Mikrobiyolojik Tarama Sistemleri ve Mekanizmaları

MİKROBİYOLOJİK TARAMA
SİSTEMLERİ
VE
MEKANİZMALARI
Dr. Nafiz KOÇAK
GATA Haydarpaşa Eğt.Hst.
Mikrobiyolojik donör tarama testleri
 Transfüzyonla bulaşan enfeksiyonlar
yönünden bağışlanan kanların taranması,
kan güvenliği ve kullanılabilirliği
stratejilerinin bir parçasını oluşturmaktadır.
• Son 30 yıl içinde kan taramalarında kullanılmak üzere çeşitli
tipte mikrobiyolojik testler geliştirilmiştir.
• En yaygın kullanılan testler
– enfeksiyon ajanlarına karşı oluşan antikor, antijenler
veya
– nükleik asiti belirlemek üzere tasarlanmışlardır.
• Geliştirilmiş olan bütün testler her durum için uygun
olmayıp, her bir testin kısıtlamaları mevcuttur, bu sebeple
test seçerken bunların göz önünde bulundurulması
gerekmektedir.
Kan taramasında kullanılan başlıca test tipleri
İmmuntestler
Enzim immunassay (EIA)
Kemilüminesans immunoassay (CLIA)
Hemaglutinasyon (HA)/partikül aglutinasyon (PA) testleri
Hızlı/ basit tek kullanımlık testler (hızlı testler)
Nükleik
asit amplifikasyon teknolojisi (NAT) prensibine
dayanan testler
• Testlerin
– Duyarlılık, özgüllük,
– Maliyet
– Kolay kullanım
gibi kritik özeliklerine göre her bir enfeksiyöz etken için uygun test
tipinin seçilmesi gerekmektedir.
• Ayrıca son zamanlarda test üreticileri, otomasyon ile
duyarlılık ve özgüllükleri yükselen ürün geliştirmeye devam
etmektedir.
FDA (Food and Drug Administration), kan
kaynaklarının güvenliğinden emin olmak için lisanslı
tarama testlerinin kullanılması gerektiğini ifade
etmektedir
Kan donörlerinde enfesiyöz etken
taramasında kullanılan testler
Serolojik tarama testleri
Nükleik asit testleri (NAT)
HBsAg
Anti-HBc
Anti-HCV
Anti-HIV-1
Anti-HIV-1/2
Anti-HIV-2
Anti-HTLV-I/II
Anti- Treponema pallidum (Sifiliz antikorları)
Anti-CMV
Kombo testler
Anti-HIV-1/2 testi ve HIV-1 Antigen
HBV-DNA NAT
HCV-RNA NAT
HIV-1-RNA NAT
West Nile Virus-RNA NAT
Multipleks testler
Ülkemizde kullanılan mikrobiyolojik donör
tarama testleri:
• Ülkemizde şu anda yürürlükte olan 9/1/2007 tarih ve 26398 sayılı Resmi
Gazetede yayınlanmış olan Kan ve Kan Ürünleri Yönetmeliği’ne göre
• Donör kanlarına uygulanan zorunlu mikrobiyolojik tarama testleri;
HBsAg,
anti-HCV,
anti-HIV-1/2
sifiliz (RPR/VDRL) markırlarını içermektedir.
• Sağlık Bakanlığı tarafından onaylanmış test kitlerinden seçilmeli ve
üretici firmanın önerdiği çalışma prosedürleri takip edilerek
gerçekleştirilmelidir.
İmmunteknikler
• İmmunteknikler, antijen, antikor veya her
ikisinin tespit edilmesinde kullanılabilen, çeşitli
test formatlarında temin edilebilen test sistemleridir.
•
Antikor belirleyen testler,
•
Antijen belirleyen testler,
– donör örneğinde bulunan spesifik antikoru yakalayan
immobilize antijenlerin kullanımına dayanmaktadır (indirekt
immunoassay).
– örnekte bulunan patojene spesifik antijenleri yakalayan
immobilize antikorların kullanımı prensibine dayanmaktadır.
İmmunteknikler,
– orta ölçekli laboratuvarlarda tam otomasyon,
– küçük ölçekli laboratuvarlarda yarı otomasyon
gibi farklı şekillerde kullanılabilmektedir.
Antikor belirleyen testler
Antijen belirleyen testler
• Günümüzde
en
mekanizmaları
yaygın
kullanılan
serolojik
test
– Enzim immunassay (EIA)
– Kemilüminesans immunassay (CLIA)
• EIA ve CLIA’ların tasarımı benzerdir.
• Sadece oluşan immun komplekslerin belirlenme şekli farklılık
göstermektedir.
• EIA…………….renk oluşumu
• CLIA…………..kimyasal reaksiyonun ürettiği ışığın ölçümü
değerlendirilmektedir.
• Yüksek duyarlılıktaki bu testlerden herhangi biri, kan
taramalarının uygun bir şekilde değerlendirmesi için gerekli
olan hedef enfeksiyon markırlarını belirlemektedir.
• EIA ve CLIA
CLIA;;
– Çok sayıda örneğin taranması için uygundur
• özel ekipman gerektirmektedir.
– Manuel veya özel olarak tahsis edilmemiş otomatize test
sistemlerinde gerçekleştirilebilmektedir (açık sistem)
– Özel olarak belirli otomatize
üretilebilmektedir (kapalı sistem)
sistemler
için
de
EIA ve CLIA’lar, antijen veya antikoru immobilize eden
değişik katı fazlar içermektedir
• En yaygın kullanılan katı fazlar
 Polistiren mikrokuyucukların taban veya kenarları
 Polistiren veya diğer materyallerin yüzeyi
 Mikropartiküller
 Otomatize, kapalı test sistemlerinde kullanılan özel
tek kullanımlık araçların yüzeyleri;
 bunlar üretici firmaya göre değişmekte olup, genelde
polistiren yapıdadır
Günümüzde, kan kaynaklarının güvenliğinden
emin olmak için kullanılan FDA lisanslı veya
FDA tarafından açıklanmış zorunlu donör
tarama testlerine ulaşılabilmektedir
Ticari test isim(leri)
Yöntem
Üretici
Onay yılı
EIA
EIA
EIA
Abbott Laboratories
Bio-Rad Laboratories
Ortho-Clinical Diagnostics, Inc
2001
2003
2003
Abbott Laboratories
2006
Hepatit B virus (HBV)
HBsAg testleri (Hepatit B yüzey antijenini belirler)
Auszyme Monoclonal*
Genetic Systems HbsAg EIA 3.0
ORTHO Antibody to HbsAg ELISA
Test System 3
Abbott Prism HbsAg Assay
CLIA
*Donör tarama için lisans almıştır, ancak temin edilemeyebilir
HBsAg’nin rutin taraması, katı fazı Anti-HBs ile kaplı mikroplaklarda gerçekleşmektedir.
EIA prensibi ile çalışan test örneğinde;
enzimatik reaksiyon sonucu oluşan renk yoğunluğu mikroplak okuyucularında
spektrofotometrik olarak okunmaktadır.
CLIA prensibi ile çalışan test örneğinde;
örnekler, fare monoklonal anti-Hbs antikorları ile kaplı mikropartiküllerin bulunduğu reaksiyon
kuyularında inkube olmaktadır.
Mikropartiküllerdeki antijen-antikor kompleksi, akridinium ile işaretli (keçi) poliklonal anti-HBs
konjugatı ile tespit edilmektedir.
Sandwich ELISA (antijen)
4. Substrat eklenir, renk
gelişmesine neden olur
1. Ab kaplı
mikroplak tabanı
Y
3. Konjugat eklenir
(genelde anti-insan Ab)
Y
5. Renk gelişiminin
(reaksiyonun)
durdurulmasında genelde
asit solüsyonu kull. OD
okunur.
2. Hasta örneğinde
Antijen (var ise) antikora
bağlanır
5
3
1&2
4
• Reaktif bulunan örnekler için doğrulama testi yapılmalıdır.
• HBsAg doğrulama testi,
• anti-HBs
(insan)
nötralizasyon
yapılmaktadır.
antikorlarının
doğrulama
kullanıldığı,
lisanslı
prosedürü
ile
• Nötralizasyon testi doğrulanan örnekler HBsAg pozitif
olarak kabul edilmektedirler.
Anti-HBc Testleri (Hepatit B kor antijenine karşı oluşan
toplam antikorları (IgG+IgM) belirler)
CORZYME*
EIA
Abbott Laboratories
1991
Ortho HBc ELISA Test System
EIA
Ortho-Clinical Diagnostics, Inc
1991
ABBOTT PRISM HBcore
CLIA Abbott Laboratories
2005
*Donör tarama için lisans almıştır, ancak temin edilemeyebilir
• HBsAg’den hemen sonra ortaya çıkan bu antikor, HBsAg
temizlenmesini takiben tespit edilebilir hale gelir.
• HBsAg’nin kaybolduğu ve anti-HBs’nin ortaya çıkması
geciktiğinde, anti-HBc; yakın zamanda geçirilmekte olan
HBV enfeksiyonunun tek markırı olabilmektedir.
• Donörlerde anti-HBc taranması (IgG ve IgM) rekombinant-hepatit B
kor antijeni (rHBcAg) ile kaplı plaklarda gerçekleştirilmektedir
• EIA prensibi ile çalışan test örneklerinde;
•
Enzimatik reaksiyon sonucu oluşan renk yoğunluğu mikroplak okuyucularında
spektrofotometrik olarak okunmaktadır.
• CLIA prensibi ile çalışan test örneklerinde,
– rekombinant HBc antijeni ile kaplı mikropartiküller kullanılır
– Antijen-antikor kompleksi akridinium ile işaretli insan anti-HBc konjugatı ile
belirlenmektedir.
• Reaktif bulunan örneklerin tekrar test edilmesi gerekmektedir
• Tekrarında da pozitif bulunan donör örnekleri pozitif olarak
kabul edilmektedir.
indirekt ELISA (antikor)
Hasta serumundaki
antikorlar
antijen
Substrat kullanımı ile
renk değişimi
Anti-human
antikoru
+
-
ANTİ HCV TANISINDA ELISA TESTLERİ
Her yöntemden bir sonra çıkan yeni jenerasyon kitler HCV serolojisini bir adım
daha ileriye götürmüştür.
1 nci kuşak
•Rekombinant antijen
C-100-3 (NS3 ve NS4)
•HCV
epidemiyolojisindeki
ilk
bilgiler bu testlerle elde edilmiştir.
•Duyarlılık ve özgüllükleri düşük
olup,
serokonversiyonu
saptamada yetersiz testlerdir.
•Günümüzde kullanımdan kalkmış
olan testlerdir.
2 nci kuşak
•Rekombinant antijenler
•C-100-3
•C-22 (kor bölg.)
•C-33-c (NS3)
•daha duyarlı ve özgül
•destekleyici testlere ihtiyaç var
•Herhangi bir 2 nci kuşak ELISA kiti
ile alınan sonucun farklı bir
antijenik yapı gösteren başka bir
kit
ile
doğrulanması
gerekmektedir.
3 üncü kuşak
•Rekombinant antijenler
•C-100-3
•C-22 (kor bölg.)
•C-33-c (NS3)
•NS5 antijenleri
•HCV
genomunun
uç
bölgelerindeki antijenleri içerdiği
için;
•infeksiyonun
herhangi
döneminde tanıyı daha
olanaklı kılmaktadır.
bir
da
Hepatit C virus (HCV)
Anti-HCV testleri (HCV’ye karşı oluşan antikorları belirler)
Chiron RIBA HCV 3.0 Strip
Immunoblot Assay
Abbott HCV EIA 2.0
Abbott PRISM HCV
Ortho HCV Version 3.0 ELISA Test
System
SIA
1999
EIA
Novartis Vaccines
and Diagnostics, Inc
Abbott Laboratories
CLIA
Abbott Laboratories
2007
Ortho-Clinical
Diagnostics, Inc
2009
EIA
2004
EIA ile çalışan test örneğinde;
– plak kuyu yüzeyleri rekombinant
antijenleri ile kaplıdır.
HCV
protein
• Testte 3 rekombinant HCV antijeni kullanılmaktadır:
– (i) c22-3 proteini……...kor bölgesi
– (ii) c200 proteini….......NS3 ve NS4
– (ii) NS5 proteini…….HCV replikasyon enzimini (viral polimeraz)
kodlayan, yapısal olmayan gen bölgesi
CLIA ile çalışan test örneğinde;
– Reaksiyon kuyularında
mikropartiküller içerir.
rekombinant
antijenler
ile
kaplı
• Kullanılan rekombinant antijenler;
– c100-3 proteini……....NS3 ve NS4
– HCr43 proteini………...kor (1-150 aa) ve NS3 (1192-1467 aa )
– NS5 proteini……………(2054-2995 aa)
• Ag-Ab kompleksi, akridinium ile işareti konjugat (anti-insan
IgG) ile belirlenir.
– Reaktif sonuçlar tekar edilir.
– Tekrar testlerinde de reaktif bulunan donasyon örneklerin
doğrulaması;
• Kalitatif RIBA-immunblot strip test (SIA) ile yapılır.
İnsan immun yetmezlik virus (HIV)-1 ve -2
Anti-HIV-1/2 Testleri (HIV tip 1 ve2’ye karşı oluşan antikorları belirler)
Genetic Systems HIV-1/HIV-2 Plus O
EIA
HIVAB HIV-1/ HIV-2 (rDNA) EIA
ABBOTT PRISM HIV O Plus
EIA
Bio-Rad Laboratories
2003
EIA
Abbott Laboratories
2004
CLIA
Abbott Laboratories
2009
Anti-HIV-1 testleri (HIV-1’e karşı oluşan antikorları belirler)
Genetic Systems rLAV EIA
HIV-1 (Western Blot)
EIA
EIA
Bio-Rad Laboratories
Cambridge Biotech
Corp
1998
2008
Bio-Rad Laboratories
1990
Anti-HIV-2 testi (HIV-2’ye karşı oluşan antikorları belirler)
Genetic Systems HIV-2 EIA
EIA
EIA test örneği (1);
– HIV-1 ve HIV-2 env (zarf)
– HIV-1 ve HIV-2 pol (polimeraz)
gen ürünlerinin korunmuş immunodominant bölgelerinden üretilmiş
sentetik 4 peptit karışımı kullanılmaktadır.
EIA test örneği (2);
– HIV-1 kor ve env
– HIV-2 env viral proteinlerinden üretilen rekombinant DNA (rDNA)
kullanılmaktadır
– HIV-1/2’ye karşı oluşan IgG ve IgM antikorlarını birlikte
belirleyebilmektedir.
CLIA test örneği;
– HIV-1 grup M env,
– HIV-1 grup O env
– HIV-2 env viral proteinlerinden üretilmiş rDNA
– HIV-2 env sentetik peptidi kullanılmaktadır.
• Reaktif bulunan örnekler, tekrar testine alınmalı
• İkinci testte de reaktif bulunduklarında doğrulama
testlerinin yapılması gereklidir.
• Doğrulama testi,
• HIV-1 Western blot yöntemi
• Ancak test HIV-1 ve HIV-2
yapamamaktadır.
reaktivitesinin
ayrımını
• HIV-1/2 taramasında son yıllarda kullanıma giren
kombo test örnekleri;
• Kemilüminesans mikropartikül immunassay (CMIA)
veya
• EIA prensibi ile çalışmaktadır.
Ticari test isim(leri)
Yöntem
Anti-HIV-1/2 ve HIV-1 antijen testi
ARCHITECT HIV Ag/Ab Combo
CMIA
Üretici
Abbott
Laboratories
Bio-Rad GS HIV Ag/Ab Combo EIA
EIA
Bio-Rad
Laboratories
Chemi-luminescent Microparticle Immunoassay (CMIA)
Onay yılı
2010
2011
CMIA
• HIV p24 antijeni + HIV-1 (grup M ve grup O) ve/veya HIV-2
antikorlarının
birlikte
kalitatif
belirlenmesine
imkan
tanımaktadır.
• Sonuçlar kemilüminesan reaksiyonun ölçülmesi ile elde
edilmektedir.
EIA
• HIV-1 p24 antijeni + HIV-1 (grup M ve O) + HIV-2
antikorlarını taramaktadır
• Reaktif bulunan örneklerde test tekrarı yapılmaktadır.
• Tekrarda reaktif bulunan örnekler büyük ihtimal pozitif olarak kabul
edilmektedir.
• Ancak enfeksiyonun düşük prevelansta görüldüğü yerlerde non-spesifik
reaksiyonlardan dolayı,
– immun blot testleri,
– antijen testleri
– HIV NAT ile doğrulanması gerekmektedir.
• Kombo testler akut veya primer HIV-1/2 enfeksiyonunun tanısını
desteklemek için kullanılmaktadır.
– Kombo test ile reaktif bulunan sonuçlarda belirlenen p24 antijeni,
HIV-1 veya HIV-2 antikor ayrımı yapılamamaktadır.
• Şu an donör serum veya plazma örneklerinin taranmasında
etkinlikleri tam olarak ortaya konulmadığı için rutin
kullanımları yoktur.
Human T-Lymphotrophic Virus Types I ve II
Anti-HTLV-I/II Testleri
Abbott HTLV-I/HTLV-II EIA
EIA
Abbott Laboratories
1997
Vironostika* HTLV-I/II Microelisa
System
ABBOTT PRISM HTLV-1/HTLV-II Assay
EIA
bioMerieux, Inc
1998
Abbott Laboratories
2008
CLIA
*Donör tarama için lisans almıştır, ancak temin edilemeyebilir
HTLV-I/II EIA;
– mikroplak kuyu tabanları
• pürifiye HTLV-I ve HTLV-II viral lizatı
• rekombinant HTLV-I p21E antijeni ile kaplıdır.
HTLV-I/II CLIA;
– katı faza sabitlenmiş viral antijenler
– Ancak HTLV-I ve HTLV-II reaktivitelerinin ayrımını yapamamaktadır.
• Test tekrarında (farklı örnek) reaktif bulunduğunda;
• Doğrulama testleri;
– Western Blot
– RIPA (radyoimmunopresipitasyon
– Bu testlerin kombinasyonları HTLV kor (gag), p24 ve env (gp46,
gp61/68)
antijenlerine
karşı
oluşan
atikorların
ayrımını
yapabilmektedir.
Sifilizin
günümüzde kan transfüzyonu ile taşınması, soğuk saklama
koşullarında 72 saatten daha fazla yaşayamadığı için çok nadirdir.
Bu sebeple transfüzyon riski göz ardı edilebilmektedir.
Non-treponemal flokülasyon kart testi
Rapid plazma reagin (RPR) test
Veneral disease research laboratory (VDRL) test
Test,
enfeksiyonun erken dönemleride hasara uğrayan hücrelerden
salınan reagin olarak adlandırılan lipoidal materyallere ve T. pallidum
lipidlerine karşı oluşan IgG ve IgM anti-lipid antikorlarının flokülasyon
prensibi ile ölçmektedir.
Non-treponemal testler sifiliz tanısında faydalı
olsa da, spesifik değildir.
• Treponemal testler
•
– Hemaglutinasyon testi
– Mikrohemaglutinasyon
testi
(otomatize mikroplak sistemlerinde T.
pallidum antikorlarının taranması)
Test,
– Aglutinasyon ve patern tanımına prensibine
dayanmaktadır.
– Testte T. pallidum ile sensitize edilmiş tavuk
eritrositleri kullanılır.
– Donör örnekleri ile sensitize eritrositler karıştırılır,
etkene
karşı
antikorların
varlığında
hemagutinasyonun oluşması beklenir.
– Reaktif örnekler T. pallidum’a karşı IgG ve/veya
IgM antikorlarının varlığını gösterir.
Tekrar pozitif sonuçların lisanslı doğrulama testi ile değerlendirilmesi
gereklidir.
Bir örneği, EIA ile çalışmaktadır ve T. pallidum’a karşı IgG antikorları kalitatif
olarak belirlemektedir.
Non-treponemal test pozitif olarak belirlendiğinde treponemal
doğrulama testi (floresan treponemal absorbsiyon testi, FTA-ABS) ile
tekrar analiz edilmelidir
• Bu örnekler treponemal testte negatif bulunduğunda örnek negatif olarak
kabul edilmektedir.
• Treponemal testler ile pozitif bulunan donörler donasyon için uygun
değillerdir.
Sifiliz yönünden donör taramalarında FDA tarafından açıklanmış
tanısal serolojik testlerin yeterli olduğu belirtilmektedir
Ticari test isim(leri)
Yöntem
Üretici
Açıklanmış serolojik donör tarama testleri
Capture®-S
Olympus PK TP System
ASI TPHA Test
CAPTIA TM Syphilis (T. Pallidum)-G
Non-treponemal
Treponemal
Treponemal
Treponemal
Immucor
Fujirebio Inc.
Arlington Scientific, Inc
Trinity Biotech
FTA-ABS Test System
Treponemal
SCIMEDX Corporation
REMEL RPR Card Test
Non-treponemal
ASI VDRL Antigen Test
ASI RPR Card Test
TRUST (Toluidine Red Unheated
Serum Test)
Non-treponemal
Non-treponemal
Non-treponemal
Abbott Laboratories,
Diagnostic Division
Arlington Scientific, Inc
Arlington Scientific, Inc
New Horizons Diagnostics
Corporation
Açıklanmış serolojik doğrulama testleri
Açıklanmış tanısal serolojik testler
Açıklanma
yılı
2000
2003
2003
2010
1996
1983
CMV için de FDA tarafından açıklanmış donör tarama testleri
bulunmaktadır.
CMV tarama testleri IgG ve IgM total antikorları belirlemektedir.
CMV taşınma riskinin yeterince azaltılması için taramaların lökositten zengin doku,
hücre ve plazmalardan test edilmesi gerekmektedir.
CMV reaktif bulunan antikor testlerinin donörün uygun olmadığı anlamına
gelmemektedir
Ticari test isim(leri)
Yöntem
Üretici
Anti-CMV testi (CMV’ye karşı oluşan antikorları belirler)
BD CMVscan Card Test
Lateks Aglutinasyon
Capture - CMV
Solid phase red cell
adherence
Solid phase enzyme
immunoassay
Passive particle
agglutination
Abbott CMV* Total AB
EIA
Olympus PK CMV-PA
System
*Donör tarama için lisans almıştır, ancak temin edilemeyebilir
Becton, Dickinson &
Company
Immucor, Inc.
Abbott Laboratories,
Diagnostic Division
Fujirebio, Inc.
Açıklanma
yılı
1995
1995
2007
Partikül aglutinasyon testleri
• Test örneğindeki spesifik antikor veya antijenin
varlığını, komplementer spesifik antijen veya
antikor ile kaplı partiküllerin aglutinasyonu yolu ile
belirlemektedirler.
• Aglutinasyon testlerinde, özellikle antikor
testlerinde eritrosit (hemaglutinasyon) ile
jelatin ve lateks gibi inert partiküller
kullanılmaktadır.
• Bu inert partiküllerin kullanılması krosreaktivite gösteren eritrosit antijenlerine
karşı, nonspesifik reaksiyonları azalttığı
için avantaja sahiptir.
Hemaglutinasyon ve partikül aglutinasyon testlerinin temel
prensibi, kullanılan partikül tiplerine bakılmaksızın aynıdır.
• Partikül aglutinasyon testleri, sifiliz antikorlarının
belirlenmesinde halen yaygınlıkla kullanılmaktadır.
• Bu testler, çok basamaklı değildirler veya yıkama ekipmanına
ihtiyaç duyulmamaktadır.
• Manuel sistemde, test sonuçları görsel olarak okunmaktadır ve
değerlendirme subjektiftir.
• Test sonuçlarının kalıcı kaydı yapılamadığı için
saklanamamaktadır.
Hızlı/basit tek kullanımlı testler
(hızlı testler)
• Hızlı/basit tek kullanımlı testler kullanıldıktan sonra atılmaktadırlar.
• Bu testlerin çok sayıda farklı hazırlanış şekilleri vardır.
• Birçok hızlı test immunokromatografik şekilde olup,
– örnek, sabit bir strip üzerine eklenmektedir ve daha önce immobilize edilen
reaktif ile reaksiyona girmektedir.
– Örnekler serum, plazma veya bazı durumlarda tam kan olabilmektedir.
– Pozitif reaksiyon strip üzerinde nokta veya band şeklinde gözlenmektedir.
– Testlerin çoğu, her bir testte sonuçların değerlendirilebilmesi için kontrol
noktası veya bandı da içermektedir
Reaktif
Negatif
• Hızlı testlerın kullanımı basittir ve test kiti içinde gelenler
dışında başka reaktifler gerektirmemektedir.
• Sonuçlar görsel olarak okunmaktadır ve dakikalar içinde
basit kalitatif sonuç vermektedir.
• Sonuçların okunması subjektif değerlendirmeye bağlıdır ve
sonuçların saklanması için orijinal testin kalıcı kaydı
yapılamamaktadır.
 Hızlı testler, çok sayıda kan örneğinin taranması için
genelde uygun değildirler
Nükleik asit amplifikasyon teknolojisi (NAT)
prensibine dayanan testler
• Kan taramasında kullanılan NAT, donasyon örneklerinde;
– viral nükleik asit, DNA veya RNA’nın varlığını belirlemektedir.
• Bu teknolojide, virusun spesifik RNA/DNA parçası hedeflenmektedir ve
in-vitro amplifiye edilmektedir.
• Amplifikasyon basamağı, orijinal örnekte düşük seviyelerde bulunan
virusun miktarını artırarak tespit edilebilir düzeye getirmektedir.
• Spesifik nükleik asitin varlığı, virusun varlığını gösterir ve donasyon
muhtemelen enfeksiyözdür.
• NAT teknikleri,
– bireysel (tek) donasyonlarda
veya
– mini havuzlarda
gerçekleştirilebilmektedir.
• Genellikle kullanılan NAT testleri
–
–
–
–
HBV-DNA
HCV-RNA
HIV-1-RNA
WNV-RNA
NAT teknolojisi emek yoğun olduğu için kan
endüstrisi genellikle mini havuz test algoritmalarını
benimsemiştir
• Donasyon örnekleri 16-24’lü havuzlarda test
edilmektedir.
• Pozitif çıkan havuzlar sonra pozitif örneği
bulmak için tek tek analiz edilmektedir.
FDA onaylı NAT prensibine dayanan donör tarama testleri
Ticari test isim(leri)
Yöntem
HBV NAT (Direkt HBV DNA’yı belirler)
Üretici
Onay yılı
Procleix Ultrio Plus assay
TMA
Gen-Probe, Inc.
2006
COBAS AmpliScreen HBV Test
PCR
Roche Molecular Systems Inc.
2007
UltraQual™ HBV PCR Assay
PCR
National Genetics Institute
2011
UltraQual HCV RT-PCR Assay
PCR
National Genetics Institute
2001
Procleix Ultrio
TMA
Gen-Probe, Inc.
2006
HCV RT-PCR assay
PCR
BioLife Plasma Services
2007
COBAS Ampliscreen HCV Test Version
2.0
PCR
Roche Molecular Systems
2007
HCV NAT (HCV RNA’yı direkt belirler)
HIV-1 NAT (HIV-1 RNA’yı direkt belirler)
UltraQual HIV-1 RT-PCR Assay
PCR
Versant HIV-1 RNA 3.0 (bDNA)
Signal amplification
nucleic acid probe
TMA
Procleix Ultrio
National Genetics Institute
2001
Siemens Healthcare Diagnostics, Inc
2002
Gen-Probe, Inc.
2006
APTIMA HIV-1 RNA Qualitative Assay
HIV-1 RT-PCR Assay
TMA
Gen-Probe, Inc.
2006
PCR
BioLife Plasma Services
2007
COBAS AmpliScreen HIV-1 Test, version 1.5
PCR
Roche Molecular Systems
2007
Abbott RealTime
HIV-1 Amplification Kit
PCR
ABBOTT Molecular, Inc
2007
Procleix WNV Assay
TMA
Gen-Probe, Inc
2005
Cobas TaqScreen West Nile Virus Test
PCR
Roche Molecular Systems, Inc.
2008
WNV NAT (WNV RNA’sını direkt belirler)
Birden fazla virusa ait DNA veya RNA’yı aynı anda
belirleyebilen multipleks NAT tarama testleri geliştirilmiştir
Ticari test isim(leri)
Yöntem
Üretici
Onay
yılı
Procleix HIV-1/HCV Assay/Nucleic Acid Pooled
Testing/Synthetic
TMA
Gen-Probe, Inc
2004
COBAS TaqScreen MPX Test HBV, HCV, HIV-1
(Grup 0 ve M RNA), HIV-2
PCR
Roche Molecular Systems, Inc.
2008
• Günümüzde, NAT kullanan ülkeler;
– ABD, Kanada, Fransa, Avustralya, Yeni Zelanda,
Güney Afrika, Avrupa ve Asya
PCR ve TMA
• NAT-tarama teknolojisi;
– PCR (polymerase chain reaction)
– TMA (transcription-mediated amplification)
prensibi ile çalışılmaktadır.
 En yaygın kullanılan NAT testlerinden biri, HBV-DNA, HCV ve HIV-1 RNA’yı
TMA prensibi ile amplifiye etmekte ve amplifikasyon
ürünlerinin tespiti hibridizasyon prensibine dayanmaktadır.
 TMA, transkripsiyon temelli nükleik asit amplifikasyonudur.
 MMLV revers transkriptaz ve T7 RNA polimeraz enzimleri kullanılmaktadır.
 Revers transkriptaz…….. DNA kopyasını (T7 RNA polimeraz için promoter dizi
içermektedir) oluşturmakta,
 T7 RNA polimeraz…….DNA kalıplarından birçok RNA amplikonları
üretmektedir.
 Tespit ise kemilüminesan ile işaretli tek zincirli nükleik asit problarının
hibridizasyonu ile olmaktadır.
• Yaygın kullanılan diğer test PCR tabanlı HBV, HCV ve HIV-1
testleridir .
• Amplikonların
tespiti
biotin
ile
işaretli
hibridizasyonu prensibine dayanmaktadır.
probların
Tarama platformları
• Tam entegre ve otomatize,
• Yarı-otomatize
• Modüler otomatize
• Bireysel donör testleri;
– Örnek dilüsyonu yapılmadan, bağışlanan her bir kan ünitesine yapılır.
– Bu sebeple NAT testi için en duyarlı yöntemdir.
– Pencere dönemi süresince viral titre genellikle düşüktür ve bireysel donör testleri
yüksek duyarlılığını bu süreçte devam ettirmektedir.
• Havuzlanmış test;
– Birçok donörden alınan örneklerin test edilmeden önce birleştirildiği havuzlanmış test
ise, büyük hacimde kan işleyen birçok kan merkezi tarafından tercih edilir
Tarama testi olarak NAT kullanımı
• Pozitif test sonucu için antikor yanıtının başlamasını gerektirmediği için
konvansiyonel testlerden daha duyarlı bir test metodu
• İnfeksiyon meydana geldiğinde bulunan düşük seviyelerde virus
genetik materyalini belirleyebilmekte
• “Pencere dönemi” veya donörün virusa maruz kalması ile antikorların
ortaya çıkması arasında kalan süreyi belirgin biçimde düşürmektedir.
Pencere döneminin azalması ile enfeksiyon etkenlerinn daha erken
belirlenmesine izin vermekte ve böylece transfüzyon ile bulaş olasılığı
azalmaktadır.
• Ayrıca mutantları (immunovaryant viruslar), okkült olguları (kronik
taşıyıcılar) ve serolojide yanlış negatiflikleri de belirleyebilmektedir.
Test seçimi
• Uygun testlerin seçilmesi, tarama programlarının önemli bir
parçasıdır.
• Güvenilir sonuçlar, geçerliliği olan etkin testlerin tutarlı
(sürekli) kullanılmasına bağlıdır.
• Birçok faktör test seçimine etki etmektedir.
– Tarama ihtiyaçları ve mevcut kaynaklar (mali durum, uzman
personel, ekipman, tek kullanımlık sarf malzemeler) arasında denge
sağlanması gerekir
• Her bir tarama sisteminin avantaj ve kısıtlamaları mevcuttur,
bu sebeple test seçerken bunların göz önünde
bulundurulması gereklidir.
• Bazı kısıtlamalar şunlardır;
– Enfeksiyonun, tarama testlerinin belirleyemediği pencere
dönem uzunluğu
– Donasyonların boşa harcandığı ve gereksiz donör
reddine sebep olan, yanlış pozitiflik oranı
– Otomasyon gerektiren bazı sistemlerin karmaşıklığı
• EIA, CLIA ve partikül aglutinasyon testleri
– Birçok durumda, nisbeten küçük
taranmasında uygun testlerdir.
veya
çok
sayıda
örneğin
– Bu test formatları, sonuçların hızlı testlerden daha objektif analiz
edilmesine ve kayıt altında tutulmasına izin vermektedir.
– Ancak, kullanım öncesi bütün testlerin sıkı bilimsel değerlendirmeden
geçmesi, duyarlılık ve özgüllük bakımından uygunluğunun
belirlenmesi gerekmektedir.
– Birçok EIA ve CLIA testi, partikül aglutinasyon testleri veya hızlı
testlerden daha yüksek duyarlılık ve özgüllüğe sahiptir.
– Bütün rutin markırlar için, ticari yüksek kalitede partikül aglutinasyon
testleri mevcut değildir.
• Hızlı/basit – tek kullanımlık testler
– Kan taramasında kullanımları tavsiye edilmemektedir.
– Bu testler esas olarak tanısal amaçlı olup, az sayıda örneklerin hızlı
biçimde test edilmesi için tasarlanmışlardır.
– Manuel teknikler ile çalışıldığı için orta
laboratuarlarda kullanımı sınırlı olabilmektedir.
ve
büyük
ölçekli
– Hızlı sonuç almak için acil durumlarda kullanıldıklarında, testin daha
sonra EIA, CLIA veya partikül aglutinasyon testlerinden biri
kullanarak tekrar edilmesi gerekmektedir.
• NAT uygulamaları
– NAT enfeksiyonun pencere dönemini azaltmasına
rağmen, enfeksiyonun düşük insidanslı olduğu ülkelerde,
donasyon sırasında pencere dönemindeki donör sayısı
düşük olduğu için kazanç (verim) minimaldir.
– Ancak enfeksiyonun yüksek insidanslı oluğu ülkelerde,
NAT ile pencere dönemindeki çok sayıda donasyon
belirlenebilmektedir.
– Bu sebeple, pencere döneminde toplanan kan
ünitelerinin transfüzyon riski NAT ile azaltılabilmektedir.
Yeterli kaynaklara sahip ülkeler için,
NAT antikor/antijen testleri ile kombine
edildiğinde önemli fayda sunmaktadır.
Testlerin önemi özellikleri
• Özgüllük ve duyarlılığın mümkün veya mevcut en yüksek seviyede
olması gereklidir.
• Her bir testin, kullanılacağı ülke veya bölgede, test performansı ile ilgili
teknik veriler doğrulanarak ve mümkün ise diğer çalışmaların verileri
analiz edilerek değerlendirilmelidir.
• Testin güvenilirliği ve uyumunu,
– test ve kullanıldığı laboratuvar ile ilgili birçok faktör belirlemektedir.
– Her bir testin kullanılacağı yerde, değerlendirme sonuçlarının
performansına göre onaylanması gerekmektedir.
• Teste spesifik faktörler:
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
Test tanıtımı
Talimatların anlaşılırlığı
Kullanım kolaylığı
Test özellikleri (duyarlılık ve özgüllük gibi)
Örnek hacmi
Örnek ve reaktif takibi
Dayanıklılık
Test tekrarlanabilirliği ve hassasiyeti
Her teknik için test sayısı
Kit ölçüsü
Toplam test süresi
• Laboratuvara spesifik faktörler:
– Test edilen örnek sayısı
• Personel seviyesi:
– Personel yeterliliği
– Mevcut ekipman
– Laboratuvar kalite sistem düzeyi
• Tedarik ile ilgili dikkat edilmesi gerekenler:
–
–
–
–
–
–
–
–
Bayi seçimi ve geçerlilik
Fiyat
İhale sistemi
Test kitleri ve reaktif kaynaklarına ulaşılabilirlik ve
güvenilirliği
Kit ve reaktiflerin raf ömrü
Altyapı: örn., kontrollü depolama koşulları ve kesintisiz
güç kaynakları
Sorun çözme için teknik destek
Ekipman bakımı, servis ve onarım
Testlerin gerçekleştirilmesinde
otomasyon kullanımı
•
Otomasyon kullanımı, çok sayıda tarama testi gerçekleştiren kan transfüzyon
servislerinde büyük önem taşımaktadır.
•
EIA’ler için basit düzeyde otomasyon gerekse de (otomatik plak yıkayıcı ve
okuyucu), örneklemeden sonuçların okunmasına kadar tüm aşamaları
gerçekleştiren bazı komplike otomatize tarama sistemleri de bulunmaktadır.
•
Mikroplak tabanlı olan ve ekipman veya test ile bağlantılı olmayan bu test
sistemler “açık sistemler” olarak adlandırılmaktadır.
•
Özel “kapalı sistemler” ise tamamen otomatizedir ve ekipman üreticisi
tarafından temin edilen reaktif ve kontroller ile çalışmaktadır.
•
Tamamen otomatize bu sistemler, kullanıcı hatalarını azaltmak ve test
performansını artırmak için yoğun merkezlerde tavsiye edilmektedir.
•
Bununla birlikte açık sistemlerin maliyeti daha azdır