Synchronisation par la nourriture des horloges circadiennes

THESE
Présentée à
L’UNIVERSITE LOUIS PASTEUR de STRASBOURG
FACULTE DES SCIENCES DE LA VIE
En vue de l’obtention du titre de
DOCTEUR D’UNIVERSITE
Neurosciences
par
Céline A. FEILLET
Synchronisation par la nourriture
des horloges circadiennes
centrales et périphériques
Soutenance le 8 Octobre 2007
devant la commission :
Pr. Franck DELAUNAY
Dr. Francis LEVI
Pr. Rémy SCHLICHTER
Pr. Urs ALBRECHT
Dr. Paul PEVET
Dr. Etienne CHALLET
Rapporteur externe
Rapporteur externe
Rapporteur interne
Examinateur
Examinateur
Directeur de thèse
Tous les champignons sont comestibles…
Certains, une fois seulement.
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Remerciements
Je souhaite exprimer toute ma reconnaissance au Dr. Mireille Masson-Pévet, pour m’avoir
accueillie au sein du Laboratoire de Neurobiologie des Rythmes, à l’époque en zoologie.
Merci de m’avoir permis d’y effectuer mon DEA puis ma thèse. C’est un peu grâce à vous
que je suis entrée dans la famille des rythmes biologiques et je vous en remercie. Merci aussi
pour votre soutien et votre franchise. Il est toujours bon de savoir à quoi s’en tenir.
Merci également au Dr. Paul Pévet dont la culture « physiologiste » et le franc parler m’ont
permis de développer un mode de réflexion rapide et pertinente. Devoir défendre et justifier
mes propos scientifiques (et parfois moins scientifiques) au quotidien a grandement contribué
a ma formation doctorale. Merci aussi pour votre soutien lors de la collaboration avec la
Suisse, qui n’aurait probablement pas eu lieu sans vous. J’espère vous retrouver encore dans
les congrès… autour d’une bonne bière bien sûr.
Je remercie vivement les membres de ce jury qui ont eu l’obligeance de s’intéresser à ce
travail et pris la peine de le juger. Le Pr. Rémi Schlichter qui par ses enseignements est à la
base de nombre de mes connaissances en neurosciences. Le Dr. Francis Levy qui est luimême familier avec la question de la restriction alimentaire. Le Dr. Franck Delaunay,
enseignant dans l’université dans laquelle j’ai moi-même étudié et avec qui j’ai eu la chance
d’échanger quelques idées lors de congrès.
Je tiens à remercier tout particulièrement le Pr. Urs Albrecht, qui a accepté d’être
examinateur pour ce travail. Il a contribué à l’encadrement de ma thèse durant les quelques
mois que j’ai passés dans son laboratoire… et c’est avec grand plaisir que nous continuerons
notre collaboration dans quelques mois. Urs, je souhaite vivement qu’elle soit aussi fructueuse
que par le passé et que nos rapports personnels soient toujours ce qu’ils ont été. Merci à toi
pour ton soutien et ta tolérance.
Merci également à Sylviane Gourmelen pour son aide dans chacune des expériences que j’ai
conduites durant ma thèse. Sylviane, tu as des qualités indéniables pour ce qui est des
animaux. Tu as toujours été disponible pour moi, y compris pour des expériences difficiles à
gérer, aussi bien du point de vue des chirurgies que du point de vue de la maintenance
hebdomadaire. Pour avoir pris le temps d’échanger avec moi des ragots et des points de vue
sur des sujets divers et variés, je te remercie. J’espère vivement te revoir dans les prochaines
années.
Je fais un clin d’œil au Dr. Dominique Ciocca qui m’a initiée aux canulations carotidiennes
et a accepté de m’accompagner au quotidien dans une expérience qui n’était pas gagnée
d’avance, et qui s’est même révélée plutôt maudite. Je ne sais pas si nos origines « du sud »
ont contribué à notre entente, mais je sais que nous avons formé une super équipe. Merci
Dom !
Je remercie aussi le Dr. André Malan pour sa disponibilité. Il a su répondre à mes difficultés
statistiques ou informatiques avec célérité et efficacité. Par ailleurs, nos discussions
scientifiques ont été aussi pour moi une source de réflexions très fructueuses.
N’oubliant pas que chacune des personnes du laboratoire a été à mon écoute, a supporté mes
colères, m’a aidée ou épaulée à un moment ou à un autre de ma thèse, je remercie l’ensemble
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des membres du laboratoire de neurobiologie des rythmes, qui ont contribué de près ou de
loin à ce travail.
Aucun remerciement ne serait complet sans un paragraphe sur mon super-viseur bien aimé (et
non pas chef… je sais que tu n’aimes pas que je t’appelle comme ça). Donc un grand merci au
Dr. Etienne Challet qui a encadré ce travail. Etienne, tu as accepté de m’encadrer pour mon
DEA… et tu en as assumé les conséquences sans (trop) râler, malgré mon caractère difficile et
les reproches d’autres personnes. Sans te décourager, tu es ensuite devenu mon directeur de
thèse pour ce qui aura été un marathon de 4 ans : ta culture scientifique sans bornes, ton esprit
critique et la mine d’or de biblio que tu gardes jalousement dans ton bureau sont pour
beaucoup dans le bon déroulement de ma thèse. Arriver avec une question dans ton bureau,
c’est repartir avec 3 articles à lire… tu ne donnes pas seulement les informations pertinentes,
tu obliges à les analyser. Il est difficile de ne pas acquérir un minimum d’esprit scientifique à
ton contact. Pour ce qui est de la pédagogie, c’est une autre affaire ! Nous avons longuement
discuté de mon intérêt pour l’enseignement… et nous étions rarement d’accord sur ce point.
J’étais pour toi trop souvent accaparée par les étudiants, les formations… Mais tu as toujours
respecté mon choix et je t’en remercie. Ce n’est d’ailleurs pas la seule chose que tu as
respectée : mes week-ends à Nice, Paris ou Londres, mes envies de voyages, mes idées
saugrenues en sciences, mon penchant pour les couleurs vives, mes tenues et coiffures
fantaisistes, mes éclats de voix et de caractère… en y repensant, il t’a fallu gérer une
scientifique en herbe, une enseignante acharnée, une femme colérique, une petite fille
capricieuse… tout ça en même temps. Au final, nous nous sommes accordés là-dessus, notre
tandem était un pari risqué, mais nous ne nous en sommes pas trop mal sortis… comme quoi,
des caractères opposés mais complémentaires peuvent être compatibles.
S’il est évident que je ne peux que te remercier pour ton encadrement efficace quand j’étais à
Strasbourg, ton soutien a été encore plus important pour moi lorsque je n’y étais pas. En
entrant en thèse je t’ai dit que je voulais voyager. Qu’à cela ne tienne, six mois plus tard, je
partais à Fribourg pour commencer une collaboration très fructueuse avec Urs. Un an plus
tard, tu m’apprenais que le projet avec le Mexique se concrétisait et que j’y partirais quelques
mois si je le souhaitais… ce que je faisais l’année suivante. Et enfin tu m’as autorisée à
présenter un projet de collaboration avec le Japon, ce qui, tu en avais plus conscience que
moi, allait resserrer le timing pour rendre ma thèse. En bref, tu m’as toujours soutenue dans
mes choix, épaulée au téléphone ou par mail quand, à l’autre bout du monde, j’avais des
doutes sur l’intérêt de ce que je faisais ou que je rencontrais quelques problèmes
relationnels… cela dit, je te soupçonne de m’avoir envoyée à l’étranger à époques régulières
afin de pouvoir souffler un peu face à mon caractère… En tous cas, toutes ces collaborations
ont été de merveilleuses expériences pour moi. Merci de m’avoir permis de vivre ça.
Etienne, je me rends compte, au terme de ces quatre années, combien tu as été présent tout en
me laissant autonome, directif en me laissant la liberté de discuter des protocoles, ferme sans
pour autant être autoritaire, indulgent mais pas laxiste, tu as respecté mes idées sans pour
autant me laisser aller dans le mur, tu m’as encouragée à enseigner alors que tu n’aimais pas
ça toi même… si tu étais moins lunatique tu pourrais être le « chef » parfait… compte sur moi
pour te faire un lettre de recommandation pour les prochains étudiants qui viendront. Je sais
qu’ils ne seront pas déçus du voyage.
Sur un plan plus personnel, nous avons eu l’occasion de partager de multiples discussions :
famille, amis, angoisses, coups de gueule, fou rires, déménagement, travaux, bières… tu as
été plus qu’un super-viseur… j’ai le sentiment d’avoir partagé une tranche de vie avec toi.
Sache que si nous devions collaborer de nouveau à l’avenir, j’en serais ravie, parce que tu as
des qualités indéniables… et que je connais et j’ai appris à faire avec tes défauts. Merci
Etienne.
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Si le soutien des personnes avec lesquelles j’ai collaboré durant ma thèse a été important pour
ma réussite, ma famille et mes proches l’ont été bien davantage.
Ma première pensée va à mes parents, qui m’ont épaulée, tant moralement que
financièrement au cours de ces 28 années.
Papa, tu m’as enseigné ce que le « savoir être » signifiait… depuis mon plus jeune âge, tu as
encouragé mon esprit de compétition, d’abord dans le sport puis dans les études, peut-être
parfois trop, et ma personnalité actuelle est probablement l’émanation de tes 28 années
d’éducation. Tu m’as encouragée depuis le début dans le choix difficile que j’avais fait de
quitter Nice et les miens. Tu avais confiance en ma réussite… d’autant plus que la ville qui
allait m’accueillir, tu y avais étudié toi-même 30 ans auparavant. Tu m’as assurée de ton
soutien, souvent dans l’ombre, mais nos discussions téléphoniques dans les moments les plus
difficiles ne m’ont laissé aucun doute quant au fait que tu suivais mon parcours, souvent par
l’intermédiaire de maman, plus prompte à saisir le combiné téléphonique lorsque le moindre
nuage se profilait à l’horizon. Nos conversations philosophiques lors de mes retours à Nice,
les stages de ski et notre voyage au Mexique m’accompagnent toujours comme autant de bons
moments passés… Merci Papa.
Mum, I hear you complaining seeing that my father came first in my « thanks », But you are
to be blamed as much as him for my current situation : you were ready to listen to me every
single day, for moral as well as for physical problems, you have always been like a security
blanket a baby carries around everywhere. Even if you sometimes pay for the spitefulness of
others, you welcome (most of the time) my bad moods with kindness and reassuring words…
but you were also here to listen to every day’s ordinary events, and this availability is even
more important for me than that of hard times. If my interest in Biology does not originate
from your education, you are probably responsible for my knowledge in English, partly
because you taught me that language very early, and partly because you incited me to
practice, sometimes with you, during our multiple shopping week ends in London. I am happy
to be finaly able to thank you for that… and also for the rest… everything. Thank you.
A tous les deux un grand merci d’avoir été toujours là... cette thèse est aussi un peu la votre !
Merci à toute ma famille, de sang ou non : Mamy, Ma, Néné, Nicole, Roger et tous les autres
qui m’ont soutenue et ont cru en mes capacités à réussir. Je vous embrasse tous.
Merci à Nary et Alain pour m’avoir acceptée dans leur cercle familial. Vous êtes un peu à
l’origine de mon choix de faire une thèse, puisque vous-mêmes aviez vécu cette expérience et
m’avez encouragée à faire de même. Merci pour les discussions sur des sujets divers et variés,
du cinéma aux aléas de la recherche et pour votre soutien inconditionnel.
Merci à Gérard et Marie-Jeanne, mes « parents » Alsaciens, d’abord pour m’avoir accueillie
sans conditions et intégrée à leur cercle de connaissances afin que la solitude ne me pèse pas
trop. Merci pour votre disponibilité et votre amitié. Par contre, je ne remercie pas MarieJeanne de m’avoir fait prendre ma première cuite… et d’autres après ça… même si nous
avons bien ri à ce sujet depuis ! Je souhaite vivement qu’après mon départ, nous puissions
continuer à manger (et boire) ensembles comme nous l’avons fait ces dernières années, même
si les rencontres seront probablement plus espacées. A tous les deux (et à vos deux monstres)
merci.
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Un moral au beau fixe étant essentiel à la réussite humaine d’une thèse, je souhaite associer à
ce travail tous mes amis, qui ont grandement contribué à cette thèse par leur écoute et leur
disponibilité.
Merci donc à Titi (mon choupinet belge), Narc (le plus coquin d’entre nous), Nico et Anne
(maintenant indissociables), Dams (le tombeur au grand cœur… toujours pas marié), Géry et
Fanny (les plus raisonnables… enfin, depuis l’enterrement de « la boite »), Adrien (discret,
mais toujours là dans les grands moments), Olivier (Eolh, mon bien aimé, l’autre thésard de
la bande), Camille et Yohann (qui ont toujours fait l’effort de venir à nos soirées malgré des
emplois du temps difficiles), Sylvie et Anthony (expatriés à Paris, mais toujours dans nos
pensées), et même à Laurent et Sma (parce que leurs facéties alimentent nos
conversations)… donc à tous les niçois un grand merci pour les soirées, les vacances (à la
montagne et au ski), les coups de téléphone, les fêtes… merci pour le bonne humeur que vous
m’avez apportée au quotidien, pour les bouffées d’air en votre compagnie… 10 ans déjà… je
souhaite que ça ne s’arrête jamais !
D’autres ont contribué à mon équilibre mental (ou à conserver mon déséquilibre)… je pense
bien sûr aux Anastasiens, qui pour la plupart sont devenus plus que des partenaires de jeux de
rôles. Merci donc à Kogh, Maika et Vince, les belges du groupe qui m’ont accueillie à bras
ouverts dans leur équipe et leur maison… Merci à Seb et Méli que je connais de mieux en
mieux depuis mon séjour en Suisse et que j’espère revoir plus souvent dès l’année
prochaine… Merci à Ellias et Titine pour tous les bons moments… Je n’oublie pas Fengus,
mon frère d’armure, humour décalé et délires à gogo sont sa devise… enfin, Axel, Taline,
Blackrider, Adon, Zadar, Nadram, Wark… vous me manquez tous… à très bientôt
j’espère.
Un grand clin d’œil à Audrey et Laétitia, mes amies de longue date, ainsi qu’à leurs maris.
Si la disponibilité de mes amis d’ailleurs a été déterminante, la présence de ceux de
Strasbourg m’a permis de partager mes doutes au quotidien. J’ai une douce pensée pour
R2D2, à la fois ma voisine, ma secrétaire et ma partenaire du jeudi soir, pour Ben (sans
commentaires, ce serait trop long), Steeve (trop beau pour être vrai), Laurent (toujours une
bonne blague), Anne (franche et vraie), Zeina (pour toutes nos conversations), Virginie
(statutaire co-optée), ainsi qu’à Sandrine, Jorge, Corina, Domitille, Elodie, Emma,
Anthony, Emeline, VJ… et bien d’autres qui m’ont aidée dans les moments les plus durs et
avec qui nous avons partagé de nombreuses soirées. Merci à tous.
J’ai une pensée pour ceux qui m’ont accueillie dans leur cercle d’amis lors de mes voyages :
Mary-Carmen, Roberto, Katia, Manuel, Yareli, Oscar (au Mexique), Nath, Sandra, Hélène,
Camille, Giuseppe, Cippola, Mathieu, Guillaume, Manu, Steeve, Corine, Isa, Gabi, Guru,
Sonia… (à Fribourg).
Je souhaite que les nouveaux arrivants au labo profitent autant que moi de leur thèse. Un
coucou à Marc, Laurent, Matei, Lyne, Marilyne, Maya, Julien, Laura, Nadia… Bonne chance
à vous tous.
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Enfin, parce qu’il est des personnes qui comptent au-delà du travail, des amis et de la famille
puisqu’elles partagent tout cela à la fois, j’embrasse tendrement mon petit Mikha.
Mikha, durant toutes ces années que nous avons passées ensembles tu m’as soutenue et m’as
apporté ton amour au quotidien. Nous avons fait le pari risqué de mettre 200, puis 1000 km
entre nous alors que notre relation était encore fraîche. Nous aurions pu ne jamais nous
retrouver, mais avons su évoluer en parallèle durant ces années. Puis tu as pris la décision de
venir vivre avec moi à Strasbourg, loin des tiens, après plusieurs années passées à distance.
Notre pari est réussi je crois !
Ta gentillesse t’a permis de supporter depuis des années mon caractère dominateur et tu as
appris à me dompter tout en me laissant croire que je décide de tout. Tu m’offres un oreille
attentive chaque soir quand je te raconte les fou rires et les coups de gueule du jour au labo…
je crois que tu pourrais soutenir ma thèse à ma place tant tu as entendu parler d’horloge
alimentaire ces 5 dernières années. Si tes attentions sont quotidiennes depuis longtemps, tu as
été encore plus prévenant et disponible ces derniers mois, et tu as épongé mes coups de gueule
et coups de blues sans râler afin de rendre ma fin de thèse plus facile. Tu m’as suivie dans
nombre de mes délires, a réparé nombre de mes erreurs, accepté mes défauts… Je t’aime.
Maintenant, nous pouvons enfin souffler et partir pour le voyage de notre vie… je vais tâcher
de te bichonner autant que tu l’as fait pour moi…
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REMERCIEMENTS ....................................................................................................... 2
Abréviations ..................................................................................................................... 12
CHAPITRE 1 INTRODUCTION................................................................................ 15
I. Généralités............................................................................................................... 17
1. Historique : découverte des horloges. .............................................................................. 17
2. Intérêts écologiques des horloges..................................................................................... 17
3. Qu’est ce qu’une horloge ?............................................................................................... 18
3.1. Définitions................................................................................................................. 18
3.2. Horloge ou oscillateur ? ............................................................................................ 18
4. Horloges circadiennes. ..................................................................................................... 19
II. Une horloge principale : les noyaux suprachiasmatiques de
l’hypothalamus............................................................................................................... 19
1. Historique. ........................................................................................................................ 19
1.1. Approche lésionnelle................................................................................................. 19
1.2. Localisation. .............................................................................................................. 20
2. Réception du message circadien. ..................................................................................... 21
2.1. Les voies d’entrée...................................................................................................... 22
2.1.1. Rétine. ................................................................................................................ 22
2.1.2. Feuillets inter-géniculés thalamiques (IGL)....................................................... 22
2.1.3. Raphé.................................................................................................................. 22
2.1.4. Des récepteurs. ................................................................................................... 23
2.1.4.1. Récepteurs à la mélatonine.......................................................................... 23
2.1.4.2. Récepteurs métaboliques............................................................................. 23
3. Intégration du message circadien. .................................................................................... 24
3.1. Les rythmes en absence de synchroniseur................................................................. 24
3.2. Comment savoir si un message a été intégré ?.......................................................... 24
3.3. Intégration du message photique............................................................................... 25
3.3.1. Synchronisation par la lumière........................................................................... 25
3.3.2. Créneau de lumière............................................................................................. 26
3.3.3. Décalage horaire................................................................................................. 26
3.4. Synchronisation non photique................................................................................... 27
3.4.1. Mélatonine.......................................................................................................... 27
3.4.2. Pharmacologie.................................................................................................... 28
3.4.3. Comportement.................................................................................................... 28
3.4.4. Nourriture. .......................................................................................................... 29
3.5. Limites de l’entraînement.......................................................................................... 31
4. Elaboration du message circadien. ................................................................................... 32
4.1. Origine moléculaire : les gènes horloges. ................................................................. 32
4.1.1. Boucle positive................................................................................................... 32
4.1.2. Boucle négative. ................................................................................................. 32
4.1.2.1. Les gènes Per et Cry.................................................................................... 32
4.1.2.2. Mutants simples........................................................................................... 33
4.1.2.3. Doubles mutants.......................................................................................... 34
4.1.2.4. Triples mutants............................................................................................ 34
7
4.1.3. Boucles intermédiaires. ...................................................................................... 34
4.1.3.1. Rev-erb. ....................................................................................................... 34
4.1.3.2. Ror............................................................................................................... 35
4.1.4. D’autres partenaires possibles ? ......................................................................... 35
4.1.4.1. Tim. ............................................................................................................. 35
4.1.4.2. DEC............................................................................................................. 35
4.1.5. Régulations pré et post traductionnelles............................................................. 36
4.2. Modèle moléculaire................................................................................................... 36
5. Distribution du message circadien. .................................................................................. 37
5.1. Puissance des SCN. ................................................................................................... 37
5.2. Sorties moléculaires (CCG = Clock Controlled Genes)............................................ 38
5.2.1. AVP. ................................................................................................................... 38
5.2.2. DBP. ................................................................................................................... 38
5.3. Neurotransmetteurs, neuropeptides, peptides............................................................ 38
5.3.1. Neurotransmetteurs. ........................................................................................... 38
5.3.2. Neuropeptides..................................................................................................... 39
5.3.2.1. VIP .............................................................................................................. 39
5.3.2.2. Autres .......................................................................................................... 39
5.3.3. Peptides .............................................................................................................. 39
5.3.3.1. TGF. ............................................................................................................ 39
5.3.3.2. PK2.............................................................................................................. 39
5.3.3.3. CLC. ............................................................................................................ 40
5.3.4. Régionalisation des SCN.................................................................................... 40
5.4. Relation gènes horloges / comportement. ................................................................. 41
5.4.1. Réponse photique. .............................................................................................. 41
5.4.1.1. Créneau de lumière...................................................................................... 41
5.4.2. Réponse non photique. ....................................................................................... 41
5.4.2.1. Mélatonine................................................................................................... 41
5.4.2.2. Hyperactivité transitoire.............................................................................. 42
5.4.2.3. Nourriture. ................................................................................................... 42
5.5. Activité électrique. .................................................................................................... 43
5.6. Projections nerveuses. ............................................................................................... 43
5.7. Sorties physiologiques............................................................................................... 44
5.7.1. Mélatonine.......................................................................................................... 44
5.7.2. Corticostérone. ................................................................................................... 45
5.7.3. Glucose et autres métabolites plasmatiques. ...................................................... 46
5.7.4. Température. ...................................................................................................... 47
5.8. Sorties comportementales. ........................................................................................ 47
III. D’autres horloges circadiennes ?......................................................... 48
1. Horloges cellulaires.......................................................................................................... 49
1.1. Elaboration du message : expression des gènes horloges dans toutes les cellules.... 49
1.2. Réception / intégration. ............................................................................................. 50
1.3. Distribution du message. ........................................................................................... 50
2. Horloges tissulaires périphériques ?................................................................................. 51
2.1. Foie, rein, poumon. ................................................................................................... 51
2.2. Glandes surrénales..................................................................................................... 52
2.3. Rétine. ....................................................................................................................... 53
2.3.1. Réception et distribution d’un message ............................................................. 53
2.3.2. Elaboration d’un message rythmique. ................................................................ 53
8
3. Horloges tissulaires centrales. .......................................................................................... 54
3.1. Horloges ou oscillateurs esclaves des SCN ?............................................................ 54
3.2. Les bulbes olfactifs.................................................................................................... 54
IV. Une autre horloge putative : l’horloge alimentaire. ............. 55
1. Historique. ........................................................................................................................ 55
2. Mise en évidence.............................................................................................................. 55
2.1. Rat et souris............................................................................................................... 55
3. Distribution d’un message circadien : sorties. ................................................................. 56
3.1. Activité locomotrice (FAA) ...................................................................................... 57
3.1.1. Expérience de jeûne. .......................................................................................... 57
3.2. Boisson ...................................................................................................................... 58
3.3. Autres sorties comportementales. ............................................................................. 58
3.4. Température (FAT) ................................................................................................... 59
3.5. Corticostérone (FAC) ................................................................................................ 59
3.6. Leptine et ghréline..................................................................................................... 60
3.7. Paramètres métaboliques........................................................................................... 61
4. Réception d’un synchroniseur ? ....................................................................................... 62
4.1. Non photique. ............................................................................................................ 62
4.1.1. Disponibilité alimentaire. ................................................................................... 62
4.1.2. Anticipation d’un apport en sel. ......................................................................... 63
4.1.3. Anticipation d’un seul nutriment........................................................................ 63
4.1.4. Repas appétitifs .................................................................................................. 64
4.1.5. Eau...................................................................................................................... 64
4.1.6. Pharmacologie.................................................................................................... 65
4.2. Photique..................................................................................................................... 65
5. A la frontière entre réception et distribution : Connectique de l’horloge alimentaire. .... 66
5.1. Systèmes de neurotransmetteurs et neuropeptides .................................................... 66
5.1.1. Le système glutamatergique............................................................................... 66
5.1.2. Le système dopaminergique............................................................................... 66
5.1.3. Le système noradrénergique............................................................................... 67
5.1.4. Le système histaminergique. .............................................................................. 68
5.1.5. Le système opioïdergique................................................................................... 68
5.1.6. Le système orexinergique................................................................................... 69
6. Intégration des synchroniseurs. ........................................................................................ 71
6.1. Décalage horaire de l’accès à la nourriture. .............................................................. 71
6.2. Limites de l’entraînement.......................................................................................... 72
7. Fonctionnement de l’horloge alimentaire : élaboration du message rythmique ?............ 73
7.1. Des gènes horloges ? ................................................................................................. 73
7.2. Les KO pour les gènes horloges................................................................................ 74
7.2.1. Clock................................................................................................................... 74
7.2.2. Npas.................................................................................................................... 75
7.2.2.1. KO Npas...................................................................................................... 76
7.2.2.2. Npas2, un remplaçant possible pour Clock................................................. 76
7.2.3. Cry...................................................................................................................... 77
8. Une nouvelle horloge centrale : l’horloge alimentaire..................................................... 78
9. Localisation de l’horloge alimentaire............................................................................... 79
9.1. Système nerveux central vs périphérique.................................................................. 79
9.1.1. Le foie, le pancréas............................................................................................. 79
9.1.2. Le système digestif dans son ensemble.............................................................. 80
9
9.2. Approche lésionnelle................................................................................................. 81
9.2.1. Bulbes olfactifs................................................................................................... 81
9.2.2. Structures hypothalamiques et thalamiques. ...................................................... 81
9.2.2.1. Hypothalamus ventromédial (VMH). ......................................................... 81
9.2.2.2. L’aire hypothalamique latérale (LH)........................................................... 82
9.2.2.3. Noyaux paraventriculaires hypothalamiques (PVN)................................... 82
9.2.2.4. Noyau arqué (Arc)....................................................................................... 83
9.2.2.5. Noyaux hypothalamiques dorsomédiaux (DMH). ...................................... 84
9.2.2.6. Noyau paraventriculaire thalamique (PVT). ............................................... 85
9.2.3. Système limbique. .............................................................................................. 85
9.3. Tronc cérébral ........................................................................................................... 87
9.3.1. Influence sur une seule sortie. ............................................................................ 88
9.3.1.1. Hypophyse................................................................................................... 88
9.3.1.2. Cortex infralimbique. .................................................................................. 88
9.4. Autres structures........................................................................................................ 89
9.5. Un réseau de plusieurs structures. ............................................................................. 89
CHAPITRE 2 OBJECTIFS DE MON TRAVAIL DE THESE................................... 91
CHAPITRE 3 RESULTATS ...................................................................................... 95
I. Timed hypocaloric feeding and melatonin synchronize the
suprachiasmatic clockwork in rats, but with opposite timing of
behavioral output. ...................................................................................................... 97
II. Modifications of local cerebral glucose utilization during
circadian food anticipatory activity........................................................ 108
III. Restricted feeding in SCN-lesioned rats restores daily
rhythms not only of locomotor activity but also of pineal
melatonin: role of corticosterone?.............................................................. 117
IV. Lack of Food Anticipation in Per2 Mutant Mice. ....................... 138
V. Forebrain oscillators ticking with different clock hands.153
CHAPITRE 4 DISCUSSION GENERALE................................................................187
I. Intégration du synchroniseur alimentaire ........................................ 189
1. Interprétation par les SCN du synchroniseur alimentaire. ............................................. 189
2. Intégration du message de synchronisation alimentaire hors SCN. ............................... 191
II. Mécanismes moléculaires de la synchronisation alimentaire
................................................................................................................................................ 194
1. Les souris mutantes : outil privilégié pour l’étude de la synchronisation alimentaire... 194
1.1. Les mutants Npas2 et Clock. ................................................................................... 195
1.2. Les mutants Cry ...................................................................................................... 197
1.3. Nécessité de standardiser l’étude des mutants. ....................................................... 198
1.4. Mutants Per. ............................................................................................................ 200
III. De l’importance des sorties de l’horloge alimentaire ...... 202
10
1. La mélatonine................................................................................................................. 202
2. La corticostérone. ........................................................................................................... 206
IV. Substrat anatomique de l’horloge alimentaire ............................ 206
1. La glande surrénale. ....................................................................................................... 207
2. Une approche innovante pour découvrir la localisation de l’horloge alimentaire. ........ 207
3. PER2, une protéine clé pour la recherche de l’horloge alimentaire............................... 209
4. Un modèle de réseau pour la synchronisation alimentaire............................................. 210
V. Nécessité d’une horloge chef d’orchestre : Synchronisation
alimentaire versus Horloge alimentaire................................................... 212
CHAPITRE 5 PERSPECTIVES...............................................................................215
I. Implication de Per1 dans la synchronisation alimentaire .... 217
II. A la recherche du substrat anatomique de l’horloge
alimentaire ..................................................................................................................... 217
1. Horloge centrale ou périphérique ? ................................................................................ 217
2. Restauration de fonction dans le système nerveux central............................................. 218
III. Utilisation de souris exprimant un gène rapporteur.......... 218
CHAPITRE 6 REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES...............................................221
CHAPITRE 7 ANNEXES..........................................................................................237
11
Abréviations
2-DG : 2-désoxyglucose
DMH : noyaux hypothalamiques
3V : troisième ventricule
dorsomédiaux
AA-NAT : Aryl-Alkylamine N-Acétyl
dmSCN : SCN dorsomédial
Transférase
dST : striatum dorsal
ACTH : Adreno corticotropic hormone =
EGF : Epidermal growth factor
Hormone corticotrope
FAA : Food anticipatory activity = activité
ANOVA : Analyse de la variance
anticipatoire de la prise alimentaire
a.u. : Unité arbitraire
FAC : Food anticipatory corticosterone = pic
Arc : noyau arqué
anticipatoire de corticostérone
ARNm : ARN messager
FAT : Food anticipatory thermogenesis =
AVP : Arginine vasopressine
thermogenèse anticipant la prise alimentaire
AP : area postrema
FEC : Food entrainable clock : horloge
aPirC : cortex piriforme antérieur
alimentaire
bHLH : basic helix loop helix
FEO : food entrainable oscillator : oscillateur
BLA : amygdale basolatérale
alimentaire
Bmal1/BMAL1 : Brain and muscle ARN-t like
GABA : acide γ-amino-butyrique
protein 1
GD : gyrus denté
BNST : noyau du lit de la strie terminale
GH : growth hormone = hormone de
CA : corne d’ammon
croissance
CCG : clock-controlled gene = gène contrôlé
GHT : geniculo-hypothalamic tract = tractus
par l’horloge
géniculo-hypothalamique
CEA : amygdale centrale
GLU : glutamate
CKI : Caséine kinase I
GRE : glucocorticoid responsive element
Clock/ Clk/CLOCK : Circadian locomotor
GRP : Gastrin releasing peptide
output cycles kaput
h : heures
CO : chiasma optique
KO : knock out
CRH : Corticotropin Releasing Hormone =
IGL : feuillets inter-géniculés
cortico-libérine
IML : colonne intermédio-latérale de la moelle
Cry/CRY : cryptochrome
épinière
CT : circadian time = temps circadien
LD : Light-Dark = Alterance du jour et de la
DBP : Albumin gene D-site binding protein
nuit
DD : Dark-Dark = obscurité constante
LH : Aire hypothalamique latérale
DEC : Differentially expressed chondrocytes
LL : light/light = lumière constante
protein
LUC : luciférase
DIT : Diet induced thermogenesis =
µm : micromètres
thermogenèse induite par la prise alimentaire
MPN : noyau préoptique médian
12
Npas/NPAS : Neuronal PAS
RORE : REV-ERB/ROR Response element
NPB : noyau parabrachial
Ror/ROR : Retinoic acid-related orphan
NPY : Neuropeptide Y
receptor
NRD : noyau du raphé dorsal
SCN : Noyaux suprachiasmatiques
NRM : noyau du raphé médian
SNS : Système nerveux sympathique
NTS : noyau du tractus solitaire
SUMO : Small ubiquitin-related modifier
PAS : Period-Arnt-sim
protein
Per/PER : Period
Tim : timeless
PK2 : Prokineticine 2
TGF : Transforming growth factor
PVN : noyaux paraventriculaires
TSH : Hormone stimulant la thyroïde
hypothalamiques
VIP : vasoactive intestinal peptide
PVT : noyau paraventriculaire thalamique
vlSCN : SCN ventrolatéral
RC : restriction calorique
VMH : Noyaux hypothalamiques
Rev-erb/REV-ERB : reverse viral
ventromédiaux
erythroblastis oncogene product
WT : wild type = sauvage
RF : restricted feeding = restriction temporelle
ZT : Zeitgeber Time
RHT : retino-hypothalamic tract = Tractus
rétinohypothalamique
13
14
CHAPITRE 1
INTRODUCTION
16
I. Généralités.
1. Historique : découverte des horloges.
Depuis des millénaires, l’omniprésence des phénomènes rythmiques a conduit à de
nombreuses observations et corrélations. Force nous est de constater que notre vie est rythmée
par les battements de notre cœur, notre rythme de veille/sommeil ou l’alternance de périodes
de vigilance accrue ou diminuée.
La première description écrite de rythmes journaliers date de 325 avant J.C. où Androsthènes
Thasius exposait les mouvements journaliers des feuilles de Tamarindus indicus.
Mais c’est en 1729 que l’astronome français De Mairan publie des observations cruciales pour
la chronobiologie : La Sensitive (Mimosa pudica) présente des mouvements d’ouverture (le
matin) et de repli (le soir) de ses feuilles qui sont indépendants du cycle jour/nuit (LD)
puisqu’ils persistent en obscurité constante (DD).
Une autre observation cruciale fut réalisée par le botaniste français De Candolle au 19e siècle
(1832) : il constata que la période des plantes placées en lumière constante (LL) différait
légèrement de 24 heures.
Ces travaux pionniers ont ouvert la voie à toutes les recherches actuelles en chronobiologie.
Ils ont en effet attiré l’attention sur le fait que nombre de phénomènes rythmiques ne suivent
pas passivement l’alternance du jour et de la nuit, mais persistent en l’absence de repères
temporels.
2. Intérêts écologiques des horloges.
Les organismes vivant à la surface de la Terre n’évoluent généralement pas en conditions
constantes. Plantes et animaux sont exposés à des variations journalières et saisonnières de
l’environnement et montrent des changements internes dynamiques en réponse à ces
fluctuations externes. Ces variations sont la conséquence :
- de la rotation de la Terre autour de son axe qui occasionne une alternance du jour et de
la nuit.
- de la rotation de la Terre autour du soleil qui crée des modifications saisonnières de la
durée du jour et de la température sous nos latitudes, des saisons sèches et pluvieuses
dans les régions plus tropicales.
Ces changements dynamiques de l’environnement sont rythmiques et donc prévisibles pourvu
que l’organisme possède un système adapté d’estimation du temps. Ce système, ce sont les
horloges. Elles permettent, en fournissant une estimation absolue du temps, d’anticiper les
changements de l’environnement, et de préparer ainsi l’organisme à ces modifications en
initiant des processus cellulaires et physiologiques avant que leur fonctionnement soit requis.
Quand ils deviennent nécessaires, ils fonctionnent déjà de manière optimale ; il n’y a donc pas
de délai entre la demande et l’offre.
17
Du point de vue évolutif, si l’on considère qu’une caractéristique présentant un avantage pour
la survie de l’organisme a de fortes probabilités d’être transmise et reprise dans l’évolution, il
est probable que les horloges aient un intérêt non négligeable : on les retrouve en effet dans la
grande majorité des espèces étudiées jusqu’ici, des Cyanobactéries aux Mammifères en
passant par les Champignons, les Plantes, les Insectes, les Poissons, les Reptiles et les
Oiseaux.
Cependant, même s’il serait intéressant d’effectuer une étude extensive des horloges chez ces
différents organismes, notre propos se limitera ici aux Mammifères et plus particulièrement au
Rongeurs. Même si l’on garde à l’esprit que des mécanismes voisins ou divergents existent
dans d’autres embranchements, ils ne seront pas exposés ici.
3. Qu’est ce qu’une horloge ?
Il est important, avant toute considération expérimentale, de définir ce que l’on entend par le
terme d’horloge. La première caractéristique, qui est elle même à l’origine du terme
d’horloge, est l’endogénicité du rythme : cela signifie que le rythme observé quel qu’il soit,
doit persister en conditions constantes, c’est à dire en l’absence de tout repère temporel.
3.1. Définitions
Dans les études qui vont suivre, nous nous placerons dans un cadre plus contraignant encore :
Pour pouvoir considérer un système comme étant une horloge, celui-ci devra répondre à 4
critères :
- Une horloge génère de manière endogène des oscillations auto entretenues : en
l’absence de synchroniseurs, le fonctionnement de l’horloge putative est encore
mesurable, selon une période stable et persistante nommée « période de libre
cours ».
- Une horloge est capable de percevoir des informations relatives à un ou plusieurs
stimuli.
- Une horloge peut intégrer ces informations. Le stimulus va alors influencer,
synchroniser le système. Dans ce cas, le rythme endogène sera couplé au zeitgeber
(de l’allemand « donneur de temps ») de sorte que leurs oscillations auront la
même période. Cette synchronisation ne doit être possible que dans un domaine
limité de fréquences d’entraînement, en général voisines de la fréquence endogène
de l’horloge.
- Une horloge distribue un message rythmique à une ou plusieurs sorties. Ces
sorties sont mesurables et ont la même période que l’entité qui les contrôle.
3.2. Horloge ou oscillateur ?
Les systèmes amenant des oscillations :
- Auto entretenues mais indépendantes de l’environnement (pacemakers).
- Dépendantes d’un autre système (esclaves).
18
- Caractérisées par une amplitude décroissante en absence de zeitgeber (amorties).
Ne répondent pas aux critères avancés pour des horloges. Ces systèmes seront considérés
comme des oscillateurs jusqu’à ce que preuve soit faite de leur nature d’horloge.
4. Horloges circadiennes.
Tout comme les ondes électromagnétiques, les rythmes biologiques ont un très large spectre
de fréquences, allant de 100 Hertz pour les décharges neuronales à 10-9 Hertz (30 ans) pour
les très longs cycles des populations.
Les rythmes sont ainsi classés en 3 catégories, selon leur période :
- Période très inférieure à 24 heures : rythme ultradien. Exemples : décharges
neuronales, battements cardiaques.
- Période voisine de 24 heures : rythme circadien (du latin circa : environ et dies :
un jour). Exemples : activité locomotrice, température, sécrétion d’hormones.
- Période très supérieure à 24 heures : rythme infradien. Exemples : mues
saisonnières, hibernation.
Ces rythmes peuvent être ou non sous contrôle d’une horloge. S’ils sont les sorties d’une
horloge, cette horloge pourra être synchronisée par divers paramètres environnementaux,
comme l’alternance du jour et de la nuit (rythmes circadiens), des saisons (rythmes
saisonniers, circannuels) ou des lunes (circa-lunaires). S’ils ne sont pas contrôlés par une
horloge, ils seront alors des réactions passives à des paramètres extérieurs. En l’absence du
stimulus environnemental, ils disparaîtront. Notre cadre d’étude se limitera à des rythmes
circadiens soumis au contrôle d’une horloge. Il ne sera plus fait référence aux autres types de
rythmes.
II. Une
horloge
principale :
suprachiasmatiques de l’hypothalamus.
les
noyaux
1. Historique.
1.1. Approche lésionnelle.
A l’instar d’un grand nombre de structures cérébrales, l’identification de l’horloge circadienne
des Mammifères résulte d’une approche lésionnelle. En 1972, Stephan et Zucker ainsi que
Moore et Eichler démontrent respectivement que la lésion d’une seule structure
hypothalamique paire est suffisante pour induire une perte du rythme d’activité locomotrice
et du rythme de sécrétion de corticostérone.
19
Témoin
Jours
Heure du jour
Lésion des noyaux suprachiasmatiques de l’hypothalamus
Jours
Heure du jour
Figure 1 : Expérience de lésions : l’ablation d’une structure hypothalamique abolit les rythmes
d’activité locomotrice.
Actogrammes d’un rat placé en obscurité constante. Les périodes d’activité sont représentées par des
barres noires. Les actogrammes sont en double représentation, c’est à dire que le 2e jour est représenté
à la fois sur la première ligne et la seconde ligne. Après lésion, l’activité locomotrice ne présente plus
de rythmicité circadienne.
(Adapté de Stephan et Zucker, 1972)
1.2. Localisation.
Cette structure paire composée d’environ 16000 neurones chez le rat se trouve dans
l’hypothalamus, de part et d’autre du 3e ventricule, juste au dessus du chiasma optique ce qui
lui a valu son nom : les noyaux suprachiasmatiques (SCN). Ils sont organisés en un réseau
très dense de petits neurones. Chez le rat, ils mesurent 400 µm de haut, 425 µm de large et
900 µm de longueur rostro-caudale (Van den Pol, 1980).
20
3V
Chiasma optique
CO
SCN
Figure 2 : Localisation des noyaux suprachiasmatiques chez la souris.
Coupe coronale d’un cerveau de souris représentant la position des SCN (en rouge) au dessus du
chiasma optique (CO) en gris. L’encart représente une section agrandie des SCN après coloration au
violet de crésyl. 3V = troisième ventricule.
(Adapté de Paxinos et Franklin, 2001)
Depuis ces études, il a été démontré chez de nombreuses espèces de Mammifères que les SCN
sont le siège d’une horloge circadienne qui contrôle un grand nombre de fonctions
physiologiques et comportementales. A ce titre, les SCN sont une horloge tissulaire autoentretenue capable de recevoir, d’intégrer, de générer et de distribuer un message
circadien.
2. Réception du message circadien.
Afin de pouvoir intégrer les différentes informations de l’environnement, les SCN sont reliés
à une multitude de voies nerveuses afférentes, transportant des messages variés dont
l’intégration conduira à la synchronisation de l’horloge.
21
2.1. Les voies d’entrée.
En se basant sur les voies afférentes au SCN ventrolatéral, il semblerait que cette partie soit
un relais d’intégration des voies afférentes aux SCN. Les neurones à VIP (peptide intestinal
vasoactif), majoritaires dans cette partie des SCN reçoivent ainsi 3 projections nerveuses
principales :
2.1.1. Rétine.
Les informations sur l’irradiance circadiennes sont perçues par un photopigment spécifique, la
mélanopsine, au niveau de certaines cellules ganglionnaires (Provencio et al., 1998 ; Panda et
al., 2002 ; Ruby et al., 2002 ; Semo et al., 2003). Le tractus rétino-hypothalamique (RHT)
achemine ensuite ces informations aux SCN ainsi qu’à d’autres aires cérébrales. Ces
projections sont glutamatergiques. Elles sont les plus importantes pour les SCN du point de
vue de la synchronisation.
2.1.2. Feuillets inter-géniculés thalamiques (IGL).
La deuxième voie d’entrée des informations lumineuses vers les SCN est indirecte : ce sont
les projections des feuillets inter-géniculés vers la partie ventrolatérale des SCN via le tractus
géniculo-hypothalamique. Cette voie libère essentiellement du neuropeptide Y (NPY). Il
semble que l’un des rôles de cette voie soit de moduler les informations photiques arrivant
aux SCN, sachant que SCN et IGL sont innervés par les mêmes groupes de cellules
ganglionnaires. Il a en outre été établi que le tractus géniculo-hypothalamique pouvait
véhiculer des informations non photiques vers les SCN (Harrington, 1997).
2.1.3. Raphé.
Les projections sérotonergiques depuis le raphé médian sont la troisième voie d’entrée
directe vers les SCN. Une autre projection, indirecte celle-ci, arrive du raphé dorsal via les
IGL. Il est important de noter qu’une atteinte au système sérotonergique, par application
d’agonistes ou déplétion chimique par exemple, affecte les caractéristiques des rythmes
d’activité locomotrice en LD et en DD (Van Esseveldt et al., 2000).
22
GHT
IGL
SCN
Rétine
NRD
RHT
NRM
Figure 3 : Principales voies afférentes aux SCN.
Les flèches orange et bleu foncé représentent les voies convoyant des informations lumineuses
(photiques) et non photiques respectivement.
NRD : noyau du raphé dorsal; IGL : feuillets inter-géniculés; GHT : tractus géniculo-hypothalamique;
NRM : noyau du raphé médian; RHT : tractus rétino-hypothalamique ; SCN : noyaux
suprachiasmatiques.
2.1.4. Des récepteurs.
Outre des projections nerveuses, les SCN possèdent un ensemble de récepteurs leur
permettant de recevoir des informations hormonales.
2.1.4.1. Récepteurs à la mélatonine.
La mélatonine est une hormone sécrétée uniquement pendant la nuit par la glande pinéale.
Ce rythme est sous contrôle des SCN. La mélatonine fournit une indication sur le moment du
nycthémère (jour ou nuit) ainsi que sur la durée de la nuit puisqu’elle n’est présente qu’à ce
moment. A ce titre, la glande pinéale joue un rôle crucial dans les rythmes saisonniers, rôle
qui ne sera cependant pas développé ici.
La caractérisation et la localisation des récepteurs à la mélatonine ont donné lieu à de
nombreuses études. Deux sous-types de récepteurs principaux ont été clonés : MT1 et MT2
(Reppert et al., 1995 ; Masana et Dubocovich, 2001). Si leur distribution et leur densité
diffèrent entre les espèces, dans les SCN ces récepteurs sont souvent observés. Ceci suggère
que les SCN seraient capables d’intégrer un message de rétroaction véhiculé par la
mélatonine et que celle-ci pourrait moduler le système circadien (voir section 3.4.1 de cette
partie).
2.1.4.2. Récepteurs métaboliques.
Les SCN sont en outre capables d’intégrer des informations métaboliques provenant de la
périphérie. La leptine est une hormone dérivée du tissu adipeux qui régule la masse corporelle
en diminuant la prise alimentaire et en augmentant la dépense énergétique. L’action de la
leptine est médiée par les récepteurs à la leptine situés dans l’hypothalamus. Une étude
immunohistochimique a démontré leur présence dans les SCN, suggérant que ceux-ci seraient
capables de recevoir des informations du tissu adipeux (Hakansson et al., 1998).
23
En plus de récepteurs à la leptine, il a été démontré que les SCN contiennent des récepteurs à
la ghréline : cette hormone synthétisée par l’estomac stimule la prise alimentaire et indique
une déplétion en énergie. La signalisation de cette hormone s’effectue via un récepteur,
identifié par hybridation in situ dans les SCN et l’ensemble de l’hypothalamus (Zigman et al.,
2006). Egalement, des récepteurs à l’insuline on été détectés dans les SCN. Il semble que la
liaison de l’insuline sur ce récepteur permettrait de moduler la transmission synaptique et la
libération de neurotransmetteurs dans le système nerveux central (Unger et al., 1989).
3. Intégration du message circadien.
3.1. Les rythmes en absence de synchroniseur.
En laboratoire, il est possible de créer des conditions d’isolement total vis-à-vis de
l’environnement. Les rongeurs sont alors conservés en conditions lumineuses (en général
obscurité pour des rongeurs nocturnes comme le rat et la souris) et de température constantes.
La nourriture et l’eau sont fournies ad libitum. Dans ce cas, les animaux présentent des
rythmes persistants d’une période différente mais voisine de 24 heures (en général supérieure
chez le rat et inférieure chez la souris). Ces rythmes, dits endogènes puisque persistants en
conditions constantes, sont imprimés à l’organisme par les SCN et se retrouvent dans les
paramètres habituellement mesurés tels que l’activité locomotrice ou la sécrétion de
corticostérone. L’endogénicité d’un rythme est un pré-requis afin de pouvoir parler d’horloge
et c’est l’une des caractéristiques majeures des SCN.
3.2. Comment savoir si un message a été intégré ?
Il n’est pas possible d’attester de l’intégration d’un message par les SCN sans suivre ses
sorties puisque l’influence d’un facteur en entrée se répercutera sur celles-ci. En avant propos
de cette partie, nous développerons l’activité locomotrice, communément utilisée comme
sortie des SCN.
24
ZT0
ZT12
ZT0
ZT12
Jour 1
Jour 2
LD
Jour 2
Jour 3
Jour 3
CT0
CT12
CT0
CT12
DD
Figure 4 : Exemple d’actogramme d’un rongeur nocturne (Souris) en double représentation.
L’animal est placé dans une cage munie d’une roue ; les tours de roue sont comptabilisés par blocs de
5 minutes par un système d’acquisition. Plus le nombre de tours de roue est important, plus la barre
noire qui les représente est haute. La compilation de ces données constitue l’actogramme. Celui-ci est
en double représentation : deux jours consécutifs sont placés l’un à la suite de l’autre à la fois
verticalement et horizontalement afin de faciliter la lecture.
Dans la première partie de l’actogramme, l’animal est synchronisé au cycle LD (light/dark :
alternance du jour et de la nuit). Il y a donc un synchroniseur (la lumière). Dans ce cas, les heures
astronomiques sont converties en ZT (zeitgeber time : temps du synchroniseur) : ZT0 et ZT12
correspondent au début du jour et de la nuit respectivement. Remarquer que l’animal est actif durant la
nuit.
Dans la deuxième partie de l’actogramme, l’animal est en DD (dark/dark : obscurité constante) c'est-àdire en conditions constantes, sans zeitgeber. Dans ce cas, les heures astronomiques sont converties en
CT (circadien time : temps endogène). CT12 correspond au début de la nuit subjective c'est-à-dire au
début de l’activité locomotrice chez les rongeurs nocturnes. CT0 est souvent déterminé par rapport à
CT12 et correspond au début du jour subjectif et à la fin de l’activité locomotrice, plus difficile à
déterminer. L’activité locomotrice de l’animal est ici en libre cours et présente une période endogène
contrôlée par les SCN inférieure à 24 heures.
3.3. Intégration du message photique.
3.3.1. Synchronisation par la lumière
A partir du moment où l’animal est exposé à un synchroniseur pour lequel il possède une
horloge capable d’intégrer les informations temporelles, les rythmes ne sont plus en libre
cours. La période exprimée par les différentes sorties est alors la même que celle du
synchroniseur. Pour les SCN, le synchroniseur le plus puissant est la lumière. Les
informations en provenance du RHT vont permettre la synchronisation photique, c'est-à-dire
par les informations lumineuses, des SCN. En cycle LD 12/12 classique, l’actogramme
observé correspond à la première partie de la figure 4.
25
3.3.2. Créneau de lumière.
Outre le cycle LD simple, la lumière présentée de manière ponctuelle est intégrée par les
SCN. On observe des modifications de l’activité locomotrice indiquant une intégration du
message photique. Chez des rongeurs en DD, l’exposition à un créneau de lumière à différents
temps circadiens (CTs) entraîne des effets sur l’activité locomotrice qui dépendent du CT
d’administration. En effet, des retards de phase, c'est-à-dire un début plus tardif de l’activité
locomotrice, sont observés si le créneau de lumière coïncide avec le début de la nuit
subjective (à partir de CT12). Des avances de phase caractérisées par une activité débutant
plus tôt que prévu, sont observées si l’animal est exposé à un créneau en fin de nuit
subjective (à partir de CT18). Le signal n’entraîne aucun effet durant le jour subjectif. On
peut ainsi tracer une courbe de réponse de phase qui récapitule les déphasages observés pour
des créneaux de lumière administrés à différents CTs.
A
Figure 5 : Courbe de réponse de phase des stimulations photiques.
Effet d’un créneau lumineux ( ) sur la phase du rythme d’activité en libre cours, chez un rongeur
nocturne. Appliqué en fin ou en début de nuit subjective, il induit respectivement une avance ou un
retard de phase du rythme. En revanche une stimulation appliquée pendant la période de repos (jour
subjectif) n’a aucun effet
(Adapté de Meijer et Rietveld, 1989).
3.3.3. Décalage horaire
Lors d’expériences de décalage horaire sur les SCN, les animaux sont exposés à une
modification du cycle LD, qui est avancé ou retardé de plusieurs heures. Dans ce cas,
l’activité locomotrice ne s’exprime pas d’emblée synchronisée avec le nouveau cycle LD,
mais elle dérive durant plusieurs jours vers le nouveau régime d’éclairement avant de se
resynchroniser au nouveau cycle (Daan et Aschoff, 2001).
26
3.4. Synchronisation non photique.
Bien qu’il soit le plus puissant, le cycle LD n’est pas le seul synchroniseur des SCN. D’autres
synchroniseurs se sont révélés capables de décaler ou d’entraîner les rythmes d’activité chez
les rongeurs. Ces facteurs, dits non photiques, n’ont en commun que le fait d’être différents
de la stimulation lumineuse, et d’un point de vue physiologique, la plupart d’entre eux
induisent des avances de phase lorsqu’ils sont appliqués durant le jour subjectif. La majorité
des expériences qui suivent ont été conduites en DD afin de s’affranchir de l’influence
dominante du cycle LD.
3
2
Déphasage
induit
1
(Heures)
0
Jour subjectif
-1
0
6
Nuit subjective
12
18
0
Temps Circadien (Heure)
Figure 6 : Courbe de réponse de phase des effets non photiques.
Courbe de réponse de phase complète en réponse à des stimulations non photiques à différents temps
du cycle veille/sommeil en obscurité constante.
(Adapté de Mrosovsky, 1996)
3.4.1. Mélatonine.
La mélatonine, hormone donneuse de temps par excellence, est un facteur non photique. A
des doses supra-physiologiques, elle engendre des avances de phase lorsqu’elle est
appliquée en fin de jour subjectif (Armstrong et al., 1986). De plus, une application
quotidienne de mélatonine proche du début de nuit subjectif est capable de synchroniser
l’horloge des SCN chez des rongeurs nocturnes (Redman et al., 1983 ; Pitrosky et al., 1999).
27
DD
Véhicule
20
Mélatonine
40
Jours
60
Véhicule
80 0
24/0
24
Temps (heures)
Figure 7 : Actogramme en double représentation démontrant l’entraînement des rythmes d’activité
locomotrice par une perfusion quotidienne de mélatonine.
Les rats ont été placés en DD et perfusés grâce à un cathéter placé en sous cutané de manière
chronique. Dans la première partie de l’actogramme, les animaux sont perfusés 1 heure par jour avec
la solution véhicule sans mélatonine. Il n’y a pas de synchronisation, les rythmes restent en libre cours.
Dans la deuxième partie (rectangle rouge), la mélatonine est ajoutée dans la solution de perfusion. Le
rythme d’activité locomotrice est alors synchronisé au début du signal mélatoninergique. Lorsque la
solution de perfusion ne contient plus de mélatonine, le rythme continue en libre cours et n’est plus
synchronisé (rectangle bleu, 3e partie de l’actogramme).
(Adapté de Pitrosky et al., 1999).
3.4.2. Pharmacologie.
D’autres facteurs sont également capables d’engendrer une activation comportementale et
donc capables de modifier la période de l’horloge circadienne. C’est le cas des injections de
benzodiazépines, telles que le triazolam (Van Reeth et Turek, 1989 ; Cutrera et al., 1994), de
la morphine (Marchant et Mistlberger, 1995) qui induisent des avances de phase si elles sont
appliquées durant le jour subjectif.
3.4.3. Comportement.
L’activation comportementale des hamsters dorés durant le jour subjectif est l’un des
facteurs non photiques le mieux étudié. La procédure standard consiste à mettre à la
disposition d’un hamster doré une nouvelle roue. Généralement la présence de cette roue va
inciter l’animal à courir de manière soutenue à un moment inhabituel (accès à la roue durant
la phase habituelle de repos), ce qui va décaler la phase des rythmes (Reebs et Mrosovsky,
1989 ; Bobrzynska et Mrosovsky 1998).
28
A l’exception de la mélatonine, ces effets non photiques sur l'horloge sont abolis si les voies
sérotonergiques innervant les SCN en provenance du raphé sont détruites (Cutrera et al.,
1994 ; Miller et al., 1996 ; Challet et al., 1997a). De même, une lésion des IGL affecte les
changements de phase de l’activité circadienne des SCN induits par différents stimuli non
photiques (Challet et al., 1996b ; Miller et al., 1996 ; Schuhler et al., 1999). Les IGL et les
noyaux du raphé sont donc les structures directement impliquées dans la synchronisation des
SCN par des facteurs non photiques.
3.4.4. Nourriture.
Le dernier facteur non photique que nous aborderons ici est la nourriture. Il est en effet
critique pour la survie de tout organisme de pouvoir s’adapter à la disponibilité alimentaire
dans son environnement. Il a été démontré que les rongeurs pouvaient modifier leur
comportement afin de répondre à un accès à la nourriture dans une niche temporelle différente
de celle à laquelle ils sont adaptés. Ainsi, des rongeurs comme la souris et le rat qui sont des
animaux nocturnes et se nourrissent spontanément durant la nuit, sont capables de s’adapter à
un accès à la nourriture durant le jour. Ils présentent alors dans les heures qui précèdent
l’accès à la nourriture, une augmentation de leur activité communément appelée activité
anticipatoire ou FAA (Food Anticipatory Activity), caractéristique de ces protocoles. Notons
que la FAA n’est pas contrôlée par les SCN mais par une structure oscillante extérieure
aux SCN, dont les propriétés seront développées en partie IV de cette introduction.
Même si la restriction de l’accès à la nourriture à quelques heures par jour affecte
grandement les tissus périphériques, il n’en est pas de même pour les SCN (Damiola et al.,
2000 ; Stokkan et al., 2001 ; voir section 5-4-2-3). Une expérience sur des tranches
d’hypothalamus a notamment démontré qu’une restriction alimentaire temporelle ne modifiait
pas l’activité électrique de neurones isolés dans les SCN (Shibata et al., 1983). Du point de
vue comportemental, des animaux placés en LL ou en DD, donc en libre cours, et restreints à
quelques heures d’accès à la nourriture toutes les 24 heures, présentent à la fois une activité
contrôlée par les SCN d’une période supérieure à 24 heures et une FAA d’une période de 24
heures (Mistlberger, 1994). Les deux peuvent donc co-exister.
29
Jours
Heures du jour
Figure 8 : Actogramme en double représentation démontrant la co-existence d’une FAA et d’une
composante en libre cours.
Des rats ont été placés en lumière constante. Ils présentent une activité locomotrice en libre cours avec
une période supérieure à 24 heures. Les rectangles blancs indiquent les périodes d’accès à la nourriture
en cas de restriction temporelle. Les jours précédant et suivant la restriction, la nourriture est distribuée
ad libitum. Quelques jours après le début de la restriction, les animaux présentent une FAA
(composante d’anticipation). Celle-ci co-existe mais n’est pas confondue avec la période d’activité
contrôlée par les SCN.
(Adapté de Mistlberger, 1994).
Plus récemment, il a été démontré que chez des rats rendus arythmiques par l’exposition
prolongée à une lumière constante (LL), une rythmicité comportementale peut être
restaurée par une restriction alimentaire, remettant ainsi en question la relative insensibilité
des SCN à la restriction temporelle (Lamont et al., 2005). Il semble également que chez
certaines souches de souris domestiques placées en LD puis en DD durant plusieurs mois, la
composante en libre cours contrôlée par les SCN puisse être synchronisée par une restriction
temporelle de l’accès à la nourriture (Castillo et al., 2004). Une autre étude réalisée en DD,
comparant des souris de la souche CS à des C57BL/6J, démontre que chez les premières les
SCN sont entraînés par une restriction temporelle de l’accès à la nourriture alors que ce
n’est pas le cas pour la deuxième souche (Abe et al., 1989). Encore une fois, ce phénomène
est limité à une souche particulière de souris. Dans ce type de protocoles, les animaux ont
accès à une quantité de nourriture comparable à la condition ad libitum et par conséquent ne
perdent pas de poids. Il n’y a pas de restriction calorique.
Si la restriction temporelle n’est capable d’influer sur les SCN que dans des conditions très
strictes ou pour des souches particulières, il n’en est pas de même lorsque les animaux sont
soumis à une restriction calorique. Une ration quotidienne hypocalorique, c’est à dire
inférieure à la ration normocalorique, est fournie à heure fixe à l’animal. Dans ce cas, le début
du pic nocturne de sécrétion de mélatonine est avancé de deux heures (Challet et al., 1996a ;
Mendoza et al., 2005c). Des altérations dans le rythme de mélatonine plasmatique et pinéale
avaient en outre déjà été observées par d’autres auteurs (Holloway et al., 1979 ; Chik et al.,
30
1987). Le timing du pic nocturne de corticostérone reste plus ou moins inchangé, mais un
second pic, en anticipation de l’accès à la nourriture apparaît. La composante nocturne de
l’activité locomotrice est quant à elle avancée de 6 heures, commençant ainsi dès le milieu de
la phase éclairée (Challet et al., 1997c). Ces résultats indiquent que les SCN peuvent être
influencés par des facteurs métaboliques en général et par une restriction de l’accès à la
nourriture, puisque la relation de phase avec le cycle LD peut être modifiée par un nourrissage
hypocalorique.
3.5. Limites de l’entraînement.
Les SCN ont une période endogène proche de 24 heures et propre à chaque individu, qui
s’exprime en conditions constantes. Un zeitgeber avec une période T peut entraîner les
rythmes circadiens de sorte que les rythmes contrôlés par les SCN vont avoir une période
égale à T. Cet entraînement n’est possible que si T est suffisamment proche de la période
endogène. Il y a donc des limites au delà desquelles les SCN ne peuvent pas être entraînés.
Chez le rat par exemple, la période endogène est en général légèrement plus longue que 24
heures. Les limites de l’entraînement sont déterminées par l’exposition des animaux à des
cycles T, c’est à dire des jours de durée croissante de 22 heures (LD 11/11, soit 11 heures de
jour et 11 heures de nuit) à 27 heures (LD 13.5/13.5). Il a ainsi été démontré que les limites de
l’entraînement des SCN par la lumière se situaient entre 22.5 et 26 heures. Si l’on se trouve
au delà de ces fourchettes d’entraînement, les rythmes « décrochent » et n’ont plus une
période identique à celle de l’alternance du jour et de la nuit (Daan et Aschoff, 2001).
Temps (heures)
Figure 9 : Représentation schématique des limites de l’entraînement des SCN par la lumière. Les
différents schémas représentent des actogrammes en simple représentation où la barre noire
correspond à la période d’activité de l’animal. Les zones alternativement hachurées et blanches
représentent les périodes obscures et éclairées respectivement. La période T est la période du
zeitgeber. τ est la période mesurée de l’activité locomotrice. Si τ = T, alors l’animal est entraîné (T =
23 ou 25 h). Si τ ≠ T alors on est en dehors des limites de l’entraînement (T = 22 ou 26 h). Ici, l’animal
représenté n’est pas entraîné par un cycle T de 26 heures, alors qu’en général, la plupart des rats en
sont capables.
(Adapté de Daan and Aschoff, 2001).
31
4. Elaboration du message circadien.
4.1. Origine moléculaire : les gènes horloges.
A partir des années 90, un ensemble de gènes horloges ont été identifiés comme acteurs des
boucles moléculaires de rétroaction qui génèrent les oscillations circadiennes dans les SCN.
4.1.1. Boucle positive.
C’est par une stratégie de génétique inverse que l’équipe de Takahashi a mis en évidence en
1994, une mutation sur la séquence d’ADN codant pour la protéine CLOCK : Circadian
Locomotor Output Cycles Kaput (Vitaterna et al., 1994). Une mutation ponctuelle
transformant un A en T au niveau d’un site d’épissage supprime un exon et ampute la protéine
Clock de 51 acides aminés dans la zone de transactivation (King et al., 1997). Cette mutation
affecte peu la synchronisation des souris au cycle LD. En DD, la période endogène des souris
hétérozygotes est significativement plus longue (24.8 h) que celle des souris sauvages (23.7
h). Les souris homozygotes présentent une période très longue allant de 26 à 29 heures et
deviennent le plus souvent arythmiques si les conditions constantes persistent.
En 2000, Bunger et collaborateurs identifient un autre acteur essentiel dans la génération des
rythmes circadiens : Bmal1. Tout comme Clock, c’est un facteur de transcription de la
famille des protéines à domaine bHLH-PAS (basic Helix-Loop-Helix ; Period Arnt1 Sim).
La perte de Bmal1 a pour conséquence une diminution de l’activité générale de l’animal ainsi
qu’une altération de la synchronisation au cycle LD. Lors d’un transfert en obscurité
constante, ces souris deviennent immédiatement arythmiques (Bunger et al., 2000 ; voir
également Abe et al., 1998).
Le point de départ des oscillations circadiennes dans les SCN est l’hétérodimère
CLOCK/BMAL1 qui est transloqué dans le noyau où il se fixe à l’ADN grâce aux domaines
bHLH des protéines CLOCK et BMAL1, ce qui active la transcription des gènes de la
boucle négative et des gènes contrôlés par l’horloge (CCG) via une séquence E-box (Gekakis
et al., 1998 ; Hoegenesch et al., 1998).
L’ARNm de Bmal1 est exprimé rythmiquement dans les SCN avec un maximum d’expression
durant la nuit subjective (CT 14-18). Il est également exprimé dans de nombreuses structures
du système nerveux central et dans les tissus périphériques, avec des phases plus ou moins
retardées par rapport aux SCN (Honma et al., 1998 ; Oishi et al., 2000). BMAL2, un
analogue de BMAL1 est lui aussi exprimé dans les SCN ; il aurait une fonction redondante
avec BMAL1 (Hogenesch et al., 2000 ; Ikeda et al., 2000).
L’ARNm de Clock n’est quant à lui pas exprimé de manière rythmique dans les SCN
(Shearman et al., 1999 ; Zheng et al., 1999).
4.1.2. Boucle négative.
4.1.2.1. Les gènes Per et Cry.
Les gènes Period (Per) ont été identifiés par homologie de séquence avec le gène Period
cloné chez la Drosophile. Ils sont au nombre de trois : Per1, Per2 et Per3 (Zylka et al.,
32
1998b ; Zheng et al., 2001). Les protéines PER forment le premier composant de la boucle
négative, qui est complétée les protéines CRY (Field et al., 2000), avec lesquelles les PER
dimérisent via des domaines PAS (Hastings et al., 1999). Les gènes Cryptocrome (Cry) sont
au nombre de deux : Cry1 et Cry2.
Il semblerait que les dimères PER-CRY aient à la fois une action inhibitrice sur leur propre
transcription par interaction directe avec le dimère CLOCK-BMAL1 (Lee et al., 1999 ; Bae et
al., 2000) et une action activatrice sur la transcription de BMAL1 via une inhibition de la
transcription de REV-ERB alpha (Preitner et al., 2002).
Dans les SCN, le maximum d’expression de l’ARNm de Per1 est observé vers ZT2-6, celui
de Per2 à ZT8-12 et celui de Per3 à ZT6-ZT9 (Sun et al., 1997 ; Tei et al., 1997 ; Zylka et al.,
1998b ; Hastings et al., 1999). Les protéines PER suivent les profiles des ARNm avec un
délai de 4 à 6 heures (Field et al., 2000). Le pic d’expression de Cry1 et de Cry2 se situe aux
alentours de ZT10-12 (Okamura et al., 1999).
Les gènes Per sont non seulement exprimés dans les SCN, mais aussi dans de nombreuses
autres structures cérébrales et tissus périphériques (Sun et al., 1997).
4.1.2.2. Mutants simples.
Les mutants Per1 présentent une période circadienne plus courte et plus instable (autour de
22.6 heures) que les souris sauvages (23.7 heures). Ils conservent une rythmicité circadienne
en DD (Cermakian et al., 2001 ; Zheng et al., 2001). Ces mutants ne peuvent pas produire
d’avances de phase de l’activité locomotrice suite à un créneau de lumière en conditions
d’entraînement par un cycle LD 12/12 (Albrecht et al., 2001).
Les mutants Per2 présentent une délétion dans la zone codant pour le domaine PAS
d’interaction protéine/protéine. En DD, ils présentent une période très courte d’environ 22.1
heures et deviennent arythmiques en 2 à 18 jours (Zheng et al., 1999 ; Bae et al., 2001). Il
est à noter que, contrairement aux souris sauvages, ces mutants restent rythmiques en LL,
avec une période positivement corrélée à l’augmentation de l’irradiance (Steinlechner et al.,
2002). Concernant les réponses à la lumière, les mutants Per2 entraînés en LD 12/12 ne
semblent plus capables de réaliser des retards de phase de l’activité locomotrice en réponse à
un créneau de lumière en début de nuit (Albrecht et al., 2001).
L’invalidation du gène Per3 ne semble pas avoir de conséquence notable du point de vue
comportemental (Shearman et al., 2000a).
Les souris KO pour le gène Cry1 ou le gène Cry2 ne semblent pas présenter d’altérations
comportementales en LD 12/12. Par contre, lorsqu’elles sont placées en obscurité constante,
les KO Cry1 ont une période endogène significativement plus courte que les WT (22.5
contre 23.8 heures pour les WT) alors que les mutants Cry2 ont une période endogène plus
longue (24.6 heures) (Van der Horst et al., 1999 ; Vitaterna et al., 1999). Les réponses à un
créneau de lumière en début de nuit sont altérées et l’on observe des retards de phase plus
importants que chez les WT (Spolestra et al., 2004).
33
4.1.2.3. Doubles mutants
L’invalidation combinée des gènes Per1 et Per2 a pour conséquence la perte immédiate de
rythmicité en DD (Zheng et al., 2001). Par contre, les phénotypes des souris Per1/Per3 ou
Per2/Per3 sont quasi identiques aux phénotypes des souris simples mutantes Per1 ou Per2
respectivement (Bae et al., 2001).
Les souris double KO pour les gènes Cry sont arythmiques d’emblée lorsqu’elles sont
placées en DD. En LD 12/12 cependant, leur activité est masquée par la lumière et elles
restent rythmiques (Van der Horst et al., 1999).
La délétion additionnelle du gène Cry2 chez des souris mutantes Per2 a pour conséquence
une restauration d’un phénotype circadien semblable à celui des souris WT.
Contrairement aux mutants Per2, les doubles mutants Per2/Cry2 sont rythmiques en DD.
Inversement, les souris mutantes Per2/Cry1 sont arythmiques d’emblée en DD (Oster et al.,
2002). Les doubles mutants Per1/Cry1 sont rythmiques en DD et ont une période endogène
proche de celle des WT. Les modifications les plus subtiles du comportement ont été
observées chez les souris Per1/Cry2 mutantes, qui ont des rythmes perturbés en LD mais ne
deviennent arythmiques en DD qu’à partir de l’âge de 6 à 12 mois (Oster et al., 2003a).
4.1.2.4. Triples mutants.
Suite aux études sur les doubles mutants Per/Cry, Oster et collaborateurs ont testé le
phénotype circadien de diverses combinaisons de triples mutants Per/Cry. Dans aucun des
cas étudiés, ils n’ont observé de persistance d’un rythme circadien en DD (Oster et al.,
2003b). Les auteurs démontrent ainsi qu’un seul des gènes Per ou Cry est insuffisant pour
soutenir le fonctionnement rythmique des SCN.
4.1.3. Boucles intermédiaires.
En 2002, Preitner et collaborateurs identifient dans le promoteur de BMAL1 des
séquences RORE (Retinoic acid related Orphan Receptors response Element), reconnues par
des protéines membres de la famille des récepteurs orphelins, parmi lesquelles REV-ERB et
ROR.
4.1.3.1. Rev-erb.
Chez des souris Rev-erbα-/-, l’expression de Bmal1 dans les SCN est constitutivement
élevée, ce qui indique un rôle régulateur négatif de REV-ERBα sur la transcription de
Bmal1. L’expression de Per2 et Cry2 est par contre quasi inchangée, ce qui pourrait expliquer
que ces souris restent rythmiques en DD et en LL, mais avec des périodes plus courtes que
les WT (Preitner et al., 2002). Le rôle inhibiteur de REV-ERBα est confirmé par le moment
d’expression maximale de sa protéine dans les SCN chez des souris WT (ZT3-6), en
opposition de phase avec l’ARNm de Bmal1 (Preitner et al., 2002).
En ce qui concerne l’initiation de la transcription de Rev-erbα, elle est activée par le dimère
CLOCK/BMAL1 via des E-box situées dans son promoteur (Triqueneaux et al., 2004).
34
Il existe également un gène Rev-erbβ dont la protéine est capable d’inhiber la transcription de
Bmal1 (Guillaumond et al., 2005). Il présente un rythme journalier de transcription avec un
maximum d’expression à ZT6-10 (Preitner et al., 2002 ; Guillaumond et al., 2005).
4.1.3.2. Ror.
Le gène Rorα est exprimé ubiquitairement dans l’organisme (Akashi et Takumi,
2005). Dans les SCN, il est rythmique et présente un maximum autour de ZT8 (Ueda et al.,
2002). Tout comme REV-ERBα, RORα agit sur la transcription de Bmal1 via une boîte
RORE, mais cette fois en l’activant (Sato et al., 2004). Il constitue ainsi une boucle
intermédiaire qui permettrait de réinitier la transcription de la boucle positive. La
transcription de rorα pourrait quant à elle être activée par le dimère CLOCK/BMAL1 via une
E-box (Sato et al., 2004).
Rorβ est exprimé exclusivement dans le cerveau, et particulièrement dans les SCN, la rétine et
la glande pinéale. Il présente un rythme d’expression avec un pic vers ZT4 (Sumi et al.,
2002).
Rorγ n’est exprimé que dans quelques tissus périphériques et son rôle circadien exact reste à
élucider (Guillaumond et al., 2005).
Les souris KO pour le gène Rorα, les « staggerer », malgré une ataxie cérébelleuse rendant
difficile la mesure d’activité locomotrice, semblent avoir une période endogène plus courte
que les WT en DD. En outre, l’expression de Bmal1 est sérieusement altérée chez ces
mutants (Steinmayr et al., 1998 ; Sato et al., 2004).
Les souris KO pour le gène Rorβ, dites « vascillans », sont de petite taille, présentent un
faible tonus musculaire et sont aveugles (André et al., 1998). Elles demeurent rythmiques en
DD avec cependant une période endogène légèrement plus longue que les WT.
4.1.4. D’autres partenaires possibles ?
4.1.4.1. Tim.
Ce gène a été cloné par homologie avec le gène Tim présent chez la drosophile où sa protéine
dimérise avec PER (Zylka et al., 1998a). Il est peu exprimé dans les SCN chez les rongeurs,
son ARNm n’oscille pas et il n’est pas inductible par la lumière. Il ne semble pas non plus
interagir avec les protéines PER. Etant donnée son expression robuste dans la pars tuberalis,
la rate et les testicules, il pourrait intervenir dans la signalisation de la mélatonine, peut-être
au niveau saisonnier.
4.1.4.2. DEC
DEC1 (differentiated embryo chondrocyte protein) et DEC2 sont des protéines à domaine
bHLH. Leurs ARNm sont exprimés rythmiquement dans les SCN avec un maximum en
début de jour subjectif (Honma et al., 2002 ; Grechez-Cassiau et al., 2004). Il semble que
les DEC soient capables d’inhiber la transactivation du gène Per1 par le dimère
CLOCK/BMAL1 en entrant en compétition avec CLOCK/BMAL1 sur les E-box et/ou qu’ils
interagissent directement avec BMAL1 (Hamagushi et al., 2004 ; Sato et al., 2004).
35
4.1.5. Régulations pré et post traductionnelles.
En plus des boucles de rétrocontrôle des gènes horloges, beaucoup d’autres acteurs semblent
intervenir dans la génération des oscillations circadiennes. De nombreuses études ont montré
des régulations géniques comme la régulation de la forme de la chromatine par les
histones, des régulations transcriptionnelles (enhancers, silencers) ou encore des régulations
post-traductionnelles comme les phosphorylations (Caséine kinases 1) ou les
SUMOylations des protéines horloges, leur dégradation spécifique et la formation de dimères
(pour revue Reppert et Weaver, 2002 ; Lowrey et Takahashi, 2004).
L’un des exemples de l’importance de ces régulations est la mutation « tau » : En 1988,
Ralph et Menaker découvrent chez le hamster doré, une mutation spontanée réduisant la
période endogène de 24 heures environ chez les WT, à 22 heures chez les mutants
hétérozygotes et à 20 heures chez les homozygotes (Ralph et Menaker, 1988). Ce phénotype
est la conséquence d’une mutation ponctuelle sur la caséine kinase 1 epsilon (CK1ε) qui
perd la capacité à phosphoryler PER (Lowrey et al., 2000).
4.2. Modèle moléculaire.
En bref, les gènes Clock et Bmal1 sont transcrits puis traduits. Leurs protéines
hétérodimérisent et vont activer la transcription des gènes Per et Cry, ror et rev-erb ainsi que
des CCG. Ces derniers sont considérés comme des sorties de l’horloge et seront abordés dans
la section II.5.2.
Les ARNm de Per et Cry sont traduits dans le cytoplasme, où les protéines dimérisent. Elles
peuvent éventuellement faire l’objet de modifications post traductionnelles (par exemple les
phosphorylations des protéines PER par les Caséine Kinases 1ε/δ (CK1ε/δ)). Les dimères
PER/CRY sont transloqués dans le noyau où ils inhibent leur propre transcription. Dans le
même temps, les protéines REV-ERB viennent inhiber la transcription de Bmal1, alors que les
ROR vont réinitier cette transcription.
Ces cycles qui évoluent sur 24 heures environ sont responsables de la génération des
oscillations circadiennes dans les SCN (Shearman et al., 2000b ; Ko et Takahashi, 2006, pour
revue).
36
Noyau
Cytoplasme
Sorties de l’horloge
Processus biologiques rythmiques
Figure 10 : Modèle des boucles moléculaires de régulation transcriptionnelle et traductionnelle des
gènes horloges chez les Mammifères.
Un dimère de facteurs de transcription CLOCK/BMAL1 initie la transcription d’un ensemble de gènes
possédant une E-box. Parmi ces gènes se trouvent Per1, 2 et 3, Cry1 et 2, Dec1 et 2, Rev-erbα et
probablement Rorα (présence d’une E-box à démontrer). D’autres gènes possèdent des E-boxes et sont
aussi sous le contrôle transcriptionnel de CLOCK/BMAL1. L’ensemble de ces gènes est regroupé sous
le nom de CCG (Clock controlled genes ou gènes controlés par l’horloge). Les protéines PER et CRY
(en association possible avec DEC ne figurant pas ici) subissent des phosphorylations responsables, au
moins partiellement, du contrôle temporel de leurs interactions et translocations nucléaires. Dans le
noyau, ces dimères inhibent la transcription induite pas le dimère CLOCK/BMAL1. REV-ERBα
inhibiteur et RORα activateur de la transcription de Bmal1 constituent une seconde paire de boucles,
et jouent également un rôle dans la rythmicité circadienne.
(Adapté de Ko et Takahashi, 2006)
5. Distribution du message circadien.
Une fois qu’ils ont reçu, intégré et élaboré un message circadien, les SCN distribuent ce
message à un ensemble de sorties. L’activité locomotrice est probablement la plus étudiée et
elle a déjà été développée en section 3 de cette introduction. Mais elle n’est pas la seule sortie
mesurable des SCN.
5.1. Puissance des SCN.
En 1972, Stephan et Zucker établissent que les SCN sont nécessaires à l’expression du
rythme d’activité locomotrice (Stephan et Zucker, 1972). Cependant, ces expériences n’ont
pas pu apporter la preuve formelle que les SCN étaient le siège d’un oscillateur endogène,
mais tout au plus un relais obligé dans le contrôle de ces activités rythmiques.
37
En 1990, Ralph et collaborateurs démontrent que chez des hamsters dorés de type sauvage
rendus arythmiques par une lésion bilatérale des SCN, la transplantation d’un greffon de
SCN prélevé chez des mutants tau restaure une rythmicité circadienne avec la période
phénotypique de la souche tau (Ralph et al., 1990). Ces résultats démontrent que la période
endogène du donneur est « imprimée » à au moins l’une des sorties habituelles du receveur et
ainsi que les SCN sont réellement le siège de l’horloge circadienne principale (Ralph et
al., 1990 ; Sollars et al., 1995 ; Boer et al., 1998).
5.2. Sorties moléculaires (CCG = Clock Controlled Genes).
5.2.1. AVP.
La vasopressine (ou arginine vasopressine : AVP) est un neuropeptide dont l’ARNm est
régulièrement utilisé en hybridation in situ comme CCG, et plus particulièrement comme
marqueur moléculaire de la phase de sortie de l’horloge. Il est d’ailleurs considéré ici
comme tel, sachant qu’il possède une E-box dans son promoteur et que la transcription de
son ARN messager peut être régulée positivement par le dimère CLOCK/BMAL1 (Jin et al.,
1999). Le rôle précis de l’AVP dans les SCN reste assez obscur. L’AVP ne serait pas
indispensable pour l’expression de la rythmicité circadienne au sein des SCN, mais
l’élimination sélective des neurones à AVP a pour conséquence une perte de la rythmicité
dans la prise hydrique chez le rat. Il semblerait donc que la sécrétion rythmique de l’AVP soit
une sortie de l’horloge (Van Esseveldt et al., 2000). L’ARNm de l’AVP présente un rythme
d’expression aussi bien en LD qu’en DD, avec un pic en début de jour subjectif (Jin et al.,
1999).
5.2.2. DBP.
L’albumin D-element binding protein ou DBP a été d’abord identifié dans le foie et nombre
d’autres tissus périphériques. Il appartient à une famille de facteurs de transcription, à
laquelle appartiennent également les gènes d’expression précoce FOS et JUN (Mueller et al.,
1990). L’expression de DBP est rythmique dans le foie ainsi que dans la plupart des tissus
périphériques, chez la souris et le rat. Il oscille avec une grande amplitude dans les SCN avec
un maximum d’expression à ZT5 (Lopez-Molina et al., 1997). L’activation de la
transcription de DBP s’effectue via des E-boxes, indiquant sa nature de CCG (Ripperger et
al., 2000). Les souris KO pour DBP présentent une diminution de la quantité d’activité
locomotrice. Lorsqu’elles sont placées en DD, ces souris sont rythmiques et leur période de
libre cours est plus courte que celle de souris WT (Lopez-Molina et al., 1997).
5.3. Neurotransmetteurs, neuropeptides, peptides.
5.3.1. Neurotransmetteurs.
La plupart des neurones des SCN sont GABAergiques et possèdent des récepteurs pour ce
neurotransmetteur (Moore et Speh, 1993). De plus, une libération de glutamate par les
neurones des SCN dans les PVN a pu être identifiée (Perreau-lenz et al., 2004).
38
5.3.2. Neuropeptides.
5.3.2.1. VIP
Les niveaux d’ARN et de protéines du vasoactive intestinal peptide (VIP) présentent, chez
le rat, un rythme journalier en LD dans les SCN, avec un pic durant la nuit. Par contre,
l’expression du VIP est constante en DD. Il ne serait nécessaire ni à la génération des
rythmes dans les SCN ni à la transmission du message rythmique des SCN vers ses cibles
(Van Esseveldt et al., 2000). Des études récentes du groupe de Hastings démontrent que des
souris KO pour le gène codant pour le VIPR, récepteur du VIP, deviennent arythmiques.
Cependant, une analyse fine de l’expression de Per2 (suivie par un rapporteur luciférase) dans
des neurones individuels des SCN révèle qu’ils demeurent rythmiques. Cette étude démontre
l’implication essentielle du VIP dans la synchronisation des neurones des SCN entre eux,
via les récepteurs VIPR (Maywood et al., 2006).
5.3.2.2. Autres
La somatostatine présente un rythme d’expression dans les SCN aussi bien LD qu’en DD.
Les projections de ces neurones se limitent à l’intérieur des SCN et la fonction dans l’horloge
de ces neurones reste inconnue.
Le Gastrin releasing peptide (GRP) présente un rythme journalier en LD, dont le pic est
en antiphase avec le VIP (durant le jour). Sachant que les neurones à GRP projettent à
l’extérieur des SCN, il est possible qu’ils véhiculent des informations photiques vers
d’autres aires cérébrales. Ce fait n’est cependant pas démontré (Van Esseveldt et al., 2000).
5.3.3. Peptides
Les SCN sont responsables de la génération des rythmes et de la redistribution de ces rythmes
à des fonctions physiologiques et comportementales. Parmi elles, l’activité locomotrice serait
contrôlée en partie via des facteurs sécrétés par les SCN qui agiraient localement dans
l’hypothalamus. Cette hypothèse émane des expériences de restauration des rythmes par
transplantation de SCN fœtal chez un animal SCN lésé.
5.3.3.1. TGF.
En 2001, l’équipe de Weitz identifie le Transforming growth factor- (TGF- ) comme un
probable facteur inhibiteur de l’activité locomotrice, sécrété par les SCN. En effet, il est
exprimé de manière rythmique dans les SCN, avec un large pic durant le jour. Une infusion
de TGFα dans le 3e ventricule inhibe l’activité locomotrice de manière réversible. Cette
action passe par le récepteur pour l’EGF (epidermal growth factor) qui se trouve dans la zone
subparaventriculaire de l’hypothalamus. En outre, des souris mutantes pour ce récepteur
présentent une activité diurne anormalement élevée. Le TGFα, via son récepteur, serait donc
possiblement impliqué dans l’inhibition diurne de l’activité locomotrice (Kramer et al., 2001).
5.3.3.2. PK2.
Plus récemment, il a été démontré que la prokinéticine 2 (PK2), aurait le même effet que le
TGFα. Celle-ci est exprimée de manière rythmique dans les SCN avec un maximum en début
39
de jour. Les récepteurs pour PK2 se trouvent dans les principales structures cibles des
SCN, ce qui renforce l’hypothèse. Ici encore, l’administration intracérébroventriculaire de
PK2 durant la nuit subjective inhibe l’activité locomotrice ; cependant, l’absence de
récepteurs à PK2 dans ces zones rend l’interprétation de ce résultat délicate. La transcription
de l’ARNm de PK2 pourrait être activée par le dimère CLOCK/BMAL1 via un E-box
contenue dans son promoteur ; cela accroît la possibilité que PK2 soit un CCG capable de
contrôler des sorties de l’horloge, ou en tous cas d’influer dessus (Cheng et al., 2002).
5.3.3.3. CLC.
L’équipe de Weitz récidive en 2006 et présente un nouveau facteur sécrété par les SCN et
inhibant possiblement l’activité locomotrice diurne. La Cardiotrophin-Like Cytokin (CLC)
semble avoir toutes les qualités requises : elle est exprimée dans les SCN, dans une souspopulation de neurones à AVP. Cette expression est rythmique, avec un maximum en fin de
jour, à un moment où les rongeurs nocturnes sont inactifs. Les récepteurs au CLC se trouvent
sur les parois du 3e ventricule et une infusion de CLC bloque transitoirement l’activité
locomotrice sans affecter l’horloge (Kraves et Weitz, 2006).
Cette expérience ne réfute cependant pas les précédentes et il est fort probable que l’activité
locomotrice soit contrôlée par les SCN via de multiples facteurs qui agissent de concert.
5.3.4. Régionalisation des SCN.
Du point de vue morphologique, les SCN peuvent être subdivisés en une partie dorsomédiale
et une partie ventrolatérale. Chaque partie des SCN exprime un ensemble de neuropeptides
distincts. Ainsi, dans la partie dorsomédiale, les neurones expriment majoritairement de
l’AVP ; les neurones de la partie ventrolatérale expriment quant à eux le VIP et/ou le GRP.
Une population plus réduite de neurones à somatostatine se trouve entre ces deux populations
majoritaires.
Un certain nombre d’autres substances ont été identifiées par immunohistochimie
(Angiotensine II, galanine, substance P, calbindine) mais ne seront pas développées plus
avant.
40
3V
AVP
dmSCN
GRP
vlSCN
VIP
CO
Figure 11 : Subdivisions des SCN et représentation simplifiée des neuropeptides.
Les subdivisions des SCN sont représentées sur la partie gauche. La distribution des neuropeptides
principaux ainsi que des neurotransmetteurs est représentée sur la partie droite. 3V : 3e ventricule;
AVP : arginine vasopressine (bleu); dmSCN : SCN dorsomédial; GRP : gastrin-releasing peptide
(orange); CO : chiasma optique; VIP : vasoactive intestinal peptide (vert); vlSCN : SCN ventrolatéral.
5.4. Relation gènes horloges / comportement.
5.4.1. Réponse photique.
5.4.1.1. Créneau de lumière.
Les SCN sont entraînés par la lumière et il n’est pas étonnant de constater que la lumière ait
un effet sur certains des gènes de l’horloge. Ainsi, l’expression de trois d’entre eux est
inductible par la lumière : Per1 (Shigeyoshi et al., 1997), Per2 (Sherman et al., 1997) et
Dec1 (Honma et al., 2002). Leur induction est rapide et a lieu durant la nuit subjective. Per1
et Dec1 sont induits indifféremment durant toute la nuit subjective (Honma et al., 2002), alors
que Per2 n’est induit fortement que si le créneau lumineux est présenté en début de nuit
subjective (Albrecht et al., 1997 ; Zheng et al., 2001). Ces gènes horloge seraient donc
acteurs des décalages de phase observés en réponse aux diverses stimulations lumineuses.
5.4.2. Réponse non photique.
5.4.2.1. Mélatonine.
Les récepteurs MT1 et MT2 sont présents dans les SCN. Chez la souris, la suppression des
gènes de ces récepteurs a permis d’associer le récepteur MT1 à la suppression de l’activité
électrique des SCN en réponse à l’application de mélatonine. Les récepteurs MT2 seraient
associés aux décalages de phases obtenus après l’application de la mélatonine (Liu et al.,
1997). La mélatonine appliquée à la transition jour/ nuit induit des avances de phase de
l’activité électrique des SCN in vitro (Shibata et al., 1989 ; Stehle et al., 1989 ; McArthur et
al., 1991) mettant en évidence son rétrocontrôle sur l’horloge. Cependant, d’un point de vue
moléculaire, son action sur les SCN n’est pas encore bien élucidée, car l’application de
41
mélatonine n’est suivie d’aucun effet sur les gènes horloge Per, Cry, Bmal ou Clock (Poirel
et al.,2003). Toutefois des résultats récents montrent une avance de phase de Rev-erbα dans
les SCN (Agez et al., 2007).
5.4.2.2. Hyperactivité transitoire.
L’activation comportementale a également un effet sur les gènes horloges qui est totalement
opposé à celui observé avec les facteurs photiques, c’est-à-dire qu’elle provoque une
diminution de la transcription de Per1 et de Per2 durant le jour subjectif (Maywood et
al., 1999).
5.4.2.3. Nourriture.
Comme mentionné précédemment, les changements de disponibilité alimentaire sont
capables de synchroniser les tissus périphériques de manière efficace (Damiola et al.,
2000). Il semblerait cependant que les SCN, si l’on excepte des observations isolées en
conditions constantes ou des phénomènes souche spécifiques, soient assez insensibles à la
restriction temporelle. Il a ainsi été démontré que la phase d’expression des gènes horloges
n’est pas affectée par une restriction de l’accès à la nourriture limitée à la phase éclairée du
nycthémère (Damiola et al., 2000).
Figure 12 : Expression des gènes Per1 et Per2 dans les SCN de souris en réponse à une restriction
temporelle de l’accès à la nourriture.
Les souris avaient un accès limité à la phase obscure (nighttime feeding) ou à la phase éclairée
(daytime feeding) du nycthémère. Les heures indiquées en dessous de chaque image correspondent à
l’heure de prélèvement. Les marquages ont été obtenus par hybridation in situ radioactive pour les
ARN messagers de Per1 (panneau de gauche) et de Per2 (panneau de droite) sur des coupes coronales
de cerveaux.
O = SCN
(Adapté de Damiola et al., 2000)
Par contre, comme suggéré par les modifications comportementales et physiologiques
(sécrétion de mélatonine) observées lors d’une restriction calorique, les SCN sont affectés
par ce type de restriction. Une analyse approfondie de l’expression des gènes horloges dans
les SCN dans ces conditions démontre que la phase de Per1 et Cry2 est avancée de 1 et 3
heures. La restriction calorique affecte en outre les sorties des SCN puisqu’une avance de
phase de l’AVP de plus de 4 heures est observée (Mendoza et al., 2005c).
42
Ad libitum
Nourrissage hypocalorique
Per1
Ad libitum
Nourrissage hypocalorique
AVP
Figure 13 : Expression des gènes Per1 et AVP dans les SCN de souris en réponse à un nourrissage
hypocalorique.
Les souris avaient accès à 66% de nourriture par rapport à leur prise alimentaire normocalorique. Les
heures indiquées en dessous de chaque image correspondent à l’heure de prélèvement exprimée en
temps zeitgeber. Les marquages ont été obtenus par hybridation in situ radioactive pour les ARN
messagers de Per1 (panneau supérieur) et de l’AVP (panneau inférieur) sur des coupes coronales de
cerveaux.
= heure du nourrissage.
(Adapté de Mendoza et al., 2005c).
5.5. Activité électrique.
Les changements circadiens de la fréquence de décharge électrique des SCN sont l’une des
caractéristiques les plus connues de l’horloge circadienne (Inouye et Kawamura, 1979 ; Green
et Gillette, 1982 ; Shibata et al., 1982). L’activité électrique la plus intense est observée
durant la phase lumineuse du nycthémère. En outre, un rythme d’activité électrique des
neurones des SCN persiste en DD (Nakamura et al., 2001).
L’activité électrique est une caractéristique importante d’un tissu nerveux puisqu’il en résulte
des libérations de neurotransmetteurs ou de neuropeptides. Les gènes horloges étant à
l’origine des oscillations de l’horloge circadienne, il est important de voir quelles relations
existent entre l’expression de ces gènes et l’activité électrique des cellules des SCN. La
corrélation entre gènes horloge et activité électrique dans les SCN n’est pas encore clairement
établie, toutefois quelques éléments expérimentaux tendent à la mettre en évidence :
premièrement, en DD, des souris doubles mutantes pour Cry1 et Cry2 ne montrent de
rythmicité circadienne ni dans la fréquence de décharge des SCN, ni du point de vue
comportemental (Albus et al., 2002). D’autres expériences suggèrent qu’il existe une
corrélation entre l’expression de Per1 et l’activité électrique dans les cellules des SCN
(Quintero et al., 2003). Il semblerait donc que l’activité électrique des SCN puisse être reliée
à d’autres indicateurs connus : elle serait donc également une sortie de l’horloge.
5.6. Projections nerveuses.
Les connexions nerveuses efférentes aux SCN ont été établies en utilisant l’immunomarquage
pour l’AVP et le VIP, combiné avec des techniques de lésion ou de traçage. Chez les
43
rongeurs, les projections majoritaires aboutissent dans la zone subparaventriculaire en
dessous des noyaux paraventriculaires de l’hypothalamus (PVN). Une petite partie des
projections se prolongent vers le noyau paraventriculaire thalamique (PVT) et les noyaux
dorsomédiaux (DMH) et ventromédiaux (VMH) de l’hypothalamus. Des projections
minoritaires peuvent être observées en direction du noyau préoptique médial (MPN), du
noyau antéroventral, du septum latéral, et du noyau du lit de la strie terminale (BNST). Des
projections intra SCN assurent la synchronisation de tous les neurones des SCN. Les
projections vers la zone subparaventriculaire, les PVN, les DMH et l’aire préoptique médiale
permettent la modulation de fonctions physiologiques, endocrines et autonomes comme la
sécrétion d’hormones ou la température corporelle (Van Esseveldt et al., 2000).
BNST LS
PVT
IGL
PVN
MPN
SPV
DMH
VMH
SCN
IML
Figure 14 : Efférences des SCN.
Structures innervées par les SCN. BNST : noyau du lit de la strie terminale; DMH : noyau dorsomédial
de l’hypothalamus; IGL : feuillet intergéniculé latéral; IML : colonne intermédiolatérale de la moelle
épinière; MPN : aire préoptique médiane; PVN : noyau paraventriculaire hypothalamique; PVT : noyau
paraventriculaire thalamique; LS : septum latéral; SCN : noyau suprachiasmatique ; SPV : zone
subparaventriculaire; VMH: noyau ventromédial de l’hypothalamus. Les flèches orange indiquent les
projections directes depuis les SCN. Les flèches bleues indiquent quelques projections indirectes, dont
celle des PVN vers l’IML, point d’entrée des messages empruntant les voies sympathiques.
(D’après Kalsbeek et Buijs, 2002)
5.7. Sorties physiologiques.
5.7.1. Mélatonine.
La mélatonine est une hormone libérée par la glande pinéale (ou épiphyse) uniquement
pendant la phase nocturne du nycthémère (pour revue Simonneaux et Ribelayga, 2003).
Diverses études, notamment de traçage, ont pu mettre en évidence la voie polysynaptique
permettant le contrôle de cette glande endocrine par les SCN. Brièvement, les PVN, la
colonne intermédiolatérale de la moelle épinière (IML) et les ganglions cervicaux
44
supérieurs, servent de relais successifs à l’information entre les SCN et la glande pinéale
(Larsen, 1999 ; Teclemarian-Mesbah et al., 1999). Au sein de cette glande, l’enzyme limitante
de la synthèse de mélatonine est l’AA-NAT (Aryl-alkylamine N-acétyl transférase). Le
rythme de présence des ARNm de l’aa-nat comme celui de la libération de mélatonine, sont
abolis par lésion de l’une des structures de la voie de contrôle, confirmant ainsi leur
implication dans cette voie polysynaptique (Kalsbeek et al., 2000 ; Garidou et al., 2001 ;
Perreau-Lenz et al., 2003). Les SCN, via leurs projections vers les PVN, permettent de
contrôler la libération de mélatonine par un jeu d’activation (glutamate) et d’inhibition
(GABA) de leurs neurones cibles situés dans les PVN (Perreau-Lenz et al., 2004).
Mélatonine
pg/ml
Heure du jour
Figure 15 : Profil de sécrétion de mélatonine dans le plasma de rats en fonction de l’heure du jour
(pg/ml).
Notez que la sécrétion de mélatonine s’effectue exclusivement la nuit, indiquée ici par une barre noire
au dessus de l’axe des abscisses.
(Adapté de Klante et al, 1999)
5.7.2. Corticostérone.
Les neurones GABAergiques des SCN projettent sur les neurones des PVN et inhibent
dynamiquement leur activité durant le jour. Durant la nuit, cette inhibition est levée et les
neurones autonomes des PVN sont alors actifs. Ce phénomène est renforcé par une
activation conjointe des PVN par les projections glutamatergiques des SCN (Perreau-Lenz et
al., 2004) Les SCN stimulent ainsi la libération CRH (Corticotropin-Releasing Hormone) par
les neurones des PVN. Celle-ci est libérée dans le système porte hypothalamo-hypophysaire
ce qui induit la synthèse de l’hormone corticotrope ACTH (Adreno-CorticoTropin Hormone)
par l’hypophyse antérieure, puis sa sécrétion dans la circulation générale. L’ACTH ainsi
libérée stimule la synthèse et la libération de glucocorticoïdes par le cortex surrénalien.
Selon les espèces, la stéroïdogénèse dans le cortex surrénalien se traduit par la production
principale de corticostérone (rat), de cortisol (Homme ou hamster syrien), ou d’un mélange
des deux hormones (hamster sibérien). Outre le contrôle humoral de la sécrétion des
glucocorticoïdes via l’ACTH, il existe en parallèle un contrôle nerveux de cette sécrétion par
45
le système sympathique, qui module la sensibilité de la glande surrénale à l’ACTH (Kalsbeek
et Buijs, 2002).
Corticostérone
ng/ml
Heure du jour
Figure 16 : Profil de sécrétion de corticostérone dans le plasma de rats en fonction de l’heure du jour.
Noter que l’augmentation de la sécrétion de corticostérone s’effectue en anticipation de l’arrivée de la
nuit (indiquée par des barres noires sur l’axe des abscisses). Cela prépare l’organisme au début de
l’activité, nocturne chez le rat. Deux jours consécutifs de mesures ont été rapportés ici.
(Adapté de Sage et al., 2001)
5.7.3. Glucose et autres métabolites plasmatiques.
De nombreuses enzymes du métabolisme, comme par exemple l’insuline et le glucagon
respectivement hypoglycémiante et hyperglycémiante, présentent un rythme de sécrétion
dans le plasma (LaFleur et al., 1999 ; Kalsbeek et al., 2006). Cependant, si l’on abolit
artificiellement le rythme de prise alimentaire, ce rythme disparaît. Ces rythmes sont donc une
réponse passive à la prise alimentaire.
Il n’en va pas de même pour le rythme de glucose dans le sang, qui persiste même dans le cas
où la prise alimentaire ne présente pas de rythme circadien, chez des animaux SCN intacts. Ce
rythme est donc à relier avec le fonctionnement des SCN (LaFleur et al., 1999).
Glucose
% moyenne
Temps du zeitgeber (heures)
Figure 17 : Profil de glucose dans le plasma de rats en fonction de l’heure du jour.
La concentration de glucose dans le plasma est plus importante entre ZT8 et ZT14, c’est à dire juste
avant le début de l’activité locomotrice. L’alternance du jour et de la nuit est reportée respectivement
par des barres blanches et noires sur l’axe des abscisses.
(Adapté de LaFleur et al., 1999)
46
Des rythmes plasmatiques journaliers sont également observables pour d’autres métabolites
tels que les triglycérides, le glucose ou les corps cétoniques (Escobar et al., 1998).
5.7.4. Température.
La température corporelle est contrôlée par deux variables, l’une homéostatique et l’autre
circadienne. La régulation circadienne de la température est apparente lorsqu’elle est
dissociée de la composante de l’activité locomotrice. Chez des rongeurs présentant des lésions
partielles des SCN, l’activité locomotrice peut devenir arythmique sans que la température le
soit (Satinoff et Prosser, 1988). Par contre, des lésions complètes des SCN abolissent
totalement les rythmes de température (Eastman et al., 1984). Cependant, les lésions des
SCN n’abolissent pas la réponse thermorégulatrice (Wachulec et al., 1997) sous contrôle
des systèmes sympathique et parasympathique. Il est probable que les SCN contrôlent
partiellement ces phénomènes via des projections vers les noyaux préoptiques médians (des
lésions de ces noyaux abolissent une partie des réflexes de thermorégulation ; Osborne et
Refinetti, 1995).
5.8. Sorties comportementales.
Activité locomotrice, prise alimentaire et prise hydrique sont les rythmes les plus étudiés
en tant que marqueurs de la phase des SCN. Ils demeurent rythmiques pourvu que les SCN
soient intacts (Rosenwasser et al., 1981 ; Clarke et Coleman, 1986). Ils sont concomitants en
conditions normales, mais peuvent être dissociés par des protocoles de restriction
(Mistlberger, 1994).
Prise
alimentaire
0
12
24
12
0
Heures
Figure 18 : Rythme de prise alimentaire chez le rat en LD.
La prise alimentaire est représentée en ordonnée comme étant la prise par heure. La valeur 1.0
correspond à la prise horaire maximale en nombre de croquettes (78.7 par heure) et la valeur 0.0 à la
valeur minimale de prise alimentaire horaire (0.8 par heure). Notez que la prise alimentaire survient
majoritairement la nuit.
(Adapté de Rosenwasser et al., 1981).
47
Nous voilà donc revenus à notre point de départ : au bout de la chaîne des rythmes circadiens
se trouvent les éléments qui ont permis l’identification de l’horloge circadienne principale :
les sorties comportementales de l’horloge.
Témoin
Jours
Heure du jour
Lésion des SCN
Jours
Heure du jour
Figure 19 : Expérience de lésion : l’ablation d’une structure hypothalamique abolit les rythmes
d’activité locomotrice.
Actogrammes d’un rat placé en obscurité constante. Les périodes d’activité sont représentées par des
barres noires. Les actogrammes sont en double représentation, c’est à dire que le 2e jour est représenté
a la fois sur la première ligne et la seconde ligne. Après lésion, l’activité locomotrice ne présente plus
de rythmicité circadienne.
(Adapté de Stephan et Zucker, 1972)
Les SCN sont donc capables de recevoir, d’intégrer, de générer et de distribuer un
message à caractère circadien. Ils remplissent donc toutes les conditions nécessaires à la
dénomination d’horloge. Les SCN sont l’horloge circadienne principale. Cependant, un
nombre croissant d’études dans le domaine indique que les SCN n’auraient pas l’exclusivité
de l’appellation d’horloge.
III. D’autres horloges circadiennes ?
Depuis 1997, plusieurs groupes ont démontré l’expression de gènes horloges dans la plupart
des structures cérébrales hors SCN, tissus périphériques, et même cellules isolées chez les
Mammifères (Damiola et al., 2000 ; Yamazaki et al., 2000 ; Reppert et Weaver, 2002 ; Matsui
et al., 2005). Ces tissus ou organes oscillants ont été nommés horloges périphériques. Ce titre
est-il usurpé ?
48
1. Horloges cellulaires.
1.1. Elaboration du message : expression des gènes horloges dans toutes les
cellules.
Dans les SCN, la génération des oscillations circadiennes trouve son origine dans les
oscillations moléculaires au sein non seulement d’une cellule unique, mais aussi à l’échelle
du noyau entier. Les études portant sur les oscillations de l’expression des gènes horloges
dans les cellules périphériques ont largement utilisé le modèle des fibroblastes en culture.
Elles confirment que l’oscillation, les relations de phase et le délai ARNm / protéine sont
conservés dans les fibroblastes pour l’ensemble des gènes horloges connus (Yagita et al.,
2001). Cependant ces oscillations, à la différence des SCN semblent disparaître après
quelques cycles. Cet amortissement ne résulte pas d’une perte de rythmicité mais de la
désynchronisation des cellules entre elles (Nagoshi et al., 2004 ; Welsh et al., 2004). Dans
les SCN, les cellules rythmiques sont couplées entre elles, assurant ainsi une oscillation
homogène de la structure entière (Maywood et al., 2006). Les fibroblastes en culture n’étant
pas couplés, chacun oscille indépendamment des autres, chacun avec sa période propre,
néanmoins auto-entretenue, ce qui entraîne un aplatissement du rythme lorsque l’on
considère la culture entière.
1 cellule
1 cellule
25 cellules
Champ entier
Figure 20 : Désynchronisation de
fibroblaste de rat en culture.
Un gène rapporteur (luciférase) sous
contrôle du même promoteur que Per2
permet de suivre l’expression de ce
gène. Une caméra photosensible
permet l’enregistrement d’une cellule
seule ou d’un ensemble de cellules.
Chaque cellule individuelle oscille
durant plus de 11 jours (2 premiers
panneaux, en haut). Si l’on observe 25
cellules en même temps, en 6 jours, les
oscillations
sont
amorties.
Ce
phénomène est encore plus évident sur
le champ entier (dernière courbe, en
bas).
(Adapté de Welsh et al, 2004)
Chaque cellule est donc capable d’élaborer un message rythmique de manière endogène.
49
1.2. Réception / intégration.
Afin d’établir que chaque cellule d’un mammifère est capable de recevoir et d’intégrer un
message à caractère rythmique, il faudra que le stimulus modifie la phase d’expression des
gènes horloges de cette cellule : S’il a été clairement démontré que des fibroblastes en culture
sont capables d’osciller de manière individuelle, il n’est pas certain que les fibroblastes
puissent recevoir et intégrer des messages. Sans cela, les fibroblastes seront relégués au
statut de « pacemakers », entités oscillantes isolées des signaux environnementaux. Ce n’est
bien entendu pas le cas puisqu’il a été démontré qu’un choc au sérum administré à des
fibroblastes en culture peut « déclencher » l’oscillation des gènes horloges de manière
synchrone pour toutes les cellules de la culture (Balsalobre et al., 1998). En fait, ce signal
resynchronise l’expression des gènes horloges dans tous les fibroblastes qui oscillent de
nouveau en phase. L’utilisation de forskoline, un activateur de la voie de signalisation de
l’AMP cyclique a permis d’affiner ces résultats en démontrant que la synchronisation des
fibroblastes peut s’opèrer par cette voie (Yagita et Okamura, 2000). Des résultats similaires
ont été obtenus avec une stimulation par un agoniste des récepteurs aux glucocorticoïdes : la
dexaméthasone. Le récepteur aux glucocorticoïdes est essentiel à ce phénomène, ce qui
indique que la corticostérone et/ou ses métabolites seraient impliqués dans la signalisation
temporelle in vivo (Balsalobre et al., 2000). Néanmoins il n’a pas encore été démontré que ces
synchroniseurs devaient être présentés dans des gammes de fréquences circadiennes pour
pouvoir synchroniser ces fibroblastes à long terme. La question reste donc ouverte.
1.3. Distribution du message.
Là où la condition d’horloges cellulaires devient plus difficile à établir, c’est dans la
distribution du message. Il n’a en effet jamais pu être démontré que l’expression rythmique
des gènes horloges dans les cellules individuelles avait une répercussion sur les « sorties »
éventuelles de celles-ci. Mais l’intérêt de la génération de rythmes in situ ne doit pas
forcément être recherché dans une sécrétion humorale. Il est possible et même probable que la
présence d’une horloge individuelle dans chaque cellule a un intérêt dans le timing de
fonctions cellulaires comme la mitose. Des conditions environnementales ou génétiques qui
atteignent la coordination du système circadien peuvent accélérer la progression de tumeurs
(Van Den Heiligenberg et al., 1999 ; Filipski et al., 2002 ; Filipski et al., 2004, Filipski et al.,
2005). Sachant que le système circadien a un effet de régulation négative rythmique sur le
cycle cellulaire, il est plus facile de comprendre pourquoi des souris mutantes pour le gène
Per2 sont plus enclines à développer des tumeurs en réponse à une irradiation aux rayons
gamma, par rapport à des souris sauvages (Fu et al., 2002). Egalement, suite à une ablation
partielle des lobes du foie, des divisions synchrones des hépatocytes assurent une
régénération rapide des tissus. Cette régénération est ralentie chez des souris mutantes
pour les gènes Cry1 et Cry2, même si elle est encore possible (Matsuo et al., 2003). Il est
donc probable qu’une horloge cellulaire individuelle distribue un message à caractère
50
rythmique au niveau local, ce qui permet de conserver l’intégrité cellulaire à plus long
terme. Ces systèmes d’horloges cellulaires, seraient néanmoins synchronisés par un chef
d’orchestre : les SCN. La dominance des SCN sur les oscillateurs périphériques a été
formellement démontrée par Pando et collaborateurs (2002) qui ont greffé des SCN de souris
Per1-/-, présentant une période endogène courte, chez des souris sauvages ayant subi au
préalable une lésion des SCN. Ils ont constaté que la période d’oscillation des fibroblastes
était alors entraînée à une période proche de celle des SCN greffés (Pando et al., 2002).
2. Horloges tissulaires périphériques ?
2.1. Foie, rein, poumon.
Outre les cellules isolées, bon nombre de tissus périphériques présentent des oscillations
auto-entretenues des gènes horloges. Ces oscillations ont longtemps été considérées comme
non persistantes (6-7 cycles) suite à des études réalisées chez des rats Per1-Luciférase (le
gène de la luciférase étant placé sous contrôle du promoteur de Per1) sur des explants de
tissus en culture (Yamazaki et al., 2000 ; Yamazaki et al., 2002). Une fois encore, l’absence
de couplage entre cellules semble responsable de la disparition du rythme à l’échelle du
tissu. Cependant une étude récente utilisant des souris PER2-Luciférase (protéine de fusion)
démontre une persistance des oscillations de PER2 au delà de 20 cycles dans un certain
nombre d’explants de tissus : foie, rein, poumon, cornée, hypophyse (Yoo et al., 2005).
SCN
Rein
Cornée
Aire
rétrochiasmatique
Poumon
Foie
Hypophyse
Queue
Jours
Figure 21 : Enregistrements en temps réel de la bioluminescence émise par divers tissus de souris
mutantes PER2-Luciférase. Les tissus ont été prélevés juste après extinction des lumières, comme
indiqué par la flèche en bas à gauche. La bioluminescence est exprimée en coups par minute. Il est à
noter que la quasi totalité des tissus exprime une rythmicité circadienne à une période propre, durant
plusieurs jours.
(Adapté de Yoo et al., 2005)
51
Ces oscillations persistent dans des explants de tissus prélevés chez des animaux rendus
arythmiques par une lésion des SCN. Cependant chaque tissu oscille avec une période
endogène propre, ce qui entraînerait une désynchronisation, au sein d’un organisme, entre
les différents tissus périphériques. Le rôle dominant des SCN qui donnent un signal
quotidien de remise à l’heure à tous les tissus n’est donc pas remis en cause par ces études,
même si elles n’excluent pas la possibilité que ces tissus soient eux-mêmes des horloges. Ces
horloges pourraient recevoir un signal transmis par les SCN. A ce titre, il est fort probable que
l’un des signaux synchroniseurs reconnus par l’ensemble des tissus périphériques soit les
glucocorticoïdes : en effet, Balsalobre et collaborateurs (2000) ont montré qu’une injection
de dexamethasone, synchronisait non seulement des fibroblastes en culture, mais également
les tissus périphériques in vivo, sans affecter la phase des SCN (Balsalobre et al., 2000). Cette
action s’effectue via les récepteurs aux glucocorticoïdes. Il semblerait qu’outre les
glucocorticoïdes, nombre de facteurs métaboliques puissent synchroniser les tissus
périphériques puisqu’un changement dans la disponibilité alimentaire synchronise les
tissus périphériques, mais pas les SCN (Damiola et al., 2000 ; Hara et al., 2001 ; Stokkan et
al., 2001). Une fois encore, même s’il a été démontré que les tissus périphériques peuvent
recevoir, intégrer et générer des messages à caractère circadien, aucune sortie n’a pu être
mesurée jusqu’ici. Tous les tissus périphériques précédemment cités gardent donc un statut
d’oscillateurs jusqu’à ce que le contraire soit prouvé.
2.2. Glandes surrénales.
Des souris Per1-Luciférase ont été utilisées afin de rechercher dans quels tissus périphériques
une stimulation lumineuse (en DD) entraînait une activation des gènes horloges. La glande
surrénale, responsable de la production de la corticostérone, a été observée comme répondant
fortement à cette stimulation (Ishida et al., 2005). La réponse de la glande surrénale est
évidente non seulement au niveau des gènes horloges, mais également dans la sécrétion de
corticostérone, qui augmente dans l’heure suivant l’exposition à la lumière. Cette réaction ne
dépend pas de l’axe hypothalamo-hypophysaire puisqu’il n’y a pas d’augmentation de la
quantité d’ACTH. Par contre, elle dépend d’un contrôle des SCN via le système nerveux
sympathique puisqu’une lésion des SCN ou une dénervation sympathique abolissent cet effet
(Ishida et al., 2005). Les glandes surrénales peuvent donc recevoir et intégrer rapidement des
informations lumineuses.
Plus récemment, il a été démontré que les glandes surrénales expriment de manière
rythmique les gènes horloges traditionnels, aussi bien en LD qu’en DD (Oster et al., 2006).
Ces oscillations des gènes horloges sont à l’origine de fluctuations dans la sensibilité de la
glande surrénale à l’ACTH (Oster et al., 2006) et pourraient également expliquer les
différences dans la sécrétion de corticostérone après exposition à une stimulation lumineuse à
différents temps circadiens (Ishida et al., 2005).
52
Des souris mutantes Per2/Cry1 sont arythmiques en DD. La sécrétion de corticostérone est
également arythmique chez ces souris. Cependant, la transplantation d’une glande
surrénale de souris sauvage dans une souris mutante Per2/Cry1 permet de restaurer une
rythmicité dans la libération de corticostérone, mais ni dans l’activité locomotrice, ni dans la
sécrétion d’ACTH. Cette observation, effectuée en LD, n’est cependant pas valide en DD,
indiquant que des SCN fonctionnels ne sont pas requis pour les oscillations des glandes
surrénales en LD, mais que les glandes surrénales ne sont pas capables d’osciller de manière
autonome en DD (Oster et al., 2006). Les glandes surrénales seraient donc bien influencées
« directement » par les informations lumineuses.
L’ensemble de ces résultats démontre que les glandes surrénales abritent un oscillateur
périphérique, qui joue un rôle local important dans la régulation de la fonction
surrénalienne. La glande surrénale est capable de recevoir, d’intégrer et de distribuer des
informations à caractère rythmique à l’ensemble de l’organisme (corticostérone), mais n’est
pas capable d’oscillations auto-entretenues. Encore une fois, l’une des conditions n’est pas
remplie pour pouvoir parler d’horloge périphérique.
2.3. Rétine.
La rétine est la première horloge tissulaire hors SCN à avoir été identifiée. A ce titre, elle
remplit l’ensemble des conditions requises à la condition d’horloge.
2.3.1. Réception et distribution d’un message
Les photorécepteurs rétiniens (cônes et bâtonnets) absorbent la lumière et la convertissent en
signal photique qui sera transmis au cerveau, et en particulier aux SCN, via le RHT, à partir
des cellules ganglionnaires (Meijer, 2001 pour revue). En absence de cônes et de bâtonnets
fonctionnels, la réception des informations lumineuses circadiennes non visuelles peut encore
être effectuée par les cellules ganglionnaires, grâce à un pigment photosensible : la
mélanopsine (Provencio et al., 1998 ; Panda et al., 2002 ; Ruby et al., 2002 ; Semo et al.,
2003).
Notons qu’une activité circadienne a été détectée dans la rétine des rongeurs, ce qui est
démontré par la libération rythmique de mélatonine par des rétines en culture (Tosini et
Menaker, 1996).
2.3.2. Elaboration d’un message rythmique.
En plus de ces rythmes endogènes de libération de mélatonine, une expression rythmique des
gènes horloges classiques (Per, Cry, Bmal1) a été décrite dans plusieurs types cellulaires de
la rétine, même si ces rythmes ne sont pas toujours robustes (Kamphuis et al., 2005 ; Ruan et
al., 2006). En outre, des études utilisant des gènes rapporteurs associés au gène Per1
indiquent que ce gène est exprimé de manière rythmique dans les cellules ganglionnaires de la
rétine (Witkovsky et al., 2003).
53
3. Horloges tissulaires centrales.
3.1. Horloges ou oscillateurs esclaves des SCN ?
L’expression des gènes horloges a été observée dans la quasi totalité des tissus cérébraux
testés (Asai et al., 2001; Wakamatsu et al., 2001; Abe et al., 2002 ; Granados-Fuentes et al.,
2004 ; Matsui et al., 2005). De là à vouloir les considérer comme des horloges, il n’y a qu’un
pas. Cependant plusieurs études démontrent qu’il n’en est rien, puisqu’une lésion des SCN
abolit la rythmicité dans un grand nombre de structures cérébrales. Par exemple la
protéine PER2 présente un rythme d’expression dans le noyau ovale du lit de la strie terminale
(BNST), les noyaux central et basal de l’amygdale et le gyrus denté de l’hippocampe. Ce
rythme est aboli chez des animaux SCN lésés indiquant le rôle central des SCN dans la genèse
de ces oscillations. Notons par ailleurs qu’une ablation des glandes surrénales abolit de la
même façon le rythme de PER2 dans le BNST et l’amygdale centrale (Amir et al., 2004 ;
Lamont et al., 2005 ; Segall et al., 2006) ce qui indique, tout comme pour les tissus et les
cellules périphériques, que les glucocorticoïdes sont très importants pour la distribution
du message circadien par les SCN. Ces derniers gardent donc leur place d’horloge
principale, de nombreuses autres structures leur restant subordonnées.
Cependant il ne faut pas négliger l’importance de la disponibilité alimentaire dans la phase
et le rythme d’expression des gènes horloges dans de nombreux tissus cérébraux. En effet,
une restriction temporelle de l’accès à la nourriture (Restricted Feeding : RF), modifie le
rythme d’expression de Per1 et Per2 dans la plupart des structures observées
(Wakamatsu et al., 2001; Angeles-Castellanos et al., 2007). Il en est de même pour la protéine
PER2 dont les niveaux sont altérés dans l’amygdale en réponse à une RF (Lamont et al.,
2005 ; Waddington-Lamont et al., 2007).
3.2. Les bulbes olfactifs.
Ce constat très général d’oscillateurs centraux asservis aux SCN, n’est cependant pas absolu :
les bulbes olfactifs présentent un rythme endogène d’expression de Per1, y compris chez
des animaux arythmiques du point de vue comportemental (Granaos-Fuentes et al., 2004). En
outre, les cellules des bulbes olfactifs se synchronisent entre elles, comme démontré par
leurs rythmes de fréquences de décharges neuronales (Grandos-Fuentes et al., 2004). Plus
récemment, un rythme d’induction de c-FOS, marqueur d’activation neuronale, a été détecté
en réponse à la présentation d’odeurs : Le nombre de cellules répondant au stimulus est plus
important en début de nuit. Ce rythme persiste en conditions constantes ainsi que chez des
animaux SCN lésés, excluant un contrôle de cette caractéristique par les SCN. De plus, une
lésion des bulbes olfactifs abolit le rythme d’expression de c-FOS en réponse aux odeurs dans
le cortex piriforme (cortex olfactif primaire). Les bulbes olfactifs sont donc capables de
recevoir des informations olfactives auxquelles ils réagissent de manière différentielle au
cours du nycthémère. Ils distribuent ce message rythmique au cortex piriforme pour en
54
contrôler le rythme d’expression de c-FOS (Granados-Fuentes et al., 2006). Les bulbes
olfactifs peuvent recevoir et intégrer un message, générer et distribuer un message rythmique.
Cependant, il n’a pas encore été démontré que la présentation d’un stimulus environnemental
devait être dans le domaine circadien pour pouvoir entraîner les rythmes dans ce tissu. Mise
à part cette légère objection qui reste à éclaircir, il semblerait que les bulbes olfactifs
puissent effectivement obtenir le titre d’horloge centrale.
Il est donc possible de trouver d’autres horloges tissulaires centrales, en dehors des SCN. Les
bulbes olfactifs, responsables des réactions circadiennes aux odeurs, sont l’une d’elles. Une
autre horloge putative a retenu l’attention ces 25 dernières années.
IV. Une autre horloge putative : l’horloge alimentaire.
1. Historique.
Des observations empiriques réalisées dans les années 1920-1930 sur des abeilles ouvrent de
nouvelles perspectives pour la physiologie circadienne : Beling et Wahl constatent que les
abeilles de leur jardin semblent avoir appris quand le petit déjeuner était servi dans le patio et
se préparaient à ce repas. Il a en outre été démontré dans des études ultérieures que les
abeilles étaient capables d’anticiper un accès quotidien à de l’eau sucrée, à la fois sur le plan
individuel et au niveau de la colonie, et ce si l’eau sucrée est disponible à une fréquence
proche de 24 heures (pour revue voir Mistlberger 1994). Sachant que l’anticipation
d’évènements récurrents ayant une période proche de 24 heures est l’apanage des
horloges circadiennes, il n’y a qu’un pas qui nous sépare d’une horloge synchronisée par la
nourriture. Cependant, des études extensives n’ont pas été réalisées chez l’abeille, mais chez
des Rongeurs. Notons cependant que des phénomènes similaires ont été rapportés chez
diverses espèces de Poissons, Oiseaux et Mammifères, Primates y compris mais qu’il ne sera
fait référence qu’aux rongeurs dans ce qui va suivre.
2. Mise en évidence.
2.1. Rat et souris.
Si des comportements d’anticipation de la nourriture ont été observés dès les années 1920,
rien n’indiquait qu’ils n’émanaient pas de l’horloge principale. En 1979, F. K. Stephan et
collaborateurs établissent que chez des rats présentant des lésions bilatérales des SCN (c’est à
dire arythmiques), il est possible de restaurer un rythme journalier d’activité, si les
animaux sont soumis à un accès contrôlé à la nourriture. Après quelques jours, les animaux
deviennent actifs dans les heures qui précèdent l’arrivée de la nourriture, celle-ci étant
présentée tous les jours à la même heure. Cette activité anticipatoire de la nourriture (Food
anticipatory activity : FAA) est caractéristique des rythmes de synchronisation alimentaire.
Elle est considérée comme une sortie d’un oscillateur situé à l’extérieur des SCN, puisque
55
son expression persiste après lésion de cette structure. Notons que ce phénomène est
également observable chez la souris (Marchant et Mistlberger, 1997).
Ad
libitum
Restriction
alimentaire
Heures
Figure 22 : Une restriction temporelle de l’accès à la nourriture restaure un rythme journalier
d’activité locomotrice chez des animaux arythmiques.
Actogramme en double représentation d’un rat ayant subi des lésions des SCN. Il est arythmique en
condition ad libitum. Une restriction alimentaire restaure en quelques jours un rythme journalier
d’activité locomotrice, qui s’exprime sous forme d’une FAA (rectangles jaunes). L’accès à la
nourriture est représenté par les rectangles rouges. Le cycle LD est reporté en abscisse, les barres
noires représentant la nuit.
(Adapté de Clarke et Coleman, 1986)
Il semble donc que l’existence d’un oscillateur extérieur à l’horloge principale, ou au moins
les mécanismes de synchronisation alimentaire soient observables chez les Rongeurs.
Mais est-il possible que ce que l’on a longtemps considéré comme un oscillateur possède, au
même titre que les SCN, des propriétés d’horloge ? Pour le démontrer, il nous faudra établir
que cet oscillateur est capable de recevoir un message dans le domaine circadien, d’intégrer
ce message, puis d’élaborer un signal circadien qu’il distribuera à un ensemble de sorties
mesurables, et enfin que les oscillations transmises soient auto-entretenues. Nous aurons
alors non pas un oscillateur alimentaire, mais une horloge alimentaire. D’ici là, cette horloge
putative sera désignée par le sigle FEO pour Food Entrainable Oscillator ou oscillateur
entraînable par la nourriture.
3. Distribution d’un message circadien : sorties.
Nous commençons ici par la fin, afin de nous permettre de poser les bases de cette horloge
putative. Il est évident que si nous voulons mesurer la réception potentielle d’un message et
son intégration, nous devons avoir accès à des sorties de l’horloge considérée. Sont donc
présentées dans cette section les sorties pouvant être influencées par une restriction
alimentaire, ou d’autres facteurs environnementaux comme rapporté en section IV-4.
56
3.1. Activité locomotrice (FAA)
L’activité locomotrice est le premier paramètre pour lequel il a été démontré que la nourriture
pouvait restaurer un rythme en absence des SCN (Stephan et al., 1979). La FAA est évidente
après quelques jours de restriction alimentaire. Elle peut être observée à la fois dans l’activité
de roue (Stephan et al., 1979) et dans l’activité générale (Mistlberger et Rechtschaffen,
1984). Dans ce cas, soit un transmetteur est implanté dans la cavité abdominale de l’animal et
un dispositif externe enregistre les déplacements de l’animal par unité de temps, soit l’activité
est évaluée grâce à des détecteurs infrarouges mesurant les déplacements de l’animal. La FAA
peut être observée chez des animaux SCN lésés mais aussi chez des animaux intacts
(Mistlberger, 1994 ; voir également section II.3.4.4). Dans ce cas elle s’exprime aussi bien si
la nourriture est distribuée de jour que de nuit, bien que la plupart du temps l’accès à la
nourriture soit de jour, afin d’éviter les interférences avec l’activité nocturne (Mistlberger,
1994). Après un retour des conditions de nourrissage ad libitum, la FAA persiste durant
quelques jours (Honma et al., 1983 ; Stephan, 1983) mais décroît et finit par disparaître
(Stephan et al., 1979 ; Coleman et al., 1982). Ce résultat peut laisser penser que la FAA serait
la sortie d’un oscillateur qui s’amortit au fil du temps ou qu’elle est la conséquence d’un
« effet mémoire » du système, dont l’extinction peut durer plusieurs jours. Par contre ce
phénomène de persistance en conditions ad libitum exclut que la FAA soit sous contrôle d’un
système « sablier ». Si c’était le cas, la FAA cesserait d’emblée au passage en conditions ad
libitum puisque l’absence de l’indicateur « heure du repas » entraînerait la fin du
« retournement du sablier ». Le centre de contrôle de la FAA est donc probablement un
oscillateur. Cependant, à ce stade nous ne pouvons pas exclure que la mémoire joue un rôle
dans l’expression de la FAA.
3.1.1. Expérience de jeûne.
Même si la FAA disparaît progressivement en conditions ad libitum, lorsque les animaux sont
soumis à une période de jeûne, la FAA réapparaît à la même heure que précédemment, et
ce même après 50 jours en conditions ad libitum (Stephan et al., 1979 ; Boulos et al., 1980 ;
Coleman et al., 1982 ; Clarke et Coleman, 1986 ; Ruis et al., 1989). Par contre, lors de jeûnes
répétés séparés par des périodes de nourrissage ad libitum, la réapparition de la FAA a
tendance à diminuer (Rosenwasser et al., 1984 ; Ottenweller et al., 1990), même si toutes les
études ne semblent pas aller dans ce sens (Ruis et al., 1989). De plus, des périodes
successives de jeûne voient parfois une activité comparable à la FAA réapparaître à une heure
différente du nycthémère, et se décaler au fil des jeûnes successifs (Ruis et al., 1989). Ces
décalages successifs peuvent être interprétés comme un libre cours de la FAA qui reflèterait
la période endogène du FEO. Ces résultats indiquent la probable implication d’un
oscillateur, sinon d’une horloge dans le contrôle de l’expression de la FAA puisque celle-ci
réapparaît avec une précision difficilement explicable sans un système de mesure du temps, et
reposant uniquement sur la mémoire. Le fait que la réapparition de la FAA se dissipe avec le
57
temps, peut signifier deux choses : soit le FEO est découplé de ses effecteurs par une longue
période sans indications temporelles de la disponibilité alimentaire, soit le FEO est
effectivement un oscillateur et n’est donc pas capable de produire des rythmes endogènes. Il
faut cependant garder à l’esprit que les SCN, dans des conditions de lumière constante,
peuvent devenir arythmiques, ainsi que leurs sorties, et ils sont pourtant indiscutablement une
horloge. Il n’est donc pas impossible que la condition ad libitum soit délétère pour la
rythmicité de la FEO. Cette question reste ouverte.
3.2. Boisson
Parmi les premières études réalisées sur la restauration de rythmes comportementaux suite à
une restriction alimentaire, il a été démontré que le rythme de prise hydrique était similaire
au rythme d’activité locomotrice, les animaux augmentant leur prise hydrique dans les heures
précédant l’accès à la nourriture (Boulos et al., 1980 ; Clarke et Coleman, 1986). La mesure
de la prise hydrique s’effectue par le nombre de contacts de l’animal avec la pipette du
biberon, qui sont comptés par un logiciel.
Ad
libitum
Restriction
alimentaire
Heures
Figure 23 : Une restriction temporelle de l’accès à la nourriture restaure un rythme journalier de
boisson chez des animaux arythmiques.
Actogramme en double représentation d’un rat ayant subi des lésions des SCN. Il est arythmique en
condition ad libitum. Une restriction alimentaire restaure en quelques jours un rythme journalier de
prise hydrique, qui s’exprime en anticipation de la nourriture (rectangles jaunes). Elle est mesurée par
un nombre de contacts avec la pipette du biberon. L’accès à la nourriture est représenté par les
rectangles rouges. Le cycle LD est reporté en abscisse, les barres noires représentant la nuit.
(Adapté de Clarke et Coleman, 1986)
3.3. Autres sorties comportementales.
En plus de l’activité locomotrice, des paramètres comportementaux peuvent attester de
l’anticipation et de la synchronisation à un repas unique. L’appui non renforcé sur un levier
et le comportement d’approche de la mangeoire sont des comportements couramment
mesurés donnant des profils similaires à ceux obtenus avec l’activité locomotrice et l’eau de
boisson. Dans le premier cas, l’animal a accès à un levier, en général proche de la mangeoire,
sur lequel il peut appuyer pour recevoir de la nourriture. La nourriture ne lui est fournie que
58
dans la période d’accès habituelle. On constate que plus on se rapproche de l’heure d’accès à
la nourriture, plus le nombre de pressions sur le levier augmente (Boulos et al., 1980 ;
Mistlberger, 1994). Dans le deuxième cas, le nombre de passages devant un faisceau
infrarouge situé à l’entrée de la mangeoire est comptabilisé par un système d’acquisition.
3.4. Température (FAT)
De la même manière que l’activité augmente dans les heures qui précèdent l’accès à la
nourriture, une thermogenèse anticipant l’arrivée de la nourriture (Food anticipatory
thermogenesis ; FAT) survient en même temps que la FAA (Challet et al., 1996a ; Recabarren
et al., 2005). Elle est visible aussi bien chez des animaux intacts que SCN lésés. De plus, elle
n’est pas dépendante de l’heure d’accès à la nourriture (Nelson et al., 1975). En plus de la
FAT, le nourrissage est suivi par une thermogénèse induite par la prise alimentaire (Dietinduced thermogenesis : DIT).
Thermogenèse anticipant
l’arrivée de la nourriture
38
Thermogenèse induite par
la prise alimentaire
37
Température
(°C)
36
35
Heures
Figure 24 : Thermogenèse anticipatoire et induite par une restriction alimentaire chez le rat.
La courbe s’étale sur deux jours consécutifs, le jour et la nuit étant respectivement représentés par les
rectangles blancs et hachurés. L’accès à la nourriture est figuré par les flèches noires sur l’axe des
abscisses. Cet accès est précédé par une augmentation de température (FAT) corrélé avec la FAA, et
suivi par un autre pic, induit par la prise alimentaire (DIT).
(Adapté de Challet et al., 1997c)
3.5. Corticostérone (FAC)
Tout comme pour la température et l’activité locomotrice, lors d’une restriction de l’accès à la
nourriture, un autre pic de corticostérone, en plus de celui qui s’exprime en fin de jour /
début de nuit en conditions ad libitum, apparaît en anticipation de l’accès à la nourriture
chez des animaux intacts. Il est présent que la nourriture soit présentée de jour ou de nuit
(Krieger, 1974 ; Nelson et al., 1975). Son amplitude peut être supérieure chez des rats
femelles par rapport aux mâles (Krieger, 1974).
59
Mâle
Femelle
Nourriture
Concentration
plasmatique de
corticostérone
(µg/100ml)
Heures
Figure 25 : Une restriction temporelle de l’accès à la nourriture entraîne le rythme journalier de
corticostérone chez des rats mâles et femelles.
Courbe des concentrations en corticostérone dans le plasma (µg/100ml) de rats mâles (lignes pleines)
ou femelles (lignes pointillées) soumis à une restriction temporelle de l’accès à la nourriture (accès
indiqué par les rectangles rouges). Le cycle LD est reporté en abscisse, les barres noires représentant la
nuit. Notez qu’à la fois chez les femelles et les mâles, un premier pic de corticostérone la nuit et un
second en anticipation de la nourriture. Ce phénomène est plus marqué chez la femelle.
(Adapté de Krieger 1974).
Les niveaux de corticostérone redescendent rapidement dès que l’animal a accès à la
nourriture. Ce profil est également observé lors d’un jeûne, mais les niveaux de
corticostérone diminuent moins vite (Itoh et al., 1980). La corticostérone étant associée aux
phénomènes de stress, il était possible qu’une restriction alimentaire constitue un stress,
expliquant ainsi le pic quotidien de corticostérone. Cependant l’apparition du pic de
corticostérone en anticipation du repas n’est pas corrélée avec l’apparition d’un pic
d’ACTH (Wilkinson et al., 1979). De plus, un stress d’immobilisation quotidien de 2 heures
entraîne une avance de phase du pic nocturne de corticostérone, mais aucun pic anticipatoire
n’est observable (Ottenweller et al., 1987). Le pic anticipatoire de corticostérone est donc
bien une sortie du FEO et il n’est pas relié à des phénomènes de stress.
3.6. Leptine et ghréline.
La leptine est un peptide relargué par le tissu adipeux blanc et la ghréline est libérée par les
cellules oxyntiques de la muqueuse gastrique. Elles véhiculent des signaux humoraux depuis
la périphérie vers les circuits neuronaux régulant l’homéostasie énergétique. Les neurones à
NPY du noyau arqué sont la cible principale de ces peptides. Ghréline et leptine stimulent et
60
inhibent respectivement la libération de NPY, augmentant ou diminuant en retour la prise
alimentaire. La leptine stimule le stockage des lipides dans le tissu adipeux alors que la
ghréline stimule la dépense énergétique (Kalra et al., 2003 pour revue).
Leptine et ghréline sont toutes deux rythmiques dans le plasma en conditions ad libitum
(animaux SCN intacts). Ce rythme est inversé en réponse à une restriction temporelle de
l’accès à la nourriture le jour, le pic plasmatique survenant avant ou après le repas principal
respectivement pour la ghréline et la leptine (Bodosi et al., 2004 ; Martinez-Merlos et al.,
2004).
Nourriture
% de la prise
totale sur 24 h
ng/ml
Leptine
plasmatique
pg/ml
Ghréline
plasmatique
Heures
Figure 26 : Altération des rythmes de leptine et de ghréline plasmatiques lors d’un nourrissage ad
libitum versus un nourrissage diurne chez le rat.
Les courbes représentent le rythme de prise alimentaire (en haut), de leptine plasmatique (au milieu) et
de ghréline plasmatique (en bas), sur 24 heures, en fonction du régime alimentaire. Les symboles
blancs indiquent un nourrissage ad libitum. Dans ce cas, les rats mangent principalement la nuit ; la
leptine et la ghréline sont rythmiques avec un pic en milieu de nuit et durant le jour respectivement.
Lors d’un nourrissage exclusivement le jour, un pic de prise alimentaire apparaît en début de jour. Le
rythme est inversé. La phase des rythmes de ghréline et de leptine est également inversée et leur
amplitude est accrue. Le jour et la nuit sont représentés par les fonds blanc et gris respectivement sur
chaque graphique.
(Adapté de Bodosi et al., 2004).
Les concentrations plasmatiques de leptine et de ghréline semblent donc fortement corrélées
aux rythmes de prise alimentaire. Elles pourraient donc être des entrées/sorties du FEO.
Cependant, concernant la leptine, le rythme observé en RF ne persiste pas lors d’un jeûne
consécutif à la RF (Martinez-Merlos et al., 2004). Il est donc probable que la leptine réponde
passivement à la prise alimentaire. Pour la ghréline, la question reste ouverte et de plus
amples expériences seront nécessaires pour répondre à cette question.
3.7. Paramètres métaboliques.
Un grand nombre de métabolites oscillent chez le rat en conditions d’alimentation ad libitum,
c’est à dire pour une prise alimentaire prédominante dans la phase obscure du nycthémère.
61
Cependant, ces rythmes journaliers ne semblent pas persister en conditions de jeûne
(Escobar et al., 1998). Les auteurs rapportent une réapparition d’un rythme d’acides gras
libres après 48 heures de jeûne, rythme non testé statistiquement et peu évident
graphiquement. Par contre, les rythmes observés en conditions ad libitum sont perturbés lors
d’une restriction alimentaire : leur amplitude a tendance à augmenter et le pic est décalé. De
plus, une autre étude rapporte que le rythme de LDL cholestérol est décalé de 8 heures lors
d’une restriction alimentaire (Velasco et al., 1994). Seul le glucose ne semble pas affecté par
la RF (Diaz-Munoz et al., 2000). Cependant, le pic du rythme en conditions ad libitum
(transition nuit/jour) ne correspond pas à ce qui a pu être rapporté par d’autres auteurs
(transition jour/nuit - Kalsbeek et Strubbe, 1998 ; La Fleur et al., 1999). Diaz-Munoz et
collaborateurs indiquent qu’en RF, le pic se trouve quelques heures après l’accès à la
nourriture. Il semblerait donc que le glucose soit aussi affecté par une RF.
Une autre possibilité est que les rythmes métaboliques soient la conséquence d’une
oscillation des hormones qui contrôlent leur homéostasie, comme par exemple l’insuline et
le glucagon. S’il a été démontré qu’insuline et glucagon répondaient passivement à l’accès à
la nourriture (La Fleur et al., 1999), il n’en demeure pas moins que ces paramètres peuvent
être influencés par une RF. L’insuline atteint son nadir dans les heures qui précèdent l’accès à
la nourriture, temps auquel le glucagon est au plus haut, indiquant ainsi un état catabolique
dominant. Après l’accès à la nourriture, la tendance s’inverse : la quantité plasmatique
d’insuline augmente et celle de glucagon diminue (Diaz-Munoz et al., 2000). Une fois encore,
il est difficile d’établir si les pic et nadir d’insuline et de glucagon en anticipation du repas
sont contrôlés par le FEO. De plus amples expériences combinant des lésions des SCN à une
RF et à une période de jeûne pour contrôler la persistance du phénomène seront nécessaires.
4. Réception d’un synchroniseur ?
La première caractéristique d’une horloge, pré requise pour étayer notre thèse, est que celle-ci
reçoive des informations provenant de l’environnement. Il est évident cependant que pour
nous assurer que cette horloge reçoit des informations, nous devons observer une modification
dans l’une ou plusieurs des sorties de cette horloge. Pour l’heure, nous nous concentrerons sur
la sortie la plus communément utilisée : l’activité locomotrice.
4.1. Non photique.
4.1.1. Disponibilité alimentaire.
Comme décrit par F.K. Stephan et collaborateurs en 1979, la disponibilité alimentaire est le
premier paramètre de l’environnement qui, lorsqu’il est modifié, engendre une adaptation
de l’activité locomotrice. Une restriction temporelle de l’accès à la nourriture (RF) ou une
ration hypocalorique distribuée quotidiennement à heure fixe (RC) entraînent l’expression
d’une FAA chez des animaux SCN intacts (Mistlberger, 1994 ; Challet et al., 1997c ; Castillo
et al., 2004 ; Mendoza et al., 2005c ; Abe et al., 2007) ainsi que chez des animaux SCN lésés,
62
restaurant ainsi une rythmicité (Stephan et al., 1979 ; Coleman et al., 1982 ; Stephan, 2002).
Dans le cas d’une RF, la FAA apparaît quelle que soit la durée d’accès à la nourriture (4 à
12 heures ; Stephan et Becker, 1989). De plus, les rats sont capables d’anticiper 2 repas,
séparés par 6 ou 8 heures, mais ils n’anticipent pas 3 repas séparés chacun par 8 heures ce qui
exclut un apprentissage de l’intervalle entre deux repas dans ces mécanismes. Dans le cas du
protocole à 3 repas, les animaux n’anticipent que 2 repas (Stephan, 1989 ; Mistlberger, 1994).
Les rats sont en outre capables de discriminer deux accès temporels différents dans deux
endroits différents et anticipent correctement par des pressions sur un levier les heures et
place de chaque accès (Boulos et Logothetis, 1990). Enfin, l’anticipation de deux repas
présentés l’un toutes les 25 heures et l’autre toutes les 26 heures, donc avec des périodes
différentes, est possible, bien que la FAA ne soit pas toujours stable pour les deux repas
(Mistlberger, 1994 pour revue).
En plus de l’activité locomotrice, RF et RC modifient les patrons d’expression de tous les
paramètres cités en section IV-3. Il est donc clair que le FEO est capable de recevoir les
informations relatives à ce synchroniseur alimentaire.
4.1.2. Anticipation d’un apport en sel.
Si l’anticipation d’un accès quotidien à la nourriture est possible, il n’en est pas de même pour
le sel si son accès est limité à une fois par jour, une nourriture appauvrie en sel étant
distribuée ad libitum. Ainsi, la restriction à 2 heures par jour de l’accès à une solution salée ou
à de la nourriture salée n’entraîne pas de comportement anticipatoire (activité de roue), y
compris si les animaux ont subi des traitements supposés augmenter l’appétence pour cet
élément (Rosenwasser et al., 1985).
4.1.3. Anticipation d’un seul nutriment.
Des rats n’anticipent pas un accès quotidien à une source de carbohydrates, protéines ou
lipides (activité de roue, activité générale ou approche de la mangeoire), les autres nutriments
étant disponibles ad libitum (Mistlberger et al., 1990). Par contre, les rats sont capables
d’anticiper 2 repas, chacun constitué d’un seul nutriment, les deux nutriments étant
complémentaires (protéines et carbohydrates ou protéines et lipides). Dans ce cas, la quantité
de calories ingérées est réduite. Même si une restriction calorique n’est normalement pas
nécessaire à l’expression de la FAA (Mistlberger et Rusak, 1987), il semble que la teneur
énergétique (absolue ou relative à la prise alimentaire totale) d’un repas composé d’un seul
nutriment soit importante pour que ce nutriment ait un pouvoir de synchronisation sur le
FEO (Mistlberger et al., 1990). Cette hypothèse est partiellement confirmée par une autre
étude sur la capacité d’un nutriment unique (glucose, saccharine, huile végétale ou minérale) à
décaler la FAA après un décalage horaire de l’accès à la nourriture (Stephan et Davidson,
1998). Des animaux entraînés à une RF présentent une FAA qui se resynchronise en quelques
jours après un décalage de l’accès à la nourriture (voir section IV-6-1). Seul un repas
constitué de glucose avait la capacité de remettre rapidement à l’heure le FEO. Pour les
63
autres nutriments, soit la remise à l’heure était lente (saccharine), soit la FAA était diminuée,
à la fois pour l’activité de roue et l’approche de la mangeoire (huiles). Il est donc possible que
l’huile, malgré un contenu calorique important, ne soit pas un zeitgeber satisfaisant pour
entraîner le FEO, peut être à cause de son absorption plus lente par le système digestif
(Stephan et Davidson, 1998).
4.1.4. Repas appétitifs
La question a été posée de savoir si la restriction était une composante nécessaire pour
qu’une FAA se développe. Un protocole a ainsi été mis en place où un accès quotidien de jour
à une pâte à base de chocolat ou de beurre de cacahuète, est associé à une nourriture ad
libitum. En quelques jours, une FAA se développe, qui est similaire à celle observée dans les
protocoles de RF classiques (Mistlberger et Rusak, 1987 ; Mendoza et al., 2005a). La prise
alimentaire nocturne diminue d’autant plus que la quantité de pâte chocolatée ingérée
augmente. Par contre, aucune FAA n’est observable si la pâte chocolatée est dépourvue de
valeur nutritive ou si sa quantité est limitée à quelques grammes par jour (Mistlberger et
Rusak, 1987). Il semble donc qu’un repas d’une valeur nutritive significative soit requis
pour qu’une anticipation se manifeste. Par contre, une restriction quantitative de la
nourriture n’est pas nécessaire pour induire la FAA. Cette observation, effectuée chez le
rat a été dans une certaine mesure confirmée avec le hamster doré, chez lequel la FAA en
réponse à un accès quotidien à une pâte chocolatée ne s’exprime que si les SCN sont
endommagés ou la nourriture traditionnelle légèrement limitée (Abe et Rusak, 1992).
4.1.5. Eau.
Si une modification de la disponibilité alimentaire entraîne de manière évidente un oscillateur
alimentaire, il ne semble pas en être de même pour la disponibilité en eau. Chez le hamster,
une restriction à 2 heures d’accès quotidien à un biberon durant le jour entraîne l’apparition
d’une composante d’anticipation, la nourriture étant distribuée ad libitum. Cependant cette
restriction s’accompagne d’une modification du patron de prise alimentaire, un repas
important (jusqu’à 55% de la prise quotidienne) apparaît durant la période d’accès à l’eau de
boisson (Mistlberger, 1993). Dans ce cas, il n’est pas possible de s’affranchir de l’influence de
la réorganisation de la prise alimentaire. Cette possibilité est également abordée dans une
étude où l’accès à l’eau de boisson est limité à une demi-heure par jour. Dans ce cas, un pic
anticipatoire de corticostérone apparaît avant l’accès au biberon et diminue la sécrétion
d’hormone de croissance (growth hormone : GH) et d’hormone stimulant la thyroïde (Thyroid
stimulating hormone : TSH). Les auteurs attribuent cependant ces phénomènes à une
réduction concomitante de la prise alimentaire (Armario et Jolin, 1986). R. Mistlberger a
mis en place un protocole permettant de dissocier la composante alimentaire de la prise
hydrique afin de déterminer si l’oscillateur alimentaire était également influencé par la
disponibilité en eau, et si différentes sorties de l’oscillateur pouvaient répondre différemment.
Il a ainsi restreint l’accès à l’eau à une heure par jour, en milieu de jour, et l’accès à la
64
nourriture à la période nocturne. Dans ce protocole les rats ne présentaient jamais
d’anticipation de l’accès à l’eau dans leur activité de roue. Quelques rats seulement
présentaient une petite anticipation dans le comportement d’approche du biberon. Lorsque
l’accès à l’eau et à la nourriture étaient séparés de 7, 10 ou 12 heures, alors que l’anticipation
de la nourriture était évidente, l’anticipation de l’eau était faible voire inexistante
(Mistlberger, 1992). L’eau, si elle peut être un zeitgeber pour l’oscillateur alimentaire, n’a en
tout cas pas la même puissance de synchronisation que la nourriture.
4.1.6. Pharmacologie.
La méthamphétamine est un agoniste catécholaminergique. Une injection quotidienne de
méthamphétamine induit un comportement rappelant la FAA, l’activité augmentant dans
les 2 heures suivant l’injection et continuant pendant plusieurs heures (Shibata et al., 1994 ;
Shibata et al., 1995). Une étude récente démontre qu’une injection quotidienne d’adrénaline,
mais pas de noradrénaline, induit une anticipation dans le comportement de prise
hydrique. Cette anticipation n’est cependant pas aussi intense que celle observée lors d’une
RF (Mendoza et al., 2003). Il est donc possible que la « FAA » observée pour l’injection
quotidienne de méthamphétamine soit médiée par les récepteurs adrénergiques. L’activité
locomotrice induite par la méthamphétamine est également observée chez des animaux
présentant des lésions des SCN (Iijima et al., 2002). De plus, ce type de protocole provoque
une modification de l’expression des gènes horloges (Per1, Per2, Bmal1, Npas2) dans le
striatum, mais pas dans les SCN (Iijima et al., 2002).
Un traitement chronique de rats présentant des lésions des SCN avec de la méthamphétamine
distribuée dans l’eau de boisson peut induire une restauration du rythme d’activité
locomotrice en libre cours (Honma et al, 1987a). Ce rythme n’est pas dépendant du cycle
LD, mais il peut être entraîné par une RF. Cependant, dans ce cas la FAA n’apparaît pas en
anticipation de l’accès à la nourriture, mais après l’accès à la nourriture. Une FAA
« traditionnelle » est par ailleurs absente dans ce type de protocoles (Honma et al., 1989).
Deux interprétations sont possibles pour ce phénomène : soit la méthamphétamine agit sur
une autre horloge que le FEO, ce qui expliquerait qu’une période de libre cours apparaisse
lorsque la méthamphétamine est délivrée de manière chronique dans l’eau de boisson,
démasquant ainsi cette horloge ; soit la méthamphétamine agit directement sur le FEO et
modifie l’entraînement du FEO à la nourriture. Cette seconde hypothèse est plus probable,
sachant qu’aucune activité n’est observable en anticipation du nourrissage alors que le FEO
doit toujours fonctionner.
4.2. Photique.
Les SCN semblent être LA structure dédiée à la réponse photique. Si la nourriture peut influer
sur la synchronisation des SCN (Challet et al., 1997c ; Challet et al., 1998 ; Mendoza et al.,
2005c), il ne semble pas en être de même pour la lumière sur le FEO, les animaux SCN
lésés étant arythmiques dans tous les paramètres mesurés en absence de restriction
65
alimentaire. De plus, l’expression de la FAA est indépendante des conditions lumineuses
chez des animaux SCN lésés (Yoshihara et al., 1997). Cependant, si des rats sont restreints à 2
heures d’accès à la nourriture 2 heures après l’allumage des lumières, la FAA s’exprime alors
à la transition jour/nuit ; lorsque la nourriture est de nouveau distribuée ad libitum, la FAA
disparaît. Elle réapparaît normalement lors d’un jeûne à l’heure attendue du repas. Si, durant
la période ad libitum, le cycle LD a été avancé ou retardé, la FAA réapparaît lors d’un jeûne
non pas à l’heure précédent le décalage horaire, mais à la nouvelle transition jour/nuit, c’est à
dire à la même phase du nycthémère (Ottenweller et al., 1990). De plus, lorsque des rats
soumis à une restriction calorique en LD sont par la suite relâchés en conditions ad libitum
en DD, la FAA peut continuer en libre cours, parallèlement à l’activité contrôlée par les
SCN, durant quelques jours (Challet et al., 1998).
Ces études démontrent que même si le FEO n’est pas directement sensible à la lumière, il est
très probable qu’il soit couplé aux SCN, qui serviraient alors de repère de phase par rapport
au cycle LD, qui influerait ainsi indirectement sur le FEO (voir Stephan, 1986).
5. A la frontière entre réception et distribution : Connectique de l’horloge
alimentaire.
Se basant sur un ensemble d’expériences combinant lésion ou blocage d’un système de
neurotransmetteurs et protocoles de restriction alimentaire, un certain nombre de voies
possiblement impliquées dans le transport des informations vers ou depuis le FEO ont été
dégagées.
5.1. Systèmes de neurotransmetteurs et neuropeptides
5.1.1. Le système glutamatergique
Parmi les systèmes de neurotransmetteurs impliqués dans une certaine mesure dans
l’expression de la FAA, le système glutamatergique, largement réparti dans le système
nerveux central, semble être incontournable. Le blocage des récepteurs NMDA au glutamate
par une injection quotidienne de l’agoniste non compétitif MK-801 réduit de manière dose
dépendante l’expression de la FAA (Ono et al., 1996). Malheureusement, connaissant la
répartition très large de ce système, il est impossible de déterminer si la FAA disparaît suite à
une impossibilité du FEO de transmettre son message ou suite à l’acheminement défectueux
des informations vers le FEO. Il est donc probable que les effets observés soient peu
spécifiques.
5.1.2. Le système dopaminergique.
Les neurotransmetteurs impliqués dans la FAA peuvent être identifiés en traitant des rats avec
des agonistes ou des antagonistes de ces neurotransmetteurs avant l’accès à la nourriture.
C’est l’approche qui a été utilisée pour la dopamine. Le noyau accumbens et ses afférences
dopaminergiques semblent responsables de l’augmentation de l’activité lors d’un jeûne ou de
66
l’hyperactivité induite par une injection d’amphétamines. L’activité dopaminergique dans le
noyau accumbens est augmentée avant l’heure du nourrissage dans les protocoles de
restriction alimentaire (Mistlberger et Mumby, 1992). Inversement, l’ingestion d’un repas
quotidien non nutritif mais appétant n’entraîne pas la FAA et n’augmente pas le métabolisme
dopaminergique dans le noyau accumbens. Le système dopaminergique mésolimbique
pourrait donc véhiculer les messages afférents au FEO ou faire partie intégrante du FEO.
Un traitement quotidien à l’halopéridol (antagoniste des récepteurs à la dopamine) de rats en
RF diminue le niveau de base d’activité mais n’empêche pas l’expression de la FAA, qui
persiste en conditions de jeûne (Mistlberger et Mumby, 1992). Il est donc probable que le
système dopaminergique ne soit essentiel ni à la génération de la FAA, ni à son maintien.
5.1.3. Le système noradrénergique.
Ear2 (Nr2f6), COUP-TFI et COUP-TFII sont des membres de la sous famille des récepteurs
orphelins et sont impliqués dans la formation des neurones dopaminergiques
mésencéphaliques. Ear2 peut homo- ou hétéro-dimériser avec COUP-TFI et COUP-TFII
(Avram et al., 1999) et se fixer à des séquences activatrices dans le promoteur de multiples
gènes. Chez des souris Ear2-/-, la majeure partie du locus coeruleus est absente ; Or cette
structure est à l’origine de l’essentiel des projections noradrénergiques chez les mammifères
vers un grand nombre de structures cérébrales, particulièrement dans le télencéphale
(Warnecke et al., 2005). Aston-Jones et collaborateurs (2001) ont rapporté que la fréquence de
décharge des neurones du locus coeruleus présente un rythme circadien, suggérant une
participation de cette structure dans la transmission des rythmes (Aston-Jones et al., 2001).
Il envoie d’ailleurs des projections vers les SCN. Partant de l’observation que le rythme de
Per1 est amorti dans le cortex frontal des souris Ear2-/-, et que ce mutants s’adaptent plus
lentement que de souris sauvages à un décalage horaire, l’hypothèse a été avancée que ces
mutants avaient un système de mesure du temps altéré (Warnecke et al., 2005). Il était
donc possible que ce défaut se répercute sur l’adaptation à une restriction alimentaire. En
effet, lorsque les souris Ear2-/- étaient soumises à une RF, la FAA était significativement
réduite par rapport aux souris sauvages. De même, une réduction drastique de la quantité
de noradrénaline était observée dans le cortex frontal des mutants (Warnecke et al., 2005).
Même si la réduction de FAA est évidente dans cette expérience, la noradrénaline peut ne pas
être le seul neurotransmetteur responsable de ces effets : les neurones du locus coeruleus
expriment également des neuropeptides comme l’AVP, la galanine ou le NPY. Leur absence
peut être responsable plus ou moins directement de la diminution de la rythmicité dans le
cortex frontal et de la réduction de la FAA. De plus, aucune expression de gènes horloges
connus n’a pu être détectée dans le locus coeruleus, ce qui indiquerait que cette structure
n’abriterait pas d’oscillateur et ne serait donc qu’un relais vers le cerveau antérieur. Ce rôle
de relais pourrait être appliqué aussi bien pour les SCN que pour le FEO. Dans ce dernier cas,
67
une perturbation de la fonction du locus coeruleus pourrait conduire à un acheminement
partiel des entrées au FEO ou à des signaux de sortie incomplets vers les effecteurs du FEO,
aboutissant à une diminution de la FAA.
5.1.4. Le système histaminergique.
Une cartographie des noyaux cérébraux activés durant la FAA et formant une voie
ascendante promouvant l’éveil a pu être réalisée dans une expérience utilisant l’expression
de c-FOS. Les résultats indiquent que les neurones histaminergiques dans la partie ventrale
des noyaux tubéromammillaires sont activés en anticipation du nourrissage (Inzunza et al.,
2000). Les auteurs proposent que l’augmentation de l’activation des noyaux
tubéromammillaires contribue à l’éveil des animaux durant la FAA. De plus il a été
démontré ultérieurement que 35% des neurones histaminergiques de cette structure étaient
activés en anticipation du nourrissage puisqu’ils expriment c-FOS à un niveau maximal
durant la FAA (Meynard et al., 2005). De nouvelles études devront être réalisées afin de
déterminer l’importance des neurones histaminergiques dans le transport des informations et
l’éveil associé à la FAA.
5.1.5. Le système opioïdergique.
Durant l’activation d’un comportement anticipatoire d’une récompense (ici la nourriture),
le système opioïdergique mésolimbique est activé et permettrait de surmonter la fatigue pour
accomplir une tâche (ici la recherche alimentaire sous forme d’activité locomotrice ; Spruijt et
al., 2001). L’aire tegmentale ventrale contient les corps cellulaires des neurones
dopaminergiques des aires mésolimbiques. Sur ces neurones, les récepteurs aux opioïdes,
parmi lesquels les récepteurs µ-opioïdes, augmentent la libération de dopamine dans le
striatum ventral lorsqu’ils sont activés. Des souris KO pour les récepteurs µ-opioïdes
présentent une diminution de la FAA lorsqu’ils sont soumis à une restriction alimentaire,
comparés aux souris sauvages. Ils présentent un patron d’activité différent des souris
sauvages pour lesquelles la quantité d’activité durant la FAA est supérieure à la quantité
d’activité durant l’accès à la nourriture. Chez les souris KO, la quantité d’activité est
équivalente avant et pendant l’accès à la nourriture. Notons que la perte de poids est
équivalente pour les deux génotypes (Kas et al., 2004). Sachant que les récepteurs µ-opioïdes
régulent l’activité des neurones dopaminergiques mésolimbiques, il est possible que ceuxci aient perdu leur capacité d’activation suite à l’invalidation des récepteurs µ-opioïodes, ce
qui expliquerait éventuellement la diminution de la FAA. Or, une injection sous cutanée de damphétamine, agoniste du système dopaminergique, induit une augmentation de l’activité
locomotrice plus importante chez les souris KO que chez les souris sauvages. Cela démontre
que les neurones dopaminergiques sont toujours activables (Kas et al., 2004). Ces résultats
suggèrent un rôle des opioïdes dans l’adaptation comportementale à des récompenses, ici la
disponibilité alimentaire. Cette hypothèse a été confirmée récemment par Yoshida et
collaborateurs qui démontrent que le rythme d’expression des récepteurs µ-opioïdes, qui
68
présente un pic d’expression au début de la phase obscure en conditions ad libitum, est décalé
vers le début du jour en RF (nourrissage en début de jour). Ce pic est concomitant du pic de
corticostérone dans les deux conditions, et le rythme journalier d’expression de l’ARNm des
récepteurs µ-opioïdes est aboli chez des animaux surrénalectomisés (Yoshida et al., 2006).
Il est donc probable que le système opioïdergique soit impliqué dans la modulation des
comportements associés à une récompense, mais de manière indirecte via les
glucocorticoïdes.
5.1.6. Le système orexinergique.
Les orexines (ou hypocrétines) A et B sont des neuropeptides pour lesquels on peut trouver
des récepteurs (orexine-1 et orexine-2) dans le télencéphale, les noyaux hypothalamiques,
thalamiques, le tronc cérébral et la moelle épinière. Les neurones orexinergiques sont
exclusivement localisés dans l’hypothalamus, majoritairement dans l’aire périfornicale, les
noyaux hypothalamiques dorsomédiaux et l’aire hypothalamique latérale (Peyron et al.,
1998). Ils projettent vers un grand nombre d’aires cérébrales, et particulièrement dans
l’hypothalamus. Parmi les projections extra-hypothalamiques, la plus importante arrive dans
le locus coeruleus. Des fibres ont également été identifiées comme projetant sur le septum, le
BNST, les noyaux paraventriculaire et reuniens du thalamus, la zona incerta, le noyau
subthalamique, la substantia nigra, les noyaux du raphé, l’aire parabrachiale, la formation
réticulée médullaire et le noyau du tractus solitaire. Des projections moins importantes ont été
observées vers les régions corticales, l’hippocampe, les noyaux amygdaloïdes antérieur et
central et les bulbes olfactifs (Peyron et al., 1998 ; Date et al., 1999).
Les orexines, administrées dans les ventricules cérébraux par exemple, augmentent
l’activité locomotrice et les comportements motivés. Elles coordonnent également les
patrons de veille/sommeil (Hagan et al., 1999). De plus, des souris déficientes pour le gène
codant pour les orexines ou n’ayant pas de neurones à orexines présentent un phénotype
similaire à la narcolepsie humaine (Chemelli et al., 1999). Une relation étroite a également
été établie entre orexines et nourriture puisqu’une injection centrale d’orexines déclenche la
prise alimentaire (Mignot et al., 2002). Connaissant l’importance des orexines dans la
coordination de l’éveil et dans les comportements motivés comme la recherche alimentaire,
Akiyama et collaborateurs (2004) ont testé l’activation des neurones à orexines
(immunoréactivité pour c-FOS) en réponse à une restriction alimentaire. L’apparition de la
FAA a de plus été mesurée chez des souris sauvages ou chez des souris mutantes présentant
une dégénérescence précoce des neurones à orexines, suite à la co-expression du gène de
l’orexine avec la partie C-terminale de l’ataxine-3. L’ADNc de l’ataxine-3 possède une
extrémité anormalement longue codant pour une queue de polyglutamines et induit l’apoptose
des cellules lorsqu’elle est exprimée de manière exogène (Hara et al., 2001). La RF décale de
6 heures le pic d’expression de c-FOS dans les cellules à orexines de la nuit vers le jour
chez des souris sauvages. Il est intéressant de constater que la FAA est réduite chez les
69
souris mutantes. Il semble que les neurones à orexines ne soient pas responsables de la
génération de la FAA en elle-même mais qu’ils participeraient à l’éveil concomitant de la
FAA (Akiyama et al., 2004).
FAA
RF
WT
Mutants orexines
% de l’activité
totale
ZT (heures)
Figure 27 : Diminution de la composante d’anticipation chez des souris mutantes pour les orexines.
Les courbes noire (souris mutantes) et blanche (souris WT) représentent la quantité d’activité de roue
pour une heure d’enregistrement, en % de l’activité totale journalière. La nourriture est distribuée entre
ZT5 et ZT9 (indiqué par l’abréviation RF dans le rectangle blanc à l’intérieur du graphique). Le cycle
LD est figuré par les rectangles horizontaux noir (nuit) et blanc (jour) au dessus du graphique. Noter
que la FAA (dans le rectangle gris) est réduite chez les souris mutantes orexines.
(Adapté de Akiyama et al., 2004).
Ces résultats ont été confirmés par une autre étude recherchant l’implication des orexines dans
l’établissement et le maintien de la FAA induite par la restriction alimentaire (Mieda et al.,
2004) chez la même souche de souris. Cependant, l’ablation des neurones à orexine dans
l’hypothalamus latéral suite à une injection dans cette structure d’hypocrétine-2 couplée à
une saporine (protéine inactivant les ribosomes) n’abolit pas la composante d’anticipation
de boisson et d’approche de la mangeoire chez des rats (Mistlberger et al., 2003). Les rats
deviennent cependant hypophagiques, hypodipsiques et perdent du poids. Malgré cela,
l’amplitude des rythmes de prise hydrique et de prise alimentaire est conservée.
Ces études utilisent des mesures du comportement anticipatoire sur différents paramètres
et ne sont par conséquent pas totalement comparables. Il est ainsi possible que l’anticipation
n’ait pas été visible dans l’étude de Mistlberger et collaborateurs si les auteurs avaient mesuré
l’activité locomotrice, et inversement que la mesure de la prise hydrique n’ait pas révélé
d’altération de la composante d’anticipation dans les études d’Akiyama et collaborateurs et de
Mieda et collaborateurs. De plus, dans les premières études, la totalité des neurones à orexines
et leurs projections ont été supprimés alors que dans la seconde, seuls les neurones de
l’hypothalamus latéral ont été détruits.
70
L’ensemble de ces résultats suggère que les neurones à orexines pourraient véhiculer des
signaux efférents depuis le FEO, augmentant ainsi l’éveil et maintenant les comportements
anticipatoires dans les heures précédant l’accès à la nourriture. Ils ne seraient pourtant pas à
l’origine de la genèse de la FAA. Dans des conditions naturelles, ces neurones pourraient
être essentiels pour que l’animal exprime un comportement de recherche alimentaire en
réponse à une réduction de la disponibilité alimentaire. De plus amples investigations seront
nécessaires pour établir si les neurones orexinergiques sont essentiels à la composante
locomotrice de l’anticipation, ou à d’autres sorties du FEO comme le pic anticipatoire de
corticostérone ou de température.
6. Intégration des synchroniseurs.
Dans les SCN, il avait été possible de démontrer l’intégration d’un synchroniseur à la fois par
le changement d’un paramètre physiologique et par la modification de l’expression des gènes
horloges. Cette dernière méthode n’est pas accessible en ce qui concerne le FEO,
premièrement parce que l’on ne connaît pas de manière précise la machinerie moléculaire du
FEO et ensuite parce qu’on n’a pas accès à son substrat anatomique, ce qui nous interdit toute
analyse moléculaire in situ.
Par contre, le simple fait que chez des animaux SCN lésés ayant des profils d’activité, de
température, de corticostérone arythmiques, on puisse restaurer des rythmes par une
restriction alimentaire pour ces trois paramètres (voir sections 3 de cette partie), démontre que
l’information est intégrée. Une structure intègre et redistribue donc un message rythmique à
ses sorties, les synchronisant ainsi à 24 heures.
D’autres expériences vont également dans le même sens :
6.1. Décalage horaire de l’accès à la nourriture.
Lors d’expériences de décalage horaire sur les SCN, les animaux expriment des transitions
de l’activité locomotrice avant de se resynchroniser au nouveau cycle LD (Daan et Aschoff,
2001). Partant de l’idée qu’une horloge, lorsqu’elle est synchronisée à un élément de son
environnement va être mise à l’heure progressivement si cet indicateur est déplacé dans le
temps, la réaction du FEO, et donc de ses sorties, a été testée en réponse à des décalages de
l’heure d’accès à la nourriture. Des animaux aux SCN lésés ont été entraînés à 2 heures
quotidiennes d’accès à la nourriture, puis cet accès a été avancé ou retardé de 4, 6 ou 8
heures. Tous les rats exposés à des retards de phase répondaient par des transitions dans
l’activité locomotrice qui apparaissait chaque jour un peu plus tard, se rapprochant ainsi de la
nouvelle heure d’accès à la nourriture. Ces transitions ne sont évidentes à la fois dans
l’initiation et l’extinction de la FAA que pour un retard de 8 heures, mais sont visibles dans le
début de l’activité anticipatoire pour 4 heures et 6 heures de décalage (Figure 28). Dans le cas
d’avances de phase de l’accès à la nourriture, soit aucune transition n’était observée et la FAA
apparaissait en anticipation de la nouvelle heure du nourrissage en quelques jours, soit des
71
transitions étaient observées dans l’activité locomotrice. Dans ce cas, la FAA se décalait
chaque jour vers le nouvel accès à la nourriture, non pas par des avances de phase, mais par
des retards de phase, tout comme dans le premier cas. Une association des deux phénomènes
(réapparition spontanée et transitions) a également pu être observée (Stephan, 1984 ;
Mistlberger, 1994).
Figure 28 : Décalage horaire de l’accès à la nourriture chez des rats SCN lésés.
Actogramme en double représentation d’un rat ayant subi une lésion des SCN (indiqué par la flèche en
haut de l’actogramme) suivie d’une restriction temporelle de l’accès à la nourriture (indiquée par les
rectangles rouges). Les rats, initialement placés es LD, sont alors transférés en DD. En quelques jours,
une FAA apparaît. L’accès à la nourriture est ensuite décalé de plusieurs heures (indiqué à gauche de
l’actogramme). La FAA se décale progressivement vers le nouvel accès à la nourriture. L’étoile
correspond à une période de jeûne où la FAA réapparaît à l’heure attendue.
(Adapté de Stephan 1984).
Ces résultats accroissent la possibilité que le FEO soit non pas un oscillateur mais bien une
horloge. En effet, les transitions successives ne sont pas explicables par des phénomènes de
mémoire ou de conditionnement. Si c’était le cas, la FAA disparaîtrait à la première heure
d’accès pour réapparaître à la seconde sans transition, ou encore deux FAA coexisteraient
quelques jours avant que seule la deuxième s’exprime. Nous avons donc ici un argument fort
pour dire que le FEO serait en fait une horloge.
6.2. Limites de l’entraînement.
La FAA, sortie comportementale du FEO, ne peut s’exprimer en réponse à une RF que si la
période de présentation de la nourriture se trouve dans le domaine circadien : ainsi, des
72
rats SCN lésés sont capables de présenter une FAA si la nourriture est présentée au moins
toutes les 23 heures (mais pas moins) et au plus toutes les 32 heures (mais pas plus). En
dehors de cette fourchette circadienne, l’activité locomotrice est rythmique (et ce malgré le
fait que les animaux soient SCN lésés) mais avec une période différente de celle du zeitgeber
(présentation de la nourriture). Cet échappement est typique des conditions où
l’entraînement n’est pas possible (Stephan, 1981 ; Mistlberger, 1994).
Une fois encore, ce phénomène ne peut être attribué seulement à des processus de mémoire :
effectivement, il n’est pas explicable dans ce cadre qu’un animal puisse estimer une
fourchette de temps de 23 ou 24 heures, mais pas une période de 22 heures.
Périodes d’entraînement
inférieures à 24 heures
Périodes d’entraînement
supérieures à 24 heures
Figure 29 : Limites d’entraînement de la FAA à différentes périodes d’accès à la nourriture.
Actogrammes en double représentation de rats ayant subi des lésions des SCN. Les animaux sont en
DD et les heures sont reportées en haut de chaque actogramme. L’indication « AD LIB » correspond à
la période où les animaux sont nourris ad libitum. Dans ce cas, ils sont arythmiques. Les rats sont
ensuite soumis à une restriction temporelle de l’accès à la nourriture, celle-ci étant disponible toutes
les 20 à 33 heures. Les lignes à l’intérieur des actogrammes indiquent le début de l’accès. Si les rats
sont capables d’anticiper chaque période, la FAA précède la ligne à chaque fois. C’est le cas pour les
périodes comprises entre 23 et 31 heures, mais pas au delà. La FAA n’est alors plus observable avant
l’accès à la nourriture. A la fin de l’expérience, les animaux sont de nouveau laissés en conditions ad
libitum.
(Adapté de Stephan 1981).
7. Fonctionnement de l’horloge alimentaire : élaboration du message rythmique ?
7.1. Des gènes horloges ?
Nous avons vu en section II-4 que l’élaboration d’un message circadien par les SCN reposait
sur des boucles moléculaires impliquant un ensemble de gènes horloges. Ces gènes horloges
73
étant exprimés de manière ubiquitaire dans les cellules d’un organisme, de nombreux auteurs
ont émis l’hypothèse que si une horloge tissulaire existait hors des SCN, elle devait
probablement fonctionner sur le même modèle que ceux-ci. De la même manière que l’utilité
de tel ou tel gène horloge pour le fonctionnement des SCN a été établie sur la base d’études
réalisées chez des animaux mutants, des souris mutantes pour divers gènes horloges ont été
utilisées pour répondre à cette question concernant le FEO. Ainsi ces animaux ont été soumis
à une restriction alimentaire, considérant que si la mutation n’affecte pas l’expression de la
FAA, alors le gène n’entre pas dans la machinerie du FEO et inversement qu’une mutation
affectant l’une ou l’autre des sorties du FEO indiquerait l’implication du gène dans la
synchronisation alimentaire et donc probablement dans les mécanismes moléculaires du FEO.
7.2. Les KO pour les gènes horloges.
7.2.1. Clock.
Le premier gène testé dans le domaine, a été le gène Clock, membre de la boucle positive
principale des SCN. Considérant que Clock était important pour les SCN il apparaissait
logique qu’il le soit également dans le FEO. Cependant, lorsque ces souris mutantes ont été
soumises à un accès à la nourriture quotidien de 4 heures, elles présentaient une FAA
normale. Cette observation était indépendante des conditions lumineuses puisque valable à la
fois en LD et en DD, condition où les souris Clk/Clk sont arythmiques (Pitts et al., 2003). Il
semblerait donc que Clock ne soit pas essentiel pour l’expression de la FAA. Il est donc
probable qu’il n’entre pas dans la machinerie moléculaire de la FEO.
74
Figure 30 : Actogrammes représentatifs de deux souris sauvages (WT) et deux souris mutantes pour le
gène Clock (Clk/Clk) en LD (gauche) ou en DD (droite), soumises à une restriction alimentaire.
Le régime lumineux est indiqué au dessus de chaque actogramme. La zone grisée correspond à la
période durant laquelle la nourriture est disponible. Les rectangles jaunes indiquent la FAA. Celle-ci
est évidente pour les deux génotypes aussi bien en LD qu’en DD. Après la restriction alimentaire, les
animaux en LD sont replacés en conditions ad libitum quelques jours, puis soumis à un jeûne pour
contrôler la réapparition de la FAA. Elle n’est évidente dans aucun des génotypes.
AL : nourriture ad libitum ; FR : restriction alimentaire ; TD : jeûne.
(Adapté de Pitts et al., 2003).
7.2.2. Npas.
Considérant que le gène Clock ne serait pas impliqué dans la machinerie moléculaire soustendant le fonctionnement circadien de l’horloge alimentaire, un autre partenaire possible
de Bmal1 a été recherché.
De nombreux autres facteurs de transcription comprenant des domaines bHLH-PAS et ont
été identifiés. Parmi eux, la famille des gènes NPAS (neuronal PAS domain protein) compte
trois membres : NPAS1, NPAS2 et NPAS3. Ils sont exprimés majoritairement dans le
système nerveux central, bien que NPAS2 et NPAS3 soient également présents dans quelques
tissus périphériques (Zhou et al., 1997 ; Brunskill et al., 1999).
En 2001, NPAS2 est identifié comme analogue de CLOCK dans le cerveau antérieur. Il
n’est pas exprimé à des niveaux détectables en hybridation in situ dans les SCN. Cependant,
des études récentes indiquent qu’il dimériserait avec BMAL1 dans les SCN en absence de
Clock (DeBruyne et al., 2006, DeBruyne et al., 2007). Il a en outre été démontré que la coinduction de NPAS2 avec BMAL1 pouvait activer la transcription des gènes Per et Cry.
NPAS2 pourrait donc intervenir dans des mécanismes d’horloges dans le système nerveux
central, et particulièrement à l’extérieur des SCN (Reick et al., 2001). Il remplacerait ou
agirait de concert avec CLOCK, dimérisant avec BMAL1 pour activer la transcription
d’autres gènes.
Considérant qu’une modification de la disponibilité alimentaire peut influer sur le
comportement circadien des rongeurs (FAA), des pistes ont été explorées pour trouver un
75
relais entre métabolisme et horloge : en 2001, Rutter et collaborateurs établissent que la
balance entre les facteurs NAD+/NADP+ et NADH /NADPH (cofacteurs impliqués dans le
métabolisme du glucose) est importante pour l’activation des dimères NPAS2/BMAL1. La
forme réduite dominante favoriserait la liaison des dimères avec l’ADN (Rutter et al., 2001).
Cet argument renforce la théorie de l’implication de NPAS2 dans la machinerie moléculaire
de l’horloge alimentaire.
7.2.2.1. KO Npas.
Les souris mutantes NPAS2 ne présentent pas d’altérations du rythme d’activité
locomotrice en LD. En DD, elles conservent une rythmicité circadienne dont la période est
légèrement inférieure à celle des WT. Cependant, en LD comme en DD, leur patron d’activité
est un peu différent et leur quantité d’activité légèrement supérieure à celle des WT (Dudley
et al., 2003). Les souris KO pour les gènes NPAS1 et NPAS3 ont été peu étudiées. Il semble
que ces mutations n’aient pas de conséquences du point de vue circadien, mais plutôt du
point de vue cognitif avec une implication possible dans l’étiologie des psychoses
schizophrènes (Erbel-sieler et al., 2004).
7.2.2.2. Npas2, un remplaçant possible pour Clock.
Pour établir si Npas2 était effectivement le remplaçant possible de Clock dans les mécanismes
de la FEO, l’activité locomotrice des souris KO pour le gène Npas2 soumises à une
restriction alimentaire a été mesurée (Dudley et al., 2003). Les résultats indiquent que
même si la FAA ne disparaît pas chez ces animaux, son expression est retardée par rapport
à la souche sauvage. Les conclusions tirées par les auteurs sont cependant à considérer avec
prudence puisque le protocole de restriction alimentaire plutôt sévère (seulement 4 heures
d’accès à la nourriture), entraîne une perte de masse et une mortalité importantes chez les
mutants. Les actogrammes révélant un délai dans l’apparition de la FAA, pourraient indiquer
une absence totale de FAA dans le cadre d’une approche analytique différente, à laquelle il
sera fait référence en discussion générale. Cependant, si l’on s’en tient à l’interprétation des
auteurs il semblerait que NPAS2 joue un rôle dans l’adaptabilité à la restriction
alimentaire. Il y aurait donc une modification de la machinerie moléculaire des SCN dans le
FEO, s’appuyant non pas sur une boucle positive principale impliquant CLOCK et BMAL1,
mais plutôt NPAS2 et BMAL1, l’implication de ce dernier restant cependant à démontrer.
76
WT
Npas2-/-
Jours
Figure 31 : Actogrammes en double représentation d’une souris sauvage (WT) et d’une souris
mutante pour le gène Npas2 (Npas2-/-) en LD, puis en DD (début indiqué par la flèche rouge)
soumises à une restriction alimentaire.
Le régime lumineux est indiqué au dessus de chaque actogramme. La zone grisée correspond à la
période durant laquelle la nourriture est disponible. Les rectangles jaunes indiquent la FAA. Celle-ci
est retardée chez les Npas2-/-. Les jours sont reportés à gauche de chaque actogramme.
(Adapté de Dudley et al., 2003).
7.2.3. Cry.
Comme mentionné en section II-4, les gènes Cry sont des composants essentiels de l’horloge
suprachiasmatique. L’implication des gènes Cry a donc été testée concernant le comportement
d’anticipation et le FEO (Iijima et al., 2005). Comparées à des souris sauvages, des souris
Cry1-/- / Cry2-/- expriment en LD une FAA qui est moins stable et apparaît plus tard. Il
semblerait donc que les gènes Cry ne soient pas essentiels à la synchronisation par la
nourriture en elle-même mais affecteraient plutôt la stabilité et le développement de la FAA,
faisant ainsi partie intégrante du FEO. Cette étude intègre en complément une étude en DD
afin de s’affranchir de l’influence de l’alternance du jour et de la nuit sur la synchronisation
alimentaire, une sensibilité accrue à la lumière chez les mutants pouvant expliquer la
diminution de la FAA. Or, les résultats indiquent que cela ne serait pas le cas ici. Enfin,
l’expérience de synchronisation alimentaire est répétée chez des souris sauvages ou mutantes
présentant des lésions des SCN afin de supprimer tout repère temporel éventuel qui
permettrait un phénomène de mémoire sablier, en établissant une concordance entre l’heure
du nycthémère et l’heure d’accès à la nourriture. Ici encore, la FAA semble moins nette et
moins stable chez les mutants que chez les WT.
Un complément non négligeable apporté à cette étude est la mesure de la persistance de la
FAA pour les deux génotypes lors d’un jeûne consécutif à la restriction alimentaire. La
mesure est ici effectuée durant 2 jours de jeûne et 2 jours ad libitum suivant la restriction. La
persistance de la FAA semble évidente pendant 4 jours chez les WT dans tous les cas, et
pendant 4 jours, 2 jours et 1 jour en LD, DD et après lésion des SCN respectivement chez les
mutants. Cela soulève le problème de l’endogénicité du comportement observé, mais cette
77
question n’est pas adressée par les auteurs. Les résultats peuvent également être discutés
considérant la lisibilité limitée des actogrammes présentés dans ce travail ; il est probable que
l’influence de la suppression de Cry1 et Cry2 soit plus importante que celle qui est dégagée
dans cet article. On peut aussi regretter que, dans cette étude, il ne soit pas possible de
distinguer les rôles respectifs de Cry1 et Cry2, seuls les doubles mutants ayant été utilisés
(Iijima et al., 2005).
Souris placées en LD
Jeûne
Restriction
alimentaire
Jeûne 2 jours
Ad libitum
Figure 32 : Actogrammes en double représentation d’une souris sauvage (Wild type) et d’une souris
mutante pour les gènes Cry1 et Cry2 (Cry1-/- /Cry2-/-) en LD, soumises à une restriction alimentaire.
Le régime lumineux est indiqué au dessus de chaque actogramme. Les rectangles jaunes et rouges
indiquent la FAA et l’accès à la nourriture respectivement. La FAA est présente pour les animaux
sauvages mais elle n’est pas évidente chez les mutants. Les auteurs concluent à un retard dans son
apparition. La restriction est précédée et suivie d’un jeûne. Le jeûne précédant la RF démontre qu’il
n’y a pas de FAA préexistante. Le jeûne post FAA doit démontrer la persistance de la FAA, mais
celle-ci n’est pas nette, ce qui est probablement dû à un challenge énergétique trop important pour les
souris.
(Adapté de Iijima et al., 2005).
8. Une nouvelle horloge centrale : l’horloge alimentaire.
Depuis une trentaine d’années, les arguments en faveur de l’existence d’une nouvelle horloge
s’accumulent : cet oscillateur alimentaire est capable de recevoir un certain nombre
d’informations relatives à la disponibilité alimentaire de l’environnement.
Il intègre ces différents synchroniseurs lorsqu’ils sont présentés dans le domaine circadien
uniquement. Cette intégration se traduit par des modifications comportementales (anticipation
dans divers paramètres) et physiologiques (corticostérone, température). L’oscillateur
distribue donc le message à des effecteurs ou à des sorties. Ces modifications
comportementales et physiologiques persistent durant quelques jours en conditions ad
libitum et réapparaissent à l’heure attendue lors d’un jeûne, plusieurs semaines ou mois après
l’arrêt de la restriction alimentaire. Cet oscillateur est donc auto-entretenu. Il exprime des
78
périodes de transition dans l’adaptation à un nouvel horaire d’accès à la nourriture après un
décalage horaire. Différents systèmes de neurotransmetteurs ont pu être impliqués dans son
fonctionnement. Une mutation de certains gènes horloges modifie les sorties de cet
oscillateur ; ces gènes entrent donc probablement dans la machinerie moléculaire sous tendant
la rythmicité de l’oscillateur. Il peut donc générer des messages à caractère rythmique. Ces
arguments démontrent que l’oscillateur alimentaire est bien une nouvelle HORLOGE :
L’HORLOGE ALIMENTAIRE (Food entrainable Clock : FEC).
9. Localisation de l’horloge alimentaire.
Un pré requis à l’étude extensive d’une horloge putative est, bien entendu, la connaissance de
la localisation de cette entité. Point faible de notre argumentation et frein à l’étude de la
synchronisation alimentaire : malgré les récentes avancées dans le domaine, on ne connaît pas
la localisation exacte de la FEC.
De nombreuses hypothèses ont été avancées quant au site de la FEC : une structure centrale
unique, un organe périphérique unique, un système multi-oscillateur central. Les études
présentées ici nous donnent quelques indications.
9.1. Système nerveux central vs périphérique.
Du fait que de nombreux organes périphériques comme les intestins, les reins ou le foie
expriment des gènes horloges et peuvent être synchronisés par une restriction alimentaire
(Damiola et al., 2000 ; Hara et al., 2001 ; Stokkan et al., 2001), il était possible que certains
tissus périphériques fassent partie intégrante de la FEC et, pourquoi pas, être eux-mêmes la
FEC.
9.1.1. Le foie, le pancréas.
Des injections intrapéritonéales chroniques de tétrachloride de carbone (CCl4) chez des rats
altèrent considérablement la fonction hépatique suite à l’apparition d’une cirrhose
généralisée, ce qui se traduit par des modifications de l’architecture cellulaire et de la
physiologie du foie. Ce traitement ne change ni la rythmicité circadienne, ni la prise
alimentaire ou la prise de poids. Lorsque les animaux traités sont soumis à une restriction
alimentaire, la FAA, mesurée au moyen de la prise hydrique, ne semble pas être modifiée
comparée aux rats contrôles, indiquant que le foie ne serait essentiel ni pour l’expression de
la FAA, ni pour la synchronisation de la FEC par la nourriture (Escobar et al., 2002).
Cependant, dans ce protocole, il n’est pas possible d’exclure que certaines cellules intactes du
foie puissent encore percevoir et redistribuer une information relative à la disponibilité
alimentaire. La question reste donc ouverte.
Sachant que l’insuline est libérée dans la circulation générale durant un repas, il est possible
que le pancréas soit à l’origine de signaux humoraux distribués à la fois au système nerveux
central et aux tissus périphériques. Une injection de streptozotocine induit une destruction
des cellules β produisant l’insuline dans les îlots de Langerhans, rendant les rats
79
immédiatement diabétiques. Ces animaux, soumis à une RF, présentent une FAA identique
à celle des rats contrôles (Davidson et al., 2002).
L’ensemble de ces travaux indique que les signaux du foie et du pancréas ne seraient pas
nécessaires à l’établissement de la FAA.
9.1.2. Le système digestif dans son ensemble.
Il faut ajouter à l’expérience décrite ci-dessus, celle réalisée sur des rats génétiquement
modifiés chez lesquels le promoteur du gène Per1 a été associé à un gène rapporteur codant
pour la luciférase. Ces rats étaient entraînés pendant 10 jours à un accès à la nourriture durant
le jour, puis à 10 jours en conditions ad libitum, et enfin étaient soumis à 2 jours de jeûne.
Après quelques jours de nourrissage diurne, les animaux présentaient une FAA qui
disparaissait en conditions ad libitum et réapparaissait durant le jeûne. Le pic d’expression de
Per1 était décalé de la période nocturne à la période diurne dans le foie, l’estomac et le
colon durant un nourrissage diurne et durant le jeûne et redevenait nocturne en conditions ad
libitum (Davidson et al., 2003). En plus de présenter une FAA pour un nourrissage diurne, les
animaux ont été entraînés à anticiper deux repas séparés de 12 heures. Les tissus du système
digestif ne présentaient un pic d’expression de Per1 ne correspondant qu’au nourrissage
nocturne, alors que les animaux présentaient une FAA pour chacun des deux repas. Il
semblerait donc que la FAA ne soit pas intégralement générée au moyen de sorties émanant
du système gastro-intestinal. Ces organes n’abriteraient donc pas l’horloge alimentaire
(Davidson et al., 2003).
De plus, Miki et collaborateurs (2003) démontrent que les signaux émanant de l’estomac et
du système digestif dans son ensemble ne sont pas nécessaires à l’entraînement des SCN et
des tissus périphériques par la nourriture : en effet, une nutrition parentérale délivrée de
jour uniquement décale l’expression des gènes horloges dans ces deux structures (Miki et al.,
2003). En outre une vagotomie sub-diaphragmatique ne supprime ni le pic anticipatoire de
corticostérone (Moreira et Krieger, 1982), ni la FAA (Comperatore et Stephan, 1990) alors
qu’elle supprime toutes les informations parasympathiques afférentes des tissus périphériques
vers les noyaux du tractus solitaire et le tronc cérébral dorsal. De plus une désafférentation
par injection intra-péritonéale de capsaïcine, combinée à des lésions des SCN ne supprime
pas la FAA (Davidson et Stephan, 1998).
La genèse des comportements anticipatoires serait donc indépendante des signaux ascendants
des viscères vers le système nerveux central. Au vu de ces résultats, il est probable que la
FEC se trouve dans le système nerveux central et non dans un organe périphérique. Il n’en
demeure pas moins que les organes périphériques puissent être des sorties de l’horloge
alimentaire (par exemple les glandes surrénales dans la production du pic anticipatoire de
corticostérone), ou même des senseurs transmettant des informations sur l’état métabolique
général à la FEC.
80
9.2. Approche lésionnelle.
La première hypothèse concernant la localisation de la FEC a été que celle-ci se trouvait dans
une structure centrale unique. L’approche logique pour déterminer ce site a été la même
qu’avec les SCN : effectuer une lésion de la structure cible et s’assurer que cette lésion abolit
le comportement contrôlé par cette structure, ici l’entraînement par une restriction alimentaire
et l’expression d’une composante d’anticipation.
9.2.1. Bulbes olfactifs.
Parmi les propriétés de l’accès à la nourriture susceptibles d’entraîner les rythmes de la FEC,
les informations olfactives pourraient avoir une influence. Afin d’éliminer l’olfaction comme
facteur essentiel de l’entraînement alimentaire, des bulbectomies ont été réalisées chez le rat
(Davidson et al., 2001b). Lorsqu’ils sont soumis à une restriction alimentaire de 2 heures par
jour, les animaux opérés présentent en quelques jours une FAA dans le comportement
d’approche de la mangeoire, identique à celle observée chez les animaux contrôles. Cette
FAA persiste en condition de jeûne. Les informations olfactives ne seraient donc pas
nécessaires à l’établissement de la FAA (Davidson et al., 2001b). De plus, s’il avait déjà été
démontré que les bulbes olfactifs renferment une horloge centrale (Granados-Fuentes et al.,
2004 ; Granados-Fuentes et al., 2006), il ne semble pas que cette horloge soit la FEC.
9.2.2. Structures hypothalamiques et thalamiques.
9.2.2.1. Hypothalamus ventromédial (VMH).
Les VMH sont impliqués dans la régulation du métabolisme énergétique et des
comportements alimentaires (Pénicaud et al., 1983). Une lésion des VMH a pour conséquence
une hyperphagie. Les rythmes d’entraînement à une restriction alimentaire ont été testés chez
des rats présentant des lésions bilatérales des VMH. Les résultats sont quelque peu
contradictoires : des études datant d’une vingtaine d’années indiquent que des lésions
électrolytiques des VMH abolissent la FAA (Inouye, 1982) ainsi que les pics anticipatoires
de température et de corticostérone (Krieger, 1980). Des études plus récentes démontrent que
5 à 9 semaines après lésion, les rats recouvraient la possibilité d’exprimer une FAA
(Mistlberger et Rechtschaffen 1984) ainsi qu’un pic anticipatoire de corticostérone (Honma et
al., 1987b). Ce dernier n’était apparent qu’après 8 à 10 semaines après lésion pour un accès à
la nourriture de 4 heures par jour, mais il était observable dès 2 semaines après lésion lorsque
l’accès à la nourriture était réduit à 1 heure par jour (Honma et al., 1987b). La période de 8
semaines correspond au temps de stabilisation de la prise alimentaire chez les rats lésés.
Challet et collaborateurs (1997) confirment ces résultats en effectuant à la fois des lésions
électrolytiques et chimiques des VMH (acide iboténique). Contrairement aux lésions
électrolytiques, les lésions chimiques n’endommagent pas les fibres de passage. Une
atténuation générale de l’activité, y compris de la FAA, est constatée pour les deux types de
lésions, qui est cependant moindre dans le groupe lésé à l’acide iboténique (Challet et al.,
1997b). Ce résultat confirme d’une part que la FAA n’est pas abolie par une lésion des
81
VMH, et indique d’autre part l’importance des fibres de passage dans les VMH. Ces
expériences démontrent que les VMH ne seraient pas un composant essentiel de la FEC. Il est
possible que les premiers résultats soient la conséquence d’un état métabolique instable dans
les semaines qui suivent la lésion des VMH.
9.2.2.2. L’aire hypothalamique latérale (LH).
Tout comme les VMH, le LH est impliqué dans la régulation des comportements alimentaires.
Une lésion du LH provoque, en miroir des VMH, une hypophagie. La LH participe
également à l’éveil via le système orexinergique puisqu’il est très riche en neurones à
orexines (Akiyama et al., 2004). L’activité neuronale dans le LH est modulée par des stimuli
pré et post prandiaux et pourrait donc véhiculer des informations sur l’heure des repas. De
plus, une étude a identifié des rythmes dans l’activité multi-unitaire neuronale dans le LH
d’animaux présentant des lésions des SCN (Kurumiya et Kawamura, 1985 cité par
Mistlberger et Rusak 1988). De ce fait, il est possible qu’il participe à la genèse des signaux
d’entraînement à la nourriture. Des lésions à l’acide iboténique de cette structure ont donc
été réalisées. Durant 3 à 6 jours suivant les lésions, les rats ne s’alimentaient ni ne buvaient
plus. Cependant, une croissance normale était évidente au delà. Six semaines après la
chirurgie, les animaux étaient soumis à une RF de 2 heures par jour. La FAA était évidente
en quelques jours chez la plupart des animaux, et persistait en condition de jeûne, à la fois
dans l’activité et le comportement d’approche de la mangeoire (Mistlberger et Rusak, 1988).
Il semblerait donc que la LH ne soit pas un composant essentiel de la FEC. Par contre, les
neurones à orexines, en grand nombre dans cette structure, pourraient jouer un rôle dans
l’éveil lors de la FAA. Dans ce cas, il faudra considérer d’autres structures possédant des
neurones à orexine (l’aire périfornicale par exemple) comme sorties de la FEC, ou
éventuellement comme l’un de ses composants.
9.2.2.3. Noyaux paraventriculaires hypothalamiques (PVN).
Tout comme le LH, les PVN reçoivent des informations relatives à la prise alimentaire. Ils
sont en outre reliés aux systèmes neuroendocrine et autonome, et peuvent à ce titre moduler
des processus physiologiques en relation avec la prise alimentaire. Il est donc possible qu’ils
participent aux mécanismes de la FEC. De larges lésions à radiofréquence dirigées vers les
PVN et endommageant par la même occasion partiellement SCN, noyaux périventriculaires,
aire préoptique médiale, hypothalamus dorsomédial (DMH) et VMH, ont été réalisées chez le
rat. Les animaux lésés présentent un patron d’activité normale avant la restriction.
Lorsqu’ils sont soumis à une restriction de l’accès à la nourriture à 2 heures par jour, la
plupart des rats lésés présentent une FAA dans l’approche de la mangeoire, mais celle ci est
atténuée pour l’activité locomotrice de roue. Chez 3 rats présentant des lésions complètes,
la FAA disparaît complètement pour l’activité locomotrice, mais persiste dans l’approche de
la mangeoire. Ces caractéristiques persistent lors d’un jeûne (Mistlberger et Rusak, 1988).
82
Figure 33 : Diminution de la FAA suivant une lésion des PVN.
Les actogrammes représentent l’activité locomotrice (gauche) et l’approche de la mangeoire (droite)
pour des rats présentant des lésions des PVN débordant sur les SCN. Les animaux sont donc
arythmiques. Ils anticipent parfaitement l’accès à la nourriture (rectangles rouges) dans le
comportement d’approche de la mangeoire alors que la FAA est quasiment absente dans l’activité
locomotrice. À la fin de l’expérience, les animaux sont soumis à 72 heures de jeûne, puis sont placés
en DD. Le cycle LD est représenté en haut de chaque actogramme.
(Adapté de Mistlberger et Rusak, 1988).
Cette expérience démontre qu’il est possible de dissocier les sorties de la FEC. De plus, elle
indique l’implication probable des PVN dans l’expression de la FAA mesurée par l’activité de
roue. Ils pourraient donc être l’un des chemins de sortie de la FEC.
9.2.2.4. Noyau arqué (Arc).
Une étude systématique de l’apparition de la FAA chez des animaux SCN lésés a révélé que
dans le cadre de lésions débordant sur l’Arc, l’anticipation était moins nette, voire absente.
Le noyau arqué envoie des projections à NPY vers plusieurs noyaux hypothalamiques
intervenant dans le contrôle de la prise alimentaire. De plus, le NPY a été impliqué dans la
régulation de l’alimentation : il est un puissant orexigène. Une administration de glutamate
monosodium dans les jours qui suivent la naissance de rats induit des dégâts irréversibles
dans l’Arc (cellules à NPY). Cette injection a les mêmes conséquences qu’une lésion
électrolytique de l’Arc (hypophagie, dérèglements hormonaux et problèmes de croissance,
atténuation du rythme de prise alimentaire ; Mistlberger et Antle, 1999). Par contre, même si
les dommages semblent importants, lorsque les rats sont soumis à 4 heures d’accès quotidien
à la nourriture de jour, une FAA tout à fait normale se développe en 5 à 7 jours. Elle semble
même plus longue que celle observée chez des rats témoins. Notons que cette FAA est
mesurée, non pas grâce à l’activité locomotrice, mais au moyen du comportement d’approche
de la mangeoire. Cette FAA persiste durant 3 jours consécutifs de jeûne.
83
9.2.2.5. Noyaux hypothalamiques dorsomédiaux (DMH).
Les DMH sont interconnectés avec l’ensemble des noyaux hypothalamiques et reçoivent à la
fois des informations humorales et neuronales de voies impliquées dans la prise alimentaire et
la balance énergétique. C’est donc un bon candidat pour abriter la FEC ou l’un de ses
composants. Deux études publiées consécutivement ont impliqué ces noyaux dans les
mécanismes de synchronisation alimentaire.
Des lésions à l’acide iboténique des DMH ont été réalisées chez des rats qui ont ensuite été
soumis à une RF (3 heures par jour). Une diminution de la FAA est observée aussi bien dans
l’activité générale que dans la température (mesures télémétriques) et l’éveil (électroencéphalographie). Cependant il faut noter que les animaux lésés présentent une diminution
drastique de leur activité générale, même en condition de nourriture ad libitum. Il est
néanmoins très net que l’anticipation de la température et l’éveil sont fortement diminués
(Gooley et al., 2006). Malgré ces résultats prometteurs, les auteurs concluent prudemment que
les DMH peuvent être la FEC mais également l’une de ses entrées ou sorties.
Figure 34 : Diminution de la FAA suivant une lésion des DMH.
Actogrammes en double représentation correspondant à l’activité locomotrice chez un rat intact
(gauche) ou ayant subi des lésions des DMH (droite) à l’acide iboténique. Les rats intacts anticipent
parfaitement l’accès à la nourriture (rectangles rouges). Les animaux lésés sont quasiment arythmiques
en DD (première partie de l’actogramme), leur activité générale diminue et la FAA est moins
importante que chez les contrôles. Le fond gris correspond à la nuit et le fond blanc au jour.
(Adapté de Gooley et al., 2006).
Parallèlement, une approche originale a indiqué que les DMH abritent un oscillateur
entraîné par la nourriture. En effet, ils présentent une expression rythmique des gènes
Per1 et Per2 uniquement lorsque les souris sont soumises à une RF (4 heures d’accès).
Même si l’amplitude de ce rythme est un peu réduite lors d’un jeûne, elle persiste durant
plusieurs jours dans ces conditions (Mieda et al., 2006). Le fait qu’une expression rythmique
de novo soit observable dans les DMH en RF n’indique malheureusement pas que cette
structure abrite la FEC, mais il démontre que les DMH sont entraînables par la nourriture. Ce
résultat renforce cependant le précédent. Enfin, une troisième étude a donné des résultats
opposés à ceux publiés par Gooley et collaborateurs (2006) : en effet des lésions par
84
radiofréquences des DMH ont pour effet de diminuer l’activité générale des rats, mais la
FAA ne semble quasiment pas affectée par cette lésion. En outre, elle persiste plusieurs
jours lorsque la nourriture est de nouveau fournie ad libitum et réapparaît lors d’un jeûne
(Landry et al., 2006).
Heures
Jeûne
Jours
Jeûne
Jeûne
Figure 35 : la FAA suivant une lésion des DMH.
Les actogrammes représentent l’activité locomotrice chez un rat intact (gauche) ou ayant subi des
lésions des DMH (droite) par radiofréquences. Les rats intacts anticipent parfaitement l’accès à la
nourriture (rectangles rouges). Les animaux lésés ont une activité générale diminuée mais la FAA est
toujours présente. Elle persiste lors d’un jeûne. Le fond gris correspond à la nuit et le fond blanc au
jour.
(Adapté de Landry et al., 2006).
Ces résultats contradictoires laissent ouverte la question du rôle des DMH dans la FEC. Ils
peuvent être la conséquence des deux types de lésions utilisées.
9.2.2.6. Noyau paraventriculaire thalamique (PVT).
Le PVT reçoit des afférences de régions du tronc cérébral et de l’hypothalamus impliquées
dans la prise alimentaire et l’éveil. Il envoie des projections vers les régions limbiques,
corticales et hypothalamiques. Une lésion par radiofréquences des PVT augmente le niveau
moyen de l’activité générale chez le rat nourri ad libitum, mais n’altère pas la FAA, mesurée
par le comportement d’approche de la mangeoire (Landry et al., 2007). Les PVT ne semblent
donc pas abriter la FEC.
9.2.3. Système limbique.
Outre la composante purement énergétique de la prise alimentaire, il est possible qu’une
composante motivationnelle soit le déclencheur de la FAA lorsque l’accès à la nourriture est
limité dans le temps. Dans ce cas, les structures limbiques pourraient abriter l’horloge
alimentaire. L’hypothèse selon laquelle la FAA pourrait être partiellement ou totalement un
phénomène de mémoire a également été avancée.
Dans une approche lésionnelle, de larges lésions combinées englobant soit l’hippocampe
(aspiration + lésion électrolytique), soit le noyau accumbens et la partie du télencéphale
médian antérieure au thalamus (lésions par radiofréquences), ont été réalisées.
85
L’activité locomotrice et le comportement d’approche de la mangeoire de ces rats ont ensuite
été enregistrés en conditions de nourriture ad libitum ou lors d’une restriction alimentaire de 2
heures par jour. Si les rythmes en libre cours semblent perturbés dans certains cas par une
lésion de l’hippocampe, il n’en est pas de même pour la FAA qui s’exprime normalement
pour toutes les lésions. Elle persiste en conditions de jeûne (Mistlberger et Mumby, 1992).
L’hippocampe est une structure dédiée à l’apprentissage et à la mémoire au sens large, qui
pourraient englober des mécanismes d’apprentissage de l’heure des repas. Or, les auteurs
démontrent dans cette expérience que les lésions de l’hippocampe n’empêchent pas les
animaux « d’apprendre » l’heure d’accès des repas ou la FAA de se développer. La
composante mnésique n’est donc pas essentielle au fonctionnement de la FEC. Le noyau
accumbens est considéré comme l’interface entre les systèmes limbique et moteur et il est
activé en relation avec des processus motivationnels (Mogenson et al., 1980). Cependant, une
fois encore, des lésions larges touchant ce noyau n’empêchent pas la FAA d’apparaître et de
persister, y compris lors d’un jeûne (Mistlberger et Mumby, 1992). La composante
motivationnelle ne serait donc pas nécessaire à l’entraînement par la nourriture et à
l’expression de la FAA. Etant donné que dans cette expérience la quasi totalité des efférences
depuis l’amygdale ont été détruites (BNST, septum, noyau accumbens) et parfois même
l’amygdale elle même, les auteurs concluent que le complexe amygdalien n’est pas un
composant de la FEC (Mistlberger et Mumby, 1992).
Une autre expérience a utilisé des lésions excitotoxiques du noyau accumbens, localisées au
niveau de la « coquille (shell) » ou du « centre (core) » de cette structure. Une lésion du shell
induit une augmentation de la prise alimentaire et du poids des rats, alors qu’une lésion du
core a l’effet inverse (Mendoza et al., 2005b). Lors d’une RF, une FAA normale se développe
chez les rats shell lésés, mais la FAA est réduite par des lésions du core. De plus,
l’immunoréactivité pour c-FOS augmente en anticipation du nourrissage dans le core et
durant le repas dans le shell indiquant que ce dernier serait plutôt impliqué dans le
comportement de consommation de nourriture. Ces profils ne sont conservés en conditions
de jeûne que dans le core, indiquant la présence d’un oscillateur dans cette zone, mais pas
dans le shell (Mendoza et al., 2005b). Core et shell ont une connectivité efférente différente,
le premier ayant plutôt des projections vers le système moteur, et le second vers le système
limbique. Ces projections différentes peuvent être à l’origine des différences observées lors de
la lésion des subdivisions du noyau accumbens.
Il n’en demeure pas moins qu’une lésion du core diminue la FAA. Il est cependant difficile de
conclure sur cette expérience : la diminution de la FAA peut signifier que le core se trouve sur
un chemin afférent ou efférent de la FEC. C’est cette seconde hypothèse qui est privilégiée
par les auteurs (Mendoza et al., 2005b). Cependant, si la FEC n’est pas une structure unique,
la diminution de la FAA peut signifier que le core du noyau accumbens peut être l’un des
éléments de la FEC. Dans cette expérience, seule l’activité locomotrice a été testée pour la
86
FAA. D’autres paramètres (corticostérone, température) permettraient de trancher sur la
question : si toutes les sorties sont affectées également, cela signifie que le core est partie
intégrante de la FEC. Si ce n’est pas le cas, il est probablement sur le chemin de sortie de
celle-ci et contrôle l’activité locomotrice.
9.3. Tronc cérébral
Si le télencéphale a été souvent ciblé dans les approches lésionnelles, le tronc cérébral a,
quant à lui été un peu délaissé. Le noyau de tractus solitaire (NTS) reçoit des informations
des intestins. Non loin, l’area postrema (AP) ne possède pas de barrière hémato-encéphalique
ce qui permet à des signaux sanguins d’agir sur le système nerveux central. Le noyau
parabrachial (NPB) est également localisé dans le tronc cérébral et reçoit des projections du
NTS et de l’AP. Une lésion de l’AP par cautérisation ne supprime pas la FAA (approche
de la mangeoire) chez des rats soumis à 2 heures d’accès à la nourriture (Davidson et al.,
2001a). Il est donc probable que l’AP ne véhicule pas les informations métaboliques
sanguines vers la FEC.
Par contre, des lésions électrolytiques ou par injection d’acide iboténique du NPB diminue
considérablement la FAA dans le comportement d’approche de la mangeoire et abolit le pic
anticipatoire de température, comparé à des rats contrôles. En dehors de la FAA, ces
paramètres ne sont pas modifiés par la lésion. En outre, les rats lésés ne perdent pas plus de
poids que les rats contrôles, indiquant que la prise alimentaire serait comparable (Davidson et
al., 2000).
Heures
Heures
Figure 36 : Diminution de la FAA suivant une lésion du noyau parabrachial.
Les courbes représentent les valeurs de température corporelle (gauche) et d’approches de la
mangeoire par 10 minutes (droite) moyennées sur 3 jours consécutifs. Les animaux intacts (courbes
noires) anticipent parfaitement l’accès à la nourriture (rectangles rouges) alors que la FAA est
quasiment absente chez les animaux lésés (courbes grises). Le cycle LD est représenté en haut de
chaque courbe.
(Adapté de Davidson et al., 2000).
Dans cette expérience, on peut déplorer le petit nombre d’animaux correctement lésés qui ont
été utilisés. Ce résultat reste néanmoins spectaculaire puisque c’est la seule lésion décrite
87
jusqu’ici capable d’altérer la FAA à la fois pour un paramètre physiologique (température) et
comportemental (approche de la mangeoire). Il peut signifier soit que le NPB renferme la
FEC, soit qu’il est une entrée ou une sortie essentielle de cette horloge.
9.3.1. Influence sur une seule sortie.
Il a déjà été démontré qu’une lésion des PVN diminuait la FAA mesurée au moyen de
l’activité de roue, mais pas au niveau du comportement d’approche de la mangeoire. Des
résultats similaires ont été obtenus en effectuant des lésions d’autres structures centrales.
9.3.1.1. Hypophyse.
Les liens entre rythmes circadiens et fonction pituitaire sont bien établis : les rythmes des
hormones sexuelles chez la femelle sont par exemple contrôlés par l’hypothalamus. De plus,
les cycles œstriens sont perturbés par une lésion des SCN, de même que les rythmes de
sécrétion de corticostérone. Etant donnée l’importance de l’hypophyse dans la transmission
de ces rythmes, et le fait que des hormones comme la corticostérone sont entraînées par une
RF, il est possible qu’elle joue un rôle dans la synchronisation alimentaire. Des rats
hypophysectomisés et soumis à une RF anticipent parfaitement une accès quotidien de 4
heures à la nourriture pour le comportement d’approche de la mangeoire. Une lésion des SCN
n’altère pas ce comportement. Après un décalage de 8 heures de l’accès à la nourriture, la
FAA est entraînée en quelques jours au nouvel accès (Davidson et Stephan, 1999). Par contre,
la température corporelle, significativement plus basse chez les animaux
hypophysectomisés, ne présente pas l’augmentation habituelle en anticipation (FAT). Il
est probable que l’hypophyse se trouve sur le chemin de sortie de la FEC et participe à la
genèse de la FAT. Cependant, les auteurs soulignent que les rats hypophysectomisés étant
plus petits en taille, ils ne peuvent stocker suffisamment d’énergie pour produire une élévation
de température (Davidson et Stephan, 1999). Cette hypothèse serait supportée par le fait que
la température de ces rats augmente consécutivement à l’accès à la nourriture. Ceci dit, des
rats et des souris soumis à une restriction calorique présentent une FAT en dépit d’une
déplétion évidente en énergie. Il est donc également possible que l’effet sur la FAT ne soit pas
spécifique d’une perte de fonction sur un chemin de sortie de la FEC, mais d’un état
hypothermique général chez l’animal.
9.3.1.2. Cortex infralimbique.
Le cortex préfrontal médial a été impliqué dans la préparation et la coordination des messages
du système nerveux autonome. Le cortex infralimbique est l’une des subdivisions du cortex
préfrontal médial. Il est considéré comme une aire autonome corticale. Une lésion à l’acide
iboténique de cette structure a pour conséquence une disparition à la fois de la FAT et de la
hausse de température post-prandiale (DIT). Tout comme dans le cadre d’une lésion de
l’hypophyse, la température corporelle moyenne des rats ayant subi une lésion du cortex
infralimbique est inférieure à celle des rats contrôles (Recabarren et al., 2005). Une fois de
plus, cette expérience démontre que les sorties de la FEC peuvent être dissociées. Les rats
88
ayant des lésions du cortex infralimbique étant à priori moins affectés que ceux ayant subi une
hypophysectomie, il est plus probable que cette aire soit sur le même trajet de sortie de la FEC
que l’hypophyse. Cela dit, il est possible que ces deux structures fassent partie d’un même
réseau contrôlant la réponse thermique de la FEC.
9.4. Autres structures.
D’autres structures, éliminées en général comme régions adjacentes d’autres structures visées,
ont ainsi été identifiées comme n’interférant pas avec la FAA : les cortex orbital et
pédonculaire dorsal, le gyrus cingulaire, le septum médial et latéral, la zone verticale de la
bande diagonale, le pallidum, le noyau du lit de la strie terminale, le noyau caudé, le feuillet
inter-géniculé, le néocortex (Mistlberger, 1994 pour revue). Ces structures ne seront pas
détaillées plus avant.
9.5. Un réseau de plusieurs structures.
Considérant les résultats contradictoires obtenus lors de lésions d’une seule structure
cérébrale, un nombre croissant d’études postulent que la FEC ne résiderait pas dans une
structure unique mais que son activité résulterait de l’influence combinée de plusieurs
oscillateurs centraux ayant une fonction partiellement redondante. De nouvelles
approches s’avèrent nécessaires pour rechercher des systèmes multi-oscillateurs. L’une de ces
approches a été utilisée par Mieda et collaborateurs (2006) et consiste à rechercher une
expression rythmique de novo d’un gène horloge en réponse à une RF. Elle a permis
d’identifier les DMH comme FEC putative.
Une autre possibilité est de rechercher quelles structures sont activées durant la FAA,
formulant l’hypothèse qu’une structure contrôlant la FAA doit être active avant ou durant la
FAA. Cette approche est illustrée dans des études où l’expression de c-FOS a été mesurée en
anticipation de la prise alimentaire lors d’une RF. Ainsi, dans la LH, l’aire périfornicale et les
DMH, l’immunoréactivité pour c-FOS augmente avant l’accès à la nourriture. Ce pic
réapparaît à l’heure attendue lors d’un jeûne (Angeles-Castellanos et al., 2004). Une autre
étude décrit en outre une activation transitoire du noyau tubéromammillaire en anticipation de
l’heure du repas (Inzunza et al., 2000). Chez des rats entraînés à une RF, un pic de c-FOS est
également observé dans le noyau accumbens, l’amygdale centrale et basolatérale, le noyau du
lit de la strie terminale, le septum latéral, le cortex préfrontal et les PVT, à la fois en
anticipation et durant l’accès à la nourriture (Angeles-Castellanos et al., 2007). De plus, le
rythme de la protéine PER1 est décalé vers l’heure du repas lors d’une RF. Son pic
d’expression suit l’accès à la nourriture dans le noyau accumbens, le noyau du lit de la strie
terminale, l’hippocampe, l’amygdale centrale, le septum latéral et l’aire périfornicale. Le
rythme est amplifié dans les PVT et l’amygdale baso-latérale (Angeles-Castellanos et al.,
2007). La modification du rythme d’une protéine horloge indique que ces structures sont
sensibles à l’information alimentaire et pourraient donc participer aux mécanismes de
l’horloge alimentaire. Ces études démontrent ainsi l’implication possible des structures
89
cortico-limbiques et hypothalamiques dans l’anticipation de l’heure du repas et la
synchronisation alimentaire.
Concernant le tronc cérébral, centre de relais pour la communication entre tissus
périphériques et structures centrales, il semble que la synthèse de c-FOS augmente après
l’accès à la nourriture dans un certain nombre de structures (NPB, NTS, AP, noyau moteur
dorsal du nerf vague) qui ne persiste pas lors d’un jeûne. Cette augmentation de c-FOS dans
ces structures est donc directement dépendante de la prise alimentaire. Elles ne sont donc
probablement pas à l’origine de la génération de rythmes liés à la prise alimentaire et
n’abritent probablement pas la FEC (Angeles-Castellanos et al., 2005).
Ensemble, ces études démontrent la complexité de la FEC. Le fait qu’aucune lésion unique
n’a clairement engendré à ce jour la disparition des rythmes liés à la prise alimentaire
indiquerait qu’elle réside dans un réseau de structures oscillantes. Cependant, une approche
utilisant l’activation neuronale (c-FOS) ne peut permettre d’identifier ce réseau, le marquage
n’étant pas spécifique : comment alors distinguer une structure, ou un réseau de structures
générant des oscillations des sorties de ce réseau, contrôlant le comportement et la
physiologie de l’animal ? En effet, ces données ne permettent pas d’établir une hiérarchie
entre les différentes structures.
La FEC reste donc un mystère : une structure unique que toutes les études lésionnelles
auraient jusqu’ici épargnée ou un réseau de structures oscillantes ayant des fonctions
redondantes. La question reste ouverte et de nouvelles approches sont nécessaires à
l’identification du substrat anatomique de cette nouvelle horloge centrale.
90
CHAPITRE 2
OBJECTIFS DE MON
TRAVAIL DE THÈSE
92
Horloges ou oscillateurs, tous sont soumis à l’influence de synchroniseurs, véhiculant des
informations temporelles. Ceux-ci régulent la phase ou l’amplitude du rythme exprimé. Pour
une horloge, le(s) synchroniseur(s) permet(tent) la remise à l’heure quotidienne et la mise en
adéquation des rythmes circadiens (environ 24 heures) avec les rythmes astronomiques
(exactement 24 heures). Pour un oscillateur, la récurrence du synchroniseur est essentielle au
maintien du rythme et prévient son atténuation.
Nous avons vu en première partie de l’introduction que les SCN peuvent répondre à différents
types de synchroniseurs : la lumière (ou synchroniseur photique) véhicule l’information
dominante de mise à l’heure pour cette horloge. Cependant, des synchroniseurs non
photiques, comme une application pharmacologique quotidienne de mélatonine ou une
restriction de l’accès à la nourriture, peuvent également influer sur l’horloge principale. Pour
l’horloge alimentaire, l’information essentielle et dominante pour la synchronisation est
véhiculée par l’occurrence sur une base circadienne du ou des repas, bien que des
informations pharmacologiques (méthamphétamine) puissent également influencer cette
horloge.
Les oscillateurs périphériques sont en général considérés comme « esclaves » des SCN en ce
sens que la phase d’expression des gènes horloges dans la plupart de ces tissus semble
imposée par les SCN. Pourtant, alors que la phase d’expression des gènes horloges dans les
SCN n’est pas affectée par une inversion de la disponibilité alimentaire (accès durant le jour
chez les espèces nocturnes), les rythmes d’expression des gènes horloges sont inversés dans
les tissus périphériques dans ces conditions. Le synchroniseur dominant pour les tissus
périphériques serait donc l’information métabolique (alimentaire).
A la lumière de ces résultats, il semblerait que tous les tissus puissent être synchronisés par
des informations métaboliques et alimentaires, alors que tous ne sont pas directement
sensibles à la synchronisation photique. Cette constatation nous a amenés à nous interroger
sur le caractère multi-oscillant de la synchronisation alimentaire.
Comment l’information temporelle véhiculée par la nourriture est-elle interprétée par les
différents tissus ?
Quels acteurs moléculaires sont-ils impliqués dans cette synchronisation aux niveaux central
et périphérique ?
Quelles structures, centrales ou périphériques, sont-elles à l’origine des réponses
comportementales à une restriction alimentaire ?
Afin d’apporter des réponses à ces questions, mon travail de thèse a été axé sur la
compréhension des mécanismes sous tendant la synchronisation alimentaire, par l’étude de
l’expression des gènes horloges dans diverses structures cérébrales et périphériques en
réponse à une restriction alimentaire. A cette approche moléculaire, nous avons ajouté des
études fonctionnelles dans le système nerveux central ainsi que des expériences d’ablation
93
chirurgicale. Ces approches moléculaires et physiologiques combinées au suivi
comportemental des animaux doit apporter une meilleure connaissance des mécanismes et du
substrat neuroanatomique sous-tendant la synchronisation alimentaire.
94
CHAPITRE 3
RESULTATS
96
I. Timed hypocaloric feeding and melatonin synchronize
the suprachiasmatic clockwork in rats, but with opposite
timing of behavioral output.
L’horloge circadienne principale, les noyaux suprachiasmatiques de l’hypothalamus, peut être
remise à l’heure quotidiennement soit par l’alternance du jour et de la nuit (cycle LD) soit par
des facteurs non photiques, tels que l’application pharmacologique de mélatonine ou une
restriction calorique. Jusqu’ici, les relations de phase entre les acteurs des oscillations
circadiennes et le comportement n’ont été étudiés que chez des animaux synchronisés au
cycle LD ou en conditions constantes d’éclairement.
Dans l’article qui va suivre, nous avons mis en place des expériences nous permettant de
déterminer si l’organisation temporelle de l’horloge moléculaire est altérée par des
synchroniseurs non photiques. Nous avons mesuré l’expression des gènes horloges (Per1,
Per2, Bmal1) et des gènes contrôlés par l’horloge (AVP), chez des rats synchronisés par la
lumière ou placés en obscurité constante et synchronisés par la mélatonine ou la nourriture.
La phase d’expression des gènes horloges a ensuite été comparée à celle de l’activité
locomotrice, mesurée par actimétrie.
Dans les SCN d’animaux synchronisés à un cycle LD, les pics d’expression de Per1 et Per2
surviennent durant le jour, c’est à dire durant la phase de repos d’un rongeur nocturne, et le
pic d’expression de Bmal1 apparaît durant la nuit (phase d’activité de l’animal nocturne).
Chez des rats en obscurité constante, les rythmes d’activité locomotrice peuvent être
synchronisés par un créneau lumineux quotidien de 1 heure. Ce créneau est interprété comme
le début du jour, comme démontré par l’arrêt de l’activité locomotrice après celui-ci. Une
perfusion sous cutanée quotidienne de mélatonine (hormone normalement sécrétée
uniquement la nuit) peut également synchroniser les rythmes d’activité locomotrice. Dans ce
cas, le début de la perfusion coïncide avec le début de la nuit et l’activité commence au début
de la perfusion quotidienne.
L’analyse de l’expression des gènes horloges dans les SCN confirme cette interprétation
puisque, dans les deux cas, le pic d’expression de Bmal1 (« gène de nuit ») coïncide avec la
phase d’activité locomotrice.
Par contre, la synchronisation par un nourrissage hypocalorique modifie profondément
l’organisation de l’activité locomotrice par rapport aux informations de l’horloge moléculaire.
La phase d’activité locomotrice se trouve ainsi en phase avec les pics d’expression de Per1 et
Per2 (« gènes de jour »). Cela indiquerait que la restriction calorique inverse la relation de
phase entre l’horloge des SCN et la sortie comportementale, c'est-à-dire que les rats,
habituellement nocturnes, deviennent actifs durant le jour subjectif.
Dans le cortex piriforme, structure du système nerveux central exprimant des gènes horloges
mais n’abritant pas une horloge, le pic d’expression de Per2 survient entre le début et le
milieu de la phase l’activité (mélatonine et synchronisation à la lumière) ou de l’accès à la
97
nourriture. Sachant qu’en conditions de nourriture ad libitum les rats mangent majoritairement
durant la phase nocturne du nycthémère, il semble ici que le pic d’expression de Per2 dans le
cortex piriforme coïncide toujours avec la prise alimentaire.
Ces expériences démontrent que tous les synchroniseurs non photiques ne sont pas
équivalents, ni dans leurs effets sur l’horloge principale, ni pour l’interprétation des signaux
de sortie émis par les SCN. Il est possible que la restriction calorique agisse en aval des
boucles moléculaires des SCN pour générer une organisation comportementale temporelle
opposée à celle du synchroniseur photique et de la mélatonine exogène.
98
[Signalement bibliographique ajouté par :
SICD Strasbourg - Département de la Documentation électronique
Service des thèses électroniques]
Timed hypocaloric feeding and melatonin synchronize the suprachiasmatic
clockwork in rats, but with opposite timing of behavioral output
Ivette CALDELAS, Céline A. FEILLET, Hugues DARDENTE, Françoise ECLANCHER, André
MALAN, Sylviane GOURMELEN, Paul PEVET and Étienne CHALLET
European journal of neuroscience, 2005, Vol. 22, Pages 921-929
Blackwell Synergy® is a Blackwell Publishing, Inc. registered trademark
Copyright © 2005, Published on behalf of the Federation of European Neuroscience Societies
Pages 99-107 :
La publication présentée ici dans la thèse est soumise à des droits détenus par un éditeur
commercial.
Pour les utilisateurs ULP, il est possible de consulter cette publication sur le site de
l’éditeur :
http://dx.doi.org/10.1111/j.1460-9568.2005.04284.x
La version imprimée de cette thèse peut être consultée à la bibliothèque ou dans un autre
établissement via une demande de prêt entre bibliothèques (PEB) auprès de nos services :
http://www-sicd.u-strasbg.fr/services/peb/
II. Modifications of local cerebral glucose utilization
during circadian food anticipatory activity.
Nous savons qu’après ablation chirurgicale des SCN les animaux deviennent arythmiques et
ne sont plus capables de se synchroniser à l’alternance du jour et de la nuit. Cependant les
animaux peuvent encore répondre à des synchroniseurs non photiques, comme l’heure d’accès
à la nourriture. Il est ainsi possible de synchroniser plusieurs rythmes circadiens par une
restriction alimentaire. Les rats précédemment arythmiques présentent alors une FAA
observable dans de multiples paramètres physiologiques et comportementaux. Le contrôle de
la synchronisation alimentaire, et donc de la composante d’anticipation repose sur l’horloge
alimentaire, structure cérébrale dont la localisation reste inconnue à ce jour.
L’approche lésionnelle ayant jusqu’ici échoué dans la recherche du substrat anatomique soustendant la synchronisation alimentaire, nous avons cherché une approche nouvelle.
Nous avons émis l’hypothèse selon laquelle une structure impliquée dans la synchronisation
alimentaire aurait une activité modifiée durant la FAA, et donc que sa consommation de
glucose serait modifiée à ce temps horaire en condition de restriction alimentaire par rapport à
une condition de nourriture disponible ad libitum.
Nous avons donc analysé l’influence d’une restriction temporelle et d’une restriction
calorique sur les variations d’activité métabolique locale, mesurées dans un grand nombre de
structures cérébrales, grâce à la technique du 2-DésoxyGlucose, en comparaison avec une
condition de nourriture ad libitum, chez le rat. Les deux conditions de restriction devaient
nous permettre de différencier les structures impliquées dans la synchronisation alimentaire
en elle-même (restriction temporelle, sans déplétion d’énergie) par rapport aux structures
impliquées dans la réponse à une déplétion en énergie (restriction calorique).
Nous avons ainsi démontré que le noyau paraventriculaire thalamique ne répond qu’à une
restriction temporelle. La consommation locale de glucose dans les feuillets intergéniculés,
les noyaux arqués et les noyaux paraventriculaires hypothalamiques ne varie qu’en condition
de restriction calorique. L’aire préoptique médiale, le cervelet et le noyau du tractus solitaire
répondent aux deux types de restriction.
Ces travaux soulignent la complexité du réseau sous-tendant la synchronisation alimentaire et
révèlent des structures qui devront être privilégiées dans la recherche de l’horloge alimentaire.
108
[Signalement bibliographique ajouté par :
SICD Strasbourg - Département de la Documentation électronique
Service des thèses électroniques]
Modifications of local cerebral glucose utilization during circadian foodanticipatory activity
A. PEREIRA DE VASCONCELOS, I. BARTOL-MUNIER, C.A. FEILLET, S. GOURMELEN, P.
PEVET and E. CHALLET
Neuroscience, 2006, Vol. 139, Pages 741-748
Copyright © 2006 IBRO Published by Elsevier Ltd.
Pages 109-116 :
La publication présentée ici dans la thèse est soumise à des droits détenus par un éditeur
commercial.
Pour les utilisateurs ULP, il est possible de consulter cette publication sur le site de
l’éditeur :
http://dx.doi.org/10.1016/j.neuroscience.2005.12.045
La version imprimée de cette thèse peut être consultée à la bibliothèque ou dans un autre
établissement via une demande de prêt entre bibliothèques (PEB) auprès de nos services :
http://www-sicd.u-strasbg.fr/services/peb/
III. Restricted feeding in SCN-lesioned rats restores
daily rhythms not only of locomotor activity but also of
pineal melatonin: role of corticosterone?
Même si une lésion des SCN chez le rat a pour conséquence une arythmie immédiate dans
nombre de paramètres, elle n’empêche pas la synchronisation des animaux par une restriction
temporelle de l’accès à la nourriture (RF). Cette synchronisation se manifeste notamment
dans l’activité locomotrice (FAA) et la sécrétion de corticostérone, qui augmentent dans les
heures précédant l’accès à la nourriture. Ces phénomènes sont sous contrôle de la FEC.
Le système nerveux sympathique (SNS) est à la fois impliqué dans le contrôle du pic
anticipatoire de corticostérone (FAC) par la FEC, dans le contrôle de la sécrétion de
mélatonine par les SCN et peut être influencé par l’activité locomotrice. Ce système constitue
donc un lien important entre les horloges circadiennes et leurs sorties.
Sachant qu’une RF provoque une FAA et une FAC, il était possible que la FEC soit capable
d’exercer un contrôle, direct ou indirect, sur le SNS et ainsi d’influer sur une autre sortie des
SCN : la sécrétion rythmique de mélatonine par la glande pinéale.
Dans la présente expérience, nous confirmons une perte de rythmicité dans la sécrétion de
mélatonine chez des rats SCN lésés nourris ad libitum. De manière inattendue, cette sécrétion
redevient rythmique lorsque les animaux sont soumis à une RF.
Afin de déterminer si un rétrocontrôle d’une ou plusieurs des sorties connues de la FEC
pourrait être responsable de cette restauration, nous avons induit un pic quotidien de
corticostérone chez des animaux nourris ad libitum, grâce à une immobilisation quotidienne
dans les heures précédant l’accès à la nourriture. Ce traitement ne restaure pas le rythme de
sécrétion de mélatonine par la glande pinéale, indiquant que la FAC n’est probablement pas à
l’origine de ce phénomène. Par contre, une immobilisation quotidienne durant la FAA chez
des animaux en RF abolit le rythme de mélatonine, indiquant que le rétrocontrôle de l’activité
locomotrice sur le SNS participe au rythme de mélatonine dans la glande pinéale.
Dans une deuxième expérience, nous avons recherché si la FAC pouvait être à l’origine de la
genèse ou du maintien de la FAA. Nous avons donc aboli le pic anticipatoire de
corticostérone soit par une ablation chirurgicale de la glande surrénale, chez des rats SCN
lésés. Cette chirurgie était réalisée avant le début de la RF, afin de déterminer si la
corticostérone était essentielle au déclanchement de la FAA. Un second groupe de rats SCN
lésés était soumis à la RF et recevait une injection quotidienne de métyrapone, un inhibiteur
de la synthèse de corticostérone, une fois que la FAA était stable. Cela devait nous permettre
117
de déterminer si la corticostérone était essentielle au maintien de a FAA. Ces deux
expériences nous ont permis de démontrer que la FAC n’est nécessaire ni à l’établissement, ni
au maintien de la FAA. La corticostérone ne peut donc pas être à l’origine de la restauration
du rythme de sécrétion de mélatonine en RF, même de manière indirecte.
Nous avons donc démontré que la mélatonine, jusqu’ici considérée comme une sortie
exclusive des SCN, peut désormais être considérée comme une sortie indirecte de la FEC.
118
Restricted feeding in SCN-lesioned rats restores daily rhythms not only of
locomotor activity but also of pineal melatonin : role of corticosterone?
Céline A. Feillet1, Paul Pévet1 and Etienne Challet1
1
Department of Neurobiology of Rhythms, Institute of Cellular and Integrative
Neurosciences, IFR37, University Louis Pasteur, Centre National de la Recherche
Scientifique, 67084 Strasbourg, France.
Number of pages: 19.
Number of figures: 6.
Abstract : 204 words.
Introduction : 568 words.
Discussion : 829 words.
Support for this study was provided by the Centre National de la Recherche Scientifique
(E.C.). We would like to thank Dr. Jorge Mendoza for useful comments on this manuscript.
Correspondence should be addressed to Etienne Challet, Department of Neurobiology of
Rhythms, Institute of Cellular and Integrative Neurosciences, IFR37, University Louis
Pasteur, Centre National de la Recherche Scientifique, 5 rue Blaise Pascal, F-67084 cedex
Strasbourg, France. E-mail: [email protected]
Abstract
A food entrainable oscillator (FEO), distinct from the main, light entrainable oscillator
residing in the suprachiasmatic nuclei of the hypothalamus (SCN), is capable of controlling
several rhythmic behaviours such as locomotor activity and corticosterone secretion in SCN
lesioned rats. The sympathetic nervous system is implicated in the control of food anticipatory
corticosterone by the FEO, melatonin secretion by the SCN and can be influenced by
locomotor activity. In the present study, we investigated the effects of a daily restricted
feeding (RF) on food anticipatory activity (FAA), food anticipatory corticosterone (FAC) and
pineal melatonin secretion, in SCN-lesioned rats. Unexpectedly, restricted feeding restored a
rhythmic secretion of melatonin in the pineal gland. A daily immobilization stress, although
mimicking FAC, does not restore rhythmic secretion of pineal melatonin. Moreover, a daily
inhibition of FAA abolishes restoration of rhythmic pineal melatonin. A feedback of FAA on
the sympathetic nervous system is probably responsible for the observed effect on melatonin
secretion under RF. Additional investigation of the importance of FAC for generation of FAA
revealed that corticosterone is neither necessary for generation nor for maintenance of FAA.
Thus we found that melatonin, until now exclusive output of the SCN, can also be controlled
by feeding cues synchronizing the FEO.
Key words: circadian rhythm, corticosterone, food entrainable oscillator, melatonin,
sympathetic nervous system.
Introduction
A master, light-entrainable, circadian clock has been localized in the suprachiasmatic nuclei
of the hypothalamus (SCN) in mammals (Takahashi et al., 2001). Lesions aimed at this
structure, although rendering animals arrhythmic, do not prevent rhythmicity induced by a
daily restricted feeding (RF; Mistlberger, 1994). This rhythmicity manifests itself in various
behavioural and physiological parameters such as locomotor activity, core body temperature
and corticosterone secretion. An increasing number of studies show that an oscillator situated
outside the SCN and entrained by food is responsible for the control of these parameters
(Mistlberger, 1994). When synchronized by a RF, such a Food Entrainable Oscillator (FEO)
distributes rhythmic messages that control anticipatory peaks in activity (food anticipatory
activity: FAA; Stephan et al, 1979), temperature (food anticipatory thermogenesis: FAT;
Krieger et al., 1977; Challet et al, 1997; Recabarren et al, 2005,) and corticosterone (food
anticipatory corticosterone secretion: FAC; Krieger et al., 1977; Honma et al., 1984; DiazMunoz et al., 2000; Bodosi et al., 2004), thus restoring a circadian rhythmicity.
Corticosterone secretion is achieved by the adrenal gland and controlled via both humoral and
sympathetic nervous information (Kalsbeek and Buijs, 2002). Considering that no increase of
ACTH (the hypophysis hormone triggering corticosterone release) is found during FAC
(Wilkinson et al, 1979), it is likely that the FEO controls FAC via sympathetic fibres.
Moreover, it is known that increased locomotor activity is associated with activation of the
sympathetic system (Saris, 1995; Leal-Cerro et al., 2003; Mueller, 2007). So sympathetic
pathways may play a role in FEO’s outputs..
The sympathetic nervous system (SNS) has also been implicated in melatonin secretion, a
well-known output of the circadian system. The SCN control rhythmic melatonin secretion
via a polysynaptic pathway leading to noradrenaline release by sympathetic terminals in the
pineal gland (Larsen, 1999 ; Teclemarian-Mesbah et al., 1999). It cyclically activates the
transcription of the Aryl-Alkylamine-N Acetyl Transferase (AA-NAT), the rate limiting
enzyme for melatonin synthesis. After SCN lesion (SCN-X), both AA-NAT and melatonin
rhythms are abolished (Perreau-Lenz et al., 2003). Knowing that RF increases locomotor
activity (FAA) and corticosterone secretion (FAC) in anticipation to mealtime, it is possible
that RF could also restore a melatonin rhythm in the pineal gland even without functional
SCN. To test this hypothesis, we submitted SCN-X rats to a daily RF. We then demonstrated
that RF can restore melatonin rhythm in the pineal gland of SCN-lesioned rats.
To dissociate the possible role of FAA and FAC in this phenomenon, we suppressed FAA in
food restricted animals by submitting them do a daily immobilization. In addition, we
submitted ad libitum fed SCN-X rats to a daily immobilization stress at the time of FAA. This
treatment is known to induce a daily rise in corticosterone secretion and then should mimic
FAC without RF. We found that RF in SCN-X rats restores a rhythm in pineal melatonin
content independently of corticosterone.
Given that RF also restores rhythms in both corticosterone and activity we could not exclude
that the rise in corticosterone would trigger FAA, which would in turn feedback on the
sympathetic system to elicit melatonin secretion. Although we know that adrenalectomy does
not suppress FAA in SCN intact rats (Boulos et al, 1980), its influence in SCN-X animals
remains unknown. We then suppressed FAC both by surgical and pharmacological means in
SCN-X rats under RF. Because FAA does not originate from anticipatory corticosterone
secretion, FAC and FAA appear to be independent outputs of the FEO.
Materials and methods
Animals
All experiments were performed in accordance with the European Committee Council
Directive of November 24th, 1986 (86/609/EEC), and the French Department of Agriculture.
For all experiments, 3 months old Long Evans male rats (Janvier, France) were used. After 2
weeks of stabulation, animals were transferred to individual cages equipped with a running
wheel to allow activity monitoring. They were kept under 12 hours of light / 12 hours of dark
conditions (LD 12/12), with 200 lux light intensity from 0700 h, under constant conditions of
ambient humidity and temperature, with food and water provided ad libitum unless otherwise
stated. In both experiments, animals were weighed every week.
Experimental procedures
Experiment 1: role of corticosterone peak for genesis of melatonin rhythm.
The aim of this experiment was to assess if FAA could restore melatonin secretion on the
pineal gland in SCN-X rats under RF. 80 rats were used for this experiment. After SCN lesion
(see below), they were left three weeks to recover from surgery? Based on arrhythmic wheel
running activity during the 3 weeks of recovery, 63 animals were kept for the next steps of the
experiment. Rats were randomly assigned to the ad libitum group (AL) or the food restricted
group (RF) and transferred to constant dim red light conditions (DD). The RF group was
submitted to a 6 hours food access, ZT0 being the time when food was provided. After 2
weeks of restriction, each group was further divided in 2 groups: the AL (24 rats) and RF (28
rats) groups were kept under the same feeding conditions as above. The ALi (12 rats) and RFi
(15 rats) groups were submitted to a 3 hours immobilization (ZT21 to ZT0) in a semi circular
tube (diameter : 5 cm) every day for 7 days, to prevent locomotor activity at the time of FAA.
On the 7th day of immobilization, all rats were decapitated under deep pentobarbital
anaesthesia, at ZT22, ZT4, ZT10 and ZT16. Brains were removed and frozen in cooled
isopenthane. They were then sliced in a cryostat at the level of the SCN and stained with
Cresyl violet to confirm complete SCN lesion. Pineal glands were taken separately to assess
for melatonin content by radio-immuno assay (see below).
Experiment 2: role of corticosterone anticipatory peak for genesis and maintenance of FAA.
The aim of this experiment was to test the necessity of the anticipatory rise in corticosterone
synthesis for the generation and maintenance of FAA. Thus, we inhibited this peak, either by
using adrenalectomized animals or by a daily injection of metyrapone (Sigma, St. Louis, MO,
USA). This treatment inhibits stress-induced corticosterone synthesis by suppressing 11 beta
steroid hydroxylation (Jenkins et al, 1958). 30 rats were used for this experiment. After
undergoing SCN lesion (see below), wheel-running activity was assessed during the 2 weeks
of recovery to check for arrhythmicity which would account for a successful lesion. 24 rats
were kept for the rest of the experiment. Animals were then randomly assigned to the ad
libitum fed group (AL: 4 rats) or the restricted fed group (RF: 20 rats). The RF group was
further divided into 3 groups: metyrapone injection group (RFm: 8 rats), vehicle injection
group (RFs: 7 rats) and adrenalectomized group (RFadX: 5 rats). The RFadX group
underwent adrenalectomy the next day (see below). All animals were kept under ad libitum
conditions until then. After a recovery period of 12 days, all animals were transferred to
constant dim light (5-10 lux at the level of the cages) and RF was started for all RF groups.
Under this lighting condition, ZT0 was the time of food access, and food was provided for 6
hours. After 17 days of food restriction, a daily subcutaneous injection of metyrapone (100
mg/kg dissolved in 0.9% NaCl + 3% Tween 80) was performed at ZT18 on the RFm group.
As a control, we also injected 0.9% NaCl + 3% Tween 80 at the same time to the RFS group
and to the AL group to assess for non specific effect of the vehicule or synchronizing effect of
the injection respectively. Wheel running was recorded at all times to follow the evolution of
FAA. On the 7th day of injection, animals were sacrificed by decapitation under deep
pentobarbital anaesthesia, either at ZT22 or at ZT0. Brains were removed and frozen in
cooled isopenthane. They were then sliced in a cryostat at the level of the SCN and coloured
with Cresyl violet to confirm complete SCN lesion. Blood samples were also taken to
measure plasma corticosterone concentration.
Surgery
Electrolytic SCN lesion
After spending 2 weeks in their individual cage, all rats were deeply anesthetized with i.p. 60
mg/kg ketamine and 10 mg/kg xylazine i.p. and positioned in a stereotaxic head frame with
the incisor bar set at + 5 mm. After midline incision of the skin, 2 symmetrical holes were
drilled in the skull. A lesion electrode aimed at the SCN, insulated everywhere but at its tip,
was descended bilaterally, with an angle of 2° at predetermined coordinates (from Bregma:
AP +1.8 mm; ML ± 0.5 mm; DV – 8.4 mm). An anodal current of 1 mA was passed through
the electrode for 20 sec. The electrode was then removed, the skin sutured and the animals
were left 2 weeks to recover from surgery.
Adrenalectomy
Rats from the RFadX group were deeply anesthetized with i.p.60 mg/kg ketamine and 10
mg/kg xylazine. Two incisions in the skin and muscles were made on each side of the spine to
allow access to the adrenal gland. The adrenal glands were removed, muscles were sutured
and a 250 mg corticosterone implant containing 35% corticosterone and 65% cholesterol was
inserted subcutaneously. This type of implant is known for providing a constant intermediate
level of corticosterone for 2 to 3 weeks (Maurel et al., 2001).The skin was then sutured and
the animals were left 12 days to recover. From the day of surgery, all adrenalectiomized (adX)
animals had free access to NaCl 0.9% containing water to compensate for mineralocorticoid
loss after adrenalectomy.
Radio-immuno assays (RIA)
Pineal melatonin content in AL, Ali, RF and RFi rats.
pineal glands were homogenized by sonication in 500 µL 1X PBS and further processed in
RIA for melatonin. Briefly, a rabbit polyclonal anti-melatonin antibody (R 19540 INRA,
Nouzilly, France) was used at a final concentration of 1/90000. The antibody was added to
200 µL of sample and 100 µL of
125
I-radiolabeled melatonin (10000 cpm/100 µl). This mix
was left overnight at 4°C. The next day, the antibody-linked fraction was precipitated with a
sheep/anti-rabbit serum (INRA, Nouzilly, France). After centrifugation, the supernatant was
discarded and pellets, together with standard solutions, were counted in a gamma counter to
determine melatonin concentrations.
Protein content was assayed on the remaining pineal homogenates.
Plasma corticosterone content in AL, RFs, RFm and RFadX rats
Corticosterone was assayed with a commercial kit (ICN Biomedical division Carson, CA,
USA). All reactives were diluted to half their original concentration to match assay to
volumes and concentrations of our plasma samples. All samples were diluted to 1/200 of their
initial concentration with the steroid diluent from the kit. The assay was then performed
according to a modified manufacturer’s protocol. Briefly, 50 µl of anti-corticosterone
antibody, 25 µl of sample (or standard solution provided in the kit) and 50 µl of
125
I-
radiolabeled corticosterone (6000 cpm/50 µl) were incubated overnight at 4 °C. The next day,
activated charcoal was added to the mix to precipitate linked antibodies. After centrifugation,
the supernatant was discarded and pellets, together with standard solutions, were counted in a
gamma counter to determine plasma corticosterone concentrations.
Wheel running activity analysis
Mean daily wheel running activity and activity between ZT20 and ZT0 (corresponding to
FAA) were quantified during the last 8 days of ad libitum feeding, restricted feeding (before
immobilization and injection treatments) and during treatment periods, using Clocklab
software (actimetrics, Evanston, IL, USA). Loss of rhythmicity after SCN lesion and
restoration of a daily rhythmicity by RF were assessed by χ2 periodogram (Clocklab).
Statistical analysis
Data are presented as means ± SEM. ANOVAs, with or without repeated measures, followed
by post-hoc comparisons with the Tukey test were used to compare more than two groups.
Pineal melatonin levels were fitted by a nonlinear least-squares regression using the following
cosine-wave equation (cosinor): y = [A+B×cos (2π×(t-C)/24] where y is the level of
melatonin, A the mean level of melatonin, B the amplitude of melatonin oscillation, C the
acrophase of oscillation and t the time (h).
Results
Experiment 1: role of corticosterone peak for genesis of melatonin rhythm.
The aim of this experiment was to assess if FAA could influence melatonin synthesis by the
pineal gland in SCN-lesioned rats under RF. The 63 animals kept for the experiment were
arrhythmic as assessed by χ2 periodogram and histology confirmed complete bilateral lesion
of the SCN. Mean daily activity was not different between groups before restriction. After a
few days under RF, a clear FAA developed in all restricted groups (fig. 1). When quantifying
FAA in the 4 hours preceding access to food, wheel-running activity was significantly higher
in the RF and RFi groups compared to the AL and Ali groups (fig. 2). The 3 hours of
immobilization abolished activity between ZT21 and ZT0 in both RFi and ALi groups, but did
not modify wheel running activity any further during the other 20 h of the day (fig. 1).
Knowing that immobilization can elicit high concentrations of plasma corticosterone, we
performed RIA for corticosterone in the plasma of AL, ALi, RF and RFi rats. All immobilized
animals showed stress levels of corticosterone at ZT22 and levels comparable to non
immobilized rats at all other time points (fig. 3). Cosinor analysis confirmed restoration of a
daily rhythm of corticosterone release in ALi and RFi animals.
RIA assay of pineal melatonin revealed different profiles: no significant oscillation was
detected in AL, ALi and RFi rats. A clear restoration of a rhythmic pineal melatonin secretion
was observed in RF animals with a peak at ZT10, which was confirmed by cosinor analysis.
A significant effect of both RF and immobilization were revealed by ANOVA (p<0.05)
accounting for restoration of a melatonin rhythm under RF and a disappearance of that rhythm
under immobilization condition (fig 3). So it is probable that FAA is essential for restoration
of a rhythm in melatonin secretion in SCN-X animals. This observation is reinforced by the
fact that this rhythm disappears in RFi animals. Also note that no rhythm in pineal melatonin
could be detected in ALi animals, thus demonstrating that a daily peak of corticosterone
cannot by itself restore a rhythm in melatonin secretion.
Experiment 2: Role of corticosterone for genesis and maintenance of FAA.
The aim of this experiment was to test the necessity of the anticipatory rise in corticosterone
synthesis for the generation and maintenance of FAA. Thus, we inhibited this peak, either by
using adrenalectomized animals or by a daily injection of metyrapone. All 24 SCN-lesioned
rats were arrhythmic as assessed by χ2 periodogram. Mean daily activity was not different
between groups before restriction. After a few days under RF, a clear FAA developed in all
restricted groups (fig. 4). Appearance of FAA was concomitant with a significant increase in
daily wheel running activity that was significantly higher in the RFs group (p<0.05). FAA
was significant in the RFs group compared to AL group (fig. 5; p<0.05). Moreover, no
statistical difference could be detected in FAA intensity between RFs, RFadX and RFm
before injections (p>0.05) indicating that FAC is not essential for the generation of FAA.
Nonetheless, a significant difference was observed after metyrapone treatment between RFs
and RFm groups and within the RFm group when comparing before and after treatment
conditions (p<0.05). The ratio of FAA compared to total daily activity was nonetheless
conserved. The significant effect of metyrapone would suggest the implication of FAC in
maintenance of FAA, but we cannot fully exclude an influence of vehicle injection on activity
as we also found a significant reduction in daily activity in the AL group injected with saline
(p<0.05). FAA was though still evident and significant differences between RFm and AL
groups were still detectable (p<0.05; fig. 5).
RIA for corticosterone revealed that, as expected, metyrapone injection at ZT21 inhibited the
FAC, levels of corticosterone being intermediate (200 ng/ml) at both ZT22 and ZT0 (fig. 6),
which also correspond to levels observed in the AL group at ZT22. Corticosterone implants
restored the same levels in RFadX rats (fig. 6). Higher mean levels (370 ng/ml) were observed
in RFs animals, though not significantly different from AL rats probably due to high
dispersion. Higher levels (430 ng/ml) with smaller dispersion were observed in this group at
ZT0 when the FAC is supposed to be maximal. It was significantly different from the RFm
group confirming inhibition of FAC by metyrapone injection. These results rule out
corticosterone as an essential message for generation of FAA but do not permit to fully
exclude its implication in maintenance and stabilization of FAA.
Discussion
The present study aimed at testing if RF can influence a well known output of the SCN, in
SCN-X animals: melatonin synthesis by the pineal gland. Our results confirmed that
melatonin displays no daily variation in SCN-X rats fed ad libitum (Perreau-Lenz et al, 2003).
Importantly, our results in the RF group show that a rhythmic melatonin secretion can be
restored by RF in the pineal gland of SCN-X rats. It is known that RF induces both a FAA
and a FAC (Mistlberger, 1994; Honma et al., 1984) Thus at least two causes could explain
how RF restores melatonin rhythm in the pineal gland: the rise in plasma corticosterone
and/or the rise in wheel-running activity in anticipation to feeding, that would feedback on the
pineal gland. To test the first hypothesis, we submitted SCN-X rats fed ad libitum to a daily
immobilization at the time of anticipation (ALi group). This treatment is known to elicit a
daily peak of corticosterone due to restraint stress but is not equivalent to restricted feeding in
terms of entrainment (Ottenweller et al, 1987). When assaying pineal melatonin in the ALi
group, we did not find any restoration of its rhythm. Thus it is probable that FAC does not
trigger the observed phenomenon on melatonin in the RF group. Our second hypothesis was
that FAA was responsible for the de novo rhythmic content of melatonin in the pineal gland: it
is known that locomotor activity can feedback on the SNS (Saris, 1995; Leal-Cerro et al.,
2003; Mueller, 2007). So we postulated that restoration of melatonin rhythm would be a
consequence of a feedback of locomotor activity on the SNS that would trigger melatonin
secretion in the pineal gland. Thus we submitted RF animals to a daily immobilization at the
time of FAA, to suppress locomotor activity (RFi group). As expected, this treatment
abolishes the rhythm of melatonin content in the pineal gland, that was otherwise observed in
the RF group. Therefore it seems that FAA is necessary for rhythmic melatonin secretion by
the pineal gland in SCN-X rats. Hence we demonstrate that the FEO can indirectly control a
well-known, and until now exclusive, output of the SCN. We have then identified a new
putative output of the FEO.
Considering those results on the relative independency of melatonin rhythm restoration to
corticosterone secretion, we could not rule out that anticipatory corticosterone could be a
primary output of the FEO, triggering FAA that would be then an indirect output of the FEO.
Thus we could not exclude that the rise in corticosterone would trigger FAA, which would in
turn feedback on the sympathetic system to elicit melatonin secretion. Moreover, no previous
study had explored the effect of the absence of corticosterone secretion on the genesis and
maintenance of FAA in SCN-X animals. In our second experiment, we inhibited FAC by
means of adrenalectomy or a daily injection of metyrapone, in SCN-X rats. Ad libitum and
food restricted animals injected with saline at the time of metyrapone injection were used as
controls. In the ALs group, no rhythmicity was detected at anytime. A significant decrease in
wheel-running activity was detected in this group after the injection even with vehicle,
showing a deleterious effect of the injection/vehicle on locomotor activity. Nevertheless, such
an effect was not detected in the RFs group. As expected in the RFs group, a clear FAA
developed within a few days after the start of RF. FAA was also evident in the RF +
adrenalectomy group and was equivalent to that observed in the RFs group. This result
indicates that FAC and corticosterone are not essential for generation of FAA. In the RF +
metyrapone injection group, FAA developed as in the RFs group before the injection. After
the injection, a significant decrease in general activity could be detected like in the ALs
group, but FAA was still evident in the RFm group. If we cannot fully exclude a modulatory
effect of FAC on FAA intensity, its is clear that corticosterone is not essential for
maintenance of FAA.
Taken as a whole, this study demonstrates that a rhythmic daily secretion of melatonin can be
restored by RF in the pineal gland of SCN-X rats. Both FAA and rhythmic melatonin
secretion in this context seem to be corticosterone independent, or at least, corticosterone
seems to be dispensable for generation of these two phenomena. Additional experiments will
be needed to assess the modulatory role of corticosterone.
Finding melatonin as another output of the FEO provides new insights in the field of food
synchronization: structures and tissues otherwise insensitive to feeding cues and expressing
melatonin receptors, could be indirect targets of the FEO via the control of melatonin
secretion. When the main cerebral clock is lacking, feeding cues can synchronize the FEO and
restore a global temporal organization not only for locomotor activity, but also for hormones
secretion, including corticosterone and melatonin. Such an overall rhythmicity could be
mediated via daily activation of the sympathetic nervous system.
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A
B
C
D
Figure 1: Influence of RF and immobilization on rhythms of wheel running activity in SCN
lesioned rats.
Double-plotted actograms of SCN-X rats, representative of each group: (A) AL group, (B)
ALi group, (C) RF group, (D) RFi group. Red arrows mark the day of SCN lesion. Note the
development and persistence of FAA (green box) in all RF groups. Lighting conditions are
indicated in the background, grey shading indicating the dark period. The red and blue boxes
show access to food during RF and immobilization period, respectively.
FAA
450
*
400
wheel revolutions
350
300
250
AL
200
RF
150
100
50
0
1
group
Figure 2: Influence of RF on Food Anticipatory Activity in SCN-lesioned rats.
Histograms represent mean wheel counts ± SEM between ZT20 and ZT0 in the AL and RF
group, before immobilization.
A
Melatonin (pg/mg prot)
Pineal melatonin
400
350
300
250
200
150
100
50
0
AL
ALi
RF
RFi
ZT22
ZT4
ZT10
ZT16
ZT22
Time (h)
B
Corticosterone (ng/ml)
Plasma corticosterone
800
700
600
500
400
300
200
100
0
AL
ALi
RF
RFi
ZT22
ZT4
ZT10
ZT16
ZT22
Time (h)
Figure 3: pineal melatonin (A) and plasma corticosterone (B) in AL, ALi, RF and RFi rats.
AL, ALi, RF and RFi groups are represented in dark blue, pink, yellow and light blue
respectively. All curves represent mean values ± SEM. The ZT22 point was double plotted to
increase readability but was not used for statistical analysis. Red boxes indicates timing of
food availability under RF.
A
B
C
D
Figure 4: Importance of FAC for FAA.
Double-plotted actograms of SCN-X rats, representative of each group: (A) AL group, (B)
RFs group, (C) RFadX group, (D) RFm group. Red, green and blue arrows mark the day of
SCN lesion, adrenalectomy and first day of injection respectively. Note the development and
persistence of FAA (green box) in all RF groups. Lighting conditions are indicated in the
background, grey shading indicating the dark period. The red box shows access to food during
RF.
FAA
80
*
70
% daily mean
60
50
40
before injection
*
after injection
30
20
10
0
Als
RFs
RFadX
RFm
group
Figure 5: Influence of RF, adrenalectomy and metyrapone injection on Food Anticipatory
Activity (FAA) in SCN-lesioned rats.
Histograms represent % of activity compared to total daily activity ± SEM, between ZT20 and
ZT0 in the ALs, RFs, RFadX and RFm groups, before and after injection treatment. Stars
show statistical difference between two groups (p<0.05).
Plasma corticosterone
600
*
Corticosterone (ng/ml)
500
*
*
400
Als
RFs
300
RFadX
RFm
200
100
0
ZT22
ZT0
Time (ZT)
Figure 6: Plasma corticosterone in AL (ZT22), RFs (ZT22, ZT0), RFm (ZT22, ZT0) and
RFadX (ZT0).
Data are presented as mean concentration in ng/ml ± SEM. Stars show statistical difference
between two groups (p<0.05).
IV. Lack of Food Anticipation in Per2 Mutant Mice.
À la différence des SCN, pour lesquels la lumière est le synchroniseur le plus puissant, les
oscillateurs centraux et périphériques sont très sensibles à une restriction de l’accès à la
nourriture. Lors d’une restriction alimentaire, les rongeurs expriment une FAA qui
correspondrait au comportement de recherche alimentaire dans des conditions naturelles. Ce
phénomène est observé à la fois pour l’activité locomotrice et la température corporelle, qui
augmentent dans les heures précédant l’accès à la nourriture. Ces paramètres sont considérés
comme des sorties de l’horloge alimentaire, entité qui permettrait l’estimation de l’heure de
disponibilité alimentaire.
Alors que la machinerie moléculaire des SCN implique un ensemble de gènes horloges, les
mécanismes sous-tendant la synchronisation alimentaire et le fonctionnement de l’horloge
alimentaire restent mal connus.
Les gènes Npas2 et Cry1/Cry2 ont été identifiés comme acteurs moléculaires possibles de
l’horloge alimentaire, mais les altérations phénotypiques observées lorsque ces mutants sont
soumis à une restriction alimentaire sont assez modérées.
Les gènes Per ont été largement impliqués dans la synchronisation des SCN par la lumière, et
il était donc probable qu’il soient également impliqués dans des mécanismes de
synchronisation plus généraux. Nous avons donc étudié le rôle des gènes Per1 et Per2 dans la
genèse du comportement anticipatoire en réponse à une restriction alimentaire quotidienne.
Pour ce faire, nous avons soumis des souris Per1 knock out (KO), Per2 mutantes (Per2Brdm1)
et sauvages (WT), à une restriction alimentaire et mesuré leur activité locomotrice et leur
température corporelle, dans 3 conditions d’éclairement (LD, DD, LL).
Alors que l’activité anticipatoire est parfaitement normale chez les WT et les Per1 KO, nous
avons observé que la FAA est totalement absente chez les Per2Brdm1 aussi bien dans l’activité
de roue que dans l’activité générale et la température. Par contre, concernant la température,
la réponse de thermogenèse suivant l’accès à la nourriture est tout à fait normale. L’absence
de FAA ne semble pas être la conséquence d’une déplétion plus importante en énergie chez
ces mutants. Le fait que la FAA soit absente dans les trois conditions d’éclairement, y
compris en obscurité constante, élimine la possibilité que les souris ne courent pas en
conséquence d’une photophobie accrue.
Afin de compléter ces résultats comportementaux, nous avons mesuré l’expression de gènes
horloges et de gènes contrôlés par l’horloge dans les SCN et les tissus périphériques de souris
WT, Per1 KO et Per2Brdm1, en conditions de restriction calorique et ad libitum. L’expression
des gènes horloges dans les SCN est altérée par une restriction calorique, de manière
différentielle entre les génotypes. Comme démontré auparavant, la restriction alimentaire
affecte de façon majeure la phase d’expression des gènes horloges dans le foie et les reins.
Les déphasages observés sont comparables entre les génotypes, ce qui indique que la
138
synchronisation par la nourriture ne repose pas sur les gènes Per dans les tissus
périphériques.
Cette étude démontre donc qu’une mutation du gène Per2 abolit l’anticipation des repas sans
interférer avec la synchronisation alimentaire des tissus périphériques. Elle révèle Per2
comme l’un des acteurs majeurs de la synchronisation alimentaire au niveau central et
probablement de la machinerie moléculaire sous-tendant le fonctionnement de l’horloge
alimentaire.
139
[Signalement bibliographique ajouté par :
SICD Strasbourg - Département de la Documentation électronique
Service des thèses électroniques]
Lack of Food Anticipation in Per2 Mutant Mice : report and supplemental data
Céline A. FEILLET, Jürgen A. RIPPERGER, Maria Chiara MAGNONE, Abdul DULLOO, Urs
ALBRECHT, and Étienne CHALLET
Current biology, 2006, Vol. 16, Pages 2016-2022
Copyright © 2006 Elsevier Ltd All rights reserved.
Pages 140-146 et 147-152 :
La publication présentée ici dans la thèse est soumise à des droits détenus par un éditeur
commercial.
Pour les utilisateurs ULP, il est possible de consulter cette publication sur le site de
l’éditeur :
http://dx.doi.org/10.1016/j.cub.2006.08.053 (report)
http://www.current-biology.com/cgi/content/full/16/20/2016/DC1/mmc1.pdf
(supplemental data)
La version imprimée de cette thèse peut être consultée à la bibliothèque ou dans un autre
établissement via une demande de prêt entre bibliothèques (PEB) auprès de nos services :
http://www-sicd.u-strasbg.fr/services/peb/
V. Forebrain
hands.
oscillators
ticking
with
different
clock
La machinerie moléculaire des SCN repose sur des boucles de rétroaction composées de
gènes horloges tels que Per1-2, Cry1-2, Bmal1 et Clock.
Une expression rythmique des gènes Per1 et Per2 a été observée dans de nombreuses
structures centrales hors SCN.
Cependant, les entités fonctionnelles des boucles moléculaires sont les protéines horloges.
Pourtant, à part dans les SCN où leur expression est bien établie, ainsi que dans un nombre
limité de structures centrales, les patrons d’expression de PER1 et PER2 sont peu connus.
Nous avons donc étudié par immunohistochimie, chez des souris nourries ad libitum, les
rythmes d’expression des protéines PER1 et PER2 dans le striatum dorsal (dST), le noyau
paraventriculaire thalamique (PVT), les noyaux paraventriculaires hypothalamiques (PVN), le
cortex piriforme antérieur (aPirC), les noyaux dorsomédiaux de l’hypothalamus (DMH), les
noyaux ventromédiaux de l’hypothalamus (VMH), les noyaux arqués (Arc), l’hippocampe,
l’amygdale centrale (CEA) et basolatérale (BLA).
Nous démontrons ainsi que PER1 et PER2 ne sont pas exprimées uniformément dans le
télencéphale de la souris, certaines structures exprimant soit l’une ou l’autre des protéines,
soit les deux ensembles. De même, leur phase d’expression n’est pas identique dans toutes les
structures quantifiées.
Afin de rendre compte de la fonctionnalité de cette expression différentielle, des souris
mutantes pour les gènes Per1 ou Per2 ont été utilisées. Nous avons réalisé des hybridations in
situ pour le gène Cry1 dans les mêmes structures que celles utilisées pour
l’immunohistochimie, chez ces souris nourries ad libitum. Le gène Cry1 est un gène horloge
de la boucle négative principale, tout comme Per1 et Per2. nous avons formulé l’hypothèse
que si PER1 est exprimé seul dans une structure, l’expression des autres gènes horloges, par
exemple de Cry1, sera altérée dans cette structure chez des Per1 mutants mais pas chez des
Per2 mutants. Inversement, si c’est PER2 qui est exprimé dans une structure, l’expression de
Cry1 pourrait être altérée chez des Per2 mutants. Enfin, dans les structures exprimant les deux
protéines, on observera une altération différentielle du rythme de Cry1 chez les Per1 et les
Per2 mutants. Ces expériences ont été réalisées en prenant des souris sauvages de la même
souche que les mutantes, maintenues dans les mêmes conditions.
Les résultats obtenus sont en adéquation avec nos hypothèses et lorsqu’une structure exprime
PER1 et/ou PER2, des altérations dans l’expression de Cry1 sont observées dans les mutants
respectifs, comparés à des souris sauvages nourries ad libitum.
Une restriction alimentaire produit des changements physiologiques et comportementaux, qui
sont plus marqués lors d’une restriction calorique. L’expression des gènes horloges peut être
modifiée dans les SCN, les oscillateurs cérébraux hors SCN et les tissus périphériques par ce
type de restriction. Les gènes Per, et a fortiori les protéines PER, sont impliquées dans la
153
synchronisation des SCN par la lumière, et dans des mécanismes plus larges de
synchronisation, comme démontré dans l’article précédent. Il est donc important, pour
comprendre les mécanismes de la synchronisation alimentaire et son intégration par les
différentes structures, d’étudier la réponse des protéines PER1 et PER2 à une restriction
calorique, dans différentes structures du cerveau antérieur. Nous avons ainsi établi que
certaines structures comme l’hippocampe ne répondent pas ou peu à la restriction calorique.
Pour toutes les autres structures, le niveau d’expression de PER1 est augmenté et le rythme
d’expression de PER2 est décalé en réponse à la restriction calorique. Le rythme d’expression
de Cry1 est modifié par la restriction calorique dans les structures étudiées. Cependant, tout
comme pour la condition ad libitum, les profils d’expression observés sont différents en
fonction du génotype : les profils d’expression de Cry1 sont altérés chez les Per1 mutants
dans les structures exprimant normalement PER1 chez des souris sauvages et chez les Per2
mutants dans les structures exprimant normalement PER2, chez les souris sauvages, en
réponse à une restriction calorique.
PER1 et PER2 étant importants pour la synchronisation, l’altération de leur expression dans
des structures cérébrales, corroborée par l’altération différentielle de l’expression des gènes
horloges chez des mutants Per en réponse à une restriction alimentaire, donne des indices sur
les structures importantes pour la synchronisation alimentaire.
De plus, le fait que les protéines PER ne soient pas exprimées de manière uniforme dans le
système nerveux central suggère que les mécanismes de l’horloge, jusqu’ici supposés
ubiquitaires, pourraient être partiellement modifiés, de nombreux oscillateurs cérébraux
fonctionnant avec différentes aiguilles de l’horloge (différents gènes).
154
Forebrain oscillators ticking with different clock hands*
Céline A. Feillet1,3, Jorge Mendoza1,3, Urs Albrecht2, Paul Pévet1 and Etienne Challet1,4
1
Department of Neurobiology of Rhythms, Institute of Cellular and Integrative
Neurosciences, IFR37, University Louis Pasteur, Centre National de la Recherche
Scientifique, 5 rue Blaise Pascal, 67084 Strasbourg, France.
2
Department of Medicine, Division of Biochemistry, University of Fribourg, 1700 Fribourg,
Switzerland.
3
these authors contributed equally to this work.
4
Corresponding author.
E-mail: [email protected]
Tel +33 3 88 45 66 93
Fax +33 3 88 45 66 54
*Supported by Swiss-French Funds “Programme d’actions intégrées Germaine de Staël”
(U.A. and E.C.), the Swiss National Science Foundation, the State of Fribourg and
EUCLOCK (U.A.), the Centre National de la Recherche Scientifique (E.C.), the Institut
Servier (J.M.) and the Fondation pour la Recherche Médicale (J.M.).
1
Abstract
Clock proteins like PER1 and PER2 are expressed in the brain, but little is known about their
functionality outside the main suprachiasmatic clock. Here we show that PER1 and PER2
were neither uniformly present, nor identically phased in forebrain structures of mice fed ad
libitum. Altered expression of the clock gene Cry1 was observed in respective Per1 or Per2
mutants. In response to hypocaloric feeding, PERs timing was not markedly affected in few
forebrain structures (hippocampus). In most other forebrain oscillators, including those
expressing only PER1 (e.g., dorsomedial hypothalamus), PER2 (e.g., paraventricular
hypothalamus) or both (e.g., paraventricular thalamus), PER1 was up-regulated and PER2
largely phase-advanced. Cry1 expression was selectively modified in the forebrain of Per
mutants challenged with hypocaloric feeding. Our results suggest that there is not one single
cerebral clock, but a system of multiple brain oscillators ticking with different clock hands
and differentially sensitive to nutritional cues.
Key words: circadian rhythm, clock proteins, Period, Cryptochrome, DBP, Per mutant.
2
Introduction
In mammals, the master circadian clock which synchronizes physiology and behaviour,
resides in the suprachiasmatic nuclei of the hypothalamus (SCN) and is reset by light/dark
cycles (Takahashi et al., 2001). The SCN clockwork relies on feedback loops in which the
CLOCK/BMAL1 heterodimer activates the transcription of three Period (Per1-3), two
Cryptochrome (Cry1-2) genes and clock-controlled genes such as Dbp (albumin D-site
binding protein). PER and CRY dimers act as negative regulators of CLOCK/BMAL1
(Albrecht, 2004; Ko and Takahashi, 2006). Per1 and Per2 genes are the principal actors of
SCN resetting (Albrecht et al., 1997; 2001; Zheng et al., 2001).
A number of extra-SCN oscillators have been identified in the mammalian brain (Rev. in
Guilding and Piggins, 2007). For instance, rhythmic expression of Per1 and Per2 mRNA is
observed in forebrain structures such as olfactory bulbs, piriform and cerebral cortices,
hippocampus, paraventricular and arcuate hypothalamic nuclei (Asai et al., 2001; Wakamatsu
et al., 2001; Abe et al., 2002; Granados-Fuentes et al., 2004). PER2 expression has also been
reported in limbic structures, such as amygdala and bed nucleus of the stria terminalis (Amir
et al., 2004; Lamont et al., 2005). Except for the SCN in which the rhythm of PERs follows
the mRNA expression by 4-6 h (Field et al., 2000; Mendoza et al., 2007), little is known about
the exact timing of both PER1 and PER2 oscillations in forebrain structures. For that purpose,
we investigated the daily patterns of PER1 and PER2 expression throughout the forebrain in
mice fed ad libitum. Furthermore, to assess the functional significance of PER1 or PER2
oscillations in forebrain structures, we tested the first hypothesis that their molecular
clockwork, as assessed by oscillations of Cry1 and Dbp mRNA levels, would be specifically
altered in Per1 or Per2 mutant mice fed ad libitum.
Whereas light is the principal synchronizer for the SCN, Per oscillations in extra-SCN brain
regions can be affected by feeding cues (Wakamatsu et al., 2001; Lamont et al., 2005;
Angeles-Castellanos et al., 2007). Restricted feeding can produce changes in physiology and
behaviour which are even more marked in response to hypocaloric feeding (HF) (Challet et
al., 2003; Mendoza et al., 2005b; Feillet et al., 2006). Rodents exposed to restricted feeding or
HF express a bout of locomotor activity in the hours preceding access to food. That so-called
food-anticipatory activity is supposed to be controlled by a circadian clock outside the SCN
(Mistlberger, 1994; Stephan, 2001). Per2 mutant mice do not show food-anticipatory activity,
pointing out the essential involvement of Per2 in the anticipation of mealtime (Feillet et al.,
2006). Thus, finding alterations in protein level of PER2 in forebrain areas in response to food
restriction may help to identify structures relevant for food synchronization. For that purpose,
we assessed the expression of both PER1 and PER2 proteins throughout the forebrain of mice
challenged with HF. To evaluate the role of PER1 and PER2 in the adaptation of forebrain
oscillators to food restriction, we hypothesized that HF-induced changes in their clockwork,
evaluated via oscillations of Cry1 and Dbp expression, would be selectively impaired in Per1
or Per2 mutant mice.
Results
Daily patterns of wheel-running activity
All mice fed ad libitum displayed a regular pattern of locomotor activity, with predominant
wheel-running activity during nighttime. When restricted to feed only a hypocaloric diet (HF)
during daytime, WT mice (i.e., C3H and C57BL×129Sv) and Per1 mutant (Per1-/-) mice
developed a daily bout of activity in anticipation of feeding time. By contrast, Per2 mutant
(Per2Brdm1) mice did not show food-anticipatory activity (Fig. 1), in accordance with previous
findings (Feillet et al., 2006).
3
PER1 and PER2 expression in the forebrain of mice fed ad libitum
To test whether the expression of PER1 and PER2 was ubiquitous in the forebrain, we
performed immunohistochemistry for both proteins in mice fed ad libitum. PER1 and PER2
were not both expressed in all structures quantified. In particular, PER1 was expressed alone
in aPirC, dST and DMH; it was rhythmic (p<0.05) with fitted peak values at ZT17, ZT19 and
ZT9, respectively (Table 1, Figs. 2A and 3A), as assessed with cosinor analysis.
PER2 was expressed alone in BLA, PVN and VMH; it was rhythmic (p<0.05) with daily
peaks at ZT21, ZT15, and ZT15, respectively (Table 1, Figs. 2B and 3B). Data obtained for
PER2 expression in BLA confirm previous results gathered in rats (Lamont et al., 2005).
Immunoreactive (IR) signals to both PER1 and PER2 were detected in CA1, DG, CEA, PVT
and Arc; they were found rhythmic in all cases (p<0.05; Figs. 2A, 2B and 3C). PER1 and
PER2 peaked in phase just before dark-light transition (i.e., ZT22) in CA1 and DG, and at
ZT16 in the PVT (Figs. 2A and 3C). In both CEA and Arc, PER1 and PER2 IR displayed
different patterns, with respective peaks around ZT13/14 and ZT18/19 (Figs. 2A and 3C,
Table 1). In CEA, timing of PER2 expression in mice does not match exactly that found in
rats (i.e., peak at ZT13; Lamont et al., 2005; Waddington-Lamont et al., 2007). As a whole,
there is a differential expression of PER1 and PER2 in forebrain structures of mice fed ad
libitum.
Modifications of PER1 and PER2 expression in the forebrain of mice in response to
hypocaloric feeding (HF)
Next we studied mice exposed to HF compared to the ad libitum condition. This procedure
led to a significant body mass loss (19.4±0.3 vs. 25.9±0.5 g, respectively, n=24; p<0.05).
Modifications in PER1 and/or PER2 IR were investigated in the forebrain of mice challenged
with HF. In the aPirC of HF mice, a 3 h phase-advance was detected in the daily oscillation of
PER1 compared to the ad libitum condition (Fig. 3A, Table 1).
In DMH, while the phase of daily PER1 expression was unchanged with high values around
ZT11, both its mean level and amplitude were increased under HF conditions in comparison
with ad libitum values (p<0.05; Figs. 2A and 3A). As in DMH, increased level and amplitude
of PER1 expression were observed in dST (Fig. 3A, Table 1).
For PER2 IR in PVN, there was a large (9 h) phase-advance (p<0.05), accounting for opposite
patterns between HF and ad libitum feeding conditions (Fig. 3B, Table 1). Rhythmic
expression of PER2 in the VMH was advanced by 7 h (peak around ZT8) compared to the ad
libitum condition. It was also up-regulated, as shown by higher mean level (Figs. 2B and 3B).
In BLA, the daily rhythm of PER2 in HF mice was no longer significant (Table 1), due to an
apparent bimodal shape (Fig. 3B).
In Arc and PVT, where both PER1 and PER2 were found to be expressed under ad libitum
conditions, the daily patterns of these proteins were still rhythmic under HF (p<0.05, Table 1).
In keeping with the observation made in DMH and dST, levels of PER1 were significantly
up-regulated in both Arc and PVT due to higher means (p<0.05; Figs. 2A and 3C, Table 1),
whereas the peak time remained unchanged (Arc: ZT13 and PVT: ZT16). PER2 was also
found rhythmic in both cases (p<0.05). A large phase-advance was observed in both Arc and
PVT where the peak time was advanced by 5 and 6 h, respectively (Figs. 2B and 3C). In
CEA, PER1 expression under HF was globally up-regulated due to an increase in both mean
level and amplitude, while PER2 IR was phase-advanced by 6 h (Fig. 3C, , Table 1), in
accordance to previous observations in food-restricted rats (Waddington-Lamont et al., 2007).
In response to HF, a 3 h phase-advance of PER1 oscillations was detected in both DG and
CA1. For PER2 expression, there is a lack of responsiveness to calorie restriction in those two
structures (Figs. 2 and 3C, Table 1).
4
To sum up, we established that there is a differential expression of PER1 and PER2 in the
forebrain of mice fed ad libitum and that their expression patterns are not uniformly altered by
timed HF. In forebrain structures expressing PER1, a small set including aPirC, CA1 and DG
displays phase-advanced oscillations of PER1 (≤ 3 h) while in the others, (i.e., CEA, PVT,
DMH and Arc), PER1 is up-regulated in response to HF. Except for CA1 and DG in which
the timing of PER2 oscillations remains unaffected by HF, in other forebrain structures
expressing PER2 (i.e., CEA, PVN, PVT, VMH and Arc), PER2 oscillations are phaseadvanced by at least 5 h in response to HF.
Cry1 and Dbp expression in WT, Per1 KO and Per2Brdm1 mutant mice fed ad libitum
We measured Cry1 and Dbp expression in the forebrain of WT, Per1 KO and Per2Brdm1
mutant mice fed ad libitum (Figs. 4 and 5) and raised a first hypothesis that differential
expression of PER proteins in the forebrain should be mirrored in alterations of the clockwork
in respective Per mutant mice under ad libitum conditions. If PER1 or PER2 protein is
expressed alone in a structure, then clock mechanisms should be impaired in Per1 KO mice or
Per2Brdm1 mutant mice, respectively. If both proteins are expressed, then differential
alterations should be observed in each mutant.
In a forebrain structure that was found to express only PER1, i.e. DMH, Cry1 was
rhythmically expressed in WT mice with a peak at ZT22 under ad libitum conditions (Figs.
4A and 6A, Table 2). In the DMH of Per1-/- mutant mice, the amplitude of Cry1 was
decreased. Its expression was found to be significantly rhythmic in Per2Brdm1 mice (with a
daily peak at ZT21), but not in Per1-/- mutant mice (Fig. 6A). In accordance with PER1
expression detected in the DMH of WT mice, a major alteration of Cry1 expression was
found in that hypothalamic structure in Per1 KO mice. Interestingly, the alterations observed
in another PER1 expressing forebrain structure (i.e., aPirC) were comparable to those
described above for DMH (Supplemental Fig. 1). We also quantified Dbp expression in the
DMH. No significant oscillation of Dbp was found in all genotypes. The mean level of Dbp
was significantly reduced in Per2Brdm1 mice compared to WT and Per1 KO animals (Figs. 4B
and 6A).
In a forebrain structure expressing only PER2, i.e. PVN, Cry1 expression profiles displayed
similar apparent phases between WT and Per1 KO mice (Figs. 4A and 6B, Table 2).
According to the cosinor analysis, however, a daily rhythm was significant in WT mice only,
with a peak at ZT20 under ad libitum conditions. Note that the shape of the daily profile of
Cry1 expression in the PVN of Per1 mutant mice looks close to the control pattern, albeit
with higher values (Fig. 6A). In accordance with the PER2 expression detected in the PVN of
WT mice, the expression of Cry1 was markedly altered in that hypothalamic nucleus in Per2
mutant mice (Fig. 6B). Differential alterations were also noted in Cry1 expression within the
VMH of Per2 mutant mice, compared to both WT and Per1 -/- mice (Supplemental Fig. 1).
Concerning Dbp expression in the PVN, it was found to be rhythmic only in WT mice, and
was down-regulated in Per2 mutant mice (Figs. 4B and 6B).
In a forebrain structure expressing both PER1 and PER2 such as PVT, Cry1 profiles were
quite different between genotypes, with a daily rhythm for WT and Per2 mutant mice peaking
respectively at ZT15 and ZT23, and no significant rhythm for Per1 KO mice (Fig. 6C, Table
2). In CA1 that also expresses both PER1 and PER2, no significant rhythm in Cry1
expression was found in any genotype (Supplemental Fig. 1).
To sum up, in mice fed ad libitum, when a structure expressed either PER1 or PER2,
alterations in Cry1 expression could be observed in the corresponding mutant mice compared
to WT littermates. By contrast, in structures expressing both proteins, differential alterations
were observed in respective mutant mice.
5
Cry1 and Dbp expression in WT, Per1 KO and Per2Brdm1 mutant mice challenged with HF
We challenged WT, Per1 KO and Per2Brdm1 mutant mice with HF that led to a significant loss
of body mass compared to ad libitum feeding conditions (26.5±1.0 vs. 31.7±1.3 g, n=15;
p<0.05) in WT as well as in Per1 mutant (25.3±1.1 vs. 31.2±1.4 g, n=15; p<0.05) and Per2
mutant mice (28.3±1.0 vs. 33.6±1.2 g, n=15; p<0.05). No significant difference in body mass
was found between genotypes neither under ad libitum food, nor HF. We have previously
reported that such a HF paradigm elicits a bout of food-anticipatory activity prior to mealtime
in WT and Per1 KO mice, while Per2 mutant mice did not display food anticipation (Fig. 1).
Similar results have been obtained in mice of the same genotypes, but challenged with a
temporally restricted food access (Feillet et al., 2006).
Our second hypothesis was that different expression of PER1 or PER2 in the forebrain should
result in differential adaptability of the clock components to nutritional cues. Thus, if PER1 or
PER2 protein is expressed alone in a structure, then clock mechanisms should be impaired
under HF in Per1 KO mice or Per2Brdm1 mutant mice, respectively. If both proteins are
expressed in a given cerebral region of WT animals, then differential alterations should be
observed in each mutant. To test this, we investigated Cry1 and Dbp expression in the
forebrain in Per mutant mice under HF conditions.
In a structure that expresses only PER1, i.e. DMH, Cry1 expression in WT mice was no
longer rhythmic under HF conditions (Fig. 6D, Table 2). Moreover, Cry1 profiles in the DMH
were not found rhythmic in Per1 nor Per2 mutant mice (Fig. 6D). While flat in all genotypes,
daily expression of Dbp was up-regulated in response to HF in WT and Per1 mutant mice, but
not in Per2 mutant mice (Fig. 6D).
In a structure expressing only PER2, i.e. PVN, the daily profile of Cry1 expression in WT
mice exposed to HF was phase-advanced by 10 h (with a peak at ZT10) compared to
conditions of food ad libitum (Figs. 4A and 5E, table 2). No significant rhythm of Cry1
expression was detected in Per1 KO mice or Per2Brdm1 mutant mice. Daily expression of Dbp
in the PVN was found to be flat in all genotypes, albeit with lower mean values in Per2Brdm1
mutant mice compared to WT and Per1 KO mice (Fig. 6E).
In a structure expressing both PER1 and PER2, such as PVT, profiles of Cry1 were altered
under HF in all genotypes (Figs. 4A and 6F), Cry1 expression still showing a narrow but non
significant daily peak in WT animals, whereas no rhythm at all could be detected in both
mutants (Fig. 6F, Table 2). Daily expression of Dbp in the PVT was found to be flat in WT
and Per1 KO mice, but rhythmic in Per2 mutant mice (Fig. 6F). The mean values of Dbp
mRNAs in Per2Brdm1 mutant mice were lower compared to WT and Per1 KO mice (Table 2).
To sum up, there are distinct changes of PER1 and PER2 expression in various forebrain
areas of mice challenged with HF. Their differential expression was generally mirrored in the
response of Cry1 expression in Per mutant mice under HF. In structures that express only
PER1 or PER2 in WT animals, Cry1 expression was altered respectively in Per1 KO or
Per2Brdm1 mice challenged with HF. In structures that express both PER1 and PER2 in WT
mice and were sensitive to nutritional cues (i.e., PVT), HF-induced changes can be modified
in both Per1 KO and Per2Brdm1 mice.
Discussion
The present study investigated the expression patterns of PER1 and PER2 in the forebrain of
mice. The main findings are that PER1 and PER2 are not equally expressed throughout the
forebrain of mice with food ad libitum. When a structure expresses either PER1 or PER2,
alterations in Cry1 expression can be observed in the corresponding Per1 or Per2 mutant
mice compared to WT littermates. Moreover, forebrain oscillators expressing PER1 and/or
PER2 are differentially sensitive to nutritional cues mediated by daily hypocaloric feeding
6
(HF). Altered responses of Cry1 expression were observed in respective Per1 or Per2 mutant
mice challenged with HF.
Circadian oscillations in the forebrain of mice fed ad libitum
A number of extra-SCN oscillators have been identified in the mammalian forebrain (Rev. in
Guilding and Piggins, 2007). Here we found that PER1 immunoreactivity (IR) is observed
alone in the DMH, aPirC and dST, and concomitant with PER2 in the PVT, CA1, DG, CEA
and Arc. PER2 IR alone is detected in the PVN, BLA and VMH (Fig. 7). Previous
observations have shown a differential expression of Per1 and Per2 genes in the forebrain of
rodents (Yamamoto et al., 2001; Matsui et al., 2005; Shieh et al., 2005). Nonetheless, some
discrepancies exist between these studies and ours: Per1 expression was detected in the PVN
and VMH (Yamamoto et al., 2001; Matsui et al., 2005), whereas we found no PER1 IR in
those areas. Conversely, faint Per2 expression was observed in the aPirC (Matsui et al., 2005;
Shieh et al., 2005) and we could not detect PER2 expression in that structure. We did not
observe PER1 IR in the PVN, a result consistent with a previous study (Hastings et al., 1999).
Post-transcriptional mechanisms can account for the differences observed; for instance, it is
possible that Per genes are transcribed, but not translated. Alternatively, a number of posttranslational modifications of PER1 or PER2 have been characterized (Gallego and Virshup,
2007; Nishii et al., 2006). Therefore, we cannot fully exclude that post-translational changes
that would be specific to certain forebrain oscillators may impair respective binding of the
antibodies to PER1 or PER2 used here, preventing immunoreactive signals in those structures.
Moreover, in addition to the circadian control of CLOCK-BMAL1 described in introduction,
fine-tune regulation of Per1 (e.g., by glucocorticoids; Yamamoto et al., 2005) and Per2 (e.g,
by heat shock proteins or acute temperature changes; Kornmann et al., 2007) may also
account for differential expression of these genes in various cerebral oscillators. Nevertheless,
our data on daily patterns of PER2 expression in the BLA and DG in mice fed ad libitum are
consistent with previous results obtained in rats (Lamont et al., 2005; Waddington-Lamont et
al., 2007). Compared to the PER2 peak observed around ZT12 in the CEA of rats (Lamont et
al., 2005) however, maximal expression of PER2 in the CEA occurs later (i.e., ZT20) in mice
fed ad libitum.
Thus, forebrain oscillators in mice may not need both PER proteins to keep their clockwork
going. In addition, there may be oscillators ticking with different clock hands, depending on
their function. This suggests that the PER proteins may have different functions when
entering in a clock mechanism. Genes coding for nuclear orphan receptors (ROR), other
members of the feedback loops underlying central and peripheral clocks functioning, were
found to be unevenly expressed in various peripheral tissues. In that respect, the possibility of
differential function for those genes has been evoked (Guillaumond et al., 2005).
As a phase marker of circadian oscillations, we analyzed expression of a clock gene, namely
Cry1, in the forebrain of WT mice of the C57BL6×129Sv strain. In the PVN, PVT and DMH,
the highest levels of Cry1 were observed at night, while those of Dbp, a clock-controlled
gene, were observed a few hours earlier (except for DMH in which Dbp is not cycling),
following comparable phase-relationships in expression of the two genes within the SCN
clock (Okamura et al., 1999; Yan et al., 2000).
To reinforce our point on a differential expression of PER1 and PER2 in the forebrain of mice
fed ad libitum, we tested the first hypothesis that if a structure expresses PER1 and/or PER2,
then alterations in clock mechanisms should be observed in respective mutants. We actually
confirmed this hypothesis by assessing Cry1 expression in the forebrain of WT, Per1 KO and
Per2 mutant mice. Consistently, compared to WT littermates, the pattern of Cry1 mRNA was
altered in Per1 KO mice in those structures that normally express PER1 (i.e., DMH or PVT)
in WT mice. The same observation was made in Per2 mutant mice in those structures that
7
normally express PER2 (i.e., PVN or PVT) in WT animals. Previous findings for altered
patterns of Cry1 and Dbp expression in the SCN clock of these mutant mice also fit with these
assumptions (Feillet et al., 2006).
Circadian oscillations in the forebrain of mice fed with a hypocaloric diet
It has been well documented that restricted feeding affects clock gene expression in peripheral
tissues and various brain structures (Damiola et al., 2000; Stokkan et al., 2001; Lamont et al.,
2005; Angeles-Castellanos et al., 2007; Waddington-Lamont et al., 2007). In the present
study, mice were challenged with HF during daytime to assess modifications of daily
expression of PER1 and PER2 in the forebrain. Interestingly, daily patterns of PER proteins
differentially responded to HF depending on the area considered (Fig. 7). This indicates
changes in phase-relationships between various forebrain regions under HF compared to ad
libitum feeding, suggesting a central dissociation in the rhythms of cerebral regions
responding or not to nutritional cues.
In BLA, consistent with our observation in mice fed with HF, PER2 expression has been
shown to be transiently decreased at dark-light transition in rats exposed to daytime restricted
feeding (Waddington-Lamont et al., 2007). This modest effect together with the lack of shift
suggest that BLA is relatively impervious to feeding cues.
In CA1 and DG, HF produced a phase-advance of PER1 IR in keeping with previous studies
on Per1 mRNA (Wakamatsu et al., 2001) as well as on PER1 levels in food-restricted rats
(Angeles-Castellanos et al., 2007). This shifting effect (3 h) for PER1 expression differs from
what can be observed in other forebrain regions sensitive to HF, in which PER1 is upregulated, but not shifted (see below). The amplitude of PER2 expression in DG had been
demonstrated to be reduced by restricted feeding (Waddington-Lamont et al., 2007), but no
difference in phase was detected in accordance with our observation. Lesions of the
hippocampus do not impair expression of food-driven behaviours, such as food-anticipatory
activity, elicited by restricted access to food, reinforcing the hypothesis that the hippocampus
does not play a key role in food synchronization mechanisms (Mistlberger and Mumby,
1992). This finding fits with the relative insensitivity to HF of this brain region concerning
PER2 expression and to some extent PER1. It is of note that in the SCN of mice challenged
with HF, PER1 expression is phase-advanced, while PER2 is up-regulated compared to the ad
libitum condition (Mendoza et al., 2007). Also, in the SCN of mice fed with HF, Cry1
expression instead of being phase-changed is up-regulated not only in WT, but also in Per1
and Per2 mutant mice (Feillet et al., 2006). It is possible that the hippocampus and BLA
remain phase-locked to the SCN and/or the light-dark cycle under HF.
Apart from the hippocampus, BLA and aPirC, all the other forebrain structures quantified
here were highly sensitive to HF signals, leading to major modifications of daily patterns of
PER1 and PER2 IR: PER1 was generally up-regulated and PER2 is always phase-advanced in
response to HF (Fig. 7). For instance, in CEA, the amplitude of PER1 expression appears to
be increased in HF mice, as previously observed in food-restricted rats (Angeles-Castellanos
et al., 2007), whereas PER2 pattern was phase-advanced by HF (this study) and restricted
feeding as well (Waddington-Lamont et al., 2007). Similar effects on the amplitude of PER1
oscillations were noted for DMH, PVT and Arc, and comparable shifting responses of PER2
were detected for PVN, PVT, Arc and VMH. These different responses to HF considering
PER1 or PER2 are in agreement with our first hypothesis about differential function of PER1
and PER2 in the forebrain of mice fed ad libitum. PER2 may be essential for adaptability to
variations in feeding cues, whereas PER1 may potentiate or increase reactivity to those cues,
without being critical for adaptability per se. This hypothesis is supported by the recent
finding that Per2 is critical for the expression of food-driven behaviours, whereas Per1 is
dispensable (Feillet et al., 2006). Therefore, most forebrain oscillators expressing PER2
8
would be directly implicated in adaptation to nutritional cues. An example supporting this
differential role of PER1 and PER2 is aPirC, the primary olfactory cortex. Ablation of the
olfactory bulbs does not abolish food-anticipatory activity (Davidson et al., 2001), indicating
that olfactory information is not essential for meal anticipation. It is probable though that it
can reinforce feeding cues. Here we find that aPirC expresses PER1 only and is affected by
HF. So it would convey information about food to other area expressing PER2, the
synchronization of which would be in turn reinforced.
The DMH had been previously demonstrated to show a de novo expression of Per1 and Per2
mRNA under restricted feeding (Mieda et al., 2006). Moreover, expression of PER2 has been
described in the DMH of food-restricted rats (Verwey et al., 2007). Even if we could detect
altered patterns of PER1 under HF, no sizeable expression of PER2 in that structure could be
seen in any condition. Thus, in the DMH of mice, Per2 mRNA may actually be transcribed,
but not translated. The DMH had been hypothesized to host a putative food-entrainable
oscillator controlling food-anticipatory activity. Note however that lesions of the DMH either
almost abolish (Gooley et al., 2006) or do not affect (Landry et al., 2006) expression of foodanticipatory activity. Considering that the DMH do not express PER2 in mice while Per2
seems to be essential for food synchronization, we propose the DMH could be a major output
of the food-entrainable oscillator rather than its actual site.
In WT (C57BL×129Sv) mice challenged with HF, Cry1 expression in the PVN was phaseadvanced by 10 h compared to conditions of food ad libitum. This shifting effect fits well with
the 9-h phase-advance of PER2 oscillation observed for the same structure in mice of another
strain (C3H) also fed with HF during daytime (present study). In other structures such as
DMH and PVT, Cry1 mRNA levels were no longer rhythmic in calorie-restricted mice,
precluding assessment of phase-shifts. Furthermore, Dbp expression in WT mice was downregulated in the DMH, PVN and PVT in response to HF.
In all structures quantified, compared to WT littermates, the pattern of Cry1 expression in
response to HF was altered in Per1 KO and/or Per2 mutant mice in structures normally
expressing PER1 and/or PER2 in WT mice. In the Arc, a region implicated in the regulation
of energy metabolism and food intake (Williams et al., 2000), this feature was confirmed
under HF only, suggesting that PERs may not be implicated in the Arc functioning under ad
libitum conditions. Nevertheless, the Arc seem to be essential for adaptability to restricted
feeding. HF induces changes in local cerebral metabolic rate for glucose (LCMRglc) during
food-anticipatory activity in the Arc of rats (Pereira de Vasconcelos et al., 2006). Under ad
libitum feeding, this area would be synchronized by the SCN and nocturnal feeding, whereas
daytime restricted feeding may trigger temporal processes in that area.
The PVT is considered as a relay between circadian and limbic systems (Peng and
Bentivoglio, 2004) and mediates the entrainment of the SCN to a palatable meal (Mendoza et
al, 2005a), suggesting a role in the regulation of food-anticipatory activity (Nakahara et al.,
2004). The LCMRglc increase in the PVT of food-restricted rats fits with this hypothesis
(Pereira de Vasconcelos et al., 2006). Even if PVT lesion does not impair food-anticipatory
activity (Landry et al., 2007), our results clearly demonstrate its sensitivity to feeding cues.
As mentioned above, no PER1 IR was detected in the PVN under ad libitum conditions
(Hastings et al., 1999). The PVN play an important role in feeding behaviour (Sahu, 2004).
Moreover, expression of clock genes and c-FOS in this region is altered during restricted
feeding (Wakamatsu et al., 2001; Angeles-Castellanos et al., 2004). LCMRglc in the PVN
was found to be specifically affected during food-anticipatory activity in HF rats (Pereira de
Vasconcelos et al., 2006). According to our second hypothesis, as the PVN synthesize PER2
whose expression pattern is altered under HF, it may contribute to food-driven behaviours.
Also expressing PER2 only, the VMH are involved in the regulation of energy metabolism
and feeding behaviour (Pénicaud et al., 1983). In particular, they play a role in sensing
9
hypoglycaemia (Yang et al., 1999). Chemical lesions of the VMH reduce behavioural phase
changes induced by HF (Challet et al., 1997). Therefore, the VMH can be directly
synchronized by feeding cues and in turn influence physiological responses.
In conclusion, our study reveals a differential expression of PER1 and PER2 in the forebrain
of mice. Differences of expression may originate in a differential role for both proteins, as
respective mutants show altered patterns of Cry1 expression in ad libitum and HF conditions.
It reinforces the growing hypothesis that there is not one single clock, but a system of multiple
brain oscillators (Roenneberg and Merrow, 2003; Guilding and Piggins, 2007) ticking with
different clock hands and differentially sensitive to nutritional cues. It would be interesting to
distinguish between motivational and metabolic responses to hypocaloric feeding and their
interpretation in each forebrain region. Additional studies by means of real-time reporters and
local knock-in or knock-out will reveal the actual function of coupling and/or synchronization
between forebrain oscillators.
Experimental Methods
Animals and housing
Adult male C3H mice (Charles River, Lyon, France) were used for PER1 and PER2
expression analysis. Adult male and female F2 homozygous Per1 and Per2 mutant mice and
their Wild Type (WT) C57BL/6×129SvEvBrd littermates were used for Cry1 and Dbp mRNA
expression analysis. The loss-of-function Per1 mutation (Per1-/-) results from deletion of
exon 3 to exon 19 of mPer1. The deleted region includes the PAS domain, thus precluding
protein dimerization. The Per2 mutation (Per2Brdm1) was obtained by deleting part of the PAS
domain, thus impairing normal protein dimerization. The Per1-/- and Per2Brdm1 mutations are
described in detail in Zheng et al. (2001) and Zheng et al. (1999), respectively. All animals
were housed singly in cages equipped with a running wheel in a room at 23 ± 1°C under a
12/12 light-dark cycle (LD light 200 lux; darkness 0 lux). Under these lighting conditions,
times of day were converted to Zeitgeber times (ZT) in which ZT0 and ZT12 were the onsets
of light and darkness, respectively. Food and water were available ad libitum unless otherwise
stated.
The two experiments were performed in accordance with the Principles of Laboratory Animal
Care (national institute of Health publication 86-23, revised 1985) and the French national
Laws.
The two experiments of the present study were carried out in two strains of mice: C3H and
C57BL6×129Sv. Circadian differences in mouse strains have been clearly characterized in
terms of endogenous period and shifting responses to light (Hofstetter et al., 1995; Schwartz
and Zimmerman, 1990). However, the endogenous period is similar in both strains
(tauC3H=23.8 h, see Mendoza et al., 2005b; tauC57BL6×129Sv=23.7 h, see Zheng et al. 1999;
2001), as are their circadian responses to light (for C3H, see Mendoza et al., 2005b; for
C57BL6×129Sv, see Albrecht et al., 2001). Thus, except for possible differences in melatonin
secretion, we consider that the circadian timing system is comparable in the two strains of
mice studied here.
In contrast to temporally restricted feeding paradigms, that do not reduce calorie intake and
that allow enough food to be eaten daily, hypocaloric feeding is known to lead to several
beneficial physiological actions, such as slowing of ageing, extended lifespan, delayed onset
of major age-related diseases in a number of species, including rodents and primates (Hyun et
al., 2006; Wolf, 2006). In mice under a light/dark cycle, a daily hypocaloric feeding (i.e., 66%
of animal’s daily food intake given each day at the same time), but not temporally restricted
feeding, leads to phase advances of behavioural and physiological circadian rhythms
10
controlled by the SCN, whatever the feeding time over the daily cycle (Challet et al., 1998;
Mendoza et al., 2005b).
Experimental design for immunohistochemistry
C3H mice were randomly divided into two groups: a group of mice fed ad libitum (AL) with a
mean spontaneous food intake of 4.6 ± 0.04 g and a HF group which was given 66% (i.e., 3.0
± 0.02 g) of the daily food intake at midday (i.e., ZT6). Under HF conditions, mice eat their
diet in the first 3 h after food is provided (Mendoza et al., 2005b). If an animal lost more than
20% of its initial body mass, it was refed accordingly. Three weeks later, ad libitum and HF
mice were killed and brains were removed for immunohistochemistry. Sampling was
performed at six temporal points with 4 h intervals (ZT0, ZT4, ZT8, ZT12, ZT16 and ZT20)
over a 24 h cycle (n = 4, per temporal point).
At the selected intervals, animals were killed with an isoflurane overdose and perfused
transcardially with 50 ml of 0.9% saline followed by 50 ml of cold 4% paraformaldehyde in
0.1-M phosphate buffer (PB; pH 7.4). Brains were removed, post-fixed (overnight in 4%
paraformaldehyde at 4 °C) and transferred to cryoprotectant buffered sucrose solution (30%)
for 72 h at 4 °C. Brains were then frozen in isopentane at -60 °C and stored at -80 °C. Serial
coronal sections (30-µm) through forebrain structures were prepared on a cryostat at -20°C
and collected in 0.1-M phosphate-buffered saline (PBS). Free-floating sections were washed
in cold 50-mM Tris-buffered saline (TBS; pH 7.4; Sigma, St Louis, MO) and incubated in a
solution of 3% of H2O2 (Sigma) in TBS for 30 min at room temperature. Brain sections were
then rinsed in TBS, and incubated for 2 hr in a blocking solution in 3% normal horse or goat
serum and 5% bovine serum albumine (BSA) in TBS with 0.1% Triton X-100 (0.1% TBS-X),
followed by 48 h incubation in the primary antibody (in 0.1% TBS-X and horse or goat
serum) at 4°C. We used a goat polyclonal anti-PER1 antibody (1:2000, raised against an
epitope mapping the N-terminus of human Per1; SC-7724, Santa Cruz Biotechnology; Santa
Cruz, CA), and a rabbit polyclonal anti-PER2 (1:1000, affinity purified raised against an
epitope mapping the C-terminus of mouse Per2, Alpha Diagnostic International, San Antonio,
TX). Following incubation in the primary antibody, sections were rinsed in TBS-X and
incubated for 2 h at 4°C with a biotinylated anti-rabbit IgG made in goat or anti-goat IgG
made in horse (Vector Laboratories, Burlingame, CA), diluted 1:500 with 0.1% TBS-X.
Following incubation with secondary antibody, sections were rinsed in TBS-X and incubated
for 1 h at room temperature with an avidin-biotin-peroxidase complex (Vectastain Standard
Elite ABC Kit, Vector Laboratories). Then sections were rinsed two times for 10 min in TBS,
and incubated with 0.025% 3,3′-diaminobenzidine (Sigma) with 0.01% H2O2 in 50-mM Tris
buffer. After this final incubation, sections were rinsed with TBS, wet-mounted onto gelcoated slides, dehydrated through a series of alcohols, soaked in xylene, and coverslipped.
The specificity of antibodies was established in mouse brain by preadsorption control
experiments. Antibody binding to antigen was blocked by adding the PER1 or PER2 peptides
(PER1, sc-7724-P Santa Cruz Biotechnology; PER2 blocking peptide, Alpha Diagnostic
International; 1 mg/ml, both diluted 1:100) to the primary incubation solution. The addition of
each peptide prevented PER1 and/or PER2 immunostaining (Supplemental Fig. 2).
Sections were viewed using a monitoring CCD video camera with Viewfinder Lite software
coupled to a microscope (Leica Microsystems, Rueil Malmaison, France). For the image
analysis we used NIH ImageJ software (National Institutes of Health [NIH], Bethesda, MD).
For each section, background intensity of staining was determined in an adjacent region
devoid of immunoreactive signals. Immunopositive cells were considered positive when their
immunostaining exceeded twice the intensity of threshold background. The mean number of
immunoreactive nuclei were counted by a researcher blind to the treatment (feeding condition
and time) in the dorsal striatum (dST), paraventricular nucleus of the thalamus (PVT),
11
paraventricular nuclei of the hypothalamus (PVN), anterior piriform cortex (aPirC),
dorsomedial nuclei of the hypothalamus (DMH), ventromedial nuclei of the hypothalamus
(VMH), arcuate nuclei (Arc), hippocampus (Ammon’s Horn: CA1 and dentate gyrus: DG)
and central (CEA) and basolateral amygdala (BLA) (2-3 sections/level/animal).
Experimental design for in situ hybridization
Daily food intake of WT, Per1 and Per2 mutant mice was determined during 2 weeks of
baseline with food ad libitum. Mice and food were weighed every week. After the baseline
period mice were randomly assigned to an ad libitum fed group or to a hypocaloric diet
group (HF group), i.e. they were provided 66% of their initial intake close to midday (ZT4)
during the following 3 weeks. After 3 weeks of food restriction, mice of each genotype under
ad libitum or HF conditions were sacrificed. Sampling was performed at 4 temporal points
with 6-h intervals (ZT2, ZT8, ZT14 and ZT20) over a 24 h cycle (n = 4 per temporal point
per genotype).
Antisense and sense RNA probes were generated with an in vitro transcription kit
(Maxiscript, Ambion, TX). Here we used a riboprobe for mCry1 (GenBank accession number
AF156986) and mDbp (GenBank accession number NM016974). Cry1 was chosen as phase
marker because its rhythmic expression is known to be more reliable than that of other clock
genes such as Cry2, for example (Kume et al., 1999; Okamura et al., 1999). mDbp is a clockcontrolled gene coding for a transcription factor called albumin D-site binding protein (DBP)
whose transcription shows robust daily oscillations in the SCN (Lopez-Molina et al,. 1997;
Yan et al., 2000).
Forebrain sections (14-µm thick) were fixed in 4 % phosphate-buffered paraformaldehyde,
rinsed twice with PBS, and then acetylated twice in 0.1 M triethanol-amine, washed again
with PBS, and dehydrated in a graded ethanol series. Sections were hybridized overnight with
either denatured antisense or sense riboprobe in a humid chamber at 54 °C. Sections were
then rinsed with saline sodium citrate, treated with ribonuclease A (Sigma), rinsed with
stringency washes of saline sodium citrate, and dehydrated in a graded ethanol series. Slices
and radioactive standards were exposed for one week to an autoradiographic film (Biomax
MS-1 Kodak, Sigma). Standards were included in each cassette to verify that the measured
values of optical densities were in the linear response range of the film. Densitometric
analysis of hybridization signals was performed using ImageJ (NIH) by a researcher blind to
the feeding condition, time point, and genotype. Before densitometric measures, each
forebrain region was first identified on an adjacent section stained with cresyl violet. The
optical density of specific signal was calculated by subtracting the intensity of staining
background area (defined as a circle of 100 µm diameter) measured in the corpus callosum
from that of a circle of 100 µm diameter measured in various forebrain areas (aPirC, PVT,
CA1, DMH, VMH, Arc, PVN for Cry1 and PVT, DMH and PVN for Dbp). Measures were
made bilaterally (for paired structures) on three slices for each structure and averaged for a
given brain. Data were expressed as relative optical density values.
Statistical Analysis
Data are presented as means ± SEM. The daily patterns of proteins or genes expression were
fitted by a non-linear least-squares regression (SigmaPlot software, Jandel Scientific,
Chicago, USA). The fitting equation (cosinor) was:
y = [ A+ B·cos (2π·(t-C)/24)]
where y is the level of mRNA, A the mean level, B the amplitude of mRNA oscillation, C the
acrophase of mRNA oscillation, and t the time (h). Only significant best-fit parameters
(p<0.05) were included in this study.
12
Unpaired Student's t-test was used for comparisons of mean level, amplitude and acrophase
between AL and HF groups in a given structure for a given genotype. One-way analysis of
variance was used to for comparisons of mean level, amplitude and acrophase in a given
structure between WT, Per1 KO and Per2Brdm1 mutant mice. Post-hoc comparisons were
performed with Tukey’s test (SigmaStat, Jandel Scientific). The first data points were doubleplotted on the figures but were not taken into account for statistical analysis.
Acknowledgments:
We thank Dr. Françoise Eclancher for helpful comments on the manuscript and Dr. Hugues
Dardente for providing Cry1 clone.
13
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17
Figure legends
Fig. 1. Daily wheel-running activity in mice fed ad libitum fed ad libitum for 10 days and
submitted to hypocaloric feeding (arrows) during 3 wks (A, Wild-type C3H mouse; B, Wildtype C57BL×129Sv mouse; C, Per1-/- mouse; and D, Per2Brbm1 mouse). Locomotor activity
is plotted as an actogram with each horizontal line corresponding to two consecutive days and
with the second day being double-plotted on the next line. Nighttime is indicated by black bar
on top abscissa.
Fig. 2. PER1-immunoreactive cells (left panels, A) in the dorsomedial nuclei of the
hypothalamus (DMH; upper left panels), Ammon’s horn (CA1; middle left panels) and
arcuate nuclei (Arc; lower left panels) and PER2-immunoreactive cells (right panels, B) in
the ventromedial nuclei of the hypothalamus (VMH; upper right panels), Ammon’s horn
(CA1; middle right panels) and arcuate nuclei (Arc; lower right panels). For each structure,
feeding conditions are either food ad libitum (left) or hypocaloric feeding (right). 3V, third
ventricle; ME, median eminence. Data correspond to ZT8 in DMH, VMH and Arc, and ZT20
in CA1. Scale bar: 200 µm.
Fig. 3. Daily profiles of PER1 (circles) and PER2 (diamonds) immunoreactive cells (mean ±
SEM) in specific forebrain regions of mice (n = 4 per group and time point) under food ad
libitum (black symbols) or hypocaloric feeding (white symbols) conditions. Structures
expressing PER1 only (A): anterior piriform cortex (aPirC) and dorsomedial nuclei of the
hypothalamus (DMH); structures expressing PER2 only (B): ventromedial nuclei of the
hypothalamus (VMH), paraventricular nuclei of the hypothalamus (PVN) and basolateral
amygdala (BLA); structures expressing PER1 and PER2 (C): Ammon’s horn (CA1), Central
amygdala (CEA), paraventricular nucleus of the thalamus (PVT) and arcuate nuclei (Arc).
The arrow above the X axis indicates time of feeding. Nighttime is indicated by a black bar on
the X axis.
Fig. 4. Autoradiograms of Cry1 (A) and Dbp expression (B) at different Zeitgeber times (ZT)
in the paraventricular hypothalamic nuclei (PVN), suprachiasmatic nuclei (SCN) and
paraventricular thalamic nucleus (PVT) in wild type (WT) mice under ad libitum (AL) or
hypocaloric feeding (HF) conditions. Scale bar: 400 µm.
Fig. 5. Autoradiograms of Cry1 expression at Zeitgeber time (ZT) 14 in Ammon’s horn
(CA1), dentate gyrus (DG; top panels), dorsomedial nuclei of the hypothalamus (DMH),
ventromedial nuclei of the hypothalamus (VMH) and arcuate nuclei (Arc; bottom panels), in
wild type (WT), Per1 mutant (Per1-/-) and Per2 mutant (Per2Brbm1) mice under ad libitum
(AL, left) or hypocaloric feeding (HF, right) conditions. Scale bar: 400 µm.
Fig. 6. Daily expression of Cry1 gene in the forebrain of mice under ad libitum (A, B and C)
or hypocaloric feeding (D, E and F) conditions, as assessed by in situ hybridization.
The dorsomedial nuclei of the hypothalamus (DMH) express PER1 only (A and D). The
paraventricular nuclei of the hypothalamus (PVN) express PER2 only (B and E). The
paraventricular nucleus of the thalamus (PVT) expresses both PER1 and PER2 (C and F).
Wild type (WT; black circles, solid lines), Per1 mutant (Per1-/-; green squares, dashed lines)
and Per2 mutant (Per2Brbm1; blue triangles, dotted lines) mice (n=3-4; means ± SEM). Data
for ZT2 were double-plotted. The arrow above the X axis indicates time of feeding. Nighttime
is indicated by a black bar on the X axis.
18
Fig. 7. Schematic sagittal section of a mouse forebrain summarizing differential PER1
(orange) and PER2 (purple) immunoreactivity (IR) under food ad libitum and respective
modifications in response to hypocaloric feeding. aPirC: anterior piriform cortex, Arc: arcuate
nuclei of the hypothalamus, BLA: basolateral amygdala, CA1: Ammon’s Horn, CEA: central
amygdala, DG: dentate gyrus, DMH: dorsomedial nuclei of the hypothalamus, dST: dorsal
striatum, PVN: paraventricular nuclei of the hypothalamus, PVT: paraventricular nucleus of
the thalamus, SCN: suprachiasmatic nuclei (Data analyzed in Mendoza et al., 2007), VMH:
ventromedial nuclei of the hypothalamus.
19
Supplemental Fig. 1. Daily expression of Cry1 gene in the forebrain of mice under ad libitum
(A, B and C) or hypocaloric feeding (D, E and F) conditions, as assessed by in situ
hybridization.
A structure expressing PER1 only (A and D): anterior piriform cortex (aPirC); a structure
expressing PER2 only (B and E): ventromedial nuclei of the hypothalamus (VMH); two
structures expressing both PER1 and PER2 (C and F): Ammon’s horn (CA1) and arcuate
nuclei (Arc). Wild type (WT; circles, solid lines), Per1 mutant (Per1-/-; squares, dashed lines)
and Per2 mutant (Per2Brbm1; triangles, dotted lines) mice (n=3-4; means ± SEM). Data for
ZT2 were double-plotted. The arrow above the X axis indicates time of feeding. Nighttime is
indicated by a black bar on the X axis.
Supplemental Fig. 2. Adsorption controls for antibodies specificity. For all experiments
animals were sacrificed at Zeitgeber 12 with food ad libitum. Scale bar, 200µm
PVN: paraventricular nuclei of the hypothalamus, PVT: paraventricular nucleus of the
thalamus.
20
Table 1. Characteristics of daily oscillations of PER1 and PER2 in the forebrain of mice fed
ad libitum or challenged with hypocaloric feeding
aPirC PER1
aPirC PER2
Mean level (n cells)
AL
HF comp.
193±9 198±12 =
∅
∅
Forebrain
dST PER1
373±18 451±24
structures
dST
PER2
∅
∅
expressing
PER1 only DMH PER1 75±4
96±4
DMH PER2
∅
∅
Forebrain
structures
expressing
PER2
only
Forebrain
structures
expressing
PER1 and
PER2
Amplitude (n cells)
Acrophase (h)
AL
HF
AL
HF
comp.
comp.
=
85±12 61±17
17.2±0.6 13.6±1.0 +3h
/
/
/
/
↑
58±24
/
231±34
/
↑
18.9±1.7 18.6±0.6
/
/
=
↑
34±6
/
59±5
/
↑
9.4±0.7 10.8±0.4
/
/
=
/
/
BLA PER1
BLA PER2
∅
114±7
∅
102±10
=
/
61±10
PVN PER1
PVN PER2
∅
90±8
∅
91±8
=
/
45±11
/
35±11
=
/
/
15.3±0.9 6.6±1.2
+9h
VMH PER1
∅
∅
VMH PER2 151±15 233±12
↑
/
/
100±21 120±17
=
/
/
14.7±0.8 7.5±0.5
+7h
CA1 PER1
CA1 PER2
48±4
44±7
58±4
43±6
=
=
46±5
66±9
35±6
54±8
=
=
22.0±0.4 18.6±0.6
22.0±0.5 22.0±0.6
+3h
=
DG PER1
DG PER2
31±3
40±4
30±3
41±0
=
=
31±4
48±5
19±4
31±4
↓
↓
22.1±0.4 18.8±0.7
22.9±0.4 21.9±0.5
+3h
=
CEA PER1
CEA PER2
95±13
111±4
167±11
120±5
↑
56±19
13±6
109±16
15±8
↑
=
14.3±1.3 16.1±0.6
18.3±1.9 12.0±2.0
=
+6h
PVT PER1
PVT PER2
142±8
99±7
222±8
94±6
24±12
71±10
44±12
56±9
=
=
16.1±1.9 15.1±1.0
16.1±0.5 11.2±0.6
=
+5h
Arc PER1
Arc PER2
47±8
99±10
68±4
117±8
47±12
45±14
40±5
56±11
=
=
12.7±0.9 11.0±0.5
18.9±1.2 10.1±0.7
=
+6h
=
↑
=
↑
=
/
21.7±0.6
/
/
AL, food ad libitum; HF, hypocaloric feeding; comp., comparison between AL and HF; =, no
significant difference (p>0.05); ↑ significant increase (p <0.05); ↓, significant decrease (p
<0.05); /, lack of significant parameter (p >0.05) in the cosinor analysis; ∅, lack of
immunoreactive signals above background intensity.
21
Table 2 Characteristics of daily oscillations of Cry1 and Dbp mRNA in the forebrain of WT,
Per1-/- and Per2Brdm1 mutant mice fed ad libitum or challenged with hypocaloric
feeding.
WT
DMH Cry1 Per1-/Per2Brdm1
Mean level (a.u.)
Amplitude (a.u.)
Acrophase (h)
AL
HF
AL
HF
AL
HF
comp.
comp.
comp.
a
a
/
/
0.8±0.3
21.6±1.7
4.6±0.6
3.6±0.2
↑
a
a
/
/
/
/
=
4.1±0.8
3.3±0.4
a
a
/
/
0.6±0.3
20.6±2.0
2.9±0.2
4.2±0.5
↑
PVN Cry1
WT
4.6±0.6a
Per1-/6.6±0.6b
Per2Brdm1 5.2±0.3ab
5.2±0.4a
5.4±0.6a
5.6±0.7a
=
=
=
1.7±0.8 1.1±0.5
/
/
/
/
PVT Cry1
WT
Per1-/Per2Brdm1
6.8±0.8a
6.7±0.7a
6.5±0.7a
4.7±0.7a
5.5±0.7a
5.4±0.6a
=
=
=
3.1±1.1
/
2.3±0.7
/
/
/
/
/
/
/
/
/
WT
11.3±1.6a 6.7±0.8ab
DMH Dbp Per1-/10.9±1.7a 8.8±1.9a
Per2Brdm1 5.7±0.9b 4.4±1.5b
↓
=
=
/
/
/
/
/
/
/
/
/
/
/
/
PVN Dbp
WT
Per1-/Per2Brdm1
7.9±0.7a
8.5±0.7a
4.0±0.4b
=
=
=
3.1±0.9
/
/
/
/
/
9.1±1.2
/
/
/
/
/
PVT Dbp
WT
8.6±0.5ab 9.7±0.7a
Per1-/10.1±0.6a 10.7±1.1a
Brdm1
Per2
8.0±0.7b 7.2±0.5b
=
=
=
/
1.9±0.7
/
/
/
1.9±0.6
7.6±0.7a
7.8±0.8a
4.8±0.5b
=
20.1±1.9 10.2±1.9
/
/
/
/
/
10.9±1.4
/
/
/
1.0±1.4
AL, food ad libitum; HF, hypocaloric feeding; comp., comparison between AL and HF; =, no
significant difference (p >0.05); ↑, significant increase (p <0.05); ↓, significant decrease (p
<0.05); /, lack of significant parameter (p >0.05) in the cosinor analysis. For a given feeding
condition (AL or HF) in a given forebrain structure, means lacking common superscripts are
significantly different (p <0.05). DMH, PVN and PVT were chosen as examples of forebrain
structures expressing only PER1, only PER2 or both PER1 and PER2, respectively.
22
+10 h
WT C57BL×129Sv
Per2Brbm1
Per1-/-
Time (Days)
WT C3H
0
24
48
0
24
48
0
Time (h)
Revised Fig. 1
24
48 0
24
48
Revised Fig. 2
Revised Fig. 3
Revised Fig. 4
Revised Fig. 5
Revised Fig. 6
CA1
dST
DG
∅
PVT
CEA
aPirC
∅
BLA
∅
PVN
∅
DMH
∅
VMH
SCN
∅
Arc
PER1 IR
PER2 IR
∅
∅
No PER1
No PER2
Responses to
hypocaloric feeding :
Up-regulation
Phase-shift
No Effect
Revised Fig. 7
Revised Suppl. Fig. 1
Revised Suppl. Fig. 2
186
CHAPITRE 4
DISCUSSION GÉNÉRALE
188
Mon travail de thèse a permis de préciser les connaissances relatives à la synchronisation
alimentaire, à la fois dans le domaine de l’intégration du message temporel alimentaire et
concernant les mécanismes moléculaires sous-tendant la genèse des messages transmis vers
les sorties de l’horloge alimentaire. L’étude des conséquences d’une synchronisation
alimentaire sur des sorties comportementales connues des SCN, ainsi que l’importance des
sorties endocrines ont également été détaillées dans ce travail. Enfin, des connaissances
substantielles, ouvrant de nouvelles pistes de recherche du substrat anatomique de l’horloge
alimentaire, ont été révélées. Ces différents aspects vont être abordés successivement dans
cette discussion.
I. Intégration du synchroniseur alimentaire
1. Interprétation par les SCN du synchroniseur alimentaire.
L’intégration du message synchronisateur alimentaire était bien connue du point de vue
comportemental (expériences de décalage horaire de l’accès à la nourriture par exemple). En
revanche, les effets d’une synchronisation alimentaire sur l’horloge moléculaire des SCN
ainsi que l’intégration de ces informations par d’autres oscillateurs était inconnue.
Une restriction temporelle de l’accès à la nourriture n’est capable d’agir sur l’horloge
moléculaire des SCN que dans des cas isolés [souche particulière (Castillo et al., 2004 ;
Abe et al., 1989), SCN rendus arythmiques par une exposition à la lumière continue (Lamont
et al., 2005)]. Par contre, une restriction calorique peut avancer la phase d’expression des
gènes horloges dans les SCN (Mendoza et al., 2005c). La composante métabolique plus que
la composante temporelle est donc déterminante pour la synchronisation alimentaire de
l’horloge principale. Néanmoins, la composante temporelle liée aux repas est essentielle pour
la synchronisation de l’horloge alimentaire puisque celle-ci ne répond aux stimuli
alimentaires que lorsqu’ils sont présentés dans le domaine circadien (Stephan, 1981 ;
Mistlberger, 1994) ; Cependant, cela ne signifie pas que l’horloge alimentaire soit insensible à
la composante calorique des repas puisqu’un repas appétitif dépourvu de valeur nutritive
n’entraîne pas cette horloge (Mistlberger et Rusak, 1987). La déplétion en énergie pourrait
donc influencer directement la machinerie moléculaire des SCN, et probablement l’horloge
alimentaire, éventuellement via des récepteurs à la leptine ou à la ghréline. Nous savons que
ces récepteurs existent dans les SCN (Hakansson et al., 1998 ; Zigman et al., 2006) ; par
contre leur présence devra être démontrée sur l’horloge alimentaire. Restrictions temporelle et
calorique ne sont donc pas équivalentes du point de vue de leur intégration moléculaire.
Nous avons démontré en outre que ces deux types de restriction ne sont pas non plus
équivalents du point de vue de leur interprétation comportementale : des rats placés en
obscurité constante peuvent être synchronisés par un nourrissage normocalorique si l’heure du
repas coïncide avec la fin de la période d’activité. Un nourrissage hypocalorique synchronise
quant à lui toujours l’activité locomotrice, quelle que soit la phase du repas unique. Résultat
inattendu : le nourrissage normocalorique synchronise toujours l’activité locomotrice en fin
189
de nuit subjective, ce qui indique que celui-ci est interprété comme un signal nocturne. Au
contraire, le nourrissage hypocalorique engendre un patron d’expression des gènes horloges
opposé à celui observé avec la lumière ou la mélatonine : la phase d’activité locomotrice
coïncide avec le pic d’expression de Per1 au lieu de Bmal1, ce qui indique que le nourrissage
hypocalorique est interprété par le système circadien comme un signal de jour (Caldelas et al.,
2005). Il faut souligner que les animaux étaient dans ce cas gardés en obscurité constante,
donc sans repère temporel. Il se trouve que, dans la quasi totalité des expériences de
restriction alimentaire en LD, la nourriture est distribuée de jour afin de dissocier l’activité
nocturne de l’activité induite par la restriction. L’interprétation habituelle du message de
synchronisation alimentaire est dans ce cas un signal de jour. Il est plus surprenant de
constater que lorsque l’information lumineuse est absente, le système perçoit le nourrissage
hypocalorique comme un signal de jour. Qu’est-ce qui, dans la restriction calorique, par
opposition à la restriction temporelle, déclenche un tel changement de patron d’activité ? Une
possibilité serait que l’intégration du message de synchronisation alimentaire soit interprétée
par le système circadien en terme de niche temporelle énergétique par rapport au patron
d’activité sélectionné par l’espèce : si l’animal trouve une source énergétique suffisante
(nourriture ad libitum ou nourrissage normocalorique) dans la niche temporelle qu’il occupe
habituellement (la nuit pour un rongeur nocturne), l’accès à la nourriture est interprété comme
un signal de nuit. Si l’animal est soumis à une déplétion en énergie (nourrissage
hypocalorique) cela pourrait indiquer au système que la ration nocturne est insuffisante et
déclencherait un comportement de recherche alimentaire dans une niche temporelle différente
(le jour pour un rongeur nocturne) afin d’augmenter les chances de trouver de la nourriture.
Cela expliquerait pourquoi en DD les rats interprètent systématiquement la restriction
calorique comme un signal diurne.
Plus encore que la seule interprétation d’un signal métabolique par le système circadien d’un
rongeur nocturne, ce phénomène pourrait participer au maintien de la nocturnalité ou de la
diurnalité. Nous savons que la machinerie moléculaire des SCN est identique entre rongeurs
nocturnes et rongeurs diurnes (Caldelas et al., 2003) et qu’elle ne peut donc pas expliquer ce
phénomène. Nous venons également de voir qu’un signal métabolique hypocalorique entraîne
un changement d’un patron d’activité nocturne en diurne chez le rat. Il serait donc possible
que la propension à être diurne ou nocturne soit modulée par l’interprétation des signaux
métaboliques par le système circadien et qu’un animal nocturne ou diurne puisse inverser sa
période d’activité en réponse à des pressions de survie. Ces mécanismes pourront être testés
en soumettant des rongeurs diurnes tel que l’Arvicanthis à une restriction calorique en
conditions constantes d’éclairement et vérifier si les animaux deviennent partiellement ou
totalement « nocturnes » en mesurant la phase d’expression des gènes horloges dans les SCN
en relation avec la phase d’activité.
190
2. Intégration du message de synchronisation alimentaire hors SCN.
Nous avons souligné en introduction l’importance des gènes Per dans la synchronisation des
SCN par la lumière, puisque les souris mutantes pour les gènes Per1 et Per2 présentent des
réponses altérées à un créneau de lumière en obscurité constante (Albrecht et al., 2001). Nous
travaux ont permis d’impliquer plus largement ces gènes dans des mécanismes généraux de
synchronisation au niveau central : chez des souris mutantes pour les gènes Per1 ou Per2,
l’expression du gène Cry1, autre gène horloge de la boucle négative, est altérée en conditions
de nourrissage hypocalorique par rapport aux souris sauvages (Feillet et al., soumis). Cela
indique que l’intégration des informations métaboliques est altérée de manière générale chez
ces mutants.
Ce résultat est à mettre en relation avec l’expression différentielle des protéines PER1 et
PER2 dans le système nerveux central : l’expression des gènes Per1 et Per2 avait déjà été
observée dans la quasi-totalité des structures cérébrales (Asai et al., 2001; Wakamatsu et al.,
2001; Abe et al., 2002; Granados-Fuentes et al., 2004 ; Matsui et al., 2005). Sachant qu’un
grand nombre de mécanismes post-transcriptionnels et post-traductionnels interviennent dans
la régulation de l’expression des gènes horloges et des protéines horloges (Ralph et Menaker,
1988 ; Reppert et Weaver, 2002 ; Lowrey et Takahashi, 2004), il était nécessaire de confirmer
par immunohistochimie la présence de protéines horloges en lieu et place des gènes horloges.
Nous avons démontré que, de manière inattendue, la présence d’un ARN messager pour Per1
ou Per2 n’entraînait pas forcément la présence de la protéine correspondante à un seuil
détectable par immunohistochimie. Ainsi, nous ne trouvons pas d’expression de PER1 dans
les VMH et les PVN et pas de PER2 dans les DMH alors que des ARN messagers pour ces
deux protéines avaient été auparavant observés dans ces structures. Il est donc probable que
dans certaines structures centrales les ARN messagers pour les gènes horloges soient
transcrits, et donc détectés par hybridation in situ, mais pas traduits, et donc non détectables
en immunohistochimie. Il y a ainsi une expression différentielle des protéines PER dans le
système nerveux central. Une autre étude portant sur l’expression des gènes Ror (récepteurs
orphelins de la boucle positive secondaire dans les SCN) démontre que Rorα, Rorβ et Rorγ ne
sont pas exprimés systématiquement dans tous les tissus périphériques (Guillaumond et al.,
2005). Notre étude ciblée dans le cerveau antérieur confirme cette observation et renforce
l’hypothèse grandissante que les mécanismes d’horloges, s’ils sont ubiquitaires, ne s’appuient
pas toujours sur les mêmes protéines. Il y aurait donc à la fois au niveau central et au niveau
périphérique, une multitude d’oscillateurs potentiels, fonctionnant avec des aiguilles
différentes (Feillet et al., soumis). De plus, la présence de l’une ou l’autre des protéines PER1
ou PER2 aurait des conséquences différentes du point de vue fonctionnel : nous démontrons
en effet que dans une structure exprimant uniquement PER1 ou PER2, des altérations de la
machinerie moléculaire (expression de Cry1) sont observables dans les mutants respectifs
correspondants. Par exemple, dans les VMH, structure n’exprimant que PER2, les profils
191
d’expression de Cry1 sont identiques aux WT, alors qu’ils sont altérés chez les souris Per2
mutantes. Dans les structures exprimant les deux protéines, des effets différentiels sont
observés chez les mutants Per1 et Per2. Comment expliquer ces mécanismes différents
puisqu’il a été démontré que l’horloge des SCN ne fonctionne correctement que si PER1 et
PER2 sont présents tous les deux ? Nous avons vu que les gènes Per1 et Per2 ne sont pas
équivalents en terme de synchronisation lumineuse. Per1 est essentiel aux avances de phase
alors que Per2 serait nécessaire aux retards de phase (Albrecht et al., 2001). De plus, Per2 est
indispensable au maintien de la rythmicité en obscurité constante, ce qui n’est pas le cas de
Per1 (Zheng et al., 1999 ; Bae et al., 2001 ; Cermakian et al., 2001 ; Zheng et al., 2001). Il est
donc avéré que PER1 et PER2 ont des fonctions différentes pour l’horloge des SCN. Et il
pourrait en être de même en terme de synchronisation alimentaire : si l’on se base sur ce qui
est connu pour les SCN, il est possible que des structures exprimant PER1 ou PER2 soient
impliquées dans des types d’intégration différents du message alimentaire. Une structure
essentielle dans les mécanismes de rythmicité alimentaire exprimera PER2. Une structure
exprimant PER1 par contre ne sera pas critique pour la rythmicité en réponse à une
synchronisation alimentaire à proprement parler, mais transmettra un message récurrent aux
structures exprimant PER2, renforçant ainsi leur rythmicité ; elle sera donc plus
particulièrement impliqué dans la synchronisation. Une structure exprimant les deux protéines
serait capable d’assurer les deux fonctions. Cette hypothèse est renforcée par le fait qu’il a été
démontré que PER1 agit comme stabilisateur de PER2 dans les SCN (Masubuchi et al.,
2005). De plus nous avons établi que Per2, mais pas Per1, était essentiel pour le bon
fonctionnement de l’horloge alimentaire et donc pour une synchronisation alimentaire
normale au niveau central (Feillet et al., 2006). Aucun comportement, ni aucune fonction
rythmique en relation avec la synchronisation alimentaire ne peut s’exprimer chez ces
mutants. Cela n’exclut pas que certaines structures puissent être synchronisées par la
nourriture au niveau central, PER1 étant encore exprimé. Cette synchronisation n’aboutirait
cependant pas à la transmission d’un comportement rythmique. C’est d’ailleurs ce qui est
suggéré par les résultats obtenus pour l’expression de Cry1 chez les souris mutantes pour les
gènes Per et synchronisées par une restriction calorique : dans les structures exprimant PER1,
l’expression de Cry1 est altérée chez les mutants Per1 et dans les structures exprimant PER2,
l’expression de Cry1 est altérée chez les mutants Per2. La synchronisation est donc toujours
possible, quoique aberrante.
En ce qui concerne la synchronisation alimentaire, les résultats obtenus pour la réponse des
protéines PER vont également dans le sens de rôles distincts pour PER1 et PER2 : en effet
nous avons constaté que dans les structures hors SCN répondant à un nourrissage
hypocalorique, l’expression journalière de PER2 présentait toujours une avance de phase alors
que les niveaux de PER1 étaient augmentés. Le fait que la phase de PER1 ne soit pas
modifiée dans ces structures en réponse à une restriction alimentaire suggère qu’il ne serait
192
pas impliqué dans l’adaptation au nourrissage, mais plutôt dans l’amplification du message,
comme postulé dans le paragraphe précédent.
Indiquons ici que ce modèle ne serait valable que dans les structures répondant à une
restriction alimentaire, ce qui, nous l’avons démontré, n’est pas le cas de toutes les structures :
l’hippocampe par exemple, ne répond que très peu à une restriction calorique. Le fait que
cette structure ne soit pas capable d’être synchronisée par la nourriture révèle qu’elle peut être
éliminée de la liste des structures abritant potentiellement l’horloge alimentaire. Ce résultat
confirme une approche lésionnelle démontrant qu’une lésion électrolytique de l’hippocampe
n’abolit pas la composante d’anticipation de la nourriture (Mistlberger et Mumby, 1992). Ce
résultat renforce l’hypothèse selon laquelle les phénomènes de mémoire joueraient un rôle
limité dans l’horloge alimentaire (Stephan, 1984 ; Stephan, 1989 ; Mistlberger, 1994).
Egalement, une étude récente sur l’influence d’une restriction calorique sur l’expression de
PER1 et PER2 dans les SCN démontre que l’horloge principale réagit à l’inverse des autre
structures étudiées dans le cerveau antérieur : l’expression de PER1 présente une avance de
phase alors que PER2 est surexprimé en réponse à une restriction calorique (Mendoza et al.,
2007). Or cette tendance est également observée dans l’hippocampe, suggérant que deux
catégories de structures cérébrales existeraient, répondant différemment vis-à-vis de la
synchronisation alimentaire.
Si deux types de structures peuvent être séparés dans le système nerveux central, il ne faut pas
négliger une troisième catégorie de structures, synchronisées par la nourriture et exprimant
Per1 et Per2, mais dans lesquelles ces gènes ne semblent pas capitaux pour la synchronisation
alimentaire : les tissus périphériques (Damiola et al., 2000 ; Stokkan et al., 2001, Hara et al.,
2001 ;Yamazaki et al., 2002 ; Yoo et al., 2005). Nous avons en effet démontré que dans le
foie et les reins, l’effet d’une synchronisation alimentaire sur l’expression des gènes horloges
et des gènes contrôlés par l’horloge est identique chez des souris sauvages ou mutantes pour
les gènes Per1 ou Per2. En effet, si l’expression des gènes horloges est un peu différente dans
le foie et les reins pour les différents génotypes disposant de nourriture à volonté, la phase
d’expression de ceux-ci devient identique en réponse à une restriction alimentaire (Feillet et
al, 2006). La synchronisation alimentaire périphérique ne reposerait donc pas de manière
critique sur les gènes Per, ou tout au moins sur les gènes Per1 et Per2, puisque nous n’avons
pas testé l’implication de Per3, dont le rôle reste obscur au niveau central. Il est possible qu’il
ait un rôle inattendu dans la synchronisation alimentaire périphérique. Une autre possibilité
est que dans les tissus périphériques, qui semblent très sensibles aux variations de la
disponibilité alimentaire, les gènes Per1 et Per2 aient des fonctions redondantes. Chez des
mutants Per1 ou Per2, la fonction de l’un compensant les déficits provoqués par l’absence de
l’autre, la synchronisation resterait normale et aucune différence ne serait visible sur la
synchronisation après 3 semaines de restriction. Il sera possible de tester cette hypothèse en
réalisant des expériences de restriction alimentaire chez des doubles mutants Per1/Per2.
193
Enfin, si l’on suppose que PER1 et PER2 conservent un rôle différentiel dans les tissus
périphériques et sont impliqués dans la synchronisation alimentaire, ils pourraient commander
l’un et l’autre des modes de remise à l’heure différents : dans les SCN, PER1 est impliqué
dans les avances de phase de l’activité locomotrice alors que PER2 est essentiel pour les
retards de phase (Albrecht et al., 2001). Il n’a pas été démontré de manière définitive à ce
jour, que les organes périphériques sont des horloges tissulaires (Yamazaki et al., 2000 ; Yoo
et al., 2005 ; Ishida et al., 2005 ; Oster et al., 2006). PER2 et éventuellement PER1 n’auraient
pas pour rôle dominant dans ces tissus de produire des oscillations auto-entretenues, mais
interviendraient plutôt dans la synchronisation des oscillateurs périphériques par des messages
centraux et environnementaux (Kornmann et al., 2007). Dans ce cas, PER1 et PER2 seraient
impliqués directement dans les remises à l’heure des tissus périphériques par avance ou retard
de phase respectivement. Chez des souris mutantes pour Per1 ou Per2, la synchronisation
serait donc possible, mais uniquement par retards de phase chez les mutants Per1 et par
avances de phase chez les mutants Per2. On peut même penser que dans la phase dynamique
de l’entraînement par la nourriture, les déphasages pourraient être plus rapides, en
conséquence de l’absence de l’un des deux signaux de déphasage antagoniste à l’autre. Dans
une phase de synchronisation dynamique, les deux phénomènes seraient radicalement
différents, aboutissant cependant à un état stable identique, comme celui que nous observons
pour les deux génotypes après 3 semaines de RF (Feillet et al, 2006). Cette hypothèse n’est
bien sûr que pure conjecture, mais pourrait être testée en effectuant un suivi de l’évolution de
la phase d’expression d’un gène horloge comme Bmal1 dans le foie, chez des souris Per1 ou
Per2 mutantes. Un suivi dynamique sera nécessaire, par exemple grâce à un gène rapporteur
type luciférase et confirmera ou infirmera l’hypothèse présente.
En l’état actuel des connaissances, il est donc difficile d’établir de manière absolument
certaine si la synchronisation alimentaire périphérique est totalement indépendante des gènes
Per.
II. Mécanismes
alimentaire
moléculaires
de
la
synchronisation
1. Les souris mutantes : outil privilégié pour l’étude de la synchronisation
alimentaire.
Parmi les approches destinées à comprendre le fonctionnement de l’horloge alimentaire, les
souris mutantes ont fourni plusieurs résultats intéressants : Les souris KO pour les orexines
présentent une atténuation de la FAA (Akiyama et al, 2004 ; Mieda et al, 2004), ainsi que les
souris mutantes pour les récepteurs µ-opioïdes (Kas et al, 2004) ou les récepteurs orphelins
Ear2 (Warnecke et al., 2005), impliquant ainsi plusieurs systèmes de neurotransmetteurs et de
neuropeptides dans la connectivité de l’horloge alimentaire.
194
Mais l’approche mutante a surtout été un outil de choix dans l’acquisition de connaissances
concernant la machinerie moléculaire sous-tendant le fonctionnement de l’horloge
alimentaire. Le principe utilisé est le même que celui qui a permis d’identifier les premiers
gènes horloges dans les SCN : on suppose qu’un gène intervient dans la rythmicité
circadienne et une lignée de souris mutantes pour ce gène est générée. Les souris sont ensuite
placées dans diverses conditions lumineuses, soumises à des créneaux de lumière, puis les
rythmes d’expression des autres gènes horloges sont mesurés dans les SCN. Si des altérations
par rapport aux souris sauvages sont observées, des hypothèses sont formulées quant à la
place occupée par le gène muté dans les boucles moléculaires (voir introduction section II-4
pour les caractéristiques des différents mutants pour le gènes horloges). Pourquoi utiliser ces
mêmes mutants dans la recherche des mécanismes de la synchronisation alimentaire ? Peutêtre parce qu’il est rassurant de pouvoir s’appuyer sur des mécanismes existants, connus dans
d’autres horloges et oscillateurs. En effet, l’expression des gènes horloges semble ubiquitaire
et même des cellules isolées en culture expriment ces gènes de manière rythmique. Pourquoi
n’en serait-il pas de même pour toutes les horloges ? Pourtant, une certaine prudence semble
requise puisque nous avons démontré que l’expression d’un gène horloge dans un tissu
n’entraînait pas systématiquement la présence de sa protéine (Feillet et al., soumis).
Cependant, en absence d’un meilleur modèle, nous devons discuter en fonction de ce dont
nous disposons : des boucles moléculaires de rétroaction. Et finalement, il semblerait que
cette stratégie soit prometteuse, puisqu’un certain nombre de mutations des gènes horloges
altèrent la réponse comportementale à une synchronisation alimentaire.
1.1. Les mutants Npas2 et Clock.
Pourtant ce pari n’était pas gagné d’avance puisque la première étude du genre, réalisée par
Pitts et collaborateurs en 2003 a révélé que le gène Clock, identifié comme l’un des acteurs
majeurs des boucles moléculaires des SCN (King et al., 1994 ; DeBruyne et al., 2007),
n’entrerait pas dans les boucles moléculaires de l’horloge alimentaire. Les résultats, obtenus
sur la base de la quantification de la FAA en LD et en DD, en réponse à une restriction
temporelle de l’accès à la nourriture, semblent clairs. Il n’en est malheureusement pas de
même pour les études qui ont suivi : en 2001, Reick et collaborateurs identifient le remplaçant
potentiel de Clock pour l’horloge alimentaire. Il s’agirait de son analogue, présent dans le
télencéphale : NPAS2 (Reick et al., 2001). Les souris mutantes pour ce gène sont testées pour
la composante d’anticipation en réponse à une restriction temporelle. Les auteurs concluent à
un retard dans l’apparition de la FAA, ce qui impliquerait NPAS2 dans les mécanismes
moléculaires de l’horloge alimentaire (Dudley et al., 2003). Cependant, le protocole utilisé ne
semble pas toujours approprié : tout d’abord, le temps d’accès à la nourriture, 4 heures dans
cette expérience, ne correspond pas à une restriction temporelle, supposée permettre le
maintien de la masse corporelle, puisque les souris perdent jusqu’à 30 % de leur poids de
195
départ dans les 7 jours suivant le début de la restriction, mais serait plutôt une restriction
calorique sévère. Il s’ensuit une mortalité importante, interdisant à mon sens toute conclusion
définitive sur la fonction de NPAS2. Les auteurs pallient à la déplétion en énergie en
distribuant une ration supplémentaire quotidienne aux souris jugées « malades ». Un
protocole de restriction plus modéré aurait probablement permis d’éviter la perte importante
des souris restreintes. De plus, le seul paramètre utilisé pour estimer les conséquences de la
mutation est l’activité locomotrice, alors qu’une lésion peut par exemple altérer l’une ou
l’autre des sorties de l’horloge alimentaire indépendamment des autres (Davidson et Stephan,
1999 ; Recabarren et al., 2005).
WT
Npas2 -/-
Jours
Figure 37 : Actogrammes en double représentation d’une souris sauvage (WT) et d’une souris
mutante pour le gène Npas2 (Npas2 -/-) en LD, puis en DD (début indiqué par la flèche rouge)
soumises à une restriction alimentaire.
Le régime lumineux est indiqué au dessus de chaque actogramme. La zone grisée sur chaque
actogramme correspond à la période durant laquelle la nourriture est disponible. Les jours sont
reportés à gauche de chaque actogramme. La ligne verte pointillée indique la projection possible du
début de l’activité chez les mutants NPAS2, probablement contrôlée par les SCN.
(Adapté de Dudley et al, 2003)
Enfin, à l’observation approfondie de l’actogramme, il semblerait que l’activité locomotrice
présente un phénomène de libre cours, l’activité suivant la fin de l’accès à la nourriture en
début d’expérience, puis disparaissant derrière cet accès probablement masquée par la prise
alimentaire, et enfin réapparaissant en une composante d’anticipation. Si cette hypothèse est
exacte, ces mutants pourraient bien présenter un phénotype plus marqué que celui qui a été
dégagé par les auteurs. La FAA observée avec un retard pourrait n’être que la traversée de
l’activité locomotrice contrôlée par les SCN, à travers la période d’accès à la nourriture. Un
protocole d’accès à la nourriture calibré, sur une durée plus longue, ainsi que la mesure de
paramètres supplémentaires sera nécessaire pour tirer une conclusion sur ces mutants, qui ne
sont peut-être plus capables d’anticiper l’heure d’accès à la nourriture.
196
1.2. Les mutants Cry
Dans la troisième étude, portant sur les mutants Cry1/Cry2, une fois encore, la question de la
méthodologie est posée. Les auteurs adressent cependant un grand nombre de questions,
même si la lisibilité limitée des actogrammes remet parfois en question leur interprétation. La
FAA est ainsi estimée dans trois conditions : en LD, en LD suite à des lésions des SCN et en
DD (Iijima et al., 2005). Les auteurs s’affranchissent ainsi de l’éventuelle influence délétère
de la lumière sur l’activité locomotrice (en DD) et évitent tout repère temporel supplémentaire
qui permettrait un phénomène de mémoire sablier, en établissant une concordance entre
l’heure du nycthémère et l’heure d’accès à la nourriture (lésion des SCN). Ces contrôles sont
importants et ajoutent un poids méthodologique à cette étude. Un autre point important
soulevé par les auteurs est le problème de la persistance du comportement anticipatoire
observé. Il a été démontré que la FAA peut persister et même réapparaître après une période
ad libitum, à l’heure attendue de l’accès à la nourriture, lorsque l’animal est soumis à une
période de jeûne (Stephan et al., 1979 ; Boulos et al., 1980 ; Coleman et al., 1982 ; Clarke et
Coleman, 1986 ; Ruis et al., 1989). Cette caractéristique démontre l’endogénicité du rythme.
Iijima et collaborateurs ont testé ce phénomène dans chacune de leurs expériences. La
persistance durant 2 jours de jeûne et 2 jours de nourrissage ad libitum chez les WT confirme
les résultats obtenus précédemment. La disparition de la FAA chez les doubles mutants
Cry1/Cry2 après 2 jours en DD et après 1 jour après lésion des SCN démontre la probable
disparition de l’endogénicité de la FAA et le fonctionnement défectueux de l’horloge
alimentaire. Il est regrettable, avec un résultat si fort, que les auteurs ne discutent pas de
l’implication des SCN et de l’information lumineuse sur le comportement d’anticipation chez
ces mutants en LD, condition où la FAA persiste lors du jeûne. Une interprétation possible
serait que les SCN, toujours synchronisés par l’alternance du jour et de la nuit, fournissent un
repère temporel à l’ensemble du cerveau. Pour pallier au fonctionnement défectueux de
l’horloge alimentaire chez les mutants, des systèmes de mesure du temps de type sablier
pourraient se mettre en place : la nourriture arrivant 4 heures après l’allumage des lumières,
ce système mesurerait approximativement le délai entre l’allumage des lumières et l’arrivée
de la nourriture, déclenchant ainsi un pseudo-comportement de recherche alimentaire,
interprété comme FAA sur les actogrammes en LD. Cela pourrait expliquer la relative
instabilité de la FAA, un système de type sablier pouvant être moins précis qu’une horloge
véritable. En LD, le repère temporel persistant, la FAA persisterait également lors d’un jeûne.
En DD, en absence de repère vis-à-vis du cycle LD et les SCN étant arythmiques, la
persistance serait limitée à un ou deux cycles, s’appuyant peut-être sur des phénomènes de
mémoire temporelle. Enfin, suite à une lésion des SCN en LD, aucune perception de l’heure
externe n’étant disponible, l’absence de repère temporel exclut toute remise à l’heure ou
déclenchement d’un sablier. Le comportement anticipatoire disparaît en un cycle. Il
197
semblerait donc que l’implication des gènes Cry puisse être plus importante que celle conclue
par les auteurs.
Si les auteurs ont analysé en détail les caractéristiques de l’horloge alimentaire, aucune
information sur la perte de poids des souris n’est disponible ici et il est difficile d’estimer si
les souris ont été soumises à une réelle restriction temporelle (4 heures d’accès à la
nourriture). Cependant, les résultats de perte de masse obtenus avec le même accès dans
l’étude précédente, ainsi que les valeurs de prise alimentaire (inférieures de 30 à 60 % à la
prise alimentaire de la condition ad libitum) laissent supposer que la restriction serait bien une
restriction calorique. De plus, connaissant la sensibilité importante des souris au jeûne, un
jour de jeûne précédent la restriction, plus deux jours de jeûne suivant la restriction, ont
probablement constitué une déplétion importante en énergie. Ce type de protocole peut
provoquer une irrégularité dans l’activité locomotrice et rendre difficile la lecture et
l’interprétation de actogrammes. De plus, la période limitée de la restriction, seulement 7
jours, est un peu courte pour l’établissement d’un comportement stable. Une restriction plus
longue, mais aussi plus modérée, suivie d’une période ad libitum et d’un jeûne auraient peutêtre permis de tirer des conclusion plus sûres et plus fortes quant à l’implication des gènes
Cry dans le fonctionnement de l’horloge alimentaire. Tout comme dans l’article sur les
mutants NPAS2, on peut également regretter qu’un seul paramètre comportemental ait été
utilisé pour la mesure de la FAA.
Si l’implication des gènes Cry dans la machinerie moléculaire sous tendant le fonctionnement
de l’horloge alimentaire est plus que probable, un protocole un peu différent et des mesures
additionnelles, ainsi que l’investigation de l’implication individuelle de Cry1 et Cry2 (chez
des mutants simples par exemple) sont souhaitables afin d’affiner les résultats disponibles à
ce jour.
1.3. Nécessité de standardiser l’étude des mutants.
Les différentes études réalisées chez des souris mutantes ont soulevé un certain nombre de
problèmes méthodologiques vis-à-vis de la synchronisation alimentaire. Si les protocoles
d’étude de la rythmicité et de l’influence d’une mutation sur l’horloge des SCN sont
désormais calibrés et comprennent un batterie de tests standardisés (LD, conditions
constantes, créneaux de lumière, décalages de phase), il n’en est pas de même pour l’horloge
alimentaire, ce qui rend parfois difficile l’interprétation des résultats obtenus. La connaissance
des limites soulevées par les expériences analysées ci-dessus nous enseigne les précautions à
prendre lorsque l’on veut tester la synchronisation alimentaire chez des souris mutantes pour
les gènes horloges, ou chez d’autre espèces d’ailleurs :
- En premier lieu, il convient de mettre en place un protocole de restriction stricte selon
les paramètres à tester :
198
Une restriction temporelle de l’accès à la nourriture se distingue d’une
restriction calorique en cela que la prise alimentaire doit être suffisante pour
que la masse corporelle de l’animal ne diminue pas et puisse même augmenter
au cours de l’expérience. Dans ce cas, l’animal a accès à la nourriture plusieurs
heures par jour, l’accès commençant toujours à la même heure. Il ne peut
manger que durant ces heures.
Un accès normocalorique se distingue de la restriction temporelle en cela que
la nourriture est pesée quotidiennement et une ration équivalente à la prise
alimentaire mesurée en conditions ad libitum est distribuée chaque jour à la
même heure. Dans ce cas, l’animal peut consommer sa ration à la fois durant le
jour et la nuit (Mendoza et al., 2005c) et il est plus difficile de déterminer les
heures durant lesquelles survient la prise alimentaire.
Une restriction calorique comprend, en plus de la composante temporelle de
synchronisation alimentaire, une composante métabolique puisque par
-
définition une ration hypocalorique est fournie à l’animal. Ce protocole
suppose une mesure préalable de la prise alimentaire en condition ad libitum
puis la distribution quotidienne d’une ration hypocalorique individuelle.
Afin de calibrer les étapes d’un protocole de restriction il faut connaître parfaitement
la tolérance de l’espèce considérée vis-à-vis d’une restriction alimentaire.
L’accès à la nourriture lors d’une restriction temporelle peut par exemple
difficilement être inférieur à 6-8 heures chez la souris puisque cette espèce,
disposant de peu de réserves énergétiques, va rapidement perdre du poids si
l’accès est diminué à 4 heures. Par contre, chez le rat, selon la souche, un accès
quotidien de 2 à 6 heures est en général bien toléré.
La restriction calorique correspond en général à 66% de la prise alimentaire de
base chez la souris. Cette restriction permet d’obtenir une perte de poids
stabilisée autour de 20 %. Au delà de 20% de perte de poids, la déplétion en
énergie est trop grande et peut entraîner des changements comportementaux
comme l’hyperactivité ou la prostration, pouvant aller jusqu’à la mort de
l’animal. Chez le rat, une perte de masse stable autour de 20% peut être
obtenue en distribuant une ration hypocalorique de 50% inférieure à la ration
normocalorique.
Dans tous les cas, le protocole doit être testé au préalable sur un groupe
contrôle ou faire référence à un protocole identique déjà utilisé et dont les
caractéristiques sont satisfaisantes pour un protocole de restriction temporelle
ou calorique.
199
-
-
-
Un suivi hebdomadaire, voir bihebdomadaire, de la masse corporelle et de la prise
alimentaire est essentiel à la validation d’une condition de restriction temporelle ou
calorique.
Il est préférable que l’heure d’accès à la nourriture ne se trouve pas durant la nuit afin
de dissocier la FAA de la composante nocturne d’activité.
La restriction devrait systématiquement être appliquée durant au moins 15 jours afin
d’obtenir un comportement stable. Cette durée peut être allongée si l’on veut mesurer
le passage de la composante d’activité contrôlée par les SCN à travers la FAA
contrôlée par l’horloge alimentaire, en conditions d’obscurité ou de lumière
constantes.
Toute expérience estimant l’effet d’une mutation ou d’un traitement sur la
synchronisation alimentaire devrait être réalisé dans deux conditions lumineuses
différentes, par exemple LD et DD, afin d’estimer l’influence de l’alternance du jour
et de la nuit sur la persistance de la FAA (LD) et de s’affranchir de cette composante
(DD ou LL).
- Il est préférable de tester la FAA sur deux paramètres comportementaux ou
physiologiques afin d’éviter tout effet spécifique d’une mutation sur l’une des sorties
de l’horloge alimentaire.
- Sachant que le fonctionnement de l’horloge alimentaire est endogène, un test de jeûne
semble requis pour démontrer que la FAA observée, s’il est possible d’en observer
une, est bien une sortie d’une horloge auto-entretenue. Ce test sera fait de préférence
plusieurs jours après l’arrêt de la restriction, après une période de nourrissage ad
libitum par exemple, afin d’éviter tout phénomène de sablier. Suite à une restriction
calorique, la période ad libitum avant le jeûne permet d’éviter une déplétion en énergie
supplémentaire.
- Une lésion des SCN pourra être réalisée en addition, afin d’éviter tout repère temporel
en association avec l’horloge principale, via le couplage SCN/horloge alimentaire par
exemple.
Il est souhaitable qu’un protocole standardisé de ce type soit utilisé pour chacune des
expériences investigant la persistance du fonctionnement de l’horloge alimentaire à la fois
chez des mutants et dans le cadre de lésions. Cela devrait permettre une meilleure lisibilité de
résultats et la comparaison des différences obtenues pour chaque génotype ou condition
expérimentale.
1.4. Mutants Per.
Conscients des contraintes liées à l’investigation de l’implication d’une mutation sur un gène
horloge pour le fonctionnement de l’horloge alimentaire, nous avons mis en place un
protocole répondant aux critères mentionnés ci-dessus.
200
Nous avons ainsi démontré que dans 3 conditions lumineuses différentes (LD, DD, LL), dans
deux conditions de restriction (temporelle et calorique) et pour trois paramètres
comportementaux et physiologiques (activité de roue, activité générale et température) la
composante d’anticipation des repas est absente chez les souris mutantes pour le gène Per2 et
ce, dans un état de synchronisation stable. Par contre, le phénotype observé chez les mutants
Per1 est comparable, en termes d’anticipation, à celui observé chez les souris sauvages de la
même souche.
Le résultat tranché obtenu chez les mutants Per2 est à mettre en balance avec les phénotypes
plus modérés observés jusqu’ici. Il nous permet d’impliquer Per2 comme l’un des
composants majeurs de la machinerie moléculaire de l’horloge alimentaire, nécessaire pour le
fonctionnement de cette horloge et pour le contrôle d’au moins deux de ses sorties (Feillet et
al., 2006). Ce résultat confirme également que les mutants pour les gènes horloges sont de
bons outils pour étudier le fonctionnement de l’horloge alimentaire.
Cependant, nos résultats ne permettent pas d’éliminer Per1 de cette machinerie de manière
définitive : dans les SCN, Per2, mais pas Per1, est essentiel au maintien de la rythmicité
circadienne. Par contre, tous deux participent aux réponses normales à la lumière. Il est donc
possible que Per1 est une fonction dans la synchronisation dans l’horloge alimentaire et non
un rôle de maintien des oscillations (voir perspectives). En outre, nous avons démontré que
des structures n’exprimant que PER1 pouvaient être synchronisées par la nourriture, soulevant
une fois de plus la question du rôle de Per1 dans l’horloge alimentaire.
Nos résultats, associés à ceux obtenus auparavant, nous conduisent à proposer un modèle
moléculaire sous tendant le fonctionnement circadien de l’horloge alimentaire :
201
Cytoplasme
CRY
PER2
PER2
Noyau
CRY
PER1 ?
NPAS2 BMAL1
E-BOX
Pers & Crys
REV-ERB
NPAS2 BMAL1
E-BOX ?
ROR
Rev erb & ROR
ROR
REV-ERB
-
+
RORE
NPAS2 BMAL1
Bmal1
Npas2
NPAS2 BMAL1
E-BOX
CCG : gènes contrôlés par l’horloge
Contrôle de l’activité
locomotrice, la température, la
sécrétion de corticosterone
CCG
Sortie rythmique
Figure 38 : Modèle potentiel des mécanismes moléculaires sous tendant la rythmicité de l’horloge
alimentaire.
Jusqu’ici, les gènes Npas2, Cry1, Cry2 et Per2 ont été impliqués dans ces mécanismes. Ainsi, leurs
produits protéiques et les flèches qui y sont connectées sont en traits pleins. Le rôle possible de Per1,
Rev-erb, ror et Bmal1, ainsi que la présence de gènes contrôlés par l’horloge restent à confirmer. Leur
présence a été extrapolée à partir des mécanismes connus dans les SCN. Leurs produits protéiques
ainsi que les flèches connexes sont en couleurs hachurées et en traits pointillés respectivement, afin
d’indiquer le caractère purement conjecturel de cette partie du modèle.
III. De l’importance des sorties de l’horloge alimentaire
1. La mélatonine.
Comme nous l’avons vu en introduction, un certain nombre de sorties connues de l’horloge
principale (activité locomotrice, corticostérone, température) peuvent être influencées par une
restriction alimentaire (Holloway et al., 1979 ; Chik et al., 1987 ; Challet et al., 1997c ;
Mendoza et al., 2005c). Chez des animaux intacts, leurs patrons d’expression sont la
résultante de l’influence des SCN et de l’horloge alimentaire (Mistlberger, 1994). Après
lésion des SCN, le contrôle unique par l’horloge alimentaire synchronise toutes ces sorties.
Un pic anticipatoire s’exprime donc dans l’activité locomotrice, la corticostérone et la
202
température (Krieger, 1974 ; Nelson et al., 1975 ; Stephan et al., 1979 ; Mistlberger, 1994 ;
Challet et al., 1997c ; Recabarren et al., 2005). Si ces phénomènes étaient bien connus, il est
plus exceptionnel de constater que l’horloge alimentaire peut influer sur une sortie jusque là
considérée comme exclusive des SCN : la sécrétion de mélatonine par la glande pinéale.
Après lésion des SCN, les rythmes d’aa-nat, enzyme limitante dans la synthèse de
mélatonine, et de mélatonine sont arythmiques dans la glande pinéale (Perreau-Lenz et al.,
2003). De manière inattendue, la mélatonine, redevient rythmique dans cette même structure
lors d’une restriction temporelle de l’accès à la nourriture chez le rat. Nous avons donc ici une
nouvelle sortie inattendue de l’horloge alimentaire (Feillet et al., en préparation).
Mais la glande pinéale est-elle une sortie directe ? Si nous supposons que c’est le cas, il nous
faut envisager que l’horloge alimentaire compte parmi ses voies de sortie, l’un des
composants de la voie poly-synaptique bien connue des SCN à la glande pinéale et contrôlant
la sécrétion de mélatonine : noyaux paraventriculaires de l’hypothalamus (PVN), colonne
intermédiolatérale de la moelle épinière, ganglions cervicaux supérieurs (Larsen, 1999 ;
Teclemarian-Mesbah et al., 1999 ; Simonneaux et Ribelayga, 2003). Cette hypothèse pourra
être testée en réalisant soit une lésion des PVN, soit une dénervation sympathique. L’une ou
l’autre de ces chirurgies, voire les deux, si elles suppriment le rythme de mélatonine restauré
par la RF, indiqueront que le contrôle de la sécrétion de mélatonine par l’horloge alimentaire
est similaire à celui opéré par les SCN.
Cependant, au vu des résultats obtenus dans notre expérience, il est également possible que la
restauration de la rythmicité observée soit une conséquence indirecte des réponses
physiologiques et comportementales à la restriction. La mélatonine serait alors une sortie,
mais indirecte, de l’horloge alimentaire : les rats restreints présentent à la fois une FAA et un
pic anticipatoire de corticostérone ; chez ces animaux, le rythme de mélatonine est restauré.
Chez les animaux restreints et immobilisés, le pic de corticostérone persiste, mais l’activité
locomotrice est inhibée. Le rythme de mélatonine n’est pas restauré. Une interprétation
possible est que la FAA stimule le système nerveux sympathique, provoquant une libération
de noradrénaline dans la glande pinéale, ce qui aboutirait à la synthèse de mélatonine
(Simonneaux et Ribelayga, 2003). Chez les rats nourris ad libitum et soumis à une
immobilisation pendant l’anticipation des rats restreints, un pic de corticostérone est exprimé,
dû au stress d’immobilisation : chez ces animaux, aucun rythme de mélatonine n’est
observable, éliminant la corticostérone comme message suffisant pour contrôler la
restauration du rythme de mélatonine dans la glande pinéale (Feillet et al., en préparation).
Cependant, nous ne pouvons pas exclure, sur la base de nos résultats, que le pic anticipatoire
de corticostérone participe à cette restauration. Des informations redondantes provenant de
sorties de différentes sorties l’horloge alimentaire (activité locomotrice et corticostérone)
déclenchent la synthèse de la mélatonine : la corticostérone pourrait agir sur des récepteurs
aux glucocorticoïdes présents dans la glande pinéale, qui à leur tour iraient activer la
203
transcription de l’aa-nat via une boîte GRE (glucocorticoid responsive element) présente dans
son promoteur (Estrada-Rodgers et al., 1998 ; De Kloët et al., 1998 ; Ferreira et al., 2005 ;
Fernandez et al., 2006). Un signal supplémentaire, provenant de l’activité locomotrice, via le
système nerveux sympathique par exemple, complèterait le signal de biosynthèse de la
mélatonine. Une expérience utilisant des rats SCN lésés et surrénalectomisés, soumis à une
restriction alimentaire et éventuellement immobilisés, nous permettrait d’éliminer la
corticostérone comme possible acteur de la restauration du rythme de mélatonine dans la
glande pinéale.
En se basant sur nos résultats, nous proposons le modèle ci-après, qui résume notre hypothèse
actuelle :
204
Mélatonine
noyau
+
? +
+
GR
aa-nat
GRE
AA-NAT
?
Glande
pinéale
+
ARNm
+
Noradrénaline
Horloge
alimentaire
SNS
Pic anticipatoire
de
corticostérone
+
Glande
surrénale
+
Activité locomotrice
(FAA)
Figure 39 : Mécanismes de stimulation de la synthèse de mélatonine par l’horloge alimentaire.
Lors d’une restriction alimentaire chez un animal SCN lésé, l’horloge alimentaire (cercle bleu)
contrôle le pic anticipatoire de corticostérone et la FAA. La corticostérone agit par voie humorale sur
la glande pinéale en se fixant sur ses récepteurs (GR) sur la membrane nucléaire des pinéalocytes. Les
récepteurs GR agissent à leur tour dans le noyau sur des boites GRE, présentes dans le promoteur de
l’aa-nat, pour stimuler sa transcription. L’activité locomotrice active la traduction de l’aa-nat (flèches
jaunes pleines ou pointillées), ce qui aboutit à la synthèse de mélatonine, potentiellement via un
message noradrénergique libéré par le système nerveux sympathique (SNS, flèches jaunes pointillées)
dans la glande pinéale.
205
Il est donc possible que la mélatonine soit une sortie indirecte de l’horloge alimentaire,
permettant ainsi la synchronisation supplémentaire par l’intermédiaire de cette hormone. Des
tissus qui ne seraient pas des cibles directes de l’horloge alimentaire et possédant des
récepteurs à la mélatonine, pourraient ainsi être synchronisés par celle-ci grâce au message
mélatoninergique généré de manière secondaire.
2. La corticostérone.
Considérant les résultats obtenus avec la mélatonine, il n’est pas impossible que certaines des
sorties mesurées habituellement lors de la synchronisation alimentaire soient des sorties
indirectes de l’horloge alimentaire, exprimées en réponse au pic anticipatoire d’une autre
sortie. Il était donc possible que la FAA soit provoquée par le pic anticipatoire de
corticostérone. Or, nos résultats permettent de réfuter cette hypothèse puisqu’une inhibition
du pic de corticostérone par voie pharmacologique (injection de métyrapone, inhibiteur de
synthèse de corticostérone) ou chirurgicale (ablation de la glande surrénale) n’abolit pas la
FAA (Feillet et al., en préparation).
Par contre, il ne nous est pas possible de conclure le fait inverse : nous avons effectivement
inhibé la FAA par immobilisation quotidienne des animaux, mais ce traitement semble
constituer un stress important et les animaux présentent donc un pic de corticostérone au
même moment que l’anticipation. Il est difficile de savoir si ce pic est exclusivement une
réponse de stress ou s’il résulte à la fois du stress d’immobilisation et de la composante
d’anticipation. La question reste donc entière et d’autres expériences seront nécessaires pour y
répondre.
Cependant, une expérience permettant l’inhibition de l’activité locomotrice sans manipulation
ou immobilisation de l’animal sera difficile à mettre en place : une possibilité serait d’injecter
un hypnotique afin que l’animal dorme durant la composante d’anticipation. Nous pouvons
nous attendre dans ce cas à des effets secondaires dus à l’hypnotique et non spécifiques de la
simple inhibition de l’activité locomotrice. Des peptides comme le TGF, la PK2 ou le CLC
ont été identifiés comme de potentiels facteurs sécrétés par les SCN inhibant l’activité
locomotrice durant le jour (Kramer et al., 2001 ; Cheng et al., 2002 ; Kraves et Weitz, 2006).
Une infusion intra-cérébro-ventriculaire de l’un de ces peptides pourrait être utilisée pour
inhiber de manière plus spécifique l’activité locomotrice de manière réversible durant la FAA
et mesurer ainsi la sécrétion de corticostérone durant cette période.
IV. Substrat anatomique de l’horloge alimentaire
Si ce travail de thèse a apporté des informations substantielles sur les mécanismes
moléculaires sous-tendant le fonctionnement de l’horloge alimentaire, sa localisation reste
encore à déterminer. Quelques pistes ont été explorées, certaines conduisant à l’élimination de
structures, d’autres ouvrant de nouvelles perspectives de recherche.
206
1. La glande surrénale.
De nombreuses études suggèrent que l’horloge alimentaire se trouverait dans le système
nerveux central, ou du moins qu’elle ne se trouverait pas dans le système digestif (Davidson
et al., 2003). La glande surrénale, responsable de la production de corticostérone, était elle
aussi un candidat possible, sinon pour abriter l’horloge alimentaire en elle-même, au moins
pour constituer un système d’entrée nécessaire à l’entraînement de celle-ci. Il est en effet
improbable que la glande surrénale abrite une horloge (Ishida et al., 2005 ; Oster et al., 2006).
Par contre, qu’elle soit entraînable par la nourriture et fournisse un signal capital pour la
synchronisation de l’horloge alimentaire (pic anticipatoire de corticostérone) n’était pas une
hypothèse aberrante. Notre étude sur des rats surrénalectomisés indique pourtant que la FAA
est tout à fait normale dans ce cas, réfutant cette hypothèse et éliminant à la fois la
corticostérone et tout autre message provenant de la glande surrénale comme nécessaires à la
synchronisation de l’horloge alimentaire (Feillet et al, en préparation). La glande surrénale et
la corticostérone sont donc bien des sorties de l’horloge alimentaire.
2. Une approche innovante pour découvrir la localisation de l’horloge alimentaire.
S’il n’est pas possible, en l’état actuel des connaissances, d’éliminer totalement les tissus
périphériques comme substrat anatomique de l’horloge alimentaire, la probabilité pour qu’elle
se trouve dans une structure centrale est élevée.
Cependant, la lésion de la quasi-totalité des structures impliquées dans la prise alimentaire,
l’éveil et la balance énergétique s’étant révélée infructueuse (Mistlberger et Rechtschaffen
1984 ; Mistlberger et Rusak, 1988 ; Challet et al., 1997b ; Mistlberger et Antle, 1999 ;
Davidson et al., 2000 ; Davidson et al., 2001a ; Gooley et al., 2006 ; Landry et al., 2006 ;
Landry et al., 2007), il était nécessaire de mettre en place une nouvelle méthode
d’investigation. Notre hypothèse était que des structures impliquées dans la synchronisation
alimentaire au niveau central verraient leur activité s’adapter en cas de restriction alimentaire,
et donc leur consommation locale de glucose se modifier. Nous avons donc mesuré la
consommation locale de glucose dans un grand nombre de structures cérébrales lors d’une
restriction temporelle ou d’une restriction calorique, comparée à une condition ad libitum,
grâce à la technique du 2-DésoxyGlucose (2-DG). Les deux types de restriction devaient nous
permettre de distinguer les structures impliquées dans les composantes temporelle ou
énergétique de la synchronisation alimentaire. Le 2-DG est une molécule analogue au
glucose, qui peut être captée par les cellules grâce aux mêmes transporteurs que celui-ci et
peut subir la première étape de la glycolyse. Sa structure ne lui permet cependant pas d’être
métabolisé plus avant et il s’accumule donc dans les cellules métaboliquement actives.
Marqué au 14C, il permet d’estimer la consommation locale de glucose. Cette technique
présentait pour nous de nombreux avantages : nous pouvions quantifier sans a priori les
207
variations de consommation de glucose dans le cerveau, afin d’obtenir des données sur
l’activité cérébrale fonctionnelle entre les différentes conditions (Sokoloff, 1981). Nous
avions donc une approche inverse de celles qui avaient été utilisées jusque là : nous n’avions
pas une seule structure pour cible, mais des dizaines. Cela nous permettait également de
mettre à l’épreuve une théorie avancée depuis plusieurs années et qui indiquait que l’horloge
alimentaire ne se trouverait pas dans une seule structure mais reposerait sur le fonctionnement
redondant d’un réseau de structures (Angeles-Castellanos et al., 2004 ; Angeles-Castellanos et
al., 2005 ; Angeles-Castellanos et al., 2007) : nous pouvions rechercher les éléments de ce
réseau par leur activation simultanée, avec une résolution anatomique tout à fait correcte.
Nous avons ainsi identifié plusieurs acteurs potentiels du réseau sous tendant l’horloge
alimentaire : les PVT, les IGL, les noyaux arqués (Arc), les PVN, l’aire préoptique médiale
(MPO), le cervelet et le NTS(Pereira de Vasconcelos et al, 2006). Certaines de ces structures
ont fait l’objet de lésions électrolytiques auparavant : les PVN, les PVT, les IGL et l’Arc
(Mistlberger et Rusak, 1988 ; Mistlberger, 1994 ; Mistlberger et Antle, 1999 ; Landry et al.,
2007). Parmi ces lésions, aucune n’abolit la FAA, ce qui n’élimine pas la possibilité non
négligeable qu’ils puissent avoir des fonctions redondantes pour l’horloge alimentaire. Il est
probable que l’activation des NTS soit consécutive à des messages provenant du système
digestif, cette structure en recevant des informations abondantes. Le MPO étant impliqué dans
l’homéostasie du glucose (Foscolo et al., 2003), il n’est pas étonnant de voir que cette
structure est affectée par une restriction alimentaire. Enfin, le cervelet étant impliqué dans la
locomotion, une modification de son métabolisme durant la FAA était attendue. Ceci dit, il
n’est pas exclu qu’il puisse jouer un rôle plus important que le simple contrôle de la sortie
locomotrice. Une approche similaire du point de vue conceptuel, qui recherchait les structures
exprimant c-FOS en anticipation ou durant l’accès à la nourriture, a dégagé elle aussi un
certain nombre de structures possiblement impliquées dans le réseau de l’horloge alimentaire
(Angeles-Castellanos et al, 2004 ; Angeles-Castellanos et al, 2007. Voir introduction section
IV.9.5). Les PVT par exemple, sont identifiés par les deux approches, mais d’autres structures
trouvées dans notre étude ne sont pas retrouvées dans les autres et inversement. Le marquage
c-FOS identifiant l’activité neuronale nucléaire (Sharp et al., 1988 ; Dragunow et Faull, 1989)
et la technique du 2-DG détectant plutôt l’activité au niveau des terminaisons présynaptiques
(Nudo et Masterton, 1986 ; Sharp et al., 1988 ; Kurumaji et al., 1993), il n’est pas incohérent
d’observer des divergences de résultats entre ces deux techniques, néanmoins
complémentaires.
Ces résultats intéressants rendent cependant difficile la proposition d’un réseau pour l’horloge
alimentaire. Ces structures appartiennent à des ensembles bien différents, impliqués dans le
contrôle de fonctions très variées. C’est justement l’une des limitations des techniques du 2DG et du marquage c-FOS : si elles donnent des pistes d’étude, elles ne rendent compte
d’aucune hiérarchie entre les structures. Que ces structures aient des fonctions redondantes ou
208
que les modifications de l’activité de certaines soient la conséquence de l’activation d’autres
ne peut pas être déterminé ici.
Le protocole de restriction mis en place ici, bien que tout à fait adéquat pour l’étude de la
synchronisation alimentaire, a pu également induire ici une limitation pour l’investigation des
structures importantes pour l’horloge alimentaire : en effet, nous avons mesuré les variations
de glucose après 3 semaines de restriction, donc dans un état stable. Il est possible que des
structures voient leur consommation de glucose modifiée dans la phase dynamique de
l’adaptation à la restriction alimentaire, puis reviennent à un état « basal » lorsque
l’entraînement est stable. Cela dit, la complexité et la lourdeur d’analyse des résultats pour la
technique du 2-DG sont telles qu’il est difficile d’envisager de reproduire cette expérience sur
plusieurs jours successifs pour observer les changements dynamiques de consommation de
glucose. De plus, la plupart des autres résultats obtenus concernant l’horloge alimentaire sont
en conditions stables et sont donc comparables du point de vue méthodologique avec nos
résultats.
La lourdeur de mise en place des mesures en 2-DG a introduit une autre limite dans ce
travail : nous n’avons pu réaliser les mesures de consommation de glucose qu’à un seul point
horaire, à savoir la période durant laquelle s’exprime la FAA, moment auquel nous attendions
que les structures impliquées dans son contrôle voient leur consommation de glucose
modifiée. Nous gardons à l’esprit qu’une analyse à d’autres points horaires aurait pu nous
permettre d’identifier d’autres structures ou d’affiner nos résultats.
Enfin, il faut souligner que si la technique du 2-DG est une technique d’imagerie de choix
pour visualiser des phénomènes pathologiques de consommation de glucose (épilepsie par
exemple), il était exceptionnel de trouver des variations telles que celles que nous avons
observées (30 à 55 %) dans un état stable et non pathologique dans le cerveau d’un rongeur.
Nos résultats donnent de nouvelles pistes d’étude et il sera bon d’étudier en détail
l’implication possible de chacune des structures, dans un esprit de hiérarchisation, par des
lésions ou des techniques moléculaires utilisant les gènes horloges par exemple.
3. PER2, une protéine clé pour la recherche de l’horloge alimentaire.
Deux autres de nos études nous permettent de compléter les résultats obtenus avec le 2-DG.
Nous avons démontré que le gène Per2 était essentiel à l’expression de la composante
d’anticipation de la température et de l’activité locomotrice, et entrait dans la machinerie
moléculaire de l’horloge alimentaire (Feillet et al, 2006). Nous avons en outre démontré que
toutes les structures du cerveau antérieur, si elles expriment l’ARNm pour Per2, n’expriment
pas systématiquement la protéine PER2 (Feillet et al, soumis). La recherche du substrat
anatomique de l’horloge alimentaire doit s’appuyer sur ces deux études afin de proposer de
nouvelles pistes. Mieda et collaborateurs ont employé une approche intéressante dans ce
domaine, recherchant les structures où une expression rythmique de Per1 ou Per1 était
209
observée en réponse à une restriction alimentaire (Mieda et al., 2006). Nous devons aller plus
loin dans ce raisonnement : une approche possible serait de rechercher les structures où
l’expression de la protéine PER2 est modifiée en réponse à une synchronisation alimentaire.
En adéquation avec notre étude sur les mutants Per, l’horloge alimentaire doit être une
structure qui exprime la protéine PER2, et qui est influencée par une restriction alimentaire.
Cette assertion implique que toute structure n’exprimant pas PER2 mais PER1 ne
constituerait pas le substrat anatomique de l’horloge alimentaire. Si l’on se réfère aux résultats
obtenus pour l’expression centrale des protéines PER1 et PER2 dans le cerveau antérieur de
souris en réponse à une restriction calorique, les DMH ne pourraient donc pas renfermer
l’horloge alimentaire. Ce résultat réfute donc l’hypothèse de Gooley et collaborateurs qui
proposaient cette structure comme une possible horloge alimentaire (Gooley et al., 2006). Par
contre, en adéquation avec l’hypothèse proposée pour les rôles différentiels de PER1 et PER2
dans le cerveau antérieur, les DMH pourraient être une région connexe de l’horloge
alimentaire, se trouvant soit sur son chemin d’entrée et renforçant les messages
synchronisateurs, soit sur la voie de sortie de l’horloge.
Dans notre étude sur l’expression centrale des protéines PER1 et PER2, nous observons que
certaines structures comme l’hippocampe ou BLA expriment PER2, mais sont relativement
insensibles à la restriction. En revanche, les VMH, CEA ainsi que les PVN, PVT et Arc, déjà
identifiés dans notre étude 2-DG, expriment PER2 et répondent à une synchronisation
alimentaire. Il est à la fois encourageant et décourageant de constater que des structures
familières peuvent être impliquées dans la synchronisation alimentaire : décourageant car la
toutes ces structures, à l’exception de CEA, ont déjà été lésées sans révéler la localisation de
l’horloge alimentaire. Mais cela est encourageant dans la mesure où l’hypothèse d’un réseau
de structures peut une fois de plus être évoqué et qu’il reste donc une multitude de
caractéristiques de l’horloge alimentaire à découvrir.
4. Un modèle de réseau pour la synchronisation alimentaire.
Les résultats obtenus au cours de ma thèse, s’ils ont amené des éléments nouveaux, n’ont
certes pas simplifié le modèle possible expliquant la synchronisation alimentaire. Le schéma
qui suit vise à éclaircir et résumer certains points de cette histoire. Cependant, étant données
les zones d’ombres qui subsistent dans le domaine, il sera probablement amené à être
amélioré dans les années à venir :
210
INFORMATIONS D’ENTREE (disponibilité alimentaire)
Tissus périphériques
Réception par des structures centrales
Réception directe de paramètres métaboliques par l’horloge alimentaire
Noyau
parabrachial ?
Cytoplasme
CRY
PER2
PER2
Noyau
CRY
PER1 ?
NPAS2 BMAL1
E-BOX
Pers & Crys
REV-ERB
NPAS2 BMAL1
E-BOX ?
ROR
Rev erb & ROR
ROR
REV-ERB
-
+
RORE
NPAS2 BMAL1
Bmal
Npas
NPAS2 BMAL1
E-BOX
CCG : gènes contrôlés par l’horloge
Contrôle de l’activité
locomotrice, la température, la
sécrétion de corticosterone
CCG
Sortie rythmique
HORLOGE ALIMENTAIRE
Structure ou réseau de structures
centrales exprimant PER2
Neurones
orexinergiques et
histaminergiques
Structures relais de
sorties (DMH, PBN)
Hypophyse
Cortex infralimbique
SORTIES dont
ACTIVITE
LOCOMOTRICE
(FAA)
CORTICOSTERONE
(FAC)
MELATONINE
TEMPERATURE
(FAT)
système opioïdergique
211
Figure 40 : Modèle du réseau « synchronisation alimentaire ».
Les informations en entrée sont perçues soit par les tissus périphériques, soit par des structures
d’entrée vers l’horloge alimentaire, soit par l’horloge alimentaire elle-même. La transmission des
facteurs environnementaux relatifs à la disponibilité alimentaire peuvent être transmis à l’horloge
alimentaire (s’il n’y a pas de détection directe) via des structures cérébrales (noyau parabrachial) ou
directement par voie nerveuse (système noradrénergique : flèches hachurées en orange ; système
glutamatergique : flèches hachurées en bleu ; ou autre : flèches blanches). L’horloge alimentaire est
une structure ou un réseau de structures, exprimant la protéine PER2. Des structures relais uniques ou
multiples transmettent aux sorties les informations générées par l’horloge alimentaire. Il est probable
que les neurones orexinergiques et histaminergiques contribuent à l’éveil durant la FAA. Ils peuvent
être contrôlés directement par l’horloge alimentaire ou via l’un de ses relais. Même remarque pour
l’hypophyse et le cortex infralimbique qui semblent contrôler plus spécifiquement la FAT. Les voies
noradrénergiques et glutamatergiques servent probablement à la neurotransmission de l’ensemble des
messages. Ils ont été représentés comme connexions de manière aléatoire entre les différentes
structures, respectivement en orange et bleu. Les sorties primaires de l’horloge alimentaire peuvent
rétroagir au niveau central, éventuellement sur l’horloge alimentaire elle même pour activer d’autres
systèmes (mélatonine, système µ-opioïdergique), qui par commodité ont été représentés à la suite des
sorties primaires sur le schéma. L’influence de la corticostérone est représentée en vert, et celle de
l’activité locomotrice en jaune. Les flèches pointillées roses représentent les rétroactions possibles des
sorties au niveau cérébral, sur l’horloge, des relais primaires ou même de nouveaux relais.
V. Nécessité
d’une
horloge
chef
d’orchestre :
Synchronisation alimentaire versus Horloge alimentaire.
Au cours de ma thèse j’ai été amenée à travailler sur deux concepts, que j’ai souvent
superposés : la synchronisation alimentaire et l’horloge alimentaire.
Si la synchronisation alimentaire est obligatoire lorsque l’on parle de l’horloge alimentaire
puisque c’est le zeitgeber dominant pour cette horloge, l’inverse n’est pas vrai. En effet, une
structure peut être synchronisée par l’accès à la nourriture, sans pour autant renfermer
l’horloge alimentaire. Le meilleur exemple est celui des SCN qui peuvent être synchronisés
par une restriction calorique (Mendoza et al., 2005c), mais dont la lésion n’altère pas les
réponses physiologiques et comportementales à cette même restriction.
Pourtant une question subsiste : la synchronisation alimentaire observée dans la quasi totalité
des tissus est-elle une propriété intrinsèque de ceux-ci ? Est-il possible qu’elle soit la
conséquence de la synchronisation de l’horloge alimentaire par la nourriture qui redistribue un
message donneur de temps à l’ensemble de l’organisme, remettant ainsi les oscillateurs à
l’heure, en adéquation avec la disponibilité alimentaire ? Considérant que chez des souris
mutantes pour le gène Per2, essentiel à l’expression de la FAA, les tissus périphériques sont
capables d’être synchronisés par la nourriture (Feillet et al., 2006), nous pourrions penser que
la synchronisation alimentaire est une propriété intrinsèque et ne nécessite pas la participation
d’une horloge « chef d’orchestre ». Cependant, si une synchronisation alimentaire
indépendante d’un comportement anticipatoire a pu être démontrée dans le foie, aucun résultat
n’indique qu’il en soit de même pour le système nerveux central : comme démontré dans
notre étude sur l’expression de Cry1 dans le cerveau antérieur en réponse à un nourrissage
hypocalorique, des altérations de l’expression des gènes horloges sont observées chez des
212
souris mutantes pour les gènes Per comparées aux WT (Feillet et al., soumis). La
synchronisation alimentaire comme propriété intrinsèque serait donc spécifique aux tissus
périphériques.
Quelle pourrait être alors l’utilité d’une horloge centrale, si la périphérie peut répondre
indépendamment aux pressions alimentaires environnementales ?
Si l’intérêt d’une synchronisation indépendante des tissus périphériques est évidente (synthèse
d’enzymes de la digestion en adéquation avec l’heure à laquelle elles sont utiles), sa portée ne
peut être que locale. Chez les mutants Per2, le foie est parfaitement synchronisé à l’heure du
repas ; par contre le comportement n’est pas adapté à cette synchronisation : les souris ne
présentent pas de FAA. Dans un environnement naturel, ces animaux ne présenteraient pas de
comportement de recherche alimentaire et ne seraient donc probablement pas capables de
trouver de la nourriture dans des niches temporelles inhabituelles. Par conséquent, même si
les tissus périphériques peuvent êtres synchronisés de manière indépendante par la nourriture,
ils ne sont pas capables de générer et distribuer un message synchronisateur permettant de
contrôler les comportements à l’échelle de l’animal entier. Une horloge centrale « chef
d’orchestre » est donc indispensable à la réalisation de la totalité des mécanismes de survie de
l’animal confronté à un changement de niche temporelle de la disponibilité alimentaire.
213
Disponibilité
alimentaire
Alternance du jour
et de la nuit
SCN
Rythme
Veille/sommeil,
hormones
FEC
rythmicité alimentaire,
hormones
Oscillateurs
périphériques
Figure 41 : Schéma bilan du contrôle de la rythmicité alimentaire.
Dans des conditions normales, l’horloge alimentaire (bleu) est couplée (double flèche bleue et jaune) à
l’horloge principale des SCN (jaune). La première est sensible aux informations alimentaires (flèche
bleue courbe), la seconde est synchronisée par les informations lumineuses (flèche jaune courbe).
Elles contrôlent ensembles la rythmicité de l’organisme (flèches pleines jaunes, bleue et verte),
transmise vers les tissus périphériques. Si un challenge énergétique survient, l’horloge alimentaire
contrôlerait alors seule la rythmicité alimentaire, et les SCN continueraient à transmettre leur message
synchronisateur pour rythmer le reste des fonctions physiologiques. Les oscillateurs périphériques
seraient à la fois directement sensibles aux informations métaboliques environnementales (flèche
bleue étroite), et synchronisés par les deux horloges (flèches verte et jaune). Ils seraient en outre
capables de transmettre à leur tour des messages au système nerveux central (flèches roses).
214
CHAPITRE 5
PERSPECTIVES
216
En plus des quelques expériences évoquées en discussion, et qui permettraient de préciser
certaines questions soulevées par les résultats obtenus au cours de ma thèse, de nouveaux
concepts et outils de recherche mis à notre disposition devraient apporter des réponses
concernant les mécanismes moléculaires de l’horloge alimentaire ainsi que sur sa localisation.
I. Implication
alimentaire
de
Per1
dans
la
synchronisation
Si le rôle de Per2 dans la synchronisation alimentaire au niveau central a été démontré par nos
travaux (Feillet et al., 2006), nos résultats concernant PER1 indiquent que cette protéine
répond à la synchronisation alimentaire et il n’est pas exclu que Per1 entre dans la machinerie
moléculaire de l’horloge alimentaire, non pas au niveau de la génération du message
rythmique de sortie de l’horloge, mais pour le renforcement de la synchronisation ou
l’adaptation à un nouvel accès à la nourriture après un décalage de phase de l’heure d’accès.
Nous savons que dans les SCN, Per1 et Per2 sont impliqués dans les avances et les retards de
phase induits par la lumière, respectivement. Pourrait-il en être de même pour l’horloge
alimentaire ? Une expérience possible pour tester cette hypothèse serait d’entraîner des souris
KO pour le gène Per1 à une restriction alimentaire, puis après avoir atteint un état stable, de
réaliser un décalage de l’accès à la nourriture en avançant ou retardant celui-ci de quelques
heures. Si notre hypothèse est exacte, les KO Per1 devraient présenter des anomalies dans la
remise à l’heure de l’horloge alimentaire et probablement un comportement altéré par rapport
aux souris sauvages dans les mêmes conditions.
II. A la recherche du substrat anatomique de l’horloge
alimentaire
Les approches lésionnelles s’étant révélées infructueuses dans la recherche du substrat
anatomique de l’horloge alimentaire, les approches utilisant c-FOS ou le 2-DG ne permettant
pas d’établir une hiérarchie entre les structures, des approches nouvelles, utilisant des
techniques plus récentes sont désormais nécessaires.
1. Horloge centrale ou périphérique ?
S’il est fort probable que l’horloge alimentaire se trouve dans le système nerveux central,
aucune preuve absolue n’a été apportée jusqu’ici. Or, nous savons que le gène Per2 est
essentiel au fonctionnement de l’horloge alimentaire. Mais cette hypothèse émane de résultats
obtenus chez des souris pour lesquelles le gène Per2 a été invalidé depuis la naissance dans la
totalité des tissus. Une étude plus fine serait nécessaire afin de déterminer dans quels tissus
spécifiques l’expression de Per2 est absolument nécessaire à l’entraînement par la nourriture.
Pour ce faire, nous proposons de générer des lignées de souris mutantes pour le gène Per2
dans un système tissu spécifique, grâce au système CRE-LOX. Dans un premier temps, il
217
serait intéressant d’étudier la synchronisation alimentaire chez des mutants Per2 neurones
spécifiques, afin de déterminer si le substrat de l’horloge alimentaire est bien neuronal. En
association avec cette étude, des mutants Per2 seulement dans le foie ou les intestins peuvent
être utilisés comme contrôles, puisque la synchronisation alimentaire semble normale dans
ces tissus chez les mutants Per2. Si la nature neuronale du substrat de l’horloge alimentaire
est confirmée, nous pourrons alors lancer une étude plus ciblée dans le système nerveux
central.
2. Restauration de fonction dans le système nerveux central.
Des recherches récentes en virologie ont développé un outil adéquat pour la recherche de
l’horloge alimentaire : les construits lentiviraux. Ces vecteurs basés sur le virus HIV peuvent
infecter des cellules post mitotiques tels que les neurones. Modifiés par génie génétique pour
exprimer un transgène d’intérêt, et injectés en un site spécifique, ces construits peuvent
provoquer une expression soutenue du transgène dans une zone limitée au voisinage du site
d’injection, puisqu’ils permettent l’insertion du transgène dans le génome de l’hôte. Cette
technique pourrait être adaptée à notre recherche de l’horloge alimentaire. Il serait possible de
cloner Per2 dans un vecteur lentiviral et d’injecter ce construit par stéréotaxie dans des aires
cérébrales d’intérêt chez des souris Per2 mutantes. L’infection stable des cellules neuronales
d’une structure chez ces mutants doit restaurer la fonction de la protéine PER2 dans cette
structure. Normalement, les mutants Per2 ne présentent pas de FAA en réponse à une
restriction alimentaire. Si la transfection a lieu dans une structure critique pour le
fonctionnement de l’horloge alimentaire, la FAA doit être restaurée par l’injection des
construits. L’expression stable de la protéine PER2 ainsi que l’étendue anatomique de la
restauration de fonction peut être estimée grâce à une immunohistochimie dans les zones
proches de l’injection. L’une des premières structures qui devra être testée est les DMH,
puisqu’ils ont été proposés comme une horloge alimentaire possible. Les structures pour
lesquelles nous avons trouvé une expression rythmique de PER2 en réponse à une restriction
calorique peuvent également être des cibles potentielles, ainsi que les structures identifiées par
marquage c-FOS ou 2-DG. Une combinaison d’injections, plus lourde techniquement, peut
également être envisagée.
Cette approche pourrait permettre de circonscrire le substrat anatomique de l’horloge
alimentaire grâce à une approche nouvelle et innovante.
III. Utilisation de souris exprimant un gène rapporteur.
Une autre approche récente a utilisé la modification de l’expression des gènes horloges dans
le système nerveux central en réponse à une restriction alimentaire. Cependant, ces analyses,
réalisées sur des tissus fixés ou congelés par hybridation in situ, mesurent la quantité
218
d’ARNm à une heure donnée mais ne fournissent pas d’images dynamiques de l’évolution de
ces ARNm. Les avancées des techniques portant sur des gènes et protéines rapporteurs type
luciférase nous fournissent pourtant un outil permettant d’enregistrer de manière continue la
présence d’ARN ou de protéines. Des souris génétiquement modifiées peuvent effectivement
exprimer soit la luciférase sous contrôle du promoteur de l’ARNm d’intérêt, rendant compte
du rythme de production d’un ARNm, soit une protéine de fusion « protéine d’intérêt /
luciférase », rendant compte de la présence de la protéine elle même. Dans le cadre de
l’identification de l’horloge alimentaire, la protéine d’intérêt que nous rechercherons sera la
protéine PER2, en tant que protéine de fusion dans un système PER2-Luciférase.
Des souris PER2-Luciférase seront entraînées dans un premier temps de manière stable à une
restriction alimentaire, ce qui peut être contrôlé par actimétrie. Les cerveaux seront prélevés et
des tranches mises en culture pour observation de l’expression de PER2 dans différentes
structures centrales, en comparaison avec des souris nourries ad libitum. Ces enregistrements
peuvent habituellement être poursuivis durant plusieurs cycles. Nous espérons que les
structures impliquées de manière critique dans la synchronisation alimentaire seront
grandement affectées par la restriction, alors que d’autres, moins critiques ou indépendantes
du phénomène ne seront pas affectées. Egalement, il est possible d’avoir une vue d’ensemble
du système grâce à cette technique et il est probable que la ou les structures constituant
l’horloge alimentaire expriment PER2 ensembles, puis transmettent des oscillations à d’autres
structures où PER2 sera exprimé plus tard, permettant de hiérarchiser les structures entre
elles. Si certaines structures du réseau n’expriment pas PER2 mais PER1, une expérience
similaire chez des PER1-Luciférase est envisageable, en association avec la première. Des
combinaisons d’expériences chez des souris Per2 mutantes / PER1 luciférase sont
envisageables afin d’affiner ce type d’études.
Des études dans un état dynamique de synchronisation, par exemple en préparant des tranches
de cerveaux à différents temps après le début du protocole de restriction pourrait également
apporter des informations nouvelles sur le déroulement de la synchronisation alimentaire
centrale, en indiquant par exemple que certaines structures réagissent plus tôt que d’autres à
cette restriction.
Cette approche, bien que lourde à mettre en place, s’appuie sur des techniques récentes et
permettra probablement d’observer en temps réel l’oscillation des structures centrales et
d’établir une hiérarchie dans ces réseaux de structures oscillantes.
219
220
CHAPITRE 6
RÉFÉRENCES
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CHAPITRE 7
ANNEXES
238
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Journal of Physiology - Paris 100 (2006) 252–260
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‘‘Feeding time’’ for the brain: A matter of clocks
Céline A. Feillet a, Urs Albrecht b, Etienne Challet
a
a,*
Department of Neurobiology of Rhythms, Institute of Cellular and Integrative Neurosciences, University Louis Pasteur and CNRS,
67084 Strasbourg, France
b
Department of Medicine, Division of Biochemistry, University of Fribourg, 1700 Fribourg, Switzerland
Abstract
Circadian clocks are autonomous time-keeping mechanisms that allow living organisms to predict and adapt to environmental
rhythms of light, temperature and food availability. At the molecular level, circadian clocks use clock and clock-controlled genes to generate rhythmicity and distribute temporal signals. In mammals, synchronization of the master circadian clock located in the suprachiasmatic nuclei of the hypothalamus is accomplished mainly by light stimuli. Meal time, that can be experimentally modulated by temporal
restricted feeding, is a potent synchronizer for peripheral oscillators with no clear synchronizing influence on the suprachiasmatic clock.
Furthermore, food-restricted animals are able to predict meal time, as revealed by anticipatory bouts of locomotor activity, body
temperature and plasma corticosterone. These food anticipatory rhythms have long been thought to be under the control of a food-entrainable clock (FEC). Analysis of clock mutant mice has highlighted the relevance of some, but not all of the clock genes for foodentrainable clockwork. Mutations of Clock or Per1 do not impair expression of food anticipatory components, suggesting that these
clock genes are not essential for food-entrainable oscillations. By contrast, mice mutant for Npas2 or deficient for Cry1 and Cry2 show
more or less altered responses to restricted feeding conditions. Moreover, a lack of food anticipation is specifically associated with a
mutation of Per2, demonstrating the critical involvement of this gene in the anticipation of meal time. The actual location of the
FEC is not yet clearly defined. Nevertheless, current knowledge of the putative brain regions involved in food-entrainable oscillations
is discussed. We also describe several neurochemical pathways, including orexinergic and noradrenergic, likely to participate in conveying inputs to and outputs from the FEC to control anticipatory processes.
Ó 2007 Elsevier Ltd. All rights reserved.
Keywords: Circadian rhythms; Clock gene; Food synchronisation
1. Introduction
As a consequence of the earth’s rotation around the sun
and around its axis, all living organisms experience cyclic
variations of their environment. Circadian clocks are a
way of adapting by anticipating these changes. In mammals, the suprachiasmatic nucleus of the hypothalamus
(SCN) is the master clock, as demonstrated both by lesion
and transplantation studies (Ralph et al., 1990). The SCN
is able to elaborate and distribute rhythmic messages of
about 24 h to the entire organism (van Esseveldt et al.,
2000). These rhythmic signals have been demonstrated to
*
Corresponding author. Tel.: +33 3 88 45 66 93; fax: +33 3 88 45 66 54.
E-mail address: [email protected] (E. Challet).
0928-4257/$ - see front matter Ó 2007 Elsevier Ltd. All rights reserved.
doi:10.1016/j.jphysparis.2007.05.002
originate in transcriptional/translational feedback loops
involving a set of clock genes (Ko and Takahashi, 2006).
Among all cues able to synchronise the SCN to exactly
24 h, the light/dark cycle is the most powerful (photic
cues). Nevertheless, the SCN clockwork and its photic
responses can be modulated by nutritional cues (Castillo
et al., 2004; Challet et al., 2003; Lamont et al., 2005; Mendoza et al., 2005b). Moreover, restricted feeding schedules
(Mendoza, 2007; Waddington-Lamont et al., 2007) and
other non-photic cues, like methamphetamine administration (Iijima et al., 2002), have also been shown to influence
behaviour and physiology outside the SCN. Thus, even if
the SCN is undoubtedly the master circadian clock, other
brain regions and many other cells around the body express
clock genes and are capable of sustained clock gene
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C.A. Feillet et al. / Journal of Physiology - Paris 100 (2006) 252–260
oscillations (Welsh et al., 2004; Yoo et al., 2004; Nagoshi
et al., 2005). Does this generalized clock gene expression
suggest a network of local oscillators commanded by the
master SCN, or does it reveal the existence of new central
clocks? Considering recent data, we would favour the second possibility.
2. Existence of another clock: the food entrainable clock
(FEC)
2.1. The first hints for the existence of the FEC
In 1979, F.K. Stephan and colleagues demonstrated that
in rats made arrhythmic by bilateral lesion of the SCN, a
circadian bout of locomotor activity can be restored when
the animals are submitted to a restricted feeding schedule,
i.e. an access to food limited to a certain duration, delivered every day at the same time point. In these conditions,
the animals start to run in the hours prior to food access,
thus restoring circadian locomotor activity (the so-called
the Food Anticipatory Activity: FAA; Stephan et al.,
1979). This phenomenon is not limited to activity but is
also observed in core body temperature, which rises in
the hours preceding food access (Food Anticipatory Thermogenesis), and in plasma corticosterone, which peaks during Food Anticipatory Corticosterone (Mistlberger, 1994).
Interestingly, the FAA can be entrained only if food is presented within the circadian range (between 22.5 and 29 h;
Stephan and Becker, 1989). Moreover, when food access
is shifted, the FAA is progressively shifted to the new feeding time (Stephan, 2002). In addition, it has been established that the FAA is also expressed in animals with an
intact SCN housed in constant darkness (DD, e.g. Mistlberger, 1994), or in LD when food is presented during
the inactive phase (Castillo et al., 2004; Mendoza et al.,
2005b).
All of these clues seem to indicate the existence of
another clock, distinct from the SCN and entrained by
food: the Food Entrainable Clock (FEC). This clock would
have multiple outputs, among which one finds activity
(FAA), temperature and corticosterone. Under ad libitum
feeding conditions, these outputs would be phase locked
to the SCN clock. Under restricted feeding conditions,
daily patterns of activity, temperature and plasma corticosterone would result from the influence of both clocks.
2.2. How and where is the FEC ticking?
2.2.1. Functioning of the SCN
It appears that clock mechanisms share common
features in all organisms investigated from cyanobacteria
to mammals (Wijnen and Young, 2006). They all rely on
transcriptional/translational feedback loops involving the
so-called ‘‘clock genes’’. In the past few years, we have
learned more and more about the SCN clockwork, and
all cellular clocks in mammals seem to work in roughly
the same way.
253
It is now known that circadian oscillations rely on two
positive and negative feedback loops. In the main positive
loop, two genes Clock and Bmal1 (members of the bHLHPAS family) are transcribed and translated into proteins
that dimerize and activate the transcription of Period
(Per) 1-2-3, Cryptochrome (Cry) 1-2, Rev-erba, rora genes
via E-Box sequences in their promotors (Albrecht and Eichele, 2003; Okamura et al., 2002; Shearman et al., 2000).
PER-CRY heterodimers inhibit their own transcription
by interacting with the BMAL1/CLOCK dimers (main
negative loop) while REV-ERBa directly inhibits Bmal1
transcription (secondary negative feedback loop, Preitner
et al., 2002). RORa acts in the opposite way (secondary
positive feedback loop, Akashi and Takumi, 2005; Sato
et al., 2004). The CLOCK/BMAL1 dimer is also able to
activate the transcription of ‘‘clock-controlled genes’’
(CCG) by interacting with E-Boxes in their promoters.
CCG then deliver a rhythmic output to control physiology
and behaviour. Among those CCGs, vasopressin and albumin D-site binding protein (DBP) are often taken as phase
reference of the SCN (Ko and Takahashi, 2006).
2.2.2. Does FEC function rely on the same genes?
The mutant approach
To assess whether the FEC clockwork relies on the same
genes as the SCN, mutant mice for diverse clock genes have
been challenged with restricted feeding schedules, hypothesizing that FAA should be expressed if the mutation does
not affect FEC functioning; conversely, mutation of a gene
that is critical for the FEC should impair FAA expression.
The first gene to be tested in this respect was a member
of the positive feedback loop, the Clock gene (Pitts et al.,
2003). Under regular LD conditions and ad libitum feeding, Clock mutants exhibit normal entrainment, but in
constant darkness their free running period is lengthened
drastically compared to wild-type mice and they become
mostly arrhythmic (Vitaterna et al., 1994); note that a single nucleotide transversion in a splice donor site, causing a
deletion in the transactivation domain of the CLOCK
protein is responsible for this phenotype (King et al.,
1997). Given that CLOCK is important for time-keeping
in the SCN, it was expected to be involved in food synchronisation. When submitted to a daily 4 h food access
in LD and in DD conditions, Clk/Clk mutant mice exhibit
FAA, even when their circadian wheel-running behaviour
is arrhythmic in DD conditions (Pitts et al., 2003). Apparently, the Clock gene is not a part of the FEC clockwork.
It is noteworthy that Clock KO mice have been recently
generated (Debruyne et al., 2006). Unlike the Clock
mutant mice, the KO mice remain rhythmic in DD and
free-run with a period similar to WT mice. This result
raises the possibility that the Clock gene would not be
as essential as postulated based on the Clock mutant mice
phenotype. This finding also questions the results found
for the FEC functioning. Until that question is addressed,
we would state that the Clock gene is not essential for the
FEC clockwork.
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In 2001, another clock gene was identified as an analogue of Clock:Npas2 (Reick et al., 2001). It dimerizes with
BMALL and is expressed throughout the forebrain. It was
suggested to replace CLOCK in its functions outside the
SCN. To investigate the possible role of NPAS2 in behavioural manifestations of circadian rhythm, Dudley and colleagues studied locomotor activity and sleep patterns under
restricted feeding conditions in Npas2-deficient mice (Dudley et al., 2003). When fed ad libitum, locomotor activity in
Npas2 / mice is unaffected. In DD, they are perfectly
rhythmic with a period slightly shorter than their wild type
littermates. Even if their pattern of activity is somewhat
different from that of wild-type mice, considering that
NPAS2 appears not to be expressed in the SCN, no major
alteration in circadian behaviour was to be expected. Furthermore Npas2 / mice were placed under restricted
feeding schedules to measure FAA: the results indicate that
even if FAA does not disappear in these KO mice, its
expression is delayed, indicating that NPAS2 plays a role
in adaptability to food restriction. So there may be a slight
modification of the molecular feedback loops in the FEC
compared to the SCN, including a replacement of CLOCK
by its analogue NPAS2.
As mentioned above, the Cry genes are essential components of the SCN clockwork, belonging to the main negative feedback loop. The involvement of Cry genes has
been tested in food anticipatory behaviours (Iijima et al.,
2005). If Cry1 or Cry2 single mutant mice do not show
major defects in circadian behaviour, Cry1/Cry2 double
mutants become arrhythmic upon transfer to DD when
fed ad libitum. Their persistent rhythmicity in LD has been
interpreted as a masking effect by light (Van der Horst
et al., 1999; Vitaterna et al., 1999). Compared to wildtype littermates, food-restricted Cry1 / /Cry2 / mice
expressed a FAA that was less stable and with delayed
onset (Iijima et al., 2005). So it seems that the Cry genes
are not essential for synchronisation to feeding schedules,
but rather affect the stability and development of the
FAA, being a part of the FEC.
All these studies pointed to modest alterations in the
FAA rather than drastic suppression of the FEC output.
It is possible that the outputs chosen did not reflect actual
defects in the FEC, and that other outputs like corticosterone may have given clear-cut results.
The Per1 gene, originally cloned by homology to dPer in
Drosophila (Tei et al., 1997), and the Per2 gene (an homologue of Per1) have been demonstrated to be critical for
normal synchronisation of the SCN to light (Albrecht
et al., 1997, 2001; Shigeyoshi et al., 1997; Spoelstra et al.,
2004). With regard to their role in the SCN clock, it seems
that not all Per genes are equal: normal under LD conditions, Per1 KO mice are still rhythmic in DD (Cermakian
et al., 2001; Zheng et al., 2001) (although another line of
Per1 mutant mice become arrhythmic in similar constant
conditions: Bae et al., 2001). Two lines of Per2 mutant mice
become arrhythmic after a few days in DD (Bae et al.,
2001; Zheng et al., 1999). Being critical for SCN synchroni-
sation to light, it was possible that Per genes would also be
responsive to other kinds of synchronizers, e.g. food. We
challenged both Per1 and Per2 mutant mice with restricted
feeding in LD and showed that there is no significant alteration in FAA expression in Per1 mutant mice (Feillet et al.,
2006). Interestingly, Per2 mutant mice failed to show any
anticipation of meal time as assessed by wheel running
and general cage activity, whether in LD, DD or LL conditions for three weeks under a temporal restricted feeding
schedule, or if only a daily hypocaloric diet is given. In this
latter case, mice are provided 66% of their normocaloric
intake, given daily at a fixed time point, measured as the
average daily intake over 2 weeks of ad libitum feeding.
This protocol is known to exert a very powerful effect on
the SCN clock whereas restricted feeding alone does not
(Mendoza et al., 2005b). Moreover, mice lose about 20%
of their initial weight under hypocaloric feeding, as
opposed to traditional restricted feeding, where mice usually maintain their weight. Added to the lack of anticipation of meal time in wheel running and general cage
activity, the anticipatory bout of temperature rise was also
absent in food-restricted Per2 mutant mice, reinforcing the
hypothesis that they demonstrate major impairment of the
FEC, as shown by the alteration of two of its outputs (Feillet et al., 2006). These results therefore suggest a critical
role of Per2 but not Per1 in the molecular regulation of
the FEC. Even if not all the clock gene mutants have been
challenged with limited access to food, we can nonetheless
propose a putative model for the FEC clock, mirroring to
some extent that of the SCN (Fig. 1). Afferent and efferent
pathways, sensors to and effectors of the FEC have nonetheless yet to be clearly identified, as well as its exact
location.
2.3. Location of the FEC
Many hypotheses have been raised concerning the anatomical substrate of the FEC, whether it be a single central
structure, a single peripheral organ, or a multi-oscillator
system within the central nervous system. Because many
peripheral organs such as intestine, kidney or liver express
clock genes and can be entrained by restricted feeding
schedules (Damiola et al., 2000; Hara et al., 2001; Stokkan
et al., 2001), it has been proposed that they might actually
be a part of the food-entrainable clock, or constitute the
FEC itself.
Experiments on rats made cirrhotic by CCl4 injection
show that the FAA is not abolished in these animals, even
though hepatic function is severely altered (Escobar et al.,
2002). In addition, in food-restricted Per1 luciferase rats,
FAA does not arise as an output of rhythms in the gastrointestinal system, suggesting that the FEC does not reside
in the liver or in other peripheral tissues of the digestive
system (Davidson et al., 2003). These organs probably contain outputs of the FEC, or even sensors which indicate the
metabolic state of the body to the brain, but the FEC may
arise as a central structure or network of structures, that
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Fig. 1. Putative clockwork of the Food-entrainable Clock (FEC). This scheme represents genes possibly implicated in FEC functioning. So far Npas2, Cry
and Per2 have been clearly demonstrated to participate in this mechanism. Therefore their proteins and connected arrows are in plain colours. Other genes
and proteins shown here, the roles of which are inferred from known mechanisms occurring in the SCN, are represented with hatched colours and dashed
arrows. Their involvement in the FEC clock is still speculative and remains to be demonstrated.
receives and integrates information from the periphery, and
in turn generates a new temporal message that is distributed to all peripheral organs. It is noteworthy that neither
Per1 nor Per2 appear to be critically involved in the synchronisation of peripheral organs to meal time (Feillet
et al., 2006).
Numerous experiments have been performed to locate
this new clock. Speculating it to exist as a single structure
in the central nervous system, lesions of the hippocampus
(Mistlberger and Mumby, 1992), the neocortex (Mistlberger, 1994), the ventromedial nucleus of the hypothalamus
(Mistlberger and Rechtschaffen, 1984), the lateral area and
paraventricular nucleus of the hypothalamus (Mistlberger
and Rusak, 1988), the arcuate nucleus of the hypothalamus (Mistlberger and Antle, 1999), the area postrema
(Davidson et al., 2001a), and the olfactory bulbs (Davidson et al., 2001), have had little if any influence on FAA
expression. Interestingly, while complete ablation of the
nucleus accumbens does not impair FAA (Mistlberger
and Mumby, 1992), specific damage of the core but not
the shell reduces the expression of FAA (Mendoza
et al., 2005a).
Lesions of the parabrachial nucleus alter both FAA and
food anticipatory thermogenesis, but the authors concluded that this structure is a relay for information to or
from the FEC rather than constituting the FEC itself
(Davidson et al., 2000). Another publication showed a dissociation between FAA and food anticipatory thermogenesis in SCN-lesioned and hypophysectomised rats: the
anticipatory rise in temperature was no longer expressed
under restricted feeding conditions, whereas FAA was still
present. Although this study did not unravel the location of
the FEC, it demonstrated the possibility to distinguish different outputs of a same clock (Davidson and Stephan,
1999). This kind of dissociation between food anticipatory
variables has also been noted after chemical lesions of the
infralimbic cortex, that impair specifically food entrainable
thermogenesis, but not FAA (Recabarren et al., 2005).
Lesions of the dorsomedial hypothalamus (DMH) have
been shown recently to markedly impair FAA expression
(Gooley et al., 2006). In addition, it was demonstrated that
Per1 expression becomes rhythmic in this structure only
under restricted feeding (Mieda et al., 2006). In spite
of the fact that the DMH may participate in the FEC,
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chemical lesions of the DMH also clearly diminish baseline
activity (Gooley et al., 2006). Moreover, another recent
study showed that FAA persists after electrolytic lesion
of the DMH (Landry et al., 2006). Transplantation studies
as well as rescue of function will provide more definitive
arguments to delineate the actual role of the DMH with
respect to food synchronisation.
In light of the contradictory data obtained when lesioning a single central structure, an increasing number of studies suggest that the FEC may result from the combined
activity of a network of structures with partially redundant
function. This hypothesis was exemplified in studies that
measured sustained c-FOS expression in anticipation of
meal time in hypothalamic regions like the lateral hypothalamus, perifornical area and DMH, that persisted when
food was not provided at the expected time (Angeles-Castellanos et al., 2004). In food entrained rats, c-FOS immunoreactivity was also observed in anticipation to and after
meal time in nucleus accumbens, basolateral and central
amygdala, in the bed nucleus of the stria terminalis, lateral
septum, prefrontal cortex and paraventricular nucleus of
the thalamus, but not in the hippocampus (AngelesCastellanos et al., 2007). This study thus shows the possible involvement of cortico-limbic structures in food
synchronisation.
The brainstem receives all the information from the gastrointestinal system. Considering the importance of communication between peripheral organs and central
structures, it was of interest to characterize the response
of the brain stem to food restriction. It was demonstrated
that the expression of c-FOS immunoreactivity was
increased after meal time in a number of brainstem nuclei.
These increases were no longer detectable if food was not
presented at the expected time (Angeles-Castellanos et al.,
2005). This work reveals the probable involvement of
brainstem structures in conveying food ingestion information to the brain, but not directly in FEC functioning.
Another approach in searching for a network underlying the FEC came from the study of modifications of local
cerebral metabolic rate for glucose in response to food
restriction at the time of FAA. Glucose utilization was
assessed by the 2-deoxyglucose technique in various brain
areas in food-restricted rats compared to animals fed
ad libitum. It was hypothesized that structures undergoing
major changes in their glucose consumption in response to
food restriction would play a role in the network underlying the FEC, or at least in FAA expression. The data
showed specifically diminished glucose consumption in
the intergeniculate leaflets, the paraventricular hypothalamic and thalamic nuclei, the medial preoptic area, the
arcuate nucleus, the nucleus of the solitary tract, and the
cerebellar cortex in food-restricted rats compared with control animals (Pereira de Vasconcelos et al., 2006). Taken
together, these studies show the complexity of food
entrainment and support the hypothesis that the FEC
may not reside in a single brain structure. If it is actually
a network of structures, it would explain why single lesion
studies failed to localise the site hosting the FEC. Unfortunately, neither c-FOS immunoreactivity nor local glucose
utilization address a possible hierarchy in these structures:
is there among them a conductor giving tempo to the others, or do they all participate in food-entrained rhythms?
This question is still open, and genesis of food-entrainable
oscillations will have to be addressed in the coming years.
2.4. Neurochemical pathways involved in the expression of
FAA
2.4.1. Glutamatergic, histaminergic and opioidergic
pathways
Among the neurochemical systems involved in FAA is
the glutamatergic network. Blockade of NMDA receptors
reduces the expression of FAA in a dose-dependent manner (Ono et al., 1996). However, this interesting result does
not provide specific clues to locate structures involved
directly in the FEC because NMDA receptors are so widely
expressed in the central nervous system.
Brain histamine is considered to participate in the regulation of feeding behavior. Of interest, histaminergic neurons of the tuberomammillary nucleus have been shown
to be activated during FAA (Meynard et al., 2005). Further
studies will be helpful to determine whether hypothalamic
histaminergic neurons are situated on the afferent or efferent pathways of the FEC network.
The mesolimbic opioid-dopamine system plays a key
role in motivated behaviours. Mu-opioid receptor KO mice
challenged by restricted feeding display reduced FAA compared to WT, while their dopaminergic system remains
unaffected (Kas et al., 2004). These findings therefore indicate that the opioidergic system plays a role in the regulation of FAA.
2.4.2. The orexinergic pathway, an efferent of the FEC
promoting FAA
The orexinergic system has also been considered with
respect to food anticipation. Orexins (hypocretins) A and
B are neuropeptides whose receptors (orexin-1 and
orexin-2, receptors) are found mainly in the forebrain, in
hypothalamic, thalamic and brainstem nuclei and in spinal
cord. Orexinergic neurons are located only in the lateral/
perifornical hypothalamic area. They promote locomotor
activity, food intake and motivated behaviours, and coordinate sleep/wake patterns. Mice lacking either the orexin
gene or orexinergic neurons show phenotypes similar to
human narcolepsy. Moreover, central administration of
orexin triggers feeding behavior (Mignot et al., 2002). Considering the importance of orexins in the coordination of
wakefulness and motivated behaviours like food seeking,
Akiyama and colleagues tested activation of orexin neurons (c-FOS immunoreactivity) under RF, and FAA in
wild type and orexinergic neuron-ablated mice. Orexinergic
neuronal activation is advanced by 6 h in wild type mice
in response to daytime RF. Interestingly, FAA is reduced
in orexinergic neuron-ablated mice under the same
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conditions. It seems that orexinergic neurons would not
generate FAA per se, but they would participate in the
wakefulness component of FAA (Akiyama et al., 2004).
These results were confirmed by another group that studied
the involvement of orexin in the establishment and maintenance of FAA induced by restricted feeding (Mieda et al.,
2004). Interestingly, activity of orexinergic neurons markedly increases during food anticipation under restricted
feeding in wild-type mice (Mieda et al., 2004). Taken
together, these studies would suggest that orexin neurons
may convey an efferent signal from the FEC, thus increasing wakefulness, and promoting and maintaining FAA in
the hours prior to food.
In natural conditions, these neurons may be essential for
the animals to express a seeking behaviour in response to a
reduction in food availability. However, they would not be
the site of the FEC, because neither electrolytic lesions of
the lateral hypothalamic area (Mistlberger and Rusak,
1988), nor targeted ablation of orexinergic neurons (Mistlberger et al., 2003) abolish FAA. It is also possible that
orexinergic neurons specifically control locomotor output
of the FEC. Considering that no data exists on temperature
and corticosterone secretion, these two outputs of the FEC
SENSORS
Locus coeruleus/
Noradrenergic
pathways
Orexinergic neurons
(Lateral hypothalamus)
Locomotor
activity (FAA)
257
may be expressed normally in such mutants. That question
remains to be addressed.
2.4.3. Noradrenergic projections as possible routes from or to
the FEC
Ear2 (Nr2f6), COUP-TFI and COUP-TFII are members of a subfamily of orphan receptors involved in the formation of midbrain dopaminergic neurons. Ear2 can
homo- or hetero-dimerize with COUP-TFI and COUPTFII (Avram et al., 1999) and bind to enhancers in the
sequence of various genes. Ear2 / mice lack the major
part of the locus coeruleus, which provides the majority
of noradrenergic transmission in mammals (Warnecke
et al., 2005) and contacts a great number of brain structures, particularly in the forebrain. Starting with the observation that Per gene expression is dampened in the frontal
cortex of Ear2 / mice, it was hypothesized that these
mice have a defective circadian timing system in the forebrain. When Ear2 / mice are challenged with restricted
feeding, FAA is significantly reduced, concomitant with a
drastic reduction of noradrenaline concentration in the
frontal cortex (Warnecke et al., 2005). Though the reduction of FAA is obvious in this experiment, noradrenalin
Peripheral organs
(sensing metabolic
parameters)
Food
Entrainable
Clock
Brain structures /
relays to the outputs
(DMH)
Corticosterone
secretion (FAC)
Parabrachial
nucleus
Hypophysis
Infralimbic cortex
(FAT)
Temperature
(FAT)
OUTPUTS
Fig. 2. A model for the Food-entrainable Clock (FEC). This scheme represents the possible network underlying mechanisms related to food
synchronisation. Plain open arrows represent demonstrated mechanisms. Plain-line and dashed-line arrows represent probable and more hypothetical
pathways, respectively. A central FEC receives information from peripheral organs such as the liver, stomach or intestine. Possible relays (locus coeruleus,
parabrachial nucleus) are also connected to the periphery and may deliver redundant messages to the FEC. They can also serve as relay outputs from the
FEC. Outputs originating from the FEC are distributed to brain structures that in turn control behavioural and physiological anticipatory outputs. DMH:
dorsomedial hypothalamic nuclei, FAA: food anticipatory activity, FAC: food anticipatory corticosterone secretion, FAT: food anticipatory
thermogenesis.
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may not be the unique transmitter: neurons in the locus
coeruleus also express neuropeptides such as vasopressin,
galanin and neuropeptide Y, which may be responsible
for the observed reduction in frontal cortex rhythmicity
and indirectly related to reduced FAA. Moreover no
expression of known clock genes could be detected in the
locus coeruleus (Warnecke et al., 2005), which would indicate that this structure does not harbour its own clock but
constitutes a relay conveying information to the forebrain,
possibly from or to the FEC. If this were the case, functional impairment of the locus coeruleus could lead to only
partial delivery of inputs to the FEC or incomplete output
signals to its effectors, thus resulting in reduction of FAA.
2.5. A possible model for the FEC network
Although the increasing number of studies on the FEC
adds complexity to the scheme, they provide new information that allows us to propose a model for the FEC network (Fig. 2).
3. Conclusion
After 30 years of research on the FEC, only the physiological and behavioural outputs of this clock seem to be
clearly defined, such as locomotor activity, temperature
and corticosterone. As for the FEC itself, it remains a mystery: its exact location, afferent and efferent pathways are
still not fully defined. Nevertheless, it seems that the
DMH represents a good candidate to be involved in this
mechanism, and will certainly be targeted in future work.
Orexinergic neurons could provide an output pathway from
the FEC, and noradrenergic connexions are probably a part
of the FEC network. Recently, much effort has been made
to unravel the clockwork that governs the FEC oscillations:
especially Per2, and to a less critical extent Npas2 and Cry
genes, have been implicated in the FEC machinery. Other
molecular actors known for their involvement in the SCN
have yet to be tested regarding the FEC question.
We should keep in mind that discovering the in and outs
of the FEC will open doors for the treatment of feeding
rhythm disorders, such as those experienced by shift workers or patients suffering from night-eating syndrome. Their
erratic feeding rhythms often lead to obesity, digestive and
cardiovascular problems. Hopefully, appropriate synchronisation of feeding rhythms in these patients will alleviate
those symptoms.
Acknowledgements
We thank Dr. David Hicks and Dr. Jorge Mendoza for
helpful discussions and comments. Part of our work described in this account has been supported by Swiss-French
Funds ‘‘Programme d’actions intégrées Germaine de
Staël’’.
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Résumé
Les noyaux suprachiasmatiques de l’hypothalamus (SCN) sont le siège de l’horloge
circadienne principale chez les Mammifères. Ils sont essentiellement synchronisés par les
informations d’alternance du jour et de la nuit. Une autre horloge circadienne, l’horloge
alimentaire (FEC), dont le substrat anatomique reste inconnu, est quant à elle synchronisée
par la disponibilité alimentaire. Mon travail de thèse a consisté en la caractérisation des
mécanismes de synchronisation des horloges circadiennes et des oscillateurs centraux et
périphériques par les informations alimentaires.
Mon premier axe de recherche portait sur la compréhension des mécanismes d’interprétation
des différents messages lumineux, humoraux (mélatonine) et alimentaires par les SCN : nous
avons ainsi déterminé qu’une restriction calorique de la disponibilité alimentaire est
interprétée par le système circadien comme un accès à la nourriture diurne chez le rat, animal
habituellement nocturne.
Mon second axe de recherche visait à préciser le substrat anatomique sous-tendant la
synchronisation alimentaire : nous avons recherché dans quelles structures centrales la
consommation locale de glucose était modifiée en réponse à une restriction alimentaire (RF)
temporelle ou calorique, grâce à la technique du 2-Désoxyglucose. Cette approche originale
nous a permis de proposer de nouvelles pistes de recherche quant à la localisation de l’horloge
alimentaire, notamment dans les régions thalamiques et hypothalamiques.
Nous avons ensuite cherché à comprendre quelle était l’importance des différentes sorties de
la FEC (activité locomotrice, sécrétion de corticostérone) les unes par rapport aux autres : de
manière inattendue, notre étude sur des animaux SCN lésés et soumis à une RF a révélé que la
sécrétion rythmique de mélatonine par la glande pinéale, sortie jusque là exclusive des SCN,
pouvait être contrôlée par l’horloge alimentaire. Ce contrôle est corticostérone-indépendant,
mais une augmentation de l’activité locomotrice dans les heures précédant l’accès à la
nourriture (FAA) semble nécessaire. De plus, le processus de genèse et de maintien de la FAA
est également corticostérone-indépendant.
S’il est connu que le fonctionnement rythmique des SCN repose sur un ensemble de gènes
horloges (Per1-2-3, Cry1-2, Bmal1, Clock, Rev-erb, Ror), la machinerie moléculaire soustendant le fonctionnement de l’horloge alimentaire était mal définie. Nous avons étudié la
synchronisation alimentaire chez des souris mutantes pour les gènes Per1 et Per2 : l’activité
anticipatoire et le pic anticipatoire de thermogénèse observés chez les souris sauvages dans les
heures qui précèdent l’accès à la nourriture, sont absents chez les souris mutantes Per2. Par
contre, la synchronisation des tissus périphériques est normale chez ces animaux. De plus les
paramètres d’activité sont normaux chez des souris mutantes pour le gène Per1 soumises à
une RF. Per2 est donc un acteur majeur de la synchronisation alimentaire au niveau central et
probablement de la machinerie moléculaire sous-tendant le fonctionnement de la FEC.
Considérant l’importance de Per2 pour la synchronisation alimentaire, nous avons recherché
l’expression des protéines PER1 et PER2 dans le système nerveux central, ainsi que leur
réponse à une RF. Ces protéines ne sont ni exprimées de manière homogène, ni ne réagissent
de manière identique à une RF : l’expression de PER1 est augmentée et celle de PER2 est
décalée. De plus, toutes les structures centrales ne sont pas affectées par une RF. Enfin une
structure exprimant PER1 et/ou PER2 présente des altérations des oscillations moléculaires
(expression de Cry1) dans les différentes conditions alimentaires, chez des souris mutantes
pour Per1 ou Per2 respectivement. Ce travail révèle des oscillateurs centraux fonctionnant
avec des acteurs moléculaires différents.
L’ensemble de ces travaux a apporté de nouveaux éléments pour comprendre les mécanismes
de la synchronisation alimentaire et ouvrent sur de nombreuses perspectives dans ce domaine.