tipizzazione e caratterizzazione di varietà precoci di patata con l

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VOLUME 24 - SUPPL 1 to No. 1 - MARCH 2012
TIPIZZAZIONE E CARATTERIZZAZIONE DI VARIETÀ PRECOCI
DI PATATA CON L’IMPIEGO DI TECNICHE MOLECOLARI
E SPETTROSCOPICHE
MINERVA BIOTECNOLOGICA
Vol. 24
Marzo 2012
Suppl. 1 al Numero 1
TIPIZZAZIONE E CARATTERIZZAZIONE
DI VARIETÀ PRECOCI DI PATATA
CON L’IMPIEGO DI TECNICHE
MOLECOLARI E SPETTROSCOPICHE
INDICE
1
Presentazione
Carputo D.
3
ARTICOLI ORIGINALI
Utilizzazione di marcatori molecolari SSR e AFLP per l’identificazione varietale in patata
Villano C., Aversano R., Frusciante L., Garramone R., Iorizzo M., Carputo D.
11
Strumenti di genomica funzionale per la tipizzazione dell’origine di coltivazione della patata
Onofri C., Pacifico D., Ostano P., Mello-Grand M., Ghimenti C., Parisi B., Mandolino G.
23
Progettazione e sintesi di DNA ricombinante come standard per la determinazione quantitativa di ingredienti
geneticamente modificati in alimenti
Cirillo A., Del Gaudio S., Di Bernardo G., Gaglione F., Galderisi U., Cipollaro M.
35
La proteomica quale strumento di tipizzazione di cultivar precoci di patata
Scelza R., Russo F., Gianfreda L., Rao M. A.
Vol. 24 - Suppl. 1 al N. 1
VII
INDICE
43
Studio dei metaboliti secondari di varietà precoci di Solanum tuberosum
Lepore L., Pesca M., De Tommasi N., Carputo D., Dal Piaz F.
51
Definizione di una firma “geochimico-mineralogica” dei suoli destinati alla produzione della patata precoce
Vingiani S., Zampella M., Minieri L., Terribile F., Adamo P.
61
Indagine sullo stato fitosanitario delle produzioni di varietà precoci di patata da consumo
Sigillo L., Serratore G., Spina V., Senape V., Bravi R.
71
Costi e benefici di un programma di tracciabilità per la filiera della patata precoce italiana
Lombardi P., Caracciolo F., Cicia G., Cembalo L., Colantuoni F., D’amico M., Del Giudice T., Maraglino T., Menna C., Panico T.,
Sannino G., Tosco D.
VIII
Marzo 2012
MINERVA BIOTEC 2012;24(Suppl. 1 al N. 1):1
Presentazione
D. CARPUTO
Dipartimento di Scienze del Suolo, della Pianta, dell’Ambiente e delle Produzioni Animali
Università degli Studi di Napoli Federico II, Napoli, Italia
L
a tipicizzazione delle produzioni ha assunto oramai il ruolo di fattore produttivo vero e proprio, in
quanto strumento per prevenire le frodi, garantire la sicurezza e valorizzare le produzioni. Essa consente di guidare il consumatore nelle scelte, di fornire un riferimento preciso sulla provenienza e/o sulla
composizione di ciò che è acquistato, di effettuare azioni di prevenzione di tipo sanitario, di conoscere i movimenti commerciali e di avere riferimenti precisi sull’origine dei prodotti movimentati. Con il regolamento
178/2002, l’Unione Europea ha stabilito in maniera chiara i principi e i requisiti generali della legislazione
alimentare e ha altresì definito i concetti di tracciabilità e rintracciabilità. In coerenza con le politiche
europee e nazionali, nel 2007 il MiPAAF ha finanziato il Progetto speciale triennale “Tipicizzazione e
caratterizzazione di varietà precoci di patata con l’impiego di tecniche molecolari e spettroscopiche” (TIPIPAPA). L’interesse delle istituzioni nazionali nei confronti della patata, e in particolare di quella precoceextrastagionale a ciclo vernino-primaverile, deriva dalla necessità di valorizzare e proteggere questo tipo di
produzione, che può essere molto remunerativo.
Questo supplemento di Minerva Biotecnologica propone una sintesi dei risultati più significativi ottenuti
dagli otto gruppi di ricerca che, con un approccio multidisciplinare, hanno operato nell’ambito del Progetto
TIPIPAPA. Per il raggiungimento dei suoi obiettivi il progetto si è avvalso di metodologie molecolari, proteomiche, chimiche e biochimiche avanzate che hanno consentito non solo la messa a punto di un sistema
di tracciabilità integrato, affidabile e sicuro, ma anche la determinazione di importanti aspetti qualitativi
legati alla produzione pataticola. Il progetto ha previsto anche lo screening dello stato fitopatologico degli
areali di coltivazione tipici delle tre regioni nonché lo studio economico dei costi-benefici di un sistema di
tracciabilità nella filiera della patata extra-stagionale. Nel suo insieme questa raccolta di contributi costituisce un utile riferimento per tutti coloro che, da differenti punti di vista (ricerca sperimentale, commercializzazione, prevenzione frodi, etc.), operano nel settore. Dai risultati emerge fortemente l’opportunità di
approfondire in futuro i metodi di tracciabilità proposti allargandone l’impiego anche ad altre colture. Le
strategie e gli approcci utilizzati nelle ricerche qui presentate potranno infatti essere estesi anche ad altre
colture per le quali è necessario salvaguardare la territorialità, la tradizionalità e la tipicità italiana.
Nel presentare questo supplemento è d’obbligo ringraziare tutti quelli che hanno contribuito alla realizzazione di questo progetto: il MiPAAF, che ha finanziato TIPIPAPA; i Dr. A. Ierna e L. Tedone, che hanno
collaborato alle attività di campionamento in Sicilia e in Puglia; le aziende agricole, che hanno fornito informazioni e i campioni di tuberi e suolo; un ringraziamento particolare, infine, ai tanti giovani ricercatori
che hanno preso parte alle attività sperimentali delle singole unità di ricerca.
Il Coordinatore del Progetto
Domenico Carputo
Autore corrisponderei contatto: D. Carputo, Dipartimento di Scienze del Suolo, della Pianta, dell’Ambiente e delle Produzioni Animali, Università degli Studi di Napoli Federico II, (DiSSPAPA), Via Università 100, 80055 Portici, Napoli, Italia. E-mail: [email protected]
1
ARTICOLI ORIGINALI
MINERVA BIOTEC 2012;24(Suppl. 1 al N. 1):3-10
Utilizzazione di marcatori molecolari SSR e AFLP
per l’identificazione varietale in patata
C. VILLANO, R. AVERSANO, L. FRUSCIANTE, R. GARRAMONE, M. IORIZZO, D. CARPUTO
Obiettivo. La tracciabilità dei prodotti alimentari tramite la caratterizzazione varietale delle produzioni
agricole è uno degli aspetti di maggior rilievo nel campo della valorizzazione del patrimonio agroalimentare
italiano e della tutela del consumatore. Le moderne
tecniche di biologia molecolare offrono strumenti analitici di grande efficacia nell’identificazione varietale.
Tra i prodotti caratteristici dell’agricoltura italiana, la
patata precoce, coltivata tipicamente in Campania, Puglia, Sicilia e Sardegna, riveste un ruolo di primaria
importanza, ma è oggetto di frodi alimentari tramite il
supplemento di materiale proveniente dall’Africa settentrionale o da Cipro. L’obiettivo di questa ricerca è
stato l’ottenimento di un fingerprinting molecolare di
varietà di patata comunemente utilizzate per la produzione extrastagionale.
Metodi. Il materiale genomico è stato estratto dai tuberi di 22 varietà, raccolte nelle zone di origine, e analizzato con otto microsatelliti e cinque combinazioni
di primer AFLP.
Risultati. Dal confronto dei profili allelici è risultato
che il numero minimo di loci SSR necessario per distinguere le varietà analizzate è stato cinque (STI0032,
STG0001, STI0012, STM5127 e STM1106). L’analisi
AFLP, invece, ha permesso di individuare 83 frammenti specifici per le quattro varietà maggiormente coltivate nei cicli extrastagionali e, in particolare, 34 per
Sieglinde, 23 per Spunta, 15 per Elvira e 11 per Agria.
Conclusione. In conclusione, è stato possibile sviluppare nuovi marcatori molecolari specifici di varietà di
patata precoce, utili per la tracciabilità molecolare e
per garantire la veridicità delle indicazioni presenti
sulle etichette dei prodotti.
Parole chiave: Microsatelliti - Tracciabilità - Fingerprinting.
Autore di contatto: D. Carputo, Dipartimento di Scienze del Suolo,
della Pianta, dell’Ambiente e delle Produzioni Animali, Università degli
Studi di Napoli Federico II, (DiSSPAPA), Via Università 100, 80055 Portici, Napoli, Italia. E-mail: [email protected]
Dipartimento di Scienze del Suolo, della Pianta,
dell’Ambiente e delle Produzioni Animali
Università degli Studi di Napoli Federico II, Napoli, Italia
I
n un contesto di produzioni standardizzate per
mercati sempre più di massa e globali, l’agricoltura è diventata “anonima” e il consumatore non
conosce né l’origine degli alimenti, né le imprese
produttrici. La creazione di marchi di qualità da parte dell’Unione Europea si è rivelata uno strumento
efficace per proteggere il patrimonio agroalimentare
italiano e tutelare il consumatore nella conoscenza dei prodotti tipici con forte valenza territoriale
e grande tradizionalità. La tipicizzazione delle produzioni agricole, in tal senso, è uno degli aspetti di
maggior rilievo nel campo della valorizzazione dei
prodotti alimentari, nonché della prevenzione delle
frodi e della sicurezza alimentare 1. Essa è indispensabile per qualsiasi politica di qualità, dalle produzioni a denominazione d’origine ai prodotti tradizionali. Le produzioni di Qualità sono controllate a
livello comunitario e nazionale. Fra le più importanti si possono ricordare le Indicazioni Geografiche
(IGP) e le Denominazioni di Origine Protetta (DOP),
regolamentate dal reg. CEE 2081/92, le Attestazioni
di Specificità dal reg. CEE 2082/92 e i disciplinari DOC/DOCG/IGT. L’Unione Europea ha messo in
atto numerose iniziative finalizzate al miglioramento
della tracciabilità delle produzioni agroalimentari.
Le moderne tecniche di biologia molecolare offrono
strumenti analitici di grande efficacia nell’identificazione di varietà ai fini della tracciabilità. In particolare, le tecniche basate sull’analisi del DNA presentano
3
VILLANO
molti vantaggi rispetto ai metodi tradizionali basati
sulla valutazione di caratteri morfologici e biochimici, soggetti all’influenza delle condizioni ambientali
e utilizzabili solo su prodotti non processati. Esse
consentono di identificare i cosiddetti marcatori molecolari, sequenze di DNA che caratterizzano
in modo inequivocabile un organismo. Basandosi
direttamente su differenze (polimorfismi) nella sequenza nucleotidica del DNA, i marcatori molecolari non presentano effetti epistatici o pleiotropici e
non soffrono l’interferenza dell’ambiente. Essi sono
distribuiti lungo tutto il genoma e ciò permette di
distinguere anche individui geneticamente simili e
fenotipicamente indistinguibili. La maggior parte di
essi è basata sull’uso della tecnica denominata polymerase chain reaction (PCR), che consente di amplificare milioni di volte, e in poche ore, sequenze
specifiche di DNA. La PCR è un processo esponenziale molto sensibile; generalmente un quantitativo
necessario di prodotto amplificato è ottenuto dopo
soli 30 cicli di amplificazione. Tra i marcatori maggiormente impiegati figurano gli AFLP (Amplified
Fragment Length Polymorphism) e gli SSR (Simple
Sequence Repeat), vantaggiosi nella caratterizzazione varietale (fingerprinting) e individuale (genotyping) grazie all’elevato grado di polimorfismo in
grado di essere rilevato da entrambi 2.
Tra i prodotti dell’agricoltura italiana, la patata riveste un ruolo di primaria importanza. In Italia, grazie alle condizioni ambientali riscontrabili in alcune aree costiere meridionali, è possibile usufruire
di una produzione di tuberi pressoché ininterrotta
durante tutto l’anno differenziata in tre raccolti: patata comune (da giugno a ottobre) e patata extrastagionale, che può essere bisestile (da dicembre a
febbraio) o precoce (da marzo a giugno). La quota
principale del prodotto nazionale è costituita dalla
patata comune, molto diffusa nelle regioni settentrionali, mentre tipica coltura remunerativa dell’Italia
meridionale è la patata precoce, coltivata soprattutto
in Campania, Sicilia, Puglia e Sardegna per le sue
peculiari esigenze climatiche. Queste quattro regioni
italiane coltivano il 93% della superficie nazionale
e danno luogo al 94% della produzione complessiva di patata precoce. Dagli anni Ottanta a oggi,
la Sicilia ha aumentato le proprie superfici coltivate
di circa il 50%, diventando la regione leader nella
coltivazione della patata precoce con i suoi quasi
10000 ha, pari a metà dell’intera superficie nazionale. Le produzioni unitarie hanno manifestato un
rilevante incremento passando da 16 t/h del triennio
4
1987-1989 alle 21 t/h dell’ultimo triennio 2007-2009
(dati ISTAT). La produzione extrastagionale precoce
è considerata un prodotto tipico con caratteristiche
qualitative peculiari, come il basso contenuto di sostanza secca. Essa ha anche caratteristiche culinarie
speciali che hanno indotto il Ministero delle politiche agricole alimentari e forestali a inserire alcune
di queste produzioni in un elenco di prodotti tipici
(http://www.politicheagricole.it/flex/cm/pages/ServeBLOB.php/L/IT/IDPagina/202), tra essi la patata
novella Sieglinde di Galatina, della quale è in corso il riconoscimento della DOP da parte della’Associazione produttori “Patate di Galatina” con la sede
nel comune di Alliste (LE). L’esigenza dell’identificazione varietale nasce anche dal fatto che nella
produzione nazionale talvolta è presente materiale
proveniente dall’Africa settentrionale o da Cipro.
Per valorizzare e, allo stesso tempo, salvaguardare
la produzione nazionale occorre dunque definire
un sistema di tracciabilità affidabile, ossia capace di
fornire al consumatore le informazioni sul prodotto
acquistato, tutelando, allo stesso tempo, i produttori
pertinenti ai Consorzi di produzione tipica.
Obiettivo di questa ricerca è stato quello di effettuare un fingerprinting molecolare di varietà di patata
comunemente utilizzate per la produzione precoce.
I marcatori utilizzati hanno permesso l’identificazione di alleli polimorfici tra le varietà analizzate,
confermando la validità degli strumenti genomici
nell’autenticazione varietale.
Materiali e metodi
Materiale vegetale
Sono state utilizzate ventidue varietà di patata, delle quali sette (Agata, Agria, Antea, Arinda, Elvira,
Sieglinde e Spunta) raccolte presso tredici aziende
agricole site in Campania, Puglia e Sicilia (Italia) e
quindici (Arrow, Asterix, Badia, Bartina, Dayana,
Elfe, Frisia, Inova, Liseta, Marabel, Primura, Terragold, Veronie, Vivaldi e Volumia) provenienti dalla
banca del germoplasma del DiSSPAPA.
Isolamento del DNA e analisi molecolari
Per ciascuna varietà, il DNA è stato estratto da tre
repliche biologiche di tuberi a maturità fisiologica
previamente liofilizzati, seguendo il protocollo di
Wulff et al.3 Il DNA totale è stato analizzato con otto
Marzo 2012
microsatelliti di tipo SSR (Simple Sequence Repeats)
(Tabella I), scelti dalla banca dati SSR di patata del
Centro Internazionale della Patata (http://research.
cip.cgiar.org/confluence/display/IPD/SSR+Marker).
La reazione PCR è stata realizzata in un volume finale di 20 μL contenente 20 mM Tris pH 8.4, 50 mM
KCl, 1,6 mM MgCl2, 0,2 mM dNTPs, 0,4 μM primer
forward marcato 5’-Hex (esa-cloro-6-carbossifluoresceina) o 5’-Fam (6-carbossifluoresceina), 0,4 μM
primer reverse, 1 unità di Taq polimerasi (Invitrogen Life Technologies) e 30 ng di DNA. Il ciclo di
amplificazione PCR utilizzato è stato realizzato seguendo le seguenti tre fasi: 1) cinque cicli di tipo
touch down (con decremento della temperatura di
annealing di 1°C ad ogni ciclo di amplificazione) a
94 °C per 45s, Ta °C + 5 °C per 60s, 72 °C per 30s;
2) 30 cicli di amplificazione a 94 °C per 45s, Ta °C
per 60s, 72 °C per 30s; 3) una fase di elongazione
finale a 72 °C per 20 min. I profili SSR sono stati
analizzati tramite elettroforesi capillare con il Genetic Analizer 3130 (Applied Biosystems) utilizzando
il programma Peak Scanner versione 1.0 (Applied
Biosystems). Per verificare la riproducibilità dei dati
ottenuti, tutti gli esperimenti sono stati compiuti in
triplicato. Le varietà Agria, Elvira Sieglinde e Spunta sono state sottoposte a genotipizzazione anche
mediante l’AFLP Analysis System-I (Invitrogen Life
Technologies), cui sono state apportate alcune modifiche. Il DNA genomico (125 ng) è stato digerito
in una miscela di reazione contenente due enzimi di
restrizione EcoRI e MseI. La miscela è stata incubata
a 37 °C per una notte e, in seguito, a 70 °C per 15
min per l’inattivazione delle endonucleasi di restrizione. Il DNA digerito è stato miscelato agli adattatori oligonucleotidici EcoRI e MseI e alla T4 DNA ligasi
(Invotrogen Life Technologies), quindi incubato per
2 ore a 20°C. Per la reazione di pre-amplificazione,
20 μl di ligato diluito 1:10 e primer di pre-amplifica-
VILLANO
zione EcoRI e MseI sono stati sottoposti al seguente
programma di amplificazione: 20 cicli a 94 °C per
30s, 56 °C per 60s e 72 °C per 60s. I prodotti della
reazione sono stati diluiti 1:30 con TE 1x. Per l’amplificazione selettiva la miscela di componenti di reazione (20 µl) è stata preparata utilizzando i primer
EcoRI marcati con i fluorocromi Hex o Fam, 4,5 µl
di primer MseI, 1U di Taq polimerasi, 20 mM Tris pH
8.4, 50 mM KCl, 1,6 mM MgCl2, 0,2 mM dNTPs e 5
µl di DNA pre-amplificato diluito 1:30. La reazione
di amplificazione PCR ha previsto 1 ciclo di 94 °C
per 30s, 65 °C per 30s, 72 °C per 60s, 12 cicli di tipo
touch-down con decremento della temperatura di
annealing di 0.6 °C per ciclo, e 23 cicli a 94 °C per
30s, 56 °C per 60s e 72 °C per 60s. Il prodotto della
reazione d’amplificazione è stato diluito con un fattore di diluizione 1:5 e miscelato con il GeneScan
500 ROX Size Standard (Applied Biosystem). Complessivamente, le amplificazioni selettive sono state
condotte con cinque combinazioni di primer EcoRI e MseI: E-ACT/M-CAT; E-ACT/M-CTT; E-AGC/MCTT; E-AGC/M-CTA e E-AGC/M-CTG. I profili AFLP
sono stati analizzati tramite elettroforesi capillare
con Genetic Analizer 3130 (Applied Biosystems)
utilizzando il programma Gene Mapper versione 4.0
(Applied Biosystems).
Analisi dei dati
Tutte le varietà che hanno mostrato un unico allele SSR amplificato sono state considerate omozigoti
per il locus corrispondente. Per ogni microsatellite sono stati individuati il numero di alleli effettivi,
l’eterozigosità e il potere di discriminazione. In particolare, l’eterozigosità (H) è stata calcolata mediante
la formula Neis 4:
H=n*(n−1)*(1−∑Pi 2)
dove Pi è la frequenza dell’allele i e n è il numero di
Tabella I. — Marcatori molecolari SSR selezionati. Per ogni marcatore sono stati riportati i rispettivi codici identificativi, i motivi
ripetuti, la sequenza e la dimensione allelica in paia di basi del marcatore e la localizzazione cromosomica.
Locus SSR
Motivo ripetuto
Sequenza primer (5’->3’)
STM1053
(TA)4 (ATC)5
FW_TCTCCCCATCTTAATGTTTC RV_ CAACACAGCATACAGATCATC
STM1052 (AT)14 GT (AT)4 (GT)6 FW_CAATTTCGTTTTTTCATGTGACAC RV_ATGGCGTAATTTGATTTAATACGTAA
FW_TCCAGCTGATTGGTTAGGTTG RV_ATGCGAATCTACTCGTCATGG
STM1106
(ATT)13
FW_AATGGCTCTCTCTGTATGCT RV_GCTGTCCCAACTATCTTTGA
STM5114
(ACC)7
FW_TTCAAGAATAGGCAAAACCA RV_CTTTTTCTGACTGAGTTGCCTC
STM5127
(TCT)5
FW_CAGCCAACATTTGTACCCCT RV_ACCCCCACTTGCCATATTTT
STG0001
(CT)10
FW_GAAGCGACTTCCAAAATCAGA RV_AAAGGGAGGAATAGAAACCAAAA
STI0012
(ATT)n
FW_TGGGAAGAATCCTGAAATGG RV_TGCTCTACCAATTAACGGCA
STI0032
(GGA)n
Dimensione Cromosoma
allelica (bp)
170–196
214–263
145–211
297–322
248–291
137–163
183–234
127–148
III
IX
X
II
I
XI
IV
V
5
VILLANO
alleli. Il potere di discriminazione (PD) per ogni locus è stato calcolato mediante la seguente formula:
PD=1−∑Pi2
dove Pi è la frequenza del genotipo i. I dati ottenuti dalla lettura dei profili elettroforetici sono stati immessi in una matrice binaria riportante per
ciascun campione, l’assenza (0) e la presenza (1)
dell’allele. Per la valutazione della distanza genetica
è stato utilizzato il coefficiente di Dice. La matrice
di similarità è stata analizzata con il metodo UPGMA (Unweighted Paired Group Method with Arithmetic mean) mediante il software NTSYS-PC 5 e il
dendrogramma corrispondente. Al fine di effettuare
un’analisi esaustiva delle relazioni tassonomiche riscontrate tra le varietà esaminate è stata utilizzata la
banca dati dei pedigree di patata della Wageningen
University & Research (http://www.plantbreeding.
wur.nl/potatopedigree/). I dati ottenuti dalla lettura
dei profili elettroforetici AFLP sono stati immessi in
una matrice binaria riportante nei diversi campioni,
l’assenza (0) e la presenza (1) dei frammenti. La similarità tra i generici individui i e j, è stata calcolata
utilizzando la seguente formula:
SMij=(a+d)/(a+b+c+d)
in cui a è il numero di bande presenti in entrambi
gli individui, b è il numero di bande presenti in i ed
assenti in j, c è il numero di bande presenti in j ed
assenti in i, d indica il numero di bande assenti sia
in i che in j 6.
Risultati
Il fingerprinting molecolare è stato condotto mediante un set di otto microsatelliti di patata, che han-
no mostrato polimorfismo in tutti i loci considerati.
In totale sono stati analizzati 40 alleli, con una media
di 5±1,03 alleli per locus e 2,3±0,55 (media±errore
standard) per varietà. Due alleli (172 bp e 298 bp
ai loci STM1053 e STM5114, rispettivamente) sono
stati riscontrati in tutte le ventidue varietà analizzate,
altri due (132 e 190 bp ai loci STG0001 e STI0012)
in due varietà, (Sieglinde e Spunta, rispettivamente)
e i restanti trentasei alleli hanno mostrato un livello
di polimorfismo variabile. In particolare, il locus che
ha presentato il minor numero di alleli polimorfici
(due) è stato STM1053, mentre quello che ne ha presentati di più (otto) è stato STG0001. La dimensione
dei microsatelliti amplificati è stata compresa tra 107
bp (STI0032) e 298 bp (STM5114). Il valore medio
dell’eterozigosità è stato 0,81±0,07, con il valore più
basso (0,35) del locus STM1053 e il più alto (0,99)
dei loci STM1106 e STM1052. Il PD è stato molto alto
(≥0,95) in tutti i loci considerati, a rilevare un’alta
capacità discriminante complessiva per l’intero set
di loci SSR saggiati (Tabella II). Il numero totale di
polimorfismi SSR osservati in ciascuna varietà analizzata è mostrato in Tabella III. Il numero di alleli identificati è variato da 15 (Bartina) a 22 (Agria)
con una media di 18,4±0,96 per varietà. I gruppi
di alleli amplificati in ciascuna varietà mediante le
otto coppie di primer SSR sono stati classificati in
tipologie di profili, indicate con le lettere dell’alfabeto latino (Tabella III): ai loci aventi alleli identici, è
stata assegnata la stessa lettera. Tale sistema di classificazione ha permesso di individuare le coppie di
primer in grado di discriminare univocamente una
varietà dalle restanti grazie al suo specifico profilo
allelico. Al locus STG001 sono stati osservati quindici profili (A-O), tredici in STI0012 (A-M), dodici
Tabella II. — Risultati delle analisi di otto loci microsatelliti di patata su 22 varietà di patata. Per ciascun locus sono riportati
le temperature ottimali di annealing (Ta), il numero, la dimensione e la frequenza assoluta degli alleli, il numero di alleli
polimorfici e i valori di eterozigosità (He) e del potere di discriminazione (PD).
Locus SSR
Ta (°C)
Alleli,
no.
Alleli polimorfici,
no.
Alleli in bp (frequenza assoluta)
He
PD
STM1053
55
2
169 (7), 172 (22)
0,36
0,95
STM1052
57
3
1
3
210 (17), 219 (7), 228 (14)
0,99
0,95
STM1106
56
4
4
137 (4), 141 (7), 154 (2), 157 (16)
0,99
0,95
STM5114
53
5
4
284 (3), 286 (10), 289 (17), 292 (7), 298 (22)
0,73
0,95
STM5127
55
6
6
241 (19), 244 (20), 250 (2), 253 (4), 271 (8), 274 (9)
0,76
0,95
STG0001
55
8
8
120 (6), 125 (3), 127 (11), 129 (5), 132 (1), 135 (14), 139 (12), 143 (18)
0,98
0,96
STI0012
58
7
7
165 (7), 168 (18), 171 (16), 174 (8), 184 (12), 187 (3), 190 (1)
0,98
0,95
STI0032
54
5
5
107 (13), 110 (6), 116 (3), 119 (17), 122 (15)
0,74
0,95
6
Marzo 2012
VILLANO
Tabella III. — Schema riassuntivo della dimensione degli alleli (in paia di basi) identificati mediante l’analisi di otto loci SSR
in 22 varietà di patata precoce. Per ciascun locus è riportata la tipologia di profilo (Pr.) allelico (A-O) osservata. Dettagli in
materiali e metodi.
Varietà
Locus
STI0032
Agata
107, 119
Agria
107,116,
119, 122
Antea
107, 119
Arinda
Arrow
107, 119,
122
110, 119,
122
Asterix
Pr.
F
K
F
C
STM1053
169, 172
169, 172
172
B
241, 244
A
STM5114
289, 292,
298
286, 289,
298
A
241, 244,
271
C
289, 298
A
286, 289,
298
B
STM5127
241, 244,
271
Pr.
C
A
241, 244
H 172
A
H 289, 298
107, 119
F
172
A
Badia
116, 119,
122
L
172
A
Bartina
116, 122
D 172
A
241, 244,
253
241, 244,
271
241, 244,
274
241, 244,
274
241, 244,
271
C
284, 298
B
286, 289,
298
B
289, 298
Elfe
107, 110,
119, 122
A
172
A
241, 244
A
286, 292,
298
Elvira
107, 110
J
172
A
241, 250
K
292, 298
Frisia
107, 119,
122
C
169, 172
B
241, 244
A
289, 298
A
241, 244,
250, 274
L
289, 292,
298
284, 289,
298
286, 292,
298
286, 289,
298
286, 289,
298
Liseta
107, 119
Marabel
107, 119,
122
F
F
C
172
169, 172
172
A
286, 298
119, 122
107, 119
172
C
Dayana
Inova
E
172
Pr.
B
A
A
241, 244
A
244, 271,
274
241, 253,
271, 274
241, 244,
274
241, 244,
253, 271
244, 253,
274
241, 244,
274
241, 244,
271, 274
E
Primura
119, 122
E
172
A
Sieglinde
107
I
172
A
Spunta
H 169, 172
Terragold
110, 119,
122
107, 119,
122
172
A
Veronie
122
G 169, 172
B
Vivaldi
110, 122
B
169, 172
B
Volumia
119, 122
E
172
A
C
241, 244
B
I
J
Pr.
289, 298
289,
D 286,
298
289,
G 286,
292, 298
289,
B 284,
292, 298
F
289, 298
in STI0032 e STM5127 (A-L), nove in ST5114 (A-J),
sette in STM1106 (A-G), sei in STM1052 (A-F) e due
in STM1053. Mediamente il numero di profili per
locus è stato 9,5, mentre il numero di profili per varietà è stato inferiore a 0,5 (dati non mostrati). Dal
confronto dei profili allelici è risultato che il numero
minimo di loci necessario per distinguere le ventidue varietà analizzate è cinque (STI0032, STG0001,
STI0012, STM5127 e STM1106). Per valutare le relazioni esistenti tra i campioni in base alla loro distanza genetica, i dati generati dall’analisi SSR sono
STG0001
129,
J 143 139,
139,
E 127,
143
139,
C 127,
143
125,
E 120,
135
139,
C 135,
143
135,
F 127,
139, 143
139,
E 127,
143
135,
C 120,
139
135,
D 129,
143
135,
A 129,
143
135,
H 120,
139
127,
C 120,
135, 143
127,
J 120,
135, 143
I
135, 143
127,
A 125,
139, 143
135,
E 129,
143
132,
E 127,
143
C 127, 135,
143
135,
E 129,
139
135,
G 127,
143
Alleli
Pr.
STI0012
165,
O 171, 168,
174
168,
L 165,
171, 184
171,
L 168,
174
Pr.
STM1052
M 210
Pr.
STM1106
Pr.
no.
C
141
C
19
L
210, 219,
228
E
157
A
22
F
210, 219
F
154, 157
F
18
N
168, 174
I
210, 219
F
157
A
17
I
168, 171,
184
165, 168,
171
168, 171,
174, 184
H 210, 228
B
157
A
18
G 210
C
137, 141
D
18
L
228
D 157
A
19
D 171, 174
B
210
C
157
A
15
174,
A 171,
187
184,
A 168,
187
171,
D 168,
184
171,
K 165,
184
168,
K 165,
171
171,
M 168,
184
184,
C 168,
187
171,
A 168,
174
171,
J 168,
184
184,
H 165,
190
168,
E 165,
174
D 210, 228
B
157
A
17
A
219, 228
A
157
A
19
H 210, 228
B
157
A
16
K
B
157
A
19
C
157
A
19
H 210, 228
B
137, 141,
157
G
19
A
219, 228
A
157
A
19
F
210
C
141
C
17
H 210, 228
B
137, 141
D
19
J
210, 219,
228
E
157
A
20
E
210
C
157
A
19
H 168, 184
I
228
D 137, 141
D
18
B
210, 228
B
141, 157
B
19
H 219, 228
A
154
E
19
F
L
B
139, 143
B
168, 171
C
120, 125,
139, 143
171,
G 168,
184
210, 228
G 210
sottoposti ad analisi cluster ed è stato prodotto un
dendrogramma. La topologia ha indicato la presenza
di gruppi di genotipi con elevata similarità genetica. Nel dendrogramma mostrato in figura 1, è stato
possibile distinguere due cluster principali: il Cluster
I, che comprende le varietà Veronie e Sieglinde, e
il Cluster II, che raggruppa tutte le altre varietà e a
sua volta costituito da due sotto-gruppi, dei quali
uno comprende le varietà Bartina, Terragold, Arinda, Dayana, Primura, Asterix, Agata e Antea e l’altro
Elfe, Marabel, Agria, Badia Volumia, Vivaldi, Arrow,
7
VILLANO
ELFE
MARABEL
AGRIA
BADIA
VOLUMIA
VIVALDI
ARROW
LISETA
SPUNTA
FRISIA
INOVA
ELVIRA
BARTINA
TERRAGOLD
ARINDA
DAYANA
PRIMURA
ASTERIX
AGATA
ANTEA
VERONIE
SIEGLINDE
0.59
0.68
0.77
0.86
comuni con le altre varietà appartenenti al secondo
cluster. Nel primo sotto-gruppo del cluster 2, invece,
non sono state evidenziate correlazioni genealogiche tranne che per Arinda, presente nel pedegree di
Primura come parentale. Nel secondo sotto-gruppo,
invece, sono stati individuati parentali in comune tra
Elfe e Marabel (Hansa) e tutti gli altri componenti
presentano molti progenitori in comune, tra cui i più
frequenti sono Saskia e Katahdin; le uniche varietà
che non si correlano al resto del gruppo sono Agria
e Badia.
Per quanto concerne l’analisi AFLP, è stato eseguito lo studio dei profili elettroforetici e il confronto
degli elettroferogrammi per tutte le combinazioni di
primer selettivi. Per ognuna di essa sono stati individuati gli alleli totali amplificati, il cui numero è variato da 61 (E-ACT M-CAG) a 81 (E-ACT/M-CAT) e il
numero di alleli polimorfici, variabile tra 26 (E-ACT/
M-CAG) e 41 (E-ACT/M-CAT) (Tabella IV). L’analisi
dei frammenti polimorfici ha permesso di identificare marcatori specifici per ognuna delle quattro varietà analizzate: nel particolare, 34 frammenti specifici
consentono di discriminare Sieglinde, 23 Spunta, 15
Elvira e 11 Agria.
0.95
Figura 1. — Dendrogramma costruito per le 22 varietà di patata
precoce analizzate mediante otto marcatori SSR.
Discussione
Liseta, Spunta, Frisia, Inova e Elvira. Tramite le analisi del pedigree è stato possibile caratterizzare ogni
varietà identificando progenitori in comune presenti
tra le varietà coltivate. Nel primo cluster le due varietà Veronie e Sieglinde presentano un unico progenitore in comune ( Juli), e molti più progenitori
Il rispetto della normativa europea sull’etichettatura
degli alimenti richiede che sia accertata l’identità dei
prodotti al fine di prevenire casi di frodi dovute alla
sostituzione di una parte del prodotto con un altro di
diversa origine. Tra i metodi analitici usati per l’autenticazione di specie animali o vegetali in prodotti
alimentari, quelli basati sull’analisi del DNA hanno il
vantaggio di essere sicuri e rapidi nell’accertamento
Tabella IV. — Risultati dell’analisi mediante marcatori AFLP su quattro varietà di patata precoce. Per ciascuna combinazione
di primer sono riportati il numero di frammenti totali, il numero e la percentuale dei frammenti polimorfici e il numero di
frammenti specifici per ciascuna varietà analizzata.
Combinazione di primer
E-ACT/M-CTT
E-ACT/M-CTG
E-ACT /M-CAT
E-ACT/M-CAC
E-ACT/M-CAG
E-AGC/M-CTG
Totale
8
Frammenti totali,
no.
77
74
81
62
61
64
419
Frammenti
polimorfici, no (%)
39
37
41
29
26
28
200
(50,6)
(50)
(50,6)
(46,8)
(42,6)
(43,7)
(47,7)
Frammenti specifici, no.
SIEGLINDE
SPUNTA
ELVIRA
AGRIA
7
5
5
6
7
4
34
1
4
7
6
2
3
23
4
3
2
0
1
5
15
0
1
1
0
6
3
11
Marzo 2012
dell’identità genetica. Nell’ambito della tracciabilità genetica dei materiali vegetali nella filiera agroalimentare, tra i marcatori maggiormente impiegati
figurano gli AFLP e gli SSR. Gli AFLP sono stati utilizzati per l’autenticazione di molte specie vegetali tra
cui Brassica 7, olivo 8, carciofo 9 e di materie prime
di origine animale spesso utilizzate per l’adulterazione di prodotti alimentari 10. I microsatelliti, invece,
sono stati applicati per la caratterizzazione varietale
di altre specie vegetali come la vite 11, il noce 12 e il
pomodoro 13. In ambito forense la genotipizzazione
attraverso l’utilizzo di marcatori microsatelliti è ormai una prassi comune e ampiamente riconosciuta.
In patata, diversi tipi di marcatori molecolari sono
stati usati al fine di esaminare la diversità genetica
o semplicemente per il fingerprinting varietale. Tra
i tanti si annoverano gli RFLP 14, i RAPD 15, gli AFLP
16, 17 e gli I-SSR 18. I marcatori molecolari utilizzati in
questo lavoro sono stati scelti tra quelli ritenuti più
affidabili per la caratterizzazione e l’identificazione
delle cultivar, analizzabili con grande precisione
mediante tecniche semi-automatizzate e in grado di
produrre risultati affidabili e ripetibili nel tempo. I
microsatelliti, in particolare, sono marcatori d’elezione per la tracciabilità genetica dei materiali vegetali
nelle filiere agro-alimentari, grazie alla loro capacità
di amplificare corti DNA-stampo, un requisito fondamentale per l’analisi del DNA estratto da matrici
alimentari.
Più di 200 SSR sono stati identificati partendo da
sequenze nucleotidiche di patata contenenti motivi ripetuti. Milbourne et al.19 hanno sviluppato 112
marcatori SSR, la cui validazione su un set di sei
genotipi di patata, ha permesso di selezionarne 98
altamente polimorfici. Feingold et al.20, invece, hanno individuato 94 microsatelliti, 61 utilizzati per il
mappaggio e 30 per la caratterizzazione genetica di
30 cultivar di patate. Con la pubblicazione del genoma completo di patata 21, il numero di sequenze contenenti motivi ripetuti è aumentato enormemente. L’ultimo riepilogo delle statistiche SSR del
Solanaceae Genome Resource (http://solanaceae.
plantbiology.msu.edu/analyses/ssr/summary) documenta 10.000 sequenze con più di 16.000 SSR potenzialmente utili (ripetizioni di 2-6 nucleotidi) per
lo studio della diversità genetica in patata. Tuttavia,
questi SSR sono molto diversi in termini di qualità,
posizione sul genoma e capacità di discriminazione.
Recentemente, Ghislain et al.22 hanno descritto un
nuovo ‘’Kit per l’accertamento dell’identità genetica
di patata” costituito da 24 marcatori SSR in grado
VILLANO
di discriminare il 94% delle varietà sud americane
(oltre 700). Tale kit è particolarmente utile per standardizzare la selezione di SSR e per l’assegnazione
delle dimensioni ai microsatelliti, permettendo, in tal
modo, l’analisi comparativa di dati generati in modo
indipendente. Nel presente studio abbiamo usato 8
dei 24 marcatori SSR messi a punto da Ghislain et
al.22, identificando profili allelici varietà-specifici utili per la loro autenticazione genetica. I valori elevati
di eterozigosità riscontrati e il numero medio di alleli per locus hanno dimostrato che il set di marcatori
testato risulta estremamente efficiente nel distinguere la collezione di varietà esaminate. Valori simili
sono stati riportati in letteratura da altri autori. In
particolare, Milbourne et al.23, in un lavoro di caratterizzazione molecolare di 16 varietà di patata mediante 17 SSR, hanno riportato un numero medio di
alleli per locus di 5,7. Ghislain et al.22, invece, hanno
evidenziato 6,8 alleli per locus, in media, in un campione più ampio di genotipi (30 varietà di patata
proveniente dal Sud America). Ruiz de Gallatera et
al.24, infine, hanno calcolato un numero medio di alleli per locus più basso (3,24) in 19 ecotipi spagnoli
di patata. L’oscillazione di tali valori è da ricondurre
certamente alla base genetica delle varietà messe a
confronto e alla capacità discriminante dei loci saggiati. Quest’ultima, che è una misura della capacità
informativa di un marcatore, nel presente studio si è
attestato su valori molto alti, non scendendo mai al
di sotto di 0,95. Tali valori si avvicinano a quelli riportati in letteratura, ove alcuni esempi simili riportano i valori del potere di discriminazione oscillanti
tra 0,64 e 0,97 25, da 0,79 a 0,91 26.
Gli AFLP, ancora oggi, sono i marcatori molecolari più utilizzati per il fingerprinting e il genotyping
molecolare nelle piante superiori. L’elevato grado di
polimorfismo che tali marcatori sono in grado di rilevare e la loro elevata riproducibilità, rendono gli
AFLP uno strumento valido per l’autenticazione varietale non solo in patata. Meneghetti et al. 27, ad
esempio, tramite l’uso di AFLP sono riusciti a distinguere 132 accessioni di 3 differenti cultivar di vite
(Malvasia nera di Brindisi/Lecce, Negroamaro e Primitivo) e a correlare le loro origini geografiche alle
differenze genetiche. In questa ricerca, mediante le
analisi AFLP sono state esaminate quattro varietà di
patata, scelte perché rappresentative della coltivazione extra-stagionale in Puglia, Sicilia e Campania.
Le combinazioni AFLP utilizzate si sono rivelate efficienti e hanno permesso di individuare alleli polimorfici specifici in tutte le varietà prese in esame. La
9
VILLANO
creazione di marchi di qualità e la messa a punto di
nuove tecniche genomiche per la caratterizzazione
varietale possono essere uno strumento indispensabile per proteggere la tipicità dei prodotti alimentari.
In tale contesto, la tracciabilità genetica consente di
controllare un determinato materiale vegetale in tutta la sua filiera di produzione. Le indagini molecolari
condotte sul pomodoro S. Marzano, sull’IGP Melannurca Campana, sull’Olio DOP di Collina di Brindisi, sul DOP Pane di Altamura 28 e sull’IGP Patata
della Sila sono casi studio di tracciabilità molecolare
di prodotti a denominazione d’origine. Questi sono
solo una parte dei 142 prodotti italiani a Denominazione di Origine Protetta e degli 84 prodotti italiani
ad Indicazione Geografica Protetta.
Conclusioni
In questa ricerca è stato possibile sviluppare marcatori molecolari SSR e AFLP specifici di varietà di patata precoce, confermando la validità degli strumenti
genomici nell’autenticazione varietale. Gli alleli SSR
e AFLP potranno essere registrati in un database
di marcatori molecolari per permettere lo sviluppo
d’informazioni cumulative sul fingerprinting varietale in patata. I risultati ottenuti, inoltre, saranno un
utile strumento per la certificazione genetica e la
tracciabilità molecolare dei prodotti alimentari derivati dalla lavorazione della patata.
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Marzo 2012
Strumenti di genomica funzionale per la tipizzazione
dell’origine di coltivazione della patata
C. ONOFRI 1, D. PACIFICO 1, P. OSTANO 2, M. MELLO-GRAND 2, C. GHIMENTI 2, B. PARISI 1, G. MANDOLINO
Obiettivo. È stata valutata la possibilità di utilizzare l’oligo glass array Agilent di Solanum tuberosum
POCI (Potato Oligo Chip Initiative) 4X44 K (44000
sonde presenti) per l’analisi comparativa del trascrittoma di tuberi maturi e dormienti di patata di diverse
varietà, coltivate in diverse aree geografiche.
Metodi. L’RNA totale è stato estratto dai tuberi liofilizzati di alcune varietà coltivate in specifiche località
di Puglia e Sicilia. L’RNA è stato marcato con Cy3 e
ibridato sull’array; in seguito a lettura mediante scanner, i dati di ibridazione sono stati confrontati con altre varietà, località o regioni per ottenere una mappa
genome-wide della up- o down-regolazione dei geni
nelle diverse condizioni comparate.
Risultati. I dati sui tuberi raccolti nel 2008 sembrano indicare una forte preponderanza dell’effetto della varietà sulla modulazione dell’espressione genica,
mentre gli effetti delle località esaminate, a parità di
varietà, sembrano molto limitati. Nel 2009 questi dati
non sono stati confermati, mostrando anzi un forte
effetto delle località sul numero e tipo di geni regolati.
Conclusioni. La conclusione è che le variazioni dovute
all’annata di coltivazione siano superiori a quelle dovute alla varietà e al luogo di coltivazione.
Parole chiave: RNA - Solanum tuberosum - Microarray.
La genomica della patata
L
a patata (Solanum tuberosum) fa parte della famiglia delle solanacee, insieme a numerose altre
specie di grande rilevanza economica come il pomodoro, la melanzana, il tabacco e così via.
Data la sua importanza – dopo riso e frumento è
Autore di contatto: G. Mandolino, CRA - Centro di Ricerca per le
Colture Industriali, via di Corticella 133, 40128 Bologna, Italia.
E-mail: [email protected].
1
1CRA
– Centro di Ricerca per le Colture Industriali,
Bologna, Italia
2Fondazione Edo ed Elvo Tempia Valenta per la lotta
contro i tumori – ONLUS, Biella, Italia
la terza coltura nel mondo – la patata è stata oggetto di studio sotto molti punti di vista, sia chimicoqualitativo sia genetico-molecolare.
Già dalla fine degli anni ’80 sono state sviluppate
mappe genetiche di varietà diploidi di patata, basate
su marcatori molecolari Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP), mappe poi implementate
introducendo altri marcatori quali micro satelliti e
Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP).
Lo sviluppo delle più recenti, ultra-dense mappe molecolari di patata 1 che hanno aperto la strada al sequenziamento dell’intero genoma, sono state inizialmente facilitate anche dalla elevatissima sintenia del
genoma di patata con quello di pomodoro, che ha
permesso di utilizzare marcatori comuni ad entrambe
le specie ed effettuare studi di genomica comparativa
su queste due specie sin dai primi anni ’90 2. Il sequenziamento completo del genoma di pomodoro, e
lo sviluppo delle conseguenti risorse bioinformatiche
e dei database che permettono lo sfruttamento delle
conoscenze acquisite su una pianta e la loro applicazione sistematica all’altra, ha ulteriormente accelerato
i progressi della genomica della patata 3.
Il genoma di patata è composto da 12 cromosomi,
e la sua lunghezza (aploide) stimata è di circa 850
milioni di paia di basi. Il Potato Genome Sequencing Consortium (PGSC), composto da 17 gruppi
di ricerca appartenenti a 13 diversi paesi, ha reso
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ONOFRI
Tipizzazione dell’origine di coltivazione della patata
pubblica nel 2010 la prima sequenza del genoma
di patata 4. Poiché sia il breeding sia l’analisi genetica della patata sono rese difficili dal fatto che
per lo più le varietà commerciali sono tetraploidi
di recente origine, che la patata è una specie altamente eterozigote e che tollera male l’inbreeding, il
PGSC ha deciso di ottenere le sequenze genomiche
a partire da materiali diploidi, in particolare ottenendo la gran parte delle sequenze da un’accessione
doppio monoploide (DM) ottenuta tramite coltura di
antere e successivo raddoppiamento cromosomico
(e quindi omozigote a tutti i loci), appartenente al
gruppo Phureja di S. tuberosum, e successivamente
integrando in questa bozza sequenze ottenute da
una breeding line eterozigote ma anch’essa diplode,
e appartenente al gruppo tuberosum.
Infine, al lavoro di sequenziamento del genoma,
è stato affiancata, ed è in continuo sviluppo, un’indagine di “deep transcriptome sequencing”: 31 Gb
di sequenziamento del trascrittoma, il cui RNA proveniva da varie accessioni, e da tutti i tipi di tessuto, stadi di sviluppo e condizioni ambientali di
stress biotico e abiotico. Ne sono risultati circa 39000
geni codificanti per proteine, i geni cioè che maggiormente contribuiscono ai fenotipi cui sono particolarmente interessati i breeder, presiedendo per
esempio alla sintesi di molecole che influenzano la
qualità dei tuberi quali glicoalcaloidi o carotenoidi;
oppure proteine che mediano resistenze a fattori di
stress, o strutturali, coinvolte nella consistenza, tessitura e comportamento alla cottura del tubero, e così
via. Un dato interessante che è emerso dal sequenziamento del trascrittoma di patata, è che oltre 9000
geni, cioè il 25% del totale, esibisce il fenomeno
dello “splicing alternativo”, in seguito al quale uno
stesso gene codifica per due o più isoforme proteiche. Considerando che questi dati sono stati ottenuti
su genomi diploidi, si può supporre che le varietà
tetraploidi di patata, e le specie selvatiche di Solanum, contengano un tasso di variabilità genetica
ancora sconosciuto e non sfruttato, ben al di là del
mero numero di geni identificati.
Si può prevedere che saranno moltissime le ricadute del recente completamento di una bozza della
sequenza completa del genoma di patata 5. Oltre alla
possibilità di individuare per molti geni di rilevanza
agronomica varianti più o meno interessanti nel germoplasma di Solanum, si potrà cominciare a comprendere la base di caratteri di grande importanza
ma che sono fino ad oggi sfuggiti in parte all’analisi genetica tradizionale a causa del loro determini-
12
smo multifattoriale. Si può inoltre prevedere che la
disponibilità della sequenza genomica della patata
porterà, ed in parte ha già portato, allo sviluppo di
strumenti nuovi per la ricerca e per il breeding.
Fra le ricadute della conoscenza della sequenza
del genoma di patata, c’è certamente poi l’identificazione dei geni che codificano per proteine enzimatiche o strutturali, della loro variazione nel germoplasma, e la possibilità di studiarne il funzionamento in
relazione a situazioni specifiche della pianta, quale
lo stadio di sviluppo, l’organo, le condizioni ambientali, l’attacco di patogeni, ecc. Questo immenso
campo di studi è oggi più alla portata dei ricercatori,
grazie alla disponibilità di “microarrays” sia commerciali che ottenibili “su misura” da alcune fra le principali aziende biotecnologiche mondiali.
I microarrays, strumento di
analisi del trascrittoma
I microarrays sono strumenti analitici high-throughput (cioè che generano grandi quantità di informazioni in maniera automatizzabile e informatizzata, attraverso procedure spesso robotizzabili) e
genome-wide (cioè capaci di estrarre dati dall’intero
complemento di geni, o da una sostanziale frazione
di esso), la cui origine risale alla prima metà degli
anni ’90, quando furono sviluppati da Mark Schena
et al. alla Stanford University 6.
Si possono definire come matrici ordinate (ad es.
organizzato in colonne e file) di elementi microscopici (ad es. brevi segmenti di DNA) posizionati su
un substrato solido e planare (ad es. vetrini), e che
consentono il binding specifico di geni o prodotti
genici (es. mRNA).
I primi esperimenti con microarray per lo studio
dell’espressione genica utilizzavano spot a cDNA, tipicamente di lunghezza 500-2000 bp, che consente
forti segnali di ibridazione data la estesa complementarietà con l’mRNA-sonda in soluzione marcato
con un fluorocromo. I microarray a oligonucleotidi,
invece, trovano applicazioni oltre che negli studi di
profiling dell’espressione genica, anche nella genotipizzazione. Gli oligonucleotidi che vengono fissati
al vetrino sono di 15-70 bp, e ottenuti mediante sintesi chimica; il segnale di ibridazione ha alta intensità e specificità dopo ibridazione all’mRNA-sonda. Il
principio di funzionamento dei chip genici è schematizzato in Figura 1.
Oltre allo sviluppo di tecniche fotolitografiche,
Marzo 2012
ONOFRI
CAMPIONE
Estrazione
RNA o DNA
Amplificazione
e marcatura
Ibridazione
RIFERIMENTO
Ibridazione
Inferenza
statistica
Scansione
Processing
dati
Analisi
immagine
Figura 1. — Schema del funzionamento del microarray con la tecnica “one-color” della Agilent.
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ONOFRI
mediante le quali si possono fissare a supporti solidi
brevi segmenti di DNA (oligo o cDNA), il principale
progresso che ha permesso il diffondersi dei microarray come strumento di ricerca e di analisi, è la disponibilità di enormi quantità di informazioni di sequenze genomiche; senza queste recenti acquisizioni, non
sarebbe possibile infatti la sintesi né di cDNA specifico per ogni dato gene, né di oligonucleotidi con il
necessario grado di specificità. Oggi sono disponibili
numerosi database dedicati, come quello gestito dal
PSGC (www.potatogenome.net) o quelli della Cornell
University (www.sgn.cornell.edu/) o della Wageningen University (https://cbsgdbase.wur.nl/).
In seguito alla disponibilità di un crescente numero di genomi di diversi organismi interamente
sequenziati, molte aziende biotech hanno introdotto sul mercato chip commerciali, contenenti l’intero
repertorio di geni di diversi organismi. Fra questi, il
primo organismo vegetale interamente sequenziato
(Arabidopsis thaliana) e di cui è stato prodotto un
microarray commerciale (ATH1, da parte della Affymetryx) è stato presto seguito da altri, man mano
che le tecnologie di nuova generazione (NGS) rendevano il sequenziamento massiccio sempre più efficiente, economico ed abbordabile anche da laboratori dotati di medio budget.
Applicazione dei microarray alla
genomica funzionale di patata
Già negli anni precedenti al completamento della
prima sequenza genomica di patata (2010), l’estesa sintenia fra i genomi delle due più importanti
Solanacee aveva consentito ai ricercatori di utilizzare alcune risorse sviluppate in seguito al sequenziamento del genoma di pomodoro, già portato a
termine. Uno di questi strumenti, commercializzato
da Affymetryx, il Gene Chip Tomato Array, contenente 10.000 geni espressi ed annotati di pomodoro,
è stato utilizzato dal gruppo del CRA.-CIN (Centro
di Ricerca per le Colture Industriali) di Bologna che
lavorava sul fenomeno dell’addolcimento dei tuberi in seguito a frigoconservazione, elaborando un
algoritmo che era in grado di correggere in parte i
mismatch di ibridazione dovuti alle differenze fra le
sequenze di pomodoro e quelle di patata 7.
L’aumento esponenziale del numero di sequenze
omologhe di patata presenti nelle banche dati internazionali, ha portato tuttavia ben presto all’avvento
di microarray omologhi, cioè costituiti da sequenze
14
effettivamente di S. tuberosum, per studi di genotipizzazione e di genomica funzionale, utilizzando entrambe le tipologie di chip (a cDNA e ad oligo), a partire dal 2005. I primi microarray di patata sono stati a
cDNA, inizialmente con poche migliaia di feature (le
sequenze target fissate al vetrino e sulle quali avviene l’ibridazione), e miravano ad individuare i geni di
patata differenzialmente espressi durante lo sviluppo dei tuberi 8. Successivamente, per l’analisi degli
eventi trascrizionali associati alla formazione del tubero, è stato utilizzato un’evoluzione di questo primo
chip, un microarray ad oligo 60-mer, complementari
a 44000 sequenze unigene di patata, array che è stato
denominato POCI (Potato Oligo Chip Initiative 9).
Anche un gruppo inglese dello Scottish Crop Research Institute (SCRI), parte del consorzio PSGC, ha
utilizzato il microarray POCI per un’analisi genomewide dei geni che influenzano la qualità dei tuberi,
ed in particolare il sapore, la tessitura, il contenuto
di carotenoidi e la precocità di maturazione 10. In
questo lavoro, sono stati comparati due genotipi di
S. tuberosum appartenenti al gruppo Phureja, e due
al gruppo Tuberosum, ottenuti in campo in due diverse annate. L’obiettivo era attribuire ai geni del
gruppo Phureja o Tuberosum che mostravano maggiore variazione nel confronto, un possibile ruolo
nel determinismo dei caratteri associabili alla qualità. In questo lavoro nella prima annata, 2075 geni
risultarono significativamente regolati (meno del 5%
delle sequenze rappresentate sul chip), e nella seconda questo numero scese a 1386 (circa il 3%).
Questi dati mettono in evidenza la grande variazione che si riscontra quando si esamina il trascrittoma
di materiale maturato in condizioni di pieno campo,
e il fortissimo effetto dell’annata pur in presenza di
materiale geneticamente omogeneo. I geni consistentemente up-regolati nel gruppo Phureja rispetto
al Tuberosum, risultarono 309, e 555 quelli down-regolati. Questi importanti dati portano a considerare
quanto relativamente limitato sia il numero di geni
che distinguono due gruppi di accessioni (Phureja e
Tuberosum), nonostante le grandi differenze morfologiche e funzionali che le caratterizzano.
Il lavoro che viene qui presentato, svolto nell’ambito del progetto TIPIPAPA (tipizzazione e caratterizzazione di varietà precoci di patata con l’impiego di
tecniche molecolari e spettroscopiche) ha cercato di
applicare per la prima volta un potente strumento per
lo studio della trascrittomica della patata, il microarray POCI da circa 44000 sonde, alla caratterizzazione
del luogo di coltivazione (località e regione) di alcune
Marzo 2012
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Tabella I. — Varietà, regioni e località di coltivazione che sono state confrontate a coppie per l’analisi dell’espressione genica
con il microarray POCI 44 K.
Codice
SP-P A
SP-P C
SG-P B
SG-P D
SG-P F
SP-S C
SP-S L
SG-S E
09-SP-P I
09-SP-S B
09-SP-P A
09-SG S F
09-SG P C
09-SG P D
09-SG S I
Varietà
Regione
Zona
Località
Annata
Spunta
Spunta
Sieglinde
Sieglinde
Sieglinde
Spunta
Spunta
Sieglinde
Spunta
Spunta
Spunta
Siegliende
Siegliende
Siegliende
Siegliende
Puglia
Puglia
Puglia
Puglia
Puglia
Sicilia
Sicilia
Sicilia
Puglia
Sicilia
Puglia
Sicilia
Puglia
Puglia
Sicilia
Mola (BA)
Conversano (BA)
Mola (BA)
Conversano (BA)
Manfredonia (FG)
Siracusa (SR)
Santa Venerina (CT)
Monforte Marina (ME)
Mola (BA)
Siracusa
Alliste (LE)
Torregrotta (ME)
Alliste (LE)
S.Ferdinando (BAT)
Giarre (CT)
Cozze
Margiotta
Cozze
Margiotta
Sciali
Cassibile
Noce Don Gerolamo
Cavaliere
Cozze
Cassibile
Chianchi
Scala
Cisternella
S.Ferdinando
Giarre
2008
2008
2008
2008
2008
2008
2008
2008
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
varietà di patata comunemente utilizzate in ciclo precoce in Italia meridionale. L’obiettivo è la valutazione
della possibilità di utilizzare il microarray POCI per
monitorare l’espressione di determinati geni, gruppi,
o categorie funzionali di geni, per distinguere, a parità
di varietà, gli effetti di modulazione dell’espressione
dei geni che siano specifici per i diversi luoghi di coltivazione. L’ipotesi è che la coltivazione della patata
precoce in diversi siti implichi l’esperienza, da parte
della coltura, di tutta una serie di stimoli ambientali
in grado di innescare risposte differenziate e caratteristiche, e che se tali stimoli si rivelassero sufficientemente costanti e riproducibili nelle diverse annate,
tali risposte a livello di trascrittoma potrebbero essere
proposte come strumento di identificazione del luogo
di coltivazione. Ciò permetterebbe la messa a punto di un interessante strumento analitico di contrasto
alle frodi alimentari o di monitoraggio del flusso delle
merci. L’analisi che verrà descritta, dati gli elevati costi,
si è limitata a due varietà coltivate in diverse località
delle regioni Puglia e Sicilia, ed in due diverse annate
di raccolta, il 2008 ed il 2009.
Materiali e metodi
Materiale analizzato
I risultati ottenuti saranno descritti separatamente
per le due annate, il 2008 e il 2009. In entrambi gli
anni i tuberi delle varietà considerate sono stati raccolti a maturità in aziende delle località indicate in
Tabella I, e immediatamente liofilizzati e conservati
a -80 °C fino all’estrazione dell’RNA.
Estrazione dell’RNA
Sono stati utilizzati per l’estrazione di RNA totale 50-100 mg di liofilizzato ottenuto dai tuberi, utilizzando un protocollo specifico di estrazione da
materiale liofilizzato 10. Qualità, quantità e purezza dell’RNA totale sono stati verificati con Agilent
2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Palo Alto,
CA, USA) e lo spettrofotometro NanoDrop (Thermo
Scientific, Wilmington, DE, USA).
L’RNA messaggero è stato amplificato con il kit
Amino Allyl Message Amp II (Ambion, Austin, TX,
USA) seguendo il protocollo allegato: in breve, l’RNA
messaggero è stato retrotrascritto a cDNA a singolo
filamento e, dopo la sintesi del secondo filamento,
trascritto in vitro ad aaRNA (amminoallil antisenso
RNA). Durante la fase di trascrizione/amplificazione
è stato aggiunto un nucleotide amminoallil modificato al 50% (aaUTP). Sia il cDNA a doppio filamento
sia l’aaRNA sono stati purificati su membrane silicee
fornite dal kit stesso. Efficienza di amplificazione e
qualità dell’aaRNA sono stati verificati con il Bioanalyzer e il NanoDrop.
Cinque ug di aaRNA di campione sono stati marcati con la cianina Cy3 (Amersham Biosciences,
Buckinghamshire, UK), avente un gruppo chimico
capace di legarsi covalentemente all’aaRNA e l’efficienza della marcatura (marcatura indiretta) è stata
valutata con il NanoDrop.
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ONOFRI
Figura 2. — A) Il chip POCI della Agilent. Ogni vetrino è composto da 4 array rappresentanti 44000 sequenze di patata, e può essere ibridato con un campione diverso; B) la ripartizione in categorie funzionali mediante Gene Ontology delle sequenze rappresentate sul chip
POCI.
Il microarray POCI
In questo lavoro è stato utilizzato un oligo microarray POCI 4x44K (Figura 2A), sviluppato dal PSGC
e commercializzato a partire dal marzo 2010 da Agilent. È stato disegnato a partire da una collezione di
246.182 sequenze di patata disponibili nella banche
dati, e che sono state assemblate in 46345 unigenes.
Nei casi in cui la funzione putativa delle sequenze
presenti sul POCI sia nota, è disponibile un’annotazione funzionale e una categorizzazione per processo biologico (Figura 2B).
L’ibridazione dei campioni marcati sull’oligo glass
array è avvenuta in rotazione (10 rpm), a temperatura controllata (65 °C) per 17 ore. I vetrini sono stati
lavati seguendo la procedura di lavaggio Agilent e
scannerizzati con lo scanner a doppio laser G2505B
(Agilent Technologies).
Per ogni esperimento è stato eseguito un replicato
tecnico. L’intensità di fluorescenza per ogni singola sonda è stata rilevata, con l’intensità del segnale
che risulta proporzionale alla quantità di RNA legata
alla sonda. Per il nostro studio è stato impiegato il
protocollo one-color assay che prevede per ogni array l’ibridazione di un unico campione marcato con
un solo fluorocromo; ciò permette di confrontare
l’espressione genica di un campione con quella di
16
vari campioni diversi e non con quella di un unico
campione come nel caso del two-color assay. Ogni
campione, tuttavia, è stato ibridato a due array di
due vetrini diversi, per valutare la riproducibilità ed
ottenere valori medi che tengano conto dell’eventuale variabilità tecnica sui dati ottenuti.
Analisi dei dati
In seguito all’ibridazione e ai lavaggi, gli array
POCI sono stati scansionati con lo scanner Agilent a
doppio laser, versione B (G2505B, Agilent Technologies) Le immagini sono state analizzate utilizzando
il software Feature Extraction (Agilent Technologies)
versione 9.5.
I dati grezzi sono stati processati con il software
Bioconductor (www.bioconductor.org 11) nell’ambiente statistico R, applicando il metodo normexp
per la correzione del background e quantile come
metodo di normalizzazione tra gli array. Il pacchetto
LIMMA (LInear Models for MicroArray data) è stato utilizzato per identificare i geni differenzialmente
espressi nelle varie condizioni, applicando un filtro
sul logaritmo in base 2 del Fold Change (>1 per i
geni up-regolati e ≤1 per i geni down-regolati) e sulla statistica B corretta per i test multipli (>2).
I dati finali dell’intensità di fluorescenza di ogni
Marzo 2012
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campione ibridato su un array, nella procedura onecolor, possono essere utilizzati per diversi tipi di
confronto, ed espressi come fold change del campione scelto come ‘test’ rispetto al campione scelto
come reference; nel nostro lavoro sono stati considerati geni differenzialmente espressi quelli per
cui il valore di fold change era maggiore di 2 (geni
up-regolati) o minore di -2 (geni down-regolati).
È applicato un filtro anche alla statistica B corretta
per test multipli (>2). I risultati, quindi, non sono
espressi come valore assoluto dell’espressione genica, ma sempre come espressione relativa, fra coppie
di campioni a confronto.
Risultati
In primo luogo va sottolineato che tutte le informazioni ottenibili sulla regolazione dei geni nei diversi confronti si riferiscono all’espressione genica in
tuberi maturi, e dormienti. Secondariamente è stato
osservato che un numero variabile da 34524 a 39533
sonde del chip davano segnali positivi e significativamente al di sopra della soglia del background, numeri che corrispondono rispettivamente al 75-85% delle
feature presenti sul vetrino. La relativa costanza di
questa percentuale nelle varie ibridazioni, nel corso
delle prove di entrambi gli anni e per tutti i confronti,
permette di ritenere il numero di geni valutato come
differenzialmente espresso come affidabile. In altre
parole, le forti fluttuazioni osservate nel numero di
geni differenzialmente espressi nei vari confronti effettuati, non possono essere ascritte a diversità importanti nell’efficienza di ibridazione di ciascun RNA al
suo array. Questa informazione permette di valutare
comparativamente in maniera affidabile tutte le coppie di confronti di seguito considerate.
Confronto fra i campioni del 2008
Nella Tabella II sono sintetizzate le statistiche dei
confronti effettuati sui campioni 2008 fra alcune coppie di località e/o varietà. L’obiettivo di questo confronto di tipo quantitativo era verificare quale dei tre
fattori considerati (varietà, regione e località) avesse
l’effetto maggiore nel modulare l’espressione genica genome-wide, come osservabile mediante l’array
POCI. Dai dati del 2008, e senza ancora considerare
quali geni vengano modulati, emergono alcune informazioni preliminari. In primo luogo, il massimo
numero di geni differenzialmente espressi più di 2
volte (up- o down-regolati), è stato in questa prima
Tabella II. — Riassunto del numero di geni differenzialmente espressi (>2 o <2) osservati nei diversi confronti effettuati.
Tipo di confronto
Confronto
N. geni differenzialmente espressi
Media
2008
Fra varietà
Spunta vs. Sieglinde
Fra regioni
Puglia vs. Sicilia
Fra località
Fra varietà
Spunta vs. Sieglinde
Puglia vs. Sicilia
Fra regioni
Fra località
Cozze, Puglia
Margiotta, Puglia
Spunta - Cozze (P) vs. Cassibile (S)
Spunta - Margiotta (P) vs. Cassibile (S)
Spunta – Cozze (P) vs. Noce (S)
Spunta - Margiotta (P) vs. Noce (S)
Sieglinde - Cozze (P) vs. Cavaliere (S)
Sieglinde - Margiotta (P) vs. Cavaliere (S)
Sieglinde – Sciali (P) vs. Cavaliere (S)
Spunta - Cozze (P) vs. Margiotta (P)
Sieglinde - Cozze (P) vs. Margiotta (P)
Spunta – Noce (S) vs. Cassibile (S)
Sieglinde – Cozze (P) vs. Sciali (P)
Sieglinde – Margiotta (P) vs. Sciali (P)
2009
Cassibile, Sicilia
Spunta-Cozze (P) vs. Cassibile (S)
Spunta-Cassibile (S) vs. Chianchi (P)
Siegliende-Cisternella (P) vs. Giarre (S)
Siegliende-S. Ferdinando (P) 1 vs. Giarre (S)
Siegliende-S. Ferdinando (P) 2 vs. Giarre (S)
Spunta-Cozze (P) vs. Chianchi (P)
Siegliende-Cisternella (P) vs. S. Ferdinando (P)
520
394
219
76
40
55
69
48
96
26
8
21
41
37
1070
1991
698
859
1954
1274
3696
2047
457
86
26
1355
2871
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ONOFRI
annata sorprendentemente limitato: 520 è stato il
massimo numero osservato, per il confronto fra due
varietà, Spunta e Sieglinde, entrambe coltivate in località Cozze, in Puglia. Anche il confronto varietale
Spunta-Sieglinde in un’altra località, Margiotta, Puglia,
risulta in 394 geni differenzialmente espressi in modo
significativo ed al di sopra della soglia di 2 x. Dai
dati del 2008 presi nel loro insieme, appare quindi
che le differenze fra varietà (sezione superiore della
Tabella II) giustifichino la maggior parte della modulazione dell’espressione dei geni che si può osservare; minore il numero di geni modulati (40-219) che
si osservano confrontando le stesse varietà coltivate
in regioni diverse (sezione intermedia in Tabella II).
Infine, l’effetto della località (a parità quindi di varietà
e regione considerata) appare praticamente trascurabile (anche se potenzialmente importante ai fini della
caratterizzazione geografica del luogo di coltivazione), modulando soltanto 8-41 geni, a seconda delle
località considerate, quindi meno dello 0,1% dei geni
monitorati (sezione inferiore della Tabella II).
Per valutare la possibilità di caratterizzare il luogo
o la regione di coltivazione mediante l’identificazione di uno specifico set di geni regolato rispetto ad
una delle località utilizzate come riferimento, è utile
avere una categorizzazione dei geni che mostrano
significativa up- o down-regolazione nei vari confronti ed individuare un eventuale gruppo di geni
costantemente regolati in diversi confronti, e la loro
funzione putativa. I geni regolati nei vari confronti
del 2008 sono perciò stato categorizzati in base ad
una “gene ontology” predefinita, ed i risultati sono
riassunti in Figura 3. Nel considerare la heat map di
cui è composta questa figura, non va dimenticato
che le zone rosse o verdi sono di fatto equivalenti, in quanto un gruppo di geni che viene definito
come “up-regolato” in un confronto ad esempio fra
Sieglinde rispetto a Spunta, si definirebbe “downregolato” confrontando Sieglinde rispetto a Spunta;
in realtà anche le zone bianche corrispondono a
categorie funzionali non interamente indotte o represse, ma in cui un numero pressappoco uguale di
geni è up- o down-regolato, ma pur sempre regolato. Di conseguenza, ciò che è rilevante in queste
heat maps è la presenza di zone rosse (maggioranza
di geni afferenti a quella categoria funzionale up-regolati) o verdi (maggioranza down-regolata nel confronto), ed in misura minore bianche (uguale quantità di geni indotti e repressi nella categoria), rispetto
a quelle grigie (che segnalano mancata regolazione
di praticamente tutti i geni di quella categoria).
18
Come si può notare nella parte destra della tavola
di Figura 3, dove sono riassunti i confronti fra località diverse delle stesse regioni e varietà, le classi
metaboliche di geni che non variano sono la maggioranza (zone grigie). È interessante peraltro notare
come in quasi tutti i confronti che riguardano due
località, a parità di varietà e regione, il gruppo di
geni afferenti al metabolismo secondario e alla risposta agli stress venga quasi sempre regolato, suggerendo che gli effetti maggiori della località siano
soprattutto legati a situazioni contingenti di stress
cui le colture si trovano a far fronte più che a fattori
costitutivi. Ancora da notare il fatto che, come atteso, nel confronto fra le due varietà (sezione sinistra
della tavola), siano sempre regolate quasi tutte le
categorie, e nella maggior parte dei casi in maniera concorde in un senso o nell’altro (zone rosse e
verdi), ed in una minoranza di casi in maniera disuguale, parte indotta e parte repressa (zone bianche). Solo nel confronto fra Spunta e Sieglinde in
una specifica località, due categorie funzionali (di
cui una, Other, onnicomprensiva) non sono risultate
regolate. In qualche modo, il fatto che la maggioranza dei geni sia significativamente regolata in tutte
le categorie funzionali per entrambi in confronti fra
varietà, rafforza la nozione che le differenze varietali
sono risultate ben più importanti di quelle dovute
all’ambiente di coltivazione. Inoltre, i geni che appaiono differenzialmente regolati fra le varietà (Tabella
II) risultano uniformemente distribuiti in tutte le categorie funzionali, mentre per esempio i geni collegati alla crescita cellulare e ai processi biosintetici,
sono in quasi tutti i confronti fra regioni e località
non regolati (righe 3 e 18 rispettivamente della heat
map), come atteso da tuberi maturati contemporaneamente ed in condizione di dormienza.
Come si nota dalla Figura 3, sono anche molto numerosi i geni che vengono segnalati come regolati, ma
che non trovano omologhi funzionali in nessuna banca
dati (no hits found) oppure anche perché gli omologhi
hanno funzione sconosciuta (not assigned). Il limite
nell’uso di uno strumento come il microarray risiede
nel fatto quindi che, pur essendo stato interamente
sequenziato il genoma di patata, la sua annotazione
funzionale non è ancora completa. Di conseguenza, i
dati ottenibili con questi confronti sono moltissimi, e
richiederebbero di analizzare in dettaglio tutti questi
geni sconosciuti ma potenzialmente importanti.
L’analisi sui campioni 2008 si è poi rivolta ad individuare quali fossero specificatamente i geni che
mostravano la regolazione maggiormente alterata in
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Figura 3. — A) “Heat map” delle classi di geni up-, down- e non regolati nei diversi confronti effettuati nel 2008; B) “Heat map” delle classi
di geni up-, down- e non regolati nei diversi confronti effettuati nel 2009.
19
ONOFRI
senso positivo o negativo tra i confronti considerati,
nell’ipotesi che l’attività di questi geni, se riproducibile fra le annate, possa fare da “marcatore” del
luogo di coltivazione. Un’altra informazione di interesse è rappresentata da quali geni siano sempre
regolati, ogni volta che si confrontano ad esempio
diverse varietà, o diverse località, nell’ipotesi che ci
siano marcatori “funzionali” costanti della varietà o
del luogo di coltivazione. Questi geni che si sono
mostrati differenzialmente espressi in tutti i confron-
ti di un determinato tipo (es. fra varietà, fra regioni,
o fra località) sono elencati, con la loro annotazione
funzionale quando disponibile, in Tabella III. Alcune indicazioni possono essere di interesse preliminare, dato che alcuni geni differenzialmente regolati
sono correlabili in parte con alcune caratteristiche
qualitative del tubero. Così, in tutti e tre confronti fra
regioni in cui la cv. Sieglinde è stata confrontata con
quella coltivata in Puglia, si è sempre osservata la repressione del gene codificante per la endo-1,4-beta
Tabella III. — Geni che vengono regolati in tutti i confronti dello stesso tipo effettuati. Le colonne riportano, da sinistra: il codice
della sequenza, l’annotazione funzionale del gene, la classe metabolica cui il gene afferisce, il tipo di confronto in cui il gene
è risultato concordemente regolato in tutti i test, ed il numero di confronti effettuati. Tutti i dati si riferiscono all’annata 2008.
Sequence Id. number
Gene Description
Gene Function
bf_mxlfxxxx_0019g05.t3m.scf_191
MICRO.16550.C1_898
MICRO.173.C3_1624
MICR0.1759.C2_736
STMIV448TV_295
No hits found
Anthocyanin-1
Nuclear RNA binding protein
Salutaridinol 70 acetyltransferase
No hits found
Flavonoid biosynthesis
RNA metabolism
Alkaloid biosynthesis
-
bf_aarayxxx_0017b11.t3m-scf_490
MICRO.3274.C2_942
No hits found
No hits found
Xyloglucan endo 1,4 beta
D-glucanase
Calmodulin
Ferredoxin
Heat shock transcription factor
Putative splicing factor
-
Cell wall modelling in
response to mycotic
infection
MICRO.37.C15_1570
MICRO.37.C8_561
MICRO.7884.C2_509
1,3-beta.glucan glucanhydrolase
(synonym)
acidic class II 1,3-beta-glucanase
precursor
glucan endo-1,3-beta-Dglucosidase
pathogenesis related protein
isoform b1
elongation factor 1-alfa
elongation factor 1-alfa
protein kinase-like protein
140F10AF.esd_564
putative AIM1 protein
MICRO.6399.C1_8211
bf_ivrootxx_0017b02.t3m.scf_21
MICRO.11295.C1_530
MICRO.4263.C4_419
POCBO55TP_58
MICRO.2286.C17_1144
MICRO.2286.C42_636
MICRO.6187.C1_994
MICRO.5426.C4_487
bf_suspxxxx_0055c04.t3m.scf_ 379
MICRO.3400.C3_926
STMDF03TV_242
MICRO.15401.C1_1040
MICRO.9976.C1_672
MICRO.1081.C35_1065
MICRO.13081.C3 473
Doen-regulated gene
20
Cell wall metabolism
Signal transduction
Electron transport chain
Stress response
RNA metabolism
Response to biotic stress
Comparison type
n. of confrontations
Different Varieties
Same location
2
cv. Spunta
Same Variety
Different Regions
3
cv. Siegliende
grown in Apulia
Same variety
Same region
Different Locations
2
cv. Siegliende
grown in
Conversano
Same variety
Same region
Different Locations
2
cv. Siegliende
grown in Sciali
Protein translation
Signal transduction
Lipid metabolism (betaoxydation)
Protein degradation (seringlucose acyltransferase
protease activity)
Protein degradation
SKP1-like protein
ubiquitin-dependent
60S ribosomal protein L1
Protein translation
short-chain dehydrogenase/
Generation of energy
reductase (SDR) family protein metabolism precursors
unknown (Arabidopsis thaliana) No hits Found
unknown (Lycopersicon
esculentum)
Up-regulated gene.
Marzo 2012
D-glucanasi, un enzima coinvolto nella sintesi e nel
modellamento delle pareti cellulari, putativamente
in grado di influenzare la consistenza e tessitura dei
tuberi 12; nei confronti con la cv. Sieglinde coltivata a Sciali (Puglia), si è sistematicamente osservata,
nelle altre località della stessa regione, un’induzione
del gene per una putativa proteina AIM1, che gioca
un ruolo nella beta-ossidazione degli acidi grassi e
nello sviluppo dell’ aroma e del gusto dei tuberi 13.
Sulla base di questi dati preliminari, si è poi considerato l’effetto, presumibilmente molto grande, delle
annate di coltivazione sulla regolazione differenziale
di questi geni e classi di geni. Sfortunatamente, le
vere repliche biologiche fra il 2008 ed il 2009 sono
state molto limitate, e i confronti fra annate hanno
quindi solo un valore relativo.
Confronto fra i campioni del 2009
In Tabella II sono sintetizzati quantitativamente i
risultati dei confronti che è stato possibile fare nel
2009. Va sottolineato che nessuno dei confronti effettuati costituisce di fatto la replica esatta di quelli
del 2008; ciò perché il materiale utilizzato in questo
lavoro è quello effettivamente coltivato in aziende
non sperimentali nei vari siti.
Il confronto fra due varietà (le stesse utilizzate nel
2008, anche se la località e la regione di coltura era
diversa) mostra che 1070 geni sono differenzialmente espressi in maniera significativa. Questo numero
è nettamente più alto di quello osservato nel 2008
(457 in media) ma comunque dello stesso ordine di
grandezza. Tuttavia, l’effetto dell’annata risulta preponderante rispetto ad ogni altra differenza; infatti,
come si può vedere dalla Figura 3B, le categorie di
geni differenzialmente espressi fra le varietà a parità
di località sono la maggioranza, come nel 2008, ma
le classi non regolate non sono le stesse dell’annata
precedente, il che suggerisce che la maggior parte
delle up- o down-regolazioni che si osservano siano dovute a condizioni contingenti quali presenza
di stress localizzati o risposte a condizioni ambientali diverse, più che a reali differenze strutturali che
concorrano alla specificità della varietà. L’estrema
dipendenza dell’ espressione genica da fattori legati
all’annata è confermata dal numero di geni differenzialmente regolati nel confronto fra regioni (Tabella
II), che nel 2008 erano in media appena 86, mentre
nel 2009 risultano oltre 1300. Tale grande variazione può essere in parte ascritta al fatto che si stanno
osservando confronti fra località per la maggioranza
ONOFRI
non ripetuti nei due anni; tuttavia anche nell’unico
caso in cui si utilizza la stessa varietà (Spunta) per un
confronto fra le stesse località e regioni nelle due annate (Cozze, Puglia vs. Cassibile, Sicilia, 2008 e 2009)
la differenza nel numero di geni regolati è molto marcata (219 nel 2008 e 1991 nel 2009). Inoltre, come si
osserva dalla Tabella II, l’effetto delle località, che nel
2008 sembrava molto limitato, nel 2009 è al contrario
quello che provoca un maggior numero di importanti regolazioni dell’espressione genica, come si può
notare anche dall’assenza delle zone grigie (classi di
geni non regolate) nella sezione più a destra di Figura 3B in confronto alla Figura 3A, dove erano invece
la maggioranza. Nel 2009 rispetto al 2008, in sintesi, sembra aver avuto molta più importanza il fattore
località nell’induzione/repressione di geni del tubero maturo. Questo è probabilmente legato a fattori
climatici o epidemiologici, che quindi interferiscono
pesantemente con la possibilità di individuare in maniera riproducibile geni o classi di geni regolati in
risposta alle condizioni locali di coltivazione.
Conclusioni
Dalle esperienze fatte con l’uso del microarray
POCI 4X44K per l’analisi dell’espressione genica in
tuberi maturi e dormienti di patata, si possono trarre alcune conclusioni preliminari ed alcuni suggerimenti sul possibile proseguimento del lavoro.
In primo luogo, dal momento che l’effetto dell’annata è assolutamente preponderante su effetti strettamente genetici come quelli legati a differenze varietali, è evidente che per “calibrare” uno strumento
basato sulla trascrittomica in grado di individuare
caratteristiche legate al luogo di coltivazione, occorre analizzare dati per un numero di annate sufficiente a “neutralizzare” la variabilità legata a tale dato,
non interessante ai fini della tipizzazione. Questo
problema è particolarmente importante per l’analisi
di espressione, in quanto altri livelli di analisi quali
quella del metaboloma dei tuberi di patata non risentono così tanto delle fluttuazioni ambientali, in
quanto solo una limitata percentuale delle variazioni nei trascritti si traduce poi in un fenotipo finale
variante e stabile a maturità; la maggior parte delle
variazioni a livello di mRNA non ha infatti necessariamente effetti fenotipici e qualitativi visibili a livello di metaboliti. L’estrema sensibilità dell’analisi a
livello trascrizionale, evidenziato anche dai risultati
riportati, rende difficilmente utilizzabile l’impiego di
21
ONOFRI
queste tecniche, tradizionalmente utili in ricerche
svolte in ambiente controllato, su materiali di campo, a meno di non aver svolto una prolungata analisi
dell’effetto dell’annata sulla trascrizione genica.
A parte i limiti di cui si è discusso, è evidente che
la stessa sensibilità che può costituire un problema,
è anche una risorsa in quanto la massa di dati ottenibili per ciascuna condizione analizzata (varietà, regione, località) costituisce un patrimonio di informazioni il cui accumulo nel tempo potrà davvero fornire
un quadro interessantissimo della risposta, a livello
dell’espressione genica, dei tuberi alle condizioni ambientali nelle quali maturano. Basti considerare che
per ogni coppia di confronti effettuati in questo lavoro, sono stati ottenuti dati relativi a circa 42000 geni
di patata, molte delle quali a funzione ignota e potenzialmente importanti nella risposta all’ambiente della
pianta. Una via per l’utilizzazione di questi dati è la
costituzione di database di sequenze espresse nelle
varie località il cui prodotto si voglia tipizzare; ma,
soprattutto, la possibilità di incrociare ed integrare i
dati di espressione come quelli qui descritti, con i
dati relativi al profilo proteico e metabolico dei tuberi
maturati nelle stesse condizioni, in modo da costituire
un profilo unico di ciascuna combinazione fra varietà
e luogo di origine del prodotto.
Un altro elemento da prendere in considerazione
per valutare l’analisi del trascrittoma mediante microarray come elemento di caratterizzazione della
patata, è che i confronti sono stati effettuati su tuberi
maturi e dormienti; da notare che, almeno nel materiale del 2009, il numero di geni differenzialmente
espressi è stato comparabile a quello riportato da
Ducreux et al. (2008), ma che in ogni caso il numero di geni che mostra regolazione è piuttosto basso rispetto al numero di sequenze rappresentate sul
microarray (intorno al 4-5% al massimo). Questo è
probabilmente dovuto al fatto che si sono esaminati
tuberi dormienti, e che forse per questo specifico
livello di analisi, una fase pre-maturità, durante la
quale il tubero in sviluppo potrebbe essere maggiormente influenzato da specifiche condizioni ambientali, potrebbe essere più indicata di un’analisi dei
trascritti di un tubero ormai entrato in dormienza.
Questa ulteriore possibilità andrà monitorata nel lavoro futuro, confrontando una stessa varietà in due
diverse località, ben caratterizzate nelle loro differenze climatiche ambientali e pedologiche, in almeno 2 o 3 fasi dello sviluppo del tubero prima della
maturazione; è possibile che la regolazione di geni
che governano l’accrescimento ed il riempimento
22
del tubero, ovviamente esclusi dall’analisi effettuata
su tuberi maturi, possa fornire indicazioni più utili ai
fini di una caratterizzazione geografica.
L’analisi di espressione genica fornisce dunque un
prezioso supporto ad altre modalità di analisi del
prodotto tubero, ma la sua complessità è tale da
richiedere attente indagini preliminari, ripetute in
molte annate ed in diverse e ben caratterizzate condizioni ambientali.
Bibliografia
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13. Fischer RL, Bennett AB. Role of cell wall hydrolases in fruit ripening. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 1991;42:675-703.
Finanziamenti.—Lavoro svolto con il finanziamento del MiPAF per il
progetto TIPIPAPA (Tipicizzazione e caratterizzazione di varietà precoci
di patata con l’impiego di tecniche molecolari e spettroscopiche).
Marzo 2012
Progettazione e sintesi di DNA ricombinante
come standard per la determinazione quantitativa
di ingredienti geneticamente modificati in alimenti
A. CIRILLO, S. DEL GAUDIO, G. DI BERNARDO, F. GAGLIONE, U. GALDERISI, M. CIPOLLARO
L
Sezione di Biotecnologie e Biologia Molecolare “A. Cascino”
Dipartimento di Medicina Sperimentale
Seconda Università degli Studi di Napoli, Napoli, Italia
Autore di contatto: G. Di Bernardo, Sezione di Biotecnologie e Biologia Molecolare “A. Cascino”,Dipartimento di Medicina Sperimentale,
Seconda Università degli Studi di Napoli, Via Costantinopoli 16, 80138
Napoli, Italia. E-mail: [email protected]
tore plasmidico in cui sono integrate differenti sequenze bersaglio quali le sequenze transgeniche e
quelle del gene endogeno di riferimento 4. L’impiego di DNA ricombinante come standard rappresenta
un’interessante innovazione nell’ambito della certificazione OGM. In letteratura sono, infatti, presenti
diversi lavori 4-7 che hanno come scopo la sintesi e
l’utilizzo di questi calibratori, testimoniando il notevole interesse per questo argomento. Innanzitutto il
DNA plasmidico può essere prodotto in quantità illimitata attraverso il clonaggio in cellule batteriche. Le
collaudate procedure di estrazione e conservazione
consentono di ottenere un DNA altamente purificato
e di poter costruire curve di calibrazione in un qualunque intervallo di concentrazione. La possibilità
di effettuare un’analisi quantitativa anche nei casi
in cui non siano disponibili gli standard certificati
dall’IRMM costituisce il vantaggio maggiore offerto
da queste molecole.
In questo lavoro viene descritta la progettazione
e realizzazione di un calibratore plasmidico per la
quantificazione della patata EH92-527-1, unica varietà di patata GM ammessa alla commercializzazione
in Europa, ottenuta dalla cultivar Prevalent, attraverso l’introduzione del gene “GBSS” (granule bond
starch syntase protein), deputato alla produzione di
amilosio. La varietà contiene il 98% di amilopectina
ed il 2% di amilosio contro l’85% di amilopectina ed
il 15% di amilosio della cultivar tradizionale, pertan-
’impiego di Organismi Geneticamente Modificati
(OGM) e di prodotti derivati da OGM nella catena alimentare è sottoposto a precise regolamentazioni in diversi paesi allo scopo di garantire la libertà di scelta dei consumatori. L’Unione Europea
ha reso obbligatoria l’etichettatura dei cibi nei casi
in cui in essi sia presente una percentuale maggiore
dello 0.9% di ingredienti geneticamente modificati
(Reg.1829/2003) 1. Lo sviluppo di metodi affidabili
per la quantificazione di OGM assume pertanto un
ruolo sempre crescente.
L’amplificazione del DNA attraverso PCR real
time 2 (reazione a catena della polimerasi in tempo
reale) costituisce attualmente l’analisi di elezione
per la rilevazione di OGM nelle matrici alimentari in quanto permette di sfruttare l’alta sensibilità
della metodica per ottenere la quantificazione del
contenuto di OGM 3.
Nelle reazioni di PCR real time, per la costruzione
delle curve di riferimento, vanno inclusi una serie
di calibratori che, di norma, sono costituiti dal DNA
estratto da farine ottenute dalle cultivar vegetali di
interesse, certificate dall’Istituto di Riferimento per
i Materiali e le Misure (IRMM, Belgio). L’impiego
di tali farine presenta, tuttavia, alcuni punti deboli:
innanzitutto la deperibilità dei materiali, il loro costo e l’impossibilità di reperire materiale certificato
per tutti gli eventi geneticamente modificati (GM).
Come calibratori alternativi si possono impiegare
molecole di DNA ricombinante costituite da un vet-
23
CIRILLO
PROGETTAZIONE E SINTESI DI DNA RICOMBINANTE
to il tubero GM, contenendo una minore quantità
di amilosio, si presta meglio alla lavorazione industriale.
Il calibratore plasmidico descritto in questo lavoro contiene in tandem due frammenti target (evento-specifico e specie-specifico) necessari per la determinazione quantitativa di EH92-527-1 attraverso
la PCR real time. La costruzione del tandem è stata
ottenuta utilizzando la tecnica della PCR overlapping 4 che prevede l’uso di primer progettati ad
hoc per ottenere ampliconi parzialmente complementari tra loro.
Nell’ambito della tracciabilità dei prodotti OGM
lungo la filiera produttiva è stato affrontato il problema della loro rilevabilità anche in prodotti lavorati.
Infatti, mentre l’amplificazione del DNA estratto da
matrici non lavorate (semi, foglie) o poco lavorate
(sfarinati) non presenta particolari problemi, l’analisi
dei prodotti lavorati risulta più difficoltosa poiché
i procedimenti meccanici, termici e chimici possono danneggiare il DNA causando idrolisi, depurinazione, cross-linking ed ossidazione 8. È stato anche
dimostrato 9, 10 che i metodi di estrazione possono
avere un effetto significativo sulla resa e sulla qualità
del DNA e che ciascuna matrice alimentare richiede,
pertanto, l’individuazione del metodo di estrazione
più appropriato o l’ottimizzazione di esso. La presenza di un DNA danneggiato e frammentato comporta una ridotta efficienza di amplificazione o, addirittura, l’impossibilità di rilevare le sequenze target
quando si utilizzano ingredienti processati o quando
questi ingredienti siano presenti in tracce. La strategia di preamplificazione, una tecnica di biologia
molecolare che consente di aumentare la sensibilità
della PCR Real time e conseguentemente il numero di target analizzabili in DNA estratti da alimenti
lavorati 11 è stata applicata alla rilevazione di OGM
in prodotti lavorati contenenti mais e/o soia con
l’obiettivo di risolvere le problematiche su esposte.
Metodi
Materiali e metodi
Estrazione
Materiali
Sono stati usati materiali di riferimento (SigmaAldrich St. Louis, UK) certificati dall’IRMM contenenti 100% (ERM-BF421b) e 0% (ERM-BF421a) di
farina di patata EH92-527-1, 5% (ERM-BF412f), 1%
(ERM-BF412d) e 0.1% (ERM-BF412b) di farina di
mais Bt11, 5% (ERM-BF410f), 1% (ERM-BF410d) e
24
0.1% (ERM-BF410b) di farina di soia RR. I campioni di controllo (GeMSU09A, GeMSU09B, GeMSU22A
e GeMSU22B) sono stati acquisiti presso il “Central
Science Laboratory”, (UK) nell’ambito del circuito
FAPAS (Proficiency testing schemes).
Le matrici alimentari (farina di soia, polenta, snack
salato, snack al mais, merendina alla frutta, pane di
soia, latte di soia) sono state reperite in negozi locali, ad eccezione del mix shake e dei semi di soia
tostati, forniti da un agente di vendita.
Primer e sonde TaqMan
Le sequenze dei primer e delle sonde TaqMan
(ADH1, LE1, p35S, tNOS, mais Bt11, soia RR)
sono quelle riportate nella norma UNI EN ISO
21570:2005 12. Le sequenze dei primer e delle sonde specifiche dell’evento transgenico EH92-527-1
sono suggerite dal protocollo di amplificazione
proposto dal Community Reference Laboratory
(CRL). I primer e le sonde TaqMan per l’amplificazione del gene endogeno UDP-glucose pyrophosphorylase (UGP-ase), per il gene codificante per
il tRNA della leucina (tRNA leu) e per la sequenza
codificante il terminatore del gene della nopalina
sintasi (tNOS) sono stati disegnati impiegando il
software Primer Express 5.0 (Applied Biosystems).
Il primer St527-r1- tail è stato progettato “ad hoc”
per la esecuzione della PCR overlapping.
Per la progettazione dei primer specifici per tLeu,
un gene plastidiale altamente conservato nelle specie vegetali, sono state allineate sequenze di mais,
soia, colza, grano, riso, cotone e patata. La presenza
di diversi polimorfismi nella sequenza compresa tra
i primer ha impedito la progettazione di una sonda
e pertanto l’amplificazione in PCR Real time di tLeu
è stata effettuata impiegando, in alternativa, l’intercalante aspecifico SYBR Green.
I primer e le sonde sono state preparate in parte
dalla ditta Eurofins MWG Operon, in parte dalla ditta Life Technologies.
del
DNA
Le matrici alimentari sono state polverizzate attraverso l’uso di mortaio e pestello in presenza di
azoto liquido. L’estrazione del DNA è stata effettuata
impiegando un metodo basato sull’utilizzo del bromuro di cetil-trimetilammonio (CTAB) secondo il
protocollo descritto in UNI EN ISO 21571:2005 13.
Tutte le estrazioni sono state condotte in duplica-
Marzo 2012
CIRILLO
to. La concentrazione del DNA è stata determinata
impiegando lo spettrofotometro Nanodrop ND1000
(Thermo Scientific, Wilmington, DE). L’integrità del
DNA estratto è stata verificata mediante corsa elettroforetica su gel di agarosio all’1% in TE (Tris-EDTA).
Realizzazione
del calibratore plasmidico:
PCR
over-
lapping
Amplificazione del DNA da farina di patata con
primer specie-specifici ed evento specifici.
Le reazioni di amplificazione dei frammenti target
nella prima fase della PCR sono state condotte impiegando 100ng di DNA estratto da farina di patata
100% OGM in un volume totale di 25 µl di una solu-
zione 3 mM MgCl2, 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl pH
9.0, 0.1% Triton X-100, 200 µM dNTP e 2.5 U di AmpliTaq Gold DNA Polymerase (Applied Biosystems)
(Figura 1).
Il primer St527-r1- tail è costituito, a partire
dall’estremità 5’, da 12 nucleotidi complementari ad
un tratto dell’estremità 5’ del primer UGPf e condivide poi la sequenza dei primi 15 nucleotidi del primer st 527-r, in modo tale che l’amplicone ottenuto
con i primer Event 527 bf1 e St527-r1-tail contenga
una sequenza complementare all’amplicone ottenuto con i primer UGPf e UGPr.
Dopo una fase di denaturazione iniziale del DNA
a 95 °C per 6 minuti, i 35 cicli di amplificazione
prevedono una fase di denaturazione a 95 °C per 45
Figura 1. — Schema semplificativo della reazione di PCR overlapping. In una prima reazione di PCR vengono amplificati separatamente
il frammento evento-specifico e quello specie-specifico. In una seconda reazione di PCR i prodotti della prima amplificazione vengono
miscelati in eguale quantità e sottoposti ad amplificazione. Il risultato è l’integrazione in tandem dei due ampliconi. Il riquadro rappresenta
uno stadio intermedio della seconda reazione di PCR in cui le estremità 3’ delle molecole ibride sono estese dalla Taq DNA polimerasi.
25
CIRILLO
secondi, una fase di annealing ed estensione a 60°C
per 45 secondi.
Le sequenze dei primer (evento-specifici) Event
527 bf1 e St527-r1- tail, dei primer (specie-specifici)
UGPf e UGPr diretti contro una porzione del gene
UGP-ase e le relative concentrazioni d’uso sono riportate in Tabella I, pannello A.
Blunt ending degli ampliconi.
Il trattamento con la T4 DNA polimerasi è stato
condotto in un volume totale di 100 µl di una soluzione 165 mM tris-acetato pH 7.9, 330 mM sodio
acetato, 50 mM DTT, 100 µM dNTP, 10 U T4 DNA
polimerasi (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) in presena di 3µl di prodotto di PCR. La miscela è stata incubata a 11°C per 15 minuti, in ghiaccio per 2 minuti
ed incubata a 75°C per 10 minuti per l’inattivazione
dell’enzima.
Integrazione in tandem dei frammenti specie-specifici ed evento specifici.
La reazione di amplificazione della seconda fase
della PCR overlapping è stata condotta in un volume
totale di 25 µl di una soluzione 1,5 mM MgCl2, 50 mM
KCl, 10 mM Tris-HCl pH 9.0, 0,1% Triton X-100, 200
µM dNTP, 0.2 µM di ciascun primer (Event 527bf1 ed
UGPr), 2,5 U di AmpliTaq Gold DNA Polymerase (Applied Biosystems) in presenza di 0,5 µl del prodotto di
PCR ottenuto per l’amplificazione del gene endogeno
UGP-ase e 0,5 µl del prodotto di PCR evento-specifico
dopo trattamento con T4 DNA polimerasi. Dopo una
fase di denaturazione iniziale del DNA a 95 °C per 6
minuti, i 40 cicli di amplificazione prevedono una fase
di denaturazione a 95 °C per 45 secondi, una fase di
annealing ed estensione a 60 °C per 45 secondi.
La dimensione attesa dell’amplicone è di 196 bp.
Tabella I. — Sequenze dei primer e delle sonde utilizzate per la realizzazione del calibratore plasmidico (Pannello A) e per la
preamplificazione (Pannello B). Da sinistra a destra troviamo il target, il nome del primer e della sonda, le sequenze, le concentrazioni d’uso e le dimensioni attese dell’amplicone.
Target
Pannello A
UGP-ase
Evento EH92-527-1
Pannello B
Leu tRNA
ADH1
LE1
p35S
tNOS
Evento Bt11
Costrutto RR
26
Primer e sonda
Sequenza
Concentrazione (nM)
UGP f
UGPr
UGP probe
Event 527 bf1
St527-r1
St527-S1
St527-r1- tail
5’-TGGCCTCTGTGGTGGACAA-3’
5’-TCTCTTCACATGTCCAAACCATCT-3’
5’-VIC-CTGAGGGAAGCGAGACT-BHQ-3’
5’-GTGTCAAAACACAATTTACAGCA-3’
5’-TCCCTTAATTCTCCGCTCATGA-3’
5’-FAM-AGATTGTCGTTTCCCGCCTTCAGTT-TAMRA-3’
5’-CCACAGAGGCCATCCCTTATTCTCCG-3’
900
300
100
900
900
160
100
tLeu F
tLeu R
ADH F3
ADH R4
ADH1-MDO
GM1-F
GM1-R
Sonda GM1
35S-F
35S-R
35S-TMP
tNOS-F
tNOS-R
Sonda tNOS
Bt11 3JF
Bt11 3JR
Bt11 3JFT
RR1-F
RR1-R
Sonda RR1
5’-TCCAAATTCAGAGAAACCCTGG-3’
5’-GCTAAGCAATCTTGTCGAAGGT-3’
5’-CGTCGTTTCCCATCTCTTCCTCC-3’
5’-CCACTCCGAGACCCTCAGTC-3’
5’-FAM-AATCAGGGCTCATTTTCTCGCTCCTCA-TAMRA-3’
5’-CCAGCTTCGCCGCTTCCTTC-3’
5’-GAAGGCAAGCCCATCTGCAAGCC-3’
5’-FAM-CTTCACCTTCTATGCCCCTGACAC-TAMRA-3’
5’-GCCTCTGCCGACAGTGGT-3’
5’-AAGACGTGGTTGGAACGTCTTC-3’
5’-FAM-CAAAGATGGACCCCCACCCAC-TAMRA-3’
5’-CAAACATTTGGCAATAAAGTTTCTTAAG-3’
5’-TTATTACATGCTTAACGTAATTCAACAG-3’
5’-FAM-TCCTGTTGCCGGTCTTGCGATGATTATC-TAMRA-3’
5’-GCGGAACCCCTATTTGTTTA-3’
5’-TCCAAGAATCCCTCCATGAG-3’
5’-FAM-AAATACATTCAAATATGTATCCGCTCA-TAMRA-3’
5’-CATTTGGAGAGGACACGCTGA-3’
5’-GAGCCATGTTGTTAATTTGTGCC-3’
5’-FAM-CAAGCTGACTCTAGCAGATCTTTC-TAMRA-3’
200
200
300
300
200
600
600
120
300
900
100
300
300
120
750
750
250
600
600
120
Dimensione
dell’amplicone
62
134
196
180 bp
134 bp
74 bp
82 bp
98 bp
70 bp
74 bp
Marzo 2012
Clonaggio
CIRILLO
del costrutto in cellule batteriche
Gli ampliconi ibridi ottenuti dalla PCR overlapping sono stati integrati nel plasmide pCR 2.1 attraverso l’uso del kit TA Cloning Kit (Invitrogen), clonati in cellule batteriche chimicamente competenti
di E. coli “One Shot Top 10 Chemically Competent
E. coli” (Invitrogen) secondo le indicazioni del fornitore e piastrate su un terreno di coltura selettivo
contenente ampicillina (Sigma-Aldrich). Le colonie
ottenute sono state sottoposte a mini preparazione
plasmidica utilizzando il kit Nucleo Spin Plasmid
(Macherey-Nagel, Düren, Germany) secondo le
istruzioni del fornitore. 800 ng di DNA plasmidico
sono stati sequenziati utilizzando il kit “CEQ 8000
dye terminator cycle sequencing with quick start kit’’
protocol” (Beckman Coulter Fullerton, CA) utilizzando il sequenziatore automatico CEQ8000 (Beckman
Coulter).
Linearizzazione
del calibratore plasmidico
La digestione di 1 µg di plasmide viene condotta in un volume totale di 25 µl di una soluzione 100 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2,
1 mM DTT in presenza di 20 U dell’enzima di restrizione BssHII e 20 U dell’enzima di restrizione BglII.
La miscela è stata incubata a 37 °C per 2 ore e la
presenza di DNA digerito è stata verificata con una
corsa elettroforetica su gel di agarosio all’ 1,2 %.
Preamplificazione
La procedura sperimentale di preamplificazione
come indicato da Del Gaudio et al., (2009) è stata
eseguita utilizzando 9 pmol di ciascun primer (Tabella I, pannello B) per ottenere una pooled mix.
Le condizioni di reazione prevedono la preamplificazione di 200 ng di DNA in un volume totale di 50
µl, contenente 25 µl di TaqMan PreAmp Master Mix
(Applied Biosystems) e 6.25 µl di pooled mix. La reazione condotta in un termociclatore Veriti (Applied
Biosystems), prevede una fase di denaturazione del
DNA a 95 °C per 10 minuti, seguita da 10 cicli di amplificazione così costituiti: denaturazione del DNA a
95 °C per 15 secondi, 4 minuti a 60 °C per annealing
ed estensione. I prodotti della preamplificazione
sono stati diluiti 1:5 con il buffer 1X Tris-EDTA ed
usati come stampo per le successive PCR Real time.
Per ciascun target la PCR real time è stata condotta
in triplicato sia su campioni preamplificati che non
preamplificati, utilizzando il termociclatore DNA Engine Opticon 2 MJ Research (Biorad). Sia per la reazione con SYBR Green sia con sonde TaqMan, 5 µl
di DNA sono stati amplificati in un volume totale di
reazione di 25 µl con primer specifici per il target di
interesse alle condizioni descritte in Del Gaudio et
al. (2009) 11.
Raccolta ed analisi dei dati
Le curve di calibrazione sono state costruite diluendo serialmente il DNA estratto dalla farina al
5% di mais Bt11, ottenendo 258 129, 65, 16 e 5 ng
di DNA corrispondenti a 4734, 2366, 1184, 296, 98
copie della sequenza transgenica e 94676, 47340,
23680, 5920, 1960 copie del genoma di mais per
reazione 14.
Il DNA estratto dalla farina al 5% di soia RR è
stato diluito serialmente ottenendo 100, 50, 12.5, 4.2
ed 1.4 ng di DNA corrispondenti a 4425, 2212, 533,
184, 61 copie della sequenza transgenica e 88495,
44248, 11062, 3687, 1229 copie del genoma di soia
per reazione.
Le curve di calibrazione per la quantificazione
dell’evento EH92-527-1 sono state costruite utilizzando DNA estratto da farina al 100% di OGM diluito in rapporto 1:10 in DNA estratto da farina di patata 0% OGM al fine di ottenere un campione di DNA
al 10%. I campioni a percentuale nota di EH92-527-1
pari a 0.1%, 0.5%, 1%, 2%, 5% sono stati ottenuti miscelando quantità opportune di DNA estratto da farina al 100% con DNA estratto da farina di patata 0%.
Per la costruzione della curva di riferimento sono
state eseguite diluizioni in H2O bidistillata pari a
200, 66.6, 22.2, 7.04, 2.46, 1 ng di DNA corrispondenti a 11111, 3704, 1234, 411, 137, 46 copie della
sequenza transgenica e 111111, 37036, 12346, 4115,
1372, 457 copie del genoma di patata per reazione. Le curve di calibrazione utilizzando il calibratore
plasmidico sono state eseguite diluendo il DNA plasmidico digerito al fine di ottenere 107, 106, 105, 104,
103, 102, 50, 25 copie della sequenza transgenica ed
endogena per reazione. 5 µl di ciascuna diluzione
sono stati utilizzati in una reazione condotta in 25 µl
di soluzione 1X TaqMan Universal PCR Master Mix,
utilizzando primer e sonde alle concentrazioni d’uso
indicate in Tabella III.
I valori di Ct in funzione del log10 del numero
di molecole sono stati utilizzati per determinare il
contenuto di OGM del campione incognito come
rapporto espresso in percentuale tra il numero di
27
CIRILLO
molecole del transgene ed il numero di molecole
del gene endogeno. Per ciascun valore è stata riportata la media, la deviazione standard (SD) e la
deviazione standard relativa (RSD o CV). Per la determinazione del LOD (limite di rilevamento) si è
proceduto calcolando il più basso numero di copie
corrispondenti ad un RSD≤33%. Per la determinazione del LOQ (limite di quantificazione) si è proceduto calcolando il più basso numero di copie corrispondenti ad un RSD≤25%.
L’efficienza di amplificazione è stata determinata
amplificando diluzioni seriali del DNA mediante la
seguente formula: 10(-1/slope)-1.
L’analisi statistica è stata effettuata con l’ausilio del
software GraphPad (Prism 5). Per analizzare le differenze significative tra i campioni preamplificati e
non preamplificati, è stato eseguito il test ANOVA
a due code: un valore di probabilità P<0.05 è stato
considerato statisticamente significativo.
Risultati
Realizzazione del calibratore plasmidico
Per la messa a punto del protocollo di sintesi del
calibratore plasmidico per la quantificazione di tipo
evento-specifico della patata EH92-527-1 è stata utilizzata la farina certificata dall’IRMM contenente il
100% di OGM. Il calibratore plasmidico è stato realizzato integrando, nel vettore plasmidico pCR 2.1,
un inserto costituito da un tratto evento-specifico,
ottenuto amplificando la zona di giunzione tra il
DNA esogeno ed il genoma della pianta ospite in
tandem con un tratto del gene UGP-ase scelto come
endogeno della specie Solanum tuberosum. La contemporanea amplificazione del gene endogeno è
indispensabile per la quantificazione del costrutto
stesso in quanto la quantificazione degli OGM è di
tipo relativo.
L’integrazione in tandem dei frammenti descritti
è stata realizzata impiegando la tecnica denominata
PCR overlapping, in tre fasi. Durante la prima fase
sono stati amplificati separatamente sia i tratti specifici della sequenza endogena utilizzando i primer
UGPf ed UGPr sia la sequenza transgenica utilizzando i primer Event 527 bf1 ed St527-r1- tail (Tabella
I). Nella seconda fase, i due ampliconi ottenuti sono
stati sottoposti a trattamento con T4 DNA polimerasi
che, grazie all’attività esonucleasica 3’-5’ rimuove la
coda di poli-A che la Taq DNA polimerasi aggiunge
28
durante l’amplificazione. Durante l’ultima fase, i due
prodotti di PCR specie-specifico ed evento-specifico
sono stati mescolati e le estremità 3’ complementari dei due filamenti, sono state estese dalla Taq
DNA polimerasi ottenendo un frammento costituito
dai due target integrati, successivamente amplificato
con i primer Event 527 bf1 e UGPr (Tabella I). Il
frammento così ottenuto è stato clonato nel vettore plasmidico pCR2.1 e successivamente sottoposto
a sequenziamento che ha confermato la sequenza
attesa. Il plasmide è stato linearizzato con gli enzimi di restrizione BssHII e BglII ed utilizzato per la
fase di messa a punto di protocolli di quantificazione dell’OGM in PCR Real time. I punti di diluizione
del plasmide utilizzati per la costruzione della retta
di calibrazione sono stati scelti in base al valore soglia dello 0,9%, limite massimo della percentuale di
OGM nei prodotti alimentari ammessi dalla Comunità Europea, in un intervallo compreso tra 5 volte il
valore soglia e 10 volte inferiore ad esso 15 coprendo
un intervallo compreso tra 0,1% e 4,5%. In base alla
dimensione del genoma di patata, il valore di 0,1%
di EH92-527-1 corrisponde a 111 molecole, mentre,
un valore del 4,5% corrisponde a 4995 molecole. Per
la realizzazione della retta di taratura sono state impiegate diluizioni seriali del calibratore plasmidico
comprese tra 25 e 107 di molecole.
Sono stati valutati i parametri di “slope” ed efficienza della retta di calibrazione utilizzando come
calibratori sia il DNA al 10% di OGM sia il plasmide.
I valori ottenuti nel primo caso sono: “slope”-3,7;
efficienza 86% per il transgene, quelli ottenuti per
il gene endogeno sono: “slope” -3,8; efficienza 83%.
I valori di “slope” ed efficienza della retta di calibrazione per la sequenza endogena e transgenica
utilizzando il plasmide come calibratore sono riportati in Tabella II.
Allo scopo di determinare il range dinamico del
metodo e l’accuratezza del calibratore, sono stati
quantificati in quadruplicato campioni a percentuale
nota di EH92-527-1 pari a 0.1%, 0.5%, 1%, 2%, 5%
(Tabella III). Come è mostrato in Tabella III, alle misure è stato applicato un fattore di calibrazione pari
a 0,007 ottenendo un nuovo valore, definito valore
misurato corretto.
Uno dei principali problemi nella rilevazione del
DNA da prodotti alimentari trasformati è la qualità
del DNA estratto dal momento che il DNA danneggiato e/o frammentato, la presenza di impurità residue o basse rese di estrazione possono inibire la
reazione di amplificazione. Il metodo di estrazione
Marzo 2012
CIRILLO
Tabella II. — Valori di pendenza, efficienza di amplificazione, coefficiente di correlazione, LOD e LOQ delle rette di calibrazione
per la sequenza endogena (UGPase) e transgenica (EH92-527-1) relativi ad esperimenti di Real-time PCR in cui il plasmide
linearizzato è stato utilizzato come calibratore.
UGPase
EH92-527-1
Pendenza
Efficienza
R2
Pendenza
Efficienza
R2
-3,36
-3,51
-3,57
-3,46
-3,55
98,43
92,70
90,59
94,54
91,30
LOD
LOQ
0,99
0,99
0,99
0,98
0,99
6
33
-3,70
-3,69
-3,68
-3,60
-3,65
86,32
86,64
86,95
89,57
87,92
LOD
LOQ
0,99
0,99
0,99
0,98
0,99
21
148
Tabella III. — Valori misurati del contenuto percentuale di EH92-527-1 nei campioni a concentrazione nota ottenuti impiegando il calibratore plasmidico. In tabella sono riportati: il valore atteso corrispondente al contenuto percentuale noto di OGM
nei campioni analizzati; il valore misurato e la deviazione standard relativa (RSD); il fattore di calibrazione calcolato come
rapporto tra il valore misurato ed il valore atteso; il valore misurato corretto ottenuto dal rapporto tra il valore misurato ed il
fattore di calibrazione e la deviazione standard relativa ad esso associato.
Valore atteso
(%)
Valore misurato
(%)
RSD (%)
0,1
0,5
1
2
5
Media
3,800 x 10-6
0,004
0,017
0,009
0,034
20,789
4,040
55,704
13,793
42,353
27,336
Fattore di
calibrazione
3,8 x 10-5
0,008
0,017
0,005
0,007
0,007
basato sull’impiego del CTAB è risultato quello più
efficace tra tutti quelli utilizzati per l’estrazione di
DNA dalle matrici alimentari in esame (dati non mostrati). L’amplificabilità dei DNA estratti con questo
metodo dalle matrici di interesse è stata valutata mediante l’amplificazione del gene tRNA leu. Risultati
positivi sono stati ottenuti per tutti i campioni in
esame come mostrato in Tabella IV.
Per quanto riguarda l’individuazione di OGM, è
stata dapprima effettuata l’amplificazione delle sequenze specie-specifiche, quali ADH1 per il mais
e LE1 per la soia i cui risultati sono riassunti nella
Tabella IV: quattro campioni contenevano DNA di
mais (polenta, snack salato, snack al mais, mix shake), cinque contenevano DNA di soia (farina di soia,
mix shake, semi di soia tostati, pane di soia, latte di
soia) e solo uno conteneva il DNA di entrambe le
specie vegetali (mix shake). La sequenza del promotore 35S è stata rilevata in cinque campioni (farina
di soia, polenta, mix shake, pane di soia, latte di
soia) mentre il terminatore NOS è stato rilevato in
tre campioni (mix shake, pane di soia, latte di soia).
Valore misurato
corretto (%)
RSD
(%)
5,430 x 10-4
0,500
2,125
1,225
4,881
29,466
3,968
55,718
11,673
42,041
28,573
I campioni di snack salato, snack al mais e semi di
soia tostati, pur contenendo mais, soia o entrambe
le specie, sono risultati negativi all’amplificazione
del promotore 35S e del terminatore NOS.
Per quanto riguarda le matrici alimentari contenenti soia gli estratti risultati positivi alla fase di screening (mix shake, pane di soia, latte di soia) sono
stati sottoposti ad una PCR costrutto-specifica che
prevedeva l’amplificazione della regione di giunzione tra il promotore 35S e la sequenza del Chloroplast Transit Peptide (CTP) che precede la sequenza
del gene EPSPS presente nella soia Roundup Ready. I risultati (Tabella IV) indicano che le matrici in
esame contengono effettivamente soia transgenica
derivante dall’evento di trasformazione GTS 40-3-2
(Roundup Ready), regolarmente autorizzato nell’ambito dell’UE.
Per la specie Zea mays l’identificazione è stata
limitata all’evento Bt11. Gli estratti risultati positivi
all’analisi di screening (polenta e shake mix) sono
stati saggiati impiegando una coppia di primer ed
una sonda specifici per la regione di giunzione tra
29
CIRILLO
Tabella IV. — Sono riportati media, deviazione standard e coefficiente di variazione dei valori di Ct ottenuti dall’amplificazione
di sette geni target, I. — campioni preamplificati rispetto ai non preamplificati mostrano una riduzione altamente significativa
(p< 0,0001) del valore di Ct in un intervallo tra 3,03 e 7,45.
leu tRNA
Matrice
Preamplificato
Farina di soia
Polenta
Snack salato
Snack al mais
Merendina alla
frutta
Mix shake
semi di soia tostati
Pane di soia
Latte di soia
16,52±0,14 0,85%
12,22±0,01
0,13%
12,68±0,02
0,16%
11,49±0,22
1,91%
14,83±0,50
3,37%
18,17±0,14
0,76%
19,31±0,38
1,97%
13,25±0,35
2,66%
14,62±0,35
2,41%
adh1
Non
preamplificato
19,54±1,05
5,37%
16,06±0,47
2,92%
17,49±0,09
0,52%
14,44±0,30
2,10%
19,46±0,62
3,19%
22,70±0,84
3,7%
22,79±0,17
0,74%
17,42±0,41
2,36%
19,48±0,82
4,2%
Preamplificato
-
-
19,57±0,32
1,63%
29,08±0,16
0,57%
20,09±0,13
0,64%
-
25,69±0,33
1,28%
34,65±0,67
1,93%
25,23±0,74
2,91%
-
29,04±0,38
1,30%
-
34,37±0,50
1,47%
-
-
-
-
-
l’estremità 3’ del costrutto ed il genoma della pianta
ospite ottenendo risultato positivo solo per il DNA
estratto da polenta.
Tutte le reazioni di amplificazione in PCR Real
time sono state condotte sia sui campioni preamplificati che non preamplificati ed i risultati sono stati
confrontati per verificare l’applicabilità della tecnica
ed individuarne gli effettivi vantaggi. I parametri che
sono stati considerati sono: la sensibilità, la linearità,
la precisione, l’efficienza e l’accuratezza.
La Tabella IV riporta i valori medi, la deviazione
standard (SD) e la deviazione standard relativa (CV)
dei valori di Ct. I campioni preamplificati, rispetto a
quelli non preamplificati, hanno mostrato un significativo miglioramento dei valori di Ct (P<0.0001) in
un intervallo di valori compreso tra 3,03 fino a 7,45.
Il confronto dei Ct medi relativi ai campioni preamplificati e non preamplificati ha evidenziato un’alta
correlazione (R2=0,983).
Le deviazioni standard relative dei Ct medi dei
campioni preamplificati sono risultate significativamente più basse di quelle ottenute per i campioni
non preamplificati (P=0,0319), indicando che la procedura di preamplificazione aumenta la precisione
dell’analisi quantitativa.
Un ulteriore vantaggio della preamplificazione
è legato alla possibilità di effettuare analisi in PCR
30
le1
non
preamplificato
Preamplificato
Non
preamplificato
22,30±0,23
1,03%
-
27,48±0,30
1,09%
-
-
-
-
-
-
-
20,33±0,34
1,67%
19,48±0,14
0,72%
22,75±0,40
1,75%
18,63±0,30
1,61%
25,86±0,37
1,43%
25,32±0,38
1,50%
28,37±0,23
0,81%
24,67±0,22
0,89%
Real time in triplicato per 15 target utilizzando 200
ng di DNA mentre per le reazioni di amplificazione
non precedute dalla preamplificazione sono richiesti
100 ng di DNA per ogni singolo target.
L’efficienza di amplificazione è stata determinata
per le matrici in esame relativamente ai target endogeni (Tabella V): mentre l’efficienza di amplificazione di ADH1 e LE1 non mostra differenze significative tra i campioni preamplificati e non preamplificati,
i dati evidenziano una significativa (P=0,0112) riduzione dell’efficienza di amplificazione di tRNA leu
nei campioni preamplificati rispetto ai non preamplificati.
I campioni polenta, mix shake, pane di soia e
latte di soia, risultati positivi all’analisi qualitativa
(Tabella IV), sono stati analizzati in PCR Real time
per la quantificazione del mais Bt11 e/o della soia
Roundup Ready.
La Tabella VI riporta per ciascun campione, preamplificato e non preamplificato, il contenuto percentuale di OGM, la deviazione standard e la deviazione standard relativa.
In Tabella VI sono anche mostrati i risultati ottenuti dall’amplificazione di DNA estratti dalle farine
di riferimento (0.1% e 1% mais Bt11 e soia RR) e dalle farine fornite dal FAPAS, per valutare l’accuratezza
della tecnologia di preamplificazione.
Marzo 2012
p35S
CIRILLO
tNOS
mais Bt11
Preamplificato
non
preamplificato
-
RR soia
Preamplificato
Non
preamplificato
preamplificato
non
preamplificato
preamplificato
non
preamplificato
31,00±0,00
29,83±0,02
0,07%
-
36,25±1,06
2,92%
34,85±0,32
0,92%
-
-
NT
NT
-
-
-
-
-
-
32,50±0,30
0,92%
NT
39,45±0,60
1,5%
NT
NT
NT
NT
NT
-
-
-
-
NT
NT
NT
NT
-
-
-
-
NT
NT
NT
NT
33,84±0,40
1,20%
-
38,38±0,44
1,15%
-
35,55±0,07
0,20%
-
38,76±1,07
2,76%
-
-
-
NT
NT
34,88±0,08
0,23%
NT
40,15±0,30
0,75%
NT
34,38±1,12
3,26%
23,05±0,22
0,95%
37,29±0,52
1,39%
28,10±0,46
1,64%
31,67±0,15
0,47%
30,63±1,30
4,24%
38,22±0,59
1,54%
38,08±1,02
2,69%
NT
NT
NT
NT
32,53±0,14
0,43%
32,71±0,24
0,75%
38,36±0,61
1,59%
38,59±0,25
0,65%
Tabella V. — Efficienze di amplificazione dei diversi campioni e target.
Campione
Farina di soia
Polenta
Snack salato
Snack al mais
Merendina
alla frutta
Mix shake
Semi di soia tostati
Pane di soia
Latte di soia
Leu tRNA
ADH1
Preamp,
Non-preamp,
Preamp,
Non-preamp,
Preamp,
Non-preamp,
0,49
0,79
0,91
0,87
0,76
0,66
1,00
1,00
1,00
0,99
0,81
0,87
0,90
-
0,69
0,91
0,90
-
0,92
-
0,66
-
0,44
0,55
0,70
0,83
1,10
0,80
1,09
1,11
1,03
-
1,15
-
0,90
0,77
0,91
0,93
0,87
0,76
0,84
0,94
Discussione
L’impiego di DNA ricombinante come standard
rappresenta un’interessante innovazione nell’ambito
della certificazione OGM. La sua progettazione, realizzazione ed applicazione presenta tre fasi critiche:
a) clonaggio della sequenza GM desiderata; b) accuratezza delle diluizioni del plasmide; c) verifica che
il calibratore plasmidico si comporti in maniera equivalente a quello costituito da DNA genomico (commutabilità)5. Per quanto riguarda il primo parametro,
i risultati ottenuti dal sequenziamento dell’inserto
LE1
integrato nel plasmide pCR2.1 hanno confermato il
corretto clonaggio della sequenza GM. Per quanto
riguarda la seconda fase un calibratore plasmidico
che contenga entrambi i target (evento-specifico e
specie-specifico) necessari per la quantificazione garantisce un errore minore nelle diluizioni.
Infine, per verificare che il calibratore plasmidico
si comporti in maniera equivalente a quello costituito da DNA genomico è necessario valutare una serie
di requisiti che prendono in esame l’applicabilità e
la commutabilità.
Per la verifica della applicabilità del protocollo di
31
CIRILLO
Tabella VI. — Risultati dell’analisi quantitativa condotta su DNA estratto da prodotti lavorati, materiali di riferimento certificati
(IRMM) e provenienti da proficiency test (FAPAS). I risultati sono espressi come percentuale di OGM±deviazione standard e
coefficiente di variazione (%). Il valore del limite di quantificazione (LOQ) per il mais Bt11 e la soia RR è, rispettivamente, pari
a 0.07% e 0.05%.
OGM
Matrice
DNA
preamplificato
DNA non
preamplificato
mais Bt11
Polenta
0,12±0,02
19,32
0,07±0,01
12,13
0,66±0,20
30,29
1,42±0,36
25,26
< LOQ (0,05)
0,25±0,05
20,00
< LOQ (0,05)
0,11±0,03
27,27
0,70±0,08
11,28
0,81±0,15
18,68
< LOQ (0,05)
0,08±0,03
20,35
0,09±0,01
13,94
0,85±0,17
20,00
1,68±0,60
35,79
< LOQ (0,05)
0,29±0,14
48,27
< LOQ (0,05)
0,10±0,02
20,00
1,06±0,24
22,84
0,67±0,04
6,33
< LOQ (0,05)
0,1% mais Bt11 (IRMM)
1% mais Bt11 (IRMM)
FAPAS GeMSU09A (farina di mais + Bt11)
soia
Roundup Ready
FAPAS GeMSU09B (farina di mais + Bt11)
Latte di soia
Pane di soia
Shake mix
0,1% soia Roundup Ready (IRMM)
1% soia Roundup Ready (IRMM)
FAPAS GeMSU22A (farina di soia + RR)
FAPAS GeMSU22B (farina di soia + RR)
-: negativo per mais Bt11.
quantificazione di EH92-527-1 nei prodotti alimentari sono stati valutati i requisiti minimi, Minimum
Performance Requirements, che un buon metodo
analitico per la rivelazione di OGM basato sulla PCR
Real time deve soddisfare 15. Essi comprendono diversi aspetti tra i quali:
—— la specificità (il metodo deve essere eventospecifico);
—— l’efficienza di amplificazione (il coefficiente
angolare della retta di taratura o slope, proporzionale all’efficienza di amplificazione, deve essere
compreso nel seguente intervallo di valori: -3.1<slope<-3.7);
—— l’R2, ovvero il coefficiente di correlazione
(deve essere maggiore di 0,98);
—— il limite di quantificazione (LOQ), ovvero il più
basso livello di analita quantificabile (deve essere inferiore ad 1/10 dei valori soglia indicati dalla legge);
—— il limite di rilevazione (LOD), ovvero il più
basso livello di analita rilevabile (deve essere inferiore ad 1/20 dei valori soglia indicati dalla legge);
—— range dinamico, cioè l’intervallo di concentrazioni in cui il metodo si comporta in maniera lineare
con un livello accettabile di accuratezza e precisio-
32
ne, dovrebbe essere compreso tra 1/10 ed almeno
5 volte la percentuale soglia stabilita dalla legge
(0,09% e 4,5% per una soglia dello 0,9%);
—— la precisione espressa come deviazione standard relativa deve essere inferiore al 25% nell’intero
range dinamico considerato;
—— l’accuratezza, espressa come lo scostamento
tra il valore medio misurato ed il valore atteso, deve
essere inferiore al 25% del valore atteso nell’intero
range dinamico del metodo.
La specificità del metodo di quantificazione di
EH92-527-1 è assicurata dall’utilizzo del target evento-specifico. Come si evince dalla Tabella II, anche
i requisiti di efficienza, R2 e LOD risultano compresi
entro i limiti richiesti dai Minimum Performance Requirements. Per quanto rigurda il LOQ, tale requisito
è soddisfatto solo nel caso dell’amplificazione del
gene endogeno UGP-ase. Nel caso del transgene saranno necessari ulteriori esperimenti.
Uno dei vantaggi dell’uso dei calibratori plasmidici è quello di poter realizzare rette di calibrazione
in un intervallo di concentrazioni compreso tra 25 e
107 di molecole molto più ampio di quello realizzabile con i calibratori a DNA genomico.
Marzo 2012
CIRILLO
La verifica della commutabilità del metodo che
utilizza il calibratore plasmidico è stata realizzata
effettuando esperimenti di quantificazione di campioni a percentuale nota di EH92-527-1. I dati riportati in Tabella III indicano che nell’ambito del range
considerato si evidenziano significative deviazioni
del contenuto percentuale di OGM rispetto al valore atteso, accompagnati da una RSD superiore al
25%. È stato calcolato un fattore di calibrazione12
che indica la variazione del valore misurato rispetto
a quello noto. Anche in questo caso la RSD mostra
valori superiori al 25%.
I risultati di commutabilità contrastano quindi con
i dati di efficienza, R2, LOD e range dinamico. Le discrepanze osservate possono essere dovute ad errori di accuratezza nella preparazione dei campioni a
percentuale nota di EH52-927-1. La preparazione di
campioni a percentuali note è inevitabile in quanto
la farina a concentrazione nota di riferimento da cui
essi sono ottenuti è disponibile in commercio solo
alla percentuale del 100%.
La strategia attuata per il rilevamento di OGM
è basata su uno screening iniziale per le due più
comuni sequenze di regolazione (promotore 35S e
terminatore Nos) associato all’amplificazione di sequenze specie-specifiche per mais e soia. Infine, sulla base dei risultati di screening, la strategia prevede
amplificazioni costrutto e/o evento specifiche per
identificare e quantificare la soia Roundup Ready
(RRS) ed il mais Bt11. Come già accennato abbiamo
applicato a tutte le fasi della strategia di rilevamento
una procedura di preamplificazione basata sull’utilizzo del reagente TaqMan® PreAmp Master Mix
(Applied Biosystems) e di una miscela di coppie di
primer e sonde specifiche per i marcatori da analizzare. In questo contesto la tecnologia di preamplificazione ha aumentato la sensibilità della reazione di
amplificazione in PCR Real time.
L’efficienza della PCR deve essere valutata per eseguire una determinazione quantitativa attendibile del
contenuto di OGM 16. La riduzione dell’efficienza di
amplificazione di tRNA leu nei campioni preamplificati rispetto ai non preamplificati potrebbe essere legata ad una possibile interazione dei primer all’interno
della pooled mix utilizzata nella reazione di preamplificazione. Una spiegazione alternativa è stata fornita
da Coudry e collaboratori (dati non pubblicati) che
hanno evidenziato una riduzione dell’amplificazione
dei geni altamente espressi in campioni di cDNA preamplificati. e questo potrebbe essere vero anche per
geni ad alto numero di copie come tRNA leu.
Conclusioni
I vantaggi offerti dall’uso di calibratori plasmidici sono molteplici e testimoniati da diversi lavori presenti in letteratura. In particolare, accanto
alla quantità illimitata di tali molecole che si può
ottenere, esse offrono la possibilità di effettuare
un’analisi quantitativa anche nei casi in cui non
siano disponibili i calibratori certificati dall’IRMM.
La loro realizzazione e soprattutto la loro applicazione alla quantificazione di OGM in DNA estratto
da matrici alimentare presenta, però, non poche
difficoltà.
I dati ottenuti in questo lavoro dimostrano che i
risultati di quantificazione ottenuti con un calibratore plasmidico non risultano sempre commutabili con quelli ottenuti con l’uso di un calibratore a
DNA genomico, anche se nell’ambito dei Minimum
Performance Requirements diversi parametri, quali
efficienza, R2 e LOD vengono soddisfatti.
La tecnologia di preamplificazione ha aumentato
la sensibilità della reazione di amplificazione in PCR
Real time, risultando utile in particolare per i target
presenti in basso numero di copie aumentando inoltre il numero di target analizzabili in DNA estratti da
alimenti lavorati.
I risultati ottenuti con la reazione di preamplificazione indicano che essa non influisce sull’affidabilità
del dato quantitativo, suggerendo che tale strategia
possa trovare interessanti applicazioni in tutti quei
campi che richiedono analisi quantitative mediante
PCR Real time.
Riassunto
La rilevazione e la quantificazione degli organismi geneticamente modificati (OGM) negli alimenti viene effettuata mediante la Reazione a Catena della Polimerasi in Tempo reale
(PCR Real time). L’impiego di tale tecnica è condizionata da
due fattori critici: la scelta di calibratori adeguati e un DNA
di qualità e quantità adeguate. In questo lavoro sono descritti
esperimenti relativi all’applicabilità di un calibratore plasmidico come standard per la determinazione quantitativa della
patata EH92-527-1. Inoltre, vengono presentati risultati ottenuti applicando la tecnica di preamplificazione al DNA estratto
da alimenti lavorati per migliorare la sensibilità della PCR real
time ed aumentare il numero di target analizzabili.
Parole chiave: Reazione a catena della polimerasi in tempo
reale - DNA, recombinant - Organismi geneticamente modificati.
33
CIRILLO
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method and sample matrix on quantification of genetically modified organisms. BMC Biotechnol 2006;6:37.
Ringraziamenti. — Questo lavoro è dedicato alla memoria del Prof.
Antonino Cascino.
Finanziamenti. — Questo progetto è stato finanziato dal Ministero delle Politiche Agricole e Forestali (MIPAF) Progetto Speciale MIPAF: “Tipicizzazione e caratterizzazione di varietà precoci di patata
con l’impiego di tecniche molecolari e spettroscopiche” (2008-2011)
a M.C.
Marzo 2012
La proteomica quale strumento di tipizzazione
di cultivar precoci di patata
R. SCELZA, F. RUSSO, L. GIANFREDA, M. A. RAO
La tipizzazione in campo alimentare è uno degli
aspetti di maggior rilievo nell’ambito della prevenzione delle frodi, della sicurezza e della valorizzazione degli alimenti. Tra i prodotti dell’agricoltura
italiana, la patata riveste un ruolo molto importante, soprattutto per quel che riguarda la produzione
extra-stagionale o “precoce” (ciclo invernale-primaverile), molto apprezzata dai consumatori nazionali
e nord-europei. Tale produzione, tuttavia, è talvolta contaminata da materiale proveniente dal nord
Africa o da Cipro, da zone quindi che non sono
quelle tipiche della produzione di patata extrastagionale (Campania, Sicilia, Puglia) e che non sono
sottoposte ad appropriati controlli di qualità e sicurezza. Pertanto, il presente lavoro si propone di
individuare marcatori proteici per alcune varietà di
patata precoce (Solanum tuberosum L.) coltivate
nel Sud Italia mediante l’impiego di metodologie
proteomiche. La proteomica, infatti, può aumentare
la possibilità di descrivere le proprietà nutrizionali,
biologiche, conformazionali e di interazioni funzionali delle proteine alimentari ampliando la possibilità di “definizione di qualità” di prodotti destinati
all’alimentazione.
I proteomi ottenuti per ciascuna varietà hanno messo in evidenza una grande abbondanza di patatine,
gruppo di glicoproteine aventi funzione di conservazione e difesa. Sono state rilevate differenze significative tra diverse cv e nell’ambito della stessa
cv proveniente da diverse regioni non in termini di
numero, ma di intensità di spot, quindi di espresAutore di contatto: M. A. Rao, Dipartimento di Scienze del Suolo,
della Pianta dell’Ambiente e delle Produzioni Animali, Università degli
Studi di Napoli Federico II, Portici, Napoli, Italia.
E-mail [email protected]
Dipartimento di Scienze del Suolo, della Pianta,
Università degli Studi di Napoli Federico II, Portici
Napoli, Italia
sione di proteine. Analisi di spettrometria di massa
saranno necessarie per identificare le proteine individuate.
Parole-chiave: Proteomica - Tecnologia, industria e agricoltura - Valore nutrizionale.
L
a proteomica consente di studiare il proteoma
di un organismo identificando la struttura delle
proteine che lo compongono, le loro funzioni e le
loro interazioni.
Il termine “proteoma” nasce dall’unione di due
termini, proteine e genoma, ed indica l’insieme di
proteine codificate ed espresse dall’intero genoma
di un organismo in un distretto ben preciso ed in
un momento specifico del suo ciclo vitale 1. A differenza del genoma, che rappresenta qualcosa di
statico e uguale in tutte le cellule e, in qualunque
momento della vita di un organismo, il proteoma è
invece dinamico, in quanto capace di modificarsi,
qualitativamente e quantitativamente, in funzione
degli stimoli esterni o più semplicemente in funzione dello specifico stato metabolico in cui l’organismo si trova.
Attualmente gli studi del proteoma non sono più
ristretti al settore medico-diagnostico, ma si stanno
diffondendo in altri campi, come ad esempio quello agroalimentare.
35
SCELZA
La proteomica
La composizione nutrizionale degli alimenti può
essere influenzata dalla diversità dei territori, per
cui il prodotto tradizionale tipizzato assume un
ruolo fondamentale per la sostenibilità salutistica e
sanitaria, sia per l’uomo che per l’animale, nonché
per il territorio stesso, con riflessi positivi anche
sulla sostenibilità economica. Inoltre, la tipizzazione in campo alimentare è uno degli aspetti di
maggior rilievo nell’ambito della prevenzione delle
frodi, della sicurezza e della valorizzazione degli
alimenti 2.
La proteomica rappresenta dunque un prezioso
strumento per la caratterizzazione alimentare di
uno specifico territorio. È, infatti, possibile ottenere
delle vere e proprie impronte (fingerprinting) di
mappe bidimensionali polipeptidiche dei prodotti tradizionali tipizzati, che vengono poi registrate
come immagini in banche dati e che possono essere utilizzate, nelle analisi di tracciabilità, per verificare la presenza di alcuni parametri di tipicità e di
salubrità nel prodotto in esame 3.
Tra i prodotti dell’agricoltura italiana la patata riveste un ruolo molto importante, soprattutto per quel
che riguarda la produzione extrastagionale 4-6. Le
condizioni climatiche di alcune aree costiere dell’Italia meridionale (Campania, Sicilia e Puglia) e la nota
capacità di adattamento della patata a condizioni non
ottimali di temperatura, radiazione solare e fotoperiodo, permettono di realizzare due cicli di coltivazione extrastagionali: uno autunno-vernino-primaverile
e l’altro estivo-autunno-vernino, temporalmente differenti da quello ordinario primaverile-estivo. Con il
primo ciclo si ottiene la classica e affermata produzione precoce (denominata anche primaticcia o novella), realizzata tra marzo e giugno. Con il ciclo estivoautunnale si realizza, invece, la produzione invernale
o di secondo raccolto o bisestile, che in questi anni
ha visto aumentare la propria importanza relativa, in
virtù soprattutto della favorevole e interessante dislocazione temporale delle raccolte, che consente la
commercializzazione della patata durante tutto l’anno.
Le patate extrastagionali sono molto apprezzate dai consumatori nazionali e nord-europei, anche se, talvolta, tale produzione è contaminata da
materiale proveniente dal nord Africa o da Cipro,
da zone quindi che non sono quelle tipiche della produzione di patata extrastagionale e che non
sono sottoposte ad appropriati controlli di qualità
e sicurezza.
Pertanto, lo scopo del presente lavoro è la carat-
36
terizzazione proteomica di alcune varietà di patate
extrastagionali (Spunta, Arinda, Antea, Agria, Agata,
Sieglinde) provenienti dal sud Italia, in particolare
da Campania, Puglia e Sicilia, al fine di identificare
eventuali marcatori proteici legati al luogo di provenienza del prodotto.
Materiali e metodi
Preparazione del campione
Dopo la raccolta, un campione di 500 g di tuberi
è stato prelevato in maniera casuale, eliminando
quelli con evidenti attacchi fitopatologici. I tuberi
selezionati sono stati lavati prima in acqua corrente
per eliminare tracce di suolo, poi in acqua deionizzata, e quindi asciugati con carta assorbente. Ciascun tubero è stato tagliato ortogonalmente rispetto
alla sua lunghezza maggiore in otto sezioni, di cui
sono state scartate le due sezioni apicali 7. Le sei
sezioni più interne sono state poi rapidamente tagliate in cubetti e questi ultimi mescolati con quelli
provenienti da altri tuberi dello stesso campione,
sottoposti allo stesso trattamento (Figura 1).
Sono stati prelevati 200 g di cubetti e subito
congelati per immersione in azoto liquido fino al
raggiungimento dell’equilibrio termico. I campioni
sono stati poi trasferiti e conservati temporaneamente a -80 °C, liofilizzati, e infine ridotti in polvere
con un blender in acciaio e conservati a -20 °C.
Estrazione della frazione proteica
I tuberi liofilizzati sono stati sottoposti a prove
di estrazione della frazione proteica al fine di individuare una procedura che risultasse efficace nella visualizzazione del loro intero corredo proteico.
Per l’analisi 2-D la preparazione del campione rappresenta un fattore critico, soprattutto nel caso di
tessuti vegetali dove si riscontra un basso rapporto
quantità di proteine/volume di estrazione e un’alta
concentrazione di sostanze interferenti quali pigmenti, enzimi proteolitici, carboidrati, ecc.
Sono stati selezionati due metodi tra quelli maggiormente riportati in letteratura in cui era previsto l’impiego di fenolo o di sodio dodecilsolfato
(SDS) 3.
Per quanto riguarda il metodo di estrazione con
fenolo, il tubero liofilizzato (0,25 g) è stato omogeneizzato con 4 ml di tampone di estrazione (sac-
Marzo 20125
La proteomica
SCELZA
Figura 1. — Preparazione dei tuberi.
carosio 0,7 M, EDTA 50 mM, KCl 0,1 M, tiourea
10 mM, TRIS 0,5 M, PMSF 2 mM, DTT 50 mM) e
incubato per 10 minuti in ghiaccio. L’omogenato è
stato poi centrifugato (15 min a 13000 g e 4 °C) e il
surnatante è stato sottoposto a una nuova estrazione con 5 ml di una soluzione di fenolo tamponata a
pH 8 mediante agitazione a 1800 rpm per 10 minuti
a temperatura ambiente. Dopo la centrifugazione
(10 minuti a 6000 g), un’ulteriore estrazione è stata
eseguita sulla fase fenolica con 5 ml del tampone
di estrazione mediante agitazione a 1800 rpm per
10 minuti e centrifugazione nuovamente come già
descritto. Il tampone è stato rimosso e la precipitazione delle proteine contenute nella fase fenolica è
stata ottenuta mediante aggiunta di 20 ml di acetato
di ammonio in metanolo 0,1 M, con tempo di reazione di 16 ore a -20 °C e centrifugazione a 20000
g per 20 minuti a 4 °C.
Il precipitato è stato lavato due volte con 4 ml di
una soluzione fredda di ammonio acetato in metanolo 0,1 M e una volta con una soluzione fredda
di ditiotreitolo (DTT) 10 mM in acetone. Il pellet
così lavato è stato essiccato all’aria per 30 minuti
a temperatura ambiente e poi solubilizzato in 1 ml
di tampone di reidratazione (urea 5 M, tiourea 2M,
CHAPS 2% p/v, C7BzO 2% p/v, DTT 20 mM, TCEPHCl 5 mM) per le analisi successive.
La procedura prevista nel metodo di estrazione
con SDS è pressoché simile: il tubero liofilizzato
(0,25 g) è stato miscelato ed incubato a 65 °C per
10 minuti con 2 ml di tampone di lisi (SDS 4% p/v,
saccarosio 5% p/v, polivinilpirrolidone (PVP) 10%
p/v, DTT 0,3% p/v, fosfato di sodio 20 mM a pH
7). L’omogenato è stato raffreddato per 15 minuti
in ghiaccio prima della centrifugazione (15 minuti
a 15000 g e 4 °C). Il surnatante è stato centrifugato
una seconda volta prima della precipitazione ottenuta mediante l’aggiunta di 8 ml di una soluzione
fredda di 10 mM DTT in acetone, con tempo di reazione di 16 ore, e della successiva centrifugazione a
20000 g per 20 minuti a 4 °C. Il precipitato proteico
è stato lavato 2 volte con DTT 10 mM in acetone
e poi essiccato all’aria per 30 minuti a temperatura
ambiente prima di essere solubilizzato in 1 ml di
tampone di reidratazione per le analisi successive.
Determinazione della concentrazione proteica
La concentrazione proteica è stata valutata mediante il 2-D Quant Kit (GE Healthcare) utilizzando
una soluzione di sieroalbumina 2 mg ml-1 per la
costruzione della retta di taratura. Le analisi sono
state eseguite in triplicato.
Analisi elettroforetica
Gli estratti proteici sono stati sottoposti dapprima
ad elettroforesi monodimensionale SDS-PAGE per
verificare l’avvenuta estrazione. Le proteine presenti nel campione, precedentemente solubilizzato in
37
SCELZA
La proteomica
tampone riducente SDS, sono state separate su gel
al 10% di poliacrilammide secondo il metodo Laemmli 8.
Dopodiché è stata eseguita l’analisi 2-D. L’iso
elettrofocalizzazione (IEF) è stata effettuata utilizzando IPG strip di 17 cm, pH 4-7 (Bio-Rad) sulle
quali sono stati caricati circa 500 µg di proteine.
Dopo la reidratazione attiva delle strip a 50 V per
12 h, la focalizzazione è stata eseguita mediante
una PROTEAN® IEF Cell, (Bio-Rad) utilizzando le
seguenti condizioni: da 0 a 500 V in 1 h, da 500 a
1000 V in 8 h, da 1000 a 5000 V in 3 h, da 5000 a
10000 V fino ad un massimo di 60000 V/h. Prima
St
CN
P1
P2
P3
S1
S2
S3
della seconda dimensione le strip sono stare equilibrate per 15 minuti in 3 ml di tampone di equilibrazione (urea 6 M, SDS 2%, Tris-HCl 0,375 M pH 8,8,
glicerolo 20%) contenente DTT 130 mM e successivamente per 15 minuti in 3 ml di tampone di equilibrazione contenente 135 mM iodoacetammide. Per
la seconda dimensione sono stati preparati gel al
12% di poliacrilammide. La seconda dimensione è
stata realizzata a 12 mA/gel per 30 minuti e 24 mA/
gel per 6 h mediante una PROTEAN® II XL MultiCells, (Bio-Rad).
La scansione dei gel, colorati con Coomassie
colloidale G-250 9, è stata eseguita mediante den-
St CN P1 S1
Acrilammide 10%
St = standard molecolari
CN = controllo negativo
kD
250
150
100
75
P1 = Estr. fenolica rep. 1
S2 = Estr. con SDS rep. 2
37
P1 S1
P1 S1
Acrilammide 10%
St = standard molecolari
250
150
100
75
CN = controllo negativo
P1 = Estr. fenolica
S1 = Estr. con SDS
50
50
P1 S1
kD
37
25
20
25
20
5 μL
Volume caricato: 2.5 μL
Campione: Agria (AG-C A 1)
Volume caricato: 20 μL
Campione: Agria (AG-C A 1)
Figura 2. — Gel SDS-PAGE degli estratti proteici della cv Agria,
ottenuti con i diversi metodi di estrazione.
10 μL
15 μL
Figura 3. — Gel SDS-PAGE preparati con diversi volumi degli
estratti proteici della cv Agria, ottenuti con i diversi metodi di
estrazione.
40
Campagnia
Protein (mg·g-1)
35
Sicilia
Puglia
30
25
20
15
10
Sieglinde
Sieglinde
Sieglinde
Elvira
Elvira
Spunta
Spunta
Sieglinde
Sieglinde
Sieglinde
Sieglinde
Arinda
Arinda
Arinda
Antea
Antea
Antea
Spunta
Spunta
Agria
0
Agria
5
Figura 4. — Contenuto proteico delle cv di patata raccolte nelle tre Regioni italiane.
38
Marzo 20125
La proteomica
SCELZA
sitometro GS-800 (Bio-Rad) e l’acquisizione delle
immagini è stata realizzata utilizzando il software
PDQuest (Bio-Rad).
Le corse elettroforetiche mono- e bi-dimensionali
sono stati eseguite in duplicato.
kDa
170
130
95
72
Risultati
55
43
Confronto dei metodi di estrazione
I metodi di estrazione proteica basati, rispettivamente, sull’uso di fenolo e di SDS sono stati testati
sulla cv Agria. Per verificare l’efficienza estrattiva
dei due metodi messi a confronto, i campioni ottenuti dalle due diverse estrazioni sono stati sottoposti ad analisi elettroforetica monodimensionale SDS-PAGE. Dai risultati ottenuti è emerso che
nel campione di tubero erano presenti proteine di
diverso peso molecolare e che il metodo basato
sull’uso di fenolo è risultato più efficiente (Figura 2). In particolare quest’ultimo ha mostrato una
maggiore efficienza nell’estrazione di proteine ad
alto peso molecolare (75 e 100 kD), mentre quello
basato sull’utilizzo di SDS è risultato più efficiente
per le proteine a più basso peso molecolare (<37
kDa) (Figura 3).
34
26
A
kDa
170
130
95
72
55
43
Contenuto proteico delle cv di patata
Una volta accertata la maggiore efficienza del
metodo di estrazione basato sull’uso di fenolo tale
metodo è stato adottato per estrarre la frazione proteica da tutti i campioni di tuberi oggetto di studio,
della quale è stata poi determinata la concentrazione (Figura 4).
La cv Antea coltivata a Spadafora (Messina) ha
mostrato il più elevato contenuto proteico (35 mg
g-1) tra tutte le cv studiate, mentre tra quelle coltivate in Puglia la cv Spunta, proveniente da Lecce,
è risultata la più ricca in proteine (28 mg g-1). La
cv Sieglinde, coltivata sia nelle località siciliane che
pugliesi, è risultata caratterizzata da bassi contenuti
proteici (~10 mg g-1), come del resto anche le due
cv campane.
Profili proteici dei tuberi di patata
Gli estratti proteici, previa determinazione della
loro concentrazione, sono stati sottoposti ad analisi
elettroforetica 2D.
34
26
B
Figura 5. — Mappe proteiche 2D dei tuberi appartenenti alle cv
Spunta provenienti da a) Siracusa (Sicilia) e b) Bari (Puglia).
Dall’analisi dei profili proteici delle cv Spunta
provenienti dalla Sicilia e dalla Puglia non sono state evidenziate differenze significative in termini di
numero di spot (da 100 a 300). Nella Figura 5 sono
riportati, a titolo esemplificativo, i profili proteici
dei tuberi appartenenti alla cv Spunta raccolti a Siracusa (Sicilia) e Bari (Puglia). È sempre ben presente il gruppo delle proteine acide appartenenti
alle patatine (tra 35 e 45 kD) comprendenti anche
singole patatine, in accordo con Bauw et al.10
L’analisi delle immagini dei gel 2D di tutte le
cv Spunta ha mostrato che i profili proteici sono
molto simili tra loro e che, come indicato dal
39
SCELZA
La proteomica
Tabella I. — Match set dei profili proteici delle cv Spunta.
Spunta Lecce
Siracusa
Catania
Bari
Spunta Siracusa
Lecce
Catania
Bari
Spunta Catania
Lecce
Siracusa
Bari
Spunta Bari
Lecce
Siracusa
Catania
Incremento
Decremento
ON
OFF
kDa
170
130
1
2
2
8
10
11
2
1
0
0
0
0
95
8
2
6
1
3
5
0
0
0
2
0
0
10
3
5
2
2
4
0
0
0
1
0
0
11
5
4
2
6
5
0
0
0
0
0
0
match set (Tabella I) non ci sono differenze in
termini di numero, ma solo in termini di intensità
degli spot.
Differenze in termini di numero di spot individuati nei profili proteici sono state rilevate per le
cv Antea e Arinda coltivate in Sicilia, e in numero
limitato anche tra le cv Agria e Agata coltivate in
Campania. Per quanto riguarda, invece, la cv Elvira, sono stati messi a confronto campioni di tuberi
coltivati a Foggia e tuberi già immessi sul mercato
pugliese. I due profili proteici hanno mostrato differenze nel numero e nell’intensità degli spot proteici (Figura 6). Il match set delle immagini 2D ha
rilevato ben 36 spot proteici nella cv commerciale
che non sono stati individuati nei tuberi coltivati a
Foggia (Tabella II).
55
43
34
26
A
kDa
170
130
95
72
55
43
34
26
B
Figura 6. — Mappe proteiche 2D dei tuberi appartenenti alle cv
Elvira provenienti da A) Foggia (Puglia) e B) prodotto commerciale (Puglia).
Discussione
La scelta del metodo di estrazione è stato uno
dei punti cruciali del presente lavoro. Infatti, come
è noto, l’estrazione proteica dai tessuti vegetali è
resa più complessa dalla particolarità che i tessuti
vegetali contengono una serie di componenti che
possono interferire con l’estrazione, quali fenoli,
pigmenti, enzimi proteolitici ed ossidativi, e carboidrati (quali amido). Pertanto, la preparazione
del campione è molto importante soprattutto in
previsione di analisi elettroforetiche 2D, in quanto
una negligenza in tale fase può comportare interferenze durante l’isoelettrofocalizzazione delle
40
72
Tabella II. — Match set dei profili proteici della cv Elvira.
Elvira Foggia
Elvira comm.
Incremento
Decremento
ON
OFF
52
24
4
36
proteine mettendo quindi a rischio la qualità dei
gel.
Dall’analisi comparativa è stato scelto il metodo
del fenolo perché, in accordo con quanto ripor-
Marzo 20125
La proteomica
SCELZA
tato da Delaplace et al. 3, ha permesso di estrarre
una maggior quantità di proteine e di ottenere gel
di migliore qualità. La concentrazione di proteine
riscontrata nelle cv siciliane oggetto di studio (Antea, Arinda e Spunta) è risultata maggiore rispetto a
quelle campane e pugliesi, probabilmente a causa
di fattori ambientali. Infatti la temperatura durante
la crescita della pianta, le origini geografiche, la
data di raccolta ed il tempo di conservazione possono influenzare le proprietà della patata 11-14. La
quantità di proteine misurata nei tuberi oggetto di
studio è stata comunque maggiore rispetto a quella riportata in letteratura, pari a 1,55 g per 100 g
di patata liofilizzata 15. Questo risultato potrebbe
essere spiegato dalla non preventiva eliminazione
del periderma (o buccia) dai tuberi analizzati, dal
momento che la buccia è la frazione che contiene
la maggior concentrazione di proteine 16.
Le frazioni proteiche estratte dai tuberi provenienti dalle diverse regioni oggetto di studio sono
state analizzate mediante elettroforesi 2D per meglio evidenziare il profilo proteico dei tuberi e
per individuare eventuali marcatori molecolari. Le
proteine del tubero di patata possono essere classificate in tre gruppi: le patatine, gli inibitori delle proteasi e altre proteine 17. I primi due gruppi
rappresentano la frazione principale delle proteine
della patata. Le varie isoforme sono legate ad attività enzimatiche e di inibizione che potrebbero
avere rilevanza fisiologica 10. Le patatine, in particolare, considerate il principale gruppo di proteine di
conservazione e difesa della patata, rappresentano
un gruppo di glicoproteine con peso molecolare
nell’intervallo di 40-45 kDa e il 40% di tutte le proteine solubili presenti nei tuberi di patata 18. Da
quanto riportato in letteratura le patatine sembrano
essere coinvolte nelle attività di alcuni enzimi, quali
esterasi degli acidi grassi, aciltransferasi e acil idrolasi lipidica 19-21.
Nei proteomi delle diverse cv analizzate il gruppo delle patatine è risultato essere sempre presente e sempre molto espresso rispetto al totale delle
proteine rilevate. Proteine a più basso peso molecolare (<26 kD) con funzione di trasporto e di
difesa ai patogeni sono inoltre presenti in accordo
con Lehesranta et al.7
Mentre il confronto del profilo proteico di cv diverse ha messo in evidenza differenze sia nel numero che nell’intensità degli spot proteici, l’analisi
dei profili proteici ottenuti nell’ambito della stessa
cv provenienti da regioni diverse non ha messo in
evidenza differenze significative. Il numero di spot
è risultato pressoché identico per le cv aventi diversa origine, anche se sono state evidenziate differenze in termini di intensità degli spot. Tali differenze
di espressione potrebbero essere legate al tipo di
coltivazione e fertilizzazione 7.
Un risultato interessante è stato ottenuto dal
match set del profilo di una cv Elvira coltivata in
Puglia con quello di un campione prelevato dal
mercato locale: Il proteoma di quest’ultima è risultato più ricco in proteine ad alto peso molecolare
(>72 kD) che, in accordo con quanto riportato da
Lehesranta et al. 7, sarebbero proteine coinvolte nel
metabolismo dei fenoli e nel loro deposito nei tuberi.
Conclusioni
Alla luce dei risultati ottenuti l’analisi proteomica dei tuberi di patata può essere considerata un
buono strumento per individuare marker molecolari che possano essere utili all’identificazione e alla
tipizzazione dei tuberi di patata. Ciò nonostante il
contributo di una successiva analisi di spettrometria di massa che permette l’identificazione delle
proteine presenti nei gel elettroforetici 2D si rende
necessario e può rafforzare la validità e l’applicabilità delle tecniche proteomiche.
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SCELZA
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haemosorbents based on proteinase inhibitor. I. Synthesis and
properties. Biomaterials 1993;14:51-6.
Finanziamenti.—La ricerca è stata finanziata dal MiPAF, Progetto
speciale “Tipizzazione e caratterizzazione di varietà precoci di patata
con l’impiego di tecniche molecolari e spettroscopiche”.
Pervenuto il 12 dicembre 2011.
Accettato il 19 marzo 2012.
Marzo 20125
Studio dei metaboliti secondari
di varietà precoci di Solanum tuberosum
L. LEPORE 1, M. PESCA 1, N. DE TOMMASI 1, D. CARPUTO 2, F. DAL PIAZ
Obiettivo. Negli ultimi anni si è osservato un crescente
interesse alle proprietà nutraceutiche degli alimenti.
Poiché il tubero di patata (Solanum tuberosum) rappresenta la terza coltura alimentare destinata al consumo umano, abbiamo condotto uno studio volto alla
valutazione del contenuto in metaboliti secondari in
tuberi di patata precoce appartenenti a diversi cultivar e cresciuti in diverse aree geografiche e su differenti terreni.
Metodi. A questo scopo, abbiamo messo a punto tecniche analitiche che consentissero lo studio qualiquantitativo di numerosi composti, minimizzando i
trattamenti pre-analitici fonte di problemi di affidabilità. Abbiamo così identificato e quantizzato i metaboliti maggioritari: acido ascorbico, tirosina, caffeoil
spermina, triptofano, acido-3-O-caffeoil-5-O-feruloilchinico, bis-diidrocaffeoil spermina, acido clorogenico e neoclorogenico, ammide dell’acido ferulico, bis
e tris-diidro-caffeoil-spermidina, rutina, apigenina,
glicoalcaloidi (α-solanina e α-chaconina), kaemferolo3-O-rutinoside e quercetina dimetil-etere.
Risultati. I metaboliti più abbondanti nei tuberi di patata precoce sono l’acido clorogenico e l’acido ascorbico. In particolare, la patata precoce è risultata più
ricca di quest’ultimo metabolita rispetto alla patata
comune; metaboliti come flavonoidi, derivati poliammidici e triptofano sono risultati presenti in bassissime quantità.
Conclusioni. L’analisi del contenuto in glicoalcaloidi
dei tuberi di patata precoce studiati ha permesso di
dimostrare che questi metaboliti sono presenti a concentrazioni molto più basse dei limiti critici. L’analisi
statistica dei risultati ottenuti ha consentito di individuare le proprietà metabolomiche preponderanti
nei cultivar studiati, ma anche di osservare come le
caratteristiche chimiche del terreno sui quali i diversi
Autore di contatto: F. Dal Piaz, Dipartimento di Scienze Farmaceutiche e Biomediche, Università di Salerno, via Ponte Don Melillo, 84084
Fisciano, Salerno, Italia. E-mail: [email protected]
1
1Dipartimento
di Scienze Farmaceutiche e Biomediche
Università di Salerno, Fisciano, Salerno, Italia
2Dipartimento di Scienze del Suolo della Pianta
dell’Ambiente e delle Produzioni Animali (DISSPAPA)
Università di Napoli Federico II, Portici, Napoli, Italia
tuberi sono stati coltivati hanno un effetto chiaro e
riproducibile sul loro contenuto in alcuni metaboliti
secondari.
Parole chiave: Metaboliti secondari - Solanum tuberosum Polifenoli - Glicoalcaloidi.
I
l tubero di patata (Solanum tuberosum) segue solo
il riso e il grano in importanza mondiale, come coltura alimentare destinata al consumo umano. Oltre
ad avere un alto valore nutrizionale, le patate, come
altri vegetali, accumulano una serie di metaboliti secondari, tra cui composti polifenolici e glicoalcaloidi,
come mezzo di difesa da insulti sia biotici che abiotici. In particolare i polifenoli sono riconosciuti come
importanti componenti in grado di esercitare effetti
positivi sulla salute dell’uomo 1, 2, mentre i glicoalcaloidi della patata sono noti per la loro tossicità 3, 4.
L’interesse per lo studio del contenuto in metaboliti
secondari della patata precoce nasce dalla crescente attenzione posta negli ultimi anni alle proprietà
nutraceutiche e anti-nutraceutiche degli alimenti 5.
Nel presente lavoro sono state messe a punto tecniche estrattive e analitiche al fine di identificare e
quantizzare i metaboliti secondari più abbondanti nei tuberi di alcune cultivar di patata precoce. I
metaboliti identificati e successivamente quantizzati
43
LEPORE
sono stati: acido ascorbico, tirosina, caffeoil spermina, triptofano, acido-3-O-caffeoil-5-O-feruloil-chinico, bis-diidrocaffeoil spermina, acido clorogenico
e neoclorogenico, ammide dell’acido ferulico, bis e
tris-diidro-caffeoil-spermidina, rutina, apigenina, glicoalcaloidi (α-solanina e α-chaconina), kaemferolo3-O-rutinoside, quercetina dimetil-etere. I metaboliti
più abbondanti nei tuberi di patata precoce sono risultati l’acido clorogenico, e l’acido ascorbico (vitamina C) 6. Di quest’ultimo metabolita la patata precoce
risulta più ricca rispetto alla patata comune (30 mg/
kg vs. 15 mg/kg), mentre metaboliti come flavonoidi,
derivati poliammidici e triptofano sono risultati presenti in bassissime quantità. L’analisi del contenuto in
glicoalcaloidi dei tuberi di patata precoce studiati ha
permesso di dimostrare che questi metaboliti sono
presenti a concentrazioni molto più basse dei limiti critici. Correlando la provenienza geografica e il
contenuto metabolico delle cultivar studiate, è stato
possibile dedurre che all’interno della stessa cultivar
studiate, coltivata in regioni differenti, le differenze
nel tenore di metaboliti secondari sono significative.
Materiali e metodi
Materiale vegetale
Sono stati analizzati tuberi di patata precoce delle
cultivar Arinda, Sieglinde, Spunta prelevati da differenti zone di coltivazione nelle regioni Puglia e
Sicilia (Tabella I).
Estrazione
L’estrazione è stata effettuata secondo il metodo
riportato da Shakya et al. (2006) 1-12. I tuberi sono
stati lavati con acqua deionizzata senza asportarne
la buccia, asciugati e tagliati longitudinalmente in
otto parti uguali scartando le due estremità. In seguito sono stati ridotti in cubetti e, per evitare reazioni di degradazione enzimatica, sono stati immediatamente congelati in azoto liquido e liofilizzati.
Solo dopo la completa disidratazione, il campione
è stato ridotto in polvere fine mediante l’uso di un
omogeneizzatore. I campioni polverizzati sono stati
conservati a -20 °C, al buio, fino all’uso. Sono stati
pesati 400 mg di liofilizzato e messi in eppendorf da
2 ml con 0,9 ml di buffer di (50% v/v di MeOH, 50%
v/v di H2O, con 2,5% di acido metafosforico e 1 mM
di EDTA). Le eppendorf contenenti il campione disperso nel buffer di estrazione sono state agitate con
vortex per 1 minuto circa, sottoposte a sonicazione
per 15 minuti, a bassa temperatura e alla massima
potenza disponibile. Dopo la sonicazione, le eppendorf sono state nuovamente agitate con vortex per
1 minuto circa, poi centrifugate per 7 minuti, a 4 ºC,
a 13000 rpm.
Il surnatante è stato prelevato e trasferito in altre
eppendorf. Il pellet rimanente è stato riestratto con
0,6 ml del buffer di estrazione, sonicato e centrifugato. Della soluzione dei due surnatanti sono stati
prelevati 200 µl, congelati a -80 ºC per 15 minuti e
seccati in Speed Vac (Eppendorf, Amburgo, Germania) a temperatura ambiente, per due ore.
Tabella I. — Siti di campionamento delle differenti aree di coltivazione nelle regioni Puglia e Sicilia.
Campione
Arinda (Sicilia)
Arinda (Sicilia)
Arinda (Sicilia)
Sieglinde (Puglia)
Sieglinde (Puglia)
Sieglinde (Puglia)
Sieglinde (Sicilia)
Sieglinde (Sicilia)
Sieglinde (Sicilia)
Sieglinde (Sicilia)
Spunta (Puglia)
Spunta (Puglia)
Spunta (Puglia)
Spunta (Puglia)
44
Sigla
Siti di campionamento
Data raccolta
09-AR-S-A1-3
09-AR-S-E1-3
09-AR-S-G1-3
09-SG-P-C1-3
09-SG-P-D1-3
09-SG-P-C-COM
09-SG-S-F2-3
09-SG-S-I-GIARRE
09-SG-S-L-ISPICA
09-SG-S-H-MARSALA
09-SP-P-A1-3
09-SP-P-I1-3
09-SP-S-B1-3
09-SP-S-C1-3
Torre Milocca (SR)
Carruba-Riposto (CT)
Giardinaccio-Montef. S. Giorgio (ME)
Cisternella (LE)
San Ferdinando (BAT)
Puglia
Scala- Torregrotta (ME)
Giarre (CT)
Ispica (RG)
Marsala (TP)
Chianchi (LE)
Mola di Bari-Cozze (BA)
Cassibile (SR)
Acireale-Scura (CT)
2009
21/05/2009
22/05/2009
25/05/2009
26/05/2009
2009
22/05/2009
2009
2009
2009
25/05/2009
2009
21/05/2009
21/05/2009
Marzo 2012
Analisi HPLC-DAD
Le analisi sono state realizzate usando un HPLCDAD Agilent 1200 Series (Agilent Technologies, Palo
Alto, CA, USA), costituito da una pompa binaria (G1312A), un auto-campionatore (G-1329A), un degassatore (G-1322A) e un rivelatore a serie di diodi
(1315D). I solventi usati sono il metanolo (ottenuto
da Romil, Cambridge, UK),) per la fase B e l’acqua
milliQ (preparata usando un Millipore, Bedford, MA,
USA). Gli standard sono stati acquistati da Extrasynthese (Lione, Francia), e Sigma Aldrich (Milano, Italia). Le analisi sono state effettuate utilizzando una
colonna monolitica Onyx (50x2 mm C18, Phemomenex, Italia), velocità di flusso utilizzata 0,600 ml/min,
lunghezza d’onda selezionata 280 nm. I campioni
sono stati iniettati in triplicato.
Il gradiente utilizzato è stato: da 0 a 1 min, 100%
di tampone A (H2O + 0,01% acido trifluoroacetico);
da 1 a 6,7 min, 0-30% di tampone B (MeOH Merck);
da 6,7 a 11,7 min, 30-70% di B; da 11,7 a 14,56, 7090% di B; da 14,56 a 18, 90% di B, con un post-time
di 4 minuti. L’identificazione dei picchi cromatografici è stata effettuata mediante analisi di spettrometria di massa. Gli standard sono stati preparati alla
concentrazione di 0,05 mg/ml. La quantificazione
dei composti fenolici, aminoacidi e acido ascorbico, è stata effettuata nelle medesime condizioni di
analisi dell’estratto. Sono state costruite le curve di
calibrazione degli standard acido ascorbico, tirosina,
triptofano, acido ferulico, acido caffeico, acido clorogenico, rutina e quercetina. L’acido neoclorogenico è
stata valutato come equivalente di acido clorogenico.
I derivati dell’acido caffeico (caffeoil spermina, bis-diidrocaffeoil spermina, tris-diidro caffeoil spermidina)
sono stati studiati come equivalenti di acido caffeico.
Gli standard sono stati preparati a una concentrazione stock di 10 mg/ml in metanolo, eccetto la tirosina
e triptofano preparate ad una concentazione 10 mg/
ml 0,1 N HCl 7. Sono state effettuate iniettate a diversi volumi di iniezione (da avere 0,1 µg, 0,5 µg, 1
µg, 1,5 µg, 2 µg, 3 µg). Riportando in grafico le aree
dei picchi cromatografici inn funzione delle rispettive
concentrazioni, è stata ottenuta una curva di calibrazione con almeno 6 punti per ogni standard, utile per
quantizzare i metaboliti.
USA), dotato di una sorgente electrospray, accoppiato ad un HPLC Alliance 2695 (Waters).
Il tuning e la calibrazione dello strumento sono state effettuate utilizzando uno standard puro di Solanina
([M+H]+= m/z 869,07). I campioni sono stati sciolti in
1,5 ml di acqua, agitati mediante vortex per 1 minuto
circa, e poi centrifugati per 2 min a 13 rpm. Dalla soluzione ottenuta, sono stati prelevati 1 ml a cui sono
stati aggiunti 20 µl di angiotensina come standard interno. Lo standard è stato preparato partendo da una
soluzione standard 8 mg/ml, successivamente diluito
fino ad una concentrazione di 40,8 µg/ml. La separazione cromatografica è stata condotta iniettando 10 μl
di ciascun campione su una colonna monolitica Onyx
(Phenomenex) (50x2 mm, una velocità di flusso 0.4
ml/min). Il gradiente di eluizione è: 0-1 min buffer A
al 100% (H2O + 10 mM di acido formico, pH 3,5, con
NH4OH), 1-6,7 min 0-30% di buffer B (MeOH), 6,711,7 min 40-70% di buffer B, 11,7-14,56 min 70-100%
di buffer B, 14,56-20 min 100% buffer B. Le analisi
sono state condotte in polarità positiva. La temperatura della sorgente è stata fissata a 80 ºC, con temperatura di desolvatazione di 150 ºC. Il capillary voltage
usato era pari a 3 kV e il sampling cone 30 eV. La
collision energy pari a 2, la cell entrance 5, la cell exit
-20. I metaboliti analizzati mediante HPLC sono stati
identificati mediante analisi LC-ESI-MS sia dell’estratto che di una soluzione multi-standard, contenente
i principali metaboliti caratterizzati. Il multi-standard
è stato preparato a partire dai singoli analiti ad una
concentrazione 100 mg/ml in MeOH. Successivamente tutte le soluzioni sono state diluite a 0,1 mg/ml. Di
ogni standard diluito a 0,1 mg/ml sono stati prelevati
5 µl e portato a 500 µl finali di acqua.
Mediante LC-MS sono stati identificati e quantizzati i glicoalcaloidi α-chaconina e α-solanina (metodo
dell’aggiunta standard). I dati sono stati analizzati attraverso l’uso del software MassLynx 4.1 (Waters). La quantizzazione è stata ottenuta mediante
la curva di calibrazione, utilizzando come standard
α-chaconina, α-solanina e apigenina. Gli esperimenti
sono stati condotti in triplicato, sono stati iniettati diversi volumi in modo da ottenere per i glicoalcaloidi
25 ng, 50 ng, 75 ng, 100 ng, 150 ng e 250 ng e per
l’apigenina 0,125 ng, 0,25 ng, 1 ng, 1,5 ng.
Risultati e discussione
Analisi LC-MS
Le analisi LC-MS/MS sono state eseguite con uno
strumento di Q-TOF Premier (Waters, Milford, MA,
LEPORE
Lo studio dei metaboliti secondari di varietà precoci di Solanum tuberosum L. (solanaceae) è stato
45
LEPORE
1.800
conservati al buio a -20 °C fino all’uso, l’estrazione è
stata effettuata in metanolo ed acido meta-fosforico
utilizzando gli ultrasuoni sul prodotto liofilizzato 7.
L’identificazione e la quantizzazione dei metaboliti
presenti negli estratti di tubero è stata ottenuta mediante HPLC-DAD, l’analisi quantitativa è stata effettuata attraverso curve di calibrazione da standard
puri. In tutti i tuberi analizzati i metaboliti più abbondanti sono risultati acido clorogenico ed ascorbico. La definitiva identificazione dei metaboliti secondari e l’analisi quali-quantitava dei glicoalcaloidi
è stata ottenuta mediante LC-MS/MS (Figura 1) 8-10.
I risultati dello studio quali quantitativo sono mostrati nelle Figure 2-4. Analizzando i risultati ottenuti
per i tuberi della cultivar Spunta un contenuto di
acido ascorbico e acido clorogenico superiore è stato osservato per il campione 09-SP-P-A (1600 mg/
kg e 1200 mg/kg rispettivamente) rispetto a quanto
osservato per gli altri tuberi della stessa cultivar (acido ascorbico 900-1200 mg/kg ed acido clorogenico
400-700 mg/kg, rispettivamente, Figura 3).
Il contenuto degli analiti identificati nei tuberi della cultivar Arinda è risultato mediamente più basso
rispetto a quanto rilevato per i tuberi della varietà
Spunta, con l’eccezione di acido ascorbico, tirosina
ed acido clorogenico, che risultavano i metaboliti
più abbondanti (44%, 17% e 15%, rispettivamente).
I flavonoidi e i derivati poliamminici (caffeoil spermina, bis-diidrocaffeoil spermina, tris diidrocaffeoil
1.600
mg/Kg
1400
1200
1000
800
600
400
200
0
1
2
3
4
5
09-AR-S-A
6
7
8
9
09-AR-S-E
10
11
12
13
09-AR-S-G
Figura 1. — ESI (+) LC-MS di un estratto totale di tubero. Picchi:
(1) acido ascorbico; (2) tirosina; (3) caffeoil spermina, (4) triptofano, (5) 3-O-caffeoil-5-O-feruloil acido chinico; (6) bis-diidrocaffeoil
spermina; (7) acido clorogenico, (8) rutina; (9) Tris(dihydrocaffeoyl)
spermidine; (10) α-chaconine; (11) α-solanina; (12) kaemferol- 3-Orutinoside; (13) 3-OMe-Quercetina; (14) apigenina.
realizzato utilizzando tuberi raccolti in diversi siti di
coltivazione in Puglia e Sicilia. Le regioni dei siti
di raccolta del tubero di Solanum tuberosum rappresentano le zone agricole dove si concentra la
maggior parte della produzione, commercializzazione ed esportazione della patata novella in Italia. I
tuberi freschi sono stati congelati in azoto liquido,
1.800
1.600
mg/Kg
1400
1200
1000
800
600
400
200
0
1
2
09-SG-P-C
09-SG-S-I-GIARRE
3
4
5
6
09-SG-P-D
09-SG-S-L-ISPICA
7
8
9
09-SG-S-F
09-SG-S-H-MARSALA
10
11
12
13
09-SG-P-C-COM
Figura 2. — Metaboliti (mg/kg di droga secca) osservati nei tuberi della cultivar spunta: (1) acido ascorbico, (2) tirosina, (3) caffeoil spermina, (4) triptofano, (5) acido 3-caffeoil-5-o- feruloil chinico, (6) bis-diidrocaffeoil spermina, (7) acido neoclorogenico, (8) acido clorogenico,
(9) ammide dell’acido ferulico, (10) bis-diidrocaffeoil spermidina, (11) tris-diidrocaffeoil spermidina, (12) flavonoidi,, (13) alcaloidi.
46
Marzo 2012
LEPORE
1.800
1.600
mg/Kg
1400
1200
1000
800
600
400
200
0
1
2
3
4
09-SPP-A
5
6
09-SPP-I
7
8
09-SPS-B
9
10
11
12
13
09-SPS-C
Figura 3. — Metaboliti (mg/kg di droga secca) osservati nei tuberi della cultivar arinda: (1) acido ascorbico, (2) tirosina, (3) caffeoil spermina, (4) triptofano, (5) acido 3-caffeoil-5-o-feruloil chinico, (6) bis-diidrocaffeoil spermina, (7) acido neoclorogenico, (8) acido clorogenico,
(9) ammide dell’acido ferulico, (10) bis-diidrocaffeoil spermidina, (11) tris-diidrocaffeoil spermidina, (12) flavonoidi, (13) alcaloidi.
Arinda
Acido ascorbico
Sieglinde
Ammide dell’acido ferulico
Chlorogenic acid
Acido 3-0-caffeoil-5-0-feruloil
chinico
Flavonoidi
Acido neoclorogenico
Spunta
Totale alcaloidi
Totale spermina
Triptofano
Tirosina
Figura 4. — Metaboliti (mg/kg di droga secca) osservati nei tuberi
della cultivar sieglinde: (1) acido ascorbico, (2) tirosina, (3) caffeoil
spermina, (4) triptofano, (5) acido 3-caffeoil-5-o- feruloil chinico,
(6) bis-diidrocaffeoil spermina, (7) acido neoclorogenico, (8) acido
clorogenico, (9) ammide dell’acido ferulico, (10) bis-diidrocaffeoil
spermidina, (11) tris-diidrocaffeoil spermidina, (12) flavonoidi, (13)
alcaloidi.
spermidina e bis diidrocaffeoil spermidina) erano
presenti in piccole quantità 11-13. Anche i tuberi della
cultivar Sieglinde presentavano un alto contenuto di
acido clorogenico, che risultava essere il costituente principale tra i metaboliti secondari (31%, corrispondente ad un valore medio 800 mg/kg in peso
secco). In particolare, i tuberi di SG-P-D e 09-SG-PC-COM risultavano particolarmente ricchi in questo
metabolita, con un contenuto totale pari a 1000 mg/
kg. Altri metaboliti secondari osservati con concentrazioni elevate sono stati l’acido ascorbico, tirosina,
glicoalcaloidi, ed acido neoclorogenico risultano rispettivamente 23%, 17%, 8% e 10% dei metaboliti
totali. Meno abbondanti sono risultati, come per le
altre cultivar, flavonoidi, esteri poliamminici (caffeoil spermina, bis-diidrocaffeoil spermina, tris diidrocaffeoil spermidina e bis diidrocaffeoil spermidina),
triptofano ed acido ferulico. La variabilità e le analogie tra le diverse cultivar di patata precoce e le
eventuali relazioni tra il contenuto in metaboliti secondari e la loro provenienza geografica, sono state
studiate mediante il confronto del contenuto qualiquantitativo dei composti identificati (Figura 5).
Il contenuto in metaboliti secondari delle cultivar Spunta e Arinda risultava simile nonostante i
campioni analizzati provengano da regioni diverse. Il contenuto di acido ascorbico e tirosina variava da 35-44% e 11-18% rispettivamente, mentre
il contenuto in acido clorogenico presentava note-
47
LEPORE
300
a-chaconine
a-solanine
Alcaloidi totali
250
mg/Kg
200
150
100
7%
50
93%
0
2
1
3
4
5
6
7
8
9
10 11 12 13 14
Figura 5. — Confronto tra le quantità (mg/kg di droga secca) di metaboliti secondari osservati nei tuberi della cultivar Arinda, Spunta,
Seglinde.
voli variazioni (dal 16 al 31%, Figura 5). Le abbondanze relative dei metaboliti minori, quali i derivati
poliamminici (caffeoil spermina, bis-diidrocaffeoil
spermina, tris diidrocaffeoil spermidina e bis diidrocaffeoil spermi dina, total spermine), gli alcaloidi e
i flavonoidi risultavano simili nelle 2 cultivar. I tuberi delle cultivar Arinda e Spunta si presentavano
particolarmente ricchi in acido ascorbico (circa 44%
per entrambe), mentre quelli della cultivar Sieglinde presentavano un contenuto di acido ascorbico
del 23-26%, il contenuto di acido clorogenico e alcaloidi in questa cultivar era leggermente superiore
rispetto alle altre (31-33%). La quantità di alcaloidi osservata in tutte le cultivar analizzate risultava
omogenea (5-8%), i glicoalcaloidi identificati sono
l’α-chaconina e l’α-solanina. Il glicoalcaloide più
abbondante è risultato l’α-chaconina (93%), come
mostra il grafico in Figura 6. Studi di letteratura
hanno evidenziato che il contenuto in glicoalcaloidi
in Solanum tuberosum è proporzionale a quello in
acido cloro genico 4, ciò è risultato evidente anche
dai nostri dati come si può osservare nei grafici nelle Figure 7-8, l’andamento del contenuto metabolico dei glicoalcaloidi è correlato a quello dell’acido
clorogenico.
Successivamente, il contenuto in metaboliti secondari delle stesse cultivar è stato analizzato rispetto al pH dei terreni di raccolta dei tuberi 14. Dai dati
ottenuti il contenuto di acido ascorbico sembra non
essere influenzato dal pH (400-600 mg/kg), tirosina
48
mg/Kg
Figura 6. — Valore medio dei glicoalcaloidi (mg/kg di droga secca)
osservati nei campioni analizzati.
1.800
1.600
1.400
1.200
1.000
800
600
400
200
0
Acido clorogenico
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10 11 12 13 14
Figura 7. — Glicoalcaloidi (mg/kg di droga secca) osservati nei
campioni (1) 09-AR-S-A, (2) 09-AR-S-E, (3) 09-AR-S-G, (4) 09-SP-P-A,
(5) 09-SP-P-I, (6) 09-SP-P-B, (7) 09-SP-P-C, (8) 09-SG-P-C, (9) 09-SGP-D, (10) 09-SG-S-F, (11) 09-SG-P-C-COM, (12) 09-SG-S-I-GIARRE,
(12) 09-SG-S-ISPICA, (13) 09-SG-S-H-MARSALA
1.400
1.200
1.000
800
600
400
200
0
Molto acido
Neutro
Alcalino
Figura 8. — Acido clorogenico (mg/kg di droga secca) osservato nei
campioni (1) 09-AR-S-A, (2) 09-AR-S-E, (3) 09-AR-S-G, (4) 09-SP-P-A,
(5) 09-SP-P-I, (6) 09-SP-P-B, (7) 09-SP-P-C, (8) 09-SG-P-C, (9) 09-SGP-D, (10) 09-SG-S-F, (11) 09-SG-P-C-COM, (12) 09-SG-S-I-GIARRE,
(12) 09-SG-S-ISPICA, (13) 09-SG-S-H-MARSALA
e 3-O-caffeoil-5-O-feruloil-chinico presentavano una
concentrazione inversamente proporzionale all’aumentare del pH (555, 413, 238 mg/kg, e193, 83, 35
Marzo 2012
LEPORE
100
50
0
2.50
5.00
7.50
10.00
12.50
15.00
17.50
20.00 Time
Figura 9. — Acido clorogenico (mg/kg di droga secca) osservato in tuberi cresciuti in terreni a pH acido, neutro e alcalino.** La differenza
fra le medie osservate è significativa al 95%, P<0,05.
mg/kg, rispettivamente), triptofano, acido clorogenico e acido neoclorogenico presentavano un profilo
simile e pH dipendente; infatti questi analiti sono
prodotti in quantità significativamente superiori dai
tuberi coltivati in terreni alcalini (117, 1200, 400 mg/
kg, rispettivamente). In Figura 9 sono riportati i valori dell’acido clorogenico in funzione del pH del
terreno di coltivazione dei tuberi, come appare evidente il valore medio di questo analita a pH bassi è
di circa 300 mg/kg, a pH neutri è di circa 650 mg/
kg e cresce significativamente a pH alcalini (circa
1200 mg/kg).
Uno studio comparativo dei metaboliti secondari
presenti nei tuberi della Cultivar Spunta raccolti in
Sicilia e Puglia evidenziava nei tuberi provenienti
dalla Puglia un contenuto di acido ascorbico, acido
clorogenico e alcaloidi maggiore rispetto a quello
dei tuberi prelevati della Sicilia. I tuberi di Sieglinde della Puglia mostravano un contenuto di acido
ascorbico e tirosina significativamente maggiore rispetto ai campioni provenienti dalla Sicilia. La tirosina non sembra essere influenzata dal variare della
regione di provenienza del tubero, tutti gli altri metaboliti (acido clorogenico e neoclorogenico, alcaloidi, spermine e triptofano) sono presenti in maggior quantità nei campioni di tubero provenienti
dalla Puglia (Figure 2-4).
Conclusioni
È stata sviluppata una strategia analitica per lo
studio dei metaboliti di tuberi di patata precoce, volta ad una valutazione comparativa sul piano delle
proprietà nutrizionali e ad identificare e quantizzare contemporaneamente metaboliti secondari con
caratteristiche di polarità diverse (glicoalcaloidi steroidei, flavonoidi, derivati dell’acido caffeico). Sono
stati identificati e quantizzati i seguenti metaboliti
secondari: acido ascorbico, tirosina, caffeoil spermina, triptofano, acido-3-O-caffeoil-5-O-feruloil-chinico, bis-diidrocaffeoil spermina, acido clorogenico
e neoclorogenico, ammide dell’acido ferulico, bis e
tris-diidro-caffeoil-spermidina, rutina, apigenina, gli-
49
LEPORE
coalcaloidi (α-solanina e α-chaconina), kaemferolo3-O-rutinoside, quercetina dimetil-etere. Il confronto
dei profili dei metaboliti secondari osservati per i
diversi tuberi analizzati è stato effettuato mediante comparazioni intra e inter-cultivar. Dalle analisi
inter-cultivar è emerso che Arinda e Spunta sono
particolarmente ricche in acido ascorbico. Il contenuto in acido clorogenico è abbastanza omogeneo,
tranne nella cultivar Arinda, dove risulta in quantità
inferiori. Flavonoidi, derivati poliammidici, triptofano sono presenti in bassissime quantità in tutte le
cultivar analizzate, così come il contenuto in alcaloidi.
Al fine di determinare eventuali correlazioni tra il
profilo dei metaboliti secondari quantizzati e la loro
provenienza geografica, o il pH del terreno in cui i
tuberi erano stati coltivati, analisi intra-cultivar sono
state effettuate. Mettendo in correlazione la provenienza geografica e il contenuto metabolico delle
cultivar, è stato possibile dedurre che all’interno
della stessa cultivar, coltivata in regioni differenti, le
differenze in metaboliti sono significative, tuttavia
tali differenze non presentano lo stesso andamento
per tuberi di cultivar differenti. Dalle analisi intracultivar, effettuate per la valutazione dell’effetto del
pH del terreno (composizione vs. pH), si è potuto
osservare che il contenuto di acido ascorbico, ammide dell’acido ferulico e alcuni derivati delle spermine non è influenzato dal pH del terreno, tirosina
ed acido 3-O-caffeoil-5-O-feruloil chinico presentano una concentrazione inversamente proporzionale all’aumento del pH, mentre triptofano, acido
neoclorogenico, acido clorogenico presentano un
aumento di concentrazione proporzionale all’aumento del pH. Le cultivar di patata precoce analizzate risultavano una interessante fonte di acido
ascorbico 15, 16.
50
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polyphenols. A review. J Agric Food Chem 1997;45:1523-40.
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Marzo 2012
Definizione di una firma “geochimico-mineralogica”
dei suoli destinati alla produzione della patata precoce
S. VINGIANI, M. ZAMPELLA, L. MINIERI, F. TERRIBILE, P. ADAMO
Obiettivo. Definire parametri mineralogici e pattern geochimici identificativi dei suoli delle aree di provenienza
di patate precoci prodotte in tre regioni del sud Italia.
Per un numero selezionato di campioni, tali parametri
sono stati ricercati anche nel suolo adeso ai tuberi.
Metodi. Suolo e tuberi sono stati prelevati a fine ciclo
produttivo in 12 siti ubicati in Puglia, Campania e Sicilia.
Dei siti è stato studiato il contesto geologico e sui suoli sono stati determinati: granulometria (granulometro
laser), pH, carbonati totali (calcimetro), carbonio organico (Walkley-Black), CSC e basi di scambio (BaCl2 a pH
8.2), P assimilabile (metodo Olsen), Fe, Al e Si (ossalato
e DCB), composizione multielementare (ICP-MS), mineralogia (XRD).
Risultati. I substrati parentali sono riconducibili a tre
tipologie principali: rocce calcaree, sedimenti alluvionali
e substrati vulcanici. I suoli sono caratterizzati da tessitura sciolta e pH generalmente neutro e subalcalino. La
maggior parte è povera di carbonati e CO con bassa CSC.
Quarzo, feldspati, calcite e minerali argillosi in diverse
quantità relative si associano in ambiente vulcanico con
ossidi di ferro e alluminosilicati a scarso ordine cristallino. Distintivo è il contenuto totale di macro e micronutrienti, mentre le quantità biodisponibili degli stessi elementi non differenziano altrettanto bene i suoli di aree
geografiche diverse. Il suolo adeso ai tuberi ha curve
granulometriche e tracciati XRD simili al suolo tal quale,
ma più elevate quantità di particelle di minori dimensioni che ne differenziano la composizione geochimica.
Conclusioni. Gli indicatori suolo-dipendenti differenziano bene i suoli di provenienza della patata precoce. Il
suolo adeso ai tuberi con alcune differenze rispecchia la
mineralogia, la granulometria e la composizione geochimica del suolo di provenienza.
Parole chiave: Suolo - Tracciabilità - Prodotti agroalimentari.
Autore di contatto: S. Vingiani, Dipartimento di Scienze del Suolo,
della Pianta, dell’Ambiente e delle Produzioni Animali, Università di
Napoli Federico II, Via Università, 100, 80055 Portici (Napoli), Italia.
E-mail: [email protected]
Dipartimento di Scienze del Suolo, della Pianta
Università di Napoli Federico II, Napoli, Italia
I
l regolamento CE 178/2002, che istituisce la European Food Safety Authority, stabilisce principi e requisiti generali riguardo alla “rintracciabilità” dei prodotti agroalimentari definendola come la capacità di
ritrovare la traccia o origine dei prodotti. Ciò in risposta alle crescenti richieste di sicurezza alimentare da
parte dei consumatori e all’esigenza delle aziende di
innovarsi per essere competitive su un mercato sempre più globalizzato 1. La denominazione di origine
ha rappresentato un primo passo finalizzato alla salvaguardia dei prodotti agroalimentari, definendo dei
parametri distintivi che permettono di individuarne la
tipicità. Il passo successivo è stato l’identificazione e
valutazione di metodi e tecniche analitiche che forniscano informazioni significative per la determinazione della zona geografica di origine del prodotto. Tra
i metodi considerati: l’analisi sensoriale, le tecniche
spettroscopiche, la risonanza magnetica nucleare,
i metodi di rilevamento delle impronte elementare
ed isotopica basati sull’impiego della spettrometria
di massa 2. Diffuso è l’impiego dell’analisi mediante
GS-IRMS del rapporto isotopico dei cosiddetti “bioelementi” (C, N, O, H e S), il cui valore, tuttavia, risulta
fortemente influenzato da parametri sia ambientali,
quali le variazioni climatiche, sia di gestione, quali
l’impiego di fertilizzanti 3. Diversi altri metodi sono
attualmente oggetto di studio allo scopo di ottenere
informazioni univoche circa la provenienza geografica degli alimenti. Tra questi, di particolare interesse
51
VINGIANI
sono quelli basati sull’impiego di traccianti o indicatori geogenici e pedogenici caratterizzati da scarsa
o nulla variazione stagionale o annuale e pertanto
stabili nel lungo periodo 4, 5.
La composizione mineralogica e la concentrazione
di macro e microelementi del suolo sono, infatti, il
risultato dell’influenza esercitata per lungo tempo e
in modo combinato dalla matrice litologica e da tutti i
fattori attivi nella pedosfera, con particolare riferimento all’intensità dei processi di weathering, lisciviazione e pedogenesi. Mineralogia e geochimica riflettono
le interazioni che si stabiliscono tra i fattori di formazione del suolo: roccia madre, clima, tempo, rilievo
ed entità biotiche. Pertanto, suoli formatisi in areali
geografici diversi tendono ad essere caratterizzati da
qualità e quantità di minerali diversi la cui identificazione e caratterizzazione chimica può consentire
di ottenere preziose informazioni su tipo e proprietà
del suolo di appartenenza. Le stesse concentrazioni
di elementi in traccia nei tessuti delle piante sono regolate dal loro contenuto nei suoli, dalla forma in cui
si trovano e dai fattori che ne influenzano la mobilità,
nonché dalla capacità di assorbimento da parte dei
vegetali.
Sulla base di tali premesse, l’obiettivo principale
del presente lavoro è stato caratterizzare da un punto
di vista geo-pedologico le aree di produzione della patata precoce oggetto di studio del progetto TIPIPAPA. Tale caratterizzazione ha avuto lo scopo di
definire parametri mineralogici e pattern geochimici
identificativi delle aree di provenienza dei tuberi. Per
un numero selezionato di campioni, tali parametri
sono stati ricercati anche nel suolo che rimane aderente a tuberi raccolti in campo e a tuberi in fase
di commercializzazione per verificare la possibilità di
rintracciarne la provenienza. La diversità geo-pedologica delle aree di studio considerate ha reso tale
approccio particolarmente interessante, consentendo
di definire una firma “geochimico-mineralogica” dei
suoli destinati alla produzione della patata precoce.
Materiali e metodi
Inquadramento geologico e geomorfologico delle aree
di studio
I punti di campionamento georeferenziati sono
stati riportati sulla cartografia di Google Earth e per
ciascuna area di studio è stato realizzato un inquadramento geologico e geomorfologico alla scala di se-
52
mi-dettaglio. A tale fine sono state utilizzate le Carte
Geologiche d’Italia in scala 1:100.000, realizzate dal
Servizio Geologico d’Italia. Le carte sono state consultate attraverso il sito web dell’ISPRA 6. Le descrizioni di carattere geomorfologico e geologico sono
state elaborate tenendo conto delle Note illustrative
allegate alle carte geologiche e di relazioni geologiche e geomorfologiche redatte per i singoli comuni e
disponibili in rete.
Campionamento e preparazione di suolo e tuberi
Campioni di suolo di superficie (0-30 cm) e di tuberi di patata sono stati prelevati contemporaneamente
e a fine ciclo produttivo nel periodo maggio-giugno
2009 in corrispondenza di 12 siti di studio ubicati in
tipiche aree di produzione della patata precoce di tre
regioni del sud dell’Italia (Tabella I). In ciascun sito, è
stata adottata una strategia di campionamento con 3
repliche di campo. Campioni di tuberi in fase di commercializzazione e provenienti dai siti FG-Manfredonia (EL-PEcom) e LE-Alliste-Cisternella (SG-PCcom)
sono stati anche inclusi nello studio.
Campioni di suolo aderente alla superficie esterna
dei tuberi sono stati prelevati da campioni selezionati
di tuberi presi in campo e in fase di commercializzazione, mediante lavaggio in acqua ultrapura ed essiccamento in stufa a 40 °C. Tutti i campioni di suolo
sono stati essiccati all’aria e setacciati a 2 mm (terra
fine), prima delle determinazioni analitiche.
Determinazioni analitiche
Le analisi chimiche e chimico-fisiche sono state
condotte sulla terra fine, secondo i Metodi Ufficiali
di Analisi Chimica del Suolo 7: il pH è stato misurato per via potenziometrica su sospensioni suolo-H2O
(rapporto 1:2.5); il carbonio organico con il metodo Walkley e Black; la conducibilità elettrica (CE) in
estratto acquoso con conduttivimetro a cella di misura; il calcare totale con determinazione gas-volumetrica della CO2; il fosforo assimilabile con il metodo
Olsen; la capacità di scambio cationico (CSC) con
BaCl2 a pH 8.2 e le basi di scambio per Spettrometria ad Assorbimento Atomico (AAS). La distribuzione granulometrica è stata determinata su campioni
dispersi con sodio esametafosfato, mediante granulometro laser, con un sistema Mastersizer 2000 della Malvern. Le estrazioni selettive di Fe, Al e Si con
ossalato d’ammonio acido a pH 3 (Feo, Alo, Sio) e
Na ditionito-citrato-bicarbonato (Fed, Ald) sono sta-
Marzo 2012
VINGIANI
Tabella I. — Codici dei campioni di suolo e tuberi raccolti e ubicazione dei siti di campionamento.
Codice*
SP-P A1-2-3
SG-P C1-2-3
EL-P E1-2-3
SP-P F1-2-3
SP-P I1-2-3
AR-S A1-2-3
SP-S B1-2-3
SP-S C1-2-3
AR-S E1-2-3
SG-S F1-2-3
AR-S G1-2-3
AGR-C A1-2-3
Varietà
Regione
Provincia
Sito di campionamento
Latitudine N
Spunta
Sieglinde
Elvira
Spunta
Spunta
Arinda
Spunta
Spunta
Arinda
Sieglinde
Arinda
Agria
Puglia
“
“
“
“
Sicilia
“
“
“
“
“
Campania
Lecce (LE)
“
Foggia (FG)
Bari (BA)
“
Siracusa (SR)
“
Catania (CT)
“
Messina (ME)
“
Napoli (NA)
Alliste-Chianchi
Alliste-Cisternella
Manfredonia
Bitonto
Mola di Bari
Contrada Milocca
Agro di Cassibile
Acireale
Riposto
Torregrotta
Monteforte S. Giorgio
Afragola
39°
39°
41°
41°
41°
37°
36°
37°
37°
38°
38°
40°
56.254
54.655
32.563
06.641
02.051
01.581
58.593
39.885
41.306
12.503
12.536
55.230
Longitudine E
18°
18°
15°
16°
17°
15°
15°
15°
15°
15°
15°
14°
06.344
05.102
53.514
43.635
07.388
15.862
12.270
09.517
10.957
20.465
20.290
20.370
*codice: XX-Y-Zn, dove XX=varietà (SP: Spunta; SG: Sieglinde; EL: Elvira; AR: Arinda; AGR: Agria), Y: regione (P: Puglia; S: Sicilia; C: Campania), Z: lettera
progressiva di identificazione del campione, N.: replica dello stesso campione (1,2,3).
te effettuate secondo i metodi di Schwertmann 8 e
Mehra e Jackson9 rispettivamente, ed i contenuti di
Fe, Al e Si determinati mediante Spettrofotometria ad
Emissione Atomica, utilizzando un ICP-AES modello
Liberty 150, Varian.
Le indagini mineralogiche sono state condotte sulla frazione terra fine di tutti i suoli prelevati in campo
e su una selezione di suoli adesi alle patate, mediante
l’impiego della diffrattometria a raggi-X (XRD). Campioni non orientati sono stati analizzati con un diffrattometro RigakuGeigerflex D/Max IIIC, con radiazione Co-kα ferro-filtrata.
L’analisi geochimica o multielemento, finalizzata ad
accertare la composizione chimica quali-quantitativa
dei suoli, con particolare riferimento al contenuto di
macro e micronutrienti, è stata effettuata mediante digestione acida ad alta temperatura (HNO3:HClO4:HF
6:3:10) ed analisi degli estratti con ICP-MS. Per l’analisi delle frazioni biodisponibili degli elementi presenti
nel suolo delle aree di campionamento sono stati utilizzati due metodi: 1. estrazione mediante EDTA 0.05
M; 2. estrazione mediante NaNO3 0.1 M. Le misure
sono state effettuate mediante ICP-MS.
Risultati e discussione
Inquadramento geologico e geomorfologico delle aree
di studio
I risultati sono riportati in forma sintetica in Tabella
II. Le aree di campionamento sono caratterizzate da
un’ampia variabilità geologica, sia in termini di lito-
tipo sia di età del substrato roccioso sul quale si rinvengono i suoli. Si fa riferimento al substrato roccioso
poiché la sua determinazione è agevole attraverso le
carte geologiche. È importante considerare, però, che
le rocce rinvenute al di sotto di un suolo non sempre
costituiscono la “roccia madre” dalla cui alterazione
si forma il suolo e che a questo conferisce proprietà
chimiche e fisiche. I suoli possono formarsi anche
da depositi eolici, non riportati in carta geologica e
nemmeno osservabili in campo. In ogni caso, l’indicazione della carta geologica rappresenta il punto
di partenza per l’identificazione della roccia madre
del suolo, sebbene non costituisca una informazione
certa.
Dallo studio della cartografia geologica nazionale
è stato osservato che, per quanto riguarda la regione
Puglia, i substrati rocciosi possono essere ricondotti
a 3 tipologie principali: 1) calcari detritici stratificati e
calcari dolomitici del Cretacico (Terziario); 2) calcari
grossolani e sabbioni calcarei Plio-Pleistocenici (Quaternario); e 3) alluvioni per colmata e cordoni litorali.
Dal punto di vista geomorfologico, invece, i siti si
differenziano sensibilmente. Alliste ha una morfologia simile a quella di tutta la penisola salentina, molto
dolce e caratterizzata dalla presenza delle serre. Si
tratta di modesti rilievi allungati in direzione NNOSSE o NO-SE che, unitamente alle aree depresse, rispecchiano le condizioni strutturali della zona. Manfredonia si colloca in una pianura costiera all’interno
del golfo omonimo. I sedimenti fluviali nell’area
costiera sono soggetti a rielaborazione da parte del
moto ondoso, che produce cordoni litorali. Alcune
di queste aree, a partire dal 1900, sono state soggette
53
VINGIANI
Tabella II. — Inquadramento sintetico della geologia delle aree di studio.
Regione
Comune
Località
Puglia
Lecce
Alliste-Chianchi
Lecce
Foggia
Bari
Bari
Sicilia
Siracusa
Catania
Catania
Messina
Campania
Napoli
Formazione
geologica
Litotipi*
Calcareniti del
calcareniti, calcari grossolani tipo “panchina”,
Salento (coeve ai
sabbioni calcarei più o meno cementati,
Tufi delle Murge)
talora argillosi (“tufi”)
Alliste-Cisternella Calcari di Melissano calcari compatti, a frattura irregolare, grigi e
(coeve ai Calcari di nocciola, con intercalati calcari dolomitici e,
Mola)
più raramente, dolomie calcaree vacuolari
Manfredonia
alluvioni per colmata; cordoni litorali
Bitonto
Calcare di Bari
Calcari detritici in strati e banchi; calcari
dolomitici; calcari massicci
Mola di Bari
Calcare di Bari/Tufi
Calcari detritici in strati e banchi; calcari
delle Murge
dolomitici; calcari massicci; depositi calcareoarenacei e calcareo-arenaceo-argillosi più
o meno cementati, con frequenti livelli
fossiliferi
Agro di Cassibile e
biocalcareniti tenere giallastre che passano
Contrada Milocca
verso l’alto e lateralmente ad argille grigioazzurre
Acireale
lave
Riposto
alluvioni, sabbie e ghiaie di natura vulcanica
e argille fluviali
Monforte S. Giorgio,
alluvioni, ghiaie e sabbie marine; sabbie,
Torregrotta
ghiaie ed argille fluviali
Afragola
depositi vulcanici: ceneri e pomici da caduta;
tufi
Età delle rocce del
substrato
Plio- Pleistocene
(Quaternario)
Cretacico (Terziario)
Depositi recenti
Plio-Pleistocene
(Quaternario)
Pleistocene
XIV secolo
Pleistocene
Depositi recenti
Depositi recenti
* descrizione della Carta Geologica d’Italia in scala 1:100.000.
a bonifiche. Bitonto si colloca nell’area morfologicostrutturale del rilievo murgiano (altopiano murgiano).
Tale “rilievo mostra, anche localmente, il suo tipico
aspetto di tavolato a vasti ripiani, allungati parallelamente alla linea di costa” 10. Nell’altopiano, le rocce
carbonatiche sono caratterizzate da una successione
ininterrotta di bacini endoreici, vallette carsiche, doline e inghiottitoi 11. In tali depressioni topografiche il
deposito dell’eluvium sul fondo delle doline occlude,
più o meno totalmente, gli inghiottitoi e i condotti
carsici. Altro aspetto caratteristico del territorio è la
diffusa presenza della “terra rossa”, un suolo molto
comune in Puglia e prevalentemente nella parte sudorientale delle Murge. Mola di Bari è al limite tra la
scarpata murgiana e l’area dei terrazzi marini della
fascia costiera. I tratti caratteristici della fascia costiera
sono dati dai terrazzi di origine marina, leggermente
degradanti verso il mare, e dai torrenti (lame) che li
incidono, tutti a corso brevissimo, paralleli tra loro e
perpendicolari alla linea di costa.
Per la Sicilia si distinguono quattro tipi litologici:
1) le biocalcareniti pleistoceniche della Sicilia sud-
54
orientale; 2) le lave; 3) le alluvioni vulcaniche del
monte Etna; e 4) i depositi alluvionali e fluviali della
Sicilia settentrionale. Dal punto di vista geomorfologico, anche i siti siciliani sono molto diversi. I siti
di Siracusa si collocano sul margine orientale di un
altopiano prevalentemente calcareo, che a partire da
quota 1000 m s.l.m degrada gradualmente verso sud
e verso est, fino al livello del mare. Acireale e Riposto si trovano sul versante sud-orientale del monte
Etna, mentre Torregrotta e Monteforte S. Giorgio occupano zone di pianura soggette alla deposizione
di sedimenti alluvionali provenienti dalla Fiumara di
Niceto, che sfocia nell’area costiera della Sicilia settentrionale.
In Campania, il sito di Afragola ha come substrato
i depositi vulcanici, prevalentemente piroclastici, di
origine flegrea e vesuviana. Infatti, la zona occupa
la porzione centrale della Piana Campana, un graben peritirrenico al margine occidentale della catena
appenninica. Individuatasi a partire dal Pliocene superiore, è stata coinvolta in processi di subsidenza a
partire dal Quaternario. La Piana è colmata da oltre
Marzo 2012
4000 m di depositi clastici di ambiente marino, transizionale ed alluvionale, vulcaniti e piroclastici.
La diversità di substrati, riscontrata anche per siti
di campionamento ubicati all’interno dello stesso
comune, può costituire un elemento importante, di
supporto alle indagini analitiche, per la definizione
della firma “geochimico-mineralogica” dei suoli destinati alla produzione di patate di cui si vuole accertare
la provenienza.
Caratterizzazione fisica e chimica del suolo
Dalla combinazione delle diverse percentuali di
sabbia, limo e argilla risulta che tutti i suoli studiati,
in accordo con le esigenze colturali della patata, sono
caratterizzati da una tessitura loam (franco sabbiosa,
franca e franco limosa) con la sola eccezione dei suoli della fascia retrodunale di Manfredonia, prevalentemente sabbiosi (Figura 1).
La determinazione granulometrica, effettuata mediante la tecnica della diffrattometria laser, evidenzia
differenze tra la “particle-size distribution” del suolo
adeso ai tuberi rispetto al suolo tal quale (Figura 2)
con una più elevata percentuale di particelle delle dimensioni dell’argilla, del limo e della sabbia fine nel
primo rispetto al secondo. Ciononostante, le curve
granulometriche hanno un andamento simile, come
Figura 1. — Tessitura dei suoli studiati.
Volume (%)
14
13
12
11
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
0.01
VINGIANI
FG-Manfredonia
0.1
1
10
Particle size (μm)
100
1000 3000
Figura 2. — Curve granulometriche del suolo del sito di studio di
Manfredonia (FG), del suolo adeso ai tuberi prelevati in campo e ai
tuberi in fase di commercializzazione provenienti dallo stesso sito.
descritto da parametri statistici quali la moda primaria
e la mediana.
Le principali proprietà chimiche dei suoli studiati
sono riportate in Tabella III. Sulla base del valore di
pH i suoli possono essere classificati in: molto acido
(pH<5.3): SG-P-C (LE-Alliste-Cisternella), SP-S-C (CTAcireale) e AR-S-E (CT-Riposto); subacido (pH 6.06.7): AR-S-G (ME-Monteforte S. Giorgio) e AGR-C-A
(NA-Afragola); neutro (pH 6.8-7.2): SP-P-I (BA-Moladi-Bari) e AR-S-A (SR-C/da Milocca); subalcalino (pH
7.3-8.1): SP-P-A (LE-Alliste-Chianchi), SP-S-B (SRAgro di Cassibile) e SG-S-F (ME-Torregrotta); alcalino
(pH 8.2-8.8): SP-P-F (BA-Bitonto) e EL-P-E (FG-Manfredonia). La maggior parte dei suoli risulta priva o
povera di carbonati. Possono essere considerati calcarei (calcare totale >50 g kg-1) solo i suoli pugliesi
di Manfredonia ed il suolo siciliano Agro di Cassibile.
Tutti i suoli pugliesi ed i suoli siciliani campionati in
provincia di Messina sono poveri o molto poveri di
C organico (CO <11 g kg-1), mentre tale contenuto
è soddisfacente nei suoli campani e nei rimanenti
siciliani. La CSC è: bassa (<10 cmol+ kg-1) nei suoli pugliesi della fascia retrodunale di Manfredonia e
nei suoli siciliani campionati in provincia di Messina;
elevata (>25 cmol+ kg-1) in tutti i suoli pugliesi campionati in provincia di Bari e nei siciliani campionati
in provincia di Siracusa; media (10-20 cmol+ kg-1) in
tutti gli altri. La distribuzione dei cationi sul complesso di scambio riflette le caratteristiche mineralogiche
ed il pH dei suoli. I suoli acidi hanno una bassa dotazione di calcio scambiabile (<40% della CSC). Elevata
55
VINGIANI
Tabella III. — Principali proprietà chimiche dei suoli. Valori medi riferiti al peso secco in stufa (105 °C) e in corsivo dev. standard
(N.=3).
Puglia
SP-P A
pH H2O
CE
dS m-1
Calcare totale
g kg-1
C.O.
g kg-1
CSC
cmol(+)kg-1
Ca-scamb.
“
Mg-scamb.
“
Na-scamb.
“
K-scamb.
“
P-Olsen
mg kg-1
7,3
0,2
0,24
0,05
9
0,1
9,2
1,7
23,4
0,7
24,0
2,4
4,1
0,3
1,2
0,07
1,8
0,20
199
30,4
SG-P C
4,5
0,2
0,77
0,05
assente
7,6
0,9
20,8
0,4
3,7
1,6
3,1
0,5
2,4 0,13
2,4
0,09
510
46,0
Sicilia
EL-P E
8,8
0,1
0,34
0,07
228
6,6
5,3
1,4
4,9
0,2
1,3*
0,6
1,2
0,3
1,6
0,14
0,8
0,37
146
42,3
SP-PF
SP-PI
8,3
6,9
0,1
0,7
0,18
0,14
0,02
0,04
16
6
2,6
2,5
10,4
10,6
0,8
2,1
36,4
27,7
2,4
1,6
41,5
21,9
1,0
5,3
11,9
5,8
0,6
0,7
1,4
0,6
0,04
0,04
1,1
1,8
0,06
0,05
226
318
26,6
54,8
AR-S A
7,2
0,3
0,37
0,04
13
4,5
13,5
0,7
51,5
1,9
62,6
6,0
7,9
0,4
2,4
0,16
1,6
0,33
231
25,3
SP-S B
8,1
0,2
0,26
0,18
276
47,3
17,8
1,2
43,2
2,8
33,1*
2,6
7,9
1,3
0,8
0,07
1,3
0,79
98
28,6
SP-S C
Campania
AR-S E
SG-S F
4,9
5,2
7,7
0,1
0,7
0,1
0,47
0,54
0,22
0,08
0,21
0,05
assente assente 15
1,2
12,6
23,3
5,9
0,9
5,1
0,3
14,5
17,0
9,3
1,0
3,3
1,2
5,2
6,9
9,8
0,8
7,5
0,9
1,3
2,2
0,5
0,3
2,3
0,1
0,6
0,8
0,6
0,04
0,13
0,05
0,9
1,6
0,9
0,14
0,78
0,23
220
188
65
24,9
25,9
3,8
AR-S G
Agr-C A
6,3
0,8
0,28
0,09
assente
6,5
0,2
0,10
0,01
assente
9,3
0,9
12,1
1,0
12,2
4,4
1,5
0,5
0,7
0,01
1,6
0,09
156
12,2
15,6
0,3
21,3
1,6
16,0
2,31
1,7
0,2
1,1
0,06
2,7
0,04
244
25,3
*calcolato per differenza tra la CSC e la somma degli ioni sodio, potassio e magnesio.
Tabella IV. — Composizione mineralogica dei suoli studiati.
Codice
SP-P A
SG-P C
EL-P E
SP-P F
SP-P I
AR-S A
SP-S B
SP-S C
AR-S E
SG-S F
AR-S G
AGR-C A
Regione
Siti
Argille
Quarzo
Puglia
“
“
“
“
Sicilia
“
“
“
“
“
Campania
Alliste-Chianchi (LE)
Alliste-Cisternella (LE)
Manfredonia (FG)
Bitonto (BA)
Mola di Bari (BA)
Contrada Milocca (SR)
Agro di Cassibile (SR)
Acireale (CT)
Riposto (CT)
Torregrotta (ME)
Monforte S. Giorgio (ME)
Afragola (NA)
X
X
XX
X
X
X
X
X
XXX
XXX
XXX
XXX
XXX
XXX
XXX
XX
XX
XXX
XXX
Feldspati
X
XX
X
X
X
X
XXX
XXX
XX
XX
XXX
Calcite
Leucite
Pirosseni
XX
X
XX
X
X
XXX
XXX, XX, X=quantità relativa decrescente
è la percentuale di sodio di scambio (ESP=32%) dei
suoli della fascia retrodunale di Manfredonia. Elevato
è il contenuto di K scambiabile dei suoli campani di
Afragola.
Caratterizzazione mineralogica
In Tabella IV viene riportata in maniera sintetica
la composizione mineralogica dei suoli analizzati. In
tutti i suoli della regione Puglia, l’andicità (espressa
56
attraverso il valore % Alo+0,5Feo) è sempre inferiore
allo 0,4%, che costituisce il valore soglia al di sotto
del quale i suoli non hanno né proprietà andiche (%
Alo+0,5Feo> 2), né vitriche (% Alo+0,5Feo tra 0,4 e 2)
12, e di conseguenza non sono di origine vulcanica.
Dall’activity ratio (Feo/Fed=0,1) si evince che le forme del ferro prevalenti in questi suoli sono quelle
degli ossidi cristallini, in coerenza con il colore rosso
di questi suoli. Per quanto riguarda la composizione
mineralogica ottenuta dall’XRD, il quarzo è il mine-
Marzo 2012
15
Intensity (count)
rale dominante in tutti i suoli della Puglia, mentre
secondaria è la presenza dei minerali argillosi. Anche
i feldspati sono tra i minerali presenti, ad eccezione
del sito di Alliste-Chianchi, e la calcite viene identificata solo a Manfredonia e Bitonto. Considerato
che sia il quarzo che i feldspati non sono componenti delle rocce prevalentemente carbonatiche del
substrato, è possibile ipotizzare che la pedogenesi di
questi suoli sia stata influenzata da materiali eolici.
Per quanto riguarda i suoli della Sicilia, quelli di Torregrotta e Monteforte S. Giorgio non risultano né andici, né vitrici (% Alo+0,5Feo<0,4), hanno un activity
ratio intermedio (0,3-0,5) e i minerali in essi presenti
sono quarzo, feldspati e minerali argillosi. Questi risultati tendono a confermare l’origine alluvionale di
questi suoli, suggerita dal substrato geologico. Anche
i suoli di Siracusa non sono andici, ma sono al limite
(% Alo+0.5Feo tra 0,4 e 0,5) con le proprietà vitriche,
presentano un activity ratio basso (0,1), e sono caratterizzati da minerali come quarzo, calcite, feldspati e
minerali argillosi. Tali risultati indicano che la pedogenesi ha portato alla formazione di ossidi cristallini
del ferro e che, seppur scarsa, i suoli hanno avuto
una “contaminazione” da parte di prodotti vulcanici
provenienti dal centro eruttivo più vicino, il monte
Etna. Più chiara risulta, invece, l’origine vulcanica dei
suoli di Acireale e Riposto, che presentano proprietà vitriche da moderate ad elevate (% Alo+0,5Feo tra
0,8 e 1,8), al limite con quelle andiche, un activity
ratio alto (0,7-1,2) che indica la prevalenza di ossidi
amorfi ed una composizione mineralogica che vede
i feldspati come minerali dominanti. Nel caso di questi ultimi due suoli, l’influenza dei materiali vulcanici
sulla pedogenesi è certamente rilevante e non inattesa, considerata la vicinanza di questi due siti al monte
Etna. Per questi stessi due suoli è stata calcolata 13,
14 la quantità di minerali a scarso ordine cristallino,
minerali tipici dei suoli di ambienti vulcanici, che è
risultata compresa tra 1,7% e 3,9% per le allofani e
2,8% e 1% per la ferridrite, rispettivamente per Riposto e Acireale. Il suolo della regione Campania (sito
di Afragola) mostra proprietà vitriche moderate (%
Alo+0.5Feo=1,4) e una composizione mineralogica
dominata da feldspati, in cui sono secondariamente
presenti leucite e pirosseni.
Per quanto riguarda il sito di Manfredonia, è stata
messa a confronto la composizione mineralogicadel
suolo adeso ai tuberi raccolti in campo con quella
del suolo adeso alla patata destinata alla commercializzazione (prelevata in una azienda che opera sempre nel sito di Manfredonia) e con il suolo tal quale
VINGIANI
10
ELP tubero comm
5
x102
FG-Manfredonia
ELPG tubero
10
20
30
40
50
Two-Theta (deg)
60
70
Figura 3. — Tracciati XRD di campioni di suolo del sito di studio di
Manfredonia (FG), del suolo adeso ai tuberi (varietà Elvira) prelevati
in campo e in fase di commercializzazione provenienti dallo stesso
sito.
prelevato in campo. I risultati mostrano una grande
similitudine tra composizione del suolo tal quale e
del suolo adeso al tubero raccolto nello stesso campo, mentre la mineralogia del suolo adeso ai tuberi
destinati alla commercializzazione si differenzia lievemente da ambedue (Figura 3).
Analisi geochimica o multielemento
I risultati dell’analisi geochimica dei suoli, elaborati statisticamente mediante analisi multivariata (cluster analysis (CA), Figura 4A; principal component
analysis (PCA), Figura 4B), riescono a differenziare
piuttosto bene i suoli di aree geografiche diverse,
consentendo in molti casi, sulla base del contenuto
totale di macro e micronutrienti, di distinguere anche
suoli di zone diverse della stessa regione. La diversa
granulometria e la diversa mineralogia dei campioni
di suolo aderente ai tuberi influiscono sulla composizione geochimica di tali campioni, che si differenziano dai campioni di suolo tal quale della stessa area
geografica e si raggruppano in insiemi a sé stanti.
Tale risultato indica la necessità di estendere l’analisi
del suolo aderente ai tuberi.
Le quantità biodisponibili solubilizzate da ciascun estraente, espresse come percentuali del totale, variano a seconda dell’elemento e del suolo.
L’EDTA ed il nitrato di sodio estraggono dal suolo
rispettivamente fino all’84% e all’8% del contenuto
totale degli elementi misurati. Le quantità estratte in EDTA risultano sempre superiori a quelle
estratte in nitrato di sodio, in virtù delle proprietà
chelanti del primo estraente. Le frazioni biodispo-
57
VINGIANI
Dendogramma per 44 casi
Legame completo
Distanze Euclidee
1800
12
1600
10
Factor 2: 22.91% (Sr, Na)
Distanze legami
1400
1200
1000
800
600
400
200
0
Projection of the cases on the factor-plane (1 x 2)
Cases with sum of cosine square ≥ 0.00
Active
8
6
4
2
0
Acireale e
S. Venerina
Manfredonia
Siracusa
Monforte m.
Capaccio
-2
Suolo
aderente
ai tuberi
Mola di Bari,
Conversano
e Bitonto
-4
-6
-14 -12 -10
-8
-6
-4
-2
0
2
4
6
8
10
12
Figura 4. — Dendrogramma di cluster analysis (A) e diagramma di ordinamento PCA (B) dei suoli campionati
nibili estratte con i due metodi risultano correlate
tra loro solo nel caso del Li (P<0,05, r=0,81) e del
Mg (P<0,05, r=0,84). Correlazioni positive si osservano tra le quantità totali di Li e Cu del suolo
e le rispettive quantità estratte in nitrato di sodio
(P<0,05, r≥0,63) e tra le quantità totali Rb, Be, Ca,
Mn, Ni, Cu, Y, Zr, La, Ce, Al e Pb e le rispettive
quantità estratte in EDTA (P<0,05, r≥0,65). Le frazioni biodisponibili, elaborate statisticamente mediante analisi multivariata (CA e PCA, Figura 5),
non sembrano riuscire a differenziare i suoli di
aree geografiche diverse altrettanto bene quanto
il contenuto totale degli stessi elementi nel suolo
(Figura 4).
Conclusioni
La caratterizzazione geopedologica dei suoli di
provenienza delle patate precoci di 12 siti di studio
ubicati nelle regioni Puglia, Sicilia e Campania ha
prodotto risultati interessanti, che hanno consentito
di differenziare i suoli sulla base della loro composizione multielementare e mineralogica, e pertanto
di definirne una firma “geochimico-mineralogica”. Il
parent material dei suoli delle aree di studio è stato
ricondotto a tre tipologie principali: rocce calcaree,
sedimenti alluvionali e substrati vulcanici. Tessitura
58
sciolta e pH generalmente neutro e subalcalino caratterizzano i suoli in larga parte poveri di carbonati, CO
e siti di scambio cationico. Diverse quantità relative di
minerali primari (quarzo, feldspati, calcite) e secondari (minerali argillosi) si accertano nei suoli di diversa provenienza, in associazione nei distretti vulcanici
con ossidi di ferro e alluminosilicati a scarso ordine
cristallino. Con l’ausilio di metodi di analisi multivariata del contenuto totale di macro e micronutrienti
si riescono a differenziare bene i suoli di aree geografiche diverse, riuscendo in molti casi a distinguere anche suoli di zone diverse della stessa regione.
Le frazioni biodisponibili degli stessi elementi non
sembrano riuscire a differenziare i suoli altrettanto
bene. Di particolare interesse il confronto tra il suolo
adeso ai tuberi ed il rispettivo suolo di provenienza
delle patate. Il suolo adeso ha curve granulometriche
e tracciati XRD simili al suolo tal quale, ma più elevate quantità di particelle di minori dimensioni che
ne differenziano la composizione geochimica. Il suolo adeso ai tuberi, pertanto, con alcune differenze,
sembra rispecchiare la mineralogia, la granulometria
e la composizione geochimica del suolo di provenienza. Pertanto, pur tenendo conto della necessità
di approfondire lo studio allargandolo ad un numero
più elevato di campioni, è possibile concludere che
la caratterizzazione fisica, mineralogica e geochimica del binomio “suolo preso in campo-suolo adeso
Marzo 2012
Legame completo
Distanze Euclidee
2,5e7
10
4
Factor 2: 12.43%
Distanze legami
Active
6
1,5e7
1e7
5e6
0
2
0
-2
-6
Acireale e
S. Venerina
Manfredonia
Capaccio
Siracusa
-4
-8
-12 14 -10 -8
-6
-4
-2
0
2
4
6
8
10 12 14
Factor 1: 49.84%
Legame completo
Distanze Euclidee
2e6
8
6
1,5e6
Active
4
2
1e6
Factor 2: 14,17%
Distanze legami
8
2e7
VINGIANI
5e5
0
0
-2
-4
Siracusa
-8
Manfredonia
Acireale e
S. Venerina
-6
-10
-10
-5
0
5
15
20
25
Figura 5. — Dendrogramma di cluster analysis e diagramma di ordinamento PCA della frazione estratta dai suoli mediante EDTA (A, B) e
NaNO3 (C, D).
alla patata” può costituire un marchio di origine dei
tuberi. Ciò consentirà di individuare ed evitare frodi
di commercializzazione di tuberi provenienti da aree
diverse da quelle dichiarate.
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59
VINGIANI
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Cremlingen, Germany: Catena Verlag; 1985. p. 1-8.
Ringraziamenti.—Si ringraziano il MIPAF per avere finanziato il lavoro di ricerca e tutte le aziende agricole che hanno collaborato alla realizzazione del lavoro rendendo possibili i campionamenti e fornendo
tutte le informazioni necessarie circa le pratiche colturali.
Marzo 2012
Indagine sullo stato fitosanitario
delle produzioni di varietà precoci di patata da consumo
L. SIGILLO, G. SERRATORE, V. SPINA, V. SENAPE, R. BRAVI
Dall’anno 2008 al 2010 è stata eseguita un’indagine
per valutare lo stato fitosanitario di produzioni di patata precoce prelevati nell’Italia meridionale e in Sicilia. I
patogeni ricercati sono stati: Ralstonia solanacearum,
Potato Spindle Tuber Viroid, i virus Y, X, V della patata
e il Potato Leafroll Virus (PLRV). Le analisi batteriologiche sono state eseguite mediante isolamento su substrato semi-selettivo mentre la ricerca del PSTVd è stata effettuata per ibridazione su membrana con l’uso di
un kit commerciale. In generale, le analisi virologiche
sono state eseguite mediante DAS-ELISA. Per il virus Y
è stata eseguita anche la caratterizzazione in varianti
genetiche con metodi immunologici (TAS-ELISA) e molecolari (RT-PCR e analisi filogenetica). In nessuno dei
campioni analizzati sono stati riscontrati R. solanacearum, PSTVd e PVV; la frequenza di rilevamento di PVX
e PLRV è stata molto bassa. Il patogeno maggiormente
presente è risultato essere il PVY e, in particolare, le
sue varianti NTN e Wilga. Il protocollo di RT-PCR impiegato si è mostrato il metodo più preciso per la differenziazione in varianti e il suo utilizzo per le analisi
diagnostiche connesse alla certificazione dei tuberi-seme sarebbe auspicabile. L’analisi filogenetica della regione genica VPG-NIa degli isolati di PVY ha permesso
la differenziazione in due cluster che raggruppano gli
isolati NTN e Wilga.
Parole chiave: Virus - Agricoltura - Pianta, malattia.
L
e malattie che influenzano le produzioni di patata,
sia da seme che da consumo, sono diverse: di origine abiotica e biotica. Tra le malattie di origine batterica, una delle più preoccupanti nei paesi a clima
caldo-piovoso è l’avvizzimento batterico causato da
Autore di contatto: L. Sigillo, INRAN, Istituto Nazionale di Ricerca per
gli Alimenti e la Nutrizione, Sezione di Battipaglia, SS 18, Km 77,700,
84091, Battipaglia (SA). E-mail: [email protected]
INRAN, Istituto Nazionale di Ricerca
per gli Alimenti e la Nutrizione
Sezione di Battipaglia, Battipaglia, Salerno, Italia
Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. 1995
biovar 2 razza 3. I sintomi dovuti all’infezione causata da questo batterio si presentano sia sul tubero
che sulla parte aerea. Il tubero mostra, in sezione, un
imbrunimento dell’anello vascolare e, in corrispondenza delle zone alterate, si osserva la produzione
di un essudato cremoso. Sulla parte aerea, si verifica
un ingiallimento iniziale delle foglie basali seguito da
un avvizzimento generalizzato dell’intera pianta 1. R.
solanaceraum è incluso dall’EPPO (European Plant
Protection Organization) nella lista A2 2 dei patogeni
da quarantena, ne è vietata l’introduzione e la diffusione su territorio italiano e rientra tra i microrganismi a “tolleranza zero” 3. Altro importante patogeno
da quarantena è il viroide Potato Spindel Tuber Viroid 3, agente dell’affusolamento del tubero di patata,
anch’esso compreso nella lista A2 dell’EPPO 4. Il sintomo principale dell’affusolamento è rappresentato
da una deformazione dei tuberi che si presentano
allungati e talvolta con screpolature esterne. Le parti
epigee della pianta presentano, invece, sintomi piuttosto leggeri: il fogliame assume un comportamento
molto eretto e una tonalità scura 1.
Particolarmente importanti per la qualità dei tuberi
sono le malattie ad eziologia virale soprattutto per le
problematiche correlate alla sanità del materiale di
moltiplicazione. Numerosissimi sono i virus che colpiscono la patata ma quelli più frequenti e dannosi
sono il Potato virus X (PVX), il Potato leafroll virus
(PLRV) e il Potato virus Y (PVY).
61
SIGILLO
Il PVX è il responsabile del mosaico leggero della
patata, è facilmente trasmissibile (prevalentemente
per contatto) e causa sintomi la cui severità varia
in base alla cultivar colpita. La sintomatologia comprende un mosaico internervale più o meno accentuato, la riduzione delle dimensioni fogliari e l’increspatura dei margini del lembo fino alla necrosi
dei tessuti; in alcuni casi il virus si può presentare in
forma latente 1.
Il PLRV è l’agente dell’accartocciamento fogliare della patata. Le piante infette presentano clorosi
diffusa sulle foglie apicali che si ripiegano a doccia
verso l’alto, inoltre i tessuti fogliari si ispessiscono assumendo consistenza vetrosa. L’evidenza dei sintomi
è fortemente condizionata dalla varietà e dall’epoca
di infezione 1.
Il virus più diffuso su patata è universalmente il
Potato virus Y (PVY), capostipite della famiglia dei
Potyvirus 5. Sia in America che in Europa la sua presenza viene monitorata nei programmi di certificazione della patata da seme e le normative sementiere
prevedono, per la commercializzazione, la presenza
dell’organismo solo entro determinate soglie di tolleranza 5.
Il PVY è agente del mosaico nervale della patata. La malattia si manifesta comunemente come una
clorosi maculata del lembo fogliare che assume un
aspetto ruvido-rugoso. Le nervature vanno incontro a
processi necrotici talvolta seguiti anche da necrosi del
picciolo e dello stelo 1.
Il virus Y è distinto in tre tipologie principali: il
PVYO, PVYN e PVYC, caratterizzate dalla diversa sintomatologia che inducono in Nicotiana tabacum 5.
Il primo ad essere stato descritto e ritrovato in tutto
il mondo è stato il PVYO (ceppo comune) ma successivamente, prima in Europa e poi negli altri continenti, è stato rilevato un nuovo gruppo: il PVYN
(ceppo necrotico) 6, 7. All’interno del gruppo PVYN
sono stati successivamente identificati ulteriori ceppi, originati dalla ricombinazione genetica del PVYO
con il PVYN. La loro classificazione è in continua evoluzione e diversi autori si sono occupati della loro
patogenesi 5. Nel nostro lavoro, faremo riferimento
alla classificazione utilizzata da Lorenzen 8 che riconosce, oltre ai due gruppi principali (PVYN e PVYO), i
sottogruppi PVYN:O (Wilga-type) 9-11, PVYNTN (agente
della maculatura ad anelli dei tuberi di patata) 12, NAPVYN e NA-PVYNTN (isolati nordamericani del PVYN
e PVYNTN) 13. Questa classificazione è basata sulle sequenze nucleotidiche e sui punti di ricombinazione
del genoma 11. Nel caso del PVYNTN sembrerebbe che
62
una ricombinazione a livello della coat protein 14 sia
responsabile della capacità di tali ceppi di determinare la maculatura necrotica; ulteriori studi dimostrano
però che non tutti i ceppi NTN presentano tale ricombinazione 15.
Diversa è la classificazione del PVY basata sul
comportamento sierologico. Mediante l’uso di antisieri monoclonali, infatti, è possibile riconoscere solo
i tre sierotipi: PVYO, PVYN e PVYC 16. In base alla
reazione sierologica, i ceppi Wilga (PVYN:O), inoltre,
vengono riconosciuti come sierotipi O anche se si
comportano in vivo come ceppi necrotici e gli isolati
NTN non vengono distinti dagli N 17, 18.
Un altro importante potyvirus che infetta la patata è
il Potato virus V (PVV). Alcuni isolati europei di PVV
erano originariamente considerati varianti di isolati
di PVYC poiché causavano sintomi necrotici nelle varietà contenenti il gene Nc, gene responsabile della
risposta di ipersensibilità di isolati di PVYC in patata.
Successivamente fu verificata la presenza, in queste
stesse cultivar, del gene Nv, responsabile di una reazione di ipersensibilità specifica nei confronti degli
isolati di PVV. Il PVYC e il PVV sono inoltre sierologicamente distinguibili 19.
In questo lavoro vengono presentati i risultati di
un’indagine eseguita dall’anno 2008 all’anno 2010
al fine di studiare lo stato fitosanitario di tuberi di
patata precoce da consumo prodotti nel Sud Italia.
La ricerca è stata condotta nell’ambito del progetto
“Tipicizzazione e caratterizzazione di varietà precoci
di patata con l’impiego di tecniche molecolari e spettroscopiche” finanziato dal Ministero delle Politiche
Agricole, Alimentari e Forestali.
Oggetto dello screening è stata la ricerca di R. solanacearum e PSTVd. Oltre a questi due patogeni
da quarantena, sono stati ricercati i più importanti
patogeni di qualità presenti su territorio nazionale,
dedicando particolare interesse ai virus trasmissibili
per tubero-seme: virus X, V e Y della patata e il virus
dell’accartocciamento fogliare (PLRV) 5.
Nel caso del virus Y, inoltre, è stato eseguito uno
studio filogenetico delle varianti genetiche al fine di
ricercare anche una eventuale correlazione tra sequenze nucleotidiche e l’origine geografica degli isolati.
Materiali e metodi
Le analisi sono state eseguite in tre anni successivi, dal 2008 al 2010, su un totale di 119 campioni di
Marzo 2012
SIGILLO
Per la ricerca di PVX, PLRV e PVV le analisi sono
state eseguite con tecniche sierologiche (DAS-ELISA) 23 impiegando antisieri commerciali (Agdia Incorporated, Indiana).
Nel caso del PVY, oltre alla diagnosi del patogeno eseguita mediante DAS-ELISA (screening), è stata
eseguita anche la caratterizzazione in varianti genetiche. A tal fine, nei primi due anni di sperimentazione sono stati impiegati sia metodi sierologici che
molecolari.
Le indagini sierologiche sono state eseguite su tutti i tuberi di ciascun campione (screening). Alla fase
di screening, è seguita una seconda fase di caratterizzazione delle varianti genetiche del virus sia mediante ELISA, sia mediante RT-PCR. La caratterizzazione sierologica è stata eseguita con un protocollo
di TAS-ELISA e l’impiego di kit commerciali (Agdia
Incorporated, Indiana) che hanno consentito la distinzione dei ceppi virali nelle varianti PVYO, PVYN
e PVYC grazie all’impiego di anticorpi monoclonali.
La caratterizzazione molecolare degli isolati di
PVY è stata invece eseguita mediante l’impiego di
un protocollo di touch-down multiplex RT-PCR messo a punto da Lorenzen e collaboratori 8. Il metodo
prevede l’estrazione dell’RNA mediante l’utilizzo di
un kit commerciale (Qiagen, Hilden, D), la trascrizione del DNA complementare e l’amplificazione
simultanea di diverse regioni geniche mediante l’utilizzo di quattro coppie di primer.
La trascrizione del cDNA è stata effettuata in un
volume totale di 15 µl, utilizzando una miscela di
oligodT (1 µM), 6U di Rnase Out Ribonuclease Inhibitor (Invitrogen, Carlbad, CA) e 60U di trascrittasi inversa (SSIII Reverse Transcriptase, Invitrogen,
Carlbad, CA). La temperatura e il tempo di trascrizione erano di 50°C per 50 minuti.
La successiva reazione di PCR è stata realizzata
in un volume totale di 20 µl secondo le indicazioni
degli autori 8.
Il ciclo di amplificazione è un ciclo “touch-down”
in cui la temperatura di annealing decresce da 66 °C a
60 °C, diminuendo di 0,5 °C per ogni ciclo. Le combi-
tuberi di patata da consumo appartenenti alle varietà Agria, Annabel, Arinda, Bellini, Elvira, Inova, Lady
Rosetta, Nicola, Safrane, Santè, Sieglinde e Spunta. Il
campionamento è stato effettuato in diverse aziende della Campania, della Puglia e della Sicilia per
lo svolgimento di un progetto multidisciplinare intitolato “Tipicizzazione e caratterizzazione di varietà
precoci di patata con l’impiego di tecniche molecolari e spettroscopiche”. Nell’ultimo anno di sperimentazione sono stati analizzati anche campioni
provenienti dall’Egitto e dall’Italia settentrionale. In
Tabella I è riportato il numero di campioni studiati,
raggruppati per anno e origine geografica.
Sui 119 campioni sono state eseguite le analisi per
la detection di Ralstonia solanacearum, Potato Spindle Tuber Viroid (PSTVd), PVX, PVV, PVY e PLRV.
Per la ricerca di R. solanacearum, le analisi sono
state eseguite mediante isolamento dai tessuti prelevati dai tuberi, su substrato semi-selettivo (SMSA).
La procedura per la preparazione del campione ha
previsto il lavaggio dei tuberi in acqua corrente, il
prelievo dei coni ombelicali e la macerazione in
un’opportuna quantità di tampone fosfato addizionato di un antiossidante 20, 21.
Eventuali colonie sospette isolate sono state purificate su substrato generico NAG (agar nutritivo
addizionato di glucosio) e identificate mediante reazione di ipersensibilità in tabacco e analisi PCR. La
reazione di PCR è stata eseguita secondo il protocollo di Seal e collaboratori 22.
La ricerca del PSTVd è stata eseguita sui tessuti
fogliari sviluppatisi in seguito al germogliamento dei
tuberi ottenuto in condizioni controllate. Lo screening è stato eseguito mediante ibridazione su membrana (DOT-BLOT) con l’utilizzo di un kit commerciale (Agdia Incorporated, Indiana). L’utilizzo del kit
prevede un metodo di estrazione rapido dell’RNA e
la detection mediante una sonda marcata con digossigenina.
Come per il viroide, le analisi virologiche sono
state eseguite su tessuti fogliari sviluppatisi in seguito a germogliamento dei tuberi in serra.
Tabella I. — Numero campioni analizzati, provenienza geografica e anno di sperimentazione.
Anno
2008
2009
2010
Numero campioni
Campania
Puglia
Sicilia
Nord-Italia
Egitto
Non nota
3
0
3
20
27
6
15
33
2
0
0
4
0
0
5
0
0
1
63
SIGILLO
Tabella II. — Primer specifici e dimensione delle bande attese
in seguito ad amplificazione mediante touch-down multiplex RT-PCR per ogni variante PVY.
gruppo
PVYO
PVYN
PVYNTN
PVYN:O (Wilga)
NA-PVYN/NTN
combinazione dei primer
o2127
S5585m
n5707
n2258
n2258
S5585m
n2258
S5585m
n5707
+
+
+
+
+
+
+
+
+
o2439c
o6266c
A6032m
n2650c
o2439c
A6032m
o2439c
o6266c
A6032m
Bande attese (bp)
267
689
328
398
181
452
181
689
328
nazioni degli otto primer permettono l’amplificazione
delle regioni nelle quali si trovano i punti di ricombinazione (HC-Pro/P3 e VPG/NIa) e l’ottenimento di
differenti profili di bande che caratterizzano i diversi
gruppi del virus (Tabella II). Con questo metodo è
possibile anche il rilevamento di infezioni miste.
Negli anni 2008 e 2009, una parte rappresentativa
dei tuberi costituenti i diversi campioni risultati infetti da PVY è stata sottoposta a detection e caratterizzazione con il metodo di Lorenzen et al.
Nell’anno 2010, in seguito al confronto dell’esito
delle caratterizzazioni eseguite nel 2008 e nel 2009
con i due differenti metodi, le analisi sono state condotte solo con i metodi molecolari.
Gli isolati di PVY ritrovati nei campioni analizzati
nel 2009 e 2010 sono stati ulteriormente caratterizzati
mediante sequenziamento di un frammento della regione VGP-NIa in cui ricade uno dei punti di ricombinazione tra gli isolati PVYN e PVYO. La regione è
stata amplificata utilizzando le due coppie di primer
S5585m/A6032m e S5585m/o6266c che consentono
l’ottenimento di una banda di 452 paia di basi, tipica
degli isolati PVYNTN, e di una di 689 paia di basi, caratteristica degli isolati Wilga e PVYO. L’analisi filogenetica è stata eseguita allineando le sequenze dei ceppi
oggetto di questo lavoro con i programmi Klustal W
24 e MEGA-versione 5 25; le sequenze sono state messe a confronto con sequenze di riportate in banca dati
(GenBank/NCBI) grazie al programma BLAST.
Per la valutazione delle distanze geniche è stato
utilizzato il metodo UPGMA. Gli isolati sottoposti al
sequenziamento sono stati scelti, tra tutti quelli rilevati, considerando la variante genetica e la regione
geografica d’origine dei tuberi. La lista è riportata
nella tabella III.
Risultati
Nei tre anni di sperimentazione, non sono stati
mai riscontrati campioni positivi a R. solanacearum
o PSTVd.
Tabella III. — Isolati sottoposti ad analisi filogenetica nella regione VGP-NIa.
Nome isolato
09
09
09
09
09
09
09
09
09
09
10
10
10
10
10
10
10
10
10
SG-P B1
SG-P B3
SG-P C2
SG-P D3
SG-P F2
SG-S F1
SP-S C3
SP-S B2
SP-S D2
SP-S D3
SF-P 11
AR-P 3
AR-P 5
AR-P 7
IN-EG T.1
IN-EG T.5
IN-EG T.8
IN-EG Z
IN-EG Z.11
Variante genetica
Campione di provenienza
Regione geografica di provenienza dei tuberi
PVYNTN
SG-P B209
SG-P B3-09
SG-P C2-09
09 SG-P D3
SG-P F2-09
SG-S F1-09
SP-S C3-09
SP-S B2-09
SP-S D2-09
SP-S D3-09
10P
10R
10R
10R
10T
10T
10T
10Z
10Z
Puglia (IT)
Puglia (IT)
Puglia (IT)
Puglia (IT)
Puglia (IT)
Sicilia (IT)
Sicilia (IT)
Sicilia (IT)
Sicilia (IT)
Sicilia (IT)
Puglia (IT)
Puglia (IT)
Puglia (IT)
Puglia (IT)
Egitto
Egitto
Egitto
Egitto
Egitto
PVYNTN
PVYNTN
PVYWILGA
PVYNTN
PVYNTN
PVYNTN
PVYNTN
PVYWILGA
PVYWILGA
PVYO
PVYNTN
PVYO
PVYNTN
PVYNTN
PVYNTN
PVYWILGA
PVYNTN
PVYWILGA
09: 2009; 10: 2010, AR: Arinda; IN: Ivova; SG: Sieglinde, SF: Safrane; SP: Spunta; P: Puglia; S: Sicilia; EG: Egitto
64
Marzo 2012
Nella tabella seguente (Tabella IV) sono riportati
i risultati delle analisi virologiche eseguite mediante
DAS-ELISA nell’anno 2008. Nessun campione è risultato positivo al PVV e al PVX e un singolo campione
proveniente dalla Campania è risultato positivo al
PLRV. Il PVY è stato il virus rilevato con maggiore frequenza. Dalla caratterizzazione sierologica dei
ceppi di PVY, riportata in Tabella V, si osserva una
preponderanza dei sierotipi N rispetto ai sierotipi
O. Tutti i ceppi del virus pugliesi e il 60% di quelli
siciliani sono infatti stati identificati come PVYN. I tre
campioni campani sono risultati infetti dalla variante
PVYO. In seguito alle analisi RT-PCR, è stato rilevato
che tutti i sierotipi O erano identificati come ceppi
ricombinanti Wilga, mentre i sierotipi N ricadevano
sempre nella variante NTN. Non sono state rilevate
infezioni miste.
In Tabella VI sono riportati i risultati delle analisi virologiche eseguite nell’anno 2009 mediante
diagnosi sierologica. Come nell’anno precedente,
il virus maggiormente rappresentato è stato il PVY
SIGILLO
mentre solo il 3% dei campioni siciliani ha presentato infezione da PVX. Nessun campione è risultato
positivo al PLRV e al PVV.
Nel caso del PVY, successivamente all’analisi preliminare mediante DAS-ELISA, tutti i campioni positivi al virus sono stati sottoposti alla caratterizzazione del virus PVY sia con metodi sierologici che
molecolari e i dati ottenuti sono stati messi a confronto (Tabella VII).
Come si osserva dalla Tabella VII, c’è una perfetta
corrispondenza tra i dati ottenuti mediante detection
con DAS-ELISA e RT-PCR. Le varianti riconosciute
come PVYO in DAS-ELISA vengono sempre identificate come Wilga in RT-PCR mentre quelle identificate come PVYN in DAS-ELISA vengono identificate
come PVYNTN in RT-PCR.
Da questo momento in poi, faremo riferimento
alla caratterizzazione delle varianti ottenute mediante analisi molecolare.
Nell’anno 2009 è stata riscontrata una maggiore
frequenza della variante NTN rispetto alle altre. Sia
Tabella IV. — Incidenza di PVY, PLRV, PVV e PVX. Esito dei saggi DAS e TAS-ELISA eseguiti nel 2008.
Numero campioni infetti/totale campioni analizzati
Regione di provenienza
Campania
Puglia
Sicilia
PVY
PLRV
PVV
PVX
3/3
6/20
12/15
1/3
0/20
0/15
0/3
0/20
0/15
0/3
0/20
0/15
Tabella V. — Anno 2008. Varianti del PVY riscontrate e confronto dei risultati ottenuti con metodi sierologici e molecolari.
Varianti PVY (% sul totale dei campioni risultati positivi al PVY)
Campania
Puglia
Sicilia
PVYN
TAS-ELISA
RT-PCR
TAS-ELISA
RT-PCR
TAS-ELISA
RT-PCR
0
/
100
/
60
/
PVYNTN
PVYO
PVYWILGA
/
100
/
0
/
40
/
/
100
/
0
/
40
0
/
100
/
60
Tabella VI. — Incidenza di PVY, PLRV, PVV e PVX. Esito dei saggi DAS e TAS-ELISA eseguiti nel 2009.
Puglia
Sicilia
Numero campioni infetti/totale campioni analizzati
PVY
PLRV
PVV
PVX
44%
33%
0
0
0
0
0
3%
65
SIGILLO
Tabella VII. — Anno 2009. Varianti del PVY riscontrate e confronto dei risultati ottenuti con metodi sierologici e molecolari
Regione di
provenienza
Puglia
Sicilia
Varianti PVY (% sul totale dei campioni risultati positivi al PVY)
Metodo
PVYN
PVYNTN
PVYO
TAS-ELISA
RT-PCR
TAS-ELISA
RT-PCR
33
/
27
/
/
33
/
27
11
/
12
/
PVY
WILGA
/
11
/
12
PVY
N +O
PVY
0*
/
9*
/
WILGA+NTN
/
0*
/
9*
*i campioni presentano infezione mista e contemporaneamente infezioni singole da PVYN e PVYO
Tabella VIII. — Caratterizzazione delle varianti genetiche del PVY rilevato nei campioni analizzati nell’anno 2010.
Regione di
provenienza
Campione
Puglia (IT)
Puglia (IT)
Egitto
Egitto
Tuberi infetti/totale tuberi analizzati (%)*
PVY
PVYN
PVYNTN
PVYO
PVYWILGA
Infezioni miste
10P
100
/
17
8
8
10R
10T
10Z
36
78
90
/
/
/
21
67
67
7
/
/
/
11
9
50 PVYO+NTN
17 PVYNTN+Wilga
7 PVYO+Wilga
/
14
*i valori sono approssimati alle unità
per i campioni siciliani che per quelli pugliesi, il
30% circa dei campioni è risultato positivo a questa
variante, mentre solo circa il 10% ha presentato la
variante Wilga. Nel 9% dei campioni siciliani, inoltre,
sono state riscontrate infezioni da PVYNTN, PVYWilga
e infezioni miste (PVYNTN + PVYWilga) contemporaneamente.
Nell’anno 2010, nessuno dei campioni analizzati
è risultato infetto da PVX, PVV e PLRV. Dei 21 campioni esaminati, solo quattro sono risultati positivi al
PVY e nessuno di questi era di origine siciliana. Per
questi quattro campioni, i risultati della caratterizzazione nelle varianti genetiche è riportata in tabella 8.
Anche in questo anno si osserva una predominanza
della variante NTN rispetto alle altre. In particolare,
nel campione 010P proveniente dalla Puglia tutti i
tuberi sono risultati infetti è si è registrata una elevata variabilità di varianti genetiche del virus.
Gli isolati riportati in Tabella III, ottenuti negli
anni 2009 e 2010, sono stati analizzati mediante
sequenziamento di un frammento a cavallo delle
regioni VPG-NIa. I risultati dell’analisi filogenetica
sono riportati nel grafico rappresentato in figura 1.
Come si osserva dalla figura, l’analisi dei cluster
ci permette di raccogliere i ceppi di PVY isolati nel
corso di questo lavoro in due grossi gruppi: uno
contenente tutti gli isolati NTN e l’altro contenente
gli isolati Wilga e O. Questi vengono distinti da un
66
terzo gruppo di tre isolati appartenenti alla variante
N (sequenze ottenute dalla banca dati). Dall’analisi, l’isolato PVYO 10 AR-P.5, proveniente dalla Puglia, risulta essere molto simile agli isolati PVYN
Fr (X12456), proveniente dalla Francia, e PVYN
(AF522296) di origine egiziana.
Discussione
Nel triennio 2008-2010 è stato eseguito uno screening per valutare lo stato fitosanitario di 119 campioni di tuberi di patata precoce raccolti prevalentemente in Campania, Puglia e Sicilia.
Nell’ultimo anno di sperimentazione i campioni
prelevati sono stati messi a confronto con campioni provenienti da regioni dell’Italia settentrionale e
dall’Egitto.
I patogeni da quarantena ricercati durante il monitoraggio sono stati R. solanacearum e Potato Spindle Tuber Viroid: nessuno dei campioni analizzati è
risultato positivo alla ricerca di questi due organismi,
confermandone l’assenza su territorio nazionale.
Il monitoraggio ha previsto inoltre la ricerca dei
virus PVY, PVX, PVV e PLRV.
Il virus V della patata non è stato riscontrato su
nessun campione esaminato mentre i virus PVX e
PLRV sono stati rilevati rispettivamente in Sicilia e
Marzo 2012
SIGILLO
09 SG-P C2 NTN
10 AR-P.3 NTN
09 SG-P F2 NTN
PVY NTN DSMZ PV-0410
PVY NTN (AY884984) isolato americano
10 IN-EG T.5 NTN
09 SG-P B1 NTN
09 SG-P B3 NTN
10 IN-EG T.1 NTN
NTN
PVY NTN (FJ201166.1) isolato americano
09 SG-S F1 NTN
10 IN-EG Z NTN
10 IN-AR-P.7 NTN
PVY Wilga (AJ889867) Germania
PVY NTN (AJ889866) Polonia
PVY N (HM590405.1) Cina
09 SP-S C3 NTN
PVY common strain (O)(U09509) Canada
PVY Wilga (EF558545) Polonia
PVY Wilga (AM113988) Germania
10 SF-P .11 O
Wilga
09 SP-S B2 NTN
PVY N (EU182576.1) Cina
PVY N (AF522296) Egitto
PVY N (X12456) Francia
10 AR-P .5 O
PVY common strain (O) DSMZ PV-0078
10 IN-EG T.8 Wilga
PVY N (AY166867.1)
PVY N (AJ585197) Regno Unito
PVY N (X97895) Svizzera
0.06
0.05
0.04
0.03
0.02
0.01
N
09 SP-S D2 Wilga
09 SP-S D3 Wilga
09 SG-P D3 Wilga
10 IN-EG Z.11 Wilga
0.00
*legenda: SG = Sieglinde; AR = Arinda; IN = Inova; SP = Spunta; SF = Safrane; P = Puglia; S = Sicilia; EG = Egitto
Figura 1. — Albero filogenetico degli isolati di PVY ottenuto dal calcolo delle distanze genetiche nella regione nucleotidica VPG-NIa amplificata con le coppie di primer S5585m/A6032m e S5585m/o6266c e usando come riferimento sequenze depositate in banca dati (GenBank/
NCBI).
Campania ma con una frequenza molto bassa. Decisamente più preoccupante per lo stato fitosanitario
dei tuberi italiani è risultato essere il virus Y della
patata. Questo, infatti, è stato rilevato con una maggiore frequenza in tutte e tre le regioni italiane e
anche i tuberi provenienti dall’Egitto sono risultati
infetti dal patogeno. L’incidenza del PVY è stata valutata con il metodo DAS-ELISA che ha dimostrato
essere, per le analisi massali, un metodo sufficientemente sensibile, rapido ed economico. Interessante è stato anche l’esito della caratterizzazione del
PVY nelle sue varianti genetiche. Nei primi due
67
SIGILLO
anni di sperimentazione la caratterizzazione è stata effettuata sia con metodi sierologici (TAS-ELISA)
che molecolari (touch down multiplex RT-PCR). In
questo biennio i due metodi diagnostici sono stati
messi a confronto. La caratterizzazione sierologica
ha consentito la distinzione delle varianti in PVYO
e PVYN ma non ha permesso di distinguere i ceppi
ricombinanti. Come riportato in bibliografia, la variante NTN non viene distinta dagli isolati PVYN così
come la variante Wilga non viene distinta dal ceppo
comune. L’identificazione dei ceppi necrotici Wilga
come varianti O conferisce ambiguità ai risultati delle analisi diagnostiche. In alcuni paesi, per la certificazione dei tuberi-seme, è ammessa una certa soglia
di tolleranza per gli isolati comuni mentre non è
consentita la presenza dei ceppi necrotici; in paesi
come il Canada, la mancata identificazione di questi
ultimi è stata la causa di una incontrollata diffusione
degli isolati necrotici sul territorio 26.
Il protocollo di RT-PCR messo a punto da Lorenzen e collaboratori consente, invece, di distinguere
contemporaneamente tutte le varianti e di identificare con maggiore precisione le infezioni miste, dovute a due o più varianti in uno stesso tessuto.
Lo studio di caratterizzazione effettuato sui ceppi
di PVY isolati nel corso di questo lavoro ha permesso di rilevare una maggiore frequenza degli isolati
ricombinanti rispetto agli originari. In particolare, è
stata registrata una maggiore presenza della variante
PVYNTN rispetto alla variante Wilga. Nell’anno 2008,
la totalità degli isolati provenienti dalla Puglia ricadeva nella variante NTN e l’anno successivo se ne è
registrata una maggiore frequenza rispetto al ricombinate Wilga, indipendentemente dall’origine geografica dei tuberi. Risultati simili sono stati ottenuti
in seguito a monitoraggi eseguiti in Svizzera 27 e in
altri paesi europei 28.
Molto poco frequente è stato il rinvenimento del
PVYO, riscontrato solo nell’anno 2010 in tuberi provenienti dalla Puglia, mentre le varianti PVYN e PVYC
non sono mai state ritrovate. D’altra parte, i casi di
infezione da PVYN e PVYC riscontrati sino ad oggi
sono stati piuttosto rari anche in altre aree geografiche 29, 30 e il rilevamento delle due varianti ricombinanti nella quasi totalità dei campioni testimonia
quanto sia comune la ricombinazione genetica nei
Potyvirus in generale e nel PVY in particolare 14.
In seguito all’osservazione della distribuzione delle diverse varianti, gli studi sono stati completati da
un’analisi filogenetica di un frammento a cavallo
della regione genica VPG-NIa. Tale analisi ha con-
68
sentito di distinguere gli isolati in due grossi gruppi;
nel primo sono ricaduti gli isolati appartenenti alla
variante NTN mentre, nel secondo, gli isolati Wilga
e O. La composizione in basi delle sequenze dei diversi ceppi, nell’ambito di ciascuno dei due gruppi,
risulta essere però piuttosto omogenea e non permette di trovare una correlazione tra sequenza e origine geografica dell’isolato. Gli isolati della variante
PVYNTN provenienti dall’Egitto risultano essere, in
questa regione nucleotidica, del tutto simili agli isolati ritrovati in tuberi pugliesi e siciliani e, inoltre, le
loro sequenze non si discostano di molto da quelle
riportate in banca dati per ceppi tedeschi e americani. Risultati simili sono stati ottenuti in seguito a studi
eseguiti negli Stati Uniti in cui, le sequenze di ceppi
necrotici americani sono risultate molto simili agli
isolati europei 31. Anche gli isolati Wilga rinvenuti
nei campioni analizzati sono molto simili tra loro
e le sequenze della regione nucleotidica studiata si
differenziano, seppure leggermente, da quelle riportate in banca dati per l’isolato 261-4 (AM113988)
tedesco, per il ceppo PVYWilga (EF558545) polacco
o per il ceppo PVYO139 (U09509) canadese. Studi
preliminari eseguiti nella regione di ricombinazione
HC-Pro/P3 hanno invece consentito una certa distinzione delle sequenze di isolati italiani rispetto
alle sequenze riportate in banca dati (Tomassoli L.,
comunicazione personale).
Conclusioni
In questo lavoro sono riportati i risultati delle
analisi per la valutazione dello stato fitosanitario di
tuberi di patata precoce prelevati nell’Italia meridionale e in Sicilia.
Il patogeno che ha inciso maggiormente sulla
qualità dei tuberi analizzati è risultato essere il virus Y della patata e, in particolare, la sua variante
PVYNTN, agente della maculatura anulare necrotica
dei tuberi. Il virus si trasmette in maniera non persistente a mezzo di afidi ma la sua propagazione è
favorita anche dall’uso di tuberi-seme infetti 1. Nella
maggior parte dei campioni analizzati i sintomi della
malattia non erano evidenti pertanto la diagnosi con
metodi analitici risulta fondamentale per rilevare il
patogeno e per limitarne, di conseguenza, la diffusione. Lo studio filogenetico eseguito nella regione
VPG/NIa degli isolati italiani ha consentito la distinzione di due gruppi corrispondenti alle due varianti
ricombinanti (PVYNTN e Wilga) ma non ha messo in
Marzo 2012
evidenza una relazione tra le loro origini geografiche. Una relazione tra le sequenze degli isolati e la
loro origine geografica potrebbe essere individuata
con lo studio del punto di ricombinazione nella regione genica HC-Pro/P3.
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69
Costi e benefici di un programma di tracciabilità
per la filiera della patata precoce italiana
P. LOMBARDI 1, F. CARACCIOLO 1, G. CICIA 1, L. CEMBALO 1, F. COLANTUONI 1, M. D’AMICO
T. DEL GIUDICE 1, T. MARAGLINO 3, C. MENNA 4, T. PANICO 1, G. SANNINO 4, D. TOSCO
La patata novella fino a qualche anno fa ha rappresentato uno dei prodotti di punta dell’export meridionale verso i mercati europei. Attualmente l’Italia
sta soffrendo di una crisi che che ha fatto fortemente
diminuire i volumi di produzione e, nel contempo, i
flussi destinati ai mercati esteri. Oggi l’Italia si connota come un paese importatore netto e, pertanto, addirittura deficitario sui mercati internazionali. Una politica di valorizazione delle produzioni che faccia perno
sulla tracciabilità e sulla identificazione dell’origine
del prodotto, potrebbe favorire il rilancio di tale produzione. In questo studio si valuta la possibilità di un
simile intervento.
Parole chiave: Patata novella - Tracciabilità - Denominazione di origine.
L
a valorizzazione della produzione di patate novelle (precoci e/o primaticce) nell’Italia meridionale è una esigenza non più differibile nel tempo,
vista l’importanza che essa assume in particolari ambiti reginali. In effetti l’interesse per tale coltivazione
è confinata in modo soatanziale in Sicilia, in Campania e in Puglia. Mentre, però, nella prima regione
la base produttiva sembra tenere, nelle altre due la
situazione retrocede di anno in anno facendo presagire, in assenza di interventi risolutivi, un definitivo
abbandono di questa coltivazione negli ordinamenti
produttivi aziendali. La conseguenza, già oggi vissuta, è che mentre prima l’Italia rappresentava il paese
leader sui mercati europei con le sue esportazioni
(particolarmente rilevanti quelle destinate al mercato tedesco), allo stato attuale delle cose il nostro
Autore di contatto: P. Lombardi, Dipartimento di Economia e Politica
Agraria dell’Università degli Studi di Napoli Federico II, Via Università
96, 80055, Portici, Napoli, Italia. E-mail: [email protected]
2
4
1Ministero delle Politiche Agricole e Forestali
(Ex Centro di Portici) e Università Federico II di Napoli,
Napoli, Italia
2Università degli Studi di Catania, Catania, Italia
3INEA - Sede regionale per la Puglia, Bari, Italia
4Ministero delle Politiche Agricole e Forestali
(Ex Centro di Portici), Portici, Napoli, Italia
paese risulta importatore netto accusando significative perdite in termini di quote di mercato su tutto il
fronte europeo.
Le possibilità di rilanciare questo settore passano
per diverse possibili azioni. Una di queste è la tracciabilità di prodotto che permette al consumatore
di identificare con certezza l’origine del prodotto.
Esiste un’ampia letteratura sul ruolo che può svolgere questa politica nell’aumentare la competitività dei prodotti italiani a cui i consumatori nazionali
ma anche europei associano in genere un’immagine
fortemente positiva. Nel lavoro che qui presentiamo
vengono valutate la fattibilità e l’efficacia di simili
interventi stimando anche i costi e i vantaggi che
essi comportano.
La filiera della patata precoce in Italia
La produzione complessiva della patata primaticcia in Italia è di 3,5 milioni di quintali ricavata su
una superficie di poco superiore ai 18 mila ettari e
una resa media di 195 quintali/ha ma che varia a
seconda dell’ambito territoriale anche all’interno di
una stessa regione. Rispetto alla situazione di fine
71
LOMBARDI
Tracciabilità della patata precoce italiana
Tabella I. — Patata primaticcia: superficie (ha) e produzione
(q) nel 2010.
Regioni
Ha
Nord
Centro
Mezzogiorno
di cui
Campania
Puglia
Sicilia
Italia
Q.li
650
300
17160
149.274
65.895
3.300.291
2458
3523
9170
18110
630.064
595.579
1.735.710
3.515.460
12.000
10.000
8.000
6.000
4.000
2.000
0
1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010
Sicilia
Campania
Puglia
Figura 2.—Superfici coltivate a patata novella.
Prod.
Sup.
Altre
Campania
Puglia
Sicilia
Figura 1.—Produzioni regionali.
millennio si deve segnalare una contrazione delle
superfici coltivate valutabile nell’ordine del 25%, cui
ha corrisposto una riduzione di prodotto raccolto di
quasi il 30% (Tabella I).
Nelle regioni meridionali si localizza il 95% della
coltivazione sia in riferimento alle superfici, sia in
termini di prodotto raccolto che si distribuiscono secondo le quote rappresentate nella Figura 1.
Come si è già avuto modo di anticipare la Sicilia è,
tra le regioni nelle quali si concentra la produzione,
l’unica a caratterizzarsi per un importante aumento
delle superfici investite a fronte di una sostanziale
situazione stazionaria per la Campania e in decisa
controtendenza per la regione Puglia (Figura 2).
Nelle pagine che seguono sarà meglio specificato
il contesto produttivo cercando anche di delineare
con maggiore dettaglio il profilo di filiera che caratterizza i tre contesti regionali.
La filiera siciliana
In Sicilia la quasi totalità delle superfici coltivate
a patate è indirizzata alla produzione di patata novella detta anche precoce o primaticcia (ciclo stagio-
72
nale autunno-vernino-primaverile), con raccolta dei
tuberi nei mesi di marzo-giugno. Tale produzione
contribuisce alla PLV regionale con quasi 95 milioni
di euro. La coltivazione precoce risulta concentrata
sostanzialmente in tre poli: il territorio sud orientale
della Sicilia nelle provincie di Siracusa e Ragusa, con
quasi l’80% delle superfici, il territorio tirrenico della
provincia di Messina, e quello jonico catanese. Le
produzioni regionali si attestano intorno a 200 mila
tonnellate in virtù di rese medie unitarie regionali
pari a 207 quintali/ha (Tabella II).
Nell’Isola, negli ultimi anni, si è assistito ad un
processo di concentrazione dell’offerta commerciale, che si presenta particolarmente marcato nelle aree di maggiore specializzazione (siracusano e
ragusano), soprattutto integrata con le fasi a valle
di tale processo. Ci si trova in presenza di imprese
commerciali che, al fine di limitare le “fluttuazioni”
di mercato, sia in termini di offerta che di prezzi,
hanno sviluppato strategicamente processi di integrazione verticale (attraverso l’acquisto di aziende
o l’affitto di terreni). Negli anni passati non erano
rari rapporti di compartecipazione molto diversi tra
gli attori della filiera. Tale fenomeno, tuttavia, oggi
risulta fortemente rarefatto.
Il prodotto fresco dopo le necessarie manipolazioni e confezionamenti, in relazione ai canali distributivi utilizzati, raggiunge i consumatori attraverso vendite dirette in azienda (2%), punti vendita al
dettaglio specializzati (48%) e grande distribuzione
organizzata (55%). Tuttavia, durante questo percorso commerciale si assiste, non di rado, alla perdita dell’identità del prodotto inteso come “Sicilia” a
causa delle manipolazioni subite soprattutto per
le merci veicolate in prima lavorazione (big bags,
ecc.), finendo per mescolarsi con altre patate di pro-
Marzo 2012
LOMBARDI
Tabella II. — Sicilia: superfici e produzioni di patate novelle per provincia (trend del decennio 2000-2010).
Province
Caltanissetta
Catania
Messina
Siracusa
Ragusa
Altre
SICILIA
Superfici (ha)
Produzioni (t)
2000
2010
2000-2003
2007-2010
830
600
1300
4500
1200
650
9080
700
250
450
6300
1000
470
9170
12931
12175
20019
98694
43276
11483
198.577
15805
8925
10000
125.800
19625
9527
189.682
Fonte: nostre elaborazioni su dati ISTAT.
venienza extraeuropea. Quando, invece, le patate
sono commercializzate in seconda lavorazione (reti
e retine da 1 a 10 kg, ma anche in cassette o sacchi
di juta sino a 25 kg) il prodotto mantiene l’etichetta
del produttore e/o del commerciante mantenendo la
propria identità.
Un aspetto di assoluto rilievo, emerso nel corso
dell’indagine, è il ridimensionamento delle esportazioni rispetto ai decenni precedenti che risulta attestarsi attualmente intorno al 40% del totale regionale. Tra i paesi destinatari delle produzioni pataticole
primaticce siciliane mantiene saldamente il ruolo
di leader la Germania, con il 15%. Tuttavia, è da
registrarsi una perdita d’importanza della domanda
esercitata dalle imprese tedesche e tradizionalmente
particolarmente fidelizzate verso la patata precoce
siciliana. Tale fenomeno, particolarmente marcato
negli ultimi 4-5 anni, è da associare al ruolo che
hanno assunto le produzioni precoci di alcuni paesi
extraeuropei (Egitto, Tunisia, Marocco e Israele). Altri destinatari sono, in ordine decrescente, l’Olanda
e la Francia (6%), il Regno Unito (4%) e l’Austria e
la Danimarca (3%). Gli “altri Paesi” intercettano, nel
complesso, il 5% delle esportazioni complessive di
patata precoce siciliana. Tra questi un interesse crescente è riservato alla Polonia il cui mercato sembra
molto interessato alla patata precoce così come ad
altri prodotti agricoli regionali (agrumi, ortaggi fuori
stagione, ecc.).
Il trasporto, per l’Europa (Germania compresa)
avviene quasi esclusivamente su gomma rimorchi
frigoriferi o telonati. Il trasporto su nave viene utilizzato solo per le “piazze” orientali, vale a dire Russia
e Ucraina. Paesi che a fasi più o meno alterne acquistano patata precoce siciliana.
L’assottigliarsi, nel corso di questi ultimi anni, delle quote di mercato relative al prodotto esportato ed
in particolare delle aliquote esportate sulle piazze
“storiche” (Germania, Francia) a favore di nuovi produttori dell’area del Bacino del Mediterraneo (Egitto, Marocco, Tunisia e Israele) appare nel complesso, alla pari di quanto accade con altre produzioni
mediterranee (agrumi, ortaggi da pieno campo),
un percorso difficilmente invertibile a meno di non
riuscire a fare emergere le peculiarità delle patate
novelle siciliane anche e soprattutto attraverso una
corretta politica di valorizzazione delle produzioni
in grado di soddisfare i segmenti di mercato più esigenti, tra i quali quello tedesco.
Per indagare meglio sulle caratteristiche della filiera abbiamo somministrato un questionario ad
un campione di 12 unità aziendali localizzate nelle province di Siracusa e Ragusa, con lo scopo di
evidenziare il livello di competitività del comparto
attraverso l’analisi dei risultati economici dell’attività
produttiva.
Le aziende del campione risultano in prevalenza
di dimensioni medie e si caratterizzano per essere
condotte in forma capitalistica con salariati. Il valore
medio del capitale terra è di circa 44000 €/ha, quello
del capitale esercizio e di investimento 4900 €/ha.
I risultati economici delle aziende pataticole risultano influenzati prevalentemente da due elementi: la produttività degli appezzamenti e i prezzi di
vendita. La prima, inversamente proporzionale alla
precocità di raccolta e, i secondi, direttamente correlati alla stessa, in conseguenza dell’arrivo sul mercato interno di produzioni provenienti da altri Paesi
(Egitto, ecc.), oltre che da altre regioni italiane (Puglia e Campania).
I dati riscontrati e riferiti all’annata agraria 20092010 evidenziano prezzi di vendita dichiarati che
oscillano da 35 a 40 €/q.le, con una media di 37
€/q.le e, rese che variano da 220 a 280 q.li/ha con
una media pari a 257 q.li/ha.
La struttura del costo di produzione è dominata
73
LOMBARDI
dai costi espliciti (75-81% del costo di produzione di
riferimento per le aziende che posseggono la terra
e 92-93% per quelle che affittano) e, fra gli stessi,
dalla voce mezzi tecnici (39-50%) e salari (35-44%).
A questo proposito va rilevato che le patate da seme
vengono importate con costi unitari elevati ed il fabbisogno di lavoro della coltivazione è rilevante poiché la raccolta è eseguita manualmente, in quanto
si tratta di un prodotto che potrebbe essere danneggiato dalla macchina raccoglitrice.
La composizione del reddito netto di riferimento varia profondamente passando dalle aziende che
posseggono la terra a quelle che l’affittano. Nelle
prime la voce più rilevante riguarda il compenso
del capitale terra (61-73%), segue la voce direzione
e amministrazione (20-26%). Nelle seconde la componente dominante è rappresentata dalla direzione
(61-70%), segue la voce interessi (30-39%).
Gli indici di redditività accertati ricadono nel range 1,1/2,4. Come già evidenziato, la redditività dei
fattori conferiti risulta influenzata soprattutto dalla
resa produttiva e dal prezzo di vendita. Essendo il
modello agrotecnico adottato dalle varie aziende
sostanzialmente lo stesso, le oscillazioni delle rese
produttive risultano meno accentuate di quelle dei
prezzi. Le une e le altre tendono ad essere più elevate nelle aziende di maggiori dimensioni.
I risultati economici della coltivazione risultano
mediamente positivi, tali da configurare una differenza positiva tra il reddito netto e il reddito netto di
riferimento. Le analisi effettuate indicano, infatti, un
valore medio di tale indicatore paria a circa 900 euro
per ettaro. Tuttavia, anche in presenza di soddisfacenti livelli reddituali la pataticoltura precoce siciliana evidenzia una certa “dinamicità” delle superfici
interessate, come già emerso nel corso di altre ricerche 1-10, con oscillazioni, da anno in anno, delle
superfici aziendali investite anche nell’ordine del 1520%. Tale fenomeno è riconducibile sia a problematiche tecniche (stanchezza dei terreni, ecc.) che,
ancora, agli andamenti di mercato (prezzi contenuti
alla produzione ed elevata offerta nella campagna
precedente, importazioni massicce da altri paesi,
ecc.). Non bisogna, inoltre, trascurare la competizione tra patata e carota, che insistono sugli stessi areali, e che risulta attualmente squilibrata a favore della
carota. Questa, negli ultimi anni, ha riscosso notevole interesse sia sui mercati interni che su quelli
europei, generando risultati economici positivi, per
gli operatori delle imprese della filiera, superiori a
quelli della pataticoltura precoce.
74
La filiera pugliese
La Puglia si configura come una delle regioni di
riferimento nel contesto nazionale, per quel che concerne la produzione di patata precoce e contribuisce
alla formazione del valore delle produzioni agricole
regionali con circa 49 milioni di euro. Le coltivazioni si concentrano principalmente lungo l’arco jonicosalentino in provincia di Lecce e sul litorale adriatico
delle province di Bari e Foggia. Il tessuto produttivo è
composto per la quasi totalità da aziende di piccole dimensioni, la cui estensione spesso non supera l’ettaro.
Sebbene nell’ultimo decennio sia stato interessato da un fortissimo ridimensionamento della base
produttiva e dei volumi di produzione (più che dimezzate), il comparto ricopre ancora una notevole
importanza nel panorama produttivo italiano. Basti
pensare che con 3523 ettari di superficie dedicati
alla produzione di patate primaticce e con oltre 71
mila tonnellate di produzione (media anni 20072010) esso incide, rispettivamente per il 19% sull’intera superficie nazionale destinata al comparto e per
il 18% sui corrispondenti volumi di produzione (Tabella III).
La filiera pataticola pugliese sconta da alcuni anni
l’effetto del calo di competitività del prodotto sui
suoi principali mercati di sbocco del nord Europa
(Germania e Inghilterra) e la riduzione dei consumi di patate primaticce nel mercato interno. Risulta
poco strutturata e caratterizzata da uno scarso coordinamento tra gli operatori, a causa della notevole
polverizzazione aziendale sia nella fase agricola che
in quella della commercializzazione. Questo tessuto
produttivo e commerciale particolarmente frammentato si confronta, invece, con un comparto distributivo altamente concentrato. Negli anni, la crescita
della quota di mercato detenuta dalla grande distribuzione organizzata (verso cui viene convogliato
circa l’85% della produzione regionale) ha indebolito le imprese agricole che, nel processo di negoziazione, vedono sostanzialmente azzerato il loro potere contrattuale. È soprattutto nella definizione del
prezzo di vendita e delle quantità che i produttori
di patate precoci accusano la maggiore sofferenza,
ritrovandosi a dover accettare una remunerazione
sostanzialmente fissata dalle imprese acquirenti e
riferita a una domanda di volumi scarsamente negoziabile. Le opinioni prevalenti raccolte durante
l’indagine conoscitiva vedono nell’aggregazione
dell’offerta agricola, nel miglioramento dell’efficienza dei sistemi di trasporto/logistica e nelle azioni di
Marzo 2012
LOMBARDI
Tabella III. — Puglia: superfici e produzioni di patate novelle per provincia (trend del decennio 2000-2010).
Province
Foggia
Bari
Lecce
Taranto
Brindisi
PUGLIA
Superfici (ha)
Produzioni (t)
2000
2010
450
3880
1750
295
23
6398
293
1250
1800
180
0
3523
2000-2003
2007-2010
10889
82876
31981
4990
315
131.052
5664
38463
23479
4085
0
71691
Fonte: nostre elaborazioni su dati ISTAT
qualificazione del prodotto le strade da percorrere
per l’accrescimento della competitività del comparto.
Nel passato, i tentativi di concentrazione dell’offerta attraverso il cooperativismo e l’associazionismo si
sono dimostrati o poco efficaci, al punto da risultare
molto spesso fallimentari, oppure, pur producendo
in un caso isolato (quello dell’Associazione Produttori Patate) risultati soddisfacenti, hanno subito un
arresto a causa del ridimensionamento dei volumi
di prodotto conferito. Alla difficoltà dei produttori
agricoli di fare massa critica si aggiunge la frammentazione del settore commerciale che, salvo poche
realtà di maggiori dimensioni, non è dotato di strutture in grado di aggregare l’offerta e razionalizzarla
in volumi che rendano possibile stabilire strategie
di partenariato con la grande distribuzione. In questo sistema, caratterizzato da scarso coordinamento
tra gli attori della filiera, risultano necessarie forme
di razionalizzazione anche nella gestione logistica e
dei trasporti attraverso un maggiore coordinamento e cooperazione tra gli attori in gioco. Ad oggi,
la movimentazione della produzione pataticola si
serve di piattaforme/centri distributivi fuori regione
(principalmente in Emilia Romagna e Veneto) che
gestiscono l’approvvigionamento delle grosse catene distributive e per una quota residuale dei mercati
all’ingrosso (che alimentano soprattutto le esportazioni verso il mercato polacco e il dettaglio tradizionale). Il trasporto è esclusivamente su gomma, mentre altre soluzioni, come l’intermodale camion più
treno, risultano poco utilizzate a causa dei maggiori
tempi di percorrenza e delle carenze del sistema ferroviario italiano. Alla luce delle caratteristiche del
comparto e in virtù di una produzione che può contare su varietà particolarmente apprezzate per forma, colore, sapore e valori nutrizionali (come la patata novella di Zapponeta e la Sieglinde di Galatina),
risulta essenziale agire sulla tracciabilità di prodotto
attraverso certificazione, comunicazione, promozione e packaging adeguati e sull’innovazione che nel
recente passato è stata sostenuta anche da progetti
regionali come il progetto INNOVALO (INNOvazioni
di processo e di prodotto per VALOrizzare la patata
primaticcia in Puglia).
La filiera campana
La patata precoce, prodotto tradizionalmente di
punta dell’agricoltura campana, è andata perdendo
progressivamente importanza per la concomitanza
di fattori emersi alquanto chiaramente dall’indagine
svolta nell’ambito di questa ricerca sui diversi operatori della filiera regionale i.
I dati relativi alla coltivazione della patata primaticcia in Campania nel periodo 2000-2010, hanno
evidenziato forti oscillazioni annuali delle superfici
investite: ad anni in cui si superano i 4000 ettari seguono anni in cui si scende intorno ai 2000.
Sul fronte della produzione, a inizio decennio ci
sono stati anni in cui si sono superate le 170.000
tonnellate, 30% di quella meridionale e nazionale
mentre, mediamente, si è intorno al 25%. Nella seconda metà del periodo, il peso regionale sulla produzione meridionale e nazionale si attesta sul 21%
e il 20%, rispettivamente 7, 9. Ne deriva un quadro di
insieme di importanza decrescente. Le province di
Napoli e Caserta seguite, a debita distanza, da Salerno (Tabella IV) confermano la loro importanza per
la presenza delle tradizionali aree di produzione:
l’agro nolano-mariglianese, quello acerrano-afragolese, casertano; nocerino-sarnese.
i Indagine che ha previsto, oltre ad una fase di acquisizione di dati, a livello
provinciale, relativi alla superficie destinata a questo prodotto ed alle produzioni realizzate nell’ultimo decennio, interviste, condotte nella primavera del
2011, a testimoni privilegiati quali dipendenti pubblici a livello provinciale
e regionale e questionari sottoposti ad operatori della produzione, distribuzione e della trasformazione.
75
LOMBARDI
Tabella IV. — Campania: superfici e produzioni di patate novelle per provincia (trend del decennio 2000-2010).
Province
Caserta
Napoli
Salerno
Campania
Superfici (ha)
Produzioni (t)
2000
2010
2000-2003
2007-2010
1230
3882
380
5792
850
1315
293
2458
23041
80318
9242
112.601
22185
52804
7570
82.559
Fonte: nostre elaborazioni su dati ISTAT.
È da queste che si sono originati in passato, importanti flussi di esportazione, soprattutto verso
Germania e Francia. La produzione segue sostanzialmente due grossi canali di vendita: quello tradizionale dei commercianti all’ingrosso e quello, più
moderno, delle organizzazioni di produttori (OP)
di cui sempre più agricoltori fanno parte. I grossi commercianti, in numero piuttosto esiguo, operano nelle aree sopra indicate. Forniscono, quasi
sempre, gli agricoltori di tuberi seme importati, a
prezzi generalmente molto sostenuti e ritirano, poi,
il prodotto dalla campagna a prezzi che, ai primi
segni di saturazione del mercato, divengono irrisori. Praticamente la totalità del prodotto da loro trattato è destinata al consumo fresco, di cui circa il
20% viene collocato sul mercato estero. Di quello
destinato al mercato interno, il 60% viene venduto
ai mercati generali, il 20% circa alla grande distribuzione organizzata (GDO). Anche le OP operano
prevalentemente nelle aree sopra indicate e sono
in numero molto esiguo. Esse conferiscono generalmente più del 50% della produzione all’industria di
trasformazione, mentre alla GDO, ai grossisti ed agli
esportatori ne va, più o meno in parti uguali, il 45%.
Gli aspetti più salienti della filiera regionale sono la
debole integrazione tra le diverse fasi e l’assenza di
efficienti strutture di stoccaggio e trasferimento del
prodotto. Ancora oggi ciò trasforma annate di buona
produzione in situazioni di crisi per gli agricoltori
costretti a vendere ai grossisti a prezzi bassissimi o a
ritardare la raccolta del prodotto, collocato poi come
patata comune. Le crisi degli anni scorsi sono state
così pesanti da indurre la Regione Campania ad intraprendere iniziative volte sia a stabilizzare i prezzi
come La Borsa Patata ii, sia a promuovere il prodotto sul mercato con l’istituzione del marchio “Patata
ii La Borsa patata fu istituita su iniziativa dell’Assessorato all’Agricoltura della
Regione Campania nell’intento di fissare prezzi minimi di ritiro del prodotto
da parte dei commercianti all’ingrosso e delle Associazioni dei Produttori.
Ha smesso di funzionare per le numerose difficoltà presentatesi.
76
felix” iii. Va sottolineato che, sempre di più, le OP
ma anche i commercianti, avviano iniziative di miglioramento qualitativo attraverso attività di collaudo
varietale e sperimentazione in collaborazione con
istituti di ricerca, pubblici e/o privati. Ci si orienta
sempre più frequentemente verso produzioni integrate e confezioni di piccola taglia (1,5-2,5 kg) le
cui etichette riportano informazioni su provenienza,
modalità di coltivazione, varietà, calibratura e consigli per l’uso. Ciò allo scopo di rilanciare un prodotto dalle impareggiabili caratteristiche organolettiche
che da alcuni anni si rivolge in misura crescente
verso i paesi dell’Est Europa, ancora poco esigenti.
A tale riguardo gli operatori denunciano la persistenza delle inefficienze della rete ferroviaria che, in
pratica, costringe al trasporto su gomma, più facile
da gestire e più controllabile. Gli attuali interporti di
Marcianise e Nola, nonostante la localizzazione nel
“cuore” delle aree produttive, manifestano carenze
strutturali tali da non essere compatibili con i rapidi
tempi di smistamento nonché le modalità di trasporto richiesti da un prodotto assai delicato come la
patata precoce.
Il commercio internazionale della patata precoce
italiana
L’analisi della filiera delle patate novelle italiane
ha mostrato chiaramente un’antica vocazione alle
esportazioni sui mercati centroeuropei, con particolare riguardo a quello della Germania. Le vicende
dello scorso decennio testimoniano purtroppo un
sensibile decadimento della performance italiana su
questi mercati. Nella Tabella V sono riportate le medie biennali dei dati di commercio estero che eviiii Si tratta di un marchio di proprietà della Regione Campania che può
essere usato dietro impegno a seguire il protocollo previsto che implica tra
l’altro l’adesione al Programma regionale di produzione integrata. La Regione si è fatta carico di stipulare una convenzione con UNICOOP Tirreno per
la distribuzione del prodotto in alcuni punti vendita regionali.
Marzo 2012
LOMBARDI
Tabella V. — Import ed export di patate novelle per paese di origine e destinazione (2000/2001 vs. 2008/2009).
Importazioni
Paese
2000/2001
2008/2009
Migliaia di euro
Germania
Francia
Egitto
Israele
Altri
Mondo
685
3434
15486
276
1629
21510
1722
4087
34455
4249
1597
46110
Esportazioni
2000/2001
2008/2009
2000/2001
Tonnellate
4937
20467
60057
754
4644
90859
2000/2001
Migliaia di euro
10905
20614
100.736
11346
4963
148.564
denziano la sensibile caduta delle esportazioni italiane e il significativo aumento dei flussi in entrata.
La situazione è stata evidenziata nella Figura 3 che
mostra come da una situazione di paese forte esportatore, l’Italia a fine decennio si ritrova a vestire i
panni di importatore netto; per effetto della netta
controtendenza tra i flussi in entrata che aumentano
del 64% e quelli in uscita che si riducono del 23%
tale che nel periodo indagato il saldo normalizzato
(indice di specializzazione degli scambi) che rappresenta un importante indicatore di commercio internazionale passa da un valore 0,32 positivo a un
valore di 0,11 negativo.
Una indagine di maggior dettaglio relativa ai flussi
reali (quantità) che prende in considerazione i tre
bimestri di commercializzazione della patata novella, consente considerazioni più approfondite. La prima consiste nel fatto (Figura 4) che le esportazioni
italiane sono destinate in massima parte e in ogni
periodo di commercio al mercato tedesco e questa
caratteristica lega pericolosamente la performance
del prodotto ad un unico sbocco commerciale.
2008/2009
42054
1130
4249
1992
14628
64053
2008/2009
Tonnellate
39735
1556
1619
2255
9420
54584
122.468
2569
10928
7189
40054
183.207
101.595
3735
3882
7630
24316
141.157
La seconda considerazione, stavolta di valenza
positiva, attiene alla “qualità” che ancora si riconosce al prodotto italiano cosi come si può evincere (Figura 5) dalle informazioni sui valori impliciti
M-J
M-A
J-F
0
20
40
60
80
100
%
Polonia
Germania
Olanda
Altri (UE)
Figura 4.—Export italiano per bimestre e per paese.
50
200.000
40
180.000
160.000
30
140.000
20
120.000
10
100.000
80.000
00/’01
02/’03
04/’05
Import
Figura 3.—Import ed export totali in quantità.
06/’07
08/’09
0
J-F
Export
M-A
PM
M-J
PX
Figura 5.—Prezzi medi impliciti da e verso mondo.
77
LOMBARDI
(proxy prezzo) che per tutti i periodi di commercio
fanno registrare una ragione di scambio favorevole
ai nostri flussi in uscita.
La circostanza che maggiormente preoccupa al
riguardo della situazione italiana, risiede nel fatto
che il mercato dell’Unione Europea, fondamentale
riferimento per tutti i flussi di commercio estero, relativamente alle patate novelle, ha visto una crescita
decisamente importante della domanda interna che
ha fatto lievitare i quantitativi importati da 700 mila
tonnellate di inizio decennio ad oltre 1 milione di
tonnellate dei nostri giorni. La pertinenza italiana in
questo contesto di crescita, come si può vedere nel
Figura 6, è restata purtroppo stazionaria in valore
assoluto e addirittura in diminuzione se riferita alle
quote di mercato.
In riferimento a queste ultime e considerando i
tre periodi di commercializzazione, la situazione sul
mercato dell’UE è quella rappresentata nella Figura 7
che mostra in maniera incontrovertibile che Francia,
Egitto e Israele assumono una posizione di assoluta
dominanza da gennaio ad aprile, lasciando margini
di una certa significatività alla Spagna e all’Italia solo
nel periodo maggio-giugno.
La cosa più sorprendente in questo contesto, non
è tanto la posizione che occupano Israele ed Egitto,
viste sia la loro latitudine che le condizioni esistenti
sui loro mercati del lavoro, quanto la imponente e
diffusa penetrazione commerciale della Francia che
trova spiegazione, a nostro avviso, solo tirando in
ballo la posizione dominante di trader piuttosto che
di produttore (Figura 8).
Le ragioni politiche per la tracciabilità
Come descritto nei paragrafi precedenti, il comparto della patata precoce si caratterizza per tre elementi fondamentali: la concentrazione della produzione in poche aree del paese; l’importanza delle
esportazioni per l’economia del settore; la buona
reputazione del prodotto italiano derivante dalle
particolari caratteristiche organolettiche della patata
precoce locale.
In tale scenario, quindi, poter differenziare le patate precoci delle regioni italiane, attraverso la certificazione della provenienza, potrebbe diventare una
scelta strategica obbligata al fine di aumentare la
competizione del prodotto nei mercati esteri e in
quello nazionale.
Quanto detto diviene maggiormente auspicabile
78
300.000
250.000
200.000
150.000
100.000
50.000
0
2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009
Francia
Italia
Egitto
Israele
Figura 6.—Trend delle importazioni UE 25.
M-J
M-A
J-F
0
20
40
60
80
100
%
Spa
Fra
Ita
Ola
Egt
Isr
Mrc
Altri
Figura 7.—Quote di mercato UE per bimestre.
M-J
M-A
J-F
0
20
40
60
80
100
%
Altri
Be-Lux
Ger
Spa
RU
Ola
Por
Figura 8.—Francia: export per bimestre e per paese.
Marzo 2012
LOMBARDI
se si osservano i trend dei flussi commerciali. In particolare, come riportato nel paragrafo precedente,
vanno sottolineati la progressiva rilevanza dei volumi commercializzati principalmente dalla Francia,
da Israele e dall’Egitto e il contestuale calo delle
esportazione verso il mercato storico di destinazione
rappresentato dalla Germania.
In un mercato, come quello dalla patata precoce, caratterizzato, quindi, da un profondo processo
di cambiamento, poter fornire un prodotto la cui
provenienza e tracciabilità fossero assicurate, permetterebbe, oltre che una migliore performance sui
mercati esteri, l’impedimento di comportamenti opportunistici a causa dei quali prodotti non italiani
potrebbero essere venduti come tali solo grazie alla
realizzazione del confezionamento o della semplice
tolettatura in Italia.
Ottenere un prodotto tracciato, per il quale fosse
possibile assicurare la provenienza nazionale rappresenta una strategia di differenziazione che è in
linea con la corposa normativa privata in materia di
sicurezza alimentare che nei moderni scenari competitivi regola i rapporti fra fornitori e grande distribuzione organizzata.
La strategia seguita dalla fase commerciale della
filiera è stata, infatti, quella di moltiplicare e differenziare un numero elevato di standard privati che,
molto prima di quanto abbia fatto la regolamentazione pubblica obbligatoria, hanno avuto come
obiettivo quello di selezionare i fornitori al fine di
raggiungere livelli più elevati di sicurezza alimentare e tracciabilità, addossando un parte rilevante dei
costi e dei rischi alle fasi a monte della filiera e ai
consumatori finali 4, 5.
La grande distribuzione rappresenta attualmente
l’attore chiave nelle filiere produttive, il cliente intermedio con cui tutti i comparti dell’agroalimentare
italiano dovranno confrontarsi in Italia e all’estero.
In tale ottica, anche la patata precoce non può sottrarsi alla sfida descritta.
Il successo del processo descritto risiede da un
lato in una ristrutturazione della filiera produttiva
così da divenire un interlocutore della GDO e dall’altro nell’offerta crescente di innovazione e di “qualità
riconoscibile” in termine di servizio e di prodotto.
Per quanto discusso relativamente alla domanda
crescente di sicurezza da parte del consumatore moderno e all’importanza che la tracciabilità ha fra le
numerose dimensioni della qualità e della sicurezza
stessa, appare evidente come la certificazione, l’assicurazione e la tutela della provenienza della pata-
ta precoce divengano attributi capaci di conferire al
prodotto l’innovatività necessaria per aumentare la
competitività nei moderni mercati alimentari.
La correlazione esistente fra innovatività, sicurezza alimentare e certificazione di origine rappresenta
un aspetto rilevante, destinato ad una crescente valenza strategica.
Fra le motivazioni che si trovano alla base di tale
affermazione vi è una rinnovata attenzione sia alla
provenienza dei prodotti alimentari sia alle politiche
a questa connesse da parte di paesi, in passato, non
sensibili a questo argomento quali gli Stati Uniti o
alcuni dei paesi emergenti 2, 6. Tale processo implica
che, in futuro, la differenziazione dei prodotti alimentari e la competizione di questi sul mercato europeo e globale saranno ancor più legate a politiche
COOL (Country Of Origin Labelling) che si caratterizzeranno come un mix fra normazione privata e
regolamentazione pubblica. Inoltre, la crescente domanda da parte dei consumatori non solo di sicurezza alimentare in senso stretto ma di “rassicurazione
generale sul prodotto” relativamente agli impatti che
questo può avere sull’ambiente, sulla salute e sulla
società renderà sempre più ampi gli ambiti correlati
alla semplice certificazione di origine. Non solo un
prodotto ottenuto in un determinato territorio, con
determinati protocolli produttivi, con determinate
caratteristiche organolettiche e salutistiche ma anche
un alimento la cui filiera possa dare assicurazione di
un’attenzione crescente alla riduzione degli impatti
ambientali e al rispetto delle condizioni di lavoro dei
soggetti coinvolti in linea con quelli che sono i diritti
umani e del lavoratore.
I costi della tracciabilità
Da quanto esposto nei paragrafi precedenti emerge chiaramente l’esigenza di puntare sulla soluzione
di nodi strutturali ma anche di elementi innovativi
che conferiscano al prodotto italiano caratteristiche
distintive tali da fargli recuperare le quote di mercato
perse negli anni addietro. In particolare, la tracciabilità, per i motivi esposti nel paragrafo precedente,
rappresenta uno di questi elementi. Diviene allora
importante capire quanto ciò possa incidere sui costi e, dunque, sul prezzo finale di vendita. A questo
proposito quanto avvenuto in Regione Campania
nell’ultimo decennio, rappresenta un interessante
caso studio, peraltro unico nel panorama nazionale
relativamente alla patata precoce. La filiera campa-
79
LOMBARDI
na, difatti, accanto ad elementi tradizionali, presenta
oggi realtà interessanti dal punto di vista del miglioramento qualitativo della produzione. Gli aspetti più
salienti di questo miglioramento riguardano sia la
fase produttiva che quelle successive di lavorazioneconfezionamento. Esso interessa sia i grossi commercianti che le OP e, più in dettaglio, consiste nella
sperimentazione di nuove varietà, introduzione di
modalità di coltivazione biologica e/o integrata, modalità di confezionamento ed etichettatura del prodotto. Ne segue, spesso, l’adesione a sistemi di tracciabilità e a marchi di provenienza e/o di qualità che,
pur non avendo un riconoscimento nazionale e/o
europeo, costituiscono un significativo tentativo di
differenziazione del prodotto campano com’è avvenuto con l’istituzione del già richiamato marchio regionale Patata felix iv. Rispetto alle OP, i commercianti risultano attenti più al discorso varietale e a quello
lavorazione-confezionamento-etichettatura. Riguardo
al confezionamento, prendono sempre più piede le
confezioni di piccola taglia, 1,5-2,5 kg, la cui etichetta riporta informazioni su provenienza, modalità di
coltivazione, varietà, calibratura e consigli d’uso.
L’indagine svolta per individuare ed analizzare i
costi relativi alle diverse fasi/operazioni (Per quanto attiene ai costi relativi alla produzione, la metodologia adottata per la determinazione dei risultati
economici delle aziende (costo di produzione e redditività) si basa sul calcolo del costo di produzione
di riferimento [CPR] inteso quale sommatoria dei costi espliciti [Ce] e dei costi impliciti [Ci]) ha previsto
interviste, effettuate a fine estate 2011, ai principali
grossisti ed alle principali OP che operano in Campania, localizzati nelle aree di produzione tradizionale della patata precoce campana che, ovviamente,
producono e commercializzano anche patata comune oltre che altri ortofrutticoli. Da sottolineare, ai fini
della determinazione dei costi, che la patata precoce
presenta diverse varietà dalle caratteristiche organolettiche, di serbevolezza e resistenza agli stress assai
variabili i cui costi di produzione possono variare
significativamente. Di conseguenza, anche i prezzi
di vendita possono presentare un’elevata variabilità, in funzione della varietà, del momento e delle
modalità di raccolta, dell’andamento climatico, della
specifica piazza di contrattazione e persino del moiv L’iniziativa regionale ha costituito per qualche Associazione uno stimolo
a fare in proprio, cimentandosi nella registrazione di un proprio marchio,
come quello Patata Fresca Campana della OP Campania Patate, quale elemento di rilancio del prodotto per il consumo fresco, sia a livello nazionale
che internazionale.
80
mento della giornata in cui si effettuano gli scambi.
In particolare, nell’ultima annata agraria, il prezzo
della patata precoce commercializzata nei principali
mercati ortofrutticoli all’ingrosso, è risultato compreso tra un minimo di 20 €/q ed un massimo di 35 €/q
v. Si comprende, dunque, quanto sia problematica
la ricostruzione e l’interpretazione dei costi lungo i
diversi stadi della filiera. Nei questionari è stata prevista, perciò, una sezione apposita per la rilevazione
dei costi sostenuti in relazione alle diverse fasi di lavorazione del prodotto, vale a dire: trasporto, lavorazione, confezionamento, stoccaggio e certificazione.
In base alle informazioni ottenute i costi risultano
distribuiti come di seguito indicato vi. Il trasporto,
che avviene esclusivamente su gomma, è una delle voci più importanti incidendo, mediamente, per
un ammontare pari a 3-3,5 €/q di prodotto. Le fasi
di lavorazione-confezionamento hanno un’incidenza che dipende dalla lavorazione effettuata e dalle
confezioni utilizzate. Difatti, queste tipologie di costo sono quelle per le quali si sono riscontrate le
maggiori differenze potendo variare da un minimo
da 2,5 €/q a un massimo di 5-6 €/q. Ciò dipende
dalle caratteristiche del prodotto che esce dal magazzino. Laddove le fasi di scarico, lavaggio, scarto
e calibratura della merce sono molto accurate, così
come avviene quando il prodotto viene confezionato in contenitori di media-piccola taglia (cassette o
sacchetti riciclabili di 1,5-3 kg ma anche sacchi fino
a 15-20 kg) con etichetta riportante informazioni su
provenienza e certificazioni, allora il costo è quello
massimo indicato. Se, viceversa, il grado di accuratezza delle fasi di lavorazione è inferiore perché
il prodotto magari è destinato ad essere venduto
come prodotto sfuso o essere ulteriormente lavorato da altri, allora il costo è decisamente più basso.
Anche per i costi relativi allo stoccaggio è stata riscontrata una notevole variabilità che dipende dai
tempi e dalle modalità di permanenza del prodotto in magazzino. Se, come avviene spesso nel caso
della patata precoce commercializzata dagli operatori intervistati, si tratta di una breve permanenza
(alcuni giorni) allora il costo si aggira sui 2,5 €/q;
se, invece, si tratta di stoccaggio di merce lavorata
che resta in frigorifero anche qualche mese, in attesa
vDa precisare che quello massimo indicato è un prezzo “eccezionale” che
si è verificato in condizioni di mercato particolari e comunque con un prodotto di qualità elevata quale, per esempio, quello di varietà Agata, ben
presentata.
vi Le diverse categorie di costi sono comprensive di quelli relativi al lavoro
impiegato, all’uso di impianti e macchinari ed alle diverse tipologie di confezioni utilizzate.
Marzo 2012
LOMBARDI
di essere venduta quando le condizioni di mercato
migliorano, allora si arriva anche a 5-6 €/q. Infine,
bisogna considerare, là dove presenti i costi della
certificazione. Come sottolineato a inizio paragrafo, in Campania, sempre più OP ma anche grossisti,
aderiscono a protocolli di qualità per poi richiedere
a Istituti Certificatori il rilascio delle certificazioni relative. Quelle più diffuse riguardano le modalità di
produzione, tipo produzioni integrate o biologiche,
e la tracciabilità del prodotto commercializzato. Gli
istituti cui si fa maggiore ricorso sono ISMECERT,
per l’uso del marchio regionale Patata felix, e CCPV
per certificazione Global G.A.P. sempre più richiesta
a livello europeo ed alla quale gli operatori della filiera campana aderiscono per il consolidamento dei
rapporti commerciali. Trattasi, in quest’ultimo caso,
di una certificazione di tracciabilità riguardante l’intera filiera, dalla produzione alla lavorazione e al
confezionamento del prodotto pronto per essere destinato al consumo finale. Mediamente, l’incremento
di costo dovuto all’adesione a sistemi di tracciabilità
e di qualità, come quelli precedentemente descritti, intorno ai 0,23 centesimi di euro per chilogrammo di prodotto. Tale importo deve intendersi come
comprensivo sia dei più elevati costi di gestione che
di quelli vivi sostenuti per l’ente certificatore.
Un stima dei benefici della tracciabilità
La stima dei benefici della tracciabilità è stata effettuata somministrando un questionario a un cam-
pione di 1004 famiglie, rappresentativo della popolazione italiana. Il questionario è stato somministrato
nel mese di luglio 2011 dalla GFK Eurisko.
Il questionario era articolato in quattro parti. La
prima sezione, di natura introduttiva, presentava una
serie di quesiti relativi all’analisi delle preferenze e
dei comportamenti di acquisto di frutta e ortaggi. In
questa sezione si investigava anche su quali potessero essere gli attributi chiave utilizzati dai consumatori finali per definire la qualità dei prodotti citati.
La seconda parte, invece, focalizzava l’attenzione
esclusivamente sulla patata precoce. In tale sezione
venivano indagate le abitudini di acquisto e consumo di questo prodotto nonché veniva analizzata
l’influenza che alcuni attributi, in particolare il luogo
di produzione, potevano avere sulle scelte di acquisto e consumo.
Nella terza sezione veniva presentato all’intervistato uno scenario ipotetico basato sul seguente
quesito:
Immagini di trovarsi nel negozio dove generalmente acquista le patate novelle. Immagini di voler
acquistare le patate novelle e di trovarsi di fronte
alle seguenti 4 etichette riferite ad 1 kg di prodotto.
Tra i 4 prodotti esposti ne sceglierebbe uno? Se sì
quale?
Le etichette differivano tra di loro per i livelli assunti da 6 differenti attributi di prodotto. Gli attributi
e i possibili livelli sono illustrati in Tabella VI.
Le etichette presentate al consumatore sono state
generate attraverso un disegno sperimentale ortogonale ad effetti principali, in cui gli insiemi di scelta
Tabella VI. — Attributi e livelli.
Attributi
Livelli
Prezzo (€/kg)
a) 0,60
b) 1,00
c) 1,40
a) Italia
b) prodotto di nazionalità diversa da quella italiana
c) nessuna informazione sul paese di origine
a) biologico
b) agricoltura integrata
c) convenzionale
a prodotto con emissioni di carbonio ridotte e certificate
b) prodotto con emissioni di carbonio non note
a) equo-solidale
b) convenzionale
a) plastica
b) plastica biodegradabile
c) sfuso
Paese di origine
Tecnica di produzione
Impronta carbonica
(riduzione delle emissioni di CO2)
Certificazione etica
Confezione
81
LOMBARDI
Tabella VII. — Risultati del modello Mixed Logit.
Attributi
Prezzo
Prodotto di nazionalità diversa da quella italiana
Italia
Agricoltura integrata
Biologico
Prodotto con emissioni di carbonio
ridotte e certificate
Equo-solidale
Confezione di plastica
Confezione di plastica biodegradabile
Media
Varianza
Disponibilità a pagare
(€/kg)
-0,72
0,41
(0,07)
2,24
(0,07)
0,11
(0,06)
0,20
(0,05)
0,28
(0,04)
0,27
(0,04)
0,28
(0,06)
0,29
(0,05)
0,06
0,438
(0,09)
1,45
(0,07)
0,07
(0,16)
0,053
(0,15)
0,22
(0,09)
0,383
(0,08)
0,36
(0,02)
0,16
(0,19)
0,570
(0,88)
3,11
(2,01)
0,16
(0,09)
0,28
(0,07)
0,39
(0,45)
0,38
(0,77)
0,39
(0,72)
0,40
(0,31)
Valore della funzione di verosimiglianza alla convergenza: -6080,80.
sono stati generati tramite il metodo dell’ “enumerazione completa” (il disegno sperimentale adottato
garantisce: 1) ortogonalità delle etichette; 2) minima
sovrapposizione dei livelli; 3) livelli degli attributi bilanciati). Ogni insieme di scelta comprendeva quattro etichette differenti a cui si aggiungeva la possibilità di non scegliere alcuno dei prodotti presentati.
Sulla base delle scelte effettuate dai consumatori,
tramite un Mixed Logit, è stata stimata la rilevanza
degli attributi nella scelta e la disponibilità a pagare
un premio di prezzo per un chilo di patate novelle
che presentasse quello specifico attributo (per una
presentazione di dettaglio del metodo impiegato si
veda Cicia et al.3).
La Tabella VII illustra i risultati del modello stimato. I valori medi dei parametri stimati forniscono
una stima dell’importanza che i consumatori attribuiscono ai diversi attributi. Maggiore il valore del parametro, maggiore il peso di questo nella scelta. Un
segno positivo indica che all’aumentare del valore
che assume il parametro aumenta anche la probabilità che venga scelto. Il contrario nel caso di segno
negativo. Il prezzo, come quasi sempre avviene in
questa classe di modelli, e come è lecito attendersi,
presenta segno negativo. Tutti i parametri sono ampiamente significativi da un punto di vista statistico.
Sulla base dei parametri stimati appare evidente
che il luogo di origine è l’attributo che pesa maggiormente nella scelta d’acquisto (tra quelli conside-
82
rati) del prodotto patata precoce. Di gran lunga più
importante di attributi quali equo-solidale, biologico,
impronta di carbonio, e packaging biodegradabile.
Tale importanza si riflette anche nella disponibilità
a pagare per questo attributo, riportata nell’ultima
colonna è alquanto elevata ed indica una forte preferenza dei consumatori italiani per le patate novelle
di origine italiana.
L’impatto sul mercato nazionale della
tracciabilità della patata novella italiana
In questo paragrafo sono illustrati i risultati
dell’impatto sul consumo domestico di verdura fresca dell’introduzione di una procedura di tracciabilità sulla patata precoce. Per ottenere i parametri
necessari a svolgere la simulazione è stato stimato
un sistema di funzioni di domanda, utilizzando i dati
della spesa domestica (2009) di circa 3,000 famiglie
Italiane statisticamente rappresentative dell’intera popolazione nazionale. La stima del sistema di
domanda ha quindi permesso di studiare gli effetti
dell’introduzione della procedura di tracciabilità in
modo esplicito e definire una previsione dei suoi
effetti sui consumi domestici. La stima del sistema di
domanda ha fornito infatti importanti informazioni
sulle dinamiche prezzo-consumo di un vasto insieme di verdure fresche consumate in Italia (patate
Marzo 2012
LOMBARDI
divise in precoci e comuni, cavoli, lattuga, funghi,
carote, asparagi, cipolle, pomodori, peperoni e melanzane, cetrioli, fagioli e legumi, zucchine ed altri):
in particolare il modello stocastico implementato ha
fornito stime puntuali dei valori dell’elasticità diretta
ed incrociata della domanda alle variazioni di prezzo.
I parametri stimati forniscono precise indicazioni
sugli effetti delle variazioni del prezzo iniziale di patata precoce sulla domanda dei beni sostituti e complementari. Questo effetto è stato misurato in termini di elasticità al prezzo diretta (-0,57) ed incrociata:
fra i prodotti sostituti riscontriamo la patata comune
(0,16), il finocchio (0,13) ed i legumi (0,12). Mentre
i prodotti complementari comprendono la lattuga
(-0,07) e le altre verdure (-0,08). Per quanto riguarda
la simulazione sono stati utilizzati i parametri cosi
come stimati dal modello, introducendo l’adozione
di tracciabilità nel modello come un “costo puro” t
che aumenta di una quota s, il prezzo di vendita del
prodotto considerato: (t=s×P).
L’analisi effettuata simula di fatto l’impatto ceteris
paribus di breve periodo sul consumo di verdure
fresche, ma non tiene conto in maniera esplicita del
possibile incremento della disponibilità a pagare del
consumatore Italiano (DAP) per i prodotti tracciati,
cosi come il paragrafo precedente sembra evidenziare.
La Tabella VIII mostra l’impatto della tracciabilità
sui consumi di verdura fresca delle famiglie, per i
diversi valori di t. Il modello ha confermato empiricamente l’ipotesi che la patata comune è, in termini di abitudini alimentari, un sostituto diretto della
patata precoce. I risultati consentono di affermare
che i consumatori ritengono la patata comune come
bene debolmente inferiore a quella novella. L’im-
plicazione è che la patata novella già è considerata
un bene superiore ma un aumento della forbice dei
prezzi, a favore della patata comune, avrebbe effetto
significativo sul consumo della novella. A seconda
dell’incidenza dei costi della tracciabilità sui prezzi
al consumo della patata precoce, i consumi in quantità potrebbero ridursi dal 3% al 7% a favore della
patata comune.
Tuttavia i costi lungo la filiera cosi come calcolati
in dettaglio nei precedenti paragrafi del lavoro dovrebbero incidere sul prezzo al consumo in misura
ancora inferiore di quanto qui ipotizzato nella simulazione: l’impatto al consumo dell’incremento di
costi attribuibile alla procedura di certificazione può
ritenersi del tutto trascurabile se dovesse essere inclusa nel sistema la disponibilità a pagare (DAP) per
l’ attributo “precoce italiana” così come stimata dal
precedente paragrafo. Gli effetti sul prezzo al consumo sarebbero, infatti, del tutto più che controbilanciati dall’incremento della DAP del consumatore per
la patata precoce Italiana.
Conclusioni
La presente ricerca ha mostrato che una politica
di valorizzazione che passa per il riconoscimento di
origine del prodotto nel settore della patata novella
italiana potrebbe avere ampi margini di successo. Il
differenziale tra i costi della tracciabilità e la disponibilità a pagare da parte dei consumatori italiani per
un prodotto tracciato è molto ampio, tanto ampio da
poter prevedere che l’incremento di prezzo che si
realizzerebbe sul mercato produrrebbe una minima,
ancorché nulla, riduzione nella domanda di questo
prodotto.
Tabella VIII. — Simulazioni di prezzo della patata novella, acquisti delle famiglie (%), quantità consumate (kg) e variazioni
percentuali.
Verdura fresca
Valore iniziale
Prezzo novella + 5%
Prezzo novella + 7%
Prezzo novella + 10%
Prezzo novella + 15%
Comuni
Novelle
Comuni
Novelle
Comuni
Novelle
Comuni
Novelle
Comuni
Novelle
Acquisto delle famiglie (%) e variazioni per
scenario
92,07
51,08
92,07
51,04
62,07
51,02
92,07
51,00
92,07
50,07
0
-0,8
0
-1,2
0
-1,6
0
-2,1
Quantità consumate (kg) per famiglia/anno
e variazioni percentuali
26,11
3,34
+0,21
-0,09
+0,29
-0,12
+0,40
-0,18
+0,59
-0,26
+0,8
-2,7
+1,1
-3,7
+1,6
-5,3
+2,3
-7,7
83
LOMBARDI
La certificazione di origine, però, va considerata
una condizione necessaria per il rilancio della pataticoltura precoce italiana ma da sola probabilmente
non sufficiente a recuperare margini competitivi sui
mercati nazionali ed europei.
Il settore della pataticoltura precoce dovrebbe prestare molta attenzione non solo alla diversificazione
delle produzioni cercando di anticipare la raccolta
e la commercializzazione, ma anche ad una migliore organizzazione ed integrazione tra le diverse fasi
della filiera. In effetti una strategia di differenziazione che si rispetti comporta il conferimento ai prodotti di caratteristiche distintive rilevanti per il consumatore in grado di incidere (aumentandolo) sul
valore percepito. Perché questo accada è necessario
un attivo coinvolgimento di tutti gli operatori della
filiera. Purtroppo l’esperienza maturata nel corso di
questa indagine hanno fatto maturare la sensazione che una caratteristica peculiare della filera “patata precoce” consiste in una sostanziale marginalità
del ruolo svolto dalla fase produttiva propriamente
detta. La scelta di quanto e cosa (varietà) coltivare
sono input operativi che il coltivatore “esegue” in
un contesto di asimmetria informativa, mentre tutto il faire valoir è spostato al post-raccolta. Questa
circostanza rappresenta la principale causa che sta
alla base della difficoltà che incontra l’adozione di
marchi di qualità e, più in generale, di politiche di
valorizzazione. Non si spiega altrimenti il divario talora troppo ampio tra i costi della certificazione e
della gestione di un marchio (contenuti) e i valori
(importanti) della DAP risultati dalle nostre indagini.
Conviene, inoltre, anche tenere conto che l’opportunità di risalire la china e tornare ad occupare le
posizioni che tradizionalmente competono all’Italia
(non solo per la patata novella ma per tutti i prodotti
di qualità) esistono e sono concrete solo se si riesce
ad assecondare la crescita consistente del mercato
comunitario. A tal riguardo è estremamente interessante il caso della Francia, che ha acquisito negli
ultimi anni un ruolo leader nel mercato della patata
precoce europea pur con limitati livelli produttivi
84
propri. Deve far riflettere il fatto che, quando non si
commercializzano commodity, i mercati sono molto
ristretti e molto più fidelizzati e sensibili per cui è
opportuno curare le relazioni di filiera (trasparenza
e serietà) tale da avere la opportunità di ampliare il
“portafoglio” cliente/prodotto per minimizzare i rischi associati alla precarietà dei mercati e aumentare
la capacità di penetrarli dal punto di vista commerciale. In definitiva c’è solo da augurarsi che quanto prima prenda sostanza un progetto di filiera che
partendo dal riconoscimento di un ruolo attivo dei
produttori sia capace di rilanciare l’economia di un
prodotto che in passato, per decenni, è stato un fiore all’occhiello dell’economia agricola meridionale.
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www.statistica.regione.campania.it/tematiche/agricoltura/
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symposium on “The Horizons of Using Organic Matter and Substrates in Horticulture”. 6-9 April 2005, Cairo, Egypt.
Finanziamenti.—Questa ricerca è stata finanziata dal Ministero Italiano delle Politiche Agricole e Forestali nell’ambito del progetto TIPIPAPA.
Marzo 2012

tipizzazione e caratterizzazione di varietà precoci di patata con l

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