Técnicas para el estudio del crecimiento y desarrollo en

UNIVERSIDAD DE LAS PALMAS DE G.C.
DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA
TÉCNICAS PARA EL ESTUDIO DEL CRECIMIENTO Y DESARROLLO
EN MACROALGAS.
Marta Rodrigo Sanz
1997
Memoria que presenta la Leda. Marta Rodrigo Sanz en el Dpto. de Biología de la u.L.P.G.c. para
la obtención de la Suficiencia Investigadora.
Las Palmas G. C. , noviembre de 1997.
INDICE.
l . INTRODUCCIÓN .... ....... .... ...... .................. ... ......... ..... ....... .... .... ........ ..... ........ ..... ....... ... ... ..... .2
2.
APLICACIÓN DE LAS TÉCNICAS DE CULTIVO AL ESTUDIO DEL CRECIMIENTO Y
DESARROLLO DE Grateloupia doryphora... ... ..... ......... ..................... .... .. ... ........ ... ... ............. ... 3
2.1. Establecimiento
de diferentes estadíos de crecimiento ........ .. .. ...... ........ .... .. .. .. .. .......... 3
2.2. Experimento(s) 1:
Regulación efectiva del crecimiento y desarrollo por
los
reguladores de crecimiento en el Estadío O.. ... ..... ........................................... ........... .. ......3
2.3.
Experimento(s)
2: Diferenciación
celular
producida
por
el
fotoperiodo .
Tetrasporogénesis en fases tempranas del crecimiento y desarrollo ................... .. .. ............ 4
2.4. Experimento(s) 3: Cambios fisiológicos durante el crecimiento y desarrollo . .. .. .. ....... 5
3. HANSATECH ®: EL USO DEL ELECTRODO DE OXÍGENO PARA LAS MEDIDAS DE
FOTOSÍNTESIS ....... ................ ........... ......................... .. .. ........ .. ........ .... .. ....... ........ .......... ... ...... ... 6
3.1. Introducción: Medidas de actividad fotosintética ........... .. ........ ................ :............... .. .6
3.2. Componentes del Hansatech ... ..... ............ ... .. ................ ... .... ............ ... ... ................... ..7
3.3. El electrodo de oxígeno ................. .. .... ..... .. ....... ............ ....................... .. ... ........ ......... 8
· Principio de funcionamiento del electrodo ................................ ............ ..... .. ........ 8
· Montaje y mantenimiento .................................................... ........ .. ..... ....... .. ......... 9
· Calibración ...................... ..... .... ............... ........ ... ............. ... .... .......... ..... .... ........... 9
3.4. Cámara de incubación ............. .. .. ................. .. .... .................. .... .... ...... .. .... .. .... .... ....... 10
3.5. Las fuentes de luz ................................... .................. ....................... ........................... 11
3.6.
Software acoplado al electrodo de Hansatech: Programa Leaf-Disc ........................ 12
4. PROCEDIMIENTO DE MEDIDA: APLICACIÓN DEL HANSATECH AL CASO
CONCRETO
TOLERANCIA
DEL
AL
" ESTUDIO
ESTRÉS
COMPARATIVO
(TERMAL
Y
DE
LA
FOTOFISIOLOGÍA
SALINO)
DE
DOS
EST ADÍOS
y
DE
CRECIMIENTO DEL ALGA Grateloupia doryphora.".. ...... .................................................... .. 12
5. BffiLIOGRAFÍA................................ ... ........... .. ...... ............................. ....... ............................. 16
6. TABLAS Y FIGURAS ...... ..... ....... ...... ............ ..... ............. ...... .. .... .............. .. ... ............... .... ...... 19
7. PUBLICACIONES .................................................................. ..... .... .. ....................... .. ...... ... .. .. .26
2
1. INTRODUCCIÓN.
Una gran parte del conocimiento sobre la biología de las algas ha derivado del estudio
directo de muestras naturales, aunque cada vez son más los autores que consideran que el material
recogido en la naturaleza no es el más adecuado para los estudios fisiológicos (Macler & Zupan
1991). El cultivo en el laboratorio de las macroalgas marinas se utiliza como herramienta de trabajo
para estudiar aspectos básicos de la fisiología (Ramus 1990, Falkowski & LaRoche 1991, Yokoya
& OLiveira 1993), cultivo y desarrollo (Dring 1988, Correa el al. 1985, Bradley 1991, DeCew el
al. 1992) y fenología (historias de vida) (Lüning 1993, Brodie el al. 1994) de estos organismos
mannos.
Si lo que se pretende es analizar las variaciones durante el crecimiento y desarrollo, es
importante partir de un material del que se conozcan sus requerimientos nutritivos y de luz, los
estadíos en la historia de vida del alga y la fase de desarrollo en la que se encuentra. En definitiva,
que sea homogéneo, con una historia fisiológica previa conocida y muy similar entre todos los
individuos a estudiar. Es dificil que el material recogido de la naturaleza cumpla estas caracteristicas
y de ahí la necesidad de contar con cultivos en el laboratorio. Los cultivos además permiten trabajar
con una misma población y controlar así la variabilidad genética, que en ocasiones puede interferir
o ser un inconveniente a la hora de interpretar resultados.
3
2.
APLICACIÓN
DE
LAS
TÉCNICAS
DE
CULTIVO
AL
ESTUDIO
DEL
CRECIMIENTO Y DESARROLLO DE Grateloupia doryphora.
2.1. Establecimiento de diferentes estadíos de crecimiento.
Siguiendo la metodología ya establecida para macro algas por Robaina (1988) y
García-Jiménez (1994), se obtuvieron explantos fértiles axénicos. Después de 30 días, la mayoria
de los explantos cultivados habían liberado carposporas que se recolectaron y cultivaron en medio
PES sólido (provasoli 1968). Tras 1-2 meses las carposporas germinadas (germilings) , cultivadas
en medio líquido, desarrollaron tres o cuatro ejes de crecimiento (sporelings) y posteriormente se
transfirieron a medios líquidos aireados (no asépticos) hasta la obtención de talos adultos.
En el momento de la transferencia de los gerrnlings a medio líquido, comenzamos un
seguimiento diario del crecimiento en términos de peso fresco, hasta que se alcanzó el tamaño
máximo en cultivo. Al representar los datos de biomasa fresca frente al tiempo, se obtuvo una
curva que se ajusta a una curva logística sobre la que empíricamente caracterizamos cuatro fases o
estadíos (Fig. 1 en la publicación de Marine Biology adjunta y Fig 2).
A partir de estos 4 estadíos establecidos (Estadíos O, 1, II Y ID) tan sólo como etapas de
crecimiento en una curva asociados a una determinada tasa de crecimiento, se realizaron distintos
ensayos que mostraron algunos de los cambios que tienen lugar ligados a la adquisición de mayor
grado de desarrollo y capacidades funcionales.
Estos estadíos de cultivo nos permitieron caracterizar en todo momento el material de
partida, constituyendo la base de todos los experimentos posteriores.
2.2. Experimento(s) 1:
Regulación efectiva del crecimiento y desarrollo por los
reguladores de crecimiento en el Estadío O.
La bibliografia muestra que las respuestas de las algas frente a los reguladores de
crecimiento son muy variables. Para un mismo material, estas sustancias pueden provocar
morfogénesis o por el contrario no causar respuesta alguna. El efecto causado también varia en
función de las condiciones de cultivo, el tamaño y la edad del material vegetal.
Los reguladores de crecimiento tienen escaso efecto en el tejido bien desarrollado de las
Rhodophytas. En un estudio previo realizado con explantos y talos desarrollados (Estadío ID) de
4
G dOlyphora (Robaina 1988, García-Jiménez el al. 1997), los reguladores tampoco resultaron
efectivos.
A partir de estos resultados preliminares se estableció que el Estadío O era el único que
respondía al aporte exógeno de estas sustancias. Gran parte del interés de este trabajo radica en las
Escasas referencias del uso de los reguladores de crecimiento en las fases más tempranas de
desarrollo.
Por otra parte, conocíamos también los efectos del glicerol como fuente de carbono externa
estimuladora del crecimiento vegetativo y morfogénesis en explantos y sporelings (Robaina el
al.1990 a,b 1995; García-Jiménez el al. 1996).
Basándonos en las experiencias anteriores con estos compuestos y mediante el cultivo de
laboratorio, llevamos a cabo un estudio de los efectos combinados de los reguladores de
crecimiento y del glicerol en los gennlings (Estadio O) de G doryphora.
El estudio comprendía un seguimiento completo del material sometido a los diferentes
tratamientos con técnicas histológicas e histoquímicas y de valoración de dos indices de desarrollo
y morfogénesis.
Todos los reguladores de crecimiento probados en los gennling del Estadío O tuvieron
respuestas aunque diferentes, incluyendo la inhibición del crecimiento, la formación de callo y
masas celulares y la emisión de yemas.
Los resultados más sobresalientes se resumen en la Tabla 1 yen el trabajo que acompaña
esta memoria y que será publicado en el 1. Appl. Phycology.
2.3. Experimento(s) 2: Diferenciación celular producida por el fotoperiodo.
Tetrasporogénesis en fases tempranas del crecimiento y desarrollo.
Este trabajo se basó en el uso muy extendido en la literatura de uno de los
parámetros de cultivo, el fotoperiodo, para favorecer la formación de estructuras reproductoras
(tetrasporas) en las algas (Dring 1988; Lewis el al. 1991 ; Guiry & Dawes 1992; Cunningham el al.
1993).
Se adaptaron los métodos de cultivo de Gdoryhora introduciendo un control del
fotoperiodo por bandeja de la cámara de cultivo. Combinando las técnicas de cultivo en el
laboratorio y las técnicas de microscopía óptica y electrónica, se realizó un seguimiento que
5
permitió la descripción de los distintos eventos a nivel tisular y celular que tienen lugar en las
primeras etapas de la tetrasporogénesis
Así, el tratamiento inductor de la tetrasporogénesis en G. doryphora se estableció en tres
semanas de cultivo en fotoperiodo corto (8 h luz: 16 h oscuridad).
Mediante el diseño de experimentos basados en transferencias de los sporelings cultivados desde
un fotoperiodo largo (16:8) (control) al fotoperiodo inductor (8:16), se establecieron los tiempos
necesarios en uno y otro fotoperiodo para la inducción de las primeras etapas de la
tetrasporogénesis. Las primeras estructuras bien definidas aparecen en sporelings del Estadío
n,
tras cuatro semanas de cultivo en el fotoperiodo largo y tres en el corto. Estos resultados están en
fase de redacción para su posterior publicación.
2.4. Experimento(s) 3: Cambios fisiológicos durante el crecimiento y desarroUo.
La respuesta marcadamente diferente del Estadío O frente a los reguladores de
crecimiento apuntaba la posibilidad de que hubiese comportamientos biológicos diferentes entre los
estadíos.
Para corroborar esta hipótesis se planteó un ensayo en el que se eligieron dos estadíos
claramente diferenciados entre sí (I.vs. ID) y se Uevó a cabo un estudio comparativo de su
fotofisiología (contenido pigmentario y tolerancia fotosintética al estrés termal y salino).
Para su realización fue necesario la mejora del método de extracción de clorofilas con
DMSO (Dimetilsulfóxido) y de las ficobiliproteínas, así como la puesta a punto de la técnica del
Hansatech, cuyo uso se aborda en detaUe posteriormente, que nos permitió obtener las curvas P-I
(Fotosíntesis- Intensidad) a partir de las que medir y comparar la actividad fotosíntética en ambos
estadíos de crecimiento.
La primera diferencia importante entre los estadíos 1 y ID de G. doryphora se observó en la
composición pigmentaria, a pesar de que los dos estadíos se habían cultivado bajo las mismas
condiciones (Tabla 2).
Esta diferencia en el contenido pigmentario quedó reflejada también en las tasas
fotosíntéticas, presentando el Estadío 1 tasas mayores que el Estadío ID (Figura 3). Además la
respuesta y tolerancia al estrés salino y termal de los dos estadíos (medida comparando los valores
medios de los parámetros fotosíntéticos) también resultó muy distínta tal y como muestra las Tablas
3.a y 3.b Estos resultados han sido recogidos en la publicación (Marine Biology) que acompaña
esta memoria.
6
El estudio fotofisiológico comparativo entre los Estadíos 1 y ID de cultivo de G.doryphora
había mostrado la existencia de cambios pigmentarios ligados al desarrollo del alga.
Utilizando de nuevo el factor longitud de día (fotoperiodo) se planteó un nuevo ensayo
cuyo objetivo consistía en estudiar si cultivando los sporelings a diferentes fotoperiodos, además de
los cambios ligados al desarrollo, se producían otros cambios fotofisiológicos. Estas alteraciones
estarían provocados por los diferentes regímenes de luz: oscuridad durante el crecimiento en
cultivo y de esta manera, se podría considerar el parámetro "longitud del día" como factor causante
de fotoaclimatación. El análisis de pigmentos realizado con el HPLC mostró cambios cualitativos y
cuantitativos en el contenido pigmentario de los individuos del Estadío ID cultivados en diferentes
regímenes de luz (8 :16, 12:12 y 16:8). Las medidas obtenidas mediante el Hansatech no mostraron
sin embargo que la diferencia en el contenido pigmentario se reflejara en una actividad fotosintética
diferente entre los tratamientos de luz.
Por otro lado, el distinto contenido en ficocianina entre los tratamientos, lleva incluso a
pensar que la longitud del día pueda afectar a la estructuración de los ficobilisomas. Para verificar
esta hipótesis, fue necesario poner a punto la técnica de aislamiento de ficobilisomas mediante
gradientes de densidad de sacarosa. Posteriormente se realizó una electroforesis en gel de
acrilamida, en condiciones desnaturalizantes, para observar si la configuración de pigmentos y
linkers que conforman la estructura del ficobilisoma, coincidían en todos los tratamientos de
longitud de día.
3. HANSATECB: EL USO DEL ELECTRODO DE OXÍGENO PARA LAS MEDIDAS
DE FOTOSÍNTESIS.
3.1. Introducción: Medidas de actividad fotosintética.
En el proceso de la fotosíntesis, la energía de la luz es absorbida por la clorofila y
utilizada para conducir la reducción del dióxido de carbono a carbohidrato. El proceso fotosintético
se puede sintetizar mediante la siguiente ecuación general:
Para medir la actividad foto sintética, los métodos más usados son la medida del C02
7
incorporado en el proceso, mediante el método IRGA (Infra Red Gas Analysis) o utilizando el
marcaje radiactivo del carbono incorporado
tc).El método IRGA es más complicado de usar e
interpretar en fases acuosas y su uso no está muy extendido en el campo de las algas. El método
radiactivo del 14C requiere de unas instalaciones y de un equipamiento específico para su medida,
además de presentar el inconveniente de usarse la radiactividad.
Atendiendo a la ecuación general del proceso, la actividad foto sintética también se puede
medir cuantificando el oxígeno liberado. Los métodos más usuales para medir las concentraciones
de oxígeno disuelto son los de Winkler y los electrodos de oxígeno basados en la polarografia.
Para medidas puntuales e instantáneas a distintas intensidades de luz, el método Winkler
resulta poco práctico porque necesita de prolongadas incubaciones para su resolución. Este hecho
conlleva además problemas de saturación de oxígeno y de contaminación bacteriana (Arnold &
Littler 1985), aparte de que nadie asegura la linealidad de las medidas.
Los electrodos de oxígeno tienen la ventaja de suministrar lecturas instantáneas y continuas,
y 10 que es más importante, proporcionan medidas lineales de evolución de oxígeno frente a
distintas intensidades de luz, 10 que permite el cálculo posterior de la tasa de actividad foto sintética
con precisión.
En la actualidad los electrodos de oxígeno empleados se acompañan de programas de
ordenador que permiten automatizar las
medidas y las diferentes intensidades de luz,
proporcionando resultados fiables (Henley 1993).
3.2. Componentes del Hansatech.
Hansatech es una marca registrada (Instituto para la Investigación de la fotosíntesis.
Sheffield. u.K.) de un instrumento de laboratorio de precisión usado para medir la cinética o
evolución del oxígeno liberado por un vegetal
durante el proceso fotosintético . Es útil para
cualquier planta C3(Walker 1987)
El equipo para su correcto funcionamiento necesita de los siguientes elementos fundamentales :
. El electrodo de oxígeno, junto con su unidad de control.
. La cámara donde se disponen los vegetales y en la que se inserta el electrodo. En el caso
de la cámara de agua, es necesario también una base magnética agitadora .
8
· Baño termostatizado que permite el control de la temperatura en el interior de la cámara.
· La/s fuente/s de luz adaptables a la cámara junto con su unidad de control.
· Sistema de registro conectado a la salida de la unidad control del electrodo.
· Como elemento opcional: Un ordenador cargado con el programa específico de registro y
gráficos, conectado a las unidades de control del electrodo y fuente de luz.
3.3. El electrodo de oxígeno.
De acuerdo al proceso foto sintético, un vegetal dispuesto en una cámara provisto
de una fuente de carbono e iluminado, liberará oxígeno. El oxígeno que se acumula en fase gaseosa
durante la fotosíntesis, es detectable polarográficamente utilizando un electrodo "tipo Clark" .
· Principio de funcionamiento del electrodo.
El electrodo tipo-Clark del Hansatech consta básicamente de un cátodo de platino
y un ánodo de plata unidos o conectados mediante un electrolito. Ambos electrodos están
engarzados en un disco de plástico: el cátodo en el centro del domo y el ánodo de plata en una
ranura circular que sirve a su vez como recipiente del electrolito. Los electrodos irán protegidos
por una membrana de teflón o polietileno, permeable al oxígeno, que mantiene una fina capa del
electrolito sobre la superficie de los electrodos. Debajo de la membrana se coloca un papel para
mantener una capa uniforme y continua de electrolito entre el ánodo y el cátodo.
Cuando se aplica un voltaje eficaz entre los electrodos, el platino se vuelve negativo (se
convierte en el cátodo) y la plata (el ánodo) se toma positiva. El oxígeno se difunde a través de la
membrana y se reduce en la superficie del cátodo, inicialmente en forma de peróxido de hidrógeno
H20 2 de tal forma que la polaridad tiende a descargarse a medida que se donan electrones al
oxígeno, que actúa como aceptor de electrones. La plata se oxida y se deposita cloruro de plata en
el ánodo . La corriente generada es directamente proporcional al oxígeno reducido y se registra
como voltaje en un registrador o se convierte en un registro de salida digital (~ol 02 tiempo·l) si
se emplea el control de lectura que dispone el Hansatech.
La caja de control del electrodo de oxígeno cumple una doble función : por una parte
proporciona el voltaje de potenciación necesario que asegure un nivel de operación óptimo (700
mV aproximadamente), y por otra, convierte la corriente generada por el electrodo en una señal
suficientemente fuerte que se pueda registrar.
9
. Montaje del electrodo y mantenimiento.
Para su montaje se disponen unas gotas de electrolito en la ranura del ánodo y una
gota en el cátodo. A continuación se coloca un papel de aproximadamente 2 cm 2 que cubra todo
el electrodo y se empapa con el electrolito. El papel de fumar por ser fino y uniforme, es muy
adecuado para este fin . Encima del papel, se coloca un trozo de membrana de tamaño similar a
este, y ambos se ajustan al domo mediante un anillo de goma que se coloca con la ayuda del
aplicador.
Finalmente el electrodo ya montado, se enrosca en la parte inferior de la cámara, en
contacto directo con la columna de incubación .
Se utilizan muchos tipos de electro lito s y membranas y la elección de unos u otros se basa
en la obtención de mejores o peores resultados durante su uso. En nuestro caso concreto,
obtuvimos un buen funcionamiento del electrodo utilizando una solución de cloruro potásico
saturada al 50 % como electrolito, y la membrana de teflón de 0.0125 mm de grosor que incluye el
propio Hansatech.
El electrodo para su buen funcionamiento debe estar limpio, para lo cual se pule
cuidadosamente con una pasta de óxido de aluminio, se eIÜuaga bien con agua destilada y se seca.
El cambio de membrana y la limpieza del electrodo debe ser semanal y en cada cambio, es
recomendable que permanezca funcionando un día, antes de realizar medición alguna.
Los electrodos están engarzados en epoxi-resinas y tienden a absorber agua y por ello
incrementarse la corriente residual. Es recomendable para evitar este problema, tener un par de
electrodos que permita guardar uno de ellos con silica-gel mientras se utiliza el otro y viceversa .
. Calibración del electrodo.
Las reaccIOnes electroquímicas generan una corriente residual incluso en la
ausencia de oxigeno, que hace necesario calibrar el electrodo. Además se debe conocer el rango de
concentración de oxigeno en el que nos movemos, para poder ajustar la escala apropiada durante
las medidas.
Para su calibración se llena la mitad de la cámara con agua destilada en la que se pone a
burbujear nitrógeno para obtener el cero, pudiéndose reemplazar el N2 por una gota de una
solución de ditionito sódico (Na2S204) que consume oxígeno en su reacción con el agua. Con este
10
último hay que tener especial cuidado, ya que el ditionito es corrOSIVO, pudiendo dañar o
contaminar la membrana, por ello es mejor evitarlo y utilizar N2.
Mientras se burbujea, se elige en la pantalla del software la opción de registrador gráfico
(pen-recorder) y junto con la ayuda de la rueda del ajuste de la caja control, graduar en el monitor
la señal gráfica hasta aproximarse al cero, de esta manera se fija la llamada "línea de nitrógeno"
equivalente al cero.
Para graduar el máximo o la "línea de aire", se vacía la cámara y se vuelve a llenar con agua
de mar en la que se burbujea aire durante unos minutos hasta que llegue a la saturación. Se mide la
temperatura dentro de la cámara y se busca en las tablas el contenido de oxígeno a la temperatura
con la que se está procediendo. El valor obtenido es al que deberemos aproximamos en la pantalla
del ordenador utilizando nuevamente el botón de ajuste de la caja control.
Como procedimiento habitual, y para evitar niveles de saturación, el agua de incubación se
burbujea con nitrógeno durante unos 5 minutos previamente a las medidas.
3.4. Cámara de incubación.
La cámara de incubación se elige en función del organismo fotosintético. Para el
caso de las algas se eligió la cámara de fase acuosa DWI (Hansatech). Esta cámara consta de un
cilindro central a modo de columna de cristal de 5 mi de capacidad donde se coloca el organismo
fotosintético. La columna está rodeada por un espacio por el que fluye un circuito cerrado de agua
termostatizado, que permite que durante todas las medidas y ensayos la temperatura en el interior
de la cámara no varíe. Este hecho tiene una importancia relevante considerando que el valor del
contenido de oxígeno de la columna de agua es variable con la temperatura; además de las
consecuencias que acarrea la variación de las condiciones de incubación para la medida.
El principio de funcionamiento y medida en el aire o en la fase acuosa es el mismo,
exceptuando que la difusión del oxígeno a través del agua es de tres órdenes de magnitud menor
que en el aire. Es necesario por tanto la agitación continua de la solución mediante un agitador
magnético que a su vez sirve de soporte de la cámara, y un imán de reducidas dimensiones que se
introduce en la cámara de incubación al comienzo de la medida.
11
3.5. Fuentes de luz.
Una de las fuentes de luz más comunes utilizada en los laboratorios para la medida
de fotosíntesis suele ser el proyector de diapositivas, sín embargo, a no ser de que se utilice un filtro
de calor, no es la más adecuada por el peligro de recalentamiento del material vegetal. Resulta más
dificil todavía evitar este ínconveniente si se emplean intensidades de luz altas.
Además de los proyectores de diapositivas existe una gama muy amplia de fuentes de luz
disponibles para la medida de fotosíntesis. Cada marca registrada suele proveer un modelo de
lámpara. En el caso de Hansatech, el equipo venía provisto de un juego de tres fuentes de luz
denominados LED (Light Emitting Diodes: Diodos Emisores de Luz).
Los LED constituyen una fuente de luz muy útil para aplicaciones fotosintéticas : son
pequeños, manejables y capaces de emitir altas intensidades de luz sin producir mucho calor. Son
además relativamente baratas, estables y tienen una larga duración.
Los tres diodos (modelo: LH 36 U) que utilizamos en nuestro estudio emitían en una
longitud de onda de 660 nm (luz roja), muy cercana al pico de absorción de la clorofila en el rojo.
Al tratarse de un proceso cuántico, la medida más útil para expresar la actividad
fotosintética es por el número de fotones de radiación foto sintéticamente activa y por unidad de
superficie. Esta medida se denomina densidad de flujo de fotones, abreviado como PFD (photon
Flux Density). Las unidades más empleadas para expresar el
2
cuadrado por segundo (~ m-
S-I),
simplemente el término mol (o
~ol)
PFp son los microeinsteins por metro
donde un einstein es un mol de fotones. Algunos autores usan
porque el einstein no es una unidad del Sistema Internacional
(Salisbury 1991 ).
Los diodos utilizados pueden ser calibrados para dar un PFD determinado, que se muestra
digitalmente en el monitor control de la luz. El dígito que aparece representa el porcentaje del
máximo PFD que alcanza la fuente de luz. Los tres diodos disponibles en nuestro caso emitían un
máximo (100 %) de 900 PFD.
Actualmente, disponiendo del software adecuado, pueden programarse el encendido
automático de los distintos PFD de las lámparas y el tiempo que deben permanecer encendidas.
En nuestro caso los cambios de PFD se realizaron manualmente desde el monitor de
control de la fuente de luz.
12
3.6. Software acoplado al electrodo de Hansatech: Programa Leaf-Disc.
El programa infonnático que complementa el aparataje del Hansatech se denomina LeafDisc. La versión con la que se llevó a cabo el estudio permite registrar gráficamente las medidas de
concentración de oxígeno frente al tiempo, a medida que se va generando corriente en el electrodo.
Durante el registro y a intervalos de tiempo programables, el software va realizando los cálculos de
las tasas lineales de producción de oxígeno, que aparecen en pantalla pulsando una tecla. En esta
versión del Leaf-Disc, las tasas no se pueden programar ni almacenar por 10 que a medida que van
apareciendo 10 valores, estos se tienen que ir anotando manualmente.
El menú principal del programa permite ajustar numerosos parámetros de medida como la
escala de ambos ejes, los tiempos de medida, cálculo de tasas, etc.
La versión con la que trabajamos dispone de un programa de almacenamiento de datos y
realización de gráficos muy básico y por sus muchas limitaciones, no resulta cómodo trabajar con
él.
4. PROCEDIMIENTO DE MEDIDA: APLICACIÓN DEL HANSA TECH AL CASO
CONCRETO DEL" ESTUDIO COMPARATIVO DE LA FOTOFISIOLOGÍA y
TOLERANCIA AL ESTRÉS (TERMAL Y SALINO) DE DOS ESTADÍOS DE
CRECIMIENTO DEL ALGA Grateloupia doryphora."
Para cumplir el objetivo del trabajo, se planteó un diseño experimental con el que se
pudiera analizar la actividad fotosintética (como reflejo de la capacidad fisiológica) de los dos
estadíos (1 y ID) en condiciones nonnales de cultivo, y tras someterles a periodos de incubación
cortos (30 minutos) en diferentes temperaturas y salinidades.
El diseño experimental planteado para realizar las medidas foto sintéticas con el Hansatech
se resume en el siguiente esquema:
Condiciones
control
Salinidad
Salinidad
(18%0)
(65%0)
Temperatura
Temperatura
(25 °)
(3 0°)
Estadío 1
5 curvas
5 curvas
5 curvas
5 curvas
5 curvas
Estadío Il1
5 curvas
5 curvas
5 curvas
5 curvas
5 curvas
13
Para el montaje del electrodo se procedió tal y como se explicó anteriormente, con
KCl al 50 % de saturación como electrolito, el papelillo de fumar y la membrana de teflón. El
electrodo ya montado permanecía antes de su uso estabilizándose durante al menos una hora,
tiempo en el que se procedía a las incubaciones y preparación del material.
La temperatura del baño termostatizado y por tanto la de la cámara durante las
medidas, se ajustó para que coincidiera con la temperatura de cultivo (condiciones control).
De esta manera todas las medidas se llevaban a cabo en las mismas condiciones y no se
producía una re-incubación durante el proceso.
Inmediatamente tras la incubación durante 30 minutos en los distintos tratamientos de
salinidad y temperatura, se procedía a medir la actividad fotosintética de los individuos de
ambos estadíos. Tanto las medidas como las incubaciones se realizaron en agua de mar
pretratada (filtros de 100, 10 Y 1 ~m antes de pasar por luz U.V.).
Debido a la diferente morfología y tamaño del material en los diferentes estadíos, se
llevaron a cabo diversas pruebas para determinar el número de sporelings (Estadío 1) o peso
del alga (Estadío ID) que debían ser colocados en el volumen de la cámara de incubación (5
mi) para que el oxígeno liberado fuera detectable y diera una señal clara. Se encontraron
buenas respuestas utilizando una media de peso fresco de 6 mg, correspondiente a 20
sporelings del Estadío 1, y a las partes terminales de 2cm de longitud de individuos del estadío
1II.
Para las medidas de los individuos del Estadío ID fue preciso introducir los fragmentos
del alga en una malla de plástico que se desgasificaba previamente junto al agua de incubación,
y evitar así las burbujas de aire. Los sporelings del Estadío I por sus reducidas dimensiones no
interferían con el imán, y permanecían libres en la columna de incubación mientras se procedía
a las medidas.
Todas las mediciones de la actividad fotosintética se realizaron de 8 a las 14.00 p.m.
para evitar la variación diurna de la fotosíntesis (Coutinho & Zingmark 1987).
Las medidas se iniciaban cambiando el agua de la cámara por la desgasificada, y una
vez colocado el material vegetal dentro de la cámara, esta se sellaba con la tapa y vaselina y se
mantenia en oscuridad. Una vez elegido en el menú de pantalla la opción del registrador
gráfico (pen-recorder), aparecían los ejes de la gráfica de concentración de oxígeno frente a
tiempo y se ajustaba la escala de la ordenada (concentración de oxígeno) a 5
~moles
de 02,
14
mientras que, la abscisa, se mantenía en intervalos de dos minutos.
Tras 8 minutos de registro en oscuridad, se obtenía la primera tasa y un minuto
después (A los 9') una segunda, pulsando para ello la tecla F4. Estas primeras tasas negativas
representan los valores de respiración en la oscuridad. El valor de las tasas aparece en pantalla
y permanece 20 minutos hasta que esta cambia, por lo que a medida que se obtenían, se iban
copiando en un estadillo.
A partir de este momento se encendían las lámparas en el monitor de control. El primer
2
PFD fijado era del 2% (equivalente a 18 J.LI1101 de fotones m-
S-I) .
Cada vez el PFD se
incrementaba en un 2%. Los PFD a los que realizamos las medidas de evolución de oxígeno
fueron 0, 18, 36, 54, 72, 90, 108, 126, 144, 162, 180, 198, 216, 234 Y 252 PFD.
Cada uno de los PFD se mantenía durante 4 minutos en los que se registraban 3 tasas
consecutivas, para posteriormente calcular la media. Así sucesivamente, hasta que llegado a un
determinado PFD, las tasas obtenidas no superaban las anteriores, o incluso disminuían. En
este momento finalizaba la medida.
Para obtener buenos resultados es muy importante estandarizar el procedimiento de
medida, teniendo en cuenta para ello el número de PFD utilizados (cuantos más, mejor) y la
duración de cada uno (Henley 1993).
El Hansatech en este ensayo sólo se utilizó para la obtención de las tasas. Debido a las
limitaciones de la versión antigua del programa Leaf- Disc, preferimos emplear para el
posterior tratamiento de datos y gráficos otros programas como el SigmaPlot.
Se representaron las tasas obtenidas, normalizadas a cantidad de clorofila
ª, frente a
los PFD correspondientes y se obtuvieron las curvas P-I (Fotosíntesis-Irradiancia) (Fig.3) .
Para cada una de las curvas se calcularon los parámetros fotosintéticos de respiración
en la oscuridad (R1), eficiencia fotosintética (alfa) y fotosíntesis máxima (P max) . El valor de
~
coincidía con el valor de la ordenada en el origen. Para calcular alfa, se trazó una recta de
regresión de los cuatro primeros puntos de la curva y alfa tomó el valor de la pendiente de esa
recta. Pmax coincide con los valores máximos de las tasas obtenidas a determinados PFD.
Los valores de estos tres parámetros, en los diferentes tratamientos, permitieron hacer
las comparaciones estadísticas y marcar las diferencias ya mencionadas entre los dos estadíos.
La medida de la actividad fotosintética mediante el Hansatech puede optimizarse si se
dispone de un juego de lámparas de luz de amplio espectro (luz blanca), que excite tanto los
15
pigmentos principales como los accesonos. Las lámparas disponibles emiten una luz
monocromática centrada en 660 nm, que sólo permite la participación de la clorofila; hecho
que hay que considerar por ejemplo, a la hora de interpretar los resultados en Rhodophyta.
El trabajo puede agilizarse considerablemente con los nuevos programas informáticos
de los que dispone actualmente Hansatech. Estos programas permiten la automatización de las
fuentes de luz, de las medidas y el almacenamiento y tratamiento de datos, además de
representar directamente las curvas P-I y calcular cada uno de sus parámetros.
16
5. BmLIOGRAFIA.
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19
6. Tablas y Figuras.
Figura 2. Peso fresco frente al tiempo durante 80 días de cultivo de los sporelings (la ecuación se
obtuvo ajustando el peso fresco (x) frente al tiempo (y) con datos de 8 replicados, donde a, b, c y d
son constantes).
Rodrigo and Robaina
Marine Blology 1997.
2
,--------
------¡-- -- -
-
-
- , - - - - -- - - - , - - --
y = a + b4n/(1 +n)2
n =e (-(x-c)/d)
8=-0_07
b=1 _57
c=89_32
d=18 _61
•
.a. •
• 1/
• ..-1
: :. .I
Stage 11
:
1
•
••
•
••• ,....-¡•
.
. y.
Stage 111
=0.94
~
r-------,
•
~./.
'
¡:
•••
:I
.... .
•••
• - I• i• •
•
e! :•.
,..:- r
l
)/~.:r
Stage I
o
~___=__
o
...-«"
_______ _______ I.. _ _
20
__ __
I
_ l __ __
40
__'_
60
_
_
___'__
80
Time (days)
____'
Tabla 1. Efecto de los reguladores de crecimiento en los germlings
de Grateloupia doryphora en presencia-ausencia del glicerol.
Reguladores
2,4-0 lO 3 M
Spm 10- 3 M
2,4-0 lO -3M
Spm 10- 3 M
+0 .1 M
glicerol
Efecto
moñogenético
Callo
Indice de
crecimiento de
masa (mm)
In dice
moñogenético
0.5±O.15
--------
(yemas por
eerrnlill2)
Masas
celulares
1.18±O.21
18.5±2 .20
Emisión de
yemas
------------
23 .5±4.68
Otros reguladores probados: BA, KIN,
GA, Put, Spd (lO -6 Y 10-3 M)
Control: 0.1 M glicerol 0.72 ± 0.08 indice de crecimiento ;9.83 ± 1.25 indice morfogenético.
Tabla 2. Grateloupia doryphora.
clorofila
Concentración (medias ± SE de 6 replicados) de
ª, R-ficoeritrina (RPE) y R-ficocianina (RPC) (Ilg pigmento mg-
I
(Comparación estadística de la media entre el Estadío I y III : *** ~ ~ 0.001).
Estadío Clorofila a
I
RPC
RPE
70 1O-3±4.25 10-3 4.69 1O-3±0.327 10-3
111
(U.)
(
...
)
7.31 1O-4±3 .27 104
(
...
)
peso seco).
Fig. 3 Curvas P-I de los Estadíos I y 111
(medias ± SE de 6 replicados) .
500
-~--------------------------------------~
400 -
300 T"""
I
el
E
N
O
O
200 -
~
C/)
C/)
ID
......
e
Estadía 111
100 -
C/)
O
......
o
~
•
u.
.
• •••••••• • •
.
.
•
.
.
•
. •...•
•
~
:
O - ~:'-- - --• .~i~.-'~----------------------
'I.···~
. ...•..
~
-100
-~-----~I-----~I-----~I-----I~-----I~----~
O
50
100
150
200
250
300
Tabla 3.a . . Grateloupia doryphora. Parámetros fotosintéticos (medias ± SE de 6
l
experimentos replicados) P max (Jlmol O2 liberado mil clorofila h- ), alfa ( Jlmol O2
mg-l clorofila h- l Jlmor l fotón m2 S-I) y Ita (Jlmol O liberado mg- I clorofila h- l ) para
ª
ª
2
ª
el Estadío 1 (sporelings). Las condiciones control fueron 20 oC , 35%0 S (1.1 osmol kg}
(Comparación estadística de la media : * :e
~
0.05).
Tratamiento
P max
alfa
Control
404.0± 47.1 os
3.68± 0.55
360.3± 70.9 os
4.54± 0.66 os
-23 .8± 13.33
os
424.8± 102.0 os
4.85± 1.26 os
-42.2± 14.41
os
18 %0 S
398 .0± 78 .2 os
3.68± 0.55
-20.7± 10.89 ns
65 %0 S
264.3± 10.0'
3.25± 0.46 •
os
os
-41.7± 9.51
-18 .7± 5.45
os
os
Tabla 3 b. Grateloupia doryphora. Parámetros fotosintéticos (medias ± SE de 6
ª
I
I
experimentos replicados) P max (Ilmol O2 liberado mg- clorofila h- ) , alfa ( Ilmol O2
mg-I clorofila h-lllmor l fotón m2 S- I) y RI (Ilmol O 2 liberado I)1g-1 clorofila h-I ) para
ª
ª
el Estadío III (talo adulto) . Las condiciones control fueron 20 oC , 35%0 S (1.1 osmol
kg} (Comparación estadística de la media : * 0.01 > ~ < 0.05).
Tratamiento
Pmax
alfa
Control
64.8± 1.9 os
0.99± 0.08
os
-84.7± 11.5
os
25 oC
37.2± 7.0 **
1.1O± 0.40 os
-89.5± 26.7
os
30 oC
18.8± 6.0 **
0.60± 0.33
os
-36 .7± 6.3 **
18 %0 S
36.0± 7.2**
1.08± 0.32
os
-90.0± 11.0 os
65 %0 S
171.7±41.7 *
1.76± 0.17 *
-117.6± 12.4 os
26
7. Publicaciones.
Mari ne Biology ( 1997) 128: 689- 694
© Springer-Verlag 1997
M. Rodrigo . R. R. Robaina
Stress tolerance of photosynthesis in sporelings of the red alga
Grateloupia doryphora compared to that of Stage 111 thalli
Received: 21 October 1996 I Accepted: 5 February 1997
Abstract More experimental evidence is needed to understand the role of propagules in macroalgal biology.
There are no reports in the literature on the comparative
physiology (e.g. photosynthesis) of sporelings and
adults. In this paper we report on the variation in photosynthetic parameters (maximum photosynthesis, Pmax ,
and efficiency, alpha, and dark respiration (Rd) of cultivated young sporelings of the red alga Grateloupia doryphora (Montagne) Howe under normal conditions and after a short-term incubation at different salinities and temperatures. The results are compared to
those for adult Stage 111 thalli obtained in laboratory
culture from the same population of sporelings. The
pigment composition of sporelings (more chlorophyll a
and les s phycoerthryn and phycocyanin than adults)
promotes a better photosynthetic performance (higher
Pmax and alpha and lower Rd) under chlorophyll a excitation . The younger sporelings were also more ·tolerant
to variations in salinity and temperature than Stage 111,
in which the highest variation in maximum photosynthesis and dark respiration was observed.
Inb'oduction
More experimental evidence is needed to understand the
role of propagules in macroalgal biology. The scarcity of
knowledge in this field is documented in the reviews of
Santelices (1990), Clayton (1992) and Fletcher and
Callow (1992).
The rapid acquisition by the spores of basic traits of
plant physiology such as photosynthesis and respiration
for growth and development, or a stress response, is of
ecological relevance. It en sures their viability in situ and,
Communicated by A. Rodríguez, Puerto Real
M. Rodrigo · R.R. Robaina (18i)
Departamento de Biologia.
Uni versidad de Las Palmas de Gran Ca naria. Box 550.
E- 350 17 Las Palmas. Canary Islands. Spai n
consequently, the recruitment of new individuals or the
establishment of new populations of the species (Amsler
and Neushul 1991 ; Beach et al. 1995).
Viability also increases and decreases in response to
light, salinity and temperature variations (Lobban and
Harrison 1994). This is pariicularly true for intertidal
red algae inhabiting pools; these algae have large and
nonmotile spores with a rather low dispersal capacity.
Light, salinity and temperature effects on algal
physiology have been extensively studied (Gatusso and
Jaubert 1985; Smith and Berry 1986; Davison 1987,
1991 ; Zupan and West 1990; Davison et al. 1991 ; Henley
1992, 1993; Kübler and Davison 1993). These authors
reported that maximum photosynthesis (Pmax) and dark
respiration (R d ) increase as temperature increases, up to
a tempera tu re limit after which both rates decrease. The
photosynthetic efficiency (alpha) is sensitive, decreasing
of increasing as a function of species and experimental
conditions.
The effects of hypo- or hypersaline shocks on the
algal photosynthetic parameters Pmax and Rd are controversial, since these again vary according to the particular species treated, the rate and degree of the salinity
increase or decrease, the time of incubation, etc. (Lapointe et al. 1984 and references therein; Smith and
Berry 1986; Kirst 1989 and references therein).
Adult thalli have been normally used for most experiments, and almost nothing is known about the
younger stages of the algae . It is expected that physiological changes parallel morphological variations from
the sporeling to the adult individual. Amsler and Neushul (1991) reported interspecific differences in the
photosynthetic and respiratory capacity of recently
liberated spores from kelp species. They monitored
these and other physiological parameters under welldefined (fixed) enviromental conditions, but did not
compare them with adult stages. Beach et al. (1995)
reported higher photosynthetic rates and photosynthesis:respiration ratios in gametophytic thalli than in gametes of Ulvafasciata Delile and Enteromorphaflexuosa
(Roth) J. Ag.
691
2,-------.-------,--------,-------,---,
a
y
n
=a + b4n/(1 +n)2
=e (-(x-e l/di
Stage 111
•••
•
...
.
.
•
....• . I ...,.¡ ..
:. .
..• .••• .i
¡2 = 0.94
= 0.07
b = 1.57
e = 89.32
d = 18.61
a
t
I
•
1
,
1:
. ·1
•.. l·.
..I ,•
.. r'
r·t . I
• ,.,
• I
I I I
Pigments. light and photosynthesis
The spectrophotometrical quantification of pigments
revealed marked differences between the stages (Table 1).
The principal photosynthetic pigment, chlorophyll a.
was present in higher concentrations in the sporelings
than in the older Stage In cultures. In contrast, the latter
contained larger amounts of the accesory phycoerythrin
and phycocyanin pigments. The photosynthetic rates of
Stages I and III within the tested range of PFD are
shown in Fig. 2. Stage I displayed a better photosynthetic performance than Stage I1I, with higher values of
Pmax and alpha. Values of Rd up to 130% of the net Pmax
were observed in Stage nI cultures .
. I .:
40
60
80
Photosynthetic performance, salinity and temperature
Time (days)
Table 2 shows the mean Pmax , alpha and Rd for Stage I
cultures after the various salinity and temperature
treatments. No significant differences were observed
between control conditions and the 25 and 30 oC treatments nor between controls and the lowest salinity (l8:Yoo
S) conditions. Only the hypersaline treatments appeared
to alter the photosynthetic parameter, significantly reducing Pmax , alpha and Rd compared to controls.
Stage nI was more sensitive to salinity and temperature changes (Table 3). AH treatments significantly reduced Pmax , except the hypersaline-shock treatment
which increased it. Alpha increased significantly only in
the hypersaline-shock treatment. Rd decreased significantly at 30 oc.
Table 4 compares the components of the variability
of the photosynthetic parameters (Cochran's test of
heterogeneity of variance) within each stage in aH salinity and temperature treatments. In Stage 1, Pmax varied
similarly in aH treatments, although it was somewhat
higher at 30 oc. In contrast, significant differences
(P < 0.01) were observed for Stage lB. The hypersaline
treatments accounted for 92% of the total variability for
Stage III.
Alpha varied significantly between treatments in
Stage 1, with 60% of the total variability in the 30 oC
treatment. In Stage BI no significant difference was
observed for alpha. Here also, temperature treatment
was responsible for most variability (44% at 25 oC) .
For Rd , variability of Stage I was not significantly
different, but Stage III displayed significant differences.
with 65% of total variability in the 25 oC treatment.
Fig. I Grareloupia dor.~p/¡ora . a Fresh weight as a function of time
over 80 d in culture of sporelings [equation was obtained by fitting
fresh weight (y) versus time (x) with data from 18 replicates. where a.
b. c. d are constants]: b Stage 1; c Stage JII
693
Table 4 Grareloupia dorvplw ra.
Photosynthetic parameters
(percentage of total variance in
all treatments within each
Stage). Control conditions were
35%, S ( l.l osmol kg-l) and
20 oC
Trea tment
Control
18:Yoo S
65:Yoo S
25 oC
30 oC
Statistical difference
Pmax
Rd
C!
Stage I
Stage III
Stage 1
Stage III
Stage I
Stage III
9
26
O
21
44
O
3
92
3
2
7
lO
7
15
61
3
22
6
44
24
14
19
5
28
33
12
9
II
65
3
NS
**
**
NS
NS
**
The differences in the mean values for the photosynthetic parameters of Stages I and 111 shown in Fig. 2
were maintained throughout all the salinity and temperature regimes tested (Tables 2 and 3). Further analysis revealed that: (i) the particular salinity or
temperature treatments that changed photosynthetic
performance in both stages were different (statistical
comparison of the mean. Tables 2 and 3); (ii) the variability caused by all treatments was higher in Stage III
than Stage I (heterogeneity of variance. Table 4).
Regarding (i), only hypersaline shock affected both
stages. Pmax , alpha and Rd decreased in Stage I but in. creased in Stage 111. Changes in salinity affect physiological responses (Lapointe et al. 1984 and references
therein; Smi th and Berry 1986; Kirst 1989 and references
therein), but it is difficult to explain such different responses in two stages of the same species. There is no
data in the literature on intraspecific variation in physiological rates.
In Stage III, Pmax was significantly affected by all the
conditions tested and Rd was affected by a temperature
of 30 oC only (Table ~) . Several authors (Gatusso and
Jaubert 1985; Smith and Berry 1986; Kübler and Davison 1993) have reported an upper limit (threshold)
aboye which a further temperature increase would result
in a decrease in Pmax ' This may be 25 oC for Stage 111
samples of Grateloupia doryphora, although higher limits
(i.e. 35 oC) ha ve been reported for other algal species.
The same appears to be true for Rd when temperature
increases over 25 oc.
An analysis of the heterogeneity of the variance was
employed in this study since this measures the heterogeneity of the changes produced by all the treatments.
As shown in Table 4, the heterogenity of the variance
was higher for Stage III than for Stage 1. It is concluded
that the Stage J cultures did not vary between treatments, except for the 65 ~oo S treatment (Table 3), and
their responses were homogeneous (Table 4). They tolerated changes in salinity and temperature better than
Stage III .
In conclusion. several important differences have
been found between the photophysiology of young
sporelings (here called Stage 1) and adult thalli (Stage
III ) of Grateloupia doryphora. The pigment composition
of sporelings (more chlorophyll a and less RPE and RPC
than adults) promotes a better photosynthetic performance under chlorophyll a excitation. Unexpectedly, the
younger sporelings were also more tolerant to variations
in salinity and tempera tu re than Stage 111 - in which the
highest variation in mean photosynthetic performance
(Pmax and Rd ) was observed .
Acknowledgements This work was supported by the Government
of Canary Islands (Grant # 154/93). The fellowship of the University of Las Palmas G .c. to M .R. is also acknowledged .
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Editor
B A Whltton
Departmen t of Blological Sciences
UnlverSlt y of Durham
Durham . DH1 3L E. U.K.
Tel. (0191 ) 374-2427
Fax . (0191 ) 386-0619
E·mail : BA-WH ITTON @DURHAM .AC .UK
Dra P. Garcia-Jimenez
Departamento de Biologia
Universidad de Las Palmas G.c.
Campus de Tafira
35017 Las Palmas G.c.
Canary Islands
6 June 1997
Dear Dra Garcia-Jimenez,
Thank:s for your paper , "Plant growth regulators and glycerol induced cell growth and
morphogenesis in carpospore-seedlings cultivated in vitro" submitted to Journal of Applied
Phycology (provisional number BJ 774). (The paper has only just arrived - presumably taking
three weeks to get here!)
1 have forwarded copies to two reviewers and will contact you as soon as 1 get their
responses ; 1 hope this will be within a month.
Yours sincerely,
: ~
B. A. Whitton
AN INTER NAT IONAL JOU RNAL PUBLlSHED BY KLUWER ACADEM IC PUBLl SHERS
I
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JAP '1
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OC • .
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Ema l1 RENE M US e. ....,,:. .. . .
Plant growth regulators and glycerol induced cell growth and morphogenesis in carposp
seedlings cultivated in vitro.
Pilar Garcia-Jimenez, Marta Rodrigo & Rafael R. Rohaina (*)
Departmento de Biología. Universidad de Las Palmas G.c. Campus de Tafira. 35017 Las
Palmas G.c. Canary Islands.
Keywords : carpospore-seedling., celI and tissue culture, glycerol, Grateloupia doryphora,
macro alga, PGR' s, Rhodophyta.
(*) to whom correspondence should be addressed.
Abstract
Effects of different plant growth regulators and glycerol as a carbon so urce were studied on
axenic culture of carpospore-seedlings of Grateloupia doryphora. Carpospore-seedlings
showed particular forms of cell proliferation at the light rnicroscopicallevel, originating shoot
ernission, calli and organized cell masses in order to PGR' s used. When PGR' s were
combined with glycerol, the rate growth , cell division and further morphogenesis were
stimulated .
lntroduction
As stated by Gibor (1980), it was late 70 ' s since cell and tissue culture joined the laboratory
techniques applied to propagate algae for biotechnological purposes. Many species have been
tested, being the explant or callus culture focused on efforts made to clone macroalgae (Fig.
1). Cell cultures could be exploited, not only as a source of organized plant biomass (i.e.
regenerating callus) but also as a direct source of interesting compounds known or suspected
to accumulate in algae (Fig.l). In this approach, it does not matter the source of cells used to
obtain the heterotrophyc and fast growing cellular cultures if their growth, development and
production of interesting compounds were under control.
Still, the fine control of growth and development in vitro is lacking. Plant growth
regulators (PGR's) and carbon sources have been seldom found to induce growth and
development of algae in axenic culture (Gusev el al. , 1987; Aguirre-Lipperheide el al.,
1995).
Cytokinins, gibberellins and auxins have been identified and characterized to operate
endogenously in macroalgae (Bradley, 1991 ; Evans & Trewavas, 1991). Difficulties connected
with specific culture conditions, size or age of plant material can mislead the evaluation, the
effect of exogenous PGR ' s in algal cell and tissue culture remain, at least, controversial.
Several plant growth regulators have been tested with no success on explants (i.e. Laurencia,
Gelidium, Gracilaria and Grateloupia , Robaina, 1988 as own experience). When proved to
be effective, it is scarce a precise description ofthe structure induced (i.e. cell arrangement),
more important than the effect ofthe PGR' s by itself, as it can make the difference with
callus and callus-like structures obtained without PGR' s. Phenolic compounds (Fries, 1976,
1977), or the physical culture conditions (i.e. agarized versus liquid medium) exhibited
positively stimulatory effects on growth and development in a wide variety of algae cultivated
and propagated in vitro. Callus and callus-like structures were induced by increasing the agar
concentration ofthe culture medium (Polne-Fuller & Gibor, 1987; Robaina el al. , 1990a,
1990b; Robaina el al., 1992).
Searching for carbon sources, heterotrophic activity in macro alga have been reported
in a few scattered references (Neilson & Lewin, 1974; Markager & Sand-Jensen, 1990). We
have reported that glycerol as an extemal organic substrate stimulated vegetative growth and
shoot emission in explants and carpospore-seedlings of Graleloupia doryphora (Montagne)
Howe cultured in vitro (Robaina el al. , 1990a, 1990b). Besides it altered respiratory and
photosynthetic performance and induced cell division and biosynthesis (Robaina el al., 1995 ;
Robaina el al., 1996; Garcia-Jimenez el al. , 1996) .
Seedlings have not been used as material to start cell cultures in macroalgae. The
lack ofaxenic cultures could prevent it in most cases. The combined effect of carbon sources
and plant growth regulators on the pattern followed by the cells to became callus or shoots
have not been well established. In this work, carpospore-seedlings ofthe carragenophytic red
algae Graleloupia doryphora were aseptically cultivated in media containing glycerol and
plant growth regulators. We focus on the identification and precise microscopical description
of cell growth and morphogenesis of carpospore-seedling induced by a particular
concentration of glycerol and a regulator instead of non-completely defined morphological
changes promoted by complex PGR's balances and glycerol mixtures. We hypothesized that
carpospore-seedlings could be a source for cell culture of macroalgae if an appropiate
combination of glycerol as carbon source and plant growth regulator is encountered.
Material & methods
Culture conditions.
Thalli of Graleloupia doryphora (Sheet 129 ofthe LPA herbarium) were collected in the
upper and middle part ofthe littoral zone in Gran Canaria (Canary Islands). Fertile material
containing cystocarps were cut in 3 mm diameter and desinfected according to the methods
previously described (Robaina el al. , 1990a, 1990b). Sterile and fertile discs fragments were
then cultured in agarised Provasoli Enriched Seawater (PES, Provasoli, 1968) during 1 month
until carpospores were liberated (Garcia-Jimenez, 1994). Culture conditions were 30 ~ m-
2
s-¡ light intensity from cool white fluorescent lamps (Sylvania grolux) at the leve! ofPetri
dishes, 17 "2 lC temperature and on a 18 :6 h light: dark cycle.
Four stages could be distinguished during in vitro propagation ofthe carpospores
(Rodrigo & Robaina, 1997): stage O matched seedlings over aseptic explants (30 days old) and
culture medium. Stage 1 corresponded to gerrnlings transferred to Petri dishes with
autoclavated liquid PES medium. Stage n and
nI belonged to plants growing in aireated liquid
PES cultivated in Pyrex botdes. Pre!irninary experiments had shown that plant growth
regulators were ineffective or even inhibitory from stage 1 to stage nI.
AlI experiments were carried out with stage O carpospore-seedlings. Base culture medium
was solidified (0.8% agar) PES (Provasoli, 1968). Glycerol-containing media were prepared
with an enriched seawater medium based on PES which was supplemented with 0.1 M of
glycerol + 0.8 % agar (PES90-glycerol, Robaina el al., 1990a, 1990b, 1995), and made by
dilution ofthe seawater with distilled water (90% seawater) to reach 1 Osmol kg-¡ and to
stimate the combinated effect of glycerol and PGR. The osmolality was checked in an Autostat
TM osmometer (Daiichi kogaku Co. Ltd., Tokyo, Japan). PGR' s were individually added to
autoclavated PES or PES90-glycerol as filter-sterilized stock solutions of cytokinins
benzylarninopurine (BA) and kinetin (Kin); gibberellins as gibberellic acid (GA); auxins as 2,4
dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) and polyarnines putrescine (Put), sperrnine (Spm) and
3
Sperrnidine (Spd) at final concentrations of 10- M and 10-6 M in the medium. AlI chemicals
were from Sigma Chernical Company. The seedlings (12 to 20 per petri dish, c.a 45 per
treatment) were recultured each 15 days (3 recultures) . The experiments were repeated twice
with three replicates of each treatment.
To ensure that results were caused by the addition ofPGRs, control assays with PES, PES +
PGR 's and PES90-glycerol without PGR 's were run simultaneously.
Three specimens from each treatment were fixed with 2.5% glutaraldehyde in 0.1 M sodium
cacodylate buffer containing 0.3 M NaCl (pH 7.4) for 4 hours at room temperature. This was
followed by washing in the same buffer containing 0.3 M NaCI (2 x 30 minutes) and
embedded in glycol metacrylate (GMA, Historesin TM, Reichert-Jung, Gerrids & Smid,
1983). Serial sections of 5 I-lm thick, cut on a Reichert-Jung 2050 microtome and stained for
the observation of general morphology with toluidin blue and haematoxylin-eosin (Tsekos,
1983).
Indeces and statistics
The induction of callus, cell mas s and/or shoot emission was followed in each treatment. To
check whether the effect of a particular PGR contributes further to that of glycerol (cell
mas ses and shoot emission) (Robaina et al. , 1990a, 1990b; Garcia-Jimenez et al. , 1996), two
quantitive indeces were used: mas s growth index (MG) = diameter ofthe cell mas s in mm as
determined by using an electronic caliper (Mitutoyo Digimatic Caliper, Mitutoyo Co.);
morphogenic index (MI): the number of protrussions or shoots regenerated per seedling
(Robaina et al. , 1990a, 1990b; Robaina et al. , 1992). Mean values ofthe index in the different
treatments were compared to control (pES90-glycerol) by using mean comparison ofthe
statistical software SPSS 5.1.
Results
In PES, and in most of the control treatments with PGR ' s without glycerol (Table 1), the
carpospore-seedlings became a sporeling by regenerating shoots in two weeks (Fig. 2a).
Compact medulla and cortex were observed initially at the light microscopical level (Fig. 2b).
Shoot started as a small protrussion on a restricted zone of the carpospore-seedling (Fig. 2c),
which elongated to became a shoot with medullary and cortical cell layers well defined (Fig.
6
2d) . As shown in Table 1, shoot formation was also observed in treatments at 10- M 2,4-0
6
3
3
and BA so as at both concentrations tested of GA. BA 10- M and Kin 10- and 10- M were
inhibitory as the seedling did not develop further.
3
6
3
Calli were observed in 2,4-D at 10- M and Spm at 10- M and 10- M respectively
(Table 1, Fig. 3a). Calli extended from the surface ofthe seedling as a disorganized mas s of
tissue to cover almost enterely. At the rnicroscopicallevel , it was observed that disorganized
dense cellular mass formed the calli (Figs. 3b, c) .
Cell masses, which are typical of seedlings grown in glycerol, were also observed in
the treatments with Put and Spd alone (Table 1, Fig. 4a). Cell mas ses were produced by
multiple cells which were rapidly arranged in concentric and compact position to a clump
center (Fig. 4b). Then, protrussions commenced to proliferate and were constituted by rows of
small and rounded cells aligned with the medulla (inner cells) ofthe carpospore-seedling (Fig.
4c).
In Table 2 shown the quantification of cell growth and morphogenesis resulting from
the combination of the carbon source (glycerol) and PGR. Since glycerol was included in the
medium, all of the treatments stimulated or enhanced cell growth and morphogenesis as
indicated by the values ofthe index MG and MI obtained obtained in all treatments (except
those inhibitory) compared to the average values ofthe control s (Tab. 1). Glycerol prevented
6
the inhibitory effect at 10- M ofKin and the formation of calli observed when Spm and 2,4D were used alone (described aboye). Outstanding results were obtained with glycerol plus
polyarnines (Table 2) : cell growth (MG) increased due to cell division and cell masses became
even more morphogenic (MI) in treatments with Put, Spd and Spm.
Discussion
There are no doubt that plant growth regulators exist and participate in algal processes
analogous to that occurring in higher plants (Featonby-Srnith & Van Staden, 1984; Bradley,
1991 ; Bradley & Cheney, 1990; Evans & Trewavas, 1991 ; de Nys et al., 1991), but when
applied exogenously, procedures did not establish unequivocally what effects are originated
by these, natural and synthetic, growth substances. Recent literature reports plant growth
regulator effect on in vitro cultivated macro alga that made posible to induce and maintain
callus, free cell cultures or regenerate new plants (Bradley & Cheney, 1990; Kaczyna &
Megnet, 1993 ; Aguirre-Lipperheide et al. , 1995 and references therein; Yokoya & Handro,
1996). However negative test or the same results (callus, callus-like induction and/or
regeneration) were obtained without the addition ofplant growth regulators (Dawes & Koch,
1991 ; Robaina et al., 1992; Aguirre-Lipperheide et al. , 1995 and references therein) . On the
other hand, it has been reported for the same specie and the same treatments that differences
in explant originated differences in the results obtained (Bradley & Cheney, 1990). Or that,
despite simultaneous alteration of physical conditions were requiered in the PGRs containing
medium (i .e. air exposition in Gracilaria, Kaczyna & Megnet, 1993 or osmolality not fullcontrolled, Gusev et al. , 1987), the effect was only considered to be due to the PGR 's added .
Consequently, we can not ensure a priori whether a particular specie reacts to PGR's
or if the PGR's are strictly necessary to obtain that response.
The results obtained in this work with carpospore-seedlings could shed sorne light on the
controversy. The results in table 1 and 2 show that al! PGR' s tested clearly influenced cell
3
division and/or morphogenesis. An inhibitory effect was seen for the citoquinins: Kin at 10- M
6
6
and 10- M were inhibitory when tested alone but induced cell division at 10- M when
combined with glycerol. BA was inhibitory to the higher concentration, both alone and with
glycerol (Tab. 1, 2). The synthetic auxin 2,4-D contributed to in crease the cell growth and
morphogenesis. Effects promoted by polyarnines will be discussed below.
From our experience no carbon source, even the effective glycerol, have had effect on
seedlings or explants of G. doryphora at concentration below 0.1 M (Robaina et al. , 1990a,
1990b). Consequently the effect ofPGR as a carbon source is unlikely. Neither none ofthe
effects of PGR ' s observed can be related to agar concentratíon, which was constant, or to
osmolality which was also controlled.
As early as 1982 Trevawas pointed out that considerations should be given to the
actual sensitivity oftissues to growth substances. Previous experience showed us that explant
cultures of Graleloupia doryphora did not react to any auxin, cytoquinin or other PGR ' s
added to the culture medium . Even the so young Stage 1 of carpospore cultures of
Grateloupia doryphora obtained from the Stage O (carpospore-seedling) was "insensitive": the
effects ofthe PGR' s was only observed in the remaining tissue ofthe former Stage O.
The seedling seems to be more sensitive to PGR ' s than the explants of G. doryphora.
This is most probably due to its potential for growth and deve!opment, and it must be
exploited as a plant material for cell cultures,
Outstanding results were those obtained with the polyamines putrescine, spermidine and
spermine. When Put and Spd were tested alone, the carpospore-seedling became cell masses
with a cellular arrangement similar to that previously described in glycerol (Garcia-Jimenez el
al., 1996). Polyamines also enhanced and accelerated the effects of glycerol i.e. cell mass
induction and further shoot regeneration when they were combined as shown in table 3.
Polyamines are metabolic products of descarboxilation of the aminoacids ornithine and
arginine giving putrescine which is the precursor ofthe triamine spermidine and the tetraamine
spermine (Smith, 1985). Their respective concentration produced a range of effects in higher
plants comparable to that ofthe well known groups ofplant hormones (Galston & KaurSawhney, 1982; Smith, 1982 and references therein, 1985 ; Tiburcio el al. , 1993). To our
knowledge, this is the first work reporting its activity in seaweeds. In this work we focused
on the effects ofPGR' s when tested separate or in combination with glycerol. The
combination of different PGR and balances of polyamines with glycerol must be explore.
Tissue culture is normally understood as a tool to induce cells culture and its
propagation. Suitable culture conditions and the controlled use of plant growth substances for
calli induction and/or morphogenic effect are two main trends for the continuous advance in
this fie!d . Considering this and results in tables 1 and 2 and cell arrangement observed at the
microscopical leve!, it is concluded that the carpospore-seedling reacted to plant growth
regulators as summarize in table 3. To our knowledge, this is the first work reporting to plant
growth regulators positive effects on young stages of development (carpospore-seedling) of a
macroalgae.
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Table 1. Effects ofPGR 's on carpospore-seedlings ofGrateloupia dOlyphora : organized or
disorgaruzed cell growth. Significant differences could not be detected among treatments with
the same effect; shoot errussion ranged within 1. 70 to 6.83 shoot per morphogeruc seedling
and callus reached 0.5O "O. 15 of the cell mass diammeter (mm) in 2,4-D 10-3 M as the
maximum value.
None
(PES)
2,4-D
shoot
shoot
callus
BA
shoot
shoot
inhibitory
Kin
shoot
inhibitory
inhibitory
GA
shoot
shoot
shoot
Put
shoot
cell masses
cell masses
Spd
shoot
cell masses
cell masses
Spm
shoot
callus
callus
Table 2. Effect ofPGR 's on carpospore-seedlings of Grateloupia doryphora when combined
with glycerol. Values ofthe indeces ofgrowth (MG = diarnmeter ofthe cell mas s in mm) and
morphogenesis (MI = shoots per morphogenic seedling). Medium control was PES90glycerol. Data are the mean (SE) from two experiments with three replicates each .. (*) = P
<0.001 as compared to control. n.m = Non morphogenic. Inh.= carpospore-seddling looked
the same as the beginning ot the experiment.
Growth
Morphogenesis
(MG)
(MI)
None
Control
2,4-D
BA
10-6M
10-3 M
0.72
9.83
(0.08)
(1.25)
0.90
•
1.36
•
10-6 M
10-3 M
9.5
23 .5
·
(0.15)
(0.31)
(4 .34)
(4.68)
0.75
inh .
10
inh.
(0.13)
Kin
None
0.72
(4.9)
inh.
n.m
inh.
0.74
0.64
n.m
n.m
(0.07)
(0.05)
0.63
0.91
n.m
14.7
(0.10)
(0.15)
(0.09)
GA
Put
Spd
1.05
•
(0 .32)
Spm
1.21
•
(0.17)
•
(4.65)
•
0.83
16
(0.13)
(3 .51 )
1.18
•
(0.21)
•
18
•
(4.14)
12
•
(1.86)
•
18.5
(2.20)
Table 3.- Effect ofPGR's on growth Grateloupia doryphora when tested alone and/or
combined with glycerol.
PGR
Disorganized cell
24-D
10-3 M
,
growth. CALLI
Spm 10-3 M
Organized cell growth
PGR + Glycerol
shoot
2,4-D 10-6 M
24-D
10-3 , 10-6 M
,
enusslOn
BA 10-6 M
BA 10-6 M
GA 10-3, 10-6 M
MORPHOGENESIS
cell mas ses
Put 10-3 , 10-6 M
Put 10-3 ,10-6 M
SPd 10-3 , 10-6 M
SPd 10-3 ,10-6 M
Spm 10-3 ,10-6 M
GA 10-3 , 10-6 M
Figure captions
Fig.l Outline for algae propagation according to biotechnological purposes.
Fig.2 earpospore-seedlings of Grateloupia doryphora growing in Provasoli Enriched
Seawater. (A) Seedlings regenerating shoots (small arrows) x4 . (B) Transversal section of a
carpospore-seedling showing a compact medulla (m) and cortex (arrow). Stain haematoxylineosin. x120. (e) Longitudinal section ofa carpospore-seedling protruding a shoot at 2 days in
culture. Stain toluidin blue. x40 . (D) Longitudinal section ofa shoot of2 months old showing
medullar and corticallayers well defined . Stain toluidin blue. x130 .
Semithin sections 51lm.
3
Fig.3 eaUi of G. doryphora cultivated in 2,4-D 10- M. (A) Growth of calli from
carpospore-seedlings. x4 . (B) Transversal section of a calli. Note the disorganized mass
(headarrow). xIO . (e) Detail ofcalli disorganized area. Note uneven cellular arrangement
(arrow). x40 . Sections 51lm stained with toluidin blue.
Fig.4 eell masses of G. doryphora growing in 0.1 M glycerol. (A) Growth of cell
masses from carpospore-seedlings. x2. (B) Detail of a cell mass section. Note the organized
cellular disposition with regard to c1ump center (c). x40. (e) Longitudinal section ofcell
masses. Note as protrussions to proliferate (arrows) and the concentric cellular arrangement.
xIO . Semithin sections (5Ilm) stained with haematoxylin-eosin.
Fig.1
'".:;.: .