INSTRUCTIONS FOR USE BINDAZYME Human Anti Gliadin IgG

CONTENTS
Page No
1
Intended Use
2
Background
3
Principle of the Assay
4
Precautions
5
Sample Collection and Storage
6
Materials
7
Assay Method
INSTRUCTIONS FOR USE
BINDAZYME Human Anti Gliadin IgG
EIA Kit
MK035
BINDAZYME Human Anti Gliadin IgA
EIA Kit
MK036
BINDAZYME Human Anti Gliadin
IgG/IgA EIA combi Kit
MK037
For In-vitro diagnostic use
FDA (USA) Information
IgG (MK035)
8
Analyte ID
Results and Quality Control
9
Expected Values
10
Performance Characteristics
11
References
12
Plate Template
IgA (MK036)
Combi (MK037)
0528
Test system
61359
Complexity Cat.
61360
61361
High
Product manufactured by:
The Binding Site Ltd, PO Box 11712, Birmingham, B14 4ZB, U.K.
www.bindingsite.co.uk
Telephone : +44 (0)121 436 1000
Fax : +44 (0)121 430 7061
e-mail: [email protected]
1
Deutsch
Siehe Seite
Français
Cf page
INTENDED USE
These assays are designed for the in-vitro measurement of specific IgG or IgA
antibodies against gliadin present in human serum, as an aid in the diagnosis
and treatment of coeliac disease.
Sufficient materials are supplied to allow a maximum of 41 samples to be
tested in duplicate or 89 in single, with a calibration curve and 2 controls.
2
BACKGROUND
Coeliac disease is characterised by gluten intolerance leading to a chronic
malabsorptive disorder. IgG and IgA antibodies to gliadin (the ethanol soluble
fraction of wheat and rye gluten) have been reported in untreated coeliac
disease1,2,3.
The measurement of IgA antigliadin antibodies (AGA) is useful in following
disease activity and as a monitor of the maintenance to a gluten free diet2. IgG
AGA appear to be more sensitive but less specific markers of disease than IgA
AGA. It is recommended, however, that both antibodies should be measured,
due to the high incidence of IgA deficiency among coeliac patients, as an IgA
deficiency may serologically mask the disease. IgA deficient patients are 10
times more likely to have coeliac disease than the normal population4.
AGA have been observed in a range of other clinical conditions where
gastrointestinal symptoms are absent, including; Down’s syndrome, selective
IgA deficiency5, osteoporosis6, insulin dependent diabetes and other
autoimmune disorders7. Patients with symptomatic coeliac disease have a
higher frequency of both IgG and IgA AGA than asymptomatic patients8.
3
PRINCIPLE OF THE ASSAY
Microwells are pre-coated with the gliadin antigen. The calibrators, controls and
diluted patient samples are added to the wells and autoantibodies recognising
the gliadin antigen bind during the first incubation. After washing the wells to
remove all unbound proteins, purified peroxidase labelled rabbit anti-human IgG
or IgA (γ or α chain specific) conjugate is added. The conjugate binds to the
captured human autoantibody and the excess unbound conjugate is removed by
a further wash step. The bound conjugate is visualised with 3,3’,5,5’
tetramethylbenzidine (TMB) substrate which gives a blue reaction product, the
intensity of which is proportional to the concentration of autoantibody in the
sample. Phosphoric acid is added to each well to stop the reaction. This
produces a yellow end point colour, which is read at 450nm.
4
PRECAUTIONS
4.1 WARNING
•
All human sera supplied have been tested at donor level and found negative for
Hepatitis B surface antigens and antibodies to HIV 1 and 2 and Hepatitis C virus.
However, these tests cannot guarantee the absence of infectious agents. Proper
handling and disposal methods should be established and only personnel
Insert Code: E035, Version: 28 March 2006, Page 1 of 13
•
•
•
•
•
qualified in handling of potentially infectious materials should be permitted to use
this kit.
Sodium azide may react with lead and copper plumbing to form explosive metal
azides. On disposal of reagents flush with a large volume of water, to prevent
azide build-up.
The buffers and serum supplied in this kit contain various enzyme inhibitors as
listed below. These should be handled with care.
INHIBITOR
CONCENTRATION
Kathon
Sodium Azide
Proclin™ 300
Bromonitrodioxane
Methylisothiazone
0.02%
0.099%
0.045%
0.002%
0.002%
Proclin™ is a trademark of Rohm and Haas Corp. Philadelphia, PA
.
Kathon is an irritant and may cause sensitisation by skin contact.
The stop solution contains 3M phosphoric acid, which is an irritant. Avoid contact
with skin and eyes.
Reagent spills should be cleaned up appropriately, observing local and
environmental regulations.
4.2 CAUTION
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
These products should only be used by appropriately trained personnel.
Strict adherence to the protocol is recommended. Any deviation may affect
assay performance, and the results obtained. Pay attention to specific ‘Notes’
and warnings throughout these Instructions for Use.
Calibrator, control, conjugate and plate batch numbers are not interchangeable.
Substitution of such components with batch numbers that differ from those that
are provided in the kit could lead to inconsistent and inaccurate results. All strips
used must be taken from the same foil pouch.
To avoid reagent contamination, only use new or clean plastic / glassware.
Never return unused reagents to the bottles.
Do not leave reagent bottles uncapped; any resulting evaporation or
contamination will lead to inconsistent results.
TMB substrate must not be exposed to light or water.
Microbially contaminated, haemolysed or lipaemic serum and specimens
containing particulate matter should not be used.
Inaccurate sample dilution cannot be checked, as kit controls are ready to use.
The use of calibrated pipettes and appropriate internal QC samples is
recommended.
The use of automated assay systems, sample dilutors and other automated
equipment may lead to differences in results when compared to the manual
procedure. It is the responsibility of any laboratory to fully validate the system,
and ensure the results fall within the limits as defined in this insert and
associated QC certificate.
All equipment used must be calibrated and maintained according to the
manufacturer’s instruction.
•
6.2.2 BINDAZYME Antigliadin IgA (MK036)
•
Gliadin IgA Calibrators: 5 bottles each containing 1mL of diluted human
serum, with the following concentrations of antigliadin IgA autoantibody: 100,
33.3, 11.1, 3.7, 1.23 U/mL. Ready to use.
•
Gliadin IgA Positive Control: 1 bottle containing 1mL of diluted human
serum. The expected value is given on the QC certificate. Ready to use.
•
Gliadin Negative Control: 1 bottle containing 1mL of diluted human serum.
The expected value is given on the QC certificate. Ready to use.
•
Gliadin IgA Conjugate: 1 bottle containing 12mL of purified peroxidase
labelled antibody to human IgA. Coloured green, ready to use.
6.2.3 BINDAZYME Antigliadin IgG/IgA Combi kit (MK037)
•
Gliadin IgG Calibrators: 5 bottles each containing 1mL of diluted human
serum, with the following concentrations of antigliadin IgG autoantibody: 100,
33.3, 11.1, 3.7, 1.23 U/mL. Ready to use.
•
Gliadin IgA Calibrators: 5 bottles each containing 1mL of diluted human
serum, with the following concentrations of antigliadin IgA autoantibody: 100,
33.3, 11.1, 3.7, 1.23 U/mL. Ready to use.
•
Gliadin IgG Positive Control: 1 bottle containing 1mL of diluted human
serum. The expected value is given on the QC certificate. Ready to use.
•
Gliadin IgA Positive Control: 1 bottle containing 1mL of diluted human
serum. The expected value is given on the QC certificate. Ready to use.
•
Gliadin IgG Conjugate: 1 bottle containing 12mL of purified peroxidase
labelled antibody to human IgG. Coloured red, ready to use.
•
Gliadin IgA Conjugate: 1 bottle containing 12mL of purified peroxidase
labelled antibody to human IgA. Coloured green, ready to use.
•
Gliadin Negative Control: 1 bottle containing 1mL of diluted human serum.
The expected value is given in the QC certificate
6.3 ADDITIONAL MATERIALS AND EQUIPMENT – not supplied
•
•
•
•
•
•
7
•
•
5
•
•
•
•
6
6.1
•
•
•
•
•
•
•
The kit should be stored at 2-8°C and should not be frozen. Inappropriate
storage temperatures will affect the results.
Diluted wash buffer can be stored at 2-8°C for a maximum of four weeks, and
can be used direct from cold without affecting assay performance.
The expiry date of the kit is shown on the outer label.
Bring the kit to room temperature
The kit is designed for room temperature operation (20-24°C).
Remove the kit from storage and stand at room temperature for approximately
60 minutes. Wells must not be removed from the foil bag until they have
reached room temperature.
NOTE: The kits may be maintained at room temperature for up to 1 week.
2.
Kit components
Gently mix each kit component before use.
3.
Wash buffer dilution
Add 50mL of the wash buffer concentrate to 950mL of distilled water (1 in 20
dilution) into a clean container and mix. Smaller volumes can be diluted as
appropriate.
NOTE: Diluted wash buffer can be stored at 2-8°C for up to 4 weeks, therefore
only dilute the appropriate amount. If the buffer shows any sign of microbial
contamination or turns cloudy, discard and prepare a fresh solution.
4.
Sample dilution
Dilute 10µL of each sample with 1000µL of sample diluent (1:100) and mix well.
NOTE: Diluted sample must be used within 8 hours.
5.
Strip and frame handling
Place the required number of wells in the strip holder. Position from well A1,
filling columns from left to right across the plate. When handling the plate,
squeeze the long edges of the frame to prevent the wells falling out.
NOTE: Return unused wells to the foil bag immediately with the two desiccant
pouches and re-seal tightly to minimise exposure to moisture.
Take care not to puncture or tear the foil bag, see below.
WARNING: Exposure of wells to moisture or contamination by dust or
other particulate matter will result in antigen degradation, leading to poor
assay precision and potentially false results.
MATERIALS
MATERIALS SUPPLIED - Common to all kits
Instruction Leaflet: Giving full assay details.
QC Certificate: Indicating the expected performance of the batch.
Gliadin Coated Wells: 12 breakapart 8 well strips coated with gliadin. Each
plate is packaged in a re-sealable foil bag containing two desiccant pouches.
Type III Sample Diluent: 2 bottles containing 50mL of buffer for sample
dilution. Coloured yellow, ready to use.
Type III Wash Buffer: 1 bottle containing 50mL of a 20-fold concentrated
buffer for washing the wells.
TMB Substrate: 1 bottle containing 14mL TMB substrate. Ready to use.
Stop Solution: 1 bottle containing 14mL of 3M phosphoric acid. Ready to use.
6.2 PRODUCT SPECIFIC MATERIALS SUPPLIED
6.2.1 BINDAZYME Antigliadin IgG (MK035)
•
Gliadin IgG Calibrators: 5 bottles each containing 1mL of diluted human
serum, with the following concentrations of antigliadin IgG autoantibody: 100,
33.3, 11.1, 3.7, 1.23 U/mL. Ready to use.
•
Gliadin IgG Positive Control: 1 bottle containing 1mL of diluted human
serum. The expected value is given on the QC certificate. Ready to use.
•
Gliadin Negative Control: 1 bottle containing 1mL of diluted human serum.
The expected value is given on the QC certificate. Ready to use.
ASSAY METHOD
1.
•
•
SAMPLE COLLECTION AND STORAGE
Blood samples should be collected by venepuncture allowed to clot naturally
and the serum separated.
The serum may be stored at 2-8°C for up to 7 days prior to assay9, or for
prolonged storage, aliquoted and stored at -20°C or below.
Repeated thawing and freezing should be avoided.
Serum samples should not be heat-inactivated, as this may give false positive
results.
Automatic microplate plate washer: This is recommended, however, plate
washing can be performed manually.
Plate reader: Capable of measuring optical densities at 450nm referenced on
air.
Distilled or deionised water: This should be of the highest quality available.
Calibrated micropipettes: For dispensing 1000, 100 & 10µL.
Multichannel pipette: Recommended for dispensing 100µL volumes of
conjugate, substrate and stop solution.
Glass/plastic tubes: For sample dilution.
7.1 PRE-ASSAY STEPS
4.3 STORAGE AND STABILITY
•
Gliadin IgG Conjugate: 1 bottle containing 12mL of purified peroxidase
labelled antibody to human IgG. Coloured red, ready to use.
7.2 ASSAY METHOD
1.
Sample addition
Dispense 100µL of each calibrator, control and diluted (1:100) sample into the
appropriate wells of the plate provided.
NOTE: Samples should be added as quickly as possible to the plate to
minimise assay drift, and the timer started after the addition of the last sample.
Incubate at room temperature for 30 minutes.
Insert Code: E035, Version: 28 March 2006, Page 2 of 13
2.
Washing
The washing procedure is critical and requires special attention. An improperly
washed plate will give inaccurate results, with poor precision and high
backgrounds.
After incubation remove the plate and wash wells 3 times with 250-350µL wash
buffer per well. Wash the plate either by using an automatic plate washer or
manually as indicated below. After the final automated wash, invert the plate
and tap the wells dry on absorbent paper.
9
Plates can be washed manually as follows:
a.
Flick out the contents of the plate into a sink,
b.
Tap the wells dry on absorbent paper.
c.
Fill each well with 250-350µL of wash buffer using a multichannel
pipette.
d.
Gently shake the plate on a flat surface.
e.
Repeat a-d twice
f.
Repeat a and b.
3.
Washing
Repeat step 2.
5.
Substrate (TMB) addition
Dispense 100µL of TMB substrate into each well, blot the top of the wells with a
tissue to remove any splashes.
Note: To avoid contamination never return excess TMB to the reagent bottle.
Incubate at room temperature in the dark for 30 minutes.
6.
Stopping
Dispense 100µL of stop solution into each well. This causes a change in colour
from blue to yellow.
7.
8
1.
•
•
•
2.
3.
•
•
4.
5.
6.
7.
8.
•
•
•
Antigliadin IgG
Antigliadin IgA
Negative result
<10 U/mL
<5 U/mL
Positive result
≥10 U/mL
≥5 U/mL
The reported % incidence of antigliadin autoantibodies is indicated below for a
range of population groups10.
Conjugate addition
Dispense 100µL of conjugate into each well, blot the top of the wells with a
tissue to remove any splashes.
Note: To avoid contamination, never return excess conjugate to the reagent
bottle.
Incubate at room temperature for 30 minutes.
4.
EXPECTED VALUES
The normal range was determined on serum from 200 normal adult blood
donors. Three were confirmed positive for gliadin IgA and three for gliadin IgG
autoantibodies (Section 10.4).
The ranges are provided as a guide only. ELISA assays are very sensitive and
capable of detecting small differences in sample populations. It is
recommended that each laboratory determine its own normal range, based on
the population techniques and equipment employed.
Antigliadin IgG
Antigliadin IgA
Normal controls (n=52)
13
4
Coeliac patients (n=57)
19
5
Untreated Coeliac (n=100)
78
92
Untreated adults consisted of 29 males and 71 females aged 14-79 years.
10
PERFORMANCE CHARACTERISTICS
10.1 PRECISION
INTRA-ASSAY PRECISION
The intra-assay precision was measured using six samples tested within the
range of the calibration curve. The % C.V. for each sample is given below:
Antigliadin IgG
n=20
Concentration (U/mL)
% C.V.
Sample 1
2.43
6.35
Sample 2
9.25
4.79
Sample 3
10.04
4.91
Sample 4
24.31
3.44
Sample 5
30.37
2.80
Quality control
In order for an assay to be valid, all the following criteria must be met:
Calibrators and positive and negative controls must be included in each run.
The values obtained for the positive and negative controls should be in the
ranges specified on the QC Certificate.
The curve shape should be similar to the calibration curve, shown on the QC
Certificate.
If the above criteria are not met, the assay is invalid and the test should
be repeated.
Sample 6
58.42
5.47
Calculate mean optical densities (For assays run in duplicate only)
For each calibrator, control and sample calculate the mean OD of the duplicate
readings. The percentage coefficient of variation (% CV) for each duplicate OD
should be less than 15%.
Optical density measurement
Read the optical density (OD) of each well at 450nm on a microplate reader,
within 30 minutes of stopping the reaction.
RESULTS AND QUALITY CONTROL
Plot calibration curve
The calibration curve can be plotted either automatically or manually as follows
by plotting the antigliadin autoantibody concentration on the log scale against
the OD on the linear scale for each calibrator:
Automatic – use appropriately validated software, and the curve fit that best fits
the data.
Manual – using log/linear graph paper, draw a smooth curve through the points
(not a straight line or point to point).
Treatment of anomalous points
If any one point does not lie on the curve, it can be removed. If the absence of
this point means that the curve has a shape dissimilar to that of the sample
calibration curve, or more than one point appears to be anomalous, then the
assay should be repeated.
Calculation of the control values
Read the level of the antigliadin autoantibody from the calibration curve. The
values should fall within the ranges given on the QC Certificate.
Calculation of autoantibody levels in diluted samples
Read the level of the antigliadin autoantibody in the diluted samples directly
from the calibration curve.
NOTE: The calibrator values have been adjusted by a factor of 100 to account
for a 1:100 sample dilution, therefore no further conversion is required.
Assay calibration
The assay is calibrated in U/mL against an arbitrary reference calibrator, as no
internationally recognised reference preparation is currently available.
Conversion factor – To express the results in mg/L use the following conversion
factors:
IgG 1U/mL = 6mg/L
IgA 1U/mL = 3.5mg/L
Limitations
This kit is used to aid diagnosis only. A positive result suggests certain
diseases, which must be confirmed by clinical findings and other serological
tests.
The results obtained from this assay are not diagnostic proof of the presence or
absence of disease.
The use of this assay with paediatric samples has not been established.
Antigliadin IgA
n=20
Concentration (U/mL)
% C.V.
Sample 1
4.26
4.54
Sample 2
5.53
4.61
Sample 3
15.45
5.80
Sample 4
29.28
1.51
Sample 5
41.08
3.91
Sample 6
61.23
3.77
INTER-ASSAY PRECISION
The inter-assay precision was measured using six samples tested in duplicate
six times for three days. The %C.V. for each sample is given below:
Antigliadin IgG
n=6
Concentration (U/mL)
% C.V.
Sample 1
2.43
14.59
Sample 2
9.56
6.37
Sample 3
10.54
10.93
Sample 4
23.22
5.18
Sample 5
33.35
6.23
Sample 6
58.97
7.47
Antigliadin IgA
n=6
Concentration (U/mL)
% C.V.
Sample 1
3.22
6.36
Sample 2
5.94
6.16
Sample 3
18.0
3.99
Sample 4
26.56
7.56
Sample 5
38.31
9.27
Sample 6
57.34
12.48
10.2 ANALYTICAL SENSITIVITY
Assay sensitivity of 1.23U/mL was confirmed by assaying two samples in
multiple replicates with values of 1.4 and 1.9 (Gliadin IgA) and 1.5 and 2.0
(Gliadin IgG) times the lowest calibrator point (1.23U/mL). Statistical analysis
by the Student’s t test confirmed that these samples were significantly different
from each other (p<0.0001).
Insert Code: E035, Version: 28 March 2006, Page 3 of 13
10.3 MEASURING RANGE
develop a practical routine. Acta Peadiatr 1995; 84: 294-298.
Chartrand L T et al. Effectiveness of antigliadin antibodies as a screening test
for coeliac disease in children. Canadian Med Assoc J. 1997; 157 (5): 527 553.
Collin P et al. Selective IgA deficiency and coeliac disease in children. Scand
J Gastroenterol. 1997; 27: 367 – 371.
E Lindh et al. Screening for antibodies against gliadin in patients with
osteoporosis. Journal of Internal Medicine 1992; 231: 403-406.
Cornelius C Cronin, Fergus Shanahan. Insulin-dependent diabetes mellitus
and coeliac disease. The Lancet. 1997; 349: 1096-1097.
Grodzinsky E et al. High prevalence of celiac disease in healthy adults
revealed by antigliadin antibodies. Annals of Allergy. 1992; 69: 66 - 70.
4.
The measuring range of the assays is 1.23-100 U/mL.
10.4 NORMAL RANGE
5.
Anti-gliadin IgA and IgG autoantibody levels were measured in serum from 200
normal adult blood donors. Based on the guide line result interpretation, 1.5%
(3/200) were positive for gliadin IgA and IgG autoantibodies. Of the gliadin IgA
positive samples, 2/3 were positive on an alternative ELISA kit, while all the
gliadin IgG positive samples were positive by an alternate ELISA.
Antigliadin IgG
Antigliadin IgA
No. of samples
200
200
Mean result
1.95 U/mL
1.31 U/mL
Standard deviation
2.19 U/mL
4.57 U/mL
Upper limit of normal
10 U/mL
5 U/mL
In addition, 52 other autoimmune positive samples containing autoantibodies to
dsDNA, thyroglobulin, thyroid microsomes, cardiolipin, ENAs and antineutrophil
cytoplasmic antigens were tested by ELISA. All were found to be negative for
gliadin IgA and IgG autoantibodies.
40 samples from patients with Crohn’s disease (n=21) and Ulcerative colitis
(n=19) were also tested. All three gliadin IgG positive samples were positive by
an alternative ELISA, while 2/3 gliadin IgA positive samples were confirmed
positive on an alternative ELISA kit.
6.
7.
8.
9.
Protein Reference Unit Handbook of Autoimmunity (3rd Edition) 2004 Ed A Milford
Ward. J. Sheldon, GD Wild. Publ. PRU Publications, Sheffield. 14.
10.
Sategna-Guidetti C et al. Comparison of Serum Anti Gliadin, AntiEndomysium and Anti-Jejunum Antibodies in Adult Celiac Sprue. J Clin
Gastroenterol 1995; 20 (1): 17-21.
12
PLATE TEMPLATE
Please see back of insert.
1.
2.
Add 100µL of conjugate to each well.
Incubate for 30 minutes.
Wash.
3.
Add 100µL of substrate to each well.
Incubate for 30 minutes.
4.
Add 100µL of stop solution to each well.
Measure the absorbance at 450nm.
10.5 RELATIVE SPECIFICITY, SENSITIVITY, AGREEMENT
The relative specificity, sensitivity and agreement has been determined against
alternative antigliadin IgG and IgA EIA kits using 71 and 77 test samples
respectively.
Alternative EIA
+
Summary of Procedure
Add 100µL of each calibrator, control and 1:100 diluted
sample to the appropriate wells.
Incubate for 30 minutes.
Wash.
-
BINDAZYME
+
31
Antigliadin IgG
-
11**
2*
27
Relative sensitivity
73.8%
Relative specificity
93.1%
Relative agreement
81.7%
BINDAZYME™ is a registered trademark of
The Binding Site Ltd.
P.O. Box 11712, Birmingham
B14 4ZB. England
* Positive on a second alternative EIA kit.
**10/11 samples negative on a second alternative EIA kit.
Alternative EIA
+
2
BINDAZYME
+
33
Antigliadin IgA
-
0
42
Relative sensitivity
100.0%
Relative specificity
95.6%
Relative agreement
97.4%
10.6 INTERFERING SUBSTANCES
A range of interfering substances were spiked into anti-gliadin IgA and IgG
negative and positive samples, which were subsequently tested on the gliadin
IgA and IgG assays. The method used to check these substances was based
on the Interference Check A PlusTM –Kokusai, Japan.
Substance
Concentration
Bilrubin F (Free)
19.3mg/dL
Bilrubin C (Conjugate)
19.9mg/dL
Haemolysed Haemoglobin
485mg/dL
Chyle
1550 Units
Rheumatoid factor
45 IU/mL
No interference by these samples was observed in any of the samples tested.
10.7 ASSAY LINEARITY
Three samples were tested for linearity across the calibration range, the
regression coefficient R2 was greater than 0.997 (Gliadin IgA) and 0.992
(Gliadin IgG) when comparing the actual to the expected values in U/mL, with
mean recoveries of 96% and 97% respectively.
10.8 PROZONE STUDIES
Three positive samples were diluted 1:6.25 in sample diluent (normal dilution
1:100) to assess possible prozone effects. In both gliadin IgA and IgG assays,
all samples diluted out appropriately. No false negative values were observed
at the lowest sample dilutions, thus no prozone was observed.
11
1.
2.
3.
REFERENCES
Jerry S. Trier. Celiac Sprue. The New England Journal of Medicine 1991; 24:
1709-1719.
A Bürgin-Wolff et al. Antigliadin and antiendomysium antibody determination
for coeliac disease. Archives of Disease in Childhood 1991; 66: 941-947.
Grodzinsky E et al. Anti-endomysium and anti-gliadin antibodies as
serological markers for coeliac disease in childhood: a clinical study to
Insert Code: E035, Version: 28 March 2006, Page 4 of 13
INHALT
Seite
1
Verwendungszweck
2
Einführung
3
Testprinzip
4
Warnungen und Vorsichtsmaßnahmen
5
Probenentnahme und –vorbereitung
6
Materialien
7
Testdurchführung
8
Ergebnisse und Qualitätskontrolle
9
Erwartete Werte
10
Leistungsdaten
11
Referenzen
12
Plattenschema
ARBEITSANLEITUNG
Bindazyme Anti-Gliadin Enzym-Immunoasay (EIA) Kits
Anti-Gliadin IgG
Anti-Gliadin IgA
Anti-Gliadin IgG/IgA-Kombi-Kit
Bestell-Nr.: MK035
Bestell-Nr.: MK036
Bestell-Nr.: MK037
Nur zur in vitro Diagnostik
In England hergestellt von:
The Binding Site Ltd, P.O. Box 11712, Birmingham, B14 4ZB, U.K.
www.bindingsite.co.uk
Vertrieb in Deutschland und Österreich durch:
The Binding Site GmbH, Robert-Bosch-Straße 2A
D-68723 Schwetzingen, Deutschland
Telefon: +49 (0) 6202 92 62 0
Fax: +49 (0) 6202 92 62 222
e-mail: [email protected]
1
VERWENDUNGSZWECK
Die Kits dienen zur quantitativen in vitro Bestimmung von Anti-Gliadin-IgA- und
IgG-Antikörpern (AGA) in Humanserum zur Unterstützung der Diagnose von
Zöliakie.
Ein Kit enthält ausreichend Material, um maximal 41 Proben in Doppelbestimmung oder 89 Proben in Einzelbestimmung, inklusive einer Kalibrationskurve und 2 Kontrollen, zu messen.
2
EINFÜHRUNG
Zöliakie-Patienten zeigen eine Intoleranz gegenüber Gluten, einem Protein,
das in Weizen und verwandten Getreidesorten vorkommt. Gliadin, eine in
Ethanol lösliche Fraktion des Glutens, ist der für die Zöliakie verantwortliche
Bestandteil.1,2,3
Bei der Zöliakie findet man Schädigungen des Dünndarms und klinische
Symptome wie Diarrhoe, Unterernährung und Wachstumsstörungen. Eine
glutenfreie Diät führt zum Verschwinden der Symptome.2 Die Bestimmung der
anti-Gliadin-IgA- und IgG-Antikörper ist eine einfache, nichtinvasive Screeningund Diagnosemethode auf Zöliakie. Die Anti-Gliadin-IgA-Antikörper zeigen eine
höhere Spezifität als die IgG-Antikörper, allerdings ist die Sensitivität der IgGAntikörper größer. Es wird empfohlen beide Antikörper zu bestimmen, da bei
Zöliakie-Patienten eine IgA-Defizienz besonders häufig auftritt. IgA-defiziente
Menschen erkranken 10mal häufiger an Zöliakie als die normale Population.4
Weiterhin sind Anti-Gliadin-Antikörper auch mit anderen Krankheiten wie z.B.
Down’s Syndrom, selektivem IgA-Mangel5, Osteoporose6, Insulin-abhängiger
Diabetes mellitus und anderen Autoimmunerkrankungen assoziiert7, wobei die
typischen gastrointestinalen Symptome fehlen. Patienten mit ZöliakieSymptomen haben häufiger IgG- und IgA-Anti-Gliadin-Antikörper als Patienten
ohne Symptome.8
3
TESTPRINZIP
Die Wells (Vertiefungen) der Mikrotiterplatten sind mit dem Gliadin-Antigen
beschichtet. Die Kalibratoren, Kontrollen und zu testenden Proben werden in
den Wells inkubiert, so dass die Anti-Gliadin-Autoantikörper während der
ersten Inkubation an das immobilisierte Antigen binden können. Nach dem
Waschen der Wells - zum Entfernen des ungebundenen Proteins - gibt man
das, mit Peroxidase markierte Kaninchen-anti-human-IgG oder Anti-humanIgA-Konjugat (spezifisch für γ- oder α-Kette) hinzu. Nach einer weiteren
Inkubation und einem weiteren Waschvorgang - um das ungebundene
Konjugat zu entfernen - wird das gebundene Konjugat mit Hilfe von 3,3',5,5' Tetramethylbenzidin (TMB) sichtbar gemacht. TMB ergibt ein blaues
Reaktionsprodukt, dessen Intensität proportional zur AutoantikörperKonzentration der Probe ist. Phosphorsäure wird in jedes Well pipettiert um die
Reaktion zu stoppen. Das daraus resultierende gelbe Reaktionsprodukt wird
bei 450 nm gemessen.
4
WARNUNGEN UND VORSICHTSMAßNAHMEN
4.1 WARNUNGEN
•
Das Ausgangsmaterial zur Erstellung der Kalibratoren und Kontrollen stammt
aus menschlichem Blut. Jede Einzelspende wurde bezüglich Antikörper gegen
Human-Immunschwäche-Virus (HIV 1 & 2), Hepatitis-C-Virus und Hepatitis-BOberflächenantigen (HBsAG) untersucht und als negativ befunden. Es gibt
aber zur Zeit keine absolut sicheren Testmethoden zum Auschluss von
Infektionsträgern. Deshalb sollten die Reagenzien als potentiell infektiös
behandelt werden. Umgangs- und Entsorgungsmethoden sollten denen für
Insert Code: E035, Version: 28 March 2006, Page 5 of 13
•
•
potentiell infektiösem Material entsprechen und der Test nur von entsprechend
geschultem Personal durchgeführt werden.
Natriumazid kann mit Blei- oder Kupferrohren explosive Metallazide bilden.
Nach der Entsorgung mit ausreichender Menge Wasser nachspülen, um
Azidablagerungen zu vermeiden.
Alle Puffer und Seren im Kit enthalten die unten aufgelisteten EnzymInhibitoren als Konservierungsmittel. Diese sollten mit der entsprechenden
Vorsicht behandelt werden.
INHIBITOR
KONZENTRATION
Kathon
Natriumazid
Proclin™ 300
Bromonitrodioxan
Methylisothiazon
0,02%
0,099%
0,045%
0,002%
0,002%
Proclin™ ist ein eingetragenes Warenzeichen der Rohm and Haas Corp. Philadelphia, PA
•
•
•
Kathon wirkt reizend und kann bei Hautkontakt zu einer Sensibilisierung
führen.
Die Stopp-Lösung enthält 3M Phosphorsäure. Sie ist reizend, deshalb Kontakt
mit Haut und Augen vermeiden.
Verschüttete Reagenzien entsprechend beseitigen, dabei sind ökologische und
gesetzliche Bestimmung zu beachten.
4.2 VORSICHTSMAßNAHMEN
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Dieser Test sollte nur von entsprechend geschultem Laborpersonal
durchgeführt werden.
Testdurchführung strikt nach Arbeitsanleitung. Jegliche Abweichung kann die
Testqualität und Ergebnisse beeinflussen. Beachten Sie die spezifischen
‚Hinweise‘ und Warnungen in dieser Arbeitsanleitung.
Die Chargen von Kalibrator, Kontrollen, Konjugat und Mikrotiterstreifen sind
nicht austauschbar. Wird eine dieser Komponenten durch eine andere Charge,
die nicht in dem gelieferten Kit enthalten ist, ersetzt, kann es zu inkonsistenten
und inakkuraten Ergebnissen kommen. Alle Mikrotiterstreifen müssen aus
demselben Folienbeutel entnommen werden.
Zur Vermeidung von Kontaminationen der Reagenzien immer saubere Plastikoder Glasgefäße verwenden. Niemals unbenutztes Reagenz in die Flaschen
zurückgeben.
Reagenzienflaschen nicht für längere Zeit offen stehenlassen. Die daraus
resultierende Verdunstung oder Verunreinigung führt zu widersprüchlichen
Ergebnissen.
TMB darf weder mit Licht noch mit Wasser in Berührung kommen.
Die Verwendung von mikrobiell oder mit Partikeln verunreinigter, hämolytischer
oder lipämischer Seren vermeiden.
Falsche Probenverdünnungen können nicht erkannt werden, da die KitKontrollen gebrauchsfertig sind. Es wird empfohlen, kalibrierte Pipetten und
geeignete interne Kontrollen zu verwenden.
Die Verwendung von ELISA-Automaten, Pipettierautomaten oder anderen
automatisierten Geräten kann im Vergleich zur manuellen Testdurchführung zu
abweichenden Ergebnissen führen. Jedes Labor muss das System vollständig
validieren und sicherstellen, dass die Ergebnisse innerhalb der in dieser
Arbeitsanleitung und dem beigefügten QC-Zertifikat Spezifikationen liegen.
Die verwendeten Geräte und Pipetten müssen gemäß der Herstellerangaben
kalibriert und gewartet werden.
4.3 LAGERUNG UND STABILITÄT
•
Den Kit bei 2-4°C lagern, nicht einfrieren. Lagerung bei falscher Temperatur
beeinflusst die Ergebnisse.
•
Der verdünnte Waschpuffer ist bei 2-8°C bis maximal 4 Wochen haltbar und
kann kalt (direkt aus dem Kühlschrank) verwendet werden, ohne das die
Testqualität beeinflusst wird.
• Die Haltbarkeit des Kits wird auf dem Auβenetikett angegeben.
5
•
•
•
•
6
6.2 GELIEFERTE MATERIALIEN - PRODUKTSPEZIFISCH
6.2.1 Bindazyme Anti-Gliadin IgG (MK035)
•
Gliadin IgG Calibrators (Gliadin-IgG-Kalibratoren): 5 Flaschen mit je 1mL
gebrauchsfertig verdünntem Humanserum mit folgenden Konzentrationen an
Anti-Gliadin-IgG-Autoantikörper: 100; 33; 11,1; 3,7; 1,23 U/mL.
•
Gliadin IgG Positive Control (Gliadin-IgG-Positivkontrolle): 1 Flasche mit 1mL
verdünntem Humanserum. Der Sollwert ist auf dem QC-Zertifikat angegeben.
Gebrauchsfertig.
•
Gliadin Negative Control (Anti-Gliadin-Negativkontrolle): 1 Flasche mit 1mL
verdünntem Humanserum. Der Sollwert ist auf dem QC-Zertifikat angegeben.
Gebrauchsfertig.
•
Gliadin IgG Conjugate (IgG-Konjugat): 1 Flasche mit 12mL gereinigtem, Peroxidase-markiertem Antikörper gegen Human-IgG. Farbcodierung: Rot.
Gebrauchsfertig.
6.2.2 Bindazyme Anti-Gliadin IgA (MK036)
•
Gliadin IgA Calibrators (Gliadin-IgA-Kalibratoren): 5 Flaschen mit je 1mL
gebrauchsfertig verdünntem Humanserum mit folgenden Konzentrationen an
Anti-Gliadin-IgA-Autoantikörper: 100; 33; 11,1; 3,7; 1,23 U/mL.
•
Gliadin IgA Positive Control (Gliadin-IgA-Positivkontrolle): 1 Flasche mit 1mL
verdünntem Humanserum. Der Sollwert ist auf dem QC-Zertifikat angegeben.
Gebrauchsfertig.
•
Gliadin Negative Control (Anti-Gliadin-Negativkontrolle): 1 Flasche mit 1mL
verdünntem Humanserum. Der Sollwert ist auf dem QC-Zertifikat angegeben.
Gebrauchsfertig.
•
Gliadin IgA Conjugate (IgA-Konjugat): 1 Flasche mit 12mL gereinigtem, Peroxidase-markiertem Antikörper gegen Human-IgA. Farbcodierung: Grün.
Gebrauchsfertig.
6.2.3 Bindazyme Anti-Gliadin IgG/IgA Kombi Kit (MK037)
•
Gliadin IgG Calibrators (Gliadin-IgG-Kalibratoren): 5 Flaschen mit je 1mL
gebrauchsfertig verdünntem Humanserum mit folgenden Konzentrationen an
Anti-Gliadin-IgG-Autoantikörper: 100; 33; 11,1; 3,7; 1,23 U/mL.
•
Gliadin IgA Calibrators (Gliadin-IgA-Kalibratoren): 5 Flaschen mit je 1mL
gebrauchsfertig verdünntem Humanserum mit folgenden Konzentrationen an
Anti-Gliadin-IgA-Autoantikörper: 100; 33; 11,1; 3,7; 1,23 U/mL.
•
Gliadin IgG Positive Control (Gliadin-IgG-Positivkontrolle): 1 Flasche mit 1mL
verdünntem Humanserum. Der Sollwert ist auf dem QC-Zertifikat angegeben.
Gebrauchsfertig.
•
Gliadin IgA Positive Control (Gliadin-IgA-Positivkontrolle): 1 Flasche mit 1mL
verdünntem Humanserum. Der Sollwert ist auf dem QC-Zertifikat angegeben.
Gebrauchsfertig.
•
Gliadin Negative Control (Anti-Gliadin-Negativkontrolle): 1 Flasche mit 1mL
verdünntem Humanserum. Der Sollwert ist auf dem QC-Zertifikat angegeben.
Gebrauchsfertig.
•
Gliadin IgG Conjugate (IgG-Konjugat): 1 Flasche mit 12mL gereinigtem, Peroxidase-markiertem Antikörper gegen Human-IgG. Farbcodierung: Rot.
Gebrauchsfertig.
•
Gliadin IgA Conjugate (IgA-Konjugat): 1 Flasche mit 12mL gereinigtem, Peroxidase-markiertem Antikörper gegen Human-IgA. Farbcodierung: Grün.
Gebrauchsfertig.
6.3
BENÖTIGTE, NICHT IM KIT ENTHALTENE MATERIALIEN
•
•
•
•
•
•
PROBENENTNAHME UND -VORBEREITUNG
Blutproben über Venenpunktur sammeln und auf natürliche Weise gerinnen
lassen. Serum vom Gerinnsel trennen.
Die Seren können bei 2-8°C bis zu 7 Tage vor dem Test9 gelagert werden. Für
eine längere Lagerung empfiehlt es sich, die Seren unverdünnt und aliquotiert
bei mindestens -20°C einzufrieren.
Wiederholtes Einfrieren und Auftauen der Proben vermeiden.
Serumproben nicht hitzeinaktivieren, dies kann zu falsch-positiven
Ergebnissen führen.
MATERIALIEN
7
7.1
•
•
•
•
•
Arbeitsanleitung: mit genauen Angaben zur Testdurchführung.
QC-Zertifikat: mit Chargen-spezifischen Angaben zu Kontroll-Sollwerten und
ideale Kalibrationskurve.
Gliadin Coated Wells (Gliadin beschichtete Mikrotiterstreifen): 12 Mikrotiterstreifen mit je 8 vereinzelbaren Wells, die mit Gliadin-Antigen beschichtet sind.
Die Streifen sind in einem wiederverschließbaren Folienbeutel, der ein
Trockenmittel enthält, verpackt.
Type III Sample Diluent (Probendiluens Typ III): 2 Flaschen mit je 50mL
Puffer zur Probenverdünnung. Farbcodierung: gelb. Gebrauchsfertig.
Type III Wash Buffer (Waschpuffer Typ III): 1 Flasche mit 50mL eines 20-fach
konzentrierten Puffers zum Waschen der Wells.
TMB Substrate (TMB-Substrat): 1 Flasche mit 14mL TMB-Lösung.
Gebrauchsfertig.
Stop Solution (Stopp-Lösung): 1 Flasche mit 14mL 3M Phosphorsäure. Gebrauchsfertig.
TESTDURCHFÜHRUNG
TESTVORBEREITUNG
1.
•
•
Kit auf Raumtemperatur erwärmen
Die optimale Temperatur für die Testdurchführung liegt bei 20-24°C.
Den Kit nach Entnahme aus dem Kühlschrank ca. 60 Minuten bei
Raumtemperatur erwärmen lassen. Die Wells bis zum tatsächlichen Gebrauch
in der Folie belassen!
HINWEIS: Der Kit kann bis zu 1 Woche bei Raumtemperatur gelagert werden.
2.
Kit-Komponenten
Jede Kit-Komponente vor Gebrauch kurz schütteln.
3.
Waschpuffer verdünnen
Dazu 50mL Waschpuffer-Konzentrat zu 950mL destilliertem Wasser geben
(1:20) und mischen.
HINWEIS: Der verdünnte Puffer ist bei 2-8°C bis zu 4 Wochen haltbar; deshalb
nur die benötigte Menge verdünnen. Den Waschpuffer verwerfen, falls er
Anzeichen für eine mikrobielle Kontamination zeigt oder trübe wird. In diesem
Fall eine frische Verdünnung herstellen.
4.
Verdünnung der Proben
10µL jeder Probe mit 1000µL Probendiluens verdünnen (1:100) und gut
mischen.
Hinweis: Die verdünnten Proben müssen innerhalb von 8 Stunden verwendet
werden.
5.
Umgang mit Streifen und Rahmen
Die benötigte Anzahl Wells aus dem Folienbeutel entnehmen und in den
Rahmen setzen. Dabei von Position A1 ausgehend die Spalten von links nach
rechts auffüllen. Achten Sie darauf, die langen Seiten des Rahmens
zusammenzudrücken, damit die Wells nicht herausfallen können.
6.1 GELIEFERTE MATERIALIEN – Für alle Kits
•
•
Destilliertes Wasser: Es sollte von höchster Qualität und frei von Metallionen
sein.
Kalibrierte Mikropipetten: Zum Pipettieren von 1000, 100 & 10µL.
Mehrkanal-Pipette: Zum Pipettieren von Volumina von 100µL.
Automatisches Mikrotiterplatten-Waschgerät: ist empfehlenswert, aber die
Platten können auch manuell gewaschen werden.
Mikrotiterplatten-Reader: Messung der optischen Dichte in den Wells bei
450nm.
Glas- oder Plastikgefäße: Zur Probenverdünnung.
Insert Code: E035, Version: 28 March 2006, Page 6 of 13
Hinweis: Um die Kontaktzeit mit der Luftfeuchtigkeit zu minimieren, die nicht
verwendeten Wells sofort in den wiederverschließbaren Folienbeutel mit dem
Trockenmittel geben und gut verschließen.
Darauf achten, dass der Folienbeutel nicht beschädigt wird.
ACHTUNG: Kontakt mit Feuchtigkeit oder Verunreinigung durch Staub
oder anderen Partikeln kann einen Antigen-Abbau verursachen. Daraus
resultiert eine schlechte Präzision und potentiell falsche Ergebnisse.
5.
Berechnung der Autoantikörper-Konzentrationen in den Kontrollen
Die Anti-Gliadin-Autoantikörper-Konzentrationen der Kontrollen direkt aus der
Kalibrationskurve ablesen. Die Kontrollwerte müssen in den im QC-Zertifikat
angegebenen Bereich fallen.
6.
Berechnung der Autoantikörper-Konzentrationen in den Proben
Die Anti-Gliadin-Autoantikörper-Konzentrationen der Proben direkt aus der
Kalibrationskurve ablesen.
Hinweis: Die Standard-Probenverdünnung von 1:100 ist in der Kalibrationskurve bereits berücksichtigt. Es sind keine weiteren Korrekturen nötig.
7.
Kalibration des Tests
Der Kit ist gegen eine willkürliche Referenzpräparation kalibriert, da kein
anerkannter internationaler Standard verfügbar ist. Die Angaben sind in U/mL
Für die Angabe der Ergebnisse in mg/L folgende Umrechnungsfaktoren
verwenden:
IgG 1U/mL = 6mg/L
IgA 1U/mL = 3,5mg/L
8.
•
Grenzen des Tests
Dieser Testkit dient nur zur Unterstützung der Diagnose. Ein positives Ergebnis
muss durch den klinischen Befund und andere serologische Untersuchungen
bestätigt werden.
Die Testergebnisse können nicht als diagnostischer Beweis für das Vorliegen
bzw. Nichtvorliegen einer Krankheit verwendet werden.
Diese Kits wurden nicht mit pädiatrischen Proben getestet.
7.2 TESTDURCHFÜHRUNG
1.
2.
Pipettieren der Kalibratoren, Kontrollen und Proben
100µL von jedem Kalibrator, jeder Kontrolle und jeder verdünnten (1:100)
Probe in das dafür laut Plattenschema vorgesehene Well pipettieren.
HINWEIS: Die Proben müssen so schnell wie möglich pipettiert werden, um
eine Drift des Assays zu minimieren. Die Inkubationszeit läuft ab Zugabe der
letzten Probe.
30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
Waschen der Platte
Sorgfältiges Waschen der Wells ist wichtig für eine hohe Präzision und genaue
Testergebnisse. Bei nicht korrekt gewaschenen Wells können ungenaue
Ergebnisse mit schlechter Präzision und hohem Hintergrund auftreten.
Nach der Inkubation die Wells dreimal mit 250-350µL Waschpuffer waschen.
Das Waschen kann mit einem automatischen Platten-Waschgerät oder
manuell erfolgen. Nach dem letzten Waschschritt die Wells durch leichtes
Klopfen auf eine absorbierende Unterlage (z.B. Papiertücher) trocknen.
Manuelles Waschen:
a.
Den Inhalt der Wells in den Ausguss schütten, dabei die langen Seiten
des Rahmens zusammendrücken.
b.
Die Wells auf einer absorbierenden Unterlage (z. B. Papiertücher)
leicht ausklopfen.
c.
250 - 350µL Waschpuffer in der Arbeitskonzentration in die Wells
pipettieren.
d.
Die Mikrotiterplatte auf einer flachen Unterlage stehend leicht
schütteln.
e.
Zweimaliges Wiederholen der Schritte a bis d.
f.
Die Wells wie unter a und b entleeren.
3.
4.
5.
Pipettieren von Substrat (TMB)
Nach dem Waschen 100 µL TMB in jedes Well pipettieren. Die Ränder der
Wells mit Filterpapier abtrocknen, um Spritzer zu entfernen.
Hinweis: Um Verunreinigungen zu vermeiden, niemals überschüssiges TMB in
die TMB-Flasche zurückgeben.
30 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren.
7.
Farbmessung
Die optische Dichte (OD) bei 450nm in jedem Well mit einem MikrotiterplattenReader innerhalb von 30 Minuten nach Reaktionsende bestimmen.
•
•
•
2.
3.
•
•
4.
9
ZU ERWARTENDE WERTE
Der Normalbereich wurde im Serum von 200 normalen Blutspendern ermittelt.
Drei davon wurden als Anti-Gliadin IgA positiv und drei als Anti-Gliadin IgG
positiv bestätigt. (Siehe Abschnitt 10.4.)
Diese Werte dienen nur zur Orientierung. ELISA’s sind sehr sensitiv und in der
Lage kleine Unterschiede in der ‘Proben-Population’ festzustellen. Daher wird
empfohlen, dass jedes Labor auf der Basis der lokalen Population und der
verwendeten Geräte und Techniken seinen eigenen Normalbereich ermittelt.
Anti-Gliadin IgG
Anti-Gliadin IgA
Negatives Ergebnis
< 10 U/mL
< 5 U/mL
Positives Ergebnis
≥ 10 U/mL
≥ 5 U/mL
Das prozentuale Vorkommen von Anti-Gliadin-Autoantikörper in verschiedenen
Bevölkerungsgruppen wird folgendermaßen angegeben:10
Waschen der Platte
Siehe Abschnitt 2.
Reaktionsende
100µL Stopp-Lösung in jedes Well pipettieren. Die Farbe schlägt von blau nach
gelb um.
1.
•
Pipettieren des Konjugats
100µL Konjugat in jedes Well pipettieren. Die Ränder der Wells mit Filterpapier
abtrocknen, um Spritzer zu entfernen.
Hinweis: Um Verunreinigungen zu vermeiden, niemals überschüssiges
Konjugat in die Konjugat-Flasche zurückgeben.
30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
6.
8
•
Anti-Gliadin IgG
Anti-Gliadin IgA
Gesunde (n=52)
13
4
Zöliakie-Patienten (n=57)
19
5
Unbehandelte Zöliakie
Patienten (n=100)
78
92
Die Gruppe der unbehandelten Zöliakie-Patienten setzt sich aus 29 männlichen
und 71 weiblichen Erwachsenen im Alter zwischen 14 - 79 Jahren zusammen.
10
LEISTUNGSDATEN
10.1 PRÄZISION
INTRA-ASSAY-PRÄZISION
Die Intra-Assay-Präzision wurde mit 6 Proben, deren Konzentrationen
innerhalb der Kalibrationskurve liegen, bestimmt. Die Variationskoeffizienten
(%VK) jeder Probe sind nachfolgend angegeben:
Anti-Gliadin-IgG
n = 20
Konzentration U/mL
% VK
Probe 1
2,43
6,35
Qualitätskontrolle
Nur, wenn alle nachfolgend aufgeführten Kriterien erfüllt sind, ist der Test
gültig. Ist dies nicht der Fall, ist der Test ungültig und muss wiederholt werden.
Kalibratoren und Kontrollen müssen bei jedem Testansatz mitgeführt werden.
Das Ergebnis der Kontrollen muss in dem angegebenen Wertebereich (siehe
QC-Zertifikat) liegen.
Die berechnete Kalibrationskurve sollte der auf dem QC-Zertifikat abgebildeten
Kalibrationskurve ähnlich sein.
Probe 2
9,25
4,79
Probe 3
10,04
4,91
Probe 4
24,31
3,44
Probe 5
30,37
2,80
Probe 6
58,42
5,47
n = 20
Konzentration U/mL
% VK
Berechnung der mittleren optischen Dichte (nur bei Doppelbestimmung):
Für jeden Kalibrator und jede Kontrolle und Probe die mittlere optische Dichte
(OD) der Doppelbestimmungen berechnen. Der Variationskoeffizient (%VK)
der Doppelbestimmungen sollte jeweils unter 15% liegen.
Probe 1
4,26
4,54
Probe 2
5,53
4,61
Probe 3
15,45
5,80
Probe 4
29,28
1,51
Probe 5
41,08
3,91
Probe 6
61,23
3,77
ERGEBNISSE UND QUALITÄTSKONTROLLE
Erstellen der Kalibrationskurve
Die Kalibrationskurve kann entweder automatisch oder manuell erstellt werden.
Dazu
wird
die
Anti-Gliadin-Autoantikörper-Konzentration
auf
der
logarithmischen Skala gegen die OD-Werte auf der linearen Skala für jeden
Kalibrator aufgetragen.
Automatisch: Geeignete, validierte Software verwenden. Kalkulationsmodus
verwenden, der am besten zu den Daten passt.
Manuell: Halblogarithmisches Millimeterpapier verwenden, eine Ausgleichskurve durch die Punkte legen (keine Gerade oder Punkt-zu-Punkt-Verbindung).
Anti-Gliadin-IgA
INTER-ASSAY-PRÄZISION
Die Inter-Assay-Präzision wurde mit sechs Proben, die an drei verschiedenen
Tagen 6-fach in Doppelbestimmung gemessen wurden, bestimmt. Die
Variationskoeffizienten (%VK) jeder Probe sind nachfolgend angegeben:
Umgang mit abweichenden Kalibrationspunkten
Liegt ein Messpunkt nicht auf der Kalibrationskurve, so kann er weggelassen
werden. Der Test sollte wiederholt werden, wenn die daraus resultierende
Kalibrationskurve deutlich von der im QC-Zertifikat angegebenen Kurvenform
abweicht oder, wenn mehrere Kalibrationspunkte zu starke Abweichungen aufweisen.
Insert Code: E035, Version: 28 March 2006, Page 7 of 13
10.6
Anti-Gliadin-IgG
n=6
Konzentration U/mL
% VK
Probe 1
2,43
14,59
Probe 2
9,56
6,37
Probe 3
10,54
10,93
Probe 4
23,22
5,18
Probe 5
33,35
58,97
Probe 6
INTERFERIERENDE SUBSTANZEN
Anti-Gliadin IgA und IgG negative und positive Seren wurden mit
verschiedenen interferierenden Substanzen versetzt und anschließend mit
diesen ELISAs getestet. Die Überprüfungsmethode für diese Substanzen
basiert auf ,Interference Check A plus -Kokusai Shiyaku, Japan’.
Substanz
19,3mg/dL
6,23
Bilirubin C (Konjugat)
19,9mg/dL
7,47
Hämolysiertes Hämoglobin
485mg/dL
Chylus (Milchsaft)
1550 Einheiten
Rheumafaktor
45 IU/mL
Anti-Gliadin-IgA
n=6
Konzentration U/mL
% VK
Probe 1
3,22
6,36
Probe 2
5,94
6,16
Probe 3
18,0
3,99
Probe 4
26,56
7,56
Probe 5
38,31
9,27
Probe 6
57,34
12,48
Es wurden keinerlei Störungen bei den getesteten Proben gefunden.
10.7
LINEARITÄT
Drei Proben wurden innerhalb des Messbereichs auf Linearität untersucht. Für
den Vergleich der erwarteten Konzentration und der gemessenen
Konzentration wurde ein Regressionskoeffizient R2 von größer als 0,997
(Gliadin IgA) und 0,992 (Gliadin IgG) gefunden. Die mittlere Wiederfindung war
96% bzw. 97%.
10.8
PROZONENEFFEKT
Drei positive Proben wurden 1:6,25 mit dem Probendiluens (Standardverdünnung ist 1:100) verdünnt um mögliche Prozoneneffekte zu untersuchen.
Für alle Probenverdünnungen wurden sowohl für Anti-Gliadin-IgA als auch
Anti-Gliadin-IgG korrekte Ergebnisse erhalten, auch bei der niedrigsten
Probenverdünnung wurden keine falsch-negativen Ergebnisse erhalten. D. h.
es wurde kein Prozonen-Effekt gefunden.
10.2
ANALYTISCHE SENSITIVITÄT
Die Sensitivität des Tests von 1,23 U/mL wurde anhand der Mehrfachbestimmung von 2 Proben, deren Konzentration das 1,4- bzw. 1,9-fache
(Gliadin IgA) und das 1,5- bzw. 2,0-fache (Gliadin IgG) des niedrigsten
Kalibrators (1,23 U/mL) betrug, bestätigt. Die statistische Analyse mit dem
‚Student’s t Test’ zeigt, dass sich diese Proben signifikant voneinander
unterscheiden (p<0,0001).
11
10.3
MESSBEREICH
Der Messbereich dieser Kits liegt zwischen 1,23-100 U/mL.
1.
10.4
NORMALBEREICH
Zur Bestimmung der Normalbereiche für Anti-Gliadin IgA und IgG Autoantikörper wurden Seren von 200 gesunden Blutspendern verwendet. Auf
Basis der empfohlenen Ergebnisinterpretation wurden 1,5 % (3/200 für AntiGliadin IgA und IgG Autoantikörper positiv gefunden. 2/3 der IgA-positiven
Proben wurden auch in einem alternativen ELISA positiv gefunden, während
alle 3 IgG-positiven Proben in einem alternativen ELISA positiv waren.
Anti-Gliadin IgG
4.
5.
200
200
6.
1,95 U/mL
1,31 U/mL
7.
Standardabweichung SD
2,19 U/mL
4,57 U/mL
8.
10 U/mL
5 U/mL
Obere Grenze von Normal
10.5
Anti-Gliadin IgA
2.
3.
Mittlere Konzentration
Anzahl Proben
Konzentration
Bilirubin F (Frei)
REFERENZEN
Jerry S. Trier. Celiac Sprue. The New England Journal of Medicine 1991; 24:
1709-1719.
A Bürgin-Wolff et al. Antigliadin and antiendomysium antibody determination
for coeliac disease. Archives of Disease in Childhood 1991; 66: 941-947.
Grodzinsky E et al. Anti-endomysium and anti-gliadin antibodies as
serological markers for coeliac disease in childhood: a clinical study to
develop a practical routine. Acta Peadiatr 1995; 84: 294-298.
Chartrand L T et al. Effectiveness of antigliadin antibodies as a screening test
for coeliac disease in children. Canadian Med Assoc J. 1997; 157 (5): 527 553.
Collin P et al. Selective IgA deficiency and coeliac disease in children. Scand
J Gastroenterol. 1997; 27: 367 – 371.
E Lindh et al. Screening for antibodies against gliadin in patients with
osteoporosis. Journal of Internal Medicine 1992; 231: 403-406.
Cornelius C Cronin, Fergus Shanahan. Insulin-dependent diabetes mellitus
and coeliac disease. The Lancet. 1997; 349: 1096-1097.
Grodzinsky E et al. High prevalence of celiac disease in healthy adults
revealed by antigliadin antibodies. Annals of Allergy. 1992; 69: 66 - 70.
9.
Zusätzlich wurden 52 Proben von anderen Autoimmun-Patienten, die
Autoantikörper
gegen
dsDNA,
Thyreoglobulin,
Thyroid-Microsomen,
Cardiolipin, ENAs und antineutrophile cytoplasmatische Antikörper (ANCA)
enthalten, getestet und alle waren negativ.
Protein Reference Unit Handbook of Autoimmunity (3rd Edition) 2004 Ed A Milford
Ward. J. Sheldon, GD Wild. Publ. PRU Publications, Sheffield. 14.
10.
Sategna-Guidetti C et al. Comparison of Serum Anti Gliadin, AntiEndomysium and Anti-Jejunum Antibodies in Adult Celiac Sprue. J Clin
Gastroenterol 1995; 20 (1): 17-21.
Zusätzlich wurden 40 Seren von Patienten mit Morbus Crohn (n = 21) und
Colitis Ulcerosa (n = 19) getestet. Alle 3 im Anti-Gliadin-IgG-Test positiven
Proben waren auch in einem alternativen Test positiv. Bei 2/3 Anti-Gliadin-IgA
positive Proben wurden 2 in einem alternativen Test als positiv bestätigt.
11
RELATIVE SPEZIFITÄT, SENSITIVITÄT UND ÜBEREINSTIMMUNG
Die relative Spezifität, Sensitivität und Übereinstimmung zu einem alternativen
IgG Anti-Gliadin (71 Proben) und IgA Anti-Gliadin (77 Proben) EIA wurde
ermittelt.
Alternativer EIA
+
Bindazyme
Anti-Gliadin IgG
Siehe Ende der Arbeitsanleitung.
KURZARBEITSANLEITUNG
1.
100µL von jedem Kalibrator, jeder Kontrolle und 1:100 verdünnter
Probe in das entsprechende Well pipettieren.
30 Minuten inkubieren.
Waschen.
2.
100µL Konjugat in jedes Well geben.
30 Minuten inkubieren.
Waschen.
3.
100µL Substrat in jedes Well geben.
30 Minuten im Dunkeln inkubieren.
4.
100µL Stopp-Lösung in jedes Well pipettieren.
Absorption bei 450nm messen.
-
+
31
2*
-
11**
27
Relative Sensitivität
73,8 %
Relative Spezifität
93,1 %
Relative Übereinstimmung
81,7 %
BINDAZYME™
ist ein eingetragenes Warenzeichen von
The Binding Site Ltd., UK.
P.O. Box 11712, Birmingham
B14 4ZB. England
*Positiv in einem zweiten alternativen EIA.
**10/11 Proben negativ in einem zweiten alternativen EIA.
Alternativer EIA
Bindazyme
Anti-Gliadin IgA
PLATTENSCHEMA
+
-
+
33
2
-
0
42
Relative Sensitivität
100,0 %
Relative Spezifität
95,6 %
Relative Übereinstimmung
97,4 %
Insert Code: E035, Version: 28 March 2006, Page 8 of 13
CONTENU
Page No.
1
Indications
2
Présentation générale
3
Principe du test
4
Précautions
5
Echantillons
6
Matériel
7
Procédure
8
Résultats et contrôle de qualité
9
Valeur attendues
10
Performances
Instructions d’ utilisation
COFFRET ELISA BINDAZYME ANTI-GLIADINE
ANTI-GLIADINE IgG
MK035
ANTI-GLIADINE IgA
MK036
ANTI-GLIADINE IgG/IgA
MK037
Pour un usage en diagnostic in vitro uniquement
Produits fabriqués en Angleterre par la société :
The Binding Site, PO Box 11712, Birmingham, B14 4ZB, United Kingdom.
Distribués en France par la société :
The Binding Site, 14 rue des Glairaux, BP226, 38522 St Egrève Cedex
Téléphone : 04.38.02.19.19.
Fax : 04.38.02.19.20.
1
INDICATIONS
11
Bibliographie
Ces coffrets permettent de quantifier in vitro les autoanticorps IgG et/ou IgA
spécifiques dirigés contre la gliadine dans le sérum humain. Ils apportent une
aide au diagnostic et au traitement de la maladie coeliaque.
12
Plan de plaque
Au maximum, il est possible de quantifier 41 sérums en double avec 5 points
de calibration et 2 contrôles ou 89 échantillons en simple.
2
PRESENTATION GENERALE
La maladie coeliaque est caractérisée par une intolérance au gluten induisant
un désordre chronique de malabsorption. Les anticorps IgG et IgA dirigés
contre la gliadine (fraction soluble en éthanol du gluten de blé ou de seigle)
sont tous les deux présents chez des personnes atteintes de maladie
coeliaque non traitée 1,2,3.
La mesure des anticorps IgA antigliadine (AGA) est utilisée pour suivre
l’activité de la maladie et comme moyen de suivi du régime sans Gluten2. Les
IgG AGA semblent être des marqueurs plus sensibles mais moins spécifiques
de la maladie que les IgA AGA. Il est recommandé, cependant, que les deux
anticorps soient mesurés, en raison d’une fréquence élevée de déficit en IgA
parmi les patients coeliaques, car une insuffisance en IgA peut
sérologiquement masquer la maladie. Les patients déficients en IgA ont 10 fois
plus de risques d’avoir la maladie coeliaque que la population normale.
Cette maladie est associée à d’autres conditions cliniques où les symptomes
gastro-intestinaux sont absents comme le syndrome de Down, la déficience
IgA sélective5, l’ostéoporose6, les diabètes insulino-dépendants et d’autres
désordres autoimmuns7. Les patients avec une maladie coeliaque
symptomatique ont un taux plus élevé en IgA et IgG AGA que les patients
asymptomatiques8.
3
PRINCIPE DU TEST
Les micropuits sont recouverts de l’antigène gliadine. Les échantillons dilués,
les calibrateurs et les contrôles sont déposés dans les puits permettant ainsi la
liaison spécifique de l’anticorps à l’antigène fixé.Après avoir rincé les puits pour
éliminer toute trace de protéines non accrochées, un anti IgG humain ou un
anti IgA humain purifié par affinité et conjugué à la péroxydase est déposé. Au
cours de l’incubation, le conjugué enzymatique se lie aux IgG ou aux IgA ayant
reconnu la gliadine. L’excès de conjugué marqué non accroché est éliminé par
lavages. Le conjugué accroché est visualisé en utilisant du 3,3',5,5' tetraméthyl
benzidine (TMB). En présence de péroxydase, on obtient une coloration bleue
qui vire au jaune après l’ajout d’une solution d’arrêt. L’intensité de la couleur
produite dépend de la concentration dans l’échantillon d’IgG ou d’IgA
spécifiques de l’antigène.
4
PRECAUTIONS
4.1 AVERTISSEMENT
•
•
Tous les sérums des donneurs humains ont subi un dépistage négatif pour les
anticorps anti-VIH 1 et 2, les anticorps anti-VHC et l’Ag Hbs. Toutefois, ces
tests ne peuvent garantir l’absence totale d’agents infectieux. Tous les
échantillons doivent donc être manipulés comme des produits potentiellement
infectieux. Seul un personnel qualifié dans la manipulation d’échantillons
potentiellement infectieux est autorisé à utiliser ce kit.
L’azide de sodium peut réagir avec les tuyauteries en plomb ou cuivre pour
former des azides de metaux explosifs. Il est nécessaire d’ajouter de grands
volumes d’eau pour éviter la formation d’azides.
Insert Code: E035, Version: 28 March 2006, Page 9 of 13
•
Les tampons et sérums fournis dans ce coffret contiennent plusieurs inhibiteurs
d’enzymes listés ci-dessous. Les manipuler avec précaution.
INHIBITEURS
CONCENTRATION
Kathon
Azide de sodium
Proclin™ 300
Bromonitrodioxane
Methylisothiazone
0,02%
0,099%
0,045%
0,002%
0,002%
Proclin 300 est une marque déposée par la Rohm and Haas Corp. Philadelphie, PA.
•
•
•
4.2
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
4.3
•
•
•
5
•
•
•
•
6
Le kathon est un irritant et peut induire une sensibilisation en cas de
contact avec la peau.
La solution d'arrêt contient de l'acide phosphorique 3M qui est un irritant. Eviter
le contact avec la peau et les yeux.
Les éclaboussures de réactifs doivent être nettoyées en respectant la
réglementation locale et l’environnement.
PRECAUTIONS
Ce réactif doit être utilisé par un personnel formé.
Il est recommandé de suivre scrupuleusement le protocole. Toute déviation
peut affecter les performances et les résultats obtenus. Lire attentivement les
« Notes » et et les « Avertissements ».
Les calibrateurs, contrôles, conjugués et plaques ayant des numéros de lots
différents ne sont pas interchangeables. La substitution de certains réactifs
peut induire des résultats incorrects. Toutes les barrettes utiliées doivent être
issues du même sachet aluminium.
Afin d’éviter la contamination des réactifs, utiliser uniquement de nouveaux
récipients ou des récipients propres en verre ou en plastique. Ne jamais
remettre les réactifs non utilisés dans leur flacon d’origine.
Eviter de laisser les réactifs sans bouchon ; l’évaporation ou la contamination
des réactifs peut induire des résultats incorrects.
Le substrat TMB ne doit pas être exposé à la lumière ou mis en contact avec
de l’eau.
Les échantillons hémolysés, lipidiques, contaminés par des bactéries ou
contenant des particules de matières ne doivent pas être utilisés.
L’utilisation de pipettes calibrées et de contrôles qualité internes est
recommandée.
L’utilisation d’automates, de diluteurs et d’autres équipements automatiques
peut induire des différences de résultats par rapport à la technique manuelle. Il
est de la responsabilité de chaque laboratoire de valider complètement le
système et de s’assurer que les résultats soient conformes à la fiche technique
et au certifcat de contrôle de qualité.
Tous les équipements doivent être calibrés et doivent respecter les instructions
du fabricant.
STOCKAGE ET STABILITE
Le kit doit être stocké à 2-8°C et ne doit pas être congelé. Un stockage à des
températures non appropriées peut entraîner de faux résultats.
Le tampon de lavage dilué peut être stocké entre 2-8°C pendant un maximum
de 4 semaines et peut être utilisé directement à la sortie de frigo sans affecter
les résultats.
La date de péremption figure sur l’étiquette du kit.
ECHANTILLONS
Les échantillons doivent être prélevés par ponction veineuse et le sérum doit
être séparé après coagulation.
Les sérums peuvent être conservés à 2-8°C pendant 7 jours avant les tests9 ou
aliquotés et congelés à -20°C minimum pour une conservation plus longue.
Congélations et décongélations répétées altèrent les protéines.
Les sérums ne doivent pas être inactivés par la chaleur, ceci peut induire de
faux positifs.
REACTIFS
•
6.2.2 Kit Bindazyme antigliadine IgA (réf. MK036)
•
Gliadin IgA Calibrators (Calibrateurs gliadine IgA) : 5 flacons de 1 mL de
sérum humain prédilué dont les concentrations en anticorps IgA anti-gliadine
sont les suivantes : 100; 33; 11,1; 3,7; 1,23 U/mL; chacun étant prêt à l’emploi.
•
Gliadin IgA Positive Control (Contrôle positif gliadine IgA) : 1 flacon de 1mL
de sérum humain prédilué et prêt à l’emploi.
•
Gliadin Negative Control (Contrôle négatif gliadine) : 1 flacon de 1mL de
sérum humain prédilué et prêt à l’emploi.
•
Gliadin IgA Conjugate (Conjugué IgA) : 1flacon de12mL d’antisérum anti-IgA
humaines purifié par affinité et conjugué à la péroxydase. Il est prêt à l’emploi
et coloré en vert.
6.2.3 Combikit Bindazyme Antigliadine IgG/IgA (réf. MK037)
•
Gliadin IgG Calibrators (Calibrateurs gliadine IgG) : 5 flacons de 1mL de
sérum humain prédilué dont les concentrations en anticorps IgG anti-gliadine
sont les suivantes : 100; 33; 11,1; 3,7; 1,23 U/mL; chacun étant prêt à l’emploi.
•
Gliadin IgA Calibrators (Calibrateurs gliadine IgA) : 5 flacons de 1mL de
sérum humain prédilué dont les concentrations en anticorps IgA anti-gliadine
sont les suivantes : 100; 33; 11,1; 3,7; 1,23 U/mL; chacun étant prêt à l’emploi.
•
Gliadin IgG Positive Control (Contrôle positif gliadine IgG) : 1 flacon de 1mL
de sérum humain prédilué et prêt à l’emploi.
•
Gliadin IgA Positive Control (Contrôle positif gliadine IgA) : 1 flacon de 1mL
de sérum humain prédilué et prêt à l’emploi.
•
Gliadin Negative Control (Contrôle négatif gliadine) : 1 flacon de 1mL de
sérum humain prédilué et prêt à l’emploi.
•
Gliadin IgG Conjugate (Conjugué IgG) : 1flacon de12mL d’antisérum anti-IgG
humaines purifié par affinité et conjugué à la péroxydase. Il est prêt à l’emploi
et coloré en rouge.
•
Gliadin IgG Conjugate (Conjugué IgA) : 1 flacon de12mL d’antisérum anti-IgA
humaines purifié par affinité et conjugué à la péroxydase. Il est prêt à l’emploi
et coloré en vert.
6.3
•
•
•
•
•
•
7
•
•
•
•
Une fiche technique : donnant tous les détails de la technique.
Un certificat de contrôle qualité : indiquant les performances du lot.
Gliadin Coated Wells (Puits) : 12 barrettes de 8 puits sécables coatés avec la
gliadine. Chaque barrette est emballée dans un étui contenant un dessicateur.
Type III Sample Diluent (Diluant de l’échantillon) : 2 flacons de 50mL de
tampon prêt à l’emploi et coloré en jaune. Nécessaire à la dilution des
échantillons.
Type III Wash buffer (Tampon de lavage) : 1 flacon de 50mL de tampon
concentré 20 fois pour le lavage des puits.
TMB Substrate (Substrat TMB) : 1 flacon de 14mL de TMB prêt à l’emploi.
Stop Solution (Solution d’arrêt) : 1 flacon de 14mL d’acide phosphorique 3M
prêt à l’emploi.
6.2 MATERIEL FOURNI - spécifique de chaque kit
6.2.1 Kit Bindazyme Antigliadine IgG (réf. MK035)
•
Gliadin IgG Calibrators (Calibrateurs gliadine IgG) : 5 flacons de 1mL de
sérum humain prédilué dont les concentrations en anticorps IgG anti-gliadine
sont les suivantes : 100; 33; 11,1; 3,7; 1,23 U/mL; chacun étant prêt à l’emploi.
•
Gliadin IgG Positive Control (Contrôle positif gliadine IgG) : 1 flacon de 1mL
de sérum humain prédilué et prêt à l’emploi.
•
Gliadin Negative Control (Contrôle négatif gliadine) : 1 flacon de 1mL de
sérum humain prédilué et prêt à l’emploi.
MATERIEL NECESSAIRE ET NON FOURNI
Eau distillée ou eau désionisée : elle doit être de très bonne qualité.
Micropipettes : pour la distribution de volumes de 1000, 100 et 10µL.
Pipette multicanaux : pour la distribution de volumes de 100µL.
Laveur automatique de plaque : recommandé, cependant les lavages
manuels sont également possibles.
Lecteur de microplaques : capable de mesurer la densité optique à 450nm.
Tubes : pour la dilution des sérums.
PROCEDURE
7.1 ETAPES PRELABLES
1.
•
•
Ramener le kit à température ambiante
Ces kits sont opérationnels à une température comprise entre 20 et 24°C.
Avant utilisation, laisser le kit à température ambiante pendant environ 60
minutes. Ne pas retirer les barrettes de leur sachet aluminium durant cette
période. Attendre que les barrettes soient à température ambiante.
Note : Ce coffret peut être gardé une semaine à température ambiante sans
altérer ses performances.
2.
Composants
Les réactifs du coffret doivent être homogénéisés avant utilisation.
3.
Préparation du tampon lavage
Ajouter les 50mL de tampon concentre à 950mL d’eau distillée (dilution 1:20)
dans un flacon propre et mélanger.
Note : le tampon dilué peut être stocké à 2-8°C pendant 4 semaines. Il est
recommandé de ne diluer que la quantité nécessaire pour la manipulation. Si le
tampon montre des signes de contamination microbiennes ou devient trouble,
le jeter et en préparer de nouveau.
4.
Dilution des échantillons
Diluer 10µL de chaque échantillon avec 1000µL de diluant (dilution: 1:100) et
mélanger.
Note : les dilutions des échantillons doivent être utilisées dans les 8 heures
suivant leur préparation.
5.
Manipulation des barrettes
Sortir le nombre nécessaire de puits et les enfiler sur le cadre. A partir de la
position A1, remplir les colonnes de gauche à droite. Lors de la manipulation
du cadre, le maintenir dans le sens de la longueur afin d’empêcher les
barrettes de sortir de leur logement.
Note : les puits non utilisés doivent être replacés dans leurs étuis contenant un
dessicateur.
Attention : Fermer hermétiquement les étuis afin de minimiser
l’exposition à l’humidité qui peut induire une dégradation de l’antigène.
6.1 MATERIEL FOURNI- commun à tous les kits
•
•
•
Gliadin IgG Conjugate (Conjugué IgG) : 1 flacon de 12mL d’antisérum antiIgG humaines purifié par affinité et conjugué à la péroxydase. Il est prêt à
l’emploi et coloré en rouge.
7.2 PROCEDURE
1.
Dépôt de l’échantillon
Déposer 100µL de chaque calibrateur, contrôle et échantillon dilué (1:100)
dans les puits appropriés suivant le plan de plaque.
NOTE : Les échantillons doivent être déposés sur la plaque aussi rapidement
que possible afin de minimiser les écarts, le décompte du temps doit
commencer aprés l’addition du dernier échantillon.
Incuber pendant 30 minutes à température ambiante.
2.
Lavage de la plaque
La procédure de lavage est très importante et requiert une attention spéciale.
Une plaque mal lavée peut donner des résultats incorrects avec une précision
Insert Code: E035, Version: 28 March 2006, Page 10 of 13
faible et un bruit de fond important. Après incubation, laver trois fois les puits
avec 250 à 350µl de tampon de lavage en utilisant un laveur automatique ou
manuellement comme indiqué ci-dessous. Après le lavage final, renverser la
plaque et sécher les puits en tapant la plaque sur du papier absorbant.
•
9
Lavage de la plaque
(cf 2)
5.
Substrat TMB
Déposer 100µL de TMB dans chaque puits. Cette étape doit être effectuée
rapidement.
Note : Afin d’éviter les contaminations, ne jamais remettre l’excès de TMB
dans le flacon d’origine.
Incuber 30 minutes à température ambiante à l’obscurité.
6.
7.
8
1.
•
•
•
2.
3.
•
•
Arrêt de la réaction
Ajouter 100µL de solution d ‘arrêt dans chaque puits dans le même ordre que
pour le dépôt du substrat. Ceci induit un changement de couleur du bleu au
jaune.
Lecture
La densité optique (DO) de chaque puits doit être lue à 450nm à l’aide d’un
lecteur de plaque dans les 30 minutes suivant l’arrêt de la réaction.
CONTROLE QUALITE ET RESULTATS
Contrôle de qualité
Pour valider le test, tous les critères suivants doivent être respectés :
Les calibrateurs, le contrôle positif, le contrôle négatif doivent être inclus dans
chaque test.
Les valeurs obtenues pour tous les contrôles doivent être dans les gammes
spécifiées sur la fiche de contrôle qualité.
La forme de la courbe doit être similaire à celle fournie sur le certificat de
contrôle qualité.
Si les critères ci-dessus ne sont pas respectés, le test est invalide et doit
être répété.
Calcul des moyennes des densités optiques (pour les tests réalisés en
double uniquement)
Pour chaque calibrateur, contrôle et échantillon, calculer la DO moyenne. Le
pourcentage du coefficient de variation (% CV) pour chaque duplicata doit être
inférieur à 15%.
Courbe de calibration
La courbe de calibration peut être tracée de façon automatique ou manuelle en
plaçant les concentrations en gliadine sur l’échelle log et les DO sur l’échelle
linéaire.
Pour un tracé automatique, utiliser un logiciel approprié et validé qui permettra
le meilleur tracé.
Pour un tracé manuel, utiliser un papier log/linéaire pour tracer une courbe la
plus prodre des points possible (ne pas faire de point à point ou de lineaire).
4.
Traitement des points anormaux
Si seul un point n’est pas sur la courbe, il peut être supprimé. Si en l’absence
de ce point, la courbe a une forme différente de celle du certificat de contrôle
de qualité ou si plusieurs points ne sont pas sur la courbe, le test doit être
répété.
5.
Calcul des valeurs de contrôle
Lire la concentration en autoanticorps de chaque contrôle à partir de la courbe
de calibration. Les valeurs des contrôles doivent être comprises dans les
limites indiquées sur le certificat de contrôle qualité.
6.
Calcul des concentrations d’autoanticorps dans les échantillons dilués
Lire la concentration en autoanticorps des échantillons dilués directement à
partir de la courbe de calibration.
Note : Les valeurs des calibrateurs ont été ajustées par un facteur de 100 pour
tenir compte de la dilution de l’échantillon au 1:100. Aucune autre conversion
n’est requise.
7.
Calibration du test
Etant donné qu’aucune référence internationale n’est actuellement disponible,
le test est calibré en U/ mL contre un calibrateur arbitraire de référence.
Pour exprimer les résultats en mg/l, utiliser les facteurs de conversion
suivants :
1 U/mL IgG = 6mg/L
1 U/mL IgA = 3,5mg/L
8.
•
Limites
Ce coffret est utilisé pour aider au diagnostic uniquement. Un résultat positif
suggère certaines maladies qui doivent être confirmées par les données
cliniques et par d’autres tests sérologiques.
Les résultats obtenus ne sont pas une preuve diagnostique de la présence ou
•
Anti-Gliadine IgG
Conjugué
Déposer 100µL de conjugué par puits.
Note : Afin d’éviter les contaminations, ne jamais remettre l’excès de conjugué
dans le flacon d’origine.
Incuber à température ambiante pendant 30 minutes.
4.
VALEURS ATTENDUES
La valeur normale a été déterminée pour chaque test sur le sérum de 200
donneurs de sang sains (voir section 10.4). 3 ont été confirmés positifs en
anticorps anti-Gliadine IgA et 3 anticorps anti Gliadine IgG (section 10.4).
Ces valeurs sont fournies à titre indicatif. La technique ELISA est très sensible
et de faibles variations peuvent être détectées. Il est recommandé à chaque
laboratoire d’établir ses propres normes.
Les plaques peuvent être laver manuellement de la façon suivante:
a.
Vider le contenu de la plaque au dessus d’un évier,
b.
Sécher les puits en tapant la plaque sur du papier absorbant.
c.
Remplir chaque puits de 250-350µL de tampon de lavage à l’aide d’une
pipette multicanaux.
d.
Agiter la plaque sur une surface plane.
e.
Répéter a-d deux fois.
f.
Répéter a et b.
3.
de l’absence de maladies.
L’utilisation de ce test avec des échantillons pédiatriques n’a pas été établie.
Anti-Gliadine IgA
Résultat négatif
< 10 U/ mL
< 5 U/ mL
Résultat positif
> 10 U/ mL
> 5 U/ mL
Le pourcentage d’incidence des autoanticorps anti-gliadine est indiqué cidessous suivant le groupe de population (réf 10).
Anti-Gliadine IgG
Anti-Gliadine IgA
Contrôles normaux
13
4
Patients atteints de la
maladie coeliaque
19
5
Patients non traités
78
92
(29 hommes et 71 femmes de 14 à 79 ans non traités)
10
PERFORMANCES
10.1 PRECISION
PRECISION INTRA-ESSAI
La précision intra-essai a été mesurée en utilisant 6 échantillons testés dans
la gamme de la courbe de calibration. La concentration et le pourcentage du
coefficient de corrélation pour chaque échantillon sont donnés ci-dessous :
ANTI-GLIADINE IgG
n=20
Concentration (en U/mL)
Echantillon 1
2,43
% C.V.
6,35
Echantillon 2
9,25
4,79
Echantillon 3
10,04
4,91
Echantillon 4
24,31
3,44
Echantillon 5
30,37
2,80
Echantillon 6
58,42
5,47
n=20
Concentration (en U/mL)
Echantillon 1
4,26
4,54
Echantillon 2
5,53
4,61
Echantillon 3
15,45
5,80
Echantillon 4
29,28
1,51
Echantillon 5
41,08
3,91
Echantillon 6
61,23
3,77
ANTI-GLIADINE IgA
% C.V.
PRECISION INTER-ESSAI
La précision inter-essai a été mesurée en utilisant 6 échantillons en duplicats
6 fois pendant 3 jours. Le % du CV pour chaque échantillon est donnée cidessous :
ANTI-GLIADINE IgG
n=6
Concentration (en U/mL)
% C.V.
Echantillon 1
2,43
Echantillon 2
9,56
14,59
6,37
Echantillon 3
10,54
10,93
Echantillon 4
23,22
5,18
Echantillon 5
33,35
6,23
Echantillon 6
58,97
7,47
Insert Code: E035, Version: 28 March 2006, Page 11 of 13
Aucune interférence par ces substances n’a été observée sur les échantillons
testés.
ANTI-GLIADINE IgA
10.2
10.3
10.4
n=6
Concentration (en U/mL)
% C.V.
Echantillon 1
3,22
6,36
Echantillon 2
5,94
6,16
Echantillon 3
18,0
3,99
Echantillon 4
26,56
7,56
Echantillon 5
38,31
9,27
Echantillon 6
57,34
12,48
SENSIBILITE ANALYTIQUE
La sensibilité analytique de 1,23 U/mL a été déterminée en testant 2
échantillons par de multiple replicats avec des valeurs de 1,4 et 1,9 (Gliadine
IgA) et 1,5 et 2.0 (Gliadine IgG) fois la valeur du plus petit point de calibration
(1,23 U/mL). L’analyse statistique par le test de Student a confirmé que ces
échantillons étaient significativement différents l’un de l’autre (p<0,0001).
GAMME DE MESURE
Pour les coffrets, la gamme de mesure est la suivante : 1,23 à 100 U/mL..
VALEURS NORMALES
Les taux d’auto-anticorps IgA et IgG anti-gliadine ont été measures dans le
serum à partir de 200 donneurs de sang adultes. 1,5% (3/200) étaient positif en
auto-anticorps anti-gliadine IgA et IgG. Sur les échantillons IgA postifs, 2/3
étaient positifs avec des kits Elisa alternatifs alors que tous étaient positifs en
anti-gliadine IgG.
Anti-Gliadine IgG
Anti-Gliadine IgA
Nbre d’échantillons
200
200
Résultat moyen
1,95 U/ mL
1,31 U/ mL
Deviation Standard
2,19 U/ mL
4,57 U/ mL
Limite supérieure
10 U/ mL
5 U/ mL
10.7
LINEARITE DU TEST
3 échantillons ont été testés pour la linéarité contre la gamme de mesure. Le
coefficient de corrélation R2 était supérieur à 0,997 (gliadine IgA) et 0,992
(gliadine IgG) et en comparant l’actuel à celui attendu, le recoupement était
respectivement de 96% et 97%.
10.8
ETUDE DE L’EFFET DE PROZONE
3 échantillons positifs ont été dilués au 1:6,25 dans le diluent échantillons
(dilution normale au 1:100) pour vérifier un possible effet de prozone. Pour les
deux tests IgA et IgG, aucun faux négatif n’a été trouvé, ce qui prouve
l’absence de phénomène de prozone.
11
BIBLIOGRAPHIE
1.
Jerry S. Trier. Celiac Sprue. The New England Journal of Medicine 1991; 24:
1709-1719.
A Bürgin-Wolff et al. Antigliadin and antiendomysium antibody determination
for coeliac disease. Archives of Disease in Childhood 1991; 66: 941-947.
Grodzinsky E et al. Anti-endomysium and anti-gliadin antibodies as
serological markers for coeliac disease in childhood: a clinical study to
develop a practical routine. Acta Peadiatr 1995; 84: 294-298.
Chartrand L T et al. Effectiveness of antigliadin antibodies as a screening test
for coeliac disease in children. Canadian Med Assoc J. 1997; 157 (5): 527 553.
Collin P et al. Selective IgA deficiency and coeliac disease in children. Scand
J Gastroenterol. 1997; 27: 367 – 371.
E Lindh et al. Screening for antibodies against gliadin in patients with
osteoporosis. Journal of Internal Medicine 1992; 231: 403-406.
Cornelius C Cronin, Fergus Shanahan. Insulin-dependent diabetes mellitus
and coeliac disease. The Lancet. 1997; 349: 1096-1097.
Grodzinsky E et al. High prevalence of celiac disease in healthy adults
revealed by antigliadin antibodies. Annals of Allergy. 1992; 69: 66 - 70.
Protein Reference Unit Handbook of Autoimmunity (3rd Edition) 2004 Ed E
MILFORD, Ward J.SHELDON, GD Wild. Publ. PRU Publications, Sheffield.
14.
Sategna-Guidetti C et al. Comparison of Serum Anti Gliadin, AntiEndomysium and Anti-Jejunum Antibodies in Adult Celiac Sprue. J Clin
Gastroenterol 1995; 20 (1): 17-21.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
En plus, 52 autres échantillons positifs autoimmuns contenant des autoanticorps contre: ADN double brin, thyroglobuline, microsomes thyroïdien,
cardiolipides, ENA, et antigène anti-neutrophile cytoplasmique ont été testés
en Elisa. Tous ont été trouvés négatifs pour les auto-anticoprs anti-gliadine IgG
et IgA.
40 échantillons de patients ayant la maladie de Crohn pour 21 d’entres eux ou
une colite ulcérente pour les 19 autres ont aussi été testés. Les 3 échantillons
gliadine IgG ont été trouvés positifs par des Elisa alternatifs et 2/3 gliadine IgA.
12
PLAN DE PLAQUE
Veuillez regarder au dos de la fiche technique.
Résumé de la procédure
10.5 SPECIFICITE, SENSIBILITE ET CORRELATION RELATIVES
1.
La spécificité, sensibilité et correlation relatives ont été determinées avec un kit
Elisa alternatif IgG et IgA anti-Gliadine en utilisant respectivement 71 et 77
échantillons tests.
Ajouter 100µL de chaque calibrateur, contrôle et échantillon dilué au
1/100 aux puits appropriés.
Incuber pendant 30 minutes. Laver.
2.
Ajouter 100µL de conjugué à chaque puits.
Incuber pendant 30 minutes. Laver.
3.
Ajouter 100µL de substrat à chaque puits.
Incuber pendant 30 minutes.
4.
Ajouter 100µL de solution d’arrêt à chaque puits.
Mesurer l’absorbance à 450nm.
Autre coffret
KIT BINDAZYME
Anti gliadine IgG
+
-
+
31
2
-
11
27
Sensibilité relative
73,8%
Spécificité relative
93,1%
Corrélation relative
81,7%
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P.O. Box 11712, Birmingham
B14 4ZB England
* Positif avec un second kit Elisa alternatif.
**10/11 échantillons négatifs avec un second kit Elisa alternatif.
Autre coffret
KIT BINDAZYME
Anti gliadine IgA
10.6
+
-
+
33
2
-
0
42
Sensibilité relative
100,0%
Spécificité relative
95,6%
Corrélation relative
97,4%
SUBSTANCES INTERFERANTES
Une gamme de mesure de substances interférentes a été établie à partir des
échantillons anti-gliadine IgG et IgA. La méthode utilisée pour vérifier ces
substances est la Check A PlusTM – Kokusai, Japon.
Sustances
Concentration
Bilirubine F (libre)
19.3mg/dL
Bilirubine C (conjuguée)
19.9mg/dL
Hémoglobine hémolysée
485mg/dL
Chyle
1550 unités
Facteur rhumatoïde
45 UI/mL
Insert Code: E035, Version: 28 March 2006, Page 12 of 13
Plate Template
Plattenschema
Plan de plaque
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
A
B
C
D
E
F
G
H
Insert Code: E035, Version: 28 March 2006, Page 13 of 13