), dieta padrão + A. blazei a 1% (CAb), dieta hipercolesterolemiante (H) e dieta 50
hipercolesterolemiante + A. blazei a 1% (HAb) ..................................................................
TABELA VII: Concentrações séricas de creatinina e uréia de grupos de animais
alimentados com dieta padrão (C), dieta padrão + A. blazei a 1% (CAb), dieta 51
hipercolesterolemiante (H) e dieta hipercolesterolemiante + A. blazei a 1% (HAb) ...........
TABELA VIII: Concentrações séricas do colesterol total, colesterol não-HDL,
colesterol HDL, triacilgliceróis e índice aterogênico de grupos de animais alimentados
com dieta padrão (C), dieta padrão + A. blazei a 1% (CAb), dieta hipercolesterolemiante 53
(H) e dieta hipercolesterolemiante + A. blazei a 1% (HAb) ................................................
TABELA IX: Porcentagem de gordura hepática e fecal e concentrações do colesterol
total e triacilgliceróis no fígado de grupos de animais alimentados com dieta padrão (C),
dieta padrão + A. blazei a 1% (CAb), dieta hipercolesterolemiante (H) e dieta 54
hipercolesterolemiante + A. blazei a 1% (HAb) ...................................................................
TABELA X: Concentração sérica de sulfidrilas totais e concentração hepática de
TBARS e proteína carbonilada de grupos de animais alimentados com dieta padrão (C),
55
dieta padrão + A. blazei a 1% (CAb), dieta hipercolesterolemiante (H) e dieta
hipercolesterolemiante + A. blazei a 1% (HAb) ..................................................................
TABELA XI: Concentração hepática de glutationa total e atividade arilesterásica e
paraoxonase da enzima paraoxonase no soro de grupos de animais alimentados com
dieta padrão (C), dieta padrão + A. blazei a 1% (CAb), dieta hipercolesterolemiante (H) e 56
dieta hipercolesterolemiante + A. blazei a 1% (HAb) .........................................................
XI
MIRANDA, A. M.
Lista de Abreviaturas
LISTA DE ABREVIATURAS
ABM: Agaricus blazei Murril
A.blazei: Agaricus blazei
AIN: American Institute of Nutrition
ALT: Alanina aminotransferase
AMP: Adenosina monofosfato
ANOVA: Análise de variância
ANVISA: Agência Nacional de Vigilância Sanitária
ALT: Alanina aminotransferase
AOAC: Association of Official Agricultural Chemists
AST: Aspartato aminotransferase
C: Grupo de animais que receberam dieta padrão
CAb: Grupo de animais que recebeu dieta padrão acrescida do Agaricus blazei
CETEP: Proteínas transferidoras de éster de colesterol
COPERCOM: Cooperativa dos Produtores de Cogumelos
DAC: doença arterial coronariana
DCV: doença cardiovascular
DMSO: dimetilsulfossalicílico
DNP: 2,4 dinitrofenilhidrazina
DTNB: 5,5-ditio-bis-2-nitro-benzóico
EDTA: Ácido etilenodiaminotetracético
EROS: Espécies reativas de oxigênio
FA: Fosfatase alcalina
FDN: fibra detergente neutro
FOSHU: Food for Specified Health Use
GSH: Glutationa reduzida
GSSG: Glutationa oxidada
H: Grupo de animais que receberam dieta hipercolesterolemiante
HAb: Grupo de animais que receberam dieta hipercolesterolemiante acrescida do Agaricus
blazei
HDL: High density lipoprotein
XII
MIRANDA, A. M.
Lista de Abreviaturas
HMG - CoA: 3-Hidroxi-3metil-glutaril CoA
IDL: Intermediate density lipoprotein
LCAT: Lecitina colesterol acil transferase
LDL: Low density lipoprotein
LDL-OX: LDL modificada oxidativamente
LDLR: Receptores de LDL
LPL: lipase lipoprotéica
MAFF: Ministério da Agricultura, Pesca e Alimentos
OMS: Organização Mundial da Saúde
NK: Natural killer
PM: peso molecular
PON: Paraoxonase
PLTP: proteína transportadora de fosfolipídios
PUFAs: Ácidos graxos poliinsaturados
ROS: Espécies reativas de oxigênio
RPM: Rotações por minuto
SDS: Dodecilssulfato de sódio
SREBPs: Proteínas ligadoras de elementos de resposta a esteróis
TBA: ácido tiobarbitúrico
TBARS: Substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico
TCA: Ácido tricloroacético
TEA: Cloreto de trietanolamina
TNB: 2-nitro-5-tiobenzóico
VLDL: Very low density lipoprotein
XIII
MIRANDA, A. M.
Lista de Anexos
LISTA DE ANEXOS
ANEXO I: Carta do Comitê de Ética em Pesquisa / UFOP
ANEXO II: Protocolos das dosagens Bioquímicas
II.1 - Albumina
II.2 - Alanina Aminotransferase
II.3 - Aspartato Aminotransferase
II.4 - Colesterol HDL
II.5 - Colesterol Total
II.6 - Creatinina
II.7 - Fosfatase Alcalina
II.8 - Glicose
II.9 - Proteínas Totais
II.10 - Triacilgliceróis
II.11 - Uréia
XIV
MIRANDA, A. M.
Sumário
SUMÁRIO
RESUMO .................................................................................................................... VII
ABSTRACT ............................................................................................................... VIII
LISTA DE FIGURAS ................................................................................................
IX
LISTA DE QUADROS ..............................................................................................
X
LISTA DE TABELAS ...............................................................................................
XI
LISTA DE ABREVIATURAS ................................................................................
XII
LISTA DE ANEXOS ................................................................................................. XIV
2
CAPÍTULO 1: INTRODUÇÃO ...............................................................................
4
CAPÍTULO 2: REVISÃO DE LITERATURA ......................................................
2.1 Alimentos funcionais ..............................................................................................
4
2.1.1 Conceito .........................................................................................................
4
2.1.2 Alimentos funcionais versus doenças cardiovasculares ................................
6
2.2 Cogumelos Comestíveis .........................................................................................
8
2.2.1 Características gerais ......................................................................................
8
2.2.2 Composição e propriedades dos cogumelos ...................................................
10
2.3 Agaricus blazei ......................................................................................................
14
2.3.1 Concepção popular versus científica ..............................................................
14
2.3.2 Histórico .........................................................................................................
17
2.3.3 Propriedades funcionais do Agaricus blazei ..................................................
19
2.4 Metabolismo do colesterol, lipoproteínas e sua relação com as doenças
22
cardiovasculares ..........................................................................................................
CAPÍTULO 3: OBJETIVOS ....................................................................................
28
3.1 Objetivo Geral .......................................................................................................
28
3.2 Objetivos Específicos ............................................................................................
28
CAPÍTULO 4: MATERIAL E MÉTODOS ...........................................................
29
4.1 Animais ..................................................................................................................
29
4.2 Dietas .....................................................................................................................
29
4.3 Composição centesimal do Agaricus blazei ..........................................................
30
4.3.1 Umidade .............................................................................................................
30
4.3.2 Proteínas .............................................................................................................
30
4.3.3 Cinzas .................................................................................................................
31
4.3.4 Lipídios ..............................................................................................................
31
4.3.5 Fibras alimentares ...............................................................................................
31
4.3.6 Carboidratos .......................................................................................................
31
4.4 Delineamento do experimento ...............................................................................
31
4.5 Obtenção do soro e plasma ...................................................................................
32
4.6 Dosagens dos parâmetros bioquímicos .................................................................
32
4.6.1 Protocolo de dosagem da atividade de Paraoxonase .......................................
33
4.6.1.1 Paraoxonase – Atividade arilesterase ........................................................
33
xv
MIRANDA, A. M.
Sumário
4.6.1.2 Paraoxonase – Atividade paraoxonase ..........................................................
4.6.2 Protocolo de dosagem dos grupos sulfidrilas ...................................................
4.7 Protocolos de análise das defesas antioxidantes e da concentração de
biomarcadores do estresse oxidativo em tecido ..........................................................
4.7.1 Concentração de Glutationa Total ...................................................................
4.7.2 Proteína Carbonilada ........................................................................................
4.7.3 Proteínas Totais em tecido – Método de Lowry ..............................................
4.7.4 Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico – TBARS ...............................
4.8 Extração de gordura do fígado ..............................................................................
4.9 Dosagem de colesterol total e triacilgliceróis na gordura do fígado ...................
4.10 Extração de gordura das fezes .............................................................................
4.11 Análise estatística .................................................................................................
CAPÍTULO 5: RESULTADOS ................................................................................
5.1 Caracterização bromatológica do Agaricus blazei ...............................................
5.2 Parâmetros biométricos .........................................................................................
5.2.1 Ganho de Peso, Ingestão alimentar e Excreção fecal .......................................
5.2.2 Peso dos órgãos ................................................................................................
5.2.2.1 Peso total e relativo do fígado, gordura abdominal e rins ..........................
5.3 Parâmetros relacionados ao metabolismo nitrogenado e glicídico ......................
5.3.1 Proteínas totais, Albumina e Glicose ..................................................................
5.3.2 ALT, AST e FA ..................................................................................................
5.3.3 Uréia e Creatinina ...............................................................................................
5.4 Parâmetros do metabolismo de lipídios ................................................................
5.4.1 Lipídios Séricos ...............................................................................................
5.4.2 Lipídios Hepáticos e Fecais.................................................................................
5.5 Marcadores de estresse oxidativo ..........................................................................
5.5.1 Grupos sulfidrilas, TBARS e Proteína Carbonilada ........................................
5.6 Defesas antioxidantes .............................................................................................
5.6.1 Glutationa total em tecido e Paraoxonase .......................................................
CAPÍTULO 6: DISCUSSÃO ....................................................................................
CAPÍTULO 7: CONCLUSÃO ..................................................................................
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .....................................................................
XVI
34
34
36
36
39
41
42
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44
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55
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78
INTRODUÇÃO
MIRANDA, A. M.
Introdução
CAPÍTULO 1 - INTRODUÇÃO
A possibilidade de reduzir os riscos de enfermidades por meio dos alimentos está
atraindo cada vez mais pesquisadores interessados em estudar seus possíveis efeitos sobre
a saúde. Inúmeras pesquisas demonstram a relação direta entre consumo/carência de
alimentos e o desenvolvimento de enfermidades, mostrando como a saúde é fortemente
influenciada pela alimentação (BASHO e BIN, 2010; GUILLAMÓN et al., 2010; SERRA,
2009). Nas últimas décadas, observa-se um aumento considerável na incidência de
doenças cardiovasculares. De acordo com a Organização Mundial de Saúde cerca de 80%
de todas as mortes provocadas por essas doenças ocorrem nos países em desenvolvimento
(SODJINOU et al., 2008).
Sabe-se que a redução dos altos níveis séricos e hepáticos de lipídios desempenha
um papel significativo na redução e até mesmo na reversão da aterosclerose, tida como a
principal causa de doenças cardiovasculares (HAIPING, MINGMING ZHANG e GUIJI,
2009). Com isso, o reconhecimento da hipercolesterolemia e do estresse oxidativo – esse
último associado ao processo inflamatório induzido pelos altos níveis de colesterol,
principalmente da fração LDL – como fatores de risco para as doenças ateroscleróticas
levou a uma busca por alimentos que fossem eficazes na redução dos níveis de colesterol e
de radicais livres.
Diversas espécies de cogumelos têm sido relacionadas ao controle da
hiperlipidemia (CHEUNG, 1998; GUNDE-CIMERMAN e CIMERMAN, 1995;
HAIPING, MINGMING ZHANG e GUIJI, 2009; HOSSAIN et al., 2003; MORI et al.,
2008). Os cogumelos comestíveis são considerados um alimento ideal para a prevenção da
aterosclerose, uma vez que possuem alto conteúdo em fibras aliado ao seu baixo teor em
lipídios.
A utilização de cogumelos como alimento, medicamento, veneno ou em rituais
religiosos tem registro em todas as culturas e regiões do mundo, mas foi na Ásia que eles
começaram a ser cultivados sistematicamente para fins alimentícios e medicinais
(HERRERA, 2001). No entanto, é recente o interesse da medicina ocidental por suas
propriedades medicinais. No Brasil, o consumo de cogumelos se expandiu com o
crescimento das colônias orientais (chinesas, japonesas e coreanas). O hábito também foi
2
MIRANDA, A. M.
Introdução
assimilado pelos brasileiros e hoje trata-se de um componente muito utilizado pela
gastronomia.
Ao lado do interesse culinário, os cogumelos vêm despertando grande atenção da
comunidade científica por suas propriedades medicinais. No que se refere especificamente
ao Agaricus blazei, a maioria dos trabalhos versa sobre sua potencialidade antitumoral
(BERNARDSHAW et al., 2006; KAWAMURA e KASAI, 2006; KIMURA et al., 2004;
SORIMACH et al., 2001). Entretanto, os efeitos medicinais dos cogumelos, em especial,
do Agaricus blazei são, muitas vezes, promovidos sem evidências científicas. Nessa
perspectiva, o Agaricus blazei, popularmente conhecido como Cogumelo do Sol, será o
nosso objeto de estudo. Este cogumelo tem gerado inúmeras dúvidas que vão desde a
classificação taxonômica até o tipo de comercialização e utilização pela população.
Tendo em vista a carência de estudos voltados para os efeitos deste cogumelo
enquanto alimento sobre a hipercolesterolemia, esta pesquisa procurou identificar alguns
dos benefícios do consumo regular do Agaricus blazei, especialmente sobre a ingestão
alimentar, crescimento corporal, perfil lipídico, concentração de biomarcadores do estresse
oxidativo e defesas antioxidantes. Além disso, como demonstra a literatura (EIRA, 2003),
a depender da forma de administração e do extrato utilizado, efeitos hepatotóxicos ou
sobrecarga renal podem ser causados. Nesse sentido, os marcadores da função hepática e
renal foram avaliados a fim de verificar uma possível toxicidade do cogumelo.
3
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
MIRANDA, A. M.
Revisão Bibliográfica
CAPÍTULO 2 - REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 - ALIMENTOS FUNCIONAIS
2.1.1 - Conceito
Os alimentos fornecem a energia e os nutrientes de formação para as incontáveis
substâncias que são essenciais ao crescimento e à sobrevivência dos seres vivos (MAHAN
e ESCOTT-STUMP, 2005). Nota-se, no entanto, uma mudança considerável no conceito
de alimentos. Hoje em dia, procuram-se alimentos que, além das funções nutricionais
básicas, possam trazer benefícios fisiológicos à saúde, prevenindo doenças. A percepção
do alimento como “elixir mágico” da saúde, não é recente, visto que a crença no poder
medicinal dos alimentos é tão antiga quanto a história escrita da humanidade. Todavia, nos
últimos anos tem se observado uma explosão no interesse pelos alimentos presumidamente
saudáveis e/ou curativos, o que está relacionado à demanda crescente dos consumidores
preocupados com um bem-estar físico e mental permanente (ROS, 2001).
Na década de 80, surgiu no Japão uma nova concepção de alimento, lançada através
de um programa de governo que tinha por objetivo desenvolver alimentos saudáveis para
uma população que envelhecia e que apresentava uma enorme expectativa de vida (ANJO,
2004). Em decorrência disso, em 1991 esses alimentos foram regulamentados com a
denominação “FOODS FOR SPECIFIED HEALTH USE” (FOSHU). Hoje, há em todo o
mundo um grande interesse sobre o papel exercido pelos alimentos na saúde, seja aqueles
que contenham componentes que influenciam em atividades fisiológicas ou metabólicas,
seja aqueles enriquecidos com substâncias isoladas de alimentos que possuam uma destas
propriedades, que passaram a ser denominados alimentos funcionais (VIEIRA,
CORNÉLIO e SALGADO, 2006).
Tal interesse se expressa no crescimento verificado no mercado de alimentos
funcionais. Atualmente, o mercado global desses alimentos cresce a uma taxa de
aproximadamente 10% frente aos 2% verificados para os demais alimentos e bebidas
(BENTO, 2008). Em virtude do incremento nos custos com a manutenção da saúde e do
interesse em melhorar a qualidade de vida, a procura pelos alimentos funcionais tem
aumentado, aquecendo o mercado. Japão, Estados Unidos e Europa são os principais
mercados para os alimentos funcionais. Estima-se que em 2005 esse setor tenha
4
MIRANDA, A. M.
movimentado em torno de US$ 600 bilhões nesses países. No Brasil, o valor avaliado para
esse mesmo ano foi de US$ 600 milhões (ABIA, 2005). Essas alegações de saúde estão
muitas vezes associdadas à capacidade destes alimentos em reduzir os riscos relacionados
ao desenvolvimento de certas doenças, como a hipercolesterolemia e o estresse oxidativo
(MÃKINEN - AAKULA, 2006).
Em países asiáticos, vários tipos de alimentos são tradicionalmente associados a
benefícios de saúde específicos (WESTSTRATE, VAN POPPEL e VERSCHUREN,
2002). Nesses países, os alimentos funcionais são tidos como parte integrante de sua
cultura e há uma sólida convicção de que os alimentos e os medicamentos provêem de uma
mesma fonte, devendo, portanto, servir ao mesmo fim. De fato, esta classe de alimentos
possui um vasto alcance em diferentes países, sendo assim, dificilmente existirá uma
definição simples e universalmente aceita de alimento funcional (ROBERFROID, 2000).
Este conceito tem tantas definições quanto o número de autores se referindo a ele,
seja por meio da literatura científica ou da mídia. E essas definições podem consistir desde
simples citações a definições muito mais complexas. No Brasil, esta definição está sob
responsabilidade da Agência Nacional de Vigilância Sanitária, como sendo:
Aquele alimento ou ingrediente que além das funções nutritivas básicas, quando
consumido como parte de uma dieta usual, produz efeitos metabólicos e/ou
fisiológicos e/ou efeitos benéficos à saúde, devendo ser seguro para consumo
sem supervisão médica (RDC 18/99).
No Reino Unido, o Ministério da Agricultura, Pesca e Alimentos (MAFF) define
alimentos funcionais como “alimento[s] cujo componente incorporado oferece benefício
fisiológico e não apenas nutricional” (MORAES e COLLA, 2006). Já na Europa, os
mesmos são definidos como
Alimentos que tenham demonstrado satisfatoriamente afetar uma ou mais
funções no corpo, além de possuírem efeitos nutricionais adequados de modo
que seja relevante tanto para melhorar o estado de saúde quanto para reduzir o
risco de doenças (VERSCHUREN, 2002).
Para o Japão, pioneiro na regulamentação destes alimentos, os “Alimentos para uso
específico de saúde” (FOSHU) são aqueles que possuem efeitos específicos sobre a saúde
devido a sua constituição química e que não exponham a um risco de saúde ou higiênico
(MORAES e COLLA, 2006).
Além das diversas definições, os alimentos funcionais são conhecidos em outros
países por vários nomes diferentes (CÂNDIDO e CAMPOS, 2005). Nos Estados Unidos,
5
MIRANDA, A. M.
por exemplo, os mais utilizados são: medical food, nutraceutical, functional food,
nutritional food, pharmafood, designer food, fitness food, therapeutical food, entre outros.
É evidente a relação entre os alimentos que consumimos e a nossa saúde, na medida
em que inúmeras pesquisas demonstram uma relação direta entre consumo/carência de
alimentos e o desenvolvimento de enfermidades (BASHO e BIN, 2010; GUILLAMÓN et
al., 2010; SERRA, 2009). No entanto, alimentos funcionais são e devem ser alimentos, não
drogas. Nesse sentido, embora os pesquisadores estejam adquirindo mais experiência e
entendimento sobre a saúde e a nutrição, o tema alimentos funcionais ainda é bastante
complexo. Torna-se, portanto, de grande importância o reconhecimento do verdadeiro
papel do consumo de determinados alimentos sobre o crescimento, desenvolvimento e
risco de doenças para o entendimento de como as dietas influenciam estes fatores
(VERSCHUREN, 2002).
2.1.2 - Alimentos Funcionais versus Doenças Cardiovasculares
O aumento da expectativa de vida e o crescente aparecimento de doenças crônicas
como obesidade, aterosclerose, hipertensão, diabetes e câncer têm despertado uma
preocupação cada vez maior com a alimentação (MOLLET e ROWLAND, 2002; VIEIRA,
2003).
De acordo com a Organização Mundial da Saúde (OMS), todo ano mais de 17
milhões de pessoas morrem vítimas de doenças cardiovasculares (DCV) (SMITH Jr. et al.,
2004). Essas doenças, dentre as afecções crônico-degenerativas, estão entre as principais
responsáveis pelo aumento da morbi-mortalidade, principalmente quando nos referimos
aos países ocidentais e em desenvolvimento (GUILLAMÓN et al., 2010). Em muitos
países esta é a principal causa de morte, superando o câncer e os acidentes, sendo boa
parte desses eventos associada aos altos níveis de colesterol no sangue, particularmente à
fração colesterol-LDL e ao estresse oxidativo.
A aterosclerose – induzida por distúrbios do metabolismo lipídico – é considerada
a principal causa de DCV. Obesidade, diabetes, hipertensão e hipercolesterolemia estão
entre os fatores de risco tradicionais para o seu desenvolvimento. Inúmeros estudos têm
demonstrado que a hipercolesterolemia está intimamente relacionada ao desenvolvimento
da aterosclerose (MOURA, 2003; STEINBERG, GLASS e WITZTUM, 2008). Nesse
sentido, a dietoterapia, considerada a principal ação contra esses distúrbios do
6
MIRANDA, A. M.
metabolismo lipídico, tem sido indicada isoladamente ou em conjunto com outros tipos de
tratamentos. Além disso, não há qualquer outro tratamento para estas doenças que não
esteja associado à mesma. (SANTOS et al., 2001).
Considerando que a principal conduta a ser adotada na prevenção e no tratamento
das dislipidemias é a nutricional, a nutrição preventiva tem sido cada vez mais valorizada,
uma vez que a incidência das doenças cardiovasculares está intimamente relacionada ao
estilo de vida, sendo a dieta um importante fator para sua etiologia (VIEIRA, 2003). Hoje,
os alimentos não são utilizados apenas como fonte de calorias e nutrientes. Eles são
ingeridos com o intuito de proporcionar um benefício fisiológico adicional, como por
exemplo, a prevenção de uma variedade de doenças, melhorando assim o bem estar físico e
mental de seus consumidores (MENRAD, 2003).
Nessa perspectiva, a baixa incidência de doenças em alguns povos também vem
incentivando muitos estudos no intuito de elucidar os mecanismos de proteção atuantes em
cada tipo de dieta. Cita-se, por exemplo, a baixa incidência de câncer e doenças
coronarianas observada nos países orientais e do mediterrâneo, onde prevalece a dieta com
baixo consumo de carnes vermelhas e elevado consumo de soja, aliada ao alto consumo de
peixes, frutas e verduras. Destaca-se ainda a dieta dos esquimós, em que se observa um
alto consumo de peixes e produtos do mar, ricos em ácidos graxos da família ômega 3 e 6,
o que reflete no baixo índice de problemas cardíacos (MORAES e COLLA, 2006;
VIGGIANO, 2006). Além disso, compostos presentes no grupo dos polifenóis (flavonóides
e isoflavonas), carotenóides e ácidos graxos ômega 3 encontrados em alimentos usuais
como alho, tomate, berinjela, chocolate amargo, uva, vinho tinto, peixe, oleaginosas, chá
verde, soja, cogumelos entre outros, pertencem ao grupo dos principais compostos
bioativos responsáveis pelas ações preventivas das doenças cardiovasculares (BRAGA e
BARLETA, 2007).
Visto que alguns dos danos causados por essas doenças podem ser revertidos
principalmente por mudanças no estilo de vida, em que a dieta coloca-se como ponto
fundamental, estudos têm sido elaborados para verificar a eficácia de determinados
alimentos, seja no que diz respeito à promoção da saúde seja na prevenção de doenças.
7
MIRANDA, A. M.
2.2 - COGUMELOS COMESTÍVEIS
2.2.1 - Características gerais
Com mais de 1,5 milhões de espécies, o reino dos fungos é ainda quase
desconhecido pela ciência. Estes são classificados em vários grupos de acordo com uma
série de características, sobretudo em relação às suas microestruturas, reprodução sexuada
e assexuada, especializações de acordo com o modo de vida e enzimas produzidas
(BONONI, CAPELARI e TRUFEM, 1999). Em relação à classificação mais moderna, 4
classes de fungos são reconhecidas: Ascomycota, Basidiomycota, Zygomycota e
Chytridiomycota (LOGUERCIO-LEITE et al., 2006). Os cogumelos comestíveis
pertencem às classes dos basiodiomicetos e ascomicetos (MODA, 2008). A importância
atribuída a esta última classe está intimamente relacionada à utilização de seus
representantes na alimentação e medicina popular desde a Antiguidade (WASSER, 2002).
Os Basidiomicetos caracterizam-se por possuírem uma estrutura especializada
chamada basídio ou corpo de frutificação, que lhes confere a denominação de cogumelo.
Esse corpo de frutificação encontrado nos cogumelos comestíveis é o material usualmente
coletado e consumido como alimento. Hoje, existem no mercado vários produtos feitos a
partir do corpo de frutificação desses fungos, sendo comercializados como suplementos
dietéticos devido ao seu potencial terapêutico (GUILLAMÓN et al., 2010).
Os cogumelos comestíveis sempre foram apreciados por seu valor gastronômico,
nutricional e medicinal. Atualmente, estima-se que já existam mais de 30 espécies
catalogadas com propriedades terapêuticas. Sua utilização tem registro em todas as culturas
e regiões do mundo. Observa-se, entretanto, um mercado inexplorado para as ilimitadas
opções de espécies que podem ser cultivadas e utilizadas na alimentação, seja como
nutracêutico ou como fitoterápico (HERRERA, 2001).
No Brasil, os cogumelos mais conhecidos são o Champignon de Paris (Agaricus
bisporus), Shiitake (Lentinula edodes), Shimeji (Pleurotus ostreatus), o Hiratake
(Pleurotus sajor-caju) e mais recentemente o Cogumelo do Sol ou Himematsutake
(Agaricus blazei Murrill) (Fig. 1) (EIRA, 2003). Devido ao fato de seus componentes
ativos exercerem efeitos nutricionais, medicinais e farmacológicos imprescindíveis para os
portadores de diversos tipos de câncer, os cogumelos Agaricales têm sido utilizados por
milênios (FORTES e NOVAES, 2006).
8
MIRANDA, A. M.
Já na indústria de alimentos, o Agaricus bisporus, Lentinula edodes, Pleurotus
ostreatus e Volvariella volvacea (Fig. 1) constituem as quatro espécies com grande
destaque (FORTES e NOVAES, 2006). Atualmente, observa-se um aumento na produção
mundial de cogumelos, decorrente tanto da industrialização como da popularização do
cultivo (FAN et al., 2006). Embora de forma mais modesta, essa mesma tendência pode ser
observada para o Brasil. O consumo de cogumelos no país aumentou e ganhou destaque,
principalmente pelo reconhecimento do seu alto valor nutricional, potencial medicinal e
também pelo aumento da oferta, o que tem tornado o produto mais popular e acessível
(SHIBATA e DEMIATE, 2003).
A
B
D
C
E
Figura 1: Cogumelos comestíveis mais conhecidos no Brasil. A: Agaricus bisporus, B: Lentinula
edodes, C: Pleurotus ostreatus, D: Volvariella volvacea, E: Agaricus blazei. Fonte: <
http://www.embrapa.com.br>.
9
MIRANDA, A. M.
2.2.2 - Composição e propriedades dos Cogumelos
Os cogumelos são alimentos apreciados desde a Antiguidade por se acreditar em
seu elevado valor nutricional e em seu potencial medicinal, além de serem apreciados
como uma especiaria nobre em diversos pratos culinários. Seu consumo cresceu
consideravelmente na cultura ocidental, envolvendo um grande número de espécies, além
do popular “Champignon” (MATTILA, SUONPÃÃ e PIIRONEN, 2000).
Cogumelos in natura apresentam teores de umidade que variam de 73,7 a 94,7%
(YANG, LIN e MAU, 2001; MANZI, AGUZZI e PIZZOFERRATO, 2001; VETTER,
2003). Este percentual, no entanto, irá depender muito da espécie e também de parâmetros
relacionados ao período da colheita, crescimento e condições de armazenamento. Esse é
um dos grandes desafios da indústria de alimentos, que precisa utilizar vários sistemas de
proteção diferenciados para aumentar o período de armazenamento, preservando suas
características nutricionais e organolépticas (MATTILA, SUONPÃÃ e PIIRONEN, 2000).
Em geral, os cogumelos possuem uma quantidade considerável de proteínas, com
um importante conteúdo em aminoácidos essenciais. Fornecem ainda uma grande
quantidade de carboidratos e fibras, ao mesmo tempo em que apresentam um baixo
contéudo em gordura (MATTILA, SUONPÃÃ e PIIRONEN, 2000). No que se refere ao
conteúdo de fibras, um componente em especial, as β-glucanas, tem sido consideradas
como importante composto funcional, visto que parece modular positivamente o sistema
imune, mostrando ainda ser benéficas contra infecções e sobre o metabolismo de
colesterol, apresentando assim um importante efeito hipocolesterolemiante (HETLAND et
al., 2008; MANTOVANI et al., 2008).
Embora essas características nutricionais já estejam sendo divulgadas de forma
ampliada principalmente pelos meios de comunicação em massa, os dados na literatura
sobre as mesmas ainda são poucos e por vezes conflitantes. Estudo comparativo entre
espécies diferentes de cogumelos, a saber, A. bisporus, Lentinula edodes e Pleorotus spp,
mostra diferença significativa entre os lotes e marcas, que possivelmente foram afetados
por fatores como condições de cultivo, armazenamento pós-colheita, entre outros,
concluindo que a composição dos cogumelos poderá ser diversa, dependendo da região e
do país de cultivo (FURLANI e GODOY, 2007). O mesmo é sugerido por Savoie
Minvielle e Largeteau (2008) ao estudar as propriedades antioxidantes do Agaricus
bisporus. Para os autores, o estádio ideal de colheita associado à escolha do tecido para
10
MIRANDA, A. M.
aplicação na indústria poderia melhorar a eficiência deste cogumelo enquanto alimento
funcional.
Sturion & Oetterer (1995) afirmam que o tipo de substrato utilizado no cultivo
influencia a composição química dos cogumelos, principalmente quanto aos teores de
proteínas, fibras e minerais. Uma revisão de literatura envolvendo os problemas fármacotoxicológicos (FIRENZUOLI et al., 2007) cita a potencialidade que algumas espécies de
cogumelos teriam de acumular substâncias radioativas, assim como altas concentrações de
metais. Tal relato ressalta a importância de uma avaliação prévia das condições de cultivo,
bem como a necessidade de mais estudos científicos sobre o tempo de colheita e
conservação, uma vez que não se pode desconsiderar a possibilidade de que a maturação
esteja diretamente relacionada a uma possível atividade inibitória da tumorigênese
fornecida por algumas espécies de cogumelos.
Outras análises têm destacado que em sua composição os cogumelos apresentam
diversos nutrientes, tais como vitaminas do complexo B, aminoácidos como arginina e
glutamina (potentes imunomoduladores), ergosterol, niacina, P, Ca e Fe, sendo ricos ainda
em polissacarídeos como as β-glucanas (OLIVEIRA, 1999; CHEUNG, 2010). No entanto,
assim como as condições de cultivo precisam ser avaliadas com cautela, o uso de
metodologias apropriadas deve ser considerado, tendo em vista sua influência direta sobre
a constatação ou não do cogumelo como fonte de determinados nutrientes (FURLANI e
GODOY, 2005).
Sabe-se ainda que a composição química dos cogumelos contém alguns
componentes que podem afetar a digestibilidade ou mesmo exercer outros efeitos
negativos. É o caso da quitina (N-acetil glicosamina), um componente estrutural presente
nas paredes celulares dos fungos. Esse composto é conhecido por diminuir a
digestibilidade ao mesmo tempo em que desempenha um importante papel como
constituinte das fibras (BAUER-PETROVSKA et al., 2001). À quitosana, um produto
resultante da desacetilação da quitina, tem sido atribuído efeito hipocolesterolemiante
(ZHANG et al., 2008).
Além de seus componentes nutricionais básicos, alguns cogumelos são ricos em
compostos bioativos, como os compostos fenólicos. Esses compostos bioativos podem
ainda variar com a espécie de cogumelo. Da mesma forma, as condições de cultivo
11
MIRANDA, A. M.
também podem afetar a concentração destas substâncias (BARROS et al., 2007; BARROS
et al., 2008; MATTILA, SUONPÃÃ e PIIRONEN, 2000).
Em geral, inúmeras propriedades terapêuticas são atribuídas aos cogumelos:
antiviral, antibacteriana, hipoglicêmica, anti-hipertensiva, antitumoral e imunomoduladoras
(YU et al., 2009; KODAMA et al., 2005; GAO et al., 2004; MATTILA, SUONPÃÃ e
PIIRONEN, 2000). Pesquisas têm demonstrado que os mesmos podem ser utilizados ainda
na prevenção de doenças como asma (LIU et al., 2003), alergias alimentares (HSIEH et al.,
2003), dermatite atópica (KUO et al., 2002), trombose (YOON et al., 2003), turbeculose
(MARKOVA et al., 2003), choque séptico (KIM et al., 2003) e aterosclerose (YAMADA
et al., 2002). No que tange a suas propriedades sobre as doenças cardiovasculares e a
hipercolesterolemia, o uso dos cogumelos como apoio à prevenção e ao tratamento tem
sido baseado em sua composição rica em fibras, esteróides, proteínas e outros nutrientes,
além do seu baixo valor calórico, combinação ideal para a prevenção inicial destas doenças
(GENNARI et al., 2003; GUILLAMÓN et al., 2010). Da mesma forma, diversos estudos
vêm demonstrando uma relação íntima entre substâncias presentes nos cogumelos e o
metabolismo de colesterol, agindo, portanto, como importantes reguladores de sua síntese e
absorção (BOBEK, GINTER e OZDIN, 1993; CHEUNG, 1998; GUNDE-CIMERMAN e
CIMERMAN, 1995; HAIPING, MINGMING ZHANG e GUIJI, 2009; HOSSAIN et al.,
2003; MORI et al., 2008). Como exemplo, tem-se a eritadenina, isolada do Lentinula
edodes. O efeito hipocolesterolêmico desse composto pode estar associado a alterações no
metabolismo de fosfolipídios, induzindo uma deficiência da fosfatidiletanoamina Nmetiltransferase e a uma alteração, a nível molecular, no perfil de ácidos graxos
plasmáticos e hepáticos, suprimindo a conversão metabólica do ácido linoléico a ácido
araquidônico. Há ainda o Mevinolin (Lovastatina), extraído do Pleurotus ostreatus,
conhecido como um potente inibidor da HMG-CoA redutase – enzima chave na biossíntese
de colesterol (Fig. 2) (GUILLAMÓN et al., 2010). Já quando nos referimos às
propriedades antimicrobianas, o Lentinan, nome comercial dado ao polissacarídeo extraído
do Lentinula edodes, vem exibindo uma potente ação contra o HIV, inibindo a replicação
viral (GORDON et al., 1998; NGAI e NG, 2003).
12
MIRANDA, A. M.
B
A
Figura 2: Estrutura química da Lovastatina (A) e da Eritadenina (B). Fonte: GUILLAMÓN et
al.(2010).
Muitas espécies de cogumelos, dentras elas o Agaricus bisporus, Boletus edulis
Agaricus blazei, Agrocybe cylindracea, Ganoderma lucidum têm sido estudadas para
avaliar seus efeitos antiinflamatórios e antioxidantes (LAKSHMI et al., 2003; TSAI et al.,
2007; OLIVEIRA et al., 2007; SAVOIE, MINVIELLE e LARGETEAU, 2008).
Diferentes substâncias antioxidantes estão sendo encontradas, dentre elas alguns
polissacarídeos, ergosterol, ácido nicotínico, triterpenos e compostos fenólicos. De acordo
com a literatura, alguns polissacarídeos extraídos de cogumelos podem atuar como
removedores do radical superóxido ou como “varredores” do radical hidroxila (MAU, LIN
e CHEN, 2002).
No entanto, as maiores evidências científicas sobre as propriedades terapêuticas dos
cogumelos
encontram-se
junto
ao
seu
efeito
antitumoral
e
imunomodulador
(FULLERTON et al., 2000; YU et al., 2009; NIU et al., 2009; PINTO et al., 2009;
TAKAKU, KIMURA e OKUDA, 2001). Estudos têm sugerido que os cogumelos são
capazes de modular a carcinogênese em todas as fases da doença através de distintos
mecanismos. No entanto, o exato mecanismo de ação de seus princípios ativos ainda não
está completamente esclarecido na literatura. Alguns autores sugerem que substâncias
presentes nesses fungos, como glucanas, ergosterol, arginina estejam envolvidas na
redução/inibição do crescimento tumoral, na medida em que atuam estimulando as funções
imunológicas (KUO et al., 2002; MIZUNO, SAKAI e CHIHARA, 1995; MIZUNO, 1996;
NOVAES et al., 2003). Outras substâncias como as proteoglicanas e a glutamina, por sua
13
MIRANDA, A. M.
vez, atuam melhorando a qualidade de vida, aumentando assim a sobrevida dos pacientes,
reduzindo por vezes o catabolismo debilitante e promovendo uma maior tolerância à
quimioterapia (KIDD, 2000; KUO et al., 2002; SKUBITZ, 1994). No entanto, outros
estudos são necessários a fim de elucidar os possíveis efeitos colaterais, a toxicidade e os
mecanismos de ação desses componentes bioativos.
2.3 - Agaricus blazei
2.3.1 - Concepção popular versus científica
Atualmente, nota-se um grande interesse não só da comunidade científica, mas
também por parte da população em relação ao cogumelo do sol. Nesse ponto, interesses
científicos muitas vezes entram em conflito com os interesses populares, surgindo então a
necessidade de que algumas questões sejam melhor esclarecidas, inclusive com relação à
forte influência exercida pela mídia que, visando sobretudo o lucro, nem sempre se
preocupa com o embasamento científico.
No que se refere à saúde da população brasileira, nota-se uma transição nutricional
nos últimos anos, na qual boa parte dela encontra-se acima do peso. Essa transição tem
contribuído de modo significativo para uma corrida pela qualidade, segurança e
diferenciação dos alimentos, provavelmente conseqüência de uma diminuição do seu valor
intrínseco, tornando-se assim cada vez mais tênue a linha de separação entre um
medicamento e um alimento (PANETTA, 2004). Surgem então, como mencionado acima,
inúmeras propostas sobre os alimentos funcionais, uma vez que, obrigatoriamente, tornamse presentes no dia a dia do cidadão comum, suscitando, na maioria das vezes, inúmeras
dúvidas e más interpretações.
Segundo Lévy-Strauss (1963), a condição de cura estaria no axioma: a “eficácia da
magia implica na crença em magia”. Não obstante, passadas algumas décadas, ainda se
atribui muita eficácia aos tratamentos ditos xamanísticos. Minayo (1988), em seu artigo
“Saúde-doença: uma concepção popular da etiologia” observa que o desenvolvimento de
teorias populares está relacionado às experiências da vida e que tais teorias reorganizam-se
constantemente a partir do contato com a prática, tanto no campo da medicina “oficial”
quanto no que se refere aos sistemas alternativos.
14
MIRANDA, A. M.
Ao nos determos na relação entre estudos científicos e apropriação popular,
verificamos como as observações feitas acima se mostram pertinentes. Seja no campo da
fé, que invariavelmente exerce grande influência sobre explicações saúde/doença, ou na
própria manutenção de crenças tradicionais ou ainda em novas formas que vão sendo
incorporadas pela população, o consumo de alimentos considerados benéficos à saúde
muitas vezes extrapola as comprovações científicas. Especificamente no caso do cogumelo
do sol, observa-se como esse enorme interesse, seja ele científico ou econômico, vem
provocando imensa polêmica. É o que ocorre, por exemplo, com a relação feita entre os
tibicos e o cogumelo do sol (Fig. 3C e 3A, respectivamente), identificados como sendo um
único produto, fato não confirmado pela literatura. Para muitos, os tibicos, por vezes
mencionado como cogumelo do sol, consistem em uma promessa de salvação, trazida ao
México por Madre Tereza de Calcutá (Em: <http://www.happyherbalist.com>. Acesso em
27 novembro 2007). Porém, a forma como esse suposto cogumelo foi e vem sendo
disseminado é diferente daquelas tradicionalmente comercializadas (in natura, cápsulas ou
desidratado) e atualmente autorizadas pela ANVISA (Informe Técnico nº. 6 de 31 de
janeiro de 2003).
Embora quando cultivados por fermentação submersa os cogumelos adquiram uma
conformação semelhante a este grão, uma criteriosa avaliação deve ser feita, visto que
neste tipo de cultivo a identificação do cogumelo se torna mais complexa, justamente por
não termos a formação do corpo de frutificação, sendo usualmente esféricos (Fig. 3B)
(BIFENG e YUEXIN, 2003). O mesmo cuidado deve ser tomado a fim de não confundir o
Agaricus blazei com o cogumelo tibetano – um consórcio microbiano – nem com outras
associações simbióticas da mesma natureza, como Kumish e o cogumelo Kombucha,
presentes na medicina popular dos países asiáticos (CARDOSO et al., 2005).
15
MIRANDA, A. M.
B
A
C
Figura 3: Cultivo do Agaricus blazei (Murrill): Canteiro protegido (A) e Cultivo submerso (B).
Fonte: Adaptado GUIMARÃES (2006). C: Tibicos. Fonte: <http://www.happyherbalist.com>.
Verifica-se ainda em páginas da Internet que comercializam o cogumelo do sol, sua
indicação como o famoso “bom para tudo”, exaltando e evidenciando muitas das
propriedades que até então não possuem comprovação científica, como no caso da
eliminação da catarata, alegação que certamente influencia na divulgação e utilização do
produto, aumentando a sombra da ansiedade sobre a “cura” através dos alimentos.
No entanto, o que se pode observar a partir de tais colocações é que nem sempre a
denominação “produto natural” consegue ser bem interpretada pela sociedade. Já no século
XV o filósofo Paracelsus dizia: “Toda substância é um veneno, a dose certa é que
diferenciará o veneno do remédio”. E mesmo hoje, mediante tanta informação, muitos
assuntos ainda geram controvérsias e más interpretações de certa forma prejudiciais a
certos indivíduos em determinados períodos de sua vida. E mesmo diante das mais recentes
tecnologias e inovações, a cultura popular ainda se mantém como ponto forte e responsável
pela maioria das atitudes da população, sejam estas benéficas ou não.
16
MIRANDA, A. M.
2.3.2 - Histórico
B
A
C
Figura 4: Corpos de frutificação do Agaricus blazei. A e B: Em diferentes estágios de maturação,
C: Cultivo protegido. Fonte: <http://www.portaldoagronegocio.com.br>.
O Agaricus blazei é nativo do Brasil (Fig.4). De acordo com sua classificação
taxonômica, consiste em um fungo verdadeiro, pertencente ao reino Fungi, divisão
Basidiomycota, ordem Agaricales, família Agaricaceae. Seu corpo de frutificação, também
conhecido como basidiocarpo ou cogumelo, é visível a olho nu, tendo como características
o estipe central separado do píleo, lamelas livres, acinzentadas quando jovens, tornando-se
marrom-escuras na maturidade (URBEN et al., 2001).
A descoberta do A. blazei ocorreu no município de Piedade, região sudoeste de São
Paulo. Conta-se que o Cogumelo de Piedade ou Princesa, como era denominado, foi
descoberto há mais de 40 anos pelo imigrante japonês Takatoshi Furumoto. Ao constatar
que este cogumelo era diferente das espécies cultivadas por ele – Agaricus bisporus e
Lentinula edodes – e por não conseguir identificá-la, enviou amostras ao Instituto de
Botânica de São Paulo e para centros de pesquisa no Japão. Como as tentativas de
17
MIRANDA, A. M.
identificação não foram bem sucedidas nestas instituições, as amostras foram enviadas aos
renomados taxonomistas de fungos David Pegler (Inglaterra) e Paul Heinemann (Bélgica) .
Então, em 1993, Heinemann identificou o fungo como Agaricus blazei. Segundo o
pesquisador, tal espécie era de ocorrência natural da América do Norte, descrita na Flórida
em 1945 por Murrill (AMAZONAS, 2004). Essa denominação tem sido a mais usada na
literatura para se referir aos aspectos biotecnológicos e medicinais do cogumelo, assim
como para a maioria de seus produtos comercializados. No entanto, existem controvérsias
sobre o correto nome das espécies brasileiras. Em 2002, ao analisar as estruturas
reprodutivas deste fungo, Wasser propôs que o cogumelo nativo do Brasil fosse
considerado como uma nova espécie – Agaricus brasilienses – ou então referido como
Agaricus blazei ss.Heinemann.
Segundo Kerrigan (2005), em 1893 o botânico americano Peck, a partir de
exemplares cultivados no estado de Nova York, foi o primeiro a descrever este cogumelo,
denominando-o como Agaricus subrufescens. E que, segundo as normas da nomenclatura
botânica, o A. subrufescens, por ser o nome de maior antecedência, deveria ser o utilizado.
Há ainda no Brasil, a utilização do nome Agaricus sylvaticus Shaeffer, o que segundo
especialistas, constitui um erro taxonômico, visto que segundo a literatura o nome correto
seria Agaricus silvaticus Schaeffer (DIAS, ABE e SCHWAN, 2004). Neste trabalho, será
mantido o nome de Agaricus blazei, por se tratar do nome comumente utilizado e
encontrado na literatura.
O A. blazei cresce em regiões temperadas, onde a temperatura ambiente varia de
23ºC a 28ºC. Dependendo da região onde venha crescer, poderá apresentar de 10 a 15 cm.
Sua característica de crescimento e desenvolvimento em campos abertos e ensolarados,
requerendo normalmente a luz para desenvolver os corpos de frutificação, lhe conferiu a
denominação de cogumelo do sol, pela qual passou a ser conhecido em outros países,
exceto no Japão, onde é conhecido como “Himematsutake”.
Ao contrário de outras espécies, este cogumelo não nasce em árvores, mas em
lugares abertos. A sobrevivência ou não dos cogumelos estaria relacionada às condições de
temperatura a que são submetidos (BORZACCHINI, 2008). Segundo Vilela (2008), o
Brasil não possui estatística oficial sobre a produção de cogumelos, mas a maior região
produtora estaria localizada no alto Tietê, em São Paulo. Ainda de acordo com Oliveira et
18
MIRANDA, A. M.
al. (1999), esse cogumelo possui características agronômicas com alto potencial de cultivo
em nosso território.
2.3.3 - Propriedades funcionais do Agaricus blazei
No que se refere ao potencial hipocolesterolêmico do Agaricus blazei, poucos são
os trabalhos envolvendo essa espécie e os que existem são conflitantes. Em 2003, Lee e
Koh avaliaram os efeitos da suplementação de cultura líquida do Agaricus blazei sobre o
metabolismo de lipídios em ratos. Os autores encontraram uma redução significativa nos
níveis séricos de colesterol total, LDL-c e triacilgliceróis, concomitante a um aumento nos
níveis de HDL-c, resultado atribuído a um efeito dose-dependente. Já Braga et al. (2008),
ao avaliarem os efeitos do Agaricus blazei também administrado na água, encontraram
uma redução significativa somente para os níveis de triacilgliceróis e VLDL, não sendo
observada nenhuma alteração para os níveis de LDL e HDL quando comparados aos
controles. Por outro lado, Gonçalves (2007) ao verificar a influência da suplementação do
ABM (5%) na aterogênese em camundongos apo-E knockout não encontraram qualquer
alteração desse cogumelo sobre o perfil lipídico. Ao contrário, essa suplementação parece
ter aumentado a lesão aterosclerótica, por uma ativação do estado inflamatório.
Os trabalhos envolvendo este cogumelo versam, em sua maioria, sobre sua
capacidade em potencializar o sistema imunológico, agindo como ativadores das células B
do sistema imune e fortalecendo o mesmo. Tais trabalhos enfocam, assim, sua
potencialidade anticarcinogênica (BERNARDSHAW et al., 2006; KAWAMURA e
KASAI, 2006; KIMURA et al., 2004; SORIMACH et al., 2001). Com relação a essa
potencialidade junto ao sistema imune, um componente em especial, as β-glucanas, tem
despertado grande interesse.
Estudo realizado por Zhong, Tai e Yamamoto (2005) relatam como vem crescendo
nos últimos anos o consumo do A. blazei como alimento funcional no Japão. Esse trabalho
demonstra que a relação de seu mecanismo antitumor, via imunidade inata e/ou adaptativa,
implica em um aumento das respostas imunes e da potencialização da autodefesa da
imunidade celular. Porém, detalhes desta ativação, ou seja, de como essas células estariam
respondendo a este estímulo, não são esclarecidos. Os autores sugerem que a ativação
esteja relacionada ao tipo de administração e ao extrato utilizado.
19
MIRANDA, A. M.
Nessa mesma perspectiva, Kawamura e Kasai (2006) relatam como muitos
pacientes com câncer no Japão estão consumindo o A. blazei na crença em suas
propriedades medicinais. Em 2001, Takaku, Kimura e Okuda isolaram uma fração lipídica
deste cogumelo com atividade antitumoral. Esta fração, identificada como ergosterol, após
20 dias de admistração oral em camundongos com sarcoma 180, permitiu uma redução
significativa do tumor, sem provocar qualquer efeito colateral. Bernardshaw, Johnson e
Hetland (2005), ao analisarem a administração oral de extratos do ABM, observaram que
os mesmos ofereceram proteção sistêmica contra infecção por S. pneumoniae em
camundongos, sendo considerados um adicional profilático e uma possibilidade terapêutica
contra bactérias e outras infecções em humanos. Todavia, Zhong, Tai e Yamamoto (2005),
ao utilizarem o extrato aquoso do Agaricus blazei preparado em diferentes temperaturas e
fracionado por precipitação com diferentes concentrações de etanol, verificaram que o
efeito foi dependente da concentração e do tratamento dado ao extrato. O extrato aquoso
original do Agaricus blazei não apresentou qualquer efeito sobre a estimulação das células
NK (Natural killer). Da mesma forma, em estudo já citado, Firenzuoli et al. (2007)
relataram as dificuldades em estabelecer o melhor extrato e substâncias ativas do cogumelo
e mostraram a necessidade de encontrar um extrato homogêneo que possa servir de padrão
para que suas atividades possam ser estudadas e esclarecidas.
Com relação às β-glucanas, por se tratar de uma fibra solúvel, evidências científicas
têm demonstrado que elas apresentam significativa importância na redução do colesterol
sangüíneo e na absorção de glicose pelos diabéticos (KIM et al., 2005). Verifica-se ainda
sua eficácia no combate às toxinas do organismo, auxiliando na prevenção e tratamento do
câncer. Entretanto, a adoção das β-glucanas como um critério de qualidade nutracêutica
dos cogumelos deve ser tratada com reservas, uma vez que é comum observar na literatura
a utilização de métodos inespecíficos para sua determinação. A aplicação inadequada
destes métodos muitas vezes é responsável por estimativas erradas dos reais valores de βglucanas (PARK et al., 2003). De acordo com Eira (2003), é preciso ter cuidado na adoção
dos métodos enzimáticos de análise, visto que nem sempre apresentam uma boa
reprodutibilidade.
Considerando que a ação biológica das glucanas pode estar relacionada à sua
estrutura, o quadro I apresenta as principais estruturas químicas de diversas glucanas
presentes no A. blazei, principalmente β-glucanas e seus respectivos mecanismos de ação.
20
MIRANDA, A. M.
Quadro I: Principais glucanas encontradas nas frutificações do A. blazei e suas respectivas
atividades e mecanismos de ação.
Glucanas
Atividades
In Vitro
Mecanismo de Ação
In Vivo
(1-6)βglucanaproteína
Anti-tumor
Sarcoma 180
(1-6) (1-3)βglucana
Anti-tumor
Sarcoma 180
Anti-tumor
Meth A
(1-4) α-glucana
(1-4) α-glucana
(1-6)(1-3)βglucana e (1-6)
Tumoricida em
células de
tumor Meth A
(1-6) (1-3)βglucana
Proliferação de
linfócitos T e B
Autores
KAWAGISHI et
al.(1990);
MIZUNO et
al.(1990b)
MIZUNO et al.
(1990a)
Linfócitos Taux.
Linfócitos Tsupres.
ITOH et al.
(1994)
Anti-metastase
Meth A (intra
tumoral)
Imunoestimulação
com citotoxicidade
seletiva
EBINA e
FUJIMIYA(1998)
Anti-tumor e
anti-metástase
Meth A
Citotoxicidade
seletiva, aumento
das NK e apoptose
FUJIMIYA et
al.(1998)
Anti-tumor
Sarcoma 180
Imunoestimulação
OHNO et
al.(2001)
DONG et al.
(2002)
Fonte: Adaptado de CAMELINI et al. (2005)
Sabe-se também que o tipo de tratamento dado às β-glucanas poderá influenciar
positiva ou negativamente sua potencialidade antitumor (KIMURA et al., 2004), assim
como o tipo de administração e o extrato utilizado. É comum observarmos na literatura
diferenças com relação a sua concentração. Alguns estudos mostraram que as β-glucanas
presentes no A. blazei estão em maior quantidade quando comparado a outras espécies
(CAMELINI et al., 2005). Outros não encontraram diferenças significativas no conteúdo
de β-glucanas entre as diferentes espécies de cogumelos. Isto porque, por fazerem parte da
21
MIRANDA, A. M.
parede das hifas, as β-glucanas estariam presentes em quantidades semelhantes em todos
os fungos (EIRA, 2003).
Os cogumelos constituem ainda uma importante fonte de antioxidantes naturais.
Nas últimas três décadas, a procura por compostos naturais que possam atuar como
antioxidantes tem aumentado significativamente (OYETAYO, 2009). Segundo Tsai et al.,
(2007) a propriedade antioxidante do A. blazei pode estar associada à sua alta concentração
em tocoferóis. Outros trabalhos, utilizando-o na forma de extratos, também ressaltam sua
potencialidade antioxidante, embora atentem para a necessidade de que mais pesquisas
sejam feitas a fim de identificar esses agentes isoladamente (OLIVEIRA et al., 2007; TSAI
et al., 2007). Contudo, embora diversos estudos se concentrem nos efeitos terapêuticos
deste cogumelo, pouca informação está disponível sobre suas propriedades antioxidante e
hipocolesterolemiante.
2.4 - Metabolismo de colesterol, lipoproteínas e sua relação com o
desenvolvimento das doenças cardiovasculares
Atualmente, observa-se uma relação íntima entre um crescente problema de saúde
pública – as doenças cardiovasculares – e os níveis de lipídios plasmáticos e lipoproteínas.
A hiperlipidemia, representada por um aumento dos níveis de triacilgliceróis ou colesterol
é a principal causa de aterosclerose e doenças associadas a ela, dentre elas a doença
cardíaca coronariana, doença cerebrovascular isquêmica e doença vascular periférica.
Hoje, uma das grandes preocupações da humanidade está relacionada a alguns tipos de
lipídios ou compostos que contém lipídios, presentes na corrente sanguínea e que podem
provocar distúrbios cardiocirculatórios com consequências graves (ESMAILLZADEH e
AZADBAKHT, 2008; SODJINOU et al., 2008).
Os lípides biologicamente mais relevantes, tanto do ponto de vista fisiológico
quanto clínico, são os fosfolípides, o colesterol, os triacilgliceróis e os ácidos graxos. Os
fosfolípides
formam
a
estrutura
básica
das
membranas
celulares
(LENOIR,
WILLIAMSON e HOLTHUIS 2007). O colesterol, além de ser constituinte das
membranas celulares, atuando na fluidez e na ativação de enzimas aí situadas, é precursor
dos hormônios esteróides, dos ácidos biliares e da vitamina D (QIN et al., 2006). Os
triacilgliceróis, por sua vez, consistem em uma das formas de armazenamento energético
22
MIRANDA, A. M.
mais importante no organismo, sendo compostos por ácidos graxos livres ligados por
grupos éster a uma molécula de glicerol (HEGELE, 2009).
Quase todas as células dos mamíferos são capazes de produzir colesterol. E, embora
intestino, córtex adrenal e gônadas sejam capazes de produzi-lo em quantidades
significativas, a maior parte desta biossíntese ocorre dentro das células do fígado. O grupo
acetil do acetil-CoA (Fig. 5), que pode ser produzido a partir de glicose, ácidos graxos ou
aminoácidos, é o precursor de todos os carbonos do colesterol e de seus derivados
esteróides (CAMPO E CARVALHO, 2007). Sabe-se que apenas uma pequena parte do
colesterol circulante é proveniente da dieta. A síntese endógena desse metabólito é
responsável por aproximadamente 80% de seu conteúdo. A 3-hidroxi-3metilglutaril
coenzima A redutase (HMG-CoA redutase) catalisa o passo limitante desse processo
(HEGELE, 2009).
Figura 5: Biossíntese do Colesterol a partir do acetil-CoA. Fonte: CAMPO e CARVALHO
(2007).
23
MIRANDA, A. M.
Um controle minucioso é exercido por meio de uma série de vias de regulação
sobre a homeostase do colesterol. Essas vias controlam a síntese endógena, a absorção
dietética e o catabolismo do colesterol e de seus metabólitos. Sabe-se que distúrbios em
sua homeostase podem levar a consideráveis aumentos de sua circulação plasmática,
culminando com o desenvolvimento da aterosclerose e demais doenças coronarianas
(LAMMERT e WANG, 2005).
A insolubilidade do colesterol e dos triacilgliceróis no plasma faz com que eles
necessitem ser transportados em macromoléculas esferoidais chamadas lipoproteínas
(HEGELE, 2009). As lipoproteínas plasmáticas são complexos moleculares de lipídios e
proteínas específicas denominadas apolipoproteínas. O tamanho e a diversidade destas
lipoproteínas variam de acordo com a proporção de seus constituintes lipídicos e protéicos.
Consistem ainda em partículas extremamente dinâmicas, visto que estão em constante
estado de síntese, degradação e remoção do plasma. Os quilomícrons são as partículas de
lipoproteínas de menor densidade e maior tamanho. Contêm a maior porcentagem de
lipídios (cerca de 85 a 95% em triacilgliceróis) e a menor porcentagem de proteínas (1 a
2%). As VLDLs e LDLs são mais densas tendo um maior conteúdo de proteína (cerca de
10% em VLDL e 25% em LDL) e menor conteúdo lipídico. As partículas HDL, por sua
vez, são as menores e mais densas das frações lipoprotéicas plasmáticas, com cerca de 50%
de proteínas, 20% de colesterol, sendo a maioria esterificado e 30% de fosfolipídios,
apresentando
somente
traços
de
triacilgliceróis
(BACHORIK,
RIFKIND,
KWITEROVICH, 1996; LIMA e COUTO, 2006).
O metabolismo de lipídios da dieta envolve um grande número de etapas e os
quilomícrons são as primeiras lipoproteínas envolvidas nesse processo. Os mesmos são
sintetizados na mucosa intestinal de onde fazem o transporte dos lipídios oriundos da dieta,
notadamente os triacilgliceróis. Os quilomícrons são secretados na linfa e, uma vez na
circulação, sofrem hidrólise de seus triacilgliceróis pela lipoproteína lipase (LPL),
principal enzima responsável pela hidrólise destes lipídios presente em lipoproteínas,
formando assim os quilomícrons remanescentes (COOPER, 1997; GOLDBERG, 1996).
Essas partículas são enriquecidas de ésteres de colesterol, vitaminas lipossolúveis, contêm
apo-B48 e apo-E e são rapidamente removidas da circulação pelo fígado (COOPER, 1997).
Dentro do fígado, os quilomícrons remanescentes são decompostos em seus aminoácidos e
componentes lipídicos. O colesterol liberado dos lisossomos nos hepatócitos pode ser
24
MIRANDA, A. M.
secretado na bile, convertido em ácidos biliares, incorporado em VLDLs para secreção no
sangue via Complexo de Golgi ou esterificado como longas cadeias de ácidos graxos e
estocados nos hepatócitos (OLSON, 1998).
A VLDL, principal lipoproteína do fígado, contém colesterol, fosfolípides,
triacilgliceróis, apo-B100 e pequenas quantidades de apo-E e apo-C. A IDL é formada
quando parte dos triacilgliceróis da VLDL são hidrolisados pela LPL, que passa a ser
considerada como VLDL remanescente, que então é captada pelo fígado (OLSON, 1998).
Parte da fração IDL é degradada pela lipase hepática à LDL, uma lipoproteína que carreia
aproximadamente dois terços do colesterol plasmático humano e que contém somente a
apo-B100 (ORAM e VAUGHAN, 2006).
Já as partículas de HDL carreiam cerca de um terço do colesterol no plasma
humano. Sua principal função é o transporte de colesterol de tecidos periféricos para o
fígado com conseqüente eliminação na bile. Isso ocorre por uma via chamada transporte
reverso do colesterol, que envolve a ação coordenada de múltiplas proteínas celulares e
plasmáticas (ORAM e VAUGHAN, 2006). A HDL atua ainda como um transportador
plasmático eficaz de proteínas envolvidas com o metabolismo de lipídios, como proteína
transportadora de éster de colesterol (CETP), lecitina, colesterol aciltransferase (LCAT) e
proteína transportadora de fosfolipídios (PLTP). Todavia, além do transporte reverso de
colesterol, a HDL possui outras ações protetoras importantes, a saber, proteção
antioxidante, mediação do efluxo de colesterol, inibição da expressão de moléculas de
adesão celular, ativação de leucócitos, indução da produção de óxido nítrico, regulação da
coagulação sanguínea e da atividade plaquetária, que a caracterizam como uma importante
partícula antiaterogênica (LIMA e COUTO, 2006).
Há um controle minucioso por parte do organismo a fim de garantir as necessidades
de lipídios das células ao mesmo tempo em que evita seu acúmulo. Entretanto, esse
delicado equilíbrio, por motivos ainda não totalmente esclarecidos, pode romper-se,
elevando assim o nível de um ou mais componentes lipídicos na corrente sanguínea,
consistindo desta forma no que se denomina dislipidemia (GONÇALVES et al., 2006).
A relevância das dislipidemias como problema de saúde pública está na sua relação
com as doenças cardiovasculares, principalmente como fator de risco para o
desenvolvimento da aterosclerose. As correlações existentes entre o risco para a doença
arterial coronariana (DAC) e as concentrações séricas elevadas de colesterol total,
25
MIRANDA, A. M.
principalmente na forma de colesterol em lipoproteína de baixa densidade, e baixas
concentrações de colesterol em lipoproteínas de alta densidade, já estão bem estabelecidas
(CHEN, SHAO e SU, 2004; BALKAN et al., 2004). Segundo dados da Sociedade
Brasileira de Cardiologia, a apresentação laboratorial das dislipidemias compreende quatro
situações bem definidas, a saber, hipercolesterolemia isolada (valores aumentados de
colesterol total); hipertrigliceridemia isolada (valores aumentados de triacilgliceróis);
hiperlipidemia mista (valores aumentados de colesterol total e de triacilgliceróis) e a
diminuição isolada de HDL ou em associação com um aumento de LDL e/ou dos
triacilgliceróis.
Sabe-se que em condições normais a captação da LDL-c pelas células através do
receptor clássico de LDL não pode provocar um acúmulo apreciável de colesterol, porque
o receptor está sujeito à inibição pelo conteúdo intracelular de colesterol. Contudo, formas
modificadas de LDL, como a LDL acetilada ou LDL oxidada, são captadas através do
mecanismo de reconhecimento pelo receptor scavenger (presente em macrófagos), que por
não possuírem um mecanismo de regulação do colesterol por feedback, acabam levando a
um substancial acúmulo deste metabólito e subseqüente formação de células espumosas, o
que caracteriza a primeira manifestação clínica da placa aterosclerótica (CARMENA,
DURIEZ e FRUCHART, 2004; STROCKER e KEANEY-Jr, 2004; GOTTO, 2003).
Nessa perspectiva, muitos estudos têm examinado o potencial papel do estresse
oxidativo na aterosclerose, visto que fatores de risco para esta patologia, especialmente a
hipercolesterolemia, aumentam o risco da produção de espécies reativas de oxigênio
(EROs), facilitando assim o dano oxidativo (ARMSTRONG, MORROW e SABATINE,
2006). Cabe lembrar, contudo, que espécies reativas de oxigênio são produzidas durante o
metabolismo normal, seja por processos enzimáticos ou não enzimáticos. Porém, quando o
equilíbrio entre os agentes pró-oxidantes e antioxidantes é rompido em favor dos próoxidantes, diz-se que o organismo ou a célula encontra-se sob estresse oxidativo com
potenciais danos a suas principais estruturas (ARAÚJO, PRADA e MELLO, 2006;
MADAMANCHI et al., 2005). Do mesmo modo, diversas linhas de evidência indicam que
a modificação oxidativa de proteínas e seu posterior acúmulo – que podem ser prévios
indicativos de dano tecidual mediado por EROs – são encontrados em células durante o
estresse oxidativo e aterosclerose. Isto porque aminoácidos livres e resíduos dos mesmos
26
MIRANDA, A. M.
em proteínas são altamente suscetíveis a oxidação por uma ou mais destas espécies
(STADTMAN e LEVINE, 2003).
Como vimos, a aterosclerose é uma doença de alta incidência, causando mais
mortes que todos os tipos de câncer combinados e que demanda custos elevados para seu
tratamento.
Um número considerável de estudos tem demonstrado que o uso de drogas
hipolipemiantes reduz o número de eventos cardiovasculares e a mortalidade por doenças
coronarianas (ARONOW, 2008). No entanto, os hipolipemiantes devem ser empregados, a
priori, sempre que não houver um efeito satisfatório na mudança no estilo de vida ou uma
impossibilidade de aguardar os efeitos desta mudança por fatores clínicos. Entretanto,
devido a certa resistência à restrição dietética e às limitações financeiras para o uso
prolongado de drogas hipolipemiantes, muitos indivíduos têm buscado tratamentos
alternativos para o controle dos níveis de colesterol. Porém, vários destes tratamentos que
vem sendo utilizados empiricamente carecem de estudos científicos que permitam
conclusões mais confiáveis (DICKEL, RATES e RITTER, 2007).
Nesse sentido, a busca por substâncias naturais eficazes em reduzir os níveis de
colesterol e de radicais livres é crescente. As propriedades e particularidades dos
cogumelos, aliadas a seu potencial hipolipidêmico, tornam estes fungos alvo importante de
pesquisa para os eventos associados à hiperlipidemia e à aterosclerose, como mencionado
anteriormente. Contudo, os efeitos medicinais destes cogumelos são, muitas vezes,
promovidos sem evidências científicas, baseados apenas na crença popular. Desta forma,
este trabalho busca acrescentar à literatura dados sobre os efeitos da suplementação do
Agaricus blazei sobre o perfil lipídico hepático e sérico, defesas antioxidantes e
marcadores do estresse oxidativo em ratos. Além disso, parâmetros relacionados ao
metabolismo nitrogenado foram avaliados através de marcadores bioquímicos séricos a fim
de se assegurar sua utilização como alimento funcional, sem, contudo, causar prejuízos
hepáticos e renais, o que por vezes se observa quando o mesmo é ingerido na forma de
extratos ou chás devido ao seu grande conteúdo em bases púricas e pirimídicas.
27
OBJETIVOS
MIRANDA, A. M.
Objetivos
CAPÍTULO 3 - OBJETIVOS
3.1 - OBJETIVO GERAL
Avaliar o potencial hipocolesterolêmico e antioxidante do Agaricus blazei (Cogumelo do
Sol) em um modelo de hipercolesterolemia induzida por dieta em ratos.
3.2 - OBJETIVOS ESPECÍFICOS
3.2.1 - Caracterização bromatológica do Agaricus blazei
3.2.2 - Caracterização nutricional e bioquímica dos animais
3.2.3 - Avaliação do potencial hipocolesterolêmico do Agaricus blazei
3.2.4 - Avaliação do potencial antioxidante do Agaricus blazei
28
MATERIAL E MÉTODOS
MIRANDA, A. M.
Material e Métodos
CAPÍTULO 4 - MATERIAL E MÉTODOS
4.1 - Animais
Foram utilizadas 32 ratas da linhagem Fischer, com aproximadamente 90 dias de
idade e peso médio de 176g, provenientes do Laboratório de Nutrição Experimental do
Departamento de Alimentos, Escola de Nutrição, Universidade Federal de Ouro Preto. Os
animais foram mantidos em gaiolas individuais, dispostas em ambiente arejado com
controle de temperatura, umidade e luminosidade. O experimento foi aprovado pelo
Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Federal de Ouro Preto (UFOP) (ANEXO I),
sendo o manejo dos animais realizado de acordo com os princípios e diretrizes descritas no
Canadian Council on Animal Care (1984).
4.2 - Dietas
Os animais foram alimentados com dietas padrão AIN-93M, 4% óleo de soja
(REEVES, NIELSEN e FAHEY, 1993) ou dieta hipercolesterolemiante com 25% de óleo
de soja e 1% de colesterol (MATOS et al., 2005), suplementadas ou não com o cogumelo
em pó, conforme a Tabela I. Para cada quilo de dieta preparada foram utilizados 10 gramas
de cogumelo desidratado em pó. O cogumelo foi cedido pelo Laboratório de Cogumelos
Comestíveis da Universidade Federal de Lavras.
As dietas foram confeccionadas no Laboratório de Nutrição Experimental, Escola
de Nutrição, Universidade Federal de Ouro Preto. As mesmas foram acondicionadas em
sacos plásticos devidamente identificados e armazenadas em freezer durante o período
experimental. Para seu preparo, utilizou-se mistura de sais e de vitaminas preparadas no
referido laboratório, a partir dos compostos descritos na tabela abaixo:
29
MIRANDA, A. M.
Material e Métodos
TABELA I: Composição dos nutrientes das dietas em gramas para cada 1000g de dieta.
Nutrientes
Padrão
Padrão + A. blazei
Hipercolesterolemiante
140,0
722,5
40,0
0,0
2,5
35,0
10,0
50,0
0,0
140,0
712,5
40,0
0,0
2,5
35,0
10,0
50,0
10,0
140,0
502,5
250,0
10,0
2,5
35,0
10,0
50,0
0,0
Hipercolesterolemiante + A.
blazei
140,0
492,5
250,0
10,0
2,5
35,0
10,0
50,0
10,0
3810,0
3794,0
4910,0
4894,0
Caseína
Amido Milho
Óleo de Soja
Colesterol
Colina
Mist. Minerais1
Mist. Vitaminas2
Celulose
A. blazei
Valor Calórico
(Kcal)
1
Mistura de minerais (expresso em g/kg da mistura): NaCl - 74/KI - 0,01/Citrato Tripotássico - 28/CaCO3357/MnCO3- 0,63/Citrato de Ferro - 6,06/ MgO - 24/ K2SO4 - 46,6/ KH2PO4 - 250 / ZnCO3 - 1,65/ CuCO3 - 0,3 /
Na2SeO4 - 0,01 / (NH4)6MoO24 . 4 H2O - 0,00795. Os sais foram adquiridos do Reagen, Rio de Janeiro, Brasil.
2
Mistura de vitaminas (expresso em g/kg da mistura): Niacina - 3 / Pantotenato de Cálcio - 1,6 / Piridoxina HCl - 0,7
/ Tiamina HCl - 0,6 / Riboflavina - 0,6 / Ácido Fólico - 0,2 / Biotina - 0,02 / Cianocobalamina - 2,5 / Vitamina E (500
IU/g) - 15 / Vitamina A (500.000 IU/g) - 0,8 / Vitamina D (400.000 IU/g) - 0,25 / Vitamina K - 0,075 / Sacarose q.s.p.
1Kg. As vitaminas foram adquiridas da Merk, Darmstadt, Alemanha.
4.3 - Composição Centesimal do Agaricus blazei
Foram determinados os teores de umidade, proteínas, cinzas, lipídios totais, fibras e
carboidratos. As análises foram realizadas no Laboratório de Bromatologia do
Departamento de Alimentos da Escola de Nutrição, Universidade Federal de Ouro Preto.
4.3.1 - Umidade
A umidade se caracteriza pela perda de peso que ocorre no produto quando este é
aquecido em condições nas quais somente a água é removida. O método utilizado para esta
determinação foi o da secagem em estufa a 105ºC, até peso constante, conforme descrito
pela AOAC (1984).
4.3.2 - Proteínas
O teor de nitrogênio total foi determinado segundo o método semimicro Kjeldahl,
descrito pela AOAC (1984), com amostras em triplicata. Usou-se o fator 4,38 no cálculo
da conversão do nitrogênio em proteína.
30
MIRANDA, A. M.
Material e Métodos
4.3.3 - Cinzas
O teor de cinzas foi determinado por meio da calcinação da amostra em mufla entre
550 a 600 ºC por seis horas, segundo método descrito pela AOAC (1984).
4.3.4 - Lipídios totais
Os lipídios totais foram extraídos com éter de petróleo, em extrator de Soxhlet,
conforme procedimento descrito nas Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz (2008).
4.3.5 - Fibras alimentares
Utilizou-se o método de determinação de fibra em detergente neutro - aparelho
digestor para fibra Tecnal/TE-149. Este método consiste em um processo rápido para a
determinação da fibra total em alimentos. A fibra em detergente neutro (FDN) é
constituída por celulose, hemicelulose e lignina.
4.3.6 - Carboidratos
Os teores de carboidratos foram obtidos por diferença em relação aos demais
componentes, ou seja, ao valor 100 foi subtraída a soma dos valores obtidos para umidade,
proteínas, lipídeos, fibras e cinzas.
4.4 - Delineamento do experimento:
Os animais foram divididos em quatro grupos de 8 animais de acordo com a dieta
recebida, sendo os seguintes grupos: grupo controle (C) (recebeu dieta padrão), grupo
hipercolesterolêmico (H) (recebeu dieta hipercolesterolemiante), grupo controle +
Agaricus blazei (CAb) (recebeu dieta padrão suplementada com 1% de cogumelo) e grupo
hipercolesterolêmico + Agaricus blazei (HAb) (recebeu dieta hipercolesterolemiante
suplementada com 1% de cogumelo). Nos primeiros 14 dias de experimento, os grupos
passaram por um período de adaptação às dietas, onde os grupos C e CAb receberam dieta
padrão e os grupos H e HAb receberam a dieta hipercolesterolemiante. Após essas duas
semanas de adaptação, cada grupo passou a receber sua respectiva dieta por mais seis
semanas. Os animais foram pesados semanalmente durante todo o experimento. As
31
MIRANDA, A. M.
Material e Métodos
medidas de ingestão alimentar também foram realizadas durante todo período
experimental.
4.5 - Obtenção do soro e plasma
Ao final das 8 semanas de experimento realizou-se a eutanásia. Os animais foram
deixados no mínimo 8 horas e no máximo 12 horas em jejum, anestesiados e eutanasiados.
O sangue foi coletado através do plexo braquial e colocado em tubo eppendorf (com 2,0
mL de capacidade) que posteriormente foi centrifugado a 13000 rpm por 15 minutos para
obtenção do soro, o qual foi guardado sob refrigeração (4°C). Para as dosagens que
necessitaram ser realizadas usando o plasma, 15µL de anticoagulante Glistab® (Labtest
cat. 29) foram adicionados previamente ao eppendorf. As diversas dosagens bioquímicas
foram realizadas imediatamente ou em até três dias.
O fígado, os rins e a gordura abdominal foram retirados no momento da eutanásia e
pesados. Os fígados retirados foram congelados para posterior dosagem de lipídios totais.
4.6 - Dosagens dos Parâmetros Bioquímicos
No experimento, as dosagens bioquímicas foram realizadas utilizando-se kits
comerciais Labtest Diagnóstica S.A., sendo elas: Albumina, ALT, AST, Colesterol Total,
Colesterol-HDL, Creatinina, Fosfatase alcalina (FA), Glicose, Proteínas Totais,
Triacilgliceróis e Uréia. Os princípios dos mesmos e seus respectivos protocolos são
descritos no anexo II.
A concentração do colesterol não-HDL (colesterol VLDL e LDL) foi calculada a
partir da diferença do colesterol total pelo colesterol HDL e expressa em mmol/L:
Outras Frações do Colesterol (mmol/L) = Colesterol Total (mmol/L) – Colesterol HDL (mmol/L)
Os parâmetros bioquímicos realizados sem o uso de kits comerciais foram
Paraoxonase (PON) e Grupos Sulfidrilas cujos protocolos são descritos a seguir:
32
MIRANDA, A. M.
Material e Métodos
4.6.1 - Protocolo de dosagem da atividade de Paraoxonase
4.6.1.1 - Paraoxonase – Atividade arilesterase
Objetivo:
Determinar a atividade arilesterase da enzima paraoxonase, usando o fenilacetato
como substrato, tendo como base a velocidade de hidrólise do fenilacetato, conforme
descrito por Beltowski, Wojcicka e Jamroz (2002).
Procedimento da dosagem:
Adicionou-se, em tubo de ensaio, 2mL de tampão Tris-HCl, 9mM; pH = 8,0
contendo 0,9mmol/L de cloreto de cálcio e 5µL de soro. O conteúdo do tubo foi
homogeneizado no vórtex, incubado em banho-maria durante dois minutos, sendo então
adicionado de 0,5mL da solução Tris - fenilacetato (1µL de fenilacetato para cada 1500µL
de Tris-HCl 9mM; pH = 8,0). Após exatamente 3 minutos, a absorbância foi lida a 270nm.
O espectrofotômetro foi zerado com o branco que continha todos os reagentes acima,
exceto o soro.
Cálculo:
A definição para atividade enzimática é feita de acordo com Beltowski, Wojcicka e
Jamroz (2002), onde 1U de paraoxonase é equivalente à hidrólise de 1mmol de fenilacetato
(ε = 1310 L.mol-1.cm-1) por minuto (usualmente a atividade desta enzima é representada
por 1mL de soro). Assim, a atividade arilesterásica da enzima é:
U/mL = Absorbância
εxb
Onde:
ε = Coeficiente de extinção molar;
b = Caminho óptico, igual a 10 mm.
33
X
1000
Tempo x Volume de soro
MIRANDA, A. M.
Material e Métodos
4.6.1.2 - Paraoxonase – Atividade paraoxonase
Objetivo:
Determinar a atividade paraoxonase da enzima paraoxonase, usando paraoxon
como substrato, tendo como base a velocidade de hidrólise deste, com a liberação do
paranitrofenol por minuto, conforme descrito por Beltowski, Wojcicka e Jamroz (2002).
Procedimento da dosagem
Inicialmente, preparou-se uma solução contendo 9mL de tampão glicina/NaOH a
50mM; pH 10,5 contendo CaCl2 a 0,9mM e 2µL de paraoxon. Posteriormente, em tubo de
polipropileno adicionou-se 780µL dessa solução e 20µL de soro. A solução foi
homogeneizada e as absorbâncias das amostras lidas no espectrofotômetro a 412nm,
exatamente a cada minuto, por 3 minutos. O branco (tubo com 780µL da solução
preparada inicialmente e 20µL de água) foi utilizado para acertar o aparelho.
Cálculo
Segundo Beltowski, Wojcicka e Jamroz (2002) 1U da enzima paraoxonase é
equivalente à hidrólise de 1mmol de paraoxon (ε = 18290 L.mol-1.cm-1) por minuto
(usualmente a atividade dessa enzima é representada em unidade por mL de soro). A
atividade paraoxonase da enzima paraoxonase é:
U/mL = Absorbância
εxb
X
1000
Tempo x Volume de soro
A absorbância utilizada nessa expressão é o delta obtido das três absorbâncias lidas
(absorbância final – absorbância inicial / 2).
4.6.2 - Protocolo de dosagem dos grupos sulfidrilas
Os radicais sulfidrilas representam todos os grupos tióis encontrados em proteínas
como albumina e compostos de baixo peso molecular, como a glutationa. Quando o
estresse oxidativo está elevado, estes grupos podem ser oxidados. A determinação dos
grupos sulfidrilas totais foi realizado usando o reagente de Ellman (DNTB) conforme
34
MIRANDA, A. M.
Material e Métodos
proposto por Sedlak e Lindsay (1968). Os grupos tióis reagem com DNTB formando um
complexo que absorve luz a 412nm.
Reagentes e formas de preparo
Tampão Tris-HCl, pH = 8,2: Foram dissolvidos 24,22g de Trizma Base (PM
121,1) e 8,32g de Ácido Etilenodiaminotetracético (EDTA; PM: 416,21; 99% m/m)
em 800mL de água destilada. O pH foi ajustado em 8,2 usando HCl 3mol/L e água
destilada foi adicionada para completar o volume final para 1000mL. A solução
final continha 30mmol/L de Trizma Base e 3mmol/L de EDTA.
Cloreto de Trietanolamina:
Foram
dissolvidos
1,33mL de
cloreto de
trietanolamina (TEA; PM: 185,7) e adicionou-se água destilada para completar o
volume para 500mL.
Ácido 5,5´-Ditio-bis-(2-nitrobenzóico): Foram dissolvidos 10mg de ácido 5,5´ditio-bis-(2-nitrobenzóico) (DTNB; Reagente de Ellman; PM 396,3) em 14,71mL
de metanol (PM: 32,04; 0,79g/mL). Este reagente foi preparado pouco antes da
dosagem e mantido armazenado no gelo durante a utilização.
Solução padrão estoque: Foram dissolvidos 12mg de cisteína (PM: 121,16) em
volume de TEA suficiente para 5mL. A solução final continha 20mmol/L de
cisteína. Este reagente foi preparado pouco antes da dosagem e mantido
armazenado no gelo durante a utilização.
O padrão de cisteína foi feito dissolvendo 50µL de solução padrão estoque em
950µL de TEA. O procedimento foi feito da seguinte forma:
TUBO
CONC (µmol/L)
Padrão Cisteína
(µL)
TEA (µL)
1
0
2
50
3
100
4
250
5
500
6
1000
0
25
50
125
250
500
500
475
450
375
250
0
35
MIRANDA, A. M.
Material e Métodos
Para cada amostra, adicionou-se 800µL de metanol, 150µL de Tris-HCl, pH = 8,2,
50µL de DTNB e 40µL de amostra (ou da série de padrões). As mesmas foram
centrifugadas a 13000 rpm durante 15 minutos à temperatura ambiente. As absorbâncias
das amostras foram determinadas a 412nm e a 25°C. Nesta dosagem são feitos dois
brancos, o branco 1 que contém todos os reagentes menos a amostra e o branco 2 que não
contém amostra e DTNB. O branco 2 é utilizado para acertar o aparelho. E as absorbâncias
obtidas de todas as amostras são diminuídas da absorbância obtida para o branco 1.
Cálculos
Foi feita uma curva de calibração padrão nas seguintes concentrações: 0; 50; 100;
250; 500; 1000. Após uma análise de regressão linear da curva padrão, obteve-se a equação
da reta (Concentração = a X Absorbância + b) que foi utilizada para determinar a
concentração de sulfidrilas totais.
4.7 - Protocolos de análise das defesas antioxidantes e da concentração de
biomarcadores do estresse oxidativo em tecido
4.7.1 - Concentração de Glutationa Total
Princípio da técnica
A concentração de glutationa total foi determinada utilizando o kit Sigma #
CS0260. Representando em torno de 90%, a glutationa está presente nas células
principalmente na sua forma reduzida (GSH), o restante aparece na forma de glutationa
oxidada (GSSG). Este kit utiliza um método cinético para mensurar os níveis de glutationa
total (GSH+GSSG) em amostras biológicas, através da redução do DTNB (Ácido 5,5´Ditio-bis-(2-nitrobenzóico) a TNB.
1. 2 GSH + DTNB
GSSG + 2 TNB
2. GSSG + NADPH + H+
2GSH + NADP+
Glutationa Redutase
36
MIRANDA, A. M.
Material e Métodos
Combinando as duas reações:
Glutationa Redutase
+
2TNB + NADP+
DTNB + H + NADPH
GSSG / GSH
Preparo da amostra biológica
Foram utilizados 100mg de fígado. O tecido foi homogeneizado com 1mL de ácido
sulfossalicílico a 5% (SSA), e em seguida centrifugado por 10 minutos a 4ºC. O
sobrenadante foi retirado e utilizado para a dosagem.
Preparo dos reagentes de estoque
Solução de ácido sulfossalicílico (SSA) a 5%.
Tampão fosfato 5 X (500 mM), contendo EDTA a 5 mM.
Solução padrão estoque de glutationa: 0,3mg de glutationa reduzida em 0,1mL de
água destilada.
Solução estoque de DTNB: 8mg de DTNB foram dissolvidos em 5,33mL de
dimetilsulfossalicílico (DMSO), resultando em uma solução com 1,5mg/mL de
concentração.
Estoque de NADPH (solução de 40mg/mL).
Preparo dos reagentes de trabalho
Solução de enzimas diluída: Diluir 15,2μL de glutationa redutase (100
unidades/mL) em 250μL de tampão fosfato 1x.
Solução de NADPH de trabalho: Da solução estoque de NADPH preparada são
retirados 30μL para 7,5mL de tampão fosfato 1x.
Mistura de trabalho: 8mL de tampão 1x, 228μL da solução de enzimas diluída e
228μL de solução estoque de DNPH.
Solução padrão de glutationa - preparar para a curva padrão: Diluir 10μL de
solução estoque de glutationa padrão com 2mL de ácido SSA a 5%.
37
MIRANDA, A. M.
Material e Métodos
A curva padrão e a dosagem das amostras foram feitas em placas de ELISA. Os
reagentes e a sequência de adições estão descritas nas tabelas abaixo.
Procedimento para curva padrão
Poço
1
2
3
4
5
[GSH] µM
Solução de GSH
(μL)
SSA 5% (μL)
nmoles de GSH
em10 μL de
amostra
50
25
12,5
6,25
3,125
25 (Tubo 2)
25(Tubo 3)
25(Tubo 4)
50
25 (Tubo 1)
-
25
25
25
25
0,5
0,25
0,125
0,062
0,0312
Procedimento para o teste
Amostra (*)
SSA 5%
Mistura de trabalho
Branco
-
10 (μL)
150 (μL)
Padrão (Tubos preparados
10 (μL)
-
150 (μL)
10 (μL)
-
150 (μL)
para a curva)
Amostra
(*)
O termo amostra nos tubos preparados para a curva padrão refere-se aos padrões preparados anteriormente.
As amostras foram incubadas por 5 minutos à temperatura ambiente.
Posteriormente, 50μL de NADPH foram adicionados às mesmas e o cronômetro disparado.
As absorbâncias foram lidas durante 5 minutos, no leitor de ELISA a 412 nm.
Cálculo
Um gráfico foi feito utilizando os pontos obtidos na curva padrão (estes pontos
obtidos consistem no delta das absorbâncias). A equação da reta [Concentração = a X
(delta das absorbâncias) + b] foi determinada após análise de regressão linear. Esta
equação foi utilizada para determinar a concentração em nmoles de glutationa total em
10μL de amostra e este valor convertido para 1mL de amostra.
38
MIRANDA, A. M.
Material e Métodos
4.7.2 - Proteína Carbonilada
Objetivo
A oxidação de proteína por EROS leva à formação de derivados carbonílicos. Estes
podem ser mensurados por métodos sensíveis, particularmente aqueles que utilizam a 2,4
dinitrofenilhidrazina (DNP). A DNP reage com grupos carbonílicos gerando a hidrazona
correspondente, que pode ser analisada espectrofotometricamente. A determinação da
concentração hepática de proteína carbonilada foi realizada conforme descrito por Levine
et al. (1994).
Foram utilizados 400mg de fígado. O tecido foi homogeneizado com 2mL de
tampão fosfato a 50 mM, pH: 6,7 contendo EDTA a 1mM e em seguida, centrifugado a
10000 rpm por 10 minutos a 4º C. O sobrenadante foi retirado e utilizado para a dosagem.
Reagentes utilizados e forma de preparo
Ácido Clorídrico a 2,5M.
DNPH (2,4-dinitrofenilhidrazina): 0,01g de DNPH foram diluídos em 10mL de
HCl 2,5 M. Obtendo-se uma solução de DNPH a 0,1%. Esta solução foi estocada
no escuro a 4°C.
Solução de TCA (ácido tricloroácetico): Inicialmente uma solução de TCA 2g/ml
foi preparada. Dessa solução foram retirados 12mL e diluídos em 108mL de água,
obtendo-se uma solução final de TCA a 20%. Em seguida, 40mL da solução de
TCA a 20% foram retirados e diluídos em 40mL de água, tendo uma solução final
de TCA a 10%.
SDS 6%: Dodecilssulfato de Sódio.
Mistura de etanol e acetato de etila: Em um frasco foram diluídos 30mL de
etanol e 30mL de acetato de etila.
39
MIRANDA, A. M.
Material e Métodos
Dois tubos de polipropileno são utilizados para cada amostra, sendo um
denominado Amostra (A) e outro Controle (C). Transferiu-se então, 500 L de
homogeneizado de fígado para cada tudo (A e C). Em seguida, adicionou-se 500 L de
TCA a 10%, com posterior homogeneização e centrifugação a 5000rpm por 10minutos a
4°C. Depois, adicionou-se ao tubo A 500 L de DNPH (2,4-dinitrofenilhidrazina) e 500 L
de HCl 2,5mol/L no tubo C. Ambos os tubos foram mantidos no escuro à temperatura
ambiente por um período de 30 minutos, sendo novamente homogeneizados a cada 15
minutos. Em seguida adicionou-se novamente 500 L de TCA a 10% em cada tubo, com
nova homogeneização e centrifugação.
Após a centrifugação, o sobrenadante foi
descartado e 1mL de mistura de etanol:acetato de etila foi adicionado aos tubos e
novamente homogeneizados. Uma nova centrifugação foi realizada. Em seguida, o
sobrenadante foi novamente descartado e repetiu-se a lavagem com a mistura
etanol:acetato de etila. Após esse processo, o sobrenadante dos tubos foi novamente
descartado e adicionado 1mL de SDS a 6% em ambos os tubos. Após nova
homogeneização e centrifugação, os sobrenadantes dos tubos foram retirados e lidos no
espectrofotômetro a 370nm.
Cálculos
Para determinar a concentração de proteína carbonilada foi utilizada a equação de
Lambert Beer:
A= C x b x ε
Onde
A = Subtração da absorbância do tubo A (amostra) pela absorbância do tubo C (controle).
C = Concentração
b=Caminho óptico
ε=Coeficiente de extinção molar
O conteúdo de proteína carbonilada foi calculado usando o coeficiente de extinção
molar de 22000 M -1 cm -1 e expresso por nmol de proteína carbonilada formada por mg de
proteína.
40
MIRANDA, A. M.
Material e Métodos
Para se obter a concentração de proteína carbonilada em relação à concentração de
proteínas totais no fígado, este parâmetro foi determinado pelo método de Lowry (descrito
a seguir).
4.7.3 - Proteínas Totais em tecido - Método de Lowry
Este método foi descrito pela primeira vez por Lowry et al. (1951). Consiste em um
método muito confiável, sendo, portanto, amplamente utilizado. Este método é baseado nas
ligações das proteínas, que em meio alcalino, unem-se aos íons cobre (Cu+) formando uma
cor azul que é dependente em parte, do índice de tirosina e triptofano da amostra, já que os
íons cobre catalisam a oxidação de aminoácidos aromáticos.
Reagentes utilizados e forma de preparo
Reagente A: São dissolvidos 0,25g de sulfato de cobre (CuSO4 . 5H2O) e 0,5g de
citrato de sódio em 100mL de H2O destilada. A solução foi armazenada, no escuro,
em temperatura ambiente.
Reagente B: São dissolvidos 5g de carbonato de sódio e 1g de hidróxido de sódio
em 250mL de H2O destilada. Foi armazenado em temperatura ambiente.
Reagente C: 1mL do reagente A é adicionado em 50mL do reagente B. Preparado
na hora do teste.
Reagente D: 1mL do reagente de Folin-Ciocateau é dissolvido em 1mL de água
destilada. Preparado na hora do teste.
Curva padrão para proteínas totais
Para a curva foram feitos quatro pontos, de acordo com o seguinte procedimento:
P1: 25µL de uma solução estoque de proteínas a 0,2mg/dL foram pipetados e o
volume completado com água destilada para 100mL. A concentração final obtida
deste ponto foi de 0,05mg/mL.
P2: 7,5µL de uma solução estoque de proteínas a 2mg/dL foram pipetados e o
41
MIRANDA, A. M.
Material e Métodos
P3: 15µL de uma solução estoque de proteínas a 2mg/dL foram pipetados e o
P4: 25µL de uma solução estoque de proteínas a 2mg/dL foram pipetados e o
Foram pipetados 10µL da amostra ou do padrão, em um tubo de polipropileno e o
volume final foi completado para 100µL com água destilada. Para a determinação das
proteínas totais, foi utilizado o sobrenadante obtido do homogenato na dosagem de
TBARS, descrito abaixo. O branco, usado para zerar o espectrofotômetro, foi feito apenas
com 100µL de água destilada. Em seguida, foi adicionado 1mL do reagente C em todos os
tubos. A mistura foi levada ao vórtex e mantida a temperatura ambiente por 15 minutos.
Posteriormente, foi adicionado, em cada tubo, 100µL do reagente D. O volume foi
misturado e incubado a temperatura ambiente por 30 minutos, no escuro. A leitura foi
realizada em espectrofotômetro a 660nm.
Cálculos
A Concentração do padrão (Eixo Y) versus a Absorbância do padrão (Eixo X) foi
expressa em um gráfico. Após análise de regressão linear, a equação da reta foi
determinada com a seguinte característica: Concentração = a X Absorbância + b. Esta
equação foi utilizada para determinar a concentração de proteínas totais no homogenato
dos tecidos. Todas as concentrações foram obtidas em mg/mL.
4.7.4 - Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico - TBARS
Princípio da técnica
Determinar a concentração de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico - TBARS
baseado na capacidade do ácido tiobarbitúrico (TBA) em se ligar a lipídeos oxidados. Esta
dosagem foi realizada conforme descrito por Buege e Aust (1978).
42
MIRANDA, A. M.
Material e Métodos
Foram utilizados 100mg de fígado. O tecido foi homogeneizado com 1mL de
tampão fosfato, pH: 7,4 e em seguida centrifugado por 10 minutos a 4ºC. O sobrenadante
foi retirado e utilizado na dosagem.
Em um tubo, foram colocados 500µL do sobrenadante, 250µL de ácido
tricloroacético (TCA) a 28% dissolvido em HCl 0,25 N, 250µL de ácido tiobarbitúrico a
1% dissolvido em ácido acético 1:1 e 125µL de butilhidroxitolueno (BHT) a 5mM
dissolvido em etanol. O tubo foi levado ao vórtex, em seguida, colocado em banho-maria a
95ºC por 15 minutos. Posteriormente, este tubo foi centrifugado por 10 minutos a
10000rpm. O espectrofotômetro foi zerado com água destilada e o sobrendante lido a
535nm.
Cálculo
A concentração de TBARS foi determinada seguindo a lei de Lambert Beer,
utilizando o coeficiente de extinção molar ε = 1,56 X 105 L.mol -1. cm -1. Usualmente, esta
concentração é expressa em nmoles por mg de proteínas.
4.8 - Extração de gordura do fígado
Amostras dos fígados dos animais foram previamente secas em estufa ventilada e a
extração dos lipídios totais dessas amostras foi realizada segundo metodologia proposta
pela Association of Official Agricultural Chemists dos Estados Unidos da América
(AOAC, 1984). As foram deixadas por 8 horas sob refluxo no aparelho de extração
(Sohxlet). A porcentagem de gordura foi determinada pela fórmula abaixo:
% gordura = 100 x D
A
D = Peso do balão contendo a gordura extraída menos o peso do balão vazio.
A = Peso da amostra.
43
MIRANDA, A. M.
Material e Métodos
4.9 - Dosagem de colesterol total e triacilgliceróis na gordura do fígado
A gordura hepática foi solubilizada em isopropanol anteriormente aos
procedimentos das dosagens. Dissoluções de 1:50 foram preparadas a partir da
homogeneização de 20μL de gordura em 980μL em isopropanol e novas dissoluções de
1:100 foram preparadas a partir de alíquotas conhecidas da diluição de 1:50 em
isopropanol. As dissoluções de 1:50 foram utilizadas para todas as dosagens de
triacilgliceróis e para as dosagens de colesterol total dos grupos C e CAb e as de 1:100
foram utilizadas na dosagem de colesterol total dos grupos H e HAb.
As dosagens foram realizadas a partir de 10μL das dissoluções de acordo com os
protocolos descritos para dosagem de colesterol total e de triacilgliceróis (ANEXO II) e
expressas em mg de colesterol (ou triacilglicerol) / g de tecido.
4.10 - Extração de gordura das fezes
Nas fezes a extração de gordura foi realizada segundo método descrito por Folch et
al. (1957) com modificações segundo o proposto por Peluzio et al.(2002) (Cf. OLIVEIRA,
2006). Inicialmente, 100mg de amostras foram homogeneizadas com 1,9mL de
clorofórmio/metanol (2:1). À mistura foram adicionados 0,4mL de metanol e
posteriormente realizada a centrifugação a 5000 rpm por 10 minutos. A fase superior foi
transferida para tubo de ensaio seco, pesado e identificado. A esta solução foram
acrescentados mais 0,8mL de clorofórmio e 0,64mL de solução aquosa de NaCl a 0,73%.
Em seguida, foram misturados no vórtex e nova centrifugação foi feita a 5000 rpm por 10
minutos. A fase superior foi descartada e as paredes internas do tubo lavadas com 0,3 mL
de solução de Folch - clorofórmio/metanol/água (3: 48: 47) - este procedimento foi
repetido 3 vezes. Após cada lavagem a fase superior foi descartada. Os extratos lipídicos
foram secos em estufa semi-aberta a 40º C. Os lipídios foram quantificados pela diferença
de peso entre o tubo contendo os lipídios e o mesmo tubo vazio, previamente pesado.
4.11 - Análise Estatística
Os dados foram avaliados através da análise de variância bivariada (Two-way
ANOVA) utilizando o software Prism® da GraphPad versão 5. As diferenças foram
44
MIRANDA, A. M.
Material e Métodos
consideradas significativas quando o valor de p foi menor do que 0,05. Os dados foram
expressos como média ± desvio padrão. Para os dados que não seguiram uma distribuição
normal, o teste não paramétrico Kruskal-Wallis e o pós-teste de Dunns foram utilizados.
45
RESULTADOS
MIRANDA, A. M.
Resultados
CAPÍTULO 5 - RESULTADOS
5.1 - Caracterização bromatológica do Agaricus blazei
A tabela II apresenta a caracterização bromatológica do Agaricus blazei.
O conteúdo calórico em 100g do cogumelo corresponde a 240 Kcal. Para umidade
o valor encontrado foi de 9,4%, em base seca. Proteínas 17,81%. Teor de cinzas 8,18%.
Conteúdo em lipídios de 1,22%. Fibra dietética em detergente neutro (FDN) 23,81%. E o
conteúdo em carboidratos obtido por diferença foi de 39,41%.
TABELA II: Composição centesimal em 100g do Agaricus blazei.
Nutrientes
Umidade
Proteína †
Cinzas
Lipídios
Fibra dietética (FDN)
Carboidrato **
Valor Calórico (Kcal)
%
9,4
17,81
8,18
1,22
23,98
39,41
240
* As análises foram feitas em triplicata. Os dados são apresentados como a média destas
análises. FDN = fibra detergente neutro.
†
Fator de conversão do nitrogênio em proteína: 4,38.
** Carboidratos = 100- (% umidade + % proteína + % de lipídios + % cinzas + % fibras)
5.2 - Parâmetros biométricos
5.2.1 - Ganho de Peso, Ingestão alimentar e Excreção fecal
Em um primeiro momento, examinamos como a suplementação do Agaricus blazei
às dietas (padrão e hipercolesterolemiante) afetaria o ganho de peso, a ingestão alimentar e
a excreção fecal dos animais.
No início do experimento, como mostra a tabela III, os animais de todos os grupos
experimentais apresentavam em média um peso de 176g. Entretanto, o ganho de peso final
foi estatisticamente diferente, ou seja, 72% maior nos grupos alimentados com a dieta
hipercolesterolemiante (H e HAb) quando comparados aos grupos que receberam a dieta
padrão (C e CAb). No que se refere à ingestão alimentar, a análise dos resultados revelou
que houve uma interação entre a dieta e o cogumelo. A ingestão mostrou que os animais
dos grupos com uma dieta hipercolesterolemiante tiveram uma ingestão maior que a dos
46
MIRANDA, A. M.
Resultados
animais dos grupos que receberam uma dieta controle. Em relação a esse mesmo dado,
observa-se ainda um maior consumo por parte do grupo HAb quando comparado ao H e
aos grupos C e CAb. Estes últimos apresentaram valores similares entre si.
Uma interação entre a dieta e o A. blazei também foi observada quando da análise
da excreção fecal, com os grupos H apresentando uma maior excreção em relação ao HAb.
Já os grupos C e CAb foram estatisticamente semelhantes entre si e aos grupos H e HAb.
Tabela III: Crescimento corporal, ingestão alimentar e excreção fecal de grupos de animais
alimentados com dieta padrão (C), dieta padrão + A. blazei a 1% (CAb), dieta hipercolesterolemiante
(H) e dieta hipercolesterolemiante + A. blazei a 1% (HAb).
Grupos Experimentais
C
Peso Inicial
(g)
Peso Final
(g)
Ganho de Peso Final
(g)
Ingestão Alimentar
(g/7d)
Excreção Fecal
(g/7d)
CAb
176,50 ± 10,88 175,75 ± 8,14
H
NS
NS
NS
214,13 ± 13,37 210,63 ± 11,45 238,88 ± 13,94 237,25 ± 22,47
< 0,05
NS
NS
37,63 ± 17,65
61,13 ± 28,15
<0,05
NS
NS
122,41 ± 3,05c 124,06 ± 1,93c 136,80 ± 5,21b 147,51 ± 6,98a
<0,05
<0,05
<0,05
NS
NS
<0,05
3,95 ± 0,86ª,b
34,88 ± 14,66
4,66 ± 0,51ª,b
175,25 ± 7,03
HAb
63,63 ± 15,84
5,09 ± 1,02a
176,13 ± 8,92
ANOVA (Valor P )
Dieta
Dieta
Ab
X
Ab
3,81 ± 1,08b
* Os dados são apresentados como média ± desvio padrão (n=8). Letras diferentes sobrescritas indicam diferença
estatística significativa na mesma linha (P<0,05). NS: não significativo. Ab: Agaricus blazei.
5.2.2 - Peso dos órgãos
5.2.2.1 - Peso total e relativo do fígado, gordura abdominal e rins
A tabela IV apresenta os valores do peso total e relativo do fígado, da gordura
abdominal e dos rins.
O peso total e relativo do fígado foram influenciados apenas pela dieta. As dietas
hipercolesterolemiantes (H + HAb) determinaram um aumento de aproximadamente 86%
no peso do fígado, bem como um aumento de 67% no peso relativo deste órgão quando
comparadas às controles (C + CAb).
Para a gordura abdominal, a suplementação das dietas com o Agaricus blazei
influenciou tanto os valores de peso total quanto os valores de peso relativo. Os animais
que receberam o cogumelo na dieta hipercolesterolemiante apresentaram os menores
47
MIRANDA, A. M.
Resultados
valores de peso total da gordura abdominal quando comparados aos que não receberam a
suplementação. Foi observada ainda uma redução de aproximadamente 30% para o peso
relativo da gordura abdominal para os animais do grupo HAb quando comparados ao
grupo H.
Com relação ao peso dos rins observamos apenas um efeito da dieta, com os grupos
H e HAb apresentando as maiores médias quando comparados ao C e CAb. No entanto, o
efeito não foi mantido ao analisarmos o peso relativo do respectivo órgão, sendo
estatisticamente semelhante para todos os grupos.
Tabela IV: Peso total e peso relativo (peso total do órgão / peso do animal x 100) do fígado, da
gordura abdominal e dos rins de grupos de animais alimentados com dieta padrão (C), dieta padrão +
A. blazei a 1% (CAb), dieta hipercolesterolemiante (H) e dieta hipercolesterolemiante + A. blazei a
1% (HAb).
Fígado
(g)
PR do Fígado
(g)
Gord. Abdominal
(g)
PR da Gord.
Abdominal
(g)
Rins
(g)
PR dos Rins
(g)
ANOVA (Valor P )
Dieta
Dieta
Ab
X
Ab
C
CAb
H
HAb
6,02 ± 0,94
6,02 ± 0,54
10,91 ± 0,97
11,57 ± 0,97
<0,05
NS
NS
2,81 ± 0,38
2,86 ± 0,19
4,56 ± 0,21
4,89 ± 0,38
<0,05
NS
NS
0,24 ± 0,09
0,23 ± 0,03
0,34 ± 0,05
0,25 ± 0,06
0,05
0,05
NS
0,11 ± 0,04
0,11 ± 0,01
0,14 ± 0,03
0,10 ± 0,02
NS
<0,05
NS
1,21 ± 0,10
1,27 ± 0,06
1,41 ± 0,11
1,45 ± 0,09
<0,05
NS
NS
0,57 ± 0,04
0,60 ± 0,02
0,59 ± 0,04
0,62 ± 0,07
NS
NS
NS
* Os dados são apresentados como media ± desvio padrão (n = 8). Letras diferentes sobrescritas indicam diferença
estatística significativa na mesma linha (P < 0.05). NS: não significativo. Ab: Agaricus blazei. PR = Peso relativo.
48
MIRANDA, A. M.
Resultados
5.3 - Parâmetros relacionados ao metabolismo nitrogenado e glicídico
5.3.1 - Proteínas totais, Albumina e Glicose
A tabela V apresenta as concentrações de proteínas totais, albumina e glicose.
Não houve diferença entre os grupos com relação às proteínas totais. A análise dos
resultados para a albumina revelou que a dieta e o cogumelo mostraram efeitos
significativos. Os animais que receberam a dieta CAb e HAb apresentaram menores níveis
séricos de albumina quando comparados aos grupos C e H, respectivamente.
Quando nos remetemos à análise dos dados para glicose, observamos que os
diferentes grupos foram estatisticamente iguais entre si, demonstrando que não foram
influenciados pela dieta ou pelo cogumelo.
Tabela V: Concentração sérica de proteínas totais, albumina e glicose de grupos de animais
alimentados com dieta padrão (C), dieta padrão + A. blazei a 1% (CAb), dieta
hipercolesterolemiante (H) e dieta hipercolesterolemiante + A. blazei a 1% (HAb).
Proteínas Totais
(g/L)
Albumina
(µmol/L)
Glicose
(mmol/L)
C
CAb
H
HAb
71,76 ± 3,25
71,75 ± 2,99
76,14 ± 9,13
75,38 ± 7,35
487,59 ± 21,95 476,72 ± 33,89 446,65±45,33 393,04 ± 44,31
8,02 ± 1,88
8,07 ± 1,40
7,84 ± 0,67
6,12 ± 2,07
ANOVA (Valor P )
Dieta
Dieta
Ab
X
Ab
NS
NS
NS
<0,05
<0,05
NS
NS
NS
NS
5.3.2 - ALT, AST e FA
A tabela VI apresenta os valores da atividade de ALT, AST e FA.
Com relação à atividade das enzimas alanina aminotransferase, aspartato
aminotransferase e fosfatase alcalina, apenas o efeito da dieta foi observado. A dieta
hipercolesterolemiante aumentou significativamente a atividade das aminotransferases e da
fosfatase alcalina. Não foi observada nenhuma influência da suplementação da dieta com o
cogumelo nestes parâmetros.
49
MIRANDA, A. M.
Resultados
Tabela VI: Atividade das enzimas séricas aspartato aminotransferase, alanina aminotransferase e
fosfatase alcalina de grupos de animais alimentados com dieta padrão (C), dieta padrão + A. blazei a
1% (CAb), dieta hipercolesterolemiante (H) e dieta hipercolesterolemiante + A. blazei a 1% (HAb).
AST
(U/I)
ALT
(U/I)
FA
(U/L)
ANOVA (Valor P )
Dieta
Dieta
Ab
X
Ab
C
CAb
H
HAb
15,02 ± 4,36
13,39 ± 3,20
24,68 ± 11,85
25,83 ± 10,45
<0,05
NS
NS
4,14 ± 1,51
3,42 ± 0,46
5,06 ± 1,88
7,05 ± 3,65
<0,05
NS
NS
12,69 ± 2,07
13,81 ± 1,49
21,89 ± 9,00
19,03 ± 2,00
<0,05
NS
NS
5.3.3 - Uréia e Creatinina
A tabela VII apresenta os valores da concentração sérica de creatinina e uréia.
As concentrações de creatinina foram influenciadas pela dieta e pela suplementação
com o cogumelo. As dietas hipercolesterolemiantes provocaram um aumento na
concentração de creatinina. Um aumento também foi observado quando o Agaricus blazei
foi adicionado às dietas, com os grupos HAb (50,85 ± 10,83 µmol/L), H (41,73 ± 9,55
µmol/L) e CAb (40,49 ± 7,17 µmol/L) apresentando os maiores valores quando
comparados ao C (28,28 ± 9,65 µmol/L). No entanto, a maior alteração foi observada
quando da suplementação do grupo controle com o cogumelo, com o grupo CAb
apresentando um aumento de aproximadamente 43% em relação ao C.
Os dados para a uréia dos diferentes grupos foram estatisticamente iguais entre si,
demonstrando que não foram influenciados pela dieta ou pelo cogumelo.
50
MIRANDA, A. M.
Resultados
Tabela VII: Concentrações séricas de creatinina e uréia de grupos de animais alimentados com
dieta padrão (C), dieta padrão + A. blazei a 1% (CAb), dieta hipercolesterolemiante (H) e dieta
hipercolesterolemiante + A. blazei a 1% (HAb).
Creatinina
(µmol/L)
Uréia
(mmol/L)
ANOVA (Valor P )
Dieta
Dieta
Ab
X
Ab
C
CAb
H
HAb
28,28 ± 9,65
40,49 ± 7,17
41,73 ± 9,55
50,85 ± 10,83
<0,05
<0,05
NS
3,98 ± 0,74
3,76 ± 0,51
3,54 ± 0,92
3,75 ± 0,46
NS
NS
NS
* Os dados são apresentados como media ± desvio padrão (n = 8). Letras diferentes sobrescritas indicam diferença estatística
significativa na mesma linha (P < 0.05). NS: não significativo. Ab = Agaricus blazei.
5.4 - Parâmetros do metabolismo de lipídios
5.4.1 - Lipídios séricos
Frente às características observadas sobre os componentes presentes nos cogumelos
e sua capacidade em regular os níveis séricos de colesterol, aliadas ao fato de serem poucos
os dados sobre os efeitos dos cogumelos em animais normocolesterolêmicos, avaliamos se
a suplementação da dieta com o Agaricus blazei modificaria o perfil sérico de lipídios em
animais controle e hipercolesterolêmico. Para isto, o colesterol total, colesterol não-HDL,
colesterol-HDL e triacilgliceróis foram mensurados. Da mesma forma, o índice
aterogênico, um importante marcador do risco cardiovascular, foi avaliado, conforme se
observa na tabela VIII.
A análise desses dados demonstra que a dieta foi eficiente em tornar os animais
hipercolesterolêmicos. Isso se comprova na medida em que houve um aumento
significativo nos níveis séricos de colesterol total e não-HDL nos animais alimentados com
a dieta hipercolesterolemiante, aliada a uma redução de aproximadamente 83% na
concentração do colesterol-HDL quando comparados aos grupos C e CAb. Todavia, estes
elevados níveis de colesterol total e não-HDL foram significativamente reduzidos quando
o A. blazei foi adicionado à dieta, sendo encontrada uma interação entre o cogumelo e a
dieta para estes parâmetros. Não foi observada diferença estatística para a média das
concentrações de colesterol total entre os grupos C (2,24 ± 0,19 mmol/L) e CAb (2,24 ±
0,25 mmol/L). No entanto, as diferenças foram significativas ao compararmos os grupos H
51
MIRANDA, A. M.
Resultados
(8,40 ± 3,02 mmol/L) e HAb (3,74 ± 0,91 mmol/L), com o grupo HAb apresentando uma
redução de aproximadamente 55% nos níveis deste metabólito quando comparado ao
grupo H. Este mesmo perfil pode ser observado para a fração não-HDL do colesterol, onde
as médias dos grupos C (0,57 ± 0,18 mmol/L) e CAb (0,43 ± 0,12 mmol/L) foram
similares e a suplementação com o A. blazei reduziu significativamente a concentração de
colesterol não-HDL no grupo HAb (3,38 ± 0,91 mmol/L) quando comparado ao grupo H
(8,17 ± 3,03 mmol/L). Estas alterações do colesterol não-HDL refletiram no índice
aterogênico onde os animais do grupo H (38,64 ± 22,66) apresentaram o maior índice
quando comparados ao HAb (11,15 ± 9,01) e aos controles, C (0,34 ± 0,13) e CAb (0,24 ±
0,08), que foram estatisticamente semelhantes entre si.
A análise dos dados relacionados à fração HDL demonstra que os animais
submetidos a uma dieta hipercolesterolemiante, H (0,23 ± 0,03 mmol/L) e HAb (0,38 ±
0,05 mmol/L) apresentaram os menores níveis para esse parâmetro quando comparados aos
grupos que receberam a dieta controle, C (1,67 ± 0,12 mmol/L) e CAb (1,87 ± 0,14
mmol/L).
Uma redução significativa também foi observada com relação à concentração sérica
de triacilgliceróis dos animais submetidos à dieta controle suplementada com o cogumelo,
mostrando ter ocorrido uma interação entre o tipo de dieta e a suplementação com o
cogumelo. Tal fato fez com que a média de triacilgliceróis do grupo CAb (0,60 ± 0,06
mmol/L) fosse significativamente menor (próximo a 36%) que a do grupo C (0,94 ± 0,19
mmol/L), com os grupos H (0,50 ± 0,10 mmol/L) e HAb ( 0,50 ± 0,28 mmol/L)
apresentando valores similares entre si e estatisticamente semelhantes ao grupo CAb.
52
MIRANDA, A. M.
Resultados
Tabela VIII: Concentrações séricas do colesterol total, colesterol não-HDL, colesterol HDL,
triacilgliceróis e índice aterogênico de grupos de animais alimentados com dieta padrão (C), dieta
padrão + A. blazei a 1% (CAb), dieta hipercolesterolemiante (H) e dieta hipercolesterolemiante + A.
blazei a 1% (HAb).
ANOVA (Valor P )
Dieta
Dieta
Ab
X
Ab
C
CAb
H
HAb
Colesterol Total
(mmol/L)
Colesterol não HDL
(mmol/L)
Colesterol HDL
(mmol/L)†
Triacilgliceróis
(mmol/L)
2,24 ± 0,19b
2,24 ± 0,25b
8,40 ± 3,02a
3,74 ± 0,91b
0,05
0,05
0,05
0,57 ± 0,18c
0,43 ± 0,12c
8,17 ± 3,03a
3,38 ± 0,91b
0,05
0,05
0,05
1,67 ± 0,12a
1,87 ± 0,14a
0,23 ± 0,03b
0,38 ± 0,05b
-
-
-
0,94 ± 0,19a
0,60 ± 0,06b
0,50 ± 0,10b
0,50 ± 0,28b
0,05
<0,05
0,05
Índice aterogênico**
0,34 ± 0,13b
0,24 ± 0,08b
38,64 ± 22,66a 11,15 ± 9,01b
0,05
0,05
0,05
* Os dados são apresentados como media ± desvio padrão (n = 8). Letras diferentes sobrescritas indicam diferença estatística
significativa na mesma linha (P < 0.05). † Dados analisados pelo teste não paramétrico de Kruskal-Wallis.
** Índice aterogênico = (Colesterol não HDL) / (HDL colesterol). HDL: Lipoproteína de alta densidade. NS: Não significativo.
Colesterol não HDL = (Colesterol Total) – (HDL colesterol). Ab = Agaricus blazei.
5.4.2 - Lipídios Hepáticos e Fecais
A tabela IX mostra os valores da porcentagem de gordura total no fígado e as
concentrações hepáticas de colesterol total e triacilgliceróis, assim como a porcentagem de
gordura obtida nas fezes.
A porcentagem de gordura hepática, assim como a concentração hepática de
colesterol total foram influenciadas pela dieta e pelo Agaricus blazei. Tanto a dieta
hipercolesterolemiante como a suplementação com o cogumelo aumentaram o percentual
de gordura hepática quando comparados ao grupo C. Uma interação foi observada para os
níveis hepáticos de colesterol total, em que os grupos H (6,93 ± 1,29), HAb (6,34 ± 2,15) e
CAb (7,34 ± 2,52) apresentaram valores semelhantes entre si quando comparados ao C
(2,18 ± 1,87). Com relação aos níveis de triacilgliceróis, não foi observada qualquer
influência, seja pela dieta, seja pela suplementação com o cogumelo.
Quanto à porcentagem de gordura fecal, os resultados obtidos mostraram uma
interação entre a dieta e o cogumelo. Os animais do grupo HAb (41,67± 7,53),
apresentaram os maiores valores, seguido do grupo H (21,67 ± 7,53). Já os animais dos
grupos controle apresentaram os menores valores C (13,33 ± 5,16) e CAb (18,33 ± 7,53).
53
MIRANDA, A. M.
Resultados
Tabela IX: Porcentagem de gordura hepática e fecal e concentrações do colesterol total e
triacilgliceróis no fígado de grupos de animais alimentados com dieta padrão (C), dieta padrão + A.
blazei a 1% (CAb), dieta hipercolesterolemiante (H) e dieta hipercolesterolemiante + A. blazei a
1% (HAb).
ANOVA (Valor P )
Dieta
Dieta
Ab
X
Ab
C
CAb
H
HAb
% Gordura hepática
12,23 ± 7,54
25,64 ± 4,00
41,90 ± 7,89
49,13 ± 18,43
0,05
0,05
NS
Colesterol Total
2,18 ± 1,87b
7,34 ± 2,52a
6,93 ± 1,29a
6,34 ± 2,15a
0,05
0,05
0,05
Triacilgliceróis
3,10 ± 2,82
3,34 ± 0,62
2,22 ± 0,68
4,35 ± 1,17
NS
NS
NS
% Gordura Fecal
13,33 ± 5,16b
0,05
0,05
0,05
18,33 ± 7,53b 21,67 ± 7,53a,b 41,67 ± 7,53a
5.5 - Marcadores de estresse oxidativo
5.5.1 - Grupos sulfidrilas, TBARS e Proteína Carbonilada
Como biomarcadores do estresse oxidativo, o nível sérico do grupo sulfidrilas totais
assim como a concentração hepática de proteína carbonilada e substâncias reativas ao
ácido tiobarbitúrico - TBARS foram avaliados (Tabela X).
Uma interação entre a dieta e o cogumelo foi observada na concentração dos grupos
sulfidrilas totais. A dieta hipercolesterolemiante acrescida do Agaricus blazei, HAb
(195,64 ± 17,81µmol/L), reduziu significativamente os níveis dos grupos sulfidrilas totais
quando comparada aos grupos CAb (234,61 ± 15,91µmol/L), H (219,76 ± 14,73 µmol/L) e
C (219,76 ± 13,93 µmol/L), que foram estatisticamente semelhantes entre si.
Em relação à concentração de TBARS, a análise dos dados revela apenas um efeito
da dieta. As dietas hipercolesterolemiantes, H e HAb aumentaram significativamente os
níveis de TBARS quando comparadas às controles, C e CAb.
A dieta e o cogumelo influenciaram na concentração de proteínas carboniladas. A
adição de cogumelo à dieta hipercolesterolemiante aumentou em 20% o nível de
carbonilação protéica quando comparada às demais, que mantiveram valores similares
entre si.
54
MIRANDA, A. M.
Resultados
Tabela X: Concentração sérica de sulfidrilas totais e concentração hepática de TBARS e proteína
carbonilada de grupos de animais alimentados com dieta padrão (C), dieta padrão + A. blazei a 1%
(CAb), dieta hipercolesterolemiante (H) e dieta hipercolesterolemiante + A. blazei a 1% (HAb).
C
CAb
H
HAb
Sulfidrilas Totais
219,76 ± 13,93a 234,61 ± 15,91a 219,76 ± 14,73a 195,64 ±17,81b
( mol/L)
TBAR
0,79 ± 0,31
0,94 ± 0,42
1,29 ± 0,81 2,03 ± 1,29
(U/mL/mg prot)
Proteína carbonilada
8,65 ± 1,52
8,24 ± 1,89
8,95 ± 1,55
10,82 ± 1,55
(nmol/mg prot)
ANOVA (Valor P )
Dieta
Dieta
Ab
X
Ab
<0,05
NS
<0,05
<0,05
NS
NS
<0,05
<0,05
NS
estatística significativa na mesma linha (P<0,05). NS: não significativo. TBARS: Substâncias Reativas ao Ácido
Tiobarbitúrico. Ab: Agaricus blazei.
5.6 - Defesas antioxidantes
5.6.1 - Glutationa total em tecido e Paraoxonase
A tabela XI apresenta os valores da concentração hepática de glutationa total.
Os resultados obtidos para glutationa total mostraram apenas um efeito da dieta. A
dieta hipercolesterolemiante reduziu significativamente os níveis deste metabólito, não
sendo observado efeito da suplementação do cogumelo.
Junto aos dados da concentração hepática de glutationa total, investigamos o status
antioxidante dos animais ao mensurar a atividade sérica da PON utilizando o fenilacetato e
o paraoxon como substratos.
A dieta hipercolesterolemiante reduziu em 55% a atividade arilesterásica da PON
nos grupos H e HAb em relação aos grupos C e CAb. A análise da interação entre a dieta e
o cogumelo revelou que a adição do A. blazei, tanto na dieta hipercolesterolemiante quanto
na dieta controle provocou uma redução desta atividade.
Assim como os resultados encontrados para a PON - atividade arilesterase, a
atividade paraoxonase também foi reduzida pela dieta hipercolesterolemiante. Porém,
apenas um efeito da dieta foi observado, não sendo identificado qualquer efeito do
cogumelo, seja na dieta hipercolesterolemiante, seja na controle.
55
MIRANDA, A. M.
Resultados
Tabela XI: Concentração hepática de glutationa total e atividade arilesterásica e paraoxonase da
enzima paraoxonase no soro de grupos de animais alimentados com dieta padrão (C), dieta padrão +
A. blazei a 1% (CAb), dieta hipercolesterolemiante (H) e dieta hipercolesterolemiante + A. blazei a
1% (HAb).
PON - arilesterase
(U/mL)
PON - paroxon
(U/mL)
Glutationa total
(nmoles/mL)
ANOVA (Valor P )
Dieta
Dieta
Ab
X
Ab
C
CAb
H
HAb
43,19 ± 4,64a
37,50 ± 6,12a
20,15 ± 3,61b
15,84 ± 4,30b
<0,05
NS
<0,05
0,18 ± 0,01
0,18 ± 0,02
0,07 ± 0,02
0,07 ± 0,04
<0,05
NS
NS
<0,05
NS
NS
261,40 ± 43,88 261,91 ± 45,58 128,42 ± 68,85 127,09 ± 84,43
56
DISCUSSÃO DOS RESULTADOS
MIRANDA, A. M.
Discussão
CAPÍTULO 6 - DISCUSSÃO
CARACTERIZAÇÃO BROMATOLÓGICA DO Agaricus blazei
Atualmente, os alimentos contendo nutrientes funcionais estão entre as principais
demandas da sociedade de consumo, pois os mesmos, além de nutrir, trazem benefícios
adicionais à saúde (BRITO e VOLP, 2010).
O valor nutritivo de um alimento é expresso, de forma geral, pela sua composição
centesimal. Essa composição reflete a proporção dos grupos homogêneos de substâncias
presentes em 100g do alimento considerado. Umidade, cinzas ou resíduo mineral fixo,
proteínas, lipídios ou extrato etéreo, carboidratos e fibras são os grupos de substâncias
consideradas homogêneas, ou seja, são aqueles que se encontram em todos os alimentos
(LIMA e CARVALHO, 1998).
Os cogumelos comestíveis são, em geral, alimentos de alto valor nutricional, com
quantidades significativas de proteínas e carboidratos, além de possuírem baixo teor de
gordura (FURLANI e GODOY, 2005). No entanto, são raros os dados na literatura sobre a
composição dos cogumelos comestíveis cultivados no Brasil. Especificamente com relação
ao Agaricus blazei, poucos são os dados disponíveis sobre sua composição e valor
nutricional. A tabela II resume a composição centesimal do cogumelo utilizado nesse
estudo.
Os valores encontrados para umidade (9,4%), em base seca, assemelham-se aos
obtidos em outros estudos sobre a composição do A. blazei (OLIVEIRA et al., 1999;
EIRA, 2003), assim como para outras espécies como Agaricus bisporus (8,95%), Lentinula
edodes (9%), Pleurotus florida (9,1%) e Pleurotus ostreatus (9,3%) (EIRA, 2003). Esses
resultados confirmam, portanto, o alto valor de umidade encontrado nesses alimentos.
Pedroso e Tamai (2001) encontraram para o basidiocarpo desidratado do Agaricus
blazei teores de cinza que variaram de 5 a 7%, resultados semelhantes aos encontrados em
nosso estudo (8,18%) e aos observados por Oliveira et al. (1999). Contudo, uma variação
pode ser observada quando outras espécies são analisadas. Como exemplo, cita-se o estudo
realizado por Furlani e Godoy (2005), onde os teores de cinza de cada uma das espécies, a
saber, Agaricus bisporus, Lentinula edodes e Pleurotus spp. variaram de acordo com o lote
avaliado.
57
MIRANDA, A. M.
Discussão
Sabe-se que são inúmeros os fatores que podem influenciar na composição dos
cogumelos, dentre eles as condições de cultivo, solo, clima e substrato utilizado. Os
cogumelos são considerados boas fontes de proteína, sendo muitas vezes comparados aos
produtos de origem animal. Segundo Furlani e Godoy (2005), talvez o substrato, dentre
estes fatores, seja o principal a influenciar os teores desse nutriente. Uma variação também
pode ser observada em função do fator de correção utilizado para se calcular o teor de
proteína a partir do conteúdo de nitrogênio orgânico. O fator 6,25 – utilizado para a
maioria dos alimentos – assume que as proteínas contêm 16% de nitrogênio e que são
totalmente digeríveis. Contudo, esse fator despreza quantidades de compostos nitrogenados
não protéicos presentes na maioria dos alimentos e que são comumente insignificantes.
Porém, no caso dos cogumelos, que possuem uma quantidade significativa de quitina em
suas paredes celulares, outro fator deve ser considerado (FURLANI e GODOY, 2005). Em
nosso estudo, o fator utilizado foi o de 4,38. Este fator assume que apenas 70% dos
compostos nitrogenados existentes no cogumelo sejam digeríveis pelo organismo humano.
Oliveira et al. (1999), por exemplo, utilizaram 6,25 como fator de correção, encontrando
aproximadamente 30,13% de proteína para o Agaricus blazei. A análise bromatólogica
desse mesmo cogumelo feita por Celso (2002 apud EIRA, 2003), mostrou valores
semelhantes, 28,94 a 35,88%, no entanto, o fator de correção utilizado não foi
especificado. Os dados obtidos revelam que o A. blazei, possui um maior conteúdo em
proteína quando comparado ao Pleurotus ostreatus e Lentinula edodes. Esses valores
variaram ainda em função da linhagem utilizada e do estádio do basidioma (aberto ou
fechado). Para Pedroso e Tamai (2001), o basidiocarpo desidratado do Agaricus blazei
contém de 40 a 45% de proteínas. Porém, em nosso estudo o valor encontrado para esse
nutriente foi de 17,81%. Esse resultado, ao contrário do mencionado acima, assemelha-se
ao encontrado para o Lentinula edodes (19,49%) (CELSO, 2002 apud EIRA, 2003).
Outro aspecto importante relatado por alguns pesquisadores refere-se às diferenças
que podem ser atribuídas a esse nutriente quando o tamanho e o estádio de maturação são
considerados. Shibata e Demiate (2003) encontraram diferenças significativas com relação
ao tamanho dos cogumelos, com os menores apresentando maiores teores de proteína,
principalmente na região do píleo. Relatam ainda que os cogumelos jovens possuem um
teor de proteína maior do que os maduros.
Os cogumelos comestíveis geralmente apresentam um baixo conteúdo em lipídios,
na maioria das vezes uma quantidade menor do que 5% do peso seco. Os valores
58
MIRANDA, A. M.
Discussão
encontrados em nosso estudo (1,22%) são similares aos relatados por outros autores, tanto
para esta espécie de cogumelo (OLIVEIRA et al., 1999), quanto para outras espécies,
como no caso do Pleurotus spp (STURION e OETTERER, 1995).
O conteúdo total em carboidratos, tanto para os digeríveis quanto para os não
digeríveis, varia de acordo com a espécie, ficando entre 35 a 70% do peso seco (DÍEZ e
ALVAREZ, 2001; LONGVAH e DEOSTHALE, 1998; MAU et al., 2001). Seguidos da
umidade (quando in natura), os carboidratos são os constituites que estão em maiores
quantidades no cogumelo. Na maioria dos trabalhos descritos na literatura, o teor de
carboidratos em cogumelos é calculado por diferença (MANZI,
AGUZZI e
PIZZOFERRATO, 2001; YANG, LIN e MAU, 2001). Para esse nutriente, encontramos
um teor de 39,41%. Esse valor, assemelha-se ao encontrado para a mesma espécie descrito
em outros trabalhos, como 34,78% (OLIVEIRA et al., 1999) e 38,3% (COPERCOM apud
EIRA, 2003), sendo, contudo, menor do que o observado para outras espécies como
Agaricus bisporus (54,12%), Lentinula edodes (69,58%) e Pleurotus spp. (65,82%)
(FURLANI e GODOY, 2005).
Com relação aos teores de fibra, uma grande diferença é observada, visto que várias
metodologias são utilizadas, o que por vezes pode interferir com os reais valores desse
nutriente. Segundo Mizuno (2002), o Agaricus blazei apresenta altos teores de fibras
alimentares, em média 20-28%, como as β-glucanas, quitina, hemiceluloses e pectina. No
presente trabalho, nosso objetivo foi encontrar os valores de fibra total, sem diferenciá-las,
portanto, em solúveis ou insolúveis. Nesse sentido, o método utilizado foi o da
determinação em detergente neutro, que nos forneceu um valor de 23,98%. Oliveira et al.
(1999), utilizando o método de Weende, encontraram 14,57% para a mesma espécie. Por
este método são determinadas as frações de celulose e lignina insolúvel. Já pela
determinação em detergente neutro, celulose, hemicelulose e lignina são as frações
encontradas. Em muitos trabalhos, no entanto, o método utilizado não é mencionado. Dada
a importância das fibras na alimentação e sua íntima relação com o desenvolvimento de
doenças e promoção da saúde, este fato deve ser considerado a fim de minimizar possíveis
erros relacionados à inadequada determinação desse nutriente.
Como vimos, a composição centesimal do Agaricus blazei pode variar em relação a
alguns nutrientes, o que justifica e ressalta a necessidade de que a mesma seja determinada.
Nesse sentido, as maiores alterações encontradas foram em relação ao conteúdo de
proteínas, valor que se mostrou abaixo do que vem sendo descrito na literatura. Tal
59
MIRANDA, A. M.
Discussão
alteração pode estar relacionada, além dos fatores já mencionados, ao fator de conversão
utilizado. Apesar dessa variação, pode-se concluir que o Agaricus blazei consiste em um
alimento com considerável valor nutricional, apresentando teores significativos de
proteínas e fibras, além do baixo teor em gorduras.
PARÂMETROS BIOMÉTRICOS
O consumo de cogumelos, principalmente os da ordem Agaricales, vêm
aumentando muito nas últimas décadas. Por suas características nutricionais, medicinais e
farmacológicas, esses fungos vêm sendo muito utilizados como coadjuvantes a muitos
tratamentos medicamentosos. Caramori e colaboradores (2003) avaliaram a influência da
suplementação dietética do cogumelo do sol na evolução do estado nutricional e do
tratamento da hepatite C. Nesse trabalho, o cogumelo atuou como um importante
coadjuvante no tratamento dessa patologia, na medida em que melhorou o apetite dos
pacientes, que costumam emagrecer muito (EIRA, 2003). Esse mesmo efeito foi observado
por Ahn et al. (2004). Os autores observaram que os pacientes com câncer ginecológico
que recebiam a suplementação com o Agaricus blazei apresentavam uma significativa
melhora de seu estado nutricional, o que nem sempre era observado no grupo placebo.
Nesse sentido, achamos importante verificar quais seriam os efeitos desse cogumelo sobre
os parâmetros biométricos de animais normo e hipercolesterolêmicos.
Os dados referentes à ingestão alimentar em nosso experimento mostraram que os
animais do grupo hipercolesterolêmico que receberam a suplementação com o Agaricus
blazei apresentaram uma maior ingestão quando comparados aos outros grupos, seguidos
pelo grupo hiper. Estudos têm sugerido que a ingestão de alimentos calóricos e com altas
taxas de gordura fazem com que as partes do cérebro que lidam com o prazer deterioremse gradativamente, à medida que o consumo aumenta. Recentemente, estudo realizado por
Johnson e Kenny (2010), mostraram que animais submetidos a uma dieta semelhante à de
cafeteria, rica em açúcares e gordura, apresentavam uma maior ingestão quando
comparados aos outros grupos controle e com acesso restrito aos alimentos. Os dados
demonstram que o consumo excessivo de alimentos “saborosos” desencadeia dependência
com respostas neuroadaptativas nos circuitos cerebrais de recompensa, impulsionando o
desenvolvimento do “comer” compulsivo. Tal fato assemelharia-se à dependência
desenvolvida por usuários de drogas, como a cocaína e heroína.
60
MIRANDA, A. M.
Discussão
Por outro lado, essa maior ingestão do grupo HAb quando comparado ao H não
refletiu em maior ganho de peso por parte desse grupo. Com relação ao ganho de peso, as
alterações ficaram a cargo apenas da dieta hipercolesterolemiante, não havendo diferença
significativa quando da suplementação com o Agaricus blazei. Cheung (1998), ao estudar
os efeitos da suplementação da dieta com o micélio e com o corpo de frutificação do
Volvariella volvacea (5%) não encontrou diferenças significativas com relação ao peso ou
mesmo em relação à ingestão alimentar. O mesmo foi observado por Bobek, Ozdin e
Galbavy (1998) que ao estudarem os efeitos do Pleurotus ostreatus em ratos não observou
qualquer alteração do peso, seja para as diferentes doses utilizadas (1; 2,5 e 5%), seja em
relação ao tempo do experimento (8, 16, 28 e 52 semanas). Em relação ao nosso estudo,
podemos inferir que a maior ingestão por parte dos grupos H e HAb seja responsável, junto
ao conteúdo calórico da dieta, pelo maior ganho de peso observado para esses grupos.
Sabe-se que o excesso de gordura corporal é responsável por uma série de
complicações endócrinas e metabólicas, que geralmente são combatidas mediante o uso de
drogas e a modificação do estilo de vida, esta última através de mudanças nos hábitos
alimentares e da prática de exercícios físicos, por exemplo. Nesse sentido, outro achado
importante remete-se aos valores encontrados para a gordura abdominal, onde os animais
do grupo HAb tiveram seus valores reduzidos a níveis próximos à normalidade. Esses
dados se confirmaram quando o peso relativo da respectiva gordura foi aferido e o efeito
mantido. Esses dados são sugestivos de que o A. blazei possa suprimir significativamente o
sobrepeso corporal. Redução semelhante foi encontrada em um estudo feito por Haiping,
Mingming Zhang e Guiji (2009), ao avaliarem o efeito hipolipidêmico dos polissacarídeos
isolados do Pholiota nameko.
Já em relação à excreção fecal, observamos uma redução da mesma quando o grupo
HAb foi comparado ao H. O contrário foi observado por Cheung (1998), em que a
suplementação da dieta hipercolesterolemiante com o cogumelo apresentou uma excreção
fecal significativa. Essa diferença, no entanto, pode estar relacionada à concentração do
cogumelo utilizada nos dois experimentos – nossa concentração foi de 1% em substituição
ao amido de milho e a do estudo acima foi de 5% em substituição à fibra. Matos et al.
(2005)
também
encontraram
uma
maior
excreção
fecal
para
os
grupos
hipercolesterolêmicos que tiveram suas dietas acrescidas de um conteúdo maior de fibras.
Contudo, o fato do cogumelo ter sido utilizado como alimento e não somente como uma
fonte de fibra deve ser levado em consideração. A possível presença de fatores
61
MIRANDA, A. M.
Discussão
antinutricionais no A. blazei (questão ainda não esclarecida pela literatura) aliada a seu alto
teor em fibras deve ser considerada a fim de avaliar as possíveis interferências no processo
de digestão e absorção de alimentos contendo teores significativos desse nutriente, nos
quais existe a probabilidade de interações entre si e com esses fatores.
METABOLISMO NITROGENADO E GLICÍDICO
O consumo de cogumelos vem aumentando consideravelmente por todo o mundo.
Contudo, isso vem sendo acompanhado por um aumento dos novos tipos de intoxicações
decorrentes do consumo prolongado desses fungos. Em estudo realizado por Pinto et al.
(2000), os extratos aquosos do Agaricus blazei obtidos por fervura diminuíram a sobrevida
de camundongos portadores de tumor, o que foi atribuído a prováveis efeitos
hepatotóxicos. Relatos sobre uma possível sobrecarga renal também foram evidenciados,
visto o alto conteúdo em bases púricas e pirimídicas encontradas em alguns
microorganismos (KIHLBERG apud EIRA, 2003). Por outro lado, efeito hepatoprotetor
também tem sido verificado em algumas espécies de cogumelos (HSU et al., 2008). Nesse
sentido, os parâmetros relacionados ao metabolismo nitrogenado e glicídico foram
avaliados a fim de verificar uma possível toxicidade do cogumelo.
O fígado é o órgão mais importante na manutenção da homeostase do colesterol,
assim como é bem conhecido por seu papel central no metabolismo dos carboidratos e das
proteínas. Dada sua versatilidade metabólica, é a sede central de reconhecimento e
reciclagem para o corpo. É o local onde os catabólitos produzidos são detoxificados, como
por exemplo, pela desaminação de aminoácidos produzindo uréia. É o responsável pela
manutenção dos níveis glicêmicos, seja através da captação e estoque de glicose como
glicogênio, seja quebrando a mesma quando necessário. Encarrega-se ainda da síntese e
secreção de ácidos biliares, síntese de lipoproteínas e síntese de outras proteínas
plasmáticas. É o único órgão responsável pela produção da albumina.
Um dano hepático, seja agudo ou crônico, ocasionalmente resultará em um
aumento da atividade sérica das aminotransferases. A ALT e a AST são enzimas
intracelulares presentes em grandes quantidades no citoplasma dos hepatócitos. A ALT é
encontrada principalmente no citoplasma do hepatócito, enquanto 80% da AST está
presente na mitocôndria. Essa diferença tem auxiliado no diagnóstico e prognóstico de
doenças hepáticas. Em dano hepatocelular leve a forma predominante no soro é a
citoplasmática, enquanto que em lesões graves há liberação da enzima mitocondrial,
62
MIRANDA, A. M.
Discussão
elevando a relação AST/ALT (MOTTA, 2003). Já quando nos referimos às alterações
hepáticas de predominância colestática, encontramos a fosfatase alcalina. Essa enzima
transporta metabólitos ao longo das membranas celulares. Embora a fosfatase possa ser
originada de outros tecidos como placenta, rins, intestino ou leucócitos, as doenças
hepáticas e dos ossos são as causas mais comuns de sua elevação.
A atividade das aminotransferases ALT, AST e da FA foi verificada para
observarmos se as alterações do metabolismo lipídico estavam provocando algum dano
hepático. Como esperado, a dieta hipercolesterolemiante oferecida aos animais durante
nosso experimento ocasionou um prejuízo hepático, levando ao aumento do estresse
oxidativo e dos níveis de colesterol neste órgão. A lesão hepática foi caracterizada por
hepatomegalia e aumento da atividade das enzimas AST, ALT e da FA. Contudo, essas
alterações ficaram a cargo apenas da dieta hipercolesterolemiante, não sendo observado
qualquer efeito por parte do cogumelo. Na tabela IV, encontramos um aumento de
aproximadamente 86% no peso do fígado dos animais hipercolesterolêmicos (H e HAb).
Nieminen, Karja e Mustonen (2009) afirmaram que as doses e o período de tempo
normalmente requeridos para que os cogumelos exerçam seus efeitos benéficos podem
também estar associados ao surgimento de efeitos indesejáveis. Em seu estudo, o efeito
hepatotóxico foi observado pelo aumento da concentração plasmática de bilirrubina e da
atividade de AST e ALT por ação dos cogumelos Agaricus bisporus, Lentinula edodes e
Pleurotus ostreatus.
Segundo Hsu et al. (2008), os extratos do Agaricus blazei (3 cápsulas-500mg/dia
durante 12 meses) podem ser eficazes em normalizar a função hepática de pacientes com
hepatite B crônica. Em nosso estudo, entretanto, o Agaricus blazei não exerceu qualquer
influência sobre os parâmetros hepáticos. No entanto, a diferença obtida entre os estudos
nos permite supor que a dose utilizada, a forma de administração e a duração dos
experimentos possam ter sido fatores cruciais na obtenção desses efeitos.
Muitas funções biológicas têm sido atribuídas aos polissacarídeos encontrados em
fungos, principalmente as glucanas. Hoje, muito se tem investigado sobre seu potencial
nutricional e farmacológico. Dentre as propriedades relatadas na literatura relacionadas aos
benefícios do A. blazei, tem-se demonstrado que o tipo de fibra presente nesse cogumelo
mantém íntima relação com os níveis séricos de glicose. Estudo realizado por Kim et al.
(2005) mostrou que tanto a β-glucana, extraída do Agaricus blazei, como os
oligossacarídios preparados a partir dessa fibra apresentaram efeitos hipoglicemiantes in
63
MIRANDA, A. M.
Discussão
vitro e in vivo em ratos diabéticos. Os autores observaram ainda que os oligossacarídeos
apresentaram uma atividade duas vezes maior do que a β-glucana.
Estudos têm demonstrado também que extratos do Agaricus blazei são efetivos em
melhorar os níveis glicêmicos de pacientes com diabetes tipo II na medida em que reduzem
a resistência à insulina. O mecanismo pelo qual esse extrato estaria diminuindo a
resistência parece relacionar-se a um aumento na concentração de adiponectina (HSU et al.
2007). Por outro lado, DI NASO et al. (2010) não encontraram efeito hipoglicemiante do
A. blazei ao avaliarem seus efeitos no tecido pulmonar de animais diabéticos induzidos por
estreptozotocina. Os autores atribuíram a ausência desse efeito à utilização de um extrato
bruto do cogumelo, sem isolar qualquer substância. Em nosso experimento, no qual
utilizamos animais normoglicêmicos, não foi observada qualquer alteração do Agaricus
blazei em relação aos níveis glicêmicos. Os grupos foram semelhantes entre si com relação
a esse parâmetro.
Já em relação aos níveis de albumina, uma redução significativa foi observada em
nosso experimento para o grupo HAb. Quando nos remetemos à análise dos dados para as
proteínas totais, os mesmos não apresentaram diferenças significativas entre os grupos.
Cabe lembrar que a dosagem isolada da proteína total tem pouco valor, uma vez que a
alteração em uma das frações pode ser compensada por alteração oposta de outra fração
como ocorre, por exemplo, nas doenças crônicas (MOTTA, 2003). No entanto, quando
analisadas em conjunto com os dados referentes à albumina, verificou-se um aumento nos
níveis de globulinas. A concentração de globulinas por sua vez, é obtida pelo cálculo da
diferença de concentração das proteínas totais e da albumina. Apesar de agirem como
indicadores limitados do metabolismo protéico, as globulinas adquirem grande importância
como indicadores de processos inflamatórios. Gonçalves (2007), ao avaliar os efeitos da
suplementação dietética com A. blazei (5%) e suas implicações na aterogênese em
camundongos APO-E -/-, observou que o mesmo não modificou o metabolismo lipídico, os
níveis glicêmicos ou a peroxidação lipídica. No entanto, induziram um aumento na lesão
aterosclerótica, que foi atribuído a uma provável ativação do estado inflamatório.
As dislipidemias contribuem para a progressão da aterosclerose e doenças crônicas
nos rins e estas, por sua vez, levam ao desenvolvimento de anormalidades no metabolismo
lipídico, o que contribui para o aumento das doenças cardiovasculares (ABRASS, 2004;
ZAGER, ANDOH e BENNETT, 2001). O sistema renal exerce papel fundamental sobre a
regulação dos líquidos e eletrólitos. Além disso, a eliminação dos resíduos metabólicos é
64
MIRANDA, A. M.
Discussão
essencial para a homeostase corpórea. Nesse sentido, as concentrações plasmáticas de
creatinina e uréia também foram avaliadas.
Para o peso dos rins, observamos em nosso estudo apenas um efeito da dieta com os
grupos hipercolesterolêmicos apresentando as maiores médias. Contudo, ao fazermos a
relação entre o peso do órgão e o peso corporal do animal, o efeito não foi mantido. Em
relação à uréia, nenhuma alteração foi observada. Quanto à creatinina, um aumento foi
observado para o grupo H e para os grupos que tiveram suas dietas acrescidas do Agaricus
blazei. Esses dados corroboram a literatura, na medida em que algumas espécies de
cogumelo, a saber, Pleurotus sajor caju e Marasmius oreades têm sido indicadas por
possuírem efeitos prejudiciais sobre a filtração glomerular (TAM et al., 1986; WARNER
et al., 2004). Segundo Tam et al. (1986), a utilização de extratos do Pleurotus sajor caju
reduziram a filtração glomerular por mais de 50% em menos de 1 hora, causando, portanto,
um prejuízo à hemodinâmica renal. Nessa mesma perspectiva, para Warner et al. (2004), a
lecitina presente no M. oreades teria causado uma lesão glomerular microangiopática em
camundongos. Por outro lado, a suplementação da dieta de camundongos com o micélio do
Agaricus blazei por 14 semanas não produziu qualquer alteração da função renal (STUTZ
et al., 2009).
Em relação aos parâmetros uréia e creatinina podemos observar que, embora os
níveis de uréia tenham se mantido inalterados nas condições experimentais estabelecidas,
um aumento considerável nos níveis de creatinina foi observado. Diferentemente do
observado para a uréia, que tem sua concentração afetada pela dieta e pelo estado de
nutrição e hidratação, consistindo assim em um indicador grosseiro da função renal, a
velocidade de excreção da creatinina é relativamente constante. Sua produção não é
influenciada pelo metabolismo protéico ou outros fatores externos, o que a torna uma
excelente medida para avaliar a função renal. Qualquer condição que reduza a filtração
glomerular promove uma menor excreção urinária de creatinina com conseqüente aumento
de sua concentração no plasma (MOTTA, 2003). Contudo, não se pode afirmar que o
Agaricus blazei esteja provocando algum prejuízo renal sem que para isso se investigue,
por exemplo, se esse aumento está ocorrendo como uma forma de compensar a ausência de
alterações ocorridas no metabolismo da uréia.
65
MIRANDA, A. M.
Discussão
METABOLISMO LIPÍDICO
A hipercolesterolemia é considerada o principal fator de risco para as doenças
cardiovasculares, em especial a aterosclerose (LEE et al., 2006). A elevação dos níveis
plasmáticos de colesterol de baixa densidade (LDL-c), a redução do colesterol de alta
densidade (HDL-c) e também o aumento dos triacilgliceróis (TG) são fatores de risco para
eventos cardiovasculares, sendo esta a principal causa de morte no mundo (MAGALHÃES
et al., 2004). Torna-se crescente, portanto, a busca por substâncias naturais eficazes em
reduzir e/ou regular a concentração de triacilgliceróis e colesterol plasmático. Nesse
sentido, as propriedades e peculiaridades dos cogumelos os tornam alvo importante de
pesquisa para os eventos associados à hiperlipidemia e aterosclerose (GUILLAMÓN et al.,
2010).
Diversos estudos vêm demonstrando os efeitos hipocolesterolêmicos de um número
cada vez maior de espécies de cogumelos, a saber, Grifola frondosa (Maitake)
(FUKUSHIMA et al., 2001; KUBO e NANBA, 1997), Lentinula edodes (Shiitake)
(FUKUSHIMA et al., 2001), Flammulina velutipes (Enokitake) (FUKUSHIMA et al.,
2001), Pleurotus ostreatus (Cogumelo ostra) (BOBEK, OZDIN e GALBAVY, 1998),
Polyporus confluens (SUGIYAMA et al., 1992), Ganoderma lucidum (Cogumelo Reishi)
(BERGER et al., 2004), Auricularia aurícula (CHEUNG, 1996), Tremella fuciforms
(CHEUNG, 1996) e Volvariella volvacea (Cogumelo palha) (CHEUNG, 1998). O
Agaricus blazei tem sido amplamente utilizado em diversos países orientais como alimento
funcional ou na forma de extrato medicinal, como um importante coadjuvante na
prevenção e tratamento de vários tipos de câncer. Na cultura popular, esse cogumelo vem
sendo usado contra uma variedade de doenças, tais como diabetes, aterosclerose,
hipercolesterolemia e doenças cardiovasculares (FIRENZUOLI et al., 2007). Até o
momento, a maioria dos estudos tem enfatizado a utilização do A. blazei na forma de
extratos concentrados. Com o objetivo de verificar a potencialidade deste cogumelo
enquanto alimento frente à hipercolesterolemia, o presente estudo avaliou os efeitos que as
dietas suplementadas com 1% do Agaricus blazei proporcionaram ao perfil lipídico de
ratas controle e hipercolesterolêmicas.
Conforme mencionado anteriormente, a literatura apresenta diversos trabalhos
envolvendo as mais variadas espécies de cogumelos e seus benefícios em relação aos
níveis de colesterol. Contudo, a maioria dos estudos envolvendo o Agaricus blazei referese ou à sua capacidade antitumoral através da utilização de extratos concentrados ou a
66
MIRANDA, A. M.
Discussão
observações, muitas vezes, sem caráter científico sobre seu emprego como um agente
hipocolesterolêmico. Nosso estudo, no entanto, fornece evidências de que a suplementação
da dieta com 1% do A. blazei melhora significativamente o perfil lipídico sérico nos
animais induzidos à hipercolesterolemia.
Embora alguns autores argumentem sobre a resistência que os ratos apresentam em
desenvolver hipercolesterolemia e aterosclerose (MACHADO et al., 2003; SANDERS,
1993), a dieta hipercolesterolemiante utilizada nesse experimento foi capaz de aumentar os
níveis séricos de colesterol total e colesterol não-HDL, reduzindo ao mesmo tempo a
fração HDL, o que reforça a utilização desse modelo animal para estudos relacionados à
hipercolesterolemia induzida pela dieta. Esses mesmos resultados indicam ainda a
eficiência da dieta hipercolesterolemiante utilizada. A dieta suplementada com 1% do
cogumelo foi capaz de reduzir o colesterol plasmático, embora essa mesma redução não
tenha sido observada para os animais normocolesterolêmicos. O mesmo foi observado por
Hossain et al. (2003) ao avaliar os efeitos da suplementação da dieta com 5% do Pleurotus
ostreatus. Segundo os autores, esse achado é sugestivo de que a suplementação da dieta
com o cogumelo não altera o metabolismo basal do colesterol. Ainda para esses autores,
esse resultado não exclui a possibilidade de que aumentando a ingestão ou o período de
experimentação
possam
se
alterar
os
níveis
de
colesterol
nesses
animais
normocolesterolêmicos. Tal afirmação é pertinente, na medida em que os animais dos
grupos controle (C e CAb) apresentaram uma menor ingestão quando comparados aos
demais. Interessante notar que embora a concentração utilizada dos cogumelos tenha sido
diferente nos dois experimentos, o período de 8 semanas utilizado por nós também não foi
suficiente para provocar alterações nesse grupo. Uma hipótese para esse resultado talvez
esteja na concentração utilizada.
Em geral, a presença de algumas substâncias específicas como a lovastatina e a
eritadenina, assim como de outros compostos bioativos, tornam os cogumelos importantes
alvos na pesquisa contra doenças cardiovasculares (GUILLAMÓN et al., 2010). O exato
mecanismo pelo qual esses fungos reduzem a hipercolesterolemia em ratos ainda não está
completamente elucidado. Redução no perfil lipídico sérico, aumento na excreção de
ácidos biliares e na expressão de receptores para LDL, modificação no metabolismo de
fosfolipídios hepáticos e a inibição da HMG-CoA redutase tem sido considerados como
possíveis responsáveis pelas propriedades hipocolesterolêmicas de algumas espécies de
cogumelos (FUKUSHIMA et al., 2000; HU et al., 2006; KHATUN et al., 2007).
67
MIRANDA, A. M.
Discussão
No caso do A. blazei, as β-glucanas têm recebido grande atenção, sendo
consideradas por alguns as responsáveis por esta redução. Segundo Kim et al. (2005), por
se tratar de uma fibra solúvel, as β-glucanas apresentam significativa importância na
redução do colesterol sangüíneo e na absorção de glicose pelos diabéticos. De fato, a
formação de um gel viscoso por essas fibras pode contribuir para inibir a absorção de
colesterol e triacilgliceróis. Historicamente, o efeito hipocolesterolêmico das fibras
solúveis tem sido atribuído à sua capacidade em aumentar a excreção fecal de ácidos
biliares e ácidos graxos de cadeia curta, como, por exemplo, o propionato que inibe a
incorporação do acetato aos lipídios séricos (WOLEVER et al., 1995). Contudo, os efeitos
observados em nosso estudo sugerem que o aumento na excreção fecal de gordura tenha
sido influenciado mais pelo conteúdo em gordura da dieta do que pelo conteúdo em fibras
do A. blazei. Com isso, o efeito fisiológico das fibras presentes nesse cogumelo, a exemplo
do que ocorre com os demais, provavelmente está associado a uma ação conjunta e
cumulativa de seus vários componentes. A β-glucana provavelmente exerce um efeito
crucial, contudo, outros componentes podem estar envolvidos em vários de seus efeitos
(MANZI e PIZZOFERRATO, 2000). O contrário, por exemplo, acontece com o Pleurotus
ostreatus e o Volvariella volvacea, que provavelmente atuam aumentando a atividade da
colesterol-7-α hidroxilase, uma enzima chave no catabolismo do colesterol, diminuindo,
portanto, a absorção intestinal de colesterol e aumentando sua excreção através das fezes
(CHEUNG, 1998; HOSSAIN et al., 2003). Outras substâncias, no entanto, podem estar
envolvidas no efeito hipocolesterolêmico do cogumelo do sol.
Os cogumelos acumulam uma variedade de metabólitos secundários como
compostos fenólicos, policetídeos, terpenos e esteróides (TURKOGLU et al., 2007).
Alguns estudos têm sugerido que compostos fenólicos podem inibir a absorção intestinal
de lipídios da dieta na medida em que formam complexos com essas biomoléculas,
interferindo assim no processo de emulsificação, solubilização e hidrólise das micelas
(BOSE et al., 2008; NAISSIDES et al., 2004). Ainda de acordo com Ikeda et al. (2005), o
consumo de compostos fenólicos poderia levar a uma redução nos níveis séricos de
triacilgliceróis, o que estaria associado à inibição da lipase pancreática por estes
compostos. Tal fato corrobora com nossos resultados, na medida em que uma redução
significativa nos níveis de triacilgliceróis foi encontrada nos animais controle que tiveram
suas dietas suplementadas com o cogumelo.
68
MIRANDA, A. M.
Discussão
Uma redução foi observada nos níveis do colesterol HDL nos animais dos grupos H
e HAb quando comparados aos controle C e CAb, porém, a razão colesterol nãoHDL/colesterol HDL – índice aterogênico – foi menor nos animais HAb, traduzindo um
importante efeito sobre os fatores de risco para a aterosclerose, na medida em que
considera-se que quanto menor esse índice, menor é a probabilidade de agregação
plaquetária nas artérias, menor o risco de doenças coronarianas e maiores são os efeitos
benéficos ao organismo. Haiping, Mingming Zhang e Guiji (2009) ao avaliarem o efeito
hipolipidêmico de polissacarídeos isolados do Pholiota nameko observaram um efeito
dose-dependente em relação ao índice aterogênico, com as maiores doses fornecendo os
melhores resultados para este marcador.
Com relação aos níveis séricos de triacilgliceróis, podemos observar uma redução
nos grupos CAb, H e HAb quando comparados ao controle. No caso dos grupos
alimentados com a dieta hipercolesterolemiante, os baixos níveis de triacilgliceróis
plasmáticos podem ser explicados pela alta quantidade de óleo insaturado usado nessas
dietas, aliado ao fato de que a maioria dos ácidos graxos presentes nesse cogumelo são
insaturados. Apesar dos cogumelos apresentarem quantidades reduzidas de gorduras totais
e baixos teores de ácidos graxos saturados, possuem alta porcentagem de ácidos graxos
poliinsaturados (BORCHERS et al., 1999). Alguns alimentos ricos nesses nutrientes
podem inibir importantes enzimas relacionadas ao metabolismo das LDL (CONNOR, DE
FRANCESCO, CONNOR, 1993). Segundo Fernandez e West (2005), a ingestão de ácidos
graxos insaturados leva à redução do colesterol total e da fração LDL na circulação, por
aumentar a expressão ou a atividade de receptores de LDL no fígado. No caso do A. blazei,
o ácido linoléico está entre os principais ácidos graxos insaturados encontrados nessa
espécie (EIRA, 2003), cerca de 70 a 80% dos lipídios totais (MIZUNO, 1995). Embora, o
perfil de ácidos graxos presentes nos cogumelos comestíveis possa estar intimamente
relacionado a uma redução nos níveis de colesterol, devemos ser cautelosos ao considerar
que o efeito do A. blazei, na concentração utilizada (1%) nesse estudo, tenha sido causado
exclusivamente por esse nutriente.
Hossain et al. (2003), ao avaliarem os efeitos da suplementação do Pleurotus
ostreatus (5%) na dieta de ratos normo e hipercolesterolêmicos, observaram um aumento
significativo nos níveis séricos de ácidos graxos poliinsaturados, tanto nos animais controle
quanto nos hipercolesterolêmicos. Pelos dados encontrados quando da suplementação da
69
MIRANDA, A. M.
Discussão
dieta controle com o A. blazei, sugerimos, portanto, que o mesmo, associado a uma dieta
saudável possa ser eficiente em reduzir os níveis séricos de triacilgliceróis.
Como vimos, o Agaricus blazei foi eficiente em reduzir os níveis séricos de
colesterol total, colesterol não HDL e triacilgliceróis, produzindo um significativo efeito
hipolipidêmico. Esse mesmo efeito foi observado por Fukushima et al. (2000), ao
suplementarem a dieta de ratos com as fibras do Agaricus bisporus. Segundo esses
pesquisadores, tal redução estaria relacionada a um aumento nos níveis de RNAm dos
receptores hepáticos de LDL. Nesse sentido, embora a abordagem do nosso trabalho não
nos permita propor mecanismos pelos quais o Agaricus blazei esteja reduzindo esses níveis
de colesterol, podemos sugerir que a suplementação da dieta hipercolesterolemiante com
este cogumelo possa estar envolvida no aumento da expressão dos receptores de LDL. Isso
poderia explicar, em parte, a redução do colesterol total observada em nossos animais, que
mesmo sob dieta hipercolesterolemiante poderiam continuar expressando os receptores de
LDL, promovendo sua captação.
Contudo, junto a esse efeito foi observada uma mudança no metabolismo hepático,
favorecendo a deposição de lipídios no fígado. Essa mesma deposição tem sido observada
em alguns estudos envolvendo a suplementação das dietas com ácidos graxos
poliinsaturados. Gaiva et al. (2003), investigando os efeitos de dietas ricas em ácidos
graxos ώ-3 e ώ-6 sobre o metabolismo hepático de ratos, verificaram que o enriquecimento
da dieta com o ώ-3 produzia hipolipidemia, mas favorecia o acúmulo desses lipídios no
fígado. Por outro lado, os efeitos do ώ-6 não parecem estar muito claros. Porém, os efeitos
sobre o metabolismo hepático foram diferentes quando uma fonte de ácidos graxos
poliinsaturados (óleo de linhaça) foi associada à fibra (goma arábica) (MELO et al. 2008),
sugerindo que o efeito combinado desses nutrientes tenha sido eficaz em reduzir os lípides
hepáticos. Considerando o Agaricus blazei como uma importante fonte de fibras e devido
ao fato de grande parte de seus lipídios serem constituídos por ácidos graxos
poliinsaturados, o que estaria levando ao acúmulo de lipídios? Estaria esse efeito
ocorrendo em função da dose utilizada? Estas são questões que ainda suscitam dúvidas,
uma vez que poucos estudos relativos às concentrações de colesterol hepático são
encontrados na literatura, o que permitiria compreender melhor o envolvimento de alguns
nutrientes no metabolismo lipídico de animais e mesmo em humanos.
Como vimos, diversos são os mecanismos que podem estar envolvidos no efeito
hipocolesterolemiante dos cogumelos. Especificamente no caso do Agaricus blazei, um
70
MIRANDA, A. M.
Discussão
conjunto de mecanismos parece estar envolvido no efeito hipolipidêmico desse cogumelo.
Além dos componentes já citados acima, os esteróis presentes nesses fungos, dada sua
característica estrutural similar a do colesterol, podem reduzir a absorção desse composto
por meio de uma inibição competitiva. Segundo Mizuno (1995), o Agaricus blazei possui
uma quantidade considerável de ergosterol. Da mesma forma, a quitina, um componente
encontrado normalmente em crustáceos e insetos, junto às β-glucanas consistem nos
principais componentes encontrados na parede celular dos fungos. Esse biopolímero,
através de sua conversão à quitosana, apresenta ótima afinidade pelos ácidos biliares.
Neyrinck et al. (2009), demonstraram que a suplementação das dietas de camundongos
obesos submetidos à dieta rica em gordura com 5% de quitosana fúngica (A. bisporus),
além de modular a absorção de lipídios, parece ter sido eficiente em reduzir a secreção de
adipocitocinas no soro, um fenômeno que poderia estar associado à redução da
adiposidade.
Contudo, dadas as características observadas nesse estudo, em que uma redução
significativa foi observada no perfil lipídico sérico acompanhada de uma redução
expressiva da adiposidade e um concomitante acúmulo hepático de lipídios, não podemos
descartar a possibilidade de que outro nutriente possa estar envolvido nos efeitos
promovidos pelo A. blazei. A eritadenina, por exemplo, presente em cogumelos como o
Lentinula edodes, parece não exercer seus efeitos por meio da inibição da colesterogênese
hepática ou por estímulo à excreção de esteróides nas fezes. Estudos tem sugerido que seu
efeito hipocolesterolêmico possa estar associado a uma depressão na secreção de colesterol
do fígado para a corrente sanguínea e/ou através de um aumento de sua captação pelos
tecidos extrahepáticos (SUGIYAMA, AKACHI e YAMAKAWA, 1995). Recentemente,
estudos tem demonstrado que o efeito hipocolesterolemiante desse composto possa estar
associado a alterações no metabolismo de fosfolipídios (SHIMADA, MORITA e
SUGIYAMA, 2003). Observa-se, portanto, a necessidade de um estudo minucioso a fim de
verificar o exato mecanismo pelo qual o Agaricus blazei estaria atuando sobre o
metabolismo dos lipídios, assim como investigar a presença de outras substâncias que
poderiam estar agindo nesse mecanismo, esclarecendo dessa forma o possível acúmulo de
gordura hepática ocorrido.
71
MIRANDA, A. M.
Discussão
MARCADORES DO ESTRESSE OXIDATIVO E DEFESAS ANTIOXIDANTES
Caracterizado como um desequilíbrio entre oxidantes/antioxidantes, o estresse
oxidativo desempenha um papel importante na gênese de inúmeras doenças como diabetes
mellitus, inflamação crônica, desordens neurodegenerativas e aterosclerose (HALLIWEL,
2006; MacNEE, 2000). Radicais livres ou espécies reativas de oxigênio podem contribuir
para o aparecimento dessas doenças ou estarem presentes em situações de toxicidade.
Esses radicais gerados no organismo podem atacar macromoléculas como proteínas, DNA
e membranas, prejudicando o funcionamento das mesmas através de alterações da fluidez,
permeabilidade e inativação de seus receptores (NIKI, 2004).
Tidos como uma das principais causas da disfunção endotelial que precede e
promove a aterogênese, os radicais livres, principalmente as espécies reativas de oxigênio,
são capazes de lesar as membranas celulares e o núcleo (WEVER et al., 1998). Inativam os
efeitos vasodilatadores por meio da interação com os mediadores vasomotores, agindo
principalmente na oxidação dos lipídios presentes na LDL, considerado o elemento chave
na aterosclerose (AVIRAM et al., 2000).
Nas últimas décadas, a procura por compostos naturais que possam atuar c omo
antioxidantes tem aumentado consideravelmente (OYETAYO, 2009). Estudos têm
demonstrado uma relação inversa entre o consumo de frutas e hortaliças, ricos em
antioxidantes, e a incidência de doenças como câncer, Alzheimer e aterosclerose
(WILLET, 2001).
A defesa contra o dano provocado pelos radicais livres é realizada pela utilização
de reservas antioxidantes celulares. Nesse sentido, a função primária dos antioxidantes é
reduzir a velocidade de iniciação e/ou propagação dos processos oxidativos, suprimindo a
geração de espécies reativas de oxigênio ou eliminando-as, diminuindo ou mesmo inibindo
o dano oxidativo a uma molécula alvo.
Nesse contexto, um antioxidante é qualquer substância que, presente em baixas
concentrações quando comparado àquelas do substrato oxidável, atrasa significativamente
ou mesmo evita a oxidação deste substrato (HALLIWELL e GUTTERIDGE, 1999). Nesse
sentido, os cogumelos têm sido considerados uma importante fonte de antioxidante,
possuindo compostos como os fenólicos (ácidos fenólicos e flavonóides) e tocoferóis
(FERREIRA, BARROS e ABREU, 2009).
Diante disso, dosamos alguns marcadores hepáticos do estresse oxidativo como as
substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) e as proteínas carboniladas, assim
72
MIRANDA, A. M.
Discussão
como os grupos sulfidrilas totais. As defesas antioxidantes, por sua vez, foram
determinadas a partir da atividade sérica da PON e dos níveis hepáticos de glutationa total.
Considerado a espécie mais reativa do sistema biológico, o radical hidroxila (OH•)
pode atuar inativando várias proteínas (enzimas e de membrana celular) ao oxidar seus
grupos sulfidrilas (-SH) a pontes dissulfeto (-SS). O mesmo pode iniciar a oxidação dos
ácidos graxos poliinsaturados das membranas celulares (lipoperoxidação). Os radicais
sulfidrilas representam todos os grupos tióis encontrados na glutationa (L-g-glutamil-Lcisteinil-glicina), em proteínas e em compostos de baixo peso molecular no plasma.
Quando o estresse oxidativo está alto, os tióis podem ter seus níveis plasmáticos reduzidos
(WISDOM et al., 1991).
No meio intracelular, a glutationa reduzida está presente na maioria das células,
sendo o tiol (-SH) mais abundante nesse meio. A glutationa reduzida (GSH) pode ser
considerada um dos agentes mais importantes do sistema de defesa antioxidante da célula.
Como pode ser parcialmente absorvida no intestino, ela pode ser sintetizada de novo,
sendo, portanto, um antioxidante endógeno e exógeno. Já a albumina é a principal fonte de
grupos tióis do plasma, sendo quantitativamente o mais importante componente
extracelular de defesa antioxidante (FANG, YANG e WU, 2002).
Em relação aos níveis de sulfidrilas totais, nossos resultados mostraram que houve
uma interação entre a dieta e o Agaricus blazei. A suplementação da dieta
hipercolesterolemiante com o cogumelo promoveu uma redução significativa na
concentração desses grupos. Diante dos resultados obtidos, podemos observar que dietas
hipercolesterolemiantes desencadeiam uma condição de maior estresse oxidativo, com uma
maior produção de radicais livres. Esses radicais por sua vez reagem com os grupos
sulfidrilas e levam a formação de pontes dissulfeto, que consequentemente levam a uma
redução na concentração de sulfidrilas reduzidas. Esses resultados sugerem, portanto, que
na maior condição de estresse desencadeado por essa dieta, o Agaricus blazei não foi capaz
de reverter esse efeito. Tal fato, no entanto, pode estar relacionado à dose utilizada em
nosso experimento.
Os produtos do estresse oxidativo também têm sido descritos para demonstrar o
dano oxidativo. Dentre esses produtos encontram-se as TBARS. Os níveis dessas
substâncias são utilizados como marcadores do balanço redox e da peroxidação lipídica em
células hepáticas. Em nosso estudo, observamos apenas um efeito da dieta sobre essas
substâncias, com as dietas hipercolesterolemiantes apresentando os maiores valores quando
73
MIRANDA, A. M.
Discussão
comparadas às controles. No entanto, isso pode ser explicado na medida em que sendo
essas dietas ricas em ácidos graxos insaturados, ficam mais suscetíveis à lipoperoxidação
(MAHFOUZ e KUMMEROW, 2000). Da mesma forma, essa seria uma possível
explicação para a ausência de efeito do Agaricus blazei, visto que 80 % de seus lipídios são
constituídos por ácidos graxos poliinsaturados.
Além dos níveis de TBARS, as proteínas carboniladas também têm sido utilizadas
como marcadores bioquímicos para detectar a modificação oxidativa de resíduos de
aminoácidos em proteínas (BEAL, 2002). Alguns cátions, como Fe2+ e Cu2+ podem se ligar
a locais de ligação dos cátions nas proteínas, permitindo o ataque por espécies como H2O2
e O2-. Por fim, essas espécies transformam suas cadeias de aminoácidos em carbonilas
(DONNE et al., 2003). Nossos resultados mostraram que a suplementação das dietas com o
Agaricus blazei promoveu um aumento na carbonilação dessas proteínas.
Em relação à glutationa, observamos apenas um efeito da dieta, com as dietas H e
HAb apresentando as menores concentrações. Sabe-se que a dieta hipercolesterolemiante
promove uma piora no balanço redox do organismo, levando a uma maior produção de
espécies reativas (KUROSOWA et al., 2005). A partir dos resultados encontrados,
observamos que a concentração de glutationa total foi reduzida pelas dietas hiper, não
havendo nenhum efeito do Agaricus blazei.
No presente estudo, os animais que receberam as dietas hipercolesterolemiantes
apresentaram as menores atividades de PON. Esses dados corroboram os encontrados por
Ayub et al. (1999) e Aviram et al. (1998). Segundo os autores, animais alimentados com
dietas ricas em gorduras e colesterol apresentam uma redução tanto na expressão gênica
como na atividade sérica da PON.
A paraoxonase consiste em uma esterase dependente de cálcio. Sua família consiste
de 3 genes: PON 1, PON 2 e PON 3 (CHAIT et al., 2005). O RNAm da PON 1 é expresso
principalmente no fígado, enquanto que o da PON 3 é expresso no fígado e no rim. Tanto a
PON 1 quanto a PON 3 são secretadas pelo fígado associadas à HDL, contribuindo assim
para o efeito ateroprotetor dessa lipoproteína (NG et al., 2004). Já a PON 2 é amplamente
expressa em muitos tecidos. As três proteínas possuem atividade hidrolítica tendo atividade
arilesterásica ou paraoxonase. Os substratos a serem hidrolisados, ácidos carboxílicos
aromáticos ou compostos organofosfatos, é que determinarão qual atividade estará ativa
(GETZ e REARDON, 2004).
74
MIRANDA, A. M.
Discussão
Em nosso experimento, as dietas hipercolesterolemiantes promoveram uma redução
em ambas as atividades da PON. Uma interação foi observada ainda entre a dieta e o
cogumelo para a atividade arilesterase. Sendo assim, a suplementação das dietas com o
Agaricus blazei não foi capaz de impedir que essa redução ocorresse. Esses dados quando
tomados em conjunto com os demais parâmetros analisados são indicativos de que possa
ter ocorrido uma diminuição das defesas antioxidantes em detrimento do aumento do
estresse oxidativo. Contudo, visando compreender melhor o papel deste cogumelo como
um potencial agente antioxidante – dadas as suas características e ao que já se tem descrito
na literatura – ressalta-se a importância de que outros parâmetros relacionados tanto ao
estresse oxidativo quanto à atividade antioxidante sejam avaliados, bem como a utilização
de diferentes doses.
Diversos estudos têm demonstrado que os cogumelos apresentam significativo
efeito antioxidante. A maioria desses estudos tem atribuído esse efeito à presença de
compostos obtidos por meio do metabolismo secundário, como mencionado acima. Entre
esses compostos, grande parte desses efeitos tem sido conferida pelos compostos fenólicos
(HELENO et al., 2010; SOARES et al., 2009; TSAI et al, 2007). No entanto, os dados
referentes à atividade antioxidante dos cogumelos na literatura são conflitantes. Bobek et
al. (1997), ao estudar os efeitos do Pleurotus ostreatus e de suas β-glucanas isoladas, não
encontrou qualquer efeito antioxidante para esse último. Já quando os extratos metanólicos
desse mesmo cogumelo e de outras três espécies (Volvariella volvacea, Lentinula edodes e
F. velutipes) foram analisados, um importante efeito antioxidante sobre a peroxidação
lipídica foi observado (CHEUNG e CHEUNG, 2005; YANG et al., 2002). Cheung e
Cheung (2005) e Yang et al. (2002), relacionaram esse efeito sobre a peroxidação lipídica
aos compostos fenólicos presentes nos extratos metanólicos.
Da mesma forma, importante atividade antioxidante tem sido atribuída ao Agaricus
blazei. Savoie, Minvielle e Largeteau (2008), ao analisarem o Agaricus bisporus
comparando-o a outras espécies, observaram uma alta capacidade antioxidante de extratos
metanólicos de várias partes desse cogumelo in vitro. Para os autores, esse cogumelo
poderia ser inserido no grupo dos cogumelos com excelente potencial antioxidante, ficando
atrás somente do A. blazei. Segundo Oliveira et al. (2007), os extratos etanólicos e
preparados de outras frações do
A. blazei também apresentaram significativo poder
antioxidante.
75
MIRANDA, A. M.
Discussão
Contudo, em nosso estudo não foi observada atividade antioxidante significativa
para o Agaricus blazei. Porém, dados na literatura demonstram que da mesma forma que o
consumo de compostos fenólicos pode levar a um aumento na atividade das defesas
antioxidantes, os mesmos compostos podem não causar nenhum tipo de efeito. A natureza
desses resultados contraditórios indica ainda que a resposta à atividade dessas defesas pode
depender da origem do estresse oxidativo, do modelo animal utilizado, da defesa
antioxidante estudada e do tipo e fonte do antioxidante dietético (ALIA et al., 2003;
DRAGSTED et al., 2004). Nesse sentido, se considerarmos essa espécie como uma
importante fonte de compostos fenólicos, principalmente em relação ao seu conteúdo em
tocoferóis (TSAI et al. 2007), essa pode ser, pelo menos em parte, uma possível explicação
para a ausência do efeito antioxidante observado para o A. blazei. No entanto, tais
resultados sugerem a necessidade de mais estudos a fim de verificar o exato mecanismo
envolvido na atividade antioxidante desse cogumelo, principalmente quando adicionado à
dieta.
76
CONCLUSÃO
MIRANDA, A. M.
Conclusão
CAPÍTULO 7 - CONCLUSÃO
A análise bromatológica do Agaricus blazei confirmou que o mesmo consiste em
um alimento com considerável valor nutricional, apresentando teores significativos de
proteínas e carboidratos, aliado ao baixo teor em gorduras.
Nossos resultados demonstram que o Agaricus blazei consiste em um importante
agente hipolipidêmico. A suplementação da dieta hipercolesterolemiante com o A. blazei
(1%) promoveu uma redução significativa nos níveis séricos de colesterol total e da fração
não HDL, embora esse mesmo efeito não tenha sido observado para os animais
normocolesterolêmicos. Por outro lado, sua suplementação à dieta controle proporcionou
uma redução significativa nos níveis de triacilgliceróis, sugerindo que este cogumelo,
associado a uma dieta balanceada, pode ser benéfico à saúde. O A. blazei também mostrouse eficiente em suprimir o acúmulo de gordura corporal nos animais hipercolesterolêmicos.
Em contrapartida, os resultados para os marcadores do estresse oxidativo sugerem
que a suplementação da dieta hipercolesterolemiante com o Agaricus blazei não tenha sido
capaz de reverter o dano oxidativo promovido por essa dieta, não sendo verificado,
portanto, efeito antioxidante significativo por parte deste cogumelo.
Tais resultados, no entanto, são animadores, pois além de traduzirem um importante
efeito hipocolesterolemiante deste cogumelo enquanto alimento, constituem um passo
importante para a desmitificação de algumas propriedades atribuídas ao Agaricus blazei,
fator que provoca más interpretações em relação a seu uso pela população em geral.
Contudo, ressalta-se a importância de novas pesquisas a fim de verificar o exato
mecanismo e os possíveis componentes envolvidos no efeito hipocolesterolêmico do
Agaricus blazei, assim como esclarecer a ausência de seu efeito antioxidante.
77
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MIRANDA, A. M.
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96
ANEXOS
MIRANDA, A. M.
ANEXO I – Carta do Comitê de ética em pesquisa
Anexos
MIRANDA, A. M.
Anexos
ANEXO II - Protocolos das Dosagens Bioquímicas
II. 1 - ALBUMINA
Princípio
A albumina interage com o verde de bromocresol tamponado e, devido ao erro
protéico dos indicadores, ocorre formação de cor verde, proporcional à concentração da
albumina na amostra. O verde de bromocresol possui especificidade para albumina e não
sofre interferência de valores elevados de bilirrubina e hemoglobina, permitindo também
que as interferências de valores elevados de triglicérides possam ser corrigidas utilizando o
branco de amostra.
Amostra
Recomenda-se jejum mínimo de 8 horas. Usar soro. Não usar plasma. O analito é
estável por 3 dias entre 2 – 8°C e 7 dias a 10ºC negativos.
Produto Utilizado
Albumina, Catálogo 19 - ANVISA – 10009010025
Labtest Diagnóstica: Av. Paulo Ferreira da Costa, 600. Lagoa Santa, MG, 33400-000
Reagente de Cor: Armazenar entre 2 – 8 ºC. Contém tampão 60 mmol/L, pH3,8, verde de
bromocresol 300 mol/L e Brij 35 ≥ 6,0 mmol/L.
Padrão - 3,8 g/dL: Armazenar entre 2 – 8 ºC bem vedado para evitar evaporação. Contém
azida sódica 15,4 mmol/L.
Equipamentos
1. Fotômetro capaz de medir com exatidão a absorbância em 630 nm ou filtro vermelho
(600 a 640 nm).
2. Pipetas para medir amostras e reagentes.
3. Cronômetro.
Procedimento
Tomar 3 tubos de ensaio e proceder como a seguir:
Branco
Teste
Padrão
Reagente de Cor (nº 1)
1,0 mL
1,0 mL
1,0 mL
Soro
Padrão (nº 2)
---------
0,01 mL
-----
----0,01 mL
Misturar e após 2 minutos, no máximo 10 minutos, determinar as absorbâncias do
teste e padrão em 630 nm ou filtro vermelho (600 a 640 nm), acertando o zero com o
branco.
MIRANDA, A. M.
Anexos
Cálculos
Albumina (g/dL) =
Absorbância do Teste
Absorbância do Padrão
X 3,8
Conversão de g/dL para Unidade SI: µmol/L = g/dL x 144,9
O resultado da medição é linear até 6,0 g/dL. Para valores maiores diluir o soro
com NaCI 150 mmol/L e repetir a determinação. Multiplicar o resultado obtido pelo fator
de diluição. Diluir o soro de tal modo que o valor encontrado se situe entre 3,0 e 4,5 g/dL.
II. 2 - ALANINA AMINOTRANSFERASE
Princípio
A ALT catalisa a transferência de grupos amina da alanina para o cetoglutarato,
com formação de glutamato e piruvato. Este é reduzido a lactato por ação da lactato
desidrogenase (LDH), enquanto que a coenzima NADH é oxidada a NAD. A conseqüente
redução da absorbância em 340 ou 365 nm, monitorizada espectrofotometricamente, é
diretamente proporcional à atividade da enzima na amostra.
L-Alanina + Cetoglutarato
Piruvato + NADH
Piruvato + L-Glutamato
L-Lactato + NAD
Amostra
Recomenda-se jejum mínimo de 8 horas. Usar soro ou plasma (EDTA, heparina). A
atividade enzimática é estável por 4 dias entre 2 – 8 ºC e por 2 semanas a 10 ºC negativos.
Produto Utilizado
ALT/GPT Liquiform, Catálogo 74-4/30 - ANVISA - 10009010029
Reagente 1: Armazenar entre 2 – 8°C.
Reagente de Trabalho: O conjunto de um frasco de Reagente 1 e de um frasco de Reagente
2 permite preparar o Reagente de Trabalho. Estável por 5 dias entre 15 - 25 ºC e 14 dias
entre 2 – 8°C. Contém tampão 80 mmol/L, pH 7,8, L-Alanina 500 mmol/L, 2-cetoglutarato
15 mmo/L, NADH 180
Equipamentos
1. Fotômetro com cubeta termostatizada a 37 ºC capaz de medir a absorbância em 340 ou
365 nm com exatidão.
3. Cronômetro.
MIRANDA, A. M.
Anexos
Procedimento
Condições de Reação: comprimento de onda de 340 ou 365 nm; cubeta termostatizada a
37ºC com 10 mm de espessura de solução; banda de passagem de 8 nm ou menos e luz
espúria menor que 0,1%.
1. Adicionar 0,1 mL de amostra a 1,0 mL do Reagente de Trabalho.
2. Homogeneizar.
3. Transferir para a cubeta termostatizada a 37 ºC.
4. Esperar 1 minuto.
5. Fazer a leitura inicial, disparando simultaneamente o cronômetro.
6. Repetir as leituras após 1, 2 e 3 minutos.
Cálculos
Calcular a média das diferenças de absorbância por minuto ( A/minuto) e utilizar
para calcular o resultado.
ALT/GPT (U/L) 340 nm =
A/minuto x 1746
Conversão: Unidades Convencionais (U/L) x 16,7 = Unidades SI (nkat/L).
II. 3 - ASPARTATO AMINOTRANSFERASE
Princípio
A AST catalisa a transferência de grupos amina da alanina para o cetoglutarato,
com formação de glutamato e oxalacetato. Este é reduzido a malato por ação da malato
desidrogenase (MDH), enquanto que a coenzima NADH é oxidada a NAD.
A conseqüente redução da absorbância em 340 ou 365 nm, monitorizada
espectrofotometricamente, é diretamente proporcional à atividade da enzima na amostra.
L-Aspartato + Cetoglutarato
Oxalacetato + NADH
Oxalacetato + L-Glutamato
L-Malato + NAD
Amostra
Recomenda-se jejum mínimo de 8 horas. Usar soro ou plasma (EDTA, heparina). A
atividade enzimática é estável por 4 dias entre 2 – 8°C e por 2 semanas a 10°C negativos.
Produto Utilizado
AST/GOT Liquiform, Catálogo 75-4/30 - ANVISA - 10009010018
Reagente de Trabalho: o conjunto de um frasco de Reagente 1 e de um frasco de Reagente
2 permite preparar o Reagente de Trabalho. Estável por 5 dias entre 15 – 25°C e por 14
dias entre 2 – 8°C; Contém tampão 80 mmol/L,pH 7,8,L-Aspartato 240 mmol/L, 2cetoglutarato 12 mmo/l,NADH 180 µmol/l,LDH ≥900 U/L, MDH ≥600 U/L e azida sódica
MIRANDA, A. M.
Anexos
14,6 mmol/L.
Equipamentos
1. Fotômetro com cubeta termostatizada a 37 ºC capaz de medir a absorbância em 340 ou
365 nm com exatidão.
3. Cronômetro.
Procedimento
Condições de Reação: comprimento de onda de 340 ou 365 nm; cubeta termostatizada a
37ºC com 10 mm de espessura de solução; banda de passagem de 8 nm ou menos e luz
1. Adicionar 0,1 mL de amostra a 1,0 mL do reagente de trabalho.
2. Homogeneizar.
3. Transferir para a cubeta termostatizada a 37 ºC.
4. Esperar 1 minuto.
5. Fazer a leitura inicial, disparando simultaneamente o cronômetro.
6. Repetir as leituras após 1, 2 e 3 minutos.
Cálculos
Calcular a média das diferenças de absorbância por minuto ( A/minuto) e utilizar
para calcular o resultado.
AST/GOT (U/L) 340 nm =
A/minuto x 1746
Conversão: Unidades Convencionais (U/L) x 16,7 = Unidades SI (nkat/L).
II. 4 - COLESTEROL HDL
Princípio
As lipoproteínas de muita baixa densidade (VLDL) e as lipoproteínas de baixa
densidade (LDL) são quantitativamente precipitadas e, após centrifugação, o colesterol
ligado às lipoproteínas de alta densidade (Colesterol HDL) é determinado no sobrenadante.
Amostra
O jejum não é imprescindível para a dosagem de colesterol HDL. Usar soro. O analito é
estável por 3 dias entre 2 – 8ºC.
Produto Utilizado
Colesterol HDL, Catálogo 13 - ANVISA – 10009010026
Precipitante: Armazenar entre 2 – 8°C. Contém ácido fosfotúngstico 1,5 mmol/L e cloreto
de magnésio 54 mmol/L.
Padrão - 20 mg/dL: Armazenar entre 2 – 8°C. Armazenar bem vedado para evitar
evaporação.
MIRANDA, A. M.
Anexos
Equipamentos
1. Centrífuga para tubos.
2. Fotômetro capaz de medir com exatidão a absorbância em 500 nm ou filtro verde (490
a 510 nm).
3. Banho-maria mantido à temperatura constante (37 ºC).
5. Cronômetro.
Procedimento
Precipitação das VLDL e LDL
Em um tubo 12 x 75 colocar 0,25mL de soro e 0,25mL de precipitante. Agitar
vigorosamente durante 30 segundos. A agitação sugerida é fundamental para obtenção de
resultados consistentes. Centrifugar a 3.500 rpm por pelo menos 15 minutos para obter um
sobrenadante límpido. Pipetar o sobrenadante límpido imediatamente após a centrifugação,
tomando o cuidado para não ressuspender o precipitado, a fim de evitar resultados
falsamente elevados.
Utilizar com o Reagente 1 - Colesterol Liquiform Labtest Cat. 76. Tomar 3 tubos de ensaio
e proceder como a seguir:
Branco
Teste
Padrão
Sobrenadante
-----
0,1 mL
-----
Padrão (nº 2)
Reagente 1
----1,0 mL
----1,0 mL
0,1 mL
1,0 mL
Misturar e colocar no banho-maria a 37 ºC durante 10 minutos. O nível da água no
banho deve ser superior ao nível do reagente nos tubos de ensaio. Determinar as
absorbâncias do teste e padrão em 500 nm ou filtro verde (490 a 540 nm) acertando o zero
com o branco. A cor é estável por 60 minutos.
Cálculos
HDL (mg/dL) =
X 40
Conversão de mg/dL para Unidade SI: mmol/L = mg/dL x 0,026
II. 5 - COLESTEROL TOTAL
Princípio
O colesterol total é determinado de acordo com as seguintes reações :
Ésteres de colesterol
Colesterol + O2
Colesterol + Ácidos graxos
Colest-4-en-ona + H2O2
MIRANDA, A. M.
Anexos
2H2O2 + Fenol + 4-Aminoantipirina
Antipirilquinonimina + 4H2O
A intensidade da cor vermelha formada é diretamente proporcional à concentração de
colesterol na amostra.
Amostra
O jejum não é imprescindível para a dosagem de colesterol total. Usar soro.
Anticoagulantes como citrato, oxalato ou EDTA produzem resultados falsamente
diminuídos. O analito é estável por 7 dias entre 2 – 8 ºC e vários meses a 10 ºC negativos.
Produto Utilizado
Colesterol Liquiform, Catálogo 76-2/100 - ANVISA - 10009010068
Reagente 1: Armazenar entre 2 – 8°C. Contém tampão 50 mmol, pH 7,0, fenol 24,0
mmol/L, colato de sódio 500 µmol/L, azida sódica 15 mmol/L, 4 aminoantipirina 500
µmol/L, colesterol esterase ≥250 U/L, colesterol oxidase ≥250 U/L e peroxidase ≥1000
U/L.
Padrão 200 mg/dL: Armazenar entre 2 – 8°C. Após o manuseio armazenar bem vedado
para evitar evaporação. Contém azida sódica 15 mmol/L.
Equipamentos
a 510 nm).
4. Cronômetro.
Procedimento
Amostra
Padrão (nº 2)
Reagente 1
Branco
Teste
Padrão
--------1,0 mL
0,01 mL
----1,0 mL
----0,01 mL
1,0 mL
Misturar e colocar em banho-maria 37 ºC 10 minutos. O nível de água no banho
deve ser superior ao nível de reagentes nos tubos de ensaio. Determinar as absorbâncias do
teste e padrão em 500 nm ou filtro verde (490 a 510 nm), acertando o zero com o branco.
A cor é estável por 60 minutos.
MIRANDA, A. M.
Anexos
Cálculos
Colesterol (mg/dL) =
X 200
II. 6 - CREATININA
Princípio
O método se baseia na observação de que a reação da creatinina com o picrato
alcalino é muito rápida, enquanto a reação do picrato com os cromogênios é mais lenta. A
medida da reação nos primeiros minutos permite a determinação da creatinina verdadeira.
A creatinina e outros componentes do soro reagem com a solução de picrato em meio
alcalino, formando um complexo de cor vermelha que é medido fotometricamente.
Creatinina + Ácido Pícrico  Picrato de Creatinina
Amostra
Para creatinina sérica recomenda-se jejum mínimo de 8 horas. Soro ou plasma
(heparina, EDTA, fluoreto, oxalato, citrato). O anticoagulante Glistab (Labtest Cat. 29)
permite a colheita de uma só amostra para as dosagens de creatinina, glicose e uréia. O
analito é estável por 7 dias entre 2 – 8°C.
Produto Utilizado
Creatinina K, Catálogo 96 - ANVISA - 10009010143
NaOH: Armazenar entre 15 – 30°C. Contém hidróxido de sódio 200 mmol/L.
Ácido Pícrico: Armazenar entre 15 – 30°C. Contém ácido pícrico 22,2 mmol/L.
Padrão - 4,0 mg/dL: Armazenar entre 2 – 30°C. Após o manuseio, sugere-se armazenar
bem vedado para evitar evaporação.
Ferricianeto: Armazenar entre 15 – 30 ºC. Contém ferricianeto de potássio 11 mmol/L.
Equipamentos
1. Fotômetro com cubeta termostatizada capaz de medir com exatidão a absorbância em
510 nm.
2. Pipetas para medir amostras e reagente.
3. Cronômetro.
Procedimento
Preparo do picrato alcalino: Misturar 4 volumes de NaOH (nº 1) com 1 volume de
Ácido Pícrico (nº 2). Estável 15 dias entre 2 - 8 ºC. O CO2 atmosférico altera
significativamente a estabilidade do NaOH (No. 1) e do Picrato Alcalino, quando os
reagentes são mantidos em recipientes abertos. A modificação da estabilidade é
influenciada pelo tempo de exposição e condições ambientais. Sugerimos manter na
bandeja do analisador somente o volume suficiente para a realização de uma corrida
MIRANDA, A. M.
Anexos
analítica ou usar as informações do controle da qualidade como indicador da necessidade
de realizar nova calibração.
Procedimento: Ajustar o fotômetro a zero em 510 nm com água destilada.
Adicionar 0,1 mL de padrão, soro, plasma ou urina diluída a 1,0 mL do Picrato Alcalino.
Misturar e aspirar imediatamente para a cubeta. Disparar um cronômetro e medir as
absorbâncias aos 30 e 90 segundos.
Cálculos
ΔA do Teste ou Padrão = Abs 90 segundos – Abs 30 segundos
Creatinina (mg/dL) =
∆ Absorbância do Teste
∆ Absorbância do Padrão
X 4
II. 7 - FOSFATASE ALCALINA
Princípio
A fosfatase alcalina (FALC) do soro, em pH alcalino, hidrolisa o pnitrofenilfosfato, liberando p-nitrofenol e fosfato inorgânico de acordo com a seguinte
reação:
p-nitrofenilfosfato + H2O
p-nitrofenol + fosfato
A quantidade de p-nitrofenol produzida tem elevada absorbância em 405 nm e é
diretamente proporcional à atividade da fosfatase alcalina na amostra.
Amostra
Recomenda-se jejum mínimo de 8 horas. Soro ou plasma (heparina). A amostra é
estável por 7 dias entre 2 – 8°C. Quando a amostra é armazenada à temperatura ambiente,
obtêm-se resultados falsamente elevados.
Produto Utilizado
Fosfatase Alcalina Liquiform, Catálogo 74-4/30 - ANVISA - 10009010050
Reagente 1: Armazenar entre 2 - 8 ºC.
Reagente 2: Armazenar entre 2 - 8 ºC.
Reagente de Trabalho: o conjunto de um frasco de Reagente 1 e de um frasco de Reagente
2 permite preparar o Reagente de Trabalho. Estável 5 dias entre 15 – 25°C e 30 dias entre 2
– 8°C. Contém tampão 350 mmol/L pH 10,4, sulfato de zinco 1,0 mmol/L, acetato de
magnésio 2,0 mmol/L p-nitrofenilfosfato ≥12 mmol/L, azida sódica 6,4 mmol/L.
Equipamentos
1. Fotômetro com cubeta termostatizada capaz de medir com exatidão a absorbância em
405 nm.
MIRANDA, A. M.
Anexos
2. Banho-maria mantido à temperatura constante (37 °C).
3. Pipetas para medir amostras e reagente.
4. Cronômetro.
Procedimento
Condições de Reação: comprimento de onda de 405 ± 2 nm, cubeta termostatizada
a 37 ºC com 10 mm de espessura da solução, banda de passagem de 8 nm ou menos e luz
Pipetar 1,0 mL do Reagente de Trabalho em um tubo 12x75 e adicionar 0,02 mL de
amostra. Homogeneizar. Transferir imediatamente para a cubeta termostatizada a 37°C.
Esperar 30 segundos. Fazer a leitura da absorbância inicial (A1), disparando
simultaneamente o cronômetro. Repetir a leitura após 2 minutos (A2).
Cálculos
A Teste =
Atividade da Fosfatase Alcalina (U/L) = A Teste x 2764
Conversão de U/L para Unidades SI: kat = U/L x 0,0167
II. 8 - GLICOSE
Princípio
A glicose oxidase catalisa a oxidação da Glicose a Ácido Glucônico e Peróxido de
Hidrogênio. O peróxido de hidrogênio formado reage com 4-aminoantipirina e fenol, sob
ação catalisadora da peroxidase, através de uma reação oxidativa de acoplamento,
formando uma antipirilquinonimina vermelha cuja intensidade de cor é proporcional à
concentração da glicose na amostra.
Amostra
Recomenda-se jejum mínimo de 8 horas. Usar plasma ou soro. Realizar a colheita
do sangue utilizando um anticoagulante contendo um inibidor da glicólise. O uso do
anticoagulante Glistab (Labtest cat. 29) permite a colheita de uma só amostra para as
dosagens de creatinina, glicose e uréia. As amostras de sangue não contendo antiglicolítico
devem ser centrifugadas imediatamente após a colheita e o plasma ou soro separados das
células ou coágulo.
O analito é estável por 8 horas em amostras colhidas com antiglicolítico. No
plasma, soro e outros líquidos separados das células, a glicose permanece estável por 3 dias
entre 2 – 8°C, quando não ocorre contaminação bacteriana.
Produto Utilizado
Glicose PAP Liquiform, Catálogo 84-2/250, 84-2/500 -ANVISA - 10009010003
Reagente 1: Armazenar entre 2 – 8°C. Contém tampão 50 mmol/L; pH 7,5; glicose oxidase
MIRANDA, A. M.
Anexos
≥11.000U/L; peroxidase ≥700 U/L; 4-aminoantipirina ≥290 µmol/L; fenol ≥1 mmol/L e
Padrão - 100 mg/dL: Armazenar entre 2 – 30°C. Após o manuseio, sugere-se armazenar
bem vedado para evitar evaporação. Contém glicose 100 mg/dL e biocida não tóxico. O
estabilizador do padrão pode precipitar-se em baixas temperaturas, fato que não interfere
na sua qualidade.
Equipamentos
a 540 nm).
4. Cronômetro.
Procedimento
Branco
Teste
Padrão
Amostra
Padrão (nº 2)
---------
0,01 mL
-----
----0,01 mL
Reagente 1
1,0 mL
1,0 mL
1,0 mL
Misturar vigorosamente e colocar em banho-maria a 37°C durante 15 minutos. O
nível da água no banho deve ser superior ao nível dos reagentes nos tubos de ensaio.
Determinar as absorbâncias do teste e padrão em 505 nm ou filtro verde (490 a 540 nm),
acertando o zero com o branco. A cor é estável por 60 minutos.
Cálculos
Glicose (mg/dL) =
X 100
Conversão de mg/dL para unidade SI: mmol/L = mg/dL x 0,0556
II. 9 - PROTEÍNAS TOTAIS
Princípio
Os íons cobre (Cu+2) em meio alcalino (Reagente de Biureto) reagem com as
ligações peptídicas das proteínas séricas formando cor púrpura, que tem absorbância
máxima em 545 nm, proporcional à concentração das proteínas na amostra.
Amostra
Recomenda-se jejum mínimo de 8 horas. Usar soro. O analito é estável por 3 dias
entre 2 – 8°C e 7 dias a 10°C negativos.
MIRANDA, A. M.
Anexos
Produto Utilizado
Proteínas Totais, Catálogo 99 - ANVISA - 10009010080
Reagente Biureto: Armazenar entre 15 – 30°C. Contém hidróxido de sódio 600 mmol/L,
sulfato de cobre 12 mmol/L, estabilizador e antioxidante.
Padrão - 4,0 g/dL; Armazenar entre 15 – 30°C. Após o manuseio, sugere-se armazenar
bem vedado para evitar evaporação. Contém albumina bovina 4 g/dL e azida sódica 15,4
mmol/L.
Equipamentos
1. Fotômetro capaz de medir com exatidão a absorbância em 545 nm (530 a 550 nm).
3. Cronômetro.
Procedimento
Branco
Teste
Padrão
Amostra
Padrão (nº 2)
---------
0,02 mL
-----
----0,02 mL
Água destilada ou deionizada
Biureto de Uso
0,02 mL
1,0 mL
----1,0 mL
----1,0 mL
Misturar e incubar a 37 °C durante 10 minutos. Determinar as absorbâncias do teste
e do padrão em 545 nm (530 a 550 nm), acertando o zero com o branco. A cor é estável
durante 1 hora.
Cálculos
Proteínas Totais (g/dL) =
X 4
II. 10 - TRIACILGLICERÓIS
Princípio
Os triacilglicerós são determinados de acordo com as seguintes reações:
Triglicérides
Glicerol + Ácidos Graxos
Glicerol + ATP
Glicerol-3-Fosfato + ADP
Glicerol-3-Fosfato + O2
Dihidroxiacetona + H2O2
2 H2O2 + 4 Aminoantipirina + 4-Clorofenol Quinoneimina + 4 H2O
MIRANDA, A. M.
Anexos
A intensidade da cor vermelha formada é diretamente proporcional à concentração
de triglicérides na amostra.
Amostra
Jejum de 12 a 14 horas. Usar soro ou plasma com EDTA. O analito é estável por
dois dias entre 2 – 8°C. Armazenamento prolongado da amostra não é recomendado,
porque várias substâncias podem ser hidrolizadas liberando glicerol, levando à obtenção de
resultados falsamente elevados. A heparina promove a ativação in vivo ou in vitro da
lipase da lipoproteína, fazendo com que a concentração dos triglicérides se reduza
gradativamente em amostras contendo heparina.
Produto Utilizado
Triglicérides Liquiform, Catálogo 87 - ANVISA - 10009010070
Reagente 1 - Armazenar entre 2 - 8 ºC. Contem tampão 50 mmol/L, pH 6,9; acetato de
magnésio 4 mmol/L; 4-clorofenol 5 mmol/L; 4-aminoantipirina 300 mol/L ATP 1,0
mmol/L; lipase da lipoproteína 1400 U/L; glicerolquinase 1000 U/L e azida sódica 7
mmol/L.
Padrão - 200 mg/dL - Armazenar entre 2 - 30 ºC. Contém triglicérides 200 mg/dL e azida
sódica 7 mmol/L.Após o manuseio sugere-se armazenar bem vedado, para evitar
evaporação.
Equipamentos
a 520nm).
2. Banho-maria mantido à temperatura constante (37°C).
4. Cronômetro.
Procedimento
Branco
Teste
Padrão
Amostra
Padrão (nº 2)
---------
0,01 mL
-----
----0,01 mL
Reagente 1 (nº 1)
1,0 mL
1,0 mL
1,0 mL
Misturar e colocar no banho-maria 37 ºC por 10 minutos. O nível da água no banho
deve ser superior ao nível do reagente nos tubos de ensaio. Determinar as absorbâncias do
teste e padrão em 505 nm ou filtro verde (490 a 520 nm) acertando o zero com o branco. A
cor é estável por 60 minutos.
MIRANDA, A. M.
Anexos
Cálculos
Triglicérides (mg/dL) =
X 200
II. 11 - URÉIA
Princípio
A uréia é hidrolisada pela urease a íons amônia e CO 2. Os íons amônia reagem em
pH alcalino com salicilato e hipoclorito de sódio, sob a ação catalisadora do nitroprussiato
de sódio, para formar azul de indofenol. A formação de cor é proporcional à quantidade de
uréia na amostra.
Amostra
Recomenda-se jejum mínimo de 8 horas. Usar soro ou plasma (fluoreto, heparina,
EDTA) e urina. Não usar anticoagulantes contendo amônia. A concentração de fluoreto na
amostra não deve ser maior que 3 mg/mL, pois o fluoreto em altas doses é inibidor da
urease. O uso do anticoagulante Glistab (Labtest Cat. 29) permite a colheita de uma só
amostra para as dosagens de uréia, glicose e creatinina. O analito é estável no soro ou
plasma por 12 horas entre 15 – 25°C, por 3 dias entre 2 – 8°C e 3 meses a 20°C negativos.
Produto Utilizado
Uréia CE, Catálogo 27 - ANVISA - 10009010011
Urease: Armazenar entre 2- 8°C. Contém tampão fosfato 10 mmol/L, EDTA 6 mmol/L e
urease 268 KU/L.
Tampão (Estoque): Armazenar entre 2- 8°C. Contém tampão fosfato 100 mmol/L pH 6,9,
salicilato de sódio 312 mmol/L, nitroprussiato de sódio 16,8 mmol/L.
Oxidante (Estoque): Armazenar entre 2- 8°C. Contém hidróxido de sódio 2,8 mol/L e
hipoclorito de sódio 121 mmol/L.
Padrão - 70 mg/dl: Armazenar entre 2- 8°C bem vedado para evitar evaporação. Contém
Preparo do Tampão de Uso: Adicionar o conteúdo do frasco de tampão (100 mL) a 400 mL
de água destilada ou deionizada e misturar. Estável 12 meses em frasco âmbar, entre 2 –
8°C.
Preparo do Oxidante de Uso: Adicionar o conteúdo do frasco de oxidante (25 mL) a 475
mL de água destilada ou deionizada e misturar. Estável 12 meses em frasco plástico, entre
2 e 8°C.
Preparo da Urease Tamponada: Adicionar 1,0 mL de urease a 20 mL do Tampão de Uso.
Estável 21 dias em frasco de vidro âmbar, entre 2 – 8°C.
MIRANDA, A. M.
Anexos
Equipamentos
1.
2.
3.
4.
Fotômetro capaz de medir com exatidão a absorbância em 600 nm (580 a 610 nm).
Banho-maria mantido à temperatura constante (37 ºC).
Pipetas para medir amostras e reagentes.
Cronômetro
Procedimento
Branco
Teste
Padrão
Amostra
Padrão (nº 2)
---------
0,01 mL
-----
----0,01 mL
Urease tamponada
1,0 mL
1,0 mL
1,0 mL
Misturar e incubar a 37 ºC durante 5 minutos e adicionar 1,0mL de oxidante de uso
em todos os tubos. Misturar e incubar a 37 ºC durante 5 minutos. Determinar as
absorbâncias do teste e padrão em 600 nm (580 a 610 nm), acertando o zero com o branco.
A cor é estável por 2 horas.
Cálculos
Uréia (mg/dL) =
Conversão de mg/dL para Unidade SI: mmol/L = mg/ dL x 0,166
X 200

Alimentos funcionais - REPOSITORIO INSTITUCIONAL DA UFOP

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