7 Anlagen 7.1 Material 7.1.1 Zellgewinnung PBS

7 Anlagen 7.1 Material 7.1.1 Zellgewinnung PBS

7
Anlagen
7.1
Material
7.1.1
Zellgewinnung
PBS-Dulbecco, Ca++/ Mg ++, SEROMED, BIOCHROM KG (Ch.-Nr. 593U)
Percoll (Dichte: 1,077 g/cm3) SEROMED, BIOCHROM KG (Ch.-Nr. 152U)
7.1.2
Zellanzahlbestimmung
Trypan Blue (0,5 %), SEROMED, BIOCHROM KG (Ch.-Nr. 444U)
7.1.3
Bestrahlung
Kupferfilter (0,5 mm), PHILIPS
Tubus (15x20x40 cm), PHILIPS
Piacryl-Platten (20x30x0,5 cm), WERKSTATT STRAHLENTHERAPIE,
eine Piacryl-Platte enthält Aussparungen für 5 Objektträger
7.1.4
Comet Assay
a) PBS-Lösung
PBS (Phosphate Buffered Saline) Dulbecco’s, Ca++/Mg++-frei, GIBCO BRL (Ch.-Nr.
3011070 und 3027714)
b) RPMI-Lösung
RPMI 1640 mit 25mM Hepes und L-Glutamin, BIOWHITTAKER EUROPE
(Ch.-Nr. 9MB0058)
c) Agarosen
1 g Agarose (1 %), GIBCO BRL, (Ch.-Nr. 66G1371 und 65G1359) ad 100 ml PBS
0,6 g Agarose (0,6 %), GIBCO BRL, (Ch.-Nr. 66G1371 und 65G1359) ad 100 ml PBS
0,5 g Low-Melting-Point(LMP)-Agarose (0,5 %), GIBCO BRL, (Ch.-Nr. 97D1664) ad 100
ml PBS-Lösung (ohne Reparatur) bzw. mit 10 ml Fetales Kälberserum (FKS) ad 100 ml
RPMI-Lösung (mit Reparatur)
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d) Reparaturmedium
15 ml FKS, C.C.PRO (Ch.-Nr. H367) ad 100 ml RPMI-Lösung
e) EDTA-Lösung
14,89 g EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid; Disodium Salt: Dihydrate), SIGMA (Ch.Nr. 87H0089 und 29H001715) ad 200ml Aqua dest.
f) 10M Natriumhydroxid-Lösung
400 g Natriumhydroxid Plätzchen, MERCK (Ch.-Nr. B210798814) ad 1000 ml Aqua dest.
g) Lysis-Lösung
Die Lysis-Stammlösung wurde monatlich erneuert und die daraus bereitete LysisGebrauchslösung jeweils frisch hergestellt.
h) Lysis-Stammlösung
146,1 g Natriumchlorid, MERCK (Ch.-Nr. K26646404 928 und K26811304 952)
37,2 g EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid; Disodium Salt: Dihydrate), SIGMA (Ch.-Nr.
87H0089 und 29H001715)
1,2 g Tris(hydroxymethyl)-aminomethan, MERCK (Ch.-Nr. K26037782 919 und
K26836782 942)
7,5 g Natriumhydroxid Plätzchen, MERCK (Ch.-Nr. B210798814)
ad 890 ml Aqua dest.
Nach Auflösung der Substanzen in Aqua dest. wurde mit 10M Natriumhydroxidlösung
(NaOH) der pH-Wert 10 eingestellt. Anschließend erfolgte die Zugabe von NatriumLaurylsarcosinat (N-Laurylsarcosine).
10 g Natrium-Laurylsarcosinat(N-Laurylsarcosine), SIGMA (Ch.-Nr. 38H0149)
i) Lysis-Gebrauchslösung
2,5 ml Triton X-100, SIGMA (Ch.-Nr. 28H2536)
25 ml Dimethylsulfoxid (DMSO), MERCK (Ch.-Nr. K26174152923)
ad 250 ml Lysis-Stammlösung
Die Lysis-Gebrauchslösung wurde auf drei Küvetten portioniert und auf 4-8 °C im
Kühlschrank temperiert.
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j) Elektrophorese-Lösung
58 ml 10M Natriumhydroxidlösung (NaOH)
10ml EDTA-Lösung
ad 2000ml Aqua dest.
Der pH-Wert der Elektrophorese-Lösung betrug 13,3.
k) Neutralisations-Lösung
48,5 g Tris(hydroxymethyl)-aminomethan, MERCK (Ch.Nr. K26037782 919 und
K26836782 942)
Mit 1M Salzsäure wurde der pH-Wert von 7,5 eingestellt:
49 ml Titrisol Salzsäure(1M HCl), MERCK (Ch.Nr. 70266970 und 80289926)
ad 1000ml Aqua dest.
l) Fluoreszenzfarbstoff-Lösung
20 µl Ethidiumbromid (Ethidium Bromide), SIGMA (Ch.Nr. 55H6772)
ad 10ml Aqua dest.
m) Amifostin
5 mg oder 10 mg Ethyol (Amifostin), ESSEX PHARMA (Ch.Nr. 97K0917K), steril
portioniert von der Universitätsapotheke Halle
n) Alkalische Phosphatase
Alkaline Phosphatase (pH 7,6); 0,1ml entsprechen 2000 Units, 1 Unit hydrolisiert 1
µmol/min bei pH 9,8 und 37 °C, SIGMA (Ch.Nr. 115H7060)
o) pH-Messung
Technischer Einheitspuffer (TEP) pH 7 bei 25 °C, WTW WEILHEIM (Ch.Nr. 05.02-8)
Technischer Einheitspuffer (TEP) pH 10 bei 25 °C, WTW WEILHEIM (Ch.Nr. 02.01-2)
Kaliumchlorid-Lösung (3M KCl), MERCK (Ch.Nr. 60195718)
p) Computergestützte Auswertung
Komet 3.1, KINETIC IMAGING
SPSS 10.0 für Windows, SPSS INC.
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7.1.5
Verbrauchsmaterial
Deckgläschen, 24x60 mm, MENZEL,
EDTA-Monovette (5 ml), SARSTEDT,
Färbeküvetten, KARTELL,
Gewebekulturröhrchen Zellstar (10 ml), GREINER LABORTECHNIK, steril,
Objektträger (fully frosted slides) 3”x1”, 1,2 mm dick, LABCRAFT, BRAND,
Quecksilberdampf-Kurzbogenlampe HBO 50, OSRAM,
Röhrchen (1 und 2 ml), EPPENDORF,
Röhrchen (15 ml), CORNING,
Sixwells, HERAEUS,
Zellkulturflaschen (50 ml), NALGE NUNC INTERNATIONAL, steril, gewinkelt,
Zitrat-Monovette (5 ml), SARSTEDT,
7.2
Geräte
Brutschrank IG 150, JOUAN,
Brutschrank, MEMMERT,
Computer (133 MHz, 8MB), AMD mit 2 Monitoren 4v/ADI, MICROSCAN,
Eis- und Kühlschrankkombination DKK 172, FORON,
Elektrophoresegerät Phero-Stab 550, BIOTEC FISCHER,
Elektrophoresekammer, BIOTEC FISCHER,
Auflichtfluoreszensmikroskop Axioskop, ZEISS (JENA),
Mikroskop-Kamera MC80, ZEISS (JENA),
Hämatologie-System Sysmex K1000, DIGITANA,
Heizplatte, ROMMELSBACHER,
Laminarbox TC 72, GELAIRE FLOW LABORATORIES,
Mikroskop, ZEISS (JENA), mit Lichtquelle Typ 515A/y von PGH RUNDFUNKFERNSEHEN,
Präparatekammer, WERKSTATT STRAHLENTHERAPIE,
Röntgentiefentherapieanlage RT 250, PHILIPS,
Temperiertes Wasserbad, Typ 1083, GFL,
Zentrifuge Universal 16R Typ 1602, HETTICH
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