Diagnóstico molecular em doenças infecciosas

Prof. Dr. Antonio Carlos Pignatari
Laboratório Sergio Franco-DASA
Hospital 9 de Julho
Material biológico
• Sangue
• Líquor
• Urina
• Secreção respiratória
• Secreção de pele, subcutâneo e mucosas
• Fezes
• Líquido articular, pleural, pericárdico, ascite, humor
aquoso e vítreo
• Biópsias
Testes rápidos para detecção do
agente etiológico
Microscopia
Antígeno
Anticorpo
Acido nucleico: RNA, DNA
Espectometria: Proteínas
Testes rápidos
Dengue
HIV
Influenza
Adenovirus
Sincicial respiratório
Estreptococo do grupo A
Antígenos de meningococo, pneumococo, e haemophilus em líquor
Pneumococo em urina e líquido pleural
Estreptococo do grupo B em secreção vaginal
Toxina A e B de Clostridium difficile
Legionela em urina
Monotest – mononucleose infecciosa
Microbiologia molecular
diagnóstica
Custo benefício para os pacientes
Custo benefício para o hospital
Custo benefício para o laboratório clínico
Custo benefício para o sistema de saúde público e
privado
Vantagens
Alta sensibilidade e especificidade
Possibilidade de quantificação
Rapidez no processamento laboratorial
Pre-requisitos
Necessidade de laboratório especializado em biologia
molecular
Equipe tecnica especializada
Com exceção do GeneXpert
Plataformas de amplificação e
detecção de ácidos nucleicos
PCR convencional – gel de agarose, in house
Real-time PCR – varios marcadores para emissão de
sinal, curvas de amplificação com detecção
computadorizada, formato simples ou multiplex, in
house ou kits comerciais
Microarray – multiplex
Luminex – multiplex
GeneXpert
Sequenciadores – 16 S, 18 S
REAÇÃO DE POLIMERIZAÇÃO EM
CADEIA - PCR
1983 - Kerry Mullis – Thermus aquaticus
Oligonucleotideos iniciadores – primers
Termocicladores – amplificação das cópias de DNA – 2n
72° C
T 94° C
52°C a 65° C
Saiki et al., 1988
Konena et al., 2006
Multiplex-PCR
Detecção de MβL
Mendes et al. J Clin Microbiol. 2007.
Diagnóstico Molecular
em Amostras Clínicas
Amplificação do DNA - PCR EM TEMPO REAL
Equipamentos
Kit comerciais
PLATAFORMA ROCHE
PLATAFORMA APPLIED BIOSYSTEM
METODOLOGIA
SYBR GREEN
TAQMAN
FRET
LightCycler®
www.roche.com
In House
METODOLOGIA
SYBR GREEN
TAQMAN
7500 REAL TIME PCR SYSTEM
www.appliedbiosystems.com.br
Multiplex RT-PCR
Detecção de MβL
SPM – 798 bp; 83,5° C
SIM – 569 bp; 80,4° C
VIM – 382 bp; 88,5° C
IMP – 188 bp; 77° C
GIM – 72 bp; 72° C
Mendes et al. J Clin Microbiol. 2007.
LUMINEX MULTIPLEX
Virus Respiratórios
Infecções intestinais - virus, bactérias,
protozoários e toxinas (E. coli, Clostridium difficile,
Toxina shiga-like)
Liquor - bactérias, vírus , fungos
Sangue – bactérias e fungos
Sequenciamento do gene blaKPC
Seqüência Editada Pesquisada no Banco do NIH utilizando o programa BLAST
Principais testes disponíveis para
infecções virais
Carga viral para HIV
Carga viral para virus das hepatites B e C
PCR qualitativo e quantitativo para CMV
PCR para Influenza H1N1
Painel Viral Respiratório
PCR para Enterovirus
PCR para Herpes virus : Herpes simples, Varicela
zoster EB virus e CMV
PCR para Parvovirus
PCR para adenovirus
Principais testes disponíveis para
infecções bacterianas
PCR para Clostridium difficile
PCR para Mycobacterium tuberculosis
PCR para detecção de genes de resistência a
antimicrobianos : mecA, vanA, KPC, New Dehli,
PCR para Clamídea (trachomatis e pneumoniae)
PCR par Mycoplasma pneumoniae
PCR para meningococo, pneumococo e haemophilus
(liquor)
GENES DE RESISTÊNCIA A
ANTIMICROBIANOS
Bactérias Gram positivas:
• mecA – resistência a Betalactâmicos - Staphylococcus
• vanA; vanB – Resistência a Vancomicina - Enterococcus
Bactérias Gram negativas:
• ESβL: blaCTX-M; blaTEM; blaSHV: Resistência aos Betalactâmicos com
excessão de Cefoxitina, Cefotetan e Carbapenêmicos
• Carbapenemases: blaKPC : Resistência a Carbapenêmicos
• Metalo-β-Lactamases: blaIMP; blaVIM; blaSPM : Resistência a
Carbapenêmicos e Betalactâmicos (exceto monobactâmicos)
Silveira et al., 2006
Bush, 2010
Hackbarth et al., 1989
Laboratory diagnosis of viral respiratory tract infections in a Children’s Hospital in São Paulo, Brazil, one year study.
Pignatari, A. C. C.; Cruz, S. E. M; Faro, L. B.; Gaburo, N.; Bousso, A.; Sapieza, A.; Lora, F. M.; Almeida, L. R.
Background
Acute respiratory tract infection in children represents a high number on the World Health Organizations statistics data, the high incidence of respiratory tract infection is highly observed in developing countries including
Brazil. Viruses are recognized as the major cause of these infections and usually suspected in clinical practice. Emerging virus and new stains is well detected by Molecular Biology methods, the sensibility and specificity
allows Molecular Biology to detect more than one virus of the panel from the same sample allowing specific treatment.
Methods
All results of respiratory virus panel of all pacients of a children´s hospital in the city of São Paulo Brazil from January to December 2013 were collected using the laboratory system Motion ®. The respiratory virus panel is
done by RT-PCR Microarray: CLART® Pneumovir. The molecular biology panel detects Influenza A, Influenza A H1N1 strain 2009, Influenza B, Parainfluenza1, 2, 3 and 4, Syncycial Respiratory Virus (SRV) A and B,
Adenovirus, Bocavirus, Metapneumovirus, Coronavirus, Enterovirus and Rhinovirus.
Results
1325 samples were tested on the respiratory virus panel, 1437 tests were positive Tab1,2,3 considering samples
with more than one positive virus. The months with higher positivity were from march to june these months
represent the colder seasons the begin of autumn and the begin of winter in Brazil. April showed the major
positivity, 28% when compared with the other months Tab2. The most frequent viruses identified were, SRV
36%, Bocavirus 14%, Methapneumovirus 7,2% and Adenovirus 6,3%. The samples analyzed were collected from
Children from 0 to 14 years old and the positivity in young children under 2 years old is observed in 80% of the
positive samples and on April that showed the highest positivity, 94%, the samples were from children under 2
yeas old.
Tab1. Number of processed panel and positive results
JAN
FEB
MAR
APR
MAY
JUN
JUL
AGU
SEP
OCT
NOV
DEC
60
69
175
288
252
181
132
56
38
46
22
75
34 (56%)
54 (78%)
149 (85%)
Total of panel
Positive
251 (87%) 174 (69%) 102 (56%) 58 (43%) 31 (55%) 26 (68%) 27 (58%) 12 (54%) 20 (26%)
Tab2. Identified virus by RT-PCR Microarray – CLART Pneumovir
JAN
FEB
MAR
APR
MAY
JUN
JUL
AGU
SEP
OCT
NOV
DEC
Total
%
Adenovirus
5
2
14
19
18
10
4
2
3
4
5
3
89
6,30%
Bocavírus
4
6
17
54
47
35
8
10
8
6
3
3
201
14,00%
Enterovírus (echovírus)
4
6
17
24
8
8
3
0
0
3
3
2
78
5,50%
Influenza A
0
0
0
0
1
1
0
0
0
0
0
1
3
0,30%
Influenza A H1N1/2009
0
0
3
15
12
3
2
0
0
0
0
0
35
2,50%
Influenza B
0
0
1
4
5
6
0
1
2
1
0
0
20
1,40%
Influenza C
0
0
2
3
o
2
0
0
1
0
0
0
8
0,60%
Methapneumovírus A
2
5
6
4
Methapneumovírus B
3
2
11
5
6
10
6
4
2
8
2
0
59
4,20%
Parainfluenza 1
0
0
1
2
5
1
1
0
0
0
0
0
10
0,70%
Parainfluenza 2
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0%
Parainfluenza 3
2
3
2
7
7
3
3
2
4
2
1
4
40
3,00%
Parainfluenza 4
4
7
3
4
3
2
0
0
40
1
5
7
5
6
2
0
4
0
0
0
4
34
2,50%
18
43
67
37
39
18
26
7
8
5
9
287
20%
RSV A
4
19
75
165
84
33
28
10
1
6
1
4
430
29%
RSV B
1
1
23
37
27
5
3
1
2
3
0
0
103
7%
38
64
221
414
269
162
79
64
33
43
20
30
1437
100,00%
Total
Number of Virus/ positive
JAN
FEB
MAR
APR
MAY
JUN
JUL
AGU
SEP
OCT
NOV
DEC
1 virus/ positive panel
31
45
92
131
107
56
37
22
19
14
5
13
2 virus/ positive panel
2
9
42
86
46
36
21
8
7
11
6
4
3 virus/ positive panel
1
0
14
26
14
7
0
1
0
2
1
3
4 virus/ positive panel
0
0
1
8
6
2
0
0
0
0
0
0
5 virus/ positive panel
0
0
0
0
1
1
0
0
0
0
0
0
Conclusion
The molecular panel detected a wide range of respiratory virus, including 2 stains of Influenza A
H3N2, this shows that molecular biology keeps the best methodology to identify respiratory tract
viruses. The results is given in two or three days, for over 90% of the samples the rapid test to
detect SRV were realized which is helpful for the primary clinical practice but the rapid test does not
have precise identification and it detects only one virus, the most important pathogen, other
important virus are only detected by the molecular panel.
References
1. Diniz, E.M.A; Vieira R.A; Ceccon M.E.J; Ishida M.A; Flávio Adolfo Costa Vaz F.A.C. Incidence of
respiratory viroses in preterm infants submitted to mechanical ventilation.
3,00%
10
Rhinovírus
Tab3. Positive panel according with the number identified by test
Temporary Number: 958
Permanent Number: B-048
Title: Laboratory diagnosis of viral respiratory tract infections in a Children’s Hospital in São Paulo, Brazil,
one
year study
Session: 10/Infectious Disease
GeneXpert®: The Molecular Lab in
a Cartridge
3 areas of assays
Infectious Disease
Oncology
Genetic Disease
All Testing Done Within Cartridge
Sample Prep
Amplification
Detection
Same Basic Cartridge
Works With all Tests and GeneXpert®
Systems
GeneXpert cartridge: High
complexity lab in a small package
(FDA Moderate complexity)
A Better Way to Platform Design
GeneXpert
Infinity-48
GX-16
GeneXpert®
Module
GX-1
GX-4
Diagnóstico Molecular
em Amostras Clínicas
Kit comerciais - Cepheid’s Xpert
Xpert SA Nasal Complete
Xpert vanA
Xpert C. difficile
Xpert MRSA/SA SSTI
Xpert MRSA/SA BC
Xpert MRSA
Xpert EV
Xpert GBS
Xpert HemosIL
Smart GBS
http://www.cepheid.com
Solution: Rapid, reliable intrapartum test for GBS
colonization
Results starting at 35 min !
Sample =vaginal swab
1. Break off swab in port
labeled S for sample
2. Reagent 1 into port 1
3. Reagent 2 into port 2
27
Genetics of Rifampin Resistance
in M. tuberculosis
rpoB gene
Deletion
AATTCATGG
Deletion
Deletion
GACCAG GAACAA
Deletion
CCATTC
Deletion
GGCACC
Deletion
CAGAAC
Insertion Insertion
TTCATG
TTC
Del
AAC
GGCACCAGCCAGCTGAGCCAATTCATGGACCAGAACAACCCGCTG TCGGGGTTGACCCACAAGCGCCGACTGTCGGCGCTG
507
* ********** * *** *
* *
81 base pair core region
******
**
**** *
* 533
Majority of mutations associated with rifampin resistance
Occur in 81 base pair (27 amino acid) region of rpoB (RNA polymerase gene)
Cepheid Gene Xpert® C difficile Assay
Place swab with stool into buffer vial, vortex, pipette into cartridge.
• Rapid detection of toxin B gene in
47 minutes
• 99% Sensitive, 91% Specific vs
Direct Toxigenic culture
• Detects the 027 epidemic strain
Close top and place into instrument.
Inter-relatedness of Healthcare Associated
Pathogens
Which is often treated with
clindamycin
VRSA (or VISA)
Clostridium
difficile
MRSA
Which may lead to
Which can donate
the vanA resistance
gene
Which selects for
Which is treated with
oral vancomycin
VRE
Which selects for
PAGE | 30
Surveillance Methods
Microbiology
Culture
BD Gene-Ohm
Conventional
Real time PCR
• Least cost
• Medium labor
• Slowest TAT
• Medium cost
• Most labor
• Run in batches
• Medium TAT
GeneXpert®
Real time PCR
• Highest cost
• Least labor
• Random access
• Rapid TAT
Previous gold standard (2+ day TAT)
Detection of Cytotoxin B direct from stool in cell culture
Cell culture cytotoxin neutralization (CCCN)
Stool supernatant
Normal, negative
or toxin + antitoxin =
neutralized (no effect)
<1% of U.S. labs doing this
test and it takes at least 2
days
Positive - CPE
Emergence of an epidemic strain
BI/NAP-1/027
REA
PFGE
PCR Ribotype
Toxinotype III
• Associated with hospital outbreaks of severe disease
• Associated with severe morbidity (toxic mega-colon, sepsis•
•
•
•
like syndrome)
High case-fatality rate
Fluoroquinolone resistant
Produces >20x more toxin B (due to a deletion in TcdC toxin
production regulatory gene) & a binary toxin
Produces larger #s of spores, leading to larger inocula and
easier transmission
Enzyme immunoassays for toxins A&B
97% of U.S. labs doing this test !!
Takes < 2 hrs
Glutamate Dehydrogenase (GDH)
Clostridium difficile “common antigen”
thought to be present in all strains
Cepheid Gene Xpert® C difficile Assay
Place swab with stool into buffer vial, vortex, pipette into cartridge.
• Rapid detection of toxin B gene in
47 minutes
• 99% Sensitive, 91% Specific vs
Direct Toxigenic culture
• Detects the 027 epidemic strain
Close top and place into instrument.
Phoenix ®
BD
Vitek 2®
BioMérieux
Identificação
Bacteriana
Api ®
BioMérieux
MicroScan Walkaway ®
Dade Behring
RT-PCR
16s
MALDI-TOF na Microbiologia
Espectro de Massa
Bactéria
(Amostra)
Proteínas
Carboidratos
Lipídios
DNA
RNA
…
MALDI-TOF
Característica da
espécie
Impressão Digital
“fingerprint”
MALDI
Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization
Processo de ionização por dessorção a laser assistida por matriz
Ionização
Dessorção
Laser
Formação de íons
Liberação de uma
substância de uma
superfície ou através dela
Amplificação da luz
estimulada por
radiação
Espécies químicas
eletricamente carregadas
Matriz
Molécula orgânica
envolvida no processo
de ionização e
dessorção
Energia (comp. de onda) para o
processo de dessorção
MALDI-TOF
Time of Flight
+
Tubo sob vácuo
Tempo de Vôo
MALDI-TOF
Time of Flight
+
Tubo sob vácuo
Tempo de Vôo
Tempo de extração da amostra:
5 minutos
300 µL H2O
Transferência
900 µL etanol
direta da
colônia
absoluto
Alça
2 min/13.000
rpm
Ponteira
50µL ácido fórmico
70% + 50µL
acetonitrila
1 µL
sobrenadante
2 min/13.000
rpm
Swab
Microflex LT MALDI-TOF
Tempo de Análise:
1 minuto por amostra
MALDI Biotyper 2.0
+ 1 µL de matriz
1 µL de matriz
(ácido alfa-ciano-4
hidroxicinamico)
10 mg/mL)
Tempo de preparo:
segundos
Espectros de Massa
Diferentes
Microorganismos
Diferentes Espectros
de Massa
Carbonnelle et al. Clin Biochem. 44:104-109, 2011.
MALDI-TOF em Etapas
Identificação da espécie
Interpretação dos dados
Geração de um
Espectro protéico
Inoculação
na placa de MALDI-TOF
Seleção da colônia
Microrganismo
desconhecido
?
Limitações
Banco de Dados
Fungos filamentosos
Microorganismos com parede espessa
Testes de sensibilidade
Número de células (mínimo 104)
Vantagens
Custo
R$ 0,40 por amostra
Apresenta ¼ do custo de outras metodologias
Fácil implementação
Fácil manuseio
Somente instalação elétrica
Não gera resíduos
Simples preparação da amostra
Software – simples operação
Não precisa de especialista em massas
Tempo
Preparo de placa e resultados
(entre 1 - 2 horas / 96 amostras)
Confiável Acima de 98% de acurácia
Paciente
Diminui o custo
Diagnóstico e terapia em menor tempo
Identificação (MALDI-TOF MS) + Teste de Sensibilidade
Painéis para uso comunitário
Infecções respiratórias
Infecções intestinais
Infecções de SNC
Painéis para uso hospitalar
Infecções respiratórias
Infecções intestinais
Infecções de SNC
Infecções de corrente sanguínea
Culturas de vigilância
Pneumonia bacteriana
Acinetobacter baumannii
Bordetella pertussis
Chlamydophila pneumonia
Haemophilus influenza
Haemophilus influenza (Type B)
Klebsiella pneumonia
Legionella pneumophila
MRSA - Meth. resistant S. aureus
PVL gene
Moraxella catarrhalis
Mycoplasma pneumonia
Neisseria meningitides
Pseudomonas aeruginosa
Staphylococcus aureus
Streptococcus pneumonia
Streptococcus pyogenes Group A
Pneumonia atípica:
Bordetella pertussis
Chlamydophila pneumonia
Legionella pneumophila
Mycoplasma pneumoniae
Virus respiratórios
Coxsackie viruses/echovirus
Adenovirus types 3, 4, 7, 21
Human Bocavirus
Human Coronavirus
Human metapneumovirus
Influenza A - Human influenza
Influenza A - H1N1-09
Influenza B
Parainfluenza virus type 1,2,3,4
Respiratory syncytial virus A
Respiratory syncytial virus B
Rhinoviruses
Infecções em ambiente hospitalar
Acinetobacter baumannii
Enterobacter aerogenes
Enterobacter cloacae
Enterococcus faecalis
Enterococcus faecium
Escherichia coli
Klebsiella pneumonia
Proteus mirabilis
Pseudomonas aeruginosa
Serratia marcescens
Stenotrophomonas maltophilia
Streptococcus pyogenes Group A
MRSA - Meth. resistant S. aureus
Staphylococcus aureus
PVL gene
Methicillin resistant coag. neg. Staph
Coagulase negative Staphylococcus
Staphylococcus epidermidis
Cultura de Vigilância
MRSA
ESBL
VRE
Is repeat test needed for the diagnosis of Clostridium difficile
infection if PCR is the method?
Robert F. Luo, Niaz Banaei (Stanford UMC)
J. Clin. Microbiol. 2010. 48:3738-
<1% repeat tests
gave + result <7
days
293 patients (24% of all pts)
406 repeat tests (ave. 1.5/pt)
PCR Sens 87.2%; Spec 98.6%
Result following
the first test with a
negative result
7 new TP’s at ≥7
days