Poly-ADP-Ribosylierung
Transcription
Poly-ADP-Ribosylierung
465_507_BIOsp_0507.qxd:BIOsp_0507 476 22.08.2007 7:23 Uhr Seite 476 WISSENSCHAFT Genomische Stabilität Poly-ADP-Ribosylierung SASCHA BENEKE UND ALEXANDER BÜRKLE LEHRSTUHL MOLEKUL ARE TOXIKOLOGIE, FACHBEREICH BIOLOGIE, UNIVERSITÄT KONSTANZ Poly-ADP-Ribose-Polymerasen (PARPs) katalysieren die posttranslationale Modifikation von Proteinen mit Poly-ADP-Ribose. Poly-ADP-Ribose und die Enyzmfamilie der PARPs haben eine bemerkenswerte „Karriere“ gemacht: von einer wenig beachteten Nebenreaktion im Gefolge von DNA-Schädigung hin zum „Allzweckwerkzeug“ im Dienst der Genomstabilisierung. Das Spektrum der Aktivitätsbereiche von PARPs reicht inzwischen von der DNA-Reparatur und Modulation der Chromatinstruktur über die Regulation von intrazellulären Transportvorgängen und Transkription, die Organisation der Mitosespindel und die Telomerregulation bis hin zur Auslösung von Zelltod. ó PARPs nutzen NAD+ als Substrat und synthetisieren daraus schrittweise ein Homopolymer aus ADP-Ribose-Einheiten, welches Verzweigungsstellen aufweist[1, 2]. Dies geschieht im Sinne einer posttranslationalen Proteinmodifikation (Abb. 1). Die quantitativ bedeutsamsten Zielproteine (Akzeptorproteine) für die kovalente Poly-ADP-Ribosylierung sind die PARPs selbst (Automodifikation). Die Poly-ADP-Ribosylierung wird durch die Behandlung von Zellen mit DNA-schädigenden Agenzien, welche DNA-Strangbrüche erzeugen, stark induziert. Dies ist auf die Aktivierung der abundant exprimierten Enzyme PARP-1 und PARP-2 zurückzuführen, wobei PARP-1 für rund 90 % der Polymersynthese verantwortlich ist. Poly-ADP-Ribose unterliegt unter solchen Bedingungen einem raschen Umsatz, da gleichzeitig zur Synthese bereits der enzymatische Abbau des Polymers erfolgt. Dessen Endprodukt ist freie, monomere ADP-Ribose, die nur in einem stark energieverbrauchenden Prozess für die NAD+-Synthese wiederverwertet werden kann. Die zelluläre NAD+-Konzentration kann daher bei genotoxischer Behandlung rasch und nachhaltig abnehmen, was zum nekrotischen Zelltod führen kann. Lange wurde diese zelluläre Antwort auf genotoxische Attacken für die einzig relevante Aktion der PARPs gehalten. So gibt es beispielsweise eine umfangreiche Literatur zur Herbeiführung von Zelltod durch übersteigerte PARP-Aktivität bzw. durch Hemmung einer moderaten, physiologischen PARP-Aktivität bei Anwesenheit einer begrenzten Zahl von DNA-Strangbrüchen (Abb. 2). Letzteres führt zur Hemmung der DNA-Reparatur und damit zu einer letalen Akkumulation von DNA-Schäden. Andererseits scheint eine über das normale Maß gesteigerte PARP-1-Aktivität die Aufrechterhaltung von genomischer Stabilität unter genotoxischem Stress zu begünstigen, während eine zu niedrige PARP-1-Aktivität das Genom destabilisiert[3]. Zur Erklärung des Zelltods infolge einer übersteigerten PARP-Aktitvität wurden noch zwei weitere Mechanismen vorgeschlagen (Abb. 2): Zum einen kommt es zur Auslösung von Caspase-unabhängigem Zelltod durch den Kontakt von Poly-ADP-Ribose mit Mitochondrien, und zwar über die Freisetzung des apoptosis inducing factor (AIF) aus Mitochondrien[4]. Daraufhin wird AIF in den Zellkern transloziert und verursacht die Fragmentierung der DNA. Zum anderen wurde eine Hemmung der Aktivität von SIRT1 infolge starker PARP1-Aktivierung beschrieben. SIRT1 ist eins von sieben Sirtuins in Säugerzellen, dem eine anti-apoptotische Wirkung zugeschrieben wird. Wie die PARPs nutzt SIRT1 NAD+ als Substrat. Eine kritische Verarmung an NAD+ verhindert somit auch eine effiziente SIRT1-Aktivität[5]. T • • • PARPs und DNA-Reparatur ˚ Abb. 1: Aufbau von Poly-ADP-Ribose. Die am besten untersuchte biologische Funktion von PARP-1 und PARP-2 ist die Regula- t © BIOspektrum | 05.07 | 13. Jahrgang 465_507_BIOsp_0507.qxd:BIOsp_0507 7:23 Uhr Seite 478 WISSENSCHAFT ¯ Abb. 2: DNAStrangbruchabhängige PARPAktivierung – eine Entscheidung über Leben und Tod der Zelle. tion der Basenexzisionsreparatur (BER), insbesondere die Entscheidung zwischen shortpatch- und long-patch-Reparatur. Nach Erkennung und Ausschneiden der geschädigten Base durch Typ-II- oder Typ-I-Glykosylasen wird 5’-seitig die Zucker-Phosphat-Bindung der DNA geschnitten. Die 5’-dRPase-Aktivität der DNA-Polymerase β entfernt den übriggebliebenen Phosphoribosylrest und füllt die entstandene Lücke durch Einsetzen eines passenden Nukleotids auf, gefolgt von Ligierung durch Ligase III. Dieser Ablauf wird auch als short-patch-BER bezeichnet. Blockierte terminale Desoxyribose-Reste können jedoch zu einem Umschalten auf die long-patch-BER führen, entweder durch Stimulierung der Verdrängungssynthese der Polymerase β oder durch Beteiligung von Polymerase δ. Der daraus resultierende einzelsträngige Überhang (flap) wird durch die flap endonuclease 1 (FEN-1) abgeschnitten und der dann noch vorhandene DNA-Einzelstrangbruch ligiert. Invitro-Daten deuten auf eine Rolle der PARP-1 bei der Aktivierung der long-patch-BER hin. In der lebenden Zelle könnte die chromatinrelaxierende Wirkung von Poly-ADP-Ribose bei diesem Prozess unterstützend wirken und ist deshalb vermutlich auch in die short-patchBER involviert. Es konnte gezeigt werden, dass automodifizierte PARP-1 das Plattformprotein XRCC1 rekrutiert, welches sowohl mit DNA-Polymerase β als auch mit DNA-Ligase III interagiert. Eine Hemmung der PARP-Aktivität führt, wie bereits erwähnt, zu genomischer Instabilität. Ein nahe liegendes Szenario ist das folgende: Wenn Einzelstrangbrüche unrepariert bleiben, führt dies in der nächsten DNAReplikationsrunde zu Doppelstrangbrüchen[6]. Dementsprechend kommt es zur Aktivierung der Doppelstrangbruch-Reparaturmaschinerie, d. h. homologe Rekombination (HR) oder nichthomologe Zusammenfügung von Bruchenden (nonhomologous end joining, NHEJ). Vor allem NHEJ kommt als Mechanismus für die Herbeiführung von genomischer Instabilität infrage. Rolle von PARPs bei der Mitose PARPs wurden auch als Bestandteile von Chromosomen-organisierenden Bereichen gefunden, wie z. B. Zentromere, Telomere und Zentrosomen. Zentromer-Proteine wurden als Substrate für die Poly-ADP-Ribosylierung identifiziert, doch ist die biologische Relevanz noch unklar. PARP-2 ist insbesondere für die Stabilität des X-Chromosoms wichtig[7]. PARP1 spielt auch bei der Aufrechterhaltung eines euploiden Chromosomensatzes eine Rolle, denn PARP1-Gen-Zerstörung bzw. langfristige Behandlung von Zellen mit PARP-Inhibitoren führt zu verstärkter Aneuploidie. Letzteres ist offenbar die Folge einer Störung der Zentrosomenverdopplung, was zu einer erhöhten Anzahl von Spindelpolkörperchen und nachfolgender Mitosestörung führt. Außerdem konnte gezeigt werden, dass PolyADP-Ribose ein integraler und stabilisierender Bestandteil der Mitosespindel ist[8, 9]. PARPs und Telomere An den Enden von Chromosomen bildet der Shelterin-Komplex zusammen mit repetitiven DNA-Sequenzen (TTAGGG) das Telomer[10]. Telomer-DNA-Enden haben einen einzelsträngigen 3′-Überhang, der sich zurückfaltet und in den doppelsträngigen DNABereich invadieren kann. Diese Struktur wird t-loop genannt. Hierdurch wird die stark rekombinogene Wirkung, die von einem Dop- pelstrangbruch mit Einzelstrang-Überhang ausgeht, neutralisiert und das DNA-Ende von der Reparaturmaschinerie abgeschirmt. Für Telomer-DNA gibt es zwei spezifische Bindeproteine, nämlich den telomeric repeat binding factor TRF-1 und TRF-2. TRF-2 stabilisiert den t-loop. Andererseits hemmt der t-loop die Progression der Replikationsgabel in vitro, weshalb er in Koordination mit dem Zellzyklus vorübergehend aufgelöst werden muss, um die vollständige Replikation der telomerischen DNA zu ermöglichen. Analog zu TRF-1, dessen Dissoziation von der DNA durch die PARP-Aktivität der Tankyrasen 1 und 2 vermittelt wird[11–13], interagiert TRF2 mit PARP-1. Die Ablösung von TRF-2 von der DNA führt zu einer offenen Telomerkonfiguration, welche eine ungehinderte DNAReplikation ermöglicht. Bei diesem Vorgang der Telomeröffnung nach TRF-2-Freisetzung ist offenbar das WRN-Protein mitbeteiligt. Die Defizienz des WRN-Proteins ist die Ursache für das Werner-Syndrom (WS). WSPatienten sind durch ein beschleunigtes Altern nach der Pubertät gekennzeichnet. WSZellen weisen verstärkt Chromosomen-Translokationen und -Deletionen, eine höhere Genotoxin-Empfindlichkeit, eine beschleunigte Telomerverkürzung sowie eine verminderte replikative Lebenspanne auf. Das WRN-Protein besitzt Helikase- und Exonukleaseaktivität. Es interagiert mit einer Vielzahl von Proteinen, die an DNA-Reparatur, Replikation oder Rekombination beteiligt sind – unter anderem auch mit PARP-1, welche die beiden enzymatischen Aktivitäten von WRN supprimiert[14]. WRN agiert in vitro an solchen DNASekundärstrukturen, die bei einem Replikationsblock, bei DNA-Reparatur oder am t-loop entstehen können. Bei der BER aktiviert WRN den long-patch-Pfad durch direkte Stimulierung der DNA-Polymerase δ bzw. durch die displacement-Syntheseaktivität der DNA-Polymerase β. Ebenso stimuliert WRN auch die Aktivität von FEN-1. Abgesehen von den direkten Wechselwirkungen zwischen WRN und PARP-1 haben diese beiden Proteine viele andere Bindungspartner gemeinsam, z. B. p53, DNA-PK und TRF-2. Außerdem interagieren PARP-1 und Poly-ADP-Ribose mit dem heterotrimeren Enzymkomplex der DNA-abhängigen Proteinkinase (DNA-PK). Die katalytische Untereinheiten DNA-PKcs und auch das Ku70-Protein sind in vitro Ziele sowohl für die kovalente Modifikation mit Poly-ADP-Ribose, als auch für die nicht-kovalente Interaktion mit dem Polymer. DNA-PKcs wird durch Poly-ADPBIOspektrum | 05.07 | 13. Jahrgang 06.007 sign-berlin.de 478 22.08.2007 465_507_BIOsp_0507.qxd:BIOsp_0507 480 22.08.2007 7:23 Uhr Seite 480 WISSENSCHAFT NFκB transaktiviert. NO-Metabolite sind hochwirksame Genotoxine, was zur Stimulierung von PARP-1 bzw. PARP-2, zur NAD+Depletion und zum Zelltod führen kann. PARP-Hemmung kann daher unter diversen pathophysiologischen Bedingungen das Überleben von Zellen und Gewebe ermöglichen, wie z. B. bei experimenteller Colitis, MPTPinduziertem Parkinsonismus, IschämieReperfusions-Schäden oder Typ-I-Diabetes. Ausblick ˚ Abb. 3: Funktionelle Interaktionen zwischen PARP-1 und WRN. Ribosylierung stimuliert. Im Gegenzug ist die PARP-1 ein Substrat für die Phosphorylierung durch DNA-PKcs. Während Ku70/80 die WRNExonuklease-Aktivität stimuliert, hemmt PARP-1 beide WRN-Funktionen. Alle drei funktionellen Einheiten (PARP-1, WRN, DNAPK mit Ku70/80) können einen Komplex bilden. Die molekularen Mechanismen und die biologische Funktion dieser komplizierten physiologischen und funktionellen Interaktionen (Abb. 3) sind noch nicht verstanden. Die Forschung an der Poly-ADP-Ribosylierung befindet sich momentan in einer hochdynamischen Phase. Was früher ausschließlich in die Domäne der klassischen Biochemie fiel, ist inzwischen für alle Disziplinen der modernen biologisch-medizinischen Forschung von großem Interesse. Eine solche Verbreiterung auch der methodischen Ansätze ist dringend erforderlich für die vollständige Aufklärung grundlegender biologischen Prozesse, bei denen die Poly-ADP-Ribosylierung eine Rolle spielt. Denn nur so kann das volle Potenzial der Beeinflussung des Poly-ADP-Ribose-Stoffwechsels für medizinische Anwendungen nutzbar gemacht werden. ó Literatur PARPs und Transkription – Rolle bei pathophysiologischen Vorgängen Roeder und Kollegen identifizierten PARP-1 als einen wichtigen Faktor für die Regulation der Transkriptionsinitiation[15]. Später konnte gezeigt werden, dass PARP-1 mit diversen Transkriptionsfaktoren interagiert und diese poly-ADP-ribosyliert[16–18]. Dies erklärt den Schutzeffekt der PARP1-Genzerstörung beim septischem Schock[19, 20] und anderen entzündlichen Krankheiten, denn die Anwesenheit von PARP-1 ist für die NFκB-vermittelte Transaktivierung erforderlich. Wenn die NFκB-Aktivierung ausbleibt, ist unter anderem die Immunantwort abgeschwächt, was bei übersteigerten Immunreaktionen von Nutzen sein kann. So wird beispielsweise das Gen für die induzierbare NO-Synthase durch [1] Bürkle, A. (ed.) (2006): Poly(ADP-Ribosyl)ation. Landes Bioscience, Georgetown, TX, USA. [2] Bürkle, A. (2005): Poly(ADP-ribose). The most elaborate metabolite of NAD+. Febs J. 272: 4576–4589. [3] Meyer, R., Müller, M., Beneke, S., Küpper, J. H., Bürkle, A. (2000): Negative regulation of alkylation-induced sister-chromatid exchange by poly(ADP-ribose) polymerase-1 activity. Int. J. Cancer 88: 351–355. [4] Yu, S. W., Wang, H., Poitras, M. F., Coombs, C., Bowers, W. J., Federoff, H. J., Poirier, G. G., Dawson, T. M., Dawson, V. L. (2002): Mediation of poly(ADP-ribose) polymerase-1-dependent cell death by apoptosis-inducing factor. Science 297: 259–263. [5] Pillai, J. B., Isbatan, A., Imai, S., Gupta, M. P. (2005): Poly(ADP-ribose) polymerase-1-dependent cardiac myocyte cell death during heart failure is mediated by NAD+ depletion and reduced Sir2alpha deacetylase activity. J. Biol. Chem. 280: 43121–43130. [6] Kaina, B. (2003): DNA damage-triggered apoptosis: critical role of DNA repair, double-strand breaks, cell proliferation and signaling. Biochem. Pharmacol. 66: 1547–1554. [7] Menissier de Murcia, J., Ricoul, M., Tartier, L., Niedergang, C., Huber, A., Dantzer, F., Schreiber, V., Ame, J. C., Dierich, A., LeMeur, M., Sabatier, L., Chambon, P., de Murcia, G. (2003): Functional interaction between PARP-1 and PARP-2 in chromosome stability and embryonic development in mouse. Embo J. 22: 2255–2263. [8] Chang, P., Coughlin, M., Mitchison, T. J. (2005): Tankyrase-1 polymerization of poly(ADP-ribose) is required for spindle structure and function. Nat. Cell Biol. 7: 1133–1139. [9] Chang, P., Jacobson, M. K., Mitchison, T. J. (2004): Poly(ADP-ribose) is required for spindle assembly and structure. Nature 432: 645–649. [10] de Lange, T. (2005): Shelterin: the protein complex that shapes and safeguards human telomeres. Genes Dev. 19: 2100–2110. [11] Smith, S., Giriat, I., Schmitt, A., de Lange, T. (1998): Tankyrase, a poly(ADP-ribose) polymerase at human telomeres. Science 282: 1484–1487. [12] Cook, B. D., Dynek, J. N., Chang, W., Shostak, G., Smith, S. (2002): Role for the related poly(ADP-Ribose) polymerases tankyrase 1 and 2 at human telomeres. Mol. Cell. Biol. 22: 332–342. [13] Chang, W., Dynek, J. N., Smith, S. (2003): TRF1 is degraded by ubiquitin-mediated proteolysis after release from telomeres. Genes Dev. 17: 1328–1333. [14] Harrigan, J. A., Opresko, P. L., von Kobbe, C., Kedar, P. S., Prasad, R., Wilson, S. H., Bohr, V. A. (2003): The Werner syndrome protein stimulates DNA polymerase beta strand displacement synthesis via its helicase activity. J. Biol. Chem. 278: 22686–22695. [15] Slattery, E., Dignam, J. D., Matsui, T., Roeder, R. G. (1983): Purification and analysis of a factor which suppresses nick-induced transcription by RNA polymerase II and its identity with poly(ADP-ribose) polymerase. J. Biol. Chem. 258: 5955–5959. [16] Oei, S. L., Griesenbeck, J., Schweiger, M., Ziegler, M. (1998): Regulation of RNA polymerase II-dependent transcription by poly(ADP-ribosyl)ation of transcription factors. J. Biol. Chem. 273: 31644–31647. [17] Oei, S. L., Griesenbeck, J., Schweiger, M., Babich, V., Kropotov, A., Tomilin, N. (1997): Interaction of the transcription factor YY1 with human poly(ADP-ribosyl) transferase. Biochem. Biophys. Res. Commun. 240: 108–111. [18] Hassa, P. O., Hottiger, M. O. (2002): The functional role of poly(ADP-ribose)polymerase 1 as novel coactivator of NFkappaB in inflammatory disorders. Cell. Mol. Life Sci. 59: 1534–1553. [19] Hasko, G., Mabley, J. G., Nemeth, Z. H., Pacher, P., Deitch, E. A., Szabo, C. (2002): Poly(ADP-ribose) polymerase is a regulator of chemokine production: relevance for the pathogenesis of shock and inflammation. Mol. Med. 8: 283– 289. [20] Oliver, F. J., Menissier-de Murcia, J., Nacci, C., Decker, P., Andriantsitohaina, R., Muller, S., de la Rubia, G., Stoclet, J. C., de Murcia, G. (1999): Resistance to endotoxic shock as a consequence of defective NF-kappaB activation in poly (ADP-ribose) polymerase-1 deficient mice. Embo J. 18: 4446–4454. Korrespondenzadresse: Dr. Sascha Beneke Prof. Dr. Alexander Bürkle Lehrstuhl Molekulare Toxikologie Fachbereich Biologie Universität Konstanz Jacob-Burkhardt-Straße 31 D-78464 Konstanz Tel.: 07531-884035 Fax: 07531-884033 [email protected] [email protected] http://edukon.biologie.uni-konstanz.de AUTOREN Sascha Beneke Alexander Bürkle studierte Biologie in Marburg. Doktorand bei Dr. A. Bürkle am DKFZ, Heidelberg. Postdoktorand in Yale (Prof. Rooney) und am DKFZ (Prof. Boukamp). Schloss sich erneut der Arbeitsgruppe von Prof. A. Bürkle am Lehrstuhl für Molekulare Toxikologie der Universität Konstanz an. Seit 2004 wissenschaftlicher Assistent. Medizinstudium in Freiburg/Breisgau. Promotion bei Prof. H. zur Hausen. Postdoktorand am DKFZ (1984–1987). Habilitation 1995 für das Fach Toxikologie & Chemotherapie. 2000 Senior Lecturer am Institute for Ageing and Health, University of Newcastle upon Tyne, UK. Seit 2002 Professor und Lehrstuhlinhaber für Molekulare Toxikologie im Fachbereich Biologie der Universität Konstanz. BIOspektrum | 05.07 | 13. Jahrgang