vts_9934_15150 - OPARU

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Klinik für Innere Medizin III
Universität Ulm
Zentrum für Innere Medizin
(Hämatologie, Onkologie, Rheumatologie, Infektionskrankheiten)
Ärztlicher Direktor: Prof. Dr. med. Hartmut Döhner
Inzidenz und prognostische Bedeutung von GATA2-Mutationen
bei der akuten myeloischen Leukämie mit CEBPA-Mutation
Dissertation zur
Erlangung des Doktorgrades der Medizin
der
Medizinischen Fakultät
der
Universität Ulm
Frauke Theis
aus 54550 Daun
Ulm 2014
Amtierender Dekan: Prof. Dr. Thomas Wirth
1. Berichterstatter: Prof. Dr. Konstanze Döhner
2. Berichterstatter: Prof. Dr. Wolfgang Kratzer
Tag der Promotion: 17.12.2015
Inhaltsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis
III-V
1
Einleitung
1
1.1
Allgemeine Aspekte zur AML
1
1.2
Klinische Charakteristika und Diagnostik
1
1.3
Klassifikationsmodelle der AML
2
1.4
Zytogenetische und molekulargenetische Aberrationen
4
1.5
Erklärungsmodelle zur Leukämogenese
6
1.6
Inzidenz und prognostische Bedeutung der häufigsten
rekurrenten molekulargenetischen Veränderungen bei der AML
8
1.7
Somatische Mutationen in CEBPA bei AML-Patienten
11
1.8
Prognostische Bedeutung von CEBPA-Mutationen bei der AML
14
1.9
Keimbahnmutationen in CEBPA, Prädisposition zur Entwicklung einer AML
16
1.10
Polymorphismen in CEBPA
17
1.11
GATA2
17
1.12
Interaktion zwischen GATA2 und C/EBPα
19
1.13
Genexpression von GATA2
19
1.14
Somatische Mutationen in GATA2 und deren möglicher Einfluss
auf die Prognose
20
1.15
Vorkommen von GATA2-Mutationen in Verbindung mit Syndromen
23
1.16
GATA2-Mutationen bei familiären MDS/AML
24
1.17
Zielsetzung
25
2
Patientenkollektiv, Material und Methoden
26
2.1
Patientenkollektiv mit CEBPA-Mutation
28
2.2
Patientenkollektiv mit definierten zytogenetischen Aberrationen
30
2.3
Vergleichskollektiv
30
2.4
Materialherstellung
30
2.5
Methoden
32
2.5.1
Übersicht der angewandten Methoden
32
2.5.2
Materialgewinnung
32
2.5.3
DNA-Extraktion
34
2.5.4
Produktkontrolle mittels Gelektrophorese (Herstellung siehe Kapitel 2.4)
36
2.5.5
Konzentrationsbestimmung am NanoDrop
37
I
2.5.6.
Polymerase Kettenreaktion/Chain Reaction (PCR)
39
2.5.7
Aufreinigung zur Cycle Sequencing Reaction (CSR)
45
2.5.8
Cycle Sequencing Reaction (CSR) und Sequenzierung nach Sanger
47
2.5.9.
DNASTAR, eine Software zur DNA-Sequenzanalyse
53
2.5.10
Statistische Auswertungen
54
3
Ergebnisse
55
3.1
Inzidenz von GATA2-Mutationen
55
3.2
Verteilung der GATA2-Mutationen nach Exon
56
3.3
Mutationen der Hotspot-Region
56
3.4
Mutationen in GATA2 in Abhängigkeit des Karyotyp der Patienten
57
3.5
Charakterisierung der Mutationen in GATA2
59
3.6
Inzidenz der GATA2-Mutationen in Abhängigkeit der
verschiedenen Studien AMLHD93, AMLHD98A, AMLHD98B,
AMLSG 06-04, AMLSG 07-04, AMLSG 12-09
63
3.7
Gesamtkohorte
68
3.8
Subgruppenanalyse – CEBPAsm-mutierte Patienten (n = 89)
79
3.9
Subgruppenanalyse – CEBPAbi-mutierte Patienten (n = 113)
86
3.10-13
Weitere Subgruppenanalysen
93
4
Diskussion
105
4.1
Mutationsfrequenz von GATA2 innerhalb der CEBPA-mutierten AML
105
4.2
Lokalisation der Mutationen und mögliche Konsequenzen
für die GATA2-Funktion
106
4.3
Klinische Charakteristika
109
4.4
Mutationen in GATA2 und Korrelation mit dem Auftreten
zusätzlicher Mutationen
4.5
4.6
110
Mutationen in GATA2 und klinischer Verlauf
Unterschiede und Gemeinsamkeiten zwischen CEBPA
111
mut
mut
/GATA2
-AML
und GATA2-Mutationen bei vererbbaren Syndromen
113
4.7
Zusammenfassung und Ausblick
115
5
Zusammenfassung
117
6
Literaturverzeichnis
119
7
Anhang
134
8
Danksagung
150
II
Abkürzungsverzeichnis
A, … Y
Verzeichnis der Aminosäure- und Nukleinbasen-Symbole:
siehe Anhang
AML
Akute myeloische Leukämie
APL
Akute Promyelozytenleukämie
Aqua dest.
Destilliertes Wasser
AS
Aminosäure
ATRA
All-trans retinoic acid
bZIP Domäne
basic-leucine zipper Domäne
CALGB
Cancer and Leukemia Group B
C/EBPα
CCAAT/enhancer binding protein alpha
CEBPA
CCAAT/enhancer binding protein alpha gene
CIR
Cumulative incidence of relapse
CML
Chronische myeloische Leukämie
CMPs
allgemeine myeloische Vorläuferzellen
CN-AML
cytogenetically normal AML/zytogenetisch normale AML
CR
complete remission/komplette Remission
CSR
Cycle Sequencing Reaction
C-terminal
in Richtung Carboxy-Terminus des Proteins
del(x)
Deletion (Chromosomenabschnitt x)
ddNTP
Didesoxyribonukleosidtriphosphat
DEPC Wasser
Diethylpyrocarbonat-Wasser
DNA
Desoxyribonucleic acid/Desoxyribonukleinsäure
DNAse
Desoxyribonuklease
DNMT3A
DNA (cytosine-5)-methyltransferase 3A
dNTP
Desoxynukleosidtriphosphat
ECOG
Eastern Cooperative Oncology Group
E. coli
Escherichia coli
ED
early deaths, Frühtodesfälle
EDTA
Ethylendiamintetraacetat/Ethylendiamintetraessigsäure
EFS
event-free survival/ Ereignisfreies Überleben
FAB Klassifikation
French-American-British Klassifikation
FLT3-ITD
fms-like tyrosine kinase-3 interne Tandemduplikation
FLT3-TKD
fms-like tyrosine kinase-3 Tyrosinkinasedomäne
III
GMPs
Granulozyten/Makrophagen Vorläuferzellen
HAM
Hochdosis-Cytarabin, Mitoxantron (Therapie)
HLA
das Humane Leukozytenantigen-System
IC
Idarubicin, Cytarabin (Therapie)
ICE
Idarubicin, Cytarabin, Etoposid (Therapie)
IE
Idarubicin, Etoposid (Therapie)
inv(16)
Inversion (16)
Kb
Kilobase
KCl
Kaliumchlorid
kDa
Kilodalton (atomare Masseneinheit)
KM
Knochenmark
KMP
Knochenmarkpunktion
MDS
Myelodysplastisches Syndrom
MLL
Mixed lineage leukemia
MPN
Myeloproliferatives Syndrom
NPM1
Nucleophosmin 1
NTC
Non-template control
N-Terminal
In Richtung Amino-Terminus des Proteins
OS
overall survival/Gesamtüberleben
PB
Peripheres Blut
PCR
Polymerase chain reaction/Polymerasekettenreaktion
Primer F
Primer Forward/Vorwärts Primer
Primer R
Primer Reward/Rückwärts Primer
Ras
Rat sarcoma, Proto-Onkogen, zentraler Bestandteil vieler
Signaltransduktionswege
RFS
Relapse free survival/Rezidiv-freies Überleben
RNA
Ribonucleic acid/Ribonukleinsäure
RNAse
Ribonuklease
RR
risk of relapse/Rezidivrisiko
RUNX1
runt-related transcription factor 1
SWOG
Southwest Oncology Group
t(8;21)
Translokation (8;21)
t(15;17)
t(9;11)
IV
t(x;y)
Translokation (Chromosom x → y)
TAD
Transaktivierungsdomäne
TE-Puffer
Tris-EDTA Puffer
Tris
Tris(hydroxymethyl)-aminomethan
UV
ultraviolett
WBC
White blood cell count/Leukozytenzahl
WHO
World Health Organization/Weltgesundheitsorganisation
WT
Wildtyp
-X
Monosomie Chromosom X
+X
Trisomie Chromosom X
ZF
Zinkfinger
ZNS
Zentrales Nervensystem
V
1
Einleitung
1.1
Allgemeine Aspekte zur AML
Bei der akuten myeloischen Leukämie (AML) handelt es sich um eine genetisch
heterogene, klonale Erkrankung (Döhner K. und Döhner H. 2008), die durch eine
Häufung von erworbenen, somatischen Mutationen der hämatopoetischen
Vorläuferzellen gekennzeichnet ist. Hierdurch werden die normalen Zellfunktionen
wie Selbsterneuerung, Proliferation und Differenzierung verändert (Fröhling S. et
al. 2005). Primär fällt im Knochenmark (KM) eine gesteigerte, linksverschobene
Myelopoese mit einem Differenzierungsstopp der unreifen Blasten auf. Häufig
resultiert dies in einer insuffizienten Hämatopoese (Granulozytopenie, Anämie
sowie Thrombozytopenie) mit oder ohne Leukozytose (Löwenberg B. et al. 1999).
Aussagen zu Inzidenz und Prävalenz in Deutschland belaufen sich auf
Schätzwerte, da bislang kein zentrales Register für die Erfassung von LeukämieErkrankungen beim Erwachsenen existiert. Pro Jahr erkranken ca. 3-4 (3,7)
Menschen pro 100 000 Einwohner an einer AML (Quelle: Deutsche Gesellschaft
für Hämatologie und Onkologie/DGHO). Die Inzidenz steigt mit dem Alter weiter
an und kann für spezifische Altersgruppen (>70 Jahre) Zahlen von 100
Neuerkrankungen pro 100 000 Einwohner/Jahr erreichen. Die AML macht ca. 80%
der Leukämien im Erwachsenenalter aus.
1.2
Klinische Charakteristika und Diagnostik
Typischerweise präsentieren Patienten mit AML eine ganze Reihe verschiedenster
Symptome. Besonders typisch sind Symptome aufgrund der funktionsuntüchtigen
Hämatopoese: erhöhte Infektneigung mit/ohne Fieber aufgrund einer Granulozytopenie, Hämorrhagie aufgrund einer Thrombozytopenie, Abgeschlagenheit bis
hin zur Dyspnoe aufgrund einer Anämie. Hinzu kommen Allgemeinsymptome wie
Gewichtsverlust und Leistungsminderung sowie bei Infiltration extramedullärer
Strukturen, wie z.B. Leber, Milz, Haut, Lymphknoten, Mundschleimhaut und
zentrales Nervensystem (ZNS), eine ganze Reihe weiterer Symptome. Eine
ausgeprägte
Leukozytose
kann
zu
Symptomen
einer
Leukostase
mit
Mikrozirkulationsstörung, insbesondere in Lunge und ZNS führen (Löwenberg et
al. 1999). Nach den Guidelines der Weltgesundheitsorganisation (World Health
-1-
Organization, WHO) wird die Diagnose einer AML anhand folgender Kriterien
gestellt: Nachweis von 20% oder mehr Blasten im peripheren Blut (PB) oder
Knochenmark. Bei Vorliegen einer AML mit Translokation (8;21), t(15;17) und
Inversion(16) ist der Nachweis der genetischen Veränderung zur Diagnosestellung
ausreichend
und
somit
unabhängig
vom
Blastengehalt.
Mithilfe
der
Durchflusszytometrie erfolgt die Linienzuordnung und der Nachweis einer
aberranten Antigenexpression. Als Goldstandard in der AML-Diagnostik hat sich
die zytogenetische Untersuchung zur Karyotyp-Bestimmung etabliert. Diese kann
durch
molekulargenetische
Analysen
zum
Nachweis
AML-assoziierter
Genaberrationen verfeinert werden.
1.3
Klassifikationsmodelle der AML
Vor der Etablierung molekulargenetischer und zytogenetischer Methoden zum
Nachweis genetischer Aberrationen in der AML-Routinediagnostik war seit 1976
die vor allen Dingen zytomorphologisch und immunhistochemisch basierte
Klassifikation der French-American-British (FAB) Group gängig. Mit weiterem
Fortschritt in der zytogenetischen sowie molekulargenetischen Diagnostik haben
diese neuen Erkenntnisse die „alte“ FAB-Klassifikation zunehmend verdrängt.
Einige der molekulargenetischen Subtypen lassen sich jedoch mit spezifischen
FAB-Subtypen korrelieren. Zum Beispiel ist der FAB-Subtyp M4eo (Akute
myelomonozytäre Leukämie mit atypischen Eosinophilen) in ca. 80% der Fälle mit
einer inv(16) assoziiert (Löwenberg B. et al. 1999). Im Jahr 2008 veröffentlichte
die WHO die vierte Fassung der Classification of Tumors of the Hematopoietic and
Lymphoid Tissues. Mit dieser Überarbeitung wurde den neuen Erkenntnissen aus
klinischen und experimentellen Studien seit dem Jahre 2001 Rechnung getragen.
Die im Hinblick auf diese Arbeit entscheidende Änderung ergab sich in der
Kategorie „AML mit rekurrenten genetischen Veränderungen“. Hier wurde die AML
mit mutiertem CEBPA-Gen (CCAAT/enhancer binding protein alpha Gen) und die
AML mit mutiertem NPM1-Gen (Nucleophosmin 1 Gen) als provisorische eigene
Entität in die Klassifikation mit aufgenommen. Seit 2008 empfiehlt die WHO ein
routinemäßiges Mutationsscreening der Gene NPM1, CEBPA, und FLT3-ITD
(Vardiman J. W. et al. 2009).
-2-
Tab.1:
Auszug aus der WHO-Klassifikation der myeloischen Neoplasien und
Leukämien 2008. (AML = akute myeloische Leukämie; APL = akute
Promyelozytenleukämie; t(8;21) / (16;16) / (15;17) / (9;11) / (6;9) / (3;3) / (1;22)
/ (9;22) = Translokation (8;21) / (16;16) / (15;17) / (9;11) / (6;9) / (3;3) / (1;22) /
(9;22); inv(16) = Inversion 16; inv(3) = Inversion 3; WHO =
Weltgesundheitsorganisation; RUNX1 = runt-related transcription factor 1;
RUNX1T1 = runt-related transcription factor 1, translocated to 1; CBFB = corebinding factor beta; MYH11 = myosin heavy chain 11; PML =
Promyelozytenleukämie; RARA = retinoic acid receptor alpha; MLLT3 =
myeloid/lymphoid or mixed lineage leukemia, translocated to 3; MLL = mixed
lineage leukemia; DEK = DEK oncogene; NUP214 = nucleoporin 214kDa;
RPN1 = ribophorin 1; EVI1 = ecotropic virus integration site 1; RBM15 = RNA
binding motif protein 15; MKL1 = megakaryoblastic leukemia (translocation) 1;
NPM1 = Nucleophosmin 1; CEBPA = CCAAT/enhancer binding protein alpha;
BCR = breakpoint cluster region; ABL1 = Abelson murine leukemia viral
oncogene homolog 1)
WHO-Klassifikation 2008
AML mit rekurrenten genetischen Veränderungen
≥20% Blasten
AML mit t(8;21), RUNX1-RUNX1T1
AML mit inv(16) oder t(16;16), CBFB-MYH11
APL mit t(15;17), PML-RARA
AML mit t(9;11), MLLT3-MLL
AML mit t(6;9), DEK-NUP214
AML mit inv(3) oder t(3;3); RPN1-EVI1
AML (megakaryoblastisch) mit t(1;22), RBM15-MKL1
Provisorische Entitäten: AML mit mutiertem NPM1 und AML mit mutiertem CEBPA
AML mit Myelodysplasie-assoziierten Veränderungen
Therapie-assoziierte AML
AML not otherwise specified/nicht anders klassifizierbar (NOS)
AML mit minimaler Differenzierung
AML ohne Ausreifung
AML mit Ausreifung
Akute myelomonozytäre Leukämie
Akute monoblastische/monozytische Leukämie
Akute Erythrozytenleukämie
Akute megakaryoblastische Leukämie
Akute basophile Leukämie
Akute Panmyelosis mit Myelofibrose
Fortsetzung folgt
-3-
Fortsetzung von Tab.1
Myeloisches Sarkom
Myeloische Proliferationen assoziiert mit Down-Syndrom
Transient abnormale Myelopoese
Myeloische Leukämie assoziiert mit Down-Syndrom
Blastisch-plasmozytische Neoplasien der dendritischen Zellen
Akute Leukämien mit unklarer Linienzugehörigkeit
Akute undifferenzierte Leukämie
Akute Leukämie mit gemischtem Phänotyp mit t(9;22), BCR-ABL1
Akute Leukämie mit gemischtem Phänotyp mit t(v;11q23); MLL rearranged
Akute Leukämie mit gemischtem Phänotyp, B-myeloid, NOS
Akute Leukämie mit gemischtem Phänotyp, T-myeloid, NOS
Provisorische Entität: NK-Zell-lymphoblastische Leukämie/Lymphom
B-lymphoblastische Leukämie/Lymphom
B-lymphoblastische Leukämie/Lymphom NOS
B-lymphoblastische
Leukämie/Lymphom
mit
rekurrenten
genetischen
Veränderungen
T-lymphoblastische Leukämie/Lymphom
1.4
Zytogenetische und molekulargenetische Aberrationen
Einer der bedeutendsten Schwerpunkte in der AML-Forschung stellt die
Charakterisierung der zugrunde liegenden genetischen Aberrationen dar. Durch
sie wächst das Verständnis für die Mechanismen der Leukämogenese. Neben der
Entwicklung von schnellen und einfachen Nachweismethoden dieser Aberrationen
gewinnt die Entwicklung von Therapien, die sich zielgenau gegen die jeweilige
genetische Veränderung richten, an Bedeutung (Döhner K. und Döhner H. 2008).
Klonale Chromosomenaberrationen finden sich in ca. 55% der erwachsenen
Leukämiepatienten
(Fröhling S. et al. 2005). Die Klassifizierung dieser
Chromosomenaberrationen
hat
wesentlich
zur
Klassifizierung
der
AML
beigetragen. Darüber hinaus stellen sie den wichtigsten prognostischen Faktor für
die folgenden Endpunkte dar: Erreichen einer kompletten Remission (CR),
-4-
Rezidivrisiko (RR) und Gesamtüberleben (OS) (Döhner K. und Döhner H. 2008).
Differenzierte
Therapieschemata,
welche
die
jeweiligen
genetischen
Veränderungen berücksichtigen, haben erheblich zur Verbesserung der Prognose
der AML beigetragen. Dies hat letztlich zur Etablierung der zytogenetischen
Diagnostik in die Routinediagnostik geführt (Fröhling S. et al. 2005; Gregory T. K.
et al. 2009). Die gebräuchlichen zytogenetischen Klassifikationssysteme sind die
der Cancer and Leukemia Group B (CALGB), der Southwest Oncology
Group/Eastern Cooperative Oncology Group (SWOG/ECOG) und des United
Kingdom Medical Research Council (MRC).
Tab.2:
Einteilung in zytogenetische Risikogruppen (Mrózek K. und Bloomfield
C. D. 2006 – basierend auf Grimwade D. et al. (MRC) 1998, Slovak M.
L. et al. (SWOG/ECOG) 2000 und Byrd J. C. et al. (CALGB) 2000).
(t(3;3) / (6;9) / (6;11) / (9;11) / (11;19) / (16;16) / (8;21) / (15;17) =
Translokation (3;3) / (6;9) / (6;11) / (9;11) / (11;19) / (16;16) / (8;21) / (15;17);
inv(3) / (16) = Inversion 3 / 16; del(5q) / (7q) / (9q) / (11q) / (20q) = Deletion
(5q) / (7q) / (9q) / (11q) / (20q); -5 / -7 / -Y = Monosomie 5 / 7 / Y; +8 / +11 /
+13 / +21 = Trisomie 8 / 11 / 13 / 23)
High risk group
Komplexer Karyotyp
Balancierte strukturelle Veränderungen
inv(3), t(3;3), t(6;9), t(6;11), t(11;19)
Unbalancierte strukturelle Veränderungen
del(5q)
Nummerische Aberrationen
-5, -7
Intermediate-risk group
Normaler Karyotyp
t(9;11)
Unbalancierte strukturelle Veränderungen
del(7q), del(9q), del(11q), del(20q)
Nummerische Aberrationen
+8, +11, +13, +21, -Y
Low-risk group
inv(16), t(16;16), t(8;21), t(15;17)
Neben diesen zytogenetischen Veränderungen gewinnt auch die Diagnostik
molekulargenetischer Veränderungen immer mehr an Bedeutung. Auch hier
existieren
zunehmend
zielgerichtete
Therapiemöglichkeiten
gegen
die
spezifischen genetischen Veränderungen. Darüber hinaus finden sich bei ca. 45%
der erwachsenen AML-Patienten keine Chromosomenaberrationen; in diesen
Fällen liegt ein sog. normaler Karyotyp vor. Die Identifizierung weiterer
-5-
molekulargenetischer Veränderungen, und damit verbunden eine Verbesserung
der Risikoeinteilung, stellt aktuell eine große Herausforderungen dar. Hinzu
kommt,
dass
(Angriffspunkte)
die
Identifizierung
für
die
neuer
Entwicklung
molekulargenetischer
neuer
Targets
Therapiemöglichkeiten
von
herausragender Bedeutung ist. Je besser wir verstehen, welche Rolle bestimmte
molekulargenetische Veränderungen in der Pathogenese der AML spielen, desto
besser
können
wir
diese
Erkenntnisse
für
die
Entwicklung
neuer
Therapiestrategien (Aggressivität der Therapie) nutzen und somit die Prognose
der AML-Patienten verbessern (Gregory T. K. et al. 2009; Löwenberg B. et al.
1999).
1.5
Erklärungsmodelle zur Leukämogenese
Mehrere Beobachtungen deuten auf einen mehrstufigen Prozess in der
Pathogenese von Leukämien hin: Daten aus Mausmodellen zeigen klar, dass das
Vorhandensein einer singulären Mutation nicht zur Entwicklung einer Leukämie
ausreicht. So wird die myeloische Differenzierung durch die Fusionsgene RUNX1RUNX1T1 und CBFB-MYH11, resultierend aus einer t(8;21) und einer inv(16), in
diesen Modellen zwar deutlich beeinträchtigt, die Mäuse entwickeln jedoch keinen
leukämischen Phänotyp. Ebenfalls im Mausmodell zeigte sich ein enger
Zusammenhang im kombinierten Auftreten bestimmter Mutationen (Fröhling S. et
al. 2005). Zum anderen sind in selteneren Fällen Keimbahnmutationen in
bestimmten Genen (z.B. RUNX1, CEBPA) (Kirwan M. et al. 2009) identifiziert
worden, die für die Entwicklung einer AML prädisponieren (Nickels E. M. et al
2013). In den meisten Fällen entwickeln die Patienten die Leukämie jedoch erst
nach dem Erwerb zusätzlicher somatischer Mutationen in den hämatopoetischen
Vorläuferzellen. Schließlich findet sich bei den meisten AML-Patienten mehr als
eine genetische Veränderung (Döhner K. und Döhner H. 2008; Fröhling S. et al.
2005; Holme H. et al. 2012). Diese Beobachtungen unterstützen die sogenannte
„second-hit- oder multi-step-Hypothese“.
In der Molekulargenetik lassen sich verschiedene Arten von Mutationen
unterscheiden (Döhner K. und Döhner H. 2008; Kelly LM und Gilliland D. G. 2002):
1) Mutationen, die Signaltransduktionswege aktivieren, was zu einer gesteigerten
-6-
Proliferation und/oder gesteigertem Überleben von leukämischen Vorläuferzellen
führt. Dieses gilt z.B. für Mutationen, welche die Rezeptor-Tyrosinkinase FLT3
oder den RAS-Signalweg aktivieren. 2) Mutationen, die Transkriptionsfaktoren
oder Bestandteile des transkriptionalen Co-Aktivierungskomplexes beeinflussen,
was die Differenzierung beeinträchtigt und/oder zu einem Zugewinn an selbst
erneuernden Eigenschaften der hämatopoetischen Vorläuferzellen führt. Beispiele
hierfür sind unter anderem rekurrente genetische Veränderungen wie eine t(8;21),
inv(16) bzw. t(16;16) oder t(15;17) sowie Mutationen in CEBPA, MLL und
wahrscheinlich auch NPM1. Transkriptionsfaktoren sind Schlüsselkomponenten
während des myeloischen Zellreifungsprozesses. Jeder dieser Faktoren führt zu
der Expression charakteristischer, zelllinienspezifischer Zielgene und führt somit
dazu,
dass
Vorläuferzellen
ein
bestimmtes
„Differenzierungsprogramm“
aufnehmen (Rosenbauer F. und Tenen D. G. 2007). Mutationen in diesen Genen
beeinträchtigen den Ablauf dieser „Differenzierungsprogramme“ und tragen
demzufolge zu dem für eine AML typischen Differenzierungsblock bei.
Mutationen aus ein und derselben Klasse kommen bei einem AML-Patienten
seltener in Kombination vor, während Mutationen aus den beiden verschiedenen
Klassen häufig gemeinsam bei einem Patienten identifiziert werden können
(Fröhling S. et al. 2005).
Obwohl
gängige
Modelle
der
Leukämogenese
Mutationen,
die
Signaltransduktions-wege aktivieren, als Voraussetzung für die Entwicklung einer
Leukämie ansehen, können lediglich in 59% der AML-Patienten solche Mutationen
nachgewiesen werden (Ley T. J. et al. 2013). In einem neuen Modell zur
Leukämogenese führten Ley et al. eine funktionelle Einteilung der mutierten Gene
durch und definierten insgesamt 9 funktionelle Klassen: 1) Transkriptionsfaktoren,
die an der Bildung von Genfusionen beteiligt sind (z.B. PML-RARA, CBFBMYH11,
RUNX1-RUNX1T1),
2)
NPM1-Mutationen,
3)
Mutationen
in
Tumorsuppressorgenen (z.B. TP53, WT1), 4) Mutationen in Genen, die für die
DNA-Methylierung entscheidend sind (z.B. DNMT3A, TET1/2, IDH1/2), 5)
Genmutationen,
die
Signaltransduktionswege
aktivieren
(z.B.
FLT3,
KIT,
KRAS/NRAS, andere Tyrosinkinasen), 6) Mutationen in Genen, die myeloische
Transkriptionsfaktoren kodieren (z.B. RUNX1, CEBPA, andere myeloische
Transkriptionsfaktoren), 7) Mutationen in Chromatin-modifizierenden Genen (z.B.
-7-
ASXL1, MLL-X-Fusionen, MLL-PTD), 8) Mutationen in Genen des CohesinKomplexes und 9) Mutationen in Genen des Spliceosom-Komplexes.
1.6
Inzidenz und prognostische Bedeutung der häufigsten rekurrenten
molekulargenetischen Veränderungen bei der AML
1.6.1
Nucleophosmin
Nucleophosmin (NPM1) ist ein ubiquitär exprimiertes Phosphoprotein, das
kontinuierlich zwischen Nukleus und Zytoplasma pendelt und hauptsächlich im
Nukleolus lokalisiert ist. NPM1 ist beteiligt am Aufbau und Transport ribosomaler
Proteine und agiert als molekulares Chaperon, das Proteinaggregationen im
Nukleolus verhindert (Falini B. et al. 2005). Darüber hinaus reguliert NPM1 die
Transkriptionsaktivität und Stabilität von p53 nach Einfluss verschiedener StressInduktoren. Falini et al. konnten 2005 in 35,2% von primären AML-Patienten rein
zytoplasmatisch vorliegendes NPM1 detektieren. Schließlich konnten Mutationen
in Exon 12 von NPM1 als Ursache für die veränderte Lokalisation identifiziert
werden. Mutationen in NPM1 sind mit einer Inzidenz von ca. 45-60% die bis dato
am häufigsten detektierte molekulargenetische Veränderung in AML-Patienten mit
normalem Karyotyp (Döhner K. et al. 2005). Etwa 40% der NPM1-mutierten
Patienten weisen zusätzlich eine FLT3-ITD auf, 15% eine FLT3-TKD-Mutation. In
Abwesenheit einer zusätzlichen FLT3-ITD ist die NPM1-Mutation ein prognostisch
günstiger Marker bei der AML; Patienten mit NPM1-Mutation weisen ein
vergleichbar gutes OS wie Patienten mit core-binding-factor-Leukämien (Leukämie
mit t(8;21), inv(16) oder t(16;16)) oder AML-Patienten mit normalem Karyotyp und
CEBPA-Mutation auf (Döhner K. et al. 2005). Seit 2008 ist die AML mit mutiertem
NPM1-Gen provisorisch als eigene Entität in die WHO-Klassifikation der
myeloischen Neoplasien und Leukämien mit aufgenommen.
1.6.2
FSM-like tyrosin kinase 3
FLT3 gehört zur Familie der Klasse-III-Rezeptortyrosinkinasen und wird von
hämatopoetischen Vorläuferzellen exprimiert. FLT3 spielt eine wichtige Rolle für
die normale Entwicklung hämatopoetischer Stammzellen und des Immunsystems
-8-
(Gilliland D. G. und Griffin J. D. 2002). Die Juxtamembranäre Domäne von FLT3
besitzt autoinhibitorische Funktion. Veränderungen der Juxtamembranären
Domäne von FLT3 durch Interne-Tandemduplikationen (ITDs) führen zur
konsekutiven Aktivierung der Tyrosinkinase und somit zu gesteigerter Proliferation
(Döhner K. und Döhner H. 2008). Etwa 20% aller AML-Patienten und 28-34% aller
AML-Patienten mit normalem Karyotyp weisen eine FLT3-ITD auf. Zahlreiche
Studien konnten zeigen, dass AML-Patienten mit einer FLT3-ITD eine signifikant
schlechtere Prognose haben als AML-Patienten ohne FLT3-ITD. Dabei scheint
auch die Menge an mutiertem FLT3 und die Lokalisation der Insertionsstelle eine
bedeutende Rolle zu spielen. Neben seiner Bedeutung als prognostischer Marker
stellt die FLT3-ITD einen Angriffspunkt für zielgerichtete Therapien dar: Mehrere
FLT3-Inhibitoren befinden sich derzeit in klinischer Testung (Döhner K. und
Döhner
H.
2008).
Seit
2008
empfiehlt
die
WHO
ein
routinemäßiges
Mutationsscreening auf eine FLT3-ITD (Vardiman J. W. et al. 2009).
1.6.3
CCAAT/enhancer binding protein alpha (C/EBPα)
Der Transkriptionsfaktor CCAAT/enhancer binding protein alpha (C/EBPα) wird in
zahlreichen Geweben exprimiert, hauptsächlich in den hoch-differenzierten Zellen
der Leber, dem weißen und braunen Fettgewebe sowie in Zellen der myeloischen
Reihe. C/EBPα ist u.a. essentiell für die regelrechte Differenzierung von
Granulozyten (Gombart A. F. et al. 2002). Aufgrund der Inzidenz und der
prognostischen Bedeutung von Mutationen in CEBPA wurde die AML mit
mutiertem CEBPA-Gen ebenfalls als provisorische eigene Entität in die WHOKlassifikation der myeloischen Neoplasien und Leukämien mit aufgenommen. Im
Folgenden werden die Funktion von C/EBP, mögliche Auswirkungen von
Mutationen im CEBPA-Gen sowie deren Inzidenz und prognostische Bedeutung
bei der AML näher beschrieben.
Der Transkriptionsfaktor C/EBPα spielt eine Schlüsselrolle in der Differenzierung
multipotenter myeloischer Vorläuferzellen in reife neutrophile Granulozyten
(Fröhling S. et al. 2005; Van Waalwijk van Doorn-Khosrovani S. B. et al. 2003)
sowie beim Proliferationsstopp der Zellen (Dufour A. et al. 2010; Pabst T. et al.
2001). Er ist insbesondere für die Weiterentwicklung von CMPs (allgemeinen
-9-
myeloischen
Vorläuferzellen)
zu
GMPs
(Granulozyten/Makrophagen
Vorläuferzellen) bedeutsam (Rosenbauer F. und Tenen D. G. 2007). C/EBPα
reguliert Promotoren einer Reihe von Granulozyten-spezifischen Genen (Fröhling
S. et al. 2004). CEBPA-knockout-Mäusen fehlen reife Granulozyten, ein
Charakteristikum der AML, während die anderen hämatopoetischen Linien
unbeeinflusst bleiben (Taskesen E. et al. 2011; Van Waalwijk van DoornKhosrovani S. B. et al. 2003). Basierend auf diesen Beobachtungen und Daten
kommt CEBPA in der Leukämogenese eine bedeutende Rolle zu (Pabst T. et al.
2001). Darüber hinaus scheinen Mutationen in CEBPA zu dem für eine AML
typischen Differenzierungsblock beizutragen (Fröhling S. et al. 2004). Einen
weiteren Hinweis auf die mögliche Funktion von CEBPA in der Leukämogenese
ergibt sich aus der Tatsache, dass in anderen AML-Subtypen wie der AML mit
t(8;21) und der AML mit t(15;17) CEBPA zwar nicht mutiert vorliegt, seine DNABindungsfähigkeit
aber
durch
das
Fusionstranskript
RUNX1-RUNX1T1
beeinträchtigt (Fröhling S. et al. 2004; Pabst T. et al. 2001) und seine Expression
durch das Fusionstranskript PML-RARα deutlich herunterreguliert wird (Pabst T. et
al. 2001). Der in CEBPA-knockout-Mäusen beobachtete Differenzierungsblock
führt zu einem M2-Phänotyp. Eine AML mit t(8;21) ist ebenfalls mit einer M2Morphologie assoziiert, was zu der Vermutung führt, dass CEBPA-Mutationen und
eine t(8;21) bei der Leukämogenese über einen gemeinsamen Pathway (Pfad)
agieren, nämlich über die Inhibition einer normalen C/EBPα-Funktion (Fröhling S.
et al. 2004).
Das CEBPA-Gen ist auf Chromosom 19q13.1 lokalisiert und kodiert für ein
Mitglied der Familie der basic region leucine zipper (bZIP)-Transkriptionsfaktoren.
CEBPA enthält eine GC-reiche (>70%) kodierende Region in einem einzigen Exon
(Fröhling
S.
et
al.
2004).
Exprimiert
wird
CEBPA
überwiegend
in
myelomonozytären Zellen (Pabst T. et al. 2001). Die spezifische DNA-Bindung
erfolgt über eine Domäne, die mehrere basische Aminosäuren enthält (basic
region) und über 2 amphipathische α-Helices (leucine zipper) dimerisiert (Van
Waalwijk van Doorn-Khosrovani S. B. et al. 2003). Einmal an die DNA gebunden,
erfolgt die Transaktivierung über die N-terminale TAD1-Domäne (Lin L. I. et al.
2005). Die bZIP-Region ist am C-terminalen Ende des C/EBPα-Proteins lokalisiert.
Zur DNA-Bindung ist die fixierte dreidimensionale Anordnung zwischen basic
region und leucine zipper Domäne essenziell. Insertionen sowie Deletionen, die
- 10 -
letztlich
die
dreidimensionale
Struktur
verändern,
beeinträchtigen
die
sequenzspezifische DNA-Erkennung/Bindung. Der C-Terminus von CEBPA ist
nicht nur innerhalb der Mitglieder der CEBPA-Familie hochkonserviert, sondern
auch in verschiedenen weiteren Onkogenen. Im Gegensatz dazu ist der NTerminus weniger konserviert. Er enthält eine attenuator (abschwächende) Domäne, die jeweils von einer anderen Transaktivierungsdomäne (TAD1 und -2)
flankiert wird (van Waalwijk van Doorn-Khosrovani S. B. et al. 2003).
1.7
Somatische Mutationen in CEBPA bei AML-Patienten
Myeloischen blastären Zellen mit Mutationen in CEBPA fehlt das entscheidende
Signal
zur
neutrophilen
Ausdifferenzierung,
sodass
sie
im
myeloischen
Blastenstadium akkumulieren (Pabst T. et al. 2001). Mutationen in CEBPA
kommen mit einer Frequenz von ca. 5-14% der AML-Patienten mit normalem
Karyotyp vor (Kato N. et al. 2011). Sie sind in den meisten Fällen mit den FABSubtypen M1 bzw. M2 assoziiert (Dufour A. et al. 2010). Zwei unterschiedliche
Mutationstypen in CEBPA konnten sowohl in sporadischer wie auch familiärer
AML nachgewiesen werden. Zum einen finden sich N-terminal gelegene
Nonsense-Mutationen, welche die Translation des kompletten 358 Aminosäuren
langen und 42kDa großen Proteins verhindern und zur Entstehung eines um 117
Aminosäuren verkürzten (30kDa großen) Proteins, der p30-Isoform, mit dominantnegativem Effekt führen (Pabst T. et al. 2001; Pabst T. et al. 2009). Dominantnegativer Effekt bedeutet in diesem Zusammenhang, dass zusätzlich zur
verminderten C/EBPα-Aktivität durch Entstehen der p30-Isoform diese (die p30Isoform) die Aktivität des verbliebenen intakten C/EBPα-Proteins hemmt. Dies
geschieht durch direktes Binden an den Promoter der Wildtyp(WT)-Sequenz oder
Heterodimerisierung mit C/EBPα-WT. Das verkürzte Protein entsteht durch ein
internes ATG-Startcodon an Aminosäureposition 120 innerhalb des normalen
Leserahmens, wodurch die TAD1-Domäne verloren geht (siehe Abb.1) (Pabst T.
et al. 2001). Mäuse, die ausschließlich die p30-Isoform als C/EBPα-Protein
exprimieren, entwickeln eine myeloische Leukämie mit vollständiger Penetranz
(Kato N. et al. 2011). Im Gegensatz dazu finden sich in der C-terminal gelegenen
bZIP-Domäne in-frame-Mutationen, die zu einem C/EBPα-Protein mit verminderter
DNA-Bindungs- und Dimerisierungsaktivität führen (Kato N. et al. 2011; Pabst T.
- 11 -
et al. 2009). Es handelt sich hierbei um einen indirekten Effekt via Interaktion mit
anderen Transkriptionsfaktoren, wie z.B. PU.1 (Kato N. et al. 2011). Es zeigte
sich, dass Mäuse mit einer Punktmutation in der bZIP-Domäne lediglich präleukämische Merkmale tragen (Kato N. et al. 2011). Als Konsequenz dieser
Mutationen kommt es zu einem Ungleichgewicht
unzureichender
Differenzierung
von
von Proliferation und
hämatopoetischen
Progenitorzellen
(Taskesen E. et al. 2011). Eine Kombination aus N-terminaler frameshift-Mutation
und C-terminaler in-frame-Mutation findet sich häufiger bei de-novo AML, während
die meisten MDS/AML- oder therapieassoziierten AML-Patienten eine einzelne
CEBPA-Mutation tragen. Diese Ergebnisse implizieren, dass Doppelmutationen in
CEBPA (CEBPAdm) in Patienten eine AML induzieren können (Kato N. et al.
2011). Bereshchenko et al. konnten knockin-Mäuse generieren, die sowohl eine
C-terminale Mutation in CEBPA tragen als auch eine Nonsense-Mutation in der
p42-spezifischen Region, welche die bei Menschen vorkommenden N-terminalen
Nonsense-Mutationen imitiert. Fetale Leberzellen dieser biallelischen knockinMäuse
wurden
in
bestrahlte
Wildtyp-Empfängermäuse
transplantiert.
Die
Verwendung fetaler Leberzellen war notwendig, da biallelische Mutationen in
CEBPA postnatal letal sind. Alle Empfängermäuse entwickelten nach einer
gewissen Latenzzeit (im Median 40-50 Wochen) eine AML (Bereshchenko O. et
al. 2009).
Biallelische Mutationen in CEBPA (CEBPAbi) scheinen sowohl für einen
Differenzierungsblock als auch für eine gesteigerte Proliferation verantwortlich zu
sein und somit für die Entwicklung einer Leukämie auszureichen (Greif P. A. et al.
2012), während CEBPA single-mutations (CEBPAsm) zu einer aggressiveren Form
der AML führen, dies allerdings erst in Zusammenspiel mit anderen Genaberrationen, die noch nicht alle vollständig charakterisiert sind (Kato N. et al.
2011).
- 12 -
Abb.1:
Schematischer Aufbau von CEBPA; die N-terminalen Domänen sind in
Gelb, die C-terminalen in Blau dargestellt. Durch ein internes
Startcodon wird die TAD1-Domäne nicht abgelesen und es entsteht ein
verkürztes, 30kDa großes, Protein, angedeutet durch die parallelen
Pfeile. (CEBPA = CCAAT/enhancer binding protein alpha gene; BR = basic
region Domäne; kDa = Kilodalton; LZ = leucine zipper Domäne; TAD1 und
TAD2 = Transaktivierungsdomäne 1 und 2)
In der Mehrzahl der CEBPA-mutierten Patienten liegen zwei Mutationen vor (ca.
60% der Fälle) (Taskesen E. et al. 2011), wobei die meisten Patienten diese
Mutationen auf jeweils unterschiedlichen Allelen tragen. Diese biallelischen
Mutationen bestehen meist aus einer spezifischen Kombination aus N-terminaler
frameshift-Mutation auf dem einen und C-terminaler in-frame-Mutation auf dem
anderen Allel (Dufour A. et al. 2010; Kato N. et al. 2011; Taskesen E. et al. 2011).
Die meisten CEBPAbi-mutierten AML-Patienten tragen heterozygote Mutationen;
sehr selten finden sich homozygote (ausschließlich N- oder C-terminale)
Mutationen aufgrund einer loss-of-heterozygosity durch uniparentale Disomie
(Grossmann V. et al. 2013; Taskesen E. et al. 2011). Es scheint Hinweise darauf
zu geben, dass eine N-terminale frameshift-Mutation als Klasse I Mutation bei der
Leukämogenese fungiert, während eine C-terminale in-frame-Mutation mehr wie
eine Klasse II Mutation agiert: Nach Transduktion einer C-terminalen CEBPAMutation sowie der Kombination aus einer C-terminalen und einer N-terminalen
CEBPA-Mutation in KM-Zellen von Mäusen und anschließender Transplantation
konnte in den Empfänger-Mäusen mit CEBPAbi eine höhere Zahl an leukämischen
Blasten nachgewiesen werden als in den Mäusen mit alleiniger C-terminaler
CEBPA-Mutation. Dies deutet daraufhin, dass eine N-terminale Mutation in
CEBPA zu einer gesteigerten Proliferation der Zellen führt, deren Differenzierung
durch die C-terminale CEBPA-Mutation blockiert wurde (Kato N. et al. 2011). Im
Gegensatz zu den CEBPAbi-mutierten kommen bei den CEBPAsm-mutierten
- 13 -
Patienten vorherrschend frameshift-Mutationen vor, wobei diese hauptsächlich Nterminal lokalisiert sind (Dufour A. et al. 2010).
Patienten mit CEBPAbi-AML haben eine signifikant niedrigere Frequenz an
zusätzlichen Mutationen im Vergleich zu CEBPAsm-AML (Dufour A. et al. 2010;
Hou H. A. et al. 2009; Pabst T. et al. 2009; Taskesen E. et al. 2011). Zum Beispiel
fanden sich Mutationen in NPM1 in 3,3% der CEBPAbi-Fälle, während NPM1 in
35% der CEBPAsm-Fälle mutiert war (P < .0001) (Taskesen E. et al. 2011). Bei
Auftreten eines Rezidivs finden sich in der Regel die gleichen Mutationen in
CEBPA wie bei Diagnosestellung. Diese Ergebnisse unterstützen die These, dass
es sich bei CEBPA-Mutationen um ein frühes Event in der Entwicklung einer
Leukämie handelt.
Die meisten molekulargenetischen Aberrationen sind nicht auf eine zytogenetischnormale AML (CN-AML) beschränkt, sondern treten zu einem gewissen
Prozentsatz auch bei einer AML mit einem nicht-normalen sowie auch einem
komplexen Karyotyp auf. Ein komplexer Karyotyp ist definiert als das Vorliegen
von mindestens 3 erworbenen Chromosomenaberrationen, ohne Auftreten einer
t(8;21), inv(16)/t(16;16) oder t(15;17) und findet sich in ca. 10-20% der Patienten
(Laubach L. und Rao A. V. 2008). Bei Patienten mit nicht-normalem Karyotyp
machen Mutationen in CEBPA z.B. in der Gruppe von Patienten mit Deletion 9q
43% der Fälle aus, während bei Patienten mit komplexem Karyotyp Mutationen in
CEBPA nur in einem geringen Prozentsatz vorkommen (Döhner K. und Döhner H.
2008).
1.8
Prognostische Bedeutung von CEBPA-Mutationen bei der AML
Mittlerweile existieren Ergebnisse aus vielen Studien zur prognostischen
Bedeutung von CEBPA-Mutationen bei der AML. CEBPAbi-Mutationen sind bei
jungen AML-Patienten mit normalem Karyotyp oder intermediate-risk-Karyotyp mit
einer günstigen Prognose (höhere CR-Rate, niedrigere Rückfallrate, längeres
ereignisfreies
Überleben
(EFS))
assoziiert.
In
der
multivariaten
Analyse
bestätigten sich CEBPAbi-Mutationen als unabhängiger prognostischer Faktor für
ein günstiges OS und EFS und RFS (Taskesen E. et al. 2011) sowie für die
kumulative Rezidivrate (cumulative incidence of relapse, CIR) (Green C. L. et al.
- 14 -
2010). Darüber hinaus erreichen Patienten bei Auftreten eines Rezidives durch
eine Reinduktionschemotherapie hohe 2. CR-Raten von >80%. Diese und das
weiterhin günstige OS, trotz eines Rezidivs, sind vergleichbar mit denen einer
AML mit inv(16). Beide Entitäten stellen eine Ausnahme dar zu den sonst
signifikant schlechteren CR-Raten nach Rezidiv (Schlenk R. F. et al. 2013).
Patienten mit CEBPAbi-Mutation zeigen ein vergleichbar gutes OS wie AMLPatienten mit Mutationen in NPM1 (Dufour A. et al. 2010). Im Hinblick auf das OS
lässt sich hingegen kein Unterschied zwischen CEBPAsm- und CEBPA-Wildtyp
(CEBPAwt) AML-Patienten nachweisen (Döhner K. und Döhner H. 2008; Dufour A.
et al. 2010; Fröhling S. et al. 2005; Green C. L. et al. 2010; Taskesen E. et al.
2011). Basierend auf diesen Ergebnissen, sollte eine AML mit CEBPAbi klar von
einer AML mit CEBPAsm unterschieden werden; lediglich eine AML mit CEBPAbiMutation sollte als eigene Entität in die Klassifikation der AML aufgenommen
werden (Taskesen E. et al. 2011). Das günstige OS bei CEBPAbi-mutierten
Patienten scheint unbeeinflusst von zusätzlichen Mutationen, wie z.B. NPM1,
FLT3-ITD oder MLL (Dufour A. et al. 2010; Fröhling S. et al. 2004). Diese Daten
stehen im Gegensatz zu Untersuchungen, die zeigen, dass sich das günstigere
OS bei CEBPAbi-mutierten Patienten bei Vorliegen einer FLT3-ITD verliert (Green
C. L. et al. 2010; Preudhomme C. et al. 2002). Allerdings handelte es sich sowohl
bei Preudhomme et al. als auch bei Green et al. um eine sehr kleine Anzahl von
Patienten, die sowohl CEBPA-mutiert als auch FLT3-ITD positiv waren. In den
Analysen von Preudhomme et al. konnten in 15 CEBPA-mutierten Patienten 5
Patienten mit zusätzlicher FLT3-ITD identifiziert werden; zwischen CEBPAbi und
CEBPAsm wurde dabei nicht unterschieden. Green et al. konnten 7 Patienten mit
CEBPAbi-Mutation und zusätzlich vorliegender FLT3-ITD identifizieren.
Die Mechanismen, durch die CEBPA-Mutationen das klinische Outcome
verbessern, sind noch nicht vollständig bekannt. Deren Entschlüsselung sollte das
Ziel zukünftiger Studien sein. Das Gleiche gilt für die Rolle zusätzlicher
kooperierender
Mutationen
(Fröhling
S.
et
al.
2004):
Es
besteht
die
wissenschaftliche Herausforderung, die Kohorte der CEBPAbi-AML präziser zu
charakterisieren, um Subgruppen zu identifizieren, die sich hinsichtlich der
Prognose weiter unterscheiden (Grossmann V. et al. 2013).
- 15 -
1.9
Keimbahnmutationen in CEBPA, Prädisposition zur Entwicklung
einer AML
Der Nachweis einer CEBPA-Mutation im Remissionsmaterial weist auf das
Vorliegen einer Keimbahnmutation hin. Diese finden sich vorwiegend N-terminal.
Bislang wurden C-terminal gelegene Keimbahnmutationen nur in der Arbeit von
Taskesen et al. beschrieben. Allerdings gab es bei keinem der drei Patienten mit
nachgewiesener C-terminal gelegener Keimbahnmutation weitere AML-Fälle in
der Familie. Es handelt sich um einen autosomal-dominanten Erbgang mit nahezu
vollständiger Penetranz (Nanri T. et al. 2010; Pabst T. et al. 2008). AML-Fälle mit
einer Keimbahnmutation in CEBPA treten gehäuft bei familiärer AML auf. Zum
Zeitpunkt der Leukämiediagnose haben die meisten dieser Patienten eine
zusätzliche Mutation in CEBPA erworben. Das Vorliegen einer N-terminalen
Keimbahnmutation scheint für den Erwerb einer somatischen C-terminalen
Mutation zu prädisponieren (Nanri T. et al. 2010; Pabst T. et al. 2008; Renneville
A. et al. 2009; Sellick G. S. et al. 2005; Smith M. L. et al. 2004; Taskesen E. et al.
2011), was ein weiterer Hinweis darauf ist, dass es sich bei dem Vorliegen von
CEBPAbi-Mutationen um das Zusammentreffen zweier verschiedener Ereignisse
handelt. Im Falle von CEBPA-Keimbahnmutationen lässt sich die zweite
erworbene Mutation in CEBPA im Remissionsmaterial nicht mehr nachweisen,
während sie bei einem Rezidiv jedoch wieder nachweisbar sein kann. AMLPatienten mit einer CEBPAbi-Mutation sollten auf das Vorliegen einer CEBPAKeimbahnmutation getestet werden (Renneville A. et al. 2009). Patienten mit
CEBPA-Keimbahnmutation sind bei Diagnosestellung jünger. In Familien mit
mehreren AML-Erkrankten zeigt sich bei Diagnosestellung von Generation zu
Generation eine weitere Abnahme des Alters (Pabst T. et al. 2008). Darüber
hinaus verhält sich die Erkrankung in den bislang beschriebenen Familien
vergleichbar zu einer AML mit sporadischer CEBPA-Mutation. Auch Patienten mit
einer CEBPA-Keimbahnmutation haben gegenüber CN-AML ohne CEBPAMutation eine günstige Prognose (Klein R. D. und Marcucci G. 2010; Smith M. L.
et al. 2004). Allerdings werden bei Patienten mit einer Keimbahnmutation in
CEBPA gehäuft Rezidive beobachtet (Pabst. T. et al. 2008). Die Patienten
scheinen jedoch hohe 2. oder 3. CR-Raten aufzuweisen, z.T. auch ohne
hochdosierte Chemotherapie (Smith M. L. et al. 2004). Vergleichende Arbeiten
zwischen Patienten mit einer Keimbahnmutation in CEBPA und einer sporadisch
- 16 -
aufgetretenen Mutation, welche das Therapieansprechen und den klinischen
Verlauf mit den Endpunkten OS, EFS und RFS betrachten, existieren bislang
nicht. Diese Tatsache ist am ehesten den geringen Fallzahlen familiärer AMLPatienten mit CEBPA-Mutation geschuldet. Zum Zeitpunkt der Übersichtsarbeit
von Klein und Marcucci 2010 waren 7 Familien mit familiärer AML und Vorliegen
einer
CEBPA-Keimbahnmutation
erfasst.
Die
Häufigkeit
an
CEBPA-
Keimbahnmutationen wird in der Literatur mit Zahlen von 7% bzw. 11%
beschrieben (Pabst T. et al. 2008; Taskesen E. et al. 2011).
1.10
Polymorphismen in CEBPA
Neben den zuvor beschriebenen Mutationen in CEBPA treten sowohl bei AMLPatienten wie auch in gesunden Vergleichskollektiven Sequenzvariationen ohne
Krankheitswert auf, sogenannte Polymorphismen (Fröhling S. et al. 2004;
Leecharendkeat A. et al. 2008; Wouters B. J. et al. 2007). Diese Polymorphismen
können in dem AML-Patientenkollektiv unabhängig vom Subtyp der Erkrankung
oder der zytogenetischen Risikogruppe nachgewiesen werden (Leecharendkeat A.
et al. 2008). Leecharendkeat et al. konnten zeigen, dass Polymorphismen in
CEBPA mit einer höheren Prävalenz in einem gesunden Vergleichskollektiv
vorliegen als in AML-Patienten. Ein häufiger Polymorphismus ist eine HistidinProlin-Duplikation (HP196-197ins) in der TAD2-Domäne, die ursprünglich von
Wouters et al. als solche beschrieben wurde (Wouters B. J. et al. 2007) und in ca.
20% der AML-Patienten sowie in 39% einer gesunden Vergleichsgruppe zu finden
war.
Fröhling
et
al.
(2004)
beschrieben
ebenfalls
sogenannte
stumme
Nukleotidveränderungen, die zu keiner Veränderung der Aminosäuresequenz
führten: 1281G>T in 32%, 1164C>T in 3%, 993G>A in 1%, 630C>T, 1284C>G
und 1347G>T in jeweils 0,4% einer größeren Kohorte.
1.11
GATA2
Die Familie der GATA-Transkriptionsfaktoren besteht aus 6 Mitgliedern, von
denen bei Säugetieren GATA1-3 unersetzlich für die Hämatopoese sind (Kitajima
K. et al. 2006). Benannt wurden sie nach der Zusammensetzung ihres
- 17 -
zugehörigen DNA-Bindungsmotivs (Bresnick E. H. et al. 2012). Bei GATA2
handelt es sich um einen Zinkfinger-Transkriptionsfaktor, der eine wichtige Rolle in
der Regulation der Proliferation von hämatopoetischen Stammzellen spielt.
Darüber hinaus ist er ebenso für eine normale Megakaryozytenentwicklung
bedeutend (Greif P. A. et al. 2012). GATA2-knockout-Mäuse sind schwer
anämisch und sterben ca. an Tag 10 der Embryonalentwicklung (Bresnick E. H. et
al. 2012). GATA2 ist auf Chromosom 3q21 lokalisiert und wird durch 6 Exons
kodiert. GATA2 enthält eine konservierte DNA-Bindungsdomäne, die sich aus
zwei
multifunktionalen
Zinkfingerdomänen
der
Form
CX2C-X17-CNAC
zusammensetzt (Fasan A. et al. 2013; Trainor C. D. et al. 2000). Die N-terminale
Zinkfinger-Domäne
(ZF1) trägt
zur spezifischen
DNA-Bindung und
ihrer
Stabilisierung bei und vermittelt die Interaktion mit dem transcriptional cofactor
Friend von GATA2 (FOG1), was wichtig ist für die Erythrozyten- und
Megakaryozytenentwicklung (Bresnick E. H. et al. 2012; Greif P. A. et al. 2012).
Sie erstreckt sich über die Aminosäuren 294-344 und wird hauptsächlich durch
Exon 4 kodiert, bis auf einen kleinen Teil von 5 Aminosäuren, die von Exon 5
kodiert werden. Die C-terminale ZF-Domäne (ZF2) erstreckt sich über die
Aminosäuren 349-398 (Fasan A. et al. 2013) und wird größtenteils durch Exon 5
kodiert.
Die
Expression
von
GATA2
wird
streng
durch
mehrere
Transkriptionsfaktoren, wie z.B. NOTCH1, PU.1 und EVI1, und durch Zytokine,
wie IL-1 und TNFα, reguliert (siehe 1.15) (Fasan A. et al. 2013). So interagiert z.B.
PU.1 mit dem C-terminalen Zinkfinger von GATA2 (Zhang P. et al. 1999). Eine
Expression
von
GATA2
findet
sich
häufig
in
Leukämiezellen
sowie
Leukämiezelllinien (Luesink M. et al. 2012; Tsuzuki S. et al. 2000; Vicente C. et al.
2012). Sowohl PML-RARα als auch PLZF-RARα interagieren mit GATA2. Es
existiert die Hypothese, dass GATA2 auch in der molekularen Pathogenese der
APL eine Rolle spielt (Tsuzuki S. et al. 2000; Tsuzuki S. und Enver T. 2002).
Kürzlich konnten in pädiatrischer APL Mutationen in GATA2 identifiziert werden
(Shiba N. et al. 2013).
- 18 -
Abb.2:
Schematischer Aufbau von GATA2. Die einzelnen Rechtecke
symbolisieren die Exons 1-6. Bei den Exons 4-6 sind darüber hinaus
die Aminosäureabschnitte dargestellt, für die die jeweiligen Exons
kodieren. Die beiden Pfeile symbolisieren die beiden Zinkfinger ZF1
und ZF2 und zeigen auf, welche Exons bzw. welche
Aminosäurenabschnitte für die Zinkfinger kodieren. (aa = Aminosäure;
Ex1-6 = Exon 1-6; ZF1 und 2 = Zinkfinger 1 und 2)
1.12
Interaktion zwischen GATA2 und C/EBPα
GATA2 und C/EBPα interagieren über eine direkte Protein-Protein-Interaktion
(Tong Q. et al. 2005). Die C/EBPα-abhängige Aktivierung von Zielgenen wird
durch die Coexpression von GATA2-Wildtyp (GATA2wt) verstärkt. Die Interaktion
erfolgt auf Seiten von C/EBPα über die bZIP-Region und auf Seiten von GATA2
über eine Region, die auf den C-terminalen ZF folgt (Aminosäureposition 377415). Diese Region spielt neben der Interaktion mit C/EBPα auch eine Rolle bei
der DNA-Bindung. Innerhalb dieser Region ließ sich der Teil, der für die ProteinInteraktion mit C/EBPα verantwortlich ist, weiter auf die Aminosäurepositionen
381-385 einschränken (Tong Q. et al. 2005).
1.13
Genexpression von GATA2
Die Genexpression von GATA2 ist zu mehreren Zeitpunkten der Hämatopoese
von kritischer Bedeutung (Vicente C. et al. 2012). Zu einem gewissen Teil
bestimmt die GATA2-Expression die Weiterentwicklung bestimmter myeloischer
Zellreihen und wird aufgrund dessen streng reguliert (Vicente C. et al. 2012).
Genexpressionsanalysen von GATA1 und -2 deuten darauf hin, dass eine
Dysregulation dieser Gene ein Merkmal myelodysplastischer Hämatopoese
darstellt und dass das Muster dieser Expression mit dem vorhandenen
Dysplasiegrad korreliert (Fadilah S-A. et al. 2002). Während der Hämatopoese
- 19 -
steigt die Expression von GATA1 an, was wiederum die Expression von GATA2
hemmt und schließlich einen günstigen Einfluss auf die terminale Differenzierung
nimmt.
Bei
Patienten
mit
einer
schweren
Myelodysplasie
finden
sich
dementsprechend hohe Expressionslevel von GATA2 und eine fehlende
Expression von GATA1. Die dafür verantwortlichen Mechanismen sind bislang
noch nicht geklärt (Fadilah S-A. et al. 2002). Eine erhöhte GATA2-Expression
reguliert die Aktivität wichtiger myeloischer Transkriptions-faktoren wie PU.1 und
C/EBPα herunter (Luesink M. et al. 2012). Des Weiteren weisen kürzlich
durchgeführte Untersuchungen auf einen Zusammenhang zwischen einer hohen
GATA2-Expression und einem ungünstigen Outcome bei AML-Patienten hin.
Allerdings fand sich diese Überexpression hauptsächlich bei Patienten mit einem
schlechten zytogenetischen Risikoprofil, bei älteren Patienten, bei solchen mit
sekundärer AML sowie bei Patienten mit WT1- und EVI1-Überexpression.
Dennoch zeigte sich in einer multivariaten Analyse, angepasst an Alter und
zytogenetische Risikogruppe, eine GATA2-Überexpression als ein unabhängiger
prognostischer Faktor für ein kürzeres OS (Vicente C. et al. 2012). Eine Analyse
der GATA2-Expression bei pädiatrischer AML führte zum gleichen Ergebnis
(Luesink M. et al. 2012). Darüber hinaus konnten kürzlich in einer größeren
Kohorte pädiatrischer AML Mutationen in GATA2 in 5,1% der Fälle identifiziert
werden. Interessanterweise konnte keine Korrelation zum Auftreten von
Mutationen in CEBPA nachgewiesen werden (Shiba N. et al. 2013).
1.14
Somatische Mutationen in GATA2 und deren möglicher Einfluss auf
die Prognose
Vor kurzem wurde in der Literatur eine signifikante Assoziation von CEBPAbi-AML
mit Mutationen in GATA2 beschrieben; die Inzidenz liegt zwischen 18-41%. Im
Gegensatz hierzu lagen bei CEBPAsm- und CEBPAwt-AML keine, oder nur in
einem sehr geringen Prozentsatz, GATA2-Mutationen vor (Green C. L. et al. 2013;
Greif P. A. et al. 2012). Bezüglich der Lokalisation dieser Mutationen existieren
unterschiedliche Daten: In einer kleineren Kohorte von 33 CEBPAbi-AML-Patienten
fanden sich Mutationen in GATA2 lediglich im N-terminalen Zinkfinger, (ZF1), und
hier nur im kodierenden Exon 4 (Greif P. A. et al. 2012). Im Gegensatz dazu sind
in größeren Kohorten von CEBPAbi-AML-Patienten auch Mutationen im C- 20 -
terminalen Zinkfinger, also ebenso in Exon 5 nachgewiesen worden (Fasan A. et
al. 2013). Im Vergleich von GATA2-Mutationen zwischen CEBPAbi- und CEBPAsmAML finden sich keine unterschiedlichen Mutationstypen (Green C. L. et al. 2013).
In der Literatur wird eine Mutations-Hotspot-Region zwischen Aminosäure 317 und
321 beschrieben. Hierbei handelt es sich um eine innerhalb der Familie der
GATA2-Faktoren und speziesübergreifend hochkonservierte Region (Greif P. A. et
al. 2012). Zusätzliche genetische Aberrationen kommen in der Kohorte von
GATA2-mutierten (GATA2mut) CEBPAbi-AML-Patienten signifikant weniger vor.
FLT3-ITD und GATA2mut scheinen sich bei CEBPAbi-AML-Patienten gegenseitig
auszuschließen (Fasan A. et al. 2013; Green C. L. et al. 2013; Greif P. A. et al.
2012). In den meisten bislang durchgeführten Untersuchungen zeigten sich in
Bezug auf klinische Parameter, wie Leukozytenzahl (WBC), Alter und Geschlecht
etc., zwischen der GATA2mut- und der GATA2wt-Gruppe innerhalb der CEBPAbiAML keine signifikanten Unterschiede (Fasan A. et al. 2013; Greif P. A. et al.
2012). Jedoch berichtet eine Arbeitsgruppe, dass GATA2mut-Patienten signifikant
jünger sind im Vergleich zu GATA2wt-Patienten (Green C. L. et al. 2013). Bislang
konnte durch das Vorhandensein von GATA2-Mutationen kein signifikant
negativer Einfluss auf das günstige OS bei CEBPAbi-AML gezeigt werden;
vielmehr konnte in einigen Kohorten ein Trend zu besserem OS und EFS für
CEBPAbi-AML mit GATA2mut im Vergleich zu CEBPAbi-AML und GATA2wt und
GATA2wt-AML mit entweder CEBPAsm oder CEBPAwt nachgewiesen werden
(Grossmann V. et al. 2013; Fasan A. et al. 2013; Green C. L. et al. 2013; Greif P.
A. et al. 2012). Kritische Stimmen merken hier die fehlende Stratifizierung nach
FLT3-ITD an (Green C. L. et al. 2013). Da sich GATA2mut und FLT3-ITD in der
CEBPAbi-AML-Kohorte ausschließen, in der CEBPAbi-AML-Kohorte mit GATA2wt
jedoch FLT3-ITD vorkommen, kann nicht ausgeschlossen werden, dass der
vermeintliche Benefit einer GATA2-Mutation in der CEBPAbi-Kohorte durch den
ungünstigen prognostischen Einfluss von FLT3-ITD in der GATA2wt-Kohorte
entsteht (Green C. L. et al. 2013). Dagegen spricht, dass andere Studien gezeigt
haben, dass FLT3-ITD keinen negativen Einfluss auf das günstige OS bei
CEBPAbi-AML hat (Dufour A. et al. 2010; Fröhling S. et al. 2004). Zur weiteren
Untersuchung der Auswirkungen von GATA2mut wurden stellvertretend für einige
Mutationen
computergestützte
Strukturanalysen
durchgeführt,
die
darauf
hinweisen, dass Mutationen im ZF1 direkt die DNA-Bindungsaffinität beeinflussen
- 21 -
(Greif P. A. et al. 2012). In Genexpressionsanalysen zeigten sich verstärkte
Genexpressionen in der GATA2mut-Gruppe, insbesondere in Genen, die zum
Zellzyklus, ERBB, MTOR, p53- sowie Apoptose-Signalweg gehören. Ebenso
verstärkt exprimiert wurden interessanterweise Zielgene von CEBPA, während
Zielgene von GATA2 nicht verstärkt exprimiert wurden (Greif P. A. et al. 2012).
Allerdings zeigte sich die sonst durch Coexpression von GATA2wt verstärkte,
CEBPA-abhängige Aktivierung von Zielgenen bei allen bislang untersuchten
GATA2-ZF1-mutierten CEBPAbi-AML-Fällen insgesamt reduziert (Greif P. A. et al.
2012). Greif et al. spekulieren, dass GATA2mut die Restaktivität der p30 Isoform
von CEBPA weiter reduziert und somit GATA2-Mutationen als ein sekundäres
Event bei Vorliegen einer CEBPA-Mutation zur Entwicklung einer Leukämie
führen. Diese Überlegung stützt eine kürzlich proklamierte Hypothese, dass ein
kritisches
„Dosisfenster“
für
nukleäre
Faktoren
bei
dem
Prozess
der
hämatopoetischen Differenzierung und damit der Leukämogenese existiert
(Rosenbauer F. et al. 2004). Zum Beispiel führt die Abwesenheit von PU.1 in
knockout-Mäusen nicht zur Entwicklung einer Leukämie, während eine Reduktion
des PU.1-Levels auf 20% in einer Leukämie resultiert (Rosenbauer F. et al. 2004).
Des Weiteren hat sich gezeigt, dass GATA-Proteine (GATA1 und GATA2) selbst
die Transaktivierung von bedeutenden myeloischen Zielgenen durch PU.1
inhibieren (Zhang P. et al. 1999). Die spezifische Assoziation von Mutationen, die
zwei miteinander interagierende Regulatoren der Hämatopoese betreffen, stellen
ein neues Modell der Leukämogenese dar: das gleichzeitige Auftreten von
Mutationen zweier Transkriptionsfaktoren, die über denselben Pathway agieren
(Greif P. A. et al. 2012). Es gibt Hinweise dafür, dass es sich bei GATA2mut um ein
sekundäres Ereignis bei der Leukämieentstehung handelt, da bei Patienten, bei
denen sowohl Material vom Zeitpunkt der Diagnose, der Remission und des
Rezidivs vorlag, die ursprüngliche Mutation in GATA2 nur noch bei einem von vier
Patienten im Rezidiv nachweisbar war (Fasan A. et al. 2013). Allerdings handelte
es sich hier lediglich um vier Patienten, sodass zur Klärung dieser Fragestellung
weitere Untersuchungen an größeren Kohorten folgen müssten.
- 22 -
1.15
Vorkommen von GATA2-Mutationen in Verbindung mit Syndromen
GATA2-Mutationen finden sich nicht ausschließlich bei CEBPAbi-AML-Patienten.
In
den
letzten
Jahren
wurden
GATA2-Mutationen
auch
bei
anderen
Krankheitsentitäten entdeckt, jedoch mit einer grundlegenden Gemeinsamkeit:
einer
Prädisposition
zur
Entwicklung
eines
MDS
oder
einer
AML.
In
Immundefizienzsyndromen wie dem MonoMAC-Syndrom und der fast identischen
DCML-Defizienz konnten Mutationen in GATA2 nachgewiesen werden (Dickinson
R. E. et al. 2011; Hsu A. P. et al. 2011). Beim MonoMAC-Syndrom handelt es sich
um ein Krankheitsbild mit Monozytopenie, B-Zell- und NK-Zell-Lymphopenie,
gehäuftem
Auftreten
von
mykobakteriellen
Infektionen,
typischerweise
Mycobacterium avium complex (MAC), sowie mykotischen und viralen Infektionen,
zytogenetischen
Prädisposition
Veränderungen,
zur
Entwicklung
pulmonaler
einer
alveolärer
myeloischen
Proteinosis
Leukämie.
und
Erstmals
beschrieben wurde dieses Syndrom von Vinh et al. 2010. Bei Patienten mit
MonoMAC-Syndrom konnten sowohl sporadisch aufgetretene Mutationen in
GATA2 als auch familiär auftretende, also hereditäre Mutationen nachgewiesen
werden (Hsu A. P. et al. 2011). Meist findet sich die Mutation in GATA2 auf dem
C-terminalen ZF oder direkt proximal davon (Hsu A. P. et al. 2011, Pasquet M. et
al. 2013).
Das Syndrom der DCML-Defizienz wird charakterisiert durch den Verlust an
dendritischen Zellen (DSs), Monozyten sowie B- und NK-Zellen mit konsekutiver
Anfälligkeit für mykobakterielle- und andere Infektionen sowie einer Prädisposition
zur Entwicklung myelodysplastischer Veränderungen bis hin zur Entwicklung einer
myeloischen Leukämie. In ca. 50% der Fälle zeigt sich ein autosomal-dominanter
Erbgang (Dickinson R. E. et al. 2011). Dickinson et al. konnten in einer Gruppe
aus 4 Patienten mit DCML-Defizienz Mutationen in GATA2 identifizieren; jeder der
4 Patienten trug eine unterschiedliche Mutation.
Des Weiteren sind GATA2-Mutationen für das Emberger-Syndrom verantwortlich.
Hierbei handelt es sich um ein sporadisch wie auch hereditär auftretendes
Syndrom mit einer charakteristischen Kombination aus primärem Lymphödem mit
Myelodysplasie mit oft rascher Transformation in eine AML. Hinzu kommen
Auffälligkeiten
wie
Immundysfunktion,
begleitet
von
einem
schweren
disseminierten Auftreten von Hautwarzen sowie Innenohrschwerhörigkeit. Tritt die
- 23 -
Krankheit familiär auf, folgt sie ebenfalls einem autosomal-dominanten Erbgang,
allerdings mit inkompletter Penetranz (Ostergaard P. et al. 2011).
Kürzlich wurden GATA2-Mutationen bei Patienten mit CML in der akzelerierten
Phase bzw. Blastenkrise identifiziert (Zhang S-J. et al. 2008), während sich diese
Mutationen in der chronischen Phase der CML nicht nachweisen ließen. Hier
wurde zum ersten Mal auch eine gain-of-function-Mutation in GATA2 beschrieben
(p.L359V) (Zhang S-J. et al. 2008).
Aufgrund der geringen Fallzahlen der verschiedenen Syndrome finden sich keine
Angaben über das Risiko, eine AML zu entwickeln oder über die Latenzzeit.
Systematische Untersuchungen von Verwandten erkrankter Patienten, deren
Mutation in GATA2 als sporadisch aufgetreten beschrieben wird, finden sich nicht.
Es ist nicht auszuschließen, dass weitere Patienten in den Familien eine
entsprechende Mutation tragen, ohne bislang erkrankt zu sein. Des Weiteren
verhindern ggf. kleine Familien die Detektion eines spezifischen Erbganges.
1.16
GATA2-Mutationen bei familiären MDS/AML
Keimbahnmutationen in GATA2 prädisponieren für die Entwicklung eines MDS
bzw. einer AML. GATA2-Keimbahnmutationen wurden bislang in 13 Familien
(Stand 2012) beschrieben, inklusive der Fälle mit gleichzeitiger Diagnose eines
MonoMAC-, DCML-Defizienz- oder Emberger-Syndroms (Bödör C. et al. 2012).
Häufig finden sich entweder eine Punktmutation (p.Thr354Met) oder eine Deletion
(p.Thr355del), die beide den C-terminalen Zinkfinger (ZF2), und hier insbesondere
einen hochkonservierten Threonin-repeat betreffen (Hahn C. N. et al. 2011). Es
handelt sich hierbei um heterozygote Mutationen, die wahrscheinlich zu einem
kompletten Funktionsverlust und damit einer Haploinsuffizienz für GATA2 führen
(Kazenwadel J. et al. 2012). Im Gegensatz dazu werden auch dominant-negative
Effekte der entstehenden Variante des mutierten Allels diskutiert (Hyde R. K. und
Liu P. P. 2011). In den bislang beschriebenen betroffenen Familien tragen alle an
AML-Erkrankten die Mutation in GATA2 (Hahn C. N. et al. 2011). In vielen
Familien agieren Mutationen in GATA2 mehr als ein prädisponierender Faktor für
die Erkrankung und weniger als ein direkter Auslöser. Assoziationen mit
Mutationen in CEBPA sind bislang für Patienten mit GATA2-Keimbahnmutation
- 24 -
nicht
beschrieben.
Es
finden
sich
einige
Mutationsträger,
die
keine
Krankheitssymptome (inkomplette Penetranz) entwickeln (Bödör C. et al. 2012).
Die klinische Heterogenität innerhalb einer Familie wie auch zwischen den
betroffenen Familien scheint durch Unterschiede in den zusätzlich erworbenen
Mutationen („second-hits“) begründet (Bödör C. et al. 2012). In allen Familien war
das Auftreten der Mutationen mit einer frühen Entwicklung eines MDS bzw. einer
AML vergesellschaftet. Darüber hinaus war das Auftreten dieser Mutationen mit
einer hohen, wenn auch inkompletten Penetranz, einem autosomal-dominanten
Erbgang und einer insgesamt schlechten Prognose verbunden, außer die
Patienten erhielten zeitnah eine allogene Stammzelltransplantation (Hahn C. N. et
al. 2011; Pasquet M. et al. 2013). GATA2-Mutationsanalysen sind im Hinblick auf
junge MDS-Patienten mit möglichen Geschwisterspendern vor einer allogenen
Stammzelltransplantation sinnvoll (Bödör C. et al. 2012).
1.17
Zielsetzung
Ziel der vorliegenden Arbeit war es, sowohl die Inzidenz von GATA2-Mutationen
als auch deren klinische Relevanz in einer großen Kohorte von CEBPA-mutierten
AML-Patienten zu untersuchen. Unser Fokus lag im Besonderen auf der Kohorte
der CEBPAbi-mutierten AML-Patienten und hier auf der Evaluation eines
möglichen zusätzlichen prognostischen Einflusses von GATA2-Mutationen.
Darüber hinaus untersuchten wir die bislang als sehr niedrig beschriebene
Frequenz an GATA2-Mutationen in einer größeren Kohorte von CEBPAsm-AMLPatienten. Ein weiterer Schwerpunkt lag auf der genauen Charakterisierung der
GATA2-Mutationen. Im Rahmen dieser Analyse führten wir zusätzlich Analysen
auf das Vorliegen von GATA2-Keimbahnmutationen durch. Schließlich sollte der
Genotyp CEBPAmut/GATA2mut im Hinblick auf klinische Charakteristika sowie im
Kontext mit anderen genetischen Aberrationen untersucht werden.
- 25 -
2
Patientenkollektiv, Material und Methoden
Liste der verwendeten Materialien inklusive Bezugsfirma
SuperaseIn (Rnase Inhibitor) (2500U)
0,5M EDTA, pH 8.0, 4x 100 ml
1 M Tris pH 8.0
10x BlueJuice Loading Buffer
10x Buffer with EDTA
1x TAE Puffer
5x Sequencing Buffer
Agarose for Routine, 500g
AllPrep DNA/RNA Mini Kit (50)
Alufolie extra breit/extra stark (Normale
Haushaltsfolie)
Aluminium Klebefolie Costar
Aqua ad iniectabilia Braun
BD Falcon™ Röhrchen konisch,
Polypropylen, 50 ml
BD-TIPS Sterile 0,5 ML Bio-Cert 1 *
100ST
BD-Tips, Brand, Volumen: 2,5 ml, Typ:
steril 1 * 100 ST
Beschriftungsgerät, 2450Dx
BigDye Terminator v3.1 Cycle
Sequencing Kit
Biosphere Filter Tip 10 µl, farblos
Biosphere Filter Tip 100 µl, gelb
Biosphere Filter Tip 20 µl, gelb
Biosphere Filter Tip 20µL farblos
Biosphere Filter Tip 200 µl farblos
Biosphere Filter Tips, 1250 µl, extra long
Biosphere Tip 2,5µL farblos
DEPC Treated Water
Digitalgraphicprinter, UP-D895HD
DNAzol Reagenz 100 ml
DyeEx 2.0 Spin Kit (250)
DyeEx 96 Kit (24)
Einkanalpipette 0,1 - 2,5 µl
Einkanalpipette 0,5 - 10 µl
Einkanalpipette 10 - 100 µl
Elektrophorese Kammer, A2 OWL
Separation Systems
Elektrophorese Kammer, B2 OWL
Separation Systems
Elektrophorese Kammer, HORIZON 11.4
- 26 -
Ambion
Invitrogen/Gibco (früher Ambion)
Ambion
Invitrogen
Applied Biosystems
Eigene Herstellung
Applied Biosystems
Sigma Aldrich
Qiagen
CATBUY
CORNING
Braun
BD
Brand
Brand
Brother
Applied Biosystems
SARSTEDT
SARSTEDT
SARSTEDT
SARSTEDT
SARSTEDT
SARSTEDT
SARSTEDT
Invitrogen
Syngene
Invitrogen
Qiagen
Qiagen
Eppendorf
Eppendorf
Eppendorf
Eppendorf
Eppendorf
Eppendorf
OWL
OWL
Gibco
Elektrophoresekammern mit Schlitten,
Schiene, Kabeln und Kämmen
Eppis 0,5mL
Eppis 1,5mL
Eppis 2,0mL
Erlenmeyerkolben Weithals 500mL
Essigsäure, 100%, ACS p.a.
Ethanol absolut puriss p.a.
GeneAmp 2700 Thermal Cycler
GeneAmp 2720 Thermal Cycler
Handschuhe,Unt.,Nitril,pf,unst. Gr.M
Handschuhe,Unt.,Nitril,pf,unst. Gr.S
Handy Step
Handy Step Electronic Ni/MH Battery
Pack
Hi-Di Formamide
ISO-SEPTOL 70% 500ML 1 FLA
Kanülenentsorgungsbox 4L
Kühlzentrifuge groß, Multifuge 4KR
Lab-Marker extra fein (schwarz)
Ladepuffer Orange G
Magnetrührer, IKAMAG REO
Magnetrührer, MR 3002 S 8
Magnetrührstäbchen
Micro Amp Optical 96-well
MicroAmp 8-Cap Strip
MicroAmp 8-Tube Strip
MicroAmp Clear Adhesive Films
Mikrowelle, HF24M241
Mini Zentrifuge, Combispin FVL-2400N
Mini Zentrifuge, PCV-2400
Mini Zentrifuge, PCV-2400
Nanodrop, ND1000 Spectrophotometer
Natriumacetat 3M, pH 5,5
Parafilm M 10cmx38m
Pipettenspitze farblose, 20 µl, 1.000
Stück, lose
Pipettenspitze gelb, 200 µl, zu 500 im
Beutel, lose
Platinum Taq Polymerase
QIAquick 96 PCR Purification Kit (24)
QIAquick 96 PCR Purification Kit (24)
Platten
QIAquick PCR Purification Kit (250)
QIAshredder (250)
Reaktionsgefäß 1,5ml, SafeSeal
Reaktionsgefäß 2,0ml SafeSeal
Reaktionsgefäße, 5 ml, natur
OWL Separation System
Eppendorf
Eppendorf
Eppendorf
VWR
Sigma Aldrich
VWR
Applied Biosystems
Applied Biosystems
Ansell GMBH
Ansell GMBH
Brand
Brand
Applied Biosystems
Apotheke
HELMUT SCHWARZ GMBH
Heraeus/ Thermo Electron
VWR
Eigene Herstellung
IKA Labortechnik
Heidolph
VWR
Applied Biosystems
Applied Biosystems
Applied Biosystems
Applied Biosystems
Siemens
Grant Instruments
Grant
KNF
Thermo Scientific / peqLab
Biotechnologie
Ambion
VWR
SARSTEDT
SARSTEDT
Invitrogen
Qiagen
Qiagen
Qiagen
Qiagen
SARSTEDT
SARSTEDT
Fisher Scientific
- 27 -
Reaktionsgefäß-Ständer 0,2 ml
Reaktionsgefäß-Ständer 1,5 ml
Rotilabo®-Eisbehälter, rund, 4 l Inhalt
etwa 4 l. Höhe 200 mm
SafeSeal Gefäß 0,5ml
Sequenzierer, 3500xL Dx
Skalpell einzeln verpackt #11
Thermoblock, 2099-DA
Thermoblock, QBD2
Thermomixer 5436
Tiefkühl-Gewebe-Schrank, Comfort
Tiefkühl-Gewebe-Schrank, TGS 4000
Typ 400681
Tiefkühlschrank -80°C, Hera freeze
Tischzentrifuge 5424
Tischzentrifuge, Galaxy Mini
TrackIt 100bp Ladder
TrackIt™ 1 Kb Plus DNA Ladder
Transferpette 8 electronic
Transferpipette-8-Kanal, Ladegerät,
Research pro
TRIS Molecular biology grade
TRIS pure Ph. Eur., USP
TRIzol Reagenz, 100 ml
UltraPure™ DEPC-Treated Water
(4x100ml)
Vakuumpumpe, PM20119-840.3
Veriti 96-well Thermal Cycler
Vortexer
Vortexer Reax 1 R
Vortexer REAX top
Waage
Zentrifuge, 5424 + Rotor F-45-18-11
2.1
VWR
VWR
ROTH CARL
SARSTEDT
Applied Biosystems
AESCULAP AG & CO
Liebisch
Grant
Eppendorf
Liebherr
Liebherr
Heraeus
Eppendorf
VWR
Invitrogen
Invitrogen
Brand
Eppendorf
AppliChem
AppliChem
Invitrogen
Invitrogen
Gibco
Applied Biosystems
VWR
Heidolph
Heidolph
Eppendorf
Patientenkollektiv mit CEBPA-Mutation
Das Einschlusskriterium für die folgenden Untersuchungen war das Vorliegen des
CEBPA-Mutationsstaus. Das untersuchte Patientenkollektiv bestand aus 202
AML-Patienten zwischen 18 und 78 Jahren, bei denen eine CEBPA-Mutation
vorlag, wobei 89 der Patienten CEBPAsm- und 113 Patienten CEBPAbi-mutiert
waren. Alle Patienten waren in eine von sechs AMLSG-Studien eingeschlossen
und somit intensiv chemotherapiert worden. 15 Patienten wurden in der Studie
AMLHD93 (Schlenk R. F. et al. 2003), 53 in der Studie AMLHD98A
(NCT00146120) (Schlenk R. F. et al. 2010), 13 in der Studie AMLHD98B (Schlenk
- 28 -
R. F. et al. 2006; Schlenk R. F. et al. 2009), 74 in der Studie AMLSG 07-04
(NCT00151242), 25 in der Studie AMLSG 06-04 (NCT00151255) und 22 im
Rahmen der Studie AMLSG 12-09 (NCT01180322) behandelt. Gemeinsam war
allen Patienten, dass sie zunächst eine intensive Doppelinduktionschemotherapie
erhielten,
gefolgt
von
1-3
Konsolidierungs-chemotherapien.
Je
nach
Studienkonzept und Verfügbarkeit eines HLA-identen Fremdspenders wurden die
Patienten
nach
einer
Konsolidierungschemotherapie
allogen
stammzelltransplantiert. Eine Übersicht der Therapieschemata zu den einzelnen
Studien findet sich im Anhang dieser Arbeit. Von den 202 AML-Patienten konnten
184 als de-novo AML und 13 als sekundäre bzw. therapieassoziierte AML
klassifiziert werden. Für 5 der Patienten lagen die entsprechenden Angaben nicht
vor. Die Verteilung der Karyotypen innerhalb der 202 Patienten mit CEBPAMutation sah folgendermaßen aus: 181 der Patienten hatten einen intermediaterisk-Karyotyp, 9 einen high-risk-Karyotyp (siehe Tab.3); bei insgesamt 12
Patienten konnte der Karyotyp nicht ausgewertet werden. 142 der Patienten mit
intermediate-risk-Karyotyp hatten einen normalen Karyotyp.
Tab. 3:
Darstellung
der
9 Patienten mit high-risk-Karyotyp.
(CEBPA =
CCAAT/enhancer binding protein alpha gene; CEBPA-Mutations-status: 1 =
CEBPA, single-mutiert; 2 = CEBPA, biallelisch-mutiert; ID =
Identifikationsnummer)
Studie
ID
AMLSG 12-09
112
AMLSG 12-09
AMLSG 12-09
06-04
157
6072
160
06-04
193
06-04
07-04
515
1036
07-04
1222
98A
982
G-Bänderung (Karyotyp)
44,XY,-5,add(6)(p25),inv(11)(p13q12),18,del(20)(q13.1q13.3)[7]
44,idem,idic(11)(p11)[4]
46,XY[1]
46,XX,del(5)(q13q33)[20]
50,XY,+8,+11,+12,+13[20]
45,XY,-7[12]/46,XY[5]
47,XX,del(9)(q21q22),+21[14]/48,XX,+13,+21[2]
/
48,XX,del(9)(q21q22),+13,+21[2]/48,XX,del(9)(q
21q22), +21,+21[3]
46,XX,del(5)(q22q31)
46,XY,t(6;11)(q27;q23)
46,XX,iso(17)(q10)[10]
46,XX[11]
46,XX,del(5)(q15q32),del(12)(p11)
- 29 -
CEBPA
Mutationsstatus
1
2
1
1
2
1
1
2
1
Die
Studienprotokolle
wurden
durch
die
jeweiligen
Ethik-Kommissionen
genehmigt. Außerdem lag für alle Patienten die Einwilligungserklärung zur
Therapie, zur Probengewinnung und –asservierung (Blut und Knochenmark)
sowie deren Verwendung für weitere Forschungszwecke (informed consent)
gemäß den Bestimmungen der Deklaration von Helsinki vor.
2.2
Patientenkollektiv mit definierten zytogenetischen Aberrationen
Zur Prüfung einer möglichen Korrelation zwischen Mutationen in GATA2 und
bestimmten zytogenetischen Veränderungen führten wir ebenfalls ein GATA2Mutationsscreening an 20 Patienten mit einer inv(3), 20 Patienten mit einer
Monosomie 7, 20 Patienten mit einer del(7q), 20 Patienten mit einer sekundären
AML und 15 Patienten mit einer t(9;11) durch. Alle 95 Patienten waren ebenfalls in
eine der sechs oben genannten AMLSG-Studien eingeschlossen: 2 in der
AMLHD93, 25 in der AMLHD98A, 15 in der AMLHD98B, 3 in der AMLSG 06-04
und 50 in der AMLSG 07-04.
2.3
Vergleichskollektiv
Um das Auftreten von GATA2-Mutationen bei Gesunden zu untersuchen, führten
wir GATA2-Mutationsanalysen an Leukozyten aus sog. buffy-coats durch. Hierzu
standen Proben von 23 gesunden Probanden zur Verfügung. Von allen
Probanden lag eine Einwilligungserklärung sowie das Einverständnis für die
Lagerung/Aufbewahrung und Analyse des Materials im Rahmen weiterer
Forschungsprojekte vor.
2.4
Materialherstellung
2.4.1
Herstellung von 1%igem und 2%igem Agarosegel
Zunächst werden 1,2 Gramm Agarose mit 120ml 1x-TAE-Puffer gemischt und in
der Mikrowelle erwärmt, bis die Agarose sich vollständig aufgelöst hat.
Anschließend wird die Agarose für etwa 10-15 Minuten mithilfe eines
- 30 -
Magnetrührers homogenisiert. Wenn die Agarose auf Handwärme abgekühlt ist,
wird sie langsam in die Gelkammer gegossen. Falls Luftblasen entstehen, können
diese vorsichtig mit einer Pipette entfernt werden. Anschließend wird ein 16zähniger Kamm in die mit Agarose befüllten Schlitten eingesetzt. Durch ihn
werden die Geltaschen geformt, in die später die Produkte geladen werden. Wenn
das Gel fest geworden ist, kann der Kamm vorsichtig entfernt, der Schlitten aus
der Schiene herausgenommen und die Gummiabdichtungen entfernt werden.
Anschließend wird der Schlitten mit dem Gel in die Elektrophoresekammer gelegt.
Die Herstellung von 2%igem Agarosegel erfolgt analog zur Herstellung von
1%igem Agarosegel mit 6 Gramm Agarose und 300ml 1x-TAE-Puffer unter
Verwendung einer großen Gelkammer.
2.4.2
Herstellung DNAse I – Inkubationsmix
550µl RNAse-freies Wasser zu der lyophilisierten DNAse I spritzen, DNAseFläschchen schütteln und in 1,5ml-Tubes in der gewünschten Menge aliquotieren.
Anschließend werden die Tubes kurz abzentrifugiert und bei -20° gelagert.
2.4.3
Herstellung von TAE-Puffer
Zur Herstellung von 50x-TAE-Puffer wird 242g Trizma base (Tris(hydroxymethyl)aminomethane) abgewogen, in 600ml Delta-Select-Wasser gelöst und 20 Minuten
mittels Magnetrührer homogenisiert. Unter dem Abzug werden anschließend 57ml
konzentrierte Essigsäure dazugegeben. Nach Hinzugabe von 100ml EDTA-Puffer
(bereits gebrauchsfertig vom Hersteller) wird mit Delta-Select-Wasser auf 1000ml
aufgefüllt und für weitere 10 Minuten gerührt. Der 50x-TAE-Puffer ist für insgesamt
6 Monate haltbar. Zur Herstellung von 1x-TAE-Puffer werden 100ml 50x-TAEPuffer in einem 5-Liter Messgefäß mit 4,9l frischem entsalztem Wasser vermischt.
Der 1x-TAE-Puffer ist ebenfalls für 6 Monate haltbar.
- 31 -
2.4.4
Herstellung von 1x-TE-Puffer
Für 50ml TE-Puffer werden 500µl 1M TRIS-Puffer und 10µl 0,5M EDTA-Puffer
gemischt und mit DEPC-Wasser auf 50ml aufgefüllt. Anschließend werden jeweils
1000µl in 1,5ml-Tubes aliquotiert. Der TE-Puffer ist drei Monate haltbar.
2.5
Methoden
2.5.1
Übersicht der angewandten Methoden
Dichtegradienten-
zentrifugation
DNA - Extraktion
PCR
Anreicherung
mononukleärer Zellen aus
Blut/Knochenmark mittels
Dichtegradientenzentrifugation
aus mononukleären Zellen
DNA-basierte PCR der
Exons 1-6
Aufreinigung
CSR
Aufreinigung
Sequenzierung
2.5.2
nach Sanger der
Exons 1-6
Materialgewinnung
Als Ausgangsmaterial diente je nach Verfügbarkeit entweder PB, gewonnen
mittels Venenpunktion, oder bevorzugt Knochenmarkblut, gewonnen durch eine
- 32 -
Knochenmarkpunktion (KMP) in der Regel aus dem Beckenkamm. Im günstigsten
Falle standen ca. 40ml PB und/oder 10-20ml KM-Blut zur Verfügung. Als
Antikoagulanz wurde in beiden Fällen Heparin verwendet. Die DNA-Extraktion
erfolgt aus den sogenannten mononukleären Zellen, die mittels Dichtegradientenzentrifugation angereichert werden. Als Medium verwendeten wir Ficoll, ein
Saccharose-Epichlorhydrin-Copolymer, das mit 1,077g/ml eine größere Dichte als
Lymphozyten und Monozyten, jedoch eine kleinere als Erythrozyten und
Granulozyten aufweist. In einem 50ml-Falcon wird Ficoll-Lösung vorgelegt, die
vorsichtig, ohne beide Schichten zu mischen, mit einer äquivalenten Menge PB
bzw. KM-Blut überschichtet wird. Dieser Ansatz wird für 30 Minuten bei 400g ohne
Bremse zentrifugiert, sodass sich folgende Schichten ausbilden können:
Plasma
Erythrozyten,
Granulozyten,
Thrombozyten
Debris
Abb. 3:
Ficoll
Auftrennung mononukleärer Zellen mittels Dichtegradientenzentrifugation (FB-LP-C 85, Arbeitsbereich C). Aufgrund ihrer Dichte sinken
Erythrozyten, Granulozyten, Thrombozyten und Zell-Debris auf den
Falcon-Boden. In der sogenannten Interphase zwischen dem Plasma
und dem Ficoll-Medium reichern sich die mononukleären Zellen an.
Erythrozyten, Granulozyten, Thrombozyten und Zell-Debris sinken aufgrund ihrer
größeren Dichte auf den Falcon-Boden. Die mononukleären Zellen reichern sich in
einer Schicht zwischen dem Ficoll-Medium und dem Plasma in der sogenannten
Interphase an, sichtbar als weißer Ring. Diese Phase kann mittels steriler
Pasteurpipette vorsichtig abgenommen und in ein neues Falcon überführt werden.
- 33 -
Zur Gewährleistung einer möglichst hohen Reinheit ist es bei diesem Schritt
besonders wichtig, so wenig Material wie möglich aus den umgebenden Schichten
mit abzuziehen. Nach Extraktion der Interphase erfolgen mehrere Waschschritte,
bis
schließlich
das
Zellpellet
zuletzt
mit
RPMI-Medium
(Fa.
Biochrom)
resuspendiert werden kann. Die Bestimmung der Zellzahl wurde mithilfe des
Zellzählgerätes Sysmex XS800i durchgeführt. Anschließend wird die Probe auf
2ml-Eppendorf-Tubes verteilt und beschriftet – im günstigsten Falle mit Zellzahlen
von jeweils 1x107 Zellen/Tube. Die Tubes werden bei 5000rpm für 5min
zentrifugiert, der Überstand abpipettiert und die Tubes bei -80°C weggefroren.
Hier können die entsprechenden Pellets dann zur DNA-Extraktion entnommen
werden.
2.5.3
DNA-Extraktion
Zur Mutationsanalyse für sowohl GATA2 als auch für CEBPA wurden DNAbasierte
Verfahren
verwendet.
Die
DNA-Extraktion
erfolgte
aus
den
mononukleären KM- bzw. PB-Zellen mithilfe des RNA/DNA-Extraktion AllprepKits©
(Quiagen,
Hilden).
Dieses
Kit
ermöglicht
die
gleichzeitige
und
standardisierte Isolierung und Aufreinigung von genomischer DNA und GesamtRNA
in
einem
Ansatz.
Die
extrahierten
DNA-Fragmente
haben
eine
durchschnittliche Größe von 15-30kb und sind somit gut geeignet für eine
anschließende PCR-Diagnostik.
Entsprechend der Probenanzahl wird ein Mix aus DNAse I und RDD-Puffer
erstellt; beide Reagenzien müssen auf Eis pipettiert werden. Dazu werden die
Volumina wie folgt berechnet:
Anzahl Proben x 10µl DNAse I = benötigtes Volumen
Anzahl Proben x 70µl RDD-Puffer = benötigtes Volumen Puffer
Für jede Probe müssen folgende Verbrauchsmaterialien bereitgestellt werden: 1 x
1,5ml- und 1 x 2,0ml-Safe-Seal-Tubes, 1 x QIAshredder (lila Säule), 1 x Allprep
DNA-Säule und eine RNeasy Mini-Säule.
- 34 -
Zur Lyse der Zellpellets werden bei einer Pelletgröße ≥0,5x10 7–1x107 Zellen 600µl
RLTplus-Puffer und bei einer Pelletgröße <0,5x107 Zellen 350µl in das Tube
pipettiert, mehrfach resuspendiert und kurz gevortext. Der RLTplus-Puffer, der
Guanidin-Isocthiocyanat enthält, ist ein stark denaturierendes Agens, das DNAsen
und RNAsen sofort inaktiviert, um die Isolierung einer intakten DNA sowie RNA zu
gewährleisten. Zusätzlich induziert der Puffer eine komplette Spaltung der
Membran der Zellen sowie ihrer Organellen, sodass die in ihr enthaltenen
Nukleinsäuren
freigesetzt
werden.
Anschließend
wird
das
Lysat
zur
Homogenisierung und Entfernung von Zell-Debris auf eine QIAshredder-Säule
überführt und bei 13000U/min für 3 Minuten zentrifugiert. Dieser Schritt ist
zusätzlich notwendig, um die durch die Lysierung bedingte erhöhte Viskosität
wieder herabzusetzen. Das erhaltene Lysat wird auf eine Allprep-DNAspin-Säule
überführt und erneut für 3 Minuten bei 13000U/min zentrifugiert. Diese Säule
erlaubt über ihre Matrix die selektive Bindung von DNA. Die Allprep-DNAspinSäule wird auf ein neues Collection-Tube gestellt und 500µl AW1-Puffer auf die
Säule pipettiert und bei 13000U/min für 1 Minute zentrifugiert. Der AW1-Puffer
enthält Guanidinhydrochlorid, ein chaotropes Salz, sodass noch im Lysat
enthaltene Proteine denaturiert und anschließend aus der Säule gespült werden.
Der Durchfluss aus dem Collection-Tube kann verworfen werden. Daraufhin
werden 500µl AW2-Puffer auf die Allprep-DNA-Säule pipettiert und für 2 Minuten
bei 13000U/min zentrifugiert, um noch verbliebene Salze aus der Lösung zu
waschen. Der Durchfluss aus dem Collection-Tube kann erneut verworfen werden.
Im
folgenden
Schritt
wird
die
Säule
bei
13000U/min
für
1
Minute
trockenzentrifugiert und anschließend auf ein neues steriles Elution-Tube gestellt.
Je nach Ausgangszellzahl wird die entsprechende Menge TE-Puffer auf die Säule
pipettiert, um die DNA aus der Matrix zu eluieren und ihre Degradation zu
verhindern, bei einer Zellzahl von 1x107 100µl TE-Puffer, bei einer Zellzahl von
0,9x107 90µl TE-Puffer usw.. Bei allen Zellzahlen ≤0,5x107 Zellen wird ein
Volumen von 50µl TE-Puffer verwendet. Dieser Ansatz muss bei Raumtemperatur
3 Minuten lang inkubieren. Anschließend wird ein letztes Mal für 1 Minute bei
13000U/min zentrifugiert und die im Eluat enthaltene DNA in 1,5ml-Safe-SealTubes überführt und beschriftet. Eine Qualitätskontrolle der extrahierten DNA
erfolgt mittels Gelelektrophorese. Hierzu werden 2µl 10x BlueJuice Loading Buffer
und 8µl RNAse-freies Wasser mit jeweils 2µl DNA gemischt. Zum Schluss erfolgt
- 35 -
die Konzentrationsbestimmung mittels spektrophotometrischer Messung am
NanoDrop. (AllPrep DNA/RNA Mini Handbook 11/2005, QIAGEN)
2.5.4
Produktkontrolle mittels Gelektrophorese (Herstellung s. Kapitel 2.4)
Die Proben werden mit einem Ladepuffer, bestehend aus einem Farbstoff und
Glycerol, in die Ladetaschen des Gels pipettiert und an den beiden jeweils außen
liegenden Geltaschen durch einen Längenstandard (1Kb-DNA-Ladder) flankiert.
Die Auftrennung erfolgt nach Fragmentgröße im elektrischen Feld, wobei sich die
Wandergeschwindigkeit der einzelnen DNA-Fragmente umgekehrt proportional zu
ihrer Molekülgröße verhält. Nukleinsäuremoleküle sind negativ geladen und
werden somit von der Anode angezogen. Als Setting werden eine Spannung von
100V, eine Stromstärke von 400mA über eine Zeit von 40 Minuten verwendet.
Durch die Färbung mit einem interkalierenden Farbstoff (hier: Ethidiumbromid)
können die DNA-Banden unter UV-Licht sichtbar gemacht werden. Einzelne
Ethidiumbromidmoleküle lagern sich im Abstand von 10 Basenpaaren (bp)
zwischen die Basen der Nukleinsäure an, wodurch sich das Anregungsspektrum
von Ethidiumbromid verändert, was wiederum die Fluoreszenz der Substanz bei
Anregung mit UV-Licht stark erhöht. Somit erscheinen die Stellen im Agarosegel,
an denen sich Nukleinsäuren befinden, heller. Hierbei ist die Lichtintensität
proportional zur vorliegenden DNA/RNA-Menge. Zur Färbung wird das Gel für ca.
20 Minuten in das Ethidiumbromid-Färbebad (Konzentration von 0,5μg/ml in
Wasser) gelegt und anschließend kurz im Wasserbad gespült und unverzüglich
auf den Transilluminator gelegt.
- 36 -
Abb. 4:
2.5.5
Beispiel einer Produktkontrolle, Geldokumentation. In den mit „M“
beschriebenen Geltaschen befindet sich der Längenstandard. Er
flankiert jeweils die Proben mit den Nummern 1-4. Auf der linken Seite
des Gels sieht man die aufgereinigte DNA, auf der rechten Seite die
RNA, wobei hier auch die Auftrennung in die verschiedenen
ribosomalen Untereinheiten zu erkennen ist (28S und 18S).
Konzentrationsbestimmung am NanoDrop
Die Konzentration der Nukleinsäuren wird spektrophotometrisch über die optische
Dichte λ=260nm (OD260), dem Absorbtionsmaximum von RNA und DNA,
gemessen. Eine OD260 von 1 entspricht bei der DNA einer Konzentration von
50µg/ml. Jeweils 1µl DNA je Probe werden am NanoDrop 1000 ND gemessen.
Der NanoDrop ist ein UV-Vis-Spektralphotometer (Wellenlängenbereich von 220750nm). Die Probe wird auf das Ende eines optischen Glasfaserkabels pipettiert
(siehe Bildteil 1). Schließlich wird ein zweites optisches Glasfaserkabel mit der
Lösung in Kontakt gebracht, sodass zwischen beiden Glasfaserenden eine
Flüssigkeitssäule entsteht (siehe Bildteil 2). Das Gerät stellt den Abstand zwischen
beiden Faserenden exakt auf einen Lichtweg von 1mm bzw. 0,2mm ein (siehe
- 37 -
Bildteil 2 und 3). Als Lichtquelle wird eine gepulste Xenonlampe verwendet. Zur
Analyse des durch die Probe hindurchtretenden Lichts dient ein linearer Chargecoupled Device (CCD) Chip.
Abb. 5:
Schema NanoDrop. Die Probe wird auf das Ende eines optischen
Glasfaserkabels pipettiert (siehe Bildteil 1). Das zweite optische
Glasfaserkabel wird mit der Lösung in Kontakt gebracht, wodurch
zwischen beiden Glasfaserenden eine Flüssigkeitssäule entsteht (siehe
Bildteil 2). Der Abstand zwischen beiden Faserenden wird vom Gerät
exakt auf einen Lichtweg von 1mm bzw. 0,2mm eingestellt (siehe
Bildteil 2 und 3). (SOP-GEC1, Arbeitsbereich C)
Zur Initialisierung bzw. Kalibrierung des Gerätes werden zuerst 1-1,5µl Aqua dest.
auf den unteren Probenteller pipettiert und gemessen. Anschließend wird der
Probenteller
mit
einem
fusselfreien
Tuch
kurz
abgewischt
und
die
Leerwertmessung (Blank) mit 1µl TE-Puffer initiiert. Danach können die Proben
der Reihe nach gemessen werden. Nach jeder Probe muss der Probenteller
wieder mit einem fusselfreien Tuch gereinigt werden. Am Schluss jeder Messreihe
muss erneut der Leerwert gemessen werden, der < 2ng/µl liegen muss.
- 38 -
2.5.6
Polymerase Kettenreaktion/Chain Reaction (PCR)
2.5.6.1 Prinzip
Die PCR setzt sich aus den drei folgenden Schritten zusammen: Denaturierung
der Template-DNA durch Hitze, Anlagerung der Oligonukleotid-Primer an die
Einzelstrang-Zielsequenz und Verlängerung (Elongation) der angelagerten Primer
mittels einer hitzestabilen DNA-Polymerase (Taq-Polymerase)
anhand des 2.
DNA-Stranges, der als Matrize fungiert, und somit Amplifikation der Zielsequenz.
Die Temperatur, bei welcher Doppelstrang-DNA denaturiert, ist abhängig von
deren GC-Gehalt: Je höher der GC-Gehalt ist, desto höher muss die Temperatur
zur Denaturierung gewählt werden. Je länger die zu amplifizierenden DNAFragmente sind, desto länger muss die Dauer dieses Schrittes im Ablauf der PCR
gewählt werden. Die Taq-Polymerase kann Temperaturen von 94-95°C bis zu 30
Minuten lang tolerieren, ohne selbst zu denaturieren. Im ersten Zyklus wird in der
Regel eine längere Zeitspanne für die Denaturierung gewählt, zum Beispiel 5
Minuten bei 95°C, um eine vollständige Aufspaltung in Einzelstrang-DNA
sicherzustellen. Des Weiteren werden Oligonukleotidprimer benötigt, die an den
DNA-Einzelsträngen am 3‘-Ende der Sequenz, die amplifiziert werden soll, jeweils
die Startpunkte der DNA-Synthese festlegen. Die Wahl der Temperatur zur
Primerhybridisierung (Annealing) ist entscheidend: Wird die Temperatur zu hoch
gewählt, binden die Primer unvollständig; wählt man sie zu niedrig, binden die
Primer unspezifisch an anderen Sequenzstücken außerhalb der Ziel-Sequenz. Die
Annealing-Temperatur wird in der Regel 3-5°C niedriger gewählt als die
Schmelztemperatur der Primer, bei der diese sich von der DNA lösen würden. Zur
Bestimmung der optimalen Annealing-Temperatur bietet sich eine Testreihe aus
verschiedenen PCR-Ansätzen an, bei denen Temperaturen zwischen 2-10°C
unterhalb der Schmelztemperatur ausgetestet werden. Mithilfe eines PCRGerätes, das in der Lage ist, sogenanntes Gradient-Cycling durchzuführen, lassen
sich solche Testreihen zur Bestimmung der optimalen Annealing-Temperatur mit
erheblich weniger Zeitaufwand durchführen. Für den nächsten Schritt werden
äquimolare Mengen von dNTPs benötigt, die als Substrate der DNA-Polymerase
für die Synthese eines neuen DNA-Stranges dienen. Die Amplifikation findet nahe
des Temperaturoptimums der DNA-Polymerase statt. Dies bedeutet für die TaqPolymerase
eine
Temperatur
zwischen
- 39 -
72-78°C;
hier
beträgt
die
Polymerisierungsrate der Taq-Polymerase ca. 2000 Nukleotide/Minute. Zur
Entfaltung ihrer vollen katalytischen Aktivität benötigt die DNA-Polymerase freie,
divalente Kationen, in der Regel Mg2+. Da sowohl dNTPs als auch die Primer Mg2+
binden, muss die Mg2+-Konzentration die Konzentration der im Ansatz enthaltenen
Phosphatgruppen der Primer und dNTPs übersteigen. Die optimale Mg2+Konzentration muss empirisch für jede Primer-Konstellation ermittelt werden. Ein
Tris-Cl-Puffer mit einem pH-Wert zwischen 8,3 und 8,8 bei Raumtemperatur wird
einer Standard-PCR in einer Konzentration von 10mM hinzugefügt. Bei einer
Temperatur von 72°C fällt der pH-Wert auf ca. 7,2 ab. Zusätzlich enthält dieser
Standardpuffer Kaliumchlorid (KCl) in einer Konzentration von 50mM, was optimal
für die Amplifikation von Fragmenten einer Größe von >500bp ist. Wird die KClKonzentration auf 70-100mM erhöht, verbessert sich in der Regel die Ausbeute
bei einer Amplifikation kleinerer Segmente. Nach Erreichen eines Reaktionsgleichgewichtes läuft die Reaktion fort, bis einer der Reaktionspartner verbraucht
ist. Zu diesem Zeitpunkt ist die Ausbeute an amplifiziertem Produkt maximal,
während nicht-spezifische Produkte kaum zu detektieren sind. Dies tritt nach ca.
30 Amplifikations-Zyklen ein. Mindestens 25 Zyklen sind notwendig, um eine
akzeptable Menge an amplifiziertem Produkt zu erreichen.
2.5.6.2 Primer
Hauptziel beim Erstellen der Primer ist es, hochspezifische Primer zu
konstruieren, die stabil an ihre komplementäre Zielsequenz binden. Dabei gilt die
Faustregel,
dass
ein
Primer
umso
spezifischer
ist,
je
länger
seine
Oligonukleotidsequenz ist. Aufgrund sich wiederholender Abschnitte können nicht
mehr als 85% des Genoms zielgenau abgedeckt werden, auch wenn die Primer
20 oder mehr Nukleotide lang sind. Die in dieser Arbeit verwendeten Primer
wurden über die Firma Eurofins MWG Synthesis GmbH bezogen und für die
kodierenden Exons 2-6 ausgewählt. Auf die Sequenzierung von Exon 1 wurde
verzichtet, da Exon 1 nicht für die wesentlichen Domänen von GATA2 kodiert. In
diesem Reaktionsansatz wurde aus der Primerstockkonzentration von 100pmol/µl
eine Primerverdünnung von 10pmol/µl hergestellt (z.B. 10µl der Primerstocklösung
mit 90µl Aqua dest.).
- 40 -
Tab. 4:
Sequenz der verwendeten GATA2-Primer. (A = Adenin, C = Cytosin, G =
Guanin, T = Thymin; 2-6F = Vorwärts-Primer Exons 2-6; 2-6R = RückwärtsPrimer Exons 2-6)
GATA2_exon-2F
GATA2_exon-2R
GATA2_exon-3F
GATA2_exon-3R
GATA2_exon-4F
GATA2_exon-4R
GATA2_exon-5F
GATA2_exon-5R
GATA2_exon-6F
GATA2_exon-6R
Exon-2
Exon-3
Exon-4
Exon-5
Exon-6
5‘-ACACCTCGTGGTGGGACTT-3‘
5‘-CGCCTGGGTTCTCATCAC-3‘
5‘-CTGGTTCTGGGAGTCGTGAT-3‘
5‘-ATCTGGGAAACCAACACTGC-3‘
5‘-GACTCCCTCCCGAGAACTTG-3‘
5‘-GCGTCTGCATTTGAAGGAGT-3‘
5‘-TTAGCCCTCCTTGACTGAGC-3‘
5’-AGCCAAGCTGGATATTGTGG-3‘
5‘-GTTGCTGGAGGAAGGAACTG-3‘
5‘-AACTGTCCATGCAGGAAACC-3‘
N-Terminus
C-Terminus
Primer 2F/2R
Ex1
Ex2
Primer 3F/3R
Primer 4F/4R
Ex3
Ex4
ZF1
Abb. 6:
Primer 5F/5R
Primer 6F/6R
Ex5
Ex6
ZF2
Schematische Darstellung der Primer-Lokalisation im kodierenden
Bereich von GATA2. Die einzelnen Rechtecke symbolisieren wieder die
Exons 1-6. Bei den Exons 4-6 sind darüber hinaus die
Aminosäurenabschnitte dargestellt, für die die jeweiligen Exons
kodieren. Die beiden Pfeile symbolisieren die beiden Zinkfinger ZF1
und ZF2 und zeigen auf, welche Exons bzw. welche
Aminosäurenabschnitte für die Zinkfinger kodieren. Über den
Rechtecken sind jeweiligen Primer farblich hinterlegt. (aa = Aminosäure;
Ex1-6 = Exon 1-6; ZF1 und 2 = Zinkfinger 1 und 2; 2-6F = Vorwärts-Primer; 26R = Rückwärts-Primer)
- 41 -
2.5.6.3 Reaktionsansatz und PCR-Bedingungen
In diesem PCR-Ansatz wurde die Plantinum Taq der Firma Invitrogen verwendet.
Bei diesem Enzym handelt es sich um eine rekombinante Taq-Polymerase, die mit
Pyrococcus GB-D-Polymerase versehen ist, welche „proofreading“-Eigenschaften
besitzt, und einem Platinum Taq-Antikörper, der die Polymerase-Aktivität bis zum
ersten Denaturierungsschritt hemmt. Während der ersten Denaturierung wird der
Antikörper zerstört und das Enzym kann seine Aktivität entfalten. Dadurch ist ein
sogenannter „hot start“ des Enzyms gewährleistet, wodurch Sensitivität, Spezifität
und Ausbeute erhöht werden.
Jeder PCR-Reaktionsansatz von insgesamt 25µl enthielt die jeweils folgenden
Komponenten:

18,25µl Aqua dest.

2,5µl 10x PCR Puffer

0,75µl MgCl

0,25µl dNTPs 25mM

1µl Primer Forward

1µl Primer Reverse

0,25µl Platinum Taq

1µl Template-DNA
Master-Mix
Mit diesem gewählten Ansatz zeigte sich für das Primer-Paar 6F/6R eine
unspezifische zweite Bande in der Gelelektrophorese sowie ein hohes
Untergrundsignal in der abschließenden Sequenz.
- 42 -
Abb. 7:
Beispiel einer Produktkontrolle von Exon 6 mit Nachweis einer
unspezifischen zusätzlichen Bande bei den Proben 1 und 3. Probe 2
zeigt eine regelrechte Bande in der Kontrolle, während die PCR von
Probe 4 nicht funktioniert hat und sich keine Bande in der
Gelelektrophorese darstellt. (PCR = Polymerasekettenreaktion)
Zur Verbesserung der Spezifität erfolgten Testreihen, die zum einen veränderte
Zusammensetzungen im Master-Mix und zum anderen veränderte PCR-Settings
mittels Gradient-Cycling prüften. Für das Primer-Paar 6F/6R wurden letztlich
jeweils eine um 50% geringere Primerkonzentration und eine um 2°C höhere
Annealing-Temperatur verwendet.
Zu jedem Master-Mix wurde pro PCR ein Ansatz ohne Template-DNA als
Negativkontrolle (no-template-control/NTC) mitgeführt. Je nach Probenanzahl
wurden zunächst jeweils 1µl Template-DNA in 8er-Cup-Stripes oder 96-WellPlatten vorgelegt und mittels Mehrfachdispenser (HandyStep®) der jeweilige
Master-Mix hinzupipettiert. Nach Verschließen der Wells mit Deckeln wurden die
Stripes/Platten in einen Termocycler überführt und folgende Setting gewählt:
- 43 -
Tab. 5:
PCR-Bedingungen für die Amplifikation der Exons 2-5.
(PCR = Polymerasekettenreaktion)
Tab. 6:
Initiale Denaturierung
95°C 5 Minuten
Denaturierung
95°C 30 Sekunden
Annealing
58°C 30 Sekunden
Elongation
72°C 30 Sekunden
Finale Elongation
72°C 5 Minuten
35
Zyklen
PCR-Bedingungen für die Amplifikation von Exon 6.
(PCR = Polymerasekettenreaktion)
Initiale Denaturierung
95°C 5 Minuten
Denaturierung
95°C 30 Sekunden
Annealing
60°C 30 Sekunden
Elongation
72°C 30 Sekunden
Finale Elongation
72°C 5 Minuten
35
Zyklen
Die Produktkontrolle erfolgte ebenfalls mittels Gelelektrophorese (s. Kapitel 2.5.4)
mit einem 2%igen Agarosegel (Herstellung s. Kapitel 2.4)
Abb. 8:
Beispiel einer Produktkontrolle von Exon 6 nach PCR-(
Polymerasekettenreaktion)-Amplifikation mit modifiziertem PCR-Setting.
In den Geltaschen 1-6 befindet sich das Produkt nach PCRAmplifikation von Exon 6. In den mit „M“ bezeichneten Geltaschen
befindet sich der Längenstandard, anhand dessen die ungefähre Größe
der Produkte bestimmt werden kann. Zum Ausschluss möglicher
Verunreinigungen im Master-Mix wird zusätzlich die NTC (no-template
- 44 -
control) mitgeführt, in der lediglich der Master-Mix und kein
Patientenmaterial enthalten ist. An der Position der NTC darf keine
Bande im Gelbild zu sehen sein.
2.5.7
Aufreinigung zur Cycle Sequencing Reaction (CSR)
2.5.7.1 Prinzip, Aufreinigung im kleinen Ansatz sowie Aufreinigung einer 96Well Platte
Nach der Produktkontrolle erfolgt eine Aufreinigung der PCR-Produkte mithilfe des
QIAquick PCR-Purification-Kits©, das zur Aufreinigung von Einzel- oder
Doppelstrang-PCR-Produkten der Größe von 100bp bis 10kb verwendet werden
kann. Diese Aufreinigung dient der Entfernung von Unreinheiten nach der PCR.
Zur weiteren Aufreinigung folgen Waschschritte, die weitere Unreinheiten wie
Salze, Reste des Enzyms, Reste von Primern, ungebundene Nukleotide und
Detergenzien auswaschen. In dieser Arbeit erfolgte die Aufreinigung entweder im
kleinen Ansatz oder in der 96-Well-Platte mithilfe des QIAquick 96-PCRPurification-Kit© (QIAquick® Multiwell PCR Purification Handbook, 09/2003).
Zur Aufreinigung im kleinen Ansatz werden 200µl PB-Puffer in die jeweiligen PCRTubes pipettiert, der Ansatz durch mehrfaches Pipettieren gemischt und
anschließend auf die Säule überführt, ohne diese zu berühren. Dieser Ansatz wird
bei 13000rpm für eine Minute zentrifugiert. Nach diesem Schritt kann das Eluat
verworfen werden. Anschließend werden 700µl PE-Puffer (Waschpuffer) auf die
Säule pipettiert und der Ansatz ebenfalls für eine Minute bei 13000rpm
zentrifugiert. Das Eluat kann ebenfalls verworfen werden. Daraufhin wird der
Ansatz bei den gleichen Einstellungen trockenzentrifugiert, um den restlichen
Puffer zu entfernen, das Eluat verworfen und ein neues Auffangtube unter die
Säule gestellt. Die anschließende Elution der DNA funktioniert am effizientesten
unter
basischen
Bedingungen
und
einer
niedrigeren
Salzkonzentration,
gewährleistet durch den EB-Puffer. Eine maximale DNA-Ausbeute erhält man bei
pH-Werten zwischen 7,0 und 8,5.
Es werden 30µl EB-Puffer auf die Säule
pipettiert, wobei es bei diesem kleinen Volumen besonders wichtig ist, die
gesamte Menge genau auf die Mitte der Säule zu pipettieren. Dieser Ansatz muss
für eine Minute inkubieren, damit die DNA sich wieder vollständig von der
Membran lösen kann, und anschließend erneut bei 13000rpm für eine Minute
- 45 -
zentrifugiert werden. Die aufgereinigte DNA ist nun im Eluat enthalten.
Abschließend wird das Eluat in ein 1,5ml-Tube überführt und kann kurzzeitig bei
4°C oder langfristig bei -20°C gelagert werden.
Im Unterschied zur Aufreinigung im kleinen Ansatz kommt bei der Aufreinigung
einer 96-Well-Platte eine Vakuumpumpe zum Einsatz, welche die Proben mittels
Unterdruck durch die Säule zieht. Das optimale Vakuum liegt zwischen -100 bis 600mbar bzw. -75 bis -450mmHg. Unter der Platte befindet sich ein Auffanggefäß,
sodass der mehrfache Wechsel von Collection-Tubes wegfällt. Sind nicht alle
Wells mit Proben belegt, müssen diese, z.B. mittels einer Folie, verschlossen
werden, damit sich das Vakuum aufbauen kann. In diesem Kit wurde der PBPuffer gegen den PM-Puffer ausgetauscht, der neben den oben genannten
Eigenschaften
des
PB-Puffers
ermöglicht,
PCR-Volumina
bis
zu
250µl
aufzureinigen. Zu Beginn werden 75µl PM-Puffer mittels Mehrkanalpipette auf die
PCR-Produkte gegeben, diese, wie bei der Aufreinigung des kleinen Ansatzes,
mehrfach gemischt und anschließend auf die Säulen überführt. Durch kurzes
Anschalten der Vakuumpumpe wird dieser Ansatz durch die Säulen gezogen,
wobei es bei diesem Schritt wichtig ist, zu überprüfen, dass das gesamte Volumen
hindurchgezogen wurde, bevor das nächste Reagenz hinzupipettiert wird. Im
folgenden Schritt werden mithilfe eines Mehrfachdispensers 750µl PE-Puffer in die
Wells pipettiert und anschließend durch die Säule gezogen. Danach wird die
Vakuumpumpe für 10 Minuten angestellt, was dem Waschen und anschließenden
Trockenzentrifugieren
Anschließend
wird
der
die
Aufreinigung
Platte
im
zusätzlich
kleinen
kurz
Ansatz
ausgeklopft,
entspricht.
um
letzte
Flüssigkeitsreste zu entfernen, und auf eine 96-Well-Platte (VWR) gestellt. Mithilfe
eines elektronischen Mehrfachdispensers werden nun 40µl EB-Puffer in die Wells
pipettiert und bei 3800rpm für 6 Minuten zentrifugiert. In den Wells der VWR-Platte
befindet sich nun die aufgereinigte DNA. Die weitere Lagerung erfolgt unter oben
genannten Bedingungen.
- 46 -
2.5.8
Cycle Sequencing Reaction (CSR) und Sequenzierung nach Sanger
2.5.8.1 Prinzip der CSR und der Sequenzierung
Zur Sequenzierung der Genabschnitte verwendeten wir die Methode nach Sanger
(Sanger F. et al. 1977). Bei der Cycle Sequencing Reaction (CSR) handelt es sich
um eine sogenannte Kettenabbruch-Reaktion. Vergleichbar mit der PCR besteht
sie aus folgenden Schritten: Denaturierung der Template-DNA, Anlagerung
(Annealing)
der
Oligonukleotidprimer
und
Verlängerung
(Elongation)
der
angelagerten Primer mit Nukleotiden mithilfe einer Polymerase. Der Primer bindet
an das 3‘-Ende der nach Denaturierung entstandenen Einzelstrang-DNA. Die
DNA-Polymerase bindet an den Primer und synthetisiert den komplementären
DNA-Strang.
Im
Unterschied
zur
PCR
werden
dem
Ansatz
Didesoxyribonukleosidtriphosphate (ddNTP) hinzugefügt, denen die OH-Gruppe
am 3’-Ende fehlt, die der Bildung von Phosphodiester-Bindungen und somit der
Verknüpfung zwischen zwei Nukleotiden dient. Wird also zufällig statt eines
„normalen“ dNTPs ein ddNTP in den fortlaufenden DNA-Strang integriert, kommt
es zum Kettenabbruch. In dieser Arbeit wurde die CSR-Methode mit am 3’-Ende
fluoreszenz-markierten ddNTPs verwendet. Der Vorteil dieser Methode liegt darin,
dass keine 4 verschiedenen Ansätze, sondern lediglich ein einziger Ansatz
benötigt wird. Da jedes Fragment auf eine fluoreszenz-markierte Base endet, kann
die gesamte Sequenz des Genabschnittes über eine Kapillar-Elektrophorese
aufgeschlüsselt werden. Als Fluoreszenzfarbstoffe werden Dichlororhodamine
verwendet, die den Vorteil haben, dass sich ihre maximalen Wellenlängenspektren
weniger überlappen, was insgesamt ein saubereres, akkurateres Ergebnis mit
weniger Störsignalen gewährleistet. (BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing
Kit, Copyright 2002, Applied Biosystems; Sanger Sequencing Chemistry © 2013
Life Technologies Corporation)
- 47 -
Abb. 9:
CSR mit fluoreszenzmarkierten ddNTPs (Electrophoresis with Sanger
Sequencing, ©2015 Thermo Fisher Scientific, Inc. Used under permission,
www.lifetechnologies). Nach Denaturierung der Template-DNA lagern sich
die Primer in der Annealing-Phase an die Template-DNA an. Mithilfe
der DNA-Polymerase wird der komplementäre Strang synthetisiert.
Neben
den
„normalen“
Nukleotiden
befinden
sich
auch
Didesoxyribonukleosid-triphosphate (ddNTP) im Ansatz. Wird zufällig
statt eines „normalen“ dNTPs ein ddNTP in den fortlaufenden DNAStrang integriert, kommt es zum Kettenabbruch. Die dabei
entstehenden Produkte unterscheiden sich in genau einer Base und
enden jeweils auf eine fluoreszenzmarkierte Base. Jede der 4 Basen ist
mit einem unterschiedlichen Farbstoff markiert, symbolisiert durch die 4
farbigen Kugeln (grün, blau, gelb, rot) an den 4 Basen (Adenin, Cytosin,
Guanin und Thymin). (CSR = Cycle Sequencing Reaction; A = Adenin, C =
Cytosin, G = Guanin, T = Thymin)
Die eigentliche Sequenzierung erfolgt anhand der Methode einer KapillarElektrophorese. Hier werden die Produkte aus der CSR nach einer weiteren
Aufreinigung elektrokinetisch in die mit Polymer gefüllten Quarzglas-Kapillaren des
Sequenzierers injiziert. Hierzu wird an den Kapillaren, die in die Probengefäße
eintauchen, ein Strom angelegt, um Ionen und damit auch die fluoreszenzmarkierten DNA-Fragmente in die Kapillaren zu ziehen, ohne dass ein messbares
Volumen verbraucht wird (Electrophoresis with Sanger Sequencing, ©2013 Life
Technologies Corporation).
- 48 -
Abb. 10: Fluoreszenz-markierte DNA Fragmente wandern durch die Kapillare
(Electrophoresis with Sanger Sequencing, ©2015 Thermo Fisher Scientific, Inc. Used
under permission, www.lifetechnologies)
Kurz vor Erreichen der Anode passieren die fluoreszenz-markierten DNAFragmente
einen
Festkörper-Dioden-Laser-Strahl.
Hierdurch
werden
die
Fluoreszenzfarbstoffe angeregt und emittieren die aufgenommene Energie, die
dann mithilfe einer Charge-Coupled-Device(CCD)-Kamera optisch detektiert
werden kann. Die 4 verschiedenen Farbstoffe emittieren Licht unterschiedlicher
Wellenlängen, weshalb sie – und damit auch die verschiedenen Basen – zu
unterscheiden sind. Mithilfe einer speziellen Software werden die Signale
gespeichert und schließlich in ein vierfarbiges Elektropherogramm verrechnet.
Mithilfe der Kapillar-Elektrophorese können DNA-Moleküle aufgetrennt werden,
die sich nur in einem Nukleotid unterscheiden, sodass letztlich detektiert werden
kann, an welcher Position der DNA-Sequenz sich welche Base befindet.
Abb. 11: Schema: Fluoreszenz-markierte DNA-Fragmente passieren Laser und
optischen Detektor. Im Spannungsfeld zwischen Anode und Kathode
werden Ionen und mit ihnen die fluoreszenz-markierten DNAFragmente in die Kapillare gezogen. Sie werden durch einen Laser
angeregt und emittieren die aufgenommene Energie, die optisch
detektiert wird. Die Basen emittieren dabei Licht unterschiedlicher
Wellenlänge, wodurch sie unterschieden werden. Mithilfe einer
speziellen Software werden die Signale schließlich in ein vierfarbiges
- 49 -
Elektropherogramm verrechnet. (Electrophoresis with Sanger Sequencing,
©2015 Thermo Fisher Scientific, Inc. Used under permission, www.lifetechnologies)
2.5.8.2 Reaktionsansatz und CSR-Bedingungen
In dieser Arbeit wurde das BigDye-Termination v.3.1. Cycle-Sequencing-Kit von
(Invitrogen©) verwendet, das alle notwendigen Reagenzien enthält. Hinzugefügt
werden müssen lediglich die zu sequenzierende Template-DNA und die
entsprechenden Oligonukleotidprimer. Hier konnten die Primer-Stocklösungen
analog des PCR-Ansatzes verwendet werden. Um ein ständiges Auftauen des
BigDyes zu vermeiden, müssen die gesamten Pipettierarbeiten für den CSRAnsatz auf Eis erfolgen. Da der BigDye lichtempfindlich ist, müssen die
Pipettierarbeiten zusätzlich unter lichtgeschützten Bedingungen (z.B. in Alufolie)
erfolgen.
Jeder CSR-Reaktionsansatz von insgesamt 15µl enthielt die jeweils folgenden
Komponenten:

10 µl Aqua dest.

1µl Primer Forward oder Reverse

1µl 5x Sequencing Buffer

2µl Big Dye

1µl aufgereinigte Template-DNA
Master-Mix
Aufgrund seiner Größe wurde Exon 3 sowohl vorwärts als auch rückwärts
sequenziert, um alle kodierenden Bereiche exakt darstellen zu können. Zu jedem
Master-Mix wurde pro CSR ein Ansatz ohne Template-DNA als Negativkontrolle
(NTC) mitgeführt. Je nach Probenanzahl wurden zunächst jeweils 1µl TemplateDNA
in
8er-Cup-Stripes
und
96-Well-Platten
vorgelegt
und
mittels
Mehrfachdispenser zu dem Master-Mix hinzupipettiert. Nach Verschließen der
Wells mit Deckeln wurden die Stripes/Platten in einen Termocycler überführt und
folgendes Setting gewählt:
- 50 -
Tab. 7:
CSR-Bedingungen der Exons 2-6. (CSR = Cycle Sequencing Reaction)
Initiale Denaturierung 96°C
2 Minuten
Denaturierung
95°C
15 Sekunden
Annealing
55°C
1 Minuten
Elongation
60°C
3 Minuten
Finale Elongation
10°C
10 Minuten
30
Zyklen
2.5.8.3 Aufreinigung der CSR-Produkte zur Sequenzierung
Die Aufreinigung zur Sequenzierung erfolgte je nach Probenanzahl mithilfe des
DyeEx-2.0-Spin-Kit oder des DyeEx-96-Kit von Qiagen. Beide Kits dienen der
schnellen Entfernung von übrig gebliebenen fluoreszenz-markierten ddNTPs (DyeTerminators). Die Aufreinigung erfolgt mittels Gelfiltrationschromatographie, also
nach Gewicht. Die Dye-Terminators diffundieren in die im Gel enthaltenen Poren
und werden zurückgehalten, während die DNA-Fragmente größer sind als die
Poren und ungehindert durchfließen können. Das optimale Probenvolumen liegt
bei 10-20µl (Handbuch für DyeEx 2.0 Spin Kit und DyeEx 96 Kit, Qiagen 05/2012).
- 51 -
Abb. 12: Schema der Aufreinigung zur Sequenzierung. Durch die im Gel
enthaltenen Poren werden die Dye-Terminators, symbolisiert durch rote
Kugeln, zurückgehalten, während die DNA, symbolisiert durch blaue
Linien, durch ihre Größe nicht in die Poren passt und das Gel
ungehindert passieren kann. (DyeEx™ Handbook 2.0 Spin Kit, DyeEx 96 Kit,
Qiagen 05/2012)
Zur Aufreinigung weniger Proben wurde das DyeEx-2.0.-Spin-Kit verwendet. Die
im Kit enthaltenen Gelsäulen müssen zunächst gevortext werden, um die im Gel
befindlichen Festbestandteile zu resuspendieren. Um die Bildung eines Vakuums
zu verhindern, werden die Deckel durch ca. eine ¼-Drehung leicht gelockert und
der untere Flügel der Säule wird schließlich abgebrochen.
Schließlich stellt man jeweils ein 2ml-Auffangtube unter die Säulen und
zentrifugiert diese für 3 Minuten bei 3000rpm. Der Durchfluss kann verworfen
werden. In der Säule hat sich nun eine feste Gel-Matrix mit einer Schräge
ausgebildet. Nachdem man ein neues 2ml-Auffangtube unter die Säulen gestellt
hat, werden die CSR-Produkte auf die Mitte der Säulen pipettiert, ohne diese zu
berühren.
Dieser Ansatz wird erneut für 3 Minuten bei 3000rpm zentrifugiert. Das Eluat
enthält schließlich die aufgereinigte DNA, die in ein 1,5ml-Eppendorf-Tube
überführt und bis zum Gebrauch bei -20°C gelagert wird. Zur Sequenzierung muss
- 52 -
die gesamte Probenmenge in jeweils ein Well einer 96-Well-Platte überführt und
5µl Formamid hinzugefügt werden.
Zur Aufreinigung mehrerer Proben wurde das DyeEx-96-Kit verwendet, bei dem
die Gele in den 96-Wells einer Platte untergebracht sind. Um die Gele nicht zu
zerstören, müssen die Platten vorsichtig aus den Folien gelöst werden. Die
DyeEx-Platte wird auf eine im Kit mitgelieferte Auffangplatte gestellt, für 6:30
Minuten bei 2350rpm mit stark reduzierter Bremskraft zentrifugiert
und
anschließend auf eine Elutionsplatte gestellt. Hierzu haben wir eine 96-Well-Platte
von VWR verwendet, in der pro Well jeweils 5µl Formamid vorgelegt werden. In
„freien“ Wells, die nicht mit Proben bestückt werden, müssen jeweils 15µl
Formamid vorgelegt werden. Das Formamid verhindert dabei die Ausbildung von
Sekundärstrukturen
des
Sequenzierproduktes,
welche
die
Sequenzierung
behindern würden. Die Oberseite der Elutionsplatte sollte direkten Kontakt zur
Unterseite der Dye-Ex-Platte haben. Anschließend werden die 15µl CSR-Produkt
mithilfe einer Mehrkanalpipette auf die DyeEx-Platte pipettiert. Dieser Ansatz wird
erneut für 6:30 Minuten bei 2359rpm und stark reduzierter Bremskraft zentrifugiert.
In den Wells der VWR-Platte sind nun die aufgereinigten DNA-Fragmente
enthalten.
Die Platte wird schließlich nur noch mit einer Gummisepte abgedeckt und ist fertig
zur Sequenzierung. Kann die Platte nicht am gleichen Tag sequenziert werden,
muss sie statt der Gummisepte mit einer Folie abgeklebt und bei -20°C gelagert
werden. Wird die Platte noch am gleichen Tag sequenziert, kann sie kurzfristig bei
4-8°C im Kühlschrank gelagert werden. Vor jeder Sequenzierung muss für jede
96-Well-Platte ein passendes Sample-Sheet sowie eine Sequence-Injection-List
erstellt werden, die dem Gerät den genauen Arbeitsablauf vorgibt. Die
anschließende Analyse der Rohdaten erfolgte mithilfe der Sequencing Analysis
Software Version 5.4.
2.5.9
DNASTAR, eine Software zur DNA-Sequenzanalyse
Die Sequenzanalyse erfolgte mithilfe der DNASTAR-Lasergene-8 Software, die es
ermöglicht, mehrere DNA-Sequenzen gleichzeitig auszuwerten. Zum einen konnte
das Programm durch diese Gegenüberstellung der einzelnen Sequenzen
- 53 -
mutationsverdächtige
Unregelmäßigkeiten
markieren
und
zum
anderen
erleichterte es die Differenzierung zwischen tatsächlichen Mutationen und
Störsignalen, die sich dann ggf. in allen Sequenzen detektieren ließen. Das
Programm vergleicht die generierten Sequenzen und legt an jeder Position die am
häufigsten vorkommende Base als „Normalbefund“ fest. Aus diesem Grund ist es
notwendig, die Sequenzen zusätzlich manuell mit der realen Sequenz aus einer
Gendatenbank (siehe Anhang) zu vergleichen. Bei Polymorphismen mit einer
hohen Inzidenz stimmt die vom Analyseprogramm bestimmte Sequenz ggf. nicht
mit der sog. „Normalsequenz“ überein.
2.5.10 Statistische Auswertungen
Die statistische Analyse der erhobenen Ergebnisse sowie deren Korrelation mit
klinischen Daten und den Endpunkten OS, EFS, CIR und RFS erfolgten durch die
Studienzentrale der AMLSG in Ulm unter der Leitung von Herrn Prof. Dr. Schlenk.
Für diese Analysen wurde der Wilcoxon-Test für zwei verbundene Stichproben
sowie der Fisher-exakt-Test eingesetzt. Für die Analyse des 4-Gruppenvergleichs
wurde der Kruskal-Wallis-Test herangezogen. Mit diesem Rangsummentest
lassen sich globale Unterschiede für mehr als zwei Stichproben nachweisen. Im
Hinblick auf die Analyse der Überlebenszeiten kam die Kaplan-Meier-Methode
zum Einsatz. Für alle Tests galt das Signifikanzniveau P < 0.05.
- 54 -
3
Ergebnisse
3.1
Inzidenz von GATA2-Mutationen
In der Gesamtkohorte von 202 CEBPA-mutierten AML-Patienten im Alter von 1878 Jahren traten Mutationen in GATA2 mit einer Inzidenz von 20,8% (42/202) bei
40 der 202 Patienten auf (19,8%). Bei zwei Patienten ließen sich jeweils zwei
Mutationen nachweisen, eine in Exon 4 und eine in Exon 5. 113 Patienten der
Gesamtkohorte waren CEBPAbi-mutiert (55,9%). Innerhalb dieser Gruppe fanden
sich GATA2-Mutationen mit einer Inzidenz von 33,6% (38/113) bei 36 der 113
Patienten (31,8%). In dieser Gruppe befanden sich die beiden oben genannten
Patienten mit jeweils zwei Mutationen. 89 Patienten der Gesamtkohorte waren
CEBPAsm mutiert (44,1%). Hier konnten Mutationen in GATA2 in 4,4% der Fälle
(4/89) identifiziert werden. Die Assoziation von GATA2-Mutationen mit CEBPAbi
war signifikant (P = <.0001). Das Auftreten von Mutationen in GATA2 beschränkte
sich auf die Patienten mit einem intermediate-risk-Karyotyp (181 Patienten).
Innerhalb einer Vergleichsgruppe von 23 gesunden Probanden (CEBPAwt)
konnten keine Mutationen in GATA2 nachgewiesen werden.
202
CEBPAmut
113
CEBPAbi
36
GATA2mut
77
GATA2wt
89
CEBPAsm
4
GATA2mut
85
GATA2wt
Abb. 13: Flussdiagramm zur Übersicht über die Verteilung der GATA2Mutationen. In der Gesamtkohorte von 202 CEBPA-mutierten AMLPatienten (CEBPAmut) waren 113 Patienten biallelisch mutiert
- 55 -
(CEBPAbi). In dieser Kohorte fanden sich 36 Mutationen in GATA2
(GATA2mut), 77 Patienten waren Wildtyp (GATA2wt). 89 Patienten der
Gesamtkohorte
waren
CEBPA
single-mutiert
(CEBPAsm)
(monoallelisch). In dieser Kohorte waren 85 Patienten GATA2-Wildtyp
und nur 4 Patienten trugen eine Mutation in GATA2. (CEBPA =
CCAAT/enhancer binding protein alpha gene; AML = Akute myeloische
Leukämie)
3.2
Verteilung der GATA2-Mutationen nach Exon
31 der Mutationen in GATA2 wurden in Exon 4 detektiert (73,8%, 31/42). Diese
machten 76,3% der Mutationen der CEBPAbi-AML-Patienten aus (29/38) und
50,0% der Mutationen der CEBPAsm-AML-Patienten (2/4). Dagegen waren nur 11
der GATA2-Mutationen in Exon 5 lokalisiert (26,2%, 11/42). Diese machten 23,7%
der Mutationen der CEBPAbi-AML-Patienten (9/38) und 50,0% der CEBPAsm-AMLPatienten (2/4) aus.
3.3
Mutationen der Hotspot-Region
Von den 42 in GATA2 identifizierten Mutationen lokalisierten 21 in der
vorbeschriebenen Hotspot-Region zwischen den Aminosäuren der Positionen 317
(Asparagin) und 321 (Leucin), einschließlich dieser beiden Aminosäuren.
- 56 -
Abb. 14: Grafische Darstellung der Lokalisation der GATA2-Mutationen. Die
beiden Rechtecke symbolisieren Exon 4 und 5. Jede kleine Pyramide
steht für eine Punktmutation, deren Lokalisation im Exon mittels eines
Striches markiert ist. Jede Raute symbolisiert eine in-frame-Mutation,
deren Lokalisation ebenfalls durch einen Strich markiert wird.
Mutationen, die in der sog. Hotspot-Region liegen, sind in blauer Farbe
dargestellt. Zusätzlich stellen die beiden unteren Pfeile schematisch die
beiden Zinkfinger ZF1 und -2 dar. Ihre Länge gibt ungefähr die
jeweiligen Aminosäureabschnitte, die für die jeweiligen Zinkfinger
kodieren, wieder. (blau = Mutationen der Hotspot-Region)
3.4
Mutationen in GATA2 in Abhängigkeit des Karyotyps der Patienten
29 der GATA2 mutierten Patienten hatten einen normalen Karyotyp (72,5%,
29/40). In 9 Patienten lagen chromosomale Veränderungen vor (22,5%, 9/40),
wobei keiner dieser 9 Fälle die Kriterien für einen komplexen Karyotyp erfüllte.
Von dieser Kohorte waren 8 Patienten CEBPAbi- und 1 Patient CEBPAsm-mutiert.
Bei 2 Patienten lagen keine Metaphasen vor (5%, 2/40), jeweils ein Patient mit
- 57 -
CEBPAbi und ein Patient mit CEBPAsm. Alle 38 zytogenetisch auswertbaren
Patienten gehörten zur intermediären zytogenetischen Risikogruppe.
Tab. 8:
Auflistung der Karyotypen der GATA2-mutierten AML-Patienten.
(CEBPA = CCAAT/enhancer binding protein alpha gene; CEBPA
Mutationsstatus: 2 = CEBPA biallelisch mutiert, 1 = CEBPA single mutiert; [ ] =
Anzahl der Metaphasen; ID = Identifikationsnummer)
Studien-ID
CEBPAMutationsstatus
Betroffenes
Exon
Karyotyp
GATA2
HD93-12
2
4+5
46,XX
HD93-82
2
4
46,XY
HD93-118
2
5
46,XX
HD93-125
2
4
46,XY,del(9)(q13q34)[2]/46,XY[19]
HD98A-74
2
4+5
46,XX
HD98A-227
2
4
46,XY
HD98A-323
1
4
46,XX
HD98A-341
2
5
46,XY
HD98A-448
2
5
46,XX
HD98A-485
2
4
46,XY
HD98A-508
2
4
46,XX
HD98A-644
2
4
46,XY,+21[6]/46,XY[9]
HD98A-672
1
4
46,XY,add(19)(p13)[8]/46,XY[2]
HD98A-784
2
4
46,XY,del(9)(q22q34)[2]/46,XY[17]
HD98A-877
2
4
46,XX
HD98A-903
2
4
46,XY
HD98A-957
1
5
46,XY
HD98A-1041
2
4
45,X,-Y[14]
07-04-7
2
4
47,XY,+10[20]
07-04-202
2
5
Keine Metaphasen
07-04-323
2
4
46,XY
07-04-337
2
4
46,XX
07-04-387
2
4
46,XY
07-04-437
2
4
46,XY
07-04-513
2
4
46,XX
Fortsetzung folgt
- 58 -
Fortsetzung von Tab. 8:
Studien-ID
CEBPAMutationsstatus
Betroffenes
Exon
Karyotyp
GATA2
46,XY,del(7)(q22q32)[30]/
07-04-636
2
5
46,XY,del(7)(q22q32),del(9)(q13q3
2)[2]
07-04-684
2
4
46,XY
07-04-712
2
4
46,XY
07-04-717
2
4
46,XX
07-04-816
2
4
46,XY
07-04-838
2
4
46,XY,9ph
07-04-903
1
5
Keine Metaphasen
07-04-1025
2
5
46,XY
07-04-1044
2
4
47,XY,+mar[2]/46,XY[21]
07-04-1115
2
4
46,XX
07-04-1147
2
4
46,XX
12-09-3
2
4
46,XX
12-09-28
2
4
46,XY,del(9)(q21q34)[16]/46,XY[6]
12-09-45
2
4
46,XY
12-09-6107
2
5
46,XX
3.5
Charakterisierung der Mutationen in GATA2
Bei allen 42 Mutationen in GATA2 handelte es sich um Missense-Mutationen. 39
dieser Missense-Mutationen waren Punktmutationen, die zum Austausch einer
Aminosäure führten; 3 Mutationen waren In-frame-Mutationen, die alle den Cterminalen ZF betrafen. Bei 2 dieser Mutationen handelte es sich um
Duplikationen, einmal von 9 und einmal von 15 bp und bei 1 Mutation handelte es
sich um eine Deletion von 15 bp. Von den 39 Missense-Mutationen betrafen 8 den
C-terminalen ZF und 31 den N-terminalen ZF.
- 59 -
Tab. 9:
Charakterisierung der GATA2-Mutationen sowie deren Lokalisation in
Bezug auf die betroffene funktionelle Domäne. (CEBPA =
CCAAT/enhancer binding protein alpha gene; Mutationsstatus: 2 = CEBPA
biallelisch mutiert, 1 = CEBPA single mutiert; ZF1/2 = Zinkfinger 1/2; DNAEbene: A = Adenin, C = Cytosin, G = Guanin, T = Thymin; Protein-Ebene: A-Y
= Aminosäurenbuchstaben-Code siehe Anhang; ID = Identifikationsnummer)
Studien-ID
HD93-12
CEBPA
2
Exon
GATA2
4+5
Basen-
Aminosäuren-
austausch,
austausch,
DNA-Ebene
Protein-Ebene
919 C>T
R307W
1085 G>A
R362Q
Betroffene
Region
ZF1 + ZF2
HD93-82
2
4
953 C>G
A318G
ZF1
HD93-118
2
5
1061 C>T
T354M
ZF2
HD93-125
2
4
959 G>A
G320D
ZF1
HD98A-74
2
4+5
919 C>T
R307W
1085 G>A
R362Q
ZF1 + ZF2
HD98A-227
2
4
959 G>A
G320D
ZF1
HD98A-323
1
4
895 G>A
G299R
ZF1
HD98A-341
2
5
1042_1056dup
C348_C351dup
ZF2
HD98A-448
2
5
1027_1041del
R343_T347del
ZF2
HD98A-485
2
4
989 G>T
R330L
ZF1
HD98A-508
2
4
959 G>T
G320V
ZF1
HD98A-644
2
4
962 T>A
L321H
ZF1
HD98A-672
1
4
952 G>A
A318T
ZF1
HD98A-784
2
4
953 C>T
A318V
ZF1
HD98A-877
2
4
959 G>A
G320D
ZF1
HD98A-903
2
4
953 C>T
A318V
ZF1
HD98A-957
1
5
1114 G>A
A372T
ZF2
HD98A-1041
2
4
961 C>T
L321F
ZF1
07-04-7
2
4
948 A>G
N317S
ZF1
07-04-202
2
5
1085 G>A
R362Q
ZF2
07-04-323
2
4
959 G>A
G320D
ZF1
07-04-337
2
4
959 G>A
G320D
ZF1
07-04-387
2
4
953 C>G
A318G
ZF1
07-04-437
2
4
989 G>T
R330L
ZF1
07-04-513
2
4
953 C>T
A318V
ZF1
07-04-636
2
5
1085 G>A
R362Q
ZF2
Fortsetzung folgt
- 60 -
Fortsetzung von Tab. 9
Exon
Basen-
Aminosäuren-
austausch,
austausch,
DNA-Ebene
Protein-Ebene
Betroffene
StudienID
CEBPA
07-04-684
2
4
953 C>T
A318V
ZF1
07-04-712
2
4
962 T>A
L321H
ZF1
07-04-717
2
4
923 G>A
R308Q
ZF1
07-04-816
2
4
949 A>C
N317H
ZF1
07-04-838
2
4
911 C>A
P304H
ZF1
07-04-903
1
5
1084 C>G
R362G
ZF2
07-041025
07-041044
07-041115
07-041147
12-09-3
2
5
1085 G>A
R362Q
ZF2
2
4
907 A>T
T303S
ZF1
2
4
953 C>A
A318D
ZF1
2
4
889 A>G
N297D
ZF1
2
4
952 G>A
A318T
ZF1
12-09-28
2
4
961 C>T
L321F
ZF1
12-09-45
2
4
965 A>G
Y322C
ZF1
12-096107
2
5
1048_1056dup
A350_C351dup
ZF2
GATA2
A) ID 07-04-387, 953 C>G, A318G
Region
B) ID 98A-784, 953 C>T, A318V
- 61 -
C) ID 07-04-337, 959 G>A, G320D
D) ID 98A-644, 962 T>A, L321H
E) ID 07-04-1025, 1085 G>A, R362Q
F) ID 93-118, 1061 C>T, T354M
Abb. 15: Ausschnitte aus den Sequenzen GATA2-mutierter Patienten. Jeder
einzelne farbige Peak entspricht einer Nukleinbase, ein blauer Peak
entspricht der Base Cytosin (C), ein schwarzer der Base Guanin (G),
ein roter der Base Thymin (T) und ein grüner der Base Adenin (A).
Liegen an einer Position zwei Peaks übereinander, bedeutet dies, dass
neben der Wildtypsequenz eine weitere Sequenz mit einem
Basenaustausch an einer singulären Position vorliegt, also eine
Punktmutation. Solche Punktmutationen sind in den oberen
Beispielsequenzen durch ein Sternchen-Symbol ( ) markiert. Die
Benennung der jeweiligen Mutation erfolgt einmal auf c-DNA-Ebene mit
der Angabe der betroffenen Nukleinbasenposition sowie der Angabe,
durch welche Nukleinbase die in der Wildtypsequenz vorliegende
Nukleinbase ersetzt wurde. Auf Proteinebene wird der ggf. dadurch
resultierende Aminosäurenaustausch, ebenfalls mit der genauen
Position im Gen, angegeben. A) Bei der ID 07-04-387 ist an Position
953 auf c-DNA-Ebene die Base Cytosin durch Guanin ersetzt. Dies
führt dazu, dass an Position 318 die Aminosäure Glycin anstatt Alanin
gebildet wird. B) Bei der ID 98A-784 liegt an Position 953 die Base
Thymin anstatt Cytosin, was zum Austausch der Aminosäure Alanin
gegen Valin ebenfalls an Position 318 führt. C) Bei der ID 07-04-337
führt ein Austausch der Base Guanin gegen Adenin an Position 959
zum Austausch der Aminosäure Glycin gegen Asparaginsäure an
Position 320. D) Bei der ID 98A-644 findet ein Austausch der
- 62 -
Aminosäure Leucin gegen Histidin an Position 321 durch einen
Austausch der Base Thymin gegen Adenin an Position 962 statt. E) Bei
der ID 07-04-1025 kommt es durch einen Austausch der Base Guanin
gegen Adenin an Position 1085 zu einem Austausch der Aminosäure
Arginin gegen Glutamin an Position 362. F) Bei der ID 93-118 führt ein
Austausch der Base Cytosin gegen Thymin an Position 1061 zu einem
Austausch der Aminosäure Threonin gegen Methionin an Position 354.
3.5.1
Untersuchung auf das Vorliegen einer Keimbahnmutation in den
GATA2-mutierten Patienten
Von den 40 GATA2-mutierten Patienten war von 32 Patienten Material in
kompletter klinischer Remission zur Analyse von Keimbahnmutationen vorhanden.
Wenn möglich wurde peripheres Blut verwendet (28 der 32 Patienten). Von den
übrigen 4 Patienten war lediglich Knochenmark vorhanden, sodass die
Aussagekraft der Ergebnisse dieser Proben als eingeschränkt anzusehen ist. Die
Keimbahnanalysen wurden nach dem gleichen Schema wie die Analysen der
Diagnosematerialien durchgeführt. In keinem der 32 Patienten konnte eine
GATA2-Keimbahnmutation detektiert werden.
3.6
Inzidenz der GATA2-Mutationen in Abhängigkeit der verschiedenen
Studien
In allen sechs Studien erhielten die Patienten eine intensive Chemotherapie,
bestehend aus einer Doppel-Induktionschemotherapie, gefolgt von entweder 1-3
Konsolidierungschemotherapien oder einer allogenen Stammzelltransplantation. In
den älteren Studien AMLHD93 und AMLHD98A war als post-Remissions-Therapie
auch eine autologe Stammzelltransplantation möglich (Therapieschemata der
einzelnen Studien siehe Anhang). In den Studien AMLHD93, AMLHD98A, AMLSG
07-04 wurden Patienten von 18-60 Jahren, in der Studie AMLSG 12-09 Patienten
über 18 Jahre und in den Studien AMLHD98B und AMLSG 06-04 Patienten über
60 Jahre behandelt.
- 63 -
AMLHD93
Von den 15 Patienten mit CEBPA-Mutation aus der AMLHD93-Studie (Alter von
16-60 Jahre) waren 8 Patienten CEBPAbi- und 7 CEBPAsm-mutiert. 4 der 15
Patienten hatten eine GATA2-Mutation (26,7%); alle 4 Patienten fanden sich in der
CEBPAbi- mutierten Kohorte.
Tab. 10:
Inzidenz von GATA2-Mutationen in der AMLHD93-Studie. (CEBPAmut =
CEBPA-mutiert, CEBPAbi = biallelisch CEBPA-mutiert, CEBPAsm = CEBPAsingle-mutiert; CEBPA = CCAAT/enhancer binding protein alpha gene;
GATA2mut = GATA2-mutiert. Die Inzidenz der CEBPA- und GATA2-Mutationen
ist in [%] angegeben, die Absolutzahl steht in Klammern dahinter.)
AMLHD 93
Altersspanne
16-60 Jahre
Patienten eingeschlossen
279
Patienten auswertbar
245
CEBPA-Status analysiert
182
mut
CEBPA
8,2% (15)
GATA2mut-Patient
CEBPA
bi
26,7% (4)
8
mut
GATA2
-Patient
CEBPAsm
50,0% (4)
7
mut
GATA2
-Patient
0
AMLHD98A
Von den 53 Patienten mit CEBPA-Mutation (16-60 Jahre), die im Rahmen der
AMLHD98A-Studie behandelt wurden, waren 33 Patienten CEBPAbi- und 20
CEBPAsm-mutiert. 14 Patienten trugen GATA2-Mutationen (26,4%, 14/53), davon
waren 11 aus der CEBPAbi-mutierten Kohorte und 3 aus der CEBPAsm-mutierten
Kohorte.
- 64 -
Tab. 11:
Inzidenz von GATA2-Mutationen in der AMLHD98A-Studie. (CEBPAmut =
AMLHD 98A
Altersspanne
16-60 Jahre
1114
952
811
CEBPAmut
6,5% (53)
mut
GATA2
CEBPA
-Patient
bi
26,4% (14)
33
GATA2mut-Patient
sm
CEBPA
33,3% (11)
20
GATA2mut-Patient
15,0% (3)
AMLHD98B
Innerhalb der 13 Patienten mit CEBPA-Mutation (> 60 Jahre), die im Rahmen der
AMLHD98B-Studie therapiert wurden, waren 1 Patient CEBPAbi- und 12 Patienten
CEBPAsm-mutiert. In dieser Kohorte konnten keine Mutationen in GATA2
nachgewiesen werden.
Tab. 12:
Inzidenz von GATA2-Mutationen in der AMLHD98B-Studie. (CEBPAmut =
AMLHD 98B
Altersspanne
> 60 Jahre
914
385
301
mut
CEBPA
4,3% (13)
GATA2mut-Patient
CEBPA
bi
0
1
mut
GATA2
-Patient
sm
CEBPA
0
12
mut
GATA2
-Patient
- 65 -
0
AMLSG 06-04
Innerhalb der Kohorte von 25 Patienten mit CEBPA-Mutation (> 60 Jahre), die im
Rahmen der AMLSG 06-04-Studie therapiert wurden, waren 5 Patienten CEBPAbiund 20 Patienten CEBPAsm-mutiert. In dieser Kohorte konnten ebenfalls keine
Mutationen in GATA2 nachgewiesen werden.
Tab. 13:
Inzidenz von GATA2-Mutationen in der AMLSG 06-04-Studie.
(CEBPAmut = CEBPA-mutiert, CEBPAbi = biallelisch CEBPA-mutiert, CEBPAsm
= CEBPA-single-mutiert; CEBPA = CCAAT/enhancer binding protein alpha
gene; GATA2mut = GATA2-mutiert. Die Inzidenz der CEBPA- und GATA2Mutationen ist in [%] angegeben, die Absolutzahl steht in Klammern dahinter.)
AMLSG 06-04
Altersspanne
> 60 Jahre
588
562
408
CEBPAmut
6,1% (25)
mut
GATA2
-Patient
CEBPAbi
0
5
mut
GATA2
-Patient
sm
CEBPA
0
20
GATA2mut-Patient
0
AMLSG 07-04
Von den 74 Patienten mit CEBPA-Mutation aus der AMLSG 07-04-Studie waren
49 CEBPAbi- und 25 CEBPAsm-mutiert. Insgesamt trugen 18 Patienten eine
Mutation in GATA2 (24,3%, 18/74). Davon befanden sich 17 Patienten in der
CEBPAbi-Kohorte und 1 in der CEBPAsm-Kohorte.
- 66 -
Tab. 14:
AMLSG 07-04
Altersspanne
18-60 Jahre
1228
1180
872
CEBPAmut
8,5% (74)
mut
GATA2
-Patient
CEBPAbi
24,3% (18)
49
mut
GATA2
-Patient
CEBPAsm
34,7% (17)
25
mut
GATA2
-Patient
4,0% (1)
AMLSG 12-09
Von den 22 Patienten mit CEBPA-Mutation (≥ 18 Jahre) aus der ALMSG 12-09Studie waren 17 Patienten CEBPAbi- und 5 Patienten CEBPAsm-mutiert.
Insgesamt konnte bei 4 Patienten eine GATA2-Mutation nachgewiesen werden
(18,2%, 4/22). Davon fanden sich alle Mutationen in der CEBPAbi-Kohorte.
Tab. 15:
AMLSG 12-09
≥ 18 Jahre
Altersspanne
277
269
239
CEBPAmut
9,2% (22)
mut
GATA2
-Patient
CEBPAbi
18,2% (4)
17
mut
GATA2
-Patient
sm
CEBPA
23,5% (4)
5
GATA2mut-Patient
- 67 -
0
Die Ergebnisse dieser Betrachtung zeigen, dass die Inzidenz an CEBPAMutationen in älteren Patienten signifikant niedriger ist. Mutationen in GATA2
konnten lediglich bei zwei Patienten >60 Jahre (AMLSG 12-09) identifiziert
werden.
3.7
Gesamtkohorte
In der Gesamtkohorte von 202 CEBPA-mutierten AML-Patienten trugen 40
Patienten eine Mutation in GATA2. Die folgenden Analysen beziehen sich auf die
gesamte Kohorte der 40 GATA2-mutierten Patienten, unabhängig vom CEBPAMutationsstatus (CEBPAbi versus CEBPAsm). Alle Patienten waren in eine von
sechs AMLSG-Studien eingeschlossen und somit intensiv chemotherapiert
worden. 4 dieser 40 GATA2-mutierten Patienten wurden in der AMLHD93A, 14 in
der AMLHD98A, 18 in der AMLSG 07-04 und 4 in der AMLSG 12-09 Studie
behandelt.
3.7.1
Korrelation
zwischen
GATA2-Mutationen
bei
CEBPAmut-AML-
Patienten und dem Auftreten zusätzlicher Mutationen in FLT3, NPM1,
DNMT3A und RUNX1
In der GATA2-mutierten Gesamtkohorte von 40 Patienten treten seltener
gleichzeitig vorhandene FLT3, NPM1, DNMT3A oder RUNX1-Mutationen auf.
Allerdings wurde für keine Korrelation das Signifikanzniveau erreicht.
- 68 -
Mutationen in FLT3-ITD
160
Anzahl der Patienten
140
120
100
GATA2wt
80
GATA2mut
60
40
20
131 36
31
4
0
0
0
FLT3-ITD_0
FLT3-ITD_1
NA
Abb. 16: Auftreten von GATA2-Mutationen/GATA2-Wildtyp in Abhängigkeit des
FLT3-ITD-Mutationsstatus (P = .24). 131 der GATA2-Wildtyp-Patienten
(GATA2wt) und 36 der GATA2-mutierten Patienten (GATA2mut) waren
negativ für eine FLT3-ITD. 31 der GATA2-Wildtyp-Patienten und 4 der
GATA2-mutierten Patienten waren FLT3-ITD positiv. (FLT3-ITD = fmslike tyrosine kinase-3 interne Tandemduplikation, 0 = unmutiert, 1 = mutiert,
NA = nicht auswertbar)
Innerhalb der FLT3-ITD-mutierten Patientengruppe hatten nur 4 Patienten eine
GATA2-Mutation (11,4%; 4/35), wohingegen innerhalb der FLT3-Wildtyp-Gruppe
der Anteil an GATA2-mutierten Patienten höher war (21,6%; 36/167).
- 69 -
Mutationen in NPM1
160
140
120
100
GATA2wt
80
GATA2mut
60
40
20
130 35
30
4
NPM1_0
NPM1_1
2
1
0
NA
NPM1-Mutationsstatus (P = .24). 130 der GATA2-Wildtyp-Patienten
NPM1-Wildtyp. 30 der GATA2-Wildtyp-Patienten und 4 der GATA2mutierten Patienten waren NPM1-mutiert. Für insgesamt 3 Patienten
lag keine Information bzgl. des NPM1-Mutationsstatus vor. (NPM1 =
Nucleophosmin 1, 0 = unmutiert, 1 = mutiert, NA = nicht auswertbar)
Innerhalb der NPM1-mutierten Patientengruppe hatten nur 4 Patienten eine
GATA2-Mutation (11,8%; 4/34), wohingegen innerhalb der NPM1-Wildtyp-Gruppe
der Anteil an GATA2-mutierten Patienten höher war (21,2%; 35/165). Bei 1
GATA2-mutierten Patienten sowie bei 2 GATA2-Wildtyp-Patienten lagen keine
Informationen zum NPM1-Mutationsstatus vor.
- 70 -
Mutationen in DNMT3A
160
140
120
100
GATA2wt
80
GATA2mut
60
40
20
75
29
17
1
70
10
0
DNMT3A_0
DNMT3A_1
NA
DNMT3A-Mutationsstatus (P = .07). 75 der GATA2-Wildtyp-Patienten
DNMT3A-Wildtyp. 17 der GATA2-Wildtyp-Patienten und 1 der GATA2mutierten Patienten waren DNMT3A-mutiert. Für insgesamt 80
Patienten lag keine Information bzgl. des DNMT3A-Mutationsstatus vor
(70 aus der GATA2-Wildtyp-Kohorte und 10 aus der GATA2-mutiertenKohorte). (DNMT3A = DNA (cytosine-5-)-methyltransferase 3 alpha, 0 =
unmutiert, 1 = mutiert, NA = nicht auswertbar)
Innerhalb der DNMT3A-mutierten Patientengruppe hatte nur 1 Patient eine
GATA2-Mutation (5,6%; 1/18), wohingegen innerhalb der DNMT3A-WildtypGruppe der Anteil an GATA2-mutierten Patienten höher war (27,9%; 29/104). Bei
10 GATA2-mutierten Patienten sowie bei 70 GATA2-Wildtyp-Patienten lagen
keine Informationen zum DNMT3A-Mutationsstatus vor.
- 71 -
3.7.2
Klinische
Charakteristika
der
GATA2-mutierten
Patienten
im
Vergleich zu GATA2wt-Patienten in der Gesamtkohorte der CEBPAmutierten Patienten
In der Gesamtkohorte von 202 Patienten mit CEBPA-Mutationen waren Patienten
mit GATA2-Mutation signifikant jünger als Patienten ohne GATA2-Mutation. Das
mediane Alter bei GATA2mut-Patienten lag bei 46,6 Jahren, während es bei
GATA2wt-Patienten bei 51,2 Jahren lag (P = .02). Von den GATA2mut-Patienten
waren lediglich 2 Patienten älter als 60 Jahre (5%, 2/40), während es in der
GATA2wt-Kohorte 27,8% (45/117) waren (P = .001).
Hinsichtlich des Geschlechts zeigte sich zwischen den beiden Gruppen kein
signifikanter Unterschied. In der GATA2mut-Gruppe waren 24 Patienten männlich
(60%, 24/40) und 16 Patienten weiblich (40%, 16/40). In der GATA2wt-Gruppe
waren es 76 männliche (46,9%, 76/162) und 86 weibliche Patienten (53,09%,
86/162) (P = .16). Alle 40 GATA2mut-Patienten hatten eine de-novo AML, während
bei 13 der 162 GATA2wt-Patienten eine sekundäre oder eine therapieassoziierte
AML vorlag (8,3%) (P = .08). Für 5 Patienten lagen keine entsprechenden Daten
vor.
- 72 -
Tab. 16:
Vergleich der Laborparameter innerhalb der Gesamtkohorte, GATA2wtversus GATA2mut-Patienten. (GATA2wt = GATA2-Wildtyp, GATA2mut =
GATA2-mutiert, G/l = Giga/Liter, U/l = Units/Liter)
Laborparameter
GATA2wt
GATA2mut
(n = 162)
(n = 40)
P - Wert
Wilcoxon
Fisher
Thrombozyten
[G/l] / [x109/l]
= .04
Median
47
41
Bereich
4 – 418
4 – 319
Keine Daten
10
0
Leukozytenzahl
[G/l] / [x109/l]
= .04
Median
19,8
42,8
Bereich
0,9 – 439,5
3,9 – 217
Keine Daten
10
0
% Blasten im
PB
= .003
Median
61,5
78,5
Bereich
0 – 100
19 – 100
Keine Daten
16
2
Laktatdehydrogenase (LDH)
= .11
[U/l]
Median
420
527,5
Bereich
127 – 2503
133 – 4091
Keine Daten
9
0
In der Gesamtkohorte von 202 Patienten zeigten GATA2mut-Patienten signifikant
niedrigere Thrombozytenwerte zum Zeitpunkt der Diagnosestellung. Des Weiteren
ließen sich in der GATA2mut-Kohorte signifikant höhere Leukozytenzahlen
nachweisen und ein höherer Blastenanteil im peripheren Blut. Folglich zeigte sich
bei GATA2mut-Patienten ebenfalls eine höhere LDH als bei GATA2wt-Patienten,
allerdings nicht signifikant. Hinsichtlich des Hämoglobinwertes sowie des
Blastenanteils
im
Knochenmark
ergab
Unterschied.
- 73 -
sich
ebenfalls
kein
signifikanter
3.7.3
Einfluss des GATA2-Mutationsstatus auf das Erreichen einer
kompletten Remission (CR) nach Doppelinduktion
In der Gesamtkohorte erreichten 92,5% der GATA2mut-Patienten eine komplette
Remission nach Doppelinduktionschemotherapie (37/40). In der GATA2wt-Kohorte
waren es 80,8% (130/162), für einen Patienten waren keine Daten verfügbar.
Somit bestand
kein
signifikanter Unterschied
zwischen
beiden
Gruppen
hinsichtlich des Therapieansprechens (P = .10). Beide Gruppen unterschieden
sich nicht im Hinblick auf die Anzahl von Frühtodesfällen (ED, early deaths) (P =
.69) und den Anteil an Patienten mit refraktärer Erkrankungen (P = .18).
Tab. 17:
Auftreten von Frühtodesfällen und refraktärer Erkrankung innerhalb der
Gesamtkohorte, GATA2wt- versus GATA2mut-Patienten. In der
Gesamtkohorte unterscheiden sich GATA2-mutierte Patienten und
GATA2-Wildtyp-Patienten weder signifikant im Hinblick auf die Anzahl
von Frühtodesfällen (P = .69) noch im Hinblick auf die Anzahl
refraktärer Erkrankungen (P = .18). (GATA2wt = GATA2-Wildtyp, GATA2mut
= GATA2-mutiert, n = Anzahl der Patienten)
GATA2wt
GATA2mut
P – Wert
(n = 162)
(n = 40)
Fisher
Frühtodesfälle
9 (5,6%)
1 (2,5%)
0.69
Refraktäre Erkrankung
22 (13,7%)
2 (5,0%)
0.18
3.7.4
Einfluss des GATA2-Mutationsstatus in der Gesamtkohorte auf den
klinischen Verlauf
Die Analysen zur Korrelation des GATA2-Mutationsstatus mit den Endpunkten
EFS, RFS, CIR und OS der Patienten wurden mittels der Kaplan-Meier-Methode
erstellt. Wichtig für die Beurteilung dieser Endpunkte ist, dass sich beide Gruppen,
GATA2mut
versus
GATA2wt,
hinsichtlich
der
Postremissionstherapie
nicht
signifikant unterschieden. Vergleichbar viele Patienten der Gesamtkohorte
erhielten eine konsolidierende Chemotherapie [65,7% in der GATA2mut-Gruppe
(23/40) und 69,5% in der GATA2wt-Gruppe (89/162)] oder wurden allogen
stammzelltransplantiert [34,3% der GATA2mut-Gruppe (12//40) und 30,5% der
GATA2wt-Gruppe (39/162)] (P = .684). Für 5 Patienten der GATA2mut-Gruppe und
für 34 Patienten der GATA2wt-Gruppe lagen keine Informationen vor.
- 74 -
3.7.4.1 Ereignisfreies Überleben (EFS)
In der Gesamtkohorte der 202 CEBPAmut-Patienten zeigte sich bzgl. des EFS kein
signifikanter Unterschied zwischen GATA2mut- und GATA2wt-Patienten (P = .18).
Das EFS betrug in der GATA2wt-Gruppe im Mittel 11,2 Monate versus 17,4
Monate in der GATA2mut-Gruppe.
100
P = .18
Event-free survival(%)
75
n = 40
50
25
n = 162
0
0
12
36
60
84
108
132
156
180
204
Time (months)
Abb. 19: Grafische Darstellung des Ereignisfreien-Überlebens (EFS) in der
Gesamtkohorte (n = 202). In der Grafik sieht man auf der y-Achse den
prozentualen Anteil der beiden Patientengruppen über die Zeit (xAchse). In der Gesamtkohorte von 202 CEBPA-mutierten Patienten
zeigte sich kein signifikanter Unterschied im Hinblick auf das EFS (P =
.18). Patienten mit GATA2-Mutation hatten ein EFS von im Mittel 17,4
Monaten, während GATA2-Wildtyp-Patienten ein EFS von im Mittel
11,2 Monaten zeigten. In der GATA2-Wildtyp-Gruppe (n = 162) wurden
114 Events, in der GATA2-mutierten Gruppe (n = 40) 27 Events
gezählt. (CEBPA = CCAAT/enhancer binding protein alpha gene, rot =
GATA2-mutiert, schwarz = GATA2-Wildtyp, n = Anzahl der Patienten)
- 75 -
3.7.4.2 Rezidiv-freies Überleben (RFS)
Für das Rezidiv-freie Überleben zeigte sich in der Gesamtkohorte ebenfalls kein
signifikanter Unterschied zwischen GATA2mut- und GATA2wt-Patienten. Das RFS
betrug im Mittel 16,7 Monate in der GATA2wt-Gruppe versus 39,1 Monate in der
GATA2mut-Gruppe (P = .82). Für 22 Patienten der GATA2wt-Gruppe und 1
Patienten der GATA2mut-Gruppe lagen hier keine Daten vor.
100
P = .82
Relapse-free survival(%)
75
n = 39
50
25
n = 140
0
0
12
36
60
84
108
132
156
180
204
Time (months)
Abb. 20: Grafische Darstellung des Rezidiv-freien Überlebens (RFS) in der
Gesamtkohorte (n = 202). Für 140 Patienten mit GATA2-Wildtyp und für
39 Patienten mit GATA2-Mutation lagen Daten bzgl. des RFS vor. In
der Grafik sieht man auf der y-Achse aufgetragen den prozentualen
Anteil der beiden Patientengruppen über die Zeit (x-Achse). In der
Gesamtkohorte von 202 CEBPA-mutierten Patienten zeigte sich kein
signifikanter Unterschied im Hinblick auf das RFS (P = .82). Patienten
mit GATA2-Mutation hatten ein RFS von im Mittel 39,1 Monaten,
während GATA2-Wildtyp-Patienten ein RFS von im Mittel 16,7 Monaten
zeigten. In der GATA2-Wildtyp-Gruppe (n = 140) wurden 86 Events, in
der GATA2-mutierten Gruppe (n = 39) 25 Events gezählt. (CEBPA =
CCAAT/enhancer binding protein alpha gene, rot = GATA2-mutiert, schwarz =
GATA2-Wildtyp, n = Anzahl der Patienten)
- 76 -
3.7.4.3 Gesamtüberleben (OS)
Ebenso zeigte sich für das OS in der Gesamtkohorte kein signifikanter
Unterschied zwischen GATA2mut- und GATA2wt-Patienten. Das OS betrug bei
GATA2wt-Patienten im Mittel 51,3 Monate versus 64,3 Monate bei den GATA2mutPatienten (P = .16).
100
P = .16
Overall survival(%)
75
n = 40
50
n = 162
25
0
0
12
36
60
84
108
132
156
180
204
Time (months)
Abb. 21: Grafische Darstellung des Gesamtüberlebens (OS) in der
Gesamtkohorte (n = 202). In der Grafik sieht man auf der y-Achse
aufgetragen den prozentualen Anteil der beiden Patientengruppen über
die Zeit (x-Achse). In der Gesamtkohorte von 202 CEBPA-mutierten
Patienten zeigte sich kein signifikanter Unterschied im Hinblick auf das
OS (P = .16). Patienten mit GATA2-Mutation hatten ein OS von im
Mittel 64,3 Monaten, während GATA2-Wildtyp-Patienten ein OS von im
Mittel 51,3 Monaten zeigten. In der GATA2-Wildtyp-Gruppe (n = 162)
wurden 80 Events, in der GATA2-mutierten Gruppe (n = 40) 16 Events
GATA2-mutiert, schwarz = GATA2-Wildtyp, n = Anzahl der Patienten)
- 77 -
3.7.4.4 Kumulative Rezidiv-Inzidenz (CIR)
Es zeigte sich in der Gesamtkohorte kein Unterschied bzgl. der CIR zwischen
GATA2mut- und GATA2wt-Patienten (P = .99). Für 22 Patienten der GATA2wtGruppe und 1 Patienten der GATA2mut-Gruppe lagen hier keine Daten vor.
1.0
CIF of Relapse
P = .99
0.6
n = 39
0.4
n = 140
0.0
0.2
Cumulative incidence
0.8
0
1
0
50
100
150
200
Time(months)
Abb. 22: Grafische Darstellung der kumulativen Rezidiv-Inzidenz (CIR) in der
Gesamtkohorte (n = 202). Für 140 Patienten mit GATA2-Wildtyp und für
39 Patienten mit GATA2-Mutation lagen Daten bzgl. der CIR vor. In der
Grafik sieht man auf der y-Achse aufgetragen den prozentualen Anteil
der beiden Patientengruppen über die Zeit (x-Achse). In der
Gesamtkohorte von 202 CEBPA-mutierten Patienten zeigte sich kein
signifikanter Unterschied im Hinblick auf die CIR (P = .99). Bei
Patienten mit GATA2-Mutation betrug der Median bis zum Auftreten
eines Ereignisses 54,6 Monate, bei GATA2-Wildtyp-Patienten 29,6
Monate. In der GATA2-Wildtyp-Gruppe (n = 140) wurden 68 Events, in
der GATA2-mutierten Gruppe (n = 39) 20 Events gezählt. (- - - =
GATA2mut, ̶ ̶ = GATA2wt, CIF of relapse = cumulative incidence functions of
the relapse, n = Anzahl der Patienten; CEBPA = CCAAT/enhancer binding
protein alpha gene)
- 78 -
3.8
Subgruppenanalyse – CEBPAsm mutierte Patienten (n = 89)
3.8.1
Korrelation
zwischen
GATA2-Mutationen
und
dem
Auftreten
zusätzlicher Mutationen in FLT3, NPM1, DNMT3A und RUNX1
In der CEBPAsm-Kohorte zeigte sich kein signifikanter Unterschied in der
Assoziation mit zusätzlichen Mutationen zwischen GATA2wt- und GATA2mutPatienten. Einschränkend ist anzumerken, dass die GATA2mut-Gruppe mit 4
Patienten sehr klein ist.
Tab. 18:
Inzidenz an zusätzlichen Mutationen in FLT3, NPM1, DNMT3A und
RUNX1 bei CEBPAsm/GATA2wt versus CEBPAsm/GATA2mut. (GATA2wt =
GATA2-Wildtyp, GATA2mut = GATA2-mutiert, WT = Wildtyp, MUT = mutiert,
Zahlen in Klammern = Anteil der Patienten in (%), FLT3-ITD = fms-like
tyrosine kinase-3 interne Tandemduplikation, FLT3-TKD = fms-like tyrosine
kinase-3 Tyrosinkinasedomäne, NPM1 = Nucleophosmin 1, DNMT3A = DNA
(cytosine-5)-methyltransferase 3A, RUNX1 = runt-related transcription factor1)
GATA2wt
GATA2mut
(n =85)
(n = 4)
WT
63 (74,1%)
3 (75,0%)
MUT
22 (25,9%)
1 (25,0%)
Keine Daten
0
0
WT
77 (97,5%)
3 (100%)
MUT
2 (2,5%)
0
Keine Daten
6
1
WT
55 (66,3%)
1 (25,0%)
MUT
28 (33,7%)
3 (75,0%)
Keine Daten
2
0
WT
25 (64,1%)
3 (75,0%)
MUT
14 (35,9%)
1 (25,0%)
Keine Daten
46
0
WT
38 (92,7%)
4 (100%)
MUT
3 (7,32%)
0
Keine Daten
44
0
Gen
P - Wert
Wilcoxon
Fischer
FLT3-ITD
1.
FLT3-TKD
1.
NPM1
.13
DNMT3A
1.
RUNX1
- 79 -
1.
3.8.2
Klinische Charakteristika der GATA2mut-Patienten im Vergleich zu
GATA2wt-Patienten in der CEBPAsm-Subgruppe.
Patienten mit GATA2-Mutation waren in der CEBPAsm-Kohorte ebenfalls
signifikant jünger als Patienten ohne Mutation in GATA2. GATA2mut-Patienten
waren bei Diagnosestellung im Mittel 43,9 Jahre alt, während GATA2wt-Patienten
im Mittel 56,8 Jahre alt waren (P = .05). Von den GATA2mut-Patienten war
niemand älter als 60 Jahre, während in der GATA2wt-Kohorte 34 Patienten älter
als 60 Jahre waren (40%, 34/85).
Hinsichtlich des Geschlechts bestand kein Unterschied zwischen den beiden
Gruppen. In der GATA2mut-Gruppe waren 2 Patienten weiblich und 2 Patienten
männlich (jeweils 50%, 2/4), in der GATA2wt-Gruppe waren 45 Patienten weiblich
(52,9%, 45/85) und 40 Patienten männlich (47,1%, 40/85) (P = 1.).
Es zeigte sich kein signifikanter Unterschied hinsichtlich des Hämoglobinwertes (P
= .64), der Thrombozytenzahl (P = .50), der absoluten Leukozytenzahl (P = .26),
des LDH-Wertes (P = .18) sowie des Blastenanteils im KM (P = .17) und im PB (P
= .47) zwischen Patienten mit und ohne GATA2-Mutation in der CEBPAsmSubgruppe.
3.8.3
Bezüglich der Remissionsrate nach Doppelinduktionschemotherapie bestand kein
signifikanter Unterschied zwischen GATA2wt- und GATA2mut-Patienten. In der
GATA2mut-Gruppe erreichten alle 4 Patienten eine komplette Remission, in der
GATA2wt-Gruppe waren es 61 Patienten (72,6%) (P = .57). Beide Gruppen
unterschieden sich nicht im Hinblick auf die Anzahl von Frühtodesfällen (ED, early
deaths) (P = 1.) und den Anteil an Patienten mit refraktärer Erkrankungen (P = 1.).
- 80 -
Tab. 19:
CEBPAsm-Subgruppe, GATA2wt- versus GATA2mut-Patienten. In der
Subgruppe monoallelisch-mutierter CEBPA-Patienten unterscheiden
sich GATA2-mutierte Patienten und GATA2-Wildtyp-Patienten weder im
Hinblick auf die Anzahl von Frühtodesfällen (P = 1.) noch im Hinblick
auf die Anzahl refraktärer Erkrankungen (P = 1.). (GATA2wt = GATA2Wildtyp, GATA2mut = GATA2-mutiert, CEBPAsm = monoallelisch CEBPAmutiert (single-mutiert), CEBPA = CCAAT/enhancer binding protein alpha
gene, n = Anzahl der Patienten)
GATA2wt
GATA2mut
P – Wert
(n = 85)
(n = 4)
Fisher
Frühtodesfälle
6 (7,1%)
0 (0%)
1.
17 (20,2%)
0 (0%)
1.
3.8.4
Einfluss des GATA2-Mutationsstatus auf den klinischen Verlauf
Innerhalb der CEBPAsm-Kohorte zeigte sich bei den GATA2mut-Patienten ein
Ungleichgewicht
zwischen
allogener
Stammzelltransplantation
versus
konsolidieren-der Chemotherapie als Postremissionstherapie (P = .08). Innerhalb
der GATA2mut-Gruppe wurden 3 von 4 Patienten allogen stammzelltransplantiert
(75%). Nur 1 Patient erhielt eine konsolidierende Chemotherapie. In der GATA2wtKohorte erhielten 27,1% der Patienten eine allogene Stammzelltransplantation
(16/85), während 72,9% eine konsolidierende Chemotherapie erhielten (43/85).
Dieser Unterschied erreichte jedoch kein Signifikanzniveau. Für 26 Patienten
dieser Gruppe lagen keine Informationen vor. Auch hier muss einschränkend
gesagt werden, dass der Anteil an GATA2mut-Patienten sehr klein war.
Innerhalb der CEBPAsm-Kohorte zeigte sich ein signifikanter Unterschied für ein
besseres EFS der GATA2mut-Patienten (P = .04). Während in der GATA2wtGruppe 68 Ereignisse zu verzeichnen waren, war es in der GATA2mut-Gruppe nur
1. Die EFS betrug in der GATA2wt-Kohorte im Mittel 8,9 Monate. Für die
GATA2mut-Kohorte wurde der Median nicht erreicht. Allerdings ist in dieser kleinen
- 81 -
Subgruppe der Anteil an GATA2mut-Patienten sehr klein, sodass dieses Ergebnis
nicht statistisch aussagekräftig ist.
100
P = .04
75
n=4
50
n = 85
25
0
0
12
36
60
84
108
132
156
180
204
Time (months)
CEBPAsm-Kohorte (n=89). In der Grafik sieht man auf der y-Achse
die Zeit (x-Achse). In der Kohorte von 89 monoallelisch CEBPAmutierten Patienten zeigte sich ein signifikanter Unterschied im Hinblick
auf das EFS (P = .04). Patienten mit GATA2-Wildtyp hatten ein EFS
von im Mittel 8,9 Monaten. In der GATA2-mutierten Gruppe wurde der
Median nicht erreicht. Bei den GATA2-mutierten Patienten (n = 4)
wurde 1 Event gezählt, in der GATA2-Wildtyp-Gruppe (n = 85) wurden
68 Events gezählt. (CEBPA = CCAAT/enhancer binding protein alpha gene,
rot = GATA2-mutiert, schwarz = GATA2-Wildtyp, CEBPAsm = monoallelisch
CEBPA-mutiert (single-mutiert), n = Anzahl der Patienten)
- 82 -
Es zeigte sich kein signifikanter Unterschied für das RFS im Vergleich von
GATA2mut- und GATA2wt-Patienten (P = .11).
100
P = .11
75
n=4
50
25
n = 67
0
0
12
36
60
84
108
132
156
180
204
Time (months)
Abb. 24: Grafische Darstellung des Rezidiv-freien Überlebens (RFS) in der
CEBPAsm-Kohorte (n=89). Für 18 Patienten mit GATA2-Wildtyp lagen
keine Daten bzgl. des RFS vor. In der Grafik sieht man auf der y-Achse
die Zeit (x-Achse). In der Kohorte von 71 monoallelisch CEBPAmutierten Patienten zeigte sich kein signifikanter Unterschied im
Hinblick auf das RFS (P = .11). Patienten mit GATA2-Wildtyp hatten ein
RFS von im Mittel 11,0 Monaten. In der GATA2-mutierten Gruppe
wurde der Median nicht erreicht. Bei den GATA2-mutierten Patienten (n
= 4) wurde 1 Event gezählt, in der GATA2-Wildtyp-Gruppe (n = 67)
wurden 46 Events gezählt. (CEBPA = CCAAT/enhancer binding protein
alpha gene, rot = GATA2-mutiert, schwarz = GATA2-Wildtyp, CEBPAsm =
monoallelisch CEBPA-mutiert (single-mutiert), n = Anzahl der Patienten)
- 83 -
Auch bzgl. des OS zeigte sich in der CEBPAsm-Subgruppe kein signifikanter
Unterschied zwischen GATA2mut- und GATA2wt-Patienten (P = .14). Das OS
betrug bei GATA2wt-Patienten im Mittel 20,3 Monate, für GATA2mut-Patienten
wurde der Median bislang nicht erreicht.
100
P = .14
Overall survival(%)
75
n=4
50
25
n = 85
0
0
12
36
60
84
108
132
156
180
204
Time (months)
Abb. 25: Grafische Darstellung des Gesamtüberlebens (OS) in der CEBPAsmKohorte (n=89). In der Grafik sieht man auf der y-Achse aufgetragen
den prozentualen Anteil der beiden Patientengruppen über die Zeit (xAchse). In der Kohorte von 89 monoallelisch CEBPA-mutierten
OS (P = .14). Patienten mit GATA2-Wildtyp hatten ein OS von im Mittel
20,3 Monaten. In der GATA2-mutierten Gruppe wurde der Median nicht
erreicht. Bei den GATA2-mutierten Patienten (n = 4) wurde 1 Event
gezählt, in der GATA2-Wildtyp-Gruppe (n = 85) wurden 54 Events
GATA2-mutiert, schwarz = GATA2-Wildtyp, CEBPAsm = monoallelisch
CEBPA-mutiert (single mutiert), n = Anzahl der Patienten)
- 84 -
Es fand sich kein signifikanter Unterschied bzgl. der CIR zwischen der GATA2mutund der GATA2wt-Kohorte (P = .22). Für die GATA2mut-Kohorte wurde der Median
bislang nicht erreicht. Für 18 Patienten der GATA2wt-Gruppe lagen hier keine
Daten vor.
1.0
CIF of Relapse
0
1
0.4
0.6
n = 67
n=4
0.0
0.2
0.8
P = .22
0
50
100
150
200
Time(months)
CEBPAsm-Kohorte (n=89). Für 18 Patienten mit GATA2-Wildtyp lagen
keine Daten bzgl. der CIR vor. In der Grafik sieht man auf der y-Achse
die Zeit (x-Achse). In der Kohorte von 71 monoallelisch CEBPAmutierten Patienten zeigte sich kein signifikanter Unterschied im
Hinblick auf die CIR (P = .22). Bei Patienten mit GATA2-Wildtyp betrug
der Median bis zum Auftreten eines Ereignisses 19,0 Monate. Bei
Patienten mit GATA2-Mutation wurde der Median nicht erreicht. In der
GATA2-Wildtyp-Gruppe (n = 67) wurden 36 Events, in der GATA2mutierten Gruppe (n = 4) 1 Event gezählt. (- - - = GATA2mut, ̶ ̶ = GATA2wt,
CIF of relapse = cumulative incidence functions of the relapse, CEBPAsm =
monoallelisch CEBPA-mutiert (single-mutiert), CEBPA = CCAAT/enhancer
binding protein alpha gene, n = Anzahl der Patienten)
- 85 -
3.9
Subgruppenanalyse – CEBPAbi-mutierte Patienten (n = 113)
3.9.1
Korrelation
zwischen
GATA2-Mutationen
und
dem
Auftreten
zusätzlicher Mutationen in FLT3, NPM1, DNMT3A und RUNX1
In der CEBPAbi-Kohorte zeigte sich kein signifikanter Unterschied in der
Assoziation mit zusätzlichen Mutationen zwischen GATA2wt- und GATA2mutPatienten.
Tab. 20:
Inzidenz an zusätzlichen Mutationen in FLT3, NPM1, DNMT3A und
RUNX1 bei CEBPAbi/GATA2wt versus CEBPAbi/GATA2mut. (GATA2wt =
GATA2-Wildtyp, GATA2mut = GATA2-mutiert, FLT3-ITD = fms-like tyrosine
kinase-3 interne Tandemduplikation, FLT3-TKD = fms-like tyrosine kinase-3
Tyrosinkinasedomäne, NPM1 = Nucleophosmin 1, DNMT3A = DNA (cytosine5-)-methyltransferase 3 alpha, RUNX1 = runt-related transcription factor 1, WT
= Wildtyp, MUT = mutiert, Zahlen in Klammern = Anteil der Patienten in (%))
GATA2wt
GATA2mut
(n =77)
(n = 36)
WT
68 (88,3%)
33 (91,7%)
MUT
9 (11,7%)
3 (8,3%)
Keine Daten
0
0
WT
74 (98,7%)
31 (96,9%)
MUT
1 (1,3%)
1 (3,1%)
Keine Daten
2
4
WT
75 (97,4%)
34 (97,1%)
MUT
2 (2,6%)
1 (2,9%)
Keine Daten
0
1
WT
50 (94,3%)
26 (100%)
MUT
3 (5,7%)
0
Keine Daten
24
10
WT
53 (98,2%)
28 (100%)
MUT
1 (1,9%)
0
Keine Daten
23
8
Gen
P - Wert
Wilcoxon
Fischer
FLT3-ITD
.75
FLT3-TKD
.51
NPM1
1.
DNMT3A
.55
RUNX1
- 86 -
1.
3.9.2
Klinische Charakteristika der GATA2mut-Patienten im Vergleich zu
GATA2wt-Patienten in der CEBPAbi-Subgruppe.
In der CEBPAbi-Kohorte zeigte sich ein signifikanter Unterschied bzgl. des
Blastenanteils im KM (P = .04). Patienten mit GATA2mut hatten im Mittel einen
signifikant größeren Blastenanteil im KM (84%) als Patienten mit GATA2wt (75%).
In der CEBPAbi-Kohorte bestand hinsichtlich des Alters nun kein signifikanter
Unterschied mehr zwischen GATA2mut- und GATA2wt-Patienten (P = .83).
GATA2mut-Patienten waren im Mittel 46,6 Jahre alt, in der GATA2wt-Kohorte 48,5
Jahre. In der GATA2mut-Gruppe waren 2 Patienten älter als 60 Jahre (5,6%, 2/36),
in der GATA2wt-Gruppe waren es 11 (14,3%, 11/77) (P = .22).
Bezüglich der Geschlechterverteilung zeigte sich ebenfalls kein signifikanter
Unterschied. Unter den GATA2mut-Patienten waren 22 männlich (61,1%, 22/36)
und 14 weiblich (38,9%, 14/36). Unter den GATA2wt-Patienten waren es 36
männliche (46,8%, 36/77) und 41 weibliche (53,3%, 41/77) Patienten (P = .17).
Des Weiteren zeigte sich kein signifikanter Unterschied hinsichtlich des
Hämoglobinwertes (P = .37), der Thrombozytenzahl (P = .50), der absoluten
Leukozytenzahl (P = .09), der LDH-Werte (P = .33) sowie des Blastenanteils im
PB (P = .10) im Vergleich von Patienten mit und ohne GATA2-Mutation in der
CEBPAbi-Subgruppe.
3.9.3
Zwischen GATA2mut- und GATA2wt-Patienten bestand im Hinblick auf die
Remissionsrate kein Unterschied. In der GATA2mut-Gruppe erreichten 91,7% eine
komplette Remission (33/36) und in der GATA2wt-Gruppe 89,6% (69/77) (P = 1.).
Beide Gruppen unterschieden sich nicht im Hinblick auf die Anzahl von
Frühtodesfällen (ED, early deaths) (P = 1.) und den Anteil an Patienten mit
refraktärer Erkrankungen (P = 1.).
- 87 -
Tab. 21:
CEBPAbi-Subgruppe, GATA2wt- versus GATA2mut-Patienten. In der
Subgruppe biallelisch-mutierter CEBPA-Patienten unterscheiden sich
GATA2-mutierte Patienten und GATA2-Wildtyp-Patienten weder im
Hinblick auf die Anzahl von Frühtodesfällen (P = 1.) noch im Hinblick
auf die Anzahl refraktärer Erkrankungen (P = 1.). (GATA2wt = GATA2Wildtyp, GATA2mut = GATA2-mutiert, CEBPAbi = biallelisch CEBPA-mutiert,
CEBPA = CCAAT/enhancer binding protein alpha gene, n = Anzahl der
Patienten)
GATA2wt
GATA2mut
P – Wert
(n = 77)
(n = 40)
Fisher
Frühtodesfälle
3 (3.9%)
1 (2.78%)
1.
5 (6.49%)
2 (5.56%)
1.
3.9.4
Einfluss des GATA2-Mutationsstatus auf den klinischen Verlauf
Hinsichtlich der Postremissionstherapie bestand hier kein signifikanter Unterschied
zwischen beiden Gruppen (P = .82). In der GATA2mut-Gruppe erhielten 22
Patienten eine konsolidierende Chemotherapie (71%, 22/36), 9 Patienten wurden
allogen stammzelltransplantiert (29,0%, 9/36). In der GATA2wt-Gruppe erhielten 46
Patienten eine konsolidierende Chemotherapie (66,7%, 46/77), 23 Patienten
wurden allogen stammzelltransplantiert (33,3%, 23/77).
Zwischen GATA2mut- und GATA2wt-Patienten bestand kein Unterschied im
Hinblick auf das EFS (P = .54). Patienten mit GATA2mut zeigten im Mittel ein EFS
von 13,5 Monaten, GATA2wt-Patienten eines von 14,7 Monaten.
- 88 -
100
P = .54
75
50
n = 77
25
n = 36
0
0
12
24
36
48
60
72
84
96
108
120
132
Time (months)
CEBPAbi-Kohorte (n=113). In der Grafik sieht man auf der y-Achse
die Zeit (x-Achse). In der Kohorte von 113 biallelisch CEBPA-mutierten
EFS (P = .54). Patienten mit GATA2-Wildtyp hatten ein EFS von im
Mittel 14,7 Monaten, Patienten der GATA2-mutierten Gruppe von im
Mittel 13,5 Monaten. In der GATA2-Wildtyp-Gruppe (n = 77) wurden 46
Events gezählt, in der GATA2-mutierten Gruppe (n = 36) 26 Events.
(CEBPA = CCAAT/enhancer binding protein alpha gene, rot = GATA2-mutiert,
schwarz = GATA2-Wildtyp, CEBPAbi = biallelisch CEBPA-mutiert, n = Anzahl
der Patienten)
- 89 -
Es zeigte sich kein signifikanter Unterschied für das RFS im Vergleich von
GATA2mut- und GATA2wt-Patienten (P = .34).
100
P = .34
75
50
n = 73
25
n = 35
0
0
12
24
36
48
60
72
84
96
108
120
132
Time (months)
Abb. 28: Grafische Darstellung des Rezidiv-freien Überlebens (RFS) der
CEBPAbi-Kohorte (n=113). Für 4 Patienten mit GATA2-Wildtyp und 1
Patienten mit GATA2-Mutation lagen keine Daten bzgl. des RFS vor. In
Kohorte von 108 biallelisch CEBPA-mutierten Patienten zeigte sich kein
signifikanter Unterschied im Hinblick auf das RFS (P = .34). Patienten
mit GATA2-Mutation hatten ein RFS von im Mittel 13,6 Monaten,
Patienten mit GATA2-Wildtyp von im Mittel 26,3 Monaten. In der
GATA2-Wildtyp-Gruppe (n = 73) wurden 40 Events, in der GATA2mutierten Gruppe (n = 35) 24 Events gezählt. (CEBPA =
GATA2-Wildtyp, CEBPAbi = biallelisch CEBPA-mutiert, n = Anzahl der
Patienten)
- 90 -
Auch bzgl. des OS bestand in der CEBPAbi-Subgruppe kein signifikanter
Unterschied zwischen GATA2mut- und GATA2wt-Patienten (P = .61). Das OS
betrug bei GATA2mut-Patienten im Mittel 64,3 Monate, bei den GATA2wt-Patienten
war der Median nicht erreicht.
100
P = .61
75
Overall survival(%)
n = 77
50
n = 36
25
0
0
12
24
36
48
60
72
84
96
108
120
132
Time (months)
Abb. 29: Grafische Darstellung des Gesamtüberlebens (OS) der CEBPAbiKohorte (n=113). In der Grafik sieht man auf der y-Achse aufgetragen
den prozentualen Anteil der beiden Patientengruppen über die Zeit (xAchse). In der Kohorte von 113 biallelisch CEBPA-mutierten Patienten
zeigte sich kein signifikanter Unterschied im Hinblick auf das OS (P =
.61). Patienten mit GATA2-Mutation hatten ein OS von im Mittel 64,3
Monaten. In der GATA2-Wildtyp-Gruppe wurde der Median nicht
erreicht. Bei 77 Patienten wurden in dieser Gruppe 26 Event gezählt. In
der GATA2-mutierten Gruppe (n = 36) wurden 15 Events gezählt.
der Patienten)
- 91 -
Ebenso zeigte sich kein signifikanter Unterschied bzgl. der CIR zwischen der
GATA2mut- und der GATA2wt-Kohorte (P = .42). Für einen Patienten der GATA2mutGruppe lagen keine Daten vor, ebenso wenig für 4 Patienten der GATA2wtGruppe. Für die GATA2wt-Gruppe wurde der Median bislang nicht erreicht.
1.0
CIF of Relapse
P = .42
0.4
0.6
n = 35
n = 73
0.0
0.2
0.8
0
1
0
20
40
60
80
100
120
140
Time(months)
CEBPAbi-Kohorte (n=113). Für 4 Patienten mit GATA2-Wildtyp und 1
Patienten mit GATA2-Mutation lagen keine Daten bzgl. der CIR vor. In
Kohorte von 108 biallelisch CEBPA-mutierten Patienten zeigte sich kein
signifikanter Unterschied im Hinblick auf die CIR (P = .42). Bei
Patienten mit GATA2-Mutation betrug der Zeitraum bis zum Auftreten
eines Ereignisses 18,9 Monate. Bei Patienten mit GATA2-Wildtyp
wurde der Median nicht erreicht. In der GATA2-Wildtyp-Gruppe (n = 73)
wurden 32 Events, in der GATA2-mutierten Gruppe (n = 35) 19 Events
gezählt. (- - - = GATA2mut, ̶ ̶ = GATA2wt, CIF of relapse = cumulative
incidence functions of the relapse, CEBPAbi = biallelisch CEBPA-mutiert,
Patienten)
- 92 -
3.10
Subgruppenanalyse
–
GATA2-Mutationen
in
Abhängigkeit
der
Lokalisation in dem betroffenen Zinkfinger
Bei den beiden ZF von GATA2 handelt es sich um funktionell unterschiedliche
Domänen. Die identifizierten Mutationen in GATA2 sind überwiegend in ZF1
lokalisiert. Die gesonderte Betrachtung der GATA2-Mutationen in Abhängigkeit
von ihrer Lokalisation in ZF1 versus ZF2 hatte zum Ziel, mögliche Unterschiede
hinsichtlich klinischer und laborchemischer Charakteristika sowie der Endpunkte
EFS und OS aufzuzeigen. Einschränkend ist dabei anzumerken, dass die
Patientenzahl in dieser Subgruppenanalyse sehr klein ist. Bei insgesamt 38 der 40
GATA2mut-Patienten konnten die Mutationen in ihrer Lokalisation einer der beiden
ZF zugeordnet werden. Die beiden Patienten, die sowohl eine Mutation in ZF1 als
auch eine in ZF2 trugen, wurden bei dieser Analyse nicht berücksichtigt. 29 der
Mutationen in GATA2 betrafen den ZF1 (76,3%), 9 Mutationen den ZF2 (23,7%).
Im Vergleich dieser beiden Gruppen zeigten sich keine signifikanten Unterschiede
im Hinblick auf das Auftreten zusätzlicher Mutationen in FLT3-ITD (P = .55), FLT3TKD (P = 1.), NPM1 (P = .20) und DNMT3A (P = 1.). Mutationen in RUNX1 traten
in beiden Gruppen keine auf. Eine signifikante Korrelation zwischen dem
betroffenen ZF und dem CEBPA-Mutationsstatus (CEBPAbi versus CEBPAsm)
zeigte sich nicht. Des Weiteren fanden sich auch keine signifikanten Unterschiede
hinsichtlich klinischer Charakteristika, wie Alter (P = .79), Geschlecht (P = .25),
Hämoglobinwert (P = .11), Thrombozytenzahl (P = .78), Leukozytenzahl (P = .89),
LDH (P = .80), Blastenanteil im KM (P = .38) und Blastenanteil im PB (P = .73).
Auch im Hinblick auf die Remissionsrate (P = .13) sowie auf die Endpunkte EFS
(P = .91) und OS (P = .66) konnte kein signifikanter Unterschied zwischen
Mutationen in ZF1 und Mutationen in ZF2 nachgewiesen werden.
3.11
Subgruppenanalyse
–
GATA2-Mutationen
in
Abhängigkeit
der
Lokalisation in der beschriebenen Hotspot-Region
Aufgrund einer Akkumulation der Mutationen in der vorbeschriebenen HotspotRegion entschieden wir uns für eine zusätzliche Analyse der in der HotspotRegion mutierten Patienten. Allerdings beschränkten wir die Hotspot-Region,
definiert von Aminosäure 317 bis Aminosäure 321, in unserer Analyse auf die
- 93 -
Aminosäure-positionen 317 und 318, da innerhalb der Hotspot-Region Mutationen
an diesen Positionen am häufigsten auftraten. Die beiden Patienten mit 2
Mutationen in GATA2 wurden ausgeklammert. 11 der 38 Mutationen in GATA2
konnten an den Aminosäurepositionen 317 und 318 lokalisiert werden (28,9%). Im
Vergleich mit der Gruppe aller anderen Mutationen in GATA2 zeigten sich keine
signifikanten Unterschiede im Hinblick auf das Auftreten zusätzlicher Mutationen in
FLT3-ITD (P = .30), FLT3-TKD (P = .26), NPM1 (P = 1.) und DNMT3A (P = 1.).
Mutationen in RUNX1 traten in beiden Gruppen keine auf. Eine signifikante
Korrelation zwischen einer Mutation der Aminosäuren 317 und 318 und dem
CEBPA-Mutationsstatus (CEBPAbi versus CEBPAsm) zeigte sich nicht (P = 1.).
Darüber hinaus fanden sich ebenfalls keine signifikanten Unterschiede hinsichtlich
der klinischen Charakteristika wie Alter (P = .53), Geschlecht (P = .47),
Hämoglobinwert (P = .81), Thrombozytenzahl (P = .87), Leukozytenzahl (P = .23),
LDH (P = .34), Blastenanteil im KM (P = .56) und Blastenanteil im PB (P = .78).
Auch im Hinblick auf die Remissionsrate (P = 1.) sowie auf die Endpunkte EFS (P
= .33) und OS (P = .59) konnte kein signifikanter Unterschied zwischen
Mutationen der Aminosäuren 317 und 318 und anderen Mutationen von GATA2
nachgewiesen werden.
3.12
Subgruppenanalyse – Patienten < 60 Jahre mit intermediärem
zytogenetischem Risiko
Da Mutationen in GATA2 fast ausschließlich bei Patienten unter 60 Jahren und mit
intermediärem
zytogenetischem
Subgruppenanalyse
mit
exakt
Risikoprofil
dieser
vorkamen,
Kohorte
führten
durch.
wir
eine
Aufgrund
der
hochsignifikanten Korrelation von GATA2-Mutationen mit CEBPAbi-AML lag der
Schwerpunkt dieser Analyse bei Patienten < 60 Jahre mit intermediärem
zytogenetischem Risiko und einer CEBPAbi-AML. 2 GATA2mut-Patienten über 60
Jahre und 2 GATA2mut-Patienten, von denen kein Karyotyp vorlag, wurden in der
Analyse nicht berücksichtigt. Nach diesen Einschränkungen blieben insgesamt
143 Patienten: In der CEBPAbi-Kohorte lagen 33 GATA2mut- und 61 GATA2wtPatienten, in der CEBPAsm-Kohorte 3 GATA2mut- und 46 GATA2wt-Patienten vor.
- 94 -
3.12.1 4-Gruppenvergleich mit CEBPAsm/GATA2wt vs. CEBPAsm/GATA2mut
vs. CEBPAbi/GATA2wt vs. CEBPAbi/GATA2mut
Hinsichtlich der Assoziationen mit zusätzlichen Mutationen zeigte sich in einem 4(CEBPAsm/GATA2wt
Gruppenvergleich
versus
CEBPAsm/GATA2mut
versus
CEBPAbi/GATA2wt versus CEBPAbi/GATA2mut) ein signifikanter Unterschied im
Hinblick auf das Vorliegen einer zusätzlichen FLT3-ITD mit dem niedrigsten Wert
in
der
CEBPAbi/GATA2mut-Gruppe
und
dem
höchsten
Wert
in
der
CEBPAsm/GATA2mut-Gruppe (P = .03). In Bezug auf das Vorliegen einer
zusätzlichen NPM1-Mutation zeigte sich ebenfalls ein signifikanter Unterschied
zwischen den 4 Gruppen mit dem niedrigsten Wert in der CEBPAbi/GATA2mutGruppe und dem höchsten Wert in der CEBPAsm/GATA2mut-Gruppe (P < 0.0001).
Ein weiterer signifikanter Unterschied zeigte sich im Hinblick auf das Vorliegen
einer
zusätzlichen
DNMT3A-Mutation
mit
dem
niedrigsten Wert
in
der
CEBPAbi/GATA2mut-Gruppe und dem höchsten Wert in der CEBPAsm/GATA2wtGruppe (P < 0.0001). In Bezug auf das Vorliegen zusätzlicher Mutationen in der
FLT3-TKD sowie in RUNX1 zeigte sich kein signifikanter Unterschied zwischen
den 4 Gruppen (P = .70) und (P = .29).
Im 4-Gruppenvergleich konnte ein signifikanter Unterschied im Hinblick auf den
Hämoglobinwert
gezeigt
werden,
mit
dem
niedrigsten
Wert
in
der
CEBPAsm/GATA2wt- und dem höchsten Wert in der CEBPAbi/GATA2mut-Gruppe (P
= .02). Weitere signifikante Unterschiede zeigten sich bzgl. der Thrombozytenzahl,
mit dem niedrigsten Wert in der CEBPAbi/GATA2wt- und dem höchsten Wert in der
CEBPAsm/GATA2wt-Gruppe (P = .001) und bzgl. der Prozentzahl an Blasten im
PB, mit dem höchsten Wert in der CEBPAbi/GATA2mut-Gruppe (P = .01).
3.12.2 CEBPAbi/GATA2mut vs. CEBPAbi/GATA2wt
Für den Vergleich innerhalb der CEBPAbi-Patienten <60 Jahre mit einem
intermediären zytogenetischen Risiko standen insgesamt 94 Patienten zur
Verfügung, 61 GATA2wt-Patienten und 33 GATA2mut-Patienten. Hier zeigte sich
der Trend zu einer signifikant höheren Prozentzahl an Blasten im Knochenmark
der
GATA2mut-Patienten
(P
=
.05).
- 95 -
Für
alle
weiteren
klinischen
und
laborchemischen
Parameter
ließen
sich
keine
signifikanten
Unterschiede
aufzeigen.
3.12.3 Vergleich innerhalb der CEBPAsm-mutierten (CEBPAsm/GATA2mut vs.
CEBPAsm/GATA2wt) und CEBPAbi-mutierten Patienten (CEBPAbi/
GATA2mut vs. CEBPAbi/GATA2wt) in Bezug auf die klinischen
Endpunkte EFS, RFS, OS und CIR
Innerhalb der CEBPAsm-mutierten Kohorte <60 Jahre mit intermediärem
zytogenetischem Risiko zeigte sich für das EFS kein signifikanter Unterschied
zwischen GATA2mut- und GATA2wt-Patienten (P = .20). Innerhalb der CEBPAbimutierten Kohorte <60 Jahre mit intermediärem zytogenetischem Risiko zeigte
sich für das EFS ebenfalls kein signifikanter Unterschied zwischen GATA2mut- und
GATA2wt-Patienten (P = .30) (siehe Abb. 31 und Abb. 32).
100
P = .20
75
n =3
50
25
n = 46
0
0
12
36
60
84
108
132
156
180
204
Time (months)
Abb. 31: Grafische Darstellung des Ereignisfreien-Überlebens (EFS) bei
CEBPAsm-Patienten mit GATA2mut versus GATA2wt bei Patienten < 60
Jahre mit intermediärem zytogenetischem Risiko. In der Grafik sieht
- 96 -
man auf der y-Achse aufgetragen den prozentualen Anteil der beiden
Patientengruppen über die Zeit (x-Achse). In dieser Kohorte zeigte sich
kein signifikanter Unterschied im Hinblick auf das EFS (P = .20).
Patienten mit GATA2-Wildtyp hatten ein EFS von im Mittel 10,7
Monaten. In der GATA2-mutierten Gruppe wurde der Median nicht
erreicht. Bei den GATA2-mutierten Patienten (n = 3) wurde 1 Event
gezählt, in der der GATA2-Wildtyp-Gruppe (n = 46) wurden 31 Events
GATA2-mutiert, schwarz = GATA2-Wildtyp, CEBPAsm = monoallelisch
CEBPA-mutiert (single-mutiert), n = Anzahl der Patienten)
100
P = .30
75
n = 61
50
25
n = 33
0
0
12
24
36
48
60
72
84
96
108
120
132
Time (months)
Abb. 32: Grafische Darstellung des Ereignisfreien-Überlebens (EFS) bei
CEBPAbi-Patienten mit GATA2mut versus GATA2wt bei Patienten < 60
Jahre mit intermediärem zytogenetischem Risiko. In der Grafik sieht
kein signifikanter Unterschied im Hinblick auf das EFS (P = .30).
Patienten mit GATA2-Wildtyp hatten ein EFS von im Mittel 27,4
Monaten, Patienten mit GATA2-Mutation von im Mittel 14,9 Monaten. In
der der GATA2-Wildtyp-Gruppe (n = 61) wurden 33 Events gezählt, in
der GATA2-mutierten Gruppe (n = 33) 23 Events. (CEBPA =
Patienten)
- 97 -
Innerhalb der CEBPAsm-mutierten Kohorte <60 Jahre mit intermediärem
zytogenetischem Risiko zeigte sich für das RFS kein signifikanter Unterschied
zwischen GATA2mut- und GATA2wt-Patienten (P = .44) (siehe Abb. 33). Innerhalb
der CEBPAbi-mutierten Kohorte <60 Jahre mit intermediärem zytogenetischem
Risiko zeigte sich für das RFS ebenfalls kein signifikanter Unterschied zwischen
GATA2mut- und GATA2wt-Patienten (P = .29) (siehe Abb. 34). Für 7 der
CEBPAsm/GATA2wt-Patienten und 1 der CEBPAbi/GATA2mut-Patienten lagen keine
Daten vor. In der CEBPAsm-Kohorte wurde für GATA2mut-Patienten der Median
nicht erreicht.
100
P = .44
75
n=3
50
n = 39
25
0
0
12
36
60
84
108
132
156
180
204
Time (months)
Abb. 33: Grafische Darstellung des Rezidiv-freien Überlebens (RFS) bei
Jahre mit intermediärem zytogenetischem Risiko. Für 7 Patienten mit
GATA2-Wildtyp lagen in dieser Kohorte keine Daten bzgl. des RFS vor.
In der Grafik sieht man auf der y-Achse aufgetragen den prozentualen
Anteil der beiden Patientengruppen über die Zeit (x-Achse). In dieser
Kohorte zeigte sich kein signifikanter Unterschied im Hinblick auf das
RFS (P = .44). Patienten mit GATA2-Wildtyp hatten ein RFS von im
Mittel 47,0 Monaten. In der GATA2-mutierten Gruppe wurde der Median
- 98 -
nicht erreicht. Bei den GATA2-mutierten Patienten (n = 3) wurde 1
Event gezählt wurde, in der der GATA2-Wildtyp-Gruppe (n = 39)
wurden 20 Events gezählt. (CEBPA = CCAAT/enhancer binding protein
alpha gene, rot = GATA2-mutiert, schwarz = GATA2-Wildtyp, CEBPAsm =
monoallelisch CEBPA-mutiert (single-mutiert), n = Anzahl der Patienten)
100
P = .29
75
n = 61
50
25
n = 32
0
0
12
24
36
48
60
72
84
96
108
120
132
Time (months)
Abb. 34: Grafische Darstellung des Rezidiv-freien Überlebens (RFS) bei
Jahre mit intermediärem zytogenetischem Risiko. Für 1 GATA2mutierten Patienten lagen in dieser Kohorte keine Daten bzgl. des RFS
vor. In der Grafik sieht man auf der y-Achse aufgetragen den
prozentualen Anteil der beiden Patientengruppen über die Zeit (xAchse). In dieser Kohorte zeigte sich kein signifikanter Unterschied im
Hinblick auf das RFS (P = .29). Patienten mit GATA2-Wildtyp hatten ein
RFS von im Mittel 42,7 Monaten, Patienten mit GATA2-Mutation von im
Mittel 18,9 Monaten. In der der GATA2-Wildtyp-Gruppe (n = 61) wurden
31 Events gezählt, in der GATA2-mutierten Gruppe (n = 32) 21 Events.
der Patienten)
- 99 -
Weder in der CEBPAsm-Kohorte noch in der CEBPAbi-Kohorte zeigte sich ein
Unterschied im Hinblick auf das OS zwischen GATA2mut- und GATA2wt-Patienten
(P = .49) bzw. (P = .19) (siehe Abb. 35 und Abb. 36). In der CEBPAbi-Kohorte
wurde für GATA2wt-Patienten der Median bislang nicht erreicht.
100
P = .49
n=3
Overall survival(%)
75
50
n = 46
25
0
0
12
36
60
84
108
132
156
180
204
Time (months)
Abb. 35: Grafische Darstellung des Gesamtüberlebens (OS) bei CEBPAsmPatienten mit GATA2mut versus GATA2wt bei Patienten < 60 Jahre mit
intermediärem zytogenetischem Risiko. In der Grafik sieht man auf der
y-Achse aufgetragen den prozentualen Anteil der beiden
kein signifikanter Unterschied im Hinblick auf das OS (P = .49).
Patienten mit GATA2-Wildtyp hatten ein OS von im Mittel 107,1
Monaten, Patienten mit GATA2-Mutation von im Mittel 55,6 Monaten. In
der der GATA2-Wildtyp-Gruppe (n = 46) wurden 22 Events gezählt, in
der GATA2-mutierten Gruppe (n = 3) 1 Event. (CEBPA =
GATA2-Wildtyp, CEBPAsm = monoallelisch CEBPA-mutiert (single-mutiert), n
= Anzahl der Patienten)
- 100 -
100
P = .19
Overall survival(%)
75
n = 61
50
n = 33
25
0
0
12
24
36
48
60
72
84
96
108
120
132
Time (months)
Abb. 36: Grafische Darstellung des Gesamtüberlebens (OS) bei CEBPAbiPatienten mit GATA2mut versus GATA2wt bei Patienten < 60 Jahre mit
intermediärem zytogenetischem Risiko. In der Grafik sieht man auf der
y-Achse aufgetragen den prozentualen Anteil der beiden
kein signifikanter Unterschied im Hinblick auf das OS (P = .19).
Patienten mit GATA2-Mutation hatten ein OS von im Mittel 64,3
Monaten. Bei Patienten mit GATA2-Wildtyp wurde der Median nicht
erreicht. In der der GATA2-Wildtyp-Gruppe (n = 61) wurden 18 Events
gezählt, in der GATA2-mutierten Gruppe (n = 33) 23 Events. (CEBPA =
Patienten)
Für 7 Patienten der CEBPAsm/GATA2wt-Patienten und für 1 CEBPAbi/GATA2mutPatienten lagen keine Daten bzgl. der CIR vor. Innerhalb der CEBPAsm-mutierten
Kohorte <60 Jahre mit intermediärem zytogenetischem Risiko zeigte sich für die
CIR kein signifikanter Unterschied zwischen GATA2mut- und GATA2wt-Patienten (P
= .58) (siehe Abb. 37). Innerhalb der CEBPAbi-mutierten Kohorte <60 Jahre mit
intermediärem zytogenetischem Risiko zeigte sich für die CIR ebenfalls kein
signifikanter Unterschied zwischen GATA2mut- und GATA2wt-Patienten (P = .40)
- 101 -
(siehe Abb. 38). In der CEBPAsm-mutierten Kohorte wurde weder für GATA2mutPatienten noch für GATA2wt-Patienten der Median erreicht; das Gleiche gilt für die
GATA2wt-Patienten innerhalb der CEBPAbi-Kohorte.
CIF of Relapse
1.0
P = .58
0.6
n = 39
0.4
0.8
0
1
0.0
0.2
n=3
0
50
100
150
200
Time(months)
Abb. 37: Grafische Darstellung der kumulativen Rezidiv-Inzidenz (CIR) bei
GATA2-Wildtyp lagen keine Daten bzgl. der CIR vor. In der Grafik sieht
Patientengruppen über die Zeit (x-Achse). In der Kohorte von 42
monoallelisch CEBPA-mutierten Patienten zeigte sich kein signifikanter
Unterschied im Hinblick auf die CIR (P = .58). Bei beiden
Patientengruppen wurde der Median bis zum Auftreten eines
Ereignisses nicht erreicht. In der GATA2-Wildtyp-Gruppe (n = 39)
wurden 17 Events, in der GATA2-mutierten Gruppe (n = 3) 1 Event
gezählt. (- - - = GATA2mut, ̶ ̶ = GATA2wt, CIF of relapse = cumulative
incidence functions of the relapse, CEBPAsm = monoallelisch CEBPA-mutiert,
Patienten)
- 102 -
1.0
CIF of Relapse
P = .40
0.6
0.4
n = 32
n = 61
0.0
0.2
0.8
0
1
0
20
40
60
80
100
120
140
Time(months)
Abb. 38: Grafische Darstellung der kumulativen Rezidiv-Inzidenz (CIR) bei
GATA2-Mutation lagen keine Daten bzgl. der CIR vor. In der Grafik
sieht man auf der y-Achse aufgetragen den prozentualen Anteil der
beiden Patientengruppen über die Zeit (x-Achse). In der Kohorte von 93
biallelisch CEBPA-mutierten Patienten zeigte sich kein signifikanter
Unterschied im Hinblick auf die CIR (P = .40). Bei Patienten mit GATA2Mutation betrug der Median bis zum Auftreten eines Ereignisses 54,6
Monate. Für Patienten mit GATA2-Wildtyp wurde der Median bis zum
Auftreten eines Ereignisses nicht erreicht. In der GATA2-WildtypGruppe (n = 61) wurden 24 Events, in der GATA2-mutierten Gruppe (n
= 32) 16 Event gezählt. (- - - = GATA2mut, ̶ ̶ = GATA2wt, CIF of relapse =
cumulative incidence functions of the relapse, CEBPAbi = biallelisch CEBPAmutiert, CEBPA = CCAAT/enhancer binding protein alpha gene, n = Anzahl
der Patienten)
- 103 -
3.13
Analyse der Subgruppen mit inv(3), Monosomie 7, del(7q), t(9;11) und
sAML
Innerhalb der Kohorte von 20 Patienten mit einer inv(3) konnte lediglich eine
Mutation in GATA2 detektiert werden. Dabei handelt es sich um eine
Punktmutation in Exon 4, die zum Austausch einer Aminosäure führt (989 G>A,
p.R330Q). Des Weiteren konnte eine Mutation in GATA2 in der Kohorte von 20
Patienten mit einer Monosomie 7 identifiziert werden. Hierbei handelt es sich
ebenfalls um eine Punktmutation, in Exon 5 lokalisiert (1057 C>T, p.Q353Stop).
Durch den Austausch einer Base entsteht hier ein Stoppcodon, was zu einem
Abbruch der Proteinsynthese führt. Innerhalb der Kohorten von jeweils 20
Patienten mit einer del(7q), 15 Patienten mit einer Translokation t(9;11) sowie 20
Patienten mit einer sekundären AML konnten keine Mutationen in den Exons 2-6
von GATA2 detektiert werden. Innerhalb der oben aufgeführten zytogenetischen
Subgruppen
ist
aussagekräftige
die
Frequenz
Analysen
des
an
GATA2-Mutationen
Einflusses
durchzuführen.
- 104 -
auf
den
zu
gering,
klinischen
um
Verlauf
4
Diskussion
Während Häufigkeit und prognostische Auswirkung von CEBPA-Mutationen bei
AML-Patienten im Allgemeinen sowie auch im Hinblick auf CEBPAsm- versus
CEBPAbi- mutierte Patienten von mehreren Arbeitsgruppen ausführlich untersucht
wurden, gibt es dagegen bislang nur wenige Arbeiten an größeren Kohorten, die
sich gezielt mit dem Auftreten und dem Einfluss zusätzlicher Mutationen innerhalb
CEBPA-mutierter AML-Patienten befasst haben. Insbesondere wurde der Einfluss
von weiteren Mutationen bei den CEBPAsm- versus CEBPAbi-mutierten Patienten
bislang nicht adressiert. Deshalb sollte es ein Forschungsziel sein, die Gruppe der
CEBPAbi-mutierten Patienten weiter bzw. besser zu charakterisieren, um ggf.
prognostisch relevante Untergruppen zu identifizieren. 2012 konnten Greif et al.
erstmals eine signifikante Assoziation von GATA2mut bei CEBPAbi-AML-Patienten
nachweisen. Dieses Ergebnis konnte durch weitere Arbeiten bestätigt werden
(Grossmann V. et al. 2013; Fasan A. et al 2013; Green C. L. et al. 2013). Darüber
hinaus konnte in einigen Kohorten ein Trend zu besserem OS für CEBPAbi-AMLPatienten mit GATA2mut gezeigt werden (Grossmann V. et al. 2013; Fasan A. et al
2013; Green C. L. et al. 2013; Greif P. A. et al. 2012).
4.1
Mutationsfrequenz von GATA2 innerhalb der CEBPA-mutierten AML
In unserer Studie an 202 CEBPAmut-AML-Patienten, von denen 113 CEBPAbimutiert und 89 CEBPAsm-mutiert waren, wiesen insgesamt 33,6% der CEBPAbiAML-Patienten
(38/113)
eine
Mutation
in
GATA2
auf.
Damit
liegt
die
Mutationsfrequenz in der Größenordnung von 18-41%, wie sie auch in der
Literatur beschrieben wird. Dies ist bislang die größte Kohorte an CEBPAbi- und
CEBPAsm-mutierten AML-Patienten, die auf das Vorliegen einer GATA2-Mutation
untersucht wurde. Die mit 4,4% geringe Mutationsfrequenz von CEBPAsm-AMLPatienten (4/89) sowie der fehlende Mutationsnachweis bei CEBPAwt-Nicht-AMLPatienten sind ebenso kongruent mit der Mehrzahl der in der Literatur
vorliegenden Daten. Lediglich Green et al. wiesen 2013 in 16% der CEBPAsmmutierten Kohorte (7/43) Mutationen in GATA2 nach. Fasan et al. konnten 2013
als bislang einzige Arbeitsgruppe GATA2-Mutationen in 3,3% der CEBPAwt-AML-
- 105 -
Patienten (3/92) detektieren. Zwei dieser Patienten trugen eine Mutation in NPM1,
der dritte eine Mutation in RUNX1.
73,8% der Mutationen konnten wir in Exon 4 detektieren, 26,2% in Exon 5. Dass
manche Arbeitsgruppen keine GATA2-Mutationen in CEBPAsm-AML-Patienten
detektieren konnten (Fasan A. et al. 2013; Greif P. A. et al. 2012), mag durch die
z. T. relativ geringe Kohortengröße zu erklären sein (siehe 4.3). 2 der 4 in unserer
Studie detektierten GATA2mut innerhalb der CEBPAsm-AML-Kohorte befanden sich
in Exon 5.
4.2
Lokalisation der Mutationen und mögliche Konsequenzen für die
GATA2-Funktion
In Übereinstimmung mit allen bislang beschriebenen Mutationen in GATA2
identifizierten
wir
überwiegend
Missense-Mutationen,
davon
3
in-frame-
Mutationen. Im Unterschied zu den Daten aus der kleinen Kohorte von 33
CEBPAbi-mutierten AML-Patienten der Arbeitsgruppe um Greif et al. konnten wir
auch Mutationen im Exon 5 detektieren. Diese Ergebnisse decken sich mit den
Daten der Arbeitsgruppen um Green et al. und Fasan et al.. Auffällig ist die in der
Literatur beschriebene Hotspot-Region mit einer Häufung von Mutationen der
Aminosäuren an Position 317-321. An Position 318 konnten in dieser Arbeit mit 9
von 42 die meisten Mutationen identifiziert werden (21,4%). Die Aminosäuren
Alanin an Position 318 und Asparagin an Position 317 liegen genau zwischen 2
der 4 Cystein-Reste, die das Zinkatom kovalent binden. Ein Austausch einer
dieser beiden Aminosäuren führt zwangsläufig zu einer veränderten strukturellen
Anordnung der beiden Cystein-Reste, sowohl zueinander als auch zu dem
Zinkatom. Es ist vorstellbar, dass der Austausch einer dieser beiden Aminosäuren
zu einem veränderten Abstand der beiden Cystein-Reste zu dem Zinkatom führt
und somit die Möglichkeit der Ausbildung einer kovalenten Bindung unterbindet,
was wiederum die Ausbildung der Loop-Struktur stören würde. Ein ähnlicher
Mechanismus ist denkbar für Mutationen an den Positionen 320-322, die
unmittelbar auf einen der Cystein-Reste folgen, sowie für Mutationen an den
Positionen 297 und 299, die einen der Cystein-Reste der anderen Seite der
Schleife des Zinkfingers flankieren. Trainor et al. konnten 2000 zeigen, dass der
- 106 -
N-terminale ZF die Bindungsspezifität des C-terminalen ZF soweit beeinflussen
kann, dass die Erkennung einiger GATA-Konsensussequenzen durch den Cterminalen ZF verhindert wird. Beide GATA1-Zinkfinger kooperieren also bei der
Formation einer Bindungsdomäne, die sich in ihrer Spezifität von der der
einzelnen Zinkfinger alleine unterscheidet. Darüber hinaus ist der N-terminale ZF
von GATA2 sowohl fähig, DNA unabhängig fest zu binden (Pedone P. V. et
al.1997), mit einer Präferenz für das Motiv GATC, als auch die DNA-Bindung des
C-terminalen ZF zu stabilisieren und deren Spezifität zu erhöhen (Trainor C. D. et
al. 2000). Dies lässt die Hypothese zu, dass Mutationen im ZF1 zu strukturellen
Veränderungen führen können, welche die eigene Fähigkeit zur DNA-Bindung
stören wie auch negativ auf die C-terminale DNA-Bindungsfähigkeit sowie deren
Spezifität Einfluss nehmen. Die oben genannten Daten von Trainor et al. stammen
zum Teil aus Untersuchungen von GATA1; die verwendeten N-terminalen und Cterminalen ZF stammten sowohl aus humanem Material wie auch von Hühnern.
Omichinski et al. verwendeten für ihre Untersuchung den aus GATA1 von
Hühnern isolierten N-terminalen ZF, Pedone et al. verwendeten den ebenfalls aus
Hühnern isolierten N-terminalen ZF von GATA2, während Kowalski et al. den
murinen
N-terminalen
ZF
aus
GATA2
verwendeten.
Aufgrund
der
hochkonservierten Sequenz beider Zinkfinger, sowohl speziesübergreifend als
auch innerhalb der GATA-Familie, lassen sich die Schlussfolgerungen mit hoher
Wahrscheinlichkeit
übertragen.
auch
Omichinski
auf
et
den
humanen
al.
Transkriptionsfaktor
konnten
1993
mithilfe
GATA2
der
Kernspinresonanzspektroskopie die dreidimensionale Struktur des C-terminalen
ZF von GATA1 entschlüsseln. Dadurch konnten die Aminosäuren identifiziert
werden, die besonders zum Erhalt der Zinkfingerstruktur essenziell sind. Die oben
genannte Tatsache, dass es sich bei den beiden Zinkfingern um hochkonservierte
Sequenzen innerhalb der GATA-Familie handelt und beide Zinkfinger nach dem
gleichen Muster (CX2C-X17-CNAC) aufgebaut sind, lässt die Hypothese zu, dass
sich die Aussagen über die Bedeutung bestimmter
Aminosäuren für den
Strukturerhalt auch auf den N-terminalen ZF von GATA2 übertragen lassen. An
zwei dieser Aminosäurepositionen, die Omichinski et al. als besonders wichtig für
die strukturelle Integrität der Zinkfinger beschrieben haben, konnten in dieser
Arbeit Mutationen von GATA2 detektiert werden. Es handelt sich dabei um
Mutationen an den Aminosäurepositionen 303 und 307 in ZF1 und Mutationen der
- 107 -
Aminosäure an Position 345 in ZF2. Kowalski et al. entschlüsselten schließlich,
ebenfalls mithilfe der Kernspinresonanzspektroskopie, die Struktur des Nterminalen ZF von murinem GATA1. Der N-terminale ZF scheint eine wichtige
Rolle bei Protein-Protein-Interaktionen mit anderen Zinkfinger-Proteinen, wie zum
Beispiel FOG1, zu spielen. Die für diese Interaktion nötigen Aminosäurenreste
sind innerhalb des ZF1 speziesübergreifend hochkonserviert. In dieser Arbeit ließ
sich ebenfalls eine Mutation in einer dieser Aminosäuren identifizieren, und zwar
an Position 299. Dies stützt die Hypothese, dass durch diese Mutation die
Interaktion mit FOG1 gestört wird. Des Weiteren konnte eine Mutation in ZF2
detektiert werden, die nach den vorliegenden Daten von Omichinski et al.
essenziell für die DNA-Bindungsfähigkeit von ZF2 ist; hierbei handelt es sich um
eine Mutation der Aminosäure an Position 372. Innerhalb der von Pedone et al.
beschriebenen basischen Regionen, die den N-terminalen ZF von GATA2
flankieren und für dessen DNA-Bindungsfähigkeit essenziell sind, konnten in
dieser Arbeit interessanterweise keine Mutationen detektiert werden. Ebenso
wenig
fanden
sich
Mutationen
in
dem
Sequenzabschnitt,
der
als
die
entscheidende Sequenz zur Interaktion mit C/EBPα beschrieben wurde (Tong Q.
et al. 2005). Dieses Ergebnis passt zu den Beobachtungen von Greif et al., die für
einen Teil der von ihnen identifizierten Mutationen nachweisen konnten, dass
GATA2-Mutanten immer noch in der Lage waren, mit C/EBPα zu interagieren.
Bislang
lassen
zusammenfassen:
sich
Der
einige
mögliche
N-terminale
ZF
Funktionen
(ZF1)
der
besitzt
beiden
die
Zinkfinger
Fähigkeit
zur
eigenständigen DNA-Bindung (Pedone P. V. et al. 1997), beeinflusst die DNABindungsfähigkeit und –spezifität des C-terminalen ZF (ZF2) (Trainor C. D. et al.
2000) und ist maßgeblich an Protein-Protein-Interaktionen mit anderen ZinkfingerProteinen wie z.B. FOG1 beteiligt (Kowalski K. et al. 1999). Mutationen im Nterminalen Zinkfinger könnten demnach z.B. durch Strukturveränderungen die
DNA-Bindungsfähigkeit von ZF1 wie auch ZF2 beeinträchtigen. In unserer Arbeit
konnte des Weiteren eine Mutation in der für die mögliche Interaktion mit FOG1
entscheidenden Aminosäuren nachgewiesen werden. Der C-terminale ZF (ZF2) ist
maßgeblich an der DNA-Bindung beteiligt (Omichinski J. G. et al. 1993), sodass
die in diesem Zinkfinger identifizierten Mutationen höchstwahrscheinlich die DNABindungsfähigkeit bzw. -spezifität beeinträchtigen. Darüber hinaus konnten wir
- 108 -
Mutationen in den Abschnitten, die für den Erhalt der Zinkfingerstrukturen
essentiell sind, identifizieren. (Siehe Abbildungen 39 und 40 im Anhang)
4.3
Klinische Charakteristika
In unserer Arbeit konnten wir nachweisen, dass GATA2mut-Patienten in der
Gesamtkohorte signifikant jünger waren als Patienten ohne GATA2-Mutation.
Dieses Ergebnis deckt sich mit dem der Arbeitsgruppe um Green et al., während
andere Arbeitsgruppen (Fasan A. et al., Greif P. A. et al., Grossmann V. et al.)
keinen Unterschied im Hinblick auf klinische Charakteristika feststellen konnten.
Ein
wesentlicher
Grund
für
diesen
Altersunterschied,
den
wir
in
der
Gesamtkohorte gesehen haben, liegt sehr wahrscheinlich darin, dass mit höherem
Alter der Anteil an CEBPA-mutierten AML-Patienten signifikant abnimmt (Schlenk
R. F. et al. 2009). Hier wiederum ist im Vergleich zu Patienten < 60 Jahren nur ein
geringerer Prozentsatz CEBPAbi-mutiert. Da GATA2-Mutationen signifikant mit
CEBPAbi-Mutationen assoziiert sind, sehen wir in der Gesamtkohorte, die auch
Patienten > 60 Jahren einschließt, einen signifikanten Unterschied.
In den untersuchten Kollektiven von Fasan et al., Greif et al. und Grossmann et al.
lag der Altersmedian deutlich höher als in unserem Kollektiv (51,2 Jahre für
GATA2wt und 46,6 Jahre für GATA2mut) und dem von Green et al. (44 Jahre für
GATA2wt und 33,5 Jahre für GATA2mut). Die Arbeitsgruppe um Fasan et al.
untersuchten eine Kohorte von 98 CEBPAbi-mutierten AML-Patienten mit einem
intermediären zytogenetischen Risiko auf die Inzidenz von GATA2-Mutationen in
den Exons 4 und 5. Patienten mit GATA2wt waren im Mittel 60 Jahre alt, Patienten
mit GATA2mut 54 Jahre alt. Die Inzidenz von GATA2mut lag bei 18,3% der
CEBPAbi-mutierten AML-Patienten. Greif et al. untersuchten 33 CEBPAbi-mutierte
AML-Patienten mit normalem Karyotyp auf die Inzidenz von GATA2-Mutationen in
den Exons 1-5. Hier lag der Altersmedian für GATA2wt-Patienten bei 62 Jahren, für
GATA2mut-Patienten bei 48 Jahren. 39,4% der CEBPAbi-mutierten AML-Patienten
war in GATA2 mutiert. Grossmann et al. untersuchten 95 CEBPAbi-mutierte AMLPatienten auf das Vorliegen einer GATA2-Mutation. Der Altersmedian der Kohorte
lag bei 57,5 Jahren. Hier konnte eine Mutation in GATA2 in 21% der CEBPAbimutierten AML-Patienten detektiert werden. Die Unterschiede im Altersmedian
- 109 -
lassen darauf schließen, dass in diesen drei Arbeitsgruppen ein anders
selektioniertes und insgesamt heterogeneres Patientenkollektiv vorlag und auch
dadurch der signifikante Altersunterschied mit dem bevorzugten Auftreten von
GATA2mut bei jüngeren CEBPAmut-Patienten nicht detektiert wurde.
Dies ist auch stimmig mit der Beobachtung, dass in den AMLSG-Studien, in die
nur Patienten im Alter >60 Jahre eingeschlossen wurden (AMLHD 98B und
AMLSG 06-04), keine Mutationen in GATA2 detektiert wurden. Ebenso zeigt sich
in der Studie AMLSG 12-09, in die Patienten ≥18 Jahre ohne obere Altersgrenze
eingeschlossen werden konnten, die GATA2-Mutationsfrequenz deutlich niedriger
als in den Studien mit einer oberen Altersgrenze von 60 Jahren (18,2% versus
24,3-26,7%).
Des Weiteren zeigte sich in der Gesamtkohorte eine signifikante Korrelation von
GATA2-Mutationen
mit
niedrigeren
Thrombozytenzahlen,
höheren
Leukozytenzahlen sowie einer höheren Prozentzahl an Blasten im peripheren Blut
bei Diagnosestellung. Innerhalb der CEBPAbi hatten die Patienten mit GATA2mut
einen
signifikant
höheren
Anteil
an
Blasten
im
Knochenmark.
Diese
Beobachtungen könnten darauf hindeuten, dass akute myeloische Leukämien mit
dem Genotyp CEBPAmut/GATA2mut bzw. CEBPAbi/GATA2mut mit einer höheren
Proliferationsrate einhergehen. Beobachtungen dieser Art sind in der Literatur
bislang nicht beschrieben (Grossmann V. et al. 2013; Fasan A. et al. 2013; Green
C. L. et al. 2013; Greif P. A. et al. 2012). Ein signifikanter Unterschied in Bezug auf
weitere klinische Charakteristika, der sich konstant bei Vorliegen einer GATA2mut
nachweisen lässt, ist nicht zu identifizieren, sodass sich für den GATA2Mutationstyp keine spezifische Korrelation mit einem bestimmten Phänotyp ergibt.
4.4
Mutationen in GATA2 und Korrelation mit dem Auftreten zusätzlicher
Mutationen
Wie erwartet bestätigte sich die signifikante Korrelation von GATA2-Mutationen
und CEBPAbi-Mutationen (P = <.0001). Darüber hinaus konnte weder in der
Gesamtkohorte noch in den einzelnen Subgruppen (CEBPAsm-mutierte AMLPatienten, CEBPAbi-mutierte AML-Patienten, GATA2-Mutationen in Abhängigkeit
der Lokalisation in dem betroffenen Zinkfinger, GATA2-Mutationen in Abhängigkeit
- 110 -
der Lokalisation in der beschriebenen Hotspot-Region sowie CEBPA-mutierte
AML-Patienten < 60 Jahren mit intermediärem zytogenetischem Risikoprofil) eine
signifikante Korrelation zwischen GATA2-Mutationen und Mutationen in FLT3,
NPM1, DNMT3A und RUNX1 nachgewiesen werden. Entsprechend der Daten in
der Literatur (Dufour A. et al. 2010; Hou H. A. et al. 2009; Pabst T. et al. 2009;
Taskesen E. et al. 2011) finden sich bei CEBPAbi-AML signifikant weniger
zusätzliche Mutationen in FLT3-ITD, NPM1 und DNMT3A als in CEBPAsm-AML.
Diese Ergebnisse stützen die These, dass biallelische Mutationen in CEBPA eine
Driver-Mutation darstellen, die ausreicht, um eine Leukämie zu induzieren, und
deshalb für die Entstehung eines leukämischen Phänotyps keine weiteren
Mutationen benötigt werden (Greif P. A. et al. 2012; Kato N. et al. 2011). In der
CEBPAbi/GATA2mut-Kohorte lassen sich noch weniger zusätzliche Mutationen
detektieren, jedoch nicht signifikant. Allerdings ist diese Kohorte mit 36 Patienten
möglicherweise zu klein, um signifikante Effekte aufzuzeigen.
Im Gegensatz zu den bislang publizierten Daten von Fasan et al., Green et al.,
Greif et al. und Grossmann et al., die alle ein Fehlen von FLT3-ITD innerhalb der
GATA2mut-CEBPAmut-Kohorte beobachtet haben, konnten in unserer Arbeit in 10%
der GATA2mut-Kohorte eine FLT3-ITD identifiziert werden. Dies betraf 4 von 40
GATA2mut-Patienten, 1 in der CEBPAsm-Kohorte und 3 in der CEBPAbi-Kohorte.
Die Abweichung der Ergebnisse könnte in der unterschiedlichen Kohortengröße
begründet sein (zur Kohortengröße von Fasan A. et al., Green C. L. et al., Greif P.
A. et al. und Grossmann V. et al. siehe 4.3.). In unserer Arbeit wurde mit 113
Patienten insgesamt die bislang größte Kohorte an CEBPAbi-AML-Patienten und
mit 89 Patienten insgesamt die bislang größte Kohorte an CEBPAsm-AMLPatienten untersucht.
4.5
Mutationen in GATA2 und klinischer Verlauf
Weder in der Gesamtkohorte von 202 CEBPA-mutierten AML-Patienten noch in
den einzelnen Subgruppenanalysen (89 CEBPAsm-mutierte AML-Patienten, 113
CEBPAbi-mutierte
AML-Patienten,
GATA2-Mutationen
in
Abhängigkeit
der
Lokalisation in dem betroffenen Zinkfinger, GATA2-Mutationen in Abhängigkeit der
Lokalisation in der beschriebenen Hotspot-Region sowie 143 CEBPA-mutierte
- 111 -
AML-Patienten < 60 Jahren mit intermediärem zytogenetischem Risikoprofil)
konnte ein signifikanter Einfluss von GATA2mut auf die Endpunkte EFS, RFS, OS
und CIR nachgewiesen werden. Lediglich innerhalb der CEBPAsm-Kohorte zeigte
sich ein signifikant besseres EFS für GATA2mut-Patienten im Vergleich zu
GATA2wt-Patienten (P = .04). Allerdings ist dieses Ergebnis kritisch zu betrachten,
da es sich zum einen um eine ausgesprochen kleine Kohorte von nur 4 Patienten
mit GATA2mut und CEBPAsm handelt und zum anderen von diesen 4 Patienten 3
allogen stammzelltransplantiert wurden. Folglich ist diese kleine Kohorte nur
eingeschränkt mit den GATA2wt-Patienten mit CEBPAsm zu vergleichen; hier
wurden von 85 Patienten lediglich 16 Patienten allogen stammzelltransplantiert.
Die Gruppe von Fasan et al. konnte in ihrer Gesamtkohorte von 212 AMLPatienten (98 CEBPAbi-mutiert, 22 CEBPAsm-mutiert, 92 CEBPAwt-AML-Patienten)
ein signifikant besseres OS der GATA2mut-Patienten im Vergleich zu GATA2wtPatienten zeigen. Innerhalb der Gruppe der GATA2wt-Patienten waren jedoch
auch Patienten eingeschlossen, die CEBPAwt waren und somit per se eine
schlechtere Prognose aufwiesen als Patienten mit CEBPAbi. Durch die
hochsignifikante Assoziation von GATA2mut mit CEBPAbi sind in dieser Gruppe fast
ausschließlich Patienten mit guter Prognose zu finden, sodass daraus ein
signifikanter Unterschied resultieren muss. Somit ist in der Studie von Fasan et al.
das signifikant höhere OS der GATA2mut-Gruppe im Vergleich zur GATA2wtGruppe am ehesten durch den Einfluss von CEBPAbi zu erklären. Gleichwohl zeigt
sich in dieser Studie auch in der Subgruppenanalyse für die 98 CEBPAbi-mutierten
AML-Patienten ein Trend zum besseren OS für GATA2mut im Vergleich zu
GATA2wt (P = .06). Dieses Ergebnis muss insofern kritisch betrachtet werden, weil
keinerlei Informationen über die verschiedenen Therapieregime, das heißt
intensive versus nicht-intensive Chemotherapie, über die Postremissionstherapie,
das
heißt
Konsolidierungschemotherapie
versus
allogene
Stammzelltransplantation, und bzgl. der Anzahl der in einer Studie behandelten
Patienten vorliegen. Es handelt sich aller Wahrscheinlichkeit nach um ein sehr
heterogenes, vorselektioniertes Patientenkollektiv, sodass die Ergebnisse bzgl.
des OS nur eingeschränkt zu werten sind.
Green et al. konnten in ihren Untersuchungen an 153 Patienten mit sporadischer
AML (55 CEBPAbi-mutiert, 43 CEBPAsm-mutiert, 55 CEBPAwt mit normalem
- 112 -
Karyotyp) keinen signifikanten Einfluss von GATA2mut auf OS, EFS und RFS
zeigen. Hier handelt es sich um ein Patientenkollektiv aus den MRC-Studien, die
in Bezug auf das Kriterium Homogenität des Kollektivs am ehesten mit unserer
Patientenkohorte vergleichbar sind.
Greif et al. konnten für die CEBPAbi/GATA2mut-Patienten (13/33) ebenfalls keinen
signifikanten Vorteil bzgl. der oben genannten Endpunkte nachweisen. Allerdings
sprechen Greif et al. in einem 3-Gruppenvergleich (CEBPAbi/GATA2mut versus
CEBPAbi/GATA2wt versus 117 GATA2wt-Patienten, zusammengesetzt aus 28
CEBPAsm-AML-Patienten
und
89
CEBPAwt-AML-Patienten
mit
normaler
Zytogenetik) von einem Trend für ein besseres OS für GATA2mut-Patienten.
Allerdings werden hier, ähnlich wie bei Fasan et al., den CEBPAbi/GATA2mutPatienten auch solche GATA2wt-Patienten gegenübergestellt, die auch CEBPAwt
sind. Darüber hinaus handelt es sich bei den insgesamt 33 CEBPAbi-AMLPatienten, davon 13 GATA2mut, um ein sehr kleines Kollektiv, das zusätzlich
anhand des Karyotyps vorselektioniert wurde. Greif et al. betrachten in ihren
Untersuchungen lediglich Patienten mit normalem Karyotyp (CN-AML-Patienten).
Grossmann et al. konnten wiederum in ihrer Kohorte von 95 CEBPAbi-mutierten
AML-Patienten einen signifikant günstigen Einfluss von GATA2mut auf das OS
zeigen (P = .03). Jedoch ist auch dieses Ergebnis kritisch zu werten: Zum einen
handelt es sich wie bei Fasan et al. um ein stark heterogenes Kollektiv, ohne
vorliegende Informationen bzgl. Therapieregime und Anzahl der in Studien
therapierten Patienten. Außerdem wurden in dieser Kohorte insgesamt mehr
Patienten allogen stammzelltransplantiert als in unserer CEBPAbi-Kohorte [37,5%
(39/80) versus 28,3% (32/113)].
4.6
Unterschiede und Gemeinsamkeiten zwischen CEBPAmut/GATA2mutAML und GATA2-Mutationen bei vererbbaren Syndromen
4.6.1
MonoMac-Syndrom und Emberger-Syndrom
Betrachtet man die bislang in der Literatur beschriebenen Mutationen in GATA2
bei Patienten mit MonoMac-Syndrom (Holme H. et al. 2012, Hsu et al. 2011,
Pasquet M. et al. 2013), so lassen sich sowohl Unterschiede als auch
- 113 -
Gemeinsamkeiten zu den in unserem Kollektiv von CEBPAmut-AML-Patienten
gefundenen Mutationen darstellen. Gemeinsam ist das Auftreten von Mutationen
der Aminosäuren an den Positionen 317, 330 und 372. Bei der Aminosäure 317
handelt es sich um eine der Aminosäuren mit kritischer Lage zu einem der
Cystein-Reste, die das Zinkatom binden. Bei der Aminosäure 372 handelt es sich
um eine der durch Omichinski et al. beschriebenen Aminosäuren, die
entscheidend sind für die DNA-Bindungsfähigkeit von ZF2. Im Unterschied zu den
in dieser Arbeit gefundenen Mutationen werden in der Literatur für das MonoMacSyndrom auch Mutationen der Aminosäuren 361, 371, 396 und 398 beschrieben.
Fasan et al. konnten an der Aminosäureposition 361 Mutationen bei AMLPatienten detektieren, in unserer Studie zeigte keiner der untersuchten AML-Fälle
eine Mutation an dieser Lokalisation. An den Aminosäurepositionen 371, 396 und
398 sind in der Literatur bei sporadischer AML außerhalb von Syndromen bislang
keine Mutationen beschrieben worden.
Von den in der Literatur für das Emberger-Syndrom beschriebenen Mutationen in
GATA2 konnte keine in unserem Kollektiv nachgewiesen werden. Bislang wurden
für das Emberger-Syndrom Mutationen der Aminosäuren 337, 341, 361 sowie 373
beschrieben (Ostergaard P. et al. 2011).
4.6.2
Familiäre AML
Bei Patienten mit familiärer AML/MDS wurden, abgegrenzt zu den oben
genannten Syndromen, bislang zwei Mutationen in GATA2 beschrieben: an den
Aminosäurepositionen 354 und 355 (Hahn C. N. et al. 2011). Die Aminosäure an
Position 354 gehört zu der Gruppe der Aminosäuren, die für die Erhaltung der ZFStruktur entscheidend sind (Omichinski J. G. et al. 1993). In unserer Kohorte
konnte ebenfalls ein Patient mit einer Punktmutation an Position 354 beschrieben
werden, und zwar exakt die gleiche Mutation, die von Hahn et al. identifiziert
wurde. Zu unserem Bedauern lag von diesem Patienten kein Keimbahnmaterial
vor, sodass die Analyse bzgl. des Vorliegens einer GATA2-Keimbahnmutation
nicht erfolgen konnte.
- 114 -
4.7
Zusammenfassung und Ausblick
Ziel dieser Arbeit war die Charakterisierung von GATA2-Mutationen und deren
Inzidenz und prognostische Bedeutung bei AML-Patienten mit CEBPA-Mutationen
zu untersuchen, insbesondere innerhalb der genetischen Subgruppe der CEBPAbiAML. Die Inzidenz an GATA2-Mutationen von 33,6% in unserer Kohorte von 113
CEBPAbi-AML-Patienten deckte sich mit unseren Erwartungen aufgrund der in der
Literatur beschriebenen Angaben von 18-41%. Hierbei konnten wir wie erwartet
die signifikante Korrelation von GATA2-Mutationen und CEBPAbi-Mutationen (P =
<.0001) bestätigen. Ebenso kongruent zu den meisten vorliegenden Daten
konnten wir keine spezifische Korrelation mit einem bestimmten Phänotyp für den
GATA2-Mutationstyp aufzeigen. Weder in der Gesamtkohorte von 202 CEBPAmutierten AML-Patienten noch in den einzelnen Subgruppenanalysen (CEBPAsmmutierte AML-Patienten, CEBPAbi-mutierte AML-Patienten, GATA2-Mutationen in
Abhängigkeit der Lokalisation in dem betroffenen Zinkfinger, GATA2-Mutationen in
Abhängigkeit der Lokalisation in der beschriebenen Hotspot-Region sowie
CEBPA-mutierte AML-Patienten < 60 Jahren mit intermediärem zytogenetischem
Risikoprofil) ließ sich ein signifikanter Einfluss von GATA2-Mutationen auf die
klinischen Endpunkte EFS, RFS, OS und CIR nachweisen. Eine mögliche
Erklärung für die hier gezeigte fehlende prognostische Bedeutung einer
zusätzlichen GATA2-Mutation könnte darin liegen, dass GATA2-Mutationen
überwiegend im Kontext mit einer biallelischen CEBPA-Mutation nachgewiesen
werden, die per se zur Ausbildung eines leukämischen Phänotypes ausreicht.
Somit wäre die biallelische CEBPA-Mutation als Driver-Mutation anzusehen,
während Mutationen in GATA2 lediglich sogenannte Bystander-Mutationen
darstellen würden. Eine weitere mögliche Erklärung für die fehlende prognostische
Bedeutung einer zusätzlichen GATA2-Mutation könnte aber auch darin liegen,
dass die hier untersuchte Patientenpopulation aus statistischer Sicht für die
Beantwortung dieser Fragestellung zu klein ist. Dieser Aspekt könnte mit Hilfe von
Meta-Analysen besser adressiert werden.
Zum besseren Verständnis der Leukämogenese gerade bei dem interessanten
AML-Subtyp der CEBPAbi-mutierten Patienten sollten serielle Analysen erfolgen,
die eine Aussage darüber erlauben, zu welchem Zeitpunkt diese Mutationen
erworben werden. Neben dem Subtyp der CEBPA-mutierten AML-Patienten ist
- 115 -
dies auch insbesondere für Patienten mit GATA2-Keimbahnmutationen von
Bedeutung,
da
es
Hinweise
dafür
gibt,
dass
Patienten
mit
GATA2-
Keimbahnmutation zur Entwicklung einer Leukämie weitere Mutationsereignisse
erwerben müssen. Mithilfe von Methoden wie dem whole-exome-Sequencing bzw.
dem whole-genome-Sequencing, z.B. von Patienten mit MonoMac- oder
Emberger-Syndrom, die im weiteren Krankheitsverlauf eine AML entwickeln,
könnten Informationen über diese zusätzlichen Mutationsereignisse gewonnen
werden.
Wir haben bislang nicht nur die größte Kohorte an CEBPA-mutierten AMLPatienten auf das Vorliegen einer GATA2-Mutation untersucht, bei dem
Patientenkollektiv
handelt
es
sich
darüber
hinaus
ausschließlich
um
Studienpatienten und somit ein relativ homogenes Patientengut, was die
Aussagekraft unserer Analysen weiter stützt.
- 116 -
5
Zusammenfassung
Die akute myeloische Leukämie (AML) stellt eine genetisch äußerst heterogene,
klonale Erkrankung dar. Allerdings haben etwa 45% der AML-Patienten einen
normalen Karyotyp, sodass die wissenschaftliche Herausforderung darin besteht,
diese Patientengruppe mithilfe molekulargenetischer Untersuchungen besser zu
charakterisieren und prognostisch relevante molekulare Marker zu identifizieren.
Dadurch
könnten
prognostisch
unterschiedliche
Subgruppen
definiert,
zielgerichtete Therapieansätze entwickelt und letztendlich die Prognose der
Patienten verbessert werden. Im Rahmen vieler Studien konnten biallelische
Mutationen in CEBPA (CCAAT/enhancer binding protein alpha) als unabhängiger,
günstiger prognostischer Marker bei AML-Patienten identifiziert werden. Aktuelle
Studien konnten eine signifikante Assoziation von Mutationen in GATA2 bei
Patienten mit biallelischer CEBPA-Mutation (CEBPAbi) nachweisen. Im Rahmen
dieser Arbeit führten wir die bislang größte Studie zur Untersuchung von GATA2Mutationen bei AML-Patienten mit CEBPA-Mutation (n=202) durch. Mithilfe eines
DNA-(Desoxyribonukleinsäure)-basierten PCR-(Polymerasekettenreaktion)Assays
der Exons 2-6 von GATA2, gefolgt von der Sequenzierung nach Sanger,
analysierten wir eine Kohorte von 202 Patienten mit CEBPA-Mutation auf das
Vorliegen von GATA2-Mutationen. Von den 202 Patienten trugen 113 Patienten
eine biallelische CEBPA-Mutation, 89 Patienten waren monoallelisch CEBPAmutiert (single-mutiert, CEBPAsm). In der Gesamtkohorte konnten 42 Mutationen
(20,8%) bei 40 Patienten identifiziert werden. Wir konnten in unserer Kohorte die
hohe Inzidenz von GATA2-Mutationen bei Patienten mit CEBPAbi-Mutation
bestätigen. Innerhalb der Kohorte von 113 CEBPAbi-mutierten Patienten konnten
38 GATA2-Mutationen (33,6%) bei 36 Patienten nachgewiesen werden. Darüber
hinaus identifizierten wir zu einem geringeren Prozentsatz auch Mutationen in
CEBPAsm-mutierten Patienten (4/89, 4,4%). Aufgrund der geringen Patientenzahl
dieser Kohorte sind die Ergebnisse in Bezug auf klinische Charakteristika sowie
den klinischen Verlauf nur eingeschränkt aussagefähig. Von 32 der 40 in GATA2mutierten Patienten lag darüber hinaus Remissionsmaterial zur Analyse bzgl. des
Vorliegens einer Keimbahnmutation in GATA2 vor. Bei keinem der Patienten
konnte die vorher detektierte GATA2-Mutation auch im Remissionsmaterial
nachgewiesen werden. Es handelt sich bei diesen Patienten demnach nicht um
- 117 -
Keimbahnmutationen, die ggf. für die Entwicklung einer Leukämie prädisponieren.
Die Korrelation des GATA2-Mutationsstatus mit klinischen Charakteristika (Alter,
Geschlecht, Leukozyten- und Thrombozytenzahl, LDH , Prozentzahl an Blasten
etc.) zeigte weder in der Gesamtkohorte noch in den verschiedenen genetischen
(CEBPAsm-mutierte
Subgruppen
AML-Patienten,
CEBPAbi-mutierte
AML-
Patienten, GATA2-Mutationen in Abhängigkeit der Lokalisation in dem betroffenen
Zinkfinger,
GATA2-Mutationen
in
Abhängigkeit
der
Lokalisation
in
der
beschriebenen Hotspot-Region sowie CEBPA-mutierte AML-Patienten < 60
Jahren
mit
intermediärem
Assoziation.
Somit
zytogenetischem
scheint
es
keinen
Risikoprofil)
spezifischen
eine
signifikante
GATA2/CEBPA-
Mutationsphänotyp zu geben.
Weder in unserer Gesamtkohorte von 202 CEBPA-mutierten AML-Patienten noch
in den jeweiligen genetischen Subgruppen (CEBPAsm-mutierte AML-Patienten,
CEBPAbi-mutierte
AML-Patienten,
GATA2-Mutationen
in
Abhängigkeit
der
Lokalisation in dem betroffenen Zinkfinger, GATA2-Mutationen in Abhängigkeit der
Lokalisation in der beschriebenen Hotspot-Region sowie CEBPA-mutierte AMLPatienten < 60 Jahren mit intermediärem zytogenetischem Risikoprofil) wiesen
GATA2-Mutationen einen zusätzlichen prognostischen Einfluss auf die klinischen
Endpunkte CR-Rate (Rate an kompletten Remissionen), EFS (Ereignisfreies
Überleben), RFS (Rezidiv-freies Überleben), OS (Gesamtüberleben) und CIR
(Cumulative incidence of relapse) auf.
Die hier generierten Daten bilden eine gute Basis für die Durchführung einer MetaAnalyse, anhand derer der prognostische Stellenwert einer zusätzlichen GATA2Mutation evaluiert werden sollte. Darüber hinaus könnte die serielle Analyse von
Patienten mit GATA2-Keimbahnmutation dazu beitragen, die Pathomechanismen
der Leukämogenese weiter zu identifizieren.
Zum
jetzigen
Zeitpunkt
scheint
aufgrund
der
existierenden
Daten
ein
Routinescreening für GATA2-Mutationen bei AML-Patienten nicht gerechtfertigt zu
sein.
- 118 -
6
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GATA-2 in acute myeloid transformation of chronic myeloid leukemia.
- 133 -
7
Anhang
Schematische Darstellung von Zinkfinger 1 und Zinkfinger 2 von GATA2
Abb. 39: Schematische Darstellung von Zinkfinger 1 (ZF1) mit Kennzeichnung
der durch Mutationen betroffenen Aminosäuren. Die Buchstaben in den
Kreisen stehen für die jeweilige Aminosäure (Buchstabencode siehe
Anhang), die Zahlen neben den Kreisen für die Position der
Aminosäure im Gen. Im Zinkfinger liegt das zentrale, kovalent
gebundene, zweifach positiv geladene Zinkatom (Zn ++).
- 134 -
Abb. 40: Schematische Darstellung von Zinkfinger 2 (ZF2) mit Kennzeichnung
der durch Mutationen betroffenen Aminosäuren. Die Buchstaben in den
Kreisen stehen für die jeweilige Aminosäure (Buchstabencode siehe
Anhang), die Zahlen neben den Kreisen für die Position der
Aminosäure im Gen. Im Zinkfinger liegt das zentrale, kovalent
gebundene, zweifach positiv geladene Zinkatom (Zn ++).
- 135 -
Therapieschemata der genannten AMLHD- und AMLSG Studien
Abb. 41: Therapieschema AMLHD93 (I = Idarubicin, C = Cytarabin, E = Etoposid, HA
= Hochdosis Cytarabin, M = Mitoxantron, S-HAM = sequentieller HAM, LOW =
Niedrigrisiko, INTER = intermediäres Risiko, HIGH = Hochrisiko, auto/alloSCT = autologe oder allogene Stammzelltransplantation, RD = refraktäre
Erkrankung)
- 136 -
Abb. 42: Therapieschema AMLHD98A (I = Idarubicin, C = Cytarabin, E = Etoposid, A
= All-trans Retinol, HA = Hochdosis Cytarabin, M = Mitoxantron, G-CSF =
Granulozyten-Kolonie stimulierender Faktor, LP = Liquorpunktion LOW =
Niedrigrisiko, INTER = intermediäres Risiko, HIGH = Hochrisiko, auto/alloBSCT = autologe oder allogene Stammzelltransplantation, RD = refraktäre
Erkrankung, R = Randomisierung, APL = akute Promyelozytenleukämie)
- 137 -
Abb. 43: Therapieschema AMLHD98B (I = Idarubicin, C = Cytarabin, E = Etoposid, A
= All-trans Retinol, HA = Hochdosis Cytarabin, M = Mitoxantron, PD =
fortschreitende Erkrankung, PR = partielle Remission, CR = komplette
Remission, R = Randomisierung, APL = akute Promyelozytenleukämie, allo
BSCT = allogene Stammzelltransplantation)
- 138 -
Abb. 44: Therapieschema AMLSG 06-04 (I = Idarubicin, C = Cytarabin, E =
Etoposid, A = All-trans Retinol, HA = Hochdosis Cytarabin, M = Mitoxantron,
allo-BSCT = allogene Stammzelltransplantation, RD = refraktäre Erkrankung,
PR = partielle Remission, CR = komplette Remission, EFS = Ereignis-freies
Überleben, OS = Gesamtüberleben, R = Randomisierung)
- 139 -
Abb. 45: Therapieschema AMLSG 07-04
- 140 -
Abb. 46: Therapieschema AMLSG 12-09 (I/Ida = Idarubicin, C = Cytarabin, E/Eto =
Etoposid, Aza = Azacitidin, HiDAC = Hochdosis Cytarabin, G-CSF =
Granulozyten-Kolonie
stimulierender
Faktor, allo-SCT
=
allogene
Stammzelltransplantation, PR = partielle Remission, CR = komplette
Remission, CRi = komplette Remission mit inkompletter hämatologischer
Regeneration)
- 141 -
Sequenzausschnitte der GATA2mut Patienten
ID 93-12, 919 C>T, R307W
ID 93-12, 1085 G>A, R362Q
ID 93-82, C953 C>G, A318G
ID 93-118, 1061 C>T, T354M
ID 93-125, 959 G>A, G320D
ID 98A-74, 919 C>T, R307W
ID 98A-74, 1085 G>A, R362Q
ID 98A-227, 959 G>A, G320D
- 142 -
ID 98A-323, 895 G>A, G299R
ID 98A-485, 989 G>T, R330L
ID 98A-508, 959 G>T, G320V
ID 98A-644, 962 T>A, L321H
ID 98A-672, 952 G>A, A318T
ID 98A-784, 953 C>T, A318V
ID 98A-877, 959 G>A, G320D
ID 98A-903, 953 C>T, A318V
- 143 -
ID 98A-957, 1114 G>A, A372T
ID 98A-1041, 961 C>T, L321F
ID 07-04-7, 948 A>G, N317S
ID 07-04-202, 1085 G>A, R362Q
ID 07-04-323, 959 G>A, G320D
ID 07-04-337, 959 G>A, G320D
ID 07-04-387, 953 C>G, A318G
ID 07-04-437, 989 G>T, R330L
- 144 -
ID 07-04-513, 953 C>T, A318V
ID 07-04-636, 1085 G>A, R362Q
ID 07-04-684, 953 C>T, A318V
ID 07-04-712, 962 T>A, L321H
ID 07-04-717, 923 G>A, R308Q
ID 07-04-816, 949 A>C, N317H
ID 07-04-838, 911 C>A, P304H
ID 07-04-903, 1084 C>G, R362G
- 145 -
ID 07-04-1025, 1085 G>A, R362Q
ID 07-04-1044, 907 A>T, T303S
ID 07-04-1115, 953 C>A, A318D
ID 07-04-1147, 889 A>G, N297D
ID 12-09-3, 952 G>A, A318T
ID 12-09-28, 961 C>T, L321F
ID 12-09-45, 965 A>G, Y322C
- 146 -
Sequenz GATA2, DNA-Ebene, c-DNA-Ebene, Aminosäuren-Ebene
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NSG00000179348;r=3:128198270-128212028;t=ENST00000341105
SS
301 TGCACCCAGACCCTGAGCCGCCGCCGCCGGCCATGGAGGTGGCGCCCGAGCAGCCGCGCT
................................ATGGAGGTGGCGCCCGAGCAGCCGCGCT
................................-M--E--V--A--P--E--Q--P--R-S
M
361 GGATGGCGCACCCGGCCGTGCTGAATGCGCAGCACCCCGACTCACACCACCCGGGCCTGG
29 GGATGGCGCACCCGGCCGTGCTGAATGCGCAGCACCCCGACTCACACCACCCGGGCCTGG
10 W--M--A--H--P--A--V--L--N--A--Q--H--P--D--S--H--H--P--G--L-S
421 CGCACAACTACATGGAACCCGCGCAGCTGCTGCCTCCAGACGAGGTGGACGTCTTCTTCA
89 CGCACAACTACATGGAACCCGCGCAGCTGCTGCCTCCAGACGAGGTGGACGTCTTCTTCA
30 A--H--N--Y--M--E--P--A--Q--L--L--P--P--D--E--V--D--V--F--F-S RY
481 ATCACCTCGACTCGCAGGGCAACCCCTACTATGCCAACCCCGCTCACGCGCGGGCGCGCG
149 ATCACCTCGACTCGCAGGGCAACCCCTACTATGCCAACCCCGCTCACGCGCGGGCGCGCG
50 N--H--L--D--S--Q--G--N--P--Y--Y--A--N--P--A--H--A--R--A--R-Y
541 TCTCCTACAGCCCCGCGCACGCCCGCCTGACCGGAGGCCAGATGTGCCGCCCACACTTGT
209 TCTCCTACAGCCCCGCGCACGCCCGCCTGACCGGAGGCCAGATGTGCCGCCCACACTTGT
70 V--S--Y--S--P--A--H--A--R--L--T--G--G--Q--M--C--R--P--H--L-R
S
601 TGCACAGCCCGGGTTTGCCCTGGCTGGACGGGGGCAAAGCAGCCCTCTCTGCCGCTGCGG
269 TGCACAGCCCGGGTTTGCCCTGGCTGGACGGGGGCAAAGCAGCCCTCTCTGCCGCTGCGG
90 L--H--S--P--G--L--P--W--L--D--G--G--K--A--A--L--S--A--A--A-Y
Y
M
661 CCCACCACCACAACCCCTGGACCGTGAGCCCCTTCTCCAAGACGCCACTGCACCCCTCAG
329 CCCACCACCACAACCCCTGGACCGTGAGCCCCTTCTCCAAGACGCCACTGCACCCCTCAG
110 A--H--H--H--N--P--W--T--V--S--P--F--S--K--T--P--L--H--P--S-Y
721 CTGCTGGAGGCCCTGGAGGCCCACTCTCTGTGTACCCAGGGGCTGGGGGTGGGAGCGGGG
389 CTGCTGGAGGCCCTGGAGGCCCACTCTCTGTGTACCCAGGGGCTGGGGGTGGGAGCGGGG
130 A--A--G--G--P--G--G--P--L--S--V--Y--P--G--A--G--G--G--S--G-*
S
RR
781 GAGGCAGCGGGAGCTCAGTGGCCTCCCTCACCCCTACAGCAGCCCACTCTGGCTCCCACC
449 GAGGCAGCGGGAGCTCAGTGGCCTCCCTCACCCCTACAGCAGCCCACTCTGGCTCCCACC
150 G--G--S--G--S--S--V--A--S--L--T--P--T--A--A--H--S--G--S--H-S
841 TTTTCGGCTTCCCACCCACGCCACCCAAAGAAGTGTCTCCTGACCCTAGCACCACGGGGG
509 TTTTCGGCTTCCCACCCACGCCACCCAAAGAAGTGTCTCCTGACCCTAGCACCACGGGGG
170 L--F--G--F--P--P--T--P--P--K--E--V--S--P--D--P--S--T--T--G-M
901 CTGCGTCTCCAGCCTCATCTTCCGCGGGGGGTAGTGCAGCCCGAGGAGAGGACAAGGACG
- 147 -
569 CTGCGTCTCCAGCCTCATCTTCCGCGGGGGGTAGTGCAGCCCGAGGAGAGGACAAGGACG
190 A--A--S--P--A--S--S--S--A--G--G--S--A--A--R--G--E--D--K--D-R R
R
R
961 GCGTCAAGTACCAGGTGTCACTGACGGAGAGCATGAAGATGGAAAGTGGCAGTCCCCTGC
629 GCGTCAAGTACCAGGTGTCACTGACGGAGAGCATGAAGATGGAAAGTGGCAGTCCCCTGC
210 G--V--K--Y--Q--V--S--L--T--E--S--M--K--M--E--S--G--S--P--L-M Y R
S
1021 GCCCAGGCCTAGCTACTATGGGCACCCAGCCTGCTACACACCACCCCATCCCCACCTACC
689 GCCCAGGCCTAGCTACTATGGGCACCCAGCCTGCTACACACCACCCCATCCCCACCTACC
230 R--P--G--L--A--T--M--G--T--Q--P--A--T--H--H--P--I--P--T--Y-1081 CCTCCTATGTGCCGGCGGCTGCCCACGACTACAGCAGCGGACTCTTCCACCCCGGAGGCT
749 CCTCCTATGTGCCGGCGGCTGCCCACGACTACAGCAGCGGACTCTTCCACCCCGGAGGCT
250 P--S--Y--V--P--A--A--A--H--D--Y--S--S--G--L--F--H--P--G--G-R
Y
1141 TCCTGGGGGGACCGGCCTCCAGCTTCACCCCTAAGCAGCGCAGCAAGGCTCGTTCCTGTT
809 TCCTGGGGGGACCGGCCTCCAGCTTCACCCCTAAGCAGCGCAGCAAGGCTCGTTCCTGTT
270 F--L--G--G--P--A--S--S--F--T--P--K--Q--R--S--K--A--R--S--C-M
1201 CAGAAGGCCGGGAGTGTGTCAACTGTGGGGCCACAGCCACCCCTCTCTGGCGGCGGGACG
869 CAGAAGGCCGGGAGTGTGTCAACTGTGGGGCCACAGCCACCCCTCTCTGGCGGCGGGACG
290 S--E--G--R--E--C--V--N--C--G--A--T--A--T--P--L--W--R--R--D-**
Y
1261 GCACCGGCCACTACCTGTGCAATGCCTGTGGCCTCTACCACAAGATGAATGGGCAGAACC
929 GCACCGGCCACTACCTGTGCAATGCCTGTGGCCTCTACCACAAGATGAATGGGCAGAACC
310 G--T--G--H--Y--L--C--N--A--C--G--L--Y--H--K--M--N--G--Q--N—
****Y*************
1321 GACCACTCATCAAGCCCAAGCGAAGACTGTCGGCCGCCAGAAGAGCCGGCACCTGTTGTG
989 GACCACTCATCAAGCCCAAGCGAAGACTGTCGGCCGCCAGAAGAGCCGGCACCTGTTGTG
330 R--P--L--I--K--P--K--R--R--L--S--A--A--R--R--A--G--T--C--C-Y K
R
Y
1381 CAAATTGTCAGACGACAACCACCACCTTATGGCGCCGAAACGCCAACGGGGACCCTGTCT
1049 CAAATTGTCAGACGACAACCACCACCTTATGGCGCCGAAACGCCAACGGGGACCCTGTCT
350 A--N--C--Q--T--T--T--T--T--L--W--R--R--N--A--N--G--D--P--V-1441 GCAACGCCTGTGGCCTCTACTACAAGCTGCACAATGTTAACAGGCCACTGACCATGAAGA
1109 GCAACGCCTGTGGCCTCTACTACAAGCTGCACAATGTTAACAGGCCACTGACCATGAAGA
370 C--N--A--C--G--L--Y--Y--K--L--H--N--V--N--R--P--L--T--M--K—
R
R
1501 AGGAAGGGATCCAGACTCGGAACCGGAAGATGTCCAACAAGTCCAAGAAGAGCAAGAAAG
1169 AGGAAGGGATCCAGACTCGGAACCGGAAGATGTCCAACAAGTCCAAGAAGAGCAAGAAAG
390 K--E--G--I--Q--T--R--N--R--K--M--S--N--K--S--K--K--S--K--K-R
Y
1561 GGGCGGAGTGCTTCGAGGAGCTGTCAAAGTGCATGCAGGAGAAGTCATCCCCCTTCAGTG
1229 GGGCGGAGTGCTTCGAGGAGCTGTCAAAGTGCATGCAGGAGAAGTCATCCCCCTTCAGTG
410 G--A--E--C--F--E--E--L--S--K--C--M--Q--E--K--S--S--P--F--S-R
M
1621 CAGCTGCCCTGGCTGGACACATGGCACCTGTGGGCCACCTCCCGCCCTTCAGCCACTCCG
1289 CAGCTGCCCTGGCTGGACACATGGCACCTGTGGGCCACCTCCCGCCCTTCAGCCACTCCG
430 A--A--A--L--A--G--H--M--A--P--V--G--H--L--P--P--F--S--H--S--
- 148 -
Y
1681 GACACATCCTGCCCACTCCGACGCCCATCCACCCCTCCTCCAGCCTCTCCTTCGGCCACC
1349 GACACATCCTGCCCACTCCGACGCCCATCCACCCCTCCTCCAGCCTCTCCTTCGGCCACC
450 G--H--I--L--P--T--P--T--P--I--H--P--S--S--S--L--S--F--G--H-S
Y
Y
1741 CCCACCCGTCCAGCATGGTGACCGCCATGGGCTAGGGAACAGATGGACGTCGAGGACCGG
1409 CCCACCCGTCCAGCATGGTGACCGCCATGGGCTAG.........................
470 P--H--P--S--S--M--V--T--A--M--G--*-.........................
*
YS
S
S*
1801 GCACTCCCGGGATGGGTGGACCAAACCCTTAGCAGCCCAGCATTTCCCGAAGGCCGACAC
............................................................
............................................................
Tab. 22:
Tab. 23:
Auflistung der Aminosäuren (3-Buchstaben- und 1-Buchstabencode)
Aminosäure
Dreibuchstabencode
Einbuchstabencode
Alanin
Arginin
Asparagin
Asparaginsäure
Cystein
Glutamin
Glutaminsäure
Glycin
Histidin
Isoleucin
Leucin
Lysin
Methionin
Phenylalanin
Prolin
Serin
Threonin
Tryptophan
Tyrosin
Valin
Ala
Arg
Asn
Asp
Cys
Gln
Glu
Gly
His
Ile
Leu
Lys
Met
Phe
Pro
Ser
Thr
Trp
Tyr
Val
A
R
N
D
C
Q
E
G
H
I
L
K
M
F
P
S
T
W
Y
V
Auflistung der Basen der DNA
Abkürzung
A
C
G
T
Base
Adenin
Cytosin
Guanin
Thymin
- 149 -
8
Danksagung
Ich danke Herrn Professor Dr. med. Hartmut Döhner, Ärztlicher Direktor der Klinik
für Innere Medizin III, der mir die Möglichkeit gegeben hat, diese Arbeit an seinem
Institut durchzuführen.
Mein ganz besonderer Dank gilt Frau Professor Dr. med. Konstanze Döhner, die
als Leiterin des AMLSG Laboratory for Molecular and Cytogenetic Diagnostics
(Ulm) der Klinik für Innere Medizin III die Bearbeitung dieses außerordentlich
interessanten Forschungsthemas angeregt und ermöglicht hat. So konnte ich mich
während der gesamten experimentellen Phase und der Auswertung der
Forschungsergebnisse auf eine hervorragende wissenschaftliche Betreuung
verlassen. Ich danke ihr auch herzlich für ihr Vertrauen, dass ich Aspekte der
Arbeit auf dem 55. Jährlichen Meeting der American Society of Hematology
präsentieren durfte.
Ich danke auch allen medizinisch-technischen Assistentinnen des Labors für
zytogenetische und molekulargenetische Diagnostik der Klinik für Innere Medizin
III für die unermüdliche Hilfsbereitschaft und die ausgezeichneten
Arbeitsbedingungen; stellvertretend möchte ich hier Frau Marianne Habdank als
leitende medizinisch-technische Assistentin nennen. Besonders bedanken möchte
ich mich bei Frau Michaela Rehrl, die mich hervorragend mit der Methodik der
Arbeit vertraut gemacht hat.
Ein weiteres Dankeschön gilt Herrn Prof. Dr. med. Richard Schlenk und Frau
Daniela Weber, stellvertretend für die Studienzentrale der AMLSG Ulm, die mich
bei der statistischen Auswertung unterstützt haben.
Abschließend danke ich meinen Eltern für die uneingeschränkte und liebevolle
Unterstützung während meiner gesamten Studien- und Arbeitszeit.
- 150 -
Der Lebenslauf wurde aus Datenschutzgründen entfernt.
- 151 -

vts_9934_15150 - OPARU

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Prof. Dr. H. Döhner Dr. Döhner is Professor of Medicine and Medical

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