Quantitative Dünnschichtchromatographie Densitometrie

Einleitung
Quantitative
Dünnschichtchromatographie
Bislang fand die quantitative DC im Vergleich zur qualitativen
DC nur wenig Anwendung als Untersuchungsverfahren.
Die Arzneibücher nennen bis 1999 nur die halbquantitative
Grenzwertbestimmung, bei der Fleckengröße und Farbintensität
verglichen werden.
Densitometrie
Referenten: Anika Peusquens, Franz Thomas Rothausen
Seid 1999 wird die quantitative Direktbestimmung von DCPlatten ebenfalls beschrieben. Diese wurde aufgrund der
Entwicklung entsprechender Messgeräte möglich.
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Methode
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Probenauftragung
Verwendete DC-Platten
Grundvoraussetzung für eine genaue Messung sind die exakte
Positionierung des Startpunktes und das präzise
Auftragevolumen.
Die Probenauftragung kann auf zwei verschiedene Weisen
erfolgen:
Bei der quantitativen DC müssen HPTLC-Platten eingesetzt
werden.
Die Vorteile der HPTLC-Platten im Vergleich zu den
konventionellen Platten liegen in der
• gleichmäßigeren Beschichtung (0,1mm anstatt 0,2-1mm)
→ Minimierung des Untergrundsignals
• geringen Korngröße (5-7µm) , kleines Porenvolumen
→ optimale Trennstrecke 5cm (konvention. DC 6-17cm)
• höheren Trennleistung
→ deutlich geringere Substanzmengen erforderlich
(HPTLC: pg – ng ; konv. DC: µg)
Kontaktauftragung
Aufsprühtechnik
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Kontaktverfahren
Aufsprühverfahren
Mit Hilfe spezieller Geräte kann die Substanzlösung auf die DC-Platte aufgesprüht werden.
• Auftragung mit Hilfe von Glas- oder Platin/Iridium
Festvolumenkapillaren oder Mikroliterspritzen
Vorteile:
• geringer Zeitbedarf
• einfaches Verfahren
Nachteile:
Vorteile:
• Zirkular-Chromatographie an der Auftragestelle →
ungleichmäßige Verteilung der Probenkomponenten → breite
und unsymmetrische Flecken
• Proben können als schmale Striche aufgesprüht werden →
homogene Verteilung der Substanz über die gesamte
Länge der Auftragezone → verbesserte Auflösung und
Nachweisgrenze
• Vermeidung jeglicher Chromatographie während der
Probenauftragung
– Verbesserte Auflösung durch den Einsatz von
Konzentrierungszonen
Exaktes Auftragen wird durch Positioniergeräte ermöglicht.
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Messgeräte und Messprinzip
Entwicklung der DC-Platten
DC-Scanner/Densitometer
Üblicherweise werden DC-Platten in Glaströgen entwickelt.
Für HPTLC-Platten gibt es gesondert noch die Möglichkeit der
Entwicklung in Linearkammern.
Das seit längerem gebräuchlichste Messverfahren ist die Densitometrie. Densitometer sind Dichtemessgeräte und bestehten im
wesentlichem aus einem Photometer und einem motorbetrieben
Messtisch, der die DC-Platte durch den Lichtstrahl bewegt.
Vorteile der Linearkammer :
• Trennung der doppelten Probenzahl auf einer Platte möglich
• Ausbildung einer geraden Fließmittelfront in der Mitte bedingt
durch gegenüberliegende Entwicklungsseiten →
instrumentelle Auswertung
• Bessere Kontrolle der Dampfphase aufgrund geringeren
Volumens
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Bei der quantitativen DC
werden ausschließlich
Auflicht-Densitometer
verwendet.
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Messprinzip
• Photometer sendet monochromatisches
Licht in bestimmten Winkel auf DC-Platte
• DC-Platte wird durch Lichtstrahl bewegt (in Laufrichtung des Fließmittels)
• Substanzfreie DC-Platte reflektiert
Großteil der Lichtenergie
• Empfänger misst Remission (diffuse,
nicht gerichtete Reflexion)
• Remissionminderung durch Lichtabsorption → Chromophor (Teil eines
Moleküls der sichtbares bzw. UV-Licht
absorbiert)
• remitiertes Licht wird von Empfänger
gemessen und von Schreiber in ein
Diagramm umgesetzt (RemissionsgradOrtskurve)
Remissionsgrad-Ortskurve
Zeigt die Remissionsminderung in Abhängigkeit von einer
bestimmten Wellenlänge.
Maximum der Kurve → starke Remissionsminderung →
schwache Remission von Licht → starke Absorption von Licht
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Auswertung
Ermittlung der optimalen Messwellenlänge
Kalibrierkurve
Um die optimale Messwellenlänge festzulegen muss zunächst ein
Remissionspektrum der zu untersuchenden Probe aufgenommen
werden.
Praktische Durchführung:
• Probenauftragung und Entwicklung der DC-Platte
• Messung des Remissionsminimums bei unterschiedlichen
Wellenlängen
• Auftragung der Remissionminderung
gegen die Wellenlänge → Maximum
dieses Spektrums ist optimale
Messwellenlänge (bei Störungen kann
andere Wellenlänge versucht werden)
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Zur quantitativen Auswertung
benötigt man Kalibrierkurven.
Kalibrierung erfolgt auf der
selben DC-Platte auf der auch
die Analyse durchgeführt wird.
Die Auswertung erfolgt durch
Ermittlung der Höhe des entsprechenden Peaks im Chromatogramm und Ablesen der
dazugehörigen Substanzmenge
in der Kalibrierkurve.
Zum Erstellen der Kurve
werden die Peakhöhen gegen
die verwendeten Substanzmengen aufgetragen.
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Anwendung
In der Pharmazie:
• Qualitätskontrolle (z.B. Gehalt bei Tabletten)
• Identitäts- und Reinheitsprüfungen
Die Densitometrie ist aufgrund der weitgehenden
Automatisierung, dem sehr hohen Probendurchsatz
innerhalb kürzester Zeit und der hohen Messempfindlichkeit
ein leistungsfähiges Analyseverfahren, dass in der Zukunft
sicher auch im Arzneibuch mehr Verwendung finden wird.
Weitere Anwendungsgebiete:
• Nachweis von Pestiziden in Lebensmitteln
• Rückstands-Analytik bei Gewässern
• Drogenscreening
• Dopingnachweise
• In der Forensik (z.B. Untersuchung von Vergiftungsfällen,
Nachweis von Dokumentenfälschungen)
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