Endversion Master Arbeit - GV

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Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover
Stressbelastung durch die von der GV-SOLAS
empfohlenen Blutentnahmemethoden bei der
Maus
MASTER ARBEIT
Zur Erlangung des Grades
Master of Science des Studienganges
Biologie der Tiere
vorgelegt von
Anja Schlichting
Magdeburg
Inhaltsverzeichnis
1. Abkürzungsverzeichnis
5
2. Einleitung
6
3. Literaturübersicht
8
3.1 Narkose
8
3.1.1 Ether
9
3.1.2 CO2
9
3.1.3 Sevofluran
10
3.1.4 Isofluran
10
3.2 Richtlinien für die Blutentnahme
3.2.1 Blutvolumen der Maus
11
3.2.2 Empfohlene Blutentnahmemenge
11
3.3 Blutentnahmemethoden
12
3.3.2 Punktion der Vena saphena
16
3.3.3 Punktion der Vena facialis
17
3.3.4 Punktion der Schwanzvene
19
3.3.5 Punktion des Venenwinkels
20
3.4 Stress
21
3.4.1 Stressnachweis im Blut anhand von Glucocorticoiden
21
3.4.2 Stressnachweis anhand des Verhaltens im Open Field
22
4. Material und Methoden
4.1 Versuchstiere
4.1.1 Haltung
4.2 Versuchsgruppen
24
24
24
25
4.2.1 Narkoseversuch
25
4.2.2 Blutentnahmeversuch
25
4.3 Versuchsablauf
11
26
4.3.1 Basalwertbestimmung von Corticosteron
26
27
27
2
4.4 Narkose
4.4.1 Sevofluran
28
4.4.2 Isofluran
29
4.4.3 Ether
29
4.4.4 CO2
29
4.4.5 Sham
29
4.4.6 Kontrollen
29
30
4.5.1 retrobulbäre Blutentnahme
30
4.5.2 Blutentnahme aus der Schwanzvene
31
4.5.3 Blutentnahme aus der Vena saphena
32
4.5.4 Blutentnahme aus der Vena facialis
32
4.5.5 Blutentnahme aus dem Venenwinkel
33
4.6 Videoaufnahme
34
4.7 Open Field
34
4.8 Aufbereitung des Blutes
35
4.9 Bestimmung von Corticosteron mittels ELISA
35
4.10 Statistische Analysen
36
5. Ergebnisse
5.1 Narkose
37
37
5.1.1 Einleitung der Narkose
37
5.1.1.1 Zeit bis zur Ataxie
37
5.1.1.2 Zeit bis zum Erreichen einer operativen Tiefe
38
5.1.2 Verhalten direkt nach der Narkose
39
5.1.2.1 Zeit bis zum Erwachen aus der Narkose
39
5.1.2.2 Gesamtaktivität nach der Narkose
39
5.1.3 Blutanalyse
41
5.1.3.1 Hämatokrit
41
5.1.3.2 Corticosteron
42
5.1.4 Open Field
28
44
3
5.1.4.1 gelaufene Gesamtstrecke
44
5.1.4.2 maximal gelaufene Strecke
45
5.1.4.3 Zonenübertritte
46
5.1.4.4 Latenz des ersten Auftretens
46
5.1.4.5 gelaufene Geschwindigkeit
47
5.1.4.6 Aufenthaltsdauer in der Mitte des Open Fields
48
5.2 Blutentnahme
5.2.1 Dauer für die Blutentnahme
49
49
5.2.1.1 Dauer für die Durchführung der reinen Blutentnahme
49
5.2.1.2 Gesamtdauer für die Blutentnahme
51
5.2.1.3 Quantität des gewonnenen Blutes
52
5.2.2 Gesamtaktivität nach der Blutentnahme
53
5.2.3 Blutanalyse
55
5.2.4 Open Field
57
57
58
59
5.2.4.4 Geschwindigkeit
60
61
62
6. Diskussion
63
6.1 Narkose
63
6.2 Blutentnahme
66
7. Zusammenfassung
72
8. Literaturverzeichnis
74
9. Danksagung
82
4
1. Abkürzungsverzeichnis
ACTH
Adenocorticotropes Hormon
CO2
Kohlenstoffdioxid
CRH
Corticotropin-releasing Hormon
EDTA
Ethylendiamintetraacetat
ELISA
Enzyme Linked Immunoabsorbent Assay
ER
Endoplasmatische Retikulum
FELASA
Federation of Laboratory Animal Science Associations
GV-SOLAS
Gesellschaft für Versuchstierkunde - Society for Laboratory
Animal Science
k.A.
keine Angaben
KGW
Körpergewicht
MAC
Minimale Alveoläre Anästhetikumkonzentration
MW
Mittelwert
RPM
Rounds per Minute
s
Sekunde
SD
Standardabweichung
ZNS
Zentralnervensystem
5
2. Einleitung
Beim wissenschaftlichen Arbeiten mit Tieren wird häufig das Blut der Tiere
benötigt, um Untersuchungen wie Antikörper- bzw. Hormonbestimmung und
ähnliches durchzuführen. Bei kleinen Labornagern gibt es verschiedene
Methoden der Blutentnahme, die je nach dem wissenschaftlichen Anliegen
besser oder schlechter geeignet sind. Vor einer Entnahme muss deshalb
überlegt werden, von welcher Qualität das Blut sein soll. Außerdem spielt die
Menge der Blutprobe eine entscheidende Rolle. Dabei ist zu bedenken, ob es
eine finale Blutentnahme sein soll, oder ob einmalig bzw. mehrmals Blut
gewonnen werden soll. Die Häufigkeit der Blutentnahme muss an das
Blutvolumen des Tieres und seine Regeneration angepasst sein. Ein weiterer
wichtiger Faktor, der beachtet werden muss, ist der Stress, der bei der
jeweiligen Blutentnahme für das Tier entsteht. Zum einen verändert eine
erhöhte Stresshormonausschüttung die Versuchsergebnisse, zum anderen
sollen für das Tier bei der Entnahme möglichst wenig Schmerzen, Leiden oder
Schäden auftreten.
Aus allen diesen Gründen wurden verschiedene Blutentnahmemethoden wie
die Punktion der Schwanzvene, die Herzpunktion oder die Entnahme aus dem
retrobulbären Venenplexus entwickelt. Diese Methoden sind etabliert und
werden häufig bei Mäusen angewendet.
In einer vorherigen Studie wurden zwei von der GV-SOLAS (1999)
empfohlenen Methoden zur Blutentnahme, die retrobulbäre Blutentnahme und
die Punktion der Vena facialis mit einer Lanzette, auf Stress für das Tier
untersucht. Dabei wurden die Blutentnahmen sowohl mit Ether, CO2, als auch
ohne Narkose durchgeführt. Es stellte sich anhand der Corticosteron
Konzentration und dem Verhalten im Open Field heraus, dass die retrobulbäre
Blutentnahme ohne Narkose bei der Maus scheinbar die geringste
Stressantwort auslöst. Die Inhalationsnarkosen schienen den Stress zu
erhöhen. Bei der Punktion der Vena facialis führte die CO2 Narkose zu mehr
und die Ether Narkose zu weniger Stress (Schlichting et al., 2008).
6
Aus diesem Grund soll in dieser Arbeit zum einen untersucht werden, welchen
Einfluss Ether-, CO 2 -, Sevofluran-, und Isofluran-Narkosen auf die
Stressreaktion der Maus haben.
Zum anderen werden alle von der GV-SOLAS (2009) empfohlenen
Blutentnahmemethoden: die retrobulbäre Blutentnahme, die Punktion der Vena
saphena, der Vena facialis sowie der Schwanzvene und die Blutentnahme aus
dem Venenwinkel auf Stress untersucht. Ziel ist es eine Aussage der
Stressreaktion der Mäuse sowohl auf eine Blutentnahme, als auch auf eine
Narkose zu treffen. Dazu werden Corticosteron-Bestimmungen durchgeführt
und das Verhalten direkt nach der Narkose bzw. Blutentnahme, sowie im Open
Field beobachtet.
7
3. Literaturübersicht
3.1 Narkose
Narkotika dienen dazu, bei operativen Eingriffen Schmerzen zu vermeiden. Sie
schalten sowohl die Erregungsleitung als auch die Erregungsbildung des
zentralen Nervensystems aus. Als Folge ergeben sich Analgesie,
Bewusstlosigkeit und Muskelerschlaffung (Forth et al., 2005). Um dieses
Stadium zu erreichen, werden die Narkotika injiziert oder inhaliert. Im Rahmen
dieser Masterarbeit wird näher auf die Inhalationsnarkotika eingegangen.
Bei Nagetieren erfolgt die Narkoseeinleitung am stressfreiesten in einer
Ganzkörperkammer (Flecknell et al., 2009). Bei der Einleitung der Narkose
gelangt das Narkotikum wie zum Beispiel Halothan, Methoxyfluran, Ether oder
CO2 in den Respirationstrakt. Durch die Diffusion an der Alveolarmembran
gelangt es schließlich in den Blutstrom der Lunge und wird über den
Blutkreislauf in die Gewebe verteilt. Die Inhalationsnarkotika verfügen über eine
ausreichende Penetrationsfähigkeit, so dass die Blut-Hirn-Schranke kein
Hindernis darstellt. Der genaue Wirkmechanismus der jeweiligen Narkotika ist
bislang noch nicht geklärt (Forth et al., 2005). Volatile Anästhetika
unterscheiden sich in ihren physikochemischen Eigenschaften, wie dem
Dampfdruck, dem Öl-Gas-Verteilungskoeffizienten und dem Blut-GasVe r t e i l u n g s k o e f fi z i e n t e n . D e r D a m p f d r u c k u n d d e r B l u t - G a s Verteilungskoeffizient bestimmen die Aufnahmefähigkeit durch die Lunge,
während der Öl-Gas-Verteilungskoeffizient eine Voraussage über die
anästhetische Potenz erlaubt. Als Maßeinheit für die Wirksamkeit eines
Inhalationsnarkotikums wird die minimale alveoläre Anästhetikumkonzentration
(MAC) verwendet, was einer Konzentration im Verteilungsgleichgewicht
entspricht, bei der 50% der Patienten keine Abwehrreaktion auf einen
definierten Schmerzreiz zeigen (Forth et al., 2005). Je niedriger dieser Wert ist,
desto besser die anästhetische Wirkung des Inhalationsnarkotikums.
8
3.1.1 Ether
Ether wird bei Labortieren, vor allem Ratten und Mäusen, häufig als Narkotikum
eingesetzt. Die Narkose ist gut steuerbar und beeinflusst kaum die Atem- und
Herzkreislauffunktion. Außerdem wirkt Ether analgetisch und ist
muskelrelaxierend (Henschler und Rummel, 1987). Die Analgesie tritt schnell
ein, da Ether eine Depression des ZNS bewirkt (Green, 1979). Allerdings soll
Ether eine starke Reizung der Schleimhaut des Respirationstraktes bewirken,
ist leicht brennbar und explosiv (Hedrich, 2004). Die Explosionsgefahr besteht
schon ab einer Konzentration von 1,8% im Luftgemisch und 2,1% in Sauerstoff.
Diese Konzentration ist jedoch auch für eine Anästhesie notwendig (Fish et al.,
2008). Aus diesem Grund wird Ether im Laborgebrauch als Narkotikum nur
noch selten verwendet. Im Vergleich zu O2-NO2-Halothan erzeugt Ether mehr
Exzitationen und eine größere Urinproduktion bei Ratten (van Herck, 2001).
Tabata (1998) beschreibt, dass eine Ether Anästhesie bei einigen
Mäusestämmen, vor allem B6C3F1- und ICR-Stämmen, einen schnellen
Anstieg des Plasma Glukose Levels bewirkt.
3.1.2 CO2
Kohlenstoffdioxid kombiniert mit Sauerstoff kann für kurzzeitige Narkosen bei
kleinen Versuchstieren für kleine Eingriffe wie Blutentnahmen, Entnahmen von
Gewebsproben oder Injektionen genutzt werden (Abel und Bartling, 1978). Es
ist nicht brennbar und erst in hohen Konzentrationen giftig. Dadurch ist es für
den Experimentator ungefährlich, kostengünstig und zeigt eine schnelle
narkotische Wirkung bei Mäusen (Otto, 2004). Die genaue Wirkung von CO2 ist
noch nicht geklärt. Einige Autoren sind der Meinung, dass die Narkose durch
eine Hyp- oder Anoxie ausgelöst wird. Andere Autoren befürworten jedoch die
Theorie, dass CO2 selbst eine narkotische Wirkung hat (Corbach, 2006).
Allerdings wird der Einsatz von CO2 als Narkosegas kontrovers diskutiert.
Einige Autoren konnten anhand von Studien mit CO2 Veränderungen im
Verhalten und physiologische Antworten bei Tieren beobachten, die auf
Schmerzen und Stress der Tiere hinweisen, wie Hyperventilation und
Fluchtverhalten. Andere Autoren befürworten jedoch den Einsatz von CO2
9
sowohl als Narkose, als auch zum Euthanasieren (Conlee et al., 2005). In
unseren vorherigen Studien fanden wir, dass Inhalationsnarkotika (Ether und
CO2) bei der retrobulbären Blutentnahme zu mehr Stress führten, als eine
Blutentnahme ohne Narkose (Schlichting et al., 2008).
3.1.3 Sevofluran
Sevofluran ist ein halogenierter Ether, der nicht brennbar und explosiv ist. Es
liegt als klare Flüssigkeit vor und benötigt zur Narkoseeinleitung einen
s p e z i e l l e n Ve r d a m p f e r. A u f g r u n d e i n e s n i e d r i g e n B l u t - G a s Verteilungskoeffizienten von 0,69 und einem MAC von 2,5% (Maus) flutet
Sevofluran bei der Narkoseeinleitung rasch an, was eine schnellere
Bewusstlosigkeit als bei der Einleitung der Narkose mit Isofluran bewirkt (Forth
et al., 2005). Wallin et al. (1975) konnten bei Mäusen während der
Narkoseeinleitung mit Sevofluran keine Anzeichen von Schnaufen,
übermäßigen Speichelfluss, Krämpfe oder andere unerwünschte Reaktionen
erkennen. Außerdem sorgt Sevofluran für ein schnelles Erwachen nach der
Narkose, obwohl es eine hohe Lipidlöslichkeit hat, wodurch es bei der
Aufwachphase nur langsam pulmonal ausgeschieden wird (Forth et al., 2005;
Flecknell, 2009). Ratten zeigten in den ersten 24 h nach der Narkose einen
leichten Anstieg von anorganischen Fluorid-Ionen im ausgeschiedenen Urin
(Wallin, 1975). Frink (1992) beobachtete bei Patienten nach Sevofluran
Narkose eine kürzere Aufwachdauer als nach einer Isofluran Narkose. Die
Narkosetiefe kann außerdem gut gesteuert werden.
3.1.4 Isofluran
Das Inhalationsanästhetikum Isofluran ist eine farblose, nicht entflammbare und
flüchtige Flüssigkeit (Dale und Brown, 1987) und wird zur Anästhesie wie
Sevofluran auch mit einem speziell für Isofluran kalibrierten Verdampfer
verwendet. Isofluran hat einen unangenehm stechenden Geruch, der stärker
als Sevofluran die Atemwege reizt (Doi und Ikeda, 1993). Bei Kindern und
Katzen wurde ein Hustenreiz beobachtet und es kam in einigen Fällen zu
Bronchosekretion und Atemanhalten (Flecknell, 2009; Drummond et al., 1983).
10
Isofluran hat einen MAC-Wert von 1,41% (Maus) und einen Blut-GasVerteilungskoeffizient von 1,4, wodurch die Narkose sehr schnell eingeleitet
wird und die Aufwachphase sehr kurz ist (Forth et al., 2005). Die Narkose ist
außerdem sehr gut steuerbar. Der Hauptvorteil bei der Verwendung von
Isofluran ist jedoch, dass es im Körper zu fast keiner Biotransformation kommt
und es nahezu komplett wieder ausgeatmet wird. Dadurch wird die Leber kaum
beeinflusst und es kommt zu keinen Interferenzen bei toxikologischen Studien
(Flecknell, 2009). Aus diesem Grund wird Isofluran besonders gern in Studien
mit Versuchstieren eingesetzt.
3.2 Richtlinien für die Blutentnahme
In der Wissenschaft wird häufig Tieren Blut zu Versuchszwecken entnommen.
Während bei großen Tieren die Blutgefäße relativ gut zu erreichen sind und sie
auch ein großes Blutvolumen haben, stellt die Blutabnahme bei kleinen
Labornagern ein Problem dar und ist mit größeren Belastungen für das Tier
verbunden. Aus diesem Grund hat die Gesellschaft für Versuchstierkunde (GVSOLAS, 2009) Richtlinien veröffentlicht, die dem Experimentator Empfehlungen
über Blutvolumina, Entnahmefrequenz und Lokalisationen der Blutentnahmen
geben.
3.2.1 Blutvolumen der Maus
Mäuse haben ein durchschnittliches Gesamtblutvolumen von 74 ml/kg
Körpergewicht (KGW), dieses entspricht durchschnittlich 7,4% des KGW. Dabei
ist zu beachten, dass das Blutvolumen in Abhängigkeit vom Stamm, Alter,
Geschlecht, Ernährungs- und Gesundheitszustand variiert (Oakley und
Warrack, 1940, Riches et al., 1973, Vacha, 1975, Sluiter et al., 1984, Diehl et
al., 2001, GV-SOLAS, 2009).
3.2.2 Empfohlene Blutentnahmemenge
Die Blutmenge, die einem Tier entnommen werden kann, ist stark von der
Entnahmefrequenz abhängig. Es muss entschieden werden, ob einmalig,
11
täglich, wöchentlich oder final Blut entnommen wird. Daran muss die Menge
angepasst werden. Bei einer einmaligen Blutentnahme zeigt der Verlust von
10% des Blutvolumens keine großen Nebenwirkungen. Bei einer Entnahme von
mehr als 15% des Blutvolumens tritt häufiger ein Abfall des Blutdruckes oder
eine Reduzierung des Hämoglobingehalts auf, was für das Tier
lebensbedrohlich werden kann. Deshalb sollte dem Tier nach einer
Blutentnahme eine Erholungsphase eingeräumt werden. Generell können bei
einem Tier einmalig 10% des zirkulierenden Blutvolumens mit anschließender
4-wöchiger Erholungsphase entnommen werden. Bei täglicher Blutentnahme
sollte das Entnahmevolumen nicht mehr als 1% des Gesamtblutvolumens der
Tiere betragen (GV-SOLAS, 2009, Morton et al. 1993).
Die Entscheidung, welche Blutentnahmemethode bei einem Versuch bevorzugt
wird, hängt von vielen Faktoren ab. Zum einen ist die Blutqualität wichtig. Wird
arterielles, venöses oder Mischblut benötigt? Soll das Blut für weitere
Untersuchungen frei von Kontaminationen sein? Außerdem muss überlegt
werden, welche Blutentnahmemethode für welche Tierart am besten geeignet
ist. Während die Punktion der Ohrvene bei Kaninchen eine sehr gute Methode
ist, ist diese bei Mäusen nicht anwendbar. Ein anderer Punkt, der überlegt
werden muss, ist die Blutmenge und die Entnahmefrequenz. Es gibt einige
Punktionspunkte bei der Maus, wie beispielsweise die Schwanzvene, an denen
nur sehr geringe Blutmengen entnommen werden können. Andere Methoden
wie die Punktion der Vena cava oder eine Herzpunktion sind zum Entbluten von
Mäusen geeignet sind.
In Tabelle 1 wurden drei verschiede Empfehlungen für die Blutentnahmen
miteinander verglichen. Daraus wird ersichtlich, dass jede Institution andere
Blutentnahmemethoden und Entnahmevolumina empfiehlt.
Im Rahmen dieser Masterarbeit werden die Blutentnahmemethoden der
Empfehlung der GV-SOLAS (2009) näher betrachtet. Es werden die Punktion
der Vena facialis, des Venenwinkels, der Vena saphena, der Schwanzvene und
12
die retrobulbäre Blutentnahme untersucht. Diese Methoden werden in den
folgenden Abschnitten näher erläutert.
13
14
Coccygeal Vene
Venenwinkel
Vena facialis
Ohrvene
Vena saphena
Mandibulare Vene
Retroorbital
Amputation der
Schwanzspitze
kleinere - größere
Blutmengen (100 µl)
k.A.
k.A.
-
k.A.
k.A.
k.A.
-/+
-
mittlere - größere
kleinere - mittlere
k.A.
k.A.
-
Volumen
kleinere - mittlere
Blutmengen (50 µl)
1-2 Tropfen
Guidlines for Survival Bleeding of
Mice and Rats
(Office of Animal Care and Use)
Narkose
Laterale Schwanzvene -
Blutentnahmemethode
-
+
k.A
-
nicht empfohlen
k.A
-
-
Narkose
k.A
50-200 µl
50-200 µl
k.A
50-200 µl
nicht empfohlen
k.A
50-200 µl
50-200 µl
Volumen
k.A
Removal of blood from laboratory
mammals and birds
(Laboratory Animals)
k.A
+
-
nicht empfohlen
-
k.A
+
-
Narkose
-
k.A
größere Blutmengen (170 µl)
kleinere Blutmengen
(20-40 µl)
nicht empfohlen
k.A
Volumen
kleine Blutmengen bis zum
Absetzalter (20-40 µl)
Empfehlung zur Blutentnahme bei
Versuchstieren
(GV-SOLAS)
Tab. 1 Vergleich der Empfehlungen der Blutentnahmemethoden und empfohlenen Blutvolumina für Mäuse. (k.A. = keine Angaben)
3.3.1 Retrobulbäre Blutentnahme
Die retrobulbäre, früher auch retroorbitale Blutentnahme genannt, wurde schon
1913 von Pettit als einfache Methode zur Entnahme geringer Blutvolumina
beschrieben. In den 1970er und 1980er Jahren wurde diese Methode in vielen
europäischen und nordamerikanischen Instituten gewählt (van Herck, 1999). Es
gibt zwei verschiedene Methoden, die retrobulbäre Blutentnahme
durchzuführen. Zum einen wird eine Kapillare medial in den Augenwinkel
eingeführt, leicht nach unten geneigt und in den retrobulbär Venenplexus
geschoben. Durch eine rotierende Bewegung der Kapillare wird der
Venenplexus leicht verletzt und Blut fließt in die Kapillare. Bei der anderen
Methode verletzt die Kapillare auch den retrobulbären Venenplexus, wird aber
im lateralen Augenwinkel eingeführt (van Herck, 1999) (Abb. 5).
Laut der Gesellschaft für Versuchstierkunde (GV-SOLAS, 2009) ist diese
retrobulbäre Blutentnahme bei Mäusen dazu geeignet, sowohl kleinere, als
auch größere Blutvolumina zu entnehmen. Auch kann sie zum Entbluten
genutzt werden. Obwohl die Methode häufig genutzt wird, ist diese Technik
umstritten. Einerseits soll sie Schmerzen und Distress bei dem Tier
verursachen, andererseits gibt es eine Abneigung unter den Experimentatoren
am Auge zu manipulieren (van Herck et al., 2000). Jedoch werden bei
sachgerechter Durchführung durch einen geübten Experimentator und bei
korrektem Fixieren des Tieres die Schäden minimiert. Es wird nur Bindegewebe
und peribulbäres Fett bei der Punktion des Venenplexus verletzt (GV-SOLAS,
1999). Bei einem Vergleich der Blutentnahmemethoden aus der Vena saphena,
der Schwanzvene und dem retrobulbären Venenplexus bei Ratten konnte
gezeigt werden, dass es keine Unterschiede im anschließenden Verhalten,
betreffend des Groomings (Putzen), der Bewegung und Inaktivität gab. Jedoch
war die Zeit, die für die Blutentnahme gebraucht wurde, sehr unterschiedlich.
Die retrobulbäre Blutentnahme war gegenüber der Punktion der Vena saphena
7-mal und im Vergleich zur Punktion der Schwanzvene 15-mal schneller (van
Herck et al., 2000). Da sowohl die Zeit, als auch die Fähigkeit des
Experimentators entscheidend für die Belastung des Tieres ist, wird diese
15
Methode von der GV-SOLAS als tierschutzgerecht befunden (GV-SOLAS,
2009).
3.3.2 Punktion der Vena saphena
Die Punktion der Vena saphena ist eine gute Methode, um bei Mäusen, Ratten,
Hamster, Rennmäusen, Meerschweinchen und vielen weiteren Tieren Blut zu
nehmen, und wird von der Gesellschaft für Versuchstierkunde (GV-SOLAS,
2009) empfohlen. Rusher und Birch (1975) beschrieben sie als schnelle
Methode, um schnell und atraumatisch wiederholt Blut bei Ratten zu
entnehmen. Bei der Punktion der Vena saphena wird die Maus in einem Falcon
Tube fixiert, so dass das Bein, an dem die Blutentnahme durchgeführt werden
soll, herausragt. Dieses Bein wird rasiert und durch einen leichten Druck auf
das Fettgewebe zwischen Schwanz und Oberschenkel tritt die Vena saphena
deutlich hervor. Sie verläuft, wie in Abbildung 1 dargestellt, auf der caudalen
Oberfläche des Oberschenkels und kann so mit einer 25 Gauge-Kanüle
punktiert werden. Das Blut wird mit einem EDTA beschichteten Gefäß oder
einer Hämatokrit Kapillare aufgefangen werden. Durch die Nutzung eines
Falcon Tube ist eine Narkose vermeidbar, wodurch zusätzlicher Stress durch
die Narkose vermieden wird (Hem, 1998). Hoff (2000) beschreibt zusätzlich,
dass man das Tier mit einer Wärmeplatte erhitzen sollte, damit die Gefäße sich
weiten. Bei einem Vergleich dieser Form der Blutentnahme mit der Punktion
der Schwanzvene stellte sich heraus, dass die Glukose Konzentration, welcher
als Indikator für Stress gilt, bei der Punktion der Vena saphena signifikant
langsamer anstieg als bei der Punktion der Schwanzvene (Aasland et al.,
2010). Auch bei wiederholter Blutentnahme benötigt es keiner erneuten
Punktion. Lediglich der Schorf muss entfernt werden, um eine wiederholte
Blutentnahme durchzuführen. So wird Stress durch erneutes Punktieren
vermieden (Hem et al., 1998; Aasland et al., 2010).
16
Abb. 1 Darstellung der Vena saphena (nach Cook, 1965)
3.3.3 Punktion der Vena facialis
Eine weitere Möglichkeit Blut zu gewinnen, ist die Blutentnahme aus der Vena
facialis. An einem Punkt, an dem die orbitale Vene, die submandibulare Vene
und andere Venen zusammenfließen und die Jugularis-Vene bilden, können
Blutproben gewonnen werden (Abb. 2). Bei dieser Methode wird keine Narkose
oder Zwangsröhre benötigt, da die Tiere im Zwangsgriff fixiert werden. Dabei ist
auf eine korrekte Stauung der Venen zu achten (GV-SOLAS, 2009). Um die
Vena facialis zu punktieren, gibt es verschiedene Methoden, wie zum Beispiel
die Punktion mit dem Skalpell. Hierbei besteht jedoch die Gefahr, dass es zu
einem zu tiefen Einschnitt in das Gewebe kommt und andere Gefäße oder
Arterien verletzt werden. Darüber hinaus handelt es sich juristisch um einen
operativen Eingriff, der nur von einem bestimmten Personenkreis durchgeführt
werden darf (Maisack et al., 2007).
Weiter besteht auch die Gefahr, durch die Wange der Maus zu stechen, so
dass Blut in die Mundhöhle läuft. Hierbei kann das Blut in die Atemwege des
Tieres gelangen, woran es ersticken könnte.
Bei einer Punktion mit einer 19-, 21-, oder 23 Gauge-Kanüle anstelle des
Skalpells treten die gleichen Probleme auf. Bei beiden Methoden muss der
17
Experimentator sehr geübt sein, um solche Verletzungen des Tieres zu
vermeiden. Außerdem kann dadurch, dass unterschiedlich tief in das Gewebe
gestochen wird, die Menge des Blutes stark variieren.
Aus diesen Gründen hat die Firma Mediapoint eine Lanzette entwickelt, die je
nach Alter der Maus, von der Blut entnommen werden soll, eine variable
Spitzengröße hat. So wird bei einem Alter der Mäuse von 2-6 Wochen eine
Lanzette von 4,0 mm und ab einem Alter von 8 Wochen eine Lanzette mit 5,0
mm empfohlen. Durch die vorgegebene Länge soll durch einen geübten
Experimentator die Tiefe des Einstiches in die Vene besser kontrolliert werden
können, so dass Gewebeschäden vermieden werden. Außerdem soll mehrfach
eine konstante Menge Blut von 0,2-0,5 ml entnommen werden können und die
Maus soll weniger Schmerzen haben (Golde, 2005). Diese Lanzette wird auch
von der Gesellschaft für Versuchstierkunde (GV-SOLAS, 2009) als geeignet
empfunden. Eine frühere Untersuchung zeigte jedoch, dass diese Methode mit
der „animal bleeding“-Lanzette im Vergleich zur retrobulbären Blutentnahme zu
einem signifikant höheren Corticosteron Spiegel führte. Auch liefen die Tiere im
Open Field signifikant weniger und mit einer langsameren Geschwindigkeit, was
ein Anzeichen für Distress sein könnte (Schlichting et al., 2008). Jedoch zeigte
eine andere Studie von Madetoja (2009), dass die Punktion der Vena facialis zu
einem geringeren Corticosteron Anstieg führte als die Punktion der
Schwanzvene und der Vena saphena. Wie die Punktion der Vena facialis hier
durchgeführt wurde, wurde jedoch nicht erwähnt.
Abb. 2 Darstellung der Vena facialis (nach Cook, 1965) 18
3.3.4 Punktion der Schwanzvene
Bei Mäusen und Ratten lassen sich kleine bis große Blutvolumina durch die
Punktion der kollateralen Schwanzvenen mit einer Kanüle entnehmen (GVSOLAS, 2009). Der Schwanz einer Ratte besitzt eine dorsale- und zwei laterale
Venen und eine ventrale Arterie aus denen man Blut gewinnen kann (Brown,
2006) (Abb. 3). Vor allem das terminale Drittel des Schwanzes wird häufig für
die Blutentnahme genutzt. In diesem Segment sind die Arterien und Venen am
besten ausgeprägt und die Strukturen des muskulären Skelettsystems
reduzieren sich Richtung der Spitze des Schwanzes (Staszyk et al., 2003).
Dorsale Vene
Haut
Laterale Vene
Sehnen
Ventrale Arterie
Abb. 3 Anordnung der Schwanzvenen
Um diese Blutentnahme durchzuführen, muss das Tier fixiert werden. Das kann
entweder durch einen Zwangsgriff oder eine Zwangsröhre geschehen (GVSOLAS, 2009; Nobunaga et al., 1966). Da die Gefäße vor allen bei Mäusen
besonders klein sind, wird empfohlen die Tiere mittels Rotlicht, Wasserbad oder
Wärmeplatte zu erwärmen, um eine Vasodilation der Gefäße zu erreichen
(Brown, 2006; Conybeare et al., 1988). Dies kann jedoch Stress für das Tier
bedeuten, zu Dehydrierung führen, den Stoffwechsel steigern und ist
zeitaufwändig (Aasland et al., 2010).
Um die Blutentnahme durchzuführen, wird eine der oben genannten Venen
leicht gestaut und mit einer Kanüle oder Skalpell punktiert. Um eine wiederholte
Blutentnahme durchzuführen, sollte möglichst am distalen Ende des
Schwanzes mit der Punktion begonnen werden (Brown, 2006). Jedoch konnten
Aasland et al. (2010) zeigen, dass bei dieser Methode im Vergleich zur
Punktion der Vena saphena die Glukose Konzentration im Blut signifikant höher
19
war, was ein Anzeichen für mehr Stress durch die Blutentnahme bedeutet. Er
begründet diesen Anstieg an Glukose im Blut dadurch, dass es für die Maus
Stress bedeutet, wenn am Schwanz, welcher als Gleichgewichts Organ dient
und auch für die Thermoregulation verantwortlich ist, manipuliert wird. Auch
Müller (1999) konnte verglichen mit der retrobulbären Punktion und der
Punktion des Venenwinkels eine signifikant erhöhte Corticosteron
Konzentration nach der Schwanzvenen Punktion nachweisen. Dieser Anstieg
wurde durch Aufenthalt des nicht narkotisierten Tieres in ein Wärmekabinett,
der Fixation und den Punktionsschmerz erklärt.
3.3.5 Punktion des Venenwinkels
Unter dem Venenwinkel versteht man den Zusammenfluss der Vena jugularis
interna mit der Vena jugularis externa oder, falls nur eine dieser Venen
ausgebildet ist, ihr Zusammentreffen mit der Vena subclavia ihrer Körperseite.
Dieser befindet sich unterhalb des Schlüsselbeins (Nickel et al., 1996) (Abb. 4).
Bei dieser Methode wird der Venenwinkel des sich auf den rückenliegenden
Tieres mit einer Kanüle punktiert. Dies kann entweder unter Sichtkontrolle durch
einen kleinen Hautschnitt über der Jugular Vene erfolgen oder blind, indem eine
Kanüle direkt unter dem Schlüsselbein in dem vom Hals und Schulter
gebildeten Winkel geschoben wird, welche die Vene punktiert (Phillips et al.,
1973; Archer und Riley, 1981). Auf diese Weise lassen sich bei Mäusen, Ratten
oder Meerschweinchen sicher und schnell große Blutvolumina entnehmen bzw.
Substanzen intravenös applizieren (GV-SOLAS, 2009; Phillips et al., 1973).
Phillips et al. (1973) beschrieben, dass eine geübte Person mit dieser Methode
in einer Stunde bei 40 Ratten Blut nehmen kann. Sie beschrieben weiter, dass
diese Methode mit einem speziell konstruiertem Zwangsbrett, in dem das Tier
an allen vier Gliedmaßen mit Fußklammern, die mit Latex versehen sind,
eingespannt werden kann, ohne Narkose durchzuführen ist. Jedoch kann dies
zu Distress führen, weshalb sie eine leichte Ether Narkose empfehlen. Heute
sollte diese Methode jedoch laut Empfehlung der GV-SOLAS (2009) nur noch
unter Narkose durchgeführt werden.
20
Abb. 4 Darstellung des Venenwinkels (nach Cook, 1965)
3.4 Stress
Stress wird definiert als nichtspezifische Reaktion des Körpers auf äußere
Stimuli (Selye, 1976). Tiere befinden sich in einem dynamischen Gleichgewicht,
einer so genannten Homöostase. Stressoren physiologischer und
psychologischer Art bringen diese Homöostase aus dem Gleichgewicht,
wodurch das Tier in den Zustand des Stresses gerät und sein Verhalten ändert.
Auch physiologische Funktionen, wie die des Gastrointestinaltraktes oder die
Immun- bzw. Hormonantwort verändern sich. Wie stark eine Stressantwort ist,
hängt von der Intensität, Dauer und Frequenz des Stressors ab (Kannan,
2005). Stress führt weiterhin unumgänglich zu einer Freisetzung von ACTH
(Adenocorticotropes Hormon) und von Nebennierenhormonen, wie
Katecholaminen und Glukocorticoiden (Danzer, 1984). Der ACTH Ausschüttung
folgt wiederum zeitverzögert eine Ausschüttung von Corticosteron (Cook et al.,
1976; Kugler et al., 1988).
3.4.1 Stressnachweis im Blut anhand von Glucocorticoiden
Bei Stress verändern sich im Blut zum Beispiel die Plasma Glukose
Konzentration, die Adrenalin- oder Corticosteron Konzentrationen. Da in diesem
Versuch die Corticosteronwerte nach Stresseinfluss untersucht wurden, wird
hierauf näher eingegangen.
Corticosteron wird in der Nebennierenrinde gebildet. Die Synthese erfolgt in
zwei zellulären Kompartimenten, den Mitochondrien und dem
Endoplasmatischen Retikulum (ER) aus Cholesterin. Im ersten Schritt der
21
Biosynthese wird aus Cholesterin Pregnenolon synthetisiert. Dieses wird
anschließend in das agranuläre ER transportiert. Dort werden zum einen die
Steroidhormone Testosteron und Östradiol gebildet und 11-Desoxycorticosteron
aus Pregnenolon synthetisiert. Letzteres wird in die Mitochondrien transportiert,
wo schließlich Corticosteron entsteht (Penzlin, 2004).
Corticosteron stellt das letzte Glied der Hypothalamus-HypophysenNebennierenachse dar und unterliegt einer negativen Rückkopplungen der
ACTH und CRH-Ausschüttung (Corticotropin-releasing Hormon) (Forth et al.,
2005). Nach Einwirken eines Stressors steigt der Corticosteronspiegel in
Abhängigkeit von der Stärke des Stressors an. Van Herck et al. (1991)
beschrieben, dass die Corticosteron Konzentration nach einer Sham
Anästhesie nach 3 min und nach einer Ether Anästhesie nach 15 min am
höchsten war.
Die Corticosteron Konzentration variiert stark zwischen den Mäusestämmen
und unterliegt einem circadianen Rhythmus. So ist die Konzentration zwischen
4:00 und 12:00 Uhr mit einer Konzentration von weniger als 50 ng/ml am
geringsten, während sie ihren Höhepunkt gegen 18:00 Uhr mit 200-300 ng/ml
hat (Jilge und Kunz, 2004). Außerdem verändert sie sich bei Mäuseböcken je
nach Dominanzstatus. Schuhr (1987) beschreibt, dass die Corticosteron
Konzentration dominanter Männchen signifikant geringer ist, als die
Konzentration bei subdominanten Männchen.
3.4.2 Stressnachweis anhand des Verhaltens im Open Field
Ein Open Field ist ein abgegrenztes Feld definierter Größe, in das Tiere gesetzt
werden, um ihr Verhalten zu beobachten. Einige Verhaltensparameter sind zum
Beispiel Putzen (grooming), flach auf den Boden legen (stretching) oder
Aufrichten (rearing). Außerdem kann man unterscheiden, ob ein Tier eher aktiv
bzw. inaktiv ist, und ob es sich in der Mitte bzw. am Rand des Open Fields
aufhält. Mit Hilfe dieser Verhaltensparameter kann man darauf schließen, ob ein
Tier eher Erkundungs- oder Meideverhalten zeigt.
Stress verändert das Verhalten, welches im Open Field beobachtet werden
kann. In einem Open Field äußert sich Meideverhalten von Labortieren
dadurch, dass wenn eine Maus in ein solches Feld gesetzt wird, sie ein
22
Verhalten, wie flaches Ausstrecken auf dem Boden (stretching) oder
Kopfbewegungen, um die neue Umgebung zu erkunden, zeigt (Quartermain et
al., 1996). Außerdem konnte Quartermain (1996) zeigen, dass länger
andauernder Stress (1h), der durch 30 Fußschocks im 2 min Intervall, 1 h
Bewegungseinschränkung, oder durch das Zusammensetzen mit einer
aggressiven Maus provoziert wurde, das Erkundungs- und
Bewegungsverhalten der Mäuse im anschließenden Open Field Versuch,
welcher 30 min nach dem ausgesetzten Stress durchgeführt wurde, signifikant
gegenüber ungestressten Tieren veränderte. Die gestressten Mäuse waren
weniger aktiv als nicht gestresste. Katz et al. (1981) konnten zeigen, dass
chronischer Stress zu einer Abnahme der Anfangsakitivität von Ratten im Open
Field führte, akuter nicht traumatischen Stress, der durch Geräusche oder Licht
ausgelöst wurde, die Anfangsaktivität jedoch erhöhte. Andererseits zeigten
Mercier et al. (2003), dass Ratten, die 48 Stunden zuvor durch Fußschocks
oder Schwimmen akut gestresst worden waren, im Open Field keine
Veränderung des Verhaltens aufwiesen. Wie in der Literatur beschrieben, ist
das Verhalten der Tiere in einer neuen Umgebung schwer zu interpretieren.
Einige Autoren beschreiben, dass Tiere Erkundungsverhalten zeigen und aktiv
sind, weil sie sich fürchten. Ein anderer Standpunkt ist, dass Tiere die Angst
haben oder gestresst sind, nur wenig Erkundungsverhalten zeigen (Candland
und Nagy, 1969; Roth und Katz, 1979). Aus diesem Grund erfolgte bei diesem
Versuch zusätzlich zu den Verhaltensuntersuchungen eine Corticosteron
Bestimmung.
23
4. Material und Methoden
4.1 Versuchstiere
Für den Versuch wurden insgesamt 132 spezifiziert pathogen freie (FELASA,
2006) weibliche Mäuse des Inzuchtstammes BALB/cOlaHsd der Firma Harlan
Winkelmann, Borchen, getestet. 60 Tiere wurden für einen Narkoseversuch und
72 Tiere für einen Blutentnahmeversuch eingesetzt. Alle Tiere wurden mit
einem Alter von 6 Wochen geliefert und hatten ein Ankunftsgewicht von
16,20±1,58 g. Nach der Ankunft wurden die Tiere durch eine Ohrlochung
markiert und randomisiert in Makrolon® Typ III Käfige (375 mm x 215 mm x 150
mm) á 5 Tiere gesetzt.
4.1.1 Haltung
Alle Versuchstiere wurden in einem Scantainer® der Firma Scanbur AS
Denmark gehalten, in welchen die Luft pro Stunde ca. 10- bis 16-mal
ausgetauscht und durch einen Hepa Filter gereinigt wurde. Der Tierraum war
klimatisiert, so dass eine konstante Temperatur von 22±2°C gegeben waren.
Die Luftfeuchtigkeit im Tierraum betrug 50±10%. Die Beleuchtung des Raums
erfolgte nach einem Tag/Nachtrhythmus von 6-18 Uhr. Im Scantainer wurde
eine Lichtstärke von 35-70 Lux je nach Käfigetage gemessen. Die FaserNadelholz Einstreu Grad 5 der Firma Altromin GmbH und Co in den Käfigen
wurde einmal wöchentlich ausgetauscht. Um die Umgebung anzureichern,
wurde den Mäusen Nestbaumaterial (Nestlets, EBECO) zur Verfügung gestellt.
Zusätzlich stand den Tieren pelletiertes Alleinfutter (Nr. 1324 der Firma
Altromin) (Tab. 2) und Leitungswasser in kleinen Trinkflaschen (300 ml
Fassungsvermögen) mit Nippeltränken ad libitum zur Verfügung. Die
Adaptationszeit der Mäuse betrug 14 Tage. Während dieses Zeitraums wurden
die Mäuse täglich zwischen 9-12 Uhr „gehändelt“. Dazu wurden sie jeweils für
60 Sekunden einzeln auf den Unterarm gesetzt.
24
Tab. 2: Inhaltsstoffe des RaSen/Mäuse FuSer (Altromin 1324).
Inhaltsstoffe
Zusatzstoffe/kg
Rohprotein
19,0%
Vitamin A als Vitamin A-Acetat 15000 IE
Rohfett
4,0%
Vitamin D3 als Cholecalciferol
Rohfaser
6,0%
Vitamin E als Alpha Tocopherol 75 mg
Rohasche
7,0%
Kupfer als Kupfersulfat
Calcium
0,9%
Phosphor
0,7%
600 IE
13 mg
4.2 Versuchsgruppen
Für den Narkoseversuch wurden die Tiere randomisiert auf 6 Gruppen á 10
Tiere verteilt. Es wurde darauf geachtet, dass pro Käfig und Tag nur ein Tier
getestet wurde, um einen Anstieg des Corticosterons durch das wiederholte
Öffnen des Käfigs zu verhindern. Pro Tag wurde eine Narkose durchgeführt. Als
Narkose wurde Isofluran, Sevofluran, CO2 und Ether eingesetzt. Zusätzlich
erfolgte eine Sham Narkose und eine Kontrollgruppe. Zu Versuchsbeginn
waren die Mäuse 8 Wochen alt und hatten ein Gewicht von 18,62±1,70 g.
Zur Untersuchung der verschiedenen Blutentnahmemethoden wurden die Tiere
ebenfalls auf 6 Gruppen randomisiert verteilt. Jedoch erhöhte sich die Tierzahl
pro Gruppe auf 12, da eine Histologie der Blutentnahmestellen für einen
weiteren Versuch durchgeführt werden sollte. Auch bei diesem Versuch wurde
aus dem oben genannten Grund pro Käfig und Tag nur ein Tier getestet. Durch
die Erhöhung der Tierzahl wurden die Tiere auf 2 Scantainer in 2 Tierräumen
verteilt. So wurden zusätzlich pro Tierraum 6 Tiere an einem Tag getestet. Für
die Blutentnahme wurden Spezialisten eingeladen, die in ihrem Labor die
Entnahme routinemäßig durchführen. Aus diesem Grund wurde pro Tag eine
Blutentnahme durchgeführt. In der Tabelle 3 werden die durchführenden
Personen und Blutentnahmemethoden aufgeführt. Für zwei Methoden,
25
retrobulbär mit dünner Kapillare und die Blutentnahme aus dem Venenwinkel,
war es notwendig eine Ether Narkose durchzuführen. Die restlichen Methoden,
retrobulbär mit dicker Kapillare, Punktion der Schwanzvene, Vena saphena und
Vena facialis erfolgten ohne Narkose. Zu Versuchsbeginn waren die Mäuse 8
Wochen alt und hatten ein Gewicht von 19,26±1,21 g.
Tab. 3 Blutentnahmemethoden und durchführende Personen.
Blutentnahmemethode
Narkose
Durchführende/er
Ort
retrobulbär (dicke Kapillare)
-
Herr Prof. Hackbarth
Hannover
retrobulbär (dünne Kapillare)
Ether
Frau Wühl
Mannheim
Schwanzvene
-
Frau Wühl
Mannheim
Vena saphena
-
Frau Muench-Wuttke
Dresden
Vena facialis
-
Frau Kuschel
Hamburg
Frau Deutschmann
Venenwinkel
Ether
Herr Dr. Strauch
Freiburg
4.3 Versuchsablauf
4.3.1 Basalwertbestimmung von Corticosteron
Bei allen Tieren wurde nach einer Adaptationszeit von 5 Tagen in einem
Zeitraum zwischen 9-12 Uhr über 6 Tage 2 x 75 µl Blut entnommen, um einen
basalen Corticosteron Wert zu bestimmen. Die Blutentnahme erfolgte
retrobulbär am linken Auge mit einer 75 µl Na-heparinisierten Hämatokrit
Kapillare (Hirschmann). Um bei dieser Blutentnahme möglichst konstante Werte
zu bekommen, wurde pro Tag Blut von 2 Käfigen á 5 Mäusen entnommen. Um
5 Tieren eines Käfigs Blut zu entnehmen, wurden durchschnittlich 5 min
benötigt.
26
Der Versuch wurde an 6 aufeinanderfolgenden Tagen in einem Zeitraum
zwischen 09-12 Uhr durchgeführt. Wie oben erwähnt wurden 10 Tiere pro Tag
getestet, wobei darauf geachtet wurde, dass pro Käfig nur ein Tier getestet
wurde, um zusätzlichen Stress zu vermeiden.
Es wurde ein Tier aus dem jeweiligen Käfig geholt und in einen Transportkäfig
(Typ II, 265 mm x 190 mm x 180 mm) mit Einstreu gesetzt. Darin wurde es zum
wenige Meter entfernten Versuchsraum gebracht. Sofort nach dem Eintreffen
wurde das Tier in eine Narkosebox aus Plexiglas (150 mm x 130 mm x 280
mm) gesetzt und die entsprechende Narkose eingeleitet, welche als Stressor
diente. Das Tier wurde aus der Narkosebox entnommen, wenn die Atmung
deutlich schwächer wurde. Kontrolltiere und Tiere, die eine Sham Narkose
erhielten, verblieben 78 s (Mittelwerte der Narkoseeinleitungszeiten) in der
Narkosebox. Anschließend wurden die Tiere für 15 min in die Transportbox
gesetzt, wobei die ersten 5 min nach der Narkose mit einer Videokamera
aufgenommen wurden, um eine Verhaltensanalyse durchzuführen. Nach 15
min, in denen die Corticosteron Konzentration ansteigen sollte, erfolgte
schließlich eine retrobulbäre Blutentnahme aus dem linken Auge, bei der 2 x 75
µl Blut mit einer Na-heparinisierten Hämatokrit Kapillare entnommen wurde.
Diese diente zur Corticosteron Bestimmung. Anschließend kam die Maus
nochmals für 5 min in ein Open Field, bevor sie in ihren Heimatkäfig
zurückgebracht wurde.
Der Versuch wurde an 6 aufeinanderfolgenden Tagen in einem Zeitraum von
9-12 Uhr durchgeführt. Pro Tag wurden 12 Tiere getestet. Da die Tiere auf 2
Tierräume verteilt waren, wurde pro Tierraum 6 Mäuse getestet. Auch bei
diesem Versuch wurden pro Käfig und Tag nur ein Tier für den Versuch
eingesetzt. Der Versuchsablauf verlief genauso wie der Ablauf des
Narkoseversuchs. Das Tier wurde aus dem Käfig genommen und in einem
Transportkäfig zum Versuchsraum gebracht. Dort wurde entweder sofort die
Blutentnahme durchgeführt oder das Tier, wenn die Blutentnahme es vorsah, in
27
die Narkosebox gesetzt und eine Ether Narkose eingeleitet. Hier diente die
Blutentnahme als Stressor. Anschließend blieben die Tiere, wie auch beim
Narkoseversuch für 15 min im Transportkäfig, um einen Anstieg der
Corticosteron Konzentration abzuwarten. Während dieser Zeit wurden die Tiere
die ersten 10 min für eine spätere Verhaltensanalyse gefilmt. Nach Ablauf der
Zeit wurden auch diesen Tieren 2 x 75 µl Blut retrobulbär aus dem linken Auge
entnommen und sie kamen für 5 min ins Open Field, bevor sie in den
Heimatkäfig zurück gesetzt wurden.
4.4 Narkose
Bei allen Tieren wurden die unterschiedlichen Inhalationsnarkosen in der
gleichen Narkosebox mit den Maßen 150 mm x 130 mm x 280 mm
durchgeführt. Auch die Kontrolltiere und Tiere, die eine Sham Narkose erhielten
wurden in diese Box gesetzt. In die Narkosebox wurde Zellstoff gelegt, dass
nach jedem Tier gewechselt wurde. An dem Deckel, der mit einer
Moosgummidichtung abgedichtet wurde, befand sich ein Anschluss für die
Zuluft, über die das Narkosegas eingeleitet, und eine Abluft, über die das
Narkosegas abgeleitet wurde. So wurde Sauerstoff über einen Flussmeter zum
Verdampfer mit dem entsprechenden Narkosegas geleitet und gelangte weiter
über eine Schlauchverbindung in die Narkosebox. Bei allen Narkotika wurden
die Mäuse aus der Box genommen, wenn die Atmung deutlich schwächer
wurde.
4.4.1 Sevofluran
Die Einleitung der Narkose erfolgte über einen Sevofluran Verdampfer
(Sevorane® ABBOTT Vapor 19.3). 8% Sevofluran (Sevorane® Abbott) wurde
über ein Flussmeter mit 5 l/min reinen Sauerstoff eingeleitet.
28
4.4.2 Isofluran
Bei dieser Inhalationsnarkose wurde eine Isofluran Verdampfer (Isoflurane®,
Dräger, Vapor 19.3) verwendet. Hierbei wurden 4% Isofluran (Isofluran CP®,
Cp-pharma®) mit einem Sauerstoffeinstrom von 5 l/min in die Narkosebox
eingeleitet.
4.4.3 Ether
Bei der Einleitung der Ether Narkose wurde eine Gas-Wasch-Flasche
verwendet, die zwei Öffnungen besaß. An einer Öffnung wurde Sauerstoff
angeschlossen, die andere Öffnung führte über einen Schlauch in die
Narkosebox. So konnte der Ether (Diethylether pro narcosis), der in die GasWasch-Flasche auf Watte gegeben wurde, mit einer Flussrate von 5 l/min
eingeleitet werden. Pro Tier wurden 8 ml Ether auf die Watte geträufelt.
4.4.4 CO2
Für die CO2 Narkose wurde ein spezieller Prellplattendeckel nach Corbach
(2006) verwendet, der eine gutes Durchmischen von CO2 und Luft ermöglicht.
Hierbei wurde CO2 direkt entsprechend der Käfiggröße mit 4,6 l/min eingeleitet.
4.4.5 Sham
Bei der Sham Narkose wurden die Tiere ebenfalls wie die Tiere, bei denen eine
Narkose erfolgte, in die Narkosebox gesetzt. Bei ihnen strömte ausschließlich
Sauerstoff mit 5 l/min ein. Sie blieben in der Narkose Box für 78 s, was dem
Mittelwert der Dauer für die Sevo- und Isofluran Narkose entspricht.
4.4.6 Kontrollen
Die Kontrolltiere wurden auch in die Narkosebox gesetzt, jedoch ohne weiteren
Lufteinstrom. Auch sie blieben wie die Mäuse, die eine Sham Narkose
bekamen, für 78 s in der Box.
29
Alle Blutentnahmen dienten als Stressor. Jede Blutentnahme wurde durch eine
Person durchgeführt, die diese Methode routinemäßig anwendet. Um eine
möglichst gleiche Ausgangssituation zu erreichen, war es Ziel, 75 µl Blut von
jedem Tier zu nehmen.
4.5.1 retrobulbäre Blutentnahme
Die retrobulbäre Blutentnahme mit der dicken Kapillare wurden ohne Narkose
durchgeführt. Bei der Durchführung der Blutentnahme mit der dünnen Kapillare
wurden die Tiere in Ether Narkose gelegt.
Die Tiere wurden mit dem Zwangsgriff fixiert, was dazu führte, dass sich die
Vena jugularis staute. Anschließend wurde entsprechend der Methode eine 75
µl Hämatokrit Kapillare (Hirschmann) (Außendurchmesser 1,5-1,6 mm) oder
eine 20 µl Mikrokapillare (Blaubrand® intraEND) (Außendurchmesser 1,2 mm)
in den medialen Augenwinkel des rechten Auges eingeführt und entlang des
Augapfels mit einer rotierenden Bewegung vorsichtig vorgeschoben (Abb. 5).
Durch die rotierende Bewegung verletzte die Kapillare einige Venengefäße,
wodurch Blut aufgrund der Kapillarkräfte hineinströmte.
Bei der dicken Hämatokrit Kapillare, die 75 µl fasste, wurde diese mit Blut
gefüllt und anschließend aus dem Auge entfernt. Bei der retrobulbären
Blutentnahme mit der dünnen Hämatokrit Kapillare blieb die Kapillare im Auge
und das Blut tropfte in ein EDTA beschichtetes Gefäß. Anschließend wurde bei
beiden Methoden der Blutstau gelöst, die Kapillare entfernt und die Blutung mit
einem Tupfer gestoppt. Beide Blutentnahmen erfolgten am rechten Auge, an
dem zuvor keine Blutentnahme durchgeführt wurde, um das Ergebnis einer
anschließenden Histologie nicht zu verfälschen. Die Auswertung der Histologie
ist jedoch nicht Gegenstand dieser Masterarbeit.
30
Abb. 5 SchemaWsche Darstellung der retrobulbären Blutentnahme. Die Kapillare (5) gleitet entlang des Bulbus (4) und gelangt zu dem Venengeflecht (7). (Weiss et al., 2003)
4.5.2 Blutentnahme aus der Schwanzvene
Für die Blutentnahme aus der Schwanzvene wurden die Mäuse in ihren
Transportkäfig für 10 min unter eine Rotlichtlampe (250 Watt, 230-250 Volt) mit
einem Abstand von 20 cm zum Käfig gestellt, damit die Gefäße an der
Schwanzvene sich weiteten. Nach Ablauf der Zeit kamen die Mäuse für die
Blutentnahme in eine Zwangsröhre (Model 84). Gestochen wurde mit einer 23G
Kanüle (BD Microlance) in der Mitte des Schwanzes in die erste laterale
Schwanzvene (Abb. 6a). Dazu wurde die Kanüle flach für ca 7 mm in die Vene
geführt. Die Kanüle wurde nach einem Anstechen der Vene entfernt und das
Blut mit einer Hämatokrit Kapillare aufgefangen (Abb. 6b). Um diese vollständig
zu füllen, wurde die Vene oberhalb der Einstichstelle leicht nachgestrichen.
Nach erfolgter Blutentnahme wurde die Blutung mit einem Tupfer gestillt.
a
b
Abb. 6 Blutentnahme aus der Schwanzvene. a) EinsWchstelle in der MiSe des Schwanzes in die 1. Laterale Schwanzvene. b) Auffangen des Blutes mit einer Hämatokrit Kapillare
31
4.5.3 Blutentnahme aus der Vena saphena
Bei dieser Methode wurde die Maus in ein 50 ml Falcon Tube (BD Bioscience)
gesetzt, so dass das linke Bein herausragt. Dieses Bein wurde oberhalb des
Kniegelenks fixiert und mit einem elektrischen Rasierer (Braun) leicht rasiert, so
dass die Vena saphena gut sichtbar wurde. Durch die Fixierung wurde leichter
Druck auf das umliegende Fettgewebe ausgeübt, der die Vena saphena
anstaute und die dann deutlich hervortrat. Anschließend wurde die Vena
saphena mit einer 27G Kanüle (BD Microlance) angestochen (Abb. 7). Der sich
bildende Bluttropfen wurde mit einer 75 µl Hämatokrit Kapillare aufgefangen.
Anschließend wurde der Stau gelöst und das Tier in den Transportkäfig gesetzt.
Abb. 7 EinsWchstelle in der Vena saphena 4.5.4 Blutentnahme aus der Vena facialis
Die Blutentnahme erfolgte aus der Vena facialis der rechten Kopfseite. Das
Tiere wurde mit dem Zwangsgriff fixiert, was zu einem Anstau der Vena facialis
führte. Dann wurde mit einer Lanzette der Firma Roche Accu-Check (Abb. 8b)
an der Hinterseite des Kiefers der Maus, etwas hinter dem „Punkt“ Richtung
Ohr und Auge in einem Winkel von 90 Grad zur Oberfläche eingestochen (Abb.
8a). Eine zweite Person fing das Blut mit einer 75 μl Hämatokrit Kapillare auf.
Anschließend wurde die Stauung gelöst und die Blutung mit einem Tupfer
gestoppt.
32
a
b
4 mm
Abb. 8 a EinsWchstelle zur PunkWon der Vena facialis, b LanzeSe
4.5.5 Blutentnahme aus dem Venenwinkel
Für dieses Blutentnahmemethode wurde die Maus mit Ether narkotisiert.
Anschließend wurde sie auf den Rücken gelegt und die Beine caudal gestreckt.
In dieser Position befindet sich der Venenwinkel, die Zusammenführung der
Vena jugularis interna und Vena jugularis externa und Vena subclavia,
unterhalb des Schlüsselbeins. Nun wurde mit einer 1 ml Spritze, der eine
heparingespülte 27G Kanüle (B.Braun) aufgesetzt war im cranialen Halsbereich
unter dem Schlüsselbein in Richtung gegenüberliegendes Knie gestochen und
aspiriert, bis Blut in die Spritze lief (Abb. 9). Während dieser Prozedur wurde
zur Narkoseerhaltung 0,5 ml Ether in einer 2 ml Spritze auf Watte gegeben und
bei Bedarf der Maus vor der Nase gehalten.
Abb. 9 PosiWon der Kanüle zur Blutentnahme aus dem Venenwinkel
33
4.6 Videoaufnahme
Alle Mäuse wurden direkt nach der Narkose bzw. ersten Blutentnahme in ihren
Transportkäfigen videoüberwacht. Zunächst wurde eine Zeit von 5 min
veranschlagt. Jedoch stellte sich bei den Tieren im Narkoseversuch heraus,
dass sich diese nach 5 min noch nicht normal verhielten. Aus diesem Grund
wurden alle Tiere, denen Blut entnommen wurde, für 10 min beobachtet. Die
Aufnahme erfolgte mit einer Camera von Canon (G10Hi) und wurde auf Hi8
Kassetten aufgenommen. Später wurde das Verhalten subjektiv analysiert. Die
Parameter, die zeitlich erfasst wurden, sind in Tabelle 4 aufgelistet. Das
Verhalten wurde vom inaktiven Tier bis zum Normalverhalten beobachtet.
Tab. 4 Beobachtetes Verhalten während der Videoauswertung
Verhalten
dauerhaftes Liegen
seltene Bewegung, nicht aktiv
bewegen, aber langsam
neugierig; zeigt Interesse an ihre Umwelt
unkontrolliertes Taumeln
Erkundungsverhalten, aber taumelig
Aktiv; zeigt starkes Erkundungsverhalten
Inaktiv
Normalverhalten
4.7 Open Field
Direkt nach der zweiten Blutentnahme wurden die Mäuse für 5 min in das Open
Field gesetzt. Die Grundfläche des Open Fields betrug 60 cm x 60 cm. Das
Verhalten wurde mit einer Kamera der Firma Ikegani (Linse: F1. 8/4-10 mm)
gefilmt und mit einem Videorecorder (Panasonic TL 550) aufgezeichnet.
Abschließend wurde das Verhalten mit EthoVision Version 3.1 ausgewertet. In
dem Programm wurden manuell eine Randzone und Mittelzone (Abb. 10)
eingeteilt, um unterscheiden zu können, wo sich die Tiere aufgehalten haben.
Außerdem wurden die Zeit der Bewegung bzw. Inaktivität und die zurückgelegte
Gesamtstrecke der Mäuse innerhalb des Open Field erfasst. Alle Tiere wurden
in die Mitte der Open Fields gesetzt.
34
!"#$%&#'(
)*+',%&#'(
-.(/0(
Abb. 10 Auèilung des Open Fields
4.8 Aufbereitung des Blutes
Für die Bestimmung der Corticosteron Konzentration im Blut wurden die zwei
75 µl Kapillaren der zweiten Blutentnahme, die 15 min nach der Narkose oder
ersten Blutentnahme erfolgte, verwendet. Die mit Blut gefüllten Kapillaren
wurden mit 12000 RPM für 4 min zentrifugiert (Zentrifuge: Biofuge® haemo,
Heraeus®). Dadurch konnte zum einen der Hämatokrit-Wert bestimmt werden,
zum anderen konnte Plasma gewonnen werden. Dieses wurde in 0,5 ml
Eppendorf Gefäße (Landgraf Laborgeräte) umgefüllt und bei -18 ⁰C eingefroren.
Bei dem Blutentnahmeversuch wurden als Stressor die oben genannten
Blutentnahmen verwendet und nach 15 min jeweils 75 µl Blut in Hämatokrit
Kapillaren aufgefangen. Um die Qualität der Blutentnahme zu bewerten wurden
Luftblasen gezählt und das Blut wurde anschließend zentrifugiert.
4.9 Bestimmung von Corticosteron mittels ELISA
Aus dem Plasma der zweiten Blutentnahme wurde schließlich die Corticosteron
Konzentration mit Hilfe eines kompetitiven Corticosteron-ELISA´s der Firma
IBL bestimmt. Dazu wurden die Proben zusammen mit Standards
unterschiedlicher Corticosteronkonzentrationen (0, 5, 15, 30, 60, 120 und 240
35
nmol/L ) auf einer 96 Well Platte aufgetragen. Anschließend wurde auf jede
Vertiefung Enzym Konjugat, das Meerrettichperoxidase enthielt, gegeben und
für eine Stunde inkubiert. Dadurch konnte das Corticosteron an den in dem Well
enthaltenen Antikörper binden. Danach ist nach mehreren Waschschritten die
Substratlösung auf die Wells gegeben worden, die für eine Farbreaktion des
Corticosterons sorgt. Nach weiteren 15 min Inkubationszeit wurde diese
Reaktion mit einer Stopplösung beendet. Anschließend folgte das Auslesen des
ELISAs mit einem Mikrotiterplatten-Lesegerät bei 450 nm. Da die Corticosteron
Konzentration des Blutes über den Messbereich hinausreichte, wählte man eine
entsprechende Verdünnung (1:5 bzw. 1:15).
4.10 Statistische Analysen
Die Auswertung der Daten erfolgte mit Hilfe des Programms StatView Version
5.0 (SAS Institut, Inc., Cary, NC, USA, 1998). Sie sind auf Normalverteilung
überprüft und mit einem ANOVA-Test und anschließendem Scheffé-Test mit
einem Signifikanzlevel von 5% analysiert worden. Nicht normal verteilte Werte
wurden mit dem Kruskal-Wallis Test und dem Mann-Whitney U Test statistisch
erfasst. Im folgenden Ergebnisteil werden die Mittelwerte (MW) ±
Standardabweichung (SD) angegeben und in den Graphiken dargestellt.
36
5. Ergebnisse
5.1 Narkose
5.1.1 Einleitung der Narkose
Bei der Einleitung der jeweiligen Narkosen wurden zwei Zeiten ausgehend von
einem Zeitpunkt Null, an dem das Tier in die Narkosebox gesetzt wurde,
bestimmt. Die erste Zeit wurde genommen, als die Tiere begannen ataktisch zu
werden, was ein Zeichen für die einsetzende Narkose war. Eine zweite
Zeitmessung ergab sich durch das Entnehmen des Tieres aus der Narkosebox.
Zu diesem Zeitpunkt war die Narkose tief genug, um kleine operative Eingriffe
an dem Tier durchzuführen. Da sowohl bei der Sham Narkose, als auch bei den
Kontrolltieren beide Stadien der Narkose nicht auftraten, wurden diese Gruppen
bei der folgenden Statistik nicht berücksichtigt.
5.1.1.1 Zeit bis zur Ataxie
Bei der Zeit bis zum Schwanken (Ataxie) der Tiere ergab sich ein signifikanter
Wert von F3,36=18,82; p=<0,0001 zwischen den verwendeten Narkotika,
Sevofluran, Isofluran, Ether und CO2. Die Ataxie der Tiere setzte am schnellsten
bei der CO2 Narkose ein (27,30±4,22 s). Dann folgten die Gruppen, die eine
Sevofluran- (32,10±6,35 s) sowie Isofluran- Narkose (33,40±4,60 s) erhielten.
Die längste Zeit bis zur Ataxie und damit zum Einsetzen der Narkose benötigte
die Ether Narkose mit 44,50±5,76 s. Somit ergab sich ein statistischer
Unterschied zwischen den Einleitungszeiten der Narkosen bei Ether vs. CO2
(p<0,0001), Ether vs. Isofluran (p=0,0006) und Ether vs. Sevofluran (p=0,0001)
(Abb. 11).
37
***
***
***
Zeit [s]
60
40
20
0
Sevofluran
Isofluran
CO2
Ether
Abb. 11 Darstellung der Zeit bis zur Ataxie bei der Narkoseeinleitung. (MW±SD; n=10) (*** p<0,001; ** p<0,05; *p<0,1)
5.1.1.2 Zeit bis zum Erreichen einer operativen Tiefe
Auch bei der zweiten Zeitmessung, bei der die Narkose tief genug war, um
einen kleinen operativen Eingriff durchführen zu können, ergab sich zwischen
den einzelnen Narkosegruppen ein signifikanter Unterschied (F3,36=33,775;
p<0,0001). Dieser Unterschied war zwischen den Gruppen Sevofluran vs. CO2
(p<0,0001), Isofluran vs. CO2 (p<0,0001), Ether vs. CO2 (p<0,0001) und
Sevofluran vs. Ether (p=0,0383) zu erkennen (Abb. 12). Die CO2 Narkose
benötigte dabei die geringste Zeit für die Einleitung der Narkose (45,90±5,47 s),
die Ether Narkose hingegen die längste Zeit (89,60±15,09 s). Die
Einleitungszeiten der Isofluran- (79,90±4,89 s) und Sevofluran- Narkose
(75,60±11,77 s) unterscheiden sich im Vergleich zur Ether und CO2 Narkose
nicht sehr stark.
***
***
**
Zeit [s]
150
***
100
50
0
Sevofluran
Isofluran
CO2
Ether
Abb. 12 Darstellung der Dauer der Einleitung der Narkosen bis zur operaWven Tiefe. (MW±SD; n=10) (*** p<0,001; ** p<0,05; *p<0,1)
38
5.1.2 Verhalten direkt nach der Narkose
Nachdem die Tiere aus der Narkosebox entnommen und in ihren Transportkäfig
gesetzt wurden, wurde das Verhalten beobachtet. Hierbei wurde zum einem die
Zeit bestimmt, die das Tier brauchte, um aus der Narkose zu erwachen. Dieses
Zeitintervall endete, wenn das Tier die erste Bewegung zeigte. Auch bei dieser
Analyse wurden die Kontroll- und Sham- Tiere nicht mit einbezogen.
5.1.2.1 Zeit bis zum Erwachen aus der Narkose
Bei dem Vergleich der Aufwachzeiten aus der jeweiligen Narkose ergab sich
kein statistischer Unterschied zwischen den Gruppen (F3,36=2,197; p=0,1052).
Alle Tiere benötigen unabhängig von der Narkose durchschnittlich 34,20±10,11
(s) zum Erwachen aus der Narkose (Tab. 5).
Tab. 5 Vergleich der MW ± SD der Aufwachzeiten der jeweiligen Narkosen.
Narkose
Aufwachzeit (s)
Sevofluran
31,00±7,72
Isofluran
39,90±9,67
CO2
29,20±7,63
Ether
36,70±15,42
5.1.2.2 Gesamtaktivität nach der Narkose
Neben der Aufwachzeit wurde die Gesamtaktivität beurteilt. Dazu wurden die
Zeiten des Auftretens verschiedener Aktivitäten auf die Gesamtzeit der
Beobachtung (300 s) berechnet und mit Faktoren versehen. Daraus konnte die
Gesamtaktivität ermittelt werden. Somit ergab sich ein Wert von 1-7, wobei 1
mit „nicht aktiv“ und 7 mit „sehr aktiv“ zu bewerten ist. Die einzelnen
Verhaltensweisen mit Faktoren werden in Tabelle 6 dargestellt. Bei dieser
Beobachtung wurden Kontrolltiere und Tiere, die eine Sham Narkose erhielten
mit einbezogen.
39
Tab. 6 Darstellung der Verhaltensweisen mit dem entsprechenden Wert.
Verhalten
Wert
dauerhaftes Liegen
1
seltene Bewegung, nicht aktiv
2
bewegen, aber langsam
3
neugierig; zeigt Interesse an ihre Umwelt
4
unkontrolliertes Taumeln
5
Erkundungsverhalten, aber taumelig
6
Aktiv; zeigt starkes Erkundungsverhalten
7
Bei dieser Beurteilung der Gesamtaktivität gab es zwischen den Gruppen
zahlreiche signifikante Unterschiede (F5,54=152,596; p<0,0001). Das Verhalten
der Kontrollgruppe wurde als Normalverhalten angesehen. Diese Tiere zeigten
eine Aktivität von 7,0. Ausgehend von diesem Verhalten, wurde das Verhalten
der anderen Gruppen beurteilt. Auch die Tiere, die eine Sham Narkose erhielten
zeigten keine Veränderung im Verhalten und somit eine Gesamtaktivität von
7,0. Tiere, die eine CO2 Narkose erhielten, zeigten die geringste Aktivität mit
2,83±0,68. Die Aktivität der weiteren Gruppen war ungefähr gleich (Sevofluran:
6,18±0,13; Isofluran: 5,80±0,51; Ether: 5,62±0,44) (Abb. 13). Dementsprechend
ergab sich, dass die Kontroll- und Sham- Gruppe signifikant aktiver waren
gegenüber allen anderen Gruppen, die eine Narkose erhielten. Zusätzlich ergab
sich ein statistischer Unterschied zwischen Sevofluran vs. CO2, Isofluran vs.
CO 2 und Ether vs. CO 2 . Alle p-Werte werden zur Bewahrung der
Gesamtaktivität
Übersichtlichkeit in Tabelle 7 dargestellt.
6
4
2
0
Kontrolle
Sham
Sevofluran
Isofluran
CO2
Ether
Abb. 13 Darstellung der GesamtakWvität ohne Signifikanzen. (MW±SD; n=10)
40
Tab. 7 Darstellung der MW ± SD der GesamtakWvität und die Signifikanzen zwischen den Gruppen.
(*** p<0,001; ** p<0,05; *p<0,1)
Mittelwert
± SD
Kontrolle
Kontrolle
7,00±0,0
Sham
Sevofluran
Isofluran
CO2
Ether
Sham
7,00±0,0
Sevofluran
Isofluran
CO2
Ether
**
***
***
***
**
***
***
***
***
*
6,18±0,13
5,80±0,51
***
2,83± 0,68
***
5,62±0,44
5.1.3 Blutanalyse
Um die Blutuntersuchung durchzuführen, wurde bei allen Mäusen vor
Versuchsbeginn Blut retrobulbär entnommen, um den basalen Hämatokrit Wert
und die Corticosteron Konzentration der ungestressten Tiere zu bestimmen.
Eine zweite Blutentnahme erfolgte am Versuchstag 15 min nach der Narkose,
bei der ebenfalls der Hämatokrit und die Corticosteron Konzentration bestimmt
wurden. Nun konnten beide Werte nach der Narkose mit basalen Werten
verglichen werden.
5.1.3.1 Hämatokrit
Bei einem Vergleich des Hämatokrit Werts nach der Narkose mit dem basalen
Wert war dieser nach der Sevofluran- (p=0,0174), Isofluran- (p=0,0773) und
CO2 Narkose (p<0,0001) signifikant erhöht. Bei den Gruppen mit einer Ether
Narkose, Sham Narkose und den Kontrolltieren ergaben sich keine
signifikanten Unterschiede im Vergleich zu den basalen Werten (Tab. 8).
41
Tab. 8 Vergleich der MW ± SD der basalen Hämatokrit Werten mit denen nach der Narkose.
Narkose
vor Narkose (%)
nach Narkose (%)
Kontrolle
52,05±1,36
52,60±1,17
Sham
52,55±0,93
52,65±0,90
Sevofluran
52,00±0,88
53,10±1,13
Isofluran
51,40±1,93
52,70±1,03
Ether
52,15±1,47
51,95±1,12
CO2
51,05±0,90
55,00±1,20
5.1.3.2 Corticosteron
Auch bei dem Vergleich der Corticosteron Werte vor und nach der Narkose
ergaben sich statistische Unterschiede. So sind die Corticosteron
Konzentrationen nach der Sevofluran (p<0,0001), Isofluran (p<0,0001), Sham
(p=0,0013), CO2 (p<0,0001) und Ether Narkose (p<0,0001) signifikant höher als
die zuvor gemessenen Basalwerte (Tab. 9) (Abb. 14). Jegliche Art von
Behandlung führte zu einen Anstieg in der Corticosteron Konzentration.
Lediglich bei den Kontrolltieren ergab sich kein statistischer Unterschied
zwischen beiden Werten (Basal: 467,80±496,80 nmol/l; nach Behandlung
826,00±468,00 nmol/l).
CORT [nmol / l]
3000
**
***
***
Sham
Sevofluran
Isofluran
Basal
***
Behandlung
***
CO2
Ether
2000
1000
0
Kontrolle
Abb. 14 Darstellung der CorWcosteron KonzentraWonen vor und nach einer Behandlung (MW±SD; n=10)
(*** p<0,001; ** p<0,05; *p<0,1)
42
Tab. 9 Vergleich der MW ± SD der CorWcosteron KonzentraWonen vor und nach der Behandlung.
Narkose
vor Behandlung
(nmol/l)
nach Behandlung
(nmol/l)
Kontrolle
467,82±496,83
825,99±467,98
Sham
434,49±253,00
1207,9±406,29
Sevofluran
349,89±300,38
1877,1±292,89
Isofluran
345,77±319,47
2162,0±302,71
Ether
504,31±305,52
1948,6±291,91
CO2
434,04±390,47
1874,7±216,35
Um einen Vergleich der Corticosteron Konzentrationen zwischen den Gruppen
zu erkennen, wurden Differenzen zwischen den Werten nach der jeweiligen
Narkose und den Basalwerten gebildet. Hierbei ergab sich, dass der
Corticosteron Wert nach einer Sevofluran Narkose (1527,21±397,86 nmol/l)
signifikant höher war als bei Kontrolltieren (358,17±790,21 nmol/l). Auch die
Konzentration von Corticosteron nach einer Isofluran Narkose (1816,20±386,79
nmol) war gegenüber einer Sham Narkose (773,46±535,21 nmol/l) signifikant
erhöht. Eine CO2 Narkose (1440,70±337,16 nmol/l) und eine Ether Narkose
(1444,33±405,01 nmol/l) zeigten ebenfalls einen statistischen Unterschied im
Vergleich zu den Kontrolltieren (Abb. 15).
**
**
***
***
CORT [nmol / l]
2500
*
2000
**
1500
1000
500
0
Kontrolle
Sham
Sevofluran
Isofluran
CO2
Ether
Abb. 15 Darstellung der CorWcosteron KonzentraWonen zwischen den Gruppen. (MW±SD; n=10) (*** p<0,001; ** p<0,05; *p<0,1)
43
5.1.4 Open Field
Neben der Betrachtung der physiologischen Parameter nach der Narkose
wurde das Verhalten in einem fünf-minütigen Open Field Test analysiert. Dabei
wurde die gelaufene Gesamtstrecke, die Frequenz der Zonenübertritte, die
Latenz des ersten Auftretens, die Geschwindigkeit und die Aufenthaltsdauer in
den Kompartimenten des Open Fields betrachtet.
Bei der Auswertung der gelaufenen Gesamtstrecke ergab sich ein signifikanter
Unterschied zwischen den unterschiedlichen Narkose Gruppen von F5,47=3,528;
p=0,0086. Dabei legten Tiere, die eine Ether Narkose erhielten die größte
Strecke mit 2805,18±1455,43 cm und Tiere, die eine Isofluran Narkose
erhielten, die geringste Strecke mit 1556,12±598,53 cm zurück (Abb. 16). So
ergab sich ein signifikanter Unterschied zwischen diesen beiden Gruppen von
p=0,0581. Zwischen den anderen Gruppen ergab sich kein statistischer
Distanz [cm / 5min]
Unterschied (Tab. 10).
6000
*
4000
2000
0
Kontrolle
Sham
Sevofluran
Isofluran
CO2
Ether
Abb. 16 Darstellung der Gesamtlaufstrecke der unterschiedlichen Gruppen. (MW±SD; n=10) (*** p<0,001; ** p<0,05; *p<0,1)
44
Tab. 10 Vergleich der MW ± SD der gelaufenen Gesamtstrecke im Open Field.
Narkose
Gesamtstrecke / 5 min
(cm)
Sevofluran
2033,49±445,23
Isofluran
1556,12±598,53
Sham
2503,42±227,16
Kontrolle
2322,15±498,11
CO2
1612,42±949,59
Ether
2805,18±1455,43
Die Analyse der maximal gelaufenen Strecke ohne Unterbrechung ergab einen
signifikanten Unterschied zwischen den Gruppen von F5,47=3,458; p=0,0096.
Dieser manifestierte sich vor allem zwischen den Gruppen, die eine Sevofluran
und Ether Narkose erhielten. Nach einer Ether Narkose liefen die Tiere mit
35,83±27,75 cm signifikant (p=0,0963) mehr als Tiere nach einer Sevofluran
Narkose mit 7,53±1,22 cm (Abb. 17). Weitere statistische Unterschiede waren
nicht erkennbar. Kontroll- und Sham Tiere liefen mit 16,71±21,47 cm (Kontrolle)
und 15,61±17,42 cm (Sham) die gleiche maximale Strecke. Auch die Tiere nach
einer Isofluran Narkose, liefen mit 8,83±7,66 cm fast die gleiche Distanz wie die
Tiere nach einer Sevofluran Narkose. Tiere nach einer CO2 Narkose liefen
wiederum fast die gleiche Strecke (32,97±30,08 cm) wie Tiere nach einer Ether
max. gelaufene Strecke [cm]
Narkose.
80
*
60
40
20
0
Kontrolle
Sham
Sevofluran
Isofluran
CO2
Ether
Abb. 17 Darstellung der maximal gelaufenen Strecke der unterschiedlichen Gruppen. (MW±SD; n=10) (*** p<0,001; ** p<0,05; *p<0,1)
45
Neben der zurückgelegten Gesamtstrecke wurden zur Untersuchung der
Aktivität nach der Narkose die Zonenübertritte betrachtet. Dazu wurde das
Open Field, wie in Abbildung 10 dargestellt, in eine Rand- und Mittelzone
unterteilt. Auch bei dieser Betrachtung ergab sich zwischen allen Gruppen ein
F-Wert von F5,47=2,868; p=0,0243. Zwischen den einzelnen Gruppen bestand
auf Grund der hohen Standardabweichung kein signifikanter Unterschied. Die
Reihenfolge von Zonenübertritten war somit: Sham (23.20±7,98) > Kontrolle
(17.50±7.34) > Sevofluran (15.80±10.69) > Ether (12.00±7.02) > Isofluran
(10.80±9.92) > CO2 (10.00±9,97) (Abb. 18).
Frequenz / 5 min
40
30
20
10
0
Kontrolle
Sham
Sevofluran
Isofluran
CO2
Ether
Abb. 18 Darstellung der ZonenübertriSe im Open Field pro 5 min. (MW±SD; n=10)
Außerdem wurde die Latenz des ersten Auftretens im Open Field betrachtet.
Das ist die Zeit, die das Tier benötigt, um von der Mitte, in die sie vom
Experimentator gesetzt wurde, das erste Mal in die Randzone zu gelangen.
Auch bei dieser Analyse ergab sich ein statistischer Wert zwischen den
Gruppen von F5,47=3,324 und p=0,0119. Tiere, welche eine Sham Narkose
bekamen, betraten mit 0,84±0,93 s signifikant schneller den Randbereich als
Tiere, die eine CO2 Narkose (5,60±4,71 s) erhielten (p=0,0511) (Abb. 19).
Zwischen den anderen Gruppen ergab sich kein signifikanter Unterschied (Tab.
11).
46
20
*
Zeit [s]
15
10
5
0
Kontrolle
Sham
Sevofluran
Isofluran
CO2
Ether
Abb. 19 Darstellung der Latenz des ersten Au`retens im Open Field. (MW±SD; n=10)
!
(*** p<0,001; ** p<0,05; *p<0,1)
Tab. 11 Vergleich der MW ± SD (s) der Latenz des ersten Au`retens. Narkose
Latenz des ersten Auftretens
Kontrolle
4,97±4,48
Sham
0,84±0,93
Sevofluran
2,86±2,04
Isofluran
3,00±2,63
CO2
5,60±4,71
Ether
1,69±1,98
5.1.4.5 gelaufene Geschwindigkeit
Ein weiterer Parameter zur Betrachtung des Verhaltens im Open Field ist die
Erfassung der gelaufenen Geschwindigkeit. Auch hier wurde ein signifikanter
Unterschied zwischen den Gruppen ermittelt (F5,47=3,524; p=0,0087). Dieser
statistische Wert ergab sich durch den Gruppenunterschied zwischen Tieren,
die eine Isofluran und Ether Narkose erhielten. Nach einer Ether Narkose liefen
die Tiere mit einer Geschwindigkeit von 9,36±4,85 cm/s und legten somit die
schnellste Geschwindigkeit zurück. Tiere nach einer Isofluran Narkose liefen
hingegen 5,19±2,00 cm/s und bewegten sich somit am langsamsten im Open
Field. Dadurch ergab sich ein signifikanter Unterschied von p=0,059. Die
anderen Gruppen reihten sich mit 5,38±3,17 cm/s (CO2) < 6,79±1,49 cm/s
(Sevofluran) < 7,80±1,74 cm/s (Kontrolle) < 8,35±0,76 cm/s (Sham) in dieser
Reihenfolge zwischen der maximalen und minimalen Geschwindigkeit ein (Abb.
20).
47
Geschwindigkeit [cm/s]
20
*
15
10
5
0
Kontrolle
Sham
Sevofluran
Isofluran
CO2
Ether
Abb. 20 Darstellung der gelaufenen Geschwindigkeit im Open Field. (MW±SD; n=10)
(*** p<0,001; ** p<0,05; *p<0,1)
Bei der Betrachtung der Aufenthaltsdauer im mittleren Bereich des Open Fields
während der gesamten 5 Minuten des Tests ergab sich kein signifikanter
Unterschied zwischen den Gruppen. Alle Tiere aller Gruppen hielten sich
durchschnittlich 25,77±17,99 s auf. Wodurch man schließen kann, dass sich die
Tiere die meiste Zeit (274,24 s) am Rand aufhielten. Tiere nach der Ether
Narkose zeigten bei dieser Betrachtung die geringste Aufenthaltsdauer in der
Mitte des Open Fields (16,56±8,71 s). Die Sham Gruppe verbrachte wiederum
die längste Zeit in der Mitte des Open Fields (34,56±16,16 s) (Tab. 12)
Tab. 12 Aufenthaltsdauer in der MiSe im Open Field Test.
Narkose
Aufenthalt Mitte
(s)
Kontrolle
30,07±15,09
Sham
34,56±16,16
Sevofluran
27,70±17,95
Isofluran
24,04±24,62
CO2
21,65±19,04
Ether
16,56±8,71
48
5.2 Blutentnahme
5.2.1 Dauer für die Blutentnahme
Zur Ermittlung der Dauer der Blutentnahme wurde zum einen die Gesamtdauer
ermittelt. Das entspricht der Zeit, die der Experimentator für die genutzte
Narkose bei der retrobulbären Blutentnahme mit der dünnen Kanüle oder
Venenwinkel bzw. für die Fixation der Tiere bei den restlichen Blutentnahmen
benötigte, plus die Dauer der eigentlichen Blutentnahme. Zum anderen wurde
die Durchführungszeit der reinen Blutentnahme ermittelt.
5.2.1.1 Dauer für die Durchführung der reinen Blutentnahme
Bei der Durchführung der Blutentnahme, ungeachtet davon wie lange der
Experimentator benötigte das Tier zu narkotisieren oder zu fixieren, ergaben
sich statistische Unterschiede zwischen den Gruppen (F 5,65 =29,597;
p=<0,0001). Die Zeit für die Durchführung wurde gemessen von der ersten
Punktion der jeweiligen Blutentnahmestelle bis zum Füllen der Hämatokrit
Kapillare. Hierbei wurde die retrobulbäre Blutentnahme mit der dicken Kanüle
mit 6,42±1,24 s am schnellsten durchgeführt. Diese Blutentnahme benötigte im
Vergleich zur Blutentnahme aus der Schwanzvene mit 79,09±31,52 s, aus den
Venenwinkel mit 40,58±16,98 s und aus der Vena saphena mit 40,67±13,82 s
signifikant weniger Zeit (Abb. 21). Für die Blutentnahme aus der Schwanzvene
wurde hingegen die längste Zeit benötigt. So ergaben sich bei dieser Methode
im Vergleich zu allen anderen durchgeführten Blutentnahme signifikante
Unterschiede (Tab. 13). Die Punktion der Vena facialis mit einer
Durchführungszeit von 13,33±11,33 s war nach der retrobulbären Methode mit
der dicken Kapillare die schnellste. Sie war im Vergleich zu Blutentnahme aus
der Vena saphena (p=0,0104) und dem Venenwinkel (p=0,0108) signifikant
schneller. Eine Ausnahme zum Füllen der Hämatokrit Kapillare wurde jedoch
bei der Blutentnahme aus dem Venenwinkel gemacht. Wurde dort nach
mehreren Einstichen der Kanüle in den Venenwinkel kein Blut gewonnen,
wurde die Entnahme abgebrochen. So erreichte die Punktion des Venenwinkels
eine reine Durchführungszeit von 40,58±16,98 s und war somit, obwohl die
49
Blutentnahme beim Nicht-Befüllen der Kapillare, was in 10 von 12 Kapillaren
der Fall war, abgebrochen wurde, immer noch signifikant langsamer als die
Punktion der Vena facialis (p=0,0108), die Punktion der Schwanzvene
(p<0,0001) und die Punktion des retrobulbären Venengeflechts mit dicker
(p=0,0005) und dünner Kapillare (p=0,0747). Ein weiterer statistischer
Unterschied ergab sich zwischen der Punktion der Vena saphena (40,67±13,82
s) und der retrobulbären Blutentnahme mit der dünnen Kapillare (18,67±9,89 s).
Dauer [s]
150
100
50
0
r.b. dick
r.b. dünn
Schwanzvene Vena saphena
Vena facialis
Venenwinkel
Abb. 21 Darstellung der Dauer für die jeweiligen Blutentnahmen ohne Signifikanzen. (MW±SD; n=12)
Tab. 13 Darstellung der MW ± SD der Blutentnahmezeiten in s und Darstellung der Signifikanzen.
(*** p<0,001; ** p<0,05; *p<0,1)
Mittelwert
± SD
r.b (dick)
r.b
(dick)
r.b
(dünn)
6,43±
Schwanz
V.
-vene
saphena
V. facialis
Venenwinkel
***
***
***
***
*
*
79,09±
***
***
40,67±
**
1,24
r.b (dünn)
18,67±
9,89
Schwanzvene
V.
saphena
V. facialis
***
31,52
13,82
13,33±
**
11,33
Venenwinkel
40,58±
16,98
50
5.2.1.2 Gesamtdauer für die Blutentnahme
Die Gesamtdauer der Blutentnahme umfasst sowohl die Zeit für die jeweilige
Blutentnahme, als auch die dafür benötigte Zeit, um das Tier zu fixieren bzw. in
Narkose zu legen. Auch hierbei ergaben sich signifikante Unterschiede
zwischen den unterschiedlichen Gruppen (F5,65=99,326; p<0,0001). Die
retrobulbäre Blutentnahme ist mit dicker Kapillare mit 9,42±1,24 s inklusive der
Fixation der Tiere auch bei dieser Betrachtung signifikant schneller als die
Blutentnahme aus der Schwanzvene (117,82±26,71 s), der Vena saphena
(63,17±16,12 s), dem Venenwinkel (136,75±21,64 s) und die retrobulbäre
Blutentnahme mit der dünnen Kapillare (118,50±24,33 s) (Abb. 22). Die
retrobulbäre Blutentnahme mit der dünnen Kapillare benötigte wie oben
erwähnt 18,67±9,89 s für die reine Blutentnahme. Durch die Ether Narkose
erhöht sich die Gesamtdauer der Blutentnahme auf 118,50±24,33 s. Somit war
diese Methode signifikant langsamer als die Blutentnahme aus der Vena
saphena (p<0,0001), Vena facialis (p<0,000)1 und die retrobulbäre
Blutentnahme mit der dicken Kapillare (p<0,0001). Auch die Blutentnahme aus
der Schwanzvene, bei der das Tier in einer Zwangsröhre gesetzt wurde,
dauerte statistisch länger als die Blutentnahme aus der Vena saphena
(p<0,0001), Vena facialis (p<0,0001) und die retrobulbäre Blutentnahme mit der
dicken Kapillare (p<0,0001). Die Punktion der Vena facialis, bei der das Tier
auch lediglich in den Zwangsgriff genommen werden musste, stellte sich nach
der retrobulbären Blutentnahme Methode mit der dicken Kapillare mit
20,50±11,80 s als zweitschnellste Methode heraus. Somit war diese Methode
auch signifikant schneller in der Durchführung als die Blutentnahme aus dem
Venenwinkel (p<0,0001), bei der die Tiere in eine Ether Narkose gelegt wurden,
und aus der Vena saphena (p=0,0001), bei der die Tiere in einen Falcon Tube
gesetzt wurden. Bei der Betrachtung der Gesamtdauer benötigte die Punktion
des Venenwinkels mit 136,75±21,64 s die längste Zeit, obwohl die Methode wie
oben erwähnt abgebrochen wurde, wenn nach mehreren Versuchen kein Blut
aspiriert wurde (10 von 12 Kapillaren waren nicht vollständig gefüllt) (Tab 14).
51
Gesamtdauer [s]
200
150
100
50
0
r.b. dick
r.b. dünn
Vena facialis
Venenwinkel
Abb. 22 Darstellung der Gesamtdauer für die jeweiligen Blutentnahmen ohne Signifikanzen. (MW±SD; n=12)
Tab. 14 Darstellung der MW ± SD der Gesamtdauer (in s) der Blutentnahmezeiten und Darstellung der Signifikanzen.
(*** p<0,001; ** p<0,05; *p<0,1)
Mittelwert
± SD
r.b (dick)
r.b
(dick)
9,42±
r.b
(dünn)
***
Schwanz
V.
-vene
saphena
***
V. facialis
***
Venenwinkel
***
1,24
r.b (dünn)
118,50±
***
***
***
***
63,17±
***
***
20,50±
***
24,33
Schwanzvene
117,82±
26,71
V.
saphena
V. facialis
16,12
11,80
Venenwinkel
136,75±
21,64
5.2.1.3 Quantität des gewonnenen Blutes
Neben der Betrachtung der Durchführungszeit der jeweiligen Blutentnahmen
wurde zusätzlich subjektiv durch Erfassung der Füllstandes der Kapillaren und
der enthaltenen Luftblasen die Quantität des Blutes erfasst.
Das Blut, welches durch die Blutentnahme aus der Vena facialis und durch die
Punktion des retrobulbären Venengeflechts, sowohl mit der dicken, als auch mit
der dünnen Kapillare gewonnen wurde, zeigte keine Luftblasen und die
Kapillaren waren stets voll gefüllt, so dass 75 µl Blut entnommen wurden. Bei
52
der Punktion der Vena saphena waren die Kapillaren nach der Blutentnahme
auch stets gefüllt, jedoch waren bei drei Tieren Luftblasen enthalten, so dass
hier ein leichter Verlust an Blut auftrat. Die Punktion der Schwanzvene war
lediglich bei zwei Tieren erfolgreich, so dass die Kapillaren ohne Luftblasen voll
gefüllt waren. Fünf Kapillaren waren nur zu einem Drittel bis zu drei Viertel
gefüllt und sieben Kapillaren enthielten Luftblasen. Bei der Punktion des
Venenwinkels erfolgte keine Zählung der Luftblasen. Jedoch waren auch bei
dieser Methode die Kapillaren zu einem Viertel bis drei Viertel gefüllt. Zusätzlich
konnte bei dieser Methode kein Hämatokrit-Wert bestimmt werden, da dieser
dadurch, dass die Kanüle für die Punktion mit EDTA gespült wurde, nicht
auswertbar war, so dass Hämatokrit Werte von 24 %, 31 % oder noch geringer
(4,23 %) auftraten.
5.2.2 Gesamtaktivität nach der Blutentnahme
Auch direkt nach der Blutentnahme wurde die Gesamtaktivität für 10 min
betrachtet. Dazu wurden, wie oben beschrieben, die Zeiten des Auftretens
verschiedener Aktivitäten (Tab. 6) auf die Gesamtzeit der Beobachtung (600 s)
berechnet und mit Werten versehen. Daraus konnte die Gesamtaktivität
ermittelt werden. Somit ergeben sich Werte von 1-7, wobei 1 „nicht aktiv“ und 7
„sehr aktiv“ bedeutet.
In Tabelle 15 sind die signifikanten Unterschiede zwischen den Gruppen
(F5,63=65,752; p=<0,0001) dargestellt. Tiere, denen Blut retrobulbär mit der
dicken Kapillare entnommen wurde, zeigten hierbei mit 6,94±0,06 die höchste
Aktivität. Sie waren signifikant aktiver als Tiere nach der Blutentnahme aus der
Vena facialis (3,68±0,93), dem Venenwinkel (3,72±1,17) und nach der
retrobulbären Blutentnahme mit der dünnen Kapillare (5,86±0,34). Die geringste
Aktivität zeigten die Tiere nach der Punktion der Vena facialis mit 3,68±0,93.
Diese Tiere wiesen eine statistisch geringere Aktivität auf als Tiere nach der
Punktion der Vena saphena (6,77±0,29), Punktion der Schwanzvene
(6,87±0,38) und der retrobulbären Blutentnahme, sowohl mit dicker (6,94±0,06),
als auch mit dünner (5,86±0,34) Kapillare. Tiere, denen Blut aus dem
Venenwinkel entnommen wurde, zeigten ebenfalls eine geringe Aktivität von
3,72±1,17. Diese Aktivität unterschied sich signifikant von der Aktivität nach der
53
Blutentnahme aus der Vena saphena (p<0,0001) und der Schwanzvene
(p<0,0001) sowie nach der Punktion des retrobulbären Venengeflechts mit
dicker (p<0,0001) und dünner (p=0,0289) Kapillare. Ebenfalls waren Tiere nach
der retrobulbären Punktion mit dünner Kapillare signifikant weniger aktiv, als
Tiere bei denen die Schwanzvene (p=0,0289) bzw. die Vena saphena
(p=0,0585) punktiert wurde (Abb. 23).
Gesamtaktivität
8
6
4
2
0
r.b. dick
r.b. dünn
Vena facialis
Venenwinkel
Abb. 23 Darstellung der Gesamtdauer für die jeweiligen Blutentnahmen ohne Signifikanzen. (MW±SD; n=12)
Tab. 15 Darstellung der MW ± SD der GesamtakWvitäten in s nach der Blutentnahme und Darstellung der Signifikanzen.
(*** p<0,001; ** p<0,05; *p<0,1)
Mittelwert
± SD
r.b (dick)
r.b
(dick)
6,94±
r.b
(dünn)
Schwanz
V.
-vene
saphena
**
V. facialis
Venenwinkel
***
***
***
***
***
***
***
***
0,06
r.b (dünn)
5,86±
**
*
0,34
Schwanzvene
V.
saphena
V. facialis
3,68±
0,93
6,77±
0,29
6,87±
0,38
Venenwinkel
3,72±
1,17
54
5.2.3 Blutanalyse
Für die Ermittlung des physiologischen Stresses wurde 15 min nach der
jeweiligen Blutentnahme die Corticosteron Konzentration durch eine zweite
Blutentnahme bestimmt und mit den Konzentrationen der basalen
Blutentnahme verglichen. Dabei ergab sich, dass sich die Corticosteron Werte
aller Blutentnahmen signifikant von den basalen Corticosteron Werten
unterschieden. Bei der retrobulbären Blutentnahme mit der dicken und dünnen
Kapillare waren die Corticosteron Werte nach der Blutentnahme (dick:
1169,64±395,90 nmol/l; dünn: 1730,55±666,01 nmol/l) signifikant höher als die
basalen Werte (dick: 282,02±210,78 nmol/l; dünn: 87,01±75,10 nmol/l). Auch
die Corticosteron Werte der Punktion der Schwanzvene (2412,47±1873,39
nmol/l), der Vena facialis (2578,81±2198,99 nmol/l), der Vena saphena
(1805,06±820,21 nmol/l), des Venenwinkels (236,75±259,71 nmol/l)
unterschieden sich signifikant von ihren basalen Werten (Abb. 24, Tab. 16).
Cort basal
Cort nach Blutentnahme
CORT [nmol / l]
8000
***
***
**
***
**
**
r.b. dick
r.b. dünn
Schwanzvene
V. saphena
V. facialis
Venenwinkel
6000
4000
2000
0
Abb. 24 Vergleich der basalen CorWcosteron Werte mir denen nach der Blutentnahme. (MW±SD; n=12)
(*** p<0,001; ** p<0,05; *p<0,1)
55
Tab. 16 Vergleich der basalen CorWcosteron Werten mit den CorWcosteron Werten nach der Blutentnahme. . (MW±SD)
Blutentnahmemethoden
basale Corticosteron
Werte ± SD
(nmol/l)
Corticosteron Werte
nach Blutentnahme ± SD
(nmol/l)
retrobulbär (dick)
282,02±210,78
1169,64±395,90
retrobulbär (dünn)
87,01±75,10
1730,55±666,01
192,307±188,12
2578,81±2198,99
Vena saphena
116,65±97,33
1805,06±820,21
Schwanzvene
203,60±168,39
2412,47±1873,39
Venenwinkel
236,75±259,71
3243,61±1958,13
Vena facialis
Neben dem Vergleich der basalen Corticosteron Werte mit denen nach der
Blutentnahme, wurden die Corticosteron Werte unabhängig von ihrem
Basalwert miteinander vergleichen. Dazu wurde die Differenz zwischen den
Corticosteron Werten nach der Blutentnahme und den basalen Corticosteron
Werten berechnet. Dort ergab sich ein signifikanter Gruppenunterschied von
F5,63=2,523, p=0,0382. Jedoch lässt sich dieser Gruppenunterschied, der
zwischen allen Gruppen entstand durch die großen Standardabweichungen
(Tab. 16) nicht individuell auf die jeweiligen Gruppen übertragen. Die
retrobulbäre Blutentnahme mit der dicken Kapillare löste den geringsten
Corticosteron Anstieg mit 887,62±481,07 nmol/l aus, die Punktion des
Venenwinkels führte hingegen zu den größten Corticosteron Anstieg
(3006,86±2101,61 nmol/l). Es ergab sich ein Corticosteron Anstieg der Größe
nach: retrobulbär (dick) (887,61±481,07 nmol/l) < retrobulbär (dünn)
(1643,53±675,49 nmol/l) < Vena saphena (1688,41±811,86 nmol/l) <
Schwanzvene (2208,87±1853,51 nmol/l) < Vena facialis (2386,50±2260,98
nmol/l) < Venenwinkel (3006,86±2101,61 nmol/l) (Abb. 25).
56
CORT [nmol / l]
8000
6000
4000
2000
0
-2000
r.b. dick
r.b. dünn
Vena facialis
Venenwinkel
Abb. 25 Darstellung der Gruppenunterschiede der CorWcosteron AnsWegs nach der Blutentnahme. (MW±SD; n=12)
5.2.4 Open Field
Auch 15 min nach der Blutentnahme wurden die Tiere wie nach der Narkose für
fünf Minuten in ein Open Field gesetzt, um das Verhalten zu beobachten.
Bei dem Vergleich der gelaufenen Gesamtstrecke pro fünf Minuten im Open
Field ergaben sich statistische Unterschiede zwischen den Gruppen
(F5,65=8,336; p<0,0001). Die größte Distanz im Open Field legten Tiere nach
der Punktion der Schwanzvene mit 2183,27±648,65 cm zurück. Tiere, bei
denen Blut aus dem Venenwinkel genommen wurde, legten wiederum die
geringste Strecke mit 839,54±371,71 cm im Open Field zurück. Sie liefen in den
fünf Minuten, in denen der Open Field Test durchgeführt wurde, signifikant
weniger als Tiere nach der retrobulbären Blutentnahme mit der dicken
(1807,78±861,96 cm) und dünnen Kapillare (1699,01±498,42 cm), Tiere nach
der Punktion der Schwanzvene (2183,27±648,65 cm) und Tiere nach der
Punktion der Vena saphena mit 2110,21±443,21 cm. Nach der Punktion der
Vena facialis legten die Tiere eine Gesamtstrecke von 1225,54±697,78 cm im
Open Field zurück und unterschieden sich statistisch von Tieren nach Punktion
der Schwanzvene (p=0,0191) und nach Punktion der Vena saphena (p=0,0394)
(Abb. 26).
57
**
Distanz [cm / 5min]
**
**
*
4000
***
***
3000
2000
1000
0
r.b. dick
r.b. dünn
Vena facialis
Venenwinkel
Abb. 26 Darstellung der gelaufenen Gesamtstrecke im Open Field pro 5 Minuten. (MW±SD; n=12)
(*** p<0,001; ** p<0,05; *p<0,1)
Auch bei der Betrachtung der maximal gelaufenen Strecke im Open Field
ergaben sich signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen (F5,65=8,507,
p<0,0001). Die Mäuse mit einer Blutentnahme aus dem Venenwinkel liefen, wie
oben erwähnt, die kürzeste Gesamtstrecke im Open Field. Auch bei der
maximal gelaufenen Strecke legten diese Tiere die kürzeste Distanz zurück
(4,62±1,49 cm). Damit legten sie eine statistisch kürzere maximale Strecke
zurück als Tiere nach der retrobulbären Blutentnahme mit der dünnen Kapillare
(6,76±1,12 cm), Tiere nach der Punktion der Schwanzvene (8,19±1,55 cm) und
Tiere nach der Punktion der Vena saphena (8,13±1,45 cm) (Abb. 27). Die
größte maximale Strecke liefen Tiere nach Punktion der Schwanzvene mit
8,19±1,55 cm. Sie liefen somit signifikant mehr als Tiere nach Punktion der
Vena facialis mit 5,73±1,82 cm und Tiere nach Punktion des Venenwinkels. Ein
weiterer statistischer Unterschied ergab sich zwischen den Gruppen nach der
Blutentnahme aus der Vena saphena und Vena facialis. So liefen die Tiere nach
der Punktion der Vena saphena (8,13±1,45 cm) signifikant mehr als die Tiere
nach der Punktion der Vena facialis mit 5,73±1,82 cm (Tab 17).
58
max. gelaufene Strecke [cm]
**
*
15
**
***
***
10
5
0
r.b. dick
r.b. dünn
Vena facialis
Venenwinkel
Abb. 27 Darstellung der maximal gelaufenen Strecke im Open Field. (MW±SD; n=12)
(*** p<0,001; ** p<0,05; *p<0,1)
Tab. 17 Vergleich der gelaufenen maximalen Strecke ± SD im Open Field. (MW±SD) Blutentnahmemethode
gelaufene maximale Strecke ± SD
(cm)
6,61±2,04
6,76±1,12
Schwanzvene
8,19±1,55
Vena saphena
8,13±1,45
Vena facialis
5,73±1,82
Venenwinkel
4,62±1,49
Wie schon im Material und Methoden Teil beschrieben wurde das Open Field in
einen Rand- und Mittelbereich eingeteilt, um Zonenübertritte zu erfassen.
Hierbei ergaben sich signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen
(F5,65=3,792; p=0,0045). Auch hier zeigten Tiere nach der Blutentnahme aus der
Schwanzvene die meisten Zonenübergänge (22,42±11,16). Die wenigsten
Übertritte zeigten Tiere nach der Punktion der Venenwinkels (7,64±3,98), was
auch mit der gelaufenen Gesamtstrecke und der maximal gelaufenen Strecke
korrelierte. Somit führte dieser Unterschied zwischen den meisten
Zonenübertritten und den geringsten Zonenübertritten zu einem statistischen
Unterschied zwischen den Gruppen nach der Schwanzvenen- und Venenwinkel
Punktion (p=0,28). Ein weiterer signifikanter Unterschied wurde zwischen der
Blutentnahme aus dem Venenwinkel und der retrobulbären Blutentnahme mit
59
der dicken Kapillare (20,41±14,21) gefunden (p=0,0872). So ergab sich eine
Reihenfolge der Zonenübertritte von: Venenwinkel (7,64±3,98) < retrobulbär
(dünn) (12,00±8,63) < Vena facialis (13,67±9,73) = Vena saphena (13,67±6,17)
< retrobulbär (dick) (20,42±14,20) < Schwanzvene (22,42±11,16) (Abb. 28).
Frequenz / 5 min
50
**
40
**
30
20
10
0
r.b. dick
r.b. dünn
Vena facialis
Venenwinkel
Abb. 28 Darstellung der ZonenübertriSe im Open Field pro 5 min. (MW±SD; n=12)
(*** p<0,001; ** p<0,05; *p<0,1)
5.2.4.4 Geschwindigkeit
Eine weiterer Parameter, der im Open Field erfasst wurde, war die
Geschwindigkeit, mit der sich die Tiere bewegten. Es ergaben sich dabei
signifikante Unterschiede zwischen den Gruppe (F5,65=8,334; p<0,0001).
Hierbei liefen Tiere, denen Blut aus dem Venenwinkel genommen wurde, am
langsamsten mit 2,80±1,24 cm/s und bewegten sich somit statistisch langsamer
als Tiere nach der Punktion der Vena saphena (7,04±1,48 cm/s), Tiere nach
Punktion der Schwanzvene (7,28±2,16 cm/s) und Tiere, denen retrobulbär Blut
sowohl mit der dicken (6,03±2,88 cm/s), als auch mit der dünnen Kapillare
(5,67±1,66 cm/s) genommen wurde (Abb. 29). Neben den Tieren nach
Venenwinkel Punktion bewegten sich auch die Tiere nach der Punktion der
Vena facialis mit 4,09±2,33 cm/s sehr langsam. So wurde ein statistischer
Unterschied im Vergleich zur Punktion der Vena facialis und der Schwanzvene
errechnet, nach der die Tiere sich mit der größten Geschwindigkeit mit
7,28±2,16 cm/s bewegten.
60
Geschwindigkeit [cm/s]
**
**
15
**
*
***
10
***
5
0
r.b. dick
r.b. dünn
Vena facialis
Venenwinkel
Abb. 29 Darstellung der gelaufenen Geschwindigkeit im Open Field. (MW±SD; n=12)
(*** p<0,001; ** p<0,05; *p<0,1)
Auch bei der Betrachtung der Zeit, die die Tiere benötigten, um das erste Mal
von der Mitte der Open Fields in den Randbereich zu gelangen, ergaben sich
signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen (F5,65=4,700; p=0,0010).
Dieser Unterschied rührt vor allem daher, dass Tiere, denen Blut aus dem
Venenwinkel entnommen wurde, 20,13±24,36 s benötigten, um von der Mitte
zum Rand zu gelangen. Dadurch hatten diese Tiere, wie in Abbildung 30
dargestellt, eine signifikant längere Latenzzeit als alle anderen Tiere, die ca 2-5
s benötigten, um die Mitte zu verlassen. Somit ergab sich eine Reihenfolge von:
Venenwinkel (20,13±24,36 s) > Vena facialis (5,37±5,31 s) retrobulbär (dick) >
(4,98±4,15 s) > Vena saphena (4,42±3,75 s) > Schwanzvene (3,67±2,54 s) >
Latency of first occurrence [s]
retrobulbär (dünn) (2,50±2,06 s).
**
80
**
**
**
**
60
40
20
0
r.b. dick
r.b. dünn
Vena facialis
Venenwinkel
Abb. 30 Darstellung der Latenz des ersten Au`retens im Open Field. (MW±SD; n=12)
(*** p<0,001; ** p<0,05; *p<0,1)
61
Wie schon die Betrachtung der Aufenthaltsdauer im fünf-minütigen Open Field
Test nach der Narkose ergab auch diese Beobachtung der Aufenthaltsdauer
nach der Blutentnahme keinen signifikanten Gruppenunterschied. Am längsten
befanden sich die Tiere nach der Punktion des Venenwinkels mit 58,20±71,86 s
in der Mitte. Die kürzeste Verweildauer zeigten die Tiere nach der retrobulbären
Blutentnahme mit der dünnen Kapillare (21,43±20,79 s) (Tab. 18). Wie die Tiere
nach der Narkose hielten sich die Tiere nach der Blutentnahme die längste Zeit
(259,83 s) während des Open Field Tests im Randbereich auf.
Tab. 18. Aufenthaltsdauer in der MiSe im Open Field Test. (MW±SD)
Blutentnahmemethode
Aufenthaltsdauer Mitte
(s)
40,12±27,88
21,43±20,79
Schwanzvene
45,85±22,35
Vena saphena
25,27±15,87
Vena facialis
51,63±44,51
Venenwinkel
58,20±71,86
62
6. Diskussion
Diese Masterarbeit ist eine Fortführung meiner Bachelorarbeit, bei der zwei
unterschiedliche Blutentnahmen, retrobulbär mit dicker Kapillare und die
Punktion der Vena facialis mit einer animal bleeding Lanzette, sowohl mit
Ether-, CO2, als auch ohne Narkose durchgeführt wurden. Es stellte sich
anhand der Corticosteron Konzentration und des Verhaltens im Open Field
heraus, dass die retrobulbäre Blutentnahme ohne Narkose bei der Maus
offensichtlich die geringste Stressantwort auslöste. Die Inhalationsnarkosen
schienen den Stress zu erhöhen. Bei der Punktion der Vena facialis führte die
CO2 Narkose zu mehr und die Ether Narkose zu weniger Stress (Schlichting et
al., 2008).
Aus diesem Grund sollte in dieser meiner Masterarbeit zum einen untersucht
werden, welchen Einfluss Ether-, CO2-, Sevofluran-, und Isofluran-Narkosen auf
die Stressreaktion der Maus haben.
Zum anderen wurden alle von der GV-SOLAS (2009) empfohlenen
Blutentnahmemethoden: die retrobulbäre Blutentnahme mit dicker und dünner
Kapillare, die Punktion der Vena saphena, der Vena facialis sowie der
Schwanzvene und die Blutentnahme aus dem Venenwinkel auf das Hervorrufen
von Stress untersucht. Ziel war es, eine Aussage über die Stressreaktion der
Mäuse sowohl auf eine Blutentnahme, als auch auf eine Narkose zu treffen.
Dazu wurden Corticosteron Bestimmungen durchgeführt und das Verhalten
direkt nach der Narkose bzw. Blutentnahme sowie im Open Field beobachtet.
6.1 Narkose
Ziel dieses Narkoseversuchs war es zu untersuchen, welchen Einfluss vier
verschiedene, häufig verwendete, volatile Anästhetika (Ether, CO2, Sevofluran
und Isofluran) auf Mäuse haben. Zunächst wurden die Einleitungs- und
Aufwachzeiten der Narkotika betrachtet. Hierbei zeigte sich, dass Tiere, die eine
CO2 Narkose erhielten, am schnellsten ataktisch wurden (27,30±4,22 s), was
ein Zeichen für die einsetzende Narkose war und auch am schnellsten in
Narkose verfielen (45,90±5,47 s). Bei der Verwendung von Ether benötigten die
63
Tiere hingegen am längsten (Ataxie: 44,5±5,76 s; Narkose: 89,60±15,09 s).
Auch die Zeit bis zum Aufwachen aus der Narkose war bei der Ether Narkose
länger (36,7±15,42 s) als nach der CO2 Narkose (29,2±7,63 s). Dieses Ergebnis
stimmt nicht mit den Resultaten eines Narkoseversuchs von Fowler et al. (1980)
überein. In ihren Versuch an Wistar Ratten dauerten die Einleitung und das
Aufwachen bei der CO2 Narkose länger als bei einer Ether Narkose. Jedoch
wurde in seinem Versuch ein CO2 : O2 Gemisch verwendet und der Einstrom
betrug 1 l/min. In dem hier vorliegenden Versuch wurde ein spezieller Deckel
verwendet, in welchem das CO2 durch eine Prellplatte mit einem Einstrom von
4,6 l/min verwirbelt wurde, wodurch die Narkoseeinleitung nachgewiesen
besonders schonend ist (Corbach, 2006). Vermutlich reduziert sich daher die
Einleitungszeit mit CO2 in diesem Versuch im Vergleich zu jenem von Fowler et
al. (1980). Auch bei einer Studie von Kohler et al. (1999) zeigte sich, dass CO2
bei Mäusen zu einer sehr schnellen Einleitung und einer schnellen Aufwachzeit
führt. Flecknell (2009) erklärte die schnelle Aufwachzeit durch die hohe
Atemfrequenz, bei der das CO2 schnell wieder ausgeatmet wird.
Die Betrachtung der Einleitungs- bzw. Aufwachzeiten der Sevofluran und
Isofluran Narkose zeigte, dass es bei den Zeiten fast keine Unterschiede gab.
Bei Sevofluran benötigten die Tiere 79,9±4,89 s bis zum Erreichen einer
operativen Tiefe und bei Isofluran 75,6±11,77 s. Auch die Aufwachzeiten waren
fast gleich (Sevofluran: 31,0±7,72 s; Isofluran: 39,9±9,67 s). Das bestätigt, dass
beide Narkotika im Körper sehr schnell anfluten und auch wieder schnell
ausgeatmet werden. Jedoch widerspricht dieses Ergebnis Studien von Hikasa
et al. (1996) und Flecknell (2009), die herausfanden, dass Sevofluran eine
geringere Einleitungszeit benötigt als Isofluran.
Neben den Einleitung- und Aufwachzeiten wurde das Verhalten direkt nach der
Narkose, die Corticosteron Konzentration und das Verhalten im Open Field zur
Beurteilung des auftretenden Stresses durch die Narkose betrachtet. Hier
konnte gezeigt werden, dass alle Tiere, die eine Narkose erhielten, insgesamt
signifikant weniger aktiv waren, als Tiere ohne bzw. mit einer Sham Narkose.
Auch bei der Auswertung der Corticosteron Konzentration ergaben sich
signifikante Unterschiede zwischen den Werten nach der Narkose, verglichen
mit den basalen Corticosteron Werten. Alle Corticosteron Konzentrationen
64
waren nach der Narkose unabhängig davon, ob eine Sham-, CO2-, Sevofluran-,
Isofluran- oder Ether- Narkose durchgeführt wurde, im Vergleich zu den basalen
Werten stark erhöht. Zwischen den Narkosegruppen ergaben sich keine
Unterschiede nach der Narkose (CO2: 1874,7±26,4 nmol/l, Ether: 1948,6±291,9
nmol/l, Sevofluran: 1877,1±292,9 nmol/l, Isofluran: 2162,0 ±302,7 nmol/l). Diese
Ergebnisse zeigen, dass jegliche Art von volatilen Narkotika, sogar der
Lufteinstrom allein, in einer Narkosebox zu Stress bei Tieren führen kann.
Bestätigt wird dieses Ergebnis durch zahlreiche Literaturquellen, die erwähnen,
dass Ether beispielsweise dadurch Stress induziert, dass es zu einer Reizung
der Atemwege führt oder dass es zu einer vermehrten Schleimproduktion
kommt (Otto, 2004; Fish, 2008). Conlee et al. (2005) berichteten in einem
Review von zahlreichen Autoren, die beschreiben, dass CO2 bei Tieren,
gemessen an physiologischen Parametern wie Herzschlagrate, Atemfrequenz
und Blutdruck, zu Schmerzen und Distress führt. Bei einem Vergleich der durch
Sevofluran und Isofluran entstehenden Atemwegsreizung zeigte sich, dass
Isofluran im Vergleich zu Sevofluran zu mehr Reizungen führte (Doi und Ikeda,
1993). Obwohl Sevofluran weniger Reizungen der Atemwege verursachte,
traten dennoch welche auf. So führt jedes Narkotikum zu einer Veränderung im
Körper des Tieres, was Stress auslösen kann.
Im Open Field Test zeigten die Tiere jedoch unabhängig davon, welches
Anästhetikum verwendet wurde, keine auf die Narkose zurückführbare
Veränderung. Lediglich Tiere, die eine Ether Narkose erhalten hatten, liefen
eine längere Gesamtstrecke als Tiere, die eine Isofluran Narkose erhalten
hatten. Weiterhin zeigten Tiere nach einer CO2 Narkose eine längere Latenzzeit
als Tiere, die eine Sham Narkose erhielten. Quatermain et al. (1996)
berichteten, dass Stress zu einer Reduktion der Bewegung führt. Jedoch hatten
fast alle Tiere unabhängig davon, ob sie eine Narkose bekamen oder nicht, eine
annähernd gleiche Bewegungsaktivität. Das lässt sich schließen, dass der
Stress, der durch eine Narkose ausgelöst wird, nur von kurzzeitiger Dauer ist
und keinen entscheidenden Einfluss auf das Verhalten im Open Field 15 min
nach der Narkose zu haben scheint.
Die Bewegung direkt nach der Narkose ist jedoch stark reduziert, im Vergleich
zu Tieren, die keine Narkose erhielten. Zusätzlich stieg die Corticosteron
65
Konzentration nach der Narkose signifikant an. Somit scheinen also die in
dieser Studie verwendeten volatilen Anästhetika bei den Tieren kurzfristig
Stress auszulösen. Daher sollte überlegt werden, ob bei kurzen experimentellen
Eingriffen, wie zum Beispiel einer Blutentnahme, auf eine Narkose verzichtet
werden sollte, da diese genau wie die kurze Behandlung auch zu temporärem
Stress führen kann.
6.2 Blutentnahme
Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war es verschiedene Blutentnahmemethoden
vergleichend zu untersuchen. Bei der Arbeit in der Versuchstierkunde wird
häufig Blut von Labortieren benötigt, um beispielsweise eine Blutgasanalyse
oder eine Hormonbestimmung durchzuführen. Aus diesem Grund soll eine
Methode gefunden werden, die für die Tiere besonders schonend ist und ihnen
den geringsten Stress bereitet. Die GV-SOLAS hat in ihrer Empfehlung einige
Methoden zur Blutentnahme bei Mäusen, wie die retrobulbäre Blutentnahme,
die Blutentnahme aus dem Venenwinkel, der Vena facialis, der Vena saphena
und der Schwanzvene empfohlen. Aus einer früheren Studie (Schlichting et al.,
2008) wurde ersichtlich, dass bei einem Vergleich der retrobulbären
Blutentnahme mit der Punktion der Vena facialis mit einer animal bleeding
Lanzette die retrobulbäre Blutentnahme sowohl bei der Bestimmung der
Corticosteron Konzentration, als auch im Verhalten im Open Field Test für das
Tier stressärmer ist. In der vorliegenden Studie wurden daher alle von der GVSOLAS empfohlenen Blutentnahmemethoden auf Stress untersucht.
Zunächst wurden die Durchführungszeiten der verschiedenen Blutentnahmen
analysiert. Dabei ist zu beachten, dass zwei Entnahmemethoden, die
retrobulbäre Blutentnahme mit der dünnen Kanüle und die Punktion des
Venenwinkels, eine Narkose benötigten. Für die Punktion der Schwanzvene
musste die Maus in eine Zwangsröhre verbracht werden. Aus diesem Grund
benötigten diese Methoden (retrobulbär dünn: 118,5±24,33 s; Schwanzvene:
117,82±26,71 s; Venenwinkel: 136,75±21,64 s) im Vergleich zu den anderen
Methoden mehr Zeit. Bei der Punktion der Vena facialis und der retrobulbären
Blutentnahme mit der dicken Kapillare wurden die Tiere lediglich in den
66
Zwangsgriff genommen, um ihnen Blut zu entnehmen. Diese Prozeduren
dauerten nur wenige Sekunden (retrobulbär dick: 9,42±1,24 s; Vena facialis:
20,5±11,8 s) und waren somit signifikant schneller als die zuvor erwähnten
Methoden. Eine mittlere Position von der Betrachtung der Zeit erreichte die
Punktion der Vena saphena (63,17±16,12 s). Dieses Ergebnis in der
Durchführungszeit bestätigt das Ergebnis von van Herck et al. (2001). Bei
einem Vergleich der Behandlungszeiten dreier Blutentnahme Techniken stellten
auch sie fest, dass die retrobulbäre Blutentnahme Methode die schnellste und
die Punktion der Schwanzvene die langsamste Methode war. Die Punktion der
Vena saphena nahm auch bei dieser Studie zeitlich gesehen die mittlere
Position ein. Obwohl bei der Punktion der Vena saphena die Tiere ebenfalls in
ein Gefäß, hier ein Falcon Tube, gesetzt wurden und noch das Bein rasiert
werden musste, benötigte diese Methode signifikant weniger Zeit als die
Punktion der Schwanzvene, bei der das Tier ebenfalls in ein Gefäß
(Zwangsröhre) gesetzt wurde. Jedoch musste bei der Punktion der
Schwanzvene häufiger nachgestochen werden, da die einmalige Punktion oft
nicht ausreichte, um eine Hämatokrit Kapillare zu füllen, wodurch diese
Methode mehr Zeit in Anspruch genommen hat. Diese mehrfach Punktionen
traten bei allen Methoden auf außer bei der retrobulbären Blutentnahme,
sowohl mit dicker, als auch mit dünner Kapillare. Eine weitere Variation der
unterschiedlichen Entnahmezeiten kam durch das individuelle Arbeitstempo der
Personen, die die Punktionen durchführten, zustande. Jedoch ließ sich diese
Variation nicht verhindern, da jede Blutentnahme durch eine geübte Person
durchgeführt werden sollte und niemand alle Blutentnahmemethoden perfekt
beherrscht.
Um den Stress der verschiedenen Entnahmemethoden abzuschätzen, wurde
das Verhalten direkt nach der Blutentnahme, die Corticosteron Konzentration
und das Verhalten im Open Field beurteilt.
Das Verhalten direkt nach der Blutentnahme ergab, dass die Tiere nach der
retrobulbären Blutentnahme mit der dicken Kanüle und nach der Punktion der
Vena saphena bzw. Schwanzvene fast genauso aktiv waren, wie die
Kontrolltiere des Narkoseversuchs, was für Normalverhalten spricht. Diese
Tiere schienen direkt nach der Blutentnahme keine Veränderung im Verhalten
67
zu zeigen. Tiere hingegen, bei denen der Venenwinkel bzw. die Vena facialis
punktiert wurde, schienen sich weniger zu bewegen und waren insgesamt direkt
nach der Blutentnahme wenig aktiv. Die Aktivität scheint nicht mit der Dauer der
Blutentnahme zu korrelieren. Man könnte zwar der Meinung sein, je länger eine
Blutentnahme dauert, desto mehr Stress müssten die Tiere haben. Dies trifft
jedoch nicht zu, da die Blutentnahme aus der Vena facialis eine recht kurze
Durchführungszeit hatte, die Tiere dennoch nicht sehr aktiv waren.
Als weiterer Parameter zur Beurteilung des durch die Blutentnahme Techniken
verursachten Stresses war die Corticosteron Konzentration. Stress hat einen
Einfluss auf die Bildung des Corticosterons (Harvey et al., 1980). Außerdem hat
Corticosteron im Gegensatz zu Adrenalin und Noradrenalin, welche auch bei
Stress im Körper anfluten, einen langsameren Anstieg und erreicht seinen Peak
erst nach 15 min (Gartner er al., 1980, Wong et al. 1983, van Herck et al.,
1991), wodurch es sich gut als Stressparameter eignet. Bei dieser Betrachtung
ergab sich, dass alle Corticosteron Werte nach der Blutentnahme, unabhängig
mit welcher Technik durchgeführt, signifikant im Vergleich zu den basalen
Werten anstiegen. Somit kann davon ausgegangen werden, dass jegliche Form
der Blutentnahme Stress bei der Maus auslöst. Zwischen den Blutentnahme
Gruppen ergab sich zwar kein signifikanter Unterschied, tendenziell hatten Tiere
nach der Punktion der Schwanzvene, der Vena facialis und des Venenwinkels
aber eine höhere Corticosteron Konzentration als die anderen Gruppen. Jedoch
lässt sich dieser Unterschied statistisch nicht nachweisen, da einige Werte
dieser beiden Gruppen trotz einer hohen Verdünnung über den Messbereich
hinausgingen. Da die Standardkurve leicht abknickte, wurden diese hohen
Werte bei der Betrachtung der Corticosteron Konzentration nicht mit
einbezogen. Um eine genaue Aussage zu treffen, müsste diese Analyse
wiederholt werden.
Auch im Open Field Test spiegelt sich die Aktivität direkt nach der Blutentnahme
wider. Tiere, denen Blut aus dem Venenwinkel und der Vena facialis
entnommen wurde, zeigten auch hier ein verändertes Verhalten. So liefen Tiere
nach der Punktion des Venenwinkels mit 839,54±371,71 cm die geringste
Gesamtstrecke, gefolgt von der Punktion der Vena facialis mit 1225,54±697,78
cm. Tiere nach der Punktion der Schwanzvene legten im Gegensatz dazu die
68
längste Strecke zurück. Dieses Verhalten zeigte sich auch in der gelaufenen
Geschwindigkeit. Auch hier liefen die Tiere, denen die Schwanzvene punktiert
wurde mit der höchsten Geschwindigkeit mit 7,28±2,16 cm/s und Tiere nach der
Punktion des Venenwinkels mit 2,80±1,24 cm/s bzw. der Vena facialis mit
4,09±2,33 cm/s mit eine geringeren Geschwindigkeit. Bei der Betrachtung der
Latenzzeit hielten sich die Tiere, denen Blut aus dem Venenwinkel entnommen
wurde, statistisch signifikant im Vergleich zu allen anderen Gruppen am
längsten in der Mitte auf, bevor sie sich das erste Mal in den Randbereich
begaben.
Das Verhalten im Open Field ist schwierig zu analysieren. Viele Autoren sind
der Meinung, dass Stress im Open Field Test zu einer Reduktion der
Bewegungsaktivität führt. Andere Autoren beschreiben, dass vorhergehende
Manipulationen des Verhaltens wie Schocks und Angst Konditionierung im
Open Field zu einem Anstieg der Aktivität führt (Roth und Katz, 1979).
Wenn man wie Quartermain et al. (1996) davon ausgeht, dass Stress zu einer
Reduktion der Bewegungsaktivität führt, so zeigten die Tiere nach der Punktion
der Vena facialis und nach Punktion des Venenwinkels in dieser Untersuchung
ein hohes Maß an Stress. Das manifestiert sich neben dem Open Field Versuch
auch in der Aktivität direkt nach der Blutentnahme, welche stark reduziert war.
Außerdem war die Corticosteron Konzentration bei diesen Gruppen tendenziell
erhöht. Vermutlich liegt diese Reaktion an der Methode selbst. Sowohl bei der
Vena facialis, als auch bei der Punktion des Venenwinkels stechen die
durchführenden Personen blind. So kann es passieren, dass bei der
Blutentnahme aus der Vena facialis der Experimentator in die
Massetermuskulatur stechen könnte oder Nerven, die auf der Muskulatur
verlaufen, verletzen könnte. Bei der Punktion des Venenwinkels könnten auch
andere Gefäße verletzt werden oder gar Lunge oder Herz getroffen werden.
Müller (1999) und Meyer-Eilers (2000) fanden bei einer histologischen
Untersuchung des Venenwinkels nach mehrfacher Punktion Veränderungen in
der Muskulatur (fibrotische Zubildungen, Degenerationen, granulomatöse
Entzündungen, Infiltration mit Lymphozyten), im Bindegewebe (Fibrose,
granulomatöse Entzündungen) und am Nervengewebe (Degeneration,
Infiltration mit Lymphozyten). Dadurch können bei den Tieren starke Schmerzen
69
entstehen, die Rückzugsverhalten und/oder eine verlangsamte Bewegung
auslösen (Weiß, 2008; van Zutphen et al., 1995).
Wenn man im Gegensatz dazu davon ausgeht, dass Stress zu einer
Bewegungssteigerung führt (Katz et al., 1981), könnten auch die Tiere nach der
Punktion der Schwanzvene gestresst sein. Sie zeigten wie die Tiere nach der
retrobulbären Blutentnahme (dick und dünn) und Tiere nach der Punktion der
Vena saphena eine starke Aktivität direkt nach der Blutentnahme. Diese
Aktivität hielt jedoch nach der Schwanzvenen Punktion bis zum Open Field Test
an, wo sie die längste Gesamtstrecke mit der höchsten Geschwindigkeit
zurücklegten. Auch die Corticosteron Konzentration war wie bei der
Venenwinkel und Vena facialis Punktion erhöht. Das konnten auch Aasland et
al. (2010) zeigen. Sie stellten fest, dass nach der Punktion der Schwanzvene im
Vergleich zur Punktion der Vena saphena die Glukose Konzentration im Blut
signifikant höher war, was ein Anzeichen für Stress durch die Blutentnahme ist.
Dies könnte zum einen daran liegen, dass durch die Blutentnahme am
Schwanz Hämatome entstehen (Müller, 1999). Zum anderen wurde das Tier für
die Blutentnahme erwärmt, was den Stoffwechsel beeinflusst, wodurch Stress
entstehen könnte. Ein weiterer Grund könnte sein, dass die Durchführung der
Blutentnahme mit 117,82±26,71 s sehr lang war. Zwar waren auch die
Durchfühungszeiten der Punktion des Venenwinkels und die retrobulbäre
Blutentnahme mit der dünnen Kapillare sehr lang, jedoch lagen die Tiere bei
diesen Methoden in Narkose, bei der Punktion des Schwanzvene wurden sie
jedoch in eine Zwangsröhre gesteckt. Zusätzlich wurden die Tiere 10 min vor
der Blutentnahme mit einer Rotlichtlampe erwärmt.
Die Blutentnahmen aus der Vena saphena und die retrobulbäre Blutentnahme
mit dicker bzw. dünner Kapillare scheinen hingegen nicht so starken Stress
auszulösen. Die Tiere hatten eine hohe Aktivität direkt nach der Blutentnahme
und befanden sich in der Aktivität im Open Field zwischen den beiden
Extremen. Auch die Corticosteron Konzentrationen waren niedriger als bei der
Punktion der Schwanzvene, der Vena facialis und des Venenwinkels. Bei der
Punktion der Vena saphena kann der Experimentator die Vene sehr gut sehen,
wodurch eine Verletzung des umliegenden Gewebes gemindert wird. Außerdem
wird das Tier weder mit der Hand noch mit der Zwangsröhre fixiert, sondern in
70
ein Falcon Tube gesetzt, wo sich das Tier relativ frei bewegen kann. Dadurch
könnte der Stress vermindert sein. Bei der retrobulbären Blutentnahme war die
Druchführungszeit extrem kurz bei der dicken Kapillare bzw. das Tier lag bei der
dünnen Kapillare in Narkose, wodurch Stress vermieden werden kann. Jedoch
weisen Untersuchungen von Meyer-Eilers (2000) histologische Veränderungen
an der HARDERschen Drüse und retinale Degenerationen auf.
Um eine genauere Betrachtung des durch den einzelnen Blutentnahme
Techniken entstehenden Stress zu machen, müsste eine erneute Untersuchung
der Corticosteron Konzentrationen erfolgen, da eine bloße Aussage auf Grund
von Verhaltensparametern sehr ungenau zu sein scheint. Des Weiteren könnte
eine histologische Untersuchung eine Aussage über die Qualität der jeweiligen
Blutentnahme Techniken bringen. Diese Studie erfolgt zur Zeit parallel zu dieser
Arbeit. Aus der hier vorliegenden Untersuchung lässt sie jedoch schließen, dass
jegliche Art von Blutentnahme bei der Maus gemessen an Verhalten und
physiologischen Parametern zu Stress zu führen scheint. Des Weiteren lässt
sich vermuten, dass durch die Punktion der Vena facialis und des Venenwinkels
im Vergleich zu den anderen Methoden die Maus mehr Schmerzen und Stress
erleidet. Die Blutentnahme aus der Schwanzvene hat eine lange
Durchführungszeit und durch das Erwärmen des Tieres kommt es bei dem Tier
ebenfalls zu Stress. Als Blutentnahmemethoden, die den offensichtlich
geringsten Stress verursachen, sind die retrobulbäre Blutentnahme mit dicker
und dünner Kapillare und die Blutentnahme aus der Vena saphena anzusehen.
71
7. Zusammenfassung
Anja Schlichting
Stressbelastung durch die von der GV-SOLAS empfohlenen
Blutentnahmemethoden bei der Maus
Im Rahmen von Tierversuchen gibt es viele Methoden zur Blutentnahme bei
Mäusen. Aber nur wenige Studien liegen vor, welche Auswirkungen diese
verschiedenen Techniken auf die Maus haben. Zusätzlich wird häufig diskutiert,
ob der Einsatz einer volatilen Anästhesie den Stress, der durch die
Blutentnahme entsteht, minimiert. Aus diesem Grund wurde in dieser Studie
einerseits die Stressbelastung durch verschiedene volatile Narkotika wie
Sevofluran, Isofluran, CO2 und Ether untersucht. Andrerseits wurden die von
der GV-SOLAS empfohlenen Blutentnahme Techniken (retrobulbär mit dicker
und dünner Kapillare, Venenwinkel, Vena saphena, Vena facialis,
Schwanzvene) durch erfahrenes Personal durchgeführt, um eine Aussage zu
dem dadurch entstehenden Stress für das Tier machen zu können.
Dazu wurden insgesamt 132 weibliche Mäuse des Inzuchtstammes BALB/
cOlaHsd getestet, wobei 60 Mäuse (10 pro Gruppe) für den Narkoseversuch
und 72 Mäuse (12 pro Gruppe) für den Blutentnahmeversuch eingeteilt wurden.
Bei jedem Tier wurde entsprechend der Gruppe Blut genommen bzw. eine
Narkose eingeleitet und direkt danach das Verhalten nach der Blutentnahme
bzw. nach der Narkose beobachtet. Außerdem wurde die Zeit gemessen, die für
die Einleitung der jeweiligen Narkose bzw. für die Durchführung der
Blutentnahmen benötigt wurde. Nach 15 min erfolgte nochmals bei allen Tieren
retrobulbär eine Blutentnahme, aus welcher die Corticosteron Konzentration als
Stressindikator bestimmt wurde. Anschließend wurde das Verhalten im Open
Field beobachtet.
Bei der Narkose Untersuchung zeigte sich, dass die Einleitungszeit für die CO2
Narkose am kürzesten und für die Ether Narkose am längsten war. Bei der
Betrachtung des Verhaltens direkt nach der Narkose zeigte sich, dass alle
Tiere, die eine Narkose erhielten, insgesamt signifikant weniger aktiv waren, als
Tiere ohne bzw. mit einer Sham Narkose. Auch bei der Betrachtung der
Corticosteron Konzentration ergaben sich signifikante Unterschiede zwischen
den Werten nach der Narkose im Vergleich zu den basalen Corticosteron
72
Werten. Alle Corticosteron Konzentrationen waren nach der Narkose
unabhängig ob Sham, CO2, Sevofluran, Isofluran oder Ether im Vergleich zu
den basalen Werten erhöht. Zwischen den Narkosegruppen ergaben sich keine
signifikanten Unterschiede. Im Open Field Test zeigten die Tiere jedoch
unabhängig davon, welches Anästhetikum verwendet wurde, keine auf die
Narkose zurückführbare Veränderung. Somit scheinen also alle in dieser Studie
verwendeten volatilen Anästhetika bei den Tieren nur kurzfristig Stress
auszulösen.
Bei der Untersuchung der Blutentnahme wurden zwei Techniken, die Punktion
des Venenwinkels und die retrobulbäre Blutentnahme mit dünner Kapillare,
unter einer Ether Narkose durchgeführt. Aus diesem Grund benötigten diese
Methoden zusammen mit der Punktion der Schwanzvene, bei der das Tier in
eine Zwangsröhre gesetzt wurde im Vergleich zu den anderen Methoden sehr
viel Zeit. Bei der Betrachtung des Verhaltens direkt nach der Narkose zeigte
sich, dass Tiere, denen Blut aus dem Venenwinkel bzw. aus der Vena facialis
entnommen wurde, sich weniger zu bewegen schienen und insgesamt, direkt
nach der Blutentnahme, sehr wenig aktiv waren. Alle anderen Gruppen zeigten
eine starke Aktivität. An Hand der Corticosteron Konzentration ist deutlich, dass
alle Blutentnahmemethoden zu einem Anstieg des Plasma-Corticosterons
führte. Zwischen den Gruppen waren die Corticosteron Konzentrationen nach
der Punktion des Venenwinkels, der Schwanzvene und der Vena facialis
tendenziell erhöht. Dieses Ergebnis spiegelte sich auch im Open Field Test
wider, bei dem die Tiere nach der Punktion des Venenwinkels und der Vena
facialis sich extrem langsam bewegten, Tiere, denen die Schwanzvene
punktiert wurde, zeigten wiederum im Vergleich zur retrobulbären Blutentnahme
und zur Punktion der Vena saphena ein hyperaktives Verhalten. Somit lässt
sich vermuten, dass durch die Punktion der Vena facialis und des Venenwinkels
die Maus mehr Schmerzen und Stress hat. Die Blutentnahme aus der
Schwanzvene hat eine lange Durchführungszeit und durch das Erwärmen des
Tieres könnte es bei dem Tier ebenfalls zum Stress kommen. Als
Blutentnahmemethoden, die den vermeintlich geringsten Stress verursachen
sind daher die retrobulbäre Blutentnahme mit dicker und dünner Kapillare und
die Blutentnahme aus der Vena saphena anzusehen.
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80
Hiermit bestätige ich, dass ich die vorliegende Arbeit mit dem Titel:
Stressbelastung durch die von der GV-SOLAS empfohlenen
Blutentnahmemethoden bei der Maus
selbstständig verfasst und nur unter Verwendung der angegebenen Hilfsmittel
angefertigt habe.
Hannover, September 2010
81
9. Danksagung
Bedanken möchte ich mich bei Herrn Prof. Dr. Hackbarth für die Bereitstellung
und Betreuung des Themas meiner Master Arbeit.
Auch Frau Tsai, PhD gebührt großer Dank für die Betreuung dieser Arbeit und
die statistische Auswertung.
Herrn Helge D. Stelzer möchte ich für die Hilfe bei der Organisation und
Durchführung der Versuche herzlich danken.
Für die Durchführung der Sevofluran und Isofluran Narkose bedanke ich mich
ebenfalls bei Herrn Dr. Haberstroh.
Weiterhin bedanke ich mich bei Frau Wühl, Frau Muench-Wuttke, Frau Kuschel,
Frau Deutschmann und Herrn Dr. Strauch für die Durchführung der
verschiedenen Blutentnahmen.
Auch dem Institut für Pharmakologie, insbesondere Herrn Prof. Dr. Bäumer,
möchte ich danken, dass es mir ermöglicht wurde meinen ELISA
durchzuführen.
Meiner Familie und meinem Freund Ansgar möchte ich für die Unterstützung
und das Verständnis während der Durchführung dieser Arbeit danken.
Besonders Ansgar hat mich dabei immer wieder motiviert. Danke
82

Endversion Master Arbeit - GV

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