Técnicas para el estudio del crecimiento y desarrollo en
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Técnicas para el estudio del crecimiento y desarrollo en
UNIVERSIDAD DE LAS PALMAS DE G.C. DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA TÉCNICAS PARA EL ESTUDIO DEL CRECIMIENTO Y DESARROLLO EN MACROALGAS. Marta Rodrigo Sanz 1997 Memoria que presenta la Leda. Marta Rodrigo Sanz en el Dpto. de Biología de la u.L.P.G.c. para la obtención de la Suficiencia Investigadora. Las Palmas G. C. , noviembre de 1997. INDICE. l . INTRODUCCIÓN .... ....... .... ...... .................. ... ......... ..... ....... .... .... ........ ..... ........ ..... ....... ... ... ..... .2 2. APLICACIÓN DE LAS TÉCNICAS DE CULTIVO AL ESTUDIO DEL CRECIMIENTO Y DESARROLLO DE Grateloupia doryphora... ... ..... ......... ..................... .... .. ... ........ ... ... ............. ... 3 2.1. Establecimiento de diferentes estadíos de crecimiento ........ .. .. ...... ........ .... .. .. .. .. .......... 3 2.2. Experimento(s) 1: Regulación efectiva del crecimiento y desarrollo por los reguladores de crecimiento en el Estadío O.. ... ..... ........................................... ........... .. ......3 2.3. Experimento(s) 2: Diferenciación celular producida por el fotoperiodo . Tetrasporogénesis en fases tempranas del crecimiento y desarrollo ................... .. .. ............ 4 2.4. Experimento(s) 3: Cambios fisiológicos durante el crecimiento y desarrollo . .. .. .. ....... 5 3. HANSATECH ®: EL USO DEL ELECTRODO DE OXÍGENO PARA LAS MEDIDAS DE FOTOSÍNTESIS ....... ................ ........... ......................... .. .. ........ .. ........ .... .. ....... ........ .......... ... ...... ... 6 3.1. Introducción: Medidas de actividad fotosintética ........... .. ........ ................ :............... .. .6 3.2. Componentes del Hansatech ... ..... ............ ... .. ................ ... .... ............ ... ... ................... ..7 3.3. El electrodo de oxígeno ................. .. .... ..... .. ....... ............ ....................... .. ... ........ ......... 8 · Principio de funcionamiento del electrodo ................................ ............ ..... .. ........ 8 · Montaje y mantenimiento .................................................... ........ .. ..... ....... .. ......... 9 · Calibración ...................... ..... .... ............... ........ ... ............. ... .... .......... ..... .... ........... 9 3.4. Cámara de incubación ............. .. .. ................. .. .... .................. .... .... ...... .. .... .. .... .... ....... 10 3.5. Las fuentes de luz ................................... .................. ....................... ........................... 11 3.6. Software acoplado al electrodo de Hansatech: Programa Leaf-Disc ........................ 12 4. PROCEDIMIENTO DE MEDIDA: APLICACIÓN DEL HANSATECH AL CASO CONCRETO TOLERANCIA DEL AL " ESTUDIO ESTRÉS COMPARATIVO (TERMAL Y DE LA FOTOFISIOLOGÍA SALINO) DE DOS EST ADÍOS y DE CRECIMIENTO DEL ALGA Grateloupia doryphora.".. ...... .................................................... .. 12 5. BffiLIOGRAFÍA................................ ... ........... .. ...... ............................. ....... ............................. 16 6. TABLAS Y FIGURAS ...... ..... ....... ...... ............ ..... ............. ...... .. .... .............. .. ... ............... .... ...... 19 7. PUBLICACIONES .................................................................. ..... .... .. ....................... .. ...... ... .. .. .26 2 1. INTRODUCCIÓN. Una gran parte del conocimiento sobre la biología de las algas ha derivado del estudio directo de muestras naturales, aunque cada vez son más los autores que consideran que el material recogido en la naturaleza no es el más adecuado para los estudios fisiológicos (Macler & Zupan 1991). El cultivo en el laboratorio de las macroalgas marinas se utiliza como herramienta de trabajo para estudiar aspectos básicos de la fisiología (Ramus 1990, Falkowski & LaRoche 1991, Yokoya & OLiveira 1993), cultivo y desarrollo (Dring 1988, Correa el al. 1985, Bradley 1991, DeCew el al. 1992) y fenología (historias de vida) (Lüning 1993, Brodie el al. 1994) de estos organismos mannos. Si lo que se pretende es analizar las variaciones durante el crecimiento y desarrollo, es importante partir de un material del que se conozcan sus requerimientos nutritivos y de luz, los estadíos en la historia de vida del alga y la fase de desarrollo en la que se encuentra. En definitiva, que sea homogéneo, con una historia fisiológica previa conocida y muy similar entre todos los individuos a estudiar. Es dificil que el material recogido de la naturaleza cumpla estas caracteristicas y de ahí la necesidad de contar con cultivos en el laboratorio. Los cultivos además permiten trabajar con una misma población y controlar así la variabilidad genética, que en ocasiones puede interferir o ser un inconveniente a la hora de interpretar resultados. 3 2. APLICACIÓN DE LAS TÉCNICAS DE CULTIVO AL ESTUDIO DEL CRECIMIENTO Y DESARROLLO DE Grateloupia doryphora. 2.1. Establecimiento de diferentes estadíos de crecimiento. Siguiendo la metodología ya establecida para macro algas por Robaina (1988) y García-Jiménez (1994), se obtuvieron explantos fértiles axénicos. Después de 30 días, la mayoria de los explantos cultivados habían liberado carposporas que se recolectaron y cultivaron en medio PES sólido (provasoli 1968). Tras 1-2 meses las carposporas germinadas (germilings) , cultivadas en medio líquido, desarrollaron tres o cuatro ejes de crecimiento (sporelings) y posteriormente se transfirieron a medios líquidos aireados (no asépticos) hasta la obtención de talos adultos. En el momento de la transferencia de los gerrnlings a medio líquido, comenzamos un seguimiento diario del crecimiento en términos de peso fresco, hasta que se alcanzó el tamaño máximo en cultivo. Al representar los datos de biomasa fresca frente al tiempo, se obtuvo una curva que se ajusta a una curva logística sobre la que empíricamente caracterizamos cuatro fases o estadíos (Fig. 1 en la publicación de Marine Biology adjunta y Fig 2). A partir de estos 4 estadíos establecidos (Estadíos O, 1, II Y ID) tan sólo como etapas de crecimiento en una curva asociados a una determinada tasa de crecimiento, se realizaron distintos ensayos que mostraron algunos de los cambios que tienen lugar ligados a la adquisición de mayor grado de desarrollo y capacidades funcionales. Estos estadíos de cultivo nos permitieron caracterizar en todo momento el material de partida, constituyendo la base de todos los experimentos posteriores. 2.2. Experimento(s) 1: Regulación efectiva del crecimiento y desarrollo por los reguladores de crecimiento en el Estadío O. La bibliografia muestra que las respuestas de las algas frente a los reguladores de crecimiento son muy variables. Para un mismo material, estas sustancias pueden provocar morfogénesis o por el contrario no causar respuesta alguna. El efecto causado también varia en función de las condiciones de cultivo, el tamaño y la edad del material vegetal. Los reguladores de crecimiento tienen escaso efecto en el tejido bien desarrollado de las Rhodophytas. En un estudio previo realizado con explantos y talos desarrollados (Estadío ID) de 4 G dOlyphora (Robaina 1988, García-Jiménez el al. 1997), los reguladores tampoco resultaron efectivos. A partir de estos resultados preliminares se estableció que el Estadío O era el único que respondía al aporte exógeno de estas sustancias. Gran parte del interés de este trabajo radica en las Escasas referencias del uso de los reguladores de crecimiento en las fases más tempranas de desarrollo. Por otra parte, conocíamos también los efectos del glicerol como fuente de carbono externa estimuladora del crecimiento vegetativo y morfogénesis en explantos y sporelings (Robaina el al.1990 a,b 1995; García-Jiménez el al. 1996). Basándonos en las experiencias anteriores con estos compuestos y mediante el cultivo de laboratorio, llevamos a cabo un estudio de los efectos combinados de los reguladores de crecimiento y del glicerol en los gennlings (Estadio O) de G doryphora. El estudio comprendía un seguimiento completo del material sometido a los diferentes tratamientos con técnicas histológicas e histoquímicas y de valoración de dos indices de desarrollo y morfogénesis. Todos los reguladores de crecimiento probados en los gennling del Estadío O tuvieron respuestas aunque diferentes, incluyendo la inhibición del crecimiento, la formación de callo y masas celulares y la emisión de yemas. Los resultados más sobresalientes se resumen en la Tabla 1 yen el trabajo que acompaña esta memoria y que será publicado en el 1. Appl. Phycology. 2.3. Experimento(s) 2: Diferenciación celular producida por el fotoperiodo. Tetrasporogénesis en fases tempranas del crecimiento y desarrollo. Este trabajo se basó en el uso muy extendido en la literatura de uno de los parámetros de cultivo, el fotoperiodo, para favorecer la formación de estructuras reproductoras (tetrasporas) en las algas (Dring 1988; Lewis el al. 1991 ; Guiry & Dawes 1992; Cunningham el al. 1993). Se adaptaron los métodos de cultivo de Gdoryhora introduciendo un control del fotoperiodo por bandeja de la cámara de cultivo. Combinando las técnicas de cultivo en el laboratorio y las técnicas de microscopía óptica y electrónica, se realizó un seguimiento que 5 permitió la descripción de los distintos eventos a nivel tisular y celular que tienen lugar en las primeras etapas de la tetrasporogénesis Así, el tratamiento inductor de la tetrasporogénesis en G. doryphora se estableció en tres semanas de cultivo en fotoperiodo corto (8 h luz: 16 h oscuridad). Mediante el diseño de experimentos basados en transferencias de los sporelings cultivados desde un fotoperiodo largo (16:8) (control) al fotoperiodo inductor (8:16), se establecieron los tiempos necesarios en uno y otro fotoperiodo para la inducción de las primeras etapas de la tetrasporogénesis. Las primeras estructuras bien definidas aparecen en sporelings del Estadío n, tras cuatro semanas de cultivo en el fotoperiodo largo y tres en el corto. Estos resultados están en fase de redacción para su posterior publicación. 2.4. Experimento(s) 3: Cambios fisiológicos durante el crecimiento y desarroUo. La respuesta marcadamente diferente del Estadío O frente a los reguladores de crecimiento apuntaba la posibilidad de que hubiese comportamientos biológicos diferentes entre los estadíos. Para corroborar esta hipótesis se planteó un ensayo en el que se eligieron dos estadíos claramente diferenciados entre sí (I.vs. ID) y se Uevó a cabo un estudio comparativo de su fotofisiología (contenido pigmentario y tolerancia fotosintética al estrés termal y salino). Para su realización fue necesario la mejora del método de extracción de clorofilas con DMSO (Dimetilsulfóxido) y de las ficobiliproteínas, así como la puesta a punto de la técnica del Hansatech, cuyo uso se aborda en detaUe posteriormente, que nos permitió obtener las curvas P-I (Fotosíntesis- Intensidad) a partir de las que medir y comparar la actividad fotosíntética en ambos estadíos de crecimiento. La primera diferencia importante entre los estadíos 1 y ID de G. doryphora se observó en la composición pigmentaria, a pesar de que los dos estadíos se habían cultivado bajo las mismas condiciones (Tabla 2). Esta diferencia en el contenido pigmentario quedó reflejada también en las tasas fotosíntéticas, presentando el Estadío 1 tasas mayores que el Estadío ID (Figura 3). Además la respuesta y tolerancia al estrés salino y termal de los dos estadíos (medida comparando los valores medios de los parámetros fotosíntéticos) también resultó muy distínta tal y como muestra las Tablas 3.a y 3.b Estos resultados han sido recogidos en la publicación (Marine Biology) que acompaña esta memoria. 6 El estudio fotofisiológico comparativo entre los Estadíos 1 y ID de cultivo de G.doryphora había mostrado la existencia de cambios pigmentarios ligados al desarrollo del alga. Utilizando de nuevo el factor longitud de día (fotoperiodo) se planteó un nuevo ensayo cuyo objetivo consistía en estudiar si cultivando los sporelings a diferentes fotoperiodos, además de los cambios ligados al desarrollo, se producían otros cambios fotofisiológicos. Estas alteraciones estarían provocados por los diferentes regímenes de luz: oscuridad durante el crecimiento en cultivo y de esta manera, se podría considerar el parámetro "longitud del día" como factor causante de fotoaclimatación. El análisis de pigmentos realizado con el HPLC mostró cambios cualitativos y cuantitativos en el contenido pigmentario de los individuos del Estadío ID cultivados en diferentes regímenes de luz (8 :16, 12:12 y 16:8). Las medidas obtenidas mediante el Hansatech no mostraron sin embargo que la diferencia en el contenido pigmentario se reflejara en una actividad fotosintética diferente entre los tratamientos de luz. Por otro lado, el distinto contenido en ficocianina entre los tratamientos, lleva incluso a pensar que la longitud del día pueda afectar a la estructuración de los ficobilisomas. Para verificar esta hipótesis, fue necesario poner a punto la técnica de aislamiento de ficobilisomas mediante gradientes de densidad de sacarosa. Posteriormente se realizó una electroforesis en gel de acrilamida, en condiciones desnaturalizantes, para observar si la configuración de pigmentos y linkers que conforman la estructura del ficobilisoma, coincidían en todos los tratamientos de longitud de día. 3. HANSATECB: EL USO DEL ELECTRODO DE OXÍGENO PARA LAS MEDIDAS DE FOTOSÍNTESIS. 3.1. Introducción: Medidas de actividad fotosintética. En el proceso de la fotosíntesis, la energía de la luz es absorbida por la clorofila y utilizada para conducir la reducción del dióxido de carbono a carbohidrato. El proceso fotosintético se puede sintetizar mediante la siguiente ecuación general: Para medir la actividad foto sintética, los métodos más usados son la medida del C02 7 incorporado en el proceso, mediante el método IRGA (Infra Red Gas Analysis) o utilizando el marcaje radiactivo del carbono incorporado tc).El método IRGA es más complicado de usar e interpretar en fases acuosas y su uso no está muy extendido en el campo de las algas. El método radiactivo del 14C requiere de unas instalaciones y de un equipamiento específico para su medida, además de presentar el inconveniente de usarse la radiactividad. Atendiendo a la ecuación general del proceso, la actividad foto sintética también se puede medir cuantificando el oxígeno liberado. Los métodos más usuales para medir las concentraciones de oxígeno disuelto son los de Winkler y los electrodos de oxígeno basados en la polarografia. Para medidas puntuales e instantáneas a distintas intensidades de luz, el método Winkler resulta poco práctico porque necesita de prolongadas incubaciones para su resolución. Este hecho conlleva además problemas de saturación de oxígeno y de contaminación bacteriana (Arnold & Littler 1985), aparte de que nadie asegura la linealidad de las medidas. Los electrodos de oxígeno tienen la ventaja de suministrar lecturas instantáneas y continuas, y 10 que es más importante, proporcionan medidas lineales de evolución de oxígeno frente a distintas intensidades de luz, 10 que permite el cálculo posterior de la tasa de actividad foto sintética con precisión. En la actualidad los electrodos de oxígeno empleados se acompañan de programas de ordenador que permiten automatizar las medidas y las diferentes intensidades de luz, proporcionando resultados fiables (Henley 1993). 3.2. Componentes del Hansatech. Hansatech es una marca registrada (Instituto para la Investigación de la fotosíntesis. Sheffield. u.K.) de un instrumento de laboratorio de precisión usado para medir la cinética o evolución del oxígeno liberado por un vegetal durante el proceso fotosintético . Es útil para cualquier planta C3(Walker 1987) El equipo para su correcto funcionamiento necesita de los siguientes elementos fundamentales : . El electrodo de oxígeno, junto con su unidad de control. . La cámara donde se disponen los vegetales y en la que se inserta el electrodo. En el caso de la cámara de agua, es necesario también una base magnética agitadora . 8 · Baño termostatizado que permite el control de la temperatura en el interior de la cámara. · La/s fuente/s de luz adaptables a la cámara junto con su unidad de control. · Sistema de registro conectado a la salida de la unidad control del electrodo. · Como elemento opcional: Un ordenador cargado con el programa específico de registro y gráficos, conectado a las unidades de control del electrodo y fuente de luz. 3.3. El electrodo de oxígeno. De acuerdo al proceso foto sintético, un vegetal dispuesto en una cámara provisto de una fuente de carbono e iluminado, liberará oxígeno. El oxígeno que se acumula en fase gaseosa durante la fotosíntesis, es detectable polarográficamente utilizando un electrodo "tipo Clark" . · Principio de funcionamiento del electrodo. El electrodo tipo-Clark del Hansatech consta básicamente de un cátodo de platino y un ánodo de plata unidos o conectados mediante un electrolito. Ambos electrodos están engarzados en un disco de plástico: el cátodo en el centro del domo y el ánodo de plata en una ranura circular que sirve a su vez como recipiente del electrolito. Los electrodos irán protegidos por una membrana de teflón o polietileno, permeable al oxígeno, que mantiene una fina capa del electrolito sobre la superficie de los electrodos. Debajo de la membrana se coloca un papel para mantener una capa uniforme y continua de electrolito entre el ánodo y el cátodo. Cuando se aplica un voltaje eficaz entre los electrodos, el platino se vuelve negativo (se convierte en el cátodo) y la plata (el ánodo) se toma positiva. El oxígeno se difunde a través de la membrana y se reduce en la superficie del cátodo, inicialmente en forma de peróxido de hidrógeno H20 2 de tal forma que la polaridad tiende a descargarse a medida que se donan electrones al oxígeno, que actúa como aceptor de electrones. La plata se oxida y se deposita cloruro de plata en el ánodo . La corriente generada es directamente proporcional al oxígeno reducido y se registra como voltaje en un registrador o se convierte en un registro de salida digital (~ol 02 tiempo·l) si se emplea el control de lectura que dispone el Hansatech. La caja de control del electrodo de oxígeno cumple una doble función : por una parte proporciona el voltaje de potenciación necesario que asegure un nivel de operación óptimo (700 mV aproximadamente), y por otra, convierte la corriente generada por el electrodo en una señal suficientemente fuerte que se pueda registrar. 9 . Montaje del electrodo y mantenimiento. Para su montaje se disponen unas gotas de electrolito en la ranura del ánodo y una gota en el cátodo. A continuación se coloca un papel de aproximadamente 2 cm 2 que cubra todo el electrodo y se empapa con el electrolito. El papel de fumar por ser fino y uniforme, es muy adecuado para este fin . Encima del papel, se coloca un trozo de membrana de tamaño similar a este, y ambos se ajustan al domo mediante un anillo de goma que se coloca con la ayuda del aplicador. Finalmente el electrodo ya montado, se enrosca en la parte inferior de la cámara, en contacto directo con la columna de incubación . Se utilizan muchos tipos de electro lito s y membranas y la elección de unos u otros se basa en la obtención de mejores o peores resultados durante su uso. En nuestro caso concreto, obtuvimos un buen funcionamiento del electrodo utilizando una solución de cloruro potásico saturada al 50 % como electrolito, y la membrana de teflón de 0.0125 mm de grosor que incluye el propio Hansatech. El electrodo para su buen funcionamiento debe estar limpio, para lo cual se pule cuidadosamente con una pasta de óxido de aluminio, se eIÜuaga bien con agua destilada y se seca. El cambio de membrana y la limpieza del electrodo debe ser semanal y en cada cambio, es recomendable que permanezca funcionando un día, antes de realizar medición alguna. Los electrodos están engarzados en epoxi-resinas y tienden a absorber agua y por ello incrementarse la corriente residual. Es recomendable para evitar este problema, tener un par de electrodos que permita guardar uno de ellos con silica-gel mientras se utiliza el otro y viceversa . . Calibración del electrodo. Las reaccIOnes electroquímicas generan una corriente residual incluso en la ausencia de oxigeno, que hace necesario calibrar el electrodo. Además se debe conocer el rango de concentración de oxigeno en el que nos movemos, para poder ajustar la escala apropiada durante las medidas. Para su calibración se llena la mitad de la cámara con agua destilada en la que se pone a burbujear nitrógeno para obtener el cero, pudiéndose reemplazar el N2 por una gota de una solución de ditionito sódico (Na2S204) que consume oxígeno en su reacción con el agua. Con este 10 último hay que tener especial cuidado, ya que el ditionito es corrOSIVO, pudiendo dañar o contaminar la membrana, por ello es mejor evitarlo y utilizar N2. Mientras se burbujea, se elige en la pantalla del software la opción de registrador gráfico (pen-recorder) y junto con la ayuda de la rueda del ajuste de la caja control, graduar en el monitor la señal gráfica hasta aproximarse al cero, de esta manera se fija la llamada "línea de nitrógeno" equivalente al cero. Para graduar el máximo o la "línea de aire", se vacía la cámara y se vuelve a llenar con agua de mar en la que se burbujea aire durante unos minutos hasta que llegue a la saturación. Se mide la temperatura dentro de la cámara y se busca en las tablas el contenido de oxígeno a la temperatura con la que se está procediendo. El valor obtenido es al que deberemos aproximamos en la pantalla del ordenador utilizando nuevamente el botón de ajuste de la caja control. Como procedimiento habitual, y para evitar niveles de saturación, el agua de incubación se burbujea con nitrógeno durante unos 5 minutos previamente a las medidas. 3.4. Cámara de incubación. La cámara de incubación se elige en función del organismo fotosintético. Para el caso de las algas se eligió la cámara de fase acuosa DWI (Hansatech). Esta cámara consta de un cilindro central a modo de columna de cristal de 5 mi de capacidad donde se coloca el organismo fotosintético. La columna está rodeada por un espacio por el que fluye un circuito cerrado de agua termostatizado, que permite que durante todas las medidas y ensayos la temperatura en el interior de la cámara no varíe. Este hecho tiene una importancia relevante considerando que el valor del contenido de oxígeno de la columna de agua es variable con la temperatura; además de las consecuencias que acarrea la variación de las condiciones de incubación para la medida. El principio de funcionamiento y medida en el aire o en la fase acuosa es el mismo, exceptuando que la difusión del oxígeno a través del agua es de tres órdenes de magnitud menor que en el aire. Es necesario por tanto la agitación continua de la solución mediante un agitador magnético que a su vez sirve de soporte de la cámara, y un imán de reducidas dimensiones que se introduce en la cámara de incubación al comienzo de la medida. 11 3.5. Fuentes de luz. Una de las fuentes de luz más comunes utilizada en los laboratorios para la medida de fotosíntesis suele ser el proyector de diapositivas, sín embargo, a no ser de que se utilice un filtro de calor, no es la más adecuada por el peligro de recalentamiento del material vegetal. Resulta más dificil todavía evitar este ínconveniente si se emplean intensidades de luz altas. Además de los proyectores de diapositivas existe una gama muy amplia de fuentes de luz disponibles para la medida de fotosíntesis. Cada marca registrada suele proveer un modelo de lámpara. En el caso de Hansatech, el equipo venía provisto de un juego de tres fuentes de luz denominados LED (Light Emitting Diodes: Diodos Emisores de Luz). Los LED constituyen una fuente de luz muy útil para aplicaciones fotosintéticas : son pequeños, manejables y capaces de emitir altas intensidades de luz sin producir mucho calor. Son además relativamente baratas, estables y tienen una larga duración. Los tres diodos (modelo: LH 36 U) que utilizamos en nuestro estudio emitían en una longitud de onda de 660 nm (luz roja), muy cercana al pico de absorción de la clorofila en el rojo. Al tratarse de un proceso cuántico, la medida más útil para expresar la actividad fotosintética es por el número de fotones de radiación foto sintéticamente activa y por unidad de superficie. Esta medida se denomina densidad de flujo de fotones, abreviado como PFD (photon Flux Density). Las unidades más empleadas para expresar el 2 cuadrado por segundo (~ m- S-I), simplemente el término mol (o ~ol) PFp son los microeinsteins por metro donde un einstein es un mol de fotones. Algunos autores usan porque el einstein no es una unidad del Sistema Internacional (Salisbury 1991 ). Los diodos utilizados pueden ser calibrados para dar un PFD determinado, que se muestra digitalmente en el monitor control de la luz. El dígito que aparece representa el porcentaje del máximo PFD que alcanza la fuente de luz. Los tres diodos disponibles en nuestro caso emitían un máximo (100 %) de 900 PFD. Actualmente, disponiendo del software adecuado, pueden programarse el encendido automático de los distintos PFD de las lámparas y el tiempo que deben permanecer encendidas. En nuestro caso los cambios de PFD se realizaron manualmente desde el monitor de control de la fuente de luz. 12 3.6. Software acoplado al electrodo de Hansatech: Programa Leaf-Disc. El programa infonnático que complementa el aparataje del Hansatech se denomina LeafDisc. La versión con la que se llevó a cabo el estudio permite registrar gráficamente las medidas de concentración de oxígeno frente al tiempo, a medida que se va generando corriente en el electrodo. Durante el registro y a intervalos de tiempo programables, el software va realizando los cálculos de las tasas lineales de producción de oxígeno, que aparecen en pantalla pulsando una tecla. En esta versión del Leaf-Disc, las tasas no se pueden programar ni almacenar por 10 que a medida que van apareciendo 10 valores, estos se tienen que ir anotando manualmente. El menú principal del programa permite ajustar numerosos parámetros de medida como la escala de ambos ejes, los tiempos de medida, cálculo de tasas, etc. La versión con la que trabajamos dispone de un programa de almacenamiento de datos y realización de gráficos muy básico y por sus muchas limitaciones, no resulta cómodo trabajar con él. 4. PROCEDIMIENTO DE MEDIDA: APLICACIÓN DEL HANSA TECH AL CASO CONCRETO DEL" ESTUDIO COMPARATIVO DE LA FOTOFISIOLOGÍA y TOLERANCIA AL ESTRÉS (TERMAL Y SALINO) DE DOS ESTADÍOS DE CRECIMIENTO DEL ALGA Grateloupia doryphora." Para cumplir el objetivo del trabajo, se planteó un diseño experimental con el que se pudiera analizar la actividad fotosintética (como reflejo de la capacidad fisiológica) de los dos estadíos (1 y ID) en condiciones nonnales de cultivo, y tras someterles a periodos de incubación cortos (30 minutos) en diferentes temperaturas y salinidades. El diseño experimental planteado para realizar las medidas foto sintéticas con el Hansatech se resume en el siguiente esquema: Condiciones control Salinidad Salinidad (18%0) (65%0) Temperatura Temperatura (25 °) (3 0°) Estadío 1 5 curvas 5 curvas 5 curvas 5 curvas 5 curvas Estadío Il1 5 curvas 5 curvas 5 curvas 5 curvas 5 curvas 13 Para el montaje del electrodo se procedió tal y como se explicó anteriormente, con KCl al 50 % de saturación como electrolito, el papelillo de fumar y la membrana de teflón. El electrodo ya montado permanecía antes de su uso estabilizándose durante al menos una hora, tiempo en el que se procedía a las incubaciones y preparación del material. La temperatura del baño termostatizado y por tanto la de la cámara durante las medidas, se ajustó para que coincidiera con la temperatura de cultivo (condiciones control). De esta manera todas las medidas se llevaban a cabo en las mismas condiciones y no se producía una re-incubación durante el proceso. Inmediatamente tras la incubación durante 30 minutos en los distintos tratamientos de salinidad y temperatura, se procedía a medir la actividad fotosintética de los individuos de ambos estadíos. Tanto las medidas como las incubaciones se realizaron en agua de mar pretratada (filtros de 100, 10 Y 1 ~m antes de pasar por luz U.V.). Debido a la diferente morfología y tamaño del material en los diferentes estadíos, se llevaron a cabo diversas pruebas para determinar el número de sporelings (Estadío 1) o peso del alga (Estadío ID) que debían ser colocados en el volumen de la cámara de incubación (5 mi) para que el oxígeno liberado fuera detectable y diera una señal clara. Se encontraron buenas respuestas utilizando una media de peso fresco de 6 mg, correspondiente a 20 sporelings del Estadío 1, y a las partes terminales de 2cm de longitud de individuos del estadío 1II. Para las medidas de los individuos del Estadío ID fue preciso introducir los fragmentos del alga en una malla de plástico que se desgasificaba previamente junto al agua de incubación, y evitar así las burbujas de aire. Los sporelings del Estadío I por sus reducidas dimensiones no interferían con el imán, y permanecían libres en la columna de incubación mientras se procedía a las medidas. Todas las mediciones de la actividad fotosintética se realizaron de 8 a las 14.00 p.m. para evitar la variación diurna de la fotosíntesis (Coutinho & Zingmark 1987). Las medidas se iniciaban cambiando el agua de la cámara por la desgasificada, y una vez colocado el material vegetal dentro de la cámara, esta se sellaba con la tapa y vaselina y se mantenia en oscuridad. Una vez elegido en el menú de pantalla la opción del registrador gráfico (pen-recorder), aparecían los ejes de la gráfica de concentración de oxígeno frente a tiempo y se ajustaba la escala de la ordenada (concentración de oxígeno) a 5 ~moles de 02, 14 mientras que, la abscisa, se mantenía en intervalos de dos minutos. Tras 8 minutos de registro en oscuridad, se obtenía la primera tasa y un minuto después (A los 9') una segunda, pulsando para ello la tecla F4. Estas primeras tasas negativas representan los valores de respiración en la oscuridad. El valor de las tasas aparece en pantalla y permanece 20 minutos hasta que esta cambia, por lo que a medida que se obtenían, se iban copiando en un estadillo. A partir de este momento se encendían las lámparas en el monitor de control. El primer 2 PFD fijado era del 2% (equivalente a 18 J.LI1101 de fotones m- S-I) . Cada vez el PFD se incrementaba en un 2%. Los PFD a los que realizamos las medidas de evolución de oxígeno fueron 0, 18, 36, 54, 72, 90, 108, 126, 144, 162, 180, 198, 216, 234 Y 252 PFD. Cada uno de los PFD se mantenía durante 4 minutos en los que se registraban 3 tasas consecutivas, para posteriormente calcular la media. Así sucesivamente, hasta que llegado a un determinado PFD, las tasas obtenidas no superaban las anteriores, o incluso disminuían. En este momento finalizaba la medida. Para obtener buenos resultados es muy importante estandarizar el procedimiento de medida, teniendo en cuenta para ello el número de PFD utilizados (cuantos más, mejor) y la duración de cada uno (Henley 1993). El Hansatech en este ensayo sólo se utilizó para la obtención de las tasas. Debido a las limitaciones de la versión antigua del programa Leaf- Disc, preferimos emplear para el posterior tratamiento de datos y gráficos otros programas como el SigmaPlot. Se representaron las tasas obtenidas, normalizadas a cantidad de clorofila ª, frente a los PFD correspondientes y se obtuvieron las curvas P-I (Fotosíntesis-Irradiancia) (Fig.3) . Para cada una de las curvas se calcularon los parámetros fotosintéticos de respiración en la oscuridad (R1), eficiencia fotosintética (alfa) y fotosíntesis máxima (P max) . El valor de ~ coincidía con el valor de la ordenada en el origen. Para calcular alfa, se trazó una recta de regresión de los cuatro primeros puntos de la curva y alfa tomó el valor de la pendiente de esa recta. Pmax coincide con los valores máximos de las tasas obtenidas a determinados PFD. Los valores de estos tres parámetros, en los diferentes tratamientos, permitieron hacer las comparaciones estadísticas y marcar las diferencias ya mencionadas entre los dos estadíos. La medida de la actividad fotosintética mediante el Hansatech puede optimizarse si se dispone de un juego de lámparas de luz de amplio espectro (luz blanca), que excite tanto los 15 pigmentos principales como los accesonos. Las lámparas disponibles emiten una luz monocromática centrada en 660 nm, que sólo permite la participación de la clorofila; hecho que hay que considerar por ejemplo, a la hora de interpretar los resultados en Rhodophyta. El trabajo puede agilizarse considerablemente con los nuevos programas informáticos de los que dispone actualmente Hansatech. Estos programas permiten la automatización de las fuentes de luz, de las medidas y el almacenamiento y tratamiento de datos, además de representar directamente las curvas P-I y calcular cada uno de sus parámetros. 16 5. BmLIOGRAFIA. Arnold K.E. Littler MM (1985) The carbon-14 method for measuring primary productivity. En: Handbook of Phycological methods. Vol 4. Ecological field methods: macroalgae. Pp.377-396. Littler MM & Littler DS (eds.). Cambridge Univ. Press. Cambridge Bradley PM (1991) Plant hormones do have a role in controlling growth and development of algae. J Phycol27: 317-321 Brodie 1. Masuda M . Guiry M (1994) Life history and photoperiodic responses in Chondrus giganteus forma flabellatus (Gigartinaceae, Rhodophyta) from Japan. Eur J Phycol 29 : 159164 Cunningham EM. Guiry MD. Breeman AM (1993) Enviromental regulation of development, life history and biogeography of Helrninthora stackhousei (Rhodophyta) by daylength and temperature. J Exp Mar Biol Ecol 171 : 1-21 Correa 1. Avila M . Santelices B. (1985) Effects of sorne enviro mental factors on growth of sporelings in two species of Gelidium (Rhodophyta). Aquaculture 44 : 221-227 Coutinho R. Zingmark R (1987) Diurnal photosynthetic responses to light by Macroalgae. J Phycol23 : 336-343 DeCew T. West JA. Silva PC (1992) The life history and anatomy of Opuntiella californica (Gigarinles, Rhodophyceae) . Phycologia 31(5): 462-469 Dring MJ (1988) Photocontrol of development in algae. A Rev PI Physiol (PI molec Biol) 39: 157-74 Falkowski PG. LaRoche J (1991) Acclimation to spectral irradiance in algae. J Phycol 27 : 814 17 García-Jiménez P (1994) Aclimatación reproductiva, fisiológica y estructural al cultivo in vitro del alga roja Grateloupia doryphora. Doctoral thesis. ULPGC . García-Jiménez P. Robaina R.R. Luque A. Tsekos I (1996) Glycerol activated cellular division and biosynthetic activity during growth and morphogenesis of carpospore seedlings of Grateloupia doryphora (Cryptonerniales, Rhodophyta). Phycologia 35(3): 261-269. García-Jiménez P. Rodrigo M. Robaina RR (1997) Plant growth regulators and glycerol induced cell growth and morphogenesis in carpospore-seedling culltivated in vitro. J Appl Phycol (In press). Guiry MD. Dawes CJ (1992) Daylength, temperature and nutrient control oftetrasporogenesis in Asparagopsis armata (Rhodophyta). J Exp Mar Biol Ecol 158 : 197-217 Henley W (1993) Measurament and interpretation of photosynthetic light-response curves in the context ofphotoinhibition and diel changes. J Phycol29: 729-739 Lewis N . Avila M . McLachlan JL (1991) Life-history of Gymnogongrus fucellatus (e. Ag.) J. Ag . (Rhodophyta, phyllophoraceae) from Chile. Bot Mar 34: 145-152 Lüning K (1993) Enviromental and internal control of seasonal growth in seaweeds. Hydrobiologia 260/61 : 1-14 Macler BA. Zupan JR (J 991) Physiological basis for the cultivation of the Gelidiaceace. Hydrobiologia 221 : 83-90. Provasoli L (1968) Media and prospects for the cultivation of marine algae. In Watanabe A, Hattori A (eds.) Cultures and collections ofalgae. Japanese Society ofPlant Physiologist. 6367 Ramus J (1990) A form-function analysis of photon capture for seaweeds. Hydrobiologia 204/205 : 65-71 18 Robaina RR (1988) Biotecnología del cultivo in vitro de algas rojas (Rhodophyta) de interés industrial. Doctoral thesis. UPC Robaina R.R García-Reina G. Luque A (1990 a) The effects ofthe physical characteristics of the culture medium on the development of red seaweeds in tissue culture. Hydrobiologia 2041205: 137-142 Robaina R.R. García P. García-Reina G. Luque A (1990 b) Morphogenic effect of glycerol on tissue cultures ofthe red seaweed Grateloupia doryphora. J Appl Phycol2: 137-143 Robaina RR. García-Jiménez P. Luque A (1996) Ligth and glycerol driven development of Grateloupia doryphora (Rhodophyta) in vitro. Sci Mar 60 (1) : 283-289 Salisbury FB (1991) Systéme Intemationale: The use of SI units in plant physiology. J Plant Physiol 139: 1-7 Walker D (1987) The use of the oxygen electrode and fluorescence probes In simple measurements of photosynthesis. University of Sheffield, South y orks. U.K. y okoya N. OLiveira E (1993) Effects of temperature and salinity on spore germination and sporeling development in south american agarophytes (Rhodophyta). Jpn J Phycol 41 : 283293 19 6. Tablas y Figuras. Figura 2. Peso fresco frente al tiempo durante 80 días de cultivo de los sporelings (la ecuación se obtuvo ajustando el peso fresco (x) frente al tiempo (y) con datos de 8 replicados, donde a, b, c y d son constantes). Rodrigo and Robaina Marine Blology 1997. 2 ,-------- ------¡-- -- - - - - , - - - - -- - - - , - - -- y = a + b4n/(1 +n)2 n =e (-(x-c)/d) 8=-0_07 b=1 _57 c=89_32 d=18 _61 • .a. • • 1/ • ..-1 : :. .I Stage 11 : 1 • •• • ••• ,....-¡• . . y. Stage 111 =0.94 ~ r-------, • ~./. ' ¡: ••• :I .... . ••• • - I• i• • • e! :•. ,..:- r l )/~.:r Stage I o ~___=__ o ...-«" _______ _______ I.. _ _ 20 __ __ I _ l __ __ 40 __'_ 60 _ _ ___'__ 80 Time (days) ____' Tabla 1. Efecto de los reguladores de crecimiento en los germlings de Grateloupia doryphora en presencia-ausencia del glicerol. Reguladores 2,4-0 lO 3 M Spm 10- 3 M 2,4-0 lO -3M Spm 10- 3 M +0 .1 M glicerol Efecto moñogenético Callo Indice de crecimiento de masa (mm) In dice moñogenético 0.5±O.15 -------- (yemas por eerrnlill2) Masas celulares 1.18±O.21 18.5±2 .20 Emisión de yemas ------------ 23 .5±4.68 Otros reguladores probados: BA, KIN, GA, Put, Spd (lO -6 Y 10-3 M) Control: 0.1 M glicerol 0.72 ± 0.08 indice de crecimiento ;9.83 ± 1.25 indice morfogenético. Tabla 2. Grateloupia doryphora. clorofila Concentración (medias ± SE de 6 replicados) de ª, R-ficoeritrina (RPE) y R-ficocianina (RPC) (Ilg pigmento mg- I (Comparación estadística de la media entre el Estadío I y III : *** ~ ~ 0.001). Estadío Clorofila a I RPC RPE 70 1O-3±4.25 10-3 4.69 1O-3±0.327 10-3 111 (U.) ( ... ) 7.31 1O-4±3 .27 104 ( ... ) peso seco). Fig. 3 Curvas P-I de los Estadíos I y 111 (medias ± SE de 6 replicados) . 500 -~--------------------------------------~ 400 - 300 T""" I el E N O O 200 - ~ C/) C/) ID ...... e Estadía 111 100 - C/) O ...... o ~ • u. . • •••••••• • • . . • . . • . •...• • ~ : O - ~:'-- - --• .~i~.-'~---------------------- 'I.···~ . ...•.. ~ -100 -~-----~I-----~I-----~I-----I~-----I~----~ O 50 100 150 200 250 300 Tabla 3.a . . Grateloupia doryphora. Parámetros fotosintéticos (medias ± SE de 6 l experimentos replicados) P max (Jlmol O2 liberado mil clorofila h- ), alfa ( Jlmol O2 mg-l clorofila h- l Jlmor l fotón m2 S-I) y Ita (Jlmol O liberado mg- I clorofila h- l ) para ª ª 2 ª el Estadío 1 (sporelings). Las condiciones control fueron 20 oC , 35%0 S (1.1 osmol kg} (Comparación estadística de la media : * :e ~ 0.05). Tratamiento P max alfa Control 404.0± 47.1 os 3.68± 0.55 360.3± 70.9 os 4.54± 0.66 os -23 .8± 13.33 os 424.8± 102.0 os 4.85± 1.26 os -42.2± 14.41 os 18 %0 S 398 .0± 78 .2 os 3.68± 0.55 -20.7± 10.89 ns 65 %0 S 264.3± 10.0' 3.25± 0.46 • os os -41.7± 9.51 -18 .7± 5.45 os os Tabla 3 b. Grateloupia doryphora. Parámetros fotosintéticos (medias ± SE de 6 ª I I experimentos replicados) P max (Ilmol O2 liberado mg- clorofila h- ) , alfa ( Ilmol O2 mg-I clorofila h-lllmor l fotón m2 S- I) y RI (Ilmol O 2 liberado I)1g-1 clorofila h-I ) para ª ª el Estadío III (talo adulto) . Las condiciones control fueron 20 oC , 35%0 S (1.1 osmol kg} (Comparación estadística de la media : * 0.01 > ~ < 0.05). Tratamiento Pmax alfa Control 64.8± 1.9 os 0.99± 0.08 os -84.7± 11.5 os 25 oC 37.2± 7.0 ** 1.1O± 0.40 os -89.5± 26.7 os 30 oC 18.8± 6.0 ** 0.60± 0.33 os -36 .7± 6.3 ** 18 %0 S 36.0± 7.2** 1.08± 0.32 os -90.0± 11.0 os 65 %0 S 171.7±41.7 * 1.76± 0.17 * -117.6± 12.4 os 26 7. Publicaciones. Mari ne Biology ( 1997) 128: 689- 694 © Springer-Verlag 1997 M. Rodrigo . R. R. Robaina Stress tolerance of photosynthesis in sporelings of the red alga Grateloupia doryphora compared to that of Stage 111 thalli Received: 21 October 1996 I Accepted: 5 February 1997 Abstract More experimental evidence is needed to understand the role of propagules in macroalgal biology. There are no reports in the literature on the comparative physiology (e.g. photosynthesis) of sporelings and adults. In this paper we report on the variation in photosynthetic parameters (maximum photosynthesis, Pmax , and efficiency, alpha, and dark respiration (Rd) of cultivated young sporelings of the red alga Grateloupia doryphora (Montagne) Howe under normal conditions and after a short-term incubation at different salinities and temperatures. The results are compared to those for adult Stage 111 thalli obtained in laboratory culture from the same population of sporelings. The pigment composition of sporelings (more chlorophyll a and les s phycoerthryn and phycocyanin than adults) promotes a better photosynthetic performance (higher Pmax and alpha and lower Rd) under chlorophyll a excitation . The younger sporelings were also more ·tolerant to variations in salinity and temperature than Stage 111, in which the highest variation in maximum photosynthesis and dark respiration was observed. Inb'oduction More experimental evidence is needed to understand the role of propagules in macroalgal biology. The scarcity of knowledge in this field is documented in the reviews of Santelices (1990), Clayton (1992) and Fletcher and Callow (1992). The rapid acquisition by the spores of basic traits of plant physiology such as photosynthesis and respiration for growth and development, or a stress response, is of ecological relevance. It en sures their viability in situ and, Communicated by A. Rodríguez, Puerto Real M. Rodrigo · R.R. Robaina (18i) Departamento de Biologia. Uni versidad de Las Palmas de Gran Ca naria. Box 550. E- 350 17 Las Palmas. Canary Islands. Spai n consequently, the recruitment of new individuals or the establishment of new populations of the species (Amsler and Neushul 1991 ; Beach et al. 1995). Viability also increases and decreases in response to light, salinity and temperature variations (Lobban and Harrison 1994). This is pariicularly true for intertidal red algae inhabiting pools; these algae have large and nonmotile spores with a rather low dispersal capacity. Light, salinity and temperature effects on algal physiology have been extensively studied (Gatusso and Jaubert 1985; Smith and Berry 1986; Davison 1987, 1991 ; Zupan and West 1990; Davison et al. 1991 ; Henley 1992, 1993; Kübler and Davison 1993). These authors reported that maximum photosynthesis (Pmax) and dark respiration (R d ) increase as temperature increases, up to a tempera tu re limit after which both rates decrease. The photosynthetic efficiency (alpha) is sensitive, decreasing of increasing as a function of species and experimental conditions. The effects of hypo- or hypersaline shocks on the algal photosynthetic parameters Pmax and Rd are controversial, since these again vary according to the particular species treated, the rate and degree of the salinity increase or decrease, the time of incubation, etc. (Lapointe et al. 1984 and references therein; Smith and Berry 1986; Kirst 1989 and references therein). Adult thalli have been normally used for most experiments, and almost nothing is known about the younger stages of the algae . It is expected that physiological changes parallel morphological variations from the sporeling to the adult individual. Amsler and Neushul (1991) reported interspecific differences in the photosynthetic and respiratory capacity of recently liberated spores from kelp species. They monitored these and other physiological parameters under welldefined (fixed) enviromental conditions, but did not compare them with adult stages. Beach et al. (1995) reported higher photosynthetic rates and photosynthesis:respiration ratios in gametophytic thalli than in gametes of Ulvafasciata Delile and Enteromorphaflexuosa (Roth) J. Ag. 691 2,-------.-------,--------,-------,---, a y n =a + b4n/(1 +n)2 =e (-(x-e l/di Stage 111 ••• • ... . . • ....• . I ...,.¡ .. :. . ..• .••• .i ¡2 = 0.94 = 0.07 b = 1.57 e = 89.32 d = 18.61 a t I • 1 , 1: . ·1 •.. l·. ..I ,• .. r' r·t . I • ,., • I I I I Pigments. light and photosynthesis The spectrophotometrical quantification of pigments revealed marked differences between the stages (Table 1). The principal photosynthetic pigment, chlorophyll a. was present in higher concentrations in the sporelings than in the older Stage In cultures. In contrast, the latter contained larger amounts of the accesory phycoerythrin and phycocyanin pigments. The photosynthetic rates of Stages I and III within the tested range of PFD are shown in Fig. 2. Stage I displayed a better photosynthetic performance than Stage I1I, with higher values of Pmax and alpha. Values of Rd up to 130% of the net Pmax were observed in Stage nI cultures . . I .: 40 60 80 Photosynthetic performance, salinity and temperature Time (days) Table 2 shows the mean Pmax , alpha and Rd for Stage I cultures after the various salinity and temperature treatments. No significant differences were observed between control conditions and the 25 and 30 oC treatments nor between controls and the lowest salinity (l8:Yoo S) conditions. Only the hypersaline treatments appeared to alter the photosynthetic parameter, significantly reducing Pmax , alpha and Rd compared to controls. Stage nI was more sensitive to salinity and temperature changes (Table 3). AH treatments significantly reduced Pmax , except the hypersaline-shock treatment which increased it. Alpha increased significantly only in the hypersaline-shock treatment. Rd decreased significantly at 30 oc. Table 4 compares the components of the variability of the photosynthetic parameters (Cochran's test of heterogeneity of variance) within each stage in aH salinity and temperature treatments. In Stage 1, Pmax varied similarly in aH treatments, although it was somewhat higher at 30 oc. In contrast, significant differences (P < 0.01) were observed for Stage lB. The hypersaline treatments accounted for 92% of the total variability for Stage III. Alpha varied significantly between treatments in Stage 1, with 60% of the total variability in the 30 oC treatment. In Stage BI no significant difference was observed for alpha. Here also, temperature treatment was responsible for most variability (44% at 25 oC) . For Rd , variability of Stage I was not significantly different, but Stage III displayed significant differences. with 65% of total variability in the 25 oC treatment. Fig. I Grareloupia dor.~p/¡ora . a Fresh weight as a function of time over 80 d in culture of sporelings [equation was obtained by fitting fresh weight (y) versus time (x) with data from 18 replicates. where a. b. c. d are constants]: b Stage 1; c Stage JII 693 Table 4 Grareloupia dorvplw ra. Photosynthetic parameters (percentage of total variance in all treatments within each Stage). Control conditions were 35%, S ( l.l osmol kg-l) and 20 oC Trea tment Control 18:Yoo S 65:Yoo S 25 oC 30 oC Statistical difference Pmax Rd C! Stage I Stage III Stage 1 Stage III Stage I Stage III 9 26 O 21 44 O 3 92 3 2 7 lO 7 15 61 3 22 6 44 24 14 19 5 28 33 12 9 II 65 3 NS ** ** NS NS ** The differences in the mean values for the photosynthetic parameters of Stages I and 111 shown in Fig. 2 were maintained throughout all the salinity and temperature regimes tested (Tables 2 and 3). Further analysis revealed that: (i) the particular salinity or temperature treatments that changed photosynthetic performance in both stages were different (statistical comparison of the mean. Tables 2 and 3); (ii) the variability caused by all treatments was higher in Stage III than Stage I (heterogeneity of variance. Table 4). Regarding (i), only hypersaline shock affected both stages. Pmax , alpha and Rd decreased in Stage I but in. creased in Stage 111. Changes in salinity affect physiological responses (Lapointe et al. 1984 and references therein; Smi th and Berry 1986; Kirst 1989 and references therein), but it is difficult to explain such different responses in two stages of the same species. There is no data in the literature on intraspecific variation in physiological rates. In Stage III, Pmax was significantly affected by all the conditions tested and Rd was affected by a temperature of 30 oC only (Table ~) . Several authors (Gatusso and Jaubert 1985; Smith and Berry 1986; Kübler and Davison 1993) have reported an upper limit (threshold) aboye which a further temperature increase would result in a decrease in Pmax ' This may be 25 oC for Stage 111 samples of Grateloupia doryphora, although higher limits (i.e. 35 oC) ha ve been reported for other algal species. The same appears to be true for Rd when temperature increases over 25 oc. An analysis of the heterogeneity of the variance was employed in this study since this measures the heterogeneity of the changes produced by all the treatments. As shown in Table 4, the heterogenity of the variance was higher for Stage III than for Stage 1. It is concluded that the Stage J cultures did not vary between treatments, except for the 65 ~oo S treatment (Table 3), and their responses were homogeneous (Table 4). They tolerated changes in salinity and temperature better than Stage III . In conclusion. several important differences have been found between the photophysiology of young sporelings (here called Stage 1) and adult thalli (Stage III ) of Grateloupia doryphora. The pigment composition of sporelings (more chlorophyll a and less RPE and RPC than adults) promotes a better photosynthetic performance under chlorophyll a excitation. Unexpectedly, the younger sporelings were also more tolerant to variations in salinity and tempera tu re than Stage 111 - in which the highest variation in mean photosynthetic performance (Pmax and Rd ) was observed . Acknowledgements This work was supported by the Government of Canary Islands (Grant # 154/93). The fellowship of the University of Las Palmas G .c. to M .R. is also acknowledged . References Amsler CD, Neushul M (1991) Photosynthetic physiology and chemical composition of spores of the kelp Macrocysris pyrifera, Nereocysris luerkeana. Laminaria far lo wii and Prerygoplwra californica (Pheophyceae). J Phycol 27 : 26-34 Beach KS. Smith CM, Michael T. Shin H-W (1995) Photosynthesis in reproductive unicells of Ulva fasciara and Enreromorpha flex uosa: implications for ecological success. Mar Ecol Prog Ser 125: 229-237 Beer S. Eshel A ( 1985) Detennining phycoerythrin and phycocyanin concentrations in squeous crude extracts of red algae. Aust J mar Freshwat Res 36: 785-792 Clayton MN (1992) Propagules of marine macroalgae: structure and development. Br phycol J 27: 219-232 Davison IR (1987) Adaptation of photosynthesis in Laminaria saccharina (Phaeophyta) to changes in grown temperature. J Phycol 23: 273-283 Davison IR (1991) Environmental effects on algal phytosynthesis: temperature. J Phycol 27: 2-8 Davison IR, Greene RM , Podolek EJ (1991) Temperature acclimatation of respiration and photosynthesis in the brown alga Laminaria saccharina. Mar Biol 110: 449-454 Fletcher RL, Callow ME ( 1992) The settlement. attachment and establishment of marine algal spores. Br phycol J 27: 303-329 Gantt E (1981) Phycobilisome. A Rev PI Physiol 28: 335-377 Gatusso JP, Jaubert J ( 1985) Photosynthesis and respiration of Caulerpa racemosa (Chloroph yceae. Caulerpales) grown in aquaria: effects of Iight and temperature . Bota nica mar 28 : 327332 Glazer A (1984) Phycobilisome. A supramolecular complex optimized for Iight energy transfer. Biochim biophys Acta 768: 29-5 1 Henley WJ ( 1992) Growth and photosynthesis of Ulva rorundara (Chlorophyta) as a function of temperature and square wave irradiance in indoor culture. J Phycol 28: 625-634 Henley WJ (1993) Measurement and interpretation of photosynthetic Iight-response curves in alga in the context of photoinhibition and diel changes. J Phycol 29: 729-739 Kirst GO ( 1989) Salinity tolerance of eukaryotic ma rine algae . A Rev PI Physiol (PI molec Biol) 40: 21-53 Kübler JE, Davison IR (1993) High-temperature tolerance of photosynthesis in the red a lgae Chondrus crispus. Mar Biol 11 7: 327-335 Lapointe BE. Rice DL. Lawrence JM ( 1984) Response of photosynthesis. respiration growth and cellular constituents to hypo- Editor B A Whltton Departmen t of Blological Sciences UnlverSlt y of Durham Durham . DH1 3L E. U.K. Tel. (0191 ) 374-2427 Fax . (0191 ) 386-0619 E·mail : BA-WH ITTON @DURHAM .AC .UK Dra P. Garcia-Jimenez Departamento de Biologia Universidad de Las Palmas G.c. Campus de Tafira 35017 Las Palmas G.c. Canary Islands 6 June 1997 Dear Dra Garcia-Jimenez, Thank:s for your paper , "Plant growth regulators and glycerol induced cell growth and morphogenesis in carpospore-seedlings cultivated in vitro" submitted to Journal of Applied Phycology (provisional number BJ 774). (The paper has only just arrived - presumably taking three weeks to get here!) 1 have forwarded copies to two reviewers and will contact you as soon as 1 get their responses ; 1 hope this will be within a month. Yours sincerely, : ~ B. A. Whitton AN INTER NAT IONAL JOU RNAL PUBLlSHED BY KLUWER ACADEM IC PUBLl SHERS I e ,,: - JAP '1 ! 1 l. OC • . ' . . . .... . 'Y ::. . h • • " ' .' '" J • • \i . ¡ · h ••: : i . ' · . .qJ J :" f •• ' I -¡.. 63 ~ 2 5.: Ema l1 RENE M US e. ....,,:. .. . . Plant growth regulators and glycerol induced cell growth and morphogenesis in carposp seedlings cultivated in vitro. Pilar Garcia-Jimenez, Marta Rodrigo & Rafael R. Rohaina (*) Departmento de Biología. Universidad de Las Palmas G.c. Campus de Tafira. 35017 Las Palmas G.c. Canary Islands. Keywords : carpospore-seedling., celI and tissue culture, glycerol, Grateloupia doryphora, macro alga, PGR' s, Rhodophyta. (*) to whom correspondence should be addressed. Abstract Effects of different plant growth regulators and glycerol as a carbon so urce were studied on axenic culture of carpospore-seedlings of Grateloupia doryphora. Carpospore-seedlings showed particular forms of cell proliferation at the light rnicroscopicallevel, originating shoot ernission, calli and organized cell masses in order to PGR' s used. When PGR' s were combined with glycerol, the rate growth , cell division and further morphogenesis were stimulated . lntroduction As stated by Gibor (1980), it was late 70 ' s since cell and tissue culture joined the laboratory techniques applied to propagate algae for biotechnological purposes. Many species have been tested, being the explant or callus culture focused on efforts made to clone macroalgae (Fig. 1). Cell cultures could be exploited, not only as a source of organized plant biomass (i.e. regenerating callus) but also as a direct source of interesting compounds known or suspected to accumulate in algae (Fig.l). In this approach, it does not matter the source of cells used to obtain the heterotrophyc and fast growing cellular cultures if their growth, development and production of interesting compounds were under control. Still, the fine control of growth and development in vitro is lacking. Plant growth regulators (PGR's) and carbon sources have been seldom found to induce growth and development of algae in axenic culture (Gusev el al. , 1987; Aguirre-Lipperheide el al., 1995). Cytokinins, gibberellins and auxins have been identified and characterized to operate endogenously in macroalgae (Bradley, 1991 ; Evans & Trewavas, 1991). Difficulties connected with specific culture conditions, size or age of plant material can mislead the evaluation, the effect of exogenous PGR ' s in algal cell and tissue culture remain, at least, controversial. Several plant growth regulators have been tested with no success on explants (i.e. Laurencia, Gelidium, Gracilaria and Grateloupia , Robaina, 1988 as own experience). When proved to be effective, it is scarce a precise description ofthe structure induced (i.e. cell arrangement), more important than the effect ofthe PGR' s by itself, as it can make the difference with callus and callus-like structures obtained without PGR' s. Phenolic compounds (Fries, 1976, 1977), or the physical culture conditions (i.e. agarized versus liquid medium) exhibited positively stimulatory effects on growth and development in a wide variety of algae cultivated and propagated in vitro. Callus and callus-like structures were induced by increasing the agar concentration ofthe culture medium (Polne-Fuller & Gibor, 1987; Robaina el al. , 1990a, 1990b; Robaina el al., 1992). Searching for carbon sources, heterotrophic activity in macro alga have been reported in a few scattered references (Neilson & Lewin, 1974; Markager & Sand-Jensen, 1990). We have reported that glycerol as an extemal organic substrate stimulated vegetative growth and shoot emission in explants and carpospore-seedlings of Graleloupia doryphora (Montagne) Howe cultured in vitro (Robaina el al. , 1990a, 1990b). Besides it altered respiratory and photosynthetic performance and induced cell division and biosynthesis (Robaina el al., 1995 ; Robaina el al., 1996; Garcia-Jimenez el al. , 1996) . Seedlings have not been used as material to start cell cultures in macroalgae. The lack ofaxenic cultures could prevent it in most cases. The combined effect of carbon sources and plant growth regulators on the pattern followed by the cells to became callus or shoots have not been well established. In this work, carpospore-seedlings ofthe carragenophytic red algae Graleloupia doryphora were aseptically cultivated in media containing glycerol and plant growth regulators. We focus on the identification and precise microscopical description of cell growth and morphogenesis of carpospore-seedling induced by a particular concentration of glycerol and a regulator instead of non-completely defined morphological changes promoted by complex PGR's balances and glycerol mixtures. We hypothesized that carpospore-seedlings could be a source for cell culture of macroalgae if an appropiate combination of glycerol as carbon source and plant growth regulator is encountered. Material & methods Culture conditions. Thalli of Graleloupia doryphora (Sheet 129 ofthe LPA herbarium) were collected in the upper and middle part ofthe littoral zone in Gran Canaria (Canary Islands). Fertile material containing cystocarps were cut in 3 mm diameter and desinfected according to the methods previously described (Robaina el al. , 1990a, 1990b). Sterile and fertile discs fragments were then cultured in agarised Provasoli Enriched Seawater (PES, Provasoli, 1968) during 1 month until carpospores were liberated (Garcia-Jimenez, 1994). Culture conditions were 30 ~ m- 2 s-¡ light intensity from cool white fluorescent lamps (Sylvania grolux) at the leve! ofPetri dishes, 17 "2 lC temperature and on a 18 :6 h light: dark cycle. Four stages could be distinguished during in vitro propagation ofthe carpospores (Rodrigo & Robaina, 1997): stage O matched seedlings over aseptic explants (30 days old) and culture medium. Stage 1 corresponded to gerrnlings transferred to Petri dishes with autoclavated liquid PES medium. Stage n and nI belonged to plants growing in aireated liquid PES cultivated in Pyrex botdes. Pre!irninary experiments had shown that plant growth regulators were ineffective or even inhibitory from stage 1 to stage nI. AlI experiments were carried out with stage O carpospore-seedlings. Base culture medium was solidified (0.8% agar) PES (Provasoli, 1968). Glycerol-containing media were prepared with an enriched seawater medium based on PES which was supplemented with 0.1 M of glycerol + 0.8 % agar (PES90-glycerol, Robaina el al., 1990a, 1990b, 1995), and made by dilution ofthe seawater with distilled water (90% seawater) to reach 1 Osmol kg-¡ and to stimate the combinated effect of glycerol and PGR. The osmolality was checked in an Autostat TM osmometer (Daiichi kogaku Co. Ltd., Tokyo, Japan). PGR' s were individually added to autoclavated PES or PES90-glycerol as filter-sterilized stock solutions of cytokinins benzylarninopurine (BA) and kinetin (Kin); gibberellins as gibberellic acid (GA); auxins as 2,4 dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) and polyarnines putrescine (Put), sperrnine (Spm) and 3 Sperrnidine (Spd) at final concentrations of 10- M and 10-6 M in the medium. AlI chemicals were from Sigma Chernical Company. The seedlings (12 to 20 per petri dish, c.a 45 per treatment) were recultured each 15 days (3 recultures) . The experiments were repeated twice with three replicates of each treatment. To ensure that results were caused by the addition ofPGRs, control assays with PES, PES + PGR 's and PES90-glycerol without PGR 's were run simultaneously. Three specimens from each treatment were fixed with 2.5% glutaraldehyde in 0.1 M sodium cacodylate buffer containing 0.3 M NaCl (pH 7.4) for 4 hours at room temperature. This was followed by washing in the same buffer containing 0.3 M NaCI (2 x 30 minutes) and embedded in glycol metacrylate (GMA, Historesin TM, Reichert-Jung, Gerrids & Smid, 1983). Serial sections of 5 I-lm thick, cut on a Reichert-Jung 2050 microtome and stained for the observation of general morphology with toluidin blue and haematoxylin-eosin (Tsekos, 1983). Indeces and statistics The induction of callus, cell mas s and/or shoot emission was followed in each treatment. To check whether the effect of a particular PGR contributes further to that of glycerol (cell mas ses and shoot emission) (Robaina et al. , 1990a, 1990b; Garcia-Jimenez et al. , 1996), two quantitive indeces were used: mas s growth index (MG) = diameter ofthe cell mas s in mm as determined by using an electronic caliper (Mitutoyo Digimatic Caliper, Mitutoyo Co.); morphogenic index (MI): the number of protrussions or shoots regenerated per seedling (Robaina et al. , 1990a, 1990b; Robaina et al. , 1992). Mean values ofthe index in the different treatments were compared to control (pES90-glycerol) by using mean comparison ofthe statistical software SPSS 5.1. Results In PES, and in most of the control treatments with PGR ' s without glycerol (Table 1), the carpospore-seedlings became a sporeling by regenerating shoots in two weeks (Fig. 2a). Compact medulla and cortex were observed initially at the light microscopical level (Fig. 2b). Shoot started as a small protrussion on a restricted zone of the carpospore-seedling (Fig. 2c), which elongated to became a shoot with medullary and cortical cell layers well defined (Fig. 6 2d) . As shown in Table 1, shoot formation was also observed in treatments at 10- M 2,4-0 6 3 3 and BA so as at both concentrations tested of GA. BA 10- M and Kin 10- and 10- M were inhibitory as the seedling did not develop further. 3 6 3 Calli were observed in 2,4-D at 10- M and Spm at 10- M and 10- M respectively (Table 1, Fig. 3a). Calli extended from the surface ofthe seedling as a disorganized mas s of tissue to cover almost enterely. At the rnicroscopicallevel , it was observed that disorganized dense cellular mass formed the calli (Figs. 3b, c) . Cell masses, which are typical of seedlings grown in glycerol, were also observed in the treatments with Put and Spd alone (Table 1, Fig. 4a). Cell mas ses were produced by multiple cells which were rapidly arranged in concentric and compact position to a clump center (Fig. 4b). Then, protrussions commenced to proliferate and were constituted by rows of small and rounded cells aligned with the medulla (inner cells) ofthe carpospore-seedling (Fig. 4c). In Table 2 shown the quantification of cell growth and morphogenesis resulting from the combination of the carbon source (glycerol) and PGR. Since glycerol was included in the medium, all of the treatments stimulated or enhanced cell growth and morphogenesis as indicated by the values ofthe index MG and MI obtained obtained in all treatments (except those inhibitory) compared to the average values ofthe control s (Tab. 1). Glycerol prevented 6 the inhibitory effect at 10- M ofKin and the formation of calli observed when Spm and 2,4D were used alone (described aboye). Outstanding results were obtained with glycerol plus polyarnines (Table 2) : cell growth (MG) increased due to cell division and cell masses became even more morphogenic (MI) in treatments with Put, Spd and Spm. Discussion There are no doubt that plant growth regulators exist and participate in algal processes analogous to that occurring in higher plants (Featonby-Srnith & Van Staden, 1984; Bradley, 1991 ; Bradley & Cheney, 1990; Evans & Trewavas, 1991 ; de Nys et al., 1991), but when applied exogenously, procedures did not establish unequivocally what effects are originated by these, natural and synthetic, growth substances. Recent literature reports plant growth regulator effect on in vitro cultivated macro alga that made posible to induce and maintain callus, free cell cultures or regenerate new plants (Bradley & Cheney, 1990; Kaczyna & Megnet, 1993 ; Aguirre-Lipperheide et al. , 1995 and references therein; Yokoya & Handro, 1996). However negative test or the same results (callus, callus-like induction and/or regeneration) were obtained without the addition ofplant growth regulators (Dawes & Koch, 1991 ; Robaina et al., 1992; Aguirre-Lipperheide et al. , 1995 and references therein) . On the other hand, it has been reported for the same specie and the same treatments that differences in explant originated differences in the results obtained (Bradley & Cheney, 1990). Or that, despite simultaneous alteration of physical conditions were requiered in the PGRs containing medium (i .e. air exposition in Gracilaria, Kaczyna & Megnet, 1993 or osmolality not fullcontrolled, Gusev et al. , 1987), the effect was only considered to be due to the PGR 's added . Consequently, we can not ensure a priori whether a particular specie reacts to PGR's or if the PGR's are strictly necessary to obtain that response. The results obtained in this work with carpospore-seedlings could shed sorne light on the controversy. The results in table 1 and 2 show that al! PGR' s tested clearly influenced cell 3 division and/or morphogenesis. An inhibitory effect was seen for the citoquinins: Kin at 10- M 6 6 and 10- M were inhibitory when tested alone but induced cell division at 10- M when combined with glycerol. BA was inhibitory to the higher concentration, both alone and with glycerol (Tab. 1, 2). The synthetic auxin 2,4-D contributed to in crease the cell growth and morphogenesis. Effects promoted by polyarnines will be discussed below. From our experience no carbon source, even the effective glycerol, have had effect on seedlings or explants of G. doryphora at concentration below 0.1 M (Robaina et al. , 1990a, 1990b). Consequently the effect ofPGR as a carbon source is unlikely. Neither none ofthe effects of PGR ' s observed can be related to agar concentratíon, which was constant, or to osmolality which was also controlled. As early as 1982 Trevawas pointed out that considerations should be given to the actual sensitivity oftissues to growth substances. Previous experience showed us that explant cultures of Graleloupia doryphora did not react to any auxin, cytoquinin or other PGR ' s added to the culture medium . Even the so young Stage 1 of carpospore cultures of Grateloupia doryphora obtained from the Stage O (carpospore-seedling) was "insensitive": the effects ofthe PGR' s was only observed in the remaining tissue ofthe former Stage O. The seedling seems to be more sensitive to PGR ' s than the explants of G. doryphora. This is most probably due to its potential for growth and deve!opment, and it must be exploited as a plant material for cell cultures, Outstanding results were those obtained with the polyamines putrescine, spermidine and spermine. When Put and Spd were tested alone, the carpospore-seedling became cell masses with a cellular arrangement similar to that previously described in glycerol (Garcia-Jimenez el al., 1996). Polyamines also enhanced and accelerated the effects of glycerol i.e. cell mass induction and further shoot regeneration when they were combined as shown in table 3. Polyamines are metabolic products of descarboxilation of the aminoacids ornithine and arginine giving putrescine which is the precursor ofthe triamine spermidine and the tetraamine spermine (Smith, 1985). Their respective concentration produced a range of effects in higher plants comparable to that ofthe well known groups ofplant hormones (Galston & KaurSawhney, 1982; Smith, 1982 and references therein, 1985 ; Tiburcio el al. , 1993). To our knowledge, this is the first work reporting its activity in seaweeds. In this work we focused on the effects ofPGR' s when tested separate or in combination with glycerol. The combination of different PGR and balances of polyamines with glycerol must be explore. Tissue culture is normally understood as a tool to induce cells culture and its propagation. Suitable culture conditions and the controlled use of plant growth substances for calli induction and/or morphogenic effect are two main trends for the continuous advance in this fie!d . Considering this and results in tables 1 and 2 and cell arrangement observed at the microscopical leve!, it is concluded that the carpospore-seedling reacted to plant growth regulators as summarize in table 3. To our knowledge, this is the first work reporting to plant growth regulators positive effects on young stages of development (carpospore-seedling) of a macroalgae. References Aguirre-Lipperheide M, Estrada-Rodriguez FJ, Evans LV (1995) Facts, problems and needs in seaweed tissue culture: an appraisal. 1. Phycol. 31 : 677-688 . Bradley PM (1991) Plant hormones do have a role in controlling growth and development of algae. 1. Phycol. 27 : 317-321. Bradley PM, Cheney DP (1990) Sorne effects of plant growth regulators on tissue cultures of the marine red alga Agardhiella subu/ata (Gigartinales, Rhodophyta). Hydrobiologia 2041205: 353-360. Dawes CJ, Koch EM (1990) Physiological responses ofthe red algae Gracilaria verrucosa and G. tikvahiae before and after nutrient enrichment. Bull. Marine Science. 46(2) : 335-344 . de Nys R, Jame son PE, Brown MT (1991) The influence of cytokinins on the growth of Macrocystis pyrifera. Bol. Mar. 34: 465-467. Evans LV, Trewavas AJ (1991) Is algal development controlled by plant growth substances? 1. Phycol. 27 : 322-326. Featonby-Smith Be, Van Staden J (1984). ldentification and seasonal variation of endogenous cytokinins in Eck/onia maxima Bol. Mar. 27 : 527-531 . Fries L (1976) p-Hydroxyphenylacetic acid and other phenolic compounds as growth stimulators ofthe red alga Porphyra tenera. Plant science letters. 6: 299-307. Fries L (1977). Growth regulating effects of phenylacetic acid and p-hydroxyphenylacetic acid on Fucus spiralis in axenic culture. Phycologia 16: 451-455 . Galston AW, Kaur-Sawhney R (1982) Polyamines: are they a new c1ass ofplant growth regulators . In Wareing PF (ed.), Plant growth regulators. Academic Press, 451-461. Garcia-Jimenez P (1994). Aclimatacion reproductiva, fisiologica y estructural al cultivo in vitro del alga roja Gratelollpia doryphora. Doctoral thesis. u.L.P.G .c. Garcia-Jimenez P, Robaina RR, Luque A, Tsekos 1 (1996) Glycerol activated cellular division and biosynthetic activity during growth and morphogenesis of carpospore seedlings of Gratelollpia doryphora (Cryptonemiales, Rhodophyta). Phycologia 35(3): 261-269 . . Gerrids PO, Srnid L (1983) A new les s toxic polimerization system for the embedding of soft tissue in glycol metracrylate and subsequent preparating of serial sections. J. Microscopy 132 : 81-85 . Gibor A (1980) Studies on vegetative propagation ofbenthic marine algae. In Abott lA, Foster M, Eklund LF (eds). Calif. Sea Grant ColI. Pro. 142-156. Gusev MV, Tambiev AH, Kirikova NN, Shelyastina NN, Aslanyan RR (1987) Callus formation in seven species ofagarophyte marine algae. Marine Biology 95: 593-597 . Kaczyna F, Megnet R (1993) The effects of glycerol and plant growth regulators on Gracilaria verrllcosa (Gigartinales, Rhodophyta) . Hydrobiologia 268 : 57-64. Lobban CS, Harrison PJ (1994) Seaweed mariculture. In Seaweed ecology and physiology. Cambridge University Press. 283-297. Markager S, Sand-Jensen K (1990) Heterotrophic growth of Ulva lactllca (Chlorophyceae). J. Phycol. 26: 670-673. Mooney PA, Van Staden J (1986) Algae and cytokinins. J. Plant Physiol. 123 : 1-21. Neilson AH, Lewin RA (1974) The uptake and utilization of organic carbon by algae: an essay in comparative biochernistry. Phycologia 13(3): 227-264. Polne-Fuller M, Gibor A (1987) Calluses and callus like growth in seaweeds: induction and culture. Hydrobiologia 151/152: 131-138. Provasoli L (1968) Media and prospects for the cultivation of marine algae. In Watanabe A, Hattori A (eds.) Cultures and collections ofalgae. Japanese society ofplant physiologist. 6367 . Robaina RR (1988) Biotecnología del cultivo in vitro de algas rojas (Rhodophyta) de interes industrial. Doctoral thesis. u.P .e. Robaina RR, Garcia-Reina G, Luque A (1990a) The effects ofthe physical characteristics of the culture medium on the development of red seaweeds in tissue culture. Hydrobiologia 2041205 : 137-142. Robaina RR, Garcia P, Garcia-Reina G, Luque A (1990b) Morphogenic effect of glycerol on tissue cultures ofthe red seaweed Grateloupia doryphora. 1. Applied ofPhycology 2: 137143 . Robaina RR, Garcia-Jimenez P, Luque A (1992) The growth pattern and structure of callus from the red alga Laurencia sp. (Rhodophyta, Cerarniales) compared to shoot regeneration. Bo1. Mar. 35: 267-272. Robaina RR, Garcia-Jimenez P, Brito 1, Luque A (1995) Light control ofthe respiration of exogenous glycerol by the red macro alga Grateloupia doryphora. Eur. J. Phycol. 30: 81-86. Robaina RR, Garcia-Jimenez P, Luque A (1996) Light and glycerol driven development of Grateloupia doryphora (Rhodophyta) in vitro. Scientia marina 60 : 283-289. Rodrigo M, Robaina RR (1997) Stress tolerance of photosynthesis in sporelings of red alga Grateloupia doryphora as compared to that of stage lIT thalli. Mar. Biol. in press. Smith TA (1982) The function and metabolism of polyarnines in higher plants. In Wareing P.F. (ed.) Plant growth regulators. Academic Press, 463-472 Smith TA (1985) Polyamines. Ann . Rev. Plant Physiol. 36: 117-143 . Tiburcio AF, Campos JL, Figueras X, Besford RT (1993) Recent advances in the understanding of polyamine functions during plant development. Plant growth regulation 12: 331-340 . Trevawas Al (1982) Growth substance sensitivity: the limiting factor in plant development. Physiol. Plant. 55: 60-72. Tsekos 1 (1983) The ultrastructure ofcarposporogenesis in Gigartina teedii (gigartinales, Rhodophyceae) : gonimoblast cells and carpospores. Flora 174: 191-211. y okoya NS, Handro W (1996) Effects of auxins and cytokinins on tissue culture of Grateloupia dichotoma (Gigartinales, Rhodophyta). Hydrobiologia 326/327: 393-400 . Table 1. Effects ofPGR 's on carpospore-seedlings ofGrateloupia dOlyphora : organized or disorgaruzed cell growth. Significant differences could not be detected among treatments with the same effect; shoot errussion ranged within 1. 70 to 6.83 shoot per morphogeruc seedling and callus reached 0.5O "O. 15 of the cell mass diammeter (mm) in 2,4-D 10-3 M as the maximum value. None (PES) 2,4-D shoot shoot callus BA shoot shoot inhibitory Kin shoot inhibitory inhibitory GA shoot shoot shoot Put shoot cell masses cell masses Spd shoot cell masses cell masses Spm shoot callus callus Table 2. Effect ofPGR 's on carpospore-seedlings of Grateloupia doryphora when combined with glycerol. Values ofthe indeces ofgrowth (MG = diarnmeter ofthe cell mas s in mm) and morphogenesis (MI = shoots per morphogenic seedling). Medium control was PES90glycerol. Data are the mean (SE) from two experiments with three replicates each .. (*) = P <0.001 as compared to control. n.m = Non morphogenic. Inh.= carpospore-seddling looked the same as the beginning ot the experiment. Growth Morphogenesis (MG) (MI) None Control 2,4-D BA 10-6M 10-3 M 0.72 9.83 (0.08) (1.25) 0.90 • 1.36 • 10-6 M 10-3 M 9.5 23 .5 · (0.15) (0.31) (4 .34) (4.68) 0.75 inh . 10 inh. (0.13) Kin None 0.72 (4.9) inh. n.m inh. 0.74 0.64 n.m n.m (0.07) (0.05) 0.63 0.91 n.m 14.7 (0.10) (0.15) (0.09) GA Put Spd 1.05 • (0 .32) Spm 1.21 • (0.17) • (4.65) • 0.83 16 (0.13) (3 .51 ) 1.18 • (0.21) • 18 • (4.14) 12 • (1.86) • 18.5 (2.20) Table 3.- Effect ofPGR's on growth Grateloupia doryphora when tested alone and/or combined with glycerol. PGR Disorganized cell 24-D 10-3 M , growth. CALLI Spm 10-3 M Organized cell growth PGR + Glycerol shoot 2,4-D 10-6 M 24-D 10-3 , 10-6 M , enusslOn BA 10-6 M BA 10-6 M GA 10-3, 10-6 M MORPHOGENESIS cell mas ses Put 10-3 , 10-6 M Put 10-3 ,10-6 M SPd 10-3 , 10-6 M SPd 10-3 ,10-6 M Spm 10-3 ,10-6 M GA 10-3 , 10-6 M Figure captions Fig.l Outline for algae propagation according to biotechnological purposes. Fig.2 earpospore-seedlings of Grateloupia doryphora growing in Provasoli Enriched Seawater. (A) Seedlings regenerating shoots (small arrows) x4 . (B) Transversal section of a carpospore-seedling showing a compact medulla (m) and cortex (arrow). Stain haematoxylineosin. x120. (e) Longitudinal section ofa carpospore-seedling protruding a shoot at 2 days in culture. Stain toluidin blue. x40 . (D) Longitudinal section ofa shoot of2 months old showing medullar and corticallayers well defined . Stain toluidin blue. x130 . Semithin sections 51lm. 3 Fig.3 eaUi of G. doryphora cultivated in 2,4-D 10- M. (A) Growth of calli from carpospore-seedlings. x4 . (B) Transversal section of a calli. Note the disorganized mass (headarrow). xIO . (e) Detail ofcalli disorganized area. Note uneven cellular arrangement (arrow). x40 . Sections 51lm stained with toluidin blue. Fig.4 eell masses of G. doryphora growing in 0.1 M glycerol. (A) Growth of cell masses from carpospore-seedlings. x2. (B) Detail of a cell mass section. Note the organized cellular disposition with regard to c1ump center (c). x40. (e) Longitudinal section ofcell masses. Note as protrussions to proliferate (arrows) and the concentric cellular arrangement. xIO . Semithin sections (5Ilm) stained with haematoxylin-eosin. Fig.1 '".:;.: .