Test C

Einflußfaktoren auf die serologische
Einzeltierdiagnostik der Paratuberkulose
mittels ELISA
Heike Köhler
Bundesforschungsanstalt für Viruskrankheiten der Tiere, Standort Jena
NRL Paratuberkulose
Diagnostik der Paratuberkulose am lebenden Tier
Antikörpernachweis mittels ELISA
• schnell
• automatisierbar
• eingeschränkte Spezifität und Sensitivität
Grenzen des Antikörpernachweises:
L
Antikörper erst im Alter von 2-3 Jahren nachweisbar
L
nicht alle infizierten Tiere bilden Antikörper aus
L
hohe Antigenverwandtschaft zwischen Mycobacterium
avium ssp. paratuberculosis und anderen Mykobakterien
Ursachen der Antigenverwandtschaft
• genetisch
Ø
DNA-Homologie zu M. avium ssp. avium > 99%
Ø
hohe DNA-Homologie zu anderen Mykobakterien
• phänotypisch
Ø
komplexe Zellwand
Ø
viele speziesübergreifende Proteinantigene
Kreuzreaktionen mit anderen Mykobakterien
In Deutschland zugelassene Paratuberkulose-ELISAs
ELISA
Antigen
Erhöhung der Spezifität
IDEXX/
Scandinavia
Ganzzellantigen von Map
Vorabsorption mit M. phlei
Pourquier/
Frankreich
protoplasmatischer Extrakt von Map
Vorabsorption mit M. phlei
SVANOVIR/
Schweden
Zellwandantigen (LAM) von Map
-
Synbiotics/
USA
protoplasmatisches Ag von M. avium ssp.
-
Zielstellung
Ø Validierung von in Deutschland zugelassenen ELISA´s für
die Einzeltierdiagnostik der Paratuberkulose im Serum von Milchrindern
Ø Versuch der Bewertung der diagnostischen Aussagekraft der
einzelnen Tests unter den Gesichtspunkten der Erkennung
infizierter Herden und der Bekämpfung
Ø Ermittlung von Einflussfaktoren auf den Antikörpernachweis bei
Paratuberkulose-positiven Tieren
Tiere
Negative Population
Ø 187 Milchkühe aus einem slowakischen Milchviehbestand
• seit 1990 regelmäßige serologische und kulturelle Diagnostik
• seit 2000 bei zweimaliger jährlicher Untersuchung kulturell
und serologisch (AGID, KBR) negativ
• zum Zeitpunkt der Blutentnahme alle Tiere kulturell negativ
Ø 99 Milchkühe aus 3 schwedischen Milchviehbeständen
• frei von Paratuberkulose, durch Schlachttiermonitoring bestätigt
Tiere
Positive Population
Ø 110 Milchkühe aus zwei deutschen Milchviehbeständen
• 83 Tiere mit positivem pathologisch-anatomischen Befund
sowie den Ergebnissen der kulturellen Anzüchtung von
Kot-, Lymphknoten- und Organproben
• 27 Tiere ohne Sektion mit positivem Kotbefund
• davon 74 Tiere
mit Kotbefund > 3 Monate vor Blutentnahme sowie
Kotbefund vom Tag der Blutentnahme
Weitere Charakterisierung der positiven Tiere
• Alter in Jahren
• Zeitspanne seit der letzten Abkalbung
• Vorbericht zu klinischen Symptomen
• klinisch gesund (ohne)
• klinische Symptome, die nicht auf Paratuberkulose hinweisen
(unspezifisch)
• klinische Symptome, die für Paratuberkulose sprechen (typisch)
• Ausmaß der pathologisch-anatomischen Veränderungen
• gering
• mittel
• schwer
ELISA-Tests
Test A (Pourquier) - Protoplasmatisches Ag
+ Vorabsorption mit M. phlei
Test B (IDEXX)
- Ganzzell-Antigen
+ Vorabsorption mit M. phlei
Test C (Svanovir)
- Zellwandantigen (LAM)
ohne Vorabsorption
Berechnungen
Ø Spezifität und Sensitivität
Ø Vorhersagewerte
Ø Berechnungen zur Prävalenzschätzung
Ø Abhängigkeit des Antikörpernachweises vom
• Alter der Tiere
• Zeitraum seit dem letzten Abkalben
• klinischen Bild
• Ausmaß der pathologisch-anatomischen Veränderungen
• Ausscheidungsstatus
Sensitivität (Se) und Spezifität (Sp) der Tests
Sensitivität (%)
Spezifität (%)
Test A
53,6
99,3
Test B
55,5
94,8
Test C
70,0
76,6
Kot-BU
44,6
(100)
Spezifität bei unterschiedlichen Teilpopulationen (in %)
gesamt
Schweden
Slowakische
Republik
χ2-Test
Test A
99,3
99,0
99,5
n.s.
Test B
94,8
94,9
94,7
n.s.
Test C
76,6
67,7
81,3
0,97 %
Einzeltierdiagnostik - Vorhersagewerte der Tests
Positiver Prädiktiver Wert*
Wahrscheinlichkeit, dass ein Tier bei
positivem Testergebnis tatsächlich erkrankt ist
P * Se
PPV =
(P * Se) + ((1 - P) (1 - Sp))
Negativer Prädiktiver Wert*
Wahrscheinlichkeit, dass ein Tier bei
negativem Testergebnis tatsächlich gesund ist
(1 - P) * Sp
NPV =
((1 - P) * Sp) + (P * (1 - Se))
* nach Gardner, I. A. und Greiner, M., 2000
Einzeltierdiagnostik - Vorhersagewerte der Tests
Positiver Prädiktiver Wert
Prävalenz
Test A
Test B
1%
43,61
5%
Negativer Prädiktiver Wert
Test C
Test A
Test B
Test C
9,73
2,93
99,53
99,53
99,61
80,12
35,97
13,60
97,60
97,59
97,98
10 %
89,48
54,25
24,95
95,06
95,04
95,83
20 %
95,04
72,74
42,79
89,54
89,50
91,08
30 %
97,04
82,06
56,18
83,32
83,25
85,63
Herdendiagnostik - Schätzung der wahren Prävalenz
PRG* =
AP + Sp - 1
100
Se + Sp - 1
90
80
70
P-RG
60
50
40
30
20
PRG als Funktion der
Sensitivität und Spezifität
in Relation zur scheinbaren
Prävalenz (Seroprävalenz)
10
0
0
10
20
30
40
50
60
70
Seroprävalenz % (AP)
Pourquier
* nach Rogan und Gladen, 1978
IDEXX
SVANOVIR
80
Herdendiagnostik - Schätzung der wahren Prävalenz
PRG* =
AP + Sp - 1
100
Se + Sp - 1
90
80
70
P-RG
60
50
40
30
20
PRG als Funktion der
Sensitivität und Spezifität
in Relation zur scheinbaren
Prävalenz (Seroprävalenz)
10
0
0
10
20
30
40
50
60
70
Seroprävalenz % (AP)
Pourquier
* nach Rogan und Gladen, 1978
IDEXX
SVANOVIR
80
Herdendiagnostik - Schätzung der wahren Prävalenz
PRG* =
AP + Sp - 1
100
Se + Sp - 1
90
80
70
P-RG
60
50
40
30
20
PRG als Funktion der
Sensitivität und Spezifität
in Relation zur scheinbaren
Prävalenz (Seroprävalenz)
10
0
0
10
20
30
40
50
60
70
Seroprävalenz % (AP)
Pourquier
* nach Rogan und Gladen, 1978
IDEXX
SVANOVIR
80
Herdendiagnostik - Schätzung der wahren Prävalenz
PRG* =
AP + Sp - 1
100
Se + Sp - 1
90
80
70
P-RG
60
50
40
30
20
PRG als Funktion der
Sensitivität und Spezifität
in Relation zur scheinbaren
Prävalenz (Seroprävalenz)
10
0
0
10
20
30
40
50
60
70
Seroprävalenz % (AP)
Pourquier
* nach Rogan und Gladen, 1978
IDEXX
SVANOVIR
80
Einflußfaktoren
% positiv
Positive Befunde in Abhängigkeit vom Alter
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
1,4 - 3
3-4
4-5
5 - 11
Altersklassen
Test A
Test B
Test C
Kotkultur
Einflußfaktoren
% positiv
Positive Befunde in Abhängigkeit vom Zeitpunkt der Abkalbung
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Test A
Test B
0 - 1 Mo p.p.
Test C
2 - 15 Mo p.p.
Kot-BU
Einflußfaktoren
% positiv
Positive Befunde in Abhängigkeit vom Ausmaß
der pathologisch-anatomischen Veränderungen
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
*
Test A
Test B
gering
Test C
mittel bis schwer
Kot-BU
Einflußfaktoren
% positiv
Positive Befunde in Abhängigkeit von der Klinik
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
*
*
*
*
Test A
Test B
Test C
Kot-BU
ohne
unspezifisch
typisch
Übereinstimmung der Kotbefunde (χ2-Test)
Kot-BU zum Zeitpunkt der Blutentnahme
Kot-BU
Vorbericht
positiv
Σ
negativ
positiv
14
21
35
negativ
19
20
39
Σ
33
41
74
χ2 = 0,57
α = 45,03 %
n.s.
Beziehung zwischen ELISA-Ergebnis und Kot-Befund (χ2-Test)
Kot-BU Vorbericht
+
-
Gesamt (n)
35
39
Test A pos.
16
Test B pos.
Test C pos.
Kot-BU Blutentnahmezeitpunkt
+
-
α
33
41
α
19
n.s.
29
6
< 0,1 %
17
19
n.s.
29
7
< 0,1 %
22
28
n.s.
30
20
< 0,1 %
Zusammenfassung und Schlussfolgerungen
Ø Die geprüften ELISA´s zum Nachweis von Antikörpern gegen
Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis im Serum weisen nur eine
begrenzte Sensitivität und z. T. unzureichende Spezifität auf.
Ø Der Antikörper-Nachweis wird von einer Reihe von Faktoren
beeinflußt:
• (Alter, Zeitpunkt nach der Abkalbung)
• Stadium der Erkrankung (Auftreten klinischer Symptome)
• Ausscheidungsstatus der Tiere zum Zeitpunkt
der Probenahme
Die aktuelle Zusammensetzung der positiven Teil-Herde
beeinflusst die Sensitivität des Antikörpernachweises.
Zusammenfassung und Schlussfolgerungen
Ø Screening und Monitoring, Zertifizierung freier Herden:
Einsatz von Tests mit hoher Spezifität
Ê Senkung des Anteils falsch positiver Ergebnisse
Ø Einzeltierdiagnostik (Sanierungsprogramme, Tierhandel):
Mit Hilfe des Antikörpernachweises nicht sicher möglich
Ê Wahl des Tests abhängig vom Ziel der Untersuchung
Ê Abwägung der Kosten-Nutzen-Relation nötig
Ê Kenntnis der epidemiologischen Situation wichtig
Direkter Erregernachweis (Kotkultur) ist unverzichtbar.
Vielen Dank!
Beate Burkert
Uta Möller
Renate Putsche
Irmgard Moser
Erika Bacher
Pavol Miškovic
Ivo Pavlik
Carsten Schroeder
Dieter Uthe
Sonja Kleinhans
Jürgen Plötner
Helmut Ludwig
n = 396
Test A
Sensitivität = 53,6%
Spezifität = 99,3%
400%
380%
360%
340%
320%
300%
280%
+
S/P Prozentsatz
260%
240%
220%
200%
180%
160%
140%
120%
+/-
100%
80%
60%
-
40%
20%
0%
getestete Seren (Rind)
positiv (Deutschland) negativ (Schweden)
negativ (Slowakische Republik)
n = 396
Test B
Sensitivität= 55,5%
Spezifität= 94,8%
2,85
2,7
2,55
2,4
2,25
2,1
1,95
1,8
S/P Verhältnis
1,65
+
1,5
1,35
1,2
1,05
0,9
0,75
0,6
0,45
0,3
+/-
0,15
0
-0,15
-0,3
getestete Seren (Rind)
positiv (Deutschland)
negativ (Schweden)
negativ (Slowakische Republik)
n = 396
Test C
Sensitivität = 70,0%
Spezifität = 76,6%
140%
130%
120%
110%
+
100%
Probenwert (%)
90%
80%
70%
60%
50%
+/-
40%
30%
20%
-
10%
0%
getestete Seren (Rind)
positiv (Deutschland) negativ (Schweden)
negativ (Slowakische Republik)