16 al 18 de Noviembre del 2014

16 al 18 de Noviembre del 2014
Hotel “13 de Julio”, Mar del Plata. 9 de Julio 2777. Provincia de Buenos Aires.
Autoridades de la Sociedad Argentina de Protozoología
Presidente: Dr. Esteban Serra
Vicepresidente: Dr. Alejandro Schijman
Secretaria: Dra. Miriam Postan
Prosecretaria: Dra. Silvina Wilkowsky
Tesorera: Dra. Pamela Cribb
Protesorero: Dr. Guillermo Daniel Alonso
Vocales titulares: Dras. María Cristina Paveto y Julia Cricco
Vocales suplentes: Dras. Alejandra C. Schoijet e Isabel Nocito
Comité Organizador:
Comité Científico:
Presidente:
Dr. Sergio O. Angel
Presidente:
Dra. Adriana Gruppi
Miembros:
Dra. Natalia de Miguel
Miembros:
Dr. Luis Alvárez
Dra. María Corvi
Dra. Patricia Romano
Dra. Verónica Cóceres
Dr. Pablo Gargantini
Dra. Laura Vanagas
Dr. Alejandro Schijman
Dra. Andrea Cumino
Dra. Ana Rosa Pérez
Dra. Silvia Moreno
Dra. Laura Chiapello
Dra. Alicia Saura
Dra. Patricia Juárez
Dr. Ricardo Fretes
Dra. Mara Rosenzvit
AGRADECEMOS A NUESTROS AUSPICIANTES
Consejo nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas
(CONICET)
Comisión de Investigaciones Científicas (CIC)
Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica
(AGENCIA)
Fundación Bunge & Born
Natocor
Embiotec
Microlat
Lovob
Migliore Laclaustra
Cienlab
Elea
SIGMA
Biogénesis Bagó
Villa del Sur
Mundo Sano
CRONOGRAMA
Day 1
Day 2
Day 3
8.00 – 9.45
9.00 – 9.45
9.00 – 10.00
RECEPTION /
INSCRIPTIONS
MINICONFERENCE: Ariel Silber CONFERENCE: Silvia Moreno
9.45 – 10.15 COFFEE
9.45 – 10.15 COFFEE
10.00 – 10.30 COFFEE
10.15 – 11.45
10.15 – 11.45
10.30 – 11.45
SYMPOSIUM I: Advances in
the treatment of parasitic
diseases
SYMPOSIUM II: Parasites of
veterinary interest
SYMPOSIUM V: Vectors
SYMPOSIUM VII: Immune
response to parasitic
infections
12.00 – 13.00 hs
OPENING CONFERENCE:
Boris Striepen
LUNCH
SYMPOSIUM VI: Molecular and
Cellular Biology
SYMPOSIUM VIII: Parasite :
host interaction
12.00 – 13.15 hs
12.00 – 13.00 hs
MINICONFERENCE: Robert Hirt CLOSURE Conference: Hugo
Lujan
MINICONFERENCE: Andrew
Tobin
LUNCH
LUNCH
14.30 – 15.15 hs
14.30 – 15.15 hs
MINICONFERENCE: Gustavo
Salinas
MINICONFERENCE: Sergio
Schenkman
COFFEE: 15.15 – 15.45 hs
16.00 – 17.30
SYMPOSIUM III: Signaling in
protozoan parasites
COFFEE: 15.15 – 15.45hs
16.00 – 17.30
SYMPOSIUM IV: Molecular
epidemiology in
Trypanosoma cruzi
SAP Internal Meeting
17.45 – 18.45
17.45 – 18.45
CONFERENCE: Barbara
Papadopoulou
CONFERENCE: Manuel Fresno
14.30 – 15.45 hs
SYMPOSIUM IX: Diagnostic
innovation in congenital
Chagas
Awards: 16.00 –16.15hs
19.00 – 20.30
19.00 – 20.30
POSTERS SESION:
DIVERSE TOPICS
POSTERS SESION:
DIVERSE TOPICS
……..
CONFERENCES
SAP X Congress
Mar del Plata 2014
CONFERENCES
OPENING CONFERENCE:
Boris Striepen
CELL DIVISION IN APICOMPLEXAN PARASITES
6
OP
Maria Francia1, Michael Cipriano1, Sumiti Vinayak1, Carrie Brooks1, Elena Suvrova2,
Michael White2, and Boris Striepen1
1
Center for Tropical and Emerging Global Diseases & Department for Cellular Biology,
University of Georgia, Athens, GA 30602, USA, [email protected]
2
Departments of Molecular Medicine & Global Health and the Florida Center for Drug
Discovery and Innovation, University of South Florida, Tampa, FL 33612
Apicomplexan parasites are a major threat to the health of humans and their domestic
animals. We are using Toxoplasma gondii as a genetic model to dissect parasite cell
biology and metabolism. These parasites and many of their apicomplexan relatives
undergo a complex developmental process in the cells of their hosts, which includes
genome replication, cell division and the assembly of new invasive stages. Apicomplexan
cell cycle progression is both globally and locally regulated. Global regulation is carried out
throughout the cytoplasm by diffusible factors that include cell cycle-specific kinases,
cyclins and transcription factors. Local regulation acts on individual nuclei and daughter
cells that are developing inside the mother cell. We propose that the centrosome is a
master regulator that physically tethers cellular components and that provides spatial and
temporal control of apicomplexan cell division. We will describe a series of genetic and cell
biological studies that demonstrate the molecular components of several of these tethers,
and unravel the unique architecture and remarkable complexity of the apicomplexan cell
division machinery.
Coordination: Silvia Moreno
CONFERENCE I
Barbara Papadopoulou
C01
MECHANISMS OF RNA DEGRADATION AND TRANSLATIONAL CONTROL IN THE
PROTOZOAN PARASITE Leishmania
Barbara Papadopoulou*, Prasad K. Padmanabhan, Hiva Azizi, Mukesh Samant, Ouafa
Zghidi-Abouzid, Serge Cloutier, Karen Santos Charret, Larissa Mélo do Nascimento,
Carole Dumas
Research Center in Infectious Disease, CHU de Quebec Research Center (CHUL) and
Department of Microbiology and Immunology, Laval University, Quebec, Canada
Regulation of gene expression in Leishmania, an evolutionary early-branched unicellular
parasitic protozoan, occurs almost exclusively post-transcriptionally. We have reported
previously that the Leishmania genome is full of truncated versions of formerly active
retroposons, SIDERs (Short Interspersed DEgenerate Retroposons), that are located
mainly within 3'-untranslated regions and participate in distinct RNA networks. Members of
the SIDER2 subfamily promote rapid mRNA degradation by a novel mechanism involving
endonucleolytic cleavage without prior deadenylation. Primer extension analysis and
RNase protection assays mapped the putative endonucleolytic cleavage site within the
second conserved 79-nt SIDER2 signature sequence. Deletion and site-directed
CONFERENCES
7
mutagenesis studies highlighted the importance of secondary structure in the SIDER2mediated decay process. To identity protein factors involved in this process, we used an
optimized MS2 tethering approach with reporter transcripts harboring or not SIDER2, and
we are currently investigating few selected SIDER2-interacting RNA-binding protein
candidates.
We have reported recently that conditions of reduced translation upon stress and druginduced apoptosis trigger fragmentation of antisense ribosomal RNA (rRNA) correlating
with rRNA breakdown and translation inhibition. We found that this newly discovered
process is tightly regulated by at least two RNA-binding proteins, a 67 kDa ATP-dependent
DEAD-box RNA helicase (HEL67), which through its binding to both sense and antisense
rRNAs protects rRNA from degradation by preventing antisense rRNA cleavage, and a 25
kDa RNA-binding protein (RBP25) that interacts with HEL67 to coordinate the parasite
response to stress. Extensive phenotypic analysis of a Leishmania HEL67(-/-) null mutant
demonstrated that HEL67 is a key regulator of the response to intracellular stress, and is
therefore essential for amastigote survival within macrophages. Our findings support a
model where HEL67 protects the parasite from reactive oxygen species (ROS) generated
following oxidative phosphorylation in the mitochondrion or upon oxidative stress. While
the lack of HEL67 increases dramatically the sensitivity of the parasite to stress, the
opposite was observed with the RBP25(-/-) null mutant. Additional studies are now
underway to determine the interplay between HEL67 and RBP25 in coordinating the
response to stress.
Another way Leishmania uses to control translation levels under stress is by
phosphorylating the translation initiation factor 2 (eIF2) on its alpha-subunit. We recently
identified a novel mechanism of eIF2alpha developmental regulation initiated by a Nterminal methionine excision to allow high levels of translation in the rapidly dividing
promastigote form. While amastigotes produce a single eIF2alpha product of 47kDa,
additional products of 41, 35, and 25 kDa are detected in promastigotes. Deletion and
mutagenesis studies showed that the 94-aa N-terminal extension of eIF2alpha (unique to
trypanosomatids) plays a central role in eIF2alpha differential processing through the
action of methionine aminopeptidases. Interestingly, although the 47kDa protein is poorly
phosphorylated in promastigotes, the 35 kDa sub-product (no functional in translation)
seems to be highly phosphorylated. We are currently investigating whether
phosphorylation of the 35 kDa product sequesters the regulatory sub-complex of the eIF2B
GDP-GTP exchange factor, hence allowing a more efficient binding of the catalytic eIF2B
sub-complex to eIF2 to increase ternary complex formation and translation initiation.
Coordination: Jacqueline Bua
CONFERENCE II
Manuel Fresno
C02
METABOLOMIC ANALYSIS OF T. cruzi INFECTION: INVOLVEMENT OF L-ARGININE
METABOLISM IN THE IMMUNOPATHOGENESIS OF CHAGAS’ DISEASE
Manuel Fresno, Sofia Carbajosa, Henar Cuervo, Nestor A. Guerrero, Hector O.
Rodriguez and Nuria Gironès.
Centro de Biologia Molecular. CSIC-UAM, Universisdad Autonoma de Madrid, Spain
CONFERENCES
8
Chagas disease, caused by the protozoan parasite Trypanosoma cruzi, affects several
million people in Latin America. Myocarditis, observed in the acute and chronic phases of
the disease, is characterized by a mononuclear cell inflammatory infiltrate. Different types
of T lymphocytes, Th1, Treg and Th17, and myeloid cells infiltrate the heart depending of
the strain of mice. We identified CD11b(+) myeloid cells infiltratring the heart and other
organs and analyzed their phenotype and function. Purified CD11b(+)Ly6G(-) cells, but not
Ly6G(+) cells, showed a predominant monocytic phenotype, expressed arginase I and
inducible NO synthase, and suppressed T cell proliferation in vitro by an NO-dependent
mechanism, activity that best defines myeloid-derived suppressor cells (MDSCs).
Contrarily, CD11b(+)Ly6G(+) cells, but not CD11b(+)Ly6G(-) cells, expressed S100A8 and
S100A9, proteins known to promote recruitment and differentiation of MDSCs
Besides, we have analyzed the presence of those cells in the heart of mice infected with
different strains of T.cruzi belonging to all 6 different DTUs. We found that the amount of
those MDSC infiltrating the hearts of infected mice varied among infecting strains.
Interestingly, the extent of infiltrating MDSCs correlated with the extent and type of cardiac
damage.
By global metabolomic analysis we found important alterations of the L-Arginine
metabolism both in plasma and heart resulting in plasma L-arginine depletion in the acute
phase of infection that was coincident in time with the appearance of MDSCs. This
suggests that in vivo arginase I could be contributing to L-arginine depletion and systemic
immunosuppression. More notably, L-arginine supplementation decreased parasite
replication and improve symptom and survival of infected mice suggesting that sustained
arginase expression is detrimental for the host. Mechanistically, this was mostly due to
increasing INOS activity and tripanocidal activity of myeloid cells
Coordination: Adriana Gruppi
CONFERENCE III
Silvia Moreno
C03
CALCIUM SIGNALING AND THE LYTIC CYCLE OF THE APICOMPLEXAN PARASITE
Toxoplasma gondii
Silvia N J Moreno, Ciara A McKnight, Lucas Borges, Christina Moore, Alexandre Budu,
Jing Liu, Celia Garcia, Douglas A. Pace, Myriam Andrea Hortua Triana
Center for Tropical and Emerging Global Diseases, University of Georgia, Athens, GA,
USA.
Toxoplasma gondii is a protist parasite that belongs to the phylum Apicomplexa and is an
important cause of congenital disease and infection in immunocompromised patients. As
an obligate intracellular parasite, active invasion of host cells with subsequent replication,
egress and reinvasion of new cells are essential steps for the proliferation of the parasite
and its resulting pathogenesis. Previous evidence showed that Ca2+ is a critical element
required for invasion, replication, and egress but very few studies have looked into the
source of Ca2+ released into the cytosol. We found that extracellular Ca2+ enters the
parasite through a voltage gated mechanism leading to an increase in cytosolic Ca2+ which
enhances invasion-related traits like microneme secretion, conoid extrusion and gliding
activity (traits associated with host cell invasion). Importantly, blockage of extracellular
CONFERENCES
9
Ca2+ entry with nifedipine resulted in a 75% decrease in invasion. In addition, we found
that cytosolic Ca2+ itself stimulates Ca2+ entry. We have also looked at Ca2+ during the
process of egress and for this we created T. gondii parasites expressing G-CaMPs to
monitor Ca2+ dynamics in the parasites while inside their host cells. We infected HeLa and
fibroblast cells transiently expressing Red-GECO or Blue-GECO to detect host Ca2+
fluctuations simultaneously. These indicators warrant studies of Ca2+ fluctuations in the
parasite before and during egress from host cells. Cytosolic Ca2+ in the parasite fluctuates
in response to host Ca2+ cytosolic fluctuations supporting Ca2+ entry as a potential
mechanism by which the parasite keeps its Ca2+ stores filled and ready to be used for
egress. GCAMP-expressing parasites will allow future studies on the role and identification
of other second messengers preceding Ca2+ release into the cytosol. Considering that T.
gondii is an early branching eukaryote this information will help understanding the origin of
complex signaling pathways.
Coordination: Maria Corvi
CLOSURE CONFERENCE
Hugo Lujan
CC
DEVELOPMENT OF AN ORAL VACCINE PLATFORM BASED ON THE PROTECTIVE
PROPERTIES OF SURFACE PROTEINS OF THE INTESTINAL PARASITE Giardia
lamblia.
Laboratory of Biochemistry and Molecular Biology. Catholic University of Cordoba and
Center for Research and Development in Immunology and Infectious Diseases
(CONICET). Argentina. E-mail: [email protected]
Despite the impact of world-wide vaccination programs, there is still a great necessity to
develop novel, cheap and safe vaccination strategies. Since most infectious agents invade
the organism via mucosal surfaces, adaptive mucosal immunity plays a central role in
protecting the host against infections. Oral administration of vaccines represents an
attractive option because it is not invasive and suitable for mass vaccination. However, the
main impediment for oral vaccine development has been that orally administered antigens
are easily destroyed by the gastrointestinal tract. The intestinal parasitic protozoan Giardia
lamblia expresses at its surface variant-specific surface proteins (VSPs) that are extremely
resistant to the low pH of the stomach as well as to intestinal proteases, allowing the
parasite to survive in the harsh environmental conditions of the small intestine. These
VSPs are able to induce potent mucosal and systemic immunity against this diarrheacausing parasite upon immunization via the oral route. On the other hand, it has been
reported that virus-like particles (VLPs) given by injection are efficient immunogens to
induce both cellular and humoral responses. We thus hypothesized that expression onto
VLPs of Giardia VSPs should shield these particles for oral administration. To obtain a
proof of principle and, simultaneously, to develop a potential vaccine candidate, we used
Influenza Hemagglutinin (HA) as a vaccinal antigen, for which we have already established
all the procedures to monitor cellular and humoral anti-HA immune responses, including
challenge experiments with live virus. We produced our vaccines composed of VSP-HA
chimeric proteins as control or HA-expressing VLPs covered with VSPs and HA. Our
results clearly demonstrated that Giardia VSP can protect vaccinal antigens in the
gastrointestinal track, generating strong T and B cell-mediated protective responses. The
development of this universal platform for oral delivery of vaccines should have a broad
application to different infectious diseases.
Coordination: Juan J. Cazzulo
MINICONFERENCES
SAP X Congress
Mar del Plata 2014
MINICONFERENCES
10
MINICONFERENCE I
Gustavo Salinas
MC01
SINGULARITIES OF THE REDOX METABOLISM IN FLATWORM PARASITES:
SHIFTING THE BALANCE TOWARDS THE HOST SIDE
Depto de BIociencias, Universidad de la República, Uruguay. Laboratorio de Biología de
Gusanos, Institut Pasteur Montevideo.
The synthesis of DNA and the maintenance of redox homeostasis are essential for all
organisms. The oxidative stress imposed by the host is one of the main adaptive problems
faced by the parasites and the disruption of the subtle equilibrium between oxidative
damage and antioxidant defense may shift the biochemical balance towards the host side.
Contrary to what may be expected, the array of antioxidant defenses in flatworm parasites
is limited. A hallmark of flatworm parasites´ antioxidant defenses is the absence of
catalase and the restricted reliance on glutathione- and thioredoxin-dependent
peroxidases for hydrogen and lipid peroxide detoxification. Flatworm parasites´ antioxidant
defenses also differ from those of the host in a singular aspect: they lack conventional
thioredoxin and glutathione systems, and possess a unique linked thioredoxin-glutathione
system, in which a single core enzyme, termed thioredoxin glutathione reductase (TGR),
provides reducing equivalents to both pathways. This enzyme, that supports DNA
synthesis and the overall homeostasis in flatworm parasites, possesses at its active site
the highly reactive amino acid selenocysteine, which is the central “hub” for transfer of
electrons to both pathways. The druggability of TGR, due to the presence of this amino
acid, together with the dissimilar arrangement of parasite´s and host´s redox pathways,
have directed efforts to identify drug leads to control flatworm infections by disrupting
redox homeostasis. Recent studies validated TGR as a drug target, and identified
oxadiazole N-oxides and gold compounds as potent inhibitors of this enzyme. The
sequencing of parasitic flatworm genomes has revealed the presence of a TGR-dependent
redox network with an unexpected diversity of downstream targets of TGR. We will review
the major advances made on the biochemical characterization of TGR, the TGRdependent redox network and the identification of TGR inhibitors that kill platyhelminth
parasites. The energy metabolism of parasitic flatworms is also unusual. They are unable
to oxidize lipids and obtain their energy primarily from carbohydrate sources.
Carbohydrates, their main energy source, can be catabolized by aerobic respiration or by
two complementary anaerobic pathways; the lactate fermentation and malate dismutation.
This latter pathway occurs in the mitochondria and it is absent in their hosts. In this
pathway, part of the malate is oxidized to acetate, via pyruvate, yielding NADH, and part is
reduced to succinate. Electrons from NADH are transferred via complex I and
rhodoquinone to fumarate reductase. Rhodoquinone is an electron transport absent in
mammals and its biosynthetic pathway may provide a novel antiparasitic drug target for
both flatworms. We have identified genes putatively involved in this pathway, also present
in roundworms, and we are using C. elegans as a model to elucidate this metabolic route.
This will be presented and discussed in the context of the helminhs “anaerobic”
mitochondria.
Coordination: Mara Rosenzvit
MINICONFERENCES
11
MINICONFERENCE II
Ariel Silber
MC02
MITOCHONDRIAL METABOLISM AND NEW DRUG TARGETS FOR CHAGAS'
DISEASE.
Team: Brian A. Suarez Mantilla, Elisabeth M. F. Pral, Flávia Silva Damasceno, Gustavo
Baptista, Higo Fernando Santos Souza, Leticia Marchese, Ludmila Nakamura Rapado,
Marcell Crispim, María Julia Barisón, N. Carolina Manchola Varón, Raissa F. Pimentel
Melo, Richard Girard, Sandra Carla Rocha
Address: Departamento de Parasitologia - Instituto de Ciências Biomédicas - Universidade
de São Paulo, São Paulo – Brasil
[email protected]
Over the past few years we and others have revealed unique characteristics of
Trypanosoma cruzi mitochondria and its metabolism that explain several peculiarities of T.
cruzi metabolism and can be exploited as targets for new drugs against this parasite
(Páes, Mantilla et al. 2011). Amino acids are major energy sources in most of T. cruzi
stages. Presently, we are unveiling the molecular systems involved in parasite´s
bioenergetics, focusing on most of amino acids degradation and biosynthesis pathways.
We demonstrated a metabolic switch from a glucose-based to a proline-based metabolism
during the mammalian host-cell infection (Silber, Tonelli et al. 2009). We further expanded
our research focus to discover non-canonical functions for amino acids and their
metabolites. We found that the equilibrium between proline degradation and biosynthesis
is related to the balance between the cell energy, and the reductive capacity requirements
(Magdaleno, Ahn et al. 2009, Paes, Suarez Mantilla et al. 2013). In addition, this
equilibrium is regulated by the uptake/oxidation of branched chain amino acids, which, in
turn, negatively regulates the development of the intracellular infection (unpublished data).
We recently showed that the perturbation of proline oxidation by specific inhibitors of these
pathway diminishes the ability of parasites to produce ATP and to survive to metabolic and
oxidative stress conditions. We demonstrated also the perspectives of amino acids and
derived keto acids dehydrogenases as drug targets. A library of compounds against these
targets are being currently evaluated in vitro and in vivo. Glutamate, the main product of
proline oxidation, is the main substrate for the glutamine biosynthesis, a major nitrogen
reservatoir. We showed that the enzyme responsible for the biosynthesis of glutamine is
involved also the resistance to oxidative unbalance and to the stress caused by the the
excess of NH4+ (Magdaleno, Suarez Mantilla et al. 2011). The analysis of histidine
metabolism is giving also some clues on amino acids and energy metabolism regulation:
its metabolic fate can be related to the reinforcement of proline or energy production,
depending on the physiological conditions of the cells (unpublished data). Taken together,
these data exemplify how complex are these metabolic networks, and reveals a number of
alternative ways of "traveling from one metabolite to another". We are currently devoted to
understand the logics of amino acids metabolic pathways to identify bottlenecks as well as
"exclusive" enzymes to be evaluated as new drug targets in vitro and in vivo. The present
lecture will focus on the pathways connecting histidine, glutamate, proline, glutamine and
the BCAA, and their role in the T. cruzi life cycle.
Coordination: Claudio Pereira
MINICONFERENCES
12
MINICONFERENCE III
Robert Hirt
MC03
Trichomonas vaginalis VAST POTENTIAL PROTEOME: AN EVOLUTIONARY AND
FUNCTIONAL PUZZLE
Institute for Cell and Molecular Biosciences, Faculty of Medical Sciences, Newcastle
University, Newcastle upon Tyne, NE2 4HH, UK
The annotation of the genome sequence data from one strain (G3) of Trichomonas
vaginalis identified ~60,000 protein coding genes. This is an unusually large set of proteins
in general and for a microbial eukaryote in particular. We are investigating the origins of
these genes and their potential function through detailed bioinformatics analyses focusing
on genes underlying membrane trafficking, candidate surface proteins and those acquired
through lateral gene transfers. Recent published transcriptomics data are also being
exploited to further highlight likely functional genes. Phylogenetic analyses providing
insights into the origin of T. vaginalis are also considered for future work on comparative
genomics of the human parasite and its closely related species isolated from animals,
which are also suggesting a zoonotic origin for T, vaginalis, probably from a bird infecting
trichomonad. A selection of gene families will be discussed including TvRab small
GTPases, adaptins, candidate surface proteins and genes of relatively recent bacterial
origins. An important fraction of the annotated protein coding genes are likely to be
functional. Many genes are part of genes families including some large ones with
examples of dramatic amplification across a number of functional categories including
those orchestrating membrane trafficking and candidate cell surface proteins. In addition
lateral gene transfers have also contributed to the important coding capacity of the
parasite. Together these data provide important new insights into the molecular and
cellular basis of the parasite pathobiology.
Coordination: Natalia de Miguel
MINICONFERENCE IV
Andrew Tobin
ESSENTIAL PHOSPHO-SIGNALLING CASCADES IN MALARIA
MC04
Andrew B. Tobin, Lev Solyakov and Mahmood Alam.
MRC Toxicology Unit, University of Leicester, Hodgkin Building, Leicester LE1 9HN UK.
The >500 mammalian protein kinases are organised into phospho-signalling modules that
are co-ordinated in a complex and dynamic manner to mediate the many tens of
thousands of cellular phosphorylation events. Whereas the nature of these phosphosignalling cascades are generally well understood in mammalian systems knowledge of
the phospho-signalling pathways in malaria parasites is still in its infancy. Recently,
published global phosphoproteomic studies conducted on the most virulent species of
human malaria parasites, Plasmodium falciparum, have revealed that the 80-100 parasite
protein kinases 1-3 phosphorylate proteins involved in nearly every aspect of the asexual
blood stage of the parasite life cycle 4-7. These studies have indicated that targeting the
highly divergent parasite protein kinases might be a fruitful area for development of novel
anti-malaria therapies.
MINICONFERENCES
13
One of the barriers to exploiting parasite kinases in drug development is, however, the
paucity of information regarding the role of the essential protein kinases and the nature of
phospho-signalling cascades in malaria. In this talk we address this issue by focusing on
the essential P. falciparum protein kinase PfPKG. I describe here a chemical genetic
approach that has allowed us to distinguish between the off-target and on-target actions of
a chemical inhibitor to PfPKG called compound 2. Combining this with quantitative global
phospho-proteomics we are able to determine 113 cellular targets for PfPKG - that
implicate PfPKG in a broad range of cellular processes.
I will also discuss how we are taking this approach and applying it to other parasite protein
kinases and importantly how we are employing all these approaches in drug discovery
projects in collaboration with the pharmaceutical industry.
Coordination: Julia Cricco
MINICONFERENCE V
Sergio Schenkman
MC05
TRANSLATION CONTROL AND OXIDATIVE RESPONSE IN TRYPANOSOMES
Leonardo da Silva Augusto, Nilmar Silvio Moretti, Beatriz A. Castilho, Sergio Schenkman Departamento de Microbiologia, Imunologia e Parasitologia, Escola Paulista de Medicina,
Universidade Federal de São Paulo, São Paulo, São Paulo, Brasil
Trypanosoma cruzi, the causative agent of Chagas’ disease, faces different environmental
conditions during its life cycle, such as starvation and alterations in temperature and pH,
which requires the activation of specific metabolic pathways to allow its survival. Among
those, regulation of translation initiation through the phosphorylation of the alpha subunit of
translation initiation factor 2 (eIF2) has been demonstrated to play a key role (Tonelli et
al. 2011, PlosOne 6:e27904). Here we show that one of the eIF2 kinases (TceIF2-K2) is
associated with endosomal organelles called reservosomes in the epimastigote form. This
kinase is modulated by the presence of heme, which also inhibits the differentiation of
proliferative epimastigotes to infective metacyclic-trypomastigotes. Parasite lines lacking
TcK2 lose the differentiation capacity and displayed a growth deficiency due to the
accumulation of hydrogen peroxide as consequence of an increase in the superoxide
dismutase activity and peroxidase down modulation. In the presence of iron, the
accumulated peroxide generates oxygen species that damage the parasite. As these
phenotypes could be restored by the wild type but not by a kinase dead mutant, we
conclude that this unusual eIF2 kinase is a key factor in controlling growth, responses to
oxidative stress and parasite differentiation.
FAPESP / CNPq
Coordination: Hugo Lujan
SYMPOSIA
SAP X Congress
Mar del Plata 2014
SYMPOSIA
15
SYMPOSIUM I
Advances in the treatment of parasitic diseases
Coordination: Alejandro Schijman / Sergio Sosa
Israel Molina
NEW THERAPEUTIC PERSPECTIVES AGAINST CHAGAS DISEASE
ST01
Unidad de Medicina Tropical y Salud International. Hospital Universitario Vall d’Hebron.
PROSICS Barcelona
Treatment against Chagas disease is bounded to Nifurtimox and Benznidazole. In the
acute phase of the disease both drugs have acceptable rates of cure, but in the chronic
phase, the numbers do not exceed 40% cure. Nevertheless, the current trend is to treat
adult patients with Chagas disease in chronic phase.This is mainly based on the lower
clinical progression of cardiomyopathy among treated patients compared with those who
did not receive treatment, as demonstrated the group of Dr. Viotti.
Another problem linked to the nitroderivatives drugs, is the high proportion of side effects
experienced by patients that lead to a final discontinuation in almost 15% of cases. This
therapeutic scenario has conditioned several initiatives in recent years with the aim of
finding new evidence that strengthened the classic treatments, finding new drugs or even
analyzing drug combinations.
One promising group of drugs, is ergosterol synthesis inhibitors, essential for the stability
of the membrane of the protozoa. The group of Dr. Urbina, after evaluating such drugs in
the mouse model, both acute and chronic, noted that posaconazole might be the most
potent inhibitor of ergosterol ever tested against Trypanosoma cruzi. Subsequently other
drugs in this family have been evaluated in both animal models and humans.
Therefore we pretend to do a comprehensive review of the major published works and
initiatives that are being undertaken in order to bring new developments in this field.
Faustino Torrico
ST02
AVANCES EN EL TRATAMIENTO ESPECÍFICO DE LA ENFERMEDAD DE CHAGAS
EN EL PACIENTE ADULTO CRONICAMENTE INFECTADO
Universidad Mayor de San Simón, Cochabamba – Bolivia
El Reporte del Comité de expertos de la OMSS, publicado el año 1991 referente al
tratamiento específico de la enfermedad de Chagas indica: “…Ambos medicamentos
(Benznidazol y Nifurtimox) son aceptados como útiles en la Enfermedad de Chagas
aguda… el tratamiento tripanomicida está indicado para pacientes con enfermedad
enfermedad de Chagas aguda, la mayoría de los cuales son jóvenes y más tolerantes que
los adultos a los efectos secundarios derivados del usos de estos medicamentos” y
continua … Dado que no hay información sobre la eficacia del tratamiento tripanomicida
para prevenir el desarrollo de la enfermedad de Chagas crónico, este no está indicado
durante la fase indeterminada de la infección …”
El segundo Reporte del Comité de expertos de la OMSS del año 2002 referente al mismo
tema indica: “dadas las realidades epidemiológicas de cada país, se ha establecido el
consenso que las personas con enfermedad de Chagas Crónica (individuos con serología
positiva para Chagas) deben ser tratadas con medicamentos específicos … El beneficio
general aportado por el benznidazol en las fases agudas y crónicas de la enfermedad de
SYMPOSIA
16
Chagas indica que el tratamiento con este medicamento se debe recomendar para todo
individuo con serología positiva”
Estos dos posicisionamientos, a una década de diferencia, constituyen en si un cambio de
paradigma referente al tratamiento del Chagas crónico y abre la posibilidad de beneficiar a
millones de personas adultas que se encuentra en esta situación y que actualmente viven
en regiones donde el control vectorial la reducido de forma importante el riesgo de re
infecciones.
Este misma publicación de la OMS del año 2002 indica “aunque el Benznidazol es eficaz
en la enfermedad de Chagas, para aumentar la eficacia del tratamiento se necesitan
nuevos fármacos que se puedan administrar durante menor tiempo y tengan menos
efectos secundarios”
Siguiendo estas recomendaciones se han iniciado estudios de nuevos fármacos contra la
enfermedad de Chagas crónica del adulto asi tenemos el estudio de Molina I y col:
Randomized trial of posaconazole and benznidazole for chronic Chagas' Disease (N
Engl J Med. 2014 May) que muestra que el Posaconazol tiene una actividad tripanocida
durante el tratamiento en pacientes con Chagas pero rápidamente se observa una recaída
en estos pacientes después del tratamiento, al contrario los pacientes tratados con
benznidazol muestran una actividad tripanocida sostenida de un 94% de los pacientes
que completaron el tratamiento y el seguimiento hasta los 360 días de iniciado el mismo.
De igual manera se ha realizado en Bolivia un estudio clínico fase II de prueba de
concepto del E1224 un pro-fármaco del ravuconazoll (estudio concluido y en etapa de
publicación) que de igual manera Benznidazol tuvo un actividad tripanocida rápida y
sostenida, del 81% a los 12 meses, además de una caída significativa en el recuento de
parásitos después de sólo una semana de tratamiento mientras que el Eliminación del
parásito, pero no una respuesta sostenida muy inferior con E1224 a 12 meses de iniciado
el tratamiento (DNDi, CRESIB, CEADES)
Actualmente se está desarrollando en Bolivia el “Estudio de Eficacia y Seguridad de Fase
2 Aleatorizado, Multicéntrico, Controlado con Placebo, para la Evaluación de Seis
Esquemas de Dosis Orales de Fexinidazol para el Tratamiento de Pacientes Adultos con
Enfermedad de Chagas Crónica Indeterminada” (DNDi, CRESIB, CEADES). Este estudio
está en fase de reclutamiento de pacientes y se esperan los resultados dentro de 14
meses.
En conclusión podemos indicar que hay un cambio importante de paradigma respecto al
tratamiento del Chagas crónico y una clara recomendación de la OMS para el tratamiento
con Benznidazol de toda persona con serología positiva para Chagas, este concepto debe
ser difundido y explicado al personal de salud, que aun 12 años después de la
recomendación sigue cuestionando el mismo. Después de más de 40 años se han
iniciado estudios clínicos para buscar nuevos medicamentos para esta enfermedad y por
el momento los resultados muestran que aunque estos tienen un efecto parasiticida
inmediato, la respuesta a a largo plazo no es la esperada. Sin embargo también estos
estudios han demostrado que el Benznidazol es un muy buen medicamento contra el
Trypanosoma cruzi con una respuesta parasiticida prolongada superior al 80% y que los
efectos secundarios del mismo pueden ser bien controlados por personal de salud bien
entrenado.
Claudio Salomón
ST03
NUEVAS FORMULACIONES DE BENZONIDAZOL PARA EL MAL DE CHAGAS
Facultad de Cs. Bioquímicas y Farmacéuticas, Universidad Nacional de Rosario, IQUIRCONICET
SYMPOSIA
17
Chagas’ disease or American tripanosomiasis is a zoonosis discovered by Dr. Carlos
Chagas, a Brazilian physician, who first identified the infection caused by Trypanosoma
cruzi in 1909. His valuable study included description of the entire lifecycle of the parasite,
vectors, and animals and humans that act as reservoir hosts. Although the vectorial
transmission has been reduced, Chagas’ disease is still amajor public health problem and
one of the leading causes of morbidity, long-term disability, andmortality in Latin America,
with estimates of nearly 90million people at risk of infection and more than eight million
infected in 18 endemic countries. Furthermore, the number of yearly new cases due to
vectorial transmission was around 42,000 people, and the infected neonates by congenital
Chagas’ disease per year were nearly 15,000. Additional to human morbidity and mortality,
this parasitic infection places a substantial burden in poorer, developing countries,
increasing both the poverty and vulnerability of those people.
Chagas’ disease is transmitted primarily by insects, known as “kissing bugs,” through the
bite wound or mucous membranes. Moreover, the dissemination of this parasitic infection
may occur by transfusion of blood from persons infected with T. cruzi and/or organ
transplantation. Also, infected pregnant women may transmit T. cruzi to her newborn,
resulting in congenital Chagas’ disease. A noncommon route of infection is through
ingesting food and drink contaminated with the faeces of a triatomine carrying the parasite.
Lately, and due to the great dissemination from endemic areas in Latin America to the
United States, Canada, and several countries of the European Community, Chagas’
disease has become a serious concern for the nonresident tropical population. Nearly
300,000 people live with Chagas’ disease in the United States, and more than 80,000
cases are being reported in Spain. In North America, as recently stated, this parasitic
infection is becoming a serious concern, which can have severe consequences for public
health, principally because of its potential to contaminate the blood transfusion supply as
well as its dissemination through surgical implantation of infected donor organs to patients
in nonendemic areas.
Although some progress focused in the process of drug discovery have been made in
recent years, the significant cost of these projects and the lack of assurances that they can
make a return on their investment discouraged pharmaceutical companies from investing
in research and development programs against Chagas’ disease. As a consequence, to
date, there are only two therapeutic agents applied to the treatment of Chagas’ disease.
One of them is nifurtimox, manufactured as Lampit® available only as 120mg tablets. The
other drug, benznidazole, is manufactured as Rochagan® (Brazil) or Radanil® (Argentina),
available as a unique presentation of 100mg tablets. Recently, an Argentinian drug
development consortium was able to develop Abarax® as 100 mg and 50 mg tablets.
Although both active compounds are included in the World Health Organization project
“Better medicines for children,” an effective chemotherapy for paediatric population
infected with Chagas’ disease is still lacking.
Thus, basic concepts and principles relating the development of novel solid dosage forms
of Benznidazole will be presented. In addition, the in-vitro/in-vivo evaluation of cosolvent
systems, defined as water-miscible organic solvents, to increase the solubility of
Benznidazole in order to formulate syrups and drops for treating Chagas´disease in
pediatric patients will be discussed.
SYMPOSIA
18
SYMPOSIUM II: Farmacological and immunological control of parasites with
veterinary interest
Coordination: Luis Alvarez / Silvina Wilkoski
Gonzalo Suarez
SFV01
COMBINACIÓN DE FÁRMACOS COMO ESTRATEGIA DE CONTROL PARASITARIO.
UNA MIRADA DESDE LA MEDICINA VETERINARIA
Facultad Veterinaria, Universidad de la República, Montevideo, Uruguay
e-mail: [email protected]; [email protected]
Con el objetivo minimizar la falla terapéutica ante la generalizada aparición de resistencia
nematodos gastrointestinales del ovino, se han desarrollado diferentes presentaciones
farmacéuticas que incluyen dos o más principios activos nematodicidas de diferente
mecanismo de acción. La justificación del uso de combinaciones, apunta a minimizar las
probabilidades de un fracaso terapéutico tras un único tratamiento. En un contexto
epidemiológico con presencia de poblaciones parasitarias resistentes, el uso de
combinaciones no parece ser una alternativa sustentable de control. Sin embargo, cuando
la presencia de resistencia se encuentra en niveles mínimos, podría demorarse el
desarrollo de resistencia con el uso de combinaciones. La administración de dos
productos
en
forma
combinada
puede
derivar
en
interacciones
farmacocinéticas/farmacodinámicas. Dichas interacciones han sido descriptas para
diferentes
combinaciones
incluyendo
albendazole+ivermectina
y
levamisol+albendazole+ivermectina. Es necesario conocer el impacto clínico de dichas
interacciones a la hora de diseñar una estrategia de control farmacológica racional. El uso
de combinaciones requiere de un conocimiento del contexto epidemiológico en el cuál se
va a utilizar, inmerso en un plan de Control Integrado de Parásitos, donde el diagnóstico
de resistencia es un componente fundamental. Se discutirán las principales ventajas y
desventajas del uso combinado de fármacos en el control de helmintos, a partir de las
experiencias logradas en el campo de la medicina Veterinaria. De esta forma, se pretende
realizar un aporte original en la disciplina que sirva como punto de partida en el diseño de
estrategias de control de otros parasitarios de importancia médica.
José Tort
SFV02
APORTES DESDE LA GENÓMICA Y TRANSCRIPTÓMICA A LAS ESTRATEGIAS DE
CONTROL DE HELMINTOS
Departamento de Genética, Facultad de Medicina, Universidad de la República,
(UdelaR), Montevideo, Uruguay
El control de las helmintiasis descansa mayormente sobre el uso de fármacos
antiparasitarios, pero se reiteran los casos de resistencia a las distintas drogas utilizadas.
Existe consecuentemente una necesidad de explorar nuevos blancos potenciales para el
control parasitario. La creciente disponibilidad de genomas y transcriptomas de helmintos
abre un nuevo campo de búsqueda de posibles blancos para el control de las parasitosis,
existiendo diversas estrategias para esta búsqueda.
Por un lado, la identificación in silico de moléculas secretadas y de superficie apunta a la
interacción y el contacto directo con el hospedero. El estudio de las vías metabólicas
permite identificar “cuellos de botella” metabólicos, cuyo bloqueo puede implicar el
SYMPOSIA
19
agotamiento de algún producto esencial o la acumulación de un metabolito tóxico para el
parásito. La genómica comparativa permite identificar los genes conservados en los
parásitos, pero con ortólogos ausentes en los hospederos. Otra alternativa es la búsqueda
de genes cuyos ortólogos en Caenorhabditis elegans o planarias presenten fenotipos
asociados al desarrollo o letalidad en ensayos de RNAi. Estas estrategias combinadas
resultan en listas de candidatos que pueden discriminarse identificando enzimas que son
blancos de drogas verificados en otros organismos. En cualquier caso estos deberán ser
validados en los modelos parasitarios, siendo los experimentos de RNAi una interesante
estrategia de validación funcional.
Los estudios de la variabilidad genética parasitaria son aun incipientes, pero aportan a la
historia epidemiológica de las infecciones y pueden permitir identificar a partir de la
comparación de aislados sensibles y resistentes a drogas los posibles mecanismos
subyacentes a estos procesos.
Recientemente se ha sugerido que algunos miRNAs podrían ser indicadores de infección
y/o posibles blancos de intervención, agregando la regulación génica a la lista de
candidatos. Diversos avances en estos enfoques serán presentados y discutidos.
Prando Dadin Moore
SFV03
SHOULD VETERINARIANS AND FARMERS BE AFRAID OF USING A LIVE VACCINE
AGAINST Neospora caninum?
1
National Research Council, ARGENTINA INTA Balcarce, Balcarce, Argentina
Since the description and denomination of Neospora caninum as cause of abortion in
cattle, most research groups working on Toxoplasma gondii extrapolated their expertise,
methodologies and techniques to know about this new coccidian parasite. N. caninum has
emerged not only as the first cause of abortion in dairy cattle but also as being responsible
of billion dollar losses in cattle industry worldwide (Reichel et al., 2013). For over 25 years
of research, the control of the disease is reduced to interrupt the parasite cycle, limiting the
access of canids (definitive hosts: dog, wolf, coyote and dingo) to the water and food
supplies for cattle or eliminating tissues occasioned by abortions (Dubey et al., 2007).
Costly management control also includes the culling of infected animals and not drug has
been shown to prevent neither abortions nor infections in cattle (Reichel et al., 2013;
Dubey et al., 2007). N. caninum has such adaptation to cattle that vertical transmission
occurs efficiently without any clinical sign but abortion and sporadically neurological
symptoms in newborn calves. Stress, genetic, immunosuppression, management have
been identify as risk factors for the presentation of the disease. Also postnatal
transmission occurs allowing the parasite to complete its life cycle (Dubey et al., 2007).
Many live vaccines have been used as effective tools for preventing serious diseases
including toxoplasmosis, theileriosis, babesiosis, coccidiosis (McAllister, 2014). More over
naturally attenuated strains have been shown to be useful but a live Neospora vaccine is
not in the market yet. Inactivated vaccine for preventing bovine neosporosis showed very
low efficacy like in many other parasitic diseases (Reichel et al., 2013; Dubey et al., 2007).
Disadvantages of live vaccines include reversion to pathogenicity, costly production and
latency in the intermediate host (McAllister, 2014) but none of them have been proved for
neosporosis yet. More over many molecular techniques are available for distinguish
vaccinated from naturally infected animals, these includes genetic characterization or
SYMPOSIA
20
development of live vaccine with deletion of genes coding for specific proteins which could
be used in a given serological test. Farmers should not be afraid of using a live vaccine
against bovine neosporosis. Reduced doses able to induced protective immunity should
be investigated. The NC-6 strain of N. caninum is an Argentinean isolate obtained from the
faeces of a naturally infected dog (Basso et al. 2001). The ability of tachyzoites from the
NC-6 strain to induce protection in pregnant challenged heifers has been recently
evaluated (Hecker et al., 2013) but NC-6 Argentina is pathogenic in cattle (Bacigalupe et
al., 2013). A non pathogenic Neospora-strain used as vaccine could be very useful as a
tool to control bovine neosporosis. Integrated control management control strategies
including the use of inactivated vaccines even with low efficacy could be implemented.
SYMPOSIUM III: Signaling in protozoan parasites
Coordination: Esteban Serra / Tellez Inon
Gustavo Arrizabalaga
SS01
NOT SO GRACEFUL EXIT: ROLE OF CALCIUM DEPENDENT PROTEIN KINASE 3 IN
Toxoplasma gondii EGRESS
Raj Gaji, Kaice La Favers and Gustavo Arrizabalaga
Indiana University, School of Medicine
Egress from the host cell is a crucial and highly regulated step in the biology of the
obligate intracellular parasite, Toxoplasma gondii. Active egress depends on calcium
fluxes and appears to be a crucial step in escaping the attack from the immune system
and, potentially, in enabling the parasites to shuttle into appropriate cells for entry into the
brain of the host. Previous genetic screens have yielded mutants defective in ionophoreinduced egress. Using whole genome sequencing of one mutant and subsequent analysis
of all mutants from these screens, we find that, remarkably, four independent mutants
harbor a mis-sense mutation in the same gene, TgCDPK3, encoding a calcium-dependent
protein kinase. All four mutations are predicted to alter key regions of TgCDPK3 and this is
confirmed by biochemical studies of recombinant forms of each. By complementation we
confirm a crucial role for TgCDPK3 in the rapid induction of parasite egress and we have
establish that TgCDPK3 is critical for formation of latent stages in the brains of mice. To
identify potential substrates and determine mechanism of TgCDPK3 function during
egress we adopted the recently developed Bio-ID system, which entails fusing TgCDPK3
to the bacterial biotin ligase BirA. Toxoplasma mutant parasites (MBE 1.1) were
complemented with TgCDPK3-BirA construct. MBE 1.1 parasites expressing either wildtype TgCDPK3 or TgCDPK3-BirA were treated with excess biotin and the biotinylated
proteins were pulled down using streptavidin magnetic beads. Among the proteins
specifically biotinylated in the TgCDPK3-BirA expressing parasites we identified myosin-A,
TgGAP-45 and a protein phosphatase 2C. We have analyzed the three putative substrate
proteins by peptide array analysis to identify residues that are phosphorylated by purified
recombinant TgCDPK3 and found that S20, S21, S743, S744 in TgMysoin-A and T272,
S276 in TgPP2C were strongly phosphorylated. Studies are currently underway to
generate TgMyosin-A knockout parasites complemented with various phosphorylation
mutants and also endogenous tagging of TgPP2C to examine localization within the
parasite. These studies should reveal potential signaling pathway involving TgCDPK3 and
generation of novel therapeutics against the intracellular parasite.
SYMPOSIA
21
Julia Cricco
SS02
Does Trypanosoma cruzi need heme? How is heme imported, distributed and used
by it?
Julia A. Cricco, Lucas Pagura, Marcelo L. Merli and Brenda A. Cirulli
Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario. CONICET - Universiad Nacional de
Rosario.
Suipacha 531. 2000 Rosario, Santa Fe. Argentina.
Heme plays a fundamental role in many cellular processes. It is an essential
cofactor for proteins involved in oxygen transport and storage, mitochondrial electron
transport (Complex II–IV), drug and steroid metabolism (cytochromes), signal transduction
(nitric oxide synthases, soluble guanylate cyclases), and transcription and regulation of
antioxidant defense enzymes. Heme is also a regulatory molecule; its cytosolic to nuclear
ratio and the absolute amount of its concentration affects gene transcription and
translation; thus, the intracellular heme level must be tightly regulated. The heme
biosynthetic pathway is highly conserved through evolution. Iron, porphyrins and heme are
highly toxic to cells; therefore the level of free heme inside the cell is maintained very low.
There is a tight control of its biosynthesis and degradation based on cellular requirements.
Most of the eukaryotic organisms are able to synthesize heme, however, the medically
relevant trypanosomes are completely (T. cruzi and T. brucei), or partially (Leishmania
spp.), deficient in heme synthesis and they must scavenge this molecule from their hosts.
Once heme is imported, it has to be distributed inside the cell and inserted into the target
heme-proteins. But, the processes of heme transport and distribution in trypanosomatids
remain unknown. Besides, these parasites present heme-proteins involved in essential
metabolic pathways like biosynthesis of sterols and polyunsaturated fatty acids (PUFAs)
carried out in the endoplasmic reticulum (ER) and respiratory complexes in the
mitochondrion. The understanding of how they import, distribute, utilize heme, and
assemble heme-proteins can help elucidate the essential metabolic pathway in these
trypanosomatids.
We are interested in elucidating how T. cruzi imports, distributes and uses heme.
Our results showed that this parasite takes heme from the environment (host), at least
during the replicative life stages, and distributes heme inside cell. The blockage of heme
transport or mitochondrial heme modification negatively affects cell proliferation.
.
Federico Rojas
THE TRANSMEMBRANE PROTEIN HOMOLOGUE GPR89
DEVELOPMENT OF STUMPY FORMS IN Trypanosoma brucei
PROMOTES
SS03
THE
Federico Rojas; Rachel Milne; Joanne Thompson; Keith R. Matthews
Centre for Immunity, Infection and Evolution, Institute for Immunology and infection
Research, School of Biological Sciences, Ashworth Laboratories, University of Edinburgh,
West Mains Road, Edinburgh EH943JT, Scotland
SYMPOSIA
22
G protein-coupled receptors are seven transmembrane domain (TM) proteins that
transduce signals through their interactions with extracellular ligands and G proteindependent and -independent signaling cascades allowing cells to respond to changes
within their environment. Although trypanosomes are conventionally described as lacking
GPCRs, we have identified a T. brucei protein (TbGPCR-like 1; TbGPCR-L1) related to the
GPR89 family members that have been implicated in abscisic acid signaling in plants and
Golgi acidification in mammals. The T.brucei protein has eight predicted TM and localizes
to the cell plasma membrane. Western blot and immunofluorescence analysis shows that
in pleomorphic trypanosomes (i.e. capable of generating slender and stumpy forms),
TbGPCR-L1 is expressed on slender forms but levels decrease as cells differentiate into
intermediate and stumpy forms. In pleomorphic parasites, in contrast to monomorphic
cells, inducible overexpression of TbGPCR-L1 protein drives premature differentiation in
vitro and in vivo, generating stumpy cells at lower cell density compared to uninduced or
the parental cell line. Overexpression of TbGPCR-L1 in a RNAi background targetting
RBP7- a putative RNA binding protein required for normal quorum sensing- cells do not
differentiate into stumpy cells, suggesting that TbGPR89 signalling acts upstream of RBP7
but on the same pathway. TbGPR89-L1 is rapidly degraded when overepxressed in what it
seems to be an ubiquitin-dependent process involving the C-terminal portion of the protein,
similar to the desensitization of GPCRs in other organisms. Our experiments indicate that
TbGPR89-L1 might be expressed on slender forms as a sensor of an external stimulus
thus initiating stumpy formation.
SYMPOSIUM IV: Molecular epidemiology in Trypanosoma cruzi
Coordination: Patricio Diosque
María C. Cécere
SE01
CHAGAS DISEASE IN THE SUBANDEAN VALLEYS OF NORTHWEST ARGENTINA:
EPIDEMIOLOGICAL ROLE OF TWO TRIATOMINE SPECIES AND CAVIES.
María C Cecere1, Victoria M Cardinal1, Marina Leporace1, María P Fernández1, Juan P
Arrabal2, Claudio Moreno3, Ricardo E Gürtler1
1 Lab. Eco-epidemiología, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de
Buenos Aires- Instituto de Ecología, Genética y Evolución, CONICET, Argentina. 2
Instituto Nacional de Medicina Tropical-Ministerio de Salud Puerto Iguazú, Misiones,
Argentina. 3 Coordinación Nacional de Control de Vectores, San Miguel de Tucumán,
Tucumán, Argentina.
e-mail: [email protected]
Wild and synanthropic rodent species are implicated in the transmission of Trypanosoma
cruzi in several regions where TcI is the most prevalent Discrete Typing Unit (DTU)
detected. In Argentina, several rodent species of Sigmodontinae were infected with Tc
while species of Caviinae (include “cuises” or guinea pigs) have received less attention.
Regarding Triatoma eratyrusiformis (Te), its epidemiological relevance has not been
assessed although it has a wider geographic distribution in western Argentina associated
SYMPOSIA
23
with edentate and rodents. As part of a wider research project on Chagas disease vector
control, the present study sought to understand the role of cavies and two peridomestic
triatomine species in a well-defined rural area of Tafi del Valle (Tucumán).
The occurrence of T. cruzi infection in Microcavia australis and its reservoir host
competence were assessed by xenodiagnosis and by polymerase chain reaction
amplification of the hyper-variable region of kinetoplast DNA minicircles of T. cruzi (kDNAPCR) from blood samples. For assessing host-vector contact across different ecotopes,
bloodmeal contents in Te and Triatoma infestans (Ti) were tested with a direct ELISA
assay against human, dog, cat, chicken, pig, goat, cavy, rabbit and murid rodent (rat or
mouse) antisera. Bug infection by T. cruzi was evaluated by optical microscopy or kDNAPCR. The DTUs of T. cruzi infection in cavies, domestic animals and triatomine bugs were
identified from fecal or rectal ampoule samples.
Cavies presented a very high prevalence of infection (46.3%) and TcI was the only DTU
identified. The infectiousness to Ti of cavies positive by xenodiagnosis or kDNA-PCR was
very high (mean, 55.8%; 95% CI = 48.4-63.1%) and exceeded 80% in 44% of the
individuals. The host-feeding patterns were spatially structured according to habitat type
and correlated closely with the main resident host(s). The main bloodmeal sources for Te
collected from fences and corrals was cavy (95%) followed by rat and pig. Ti fed on
chicken (57%), goat, human, rabbit and less frequently on dog, cavy and pig. In domiciles,
the main bloodmeal sources of Ti were humans (60%) followed by chickens and dogs.
Most Te and Ti had unmixed blood meals (85-88%). T. cruzi infecction in bugs was greater
in peridomiciles (53%, 79/149) than in domiciles (43%, 13/30). In peridomiciles, bug
infection reached 81%in Te and 18% in Ti. TcVI was identified in one Te captured in a
corral and in one cat, and TcI in another Te from fences and in Ti from corral, piled
material, and fence. The novel finding of T. cruzi-infected M. australis cavies thriving in
bug-infested habitats close to human dwellings represents a new scenario of TcI
transmission in Argentina. Chemical control and environmental management measures
directed to peridomestic habitats, especially to the dry-shrub fences, may be needed for
improved vector control of Ti and other secondary vectors.
Nicolás Tomasini
SE02
ES CORRECTO ESTABLECER SUB-DTUS EN Trypanosoma cruzi I?
ESTRUCTURACIÓN E INTERCAMBIO GENÉTICO DENTRO DEL LINAJE EN EL
GRAN CHACO AMERICANO
Nicolás Tomasini, Juan J. Lauthier, María M. Monje Rumi, Anahí M. Alberti D’Amato,
Paula G. Ragone, Cecilia Pérez Brandán, Patricio Diosque
Instituto de Patología Experimental – Facultad de Ciencias de la Salud – Universidad
Nacional de Salta – CONICET
Trypanosoma cruzi ha sido históricamente clasificado como una especie de evolución
clonal preponderante (PCE). Sin embargo, el advenimiento de marcadores moleculares
altamente polimórficos y el estudio poblacional en escalas geográficas reducidas ha
llevado a cuestionar la validez de dicha teoría. De hecho, particularmente algunos
estudios han sugerido que la recombinación en el linaje I de T. cruzi (TcI) es mucho más
frecuente de lo que se creía anteriormente. Bajo el supuesto de no validez del modelo de
PCE en este linaje, no sería adecuado establecer sub-DTUs para TcI. Por la relevancia de
este marco teórico, se necesitan más estudios poblacionales de TcI en diferentes
SYMPOSIA
24
regiones geográficas de América Latina para evaluar la frecuencia del intercambio
genético. En esta presentación, contribuimos a la discusión sobre este tema mediante el
análisis de la estructura poblacional de TcI en un área geográfica restringida en la región
del Chaco, Argentina. Analizamos TcI aislados de diferentes huéspedes y vectores
utilizando un enfoque de Multilocus Sequence Typing (MLST). En general, nuestros
resultados muestran claras evidencias de PCE en TCI en nuestra zona de estudio con
eventos aislados de intercambio genético. Por último, teniendo en cuenta nuestros
resultados se discute la posible organización de la estructura genética de TcI y si es
posible o no establecer sub-DTUs para este linaje.
Victoria Cardinal
SE03
EL CICLO DOMÉSTICO DE TRANSMISIÓN DE Trypanosoma cruzi EN
COMUNIDADES RURALES DEL CHACO HÚMEDO ARGENTINO.
Cardinal MV, Enriquez GF, Macchiaverna NP, Sartor PA, Gaspe MS, Provecho YM,
Fernández MP y Gürtler RE.
Laboratorio de Eco-Epidemiología, IEGEBA-CONICET, Dpto Ecología, Genética y
Evolución, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires,
Argentina. [email protected]
Los ciclos silvestres y domésticos de transmisión del Trypanosoma cruzi involucran una
gran diversidad de ambientes, hospedadores, triatominos y genotipos parasitarios
(llamados Unidades Discretas de Tipificación, UDTs). Estos ciclos presentan diferentes
grados de solapamiento. Con el fin de ahondar nuestro estudio sobre la estructura de los
ciclos de transmisión, evaluamos la prevalencia de infección de T. cruzi, identificamos las
unidades discretas de tipificación (UDTs) parasitarias y determinamos la distribución de
UDTs (identificadas a partir de PCRs) en Triatoma infestans y Triatoma sordida
(peri)domésticas, perros y gatos y humanos en el área rural del municipio de Pampa del
Indio, Chaco.
Las acciones de control vectorial disminuyeron significativamente la prevalencia de
infección en triatominos y en los niños menores de 5 años de edad (i.e.: nacidos postrociado) en comparación con los valores obtenidos previo al rociado masivo de las
viviendas. Sin embargo, se hallaron T. infestans infectadas con T. cruzi persistentemente
aún luego de 22 meses de vigilancia entomológica y control sostenido. En el ambiente
(peri)doméstico, las UDTs identificadas fueron TcVI, TcV, TcIII y TcI. TcVI predominó,
hallándose en el 82% de 45 perros, en el 71% de 14 gatos, y en el 58% de 74 T. infestans
(peri)domésticas. En humanos predominó TcV. TcI fue identificada en 1 perro y 2 gatos, y
TcIII en dos perros. Ninguna de estas dos UDTs l fueron identificadas en T. infestans y TcI
predominó (67%) entre los 18 T. sordida (peri)domiciliarias infectadas. Esto sugeriría una
potencial unión con la transmisión silvestre local. Concluimos que en estas comunidades
rurales la introducción de T. cruzi desde el medio silvestre al doméstico ocurriría
raramente en el actual contexto epidemiológico. Las medidas de control efectuadas
lograron una fuerte depresión de la transmisión doméstica pero nuevos estudios son
necesarios para identificar el origen de las infecciones detectadas post-rociado
Financiado por Fundación Bunge y Born, UBA, ANPCyT, CONICET.
SYMPOSIA
25
SYMPOSIUM V: Vectors. Phisiology of triatomins: from cell to the vector insect
Coordination: Patricia Juarez
Francisco Panzera
SV01
MOLECULAR CYTOGENETICS RELEVANCE IN THE TAXONOMY AND PHYLOGENY
OF CHAGAS DISEASE VECTORS (TRIATOMINAE, REDUVIIDAE)
PANZERA Francisco1, PITA Sebastián1, LORITE Pedro.2, SANCHEZ Antonio 2,
PALOMEQUE Teresa2, PANZERA Yanina1
1
Sección Genética Evolutiva. Facultad de Ciencias. Udelar. Montevideo, Uruguay.
2
Laboratorio de Genética. Departamento de Biología Experimental. Facultad de Ciencias
Experimentales. Universidad de Jaén, España
The subfamily Triatominae include hemipteran species called kissing bugs, vectors of
Chagas disease or American trypanosomiasis, recognized as the most serious human
parasitic disease of Latin America with around 7–8 million people infected (WHO 2013).
This subfamily currently comprises 140 species assembled in five-six tribes and 15-19
genera (Schofield & Galvão 2009) with several taxonomic uncertainties due to the
existence of cryptic species. Furthermore, the phylogenetic origin of many triatomine tribes
and genera remains problematic (Hwang & Weirauch 2012).
Karyotypic information for more than 80 species shows a highly conserved diploid
chromosome number, ranging from 21 to 25 chromosomes in males (Panzera et al. 2010).
However, C-banding pattern and chromosomal mapping of the 45S ribosomal genes (45S
rDNA), have revealed that Triatominae is one of the most chromosomally diverse groups
of Hemiptera (Panzera et al. 2010; 2012; Pita et al. 2013). Fluorescent in situ hybridization
studies had shown a high variability in the number (1-4 loci) and chromosomal location of
the 45S rDNA, never reported before in species with holocentric chromosomes. These
repeated DNA sequences are important markers to disclose chromosomal differentiation
at interspecific and populational levels (Panzera et al. 2012; 2014; Pita et al. 2013). The
simultaneous application of these two cytogenetic markers (C-banding and 45S rDNA
location) on the same individuals offers the possibility to identified and separated cryptic
species.
Chromosomal analyses using genomic in situ hybridization (GISH) and chromosome
microdissection reveal the existence of different repeated DNA sequences, which are
highly variable in their chromosomal location (Pita et al. 2014). GISH analyses determine
that autosomal repeated DNA sequences are shared between closely related species and
they permitted to evaluate the phylogenetic relationships within Triatominae subfamily.
These techniques enabled us to acquire not only reliable information about autosomal
repeated sequences distribution but also an insight into sex chromosome evolution.
Repeated sequences of Y chromosome are highly conserved in Triatomini tribe species.
Sequence conservation of the Y chromosome is a very uncommon phenomenon; hence Y
chromosome conservation in triatomines could be caused by a selective pressure. Male
fitness could be related to the Y chromosome, and the selective sweeps would be
important selective forces that cause the Y conservation.
The comparative study of repeated sequences is allowing us to elucidate evolutionary
relationships among different triatomine groups and understand the main mechanisms
involved in genome evolution of Triatominae subfamily.
Katia Calp Gondim
SV02
SYMPOSIA
26
SYNTHESIS OF LIPIDS IN Rhodnius prolixus – FROM GENOME TO THE INSECT
PHYSIOLOGY
Michele Alves-Bezerra, Felipe B. Saraiva, Katia C. Gondim
Instituto de Bioquímica Médica Leopoldo de Meis, Universidade Federal do Rio de
Janeiro, Brasil.
In insects, products of digestion are used as substrates for oogenesis, locomotion and
other activities. In adult females of Rhodnius prolixus, a blood sucking insect vector of
Chagas’ disease, free fatty acids are absorbed and used, in the midgut epithelium cells, for
the synthesis of complex lipids, such as phospholipids, triacylglycerol and diacylglycerol. In
this insect, we have demonstrated, by genomic and biochemical data, that triacylglycerol is
synthesized solely via the glycerol-3-phosphate (G3P) pathway, initiated with the acylation
of G3P with acyl-CoA in a rate-limiting step catalyzed by glycerol-3-phosphate
acyltransferase (GPAT). All the genes that encode enzymes required by this pathway were
identified in R. prolixus genome, and expression pattern of some of them was also
analyzed.
Fatty acids are also produced de novo from other blood constituents, as amino acids. The
first step of this pathway is the reaction catalyzed by acetyl-CoA carboxilase (ACC), and
one gene coding this enzyme was identified in R. prolixus genome. RpACCexpression was
measured in various organs and variation was observed at days after feeding. Fatty acids
synthesis by fat body was followed with the use of radioactive acetate. The newly
synthesized fatty acids are activated by acyl-CoA synthetase (ACSL), to be used in
anabolic or oxidative routes. In R. prolixus the two ACSL isoforms are differentially
expressed and they possibly have different roles in metabolism.
Supported by: FAPERJ, CNPq, INCT-EM
Gustavo Calderón Fernández
SV03
EXPRESSION OF CUTICLE GENES AND INSECTICIDE RESISTANCE IN Triatoma
infestans
Instituto de Investigaciones Bioquímicas de La Plata (CCT-CONICET-UNLP), Facultad de
Ciencias Médicas, calles 60 y 120, 1° piso, CP 1900, La Plata, Argentina.
E-mail: [email protected]
The insect integument, or exoesqueleton, covers the surface of the insect body; it
comprises the cuticle and the epidermal tissue. The cuticle consists of an outer thin
epicuticle, formed by lipids and lipoproteins, and an inner thick procuticle, mostly formed
by chitin embedded in a matrix of cuticular proteins. Shortly after its formation, the cuticle
is sclerotized in an enzyme-mediated sequence of reactions, becoming hard and rigid. The
epidermis is the cell layer that underlies the insect cuticle and is primarily responsible for
its formation. It includes several different types of cells with specific roles, such as
epidermal cells, oenocytes, dermal glands, and hair forming cells.
The cuticle lipids include mostly hydrocarbons, fatty alcohols, waxes and fatty acids. Fatty
acid synthases (FAS), fatty acid elongases (ELOVL) and fatty acid reductases (FAR) are
key enzymes of cuticle lipid synthesis. Structural cuticle proteins represent several families
of chitin-binding proteins involved in forming the bulk of the cuticle; the CPR family
includes most of the cuticle proteins found in the cuticle.
SYMPOSIA
27
The integument plays a crucial role in the fitness, general metabolism, communication and
survival of insects. Evidence has also been gathered showing that this tissue might be
involved in several aspects of insecticide resistance. In T. infestans, the cuticle thickness
and hydrocarbon content were shown to be related to insecticide resistance.
The sequences of several genes related to the metabolism of cuticle components were
obtained from a sequencing project of T. infestans epidermal tissue transcriptome. Present
work showed a differential expression pattern of several ELOVL and FAR genes in
insecticide resistant T. infestans compared to susceptible insects, further supporting the
cuticle barrier role. Very importantly, several cuticle protein genes, and also genes coding
for detoxifying enzymes such as cytochrome P450s, were differentially expressed in
resistant insects.
These results suggest that the differential expression of integument genes may contribute
to insecticide resistance in T. infestans through mechanisms not only involving a delayed
penetration through the cuticle, but also an increased detoxification as the insecticide is
transported through the epidermis.
Palabras clave: insect epidermal tissue, cuticle lipid metabolism, cuticle proteins,
insecticide resistance.
Patricia Juárez
SV04
CONTROL OF Triatoma infestans WITH ENTOMOPATHOGENIC FUNGI: FROM LAB
TO FIELD RESEARCH
Inibiolp, Fac Cs Médicas, UNLP, La Plata
E-mail: [email protected]
Current vector control strategies, based on chemical insecticide spraying, are growingly
threatened by the emergence of pyrethroid-resistant bug populations. We have already
shown that entomopathogenic fungi have the ability to breach the insect cuticle and are
effective both against pyrethroid-susceptible and pyrethroid-resistant Triatoma infestans
bugs, both in laboratory and field assays. We also know that T. infestans cuticle lipids play
a major role as contact aggregation pheromones. The aim of this study was to analyze the
potential of pheromone–based infection traps to effectively kill bugs indoors, and its effect
on the vector population dynamics. Laboratory and field assays were perfomed in order to
analyze virulence parameters, and the contribution of fungal horizontal transmission to the
infection process, among other factors. After modeling the infection effects on insect
population dynamics, we will discuss the biopesticide trap efficacy and its potential in
vector integrated management. This low cost, low-tech, ecologically friendly methodology
is the first proven alternative to help control T. infestans, regardless their susceptibility to
pyrethroid insecticides.
SYMPOSIUM VI: Molecular and celular biology
Coordination: Gustavo Salinas / Andrea Ropolo
Augusto Simoes-Barbosa
Trichomonas vaginalis AND lactobacilli: A TUG OF WAR
Phukan N; Pinheiro J; Bar A K, Simoes-Barbosa A.
The Centre for Microbial Innovation, School of Biological Sciences, University of
Auckland, New Zealand.
SBM01
SYMPOSIA
28
As an extracellular parasite of the human genital tract, Trichomonas vaginalis must interact
with the indigenous vaginal microbiota which is dominated by lactobacilli. Although the
vaginal ecosystem is clearly disturbed upon T. vaginalis infection, this parasite has not
been studied in the context of the host natural microbiota. Evidence supports that these
bacteria have a beneficial impact on the host. Here we initiate a study which aims to
investigate the details of this microbial interaction at different levels. Can these bacteria
protect the host against T. vaginalis infection? We developed a FACS-based approach to
quantify levels of T. vaginalis adherence - a critical step of infection - when different
strains of the parasite and bacterium are co-incubated with host cells. We observed that,
in most cases, lactobacilli significantly inhibit the adherence of the parasite to different
degrees depending on the paring between the strain of parasite and bacterium. We have
further examined the nature of this inhibition suggesting the involvement of surface
molecules from lactobacilli. We expect to identify quantitative differences on surface
proteins from lactobacilli with different inhibitory profiles using iTRAQ proteomics. Putative
S-layer proteins from lactobacilli, our first candidates responsible for the inhibitory
adhesion properties against T. vaginalis, are being tested using a heterologous
expression system. The ability of lactobacilli to modulate other virulence properties of T.
vaginalis, such as cytotoxicity, is also under investigation. In this tug of war, how does T.
vaginalis counteract against lactobacilli? We hypothesise that T. vaginalis can directly
kill and/or inhibit the growth of lactobacilli. A total of nine cell-wall hydrolase genes, typical
of bacteria, have been found in T. vaginalis genome probably derived from horizontal gene
transfer. As an eukaryote, the absence of a cell wall makes us believe that these enzymes
are used by the parasite to control the populations of vaginal bacteria by affecting their cell
integrity. We have observed by qPCR that only a few of the nine genes are significantly
upregulated when T. vaginalis comes in contact with lactobacilli. The participation of
these genes/proteins in controlling the population of lactobacilli is under investigation.
Acknowledgments: funding from the Health Research Council of New Zealand and the
Faculty Research Development Fund (University of Auckland).
Estela Castillo
SBM02
STEM CELLS IN PARASITIC FLATWORMS, FROM MYTH TO REALITY.
Estela Castillo, Fernanda Dominguez, Alicia Costábile, Ileana Corvo, Serrana
Estrade,Germán Caurla, Uriel Koziol, José Tort.
Sección Bioquímica- Biología Molecular, Facultad de Ciencias
Departamento de Genética- Facultad de Medicina,UDELAR.Montevideo Uruguay
In free-living flatworms, somatic differentiated cells do not divide, and a separatepopulation
of stem cells is responsible for cell proliferation and renewal. In cestodes, there is
evidence that similar mechanisms of cell renewal exist, and the undifferentiated stem cells
are denominated "germinative cells".
Cestodes show a remarkable proliferative capability that sustains the constant growthand
differentiation of proglottids essential for their lifestyle. It is believed that a
separatepopulation of undifferentiated stem cells (the so-called germinative cells) are the
only cells capable of proliferation during growth and development.
Cell proliferation and differentiation were studied during early adult development of
themodel cestode Mesocestoides corti by bromodeoxyuridine pulse-chase analyses.
Germinative cells have a typical neoblast morphology and are present only in the
innerparenchyma, in close proximity to the inner muscle layer. This is a conserved niche
ofproliferative cells in adult cestodes. After proliferation some of these cells migrate to
SYMPOSIA
29
theexternal regions to differentiate. Periodic accumulations of germinative cells
areobserved in the genital primordia. The innermost cells of genital primordia cease
toproliferate and differentiate into muscle cells expressing specific tropomyosin isoforms.
Limited studies on cell proliferation have been performed in parasitic cestodes,
mainlyduring development, and never before from a molecular perspective. Therefore,
inaddition to morphological characterization, we propose the identification of
molecularmarkers expressed in these cells. Our results show the expression of pumilio
and PCNA genes, being reduced by gamma irradiation, as it results in the depletion of
germinative cells.
During development of genital primordia, the accumulation of germinative cells, give rise to
somatic structures and to the germ line. They express nanos and pl10 genes, both
markers of the germ line in other organisms.
Once determined the localization and molecular characterization of germinative cells in the
whole organism, we continued its characterization in isolated cells in S and G2/M phases
of cell cycle.
The study of this particular cell subpopulation is hampered by the current lack of methods
to isolate it. We developed a reproducible flow citometry and cell sorting method to
quantify and isolate proliferating cells in the tetrathyridia larvae of M. corti, based on the
DNA content of the cells. The isolated cells display the typical germinative cell
morphology, and can be used for RNA isolation with a yield in the ng to μg range. We
expect that this approach may facilitate further characterization of the germinative cells in
M. corti and other model tapeworms.
Morever, isolated cells morphology was characterized by histology and electron
microscopy techniques and by the expression of specific molecular markers. We are also
working in the first transcriptomic description of M.corti these cells.
Now, we are optimizing the culture of these cells, taking as starting point the recent
development of Echinococcus multilocularis stem cell culture. This is of great importance
since it will allow us to perform RNAi transfection and cell transplant in M.corti.
Finally, we studied cell proliferation in the trematode Fasciola hepatica, identifying
proliferating cells by ethynyldeoxyuridine (EdU) incorporation and phosphorylated Histone
H3 detection (mitoses), as well as several molecular markers of this cells and its gene
expression pattern along the life- cycle.
Mara Rosenzvit
SBM03
SMALL RNAS OF CESTODE PARASITES AND POTENTIAL APPLICATIONS TO
CONTROL
Natalia Macchiaroli, Marcela Cucher, Laura Prada, Lucas Maldonado, Laura Kamenetzky
and Mara Rosenzvit
Instituto de Microbiología y Parasitología Médica (IMPaM), UBA-CONICET, Paraguay
2155, Piso 13. CP 1121. Buenos Aires, Argentina. [email protected]
Tapeworms (Cestoda) cause neglected diseases such as cystic echinococcosis or cystic
hydatid disease, alveolar echinococcosis and neurocysticercosis, caused by the larval
stages of Echinococcus granulosus, Echinococcus multilocularis and Taenia solium,
respectively. Understanding the mechanisms that regulate their particular characteristics of
development may allow identifying new therapeutic targets. MicroRNAs are small silencing
RNAs that impact eukaryotic development and are receiving growing attention as novel
SYMPOSIA
30
therapeutic and diagnosis targets. We have employed high throughput small RNA
sequencing to characterize the small RNAomes of Echinococcus spp. species/stages
using recently available genomic information (Tsai et al, 2013). There were obtained up to
40 million reads per library with high percentage of genome mapping. Significant
proportions of small RNA reads corresponded to microRNAs. The previously reported
Echinococcus spp. microRNA catalog consisting of 20 miRNAs (Cucher et al, 2011) was
expanded to 34 conserved and 5 new candidate microRNAs. Interestingly, one microRNA
was present in the closely related Echinococcus granulosus G1 and E. canadensis G7 but
absent from Echinococcus multilocularis. Expression analyses showed that some miRNAs
were highly expressed in all the stages and species analysed. MicroRNAs differentially
expressed between stages and species were also identified, suggesting they could play
developmental roles. Echinococcus spp. microRNA biogenesis showed particularities that
could impact on targeted genes. No evidence of other canonical small silencing RNAs like
piRNAs has been obtained so far. Host origin tRNA fragments were detected in parasite
stages facing the host surface. In conclusion, our results show that microRNAs are the
principal small RNA silencing molecules in Echinococcus spp. Highly expressed cestode
microRNAs absent or divergent in mammal hosts were indentified and could be candidates
for drug and diagnosis targeting.
SYMPOSIUM VII: Immune response in parasitic infections
Coordination: Ana Rosa Perez / Laura Chiapello
Juliana De Meis
SI01.
IMMUNE RESPONSE AFTER Trypanosoma cruzi INFECTION TROUGH THE ORAL
ROUTE.
Laboratory on Thymus Research, Oswaldo Cruz Institute, Oswaldo Cruz Foundation, Rio
de Janeiro, Brazil
Oral transmission of Trypanosoma cruzi, the causative agent of Chagas disease, is
presently the most important Brazilian route of infection (70-80% of cases). Moreover,
Venezuela, Colombia, Bolivia, Argentina and Ecuador have also reported to have acute
cases of Chagas disease associated with food/beverage consumption. In addition to the
classic cardiac involvement, orally-infected patients progress to a highly symptomatic
acute phase (fever, face oedema, exanthema, haemorrhage, meningoencephalitis,
abdominal pain, among others). Increased mortality rate is marked in the first 2 weeks (835%), surpassing the calculated mortality (5-10%) produced by the disease resulting from
metacyclic trypomastigote deposition with feces after vector biting – Classical vectorial
pathway. In endemic regions of Chagas disease, people can be infected either vectorially
or orally, and this condition raises questions as whether oral infection results in a different
disease outcome. Moreover, experimental studies related to oral infection usually
comprise inoculation in the mouth (oral infection, OI) or intragastrically/intrafaringeal
(gavage infection, GI), being roughly considered as similar routes of infection. Using
bioluminescent analysis of 1x106 Dm28c luc+/+ OI and GI infected mice, we are
demonstrating that OI mice accumulate parasites within the oral cavity 1 and 48 hours
after infection. These observations suggested that OI and GI may be considered different
route of parasite entry, leading to specific regional immune responses and changes in the
host protective immune response. To test this hypothesis, we have established an
experimental protocol of OI and GI with 5x104 trypomastigotes (Tulahuén strain) in BALB/c
mice. Interestingly, OI group presented significantly higher parasitemia and mortality rates
SYMPOSIA
31
than their GI mice. Moreover, heart histopathology showed extensive microinfiltrates in GI
mice whereas liver lesions were more severe in OI animals. Multiplex analysis revealed
that OI mice presented higher type 1 cytokine (IFN-γ, TNF-α) serum levels than GI.
Conversely, TGF-β serum levels were higher in GI animals. Interestingly, the higher
mortality rate seen in OI mice paralleled the TNF-α serum rise, and death of these animals
was blocked by anti-TNF-α antibody treatment. Overall, we can conclude that the site of
parasite entrance, through the mouth or directly to the stomach, differentially affects host
immune response and mortality.
Finacial support: FAPERJ, CNPq, IOC/FIOCRUZ
Laura Cervi
SI02
MODULATION OF INNATE IMMUNE RESPONSE BY FASCIOLA HEPATICA PROTEIN:
INTERFERENCE OF TLR SIGNALING
Department of Clinical Biochemistry. School of Chemical Sciences. National University of
Córdoba. CIBICI-CONICET.
During infection with helminth parasites, different stimuli or ligands are recognized by
receptors of innate immunity. Such ligands include both parasite molecules, which are
excreted as they migrate through the tissues of the host, or endogenous ligands, from
tissue breakdown. In this inflammatory context, the parasite has different molecules that
prevent or modulate inflammation to ensure their survival.
In previous work, we found that a total parasite F. hepatica extract (TE) is able to induce
different tolerogenic properties in dendritic cells (DC) from mouse, such as resistance to
TLR-induced maturation, inhibition of the co-stimulatory molecules expression and
reducing the ability of DC matured with LPS to induce allogeneic responses.
In this study, we found that a protein fraction of TE lower than 10 kDa, (F <10 kDa)
obtained by ultrafiltration, was capable of maintaining total extract modulating properties
on DC maturation. Furthermore, it was demonstrated that the F <10 kDa printed different
regulation to DC, depending on the absence or presence of LPS. Thus, treatment of DC
with F <10kDa, endow these cells to induce Foxp3 regulatory T cells in allogenic cultures,
while treatment with F <10 kDa plus LPS reduced allogeneic responses by a mechanism
dependent on IL-27. Moreover, it was established that the major protein present in the F
<10 kDa, is a molecule of the family of protease inhibitors as described in Kunitz type F.
hepatica (Fh-KTM), which was responsible for the modulation on TLR-induced DC
maturation and the inhibition of allogeneic responses. Despite substantial evidence
showing that helminth parasites use these inhibitors to protect from degradation by
proteases secreted by themselves, very little is known about the role of these proteins in
modulating the immune response. That is why we believe that the emerging knowledge on
the modulation exerted by this new molecule in the immune system, may help not only to
understanding the mechanisms of evasion used by the fluke, but it could also lead to a
new target therapeutic for vaccines developing or anthelmintic drugs.
Eva Acosta Rodríguez
SI03
ROLE OF IL-17RA IN THE DEVELOPMENT OF SPECIFIC CD8+ T CELL RESPONSES
TO Trypanosoma cruzi.
Departamento de Bioquimica Clinica. Facultad de Ciencias Químicas. UNC
SYMPOSIA
32
Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología. CONICET.
Cytokines of the IL-17 family have been recently shown to contribute to host defense
against many intracellular pathogens. As against extracellular microbes, the IL-17dependent protective roles during intracellular infections relied on the induction of
inflammation and the recruitment of innate and, eventually, adaptive immune cells. Here,
we describe a new effector mechanism by which IL-17RA-signaling cytokines are critically
involved in the generation of pathogen-specific CD8+ T cell responses. IL-17RA knockout
mice infected with the protozoan parasite Trypanosoma cruzi developed a reduced
frequency of parasite-specific CD8+ T cells that resulted in decreased antigen-specific
cytotoxicity in vivo and increased tissue parasitism. Adoptive transfer experiments
established that CD8+ T cell intrinsic IL-17RA-signaling is required to support CD8+ T cell
immunity to T. cruzi. Loss of IL-17RA-signaling during this parasite infection did not affect
expansion but reduced survival of parasite-specific CD8+ T cells. Phenotypic, functional
and genomic profiling determined that T. cruzi-specific CD8+ T cells arising in the absence
of IL-17RA-signaling presented an aberrant phenotype resembling memory cells with signs
of high activation and exhaustion. Altogether, our results identify IL-17RA-signaling
cytokines as critical factors for the generation of robust CD8+ T cell immunity to T. cruzi
SYMPOSIUM VIII: Interaction parasite – host cell
Coordination: Patricia Romano / Andrea Cumino
Marcel Ramírez
SPH01
MICROVESICLES
MODULATE
HOST-PARASITE
INTERACTION
DURING
Trypanosoma cruzi INFECTION
Marcel I.Ramirez1, Ingrid Evans1, Andre Mojoli1 and Igor de Almeida2 .
1- Laborario de Biologia Molecular de Parasitas e vetores, Instituto Oswaldo Cruz. Av
Brasil 4365- Rio de janeiro -Brasil.
2-Border Biomedical Research Center, University of Texas at El Paso, Texas , USA.
Recently the description of Extracellular vesicles (Exosomes, Microvesicles and apoptotic
bodies) released from eukaryotic cells have showed participate in multiple functions
altering host cells. We have been interested in Microvesicles (MVs) (0.2 -1 μm size) that
have been shown to be involved in intercellular communication, apoptosis, coagulant and
immunological roles (Reviewed in J.Cell Biol. 2013 ;200(4):373-83). Our group has been
demonstrating the role of MVs in Trypanosoma cruzi, the causative agent of Chagas
disease. The MVs production during the interaction T. cruzi metacyclic forms -host cells
protect the parasite from complement lysis, enhance the parasite infectivity and promote a
high infection in mice (J Immunol 2012 188(4):1942-52). In this work we define as main
aim how is the MVS release during the life cycle of T. cruzi and what is the role of these
Mvs at the pathogenesis of Chagas disease? We have seen the involvement of MVs
during parasite-host cell contact, using Trypanosoma cruzi and THP1 cells as biologic
model. During the interaction an increase of intracellular calcium activate scramblase
modifying phospolipids polarity of the membrane with budding of microvesicles with
phosphotidilserin exposure. We are interested to know how is the contribution of different
stages of T cruzi (metacyclic, blood trypomastigotes and epimastigotes) at the MVs
formation.
We have prepared microvesicles from different forms and strains of T. cruzi using 1.106
parasites in contact with 1.105 THP1 cell (1 h at 37 C 1 mM Cacl2) Later, microvesicles
SYMPOSIA
33
were obtained after a cycle of centrifugations (1x 2000g x 5 min, 2 times 4000g x 30 min
and 100000g x 1.5 hour). 1D-LC-MS/MS of all microvesicles-T. cruzi interaction were
performed and analysed. Different strains of T. cruzi from cell derived trypomastigotes
showed high number of MVs induction during contact with monocytes compared with other
stages. Proteomic of MVs has shown that both cells, parasite and monocyte, contribute
with membranes for the formation of these structures. However, trypomastigote membrane
proteins were observed in higher number (25 %) than proteins from epimastigotes (4 %)
and metacyclic (11 %).These vesicles presented phosphatidylserine (59%) and are
important to enhance the parasite infectivity in vitro and in vivo. We stained differentially
THP-1 and parasites membranes searching for stained MVs on the supernatant. We
observed MVs from THP-1 (green ) and parasite (red) in a Ca2+ dose dependent process.
All stages can release membranes and contribute for MVs formation. Moreover using NBD
fluorocrome in a FRET methodology we have detected a decrease in fluorescence energy
transfer, showing that MVs released from stained THP-1 membranes can fuse with MVs
released from parasite. The fusion process was inhibited at 4oC. Interestingly, MVs from
trypomastigotes present a higher fusogenic capacity when compared with other stages.
The greatest fusogenic potential observed for MVs from trypomastigotes coincide with a
higher presence of parasite proteins on the composition of MVs from trypomastigotes as
seen by proteomic analisis. MVs carrying parasite antigens constitute a mechanism to
modulate the proteins from epimastigotes (4 %) and metacyclic (11 %).These vesicles
presented phosphatidylserine (59%) and are important to enhance the parasite infectivity
in vitro and in vivo. We stained differentially THP-1 and parasites membranes searching
for stained MVs on the supernatant. We observed MVs from THP-1 (green ) and parasite
(red) in a Ca2+ dose dependent process. All stages can release membranes and
contribute for MVs formation. Moreover using NBD fluorocrome in a FRET methodology
we have detected a decrease in fluorescence energy transfer, showing that MVs released
from stained THP-1 membranes can fuse with MVs released from parasite. The fusion
process was inhibited at 4oC. Interestingly, MVs from trypomastigotes present a higher
fusogenic capacity when compared with other stages. The greatest fusogenic potential
observed for MVs from trypomastigotes coincide with a higher presence of parasite
proteins on the composition of MVs from trypomastigotes as seen by proteomic analisis.
MVs carrying parasite antigens constitute a mechanism to modulate the communication
between the parasite and the host cell. Cell derived trypomastigotes seem to participate at
the Mvs genesis and these MVs could be involved in immunopathogenesis. The
understanding of intracellular trafficking and effect of these microvesicles at the host cells
are under investigation.
Financial support: Fiocruz, Faperj, CNPq and Programa de Parasitologia Basica-CAPES
Patricia Veras
SPH02
17-AAG INDUCES INCIDENTAL CELL DEATH OF Leishmania WITH AUTOPHAGIC
FEATURES: EVIDENCE FOR A CROSSTALK BETWEEN AUTOPHAGIC AND
PROTEOSOME PATHWAYS
PETERSEN, A.L.O.A.1,2; CULL, B2; MOTTRAM, J.C2; VERAS, P.S.T.1*
1
Gonçalo Moniz Research Center/FIOCRUZ, Bahia, Brazil
2
University of Glasgow/Institute of Infection, Immunity & Inflammation
SYMPOSIA
34
*
[email protected]
For 70 years, pentavalent antimonials have been the first line of treatment for
leishmaniasis. However, the efficacy of this treatment is under scrutiny due to increases in
drug-resistant cases. As such, we employed a proteomic approach that allowed the
identification of modulated proteins in Leishmania-infected macrophages that might
function as novel targets for alternative chemotherapeutic intervention against Leishmania
infection. This approach revealed 162 proteins that exhibited altered expression due to
Leishmania infection. Of the 15 with the greatest differences in expression, at least one of
them, HIF-1a, is a potential candidate for targeted therapy using specific drugs. HIF-1α is
one of the client proteins of HSP90, a heat-shock protein, which is highly abundant in
mammalian cells and induced during stress responses. HSP90 is an ATP-dependent
chaperone known to be involved in the stabilization, correct folding and assembly of
several client proteins, including HIF-1α. Protozoan parasites also express HSP90, which
plays a crucial role in stabilizing heat-labile proteins within these cells.
We hypothesized that treatment of infected macrophages with a specific HSP90 inhibitor,
such as geldanamycin or 17-AAG, would have a highly antileishmanial effect, since these
benzoquinone ansamycin antibiotics provoke profound modifications in Leishmania
differentiation processes. Furthermore, as these types of inhibitors are known to act on
targets present in both host cells and in parasites, we postulated that treatment with 17AAG should enable macrophages to more efficiently kill intracellular parasites already
weakened by this HSP90 inhibitor. As expected, treating infected macrophages with the
17-AAG significantly reduced both the percentage of infected cells and parasite load in a
dose- and time-dependent manner. Interestingly, treatment with 17-AAG reduced the
production of pro-inflammatory mediators, including TNF-a, IL-6 and MCP-1, yet IL-12
remained unaffected. The absences of changes in nitric oxide and superoxide production
indicate that intracellular parasite death occurred independently. Electron microscopy
revealed morphological alterations, which suggest that 17-AAG-induced parasite death
resulted from an autophagic process. To further investigate 17-AAG-dependent parasite
death, mutants of the components of the autophagic pathway of Leishmania parasites,
such as GFP-ATG8 and ATG5-KO, were treated with this inhibitor. An increase in the
number of L. amazonensis-bearing autophagic vacuoles was observed, and ATG5-KO
mutants, which are unable to form autophagic vacuoles, were shown to be more resistant
to 17-AAG than wild-type parasites, indicating that 17-AAG-induced parasite death
appears to be linked to the autophagic process. We also showed that 17-AAG reduced the
fusion between autophagosomes and lysosomes/glycosomes, contributing to increases in
the number of autophagosomes in parasites upon 17-AAG treatment. Since the
autophagic pathway can crosstalk with proteasome pathway, to assess the influence of
this pathway in 17-AAG-induced L. amazonensis death, we evaluated the effect of MG132,
a proteasome inhibitor, on autophagosome formation. MG132 was found to induce
autophagosome formation and, as expected, western-blot analysis demonstrated that both
MG132 and 17-AAG induce ubiquitilated protein accumulation. In addition, the presence
of ubiquitilated proteins was more evident in ATG5-KO L. amazonensis parasites. These
findings suggest that autophagy plays an important role in ubiquitilated protein
degradation, which supports the idea that 17-AAG-induced parasite death occurs via a
mechanism dependent on the activation of the parasite autophagic pathway. Furthermore,
this is the first attempt that evidenced a cross talk between the autophagic and
proteasome pathways in Leishmania parasites that have been linked to the process of
parasite killing.
SYMPOSIA
35
Ulrike Kemmerling
SPH03
CONGENITAL CHAGAS DISEASE: TISSUE INVASION MECHANISMS OF
Trypanosoma cruzi AND POSSIBLE LOCAL DEFENSES OF THE HUMAN PLACENTA
Castillo C, Liempi A, Droguett D, Duaso J, Barahona K, Hernández A, Sandoval A, Maya
JD, Galanti N and Kemmerling U.
Institute for Biomedical Sciences, Faculty of Medicine, University of Chile.
[email protected]
Chagas disease, one of the major public health concerns in Latin America, is caused by
the haemophlagelated protozoan Trypanosoma cruzi (T. cruzi). In the past few years
congenital transmission of T. cruzi has become more important, and partly responsible for
the “globalization of Chagas’ disease”, constituting a public health problem of increasing
relevance.
Diverse pathogens, including T. cruzi, are able to cross the placental barrier and infect
both the placenta and fetus. The placental barrier is formed by the trophoblast tissue, that
comprises a continuous multinucleated, non-replicating cell layer, the syncytiotrophoblast
(STB), a replicating layer of cytotrophoblasts (CTB) that fuses with the STB, a basal
lamina and an underlying villous stroma (VS) or connective tissue, that includes vascular
endothelium. Therefore the trophoblast is the first tissue of the placental barrier to be in
contact with the parasite in the maternal blood.
In ex vivo infected human chorionic villi explants (HPCVE) as well as in placenta from
women with chronic Chagas disease, the parasite induces detachment and
disorganization of the trophoblast as well as selective destruction of basal laminae and
collagen I in the VS. Endogenous proteases such as MMP-2 and MMP-9 (matrix
metalloproteases) increase their expression and activity during this process.
On the other hand, the global congenital infection rate is estimated to be less than 5%,
therefore local placental antiparasitic mechanisms might exist. The trophoblast, is a
renewing epithelia that forms part of the innate immune system. The turnover of the
trophoblast implies a precise orchestration of various cellular processes including CTB cell
proliferation, differentiation (meaning syncytial fusion by incorporating CTB cells into a
non-replicative STB) and cell death. We have previously shown that ex vivo infection with
a low concentration of parasites induces apoptosis in the trophoblast.
In order to study cellular proliferation in that tissue DNA synthesis, mitotic index and
proliferation markers were determined in T. cruzi infected and non-infected HPCVE and
BeWo cells (a trophoblastic cell line). The effect of parasite infection on tissue
differentiation was analyzed by assaying β-human chorionic gonadotropin (β-hCG) and
syncytin, both major biochemical markers of trophoblast differentiation. Additionally,
differentiation in BeWo cells by the two-color fusion assay and by desmoplakin redistribution was also analyzed. Our results clearly show that T. cruzi induces epithelial
turnover of the trophoblast, most likely as part of a local anti-parasitic response in the
placenta.
Financed by FONDECYT Projects Nº1120230 (UK), Nº 1130189 (JM), Nº1130113 (NG).
SYMPOSIA
36
SYMPOSIUM IX: Diagnostic innovation in congenital chagas
Coordination: Sergio Angel
Carolina Carrillo
SD01
DESARROLLO DE UN TEST MOLECULAR DE DIAGNÓSTICO SIMPLIFICADO PARA
CHAGAS EN NEONATOS.
Luciana Larocca, Fabiana G. Stolowicz, Adrián A. Vojnov, Carolina Carrillo*.
Instituto de Ciencias y Tecnología Dr. César Milstein – CONICET. Saladillo 2468, Buenos
Aires, Argentina. [email protected]
La enfermedad de Chagas, una parasitosis causada por el Trypanosoma cruzi, es
endémica en América con más de 10 millones de personas infectadas. Las terapias para
tratar el Chagas son relativamente efectivas en la fase aguda de la enfermedad y en los
casos infantiles; aumentando la probabilidad de cura cuanto más precoz sea el
diagnóstico. En este contexto, en Argentina rige la “Ley 26.281 - De Control y Prevención
del Chagas” que exige que a todo/a recién nacido/a de una mujer portadora debe
realizársele un diagnóstico de Chagas. Sin embargo, el algoritmo aplicado para el
diagnóstico en neonatos/as puede tomar hasta unos 10 meses pues los métodos
disponibles para diagnosticar Chagas en adultos/as e infantes no resultan aplicables en
neonatos/as, o su aplicación requiere de tal infraestructura, equipamiento y recursos
humanos que se restringe a pocos centros de investigación y/o salud.
En el año 2011, el Ministerio de Ciencia, Tecnología e Innovación Productiva a través de
la Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica (FONARSEC) convocó a la
formación de consorcios público-privados para “la presentación de proyectos innovadores
destinados a solucionar problemas tecnológicos … (asociados) al diagnóstico de la
enfermedad de Chagas”, con especial énfasis en Chagas congénito y neonatos/as. En
respuesta a este llamado, conformamos un consorcio entre CONICET y las empresas
Unifarma S.A. y Laboratorio Pablo Cassará S.R.L., y propusimos diseñar un test de
diagnóstico molecular, sensible y específico y a la vez simple e inclusivo (para todo tipo
de condición) para neonatos/as.
Para ello trabajamos sobre técnicas de amplificación molecular isotérmica, cuya
funcionalidad se describe, en bibliografía, para iniciativas de diagnóstico simplificado en
distintos patógenos. El desarrollo inicial del test incluyó 3 etapas:
ETAPA 1: Selección de secuencias blanco y diseño de primers, mediante adquisición y
aplicación un software específico para esta tecnología y análisis bioinformático y
depuración de los sets de primers diseñados.
ETAPA 2: Puesta a punto de la reacción in vitro. Se efectuaron pruebas para ajustar:
i)- condiciones de reacción (tiempo, temperatura, componentes de las mezclas de
reacción, etc.);
ii)- sensibilidad, según carga de ADN o parasitaria y soportes donde se dispensa la
muestra; con muestras artificialmente inoculadas y con dos muestras testigo (positiva y
negativa) certificadas por el Instituto Nacional de Parasitología “Dr. Mario Fatala Chaben”
iii)- especificidad, utilizando como controles otros parásitos filogenéticamente
emparentados, células humanas y células no relacionadas al parásito ni al hospedador.
ETAPA 3: Adecuación de la técnica a condiciones simplificadas o “POC” (siglas de “Point
of care”), para todo tipo de condición (de equipamiento, infraestructura, de recursos
humanos). Para ello, se trabajó en dos puntos clave: la simplificación de la obtención del
templado molecular a partir de una muestra de sangre y del método de lectura.
SYMPOSIA
37
La reacción de diagnóstico con el test desarrollado incluye los siguientes pasos:

Obtención de una muestra de sangre: una gota de sangre del/a neonato/a (no
requiere extraccionista).

Siembra de la muestra en la mezcla de reacción.

Incubación por 40 minutos a 65°C (en cualquier tipo de dispositivo térmico).

Revelado del resultado, mediante el sistema de tiras reactivas “lateral flow
lipsticks” (LFD) (del tipo de los tests de embarazo comerciales).
El test está aún en etapa de desarrollo y ajuste de parámetros, y seguramente deban
ajustarse más detalles tanto al momento de probarlo en muestras a campo como al
momento de producirlo a mayor escala. Sin embardo esta experiencia nos anima a seguir
adelante y, en un futuro, a proponer desarrollos para otras enfermedades infecciosas.
Fernán Agüero
SD02
DISCOVERY OF NOVEL SEROLOGICAL BIOMARKERS ASSOCIATED TO
CONGENITAL CHAGAS DISEASE USING A HIGHLY-MULTIPLEXED DISCOVERY
PLATFORM BASED ON HIGH-DENSITY PEPTIDE MICROARRAYS
Santiago J Carmona1, Claus Schäfer-Nielsen2, Carlos A Buscaglia1, Juan S Mucci1, Jaime
Altcheh3, Oscar Campetella1, Alberto CC Frasch1, Morten Nielsen1, and Fernán Agüero1,*
1 Instituto de Investigaciones Biotecnológicas – Instituto Tecnológico de Chascomús,
Universidad de San Martín – Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas,
B1650HMP, San Martín, Buenos Aires, Argentina
2 Schäfer-N ApS, DK2100, Copenhagen, Denmark
3 Servicio de Parasitología y Chagas, Hospital de Niños “Ricardo Gutiérrez”, C1425EFD,
Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina
* Presenting autor, [email protected]
The full set of antibody (B-cell) specificities associated with the response to a natural
infection remains largely unexplored. We developed a highly-multiplexed discovery
platform based on next-generation high-density peptide microarrays and demonstrate for
the first time its potential to simultaneously identify and finely map hundreds of B-cell
epitopes from a complex natural human infection. The platform consists of a HD tiling
peptide array containing ~200K unique 15mer peptides synthesized in situ on a microarray
slide, using a maskless photolithographic method. The peptides completely cover the full
length of 468 T. cruzi proteins, scanning the protein sequence at maximal resolution (1
residue shift). These proteins include 59 previously described antigens, 50 proteins
randomly selected from the proteome, 100 proteins selected using a recently published
bioinformatics method (Carmona SJ et al 2012); and 232 surface proteins from a number
large gene families. The array also contains 24K 15mers corresponding to ~50 neoproteins of random sequence to estimate the array background baseline (negative control).
Using this platform we have analyzed the B-cell immune response in humans with Chagas
Disease, assaying 8 independent HD-arrays with 4 pools of purified IgGs from Chagas
Disease patients and negative controls. After defining a very conservative cutoff we
identified 1,193 positive 15mers in the set of serologically uncharacterized proteins, which
define 98 new antigens. We also identified the location of linear epitopes for a number of
known antigens, as well as a number of protein regions which are the target of nonspecific antibody binding (putative cross-reactive responses). This high-density peptide
array platform now allows high-throughput identification and mapping of B-cell epitopes. In
SYMPOSIA
38
this presentation we will discuss the use of this platform to discover epitopes associated
with congenital Chagas Disease.
Acknowledgements: Funded by a grant (FITS-Chagas-003) from the National Agency for
the Promotion of Science and Technology (ANPCyT, Argentina).
Alejandro Schijman
SD03
DEVELOPMENT AND VALIDATION OF A NEW REAL TIME PCR BASED KIT
PROTOTYPE FOR MOLECULAR DIAGNOSIS OF CONGENITAL CHAGAS DISEASE
Grupo de Biología Molecular de la Enfermedad de Chagas. Instituto de Ingeniería
Genética y Biología Molecular (INGEBI-CONICET), Buenos Aires, Argentina. En
representación del Consorcio Público Privado formado por CONICET, Wiener
Laboratorios S.A.I.C, Rosario, Argentina; Instituto Nacional de Parasitología (INP) “Dr.
Mario Fatala Chaben”- ANLIS, Argentina.
Background: Current diagnosis of Congenital Chagas disease (CCD) is based in
parasitological detection during the first months of life or serological detection at 10
months. However, the former is highly operator-dependent and presents variable
sensitivity. Due to socio-economical constrains, a high proportion of parasitologically
undetected neonates cannot attend their second opportunity of diagnosis at 10 months,
remaining undiagnosed.
Objetives: In the context of FONARSEC FITS SALUD CHAGAS, a public-private
consortium was conformed to develop a Real-Time PCR kit prototype for early detection of
T.cruzi DNA in clinical samples optimized for its application to CCD diagnosis.
Specific aims were: 1) Development, optimization and analytical validation of DNA
extraction procedures from human blood followed by Real Time PCR approaches to select
the best performing combination to generate a Kit prototype 2) Field validation of the kit
prototype in the context of congenital transmission; 3) development and validation of an
External Quality Control system for PCR.
Materials and Methods: Different combinations of reagents and procedures for blood
collection, storage, DNA extraction and amplification were evaluated in terms of analytical
sensitivity and specificity using seronegative human blood samples spiked with known
quantities of T.cruzi DNA to select the best combination for kit prototype production. DNAs
from strains representative of the six discrete typing units (Tc I to Tc VI), as well as DNAs
from T.rangeli and Leishmania spp were tested. Analytical performance of the prototype
was determined following international guidelines for molecular diagnosis of the Clinical
Laboratory Standard Institute, namely: inclusivity, exclusivity, reportable range and limit of
detection (LOD). Moreover, stability of the reagents was assessed.
Field validation: To compare the accuracy of the kit vs that of current diagnostics
(micromethod in cord blood at birth or peripheral blood within the first 15 days and at 4-8
weeks of life, plus serodiagnosis at 10 months of life), a double-blinded prospective field
study was designed and approved of CEMIC Ethical Committee and local IRBs. Activities
at fellow centers involved screening, recruitment and consent processes, data
management (filling the CRFs, data entry), sample inventory, weekly monitoring and
reporting. Each center processed the micromethod and serodiagnosis, recruited and
SYMPOSIA
39
refered samples for qPCR to INGEBI-CONICET and for serologic tests to INP. The
logistics guidelines ensured traceability and proper transport for barcoded samples.
External Quality Control panels were designed using seronegative blood spiked with serial
numbers of cultured parasites.
Results: The best analytical parameters of the test in terms of analytical sensitivity and
specificity were obtained in 1 mL of blood collected in DNA stabilizer solution and
processed using glass fiber columns. The best performing amplification procedure was
duplex qPCR with primers and TaqMan probes designed to conservative regions in
parasite satellite DNA nuclear repeats for all DTUs, and to an internal amplification
standard. PCR included UDG for reduction of amplicon carry-over contamination. The kit
Prototype has a LOD of 0.2 parasite equivalents/mL in spiked blood and 100% specificity
in seronegative panels and T. rangeli and Leishmania spp DNAs. Reagents stability tested
for at least 6months showed similar patterns of analytical sensitivity.
Field validation is currently undergone in 100 out of 500 mother-newborns binomials
recruited in Maternity Services from Tucumán, Santiago del Estero and Chaco and at the
INP. Database will be disclosed at the end of study.
Discussion: The performing parameters of the kit encourage its application not only to
early diagnosis of CCD but also to oral outbreaks, organ transplantation and monitoring of
trypanocidal therapy.
POSTER
SESIONS
SAP X Congress
Mar del Plata 2014
BIOCHEMISTRY & MOLECULAR BIOLOGY
40
BYBM01
EFFECT OF PERILLYL ALCOHOL IN Plasmodium spp. STUDIES IN VIVO AND IN
VITRO
Adriana A Marin Rodriguez(1), Emilia A Kimura(1) , Alejandro M Katzin 1)
Universidade de São Paulo. Instituto de ciências Biomédicas - Dpto de parasitologia
(1)
E-mail: [email protected]
Malaria affects about 200 to 300 million people worldwide per year, being one of the most
important infectious diseases and a major public health problem, furthermore, the
emergence of strains resistant to chemotherapeutic drugs actually used, makes necessary
the study of targets for new treatments against this disease. In our laboratory has
demonstrated the biosynthesis of several isoprenoid in Plasmodium falciparum by the 2C-methyl-D-erythritol-4-phosphate (MEP) pathway and it is also known that inhibiting
substances of the isoprenoids biosynthesis , among these, the terpenes , exhibit
antimalarial activity "in vitro" and "in vivo". The perillyl alcohol (POH) is a monoterpene
extensively studied that has been shown as an inhibitor of protein isoprenylation, inhibiting
the enzymes farnesyl transferase and geranylgeranyl transferase, proteins Ras and p21
leading to apoptosis in tumor cells.
Hence, it is believed that the isoprenoid pathway is a target for the development of new
antimalarial drugs, and for this reason we propose to evaluate the antimalarial potential of
POH through of "in vitro" test with P. falciparum and "in vivo " test with Balb / c mice
infected with P. berghei Anka gfp, evaluating the influence of treatment on survival and
parasitemia during infection. Also, determine the cytotoxic and genotoxic effects in Balb / c
mice. Preliminary results indicate that POH inhibited 50% of population growth of P.
falciparum (IC50 = 4.0 µm ± 0,5 ), however, the "in vivo" experiments showed no
significant difference in the percentages of parasitemia in the treated group compared with
control, in contrast, the survival of treated animals increased by 40% compared to the
control group. Finally, the POH has antimalarial effect in Plasmodium falciparum,
nevertheless, it is needed to improve the dosage of administration in order to have an
effect in reducing parasitemia and increasing survival of treated animals.
BYBM02
THE Trypanosoma cruzi ORTHOLOG OF P32/C1QBP INTERACTS WITH TCUBP1,
PROMOTING ITS PHOSPHORYLATION AND AFFECTING ITS BINDING TO RNA
Alejandro Cassola(1), Albertina Romaniuk(2), Gabriela Cervini(3), Ivan DOrso(4), Alberto C
Frasch(5)
(1)(2)(3)(5)
IIB-INTECH-CONICET-Universidad Nacional de San Martín. (4)Department of
Microbiology, University of Texas Southwestern Medical Center, Dallas, TX, USA.
E-mail: [email protected]
Kinetoplastid parasites regulate gene expression essentially by post-transcriptional
mechanisms. Within this picture, few polycistronic transcription start sites give birth to
immature RNA molecules that are rapidly processed by trans-splicing and polyadenylation,
ending in different mature mRNAs. RNA-binding proteins (RBPs) associate to sequences
within their 3´UTR, regulating mRNA stability and translation efficiency. One of the most
characterized RBPs from trypanosomes is TcUBP1, an mRNA destabilizing factor that
relies on its RNA-recognition motif (RRM) for recruitment to mRNA granules and
BIOCHEMISTRY & MOLECULAR BIOLOGY
41
nucleocytoplasmic shuttling. In a screening for putative proteins affecting TcUBP1 function
by binding to its RRM we identified TcP22, the ortholog of human P32/C1QBP.
Endogenous TcP22 interacts in vivo with TcUBP1, and both proteins can share
localization in few cytoplasmic foci. In vitro, TcP22 only interacts with TcUBP1 protein
constructs that have a functional RRM and not with mutated ones. This interaction is
however prevented when TcUBP1 is bound to RNA. Notwithstanding this, we found that
addition of recombinant TcP22 to cell extracts affects TcUBP1 association to
ribonucleoprotein complexes, and promotes its phosphorylation on tyrosine residues. This
phosphorylation affects TcUBP1 affinity for RNA. In vivo analysis of TcUBP1
phosphorylation showed that it becomes detectable in parasites under a lag/early log
phase of growth condition, while it cannot be detected parasites in a late log/stationary
phase of growth. TcUBP1 colocalize extensively with poly(A) and in a few foci with TcP22
in early log phase parasites, while it only colocalize with mRNA granules under starvation
stress, an extreme condition of stationary phase of growth. These results provide evidence
of the phosphorylation of TcUBP1 induced by TcP22 interaction, consequently lowering its
affinity for mRNA.
BYBM03
DEVELOPMENT OF MOLECULAR TOOLS FOR THE CHARACTERIZATION AND
FUNCTIONAL ANALYSIS OF TRYPANOTHIONE SINTHETASE (TryS) IN
Trypanosoma cruzi
Andrea C Mesías(1), María D Piñeyro(2), Carlos Robello(3), María P Zago(4)
IPE-CONICET, Salta, Argentina. (2)(3)Institut Pasteur, Montevideo, Uruguay.
E-mail: [email protected]
(1)(4)
The antioxidant system of Trypanosoma cruzi is a sophisticated network of metabolic
pathways, completely different to its human counterpart. Relying on thiols such as
trypanothione, the system maintains redox homeostasis, deals with detoxification and
respiratory burst, among other likely functions. It has also been proposed to have a role in
drug resistance phenomena, ribonucleotides synthesis regulation and possibly in parasite
persistence, avoiding the triggering of apoptosis in the infected tissue as part of the
homeostatic clearance in the host. Trypanothione syntethase (TryS), encoded by a single
copy gene, is a bifunctional enzyme in charge of trypanothione synthesis from glutathione
and spermidine. Its essentiality has been confirmed in other organisms from the
trypanosomatids. Its low abundance and substrate versatility makes it an ideal target for
drug design. A direct correlation between overexpression of antioxidant enzymes,
including TryS, and parasite virulence has formerly been shown in T. cruzi; moreover TryS
is upregulated during metacyclogenesis. The aim of this work is the development of
molecular tools to study TryS deeply. We propose the generation of parasites with different
expression levels of this enzyme using two polar isolates, an attenuated strain(TCC) and a
virulent one(Sylvio), both belonging to DTUI. In the TCC strain, we aim to overexpress
TryS using the pTREX system. In the Sylvio strain, we attempt to knock down/out one or
both alleles through the Gateway® technology. We have also designed two functional
mutants in order to affect syntethase and amidase domains by a site directed mutagenesis
strategy. Here we present the design and development of these tools, which will allow us
to address the relationship among TryS expression and virulence or pathogenicity and
parasite persistence as well. These parasites will be useful also for the study of other roles
attributed to TryS(drug resistance, ribonucleotide synthesis, among others).
BIOCHEMISTRY & MOLECULAR BIOLOGY
42
BYBM04
HIGH THROUGHPUT VIRTUAL SCREENING REVEALS A PROMISING SPECIFIC
INHIBITOR OF Toxoplasma gondii N-MYRISTOYLTRANSFERASE.
Andrés M Alonso(1), María Corvi(2), Diego M Bustos(3)
Laboratorio de Parasitología Molecular, Instituto de Investigaciones BiotecnológicasInstituto Tecnológico de Chascomus (IIB-INTECH), UNSAM -CONICET. Intendente
Marino Km 8,2 (B7130) Chascomús, Provincia de Buenos Aires, Argentina. (3)Laboratorio
de Integración de Señales Celulares. Instituto de Histología y Embriología de Mendoza
(IHEM)CONICET-UNCUyo 5500 Mendoza.
E-mail: [email protected]
(1)(2)
N-myristoyltransferase (NMT) is a monomeric enzyme that catalyzes the covalent addition
of myristate (C14:0 saturated fatty acid) onto proteins. This co- and post-translational
modification affects a variety of proteins, many of them important for the life-cycle of cells,
and influences different features such as localization, protein-protein interaction and
function. Protein myristoylation is essential for cell viability and its peptide recognition sites
are species-specific, which makes it an ideal drug target for different pathogens like fungi
and protozooan parasites. In this work we performed a bioinformatic analysis that revealed
that Toxoplasma gondii genome encodes for a putative NMT which contains the N- and Cterminal domains characteristic of the NMT family. Furthermore, primers designed for the
T. gondii NMT coding sequence (CDS) published in the ToxoDB let us determine that NMT
is expressed in the T. gondii RH strain. In parallel, a virtual screening (VS) on T. gondii
NMT (TgNMT) was performed using over 5000 compounds filtered from the ZINC
database. Since the crystal structure of TgNMT is not available, we created a homology
model to run the VS. The analysis resulted in 10 compounds with a high predicted
inhibition constant (Ki) over TgNMT, but only one of them was more specific for TgNMT
than that of the host NMT (hNMT). Interaction analysis of the compound with TgNMT
allowed us to infer that this compound might interact with the peptide binding site of the
enzyme, a site that has been described to be species-specific. Besides, the compound
interacts with the myristoil-CoA binding site of the hNMT, which is conserved along
different species, but the interaction of the compound with hNMT was found to be a
hundred times lower than with TgNMT. These preliminary results are the first report on
specific TgNMT inhibitors and the starting point for the study of treatments designed
specifically for toxoplasmosis.
BYBM05
HISTONAS H2A DE FENOTIPO SILVESTRE Y MUTANTES EN Trypanosoma cruzi.
EFECTO SOBRE PROLIFERACIÓN Y SOBREVIDA
Bernardita Julio Kalajzic, Sofía Sepúlveda Contreras, Lucía Valenzuela Pérez, Gonzalo
Cabrera Vallejos, Norbel Galanti Garrone
Universidad de Chile.
E-mail: [email protected]
Trypanosoma cruzi, agente causal de la enfermedad de Chagas, sobrevive al daño
oxidativo al DNA tanto en el insecto vector como en el hospedero mamífero. En
BIOCHEMISTRY & MOLECULAR BIOLOGY
43
eucariontes recientes la fosforilación de la histona H2AX en Ser139 es una respuesta
temprana fundamental para la reparación del DNA. En tripanosomátidos no se ha
identificado genes ortólogos para H2AX pero en T. brucei se detectó que H2A canónica es
fosforilada en Thr130 a causa de daño al DNA. En T. cruzi este residuo corresponde a
Thr132 y su rol en la respuesta al daño del DNA no se ha estudiado. Se realizaron tres
mutaciones sitio-dirigidas en el codón que codifica para Thr132 de H2A de T. cruzi:
alanina (no fosforilable), ácido glutámico y ácido aspártico (simulación fosforilación). Las
secuencias nucleotídicas fueron insertadas en el vector pTREX y expresadas como
proteínas de fusión con GFP en epimastigotes de T. cruzi. Se comprobó la expresión de
las proteínas mediante visualización directa por microscopía de fluorescencia, IF y
western blot. Las histonas unidas a GFP se localizan a nivel de núcleo, sugiriendo
asociación con la cromatina. Parásitos que expresan H2A Thr132Ala poseen una
constante de proliferación menor que aquellos que sobreexpresan la histona silvestre pero
una viabilidad similar cuando se exponen a H2O2 por 30 min o 24 hrs. Se concluye que la
sustitución Thr132Ala en la histona H2A afecta negativamente la proliferación del parásito
pero no así su resistencia al daño oxidativo agudo o sostenido.
BYBM06
THE SECRETOME OF Trypanosoma cruzi DURING THE METACYCLOGENESIS
Carla Cristi Del Campo Avila, Giuseppe Palmisano
Instituto de Ciências Biomédicas - Departamento de Parasitologia - Universidade de São
Paulo - Brasil.
E-mail: [email protected]
Trypanosoma cruzi, etiologic agent of Chagas disease, is a protozoan pathogen with a
complex life cycle. Chagas disease is a serious health problem in Latin America and is an
emerging disease in non-endemic countries. The differentiation of epimastigotes to
metacyclic trypomastigotes, named metacyclogenesis, is central for the development of
the disease. A deeper understanding of the molecular features, such as genes, proteins
and metabolites, differentially expressed during metacyclogenesis is mandatory to identify
effective drug targets. In particular, proteins released from T. cruzi modulate the pathogenhost interaction. This work aims at identifying T. cruzi secreted proteins and their functions
during metacyclogenesis. Many research groups have highlighted the importance of T.
cruzi secreted proteins. Recently it was investigated the secretome of Dm28c T. cruzi
epimastigote and metacyclic trypomastigotes. In total, 367 proteins were identified from
cell culture conditioned media and from vescicle-containing fractions. In this work, we have
analyzed the T. cruzi strain CL clone 14 secretome released in chemically defined media,
TAU3AAG, along different stages of the metacyclogenesis process. Shotgun LC-MS/MS
proteomic approach combined with label-free protein quantification allowed us to identify
1300 proteins. Functional classification based on gene ontology allowed us to identify
proteins involved in a variety of categories, such as signaling, transcription and protein
synthesis, trafficking and membrane fusion and transport and oxidation reduction
confirming the importance of this information-rich medium. Interestingly, many proteins
were not previously identified in the secreted medium opening new ways of interpreting the
T. cruzi signaling. These findings complement the current reports on secreted T. cruzi
BIOCHEMISTRY & MOLECULAR BIOLOGY
44
proteins and allow us to understand and analyze in more detail and precision the
mechanisms involved in the differentiation of T. cruzi.
BYBM07
INTERACCIÓN ENTRE EL TRANSPORTE DE POLIAMINAS Y PENTAMIDINA EN
Trypanosoma cruzi
Chantal Reigada, Mariana R Miranda, Melisa Martínez Sayé, Fabio di Girolamo, Claudio A
Pereira
IDIM-CONICET.
E-mail: [email protected]
Las poliaminas son moléculas esenciales para la proliferación de Trypanosoma cruzi
debido a que el parásito es incapaz de sintetizarlas de novo, siendo el transporte la única
vía de obtención de las mismas. Dada la esencialidad de estas moléculas y las diferencias
existentes con el hospedador mamífero, el transporte y el metabolismo de poliaminas
constituyen blancos terapéuticos promisorios. En trabajos anteriores se demostró que la
pentamidina, una droga antiparasitaria utilizada contra la Leishmaniasis y la
Tripanosomiasis Africana, también tiene efecto sobre T. cruzi mediante la inhibición del
transporte de poliaminas. En el presente trabajo, se llevó a cabo un análisis bioinformático
sobre el genoma del parásito que permitió identificar seis posibles transportadores de
poliaminas. Entre éstos se encuentra el transportador de putrescina TcPT-1, que estaría
también involucrado en el transporte de pentamidina. Bajo la hipótesis que la pentamidina
ingresa a través de estos transportadores se comenzó a estudiar otro de ellos, el TcPT-3.
Mediante la construcción de un modelo de levaduras que expresa heterólogamente dicho
transportador, se observó que dichas levaduras transportan significativamente más
espermidina que los controles. Además, se determinó su localización subcelular en el
bolsillo flagelar y en el complejo de la vacuola contráctil. Por otro lado, se comprobó que
el transporte de putrescina en parásitos wild type puede ser inhibida no sólo por
pentamidina sino también por su análogo DAPI, validando que poseen vías en común de
ingreso a la célula. Asimismo, los parásitos transgénicos que expresan niveles elevados
del transportador TcPT-1 transportan mayor cantidad de DAPI que los controles. Estos
resultados sugieren que los transportadores de poliaminas podrían ser una puerta de
entrada para la pentamidina y destacan la importancia del transporte y metabolismo de
dichos metabolitos como blancos terapéuticos de aplicación en la Enfermedad de Chagas.
BYBM08
LA NUCLEÓSIDO DIFOSFATO QUINASA 1 DE Trypanosoma cruzi
GRANULOS QUE DEPENDEN DE SU ESTRUCTURA CUATERNARIA
FORMA
Claudio A. Pereira(1), Arturo Gomez Barroso(2), Carlos F. Aguilar(3), Chantal Reigada(4),
Fabio di Girolamo(5), Melisa Sayé(6), Mariana R. Miranda(7)
(1)(4)(5)(6)(7)
IDIM-CONICET. (2)(3)Laboratorio de Biología Estructural (UNSL-IMIBIO SL-
BIOCHEMISTRY & MOLECULAR BIOLOGY
45
CONICET).
E-mail: [email protected]
Las nucleósido difosfato quinasas (NDPK) son enzimas involucradas en la homeostasis
intracelular de nucleótidos. En Trypanosoma cruzi, la TcNDPK1 es una enzima
multifuncional por poseer, además de la actividad quinasa, la capacidad de unirse y
degradar ácidos nucleicos, ser una enzima de secreción y estar involucrada en la
resistencia a drogas tripanocidas. Asimismo, TcNDPK1 es hexamérica y localiza en el
citoplasma de los parásitos, sin embargo, cuando está fusionada a una proteína
dimerizante como la GFP genera gránulos. Este comportamiento es específico de la
NDPK y depende de su estructura cuaternaria, sugiriendo que la enzima podría estar
oligomerizándose. En el presente trabajo determinamos que los gránulos también se
forman en parásitos que expresan la TcNDPK1 no fusionada a GFP bajo condiciones de
estrés como ocurre en el proceso de metaciclogénesis. Estudios realizados sobre la
estructura cristalina demuestran que la enzima adopta una estructura fibrilar formada por
hélices levógiras constituidas por tetrámeros de hexámeros apilados entre sí, nunca antes
observada. Interesantemente, mediante la construcción de diferentes mutantes en
aminoácidos claves para la formación de la hélice, pudimos establecer que la fibra
encontrada en los cristales está asociada a los gránulos observados en los parásitos.
Estos resultados sugieren que la TcNDPK1 podría ensamblarse in vivo y que sus
múltiples funciones podrían estar reguladas por un mecanismo de polimerizacióndepolimerización.
BYBM09
INHIBITION OF PHOSPHOENOLPYRUVATE (PEP) CARBOXYKINASE OF
Trypanosoma cruzi BY PYROPHOSPHATE AND ITS ROLE IN THE METABOLIC FATE
OF PEP IN THE PARASITE
Dante Maugeri(1), Juan José Cazzulo(2), Joaquín J B Cannata(3)
(1)(2)
IIB-INTECH. (3)IIB-INTECH - Facultad de Medicina, UBA.
E-mail: [email protected]
Trypanosoma cruzi has a classic glycolytic pathway with two atypical characteristics
absent in most organisms: 1) the first seven enzymes are compartmentalized in a
peroxysome-like organelle, the glycosome, and 2) the presence of fermentative pathways
operating inside the glycosome, both in aerobiosis and anaerobiosis, and required for the
generation of ATP. The glycolytic intermediate PEP has a critical role in this fermentation,
since it can follow two diverging metabolic pathways inside the glycosome. It can be used
as a substrate for the ADP-dependent phosphoenolpyruvate carboxykinase (PEPCK),
giving oxaloacetate as a product and ultimately leading to succinate. Alternatively, it can
be used as a substrate by the AMP- and PPi-dependent pyruvate phosphate dikinase
(PPDK) producing pyruvate, which then transaminates to L-alanine. Succinate and Lalanine are the two major final products of glycolysis in the epimastigote stage, as our
group demonstrated by NMR. We show here that PPi, a substrate of PPDK, acts as an
inhibitor of PEPCK, and can therefore be an important regulatory factor to direct PEP
metabolism in the glycosome towards the formation of succinate or L-alanine. This
BIOCHEMISTRY & MOLECULAR BIOLOGY
46
inhibition is unusual, since it is unidirectional, acting only on the carboxylation reaction. In
addition, the reaction kinetics is very complex, since the type of inhibition depends on the
concentration range of both, PEP and PPi, used in the experiments. Thus, the inhibition
types obtained at PPi concentrations higher or lower than 70µM are completely different
(mixed or uncompetitive, respectively). Moreover, the inhibition type also varies with the
concentrations of PEP, being different at PEP concentrations higher that 75µM or lower
(15 – 30µM). In addition, the use of these low PEP concentrations showed a property of
the enzyme not previously described, namely allosteric behaviour, which is evident only at
low PEP concentrations.
BYBM10
BIOCHEMICAL CHARACTERIZATION OF TcCYC6: A PROTEIN WITH CYCLIN
HOMOLOGY FROM Trypanosoma cruzi
Di Renzo Maria A(1), Tellez-Iñón MariaT(2), Laverriere Marc(3), Schenkman Sergio(4),
Potenza Mariana1(5)
(1)
Ingebi-Conicet CABA. (2)(5)INGEBI-CONICET, CABA. (3)Unité de Biologie des Interactions
Cellulaires, Institut Pasteur, Francia. (4)Universidade Federal de São Paulo, Brasil.
E-mail: [email protected]
The cell cycle is a highly regulated process that requires Cyclin-Dependent Kinases
(CDKs) in association with cyclins and other factors to activate or inactivate biochemical
pathways that leads to proper duplication and segregation into new daughter cells. Which
are these regulators controlling the cell cycle in Trypanosoma cruzi, a pathogen parasite
that alters between proliferative and non dividing forms, is still poorly understood and
deserves further studies. The genome of T. cruzi codify for ten sequences with cyclin
homology (TcCYC2 to TcCYC11), three of which were characterized at the functional level
by our group (TcCYC2, TcCCY4 and TcCYC5). In order to further understand the role of
the cyclin family in the cell cycle control of this parasite, a sequence with similarity to
mitotic cyclins (TcCYC6), was studied. For this purpose, we first raised polyclonal
antibodies against the N-terminal peptide of TcCYC6 protein. This antibody was unable to
detect the endogenous expression of TcCYC6 in epimastigotes either by western blot or
immunofluorescence microscopy. However, we isolated the TcCYC6 messenger RNA,
indicating that this gene is processed at least as mature transcript. Then, we cloned the
TcCYC6 coding sequence fused to the influenza hemagglutinin tag, HA (TcCYC6-HA) into
the inducible expression vector pTcINDEX. Over-expression of TcCYC6-HA causes
inhibition of epimastigote growth, although the cell cycle pattern of parasite population is
not compromise. In agreement with this, studies using immunofluorescence microscopy
did not reveal any cell cycle dependent re-localization of this recombinant protein.
However, results from treatment with specific inhibitors and affinity chromatography
suggested that TcCYC6-HA protein could be degraded by proteasome pathway.
Complementation assays suggested that TcCYC6-HA does not complement the G1 cyclin
deficiency in yeasts, although other functional experiments are in progress. Supported by
PICT 2012; CONICET
BIOCHEMISTRY & MOLECULAR BIOLOGY
47
BYBM11
REPAIR OF OXIDIZED PROTEINS IN Trypanosoma cruzi:
CHARACTERIZATION OF METHIONINE SULFOXIDE REDUCTASE B
FUNCTIONAL
Diego G Arias, Alberto A Iglesias, Sergio A Guerrero
Instituto de Agrobiotecnología del Litoral - UNL - CONICET.
E-mail: [email protected]
Methionine is an amino acid susceptible to being oxidized to methionine sulfoxide
(MetSO). The reduction of MetSO to methionine is catalyzed by methionine sulfoxide
reductase (MSR), an enzyme present in almost all organisms. In trypanosomatids, the
study of antioxidant systems has been mainly focused on the involvement of
trypanothione, a specific redox component in these organisms. However, poorly
information is available concerning their mechanisms for repairing oxidized proteins, which
would be relevant for the survival of these pathogens in the various stages of their life
cycle. Recently, we characterized two A-type MSR proteins from T. cruzi and T. brucei. In
this work, we report the molecular cloning of a gene encoding a putative B type MSR in
this pathogen. The gene was expressed in Escherichia coli, and the corresponding
recombinant protein was purified and functionally characterized. The enzyme was specific
for L-Met(R)SO reduction, using T. cruzi TXNI, TXNII and TRX as the reducing substrates.
In addition, we found that TcMSRB could compensate for MSR deficiency in yeast mutant
strain lacking both MSRA and MSRB genes. The protein presented redox-dependent
change in monomer/dimer oligomerization states. The in vivo presence of the enzymes
was evidenced by immunological detection in replicative and infective stages of T. cruzi.
Overexpression of TcMSRB in epimastigote cells confers resistance to oxidative stress.
The results support the occurrence of a metabolic pathway in T. cruzi involved in the
critical function of repairing oxidized macromolecules.
BYBM12
Trypanosoma brucei: ENDOGENOUS BIOSYNTHESIS OF UBIQUINONE 9 AND
EXOGENOUS UPTAKE OF UBIQUINONE 10
Esteban J Bontempi(1), Octavio Fusco(2), Estefanía Poropat(3), Juan C Engel(4), Juan B
Rodríguez(5)
(1)(3)
Instituto Nacional de Parasitología, ANLIS. (4)Sandler Center for Basic Research in
Parasitic Diseases and Department of Pathology, USA. (5)Departamento de Química
Orgánica
and
UMYMFOR
(CONICET-FCEyN),
UBA.
E-mail: [email protected]
Our aim is to validate the solanesyl diphosphate synthase (SPPS) as a new target for
trypanosomatids. The Trypanosoma brucei mitochondrial enzyme (Lai 2012) is essential,
as demonstrated by RNAi experiments (Lai 2014). Identical metabolic effects were
obtained by inhibiting the bloodstream forms with 1-[(n-oct-1-ylamino)ethyl] 1,1bisphosphonic acid (Compound 1), a bisphosphonate originally developed against the T.
cruzi homologue enzyme (Ferella 2006, Szajnman 2008). Under its action, the ATP pool
BIOCHEMISTRY & MOLECULAR BIOLOGY
48
diminished by 50%, resulting in cell death. In order to make the parasite more sensitive to
the drug, interactions with another drugs were studied. Using the CompuSyn software we
quantitated synergism, antagonism and additive effect between Compound 1 and other
drugs. Unexpectedly, synergisms with protease inhibitors were detected. This suggested
the existence of a mechanism of exogenous ubiquinone uptake. We hypothesized that
LDL particles could carry ubiquinone 10 into the cell, as it was demonstrated for
cholesterol. Then, different inhibitors, related to the binding, acquisition and processing of
LDL particles were assayed.
BYBM13
INTRACELLULAR AND FREE FORMS OF TRYPANOSOMATIDS ARE SENSITIVE TO
A SOLANESYL DIPHOSPHATE SYNTHASE INHIBITING BISPHOSPHONATE
Esteban J Bontempi(1), Nicolás Tomasini(2), Octavio Fusco(3), Alina Perrone(4), Patricia
Garavaglia(5), Bruno Travi(6), Juan C Engel(7), Benoit Vanhollebeke(8), Laura E Fichera(9),
Cristina Maidana(10), Gabriela García(11), Jacqueline E Búa(12), Juan B Rodríguez(13),
Mónica
I
Esteva(14),
Carlos
Pravia(15),
Patricio
Diosque(16)
(1)(3)(4)(5)(9)(10)(11)(12)(14)(15)
(2)(16)
Instituto Nacional de Parasitología, ANLIS.
Instituto de Patología
(6)
Experimental, Universidad Nacional de Salta.
Depts. of Internal Medicine and
Microbiology and Immunology, University of Texas Medical Branch, USA. (7)Sandler
Center for Basic Research in Parasitic Diseases and Department of Pathology, USA.
(8)
Laboratory of Molecular Parasitology, Institute of Molecular Biology and Medicine,
Université Libre de Bruxelles, Belgium. (13)Departamento de Química Orgánica and
UMYMFOR
(CONICET-FCEyN),
UBA.
E-mail: [email protected]
We have previously described that Trypanosoma cruzi and Trypanosoma brucei solanesyl
pyrophosphate synthases can be inhibited by 1-[(n-oct-1-ylamino)ethyl] 1,1-bisphosphonic
acid (Compound 1) (Ferella 2006, Szajnman 2008, Lai 2014). In T. brucei (Tb) Compound
1 showed metabolic effects similar to those displayed when inhibiting the enzyme or
interfering with its expression (Lai 2014). We herein report that insect, bloodstream and
intracellular forms of several pathogenic species of trypanosomatids are also sensitive to
Compound 1. We found the following EC50s (in microM): T.b.brucei 2, T.b.rhodesiense
0.92 and T.b.gambiense 0.78 (bloodstream forms), L.donovani 200 (promastigote form),
L.major >10 and L.donovani 3.3 (amastigote forms), T.cruzi 3.13 (amastigote form). Based
on the detection of amino acid differences in several T. cruzi strains, a detailed analysis
was carried out to analyze the gene philogeny in the six DTUs and to detect strain
variation in drug sensitivities. Although encouraging, the in vitro and ex vivo effectivity of
this “universal” trypanosomatid inhibitor by no means minimizes the need for in vivo
experimentation. The tissue distribution of these different human pathogens, either
extracellular in the bloodstream or intracellular in different organs, poses special
challenges for efficient drug delivery.
BIOCHEMISTRY & MOLECULAR BIOLOGY
49
BYBM14
EFFICIENT EXPRESSION OF INDEPENDENT PROTEINS FROM A SINGLE ORF
DRIVEN BY THE VIRAL 2A PEPTIDE SEQUENCE IN Trypanosoma cruzi
Gabriela Cervini Böhm, Maria A Romaniuk, Alberto C Frasch, Alejandro Cassola
iIB-INTECH-CONICET-Universidad
Nacional
de
San
Martín.
E-mail: [email protected]
Trypanosoma cruzi is the causative agent of Chagas disease. Efforts towards a cure are
being conducted towards identifying druggable targets and their inhibitors. However, this
parasite is not amenable to genetic manipulation and recombinant protein expression.
Current strategies for their synthesis involve the association to a resistance marker
through the use of polycistronic constructs that give functional mRNAs after posttranscriptional processing. Usually, low levels of protein yield hamper the use of
recombinant proteins to study protein functions. With this in mind we tested whether we
could express functional proteins from a monocistronic construct with two open reading
frames separated by the 2A peptide sequence (2A), which is derived from the foot and
moth disease virus. This sequence codes for a peptide that provokes a “ribosome
skipping” event, leading to an incomplete peptide bond formation, yielding two
independent proteins. We analyzed the functionality of the 2A peptide in recombinant
protein expression in T. cruzi using different DNA constructs coding for GST-2A-DsRed.
Wild type 2A sequences showed complete separation of GST from DsRed when analyzed
by Western blot. Although both proteins partially co-localized, a NLS-GST-2A-DsRed
construct directed NLS-GST completely to the nucleus while DsRed was distributed
throughout the cell, showing in vivo separation. As a control of the correct peptide-skipping
event we generated a nonfunctional 2A peptide that behaved like a GST-2A-DsRed fusion
when analyzed by Western blot, which also showed complete co-localization of both
proteins. These results show that this short viral peptide sequence can be used to express
two different and independent proteins from a single open reading frame, suggesting
“ribosome skipping” mechanism conservation. Furthermore it provides an easy and
successful approach to follow up the expression of a protein of interest in a humanthreatening parasite with few genetic tools.
BYBM15
TcFEN1 ENDONUCLEASE IS EXPRESSED IN Trypanosoma cruzi AND INCREASES
ITS RESISTANCE TO SUSTAINED OXIDATIVE STRESS
Iván Ponce López, Carmen Aldunate Ruiz, Sofía Sepúlveda Contreras, Lucía Valenzuela
Pérez, Rosalía Astorga , Fernando Ormeño , Camila Barrientos Bruna, Carla S. Perez
Barja, Gonzalo Cabrera Vallejos, Norbel Galanti Garrone
Universidad de Chile.
E-mail: [email protected]
T. cruzi, the etiological agent of Chagas´s disease, survives to oxygen and nitrogen
reactive oxidative species (ROS/RNS), both in vector insects and mammalian hosts. ROS
BIOCHEMISTRY & MOLECULAR BIOLOGY
50
and RNS affect diverse macromolecules, including parasite DNA. A conserved mechanism
for DNA repair is the base excision repair pathway (BER). Flap endonucleases (FEN) are
enzymes that recognize DNA intermediates presenting a DNA single strand flap and
process this flap both during DNA repair and DNA replication. Previously, we have found
that a flap endonuclease activity is present in homogenates from different cellular forms of
T. cruzi (TcFEN1) and that the expression of a recombinant flap endonuclease in the
parasite (TcFEN1-GFP) results in increased proliferation rates and parasite resistance
when exposed to oxidative agents (H2O2) for short times. Since in their hosts T. cruzi is
exposed to oxidative agents for prolonged periods, we investigated whether the
expression of the recombinant protein TcFEN-GFP confers resistance to the parasites
against sustained oxidative stress conditions. Epimastigote were exposed to H2O2 as
oxidant agent, produced by a glucose-glucose oxidase (GO) system added to the
incubation medium, for sustained production of H2O2 for extended periods of time (24 hrs
maximum). After incubation the viability of parasites was assessed by the MTT assay.
Results show increased resistance of parasites expressing the recombinant TcFEN1-GFP,
for GO concentrations of 25 and 50mU/ml. Under the described conditions, the localization
of the recombinant protein was exclusively nuclear, as observed by direct fluorescence
microscopy. These results suggest a role for TcFEN1 in the resistance of T. cruzi against
ROS, acting as a nuclear genomic DNA maintenance factor. Acknowledgments: Projects
FONDECYT 1130113 (NG) and 11100053 (GC).
BYBM17
FUNCTIONAL CHARACTERIZATION OF MALIC ENZYMES FROM Leishmania
PARASITES
Lucila Giordana, Cristina Nowicki, Cristina Nowicki
IQUIFIB, UBA Facultad de Farmacia y Bioquímica.
E-mail: [email protected]
Leishmania spp. like trypanosomes are notably sensitive against oxidative stress. For
survival these pathogens depend on a complex redox cascade which utilizes the reducing
equivalents derived from trypanothione T(SH2) for detoxification of reactive oxygen and
nitrogen species. T(SH2) is maintained in its reduced form by trypanothione reductase
which exclusively relays on NADPH as electron source. Consequently, NADPH is
essential for parasite survival and it is consumed at high rates. Pentose phosphate
pathway is considered a good candidate for the supply of the reduced coenzyme; however
amastigotes are believed to develop a glucose-sparing metabolism. To overcome this
limitation, leishmanial amastigotes are expected to count on alternative sources for
NADPH production, for instance malic enzymes (MEs). The survey of the sequenced
genomes of Leishmania species put in evidence that L. major exhibited a single gene
coding for putative ME (ME_Lmj), while L. mexicana, L. infantum and L. braziliensis
displayed two putative gene copies encoding ME isoform(s), ME_1 and ME_2. The
sequence identity between ME_1 and ME_2 is about 60%, while the putative ME_Lmj is
>95% identical to ME_1. To shed light on the biochemical properties of leishmanial MEs
we have cloned and expressed in E. coli the putative ME_1 and ME_2 from L. mexicana in
addition to ME_Lmj. Our results showed that ME_1, ME_2 and ME_Lmj were active and
specifically catalyzed the oxidative decarboxylation of malate with concomitant NADPH
production. The recombinant MEs from L. mexicana and L. major exhibited equivalent
BIOCHEMISTRY & MOLECULAR BIOLOGY
51
kinetic parameters (Kms and Vmax values) but only ME_2 showed to be allosterically
activated by L-aspatate. In the presence of 0.5 mM of this amino acid, an increase in about
8-fold in the apparent Km value of ME_2 towards malate was observed. Presumably,
leishmanial MEs might derive from different ancestors and their biochemical properties
could reflect a specific-specie metabolism.
BYBM18
APLICACIÓN DE LA BIOLOGÍA GENÓMICA EN EL DIAGNÓSTICO Y
CARACTERIZACIÓN DE Leishmania spp EN ÁREAS ENDÉMICAS DE CHACO,
ARGENTINA
Marcelo G Medina, Horacio Lucero
INSTITUTO DE MEDICINA REGIONAL-UNNE.
E-mail: [email protected]
Leishmaniosis es una enfermedad parasitaria zoonótica. Leishmania braziliensis es la
especie más frecuente en Argentina. La Reacción en Cadena de la Polimerasa (RCP) ha
facilitado el diagnóstico, caracterización y tratamiento. La presentación de casos clínicos
tiene por objetivo, mostrar la importancia de las técnicas moleculares en la detección y
tipificación de Leishmania. Caso 1: Hombre de 74 años, de Quitilipi. Consultó por tres
lesiones cutáneas, asintomáticas en miembro superior izquierdo y en ambos flancos
abdominales, de ocho meses de evolución. Exploración física; úlcera en región
anterolateral de brazo izquierdo y dos úlceras en ambos flancos abdominales bordes
eritematosos elevados y centro vegetante. Caso 2: Hombre de 65 años, de Resistencia.
Consulta por aparición de una lesión cutánea, asintomáticas en extremo distal de pierna
derecha, cara externa, de 12 meses de evolución. Exploración física; úlcera en extremo
distal de pierna derecha, cara externa, bordes irregulares, aspecto estrellado, centro con
abundante fibrina, tejido necrótico y secretante. Caso 3: Mujer de 70 años, de Resistencia,
consulta por lesión cutánea, asintomática en pierna tercio inferior izquierdo, de 12 meses
de evolución. Exploración física; úlcera en tercio inferior izquierdo, bordes eritematosos
elevados y centro vegetante, limpio. Estudios de laboratorio con coloración de Giemsa y
anatomía patológica confirman la presencia de amastigotes. Se confirma el diagnóstico y
tipificación por PCR para Leishmania brasiliensis, tomando muestra por cepillado de
lesión. Se instauró tratamiento con antimoniato de meglumina. En dos semanas se
observó la resolución completa de las lesiones dejando cicatriz residual. Conclusión: El
interés de la presentación es la importancia de la utilización de las técnicas moleculares
en la detección y tipificación de Leishmania lo cual proporciona un método de mayor
sensibilidad y especificidad, sobre todo en áreas endémicas.
BYBM19
TRANSLATIONAL CONTROL IN TRYPANOSOMATIDS
Maria Camara(1), Santiago Bertotti(2), Santiago Carmona(3), Fernan Aguero(4), Leonardo G
Panuzzi(5), Ian Flemming(6), Juan D. Alfonzo (7), Carlos A Buscaglia(8)
(1)(2)(3)(4)(5)(8)
IIB-INTECH-UNSAM. (6)(7)Department of Microbiology, The Ohio State
BIOCHEMISTRY & MOLECULAR BIOLOGY
52
University, USA..
E-mail: [email protected]
The protozoan T. cruzi is the etiological agent of Chagas disease, a major public health
issue in Latin America. Due to its predominant clonal proliferation, this species is
composed by multiple "discrete typing units" displaying considerable genetic diversity.
TcSMUG is a multiple member family of Thr-rich mucins genes, composed of two groups
of genes, named L and S, organized in independent tandem arrays and differing in the
structure of their genomic loci. One notable feature is that TcSMUGL products in contrast
to TcSMUGS show substantial differences in their expression levels among parasites
stocks. In order to understand the variability in the expression of TcSMUGL we analyzed
the secondary structure of the 3'UTR of TcSMUG L mRNAs for the Adriana and CL Brener
strain revealing very minor inter-strain differences; suggesting that the observed
expression variations may not respond to post-transcriptional mechanisms. Consequently
we calculated TcSMUG L codon bias for both strains obtaining inter-strain distortions in
the TcSMUG L usage for four codons: Thr(ACT), Val(GTT), Leu(CTT) and Leu(TTG). No
codon significant inter-strain distortions were found for TcSMUG S genes. These results
suggest that the variability in expression of TcSMUG L could be due to differences in
codon bias. Furthermore 3 out of 4 codons displaying significant inter-strain distortions in
our analysis; Thr(ACT), Val(GTT) and Leu(CTT) are affected by anticodon tRNA editing. In
vivo editing analysis revealed significant inter-strain differences in the editing profile for the
tRNAThrAGU isoacceptor, which decodes the inter-strain biased codon Thr(ACT). Finally
overexpression of tRNA editing deaminases lead to an increase in the levels of tRNAThr
editing and significant changes in the expression profile of TcSMUG L proteins Together
these findings suggest a mechanism of gene expression regulation that relies on the
efficient interaction of codons and anticodons.
BYBM20
CONSTRUCTION OF FLUORESCENT TRANSGENIC STRAINS FROM DIFFERENT
Trypanosoma cruzi DTUs
María de los Ángeles Curto(1), Juan C Ramírez(2), Susana A Besuschio(3), Alejandro G
Schijman(4)
(1)(3)(4)
LaBMECh-INGEBI. (2)LaBMEChINGEBI.
E-mail: [email protected]
At present Trypanosoma cruzi strains are classified in six Discrete Typing Units
(DTUs).These categories differ, in their geographic locations, transmission cycle and host
range, genetic content and genome organization, virulence and drug resistance. Studies
regarding their association with Chagas’ disease clinical manifestations are currently
undergone. In Argentina, in vitro assays are mostly performed with strains from DTUs I
and VI, but parasites from DTU V are predominantly found in infected patients. Previously,
we have reported the generation of transgenic cell lines from DTU I expressing a
fluorescent marker. No difference in fitness or infection capacity was observed between
wild type and transgenic parasites. Now, we are extending this methodology to the rest of
T.cruzi DTUs. Transgenic parasites from DTUs I, II, IV and VI expressing at least two
different fluorescent proteins (GFP, RFP, mCherry and dsRED2) have been obtained.
Reporter genes are carried by a vector (pTREX) that integrates in the ribosomal promoter
BIOCHEMISTRY & MOLECULAR BIOLOGY
53
of the parasite’s genome, thus enabling tests in the absence of selective pressure and
yielding high expression of the protein of interest. Similar experiments with DTUs III and V
are being performed.Furthermore, constructs carrying reporter genes that were fully
functional as artificial chromosomes in CL Brener strain ( DTU VI) are being tested in other
DTUs. We believe that these transgenic populations will be valuable tools in drug
screening, genetic exchange assays as well as in histotropism studies of mixed infections.
BYBM21
A MULTILAYER NETWORK APPROACH FOR GUIDING DRUG REPURPOSING IN
NEGLECTED DISEASES
María P Magariños(1), Ariel J Berenstein(2), Ariel Chernomoretz(3), Fernán Agüero(4)
Instituto de Investigaciones Biotecnológicas, UNSAM. (2)Laboratorio de Bioinformática,
Fundación Instituto Leloir. (3)Departamento de Física, Universidad de Buenos Aires.
E-mail: [email protected]
(1)(4)
Historically, lack of interest from the pharmaceutical industry, resulted in the lack of drugs
for the majority of the pathogens that cause neglected diseases. With the advent of open
chemical resources and the release of data from high throughput screenings the
availability of chemical information has increased greatly. However most of the information
on targets and the activity of drugs is for humans or model organisms. This creates a huge
opportunity for computational exercises that use comparative genomics and
chemogenomic approaches. In this work, using chemical datasets containing bioactivity
data for pathogen and non-pathogen targets we built a three-layer network containing
three disjoint sets of vertexes with 1) 1.5 million drugs; 2) 167,000 proteins across 221
species; and 3) three affiliation-type protein features (orthology, Pfam domains,
participation in metabolic pathways). Only statistically significant features (in the context of
drug-target predictions) were taken into account. A bipartite projection of the protein layer
was obtained capturing the protein affiliations to different annotation classes. Using this
network model, we tackled the problems of i) prioritizing targets for drug discovery for
pathogens; and ii) suggesting candidate targets for orphan compounds (those that are
active in whole-cell screenings but whose target is currently unknown). We used a tenfold
cross validation procedure to assess the performance of the network to prioritize relevant
targets and show that he method overcomes traditional similarity-based searches against
druggable targets. In the presentation we will discuss some of the top ranked proteins. We
also obtained candidate target proteins for orphan molecules that were active in whole-cell
assays against P. falciparum and will discuss the proposed targets that mediate the
antiplasmodial activity for some of these orphan compounds.
BYBM22
POLY(ADP-RIBOSE) METABOLISM IS INVOLVED IN PROCYCLIC Trypanosoma
brucei SENSITIVITY TO GENOTOXIC DAMAGE
Mariana Schlesinger, María L Kevorkian, Salomé C Vilchez Larrea, Mirtha M Flawiá, Silvia
H Fernández Villamil
BIOCHEMISTRY & MOLECULAR BIOLOGY
54
INGEBI.
E-mail: [email protected]
Poly(ADP-ribosyl)ation is a covalent modification of proteins catalyzed by poly(ADPribose) polymerases (PARPs). Poly(ADP-ribose) (pADPr) metabolism plays a role in a
wide range of biological processes among which DNA damage signaling and repair are the
most extensively studied functions. Poly(ADP-ribose) glycohydrolase (PARG) represents
the main pADPr hydrolyzing activity in the cell. In contrast to human and other higher
eukaryotes, T. brucei contains only one PARP (TbPARP) and PARG (TbPARG). We have
identified potent TbPARP inhibitors using an in vitro activity assay and verified that these
compounds effectively reduced the formation of pADPr in T. brucei parasites exposed to
genotoxic stress. Our previous results suggest that TbPARP is not necessary for T. brucei
growth under normal conditions. Surprisingly procyclic parasites become more resistant to
stress induced by hydrogen peroxide when TbPARP activity is abolished by chemical
inhibition or RNAi. On the other hand, large amounts of basal pADPr in the nucleus of the
parasites over-expressing TbPARP and down-regulating TbPARG lead to an increased
sensitivity towards genotoxic stimulus. Indeed, transgenic parasites undergo, after
extensive DNA damage, a cell death pathway different from wild type trypanosomes,
suggesting a role of pADP r polymer metabolism in cell death. The duality of pADPr as a
central player in both life and cell death has been proposed by many authors. pADPr is
required for proper mitosis and is involved in DNA damage response. However, an
augmented pADPr synthesis may deplete NAD+ and consequently remove ATP from the
cell, inducing cell death. We showed that not only the quantity of the synthesized pADPr
might have an effect on parasite survival, but also the polymer subcellular localization
seems to affect this outcome. Disrupted pADPr metabolism with nuclear accumulated
polymer has deleterious consequences to the cell, an outcome that is accelerated by
genotoxic stimulus.
BYBM23
PROTEIN PALMITOYLATION AND HOST-CELL INVASION IN Toxoplasma gondii
Marina C Caballero, Maria M Corvi
IIB-INTECH, CONICET-UNSaM, Chascomús, Buenos Aires, Argentina.
E-mail: [email protected]
As most parasites belonging to the phylum Apicomplexa, Toxoplasma gondii is an obligate
intracellular organism, which implies that host-cell invasion is a fundamental process for
parasite's survival and propagation. This process comprises a series of highly coordinated
steps which involves the sequential secretion of the contents of micronemes and rhoptries
(apical organelles characteristic of the phylum). Besides, protein palmitoylation, the
addition of palmitate (C16:0) to a cysteine residue, has been extensively proven in T.
gondii. Moreover, experiments performed by our group using 2-bromopalmitate- a global
inhibitor of protein palmitoylation- showed that host-cell invasion (among other vital
processes) was affected by this lipid modification. For this reason, while working on the
development of T. gondii's palmitoyl-proteome, we decided to explore more specifically
which proteins involved in host-cell invasion were subject to palmitoylation. Here we
present experimental confirmation that many of essential proteins involved in the
attachment-invasion machinery, are indeed palmitoylated. Further studies to unveil the
BIOCHEMISTRY & MOLECULAR BIOLOGY
55
influence of this modification on the invasion process itself are underway, since most of the
identified rhoptry proteins are kinases specific of T. gondii which turns them into interesting
therapeutic targets.
BYBM24
ESTUDIO FUNCIONAL Y DE LA REGULACIÓN DEL TRANSPORTADOR DE PROLINA
DE Trypanosoma cruzi
Melisa S Martínez Sayé, Chantal Reigada, Fabio Di Girolamo, Mariana R Miranda,
Claudio A Pereira
Laboratorio de Parasitología Molecular (LPM), Instituto de Investigaciones Médicas (IDIMCONICET).
E-mail: [email protected]
En tripanosomátidos, la prolina es un aminoácido esencial dado que constituye una fuente
de carbono y energía alternativa a la glucosa. Adicionalmente, en Trypanosoma cruzi se
ha demostrado que la prolina confiere resistencia ante estrés osmótico y que sustenta la
invasión celular en tripomastigotes metacíclicos y la progresión del ciclo intracelular en el
pasaje de epimastigotes intracelulares a tripomastigotes. Asimismo se ha establecido que
la acumulación de prolina libre intracelular constituye un mecanismo de resistencia a
estrés oxidativo. En nuestro laboratorio hemos generado una cepa transgénica de T. cruzi
que sobre-expresa el transportador de prolina Tc069 (pTREX-Tc069), y hemos
demostrado, no sólo que transporta más prolina que la cepa control, sino que además una
mayor tasa de transporte se traduce en mayores niveles intracelulares de prolina libre.
También hemos evaluado la respuesta de estos parásitos ante situaciones de estrés
oxidativo y su respuesta al tratamiento con las dos drogas tripanocidas disponibles, y
hemos reportado que los parásitos Tc069 presentan mayores IC50s que los parásitos
control. Actualmente estamos estudiando la regulación del transportador de prolina en los
parásitos Tc069. Hemos observado que la tasa de transporte varía a lo largo del
crecimiento del cultivo, presentando un pico de máxima velocidad al inicio de la fase
logarítmica, y que luego decae a valores nulos al alcanzarse la fase estacionaria.
Asimismo hemos evaluado la expresión de la proteína recombinante y su localización
subcelular mediante un “flag” durante todo el cultivo y, en concordancia con el transporte,
hemos observado que también varían de manera similar al transporte. Estos resultados
indicarían que el transporte de prolina se ve influenciado por el estado metabólico de los
parásitos, y además, se estaría evidenciando una regulación proteica post-traduccional
que llevaría a la degradación del transportador de prolina y no sólo a su inactivación.
BYBM25
SEARCHING FOR HUMAN GENETIC POLYMORPHISMS
CONGENITAL TRANSMISION OF CHAGAS DISEASE (CTCD)
ASSOCIATED WITH
Natalia A Juiz(1), Nelly M Cayo (2), Jacqueline Búa(3), Julio R Nasser(4), Silvia A Longhi(5),
Alejandro G Schijman(6)
(1)(5)(6)
INGEBI-CONICET. (2)Instituto de Investigaciones en Enfermedades Tropicales. Sede
Regional Orán. Universidad Nacional de Salta. CONICET. (3)Instituto Nacional de
BIOCHEMISTRY & MOLECULAR BIOLOGY
56
Parasitología (INP) Dr. M. Fatala Chaben, Paseo Colón 568 (1063), Administración
Nacional de Laboratorios e Institutos de Salud (ANLIS) Buenos Aires, Argentina..
(4)
Laboratorio de Química Biológica. Facultad de Ciencias Naturales. Universidad Nacional
de Salta. .
E-mail: [email protected]
Placental alkaline phosphatase (PLAP) has been proposed as one of the receptors used
by T. cruzi for placental invasion. Its encoding gene presents functional alleles: rs2014683
(A>G, decreases transcriptional activity) and rs1048988 (G>C associated with lower
enzyme activity). Another placental expressed enzymes are the metalloproteinase 2
(MMP-2) and 9 (MMP-9) which degrade and remodel specific components of the
extracellular matrix, and thus play a fundamental role in placental infections. It has been
reported that T. cruzi infection increases MMP-2 and MMP-9 basal expression and activity
in human chorionic villi explants. Some functional polymorphisms in these gene promoters
are: rs243865 and rs2285053 (C>T, display a lower promoter activity in MMP-2 gene);
rs3918242 (C>T enhances MMP-9 transcriptional activity) and rs2234681 (dCA repeat in
MMP-9, high repetition number is associated with high promoter activity). Our aim was to
compare the frequency of the above mentioned polymorphisms in DNA samples extracted
from peripheral or umbilical cord blood collected from congenitally infected (CI, N = 88)
and non-infected (NCI, N=103) children born to seropositive mothers. DNA was used for
sequencing, and specific High Resolution Melting Analysis (HRMA) was designed for each
polymorphism. This novel strategy was performed using the Type-it HRM PCR Kit
(Qiagen, USA) and PCR cycling/HRMA on the Rotor-Gene 6000™ Real Time cycler. Out
of the tested polymorphisms, only MMP-2 rs2285053 showed significant differences, being
the T allele (p=0,032), as well as the T/T genotype (p=0,018) more represented in the CI
group than in the NCI group, suggesting its association with congenital transmission.
Future gene expression studies of these allelic variants in placental samples from
transmitting and non-transmitting women will allow demonstrate if lower MMP-2 level of
expression is associated to a higher risk of transplacental transmission.
BYBM26
ASSOCIATION STUDY OF HUMAN SINGLE NUCLEOTIDE POLYMORPHISMS (SNPS)
WITH CHRONIC CHAGAS CARDIOMYOPATHY (CCC) IN ARGENTINIAN
POPULATION
Natalia A Juiz(1), Daniel O Hernández(2), Yohana Sappa Figueroa(3), Silvana Dellamea (4),
Raúl H Lucero (5), Silvia A Longhi(6), Clara I González(7), Alejandro G Schijman(8)
(1)(6)(8)
INGEBI-CONICET. (2)Consultorio de "Abordaje Integral del paciente con Enfermedad
de Chagas-Mazza" de la Facultad de Medicina de la Universidad Nacional del Nordeste.
(3)(4)
Cátedra de Parasitología de la Carrera de Bioquímica de la Facultad de Ciencias
Exactas de la Universidad Nacional del Nordeste. (5)Laboratorio de Biología Molecular,
Instituto de Medicina Regional-Universidad Nacional del Nordeste, Resistencia, Chaco,
Argentina. (7)Molecular Immunology and Epidemiology Group, GIEM, Facultad de Salud,
Universidad Industrial de Santander, Bucaramanga, Colombia..
E-mail: [email protected]
Several studies have proposed different genetic markers as chemokines and cytokines
genes for susceptibility to develop CCC. In particular, these studies have focused on
BIOCHEMISTRY & MOLECULAR BIOLOGY
57
SNPs, the most represented type of polymorphisms in the human genome. Despite the
level of complexity and heterogeneity of the populations, many genes may be involved,
each one making a small contribution. For this reason, an appropriate approach for this
problematic is to study a large number of SNPs in individuals sharing a genetic
background. The aim of our work was to analyze functional promoter SNPs inTNFR1B
(rs976881, rs1061624 and rs3397), CCR2 (rs3138042) and CCR5 (rs2856758,
rs2734648, rs1799987, rs1799988, rs41469351, rs1800023 and rs1800024) genes and
their association with CCC in Argentinean populations from high endemicity areas for
Chagas Disease. SNPs were determined by TaqMan® 5´ allelic discrimination assay
method in 199 seropositive individuals (Asymptomatic patiens, N=132; CCC, N=67)
belonging to Wichi and Creole populations. We found statistically significant differences in
genotypic frequencies of two CCR5 SNPs (rs1799987 and rs1799988), when both groups
of patients were compared. We also observed that mutant alleles in rs976881 (TNFR1B),
rs2734648, rs41469351 and rs1800023 (CCR5) were more represented in CCC patients.
Moreover, some CCR2/CCR5 haplotypes with a higher prevalence in CCC patients may
confer susceptibility to cardiopathy development. However, we detected differences
between Creole and Wichí allelic frequencies when these populations were taken
separately. These data are consistent with a previous study that showed although Wichí
and Creoles share a same geographical area, these sympatric populations are
differentiated from the genetic point of view. This analysis showed that only the CCR5
SNP rs41469351 maintained its significance in Creole population (paj=0.032), while
among Wichí individuals the T allele was not represented.
BYBM27
POSIBLE ROL DE LA ALDO-CETO REDUCTASA DE Trypanosoma cruzi(TCAKR) EN
LA ACTIVACIÓN DEL BENZNIDAZOL Y SU MODO DE ACCIÓN TRIPANOCIDA
Patricia Andrea Garavaglia(1), Joaquín J. B. Cannata(2), Gabriela Andrea García(3)
INP . (2)IIB-INTECH, UNSAM-CONICET. CEFYBO, Facultad de Medicina-UBA.
E-mail: [email protected]
(1)(3)
El Benznidazol (Bz) es un compuesto nitro-heterocíclico que debe ser reducido para
activarse y ejercer su efecto citotóxico. Si bien esta droga se ha utilizado desde los años
60 para el tratamiento de la enfermedad de Chagas, su mecanismo de acción no ha sido
totalmente dilucidado. Hasta el momento, la nitroreductasa tipo I, especifica para NADH,
es la única enzima descripta de T. cruzi involucrada en la activación del Bz. Sin embargo,
varios trabajos sugieren la participación de otras reductasas. Nuestro grupo identificó y
caracterizó una aldo-ceto reductasa, NADPH dependiente, de T. cruzi (TcAKR) que posee
actividad de AKR y de quinona-oxido reductasa, cuya actividad específica en presencia de
Bz como sustrato al utilizar TcAKR recombinante fue de 104.5 nmoles NADPH/min/mg.
Por otro lado, recientemente Trochine y col. describieron que la TcAKR interacciona con
Bz inmovilizado, sugiriendo su participación en la activación de la droga. Con el objetivo
de establecer una posible relación entre la TcAKR y la susceptibilidad al Bz, se evaluó la
expresión de esta enzima por “western blot” y actividad enzimática en dos cepas de
parásitos con diferentes susceptibilidades a esta a droga. La evaluación del Bz sobre
epimastigotes de la cepa Nicaragua (DTU I) y del clon CL Brener (DTU VI) de T. cruzi
mostró un IC50 de 20.8 µM y 10 µM, respectivamente, corroborando que el clon CL
Brener es más susceptible. Por otro lado, la evaluación de la expresión de la TcAKR
BIOCHEMISTRY & MOLECULAR BIOLOGY
58
sobre ambas cepas por “western blot” con un suero anti-TcAKRrec, mostró que el clon CL
Brener posee 1,9 veces más cantidad de TcAKR que la cepa Nicaragua y, en correlación,
la actividad específica evaluada con Bz fue significativamente mayor(20.4 nmoles
NADPH/min/mg en clon CL Brener vs 8.25 nmoles NADPH/min/mg en Nicaragua).
Nuestros resultados demuestran que la TcAKR puede reducir al Bz y además, sugieren
que esta enzima podría participar en el mecanismo de acción tripanocida de dicha droga.
BYBM28
ABIETANE OBTAINED FROM SALVIA CUSPIDATA IS ACTIVE AGAINST T cruzi
Renata M Spina Zapata(1), Esteban Lozano(2), Miguel Angel Sosa(3), Carlos Tonn(4), Diego
Cifuentes(5)
(1)(2)(3)
IHEM-CONICET, UNCuyo. (4)(5)INTEQUI-CONICET, UNSL.
E-mail: [email protected]
T.cruzi is a monoflagellate parasite, responsible for the Chagas` disease, that affects
millions of people in Latinamerica. Since decades, many natural and synthetic compounds
have been tested, but only Benznidazole and Nifurtimox remain as therapeutic agents
against this disease. However, their use is restricted because of the toxic and side effects.
Therefore, the search for new molecules with trypanocidal activity and with low toxicity to
the host cells is required. Terpenoid and derivatives are attractive because they are
abundant in the plant Kingdom and many of them showed activity against various
parasites. In this study, we tested an abietane (12-hydroxy-11,14-diketo-6,8,12-abietatrien19,20-olide) obtained from Salvia cuspidata (Ruiz & Pav. Subsp. gilliesii (Benth) J.R.I.
Wood (Lamiaceae) on the in-vitro growth of T.cruzi (strain Dm28C) and evaluated the
effects on ultrastructure of parasites. Parasites (epimastigotes) were grown for 24-48 h in
the Diamond liquid medium, in the presence or the absence of the compound at different
concentrations. The compound showed to be active against T.cruzi, inhibiting the growth
of parasites at low concentrations (1-10 ug/ml). However, the compound induced low
mortality on parasites at concentrations lesser than 5 ug/ml. In turn, the compound was
non toxic to mammalian cells at the concentrations used. We also observed that abietane
induced an intense vacuolization on parasites, even at 7,5 ug/ml. Further studies should
be done in future to identify the molecular targets on the parasites and the active groups
on the molecule, through chemical modifications. These promising results are a
breakthrough in the search for new molecules that could be used in future as a therapeutic
agent for the Chagas` disease.
BYBM29
REACTIVE OXYGEN SPECIES AND POLY(ADP-RIBOSE)POLYMER GENERATION
DURING CELL INVASION BY Trypanosoma cruzi
Salomé Vilchez Larrea, María L Kevorkian, Mariana Schlesinger, Mirtha M Flawiá, Silvia H
Fernández Villamil
INGEBI-CONICET.
E-mail: [email protected]
BIOCHEMISTRY & MOLECULAR BIOLOGY
59
Poly (ADP-ribose) (pADPr) metabolism has been demonstrated to be important for the
normal progression of the infection cycle of T. cruzi in different host cell lines. Based on
previous results obtained by our group and others, it is possible to hypothesize that cell
invasion by T. cruzi leads to the production of reactive oxygen species (ROS) and the
trigger of an inflammatory response. Generated ROS also cause DNA damage, which
would in turn activate PARP-1, NFκB and cytokine expression. Up to date, we have proven
that infection levels in Vero cells is diminished by the presence of Olaparib, a PARP-1
inhibitor, or DEA, a PARG inhibitor and that this is observed when using two different T.
cruzi strains: CL Brener, of low infectivity, and Tulahuen II, a more aggressive strain. The
use of a more specific PARG inhibitor, RBPI-5, corroborated the result obtained, indicating
that the observed outcome is due to the specific absence of PARG activity. Using
fluorescent probes, the formation of ROS in the cytoplasm of the cell after infection by
trypomastigotes was seen and the generation of pADPr, both in the nuclei of intracellular
amastigotes and in the cytoplasm of the host cell in the vicinity of these replicative forms,
could also be detected, probably as a response to the action of ROS. Nevertheless, both
PARP-1 and PARG remained in the nucleus of the host cell during the infection process.
This could indicate that the cytoplasmatic pADPr observed would be synthesized by
PARPs other than PARP-1, being Tankyrase a good candidate for this, a possibility to be
studied by the use of specific inhibitors of this enzyme. The formation of pADPr in the host
cell nucleus and its relationship to NFκB activation should be further investigated.
BYBM30
CANONICAL H2BA HISTONE DIMMERIZES WITH H2A.X IN AN OPPOSITE GENOMIC
LOCALIZATION TO H2A.Z/H2B.Z DIMMERS IN Toxoplasma gondii
Silvina S Bogado(1), Maria C Dalmasso(2), Agustina Ganuza(3), Kami Kim(4), William J
Sullivan(5), Sergio O Angel(6), Laura Vanagas(7)
(1)
Laboratorio de Parasitología Molecular, IIB-INTECH, CONICET-UNSAM. (2)Scientific
Research Comission (CIC, Buenos Aires). (3)(6)(7)INTECH. (4)3Department of Microbiology &
Immunology, Albert Einstein College of Medicine, Bronx, New York, USA. (5)Department of
Pharmacology & Toxicology, Indiana University School of Medicine,.
E-mail: [email protected]
Toxoplasma gondii is a protozoan obligate intracellular parasite belonging to the Phylum
Apicomplexa. In human T.gondii has two stages able to interconvert: tachyzoites and
bradizoites. The epigenetic control during this interconvertion, including post-translational
modifications (PTMs) of histones as well as histone variant replacement, has been
proposed as a central player in the regulation of gene expression in apicomplexan
parasites. In order to complete the nucleosome composition of T. gondii histone variants,
in this work the recombinant histone rH2Ba was generated and used to obtain specific
antibody. With such tool we were able to characterize and analyze the interactions of
H2Ba with the other variants in the nucleosome conformation. The histone H2Ba of
Toxoplasma gondii was expressed as recombinant protein (rH2Ba), and used to immunize
a mouse. It was demonstrated that the obtained αH2Ba is highly specific for rH2Ba and
detects a single band in total tachyzoite lysate of the expected molecular weight (12 kDa).
By indirect immunofluorescence (IFA) in in vitro grown tachyzoites and bradyzoites, the
signal was detected only in the nucleus. The nucleosome composition of H2Ba was
determined by co-immunoprecipitation assays, where histone H2Ba was detected in the
BIOCHEMISTRY & MOLECULAR BIOLOGY
60
same immunocomplex as H2A.X, but not with H2A.Z. Through chromatin
immunoprecipitation (ChIP) assays and QPCR it was observed that H2Ba is located at
promoters of inactive genes and silent regions, accompanying H2A.X, and opposed to
H2B.Z. According to the results in this work, completing our previous findings, it is clear
that T. gondii has a particular nucleosome composition.
BYBM31
SCREENING OF PUTATIVE Toxoplasma
SEQUENCES BINDING PROTEINS
gondii
TELOMERIC
ASSOCIATED
Susana M Contreras(1), Maria C Dalmasso(2), Bin Deng(3), Sergio O Angel(4)
IIB INTECH. Laboratorio de Parasitología Molecular. Av. Intendente Marino 8200.
(2)
Fundacion Instituto Leloir. Laboratorio de Amiloidosis y Neurodegeneracion. Av.
Patricias Argentinas 435. C1405BWE o 1405, CABA. (3) University of Vermont. Vermont
Genetics Network Proteomics Facility. 337 Marsh Life Science Building 109 Carrigan Drive
Burlington, VT 05405.
E-mail: [email protected]
(1)(4)
The Telomeric Associated Sequences (TAS) are heterochromatic regions that have an
important role on regulation of gene expression and cell replication. In Plasmodium
falciparum form clusters within the nucleus that favor rearrangements between var genes.
A recently work of our lab has identified and partially characterized these regions in 9 of 14
chromosomes of T. gondii (TgTASL). These subtelomeric regions have approximately 30
kb and are organized by three Telomeric Associated Repeat Elements (TARE 1-3).
TgTASLs are flanked by a novel T. gondii specific gene (tsf) family whose function is
unknown. In order to identify putative TgTASL binding proteins (TgTASL-BP), we perform
a pulldown assay with biotinylated sequences of 2000bp, between TARE1 and TARE3,
using nuclear proteins from intracellular tachyzoites. As control we used a biotinylated
plasmid DNA. The composition of the parasite lysate was determined by WB, resulting in
80% of nuclear proteins. Pulled down proteins were electrophoresed in SDS-PAGE and
those bands that were present in the TgTASL lane but not in the control were analized by
mass spectrometry. About 50 proteins were identified; 48, 5% of which were nuclear,
23,5% of the surface, 16% cytosolic, 10% ropthry/micronemes/dense granules, and 2%
mitochondrial. Concerning nuclear proteins putative TgTASL-BP Alba, AP2 transcription
factors, histone acetyltransferase, metiltransferases, RNA binding proteins, hypotetical
proteins, among others, were found. All nuclear putative TgTASL-BP sequences were
used to find the P. falciparum orthologues and on the basis of Y2H Pf Protein-protein
interaction (PPI) database we generated a putative TgTASL-BP PPI network. Some of
these putative TgTASL-Bps were chosen for further characterization.
BYBM32
INSIGHTS INTO RESPONSES TO STRESS CONDITIONS MEDIATED BY ADENOSINE
NUCLEOTIDES IN Trypanosoma cruzi
BIOCHEMISTRY & MOLECULAR BIOLOGY
61
Tamara Sternlieb, Alejandra C Schoijet, Mirtha M Flawiá, Guillermo D Alonso
INGEBI (CONICET-UBA).
E-mail: [email protected]
Cyclic adenosine monophosphate (cAMP) is a key second messenger in several metabolic
pathways. In Trypanosoma cruzi it was found to participate in proliferation, differentiation
and osmoregulation. Here we explore the role of cAMP in the responses to oxidative and
nutritional stress in T. cruzi epimastigotes. To determine the role of cAMP in oxidative
stress, we established an optimal work concentration of hydrogen peroxide of 150 µM,
which presents a moderate effect, allowing the recovery of the parasites’ normal growth 24
h later. Our results suggest a possible protective effect of cAMP analogs (Dibutyryl-cAMP
and 8-Bromoadenosine 3′,5′-cyclic monophosphate) over the stress produced. We will
continue analyzing this effect using Phosphodiesterases (PDEs) and Adenylate cyclase
inhibitors. Currently, we are working to identify which PDE is involved in this response. In
addition, and to deepen our research on stress responses in T. cruzi, we are studying the
AMP-activated protein kinase (AMPK). This heterotrimeric enzyme is involved in
maintaining energy homeostasis in response to nutrient stress in many organisms. The α
subunit contains a kinase domain as well as a regulatory domain that inhibits the enzyme
in the absence of AMP. The β subunit acts as a scaffold for the other components, while
the γ subunit is thought to be involved in AMP binding. We have already identified the
genes corresponding to β and γ subunits in T. cruzi and both have been cloned into
vectors for E. coli and epimastigotes expression. Furthermore, AMP binding assays will be
performed using the purified recombinant β subunit. Finally, to investigate the role in vivo
of this enzyme, parasites will be transfected with both genes, and their product activity will
be evaluated using synthetic activators. Taken together, our results unveil an unknown
role for cAMP as a protective regulator against oxidative stress in T. cruzi and point to
identify potential components of these signaling pathways.
BYBM33
EPIGENETIC REGULATION OF GENES IMPLICATED IN ADHESION TO HOST CELLS
IN Trichomonas vaginalis
Tomás Pachano, Fernando Villarruel, Ayelén Lizarraga, Verónica M Coceres, Pablo H
Strobl-Mazzulla, Natalia de Miguel
IIB-INTECH.
E-mail: [email protected]
Trichomoniasis, caused by the flagellated protozoan Trichomonas vaginalis, is the most
common non-viral sexually transmitted infection. Adhesion to the host epithelial cells is an
essential step for the survival of this extracellular parasite and the process of
pathogenesis. Surface proteins implicated in adhesion to mucosal epithelial cells were
shown to be differentially expressed in pathogenic and non-pathogenic strains.
Understanding the mechanisms involved in the control of genes related to pathogenesis
and host cell adhesion could assist in the development of new therapeutic strategies.
However, regulation of gene expression and the epigenetic influence in this parasite are
poorly understood. To elucidate the existence of histone modification possibly implicated in
the transcriptional regulation of genes associated with T. vaginalis pathogenesis, we
performed an immunofluorescence assay using antibodies against histone epigenetic
BIOCHEMISTRY & MOLECULAR BIOLOGY
62
marks. Histone modifications associated with active (H3Kac and H3K4me3) and
repressive (H3K9me3 and H3K27me3) chromatin states were found in the pathogenic
strain B7268 and non-pathogenic strain G3. In vivo chromatin immunoprecipitation assays
followed by qPCR on these parasite strains reveal an association between repressive and
permissive histone modifications and the expression of genes implicated on the parasite
attachment to human host cells.
BYBM34
CONGENITAL INFECTION OF Toxoplasma gondii AND Trypanosoma cruzi:
HISTOPATHOLOGICAL AND HISTOCHEMICAL ANALYSIS OF EX VIVO INFECTED
HPCVE
ULRIKE KEMMERLING KEMMERLING, Christian Castillo, Priscilla Figueroa, Ana Liempi,
Daniel Droguett, Norbel Galanti, Juan Diego Maya
Instituto de Ciencias Biomédicas, Facultad de Medicina, Universidad de Chile.
E-mail: [email protected]
Trypanosoma cruzi (T. cruzi; phylum Euglenozoa) and Toxoplasma gondii (T. gondii,
Phylum Apicomplexa) are two parasites, which may cross the placental barrier and infect
the fetus. We have previously shown that T. cruzi induces severe tissue alteration in
human placental chorionic villi explants (HPCVE), particularly in the extracellular matrix
(ECM). Considering, that T. gondii presents a higher transmission rate than T. cruzi, our
aim was to determine weather that parasite induces similar or more severe
histopathological changes in ex vivo infected HPCVE. HPCVE, obtained from healthy
women with uncomplicated pregnancies, were incubated with T. cruzi (strain Ypsilon; 106
parasites/ml) or different concentrations of T. gondii (strain RH; 103-106 parasites/ml)
during 6 or 24 hours. Histopathological analysis was performed in haematoxylin-eosin (HE) stained samples, while ECM alterations were determined by analysis of carbohydrate
rich molecules (periodic acid-Schiff) and collagen histochemistry (Picrosirius red–
hematoxylin). Effective infection was tested by immunohistochemistry (anti-flagellar
calcium-binding protein (T. cruzi); anti-histone 2HBv (T. gondii)) and PCR. A very low
concentration of T. gondii (103 parasites/ml) induces similar tissue alterations as high
concentration of T. cruzi (106 parasites/ml). Moreover, histopathological changes were
evidenced earlier in T. gondii infected HPCVE than in T. cruzi infected ones. T. gondii
parasites were easily identified by immunofluorescence. Contrarily, only a few parasite
antigen of T. cruzi were evidenced by the same methodology. We conclude that T. gondii
is more effective in destroying the placental barrier than T. cruzi; which is in concordance
with the higher transmission rate of this parasite. Financed by FONDECYT Grants
Nº1120230 (UK), Nº 1130189 (JM), Nº1130113 (NG) and CONICYT/MINCYT 2011-595
(UK).
BYBM35
HISTONE DEACETYLATION INHIBITION AND ACTIVATION AFFECTS Trypanosoma
cruzi REPLICATION, DIFFERENTIATION, INFECTIVITY AND GENE EXPRESSION
BIOCHEMISTRY & MOLECULAR BIOLOGY
63
Vanina A Campo
Instituto de Investigaciones Biotecnológicas “Dr. Rodolfo Ugalde” (IIB-INTECH).
Universidad Nacional San Martín (UNSAM), Campus Miguelete, Av. 25 de Mayo y
Francia, San Martín, Buenos Aires, Argentina..
E-mail: [email protected]
Introduction: Histones acetylation, mediated by histone acetyl transferases (HATs) and
Histone deacetylases (HDACs) enzymes, is one of the most studied factors affecting gene
expression. However, whether these enzymes affect gene expression in the human
parasite T. cruzi has not been yet explored. In this study, four HDACs inhibitors and one
activator for sirtuin deacetylases were used in order to assess their effect on the biology of
the CL Brener strain from T. cruzi. Methodology: HDACs inhibitors (HDACis) Trichostatin
A, Apicidin, Sirtinol and Nicotinamide and the activator Resveratrol were used on infective
and proliferative forms of the parasite. Western blot analysis using anti-acetylated H4
antibodies was performed to show changes in the amount of acetylated histones produced
by these drugs. Changes on the abundance of specific transcripts involved in cell cycle,
differentiation, chromatin association and histone acetylation were analyzed by real time
PCR. Results: All HDACis produced enrichment on acetylated histones while the opposite
effect was observed with the activator Resveratrol on both proliferative and infective forms.
Apicidin and Sirtinol caused changes of more than two fold on trypomastigotes transcript
levels. Also, this study describes for the first time the effect of Resveratrol on T. cruzi
biology. This drug killed epimastigotes, reduced infectivity of trypomastigotes and inhibited
differentiation and/or replication of intracellular amastigotes. Conclusions: HDACis
differentially affected transcripts levels and showed stage specific anti-parasitic effects,
being inhibition of differentiation to infective forms by Apicidin and Trichostatin A the most
important. Also, sirtuins activation by Resveratrol caused stronger anti-parasitic effects
than the inhibition, making this drug an interesting candidate for further studies and sirtuins
promising targets for development of therapeutic drugs.
BYBM36
CHARACTERIZATION OF ECTOSOME-LIKE VESICLES RELEASED BY Trichomonas
vaginalis
Yésica R Nievas(1), Verónica M Coceres(2), Marlene Benchimol(3), Natalia de Miguel(4)
Laboratorio de Parásitos Anaerobios. IIB-INTECH CONICET-UNSAM. Chascomús.
Argentina. (3)Instituto de Biofísica C.C.F.-Universidade federal do Rio de Janeiro.
E-mail: [email protected]
(1)(2)(4)
Trichomonas vaginalis is a common sexually transmitted parasite that colonizes the
human urogenital tract where it remains extracellular and adheres to epithelial cells.
Infections range from asymptomatic to highly inflammatory, depending on the host and the
parasite strain. Here, we report the identification and further characterization of ectosomelike microvesicles (MVs) released by T. vaginalis. "Ectosomes" or "shedding vesicles" are
derived from budding from the plasma membrane and are known to be heterogeneous in
size. As exosomes, ectosomes are considered an universal transport vehicle for
intercellular communication. Both types of MVs can incorporate peptides, proteins, lipids,
miRNA, and mRNA, all of which can be transferred to target cells through receptor-ligand
interactions, fusion with the cell membrane, and delivery of a functional cargo to the
BIOCHEMISTRY & MOLECULAR BIOLOGY
64
cytoplasm of the target cell. In this report, using parasites transfected with a Tetraspanin
(TSP1) fused to an haemaglutinin tag, we identify structures that shed from the plasma
membrane of the parasite; reminiscent to ectosomes released from other types of cells.
Hence, we set up a protocol based on filtration with different pore sizes and
ultracentrifugation to differentially isolate ectosomes and exosomes from parasite
conditioned media. Examination of the preparation by electron microscopy (EM) revealed
vesicles with size ranging 0.1-1 µm in diameter. Using flow cytometry, isolated MVs were
phosphatidil-serine (PS) positive with a size range between 0.5-1 µm diameter, similar as
described for ectosomes in other cells. As mammalian ectosomes, these structures are
enriched in three Tetraspanin proteins (TSP1, TSP3 and TSP8). Moreover, PCR analysis
on isolated MVs of transfected parasites indicated that ectosomes from T. vaginalis can
cargo DNA plasmid. Finally, we demonstrated that plasmid contained in isolated MVs
could be transferred between parasites; suggesting a role in intercellular communication.
BYBM37
LA VÍA AUTOFÁGICA INDUCIDA POR POLIAMINAS DEL HOSPEDADOR ES
REQUERIDA PARA LA AMASTIGOGÉNESIS DE Trypanosoma cruzi EN LA CÉLULA
HOSPEDADORA
Maria C Vanrell(1), Darío Barcazar(2), Carolina Carrillo(3), Patricia S Romano(4)
IHEM-Universidad Nacional de Cuyo. (2)(3)Instituto de Ciencias y Tecnología Dr. César
Milstein - CONICET.
E-mail: [email protected]
(1)(4)
Trypanosoma cruzi, el agente etiológico de la Enfermedad de Chagas; adopta en su ciclo
biológico distintas formas parasitarias que le permiten adaptarse al ambiente en el que se
encuentra. Los epimastigotes (E) presentes en el insecto vector se transforman en
tripomastigotes metacíclicos (TM) que infectan la célula hospedadora y se diferencian a
amastigotes (A) para poder replicarse y continuar con el ciclo. La Autofagia es un proceso
de degradación de componentes intracelulares que participa activamente en los procesos
de remodelación celular. La escasez de nutrientes y la poliamina (PA) espermidina, son
dos inductores fisiológicos de la misma. En trabajos anteriores demostramos que la
autofagia es requerida durante la metaciclogénesis de T. cruzi y que la mayor
disponibilidad de PA favorecía este proceso. En este trabajo estudiamos el rol de la vía
autofágica y de las PA en el proceso de diferenciación intracelular de T. cruzi, proceso
que se inicia en el interior de la vacuola parasitófora (TcPV) formada en las primeras
etapas de infección. En ensayos de diferenciación in vitro, observamos que condiciones
que estimulan la autofagia favorecen el proceso mientras que la presencia de inhibidores
lo reduce significativamente. La formación de amastigotes también se incrementó en
presencia de PA y con la cepa Y-ODC, capaz de sintetizar sus propias PA. Teniendo en
cuenta que la depleción de PA en la célula hospedadora reduce el número de
autofagosomas de la misma y la infección por T. cruzi, medimos el nivel de PA presentes
en una fracción celular enriquecida en autofagosomas en condiciones de inducción o
inhibición de la autofagia observándose un alto contenido de las mismas en comparación
con el control. Concluimos que la autofagia parasitaria participa en la amastigogénesis de
T. cruzi. Este proceso sería probablemente inducido por las PA del hospedador que llegan
al interior de la TcPV por fusión con compartimientos autofágicos.
BIOCHEMISTRY & MOLECULAR BIOLOGY
65
BYBM38
DIFFERENT STRATEGIES FOR PROTEOMIC IDENTIFICATION OF SUMOYLATED
PROTEINS IN Trypanosoma brucei
Paula A Iribarren(1), María A Berazategui(2), Julio C Bayona(3), Triin Tammsalu(4), Ronald T
Hay(5), Juan J Cazzulo(6), Vanina E Alvarez(7)
(1)(2)(3)(6)(7)
Instituto de Investigaciones Biotecnológicas-Instituto Tecnológico de Chascomús
“Dr. Rodolfo A. Ugalde” IIB-INTECH / UNSAM-CONICET. (4)(5)Centre for Gene Regulation
and Expression, College of Life Sciences, University of Dundee, Dow Street, Dundee DD1
5EH, UK.
E-mail: [email protected]
SUMOylation is a post-translational modification involving the covalent attachment of a
small ubiquitin-like protein called SUMO to a variety of proteins. In T. brucei, SUMO
resulted essential for procyclic (PC) and bloodstream (BS) forms. Moreover, there is an
association between SUMO and the expression of the variable surface glycoproteins. The
aim of this work is to compare different strategies for proteomic identification of SUMO
conjugates. We generated different cell lines with SUMO chromosomal tagging that enable
its expression at physiological levels and provide tags for tandem affinity purification of the
conjugates. We obtained parasites with a single and a double replacement of SUMO
alleles, achieving a significant improvement in the yield of the purification of conjugates
compared to SUMO overexpression cell lines. Proteomic analysis of these samples,
however, showed that the proteins in the samples did not differ significantly from the
control. To reduce the purification of contaminants we applied a complementary approach
utilizing Lysine-deficient SUMO (Matic et al., 2010). Specific digestion of the sample with
Lys-C cleaves all proteins but SUMO. Additionally, the introduction of an Arg residue prior
to the GG motif in the C-terminus of SUMO allows to map its acceptor Lys in substrates by
locating lysines modified by SUMO diGly-remnant after a subsequent cleavage of
SUMOylated peptides with trypsin. Meanwhile, since trypsin digestion creates a diGly
signature that can also derive from other Ubls, containing an Arg residue N-terminal to the
GlyGly motif, such as Ubiquitin or NEDD8, we started to work on a new scheme with the
Thr residue prior to GlyGly motif being mutated to Lys. This enables to purify SUMO
modified proteins and enrich for diGly-Lys containing peptides following their digestion with
Lys-C (Tammsalu et al., 2014). This approach allows the identification of SUMOylated
proteins together with their acceptor sites in an unambiguous manner.
BYBM39
TESTING BROMODOMAIN INHIBITORS AGAINST Trypanosoma cruzi: DISCOVERY
OF NEW DRUGGABLE TARGETS
Victoria L Alonso(1), Romina Manarin(2), Julia A Cricco(3), Esteban Serra(4)
Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas - Universidad Nacional de
Rosario. IBR-CONICET. (2)Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas Universidad Nacional de Rosario.
E-mail: [email protected]
(1)(3)(4)
Bromodomains (BrDs) are conserved protein modules capable of binding acetylated
lysines (Kac). They have an atypical four-helix bundle structure connected by two loops
BIOCHEMISTRY & MOLECULAR BIOLOGY
66
that constitute the surface accessible hydrophobic pocket, where the Kac binding site is
located. We previously characterized T. cruzi Bromodomain Factor 3 (TcBDF3), the first
exclusively nonnuclear bromodomain-containing protein reported so far. TcBDF3 is
expressed in all life cycle stages and interacts with acetylated α-tubulin, the major
component of the flagellar and subpellicular microtubules and is essential for T. cruzi
growth. Multiple studies had shown that BrD-containing proteins participate in disease
processes and that they are bona fide drug targets. The GlaxoSmithKline group developed
a bromodomain inhibitor (I-BET151) (Seal et al. 2012) that binds to the hydrophobic pocket
and blocks the recognition of the Kac by mimicking the hydrogen-bonding and hydrophobic
interactions of the native ligand. I-BET151 selectively inhibits human BRD2, which is a
member of the BET (Bromodomain Extra Terminal) family. Selectivity for the BET family is
achieved by making additional contacts outside the Kac cavity. We tested if I-BET-151 had
any effect over T. cruzi epimastigotes and amastigotes in infected Vero cells. Cytotoxicity
(by MTT assays) in this cell line was also evaluated. We were able to determine the IC50
of the compound (≈5µM) in epimastigotes, which is comparable to the IC50 of the
reference drug Benznidazole. On the other hand, we confirmed in vitro that IBET-151 was
able to bind to recombinant TcBDF3 by fluorescence quenching assays and UV-visible
spectra. We also evaluated the effect of ten commercial Bromodomain inhibitors (ApexBio)
in epimastigotes using an automatic cell counter and we determined their IC50 as well.
These results corroborate that T. cruzi bromodomains are chemotherapeutic targets and
open new perspectives for the development of novel drugs against this parasite.
BYBM40
CHRONIC CHAGAS’ DISEASE IN ABORIGINAL COMMUNITIES FROM ENDEMIC
REGION OF ARGENTINA
Raul H Lucero(1), Bettina L Brusés(2), Laura B Formichelli(3), Gustavo J Fernández(4), Daniel
O Hernandez(5), Carolina I Cura(6), Margarita Bisio(7), Alejandro G. Schijman(8)
(1)(2)(3)(4)
instituto de medicina regional-unne. (5)Facultad de Medicina-unne. (6)(8)INGEBI.
(7)
Hospital Ricardo Gutierrez.
E-mail: [email protected]
Chagas’ disease mainly affects rural and neglected populations, such as indigenous
groups, since they are highly exposed to the risk of vectorial transmission. The lack of a
reliable assay to detect and quantify parasitic loads has been an obstacle to deepening
our understanding of the impact of parasite persistence in the natural history of infection
leading to chronic Chagas disease. The aim of our study was to characterize T.cruzi
infection affecting the aboriginal people resident in an area of the Gran Chaco using
molecular tools and associate parasite burden with geographical distribution and clinical
manifestations. Peripheral blood samples from 494 individuals were studied. All
seropositive patients underwent PCR studies for detection of kDNA using a PCR
procedure. Determination of parasitic loads was determined using Real Time quantitative
PCR by Taqman procedure for detection of a 166-bp segment from T. cruzi satellite DNA.
Categorical variables were compared using the χ2 test or the Fisher test. The patients with
cardiac compromise presented higher PCR positivity (Chi2: 46.22, p < 0.05) than
asymptomatic patients. Indeed, out of 44 adult patients with chronic Chagas heart disease,
79.54 % were kDNA-PCR positives, whereas only 16.25% of the 80 tested asymptomatic
adult cases were PCR positives (p: 0,0000000. OR: 20). In accordance with the kDNA-
BIOCHEMISTRY & MOLECULAR BIOLOGY
67
PCR findings, the parasitic loads were higher among patients with cardiac disease in
comparison with the parasitic loads obtained in samples from asymptomatic patients (p:
0.0229).The higher proportion of PCR positivity and higher parasitic loads among chronic
patients with clinical symptoms suggest a role for parasite persistent infection in
stimulating disease progression. Evidences regarding the role of parasite persistence in
triggering tissue damage and clinical progression are in accordance with the existence of
associations between higher parasitic burden and cardiac disease in exposed populations.
BYBM41
CHARACTERIZATION OF Trypanosoma cruzi’s SIRTUINS
Carla Ritagliati, Victoria L Alonso, Romina Manarin, Esteban C Serra
IBR-CONICET.
E-mail: [email protected]
Trypanosoma cruzi is the protozoan pathogen responsible for Chagas disease, which
affects 8 million people and causes nearly 14,000 deaths worldwide. Current therapies rely
on a very small number of drugs, most of which are inadequate because of their severe
host toxicity. To determine efficient therapeutic alternatives, the identification of new
biotargets is essential. Class III KDACs, sirtuins, are highly conserved from Archaea to
higher eukaryotes, and they have been recently considered as promising targets for the
development of new treatments for Chagas disease. Genes encoding three Sir2 related
proteins (SIR2RPs) were found in the TriTryps. SIR2RP1 from several Leishmania species
and all three from T. brucei were characterized. T. cruzi lacks SIR2RP2, and nothing is
known about the other two. Here, we report the first characterization of the T. cruzi sirtuins.
Members of this family share a core domain of ~250 amino acids that exhibits 25-60%
sequence identity between different organisms. SIR2RPs lack the N-terminal portion,
required for nucleolar localization in ScSir2, but they contain a complete catalytic domain.
To study the expression of TcSIR2RPs, antibodies were raised in rabbit against the
recombinant proteins and used in western blot and immunofluorescence analysis. We also
cloned the sirtuins with an HA tag in the pTcIndex-GW plasmid, which allows inducible
expression in T. cruzi, and transfected Dm28 pLew epimastigotes. The expression of
these constructs after Tetracycline addition, was tested by WB and IF analysis using antiHA antibodies, no leaky expression was observed in the un-induced cultures. We
monitored the effect of sirtuins overexpression on epimastigote growth by counting cell
numbers daily, on in vitro metacyclogenesis and on mammalian cell infection.
Furthermore, we tested the effect of Nicotinamide treatment in Dm28c wt, un-induced and
induced Dm28 pTcIndex-TcSIR2RP1 and Dm28 pTcIndex-TcSIR2RP3.
BYBM42
THE TWO ISOFORMS OF RIBULOSE 5-PHOSPHATE EPIMERASE PRESENT IN
Trypanosoma cruzi
Soledad Gonzalez, Dante Maugeri, Juan José Cazzulo
Instituto de Investigaciones Biotecnológicas Dr. Rodolfo Ugalde .
E-mail: [email protected]
BIOCHEMISTRY & MOLECULAR BIOLOGY
68
Ribulose 5-Phophate Epimerase (RPE) is an enzyme of the non oxidative branch of the
Pentose Phosphate Pathway (PPP) that catalyses the interconversion of two
phosphorylated pentoses: ribulose 5-phosphate and xylulose 5-phosphate. The
importance of PPP is given by its implication in the protection of the parasite against the
oxidative stress, because it is one of the major sources of the reduced coenzyme NADPH
needed to maintain reduced the trypanothione, a molecule that plays a crucial role in
intracellular thiol-redox balance in Trypanosoma cruzi. The genome of the CL Brener clone
of T.cruzi contains two genes encoding RPEs with an identity of 52%; one of them (RPE2)
predicts a PTS1 glycosomal targeting signal (SHL) at the C-terminus. The aim of this work
was to perform the kinetic characterization and go into detail about the subcellular
localization of the two RPE isoforms. To accomplish this, we cloned, expressed, and
purified both RPEs as active enzymes which were used to determine the kinetic
parameters. Both isoforms showed Michaelian behaviour, but the catalytic efficiency of
RPE1 was two orders of magnitude higher than that of RPE2. For both isoforms the
optimal pH with Ru5P as the substrate was 7.5. We performed denaturing SDS-PAGE
analysis of both purified RPEs, which gave apparent molecular masses of 27 kDa for
RPE1 and 28 kDa for RPE2. Superdex 75 gel filtration showed that both RPEs are
oligomeric, with two active protein peaks for RPE1 and one for RPE2; in both cases there
were only traces of the monomer.
BYBM43
TbRRM1 SILENCING LEADS TO DNA SYNTHESIS IMPAIRMENT AND DISTURBS
NORMAL CELL CYCLE PROGRESSION IN PROCYCLIC Trypanosoma brucei
Gabriela V Levy, Carolina P Bañuelos, Analía G Níttolo, Valeria S Tekiel, Daniel O
Sánchez
Instituto de Investigaciones Biotecnológicas "Rodolfo Ugalde" IIB-INTECH, UNSAMCONICET.
E-mail: [email protected]
TbRRM1 is an essential RNA binding protein from T. brucei which belongs to the SRrelated protein family. Previous studies from our lab indicated that TbRRM1 RNAi
knockdown in procyclic cells disturbed normal cell cycle progression by arresting cells at
G1 phase 24h post-RNAi induction, with the concomitant emergence of nozzled parasites
which present an abnormal posterior cell end elongation. Here, we provide evidence that
after TbRRM1 silencing DNA synthesis was severely compromised since BrdU
incorporation dropped ~50% after 2 days of RNAi induction. Analysis of cell viability, using
Rhodamine 123 and propidium iodide, showed that the number of viable cells decreased
significantly only after 72h of RNAi induction, indicating that early DNA synthesis
impairment is a primary effect caused by TbRRM1 ablation and not a consequence of
parasite death. Nucleus-kinetoplast (NK) configuration studies showed that after TbRRM1
depletion, parasites with misplaced 2N2K arose along with 2N1K and 0N1K aberrant
populations, indicating a disturbed mitotic or post-mitotic phase. Moreover, the nozzled
parasite group presented an enrichment of the one nucleus-one elongated kinetoplast
(1N1K*) configuration suggesting that kinetoplast segregation might be also affected. As
shown previously, Annexin-V and cell-cycle analysis results indicated that TbRRM1
silencing led to programmed cell death. Here, we show that after TbRRM1 RNAi induction
the cell population with reduced mitochondrial membrane potential increased significantly,
BIOCHEMISTRY & MOLECULAR BIOLOGY
69
supporting the notion that cell death is mediated through an apoptotic mechanism.
Altogether, our results indicate that depletion of TbRRM1 leads to DNA synthesis
impairment and both cell-cycle arrest at G1 and disturbance of the mitotic/post-mitotic
phase suggesting that TbRRM1 is involved in cell cycle control and progression, although
its direct or indirect connection to the cell cycle regulation remains to be elucidated.
BYBM44
ANALYSIS OF THE NUCLEAR TRANSLOCATION OF ARGININE DEIMINASE DURING
Giardia DIFFERENTIATION
Gonzalo F Mayol, Natacha Zlocowski, Cecilia Vranych, María C Touz, Andrea Rópolo
Instituto de Investigaciones Médicas Mercedes y Martín Ferreyra.
E-mail: [email protected]
SUMOylation, a posttranslational modification of proteins, is vital in eukaryotic cells. In a
previous work, we analyzed the role of SUMO protein and the genes encoding the putative
enzymes of the SUMOylation pathway in the parasite Giardia lamblia. Although we
observed several SUMOylated proteins, only the enzyme Arginine Deiminase (ADI) was
confirmed as a SUMOylated substrate. During the encystations process, ADI translocates
to the nuclei. The first signal that drives ADI to the nuclei is SUMOylation which probably
exposes nuclear localization signals (NLSs) promoting the entry of the enzyme to the
nuclei. Once inside, ADI acts as a peptidyl arginine deiminase and induces the
downregulation of cwp genes, allowing the encystation process to end. In this work we
found that in trophozoites overexpressing the SUMO protein, ADI is highly observed inside
the nuclei and also the production of cyst is lower than in wild type trophozoites. Moreover,
in immunofluorescence assays, ADI and SUMO co-localize in the nuclear membrane. In
other eukaryotic cells, proteins with NLSs are transported through the nuclear envelope by
a family of transport proteins called karyopherins like importins and exportines. In the
Giardia genome data base, only the importin β-3 subunit (GL50803_15106) is described. It
shows the HEAT domain involved in intracellular transport and contains a domain with
high probability of SUMO interaction. The entire open reading frame of the importin gene
was amplified, cloned in the pTubHA pac vector and sequenced. After stable trophozoite
transfection, immunofluoresce assays were performed. Co-localization studies with the
enzyme ADI and with the SUMO protein are a matter of ongoing experiments. An
important subject for future studies will be to analyze if there is an association of the
SUMOylated form of ADI with importins, or with other cargo proteins, in order to crisscross
the nuclear membrane during Giardia differentiation.
BYBM45
ANALISIS RESTROSPECTIVO DE FROTIS DE PACIENTES DEL NORTE DE SALTA,
MEDIANTE PCR-RFLP, PARA LA IDENTIFICACIÓN DE SUBGÉNEROS DE
Leishmania
Cristina Almazán(1), Gil José F(2), Marco Jorge D(3), Cajal Pamela(4), Portelli Marcela(5),
Juarez Marisa(6), Krolewiecki Alejandro J(7), Barroso Paola A(8), Hoyos Carlos L(9), Nasser
Julio R(10)
BIOCHEMISTRY & MOLECULAR BIOLOGY
70
(1)(4)(6)(7)(10)
Instituto de Investigación de Enfermedades Tropicales (IIET), UNSa- Sede
Regional Orán. (2)Instituto de Investigaciones en Energía no Convencional (INENCO),
UNSa-CONICET. (3)(8)(9)Instituto de Patología Experimental (IPE), UNSa-CONICET.
(5)
Cátedra de Química Biológica, FCN-UNSa.
E-mail: [email protected]
Las leishmaniasis es causada por protozoos del género Leishmania. Se propuso que las
especies circulantes en Salta son de los subgéneros Viannia y Leishmania, habiéndose
reportado incluso infección por Leishmania (Leishmania) infantum en el Dpto San Martín.
El objetivo del trabajo fue identificar, mediante PCR-RFLP, los subgéneros infectantes a
partir de frotis de pacientes con leishmaniasis tegumentaria. Además, se analizó la posible
relación entre los resultados de la PCR-RFLP y diagnóstico microscópico (DM),
Intradermorreacción de Montenegro (IDRM) y tiempo de evolución (TE) de la lesión. Se
analizaron 100 frotis de pacientes diagnosticados en el año 2002 y 2008-2012. Para la
PCR se usaron los primers L5.8S 5’TGATACCACTTATCGCACTT3’ y LITSRn
5’CTGGATCATTTTCCGATG3’ y la digestión de los amplicones por RFLP se hizo con
HaeIII. En la PCR 81 muestras fueron positivas, de estas el 93% (76/81) fue positivo para
la restricción. En la totalidad de los casos, el subgénero identificado fue Viannia. Al
analizar los resultados de PCR-RFLP en función del diagnóstico parasitológico, se vio que
los frotis con DM 3+ tuvieron mayor positividad para la PCR, que aquellos 1+ y 2+ (p0.05).
Con estos resultados pudo observarse que la positividad de la PCR disminuye cuando
hay menor carga parasitaria en las úlceras y cuando existe una mayor respuesta inmune
celular. Si bien es poco probable encontrar L. (L.) infantum en úlceras cutáneas, L. (L.)
amazonensis fue reportada en varias ocasiones aunque no se observaron cuadros de
leishmaniasis difusa. Así, la ausencia de L. (L.) amazonensis y L (L.) infantum en este
estudio, es concordante con los cuadros clínicos atendidos en la zona de estudio.
BYBM46
ANALYSIS OF THE SUBCELLULAR LOCALIZATION OF SNF7 PROTEIN IN
Tritrichomonas foetus
Daniel E Moros Duarte, Lorena Frontera, Natalia de Miguel , Veronica Coceres
IIB-INTECH .
E-mail: [email protected]
Tritrichomonas foetus is the causative agent of tritrichomonosis which is characterized by
infertility, early embryonic death in cows and heifers. The SNF7 protein is member of the
endosomal protein complex (or ESCRT III) evolutionarily conserved, whose components
have been proposed to mediate membrane deformation and fission events during MVB
biogenesis and at the end of cytokinesis . In this context we transfected parasites with the
construct TfSnf7-HA and we analyzed the subcellular localization by immunofluorescence.
Our studies show that the protein TfSNF7 is located in intracellular vesicles present in the
cytoplasm and interestingly in the flagella of transfected parasites and also has been found
in the midbody in cells in division.
BIOCHEMISTRY & MOLECULAR BIOLOGY
71
BYBM47
CHARACTERIZATION OF Toxoplasma gondii TGDJ1 TYPE I HSP40
Jonathan Múnera López, Figueras María J, Fenoy Ignacio, Angel Sergio O
IIB-INTECH, sede Chascomús.
E-mail: [email protected]
The HSP40 proteins, many times called the J family of proteins, lead HSP70 to facilitate
diverse cellular processes like protein folding, protein translocation across membranes,
cellular signal transduction, DNA replication and protein degradation. Little is known about
this HSP40 family in Toxoplasma gondii. Data mining of Toxoplasma database has shown
that this family is quite large and diverse identifying until now 36 members. Among the
Hsp40s, the J protein YDJ1 (Y for yeast) is a cytosolic chaperone able to participate also
in the Hsp90-hetercomplex. Ydj1-like Hsp40s present a particular domain organization: the
N-terminal J domain, a G/F rich region, a zinc finger domain (ZFD) motif containing region,
a DNAJ_C or C-terminal CTD region and a homodimerization region. Based on that, we
found only one Hsp40 that has this domain organization and cytosolic localization
(TGME49_311240) named TgDJ1. The ORF of TgDJ1 was expressed as a recombinant
protein (rTgDJ1) in E. coli, fused to a HIS-tag to enable its purification and posterior
polyclonal antibodies generation in mice. The identity of the recombinant protein produced
was confirmed by mass spectrometry analysis. The TgDJ1 antiserum was able to
recognize a single band of the expected molecular weight (~47-kDa) in T. gondii tachyzoite
lysate showing no cross-reaction with host cell protein extract. The subcellular localization
of TgDJ1 was consistent with a cytosolic labeling in intracellular tachyzoites and
bradyzoites. Based on co-immunoprecipitation (coIP) analysis and Western blot, TgDJ1
may be forming complexes with Hsp90 and Hsp70. CoIP analysis with anti-TgDJ1 on
tachyzoites extract followed by mass spect retrieved near 63 proteins which comprise
several subcellular localizations and biological functions suggesting a broad biological role
for this chaperone in the parasite
BYBM48
HEME IS TRANSPORTED DURING Trypanosoma cruzi REPLICATIVE LIFE STAGES
Lucas Pagura, Marcelo L Merli, Brenda A Cirulli, Jerónimo Borra Beltrán, Julia A Cricco
Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario.
E-mail: [email protected]
Trypanosoma cruzi shows nutritional requirements for different cofactors including heme,
because it cannot synthesize the cofactor. However, it presents many heme-proteins
involved in essential metabolic pathways. T. cruzi must incorporate heme from the
different hosts to supply for the heme-protein pool and also, to serve as iron source.
Several eucaryotic proteins have been assigned as heme transporters (or part of them) but
none of them belongs to T. cruzi. In our laboratory we are interested in elucidate how
heme is imported by T. cruzi, identifying and characterizing the proteins involved. We have
used fluorescent heme analogues (ZnPP, GaPP, ZnMP and SnMP) to study heme
transport in epimastigotes and amastigotes life stages of T. cruzi by confocal microscopy
and direct measurement of fluorescence. We observed that all analogues impaired heme
uptake in epimastigote competing for heme entrance but not all were imported by the
BIOCHEMISTRY & MOLECULAR BIOLOGY
72
parasite. Only the incorporated analogues caused a negative effect on epimastigote
proliferation, because they could not mimic heme functions. Besides, when cells infected
with amastigotes were treated with heme analogues, the fluorescent signal was selectively
detected in amastigotes confirming that heme is transported in this intracellular life stage.
Also, we identified a T. cruzi protein (named TcHR1) that expressed in yeast cells
localized in plasma membrane and enhanced heme incorporation. As conclusion of our
studies, we can postulate that T. cruzi imports heme during the replicative life stages. This
parasite presents a selective protein transporter for heme uptake and the protein TcHR1
might play a relevant role in regulation and/or function of this transporter.
BYBM49
THE GIARDIAL EPSIN-LIKE PROTEIN POSSESS A DUAL EPSIN-EPSINR ROLE IN
CLATHRIN-MEDIATED TRAFFICKING
Constanza Feliziani(1), Nahuel Zamponi(2), Natalia Gottig(3), Adriana Lanfredi-Rangel(4),
Andrea S Rópolo(5), María C Touz(6)
(1)(2)(5)(6)
Instituto de Investigaciones Médica Mercedes y Martín Ferreyra, INIMECCONICET-Universidad Nacional de Córdoba. (3)Facultad de Ciencias Bioquímicas y
Farmacéuticas, Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario, CONICET,
Universidad Nacional de Rosario. (4)Serviço de Microscopia Eletrônica, Centro de
Pesquisas Gonçalo Moniz, FIOCRUZ-BA, Brazil.
E-mail: [email protected]
In the protozoa parasite Giardia lamblia, endocytosis and lysosomal protein trafficking are
vital parasite-specific processes that involve the action of the adaptor complexes AP-1 and
AP-2 and clathrin. In this work, we have identified in Giardia a single gene encoding a
protein containing an ENTH domain, which defines monomeric adaptor proteins of the
epsin family. This domain is present in the adaptors epsin or epsin-related (epsinR)
proteins, which are implicated in the endocytosis and Golgi-to-endosomes protein
trafficking, respectively, in other eukaryotic cells. The main objective of this study was to
functionally characterize GlENTHp (for Giardia lamblia ENTH protein) and determine
whether it might play a dual function working either as epsin or epsinR. We found that
GlENTHp localized in the cytosol and, like epsin, was associated with the alpha subunit of
AP-2, clathrin and ubiquitin, strongly interacted with PI3,4,5P3, and was involved in
receptor-mediated endocytosis. Also, this protein bonded the gamma subunit of AP-1 and
PI4P, and was implicated in ER-to-PV trafficking, like epsinR proteins. Alteration of the
GlENTHp function severely affected trophozoite growth showing an unusual accumulation
of dense material in the lysosome-like peripheral vacuoles (PVs), indicating that GlENTHp
might be implicated in the maintenance of the PV homeostasis. When the ENTH protein
family was analyzed in an evolutionary context, it was suggested that the subfamily of
epsin proteins was acquired more recently probably by duplication of the epsinR. In this
study, we showed evidence that places GlENTHp at the beginning of the whole family,
summarizing the function of epsin and epsinR and suggesting that GlENTHp might be the
epsinR adaptor from which all the family evolves.
BIOCHEMISTRY & MOLECULAR BIOLOGY
73
BYBM50
FUNCTIONAL CONSERVATION OF THE Giardia lamblia EPSIN-LIKE PROTEIN IN
Sacharomyces cerevisiae
Constanza Feliziani(1), Andrea S Rópolo(2), Beverly Wendland(3), María C Touz(4)
Instituto de Investigaciones Médica Mercedes y Martín Ferreyra, INIMEC- CONICETUniversidad Nacional de Córdoba. (3)Department of Biology, Johns Hopkins
University.Baltimore, USA..
E-mail: [email protected]
(1)(2)(4)
Endocytosis and lysosomal protein trafficking is essential in pathogenic parasites since it is
directly linked to vital parasite-specific processes. The epsin N-terminal homology (ENTH)
domain is an evolutionarily conserved protein module found primarily in proteins that
participate in clathrin-mediated trafficking. By searching in the GDB, we found the protein
GlENTHp (for G. lamblia ENTH protein) contains an ENTH domain, which is present in the
epsin or epsinR form and is involved in endocytosis and protein trafficking from the Golgi
to the lysosomes, respectively. Our findings suggest a dual epsin-epsinR role of GlENTHp,
since it was able to bind clathrin, ubiquitin and also interacts with αAP-2 and γAP-1, with
the events of endocytosis and lysosomal hydrolase trafficking being equally affected by
GlENTHp downregulation. There are two homologues of epsin, Ent1p and Ent2p, and two
orthologous of epsinR, Ent3p and Ent5p in S. cerevisiae. ENT1 and ENT2 are two
redundant genes and deletion of both genes (ent1Δent2Δ) is lethal. On the other hand,
strains lacking both Ent3p and Ent5p (ent3Δent5Δ), but not single mutant strains, exhibit
defects in TGN/endosome traffic and protein sorting into the vacuole lumen. Because
many components of the endocytic machinery are structurally and functionally conserved
between eukaryotes, the main objective of this work was to analyze whether GlENTHp
might play a function working as epsin or epsinR (or both) in S. cerevisiae. We found that
GlENTHp was expressed in S. cerevisiae and localized in patches at the plasma
membrane. This expression neither complements the growth in ent1Δent2Δ mutants nor
restores GFP-CPS1 vacuolar protein trafficking defect in ent3Δent5Δ. However, our recent
results suggest that GlENTHp might act as epsinR dominant negative mutant in yeast
cells.
BYBM51
cAMP-EPAC DEPENDENT REGULATION OF Trypanosoma cruzi INVASION
Daniel Musikant(1), Gabriel Ferri(2), Ignacio Durante(3), Carlos Buscaglia(4), Martín M
Edreira(5)
(1)(2)(5)
Departamento de Química Biológica - FCEyN - UBA. (3)(4)Instituto de Investigaciones
Biotecnológicas – Instituto Tecnológico de Chascomús – UNSAM – CONICET.
E-mail: [email protected]
The attachment of infective stages of T. cruzi to the host cell is accompanied by an
increase of intracellular cAMP levels in the host that potentiate the Ca2+ dependent
lysosome-mediated cell invasion by the parasite. In mammalian cells, both cAMP effector
pathways, i.e. PKA and Epac, are involved in Ca2+ triggered exocytic events. However,
the cAMP effectors involved in the process of invasion by T. cruzi are for the moment
unknown. Since Epac-mediated Rap activation is involved in regulated exocytosis in
BIOCHEMISTRY & MOLECULAR BIOLOGY
74
human sperm, insulin secretion and pancreatic amylase release, we hypothesized that the
Epac-Rap1 cAMP pathway might play a functional role during T. cruzi invasion of the host
cell. Using cAMP analogs to selectively activate/inhibit PKA or activate Epac in NRK cells,
we shown that cAMP can induce invasion via specific activation of the Epac-mediated
pathway. In contrast to the stimulatory effects Epac, PKA-dependent signaling had shown
no effect on invasion. Moreover, data showed that PKA might be suppressing the effects
of Epac when both pathways are simultaneously activated, suggesting a crosstalk
between pathways in the regulation of invasion.
BYBM52
A NOVEL Trypanosoma cruzi cAMP EFFECTOR PROTEIN
Jésica Mild, Daniel Musikant, Gabriel Ferri, Bárbara Mc Cormack, Martín M Edreira
Departamento de Química Biológica - FCEyN - UBA.
E-mail: [email protected]
Although cAMP plays an essential role in Trypanosoma cruzi life cycle, the exact
mechanisms of action are unknown. Up to date, Protein Kinase A (PKA) is the only known
T. cruzi cAMP effector, however experimental evidences suggest the existence of other
effectors. In order to identify new cAMP effectors, we carried out in silico studies using the
predicted T. cruzi proteome. As a result, we identified 27 proteins with putative cAMP
binding domains. Within these proteins, we subcloned and characterized the paralogs
proteins TcCLB.508523.80 and TcCLB.507035.110, the two most solid candidates.
Computational models shown that the domain present in these proteins could fold in a
similar manner than other know cAMP effectors. In fact, both proteins could specifically
bind cAMP. Moreover, transgenic T. cruzi epimastigotes expressing TcCLB.508523.80
shown an increased infectivity when incubated with 8-Br-cAMP. Our results indicate that
TcCLB.508523.80 and TcCLB.507035.110 are bona fide cAMP binding proteins that could
act as novel T. cruzi cAMP effectors during host cell infection.
BYBM53
IDENTIFICATION OF A NOVEL FAMILY OF RIBOFLAVIN TRANSPORTERS IN
TRYPANOSOMATIDS
Dario E Balcazar(1), Hernan R Bonomi(2), Claudio Pereira(3), Fernando Glodbaum(4),
Carolina Carrillo(5)
(1)(5)
ICT-Milstein- CONICET. (2)(4)Fundación Instituto Leloir. (3)Instituto de Investigaciones
Médicas Alfredo Lanari.
E-mail: [email protected]
Trypanosomatids Leishmania mexicana, Trypanosoma brucei and Trypanosoma cruzi are
human pathogenic parasites. The current drug treatments are highly toxic, posses limited
efficacy and can generate resistance, thus there is a need to identify targets to develop
new therapies. Riboflavin (Rf), an essential vitamin for all living cells, is the precursor of
the cofactors flavin mononucleotide (FMN) and flavin adenine dinucleotide (FAD)
responsible of a variety of vital cellular reactions. The aim of this work is to determine the
BIOCHEMISTRY & MOLECULAR BIOLOGY
75
molecular basis of the Rf metabolism in trypanosomatids. Our in silico analyses suggest
that trypanosomatids are auxotrophic for Rf because no biosynthetic Rf pathways are
coded in their genomes. We also identified a putative novel transporter family for this
vitamin by bioinformatic studies. Moreover, these studies indicate conservation of twelve
transmembrane regions and an MSF domain (Major Facilitator Superfamily) in all
members of the family. The corresponding transporters for L. mexicana, T. cruzi and T.
brucei were cloned and expressed in an Rf auxothroph E. coli strain, which naturally lacks
of Rf transport activities. We observed that T. cruzi and T. brucei genes were able to
restore bacterial growth in low Rf media suggesting their functionality as flavin transporter.
In vitro experiments with each trypanosomatid showed that the maximum density of
parasites (in growth curves) increases with the concentration of Rf, FMN and FAD. Finally,
overexpression of T. cruzi putative Rf transporter lowers the riboflavin dependency in
culture, achieving higher number of epimastigotes per ml in Rf limited media compared to
the wild-type strain. The putative Rf transporter family we identified in trypanosomatids
would be essential for their survival. This transporter family is different from any other Rf
transporter known to date, particularly the mammalian ones, thus we propose it as a
potential target for the development of trypanocidal therapies.
BYBM54
RIBOFLAVIN UPTAKE: POSSIBLE NEW TRYPANOCIDAL TARGETS
Dario E Balcazar(1), Hernan R Bonomi(2), Cristina Vanrell(3), Patricia Romani(4), Fernando
Goldbaum(5), Carolina Carrillo(6)
(1)(6)
ICT-Milstein- CONICET. (2)(5)Fundación Instituto Leloir. (3)(4)IHEM- Facultad de Ciencias
Médicas- UNCuyo- CONICET.
E-mail: [email protected]
Chagas disease is a parasitosis endemic in Latin-America, caused by infection with a
protozoan, Trypanosoma cruzi. The current drug treatments are highly toxic, possess
limited efficacy and can generate resistance, thus there is a need to identify targets to
develop new therapies. Riboflavin (Rf), an essential vitamin for all living cells, is the
precursor of the cofactors flavin mononucleotide (FMN) and flavin adenine dinucleotide
(FAD) responsible of a variety of vital cellular reactions. Plants, fungi and prokaryotes
synthesize it de novo while metazoans obtain it from their diet. Our previous findings show
that T. cruzi also incorporates Rf through a putative Rf transporter (”RibTCR”), identified by
in silico analyses. The aim of this work was to evaluate the role of Rf in different stages of
the parasite life cycle. Assays performed in T. cruzi epimastigote cultures showed that
flavins stimulate their proliferation (43%) and metacyclogenesis (98%) while Rf chemical
analogues significantly inhibit these processes (50% and 45%, respectively). Moreover,
the proliferative capacity of epimastigotes, reduced by the analogues, was restored by the
addition of high concentrations of Rf, FMN or FAD. Epimastigotes over-expressing
RibTCR improved their proliferative rate in Rf limited media compared with the wild-type
counterpart. The inhibitory effect of Rf analogues in the overexpressing strain was outcompeted by Rf, FMN and FAD more efficiently than in the wild-type strain. Finally,
analogues significantly reduced (25%) the intracellular amastigotes proliferation in
cardiomyocyte monolayer infectivity model, although the infectivity of trypomastigotes was
unaffected. In conclusion, Rf is a key metabolite involved in several relevant biological
processes of the parasite. Our findings suggest that RibTCR is an essential protein
BIOCHEMISTRY & MOLECULAR BIOLOGY
76
involved in development and survival of T. cruzi. We propose Rf metabolism and uptake
as potential anti-chagasic target.
BYBM55
COMPARACIÓN DE LA RESPUESTA HUMORAL INDUCIDA POR LOS LINAJES TCI Y
TCV DE Trypanosoma cruzi AISLADOS DE UNA ZONA ENDÉMICA, EN UN MODELO
MURINO
Miryam A Romano(1), Paula Ragone(2), Julio Nasser(3), Patricio Diosque(4), Rubén Cimino(5)
Cátedra de Química Biológica,FCN,UNSa. (2)(4)Instituto de Patología ExperimentalSalta.
E-mail: [email protected]
(1)(3)(5)
Actualmente se clasifica a Trypanosoma cruzi en 6 Unidades Discretas de Tipificación
(UDT TcI - TcVI); Esta diversidad genética se encuentra relacionada con la variabilidad
biológica observada dentro de este parásito. El objetivo del trabajo fue evaluar la
respuesta humoral inducida por los linajes TcI y TcV, aislados de un área endémica.
Ratones BALB/C hembras de 45 días de edad se infectaron intraperitoneal con 10.000
tripomastigotes metacíclicos de T. cruzi pertenecientes a los linajes TcI y TcV. Se realizó
la detección del parásito en sangre mediante parasitemia desde el día 7 hasta el día 30
post-inoculación y mediante la técnica de PCR a los 15 días post-inoculación (dpi). Se
tomaron muestras de suero a diferentes tiempos de infección, desde el día 7 al día 120,
para estimar títulos de anticuerpos inducidos por cada grupo experimental. Las
parasitemias hasta los 30 dpi fueron negativas en todos los animales infectados tanto en
TcI como TcV; por lo que únicamente se comprobó infección por PCR. Se aplicó la
técnica de ELISA utilizando como antígeno un homogenado de parásitos de T. cruzi (TcI y
TcV). Se plaquearon 1µg/poc/100 mL de antígeno. La dilución de suero fue de 1/100 en
PBS-leche 1%, la de Ac 2º biotinilado y conjugado (avidina-peroxidasa) fueron de 1/2500
y 1/16.000, respectivamente. Evaluando la respuesta humoral se observó que hasta los
20 dpi, no hay diferencias significativas (p>0.05) entre los títulos de anticuerpos en los
ratones infectados con TcI y aquellos infectados con TcV. A partir de los 30 dpi al día 50
post-infección, se observó mayor respuesta humoral en ratones infectados con TcI, en
comparación con los animales infectados con TcV; ya que los títulos de anticuerpos antiTcI fueron de DO=0.80±0.064, mientras que los títulos anti-TcV fueron de DO=0.29±0.15.
Este estudio preliminar de infección en un modelo murino, sugiere que aunque ambos
linajes TcI y TcV presentan una parasitemia sub-patente, inducen diferentes respuestas
serológicas.
BYBM56
ANÁLISIS COMPARATIVO DE LA ESTRUCTURA GENÉTICA POBLACIONAL DE
Trypanosoma cruzi I DEL GRAN CHACO MEDIANTE MICROSATÉLITES, RAPD,
MLST Y SL-IR
Anahí M Alberti DAmato(1), María M Monje Rumi(2), Juan J Lauthier(3), Nicolás Tomasini(4),
Christian Barnabé(5), Martin Llewellyn(6), Paula G Ragone(7), Alejandro Uncos(8), María C
Mora(9), Julio R Nasser(10), Miguel A Basombrío(11), Michel Tibayrenc(12), Patricio Diosque(13)
BIOCHEMISTRY & MOLECULAR BIOLOGY
77
(1)(2)(3)(4)(7)(13)
UNIDAD DE EPIDEMIOLOGÍA MOLECULAR-IPE-UNSA. (5)(12)Institut de
Recherche pour le Développement (IRD), Francia. (6)London School of Hygiene and
Tropical Medicine, UK. (8)(9)(11)Instituto de Patología Experimental (IPE)-CONICET-UNSA.
(10)
Instituto de Investigaciones en Enfermedades Tropicales, Orán, Facultad de Ciencias
Naturales, UNSa.
E-mail: [email protected]
El estudio de la estructura genética poblacional de Trypanosoma cruzi I (TcI) resulta de
interés en cuanto al conocimiento básico y a la epidemiología de la enfermedad de
Chagas. El objetivo de este trabajo fue analizar la estructuración poblacional encontrada
previamente que permitió definir subgrupos de aislados intra-TcI provenientes de la
provincia de Chaco (Argentina) mediante microsatélites y compararla con la estructuración
hallada mediante RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA), MLST (Multilocus
Sequence Typing) y SL-IR (Spliced Leader Intergenic Region). Se examinaron mediante 9
loci de microsatélites 39 stocks de TcI provenientes de 28 hospedadores, y se observó la
existencia de 4 subgrupos. Estas agrupaciones definidas por microsatélites se
contrastaron con aquellas producidas por otros marcadores utilizados por nuestro grupo y
aplicados a los mismos stocks. Se compararon los agrupamientos producidos por RAPD
(32 loci), MLST (10 loci) y por el locus SL-IR. Los resultados indican una concordancia
completa en la asignación de los subgrupos de TcI entre microsatélites y RAPD, lo que
puede explicarse en parte porque ambos responden a la condición de marcadores neutros
frente a la selección. La correspondencia entre microsatélites con MLST y SL-IR fue solo
parcial, mostrando una distribución en mosaico de los grupos definidos por microsatélites
y por los otros marcadores. Consideramos que no es sorprendente que un marcador
como MLST muestre agrupamientos que no concuerdan completamente con
microsatélites, ya que MLST está basado en análisis de genes metabólicos y por tanto
sometido a otro tipo de selección. Asimismo, la concordancia parcial entre microsatélites y
SL-IR, puede estar relacionada con el tipo de evolución de esta región, que posiblemente
está condicionada por la función que desempeña el mini-exón y por los mecanismos que
se han sugerido como responsables de homogeneizar estas secuencias.
BYBM57
TRAFFIC, MEMBRANE DISTRIBUTION AND SHEDDING OF A VIRULENCE FACTOR
OF Trypanosoma cruzi
Andrés Lantos(1), Sayantanee Niyogi(2), Beatriz Araoz(3), Giannina Carlevaro(4), Mariano
Bossi(5), Roberto Docampo(6), Juan Mucci(7), Oscar Campetella(8)
(1)
IIB UNSAM. (2)(6)Department of Cellular Biology and Center for Tropical and Emerging
Global Diseases and University of Georgia, Athens, Georgia.. (3)(5)INQUIMAE.
Departamento de Química Inorgánica, Analítica y Química Física, FCEN-UBA - CONICET.
Buenos Aires, Argentina.. (4)(7)(8)Instituto de Investigaciones Biotecnológicas - Universidad
Nacional de San Martín - CONICET. Buenos Aires, Argentina..
E-mail: [email protected]
trans-Sialidase (TS) is a key virulence factor for T. cruzi, the etiological agent of Chagas
disease. The enzyme is involved in crucial aspects of the parasite’s life cycle and also
generates several abnormalities in the immune system of the infected mammal. TS is a
GPI-anchored protein (GPI-AP) located in the plasma membrane of trypomastigotes,
BIOCHEMISTRY & MOLECULAR BIOLOGY
78
which is shed to the milieu. In this work we follow how TS, as well as other GPI-AP like
mucins and TSSA are delivered to the plasma membrane via the contractile vacuole
complex (CVC) during differentiation of intracellular amastigotes into trypomastigotes. TS
is transported from the CVC to the plasma membrane ushered by the small GTPase
Rab11. Expression of a dominant negative mutant for Rab11 prevents TS from locating to
the plasma membrane and also reduces T. cruzi infection. Infection reduction is rescued
by addition of recombinant TS to the culture medium. In the plasma membrane TS
appears in discrete domains, which are barely separated one from another when observed
under a confocal microscope. To have a better insight of TS distribution we performed
super-resolution (GSDIM) imaging of these domains and have determined that TS
domains are about 50-nm thick and separated by 100 nm from each other in a zig-zag
distribution, validating confocal observations. We evaluated whether TS belongs to
detergent resistant domains (DRDs) and found that they do not given that they are
susceptible to detergent extraction. However other GPI-AP in trypomastigotes, such as
mucins, does belong to DRDs and, correspondingly, does not colocalize with TS in the
trypomastigote’s membrane. In epimastigotes, the stage specific mucins (MW 35-50 kDa)
also belong to DRD and the traffic to membrane is Rab 11 independent. Lastly, TS is shed
to the milieu in exosomes and only appears as a soluble protein after digestion with
recombinant PI-PLC. This finding suggests that there is no functional native PI-PLC in T.
cruzi trypomastigotes.
BYBM58
LA CICLOFILINA A DE Trypanosoma cruzi ES SECRETADA AL MEDIO E
INTERACTÚA CON LA CÉLULA HOSPEDADORA
Alina E Perrone(1), Bustos P(2), Milduberger N(3), Fuchs AG(4), Búa J(5)
INP “Dr. M. Fatala Chaben” A.N.L.I.S.- C.G. Malbrán. (3)INP “Dr. M. Fatala Chaben”
A.N.L.I.S.- C.G. Malbrán. CAECIHS, Universidad Abierta interamericana. (4)(5)INP “Dr. M.
Fatala Chaben” A.N.L.I.S.- C.G. Malbrán. CAECIHS, Universidad Abierta Interamericana..
E-mail: [email protected]
(1)(2)
En Trypanosoma cruzi existe una familia de genes que codifican para proteínas con
actividad chaperona, denominadas ciclofilinas (CyPs). La ciclofilina de 19 kDa (TcCyP19),
homóloga a la CyPA de mamíferos, es una de las isoformas más expresadas del parásito,
de localización citoplasmática. La secreción de las ciclofilinas citosólicas al espacio
extracelular ha sido descripta para células humanas así como también en los parásitos
protozoarios Toxoplasma gondii y Trypanosoma brucei. En estudios previos habíamos
demostrado que la TcCyP19 se secreta al medio extracelular por ensayos de Western
Blot y que contiene un péptido señal para su secreción. Este hecho fue confirmado
cuando la TcyP19 no se secretó integrando una proteína recombinante con una secuencia
no relacionada en el extremo amino terminal. En el presente trabajo observamos que
incubando la proteína recombinante, expresada en bacterias E. coli, con células de
mamífero (VERO), la proteína se adhiere a las células. Experimentos adicionales por
análisis por citometría de flujo demostraron que la TcCyP19 penetra en estas células. La
proteína recombinante TcCyP19 inhibió entre un 40 y un 60 % la invasión de
tripomastigotes de la cepa Tulahuén 2 en monocapas de células VERO, en estudios
preliminares. Nuestros resultados indican que la TcCyP19 del T. cruzi se secreta,
BIOCHEMISTRY & MOLECULAR BIOLOGY
79
interactúa con la célula del mamífero y podría estar involucrada en los procesos de
infección en las células del hospedador.
BYBM59
THE ALKALINE PHOSPHATASE ACTIVITY IS DIRECTLY
ETINDRONATE IN Echinococcus granulosus CELL LINE (EGPE)
MODIFIED
BY
Melisa S. Barbery Venturi, Emilio Roldán, Alicia G Fuchs
Centro de Altos Estudios en Ciencias Humanas y de la Salud (CAECIHS)-UAI.
E-mail: [email protected]
Intracellular alkaline phosphatases (AP) have been associated with the down regulation of
signaling pathways. Nitrogen-containing bisphohsphonates (BPs) disrupt protein
prenylation (Tanimori et al., 2010). BPS were studied for anti parasitic activity on
Trypanosomatides (Lai and Bontempi et al, 2014, Docampo et al 2008). We previously
studied the effect of 5 BP on EGPE cell line. BP decreased cell grow, ATP and
mitochondrial respiration and increased intracellular Ca2+ (Fuchs et al, 2014). Etindronate
(EHdP) decreased AP activity after 3 days of incubation, corresponding to the maximum
pharmacological effect. This effect could be mediated or be direct on the AP. This work
compares the in vitro effect of two BP, EHDP and Ibandronate (IB) on AP activity from
pig’s kidney and from EGPE cells homogenate. AP from pig’s kidney (Sigma) was assayed
in 1M of 2-dimethilamine ethanol pH9.8, 0.5 mM MgCl2 reading at 405 nm the pnitrophenol. Vanadate (V) (Sigma) inhibition was used to identify AP activity. Dose
response was studied with EHDP, IB (Gador S.A) and V from 6 to 110 µM. Slope was
recorded during 10 min. In EGPE homogenate AP was measured in the same conditions
but incubating 2hrs at 37C, initial and final abs. were reordered and proteins were
measured by Bradford. The I50 of commercial AP with V was 52 µM and 50% AP activity
increased with EHDP and IB at 110 µM (n=3 for every dose). On the contrary on EGPE
cells EHDP decreased AP activity. p< 0.05 (n=3) as V. IB has no effect (control: 4.17x108U/ml*µg prot. ± 1.20x10-8 as 100%; EHDP 21.4 % ± 37.1; IB 76.6% ± 79.3 and V 17.7%
± 3) Conclusion Intracellular AP from EGPE cells are inhibited by V indicating an identity
between both enzymes origin, but BP specially EHDP inhibits AP from EGPE, while BPS
increased pig’s AP activity. These results indicate that EHDP acts directly on AP activity.
Molecular differences between mammalian AP and E.g are reflected in BP effects on
enzyme activity.
BYBM60
INHIBIDORES DE LA
ANTIPARASITARIOS
SINTESIS
DE
ISOPRENOIDES
COMO
AGENTES
Juan Bautista Rodriguez, Sergio H. Szajnman, María N. Chao, Carolina Exeni, Mariana
Ferrer-Casal, Nahir Vadra, Tamila Galaka
Departamento de Química Orgánica, FCEyN, UBA.
E-mail: [email protected]
BIOCHEMISTRY & MOLECULAR BIOLOGY
80
La quimioterapia tanto para la enfermedad de Chagas como la toxoplasmosis es aún
deficiente. Las drogas disponibles para la enfermedad de Chagas, descubiertas
empíricamente, nifurtimox y benznidazol, están asociadas a tratamientos prolongados y
severos efectos adversos. Las correspondientes para toxoplasmosis no son satisfactorias,
especialmente, no son bien toleradas por individuos inmunosuprimidos. Entonces, existe
una necesidad crucial de desarrollar nuevas drogas que sean efectivas y seguras
basadas en el conocimiento de la bioquímica y la fisiología de estos microorganismos. La
biosíntesis de isoprenoides es particularmente útil para la identificación de nuevos blancos
moleculares contra trypanosomatideos o parásitos Apicomplexa. Nuestra hipótesis es que
la biosíntesis de isoprenoides constituye un blanco molecular principal para el tratamiento
de estas enfermedades parasitarias. Para evaluar esta hipótesis, nuestros objetivos
centrales son (a) investigar el efecto de análogos de pirofosfato (bisfosfonatos) contra la
actividad enzimática de farnesil pirofosfato sintetasa (FPPS) e in vitro contra células de T.
cruzi y T. gondii; (b) investigar la acción derivados de tiocianatos de ariloxietilo, los cuales
son inhibidores muy efectivos de la proliferación de T. cruzi y T. gondii, contra escualeno
sintetasa de T. cruzi (SQS). WC-9 es un miembro representativo de esta familia de
compuesto desarrollado en nuestro laboratorio cuyo mecanismo de acción es un bloqueo
específico de la biosíntesis de novo de ergosterol a nivel de escualeno sintetasa. En
particular, WC-9 es un potente inhibidor no-competitivo de la actividad enzimática de SQS
de T. cruzi tanto glicosomal como mitocondrial en el rango bajo nanomolar. Por otro lado,
se ha demostrado que T. gondii no biosintetiza colesterol y que lo importa del huésped
sugiriendo que los inhibidores de SQS de mamíferos podrían eventualmente controlar la
proliferación de T. gondii.
BYBM61
COMPARATIVE GENOMIC STUDY OF TRANSPOSABLE ELEMENTS IN TWO
VIRULENT STRAINS OF Entamoeba histolytica
Ludmila S López Arias(1), Elisabet Caler(2), Martina S Paoletta(3), Hernán Lorenzi(4),
Graciela Garbossa(5), Marisa D Farber(6)
(1)
Institulo de Biotecnología, CICVyA, INTA-Castelar. Departamento de Química Biológica,
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires, CABA,
Argentina. Instituto de Investigaciones en Salud Pública, Universidad de Buenos Aires,
CABA, Argentina. (2)Division of Lung Diseases. National Heart, Lung and Blood Insitute.
National Institute of Health. Maryland, USA. (3)(6)Institulo de Biotecnologia, CICVyA, INTACastelar. . (4)Department of Infectious Diseases. The J. Craig Venter Institute. Maryland,
USA. (5)Departamento de Química Biológica, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales,
Universidad de Buenos Aires, CABA, Argentina. Instituto de Investigaciones en Salud
Pública, Universidad de Buenos Aires, CABA, Argentina.
E-mail: [email protected]
Entamoeba histolytica is the parasite that causes dysentery and liver abscesses in
humans. However, most infections are asymptomatic. Several strains were isolated from
feces (E. histolytica Rahman), liver (E. histolytica HM3:IMSS (HM3)) and bowel (E.
histolytica HM1:IMSS (HM1)). E. histolytica contains many Transposables Elements (TE)
among which are the non-Long Terminal Repeats retroelements: Long and Short
Interspersed Elements (LINEs and SINEs). TE can give rise to the appearance of different
virulent phenotypes by changing the expression of adjacent genes. In this context, our
BIOCHEMISTRY & MOLECULAR BIOLOGY
81
goal is to analyze the distribution of TE in the genomes of HM3 and HM1 and to assess
their impact on the expression of genes involved in pathogenicity mechanisms. Our
mapping of TE showed that the abundance of LINEs (HM3: 876; HM1: 1879 copies) was
greater than that of SINEs (HM3: 354; HM1:867 copies). LINE1 (subtype of LINE) was the
most frequent LINE: 56.2% (493/876) in HM3 and 49.7% (934/1879) in HM1. The full
coverage (percentage of the corresponding length of the assembled genome) of LINEs
was 1.38% in HM3 and 10.00% in HM1. To estimate the potential impact of TE on gene
expression we defined a criterion of TE-gene association, where any coding sequence
(CD) within 1 kb of a nearby TE is computed as associated and potentially modulated by
that element. This analysis revealed that LINEs were slightly more frequently associated to
CDs (HM3: 74.6%; HM1: 52.2%) than SINEs (HM3: 73.1%; HM1: 48.9% Subsequently, we
performed a functional categorization of associated genes based on GO terms, in order to
reveal the relatedness of TE insertions to functional categories. This analysis showed that
kinase and binding proteins were preferentially associated with both SINEs and LINEs.
These preliminary results indicate that the proposed in silico strategy will help in the
identification of candidate genes for functional assays to elucidate novel virulence
mechanisms in E. histolytica.
BYBM62
IDENTIFICATION OF A METACASPASE PROTEIN SUBSTRATE CONSERVED
AMONG Trypanosoma cruzi AND OTHER EARLY DIVERGENT EUKARYOTIC CELLS
Gabriela Niemirowicz, León Alberto Bouvier, Juan José Cazzulo, Vanina Eder Alvarez
IIB-UNSAM.
E-mail: [email protected]
Knowledge of the mechanism of action of metacaspases (MCAs), distant relatives of the
metazoan caspases, is still very limited, mostly because the targets of their activity are still
unknown. In this direction we had conducted a search for natural substrates of T. cruzi
metacaspases by the screening of a number of interactors (obtained by co-purification
from parasite extracts and identified by mass spectrometry) expecting that some of them
will be true substrates. Using a dual vector system that allowed us to simultaneously
express both, the metacaspase and the putative substrate in E. coli, we were able to
identify a potential substrate of TcMCA5. In vitro assays using both recombinant purified
proteins, plus N-terminal Edman sequencing, helped us to identify an arginine residue
upstream the cleavage site which matches perfectly the known metacaspase specificity.
Furthermore, replacement of this residue by an Ala completely abolished TcMCA5 activity
over this target protein. To further investigate the potential physiological consequences of
this proteolytic cleavage we moved to two different well-established unicellular model
organisms, the closely related Trypanosoma brucei; as well as the early divergent budding
yeast Saccharomyces cerevisiae. Therefore each metacaspase/substrate pair was
expressed, purified and assayed for cleavage in vitro. Both T. brucei TbMCA5 and YCA1,
the only metacaspase ortholog present in the genome of S. cerevisiae, indeed processed
their respective substrates after arginine residues as shown by N- terminal sequencing.
Interestingly, in each respective substrate protein, the proteolytic events take place around
the same region. Currently we are focusing on detecting the in vivo proteolytic event by
means of simultaneous inducible expression and endogenous epitope tagging based
methodologies.
BIOCHEMISTRY & MOLECULAR BIOLOGY
82
BYBM63
SISTEMA REDOX DE T.cruzi COMO FACTOR DE VIRULENCIA: ROL DE LA
TRIPAREDOXINA PEROXIDASA (TXNPx) EN LA PATOGENIA DE LA ENFERMEDAD
DE CHAGAS
Paola Zago(1), MD Piñeyro(2), A Mesías(3), N. Garg(4), C. Robello(5)
Instituto de Patología Experimental (IPE-CONICET)- Salta. (2)(5)Univers de la Republica
e Inst. Pasteur, Uruguay. (4)Dept Microbiology & Immunology, UTMB, Galveston, USA. .
E-mail: [email protected]
M.
(1)(3)
Nuestro objetivo es estudiar el rol del sistema redox de T.cruzi en la patogenia de la
Enfermedad de Chagas. Varios grupos le hemos atribuido un papel único en la virulencia
al permitirle enfrentar la primera barrera de defensa impuesta por el sistema inmune
innato. Previamente describimos la mayor expresión de proteínas de este sistema, entre
ellas, las triparedoxinas peroxidasas (TcTXNPxs), en tripomastigotes de TcI. Para
caracterizar su participación sobre la respuesta celular a la infección, se diseñaron
mutantes funcionales y sobreexpresantes de TXNPx en la cepa Sylvio X10/cl4 utilizando
el sistema pRibotex. Se clonaron la CDS wild type de TXNPx tanto citosólica como
mitocondrial y a su vez se produjeron mutaciones sitio-dirigida en dominios cys claves
tanto para su actividad redox como resolutiva, a fin de obtener de parásitos
recombinantes que sobrexpresen formas activas y no funcionales de estas enzimas y así
contar con una batería de clones con distintas capacidad antioxidante. Electroporamos
estas construcciones obteniendo transfectantes bajo presión de selección con G418 (250400µg). Confirmamos tanto la sobrexpresión por western blot con anticuerpos específicos
para ambas TXNPXs(CPX and MPX) como la actividad peroxidasa diferencial de las
transfectantes (Peroxidase Assay Kit Invitrogen®) y la sensibilidad diferencial a especies
oxidantes (H2O2 y ONOO.- ) con Alamar Blue®. Ensayamos tanto la infectividad de estos
transfectantes como la respuesta del huésped tanto in vitro (macrofagos Raw 264) como
in vivo (ratones C57BL/6). Hallamos una menor infectividad de las mutantes funcionales
negativas de TXNPXs tanto por evaluación directa e indirecta. La determinación de estrés
oxidativo global, lipoperoxidación lipídica y actividad mieloperoxidasa demostraron una
respuesta diferencial del huésped a la infección, apoyando la hipótesis de que enzimas
antioxidantes del parásito podría interaccionar con el huésped para el desarrollo de la
patología chagásica.
BYBM64
ANALYSIS OF AN UNUSUAL TRANSCRIPT WITH NON-AUG TRANSLATION
INITIATION CODON IN Giardia lamblia
Diego N Ríos(1), Gabriela A Merino(2), Marianela Serradell(3), Lucía Rupil(4), Alicia Saura(5),
Mariana Martina(6), Elmer A Fernández(7), Hugo D Luján(8), Pablo R Gargantini(9)
(1)(3)(4)(5)(6)(8)(9)
CIDIE - UCC/CONICET. (2)(7)BDMG - UCC.
E-mail: [email protected]
Giardia lamblia is a protozoan parasite that is found worldwide and has both medical and
veterinary importance. The availability of second-generation sequencers has made it
easier and less expensive to study the gene expression profile of Giardia, improving our
understanding of the unique features of these parasites and allowing us to identify
BIOCHEMISTRY & MOLECULAR BIOLOGY
83
expressed genes and verify annotated ones. We used the data from a RNA-seq study to
analyze the correct identification and quantitation of expression for a putative Non-AUG
translation initiation gene first described in this parasite. Visual inspection of the alignment
obtained with the Integrative Genomics Viewer (IGV), revealed the presence of readings in
the previous genomic region to the ATG site annotated in the public database. Transcript
levels were calculated from the mapped sequences as fragments per kilobase per million
fragments mapped (FPKM), using Cufflinks v.2.0.0. Another analysis revealed the
presence of a putative downstream box (DB) in this transcript, we used a 15 nt sequence
(5´-CAGGCGCGGGGGCUC-3´) as a query that complements precisely the 15 nt putative
anti-DB sequence at the 3´-end of the Giardia 16S-like rRNA. We also examined this
transcript looking for a frequent transcription-initiation site consensus, which could be
upstream of the Non-AUG start codon previously identified by 5´RACE. All this in silico
analysis complement others molecular experiments that could explain the unique
mechanism of translation initiation that probably falls somewhere between that of a
prokaryote and a eukaryote with a potentially close link with that in the Archaea.
BYBM65
CARACTERIZACIÓN DE PATRONES ELECTROFORÉTICOS DE PROTEÍNAS
OBTENIDAS DE LÍQUIDO HIDATÍDICO DE QUISTES HIDATÍDICOS BOVINOS DE
Echinococcus granulosus
Colette Burotto, Constanza Andrade, Pamina Horlacher, Felipe Corrêa, Caroll Stoore,
Christian Hidalgo, Edgar Jiménez, Rodolfo Paredes
Escuela de Medicina Veterinaria, Facultad de Ecología y Recursos Naturales, Universidad
Andrés Bello, Santiago, Chile.
E-mail: [email protected]
Introducción: La hidatidosis es una enfermedad zoonótica causada por el metacestodo de
Echinococcus granulosus. Existen quistes hidatídicos de tipo fértil que presentan
protoescólices y quistes de tipo infértil en los que no hay desarrollo de protoescólices. Las
causas de fertilidad e infertilidad de quistes no están dilucidadas. En la cavidad del quiste
hidatídico se presenta gran cantidad de líquido hidatídico que provee de nutrientes y otros
componentes necesarios para el crecimiento y desarrollo del quiste Objetivo: Caracterizar
el patrón electroforético proteico de líquido hidatídico provenientes de quistes hidatídicos
fértiles e infértiles de Echinococcus granulosus. Material y Métodos: Quistes hidatídicos se
obtuvieron desde pulmón e hígado de bovinos faenados en el Frigorífico La Pintana.
Utilizando jeringa, se obtuvo asépticamente el líquido desde cada quiste de forma
individual. La confirmación de fertilidad se realizó obteniendo un fragmento de la capa
germinal y observándola al microscopio de luz para confirmar o descartar la presencia de
protoescólices. 57 muestras de líquidos hidatídicos fueron liofilizadas, dializadas y luego
reliofilizadas para finalmente ser resuspendidas en PBS más inhibidores de proteasas y
separadas por SDS-PAGE en condiciones denaturantes. Resultados y Discusión: De las
muestras procesadas se obtuvieron los patrones proteicos diferenciales de líquido fértil
como infértil. Destacan las bandas diferenciales cercanas a 50 kDa solo en quistes
infértiles, mientras que el líquido fértil presenta una banda diferencial de 37 kDa,
mostrando que los líquidos hidatídicos poseen una constitución proteíca diferencial según
el tipo de quiste hidatídico. Conclusión: Existe un proteoma diferencial en los líquidos
hidatídicos según la fertilidad de quistes hidatídicos en bovinos infectados con E.
BIOCHEMISTRY & MOLECULAR BIOLOGY
84
granulosus. Estas diferencias pueden generar nuevas líneas de diagnóstico o control para
esta enfermedad. Agradecimientos: FONDECYT Nº 1130717
BYBM66
GENOTIPIFICACIÓN DE QUISTES HIDATÍDICOS DE Echinococcus granulosus DE
BOVINOS DECOMISADOS EN SANTIAGO DE CHILE
Felipe Corrêa(1), Caroll Stoore(2), Colette Burotto(3), Constanza Andrade(4), Pamina
Horlacher(5), Edgar Jiménez(6), Christian Hidalgo(7), Henrique Ferreira(8), Guilherme
Barros(9), Rodolfo Paredes(10)
(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(10)
Escuela de Medicina Veterinaria, Facultad de Ecología y Recursos
Naturales, Universidad Andrés Bello, Santiago, Chile. (8)(9)Laboratório de Genômica
Estrutural e Funcional, Centro de Biotecnologia, UFRGS, Porto Alegre, RS, Brasil.
E-mail: [email protected]
Introducción: Equinococus granulosus es un parásito del tipo cestodo que afecta cánidos
(hospederos definitivo), y cuyo estado larval causa hidatidosis quística, que afecta seres
humanos y animales ungulados (hospederos intermediarios). Hasta ahora se han descrito
10 cepas de E.granulosus (G1 a G10). El genotipo G1 es el más prevalente a nivel
mundial, mientras que reportes en humanos y caninos indican que el genotipo G1 es el
más prevalente en Chile. Sin embargo, no se encuentran reportes en nuestro país que
determinen la cepa de este parásito con mayor presencia en quistes hidatídicos de
bovinos. Objetivo: Genotipificar muestras de quistes hidatídicos presentes en bovinos
faenados en Santiago de Chile. Material y Métodos: Se obtuvo un total de 338 quistes
hidatídicos de pulmón e hígado a desde 274 bovinos de diferentes edades y sexo
decomisados en Santiago. A partir de suaves raspados de la cara interna de los quistes
se obtuvo capa germinal y se realizó extracción de ADN. A través de PCR anidado, se
amplificó el gen COX1 en cada una de las muestras, específico para todos los genotipos
de E.granulosus. Posteriormente, las muestras positivas a PCR fueron genotipificadas a
través de la enzima de restricción endonucleasa ALU-1, específica para G1. Resultados y
Discusión: El análisis determinó que dentro del total de muestras genotipificadas, el 98%
de las muestras corresponde al genotipo G1, mientras que el 2% corresponde a quistes
hidatídicos de otras cepas. Conclusiones: En este estudio preliminar se determinó que el
genotipo G1 de E.granulosus es el más prevalente en bovinos decomisados en Santiago.
Agradecimientos: FONDECYT Nº 1130717
BYBM67
EVALUACIÓN DE RESPUESTA INMUNE HUMORAL EN CAPA ADVENTICIA DE
QUISTES HIDATÍDICOS EN BOVINOS
Edgar Jiménez, Christian Hidalgo, Pamina Horlacher, Constanza Andrade, Caroll Stoore,
Colette Burotto, Iván Contreras, Felipe Corrêa, Rodolfo Paredes
Escuela de Medicina Veterinaria, Facultad de Ecología y Recursos Naturales, Universidad
Andrés Bello, Santiago, Chile.
E-mail: [email protected]
BIOCHEMISTRY & MOLECULAR BIOLOGY
85
Introducción: La hidatidosis en humanos ha demostrado que los anticuerpos IgG4
(relacionados con respuestas tipo Th2) se correlacionan con la enfermedad activa,
mientras que los anticuerpos IgG1 (relacionados con Th1) se correlacionan con la
enfermedad inactiva, lo que podría indicar que este parásito podría modular la respuesta
inmune humoral del hospedero Objetivo: Evaluar la respuesta inmune humoral en la capa
adventicia de quistes hidatídicos bovinos. Materiales y Métodos: Las muestras se
obtuvieron a partir de hígados y pulmones infectados con E. granulosus de bovinos
beneficiados en mataderos en Santiago, Chile. La pared del quiste hidatídico fue
procesada e incluida en parafina. Cortes histológicos de 5 m desde quistes fértiles e
infértiles fueron sometidos a técnica de Inmunohistoquímica contra IgG total, IgG1 e IgG2,
reveladas con Liquid DAB-Plus Substrate Kit. Resultados y Discusión: La
Inmunolocalización de IgG bovina y su isotipo IgG2 es más marcada y localizada en las
zonas adyacentes a la capa laminar de los quistes fértiles, mientras que en quistes
infértiles; IgG e IgG1 se distribuyen en toda la región inflamatoria que rodea al quiste
hidatídico. Se aprecia que el subtipo IgG1 posee una mayor localización sólo en capas
germinales de quistes infértiles. Conclusión: nuestros resultados corroboran que existe
una respuesta inmune humoral diferencial según el tipo de quiste que presenta el animal
infectado. El predominio del subtipo IgG1 en quistes infértiles se asocia con una respuesta
de tipo Th1 semejante a lo reportado en humanos. Agradecimientos: FONDECYT Nº
1130717
BYBM68
CORTES HISTOLÓGICOS MEDIANTE LA TÉCNICA DE CRIOSTATO DE QUISTES
FÉRTILES E INFÉRTILES DE Echinococcus granulosus
Lorraine Santander, Constanza Andrade, Colette Burotto, Pamina Horlacher, Caroll
Stoore, Christian Hidalgo, Rodolfo Paredes
Escuela de Medicina Veterinaria, Facultad de Ecología y Recursos Naturales, Universidad
Andrés Bello, Santiago, Chile.
E-mail: [email protected]
Introducción: La hidatidosis o equinococosis quística es una enfermedad zoonótica
causada por el metacestodo de Echinococcus granulosus. Existen quistes hidatídicos de
tipo fértil que presentan protoescólices y quistes de tipo infértil en los que no hay
desarrollo de protoescólices. Las causas de fertilidad e infertilidad de quistes no están
dilucidadas. El quiste hidatídico está formado por tres capas: germinal, laminar y
adventicia. El procesamiento histológico del quiste hidatídico permitirá hacer el estudio de
diferentes marcadores y ver su distribución y localización en estas 3 capas. Objetivo:
Realizar cortes histológicos mediante el uso de criostato en que se conserven intactas las
3 capas del metacestodo. Material y Métodos: Quistes hidatídicos se obtuvieron desde
pulmón e hígado de bovinos faenados en el Frigorífico La Pintana, Santiago de Chile. De
forma aséptica, se obtuvo una muestra de la pared de quiste, se embebió en OCT y se
congeló a -40ºC utilizando un peltier. Inmediatamente, se obtuvieron cortes de 10 m de
espesor, los que se tiñieron con hematoxilina-eosina y fotografiaron en un microscopio
Olympus FSX100. Resultados y Discusión: Se realizaron cortes desde quistes hidatídicos
fértiles e infértiles. En los quistes fértiles, la capa adventicia se desprendió en gran parte
de las muestras, quedando las capas germinal y laminar juntas, obteniendo pocos
campos en que se apreciaran las 3 capas en su conjunto. En el caso de los quistes
BIOCHEMISTRY & MOLECULAR BIOLOGY
86
infértiles se observa en gran parte de los cortes un desprendimiento de la capa germinal,
manteniéndose la laminar junto con la adventicia, resultados muy semejantes a los
observados con procesamiento corriente en parafina. Estos resultados permitirán elaborar
estudios de presencia de citoquinas y proteínas del hospedero, o de productos de
excreción secreción del parásito que podrían tener actividad diferencial entre quistes
fértiles e infértiles. Agradecimientos: FONDECYT Nº 1130717
BYBM69
MOLECULAR CHARACTERIZATION OF NATURAL POPULATIONS OF Trypanosoma
cruzi IN CHAGAS DISEASE PATIENTS ENROLLED IN THE E1224 CLINICAL TRIAL
Juan C Ramirez(1), Gonzalo R Acevedo(2), Rudy Parrado(3), Sandro Villarroel(4), Anabel de
la Barra(5), Lineth Garcia(6), Joaquim Gascon(7), Faustino Torrico(8), Isabela Ribeiro(9),
Alejandro G. Schijman(10)
(1)(2)(10)
LaBMECh, INGEBI-CONICET, Buenos Aires, Argentina. (3)(4)(5)(6)(8)IIBISMED,
Universidad Mayor de San Simón, Cochabamba, Bolivia. (7)Barcelona Centre for
International Health Research (CRESIB), Barcelona, Spain. (9)Drug for Neglected
Diseases Initiative (DNDi), Geneva, Switzerland.
E-mail: [email protected]
Natural populations of T. cruzi are composed of multiple clones from six discrete typing
units (DTUs). The role that this diversity plays in drug response remains unknown. We
aimed to analyze the genetic polymorphism of parasite populations in Chagas disease
patients enrolled in the E1224 (a pro-drug of ravuconazole) clinical trial conducted in
Bolivia by DNDi. Besides E1224 treatment groups (high, single and low dose),
benznidazole and placebo branches were included. Positive DNA samples from baseline
and follow-up were used as template for PCR targeted to T. cruzi satellite DNA (SatDNA)
and the variable regions of kinetoplastid DNA (vkDNA). SatDNA PCR products were
purified, sequenced and aligned using ClustalX. RFLP-PCR profiles were obtained after
digestion of purified vkDNA amplicons with 1U of HinfI/MspI/RsaI restriction enzymes, 10%
PAGE and Sybr Gold staining. Genetic distances among baseline and follow-up signatures
for each patient were estimated using the Jaccard's coefficient. At baseline, 31% of
samples showed SatDNA type II sequences (present in DTUs II/III) and 69% type I/II
(present in DTUs V/VI); whereas after treatment, 12.8% of samples showed SatDNA type
II and 87.2% type I/II sequences. SatDNA type I sequences (present in DTUs I/IV) were
not found. The mean of Jaccard's distances for placebo and the three E1224 branches
were around 0.45, whereas it was 0.82 for the single refractory case treated with
benznidazole. Our findings indicate that the variability in the genetic composition of T. cruzi
bloodstream populations during follow-up reflects the natural fluctuation of multiclonal
parasite populations during the chronic phase of Chagas disease. It is tempting to
speculate that the high genetic distance found in the refractory case to benznidazole could
be due to drug selective pressure and/or to natural resistance of the post-treatment
population. Further analysis are currently ongoing in other clinical trials to deepen insight
on this matter.
BIOCHEMISTRY & MOLECULAR BIOLOGY
87
BYBM70
ESTUDIO DE PREVALENCIA DE ADN DE Trypanosoma cruzi EN RESIDENTES DE
AREAS CON RIESGO VECTORIAL Y SIN RIESGO VECTORIAL
Analia P Toledano(1), Rodrigo Rey (2), Maria L Gallo Vaulet (3), Mauro Fernández Toscano
, Mariana Mestre(5), Aida J Tomeo(6), Laura D Albornoz(7), Alejandro Tapia (8), Norma
Plebani(9), Alejandra Vellicce(10), Marcelo Rodríguez Fermepín (11), Jorge A Rey(12)
(1)(4)(6)(10)(12)
Departamento Hemoterapia e Inmunohematología. Hospital de Clínicas.
Universidad de Buenos Aires.. (2)(3)(5)(11)Cátedra de Microbiología Clínica. Departamento de
Bioquímica Clínica. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Universidad de Buenos Aires..
(7)
Hospital rural Misión Nueva Pompeya. Castelli Chaco.. (8)(9)Hospital rural Misión Nueva
Pompeya. Castelli, Chaco..
E-mail: [email protected]
(4)
Introducción: La Tripanosomiasis Americana, es una enfermedad endémica en nuestro
país. El riesgo de transmisión vectorial es alto o ausente según las áreas geográficas
Objetivos: Estudiar marcadores moleculares para Tripanosoma cruzi (TC) en poblaciones
con diferente riesgo de trasmisión vectorial y serología reactiva para la enfermedad.
Materiales y Métodos: Se estudiaron 79 (de 10941) donantes de sangre (DS) residentes
en área sin riesgo, y 22 individuos residentes (IR) en área con riesgo, todos con al menos
un resultado reactivo de serología. La detección de anticuerpos anti TC se realizó con 3
ensayos comerciales: ELISA recombinante, ELISA lisado y Hemaglutinación Indirecta. Se
usaron 2 técnicas de biología molecular (BM). Técnica 1: PCR en tiempo real (blanco
ADN satélite) (PCRs) y Técnica 2: PCR convencional (blanco ADN Kinetoplasto) (PCRk).
Test estadístico: Test exacto de Fisher. Resultados: Se lograron sensibilidades analíticas
de 0.1 parásitos/ml y 0.1 fg/ul de ADN parasitario. El ADN del parásito se detectó en el
12,65% (10/79) de los DS y en el 36.6% (8/22) de IR (p=0,031), OR: 3.94(1.32-11.76),
siendo en ambos grupos mayor entre los que presentaban 2 técnicas serológicas
positivas (DS: 9/62, 14,51%. IR:8/20, 40%) que entre los que tenían una sola (DS: 1/17,
5.88%. IR: 0/2). Entre los DS una muestra dio solo PCRs + y 9 fueron + por ambas
técnicas; entre los IR 1 muestra dio PCRs +, 2 dieron PCRk + y 5 fueron + por ambas.
Conclusiones: La prevalencia de ADN de T. cruzi fue estadísticamente mayor en
residentes del área con riesgo de transmisión vectorial y podría deberse a la posibilidad
de reinfección a diferencia de los que migraron a otras áreas sin vector. Las discordancias
encontradas entre las dos técnicas de BM justificarían la necesidad de implementar más
de un blanco molecular en la detección.
BYBM71
MONOALLELIC DELETION OF HMGR GENE IN Trypanosoma cruzi ASSOCIATES
WITH DEFECTS IN EPIMASTIGOTE GROWTH AND DIFFERENTIATION
Fernando Sánchez-Valdéz(1), Cecilia Perez Brandan(2), Paula Faral-Tello(3), Carlos
Robello(4), Miguel Angel Basombrío(5)
(1)(2)(5)
Instituto de Patología Experimental-CONICET. (3)(4)Instituto Pasteur de Montevideo,
Montevideo, Uruguay.
E-mail: [email protected]
BIOCHEMISTRY & MOLECULAR BIOLOGY
88
For more than 40 years, Chagas disease treatment was based on the use of relatively
toxic drugs that produce serious side effects and have restricted indications in adult
patients and pregnant women. Currently, one of the promissing target for the development
of novel anti-T. cruzi drugs is the ergosterol byoshyntesis pathway. Ergosterol is a central
component of the parasite plasma membrane, essential for parasite viability and
proliferation during its entire life cycle. 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme a reductase A
(HMGR) is a single copy gene that encodes a mitochondrial key enzyme of the ergosterol
pathway. This enzyme is specifically inhibited by mevinolin, a potent statin widely used in
humans as a hypocholesterolemic agent. The present work aims to delete HMGR gene in
the Tulahuén T. cruzi strain generating mutant clones with reduced HMGR expression and
highly sensitivity to mevinolin. The mevinolin hyper-susceptibility constitutes an interesting
approach to control the possible persistence of genetically-attenuated parasites to be used
as experimental vaccines in murine models. Using the Gateway cloning technology, we
generated vectors carrying the neomycin or hygromicin phosphotransferase gene flanked
by HMGR 5´ and 3´ UTRs. The recombination fragment was PCR-amplified from the
vector and transfected into Tulahuén epimastigotes. G418 resistant parasites could be
selected after transfection. PCR and Southern blot analysis of a cloned recombinant
population confirmed the deletion of one allele of the HMGR gene. No double knock-out
parasites could be obtained after several transfections. Furthermore, we generate HMGR
overexpressing parasites by transfecting the pTrex-HMGR plasmid to Tulahuén parasites.
Mutant epimastigotes presented a significant decrease in growth and differentiation rate in
axenic culture media. We are characterizing at present the sensitivity to mevinolin and the
infectivity and immunoprotective behavior of mutants in murine models.
BYBM72
DESARROLLO DE UN SISTEMA DE EXPRESIÓN EN ESPORAS DE Bacillus subtilis
DE ANTÍGENOS DE Leishmania CANDIDATOS PARA INMUNOPROFILAXIS DE
LEISHMANIASIS
Leonardo Acuña(1), Fernando Sánchez-Valdez(2), Ramiro Ortiz Moyano(3), Miguel Ángel
Basombrío(4),
Yoshihisa
Hashiguchi(5),
Diego
Marco(6),
Augusto
Bellomio(7)
(1)(3)(7)
Instituto Superior de Investigaciones Biológicas (INSIBIO), CONICET-UNT, e
Instituto de Química Biológica “Dr. Bernabé Bloj”, Facultad de Bioquímica, Química y
Farmacia, UNT. San Miguel de Tucumán, Argentina.. (2)(4)(6)Instituto de Patología
Experimental, Facultad de Ciencias de la Salud, Universidad Nacional de Salta, Argentina.
(5)
Departament of Parasitology, Kochi Medical School, Kochi University, Nankoku, Japan..
E-mail: [email protected]
La leishmaniasis tegumentaria Americana (LTA), es una enfermedad endémica en
Argentina para la cual no existen vacunas de aplicación en humanos. Las esporas
bacterianas, como modelo de exposición de proteínas, podrían ser una alternativa válida
para la formulación de vacunas. Con el objetivo de obtener un sistema de exposición de
antígenos en la superficie de las esporas de Bacillus subtilis, se realizó una fusión
transcripcional entre CotB (una proteína de la capa externa de la espora de B. subtilis) y
LbAg3, una proteína inmunogénica de Leishmania (V.) braziliensis, agente causal de LTA.
El gen estructural de CotB se amplificó por PCR a partir de B. subtilis 168 y
posteriormente se reamplificó utilizando cebadores específicos que incorporan una
pequeña región de clonado múltiple hacia el extremo 3’. El amplicón se clonó en el
BIOCHEMISTRY & MOLECULAR BIOLOGY
89
plásmido pRSETa. La región del gen que codifica para LbAg3 se amplificó a partir de una
cepa de L. (V.) braziliensis MHOM/AR/03/OLO1 y posteriormente se reamplificó,
adicionando hacia el extremo 3’ un sitio de restricción XmaI, una secuencia que codifica
para seis residuos de histidina y un sitio de restricción BamHI. Este amplicón se clonó a
continuación de cotB. La fusión génica obtenida cotB-polylinker-lbAg3-6His se digirió con
las enzimas HindIII y BamHI y se clonó en el vector de integración pDG364 obteniendo el
plásmido denominado pSPOK. La expresión eficaz de la proteína heteróloga en la
superficie de la espora y su estabilidad están en proceso de evaluación. La seguridad,
estabilidad a temperatura ambiente y fácil manipulación de las esporas de B. subtilis, hace
a este sistema de expresión particularmente útil para la expresión en la superficie de
moléculas bioactivas como antígenos recombinantes capaces de disparar una respuesta
inmune protectiva.
DIAGNOSIS & TREATMENT
90
DYT01
EVALUATION OF LEISHMANICIDAL
CYCLOPALLADATED COMPLEX
AND
TRIPANOCIDAL
ACTIVITY
OF
Angela M Arenas Velásquez(1), Rodrigo Alves de Souza(2), Aline Ribeiro(3), Fabio A
Esteves Torres(4), João Aristeu da Rosa(5,) Antonio E Mauro(6), Pio Colepicolo Neto(7),
Marcia A S Graminha(8)
(1)(3)(4)(5)(8)
Faculdade de Ciencias Farmaceuticas, UNESP-Araraquara, Brasil. (2)(6)Instituto
de Química, UNESP-Araraquara, Brasil. (7)Instituto de Química, USP-São Paulo, Brasil.
E-mail: [email protected]
Leishmaniasis and Trypanosomiasis are several diseases in vertebrates caused by
parasitic protozoan. These diseases are part of tropical infectious diseases (NTD) which
have been neglected by governments and pharmaceutical industries. According to the
World Health Organization, WHO, an estimated 310 million people are at risk of
leishmaniasis in all continents, 7 to 8 million people are infected worldwide with Chagas’
disease and 70 million people are at risk of HAT(Human African Trypanosomiasis). The
conventional drugs employed to treat these diseases are antiquated, high toxicity,
produced several side effects and parasites have developed resistance against
them.Therefore is urgent to develop new drugs to treatment. Recently was suggested that
one cyclopalladated complex showed a high selectivity index with trypanocidal activity in
the treatment of Chagas’ disease. Based on the potential activity of cyclopalladated, in this
work we have evaluated in vitro leishmanicidal and trypanocidal activity of [Pd(dmba)(μCl)]2 and [Pd(dmba)(μ-NCO)]2 against L. amazonensis promastigote and amastigote
forms, T. cruzi epimastigote and amastigote forms and T. brucei procyclic form. We show
that cyclopalladated complex exhibit potential leishmanicidal and trypanocidal activity in all
forms of strains. [Pd(dmba)(μ-NCO)]2 is the most active compound in all parasites and
also exhibited a low toxicity in macrophages. The Safety Index values for this complex in
L. amazonensis and T. cruzi amastigote forms are 14.47 and 28.42, respectively. Thereby,
this compound could be a good candidate for drug.
DYT02
PRIMER CASO IDENTIFICADO DE ENFERMEDAD RESPIRATORIA CAUSADA POR
Lophomona spp. EN ESQUEL, PROVINCIA DE CHUBUT – PATAGONIA ARGENTINA
Andrei Ambrossenkov, Patricia Benvenuto y Elena Sanero
Clínica modelo esquel.
E-mail: [email protected]
La Lophomona spp. es un protozoo multiflajelado, endocomensal en el intestino grueso de
artrópodos/insectos como la cucaracha o termitas; también se las ha descripto en las
heces de ciertas aves como las Avutardas (3). Es capaz de producir enfermedad
respiratoria broncopulmonar en los seres humanos, en el contexto de compromiso
inmune, en la mayoría de los casos se presentó posterior o concomiante a Enfermedad
Respiratoria y una mínima proporción se reportó en el contexto de compromiso de la
función inmune (HIV, transplantados y enfermedades sistémicas). Es nuestro objetivo
sumar la descripción del caso clínico que tratamos de Enfermedad Respiratoria por
DIAGNOSIS & TREATMENT
91
Lophomona spp. (en la Unidad de Terapia Intensiva de la Clínica Modelo de la ciudad de
Esquel, provincia de Chubut – Patagonia Argentina) a la información brindada por los
trabajos donde se revisó la literatura sobre Lophomona spp. en el contexto de enfermedad
respiratoria. En estos trabajos se describieron un total de 61 casos la mayoría en China y
casi todos en adultos (la mayor literatura disponible es de origen chino), luego se
reportaron casos en Perú en mucha menor proporción y la mayoría de los casos fueron
pediátricos y por último en España con 2 casos en adultos. La detección del parásito se
realizo a partir de una muestra de lavado bronquioalveolar y visualización microscópica.
Se ajustó el tratamiento agregando el antiprotozoario Metronidazol evidenciando
mejoramiento de su cuadro clínico La presentación clínica fue inespecífica, incluyendo
síntomas respiratorios, fiebre y tos. El 70 % de estos casos se presentaron en individuos
de sexo masculino.
DYT03
CRUZIPAIN INHIBITION
ANTAGONIST
BY
MONTELUKAST,
A
LEUKOTRIENE
RECEPTOR
Carolina Bellera(1), Maria Laura Sbaraglini(2), Darío Balcazar(3), Laura Fraccaroli(4), Alan
Talevi(5), Carolina Carrillo(6)
(1)(2)(5)
Cátedra de Química Medicinal-Departamento de Ciencias Biológicas-Facultad de
Ciencias Exactas-UNLP. (3)(4)(6)Instituto de Ciencia y Tecnología Dr. César Milstein (ICT
Milstein-CONICET).
E-mail: [email protected]
Cruzipain (Cz) is the major cystein protease of the hemoflagelate parasite Trypanosoma
cruzi, etiologic agent of Chagas disease. This enzyme has been validated as drug target
for novel antichagasic agents, being essential for T. cruzi amastigotes and playing a role in
host-parasite interactions. In the present work, we have applied previously reported
computational models to develop a ligand-based virtual screening campaign on two
chemical repositories: DrugBank and Merck Index databases. The objective of this work is
the discovery of novel antichagasic therapies in order to overcome the limitations of
currently approved therapies, i.e. safety issues and low efficacy in the chronic stage of the
disease. replace current unsatisfactory therapies. Four of the identified drugs, namely: the
leukotriene blocker montelukast, the antinociceptive and anti-inflammatory agent atranorin,
the synthetic pyrethroid fluvalinate and the calcium blocker methoxyverapamil, were
acquired and tested on Cz activity and epimastigotes proliferative assays. Testing the four
compounds at a concentration of 100 microM on purified Cz activity it was shown that only
montelukast and atranorin had and inhibitory effect; however, only the first one maintained
an inhibitory effect in lower concentrations showing a median inhibitory concentration
(IC50) of 42.5±6.4 uM. Cultures of T. cruzi epimastigotes in the presence of montelukast
showed inhibitory effects on proliferation, affecting the maximal cell density (treated:
29.6±2.8 million parasites/ml vs control: 59.0±9.2 million parasites/ml). This compound
showed a median lethal dose (LD50) of 71.0±9.8 uM. Finding an a priori unpredictable
inhibitory compound applying in silico screening confirms the utility of our models to
identify, through a repurposing strategy, new trypanocidal therapeutics.
DIAGNOSIS & TREATMENT
92
DYT04
TRATAMIENTO DE LA INFECCIÓN POR Trypanosoma cruzi EN FASE CRÓNICA EN
UN MODELO MURINO: EFECTIVIDAD DE HIDROXIMETILNITROFURAZONA
Carolina Davies(1), Ramiro Hugo Poma(2), María Celia Mora(3), Federico Ramos(4), Verónica
Rajal(5), Miguel Ángel Basombrío(6)
(1)(3)(4)(6)
IPE-UNSa-CONICET. (2)(5)Laboratorio de Aguas y Suelo - Instituto de
Investigaciones para la Industria Química (INIQUI, CONICET-UNSa) y Facultad de
Ingeniería, Universidad Nacional de Salta.
E-mail: [email protected]
La infección por Trypanosoma cruzi, causante de la enfermedad de Chagas, se trata con
Benznidazol (BZL), que presenta efectos adversos en adultos y no es efectivo en todas
las poblaciones del parásito, necesitándose nuevas alternativas. Investigaciones en
modelos murinos demostraron que el tratamiento con hidroximetilnitrofurazona (NFOH) es
efectivo durante la fase aguda de la infección. En ese marco, el objetivo de este trabajo
fue determinar la eficacia del tratamiento con NFOH en comparación con BZL durante la
fase crónica de la infección por T. cruzi. Se inocularon 50 ratones hembra Swiss (30 días,
50 parásitos T. cruzi cepa Tulahuén) y se determinó el título de anticuerpos contra
proteínas solubles totales de T. cruzi por ELISA a los 90 días post-infección. Los ratones
con serología positiva (N=28) fueron agrupados en 4 lotes a los que se les administró v.o.
diariamente durante 6 días/semana (60 dosis): BZL, (N=8; 150 mg/Kg/día), NFOH (N=9;
150 mg/Kg/día), BZL 30 mg + NFOH 60 mg/Kg/día (N=5), placebo (N=6; 9 % NaCl – 5 %
Tween 80). A los 41 días post-tratamiento (dpt) se tomaron muestras para serología, y a
los 180 dpt los ratones fueron sacrificados para tomar muestras de suero y músculo
esquelético, tejido donde se determinó carga parasitaria por qPCR. Los niveles de
anticuerpos anti-T. cruzi no mostraron diferencias significativas a los 6 meses pt. La carga
parasitaria fue indetectable por qPCR en el grupo tratado con NFOH (0% positivos),
seguida por BZL (50%), BZL+NFOH (60%) y placebo (71%). Estos resultados indican que
NFOH es similar a BZL durante un tratamiento en fase crónica, como en tratamientos en
fase aguda. Aunque la mortalidad fue mayor en el grupo NFOH (33%), seguido por BZL
(12%), BZL+NFOH (40%) y placebo (14%), estudios previos indican que NFOH, en
contraste con BZL, no induce inflamación ni fibrosis hepática en modelos murinos de
tratamiento sin infección, por lo que NFOH podría ser una alternativa al tratamiento de la
infección por T. cruzi.
DYT05
IDENTIFICATION OF ANTICHAGASIC ACTIVITY OF CLOFAZIMINE, BENIDIPINE AND
SAQUINAVIR THROUGH COMPUTER-AIDED DRUG REPURPOSING
Carolina L Bellera(1), Darío E Balcazar(2), María C Vanrell(3), Florencia Casassa(4), Carlos A
Labriola(5), Jorge Gálvez(6), Luis E Bruno-Blanch(7), Patricia Romano(8), Carolina Carrillo(9),
Alan Talevi(10)
(1)(7)(10)
Cátedra de Química Medinal,Departamento de Ciencias Biológicas, Facultad de
Ciencias Exactas, Universidad Nacional de La Plata, Buenos Aires, Argentina. (2)(9)Instituto
de Ciencia y Tecnología Dr. César Milstein (ICT Milstein-CONICET). (3)(4)(8)Instituto de
Histología y Embriología (IHEM-CONICET), Facultad de Medicina, Universidad Nacional
DIAGNOSIS & TREATMENT
93
de Cuyo (UNCUYO), Mendoza, Argentina.. (5)Instituto de Investigaciones Bioquímicas de
Buenos Aires (CONICET), Argentina. (6)Unidad de Diseño de Fármacos y Topología
Molecular, Universidad de Valencia, España.
E-mail: [email protected]
Cruzipain (Cz) is the main cystein protease of Trypanosoma cruzi and has previously been
validated as new drug target, proving to be essential for replication of the intracellular form
of T. cruzi and playing a role in host-parasite interactions. We present an integrative
approach for the search of novel antichagasic agents, including virtual screening (VS) of
Cz inhibitors oriented to knowledge-based drug repositioning, and subsequent
biochemical, cellular and pre-clinical testing. A computational classificatory model capable
of discriminating between Cz inhibitors and non-inhibitors was obtained using
DESMOL11software (Molecular Topology & Drug Design Unit. University of Valencia,
Spain) and Statistica 10 (statsoft 2010). Such model was validated and applied in the VS
of Merck Index 12th. 154 compounds were selected as promising candidates, 34 of them
correspond to approved drugs, which are the most favorable, direct candidates for
repositioning purposes, four of which were tested in enzymatic assays and epimastigote
cultures. Three of them (clofazimine, benidipine and saquinavir) showed clear inhibitory
effects on Cz and antiproliferative effects on T. cruzi.) Based on pharmacological criteria,
clofazimine and benidipine were moved to preclinical stage, where they were effective in a
mice model of acute infection. Clofazimine also reduced the allocation of T. cruzi nests in
cardiac tissue, suggesting it could be useful to prevent the development of cardiac
damage in Chagas disease. The present work successfully integrates computer-aided
drug discovery with molecular and cellular biology and preclinical testing, confirming the
utility of VS to develop knowledge-based drug repurposing.
DYT06
IN VIVO ACTIVITY OF ALBENDAZOLE IN COMBINATION WITH THYMOL AGAINST
Echinococcus multilocularis LARVAL STAGE
Clara M Albani 1,2, Patricia E Pensel 1,2, María C Elissondo 1,2
1 Laboratorio de Zoonosis Parasitarias, Dpto de Biología, FCEyN, Universidad Nacional
de Mar del Plata. 2 CONICET. .
E-mail: [email protected]
Human alveolar echinococcosis (AE) is caused by the fox tapeworm Echinococcus
multilocularis and is usually lethal if left untreated. Infection of intermediate host (rodents
and accidentally humans) is initiated by oral uptake of infectious eggs, which upon
hatching in the host intestine, penetrates the intestinal epithelium and access to the host
organs where undergoes towards the metacestode stage. The current strategies for
treating human AE are surgical resection of the parasite mass complemented by
chemotherapy with benzimidazoles. Although these drugs inhibit parasite proliferation,
they do not cure the disease. Several investigations using in vivo rodent models have
been carried out looking for alternative treatment for AE. However, none of the compounds
investigated has been translated into clinical application. Recently encouraging findings
have been reported using combined drugs albendazole (ABZ)/thymol in vitro. The aim of
the current work was to investigate the efficacy of the combination ABZ/thymol on mice
DIAGNOSIS & TREATMENT
94
infected with E. multilocularis metacestodes. Hydatid cysts developed in all the infected
animals involved in the efficacy studies. The application of ABZ and thymol separately or
combinated resulted in a statistically significant reduction on the cysts weight (ABZ/thymol
group: 1.5±1.4g; ABZ suspension group: 4.69±1.48g; thymol group 3.72±1.25g) compared
to those obtained for unmedicated mice (9.07±2.46). Moreover, differences were found on
protoscoleces viability recovered from metacestodes. These differences were also verified
after SEM analysis of the cysts and protoscoleces from all conditions. In conclusion, the
therapeutic efficacy of ABZ/thymol was superior to ABZ suspension or thymol. The work
reported here demonstrates that in vivo treatment with ABZ/thymol impairs the
development of the AE and we propose that it could be a suitable alternative for treating
AE in humans.
DYT07
ACTIVIDAD SOBRE Trypanosoma cruzi DE DERIVADOS SINTÉTICOS DE 2FENILQUINOLINAS
Fernanda M. Frank(1), Silvia E Asis(2), Fernanda M Frank(3)
(1)(3)
IMPaM (UBA-CONICET). (2)Química Orgánica II, FFyB- UBA.
E-mail: [email protected]
Las drogas empleadas actualmente para la enfermedad de chagas son escasas, con lo
cual existe una necesidad urgente de encontrar como alternativa terapéutica nuevas
moléculas que sean de fácil obtención, económicas y efectiva. Alcaloides con núcleo
quinolínico aislados de diversos productos naturales se destacaron por ser activos frente
a T. cruzi. El objetivo de este trabajo es evaluar en una primera etapa, la actividad sobre
el estadio de epimastigote y determinar la citotoxicidad de 11 derivados sintéticos
nitrogenados. Estos derivados poseen en posición 6 un átomo de cloro ó un grupo nitro,
mientras que en la posición 2 poseen un anillo fenilo sustituído con diversos sustituyentes
o bien un resto indolilo. Un total de 11 compuestos se ensayaron forma epimastigote.
Pudo observarse que los compuestos cuyo resto fenilo de la posición 2 está sustituido con
grupos dadores de electrones tales como el grupo hidroxilo (OH) ó metoxi (OCH3) han
demostrado mayor actividad (CI50 0.49 y 0.40 µg/mL, respectivamente) frente al
compuesto que posee el resto fenilo sin sustituir (CI50 1.95 µg/mL). Cabe destacar que
estos compuestos poseen un átomo de cloro en la posición 6. Por otro lado dos
compuestos que poseen en la posición 6 un grupo nitro se destacaron por sus valores de
actividad. Sin embargo en este caso el compuesto de mayor actividad resultó ser aquel
cuyo resto fenilo de la posición 2 no está sustituído (CI50 1.30 µg/mL), con respecto a su
análogo quien está sustituído con un grupo atractor de electrones (Br, CI50 6.85 µg/mL).
Además se determinó la citotoxicidad de esta familia de compuestos sobre la línea celular
HTP-1, obteniéndose valores de CC50 que demuestran que aquellos compuestos que
poseen buenos valores de actividad no son citotóxicos. Debido a los valores de actividad
obtenidos y a su baja citotoxicidad, estos compuestos fueron seleccionados y actualmente
están siendo evaluados en una segunda etapa frente a las formas de tripomastigote y
amastigote.
DIAGNOSIS & TREATMENT
95
DYT08
COMPUTER-AIDED
ANALOGS
SEARCH
OF
NEW
ANTITRYPANOSOMAL
POLYAMINE
Lucas N Alberca(1), Carolina Carrillo(2), Alan Talevi(3)
(1)(3)
Cátedra de Química Medicinal. (2)ICT Milstein.
E-mail: [email protected]
Chagas is a Latin-American endemic disease caused by Trypanosoma cruzi. In-spite-of its
sanitary importance, there are still only two approved drugs for the treatment of Chagas:
nifurtimox and benznidazole. Both present serious adverse effects and limited efficacy.
Thus, there is a real sanitary need of new therapeutic alternatives. Recently, the role of
computer-aided drug repositioning (i.e. searching for novel indications of already known,
discontinued and/or shelved drugs) has been underlined as an efficient strategy to
discover innovative medications for Chagas disease and other disorders traditionally
labeled as “neglected diseases”. Here, we have applied computer-aided drug repositioning
to search for new antichagasic polyamine analogs. Polyamines are typically found in high
levels in fast proliferating cells such as cancerous cells and parasites. They mediate a
number of essential functions for growth, proliferation and differentiation. Interestingly, T.
cruzi lacks the enzyme responsible of the first step of the polyamines biosynthesis, thus
being dependent on the uptake of polyamines. A database containing polyamine analogs
with and without inhibitory effect on T. cruzi proliferation was compiled from literature.
Afterwards, 100 computational models capable of discriminating between active and
inactive polyamine analogs were inferred through application of Linear Discriminant
Analysis as implemented in Statistica 10 software. After validating the models, the ten best
models were combined through ensemble learning and applied in the virtual screening of
the chemical repositories DrugBank 3.0 and Sweetlead, which compile approved and
experimental drugs from the FDA and from other regulatory agencies worldwide,
respectively. 31 new drug candidates were selected. On the basis of their structures,
original therapeutic uses and safety, doses, costs and accessibility, a selection of these
candidates will be tested on in vitro and in vivo cellular assays.
DYT09
SUSCEPTIBILIDAD A DROGAS TRIPANOCIDAS DE UN AISLAMIENTO DE
Trypanosoma cruzi OBTENIDO DE UN PACIENTE CON INFECCION CRONICA EN UN
MODELO MURINO
Luz P Quebrada Palacio, Mariela N González, Gabriela C. Olivera, Miriam Postan
Instituto Nacional de Parasitología "Dr. Mario Fatala Chaben".
E-mail: [email protected]
Se sospecha que el uso continuo de Benznidazol y el Nifurtimox aumentará la resistencia
de T. cruzi, indicando la urgencia de desarrollar nuevas herramientas terapéuticas para la
infección por este parásito. En este trabajo se evaluó la susceptibilidad in vivo del
aislamiento de T. cruzi AR-SE23C, obtenido de un paciente con enfermedad de Chagas
crónica de Argentina. Se inocularon ratones hembras C3H/He de 4 semanas de edad con
100 tripomastigotes AR-SE23C por via ip y se trataron con 30 ó 40 dosis de BZ o NX (100
DIAGNOSIS & TREATMENT
96
mg/Kg/d) o 20 dosis de Pentamidina (PENT; 4 mg/Kg/d) a partir de la detección de
parasitemia. Los animales que sobrevivieron la etapa aguda de la infección se sacrificaron
70 dpi para histopatología. La prueba de Log-rank mostró aumento de la tasa de
sobrevida de los animales infectados tratados en comparación con los infectados no
tratados (P=0,0097). El tratamiento con BZ y NX negativizó la parasitemia a partir del 2°
día de tratamiento independientemente de la dosis, mientras que la PENT redujo los
niveles de parasitemia respecto de los ratones infectados no tratados (P= 0,0067). El
tratamiento con 40 dosis de BZ ó NX, ó 20 dosis de PENT redujo el porcentaje de
animales con nidos parasitarios en corazón y/ó musculo esquelético (p<0,05). El
tratamiento con 40 dosis de BZ ó NX, ó 20 dosis de PENT redujo la extensión de la
miocarditis respecto de los controles (p><0,05), mientras que no se observaron cambios
en los ratones tratados con 30 dosis de BZ o NX. A nivel del musculo esquelético, el
tratamiento con 30 y 40 dosis de BZ y 40 dosis de NX redujo la extensión de la
inflamación respecto de los controles (p><0,05), no detectándose diferencias con 30 dosis
de NX ó 20 dosis de PENT. Los resultados muestran que la susceptibilidad del
aislamiento AR-SE23C a las drogas tripanocidas convencionales depende de la duración
del tratamiento y muestran el potencial valor terapéutico de la PENT para la infección por
T. cruzi. Financiado por FONCyT, PICT-2010-2148. >
DYT10
COMPUTER-AIDED SEARCH
ANTICHAGASIC EFFECTS
OF
NOVEL
RIBOFLAVINE
ANALOGS
WITH
María Laura Sbaraglini(1), Mauricio Di Ianni (2), Laura Fraccaroli(3), Dario Balcazar(4),
Carolina Carrillo(5), Alan Talevi(6)
(1)(2)(4)(5)(6)
Facultad de Ciencias Exactas UNLP. (3)Instituto Milstein.
E-mail: [email protected]
Chagas disease is a parasitic disease endemic in Latin America, caused by the
hemoflagelate Trypanosoma cruzi. Recent data from the World Health Organization
indicate that there are around 10 million infected people and 25 million exposed to
contagion. We have previously reported that the riboflavine permease from T. cruzi might
be a promising new drug target. In this work we have applied a combination (ensemble) of
molecular similarity search techniques to search for riboflavin analogs throughout chemical
repositories DrugBank 3.0 and Sweetlead. Chemaxon (JChem 6.1.0 2013
www.chemaxon.com) and PowerMV (National Institute of Statistical Science V0.61) were
used to compute a diversity of fingerprints (e.g. extended connectivity fingerprints,
pharmacophere fingerprints, functional class fingerprints) and similarity metrics. These
metrics were thus combined to enhance their enrichment ability. 80 compounds were
selected as promising candidates; 2 of them (aloin and inosine) were acquired and their
antiproliferative effect was tested on T. cruzi epimastigotes, counting, daily, the number of
parasites per unit of volume in Neubauer chamber. Complementarily, MTT assay was
used to assess the parasite viability. The present work constitutes and example of rational
drug repurposing, in which novel therapeutic indications of already known drugs are
sought with the aid of cheminformatic and bioinformatic tools.
DIAGNOSIS & TREATMENT
97
DYT11
Sarcoptes scabiei VARIEDAD HOMINIS, SARNA COSTROSA Y COMORBILIDADES
ASOCIADAS: NUESTRA CASUÍSTICA.
Marcelo Gabriel Medina
INSTITUTO DE MEDICINA REGIONAL-UNNE.
E-mail: [email protected]
La sarna costrosa o noruega es una variedad clínica de escabiosis humana. Su hallazgo
es más frecuente en pacientes con compromiso inmunitario. Dada su alta contagiosidad,
esta forma de escabiosis requiere un diagnóstico temprano y adecuado tratamiento para
evitar la rápida diseminación en el medio familiar y comunitario. El objetivo es describir, 6
casos clínicos de sarna costrosa diagnosticados en el área de Medicina tropical.
Materiales y métodos: Se revisaron retrospectivamente las historias clínicas de
pacientes que consultaron por sarna noruega al área de dermatoinfectología,del Instituto
de Medicina Regional, Universidad Nacional del Nordeste, durante los últimos 6 años.
Resultados: Se presentan 6 pacientes, 3 hombres y 3 mujeres. La edad promedio fue de
47 años. En todos hallamos diferentes patologías asociadas: dermatomiositis, eccema
atópico, hipotiroidismo, psoriasis, diabetes mellitus con pénfigo seborreico y síndrome de
Down. Se observaron cuadros eritrodérmicos, hiperqueratosis en zonas de extensión y
palmoplantar fisurada de aspecto cretáceo asociadas a prurito de intensidad variable.
Todos nuestros pacientes mejoraron con ivermectina en dosis única. Conclusiones: La
sarna noruega ha experimentado un aumento de su incidencia debido a las malas
condiciones socioeconómicas y la falta de condiciones higiénicas de la población, lo cual
es un factor determinante junto a la depresión del sistema inmunológico. La ivermectina
es una alternativa válida en el tratamiento de la sarna noruega.
DYT12
EL TEST DE INMUNOFLUORESCENCIA
DIAGNOSTICO DE ACANTHAMOEBOSIS
COMO
HERRAMIENTA
PARA
EL
Sixto R Costamagna, Norma Basabe, Viviana Randazzo, María Prat, Elena Visciarelli,
Leandro Lucchi
Cátedra de Parasitología Clínica. Dto. Biología, Bioquímica y Farmacia. Universidad
Nacional del Sur. Bahía Blanca.
E-mail: [email protected]
Acanthamoeba sp., es una Ameba de Vida libre, que puede afectar al hombre y animales
produciendo Encefalitis Granulomatosa, sinusitis, Acanthamoebosis Cutánea o queratitis,
y requieren un rápido diagnóstico. Los objetivos de este trabajo fueron: Realizar un test de
inmunofluorescencia (IF), para identificar trofozoítos o quistes en materiales biológicos y
otro de inmunofluorescencia indirecta (IFI) para cuantificar Ac(s). Materiales y Métodos:
cultivos de Acanthamoeba polyphaga en agar no nutritivo enriquecido con Escherichia
coli, axenizados por pasajes en medio MYAS y posterior suspensión en solución
fisiológica fenolada al 5%. La inmunización se realizó en conejos, con 50000 formas / ml.
(quistes o trofozoítos) con adyuvante de Freund. Previo a las inoculaciones se obtuvo
suero pre-inmune. Controles negativos se realizaron inoculando solución fisiológica
DIAGNOSIS & TREATMENT
98
estéril. A los 45 días se obtuvo suero, determinándose su eficacia frente a improntas de
quistes y trofozoítos, separadamente con anti-IgG de conejo marcada con FITC, por IFD.
Los resultados, que se mostrarán en imágenes, fueron altamente satisfactorios, tanto para
quistes como para trofozoítos de Acanthamoeba, mostrando importante fluorescencia en
la pared de quistes, y en el citoplasma y membrana celular de trofozoítos, destacándose
las vacuolas de excusión de agua como zonas oscuras sin fluorescencia. Respecto a la
IFI, los títulos en suero pre-inmune de conejo fueron menores a 1:32 y en sueros inmunes
mayores a 1:64. Cuando se reemplazó el suero de conejo por suero humano de personas
sanas, los títulos fueron de 1:16 o menores. Conclusión: los animales inmunizados
mostraron valores indicativos de enfermedad activa a partir de títulos de IFI 1:64 y basales
de 1:32; en humanos valores basales menores a 1:16. Los resultados en IF para quistes y
trofozoítos fueron altamente satisfactorios. Actualmente estamos marcando los Ac(s)
obtenidos, con FICT, para disponer de un kit de IFD para diagnóstico sobre tejidos.
DYT13
EVALUACION IN VITRO DEL EFECTO DE Lactobacillus casei SOBRE ADULTOS DE
Trichinella spiralis
Sixto R Costamagna, Viviana Randazzo
Cátedra de Parasitología Clínica. Dto. Biología, Bioquímica y Farmacia. Universidad
Nacional del Sur. Bahía Blanca.
E-mail: [email protected]
En experiencias previas demostramos el efecto antagónico e inmunomodulador de los
probióticos Lactobacillus casei y Kefir de leche sobre la infestación por larvas del
nematode Trichinella spiralis. El objetivo del presente estudio fue evaluar la acción directa
in vitro del probiótico Lactobacillus casei ATCC 7469 sobre el estado adulto de T. spiralis
cepa BBSC01. Para la experiencia se utilizaron parásitos adultos, machos y hembras, de
T. spiralis viables y el probiótico L. casei ATCC 7469. Treinta parásitos adultos fueron
incubados con 5 ml de suspensión de L. casei 190000000 ufc/ml, en solución fisiológica.
Las incubaciones se realizaron en estufa a 37ºC durante 8 hs y fueron observadas al
microscopio óptico cada hora, verificándose la viabilidad del parásito mediante la
coloración de azul de metileno, descripta por los autores. Cada uno de los ensayos fue
realizado por duplicado, calculándose las medias y las desviaciones estándar en cada
grupo. Los resultados en la primera hora de incubación no evidenciaron cambios
significativos entre grupos, respecto a la viabilidad del parásito, manteniéndose intacto su
tegumento. A partir de la segunda hora de incubación con el probiótico, se observó una
significativa pérdida de viabilidad de los parásitos, evidenciándose un marcado daño de la
cubierta externa parasitaria, dependiente directamente del tiempo de incubación. Los
resultados, cuyas imágenes se mostrarán en el póster, demostraron el efecto nematocida
del L. casei, por acción directa, probablemente por metabolitos tóxicos que afectan la
cutícula externa del parásito. Actualmente se está tratando de determinar el mecanismo
que destruye a T. spiralis en este estudio in vitro. Este efecto, directo, se sumaría a los
efectos, inmunomoduladores de los probióticos, obstaculizando la entrada de las hembras
grávidas de este helminto a la mucosa intestinal. Se abre una nueva hipótesis referida a la
utilidad de los probióticos como antihelmínticos.
DIAGNOSIS & TREATMENT
99
DYT14
EVALUATION OF 1-INDANONE THIAZOLYLHYDRAZONE DERIVATIVES
PROBABLE SQUALENE EPOXIDASE INHIBITORS OF Trypanosoma cruzi
AS
Vanesa R Puente(1), Guido J Noguera(2), Alcira Batlle(3), Liliana M Finkielsztein(4), Elisa
Lombardo(5)
(1)(3)(5)
Centro de Investigaciones sobre Porfirinas y Porfirias (UBA - CONICET). (2)(4)Química
Medicinal, Depto de Farmacología, Facultad de Farmacia y Bioquímica, UBA.
E-mail: [email protected]
Sterol biosynthesis inhibitors are promising entities for the treatment of trypanosomal
diseases. Squalene epoxidase (SE) is a key enzyme of ergosterol biosynthetic pathway
and an attractive potential target for antichagasic drugs. We have developed a serie (17
compounds) of 1-indanone thiazolylhydrazone derivatives (TZHs) with relevant activity
against the proliferative stages of Trypanosoma cruzi. Previous results suggest that
inhibition of ergosterol biosynthesis could be a possible target for the action of these TZHs.
In this work, our aim was verify that the anti T. cruzi activity of this drugs is due to the
inhibition of squalene epoxidase. Using the ShaEP software, the molecular overlap among
TZHs and the terbinafine (specific inhibitor of squalene epoxidase) was assayed. This
program evaluates the structural similarity based on the shape and electrostatic potential
of overlapping molecules. Simultaneously, the effect of THZs on squalene epoxidase
activity was evaluated, using a cell-free supernatant (derived from parasites sonicated and
then centrifuged at 10000 g for 15 min) as enzyme source. After incubation the extracted
lipids were dissolved in chloroform and analyzed by TLC. A higher percentage of enzyme
inhibition was observed for a greater structural similarity index from computer analysis. So,
for TZH 8 and 9, which showed the highest percentages of inhibition (38.88 ± 1.12 and
40.17 ± 6.50 respectively), the computational analysis yielded values of about 80.3 to 75.9
% similarity in shape and 73.7 to 65.7% similarity in electrostatic potential, respectively. In
conclusion, the biological and computational results showed that TZHs could be able to
inhibit squalene epoxidase activity. These results prompt us to continue with the structural
modifcation of these compounds to obtain better inhibitors of this enzyme.
DYT15
ANTIGENIC AND FUNCTIONAL STUDIES ON TRYPOMASTIGOTE SMALL SURFACE
ANTIGEN OF Trypanosoma cruzi
Virginia Balouz(1), María de los Milagros Cámara(2), Gaspar E Cánepa(3), Santiago
Carmona(4), Romina Volcovich(5), Jaime Altcheh(6), Fernan Agüero(7), Carlos A Buscaglia(8)
(1)(2)(3)(4)(7)(8)
Instituto de Investigaciones Biotecnológicas . (5)(6)Servicio de Parasitología y
Enfermedad de Chagas, Hospital de Niños “Dr. Ricardo Gutierrez”.
E-mail: [email protected]
Trypanosoma cruzi is the etiological agent of Chagas disease. TSSA (Trypomastigote
Small Surface Antigen) is a 92-aa long mucin-like glycoprotein displayed on the surface of
infective trypomastigote forms that elicits strong antibody responses in T. cruzi-infected
humans. In addition, TSSA functions as a parasite adhesin, engaging surface receptor(s)
and inducing signaling pathways on the host cell as a prerequisite for trypomastigote
DIAGNOSIS & TREATMENT
100
internalization. Here, we used synthetic peptides and recombinant deletion molecules to
map the antigenic region of TSSA-CL, the TSSA isoform expressed by the CL Brener
clone. We verified specific antibody reactivity for most of the central region of TSSA-CL
(from residue 24 to 58), indicating a complex linear B-cell epitope repertoire. Additional
studies allowed us to define a 21-aa peptide (termed E2E3) showing the same
performance (in terms of sensitivity and specificity) as serodiagnostic reagent for Chagas
Disease than the whole TSSA-CL molecule. Tools generated to carry out these antigenic
characterizations were further used to explore the variability of anti-TSSA-CL humoral
responses along the human infection and to map the adhesive motifs of TSSA-CL towards
non-macrophagic cell lines. Regarding the latter issue, we show that two discrete 15-aa
peptides from TSSA-CL bound to HeLa cell monolayers in a dose-dependent manner. This
binding has a functional correlate, since when exogenously added these peptides were
able to significantly inhibit both adhesion and internalization of CL Brener trypomastigotes.
These peptides, however, did not impair adhesion/internalization of CL Brener amastigotes
(which do not express TSSA) or of Sylvio X-10 trypomastigotes (which display a different
TSSA isoform on their surface), further supporting the specificity of our results. Overall, our
data provide novel insights into the function and diagnostic properties of TSSA.
DYT16
DETECCIÓN DE TOXOPLASMOSIS AGUDA MEDIANTE INMUNOAGLUTINACIÓN
Leandro E Peretti(1), Verónica DG Gonzalez(2), Juan G Costa(3), Iván S Marcipar(4), Luis M
Gugliotta(5)
(1)(2)(5)
INTEC (UNL – CONICET), Santa Fe, Argentina.. (3)(4)Laboratorio de Tecnología
Inmunológica, FBCB, UNL, Santa Fe, Argentina..
E-mail: [email protected]
Este trabajo describe la obtención de complejos látex-proteína (CLP) y su evaluación
como reactivos de inmunoaglutinación para la detección de Toxoplasmosis aguda. Se
emplearon partículas de látex de diferente tamaño y densidad de carga superficial (2 látex
de poliestireno y 4 látex tipo “core-shell” con funcionalidad carboxilo). Las partículas de
látex fueron sensibilizadas con diferentes proteínas antigénicas de Toxoplasma gondii
mediante adsorción física (AF) y unión covalente (UC). Los antígenos (Ags) empleados
fueron 2 proteínas recombinantes de fase aguda de T. gondii, P35Ag y P22Ag, y el
homogenato del parásito. Se observó que la mayor cantidad de proteína unida se obtuvo
con las proteínas recombinantes. La menor eficiencia de unión observada con el
homogenato del parásito podría deberse a que se trata de una mezcla indefinida que
incluye un gran número de proteínas de diferentes masas molares, puntos isoeléctricos y
afinidades por la superficie de las partículas. Con el objetivo de estudiar la antigenicidad
de las proteínas ligadas a las partículas, los CLP se evaluaron en ensayos de ELISA
frente a sueros controles (clasificados por técnicas de referencia) negativos, agudos y
crónicos. Los resultados mostraron que la antigenicidad de los Ags unidos a la superficie
de las partículas no se vio afectada seriamente durante la sensibilización por AF y UC.
Finalmente, los CLP se evaluaron en ensayos de inmunoaglutinación frente a un panel de
sueros, donde la reacción de aglutinación se detectó midiendo los cambios en la
absorbancia óptica por turbidimetría. Se construyeron curvas ROC, donde los grupos
analizados fueron: i) sueros agudos (n=8) y ii) sueros negativos + crónicos (n=12). El área
DIAGNOSIS & TREATMENT
101
bajo la curva de los CLP-P35Ag y CLP-P22Ag fue de 0,927 y 0,881, respectivamente;
indicando que estos reactivos serían capaces de discriminar los sueros agudos respecto a
los crónicos y negativos.
DYT17
VALIDACIÓN DEL RECUENTO DE EPIMASTIGOTES DE Trypanosoma cruzi
MEDIANTE UN ANALIZADOR HEMATOLOGICO AUTOMATIZADO APLICADO AL
SCREENING DE COMPUESTOS
Isabel Nocito(1), Noelia Mingo(2), Romina Manarin(3), Adriana Cortadi(4), Victoria L Alonso(5)
Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas – Universidad Nacional de
Rosario. (5)Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas – Universidad Nacional de
Rosario. IBR-CONICET.
E-mail: [email protected]
(1)(2)(3)(4)
Con el propósito de reducir los tiempos de recuentos de epimastigotes de Trypanosoma
cruzi en el screening de compuestos, nos propusimos comparar los resultados obtenidos
mediante cámara de Neubauer con respecto al uso de un contador hematológico
automatizado. Para esto se utilizó el equipo WL 19 Counter AA (Weiner Lab), diseñado
para el recuento diferencial de leucocitos, glóbulos rojos y plaquetas. Después de ajustar
ciertas variables en el equipo (reemplazo del reactivo lisante por agua destilada, ajuste de
la ganancia del canal de leucocitos y cambios de unidades), observamos que los
epimastigotes eran detectados correctamente dentro de la población de leucocitos.
Diseño experimental: Se utilizaron epimastigotes de la cepa Dm28c los cuales se trataron
durante 72 horas con extractos vegetales. Luego, los parásitos, previamente fijados en
formaldehído al 3,7% y homogenizados, se contaron en cámara de Neubauer y en el
contador automatizado. Además, se registraron los posibles cambios morfológicos por
observación directa y/o coloración Giemsa. Resultados: Se evaluó el efecto de diferentes
concentraciones (5 a 100 µg/mL) de 2 extractos vegetales de la especie Myrsine Parvifolia
provenientes de fruto (A) y tallo (B). El extracto A disminuyó significativamente el
crecimiento de los parásitos respecto de los parásitos control en todas las
concentraciones empleadas. Sin embargo, el extracto B resultó ser poco efectivo. Como
control se utilizo Benznidazol, la droga utilizada actualmente para el tratamiento de la
Enfermedad de Chagas (0-20 µM) y se calculo su CI50, el cual fue comparable al
reportado en la literatura. El recuento parasitario en todas las condiciones fue similar
mediante ambas metodologías. Conclusión: Es posible reemplazar el recuento manual por
el contador automático, ya que no hay diferencias significativas entre ambos métodos.
Además, la reducción del tiempo de trabajo fue muy considerable, pudiendo evaluar un
gran número de compuestos simultáneamente.
DYT18
CLINICAL EFFICACY
METACESTODES
OF
CARVACROL
AGAINST
Echinococcus granulosus
DIAGNOSIS & TREATMENT
102
Julia Fabbri, Patricia E Pensel, Marina A Maggiore, Guillermo M Denegri, María C
Elissondo
Laboratorio de Zoonosis Parasitarias - FCEyN - UNMdP.
E-mail: [email protected]
Human cystic echinococcosis is a zoonosis caused by the larval stage of the tapeworm
Echinococcus granulosus. This disease represents an important zoonosis with highly
endemicity in some countries in South America, especially in Argentina, Chile, Uruguay
and Brazil. Echinococcosis in humans and animals is an economic and public health
concern in many parts of the world. Currently, surgery is still the preferred method of
treatment, despite the risk of intraoperative spillage of protoscoleces. However, the search
of new therapeutic alternatives such as the use of traditional medicinal plants has been
increased. Carvacrol is one of the main phenolic components from essential oils of
Thymus vulgaris (thyme) and Origanum vulgare (oregano). Its activity in vitro against
protoscoleces and cyst of E. granulosus has been reported. The aim of the present work
was to determine the clinical efficacy of carvacrol against E. granulosus metacestodes.
Carvacrol treatment resulted in a statistically significant reduction on the cysts weight
compared to those obtained for control mice (p<0.05). All cysts in the samples removed
from control mice appeared turgid, showing no observable collapse of the germinal layer.
At ultrastructural level, the cyst showed typical features of E. granulosus metacestodes,
with a germinal layer comprised of different cell types. In contrast, the ultrastructural study
of cysts developed in mice treated with the carvacrol suspension revealed lost of the
characteristic multicellular structure. The data obtained demonstrated that the in vivo
treatment with carvacrol is effective against E. granulosus metacestodes.
DYT19
ANTIPROTOZOAL POTENTIAL OF
ANTARTIC MACROALGAE
SOME
TROPICAL,
SUBANTARTICA AND
Fábio Aurélio Esteves Torres(1), Thais Gaban Passalacqua(2), Letícia de Almeida(3), Angela
Maria Arenas Velasquez(4), Erika Mattos Stein(5), Daniel Xavier Andreguetti(6), Leonardo
Zambotti Villela(7), Andres Mansilla(8), Pio Colepicolo(9), Márcia Graminha(10)
(1)(2)(3)(4)(10)
Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho (UNESP) Faculdade de
Ciência Farmacêuticas Campus Araraquara. (5)(6)(7)(9)Universidade de São Paulo (USP)
Instituto de Química. (8)University of Magallanes (UMAG).
E-mail: [email protected]
Neglected tropical diseases have a higher prevalence in tropical and subtropical regions
and affect more than 1 billion people worlwide. The Whorl Health Organization developed
a list of 17 NTDs including the protozoan-borne diaseases leishmaniasis and human
African trypanosomiasis (HAT), the main focus of this work. They are called neglected
because they persist only in the poorest, most marginzalized communities and conflict
areas. The biochemical, pharmacological and molecular aspects Leishmania amazonensis
and Trypanosoma brucei, the causative agents of tegumentar leishmaniasis and HAT
have been performed by our group. In addition, the aim of our study is to perform the
screening from different extracts of various algae species originated from Antarctic
(Shetland island), Chile (subantarctic region) and from brazilian coast. To determine the
DIAGNOSIS & TREATMENT
103
antiprotozoal activity (Ic50) of these extracts, counting of Neubauer chamber was
performed using amastigotes and promastigotes forms of L. amazonensis and procyclic
forms of T. brucei; for evaluation of citotoxicity (CC50) and selective index (SI), J774.A1
macrophages were used, according to Mosmann (1983). Preliminary results showed that
the hexane extract of the Antartic algae Himanthotallus grandifolius showed both
leishmanicidal (IC50promastigota = 112μg/mL) and trypanocidal (IC50 = 195,9 μg/mL)
activities with SI values of 4,21 amd 2,41, respectively. For the Subantartic algae
Sarcothala crispata, the antileishmanial (IC50promastigotes = 64,55μg/mL) and
trypanocidal (IC50 = 20,15μg/mL) activities were also interesting, despite the low SI for L.
amazonensis (SI = 1,49). None tropical algae presented relevant antiprotozoal activities.
These results suggest that the algae from the Antartic and Subantartic regions probably
produce different and interesting secondary metabolites from those found in the algae from
the brazilian coast, probably responsible for the bioactivities and that will be explored by
HPLC-MS analysis.
DYT20
TRATAMIENTO COMBINADO DE BENZNIDAZOL (BZ) Y ALOPURINOL (ALO) EN LA
INFECCIÓN CRÓNICA MURINA POR Trypanosoma cruzi NICARAGUA (TcN)
M.Lujan Scalise (1), Marcela Rial (2), Micaela M López Alarcón (3), Mónica Esteva (4),
Jacqueline Búa (5), Alejandro Benatar (6), Nilda Prado (7), Adelina Riarte (8), Laura E Fichera
(9)
(1)(3)(4)(5)(7)(8)(9)
INP Dr. M. Fatala Chaben ANLIS/Malbrán. (2)INP Dr. M. Fatala Chaben
ANLIS/Malbrán CAECIHS-UAI. (6)INGEBI-CONICET.
E-mail: [email protected]
El objetivo de este estudio es obtener mayor conocimiento sobre la respuesta al
tratamiento de BZ y ALO en la infección crónica con TcN en C3H/HeN y en C57BJ/6 con
dos esquemas de tratamiento: uno, con dosis diarias bajas de BZ seguido de ALO y otro,
intermitente, con 100 mg/kg cada 5 días de BZ seguido de ALO. Cuatro grupos de ratones
por cada cepa, se trataron con 30 dosis orales de BZ 75 o 50 mg/kg/día y en un grupo de
cada dosis de BZ se continuó con 30 dosis orales de ALO 64 mg/Kg/día. En el tratamiento
intermitente se trataron 2 grupos de C57BJ/6 con BZ 100mg/kg/cada 5 d y un grupo fue
continuado por 30 dosis de ALO. Luego del sacrificio, 7 meses post-infección, los
C3H/HeN muestran un índice de inflamación (II) de 0.79 que disminuye a 0.21 y 0.10 con
BZ 75mg y BZ 75mg con ALO respectivamente; la serología se negativiza en un 90% en
los tratamientos con BZ 75 y en un 50 % con las dosis más bajas. En los C57BJ/6 el II de
los tratados mejora en un 70 % la inflamación asociada a la infección. La parasitemia por
qPCR disminuyó de 3.51 a 0.16 EqP/ml. La serología se negativiza con el tratamiento a
bajas dosis de BZ y combinado con ALO en un 100% de los ratones tratados . El estudio
electrocardiográfico de los C57BJ/6 crónicos muestra una significativa disminución de la
frecuencia cardíaca mientras que con todos los tratamientos la bradicardia se revierte. El
tiempo de conducción del nódulo aurículo-ventricular en los crónicos no tratados fue
significativamente mayor que en los animales tratados. El tratamiento intermitente con BZ
mostró que la serología se negativizó en un 83 % de los ratones tratados con BZ y en un
100 % en los combinados con ALO. Conclusiones: Por la acción del BZ a bajas dosis solo
o combinado con ALO y en un protocolo de tratamiento intermitente a los 7 meses post-
DIAGNOSIS & TREATMENT
104
infección , los ratones mostraron negativización de la serología, menor parasitemia por
qPCR y menor patología cardíaca evaluada por índice de inflamación.
DYT21
TRATAMIENTO CON BENZNIDAZOL (BZ) Y ALOPURINOL (ALO) EN RATONES
C3H/HEN INFECTADOS CRÓNICAMENTE CON Trypanosoma cruzi SYLVIO X10/4
Marcela Rial(1), Luján Scalise(2), Micaela M López Alarcón (3), Jacqueline Búa(4), Mónica
Esteva(5), Nilda Prado(6), Adelina Riarte(7), Laura E Fichera (8)
(1)
INP Dr. M. Fatala Chaben ANLIS/Malbrán/CAECIHS-UAI. (2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)INP Dr. M. Fatala
Chaben ANLIS/Malbrán.
E-mail: [email protected]
La cardíopatía chagásica es provocada por una diversidad de cepas virulentas como T.
cruzi Nicaragua estudiado en nuestro laboratorio (Grosso, Lopez Alarcón y col., 2013;
López Alarcón y col., SAP 2013; Scalise y col., SAP 2014). En este trabajo ampliamos
nuestro estudio sobre el efecto de bajas dosis de BZ combinado con ALO en el modelo
crónico de infección por T. cruzi SylvioX10/4. Cuatro grupos de ratones se trataron con 30
dosis orales de BZ 75 y 50 mg/kg/día y en un grupo de cada dosis de BZ se continuó con
30 dosis orales de ALO 64 mg/Kg/día. Los ratones infectados no tratados y los tratados se
sacrificaron a los 7 meses post infección. Nuestros resultados mostraron que en los
ratones tratados la inflamación asociada a la infección disminuyó en un 80 %, la serología
se negativizó en un 64 % de los ratones tratados solo con BZ y en un 83 % en los que
continuaron con ALO, además se normalizó la disminución de la frecuencia cardíaca,
medida por electrocardiografía, en todos los tratamientos, Conclusiones: Estos resultados
indican que los tratamientos con bajas dosis de BZ en combinación con ALO en la etapa
crónica tiene efectos positivos en la evolución de la infección crónica murina por T. cruzi,
previniendo alteraciones cardiacas. Una mejor comprensión de la respuesta a los
tratamientos dada la interacción de las diferentes cepas de ratones y las diferentes cepas
de T. cruzi, podría contribuir al desarrollo de terapias más eficaces para el tratamiento de
la enfermedad de Chagas.
DYT22
LAMP, DETECCIÓN COLORIMÉTRICA DE ADN DE Trypanosoma cruzi EN
MUESTRAS DE NEONATOS INFECTADOS UTILIZANDO SYBR® GREEN
Rocío Rivero(1), Elsa B Velázquez, (2), Mónica I Esteva(3), Ana María De Rissio, (4),
Margarita Bisio(5), Andrés M Ruiz.(6)
(1)(2)(3)(4)(6)
Instituto Nacional de Parasitología . (5)Servicio de Parasitología y Enfermedad de
Chagas, Hospital de Niños Dr. Ricardo Gutiérrez, Buenos Aires, Argentina.
E-mail: [email protected]
La técnica de LAMP se basa en el principio de síntesis de ADN por desplazamiento de
cadena. Es efectuado por la enzima Bst, una ADN polimerasa con actividad de
desplazamiento y un sistema de cuatro oligonucleótidos, que reconocen un total de seis
DIAGNOSIS & TREATMENT
105
secuencias distintas en el ADN blanco. La amplificación se obtiene en una hora y es
posible la lectura directa del producto amplificado, por la adhesión de sustancias que se
integran al producto (cambian de color en presencia del blanco buscado) sin necesidad de
recurrir a un gel de agarosa. En nuestro laboratorio se realizó la optimización de la
reacción de LAMP para la detección de ADN de T. cruzi en neonatos nacidos de madres
con serología reactiva al parásito (Thekisoe, O. M., et al., Am J Trop Med Hyg. 2010).
Para la detección del ADN de T. cruzi a simple vista se adicionó SYBR® Green, Invitrogen
(S7563) a la reacción de LAMP (Goto, M., et al., Bio Techniques 2009). Se ensayó
adicionar 1µl del intercalante antes de iniciada la reacción y una vez finalizada la misma,
en las diluciones 1:10, 1:50, 1:100 en 10 muestras de neonatos infectados con T. cruzi.
Con la adición del intercalante a la master mix antes de iniciada la reacción no se obtuvo
amplificación del ADN, pero cuando se adicionó el agente después de finalizada la misma,
las muestras positivas (N=10) para T. cruzi viraron del color naranja a verde fluorescente
según lo esperado para muestras positivas mientras que los controles negativos
permanecieron de color naranja (N=3). Estas muestras fueron corridas en un gel de
agarosa como control y se observó una perfecta correlación entre ambas formas de
visualización del producto. Los resultados sugieren que LAMP puede surgir como una
alternativa frente a las técnicas convencionales aplicable en condiciones de campo ya que
no requiere equipos costosos para la amplificación así como para la lectura de los
resultados.
DYT23
EFICACIA DE LA PCR EN EL DIAGNÓSTICO DE LA TRANSMISIÓN DE CHAGAS
CONGÉNITA
Rocío Rivero, Elsa B Velázquez, , Mónica I Esteva, Débora L González, Daniela R
Oliveto, Karenina Scollo, Ana María De Rissio, Andrés M Ruiz
Instituto Nacional de Parasitología .
E-mail: [email protected]
La transmisión de Chagas congénita (TC) es la segunda forma de transmisión de
importancia en Argentina. Se estima que entre 1100 y 1300 niños infectados con
Trypanosoma cruzi nacen cada año. Cuando el diagnóstico parasitológico por métodos
directos es negativo el diagnóstico final se completará por métodos serológicos a los 10
meses de vida y dadas las características socio-económicas de la población infectada se
dificulta la finalización del seguimiento. En nuestra experiencia en TC, alrededor del
55,8% de los niños no completan el seguimiento. Cuando evaluamos el valor predictivo de
la PCR en la detección de la infección, éste porcentaje se redujo al 27%. El objetivo de
este trabajo fue evaluar la implementación de la PCR en el diagnóstico de rutina de TC
durante el periodo 2010-2013 en el INP. Para ello se recolectaron muestras de 0,5 ml de
sangre con igual volumen de guanidina se aisló el ADN con columnas y se utilizaron los
primers Tcz 1 y 2. Se estudiaron 870 niños nacidos de madres con serología reactiva para
T. cruzi con un seguimiento de hasta 24 meses. De los niños estudiados 660 completaron
el seguimiento, de los cuales 6,21% (41/660) fueron PCR positivos confirmados por micro
método o serología. El 17,07% (7/41) de los niños, que al primer control tenían menos de
un mes, fue PCR positiva recién a partir del segundo control. El porcentaje con PCR
negativa, confirmados al final del seguimiento, fue del 93,78% (619/660). La pérdida
DIAGNOSIS & TREATMENT
106
durante el seguimiento fue del 24,13% (210/870). No se observaron falsos positivos y/o
negativos durante el estudio. Es importante destacar que una PCR negativa antes del
primer mes debe ser confirmada posteriormente. Los resultados obtenidos indican que la
incorporación de la PCR en el diagnóstico de rutina permite un abordaje efectivo del niño
infectado. Con la incorporación de las técnicas moleculares en el algoritmo del diagnóstico
de la TC se podría realizar el tratamiento en forma precoz aumentando su eficacia
terapéutica.
DYT24
DIAGNÓSTICO DE LA INFECCIÓN CONGENITA POR Trypanosoma cruzi
UTILIZANDO UN TEST SEROLÓGICO CON EL ANTÍGENO SAPA EN MUESTRAS
BINOMIALES MADRE-HIJO
Bibiana J Volta(1), Patricia L Bustos (2), Karenina Scollo (3), Ana María de Rissio(4), Rita L
Cardoni(5), Graciela Russomando(6), Jacqueline Bua(7)
(1)(2)(3)(4)(5)(7)
INP Fatala Chaben. (6)Instituto de Investigaciones de Ciencias en Salud,
Universidad Nacional de Asunción.
E-mail: [email protected]
La transmisión madre-hijo del T. cruzi es de gran importancia epidemiológica. El
diagnóstico temprano del niño infectado es por detección del parasito y generalmente
requiere de un seguimiento hasta los 10 meses de edad. Con el objetivo de detectar
recién nacidos infectados congénitamente por T. cruzi, se analizaron los niveles de
anticuerpos (Acs) contra un antígeno secretado por tripomastigotes (SAPA) en 91
muestras apareadas de madres seropositivas y sus niños recién nacidos. Se estudiaron
70 muestras de madre-hijo no infectado y 21 muestras de madre-hijo con infección
congénita. En 34/70 madres de recién nacidos sin infección, con títulos de Acs anti-SAPA
> 0.4, se observó parasitemia detectable por qPCR (media= 1.71 eP/mL), mientras que en
36/70 madres con Acs anti-SAPA < 0.4, la parasitemia no fue detectable. En los casos de
transmisión congénita, las 21 madres estudiadas tuvieron una media de Acs anti-SAPA =
0.358, con una carga parasitaria de 4.9 eP/mL y en sus bebés recién nacidos la media de
Acs anti-SAPA fue muy superior, de 1.026, con carga parasitaria media de 167 eP/mL.
Los niveles de Acs anti-SAPA correlacionaron con la carga parasitaria (coeficiente
Spearman r2= 0.6921, P < 0.0001). Cuando se analizaron los niveles de Acs anti-SAPA
diferenciales (título del bebé infectado – título de la madre), la relación fue mayor a 1,
pronosticando la infección parasitaria en un 90 % de los 21 binomios madre-hijo
estudiados. Los 2 niños que tuvieron un índice diferencial negativo no tenían parasitemia
detectable, pero fueron positivos por serología y PCR a los seis meses de edad. Estos
resultados indican que estudiando el binomio madre-hijo recién nacido es posible: i)
detectar por serología casos de Chagas congénito, de utilidad en áreas rurales donde no
se puede disponer del PCR; ii) evitar pérdidas por el largo seguimiento del diagnóstico de
Chagas congénito; iii) asegurar inmediato tratamiento de niños, 100 % efectivo en edad
precoz.
DIAGNOSIS & TREATMENT
107
DYT25
ENERGETIC METABOLISM EVALUATED IN Taenia crassiceps cysticerci AFTER
ADMINISTRATION OF PRAZIQUANTEL NANOPARTICLES
Carolina Arrúa1, Luciana Damacena Silva2 Marina Clare Vinaud2, Claudio Salomon1,3.
1
IQUIR-CONICET, Rosario, Argentina. 2 Laboratory of studies of the host-parasite
relationship, Tropical Pathology and Public Health Institute, Federal University of Goiás,
Brazil. 3Área Técnica Farmacéutica, Departamento Farmacia. Facultad de Ciencias
Bioquímicas y Farmacéuticas, UNR, Suipacha 531, S2002LRK Rosario,
Argentina. [email protected]
Taeniidae parasites remain public health issues in many regions of the world, especially in
poor communities. In humans the most frequent form of the disease is neurocysticercosis.
The aim of this work was to formulate Praziquantel (PZQ) nanoparticles to determine its
effect on the energetic metabolism of T. crassiceps cysticerci. The influence of preparation
parameters on particle size, stabilizer type and concentration were evaluated. PZQwas
dissolved in etanol at 25°C, the organic solution was injected dropwise into an aqueous
phase containing a poloxamer derivative and kept under agitation to get a desired
dispersion. The dispersion was then stirred magnetically at 500 rpm at room temperature
to evaporate organic solvent. Solids were collected after filtration, washed with deionized
water and lyophilized. All samples were prepared in triplicate. Female Balb/c mice with 812 weeks old were intraperitoneally inoculated with 10 cysticerci of T. crassiceps (HYG
strain). 30 days post-infection the mice were divided into three groups: a) Group 1
received one oral dose of 50mg/kg of PZQ-P188. b) Group 2 received one oral dose of
50mg/kg of Praziquantel. c) Group 3 received one oral dose of saline solution. 24 hours
after the treatment the mice were euthanized and the cysticerci removed from the
intraperitoneal cavity, washed with PBS and frozen in liquid nitrogen. The cysticerci were
processed and analyzed through HPLC to detect the organic acids. It was possible to
detect the following organic acids: citrate, oxaloacetate, pyruvate, malate, acetate and
fumarate which confirmed the partial inversion of the tricarboxylic acid cycle that occurs in
helminths. In groups 1 and 2 was possible to detect an increase in the oxaloacetate
production and a decrease in the fumarate production when compared to the control group
(group 3) (p<0.05). These results indicate an increase in the cytosolic pathways opposed
to a partial inhibition of the mitochondrial ones.
DYT26
FORMULATION OF CROSS-LINKED AND NON-CROSSLINKED CHITOSAN-BASED
MICROPARTICLES FOR ORAL DELIVERY OF PRAZIQUANTEL FILLED IN HARDGELATIN CAPSULES
Orlandi, S.C. 1 Leonardi, D. 1,2 Salomón, C.J. 1,2
1
Área Técnica Farmacéutica, 2IQUIR – CONICET. Facultad de Ciencias Bioquímicas
y Farmacéuticas, UNR, Suipacha 531, S2002LRKRosario,
Argentina. [email protected]
DIAGNOSIS & TREATMENT
108
The interest of novel drug delivery systems has been focused on oral controlled-release
dosage forms. They distribute more uniformly in the gastrointestinal tract, resulting in more
reproducible release profiles, more predictable gastric emptying, reduced local irritation,
and a minimized risk of dose dumping. In this study, the development of novel
microparticulate solid dosage form of Praziquantel (PZQ), an anthelmintic drug, mainly
used to treat shistososomiasis, was investigated. PZQ was loaded into polymeric
microparticles based on chitosan or chitosan-sodium lauryl sulfate, and then included into
hard gelatin capsules. Spray drying technique was applied to produce the PZQ
microparticles. The product was evaluated by X-ray powder diffractometry, infrared
spectroscopy and scanning electron microscopy. Non-crosslinked microparticles were
prepared without sodium lauryl sulfate. The results obtained suggested that spray-drying is
a good technique for the preparation of both non-crooslinked and crosslinked PZQchitosan microparticles. The dissolution rate of the drug from all chitosan microparticles
was significantly higher than that of drug alone. Unexpectedly, the reinforced crosslinked
microparticles exhibited a higher dissolution rate in comparison with the non-crosslinked
microparticles, probably due to the gelation process. Regarding the behavior of the
particles when incorporated into hard gelatin capsules, it was found that the PZQ
dissolution from crosslinked chitosan formulations was faster than the reference capsule.
The characterization of the polymeric matrix indicated a clear ionic interaction between the
polymer and the surfactant that would be responsible for the modified dissolution rate. In
conclusion, chitosan-sodium lauryl sulphate microparticles prepared by spray drying, is a
promising approach to deliver PZQ in hard gelatin capsules.
DYT27
FLUORESCENT DRUG SCREENING FOR THE EVALUATION OF BENZNIDAZOLE
SUSCEPTIBILITY OF DIFFERENT Trypanosoma cruzi FIELD ISOLATES
Andrea Ramos, Paula G Ragone, Nicolás Tomasini, Mercedes Monje Rumi, Patricio
Diosque, Miguel Ángel Basombrío, Cecilia Pérez Brandán
Instituto de Patología Experimental- CONICET- Universidad Nacional de Salta.
E-mail: [email protected]
Introduction: Chagas disease is one of the most serious public health problems in Latin
America and is the clinical manifestation of the infection by Trypanosoma cruzi. Currently
the drugs used to treat Chagas' disease are Benznidazole and Nifurtimox. Therapeutic
failure of Benznidazole (BZN) has been widely documented in Chagas disease and has
been mainly associated to variations in the drug susceptibility of T. cruzi strains. Objective:
To evaluate the in vitro susceptibility to BZN of different T. cruzi genotypes from the Chaco
region in Argentina. Materials and methods. 35 T. cruzi stocks from the Chaco region in
Argentina, and belonging to the TcI, TcIII, TcV and TcVI Discrete Typing Units (DTUs)
were selected to evaluate the in vitro susceptibility to BZN. In this first stage of the study, 5
TcI isolates were transfected with the plasmid pTrex-tdTomato in order to generate
fluorescent lines to be analyzed in vitro with a fluorescent plate reader. As a preliminary
step, the IC50 to BZN of epimastigotes was determined. Additionally, the in vitro
susceptibility was correlated with genetic distances, biological and eco-epidemiological
parameters. Results. The 5 TcI isolates examined were sensitive to BZN. The IC50 value
of only one isolate showed to be slightly higher than the others. Correlations between the
DIAGNOSIS & TREATMENT
109
IC50 and genetic distances, biological and eco-epidemiological parameters do not predict
differences in susceptibility to BZN. Conclusions. Taking into account that in the Chaco
region inhabit a large number of eligible individuals to be treated, the evaluation of the
susceptibility to benznidazole of the different T. cruzi genotypes circulating in this region is
relevant. Further in vitro and in vivo studies involving the rest of the isolates are planned.
This work is supported by Fundación Fiorini, CIUNSa and ANPCyT.
DYT28
IDENTIFICACIÓN DE ESPECIES DE Leishmania EN MUESTRAS DE PACIENTES DE
SALTA: UTILIDAD DE LA TÉCNICA DE PS-PCR
Gabriela González Prieto1, Fernanda García Bustos2, Federico Ramos1, Alejandro
Uncos2, Paola Barroso2, Cecilia Parodi3 y Alejandra Barrio1
1 Fac de Cs de la Salud, Universidad Nacional de Salta- Argentina
2 Instituto de Patología Experimental-CONICET. Salta, Argentina
3 Instituto de Medicina Experimental-CONICET. Bs As, Argentina
La identificación de especies de Leishmania tiene importancia epidemiológica en Salta,
donde se encuentra la zona de mayor endemicidad en nuestro país. Sin embargo hasta el
momento, excepto por trabajos de nuestro grupo, la identificación de muestras se ha
llevado a cabo en laboratorios externos. Por este motivo nuestro objetivo fue optimizar la
técnica de PCR de polimorfismo específica (PS-PCR) (Barrio y cols, 2009), identificar
especies de Leishmania en muestras de pacientes y comparar su sensibilidad con la PCR
con primers genéricos (PCRk) que utilizamos actualmente para diagnóstico (Barrio y cols,
2007). Se incluyeron muestras de pacientes con diagnóstico parasitológico positivo
(microscópico y/o aislamiento en cultivo) y que fueron positivas mediante PCRk. Se
trabajó con dos tipos de muestras: a) parásitos aislados en cultivo mediante aspirado de
lesiones (n=38) y b) muestras clínicas obtenidas de raspado de lesiones (n=52). Además,
con el fin de determinar la sensibilidad de la técnica de PS-PCR con respecto a PCRk, se
realizaron diluciones sucesivas de parásitos en buffer TE (desde 0.0001p/300µl TE a 106
p/300µl TE). La PCRk mostró un límite de detección de 0.01 p/300µl TE, mientras que la
PS-PCR (con primers de subgénero) 103p/300µl TE. De los 90 casos analizados, se pudo
determinar el subgénero del 67.7%(n=61): 56 amplificaron subgénero Viannia (V) y 5 el
subgénero Leishmania. A su vez, 38 muestras fueron identificadas como L (V) braziliensis
y 3 como L (L) amazonensis. En el resto de casos (32.3%), no fue posible identificar la
especie. A pesar de la baja sensibilidad de la técnica de PS-PCR con respecto a PCRk
(sensibilidad=0.67) para ser utilizada en diagnóstico, es importante su aplicación en
nuestro laboratorio para la identificación de aislados en cultivo, en los cuales se pudo
determinar subgénero y especie en el 100% de casos.
DYT29
DIAGNOSIS & TREATMENT
110
EVALUACIÓN PRELIMINAR DE LA SEGURIDAD DEL NUEVO BENZNIDAZOL EN EL
TRATAMIENTO DE ADULTOS CON INFECCIÓN CRÓNICA POR Trypanosoma cruzi
Marisa L Fernandez, Juan G Tomás, Yolanda M Hernandez, Nilda G Prado, Adelina R
Riarte
INP Dr Mario Fatala Chaben.
E-mail: [email protected]
Desde el inicio del uso del benznidazol (BNZ), en la decada de 1970, se han registrado
frecuentes efectos adversos (EAs) en los pacientes adultos. A partir de 2012 se inicia la
producción en Argentina por Laboratorio Elea Métodos Se realizó un análisis retrospectivo
de las historias clínicas de pacientes >17 años con infección crónica por Trypanosoma
cruzi tratados con BNZ-Elea desde junio 2012 hasta julio 2014. Se registraron datos
demográficos, clínicos, duración del tratamiento y aparición de EAs. Se compararon los
resultados con los datos del estudio TRAENA, un ensayo clínico aleatorizado doble ciego
con 352 pacientes tratados con BNZ-Roche. Se aplicó Test exacto de Fisher y se
consideró significativo un valor de p< 0,05. Resultados: Se trataron 112 pacientes (p),
entre 18 y 57 años (media 35,27 ± 9 años) de los cuales 67% (75 p) eran mujeres. El 72%
(81 p) completaron el tratamiento; 12% (14 p) suspendieron por indicación médica; y 16%
(18 p) abandonaron el mismo. Se detectaron 1,7% (2 p) EAs serios, que requirieron
internación por neutropenia febril. El tipo y prevalencia de EA fueron: farmacodermia 49%
(55 p), intolerancia digestiva 20% (22 p), artralgias 9% (10 p), fiebre 8% (9 p), adenopatías
4% (5 p), neuropatía periférica 6% (6 p), leucopenia 3% (4 p), eosinofilia 6% (7 p) y
elevación de las transaminasas 7% (8 p) Se detectaron diferencias significativas para
hepatitis toxica (p = 0,001), artralgia/artritis (p=0,017) y leucopenia (p= 0,032) en los
pacientes tratados con BNZ-Elea vs BNZ-Roche. También se observó una mayor
tendencia al abandono del tratamiento (p=0,08) y fiebre (p=0,09) en el primer grupo. No
se observaron diferencias respecto a la presencia de farmacodermia, adenopatías y
neuropatía periférica. Conclusiones: La evaluación con el nuevo BNZ sugiere una mayor
frecuencia de ciertos EAs. Estos datos destacan la importancia de realizar un seguimiento
estricto de las personas bajo tratamiento, un registro sistemático y la optimización del
manejo de los mismos
DYT30
EVALUACIÓN DEL EFECTO IN VITRO DE LA AZITROMICINA, SOLA O EN
ASOCIACIÓN CON BENZNIDAZOL, SOBRE Trypanosoma cruzi
Maria E Solana(1), Julián E Gulin(2), Catalina D Alba-Soto(3), Jaime Altcheh(4), Facundo
García-Bournissen(5)
(1)(3)
IMPaM (UBA/CONICET). Fac. Medicina. UBA. (2)(4)(5)Servicio de Parasitología y
Enfermedad de Chagas, Hospital de Niños Dr. Ricardo Gutiérrez, Buenos Aires.
E-mail: [email protected]
La azitromicina (AZM) es un antibiótico macrólido con actividad contra Plasmodium sp,
Toxoplasma gondii y algunas especies de Leishmania. A pesar de su actividad contra
protozoos, no parece haber sido estudiado contra T. cruzi, el agente causante de la
enfermedad de Chagas. El objetivo de este trabajo fue evaluar la acción de AZM in vitro
contra T. cruzi como monodroga o en combinación con benznidazol (BZ). Células Vero
DIAGNOSIS & TREATMENT
111
previamente irradiadas e infectadas con tripomastigotes sanguíneos (trip) de la cepa VD
(relación 1:5) durante 2hs a 37°C y 5% CO2 fueron tratadas con 10-160 µg/ml de AZM
durante 72 hs. Finalizado el tratamiento, las monocapas fueron teñidas con Giemsa y se
determinó la actividad amastigoticida mediante el cálculo del porcentaje de infección por
recuento microscópico de 200 células, y del número de amastigotes/célula utilizando el
software ImageJ. La AZM mostró un efecto inhibitorio dependiente de la concentración
con un valor de IC50 de 19,57 g/ml. La droga presentó un índice de selectividad para los
parásitos de 58,69 por ensayo de reducción de resazurin sobre esplenocitos murinos al
probarla en concentraciones de 0-1500 g/ml. El efecto amastigoticida de la combinación
BZ (IC12,5 = 0,019 g/ml) y AZM (1,6-10 g/ml) se estudió sobre células Vero infectadas
con T. cruzi . La interacción entre ambas drogas se analizó por cálculo del índice de
combinación (IC) y construcción del isobolograma (software CompuSyn). Los resultados
muestran IC <1 para todas las combinaciones BZ-AZM con menores valores a bajas dosis
de AZM. Estos resultados sugieren que AZM presenta actividad inhibitoria in vitro y
sinergismo en su combinación con BZ, siendo el efecto mayor a dosis bajas de AZM. La
actividad de la AZM in vitro, sola y en combinación con BZ, sumada a su seguridad en el
uso clínico, sugiere que esta droga amerita estudios en profundidad como potencial
candidato para el tratamiento de la enfermedad de Chagas. Financiado por FONCyT,
CONICET y UBACyT.
DYT31
ALBENDAZOLE-LOADED LIPID NANOCAPSULES IN CYSTIC ECHINOCOCCOSIS:
PLASMA/CYST DISPOSITION AND EFFICACY IN INFECTED MICE
Patricia Pensel(1), Gabriela Ullio Gamboa (2), Julia Fabbri (3), Laura Ceballos (4), Sergio
Sanchez Bruni(5), Luis Alvarez(6), Daniel Allemandi(7), Jean P Benoit (8), Santiago Palma (9),
María C Elissondo (10)
(1)(3)(10)
Laboratorio de Zoonosis Parasitarias, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales,
Universidad Nacional de Mar del Plata. CONICET. (2)(7)(9)Departamento de Farmacia, Fac.
Ciencias Químicas, Universidad Nacional de Córdoba, Argentina. UNITEFA-CONICET. .
(4)(5)(6)
Laboratorio de Farmacología. CIVETAN-CONICET- Facultad de Medicina
Veterinaria. UNCPBA-Tandil, Argentina . (8)INSERM U1066. Ingenierie de la Vectorisation
Particulaire. Immeuble IBT. Angers. France..
E-mail: [email protected]
Cystic echinococcosis (CE) is a zoonotic disease caused by the larval stage of
Echinococcus granulosus. The drugs commonly used for anti-hydatid cysts treatment are
benzimidazoles. Therapeutic failures following albendazole (ABZ) administration have
been primarily linked to the poor drug absorption rate resulting in low drug level in plasma
and hydatid cysts. Lipid nanocapsules (LNCs) represent nanocarriers designed to
encapsulate lipophilic drugs, such as ABZ. Structurally, the lipophilic drug is solubilised in
the lipid core, surrounded by a tensioactive shell. The goals of the current work were: i) to
characterize the plasma drug exposure and cyst concentration profiles for ABZ-LNCs and
ABZ suspension in mice infected with E. granulosus, and ii) to compare ABZ efficacy
against secondary CE in mice after the administration of both formulations. Enhanced ABZ
sulphoxide (ABZSO) concentration profiles were obtained in plasma and cysts from LNCABZ treated animals. After oral administration of ABZ-LNC, ABZSO exposure was
DIAGNOSIS & TREATMENT
112
significantly higher in plasma and cyst (area under the concentration-versus-time curve
[AUC] plasma = 4.65±0.71 µg. h/mL; cyst = 9.37±1.42 µg. h/g) than that observed after
ABZ suspension treatment (AUC plasma= 2.37±0.35 µg. h/mL; cyst = 4.25±0.38 µg. h/g).
Additionally, ABZSO concentrations measured in cysts from ABZ-LNC treated mice were
1.5-fold higher than those detected in plasma. This enhanced drug availability correlated
with an increased efficacy against secondary CE in mice observed for the ABZ-LNC
(0.91±1.16 g), while the suspension formulation (5.38±2.4 g) did not reach differences with
the untreated control group (8.98±4.61 g). In conclusion, the improved kinetic behavior of
ABZ administered as ABZ-LNC resulted in a higher drug exposure of the hydatid cysts,
which enhanced ABZ clinical efficacy on CE developed in mice. This new nanocarrier as
drug delivery system for ABZ could be a suitable alternative for treating CE in humans.
DYT32
LEISHMANIASIS TEGUMENTARIA AMERICANA (LTA): ANÁLISIS DE
RESPUESTA AL TRATAMIENTO EN PACIENTES DE LA PROVINCIA DE SALTA
LA
María Fernanda García Bustos(1), Gabriela González Prieto(2), Federico Ramos(3), María C
Mora(4), Cecilia Parodi(5), Miguel A Basombrío(6), Sonia Moreno(7), Josefina Beckar(8), Sibila
Monroig(9), Luisa Ruiz Morales(10), Alejandra Barrio(11)
(1)(3)(4)(5)(6)
Instituto de Patología Experimental (UE CONICET - CCT Salta). (2)(11)Cátedra de
Microbiología (Fac. Cs. Salud - UNSa). (7)Servicio de Dermatología (Hospital Señor del
Milagro - Salta). (8)(9)Servicio de ORL (Hospital San Bernardo - Salta). (10)Servicio de
Dermatología (Hospital San Bernardo - Salta).
E-mail: [email protected]
La provincia de Salta presenta la mayor endemicidad de LTA en Argentina. La
quimioterapia constituye la mayor estrategia de control, y el antimoniato de meglumina
(AM) el tratamiento de primera línea. En la ciudad de Salta se diagnosticaron numerosos
pacientes con lesiones mucosas, que se desarrollan en su mayoría luego de una lesión
cutánea inicial, por falta de tratamiento o por falla luego de su administración. Esto nos
llevó a investigar las características de los regímenes terapéuticos a los que fueron
sometidos los pacientes atendidos en la ciudad de Salta. Para ello se realizó un análisis
retrospectivo de historias clínicas. Se investigaron características epidemiológicas,
clínicas y del tratamiento en una población de 90 pacientes positivos diagnosticados entre
2000-2013. Se obtuvieron datos completos de tratamiento y seguimiento en 40 pacientes.
Para evaluar la respuesta, se tomó como parámetro la cura clínica de las lesiones
(lesiones cutáneas: re-epitelización completa y aplanamiento del borde, desaparición de
induración de base y/o linfangitis o adenitis, y ausencia de nuevas lesiones; lesiones
mucosas: regresión de todos los signos clínicos de las lesiones) posterior a los 6 meses
post-tratamiento. Del total de pacientes evaluados, 19/40 (47,5%) mostraron falla
terapéutica al primer esquema administrado, y 21/40 (52,5%) exhibieron buena respuesta.
Se consideró tratamiento completo aquel que se ajustó a la recomendación de la OPS
(2013), y tratamiento incompleto aquel administrado de manera interrumpida, y/o con
cantidades subóptimas de droga. De los pacientes con falla terapéutica (de los cuales la
mayoría - 17/19 - recibió AM), sólo en 9/19 se administraron tratamientos incompletos. En
cuanto a los pacientes con buena respuesta, 16/21 recibieron esquemas completos. El
importante número de fallas terapéuticas detectado, la mayoría asociadas al tratamiento
DIAGNOSIS & TREATMENT
113
con AM, sugiere la importancia de investigar factores de riesgo para la aparición de las
mismas.
DYT33
SERONEGATIVIZACION ESPONTANEA EN
PACIENTES
ADULTOS
CON
ENFERMEDAD DE CHAGAS CRONICA EN LA RAMA PLACEBO DEL ESTUDIO
TRAENA
Nilda G Prado*, Yolanda M Hernández*, J Gonzalo Tomas*, Marisa L Fernández*, Elsa
B Velázquez*, Mónica I Esteva*, Ana M De Rissio*, Juan C Ramírez^, Alejandro G
Schijman^, Andres M Ruiz*, Adelina R Riarte*
*Instituto Nacional de Parasitologia Dr Mario Fatala Chaben. ^INGEBI-CONICET
E-mail: [email protected]
Se compararon aspectos demográficos,serológicos, parasitológicos y clínicos del grupo
placebo del
ensayo
clínico TRAENA, los que
presentaron seronegativizacion
espontánea (SNE) con los de títulos serológicos positivos (SP) estables durante 11 años
de seguimiento. Se evaluaron 323 pacientes (p); 50 (15,5%) con SNE por al menos una
de dos técnicas de ELISA convencional (ELISAc) y/o ELISA F29 (F29)), y 273(84,5%) SP.
De los 50p SNE 28 fueron por ELISAc, 7 por F29 y 15 por ambas técnicas. La SNE por
ambas técnicas fue más frecuente en nativos de Santiago del Estero (p=0.01). La ELISAc
promedio basal fue 0,293(DO) en los SNE vs 0,352 en los SP (p<0,0001); mientras que
F29 fue 0,301 en los SNE vs 0,412 en los SP (p<0,001). La cuantificación de la
parasitemia (qPCR) inicial en los SNE fue de 56,68 ± 153,21 eq/ par./ml, y fue no
detectable (ND) en el 23,2% vs los SP que fue de 67,17 ± 187,90 y 16,7% ND (p=NS).
La qPCR en el tiempo 0 fue ND en 11/50 (22%), cuantificable en 39 (78%) y ND en 3
(6%) durante el seguimiento¸33/39 con qPCR cuantificable en tiempo 0 tuvieron
mediciones entre 7-12 años, de los cuales 12 (36%) fue cuantificable x lo menos en una
medición, y en 21 (64%) fue ND siempre. Progresaron clínicamente 7/50 (14%) de los
SNE vs 50/273(18,3%) de los SP (p=NS). Ningún paciente falleció en el grupo SNE (0/50)
vs 11/273(4%) en el grupo SP (p= NS). No se registraron eventos primarios en el grupo
SNE (0/50) vs 18/273(6.6%) en SP (p= NS).
Conclusiones. Los pacientes con SNE tuvieron títulos iniciales de anticuerpos más bajos
que los SP; los procedentes de Santiago del Estero presentaron mayor SNE por ambas
técnicas. Durante el seguimiento entre 7-12 años la técnica de qPCR fue cuantificable
por lo menos en una medición. Más allá de las diferencias absolutas respecto de muertes
y otros eventos primarios, los SNE no mostraron diferencias significativas en progresión
clínica vs los SP del grupo placebo del estudio TRAENA.
DYT34
DEVELOPMENT AND VALIDATION OF A NEW KIT PROTOTYPE FOR MOLECULAR
DIAGNOSIS OF CONGENITAL CHAGAS DISEASE
DIAGNOSIS & TREATMENT
114
Susana Alicia Besuschio
INGEBI - LaBMECh.
E-mail: [email protected]
Early diagnosis of Congenital Chagas disease (CCD) is a public health priority. In the
context of FONARSEC FITS SALUD CHAGAS, a public-private consortium was
conformed to develop a TaqMan Real-Time PCR (qPCR) kit prototype for CCD diagnosis.
One mL of blood collected in DNA stabilizer solution is processed in glass fiber columns.
Duplex qPCR uses primers and TaqMan probes targeting satellite DNA repeats conserved
in all T. cruzi lineages and an internal standard. External Quality Control panels have been
designed and reagents stability tested for 6 months. To compare the accuracy of the kit vs
current diagnostics (micromethod in cord or peripheral blood within the first 15 days and at
4-8 weeks of life, plus serodiagnosis at 10 months), a double-blinded prospective field
study with two follow-up events has started upon approval of CEMIC Ethical Committee
and local IRBs. Activities at fellow centers involve screening, recruitment and consent
processes, data management (filling the CRFs, data entry), sample inventory, weekly
monitoring and reporting. Each center processes the micromethod and serodiagnosis,
recruits and refers samples for qPCR and serologic tests to INGEBI and INP, respectively.
The logistics guidelines ensure traceability and proper transport for barcoded samples.
Database will be disclosed at the end of study. Prototype analytical validation followed
Clinical Laboratory Standard Institute guidelines, rendered a Limit of detection of 0.2
parasite equivalents/mL in spiked blood and 100% specificity in seronegative panels and
T. rangeli and Leishmania spp DNAs. Field validation is currently undergone in 100 out of
500 mother-newborns binomials to be recruited in Buenos Aires, Tucumán, Santiago del
Estero and Chaco. The performing parameters of the kit encourage its application to early
diagnosis of T. cruzi infection not only by vertical transmission but also in oral outbreaks,
organ transplantation and monitoring of trypanocidal therapy.
DYT35
DETECTION OF Strongyloides stercoralis INFECTION AMONG PATIENTS IN
NORTHEAST ARGENTINA
Cristina M Gené, María JF Rea, Carlos E Borda
Centro Nacional de Parasitología y Enfermedades Tropicales (CENPETROP), Facultad de
Medicina, Universidad Nacional del Nordeste.
E-mail: [email protected]
Strongyloides stercoralis is an intestinal helminth that infects humans through contact with
soil containing the larvae. Between 30 and 100 million people are infected worldwide.
Strongyloidiasis sometimes is asymptomatic and eosinophilia is usually the only indication
of infection. Limited epidemiological information on S. stercoralis infection exists in
Argentina. The aim of our study was to describe the occurrence of intestinal parasitic
infections in our area, considering all people, including hospitalized, outpatients and
healthy people, with the suspect of intestinal parasitosis. We examined 248 patients from
February 2013 to July 2014. Six faecal samples from each subject were collected on
alternate days in plastic tubes containing formalin 10% as the preservative for the
sedimentation of Hoffmann-Pons-Janer (HPJ) assay. For the Baermann and Harada-Mori
DIAGNOSIS & TREATMENT
115
(HM) assays, one additional faecal sample was subsequently collected in a container
without a pre¬servative solution. A total of 124 (50%) specimens were positive for
intestinal parasites that included 39 (41.5%) helminths and 55 (58.5%) protozoan
infections. Nine species of parasites were found: 30 cases had co-infection with more than
one species. Maximum worm infections belonged to S. stercoralis 30 (24.2%). The next
prevalent geohelminth was hookworm (11.3%). At all, in 28 patients infected with S.
stercoralis presented eosinophilia: mild eosinophilia 33.3%, moderate 36.7% and severe
23.2 %. Parasitologic diagnosis of S. stercoralis was detected in 23 patients with HPJ, six
with Baermann method and one with HM only. This parasite was higher in females
(71.8%) and in patients more than 50 years of age (66.6%) Our results indicate that S.
stercoralis is the predominant parasite in the northeast. A negative result does not
necessarily indicate absence of the infection. It is important to detect S. stercoralis
infections before administering chemotherapy or immunosuppression in patients at risk.
DYT36
MOLECULAR
DETECTION
OF
Leishmania
(Leishmania)
chagasi
EXPERIMENTALLY INFECTED MICE’S SPLEEN TISSUES BY REAL TIME PCR
IN
Márcia Jusi Márcia
FCAV-UNESP.
E-mail: [email protected]
In order to clarify the immunological mechanisms which confer Leishmania chagasi
persistence and multiplication within the host, many studies have been performed to
assess T cells subpopulations and subclasses of immunoglobulins using a murine model.
BALB/c and C57BL/6 mice lineages are used for primary tests due to their susceptibly to
the pathogen and immune response similar to those from humans. However, the infectivity
of these animals is not always easy, depending on the virulence of the strain, route of
inoculation, and amount of inoculated parasites. Since the parasite load in this animal
species is frequently low, it is necessary the use of a very sensitive diagnostic test that
may detect the presence of amastigotes. We aimed at evaluating the presence and
quantification of amastigotes in spleen tissues of BALB/c mice inoculated with L. chagasi,
by Real Time PCR. In the present study, twelve BALB/c mice were inoculated with 1 x 107
L. chagasi promastigotas/mL by intravenous or subcutaneous route. Three animals
inoculated with saline were used as negative controls. Mice were euthanized 7, 15 and 45
days after inoculation in order to verify the presence of amastigotes in spleen tissues. DNA
samples were submitted to both conventional and Real Time PCR assays, using primers
previously described targeting a 120 bp of kinetoplastic DNA. The reagents concentration
of PCR reactions was the same for both techniques but Syto 9 was only used as an
intercalating in Real time PCR assays. All animals were positive in real time PCR but
negative in conventional PCR assays. We also verify that positive results in Real Time
PCR showed low Cqs, suggesting a low parasite load in spleen tissues. Our results
demonstrated that Real Time PCR was more sensitive than conventional PCR in detecting
L. chagasi burden in spleen tissues from experimentally infected mice.
DYT37
DIAGNOSIS & TREATMENT
116
EPIDEMIOLOGY OF CYSTOISOSPORIASIS IN HIV/AIDS POPULATION ALONG 10
YEARS IN A REFERENCE INFECTION HOSPITAL
Romero RS(1), Romero MM(2), Bava J(3)
Htal JP Garrahan. (3)Htal FJ Muniz.
E-mail: [email protected]
(1)(2)
Introduction: Subacute and cronic diarrheic episodes caused by Coccidia are frequent
clinical pictures in HIV/AIDS population. Immunocompromised hosts would be more
susceptible to acquisition and disemination of enteric parasitosis caused by protozoa.
Objective: Clinical and epidemiological characterization of patients with diarrhea nursed in
the FJ Muñiz Hospital along ten years with microbiological diagnosis of cystoisosporiasis.
Results: 79 patients were studied (n=79) within an average age of 33.23(rank= 20-53), 48
men, 31 women, 88.06% argentinian, 8.95% peruvian. The clinical picture appeared as an
opportunistic infection 3.97 years after HIV diagnosis. 2.18 was the positive sample
average per patient, and 11.44% resulted positive for other parasites with or without
coinfection with Cystoisospora spp. Blastocystis hominis was the most frequently found
(n=11, 35.48%) followed by Strongyloides stercoralis (n=5, 16.13%). At diagnosis 54.43%
of the patients presented chronical diarrhea, 46,15% recurrent diarrhea, vomiting 43%,
abdominal pain 70.5%, fever 26.86% and weight loss 83%. The most frequent
concommitant opportunistic infection was extrapulmonar Cryptococcosis (18%). 21.3% of
the patients were under weakly profilaxis with TMS and 78.5% recieved treatment with
TMS. The CD4 total count average was 113/mm3 and the CD4 percentage count 8.02%,
89.5% had equal or less than 200 CD4/mm3. The media of the total and percentage count
of eosinophils was 272/mm3 and 4.33% respectively, 14% had severe
eosinophilia,25.32% absolute leucopenia, mean of hemoglobin was 11.37 mg/dl, 69.33%
had anemia diagnosis. From the plasmatic ionogram, sodium average concentration was
134.56 mmol/ml and 3.45 mmmol/ml for potasium, 49.36% had hipokalemia diagnosis.
Conclusions: the etiological study of diarrheas lasting 30 days or more in patients infected
with HIV in C3 stage, with suspicion of cystoisosporiasis, weight loss and new episodes of
non filiated diarrhea, is of great importance.
DYT38
DIAGNOSIS OF AMERICAN TEGUMENTARY LEISHMANIASIS
ENDEMICITY IN ARGENTINA AND PARAGUAY
IN
AREA OF
María JF Rea, Carlos E Borda
Centro Nacional de Parasitología y Enfermedades Tropicales (CENPETROP), Facultad de
Medicina, Universidad Nacional del Nordeste.
E-mail: [email protected]
American tegumentary leishmaniasis (ATL) is considered to be endemic in 88 countries
and it is a major health problem in different foci of Argentina and Paraguay. The aim of this
study was to describe eight new cases of disease from 2010 and 2014. Four patients were
males and four females. Age range was between 28-82 years old. From the province of
Corrientes were six patients (two from Corrientes city and four from the Departments of
Lavalle, San Luis del Palmar, Itatí and Bella Vista), one from the province of Formosa
(Fontana) and other from the Paraguay (Pilar). Ulcers were present in five patients with
DIAGNOSIS & TREATMENT
117
lesions restricted to the skin located on leg and one woman with disseminated
leishmaniasis. In one male with two skin ulcers, mucosal compromise was observed one
year later of the primary lesion. Two patients presented only mucosal involvement (nasal
and oral). The Montenegro skin test was positive in all patients and the average size was
9.3 mm. IM Glucantime® was administered in seven patients. No relapse of infection was
recorded in cured patients, but in two women with a complete clinical cures both suffered
traumatism in the same place of the lesion scar within four or five years later, thus they
relapsed and a new ulcer was formed. A 66-year-old woman didn't receive the medication
and years after she had surgery to remove breast cancer and received
Immunosuppressive therapy. Two months later in mastectomy scar two ulcers were
formed. A 64 year-old man had erroneously diagnosed of epithelium cancer, thus he
received a transplantation of tissue. Between 9 and 12 months later this patient had
relapse and a new ulcer was formed in the same place of transplant and with metastasis
into the oral mucous. Leishmaniasis can directly or indirectly affect the presentation,
diagnosis and course of various disorders or arising among patients receiving
chemotherapy. Differential diagnosis of disease is essential in areas where it is endemic
DYT39
ESTUDIO DE PACIENTES CON ENFERMEDAD DE CHAGAS Y OTRAS PATOLOGÍAS
ASOCIADAS
Bruno Selva, Romina Blasco, Noemi Miler, Silvina Lo Presti, Daniela Velazquez, Patricia
Paglini, Walter Rivarola
Centro de Estudios e Investigación de la Enfermedad de Chagas y Leishmaniasis de la
Facultad de Ciencias Médicas de la Universidad Nacional de Córdoba.
E-mail: [email protected]
La enfermedad de Chagas es un grave problema de salud pública, con estimaciones de al
menos de 8 a 10 millones de personas que padecen la infección y alrededor de 110
millones en riesgo de adquirirla. Sin embargo no existe aún una explicación de por qué el
30% de las personas infectadas evolucionan hacia una enfermedad cardíaca y el 70%
permanece asíntomático aunque con serología persistente, así como tampoco la amplia
variabilidad clínica que puede resultar desde una cardiopatía sin consecuencias hasta
producir una muerte súbita. El presente trabajo tiene por objeto analizar y relacionar las
características clínicas, electrocardiográficas y ecocardiográficas de pacientes chagasicos
con PCR positiva y negativa y no chagasicos. Material y método: Se estudiaron 49
pacientes del Servicio de Cardiología de un sanatorio de la ciudad de Córdoba de ambos
sexos, con una mediana de edad de 63 años. A todos se les realizó serología (HAI y
ELISA) inspección clínica, electrocardiograma (ECG) y ecocardiograma y aquellos con
serología positiva se les realizo PCR (en una única toma de sangre). Resultados: De los
49 pacientes, 41 resultaron con serología positiva para Chagas y 8 con serología
negativa. De los 41 pacientes con serología positiva un 78 % resultaron con PCR positiva
y un 22 % negativa. Por otro lado un 18 % de los individuos con serología positiva fueron
asintomáticos. Con respecto a la asociación con otras patologías como Hipertensión
arterial (HTA), dislipemia, diabetes y tabaquismo, la mayoría de los pacientes que
presentaban una clínica moderada a severa (85 %) son PCR positiva, frente a el resto de
los pacientes chagasicos (15 %), con PCR negativa que presentaban una clínica
DIAGNOSIS & TREATMENT
118
moderada. Estos hallazgos plantean la necesidad de intensificar estudios sobre los
factores que podrían explicar la variabilidad de las formas clínicas, por ejemplo, la
asociación con otras patologías y el tipo y virulencia de la cepa del T. cruzi y el papel que
desempeñan.
DYT40
APLICACIÓN DE ANTÍGENOS RECOMBINANTES DE
braziliensis CANDIDATOS AL INMUNODIAGNÓSTICO
TEGUMENTARIA AMERICANA
Leishmania (viannia)
DE LEISHMANIASIS
María E. Bracamonte(1), Silvana P Cajal(2), Carlos L Hoyos(3), Mariza Juárez(4), Sabrina N
Portelli(5), Leonardo Acuña(6), Olga Sánchez Negrette(7), Paola A Barroso(8), José F Gil(9),
María F. García Bustos(10), Alejandra B Barrio(11), Augusto Bellomio(12), Rubén O Cimino(13),
Masataka Korenaga(14), Yoshihisa Hashiguchi(15), Miguel Ángel Basombrío (16), Julio R
Nasser(17), Jorge D Marco(18)
(1)(3)(5)(7)(8)(10)(16)
Instituto de Patología Experimental UNSa CONICET. (2)(4)(9)(17)Instituto de
Investigaciones de Enfermedades Tropicales - UNSa , Orán, Salta. (6)(12)Instituto Superior
de Investigaciones Biológicas (INSIBIO), CONICET-UNT, Tucumán. (11)Instituto de
Patología Experimental UNSa CONICET; 4. Cátedra de Microbiología, Facultad de
Ciencias de la Salud, UNSa, Salta. (13)Cátedra de Química Biológica, Facultad de Ciencias
Naturales, UNSa, Salta. (14)(15)Dept. Of Parasitology, Kochi Medical Sch., Kochi Univ.,
Nankoku, Japan. (18)Instituto de Patología Experimental UNSa CONICET; Cátedra de
Microbiología, Facultad de Ciencias Exactas, UNSa, Salta.
E-mail: [email protected]
Leishmaniasis tegumentaria americana(LTA) es un grupo de enfermedades desatendidas
y emergentes cuyo agente causal prevalente en Argentina es Leishmania (Viannia)
braziliensis. Las técnicas diagnósticas que se aplican actualmente en el país presentan
una eficacia relativamente baja. En este trabajo se evaluó el desempeño
inmunodiagnóstico de tres proteínas de fusión expresadas por un sistema bacteriano, y un
extracto crudo soluble enriquecido con proteínas de membrana (ESM) obtenidos de una
cepa local de L. (V.) braziliensis. Las proteínas recombinantes se denominaron HATLbAg1 (Masa Molecular: 49,76 kDa), HAT-LbAg2 (MM 94, 25) y HAT-LbAg3 (MM 40, 29).
Se incluyeron 215 sueros de pacientes que presentaron las formas clínicas cutánea o
mucocutánea, diagnosticados por la combinación de métodos parasitológicos, PCR,
Intradermorreacción de Montenegro, y el criterio clínico-epidemiológico. La ausencia de
LTA se representó con 212 muestras de pacientes diagnosticados no leishmaniásicos,
donantes de áreas endémicas y no endémicas de LTA y pacientes seropositivos para
Chagas (CH), toxoplasmosis y sífilis. Se estimó la sensibilidad (S) y especificidad (E) para
los ELISAs ajustados por doble titulación para cada antígeno y combinación de los
mismos. HAT-LbAg1 presentó mayor desempeño diagnóstico: S: 70,71% y E: 72,88% (IC
95%: 61,2-80,2; 60,7-85,1) con respecto a HAT-LbAg2 (68,32; 28,79%) y HAT-LbAg3
(68,37; 47,62%). La combinación de los mismos no mejoró el desempeño individual de
HAT-LbAg1 (42,55; 74,17%). El ESM mostró el mejor desempeño diagnóstico 91,27%,
66,23% (IC 95%: 85,9-96,6; 55-77,4), a pesar de su baja especificidad marcada por las
reacciones cruzadas con Chagas. Los métodos serológicos de inmunodiagnóstico tienen
la ventaja de la aplicabilidad frente a los parasitológicos o moleculares. HAT-LbAg1 y
DIAGNOSIS & TREATMENT
119
ESM podrían resultar buenas herramientas de tamizaje. Se deben estudiar nuevas
proteínas candidatas y sistemas de expresión eucarióticos para mejorar su desempeño.
DYT41
MÉTODO DE FLUORESCENCIA APLICADO AL SCREENING DE DROGAS CON
ACTIVIDAD LEISHMANICIDAS
Paola A Barroso(1), Cecilia Peréz-Brandán(2), Sabrina Portelli(3), Carlos Hoyos(4), Fernanda
García Bustos(5), Estefanía Bracamonte(6), Miguel A Basombrío(7), Jorge D Marco(8)
(1)
Instituto de Patología Experimental-CONICET. UNSa. . (2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)Instituto de
Patología Experimental-CONICET. UNSa.
E-mail: [email protected]
El método convencional para la evaluación de actividad leishmanicida de drogas noveles,
se basa en el conteo de parásitos al microscopio óptico. Esta técnica resulta laboriosa en
el caso de screening de compuestos. El objetivo de este trabajo fue normatizar un método
para determinar la viabilidad de parásitos a través de la expresión de una proteína
fluorescente. El gen tdtomato, que codifica para una proteína fluorescente, se subclonó en
el plásmido pIR1SAT. Se electroporó una cepa de Leishmania (Leishmania) amazonensis
(MHOM/BR/73/M2269) con 10 µg del plásmido linealizado. Los parásitos se seleccionaron
con nourseotricina y se clonaron. La expresión de fluorescencia (FL) del clon M2269/tc3,
se determinó en promastigotes (PM) y en amastigotes (AM) aislados de macrófagos (MC).
Parásitos de M2269/tc3 se diluyeron desde 3x10e8 PM/ml y desde 3x10e7 AM/ml y la FL
fue medida en un lector de placas. La eficacia de la miltefosina (MI) fue evaluada
empleando el modelo de PM y MC-AM. Para ello, 1x10e7 PM/ml de M2269/tc3 se
plaquearon con diferentes concentraciones de MI. En el modelo MC-AM, células J774.1
se infectaron en un radio de 10 PM y se incubaron con diferentes concentraciones de MI.
La viabilidad M2269/tc3 se determinó midiendo la FL. Para M2269/WT, la viabilidad se
determinó contando el número de PM vivos y calculando el porcentaje de infección en
MC-AM. La concentración inhibitoria 50 (CI50) en ambos sistemas se calculó mediante el
análisis de regresión no lineal. La expresión de FL de PM y AM fue proporcional al
número de parásitos (r2 = 0,98). Los valores de CI50 de MI determinados por el método
de FL (PM 5,3 μg/ml, AM 9,3 μg/ml) fueron similares a los obtenidos mediante los
métodos convencionales (PM 5,2 μg/ml, AM 3,5 μg/ml). Concluimos que la expresión de
FL es un buen indicador de la viabilidad de los parásitos transfectados, útil para el análisis
de drogas leishmanicidas de manera simple y rápida en un modelo in vitro de Leishmania
(L.) amazonensis.
DYT42
TRATAMIENTO ETIOLÓGICO DE T. cruzi CON BENZNIDAZOL (ABARAX) EN UN
ÁREA PERI-URBANA DE PAMPA DEL INDIO, CHACO.
Paula Sartor(1), Diego Weinberg(2), Fernando Bittel(3), Marcia Goy(4), Cintia Delgado(5),
Marcelo Abril(6)
DIAGNOSIS & TREATMENT
120
(1)(3)(4)
Hospital Dante Tardelli. (2)(5)(6)Fundación Mundo Sano.
E-mail: [email protected]
La producción nacional de benznidazol (Abarax, ELEA, ABX) mejoró el acceso al
tratamiento para la enfermedad de Chagas (TTO), este tipo de estudios permiten evaluar
su farmacoepidemiología en poblaciones prevalentes. En 2013, iniciaron el TTO con ABX
(5-8 mg/kg/día, dos tomas, 60 días) 32 pacientes de 6 y 39 años de Pueblo Viejo, zona
peri-urbana de Pampa del Indio, Chaco. La dosis media fue de 5,91±1,24 mg/kg/día (95%
intervalo de confianza, IC). El 59,4% de los pacientes completó y el 15,6% realizó más de
30 días de TTO. Fue interrumpido por indicación médica a 2 pacientes y 6 lo hicieron
voluntariamente (4 presentaron eventos adversos, EA). El 65,6% de los pacientes
presentó de 1 a 4 EA. No se registraron diferencias significativas en la ocurrencia de EA
según el sexo (15/20 femeninos vs 6/12 masculinos) o la etnia (12/20 Qom vs 9/12
Criollos, test de diferencia de proporciones); tampoco con la edad (con EA 12,5±7,0 vs sin
EA 11,0±2,4 años, 95% IC, test de Krustal Wallis). El tiempo medio de aparición de EA fue
de 9,6 ±1,9 días, durando 2,62 ±1,02 días (95% IC). El 80% de los EA fueron leves, el
16% moderados y el 4% severos. Del total de EA (n=31) los exantemas fueron los más
frecuentes (n=11), seguidos de alteraciones gastrointestinales (n=7), cefalea (n=6),
alteraciones de sistema nervioso (n=3), fiebre (n=3) y astenia (n=1). Dos pacientes
requirieron internación y el resto de los EA fueron manejados ambulatoriamente con
interrupción (n=6), disminución transitorias (n=2) o sin alteración de dosis (n=7),
empleando tratamientos paliativos. Durante el TTO con ABX los EA registrados fueron
mayoritariamente leves o moderados, que fueron fácilmente controlados. El porcentaje de
EA fue superior y el tiempo de aparición de EA fue menor a lo informado en otros estudios
con benznidazol (Roche) lo cual podría estar asociado a cambios en la biodisponibilidad
de la droga. A diferencia de otros autores, no registramos diferencias en la ocurrencia de
EA según la edad.
DYT43
MANEJO DEL TRATAMIENTO ETIOLÓGICO DE Trypanosoma cruzi CON
BENZNIDAZOL Y NIFURTIMOX EN ÁREAS RURALES LIBRES DE TRANSMISIÓN
VECTORIAL
Paula Sartor(1), Victoria Cardinal(2), Ivana Colaianni(3), Pilar Fernandez(4), Héctor Freilij(5),
Ricardo Gürtler (6)
(1)
Hospital Dante Tardelli. (2)(3)(4)(6)Laboratorio de Eco-epidemiología-FCEN-UBA.
(5)
Programa Nacional de Chagas.
E-mail: [email protected]
El nifurtimox y el benznidazol son empleados para el tratamiento etiológico de pacientes
infectados con T. cruzi. Es importante identificar estrategias que aseguren el acceso
temprano al diagnóstico y tratamiento, así como una logística para el manejo de efectos
adversos (EA) en poblaciones rurales vulnerables de áreas endémicas bajo control
vectorial. En el año 2010 se realizó tratamiento con benznidazol a 90 pacientes de 2 a 27
años (GA) y en 2013 con nifurtimox a 37 individuos de 4 a 21 años (GB) de dos áreas
rurales de Pampa del Indio, provincia del Chaco, según la Pauta del Ministerio de Salud
de Nación, 2014. El diagnóstico y tratamiento fueron planificados participativamente con la
DIAGNOSIS & TREATMENT
121
comunidad, personal del Hospital y Agentes Sanitarios de ambas áreas. El 85% y el 92%
de los pacientes del grupo GA y GB completaron el tratamiento. El porcentaje de EA fue
de 38% y 58% para GA y GB, respectivamente. El exantema fue el EA más frecuente
(28/34) en GA y las cefaleas en GB (12/20). El tiempo medio de aparición de EA fue 12
(GA) y 11 (GB) días. Los pacientes que presentaron EA no modificaron el tratamiento
(GA: 18/34; GB: 16/20), lo disminuyeron transitoriamente (GA:4/34; GB:1/20), o lo
interrumpieron por indicación médica (GA:5/34; GB:2/20) o por decisión del paciente
(GA:7/34; GB:1/20). Al emplear nifurtimox y el benznidazol la mayoría de los EA fueron
leves o moderados, pudieron controlarse y requirieron mayor atención en las primeras
semanas de tratamiento. Pese a que el porcentaje de EAs fue superior en GB, una mayor
proporción de pacientes tratados con nifurtimox completó el tratamiento. Es factible
realizar el tratamiento en áreas rurales (bajo vigilancia entomológica) incluso en
poblaciones étnicas mixtas. La metodología participativa asegura buena adherencia y
porcentaje de culminación del tratamiento y favorece la redefinición de roles de
trabajadores de salud y empoderamiento comunitario asegurando la sostenibilidad de las
intervenciones.
DYT44
AISLAMIENTOS DE Trypanosoma cruzi DE PACIENTES DE ÁREAS RURALES A
PARTIR DE UN XENODIAGNÓSTICO ARTIFICIAL
Natalia P Macchiaverna, María del Pilar Fernandez , Paula A Sartor, Ricardo E Gürtler, M
Victoria Cardinal
Laboratorio de Eco-epidemiología, FCEyN, UBA.
E-mail: [email protected]
El agente etiológico de la Enfermedad de Chagas, Trypanosoma cruzi, es un
hemoparásito de fácil cultivo in vitro. Sin embargo, el aislamiento de parásitos a partir de
pacientes crónicos de áreas rurales ha resultado clásicamente una tarea dificultosa no
sólo debido a la baja parasitemia propia de esta fase de la enfermedad, sino también a la
dificultad de contar con el equipamiento necesario en estudios a campo. Con el objetivo
de obtener aislados de T. cruzi de pacientes residentes del área rural del Municipio de
Pampa del Indio realizamos xenodiagnósticos artificiales con posterior cultivo del parásito
a partir de las heces de las vinchucas infectadas. Se seleccionaron 13 pacientes entre 7 y
18 años, que resultaron seropositivos y estaban en condiciones de iniciar el tratamiento
etiológico. Se los consideró pacientes crónicos ya que el área de estudio hacía 4 años
que se encontraba bajo vigilancia vectorial. Se tomó hasta 5 ml de sangre heparinizada de
cada paciente, la cual fue inmediatamente ofrecida a los triatominos a través de una
membrana de profiláctico utilizando un alimentador artificial. Para cada paciente se
utilizaron 2 tacos de madera cada uno conteniendo 10 Triatoma infestans de IV estadío
hambreados, las cuales se alimentaron durante 20 minutos. A los 30 y 60 días post
ingesta se estudió la infección de los triatominos examinando las heces al microscopio
óptico y a partir de los positivos, se realizaron cultivos con medio bifásico (BHI enriquecido
con SFB y base de agar-sangre). El 69,2% (n=13) de los pacientes tuvo al menos 1
triatomino infectado. La infectividad promedio fue del 14,7% (IC95=10,4-19,7). Se logró
aislar y criopreservar el parásito en todos los pacientes con xenodiagnóstico positivo. La
DIAGNOSIS & TREATMENT
122
relevancia de este trabajo radica en la elevada eficacia obtenida con este método,
posibilitando la obtención de aislados de T. cruzi de pacientes en una zona rural.
DYT45
GENETIC ANALYSIS OF TWO RECOMBINANT ANTIGENS IN Trypanosoma cruzi
AND THEIR POSSIBLE IMMUNOLOGICAL USE TO DISCRIMINATE CLINICAL FORMS
OF DISEASE
Gustavo F Saldaña(1), Longhi Silvia(2), Diaz Isabel(3), Curto María de los Angeles(4), Osuna
Antonio(5), Schijman Alejandro(6)
(1)(2)(4)(6)
INGEBI. (3)(5)Inst de BiotecnologiaGrupo Bioquimica y Parasitologia Molecular,
Universidad de Granada.
E-mail: [email protected]
Gold standard diagnosis of chronic Chagas disease (cCD) is based on serological
response to antibodies. However, serological kits, mostly those based on recombinant
antigens do not depict similar accuracy in different geographic regions. A hypothesis for
this is genetic diversity of T. cruzi, whose populations are clustered into six discrete typing
units (DTUs) with diverse regional distribution and probably linked to varied clinical forms
of chronic phase. Our aim was to characterize two widely used recombinant antigens (JL7
and 1F8) in parasite stocks representing the 6 DTUs. Coding regions were amplified from
genomic DNA of six stocks. Primers were designed from CL Brener genome project
databank; PCR products were cloned and recombinants were isolated for sequencing and
multiple alignments using ClustalT-coffee software. Alignment of 1F8 translated ORFs
showed no significant differences among DTUs (90% overall similarity, only 4 conservative
substitutions in 198 aa, except for DTUIII with 3 non-conservative changes in the N-term).
In contrast, alignment of JL7 ORFs showed significant differences mainly in the C-term
region (14 conservative and 12 non-conservative aa substitutions in positions 51-131). The
cladogram showed three clusters: Cluster 1 (DTUI and III); cluster 2 (DTUII) and cluster 3
(DTUIV, V, and VI). Accordingly, 18 peptides covering representing the different variants
were synthetized to carry out ELISA assays with sera from patients of different regions and
clinical manifestations (asymptomatic, cardiac and gastrointestinal). A preliminary assay in
sera from DTU I infected patients showed peptides with differential reactivity: JL7-6/10/12
for asymptomatic; JL7-8 for cardiopaths and JL7-11 for gastrointestinal cases (p=0.01
Turkey test). A higher number of serum samples are currently under analysis. Our findings
encourage further investigation of these peptides for discrimination of clinical status in cCD
patients from different geographic origins.
DYT46
ISOLATION OF AN ANTIPROTOZOAL FLAVONOID FROM Stevia satureiifolia var.
satureiifolia
Maria Florencia Beer(1), Laura C Laurella(2), Orlando Elso(3), Fernanda M Frank(4), Virginia
S Martino(5), Maria R Alonso(6), Silvia I Cazorla(7), Emilio Malchiodi(8), Valeria P. Sülsen(9)
(1)
IQUIMEFA (UBA-CONICET), INTEQUI (CONICET). (2)(3)(5)(9)Cátedra de Farmacognosia,
DIAGNOSIS & TREATMENT
123
IQUIMEFA (UBA-CONICET). (4)(7)IMPAM (UBA-CONICET). (6)IQUIMEFA (UBA-CONICET).
IDEHU (UBA-CONICET).
E-mail: [email protected]
(8)
Parasitic diseases such as Chagas' disease and Leishmaniasis, affect millions of people
mainly in developing countries. These parasitosis are part of a group of diseases
considered neglected, abandoned and poverty-related. Drugs available to treat these
protozoal diseases have limitations due to adverse effects, emerging resistance and lack
of effectivity. Taking in account this problem and the previous isolation of a trypanocidal
flavonoid from Stevia satureiifolia var. satureiifolia organic extract, the aim of this work was
to isolate other bioactive compounds that may be present in this species. The organic
extract of S. satureiifolia was subjected to a bioassay-guided fractionation. From one of the
most active fraction (F2), a compound (compound 1) was isolated. Compound 1 was
evaluated against T. cruzi and L. braziliensis. This compound was active against
epimastigotes and trypomastigotes of T. cruzi with IC50 values of 0.65 µg/ml and 58.79
µg/ml, respectively. When compound 1 was tested on promastigotes of L. braziliensis, it
showed an IC50 value of 6.77 µg/ml. This compound showed no toxicity to mammalian
cells. Chromatographic behavior and UV analysis indicated that compound 1 could be a 5hydroxy-tetra substituted flavone. Further analyses are being conducted in order to
complete the identification of compound 1 and to determine its effects on the intracellular
forms of the parasites.
DYT47
EVALUATION OF FILTER PAPER PROVIDED BY THE NATIONAL NEWBORN
SCREENING PROGRAM FOR PCR-BASED DETECTION OF Trypanosoma cruzi
Cecilia Irurtia(1), Saldaña G(2), Besuschio S(3), Montenegro G(4), Schijman A G (5)
Hospital Posadas-sección Microbiología. (2)(3)(5)INGEBI.
E-mail: [email protected]
(1)(4)
Our aim was to evaluate filter paper provided by the National Newborn Screening
Program, as support for molecular diagnosis of Chagas disease. DNA was purified from
spiked blood samples containing different quantities of T.cruzi cells (CL-Brener) collected
in filter paper and in EDTA-tubes. The DNA lysates were amplified by conventional PCR
tests targeted to Satellite DNA and Kinetoplastid DNA of T. cruzi and duplex TaqMan Real
Time PCR for Satellite DNA and Internal amplification control (Duffy et al., 2013).
Concordance between PCR positivity obtained from dry and fresh blood was analyzed by
Kappa Index. Analytical sensitivity was 1 parasite equivalent /ml for all PCR approaches
using filter paper and fresh blood. Clinical samples were analyzed using filter paper and by
column-based fresh blood extraction. Concordance between both extraction methods
processed by qPCR gave a Kappa index of 0,744, (p=0,011) and by conventional PCR a
kappa index of 1 (p=0.001). Analytical sensitivity obtained from dry blood in filter paper
appears adequate for diagnosis of T. cruzi infection. Our results show a very good
agreement between processing of peripheral blood from filter paper or EDTA-tubes and
encourage field validation studies to assess the application of less-invasive procedures
and easier handling and storage of clinical samples for reliable molecular diagnosis of
Chagas disease
DIAGNOSIS & TREATMENT
124
DYT48
SEARCH FOR ANTIPROTOZOAL COMPOUNDS IN Mikania periplocifolia
Laura Cecilia Laurella(1), Orlando Elso(2), Fernanda M Frank(3), Maria F Beer(4), Virginia S
Martino(5), Silvia I Cazorla(6), Emilio Malchiodi(7), Valeria P Sülsen(8), Maria R Alonso(9)
(1)(2)(5)(8)
Cátedra de Farmacognosia, IQUIMEFA (UBA-CONICET),Facultad de Farmacia y
Bioquímica, UBA. (3)(6)IMPAM (UBA-CONICET),Facultad de Medicina, UBA. (4)(9)IQUIMEFA
(UBA-CONICET),Facultad de Farmacia y Bioquímica, UBA. (7)IDEHU (UBACONICET),Facultad de Farmacia y Bioquímica, UBA.
E-mail: [email protected]
Chagas' disease and Leishmaniasis are protozoan diseases that cause significant
morbidity and mortality. According to the World Health Organization (WHO) they are
considered, among others, as Neglected Tropical Diseases (NTDs) affecting mainly poor
people throughout developing countries. Chagas' disease or American Trypanosomiasis
and Leishmaniasis are caused by the protozoan parasites Trypanosoma cruzi and
Leishmania spp., respectively. These parasitosis are endemic in Argentina, where people
co-infected with both parasites are commonly found. Nature has provided useful
antiparasitic drugs such as artemisinin and chloroquine, within others. We have previously
reported the antiprotozoal activity of the organic extract of Mikania periplocifolia. In this
sense, the aim of the present work was to isolate the antiprotozoal compounds from M.
periplocifolia. The organic extract of M. periplocifolia was fractionated by Silicagel column
chromatography. A yellow powder, namely compound A, precipitated from fractions eluted
with CH2Cl2: EtOAc (3:1). Chromatographic behavior and UV analysis of compound A
indicated that it could be a tetrasubstituted flavone with a free 5 OH group. This compound
was evaluated against T. cruzi epimastigotes and L. braziliensis promastigotes by the
thymidine uptake technique. Compound A showed trypanocidal and leishmanicidal activity
with IC50 values of 4.10 µg/ml and 1.18 µg/ml respectively and presented a CC50 value of
519.11 µg/ml when tested on mammalian cells. These findings prompt us to continue with
the study of the antiprotozoal activity of compound A and with the search of other bioactive
compounds in M. periplocifolia organic extract.
DYT49
ANÁLISIS DE PRESENTACIÓN DE FERTILIDAD DE EQUINOCOCOSIS QUÍSTICA Y
DE DISTOMATOSIS EN BOVINOS FAENADOS EN LA REGIÓN METROPOLITANA
Constanza Andrade(1), Pamina Horlacher(2), Colette Burotto(3), Felipe Corrêa(4), Caroll
Stoore(5), Christian Hidalgo(6), Edgar Jiménez(7), Marcela Hernández(8), Rodolfo Paredes(9)
(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(9)
Escuela de Medicina Veterinaria, Facultad de Ecología y Recursos
Naturales, Universidad Andrés Bello, Santiago, Chile. (8)Departamento de Patología y
Medicina Oral, Facultad de Odontología, Universidad de Chile, Santiago, Chile.
E-mail: [email protected]
Introducción: Echinococcus granulosus es un helminto que presenta un ciclo de vida de
tipo indirecto. En los hospederos intermediarios, se desarrollan los quistes hidatídicos que
DIAGNOSIS & TREATMENT
125
pueden ser de tipo fértil, en caso de generar protoescólices, o infértil, si es que no los
producen. La razón por la que algunos quistes son fértiles y otros no aún no está clara.
Objetivo: Analizar la frecuencia de presentación de la hidatidosis junto a distomatosis en
bovinos de la región metropolitana, para determinar si existe una relación entre la
infección concomitante de Fasciola hepatica y el estado de fertilidad de los quistes
hidatídicos. Material y método: A partir de 2.000 bovinos faenados, se determinó la
frecuencia de presentación de hidatidosis por inspección manual de hígados y pulmones
de todos los bovinos faenados y en el laboratorio para determinar su estado de
fertilidad/infertilidad. Para la detección de distomatosis se realizó la búsqueda manual y
por análisis serológico. Resultados y Discusión: De los 2.000 bovinos, 6 presentaban
hidatidosis con quistes hidatídicos fértiles, 121 padecían hidatidosis con quistes infértiles,
5 presentaban hidatidosis con quistes fértiles y distomatosis, y por último, 124 bovinos
presentaban hidatidosis con quistes infértiles y distomatosis. De acuerdo a lo observado,
no se pudo establecer una correlación entre la fertilidad de los quistes y la presencia de F.
hepatica. Conclusiones: No se observó una asociación entre las patologías analizadas.
Pese a ello se debe continuar estudiando los roles moduladores de la respuesta inmune
producidos por estos parásitos y la forma en que ésta puede afectar la fertilidad de los
quistes. Agradecimientos: FONDECYT Nº 1130717
DYT50
PCR: VALIDACIÓN DEL DIAGNÓSTICO DE Strongiloides stercORALIS (S.s) EN
MUESTRAS CLÍNICAS
Repetto S(1), Alba Soto C.(2), Solana ME(3), Ruybal P(4), Lopez C(5), Gonzalez Cappa SM(6)
IMPaM. (5)Hospital Durand.
E-mail: [email protected]
(1)(2)(3)(4)(6)
S.s es un nematodo endémico en Argentina. La infección crónica es usualmente
asintomática. El diagnóstico se hace por observación de larvas en materia fecal (mf) con
métodos convencionales y cultivo en agar nutritivo (CAN). El subdiagnóstico en
inmunocomprometidos conduce a cuadros severos de infección. Por ello, estandarizamos
una PCR cualitativa en mf que detecta 1 larva/g mf. La primera validación de esta técnica
se realizó en un estudio descriptivo de cohorte transversal a doble ciego con pacientes
(pac) > 18 años estratificados en 6 grupos (g). Área endémica, sin riesgo de reinfección
exógena, inmunocomprometidos: (g A) con y (g B) sin eosinofilia (eo);
inmunocompetentes: (g C) sin y (g F) con eo. Sin antecedentes de área endémica: (g D)
con eo y (g E) pac con parasitológicos negativos. Se evaluó eo (>450eo/mm3),
coproparasitológico seriado (Ritchie). En una muestra de mf fresca se realizó examen
microscópico directo, PCR y CAN en 3 placas/ pac (3 gr/placa). El CAN se realizó en
hasta 4 muestras sucesivas en diferentes días. Se utilizó el programa estadístico SSPS.
Se estudiaron 237 pac: g A: 50; g B: 29; g C: 29; g D: 30; g E: 45 y g F: 30; 45,5%
hombres. La mediana de edad fue 38 ±15,45 años. Se diagnosticó estrongiloidosis en 71
pac. La frecuencia fue de 57,3% y de 35,2 % en los grupos con antecedentes de área
endémica con eo (g A y g F) y en grupos sin eo (g B y g C), respectivamente. El CAN fue
positivo en 35/71 requiriéndose hasta cuatro muestras para arribar al diagnóstico por este
método. La PCR fue positiva en la primera muestra en 69/71 pac. Se detectó S.s solo por
PCR en 36 pac (50,7%). La sensibilidad de la PCR fue 94% y el VPN 98% cuando se la
DIAGNOSIS & TREATMENT
126
comparó con el CAN. La frecuencia de esta parasitosis es alta en pac con antecedentes
de área endémica sin riesgo de infección exógena. La PCR permite adelantar el
diagnóstico en tres semanas con respecto al diagnóstico convencional.
DYT51
ESTRATEGIAS PARA EL DIAGNÓSTICO DE LEISHMANIASIS TEGUMENTARIA
AMERICANA (LTA) POR PCR EN EL NORTE DE SALTA
Carlos L Hoyos(1), Silvana P Cajal(2), Marisa Juarez(3), Paola Barroso (4), Estefanía
Bracamonte (5), Sabrina Portelli (6), José F Gil(7), Julio R Nasser(8), Alejandro J Krolewiecki
(9)
, Ruybal Paula(10), Jorge D Marco(11)
(1)(7)(9)
Instituto de Investigaciones en Enfermedades Tropicales. UNSa Sede Oran. Consejo
Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET). . (2)(3)Instituto de
Investigacion en enfermedades Tropicale . UNSa Sede Oran . (4)(5)(6)Instituto de Patología
Experimental-Conicet, Univ. Nacional De Salta.. (8)Instituto de Investigaciones en
Enfermedades Tropicales. UNSa Sede Oran. . (10)Instituto de Investigaciones en
Microbiología y Parasitología Médica, UBA-CONICET, Facultad de Medicina, Universidad
de Buenos Aires.. (11)Instituto de Patología Experimental-Conicet, Univ. Nacional De Salta.
Instituto de Investigaciones de Enfermedades Tropicales (IIET), Sede Regional Orán, Fac.
Cs de la Salud, Univ. Nacional de Salta..
E-mail: [email protected]
La LTA es una enfermedad parasitaria endémica en norte de la provincia de Salta,
causada principalmente por Leishmania (Viannia) braziliensis. Los métodos de
diagnóstico directo actuales tienen una sensibilidad relativamente baja. En este trabajo se
evaluaron 3 métodos de la obtención de ADN de las lesiones de pacientes, para mejorar
el desempeño diagnóstico de métodos basados en PCR. Primero se comparó la
capacidad de elusión de material biológico de tres soluciones, solución salina balanceada
- Prolina (PBSS), buffer de lisis (BL) y solución fisiológica (SF). En una segunda fase, se
compararon las capacidades de extracción de palillos e hisopos de algodón obtenidos de
las lesiones. Los templados de ADN se obtuvieron siguiendo el método descripto por
Higuchi (1989) y se normatizaron las condiciones de ciclado para la amplificación de un
fragmento de 700 pb del minicirculo de Leishmania sp. por PCR. Para la primera etapa se
obtuvo material biológico de 16 pacientes, de los cuales en 12 se observaron amastigotes
en frotis. Se obtuvo la amplificación en el 66, 75 y 66% de las muestras procesadas en
PBSS, BL y SF, respectivamente. Sin embargo, se obtuvieron bandas de mayor
intensidad en material procesado con SF. En la segunda fase se utilizó SF para extraer 21
muestras, todas de pacientes con presencia de amastigotes. Se obtuvo amplificación en
70 y 81,8% de las muestras obtenidas con palillos o hisopos respectivamente que en
conjunto representa un 76% de amplificación. Además, en estas últimas muestras, se
logró observar la banda esperada, hasta en una dilución 1/600. La aplicación de estas
estrategias de toma de muestra posibilita la amplificación eficiente en templados diluidos
de ADN de lesiones. Es necesario evaluar el desempeño diagnóstico de las PCRs,
evaluar nuevos primers, y condiciones que permitan la detección y tipificación de
Leishmania spp., en muestras de pacientes que generalmente presentan baja carga
parasitaria en sus lesiones.
DIAGNOSIS & TREATMENT
127
DYT52
REACTIVIDAD DE LOS ANTÍGENOS TCTASV-A Y TCTASV-C DE Trypanosoma cruzi
PARA LA DETECCIÓN DE LA INFECCIÓN EN SUEROS DE PERROS DE ÁREA
ENDÉMICA
Noelia Floridia Yapur(1), Valeria Tekiel(2), Anahí Alberti D’ Amato(3), Mercedes Monje
Rumi(4), Juan J. Lauthier(5), Nicolás Tomasini(6), Paula Ragone(7), Patricio Diosque(8),
Rubén O. Cimino(9), Julio R. Nasser(10)
(1)(9)(10)
Cátedra de Química Biológica. FCN, UNSa. Instituto de Investigaciones en
Enfermedades Tropicales, Sede Orán, UNSa.. (2)CONICET. Instituto de Investigaciones
Biotecnológicas “R. Ugalde”, IIB-Intech, UNSAM-CONICET.. (3)(4)(5)(6)(7)Unidad de
Epidemiología Molecular (IPE), UNSa.. (8)CONICET. Unidad de Epidemiología Molecular
(IPE), UNSa..
E-mail: [email protected]
La determinación de la infección por T. cruzi de manera sensible y específica en perros es
muy relevante para la implementación de programas de control epidemiológico en zonas
endémicas. Las proteínas de la familia TcTASV (subfamilias A, B, C) no poseen ortólogos
en otras especies y se expresan diferencialmente en los estadios de T. cruzi que
parasitan al mamífero, lo que sugiere que podrían ser potencialmente útiles para el
diagnosticar la infección. El objetivo de este trabajo fue determinar la reactividad de
sueros de perros frente a las proteínas recombinantes TcTASV-A y TcTASV-C
(fusionadas a GST) mediante ELISA. Los sueros fueron previamente clasificados como
Tc+ (infectados) ó Tc- (no infectados) mediante ELISA, utilizando un homogenado del
parásito como antígeno (ELISA-HT), que es una técnica de alta sensibilidad pero con
demostrada reactividad cruzada con parásitos emparentados. Se analizó la reactividad
anti-TcTASV de 30 sueros Tc- provenientes perros de área no-endémica y 70 sueros Tc+
de perros de área endémica (en 35 de éstos perros se detectó también la presencia de T.
cruzi por xenodiagnóstico y/o PCR). La reactividad contra cada uno de los antígenos
TcTASV se evaluó en ensayos de ELISA independientes; cada muestra se analizó por
duplicado y se calculó la relación DOAg/DOGST. El 53% (37/70) y 57% (40/70) de los
sueros Tc+ fueron reactivos contra TcTASV-A y TcTASV-C, respectivamente; ningún
suero Tc- presentó reactividad contra TcTASV. La reactividad de los sueros con XD y/o
PCR positiva fue, en promedio, superior a la de aquellos positivos sólo por ELISA-HT. En
conjunto, el 76% (53/70) de los sueros Tc+ reaccionó contra TcTASV-A ó TcTASV-C, con
una concordancia Kappa sustancial (IK=0,65) con la prueba ELISA-HT. La reactividad
observada contra ambos antígenos permite plantear a futuro la utilización de mezclas
TcTASV-A+C para optimizar la detección de la infección por T. cruzi en sueros de perros,
en un único ensayo que presenta 100% de especificidad.
DYT53
RIESGO DE INFECCIÓN CON Trypanosoma cruzi EN UNA POBLACIÓN RURAL
INDÍGENA DEL CHACO ARGENTINO
DIAGNOSIS & TREATMENT
128
María del Pilar Fernández(1), Paula Sartor(2), María Sol Gaspe(3), Yael Mariana Provecho(4),
Ricardo Esteban Gürtler(5)
(1)(3)(4)(5)
Laboratorio de Eco-epidemiología, IEGEBA, CONICET- Depto. EGE, UBA.
(2)
Laboratorio de Eco-epidemiología, IEGEBA, CONICET- Depto. EGE, UBA / Hospital
"Dante Tardelli", Pampa del Indio, Chaco.
E-mail: [email protected]
La enfermedad de Chagas constituye un sistema complejo compuesto por múltiples
factores ecológicos, socio-demográficos y culturales operando a diversas escalas en
ambientes variables. El objetivo de este trabajo fue evaluar la seroprevalencia de T. cruzi
en 6 parajes rurales predominantemente indígenas (Qom) en Pampa del Indio, Chaco,
mediante una encuesta transversal y con vistas a implementar el tratamiento etiológico.
Este trabajo se encuadra en un programa más amplio sobre la (re)infestación por
Triatoma infestans y la transmisión de T. cruzi, que incluyó un rociado con piretroides de
todas las viviendas en 2008. La infestación domiciliaria pre-rociado era 31.9%,
descendiendo a <0.5% post-rociado hasta la actualidad. Los diagnósticos serológicos se
realizaron entre agosto de 2012 y julio de 2013, utilizando dos ensayos
inmunoenzimáticos (EIA Lisado y Rec V3.0, Wiener), a aquellas personas que firmaron el
correspondiente consentimiento informado. Se diagnosticó a 1202 personas (50.2% de la
población) y la seroprevalencia fue del 24.2%, siendo significativamente mayor en los
Qom (25.0%) que en la minoría criolla (14.2%). La seroprevalencia en niños nacidos luego
de 2008 (<5 años en 2012) fue del 3.5%, aumentando desde 6.0 al 18.4% entre los 5 y 24
años de edad (OR=2.9) y alcanzando un plateau entre los mayores de 25 (40.0-67.7%;
OR=29.3). Mediante un análisis de regresión logística multivariada con efectos aleatorios
de la infección en el grupo etario 5-15 años (n=281), se halló que el riesgo aumentaba con
la edad al momento del rociado (OR=1.5), si la madre era seropositiva (OR=13.1), si la
vivienda se hallaba infestada en el pre-rociado (OR=6.4) y si el género era femenino
(OR=6.7). La infección además estaba agregada a nivel del hogar. La relación de la
seroprevalencia con factores demográficos y entomológicos hallada, evidencia una
transmisión vectorial reciente y variable en el tiempo.
DYT54
DETECCIÓN MOLECULAR DE Acanthamoeba spp
Leonardo Fioravanti, María C Irurtia, Alejandra Magdaleno, Graciela Montenegro, Graciela
Peluffo, Susana Di Bartolomeo, Silvia Balconi
Hospital Posadas.
E-mail: [email protected]
Introducción: Acanthamoeba spp. es una ameba de vida libre (AVL) que produce en el
hombre Queratitis por Acanthamoeba (QA). Esta entidad tiene buena respuesta al
tratamiento si es diagnosticada a tiempo, lo que hace importante su correcta detección.
Esta enfermedad está asociada en un 80% a usuarios de lentes de contacto,
principalmente aquellos que tienen una mala práctica higiénica de los mismos. Hoy
existen técnicas de biología molecular que detectan especies de Acanthamoeba.
Objetivos: Puesta a punto de la técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
para la identificación de Acanthamoeba spp. Materiales y métodos: Se cultivaron
DIAGNOSIS & TREATMENT
129
muestras de agua en agar no nutritivo con una suspensión de E. coli como fuente de
alimento para la ameba. Luego de incubar 48 hs a 37°C se observó al microscopio óptico
entre porta y cubreobjetos y se realizó coloración de Giemsa del cultivo. También se
obtuvo una suspensión de Acanthamoeba spp. en solución de Page y se extrajo su ADN
con columnas comerciales. A partir de aquí se realizó una PCR descripta por Schroeder y
cols. en el año 2001, que amplifica un segmento de ADN que codifica para la subunidad
ribosómica 18S específica del género. Resultados: Al microscopio se observaron quistes y
trofozoitos compatibles con Acanthamoeba spp. Con la PCR se obtiene una banda de
entre 450 y 500 pb correspondiente al segmento amplificado. Conclusiones: La PCR es
una técnica que podría utilizarse para la detección de Acanthamoeba spp. a partir de
muestras biológicas.
EPIDEMIOLOGY & VECTORS
129
EYV01
EVALUACIÓN DIAGNÓSTICA DE LOS ANTÍGENOS RECOMBINANTES P2ß Y B13 DE
Trypanosoma cruzi EN SUEROS DE PERROS INFECTADOS NATURALMENTE
Fátima C Gómez Gramajo(1), Mercedes Monge Rumi(2), Paula Ragone(3), Juan Lauthier(4),
Nicolás Tomasini(5), Anahí Alberti DAmato(6), Patricio Diosque(7), Julio R Nasser(8), Iván
Marcipar(9), Rubén Cimino(10)
(1)
1Cátedra de Química Biológica, Facultad de Ciencias Naturales, UNSa..
(2)(3)(4)(5)(6)(7)
4Unidad de Epidemiología Molecular (IPE-CONICET), UNSa.. (8)1Cátedra de
Química Biológica, Facultad de Ciencias Naturales, UNSa. 2Instituto de Investigaciones
en Enfermedades Tropicales, Sede Regional Orán, UNSa.. (9)3Laboratorio de tecnología
Inmunológica. Facultad de Bioquímica y Ciencias Biológicas. UNL.CONICET. .
(10)
1Cátedra de Química Biológica, Facultad de Ciencias Naturales, UNSa. 2Instituto de
Investigaciones en Enfermedades Tropicales, Sede Regional Orán, UNSa. .
E-mail: [email protected]
La enfermedad de Chagas es la parasitosis más importante de Latinoamérica que afecta
a millones de personas y constituye un serio problema para la salud pública. El estudio de
antígenos recombinantes, potencialmente específicos, frente a paneles de sueros de
regiones endémicas es importante para determinar el valor diagnóstico de éstos. Los
perros constituyen un importante reservorio del parásito en el ciclo domiciliario de la
infección; por lo que en los últimos años se han llevado a cabo numerosos estudios para
mejorar su diagnóstico debido a que estos animales pueden ser utilizados como
“centinelas” en la transmisión de T. cruzi. El objetivo de este trabajo fue evaluar la
capacidad diagnóstica de los antígenos recombinantes del parásito P2ß y B13 y de una
mezcla antigénica de ambos. Se trabajó con 2 grupos de sueros; Controles positivos: 43
sueros de perros infectados naturalmente con serología y/o xenodiagnóstico y/o PCR
positivo para T. cruzi; Controles negativos: 22 sueros de perros de un área no endémica,
todos con serología negativa para T. cruzi. Para los ensayos serológicos se trabajó con
los antígenos recombinantes P2ß, B13 y mezcla de ambos en concentración
0,25µg/poc/100µL en buffer bicarbonato (pH:9.6). La dilución de suero, Ac. 2° biotinilado
(IgG total anti-dog) y de adivina-peroxidasa fue de 1/50, 1/1250 y 1/8000,
respectivamente. Se utilizó el programa GraphPadPrism5 para calcular el Área Bajo la
Curva (ABC) ROC para cada ensayo de ELISA. El ABC para ELISA-P2ß fue de 0,91
[IC95%: 0,83-0,99]; para ELISA-B13 [IC95%:0,80-0,10] fue de 0,91; mientras que la
mezcla ELISA-P2ß+B13 tuvo un ABC 0,71 [IC95%:0,58-0,84]. Los antígenos
recombinantes (P2ß y B13) evaluados individualmente presentaron mejor rendimiento que
cuando fue evaluado usando una mezcla entre ambos, según la comparación del Área
Bajo la Curva ROC para cada ensayo.
EYV02
PRESENCIA DE Acanthamoeba EN AGUAS DE BEBIDA PARA CONSUMO
GANADERO
Maria del carmen rojas(1), Sixto Raúl Costamagna(2), Marcelo RodriguezFermepin(3)
(1)
EEA Anguil INTA. (2)Cátedra de Parasitología Clínica. Departamento de Biología,
Bioquímica y Farmacia. Universidad Nacional del Sur. Bahía Blanca. (3)Cátedra de Análisis
EPIDEMIOLOGY & VECTORS
130
Clínicos I, Área Inmunología Clínica, Departamento de Bioquímica Clínica, Facultad de
Farmacia y Bioquímica, UBA.
E-mail: [email protected]
Introducción: Las amebas son protozoos que pueden desarrollarse en múltiples ambientes
en condición de vida libre (AVL) o parásita. Estos organismos han adquirido mayor
atención al ser causales de enfermedades en humanos y animales.Acanthamoeba ha sido
aislada de una amplia variedad de hábitats, siendo el agua una importante vía de
diseminación y contagio.El objetivo de este trabajo fue estudiar la presencia,identificación
y confirmación por métodos moleculares, de Acanthamoeba en sistemas ganaderos de la
provincia de La Pampa.Materiales y Métodos: Se analizaron aguadas de 50
establecimientos ganaderos de la provincia de La Pampa. Las muestras reposaron en
laboratorio 24 horas. Se retuvo un volumen de 40 ml y se centrifugóa volumen cero 10
minutos a 2000 rpm. Los sedimentos se sembraron en agar no nutritivo al 1.5%,
suplementado con una suspensión de Echerichia coli en solución de Page y cultivados a
37ºC. La muestra fue considerada negativa cuando no se detectó crecimiento después de
15 días de incubación.Se caracterizó microscópicamente la morfología de trofozoítos y
quistes.Los cultivos fueron concentrados por centrifugación y purificados siguiendo el
procedimiento UNSET. Los fragmentos del gen del ADNr18S de Acanthamoebafueron
amplificados mediante el set de primers JDP1/JDP2. El control positivo fue una cepa de
laboratorio.Resultados: Se identificaron AVL en 39 establecimientos (78%) pertenecientes
al género Acanthamoeba. Los diámetros promedio de trofozoitos y quistes fueron 11.8 ± 2
y9.6± 0.2 µm, respectivamente. En el 54% (21) de lasmuestras correspondieron al grupo II
y en 46% (18)al grupo III de Pussard. Hasta la fechase tipificaron 15 aislados, por PCR,
10 de los cuales confirmaron su correspondencia con Acanthamoeba sp.Conclusiones: Se
confirmó la presencia de Acanthamoeba en aguadas de sistemas ganaderos en la
provincia de La Pampa, existiendo una fuente de infección para el ganado y personal
rural.
EYV03
ORIGEN DE INDIVIDUOS REINFESTANTES DE Triatoma infestans EN UN PARAJE
RURAL DEL GRAN CHACO ARGENTINO
Romina V Piccinali, Ricardo E Gürtler
Laboratorio de Eco-Epidemiología. EGE.FCEN. UBA. IEGEBA. CONICET.
E-mail: [email protected]
Un aspecto fundamental para el control vectorial de la enfermedad de Chagas es
identificar las causas de la incompleta eliminación de Triatoma infestans en comunidades
rurales aisladas que fueron tratadas con insecticidas. Estas fallas de control pueden
deberse a múltiples factores y por esta razón resulta importante investigar el proceso de
reinfestación y establecer si los insectos que se encuentran después de la aplicación de
insecticidas son supervivientes o inmigrantes desde otras fuentes. En este trabajo se
estudia la dinámica de reinfestación de las viviendas por T. infestans analizando la
estructura genética de este insecto a una micro-escala (500-2000 m) y el origen de los
individuos reinfestantes en un paraje rural del municipio de Pampa del Indio, Chaco, el
cual fue rociado con insecticidas en 2007 y continúa bajo vigilancia entomológica. Se
genotiparon para 10 loci microsatélites insectos colectados en 16 viviendas antes de un
EPIDEMIOLOGY & VECTORS
131
rociado masivo con insecticidas (pre-rociado, N=225) y a los 6 y 10 meses del mismo
(post-rociado, N=56). Se realizó un análisis de agrupamiento con STRUCTURE 2.3.4 y
una prueba de asignación con Geneclass 2.0. Se detectaron 3 grupos genéticos
diferentes, con niveles variables de admixture. Los individuos de pre-rociado de una
misma vivienda fueron en general más parecidos entre sí que respecto de otras viviendas.
Los insectos de post-rociado mostraron proporciones de cada grupo genético similares a
las de los insectos de pre-rociado del mismo sitio, con excepción de un macho y una ninfa
V colectados en 2 viviendas. Estos 2 individuos, junto con otras 2 ninfas V de una tercera
vivienda, resultaron excluídos en la prueba de asignación cuando se los comparó con la
población de pre-rociado de la vivienda donde fueron colectados. Estos resultados indican
que la infestación post-rociado se origina principalmente en focos residuales pero que
también existen eventos de migración de insectos desde otras viviendas o fuentes no
muestreadas.
EYV04
PREVALENCIA DE PARASITOSIS EN DISTINTOS BARRIOS DE LA CIUDAD DE
ORAN PROVINCIA SALTA
Silvana Pamela Cajal(1), Caro Nicolas(2), Juarez Marisa del Valle(3), Canavire Maria (4),
Krolewiecki Alejandro (5)
(1)
Universidad Nacional de Salta - Instituto de Investigaciones de Enfermedades
Tropicales. (2)(3)Universidad Nacional de Salta - Fundacion Mundo Sano. (4)Universidad
Nacional de Salta. (5)Universidad Nacional de Salta - Instituto de Investigaciones de
EnfermedadesTropicales .
E-mail: [email protected]
INTRODUCCIÓN La alta incidencia de infección por parásitos intestinales afecta la salud
de los individuos, pudiendo causar anemias y función cognitiva, principalmente en niños,
quienes son los más afectados. El problema de las infecciones helmínticas se encuentra
concomitantemente a la desnutrición en zonas de bajos recursos y con inadecuada
infraestructura sanitaria. OBJETIVOS: Determinar prevalencia del parasitismo intestinal,
en distintos barrios de la ciudad de Oran, mediante técnicas sencillas y de alto
rendimiento. MATERIAL Y METODO: Se incluyo 449 individuos entre 1 y 70 años de
edad, de ambos sexos, que asistieron en búsqueda de diagnostico coproparasitológicos al
IIET. Se realizo estudios coproparasitologicos, de heces obtenidas por evacuación
espontanea, mediante examen previa concentración, por centrifugación y método de
flotación, ficha personal que incluye datos, epidemiológicos, número de identificación,
nombre, edad, sexo, residencia. RESULTADOS: Se encontró que el 57,68 % (n=259) de
las personas están parasitadas. Se los agrupo dependiendo de la precedencia 10 Centros
de Salud. Los enteroparásitos más frecuentes fueron Giardia lamblia (22%) seguidas por
Entamoeba coli (17,4%), Hymenolepis nana (12%), Ascaris lumbricoides (7,3%),
Enterobius vermicularis (1,5%), Strongyloides stercorlis (0,9%) Uncinarias spp (0,9%).
CONCLUSION: distribución uniforme de las parasitosis intestinalis en distintos grupos
etareos evaluados y diferentes barrios de la ciudad, evidencia la exposición en todas
regiones de la ciudad. DISCUSIÓN Los resultados muestran predominancia de
protozoarios sobre helmintos, indicando que la población posee alta contaminación fecal,
debido a medidas deficientes de salubridad, debiéndose implementar programas de
EPIDEMIOLOGY & VECTORS
132
control y prevención de enteroparásitos; una sencilla, económica y eficaz técnica
diagnóstica y adecuado tratamiento antiparasitario, para el control de las parasitosis
intestinales.
EYV05
LEISHMANIASIS VISCERAL CANINA (LVC): VÍAS DE TRANSMISIÓN (VdT) EN
ZONAS NO ENDÉMICAS (ZnE)
Victoria Fragueiro Frías, Vanesa Negri, Concepción Luna, Ángel Sinagra, Carlos Pravia,
Adelina Riarte
INP. Fatala Chabén.
E-mail: [email protected]
La LVC es una enfermedad zoonótica causada por Leishmania infantum syn L.chagasi,
vector Lutzomia longipalpis y reservorio el perro infectado, con o sin manifestaciones
clínicas. La investigación de foco del 1° caso autóctono reveló concurrencia de agente
etiológico, vector y reservorio. Dado que LVC precede a la aparición de LV humana, la
vigilancia laboratorial de caninos es parte de la estrategia de control. El diagnóstico de
LVC es necesario para la implementación de medidas destinadas a interrumpir la
transmisión. La vectorial es la VdT predominante en zonas endémicas (ZE), pero existen
evidencias de VdT vertical, venérea, transfusional y horizontal, de escasa relevancia en
ZE, perpetuando la presencia de portadores en ZnE. En el Instituto Nacional de
Parasitología, período 2009 - 2013 se evaluaron 1649 canes por inmunocromatografía
rK39 (KalazarDetect), frotis (PAAF de ganglio/médula ósea/ lesiones cutáneas), cultivos,
inoculación en hámsters y/o PCR. Provenientes de estudios de campo en ZE, 1515 y de
centros veterinarios, 134. En los perros positivos se evaluaron vías de contagio, aspectos
epidemiológicos, clínicos y de laboratorio, resultando 44 positivos: 11 de ZnE adquirieron
la enfermedad por viaje a ZE; 5 transmisión vertical; 1 transfusional; 1 horizontal y 5 en
países limítrofes. La intervención sobre el reservorio impide la circulación y/o dispersión
geográfica de la LV. El manejo del reservorio es complejo, debe desarrollarse de manera
intersectorial y las medidas de control acompañarse de políticas públicas que den
sustento legislativo a las acciones. Habiendo evidencias de otras VdT, los perros
sospechosos de LVC se deben monitorear rigurosamente: evitar la transmisión venérea,
el traslado de perros sanos y/o infectados desde/hacia ZE e ingresos provenientes de
terceros países; normatizar el control de criaderos; realizar serología a dadores de sangre
y difundir entre veterinarios el riesgo de las transfusiones sin control.
EYV07
IMPACTO DE LA INSTALACIÓN DE NUEVAS VIVIENDAS SOBRE LA INFESTACIÓN
POR Triatoma infestans EN LOS LLANOS(LA RIOJA)
María
J
Cavallo,
Ivana
Amelotti,
Silvia
S
Catalá,
David
E
Gorla
Centro Regional de Investigaciones Científicas y Transferencia Tecnológica (CRILAR).
E-mail: [email protected]
EPIDEMIOLOGY & VECTORS
133
El mal de Chagas, producido por Trypanosoma cruzi, es la enfermedad endémica más
importante de Argentina. A través del Programa de Erradicación de Viviendas Rancho
(VR), el Gobierno de La Rioja construyó nuevas viviendas (NV) en áreas rurales para
reemplazar las VR y mejorar la calidad de vida de las comunidades. El objetivo de este
trabajo es evaluar el efecto de la instalación de NV en un departamento provincial de Los
Llanos riojanos sobre la infestación domiciliaria por T. infestans antes y después de la
instalación de las NV. Durante 2014 se visitaron los 8 departamentos de los Llanos
riojanos para realizar un relevamiento donde se registró la ubicación de cada una de las
NV, características constructivas, coordenadas geográficas, datos demográficos, tipos de
estructura del peridomicilio y la presencia/ausencia de VR asociadas a las NV. Se
relevaron un total de 238 NV, de las cuales la mayoría pertenecían al Dpto. San Martin
(91 NV), históricamente el de mayor prevalencia de infestación por T. infestans. De las 91
NV de San Martin, 68 cuentan con registros históricos de infestación en las bases de
datos del Programa Chagas La Rioja. En el año 2006 se encontró 17% de infestación
intradomiciliaria (ID) y 41% infestación peridomiciliaria (PD). En 2011, en las NV, se
registró 13% de infestación ID y 37% de infestación PD. Estos resultados preliminares no
muestran diferencias significativas en la prevalencia de infestación (OR=0.71 [0.2-2.3])
luego de la construcción de las NV. El 67 % de NV aún conserva a pocos metros (x=26.3
m) las VR, donde previamente había infestación de T. infestans. Es posible que en el
movimiento de pertenencias domésticas a la NV exista transporte pasivo de T. infestans
en alguno de sus estados de desarrollo, iniciando una nueva colonización. Aún cuando en
la muestra de viviendas analizadas la infestación es relativamente elevada, no existen en
la región niños <5 años infectados por T. cruzi. Financiación: CONICET y PICT-1109
(ANPCYT)
EYV08
INTESTINAL PARASITES CAUSED BY GEOHELMINTHS IN CHILDREN FROM
ARGENTINA
Paola Cociancic(1), María L Zonta(2), Mariela Garraza(3), Graciela T Navone(4)
Centro de Estudios Parasitológicos y de Vectores (CEPAVE). UNLP-CONICET-CCT
La Plata . (3)Centro de Estudios Parasitológicos y de Vectores (CEPAVE). UNLPCONICET-CCT La Plata; Instituto de Genética Veterinaria “Ing. Fernando Noel Dulout”
(IGEVET). FCV, UNLP- CONICET-CCT La Plata .
E-mail: [email protected]
(1)(2)(4)
In Argentina, the taxonomic composition and distribution of intestinal parasites in human
populations differ depending on climatic, geographic and socio-economic factors of a
particular area.
The aim of the present study was to determine the prevalence of intestinal parasitism
caused by geohelminths in children of Argentina according to biogeographical features of
studied regions.
Serial fecal samples of 3533 children of both sexes up to 14 years old were analyzed.
They were grouped into two ranges of age (≤ 5 and ≥ 6 years old). This study was
performed in different localities in Buenos Aires (BA), Corrientes (CO), Chubut (CH), Entre
EPIDEMIOLOGY & VECTORS
134
Ríos (ER), La Pampa (LP), Mendoza (ME), Misiones (MI) y Salta (SA). Data was
processed with Epi Info 7.
Nine percent of the total population analyzed (310/3533) were parasitized by at least one
geohelminth, such as Ancylostomids (4.7%), Strongyloides stercoralis (3.3%), Ascaris
lumbricoides (2.5%) and Trichuris trichiura (0.7%), which were more frequent among
children older than 6 years old (p˂0.01). Sex differences were nonsignificant. The highest
prevalence of geohelminths was observed in MI (23.3%), followed by CO (6.7%), BA
(5.7%), ER (0.75%) and ME (0.7%) (p<0.01). Geohelminths were not found in CH, LP and
SA. Ascaris lumbricoides was highest in BA and CO (5%) followed by MI (2.6%) and ME
(0.3%) (p˂0.01). In MI, S. stercoralis and Ancylostomids showed a higher value than in BA
(11.1% vs. 0.2%) and ME (16.2% vs. 0.4%), respectively. In BA, the presence of A.
lumbricoides was associated to T. trichiura. In MI, S. stercoralis was associated to A.
lumbricoides and Ancylostomids.
The differences observed in the distribution of the geohelminths could be caused by
environmental humidity and temperature, as well as to the soil type where eggs and larvae
develop, between other factors.
In Argentina, the distribution and prevalence of geohelminths fluctuate, being possible to
estimate a multiplicity of causal factors of these infections.
EYV09
Cryptosporidium spp. PREVALENCE AND MOLECULAR IDENTIFICATION OF
Cryptosporidium parvum IN DAIRY CALVES FROM CORDOBA, ARGENTINA
Joaquín A Lombardelli(1), Guillermo Giaj-Merlera(2), Mariela L Tomazic(3), Leonhard
Schnittger(4), Karina I Tiranti(5)
(1)(5)
Departamento de Patología Animal, Facultad de Agronomía y Veterinaria, Universidad
Nacional de Río cuarto. (2)Departamento de Microbiologia e Inmunologia, Facultad de
Ciencias Exactas, Fco-Qcas y Naturales, Universidad Nacional de Río cuarto. (3)(4)Instituto
de Patobiología, Centro de Investigaciones en Ciencias Agronómicas y Veterinarias,
INTA-Castelar.
E-mail: [email protected]
Cryptosporidiosis is an important cause of gastrointestinal disease worldwide in a variety
of hosts, including humans and cattle. Cryptosporidium parvum as a causative agent
represents the main zoonotic species and is transmitted by ingestion of food and water
contaminated with oocysts as the infective parasite stage. The objective of this study was
to estimate Cryptosporidium spp. prevalence and identify C. parvum in dairy calves from
Córdoba, Argentina. Fecal samples were obtained from calves less than 7 weeks of age
and oocysts were concentrated with Telleman procedure, and subsequently stained using
the modified Ziehl-Neelsen technique. DNA samples were subjected to PCR-RFLP
analysis of the 18S rRNA in order to identify C. parvum. A total of 1050 samples from 54
dairy farms were recollected between April and October of 2013. Eighty nine percent of
dairy herds presented at least one positive calf. Prevalence of Cryptosporidium spp. on
positive dairy herds ranged from 8% to 57% (mean 27%), and in 44.4% of the herds the
prevalence was higher than the mean value. Cryptosporidium spp. calf prevalence was
EPIDEMIOLOGY & VECTORS
135
26.4% (95% CI: 23.6; 29.1), calves younger than two weeks were almost two times more
likely to be positive to Cryptosporidium spp. in comparison to older ones (RP: 1.8, 95% CI:
1.4; 2.2). Six of 35 samples were identified as C. parvum by PCR-RFLP. The current study
revealed that Cryptosporidium spp. has a high prevalence in the area, with higher rate of
positives in calves younger than two weeks. C. parvum was identified in calves,
representing a risk of zoonotic infection in high prevalence herds.
EYV10
CARACTERIZACIÓN TOXICOLÓGICA, ENZIMÁTICA Y MOLECULAR DE Triatoma
infestans RESISTENTES A DELTAMETRINA EN COMUNIDADES RURALES DE
SANTA CRUZ, BOLIVIA
Claudia V Vassena(1), Pablo L Santo Orihuela(2), Paula Marcet(3)
Centro de Investigaciones de Plagas e Insecticidas (CONICET/UNIDEF). (3)CDC
Centers for Disease Control and Prevention, Atlanta, EEUU.
E-mail: [email protected]
(1)(2)
Trabajos realizados durante la última década, mostraron que la resistencia a insecticidas
en T.infestans es un problema complejo. En Bolivia se detectaron altos niveles de
resistencia en poblaciones de Tarija, Chuquisaca y Cochabamba relacionados a fracasos
en el control. Se estudió la susceptibilidad a deltametrina en poblaciones de T. infestans
en comunidades rurales del departamento de Santa Cruz donde el control vectorial fue
irregular y discontinuo. Se capturaron T. infestans en domicilios de Guasuanti, El Cruce e
Itapicué que se criaron en laboratorio hasta la obtención de huevos. Se realizó un análisis
toxicológico y se evaluó la contribución de piretroide-esterasas en ninfas I. Se compararon
los parámetros de dosis letal (DL50) de las poblaciones de ensayo y la de referencia.
Mediante secuenciación de ADN, se evaluó la presencia de mutaciones en el gen del
canal de sodio, previamente descritas como causantes de resistencia a piretroides. Las
poblaciones presentaron diferentes grados de resistencia la deltamentrina (Guasuanti
RR=2.71; Itapicue RR=10.62 y El Cruce 13.90). Los valores de las piretroide-esterasas
variaron entre 17.91 y 18,63 picomoles por minuto y por insecto. Los valores de actividad
de enzimáticas difirieron significativamente respecto a los de la cepa de referencia. Los
individuos de Guasuanti e Itapicoe no presentaron mutaciones en el gen kdr. Sin
embargo, se encontró un individuo heterocigota (portador de las dos variantes, resistente
y susceptible) en El Cruce, lo cual indicaría el potencial de desarrollo de resistencia
molecular en esta población. La historia de control vectorial y la ubicación geográfica
puede explicar el patrón diferencial de resistencia entre comunidades. Los valores de
resistencia observados no significarían en la actualidad un problema para el control, pero
indican la necesidad de monitoreo permanente para detectar tempranamente cambios en
niveles de resitencia y adaptar los protocolos de intervención adecuadamente.
EYV11
ESTUDIO TOXICOLÓGICO, BIOQUÍMICO Y MOLECULAR DE LA RESISTENCIA A
INSECTICIDAS PIRETROIDES EN POBLACIONES DE Triatoma infestans DE SALTA,
ARGENTINA
EPIDEMIOLOGY & VECTORS
136
Pablo L Santo Orihuela(1), Claudia V Vassena(2), Paula Marcet(3)
Centro de Investigaciones de Plagas e Insecticidas (CONICET/UNIDEF). (3)Centers for
Disease Control and Prevention - Division of Parasitic Diseases and Malaria, Atlanta,
USA..
E-mail: [email protected]
(1)(2)
El control de poblaciones de triatominos se ha basado principalmente en la utilización de
insecticidas piretroides. Su empleo continuo ha llevado al desarrollo de resistencia y fallas
de control. Con el objetivo de determinar los posibles mecanismos causantes de
resistencia se evaluaron Triatoma infestans de dos localidades (Salvador Mazza y La
Pista) de la provincia de Salta, Argentina. Se determinó la posible contribución a la
resistencia de piretroide-esterasas y la presencia de dos mutaciones en la secuencia de
un gen del canal de sodio (kdr) ya descriptas en diversos grupos de insectos resistentes a
piretroides. Como colonia de referencia se utilizó una población criada en el CIPEIN sin
exposición a insecticidas. Los grados de resistencia (RRs) fueron determinados mediante
bioensayos y la actividad de piretroide-esterasas fue evaluada espectrofluorometricamente y de manera individual mediante un método desarrollado en el CIPEIN
a partir de la síntesis de un nuevo sustrato, el 7-permetrato de cumarilo. Las poblaciones
estudiadas presentaron RRs a deltametrina mayores a 130. Las actividades de piretroide
esterasas de las poblaciones estudiadas se distribuyeron en un rango de entre 13,51 a
50,43 picomoles por minuto y por insecto. Individuos de ambas poblaciones presentaron
una sustitución nucleotídica en la posición L1014 del gen kdr, mutación que genera un
cambio de aminoácidos en la proteína del canal de sodio y que confiere resistencia a
insecticidas piretroides. Esta mutación no se detectó en individuos de la población de
referencia. Ninguna de las 3 poblaciones evaluadas presentó la mutación en el sitio
L9251. El análisis de piretroide-esterasas demuestra que las enzimas evaluadas no
realizarían un aporte contributivo a la resistencia a piretroides. Sin embargo y acorde con
la caracterización toxicológica de las poblaciones analizadas, existe una correlación
significativa entre los RRs detectados y la presencia de la mutación L1014F en el gen de
kdr.
EYV12
EFECTO REPELENTE DEL DEET SOBRE LA CHINCHE DE CAMA (Cimex lectularius
l.) UNA PLAGA REEMERGENTE PRESENTE EN ARGENTINA
Claudia V Vassena, Pablo L Santo Orihuela
Centro de Investigaciones de Plagas e Insecticidas (CONICET/UNIDEF).
E-mail: [email protected]
C. lectularius es un hemíptero hematófago ectoparásito de aves y mamíferos. En los
últimos años se registró en el mundo la “resurgencia” de este insecto y la resistencia a
insecticidas. En trabajos previos del CIPEIN demostramos la presencia de estas chinches
en más de 40 ciudades y localidades de Argentina y la resistencia a insecticidas en tres
colonias de Buenos Aires. Es pública y notoria la dificultad de control y la necesidad de
evitar las picaduras en la personas. Una herramienta eficaz y de amplia distribución es el
uso de la N, N-dietil-m-toluamida (DEET) como repelente. Con el objetivo de verificar la
efectividad del DEET, se evaluó su efecto sobre la cepa susceptible de laboratorio (Harold
Harlan) con ayuno de 5 y 10 días. Se prepararon arenas experimentales (papel de filtro)
EPIDEMIOLOGY & VECTORS
137
con 2 áreas de igual superficie, una interna impregnada con acetona y otra externa
tratada con distintas concentraciones de DEET. Grupos de 10 adultos se colocaron en la
zona central y cada 5 minutos y durante 1 hora se registró el porcentaje de chinches
presentes en cada área. Cada ensayo se replicó 3 veces. El comportamiento natural de
los insectos es caminar hacia hacia la zona externa (tigmotaxis) por ello se impregna con
el repelente en esta zona. El índice de repelencia (IR) para cada concentración y estado
nutricional se calculó como el % de repelencia en la zona externa. El IR varía entre 1 y
100, a mayor repelencia mayor el índice. Se realizó una curva de índices de repelencia en
función de las dosis. Para una concentración de 0.13 mg/cm2 se registraron IR mayores a
90 para ambos estados nutricionales. Posteriormente al tratamiento se dejó durante 30
minutos a todos los insectos en una arena control y se verificó que no existe fenómeno de
adaptación. Este hallazgo sugiere que la aplicación de DEET sobre equipaje y
pertenencias de viajeros y de técnicos especializados en el control de plagas es una
buena alternativa para evitar el acercamiento del insecto.
EYV13
A PROSPECTIVE STUDY OF Toxoplasma gondii SEROPREVALENCE AT THE
LABORATORIES FROM THE TOXOPLASMOSIS NATIONAL NETWORK OF THE
PROVINCE OF BUENOS AIRES
Laura S Alvarez(1), Patricia K Campo(2), Lucia E Irazu(3), Delfina Gallo(4), Claudia Ferrer(5),
Ana Musali(6), Elizabeth Manciola(7), María L Canil(8), Fernanda Russo(9), Mónica G
Nigro(10), Bibiana A Ledesma(11)
(1)(2)(3)(10)(11)
INEI-ANLIS Dr . (4)H.M San Andrés de Giles. (5)HIGA “Presidente Perón” de
Avellaneda. (6)H.Z.G de Las Flores . (7)Gral San Martín de La Plata. (8)Dr. H. Cura de
Olavarria . (9)Htal Chivilcoy .
E-mail: [email protected]
Toxoplasmosis is a highly prevalent parasitic disease in the world. If it is firstly acquired
during pregnancy it can cause serious fetal harm depending on the moment in which the
mother becomes infected. With the purpose of estimating the seroprevalence of
Toxoplasma gondii (Tg) infection in fertile women, describing by gravidy and sanitary
region (SR), a pilot study was carried out during the period 2011-2013. A total of 2803
samples were received from the following hospitals: HIGA “Presidente Perón” from
Avellaneda, Gral. San Martín from La Plata; HZG from Las Flores; HM San Andrés de
Giles, Chivilcoy; and Dr. H. Cura from Olavarría; all belonging to different SR. The
samples were processed by the total tachyzoites ELISA in house technique for the
detection of IgG anti-Tg antibodies. Data was analyzed with theEPI info 2000 software.
The results were: 1129 (40,2%) positive (33,6% pregnant, 66,4% non-pregnant); 1510
(53,9%) negative (35,5% pregnant, 64,5% non-pregnant) and 164 (5,9%) indefinite (30,5%
pregnant; 69,5% non-pregnant). For SR IV from a total of 696 samples, 314 (45,1%) were
positive, 340 (48,9%) negative, 42 (6,0%) indefinite. SR VI from a total of 785 samples,
262 (33,4%) were positive, 485 (61,8%) negative, 38 (4,8%) indefinite. SR IX from a total
of 388 samples, 171 (44,1%) were positive, 177 (45,6%) negative, 40 (10,3%) indefinite.
SR X from a total of 248 samples, 109 (44,0%) were positive, 130 (52,4%) negative, 9
(3,6%) indefinite. SR XI from a total of 686 samples, 273 (39,8%) were positive, 378
(55,1%) negative, 35 (5,1%) indefinite. Seroprevalence is 40,4% at provincial level and, in
EPIDEMIOLOGY & VECTORS
138
pregnant women it is over 40% in four out of five regions. In pregnant women with positive
serology, their developed immunity protects the foetus from infection. However, pregnant
women with negative serology are prone to acquire toxoplasmosis and transmit the
disease to the foetus.
EYV14
MOLECULAR CHARACTERIZATION OF INFECTION BY Trypanosoma sp. IN WILD
BLACK AND GOLD HOWLER MONKEYS FROM NORTHEASTERN ARGENTINA
Mariela F Martínez(1), Martín M Kowalewski(2), Daniel O Salomón(3), Alejandro G
Schijman(4)
(1)(3)
Instituto Nacional de Medicina Tropical (INMeT) - Ministerio de Salud de la Nación.
(2)
Estación Biológica Corrientes - Museo Argentino de Ciencias Naturales (EBCo - MACN)
- CONICET. (4)Laboratorio de Biología Molecular de la Enfermedad de Chagas, Instituto de
Investigaciones en Ingeniería Genética y Biología Molecular “Dr. Héctor Torres” (INGEBI)
- CONICET.
E-mail: [email protected]
Natural populations of Trypanosoma cruzi have been classified in six discrete typing units
(DTUs) associated to different environments, vectors and mammalian hosts. Our goal was
to identify the different lineages of T. cruzi and other trypanosomes that infect howler
monkeys in northeastern Argentina using molecular techniques. The study was conducted
in Isla Brasilera (IB), a small island in the Paraná River with almost no human contact, and
in the surroundings of the rural locality San Cayetano (SC). A total of 108 animals (51 in IB
and 57 in SC) were captured using anesthetic darts. The animals were bleed by
venipuncture and each blood sample was diluted in EDTA 0,5M. PCR-amplification of
three different DNA target regions were used for diagnosis: kinetoplastid DNA (kDNAPCR), satellite DNA (SatDNA-PCR), and D7 domain 24Sα rRNA genes (rDNA-PCR). The
kDNA-PCR detected 45% positive samples from IB and 48.3% from SC. Using SatDNAPCR in positive kDNA samples we detected infections by T. cruzi in three howlers from IB
and five from SC. The SatDNA sequences obtained in one howler from IB and three from
SC shared 99% identity with those previously reported in the DTUs II, V, and VI, which are
associated to the domestic transmission cycle of T. cruzi. In contrast, a different SatDNA
sequence in other howler from IB showed high similarity (99%) to those reported in the
DTU I, which are more related to wild transmission cycle in Didelphis sp. The rDNA-PCR
detected 98% positive samples from IB and 94.8% from SC. Nine rDNA sequences (4
from IB and 5 from SC) shared 98% identity with the homologous gene in T. minasense.
This study provides the first report of infection by T. cruzi and T. minasense in wild howler
monkeys in Argentina. Our results suggest that A. caraya could be acting as a potential
reservoir in the wild transmission cycle of the Chagas disease in the study areas.
EYV15
INFECCIÓN POR Toxocara canis EN POBLACIÓN RURAL DE CORRIENTES
EPIDEMIOLOGY & VECTORS
139
María de los Angeles López(1), María V Bojanich(2), Leandro M García(3), Yohana Sappa
Figueroa(4), Gustavo J Fernández(5), Silvia E Balbachan(6)
(1)(3)(5)(6)
Instituto de Medicina Regional - UNNE. (2)(4)Facultad de Cs. Exactas - UNNE.
E-mail: [email protected]
Toxocara canis es un nematode de los caninos que infecta al hombre en forma accidental.
Se encuentra distribuido en todo el mundo y la población de mayor riesgo es la que vive
en condiciones socioeconómicas desfavorables. Según datos censales los deptos. San
Cosme y San Luis del Palmar, en el NO de la prov. de Corrientes, poseen un 76% y 47%
de población rural respectivamente. Su clima es subtropical con abundantes lluvias y
temperaturas templadas. Objetivo: Determinar las características epidemiológicas de la
toxocariosis en pobladores rurales de estas localidades. Se estudiaron 205 muestras de
suero de niños y adultos, de áreas rurales de San Luis del Palmar y San Cosme. Se
consignaron datos de edad y sexo de los individuos estudiados, y contacto con animales
en el hogar. Se investigó la presencia de anticuerpos IgG anti-T. canis por ELISA en fase
sólida utilizando antígeno de excreción/secreción de larvas L2 y anti-IgG humana
marcado con peroxidasa. Entre los 205 individuos estudiados, hubo 97 varones y 108
mujeres, edades entre 1 y 88 años. La seroprevalencia global encontrada fue de 49,3%,
siendo 41% entre los niños menores a 16 años (n=122) y 61,4% en adultos (n=83)
p=0,004. En los varones la prevalencia fue de 53,6% y en las mujeres 45,3%. Todos los
individuos refirieron la presencia de uno o más perros en la vivienda. Los valores hallados
concuerdan con los reportados en otras poblaciones rurales de características climáticas
semejantes; son más bajos a los encontrados en poblaciones carenciadas urbanas de
Corrientes, pudiendo deberse a la mayor extensión de tierras y por ende a la menor
contaminación con heces caninas en el peridomicilio. La seroprevalencia fue mayor en los
adultos que en los niños, debido probablemente a que las actividades rurales suponen un
contacto estrecho con el suelo contaminado en la edad adulta. Concluimos que la
prevalencia de toxocariosis en la población estudiada es elevada, y son necesarias
medidas sanitarias de control.
EYV16
REINFESTACIÓN DE VIVIENDAS POR Triatoma infestans EN LOS LLANOS DE LA
RIOJA EN EL PERÍODO 2005-2011
Ivana Amelotti, Silvia S Catalá, David E Gorla
Centro Regional de Investigaciones y transferencia Tecnológica La Rioja.
E-mail: [email protected]
La enfermedad de Chagas es una zoonosis causada por Trypanosoma cruzi, parásito
transmitido vectorialmente por el insecto Triatoma infestans. El Programa provincial de
Chagas de La Rioja (PPChLR) realiza evaluaciones entomológicas y rociado con
insecticidas como principal forma de control vectorial. Aunque el ideal sería que la
evaluación se realizara con cobertura completa del territorio endémico en una frecuencia
fija, los recursos disponibles afectan la periodicidad de evaluación. Al mismo tiempo, se
conoce que la prevalencia de infestación en el área de estudio es heterogénea. El objetivo
de este trabajo fue estimar el período en que es detectada la reinfestación de las
viviendas pertenecientes a localidades que conforman el cluster de mayor infestación
ubicado en la zona sur de Los Llanos (La Rioja). Utilizando los registros de infestación del
EPIDEMIOLOGY & VECTORS
140
período 2005-2011 de las 7840 viviendas georeferenciadas por el PPChLR en Los Llanos,
se detectaron clusters de alta infestación espacio-temporal y se calculó el porcentaje de
reinfestación intradoméstica (ID). Se observó que de las 391 viviendas que conforman el
cluster de alta infestación, luego del rociado masivo realizado en 2005, un 2% de las
viviendas presenta reinfestación ID antes de cumplirse el año post-tratamiento. Aunque la
frecuencia de evaluación es mayor en las localidades dentro del cluster que fuera del
mismo (587 días ± 355 vs 700 días ± 408), esta frecuencia de evaluación no evita la
reinfestación, ya que el 38 % de las reinfestaciones de ID ocurren en períodos menores a
485 días. Es necesario reconocer la heterogeneidad espacial del área a tratar al
programar la frecuencia de las actividades de control. En zonas de alta infestación
histórica sería necesario mantener una frecuencia de evaluación al menos anual, ya que
luego de un año sin vigilancia aumenta la probabilidad de que ocurran reinfestaciones.
Este trabajo fue realizado con apoyo del PPChLR. Financiación: CONICET y ANPCyT
(PICT 2012-2883)
EYV17
GEOHELMINTOS Y PARÁSITOS TRANSMITIDOS POR VECTORES EN PERROS
RURALES DEL NORESTE ARGENTINO; IMPORTANCIA PARA LA SALUD HUMANA
Gustavo F Enriquez(1), Natalia P Machiaverna(2), Hernán D Argibay(3), Paula A Sartor(4),
Ricardo E Gürtler(5), Marta V Cardinal(6), Graciela Garbossa(7)
(1)(2)(3)(4)(5)(6)
Laboratorio de Eco-Epidemiología, Departamento de Ecología Genética y
Evolución, Universidad de Buenos Aires-IEGEBA (UBA-CONICET). Ciudad Universitaria.
(7)
Laboratorio de Parasitología Clínica y Ambiental, Departamento de Química Biológica,
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires, Argentina,
Instituto de Investigaciones en Salud Pública, Universidad de Buenos Aires, Argentina.
E-mail: [email protected]
Los perros juegan un importante rol como reservorios de múltiples patógenos que son
compartidos con el humano. La presencia de coinfecciones podría desencadenar eventos
de interacción sinérgica o antagónica entre los parásitos, causando una mayor o menor
susceptibilidad a otras especies como también afectar la intensidad de infección en el
hospedador. Con el objetivo de estudiar la co-ocurrencia de Trypanosoma cruzi y otros
parásitos zoonóticos se hizo un relevamiento de perros en 6 comunidades rurales
pertenecientes a Pampa del Indio, Chaco, las cuales tenían esporádicas intervenciones
de control contra el principal vector del Mal de Chagas. Los parásitos gastrointestinales
más frecuentemente hallados (n=85 perros) fueron ancylostomideos (64%), Toxocara
canis (14%), trematodes (15%), Giardia sp. (27%) y Entamoeba sp. (12%). En menos del
5% se encontró Echinococus sp./Taenia, Spirocerca lupi, Trichuris vulpis, Capillaria sp.,
Hymenolepis diminuta, Hymenolepis nana, Dipylidium caninum, Cryptosporidium sp. y
Sarcocystis sp. La seroprevalencia fue del 15% para T. cruzi (n=219 perros) y mediante el
uso del SNAP 4D (Laboratorios IDEXX) se hallaron prevalencias del 8% para Ehrlichia
canis, 2% para Anaplasma phagocytophylum y 1% para Dirofilaria immitis (n=153 perros).
Se hallaron infecciones múltiples en el 79% de los perros. T. cruzi fue encontrado en
coinfecciones con hasta otros 4 parásitos gastrointestinales o de transmisión vectorial. El
número de infecciones múltiples y la prevalencia de infección por T. cruzi, E. canis, y
trematodes, estuvo asociada a la edad del hospedador mediante un análisis de regresión
EPIDEMIOLOGY & VECTORS
141
logística múltiple con efectos aleatorios. Estudiar la multiplicidad de parásitos y sus
interacciones posibilitaría el desarrollo de intervenciones con el fin de disminuir la
transmisión de un gran número enfermedades zoonóticas con un menor esfuerzo.
EYV18
TYPIFICATION OF Acanthamoeba BY PCR IN ISOLATES FROM OCULAR LESIONS
AND ENVIRONMENTAL SAMPLES FROM THE CITY OF MENDOZA
Laura Silvina Alvarez(1), Diego E Cargnelutti(2), Ignacio H Velazquez(3), Marta G Cabrera(4),
Rosa L Tonelli(5), María C Salomón (6)
(1)(3)(4)
INEI-ANLIS Dr . (2)(5)(6)Area Parasitologia , FCM UNCuyo.
E-mail: [email protected]
Acanthamoeba sp is on the most frequent protozoa in nature. Acanthamoeba species
exert on humans and animals an accidental parasitism acting as opportunist in the
production of pathology. There are 17 identified genotypes from which T4 is associated
with the development of granulomatous amoebic encephalitis, cutaneous acanthamebiosis
and keratitis. Has not been demonstrated inter human or zooantroponótica transmission
so the acanthamebiosis is considered a econosis. The aim of this work was to isolate
Acanthamoeba from environmental and ocular samples, confirmation of the isolates by
molecular analysis and to determine the predominant genotype. We worked with
environmental samples from the city of Mendoza and ocular material referred to the Área
de Parasitología, Facultad de Ciencias Médicas, Universidad Nacional de Cuyo for
diagnosis. 57 water samples, 68 soil samples and 30 ocular samples were cultured
conventionally. 7 soil samples, 29 water samples and all of the ocular samples were
positive for Acanthamoeba. The primers used for the PCR were JDP1 and JDP2 which
generate the ASA.S1 amplicon from the highly variable DF3 region in the 18s rDNA gene.
All environmental isolates and 27 of the 30 ocular samples were confirmed. The amplicons
obtained were sequenced and compared with the NCBI database. The correlation
obtained with Acanthamoeba genotype T4 was 95-97%. It is inferred that the soil and
water of the city of Mendoza are a source of infection for humans regarding
Acanthamoeba sp. Furthermore, the application of the PCR technique constituted an
important tool for the confirmation of Acanthamoeba performed by morphological
characterization, providing certainty in the determination of gender and allowing to know
the prevalent genotype.
EYV19
TRANSMISIÓN DE
Trypanosoma
cruzi EN TUCUMÁN:
IMPORTANCIA
EPIDEMIOLÓGICA DE Triatoma infestans, Triatoma eratyrusiformis Y Microcavia
australis (CUIS)
María Carla Cecere(1), Marina Leporace(2), Victoria M Cardinal(3), Maria P Fernandez(4),
Juan P Arrabal(5), Claudio Moreno(6), Ricardo E Gürtler(7)
(1)(3)(4)(7)
FCEN, UBA-IEGEBA-CONICET. (2)FCEN, UBA. (5)Instituto Nacional de Medicina
EPIDEMIOLOGY & VECTORS
142
Tropical-Ministerio de Salud. (6)Coordinación Nacional de Control de Vectores,.
E-mail: [email protected]
Triatoma infestans (Ti) y Triatoma eratyrusiformis (Te) son halladas en las viviendas de
comunidades rurales bajo vigilancia entomológica en Tafí del Valle, Tucumán. Con el fin
de evaluar su importancia epidemiológica en estas comunidades analizamos su infección
por Trypanosoma cruzi (Tc) y perfil alimentario en diferentes ecotopos. Posteriormente
examinamos la infección natural y la infectividad (mediante xenodiagnóstico) de
Microcavia australis (cuis) para evaluar su competencia como potencial reservorio de Tc.
Las vinchucas fueron capturadas por diferentes métodos durante 2007-09 y examinadas
para infección por microscopía óptica o kDNA-PCR. Para determinar el origen de su
ingesta mediante ELISA consideramos 9 hospedadores. Los 51 cuises capturados con
trampas Tomahawk instaladas en cercos peridomiciliarios próximos a las viviendas en
Diciembre 2011 fueron examinados por xenodiagnóstico o kDNA-PCR; y se determinó la
Unidad Discreta de Tipificación (UDT) de Tc. La principal fuente de alimentación en 22 Te
reactivos fue cuis (95%) y en menor medida ratón y cerdo. En 68 Ti reactivos, las
alimentaciones fueron 57% gallina, seguida de cabra, humano, conejo y en menor
proporción perro, cuis y cerdo. En Te y Ti predominaron alimentaciones sobre una fuente
de alimentación; el 65% de Te y 36% de Ti fueron no reactivas. Para Ti, la infección en
domicilio (10/25) fue mayor que en peridomicilio (12/66); predominaron alimentaciones
sobre humano en domicilio, y gallina y cabra en peridomicilio. Para Te, la infección en
peridomicilio (67/83) fue mayor en los cercos (85%) seguido de los corrales y
predominaron alimentaciones sobre cuis. La infección en cuises fue 46% y la infectividad
media a Ti fue 56%; TCI fue la única UDT detectada. Ti y Te participan en el
mantenimiento del ciclo de transmisión de Tc en peridomicilio, donde los cuises son un
reservorio altamente competente de TCI y fuente de alimentación de Te en los cercos, no
así para Ti que mostró un espectro más amplio de hospedadores.
EYV20
DETERMINANTES ECOLÓGICOS Y SOCIODEMOGRÁFICOS DE LA INFESTACIÓN
POR Triatoma infestans EN COMUNIDADES INDÍGENAS DEL CHACO ARGENTINO
M Sol Gaspe, Yael M Provecho, M Victoria Cardinal, M del Pilar Fernández, Ricardo E
Gürtler
Laboratorio de Eco-epidemiologia, FCEyN, UBA.
E-mail: [email protected]
En el Gran Chaco, hotspot de la enfermedad de Chagas y otras enfermedades
desatendidas, habitan >20 pueblos indígenas. En este trabajo se identificaron los
principales determinantes ecológicos y sociodemográficos de la infestación y abundancia
de Triatoma infestans en las viviendas de una población Qom (Toba) incluyendo una
minoría criolla en Pampa del Indio, Chaco, Argentina utilizando un abordaje de inferencia
multimodelo. Se realizó un estudio transversal para determinar la infestación de las 386
viviendas habitadas a través de búsquedas manuales con un aerosol desalojante y se
realizaron encuestas de hogares antes del rociado masivo con insecticidas. Los hogares
Qom presentaron una prevalencia de infestación 3 veces mayor que la de los criollos; y
habitaban viviendas pequeñas, de construcción reciente, precarias y con menor cantidad
de sitios peridomésticos y animales de cría. Las familias Qom eran más numerosas,
EPIDEMIOLOGY & VECTORS
143
tenían un menor clima educativo y una inesperada alta movilidad local. La infestación de
las viviendas (31.9%) fue menor a la esperada dada la ausencia de rociados recientes y
se halló espacialmente agregada. Cerca de la mitad de las viviendas infestadas
presentaron insectos infectados con T. cruzi. Los factores con alta importancia relativa
para la infestación y/o abundancia de triatominos en los domicilios fueron la disponibilidad
de refugio, la distancia a la vivienda infestada más cercana, uso de insecticida, presencia
de aves en el domicilio, hacinamiento y clima educativo. Estos resultados muestran la
importancia de ciertos determinantes sociodemográficos en la infestación doméstica y
corroboran el rol de la calidad de las viviendas, los animales domésticos y el uso de
insecticidas. La compleja interacción entre la calidad de la viviendas, aspectos
sociodemográficos y culturales, y la infestación de la vivienda refuerzan la necesidad de
abordajes integrales para un control y vigilancia sostenibles.
EYV21
ESTUDIO DE FRECUENCIA DE PRESENTACIÓN DE FERTILIDAD DE QUISTES
HIDATÍDICOS BOVINOS DE Echinococcus granulosus EN MATADERO DE LA
REGIÓN METROPOLITANA
Pamina Horlacher(1), Constanza Andrade(2), Colette Burotto(3), Felipe Corrêa(4), Caroll
Stoore(5), Christian Hidalgo(6), Edgar Jiménez(7), Marcela Hernández(8), Rodolfo Paredes(9)
(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(9)
Escuela de Medicina Veterinaria, Facultad de Ecología y Recursos
Naturales, Universidad Andrés Bello, Santiago, Chile. (8)Departamento de Patología y
Medicina Oral, Facultad de Odontología, Universidad de Chile, Santiago, Chile.
E-mail: [email protected]
Introducción: La equinococosis quística, es una patología causada por el metacestodo del
platelminto parásito Echinococcus granulosus. Existen dos tipos de quistes hidatídicos,
fértiles que presentan protoescólices adheridos a la capa germinal y libres en el líquido
hidatídico e infértiles que no producen protoescólices. En Chile no se han realizado
trabajos que midan la frecuencia de presentación de fertilidad de quistes hidatídicos en el
ganado bovino, ya que las vísceras son decomisadas sin realizar este análisis. Objetivo:
Analizar la frecuencia de presentación de quistes hidatídicos fértiles e infértiles de bovinos
faenados en la Región Metropolitana. Material y Métodos: Se analizaron los quistes
hidatídicos de pulmones e hígados de bovinos decomisados en la Región Metropolitana.
Se registró el número de animales faenados y el número de bovinos positivos a
equinococosis quística. La determinación de fertilidad/infertilidad se realizó por medio de
inspección macro y microscópica de la capa germinal. Resultados y Discusión: De un total
de 2005 animales, un 16% presenta equinococosis quística. De los animales positivos a
esta enfermedad el 85,6% presentan quistes infértiles, 5,1% sólo quistes fértiles, 8,6%
quistes menores a 3 centímetros y un 0,6% presentan quistes fértiles e infértiles en el
mismo animal. El 61% de los quistes se localizan en el pulmón, 16% en hígado y 23% en
ambos órganos. Conclusiones: Los bovinos infectados con hidatidosis presentan
mayoritariamente quistes de tipo infértil sin una coexistencia importante de quistes fértiles
e infértiles en el mismo animal, lo que podría indicar que los hospederos intermediarios
participarían en la determinación de la fertilidad de quistes hidatídicos. Agradecimientos:
FONDECYT Nº 1130717
EPIDEMIOLOGY & VECTORS
144
EYV22
PERFIL DEMOGRAFICO DE LA POBLACION CON ENFERMEDAD DE CHAGAS QUE
CONCURRE A LA ATENCION MEDICA UN INSTITUTO DE REFERENCIA EN CABA
ARGENTINA
Stella M Lopez, Vanesa Negri, Marcela Seiler, Karenina Scollo, Constanza L Albizu,
Adelina Riarte
INP .
E-mail: [email protected]
En el INP, instituto nacional de referencia de la Enfermedad de Chagas, situado fuera de
la zona de transmisión vectorial, se recibe una población de demanda derivada para
diagnostico y atención médica a personas con infección/enfermedad de Chagas. El
objetivo de este trabajo fue conocer las variaciones del perfil demográfico de la población
blanco en dos diferentes períodos, en los años 2003 y 2012. Se utilizaron los registros y
base de datos de los años estudiados y se evaluaron las variables lugar de nacimiento,
edad, sexo y ocupación. En 2003 se obtuvieron los datos de más de 320 pacientes de los
cuales el 52% fueron mujeres con 34% de amas de casa, el 28% fue oriundo de países
limítrofes con predominio de Bolivia, 25.5% del NOA, 22% del NEA, 16% del Centro, 11%
de CABA y Gran Buenos Aires y el resto de Cuyo. El 49.5% de la población estaba en un
rango de edad de 25 a 45 años, todos laboralmente activos, y una actividad laboral de:
operarios, empleados, albañiles y changarines, entre otras, con un nivel de desocupación
de 14%. En el año 2012 hubo un registro de 743 pacientes, de los cuales el 57% fueron
mujeres con un 32% de amas de casa, el 27.5% procedente de países limítrofes con
predominio de Bolivia y aumento de la población de Paraguay, y un 14% de la población
de CABA y Gran Bs.As. El perfil laboral es similar al periodo 2003 con un nivel de
desocupación del 4%. Conclusión: No hubo un cambio en el perfil demográfico de la
población con infección y/o enfermedad de Chagas, que concurrió a nuestro Instituto. Se
observó un aumento en la demanda de atención médica con un predominio estable de
amas de casa en ambos periodos. No hubo variaciones significativas en la calidad del
empleo que es esencialmente de tipo informal. Los datos sugieren una disminución del
nivel de desocupación.
EYV23
Babesia bovis DETECTION FROM CAPILLARY BLOOD IMPROVES DIAGNOSIS IN
CARRIER CATTLE
Eliana C. Guillemi(1), Sofía de la Fournière(2), Néstor Sarmiento(3), Marisa D. Farber(4),
Silvina E. Wilkowsky(5)
(1)(2)(4)(5)
Inst. Biotecnología, INTA. (3)EEA-Mercedes, INTA.
E-mail: [email protected]
Babesia bovis infects bovine erythrocytes turning their membrane more rigid than in
normal cells. This fact determine that B. bovis parasitized erythrocytes tend to be retained
in capillary vessels. Besides, carrier cattle show undetectable parasitemia in blood smears
turning into low sensitivity of detection by direct methods using venous blood The aim of
this work was to improve B. bovis identification by comparing DNA detection from capillary
EPIDEMIOLOGY & VECTORS
145
and venous blood in carrier cattle. Blood from three cows suffering chronic babesiosis
were sampled from two different anatomic areas: jugular vein and capillary vessels.
Venous blood was extracted by syringe and conserved in heparinized tubes. Capillary
blood was obtained by pricking the tip of the tail with a needle and collected in Whatman
papers. DNA was extracted from a drop of capillary blood and from 100 μl of venous blood
by the phenol-chloroform method. For capillary blood, a previous step was needed for
retrieving blood from the paper by pre-incubating the paper in lysis buffer. After the
incubation, the supernatant was used for standard phenol-chloroform DNA extraction.
DNA from capillary and venous blood was analyzed by an end point PCR and a
quantitative PCR (qPCR); both reactions targeted simple copy genes: rip9 and rcc
respectively. For the end point PCR, B. bovis DNA was detected in both capillary and
venous samples of the three animals with a higher intensity of the amplification band in the
capillary samples in all cases. For the qPCR, two capillary samples showed higher DNA
copy numbers than the venous samples, although the latter had value levels below the
detection threshold. These results suggest that B. bovis DNA detection from capillary
blood is a much better approach for diagnosis in carrier cattle.
EYV24
OCORRÊNCIA DE ESPÉCIES DE TRIATOMINAE (HEMIPTERA: REDUVIIDAE) NO
MUNICÍPIO DE MARABÁ, PARÁ, BRASIL
Eder S Souza (1), Noé V Atzingen(2), Maria B furtado(3), João A Rosa(4)
(1)(4)
Faculdade de Ciências Farmacéuticas - UNESP- Campus de Araraquara.
(2)(3)
Fundação Casa da Cultura de Marabá.
E-mail: [email protected]
Descrito por Carlos Chagas (1909), la tripanosomiasis americana o enfermedad de
Chagas fue reconocida como una enfermedad humana, en la Amazonia a partir de 1969 y
con una mayor énfasis desde 1996. Actualmente son conocidas 147 especies de
triatomíneos agrupadas en seis tribus y 18 géneros. Mientras tanto, algunas son
consideradas mejores vectores de Trypanosoma cruzi debido a la adaptación al medio
ambiente domestico y a la antropofilia. Este estudio tuvo como objetivo verificar la
ocurrencia de triatomíneos en la comarca de Marabá, que se encuentra localizada al
noreste de Pará. Durante dos días se realizaron visitas a cinco casas en la comunidad de
Nueva Marabá. Se recogieron los especímenes con una pinza entomológica y
posteriormente fueron colocados en un frasco con agujeros en la tapa para que pueda
facilitar la entrada del aire y posteriormente poder ser transportados para el laboratorio.
Se recogieron 23 triatomíneos de dos casas inspeccionadas de los cuales 90% se
encontraban en la parte interna de la casa (pared y del techo de las casas de paja) y 10%
al aire libre (gallinero, corral y azulejos). Rhodnius pictipes fue la especie mas abundante
(15 muestras), seguido por E.mucronatus 01; Rhodnius spp 07. De los insectos
recolectados, todos fueron llevados al laboratorio de Parasitología de la Facultad de
Ciencias Farmacéuticas de la UNESP – Araraquara donde fueron identificados y
examinados. En una de estas muestras fue observada la presencia T. cruzi (Rhodnius
pictipes). Este estudio muestra que las tres especies de triatomíneos y una nueva
especie, invadieron y/o colonizaron residencias que determinan el alto riesgo de
transmisión de la enfermedad de Chagas en la población de Nuevo Marabá
EPIDEMIOLOGY & VECTORS
146
EYV25
EXPRESIÓN DIFERENCIAL DE GENES CODIFICANTES DE ÁCIDO GRASO
REDUCTASAS EN Triatoma infestans EN FUNCIÓN DEL SEXO Y LA RESISTENCIA A
INSECTICIDAS
Natalín Valeff, Gustavo M Calderón-Fernández
Instituto de Investigaciones Bioquímicas de La Plata (CONICET-UNLP), Facultad de
Ciencias Médicas, calles 60 y 120, La Plata, 1900, Argentina. E-mail: [email protected]
La superficie cuticular de Triatoma infestans está cubierta por una mezcla compleja de
lípidos, predominando los hidrocarburos y los alcoholes grasos. Estos compuestos tienen
un rol fundamental en la supervivencia, fisiología y comportamiento de los insectos,
evitando una deshidratación letal, participando como feromonas de contacto
intraespecíficas y regulando la penetración de agentes químicos y biológicos. Hemos
demostrado anteriormente el rol de los alcoholes grasos (FA) cuticulares en el
reconocimiento sexual pero se desconoce si están relacionados con la resistencia a
insecticidas. Los FA se forman a partir de ácidos grasos de cadena larga y muy larga
producidos por la acción sucesiva de las ácido graso sintasas (FAS) y ácido graso
elongasas (ELOVL) del integumento del insecto. Esos ácidos grasos son reducidos a FA
de la misma longitud de cadena por ácido graso reductasas (FAR) también específicas del
tejido integumentario.
El objetivo de este trabajo fue analizar la expresión de los genes codificantes de las FAR
del integumento de T. infestans en función del sexo y la resistencia a insecticidas.
Se obtuvo RNA total a partir del integumento de machos y hembras y de ejemplares
susceptibles y resistentes a insecticidas, y se sintetizó cDNA mediante RT-PCR.
Empleando primers específicos diseñados a partir de secuencias parciales de FAR de T.
infestans disponibles en nuestro laboratorio se analizó la expresión diferencial de los
genes mediante PCR cuantitativa en tiempo real. Asimismo se obtuvo la secuencia
completa de una FAR mediante la técnica de RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends).
Se obtuvieron diferencias significativas de entre 3 a 20 veces en la expresión de varios
genes de FAR de T. infestans tanto en función del sexo como entre insectos susceptibles
y resistentes. Se caracterizó la secuencia de una FAR con una identidad aproximada del
56% con secuencias ortólogas de Apis mellifera y otros insectos.
EYV26
USO DE LA PCR CUANTITATIVA PARA IDENTIFICAR RESERVORIOS DOMÉSTICOS
SUPERINFECCIOSOS DEL Trypanosoma cruzi
Gustavo F Enriquez(1), Jacqueline Bua(2), María M Orozco(3), Alejandro G Schijman(4),
Ricardo E Gürtler(5), Marta V Cardinal(6)
(1)(3)(5)(6)
Laboratorio de Eco-Epidemiología, Departamento de Ecología Genética y
Evolución, Universidad de Buenos Aires-IEGEBA (UBA-CONICET). Ciudad Universitaria.
(2)
Instituto Nacional de Parasitología Dr. M. Fatala Chaben, Administración Nacional de
Laboratorios e Institutos de Salud Dr. C.G. Malbrán, Buenos Aires, Argentina.
EPIDEMIOLOGY & VECTORS
147
(4)
Laboratorio de Biología Molecular de la Enfermedad de Chagas, Instituto de
Investigaciones en Ingeniería Genética y Biología Molecular (INGEBI-CONICET),
Argentina.
E-mail: [email protected]
Los perros y gatos son importantes reservorios domésticos de Trypanosoma cruzi ya que
entre otros factores exhiben una mayor infectividad al vector que los humanos
seropositivos. En este estudio se cuantificó la carga parasitaria de T. cruzi en sangre
periférica de perros y gatos infectados y se evaluó su asociación con la infectividad al
vector en una zona de alto riesgo del Chaco argentino. Cuarenta y cuatro perros y 15
gatos infectados fueron examinados por xenodiagnóstico (10-20 Triatoma infestans) y
posteriormente los insectos fueron examinados individualmente por microscopía óptica.
La carga parasitaria (cantidades equivalentes de ADN por ml, EP/ml) se estimó por PCR
en tiempo real (qPCR) y a su vez se realizó una PCR cualitativa (PCR-kADN). Los perros
y gatos fueron clasificados como de “alta infectividad” al vector (responsables de ≥80%
del total de triatominos infectados usados en los xenodiagnósticos) o de “baja infectividad”
el resto de los animales. La infectividad estuvo asociada positiva y significativamente con
la carga parasitaria de los perros (mediana 8,1 EP/ml; OR =1,02) y gatos (mediana 9,7
EP/ml; OR =1,02), pero no con la UDT parasitaria. Sin embargo, los dos gatos y el único
perro infectado con TcI tenían nula infectividad a pesar de tener 7,4, 9,7 y 20,5 EP/ml,
respectivamente. La mitad de los perros y gatos mostraron una alta infectividad. La PCRkADN y el resultado cualitativo de la qPCR no permitieron distinguir entre hospedadores
de alta o baja infectividad, ya que detectaron ADN por encima del 87% del total de
animales examinados. El hallazgo de hospedadores con parasitemia patente pero con
nula infectividad sugiere la presencia de otros factores afectando la asociación
infectividad-carga parasitaria. Estos resultados implicarían que las estimaciones
cuantitativas de la carga parasitaria por qPCR y no los resultados cualitativos de la qPCR
o PCR-kADN serían una herramienta más precisa para identificar hospedadores
altamente infecciosos.
IMMUNOLOGY & PATHOGENESIS
148
IYP01
ALTERACIONES MITOCONDRIALES FUNCIONALES EN MÚSCULO CARDÍACO Y
MÚSCULO ESQUELÉTICO DURANTE LA EVOLUCIÓN DE LA ENFERMEDAD DE
CHAGAS.
Alejandra Báez, Silvina Lo Presti, Noel Reynoso, Carolina Bazán, Mariana Strauss, Noemí
Miler, Walter Rivarola, Patricia Paglini.
Centro de Estudios e Investigación de la enfermedad de Chagas y Leishmaniasis. Fac de
Ciencias Médicas. U.N.C. Córdoba, Argentina. INICSA-CONICET.
El ingreso del Trypanosoma cruzi en las células cardíacas genera importantes procesos
inflamatorios cuyos mediadores actúan de manera directa sobre las mitocondrias.
Anteriormente demostramos que según el aislamiento de T. cruzi que infecte al huésped,
estos influyen de manera diferente sobre la actividad funcional mitocondrial. En el
presente trabajo se estudió el efecto de la infección con el aislamiento SGOZ12 y cepa
Tulahuen, sobre la actividad enzimática mitocondrial de corazón (C) y músculo
esquelético (M) en dos etapas de la Enfermedad de Chagas.
Se estudiaron ratones albinos suizos infectados con 50 tripomastigotes de T. cruzi, cepa
Tulahuen y aislamiento SGOZ12 en la fase aguda (35 días después de la infección, dpi,
n=10), crónica indeterminada (75 dpi, n=10) y crónica cardíaca (365 dpi, n=10). Un grupo
de ratones no infectados (control, n=10) también se analizó.
Se midió la actividad de Citrato sintasa y de los complejos I a IV de la cadena respiratoria
por espectrofotometría. Los datos fueron analizados por ANOVA (nivel de significación:
p<0,05).
La actividad enzimática (µm.min-1/ mg prot), disminuyó: en la Citrato sintasa (C) en
Tulahuen y SGO Z12 en la fase crónica indeterminada; el CI (C) en las dos cepas en la
fase crónica indeterminada; el CII (C) en Tulahuen; en SGOZ12 en la fase crónica (C), y
en (M) en la fase aguda; el CIII (C) en ambas cepas durante toda la infección; el CIV (C)
en ambas cepas en la fase crónica indeterminada.
Demostramos que las mitocondrias estarían implicadas en la génesis y progresión de la
cardiopatía chagásica crónica, y que el tipo de aislamiento o cepa, está involucrado en
daños de diferente magnitud. Además estudios en músculo esquelético demuestran un
paralelismo con los daños mitocondriales en miocardio lo que permitiría de manera
sencilla (al realizar una biopsia) obtener información acerca de la evolución de la
miocardiopatía.
IYP02
EFECTO PROLIFERATIVO DEL ANTÍGENO TC13TUL DE Trypanosoma cruzi SOBRE
ESPLENOCITOS DE RATONES BALB/C NAIVE
Andrea C. Bruballa, Cecilia Albareda, Patricia A. Garavaglia y Gabriela A. García
IMMUNOLOGY & PATHOGENESIS
149
Instituto Nacional de Parasitologia “Dr. Mario FatalaChaben”- ANLIS “Dr. Carlos G.
Malbran”
La activación o la prevención de la muerte celular es un factor crítico en la evolución de la
infección por Trypanosoma cruzi, el agente etiológico de la enfermedad de Chagas.
Varios trabajos muestran que la enzima trans-sialidasa, un miembro del grupo I de la
superfamilia de las trans-sialidasas (TS), puede activar las células del sistema inmune y
modular su apoptosis. A fin de estudiar el rol del antígeno Tc13Tul, miembro del grupo IV
de la superfamilia TS, en la respuesta inmune innata contra T. cruzi, evaluamos su efecto
sobre esplenocitos de ratones BALB/c naive. Después de cultivarlos durante 48 hs en
presencia del antígeno recombinante Tc13Tul o su proteína carrier, MBP (maltose binding
protein), se evaluó la viabilidad celular por tinción con ioduro de propidio (IP). Al estimular
con Tc13Tul se observó un aumento del porcentaje de células viables (67,47 % con
Tc13Tul vs. 35,55 % con MBP, p<0,001). La observación a microscopio óptico de los
cultivos con Tc13Tul mostró la presencia de ramilletes celulares, sugiriendo un posible
efecto proliferativo. Para confirmar esta hipótesis, los esplenocitos se tiñeron con CFSE y
luego de 72 hs de cultivo se evaluaron por citometría de flujo. Los cultivos con Tc13Tul
presentaron un 5,13% de células en división, mientras que con MBP un 1,19% (p<0,01).
Para estudiar si Tc13Tul ejerce una modulación de la apoptosis, se utilizó tinción con
anexina V e IP. El estímulo con Tc13Tul produjo un aumento de células en apoptosis
temprana (35,98 % Tc13Tul vs. 15,04 % MBP, p<0,01) y una disminución de células
viables (57,27 % Tc13Tul vs. 76,99 % MBP, p<0,01). Los resultados indican que el efecto
de Tc13Tul sobre la viabilidad es producto de la proliferación celular y no de una inhibición
de la apoptosis. La estimulación con la porción repetitiva C-terminal de este antígeno, no
mostró diferencias con respecto a los controles. Nuestros resultados muestran que el
antígeno Tc13Tul participaría en la respuesta inmune innata contra T. cruzi.
IYP03
STUDY OF GALECTIN-8 ROLE IN MURINE Trypanosoma cruzi INFECTION
Carla A Pascuale(1), Adriano Bertelli(2), Hernán García Rivello(3), Virginia Tribulatti(4),
Gabriela Levy(5), Oscar Campetella(6), María S Leguizamón(7)
(1)(2)(4)(5)(6)(7)
Instituto de Investigaciones Biotecnológicas-Universidad Nacional de San
Martín. (3)Servicio de Patología, Hospital Italiano.
E-mail: [email protected]
Galectin-8 is distributed in different tissues and in the endothelium, which links it to various
processes such as migration, apoptosis induction, and platelets activation, and to the role
as pro-inflammation molecule. No information is available on Gal-8 in infections by
Trypanosoma cruzi. We have started the analysis assaying various murine infection
models combined with T. cruzi strains to induce different evolution. We studied Gal-8
expression in different organs during the acute period of the infection in BALB/cJ mice,
using the RA strain (DTU TcVI). Assays were conducted at 17 days post-infection (dpi)
with parasitemia levels ranging 7x105-1.5x 106 trypomastigotes/ml. qRT-PCR showed a
significant decrease on Gal-8 expression in infected mice hearts. Organs were analyzed in
triplicate and normalized to host β-actin expression. C57BL/6J (WT) and Gal-8KO four
month old males were infected with the Ac strain, (DTU TcI), which induces chronic
infection (survival 90%). Parasitemia was similar between groups (followed up to 80 dpi).
IMMUNOLOGY & PATHOGENESIS
150
At four months pi, Gal-8KO mice showed more exacerbated splenomegaly than infected
WT mice. The weight of infected Gal8-KO mice’s spleen was significantly larger
(p=0.0079) than the WT counterpart, while the heart’s and liver’s weight were similar
between groups. HE-stained spleen tissue samples showed greater degree of follicular
hyperplasia in Gal-8KO along with numerous secondary follicles, a higher number of
centerblasts and a pronounced amount of plasmocytes, when compared to WT both
infected and normal. In Gal-8KO, while follicle structure was maintained, there was
important lymphocyte movement towards the red pulp. These preliminary results show, for
the first time, that T. cruzi modulates Gal-8 expression. The splenomegaly seen in Gal8KO mice could suggest the involvement of this galectin in the development of polyclonal
activity, induced by T. cruzi infection.
IYP04
IMPACT OF GALECTIN-3 ON THE COURSE OF EXPERIMENTAL Trypanosoma cruzi
INFECTION.
Danielle Silva-dos- Santos1, Juliana Barreto de Albuquerque1, Luiz Ricardo
Berbert1, Désio A. Farias-de-Oliveira1, Landi V. C. Guillermo2, Wilson Savino1, Juliana de
Meis1 and Déa M. S. Villa-Verde1. 1Laboratory on Thymus Research, Oswaldo Cruz
Institute, FIOCRUZ; 2Biomedical Institute, UNIRIO, Rio de Janeiro, Brazil.
FIOCRUZ.
E-mail: [email protected]
Galectin-3, a β-galactoside binding lectin, is expressed in cells of the immune system such
as macrophages and activated lymphocytes, modulating cell adhesion, migration,
activation and cytokine production. Chagas’ disease, caused by the protozoan
Trypanosoma cruzi, is a public health problem, without effective vaccines and
therapeutics. Here we evaluated the involvement of galectin-3 in experimental T. cruzi
infection. Wild-type (WT) and galectin-3 deficient (Gal-3-/-) mice were infected with the
Tulahuén strain. Parasitemia was individually evaluated in 5 l of blood drawn from the tail
vein, by counting trypomastigote forms in 50 fields in neubauerTM chambre by optical
microscopy. Serum cytokine levels were determined by Cytometry Beads Assay.
Quantification of cell number and phenotype (CD4, CD8 and CD19) in peripheral lymphoid
organs were analyzed by flow cytometry. Peritoneal macrophages were obtained from
infected mice after 18 days post-infection. Our results showed that Gal-3-/- mice are more
susceptible to infection than WT, with higher mortality rate and increased blood
parasitemia. In addition, we observed a decrease in CD4+, CD8+ and CD19+ cell numbers
in subcutaneous lymph nodes and in CD4+ and CD19+ cell numbers in the spleen of
infected Gal-3-/- mice. No significant differences were observed in the total cell numbers of
mesenteric lymph nodes from infected Gal-3-/- and WT mice. Analysis of the serum from
infected Gal-3-/- mice showed a decrease in TH1 and TH2 cytokines secretion. We also
showed that infected Gal-3-/- macrophages are less effective in eliminating intracellular
parasites than those from WT animals, probably due to lower nitric oxide production. Our
results suggest that galectin-3 is important in modulating the host response against T.
cruzi, with implications for susceptibility to infection.
IMMUNOLOGY & PATHOGENESIS
151
IYP05
T. cruzi: INDUCCIÓN DE MEDIADORES INFLAMATORIOS EN MACROFAGOS
MURINOS
POR
LIPIDOS
DE
AMASTIGOTES
DE
DOS
CEPAS
DE
COMPORTAMIENTO BIOLÓGICO POLAR
Emanuel Bott, Guadalupe Gimenez, Estela M Lammel, Elvira LD Isola, Maria L
Belaunzarán
Instituto de Investigaciones en Microbiología y Parasitología Médica (IMPaM, UBACONICET).
E-mail: [email protected]
Existe vasta evidencia sobre la función inmunomoduladora de los lípidos de
microorganismos. En T. cruzi demostramos degradación de lípidos endógenos y
acumulación de ácidos grasos libres (AGL) y lisofosfatidilcolina (LisoPC) durante la
autólisis de amastigotes (AMA) de la cepa letal RA. Otros autores determinaron que AGL
y lisofosfolípidos (LisoPL) liberados de tripomastigotes tienen efectos citotóxicos. En este
trabajo analizamos el perfil lipídico de AMA intactos y en autólisis de la cepa no letal K98 y
el efecto de los lípidos totales (LT) de AMA K98 y RA, intactos/en autólisis, sobre la
producción en macrófagos murinos de TNFα, óxido nítrico (ON) y ciclooxigenasa 2 (COX2). En AMA K98 el PL predominante fue fosfatidiletanolamina (PE, 23% LT), con
incremento en la autólisis de AGL, lisoPE y diacilglicerol (3,0, 7,0 y 1,5 veces resp)
mientras que en RA previamente determinamos que predomina PC con aumento de AGL
y LisoPC en la autólisis. Los LT de K98 intactos estimularon la producción de ON 3,7
veces vs ctrl (por reacción de Griess) y los de RA no generaron respuesta, mientras que
al estimular con LT de RA y K98 en autólisis se observó una reducción de la misma
respecto a LT de AMA intactos (15 y 2 veces resp). Resultados similares se hallaron para
TNFα por ELISA: LT de K98 intactos estimularon su secreción 5,5 veces vs ctrl y los de
RA no generaron respuesta mientras que LT de RA y K98 en autólisis redujeron la misma
2,0 y 3,5 veces resp vs LT de AMA intactos. Sólo los LT de RA en autólisis promovieron la
expresión de COX-2 (2 veces vs ctrl) determinada por Inmunoblot.En la infección por T.
cruzi la presencia de desórdenes inmunológicos es una característica relevante. Los
presentes resultados indican que los AMA de las cepas letal/no letal, intactos/en autólisis,
poseen moléculas lipídicas capaces de modular diferencialmente la respuesta inflamatoria
en macrófagos, lo que podría contribuir en distinto grado a la patogenia de la Enfermedad
de Chagas. UBA/CONICET
IYP06
EVALUACIÓN DE LA INMUNOGENICIDAD DE LA PROFILINA DE Neospora caninum
EN BOVINOS: ESTRATEGIAS PARA MODULAR EL PERFIL DE RESPUESTA
INDUCIDO
Florencia C Mansilla(1), María Eugenia Quintana(2), Nancy P Cardoso(3), Wenzel Czepluch
, Maximiliano Wilda(5), Dadín P Moore(6), Alejandra V Capozzo(7)
(4)
IMMUNOLOGY & PATHOGENESIS
152
(1)(2)(3)(4)(7)
Instituto de Virología. CICVyA. INTA CNIA. (5)Centro de Estudios en Virología
Animal, Cevan. (6)EEA Inta Balcarce.
E-mail: [email protected]
La neosporosis bovina es una enfermedad reproductiva producida por Neospora caninum,
para la cual no hay vacunas. La inmunidad protectiva contra la neosporosis está mediada
por anticuerpos (Ac) de alta avidez y por la actividad de células T-CD4+ que secretan
IFNγ. La diferenciación a este perfil depende de células presentadoras de antígeno (APC)
productoras de IFNγ e IL-12, activadas por la vía MyD88. Seleccionamos como
inmunógeno la profilina de Neospora caninum (NcPro) producida en E.coli (rNcPro), que
activa a las APC vía TLR11. Para mejorar la respuesta inmune fusionamos epitopes T
ubicuos de la glicoproteína G del virus de la estomatitis vesicular (G) a la rNcPro e
incorporamos a la formulación agonistas de TLRs. Se inmunizaron 5 grupos de 3
vaquillonas cada uno(vía subcutánea) con tres dosis (0, 21 y 240 días post vacunación,
dpv) de 20 µg de rNcPro o rNcPro/G formuladas con un adyuvante acuoso (ProvideanAVEC®) con agonistas de TLR2 y de TLR9 (CpGs), o con hidróxido de aluminio (Alum).
Todas las vacunas indujeron Ac específicos de alta avidez a los 45 dpv, principalmente
IgG1. Los títulos más altos se obtuvieron con la vacuna NcPro/G + Alum. A los 247 DPV,
se detectaron células T-CD4+ IFNγ+ en la sangre periférica de los bovinos inmunizados
con rNcPro/G + Providean-AVEC® estimuladas ex vivo con lisado de taquizoítos. En los
bovinos vacunados con rNcPro observamos un aumento del número de células TCD4+/IFNγ+ en respuesta a rNcPro, pero no al lisado. Detectamos células T-CD8+/IFNγ+
en algunos animales vacunados con rNcPro/G. Los resultados muestran que la adición de
epitopes T y de ligandos de TLR que activan a las APC vía MyD88 permite obtener el
perfil de respuesta buscado. El diseño racional de vacunas recombinantes considerando
el tipo de respuesta que se desea inducir constituye una estrategia promisoria para el
desarrollo de vacunas contra este parásito.
IYP07
IMMUNE RESPONSE AFTER ORAL/INTRAGASTRIC INFECTION BY Trypanosoma
cruzi IN MICE
Juliana Barreto-de-Albuquerque(1), Danielle Silva-dos-Santos(2), Ana R Pérez(3), Luiz R
Berbert(4), Eliane de Santana-van-Vliet(5), Désio A Farias-de-Oliveira(6), Otacilio Moreira(7),
Eduardo Roggero(8), Carla E de Carvalho-Pinto(9), José Jurberg(10), Vinícius Cotta-deAlmeida(11),
Oscar
Bottasso(12),
Wilson
Savino(13),
Juliana
de
Meis(14)
(1)(2)(4)(5)(6)(11)(13)(14)
Laboratory on Thymus Research, Oswaldo Cruz Institute, Oswaldo Cruz
Foundation, Rio de Janeiro, Brazil. (3)(8)(12)Immunology Institute, Faculty of Medical
Science, National University of Rosario, Rosario, Argentina . (7)Laboratory on Molecular
Biology and Endemic Diseases, Oswaldo Cruz Institute, Oswaldo Cruz Foundation, Rio de
Janeiro, Brazil. (9)Laboratory on Experimental Pathology, Immunobiology Department,
Federal Fluminese University, Niteroi, Brazil. (10)National and International Laboratory on
Triatomine Taxonomy, Oswaldo Cruz Institute, Oswaldo Cruz Foundation, Rio de Janeiro,
Brazil.
E-mail: [email protected]
Oral transmission of Chagas’ disease has been documented in Latin American countries,
being the most important infection route in the Brazilian Amazon region. Most knowledge
IMMUNOLOGY & PATHOGENESIS
153
concerning the immunology of Chagas’ disease derives from studies in mice infected
intraperitoneally or subcutaneously. The few studies using oral route infection disregard
that inoculation in the oral cavity (Oral infection, OI) or by gavage (Gastrointestinal
infection, GI) represent different infection routes, as yet both show clear-cut parasitemia
and heart parasitism during the acute infection. Here, BALB/c mice were subjected to
acute oral (OI) or gavage (GI) infection, using 5x104 trypomastigotes (Tulahuén strain).
The OI group presented significantly higher parasitemia and mortality rates than their GI
counterparts (n=20/group) (0%, 45% and 20% of living mice, respectively, after 31 dpi).
Heart histopathology showed extensive microinfiltrates in GI mice (n=5/dpi/group),
although liver lesions were more severe in OI animals, which showed higher ASpartate
Transaminase and ALanine Transaminase enzyme serum contents (n=3-7). Multiplex
analysis revealed that OI mice presented higher type 1 cytokine (IFN-γ, TNF-α) (serum
levels than GI animals (n=3-7/dpi). Real time PCR confirmed higher TNF-α, IFN-γ, as well
as IL-10 gene expression in the cardiac tissue from OI group, compared to GI mice.
Conversely, TGF-β serum levels were higher in GI animals (n=3/dpi/group). Interestingly,
the high mortality rate seen in OI mice paralleled the TNF-α serum rise, and anti-TNF-α
antibody treatment reduced the mortality rate (untreated, 100%; treated, 65%)
(n=20/group). Overall, our data demonstrate that the site of parasite entrance, through the
oral cavity (as observed in natural infection) or directly to the stomach, differentially affects
the host immune response and mortality in mice.
IYP08
RESPUESTA ANTI-RA Y DISAUTONOMIA EN INFECTADOS CRÓNICOS POR T. cruzi
CON PROLONGADO SEGUIMIENTO
Lorena Verónica Olivera, Maria Laura Bizai, Evelyn Elizabet Arias, Susana Denner, Diana
Lucrecia Fabbro
CIEN-FBCB-UNL.
E-mail: [email protected]
Se ha asociado la presencia de anticuerpos anti-RA con la disautonomía en la
Enfermedad de Chagas. Objetivo: evaluar la correlación entre Ac anti-RA y disautonomía
en infectados chagásicos crónicos en seguimiento, sin patología demostrada, tratados y
no tratados con drogas tripanocidas. Diseño: Estudio longitudinal. Se utilizó el kit
Chagacor para dosar Ac anti-RA. Se analizaron 240 sueros de 84 infectados agrupados
en: A) 33 pacientes tratados con seguimiento de 18.3+/-7.3 años; B) 51 pacientes no
tratados, seguidos 15,5+/-6.8 años. Además se procesaron 32 sueros de no infectados
sanos. Se analizaron entre 2 y 4 muestras por paciente. Se midió dispersión de QT (dQT)
y Maniobra de Valsalva (IV) En el grupo A, 11/33 (33,3%) pacientes presentaron Ac antiRA al inicio. Solo 2 (6,06%) fueron reactivos hasta el final del estudio, uno constante y el
otro disminuyó. La diferencia de respuesta Ac anti-RA al inicio y final del seguimiento fue
significativa (p<<0,05). En el grupo B, 22/51 (43,1%) mostraron reactividad anti-RA en la
muestra inicial, sin variaciones durante un tiempo promedio de 15,5 años (p>0,05). No
hubo reactividad anti-RA en los controles seronegativos. En el grupo B, de los 22
pacientes anti-RA positivo, uno presentó aumento de la dQT (60mseg) y 3 mostraron IV
alterado. En el grupo tratado, los 2 pacientes con Ac anti-RA fueron normales para estas
pruebas. El tratamiento tripanocida negativizó los anticuerpos anti-RA en 81,2% de los
IMMUNOLOGY & PATHOGENESIS
154
pacientes. En los no tratados, quienes presentaron reactividad inicial permanecieron sin
cambios clínicos ni serológicos durante 15 años, sugiriendo que estos Ac no constituyen
un marcador de progresión hacia la cardiopatía. Además, no hubo asociación entre
respuesta anti-RA, dQT e IV. Se requieren pruebas de disautonomía de mayor
sensibilidad que las utilizadas para confirmar o descartar esta ausencia de correlación.
IYP09
IMMUNOENDOCRINE INTERACTIONS DURING LYMPHOCYTE MIGRATION IN
HUMAN CHAGAS DISEASE ARE RELATED TO SEVERE CARDIOPATHY
Luiz R Berbert(1), Ana R Pérez(2), Romina Manarín(3), Florencia Gonzalez(4), Silvina Villar(5),
Juan Beloscar(6), Jackeline Petrucci(7), Oscar Bottasso(8), Wilson Savino(9)
(1)(9)
LPT - Instituto Oswaldo Cruz - FIOCRUZ - Brasil. (2)(3)(4)(6)(7)(8)Instituto de Inmunología
de Rosario - UNR - Argentina. (5)Instituto de Inmunología de Rosario -UNR - Argentina.
E-mail: [email protected]
Chagas Disease remains a public health issue in Americas. In the pathological processes
seen in patients, we found changes in imunoneuroendocrine interactions, which might be
related to an imbalance in lymphocyte migration to inflammatory sites. We evaluated T
lymphocyte migratory responses from chagasic patients with different forms of
cardiopathy, correlating these events to immunoendocrine alterations that occur during
chronic disease. We firstly observed that pro-inflammatory cytokines were more expressed
in parallel with the severity of disease. Additionally, we found an imbalance on
Hypothalamus-Pituitary-Adrenal axis, where a decreasing of DHEA hormone results in
changes of circulating cortisol/DHEA ratio. Also in parallel, we found an enhanced
migratory response over fibronectin, CXCL12 and TNF-alpha, as well as with Cortisol and
DHEA pre-treatment. As miRNAs are known to be involved in migratory responses, we
also investigated the presence of these small RNAs in patients sera, intending to analyze
which mRNA targets are modulated in these events. These results indicate that endocrine
disturbances, correlated to a systemic inflammatory profile, may also contribute to
enhance migratory potential of T lymphocytes to inflammatory sites, including the heart
tissue, being thus involved in the cardiopathy seen in this disease.
IYP10
ESTUDIO FENOTIPICO DEL RECEPTOR DE IL7 Y SU ASOCIACIÓN CON
FUNCIONES DOWNSTREAM DE STAT5 EN PACIENTES CON ENFERMEDAD DE
CHAGAS CRÓNICA
María Ailén Natale(1), María C Albareda (2), Damián Perez-Mazliah (3), Melisa Castro-Eiro
, María G. Alvarez (5), Rodolfo Viotti(6), Graciela Bertocchi (7), Bruno Lococo(8), Rick L
Tarleton(9), Susana A Laucella(10)
(1)(2)(3)(4)(10)
Instituto Nacional de Parasitología Dr. Mario Fatala Chaben . (5)(6)(7)(8)HIGA Eva
Perón, San Martín Prov BsAs. (9)Center for Tropical and Emerging Global Diseases,
Athens, Georgia, USA.
E-mail: [email protected]
(4)
IMMUNOLOGY & PATHOGENESIS
155
Resultados previos del laboratorio demuestran que la infección crónica por T. cruzi
conduciría a la respuesta celular T específica para el parásito a un estado de agotamiento
inmunológico, característico de las infecciones persistentes. Este perfil funcional se asoció
con niveles disminuidos de linfocitos T totales “naive” y baja expresión del receptor de IL7
en la población T, comparado con los pacientes en mejores condiciones clínicas.
Recientemente observamos que los niveles de fosforilación del factor de transcripción
STAT5, luego de la estimulación de linfocitos T con IL7, fueron menores en pacientes
crónicamente infectados comparado con los controles no infectados, y esta disminución
fue más evidente en pacientes con cardiomiopatía más severa. En este trabajo realizamos
un estudio fenotípico y funcional del receptor de IL7 analizando la expresión de las
cadenas CD132 y CD127 del receptor y la capacidad de inducir la expresión del factor de
sobrevida Bcl2 y del factor de diferenciación CD25, cuya expresión depende de la función
de STAT5 en pacientes crónicamente infectados por T. cruzi (n=27) y controles no
infectados (n=10). Encontramos una disminución de la subpoblación de linfocitos T CD8+
y CD4+ con fenotipo CD127+CD132+ y un aumento recíproco de la población CD127CD132+ en pacientes en estadío G0 comparado con pacientes en estadios G2-G3 y
controles. La inducción de Bcl2 fue menor en la población de linfocitos T de pacientes en
estadios G2-G3 comparado con pacientes en estadios G0, G1 y controles. En
contraposición la expresión del marcador CD25 fue menor en la población de linfocitos T
CD8+ de pacientes crónicamente infectados, independientemente de su estadío clínico.
La estimulación persistente del sistema inmune sostenida por la infección crónica podría
explicar las alteraciones observadas en la señalización a través de STAT5, contribuyendo
a la dificultad de mantener los niveles de linfocitos T “naive” y de memoria a lo largo de la
infección.
IYP11
PREVALENCIA DE ANTICUERPOS ANTI-RA EN CHAGAS CRÓNICO: RELACIÓN
CON CARDIOPATÍA Y EFECTO DEL TRATAMIENTO TRIPANOCIDA
María Laura Bizai, Lorena Verónica Olivera, Evelyn Elizabet Arias, Florencia Sabbione,
Diana Lucrecia Fabbro
CIEN-FBCB.UNL.
E-mail: [email protected]
La presencia de Ac anti-RA ha sido relacionada con la fisiopatología de la enfermedad de
Chagas encontrándose aun en etapas tempranas de la infección. Objetivo: comparar la
frecuencia sérica de Ac anti-RA en infectados crónicos por T cruzi, sin patología
demostrada tratados con drogas tripanocidas y sin tratar, y con cardiopatía chagásica
(CCC). Diseño: Estudio transversal. Se utilizó el kit Chagacor para determinar la presencia
de Ac anti-RA en 137 infectados crónicos por T. cruzi agrupados en: A) 33 asintomáticos
que recibieron tratamiento (nifurtimox o benznidazol) con 24,5+/-6,5 años promedio post
tratamiento; B) 51 no tratados sin patología demostrada y C) 53 con CCC, clasificados
según Kuschnir en G1 (n=39), G2 (n=11) y G3 (n=3). Se procesaron 19 sueros de
pacientes seronegativos con patología cardíaca y 32 controles sanos. La reactividad antiRA encontrada fue: grupo A 6,06%; grupo B 43,14%; grupo C 35,85%. Los controles no
infectados resultaron negativos. La prevalencia y el nivel de reactividad de los Ac anti-RA
fue similar para los grupos B y C (p>0,05 Test de Fisher, p>0,05 Test de student). En
IMMUNOLOGY & PATHOGENESIS
156
cambio se encontraron diferencias significativas entre estos grupos (B y C) y el grupo A
(p<0,05 Test de Fisher). No se encontró asociación entre el nivel de respuesta anti-RA y
el grado de compromiso cardíaco. La prevalencia de Ac anti-RA en los grupos no tratados
B y C fue similar a la hallada en otros trabajos. En los pacientes tratados el porcentaje de
reactividad fue mucho menor, sugiriendo un beneficio del tratamiento tripanocida ya que
estos Ac no se encontraron en personas sin infección. La ausencia de correlación entre la
reactividad anti-RA y severidad de cardiopatía indicaría que por sí mismos estos Ac no
son marcadores de patología. >
IYP12
ANÁLISIS DE PACIENTES CON SEROLOGÍA POSITIVA PARA ENFEMEDAD DE
CHAGAS CON PERSISTENCIA DE T. cruzi
Noemí Miler, Romina Blasco, Daniela Velázquez, Silvina Lo Presti, Paola C Bazán,
Mariana Strauss, Alejandra Báez, Héctor W Rivarola, Patricia Paglini
Cátedra de Física Biomédica, Facultad de Ciencias Médicas. U.N.C..
E-mail: [email protected]
Se han propuesto diferentes hipótesis para explicar la patogenia de la miocardiopatía
chagásica dándole relevancia a variables relativas al parásito o al huésped. Las técnicas
más sensibles para la detección del T. cruzi rescató el rol primordial del parásito y
actualmente se considera a la enfermedad como producto de la interacción entre el
genoma del parásito y del humano. Sin embargo ninguna de estas hipótesis explica por
qué el 30% de las personas infectadas evolucionan hacia una enfermedad cardíaca y el
70% permanece asíntomático aunque con serología persistente así como tampoco la
amplia variabilidad clínica. Por ello que en el presente se estudiaron 48 pacientes con
serología positiva para Enfermedad de Chagas (HAI, ELISA y TIF), edad 61,39± 2,35,
para determinar mediante PCR (en una única toma de sangre), si el T. cruzi persiste en
circulación en estos pacientes con y sin sintomatología cardíaca. Para ello se realizó
inspección clínica, ECG y ecocardiograma. De los 48 pacientes el 23% la PCR fue
negativa y en el 77% fue positiva. Los pacientes con PCR (-) en un 54% fueron
asintomáticos mientras que los PCR (+) solamente el 35% (p<0.05). Los síntomas clínicos
más frecuentes de los pacientes PCR (+) fueron disnea, 40% palpitaciones, 21% angor
pectoris y 13% edema. Al analizar las alteraciones electrocardiográficas y ecográficas las
alteraciones más frecuentes encontradas fueron: crecimiento de aurícula izquierda en un
36%, bradicardia sinusal 23%, bloqueo de rama derecha 16,6%, hemibloqueo anterior
izquierdo e hipertrofia de ventrículo izquierdo 10%, disfunción diastólica 50% y
disminución de la fracción de eyección en un 15%. Estos resultados claramente
demuestran la persistencia del parásito en circulación en la mayoría de los pacientes con
serología positiva hecho que tiene relación directa con mayor sintomatología cardiaca lo
que con seguridad generará agravamiento en la cardiopatía, por lo cual el tratamiento en
cualquier fase resulta de importancia >
IYP13
IMMUNOLOGY & PATHOGENESIS
157
IMMUNE RESPONSE AND ITS RELATIONSHIP WITH THE PROFILE OF CYTOKINES
IN DIFFERENT ORGANS OF DOGS WITH LEISHMANIASIS VISCERAL
Pamela Rodrigues Reina Moreira(1), Márcio de Barros Bandarra(2), Filipe Santos
Fernando(3), Helio José Montassier(4), Rosemeri de Oliveira Vasconcelos(5)
(1)(4)(5)
UNESP - Jaboticabal/Brasil-Departamento de Patología Veterinaria. (2)(3)UNESP Jaboticabal/Brasil.
E-mail: [email protected]
The immune response of dogs with visceral leishmaniasis (VL) may present a varied
profile of proinflammatory (resistance) or anti-inflammatory (susceptibility) cytokines,
hindering or favoring the multiplication of the protozoan Leishmania infantum in the host
tissues. The aim of this study was to evaluate the profile of Th1, Th2 and regulatory
cytokines, transcription factors (T-bet/GATA-3) and quantification of parasite DNA in dogs
with VL and control, in the liver, spleen, popliteal and prescapular lymph nodes. We used
16 symptomatic (S) and 12 asymptomatic (A) dogs naturally infected by the parasite and
five control dogs from non-endemic area for VL. The quantification of the gene expression
of cytokines (IFN-γ, TGF-β, IL-10, IL-4, IL-12 and MIF), transcription factors and
quantification of parasite DNA was done using RT-qPCR in different organs. The spleen,
popliteal and pre-scapular lymph nodes showed a higher number of copies of the DNA of
Leishmania infantum. The expression of cytokine genes increased for pro-inflammatory
(TNF-α, IFN-γ, MIF, IL-12), anti-inflammatory (IL-4) and regulatory cytokines (IL-10, TGFβ), in infected dogs (A, S), with significant differences from the control group (P<0.05). IL4, IL-10, TGFβ and MIF had higher expression levels of mRNA in the group S, in all
organs. TNF-α and IFN-γ had higher levels in group A. The transcription factor T-bet had
higher levels in group A and GATA-3 was less expressed in the infected dogs. Maybe IL10 and TGF-β can influence the progression of VL in the dog, because sub-regulate T-bet
and GATA-3. MIF is acting in favor of the parasite and can be responsible for survival of
parasitized macrophages. We conclude that the immune response that favors the systemic
dissemination of the parasite. It has a mixed pattern Th1/Th2. This kind of response is not
efficient in controlling the parasite in susceptible organs or in dogs with advanced disease.
Acknowledgement: FAPESP-2013/00763-4 and 2010/16030-8.>
IYP14
EVIDENCE OF EXPERIMENTAL BIOLOGICAL INTERACTIONS BETWEEN
DIFFERENT ISOLATES OF Trypanosoma cruzi FROM THE CHACO REGION
Paula Ragone(1), Cecilia Pérez Brandán(2), Mercedes Monje Rumi(3), Nicolás Tomasini(4),
Juan J Lauthier(5), Rubén Cimino(6), Miguel A Basombrío(7), Patricio Diosque(8)
(1)(2)(3)(4)(5)(7)(8)
Instituto de Patología Experimental, Facultad de Ciencias de la Salud,
Universidad Nacional de Salta. (6)Cátedra de Química Biológica, Facultad de Ciencias
Naturales, Universidad Nacional de Salta.
E-mail: [email protected]
Many infectious diseases arise from co-infections or re-infections with more than one
genotype of the same pathogen. These mixed infections could alter host fitness, the
severity of symptoms, success in the pathogen transmission and the epidemiology of the
disease. Trypanosoma cruzi, the etiological agent of Chagas disease, exhibits a high
IMMUNOLOGY & PATHOGENESIS
158
biological variability often correlated with the genetic diversity. Here, we developed an
experimental approach in order to evaluate biological interaction between three T. cruzi
isolates belonging to different Discrete Typing Units (DTUs TcIII, TcV and TcVI). These
isolates were obtained from a restricted geographical area in the Chaco Region;
suggesting that they could be naturally co-infecting the same host. Different mixed
infections involving combinations of two isolates (TcIII + TcV, TcIII + TcVI and TcV + TcVI)
were evaluated in a mouse model. The parameters evaluated were number of parasites
circulating in peripheral blood, histopathology and genetic characterization of each DTU in
different tissues by DNA hybridization probes. The results suggest biological interactions
between the analyzed isolates. We found a predominance of TcVI isolate in blood and
tissues respect to TcIII and TcV; and a decrease of the inflammatory response in heart
when the damage of mice infected with TcVI and TcIII + TcVI mixture were compared. In
addition, simultaneous presence of two isolates in the same tissue was not detected,
hence, that presence of one isolate could display a negative effect on isolates belonging to
a different DTU. Overall, our results show that biological interactions between isolates with
different biological behaviors lead to changes in their biological properties. The occurrence
of interactions among different genotypes of T. cruzi observed in our mouse model
suggests that these phenomena could also occur in the natural cycles in Chaco Region.
IYP15
BIOMARCADORES DE DISFUNCIÓN
ENFERMEDAD DE CHAGAS CRÓNICO
ENDOTELIAL
EN
PACIENTES
CON
Claudia Pengue(1), Maria G Alvarez(2), Rodolfo J Viotti(3), Silvia S Cambiazzo(4), Marcos
Petti(5), María C Albareda(6), Susana A Laucella(7)
(1)(3)(5)
Hospital Interzonal General de Agudos Eva Perón, San Martín. (2)Hospital Interzonal
General de Agudos Eva Perón. (4)Hospital Teodoro Alvarez, Buenos Aires. (6)(7)Instituto
Nacional de Parasitología "Dr. M.F. Chaben", Buenos Aires.
E-mail: [email protected]
La inflamación crónica producto de la infección por T. cruzi conlleva a un estado de
activación persistente del sistema inmune. Los mediadores inflamatorios regulan la
expresión de distintas moléculas de adhesión celular entre las que se encuentran la Pselectina(CD62P) y su receptor (PSGL-1). Estas moléculas participan en el reclutamiento
de leucocitos durante la reacción inflamatoria, además se ha demostrado que estas
moléculas participarían en el reclutamiento de micropartículas leucocitarias para la
formación del trombo plaquetario. En este estudio se exploró la expresión de marcadores
de activación plaquetaria, endotelial y de daño tisular en pacientes con enfermedad de
Chagas crónica sin compromiso cardíaco (n= 13) y en pacientes con alteraciones
cardiológicas(n= 10). La expresión de CD63 y CD62P en plaquetas; y de su ligando
PSGL-1 en linfocitos CD4 y CD8 fueron evaluados por citometría de flujo. También se han
evaluado los niveles de endotelina-1 y procolágeno en suero por ELISA de captura; y los
niveles de fibrinógeno y el factor de Von Willebrand por nefelometría. La expresión de
CD62P y CD63 así como el porcentaje de plaquetas que expresan estos marcadores se
encuentran disminuídos en los pacientes crónicamente infectados por T. cruzi, no
existiendo diferencias entre grupos clínicos. Se observó un aumento significativo en los
niveles de endotelina-1 sólo en los pacientes con cardiomiopatía severa.Aunque no se
IMMUNOLOGY & PATHOGENESIS
159
observaron diferencias ni en los niveles de fibrinógeno ni en el factor Von WIllebrand entre
pacientes con o sin presencia de cardiomiopatía, un 40% de los pacientes mostraron
valores por encima del valor de referencia.Contrariamente, la expresión de PSGL-1 y los
niveles de procolágeno no se encuentran alterados. La activación plaquetaria evidenciada
en este estudio, sugieren que la infección crónica por T. cruzi induce alteraciones de
función endotelial en pacientes en los que no se evidencia aún compromiso cardíaco.
IYP16
ADN DE Toxoplasma gondii INDUCE LA EXPRESION DE α-DEFENSINA-5 EN
CELULAS DEL EPITELIO INTESTINAL
Ricardo S Corral(1), Miguel H Santamaría(2)
Servicio de Parasitología-Chagas, Hospital de Niños Dr. Ricardo Gutiérrez (CABA).
(2)
Centro de Estudios Metabólicos (CEM-Santander).
E-mail: [email protected]
(1)
El epitelio intestinal es una barrera selectiva que contribuye activamente a la homeostasis
de la mucosa y a la resistencia frente a microorganismos patógenos, entre otros T. gondii.
Múltiples mecanismos de inmunidad innata participan en dicha protección, incluyendo
aquéllos mediados por péptidos antimicrobianos como las defensinas. Dentro de esta
familia se destaca la α-defensina-5 (DEFA-5) intestinal, la cual es generada, vía receptor 9
de tipo Toll (TLR9), luego de la infección oral y es capaz de reducir la viabilidad e
infectividad del toxoplasma. Nuestro objetivo fue determinar si la interacción de TLR9 con
secuencias CpG no metiladas presentes en el ADN de T. gondii conduce a un aumento en
la producción de DEFA-5 en células del epitelio intestinal. Mediante experimentos in vitro,
se halló que el ADN purificado de taquizoitos de T. gondii cepa RH induce, en función de
la dosis, la expresión de DEFA-5 en la línea celular pD015-f. Este efecto fue revertido por
tratamiento con ADNasa y por metilación de CpG en el ADN del parásito. Por otra parte,
en células transfectadas con ADN de T. gondii (100 μg/ml) se verificó por inmunoblotting
un incremento de los niveles del péptido antimicrobiano al cabo de 24 h. Utilizando un
oligonucleótido inhibidor de TLR9 se bloqueó por completo la inducción, reflejando así que
la misma era mediada por activación de dicho receptor endosomal. En concordancia con
estas observaciones, los estudios inmunocitoquímicos revelaron una intensa señal para
DEFA-5 en las células epiteliales intestinales estimuladas con ADN del protozoo, mientras
que el análisis por citometría de flujo mostró un mayor número de células pD015-f
productoras de esta defensina en respuesta a la interacción con material genético aislado
de taquizoitos. Nuestros resultados sugieren que los motivos CpG no metilados del ADN
de T. gondii, actuando como activadores de TLR9, son importantes para la inducción de
DEFA-5 en células del epitelio intestinal.
IYP17
CYTOKINES LEVELS IN CARUNCLES OF PREGNANT HEIFERS IMMUNIZED WITH
EXPERIMENTAL VACCINES AGAINST Neospora caninum AND CHALLENGED
Yanina P Hecker(1), Javier Regidor-Cerrillo(2), Andrea Verna(3), Eleonora Morrell(4), Luis M
Ortega-Mora(5), Anselmo Odeón(6),
Carlos Campero(7), Dadín P
Moore(8)
(1)(8)
Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET).
IMMUNOLOGY & PATHOGENESIS
160
(2)(5)
SALUVET, Animal Health Department, Faculty of Veterinary Sciences, Complutense
University of Madrid, Ciudad Universitaria s/n, 28040 Madrid, Spain. (3)(4)(6)(7)Instituto
Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA), Balcarce, CC 276, 7620, Balcarce,
Argentina.
E-mail: [email protected]
The aim of the present study was to evaluate the immune response in maternal-fetal
interface of pregnant cattle immunized with a live and two inactivated experimental
vaccines against Neospora caninum and then challenged.Twenty pregnant heifers were
divided in 5 groups of 4 animals, each receiving different inoculation before mating: group
A animals were intravenously (iv) inoculated with 6.25×107 live tachyzoites of the NC-6
strain, group B heifers were inoculated twice subcutaneously (sc) with N. caninum native
antigen extract formulated with ISCOMs; group C heifers were sc inoculated twice with
three recombinant proteins (rNcSAG1, rNcHSP20, rNcGRA7) formulated with ISCOMs;
group D were sc injected with sterile phosphate-buffered saline (PBS) and group E heifers
received sc ISCOM-matrix (without antigen). All groups were iv challenged with the NC-1
strain at 70 days of gestation and were slaughtered at day 104 of gestation. Cytokine
levels (IFN-γ, IL-4, IL-10, IL-12 and TNF-α) were measured using real-time reverse
transcription-PCR. In the present study was found significantly low levels of IFN-γ, IL-4, IL10, IL-12 and TNF-α mRNA levels in group A in relation to group B, C, D and E (P<0.05).
In contrast, cytokine mRNA levels showed a high levels of IFN-γ, IL-12p40 and TNF-α,
which are representatives of Th1 response, and increased mRNA levels of Th2 (IL-4) and
regulatory cytokines (IL-10), confirming a mixed Th1 and Th2 pattern in N. caninuminfected caruncles in group B, C, D and E. There were not differences among these last
four groups (P>0.05). These findings indicated that in group A there was not active
immune response in caruncles. Possibly the solid immune response developed in dams
that received live tachyzoites (group A) avoided the arrival of N. caninum to materno-fetal
interface. On the other hand, in group B and C were observed similar levels of cytokines to
group D and E indicating the failed to induce memory response against experimental
challenge.
IYP18
USO DE PROTEINAS RECOMBINANTES COMO BLANCO DE LA RESPUESTA
INMUNE CELULAR EN PACIENTES CON ENFERMEDAD DE CHAGAS CRONICA
Melisa D Castro Eiro(1), Maria G Alvarez(2), Maria C Albareda(3), Ailen Natale(4), Rodolfo
Viotti(5), Susana Laucella(6), Rick L Tarleton(7)
(1)(3)(4)(6)
Instituto Nacional de Parasitología “Dr. F. Chaben, Buenos Aires, Argentina.
(2)(5)
HIGA “Eva Perón, Buenos Aires, Argentina. (7)Center for Tropical and Emerging Global
Diseases, Athens, Georgia, USA.
E-mail: [email protected]
La utilización de proteínas recombinantes y péptidos como estímulo antigénico para
evaluar la respuesta humoral ha sido extensamente validada. En la enfermedad de
Chagas, el ensayo serológico de multiplex en el que se emplean proteínas recombinantes
derivadas de T. cruzi plantea una alternativa de diagnóstico a la serología convencional
utilizando extractos crudos del parásito. Sin embargo, el uso de proteínas recombinantes
para la evaluación de la respuesta celular ha sido más limitado. El objetivo de este trabajo
IMMUNOLOGY & PATHOGENESIS
161
fue estudiar la respuesta inmune celular hacia 7 proteínas recombinantes de T. cruzi
incluídas en el multiplex (ANOH, ANOF, Kn104, Kn107, Kn117, Kn122, FABA). Para
evaluar esto, se realizaron ensayos de ELISPOT para interferón-gamma (IFN-γ),
utilizando células mononucleares periféricas. Se ensayaron distintas concentraciones de
proteínas recombinantes: 2,5 μg/ml, 3 μg/ml, 10 μg/ml y 20μg/ml. También se evaluó la
respuesta hacia un lisado proteico de amastigotes (10 μg/ml) para su comparación. Se
analizaron 20 pacientes con enfermedad de Chagas crónica de estadío G0 y 10 controles
no infectados. De los 20 pacientes, 11 resultaron positivos frente al estímulo con el lisado
de T. cruzi y 5 de ellos respondieron a una o varias proteínas. De los 10 controles no
infectados, sólo 1 resultó positivo para 1 sola proteína. De las 3 concentraciones
ensayadas para las proteínas recombinantes, no se encontraron diferencias entre 10
μg/ml y 20 μg/ml pero sí entre éstas y 3 μg/ml. Estos hallazgos sugieren que blancos
antigénicos de la respuesta humoral son también reconocidos por linfocitos T.
IYP19
THE TRYPOMASTIGOTE SURFACE PROTEIN TcTASV-C INDUCES PARTIAL
PROTECTION AGAINST Trypanosoma cruzi IN MICE
Lucas D Caeiro(1), Catalina D Alba Soto(2), Daniel O Sanchez(3), Valeria S Tekiel(4)
IIB-UNSAM. (2)IMPAM-UBA-CONICET.
E-mail: [email protected]
(1)(3)(4)
TcTASV is an Alanine, Serine and Valine-rich protein family, initially identified by our group
from a cDNA library of trypomastigote-enriched mRNAs. TcTASV family consists of ~40
members, is present in T. cruzi strains from different lineages and has no orthologs in
other trypanosomatids. All members of the TcTASV family have conserved coding aminoand carboxy-termini, and a central variable core that allows partitioning of TcTASV
proteins into three subfamilies, A, B and C. We showed that TcTASV-C is preferentially
expressed in trypomastigotes and is highly phosphorylated and glycosylated. TcTASV-C is
anchored to the trypomastigote’s membrane by a GPI anchor, is spontaneously released
to the medium and is localized in discrete spots or patches on cell membrane and
flagellum of trypomastigotes. Furthermore, approximately 30% of sera from infected host
(experimental animals and humans) were reactive with TcTASV-C, confirming its
expression in the natural cycle of the parasite. Preliminary results suggest that it may also
be good vaccine candidate. In this project, we studied TcTASV-C to analyze its protective
capacity against T. cruzi. We employed a prime and boost vaccination schedule (2 doses
of DNA + GM-CSF/mouse and 2 doses of protein + alum/ mouse; TcTASV-C: n=10;
controls: n=10). Fifteen days after the last dose, sera were obtained to test antibody
response, in which we observed a significant response Th1/Th2 against TcTASV-C, and
animals were challenged with the highly virulent T. cruzi RA strain (lineage VI). Vaccinated
animals presented a delay in the appearance of detectable parasites in blood, and a
significant higher survival rate in vaccinated mice than controls (100% vs 30% at 30 d.p.i.),
suggesting that TcTASV-C induces a partially protective response and is a good vaccine
candidate that deserves further studies.
IYP20
IMMUNOLOGY & PATHOGENESIS
162
B CELLS REGULATE THE INFLAMMATORY CD4+ T CELL RESPONSE IN
Trypanosoma cruzi INFECTION
Melisa Gorosito Serrán, Jimena Tosello Boari, María C Ramello, Cristian Beccaría,
Facundo Fiocca Vernengo, Daniela A Bermejo, María C Amezcua Vesely, Carolina L
Montes, Eva V Acosta Rodriguez, Adriana Gruppi
CIBICI - CONICET.
E-mail: [email protected]
B cell-deficient mice (mMT) infected with T. cruzi are able to control parasitemia similar to
C57BL/6 wild type (WT) mice but present increased parasitemia by 10 days post-infection
(dpi) and accelerated mortality. mMT and WT mice have similar tissue parasite load as
determined by RT-PCR, indicating that mortality is not caused by uncontrolled parasitism.
To assess possible causes of the increased susceptibility of mMT mice, we analyzed
cytokine production and CD4+T cell responses in mMT and WT mice infected i.p. with
10000 trypomastigotes Y-br strain. Groups of 4-7 mice were sacrificed by 4, 9, 15, 20 dpi
and sera and splenocytes were obtained. By 9 dpi, amounts of serum IFNg were
increased in both infected mice strains, but were higher in mMT mice (p<0.01). Serum
TNF amounts were increased in both mice strains by 9 dpi and afterwards diminished in
WT and increased in mMT mice (15 and 21 dpi, p<0.001). CD4+T cells where the main
IFNg producing population by 9 dpi and were higher in mMT mice in comparison to WT
(p=0.0013). CD4+T cells were also the main TNF producers by 15 and 20 dpi and in mMT
mice preferentially had a pro-inflammatory phenotype (CD4+Ly6C+). IL-10-producing cells
were reduced in infected mMT mice due to not only the absence of IL-10+B cells present
in WT mice, but also a decrease in the numbers of IL10-producing CD4+T cells (15 dpi,
p<0.001). In vitro co-culture experiments showed that B cells controlled TNF production in
splenocytes from infected mice incubated with T. cruzi antigens.
TNF neutralization by mAbs prevented the cachexia observed in infected mMT mice but
accelerated even more their mortality due to an exacerbated Th1 response with high
amounts of IL12, IFNg, TNF. In these mice, CD4+Ly6C+ cells were increased in spleen at
30 dpi.
Our data suggests that B-cell absence in T. cruzi infection could cause an altered
activation of the CD4+T-cells, leading to a systemic imbalance in the host and mortality.
IYP21
NIVELES PLASMÁTICOS DE CITOCINAS Y QUIMIOCINAS EN NIÑOS CON
INFECCIÓN CONGÉNITA POR Trypanosoma cruzi CON DISTINTOS NIVELES DE
PARASITEMIA
Bibiana Julieta Volta, Susana Laucella, Karenina Scollo, Ana María de Rissio, Rita L.
Cardoni, Jacqueline Bua
INP Fatala Chaben.
E-mail: [email protected]
Si bien en adultos, la inmunidad protectora frente a T. cruzi es mediada por una respuesta
Th1, se conoce menos sobre la respuesta inmune de neonatos con infección congénita.
IMMUNOLOGY & PATHOGENESIS
163
En este estudio, se caracterizó el perfil inmunológico de niños infectados, en relación a su
carga parasitaria, evaluando los niveles plasmáticos de citocinas (IL-1β, IL-2, IL-3, IL-4, IL5, IL-6, IL-7, IL-9, IL-10, IL-12p70, IL-13, IL-17A, IL-17F, IFN-γ, TNF) y quimiocinas (MIG,
MIP-1β, MCP-1,RANTES) en 10 niños no infectados hijos de madres seropositivas para T.
cruzi, 10 niños no infectados hijos de madres seronegativas y 40 niños infectados que se
dividieron en 3 grupos (20 neonatos con altas parasitemias en el 1° mes de vida, 10 niños
con bajas parasitemias en el 1° mes, diagnosticados en el 6° mes de vida, y 10 niños con
bajas parasitemias diagnosticados por serología alrededor del año de vida. En los niños
infectados se observó un incremento significativo de MCP-1y MIG, correlacionando la
concentración de MIG al mes de vida con la carga parasitaria de los bebés (rs= 0,81 ; p=
0,0001). En niños infectados con bajas parasitemias se detectaron niveles
significativamente más altos de IL-6 e IL-17A que en los bebés con altas parasitemias. La
infección por T. cruzi no alteró la produccion de citocinas del perfil Th1 o Th2. En los
bebés no infectados nacidos de madres seropositivas se observaron niveles plasmáticos
de IL-12p70 e IFN-γ más altos que el resto de los grupos estudiados. Estos resultados
sugieren que el perfil de citocinas y quimiocinas es diferente entre niños que contraen
infección congénita y aquellos que no. En los niños con infección congénita por T. cruzi
existe una polarización hacia el perfil Th17 mientras que en niños no infectados nacidos
de madres seropositivas se observa una polarización hacia el perfil Th1. La concentración
de MIG en plasma muestra una elevada capacidad predictiva de la infección congénita,
que debería confirmarse en estudios futuros
IYP22
CARACTERIZACION DE LINFOCITOS B Y ANALISIS DE FACTORES ASOCIADOS A
LA INMUNIDAD HUMORAL EN LA LEISHMANIASIS MUCOSA
Cecilia Parodi (1), María F García Bustos(2), Alejandra Barrio(3), Patricia Baré(4), Federico
Ramos(5), María C Mora(6), María M de Elizalde de Bracco(7), Miguel A Basombrio(8)
(1)(4)(7)
Instituto de Medicina Experimental-CONICET, Academia Nacional de Medicina.
(2)(3)(5)(6)(8)
Instituto de Patología Experimental-CONICET, Universidad Nacional de Salta.
E-mail: [email protected]
Para contribuir en dilucidar el rol de los linfocitos B en la Leishmaniasis (L) caracterizamos
receptores de memoria B, autoinmunidad y factores regulatorios, en muestras de células
mononucleares periféricas y plasmas de pacientes con L. mucosa (LM, n=5-22) y sujetos
sanos (N, n=5-11). Analizando (X±DS) la población B de memoria (CBM) CD19+, LM
presentó menor expresión de CD27+ (26.26±14.99 vs. 32.57±10.16 %, p=0.0261) y de
CBM sin cambio de isotipo CD27+ IgD+ (5.65±2.23 vs. 12.08±6.84 %, p=0.0018). En LM
se observó tendencia a aumento de CBM con cambio de isotipo IgD- IgM- (36.86±21.90
vs. 26.39±14.61 %), IgG+ (22.08±8.09 vs. 11.34±5.51 %) e IgA+ (16.35±8.94 vs.
8.27±4.03 %). No obstante, la concentración plasmática de IgG resultó similar en LM
(7.82±7.24 g/l) y en N (6.42±4.09 g/l). Además en LM aumentaron significativamente las
CBM CD27- IgD- (12.52±4.97 vs. 7.27±2.57 %, p=0.0065). La expresión de los receptores
de autoinmunidad, BAFF-R (LM: 89.96±10.95%; N: 97.62±2.02 %) y TACI (LM
32.54±13.02; N 42.32±16.64 %) fue similar en LM y N. La concentración de la citoquina
reguladora IL10 en plasma resultó mayor en LM: 11.16±20.07 vs. N: 5.43±1.30 pg/ml. En
cuanto a las células T CD4+ regulatorias, la expresión de CD25 (LM 11.79±5.59; N
IMMUNOLOGY & PATHOGENESIS
164
11.70±3.54 %) y FoxP3 (LM 7.30±2.71; N 5.32±1.79 %) fue similar, pero disminuyeron las
células regulatorias supresoras T CD4+ CD25+ CD127- en LM (1.72±0.72 vs. 2.83±0.93
%; p=0.0280). El aumento de CBM CD27- IgD-, observado también en pacientes con VIH
o malaria, podría deberse a la persistencia del patógeno, que lleva a activación crónica
inmune y puede manifestarse con signos de agotamiento celular. No encontramos
diferencias
en
receptores
relativos
a
autoinmunidad
ni
presencia
de
hipergammaglobulinemia por IgG. Debido a que en LM existe una respuesta inflamatoria
exacerbada, el aumento de IL10 podría producirse para regular dicha respuesta, aunque
en nuestro estudio, el porcentaje de células T regulatorias no aumentó paralelamente.
IYP23
INMUNOMODULACIÓN LA ENFERMEDAD DE CHAGAS POR CÉLULAS NATURAL
KILLER (NK): ROL DE LA CITOQUINA IL 10.
Estela I Batalla, Agustina M Pino Martinez, Cristian G Miranda, Stella M Gonzalez Cappa,
Catalina D Alba Soto
IMPAM (UBA-CONICET).
E-mail: [email protected]
Las NK participan en la inmunidad protectora contra patógenos intracelulares. Su
interacción temprana con las células dendríticas (CD) promueve la activación recíproca,
estimulando la respuesta adaptativa y la función efectora de ambas. También se atribuye
a las NK un rol regulador en infecciones sistémicas e inflamación mediado por su
producción de IL10. Hemos descrito que la infección temprana con una cepa de
Trypanosoma cruzi de alta virulencia altera el diálogo entre NK/CD y que la IL10 participa
en este mecanismo. Evaluamos ex vivo, en la interacción NK/CD, si la IL10 producida por
NK modificaba la producción de citoquinas. Las CD IL10-/- aumentaron su producción de
IL12 frente a NK wt de ratones infectados con T. cruzi y esto coincidió con una menor
producción de IFNγ por NK. El bloqueo del consumo de IL10 (anti-IL10R1) no modificó la
producción de IL12 pero incrementó la de IFNγ. La IL10 estaría limitando la producción de
IFNγ por NK autócrinamente o actuando sobre las CD. En experimentos de transferencia
de NK de ratones infectados (48hpi) con posterior desafío con T.cruzi evaluamos si esta
intervención modula la respuesta a la infección. Para determinar el rol de la IL10
producida por NK, usamos donantes wt y receptores IL10-/- . La transferencia
intradérmica de NK de ratones wt infectados a receptores IL10-/-, en simultánea con la
infección, aumentó la susceptibilidad de los mismos a T. cruzi. Lo mismo se observó en
receptores wt. Sin embargo, cuando realizamos la transferencia, por vía endovenosa, de
NK de ratones wt infectados 6 días previo a la infección, los receptores desafiados
aumentaron su resistencia al parásito. Las NK activadas por T.cruzi podrían promover un
ambiente inflamatorio local favorable al establecimiento del parásito por su temprana
producción de IFNγ. Transferidas previo a la infección podrían ejercer un efecto protector
relacionado con la amplificación de mecanismos efectores o la supresión de mecanismos
inflamatorios.
IYP24
IMMUNOLOGY & PATHOGENESIS
165
DIFFERENTIAL IN VITRO RESPONSE AGAINST Trypanosoma cruzi BY T-CELLS
DERIVED FROM CHRONIC CARDIAC AND ASYMPTOMATIC CHAGAS DISEASE
PATIENTS
Gonzalo R Acevedo(1), Silvia Longhi(2), Augusto Atienza(3), Pablo Chiale(4), Valeria
Judkowski(5), Clemencia Pinilla(6), Karina A Gómez(7)
(1)(2)(7)
INGEBI-CONICET, Buenos Aires, Argentina. (3)(4)Hospital Ramos Mejía, Buenos
Aires, Argentina. (5)(6)Torrey Pines Institute for Molecular Studies, San Diego, CA, EEUU.
E-mail: [email protected]
The discovery of immunologically protective Trypanosoma cruzi antigens is a matter of
particular interest, given the relevance of human Chagas disease as a major public health
issue. Despite efforts in the field are profuse and diverse, they have thus far been of very
limited success. Our line of research proposes a T-cell driven approach, by which
amplified T. cruzi-specific memory T-cells from infected patients are used to scan
combinatorial peptide libraries, allowing the discovery of T epitopes which would be, by
definition, immunogenic. The first step on this strategy is the generation of T-cell lines from
donors’ peripheral blood mononuclear cells (PBMC). This is achieved by an in vitro
stimulation and culture protocol, consisting of an initial stimulation with T. cruzi lysate, an
antigen-specific T-cells expansion stage and a challenge protocol for specificity evaluation.
Among several combinations of experimental conditions tested, our preliminary results
allowed us to adjust the following protocol variables: T. cruzi lysate concentration and
incubation time (2.5 μg/ml and 1 day, respectively), initial culture density (200,000
PBMC/well), interleukin-2 addition in culture medium (since day 6, every 3-4 days), culture
time span before specificity evaluation (27 days), antigen-specific T-cells to antigen
presenting cells ratio (1:2), and readouts (Interferon-γ secretion, cell proliferation).
Interestingly, experiments showed remarkable differences in the way T-cells respond to
parasite antigens, depending on whether the donor was classified as asymptomatic
(mainly proliferative response), or cardiac (predominantly interferon-γ secretion).
Hopefully, our contribution will help to a better understanding of the immune response
against T. cruzi in the context of Chagas disease, as it allows us to advance towards the
discovery of potential prophylactic or therapeutic vaccine candidates.
IYP25
VERTICAL TOXOPLASMOSIS IN A MURINE MODEL. PROTECTION AFTER
IMMUNIZATION WITH THE SERINE PROTEASE INHIBITOR-1 OF Toxoplasma gondii
Mariano S Picchio(1), Vanesa R Sanchez(2), Ignacio M Fenoy(3), Nadia Arcon(4), Ariadna S
Soto(5), Mariela Urrutia(6), Alejandra Goldman(7), Valentina Martin(8)
(1)
CESyMA - ECyT - UNSAM. (2)(4)(5)(7)(8)CESyMA / ECyT / UNSAM. (3)IIB-INTECH /
UNSAM. (6)Fundación Instituto Leloir; IIBBA-CONICET.
E-mail: [email protected]
Primary Toxoplasma gondii infection during pregnancy can cause severe damage to the
fetus as a result of congenital transmission in humans and abortion and loss of offspring in
farm animals. The fact that infection before pregnancy normally results in immunity able to
protect the fetus, suggests the possibility of blocking parasite vertical transmission by an
appropriate vaccine. We have previously shown that the T. gondii serine protease
IMMUNOLOGY & PATHOGENESIS
166
inhibitor-1 (TgPI-1) induced a protective immune response against parasite infection in
both C3H/HeN and C57BL/6 mice. In the present work, we evaluated its protective
capacity to prevent parasite vertical transmission in BALB/c mice. Female mice were
immunized with rTgPI-1 (2 doses + alum id plus 2 doses +CpG-ODN in) or left untreated
(control group), and then mated with males. Pregnant dams were infected orally on day 12
of gestation, with tissue cysts of T. gondii Me49 strain. Naturally delivered pups from
rTgPI-1 vaccinated mice showed a significant increase in the neonatal survival rate on day
30 after birth compared to the control group (71% vs 40%). On the other hand, both
groups presented similar rate of dead pups at birth (30% rTgPI-1 vs 44% control). In order
to evaluate whether rTgPI-1 immunization could prevent Toxoplasma-induced fetal
resorption, in another experiment the uteri of pregnant mice were removed on day 19/20 of
gestation for the documentation of the implantation sites. A similar number of dams
experienced abortions in both control and vaccinated groups (57% 50%), but the abortion
rate in the control group was significantly higher compared to the vaccinated group (100%
vs 17%, p<0.05). In fetus with visible normality, a similar rate of congenital infection was
found as analyzed by Nested-PCR (41% vs 38%, vaccinated vs control). These results let
us hypothesize that vaccination with rTgPI-1 could decrease the abortion rates and also
increase the survival of pups born to dams infected during pregnancy.
IYP26
LA PROLIL OLIGOPEPTIDASA DE 80 KDA (TC80) DE Trypanosoma cruzi CONFIERE
PROTECCIÓN EN UN MODELO AGUDO DE INFECCIÓN MURINA
Augusto E Bivona(1), Andrés Sanchez Alberti(2), Natacha Cerny(3), Alejandro C Cardoso
Landaburu(4), Silvia I Cazorla(5), Emilio L Malchiodi(6)
(1)(2)(3)
IDEHU-UBA-CONICET. IMPaM-UBA-CONICET. (4)(6)IDEHU-CONICET-UBA.
(5)
IMPaM-CONICET-UBA.
E-mail: [email protected]
Tc80 es una proteína de secreción expresada principalmente en los estadíos de
tripomastigotes y amastigotes. Esta serín proteasa degrada componentes de la matriz
extracelular como fibronectina, colágeno tipo I y IV, por lo que estaría implicada en la
invasión tisular del parásito. Se observó además, que su inhibición bloquea la infección de
células in vitro. En base a estos antecedentes, la consideramos como un posible
candidato vacunal frente a la infección por T. cruzi. Clonamos Tc80 en vectores de
expresión procariota y eucariota. A partir del vector procariota se expresó Tc80
recombinante (rTc80) en células E. coli BL21 en forma soluble. Con el vector eucariota se
transformó Salmonella enterica serovar Typhimurium aroA 7207, la que se utilizó como
sistema delivery por vía oral, del ADN codificante de Tc80 (STc80). Inmunizamos los
siguientes grupos de ratones. G1- Cuatro dosis de rTc80+CpG por vía intra muscular
(rTc80 i.m.); G2-cuatro dosis por vía oral de STc80; G3- un priming de dos dosis orales de
STc80 y un booster de dos dosis de rTc80+CpG por vía intramuscular (P.boost); y G4- un
grupo control inmunizado con Salmonella atenuada (SaroA). La respuesta humoral
desencadenada fue significativa en aquellos ratones que recibieron rTc80 i.m. Más
interesante, el priming con STc80 aumenta el sesgo hacia el isotipo IgG2a, indicio de la
estimulación de una respuesta del tipo Th1. Por el contrario, la respuesta celular fue
significativamente mayor en los ratones inmunizados con STc80, reflejado por una mayor
IMMUNOLOGY & PATHOGENESIS
167
reacción de hipersensibilidad retardada, proliferación y secreción de IL-2 por esplenocitos
frente al estímulo con rTc80. Por último, todos los grupos inmunizados presentaron una
reducida parasitemia y un aumento en la sobrevida ante un desafío letal con la cepa
virulenta T. cruzi RA. Cabe destacar que aquellos que recibieron al menos una dosis del
ADN de Tc80 presentaron una mayor sobrevida. Estos resultados consolidan a Tc80
como un candidato vacunal.
IYP27
DECIPHERING THE PUTATIVE ROLE OF HIGH MOBILITY GROUP B PROTEIN FROM
Trypanosoma cruzi IN INFLAMMATION
Luis Tavernelli(1), Romina Manarín(2), Virginia perdomo(3), Jorge Barrios-Payán(4), Rogelio
Hernandez Pando(5), Esteban Serra(6), Pamela Cribb(7)
(1)
Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario (IBR-CONICET). (2)Facultad de
Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas, Universidad Nacional de Rosario. (3) Instituto de
Biología Molecular y Celular de Rosario (IBR-CONICET). Facultad de Ciencias
Bioquímicas y Farmacéuticas, Universidad Nacional de Rosario. (4)(5)Sección Patología
Experimental, Instituto Nacional de Ciencias Médicas y Nutrición Salvador Zubiran,
México. (6)(7)Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario (IBR-CONICET). Facultad
de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas, Universidad Nacional de Rosario.
E-mail: [email protected]
High Mobility Group B (HMGB) proteins are evolutionary-conserved ubiquitous proteins
described more than 30 years ago and named for their high mobility in SDS-PAGE. As
abundant components of chromatin, they act as architectural factors and take part of many
nuclear processes like transcriptional regulation, DNA repair and replication. A member of
this family of proteins, HMGB1, has gained a lot of interest in the last decade because,
besides its nuclear functions, it can be secreted by activated macrophages or passively
released by necrotic or injured cells and act as a pro-inflammatory mediator. We
previously demonstrated that the HMGB protein from Trypanosoma cruzi (TcHMGB) is a
nuclear protein expressed in all life cycle stages with architectural functions. We decided
to test if TcHMGB can also act as an immune regulator, as a first approach to study its
putative role in Chagas Disease. We first determined the presence of TcHMGB in the
supernatants of epimastigote cultures and blood trypomastigotes incubated in PBS by
western blot, suggesting the protein can be secreted. Consistent with observations in other
organisms, acetylation may be the signal for TcHMGB secretion, since treatment with
deacetylase-inhibitors enhance the protein signal in western blots. We then stimulated
RAW 264.7 macrophages with the recombinant TcHMGB for different time periods.
Culture supernatants were collected and nitric oxide production was analyzed measuring
nitrite release by Griess reaction. Also, total RNA was purified from treated macrophages
and mRNAs for different cytokines were quantified by qRT-PCR. Recombinant TcHMGB
showed to be able of inducing macrophage activation in vitro. Finally, we tested the
immune activity in vivo, stimulating male BALBc mice with the recombinant protein for
different periods of time. Peritoneal fluid and spleens were collected to test for cytokineproduction. These preliminary results indicate that TcHMGB may have a role in
inflammation.
IMMUNOLOGY & PATHOGENESIS
168
IYP28
COMBINATION OF LIVE ATTENUATTED Trypanosoma cruzi PARASITES WITH IFNEXPRESSING PLASMID AS AN IMMUNIZATION STRATEGY
Cecilia Pérez Brandán(1), Fernando Sánchez-Valdéz(2), Rubén Cimino(3), Patricio Diosque
, Miguel Ángel Basombrío(5)
(1)(2)(4)(5)
Instituto de Patología Experimental- CONICET- Universidad Nacional de Salta.
(3)
Catedra de Quimica Biologica. UNSa.
E-mail: [email protected]
(4)
Immunization of mice with live attenuated Trypanosoma cruzi parasites has proven highly
immunogenic and protective against acute lethal challenge. It is known that early
interferon-gamma (IFN-γ) release by cells of the innate immune system is critical to lead
type 1 response able to control intracellular pathogens. Therefore, the aim of the present
work is to test whether the co-administration of a plasmid encoding IFN-γ could improve
the protection gain through vaccination with live attenuated parasites. For this purpose
C57BL/6J mice were immunized with three doses of 5x105 live metacyclic parasites in
combination with 50ug of plasmid pCDNA3- IFN-γ or plasmid alone. The immunization
regimens were done every 4 weeks either orally or intramuscularly. Thirty days after the
last immunization, animals were challenge with highly virulent T. cruzi parasites and
parasitemia was recorded weekly. During the immunization period, peripheral blood was
taken to determine infection by attenuated parasites. Serum samples as well as spleen
cells were collected to determined cytokines expression. Specific anti-T. cruzi antibodies,
avidity index and trypanolitic activity was also evaluated in immunized sera. All immunized
animals survive challenge with lethal parasites. So far, addition of IFN-γ, at least as
administer in our experimental model, does not modified the protection confer by
immunization with attenuated parasites alone. This work is supported by Fundacion
Florencio Fiorini and ANPCyT.
IYP29
HIGH QUANTITIES OF TRYPOMASTIGOTES OF Trypanosoma cruzi PRODUCES
PLACENTAL STRUCTURAL ALTERATIONS ASSOCIATED TO OXIDATIVE STRESS
IN VITRO
María Fernanda Triquell(1), María José Moreira Espinoza(2), Cintia Díaz Luján(3), Mariana
Piegari(4), Luciana Mezzano(5), Gina María Mazzudulli(6), Ricardo Fretes(7)
(1)(2)(3)(4)(5)(6)
Laboratorio de Placenta y Chagas, Biología Celular, Histología y Embriología,
Facultad Ciencias Médicas- INICSA (CONICET), Universidad Nacional de Cór.
(7)
Laboratorio de Placenta y Chagas, Biología Celular, Histología y Embriología, Fac Cs
Méd- INICSA (CONICET), UNC. 2Histología, Embriología y Genética-IICSHUM,
Universidad Nacional de La Rioja .
E-mail: [email protected]
Placenta participates actively in the control of congenital Chagas infection, which would
explain, the low transmission rate. Production of pro-inflammatory cytokines such as
TNFα, promotes nitric oxide (NO) production by the placental endothelial Nitric Oxide
Synthase (eNOS) that could play an important role of this control. NO reacts with oxygen
IMMUNOLOGY & PATHOGENESIS
169
species and produce peroxynitrites which are both trypanosidal and potentially deleterious
for placental tissue. Objective: To analyze structural alterations of the syncytiotrophoblast
(STB), induced by two populations of T. cruzi through increased TNFα, NOS and oxidative
stress. Placental villi explants co-cultured for 24 hs with 1x105 and 1x106 trypomastigotes
of Tulahuen and Lucky strains (isolated from a congenital case); controls without
parasites, and with addition of eNOS inhibitor L-NAME (1mM, 0,1mM, 0,01 mM).
Histological quantification of the detachment area of STB. In culture media: quantification
of NO (Griess), TNFα (ELISA).Tissue homogenates: NOSe and Nitrotyrosine expression
by ELISA; and Gamaglutamiltranspeptidase (GGT) activity to measure oxidative stress.
Placental explants in presence of both strains of T. cruzi showed a significant rise of TNFα,
tyrosin nitrosilation, eNOS expression and GGT activity. The structural alterations (STB
detachment) were significantly higher in presence of T. cruzi in a concentration dependent
manner. L-NAME prevents a rise of detachment with T.cruzi. The presence of high
quantity of T. cruzi in vitro produced detachment of the STB, associated with increased
production of TNFα, eNOS and oxidative stress, which could facilitate the chorionic villi
infection. These results could explain the association of some clinical aspects of the
congenital Chagas disease, with structural alterations described in placentas from
chagasic women. These results would constitute a new possible route of placental
infection. FONCyT-PICT 2012-1061,SECyT-UNLaR,MINCyT-PID(Cba),SECyT-UNC.
IYP30
EFFECTS OF PPAR-γ AGONISTS ON ADIPOSE TISSUE, IMMUNE AND METABOLIC
PARAMETERS DURING ACUTE Trypanosoma cruzi INFECTION
Florencia B González, Julia S Márquez, Eduardo A Roggero, Silvina R Villar, Oscar A
Bottasso, Ana R Pérez
IDICER / Instituto de Inmunología - FCM - UNR).
E-mail: [email protected]
Adipose tissue (TA) influences energy homeostasis and inflammation and at the same
time can act as a T. cruzi (Tc) reservoir. We recently showed that mice infected with Tc
displayed an exacerbated pro-inflammatory milieu associated with
metabolic
abnormalities like manifest lipolysis, hypoglycemia, hypoleptinemia, reduced body weight
and food intake which may play a role in lethality. PPAR-γ is a ligand-activated nuclear
factor mainly expressed in adipocytes and is involved in the modulation of energetic
metabolism and down regulation of inflammation. Thus, we wished to ascertain whether
therapeutic administration of endogenous (15dPGJ2; PGJ) or synthetic PPAR-γ agonists
(Rosiglitazone, RGZ) improved metabolic and AT inflammatory parameters and influenced
the course of T. cruzi infection. Mice were treated during the first 10 days post-infection
(dpi) with PGJ (1 mg/kg) or RGZ (10 & 20 mg/kg) and sacrificed after 17 dpi or maintained
alive to record survival. In infected mice both agonists failed to induce major changes in
survival, body weight loss, food intake, glycemia and systemic leptin levels, probably
related with a downregulation of PPAR-γ in AT during infection. On the other hand, both
drugs slightly reduced lipolysis, AT inflammation and macrophage phagocytosis. ATderived immune cells from infected animals showed an increase in CD8+ T cells, CD11b+
and CD11c+ cells, with a diminution of CD4+Foxp3+ Treg cells. In addition, RZG treated
Tc animals displayed a higher proportion of AT CD11b+ and CD11b+CD11c+ cells
IMMUNOLOGY & PATHOGENESIS
170
compared to untreated Tc mice (p<0,05). Even though both agonists increased parasite
load, only minor changes were found in heart tissue inflammation.
Collectively, AT abnormalities and immune changes seen during acute Tc infection were
slightly improved by PPAR-γ agonists, while they failed to modify the outcome of infection.
Downregulation of PPAR-γ by pro-inflammatory cytokines might be responsible for the
unresponsiveness of PPAR-γ agonists.
IYP31
SEROPREVALENCIA A Toxocara canis EN PERROS DE LA CIUDAD DE
CORRIENTES
Leandro D.M. García, María de los A. López, María V. Bojanich, Silvia E. Balbachán,
Ubaldo O. Martín
UNNE.
E-mail: [email protected]
Toxocara canis es un nematode de los caninos que accidentalmente infecta al hombre.
Los cachorros son responsables de la contaminación del ambiente a través de la
eliminación de huevos infectantes. La toxocariosis humana constituye un serio problema
sanitario, particularmente en los niños. El objetivo de este estudio fue determinar valores
de prevalencia de Toxocariosis canina mediante serología. Se estudiaron perros de los
barrios Laguna Seca, San Antonio Este y Alta Gracia, de la ciudad de Corrientes, que
concurrieron junto a sus dueños a jornadas de castración. Se obtuvieron muestras de
sangre por venopunción cefálica, y se consignaron datos de edad, sexo y barrio de
procedencia. Se realizó un test de ELISA indirecto para detección de anticuerpos de tipo
IgG específicos para Toxocara canis, empleando antígenos de excreción secreción de
larvas L2, y anticuerpo anti IgG canina marcado con peroxidasa. Se empleó el test de Chi
cuadrado para comparación de proporciones, empleando el software EpiInfo versión 6.0.
Se consideró un valor de p<0,05 como estadísticamente significativo. Se estudiaron en
total 62 perros, 11 machos y 51 hembras, de edades comprendidas entre 6 meses y 15
años (media 3.3 años; mediana 2 años).El ELISA indirecto reveló que el 72.5 % de los
canes presentaba serología positiva. No existieron diferencias significativas con respecto
al sexo. Al agruparlos por franja etaria, la mayor prevalencia correspondió al rango de 4 a
6 años (91.6%; n=12), mientras que fue del 25 % en menores de 1 año (n=8); 72.7% entre
1 y 3 años (n= 33) y del 88.8% en mayores de 7 años (n=9), siendo estas diferencias
estadísticamente significativas (p=0,005). La mayor prevalencia se encontró en el barrio
Alta Gracia con 79,4% (n= 34), sin diferencias estadísticamente significativas con respecto
a los otros barrios estudiados. Estos resultados sugieren la necesidad de implementar
medidas de control sanitario en perros y de esa manera reducir el riesgo de transmisión al
hombre.
IYP32
INTERACCIÓN DE CRUZIPAÍNA CON SU INHIBIDOR FISIOLÓGICO EN LA
MODULACIÓN DE LA RESPUESTA INMUNE EJERCIDA POR Trypanosoma cruzi
IMMUNOLOGY & PATHOGENESIS
171
Natacha Cerny(1), Augusto E Bivona(2), Andres Sanchez Alberti(3), Alejandro C Cardozo
Landaburu(4), Emilio L Malchiodi(5), Silvia I Cazorla(6)
(1)
IDEHU (CONICET-UBA) FFyB; Dto.Cs.Básicas INEDES-UNLu. (2)(3)(4)(5)IDEHU
(CONICET-UBA) FFyB. (6)IMPaM (CONICET-UBA) FMed.
E-mail: [email protected]
Comprender el rol de antígenos parasitarios y su interacción con las células del sistema
inmune, es un paso clave en el diseño de estrategias de tratamiento de la enfermedad de
Chagas, así como de vacunas preventivas y/o terapéuticas contra la infección por T. cruzi.
Seleccionamos y clonamos dos proteínas esenciales en el ciclo de vida del parásito:
Cruzipaína (Cz), principal cisteín proteasa, y su inhibidor, Chagasina (Chg). Siendo
células dendríticas (CD) y macrófagos, importantes en la regulación de la respuesta de
células T frente a la infección por T. cruzi, evaluamos la expresión de moléculas
coestimulatorias en la superficie de estas células presentadoras de antígenos (CPA) en
presencia de las proteínas recombinantes. Observamos un incremento en la expresión de
CD80 y CMH-II en la superficie de CD y de macrófagos peritoneales (MP) de ratones
Balb/C, coincubados con Cz y Chg, respecto a los controles. Este efecto desaparecía
cuando las proteínas eran desnaturalizadas por calor. En los sobrenadantes de MP
incubados con cada una de las proteínas, observamos un incremento significativo en la
producción de óxido nítrico. Similares resultados observamos en presencia de las
proteínas+polimixina. Más importante aún, detectamos un incremento en la producción de
INF-γ e IL-12, pero no así de IL-10, en los sobrenadantes de CPA incubadas
conjuntamente con Cz y Chg(10 μg/ml, de c/u) respecto a aquellas incubadas con las
proteínas en forma individual. Estos resultados sugieren en que la interacción Cz-Chg
esta última podría contribuir, al menos en parte a desviar la respuesta hacia un perfil Th1,
a través de la expresión de citoquinas y moléculas coestimulatorias por CPA. A partir de
estos resultados, evaluamos la capacidad protectiva de la inmunización conjunta de
ratones con Cz+Chg coadyuvadas con CpG. Dicha inmunización redujo la carga
parasitaria en la etapa aguda, así como las enzimas séricas marcadoras de daño tisular
durante la etapa crónica de la infección.
IYP33
EFFECT OF TRYPTOPHAN IN PLACENTAL EXPLANTS INFECTION BY Trypanosoma
cruzi IN VITRO
Maria J Moreira Espinoza(1), Maria F Triquell(2), Cintia M Díaz Lujan(3), Gina Mazzudulli(4),
Mariana Piegari(5), Luciana Mezzano(6), Ricardo E Fretes(7)
(1)(2)(3)(5)(6)
Cell Biology, Histology and Embryology Department-INICSA (CONICET), Faculty
of Medicine School, National University of Cordoba. (4)INICSA (CONICET). (7)Cell Biology,
Histology and Embryology Department-INICSA (CONICET), Faculty of Medicine School,
National University of Cordoba and La Rioja University.
E-mail: [email protected]
Tryptophan (Trp) catabolism participates in the maternal-fetal tolerance through
indoleamine 2,3-dioxigenase (IDO), which is an enzyme strongly expressed in human
placenta. IDO limits the infection of mice experimentally infected with Trypanosoma cruzi.
Objective: To analyze the effect of Trp in the invasion of human placental chorionic villi by
T. cruzi, in-vitro. Methodology: We employed explants of chorionic villi of placentas
IMMUNOLOGY & PATHOGENESIS
172
obtained from normal pregnancies at term (n=4). Women have signed informed consents.
Placental explants were treated with different concentrations (5mg, 10mg, 20mg y 40mg)
of L-Trp and D-Trp (as control), for 3hs and/or infected for 24hs with 150.000 and
1.000.000 trypomastigotes Tulahuen strain of T. cruzi, then culture media were changed.
Placental explants and their respective culture media were analyzed at 72hs using Student
t test, ANOVA and correlation analysis (r). Results: All explants were positive to infection
by T. cruzi detected by PCR and microscopical analysis, but they have distinct parasite
charge (qPCR) with different Trp concentrations. According to western blot and indirect
ELISA, IDO modified its expression at 3hs, but there was not significantly differences
respect to controls in the subsequent times of culture (p>0,05). Parasite viability was
quantified in culture media at 72 hs of cultures with decreased viability respect to controls
(p<0.05). Conclusion: Different concentrations of Trp at the beginning of the invasion of
host cell by T. cruzi do not avoid the infection of placental explants. However, Trp-IDO
system would participate limiting the sustained infection (parasite reproduction) of
placental tissue. These results could explain, at least in part, the low incidence of
congenital Chagas transmission. Grants: FONCyT-PICT 2012-1061, SECyT-UNLaR,
MINCyT-PID (Cba), SECyT-UNC.
Keywords: Trpanosoma cruzi, placenta, indoleamina 2,3-dioxygenasa.
IYP34
ASSESSMENT OF THE VERTICAL ROUTE AS A WAY OF TRANSMISSION OF
Trichinella patagoniensis IN BALB/C MICE WITH LATE PREGNANCY
Fernando A Fariña(1), Mariana Pasqualetti(2), Cardillo Natalia(3), Krivokapich Silvio(4), Rosa
Adrian(5), Ribicich Mabel(6)
(1)
Cátedra de Parasitología y Enfermedades Parasitarias, FCV-UBA/Consejo Nacional de
Investigaciones Científicas y Técnicas. (2)(5)(6)Cátedra de Parasitología y Enfermedades
Parasitarias, FCV-UBA. (3)Cátedra de Parasitología y Enfermedades Parasitarias, FCVUBA/Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET).
(4)
Departamento de Parasitología, INEI, ANLIS, “Dr. Carlos Malbrán”.
E-mail: [email protected]
In Argentina, Trichinella spiralis was for years the only species involved in human and
porcine outbreaks. Krivokapich et. al. in 2008 identified a novel Trichinella’s genotype from
a cougar of the province of Rio Negro: T. patagoniensis. Although horizontal transmission
is the most common route of infection, several authors have shown that vertical
transmission of Trichinella is possible in rats, guinea pigs, mice and ferrets. Moreover,
transplacental transmission is also possible in humans as Dubinsky et al. pointed out in
2001. The aim of the present study is to evaluate the presence of T. patagoniensis larvae
1 (L1) in offsprings belonging to experimentally infected mice in days 15 and 18 of
pregnancy. Twenty 7-week-old Balb/c mice were randomly divided according to the time of
pregnancy in two groups of ten animals each. Group 1: animals infected 15 days after the
appearance of the vaginal plug and Group 2: animals infected 18 days after the
appearance of the vaginal plug. Furthermore, each group were separated into 2 subgroups
of 5 animals which were inoculated per os with 100 and 500 L1 of T. patagoniensis
respectively. The T. patagoniensis isolate used in this study came from a cougar and was
maintained by serial passages in CF1 mice. Euthanasia and artificial digestion technique
IMMUNOLOGY & PATHOGENESIS
173
were performed on day 30 after birth on each offspring and on day 48 after infection in the
dams. There was no evidence of L1 in none of the offspring analysed. Reproductive
capacity index (RCI) mean values in dams of Group 1 were 64,1 ± 27.9 and 126,2 ± 32.1
for 100 and 500 L1 dose respectively while in Group 2 were 90,1 ± 21,2 and 178,7 ± 35,6
for 100 and 500 L1 dose respectively. There was no statistical evidence of a difference
between the RCI mean values in Group 1 and Group 2. The present study suggests that
vertical transmission of T. patagoniensis from infected dams on days 15 and 18 of
pregnancy with a dose of 100 and 500 L1 were not possible.
IYP35
HIDATIDOSIS: TRANSFERENCIA CALOSTRAL DE IGG ANTI EG95
Viviana Randazzo(1), Maria L Gertiser(2), Veronica T Poggio(3), Oscar Jensen(4)
Universidad Nacional del Sur.Catedras Parasitologia clinica-Microbiologia y
Parasitologia. (2)(4)Centro de Investigación en Zoonosis y Enfermedades que afecten la
producción ganadera. Pcia del Chubut. (3)CEVAN-Centro de Virologia Animal- ICT Milstein
-CONICET
.
E-mail: [email protected]
(1)
Introducción: La Echinococcosis quística o hidatidosis es una zoonosis controlable y
cosmopolita causada por cestodes del género Echinococcus. La enfermedad es un
problema para salud pública y ganadera en Argentina. Los Programas de control sanitario
convencionales se aplican desde hace años en las provincias patagónicas de nuestro país
con resultados no alentadores. La incorporación de la vacuna Providean Hidatil EG95(PHEG95) en rumiantes abre nuevos desafíos.Objetivo: Detectar presencia de anticuerpos
anti-EG95 (Ac) transferidos por calostro a corderos nacidos de madres vacunadas con
PH- EG95 determinando en los mismos el tiempo ideal de aplicación de la primera dosis.
Materiales y Métodos:Ovejas Merino vientre se dividieron en M1 y M2 según vacunadas
con una o dos dosis de PH-EG95. Pos-parto, y por 28 días, se extrajo suero y
calostro/leche en cada grupo. Corderos recién nacidos se dividieron en C1 y C2 según
hijos de M1 o M2 extrayéndoseles suero por 90 días. Se determinaron títulos de Ac en
suero/calostro de cada grupo en diferentes tiempos. Resultados: En ningún cordero se
detectó Ac previo a la primera ingestión de calostro observándose un pico en el nivel de
Ac vacunales en las primeras 24 hs posteriores al parto. En todos los animales expuestos
a dos dosis de vacunación los Ac fueron significativamente mayores a una única dosis.
Conclusiones: Los Ac se concentraron significativamente en el calostro de las ovejas pre
parto originándose transferencia efectiva a la cría. Teniendo en cuenta la persistencia en
suero de los Ac vacunales adquiridos por los corderos en forma pasiva, se observa que
sería ideal iniciar la vacunación durante la cuarta semana de vida de las crías de madres
vacunadas. La incorporación de la vacunación con PH-EG95 abre nuevas perspectivas
preventivas, afectando directamente al ciclo de la hidatidosis en un nuevo blanco.