Ohm, Verena Alexa - Abteilung Lebensmitteltechnologie

Transcription

Konzentrationsabhängige Interaktionen zwischen
alpha-Tocopherol und weiteren Antioxidantien in
lipidhaltigen Systemen
Dissertation
zur Erlangung des Doktorgrades
der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät
der Christian-Albrechts-Universität
zu Kiel
vorgelegt von
Dipl. LMChem Verena Alexa Ohm
Kiel, im April 2007
Dekan:
Prof. Dr. Jürgen Grotemeyer
Erstberichterstatter:
Prof. Dr. Felix Tuczek
Zweitberichterstatter:
Prof. Dr. Karin Schwarz
Tag der mündlichen Prüfung:
06. Juni 2007
Danksagung
Diese Arbeit wurde in der Abteilung Lebensmitteltechnologie am Institut für Humanernährung und
Lebensmittelkunde der Christian-Albrechts-Universität zu Kiel unter der Leitung von Frau Prof. Dr.
Karin Schwarz und Herrn Prof. Dr. Felix Tuczek (Institut für Anorganische Chemie) angefertigt. Als
ein Teil des Graduiertenkollegs 820 „Natürliche Antioxidantien – ihr Wirkungsspektrum in Pflanzen,
Lebensmitteln, Tier und Mensch“ wurde diese Arbeit von der Deutschen Forschungsgemeinschaft
(DfG) und der Union zur Förderung von Öl- und Proteinpflanzen (UFOP) finanziell gefördert.
Eine Vielzahl von Personen haben direkt oder indirekt zu dem Erfolg dieser Arbeit beigetragen. Dafür
möchte ich mich ganz herzlich bei allen bedanken.
Ein besonderer Dank gilt:
•
Frau Prof. Dr. Karin Schwarz, die zu jeder Zeit mit wertvollen Anregungen, fachlicher
Anleitung und persönlicher Betreuung zu dem Gelingen dieser Arbeit beigetragen hat.
•
Herrn Prof. Dr. Felix Tuczek, der zu dieser außergewöhnlichen Zusammenarbeit bereit war
und diese mit interessanten Diskussionen und vielen Ideen gefördert hat.
•
Herrn Dr. Gerhard Peters und Herrn Dr. Klaus Mersmann vom Institut für Anorganische
Chemie, die mir bei offenen Fragen sowohl bei der praktischen als auch bei der theoretischen
Ausführung der Redoxpotenzialmessungen zur Seite standen.
•
Frau Prof. Dr. Christine Desel, die sowohl fachlich für den Bereich Mikroskopie als auch
persönlich immer für Fragen und Diskussionen offen stand.
•
Herrn Dr. Heiko Stöckmann, der einen Grossteil der Arbeit mit seinen fachlichen Ansichten
unterstützt hat.
•
Frau Dr. Anja Heins, die den restlichen Teil der Arbeit mit ihrer fachlichen und persönlichen
Kompetenz vorangetrieben hat.
•
Frau Hertha Meier-Kay, die diese Arbeit gewissenhaft Korrektur gelesen hat und meinem
Freund, Herrn Dr. Jan-Hendrik Meier, der sowohl durch praktische Hilfe bei der Formatierung
der Arbeit als auch durch persönliche Betreuung und ewige Geduld zum Gelingen dieser
Arbeit beigetragen hat.
All meinen Kommilitonen und den Professoren aus dem Graduiertenkolleg, sowie meinen Kollegen
der Abteilung für Lebensmitteltechnologie möchte ich für eine schöne, gemeinsame Zeit, für ihre
Gesprächs- und Diskussionsbereitschaft und für die seelische Unterstützung danken. Mein ganz
besonderer Dank gilt meiner Familie, die mich immer unterstützt haben und mir die Kraft und die
Möglichkeit für eine solche Ausbildung gegeben haben.
Zusammenfassung
Ziel dieser Arbeit war es, die konzentrationsabhängigen Wechselwirkungen von Antioxidantien mit
α-Tocopherol und dessen Auswirkung auf die Stabilität von hoch ungesättigen Fettsäuren systematisch
zu untersuchen. Dazu wurde zunächst die Konzentration von α-Tocopherol in Rapsöltriglyceriden
(ROTG) mit der größten antioxidativen Effizienz bestimmt. In diesem Zusammenhang wurden auch
der Einfluss von Nebenreaktionen des alpha-Tocopherols und die Wirkung voroxidierter Lipide auf
dessen antioxidative Effizienz untersucht. Für die Auswahl von Interaktionspartnern zu α-Tocopherol
wurden die Redoxpotenziale und die antioxidativen Aktivitäten unterschiedlicher Antioxidantien
bestimmt. Anschließend wurden die ausgewählten Antioxidantien mit α-Tocopherol gemeinsam in
Oxidationstests eingesetzt.
α-Tocopherol zeigte die größte antioxidative Effizienz in einem Konzentrationsbereich von 75 –
125 µmol/kg ROTG mit einem Wirkungsoptimum (Wopt) bei 100 µmol/kg ROTG. Mit steigender
Konzentration nahm die antioxidative Wirkung von α-Tocopherol durch seine zunehmende Teilnahme
an den Seitenreaktionen der Oxidation ab. Diese Nebenreaktionen von α-Tocopherol wirkten sich
jedoch erst ab einer α-Tocopherol-Konzentration von 22,5 µmol/kg ROTG (Sproox) signifikant auf seine
antioxidative Wirkung aus. Durch kontinuierliche Zugabe von α-Tocopherol konnte die
α-Tocopherol-Konzentration während der gesamten Induktionsphase nahe des Optimums (≈ Wopt)
gehalten werden. Hierdurch wurde die Induktionsphase deutlich verlängert und somit die Effizienz
von α-Tocopherol erhöht. Durch zunehmende Mengen voroxidierter ROTG wurde das Wirkungsoptimum (Wopt ) sowohl von α-Tocopherol als auch von γ-Tocopherol zu Konzentrationen oberhalb von
250 µmol/kg ROTG verschoben. Eine Kombination der beiden Antioxidantien in voroxidierten ROTG
führte zwar mit steigender Konzentration zu einer geringfügig steigenden Inhibierung der Bildung
sekundärer Oxidationsprodukte, in Hinblick auf die Bildung primärer Oxidationsprodukte wirkte sich
die Anwesenheit von α-Tocopherol (> 100 µmol/kg ROTG) allerdings negativ auf die antioxidative
Wirkung von γ-Tocopherol aus.
Zusätzlich zu den in der Literatur bereits bekannten synergistischen Antioxidantien zu α-Tocopherol
konnten noch weitere unbekannte Antioxidantien sowohl in ROTG als auch in Emulsion identifiziert
werden, deren Aktivität konzentrationsabhängig verlief und mit steigender Synergistenkonzentration
zunahm. Eine steigende α-Tocopherol-Konzentration hingegen wirkte sich negativ auf die Interaktion
aus, was auf die Nebenreaktionen von α-Tocopherol (Sproox) zurückgeführt wird. In ROTG zeigten
allerdings nur nicht-phenolische Antioxidantien synergistische Wirkung, was auf mehrere mögliche
abweichende Reaktionsmechanismen hindeutet.
Bei den in dieser Arbeit zur Identifizierung von synergistischen Paaren aufgestellten Hypothesen
konnte weder über das Verhältnis ihrer antioxidativen Potenziale, das ihrer Redoxpotenziale noch
ihrer Strukturmerkmale Aussagen zu deren resultierender Interaktion gemacht werden. So konnte
entgegen der Aussagen von BUETTNER UND JURKIEVICZ (1993) und LARANJINHA UND CADENAS
(1999) kein Zusammenhang zwischen dem Redoxpotenzial und der resultierenden Interaktion
gefunden werden. Auch konnten die von URI (1961) und von PEYRAT-MAILLARD ET AL. (2003)
bestimmten Zusammenhänge zwischen antioxidativer Aktivität und der resultierenden Interaktion nur
teilweise bestätigt werden.
Abstract
Aim of this study was to analyze systematically the concentration dependent interactions of
antioxidants with α-tocopherol to optimize the stabilization of lipids containing high unsaturated fatty
acids.
Therefore the most efficient α-tocopherol concentration in rapeseed oil triglycerides (ROTG) was
determined. In this context also the effect of side reactions of α-tocopherol and the influence of
preoxidized lipids on its antioxidant efficiency were analyzed. The redox potentials and the
antioxidant activity of diverse antioxidants were tested for the selection of interactive partners to αtocopherol.
The most efficient concentration of α-tocopherol in ROTG for the maximum effect in inhibiting
oxidation was determined to concentrations between 75 and 125 µmol/kg ROTG with an optimum
(Wopt) at an α-tocopherol concentration of 100 µmol/kg ROTG. With increasing concentrations the
antioxidant efficiency of α-tocopherol decreased based on its increasing participation in side reactions
of the oxidation. The participation of α-tocopherol in side reactions had no significant influence on the
antioxidant action of α-tocopherol until an α-tocopherol concentration of 22,5 µmol/kg ROTG (Sproox)
was reached. By a sucsessive addition of α-tocopherol it was possible to hold a continuous αtocopherol concentration near the optimum (Wopt) during the whole induction period. Thereby the
induction period was clearly elongated and thus the efficiency of α-tocopherol increased. Increasing
concentrations of preoxidized lipids produced a shift of the antioxidant efficiency optimum (Wopt) of
α- and γ-tocopherol to concentrations above 250 µmol/kg ROTG. The combination of α- and
γ-tocopherol in preoxidized ROTG was efficient in inhibiting secondary oxidation products. But the
presence of α-tocopherol (> 100 µmol/kg ROTG) lead to a negative antioxidant activity of
γ-tocopherol in inhibiting hydroperoxides.
Additionally to the well known synergistic antioxidants to α-tocopherol further unknown antioxidants
could be identified as well in ROTG as in emulsions. Their activity was concentration dependent and
increased with increasing synergist concentrations. However, an increasing α-tocopherol concentration
exerted negative on the resulting interaction. This was attributed to the side reactions of α-tocopherol
(Sproox). In ROTG only non-phenolic antioxidants showed synergistic activity, this was referred to
several possible different reaction mechanisms.
The hypotheses which were set up during this study concerning the identification of synergistic pairs
could not verify the resulting interactions neither by the relationship of the antioxidant potentials of
the antioxidants, by their redox potentials nor by their structural attributes. The conclusions of
BUETTNER AND JURKIEVICZ (1993) and LARANJINHA AND CADENAS (1999) which showed a
correlation between redox potential and the resulting interaction could not be validated. Also the
relationship of the antioxidant activity and the resulting interaction prognosed by URI (1961) and
PEYRAT-MAILLARD ET AL. (2003) could only partly verified.
Inhaltsverzeichnis
Abbildungsverzeichnis
Tabellenverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis
1
2
XIX
XXVII
XXXIII
Einleitung
1
1.1
Einführung
1
1.2
Zielsetzung
3
Theoretischer Hintergrund
5
2.1
Matrixbeeinflussende Faktoren
7
2.1.1
2.1.2
2.1.3
7
7
7
2.2
Fettsäuremuster
Lipidbegleitstoffe: Metallionen, Sauerstoff
Oxidationsprodukte - Oxidationsgrad
Antioxidation beeinflussende Faktoren
2.2.1
2.2.2
2.2.3
2.2.4
Struktur des Antioxidans
Fettsäurezusammensetzung der Matrix
Antioxidantien-Konzentration
Oxidationsprodukte – Temperatur / Sauerstoff
8
9
10
11
11
2.3
Interaktionen zwischen Antioxidantien
13
2.4
Polarität des Antioxidans bzw. der Matrix und die Lokalisierung
des Antioxidans in der Matrix
14
2.4.1
2.4.2
14
14
„Polar Paradox“
Verteilungsverhalten der Antioxidantien in der Matrix
XIII
2.5
Redoxpotenziale der Antioxidantien bzw. der Matrix – Effekt der
Veränderung von Matrix, pH-Wert, Temperatur
16
2.5.1
17
2.5.2
2.6
20
2.6.1
2.6.2
20
23
3.1.2
3.1.3
3.1.4
25
26
30
32
35
37
40
41
45
Antioxidative Aktivität von α-Tocopherol in ROTG
3.1.1
XIV
Tocopherolderivate
Butylhydroxytoluol, Butylhydroxyanisol, Ethoxyquin, Hydrochinon,
Pyrogallol und tert-Butylhydrochinon
Gallate
Flavonoide
Ascorbinsäurederivate
Pflanzenphenole: Carvacrol, γ-Oryzanol, Oleuropein, Thymol und Tyrosol
Diterpendiphenole
Hydroxyzimtsäuren und Ester
Hydroxybenzoesäuren
Nichtphenolische antioxidative Substanzen
Ergebnisse
3.1
19
Vorkommen und Eigenschaften von Antioxidantien
2.6.3
2.6.4
2.6.5
2.6.6
2.6.7
2.6.8
2.6.9
2.6.10
3
Einteilung phenolischer Verbindungen nach Redoxpotenzial und
antioxidativer Aktivität
Beeinflussung des Redoxpotenzials durch verschiedene
Faktoren
Aktivität von α-Tocopherol in einem Konzentrationsbereich von 5 bis
1500 µmol/kg ROTG
3.1.1.1 Aktivität von α-Tocopherol in ROTG in einem Konzentrationsbereich von 25 bis 125 µmol/kg ROTG
3.1.1.2 Oxidationskinetik von ROTG in Gegenwart von α-Tocopherol
Sukzessive Zugabe von α-Tocopherol zu ROTG
Einfluss der oxidativen Belastung der Matrix bei der Zugabe des
Antioxidans
3.1.3.1 Einfluss von voroxidierten ROTG auf die antioxidative Aktivität
von α-Tocopherol
3.1.3.2 Response-Surface-Design-Experiment zur Bestimmung der
Effizienz von α-Tocopherol in voroxidierten ROTG
3.1.3.3 Einfluss auf die Oxidation durch γ-Tocopherol in
voroxidierten ROTG
Effizienz von γ-Tocopherol in voroxidierten ROTG
3.1.3.5 Vergleich des Einflusses auf den Oxidationsverlauf durch αund durch γ-Tocopherol in voroxidierten ROTG
Effizienz einer Kombination von α- und γ-Tocopherol in
voroxidierten ROTG
Interaktion von α-Tocopherol mit Ascorbinsäure in ROTG
45
45
46
49
52
59
60
62
66
67
71
71
80
3.2
Bestimmung der Redoxpotenziale zur Identifizierung potenzieller
Synergisten zu α-Tocopherol
82
3.2.1
3.2.2
82
85
3.2.3
3.2.4
3.2.5
Bestimmung der Redoxpotenziale mittels Goldchlorid-Titrimetrie
Vergleich des Redoxpotenzials von Butylhydroxyanisol in
verschiedenen Matrices mittels Differenz-Puls-Voltammetrie
Redoxpotenziale von unterschiedlichen Antioxidantien in Acetonitril mittels
Differenz-Puls-Voltammetrie
Differenz-Puls-Voltammetrie in unterschiedlichen Matrices – Auswahl der
potentiellen Synergisten
Redoxpotenziale verschiedener Antioxidantien in Acetonitril gemessen
mittels Cyclovoltammetrie
86
87
89
3.3
Bestimmung der antioxidativen Potenziale der phenolischen
und nicht-phenolischen Antioxidantien
3.4
Interaktionen von phenolischen und nicht-phenolischen
Antioxidantien mit α-Tocopherol in verschiedenen lipidhaltigen
Modellsystemen
100
3.4.1
Interaktionen phenolischer und nicht-phenolischer Antioxidantien mit
α-Tocopherol in ROTG
100
3.4.2
Konzentrationsabhängige Inhibierungen von phenolischen und
nicht-phenolischen Substanzen in ROTG
102
3.4.3
Interaktionen von α-Tocopherol mit Ascorbigen in ROTG
104
3.4.3.1 Interaktion von α-Tocopherol mit Ascorbigen in ROTG bei
einer POZ von 5 meq O2/kg ROTG
3.4.3.2 Interaktion von α-Tocopherol mit Ascorbigen in ROTG bei
unterschiedlichen Oxidationsstadien
Interaktion von α-Tocopherol mit phenolischen und nicht-phenolischen
Substanzen in ROTG bei unterschiedlichen Oxidationsstadien
104
3.4.4
3.4.5
3.4.6
98
105
107
Abbau von α-Tocopherol in An- und Abwesenheit von phenolischen und
nicht-phenolischen Antioxidantien
121
3.4.5.1 Abbau von zwei unterschiedlichen α-Tocopherol-Konzentrationen
in Gegenwart von Kaffeesäure
3.4.5.2 Abbau von zwei unterschiedlichen α-TOH Konzentrationen in
Gegenwart von Vanillinsäure
Interaktion von phenolischen und nicht-phenolischen Antioxidantien mit
α-Tocopherol in Öl-in-Wasser-Emulsionen
121
123
125
3.4.7
Konzentrationsabhängige Inhibierung von phenolischen und nichtphenolischen Antioxidantien
127
3.4.8
Interaktion von α-Tocopherol mit Butylhydroxyanisol in Öl-in-WasserEmulsion
129
3.4.8.1 Interaktion von α-Tocopherol mit Butylhydroxyanisol in Ölin-Wasser-Emulsion bei einer POZ von 5 meq O2/kg ROTG
3.4.8.2 Interaktion von α-Tocopherol mit Butylhydroxyanisol in Ölin-Wasser-Emulsion bei unterschiedlichen Oxidationsstadien
Substanzen in Öl-in-Wasser-Emulsionen bei unterschiedlichen
Oxidationsstadien
129
3.4.9
131
132
XV
3.4.10
4
XVI
147
3.4.10.1 Abbau von α-Tocopherol in micellarer Lösung
3.4.10.2 Abbau von α-Tocopherol in Gegenwart von Kaffeesäure
3.4.10.2.1
Abbau von α-Tocopherol in Gegenwart von
Carnosolsäure
3.4.10.2.2
Abbau von α-Tocopherol in Gegenwart von
Vanillinsäure
3.4.10.3 Abbau von Kaffeesäure in Gegenwart von unterschiedlichen
Konzentrationen an α-Tocopherol
3.4.10.4 Abbau von Vanillinsäure in Gegenwart
unterschiedlicher Konzentrationen an α-Tocopherol
147
147
149
150
152
153
Diskussion
155
4.1
Bestimmung des Wirkungsoptimums von α-Tocopherol in ROTG
155
4.1.1
Eingrenzung des Konzentrationsbereichs für das Wirkungsoptimum von
155
4.1.2
Abbau von α-Tocopherol in ROTG
156
4.1.3
Einfluss initialer Hydroperoxide auf die Wirkung von α-Tocopherol
161
4.1.3.1 Einfluss initialer Hydroperoxide auf die Wirkung von
α-Tocopherol
161
γ-Tocopherol
163
α- und γ-Tocopherol
164
4.2
5
Interaktionen phenolischer Antioxidantien mit α-Tocopherol in micellarer
Lösung
Interaktionen zwischen phenolischen und nicht-phenolischen
Antioxidantien und α-Tocopherol
165
4.2.1
Antioxidative Potenziale phenolischer und nicht-phenolischer
Antioxidantien
166
4.2.2
Redoxpotenziale phenolischer und nicht-phenolischer
Antioxidantien
170
4.2.3
Identifizierung von Interaktionen zwischen α-Tocopherol und
phenolischen und nicht-phenolischen Antioxidantien in ROTG
und in Emulsionen
174
4.2.4
Lokalisierung der Antioxidantien in Emulsionen und micellaren
Lösungen mit Hilfe der Redoxpotenziale
176
4.2.5
Lokalisierung der Antioxidantien in Emulsionen und micellaren Lösungen
mithilfe der Redoxpotentiale
180
Zusammenfassung und Schlussfolgerung
183
6
Material und Methoden
187
6.1
Verwendete Chemikalien
187
6.2
Zusammensetzung der Modellsysteme
187
6.3
Lipidoxidationsexperimente
189
6.3.1
Bestimmung des Hydroperoxidgehaltes mittels EisenthiocyanatMethode
189
6.3.2
Bestimmung der primären Oxidationsprodukte mittels
Konjugierter Diene-Methode
191
6.3.3
Bestimmung der sekundären Oxidationsprodukte Propanal und
Hexanal mittels HSGC
191
6.3.4
Bestimmung der Qualitätsparameter von Antioxidantien
193
6.3.4.1 Länge der Induktionsphase
193
6.3.4.2 Berechnung der Inhibierung
194
6.3.4.3 Berechnung kinetischer Parameter nach Yanishlieva und
Marinova
194
Bestimmung des Abbaus von Antioxidantien mittels HPLC
195
6.3.5.1 Bestimmung des antioxidativen Potenzials mittels DPPHMethode
196
6.3.5.2 Abbau von α-Tocopherol
197
Bestimmung des Redoxpotenzials
202
6.3.6.1 Differenz-Puls-Voltammetrie / Cyclovoltammetrie
204
6.3.5
6.3.6
6.3.6.1.1 Differenz-Puls-Voltammetrie
206
6.3.6.1.2 Cyclovoltammetrie
207
6.3.6.2 Goldchlorid-Titrimetrie
209
6.3.7
Statistische Auswertung
210
6.3.8
Design of Experiment
211
XVII
Anhang
A.1
Bildung von konjugierten Dienen in Gegenwart von α-TocopherolKonzentrationen von 5 bis 1500 µmol/kg ROTG
213
A.2
Bildung von konjugierten Dienen in Gegenwart von α-TocopherolKonzentrationen von 25 bis 125 µmol/kg ROTG
214
A.3
Bildung von konjugierten Dienen und Abbau von α-Tocopherol in
Gegenwart von α-Tocopherol-Konzentrationen von 25 bis 300 µmol/kg
ROTG
215
A.4
Bildung von sekundären Oxidationsprodukten in Gegenwart von
α-Tocopherol-Konzentrationen von 25 bis 300 µmol/kg ROTG
216
A.5
Bildung von konjugierten Dienen in Gegenwart von
α-Tocopherol-Konzentrationen von 25 bis 300 µmol/kg ROTG
217
A.6
Bildung von Hexanal bei sukzessiver Zugabe von α-Tocopherol
218
A.7
Response-Surface-Design-Experimente
220
A.8
Synergismus α-Tocopherol mit Ascorbinsäure
224
A.9
Redoxpotenziale aller Antioxidantien in Acetonitril
226
Literaturverzeichnis
XVIII
213
231
Abbildungsverzeichnis
Abb. 2.1:
Einteilung der Interaktionen zwischen zwei Antioxidantien in Synergismus,
additiven Effekt und Antagonismus. In dieser Abbildung ist ein Synergismus
zwischen α-TOH mit einer Konzentration von 100 µmol/kg ROTG und
Ascorbinsäure mit 200 µmol/kg ROTG dargestellt.
13
Abb. 2.2:
Strukturformeln der Tocopherol-Derivate
21
Abb. 2.3:
Strukturformeln der synthetischen Antioxidantien Butylhydroxytoluol,
Butylhydroxyanisol und Ethoxyquin
24
Abb. 2.4:
Strukturformeln der synthetischen Antioxidantien Pyrogallol, Hydrochinon und tertButylhydrochinon
25
Abb. 2.5:
Strukturformeln der Derivate der Gallussäure
26
Abb. 2.6:
Postulierter Reaktionsmechanismus für ortho-Dihydroxyphenole nach URI (1961)
27
Abb. 2.7:
Strukturformeln der Flavonoide Genistein und Kaempferol
29
Abb. 2.8:
Strukturformeln der Flavonoide Quercetin und Catechin
30
Abb. 2.9:
Strukturformeln der Ascorbinsäure-Derivate Ascorbinsäure und Ascorbylpalmitat
32
Abb. 2.10:
Strukturformel des Ascorbinsäure-Derivats Ascorbigen
32
Abb. 2.11:
Struktur des Pflanzenphenols γ-Oryzanol
34
Abb. 2.12:
Strukturformel des Pflanzenphenols Oleuropein
34
Abb. 2.13:
Strukturformeln der Pflanzenphenole Carvacrol, Thymol und Tyrosol
35
Abb. 2.14:
Strukturformeln der Diterpendiphenole Carnosolsäure und Carnosol
36
Abb. 2.15:
Strukturformel des Sinapinsäure-Derivats Vinylsyringol
39
Abb. 2.16:
Strukturformeln der Hydroxyzimtsäuren p-Coumarsäure, Ferulasäure, Isoferulasäure, Kaffeesäure und Sinapinsäure
39
Abb. 2.17:
Strukturformeln der Hydroxyzimtsäureester Chlorogensäure und Rosmarinsäure
40
Abb. 2.18:
Strukturformel der Hydroxybenzoesäuren Syringasäure und Vanillinsäure
41
Abb. 2.19:
Strukturformel des nicht-phenolischen Antioxidans Liponsäure
41
Abb. 2.20:
Strukturformeln der nicht-phenolischen Antioxidantien Cystein, Methionin und
Glutathion
43
Abb. 3.1:
Bildung von Hydroperoxiden in ROTG in Gegenwart von 5 - 1500 µmol
α-Tocopherol während einer Oxidation bei 40°C im Dunkeln über einen Zeitraum
von 28 Tagen
45
XIX
Abb. 3.2:
Bildung von Hydroperoxiden in ROTG in Gegenwart von 25 - 125 µmol
α-Tocopherol
47
Abb. 3.3:
Darstellung der benötigten Zeit bis zum Erreichen eines Oxidationslevels von
41,25 mmol Hydroperoxide/kg ROTG in Gegenwart von 25 - 125 µmol
α-Tocopherol
48
Abb. 3.4:
Bildung von Hexanal in ROTG in Gegenwart von 25 - 125 µmol α-Tocopherol
48
Abb. 3.5:
Bildung von Propanal in ROTG in Gegenwart von 25 - 125 µmol α-Tocopherol
49
Abb. 3.6:
Entstehung von Hydroperoxiden während der Lagerung von ROTG mit
unterschiedlichen initialen α-Tocopherol-Konzentrationen in einem Bereich von 25
bis 300 µmol/kg ROTG. gleichzeitig dargestellt der Abbau des α-Tocopherol für die
jeweiligen Proben
50
Abb. 3.7:
Oxidationslänge in Abhängigkeit von der α-Tocopherol-Konzentration: Darstellung
der Zeit in Tagen, die die ROTG-Proben mit unterschiedlichen initialen
α-Tocopherol-Konzentrationen von 25 bis 300 µmol/kg ROTG benötigen, um eine
Peroxidzahl von 15 meq O2/kg ROTG zu erreichen, und Darstellung der Länge der
Induktionsphasen dieser Proben
51
Abb. 3.8:
Graphische Darstellung von WInH
52
Abb. 3.9:
Hydroperoxidbildung bei der Probe mit 100 µmol α-Tocopherol (α-TOH)/kg ROTG
durch sukzessive Zugabe von jweils 5 µmol α-TOH/kg ROTG alle 6 Tage, im
Vergleich zu einer Probe mit einer einmaligen α-Tocopherol-Gabe mit einer
Konzentration von 100 µmol/kg ROTG, Lagerung bei 40°C im Dunkeln
53
Abb. 3.10:
Darstellung der verzögerten Abbaugeschwindigkeit von 130 µmol α-Tocopherol/kg
ROTG durch stetige Zugabe von jeweils 5 µmol α-Tocopherol/kg ROTG alle 6 Tage
53
Abb. 3.11:
Entstehung von Hydroperoxiden während der Lagerung von ROTG mit einer
initialen α-Tocopherol-Konzentration von 125 µmol/kg ROTG, im Vergleich zu
einer Probe mit einer initialen α-Tocopherol-Konzentration von 100 µmol/kg ROTG
und 5-facher Zugabe von α-Tocopherol mit einer Konzentration von jeweils 5
µmol/kg ROTG alle sechs Tage; gleichzeitig dargestellt, der Abbau des
α-Tocopherols
55
Abb. 3.12:
Entstehung von Propanal während der Lagerung von ROTG mit einer initialen
α-Tocopherol-Konzentration von 125 µmol/kg ROTG, im Vergleich zu einer Probe
mit einer initialen α-Tocopherol-Konzentration von 100 µmol/kg ROTG und 5facher Zugabe von α-Tocopherol mit einer Konzentration von jeweils 5 µmol/kg
ROTG alle sechs Tage
56
Abb. 3.13:
einer Probe mit einer initialen α-Tocopherol -Konzentration von 100 µmol/kg
ROTG und 5-facher Zugabe von α-Tocopherol mit einer Konzentration von jeweils
50 µmol/kg ROTG alle sechs Tage: gleichzeitig dargestellt, der Abbau des
α-Tocopherols
57
Abb. 3.14:
ROTG, alle sechs Tage
58
Abb. 3.15:
einer Probe mit einer initialen α-Tocopherol-Konzentration von 100 µmol/kg ROTG
und 5-facher Zugabe von α-Tocopherol mit einer Konzentration von jeweils
100 µmol/kg ROTG alle sechs Tage: gleichzeitig dargestellt, der Abbau des
α-Tocopherols
58
XX
Abb. 3.16:
ROTG, alle sechs Tage
59
Abb. 3.17:
Oxidationsverlauf von unterschiedlich stark voroxidierten ROTG-Proben mit POZ
von 2,5, 10 und 25 meq O2/kg ROTG mit und ohne Zugabe einer α-Tocopherol
(α-TOH)-Konzentration von 100 µmol/kg ROTG über 20 Tage bei 40°C (Dunkel)
60
Abb. 3.18:
Inhibierung der Lipidoxidation, berechnet aus der Entstehung von Hydroperoxiden
von vor-oxidierten ROTG-Proben mit initialen POZ von 0, 2,5, 10, 25 und 40 meq
O2/kg ROTG durch Addition einer α-Tocopherol-Konzentration von 100 µmol/kg
ROTG
61
Abb. 3.19:
POZ am Ende der Induktionsphase von unterschiedlich stark voroxidierten ROTGProben (POZ 2,5, 10, 25, 40 meq O2/kg ROTG) mit α-Tocopherol in einer
Konzentration von 100 µmol/kg ROTG
62
Abb. 3.20:
Einfluss des initialen Oxidationsgrades und der α-Tocopherol-Konzentration in
µmol/kg ROTG auf die Entstehung von Hydroperoxiden
65
Abb. 3.21:
µmol/kg ROTG auf die Entstehung von Hexanal
65
Abb. 3.22:
µmol/kg ROTG auf die Entstehung von Hexanal
66
Abb. 3.23:
Entstehung der Hydroperoxide von initial voroxidierten ROTG-Proben mit einer
POZ von 5 und 25 meq O2/kg ROTG und unterschiedlicher Konzentration an γTocopherol
67
Abb. 3.24:
Einfluss des initialen Oxidationsgrades und der γ-Tocopherol-Konzentration auf die
Entstehung von Hydroperoxiden
70
Abb. 3.25:
Entstehung von Propanal
70
Abb. 3.26:
Vergleich der Inhibierungen bei der Entstehung von Hydroperoxiden in ROTG mit
einer Konzentration von 250 µmol/kg ROTG an α- oder γ-Tocopherol mit
unterschiedlichen initialen POZ
71
Abb. 3.27:
Entstehung von Hydroperoxiden
76
Abb. 3.28:
Einfluss des initialen Oxidationsgrades und der γ-Tocopherol-Konzentration in
Gegenwart von α-Tocopherol in einer Konzentration von 100 µmol/kg ROTG auf
die Entstehung von Hydroperoxiden
77
Abb. 3.29:
die Entstehung von Hydroperoxiden
77
Abb. 3.30:
Entstehung von Propanal
78
Abb. 3.31:
die Entstehung von Propanal
79
Abb. 3.32:
die Entstehung von Propanal
79
XXI
Abb. 3.33:
Darstellung der Lagerdauer bis zu einer POZ von 5 meq O2/kg ROTG bei Proben
mit einer α-Tocopherol-Konzentration von 100 µmol/kg ROTG einzeln und in
Kombination mit unterschiedlichen Ascorbinsäure-Konzentrationen von 12,5 bis
200 µmol/kg ROTG. Ebenfalls dargestellt, die berechnete Dauer der jeweiligen
Antioxidantien-Kombination bis zum Erreichen einer POZ 5 meq O2/kg ROTG
81
Abb. 3.34:
Konzentrationsabhängiger Verbrauch an Goldchloridlösung bei unterschiedlichen
Ascorbinsäurekonzentrationen von 0,06 bis 0,24 mmol/L
84
Abb. 3.35:
Potenzialverschiebung von Butylhydroxyanisol in unterschiedlichen Matrices
86
Abb. 3.36:
Redoxpotenziale der Tocopherole in Acetonitril
87
Abb. 3.37:
Cyclovoltammogramm für α-Tocopherol in Acetonitril, vermessen gegen Ferrocen,
als Beispiel für ein quasi-reversibles System
90
Abb. 3.38:
Cyclovoltammogramm für Kaffeesäure in Acetonitril, vermessen gegen Ferrocen,
als Beispiel eines irreversiblen Vorgangs
91
Abb. 3.39:
Antioxidative Potenziale der in dieser Arbeit verwendeten potenziellen Synergisten
in Ethanol mittels DPPH-Analyse, dargestellt in Anzahl reduzierter DPPH Moleküle
pro 10 mg Analyt/L.
99
Abb. 3.40:
Inhibierung aller phenolischen und nicht-phenolischen Substanzen in einer
Konzentration von 500 µmol/kg ROTG, berechnet aus der Entstehung der
Hydroperoxide nach 10 Tagen Oxidation, Propanal und Hexanal
101
Abb. 3.41:
Lagerdauer bis zum Erreichen einer POZ von 5 meq O2/kg ROTG bei ROTGProben mit einer α-Tocopherol-Konzentration von 25 µmol/kg ROTG mit und ohne
Ascorbigen in einer Konzentration von 50, 125, 250 und 500 µmol/kg ROTG und
die berechnete Lagerdauer bei additiver Wirkung der beiden Antioxidantien in
Kombination.
104
Abb. 3.42:
Lagerdauer bis zum Erreichen einer POZ von 5 meq O2/kg ROTG bei ROTGProben mit einer α-Tocopherol-Konzentration von 500 µmol/kg ROTG mit und
ohne Ascorbigen in einer Konzentration von 50, 125, 250 und 500 µmol/kg ROTG
und die berechnete Lagerdauer bei additiver Wirkung der beiden Antioxidantien in
Kombination
105
Abb. 3.43:
Abbau von 25 µmol/kg ROTG α-Tocopherol in Gegenwart von 50 – 500 µmol/kg
ROTG Kaffeesäure
121
Abb. 3.44:
ROTG Kaffeesäure
122
Abb. 3.45:
Abbau von unterschiedlichen Kaffeesäure-Konzentrationen in Gegenwart von
25 µmol/kg ROTG α-Tocopherol
122
Abb. 3.46:
Abbau von unterschiedlichen Kaffeesäure-Konzentrationen in Gegenwart von
123
Abb. 3.47:
ROTG Vanillinsäure
123
Abb. 3.48:
ROTG Vanillinsäure
124
Abb. 3.49:
Abbau von unterschiedlichen Vanillinsäure-Konzentrationen in Gegenwart von
124
Abb. 3.50:
Abbau von unterschiedlichen Vanillinsäure-Konzentrationen in Gegenwart von
125
Abb. 3.51:
Inhibierung aller in dieser Arbeit untersuchten phenolischen und nicht-phenolischen
Antioxidantien in einer Konzentration von 500 µmol/kg ROTG, berechnet aus der
Entstehung der Hydroperoxide, Propanal und Hexanal nach 48 Stunden
126
XXII
Abb. 3.52:
Lagerdauer bis zum Erreichen einer POZ von 5 meq O2/kg ROTG von
Emulsionsproben mit einer α-Tocopherol-Konzentration von 25 µmol/kg ROTG mit
und ohne Butylhydroxyanisol in einer Konzentration von 50, 125, 250 und
500 µmol/kg ROTG und die berechnete Lagerdauer bei additiver Wirkung der
beiden Antioxidantien in Kombination
129
Abb. 3.53:
Lagerdauer bis zum Erreichen einer POZ von 5 meq O2/kg ROTG von
Emulsionsproben mit einer α-Tocopherol-Konzentration von 500 µmol/kg ROTG
mit und ohne Butylhydroxyanisol in einer Konzentration von 50, 125, 250 und
500 µmol/kg ROTG und die berechnete Lagerdauer bei additiver Wirkung der
beiden Antioxidantien in Kombination
130
Abb. 3.54:
Abbau von α-Tocopherol in einer Konzentration von 2,5 µmol/kg in micellarer
Lösung in Gegenwart von Kaffeesäure in den Konzentrationen von 5,0, 12,5, 25,0
und 50,0 µmol/kg micellarer Lösung
148
Abb. 3.55:
Lösung in Gegenwart von Kaffeesäure in den Konzentrationen von 5,0, 12,5, 25,0
149
Abb. 3.56:
Lösung in Gegenwart von Carnosolsäure in den Konzentrationen von 5,0, 12,5, 25,0
149
Abb. 3.57:
Lösung in Gegenwart von Carnosolsäure in den Konzentrationen von 5,0, 12,5, 25,0
150
Abb. 3.58:
Lösung in Gegenwart von Vanillinsäure in den Konzentrationen von 5,0, 12,5, 25,0
151
Abb. 3.59:
Lösung in Gegenwart von Vanillinsäure in den Konzentrationen von 5,0, 12,5, 25,0
151
Abb. 3.60:
Abbau von Kaffeesäure in Konzentrationen von 5,0 bis 50,0 µmol/kg in micellarer
Lösung in Gegenwart von α-Tocopherol in einer Konzentration von 2,5 µmol/kg
micellarer Lösung
152
Abb. 3.61:
Abbau von Kaffeesäure in Konzentrationen von 5,0 bis 50,0 µmol/kg in micellarer
micellarer Lösung
153
Abb. 3.62:
Abbau von Vanillinsäure in Konzentrationen von 5,0 bis 50,0 µmol/kg in micellarer
micellarer Lösung
153
Abb. 3.63:
Abbau von Vanillinsäure in Konzentrationen von 5,0 bis 50,0 µmol/kg in micellarer
micellarer Lösung
154
Abb. 4.1:
Bildung von Nebenprodukten aus dem Abbau von α-Tocopherol unter Annahme
einer äquimolaren Bildung von Nebenprodukten
160
Abb. 4.2:
Abhängigkeit der antioxidativen Aktivität (DPPH) der phenolischen und nichtphnolischen Verbindungen vom Halbwellenpotenzial
173
Abb. 4.3:
Vereinfachte Darstellung der Emulgatorschicht einer SDS-Emulsion mit darin
solubilisierten Antioxidansmolekülen an unterschiedlichen Stellen der Micelle
181
Abb. 6.1:
Struktur des Emulgators SDS
187
Abb. 6.2:
Kalibrationskurve zur Berechnung der Eisen(III)-Konzentration bei einer Extinktion
von 485 nm
190
XXIII
Abb. 6.3:
Kalibrationskurven zur Berechnung der Hexanal- und der Propanalkonzentration in
SDS-Emulsionen, bezogen auf die Ölphase
192
Abb. 6.4:
Kalibrationskurven zur Berechnung der Hexanal- und der Propanalkonzentration in
ROTG
193
Abb. 6.5:
Struktur des Radikals DPPH und Reaktionsmechanismus
196
Abb. 6.6:
Kalibrationskurve zur Berechnung der Anzahl reduzierter Radikale pro Mol
Analyt/L.
197
Abb. 6.7:
Kalibrationskurven zur Berechnung der Kaffeesäure- und der VanillinsäureKonzentration, bezogen auf die Ölphase
200
Abb. 6.8:
a. Kalibrationskurve zur Berechnung der α-Tocopherol-Konzentration, bezogen auf
die Ölphase, bestimmt mittels reversed-phase-HPLC
200
Abb. 6.9:
b. Kalibrationskurven zur Berechnung der α-Tocopherol-Konzentration, bezogen auf
die Ölphase, bestimmt mit normal-phase-HPLC
201
Abb. 6.10:
Struktur von Ferrocen
205
Abb. 6.11:
Spannungsrampe der an die Arbeitselektrode angelegten Spannung bei der
Differenz-Puls-Voltammetrie, modifiziert nach WANG (2006)
206
Abb. 6.12:
Spannungsrampe der an die Arbeitselektrode angelegten Spannung bei der
Cyclovoltammetrie, nach WANG (2006)
207
Abb. 6.13:
Aufbau des Central-Composite-Design zur Darstellung der drei verschiedenen Arten
von Punkten
212
Abb. A.1:
Bildung von konjugierten Dienen in ROTG in der Gegenwart von 5 - 1500 µmol
α-Tocopherol
213
Abb. A.2:
Bildung von konjugierten Dienen in ROTG in Gegenwart von 25 – 125 µmol
α-Tocopherol
214
Abb. A.3:
Entstehung konjugierter Diene während der Lagerung von ROTG mit unterschiedlichen initialen α-Tocopherol-Konzentrationen in einem Bereich von 25 bis
300 µmol/kg ROTG: gleichzeitig dargestellt, der Abbau des α-Tocopherols für die
jeweiligen Proben
215
Abb. A.4:
Entstehung von Hexanal während der Lagerung von ROTG mit unterschiedlichen
initialen α-Tocopherol-Konzentrationen in einem Bereich von 25 bis 300 µmol/kg
ROTG
216
Abb. A.5:
Entstehung von Propanal während der Lagerung von ROTG mit unterschiedlichen
initialen α-Tocopherol-Konzentrationen in einem Bereich von 25 bis 300 µmol/kg
ROTG
216
Abb. A.6:
Bildung konjugierter Diene bei einer Probe mit 100 µmol α-Tocopherol/kg ROTG
durch sukzessive Zugabe von jeweils 5 µmol α-Tocopherol/kg ROTG alle 6 Tage im
Vergleich zu einer Probe mit einmaliger initialer α-Tocopherol-Gabe mit einer
Konzentration von 100 µmol/kg ROTG
217
Abb. A.7:
Entstehung von Hexanal während der Lagerung von ROTG mit einer initialen
α-Tocopherol-Konzentration von 125 µmol/kg ROTG im Vergleich zu einer Probe
218
Abb. A.8:
218
XXIV
Abb. A.9:
219
Abb. A.10:
Darstellung der Lagerdauer bis zu einer POZ von 15 meq O2/kg ROTG von Proben
200 µmol/kg ROTG. Ebenfalls dargestellt: die berechnete Dauer der AntioxidantienKombination bis zum Erreichen einer POZ von 15 meq O2/kg ROTG
224
Abb. A.11:
200 µmol/kg ROTG. Ebenfalls dargestellt: die berechnete Dauer der AntioxidantienKombination bis zum Erreichen einer POZ von 50 meq O2/kg ROTG.
224
Abb. A.12:
200 µmol/kg ROTG. Ebenfalls dargestellt: die berechnete Dauer der AntioxidantienKombination bis zum Erreichen einer POZ von 10 meq O2/kg ROTG
225
Abb. A.13:
Vergleich der Redoxpotenziale von synthetischen Antioxidantien in Acetonitril
226
Abb. A.14:
Vergleich der Redoxpotenziale der Gallate in Acetonitril
227
Abb. A.15:
Vergleich der Redoxpotenziale von Flavonoiden in Acetonitril
227
Abb. A.16:
Vergleich der Redoxpotenziale der Ascorbinsäurederivate
228
Abb. A.17:
Vergleich der Redoxpotenziale von Pflanzenphenolen in Acetonitril
228
Abb. A.18:
Vergleich der Redoxpotenziale von Diterpendiphenolen in Acetonitril
229
Abb. A.19:
Vergleich der Redoxpotenziale von Hydroxyzimtsäuren und deren Ester in
Acetonitril.
229
Abb. A.20:
Vergleich der Redoxpotenziale von Hydroxybenzoesäuren in Acetonitril
230
Abb. A.21:
Vergleich der Redoxpotenziale von nichtphenolischen antioxidativen Substanzen in
Acetonitril
230
XXV
XXVI
Tabellenverzeichnis
Tab. 2.1:
Matrix und Antioxidantien beeinflussende Faktoren
6
Tab. 2.2:
Redoxpotenziale verschiedener Antioxidantien mit Angabe der Matrix, des pHWertes und der Referenzelektrode
18
Tab. 3.1:
Bildung von Hydroperoxiden nach 14 Tagen in Gegenwart von 50 - 1500 µmol
α-Tocopherol
46
Tab. 3.2:
Inhibierung der Lipidoxidation bei unterschiedlichen α-Tocopherol-Konzentrationen
von 25 - 125 µmol/kg ROTG
47
Tab. 3.3:
Darstellung der Dauer der Induktionsphase, der Hydroperoxid-Konzentration am
Ende der Induktionsphase, die Zeit bis zum Erreichen einer POZ von 15 meq O2/kg
ROTG und die aus diesen Daten berechneten kinetischen Parameter zur
Charakterisierung der Effekte der unterschiedlichen α-Tocopherol-Konzentrationen
für ROTG-Proben mit initialen α-Tocopherol-Konzentrationen von 25 bis
300 µmol/kg ROTG, sowie der Effizienz von α-Tocopherol
50
Tab. 3.4:
Vergleich der Länge der Induktionsphase und der Konzentration an Hydroperoxiden
am Ende der Induktionsphase zweier Proben mit der gleichen α-Tocopherol-StartKonzentration von ca. 130 µmol/kg ROTG, wobei die eine nur eine initiale αTocopherol-Zugabe, die andere eine sukzessive Zugabe von α-Tocopherol bis zu
einer Konzentration von 155 µmol/kg ROTG erhalten hat
54
Tab. 3.5:
Vergleich der Länge der Induktionsphase und die Dauer bis zum Erreichen einer
Hydroperoxidkonzentration von 75 mmol/kg ROTG mehrerer Probenpaare mit
jeweils gleicher Gesamt-α-Tocopherol-Konzentration von 125, 350 und
600 µmol/kg ROTG, wobei die eine Probe des Paares nur mit einer initialen α-TOHZugabe, die andere mit einer schrittweisen Zugabe von α-Tocopherol versetzt
wurde.
55
Tab. 3.6:
Faktor Level des Central-Composite-Designs zur Bestimmung des Einflusses von
voroxidierten ROTG auf die antioxidative Effizienz von α-Tocopherol
62
Tab. 3.7:
Versuchsplan zur Identifizierung des Einflusses des zunehmend oxidierten initialen
Zustands der ROTG auf die abfallende antioxidative Effizienz unterschiedlicher
α-Tocopherol-Konzentrationen
63
Tab. 3.8:
Regressionsergebnisse für alle Parameter und signifikante Interaktionen, bestimmt
für die drei Ergebnisvariablen Hydroperoxidgehalt, Propanalgehalt, Hexanalgehalt
64
Tab. 3.9:
Faktor Level des Central-Composite-Designs zur Bestimmung des Einflusses von
voroxidierten ROTG auf die antioxidative Effizienz von γ-Tocopherol
67
XXVII
Tab. 3.10:
γ-Tocopherol-Konzentrationen
68
Tab. 3.11:
für zwei der drei Ergebnisvariablen: Hydroperoxidgehalt und Propanalgehalt
69
Tab. 3.12:
Faktor Level des Central-Composite-Design zur Bestimmung des Einflusses von
voroxidierten ROTG auf die antioxidative Effizienz von α- und γ-Tocopherol
72
Tab. 3.13:
α- und γ-Tocopherol-Konzentrationen
72
Tab. 3.14:
für die drei Ergebnisvariablen Hydroperoxidgehalt, Propanalgehalt, Hexanalgehalt
74
Tab. 3.15:
Prozentuale Steigerung der antioxidativen Wirkung der Antioxidantien-Kombination
von α-Tocopherol mit Ascorbinsäure im Vergleich zu α-Tocopherol allein, bei
unterschiedlichen POZ in ROTG
81
Tab. 3.16:
Verbrauch von Goldchloridlösung bei Titration der reinen Matrix ohne Antioxidans
83
Tab. 3.17:
Verbrauch von Goldchloridlösung bei Titration einer 0,12 mM AscorbinsäurePufferlösung
83
Tab. 3.18:
Titrationsparameter für die Antioxidantien Butylhydroxyanisol, α- und
γ-Tocopherol, jeweils in einer Konzentration von 0,12 mmol/L micellarer Lösung
mit dem Titrationsmittel Goldchlorid
84
Tab. 3.19:
Redoxpotenziale aller vermessenen Substanzen in Acetonitril, micellarer Lösung,
Emulsion und Ethanol/Puffer vermessen gegen NWE
88
Tab. 3.20:
Potenziale und Reversibilität aller vermessenen Substanzen in Acetonitril gegen
NWE
92
Tab. 3.21:
Potenziale und Reversibilität aller vermessenen Substanzen in micellarer Lösung
gegen NWE
94
Tab. 3.22:
Potenziale und Reversibilität aller vermessenen Substanzen in Emulsionen gegen
NWE
95
Tab. 3.23:
Potenziale und Reversibilität aller vermessenen Substanzen in Ethanol/Puffer gegen
NWE
97
Tab. 3.24:
Darstellung der konzentrationsabhängigen Inhibierung aller phenolischen und nichtphenolischen Antioxidantien, berechnet aus der Entstehung der Hydroperoxide nach
10 Tagen, Propanal und Hexanal
102
Tab. 3.25:
Lagerdauer von α-Tocopherolproben mit einer Konzentration von 25 bzw.
500 µmol/kg ROTG, mit Ascorbigen in einer Konzentration von 50 bis 500 µmol/kg
ROTG bis zum Erreichen der POZ 5, 10 und 25 meq O2/kg ROTG. Zusätzlich
dargestellt: die Differenz zwischen berechneter und tatsächlich gemessener Dauer
bis zum Erreichen der entsprechenden POZ
106
Tab. 3.26:
500 µmol/kg ROTG, mit Butylhydroxyanisol in einer Konzentration von 50 bis
500 µmol/kg ROTG bis zum Erreichen der POZ 5, 10 und 25 meq O2/kg ROTG.
Zusätzlich dargestellt: die Differenz zwischen berechneter und tatsächlich
gemessener Dauer bis zum Erreichen der entsprechenden POZ
107
Tab. 3.27:
500 µmol/kg ROTG, mit Carnosolsäure in einer Konzentration von 50 bis
108
XXVIII
Tab. 3.28:
500 µmol/kg ROTG, mit Catechin in einer Konzentration von 50 bis 500 µmol/kg
109
Tab. 3.29:
500 µmol/kg ROTG, mit Geinstein in einer Konzentration von 50 bis 500 µmol/kg
110
Tab. 3.30:
500 µmol/kg ROTG, mit Kaempferol in einer Konzentration von 50 bis 500 µmol/kg
111
Tab. 3.31:
500 µmol/kg ROTG, mit Kaffeesäure in einer Konzentration von 50 bis
112
Tab. 3.32:
500 µmol/kg ROTG, mit Liponsäure in einer Konzentration von 50 bis 500 µmol/kg
113
Tab. 3.33:
500 µmol/kg ROTG, mit Oleuropein in einer Konzentration von 50 bis 500 µmol/kg
114
Tab. 3.34:
500 µmol/kg ROTG, mit Quercetin in einer Konzentration von 50 bis 500 µmol/kg
115
Tab. 3.35:
500 µmol/kg ROTG, mit Rosmarinsäure in einer Konzentration von 50 bis 500
µmol/kg ROTG bis zum Erreichen der POZ 5, 10 und 25 meq O2/kg ROTG.
116
Tab. 3.36:
500 µmol/kg ROTG, mit Sinapinsäure in einer Konzentration von 50 bis 500
117
Tab. 3.37:
500 µmol/kg ROTG, mit Tyrosol in einer Konzentration von 50 bis 500 µmol/kg
118
XXIX
Tab. 3.38:
500 µmol/kg ROTG, mit Vanillinsäure in einer Konzentration von 50 bis 500
119
Tab. 3.39:
500 µmol/kg ROTG, mit Vinylsyringol in einer Konzentration von 50 bis
120
Tab. 3.40:
Darstellung der konzentrationsabhängigen Inhibierung aller phenolischen und nichtphenolischen Antioxidantien, berechnet aus der Entstehung der Hydroperoxide,
Propanal und Hexanal nach 48 Stunden in Emulsion
127
Tab. 3.41:
500 µmol/kg ROTG, mit Butylhydroxyanisol in einer Konzentration von 50 bis
131
Tab. 3.42:
500 µmol/kg ROTG, mit Ascorbigen in einer Konzentration von 50 bis 500 µmol/kg
bis zum Erreichen der enstprechenden POZ
132
Tab. 3.43:
500 µmol/kg ROTG, mit Ascorbinsäure in einer Konzentration von 50 bis
gemessener Dauer bis zum Erreichen der entsrpechenden POZ
133
Tab. 3.44:
500 µmol/kg ROTG, mit Carnosolsäuree in einer Konzentration von 50 bis
134
Tab. 3.45:
500 µmol/kg ROTG, mit Catechin in einer Konzentration von 50 bis 500 µmol/kg
135
Tab. 3.46:
500 µmol/kg Emuslion, mit Genistein in einer Konzentration von 50 bis
136
Tab. 3.47:
500 µmol/kg ROTG, mit Kaempferol in einer Konzentration von 50 bis 500 µmol/kg
137
Tab. 3.48:
500 µmol/kg ROTG, mit Kaffeesäure in einer Konzentration von 50 bis
138
XXX
Tab. 3.49:
500 µmol/kg ROTG, mit Liponsäure in einer Konzentration von 50 bis 500 µmol/kg
139
Tab. 3.50:
500 µmol/kg ROTG, mit Oleuropein in einer Konzentration von 50 bis 500 µmol/kg
140
Tab. 3.51:
500 µmol/kg ROTG, mit Quercetin in einer Konzentration von 50 bis 500 µmol/kg
141
Tab. 3.52:
500 µmol/kg ROTG, mit Rosmarinsäure in einer Konzentration von 50 bis
142
Tab. 3.53:
500 µmol/kg ROTG, mit Sinapinsäure in einer Konzentration von 50 bis
143
Tab. 3.54:
500 µmol/kg ROTG, mit Tyrosol in einer Konzentration von 50 bis 500 µmol/kg
144
Tab. 3.55:
500 µmol/kg ROTG, mit Vanillinsäure in einer Konzentration von 50 bis
145
Tab. 3.56:
500 µmol/kg ROTG, mit Vinylsyringol in einer Konzentration von 50 bis
146
Tab. 4.1:
Effizienz von Carnosolsäure in ROTG, berechnet über die Induktionsphase
167
Tab. 4.2:
Vermessene Parameter der phenolischen Antioxidantien, die positive Interaktionen
mit α-Tocopherol in Bezug auf die Matrix zeigten
177
Tab. 4.3:
Vermessene Parameter der phenolischen Antioxidantien, die negative Interaktionen
mit α-Tocopherol in Bezug auf die Matrix zeigten
178
Tab. 4.4:
Löslichkeiten der untersuchten Antioxidantien in unterschiedlich polaren Matrices
182
Tab. 6.1:
Headspace und Gaschromatographie-Bedingungen für die Bestimmung von
Propanal und Hexanal
192
Tab. 6.2:
Chromatographiebedingungen für die Bestimmung von α-Tocopherol, a. mittels
reversed-phase-HPLC und b. mittels normal-phase-HPLC
198
XXXI
Tab. 6.3:
Chromatographiebedingungen für die Bestimmung von Kaffeesäure und
Vanillinsäure
198
Tab. 6.4:
Extraktionsbedingungen für die Kontrolle des Abbaus der verwendeten
Antioxidantien mittels HPLC
199
Tab. 6.5:
Darstellung der Wiederfindung der Analyte Kaffeesäure und Vanillinsäure in ROTG
bei einer Konzentration von 500 µmol/kg ROTG
201
Tab. 6.6:
Darstellung der Wiederfindung des Analyten α-Tocopherol in micellarer Lösung (b.)
und in ROTG (a.) bei einer Konzentration von 500 µmol/kg ROTG
202
Tab. 6.7:
Geräteparameter zur Messung von Differenz-Puls-Voltammogrammen und
Cyclovoltammogrammen in Acetonitril
205
Tab. 6.8:
Geräteparameter zur Messung von Differenz-Puls-Voltammogrammen und
Cyclovoltammogrammen in Acetonitril
206
Tab. A.1:
Gemessene Ergebnisse für den Versuchsplan mit α-Tocopherol - normalisiert
220
Tab. A.2:
Gemessene Ergebnisse für den Versuchsplan mit γ-Tocopherol - normalisiert
221
Tab. A.3:
Gemessene Ergebnisse für den Versuchsplan mit
α- und γ-Tocopherol - normalisiert
222
XXXII
Abkürzungsverzeichnis
Abb.
AG
ANOVA
AUC
AS
BHA
BHT
CA
CS
CTAB
CV
DPPH
DPV
GE
GC
GCE
GMP
HPLC
HSGC
irrev.
IP
Konz.
LS
KP
KS
n.a.
NWE
OL
ORR
Abbildung
Ascorbigen
Analysis of Variance
Areas under the Curve
Ascorbinsäure
Butylhydroxyanisol
Butylhydroxytoluol
Catechin
Carnosolsäure
Cetyltrimethylammoniumbromid
Cyclovoltammogramm
Diphenyl-2-picrylhydrazyl
Differenz-Puls-Voltammogramm
Genistein
Gaschromatograph
Glassy carbon electrode
Good Manufacturing Practice
High performance liquid chromatography
Headspace-Gaschromatograph
Irreversibel
Induktionsphase
Konzentration
Liponsäure
Kaempferol
Kaffeesäure
nicht analysiert
Normalwasserstoffelektrode
Oleuropein
Oxidationsratenverhältnis
XXXIII
POx
PRed
POZ
PUFA
QU
rev.
ROTG
RS
RT
SCE
SDS
SIS
Tab.
[TBA] [FP6]
TBHQ
TL
TOH
VL
VS
WF
zFΦ
XXXIV
Oxidationspotenzial
Reduktionspotenzial
Peroxidzahl [meq o2/kg]
mehrfach ungesättigte Fettsäuren (poly unsaturated fatty acids)
Quercetin
Reversibel
Rapsöltriglyzeride
Rosmarinsäure
thermische Energie
gesättigte Kalomelelektrode
Sodiumdodecylsulfat
Sinapinsäure
Tabelle
Tetrabutylammonium-hexafluorophosphat
Butylhydrochinon
Tyrosol
Tocopherol
Vinylsyringol
Vanillinsäure
Wiederfindung
elektrostatische Energie
Einleitung
1
1.1
Einleitung
Einführung
Ungesättigte Fettsäuren, wie sie in Rapsöl vorkommen (ca. 20 % Linolsäure und ca. 10 %
Linolensäure), sind lebenswichtig in der menschlichen Ernährung (SCHWARZ UND ERBERSDOBLER, 2007). Da Rapsöl in Europa zu den häufigsten Speiseölen zählt, trägt es durch seinen
hohen Anteil an essentiellen Fettsäuren in dieser Region zu einer gesunden Ernährung bei
(ISNARDY ET AL., 2003).
Aber gerade ungesättigte Fettsäuren sind besonders anfällig gegen Oxidation und verkürzen
durch ihren Verderb die Haltbarkeit der Lebensmittel (FRANKEL, 1998). Aus diesem Grunde
werden den Lebensmitteln Antioxidantien zur Inhibierung der Lipidoxidation zugesetzt
(SCHWARZ ET AL., 2000). Das häufigste in der Natur vorkommende lipidlösliche Antioxidans
ist Vitamin E (bestehend aus 8 Tocopherol- und Tocotrienol-Derivaten), was zusätzlich zu
seiner antioxidativen Aktivität noch eine wichtige ernährungsphysiologische Rolle spielt
(SCHNEIDER, 2005). Die Aktivität von Antioxidantien wird mithilfe der Bestimmung der
Induktionsphase, der Inhibierung und der von YANISHLIEVA UND MARINOVA (1992) und
MARINOVA ET AL. (1994) eingeführten Parameter untersucht.
α-Tocopherol weist in verschiedenen Matrices unterschiedliche antioxidative Aktivitäten auf.
Zusätzlich wurde nachgewiesen, dass es in hohen Konzentrationen an antioxidativer Wirkung
verliert (FRANKEL, 1998). In Rapsöl (Triglyceriden) liegt das Optimum für die α-TocopherolKonzentration zwischen 100 und 125 µmol/kg Öl (LAMPI ET AL., 1999; OHM ET AL., 2005).
Für eine Identifizierung der optimalen Konzentration sowie eine Optimierung des Oxidationsverlaufs, um eine möglichst niedrige Bildung an Hydroperoxiden während der Induktionsphase der Oxidation zu gewährleisten, sind weiterführende Studien unabdingbar.
Die Zugabe der Antioxidantien zu den Lebensmitteln geschieht grundsätzlich nach GMP
(Good Manufacturing Practice) zu einem frühen Zeitpunkt der Oxidation, im Allgemeinen
direkt nach der Raffination des Öls (OHM ET AL., 2006). Der Einfluss bereits vorhandener,
durch die Aufarbeitung des Lebensmittels entstandener Lipidoxidationsprodukte auf die
antioxidative Effizienz eines Antioxidans ist nur unzureichend untersucht und soll im Rahmen
dieser Arbeit betrachtet werden. Eine Studie hierzu wurde von KAMAL-ELDIN ET AL. (2002)
mit α-Tocopherol in voroxidiertem Methyllinoleat durchgeführt. Untersuchungen mit
1
natürlichen Matrices bzw. natürlichen Antioxidansgemischen existieren nicht.
Lebensmittel sind komplexe Systeme mit vielen Inhaltsstoffen, unter denen es zu Interaktionen kommen kann. Bei der Reaktion der Kombination aus α-Tocopherol mit Vitamin C
(Ascorbinsäure) handelt es sich um eine sehr gut untersuchte Interaktion, die zu einer
verlängerten Haltbarkeit des Lebensmittels führt (z.B. FRANKEL, 1994). Ihre Wirkung beruht
auf der Regeneration des während der Inhibierung aufgebrauchten α-Tocopherols durch die
Ascorbinsäure. Somit kann das regenerierte α-Tocopherol erneut seine antioxidative Wirkung
zur Verlängerung der Haltbarkeit des Lebensmittels einbringen. Von solchen sogenannten
Synergismen (KAMAL-ELDIN UND APPELQIST, 1996; PEYRAT-MAILLARD ET AL., 2003) mit
α-Tocopherol und anderen natürlichen Antioxidantien wird in zahlreichen Studien berichtet
(z.B. BECKER ET AL., 2004). Allerdings wird die synergistische Wirkung zwischen
Antioxidantien zum Schutz vor Oxidation in Lebensmitteln noch viel zu wenig genutzt, da
über diese Interaktionen nur wenig bekannt ist. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit stellt sich
daher die Frage, ob eine Verbesserung der antioxidativen Aktivität von α-Tocopherol durch
eine Kombination mit anderen Antioxidantien in Lebensmittelmodellsystemen hervorgerufen
werden kann (Vgl. Abschnitte 2.1.6.3, 2.1.6.4, 2.1.6.5, 2.1.6.8 und .2.1.6.10). In der Literatur
liegt darüber hinaus keine systematische Untersuchung zu der Identifizierung synergistisch
agierender Antioxidantien-Paare anhand physikalisch-chemischer Parameter vor. Außerdem
sind diese Parameter für Antioxidantien nur unzureichend in der Literatur beschrieben. Aus
diesem Grunde sollten in der vorliegenden Untersuchung eine repräsentative Anzahl an
Verbindungen bei gleichbleibenden Bedingungen vermessen werden, um einen umfassenden
Überblick über ihre Reaktionsfähigkeit zu bekommen.
2
Einleitung
1.2
Zielsetzung
Das Hauptziel dieser Arbeit ist es, die konzentrationsabhängigen Wechselwirkungen von
Antioxidantien systematisch zu untersuchen, um eine Stabilisierung von Lipiden mit hoch
ungesättigten Fettsäuren zu erreichen:
a)
Optimierung der antioxidativen Aktivität von α-Tocopherol in Rapsöltriglyceriden
im Rahmen von Oxidationstests durch:
I. Identifizierung der optimalen Konzentration von α-Tocopherol hinsichtlich
größtmöglicher inhibierender Wirkung
II. Minimierung der Hydroperoxidbildung während der Induktionsphase durch sukzessive Zugabe variierender α-Tocopherol-Konzentrationen
III. Untersuchung des Einflusses einer oxidativ vorbelasteten Matrix auf die antioxidativen Eigenschaften von α- und γ-Tocopherol
b)
Identifikation potenzieller Synergisten zu α-Tocopherol in Rapsöltriglyceriden und
in Öl-in-Wasser-Emulsion durch die Untersuchung verschiedener physikochemischer Eigenschaften durch:
I. Bestimmung der Halbwellenpotenziale von phenolischen und nicht-phenolischen
Antioxidantien mittels Differenzial-Puls-Voltammetrie
II. Bestimmung der Reversibilität von phenolischen und nicht-phenolischen Antioxidantien mit Hilfe der Cyclovoltammetrie
III. Identifizierung der antioxidativen Aktivität über die Bestimmung der radikalreduzierenden Eigenschaften von phenolischen und nicht-phenolischen Antioxidantien
c)
Untersuchung von Wechselwirkungen zwischen Antioxidantien (α-Tocopherol mit
phenolischen und nicht-phenolischen Antioxidantien) über die Inhibierung primärer und sekundärer Oxidationsprodukte in Rapsöltriglyceriden und in Öl-inWasser-Emulsion während der Lagerung
3
4
2
Autoxidation ist die direkte Reaktion von molekularem Sauerstoff mit organischen
Verbindungen unter milden Bedingungen (WITTING UND HARWITT, 1964). Allerdings ist die
direkte Reaktion von Lipiden mit Sauerstoff aufgrund des unterschiedlichen Spins der
Sauerstoff- und der Lipidelektronen nicht möglich. Aus diesem Grunde geschieht die
Oxidation über Reaktionen, die diesen direkten Weg umgehen (MINOTTI UND AUST, 1992). In
Gegenwart von Initiatoren (I·), die die Dissoziationsenergie einer Allylbindung überwinden,
verlieren Lipide (LH) ein Wasserstoffradikal (H·), um Lipidalkylradikale (L·) zu bilden (2-1).
Diese Radikale können durch Sauerstoffaddition sehr schnell zu Lipidperoxylradikalen
(LOO·) reagieren (2-2). Über eine Abstraktion eines Wasserstoffatoms von einer benachbarten Allylbindung können dann Lipidhydroperoxide entstehen (2-3) (BURTON UND INGOLD,
1981). Es kommt zu einer Fortpflanzung (Propagation) des Radikalkettenmechanismus. Die
Kettenpropagation kann durch die Reaktion von Radikalen untereinander abgebrochen
werden und führt zur Bildung nicht-radikalischer Produkte ((2-4) bis (2-6)) (WITTING, 1975).
Die gebildeten Hydroperoxide zerfallen zu unterschiedlichen sekundären Reaktionsprodukten,
wie z.B. zu Carbonylverbindungen, Alkoholen, Semialdehyden, Säuren, Laktonen und Estern
(LILLARD UND DAY, 1964). Diese Produkte tragen zum Geruchs- und Geschmacksverderb der
Lipide bei (FRANKEL, 1998).
(2-1)
I· + LH → IH + L·
Initiation
(2-2)
L· + O2 → LOO·
O2 Addition
(2-3)
LOO· + LH → LOOH + L·
Propagation
(2-4)
LOO· + LOO·
→ nicht-radikalisches Produkt
(2-5)
LOO· + L·
→ nicht-radikalisches Produkt Termination
(2-6)
L· + L·
Die Lipidoxidation ist ein von vielen Faktoren beeinflusster Prozess. Hierzu gehören der Grad
der Ungesättigtheit der Fettsäuren, enthaltene Anti- und Prooxidantien sowie chemische und
physikalische Eigenschaften des Systems (KAMAL-ELDIN UND APPELQVIST, 1996). Die
Zusammensetzung der Lipidmatrix (oder Lebensmittelmatrix) und deren Begleitstoffe
nehmen ebenfalls Einfluss auf die Wirkung von Antioxidantien.
5
Die Inhibierung der Lipidoxidation durch Antioxidantien ist von praktischer Bedeutung beim
Schutz von ungesättigten Fettsäuren vor dem oxidativen Zerfall. Die kettenabbrechenden
Antioxidantien (AH) inhibieren oder verzögern die Lipidoxidation, indem sie entweder in der
Phase der Initiation oder der Propagation eingreifen. Sie geben Wasserstoffatome an
Lipidperoxylradikale (entstanden aus Reaktion (2-1), (2-2), (2-3)) ab und werden selber zu
einem weniger reaktiven Radikal, das in der Regel die Kettenreaktion nicht fortsetzt.
(2-7)
LOO· + AH ↔ LOOH + A·
(2-8)
L· + AH → LH + A·
(2-9)
A· + LOO·
(2-10)
A· + A·
Per Definition ist die antioxidative Aktivität einer Substanz die Fähigkeit, die Lipidoxidation
zu inhibieren. Da das Antioxidans in den Radikalkettenmechanismus eingreift, indem es mit
einem kettenfortpflanzenden Radikal reagiert, wird der Name kettenabbrechendes Antioxidans verwendet. Antioxidantien sollen den oxidativen Zerfall verzögern (ROGINSKY UND
LISSI, 2004). Um die Wirkung von Antioxidantien zu testen, ist es notwendig, die Matrix zu
standardisieren, z.B. durch eine Aufreinigung des Öls zu einem reinen Triglyceridgemisch. In
Tab. 2.1 sind die wichtigsten, die Matrix und die Antioxidantien beeinflussenden Faktoren
aufgeführt, wobei eine klare Abgrenzung der Zuordnung zu Matrix oder Antioxidans
beeinflussenden Faktoren nicht immer eindeutig möglich ist.
Tab. 2.1: Matrix und Antioxidantien beeinflussende Faktoren
Matrix beeinflussende Faktoren
Antioxidantien beeinflussende Faktoren
Metallionen
Oxidationsprodukte
Konzentration des Antioxidans
Oxidationsprodukte
Verteilungsverhalten des Antioxidans
Redoxpotenzial des Antioxidans
Fettsäurezusammensetzung
Sauerstoffgehalt
Polarität der Matrix / des Antioxidans
Redoxpotenzial der Matrix / des Antioxidans
Temperatur
pH-Wert
6
2.1
Matrixbeeinflussende Faktoren
Faktoren, die die Lipidoxidation beeinflussen, sind sowohl chemischer als auch physikalischer Natur (KAMAL-ELDIN UND APPELQVIST, 1996) und müssen bei einem Vergleich von
Daten berücksichtigt werden.
2.1.1
Mit
Fettsäuremuster
zunehmend
ungesättigtem
Charakter
der
Fettsäuren
nimmt
die
Oxidations-
geschwindigkeit zu. So beträgt die Reaktionskonstante k [1/(Ms)] für Lipidhydroperoxidradikale für Oleinsäure (C18:1) 0,1 – 1, für Linolsäure (C18:2) ca. 60, für Linolensäure ca. 120
und für Arachidonsäure (C20:4) ca. 180 (FRANKEL, 1998). Öle mit unterschiedlicher
Fettsäurezusammensetzung sind dadurch unterschiedlich stark durch Oxidation angreifbar.
Beispielsweise enthält Sojaöl durchschnittlich 7,6 % Linolensäure, Rapsöl 9,4 % und
Walnussöl sogar 13,4 % (SOUCI ET AL., 2000). Der ernährungsphysiologische Wert steigt
noch weiter mit den marinen Lipiden, die zusätzlich einen großen Anteil an Docosahexaensäure und Eicosapentaensäure enthalten (KULÅS UND ACKMANN, 2001).
2.1.2
Lipidbegleitstoffe: Metallionen, Sauerstoff
Durch die Anwesenheit von Metallen steigt die Oxidationsgeschwindigkeit von Lipiden stark
an (KERN UND WILLERSINN, 1955c). Allerdings gibt es große Unterschiede im Einfluss auf
den Oxidationsverlauf zwischen den einzelnen Metallen, wie z.B. bei Kupfer, Eisen oder
Cobalt (KERN UND WILLERSINN, 1955c) und durch die Form des Metalls, z.B. (Fe2+ / Fe3+).
Die Adsorption von Sauerstoff aus der Luft variiert linear zu der Wurzel der Temperatur bis
zu einem Sättigungsmaximum von 3,5 – 4 mg Sauerstoff/100 mL Öl (OHLSON, 1965) und ist
proportional zum Sauerstoffpartialdruck (HINTZE ET AL., 1965). Bei höheren Temperaturen ist
der Sauerstoffgehalt limitierend für die Hydroperoxidbildung.
2.1.3
Oxidationsprodukte - Oxidationsgrad
Der Lipidhydroperoxidgehalt im Öl unterliegt einem ständigen Bildungs- und Zerfallsprozess.
Auch die während der Oxidation entstehenden Produkte beeinflussen den Oxidationsverlauf.
Der Zerfall von Peroxiden, die schon vor Beginn der Oxidation in ungesättigten Fettsäuren
vorliegen, wurde von KERN UND WILLERSINN (1955b) als unterstützend identifiziert.
Allerdings konnten durch hohe Konzentrationen an initialen Hydroperoxiden auch
gegenläufige Effekte auf die Stabilität von vielfach ungesättigten Fettsäuren gezeigt werden
(HICKS UND GEBICKI, 1981; TERAO UND MATSUSHITA, 1986). Während der Oxidation eines
7
Öls steigt die Oxidationsgeschwindigkeit proportional mit der Konzentration des entstandenen Peroxids an. Zusätzlich ist die Oxidationsgeschwindigkeit temperaturabhängig und nimmt
mit steigender Konzentration zu (KERN UND WILLERSINN, 1955a).
Schon 1955 konnten KERN
UND
WILLERSINN feststellen, dass verschiedene Mengen an
Lipidhydroperoxiden einen unterschiedlich starken katalysierenden Einfluss auf die Oxidation
von ungesättigten Fettsäuren hatten. Sie postulierten den Einfluss von initial vorliegenden
Hydroperoxiden nach folgenden Reaktionsgleichungen:
(2.11)
LOOH → LO· + ·OH
(2.12)
2 LOOH → LOO· + LO· + H2O
In Methyllinoleat führte eine Addition von Methyllinoleathydroperoxiden in einer
Konzentration von 40 mM im Vergleich zur Kontrolle nur zu einer sehr geringen Verstärkung
der Oxidation (KAMAL-ELDIN ET AL., 2001). Den geringen Anstieg in der Bildung der
Hydroperoxide im Vergleich zur Kontrolle führten KAMAL-ELDIN ET AL. (2001) auf den
gleichzeitigen Zerfall der Hydroperoxide zurück.
2.2
Antioxidation beeinflussende Faktoren
Eine hohe antiradikalische Aktivität geht nicht immer einher mit einer hohen antioxidativen
Aktivität. Durch Reaktion mit den Lipidoxidationsprodukten können zum Teil Phenoxylradikale und/oder Semichinone entstehen, die eine wesentlich stärkere antioxidative Aktivität
aufweisen (ROGINSKY ET AL., 2003). Zusätzlich variiert die Aktivität von Antioxidantien stark
auf Grund einer Vielzahl physikalisch-chemischer Parameter in unterschiedlichen Systemen
(COUPLAND UND MCCLEMENTS, 1996, SCHWARZ ET AL., 2000, STÖCKMANN ET AL., 2000).
Bei dispersen Systemen hat auch die Verteilung des Antioxidans in den einzelnen Phasen
einen großen Einfluss auf die Aktivität des Antioxidans, genauso wie auch andere Faktoren,
z.B. die Interaktionen mit anderen Antioxidantien und die Interaktionen mit Emulgatoren, die
die antioxidative Aktivität verringern (MULLEY UND METCALF, 1956).
Wird die Wirksamkeit eines Antioxidans in Öl untersucht, ist es wichtig, eine komplexe
natürliche Matrix zu wählen, da die Triglyceridstruktur des Systems einen starken Einfluss
auf die antioxidative Wirkung des eingesetzten Antioxidans hat (COSGROVE ET AL., 1987).
Eine Aufreinigung dieses natürlichen Systems ist allerdings unabdingbar, um ein Öl ohne die
natürlicherweise enthaltenen Pro- und Antioxidantien einsetzen zu können (LAMPI ET AL.,
1997).
Ein großes Problem stellt die Vergleichbarkeit der antioxidativen Wirkung der unterschiedli8
chen Antioxidantien dar. Die antioxidative Aktivität wird häufig mit den unterschiedlichsten
Antioxidantien in Beziehung gesetzt (2.6).
Die Bestimmung der antioxidativen Aktivität erfolgt anhand verschiedener qualitätsbestimmender Parameter, wie der Länge der Induktionsphase (dem Schnittpunkt zweier an eine
Oxidationskurve angelegten Tangenten), der Berechnung der Inhibierung (die Berechnung
erfolgt zu einem bestimmten Zeitpunkt der Oxidation, wobei der oxidative Status der Probe
ins Verhältnis zu dem oxidativen Status der Kontrolle gesetzt wird) und der von YANISHLIEVA
UND MARINOVA (1992a,b,c) und von MARINOVA ET AL. (1994) eingeführten kinetischen
Parameter. Diese umfassen unter anderem einen Stabilitätsfaktor, der die Effektivität eines
Antioxidans erklärt (berechnet auf Basis der Länge der Induktionsperiode der Oxidationskurve der entsprechenden Probe mit dem zu untersuchenden Antioxidans und der Länge der
Induktionsperiode der entsprechenden Probe ohne Antioxidans), die Stärke des Antioxidans
über das Oxidationsratenverhältnis berechnet (Oxidationsrate der Probe während der
Induktionsphase mit und ohne Antioxidans) und die antioxidative Aktivität der eingesetzten
Substanz ermittelt. Bei der Auswertung dieser Faktoren wird nicht berücksichtigt, dass sich
die Wirkung eines Antioxidans nicht nur auf antioxidative Effekte beschränkt, sondern häufig
auch prooxidative, d.h., dass Ketten fortpflanzende Wirkungen auftreten können, wie es z.B.
bei α-Tocopherol der Fall ist (2.6.1 Reaktion (2-24) bis (2-28)) (LAMPI ET AL., 1999; ISNARDY
ET AL., 2003).
2.2.1
Der primäre protektive Mechanismus von phenolischen Antioxidantien ist das Einfangen und
Stabilisieren von freien radikalischen Spezies (MASUDA ET AL., 1999). Die Stabilisierung der
Antioxidantien erfolgt über die Delokalisierung ihrer Phenoxylstruktur und ist direkt abhängig
von der Resonanzstabilisierung des Phenoxyradikals. Die antioxidative Wirkung ist ebenfalls
abhängig von der elektronenabgebenden Kraft des Phenols. So sind phenolische Verbindungen mit Substituenten in ortho- oder para-Stellung effizientere Antioxidantien als Phenole mit
Substituenten in meta-Stellung. Verbindungen mit zwei Hydroxygruppen in ortho- oder paraStellung sind Antioxidantien mit hoher Aktivität, da sie Wasserstoff abgeben und eine
delokalisierte Semichinonstruktur ausbilden können (LABUZA, 1971; FRANKEL, 1998).
Zusätzlich steigt die Effizienz von phenolischen Verbindungen mit steigender Anzahl an
Hydroxygruppen (DZIEDRIC UND HUDSON, 1984; NARDINI ET AL., 1995; TEISSEDRE ET AL.,
1996; CHEN UND HO, 1997). Auch eine steigende Anzahl an Methoxygruppen verbessert die
antioxidative Aktivität, wobei die Anzahl der Hydroxygruppen den größeren Einfluss hat
(DZIEDRIC UND HUDSON, 1984). Aus der Anordnung und der Anzahl der Hydroxygruppen am
aromatischen Ring sowie der elektronenabgebenden und der elektronenentziehenden
Substituenten ergibt sich die radikalfangende Kraft der Verbindung (BORS ET AL., 1990;
PEKKARINEN ET AL., 1999). So sind Hydroxyzimtsäuren effizientere Antioxidantien als
9
Hydroxybenzoesäuren (SATUE ET AL., 1995; MARINOVA UND YANISHLIEVA, 2003), da bei
ihnen die Stabilität des Phenoxyradikals zusätzlich durch eine ausgeweitete Konjugation in
die ungesättigte Seitenkette gewährleistet wird (GRAF, 1992). Auch CUVELIER ET AL. (1992)
bestätigten die Stabilisierung des Phenoxylradikals durch Resonanzstabilisierung über die
zusätzliche Doppelbindung. Außerdem können Metall chelatierende Eigenschaften, wie sie
z.B. die Hydroxyzimtsäure Kaffeesäure aufweist, zusätzlich die antioxidative Aktivität
unterstützen (NARDINI ET AL., 1995). Ein negativer Einfluss auf die Wasserstoff abgebende
Eigenschaft von Hydroxybenzoesäuren kommt durch die elektronenziehende Eigenschaft der
Carboxylgruppe am aromatischen Ring zustande.
Bei Hydroxybenzoesäuren zeigt die erste Hydroxygruppe am aromatischen Ring keine
radikalfangende Wirkung, erst mit der zweiten stellt sich diese ein. Eine Addition einer
Methoxygruppe vergrößert diese Wirkung allerdings nicht (PEKKARINEN ET AL., 1999). Bei
Hydroxyzimtsäuren ist die radikalfangende Eigenschaft bei zwei Hydroxygruppen größer als
bei einer. Zusätzlich vergrößert ein Methoxysubstituent diese Eigenschaft, da die wasserstoffabgebende Kraft vergrößert wird (MARINOVA UND YANISHLIEVA, 1992c; MARINOVA UND
YANISHLIEVA, 1994; PEKKARINEN ET AL., 1999). MARINOVA UND YANISHLIEVA stellten 2003
fest, dass Benzoesäurederivate stärker an Seitenreaktionen teilnehmen als Hydroxyzimtsäuren, was die bessere antioxidative Wirkung der Hydroxyzimtsäuren mit erklären würde. Auch
ist die wasserstoffabgebende Kraft eines Antioxidans abhängig von der Stärke der
Wasserstoffbrückenbindungen zwischen Antioxidans und Lösungsmittel (AVRILA ET AL.,
1995).
2.2.2
Fettsäurezusammensetzung der Matrix
Die Bindung zwischen Fettsäure und Triglycerid verändert die Teilnahme der Antioxidantien
an Seitenreaktionen nicht. Allerdings beeinflusst die Stärke des ungesättigten Charakters des
Öls die Kinetik und den Mechanismus der antioxidativen Wirkung eines Antioxidans stark
(YANISHLIEVA UND MARINOVA, 1995). Genauso wie die Oxidationsgeschwindigkeit mit
steigendem ungesättigten Charakter der Fettsäure zunimmt, verringert sich die antioxidative
Aktivität, hier am Beispiel für α-Tocopherol dargestellt. So sinkt die relative Effizienz von
α -Tocopherol von 40 für Oleinsäure über 1 für Linolsäure und 0,5 für Linolensäure auf 0,25
für Arachidonsäure (WITTING, 1969). Zusätzlich spielen die Stärke der C-H-Bindung und die
der Fettsäure an das Triacylglycerid signifikante Rollen bei der inhibierenden Aktivität eines
Antioxidans gegenüber dem Angriff von Sauerstoff oder Peroxidradikalen (YANISHLIEVA UND
POPOV, 1973a,b; MARINOVA UND YANISHLIEVA, 1994).
10
2.2.3
Antioxidantien-Konzentration
Grundsätzlich steht in Gegenwart von Antioxidantien die Geschwindigkeit der Hydroperoxidbildung in Beziehung mit dem Verhältnis der Lipid- und der Antioxidantien-Konzentration
nach Gleichung (2-13), wobei k4 die Geschwindigkeitskonstante für die Reaktion (2-7) ist.
(2-13)
d [ LOOH ] k 3 R1 [ LH ]
=
dt
k 4 [ AH ]
Da einige Antioxidantien unter bestimmten Bedingungen, wie z.B. hohen Konzentrationen,
ihre Effizienz als kettenbrechende Substanzen verlieren und durch kettenfortpflanzende
Eigenschaften die Oxidation unterstützen, sind nicht grundsätzlich höhere Konzentrationen an
Antioxidans effizienter. Dies gilt besonders für phenolische Verbindungen mit wenig
Substituenten. Sie können ihre Effizienz durch direkte Reaktion mit Sauerstoff (2-14) oder
durch Wasserstofftransferkettenreaktionen zwischen Antioxidansradikal und Lipidmatrix
(2-15) verlieren, wodurch der Kettenmechanismus wieder unterstützt wird (FRANKEL, 1998).
(2-14)
AH + O2 → A· + HO2·
(2-15)
A· + LH → AH + L·
HUANG ET AL. (1994) konnten zeigen, dass α -Tocopherol zwar mit steigender Konzentration
an Effizienz bei der Hydroperoxidinhibierung sowohl in reinen Sonnenblumenöltriglyceriden
als auch in Emulsionen verlor, jedoch stieg die Effizienz bei der Inhibierung sekundärer
Oxidationsprodukte mit steigender Antioxidantien-Konzentration an. Das galt auch für die
Inhibierung von sekundären Oxidationsprodukten durch γ-Tocopherol. Dieses Verhalten
beruht auf der Reaktion von Alkoxylradikalen mit Antioxidantien zu stabilen Hydroxyfettsäurederivaten (2-21) und verhindert somit den Zerfall von Hydroperoxiden zu Aldehyden oder
flüchtigen Verbindungen (2-22) (FRANKEL, 1998).
(2-16)
LO· + AH → LOH + A·
(2-17)
LO· + A· →LOA
2.2.4
Oxidationsprodukte – Temperatur / Sauerstoff
Sofern zum Schutz von Lipiden Antioxidantien zugegeben werden sollen, erfolgt dies für
gewöhnlich zum frühestmöglichen Zeitpunkt, damit der antioxidative Schutz am stärksten ist.
Dies ist allgemein gängige Praxis. KAMAL-ELDIN ET AL. (2001) stellten jedoch fest, dass sich
eine Addition von α-Tocopherol zu bereits unterschiedlich stark voroxidiertem Methyllinoleat
11
positiv auf die Oxidationsrate bei allen initial zugegebenen Konzentrationen an Methyllinoleathydroperoxiden auswirkte. Dieser Effekt stieg signifikant mit steigender α-TocopherolKonzentration. Allerdings nahm die positive Wirkung des α-Tocopherols mit steigender
initialer Hydroperoxid-Konzentration leicht, aber nicht signifikant ab. KAMAL-ELDIN ET AL.
(2001) schlossen daraus, dass initial vorhandene Methyllinoleathydroperoxide den Abbau von
α-Tocopherol beschleunigen und die Konzentration von α-Tocopherol an den Oxidationsstatus des Methyllinoleats angepasst werden muss. Studien zu initial voroxidierten pflanzlichen
Ölen (wie Rapsöl) und über den Einsatz der natürlicher Weise enthaltenen Antioxidantien
(einer Kombination aus α-Tocopherol mit γ-Tocopherol) liegen nicht vor. Bei höheren
Temperaturen ist der Sauerstoffgehalt limitierend für die Hydroperoxidbildung. Die Reaktion
von Lipidalkylradikalen mit einem Antioxidans (AH)
(2-18)
L· + AH → LH + A·
wird zunehmend bedeutend, und die Geschwindigkeit der Hydroperoxidbildung steht in
Beziehung zu dem Verhältnis der Sauerstoffkonzentration zu der AntioxidantienKonzentration (k3 = die Geschwindigkeitskonstante für Reaktion (2-3), R1 die Initiationsrate,
k5 = die Geschwindigkeitskonstante für Reaktion (2-18) ).
(2-19)
d [ LOOH ] k 3 ⋅ R1 [O2 ]
=
dt
k 5 [ AH ]
Zusätzlich können Antioxidantien bei hohen Temperaturen durch die Rückreaktion von
Lipidhydroperoxiden mit dem Antioxidantienradikal ihre Effizienz verlieren (2-20).
(2-20)
LOOH + A· → LOO· + AH
Eine weitere Möglichkeit des Effizienzverlustes eines Antioxidans ist die Bildung kettenfortpflanzender Alkoxylradikale (LO·) (2-21).
(2-21)
LOOH → LO· + OH·
Diese Reaktion (2-21) ist energetisch günstiger als Reaktion (2-20) und kann zusätzlich durch
hohe Temperaturen oder Metallkatalysatoren unterstützt werden (FRANKEL, 1998).
12
2.3
Werden mehrere Antioxidantien gleichzeitig in einem System eingesetzt, können sie
untereinander in Interaktion treten. Die antioxidative Wirkung der Antixodantien kann davon
unbeeinflusst bleiben oder aber positiv bzw. negativ beeinflusst werden (PEYRAT-MAILLARD
ET AL., 2003). An dem in Abb. 2.1 gezeigten Beispiel lassen sich diese Interaktionen
erläutern. Es ist die Lagerdauer [Tage] bei 40°C im Dunkeln gezeigt, die benötigt wird, um
eine bestimmte Probe bis zu einer POZ von 5 meq O2/kg ROTG zu oxidieren. Es liegt ein
12
10
Synergismus
8
6
additiver Effekt
4
Antagonismus
säure
200 Ascorbin-
4
100 α-TOH +
3
Kombination
2
Berechnete
1
säure
0
200 Ascorbin-
2
100 α-TOH
Lagerdauer bei 40°C, dunkel bis
zum Erreichen einer POZ von 5 [Tage]
additiver Effekt vor, wenn sich die antioxidative Aktivität beider Antioxidantien (100 µmol
α-TOH/kg ROTG in Kombination mit 200 µmol Ascorbinsäure/kg ROTG) addiert und genau
die Summe der Effekte der Einzelsubstanzen (100 µmol α-TOH/kg ROTG und 200 µmol
Ascorbinsäure/kg ROTG) zeigt (PEYRAT-MAILLARD ET AL., 2003). Ein Synergismus, wie in
Abb. 2.1 zu sehen, zeigt sich, wenn die antioxidative Aktivität der Antioxidantienkombination
stärker ist als die Summe der antioxdativen Aktivitäten der Einzelsubstanzen (URI, 1961;
KAMAL-ELDIN UND APPELQVIST, 1996). Hierzu kommt es, wenn das stärkere Antioxidans, in
diesem Fall das α-TOH, durch das schwächere Antioxidans, die Ascorbinsäure, regeneriert
wird. Im umgekehrten Fall, wenn das stärkere Antioxidans das schwächere Antioxidans
regeneriert, steht das stärkere Antioxidans nicht mehr zur Verfügung, um der Oxidation
entgegenzuwirken. Es resultiert ein Antagonismus (URI, 1961; PEYRAT-MAILLARD ET AL.,
2003).
Abb. 2.1: Einteilung der Interaktionen zwischen zwei Antioxidantien in Synergismus, additiven Effekt
und Antagonismus. In dieser Abbildung ist ein Synergismus zwischen α-Tocopherol (α-TOH) mit einer
Konzentration von 100 µmol/kg ROTG und Ascorbinsäure mit 200 µmol/kg ROTG dargestellt.
13
Die Regeneration eines Antioxidans durch ein anderes beruht auf einer Redoxreaktion.
Hierbei wird das Antioxidansradikal durch einen Synergisten (ein anderes Antioxidans)
reduziert. Dabei verläuft die Regeneration „freiwillig“, wenn die einzelnen Redoxpotenziale
zueinander passen, d.h., wenn die Änderung der Gibbs-Energie eine spontane Reaktion
zulässt (BUETTNER UND JURKIEVICZ, 1993). TERAO ET AL. (1994) postulierten darüber hinaus,
dass ein Synergismus zwischen zwei Antioxidantien nur stattfinden kann, wenn sie an
unterschiedlichen Stellen der Matrix lokalisiert sind (2.6.5).
2.4
Polarität des Antioxidans bzw. der Matrix und die Lokalisierung
des Antioxidans in der Matrix
Eine micellare Lösung ist ein primitives, vereinfachendes Modell für das System biologische
Membran (WEN ET AL., 1997). Öle werden in der Lebensmittel-, Kosmetik- und pharmazeutischen Industrie meist in Form disperser Systeme, d.h. als Emulsionen eingesetzt. Der Einsatz
von Antioxidantien ist auch hier gängige Praxis (SCHWARZ, ET AL. 2000).
2.4.1
„Polar Paradox“
Bei dispersen Systemen variiert die Aktivität von Antioxidantien hauptsächlich auf Grund
von Grenzflächenphänomenen (FRANKEL ET AL., 1994), aber die Aktivitätsunterschiede der
Antioxidantien zwischen Bulköl und Emulsion sind nur zum Teil durch Polaritätseffekte zu
erklären. Von PORTER ET AL. (1989) wurde der Begriff „Polar Paradox“ eingeführt. Sie
konnten nachweisen, dass polare Antioxidantien eine größere Effizienz in unpolaren Matrices,
wie Bulkölen, und unpolare Antioxidantien in polaren Matrices, wie beispielsweise
Emulsionen oder Matrix/Luft-Grenzen, aufweisen.
2.4.2
Verteilungsverhalten der Antioxidantien in der Matrix
Disperse Systeme, d.h. micellare Lösungen und Emulsionen bestehen aus mehreren Phasen.
In Lösungen mit Emulgatoren oder oberflächenaktiven Stoffen kommt es oberhalb der
kritischen Micellbildungskonzentration zur Aggregatbildung durch den Emulgator oder die
oberflächenaktive Substanz. Auch mit steigender Konzentration bleibt die Konzentration an
Monomeren in der Lösung relativ konstant, die Anzahl an gebildeten Aggregaten steigt
(GARCIA UND SANZ-MEDEL, 1986), wobei Bildung und Zerfall von Micellen im Gleichgewicht stehen. Micellen sind unabhängig vom Emulgatortyp (neutral, negativ oder positiv
geladen), aufgeteilt in zwei Regionen. Dies sind der aus Alkylketten bestehende hydrophobe
Kern und die Palisadenschicht (LISI UND MILIOTO, 1995). Diese besteht aus den Kopfgruppen
14
des Emulgatormoleküls, den ersten Methylgruppen der Alkylketten, Wassermolekülen und
gegebenenfalls Gegenionen zu den geladenen Kopfgruppen (FENDLER, 1982). Um diese zwei
Regionen der Micelle bildet sich bei ionischen Emulgatoren die Sternschicht, bestehend aus
einer äußerst starren Schicht aus Gegenionen, eng verbunden mit den Kopfgruppen, gefolgt
von einer diffusen, wesentlich beweglicheren Schicht aus Gegenionen (DÖRFLER, 1994).
Emulsionen bestehen aus einer wässrigen Phase und einer Lipidphase, wobei die eine in der
anderen dispergiert ist. Durch einen Emulgator, der sich um die fein verteilten Tropfen legt,
wird die Dispersion stabilisiert. Liegt er im Überschuss vor, kommt es zur Bildung einer
coexistierenden micellaren Pseudophase (KOMATSU ET AL., 1994; WEISS ET AL., 1997). So
besteht eine Emulsion aus mindestens vier Phasen: der Ölphase, der wässrigen Phase, der
Emulgatorpseudophase und der coexistierenden micellaren Pseudophase.
In dispersen Phasen kann sich das Antioxidans also in verschiedenen Umgebungen aufhalten
(SCHWARZ ET AL., 1996). So ist neben den Eigenschaften des Antioxidans, wie Struktur und
Polarität (vgl. 2.4.1), auch der pH-Wert der Umgebung, der Emulgatortyp und die Gegenwart
anderer Bestandteile von Bedeutung (SCHWARZ, ET AL., 1996). Die Ladung der Lipidoberfläche ist relevant für die antioxidative Aktivität der Antioxidantien (positiv oder negativ
geladene Emulgatoren) (PRYOR ET AL., 1993; BARCLAY UND VINQVIST, 1994; SCHWARZ ET
AL., 1996). Zudem wurde bereits 1970 eine Temperaturabhängigkeit des Verteilungsverhaltens von Antioxidantien (Gallussäure) in Zwei-Phasen-Systemen nachgewiesen (CORNELL ET
AL., 1970). Auch ist die Verteilung des Antioxidans in die Ölphase kettenlängenabhängig und
nimmt mit steigender Kettenlänge zu (CORNELL ET AL., 1970; STÖCKMANN ET AL., 2000).
Der Verlust der antioxidativen Aktivität von Antioxidantien ist in der Interaktion von
Antioxidans und Emulgator begründet (PEKKARINEN ET AL., 1999; SCHWARZ ET AL., 2000;
STÖCKMANN ET AL., 2000). So ist die genaue Lokalisierung von Antioxidantien in der
Umgebung des Emulgators sehr wichtig, um Aussagen über seine Aktivität machen zu
können (HEINS ET AL, 2006). Es ist Voraussetzung für eine antioxidative Wirkung, dass
Antioxidans und Radikal in direkter Nachbarschaft voneinander liegen (HEINS ET AL., 2007a).
In Öl-in-Wasser-Emulsionen mit Sodiumdodecylsulfat (SDS) als Emulgator sind die
Antioxidantien (Propylgallat) in der Sternschicht der Micellen lokalisiert (HEINS ET AL.,
2006). Der Emulgator SDS agiert als physikalische Barriere und stellt somit unterschiedliche
Umgebungen für Radikal und Antioxidans zur Verfügung (COUPLAND UND MCCLEMENTS,
1996). Allerdings muss die Anreicherung des Antioxidans an der Grenzschicht nicht
unbedingt zu einer Steigerung der antioxidativen Effizienz führen (SCHWARZ ET AL., 2000).
Denn wie dargestellt, können Interaktionen zwischen Antioxidans und Emulgator ausgebildet
werden, die durch Beeinflussung der Hydroxygruppe den Wasserstoffatomtransport von
Antioxidantien zu freien Radikalen beeinflussen können (SCHWARZ ET AL., 2000).
Für das α-Tocopheroxylradikal wurde festgestellt, dass es nicht aus den SDS Micellen
herausdiffundiert (Phosphatpuffer pH 7,4), dennoch ist eine antioxidative Wirkung möglich,
15
da die Phenolgruppe an oder in der Nähe der Wasser/Lipid-Phasengrenze und die Kohlenstoffkette entlang des aliphatischen Teils der Micelle liegen (LARANJINHA UND CADENAS,
1999).
2.5
Redoxpotenziale der Antioxidantien bzw. der Matrix – Effekt der
Veränderung von Matrix, pH-Wert, Temperatur
Das Redoxpotenzial gibt Aufschluss darüber, ob eine Substanz oxidiert oder reduziert in der
Lösung vorliegt und über ihre Fähigkeit zu reduzieren oder zu oxidieren (BUETTNER UND
JURKIEVICZ, 1993). Die Produkte, die während der Oxidation entstehen, weisen hohe
Redoxpotenziale auf und sind somit starke Oxidationsmittel. Ein Alkylperoxylradikal weist
ein Redoxpotenzial von 1050 mV bei pH 7 gegen die Normalwasserstoffelektrode in
wässriger Matrix auf (JOVANOVIC ET AL., 1992). KOPPENOL (1990) bestimmte die Redoxpotanziale von Zwischenprodukten der Lipidoxidation gegen die Normalwasserstoffelektrode
bei neutralem pH-Wert und fand für das Redoxpaar RO·, H+/ROH (aliphatisches Alkoxylradikal) ein Redoxpotenzial von 1600 mV, für das Redoxpaar ROO·, H+/ROOH (Alkylperoxylradikal) ein Potenzial von ca. 1000 mV (weiter Bereich 770 < E0 < 1440 mV) und für
mehrfach ungesättigte Fettsäuren (PUFA) (PUFA·, H+ / PUFA-H) ein Redoxpotenzial von
600 mV. Bei der Oxidation von PUFA entstehen Peroxyl- und Alkoxylradikale. Diese können
dann durch β-Spaltung kurze Alkylradikale bilden, welche mit ihrem Redoxpotenzial sehr
hoch liegen, sie treiben daher die Lipidoxidation weiter voran (BUETTNER, 1993).
MATILL war 1927 der erste Wissenschaftler, der die Beständigkeit eines Fettes mit der
Anwesenheit natürlicher Antioxidantien in Verbindung brachte und feststellte, dass ihre
Aktivität über die Hydroxygruppen beschrieben werden konnte. 1949 folgerte WACHS, dass
Antioxidantien Donatoren für Protonen bzw. Akzeptoren für aktiven Sauerstoff sind. Sie sind
in der Lage, die Kettenreaktion zu unterbrechen: WACHS (1949) brachte diese Fähigkeit in
Verbindung mit ihrem Redoxpotenzial. So ist die Anwesenheit von Antioxidantien, wie z.B.
von Tocopherolen, ein wichtiger Schutz gegen Lipidoxidation, denn sie sind in der Lage, die
Lipidoxidationsrate zu reduzieren und verlängern somit die Haltbarkeit des Öls bzw. des
Lebensmittels (FRANKEL, 1998).
Bereits 1922 stellten MOUREU UND DUFRAISSE fest, dass Oxidationsinhibitoren selber leicht
oxidiert werden. Daher ist ihr Redoxpotenzial ein Maß für ihre inhibierende Effizienz.
Demnach ist das Anodenpotenzial eines Antioxidans ein Maß für seine Oxidierbarkeit nach
folgender Reaktionsgleichung:
(2-22)
16
AH → A· + H + e
+
-
Mit Hilfe der Redoxpotenzialbestimmung können also Aussagen über die radikalkettenbrechenden Eigenschaften von Antioxidantien gemacht werden (NICOLI ET AL., 2004).
2.5.1
Einteilung phenolischer Verbindungen nach Redoxpotenzial und
antioxidativer Aktivität
Redoxpotenziale von Antioxidantien sind bisher nur für wenige Verbindungen bestimmt
worden und bieten aufgrund der Verwendung verschiedenster Messmethoden und Matrices
sowie durch die Referenzierung der gemessenen Werte auf unterschiedliche Bezugssysteme
nur schlechte Vergleichsmöglichkeiten. In der Literatur werden oftmals Schlüsse gezogen,
ohne dass die Messbedingungen bekannt sind. Ein Vergleich mit eigenen Werten ist daher nur
selten möglich.
LOWRY ET AL. (1933) stellten fest, dass Substanzen mit Redoxpotenzialen zwischen 800 und
1040 mV mäßige Antioxidantien sind. Liegt das Redoxpotenzial aber zwischen 600 und
800 mV, zeigen sie gute antioxidative Wirkung. Substanzen mit Potenzialen über 1040 mV
weisen keinerlei inhibierende Effizienz auf (gemessen in Benzin, ohne Angabe der
Referenzelektrode). Auch DOEDE (1939) bestätigte diesen Bereich und stellte fest, dass
Verbindungen mit einem Redoxpotenzial zwischen 650 und 900 mV mäßige bis gute
antioxidative Wirkung aufweisen, wobei für die Ergebnisse weder die verwendete Matrix
noch die Referenzelektrode benannt wurden. 1955 wurde durch ALEXANIAN ET AL.
beschrieben, dass das effizienteste Antioxidans ein niedriges Redoxpotenzial aufweist und
dass Substanzen mit Redoxpotenzialen >700 mV keine inhibierende Wirkung mehr zeigen. In
einer sehr umfangreichen Studie an phenolischen Verbindungen wurde 1957 durch PENKETH
ET AL. dann der Wirkungsbereich für Antioxidantien, vermessen bei pH 1,2 bis 9,5 und
normalisiert auf pH 0 in methanolischem oder ethanolischem Puffer gegen eine gesättigte
Kalomelelektrode (241 mV gegen NWE (LINDE, 2006)), wie folgt eingegrenzt: Substanzen
mit einem Redoxpotenzial >800 mV zeigen keine oder nur sehr geringe antioxidative
Wirkung, bei einem Redoxpotenzial zwischen 700 und 800 mV handelt es sich um
„ordentliche“ Antioxidantien. Um eine gute antioxidative Wirkung aufweisen zu können,
müssen die Substanzen ein Redoxpotenzial <700 mV zeigen (PENKETH, 1957). Tab. 2.2 gibt
eine Übersicht über die starke Variation der verwendeten Matrices, der pH-Werte, bei denen
gemessen wurde, und die Wahl unterschiedlicher Referenzelektroden. Oftmals werden diese
Angaben gar nicht oder nur unzureichend gemacht.
17
Tab. 2.2: Redoxpotenziale verschiedener Antioxidantien mit Angabe der Matrix, des pH-Wertes und der
Referenzelektrode (NWE: Normalwasserstoffelektrode, SCE: gesättigte Kalomelelektrode, GCE: glassy
carbon electrode)
Substanz
E1/2
[mV]
Matrix
pH-Wert
Referenzelektrode
Ascorbinsäure
280
Butylhydroxyanisol
2-Propanol wässrig
7,0
NWE
JOVANOVIC ET AL. (1994)
650
50% methanolische
Pufferlösung
0
SCE
PENKETH ET AL. (1957)
Catechin
570
2-Propanol wässrig
7,0
NWE
JOVANOVIC (1992);
Chlorogensäure
540
Oktanol/Wasser
k.A.
k.A.
NEMEIKAITö-ČöNIENö ET
AL. (2005)
(konzentrationsabhängig)
404445
12%ethanolischer
Weinsäure/Natronlauge Puffer
k.A.
GCE
PILJAC (2004)
450
300 mM AcetatPuffer + Salzsäure
3,6
SCE
FIRUZI ET AL.(2005)
Gallussäure
420
Phosphatpuffer
6,8
SCE
ZHOU ET AL. (2005)
Gallussäure und
Derivate
560
Oktanol/Wasser
Genistein
790
Hydrochinon
170
Pufferlösung
480
~950
Kaempferol
Referenz
AL. (2005)
3,6
SCE
FIRUZI ET AL.(2005)
unabhängig
SCE
GAYLOR UND ELVING
(1953)
Oktanol/Wasser
k.A.
k.A.
AL. (2005)
2-Propanol wässrig
7,0
NWE
JOVANOVIC (1992);
750
440
3,6
SCE
FIRUZI ET AL.(2005)
540
Phosphatpuffer
7,8
k.A.
BUETTNER UND
JURKIEWICZ (1993
540
Oktanol/Wasser
k.A.
k.A.
AL. (2005)
Liponsäure
-320
k.A.
k.A.
k.A.
SEARLS UND SANADI
(1960)
Quercetin
600
2-Propanol wässrig
7,0
NWE
JOVANOVIC (1992);
330
Oktanol/Wasser
k.A.
k.A.
AL. (2005)
390
3,6
SCE
FIRUZI ET AL.(2005)
331
80% Ethanol
7,0
NWH
W ACHS (1949)
480
2-Propanol wässrig
7,0
NWE
JOVANOVIC ET AL., (1994)
~500
Acetonitril
k.A.
Ferrocen
401
80% Ethanol
7,0
NWH
Kaffeesäure
α-Tocopherol
β-Tocopherol
18
W EBSTER (2007)
W ACHS (1949)
Substanz
E1/2
[mV]
Matrix
pH-Wert
Referenzelektrode
γ-Tocopherol
406
δ-Tocopherol
Trolox
Referenz
80% Ethanol
7,0
NWH
W ACHS (1949)
463
80% Ethanol
7,0
NWH
W ACHS (1949)
480
80% Ethanol
7,0
NWH
W ACHS (1949)
300
3,6
SCE
FIRUZI ET AL.(2005)
k.A.: keine Angaben
2.5.2
Beeinflussung des Redoxpotenzials durch verschiedene Faktoren
Einfluss der Molekülstruktur:
Es zeigte sich, dass die Anordnung der Substituenten einen Einfluss auf das Redoxpotenzial
hatte. Dieser war bei meta-Substitution geringer als bei ortho/para-Substitution (PENKETH,
1957).
Einfluss des pH-Werts:
Die Nernst-Gleichung beschreibt die temperaturabhängige Konzentrationsabhängigkeit des
Redoxpotenzials eines Redoxpaares. Sind an einer Redoxreaktion Protonen beteiligt, gehen
auch diese in die Berechnung des Redoxpotenzials ein. Somit ist das Redoxpotenzial
abhängig vom pH-Wert. Für jede Erhöhung des pH-Wertes vom Wert 0 um eine Einheit, wird
das Redoxpotenzial um 59 mV kleiner, unabhängig von der Zahl übertragener Wasserstoffatome. Werden die Protonen entfernt, verschiebt sich das Gleichgewicht in Richtung auf die
Oxidation.
Einfluss des Emulgators:
Der Einfluss des pH-Wertes ist bei Verwendung von emulgatorhaltigen Matrices schwierig,
da erstens die Elektrode durch den Emulgatorfilm geblockt ist, zweitens das Antioxidans
(Ascorbinsäure) von den Micellen freigegeben werden muss und drittens eine Veränderung
der Dielektrizitätskonstante an der Grenzfläche der Elektrode das elektrochemische Verhalten
beeinflusst (KAIFER UND BARD., 1985).Zusätzlich verlagert ein Emulgator (anionisches SDS)
die Lage und die Stärke des Redoxpotenzials eines Antioxidans signifikant (KAIFER UND
BARD, 1985). Das kationische Cetyltrimethylammoniumbromid (CTAB) verringert die Rate
der elektrochemischen Reduktion (DAVIDOVIC ET AL., 1990). Auch nichtionische Emulgatoren (Triton X-100) führen zu einer starken Potenzialverschiebung eines Antioxidans
(Ascorbinsäure) (ORMONDE UND O`NEILL, 1990). Diese Verschiebung ist konzentrationsabhängig und bei Verwendung von CTAB negativ, bei SDS positiv. Bei der kritischen
19
Micellbildungskonzentration beider Emulgatoren findet keine weitere Verschiebung statt.
WEN ET AL. (1997) schlossen, dass diese Verschiebung aus der Adsorption des Emulgators an
der Elektrodengrenzfläche resultieren könnte. Hierdurch würde die an der Elektrode
anliegende Überspannung herabgesetzt und die Rate des Elektronentransfers beeinflusst.
Zusätzlich könnten sich micellare Aggregate bilden, die den elektroaktiven Stofftransport zur
Elektrode beeinflussen. Durch die Adsorption des anionischen SDS an der ElektrodenGrenzfläche würde das Ascorbatanion von dieser abgeschirmt und die Reaktion wäre
verzögert. Das nachgewiesene Plateau stellt somit die Sättigung der Elektrodenoberfläche mit
Emulgatormolekülen dar, da nach kompletter Abdeckung der Elektrode die restlichen
Moleküle Micellen im Bulkwasser bilden und somit die Elektrodenoxidation nicht mehr
beeinflussen (WEN ET AL., 1997). Die Adsorption von Emulgatormolekülen an festen
Oberflächen ist bereits gut untersucht.
2.6
2.6.1
Vorkommen und Eigenschaften von Antioxidantien
Tocopherolderivate
Vorkommen:
Tocopherole sind die wichtigsten natürlich vorkommenden, fettlöslichen Antioxidantien
(KAMAL-ELDIN UND APPELQVIST, 1996; KAMAL-ELDIN UND ANDERSON, 1997) und werden
zusammen mit den Tocotrienolen unter dem Begriff Vitamin E zusammengefasst (SCHNEIDER, 2005) (Abb. 2.2). Sie können nur von Pflanzen synthetisiert werden und kommen z.B. in
Ölsaat, Blättern und anderen grünen Teilen höherer Pflanzen vor (LABUZA, 1971).
20
(5)
HO
CH3
(9)
(7)
(8)
O
5,7,8-Trimethyl
5,8-Dimethyl
7,8-Dimethyl
8-Methyl
==alpha-Tocopherol
alpha-Tocopherol
beta-Tocopherl
==beta-Tocopherol
=
gamma-Tocopherol
= gamma-Tocopherol
delta-Tocopherol
==delta-Tocopherol
HO
CH3
O
O
HO
Trolox
Abb. 2.2: Strukturformeln der Tocopherol-Derivate
Polarität:
Tocopherole sind lipidlösliche Antioxidantien (KAMAL-ELDIN UND APPELQVIST, 1996;
KAMAL-ELDIN UND ANDERSON, 1997), Trolox ist das wasserlösliche Analog zu α-Tocopherol
(FRANKEL ET AL., 1996a,b).
Antioxidative Wirkung:
Tocopherole sind Protonendonatoren und beenden durch Reaktion mit Peroxylradikalen
(LOO˙) die Propagationsphase der Kettenreaktion, wobei α-Tocopherol hierbei das effektivste
Derivat ist, gemessen in Styrol (BURTON UND INGOLD, 1981). In späteren Studien wurde eine
starke Systemabhängigkeit bewiesen, die auch eine Wirkungsumkehr der Derivate
hervorrufen kann (KAMAL-ELDIN UND APPELQVIST, 1996). Für Rapsöltriglyceride wurde
nachgewiesen, dass α-Tocopherol in geringer Konzentration (23,22 µmol/L) wesentlich
stabiler ist als γ-Tocopherol. Diese positive Wirkung von α-Tocopherol kehrt sich aber ab
einer Konzentration von 232,2 µmol/kg um (LAMPI ET AL., 1999), d.h. mit höheren
Konzentrationen verliert es seine inhibierende Wirkung (ISNARDY ET AL., 2003): bestimmt in
21
Rapsöltriglyceriden; YANISHLIEVA ET AL. (2002) und MARINOVA ET AL. (2004): bestimmt in
Sonnenblumenöltriglyceriden und Sojaöltriglyceriden). So wurde bereits 1973 festgestellt,
dass es ein Wirkungsoptimum für α-Tocopherol gibt, welches in raffiniertem Rapsöl
zwischen 697 µmol/kg und 2322 µmol/kg liegt (PILAT ET AL., 1973). Spätere Untersuchungen
zeigten ein Wirkungsoptimum von ca. 125 µmol/kg Rapsöltriglyeride (ROTG) (LAMPI ET AL.,
1999; OHM ET AL., 2005).
Abbau:
Für den zügigeren Abbau von α-Tocopherol im Verhältnis zu seinen Derivaten wird sein
vergleichsweise niedriges Redoxpotenzial verantwortlich gemacht. Es ist somit der stärkste
Protonen-Donator und damit anfälliger für Oxidation und Teilnahme an Seitenreaktionen der
Lipidoxidation (LAMPI ET AL., 1999; ISNARDY ET AL., 2003). Hierbei nimmt α-Tocopherol
besonders in hoher Konzentration an folgenden zwei Seitenreaktionen
(2-23)
AH + LOOH → A˙ + L˙ + H2O
(2-24)
AH + O2 → A˙ + HO2˙
teil, bei denen das Antioxidans durch Reaktion mit Hydroperoxiden oder Sauerstoff selbst
zum Radikal wird und gleichzeitig weitere reaktive Radikale entstehen. Ebenso können die
α-Tocopheroxylradikale die Kettenpropagation
(2-25)
A˙ + LH → AH + L˙
(2-26)
A˙ + LOOH → AH + LO2˙
(2-27)
A˙ + O2 → AOO˙
vorantreiben, indem sie durch Reaktion mit Lipiden, Hydroperoxiden oder Sauerstoff reaktive
Radikale bilden (YANISHLIEVA ET AL., 2002; MARINOVA ET AL., 2004). Zusätzlich wird das
sehr rasch entstehende α-Tocopheroxylradikal schneller abgebaut als die langsamer
entstehenden Radikale von γ- und δ-Tocopherol, d.h. das α-Tocopheroxylradikal ist weniger
stabil (HUANG ET AL., 1995). Es ist bekannt, dass aus dem α-Tocopheroxylradikal drei
unterschiedliche Produkte gebildet werden können, und zwar das α-Tocopherylchinon,
Dimere und Trimere (FUJITANI UND ANDO, 1984, GOTTSTEIN UND GROSCH, 1990). Bei dem
Einsatz von γ- und δ-Tocopherol entstehen hingegen nur zwei unterschiedliche Typen von
Dimeren (FUJITANI UND ANDO, 1984; GOTTSTEIN UND GROSCH, 1990), wobei diese ebenfalls
von GOTTSTEIN UND GROSCH (1990) als antioxidativ wirksam eingestuft wurden. Sie
propagierten, dass das α-Tocochinonperoxylradikal die Lipidoxidation unterstützt, indem es
22
Protonen aus der Lipidmatrix abspaltet und somit im Vergleich zu γ- und δ-Tocopherol seine
Wirkung in hohen Konzentrationen verliert.
Die Abbaurate von α-Tocopherol nimmt in Rapsöltriglyceriden bei einer Lagertemperatur von
40°C mit steigender α-Tocopherol-Konzentration zu. So liegt sie bei einer Konzentration von
11,61 µmol/kg bei 1,067 (nmol/kg)/Tag, bei einer Konzentration von 1161 µmol/kg schon bei
21,414 (nmol/kg)/Tag (LAMPI ET AL., 1999). Dieses Ergebnis konnte auch in Methyllinoleat
bestätigt werden (MÄKINEN UND HOPIA, 2000). Ebenfalls sehr bedeutsam ist hierbei die
Konzentration der gebildeten Hydroperoxide. So haben Proben mit einer geringen
α-Tocopherol-Konzentration zwar eine kürzere Induktionsphase, bilden in dieser Zeit aber
auch weniger Hydroperoxide als Proben mit hoher α-Tocopherol-Konzentration (LAMPI ET
AL., 1999). So war die Hydroperoxidkonzentration einer Probe mit einer α-TocopherolKonzentration von 1161 µmol/kg konstant viermal so hoch wie die einer Probe mit einer
α-Tocopherol-Konzentration von 58,1 µmol/kg (LAMPI ET AL., 1999).
Prooxidative Wirkung von α-Tocopherol:
Eine vielfach beschriebene prooxidative Wirkung von α-Tocopherol (TERAO UND MATSUSHITA, 1986; JUNG UND MIN, 1990; HUANG ET AL., 1994) konnte in mehreren Studien widerlegt
werden (CILLARD UND CILLARD, 1980; HUANG ET AL., 1995; LAMPI ET AL., 1999; OHM ET AL.,
2005) und beruht womöglich auf der Tatsache, dass in den Kontrollproben des für den
Versuch eingesetzten Öls noch Tocopherol vorhanden war (LAMPI ET AL., 1999).
2.6.2
Butylhydroxytoluol, Butylhydroxyanisol, Ethoxyquin, Hydrochinon,
Pyrogallol und tert-Butylhydrochinon
Vorkommen:
Bei den Antioxidantien dieser Gruppe handelt es sich bei allen Verbindungen um synthetische
Antioxidantien. Butylhydroxytoluol und Butylhydroxyanisol sind stark lipophile Antioxidantien und werden in Emulsionen eingesetzt, tert-Butylhydrochinon hingegen ist ein polareres
Antioxidans und kommt in Fetten und Ölen zum Einsatz (BELITZ UND GROSCH, 1992) (Abb.
2.3, Abb. 2.4).
Butylhydroxytoluol ist ein sterisch gehindertes Antioxidans. Das Phenoxylradikal propagiert
die Kettenreaktion nicht (FRANKEL, 1998). Zusätzlich reagiert Butylhydroxytoluol nicht mit
Sauerstoff, mit Lipidhydroperoxiden und mit Lipidhydroxyverbindungen (KORTENSKA ET AL.,
2002a,b). YANISHLIEVA UND MARINOVA (1992) stellten fest, dass Butylhydroxyanisol in
23
Schmalz ein effizienteres Antioxidans in einer Konzentration von 5 bis 10*10-4 mol/L ist als
Butylhydroxytoluol. Zusätzlich untersuchten sie die Teilnahme von Butylhydroxyanisol und
Butylhydroxytoluol an Seitenreaktionen, durch die die Antioxidantien nicht mehr für die
Inhibierung der Lipidoxidation zur Verfügung stehen. Eine weitere oxidationsuntersützende
Reaktion ist die Teilnahme des Butylhydroxyanisol-Radikals an kettenpropagierenden
Reaktionen, an denen das Butylhydroxytoluol-Radikal nicht teilnimmt. GORDON UND
KOURIMSKA (1995) und CHE MAN ET AL. (1999) stellten fest, dass tert-Butylhydrochinon ein
sehr effizientes Antioxidans zur Stabilisierung von Gemüseölen, speziell bei hohen
Temperaturen darstellt, da es selber nicht temperaturanfällig ist. Dieser Vergleich wurde in
gebleichtem und desodoriertem Palmöl durchgeführt. In diesem System war tertButylhydrochinon effizienter als α-Tocopherol (Ausnahmen waren die Verringerung des
Anisidin- und des Totox-Wertes). Ethoxyquin liegt zum größten Teil als freies Radikal vor,
welches sich durch Dimerisierung stabilisiert. Bei dieser Verbindung ist das Radikal die
antioxidativ wirksame Spezies (BELITZ UND GROSCH, 1992).
Synergistische Wirkung mit α-Tocopherol:
Für Pyrogallol konnte kein Synergismus mit α-Tocopherol nachgewiesen werden. Allerdings
konnte gezeigt werden, dass α-Tocopherol das Pyrogallol vor Oxidation schützt (HIRAMOTO
ET AL., 2002). Auch zwischen tert-Butylhydrochinon und α-Tocopherol konnten CHE MAN ET
AL. (1999) keinen synergistischen Effekt in raffiniertem, gebleichtem und desodoriertem
Palmöl nachweisen.
OH
OH
O
N
OMe
BHT
BHA
Ethoxyquin
Abb. 2.3: Strukturformeln der synthetischen Antioxidantien Butylhydroxytoluol (BHT), Butylhydroxyanisol (BHA) und Ethoxyquin
24
OH
OH
OH
OH
OH
OH
OH
Pyrogallol
Hydrochinon
TBHQ
Abb. 2.4: Strukturformeln der synthetischen Antioxidantien Pyrogallol, Hydrochinon und tertButylhydrochinon (TBHQ)
2.6.3
Gallate
Vorkommen:
Gallussäure wird durch alkalische oder saure Hydrolyse von Tanninen oder durch Hydrolyse
von Nährmedien von Penicillium glaucum oder Aspergillus niger (ARUOMA, 1993)
gewonnen. Bei den vier Derivaten Methyl-, Ethyl-, Propyl- und Octylgallat handelt es sich um
synthetische Antioxidantien, die mit zunehmender Lipophilie in Öl-in-Wasser-Emulsionen
zum Einsatz kommen (BELITZ UND GROSCH, 1992).
Bereits 1970 konnte gezeigt werden, dass Propylgallat im Vergleich mit Butylhydroxyanisol
und tert-Butylhydrochinon als ein effizientes Antioxidans zur Protektion von Rohölen aus
Saflorsaat, Sojabohnen, Sonnenblumensaat oder Baumwollsaat eingesetzt werden konnte
(SHERWIN UND LUCKADOO, 1970). AUROMA (1993) wies nach, dass die Ester von Gallussäure
in Ochsengehirn-Liposomen, in Ethanol und in Phosphatpuffer mit reaktiven Sauerstoffspezies reagieren können, um Lipide vor der Oxidation zu schützen (soweit es die Löslichkeit
ermöglichte). Gallussäure ist in der Lage, Peroxidradikale aus der Wasserphase der Emulsion
abzufangen und mit Lipidperoxylradikalen von der Oberfläche der Micellen zu reagieren, die
die Lipidoxidation propagieren würden (ZHOU ET AL., 2005).
LIAO UND YIN (2000) wiesen additive Effekte für die Kombination von α-Tocopherol mit
Gallussäure in menschlichen Erythrozytenmembranen und in Phosphatidylcholin-Liposomen
nach. Gallussäure ist in der Lage, das α-Tocopheroxylradikal in einer 0,2 M SDS micellaren
Lösung (Phosphatpuffer pH 7,4) zu regenerieren und somit die Wirkung von α-Tocopherol zu
vergrößern (ZHOU ET AL., 2005). Ebenso konnten ZHOU ET AL. (2005) zeigen, dass
25
Gallussäure in Linolsäure/SDS-Micellen α-Tocopheroxylradikale reduzieren und somit das
α-Tocopherol regenerieren kann.
OH
HO
OH
R
= Gallussäure
COOH
RR==COOH
= Gallussäure
R
=
CH
= Methylgallat
R = CO23CH3
= Methylgallat
CH22-CH
-CH23-CH=3 Ethylgallat
RR==CO
= Ethylgallat
R
=
[CH
]
-CH
= Propylgallat
R = CO2-[CH
= Propylgallat
2 2 2]23-CH
3
[CH
]
-CH
RR==CO
-[CH
]
-CH
= Octylgallat
2 2 7 2 73 = Octylgallat
3
Abb. 2.5: Strukturformeln der Derivate der Gallussäure
2.6.4
Flavonoide
Vorkommen:
Flavonoide (Abb. 2.7, Abb. 2.8) sind Phenolderivate und kommen in erheblicher Menge (0,5
bis 1,5 %) in Pflanzen, Schokolade, Tee, Wein, Propolis (Produkt der Honigbiene) u.a. vor
(THOMPSON ET AL., 1972; TERAO ET AL., 1994; RAPTA ET AL., 1995; PEDRIELLI UND SKIBSTED,
2002).
Die antioxidative Effizienz von Flavonoiden liegt in ihrer radikalfangenden Eigenschaft
und/oder ihrer Metall chelatierenden Aktivität. Es besteht allgemein der Konsens, dass
Polyphenole in wässriger Matrix als Elektronen-Donatoren agieren und in unpolarer Matrix
als Wasserstoffatom-Donatoren (JOVANOVIC ET AL., 1996). Für die antioxidative Reaktion
von Flavonoiden wird eine zwei-Elektronen-Reaktion postuliert. Zunächst entsteht durch eine
ein-Elektronenoxidation das Flavonoidphenoxylradikal, welches anschließend noch ein
weiteres Peroxylradikal abfangen kann (URI, 1961) (s. Abb. 2.6).
26
OH
OH
OH
O
MeO
A
O
B
+ RO2
O
MeO
C
OH
OH
OH
O
OH
O
O
O
+ RO2
O
MeO
OH
OH
O
Abb. 2.6: Postulierter Reaktionsmechanismus für ortho-Dihydroxyphenole nach URI (1961)
Bei Flavonoiden mit Catechin-Struktur am A-Ring und Catechol bzw. 2-MethoxyphenolStruktur am B-Ring wird die antioxidative Aktivität mit dem B-Ring in Verbindung gebracht,
wohingegen bei unsubstituierten B-Ringen die antioxidative Aktivität im A-Ring liegt.
Obwohl der A-Ring kein guter Elektronendonator ist, können diese Antioxidantien trotzdem
Alkylperoxylradikale und Superoxidradikale abfangen. Quercetin ist der beste ElektronenDonator unter den von JOVANOVIC ET AL. (1996) getesteten Flavonoiden: Catechin,
Epicatechin, Epigallocatechin, Hesperidin, Galganin, Rutin und Quercetin.
Bei Oxidationsuntersuchungen in Methyllinoleat konnten PEKKARINEN ET AL. (1999) für
Quercetin (1000 µM) und Catechin (50 µM) eine effektive antioxidative Wirkung und für
Kaempferol (1000 µM) vergleichsweise nur eine schwache antioxidative Aktivität
nachweisen. Quercetin wies eine stärkere antioxidative Wirkung als α-Tocopherol in gleicher
Konzentration auf. Auch LIAO UND YIN (2000) konnten eine antioxidative Wirkung für
Catechin und Quercetin, allerdings in Liposomen, identifizieren. CHU UND HSU (1999)
konnten zeigen, dass Catechin im Vergleich zu α-Tocopherol oder Ascorbylpalmitat ein sehr
effizientes Antioxidans in Erdnussöl ist.
PEKKARINEN ET AL. (1999) wiesen nach, dass die antioxidative Aktivität der Flavonoide mit
steigender OH-Gruppenzahl im B-Ring ansteigt und dass die Reaktionsrate der Radikale
abhängig ist von den Redoxeigenschaften des Flavonoids, welche wiederum stark abhängig
sind von den Substituenten des B-Rings. Zusätzlich stellten PEKKARINEN ET AL. (1999) für
Methyllinoleat fest, dass Quercetin effizienter in der Inhibierung von Hydroperoxiden ist als
Catechin. Das erklärten sie mit der unterschiedlichen Struktur des C-Rings. Quercetin weist
eine Doppelbindung zwischen C2 und C3 und eine Ketogruppe an C4 auf. Diese Struktur
27
verbessert die Elektronendelokalisierung, was das Antioxidansradikal stabilisiert. Beide
Merkmale fehlen bei Catechin. Zusätzlich ist die elektronenabgebende Kraft von Catechin
geringer. Eine zusätzliche Erklärung der verschiedenen antioxidativen Effizienz kann in der
unterschiedlichen Metall chelatierenden Kraft der beiden Antioxidantien liegen, denn auch
hierbei ist Catechin schwächer.
Diese von PEKKARINEN ET AL. (1999) bestätigten Theorien stellten HUDSON UND LEWIS bereits
1983 auf. Sie deuteten an, dass die radikalfangende Fähigkeit der Flavonoide in Abhängigkeit
zu drei strukturellen Eigenschaften steht:
1) ortho-Dihydroxystruktur des B-Rings
2) 2,3-Doppelbindung in Konjugation mit einer 4-oxo-Funktion
3) Additional die Anwesenheit von 3- und 5-Hydroxygruppen sowie
von einem 4-Ketosubstituenten, welche Komplexe mit Metallionen
eingehen können.
BORS ET AL. (1990) bestätigten zum Teil diese Theorie, konnten aber für Quercetin, das alle
drei strukturellen Eigenschaften besitzt, nur eine geringere antioxidative Aktivität als
Catechin, welches diese Kriterien nicht besitzt, nachweisen. RIETJENS ET AL. (2002) zeigten,
dass Flavonoide mit nur einer Hydroxygruppe am B-Ring die Bildung reaktiver oxidierender
Spezies um das 30- bis 50-fache vergrößern. Damit erklärten OSBORN-BARNES UND AKOH
(2003) das prooxidative Verhalten von Genistein in Emulsionen bei 50°C sowohl bei der
Entstehung primärer als auch sekundärer Oxidationsprodukte. Es wurde aber auch von
prooxidativen Wirkungen der Flavonoide berichtet. HODNICK ET AL. (1988) brachten diese
Wirkung in Zusammenhang mit der Fähigkeit der Flavonoide, in Gegenwart von gelöstem
Sauerstoff selbst zu oxidieren und Superoxid zu produzieren, welches sich zu Wasserstoffperoxid umwandelt. Zusätzlich könnten die Flavonoide direkt Eisen(III) zu Eisen(II)
reduzieren und durch eine Fenton-Reaktion könnten dann OH-Radikale produziert werden
(HODNICK ET AL. 1988).
Synergistische Wirkungen mit α-Tocopherol:
TERAO ET AL. (1994) konnten in Phospholipiddoppelschichten für eine Kombination zwischen
α-Tocopherol und Quercetin in einer Konzentration von jeweils 50 µM keine synergistische
Wirkung nachweisen, jedoch wurde der Abbau von α-Tocopherol verlangsamt. LIAO UND YIN
(2000) zeigten einen Synergismus zwischen α-Tocopherol und Catechin in humanen
Erythrozytenmembranen und in Phosphatidylcholin-Liposomen. Sie führten diese Wirkung
auf die unterschiedlichen Verteilungskoeffizienten zurück. So wies α-Tocopherol (1 mM)
einen Verteilungskoeffizienten von 549 ± 9,62 in Oktanol/Wasser (1:1) nach 72 Stunden bei
37°C auf, Catechin hingegen nur einen von 0,60 ± 0,072. Für die Kombination aus
α-Tocopherol mit Quercetin konnten sie keine synergistische Wirkung nachweisen. Das
28
führten sie auf den vergleichsweise höheren Verteilungskoeffizienten von Quercetin von 3,84
± 0,343 zurück. MURAKAMI ET AL. (2003) konnten weder mittels 1,1-Diphenyl-2picrylhydrazyl-Radikal-Test (DPPH-Test) (Antioxidantien-Konzentration 10 µM) noch
mittels Liposomen-Oxidationsmethode (Antioxidantien-Konzentration 2,5 µM) für eines der
hier verwendeten Flavonoide einen signifikanten Synergismus mit α-Tocopherol nachweisen.
HIRAMOTO ET AL. (2002) konnten ebenfalls keinen Synergismus zwischen α-Tocopherol und
Catechin nachweisen (in Hexan/Phosphatpuffer), allerdings konnten sie zeigen, dass das
Catechin von α-Tocopherol vor Oxidation geschützt wurde. NIETO ET AL. (1993) konnten
synergistische Effekte bei Quercetin mit α-Tocopherol und bei Catechin mit α-Tocopherol bei
der Inhibierung der Oxidation in Fischöl nachweisen. PEDRIELLI UND SKIBSTED wiesen 2002
ebenfalls Synergismen für Quercetin mit α-Tocopherol (JOVANOVIC ET AL., 1996) und
Catechin mit α-Tocopherol in Modellsystemen mit Methyllinoleat und Lösungsmittel nach.
Sie postulierten den Mechanismus für die Regeneration von α-Tocopherol (TOH) durch ein
Flavonoid (FlH2) nach folgendem Mechanismus:
(2-28)
TOH + ROO· → TO· + ROOH
(2-29)
TO· + FlH2 ↔ TOH + FlH·
(Gleichgewicht)
(2-30)
TO· + FlH· → TOH + Fl
(treibende Kraft)
Zusätzlich stellten PEDRIELLI UND SKIBSTEDT (2002) fest, dass das Reaktionsverhältnis eines
Gemisches von α-Tocopherol in tert-Butylalkohol/Methyllinoleat mit dem entsprechenden
Flavonoid (1:1) für α-Tocopherol mit Quercetin 1 und für α-Tocopherol mit Catechin ein
wenig geringer ist.
OH
OH
O
OH
O
HO
OH
HO
O
OH
Genistein
O
Kaempferol
Abb. 2.7: Strukturformeln der Flavonoide Genistein und Kaempferol
29
OH
OH
OH
O
HO
OH
O
HO
OH
OH
O
Quercetin
OH
OH
Catechin
Abb. 2.8: Strukturformeln der Flavonoide Quercetin und Catechin
Zusammenhänge mit dem Redoxpotenzial:
Flavonoide weisen Redoxpotenziale zwischen 0,5 und 0,7 V auf (gemessen in wässrigem
2-Propanol bei pH 7). Sie sind in der Lage, die Lipidoxidation zu unterbrechen, da die
Redoxpotenziale der Alkylperoxidradikale bei 1,05 V liegen und damit viel höher sind als die
Redoxpotenziale der Flavonoide (JOVANOVIC, 1992; JOVANOVIC ET AL., 1994). Da
Tocopherol (wasserlösliches Derivat Trolox) ein Redoxpotenzial von 0,48 V aufweist, ist die
Regeneration von Tocopherol durch Flavonoide thermodynamisch möglich (gemessen in
wässrigem 2-Propanal bei pH 7) (JOVANOVIC ET AL., 1994). Selber können Flavonoide nicht
regeneriert werden, da ihre Oxidation nicht rückgängig gemacht werden kann, denn in
Acetonitril zeigen sie ein irreversibles Verhalten (RAPTA ET AL., 1995). FIRUZI ET AL.
bestimmten 2005 in 300 mM Acetatpuffer bei pH 3,6 mit Zugabe von 20 mM Salzsäure
gegen die gesättigte Kalomelelektrode die Redoxsysteme von Kaempferol und Catechin in
der verwendeten Matrix als reversibel.
2.6.5
Ascorbinsäurederivate
Vorkommen:
Ascorbinsäure kommt in der Natur sowohl in pflanzlichen als auch in tierischen Zellen vor.
Der Bedarf eines erwachsenen Menschen wird mit 45 bis 89 mg/Tag angegeben. Ascorbylpalmitat ist das fettlösliche Derivat der Ascorbinsäure (BELITZ UND GROSCH, 1992).
Ascorbigen (Abb. 2.10) wurde zuerst von PROCHAZKA im Jahr 1957 identifiziert und kommt
in Kohl in Konzentrationen bis 50 µmg/g Nassgewicht (ALEKSANDROVA ET AL., 1992) und
auch in den Gemüsesäften von Kreuzblütlern (ZELIGS, 1998) vor.
30
Ascorbylpalmitat ist ein Radikalfänger für Peroxylradikale in oxidierten Lipidsystemen, d.h.
es kann ein Wasserstoffatom an ein Peroxylradikal abgeben (MARINOVA UND YANISHLIEVA,
1992b). Ascorbinsäure hingegen kann während des Autoxidationsprozesses kein Wasserstoffatom abgeben (PORTER, 1993; CILLARD UND CILLARD, 1986). Eine andere antioxidative
Wirkmöglichkeit von Ascorbinsäure und Ascorbylpalmitat wäre die Reduktion von
Hydroperoxiden zu stabilen Hydroxykomponenten (SCHIEBERLE UND GROSCH, 1981; VON
UHL UND EICHNER, 1990) sowie die Interaktion mit Metallionen (BONDET ET AL., 2000).
MÄKINEN ET AL. (2001) stellten fest, dass Ascorbinsäure und Ascorbylpalmitat tatsächlich
analog der von SCHIEBERLE UND GROSCH (1981) und von VON UHL UND EICHNER (1990)
festgestellten Wirkmöglichkeiten in Methyllinoleat agierten. Dennoch war ihre antioxidative
Effizienz so gering, dass sie daraus schlossen, dass der Haupteffekt von Ascorbinsäure und
Ascorbylpalmitat in der synergistischen Interaktion mit anderen Antioxidantien, wie
α-Tocopherol, liegen muss. Ascorbigen wird in einer Patientenstudie mit Fibromyalgia
antioxidative Aktivität zugesprochen. Es ist weder temperatur- noch lichtanfällig (ARFFMANN
UND ANDRUS, 1999).
In mehreren Studien konnte ein regenerativer Einfluss von Ascorbinsäure (z.B. NIKI ET AL.,
1984; BENDICH ET AL., 1986; NIKI, 1991; YIN ET AL., 1993; HARATS ET AL., 1998; LARANJINHA UND CADENAS, 1999) oder Ascorbylpalmitat (MARINOVA UND YANISHLIEVA, 1992b,
HAMILTON ET AL., 1998) auf α-Tocopherol bestimmt werden, wobei die synergistische
Wirkung mit steigender Ascorbylpalmitat-Konzentration zunahm. Ein Problem bei der
Regenerierung von α-Tocopherol durch Ascorbinsäure in micellaren Lösungen oder
Emulsionen ist die Löslichkeit. α-Tocopherol ist lipophil und Ascorbinsäure hydrophil.
Dadurch, dass das α-Tocopherol aber in der Membran mit der Hydroxygruppe an der
Wasserphase liegt, kann trotzdem eine Reaktion zwischen den beiden Antioxidantien
ablaufen (BUETTNER, 1993). 1994 postulierten TERAO ET AL., dass ein Synergismus zwischen
zwei Antioxidantien nur dann stattfinden kann, wenn sie an unterschiedlichen Stellen der
Matrix lokalisiert sind.
Auch für Ascorbinsäure mit δ-Tocopherol konnte von YI ET AL. (1991) sowohl bei 30°C als
auch bei 80°C in Fischöl-Lecithin-Emulsion ein Synergismus (vom Lecithin unabhängig)
nachgewiesen werden, der allerdings bei höherer Temperatur geringer ausfiel. YI ET AL.
(1991) vermuteten, dass der Grund dafür der Zerfall von Ascorbinsäure bei höheren
Temperaturen sein könnte.
31
Abbau:
Die Oxidation von Ascorbinsäure verläuft bei niedrigem pH-Wert nach RUIZ ET AL. (1977)
über zwei aufeinander folgende Elektronentransfers, wobei Dehydroascorbinsäure entsteht.
Anschließend folgt eine irreversible Hydrierung zu 2,3-Diketogluconsäure. Bei pH 6,8 weist
Ascorbinsäure ein Redoxpotenzial von 200 mV gegen die gesättigte Kalomelelektrode auf.
OH
O
HO
O
HO
OH
Ascorbinsäure
HO
O
O
O
O
HO
OH
Ascorbylpalmitat
Abb. 2.9: Strukturformeln der Ascorbinsäure-Derivate Ascorbinsäure und Ascorbylpalmitat
OH
O
O
N
O
OH
Ascorbigen
Abb. 2.10: Strukturformel des Ascorbinsäure-Derivats Ascorbigen
2.6.6
Pflanzenphenole: Carvacrol, γ-Oryzanol, Oleuropein, Thymol und Tyrosol
Vorkommen:
Das Phytosterylferulat γ-Oryzanol (Abb. 2.11) wird aus Reis gewonnen und kommt in
Mengen um 1,6 % in Reiskleieöl vor (MEZOUARI ET AL., 2006a). Selbst bei der Aufarbeitung
des Öls (Entwachsen) bleibt es zum größten Teil im Öl erhalten (MEZOUARI ET AL., 2006b).
Oleuropein (Abb. 2.12) ist die bekannteste phenolische Verbindung in Olivenkulturen und
kommt in Konzentrationen bis 140 mg/g Trockenmasse vor (AMIOT ET AL., 1986). Die
32
Verbindungen Thymol und Carvacrol (Abb. 2.13) sind Inhaltstoffe von Pflanzen der Familie
der Lamiaceae (TSIMIDOU UND BOSKU, 1994). Tyrosol ist ein hydrophiles Antioxidans
(MEDINA ET AL., 2002) und kommt unter anderem neben Oleuropein in Olivenöl vor
(VALAVANIDIS ET AL., 2004).
γ-Oryzanol wird eine effiziente antioxidative Wirkung, größer als die aller vier Tocopherolderivate, in Cholesterinlösung zugesprochen (XU ET AL., 2001). In Reiskleieöl zeigte es eine
andauernde Stabilität gegen Temperaturbehandlung bei 180°C (MEZOUARI ET AL., 2006a).
Natürliche Polyphenole aus Olivenöl können als Radikalakzeptoren und als Metallchelatoren
agieren (AFANAS’EV ET AL., 1989; XIN ET AL., 1990). Oleuropein wird anhand von Messungen
in Liposomenmodellen und anhand der radikalfangenden Eigenschaft eine effiziente
antioxidative Aktivität zugesprochen, vergleichbar mit der radikalfangenden Eigenschaft von
p-Coumarsäure und Rutin, lediglich Pyrogallol und Rutin zeigten in dem Versuch größere
Effizienz (MORELLÒ ET AL., 2005). Tyrosol zeigte inhibierende Wirkung in Liposomen und
Emulsionen (MEDINA ET AL., 2002), in Bulk-Kamelienöl konnte es allerdings nur die
Entstehung von sekundären Oxidationsprodukten inhibieren (HAIYAN ET AL., 2006).
Carvacrol und Thymol sind in der Lage, die Oxidation von Liposomenphospholipiden
konzentrationsabhängig zu inhibieren (AESCHBACH ET AL., 1994). Auch in Schmalz zeigten
sie in einer Konzentration von 0,1 % identische anitoxidative Wirkung bei einer Oxidation bei
35°C (LAGOURI ET AL., 1993). YANISHLIEVA ET AL. (1999) konnten in Schmalztriglyceriden
und Sonnenblumenöltriglyceriden bei 100°C nur eine geringe antioxidative Aktivität von
Thymol und Carvacrol in einer Konzentration von ca. 0,01 M zeigen. Außer bei Carvacrol in
Sonnenblumenöltriglyceriden stiegen die Effizienzen der beiden Antioxidantien nicht linear
an. Das erklärten YANISHLIEVA ET AL. (1999) mit der Teilnahme der Antioxidantien an
Seitenreaktionen der Oxidation, die den Radikalkettenmechanismus entweder unterstützen
oder die Antioxidantien einfach verbrauchen. Die Reaktion (2-31) ist abhängig von der
Reaktivität des Hydroperoxids. YANISHLIEVA ET AL. (1999) stellten fest, dass Carvacrol das
bessere Antioxidans in Lipiden ist als Thymol. Das liegt an der größeren sterischen
Hinderung der Phenolgruppe von Thymol.
(2-31)
AH + LOOH → Produkte
(2-32)
AH + O2 → A· + HO2·
33
Zusätzlich können die Antioxidansradikale kettenfortpflanzend reagieren (YANISHLIEVA
AL., 1999).
ET
A· + LH → AH + L·
(2-33)
Abbau von Oleuropein:
Bei dem Abbau von Oleuropein während der Olivenölherstellung (Spanische Methode)
entstehen durch saure oder alkalische Hydrolyse Hydroxytyrosol, Elenolsäure-(II)-Glucosid
und zu einem Teil auch freie Elenolsäure. Auch diese Verbindungen weisen antioxidative
Aktivität auf (SCHMANDTKE, 2001).
O
O
O
γ-Oryzanol
Abb. 2.11: Struktur des Pflanzenphenols γ-Oryzanol
O
O
O
HO
O
O
HO
HO
O
HO
OH
OH
Oleuropein
Abb. 2.12: Strukturformel des Pflanzenphenols Oleuropein
34
O
OH
HO
OH
OH
Carvacrol
Thymol
Tyrosol
Abb. 2.13: Strukturformeln der Pflanzenphenole Carvacrol, Thymol und Tyrosol
2.6.7
Diterpendiphenole
Vorkommen:
Carnosolsäure (Abb. 2.14) (AESCHBACH, 1990; LÖLIGER, 1991; SCHWARZ UND TERNES,
1992a) ist neben Carnosol das Hauptditerpen in Rosmarin, wobei Carnosol nur ca. 10 % des
gemeinsamen Gehaltes ausmachen (BRACCO ET AL., 1981; CHEN ET AL., 1992). In Methanol
ist Carnosolsäure instabil und zerfällt durch Oxidation zu phenolischen Komponenten mit
δ- oder γ-Lacton-Struktur (SCHWARZ UND TERNES, 1992b; CUVELIER ET AL., 1994). Carnosol
(Abb. 2.14) oxidiert zu einem γ-Lacton, wie z.B Rosmanol (SCHWARZ UND TERNES, 1992).
Durch Kontakt mit oxidiertem Methyllinoleat entsteht aus Carnosolsäure bei 50-100°C ein
Hydroxyphenoxylradikal, bei höheren Temperaturen entsteht Carnosol (GEOFFROY ET AL.,
1994). Auch bei der Extraktion zerfällt ein Teil der Carnosolsäure zu Carnosol (SCHWARZ
UND TERNES, 1992).
Sowohl Carnosolsäure als auch Carnosol werden inhibierende Eigenschaften entgegen der
Lipidoxidation in mikrosomalen und liposomalen Systemen zugesprochen. Außerdem sind sie
effiziente Fänger für Peroxylradikale (AUROMA ET AL., 1992). CUVELIER ET AL. (1994) zeigte,
dass Carnosolsäure in Methyllinoleat bei hohen Temperaturen (110°C) bessere antioxidative
Aktivität aufweist als Carnosol. FRANKEL ET AL. (1996a) und FRANKEL (1996b) wiesen nach,
dass Carnosolsäure ein besseres antioxidatives Potenzial in Bulkölen und Carnosol ein
besseres antioxidatives Potenzial in den entsprechenden Emulsionen aufweist. Zusätzlich
konnten HUANG ET AL. (1996) eine bessere antioxidative Wirkung gegen Hydroperoxide für
Carnosolsäure nachweisen als für α-Tocopherol in gleicher Konzentration, sowohl in Bulköl
als auch in der entsprechenden Emulsion. Diese bessere Wirkung schrieben sie der orthoDihydroxygruppe am aromatischen Ring der Carnosolsäure zu, da α-Tocopherol nur eine
Hydroxygruppe aufweist. HOPIA ET AL. (1996) konnten für Carnosol und Carnosolsäure (150
35
und 300 µM) in Maisöltriglyceriden, Methyllinoleat und Linolsäure bei 37°C kaum einen
Unterschied in der antioxidativen Aktivität feststellen, wohingegen für beide Verbindungen in
den entsprechenden Emulsionen keine antioxidative Wirkung nachweisbar war. Bei einer
Erhöhung der Temperatur auf 60°C zeigte sich, dass Carnosolsäure eine bessere inhibierende
Wirkung aufwies als Carnosol. Auch HOPIA ET AL. (1996) konnten zeigen, dass Carnosolsäure
in unpolaren Lipiden effizienter ist als Carnosol, welches in der stärker polaren Linolsäure
eine größere Effizienz aufwies. Diesen Wirkungsunterschied erklärten sie durch Interaktionen
der Säuregruppe der Linolsäure mit der Carboxylgruppe der Carnosolsäure, was somit die
Aktivität der Carnosolsäure in Linolsäure herabsetzt. Zusätzlich erklärten sie die unterschiedliche Wirkung der beiden Diterpendiphenole mit ihrer unterschiedlichen Polarität, denn
Carnosolsäure ist hydrophiler als Carnosol.
Abbau:
Da auch die Abbauprodukte der Carnosolsäure antioxidative Aktivitäten aufweisen, ist ein
Mechanismus für die antioxidative Wirkung sehr schwer aufzuklären (HOPIA ET AL., 1996).
So ist nachweisbar, dass Carnosolsäure in Maisöl und auch in entsprechender Emulsion
wesentlich schneller zerfällt als α-Tocopherol, dennoch ist die antioxidative Aktivität von
α-Tocopherol wesentlich geringer als die von Carnosolsäure und ihrer Abbauprodukte
(HUANG ET AL., 1996).
HOPIA ET AL. (1996) konnten in Maiskeimöl weder bei einer Kombination von α-Tocopherol
mit Carnosolsäure noch bei einer Kombination von α-Tocopherol mit Carnosol einen
Synergismus identifizieren. Bei letzterer Kombination stellte sich sogar ein negativer, d.h.
antagonistischer Einfluss heraus. Bei der Kombination von α-Tocopherol mit Carnosolsäure
zeigte sich dennoch ein schützender Einfluss der Carnosolsäure auf das α-Tocopherol,
äquivalent zu dem Mechanismus von α-Tocopherol mit Ascorbinsäure.
OH
HOOC
OH
O
O
Carnosolsäure
Carnosol
Abb. 2.14: Strukturformeln der Diterpendiphenole Carnosolsäure und Carnosol
36
2.6.8
Hydroxyzimtsäuren und Ester
Vorkommen:
Hydroxyzimtsäuren kommen weit verbreitet in Obst und Gemüse vor, die häufigsten hierbei
sind die p-Coumarsäure, Ferulasäure, Kaffeesäure und Sinapinsäure (BELITZ UND GROSCH,
1992). In Raps sind ca. 80 % des Gesamtphenolgehaltes Sinapin, ein Cholinester der
Sinapinsäure, wobei ungefähr 16 % davon als freie Sinapinsäure vorliegen (SHAHIDI UND
NACZK, 1992). Der größte Teil der Phenole geht bei der Herstellung des Öls allerdings
verloren. Durch Vorbehandlung des Rohöls bei erhöhten Temperaturen kann der Phenolgehalt
sogar um das 10-fache erhöht werden (VELDSINK ET AL., 1999). Hierbei konnte ein Derivat
der Sinapinsäure, das Vinylsyringol (Abb. 2.15) identifiziert werden. Es ist ein Decarboxylierungsprodukt der Sinapinsäure und entsteht bei hohen Temperaturen. Es ist das Hauptphenol
in Roh-Rapsöl (VUORELA ET AL., 2003).
Vinylsyringol weist sowohl in Bulkmethyllinoleat, Bulkrapsöltriglyceriden als auch in
Methyllinoleatemulsion, Rapsöltriglyceridemulsion und in Liposomenmodellen antioxidative
Aktivität (KOSKI ET AL., 2002; KOSKI ET AL., 2003) und gute radikalfangende Eigenschaften
auf (KOSKI ET AL., 2003), die auch mittels Ames-Test bestätigt wurden (KUWAHARRA ET AL.,
2004). Die antioxidative Aktivität von Vinylsyringol ist vergleichbar mit der von αTocopherol (KOSKI ET AL., 2003). Auch Sinapinsäure ist ein potenter Radikalfänger und ein
gutes Antioxidans in verschiedenen lipidhaltigen Systemen (PEKKARINEN ET AL., 1999). Bei
einem Vergleich der antioxidativen Aktivtät mittels DPPH-Test von Vinylsyringol und
Sinapinsäure zeigte sich eine größere Effizienz für Sinapinsäure, bei Einsatz des gesamten
Extraktes (Vinylsyringol und Sinapinsäure gemeinsam) resultierten sogar synergistische
Interaktionen (VUORELA ET AL., 2005).
Bei einer Oxidation von Schmalzmethylestern bei 100°C konnte eine gute antioxidative
Wirkung von p-Coumarsäure, Ferulasäure, Sinapinsäure und Kaffeesäure in einem
Konzentrationsbereich von 0,02 bis 0,2 % identifiziert werden (MARINOVA UND YANISHLIEVA, 1994). 1995 konnten YANISHLIEVA UND MARINOVA die effiziente antioxidative Wirkung
von Ferulasäure und Kaffeesäure auch in Sonnenblumenöltriglyceriden und Sonnenblumenmethylestern nachweisen. 1996 folgte von den Autoren der Nachweis dieser antioxidativen
Wirkung von Kaffeesäure auch in nativem Sonnenblumenöl bei 25 und 100 °C. Dennoch
stieg die antioxidative Wirkung nicht linear mit steigender Konzentration an. Auch TROMBINO
ET AL. (2004) stellten fest, dass Ferulasäure ein gutes Antioxdians in isolierten Membranen
und intakten Zellen darstellt. SATUE ET AL. (1995) zeigten, dass das ortho-Diphenol
Kaffeesäure in Olivenöl sowohl die Hydroperoxidbildung als auch die Hexanalbildung
inhibieren kann. Ferulasäure, bei der im Vergleich zur Kaffeesäure eine der beiden
37
Hydroxygruppen gegen eine Methoxygruppe ausgetauscht ist, zeigt ebenfalls effiziente
antioxidative Wirkung in Ölivenöl, sowohl bei der Inhibierung primärer als auch sekundärer
Oxidationsprodukte. In Methyllinoleat-Emulsionen ist die antioxidative Aktivität von
Sinapinsäure und Ferulasäure geringer als in Bulkmethyllinoleat. Kaffeesäure unterstützt
sogar die Hydroperoxidbildung (PEKKARINEN ET AL., 1999)
Abbau:
Mit zunehmender Hydroxyzimtsäurekonzentration steigt die oxidationsinhibierende Wirkung
unterproportional an. Dieser nicht lineare Wirkungsanstieg im Vergleich zur Konzentration
der Hydroxyzimtsäuren wurde von MARINOVA UND YANISHLIEVA (1994) und von YANISHLIEVA UND MARINOVA (1995; 1996) durch die Teilnahme der Antioxidantien an Seitenreaktionen der Oxidation begründet. Die hierfür vorgeschlagenen Reaktionen sind (2-29) und (230), wobei die Teilnahme an diesen Seitenreaktionen temperaturabhängig ist. MARINOVA UND
YANISHLIEVA stellten 2003 fest, dass Kaffeesäure bei 90°C an diesen Reaktionen teilnimmt,
bei Raumtemperatur jedoch nicht. Zusätzlich kann der Oxidationsverlauf durch die Reaktion
von Antioxidansradikalen mit Lipiden unterstützt werden (vgl. Reaktion (2-34)). Das
geschieht beispielsweise bei p-Coumarsäure, Syringasäure und Ferulasäure in Schmalz bei
100°C, nicht aber bei Kaffeesäure, da diese konzentrationsunabhängig reagiert (MARINOVA
UND YANISHLIEVA, 1992a).
In Kombination mit α-Tocopherol hat Kaffeesäure einen schonenden Einfluss („SparingEffect“) auf die α-Tocopherol-Konzentration, sowohl in einer in-vivo Studie mit Ratten als
auch in Phospholipiddoppelschichten (TERAO ET AL., 1994; NARDINI ET AL., 1997). Auch
LIAO UND YIN (2000) konnten eine synergistische Wirkung von Kaffeesäure auf α-Tocopherol
(in humanen Erythrozytenmembranen und in Phosphatidylcholin-Liposomen) identifizieren
und erklärten diese über die stark unterschiedlichen Verteilungskoeffizienten. So wies
α-Tocopherol in Oktanol/Wasser (1:1) nach 72 Stunden bei 37°C einen Verteilungskoeffizienten von 549 ± 9,62 und Kaffeesäure nur einen von 0,56 ± 0,052 auf. Eine synergistische
Wirkung von Ferulasäure mit α-Tocopherol konnten TROMBINO ET AL. (2004) in isolierten
Membranen und intakten Zellen nachweisen. In einer Emulsion aus Linolsäure mit dem
Emulgator Tween 20 konnten PEYRAT-MAILLARD ET AL. (2003) nur antagonistische Effekte
für Kombinationen mit einer Hydroxybenzoesäure (Kaffeesäure, Rosmarinsäure) und
α-Tocopherol identifizieren. Diese Antagonismen erklärten sie über die Regeneration des
schwächeren Antioxidans (in diesem Fall α-Tocopherol) durch das stärkere Antioxidans (in
diesem Fall Kaffeesäure bzw. Rosmarinsäure).
Kaffeesäure hat eine der höchsten Reaktivitäten von Phenolen zu Peroxylradikalen
38
k = 1,5*107 M-1s-1 und zeigt daher sehr gute antioxidative Wirkung gegen Lipidoxidation
(BALYAKOV ET AL., 1995). In SDS-Micellen hingegen ist Kaffeesäure nur ein moderates
kettenabbrechendes Antioxidans, da es nur limitierten Zugang zu den Lipidperoxylradikalen
innerhalb der Micellen hat. Es liegt also nur an der Doppelschicht und hat dort eher Zugang
zu den α-Tocopheroxylradikalen (LARANJINHA UND CADENAS, 1999). Von LARANJINHA ET
AL. (1995) wurde nachgewiesen, dass Kaffeesäure das α-Tocopheroxylradikal an Lowdensity-Lipoproteinen (LDL) Grenzflächen und in LDL Partikeln nach (2-34) regenerieren
kann, wobei ein Kaffeesäuresemichinon entsteht. Die strukturell sehr ähnliche p-Coumarsäure
ist dazu nicht in der Lage.
KS-OH + α-TO· → KS-O· + α-TOH
(2-34)
Zusammenhänge mit dem Redoxpotenzial:
Bei Betrachtung der Redoxpotenziale ist Kaffeesäure ein etwas stärkeres Antioxidans als
α-Tocopherol. Allerdings muss für die Effizienz eines Antioxidans immer auch die Anzahl
freier Radikale zu der Konzentration des eingesetzten Antioxidans betrachtet werden
(LARANJINHA UND CADENAS, 1999). So führte eine Kaffeesäure-Supplementierung zu einem
Anstieg der α-Tocopherolkonzentration in Ratten und Menschen durch die Regenerierung des
α-Tocopheroxylradikals durch die im Überschuss zum Radikal vorliegende Kaffeesäure
(NADINI ET AL., 1997; CARBONNEAU ET AL., 1997).
MeO
OMe
OH
Vinylsyringol
Abb. 2.15: Strukturformel des Sinapinsäure-Derivats Vinylsyringol
R1
COOH
HO
p-Coumarsäure:
Ferulasäure:
Isoferulasäure:
Kaffeesäure:
Sinapinsäure:
R1, R2 = H
R1 = H, R2 = OMe
R1 = OMe, R2 = H
R1 = H, R2 = OH
R1, R2 = OMe
R2
Abb. 2.16: Strukturformeln der Hydroxyzimtsäuren p-Coumarsäure, Ferulasäure, Isoferulasäure,
Kaffeesäure und Sinapinsäure
39
O
HO
O
COOH
HO
HO
OH OH
Chlorogensäure
OH
COOH
HO
O
HO
O
OH
Rosmarinsäure
Abb. 2.17: Strukturformeln der Hydroxyzimtsäureester Chlorogensäure und Rosmarinsäure
2.6.9
Hydroxybenzoesäuren
Vorkommen:
Hydroxybenzoesäuren kommen meist als Ester in verschiedenen Obstarten vor (BELITZ UND
GROSCH, 1992).
Syringasäure und Vanillinsäure (Abb. 2.18) zeigten stabilisierende Wirkung bei der Oxidation
von Schmalzmethylestern bei 100°C in Konzentrationen von 0,02 bis 0,2 %. In Sonnenblumenöl-Methylestern hingegen konnte keine antioxidative Aktivität identifiziert werden, was
von MARINOVA UND YANISHLIEVA (1994) auf den hohen Linolsäuregehalt zurückgeführt
wurde, da Linolsäure leichter oxidiert werden kann. SATUE ET AL. (1995) konnten für
Vanillinsäure, die eine ähnliche Struktur wie die Hydroxyzimtsäure aufweist, eine gute
antioxidative Wirkung in Olivenöl nachweisen. Allerdings konnte Vanillinsäure weniger
effizient die Bildung primärer Oxidationsprodukte als die Bildung sekundärer Oxidationsprodukte inhibieren.
40
OH
RR1
R
RR= =OH,
= Vanillinsäure
OHR1==HVanillinsäure
R,RR=1 OMe
= OMe= Syringasäure
= Syringasäure
COOH
Abb. 2.18: Strukturformel der Hydroxybenzoesäuren Syringasäure und Vanillinsäure
2.6.10
Nichtphenolische antioxidative Substanzen
Vorkommen:
Liponsäure ist ein Disulfid-Derivat der Oktanolsäure mit intramolekularer Disulfidbrücke in
oxidierter Form. Liponsäure kommt vorwiegend in Spinat, Broccoli und Tomaten sowie in
Herz, Niere und Leber in Form von Lipoyllysin vor (LODGE ET AL., 1997).
Liponsäure (Abb. 2.19) ist ein biologisches Thiol-Antioxidans, welches radikalfangende
Eigenschaften besitzt (SEARLS UND SANADI, 1960). PACKER ET AL. (1995) und PACKER (1998)
stellten sie als ein hervorragendes Antioxidans in vivo und in vitro dar (MOINI ET AL., 2002),
wobei es in der Lage war, z.B. Hydroxylradikale und Singulettsauerstoff zu fangen.
Außerdem war es in der Lage, mit einer Reihe von Metallen stabile Komplexe zu bilden. Bei
der Liponsäure handelt es sich um ein amphiphatisches Molekül. Aus diesem Grunde sollte
sie sowohl in hydrophiler als auch in hydrophober Matrix ihre antioxidative Aktivität zeigen
können (MOINI ET AL., 2002).
Synergistische Wirkung:
Bereits 1967 konnte JOCELYN regenerative Eigenschaften von Liponsäure auf den GlutathionRedoxzyklus (GSH/GSSG) mit einem Redoxpotenzial von -240 mV nachweisen.
O
O
ox.
O
O
SH
SH
red.
S
S
Liponsäure
Abb. 2.19: Strukturformel des nicht-phenolischen Antioxidans Liponsäure
41
Vorkommen:
Aminosäuren kommen in Eiweißen vor. Methionin ist zu 2-4 % in tierischen und 1-2 % in
pflanzlichen Eiweißen vorhanden, es gehört zu den essentiellen Aminosäuren. Auch
Glutathion ist in tierischen und pflanzlichen Organismen sowie in Mikroorganismen
verbreitet. Aus zwei Cysteinresten kann über eine Disulfidbrücke Cystin gebildet werden.
Cystin kommt zu einem großen Anteil in Kreatinin vor (9 %) (BELITZ UND GROSCH, 1992).
Bei Untersuchungen der antioxidativen Aktivität von Aminosäuren in Linoleat stellte sich
heraus, dass Tryptophan und Histidin antioxidative Wirkungen aufwiesen (MARCUSE ET AL.,
1961; MARCUSE ET AL., 1962). 1970 konnten für Methionin und Cystein (Abb. 2.20)
antioxidative Effekte in Sojaöl nachgewiesen werden (SLIWIOK UND SIECHOWSKY, 1970).
Auch MARCUSE UND FREDRIKSSON (1969) konnten eine inhibierende Wirkung auf den
Oxidationsverlauf von Linolsäure bei Raumtemperatur mit unterschiedlichen Konzentrationen
an Tryptophan feststellen. Allerdings wurde in anderen Studien für alle getesteten Aminosäuren in Emulsionen eine prooxidative Wirkung nachgewiesen. Das könnte in der NH3RGruppe der Aminosäuren begründet sein (FARAG ET AL., 1978a; 1978b, 1978c). Cystein und
Methionin zeigten geringe antioxidative Aktivität (RIISOM ET AL., 1980). Allerdings könnte
das an der sehr guten antioxidativen Wirkung von Methional liegen, das eventuell in Spuren
in den Standards enthalten war oder während der Oxidation entstanden ist (SIMS UND FIORITI,
1977).
BRIMBERG ET AL. konnten 2003 für eine Kombination aus α-Tocopherol mit Histidin in
Linolsäure-Emulsion einen Synergismus nachweisen. Der Mechanismus von Synergismen
zwischen α-Tocopherol und Aminosäuren ist noch nicht ausreichend untersucht. Phenolische
Antioxidantien verlangsamen den Übergang von der Induktionsphase zur exponentiellen
Phase, Aminosäuren tun dies nicht. Es stellte sich heraus, dass in Kombination mit
Aminosäuren die Oxidation während der exponentiellen Phase verlangsamt wurde (BRIMBERG
ET AL., 2003).
42
O
HS
O
S
OH
OH
NH2
NH2
Cystein
O
Methionin
SH
O
HO
N
N
NH2
O
OH
O
Glutathion
Abb. 2.20: Strukturformeln der nicht-phenolischen Antioxidantien Cystein, Methionin und Glutathion
43
44
Ergebnisse
3
Ergebnisse
3.1
Antioxidative Aktivität von α-Tocopherol in ROTG
3.1.1
Aktivität von α-Tocopherol in einem Konzentrationsbereich von 5 bis
1500 µmol/kg ROTG
Es wurde ein Oxidationsversuch mit α-Tocopherol-Konzentrationen von 5 bis 1500 µmol/kg
ROTG durchgeführt, mit dessen Ergebnissen der zu untersuchende Konzentrationsbereich zur
Bestimmung einer optimalen α-Tocopherol-Konzentration eingegrenzt werden sollte. Für die
Kontrolle (ROTG ohne Antioxidanszusatz) war das Ende der Induktionsphase bereits nach
6 Tagen erreicht, und es folgte ein steiler Anstieg der Bildung von Hydroperoxiden (Abb.
3.1). Eine Zugabe des Antioxidans α-Tocopherol führte in einem niedrigen Konzentrationsbereich von 5 bis 100 µmol/kg ROTG zu einer Verlängerung der Induktionsphase auf 14 bis 28
Tage. Proben mit hoher α-Tocopherol-Konzentration (250 bis 1500 µmol/kg ROTG) wiesen
keine eindeutig abzugrenzende Induktionsphase auf. Somit war eine Auswertung der
Induktionsphase bei diesen Proben nicht möglich. Höhere α-Tocopherol-Konzentrationen
führten im Gegensatz zu geringen α-Tocopherol-Konzentrationen zu einer wesentlich
stärkeren Bildung von Hydroperoxiden innerhalb der Induktionsphase.
c(Hydroperoxide)
[mmol/kg ROTG]
120
100
80
60
40
20
0
0
5
Kontrolle
50 α-TOH
500 α-TOH
10
15
20
Lagerdauer bei 40°C, dunkel [Tage]
25
5 α-TOH
100 α-TOH
1000 α-TOH
10 α-TOH
250 α-TOH
1500 α-TOH
Abb. 3.1: Bildung von Hydroperoxiden in ROTG in Gegenwart von 5 - 1500 µmol α-Tocopherol (α-TOH)
während einer Oxidation bei 40°C im Dunkeln über einen Zeitraum von 28 Tagen
45
Der Gehalt an Hydroperoxiden war zum Beispiel nach 14 Tagen bei einer Probe mit einer
α-Tocopherol-Konzentration von 250 µmol/kg ROTG mehr als dreimal so hoch wie bei einer
Probe mit nur 50 µmol/kg. Bei einer Probe mit einer α-Tocopherol-Konzentration von 1500
µmol/kg ROTG war die Hydroperoxid-Konzentration nach 14 Tagen sogar mehr als 11mal so
hoch (Tab. 3.1).
Tab. 3.1: Bildung von Hydroperoxiden nach 14 Tagen in Gegenwart von 50 - 1500 µmol α-Tocopherol
(α-TOH) während einer Oxidation bei 40°C im Dunkeln
α-TOH
[µmol/kg ROTG]
Kontrolle
50
100
250
500
1000
1500
Hydroperoxide
[mmol/kg ROTG]
203,2
5,4
6,0
17,5
25,6
48,7
57,8
Standardabweichung
9,7
1,6
0,6
5,3
0,8
3,0
2,3
Bei der Bildung konjugierter Diene (Abb. A.1) zeigten sich vergleichbare Ergebnisse, wobei
die Differenz zwischen den α-Tocopherol-Konzentrationen (50 bis 250 µmol/kg ROTG)
weniger ausgeprägt war. Dennoch bestätigte sich eine maximale Wirkung bei der Inhibierung
von Oxidationsprodukten bei einer α-Tocopherol-Konzentration von 100 µmol/kg ROTG.
3.1.1.1
Aktivität von α-Tocopherol in ROTG in einem Konzentrationsbereich von 25 bis
125 µmol/kg ROTG
Um die Konzentrationswirkungsbeziehung von α-Tocopherol im niedrigen Konzentrationsbereich in ROTG genauer zu bestimmen, wurde ein Oxidationstest mit α-TocopherolKonzentrationen in einem Bereich von 25 bis 125 µmol/kg ROTG durchgeführt (Abb. 3.1).
Die Konzentration von α-Tocopherol wurde in diesem Versuch in Schritten von 25 µmol/kg
ROTG angehoben. Die antioxidative Aktivität von α-Tocopherol stieg stetig bis zu einer
Konzentration von 100 µmol/kg ROTG. So verlängerte sich die Induktionsphase von ca.
17 Tagen bei einer Probe mit einer Konzentration an α-Tocopherol von 25 µmol/kg ROTG
auf ca. 31 Tage bei den Proben mit 100 und 125 µmol/kg ROTG. Allerdings verringerte sich
die Zunahme der Induktionsphase mit steigender α-Tocopherol-Konzentration (Abb. 3.2).
Auch bei diesem Versuch glich die Entwicklung konjugierter Diene (Abb. A.2) dem Anstieg
an Hydroperoxiden.
46
c(Hydroperoxide)
[mmol/kg ROTG]
Ergebnisse
900
800
700
600
500
400
300
200
100
0
0
5
10
15
20
25
Lagerung bei 40°C, dunkel [Tage]
30
35
00µmol
α-TOH
α-TOH
2525µmol
α-TOH
α-TOH
50
α-TOH
50µmol
α-TOH
α-TOH
7575
µmol
α-TOH
100
α-TOH
100
µmol
α-TOH
125µmol
α-TOH
125
α-TOH
Abb. 3.2: Bildung von Hydroperoxiden in ROTG in Gegenwart von 25 - 125 µmol α-Tocopherol (α-TOH)
während einer Oxidation bei 40°C im Dunkeln über einen Zeitraum von 35 Tagen
Bei einem Vergleich der gebildeten Hydroperoxid-Konzentrationen nach 14 Tagen, d.h.
einem Zeitpunkt während der Induktionsphasen aller Proben mit Antioxidans, zeigte sich eine
Hydroperoxid-Konzentration für alle Proben zwischen 13,5 und 24,0 mmol/kg ROTG,
wohingegen die Kontrolle ohne Antioxidans eine Hydroperoxid-Konzentration von
362 mmol/kg ROTG aufwies (Abb. 3.2). Das bedeutete, dass die inhibierende Aktivität von
α-Tocopherol in geringen Konzentrationen sehr stark war, zwischen 93-96 % lag und zu
diesem Zeitpunkt keine Unterschiede zwischen den einzelnen Konzentrationen festzustellen
war (Tab. 3.2).
Tab. 3.2: Inhibierung der Lipidoxidation bei unterschiedlichen α-Tocopherol- (α-TOH)-Konzentrationen
von 25 - 125 µmol/kg ROTG bei 40°C im Dunkeln nach 14 Tagen
α-TOH
[µmol/kg ROTG]
Inhibierung [%] Standardabweichung [%]
25
93,30
3,01
50
96,33
0,95
75
96,28
0,57
100
95,69
0,59
125
94,21
1,30
Bei der Berechnung der Zeit, die eine Probe benötigte, bis sie eine Peroxidzahl (POZ) von
12,5 meq O2/kg ROTG erreichte, was einem Hydroperoxidgehalt von 41,25 mmol/kg ROTG
entspricht (HEINS ET AL., unveröffentl.), wurde deutlich, dass der inhibierende Effekt einer
Probe mit einer α-Tocopherol-Konzentration von 100 µmol/kg ROTG signifikant stärker war,
als der von Proben mit 50 bzw. 75 µmol/kg ROTG. Es zeigte sich allerdings keine weitere
Steigerung bei einer α-Tocopherol-Konzentration von 125 µmol/kg ROTG (Abb. 3.3).
47
35
b
c
c
100
125
30
a
25
20
15
10
5
0
50
75
c(α-TOH) [µmol/kg ROTG]
Abb. 3.3: Darstellung der benötigten Zeit bis zum Erreichen eines Oxidationslevels von 41,25 mmol
Hydroperoxide/kg ROTG in Gegenwart von 25 - 125 µmol α-Tocopherol (α-TOH) während einer
Oxidation bei 40°C im Dunkeln. Säulen, die mit unterschiedlichen Buchstaben markiert sind,
unterschieden sich signifikant. (ANOVA, Bonferroni, p > 0,05, n = 3)
So konnte auch für die sekundären Oxidationsprodukte gezeigt werden, dass die Effektivität
der Inhibierung von Propanal und Hexanal bis zu einer α-Tocopherol-Konzentration von
100 µmol/kg ROTG anstieg und sich ebenfalls kein weiterer Effektivitätszuwachs bei einer
weiteren Konzentrationserhöhung von α-Tocopherol auf 125 µmol/kg ROTG ergab (Abb. 3.4,
Abb. 3.5).
c(Hexanal) [µmol/kg ROTG]
1000
900
800
700
600
500
400
300
200
100
0
0
5
Kontrolle
75 α-TOH
10
15
20
25
25 α-TOH
100 α-TOH
30
35
50 α-TOH
125 α-TOH
Abb. 3.4: Bildung von Hexanal in ROTG in Gegenwart von 25 - 125 µmol α-Tocopherol (α-TOH)/kg
ROTG während einer Oxidation bei 40°C im Dunkeln über einen Zeitraum von 35 Tagen
48
c(Propanal) [µmol/kg ROTG]
Ergebnisse
700
600
500
400
300
200
100
0
0
5
10
15
20
25
30
Kontrolle
25 α-TOH
50 α-TOH
75 α-TOH
100 α-TOH
125 α-TOH
35
Abb. 3.5: Bildung von Propanal in ROTG in Gegenwart von 25 - 125 µmol α-Tocopherol (α-TOH)/kg
ROTG während einer Oxidation bei 40°C im Dunkeln über einen Zeitraum von 35 Tagen
3.1.1.2
Oxidationskinetik von ROTG in Gegenwart von α-Tocopherol
Um die Effizienz der eingesetzten Mengen an α-Tocopherol zu untersuchen, wurden
unterschiedliche, von YANISHLIEVA ET AL. (2002) eingeführte Parameter für α-Tocopherol in
ROTG berechnet. Zusätzlich wurden die Effizienz∆IP und die Effizienz∆POZ berechnet, indem
die Differenz der Länge der Induktionsperioden bzw. die Differenz der Dauer bis zum
Erreichen einer POZ von 15 meq O2/kg ROTG zwischen der jeweiligen Probe und der
Kontrolle auf die Konzentration der entsprechenden Probe bezogen wurde (Tab. 3.3). Hierfür
wurde ein Oxidationsversuch mit gleichzeitiger Beobachtung des Abbaus von α-Tocopherol
durchgeführt. Abb. 3.6 vergleicht die Bildung von Hydroperoxiden mit dem Abbau von
α-Tocopherol in ROTG bei verschiedenen α-Tocopherol-Konzentrationen (25 bis 300
µmol/kg ROTG). Die Bildung konjugierter Diene und sekundärer Oxidationsprodukte
verläuft äquivalent (Abb. A.3, Abb. A.4, Abb. A.5).
49
0,45
350
0,40
0,35
300
0,30
250
0,25
200
0,20
150
0,15
100
0,10
50
0,05
0
0,00
0
10
20
30
25 α-TOH
100 α-TOH
300 α-TOH
Kontrolle
75 α-TOH
200 α-TOH
c(α-TOH) [mmol/kg ROTG]
c(Hydroperoxide) [mmol/kg ROTG]
400
40
50 α-TOH
125 α-TOH
Datenreihen10
Abb. 3.6: Entstehung von Hydroperoxiden während der Lagerung von ROTG mit unterschiedlichen
initialen α-Tocopherol (α-TOH)-Konzentrationen in einem Bereich von 25 bis 300 µmol/kg ROTG bei
40°C im Dunkeln, gleichzeitig dargestellt: der Abbau des α-Tocopherols für die jeweiligen Proben
Die Länge der Induktionsperiode der Kontrollprobe betrug 4 Tage. Mit steigender
α-Tocopherol-Konzentration von bis zu 300 µmol/kg ROTG verlängert sich diese bis zu einer
Dauer von 34,6 Tagen.
Tab. 3.3: Darstellung der Dauer der Induktionsphase (IP), der Hydroperoxid-Konzentration am Ende der
Induktionsphase (IPHyd), die Zeit bis zum Erreichen einer POZ von 15 meq O2/kg ROTG (POZ 15) und
die aus diesen Daten berechneten kinetischen Parameter zur Charakterisierung der Effekte der
unterschiedlichen α-Tocopherol-Konzentrationen (α-TOH) für ROTG-Proben mit initialen α-TocopherolKonzentrationen von 25 bis 300 µmol/kg ROTG, sowie der Effizienz von α-Tocopherol (Effizienz∆IP und
Effizienz∆POZ) während der Oxidation bei 40°C im Dunkeln
α-TOH
[µmol/kg
ROTG]
POZ 15
[Tage]
IP
[Tage]
IPHyd
[mmol/kg
ROTG]
Winh x 10-7
F
WInHx 10-10
ORR
A
Effizienz∆IP
Effizienz∆POZ
0
25
50
75
100
125
200
300
3,54
14,15
18,17
19,39
18,90
18,29
16,10
14,51
4,0
17,9
21,1
26,1
28,1
28,1
32,3
34,6
58,974
58,019
62,264
105,128
103,302
139,687
148,718
196,429
1,706
0,375
0,342
0,466
0,425
0,575
0,533
0,924
4,49
5,26
6,53
7,03
7,02
8,07
8,65
0,162
0,274
0,333
0,412
0,515
0,717
1,410
0,22
0,20
0,27
0,25
0,34
0,31
0,39
20,45
26,24
23,92
28,19
20,79
25,80
22,44
0,422
0,293
0,211
0,154
0,118
0,063
0,037
0,556
0,342
0,295
0,241
0,193
0,142
0,102
50
Ergebnisse
Mit zunehmender α-Tocopherol-Konzentration in ROTG stieg die Länge der Induktionsphase
logarithmisch an (Abb. 3.7). Wird die Zeit betrachtet, die von einer Probe benötigt wurde, um
eine POZ von 15 meq O2/kg ROTG zu erreichen, so stieg die Wirkung von α-Tocopherol
zunächst bis zu einer Konzentration von ca. 50 µmol/kg ROTG stark an und erreichte dann
ein Plateau. Die längste Zeit bis zum Erreichen einer POZ von 15 meq O2/kg ROTG (ca. 19
Tage) wurde von der Probe mit einer α-Tocopherol-Konzentration mit 75 µmol/kg ROTG
erreicht (Abb. 3.7). Bei α-Tocopherol-Konzentrationen > 125 µmol/kg ROTG nahm die
Länge bis zum Erreichen der POZ von 15 meq O2/kg ROTG wieder deutlich ab. Ein
Effizienzmaximum für α-Tocopherol ist auch unter Berücksichtigung niedrigerer Konzentrationen (5 und 10 µmol/kg ROTG, Abb. 3.1, die sich trotz geringfügig unterschiedlich
verlaufender Kontrollen gut in Abb. 3.7 einpassen) nicht festzustellen (Tab. 3.3). Die
Effizienz (Effizienz∆IP und Effizienz∆POZ) von α-Tocopherol fällt stetig.
30
(-x/29,5)
y=4,2 +20,6*(1-e
2
R = 0,99186
)+0,03*x
20
(-x/24,8)
y=3,5 +18,2*/1-e
2
R = 0,99584
10
)-0,03*x
Länge der Induktionsphase
Oxidationsdauer bis POZ15
0
0
100
200
300
α-TOH Konzentration [µmol/kg ROTG]
Abb. 3.7: Oxidationslänge in Abhängigkeit von der α-Tocopherol-Konzentration (α-TOH): Darstellung
der Zeit in Tagen, die die ROTG-Proben mit unterschiedlichen initialen α-Tocopherol-Konzentrationen
von 25 bis 300 µmol/kg ROTG benötigen, um eine Peroxidzahl (POZ) von 15 meq O2/kg ROTG zu
erreichen, und Darstellung der Länge der Induktionsphasen dieser Proben, Lagerung bei 40°C im
Dunkeln
Die Bildung der Hydroperoxide stieg mit zunehmender α-Tocopherol-Konzentration stetig an.
So betrug die Hydroperoxid-Konzentration am Ende der Induktionsphase der Kontrollprobe
59 mmol/kg ROTG, stieg nur wenig für die Proben mit einer α-Tocopherol-Konzentration
51
von 50 und 75 µmol/kg ROTG, stieg aber stark für die nachfolgenden Proben bis hin zu der
α-Tocopherol-Konzentration von 300 µmol/kg ROTG, bei der die HydroperoxidKonzentration ungefähr dreimal so hoch war (Tab. 3.3). Da das Oxidationsratenverhältnis
(ORR) immer geringer war als 1, kann gefolgert werden, dass α-Tocopherol in keiner
Konzentration einen prooxidativen Effekt bewirkt hat.
Der Abbau des eingesetzten α-Tocopherols stieg linear mit steigender α-TocopherolStartkonzentration (Abb. 3.8).
1,6
WInH [M/s*10-10]
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
0
0,00005
0,0001
0,00015
0,0002
0,00025
0,0003
0,00035
c(α-TOH) [Mol/kg ROTG]
Abb. 3.8: Graphische Darstellung von WInH
3.1.2
Sukzessive Zugabe von α-Tocopherol zu ROTG
Um die Hydroperoxidbildung in Gegenwart von hohen α-Tocopherol-Konzentrationen zu
verringern, wurde der Effekt von sukzessive zugegebenem α-Tocopherol in ROTG
untersucht. Die Startkonzentration von α-Tocopherol betrug 130 µmol/kg ROTG und hatte
somit eine optimale Konzentration, um die Hydroperoxidbildung effektiv zu inhibieren. Da
der Abbau des α-Tocopherols zu Beginn der Oxidation 5 µmol/kg ROTG in 6 Tagen beträgt,
wurde alle 6 Tage eine α-Tocopherol Menge von 5 µmol/kg ROTG zudosiert (Abb. 3.10,
Abb. A.6). Zum Ende des Versuchs betrug die insgesamt zugegebene Menge an α-Tocopherol
155 µmol/kg ROTG. Es konnte festgestellt werden, dass die Abbaugeschwindigkeit von αTocopherol zu Beginn des Oxidationsversuches wesentlich geringer war als zum Ende (Abb.
3.10).
52
Ergebnisse
c(Hydroperoxide)
[mmol/kg ROTG]
400
300
200
100
0
0
10
20
30
40
50
Kontrolle
Control
100 α
100
α-TOH
-TOH
100 α -TOH + 5 α -TOH alle 6 Tage
100 α -TOH + 5 α -TOH every 6 days
c(α
α -TOH) [mmol/kg ROTG]
α-Tocopherol [mmol/kg ROTG]
Abb. 3.9: Hydroperoxidbildung bei einer Probe mit 100 µmol α-Tocopherol (α-TOH)/kg ROTG durch
sukzessive Zugabe von jeweils 5 µmol α-TOH/kg ROTG alle 6 Tage, im Vergleich zu einer Probe mit einer
einmaligen initialen α-Tocopherol-Gabe mit einer Konzentration von 100 µmol/kg ROTG, Lagerung bei
40°C im Dunkeln
0.16
0,16
0.14
0,14
0.12
0,12
0.1
0.08
0,10
0.06
0,08
0.04
0,06
0.02
0,040
0
5
10
15
20
25
30
Lagerdauerbei
bei40°
40°
C,dunkel
dunkel[Tage]
[Tage]
Lagerdauer
C,
100
α-TOH
5 µmol
α-TOH
alle 6 Tage
100µmol
α-TOH
+ 5 α+-TOH
alle
6 Tage
35
40
100
α-TOH
100µmol
α-TOH
Abb. 3.10: Darstellung der verzögerten Abbaugeschwindigkeit von 130 µmol α-Tocopherol (α-TOH)/kg
ROTG durch stetige Zugabe von jeweils 5 µmol α-Tocopherol/kg ROTG alle 6 Tage, Lagerung bei 40°C
im Dunkeln.
53
Der Abbau des α-Tocopherols wurde mit einer Probe verglichen, die eine α-TocopherolKonzentration von 130 µmol/kg ROTG ohne weitere Zugaben enthielt. Der Abbau des
α-Tocopherols war zunächst identisch. Nach 14 Tagen war ein verzögerter Abbau bei
sukzessiver Zugabe von α-Tocopherol zu erkennen. Nach ca. 36 Tagen war das α-Tocopherol
bei beiden Proben komplett aufgebraucht.
(Die erhaltenen Oxidationsdaten können allerdings nicht direkt mit den Daten aus 3.1.1
verglichen werden nur die Verläufe sind identisch, da eine andere Ölcharge für die
Durchführung der Versuche verwendet wurde.)
Die Länge der Induktionsphase unterschied sich allerdings. Die Induktionsphase der Probe
mit einmaliger α-Tocopherol-Zugabe ist mit 29,9 Tagen ca. 4 Tage kürzer als die der Probe
mit der sukzessiven Addition von α-Tocopherol mit 33,4 Tagen (Tab. 3.4). Der Unterschied
der Proben in der Konzentration an Hydroperoxiden am Ende der Induktionsphase war nur
gering.
Tab. 3.4: Vergleich der Länge der Induktionsphase (IP) und der Konzentration an Hydroperoxiden am
Ende der Induktionsphase zweier Proben mit der gleichen α-Tocopherol (α-TOH)-Start-Konzentration
von ca. 130 µmol/kg ROTG, wobei die eine nur eine initiale α-Tocopherol-Zugabe, die andere eine
sukzessive Zugabe von α-Tocopherol bis zu einer Konzentration von 155 µmol/kg ROTG erhalten hat
Startkonzentration
α-TOH [µmol/kg
ROTG]
130
Länge der IP bei
Hydroperoxidkonzeneiner
tration am Ende der
schrittweisen
IP [mmol/kg ROTG]
Zugabe [Tage]
33,4
102
Länge der IP
bei einer
einmaligen
Zugabe [Tage]
Hydroperoxidkonzentration am Ende der
IP [mmol/kg ROTG]
29,9
97
In nachfolgenden Versuchen wurden die Proben mit sukzessiver α-Tocopherol-Zugabe
jeweils einer Probe mit gleicher Gesamtkonzentration zu Beginn des Versuches gegenübergestellt. Hierfür wurden drei unterschiedliche Gesamtkonzentrationen und somit auch
unterschiedliche sukzessive Zugabemengen für α-Tocopherol gewählt. Bei einer
α-Tocopherol-Gesamtkonzentration von 125 µmol/kg ROTG erfolgte eine Zugabe von
α-Tocopherol in 5 Schritten von jeweils 5 µmol/kg ROTG, ausgehend von einer
α-Tocopherol-Ausgangskonzentration von 100 µmol/kg ROTG. Bei einer Gesamtkonzentration von 350 µmol/kg ROTG erfolgte die Zugabe von α-Tocopherol ebenfalls in 5 Schritten,
allerdings von jeweils 50 µmol/kg ROTG und bei einer Gesamtkonzentration von
600 µmol/kg ROTG in 5 Schritten von jeweils 100 µmol/kg ROTG.
54
Ergebnisse
Bei dem Versuch mit einer Gesamt-α-Tocopherol-Konzentration von 125 µmol/kg ROTG
war kein Unterschied in der Bildung von Hydroperoxiden zu erkennen, ebenso beim Abbau
des α-Tocopherols zwischen der einmaligen und der sukzessiven Zugabe von α-Tocopherol in
0,16
0,14
0,12
0,1
0,08
0,06
0,04
0,02
0
500
450
400
350
300
250
200
150
100
50
0
0
10
Abbau 125 α-TOH
Abbau 100 α-TOH + 5*5 α-TOH
Hydroperoxide Kontrolle
Hydroperoxide 125 α-TOH
20
c(Hydroperoxide)
[mmol/kg ROTG]
einer Konzentration von je 5 µmol/kg ROTG (Abb. 3.11).
30
Abb. 3.11: Entstehung von Hydroperoxiden während der Lagerung von ROTG mit einer initialen
α-Tocopherol (α-TOH)-Konzentration von 125 µmol/kg ROTG, im Vergleich zu einer Probe mit einer
initialen α-Tocopherol-Konzentration von 100 µmol/kg ROTG und 5-facher Zugabe von α-Tocopherol mit
einer Konzentration von jeweils 5 µmol/kg ROTG, alle sechs Tage, bei 40°C im Dunkeln; gleichzeitig
dargestellt: der Abbau des α-Tocopherols
Die Länge der Induktionsphase und auch die Dauer bis zum Erreichen einer HydroperoxidKonzentration von 75 mmol/kg ROTG bei allen Proben unterscheiden sich nicht. Der einzige
Unterschied liegt darin, dass bei den Proben mit sukzessiver α-Tocopherol-Zugabe mit
steigender Konzentration die Hydroperoxid-Bildung ansteigt (Tab. 3.5).
Tab. 3.5: Vergleich der Länge der Induktionsphase (IP) und die Dauer bis zum Erreichen einer
Hydroperoxidkonzentration von 75 mmol/kg ROTG mehrerer Probenpaare mit jeweils gleicher Gesamtα-Tocopherol- (α-TOH)-Konzentration von 125, 350 und 600 µmol/kg ROTG, wobei die eine Probe des
Paares nur mit einer initialen α-TOH-Zugabe, die andere mit einer schrittweisen Zugabe von
α-Tocopherol versetzt wurde
gesamt α-TOH
[µmol/kg ROTG]
125
350
600
Dauer bis zum
Länge der IP bei
Erreichen einer
einer
Hydroperoxidkonzenschrittweisen
tration von 75
µmol/kg ROTG
Zugabe [Tage]
[Tage]
29,3
26,1
>36
22,1
~30
15,5
Dauer bis zum
Erreichen einer
Länge der IP bei
Hydroperoxidkonzeneiner einmaligen
tration von 75
Zugabe [Tage]
µmol/kg ROTG
[Tage]]
28,7
23,4
~30
19,2
~30
25,2
55
Die sukzessive Zugabe von einer α-Tocopherol-Konzentration von jeweils 5 µmol/kg ROTG
zeigte sogar einen negativen Effekt, da die Entstehung von sekundären Oxidationsprodukten
sowohl bei Propanal (Abb. 3.12) als auch bei Hexanal (Abb. A.7) höher war.
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
0
5
Kontrolle
10
15
20
25
125 α-TOH
30
35
40
100 α-TOH + 5*5 α-TOH
Abb. 3.12: Entstehung von Propanal während der Lagerung von ROTG mit einer initialen α-Tocopherol
(α-TOH)-Konzentration von 125 µmol/kg ROTG, im Vergleich zu einer Probe mit einer initial
α-Tocopherol-Konzentration von 100 µmol/kg ROTG und 5-facher Zugabe von α-Tocopherol mit einer
Konzentration von jeweils 5 µmol/kg ROTG, alle sechs Tage, bei 40°C im Dunkeln.
Bei einer Gesamt-α-Tocopherol-Konzentration von 350 µmol/kg ROTG zeigte sich bei der
Entstehung der Hydroperoxide eine geringe Steigerung bei der Inhibierung der Oxidation
durch sukzessive Zugabe. Bei Versuchsende am Tag 36 war das Ende der Induktionsphase bei
sukzessiver Zugabe von α-Tocopherol noch nicht erreicht (Abb. 3.13 und Tab. 3.5).
56
0,45
500
0,4
450
0,35
400
350
0,3
300
0,25
250
0,2
200
0,15
150
0,1
100
0,05
c(Hydroperoxide)
[mmol/kg ROTG]
Ergebnisse
50
0
0
0
10
20
30
Abbau 350 α-TOH
Hydroperoxide 100 α-TOH + 5*50 α-TOH
α-Tocopherol- (α-TOH)-Konzentration von 350 µmol/kg ROTG, im Vergleich zu einer Probe mit einer
dargestellt: der Abbau von α-Tocopherol
Diese Verbesserung der inhibierenden Wirkung zeigte sich noch stärker bei der Entstehung
von sekundären Oxidationsprodukten (Abb. 3.14, Abb. A.8). Auch hier war deutlich das Ende
der Induktionsphase der Probe mit einmaliger Dosis nach 30 Tagen zu erkennen, während bei
sukzessiver Zugabe von α-Tocopherol das Ende der Induktionsphase bei Versuchsende (Tag
36) noch nicht erreicht war. Jedoch war die Bildung von Propanal bei beiden Dosierungsformen bis zu Tag 30 identisch, dann lag die der Probe mit sukzessiver α-Tocopherol-Zugabe
höher. Im Vergleich zu dem Versuch mit einer Gesamt-α-Tocopherol-Konzentration von
125 µmol/kg ROTG war die gebildete Menge an sekundären Oxidationsprodukten bei einer
Gesamt-α-Tocopherol-Konzentration von 350 µmol/kg ROTG niedriger.
57
c(Propanal) [µmol/kg
ROTG]
100
80
60
40
20
0
0
5
10
15
20
25
30
350 α-TOH
Kontrolle
35
40
100 α-TOH + 5*50 α-TOH
Abb. 3.14: Entstehung von Propanal während der Lagerung von ROTG mit einer initialen α-Tocopherol(α-TOH)-Konzentration von 350 µmol/kg ROTG, im Vergleich zu einer Probe mit einer initialen
Konzentration von jeweils 50 µmol/kg ROTG, alle sechs Tage, bei 40°C im Dunkeln
0,7
500
450
400
350
300
250
200
150
100
50
0
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
0
10
20
c(Hydroperoxide)
[mmol/kg ROTG]
Bei Proben mit einer Gesamt-α-Tocopherol-Konzentration von 600 µmol/kg ROTG wurde
festgestellt, dass die Entstehung von Hydroperoxiden der Probe mit einer sukzessiven Zugabe
an α-Tocopherol von jeweils 100 µmol/kg ROTG parallel zu der Probe mit einmaliger Gabe
einer α-Tocopherol-Konzentration von 600 µmol/kg ROTG verlief (Abb. 3.15).
30
Abbau 600 α-TOH
Hydroperoxide 100 α-TOH + 5*100 α-TOH
α-Tocopherol- (α-TOH)-Konzentration von 600 µmol/kg ROTG, im Vergleich zu einer Probe mit einer
dargestellt: der Abbau von α-Tocopherol
58
Ergebnisse
Bei Betrachtung der Entwicklung der sekundären Oxidationsprodukte konnte, ähnlich wie bei
den Proben mit einer Gesamt-α-Tocopherol-Konzentration von 350 µmol/kg ROTG, ein
Anstieg in der Inhibierung der sekundären Oxidationsprodukte ab Tag 12 (Abb. A.9) gezeigt
werden. Allerdings war dieser Effekt hier wesentlich geringer (Abb. 3.16) als bei den Proben
mit einer Gesamt-α-Tocopherol-Konzentration von 350 µmol/kg ROTG (Abb. 3.14).
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
0
5
10
15
20
25
30
35
40
Kontrolle
600 TOH
100 TOH + 5*100 TOH
Abb. 3.16: Entstehung von Propanal während der Lagerung von ROTG mit einer initialen α-Tocopherol(α-TOH)-Konzentration von 600 µmol/kg ROTG, im Vergleich zu einer Probe mit einer initialen
Konzentration von jeweils 100 µmol/kg ROTG, alle sechs Tage, bei 40°C im Dunkeln
3.1.3
Einfluss der oxidativen Belastung der Matrix bei der Zugabe des
Antioxidans
Um den Einfluss von bereits vor Zugabe des Antioxidans existierenden Lipidhydroperoxiden
in der Matrix zu untersuchen und um den Unterschied zwischen α- und γ-Tocopherol zu
bestimmen, wurden verschiedene Versuche in unterschiedlich stark oxidierten ROTG
durchgeführt. Es sollte auch die Wirksamkeit eines gemeinsamen Einsatzes von α- und γTocopherol untersucht werden. Der Oxidationsverlauf wurde über die Entstehung primärer
und sekundärer Oxidationsprodukte beobachtet.
59
3.1.3.1
Einfluss von voroxidierten ROTG auf die antioxidative Aktivität von
α-Tocopherol
In einem Vorversuch wurde bestimmt, ob α-Tocopherol auch in bereits voroxidiertem Öl eine
antioxidative Wirkung ausüben kann. Hierzu wurden ROTG-Proben mit unterschiedlichen
Peroxidzahlen hergestellt und mit einer Konzentration an α-Tocopherol von 100 µmol/kg
ROTG versetzt. Anschließend wurde der Oxidationsverlauf über die Entstehung der
Hydroperoxide verfolgt.
Es stellte sich heraus, dass eine Addition einer α-Tocopherol-Konzentration von 100 µmol/kg
ROTG bei jeder gewählten POZ (2,5, 10, 25 meq O2/kg ROTG) in der Lage war, den
Oxidationsverlauf zu beeinflussen. Durch Addition von α-Tocopherol zu einer bereits auf eine
POZ von 10 meq O2/kg ROTG oxidierten Probe blieb die initiale POZ für fast 12 Tage gleich,
bevor die Oxidation in der Probe weiter fortschritt. Mit steigender POZ verringerte sich diese
Zeit (Abb. 3.17).
POZ [meq O2/kg]
75
50
25
0
0
5
10
15
20
PV 2,5
PV 2,5 + 100 α-TOH
PV 10
PV 10 + 100 α-TOH
PV 25
PV 25 + 100 α-TOH
Abb. 3.17: Oxidationsverlauf von unterschiedlich stark voroxidierten ROTG-Proben mit POZ von 2,5, 10
und 25 meq O2/kg ROTG mit und ohne Zugabe einer α-Tocopherol (α-TOH)-Konzentration von
100 µmol/kg ROTG über 20 Tage bei 40°C im Dunkeln
Mithilfe von Inhibierungen sollte ein direkter Einfluss der unterschiedlich stark vor-oxidierten
ROTG auf die antioxidative Effizienz von α-Tocopherol bestimmt werden. Hierzu wurde ein
Oxidationsversuch mit unterschiedlich stark voroxidierten ROTG-Proben (POZ 0, 2,5, 10, 25,
40 meq O2/kg ROTG) unter Zugabe einer α-Tocopherol-Konzentration von 100 µmol/kg
ROTG durchgeführt und die Inhibierungen der Bildung von Hydroperoxiden berechnet. Es
60
Ergebnisse
zeigte sich, dass α-Tocopherol bei jeder voroxidierten Probe in der Lage war, die weitere
Lipidoxidation zu verzögern. Die antioxidative Effizienz von α-Tocopherol stieg mit
abnehmender initialer POZ, d.h. die stärkste Inhibierung durch α-Tocopherol auf die
Neubildung von Hydroperoxiden erfolgte bei der niedrigsten initialen POZ (Abb. 3.18).
4
7
11
14
18
21
25
28
32
POZ 0
97,7
99,1
95,1
95,5
96
95,5
94,4
90,4
87,2
POZ 2,5
88,7
97,5
96,5
95,2
92,4
82,7
63,9
56,7
45,3
POZ 10
91,4
95,4
90,1
74,3
37,9
48,3
36,9
23,7
31,9
POZ 25
87,9
60,6
33
41,3
18,4
26,5
0
13,3
0
POZ 40
100
56,6
34,9
31,2
27,8
21,6
27,4
0
12,1
Inhibierung [%]
Initiale POZ
Inhibierung [%]
Abb. 3.18: Inhibierung der Lipidoxidation, berechnet aus der Entstehung von Hydroperoxiden von voroxidierten ROTG-Proben mit initialen POZ von 0, 2,5, 10, 25 und 40 meq O2/kg ROTG durch Addition
einer α-Tocopherol-Konzentration von 100 µmol/kg ROTG, Lagerung bei 40°C im Dunkeln
Zusätzlich zeigte der initiale Oxidationszustand der ROTG einen Einfluss auf die bis zum
Ende der Induktionsphase neu gebildeten Hydroperoxide. So konnte durch die Zugabe von
α-Tocopherol in einer Konzentration von 100 µmol/kg ROTG zwar die Induktionsphase der
voroxidierten ROTG-Proben verlängert werden, gleichzeitig stieg aber durch die initiale
Oxidation die Menge an gebildeten Hydroperoxiden bis zum Ende der Induktionsphase mit
steigender initialer POZ an (Abb. 3.19).
61
POZ am Ende der
Induktionsphase
120
100
80
60
40
20
0
POZ 2,5
POZ 10
POZ 25
POZ 40
Abb. 3.19: POZ [meq O2/kg ROTG ] am Ende der Induktionsphase von unterschiedlich stark
voroxidierten ROTG-Proben (POZ 2,5, 10, 25, 40 meq O2/kg ROTG) mit α-Tocopherol in einer
Konzentration von 100 µmol/kg ROTG, Lagerung bei 40°C im Dunkeln
3.1.3.2
Response-Surface-Design-Experiment zur Bestimmung der Effizienz von
α-Tocopherol in voroxidierten ROTG
Um den Einfluss der α-Tocopherol-Konzentration und des initialen Oxidationszustandes auf
die antioxidative Effizienz von α-Tocopherol in ROTG zu identifizieren, wurde mit Hilfe der
Response-Surface-Methode ein Versuchsplan mit dem Aufbau eines Central-CompositeDesigns erstellt. Es wurde ein Design mit α = 1,25 gewählt. Die beiden Faktoren waren A:
Konzentration von α-Tocopherol und B: initialer oxidativer Zustand des Öls. Der initiale
Zustand der ROTG variierte in einem Bereich von 5 bis 25 meq O2/kg ROTG, und der
α-Tocopherolgehalt schloss einen Konzentrationsbereich von 25 bis 250 µmol/kg ROTG ein (
Tab. 3.6). Der Versuchsaufbau basierte auf den für α-Tocopherol in voroxidierten ROTG
bereits erhaltenen Daten und sollte zusätzlich den Einfluss der zunehmenden α-TocopherolKonzentration auf die Neubildung der primären und sekundären Oxidationsprodukte zeigen.
Tab. 3.6: Faktor Level des Central-Composite-Designs zur Bestimmung des Einflusses von voroxidierten
ROTG auf die antioxidative Effizienz von α-Tocopherol (α-TOH) mit α = 1,25
Faktor A - α-TOH-Konzentration
[µmol/kg ROTG]
Faktor B - initiale POZ der ROTG
[meq O2/kg ROTG]
62
Niedrigster Wert [-1]
25
Faktor Level
Zentralpunkt [0]
150
Höchster Wert [+1]
250
5
15
25
Ergebnisse
Tab. 3.7 zeigt den genauen Versuchsplan zur Durchführung des gewünschten Versuchs mit
den zwei nummerischen Faktoren A: initialer oxidativer Zustand des Öls [meq O2/kg ROTG]
und B: α-Tocopherol-Konzentration [µmol/kg ROTG]. (Die erhaltenen Messwerte für die
Oxidation nach 21 und 28 Tagen sind im Anhang aufgeführt (Tab. A.1). Eine Auswertung zu
einem früheren Zeitpunkt der Oxidation war nicht möglich, da keine signifikanten
Unterschiede gefunden werden konnten.)
Tab. 3.7: Versuchsplan zur Identifizierung des Einflusses des zunehmend oxidierten initialen Zustands
der ROTG auf die abfallende antioxidative Effizienz unterschiedlicher α-Tocopherol-Konzentrationen
(α-TOH)
Proben
Nr.
Randomisierte
Reihenfolge
Messpunkt
Typ
Axialpunkt
Faktor A
POZ
[meq O2/kg ROTG]
5
Faktor B
α-TOH
[µmol/kg ROTG]
250
7
1
18
2
Axialpunkt
15
25
17
3
Axialpunkt
15
25
2
4
Axialpunkt
5
50
4
5
Axialpunkt
25
50
13
6
Sternpunkt
2.5
150
12
7
Axialpunkt
25
250
19
8
Axialpunkt
15
275
16
9
Sternpunkt
27.5
150
22
10
Zentralpunkt
15
150
25
11
Zentralpunkt
15
150
11
12
Axialpunkt
25
250
10
13
Axialpunkt
25
250
9
14
Axialpunkt
5
250
1
15
Axialpunkt
5
50
8
16
Axialpunkt
5
250
20
17
Axialpunkt
15
275
23
18
Zentralpunkt
15
150
5
19
Axialpunkt
25
50
14
20
Sternpunkt
2.5
150
24
21
Zentralpunkt
15
150
21
22
Zentralpunkt
15
150
15
23
Sternpunkt
27.5
150
6
24
Axialpunkt
25
50
3
25
Axialpunkt
5
50
Bei Betrachtung der nach 21 Tagen Oxidation gemessenen Ergebnisse wurde deutlich, dass
beide Faktoren (A und B) bei der Entstehung sowohl der primären als auch der sekundären
Oxidationsprodukte einen hoch signifikanten Einfluss ausübten. Zusätzlich zeigten sich bei
der Entstehung der Hydroperoxide und des Hexanals Faktor-Interaktionen, die bei der
Entstehung von Propanal nicht zu identifizieren waren (Abb. 3.22). Der initiale Oxidationszu63
stand (Faktor A) zeigte bei allen Ergebnisvariablen den größten Einfluss auf die inhibierende
Wirkung von α-Tocopherol. Beide Faktoren wiesen, mit Ausnahme der Propanalbildung,
sowohl lineare als auch quadratische Beziehungen auf (Tab. 3.8). Bei allen untersuchten
Oxidationsprodukten zeigte sich die stärkste Inhibierung bei einer initialen POZ von 5 meq
O2/kg ROTG und einer α-Tocopherol-Konzentration von 250 µmol/kg ROTG. Zu einem
früheren Zeitpunkt der Oxidation verlief die Reihenfolge der Proben identisch, die
Auswertung mittels Response-Surface kann allerdings erst erfolgen, wenn sich alle Proben
signifikant unterscheiden. Die erhaltenen Messwerte für die Oxidation sind im Anhang
aufgeführt (Tab. A.1). Eine Auswertung zu einem früheren Zeitpunkt der Oxidation war nicht
möglich, da keine signifikanten Unterschiede im Response-Surface-Design gefunden werden
konnte.
Tab. 3.8: Regressionsergebnisse für alle Parameter und signifikante Interaktionen, bestimmt für die drei
Ergebnisvariablen Hydroperoxidgehalt, Propanalgehalt und Hexanalgehalt, nach 21 Tagen Oxidation
1
Faktor
Hydroperoxidgehalt
Regressionskoeffizient
151,27
-116,90
-36,81
58,46
14,27
a
A
B
2
A
2
B
AB
Konst.
340,33
a
Kodierte Faktoren:
1
Modellvarianz
Modellvarianz
3
Modellvarianz
2
p
< 0,0001
< 0,0001
0,0011
< 0,0001
0,0739
2
Propanalgehalt
287,09
-204,49
kein Effekt
kein Effekt
kein Effekt
452,14
p
< 0,0001
< 0,0001
3
Hexanalgehalt
452,73
-287,75
-89,50
73,03
33,73
p
< 0.0001
< 0.0001
0.0047
0.0170
0.1781
890,42
A[-1] 5 meq O2/kg ROTG, A[+1] 25 meq O2/kg ROTG;
B[-1] 50 µmol/kg ROTG, B[+1] 250 µmol/kg ROTG α-Tocopherol
p < 0,0001 Lack of Fit
p = 0,2337
p = 0,1535
p = 0,3843
Die optimale Konzentration für die unterschiedlichen initialen POZ kann über folgende
Formeln für die Entwicklung der einzelnen primären und sekundären Oxidationsprodukte
berechnet werden:
(3-1) Hydroperoxide:
y=
340,33 + 151,27*(POZ[meq O2/kg ROTG]) – 116,9*(α-TOH-Konz.[µmol/kg
ROTG]) - 36,81*(POZ[meq O2/kg ROTG])2 + 58,46*(α-TOH-Konz.[µmol/kg
ROTG])2 + 14,27*(POZ[meq O2/kg ROTG])* (α-TOH-Konz.[µmol/kg
ROTG])
(3-2) Propanal:
y=
64
ROTG])
Ergebnisse
(3-3) Hexanal:
y=
ROTG]) – 89,5*(POZ[meq O2/kg ROTG])2 + 73,03*(α-TOH-Konz.[µmol/kg
616
482
348
214
80
nach 21 Tagen
Hydroperoxide [mmol/kg ROTG]
ROTG])2 + 33,73*(POZ[meq O2/kg ROTG])* (α-TOH-Konz.[µmol/kg
ROTG])
250
200
B: α-TOH
150
100
10
50
15
20
25
A: POZ
1581
nach 21 Tagen
Hexanal [mmol/kg ROTG]
Abb. 3.20: Einfluss des initialen Oxidationsgrades und der α-Tocopherol-Konzentration (α-TOH) in
µmol/kg ROTG auf die Entstehung von Hydroperoxiden nach 21 Tagen
1210
840
470
100
250
B: α-TOH
200 150
100
50
5
10
15 20
25
A: POZ
µmol/kg ROTG auf die Entstehung von Hexanal nach 21 Tagen
65
698
nach 21 Tagen
Propanal [mmol/kg ROTG]
944
452
206
0
250
B: α-TOH
200 150
100
50
10
15
20
25
A: POZ
µmol/kg ROTG auf die Entstehung von Hexanal nach 21 Tagen
3.1.3.3
Einfluss auf die Oxidation durch γ-Tocopherol in voroxidierten ROTG
Um den Einfluss der beiden Tocopherole aufeinander zu untersuchen, sollte neben der
alleinigen Wirkung von α-Tocopherol auch die alleinige Wirkung von γ-Tocopherol auf den
Oxidationsverlauf in bereits voroxidierten ROTG untersucht werden. Beide Substanzen
wiesen nämlich in ROTG große Effizienz-Unterschiede auf (LAMPI ET AL. 1999). Auch für
γ-Tocopherol wurden ROTG-Proben mit unterschiedlichen initialen POZ hergestellt, um zu
testen, welche Wirkung dieses Tocopherol-Derivat in bereits voroxidiertem Öl ausüben kann.
Hierfür wurden die Proben mit unterschiedlichen γ-Tocopherol-Konzentrationen in einem
Bereich von 250 bis 1178 µmol/kg ROTG versetzt, das entspricht einer niedrigen bis
mittleren in Rapsöl natürlicherweise vorkommenden Konzentration (KING ET AL., 1986).
Anschließend wurde der Oxidationsverlauf und somit die inhibierende Wirkung von
γ-Tocopherol über die Entstehung der Hydroperoxide begleitet. Es zeigte sich, dass - wie auch
schon von nicht oxidativ vorbelasteten Proben bekannt (LAMPI ET AL. 1999) - die antioxidative Wirkung von γ-Tocopherol in hohen Konzentrationen wesentlich stärker ist als in
niedrigeren Konzentrationen. Wie α-Tocopherol war γ-Tocopherol in der Lage, den
Oxidationsverlauf von initial voroxidierten ROTG-Proben zu beeinflussen und die Oxidation
zu verlangsamen (Abb. 3.23).
66
Ergebnisse
120
100
POZ [meq O2/kg ROTG]
80
60
40
20
0
0
10
20
30
POZ 5 + 250 γ-TOH
Kontrolle
POZ 25 + 1178 γ-TOH
40
POZ 5 + 1178 γ-TOH
POZ 25 + 250 γ-TOH
Abb. 3.23: Entstehung der Hydroperoxide von initial voroxidierten ROTG-Proben mit einer POZ von 5
und 25 meq O2/kg ROTG und unterschiedlicher Konzentration an γ-Tocopherol (γ-TOH) (250 und
1178 µmol/kg ROTG) bei einer Lagerung bei 40°C im Dunkeln
3.1.3.4
Response-Surface-Design-Experiment zur Bestimmung der Effizienz von
γ-Tocopherol in voroxidierten ROTG
Um den Einfluss unterschiedlicher γ-Tocopherol-Konzentrationen auf verschieden stark
voroxidierte ROTG-Proben genauer zu untersuchen, wurde ein zweiter mittels ResponseSurface-Methode entwickelter Versuchsaufbau nach dem Central-Composite-Design
verwendet. Es wurden zwei Faktoren untersucht: Zum einen die γ-Tocopherol-Konzentration
in einem Bereich von 250 bis 1178 µmol/kg ROTG (Faktor A) und zum anderen eine im
Bereich von 5 bis 25 meq O2/kg ROTG variierende initiale POZ der verwendeten ROTG
(Faktor B). Dieser initiale POZ-Bereich wurde bereits in 3.1.3.2 für die Untersuchungen mit
α-Tocopherol eingesetzt. Auch bei dem Versuch mit γ-Tocopherol wurde α = 1,25 gesetzt, um
negative Werte für die ausgewählten Faktoren zu verhindern (Tab. 3.9).
Tab. 3.9: Faktor Level des Central-Composite-Designs zur Bestimmung des Einflusses von voroxidierten
ROTG auf die antioxidative Effizienz von γ-Tocopherol (γ-TOH) mit α = 1,25
Faktor A - γ-TOH-Konzentration
[µmol/kg ROTG]
Faktor B - initiale POZ der ROTG
[meq O2/kg ROTG]
Niedrigster Wert [-1]
250
Faktor Level
Zentralpunkt [0]
714
Höchster Wert [+1]
1178
5
15
25
Tab. 3.10 zeigt den detaillierten Versuchsplan zur Durchführung des Versuchs mit den zwei
nummerischen Faktoren A: initialer oxidativer Zustand des Öls [meq O2/kg ROTG] und B: γ67
Tocopherol-Konzentration [µmol/kg ROTG]. Die erhaltenen Messwerte für die Oxidation
nach 21 bzw. 28 Tagen sind im Anhang aufgeführt (Tab. A.2). Die Reihenfolge in der
Bildung von Hydroperoxiden und Propanal war gleich. Eine Auswertung der entstandenen
primären und sekundären Oxidationsprodukte zu einem identischen Zeitpunkt der Oxidation
war nicht möglich. Ebenso war eine Auswertung zu einem früheren Zeitpunkt der Oxidation
nicht möglich, da keine signifikanten Unterschiede im Response-Surface-Design gefunden
werden konnten. Der Versuch wurde aus technischen Gründen an unterschiedlichen Tagen in
zwei Blöcken vorgenommen. Diese Einteilung wurde bereits bei der Erstellung des
Versuchsplans berücksichtigt.
der ROTG auf die abfallende antioxidative Effizienz unterschiedlicher γ-Tocopherol-Konzentrationen
(γ-TOH)
Proben
Nr.
randomisierte
Reihenfolge
Messpunkt
Typ
Block
Faktor A
POZ
[meq O2/kg ROTG]
Faktor B
γ-TOH
[µmol/kg ROTG]
1
5
1
2
Axialpunkt
Axialpunkt
1
1
5
5
250
1178
6
3
Axialpunkt
1
5
1178
8
4
Axialpunkt
1
25
1178
9
5
Zentralpunkt
1
15
714
3
6
Axialpunkt
1
25
250
2
7
Axialpunkt
1
5
250
11
8
Zentralpunkt
1
15
714
7
9
Axialpunkt
1
25
1178
4
10
Axialpunkt
1
25
250
10
11
Zentralpunkt
1
15
714
18
12
Zentralpunkt
1
15
714
15
13
Sternpunkt
2
15
1294
13
14
Sternpunkt
2
27,5
714
16
15
Zentralpunkt
2
15
714
17
16
Zentralpunkt
2
15
714
14
17
Sternpunkt
2
15
134
12
18
Sternpunkt
2
2,5
714
Bei Betrachtung der nach 21 Tagen Oxidation gemessenen Ergebnisse für die Entstehung der
Hydroperoxide wurde deutlich, dass beide Faktoren (A und B), genauso wie in 3.1.3.2 bei
dem Versuch mit α-Tocopherol, einen signifikanten Einfluss hatten. Auch hier zeigten sich
bei der Entstehung der Hydroperoxide Faktor-Interaktionen (Abb. 3.24). Der initiale
Oxidationszustand (Faktor A) hatte den größten Einfluss auf die Entstehung der Hydroperoxide. Beide Faktoren wiesen sowohl lineare als auch quadratische Beziehungen auf (
Tab. 3.11). Bei Betrachtung der Entstehung von Propanal ergab sich ein anderes Bild. Den
größten und linearen Einfluss auf die Entstehung dieser sekundären Oxidationsprodukte hatte
68
Ergebnisse
die
γ-Tocopherol-Konzentration (Faktor B). Zusätzlich zeigten sich Faktor-Interaktionen
zwischen der initialen POZ und der γ-Tocopherol-Konzentration (Abb. 3.25). Mit steigender
γ-Tocopherol-Konzentration stieg der inhibierende Effekt, mit steigender initialer POZ sank
die antioxidative Effizienz von γ-Tocopherol. Bei einer POZ von 5 meq O2/kg ROTG ergibt
sich im Hinblick auf die Inhibierung sekundärer Oxidationsprodukte eine optimale γTocopherol-Konzentration von 250 µmol/kg ROTG, entgegengesetzt dazu durchläuft die
Entstehung von Hydroperoxiden bei gleicher initialer POZ bei einer γ-TocopherolKonzentration von 585 µmol/kg ROTG ein Minimum (berechnet über die Formel (3-5)). Eine
Betrachtung der Hexanal-Konzentration war wegen der zu geringen Bildung zu diesem
Zeitpunkt nicht möglich.
Tab. 3.11: Regressionsergebnisse für alle Parameter und signifikante Interaktionen, bestimmt für zwei
der drei Ergebnisvariablen Hydroperoxidgehalt und Propanalgehalt, nach 21 bzw. 28 Tagen Oxidation
1
Faktor
a
Hydroperoxidgehalt
A
B
2
A
2
B
AB
37,38
-37,45
29,90
23,78
-50,69
Konstante
76,18
a
Kodierte Faktoren:
2
p
< 0,0001
< 0,0001
0,0011
0,0045
< 0,0001
Propanalgehalt
-21,25
15,04
kein Effekt
kein Effekt
-41,04
0,0342
0,0806
66,68
0,0018
p
B[-1] 250 µmol/kg ROTG, B[+1] 1178 µmol/kg ROTG γ-Tocopherol
1
p < 0,0001
Lack of Fit
p = 0,7937
2
p = 0,0017
Lack of Fit
p = 0,5554
Modellvarianz
Modellvarianz
Die Berechnung der optimalen γ-Tocopherol-Konzentration für die unterschiedlichen initialen
POZ kann für die einzelnen primären und sekundären Oxidationsprodukte über folgende
Formeln berechnet werde:
(3-4) Hydroperoxide:
y=
76,18 + 37,38*(POZ[meq O2/kg ROTG]) – 37,45*(γ-TOH-Konz.[µmol/kg
ROTG]) + 29,9*(POZ[meq O2/kg ROTG])2 + 23,78*(γ-TOH-Konz.[µmol/kg
ROTG])2 – 50,69*(POZ[meq O2/kg ROTG])* (γ-TOH-Konz.[µmol/kg
ROTG])
(3-5) Propanal:
y=
66,68 – 21,25*(POZ[meq O2/kg ROTG]) + 15,04*(γ-TOH-Konz.[µmol/kg
ROTG]) – 41,04*(POZ[meq O2/kg ROTG])* (γ-TOH-Konz.[µmol/kg ROTG])
69
nach 28 Tagen
Hydroperoxide [mmol/kg ROTG
255
207
158
110
61
1178
946
714
482
B: γ-TOH
250
5
15
10
20
25
A: POZ
nach 21 Tagen
Propanal [mmol/kg ROTG]
Abb. 3.24: Einfluss des initialen Oxidationsgrades und der γ-Tocopherol-Konzentration (γ-TOH) auf die
Entstehung von Hydroperoxiden nach 21 Tagen
144
113
82
51
19
1178
25
946
20
714
B: γ-TOH
492
250
15
5
10
A: POZ
Entstehung von Propanal nach 28 Tagen
70
Ergebnisse
3.1.3.5
Vergleich des Einflusses auf den Oxidationsverlauf durch α- und durch
γ-Tocopherol in voroxidierten ROTG
An Hand der aus diesen beiden Versuchsplänen (3.1.3.2, 3.1.3.4) erhaltenen Daten konnte
untersucht werden, welches Tocopherol-Derivat die Oxidation in voroxidierten ROTG
effizienter inhibiert. Hierfür wurden die Inhibierungen der beiden Derivate zu unterschiedlichen initialen POZ verglichen.
Die Addition von γ-Tocopherol in einer Konzentration von 250 µmol/kg ROTG brachte eine
ähnliche Inhibierung der Bildung von Hydroperoxiden mit sich wie die Addition von
α-Tocopherol in gleicher Konzentration bei einer initialen POZ von 5 meq O2/kg ROTG.
Dennoch war γ-Tocopherol in diesem Fall das stärkere Antioxidans, da es im Gegensatz zu
α-Tocopherol die Entstehung primärer Oxidationsprodukte über einen längeren Zeitraum
verringern konnte. Es zeigte außerdem eine stärkere inhibierende Wirkung als α-Tocopherol
bei einer hohen initialen POZ von 25 meq O2/kg ROTG (Abb. 3.26).
100
POZ 5
POZ 25
Inhibierung [%]
80
α-TOH
γ-TOH
60
40
20
0
14
21
28
14
21
28
Abb. 3.26: Vergleich der Inhibierungen bei der Entstehung von Hydroperoxiden in ROTG mit einer
Konzentration von 250 µmol/kg ROTG an α- oder γ-Tocopherol (α-oder γ-TOH) mit unterschiedlichen
initialen POZ (5 und 25 meq O2/kg ROTG)
3.1.3.6
Response-Surface-Design-Experiment zur Bestimmung der Effizienz einer
Kombination von α- und γ-Tocopherol in voroxidierten ROTG
Um Faktoren bzw. Faktorinteraktionen zu bestimmen, die einen Einfluss auf die Entstehung
primärer und sekundärer Oxidationsprodukte in unterschiedlich stark voroxidierten ROTGProben aufwiesen, wurde mit der Response-Surface-Methode ein Versuchsplan mit einem
71
Central-Composite-Design zur Bestimmung mehrerer nummerischer und kategorischer
Faktoren entwickelt. Wie auch schon bei den Versuchsplänen zuvor, wurde α = 1,25 gesetzt.
Die gewählten nummerischen Faktoren waren A: der initiale Oxidationszustand der ROTG in
meq O2/kg ROTG in einem Bereich von einer POZ von 5 bis 25 meq O2/kg ROTG und B: die
γ-Tocopherol-Konzentration in den unterschiedlichen Proben in µmol/kg ROTG, die auch
schon in 3.1.3.4 einen Konzentrationsbereich von 250 bis 1178 µmol/kg ROTG abdeckte. Die
α-Tocopherol-Konzentration wurde als kategorischer Faktor C mit untersucht. α-Tocopherol
wurde in den Konzentrationen 0, 250 und 464 µmol/kg ROTG eingesetzt (Tab. 3.12).
Tab. 3.12: Faktor Level des Central-Composite-Design zur Bestimmung des Einflusses von voroxidierten
ROTG auf die antioxidative Effizienz von α- und γ-Tocopherol (α- und γ-TOH) mit α = 1,25
Faktor Level
Niedrigster Wert [-1] Zentralpunkt [0]
Höchster Wert [+1]
Faktor A - initiale POZ der ROTG
5
15
25
[meq O2/kg ROTG]
Faktor B - γ-TOH-Konzentration
250
714
1178
[µmol/kg ROTG]
Faktor C – α-TOH-Konzentration
0
250
464
[µmol/kg ROTG]
[1]
[2]
[3]
In
Tab. 3.13 ist der Versuchsplan zur Durchführung des gewünschten Versuchs mit den zwei
nummerischen Faktoren A: initialer oxidativer Zustand des Öls [meq O2/kg ROTG] und B:
γ-Tocopherol-Konzentration [µmol/kg ROTG] und dem einen kategorischen Faktor C:
α-Tocopherol-Konzentration [µmol/kg ROTG] dargestellt. (Die erhaltenen Messwerte für die
Oxidation nach 14 Tagen sind im Anhang aufgeführt (Tab. A.3). Eine Auswertung zu einem
identischen Zeitpunkt der Oxidation mit den zwei vorhergehenden Versuchsplänen war nicht
möglich, da kein signifikantes Modell gefunden werden konnte.) Der Versuch wurde aus
technischen Gründen an unterschiedlichen Tagen in zwei Blöcken vorgenommen. Diese
Einteilung wurde bereits bei der Erstellung des Versuchsplans berücksichtigt.
der ROTG auf die abfallende antioxidative Effizienz unterschiedlicher α- und γ-TocopherolKonzentrationen (α- und γ-TOH)
Proben
Nr.
Randomisierte
Reihenfolge
Messpunkt
Typ
Block
41
29
42
22
4
3
19
26
43
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Axialpunkt
Zentralpunkt
Axialpunkt
Axialpunkt
Axialpunkt
Axialpunkt
Axialpunkt
Axialpunkt
Axialpunkt
1
1
1
1
1
1
1
1
1
72
Faktor A
POZ
[meq O2/kg
ROTG]
5
15
5
25
25
25
5
25
25
Faktor B
Faktor C
γ-TOH
α-TOH
[µmol/kg ROTG] [µmol/kg ROTG]
1178
714
1178
250
250
250
250
1178
1178
464
100
464
100
0
0
100
100
464
Ergebnisse
Proben
Nr.
Randomisierte
Reihenfolge
Messpunkt
Typ
Block
11
9
45
1
10
25
28
27
5
24
20
21
39
46
37
47
8
7
44
2
40
38
23
6
12
31
36
18
49
52
33
16
32
17
54
35
53
50
48
34
14
13
30
51
15
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
51
52
53
54
Axialpunkt
Axialpunkt
Axialpunkt
Axialpunkt
Axialpunkt
Axialpunkt
Zentralpunkt
Zentralpunkt
Axialpunkt
Axialpunkt
Axialpunkt
Axialpunkt
Axialpunkt
Axialpunkt
Axialpunkt
Axialpunkt
Axialpunkt
Axialpunkt
Axialpunkt
Axialpunkt
Axialpunkt
Axialpunkt
Axialpunkt
Axialpunkt
Sternpunkt
Sternpunkt
Zentralpunkt
Axialpunkt
Sternpunkt
Axialpunkt
Sternpunkt
Axialpunkt
Sternpunkt
Axialpunkt
Axialpunkt
Zentralpunkt
Axialpunkt
Sternpunkt
Sternpunkt
Zentralpunkt
Sternpunkt
Sternpunkt
Sternpunkt
Sternpunkt
Sternpunkt
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
Faktor A
POZ
[meq O2/kg
ROTG]
15
15
15
5
15
25
15
15
5
5
5
25
25
15
5
15
25
25
25
5
25
5
5
5
2,5
27,5
15
15
27,5
15
15
15
15
15
15
15
15
15
2,5
15
15
27,5
2,5
15
15
Faktor C
Faktor B
γ-TOH
α-TOH
[µmol/kg ROTG] [µmol/kg ROTG]
714
714
714
250
714
1178
714
714
1178
1178
250
250
250
714
250
714
1178
1178
1178
250
250
250
1178
1178
714
714
714
714
714
714
1294
714
134
714
714
714
714
134
714
714
134
714
714
1294
1294
0
0
464
0
0
100
100
100
0
100
100
100
464
464
464
464
0
0
464
0
464
464
100
0
0
100
100
0
464
464
100
0
100
0
464
100
464
464
464
100
0
0
100
464
0
Bei Betrachtung der Entstehung von Hydroperoxiden und Propanal war zu erkennen, dass alle
drei Faktoren (POZ, α-Tocopherol, γ-Tocopherol) signifikanten Einfluss ausübten. Bei der
Entstehung der Hydroperoxide waren zusätzlich noch Faktor-Interaktionen zu identifizieren.
73
Hierbei hatte der Faktor B, die γ-Tocopherol-Konzentration, nicht nur linearen, sondern auch
quadratischen Einfluss. Er übte auch den größten Einfluss auf die Bildung der Hydroperoxide
aus, gefolgt von dem initialen Zustand des Öls (Faktor A). Zusätzlich interagierte die
γ-Tocopherol-Konzentration mit der α-Tocopherol-Konzentration. Der Faktor C
(α-Tocopherol-Konzentration) hatte ebenfalls in allen Konzentrationen einen signifikanten
Einfluss auf die Entstehung der Oxidationsprodukte. Insgesamt hatte eine α-TocopherolKonzentration von 100 µmol/kg ROTG einen stärkeren Einfluss als eine Konzentration von
464 µmol/kg ROTG (Tab. 3.14). Für die Inhibierung von Hydroperoxiden bei hoher initialer
POZ zeigt γ-Tocopherol bei einer Konzentation von ca. 830 µmol/kg ROTG die stärkste
inhibierende Wirkung in Anwesenheit von 100 µmol α-Tocopherol/kg ROTG. Bei einer
Erhöhung der α-Tocopherol-Konzentration verschiebt sich diese Konzentration zu ca.
660 µmol γ-Tocopherol/kg ROTG. Bei niedriger initialer POZ zeigte die geringste
γ-Tocopherol-Konzentration den größten inhibierenden Effekt. Bei der Inhibierung von
sekundären Oxidationsprodukten wurde die Bildung von Propanal am stärksten bei höchster
initialer POZ verringert, wobei α- und γ-Tocopherol nur einen sehr geringen Einfluss auf die
Entstehung von Propanal hatten.
Tab. 3.14: Regressionsergebnisse für alle Parameter und signifikante Interaktionen, bestimmt für die drei
Ergebnisvariablen Hydroperoxidgehalt, Propanalgehalt, Hexanalgehalt, nach 14 Tagen Oxidation
1
Faktor
a
A
B
C[1]
C[2]
C[3]
2
A
2
B
AB
BC[1]
BC[2]
Konstante
a
Kodierte Faktoren:
1
Modellvarianz
Modellvarianz
2
Hydroperoxidgehalt
4,42
0,29
-23,17
-5,49
0
-1,15
5,44
-4,90
-8,32
1,54
52,65
2
p
0,0002
0,9126
< 0,0001
< 0,0001
< 0,0001
0,4319
0,0003
0,0001
< 0,0001
< 0,0001
Propanalgehalt
-2,25
0,37
0,70
-0,26
p
< 0,0001
0,4658
0,4629
5,78
B[-1] 50 µmol/kg ROTG, B[+1] 250 µmol/kg ROTG α-Tocopherol
C[1] 464 µmol/kg ROTG, C[2] 100 µmol/kg ROTG, C[3] 0 µmol/kg ROTG
α-Tocopherol
p < 0,0001
Lack of Fit
p = 0,1190
p = 0,0011
Lack of Fit
p = 0,3322
Bei einer α-Tocopherol-Konzentration von 100 µmol/kg ROTG kann zu jeder initialen POZ
die antioxidativ wirksamste γ-Tocopherol-Konzentration für die Inhibierung der Hydroperoxide über folgende Formel berechnet werden:
74
Ergebnisse
(3-6) Hydroperoxide (100 µmol α-Tocopherol/kg ROTG):
y=
52,65 + 4,42*(POZ[meq O2/kg ROTG]) + 0,29*(γ-TOH-Konz.[µmol/kg
ROTG]) – 5,49*(α-TOH-Konz.[µmol/kg ROTG]) – 1,15*(POZ[meq O2/kg
ROTG])2 + 5,44*(γ-TOH-Konz.[µmol/kg ROTG])2 – 4,9*(POZ[meq O2/kg
ROTG])* (γ-TOH-Konz.[µmol/kg ROTG]) + 1,54* (γ-TOH-Konz.[µmol/kg
ROTG])* (α-TOH-Konz.[µmol/kg ROTG])
Der Einfluss einer höheren α-Tocopherol-Konzentration (464 µmol/kg ROTG) läßt sich über
folgende Formel berechnen:
(3-7) Hydroperoxide (464 µmol α-Tocopherol/kg ROTG):
y=
52,65 + 4,42*(POZ[meq O2/kg ROTG]) + 0,29*(γ-TOH-Konz.[µmol/kg
ROTG]) – 23,17*(α-TOH-Konz.[µmol/kg ROTG]) – 1,15*(POZ[meq O2/kg
ROTG])2 + 5,44*(γ-TOH-Konz.[µmol/kg ROTG])2 – 4,9*(POZ[meq O2/kg
ROTG])* (γ-TOH-Konz.[µmol/kg ROTG]) – 8,32* (γ-TOH-Konz.[µmol/kg
ROTG])* (α-TOH-Konz.[µmol/kg ROTG])
Der negative Einfluss von α-Tocopherol auf die inhibierende Wirkung bei der Entstehung von
Hydroperoxiden ist deutlich in den nachfolgenden Abbildungen zu erkennen. Abb. 3.27 zeigt
den positiven inhibierenden Effekt steigender γ-Tocopherol-Konzentrationen, der mit
zunehmender initialer POZ abnimmt.
75
51
44
37
30
23
25
1178
B: γ-TOH
20
946
714
15
482
10
250
5
A: POZ
Entstehung von Hydroperoxiden nach 14 Tagen
Sobald die α-Tocopherol-Konzentration auf 100 µmol/kg ROTG angehoben wurde, ließ die
Effizient von γ-Tocopherol nach. Die Hydroperoxid-Konzentration stieg wesentlich stärker an
als in Abwesenheit von α-Tocopherol. Die Wirkung von γ-Tocopherol kehrte sich sogar um.
Die Hydroperoxid-Konzentration stieg mit steigender γ-Tocopherol-Konzentration (Abb.
3.28).
76
Ergebnisse
59
54
49
44
40
25
20
1178
946
15
714
B: γ-TOH
482
10
A: POZ
250
Abb. 3.28: Einfluss des initialen Oxidationsgrades und der γ-Tocopherol-Konzentration (γ-TOH) in
Gegenwart von α-Tocopherol in einer Konzentration von 100 µmol/kg ROTG auf die Entstehung von
Hydroperoxiden nach 14 Tagen
Ein weiteres Anheben der α-Tocopherol-Konzentration auf 464 µmol/kg ROTG ließ die
Entstehung der Hydroperoxide noch stärker ansteigen (Abb. 3.29).
94
88
82
75
69
25
1178
946
B: γ-TOH
15
714
482
10
250
5
20
A: POZ
Hydroperoxiden nach 14 Tagen
77
Die Entstehung von sekundären Oxidationsprodukten konnte nur anhand von Propanal
untersucht werden (Hexanal ist für eine Auswertung nicht genug gebildet worden). Hierbei
war eindeutig ein linearer Einfluss auf die Quadratwurzel der Propanal-Konzentration zu
erkennen. Die Konzentration an Propanal (Quadratwurzel der Konzentration) fiel geringfügig
durch die Addition von α-Tocopherol (Abb. 3.30, Abb. 3.31, Abb. 3.32) und kann über
folgende Formeln berechnet werden:
(3-8) Propanal (mit 100 µmol α-Tocopherol/kg ROTG):
y=
ROTG]) – 0,26*(α-TOH-Konz.[µmol/kg ROTG])
(3-9) Propanal (mit 464 µmol α-Tocopherol/kg ROTG):
ROTG]) + 0,7*(α-TOH-Konz.[µmol/kg ROTG])
Sqrt(Propanal [mmol/kg ROTG]
Quadratwurzel
Nach 14 Tagen + 1.46)
y=
9,1
7,8
6,5
5,2
3,9
1178
946
714
B: γ-TOH
482
250
25
20
15
10
5
A: POZ
Entstehung von Propanal nach 14 Tagen
78
Quadratwurzel
Ergebnisse
8,1
6,8
5,5
4,2
2,9
1178
946
25
20
714
B: γ-TOH
15
482
250
10
A: POZ
5
Quadratwurzel
Propanal nach 14 Tagen
8,0
6,7
5,3
4,0
2,7
1178
946
B: γ-TOH
25
20
714
15
482
10
250
A: POZ
Propanal nach 14 Tagen
79
3.1.4
Interaktion von α-Tocopherol mit Ascorbinsäure in ROTG
Zur Überprüfung der Messung von synergistischen Wirkungen wurde die Interaktion von
α-Tocopherol mit Ascorbinsäure untersucht, da eine synergistische Wirkung des Antioxidantienpaares in der Literatur beschrieben ist (z.B. PACKER ET AL., 1979; NIKI ET AL., 1984;
BENDICH ET AL., 1986; NIKI ET AL., 1991; YIN ET AL., 1993; HARATS ET AL., 1998). Diese
beiden Antioxidantien wurden ROTG in unterschiedlichen Konzentrationen zugesetzt und die
Proben dann bei 40°C im Dunkeln oxidiert. Für α-Tocopherol wurde eine Konzentration von
100 µmol/kg ROTG gewählt. Ascorbinsäure wurde in Konzentrationen von 12,5 bis
200 µmol/kg ROTG den Proben zugesetzt. Um nach der Durchführung des Versuchs einen
Synergismus nachweisen zu können, wurden ROTG-Proben mit den gewählten Antioxidantien in der jeweiligen Konzentration alleine und in Kombination mit α-Tocopherol vermessen.
Zur Darstellung der Interaktion wurden unterschiedliche Zeitpunkte der Oxidation zur
Auswertung gewählt. So wurde das Zusammenwirken von α-Tocopherol mit Ascorbinsäure
bei unterschiedlichen POZ bestimmt, um den Einfluss des oxidativen Zustandes des Systems
zu berücksichtigen. In Abb. 3.33 ist die Zeit in Tagen dargestellt, die die Proben mit
unterschiedlichen Antioxidantien und Antioxidantienkombinationen benötigten, um eine POZ
von 5 meq O2/kg ROTG zu erreichen. Es ist deutlich zu erkennen, dass Ascorbinsäure in allen
gewählten Konzentrationen in ROTG alleine, im Vergleich zur Kontrollprobe, keine
antioxidative Wirkung zeigte. Die Probe mit einer α-Tocopherol Konzentration von
100 µmol/kg ROTG verzögerte die Oxidation und benötigte ca. 5 Tage ehe sie zu einer POZ
von 5 meq O2/kg ROTG oxidiert war. Die weiß dargestellten Balken zeigen die berechnete
Zeit, die die Probe mit der jeweiligen Kombination aus α-Tocopherol und Ascorbinsäure
benötigen sollte, würde die Kombination der beiden Antioxidantien lediglich in einem
additiven Effekt resultieren. Die Kombination der beiden Antioxidantien (schwarze Balken)
führt bei jeder Ascorbinsäure-Konzentration zu einem ausgeprägten synergistischen Effekt.
Dieser Effekt vergrößert sich mit zunehmender Ascorbinsäure-Konzentration.
80
Lagerdauer bei 40°C, dunkel, bis zum
Erreichen einer POZ von 5 [Tage]
Ergebnisse
14
12,5 µmol
25 µmol
50 µmol
100 µmol
200 µmol
12
10
8
6
4
2
0
Abb. 3.33: Darstellung der Lagerdauer bis zu einer POZ von 5 meq O2/kg ROTG bei Proben mit einer αTocopherol-Konzentration (α-TOH) von 100 µmol/kg ROTG einzeln und in Kombination mit
unterschiedlichen Ascorbinsäure-Konzentrationen von 12,5 bis 200 µmol/kg ROTG. Ebenfalls dargestellt,
die berechnete Dauer der jeweiligen Antioxidantien-Kombination (bei Annahme eines additiven Effekts)
bis zum Erreichen einer POZ 5 meq O2/kg ROTG
Bei einer höheren POZ (10, 15 und 50 meq O2/kg ROTG) war bei jeder AscorbinsäureKonzentration ein Synergismus zu erkennen. Mit steigender Ascorbinsäure-Konzentration
nahm die synergistische Wirkung der Antioxidantien-Kombination tendenziell zu. Die
inhibierende Wirkung der Kombination der Antioxidantien nimmt mit steigender POZ ab
(Tab. 3.15). Ascorbinsäure allein zeigte im Vergleich zur Kontrollprobe auch bei allen
anderen POZ keinerlei antioxidative Wirkung (Abb. A.10, Abb. A.11, Abb. A.12).
Tab. 3.15: Prozentuale Steigerung der antioxidativen Wirkung der Antioxidantien-Kombination von
α-Tocopherol (α-TOH ) mit Ascorbinsäure im Vergleich zu α-Tocopherol allein, bei unterschiedlichen
POZ in ROTG [meq O2/kg ROTG]
Steigerung der inhibierenden Wirkung der Antioxidantien-Kombination im
Vergleich zu 100 µmol α-TOH/kg ROTG [%]
100 α-TOH + 12,5 µmol Ascorbinsäure
100 α-TOH + 25 µmol Ascorbinsäure
POZ 5
93,35
79,45
95,69
105,09
139,92
POZ 10
41,19
37,79
37,79
42,22
71,16
POZ 15
40,69
33,07
33,07
40,69
71,30
POZ 50
22,04
19,54
18,54
23,00
47,83
81
3.2
Bestimmung der Redoxpotenziale zur Identifizierung potenzieller
Synergisten zu α-Tocopherol
In der vorliegenden Arbeit wurde eine große Zahl an strukturell sehr unterschiedlichen
phenolischen und nicht-phenolischen Antioxidantien elektrochemisch zur Bestimmung ihrer
Redoxpotenziale untersucht. In der Literatur sind nur vereinzelte Werte zu finden, die sich
aufgrund verschiedener Messbedingungen nicht untereinander vergleichen lassen (2.2).
In dieser Arbeit sollte mit Hilfe der Goldchlorid-Titration, einer bereits 1949 zur Bestimmung
der Redoxpotenziale der Tocopherol-Derivate eingeführten Methode (WACHS, 1949), eine
Bestätigung der zur damaligen Zeit gemessenen Potenziale erfolgen. Außerdem sollten zur
Bestimmung der Redoxpotenziale zur gegenseitigen Verifizierung zwei voltammetrische
Methoden verwendet werden. Eingesetzt wurden: die Differenz-Puls-Voltammetrie, zur
Bestimmung des Halbwellenpotenzials und die Cyclovoltammetrie zur Verifizierung des
mittels Differenz-Puls-voltammetrisch bestimmten Halbwellenpotenzials und zur Bestimmung der Reversibilität der vermessenen Redoxsysteme.
3.2.1
Bestimmung der Redoxpotenziale mittels Goldchlorid-Titrimetrie
Mittels einer monotonen Titration (modifiziert nach WACHS, 1949) war es möglich, die
Redoxpotenziale der zu untersuchenden Antioxidantien in micellarer SDS-Lösung mit
Goldchlorid zu bestimmten. Um den Einfluss von Luftsauerstoff weitgehend auszuschließen,
erfolgte die Titration unter Stickstoff.
Zunächst erfolgte eine direkte Umsetzung der Methode von WACHS (1949), wodurch das
Redoxpotenzial von α-Tocopherol (0,012 mM in Ethanol/Wasser (80/20, v/v) bestimmt
wurde. Das Ergebnis von WACHS (1949) (Redoxpotenzial von α-Tocopherol: 331 mV) konnte
bestätigt werden. Für α-Tocopherol wurde ein Redoxpotenzial von 347±2 mV gegen die
Normalwasserstoffelektrode bei pH 7,0 bestimmt.
Anschließend wurde der Einfluss der einzelnen Matrixbestandteile bei Einsatz einer
micellaren SDS-Lösung auf das Titrationsergebnis untersucht. Bei Titration einer reinen
Pufferlösung (Natriumacetat, pH 5,0 – ohne SDS) zeigte sich, genauso wie bei Zugabe von
500 µL Ethanol (Lösungsmittel zur Herstellung der Antioxidantienstammlösungen), kein
Umschlagspunkt. Auch in micellarer Lösung konnten keine Umschlagspunkte nachgewiesen
werden (Tab. 3.16).
82
Ergebnisse
Tab. 3.16: Verbrauch von Goldchloridlösung bei Titration der reinen Matrix ohne Antioxidans
Matrix:
Puffer
Verbrauch an
n.A
Goldchlorid [mL]
n.A. = kein Umschlagspunkt
Puffer
+ 500 µL Ethanol
micellare
Lösung
Micellare Lösung
+ 500 µL Ethanol
n.A
n.A
n.A
Der Einfluss von Ethanol zeigte sich jedoch bei Titration einer 0,12 mmol/L Ascorbinsäurelösung. Die Zugabe von 500 µL Ethanol brachte eine Verschiebung des Umschlagspunktes von
durchschnittlich 5,65 mL auf 5,79 mL mit sich. Dieses Ergebnis zeigte deutlich die große
Matrixabhängigkeit des Potenzials (Tab. 3.17). Für die nachfolgenden Titrationen wurden
daher die Bedingungen möglichst konstant gehalten.
Tab. 3.17: Verbrauch von Goldchloridlösung bei Titration einer 0,12 mM Ascorbinsäure-Pufferlösung
Matrix:
Verbrauch an
Goldchlorid [mL]
Puffer
Puffer
+ 500 µL Ethanol
5,65
5,79
Um die Konzentrationsabhängigkeit der Redoxtitration zu zeigen, wurden micellare Lösungen
mit unterschiedlichen Konzentrationen an Ascorbinsäure (0,06, 0,12, 0,18, 0,24 mmol/L),
aber gleichbleibender Menge an Lösungsmittel, titriert und der Verbrauch an Goldchlorid
verglichen. Eine Ascorbinsäure-Konzentration von 0,06 mmol/L benötigt eine Menge von ca.
6,2 mL Goldchlorid bis zum Umschlagspunkt. Eine Erhöhung der AscorbinsäureKonzentration um jeweils 0,06 mmol/L bringt ebenfalls eine Erhöhung des Verbrauchs um ca.
6,2 mL Goldchlorid mit sich. Das Potenzial, bei dem der Umschlagspunkt liegt, ändert sich
nicht (Abb. 3.34).
.
83
-800
-700
-600
E [mV]
-500
-400
-300
-200
-100
28,8
27,0
25,2
23,4
21,6
19,8
18,0
16,2
14,4
12,6
10,8
9,0
7,2
5,4
3,6
1,8
0,0
0
Verbrauch an Goldchlorid [mL]
0,06 mmol/L
0,18 mmol/L
Abb. 3.34: Konzentrationsabhängiger Verbrauch an
Ascorbinsäurekonzentrationen von 0,06 bis 0,24 mmol/L
0,12 mmol/L
0,24 mmol/L
Goldchloridlösung
bei
unterschiedlichen
Bei der Titration von Ascorbinsäure, Butylhydroxyanisol, α- und γ-Tocopherol in einer
Konzentration von 0,12 mmol/L wurden folgende Ergebnisse erhalten (Tab. 3.18):
Ascorbinsäure zeigte ein Potenzial von -340 mV und Butylhydroxyanisol ein Potenzial von
-485 mV gegen die Pt-Titrode. Für α- und γ-Tocopherol konnten keine auswertbaren Daten
aufgenommen werden. Eine Referenzierung der Pt-Titrode in Acetat-Puffer (0,1 M, pH 4,89)
gegen eine Silber-Silberchlorid-Elektrode (197 mV gegen die Normalwasserstoffelektrode)
ergab 487 mV.
Tab. 3.18: Titrationsparameter für die Antioxidantien Butylhydroxyanisol, α- und γ-Tocopherol (α- und
γ-TOH), jeweils in einer Konzentration von 0,12 mmol/L micellarer Lösung mit dem Titrationsmittel
Goldchlorid (Normalwasserstoffelektrode = NWE)
Matrix:
Verbrauch an
Goldchlorid [mL]
E [mV]
micellare Lösung micellare Lösung
Butylhydroxyanisol
α-TOH
0,12 mmol/L
0,12 mmol/L
micellare Lösung
γ-TOH
0,12 mmol/L
11,54±0,41
n.A.
n.A.
-485±13,3
n.A.
n.A.
-485
-
-
199
-
-
0
E [mV]
gegen Pt-Titrode
0
E [mV]
gegen NWE
n.A. = nicht messbar
84
Ergebnisse
3.2.2
Vergleich des Redoxpotenzials von Butylhydroxyanisol in verschiedenen
Matrices mittels Differenz-Puls-Voltammetrie
Zur Identifizierung potenzieller Synergisten zu α-Tocopherol wurden die Redoxpotenziale
von phenolischen und nicht-phenolischen Antioxidantien bestimmt. Auf Grund der
unterschiedlichen Löslichkeiten der zu untersuchenden Substanzen wurden diese in vier
verschiedenen Lösungsmitteln bzw. Lösungen vermessen und die erhaltenen Potenziale der
Substanzen untereinander verglichen. Das mittels Differenz-Puls-Voltammetrie (DPV)
vermessene Halbwellenpotenzial der einzelnen Substanz unterschied sich deutlich in den
unterschiedlichen Lösungsmitteln. Diese Verschiebung wird beispielhaft an Butylhydroxyanisol erläutert (Abb. 3.35). Sie kann für die einzelnen Substanzen deutlich abweichen, da das
Potenzial lösungsmittelabhängig (Polarität) und in aprotischen Systemen auch pH-abhängig
ist (CONNELLY UND GEIGER, 1996). Ein saurer Analyt verändert die ihn umgebende Matrix
anders als ein neutraler Analyt. Die gemessenen Potenziale in den beiden wasserhatligen
Matrices (micellare Lösung und Emulsion) unterscheiden sich um ca. 50 mV. Das in der
wasserfreien Matrix Acetonitril gemessene Halbwellenpotenzial von Butylhydroxyanisol liegt
im Verhältnis zu den Potenzialen in wasserhaltigen Matrices klar in negativer Spannungsrichtung verschoben vor. Die als zusätzliches Hilfsmittel eingeführte Matrix Ethanol/Puffer, als
Darstellung der Emulgatorphase, zeigt ein beinahe identisches Redoxpotenzial, vergleichbar
mit dem Potenzial, das in der Emulsion gemessen wurde. Es ist zu erkennen, dass Butylhydroxyanisol in Acetonitril, micellarer Lösung und Emulsion jeweils ein Halbwellenpotenzial aufwies, in Ethanol/Puffer aber zwei Halbwellenpotenziale gemessen wurden.
85
Ethanol/Puffer
250 / 446 mV
0
Stromstärke I [µA]
-10
-20
Emulsion
245 mV
-30
micellare Lösung
194 mV
-40
Acetonitril
57 mV
-50
-1000
-500
0
500
1000
Spannung E [mV] versus NWE
Abb. 3.35: Potenzialverschiebung von Butylhydroxyanisol in unterschiedlichen Matrices
3.2.3
Redoxpotenziale von unterschiedlichen Antioxidantien in Acetonitril mittels
Eine Bestimmung der Redoxpotenziale in ROTG war wegen der Unlöslichkeit des
notwendigen Leitsalzes in dieser Matrix nicht möglich. Aus diesem Grunde wurden die
Messungen in der wasserfreien Matrix Acetonitril durchgeführt. Zur besseren Übersichtlichkeit wurden die Substanzen zur Auswertung der Halbwellenpotenziale in folgende Gruppen
eingeteilt: Tocopherole, synthetische Antioxidantien, Gallate, Flavonoide, Ascorbinsäurederivate, Pflanzenphenole, Diterpendiphenole, Hydroxyzimtsäuren und deren Ester sowie
Hydroxybenzoesäuren und nichtphenolische antioxidative Substanzen.
In Acetonitril zeigten alle Tocopherole negative Halbwellenpotenziale, wobei mit zunehmender Anzahl von Methylgruppen am aromatischen Ring die Halbwellenpotenziale negativer
wurden: α-Tocopherol (drei Methylgruppen, -181 mV gegen die Normalwasserstoffelektrode
(NWE)) > β-Tocopherol (zwei Methylgruppen, -135 mV gegen NWE) ≈ γ-Tocopherol (zwei
Methylgruppen, -125 mV gegen NWE) > δ-Tocopherol (eine Methylgruppe, -50 mV gegen
NWE). Trolox reiht sich mit -83 mV zwischen γ- und δ-Tocopherol ein (Abb. 3.36).
86
Ergebnisse
Innerhalb dieser Gruppe (Ausnahme: Trolox) führte eine geringere Zahl an Methylgruppen zu
einer positiven Potenzialverschiebung.
5
0
-5
-10
-15
-20
-25
Trolox
γ-Tocopherol
δ-Tocopherol
β-Tocopherol
α-Tocopherol
-30
-35
-40
-45
-50
-55
0
500
1000
Spannung E [mV] versus Ferrocenium/Ferrocen in Acetonitril
Abb. 3.36: Redoxpotenziale der Tocopherole in Acetonitril
3.2.4
Differenz-Puls-Voltammetrie in unterschiedlichen Matrices – Auswahl der
potentiellen Synergisten
Um die unterschiedlichen Analyte untereinander vergleichen zu können, wurden ihre
Halbwellenpotenziale nicht nur in Acetonitril (Abb. A.13 bis A.21), sondern auch in
micellarer Lösung, in Emulsion und in Ethanol/Puffer vermessen. Hierbei wurde deutlich,
dass sich die in unterschiedlichen Matrices gemessenen Potenziale stark unterschieden (Tab.
3.19).
87
Tab. 3.19: Redoxpotenziale aller vermessenen Substanzen in Acetonitril, micellarer Lösung, Emulsion
und Ethanol/Puffer vermessen gegen NWE (E1/2: Halbwellenpotenzial; Standardabweichung: Acetonitril
σ = ± 5 mV, wasserhatlige Matrices σ = ± 1 mV)
Vermessen gegen
NWE
Name
a
Acetonitril
E1/2 [mV]
micellare
b
Lösung
E1/2[mV]
b
Emulsion
E1/2 [mV]
Ethanol/Puffer
E1/2 [mV]
α-Tocopherol
-181
44
β-Tocopherol
-136
109
γ-Tocopherol
-125
109
δ-Tocopherol
-59
184
Trolox
-83
-32
-12
33
Synthetische
BHA
57
194
245
250 / 446
Antioxidantien
BHT
345
542
884
Ethoxyquin
33
53
99
Hydrochinon
93
33
68
63
Pyrogallol
171
68
13
53 / 340
TBHQ
59
-2
18
104
Gallate
Gallussäure
431
88
104 / 481
53 / 350
Methylgallat
403
94
88
48
Ethylgallat
439
68
83
38
Propylgallat
443
78
93
53
Octylgallat
439
88
93
23
Flavonoide
Catechin
297
169 / 491
154 / 491
124 / 421
Genistein
781
456 / 748
461 / 788
441 / 733
Kaempferol
255
129 / 778
134 / 773
53
Quercetin
181 / 433
68 / 783
68 / 778
-2 / 360
AscorbinsäureAscorbigen
37
543
602
602
Derivate
Ascorbinsäure
28
48 / 798
-97
Ascorbylpalmitat
581
819
-93
Pflanzenphenole
Carvacrol
491
451 / 1136 476 / 1131
441
Oleuropein
325
48
48
204
γ-Oryzanol
177 / 483
285
Tyrosol
487
442
496
466
Thymol
467
456
496
446
Diterpendiphenole
Carnosol
333
Carnosolsäure
55
63
53
59
Hydroxyzimtsäure
p-Coumarsäure
zerfällt
466
471
436
+ Ester
Chlorogensäure
391
139
129
73
Ferulasäure
314
275 / 401
285 / 421
260
Isoferulasäure
351
411
406
401
Kaffeesäure
243
94
88
63
Rosmarinsäure
-403 / 457
139
129
154
Sinapinsäure
259
174
229
124
Vinylsyringol
-9
124
73
HydroxybenzoeSyringasäure
437
290
295
275
säuren
Vanillinsäure
583
461
456
421
nicht-phenolische
Cystein
396 / 622
Antioxidantien
Glutathion
Liponsäure
55
562
537
773
Methionin
1065
1070
- = nicht messbar bzw. nicht auswertbar
a
Referenz Ferrocen weist ein Potenzial von 641 mV zur NWE auf (CONNELLY UND GEIGER, 1996; LINDE,
2006)
b
Referenz Silber/Silberchlorid Elektrode weist ein Potenzial von 197 mV zur NWE auf (RÖMPP, 1999)
TocopherolDerivate
88
b
Ergebnisse
Bei einem Vergleich der einzelnen Gruppen untereinander wurde schnell deutlich, dass die
Halbwellenpotenziale aller Tocopherole wesentlich unterhalb der Potenziale der anderen
untersuchten Verbindungen lagen. Außerdem besetzten unterschiedliche Strukturmerkmale
unterschiedliche Spannungsbereiche (dargestellt in Acetonitril): Tocopherol-Derivate
(-181 mV bis -83 mV) < Vinylsyringol (-9 mV) < Ascorbigen (37 mV) < Liponsäure =
Carnosolsäure (55 mV) < (synthetische Antioxidantien (57 mV bis 171 mV, Ausnahme
Butylhydroxyanisol) < Flavonoide (181 mV bis 781 mV) ≤ Hydroxyzimtsäuren = Carnosol
(243 mV bis 457 mV) ≤ Gallate (403 mV bis 443 mV) ≤ Pflanzenphenole (177 mV bis
491 mV, Ausnahme Ascorbigen) ≤ Hydroxybenzoesäure (437 mV bis 583 mV) < Ascorbylpalmitat (581 mV). Den Halbwellenpotenzialen der Tocopherole am nächsten kamen somit
das Sinapinsäure-Derivat Vinylsyringol und das Ascorbinsäure-Derivat Ascorbigen.
Da keine Substanz gefunden werden konnte, die ein ähnlich niedriges Halbwellenpotenzial
wie α-Tocopherol aufwies, wurden die gemessenen Verbindungen mit den geringsten
Halbwellenpotenzialen als potenzielle Synergisten ausgewählt. Für die Auswahl wurden die
Halbwellenpotenziale, gemessen in Acetonitril, herangezogen, da hier im Gegensatz zu
micellaren Lösungen und Emulsionen auch α-Tocopherol vermessen werden konnte.
Ausgewählt wurden die Substanzen Vinylsyringol (-9 mV), Ascorbigen (37 mV), Carnosolsäure (55 mV), Liponsäure (55 mV) und BHA (57 mV). Verbindungen, die ein ähnliches
Halbwellenpotenzial E1/2 (Acetonitril) von Kaffeesäure (243 mV) aufwiesen, waren Catechin
(297 mV), Kaempferol (255 mV) und Sinapinsäure (259 mV). Substanzen mit einem
ähnlichen Halbwellenpotenzial E1/2 (Acetonitril) von Ascorbinsäure/Ascorbylpalmitat
(581 mV), waren Rosmarinsäure (-403 / 457 mV), Vanillinsäure (583 mV), Tyrosol (487 mV)
und Genistein (781 mV). Zusätzlich wurde Oleuropein (48 mV) ausgewählt, da es in
Emulsion das gleiche Halbwellenpotenzial E1/2 (Acetonitril) aufwies wie Ascorbinsäure. Ein
ebenfalls ähnliches Potenzial E1/2 (Acetonitril) wies Quercetin mit 68 mV in Emulsion auf.
3.2.5
Redoxpotenziale verschiedener Antioxidantien in Acetonitril gemessen
mittels Cyclovoltammetrie
Mithilfe der Cyclovoltammetrie war es möglich zu untersuchen, ob ein Antioxidans in einem
bestimmten System durch einen Synergisten regeneriert werden kann. Ein Antioxidans, das
durch Lipidoxidationsprodukte oxidiert wurde (Oxidationspotenzial), konnte so anschließend
durch ein weiteres regenerierendes Antioxidans wieder reduziert werden (Reduktionspotenzial) und erneut in den Lipidoxidationsprozess eingreifen. Anhand des Cyclovoltammogramms
von α-Tocopherol in Acetonitril soll die Auswertung aller gemessenen Voltammogramme
beispielhaft erläutert werden. Es wurde ein anodischer Scan, (Potenzialvorschub in anodische
Richtung) zur Oxidation des gelösten Analyten angelegt, der resultierende Strom wurde
gemessen. Es wurden zunächst in positiver Spannungsrichtung mehrere kleine und ein starkes
89
Signal, das Oxidationspotenzial von α-Tocopherol in Acetonitril, erhalten. Die kleinen
Signale beruhen auf Verunreinigungen in der verwendeten Substanz (α-Tocopherol 95%). In
Acetonitril hat α-Tocopherol ein Oxidationspotenzial von 521 mV gegen Ferrocen (größter
Peak). In negativer Spannungsrichtung resultierten wiederum mehrere Signale. Das bei
415 mV markierte Signal zeigt das Reduktionspotenzial von α-Tocopherol (ermittelt über
Größe und Entfernung zum Oxidationspeak). Die weiteren Signale zeigen die Reduktionspotenziale der Verunreinigungen an (Abb. 3.37).
Aus theoretischen Überlegungen von NICHOLSON UND SHAIN (1964) weisen reversible
Systeme einen Potenzialunterschied von 58 mV bei 25 °C für einen Einelektronenübergang
auf. Systeme mit Differenzen bis zu 130 mV gelten als quasi-reversibel, größere Differenzen
weisen auf irreversible Systeme hin.
Die Potenzialdifferenz zwischen Reduktions- und Oxidationspotenzial ∆E beträgt 106 mV.
Das bedeutet für α-Tocopherol, dass es unter den gewählten experimentellen Bedingungen
(Elektrolyt: Acetonitril/[TBA][PF6], Arbeitselektrode: Platin) quasi-reversibel in Acetonitril
reagiert. Aus dem Cyclovoltammogramm lässt sich das Halbwellenpotenzial wie folgt
berechnen E1/2 = (106 mV/2) + 415 mV = 468 mV in Acetonitril (Abb. 3.37).
∆U=106 mV
30
Pox: 521 mV
Stromstärke [µA]
20
10
0
-10
-20
-2000
Pred: 415 mV
-1500
-1000
-500
0
500
1000
1500
Spannung [mV] versus ferrocenium ferrocene
Abb. 3.37: Cyclovoltammogramm für α-TOH in Acetonitril, vermessen gegen Ferrocen, als Beispiel für
ein quasi-reversibles System
Als Beispiel für ein total irreversibles System wird das Cyclovoltammogramm von
Kaffeesäure in Acetonitril im Folgenden dargestellt. Das Oxidationspotenzial von 966 mV in
90
Ergebnisse
positiver Spannungsrichtung ist deutlich zu erkennen, in negativer Spannungsrichtung
resultierte aber kein Reduktionspeak, d.h. Kaffeesäure reagiert irreversibel in Acetonitril
(Abb. 3.38).
40
30
Current[µA]
[µA]
Stromstärke
966 m V,P 60,86
µA
ox: 966 mV
C
ur
re
nt
20
10
0
-10
-20
-2000 -1500 -1000
-500
0
500
1000
1500
-2000
-1500 [m V]
-1000
-500
01000 1500
500
-2000 -1500
-500
0
500 ferrocene
Tension-1000
versus
ferrocenium
Spannung [mV] versus ferrocenium ferrocene
Abb. 3.38: Cyclovoltammogramm für Kaffeesäure in Acetonitril, vermessen gegen Ferrocen, als Beispiel
eines irreversiblen Vorgangs
In den nachfolgenden Tabellen sind die Oxidationspotenziale Epox, die Reduktionspotenziale
red
Ep , das resultierende Halbwellenpotenzial E1/2 sowie die Potenzialdifferenz ∆E und die
Reversibilität aller vermessenen Substanzen in Acetonitril Tab. 3.20, in micellarer Lösung
Tab. 3.21, in Emulsion Tab. 3.22 und in Ethanol/Puffer Tab. 3.23 angegeben.
Aus Tab. 3.20 ist zu erkennen, dass in Acetonitril alle Tocopherolderivate (nicht Trolox)
sowohl Reduktions- als auch Oxidationspotenziale aufweisen. Da diese mit Differenzen von
96 bis 120 mV bei einer Annahme von Einelektronenübergängen ein ∆E unterhalb von
130 mV aufweisen, reagieren die Tocopherole in Acetonitril quasi-reversibel. Auch
Liponsäure weist sowohl Reduktions- als auch Oxidationspotenziale auf. Da die Differenz ∆E
allerdings bei 164 mV liegt, sollte es irreversibel in Acetonitril reagieren. In Acetonitril
reagieren folglich nur die vier Tocopherol-Derivate reversibel.
91
Tab. 3.20: Potenziale (Oxidationspotenzial: Epox, Reduktionspotenzial: Epred, Halbwellenpotenzial: E1/2,
Potenzialdifferenz: ∆E) und Reversibilität aller vermessenen Substanzen in Acetonitril gegen NWE
(Standardabweichung: Acetonitril σ = ± 5 mV, wasserhatlige Matrices σ = ± 1 mV)
Vermessen
NWE
TocopherolDerivate
Name
a
Acetonitril
ox
Ep [mV]
-120
-87
-83
-1
-16
85
417
161
241
119
459
495
533
533
515
355
505 / 265
163
882
611
433
615
742
455
206
a
Acetonitril
Acetonitril
red
Ep [mV]
E1/2 [mV]
-228
-174
-183
-135
-191
-137
-121
-61
zerfällt über die Messung
zerfällt über die Messung
-44
38
-
∆E
[mV]
108
96
108
120
-
Reversibilität
Acetonitril
quasi-rev.
quasi-rev.
quasi-rev.
quasi-rev.
irrev.
irrev.
irrev.
irrev.
irrev.
irrev.
irrev.
irrev.
irrev.
irrev.
irrev.
irrev.
irrev.
irrev.
irrev.
irrev.
irrev.
irrev.
irrev.
irrev.
irrev.
irrev.
irrev.
irrev.
irrev.
irrev.
irrev.
irrev.
irrev.
irrev.
-
α-Tocopherol
β-Tocopherol
γ-Tocopherol
δ-Tocopherol
Trolox
Synthetische
BHA
Antioxidantien
BHT
Ethoxyquin
Hydrochinon
Pyrogallol
TBHQ
Gallate
Gallussäure
Methylgallat
Ethylgallat
Propylgallat
Octylgallat
Flavonoide
Catechin
Genistein
Kaempferol
Quercetin
Derivate
Ascorbinsäure
Ascorbylpalmitat
Pflanzenphenole
Carvacrol
Oleuropein
γ-Oryzanol
Tyrosol
Thymol
Diterpendiphenole
Carnosol
Carnosolsäure
Hydroxyzimtsäure
p-Coumarsäure
+ Ester
Chlorogensäure
637
Ferulasäure
431
Isoferulasäure
437
Kaffeesäure
325
Rosmarinsäure
509
Sinapinsäure
355
Vinylsyringol
526
säuren
Vanillinsäure
684
nicht-phenolische
Cystein
Antioxidantien
Glutathion
Liponsäure
120
164
Methionin
a
Referenz Ferrocen weist ein Potenzial von 641 mV zur NWE auf (CONNELLY UND GEIGER, 1996; LINDE, 2006)
c
Wert nach 1 Zyklus, nicht vermessen bis zum stabilen Zustand
92
Ergebnisse
In micellarer Lösung und in Emulsionen reagierten mit der Ausnahme von Ethoxyquin alle
Substanzen irreversibel. Ethoxyquin (Tab. 3.21, Tab. 3.22) zeigte in beiden Systemen mit einer
Differenz ∆E von 55 bzw. 60 mV ein quasi-reversibels Verhalten in micellarer Lösung bzw.
Emulsion. Für die Tocopherole (mit Ausnahme von Trolox), Ascorbylpalmitat, Vinylsyringol,
Oleuropein, γ-Oryzanol, Carnosol und die Aminosäuren konnten für micellare Lösung keine
auswertbaren Daten erzielt werden, da sie entweder in der Matrix nicht löslich waren oder
keine Potenziale gemessen werden konnten. Dies gilt ebenfalls für die Tocopherole (mit
Ausnahme von Trolox), Ascorbylpalmitat, Vinylsyringol, Butylhydroxytoluol, Catechin
Oleuropein, γ-Oryzanol, Carnosol, Carnosolsäure und die Aminosäuren Cystein und
Glutathion in Emulsionen.
93
Potenzialdifferenz: ∆E)und Reversibilität aller vermessenen Substanzen in micellarer Lösung gegen NWE
(Standardabweichung: Acetonitril σ = ± 5 mV, wasserhatlige Matrices σ = ± 1 mV)
Vermessen
NWE
Name
micellare
b
Lsg
ox
Ep [mV]
micellare
b
Lsg
red
Ep [mV]
micellare
b
Lsg
E1/2 [mV]
∆E
[mV]
Reversibilität
micellare Lsg.
α-Tocopherol
β-Tocopherol
γ-Tocopherol
δ-Tocopherol
irrev.
Trolox
53
-153 / -608
Synthetische
BHA
58 / 250
-279
irrev.
c
Antioxidantien
BHT
698
irrev.
Ethoxyquin
-108
-163
-136
55
quasi-rev.
Hydrochinon
94
-158
-32
252
irrev.
Pyrogallol
184 / 557
irrev.
TBHQ
63
-284
237
347
irrev.
Gallate
Gallussäure
139 / 537
irrev.
c
c
c
c
Methylgallat
134 / 159
68
105
91
Ethylgallat
134 / 522
irrev.
Propylgallat
134
irrev.
Octylgallat
154
irrev.
c
Flavonoide
Catechin
552
irrev.
c
Genistein
585
irrev.
c
Kaempferol
194
irrev.
Quercetin
119
irrev.
688
Derivate
Ascorbinsäure
114
irrev.
Ascorbylpalmitat
Pflanzenphenole Carvacrol
48 / 536
-370
irrev.
Oleuropein
γ-Oryzanol
c
Tyrosol
602
irrev.
Thymol
527
irrev.
DiterpenCarnosol
diphenole
Carnosolsäure
154
-304
383
458
irrev.
Hydroxyp-Coumarsäure
562
irrev.
zimtsäure
Chlorogensäure
225
-57
366
282
irrev.
+ Ester
Ferulasäure
164 / 486
irrev.
Isoferulasäure
159 / 466
irrev.
Kaffeesäure
149
-42
245
191
irrev.
Rosmarinsäure
225
-153
414
378
irrev.
Sinapinsäure
269 / 597
irrev.
Vinylsyringol
Hydroxybenzoe- Syringasäure
391
irrev.
säuren
Vanillinsäure
280 / 517 -249 / -133
irrev.
nicht-phenolische Cystein
Antioxidantien
Glutathion
Liponsäure
597
irrev.
Methionin
b
Referenz Silber/Silberchlorid-Elektrode weist ein Potenzial von 197 mV zur NWE auf (RÖMPP, 1999)
c
TocopherolDerivate
94
Ergebnisse
Potenzialdifferenz: ∆E) und Reversibilität aller vermessenen Substanzen in Emulsionen gegen NWE
(Standardabweichung: Acetonitril σ = ± 5 mV, wasserhaltige Matrices σ = ± 1 mV)
b
b
b
Emulsion
Emulsion
Emulsion
∆E
Reversibilität
ox
red
Ep [mV]
Ep [mV]
E1/2 [mV]
[mV]
Emulsion
α-Tocopherol
β-Tocopherol
γ-Tocopherol
δ-Tocopherol
Trolox
58
-224
-83
282
irrev.
Synthetische
BHA
139 / 350
-395
irrev.
Antioxidantien
BHT
Ethoxyquin
-128
-188
-158
60
quasi-rev.
Hydrochinon
53
-148
-48
201
irrev.
Pyrogallol
144 / 585
irrev.
TBHQ
84
-365
-141
449
irrev.
Gallate
Gallussäure
149 / 547
irrev.
Methylgallat
139
irrev.
Ethylgallat
204 / 527
irrev.
Propylgallat
144
irrev.
Octylgallat
154
irrev.
Flavonoide
Catechin
c
Genistein
522
irrev.
Kaempferol
214
irrev.
Quercetin
124
irrev.
693
irrev.
Derivate
Ascorbinsäure
295
irrev.
Ascorbylpalmitat
577
irrev.
Oleuropein
γ-Oryzanol
c
Tyrosol
602
irrev.
Thymol
33 / 582
irrev.
Diterpendiphenole Carnosol
Carnosolsäure
Hydroxyzimtsäure p-Coumarsäure
+ Ester
Chlorogensäure
240
-57
92
297
irrev.
Ferulasäure
179 / 451
irrev.
Isoferulasäure
144 / 456
irrev.
Kaffeesäure
159
-42
59
201
irrev.
Rosmarinsäure
219
-158
31
377
irrev.
c
c
Sinapinsäure
315 / 622
irrev.
Vinylsyringol
230 / 1013
irrev.
179 / 381
irrev.
säuren
Vanillinsäure
274 / 512
irrev.
Antioxidantien
Glutathion
Liponsäure
607
irrev.
Methionin
1203
irrev.
b
Referenz Silber/Silberchlorid-Elektrode weist ein Potenzial von 197 mV zur NWE auf (RÖMPP, 1999)
c
Vermessen
NWE
TocopherolDerivate
Name
95
Da die Tocopherole nur in Acetonitril, nicht aber in wässrigen Systemen vermessen und somit
nicht direkt mit Ascorbinsäure verglichen werden konnten, wurde als viertes System
Ethanol/Puffer eingeführt. In dieser Matrix waren sowohl lipophile als auch hydrophile
Substanzen löslich. Die Polarität von Ethanol/Puffer ähnelt der Emulgatorphase, in der die
Tocopherole solubilisiert sind. In dem Ethanol/Puffer-System konnte α-Tocopherol, nicht
aber seine Derivate, mit einer Potenzialdifferenz ∆E von 131 mV als quasi-reversibel
nachgewiesen werden. Alle anderen Substanzen, auch wenn sie Reduktions- und Oxidationspotenziale aufwiesen, zeigten ein irreversibles Verhalten.
96
Ergebnisse
Potenzialdifferenz: ∆E) und Reversibilität aller vermessenen Substanzen in Ethanol/Puffer gegen NWE
(Standardabweichung: Acetonitril σ = ± 5 mV, wasserhaltige Matrices σ = ± 1 mV)
Vermessen
NWE
Name
Ethanol/
b
Puffer
ox
Ep [mV]
Ethanol/
b
Puffer
red
Ep [mV]
Ethanol/
b
Puffer
E1/2 [mV]
∆E
[mV]
α-Tocopherol
145
14
80
131
β-Tocopherol
179 / 350
-601
γ-Tocopherol
189 / 345
-581
δ-Tocopherol
270
-526
-128
796
Trolox
164
-63
51
227
Synthetische
BHA
376 / 577 -505 / -1045
Antioxidantien
BHT
Ethoxyquin
-133 / 169
-516
Hydrochinon
144
-360
-108
504
c
c
Pyrogallol
204 / 577
TBHQ
199
-521
-161
720
Gallate
Gallussäure
129
Methylgallat
134
Ethylgallat
130
Propylgallat
144
Octylgallat
144
Flavonoide
Catechin
Genistein
844
Kaempferol
124
Quercetin
33 / 491
c
743
Derivate
Ascorbinsäure
9
-1024
-508
1033
Ascorbylpalmitat
13
109 / 547
-541
Oleuropein
355
-324
16
679
γ-Oryzanol
Tyrosol
627
c
Thymol
612
Diterpendiphenole Carnosol
Carnosolsäure
139
-476
-169
615
Hydroxyzimtsäure p-Coumarsäure
+ Ester
Chlorogensäure
230
-209
11
439
Ferulasäure
381
Isoferulasäure
184 / 537
Kaffeesäure
155
-203
-24
358
Rosmarinsäure
441
-440
1
881
Sinapinsäure
270
-546
-138
816
c
Vinylsyringol
189
425
(-290 / -541)
säuren
Vanillinsäure
265 / 617
-439 / -294
c
559
Antioxidantien
Glutathion
Liponsäure
854
Methionin
b
Referenz Silber/Silberchlorid-Elektrode weist ein Potenzial von 197 mV zur NWE auf
(RÖMPP, 1999)
c
TocopherolDerivate
Reversibilität
Ethanol/
Puffer
quasi-rev.
irrev.
irrev.
irrev.
irrev.
irrev.
irrev.
irrev.
irrev.
irrev.
irrev.
irrev.
irrev.
irrev.
irrev.
irrev.
irrev.
irrev.
irrev.
irrev.
irrev.
irrev.
irrev.
irrev.
irrev.
irrev.
irrev.
irrev.
irrev.
irrev.
irrev.
irrev.
irrev.
irrev.
irrev.
irrev.
irrev.
-
97
3.3
Bestimmung der antioxidativen Potenziale der phenolischen und
Das antioxidative Potenzial der untersuchten Verbindungen wurde mittels des stabilen
Radikals DPPH zur Bestimmung der radikalreduzierenden Eigenschaften untersucht. Die
einzelnen Substanzen wurden in einer durchschnittlichen Konzentration von 5 mg / 10 mL
Ethanol gelöst und gegebenenfalls verdünnt, damit die Anzahl reduzierter DPPH-Moleküle
innerhalb des linearen Bereichs der Kalibrierung liegt.
In Abb. 3.39 sind die radikalreduzierenden Eigenschaften der vermessenen Substanzen im
Vergleich zu den Tocopherol-Derivaten dargestellt. Die Substanzgruppe mit der höchsten
Aktivität stellen die Gallate dar, wobei die radikalreduzierende Eigenschaft nicht von der
Länge der Seitenkette abhängig ist (Gallussäure > Methylgallat > Octylgallat > Ethylgallat >
Propylgallat). Die radikalreduzierenden Eigenschaften der Gallate liegen in einem Bereich
von 3,0*1027 bis 13,4*1027 reduzierte DPPH-Moleküle pro mol/L. Es schließen sich die
Flavonoide Kaempferol mit 15,9*1027 und Quercetin mit 9,5*1027 reduzierter DPPHMoleküle pro mol/L an. Catechin zeigt nur eine sehr geringe Aktivität. Verbindungen mit
einer radikalreduzierenden Eigenschaft, die ähnlich denen der Tocopherole zwischen 3,6 bis
5,0*1027 reduzierte DPPH-Moleküle mol/L liegen, sind in der Gruppe der synthetischen
Antioxidantien, der Diterpendiphenole, der Hydroxyzimtsäuren und der Hydroxybenzoesäuren zu finden. Eine Ausnahme stellt Kaempferol dar, was 15,9*1027 DPPH-Moleküle pro
mol/L reduzieren kann. Geringes antioxidatives Potenzial weisen die Verbindungen
Hydrochinon, Catechin, Ascorbylpalmitat, Ascorbinsäure, tert-Butylhydrochinon fast alle
Pflanzenphenole (mit Ausnahme von Oleuropein und γ-Oryzanol), p-Coumarsäure,
Isoferulasäure und Vanillinsäure auf. Die nicht-phenolische Verbindung Liponsäure
reduzierte 2,6*1026 DPPH-Moleküle pro mol/L.
98
Ergebnisse
Anzahl reduzierter DPPH Moleküle/
mol Analyt pro Liter x 10E24
18000
16000
14000
Tocopherolderivate
synthetische
Antioxidantien
Gallate
Flavonoide
Pflanzenphenole
Diterpendiphenole
Hydroxyzimtsäuren und
Ester
Hydroxy- Ascorbinbenzoesäuresäuren
derivate
nicht
nicht
phenophelische
nolischeAO
AO
12000
10000
8000
6000
4000
2000
0
Abb. 3.39: Antioxidative Potenziale der in dieser Arbeit verwendeten potenziellen Synergisten in Ethanol mittels DPPH-Analyse, dargestellt in Anzahl reduzierter
DPPH Moleküle pro 10 mg Analyt/L. Die nicht-phenolischen Verbindungen Cystein, Methionin und Glutathion waren nicht in Ethanol löslich. (Tocopherol: TOH,
Butylhydroxyanisol: BHA, Butylhydroxytoluol: BHT, tert-Butylhydrochinon: TBHQ)
3.4
Interaktionen von phenolischen und nicht-phenolischen
Antioxidantien mit α-Tocopherol in verschiedenen
lipidhaltigen Modellsystemen
Anhand der gemessenen Redoxpotenziale wurden potenzielle Synergisten zu α-Tocopherol
ausgewählt. Anschließend sollten diese in Oxidationstests in verschiedenen lipidhaltigen
Modellsystemen überprüft werden. Hierfür wurden zwei unterschiedliche Matrices
verwendet: zum einen ein unpolares System (ROTG) und zum anderen ein polares System
(eine 0,33 molare SDS-Emulsion mit 10 % ROTG in Natriumacetat-Puffer pH 5,0). Zu diesen
Systemen wurde α-Tocopherol in zwei Konzentrationen zugegeben: 25 µmol/kg Öl und
500 µmol/kg Öl (eine in Rapsöl übliche Konzentration). Die potenziellen Synergisten wurden
in vier unterschiedlichen Konzentrationen von 50, 125, 250 und 500 µmol/kg Öl eingesetzt.
Die Beobachtung des Oxidationsverlaufs erfolgte über die Bestimmung der primären
Oxidationsprodukte (Hydroperoxide), über die Bestimmung der sekundären Oxidationsprodukte (Propanal und Hexanal) sowie über den Abbau von α-Tocopherol und von phenolischen
Verbindungen.
3.4.1
Interaktionen phenolischer und nicht-phenolischer Antioxidantien mit
Als phenolische und nicht-phenolische Substanzen wurden Ascorbigen, Butylhydroxyanisol,
Carnosolsäure, Catechin, Genistein, Kaempferol, Kaffeesäure, Liponsäure, Oleuropein,
Quercetin, Rosmarinsäure, Sinapinsäure, Tyrosol, Vanillinsäure und Vinylsyringol in
Konzentrationen von 50 bis 500 µmol/kg ROTG getestet. Die Antioxidantien wurden ROTG
in Abwesenheit und Anwesenheit von α-Tocopherol (25 und 500 µmol/kg) zugesetzt.
Zur Überprüfung der folgenden Hypothese (PEYRAT-MAIILARD ET AL., 2003) wurde die
antioxidative Wirkung von diesen phenolischen und nicht-phenolischen Antioxidantien
bestimmt: Der Einsatz einer Substanz zu α-Tocopherol ist nur dann sinnvoll, wenn sie eine
geringere antioxidative Wirkung aufweist als α-Tocopherol, denn nur dann kann durch eine
Interaktion ein Synergismus entstehen. Wird also ein stärkeres Antioxidans durch ein
schwächeres regeneriert, bleibt die Wirkung des stärkeren länger erhalten. Wird aber ein
schwächeres Antioxidans durch ein stärkeres regeneriert, geht die Wirkung des stärkeren
Antioxidans durch die Regeneration verloren und nur die antioxidative Wirkung des
schwächeren Antioxidans bleibt für die Inhibierung der Lipidoxidation erhalten.
Der Zeitpunkt während der Oxidation zur Berechnung der Inhibierungen der einzelnen
Antioxidantien wurde so gewählt, dass die Oxidation möglichst fortgeschritten war, sich aber
100
Ergebnisse
noch alle der zu untersuchenden Proben in der Induktionsphase befanden. Anhand der in
ROTG berechneten Inhibierungen der Hydroperoxide nach 10 Tagen, Propanal und Hexanal
nach 14 Tagen Oxidation - dargestellt für eine Antioxidantien-Konzentration von
500 µmol/kg ROTG (Abb. 3.40) - ist deutlich zu erkennen, dass die Substanzen Ascorbigen,
Liponsäure, Tyrosol und Vanillinsäure in ROTG keine starke inhibierende Wirkung zeigten.
Sie lag bei allen Substanzen unter 30 %, bezogen auf die Hydroperoxidbildung in der
Kontrollprobe. Bei den sekundären Oxidationsprodukten zeigte sich für Genistein, Liponsäure
und Vanillinsäure eine prooxidierende Wirkung. Tyrosol verursachte nur eine geringfügige
Inhibierung von primären Oxidationsprodukten, hingegen wurde die Bildung sekundärer
Oxidationsprodukte stark inhibiert. Genistein und Kaempferol zeigten mittlere inhibierende
Wirkung bei der Entstehung von Hydroperoxiden, keine oder nur kaum eine Wirkung für
Propanal, aber sehr ausgeprägte inhibierende Wirkung bei der Entstehung von Hexanal. Alle
anderen Substanzen zeigten ähnliche antioxidative Wirkungen wie α-Tocopherol (Abb. 3.40).
110
70
50
30
Hydroperoxide
Propanal
Vinylsyringol
Vanillinsäure
Thyrosol
alpah-Tocopherol
-70
Sinapinsäure
Rosmarinsäure
Quercetin
Oleuropein
Liponsäure
Kaffeesäure
Genistein
Kaempferol
-50
Catechin
-30
Carnosolsäure
-10
BHA
10
Ascorbigen
Inhibierung [%]
90
Hexanal
Abb. 3.40: Inhibierung aller phenolischen und nicht-phenolischen Substanzen in einer Konzentration von
500 µmol/kg ROTG, berechnet aus der Entstehung der Hydroperoxide nach 10 Tagen Oxidation,
Propanal und Hexanal nach 14 Tagen
101
3.4.2
Konzentrationsabhängige Inhibierungen von phenolischen und nichtphenolischen Substanzen in ROTG
Da die inhibierende Wirkung der Substanzen konzentrationsabhängig sein kann, wurden
weitere Konzentrationen in einem Bereich von 50, 125, 250 und 500 µmol/kg ROTG
ausgetestet. Es zeigte sich, dass mit Ausnahme von Tyrosol eine steigende Konzentration eine
steigende inhibierende Wirkung bei der Entstehung von Hydroperoxiden mit sich brachte. Bei
Tyrosol war die inhibierende Wirkung bei allen Konzentrationen gleichbleibend.
Die Inhibierung von sekundären Oxidationsprodukten zeigte in den meisten Fällen keine
konzentrationsabhängige Wirkung, aber eine 100 %-ige Inhibierung. Im Fall Kaempferol war
jedoch ein prooxidativer Effekt in geringen Konzentrationen zu erkennen, während höhere
Konzentrationen zu einer Wirkungsumkehr führten. Für Genistein und Liponsäure kehrte sich
dieses Bild um, hier war die Inhibierung stärker bei geringen Substanz-Konzentrationen und
wurde geringer mit steigender Konzentration. Für Vanillinsäure war bei der Inhibierung der
Bildung sekundärer Oxidationsprodukte kein Trend zu erkennen.
α-Tocopherol zeigte in geringer Konzentration eine stärkere Inhibierung der Hydroperoxide
im Vergleich zu einer hohen Konzentration. Bei der Inhibierung sekundärer Oxidationsprodukte zeigten allerdings die Proben mit einer α-Tocopherol-Konzentration von 500 µmol/kg
ROTG den größeren Effekt. Eine geringere antioxidative Wirkung als α-Tocopherol (bezogen
auf beide Konzentrationen) zeigten Ascorbigen, Butylhydroxyanisol (nur in geringer
Konzentration), Genistein, Kaempferol, Liponsäure, Oleuropein (nicht in höchster
Konzentration), Sinapinsäure (nur in geringen Konzentrationen), Tyrosol, Vanillinsäure und
Vinylsyringol (nur in niedriger Konzentration).
Tab. 3.24: Darstellung der konzentrationsabhängigen Inhibierung aller phenolischen und nichtphenolischen Antioxidantien, berechnet aus der Entstehung der Hydroperoxide nach 10 Tagen, Propanal
und Hexanal nach 14 Tagen (3.4.1) (Standardabweichung: σ)
α-TOH
Ascorbigen
Butylhydroxyanisol
Carnosolsäure
Catechin
102
Konz.
µmol/kg
ROTG
Hydroperoxid
Inhibierung
[%]
25
500
50
125
250
500
50
125
250
500
50
125
250
500
50
125
97,48
87,32
8,03
11,33
31,63
25,22
76,30
90,96
96,81
96,34
100,00
100,00
100,00
100,00
92,60
100,00
σ [%]
0,21
1,21
16,34
10,18
0,35
11,86
0,37
3,16
0,66
0,13
0,00
0,00
0,00
0,00
0,22
0,19
Propanal
Inhibierung
[%]
65,60
95,25
-9,78
5,72
79,31
7,82
31,05
81,15
88,66
91,32
99,85
99,93
92,84
93,40
88,56
92,62
σ [%]
2,47
n.a.
15,62
n.a.
0,92
n.a.
9,35
2,40
0,36
0,68
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
Hexanal
Inhibierung
[%]
99,77
100
-19,47
10,05
95,24
15,96
36,89
100,00
100,00
100,00
100,00
100,00
84,96
100,00
100,00
100,00
σ [%]
0,32
n.a.
38,47
n.a.
0,80
n.a.
4,16
0,00
0,00
0,00
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
Ergebnisse
Genistein
Kaempferol
Kaffeesäure
Liponsäure
Oleuropein
Quercetin
Rosmarinsäure
Sinapinsäure
Thyrosol
Vanillinsäure
Vinylsyringol
Konz.
µmol/kg
ROTG
Hydroperoxid
Inhibierung
[%]
250
500
50
125
250
500
50
125
250
500
50
125
250
500
50
125
250
500
50
125
250
500
50
125
250
500
50
125
250
500
50
125
250
500
50
125
250
500
50
125
250
500
50
125
250
500
100,00
100,00
-16,51
20,54
29,00
40,11
n.a.
n.a.
n.a.
76,11
97,49
100,00
100,00
100,00
-6,38
5,93
0,07
4,45
40,89
61,26
73,36
90,45
91,25
98,87
100,00
100,00
98,67
100,00
100,00
100,00
56,32
88,37
97,87
100,00
17,93
16,13
15,44
19,89
-1,65
11,90
9,88
20,82
81,79
96,93
99,97
100,00
σ [%]
0,27
0,22
20,93
8,45
4,37
9,57
n.a.
n.a.
n.a.
2,04
0,33
0,40
0,53
0,62
16,44
0,04
6,85
9,51
2,22
4,57
1,93
0,04
2,69
0,27
0,28
0,16
0,30
0,00
0,00
0,00
4,14
0,85
0,48
0,00
1,86
9,15
9,43
7,37
3,07
51,52
5,65
10,36
0,35
0,17
0,04
0,00
Propanal
Inhibierung
[%]
96,39
100,00
38,92
7,70
-31,68
-19,94
-211,17
-134,66
-19,64
16,38
87,93
96,94
97,86
99,06
1,24
-7,49
-10,92
-16,94
38,64
28,16
70,40
61,14
70,60
91,30
95,86
98,85
95,05
92,95
100,00
99,85
49,83
82,72
91,33
94,96
100,00
100,00
100,00
100,00
-7,67
-58,94
-39,10
5,95
100,00
100,00
100,00
100,00
σ [%]
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
0,17
10,07
9,13
n.a.
0,35
0,13
0,00
0,05
6,53
18,71
12,38
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
0,06
0,05
0,08
0,10
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
0,04
0,03
0,04
0,18
Hexanal
Inhibierung
[%]
100,00
100,00
100,00
94,84
39,24
79,08
-788,07
-406,63
-212,10
100,00
100,00
100,00
100,00
100,00
-9,67
-37,62
-46,08
-27,07
35,49
-11,31
83,30
100,00
100,00
100,00
100,00
100,00
100,00
100,00
100,00
100,00
88,26
100,00
100,00
100,00
100,00
100,00
100,00
100,00
-24,77
-343,25
-49,24
-65,14
100,00
100,00
100,00
100,00
σ [%]
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
4,49
12,99
12,65
n.a.
0,00
0,00
0,00
0,00
29,92
15,53
27,88
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
0,32
0,29
0,42
0,55
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
0,20
0,15
0,20
1,03
n.a. = nicht analysiert
103
3.4.3
Interaktionen von α-Tocopherol mit Ascorbigen in ROTG
3.4.3.1
Interaktion von α-Tocopherol mit Ascorbigen in ROTG bei einer POZ von
5 meq O2/kg ROTG
Exemplarisch wird im Folgenden die konzentrationsabhängige Interaktion von unterschiedlichen Konzentrationen an Ascorbigen (50 bis 500 µmol/kg ROTG) mit α-Tocopherol (25 und
500 µmol/kg ROTG) in ROTG in einem Balkendiagramm dargestellt. Gezeigt wird die
Lagerdauer (bei 40 °C im Dunkeln), die von den unterschiedlichen Proben bis zum Erreichen
Lagerdauer bis zum Erreichen
einer POZ von 5 [Tage]
einer POZ von 5 meq O2/kg ROTG benötigt wurde. Eine additive Wirkung ergäbe sich, wäre
die gemessene Wirkung von Ascorbigen in Kombination mit α-Tocopherol genauso groß wie
die berechnete Summe aus den Einzelwirkungen der beiden Antioxidantien. Ein Synergismus
ergäbe sich, wäre die reale Wirkung der Kombination größer als die berechnete Wirkung. In
Abb. 3.41 ist ein Antagonismus für eine Konzentration von 25 µmol/kg ROTG α-Tocopherol
mit allen Konzentrationen an Ascorbigen von 50 bis 500 µmol/kg ROTG zu erkennen, da die
reale Wirkung der Kombination der beiden Antioxidantien immer niedriger war als die
berechnete Summe der Einzelwirkungen der Antioxidantien. Ascorbigen allein war in allen
gewählten Konzentrationen ein wesentlich schwächeres Antioxidans in ROTG als
α-Tocopherol.
14
12
10
8
6
4
2
0
Abb. 3.41: Lagerdauer bis zum Erreichen einer POZ von 5 meq O2/kg ROTG [Tage] bei ROTG-Proben
mit einer α-Tocopherol-Konzentration (α-TOH) von 25 µmol/kg ROTG mit und ohne Ascorbigen (AG) in
einer Konzentration von 50, 125, 250 und 500 µmol/kg ROTG und die berechnete Lagerdauer bei
additiver Wirkung der beiden Antioxidantien in Kombination (Standardabweichung α-Tocopherol:
σ = ±1,52)
kalkulierte additive Wirkung
104
Ergebnisse
Durch Erhöhung der α-Tocopherol-Konzentration auf 500 µmol/kg ROTG veränderten sich
die Lagerstabilitäten der Proben stark. Alle Kombinationen von α-Tocopherol mit Ascorbigen
zeigten synergistische Wirkung, da alle real gemessenen Kombinationen länger bis zum
Erreichen einer POZ von 5 meq O2/kg ROTG benötigten als die berechnete Dauer der
Kombination der Einzelwirkungen. Zusätzlich war eine Konzentrationsabhängigkeit zu
beobachten. Mit steigender Ascorbigen-Konzentration stieg auch die synergistische Wirkung
(Abb. 3.42).
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
Abb. 3.42: Lagerdauer bis zum Erreichen einer POZ von 5 meq O2/kg ROTG [Tage] bei ROTG-Proben
mit einer α-Tocopherol-Konzentration (α-TOH) von 500 µmol/kg ROTG mit und ohne Ascorbigen (AG)
in einer Konzentration von 50, 125, 250 und 500 µmol/kg ROTG und die berechnete Lagerdauer bei
additiver Wirkung der beiden Antioxidantien in Kombination (Standardabweichung α-Tocopherol:
σ = ±1,52)
3.4.3.2
Interaktion von α-Tocopherol mit Ascorbigen in ROTG bei unterschiedlichen
Oxidationsstadien
Ein weiterer wichtiger Einflussfaktor neben der Konzentration war die POZ, bei der die
Interaktionen untersucht wurden. Bei zusätzlicher Betrachtung der POZ 10 und 25 meq O2/kg
ROTG wurde deutlich, dass in jedem Fall eine α-Tocopherol-Konzentration von 25 µmol/kg
ROTG eine effizientere antioxidative Wirkung zeigte als 500 µmol/kg ROTG. In keinem Fall
konnte eine synergistische Wirkung von Ascorbigen mit einer α-Tocopherol-Konzentration
von 25 µmol/kg ROTG festgestellt werden, es war im Gegenteil eine antagonistische
Wirkung zu erkennen. Bei einer hohen α-Tocopherol-Konzentration von 500 µmol/kg ROTG
105
zeigte sich aber bei einer POZ von 5 meq O2/kg ROTG für alle Ascorbigen-Konzentrationen
eine synergistische Wirkung. Für eine POZ von 10 meq O2/kg ROTG konnte nur noch für
eine Ascorbigen-Konzentration 500 µmol/kg ROTG eine synergistische Wirkung gefunden
werden. Für eine POZ von 25 meq O2/kg ROTG konnte für 250 und 500 µmol/kg ROTG eine
synergistische Wirkung identifiziert werden. Bei niedrigeren Ascorbigen-Konzentrationen
zeigte sich sogar eine antagonistische Wirkung. Insgesamt wurde festgestellt, dass mit
zunehmender α-Tocopherol-Konzentration und mit steigender Ascorbigen-Konzentration die
synergistische Wirkung stieg, dass aber mit steigender POZ, d.h. mit steigender Lagerdauer,
die synergistische Wirkung abnahm und somit nur noch in einem additiven Effekt oder sogar
in einer antagonistischen Wirkung resultierte (Tab. 3.25).
Tab. 3.25: Lagerdauer (Tage) von α-Tocopherolproben (α-TOH) mit einer Konzentration von 25 bzw.
500 µmol/kg ROTG, mit Ascorbigen (AG) in einer Konzentration von 50 bis 500 µmol/kg ROTG bis zum
Erreichen der POZ 5, 10 und 25 meq O2/kg ROTG. Zusätzlich dargestellt: die Differenz zwischen
berechneter und tatsächlich gemessener Dauer bis zum Erreichen der entsprechenden POZ, +∆ entspricht
einer synergistischen, –∆ einer antagonistischen Interaktion (Standardabweichung α-Tocopherol:
σ = ±1,52)
Antioxidanszusätze
[µmol/kg ROTG]:
POZ 5
[Tage]
POZ 10
[Tage]
POZ 25
[Tage]
Kontrolle
25 α-TOH
500 α-TOH
50 AG
125 AG
250 AG
500 AG
Berechnet 25 α-TOH + 50 AG
25 α-TOH + 50 AG
25 α-TOH + 125 AG
25 α-TOH + 250 AG
25 α-TOH + 500 AG
500 α-TOH + 50 AG
500 α-TOH + 125 AG
500 α-TOH + 250 AG
500 α-TOH + 500 AG
0,77
10,90
5,09
0,92
0,77
0,82
0,77
11,82
11,66
11,71
11,66
6,01
5,86
5,91
5,86
11,56
11,10
10,79
11,00
6,71
7,92
8,15
9,07
1,06
12,65
8,75
1,47
1,77
1,65
1,15
14,13
14,42
14,31
13,81
10,23
10,52
10,41
9,90
13,98
12,77
12,33
12,33
9,43
10,71
10,88
12,86
2,66
15,04
15,00
3,60
4,82
4,10
2,88
18,63
19,86
19,14
17,91
18,60
19,82
19,10
17,88
15,61
14,93
14,64
14,64
14,38
15,63
18,13
20,83
106
Synergismus [Tage]
∆POZ 5
∆POZ 10 ∆POZ 25
-0,26
-0,56
-0,92
-0,66
+0,70
+2,06
+2,24
+3,21
-0,15
-1,65
-1,98
-1,48
-0,80
+0,19
+0,47
+2,96
-3,02
-4,93
-4,50
-3,27
-4,22
-4,19
-0,97
+2,95
Ergebnisse
3.4.4
Substanzen in ROTG bei unterschiedlichen Oxidationsstadien
Für eine Kombination von α-Tocopherol mit dem synthetischen Antioxidans Butylhydroxyanisol konnte für keine α-Tocopherol-Konzentration, keine ButylhydroxyanisolKonzentration und keine POZ eine synergistische Wirkung gefunden werden. Jegliche
Kombinationen von Butylhydroxyanisol mit α-Tocopherol resultierten in antagonistischen
Wirkungen. Dennoch ist Butylhydroxyanisol allein mit steigender Konzentration ein sehr
effektives Antioxidans in ROTG (Tab. 3.26).
500 µmol/kg ROTG, mit Butylhydroxyanisol (BHA) in einer Konzentration von 50 bis 500 µmol/kg
ROTG bis zum Erreichen der POZ 5, 10 und 25 meq O2/kg ROTG. Zusätzlich dargestellt: die Differenz
zwischen berechneter und tatsächlich gemessener Dauer bis zum Erreichen der entprechenden POZ, +∆
entspricht einer synergistischen, –∆ einer antagonistischen Interaktion (Standardabweichung αTocopherol:
σ = ±1,52)
Antioxidanszusätze
[µmol/kg ROTG]:
Kontrolle
25 α-TOH
500 α-TOH
50 BHA
125 BHA
250 BHA
500 BHA
Berechnet 25 α-TOH + 50 BHA
25 α-TOH + 50 BHA
25 α-TOH + 125 BHA
25 α-TOH + 250 BHA
25 α-TOH + 500 BHA
500 α-TOH + 50 BHA
500 α-TOH + 125 BHA
500 α-TOH + 250 BHA
500 α-TOH + 500 BHA
POZ 5
[Tage]
POZ 10
[Tage]
POZ 25
[Tage]
0,77
10,89
1,68
4,30
8,51
12,94
12,94
15,19
19,40
23,83
23,83
15,19
19,40
23,83
23,83
12,77
14,34
15,74
15,40
5,94
6,95
6,28
5,98
1,10
12,53
8,74
7,38
10,42
15,78
17,05
19,92
22,95
28,31
29,58
16,13
19,17
24,52
25,79
15,78
17,76
18,65
19,41
9,05
9,30
9,50
9,60
2,68
15,07
16,68
14,23
14,79
21,83
28,45
29,30
29,86
36,90
43,52
30,91
31,47
38,51
45,13
18,45
21,83
24,23
30,42
15,48
15,58
16,54
16,73
Synergismus [Tage]
∆POZ 5
∆POZ 10
∆POZ 25
-2,42
-5,06
-8,09
-8,43
-9,25
-12,45
-17,55
-17,85
-4,14
-5,19
-9,66
-10,17
-7,08
-9,87
-15,02
-16,19
-10,85
-8,03
-12,67
-13,10
-15,43
-15,89
-21,97
-28,40
Carnosolsäure war ein effektives Antioxidans in ROTG. Seine Wirkung nahm mit steigender
Konzentration zu. So benötigte eine Probe mit einer Konzentration von 50 µmol/kg ROTG
fast 23 Tage bis zum Erreichen einer POZ von 5 meq O2/kg ROTG, bei einer Konzentration
von 250 µmol/kg ROTG waren es schon 80 Tage. Eine Kombination mit α-Tocopherol führte
107
allerdings nur bedingt zu einer verbesserten Lagerstabilität der Proben. Bei geringen
α-Tocopherol-Konzentrationen und geringen Carnosolsäure-Konzentrationen war ein
additiver Effekt zu beobachten. Bei niedriger α-Tocopherol-Konzentration und hoher
Carnosolsäure-Konzentration (500 µmol/kg ROTG) war ein deutlicher synergistischer Effekt
zu erkennen. Mit steigender Carnosolsäure-Konzentration und mit steigender α-TocopherolKonzentration resultierte ein antagonistischer Effekt (Tab. 3.27).
500 µmol/kg ROTG, mit Carnosolsäure (CS) in einer Konzentration von 50 bis 500 µmol/kg ROTG bis
zum Erreichen der POZ 5, 10 und 25 meq O2/kg ROTG. Zusätzlich dargestellt: die Differenz zwischen
σ = ±1,52)
Antioxidanszusätze
[µmol/kg ROTG]:
Kontrolle
25 α-TOH
500 α-TOH
50 CS
125 CS
250 CS
500 CS
Berechnet 25 α-TOH + 50 CS
25 α-TOH + 50 CS
25 α-TOH + 125 CS
25 α-TOH + 250 CS
25 α-TOH + 500 CS
500 α-TOH + 50 CS
500 α-TOH + 125 CS
500 α-TOH + 250 CS
500 α-TOH + 500 CS
108
POZ 5
[Tage]
POZ 10
[Tage]
POZ 25
[Tage]
1,15
9,62
8,85
22,88
47,31
80,00
57,31
32,50
56,92
89,62
66,92
31,73
56,15
88,85
66,15
39,42
47,31
79,04
76,92
18,08
22,88
37,31
42,31
2,67
12,53
12,53
29,87
52,27
90,13
65,87
42,40
64,80
102,67
78,40
42,40
64,80
102,67
78,40
44,80
54,13
88,00
98,67
23,20
28,27
50,40
58,67
6,32
16,32
20,53
33,42
57,37
n.a.
99,21
49,74
73,68
n.a.
115,53
53,95
77,89
n.a.
119,74
49,74
56,84
n.a.
n.a.
29,47
41,05
66,32
88,68
Synergismus [Tage]
∆POZ 5
∆POZ 10
∆POZ 25
6,92
-9,61
-10,58
10,00
-13,65
-33,27
-51,54
-23,84
2,40
-10,67
-14,67
20,27
-19,20
-36,53
-52,27
-19,73
0,00
-16,84
n.a.
n.a.
-24,48
-36,84
n.a.
-31,06
Ergebnisse
Catechin zeigte eine sehr gute antioxidative Wirkung in ROTG, welche mit steigender
Catechin-Konzentration zunahm. So konnte für Catechin in einer Konzentration von
500 µmol/kg ROTG im Vergleich zu der entsprechenden α-Tocopherol-Probe eine bessere
antioxidative Wirkung gefunden werden. Durch eine Kombination mit α-Tocopherol konnte
allerdings keine positive Interaktion im Hinblick auf die inhibierende Wirkung identifiziert
werden. Eine Addition von einer α-Tocopherol-Konzentration von 25 µmol/kg Emulsion
führte meist zu additiven Effekten bei allen POZ. Dennoch stieg die Lagerdauer mit
steigender Catechin-Konzentration an. In jedem Fall führte eine Addition einer α-TocopherolKonzentration von 500 µmol/kg ROTG zu einer antagonistischen Wirkung. Die Lagerdauer
aller Proben lag wenig oberhalb der Lagerdauer der reinen α-Tocopherol-Proben. Zusätzlich
konnte kein konzentrationsabhängiger Effekt von Catechin gefunden werden.
500 µmol/kg ROTG, mit Catechin (CA) in einer Konzentration von 50 bis 500 µmol/kg ROTG bis zum
σ = ±1,52)
Antioxidanszusätze
[µmol/kg ROTG]:
Kontrolle
25 α-TOH
500 α-TOH
50 CA
125 CA
250 CA
500 CA
Berechnet 25 α-TOH + 50 CA
25 α-TOH + 50 CA
25 α-TOH + 125 CA
25 α-TOH + 250 CA
25 α-TOH + 500 CA
500 α-TOH + 50 CA
500 α-TOH + 125 CA
500 α-TOH + 250 CA
500 α-TOH + 500 CA
POZ 5
[Tage]
0,77
10,51
7,12
7,88
18,65
25,29
41,73
18,40
29,17
35,80
52,24
15,00
25,77
32,40
48,85
15,90
21,20
32,31
36,07
7,98
14,69
8,46
9,33
POZ 10
[Tage]
0,95
12,15
8,48
9,71
22,86
32,38
44,00
21,87
35,01
44,53
56,15
18,19
31,33
40,86
52,48
19,24
30,38
43,54
45,32
11,62
12,95
14,19
14,95
POZ 25
[Tage]
2,50
15,77
16,92
14,42
33,08
39,23
n.a.
30,19
48,85
55,00
n.a.
31,35
50,00
56,15
n.a.
22,56
34,62
56,67
56,67
27,31
22,88
23,65
27,31
Synergismus [Tage]
∆POZ 5
∆POZ 10
∆POZ 25
-2,50
-7,97
-3,49
-16,17
-7,02
-11,08
-23,94
-39,52
-2,63
-4,63
-0,99
-10,83
-6,57
-18,38
-26,67
-37,53
-7,63
-14,23
1,67
n.a.
-4,04
-27,12
-32,50
n.a.
109
Genistein, ein Flavonoid wie Catechin, zeigte im Unterschied dazu in jeder Konzentration
kaum eine antioxidative Wirkung in ROTG. Eine Kombination mit α-Tocopherol resultierte
in allen Konzentrationen und bei allen POZ lediglich in additiven oder leicht antagonistischen
Effekten. Die Lagerdauer der Proben mit Antioxidantien-Kombination war bis zum Erreichen
der entsprechenden POZ immer ein wenig kürzer als die berechnete Summe der Lagerdauer
der Einzelsubstanzen. Zudem konnte keine Konzentrationsabhängigkeit identifiziert werden
(Tab. 3.29).
500 µmol/kg ROTG, mit Geinstein (GE) in einer Konzentration von 50 bis 500 µmol/kg ROTG bis zum
σ = ±1,52)
Antioxidanszusätze
[µmol/kg ROTG]:
Kontrolle
25 α-TOH
500 α-TOH
50 GE
125 GE
250 GE
500 GE
Berechnet 25 α-TOH + 50 GE
25 α-TOH + 50 GE
25 α-TOH + 125 GE
25 α-TOH + 250 GE
25 α-TOH + 500 GE
500 α-TOH + 50 GE
500 α-TOH + 125 GE
500 α-TOH + 250 GE
500 α-TOH + 500 GE
110
POZ 5
[Tage]
0,77
10,56
7,09
0,77
0,77
0,77
0,77
11,32
11,32
11,32
11,32
7,85
7,85
7,85
7,85
10,44
10,17
10,11
10,22
6,77
7,74
7,51
7,19
POZ 10
[Tage]
1,00
12,16
8,50
1,18
1,24
1,12
1,53
13,34
13,40
13,29
13,70
9,68
9,73
9,62
10,03
11,51
10,90
10,99
10,85
8,38
11,86
10,03
9,91
POZ 25
[Tage]
2,44
15,79
21,17
3,00
3,19
2,91
3,85
18,79
18,98
18,70
19,64
24,18
24,37
24,08
25,02
14,13
12,81
13,74
12,77
17,37
21,03
20,19
19,15
Synergismus [Tage]
∆POZ 5
∆POZ 10
∆POZ 25
-0,88
-1,15
-1,21
-1,10
-1,08
-0,11
-0,34
-0,66
-1,83
-2,50
-2,30
-2,85
-1,30
2,13
0,41
-0,12
-4,66
-6,17
-4,96
-6,87
-6,81
-3,34
-3,89
-5,87
Ergebnisse
Im Vergleich zu Genistein zeigte Kaempferol eine wesentlich stärkere konzentrationsabhängige antioxidative Wirkung in ROTG. Aber auch bei diesem Flavonoid zeigte sich in
Kombination mit α-Tocopherol keine synergistische Wirkung. Bei einer geringen
α-Tocopherol-Konzentration resultierte jede addierte Konzentration an Kaempferol in einer
antagonistischen Wirkung (Ausnahme: 25 µmol α-Tocopherol/kg ROTG + 500 µmol
Kaempferol/kg ROTG). Eine Konzentrationsabhängigkeit konnte aufgrund der stark
schwankenden Ergebnisse nicht eindeutig ausgemacht werden. Bei hoher α-TocopherolKonzentration konnte trotz steigender Kaempferol-Konzentration nur eine gleichbleibende
antioxidative Wirkung der Antioxidantien-Kombination gefunden werden (Tab. 3.30).
500 µmol/kg ROTG, mit Kaempferol (KP) in einer Konzentration von 50 bis 500 µmol/kg ROTG bis zum
σ = ±1,52)
Antioxidanszusätze
[µmol/kg ROTG]:
Kontrolle
25 α-TOH
500 α-TOH
50 KP
125 KP
250 KP
500 KP
Berechnet 25 α-TOH + 50 KP
25 α-TOH + 50 KP
25 α-TOH + 125 KP
25 α-TOH + 250 KP
25 α-TOH + 500 KP
500 α-TOH + 50 KP
500 α-TOH + 125 KP
500 α-TOH + 250 KP
500 α-TOH + 500 KP
POZ 5
[Tage]
0,75
10,54
7,09
17,76
17,76
18,06
3,13
28,30
28,30
28,60
13,67
24,85
24,85
25,15
10,22
12,15
10,57
12,80
12,95
22,69
22,39
22,39
7,46
POZ 10
[Tage]
0,99
12,24
8,46
18,57
18,68
19,07
6,26
30,81
30,92
31,31
18,51
27,03
27,14
27,53
14,73
14,49
15,49
21,32
21,32
25,38
9,95
25,60
25,60
POZ 25
[Tage]
16,79
15,85
16,79
20,97
21,04
21,42
8,73
36,82
36,89
37,26
24,58
37,76
37,84
38,21
25,52
16,65
12,38
17,27
17,23
31,64
32,69
32,24
19,55
Synergismus [Tage]
∆POZ 5
∆POZ 10
∆POZ 25
-16,15
-17,73
-15,80
-0,72
-2,16
-2,46
-2,76
-2,76
-16,32
-15,43
-9,99
2,81
-1,65
-17,19
-1,93
10,87
-20,17
-24,51
-19,99
-7,35
-6,12
-5,15
-5,97
-5,97
111
Die Hydroxyzimtsäure Kaffeesäure zeigte in ROTG in ansteigender Konzentration eine
zunehmende antioxidative Wirkung. Allerdings nahm diese in Kombination mit α-Tocopherol
nicht mehr zu. Eine Kombination der beiden Antioxidantien resultierte in einem antagonistischen Effekt. Bei Addition einer hohen α-Tocopherol-Konzentration war dieser besonders
groß. Der bei alleinigem Einsatz der Kaffeesäure zu beobachtende positive konzentrationsabhängige Effekt war in Kombination mit α-Tocopherol nicht mehr zu beobachten. Alle Proben
mit einer α-Tocopherol-Konzentration von 500 µmol/kg ROTG benötigten unabhängig von
der addierten Kaffeesäure-Konzentration die gleiche Zeit bis zum Erreichen einer bestimmten
POZ (Tab. 3.31).
500 µmol/kg ROTG, mit Kaffeesäure (KS) in einer Konzentration von 50 bis 500 µmol/kg ROTG bis zum
σ = ±1,52)
Antioxidanszusätze
[µmol/kg ROTG]:
Kontrolle
25 α-TOH
500 α-TOH
50 KS
125 KS
250 KS
500 KS
Berechnet 25 α-TOH + 50 KS
25 α-TOH + 50 KS
25 α-TOH + 125 KS
25 α-TOH + 250 KS
25 α-TOH + 500 KS
500 α-TOH + 50 KS
500 α-TOH + 125 KS
500 α-TOH + 250 KS
500 α-TOH + 500 KS
112
POZ 5
[Tage]
1,54
10,90
5,07
11,92
22,44
35,38
52,31
22,82
33,33
46,28
63,21
16,99
27,50
40,45
57,38
17,05
21,54
29,23
37,18
5,80
7,75
7,83
7,91
POZ 10
[Tage]
1,28
10,90
8,68
12,56
23,59
42,56
63,85
23,46
34,49
53,46
74,74
21,24
32,27
51,24
72,52
17,18
25,26
37,18
45,64
10,07
10,59
11,03
11,76
POZ 25
[Tage]
2,86
15,24
16,76
17,14
33,33
65,71
112,86
32,38
48,57
80,95
128,10
33,91
50,10
82,48
129,62
22,86
41,43
65,24
90,48
18,38
20,59
23,24
24,41
Synergismus [Tage]
∆POZ 5
∆POZ 10
∆POZ 25
-5,77
-11,79
-17,05
-26,03
-11,19
-19,75
-32,62
-49,47
-6,28
-9,23
-16,28
-29,10
-11,17
-21,68
-40,21
-60,76
-9,52
-7,14
-15,71
-37,62
-15,53
-29,51
-59,24
-105,21
Ergebnisse
Liponsäure zeigte in ROTG nur sehr geringe antioxidative Wirkung. Auch eine Kombination
mit α-Tocopherol konnte dies nicht ändern. Es zeigte sich bei allen Proben mit Antioxidantien-Kombination bis zum Erreichen einer POZ immer die gleiche Lagerdauer, die auch bei
der entsprechenden Probe nur mit α-Tocopherol gefunden wurde. Liponsäure zeigte also
keinerlei Interaktion mit α-Tocopherol in ROTG (Tab. 3.32).
500 µmol/kg ROTG, mit Liponsäure (LS) in einer Konzentration von 50 bis 500 µmol/kg ROTG bis zum
σ = ±1,52)
Antioxidanszusätze
[µmol/kg ROTG]:
Kontrolle
25 α-TOH
500 α-TOH
50 LS
125 LS
250 LS
500 LS
Berechnet 25 α-TOH + 50 LS
25 α-TOH + 50 LS
25 α-TOH + 125 LS
25 α-TOH + 250 LS
25 α-TOH + 500 LS
500 α-TOH + 50 LS
500 α-TOH + 125 LS
500 α-TOH + 250 LS
500 α-TOH + 500 LS
POZ 5
[Tage]
0,77
10,91
5,12
0,77
0,77
0,77
0,77
11,69
11,69
11,69
11,69
5,89
5,89
5,89
5,89
10,33
10,17
10,03
10,22
5,93
5,71
5,78
6,66
POZ 10
[Tage]
1,10
12,58
8,69
1,46
1,46
1,46
1,46
14,04
14,04
14,04
14,04
10,15
10,15
10,15
10,15
11,62
10,99
11,15
11,46
10,00
8,87
9,23
9,91
POZ 25
[Tage]
2,68
15,14
10,14
3,55
3,70
3,55
3,66
18,70
18,84
18,70
18,80
13,69
13,84
13,69
13,80
14,35
13,26
14,13
14,20
9,44
9,30
9,77
10,59
Synergismus [Tage]
∆POZ 5
∆POZ 10
∆POZ 25
-1.36
-1.52
-1.66
-1.47
0.04
-0.18
-0.11
0.77
-2.42
-3.05
-2.89
-2.58
-0.15
-1.28
-0.92
-0.24
-4.35
-5.58
-4.57
-4.60
-4.25
-4.54
-3.92
-3.21
113
Oleuropein zeigte eher mäßige antioxidative Wirkung in ROTG, wobei es konzentrationsabhängig wirkte und seine antioxidative Aktivität mit steigender Oleuropein-Konzentration
zunahm. Die antioxidative Wirkung einer Konzentration von 500 µmol/kg ROTG war mit der
von einer α-Tocopherol-Konzentration von 500 µmol/kg zu vergleichen. Allerdings zeigte
α-Tocopherol bei geringerer Konzentration ein Wirkungsoptimum, was bei Oleuropein
aufgrund seiner Konzentrationsabhängigkeit nicht zu beobachten war. In allen Konzentrationen zeigte eine Kombination von Oleuropein mit α-Tocopherol leichte antagonistische
Effekte, welche bei hoher α-Tocopherol-Konzentration größer waren. Hier zeigte sich dann
auch keine Konzentrationsabhängigkeit mehr. Im Vergleich zu der berechneten Summe der
Einzelwirkungen blieb die gemessene Wirkung der Kombination bei jeder Addition,
unabhängig von der Oleuropein-Konzentration, gleich (Tab. 3.33).
500 µmol/kg ROTG, mit Oleuropein (OL) in einer Konzentration von 50 bis 500 µmol/kg ROTG bis zum
σ = ±1,52)
Antioxidanszusätze
[µmol/kg ROTG]:
Kontrolle
25 α-TOH
500 α-TOH
50 OL
125 OL
250 OL
500 OL
Berechnet 25 α-TOH + 50 OL
25 α-TOH + 50 OL
25 α-TOH + 125 OL
25 α-TOH + 250 OL
25 α-TOH + 500 OL
500 α-TOH + 50 OL
500 α-TOH + 125 OL
500 α-TOH + 250 OL
500 α-TOH + 500 OL
114
POZ 5
[Tage]
0,74
10,86
7,35
1,68
2,98
4,64
8,05
12,54
13,84
15,50
18,91
9,04
10,33
11,99
15,40
10,98
13,13
11,72
13,98
7,05
7,13
7,51
7,83
POZ 10
[Tage]
9,63
12,40
9,74
3,40
5,99
7,49
11,04
15,80
18,40
19,90
23,44
13,14
15,73
17,23
20,78
12,91
16,98
17,13
17,67
10,55
9,63
10,78
10,66
POZ 25
[Tage]
13,55
14,35
18,36
7,43
8,85
10,49
14,10
21,78
23,20
24,84
28,45
25,79
27,21
28,85
32,46
17,92
21,56
24,16
27,27
18,47
20,05
22,19
23,50
Synergismus [Tage]
∆POZ 5
∆POZ 10
∆POZ 25
-1,56
-0,71
-3,78
-4,93
-1,99
-3,20
-4,48
-7,57
-2,89
-1,42
-2,77
-5,77
-2,59
-6,10
-6,45
-10,12
-3,86
-1,64
-0,68
-1,18
-7,32
-7,16
-6,66
-8,96
Ergebnisse
Quercetin zeigte eine ausgeprägte antioxidative Wirkung in ROTG. Mit zunehmender
Konzentration stieg seine Wirkung. So war es in hohen Konzentrationen effektiver als
α-Tocopherol. In Kombination mit α-Tocopherol zeigte sich bei allen Konzentrationen von
Quercetin zwar eine positive Konzentrationsabhängigkeit, die aber in geringen antagonistischen Effekten für eine POZ von 5 und 10 meq O2/kg ROTG resultierte, bei einer POZ
25 meq O2/kg ROTG zeigten sich additive Effekte. In Kombination mit α-Tocopherol in einer
Konzentration von 500 µmol/kg ROTG wurde ein starker antagonistischer Effekt bestimmt.
Eine positive Konzentrationsabhängigkeit konnte für alle ROTG-Proben mit dieser
Antioxidantien-Kombination festgestellt werden (Tab. 3.34).
500 µmol/kg ROTG, mit Quercetin (QU) in einer Konzentration von 50 bis 500 µmol/kg ROTG bis zum
σ = ±1,52)
Antioxidanszusätze
[µmol/kg ROTG]:
Kontrolle
25 α-TOH
500 α-TOH
50 QU
125 QU
250 QU
500 QU
Berechnet 25 α-TOH + 50 QU
25 α-TOH + 50 QU
25 α-TOH + 125 QU
25 α-TOH + 250 QU
25 α-TOH + 500 QU
500 α-TOH + 50 QU
500 α-TOH + 125 QU
500 α-TOH + 250 QU
500 α-TOH + 500 QU
POZ 5
[Tage]
0,74
10,85
5,12
7,87
16,38
29,15
50,43
18,72
27,23
40,00
61,28
12,99
21,50
34,27
55,54
17,77
22,02
33,19
42,87
7,44
6,60
6,88
7,35
POZ 10
[Tage]
1,18
12,50
8,71
10,29
22,35
39,71
68,09
22,79
34,85
52,21
80,59
19,00
31,06
48,41
76,79
21,03
29,26
42,94
68,09
9,65
9,76
10,00
10,65
POZ 25
[Tage]
2,62
15,24
16,74
14,05
29,29
52,38
94,76
29,29
44,52
67,62
110,00
30,79
46,03
69,13
111,51
26,43
42,86
66,67
n.a.
16,74
17,44
17,79
22,50
Synergismus [Tage]
∆POZ 5
∆POZ 10
∆POZ 25
-0,95
-5,21
-6,81
-18,41
-5,55
-14,90
-27,39
-48,19
-1,76
-5,59
-9,27
-12,50
-9,35
-21,30
-38,41
-66,14
-2,86
-1,66
-0,95
n.a.
-14,05
-28,59
-51,34
-89,01
115
Auch Rosmarinsäure war ein wirksames Antioxidans in ROTG. Sie zeigte eine starke
Zunahme der antioxidativen Wirkung bei steigender Konzentration. Bei gleicher Konzentration war sie effektiver als α-Tocopherol. Eine Kombination resultierte für alle Konzentrationen
in antagonistischen Effekten. Diese waren besonders bei hohen RosmarinsäureKonzentrationen stärker ausgeprägt. Der bei einer Kombination von α-Tocopherol in einer
Konzentration von 25 µmol/kg ROTG und Rosmarinsäure in einer Konzentration von
500 µmol/kg ROTG bei einer POZ von 25 meq O2/kg ROTG identifizierte synergistische
Effekt konnte bei keiner weiteren POZ bestätigt werden. Es könnte sich hierbei jedoch um
eine Messungenauigkeit gehandeln haben (Tab. 3.35).
500 µmol/kg ROTG, mit Rosmarinsäure (RS) in einer Konzentration von 50 bis 500 µmol/kg ROTG bis
σ = ±1,52)
Antioxidanszusätze
[µmol/kg ROTG]:
Kontrolle
25 α-TOH
500 α-TOH
50 RS
125 RS
250 RS
500 RS
Berechnet 25 α-TOH + 50 RS
25 α-TOH + 50 RS
25 α-TOH + 125 RS
25 α-TOH + 250 RS
25 α-TOH + 500 RS
500 α-TOH + 50 RS
500 α-TOH + 125 RS
500 α-TOH + 250 RS
500 α-TOH + 500 RS
116
POZ 5
[Tage]
0,73
10,66
7,27
15,27
34,18
48,00
53,09
25,93
44,84
58,66
63,75
22,55
41,45
55,27
60,36
16,05
25,75
32,22
37,84
7,27
8,36
9,45
11,27
POZ 10
[Tage]
1,44
12,31
9,48
21,86
41,86
64,33
89,07
34,16
54,16
76,64
101,38
31,34
51,34
73,81
98,56
23,22
37,76
43,64
57,62
9,48
11,55
12,58
13,61
POZ 25
[Tage]
3,73
14,24
13,87
28,80
59,20
101,60
105,60
43,04
73,44
115,84
119,84
42,67
73,07
115,47
119,47
30,61
56,06
90,91
147,27
18,93
20,27
30,40
28,80
Synergismus [Tage]
∆POZ 5
∆POZ 10
∆POZ 25
-9,88
-19,09
-26,44
-25,91
-15,28
-33,09
-45,82
-49,09
-10,94
-16,40
-33,00
-43,76
-21,86
-39,79
-61,23
-84,95
-12,43
-17,38
-24,93
27,43
-23,74
-52,80
-85,07
-90,67
Ergebnisse
Sinapinsäure, ein natürlicher Bestandteil des Rapses, zeigte geringe, aber konzentrationsabhängige antioxidative Wirkung in ROTG. Mit zunehmender Konzentration stieg auch ihre
antioxidative Effizienz. Eine Kombination mit α-Tocopherol konnte diese inhibierende
Wirkung jedoch nicht unterstützen (Ausnahme: α-Tocopherol + 500 µmol Sinapinsäure/kg
ROTG bei POZ 25 meq O2/kg ROTG). Die Lagerstabilität der Proben war bis zum Erreichen
einer POZ von 10 meq O2/kg ROTG immer identisch mit der entsprechenden Probe nur mit
α-Tocopherol. Eine Erhöhung der Sinapinsäure-Konzentration brachte keinen antioxidativen
Effekt mit sich. Erst bei einer POZ von 25 meq O2/kg ROTG konnte eine Konzentrationsabhängigkeit beobachtet werden. Hier stieg die Lagerdauer der einzelnen Proben bis zum
Erreichen der POZ mit zunehmender Sinapinsäure-Konzentration. Dennoch resultierte die
Kombination der beiden Antioxidantien immer in antagonistischen Effekten (Tab. 3.36).
500 µmol/kg ROTG, mit Sinapinsäure (SIS) in einer Konzentration von 50 bis 500 µmol/kg ROTG bis
σ = ±1,52)
Antioxidanszusätze
[µmol/kg ROTG]:
Kontrolle
25 α-TOH
500 α-TOH
50 SIS
125 SIS
250 SIS
500 SIS
Berechnet 25 α-TOH + 50 SIS
25 α-TOH + 50 SIS
25 α-TOH + 125 SIS
25 α-TOH + 250 SIS
25 α-TOH + 500 SIS
500 α-TOH + 50 SIS
500 α-TOH + 125 SIS
500 α-TOH + 250 SIS
500 α-TOH + 500 SIS
POZ 5
[Tage]
0,77
10,78
7,21
2,40
7,32
12,51
24,48
13,19
18,10
23,29
35,26
9,62
14,54
19,73
31,69
10,74
10,63
11,41
15,39
7,10
6,12
6,12
6,56
POZ 10
[Tage]
1,54
12,47
9,57
4,87
9,91
20,00
36,58
17,34
22,38
32,47
49,05
14,44
19,49
29,57
46,15
12,34
12,34
15,45
27,14
9,57
8,97
10,60
8,89
POZ 25
[Tage]
3,82
14,58
13,95
8,42
13,03
0,00
51,18
23,00
27,60
14,58
65,76
22,37
26,97
13,95
65,13
16,39
19,52
26,99
42,29
13,03
18,82
17,63
18,68
Synergismus [Tage]
∆POZ 5
∆POZ 10
∆POZ 25
-2,45
-7,47
-11,88
-19,87
-2,52
-8,42
-13,61
-25,13
-5,00
-10,04
-17,02
-21,91
-4,87
-10,52
-18,97
-37,26
-6,61
-8,08
12,41
-23,47
-9,34
-8,15
3,68
-46,45
117
Tyrosol zeigte kaum antioxidative Wirkung in ROTG. Auch war kein Anstieg des
inhibierenden Effektes mit Zunahme der Konzentration zu beobachten. Bei Kombination mit
α-Tocopherol zeigte sich bei allen Tyrosol-Konzentrationen lediglich die antioxidative
Wirkung der entsprechenden reinen α-Tocopherol-Probe. Eine Ausnahme waren die Proben
mit einer α-Tocopherol-Konzentration von 500 µmol/kg ROTG. Hier wurde eine gleichbleibende, also konzentrationsunabhängige, aber längere Lagerdauer bis zum Erreichen einer
POZ von 25 meq O2/kg ROTG nachgewiesen als bei der entsprechenden reinen
α-Tocopherol-Probe. Dennoch resultierten alle Kombinationen aus α-Tocopherol mit Tyrosol
in antagonistischen Effekten (Tab. 3.37).
500 µmol/kg ROTG, mit Tyrosol (TL) in einer Konzentration von 50 bis 500 µmol/kg ROTG bis zum
σ = ±1,52)
Antioxidanszusätze
[µmol/kg ROTG]:
Kontrolle
25 α-TOH
500 α-TOH
50 TL
125 TL
250 TL
500 TL
Berechnet 25 α-TOH + 50 TL
25 α-TOH + 50 TL
25 α-TOH + 125 TL
25 α-TOH + 250 TL
25 α-TOH + 500 TL
500 α-TOH + 50 TL
500 α-TOH + 125 TL
500 α-TOH + 250 TL
500 α-TOH + 500 TL
118
POZ 5
[Tage]
1,17
10,81
7,26
1,27
1,24
1,24
1,37
12,08
12,05
12,05
12,18
8,54
8,50
8,50
8,63
10,28
10,26
10,07
10,23
4,40
6,56
7,02
6,17
POZ 10
[Tage]
2,35
12,32
8,93
2,58
2,52
2,52
2,71
14,90
14,84
14,84
15,03
11,51
11,45
11,45
11,64
11,35
11,74
10,52
11,19
8,45
8,64
8,62
7,91
POZ 25
[Tage]
5,93
14,40
13,76
6,12
6,06
6,06
6,19
20,52
20,46
20,46
20,59
19,88
19,81
19,81
19,94
13,36
13,78
11,82
13,16
19,91
18,25
18,78
18,17
Synergismus [Tage]
∆POZ 5
∆POZ 10
∆POZ 25
-1,80
-1,79
-1,98
-1,95
-4,14
-1,94
-1,48
-2,46
-3,55
-3,10
-4,32
-3,84
-3,06
-2,81
-2,83
-3,73
-7,16
-6,68
-8,64
-7,43
0,03
-1,56
-1,03
-1,77
Ergebnisse
Vanillinsäure zeigte erst beim Erreichen hoher POZ (25 meq O2/kg ROTG) eine identische
antioxidative Wirkung wie α-Tocopherol. Allerdings konnte hier mit steigender Konzentration keine Zunahme der inhibierenden Wirkung gefunden werden. In Kombination mit
α-Tocopherol war die Wirkung von Vanillinsäure sogar noch herabgesetzt. Das bedeutete,
dass eine Probe mit einer Kombination der beiden Antioxidantien eine noch kürzere Zeit
benötigte, um eine bestimmte POZ zu erreichen, als eine reine α-Tocopherol-Probe mit der
entsprechenden Konzentration. Dieser antagonistische Effekt war besonders ausgeprägt bei
hohen α-Tocopherol-Konzentrationen und hoher POZ (Tab. 3.38).
500 µmol/kg ROTG, mit Vanillinsäure (VS) in einer Konzentration von 50 bis 500 µmol/kg ROTG bis
σ = ±1,52)
Antioxidanszusätze
[µmol/kg ROTG]:
Kontrolle
25 α-TOH
500 α-TOH
50 VS
125 VS
250 VS
500 VS
Berechnet 25 α-TOH + 50 VS
25 α-TOH + 50 VS
25 α-TOH + 125 VS
25 α-TOH + 250 VS
25 α-TOH + 500 VS
500 α-TOH + 50 VS
500 α-TOH + 125 VS
500 α-TOH + 250 VS
500 α-TOH + 500 VS
POZ 5
[Tage]
0,77
10,54
7,02
0,77
0,98
0,98
0,98
11,30
11,52
11,52
11,52
7,79
8,00
8,00
8,00
10,41
10,28
10,41
10,13
7,06
6,26
7,02
6,34
POZ 10
[Tage]
0,97
12,21
8,50
1,16
1,97
1,44
1,53
13,36
14,17
13,64
13,73
9,65
10,46
9,93
10,02
10,84
10,80
10,84
10,72
8,33
8,33
8,59
8,29
POZ 25
[Tage]
2,47
15,79
16,94
17,02
16,68
15,74
15,87
32,81
32,47
31,53
31,66
33,96
33,62
32,68
32,81
11,84
11,72
12,26
11,57
2,89
4,94
3,57
3,87
Synergismus [Tage]
∆POZ 5
∆POZ 10
∆POZ 25
-0,89
-1,24
-1,11
-1,39
-0,73
-1,74
-0,98
-1,66
-2,52
-3,37
-2,80
-3,01
-1,32
-2,13
-1,34
-1,73
-20,97
-20,75
-19,27
-20,09
-31,07
-28,68
-29,11
-28,94
119
Abschließend wurde Vinylsyringol, ein Decarboxylierungsprodukt von Ascorbinsäure,
untersucht. Es zeigte eine effektive konzentrationsabhängige antioxidative Wirkung in
ROTG, welche mit zunehmender Konzentration anstieg. Eine Kombination mit α-Tocopherol
resultierte allerdings in jeder möglichen Kombination in antagonistischen Effekten, welche
besonders stark bei niedrigen α-Tocopherol-Konzentrationen ausgeprägt waren. Es ergab sich
hier nur bei niedrigen POZ eine Konzentrationsabhängigkeit, wobei sich bei diesen niedrigen
α-Tocopherol-Konzentrationen bei allen Proben nicht einmal die Lagerdauer bis zum
Erreichen der entsprechenden POZ von α-Tocopherol in ROTG allein zeigte. Bei einer
α-Tocopherol-Konzentration von 500 µmol/kg ROTG zeigte sich eine starke Konzentrationsabhängigkeit. So stieg die inhibierende Wirkung mit zunehmender VinylsyringolKonzentration und auch die Wirkung von α-Tocopherol allein wurde bei allen Proben
überstiegen. Dennoch zeigte sich bei jeder Kombination von α-Tocopherol mit Vinylsyringol
ein antagonistischer Effekt.
500 µmol/kg ROTG, mit Vinylsyringol (VL) in einer Konzentration von 50 bis 500 µmol/kg ROTG bis
zum Erreichen der POZ 5, 10 und 25 meq O2/kg ROTG. Zusätzlich dargestellt; die Differenz zwischen
σ = ±1,52)
Antioxidanszusätze
[µmol/kg ROTG]:
Kontrolle
25 α-TOH
500 α-TOH
50 VL
125 VL
250 VL
500 VL
Berechnet 25 α-TOH + 50 VL
25 α-TOH + 50 VL
25 α-TOH + 125 VL
25 α-TOH + 250 VL
25 α-TOH + 500 VL
500 α-TOH + 50 VL
500 α-TOH + 125 VL
500 α-TOH + 250 VL
500 α-TOH + 500 VL
120
POZ 5
[Tage]
1,15
10,69
7,27
6,18
10,53
17,94
31,15
16,87
21,22
28,63
41,83
13,45
17,80
25,21
38,41
4,58
5,57
5,34
6,11
10,08
10,53
12,44
19,54
POZ 10
[Tage]
2,38
12,14
9,74
7,62
12,14
25,48
40,48
19,76
24,29
37,62
52,62
17,36
21,89
35,22
50,22
7,26
7,98
8,33
8,57
11,43
12,38
24,40
31,43
POZ 25
[Tage]
6,05
14,61
13,82
10,26
18,16
32,37
55,00
24,87
32,76
46,97
69,61
24,08
31,97
46,18
68,82
11,58
11,71
11,71
11,71
14,74
20,53
31,05
48,42
Synergismus [Tage]
∆POZ 5
∆POZ 10
∆POZ 25
-12,29
-15,65
-23,29
-35,72
-3,37
-7,27
-12,77
-18,87
-12,50
-16,31
-29,29
-44,05
-5,93
-9,51
-10,82
-18,79
-13,29
-21,05
-35,26
-57,90
-9,34
-11,44
-15,13
-20,40
Ergebnisse
Abschließend stellte sich heraus, dass nur Ascorbigen bei einer hohen α-TocopherolKonzentration von 500 µmol/kg ROTG synergistische Wirkung mit α-Tocopherol zeigte. Bei
einer Kombination mit Carnosolsäure, Genistein und Quercetin resultierten mit α-Tocopherol
unter bestimmten Bedingungen additive Effekte. Alle anderen Kombinationen mit
α-Tocopherol zeigten antagonistische Effekte.
3.4.5
Abbau von α-Tocopherol in An- und Abwesenheit von phenolischen und
Um eine regenerative Wirkung von phenolischen und nicht-phenolischen Antioxidantien zu
bestimmen, wurde der Abbau von α-Tocopherol untersucht.
3.4.5.1
Abbau von zwei unterschiedlichen α-Tocopherol-Konzentrationen in
Gegenwart von Kaffeesäure
c(alpha-TOH)
[µmol/kg ROTG]
In Gegenwart von Kaffeesäure zeigte sich bei einer α-Tocopherol-Konzentration von
25 µmol/kg ROTG eine starke Verlangsamung des Abbaus. Der Abbau nahm mit zunehmender Kaffeesäure-Konzentration stetig ab. So verlängerte sich die Zeit bis zum vollständigen
Abbau des α-Tocopherols bei einer Zugabe von Kaffeesäure in einer Konzentration von
50 µmol/kg ROTG um 7 Tage. Eine Erhöhung der Kaffeesäure-Konzentration auf
125 µmol/kg ROTG verlängerte diese Zeit noch einmal um weitere 7 Tage. 250 µmol/kg
verlängerten die Abbauzeit auf 42 Tage und 500 µmol/kg schließlich auf 96 Tage. Somit hatte
Kaffeesäure auf α-Tocopherol einen regenerierenden Einfluss, welcher mit zunehmender
Kaffeesäure-Konzentration anstieg (Abb. 3.43).
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0
0
20
40
60
25 µmol TOH
25 µmol TOH + 125 µmol KS
80
100
Abb. 3.43: Abbau von 25 µmol/kg ROTG α-Tocopherol (α-TOH) in Gegenwart von 50 – 500 µmol/kg
ROTG Kaffeesäure (KS)
121
Auch auf eine höhere α-Tocopherol-Konzentration von 500 µmol/kg ROTG hatte Kaffeesäure
einen regenerierenden Einfluss. So konnte eine Zugabe von Kaffeesäure in einer Konzentration von 500 µmol/kg ROTG den vollständigen Abbau von α-Tocopherol um 14 Tage
verschieben. Auch bei dieser hohen α-Tocopherol-Konzentration zeigte sich eine Konzentrationsabhängigkeit, wobei diese bei niedrigeren Kaffeesäure-Konzentrationen ziemlich gering
ausgeprägt war (Abb. 3.44).
800
c(alpha-TOH)
[µmol/kg ROTG]
700
600
500
400
300
200
100
0
0
10
20
30
40
50
500 µmol TOH
ROTG Kaffeesäure (KS)
c(Kaffeesäure)
[µmol/kg ROTG]
Der Abbau von Kaffeesäure wurde im Wesentlichen nur bei hohen α-TocopherolKonzentrationen beeinflusst (Abb. 3.45, Abb. 3.46).
600
500
400
300
200
100
0
0
20
40
60
80
100
50 µmol KS
250 µmol KS
120
125 µmol KS
500 µmol KS
Abb. 3.45: Abbau von unterschiedlichen Kaffeesäure-Konzentrationen (KS) in Gegenwart von 25 µmol/kg
ROTG α-Tocopherol (α-TOH)
122
Ergebnisse
c(Kaffeesäure)
[µmol/kg ROTG]
600
500
400
300
200
100
0
0
20
40
60
80
50 µmol KS
250 µmol KS
100
120
125 µmol KS
500 µmol KS
Abb. 3.46: Abbau von unterschiedlichen Kaffeesäure-Konzentrationen (KS) in Gegenwart von
500 µmol/kg ROTG α-Tocopherol (α-TOH)
3.4.5.2
Abbau von zwei unterschiedlichen α-TOH Konzentrationen in Gegenwart von
Vanillinsäure
c(alpha-TOH)
[µmol/kg ROTG]
Durch die Gegenwart von Vanillinsäure wurde die Abbaugeschwindigkeit von α-Tocopherol
sowohl in einer Konzentration von 25 als auch von 500 µmol/kg ROTG nicht beeinflusst. So
war bei allen Proben sowohl mit als auch ohne Sinapinsäure bei einer α-TocopherolKonzentration von 25 µmol/kg ROTG das gesamte α-Tocopherol nach 14 Tagen bzw. bei
einer α-Tocopherol-Konzentration von 500 µmol/kg ROTG nach 35 Tagen vollständig
aufgebraucht (Abb. 3.47, Abb. 3.48).
50
40
30
20
10
0
0
5
10
25 µmol TOH
25 µmol TOH + 125 µmol VS
15
ROTG Vanillinsäure (VS)
123
c(alpha-TOH) [µmol/kg ROTG]
800
700
600
500
400
300
200
100
0
0
5
10
15
20
25
30
35
500 µmol TOH
ROTG Vanillinsäure (VS)
Äquivalent dazu hatte auch α-Tocopherol in einer Konzentration von 25 µmol/kg ROTG
keinen Einfluss auf die Abbaugeschwindigkeit unterschiedlicher Konzentrationen an
Vanillinsäure. Über eine Messdauer von 27 Tagen wurde die Anfangskonzentration von
Vanillinsäure in ROTG nicht beeinflusst und blieb bis zum Ende des Versuchs gleich.
Vanillinsäure nahm also weder an antioxidativenVorgängen noch an der Regeneration von
α-Tocopherol teil (Abb. 3.49).
c(Vanillinsäure)
[µmol/kg ROTG]
600
500
400
300
200
100
0
0
5
10
15
20
50 µmol VS
250 µmol VS
25
30
125 µmol VS
500 µmol VS
Abb. 3.49: Abbau von unterschiedlichen Vanillinsäure-Konzentrationen (VS) in Gegenwart von
124
Ergebnisse
Bei Einsatz einer höheren α-Tocopherol-Konzentration von 500 µmol/kg ROTG zeigte sich
eine geringfügige Verlangsamung des Vanillinsäureabbaus. Möglicherweise könnte das
α-Tocopherol besonders bei hohen Vanillinsäure-Konzentrationen diese regeneriert haben
(Abb. 3.50).
c(Vanillinsäure)
[µmol/kg ROTG]
600
500
400
300
200
100
0
0
10
20
30
50 µmol VS
250 µmol VS
40
125 µmol VS
500 µmol VS
Abb. 3.50: Abbau von unterschiedlichen Vanillinsäure-Konzentrationen (VS) in Gegenwart von
3.4.6
Interaktion von phenolischen und nicht-phenolischen Antioxidantien mit
α-Tocopherol in Öl-in-Wasser-Emulsionen
Wie auch bei den Oxidationsversuchen in ROTG wurden die phenolischen und nichtphenolischen Substanzen Ascorbigen, Butylhydroxyanisol, Catechin, Carnosolsäure,
Geinstein, Kaempferol, Kaffeesäure, Liponsäure, Oleurpein, Quercetin, Rosmarinsäure,
Sinapinsäure, Tyrosol, Vanillinsäure und Vinylsyringol auf Interaktionen mit α-Tocopherol
untersucht. Zusätzlich wurde in der Emulsion noch Ascorbinsäure als potenzieller Synergist
getestet. Diese Verbindungen wurden der Emulsion in den Konzentrationen 50, 125, 250 und
500 µmol/kg ROTG-Phase zugesetzt und hatten somit eine Gesamtkonzentration von 5, 12,5,
25, und 50,0 µmol/kg Emulsion.
Auch bei den Untersuchungen in Emulsionen sollte die Hypothese von PEYRAT-MAILLARD ET
AL. (2003) überprüft werden. Ein potenzieller Synergist zu α-Tocopherol sollte ein
schwächeres Antioxidans als α-Tocopherol in Emulsion sein, da ein schwächeres Antioxidans
das stärkere regenerieren sollte, um so eine optimale antioxidative Wirkung zu gewährleisten.
Hierzu wurde die antioxidative Wirkung von phenolischen und nicht-phenolischen
Antioxidantien in Emulsionen überprüft.
125
Mithilfe der in Emulsion berechneten Inhibierungen für die Bildung der Hydroperoxide und
der sekundären Oxidationsprodukte Propanal und Hexanal (nach 48 Stunden Oxidation bei
40°C im Dunkeln) für Proben mit jeweils einer Antioxidans-Konzentration von 500 µmol/kg
Emulsion, zeigte sich, dass Oleuropein, Rosmarinsäure und Sinapinsäure die Oxidation noch
zusätzlich unterstützten und somit in Emulsionen prooxidativ wirkten. α-Tocopherol zeigte
eine inhibierende Wirkung bei der Entstehung von Hydroperoxiden bei 42 %. Catechin,
Genistein, Tyrosol, Vanillinsäure und Vinylsyringol zeigten nur sehr geringe antioxidative
Eigenschaften, wobei Tyrosol und Vinylsyringol die Bildung sekundärer Oxidationsprodukte
protegierten. Auch α-Tocopherol zeigte nur eine sehr geringe Wirkung bei der Inhibierung
sekundärer Oxidationsprodukte.
Alle anderen eingesetzten Substanzen zeigten inhibierende Wirkungen sowohl für primäre als
auch für sekundäre Oxidationsprodukte im Bereich von 50 bis 100 % und zwar in aufsteigender Reihenfolge: Liponsäure < Ascorbigen < Carnosolsäure < Kaempferol < Kaffeesäure <
BHA < Quercetin. Carnosolsäure wies stärkere inhibierende Wirkung für primäre Oxidationsprodukte als für sekundäre Oxidationsprodukte auf (Abb. 3.51).
100
60
40
20
-89
Hydroperoxide
-105
Propanal
-109
alpha-Tocopherol
Vinylsyringol
Vanillinsäure
Thyrosol
Sinapinsäure
Quercetin
Oleuropein
Liponsäure
Kaffeesäure
Kaempferol
Genistein
-80
Rosmarinsäure
-60
Catechin
-40
Carnosolsäure
-20
BHA
0
Ascorbigen
Inhibierung [%]
80
-145
Hexanal
Abb. 3.51: Inhibierung aller in dieser Arbeit untersuchten phenolischen und nicht-phenolischen
Antioxidantien in einer Konzentration von 500 µmol/kg ROTG, berechnet aus der Entstehung der
Hydroperoxide, Propanal und Hexanal nach 48 Stunden. (Für die Verbindungen Ascorbigen,
Butylhydroxyanisol (BHA), Kaffeesäure, Liponsäure und Quercetin konnten keine sekundären
Oxidationsprodukte bestimmt werden.)
126
Ergebnisse
3.4.7
Konzentrationsabhängige Inhibierung von phenolischen und nichtphenolischen Antioxidantien
Da die inhibierende Wirkung der einzelnen Antioxidantien konzentrationsabhängig sein kann,
wurde nicht nur eine Probe mit einer Konzentration der Synergisten von 500 µmol/kg ROTG
vermessen, sondern zusätzlich Proben mit den Konzentrationen von 50, 125 und 250 µmol/kg
ROTG. Es zeigte sich für Butylhydroxyanisol, Carnosolsäure, Geinstein, Kaempferol,
Kaffeesäure, Quercetin und Vanillinsäure, dass eine steigende Antioxidans-Konzentration
eine steigende inhibierende Wirkung mit sich brachte, und zwar sowohl bei der Inhibierung
der Bildung von Hydroperoxiden als auch bei der Entstehung von sekundären Oxidationsprodukten. Für Ascorbigen, Catechin, Liponsäure und Oleuropein konnte keine Konzentrationsabhängigkeit nachgewiesen werden. Die Inhibierung blieb bei allen untersuchten Konzentrationen gleich. Prooxidativ hingegen wirkten Rosmarinsäure und Sinapinsäure. Ein Anstieg der
Konzentration des eingesetzten Antioxidans führte zu einer stärkeren Bildung von primären
und sekundären Oxidationsprodukten. Für Vinylsyringol und Tyrosol konnten nur stark
schwankende Ergebnisse erreicht werden.
Folgende Substanzen wiesen geringere antioxidative Aktivität in Emulsionen auf als
α-Tocopherol: Catechin, Genistein, Liponsäure, Oleuropein, Rosmarinsäure, Sinapinsäure,
Tyrosol, Vanillinsäure und Vinylsyringol.
Tab. 3.40: Darstellung der konzentrationsabhängigen Inhibierung aller phenolischen und nichtphenolischen Antioxidantien, berechnet aus der Entstehung der Hydroperoxide, Propanal und Hexanal
nach 48 Stunden in Emulsion (Tocopherol: TOH, Standardabweichung: σ)
Konz. Hydroperoxide
µmol/kg
Inhibierung
ROTG
[%]
25
500
50
Ascorbigen
125
250
500
Butylhydroxy- 50
125
anisol
250
500
Carnosolsäure 50
125
250
500
50
Catechin
125
250
500
50
Genistein
125
α-TOH
-21,36
52,34
48,86
50,69
61,98
58,41
86,82
94,98
98,23
97,96
22,43
38,28
90,49
69,39
7,44
-0,63
-1,37
-2,91
19,79
15,16
σ [%]
5,19
1,11
9,09
5,66
0,20
6,60
0,20
1,76
0,37
0,07
5,47
6,99
2,59
3,43
2,90
2,13
2,00
2,86
3,79
9,77
Propanal
Inhibierung
[%]
-66,51
11,88
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
-24,21
-13,70
54,36
-0,84
-48,30
-0,66
-21,83
1,69
16,11
-3,25
σ [%]
20,85
1,037
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
9,80
0,10
3,53
8,95
3,29
18,46
3,86
15,98
12,68
10,25
Hexanal
Inhibierung
[%]
-96,34
5,67
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
-39,75
-21,81
77,06
18,88
-69,54
2,89
-17,73
7,37
41,12
-8,65
σ [%]
30,11
0,37
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
8,27
5,26
3,80
19,27
3,40
22,80
2,61
19,07
15,03
14,64
127
Konz. Hydroperoxide
µmol/kg
Inhibierung
ROTG
[%]
250
500
50
Kaempferol
125
250
500
50
Kaffeesäure
125
250
500
50
Liponsäure
125
250
500
50
Oleuropein
125
250
500
50
Quercetin
125
250
500
Rosmarinsäure 50
125
250
500
50
Sinapinsäure
125
250
500
50
Tyrosol
125
250
500
50
Vanillinsäure
125
250
500
50
Vinylsyringol
125
250
500
n.a. = nicht analysiert
128
24,44
28,80
5,47
15,06
59,66
78,19
69,12
89,95
94,74
96,76
40,85
47,69
44,43
46,87
-26,25
-59,82
-40,53
-35,71
95,13
99,37
100
100
0,93
-5,86
-30,32
-24,96
-33,57
-6,14
-6,78
-10,46
13,64
10,89
16,96
19,73
4,01
10,75
13,89
17,56
-0,93
0,33
-8,24
10,31
σ [%]
1,93
1,11
4,63
1,28
1,23
2,15
0,82
0,25
0,20
0,27
9,14
0,02
3,81
5,29
14,24
18,96
26,16
16,60
1,50
0,15
0,16
0,09
9,67
8,85
16,40
13,64
10,47
4,98
22,09
6,96
2,99
3,02
4,22
4,06
1,16
2,14
4,45
2,95
4,73
2,20
1,98
1,88
Propanal
Inhibierung
[%]
-24,60
17,74
-34,00
-16,56
15,84
30,54
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
-41,21
-83,12
-51,54
-89,40
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
-66,06
-33,48
-115,64
-109,14
-110,88
-85,81
-68,31
-45,72
-17,45
-36,72
-23,89
-27,43
-11,59
-11,97
-31,70
14,38
-49,31
-54,15
-44,59
-32,17
σ [%]
14,06
13,51
7,73
11,18
0,91
6,56
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
3,84
6,66
3,54
22,92
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
9,96
4,07
3,41
3,32
8,77
7,34
4,05
0,19
2,82
4,07
10,20
3,90
12,17
9,16
12,15
0,57
0,17
0,00
3,10
Hexanal
Inhibierung
[%]
-25,38
15,18
-47,93
-23,43
30,26
50,39
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
-75,52
-121,34
-74,60
-105,56
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
-145,63
-64,51
-174,83
-144,80
-143,62
-108,50
-98,48
-69,98
-26,63
-55,51
-31,52
-29,89
-21,81
-38,66
-38,57
10,63
-58,52
-61,30
-34,11
-17,34
σ [%]
2,33
15,24
9,33
13,29
0,34
5,79
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
0,46
2,61
1,20
7,46
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
19,98
7,80
17,41
14,21
20,84
10,50
0,20
3,88
3,92
4,39
15,66
2,43
0,00
6,13
18,25
0,41
0,85
0,00
2,15
Ergebnisse
3.4.8
Interaktion von α-Tocopherol mit Butylhydroxyanisol in Öl-in-WasserEmulsion
3.4.8.1
Interaktion von α-Tocopherol mit Butylhydroxyanisol in Öl-in-Wasser-Emulsion
bei einer POZ von 5 meq O2/kg ROTG
Um auch die Wirkung von Antioxidantien-Kombinationen in Emulsionen anschaulich
darstellen zu können, soll exemplarisch ein phenolisches Antioxidans zu α-Tocopherol in
Emulsion anhand eines Balkendiagramms abgebildet werden. In Abb. 3.52 wird die
Lagerdauer von Emulsionsproben bis zum Erreichen einer POZ von 5 meq O2/kg ROTG mit
Butylhydroxyanisol in den Konzentrationen von 50 bis 500 µmol/kg ROTG gezeigt. Deutlich
ist eine konzentrationsabhängige Wirkung zu erkennen. Mit steigender ButylhydroxyanisolKonzentration verlängerte sich die Lagerdauer der Proben. Sie konnte von ca. 26 auf über
50 Tage durch eine Zugabe von Butylhydroxyanisol in einer Konzentration von 500 statt
50 µmol/kg ROTG gesteigert werden. Diese Konzentrationsabhängigkeit ist auch bei der
Kombination von Butylhydroxyanisol in Kombination mit α-Tocopherol in einer Konzentration von 25 µmol/kg ROTG zu erkennen. Dennoch war die Lagerstabilität der Proben mit der
Antioxidantien-Kombination bei allen Konzentrationen geringer als bei der berechneten
Summe der Einzelwirkungen der Antioxidantien. Es zeigte sich also in jeder Kombination
eine antagonistische Wirkung.
60
50
40
30
20
10
0
Abb. 3.52: Lagerdauer bis zum Erreichen einer POZ von 5 meq O2/kg ROTG Tage] von Emulsionsproben
mit einer α-Tocopherol-Konzentration (α-TOH) von 25 µmol/kg ROTG mit und ohne Butylhydroxyanisol
(BHA) in einer Konzentration von 50, 125, 250 und 500 µmol/kg ROTG und die berechnete Lagerdauer
bei additiver Wirkung der beiden Antioxidantien in Kombination (Standardabweichung α-Tocopherol:
σ = ±2,04)
129
Bei Erhöhung der α-Tocopherol-Konzentration änderte sich die Wirkung deutlich. Die
Lagerstabilität der Proben vergrößerte sich mit steigender Butylhydroxyanisol-Konzentration.
Durch Zugabe von α-Tocopherol in einer Konzentration von 500 µmol/kg ROTG zu einer
Butylhydroxyanisol-Konzentration von 500 µmol/kg ROTG verlängerte sich die Lagerdauer
der Probe um ca. ein Drittel. Die Zugabe einer hohen α-Tocopherol-Konzentration zu
Butylhydroxyanisol resultierte mit höheren Konzentrationen in synergistischen Effekten, der
120
100
80
60
40
20
BH
A
50
0
BH
A
25
0
12
5
50
BH
A
0
BH
A
mit steigender Butylhydroxyanisol-Konzentration stärker wurde (Abb. 3.53).
Abb. 3.53: Lagerdauer bis zum Erreichen einer POZ von 5 meq O2/kg ROTG Tage] von Emulsionsproben
mit einer α-Tocopherol-Konzentration (α-TOH) von 500 µmol/kg ROTG mit und ohne Butylhydroxyanisol (BHA) in einer Konzentration von 50, 125, 250 und 500 µmol/kg ROTG und die berechnete
Lagerdauer bei additiver Wirkung der beiden Antioxidantien in Kombination (Standardabweichung
α-Tocopherol: σ = ±2,04)
130
Ergebnisse
3.4.8.2
Interaktion von α-Tocopherol mit Butylhydroxyanisol in Öl-in-Wasser-Emulsion
bei unterschiedlichen Oxidationsstadien
Da die POZ, bei der die Interaktionen untersucht wurden, einen großen Einfluss auf die
Ausbildung der synergistischen Effekte hatten, wurden auch die POZ von 10 und 25 meq
O2/kg ROTG untersucht. Es zeigte deutlich, dass bei keiner POZ eine synergistische Wirkung
zwischen BHA und α-Tocopherol in einer Konzentration von 25 µmol/kg ROTG ausgebildet
wurde. Der synergistische Effekt, der zwischen BHA und einer Konzentration von
500 µmol/kg ROTG bei einer POZ von 5 meq O2/kg ROTG identifiziert werden konnte,
wurde auch bei höheren POZ beobachtet, nahm aber mit steigender POZ in seiner Intensität
ab (Tab. 3.41).
Tab. 3.41: Lagerdauer (Stunden) von α-Tocopherolproben (α-TOH) mit einer Konzentration von 25 bzw.
500 µmol/kg ROTG, mit Butylhydroxyanisol (BHA) in einer Konzentration von 50 bis 500 µmol/kg
ROTG bis zum Erreichen der POZ 5, 10 und 25 meq O2/kg ROTG. Zusätzlich dargestellt; die Differenz
zwischen berechneter und tatsächlich gemessener Dauer bis zum Erreichen der entsprechenden POZ, +∆
entspricht einer synergistischen, –∆ einer antagonistischen Interaktion (Standardabweichung αTocopherol:
σ = ±2,04)
Antioxidanszusätze
[µmol/kg ROTG]:
Kontrolle
25 α-TOH
500 α-TOH
50 BHA
125 BHA
250 BHA
500 BHA
25 α-TOH + 50 BHA
25 α-TOH + 125 BHA
25 α-TOH + 250 BHA
25 α-TOH + 500 BHA
500 α-TOH + 50 BHA
500 α-TOH + 125 BHA
500 α-TOH + 250 BHA
500 α-TOH + 500 BHA
POZ 5
[Stunden]
13,25
1,93
19,76
25,78
35,90
41,93
51,08
27,71
37,83
43,86
53,01
45,54
55,66
61,69
70,84
24,82
34,70
40,48
49,40
26,99
55,18
73,98
103,37
POZ 10
[Stunden]
15,95
3,81
25,24
28,33
43,33
53,57
61,90
32,14
47,14
57,38
65,71
53,57
68,57
78,81
87,14
27,62
42,14
51,90
60,00
30,24
58,10
78,33
112,86
POZ 25
[Stunden]
22,93
9,51
29,76
36,10
58,78
59,51
87,80
45,61
68,29
69,02
97,32
65,85
88,54
89,27
117,56
34,88
57,07
57,56
85,37
41,95
66,59
87,80
121,46
Synergismus [Stunden]
∆POZ 5
∆POZ 10
∆POZ 25
-2,89
-3,13
-3,38
-3,61
-18,55
-0,48
12,29
32,53
-4,52
-5,00
-5,48
-5,71
-23,33
-10,47
-0,48
25,72
-10,73
-11,22
-11,46
-11,95
-23,90
-21,95
-1,47
3,90
131
3.4.9
Substanzen in Öl-in-Wasser-Emulsionen bei unterschiedlichen Oxidationsstadien
Es konnte für eine Kombination von α-Tocopherol mit Ascorbigen in Emulsion in keiner
Konzentration ein Synergismus identifiziert werden. Ascorbigen wirkte als Einzelantioxidans
in der Emulsion konzentrationsabhängig, wobei mit steigender Konzentration die Lagerstabilität der Emulsion abnahm. Dieser Trend konnte in Kombination mit α-Tocopherol nicht klar
festgestellt werden. Es war kein Unterschied in der Lagerstabilität der Proben mit Ascorbigen
in Kombination mit hoher bzw. niedriger α-Tocopherol-Konzentration zu erkennen (Tab.
3.42).
500 µmol/kg ROTG, mit Ascorbigen (AG) in einer Konzentration von 50 bis 500 µmol/kg ROTG bis zum
σ = ±2,04)
Antioxidanszusätze
[µmol/kg ROTG]:
Kontrolle
25 α-TOH
500 α-TOH
50 AG
125 AG
250 AG
500 AG
25 α-TOH + 50 AG
25 α-TOH + 125 AG
25 α-TOH + 250 AG
25 α-TOH + 500 AG
500 α-TOH + 50 AG
500 α-TOH + 125 AG
500 α-TOH + 250 AG
500 α-TOH + 500 AG
132
POZ 5
[Stunden]
13,64
1,93
19,55
11,70
5,68
3,64
2,73
13,64
7,61
5,57
4,66
31,25
25,23
23,18
22,27
2,16
2,16
1,93
2,16
2,61
2,50
5,57
1,36
POZ 10
[Stunden]
15,85
2,68
25,67
13,84
11,27
7,37
5,47
16,52
13,95
10,04
8,15
39,51
36,94
33,04
31,14
4,24
4,24
2,68
4,24
5,25
5,02
11,16
2,79
POZ 25
[Stunden]
22,27
9,77
29,20
19,66
18,52
15,68
15,68
29,43
28,30
25,45
25,45
48,86
47,73
44,89
44,89
10,68
10,23
9,77
10,45
12,95
12,39
18,07
6,82
∆POZ 5
∆POZ 10
∆POZ 25
-11,48
-5,45
-3,64
-2,50
-28,64
-22,73
-17,61
-20,91
-12,28
-9,71
-7,36
-3,91
-34,26
-31,92
-21,88
-28,35
-18,75
-18,07
-15,68
-15,00
-35,91
-35,34
-26,82
-38,07
Ergebnisse
Ascorbinsäure in Emulsion zeigte nur sehr geringe antioxidative Aktivität, welche mit
steigender Ascorbinsäure-Konzentration leicht abnahm. Auch eine Kombination mit einer
α-Tocopherol-Konzentration von 25 µmol/kg ROTG resultierte in konzentrationsabhängigen
antagonistischen Effekten, d.h. die Lagerstabilität nahm mit zunehmender Konzentration an
Ascorbinsäure ab. Nur bei einer Kombination mit α-Tocopherol in einer Konzentration von
500 µmol/kg ROTG zeigten sich bei hohen Ascorbinsäure-Konzentrationen von 250 und
500 µmol/kg ROTG additive oder leicht synergistische Effekte (Tab. 3.43).
500 µmol/kg ROTG, mit Ascorbinsäure (AS) in einer Konzentration von 50 bis 500 µmol/kg ROTG bis
σ = ±2,04)
Antioxidanszusätze
[µmol/kg ROTG]:
Kontrolle
25 α-TOH
500 α-TOH
50 AS
125 AS
250 AS
500 AS
Berechnet 25 α-TOH + 50 AS
25 α-TOH + 50 AS
25 α-TOH + 125 AS
25 α-TOH + 250 AS
25 α-TOH + 500 AS
500 α-TOH + 50 AS
500 α-TOH + 125 AS
500 α-TOH + 250 AS
500 α-TOH + 500 AS
POZ 5
[Stunden]
8,00
6,52
1,60
3,33
2,13
1,87
1,60
9,86
8,66
8,39
8,12
4,93
3,73
3,47
3,20
3,59
2,83
2,07
1,74
1,87
1,60
4,53
3,20
POZ 10
[Stunden]
12,89
12,34
3,03
6,58
4,34
3,68
3,03
18,92
16,68
16,02
15,37
9,61
7,37
6,71
6,05
7,02
5,74
4,04
3,51
3,68
3,68
8,95
6,32
POZ 25
[Stunden]
18,40
18,70
7,47
15,20
10,93
9,07
7,73
33,90
29,63
27,76
26,43
22,67
18,40
16,53
15,20
15,22
13,91
10,00
8,70
9,20
8,80
17,33
14,93
∆POZ 5
∆POZ 10
∆POZ 25
-6,27
-5,83
-6,32
-6,38
-3,06
-2,13
1,06
0,00
-11,90
-10,94
-11,98
-11,86
-5,93
-3,69
2,24
0,27
-18,68
-15,72
-17,76
-17,73
-13,47
-9,60
0,80
-0,27
133
Carnosolsäure wies eine starke antioxidative Wirkung in Emulsion auf. In Kombination mit
α-Tocopherol war diese allerdings wesentlich geringer (Ausnahme: 500 µmol
α-Tocopherol/kg ROTG + 50 µmol Carnosolsäure/kg ROTG). Diese Wirkungsabnahme
zeigte sich besonders deutlich in Kombination mit α-Tocopherol in einer Konzentration von
500 µmol/kg ROTG. Diese Proben zeigten beinahe identische Lagerstabilitäten wie die
Proben mit nur geringer α-Tocopherol-Konzentration. Die Lagerstabilität der Proben mit der
Kombination der Antioxidantien stieg mit ansteigender Carnosolsäure-Konzentration (Tab.
3.44).
500 µmol/kg ROTG, mit Carnosolsäuree (CS) in einer Konzentration von 50 bis 500 µmol/kg ROTG bis
σ = ±2,04)
Antioxidanszusätze
[µmol/kg ROTG]:
Kontrolle
25 α-TOH
500 α-TOH
50 CS
125 CS
250 CS
500 CS
25 α-TOH + 50 CS
25 α-TOH + 125 CS
25 α-TOH + 250 CS
25 α-TOH + 500 CS
500 α-TOH + 50 CS
500 α-TOH + 125 CS
500 α-TOH + 250 CS
500 α-TOH + 500 CS
134
POZ 5
[Stunden]
3,02
1,93
19,55
53,96
25,09
63,96
30,57
55,89
27,02
65,89
32,50
73,51
44,64
83,51
50,12
11,51
18,68
48,30
30,94
11,32
18,49
47,55
30,38
POZ 10
[Stunden]
4,44
2,68
25,67
55,93
28,52
69,63
36,67
58,61
31,20
72,31
39,35
81,60
54,19
95,30
62,34
15,19
24,63
55,00
37,22
15,19
24,26
54,07
36,48
POZ 25
[Stunden]
16,67
9,77
29,20
24,07
30,00
61,48
48,89
33,84
39,77
71,25
58,66
53,27
59,20
90,68
78,09
24,44
30,37
62,22
49,26
68,89
37,41
77,04
47,04
∆POZ 5
∆POZ 10
∆POZ 25
-44,38
-8,34
-17,59
-1,56
-62,19
-26,15
-35,96
-19,74
-43,42
-6,57
-17,31
-2,13
-66,41
-29,93
-41,23
-25,86
-9,40
-9,40
-9,03
-9,40
15,62
-21,79
-13,64
-31,05
Ergebnisse
Catechin zeigte nur ein geringes antioxidatives Potenzial in Emulsion. Eine Konzentrationsabhängigkeit konnte nicht nachgewiesen werden. Eine Kombination mit α-Tocopherol in
einer Konzentration von 25 µmol/kg ROTG resultierte in synergistischen Effekten bei jeder
Catechin-Konzentration und jeder POZ. Starke antagonistische Effekte hingegen waren in
Kombination mit einer α-Tocopherol-Konzentration von 500 µmol/kg ROTG zu messen. Hier
konnte keine Konzentrationsabhängigkeit nachgewiesen werden (Tab. 3.45).
500 µmol/kg ROTG, mit Catechin (CA) in einer Konzentration von 50 bis 500 µmol/kg ROTG bis zum
Erreichen der POZ 5, 10 und 25 meq O2/kg ROTG. Zusätzlich dargestellt; die Differenz zwischen
berechneter und tatsächlich gemessener Dauer bis zum Erreichen der POZ, +∆ entspricht einer
synergistischen, –∆ einer antagonistischen Interaktion (Standardabweichung α-Tocopherol: σ = ±2,04)
Antioxidanszusätze
[µmol/kg ROTG]:
Kontrolle
25 α-TOH
500 α-TOH
50 CA
125 CA
250 CA
500 CA
25 α-TOH + 50 CA
25 α-TOH + 125 CA
25 α-TOH + 250 CA
25 α-TOH + 500 CA
500 α-TOH + 50 CA
500 α-TOH + 125 CA
500 α-TOH + 250 CA
500 α-TOH + 500 CA
POZ 5
[Stunden]
8,00
1,47
15,47
2,40
1,87
1,87
1,73
3,87
3,33
3,33
3,20
17,87
17,33
17,33
17,20
13,20
5,87
4,53
11,20
1,60
1,60
1,60
1,73
POZ 10
[Stunden]
12,63
2,89
19,74
4,74
3,82
3,95
3,42
7,63
6,71
6,84
6,32
24,47
23,55
23,68
23,16
16,45
11,84
8,95
14,21
3,29
3,29
3,29
3,55
POZ 25
[Stunden]
18,40
7,47
28,27
12,00
9,60
9,87
8,80
19,47
17,07
17,33
16,27
40,27
37,87
38,13
37,07
24,53
18,93
21,33
21,33
8,53
8,53
8,53
9,60
∆POZ 5
∆POZ 10
∆POZ 25
9,33
2,54
1,20
8,00
-16,27
-15,73
-15,73
-15,47
8,82
5,13
2,11
7,89
-21,18
-20,26
-20,39
-19,61
5,06
1,86
4,00
5,06
-31,74
-29,34
-29,60
-27,47
135
Auch Genistein zeigte nur sehr geringe antioxidative Aktivität in Emulsion. Es konnte für
Genistein keine Konzentrationsabhängigkeit nachgewiesen werden. In Kombination mit einer
hohen α-Tocopherol-Konzentration von 500 µmol/kg ROTG konnte fast keine antioxidative
Wirkung identifiziert werden. Im Gegensatz dazu konnte Genistein (nicht bei 50 µmol/kg
ROTG) mit einer geringen α-Tocopherol-Konzentration zu deutlichen synergistischen
Wirkungen interagieren. Diese synergistischen Effekte gehen allerdings bei einer POZ von
25 meq O2/kg ROTG wieder verloren (Tab. 3.46).
500 µmol/kg Emuslion, mit Genistein (GE) in einer Konzentration von 50 bis 500 µmol/kg ROTG bis zum
einer synergistischen, –∆ einer antagonistischen Interaktion. (Standardabweichung α-Tocopherol:
σ = ±2,04)
Antioxidanszusätze
[µmol/kg ROTG]:
Kontrolle
25 α-TOH
500 α-TOH
50 GE
125 GE
250 GE
500 GE
25 α-TOH + 50 GE
25 α-TOH + 125 GE
25 α-TOH + 250 GE
25 α-TOH + 500 GE
500 α-TOH + 50 GE
500 α-TOH + 125 GE
500 α-TOH + 250 GE
500 α-TOH + 500 GE
136
POZ 5
[Stunden]
8,27
1,60
15,47
3,47
3,07
3,47
3,47
5,07
4,67
5,07
5,07
18,93
18,53
18,93
18,93
2,80
18,27
19,47
26,67
1,33
0,00
2,00
2,40
POZ 10
[Stunden]
12,89
3,03
19,74
6,84
6,32
6,97
7,11
9,87
9,34
10,00
10,13
26,58
26,05
26,71
26,84
5,66
24,21
24,74
30,53
2,63
0,00
4,08
4,87
POZ 25
[Stunden]
18,40
7,73
28,27
18,67
20,53
23,47
25,07
26,40
28,27
31,20
32,80
46,93
48,80
51,73
53,33
16,67
30,67
31,20
37,87
6,53
0,00
10,13
12,27
∆POZ 5
∆POZ 10
∆POZ 25
-2,27
13,60
14,40
21,60
-17,60
-18,53
-16,93
-16,53
-4,21
14,87
14,74
20,40
-23,95
-26,05
-22,63
-21,97
-9,73
2,40
0,00
5,07
-40,40
-48,80
-41,60
-41,06
Ergebnisse
Kaempferol bildet in Emulsion mit ansteigender Konzentration eine zunehmende antioxidative Wirkung aus. Dieser Effekt verbindet sich in Kombination mit einer α-TocopherolKonzentration von 25 µmol/kg ROTG zu einer deutlichen synergistischen Wirkung. Bei einer
POZ von 25 meq O2/kg ROTG geht diese allerdings verloren. Auch eine zu hohe Kaempferol-Konzentration verhindert eine synergistische Wirkung mit α-Tocopherol. In Kombination
mit einer hohen α-Tocopherol-Konzentration von 500 µmol/kg ROTG ist immer noch eine
Konzentrationsabhängigkeit, aber keine synergistische Wirkung, sondern ein antagonistischer
Effekt zu finden (Tab. 3.47).
500 µmol/kg ROTG, mit Kaempferol (KP) in einer Konzentration von 50 bis 500 µmol/kg ROTG bis zum
σ = ±2,04)
Antioxidanszusätze
[µmol/kg ROTG]:
Kontrolle
25 α-TOH
500 α-TOH
50 KP
125 KP
250 KP
500 KP
25 α-TOH + 50 KP
25 α-TOH + 125 KP
25 α-TOH + 250 KP
25 α-TOH + 500 KP
500 α-TOH + 50 KP
500 α-TOH + 125 KP
500 α-TOH + 250 KP
500 α-TOH + 500 KP
POZ 5
[Stunden]
8,11
1,49
15,81
2,43
3,11
17,03
43,11
3,92
4,59
18,51
44,59
18,24
18,92
32,84
58,92
18,38
7,03
27,84
40,41
1,62
2,30
10,54
18,38
POZ 10
[Stunden]
12,89
3,03
19,74
5,00
6,32
26,32
49,47
8,03
9,34
29,34
52,50
24,74
26,05
46,05
69,21
24,08
12,89
33,16
44,47
3,16
4,61
21,05
24,74
POZ 25
[Stunden]
18,40
7,47
28,27
12,53
17,33
36,80
61,33
20,00
24,80
44,27
68,80
40,80
45,60
65,07
89,60
29,47
23,47
40,93
54,67
8,00
11,47
32,53
43,20
∆POZ 5
∆POZ 10
∆POZ 25
14,46
2,44
9,33
-4,18
-16,62
-16,62
-22,30
-40,54
16,05
3,55
3,82
-8,03
-21,58
-21,44
-25,00
-44,47
9,47
-1,33
-3,34
-14,13
-32,80
-34,13
-32,54
-46,40
137
Kaffeesäure wies in Emulsion nur schwache antioxidative Wirkung auf, die konzentrationsunabhängig stark schwankte. In Kombination mit α-Tocopherol zeigte sich in allen
Konzentrationen ein antagonistischer Effekt, welcher besonders stark bei hohen
α-Tocopherol-Konzentrationen ausgebildet war. Auch hier waren starke Schwankungen in der
Lagerstabilität der einzelnen Proben zu erkennen (Tab. 3.48).
500 µmol/kg ROTG, mit Kaffeesäure (KS) in einer Konzentration von 50 bis 500 µmol/kg ROTG bis zum
σ = ±2,04)
Antioxidanszusätze
[µmol/kg ROTG]:
Kontrolle
25 α-TOH
500 α-TOH
50 KS
125 KS
250 KS
500 KS
25 α-TOH + 50 KS
25 α-TOH + 125 KS
25 α-TOH + 250 KS
25 α-TOH + 500 KS
500 α-TOH + 50 KS
500 α-TOH + 125 KS
500 α-TOH + 250 KS
500 α-TOH + 500 KS
138
POZ 5
[Stunden]
13,80
1,58
18,55
12,67
2,04
12,22
2,60
14,25
3,62
13,80
4,19
31,22
20,59
30,77
21,15
12,90
1,81
12,33
2,49
1,70
1,47
1,92
1,92
POZ 10
[Stunden]
15,78
3,78
24,78
14,44
4,22
13,67
5,11
18,22
8,00
17,44
8,89
39,22
29,00
38,44
29,89
14,33
4,11
13,56
5,11
3,33
2,89
4,11
4,00
POZ 25
[Stunden]
22,17
9,50
29,30
20,14
10,41
18,21
12,90
29,64
19,91
27,71
22,40
49,43
39,71
47,51
42,19
19,91
10,41
18,10
12,85
8,14
7,24
10,18
9,84
∆POZ 5
∆POZ 10
∆POZ 25
-1,35
-1,81
-1,47
-1,70
-29,52
-19,12
-28,85
-19,23
-3,89
-3,89
-3,88
-3,78
-35,89
-26,11
-34,33
-25,89
-9,73
-9,50
-9,61
-9,55
-41,29
-32,47
-37,33
-32,35
Ergebnisse
Liponsäure zeigte in Emulsion gute antioxidative Effizienz. Allerdings konnte keine
konzentrationsabhängige Wirkung festgestellt werden. In Kombination mit einer
α-Tocopherol-Konzentration von 25 µmol/kg ROTG zeigte sich eine äquivalente Wirkung. In
Kombination mit einer α-Tocopherol-Konzentration von 500 µmol/kg ROTG ging die
Lagerstabilität der Proben stark zurück. Somit konnte für diese Antioxidantien-Kombination
keine synergistische, sondern nur eine antagonistische Wirkung gefunden werden (Tab. 3.49).
500 µmol/kg ROTG, mit Liponsäure (LS) in einer Konzentration von 50 bis 500 µmol/kg ROTG bis zum
σ = ±2,04)
Antioxidanszusätze
[µmol/kg ROTG]:
Kontrolle
25 α-TOH
500 α-TOH
50 LS
125 LS
250 LS
500 LS
25 α-TOH + 50 LS
25 α-TOH + 125 LS
25 α-TOH + 250 LS
25 α-TOH + 500 LS
500 α-TOH + 50 LS
500 α-TOH + 125 LS
500 α-TOH + 250 LS
500 α-TOH + 500 LS
POZ 5
[Stunden]
13,72
1,86
19,77
12,79
14,30
13,72
13,02
14,65
16,16
15,58
14,88
32,56
34,07
33,49
32,79
12,79
14,30
13,72
13,02
2,09
12,79
2,67
2,44
POZ 10
[Stunden]
15,91
3,86
24,77
15,00
16,36
15,68
14,77
18,86
20,23
19,55
18,64
39,77
41,14
40,45
39,55
15,11
15,68
16,48
14,77
4,32
15,11
5,11
4,89
POZ 25
[Stunden]
21,84
9,66
28,05
21,72
22,99
21,15
20,23
31,38
32,64
30,80
29,89
49,77
51,03
49,20
48,28
21,95
22,99
21,61
20,23
10,69
22,30
12,87
12,07
∆POZ 5
∆POZ 10
∆POZ 25
-1,86
-1,86
-1,86
-1,86
-30,47
-21,28
-30,82
-30,35
-3,75
-4,55
-3,07
-3,87
-35,45
-26,03
-35,34
-34,66
-9,43
-9,65
-9,19
-9,66
-39,08
-28,73
-36,33
-36,21
139
Oleuropein zeigte nur eine geringe inhibierende Wirkung in Emulsion. In Kombination mit
einer α-Tocopherol-Konzentration von 25 µmol/kg ROTG konnten für die OleuropeinKonzentrationen von 50 und 125 µmol/kg ROTG synergistische Interaktionen identifiziert
werden, die aber bei weiter steigender Oleuropein-Konzentration in antagonistischen Effekten
resultierten. Es zeigte sich hier also eine konzentrationsabhängige Wirkung. In Kombination
mit einer α-Tocopherol-Konzentration von 500 µmol/kg ROTG konnten ebenfalls nur
antagonistische Wirkungen nachgewiesen werden (Tab. 3.50).
500 µmol/kg ROTG, mit Oleuropein (OL) in einer Konzentration von 50 bis 500 µmol/kg ROTG bis zum
σ = ±2,04)
Antioxidanszusätze
[µmol/kg ROTG]:
Kontrolle
25 α-TOH
500 α-TOH
50 OL
125 OL
250 OL
500 OL
25 α-TOH + 50 OL
25 α-TOH + 125 OL
25 α-TOH + 250 OL
25 α-TOH + 500 OL
500 α-TOH + 50 OL
500 α-TOH + 125 OL
500 α-TOH + 250 OL
500 α-TOH + 500 OL
140
POZ 5
[Stunden]
3,07
1,93
19,55
1,87
1,60
1,73
1,60
3,80
3,53
3,66
3,53
21,42
21,15
21,28
21,15
4,53
4,27
3,47
2,67
2,00
2,13
1,73
1,47
POZ 10
[Stunden]
6,18
2,68
25,67
3,68
3,03
3,42
3,29
6,36
5,71
6,10
5,97
29,35
28,70
29,09
28,96
9,21
8,95
6,84
5,39
3,95
4,21
3,68
2,89
POZ 25
[Stunden]
17,07
9,77
29,20
9,07
7,47
8,53
8,13
18,84
17,24
18,30
17,90
38,27
36,67
37,73
37,33
20,80
17,33
15,47
13,60
10,13
10,53
8,93
7,20
∆POZ 5
∆POZ 10
∆POZ 25
0,73
0,74
-0,19
-0,86
-19,42
-19,02
-19,55
-19,68
2,85
3,24
0,74
-0,58
-25,40
-24,49
-25,41
-26,07
1,96
0,09
-2,83
-4,30
-28,14
-26,14
-28,80
-30,13
Ergebnisse
Quercetin zeigte starke, nicht konzentrationsabhängige antioxidative Wirkung in Emulsion.
Eine Kombination mit α-Tocopherol resultierte in jeder Kombination in antagonistischen
Effekten, wobei sich hierbei eine geringe Konzentrationsabhängigkeit herausstellte. Mit
steigender Quercetin-Konzentration konnte eine geringe Verbesserung der Lagerstabilität der
Proben konstatiert werden (Tab. 3.51).
500 µmol/kg ROTG, mit Quercetin (QU) in einer Konzentration von 50 bis 500 µmol/kg ROTG bis zum
σ = ±2,04)
Antioxidanszusätze
[µmol/kg ROTG]:
Kontrolle
25 α-TOH
500 α-TOH
50 QU
125 QU
250 QU
500 QU
25 α-TOH + 50 QU
25 α-TOH + 125 QU
25 α-TOH + 250 QU
25 α-TOH + 500 QU
500 α-TOH + 50 QU
500 α-TOH + 125 QU
500 α-TOH + 250 QU
500 α-TOH + 500 QU
POZ 5
[Stunden]
13,69
1,92
19,68
14,25
12,56
13,69
15,61
16,18
14,48
15,61
17,53
33,94
32,24
33,37
35,29
2,26
2,26
6,45
9,95
5,09
6,67
2,15
14,93
POZ 10
[Stunden]
15,78
3,78
24,67
16,56
14,44
15,56
19,11
20,33
18,22
19,33
22,89
41,22
39,11
40,22
43,78
4,44
4,44
12,22
13,78
10,11
12,44
4,44
17,89
POZ 25
[Stunden]
22,17
9,62
29,19
23,42
19,80
20,93
29,86
33,03
29,41
30,54
39,48
52,60
48,98
50,11
59,05
11,31
11,31
16,97
18,89
19,00
18,55
11,09
27,94
∆POZ 5
∆POZ 10
∆POZ 25
-13,92
-12,22
-9,16
-7,58
-28,85
-25,57
-31,22
-20,36
-15,89
-13,78
-7,11
-9,11
-31,11
-26,67
-35,78
-25,89
-21,72
-18,10
-13,57
-20,59
-33,60
-30,43
-39,02
-31,11
141
Rosmarinsäure zeigte nur geringe antioxidative Effektivität in Emulsion, welche mit
steigender Rosmarinsäure-Konzentration noch geringer wurde. Eine Kombination mit
α-Tocopherol resultierte bei niedrigen Rosmarinsäure-Konzentrationen in geringen
synergistischen Effekten, diese waren bei einer POZ von 25 meq O2/kg ROTG nicht mehr
messbar. Bei allen anderen Kombinationen zwischen Rosmarinsäure und α-Tocopherol
wurden antagonistische Effekte gemessen, die besonders stark bei hoher α-TocopherolKonzentration ausgebildet waren (Tab. 3.52).
500 µmol/kg ROTG, mit Rosmarinsäure (RS) in einer Konzentration von 50 bis 500 µmol/kg ROTG bis
σ = ±2,04)
Antioxidanszusätze
[µmol/kg ROTG]:
Kontrolle
25 α-TOH
500 α-TOH
50 RS
125 RS
250 RS
500 RS
25 α-TOH + 50 RS
25 α-TOH + 125 RS
25 α-TOH + 250 RS
25 α-TOH + 500 RS
500 α-TOH + 50 RS
500 α-TOH + 125 RS
500 α-TOH + 250 RS
500 α-TOH + 500 RS
142
POZ 5
[Stunden]
3,02
1,93
19,55
2,54
3,49
1,75
1,59
4,47
5,42
3,68
3,52
22,09
23,04
21,30
21,14
5,08
4,13
2,54
2,06
25,71
1,90
2,22
1,11
POZ 10
[Stunden]
6,09
2,68
25,67
5,00
7,19
3,59
3,28
7,68
9,87
6,27
5,96
30,67
32,86
29,26
28,95
10,00
8,28
5,00
4,22
27,66
3,75
4,38
2,19
POZ 25
[Stunden]
16,83
9,77
29,20
12,70
19,37
8,89
8,25
22,47
29,14
18,66
18,02
41,90
48,57
38,09
37,45
20,63
19,05
12,70
10,63
33,17
9,52
11,11
5,40
∆POZ 5
∆POZ 10
∆POZ 25
0,61
-1,29
-1,14
-1,46
3,62
-21,14
-19,08
-20,03
2,32
-1,59
-1,27
-1,74
-3,01
-29,11
-24,88
-26,76
-1,84
-10,09
-5,96
-7,39
-8,73
-39,05
-26,98
-32,05
Ergebnisse
Sinapinsäure wies nur geringe antioxidative Aktivität in Emulsion auf, die sich auch durch
eine Kombination mit α-Tocopherol weder in einer Konzentration von 25 noch von
500 µmol/kg ROTG verstärken ließ. Bei hoher α-Tocopherol-Konzentration konnten sogar
negative Konzentrationsabhängigkeiten identifiziert werden, d.h. dass mit steigender
Sinapinsäure-Konzentration die Lagerstabilität der Proben abnahm. Eine Kombination von
Sinapinsäure mit α-Tocopherol resultierte also in antagonistischen Interaktionen (Tab. 3.53).
500 µmol/kg ROTG, mit Sinapinsäure (SIS) in einer Konzentration von 50 bis 500 µmol/kg ROTG bis
σ = ±2,04)
Antioxidanszusätze
[µmol/kg ROTG]:
Kontrolle
25 α-TOH
500 α-TOH
50 SIS
125 SIS
250 SIS
500 SIS
25 α-TOH + 50 SIS
25 α-TOH + 125 SIS
25 α-TOH + 250 SIS
25 α-TOH + 500 SIS
500 α-TOH + 50 SIS
500 α-TOH + 125 SIS
500 α-TOH + 250 SIS
500 α-TOH + 500 SIS
POZ 5
[Stunden]
3,07
1,93
19,55
1,33
2,00
1,60
1,60
3,26
3,93
3,53
3,53
20,88
21,55
21,15
21,15
1,20
1,87
1,33
1,33
2,27
1,33
1,60
1,33
POZ 10
[Stunden]
6,18
2,68
25,67
2,89
3,95
3,29
3,29
5,57
6,63
5,97
5,97
28,56
29,62
28,96
28,96
2,89
3,95
3,29
3,29
4,61
3,16
3,42
2,89
POZ 25
[Stunden]
16,80
9,77
29,20
6,00
9,73
8,27
8,27
15,77
19,50
18,04
18,04
35,20
38,93
37,47
37,47
7,33
9,73
8,27
8,27
11,47
6,40
8,53
5,60
∆POZ 5
∆POZ 10
∆POZ 25
-2,06
-2,06
-2,20
-2,20
-18,61
-20,22
-19,55
-19,82
-2,68
-2,68
-2,68
-2,68
-23,95
-26,46
-25,54
-26,07
-8,44
-9,77
-9,77
-9,77
-23,73
-32,53
-28,94
-31,87
143
Tyrosol zeigte eine gute antioxidative Aktivität in Emulsion, die eine leichte Konzentrationsabhängigkeit aufwies. So stieg die Lagerstabilität der Proben leicht durch eine Konzentrationserhöhung von Tyrosol. Bei einem kombinierten Einsatz mit α-Tocopherol konnten nur
antagonistische Effekte identifiziert werden. Bei einer Kombination mit einer geringen
α-Tocopherol-Konzentration von 25 µmol/kg ROTG zeigten sich diese nur schwach, bei
einigen Proben war sogar ein additiver Effekt zu beobachten. Bei einer höheren
α-Tocopherol-Konzentration von 500 µmol/kg ROTG waren die negativen Interaktionen stark
ausgebildet. Es konnte eine Konzentrationsabhängigkeit beobachtet werden, durch die mit
steigender Tyrosol-Konzentration die Lagerstabilität der Proben abnahm (Tab. 3.54).
500 µmol/kg ROTG, mit Tyrosol (TL) in einer Konzentration von 50 bis 500 µmol/kg ROTG bis zum
σ = ±2,04)
Antioxidanszusätze
[µmol/kg ROTG]:
Kontrolle
25 α-TOH
500 α-TOH
50 TL
125 TL
250 TL
500 TL
25 α-TOH + 50 TL
25 α-TOH + 125 TL
25 α-TOH + 250 TL
25 α-TOH + 500 TL
500 α-TOH + 50 TL
500 α-TOH + 125 TL
500 α-TOH + 250 TL
500 α-TOH + 500 TL
144
POZ 5
[Stunden]
3,07
1,93
19,55
12,27
13,07
14,27
15,33
14,20
15,00
16,20
17,26
31,82
32,62
33,82
34,88
13,60
14,13
14,40
16,93
14,27
2,40
1,60
24,80
POZ 10
[Stunden]
6,32
2,68
25,67
15,53
15,79
17,37
20,39
18,21
18,47
20,05
23,07
41,20
41,46
43,04
46,06
17,63
18,42
18,68
22,11
17,37
4,61
3,16
27,76
POZ 25
[Stunden]
16,80
9,77
29,20
24,53
24,00
25,73
25,73
34,30
33,77
35,50
35,50
53,73
53,20
54,93
54,93
27,73
28,27
27,07
32,93
30,13
11,60
8,00
36,00
∆POZ 5
∆POZ 10
∆POZ 25
-0,60
-0,87
-1,80
-0,33
-17,55
-30,22
-32,22
-10,08
-0,58
-0,05
-1,37
-0,96
-23,83
-36,85
-39,88
-18,30
-6,57
-5,50
-8,43
-2,57
-23,60
-41,60
-46,93
-18,93
Ergebnisse
Vanillinsäure war ein schwaches Antioxidans in Emulsion. In Kombination mit α-Tocopherol
in einer Konzentration von 25 µmol/kg ROTG zeigten sich aber starke, konzentrationsabhängige synergistische Effekte. So vergrößerte sich die Lagerstabilität der Proben durch eine
höhere Konzentration an Vanillinsäure. Eine Bestimmung der Interaktionen bei einer hohen
POZ von 25 meq O2/kg ROTG zeigte synergistische Effekte allerdings nur bei geringeren
Vanillinsäure-Konzentrationen. Eine Kombination mit einer α-Tocopherol-Konzentration von
500 µmol/kg ROTG vergrößerte die positiven Interaktionen nicht, sondern führte zu starken
antagonistischen Effekten (Ausnahme: 500 µmol α-Tocopherol/kg ROTG + 250 µmol
Vanillinsäure/kg ROTG) (Tab. 3.55)
500 µmol/kg ROTG, mit Vanillinsäure (VS) in einer Konzentration von 50 bis 500 µmol/kg ROTG bis
σ = ±2,04)
Antioxidanszusätze
[µmol/kg ROTG]:
Kontrolle
25 α-TOH
500 α-TOH
50 VS
125 VS
250 VS
500 VS
25 α-TOH + 50 VS
25 α-TOH + 125 VS
25 α-TOH + 250 VS
25 α-TOH + 500 VS
500 α-TOH + 50 VS
500 α-TOH + 125 VS
500 α-TOH + 250 VS
500 α-TOH + 500 VS
POZ 5
[Stunden]
8,00
1,47
15,47
2,80
2,67
2,93
3,20
4,27
4,13
4,40
4,67
18,27
18,13
18,40
18,67
14,40
13,07
37,60
17,47
1,73
56,27
1,73
1,20
POZ 10
[Stunden]
13,03
2,89
19,61
5,39
5,13
5,66
6,32
8,29
8,03
8,55
9,21
25,00
24,74
25,26
25,92
17,63
16,32
39,87
23,42
3,42
61,32
3,68
2,37
POZ 25
[Stunden]
18,40
7,60
28,27
15,20
13,87
17,60
17,60
22,80
21,47
25,20
25,20
43,47
42,13
45,87
45,87
25,07
24,27
46,13
44,40
8,53
0,00
8,80
6,00
∆POZ 5
∆POZ 10
∆POZ 25
10,13
8,94
33,20
12,80
-16,54
38,14
-16,67
-17,47
9,34
8,29
31,32
14,21
-21,58
36,58
-21,58
-23,55
2,27
2,80
20,93
19,20
-34,94
-42,13
-37,07
-39,87
145
Vinylsyringol zeigte eine von der Konzentration unbeeinflusste antioxidative Wirkung in
Emulsion. Durch eine Kombination mit α-Tocopherol in einer Konzentration von 25 µmol/kg
ROTG konnten sich synergistische Wirkungen mit allen Vinylsyringol-Konzentrationen
ausbilden. Bei einer Bestimmung der Interaktionen bei einer POZ von 25 meq O2/kg ROTG
konnten allerdings nur noch leichte antagonistische Effekte gefunden werden. Eine Erhöhung
der α-Tocopherol-Konzentration auf 500 µmol/kg ROTG brachte ebenfalls nur antagonistische Effekte mit sich. Es konnte sowohl unter den synergistischen Interaktionen als auch
unter den antagonistischen Interaktionen keine Konzentrationsabhängigkeit identifiziert
werden (Tab. 3.56).
500 µmol/kg ROTG, mit Vinylsyringol (VL) in einer Konzentration von 50 bis 500 µmol/kg ROTG bis
σ = ±2,04)
Antioxidanszusätze
[µmol/kg ROTG]:
Kontrolle
25 α-TOH
500 α-TOH
50 VL
125 VL
250 VL
500 VL
25 α-TOH + 50 VL
25 α-TOH + 125 VL
25 α-TOH + 250 VL
25 α-TOH + 500 VL
500 α-TOH + 50 VL
500 α-TOH + 125 VL
500 α-TOH + 250 VL
500 α-TOH + 500 VL
146
POZ 5
[Stunden]
3,07
1,93
19,55
8,27
6,27
5,20
7,07
10,20
8,20
7,13
9,00
27,82
25,82
24,75
26,62
14,93
16,13
16,13
16,80
14,00
9,20
9,73
12,00
POZ 10
[Stunden]
6,18
2,68
25,67
13,82
11,97
10,53
12,89
16,50
14,65
13,21
15,57
39,49
37,64
36,20
38,56
18,42
20,66
20,66
22,11
17,89
14,34
14,21
15,26
POZ 25
[Stunden]
16,80
9,77
29,20
21,47
21,07
19,60
20,80
31,24
30,84
29,37
30,57
50,67
50,27
48,80
50,00
28,00
28,27
28,27
32,27
27,20
23,20
23,20
27,73
∆POZ 5
∆POZ 10
∆POZ 25
4,73
7,93
9,00
7,80
-13,82
-16,62
-15,02
-14,62
1,92
6,01
7,45
6,54
-21,60
-23,30
-21,99
-23,30
-3,24
-2,57
-1,10
1,70
-23,47
-27,07
-25,60
-22,27
Ergebnisse
In Emulsionen konnten für α-Tocopherol folgende Substanzen mit synergistischen
Interaktionen identifiziert werden: Butylhydroxyanisol (nur bei hoher α-TocopherolKonzentration), Ascorbinsäure (nur bei hoher α-Tocopherol-Konzentration und hoher
Ascorbinsäure-Konzentration), Catechin, Genistein und Kaempferol (jeweils nur bei niedriger
α-Tocopherol-Konzentration), Oleuropein und Rosmarinsäure (jeweils nur bei niedriger
α-Tocopherol-Konzentration und niedriger Synergisten-Konzentration), Vanillinsäure und
Vinylsyringol (jeweils nur bei geringer α-Tocopherol-Konzentration). Mit Tyrosol zeigten
sich in Gegenwart von α-Tocopherol gelegentlich additive Effekte. Alle anderen Kombinationen mit α-Tocopherol führten in Emulsionen zu antagonistischen Reaktionen.
3.4.10
Interaktionen phenolischer Antioxidantien mit α-Tocopherol in micellarer
Lösung
Um den Einfluss der Matrix ohne Lipidoxidationsprodukte auf die Antioxidantien zu
untersuchen und um lipidoxidationsunabhängige Reaktionen untereinander zu identifizieren,
wurde der Abbau von α-Tocopherol und der zugegebenen phenolischen Antioxidantien in
micellarer Lösung mittels reversed-phase-HPLC (phenolische Antioxidantien) und normalphase-HPLC (α-Tocopherol) untersucht. Es wurden Konzentrationen entsprechend der
Emulsion eingesetzt und danach bei 40 °C im Dunkeln gelagert. Die Messungen erfolgten im
Abstand von 7 Tagen für die phenolischen Antioxidantien und von 14 Tagen für
α-Tocopherol.
3.4.10.1
Abbau von α-Tocopherol in micellarer Lösung
Die systemabhängigen Wechselwirkungen sollten am Beispiel von α-Tocopherol mit
Carnosolsäure, Kaffeesäure und Vanillinsäure dargestellt werden. Diese drei Antioxidantien
wurden aus unterschiedlichen Gründen ausgewählt. Carnosolsäure hatte sich als ein gutes
Antioxidans in Emulsion herausgestellt. In Kombination mit α-Tocopherol wies sie allerdings
einen antagonistischen Effekt in Emulsion auf. Kaffeesäure zeigte nur sehr geringe
antioxidative Aktivität in Emulsion und resultierte in Kombination mit α-Tocopherol
ebenfalls in negativen Interaktionen. Vanillinsäure wies nur geringe antioxidative Wirkung in
Emulsion auf, zeigte aber positive Interaktionen in Kombination mit α-Tocopherol, d.h einen
synergistischen Effekt.
3.4.10.2
Abbau von α-Tocopherol in Gegenwart von Kaffeesäure
Bei einer α-Tocopherol-Konzentration von 2,5 µmol/kg micellare Lösung hatte ein Zusatz
von Kaffeesäure in einem Konzentrationsbereich von 5,0 bis 50,0 µmol/kg micellare Lösung
147
0,030
0,030
[mmol/kg ROTG]
c(α-TOH)
keinen Einfluss auf die Abbaugeschwindigkeit von α-Tocopherol. Bei allen eingesetzten
Proben war das α-Tocopherol nach 56 Tagen abgebaut (Abb. 3.54).
0,025
0,025
0,020
0,020
0,015
0,015
0,010
0,010
0,005
0,005
0,000
0,000
0
20
40
60
80
Lagerdauer
40°
C, dunkel
Lagerdauer
beibei
40°C,
dunkel
[Tage][Tage]
2,5 µmol α-TOH
2,5 µmol α-TOH + 5,0 µmol KS
Abb. 3.54: Abbau von α-Tocopherol (α-TOH) in einer Konzentration von 2,5 µmol/kg in micellarer
Lösung in Gegenwart von Kaffeesäure (KS) in den Konzentrationen von 5,0, 12,5, 25,0 und 50,0 µmol/kg
micellarer Lösung bei 40°C im Dunkeln
Bei Erhöhung der α-Tocopherol-Konzentration auf 50,0 µmol/kg micellarer Lösung zeigte
sich, dass der Abbau von α-Tocopherol sogar schneller ablief als in Kombination mit
2,5 µmol/kg miccellare Lösung. So war bei einer Probe mit einer α-Tocopherolkonzentration
von 50,0 µmol/kg micellarer Lösung und einer Kaffeesäurekonzentration von 50,0 µmol/kg
micellarer Lösung bereits nach 14 Tagen fast das gesamte α-Tocopherol abgebaut. Je geringer
die Kaffeesäurekonzentration, desto langsamer verlief der α-Tocopherolabbau. Am
langsamsten baute sich das α-Tocopherol bei der Probe ohne jeglichen Kaffeesäurezusatz ab
(Abb. 3.55).
148
Ergebnisse
c(alpha-TOH)
[mmol/kg ROTG]
0,600
0,500
0,400
0,300
0,200
0,100
0,000
0
20
40
60
80
100
120
50,0 µmol α-TOH
Lösung in Gegenwart von Kaffeesäure (KS) in den Konzentrationen von 5,0, 12,5, 25,0 und 50,0 µmol/kg
micellarer Lösung bei 40°C im Dunkeln.
3.4.10.2.1
Abbau von α-Tocopherol in Gegenwart von Carnosolsäure
c(alpha-TOH) [mmol/kg ROTG]
Der Abbau einer α-Tocopherol-Konzentration von 2,5 µmol/kg micellarer Lösung erfolgte zu
Beginn der Lagerung in Gegenwart von Carnosolsäure schneller als in seiner Abwesenheit.
Dennoch war bei allen Proben das α-Tocopherol erst nach 56 Tagen vollständig abgebaut
(Abb. 3.56).
0,030
0,025
0,020
0,015
0,010
0,005
0,000
0
10
20
30
40
50
2,5 µmol α-TOH
2,5 µmol α-TOH + 12,5 µmol CS
60
70
80
Lösung in Gegenwart von Carnosolsäure (CS) in den Konzentrationen von 5,0, 12,5, 25,0 und 50,0
µmol/kg micellarer Lösung bei 40°C im Dunkeln.
149
Bei Erhöhung der α-Tocopherol-Konzentration auf 50,0 µmol/kg micellare Lösung wurde
dieser Effekt noch wesentlich deutlicher. Es zeigte sich eine starke Konzentrationsabhängigkeit. Das α-Tocopherol baute sich mit steigender Carnosolsäure-Konzentration immer
schneller ab. So war das α-Tocopherol mit den Carnosolsäure-Konzentrationen von 5,0, 12,5
und 25,0 µmol/kg micellare Lösung bereits nach 56 Tagen und das mit einer CarnosolsäureKonzentration von 50,0 µmol/kg erst nach 70 Tagen abgebaut. Die Probe ohne Carnosolsäure
benötigte am längsten für den Abbau des α-Tocopherols (Abb. 3.57).
c(alpha-TOH)
[mmol/kg ROTG]
0,600
0,500
0,400
0,300
0,200
0,100
0,000
0
20
40
60
80
100
120
50,0 µmol α-TOH
Lösung in Gegenwart von Carnosolsäure (CS) in den Konzentrationen von 5,0, 12,5, 25,0 und 50,0
µmol/kg micellarer Lösung bei 40°C im Dunkeln.
3.4.10.2.2
Abbau von α-Tocopherol in Gegenwart von Vanillinsäure
In Gegenwart unterschiedlicher Konzentrationen an Vanillinsäure verlief der Abbau einer
α-Tocopherol-Konzentration von 2,5 µmol/kg micellarer Lösung unbeeinflusst. Das
α-Tocopherol war nach 56 Tagen vollständig abgebaut. In der Probe mit einer VanillinsäureKonzentration von 50,0 µmol/kg micellarer Lösung verlief die Entwicklung etwas rascher.
Dafür dauerte der Abbau bei der Probe mit einer Vanillinsäure-Konzentration von
25,0 µmol/kg micellarer Lösung mit 70 Tagen etwas länger (Abb. 3.58).
150
Ergebnisse
c(alpha-TOH) [mmol/kg ROTG]
0,030
0,025
0,020
0,015
0,010
0,005
0,000
0
10
20
30
40
50
60
70
80
2,5 µmol α-TOH
2,5 µmol α-TOH + 5,0 µmol VS
Lösung in Gegenwart von Vanillinsäure (VS) in den Konzentrationen von 5,0, 12,5, 25,0 und 50,0 µmol/kg
sich ebenfalls kein deutlicher Einfluss der unterschiedlichen Vanillinsäure-Konzentrationen.
Der Abbau des α-Tocopherols verlief bei allen Proben parallel (Abb. 3.59).
c(alpha-TOH)
[mmol/kg ROTG]
0,600
0,500
0,400
0,300
0,200
0,100
0,000
0
20
40
60
80
100
120
50,0 µmol α-TOH
Lösung in Gegenwart von Vanillinsäure (VS) in den Konzentrationen von 5,0, 12,5, 25,0 und 50,0 µmol/kg
151
3.4.10.3
Abbau von Kaffeesäure in Gegenwart von unterschiedlichen Konzentrationen
an α-Tocopherol
Der Abbau unterschiedlicher Kaffeesäure-Konzentrationen im Bereich von 5,0 bis
50,0 µmol/kg micellare Lösung mit einer α-Tocopherol-Konzentration von 2,5 µmol/kg
c(Kaffeesäure)
[µmol/kg micellare Lösung]
micellare Lösung erfolgte wie schon der Abbau von α-Tocopherol in Gegenwart von
Kaffeesäure unbeeinflusst. Der Abbau der Kaffeesäure verlief sowohl mit als auch ohne
α-Tocopherol parallel, wobei der Abbau konzentrationsabhängig war. So war eine
Konzentration an Kaffeesäure von 5,0 µmol/kg micellare Lösung bereits nach 14 Tagen
vollständig abgebaut, eine Konzentration von 12,5 µmol/kg micellare Lösung nach 63 Tagen,
25,0 µmol/kg micellare Lösung nach 84 Tagen, die 50,0 µmol/kg micellare Lösung waren
nach 100 Tagen noch nicht vollständig abgebaut (Abb. 3.60).
40
35
30
25
20
15
10
5
0
0
20
40
60
80
100
120
5,0 µmol KS
12,5 µmol KS
25,0 µmol KS
50,0 µmol KS
Abb. 3.60: Abbau von Kaffeesäure (KS) in Konzentrationen von 5,0 bis 50,0 µmol/kg in micellarer Lösung
in Gegenwart von α-Tocopherol (α-TOH) in einer Konzentration von 2,5 µmol/kg micellarer Lösung bei
40°C im Dunkeln.
sich bei niedrigen Kaffeesäure-Konzentrationen kein Einfluss auf die Abbaugeschwindigkeit
der Kaffeesäure. Deutlich wurde dieser allerdings bei einer Kaffeesäure-Konzentration von
50,0 µmol/kg micellare Lösung. Hier zeigte sich ein zügigerer Abbau in Gegenwart von
α-Tocopherol zu Beginn der Lagerung. Aufgrund der anfänglich höheren Abbaugeschwindigkeit war bei der Probe mit α-Tocopherol bereits nach 56 Tagen und bei der Probe ohne
α-Tocopherol erst nach 84 Tagen die gesamte Kaffeesäure abgebaut (Abb. 3.61).
152
c(Kaffeesäure) [µmol/kg micellare
Lösung]
Ergebnisse
40
35
30
25
20
15
10
5
0
0
20
40
60
5,0 µmol KS
25,0 µmol KS
80
100
12,5 µmol KS
50,0 µmol KS
Abb. 3.61: Abbau von Kaffeesäure (KS) in Konzentrationen von 5,0 bis 50,0 µmol/kg in micellarer Lösung
in Gegenwart von α-Tocopherol (α-TOH) in einer Konzentration von 50,0 µmol/kg micellarer Lösung bei
40°C im Dunkeln.
3.4.10.4
Abbau von Vanillinsäure in Gegenwart unterschiedlicher Konzentrationen an
α-Tocopherol
c(Vanillinsäure)
Hinsichtlich des Abbaus von Vanillinsäure wurde deutlich, dass die VanillinsäureKonzentration sowohl in Gegenwart als auch in Abwesenheit von α-Tocopherol über die
gesamte Lagerdauer von fast 100 Tagen nicht beeinflusst wurde. Die Vanillinsäure lag in
allen Konzentrationen von 5,0 bis 50,0 µmol/kg micellarer Lösung stabil vor (Abb. 3.62).
70
60
50
40
30
20
10
0
0
20
40
60
80
100
5,0 µmol VS
12,5 µmol VS
25,0 µmol VS
50,0 µmol VS
Abb. 3.62: Abbau von Vanillinsäure (VS) in Konzentrationen von 5,0 bis 50,0 µmol/kg in micellarer
Lösung in Gegenwart von α-Tocopherol (α-TOH) in einer Konzentration von 2,5 µmol/kg micellarer
Lösung bei 40°C im Dunkeln.
153
c(Vanillinsäure)
Auch eine höhere α-Tocopherol-Konzentration von 50,0 µmol/kg micellarer Lösung zeigte
keinen Einfluss auf die Stabilität der Vanillinsäure (Abb. 3.63).
60
50
40
30
20
10
0
0
20
40
60
80
100
5,0 µmol VS
12,5 µmol VS
25,0 µmol VS
50,0 µmol VS
Abb. 3.63: Abbau von Vanillinsäure (VS) in Konzentrationen von 5,0 bis 50,0 µmol/kg in micellarer
Lösung in Gegenwart von α-Tocopherol (α-TOH) in einer Konzentration von 50,0 µmol/kg micellarer
Lösung bei 40°C im Dunkeln.
154
Diskussion
4
4.1
Diskussion
Bestimmung des Wirkungsoptimums von α-Tocopherol in ROTG
Zur Bestimmung des Wirkungsoptimums von α-Tocopherol in ROTG wurde ein Oxidationsversuch mit α-Tocopherol-Konzentrationen von 5 bis 1500 µmol/kg ROTG durchgeführt. Es
konnten ein Wirkungszuwachs von α-Tocopherol bis zu einer Konzentration von 100 µmol/kg
ROTG und eine Abnahme ab einer Konzentration von über 250 µmol/kg ROTG festgestellt
werden (Abb. 3.1, Abb. A.1). Die Ergebnisse sind im Einklang mit der Studie von LAMPI ET
AL. (1999). Bei hohen α-Tocopherol-Konzentrationen stieg die Bildung der Hydroperoxide
während der Induktionsphase stark an (Tab. 3.1). Dieser Anstieg der Bildung von Hydroperoxiden ist mit der Teilnahme von α-Tocopherol an Seitenreaktionen des Oxidationsprozesses
zu erklären. Für diese Eigenschaft ist wiederum das vergleichsweise niedrige Redoxpotenzial
von α-Tocopherol verantwortlich. α-Tocopherol ist dadurch zwar ein sehr guter Protonendonator, ist aber deshalb auch besonders anfällig für weitere Reaktionen, die den Radikalkettenmechanismus vorantreiben (LAMPI ET AL., 1999; ISNARDY ET AL., 2003). Hierbei werden
mehrere Reaktionsmöglichkeiten diskutiert (2-24 bis 2-28).
4.1.1
Eingrenzung des Konzentrationsbereichs für das Wirkungsoptimum von
Zur weiteren Eingrenzung des Wirkungsoptimums von α-Tocopherol wurde ein Oxidationsversuch mit geringeren α-Tocopherol-Konzentrationen von 25 bis 125 µmol/kg ROTG
durchgeführt. Die α-Tocopherol-Konzentration wurde in Schritten von 25 µmol/kg ROTG
angehoben (Abb. 3.2, Abb. 3.4, Abb. 3.5). In diesem Versuch konnte ebenfalls eine stetige
Verlängerung der Induktionsphase bis zu einer α-Tocopherol-Konzentration von 100 µmol/kg
ROTG gezeigt werden (Abb. 3.3). Eine höhere Konzentration brachte keine weitere
Verlängerung der Induktionsphase mit sich. Obwohl alle verwendeten α-TocopherolKonzentrationen nach 14 Tagen keinen Unterschied in der inhibierenden Wirkung zeigten
(Tab. 3.2), wiesen zwei Proben (100 bzw. 125 µmol α-Tocopherol/kg ROTG) eine
signifikante Verbesserung in der Lagerdauer bis zum Erreichen einer POZ von 12,5 meq
O2/kg ROTG auf. Die Verlängerung der Induktionsphase stieg nicht proportional mit
155
steigender α-Tocopherol-Konzentration, sondern die Zunahme verringerte sich zusehends
- ein Zeichen für eine Zunahme der Teilnahme an Seitenreaktionen von α-Tocopherol mit
steigender Konzentration.
Das Wirkungsoptimum von α-Tocopherol ist bei einer Konzentration von 100 bis
125 µmol/kg ROTG (OHM ET AL., 2005) erreicht. Ein Einsatz höherer α-TocopherolKonzentrationen führt zu keiner weiteren Steigerung der antioxidativen Wirkung.
4.1.2
Abbau von α-Tocopherol in ROTG
Zur Analyse der Teilnahme an Seitenreaktionen wurden die von YANISHLIEVA ET AL., (2002)
eingeführten Aktivitätsparameter zur Bestimmung von Oxidationskinetiken für α-Tocopherol
(25 bis 300 µmol/kg ROTG) angewendet (Abb. 3.6). Mit Hilfe dieser Parameter konnte eine
abnehmende Effizienz mit zunehmender α-Tocopherol-Konzentration gezeigt werden. Ein
Effizienzmaximum für α-Tocopherol ist auch unter Berücksichtigung niedrigerer Konzentrationen nicht festzustellen (Tab. 3.3). Der Stabilisationsfaktor F erhöhte sich zwar mit
steigender α-Tocopherol-Konzentration, stieg jedoch mit fallender Rate. Auch das
Oxidationsratenverhältnis (ORR) bestätigte diesen stetigen Effizienzverlust. Währenddessen
zeigte der Antioxidantienverbrauch (WInH) einen linearen Anstieg mit zunehmender
α-Tocopherol-Konzentration (Abb. 3.8), und auch die Oxidationsrate (Winh) stieg mit
steigender Antioxidantien-Konzentration. Diese Ergebnisse sind mit den Ergebnissen von
MARINOVA ET AL. (2004) für α-Tocopherol in Sojabohnentriglyceriden und Sonnenblumenöltriglyceriden (25°C) vergleichbar. Sämtliche Ergebnisse weisen auf eine mit steigender
α-Tocopherol-Konzentration immer stärker werdenden Teilnahme an Seitenreaktionen der
Oxidation hin.
Für die Funktion „Oxidationsdauer bis zum Erreichen einer POZ von 15 meq O2/kg ROTG“
in Abhängigkeit von der α-Tocopherol Konzentration wurde die folgende Gleichung
aufgestellt (Abb. 3.7): y = 3,5 + 18,2*(1-e(-x/24,8)) – 0,03*x. Anhand des Maximums der
1. Ableitung wurde eine maximale Wirkung bei einer α-Tocopherol-Konzentration von 79
µmol/kg ROTG festgestellt. An diesem Punkt befindet sich die antioxidative Wirkung von αTocopherol im Gleichgewicht mit der prooxidativen Wirkung von α-Tocopherol (Ga/p). Auch
bei Betrachtung der antioxidativen Aktivität (A) zeigte sich eine maximale Aktivität von αTocopherol bei einer Konzentration von 100 µmol/kg ROTG, ebenfalls bestätigt durch den
starken Anstieg des Oxidationsratenverhältnisses (ORR) zwischen einer α-TocopherolKonzentration von 100 und 125 µmol/kg ROTG. Diese Ergebnisse bestätigen die in 3.1.1.1
erhaltenen Werte für die optimale Konzentration von α-Tocopherol in ROTG. Da das
Wirkungsoptimum (Wopt) von α-Tocopherol in ROTG zwischen 75 und 125 µmol/kg ROTG
liegt und das Gleichgewicht (Ga/p) bei ca. 80 µmol/kg ROTG, wird als optimale Konzentration der rechnerische Mittelwert von 100 µmol/kg ROTG verwendet.
156
Diskussion
Durch Ableitung der beiden Funktionen Oxidationslänge in Abhängigkeit von der
α-Tocopherolkonzentration (Abb. 3.7) konnten ihre Punkte mit der höchsten Krümmung
bestimmt werden. Dieser Punkt entspricht der Konzentration von α-Tocopherol, bis zu der die
Bildung der Nebenprodukte keinen Einfluss auf die antioxidative Wirkung von α-Tocopherol
ausübt. Oberhalb dieses Punktes wirken sich die prooxidativen Aktivitäten von α-Tocopherol
signifikant aus (Sproox). Die 1. Ableitung stellt die Steigung der Kurven und die 2. Ableitung
ein Maß für den Krümmungssinn dar. Mit der folgenden Formel
(4-1)
κ=
f ``( x)
3
(1 + f `( x) 2 ) 2
κ = Krümmung: Richtungsänderung pro Längeneinheit
wurde der Punkt mit der höchsten Krümmung bestimmt.
Für y = 4,2 + 20,6*(1-e(-x/29,5)) + 0,03*x ist das 24 µmol/kg ROTG und für y = 3,5 + 18,2*(1e(-x/24,8)) – 0,03*x ist das 21 µmol/kg ROTG. Hieraus ließ sich die maximale Konzentration
für α-Tocopherol von 22,5 µmol/kg ROTG berechnen bis zu der die Nebenreaktionen keinen
messbaren Einfluss haben.
Die Werte konnten durch Anlegen zweier Tangenten für den Punkt der stärksten Krümmung
bestätigt werden. Für y = 4,2 + 20,6*(1-e(-x/29,5)) + 0,03*x wurden 26 µmol/kg ROTG und für
y = 3,5 + 18,2*(1-e(-x/24,8)) – 0,03*x 34 µmol/kg ROTG bestimmt. Hieraus ließ sich die
maximale Konzentration für α-Tocopherol ohne Einfluss von Nebenreaktionen auf
30 µmol/kg ROTG ablesen.
Aus den erhaltenen Ergebnissen kann geschlossen werden, dass α-Tocopherol in ROTG als
alleiniges Antioxidans in einer Konzentration von 100 µmol/kg ROTG eingesetzt werden
sollte, um eine maximale antioxidative Wirkung zu erzielen (Wopt). In Systemen, in
Kombination von α-Tocopherol mit anderen Antioxidantien kann es zu negativen Interaktionen kommen (Abb. 4.3). Sie werden meist begründet mit der Teilnahme an Nebenreaktionen
von α-Tocopherol (LAMPI ET AL., 1999; ISNARDY ET AL., 2003). Es kann davon ausgegangen
werden, dass oberhalb des Punktes mit der höchsten Krümmung im Kurvenverlauf (Abb. 3.7),
ab dessen Konzentration (> ca. 20 µmol/kg ROTG) sich die prooxidative Aktivität von
α-Tocopherol signifikant auswirkt (Sproox), α-Tocopherol in Kombination mit den Antioxidantien antagonistisch wirkt. Deshalb sollten Antioxidanskombinationen mit α-Tocopherol eine
Konzentration von 20 µmol/kg Lipidphase nicht überschreiten.
157
Hydroperoxidbildung während der Induktionsperiode in ROTG:
Bei steigender Konzentration von α-Tocopherol (25 – 300 µmol/kg ROTG, Abb. 3.6) kommt
es zum Ende der Induktionsperiode zu einer zunehmenden Bildung von Hydroperoxiden. Dies
könnte mit der Teilnahme von α-Tocopherol an Seitenreaktionen (LAMPI ET AL., 1999;
ISNARDY ET AL., 2003) begründet sein. Mit steigender Konzentration an α-Tocopherol steigt
auch die Bildung von Nebenprodukten. Um eine lange Induktionsphase zu erhalten,
gleichzeitig aber die Bildung von Hydroperoxiden gering zu halten, wurde ein Oxidationsversuch durchgeführt, dessen Ziel es war, den Effekt höherer α-Tocopherol-Konzentrationen
durch schrittweise Zugabe zu untersuchen. Die Zugabe erfolgte entsprechend dem
α-Tocopherol-Abbau mit dem Ziel, eine α-Tocopherol-Konzentration von 100 µmol/kg
ROTG über den Lagerungszeitraum beizubehalten.
In einem Vorversuch konnte diese Annahme bestätigt werden. Durch stetige Zugabe von
α-Tocopherol von jeweils 5 µmol/kg ROTG alle sechs Tage zu einer initialen Konzentration
von 130 µmol/kg ROTG konnte der Abbau von α-Tocopherol im Vergleich zu einer Probe
mit einer einmaligen α-Tocopherol-Zugabe von 130 µmol/kg ROTG zu Beginn des Versuches
verlangsamt werden (Abb. 3.9). Es konnte eine längere Induktionsphase (33,4 statt 29,9 Tage)
nachgewiesen werden (Tab. 3.4). Jedoch war der Gesamtverbrauch an α-Tocopherol bei
sukzessiver Zugabe größer als bei der Vergleichsprobe (einmaliger Zusatz an α-Tocopherol).
Aufgrund dieser Ergebnisse sollte in einem anschließenden Versuch die Probe mit
sukzessiver Zugabe einer Probe mit gleicher α-Tocopherol-Gesamtkonzentration gegenübergestellt werden. Hierfür wurde ein Oxidationsversuch mit drei unterschiedlichen sukzessiven
Zugabedosen an α-Tocopherol durchgeführt. Die initiale α-Tocopherol-Konzentration betrug
je 100 µmol/kg ROTG und die sukzessiven Dosen 5 x 5, 50 bzw. 100 µmol/kg ROTG.
Verglichen wurden die Ergebnisse dieser Proben mit den Ergebnissen der Proben mit einer
initialen α-Tocopherol-Konzentration von 125, 350 bzw. 600 µmol/kg ROTG.
Gesamt-α-Tocopherol-Konzentration von 125µmol/kg ROTG:
Bei einer Gesamt-α-Tocopherol-Konzentration von 125 µmol/kg ROTG war kein Unterschied
zwischen einmaliger und sukzessiver Zugabe von α-Tocopherol zu erkennen (Abb. 3.11).
Dies ist darauf zurückzuführen, dass die α-Tocopherol-Konzentrationen (100 und
125 µmol/kg ROTG) innerhalb des Bereichs des Wirkungsoptimums (Wopt) lagen. Bereits in
3.1.1.1 konnte kein Unterschied zwischen einer Probe mit einer α-Tocopherol-Konzentration
von 100 µmol/kg ROTG und einer mit 125 µmol/kg ROTG nachgewiesen werden. Allerdings
zeigte die Entwicklung sekundärer Oxidationsprodukte eine deutliche Verringerung durch
eine einmalige Zugabe von α-Tocopherol (Abb. 3.12). Dies entspricht den Ergebnissen von
HUANG ET AL. (1994), die feststellten, dass die Bildung sekundärer Oxidationsprodukte durch
steigende α-Tocopherol-Konzentrationen stärker inhibiert wird.
158
Diskussion
Gesamt-α-Tocopherol-Konzentration von 350 µmol/kg ROTG:
Bei einer Gesamt-α-Tocopherol-Konzentration von 350 µmol/kg ROTG konnte eine geringe
Steigerung der inhibierenden Wirkung durch sukzessive Zugabe von α-Tocopherol
nachgewiesen werden (Abb. 3.13). Noch stärker zeigte sie sich bei der Inhibierung der
Bildung von sekundären Oxidationsprodukten. Die Zunahme des inhibierenden Effekts lässt
sich auf die α-Tocopherol-Konzentration während des Oxidationsversuchs in der Probe
zurückführen. Durch die sukzessive Zugabe von α-Tocopherol wurde die Konzentration auf
einem Level nahe dem Wirkungsoptimumsbereichs (Wopt) gehalten, während das Optimum
bei einmaliger Tocopherolzugabe von 350 µmol/kg ROTG überschritten wurde. Schon zu
Beginn der Oxidation war bei einmaligem Zusatz ein stärkerer α-Tocopherol-Abbau als bei
sukzessivem festzustellen (Abb. 3.13).
Gesamt-α-Tocopherol-Konzentration von 600 µmol/kg ROTG:
Bei einer Gesamt-α-Tocopherol-Konzentration von 600 µmol/kg ROTG verlief die Bildung
an Hydroperoxiden bei sukzessivem und einmaligem Zusatz parallel und ohne signifikanten
Unterschied. Bei der Bildung der sekundären Oxidationsprodukte konnte, wie schon bei einer
Gesamt-α-Tocopherol-Konzentration von 350 µmol/kg ROTG, ein steigender inhibierender
Effekt für die sukzessive Zugabe gezeigt werden. Dieser inhibierende Effekt bei der
Entstehung von sekundären Oxidationsprodukten lässt sich auch bei diesem Versuchsaufbau
auf die zunächst geringe α-Tocopherol-Konzentration zurückführen (Abb. 3.16). Dass der
Effekt bei dieser Konzentration aber geringer ausfällt als bei den Proben mit einer Gesamt-αTocopherol-Konzentration von 350 µmol/kg ROTG, beruht auf einem Anstieg der
α-Tocopherol-Konzentration über die optimale α-Tocopherol-Konzentration (Wopt) hinaus
(Abb 3.15).
Der Anstieg der inhibierenden Wirkung durch sukzessive Zugabe an α-Tocopherol ist in
diesem Versuch geringer ausgefallen als erwartet. Es wird angenommen, dass dieser
Wirkungsverlust in der Bildung von Nebenprodukten begründet ist. Aus diesem Grunde
wurden die Mengen an gebildeten Nebenprodukten aus der Menge an zugegebenem und
während des Oxidationsverlaufs abgebautem α-Tocopherol über die Dauer des Oxidationsversuchs, unter Annahme eines äquimolaren Umsatzes, für alle Proben berechnet (Abb. 3.17).
Es wurde deutlich, dass bei den Proben mit einer Startkonzentration von 350 und
600 µmol/kg ROTG α-Tocopherol wesentlich mehr Abbau- und Nebenprodukte entstanden
als bei allen anderen Proben, deren Kurvenverlauf beinahe identisch war (Abb. 4.1).
159
Konzentration an
Nebenprodukten aus dem
α-TOH Abbau [µmol/kg ROTG]
700
600
500
400
300
200
100
0
0
10
20
100 α-TOH + 5*50 α-TOH
125 α-TOH
100 α-TOH + 5*5 α-TOH
350 α-TOH
100 α-TOH + 5*100 α-TOH
600 α-TOH
30
Abb. 4.1: Bildung von Nebenprodukten aus dem Abbau von α-Tocopherol unter Annahme einer
äquimolaren Bildung von Nebenprodukten, durchschnittliche Standardabweichung bei der α-TOHBestimmung: ± 8,2 µmol/kg ROTG, Lagerung bei 40°C im Dunkeln
Die Bildung von Nebenprodukten verlief bei sukzessiver Zugabe von (100 + 5*50 und 100 +
5*5 µmol/kg ROTG) α-Tocopherol annähernd äquivalent zur Bildung von Nebenprodukten
bei einer Probe mit einer α-Tocopherol-Konzentration von 125 µmol/kg ROTG. Hiermit
könnte sich der sehr ähnliche Verlauf der Hydroperoxidbildung erklären lassen. Der
abweichende Verlauf der Kurven für die Proben mit einer α-Tocopherol-Konzentration von
350 bzw. 600 µmol/kg ROTG nahm ab und wies am Ende der Oxidation eine hohe
Konzentration an Abbauprodukten auf (Abb. 3.17).
Bei den Proben mit sukzessiver α-Tocopherol-Zugabe (350 und 600 µmol/kg ROTG) ist die
Entstehung sekundärer Oxidationsprodukte stärker als bei einmaliger Zugabe der gleichen
Gesamtmenge an α-Tocopherol, da die Inhibierung sekundärer Oxidationsprodukte mit
höherer α-Tocopherol-Konzentration zunimmt (HUANG ET AL., 1994).
Anhand dieser Daten wurde festgestellt, dass durch eine sukzessive Zugabe von α-Tocopherol
die Teilnahme von hohen α-Tocopherol-Konzentrationen an Seitenreaktionen verringert
werden kann. Das bedeutet, dass die Induktionsphase einer Probe durch sukzessive Zugabe
einer höheren α-Tocopherol-Konzentration im Vergleich zu einer Probe mit einmaliger
Zugabe der optimalen α-Tocopherol-Konzentration verlängert werden kann. Zusätzlich bleibt
die Bildung an Hydroperoxiden zum Ende der Induktionsphase äquivalent zu einer Probe mit
einer α-Tocopherol-Start-Konzentration von 100 µmol/kg ROTG. Das ist auf die wesentlich
geringere Bildung an Nebenprodukten zurückzuführen. Die Nebenprodukte der Oxidation
initiieren die Kettenreaktion oder fördern die Oxidationsrate (POKORNY, 1987). So kann das
α-Tocopheroxylradikal reversibel mit noch nicht oxidierten Lipiden zu Alkyl- und
Peroxylradikalen reagieren. Eine weitere Möglichkeit von Nebenreaktionen von α-Tocopherol
160
Diskussion
wurde postuliert von GOTTSTEIN UND GROSCH (1990). Sie stellten fest, dass α-Tocopherol
direkt mit Triplet-Sauerstoff (3O2) reagieren kann, wodurch ein nicht mehr antioxidativ
wirksames α-Tocopherolchinon entsteht. Sie zeigten, dass die Chinone und Trimere, die
während der Oxidation aus α-Tocopherol gebildet werden, nicht weiter inhibierend in den
Oxidationsmechanismus eingreifen können. Eine Bestätigung für die Annahme von
GOTTSTEIN UND GROSCH (1990) ist die Berechnung der Konzentration an gebildeten
Hydroperoxiden in dieser Arbeit (Abb. 4.1).
4.1.3
Die Zugabe von Antioxidantien erfolgt meistens direkt nach der Raffination des Öls, dennoch
kann das Öl schon einer gewissen Oxidation unterlegen gewesen sein. Die Betrachtung der
Wirkung von Tocopherolen in Gegenwart dieser initial vorhandenen Hydroperoxide wurde
bisher nur unzureichend untersucht und kann eventuell ein Grund für die prooxidative
Wirkung von α-Tocopherol sein, von der in früheren Studien oft berichtet wurde (TERAO UND
MATSUSHITA, 1986; JUNG UND MIN, 1990; HUANG ET AL., 1994). Aus diesem Grunde wurden
in der vorliegenden Arbeit mehrere mittels Response-Surface-Design entwickelte Experimente zur Bestimmung der Wirkung von Tocopherolen in voroxidierten ROTG durchgeführt.
Die Verlängerung der Induktionsphase durch α-Tocopherol (100 µmol/kg ROTG (Wopt))
nahm mit steigender initialer Hydroperoxidkonzentration (POZ von 0, 2,5, 10, 25 und 40 meq
O2/kg ROTG) ab. Dennoch war α-Tocopherol bei allen initialen POZ in der Lage, den
Oxidationsverlauf zu verzögern (Abb. 3.18). Diese Ergebnisse stehen in Einklang mit den
Ergebnissen von KAMAL-ELDIN ET AL. (2001), die die Wirkung von α-Tocopherol in
Methyllinoleat ausgetestet haben.
4.1.3.1
KAMAL-ELDIN ET AL. (2001) nahmen an, dass die α-Tocopherol-Konzentration an den
initialen Zustand des Öls angepasst werden muss. Daher erfolgte in der vorliegenden
Untersuchung ein Response-Surface-Design-Experiment mit verschiedenen initialen
Hydroperoxidkonzentrationen und unterschiedlichen α-Tocopherol-Konzentrationen, um die
Abhängigkeit des Wirkungsoptimums von α-Tocopherol vom Oxidationsstatus der ROTG zu
bestimmten. Als niedrigste Konzentration wurde die α-Tocopherol-Konzentration gewählt,
bei der die Seitenreaktionen von α-Tocopherol noch keinen Einfluss auf die antioxidative
Wirkung von α-Tocopherol zeigten (4.1.2). Der Zentralpunkt lag bei 150 µmol/kg ROTG, als
höchste Konzentration wurden 250 µmol/kg ROTG ausgewählt. Das ist eine Konzentration,
bei der die Wirkungsumkehr von α-Tocopherol in den in dieser Arbeit durchgeführten
Oxidationstests noch nicht eingesetzt hatte. Außerdem handelt es sich bei dieser Konzentrati161
on um eine durchaus gängige α-Tocopherol-Konzentration in kommerziell erhältlichem
Rapsöl (KING ET AL., 1986). Die initialen POZ wurden zwischen 5 und 25 meq O2/kg ROTG
festgelegt und entsprachen somit einer fortgeschrittenen Oxidation (MEYER, 2006).
In diesem Versuch konnte festgestellt werden, dass nach einer Oxidation von 28 Tagen
sowohl die steigende α-Tocopherol-Konzentration als auch die steigende initiale POZ einen
Einfluss auf die inhibierende Wirkung von α-Tocopherol auf primäre und auf sekundäre
Oxidationsprodukte haben, wobei der initiale Oxidationszustand den größten Einfluss
ausübte. (Eine Auswertung der Ergebnisse mittels Response-Surface-Design zu einem
früheren Zeitpunkt der Oxidation war nicht möglich, da sich die Oxidationsverläufe der
einzelnen Proben nicht signifikant unterschieden. Die Reihenfolge, in der die Proben
oxidierten, war jedoch gleich.)
Die wirksamsten Konzentrationen für eine möglichst geringe Bildung an Hydroperoxiden
können sich deutlich von einer möglichst geringen Bildung an sekundären Oxidationsprodukten unterscheiden (HUANG ET AL., 1994; LAMPI ET AL., 1999). Es muss also darauf geachtet
werden, dass beide Arten von Oxidationsprodukten inhibiert werden. Die stärkste Inhibierung
sowohl an primären als auch an sekundären Oxidationsprodukten ist in diesem Versuch bei
der höchsten α-Tocopherol-Konzentration (250 µmol/kg ROTG) und der niedrigsten initialen
POZ (5 meq O2/kg ROTG) gegeben. Bei einer hohen initialen POZ (25 meq O2/kg ROTG)
inhibiert α-Tocopherol sowohl primäre als auch sekundäre Oxidationsprodukte ebenfalls am
stärksten in der höchsten eingesetzten Konzentration von 250 µmol/kg ROTG, bei initial
voroxidierten ROTG ist das antioxidative Wirkungsoptimum (Wopt) zu höheren Konzentrationen verschoben.
Während der Lipidoxidation zerfallen Hydroperoxide zu vielen verschiedenen radikalischen
Verbindungen (z.B. LO·, LOO· oder ·OH). Je mehr Hydroperoxide im Öl vorhanden sind,
desto mehr Radikale werden zur gleichen Zeit gebildet (KERN UND WILLERSINN, 1955). Je
mehr Hydroperoxide vorhanden sind, desto mehr α-Tocopherol wird zur Inhibierung der
Oxidation verbraucht. Die Zugabe von α-Tocopherol zu voroxidierten ROTG, d.h. zu einem
Öl, das bereits viele Radikale enthält, führt also zu einem vermehrten Verbrauch von
α-Tocopherol, während es die Oxidation hinauszögert. Dabei werden α-Tocopheroxylradikale
gebildet. Je höher die intiale POZ war, desto mehr Radikale wurden gebildet und desto
schneller wurde das α-Tocopherol aufgebraucht. Das führte dann mit steigender Hydroperoxid-Konzentration zu einer Verkürzung der Induktionsphase. Des Weiteren war die POZ am
Ende der Induktionsphase abhängig von der initialen POZ (Abb. 3.20).
162
Diskussion
4.1.3.2
Einfluss initialer Hydroperoxide auf die Wirkung von γ-Tocopherol
Da in Rapsöl γ-Tocopherol den größten Anteil an der Tocopherolfraktion mit bis zu
753 mg/kg besitzt (KING ET AL., 1986), wurde der Einfluss initialer Hydroperoxide ebenfalls
auf die Wirkung von γ-Tocopherol untersucht. Es wurde ein Konzentrationsbereich von 250
bis 1178 µmol/kg ROTG gewählt, da γ-Tocopherol in wesentlich höheren Konzentrationen in
Rapsöl vorliegt als α-Tocopherol (KING ET AL., 1986). Der initiale Oxidationsstatus der Öle
lag bei einer POZ von 0, 2,5, 10, 25 und 40 meq O2/kg ROTG (s.4.1.4.1)
Es konnte festgestellt werden, dass beide Faktoren (γ-Tocopherol-Konzentration und initiale
POZ) einen Einfluss auf die inhibierende Wirkung von γ-Tocopherol ausübten. Dabei hatte
die initiale POZ den größten Einfluss auf die Bildung der Hydroperoxide. Hingegen war die
γ-Tocopherol-Konzentration ausschlaggebend für die Entstehung von Propanal während der
Oxidation. Die gebildete Menge an Hexanal war zu diesem Zeitpunkt so gering, dass eine
Auswertung nicht möglich war. Bei der Bildung von Hydroperoxiden bei niedrigen POZ
konnte ein Abfallen der antioxidativen Wirkung von γ-Tocopherol mit steigender Konzentration bestimmt werden, was im Gegensatz zu den Ergebnissen von KULÅS UND ACKMANN
(2001), aber im Einklang mit den Ergebnissen von LAMPI ET AL. (1999) steht. Bei hohen POZ
hingegen zeigte eine hohe γ-Tocopherol-Konzentration die beste inhibierende Wirkung. Bei
der Bildung von Propanal zeigte sich ein ähnliches Bild. Mit steigender γ-TocopherolKonzentration nahm die antioxidative Wirkung bei niedrigen initialen POZ allerdings noch
stärker ab. Bei hoher initialer POZ hingegen konnte eine hohe γ-Tocopherol-Konzentration
die POZ über die Oxidationsdauer sogar noch verringern, d.h., dass genauso wie bei
α-Tocopherol auch für γ-Tocopherol das Wirkungsoptimum zu höheren Konzentrationen
verschoben wurde. Das könnte daran liegen, dass das γ-Tocopherol bei höherem Hydroperoxidgehalt schneller abgebaut wird und schneller die ebenfalls antioxidativ wirksamen
Dimere entstehen (GOTTSTEIN UND GROSCH, 1990), die dann ebenfalls inhibierend in die
Oxidation eingreifen können. Der stärkere inhibierende Effekt von γ-Tocopherol in höheren
Konzentrationen im Vergleich zu α-Tocopherol ist begründet durch die Bildung von Dimeren
aus Oxidationsprodukten von γ-Tocopherol, welche weiterhin antioxidativ wirksam sind
(GOTTSTEIN UND GROSCH, 1990). Dazu kommt, dass das α-Tocopheroxylradikal zusätzlich
die Oxidation vorantreiben kann, indem es Wasserstoff von Lipiden abstrahiert und somit
weniger wirksam ist als γ-Tocopherol (GOTTSTEIN UND GROSCH, 1990).
Es gibt für die Wirkung von γ-Tocopherol einen Unterschied zwischen der wirksamsten
Inhibierung von primären und sekundären Oxidationsprodukten. Eine γ-TocopherolKonzentration von 1178 µmol/kg ROTG führte zu einer stetig fallenden Bildung an
sekundären Oxidationsprodukten und zeigte ein Minimum bei einer initialen POZ von 25 meq
O2/kg ROTG. Die Entstehung der Hydroperoxide hingegen durchlief ein Minimum bei einer
POZ von 17,2 meq O2/kg ROTG (berechnet über die Formel (3-4). Bei einer POZ von 5 meq
O2/kg ROTG ergab sich im Hinblick auf die Inhibierung sekundärer Oxidationsprodukte eine
163
optimale γ-Tocopherol-Konzentration von 250 µmol/kg ROTG. Im Gegensatz dazu
durchläuft die Entstehung von Hydroperoxiden bei gleicher initialer POZ bei einer
γ-Tocopherol-Konzentration von 585 µmol/kg ROTG ein Minimum (berechnet über die
Formel (3-5)).
4.1.3.3
Einfluss initialer Hydroperoxide auf die Wirkung von α- und γ-Tocopherol
Da α-Tocopherol in natürlichem Rapsöl immer neben γ-Tocopherol vorkommt (KING ET AL.,
1986), wurden α- und γ-Tocopherol in Kombination in voroxidierten ROTG eingesetzt und
zwar in einem Response-Surface-Design-Experiment auf Basis der beiden vorhergehenden
Response-Surface-Experimente, wobei die Konzentration von α-Tocopherol in den
Konzentrationsstufen 0, 100, 464 µmol/kg ROTG gewählt wurde, um keine, eine optimale
und eine zu hohe α-Tocopherol-Konzentration auszutesten.
Sobald α-Tocopherol (100 µmol/kg ROTG) zu dem Oxidationsversuch zugegeben wurde,
verlor γ-Tocopherol an Wirksamkeit. So stieg die Bildung der Hydroperoxide mit steigender
γ-Tocopherol-Konzentration an. Für hohe initiale POZ konnte eine maximale Wirksamkeit für
die γ-Tocopherol-Konzentration abgelesen werden. Durch Einsetzen in die Formel (3-6) wird
für eine initiale POZ von 25 meq O2/kg ROTG die wirksamste Konzentration für
γ-Tocopherol im Hinblick auf die Bildung von Hydroperoxiden erhalten, nämlich 843
µmol/kg ROTG. Dieses Wirkungsmaximum verschiebt sich bei Erhöhung der α-TocopherolKonzentration deutlich zu geringeren γ-Tocopherol-Konzentrationen (ca. 660 µmol/kg
ROTG), denn die Zugabe von α-Tocopherol in einer Konzentration von 464 µmol/kg ROTG
zu γ-Tocopherol enthaltenden ROTG führt zu einer noch stärkeren Bildung von Hydroperoxiden (im Vergleich zu einer Probe mit einer α-Tocopherol-Konzentration von 100 µmol/kg
ROTG). Die stärkste inhibierende Wirkung für Hydroperoxide zeigte sich in Gegenwart von
100 µmol α-Tocopherol/kg ROTG bei einer POZ von 5 meq O2/kg ROTG und einer
γ-Tocopherol-Konzentration von 250 bis ca. 480 µmol/kg ROTG. In Gegenwart einer
α-Tocopherol-Konzentration von 464 µmol/kg ROTG war die stärkste Inhibierung bei einer
POZ von 5 meq O2/kg ROTG und 250 µmol γ-Tocopherol/kg ROTG erreicht. Im Gegensatz
dazu konnte die Bildung sekundärer Oxidationsprodukte (100 und 464 µmol α-Tocopherol/kg
ROTG) in Gegenwart einer γ-Tocopherol-Konzentration von 250 µmol/kg ROTG und einer
initialen POZ von 25 meq O2/kg ROTG am stärksten inhibiert werden. Eine Erhöhung der
γ-Tocopherol-Konzentation brachte keine weitere Inhibierung mit sich.
Die Entwicklung von Propanal war stark abhängig von der Menge an γ-Tocopherol. Sie stieg
mit zunehmender γ-Tocopherol-Konzentration und fiel mit steigender initialer POZ. Mit
zunehmender α-Tocopherol-Konzentration blieben zwar die Abhängigkeiten gleich, aber
insgesamt verringerte sich die Propanalbildung leicht.
164
Diskussion
Die Zugabe von α-Tocopherol in Gegenwart von γ-Tocopherol resultierte bei allen
Konzentrationen in antagonistischen Effekten bei der Bildung von Hydroperoxiden. Daraus
kann geschlossen werden, dass die optimale Konzentration von α-Tocopherol in Gegenwart
von γ-Tocopherol wesentlich niedriger liegen muss und dadurch das Gleichgewicht (Ga/p) der
inhibierenden und der prooxidativen Wirkung von α-Tocopherol auf die prooxidative Seite
verschoben ist. Je höher die α-Tocopherol-Konzentration, desto stärker war dieser Effekt.
α-Tocopheroxylradikale können an den von LAMPI ET AL. (1999), und ISNARDY ET AL, (2003)
postulierten Seitenreaktionen teilnehmen. Die Bildung von sekundären Oxidationsprodukten
wurde in Gegenwart von α-Tocopherol geringfügig inhibiert. Die Inhibierung nahm mit
steigender α-Tocopherol-Konzentration zu (HUANG ET AL., 1994).
Dieser Oxidationsversuch zeigt deutlich, dass sich α-Tocopherol im Hinblick auf die Bildung
sekundärer Oxidationsprodukte negativ auf die inhibierende Wirkung von γ-Tocopherol
auswirkt. Bezogen auf die Inhibierung sekundärer Oxidationsprodukte hingegen kann die
Kombination von γ-Tocopherol mit α-Tocopherol die Wirkung verstärken. Eine prooxidative
Wirkung von α-Tocopherol kann, wie bereits von LAMPI ET AL. (1999) postuliert, auf die
Verwendung von nicht oder nur unzureichend aufgereinigten Lipiden hinweisen. Allerdings
wird durch die hier erhaltenen Ergebnisse nicht das eventuell noch enthaltene α-Tocopherol
(in sehr geringer Konzentration), sondern das noch enthaltene γ-Tocopherol, eventuell in
Gegenwart geringer Mengen an Hydroperoxiden, das α-Tocopherol zu einer stärkeren
Teilnahme an Nebenreaktionen der Oxidation führen.
4.2
Interaktionen zwischen phenolischen und nicht-phenolischen
Antioxidantien und α-Tocopherol
Im Rahmen dieser Arbeit wurden die zwei Hypothesen, die in der Literatur als die Ursache
für synergistische Effekte zwischen α-Tocopherol und anderen Antioxidantien beschrieben
wurden, überprüft.
Hypothese 1: Substanzen sind nur dann in der Lage das α-Tocopheroxylradikal zu
regenerieren, wenn ihr antioxidatives Potenzial geringer ist als das von
α-Tocopherol. Es kann nur eine synergistische Wirkung resultieren, wenn das
stärkere Antioxidans durch das schwächere regeneriert wird und somit das
stärkere weiter in den Oxidationsmechanismus eingreifen kann (URI, 1961;
PEYRAT-MAILLARD ET AL., 2003).
Hypothese 2: Das Redoxpotenzial einer Substanz muss niedriger sein als das Redoxpotenzial
von α-Tocopherol, damit die Substanz das α-Tocopheroxylradikal reduzieren
kann, wie es bei Ascorbinsäure und α-Tocopherol der Fall ist (BUETTNER UND
165
JURKIEVICZ, 1993). Oder aber die Substanz muss ein ähnliches Potenzial aufweisen wie α-Tocopherol und zusätzlich im Überschuss zu dem
α-Tocopheroxylradikal vorliegen, wie es im Beispiel von LARANJINHA UND
CADENAS (1999) der Fall war. Bei den von LARANJIHNA UND CADENAS (1999)
verwendeten Untersuchungsbedingungen (micellarer Phosphatpuffer pH 7,4
mit dem Emulgator SDS) waren die Halbwellenpotenziale von α-Tocopherol
und Kaffeesäure (480 mV / 540 mV) vergleichbar. WEBSTER (2007) bestätigte
diese Regenerationsmöglichkeit, begründete sie allerdings nicht mit dem Überschuss des Antioxidans, sondern damit, dass bei α-Tocopherol das Redoxpotenzial in wasserfreier Matrix (Acetonitril) durch einen, durch eine chemische
Reaktion getrennten, Zwei-Elektronenübergang um ca. 100 mV zu niedrigeren
Potenzialen verschoben ist. Nur dieses Potenzial wird gemessen. Der erste Elektronenübergang erfolgt also bereits 100 mV höher und würde erklären, warum Kaffeesäure mit einem, wie es scheint, geringfügig höheren Redoxpotenzial als α-Tocopherol dennoch das α-Tocopherol regenerieren kann. Denn der
erste Elektronenübergang von α-Tocopherol liegt höher als das Redoxpotenzial
von Kaffeesäure.
4.2.1
Antioxidative Potenziale phenolischer und nicht-phenolischer Antioxidantien
Die antioxidativen Potenziale der verwendeten phenolischen und nicht-phenolischen
Antioxidantien wurden bestimmt. Mittels des stabilen Radikals DPPH konnten in Ethanol
folgende Antioxidantien mit geringeren antioxidativen Potenzialen als α-Tocopherol
identifiziert werden: β-, γ- und δ-Tocopherol, Butylhydroxyanisol, Butylhydroxytoluol,
Hydrochinon, tert-Butylhydrochinon, Catechin, Ascorbylpalmitat, Ascorbinsäure, Ascorbigen, Carvacrol, Oleuropein, γ-Oryzanol, Thymol, Tyrosol, p-Coumarsäure, Isoferulasäure,
Sinapinsäure, Vanillinsäure und Liponsäure (Abb. 3.39). Alle anderen Substanzen wiesen
gleiche oder stärkere antioxidative Aktivität auf. Das antioxidative Potenzial von Liponsäure
liegt im gleichen Bereich wie das von Ascorbylpalmitat, beide Antioxidantien weisen eine
nicht-phenolische Struktur auf.
Die Effizienz von Antioxidantien muss nicht mit steigender Konzentration abnehmen wie es
bei α-Tocopherol der Fall ist (Tab. 3.3). Als Beispiel ist Carnosolsäure in ROTG angeführt,
die mit steigender Konzentration (50, 125, 250, 500 µmol/kg ROTG) an Effizienz zunimmt
(Tab. 4.1).
166
Diskussion
Tab. 4.1: Effizienz von Carnosolsäure (CS) in ROTG, berechnet über die Induktionsphase (IP)
Konzentration
[µmol/kg ROTG]
Länge der IP [Tage]
Kontrolle
8,5
50
∆IP = IPProbe - IPKontrolle
∆IP / µmol CS in kg ROTG
12,0
3,5
0,07
125
26,4
17,9
0,14
250
48,8
40,3
0,16
500
92,8
84,3
0,17
In ROTG:
In Lipidmatrix zeigten nur Ascorbigen, Oleuropein, Tyrosol, Vanillinsäure, Liponsäure,
Genistein und Kaempferol eine schwächere antioxidative Wirkung als α-Tocopherol.
Strukturell sind keinerlei Ähnlichkeiten zu erkennen, die auf die geringe Wirksamkeit in
ROTG schließen lassen würden (Abb. 2.7, Abb. 2.10, Abb. 2.12, Abb. 2.16, Abb. 2.19). Die
meisten Verbindungen sollten auch aufgrund ihrer Polarität (Anzahl an polaren Substituenten), mit Ausnahme von Liponsäure nach dem „Polar Paradox“, in der unpolaren Matrix
ROTG antioxidativ wirksam sein (PORTER, 1989). Die Prognose von MOINI ET AL. (2002),
dass Liponsäure als amphiphatisches Molekül sowohl in hydrophiler als auch in hydrophober
Matrix ihre antioxidative Aktivität zeigen sollte, konnte nicht bestätigt werden. Bereits 1999
stellten PEKKARINEN ET AL. für Kaempferol eine vergleichsweise schwache antioxidative
Wirkung in Methyllinoleat fest. Das erklärten sie mit der geringen Anzahl an OH-Gruppen
am B-Ring (mit steigender Anzahl steigt auch die antioxidative Aktivität). Das gilt auch für
Genistein, das ebenfalls nur eine OH-Gruppe am B-Ring aufweist. Das könnte genauso wie
bei Kaempferol ein Grund für seine geringe antioxidative Aktivität in ROTG sein. Für
Ascorbigen konnten bisher nur in vivo antioxidative Aktivitäten nachgewiesen werden
(ARFFMANN UND ANDRUS, 1999). Die hier so geringe antioxidative Aktivität erklärt sich
somit über die geringe Polarität der verwendeten Matrix. Das gleiche gilt auch für Oleuropein, was in wesentlich polarerer Matrix, einem Liposomenmodell, effiziente antioxidative
Aktivität zeigen konnte (MORELLÒ ET AL., 2005). Tyrosol wies in Kamelienöl nur bei der
Inhibierung sekundärer Oxidationsprodukte stärkere inhibierende Wirkung auf als
Kaffeesäure. Bei primären Oxidationsprodukten war die Inhibierung wesentlich geringer und
bestätigt somit die nachgewiesenen Ergebnisse (HAIYAN ET AL., 2006). PEKKARINEN ET AL.
(1999) stellten in verschiedenen lipidhaltigen Systemen fest, dass Sinapinsäure ein potenter
Radikalfänger und ein gutes Antioxidans ist. Bei einem Vergleich der antioxidativen Aktivität
mittels DPPH-Test von Vinylsyringol und Sinapinsäure zeigte sich eine größere Effizienz für
Sinapinsäure (VUORELA ET AL., 2005). Das konnte in diesem Versuch nicht bestätigt werden.
Es wird vermutet, dass dieser Wirkungsunterschied an der Wahl des Systems liegt, denn die
167
von PEKKARINEN ET
wesentlich polarer.
AL.
(1999) und VUORELA
ET AL.
(2005) gewählten Systeme waren
Alle anderen Verbindungen zeigten eine bessere antioxidative Wirkung als α-Tocopherol.
Diese Ergebnisse sind im Einklang mit denen von YANISHLIEVA UND MARINOVA (1992) für
Butylhyroxyanisol in Schmalz. Mit den Ergebnissen von CUVELIER ET AL. (1994), FRANKEL
ET AL. (1996a), FRANKEL (1996b) und HUANG ET AL. (1996), die nachwiesen, dass
Carnosolsäure ein wirksameres Antioxidans als Carnosol in Bulkölen und Methyllinoleat ist.
Die Ergebnisse bestätigen auch Catechin als wirksames Antioxidans in Methyllinoleat
(PEKKARINEN ET AL., 1999). MARINOVA UND YANISHLIEVA (1994) und YANISHLIEVA UND
MARINOVA (1995) konnten ebenfalls starke antioxidative Wirkung für Kaffeesäure in
Schmalz, Sonnenblumenöltriglyceriden und Sojabohnenöltriglyceriden nachweisen. In
unpolaren Matrices wirken Flavonoide als Wasserstoffatom-Donatoren (JOVANOVIC ET AL.,
1996). So konnten PEKKARINEN ET AL. (1999) für Quercetin in Methyllinoleat analog der
vorliegenden Arbeit eine starke antioxidative Wirkung nachweisen. Rosmarinsäure zeigte
bereits im DPPH-Test in den Untersuchungen von MÜLLER (2004) stärkere antioxidative
Wirkung als α-Tocopherol. Auch die starke antioxidative Wirkung von Sinapinsäure konnten
die Ergebnisse von NOWAK ET AL. (1992) und PEKKARINEN ET AL. (1999) bestätigen. Die
antioxidative Wirkung von Vinylsyringol wurde bereits von KOSKI ET AL. (2002) und KOSKI
ET AL. (2003) in Methyllinoleat und Rapsöltriglyceriden sowie von KUWAHARRA ET AL.
(2004) mittels Ames-Test bestätigt.
In Emulsion:
In Emulsionen waren die antioxidativen Wirkungen der Substanzen erwartungsgemäß
vollständig anders. Hierbei wirkt sich das unterschiedliche Verteilungsverhalten der
Antioxidantien in der Matrix aus. So führen Unterschiede im Solubilisierungsort und
verschieden starke Interaktionen mit dem Emulgator zu unterschiedlichen Wirksamkeiten der
Antioxidantien (HEINS ET AL., 2006; HEINS ET AL., 2007a/b). Ein weiterer Grund liegt in der
Polarität der einzelnen Verbindungen. Unpolare Verbindungen sind stärkere Antioxidantien in
polaren Systemen und umgekehrt - „Polar Paradox“ (PORTER ET AL., 1989). Da SDS nur
schwache Interaktionen mit dem Antioxidans (Propylgallat) in der Sternschicht zeigt (HEINS
ET AL., 2007b), wurde es für die Untersuchungen in dieser Arbeit als Emulgator gewählt.
In Emulsion zeigten Oleuropein, Tyrosol, Vanillinsäure und Liponsäure wie schon in ROTG
keine starke antioxidative Aktivität. Dies ließe sich für Oleuropein, Tyrosol und Vanillinsäure
über ihren starken polaren Charakter („Polar Paradox“ (PORTER, 1989)) erklären. Oleuropein,
Rosmarinsäure, Sinapinsäure, Tyrosol und Vinylsyringol wirkten sogar prooxidativ (z.T. nur
bezogen auf die Entstehung sekundärer Oxidationsprodukte). Die Ergebnisse von MORELLÒ
ET AL. (2005) für Oleuropein und die Ergebnisse von NOWAK ET AL. (1992) als auch von
168
Diskussion
PEKKARINEN ET AL. (1999) für Sinapinsäure konnten nicht bestätigt werden. Ebenso konnten
die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit für Tyrosol die Untersuchungen von MEDINA ET AL.,
(2002) nicht bestätigen. MEDINA ET AL., (2002) wiesen eine inhibierende Wirkung von
Tyrosol in Liposomen und Emulsionen auf die Bildung von Hydroperoxiden nach. Die
Theorie von MOINI ET AL. (2002) konnte auch für polare Matrices für Liponsäure nicht
bestätigt werden.
Die Antioxidantien Butylhydroxyanisol, Ascorbigen, Kaempferol, Carnosolsäure, Kaffeesäure, Quercetin und Vinylsyringol zeigten in Emulsionen im Vergleich zu α-Tocopherol starke
antioxidative Wirkung. Bei einem strukturellen Vergleich zeigte sich wiederum keine
deutliche Ähnlichkeit (Abb. 2.3, 2.10, Abb. 2.7, Abb. 2.14, Abb. 2.16, Abb. 2.8, Abb. 2.15).
YANISHLIEVA UND MARINOVA (1992) stellten fest, dass Butylhydroxyanisol in Schmalz ein
effizienteres Antioxidans ist als Butylhydroxytoluol. Diese antioxidative Wirkung konnte in
diesem Versuch in polarer Matrix bestätigt werden. Ebenso konnte die antioxidative Wirkung
von Ascorbigen in polarer Matrix (ARFFMANN UND ANDRUS, 1999) bestätigt werden. In dem
im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Versuch zeigte Kaempferol in unpolarer Matrix nur
eine geringe antioxidative Aktivität, in polarer Matrix - der Emulsion - eine wesentlich
stärkere antioxidative Wirkung. Das ist eventuell durch seine geringere Polarität im Vergleich
zu Quercetin und Catechin zu erklären (weniger Hydroxygruppen), erklärt aber nicht die
geringe antioxidative Wirkung von Genistein in Emulsionen (es hat noch eine Hydroxygruppe
weniger als Kaempferol). Carnosolsäure werden inhibierende Eigenschaften auf die
Lipidoxidation in polaren Systemen zugesprochen (AUROMA ET AL., 1992). Diese konnten in
der vorliegenden Arbeit bestätigt werden. Auch die Ergebnisse von HUANG ET AL. (1996), die
für Carnosolsäure eine bessere antioxidative Wirkung gegen Hydroperoxide in Emulsion
nachwiesen als für α-Tocopherol in gleicher Konzentration, konnten in dieser Arbeit bestätigt
werden. Diese bessere Wirkung schrieben sie der ortho-Dihydroxygruppe am aromatischen
Ring der Carnosolsäure zu, da α-Tocopherol nur eine Hydroxygruppe aufweist. Für
Kaffeesäure wurden positive antioxidative Wirkungen in unpolaren Matrices beschrieben
(MARINOVA UND YANISHLIEVA, 1994, YANISHLIEVA UND MARINOVA, 1995). In der
vorliegenden Untersuchung konnte Kaffeesäure dennoch in Emulsionen eine bessere
antioxidative Wirkung zeigen als α-Tocopherol, was eventuell durch die polarere Struktur von
Kaffeesäure im Vergleich zu α-Tocopherol zu erklären ist (Abb. 2.2, Abb. 2.16). Für
Vinylsyringol konnte in dieser Untersuchung nur in Emulsionen, nicht aber in Bulklipiden,
eine wirksame antioxidative Wirkung gefunden werden. Das bestätigt daher nur zum Teil die
Studien von KOSKI ET AL. (2002) und KOSKI ET AL. (2003), die sowohl in Bulkmethyllinoleat,
Bulkrapsöltriglyceriden als auch in Methyllinoleatemulsion, Rapsöltriglyceridemulsion und in
Liposomenmodellen antioxidative Aktivität und gute radikalfangenden Eigenschaften für
Vinylsyringol nachweisen konnten. In diesem Fall war seine antioxidative Aktivität
vergleichbar mit der von α-Tocopherol (KOSKI ET AL., 2003). In der vorliegenden Arbeit ist
die antioxidative Aktivität von Vinylsyringol sogar stärker als die von α-Tocopherol.
169
4.2.2
Redoxpotenziale phenolischer und nicht-phenolischer Antioxidantien
Die Redoxpotenziale der verwendeten phenolischen und nicht-phenolischen Antioxidantien
wurden in verschiedenen Matrices bestimmt. Die erste Möglichkeit zur Bestimmung der
Redoxpotenziale der verschiedenen Antioxidantien war die Redoxtitrimetrie (3.2.1). Sie ist,
wie die Versuche nachwiesen (Abb. 3.34), eine zuverlässige, wiederholbare Methode.
Allerdings zeigte sich schnell, dass die Titrimetrie wesentlich zeitintensiver (eine Dreifachbestimmung dauerte ca. 4 Stunden), ein Sauerstoffausschluss vom apparativen Aufbau nur
schwer zu gewährleisten und die Aussagekraft der Ergebnisse weniger informativ als die
Messungen mittels Differenz-Puls-Voltammetrie und Cyclovoltammetrie war. Daher wurde
entschieden, die Messungen mittels Differenz-Puls-Voltammetrie und Cyclovoltammetrie
durchzuführen. Ein Vergleich der Ergebnisse der unterschiedlichen Methoden ist dennoch
möglich. Die Aussage von Redoxpotenzialen in Bezug auf die antioxidative Wirkung einer
Substanz ist limitiert, da die Fähigkeit, ein Proton abzugeben (wichtig für antioxidative
Effektivität), nicht gemessen werden kann. Zusätzlich wird die Aussagekraft der Messung mit
steigender Substanzvielfalt in der Matrix verringert. Bei Untersuchungen von komplexen
Lebensmitteln kann durch eine technologische Behandlung das ursprüngliche Redoxpotenzial
durch Veränderung des pH-Wertes, Verschiebung des Redox-Gleichgewichtes und durch
Bildung neuer Redoxpaare, z.B. durch Maillard-Reaktion oder oxidierte Polyphenole,
komplett verändert sein (HAYASE ET AL., 1989; NAMIKI, 1990; NICOLI ET AL., 2000).
Ursprünglich sollten die Potenziale in ROTG und in Emulsion vermessen werden. Eine
Messung in ROTG war nicht möglich, da die Löslichkeit von Leitsalzen zu gering war.
Stattdessen wurde Acetonitril eingesetzt, das aufgrund seines großen Potenzialfensters die
Vermessung von Antioxidantien mit unterschiedlichen Eigenschaften ermöglichte (PETERS,
2006).
Zusätzlich zu den Messungen in Emulsionen wurden Messungen in micellaren Lösungen und
in Ethanol/Acetat-Puffer (80/20, v/v) durchgeführt. Die micellare Lösung stellt ein einfaches
Modell für Lebensmittel dar und wurde eingesetzt, um das Redoxpotenzial der Verbindungen
in einer realen Mikroumgebung zu vermessen, d.h. direkt an ihren individuellen Solubilisierungsorten. Dadurch können Matrixeinflüsse berücksichtigt werden. Das Ethanol/PufferSystem bildet den polaren Bereich einer micellaren Pseudophase bzw. einer Grenzschicht in
einer Emulsion ab (POLEWSKI ET AL., 2002). Da die erhaltenen Ergebnisse sich sehr ähneln,
kann davon ausgegangen werden, dass die negativen Kopfgruppen des Emulgators (SDS) die
Redoxpotenziale der Verbindungen nicht stark beeinflussen. Ein weiterer Grund für die Wahl
der beiden Systeme war es, für alle zu untersuchenden Substanzen Matrices zu finden, in
denen sie solubilisiert werden können und um einen direkten Vergleich zwischen
α-Tocopherol und Ascorbinsäure (dem Referenzpaar für die Redoxpotenzialdifferenz für
synergistisch agierende Antioxidantienpaare) zu ermöglichen.
170
Diskussion
Die gemessenen Redoxpotenziale in wasserhaltigen Matrices unterscheiden sich nur
geringfügig (Abb. 3.35), allerdings sind die Unterschiede von Antioxidans zu Antioxidans
verschieden. Diese Unterschiede sind systembedingt, so haben z.B. saure Analyte einen
anderen Einfluss auf ihre Umgebung als neutrale usw. Der Unterschied zu den Redoxpotenzialen, gemessen in Acetonitril, ist allerdings wesentlich größer. Das liegt daran, dass kein pHWert aufgrund des fehlenden Wassers eingestellt werden konnte. Die Messungen wurden als
Differenz-Puls-voltammetrische und als cyclovoltammetrische Messungen durchgeführt. Die
Stärke des Signalausschlages bei der Differenz-Puls-Voltammetrie ist abhängig von der
Löslichkeit und dem Solubilisierungsort des Analyten. Eine weitere Möglichkeit für
unterschiedlich starke Signalausschläge kann die in verschiedenen Matrices unterschiedliche
Ionenbeweglichkeit darstellen.
Beide Methoden ermöglichen die Bestimmung des Halbwellenpotenzials einer Substanz.
Allerdings ist bei der Cyclovoltammetrie eine Bestimmung des Halbwellenpotenzials nur bei
reversiblen und quasi-reversiblen Systemen möglich. Zur Bestimmung der Halbwellenpotenziale wurde daher die Differenz-Puls-Voltammetrie gewählt. Die Cyclovoltammetrie wurde
zur Bestimmung der Reversibilität der Systeme verwendet, denn diese ist wichtig für eine
mögliche Regenerierbarkeit des Systems. Die erhaltenen Werte aus Cyclovoltammetrie und
Differenz-Puls-Voltammetrie sind vergleichbar.
Die in dieser Arbeit bestimmten Redoxpotenziale stimmten meist nicht mit den in der
Literatur beschriebenen Redoxpotenzialen überein. Das liegt an den verwendeten unterschiedlichen Matrices und den unterschiedlichen Bezugspunkten (sowohl Bezugselektrode als auch
pH-Wert). Die Messungen ergaben relativ ähnliche Redoxpotenziale innerhalb der einzelnen
Substanzgruppen, solange eine strukturelle Ähnlichkeit bestand.
FIRUZI ET AL. (2005) konnten in 300 mM Acetatpuffer bei pH 3,6 mit Zugabe von 20 mM
Salzsäure gegen die gesättigte Kalomelelektrode die Redoxsysteme von Kaempferol und
Catechin in der verwendeten Matrix als reversibel nachweisen. In der vorliegenden
Untersuchung konnten nur Tocopherol und Ethoxyquin als reversible Systeme identifiziert
werden. Dies stimmt mit Beobachtung von PENKETH (1957) überein, der bereits festgestellt
hatte, dass die meisten antioxidativen Verbindungen irreversibel reagieren. Die von WACHS
(1949) gefundenen Redoxpotenziale für die Tocopherole konnten in dieser Arbeit mit der
gleichen Methode nachempfunden werden, in anderen Systemen liegen die Potenziale
allerdings wesentlich niedriger. Dennoch konnte für Ascorbinsäure in Ethanol/Puffer ein
geringeres Redoxpotenzial nachgewiesen werden als das von α-Tocopherol. Das bestätigt das
niedrige Redoxpotenzial für Ascorbinsäure von JOVANOVIC ET AL. (1994). Die vergleichsweise hohen Redoxpotenziale für Flavonoide (JOVANOVIC, 1992, JOVANOVIC ET AL., 1994,
JOVANOVIC ET AL., 1998, FIRUZI ET AL., 2005, NEMEIKAITö-ČöNIENö ET AL., 2005) konnten
auch bestätigt werden. Die in der Literatur für die Hydroxyzimtsäuren beschriebenen
Potenziale liegen etwas unterhalb der Potenziale der Flavonoide. Dieses Ergebnis ist analog
171
dem der Literatur (BUETTNER UND JURKIEWICZ, 1993, NEMEIKAITö-ČöNIENö ET AL., 2005).
Einen Widerspruch stellt das Redoxpotenzial von Liponsäure dar. In der Literatur findet sich
ein sehr niedriges Potenzial von -320 mV (SEARLS UND SANADI, 1960), bei den Versuchen der
vorliegenden Arbeit wurden vergleichsweise hohe Potenziale gefunden (mit Ausnahme des
Potenzials in Acetonitril). Das könnte damit zu erklären sein, dass Liponsäure sowohl als
Liponsäure wie auch als Dehydroliponsäure vorliegen kann und somit die Potenziale
unterschiedlicher Verbindungen bei unterschiedlichen pH-Werten bestimmt wurden.
Zur Überprüfung der von PEYRAT-MAILLARD ET AL. (2003) aufgestellten Hypothese zur
Identifizierung von synergistischen Antioxidantien-Paaren anhand ihrer antioxidativen
Aktivität (3.4.1) wurden die potentiellen Synergisten mit Hilfe der folgende Kriterien
ausgewählt:
1. Eine Substanz kann eine andere reduzieren, wenn sie ein niedrigeres Redoxpotenzial
aufweist als die zu regenerierende Substanz (Beispiel: α-Tocopherol/ Ascorbinsäure).
Weist eine Substanz also ein niedrigeres Redoxpotenzial als das von α-Tocopherol auf
(d.h. < -181 mV in Acetonitril oder < 44 mV in Ethanol/Puffer) oder ein möglichst
niedriges Redoxpotenzial oder ein Redoxpotenzial ähnlich dem von Ascorbinsäure/Ascorbylpalmitat, wurde diese Substanz als potenzieller Synergist zu α-Tocopherol
ausgewählt.
Anhand der in Acetonitril gemessenen Potenziale wurden die Antioxidantien Rosmarinsäure
(-403/457 mV), Butylhydroxyanisol (57 mV), Vinylsyringol (-9 mV), Ascorbigen (37 mV),
Liponsäure (55 mV), Vanillinsäure (583 mV), Tyrosol (487 mV) und Genistein (781 mV)
ausgewählt. Anhand der in Ethanol/Puffer gemessenen Potenziale waren es Quercetin
(-2 mV), Oleuropein (48 mV), und Ethoxyquin (53 mV), über die Ergebnisse in micellarer
Lösung kam Hydrochinon (33 mV) dazu.
2. Eine Substanz kann eine andere reduzieren, wenn sie ein möglichst ähnliches Redoxpotenzial zu α-Tocopherol (LARANJINHA UND CADENAS, 1999) oder ein Redoxpotenzial ähnlich dem von Kaffeesäure aufweist.
Anhand der Redoxpotenziale, gemessen in Acetonitril, wurden Sinapinsäure (59 mV),
Kaempferol (255 mV) und Catechin (297 mV) identifiziert. Durch die Ergebnisse in
Ethanol/Puffer kamen Methylgallat (48 mV), Ethylgallat (38 mV), Propylgallat (53 mV),
Kaempferol (53 mV), Carnosolsäure (59 mV), Chlorogensäure (73 mV) und Vinylsyringol
(73 mV) dazu. In Emulsion und in micellarer Lösung fielen neben den Gallaten keine
weiteren Verbindungen mehr unter dieses Kriterium.
Ein direkter Vergleich mit dem Redoxpotenzial von α-Tocopherol war in den beiden Matrices
- micellare Lösung und Emulsion - nicht möglich, weil für α-Tocopherol in diesen Matrices
kein Potenzial gemessen werden konnte, da das α-Tocopherol komplett in den Micellen
172
Diskussion
solubilisiert und somit für eine Messung nicht zugänglich war (LARANJINHA UND CADENAS,
1999).
Vergleich der getroffenen Antioxidantienauswahl mit Hilfe von antioxidativem Potenzial und
Redoxpotenzial:
Folgende Verbindungen wurden mit Hilfe beider verwendeten Auswahlkriterien als
potenzielle Synergisten zu α-Tocopherol identifiziert: Butylhydroxyanisol, Catechin,
Ascorbigen, Oleuropein, Tyrosol, Sinapinsäure, Vanillinsäure, p-Coumarsäure und
Liponsäure. Hierzu gehören alle Antioxidantien, die in ROTG eine geringere antioxidative
Wirkung aufweisen als α-Tocopherol (Ascorbigen, Genistein, Kaempferol, Liponsäure,
Oleuropein, Tyrosol und Vanillinsäure). Es besteht also ein Zusammenhang zwischen
antioxidativer Aktivität und dem Redoxpotenzial. Es ist in Abb. 4.2 zu erkennen, dass
allerdings kein direkter Zusammenhang zwischen antioxidativer Aktivität und dem
Redoxpotenzial von Antioxidantien besteht. Verbindungen mit einem Redoxpotenzial
oberhalb von 300 mV (in Ethanol/Puffer gegen die Normalwasserstoffelektrode) sind keine
starken Antioxidantien.
Abb. 4.2: Abhängigkeit der antioxidativen Aktivität (DPPH) [Anzahl reduzierter DPPH Moleküle/mol
Analyt pro Liter x 1024]der phenolischen und nicht-phenolischen Verbindungen vom Halbwellenpotenzial
[mV], gemessen in Ethanol/Puffer gegen NWE
Bei den für diese Arbeit durchgeführten Oxidationstests zur Bestätigung der Auswahlkriterien
wurden die Substanzen Butylhydroxyanisol, Catechin, Genistein, Kaempferol, Quercetin,
Vinylsyringol, Ascorbigen, Oleuropein, Tyrosol, Carnosolsäure, Kaffeesäure, Rosmarinsäure,
173
Sinapinsäure, Vanillinsäure und Liponsäure eingesetzt. Es konnten weitere potente
Kandidaten für positive Interaktionen mit α-Tocopherol identifiziert werden. Unter ihnen war
auch eine Reihe von synthetischen Antioxidantien, sie wurden aber im Rahmen dieser Arbeit
nicht weiter untersucht.
4.2.3
Identifizierung von Interaktionen zwischen α-Tocopherol und phenolischen
und nicht-phenolischen Antioxidantien in ROTG und in Emulsionen
Mit Hilfe der Cyclovoltammetrie konnte nachgewiesen werden, dass α-Tocopherol in
Acetonitril und Ethanol/Puffer quasi-reversibel reagieren kann und es dadurch erst zu einer
Regenerierung von α-Tocopherol durch ein anderes Antioxidans kommen kann (Abb. 3.37).
Über die Reversibilität von α-Tocopherol in micellaren Lösungen und Emulsionen kann keine
Aussage gemacht werden, da keine Cyclovoltammogramme aufgenommen werden konnten
(Tab. 3.21, Tab. 3.22).
Mit Hilfe von Oxidationstests sollten die über antioxidative Potenziale (4.2.1) und über
Redoxpotenziale (4.2.2) identifizierten potentiellen Synergisten zu α-Tocopherol überprüft
werden.
In einem Vortest wurde die synergistische Wirkung von α-Tocopherol und Ascorbinsäure
(3.1.4) überprüft und konnte bestätigt werden. Es zeigte sich, dass die Interaktion der beiden
Antioxidantien abhängig ist, sowohl von der gewählten Konzentration als auch von dem
Oxidationsstatus des Systems, bei dem die Interaktionen der Antioxidantien überprüft
wurden. Aus diesem Grund wurden alle Oxidationstests mit unterschiedlichen Konzentrationen durchgeführt. Die Auswertung erfolgte bei unterschiedlichen Oxidationsstadien der
Systeme.
Identifizierung von Interaktionen zwischen α-Tocopherol und phenolischen bzw. nichtphenolischen Antioxidantien in ROTG:
In ROTG konnte nur eine synergistische Wirkung von Ascorbigen und Ascorbinsäure bei
einer hohen α-Tocopherol-Konzentration von 500 µmol/kg ROTG nachgewiesen werden.
Eine Kombination von Carnosolsäure (die Werte schwankten stark), Genistein und Quercetin
mit α-Tocopherol resultierten unter bestimmten Bedingungen in additiven Effekten. Alle
anderen Kombinationen mit α-Tocopherol zeigten antagonistische Effekte.
Die Ergebnisse für Ascorbinsäure sind im Einklang mit Daten von z.B. NIKI
ET AL.
(1984);
BENDICH ET AL. (1986); NIKI ET AL. (1991); MARINOVA UND YANISHLIEVA, (1992b); YIN ET AL.
(1993); HARATS ET AL. (1998); HAMILTON ET AL. (1998); LARANJINHA UND CADENAS (1999). Die
von NIETO ET AL. (1993) identifizierten synergistischen Effekte von Quercetin bzw. Catechin
174
Diskussion
mit α-Tocopherol bei der Inhibierung der Oxidation in Fischöl sowie die von PEDRIELLI UND
SKIBSTED (2002) für Quercetin mit α-Tocopherol und von JOVANOVIC ET AL. (1996) für
Catechin mit α-Tocopherol in Modellsystemen mit Methyllinoleat und Lösungsmittel
beschriebenen Synergismen konnten in der vorliegenden Arbeit nicht bestätigt werden. Die
Ergebnisse von HOPIA ET AL. (1996) konnten in Maiskeimöl bezüglich einer Kombination von
α-Tocopherol mit Carnosolsäure, die nicht zu synergistischer Wirkung führten, bestätigt
werden. Eine synergistische Wirkung zwischen α-Tocopherol und Ascorbigen ist in der
Literatur bisher nicht beschrieben.
Identifizierung von Interaktionen zwischen α-Tocopherol und phenolischen bzw. nichtphenolischen Antioxidantien in Emulsionen:
In Emulsionen hingegen konnten mehrere Synergisten zu α-Tocopherol identifiziert werden.
Kombinationen von α-Tocopherol mit Ascorbinsäure, Butylhydroxyanisol, Catechin,
Genistein, Kaempferol, Oleuropein, Rosmarinsäure, Vanillinsäure und Vinylsyringol führten
zu synergistischen Wirkungen. Die synergistische Wirkung von Ascorbinsäure bestätigt die
Ergebnisse von z.B. NIKI ET AL. (1984); BENDICH ET AL. (1986); NIKI ET AL. (1991); MARINOVA
UND
YANISHLIEVA, (1992b); YIN ET AL. (1993); HARATS ET AL. (1998); HAMILTON ET AL. (1998);
LARANJINHA UND CADENAS (1999). Bis auf Quercetin zeigten alle eingesetzten Flavonoide
synergistische Effekte mit α-Tocopherol in Emulsionen. Dieses Ergebnis steht im Einklang
mit den Ergebnissen von NIETO ET AL. (1993) und TERAO ET AL. (1994), die für Quercetin mit
α-Tocopherol ebenfalls keinen Synergismus identifizieren konnten. Weiterhin stehen die
Ergebnisse dieser Arbeit im Einklang mit Ergebnissen von LIAO UND YIN (2000), die eine
synergistische Wirkung zwischen α-Tocopherol und Catechin nachwiesen. Allerdings kamen
NIETO ET AL. (1993), HIRAMOTO ET AL. (2002) und MURAKAMI ET AL. (2003) zu gegensätzlichen Ergebnissen, indem sie keinen Synergismus für α-Tocopherol und Catechin nachweisen
konnten. Die Regeneration von α-Tocopherol (TOH) durch ein Flavonoid (FlH2) wurde nach
dem Mechanismus von PEDRIELLI UND SKIBSTED (2002) postuliert (Reaktion (2-28) bis (230)). Die beschriebenen synergistischen Wirkungen zwischen α-Tocopherol und Kaffeesäure
(TERAO ET AL., 1994; LARANJINHA ET AL., 1995; NARDINI ET AL., 1997; LIAO UND YIN, 2000)
konnten in dieser Arbeit nicht bestätigt werden. Hingegen bestätigen die Daten Ergebnisse
von PEYRAT-MAILLARD ET AL., 2003, die antagonistische Effekte für Kombinationen mit
Kaffeesäure und α-Tocopherol identifizierten. Diese Antagonismen erklärten sie über die
Regeneration des schwächeren Antioxidans (in diesem Fall α-Tocopherol) durch das stärkere
Antioxidans (in diesem Fall Kaffeesäure). Allerdings stehen deren Ergebnisse bezogen auf
Rosmarinsäure im Gegensatz zu den synergistischen Effekten, die in dieser Arbeit
nachgewiesen werden konnten. Für Liponsäure konnte zwar durch JOCELYN (1967) ein
synergistischer Effekt auf GSH/GSSG nachgewiesen werden, mit α-Tocopherol führte
Liponsäure allerdings nur zu antagonistischen Effekten. Die mit Histidin in Linolsäure-
175
Emulsion gefundene synergistische Wirkung mit α-Tocopherol (BRIMBERG ET AL., 2003)
konnte für die in dieser Arbeit verwendeten Aminosäuren nicht bestätigt werden. Für weitere
synergistische oder antagonistische Wirkungen mit α-Tocopherol lag keine Literatur vor.
Konzentrationsabhängige synergistische Wirkung
Auffällig ist, dass in Emulsionen die meisten positiven Interaktionen aus Kombinationen mit
geringer α-Tocopherol-Konzentration resultierten (Ausnahme: Butylhydroxyanisol). Aber
auch unter diesen Synergisten konnte keine strukturelle Ähnlichkeit ausgemacht werden. Bei
Kombination mit hohen α-Tocopherol-Konzentrationen hingegen zeigten sich antagonistiche
Effekte. Eine Erklärung hierfür wäre der in 4.1.2 eingeführte Parameter (Sproox), mit dessen
Hilfe die Konzentration von α-Tocopherol bestimmt werden konnte, bis zu der die
prooxidativen Eigenschaften von α-Tocopherol noch keinen signifikanten Einfluss auf die
antioxidative Wirkung von α-Tocopherol ausüben. Denn alle in dieser Arbeit identifizierten
Synergismen (Ausnahme: Butylhydroxyanisol) fanden in Gegenwart einer geringen
α-Tocopherol-Konzentration (25 µmol/kg ROTG) in Emulsionen statt, bei der die prooxidative Wirkung von α-Tocopherol noch keinen Einfluss zeigen konnte. Außerdem konnte
festgestellt werden, dass die positiven Interaktionen in den meisten Fällen mit steigender
Synergisten-Konzentration zunahmen.
4.2.4
Prognose von Interaktionen durch physicochemische Eigenschaften und
weitere Messparameter
Antioxidatives Potential (DPPH-Test):
Es kann gefolgert werden, dass mittels DPPH-Methode zur Bestimmung des antioxidativen
Potenzials Aussagen gemacht werden können über Antioxidantien, die in Emulsionen
synergistisch zu α-Tocopherol reagieren, denn die meisten Verbindungen, die eine
synergistische Wirkung mit α-Tocopherol zeigten, wiesen geringere antioxidative Aktivität
auf als α-Tocopherol. Allerdings gilt das nicht für Interaktionen mit α-Tocopherol in ROTG,
da weder stärkere noch schwächere Antioxidantien positive Interaktionen mit α-Tocopherol
ausbilden konnten. Es konnten keine strukturellen Eigenschaften für ein synergistisches
Verhalten verantwortlich gemacht werden.
Alle Antioxidantien (mit Ausnahme von Butylhydroxyanisol und Kaempferol), die in
Emulsionen das α-Tocopheroxylradikal reduzieren konnten, wiesen eine geringere
antioxidative Aktivität in Emulsion auf als α-Tocopherol. Auch Ascorbigen zeigte eine
geringere inhibierende Wirkung in ROTG als α-Tocopherol.
176
Diskussion
Auffällig ist, dass die Antioxidantien, die in beiden Matrices stärkere antioxidative Wirkung
zeigten als α-Tocopherol, in keiner Matrix zu einer positiven Interaktion mit α-Tocopherol in
der Lage waren. Auch bei den Substanzen, die zu antagonistischen Effekten in den einzelnen
Matrices führten, konnten keine einheitlichen Parameter zur Identifizierung negativer
Interaktionen gefunden werden (Tab. 4.3).
Tab. 4.2: Vermessene Parameter der phenolischen Antioxidantien, die positive Interaktionen mit
α-Tocopherol in Bezug auf die Matrix zeigten (O/W: Emulsion; BHA: Butylhydroxyanisol)
Antioxidans
Acetonitril
E1/2 [mV]]
Micellare
Lösung E1/2
[mV]
Emulsion
E1/2 [mV]
Ethanol/
Puffer
E1/2 [mV]
Antioxidative
Aktivität
[reduzierte
DPPHMoleküle pro
24
mol/L]*10
Matrix, in der
die antioxidative
Aktivität
geringer war als
von α-TOH
37
543
602
602
152±0,2
ROTG
-
28
48 / 798
-97
101±0,9
ROTG + O/W
BHA
57
194
245
250 / 446
1040±1,2
ROTG
Catechin
297
169 / 491
154/ 491
124 / 421
232±1,3
O/W
Genistein
781
129 / 778
134/ 773
451
n.a.
ROTG + O/W
Kaempferol
255
129 / 778
134/ 773
53
15927±0,2
ROTG
Oleuropein
325
48
48
204
3835±1,0
ROTG + O/W
-403/ 457
139
129
154
4416±1,2
O/W
Vanillinsäure
583
461
456
421
11±1,3
ROTG + O/W
Vinylsyringol
-9
-
124
73
n.a.
ROTG + O/W
ROTG:
Ascorbigen
Emulsion:
Ascorbinsäure
Rosmarinsäure
177
Tab. 4.3: Vermessene Parameter der phenolischen Antioxidantien, die negative Interaktionen mit
α-Tocopherol in Bezug auf die Matrix zeigten (O/W: Emulsion; BHA: Butylhydroxyanisol)
Antioxidans
Acetonitril
E1/2 [mV]]
Micellare
Lösung E1/2
[mV]
Emulsion
E1/2 [mV]
Ethanol/
Puffer
E1/2 [mV]
Antioxidative
Aktivität
[reduzierte
DPPHMoleküle pro
24
mol/L]*10
Matrix, in der
die antioxidative
Aktivität
geringer war als
von α-TOH
BHA
57
194
245
250 / 446
1040±1,2
ROTG
Carnosolsäure
55
63
53
59
4355±0,6
-
Catechin
297
169 / 491
154/ 491
124 / 421
232±1,3
O/W
Genistein
781
129 / 778
134/ 773
53
n.a.
ROTG + O/W
Kaempferol
255
129 / 778
134/ 773
53
15927±0,2
ROTG
Kaffeesäure
243
94
88
63
5118±22,6
-
Liponsäure
55
562
537
773
261±0,7
ROTG + O/W
Oleuropein
325
48
48
204
3835±1,0
ROTG + O/W
Quercetin
181 / 433
68 / 783
68 / 778
-2 / 360
9484±25,6
-
Rosmarinsäure
-403/ 457
139
129
154
4416±1,2
O/W
Sinapinsäure
259
174
229
124
2369±0,2
ROTG + O/W
Tyrosol
487
442
496
466
15,2±0,3
ROTG + O/W
Vanillinsäure
583
461
456
421
11±1,3
ROTG + O/W
Vinylsyringol
-9
-
124
73
n.a.
ROTG + O/W
Ascorbigen
37
543
602
602
152±0,2
ROTG
Carnosolsäure
55
63
53
59
4355±0,6
-
Kaffeesäure
243
94
88
63
5118±22,6
-
Liponsäure
55
562
537
773
261±0,7
ROTG + O/W
181 / 433
68 / 783
68 / 778
-2 / 360
9484±25,6
-
Sinapinsäure
259
174
229
124
2369±0,2
O/W
Tyrosol
487
442
496
466
15,2±0,3
ROTG + O/W
ROTG:
Emulsion:
Quercetin
178
Diskussion
Redoxpotential:
Die Bestimmung der Redoxpotenziale ergaben nur wenige Hinweise auf positive oder
negative Interaktionen zwischen den Verbindungen.
Alle phenolischen Antioxidantien wiesen in ROTG ein höheres Redoxpotential als
α-Tocopherol auf. Es wurden keine synergistischen Effekte zwischen phenolischen
Antioxidantien und α-Tocopherol in ROTG nachgewiesen. Nur Ascorbinsäure und
Ascorbigen führten zu einem synergistischen Effekt mit α-Tocopherol in ROTG. Diese beiden
Antioxidantien unterscheiden sich strukturell deutlich von den übrigen in dieser Arbeit
getesteten Verbindungen. Sie weisen keine phenolische Struktur auf, sondern sind
Heterozyklen mit Sauerstoff im Zyklus mit benachbarter Ketogruppe. Auffällig ist darüber
hinaus, dass beide Verbindungen in ROTG allein beinahe keine antioxidative Wirkung
aufweisen. Es liegt daher nahe, dass der synergistische Effekt auf einer anderen Wirkung
beruht als auf einer Regenerierung des α-Tocopheroxylradikals (wie es bei phenolischen
Antioxidantien der Fall ist). SCHIEBERLE UND GROSCH (1981) und Von UHL UND EICHNER
(1990) schlugen eine Reduktion der Hydroperoxide durch Ascorbinsäure zu stabilen
Hydroxykomponenten vor, die erst durch Anwesenheit von α-Tocopherol an Bedeutung
gewinnt. Eine weitere Möglichkeit wäre die Reaktion von Ascorbinsäure mit einem
Abbauprodukt von α-Tocopherol. Hierfür käme das α-Tocopherolchinon in Frage, das
Endprodukt im α-Tocopherolabbau, was aus dem α-Tocopheroxylradikal nach Reaktion mit
einem weiteren Lipidhydroperoxidradikal und durch Umformung entsteht (KAMAL-ELDIN
UND APPELQVIST, 1996).
In Emulsionen zeigen diejenigen Antioxidantien, die zu synergistischen Effekten mit
α-Tocopherol führen, sowohl hohe als auch niedrige Potentiale auf. Anhand der Redoxpotenziale kann keine Prognose für synergistische Effekte in Emulsionen abgeleitet werden.
Antioxidative Aktivität als einzelnes Antioxidans:
Alle nachgewiesenen Synergismen mit α-Tocopherol (Ausnahme Kaempferol und
Butylhydroxyanisol mit α-Tocopherol in Emulsion), sowohl in ROTG als auch in Emulsion,
fanden in Gegenwart von schwächeren Antioxidantien statt (in Bezug auf α-Tocopherol). Das
bestätigt die Hypothese von PEYRAT-MAILLARD ET AL. (2003), wonach Synergismen nur
möglich sind, wenn das stärkere Antioxidans vom schwächeren Antioxidans regeneriert wird.
Allerdings konnten auch zwei Synergismen mit Kaempferol und Butylhydroxyanisol
nachgewiesen werden, bei denen α-Tocopherol das schwächere Antioxidans darstellte.
179
Abbau der interagierenden Substanzen:
Anhand der Kontrolle des Abbaus der Antioxidantien in ROTG konnte exemplarisch gezeigt
werden, dass Kaffeesäure einen regenerierenden Einfluss auf α-Tocopherol hatte (Abb. 3.43,
Abb. 3.44). Allerdings führte diese nicht zu einer synergistischen Wirkung, was die
Hypothese von PEYRAT-MAILLARD ET AL. (2003) bestätigen würde. In micellarer Lösung
zeigte sich dieser regenerierende Einfluss nicht (Abb. 3.54., Abb. 3.55). Das könnte erklären,
warum auch in polarer Matrix (Emulsion) keine synergistische Wirkung nachgewiesen
werden konnte. Die Gegenwart von Vanillinsäure zeigte in ROTG keinen Einfluss auf den
Abbau von α-Tocopherol, umgekehrt hingegen zeigten sich geringfügige regenerative Effekte
von α-Tocopherol auf Vanillinsäure (Abb. 3.46, Abb. 3.47), was die leicht antagonistische
Wirkung dieser Antioxidantien-Kombination in ROTG erklären könnte. Allerdings konnten
diese Ergebnisse in micellarer Lösung nicht nachgewiesen werden, d.h. die regenerativen
Effekte in Emulsion können nicht durch einen verzögerten Abbau von α-Tocopherol erklärt
werden, denn in polarer Matrix (micellare Lösung) hatte α-Tocopherol keinen Einfluss auf
den Abbau von Vanillinsäure und umgekehrt (Abb. 3.62, Abb. 3.63). Carnosolsäure zeigte in
micellarer Lösung einen Trend dazu, sich selbst durch Oxidation von α-Tocopherol zu
regenerieren. α-Tocopherol wurde in Gegenwart von Carnosolsäure schneller abgebaut (Abb.
3.56, Abb. 57). Das bestätigt, dass in polarer Matrix (Emulsion) keine synergistische Wirkung
von α-Tocopherol durch Carnosolsäure gefunden werden konnte. Diese Reaktion könnte die
antagonistische Wirkung der Antioxidantien-Kombination erklären. Die micellare Lösung ist
allerdings keine ideale Vergleichslösung für die Emulsionen. Eine direkte Messung in
Emulsionen konnte aufgrund der zu geringen Sensitivität der Messmethode allerdings nicht
erfolgen.
4.2.5
Lokalisierung der Antioxidantien in Emulsionen und micellaren Lösungen
mithilfe der Redoxpotenziale
Wie in 4.2.3 festgestellt, spielt die Lokalisierung der Antioxidantien innerhalb der Emulsion
eine große Rolle. HEINS ET AL. (2006) bestimmten mittels NMR-Spektrometrie den
Solubilisierungsort der Antioxidantien (am Beispiel von Propylgallat) in SDS Emulsionen in
der Grenzschicht. Sie konnten nur sehr geringe Interaktionen zwischen Antioxidans und
Emulgator nachweisen. Aus diesem Grunde wurde für die vorliegende Studie der Emulgator
SDS verwendet. Eine antioxidative Wirkung der in der Grenzschicht solubilisierten
Antioxidantien sollte möglich sein, wenn Antioxidans und Radikal in direkter Nachbarschaft
vorliegen (HEINS ET AL., 2007a). Bei einer Regenerierung eines Antioxidans durch ein
anderes sollte das ebenso möglich sein. Mit Hilfe der in den einzelnen Lösungsmitteln
gemessenen Redoxpotenziale, die im Prinzip Lösungsversuchen in unterschiedlichen
Systemen gleichkommen, ist es möglich, bedingt Aussagen über die Solubilisierungsorte der
180
Diskussion
Antioxidantien in Emulsionen bzw. micellaren Lösungen zu machen. So sollten nur
Antioxidantien, die nicht an der gleichen Stelle lokalisiert sind, wohl aber in direkter
Nachbarschaft liegen, regenerative Eigenschaften untereinander ausbilden können (wenn
antioxidative Aktivität und Redoxpotenzial eine positive Interaktion ermöglichen).
Da die meisten Verbindungen in Acetonitril löslich sind, sollten sie in einer Emulsion
innerhalb der Lipidtropfen oder der Palisadenschicht (P) lokalisiert sein. Für die Substanzen,
die nicht in Acetonitril löslich sind, kann geschlossen werden, dass sie nur in der wässrigen
Phase (W), weniger tief in der Palisadenschicht oder der Sternschicht (S), solubilisiert sein
können. Verbindungen, die sich sowohl in Acetonitril als auch in wässrigem System lösen,
müssten in der Palisadenschicht liegen. Die Verbindungen, die in Acetonitril und in
Ethanol/Puffer vermessen werden konnten, nicht aber in micellarer Lösung oder in Emulsion,
sind tief in der Palisadenschicht gelöst (Abb. 4.3).
W
-
S
P
P
-
P
Abb. 4.3: Vereinfachte Darstellung der Emulgatorschicht einer SDS-Emulsion mit darin solubilisierten
Antioxidansmolekülen an unterschiedlichen Stellen der Micelle. L: Lipidphase, P:Palisadenschicht, S:
Sternschicht, W: wässrige Phase (modifiziert nach Heins, 2005)
Bei Betrachtung der Antioxidantien, die in Emulsionen positive Interaktionen mit
α-Tocopherol eingehen, wird anhand der Redoxpotenzialmessung zunächst deutlich, dass das
α-Tocopherol tief in den Micellen der micellaren Pseudophase oder in der Lipidphase der
Emulsion gelöst sein muss, da eine Bestimmung des Redoxpotenzials von α-Tocopherol in
micellarer Lösung und in Emulsion nicht möglich war. Das bestätigt die Theorie von
LARANJINHA UND CADENAS (1999), die besagt, dass α-Tocopherol nicht aus den Micellen
herauswandern kann. Die Antioxidantien, die eine synergistische Wirkung zu α-Tocopherol
zeigen konnten, waren alle (Ausnahme: Vinylsyringol) in jeder vermessenen Matrix löslich
und konnten somit in der Palisadenschicht oder der Lipidphase reduzierend auf die gebildeten
α-Tocopheroxylradikale einwirken.
181
Tab. 4.4: Löslichkeiten der untersuchten Antioxidantien in unterschiedlich polaren Matrices
Name
Acetonitril
micellare
Lösung
Emulsion
Ethanol/
Puffer
BHA
Catechin
Genistein
Kaempferol
Ascorbinsäure
Vinylsyringol
/
Oleuropein
Thymol
Rosmarinsäure
Vanillinsäure
Allerdings konnten nicht alle Antioxidantien, die in allen Matrices löslich waren,
α-Tocopherol regenerieren. Auch das deutet auf insgesamt komplexere Zusammenhänge der
Regenerationsfähigkeit der Antioxidantien hin.
182
Zusammenfassung und Schlussfolgerungen
5
Zusammenfassung und Schlussfolgerung
Für α-Tocopherol-Konzentration in ROTG wurde ein Konzentrationsbereich für die maximale
inhibierende Wirkung von 75 - 125 µmol/kg ROTG (Wirkungsoptimum, Wopt bei
100 µmol/kg ROTG) festgestellt. Durch die Einführung des kinetischen Parameters (Sproox)
konnte die Konzentration von 22,5 µmol/kg ROTG bestimmt werden, bis zu der die
Teilnahme von α-Tocopherol an den Seitenreaktionen der Oxidation keinen signifikanten
Einfluss auf die antioxidative Wirkung von α-Tocopherol hatte. Es handelt sich hierbei um
den Punkt der stärksten Krümmung der beiden Funktionen der Oxidationslänge in
Abhängigkeit von der α-Tocopherolkonzentration
Es zeigte sich, dass die Bildung von Nebenprodukten mit α-Tocopherol während der
Oxidation ausschlaggebend für die Bildung an Hydroperoxiden ist. Über eine sukzessive
Zugabe von α-Tocopherol wurde die Bildung von Nebenprodukten und Hydroperoxiden trotz
höherer Gesamtkonzentration an α-Tocopherol verringert. Lag die α-TocopherolKonzentration während der Lagerung kontinuierlich im Bereich des Wirkungsoptimums
(Wopt), wurde die Induktionsphase verlängert.
Voroxidierte Lipide führten zu einer Verschiebung des antioxidativen Wirkungsoptimums
von α-Tocopherol zu Konzentrationen oberhalb von 250 µmol/kg ROTG. Bei einem Einsatz
von γ-Tocopherol in voroxidierten ROTG zeigte sich ebenfalls eine Verschiebung des
Wirkungsoptimums zu höheren Konzentrationen bei zunehmender initialer oxidativer
Belastung.
Die Kombination von α- und γ-Tocopherol ist in voroxidierten ROTG im Hinblick auf die
Inhibierung sekundärer Oxidationsprodukte effizient. Bei Inhibierung der Hydroperoxidbildung wirkt sich α-Tocopherol (> 100 µmol/kg ROTG) negativ auf die antioxidative Aktivität
von γ-Tocopherol aus. Es wird angenommen, dass eine Konzentration von < 20 µmol
α-Tocopherol/kg ROTG (Sproox) die antioxidative Wirkung von γ-Tocopherol nicht verringert,
da eine Teilnahme an Seitenreaktionen der Oxidation noch nicht signifikant ist. Die
Ergebnisse der vorliegenden Arbeiten weisen darauf hin, dass bei Verwendung ungenügend
aufgereinigter Fettsäuretriglyceride, die als Modellmatrix zum Vergleich der antioxidativen
Wirkung
verwendet
werden,
nicht
die
noch
enthaltenen
Spuren
von
α-Tocopherol für prooxidative Wirkungen verantwortlich sind, sondern das in wesentlich
183
höherer Konzentration (in Rapsöl) verbliebene γ-Tocopherol für die Förderung der Oxidation
bis hin zu prooxidativen Effekten auszumachen ist.
Ziel dieser Arbeit war es, über die Untersuchung der antioxdativen Potenziale und der
Bestimmung der Redoxpotenziale phenolischer und nicht-phenolischer Antioxidantien ein
Prognoseinstrument zur Identifizierung von synergistischen Interaktionen mit α-Tocopherol
zu erhalten.
Die in der vorliegenden Arbeit nachgewiesenen antioxidativen Aktivitäten der eingesetzten
phenolischen und nicht-phenolischen Antioxidantien bestätigten die in der Literatur
angegebenen Werte. Auch die identifizierten Synergismen und Antagonismen stimmten zum
großen Teil mit der Literatur überein. Zusätzlich zu dem bekannten Synergisten-Paar αTocopherol/Ascorbinsäure konnten noch unbekannte synergistische Paare bestimmt werden,
wie beispielsweise α-Tocopherol mit Ascorbigen in ROTG oder mit Vinylsyringol in
Emulsionen. Es konnte festgestellt werden, dass die Interaktionen zwischen Antioxidantien in
beiden eingesetzten Matrices konzentrationsabhängig abliefen. Mit steigender Synergistenkonzentration stieg auch die synergistische Wirkung, mit steigender α-TocopherolKonzentration verringerte sich allerdings die positive Interaktion, was mithilfe des in der
vorliegenden Arbeit eingeführten Parameters zur Teilnahme von α-Tocopherol an Seitenreaktionen (Sproox) zu erklären ist.
Die zwei in dieser Arbeit aufgestellten Hypothesen für die Ursache von synergistischen
Interaktionen zwischen α-Tocopherol und anderen Antioxidantien konnten nicht bestätigt
werden. Weder das antioxidative Potenzial (DPPH-Test) eines Antioxidans im Vergleich zu
dem antioxidativen Potenzial von α-Tocopherol noch sein Redoxpotenzial im Vergleich zu
dem Redoxpotenzial von α-Tocopherol sind in der Lage, eine Aussage über die resultierende
Interaktion mit α-Tocopherol zu machen. Auch der Vergleich von Strukturmerkmalen der
Antioxidantien konnte nicht zur Vorhersage der Interaktionen verwendet werden.
Die Interaktionen mit α-Tocopherol in ROTG führten alle (mit Ausnahme von Ascorbinsäure
und Ascorbigen) zu antagonistischen Effekten. Alle eingesetzten Verbindungen wiesen sehr
viel höhere Redoxpotenziale auf als α-Tocopherol. Die synergistischen Interaktionen mit
Ascorbinsäure und Ascorbigen sind aufgrund der nicht-phenolischen Strukturen dieser beiden
Verbindungen auf einen anderen regenerierenden Mechanismus zurückzuführen. Eine andere
antioxidative Wirkmöglichkeit von Ascorbinsäure (und Ascorbigen) wurde von SCHIEBERLE
UND GROSCH (1981) und von VON UHL UND EICHNER (1990) vorgeschlagen und ist die
Reduktion von Hydroperoxiden zu stabilen Hydroxykomponenten, die vermutlich erst in
Gegenwart von α-Tocopherol einen Einfluss auf die Bildung von Oxidationsprodukten hat.
Eine weitere Möglichkeit wäre die Reaktion von Ascorbinsäure mit dem Endprodukt der
antioxidativen Wirkung von α-Tocopherol, dem α-Tocopherolchinon (KAMAL-ELDIN UND
APPELQVIST, 1996).
184
Zusammenfassung und Schlussfolgerungen
Die von URI (1961) und PEYRAT-MAILLARD ET AL. (2003) entwickelte Hypothese 1, dass nur
eine synergistische Wirkung resultieren kann, wenn das stärkere Antioxidans durch das
schwächere regeneriert wird und somit das stärkere weiter in den Oxidationsmechanismus
eingreifen kann, konnte in dieser Arbeit zum Teil bestätigt werden. So konnte Kaffeesäure
den Abbau von α-Tocopherol in ROTG verlangsamen und somit eine positive Interaktion
darstellen. Durch seine vergleichsweise starke antioxidative Aktivität resultierte jedoch eine
antagonistische Wirkung. Allerdings waren in Emulsionen auch Butylhydroxyanisol und
Kaempferol in der Lage, eine synergistische Wirkung mit α-Tocopherol auszubilden; sie
zeigten eine stärkere antioxidative Wirkung in Emulsion als α-Tocopherol.
Auch Hypothese 2, bei der das Redoxpotenzial der Substanzen für eine mögliche synergistische Wirkung verantwortlich gemacht wird (BUETTNER UND JURKIEVICZ, 1993; LARANJINHA
UND CADENAS, 1999), konnte in dieser Arbeit nicht bestätigt werden, da keinerlei Vergleichbarkeiten zwischen Redoxpotenzial und synergistischen Effekten identifiziert werden
konnten.
185
186
6
6.1
Verwendete Chemikalien
Soweit nicht anders angegeben, waren alle in dieser Arbeit verwendeten Chemikalien und
Lösungsmittel Standardartikel mit analytischer Qualität und wurden von speziellen
Chemikalien herstellenden Unternehmen bezogen (Sigma-Aldrich Cooperation, St. Louis,
USA; Carl Roth, Karlsruhe, Deutschland; Merck, Darmstadt, Deutschland; APIN Chemicals,
Oxon, United Kingdom; ACT Foods, Hannover, Deutschland). γ-Oryzanol war eine
freundliche Gabe der Firma Beiersdorf (Hamburg, Deutschland) und Carnosol wurde von
Frau Prof. Dr. Karin Schwarz bereitgestellt. Die Reagenzien wurden ohne weitere Aufreinigung für die Analysen eingesetzt.
6.2
Zusammensetzung der Modellsysteme
Um den Einfluss verschiedener Matrices auf die antioxidative Wirksamkeit der eingesetzten
Substanzen zu untersuchen, wurden unterschiedliche Modellsysteme für die Analysen
eingesetzt. Die Auswahl der verwendeten Matrix umfasste zwei polare Systeme, die sich in
ihrer Komplexität unterschieden, sowie ein unpolares System.
-
Polar 1:
Polar 2:
Unpolar:
micellare Lösung
Emulsion
Öl
Zur Herstellung der polaren Matrices wurde der anionische Emulgator SDS verwendet (Abb.
6.1).
+
Na
O
O
S
O
O
Abb. 6.1: Struktur des Emulgators SDS
187
Für die Herstellung der einfachen polaren Matrix, der micellaren Lösung, wurde ein
Natriumacetat-Puffer 0,2 M, pH 5,0 verwendet. Diesem wurden anschließend 30 mM SDS
zugegeben, welches unter Rühren bei 60°C im Wasserbad dispergiert wurde. Für die
komplexe polare Matrix, die Emulsion, und auch für die unpolare Matrix wurde gestripptes
Rapsöl, d.h. aufgereinigte ROTG verwendet. Die Aufreinigung des kommerziell erhältlichen
Rapsöls (Ölmühle Ditzingen, Deutschland) erfolgte mittels Adsorptionssäulenchromatographie nach LAMPI ET AL. (1992), um das Öl von natürlichen Antioxidantien, freien
Fettsäuren, Phospholipiden u.a. zu befreien. Die Chromatographie erfolgte in einer
lichtundurchlässigen Glassäule (zur Verhinderung von lichtinduzierter Oxidation), gefüllt mit
250 g aktiviertem Aluminiumoxid als stationäre Phase (Aktivierung: 8 h 100°C, 12 h 200°C)
und n-Hexan als mobile Phase. Das 1:1 (v/v) mit n-Hexan gemischte kommerzielle Rapsöl
wurde über die Säule gegeben, gefolgt von 300 mL Spül-n-Hexan und anschließend als
Gemisch in einer lichtundurchlässigen Glasflasche aufgefangen. Das n-Hexan wurde mittels
Vakuumrotationsverdampfer (3 x 60°C: 3 min 500 mbar, 2 min 350 mbar, 2 min 280 mbar,
10 min 250 mbar, 1 x 90°C: 3 min 500 mbar, 2 min 350 mbar, 2 min 280 mbar, 2 min 250
mbar, 10 min 100 mbar) abwechselnd durch Vakuum und Begasung mit Stickstoff entfernt.
Das gestrippte Öl wurde dann möglichst sauerstofffrei bei -20°C gelagert. Eine Kontrolle des
Strippvorgangs erfolgte durch den Nachweis der Abwesenheit von α-Tocopherol mittels
normal-phase-HPLC-Methode in n-Heptan und reversed phase-HPLC-Methode in
Methanol/Ameisensäure. Für die Untersuchung der Redoxpotenziale wurden die ROTG
aufgrund des Versuchsaufbaus und eines daraus resultierenden unüberwindbaren Gradienten
zwischen Matrix und wässriger Messelektrode mit Acetonitril substituiert.
Die Herstellung der 30 mM SDS-Emulsion mit 10 % ROTG erfolgte in 200 g Portionen.
Hierfür wurden 20 g ROTG in ein 250 mL Plastikgefäß eingewogen. Zu 1,7454 g SDS
wurden 80 g Natriumacetat-Puffer 0,2 M, pH 5,0 gegeben und bei 60°C unter Rühren
dispergiert. Anschließend wurde diese micellare Lösung zu dem Öl gegeben und für eine
Zeiteinheit mit einer Sonotrode behandelt (HF-Generator GM 2070, Ultraschallwandler UW
2070, Stufenhorn SH 70 G, Sonotrode VS 70 (Bandelin, Berlin); Zeiteinheit: 30 s, Zyklen: 5,
Power: 40 %). Während der zweiten und dritten Zeiteinheit wurden noch einmal 100 g des
Puffers zugegeben. Abschließend wurde das gesamte Gemisch für weitere zwei Zeiteinheiten
mit Ultraschall behandelt, sodass die Emulsion insgesamt für 5 Zeiteinheiten mit Ultraschall
behandelt wurde.
188
6.3
Lipidoxidationsexperimente
Um die antioxidative Effizienz der ausgewählten Substanzen zu untersuchen, wurden 20 g der
gewünschten Matrix in 100 mL gasdichte Schraubdeckelgläser eingewogen. Die unterschiedlichen Antioxidantien wurden dann in ethanolischer Lösung der jeweiligen Matrix zugegeben,
sodass in 100 µL Ethanol die in dem jeweiligen Versuch gewünschte Konzentration an
Antioxidans vorlag. Anschließend wurden die Proben nach kräftigem Schütteln für
15 Sekunden im Ultraschallbad behandelt, damit eine homogene Verteilung der zudosierten
Antioxidantien gegeben war. Während des gesamten Versuchs wurden die Proben, analog
dem modifizierten Schaal-Oven Test, bei 40°C im Dunkeln gelagert. Soweit nicht anders
beschrieben, wurde für jedes unterschiedliche Antioxidans und jede unterschiedliche
Antioxidantien-Konzentration eine Dreifachbestimmung durchgeführt, d.h. es wurden jeweils
3 Gläser mit identischem Antioxidans und identischer Konzentration angesetzt. Das
Fortschreiten der Oxidation wurde durch eine zweimal wöchentliche Kontrolle der
Konzentration der primären (Eisenthiocyanatmethode und Konjugierte-Diene-Methode) und
einer einmal wöchentlichen Kontrolle der sekundären Oxidationsprodukte (Propanal und
Hexanal) verfolgt. Dabei wurde die Bestimmung der primären Oxidationsprodukte für jede
Oxidationsprobe in Dreifachbestimmung und die der sekundären Oxidationsprodukte in
Doppelbestimmung durchgeführt, sodass die Standardabweichung dieser Werte aus 6 bzw. 9
Einzelwerten entstanden ist. Bei einigen Oxidationsexperimenten wurde außerdem der Abbau
der zugesetzten Antioxidantien mittels HPLC-Analyse dokumentiert, die ebenfalls in
Doppelbestimmung erfolgte.
6.3.1
Bestimmung des Hydroperoxidgehaltes mittels Eisenthiocyanat-Methode
Da Eisen(II) durch anwesende Hydroperoxide zu Einsen(III) oxidiert wird, ist es möglich,
dass das so entstandene Eisen(III) mit Thiocyanat einen roten Komplex bildet, welcher
photometrisch bei einem Absorptionsmaximum von 485 nm vermessen werden kann. Für die
Durchführung dieser Methode wurden jeweils ca. 10 mg der zu untersuchenden Probe in ein
Reagenzglas eingewogen und diese in 5 mL Isopropanol durch gutes Mischen der Probe
vollständig gelöst. Jeder Probe wurden zunächst 50 µL einer Ammoniumthiocyanatlösung
(30 g/100 mL NH4SCN) und anschließend 50 µL einer Eisen(II)-Lösung zugegeben
(0,5 g/50 mL FeSO4 * 7 H20 + 0,4 g/50 mL BaCl2 * 2 H20 + 3 mL HCl (25%)). Nach gutem
Mischen der Proben wurden sie für 30 min bei 60°C gelagert, um eine vollständige Reaktion
der Reagenzien zu gewährleisten. Die auf Raumtemperatur abgekühlten Proben wurden
abschließend gegen einen Lösungsmittelblindwert bei 485 nm vermessen (DU 530, Life
Science UV/VIS Spectrophotometer, Beckmann, Fullerton, USA). Die Berechnung der
Konzentration an Hydroperoxiden in der jeweiligen Probe erfolgte über die Berechnung der
189
Konzentration an oxidiertem Eisen über eine Kalibrierung mit unterschiedlichen Eisen(III)Konzentrationen (Abb. 6.2). Anhand der erhaltenen Eisen(III)-Konzentration konnte dann die
Konzentration der in der Probe enthaltenen Hydroperoxide berechnet werden.
Extinktion bei 485 nm
1,8
1,6
1,4
1,2
1
0,8
0,6
y = 0,036x + 0,309
R² = 0,993
0,4
0,2
0
0
10
20
30
40
c(Fe(III)) [µg/5mL]
Abb. 6.2: Kalibrationskurve zur Berechnung der Eisen(III)-Konzentration bei einer Extinktion von
485 nm
Aus der erhaltenen Konzentration von Eisen(III) (cFe(III),) der eingewogenen Probenmenge
(ω) und der molaren Masse von Eisen (MFe = 55,84 g/mol) kann der Gehalt an Hydroperoxiden (HydrPOZ) wie folgt berechnet werden.
(6-1)
 µg 
c Fe ( III ) 
5mL 
 mmol 

HydrPOZ Eisenthiocyanat 
=
 kg Öl  M  g ω  mg 
Fe 


 mol   5mL 
Der erhaltene Wert beträgt ca. das 3,3 fache der POZ (Peroxidzahl) (bestimmt nach Wheeler),
ist aber wesentlich präziser und die benötigte Menge an Probe, Lösungsmittel und Zeit viel
geringer (HEINS ET AL. unveröffentl.).
190
6.3.2
Bestimmung der primären Oxidationsprodukte mittels Konjugierter-DieneMethode
Eine zweite, sehr schnelle und einfach zu handhabende, allerdings weniger sensitive Methode
zur Untersuchung der primären Oxidationsprodukte ist die Verfolgung der durch Oxidation
entstehenden konjugierten Doppelbindungen (konjugierte Diene) aus zuvor isolierten
Doppelbindungen, die bei einer Absorptionswellenlänge von 254 nm detektiert werden
können. Zur Durchführung wurden ca. 10 mg der zu untersuchenden Probe in ein Reagenzglas eingewogen und durch kräftiges Mischen in 5 mL Isopropanol vollständig gelöst. Die
Messung der Extinktion erfolgte anschließend bei einer Adsorption von 254 nm gegen einen
Lösungsmittelblindwert. Die Berechnung der in der Probe vorliegenden Hydroperoxidkonzentration erfolgte dann anhand des Lambert-Beer’schen Gesetzes mit Hilfe des molaren
Extinktionskoeffizienten (ε = 26,000) für Methyllinoleathydroperoxide (CHAN UND LEVETT,
1976). Anhand der vereinfachten Formel wird der Hydroperoxidgehalt in mmol/kg Öl
erhalten, wobei folgende Faktoren berücksichtigt werden: ω die Einwaage der Probe [mg/5
mL], der berechnete Verdünnungsfaktor (d = 50), der molare Extinktionskoeffizient von 10
mM Methyllinoleathydroperoxide (fε = 0,26) und der Gehalt an Öl in der Probe (cÖl =
CÖl[%]/100).
(6-2)
6.3.3
E 234 d
 mmol 
HydrPOZ KonjugierteDiene 
=

 kg Öl  f c ω  mg 
ε Öl
 5mL 


Bestimmung der sekundären Oxidationsprodukte Propanal und Hexanal
mittels HSGC
Lipide, die zu einem Großteil Linol- und Linolensäure enthalten, bilden durch Oxidation die
flüchtigen Indikatorsubstanzen Propanal und Hexanal. Die Entstehung dieser Substanzen
während des Oxidationsprozesses kann mittels Headspace-Gaschromatographie (HP 7683
Headspacesampler, Agilent Systems 6890 Series) verfolgt werden. Hierfür wurde ca. 1 g der
zu untersuchenden Probe in ein fest verschließbares 20 mL Probengefäß eingewogen und für
15 min bei 70°C inkubiert. Während dieser Zeit stellte sich ein Verteilungsgleichgewicht von
Propanal und Hexanal zwischen Probe und darüberliegendem Gasraum ein. Ein Teil dieser
Gasphase wurde dann in den Gaschromatographen injiziert.
191
Tab. 6.1: Headspace und Gaschromatographie (GC)-Bedingungen für die Bestimmung von Propanal und
Hexanal
Headspace Bedingungen
Ofentemperatur
Probenventil
Transferlinie
Vial Äquilibrierung
Vial Druckbeaufschlagung
Probenschleifenbefüllung
Probenschleifen-Äquilibrierung
Probeninjektion
GC Bedingungen
Säule
Injektion
Gas
Split-Verhältnis
Temperaturgradient
70°C
90°C
100°C
15 min
0,15 min
0,3 min
0,05 min
1,00 min
Laufzeit
Detektion
DB 1,30 m x 1 µm (J&W)
180°C
Stickstoff, 1,6 mL/min
4:1
40°C/min für 5 min,
10°C/min bis 94°C für 7,6 min
18 min
FID, 220°C
Die Berechnung der in der Probe enthaltenen Konzentrationen erfolgte über die ermittelten
Peakgrößen, die ins Verhältnis zu der entsprechenden Kalibrationskurve gesetzt wurden.
Propanal
y = 13,785x + 9,7345
R2 = 0,9935
1200
1000
Hexanal
y = 2,2624x + 4,7124
R2 = 0,903
AUC
800
600
400
200
0
0
50
100
150
200
250
300
350
Abb. 6.3: Kalibrationskurven zur Berechnung der Hexanal- und der Propanalkonzentration in SDSEmulsionen, bezogen auf die Ölphase
192
1400
Propanal
y = 1,1203x + 5,1692
R2 = 0,9993
1200
AUC
1000
800
600
Hexanal
y = 0,0214x + 7,5448
R2 = 0,9365
400
200
0
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
Abb. 6.4: Kalibrationskurven zur Berechnung der Hexanal- und der Propanalkonzentration in ROTG
6.3.4
Bestimmung der Qualitätsparameter von Antioxidantien
Zur besseren Auswertbarkeit der erhaltenen Oxidationskurven wurden verschiedene
Qualitätsparameter der eingesetzten Antioxidantien und Antioxidantienkombinationen anhand
der erhaltenen Werte bestimmt bzw. berechnet. Dazu gehören die Bestimmung der Länge der
Induktionsphase, die Berechnung der Inhibierung der Oxidation und die Berechnung der
durch YANISHLIEVA UND MARINOVA (1992a,b,c) und MARINOVA ET AL. (1994) eingeführten
Parameter: Stärke, Effektivität und antioxidative Aktivität der eingesetzten Antioxidantien.
6.3.4.1
Länge der Induktionsphase
Die Länge der Induktionsphase wird durch den Schnittpunkt zweier an die Oxidationskurve
angelegter Tangenten bestimmt und stellt somit den Umschlagspunkt der Kurve dar.
193
6.3.4.2
Berechnung der Inhibierung
Um die Effizienz der eingesetzten unterschiedlichen Antioxidantien und Antioxidantienkombinationen besser vergleichen zu können, wurde die Inhibierung der Oxidation zu einem
bestimmten Zeitpunkt für alle zu vergleichenden Proben bestimmt. Dieser Zeitpunkt wurde
über den oxidativen Status (Hydroperoxidgehalt) der Kontrollprobe festgelegt und ist
systemabhängig. Die Berechnung erfolgte anhand nachstehender Formel (6-3),
(6-3)
 mmol 
∆HydrPOZ t ,Pr obe 
⋅100
kg Öl 

Inhibierung[%]=100−
 mmol 
∆HydrPOZ t , Kontrolle 

 kg Öl 
wobei ∆HydrPOZ = HydrPOZt – HydrPOZ0 sowohl für Probe und Kontrolle steht und t
durch die Lagerdauer [Tage] dargestellt wird, bei der ein zuvor festgelegter Hydroperoxidgehalt durch die Kontrollprobe erreicht ist.
6.3.4.3
Berechnung kinetischer Parameter nach Yanishlieva und Marinova
Die antioxidative Effektivität der einzelnen eingesetzten Antioxidantien kann mithilfe des
Stabilisationsfaktors F verglichen werden. Dieser wird auf Basis der Länge der Induktionsperiode der Oxidationskurve der entsprechenden Probe mit dem zu untersuchenden Antioxidans
(IPInH) und der Länge der Induktionsperiode der entsprechenden Probe ohne Antioxidans
(IP0,) in Sekunden berechnet.
(6-4)
F=
IPInH [s ]
IP0 [s ]
Je höher dieser Wert, desto effektiver ist der Einsatz des untersuchten Antioxidans in dem
entsprechenden System bei der Terminierung der Oxidationskette.
Ein zweiter qualitätsbestimmender Parameter ist die Stärke des zu untersuchenden
Antioxidans. Sie bestimmt sich durch das Oxidationsratenverhältnis (ORR). Dieses Verhältnis
ist eine inverse Messgröße, d.h. je niedriger der erhaltene Wert, desto stärker ist das
eingesetzte Antioxidans. Ist der Wert ORR > 1 geschieht die Oxidation schneller in
Anwesenheit eines Antioxidans als in seiner Abwesenheit. Seine Berechnung erfolgt über die
Oxidationsrate (WInh) der Probe während der Induktionsphase mit und ohne Antioxidans,
wobei sich diese wiederum über die Hydroperoxid-Konzentration in der Probe und die Länge
der Induktionsphase berechnet.
194
(6-5)
 M  HydrPOZ [ M ]
WInh   =
IPInH [ s ]
 s 
(6-6)
M 
WInh  
 s 
ORR =
M 
W0  
 s 
Aus diesen beiden Parametern folgt schließlich die antioxidative Aktivität (A) des Antioxidans. Sie ist eine Kombination der Effektivität eines Antioxidans (d.h. der Fähigkeit eines
Antioxidans, die Oxidationskette zu terminieren) mit der Fähigkeit, die Oxidationsrate
während der Induktionsperiode zu beeinflussen.
(6-7)
A=
F
ORR
Die mittlere Rate des Antioxidantienverbrauchs (WInH) berechnet sich über die anfängliche
Antioxidantien-Konzentration (InH)0 und die Länge der Induktionsphase (IPinh).
(6-8)
6.3.5
 M  ( InH ) 0 [ M ]
WInH   =
IPinh [ s ]
 s 
Bestimmung des Abbaus von Antioxidantien mittels HPLC
Der Abbau von α-Tocopherol wurde während jedes Oxidationsversuches mittels HPLCAnalyse verfolgt, um den Einfluss des eingesetzten Synergisten auf den Abbau des
α-Tocopherols zu dokumentieren. Der parallel dazu verlaufende Abbau der eingesetzten
Synergisten wurde ebenfalls mittels reversed phase HPLC-Analyse anhand der zwei BeispielAntioxidantien Kaffeesäure und Vanillinsäure untersucht. Eine mögliche regenerierende bzw.
destruktive Wirkung konnte somit über den beschleunigten bzw. verzögerten Abbau des
Synergisten bestätigt werden. Zusätzlich wurde die antioxidative Aktivität der verwendeten
Substanzen mittels DPPH-Methode untersucht.
195
6.3.5.1
Bestimmung des antioxidativen Potenzials mittels DPPH-Methode
Die antioxidativen Potenziale der verwendeten Antioxidantien sind systemabhängig. Aus
diesem Grunde wurden sie mittels eines stabilen Radikals dem 1,1-diphenyl-2picrylhydracylradikal (DPPH) (Abb. 6.5) in Ethanol bestimmt (BRAND-WILLIAMS
1995, BONDET ET AL., 1997).
NO2
(AH)n
(A.) n
ET AL.,
NO2
H
N N
NO2
N N
NO2
violett
NO2
NO2
gelb
Abb. 6.5: Struktur des Radikals DPPH und Reaktionsmechanismus
Dieses Radikal weist eine photometrisch nachweisbare violette Farbe mit einem Absorptionsmaximum bei 516 nm auf. Reagiert das freie Elektron des Radikals mit einem Wasserstoffatom des zu untersuchenden Antioxidans zu einem Elektronenpaar, verändert sich die Farbe.
Durch Reduktion entsteht das gelbe DPPH-H. Diese Reaktion ist stöchiometrisch äquivalent
zu der Anzahl der ausgetauschten Elektronen und kann daher mit Hilfe einer Kalibrationskurve zur Bestimmung der Anzahl reduzierter Radikale verwendet werden.
Für die Analyse werden 950 µL einer ethanolischen DPPH-Stammlösung (0,1 mM) und
2000 µL Ethanol zusammengegeben und bei 516 nm photometrisch (DU 530, Life Science
UV/VIS Spectrophotometer, Beckmann, Fullerton, CA, USA) vermessen. Nach Zugabe von
50 µL Antioxidantienstammlösung und nach einer Reaktionszeit von 10 min wird erneut
vermessen. Aus der Differenz der Extinktionen der Messungen vor und nach Zugabe des
Antioxidans kann nun mit Hilfe der nachfolgenden Kalibrierfunktion die Anzahl an
reduzierten Radikalen berechnet werden, die für 10 mg des eingesetzten Analyten benötigt
wurde. Jedes Ergebnis wurde in Dreifachbestimmung ermittelt.
196
3,5
y = 1,83E-20x + 0,0188
R2 = 0,9985
Extinktion bei 516 nm
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0
0,0E+00
5,0E+19
1,0E+20
1,5E+20
2,0E+20
reduzierte DPPH Moleküle/L
Abb. 6.6: Kalibrationskurve zur Berechnung der Anzahl reduzierter Radikale pro Mol Analyt/L
6.3.5.2
Abbau von α-Tocopherol
Für die Kontrolle des Abbaus der eingesetzten Antioxidantien wurden unterschiedliche HPLC
(Agilent Series 1100)-Methoden verwendet.
197
Tab. 6.2: Chromatographiebedingungen für die Bestimmung von α-Tocopherol, a. mittels reversed-phaseHPLC und b. mittels normal-phase-HPLC
a.
α-Tocopherol
Stationäre Phase
Vorsäule
Mobile Phase
Eluentengradient
Flussrate
Detektor
Retentionszeit
Injektionsvolumen
Säulentemperatur
(Agilent Series 1100)
CC 250/4 NUCLEOSIL 100-5 C18
A: 99,95 % Methanol + 0,05 % Ameisensäure
isokratisch
0,9 mL/min
Fluoreszenzdetektor, Ex. 289 nm, Em. 331 nm
9,02 min
50 µL
20 °C
b.
α-Tocopherol
Stationäre Phase
Vorsäule
Mobile Phase
Eluentengradient
Flussrate
Detektor
Retentionszeit
Injektionsvolumen
Säulentemperatur
(Shimadzu)
LiChrospher Si 100 (5 µm)
LiChrospher Si 100 (5 µm)
A: 99 % n-Heptan + 1 % Isopropanol
isokratisch
1 mL/min
Fluoreszenzdetektor, Ex. 290 nm, Em. 328 nm
ca. 5,3 min
20 µL
24 °C
Tab. 6.3: Chromatographiebedingungen für die Bestimmung von Kaffeesäure (KS) und Vanillinsäure
(VS)
KS/VS
Stationäre Phase
Vorsäule
Mobile Phase
A: 90 % H2O + 9,99 % Methanol + 0,01 % Ameisensäure
B: 99,95 % Methanol + 0,05 % Ameisensäure
Eluentengradient
KS
1
2
3
4
5
6
Zeit
[min]
8,50
10,50
12,00
16,50
18,50
25,00
%B
Fluss
43
70
100
100
43
43
0,6
0,7
0,7
0,7
0,6
0,6
Eluentengradient
Retentionszeit
Flussrate
6,50 min
0,6 mL/min
Detektor
Variabler Wellenlängendetektor, 250 nm
Injektionsvolumen
50 µL
Säulentemperatur
20°C
198
VS
1
2
3
4
5
Zeit
[min]
8,00
10,50
17,50
19,50
24,00
7,18 min
%B
Fluss
40
100
100
40
40
0,6
0,7
0,7
0,6
0,6
Zum Teil konnten die Proben direkt injiziert werden und bedurften keiner weiteren
Aufarbeitung. Für einige Untersuchungen musste dennoch ein Extraktionsschritt durchgeführt
werden. Hierfür wurde wie folgt vorgegangen (Tab. 6.4):
Tab. 6.4: Extraktionsbedingungen für die Kontrolle des Abbaus der verwendeten Antioxidantien mittels
HPLC
Matrix
Öl
Micellare Lösung
Öl
Micellare Lösung
Analyt
α-Tocopherola
α-Tocopherolb
α-Tocopherola
KS, VS
Probeneinwaage
[mg]
100
100
200
Lösungsmittel
Lösungsmittel-
Verdünnung
Methanol
n-Heptan
Methanol
900
400
800
/
/
/
100
200
Methanol
Methanol
900
800
1:1 mit H2O
1:1 mit H2O
menge [µL]
Zunächst wurde eine bestimmte Probenmenge eingewogen und mit der entsprechenden
Menge an Lösungsmittel zur Extraktion für 30 Sekunden gevortext. Anschließend wurde die
Lösungsmittelfraktion direkt in die HPLC injiziert oder Fließmittel bedingt mit H2O verdünnt.
Die Berechnung der in der Probe enthaltenen Antioxidantien-Konzentration erfolgte mittels
der entsprechenden Kalibriergeraden.
199
4500
Kaffeesäure
y = 78,901x + 16,845
R2 = 0,9999
4000
3500
AUC
3000
2500
2000
Vanillinsäure
y = 40,408x + 7,5943
R2 = 1
1500
1000
500
0
0
10
20
30
40
50
60
c(Analyt) [µmol/L]
Abb. 6.7: Kalibrationskurven zur Berechnung der Kaffeesäure- und der Vanillinsäure-Konzentration,
bezogen auf die Ölphase
6000
y = 239,1x - 6,581
R² = 0,999
5000
AUC
4000
3000
2000
1000
0
0
5
10
15
20
25
c(α-TOH) [µmol/L]
Abb. 6.8: a. Kalibrationskurve zur Berechnung der α-Tocopherol-Konzentration (α-TOH), bezogen auf
die Ölphase, bestimmt mittels reversed-phase-HPLC
200
2.
y = 13892x - 2,1925
R2 = 0,9997
7000
6000
AUC*1000
5000
1.
y = 12186x - 17,272
R2 = 0,9998
4000
3000
2000
1000
0
0,000
0,100
0,200
0,300
0,400
0,500
0,600
c(α-TOH) [µmol/L]
Abb. 6.9: b. Kalibrationskurven zur Berechnung der α-Tocopherol-Konzentration (α-TOH), bezogen auf
die Ölphase, bestimmt mit normal-phase-HPLC. Da die Lampe des Photometers getauscht wurde, musste
neu kalibriert werden.
Die Wiederfindung der einzelnen Analyte war sehr unterschiedlich, wenn die Probe nach
Verdünnung nicht direkt injiziert werden konnte, sondern extrahiert werden musste. Daher
war sie in diesen Fällen mit in die Berechnung der Konzentration in der Probe einzubeziehen.
Hierfür wurden 6 Proben mit definierter Ausgangskonzentration an Analyt hergestellt und
vermessen. Die Wiederfindung (WF) ergab sich dann aus der eigentlichen Soll-Konzentration
(Konz.SOLL) und der gemessenen Ist-Konzentration (Konz. IST):
(6-10)
WF [%] =
Konz. IST [mol / L]⋅ 100
Konz.SOLL [mol / L]
Tab. 6.5: Darstellung der Wiederfindung (WF) der Analyte Kaffeesäure und Vanillinsäure in ROTG bei
einer Konzentration von 500 µmol/kg ROTG
Probe
1
2
3
4
5
6
Durchschnitt
Kaffeesäure
Gemessene Konzentration
[µmol/L]
366,18
315,72
229,84
287,05
324,21
293,16
WF [%]
73,24
63,14
45,97
57,41
64,84
58,63
60,54
Vanillinsäure
[µmol/L]
536,25
563,27
565,80
545,95
559,22
540,71
WF [%]
107,25
112,65
113,16
109,19
111,84
108,14
110,37
201
Tab. 6.6: Darstellung der Wiederfindung des Analyten α-Tocopherol in micellarer Lösung (b.) und in
ROTG (a.) bei einer Konzentration von 500 µmol/kg ROTG
1
Micellare Lösung
[µmol/L]
0,144
28,77
ROTG
[µmol/L]
265,93
2
0,136
27,18
274,49
54,90
3
0,124
24,87
262,81
52,56
4
0,159
31,70
281,52
56,30
5
0,135
26,93
241,57
48,31
6
0,139
27,81
273,77
54,75
Probe
Durchschnitt
6.3.6
WF [%]
27,88
WF [%]
53,19
53,34
Bestimmung des Redoxpotenzials
Grundlage elektrochemischer Messungen ist eine elektrochemische Zelle aus mindestens zwei
Elektroden, die in eine Probelösung eintauchen. Es handelt sich um eine elektrolytische Zelle,
wenn aus einer externen Quelle Elektrizität für die Durchführung der Messungen benötigt
wird. Eine der beiden Elektroden reagiert auf den Analyten (polarisierbare Arbeitselektrode),
die andere Elektrode weist ein konstantes, aber lösungsabhängiges Potenzial auf und stellt die
unpolarisierbare Referenzelektrode dar. Die in dieser Arbeit verwendeten potentiostatischen
Methoden beruhen auf der Untersuchung des Ladungsaustausches an der Grenzfläche
zwischen Elektrode und Lösung und basieren somit auf dynamischen Situationen. Die
resultierende Spannung wird gemessen und kann ins Verhältnis zu der Konzentration des
Analyten gesetzt werden. Mit Hilfe des gemessenen Potenzials können Aussagen über die
Kraft gemacht werden, mit der die Substanz ein Elektron aufnehmen oder abgeben kann
(WANG, 2006).
(6-11)
-
Ox + ne ↔ Red
Ox und Red stellen die oxidierte und die reduzierte Form des Redoxpaares dar und n die
Anzahl ausgetauschter Elektronen. Diese Reaktion wird bei einem Potenzial ablaufen, bei
dem der Elektronentransfer thermodynamisch oder kinetisch begünstigt wird. Für solche
Systeme gilt die Nernst-Gleichung, über die z.B. das Standardpotenzial oder die Konzentration des Analyten berechnet werden kann.
202
k
2,3 ⋅ RT
υ
ln ∏ ai i
i =1
nF
c
2,3 ⋅ RT
= E0 +
ln ox
nF
c red
E = E0 +
(6-12)
a = Aktivität
νi = -ν Edukte; +ν Produkte
cox/red = Konzentration der oxidierten bzw. der reduzierten Substanz in der Lösung
E = Elektrodenpotenzial
E0 = Standardpotenzial für die Redoxreaktion
R = universelle Gaskonstante [8,314 1/(K*mol)]
T = Temperatur in Kelvin [K]
n = Zahl der ausgetauschten Elektronen
F = Faraday-Konstante [96,487 C]
Aus der Messung resultiert ein Strom-Potenzial-Diagramm, ein Voltammogramm (WANG,
2006).
Folgender Prozess läuft an der Elektrode ab: Die elektrische Doppelschicht ist die Anordnung
von geladenen Partikeln und/oder orientierten Dipolen, die in jeder Grenzfläche zu finden
sind. Eine positiv geladene Elektrode zieht daher eine Schicht aus negativen Ionen an und
umgekehrt. Insgesamt muss die Grenzfläche neutral geladen sein. Die Grenzfläche weist eine
komplexe Struktur mit klar trennbaren Bereichen auf. Die beiden innersten Schichten (am
dichtesten zur Elektrode) sind die Dipolschicht, die durch die Solvensmoleküldipole gebildet
wird und die innere Helmholtzschicht, die durch kontaktadsorbierte Zonen, die nicht in der
wässrigen Lösung hydratisiert sind, gebildet wird. Es treten entweder Van-der-WaalsWechselwirkungen oder Coulomb-Kräfte zwischen den Molekülen und den Elektronen des
Metalls auf. Die Lösungsmittelmoleküle können ebenfalls mit der Elektrodenoberfläche in
Wechselwirkung treten, und zwar über elektrostatische Wechselwirkungen. Sie bilden die
elektrostatische Dipolschicht. Die nächste Schicht, die äußere Helmholzschicht, ist dargestellt
durch die imaginäre Mitte der solvatisierten Ionen, die möglichst dicht an der Oberfläche der
Elektrode liegen. Diese solvatisierten Ionen sind unspezifisch adsorbiert und werden durch
weitreichende Coulombkräfte angezogen. Beide Helmholzschichten stellen zusammen eine
sehr kompakte, sehr stabile Schicht dar. Auf die äußere Helmholtzschicht folgt die diffuse
Schicht, sie ist eine dreidimensionale Region aus verstreuten Ionen. Dieses ionische
Streuverhalten reflektiert das Gleichgewicht zwischen ordnenden Kräften des elektrischen
Feldes und den in Unordnung bringenden Kräften der zufälligen thermisch bedingten
Bewegung der Lösung. Das Gleichgewicht zwischen diesen beiden gegensätzlich wirkenden
Effekten zeigt, dass die Konzentration der ionischen Spezies bei einer bestimmten Entfernung
von der Elektrodenoberfläche C(x) exponentiell mit dem Verhältnis zwischen elektrostatischer Energie (zFФ) und der thermischen Energie (RT) abklingt. Dies geschieht im Einklang
mit der Bolzmanngleichung:
203
(6.13)
C ( x ) = C ( 0) e
− zFΦ
RT
An der Arbeitselektrode wird eine variable Spannung angelegt. Erreicht diese das Zersetzungspotenzial des in der Lösung enthaltenen Analyten, wird dieser umgesetzt. Dafür müssen
die Analyte aus der äußeren Helmholtzschicht durch die Dipolschicht in die innere
Helmholtzschicht vorrücken, dort eventuelle Solvathüllen abgeben, um dann ein Elektron an
die Elektrode abgeben zu können. Sie werden entweder adsorbiert, oder aber sie nehmen
wieder eine Solvathülle auf und wandern aus der inneren Helmholtzschicht in die äußere ab.
Dieser Vorgang der Depolarisation der Arbeitselektrode, durch den ein Stromfluss zwischen
der Arbeits- und der Referenzelektrode entsteht, kann gemessen werden (KUNZE, 1990;
WANG, 2006). Der resultierende Strom steigt mit zunehmender Konzentration an Antioxidans
(GAYLOR UND ELVING, 1953).
In der vorliegenden Arbeit wird sowohl die Differenz-Puls-Voltammetrie als auch die
Cyclovoltammetrie verwendet, zwei unterschiedliche Verfahren der Spannungsanlegung.
6.3.6.1
Differenz-Puls-Voltammetrie / Cyclovoltammetrie
Da die Messungen in unterschiedlichen Systemen durchgeführt wurden, mussten zwei
verschiedene Versuchsaufbauten verwendet werden.
Für Potenzialmessungen in ROTG konnte kein geeignetes Leitsalz gefunden werden, da keins
der üblichen Salze in ROTG löslich ist. Stattdessen wurden die Messungen in Acetonitril
durchgeführt. Acetonitril wurde aufgrund seiner eigenen Stabilität gegenüber Redoxreaktionen ausgewählt. Die Probenvorbereitungen und die Messungen wurden vollständig unter
Argonatmosphäre durchgeführt, um den Einfluss von Luftsauerstoff zu verhindern (Glovebox
MBRAUN UniLab, Deutschland). Ein Dreielektroden-Potentiostat/Galvanostat (EG&G
Princton Applied Research, Model 273 A, Irland) wurde zusammen mit einer PlatinknopfArbeitselektrode (Metrohm, Pt 6.0301…100, Schweiz), einer Platinstab-Gegenelektrode und
einer Silberstabreferenzelektrode als Messeinheit verwendet. Als interner Standard diente
Ferrocen (+641 mV vs. NWE) (CONNELLY UND GEIGER, 1996; LINDE, 2006). Die vermessenen Proben enthielten 1 mM Tetrabutylammonium-hexafluorophosphat ([TBA][FP6]) als
Leitsalz und 1 mM des Analyten. Zur Referenzierung wurde nach den ersten Messdurchgängen Ferrocen mit einer Konzentration von 1 mM zugegeben und erneut gemessen. Die
weiteren Messeinstellungen werden in Tab. 6.7 aufgeführt.
Die Auswertung der Potenziale erfolgte mit dem Programm EG&G Princton Applied
Research (Model 270/250 Research Electrochemistry Software 4.30, Copyright 1996, EG&G
Instruments Inc., Irland).
204
Abb. 6.10: Struktur von Ferrocen
Tab. 6.7: Geräteparameter zur Messung von Differenz-Puls-Voltammogrammen (DPV) und Cyclovoltammogrammen (CV) in Acetonitril
Äquilibrierungszeit
Startpotenzial
Endpotenzial
Pulshöhe
Scanrate
Scan Inkrement
Schritte / Drop Zeit
Pulsweite
Schritt Zeit
Anzahl der Zyklen
DPV
15 s
-1,8 V
2,3 V
50 mV
20 mV/s
2 mV
100 ms
50 ms
/
/
CV
15 s
-1,0 V
2,0 V
/
80 mV/s
4 mV
/
/
50 ms
3
Die Messungen in den wassergaltigen Matrices - micellare Lösung, Emulsion und Ethanol/Puffer - konnten gegen eine Silber/Silberchlorid-Schliffelektrode (0,197 V vs. NWE)
(Metrohm, 6.0726.100, Schweiz) referenziert werden und erforderten somit keinen internen
Standard. Als Messelektrode wurde eine Mikro-Platin-Scheibenelektrode (Metrohm,
Schweiz) und als Gegenelektrode ein Platinstab verwendet. Der zugesetzte Emulgator SDS
und das Puffersalz Natriumacetat dienten bei den Messungen gleichzeitig auch als Leitsalz.
Die Messungen erfolgten mittels eines Autolab Potentiostaten/Galvanostaten (PG STAT 30,
Metrohm, Schweiz) und eines 663 VA Standes mit Messeinheit (Metrohm, Schweiz) unter
Stickstoff. Als Software wurde das 757 VA Computrace Programm von Metrohm verwendet.
Die Lösung enthielt eine Konzentration von 30 mM SDS und 1 mM Analyt. Um störenden
Sauerstoff zu vertreiben, wurden zunächst 5 min Stickstoff in 15 mL Matrix eingeleitet,
anschließend wurde diese Lösung mit Stickstoff belegt. Die Messung erfolgte dann an einer
ruhenden Lösung. Weitere Messeinstellungen sind der Tab. 6.8 zu entnehmen. Die
Auswertung der Potenziale erfolgte ebenfalls mit dem Programm 757 VA Computrace
(Version 1,0, Metrohm, Schweiz).
205
Tab. 6.8: Geräteparameter zur Messung von Differenz-Puls-Voltammogrammen (DPV) und Cyclovoltammogrammen (CV) in Acetonitril
Initiale Gaseinleitung (N2)
Äquilibrierungszeit
Startpotenzial
Endpotenzial
Spannungsschritte
Pulsamplitude
Pulszeit
Spannnungsschrittzeit
Rate der Durchläufe
Anzahl der Durchläufe
6.3.6.1.1
DPV
300 s
10 s
-1,2 V
2,2 V
0,005 V
0,05 V
0,04 s
0,4 s
0,0125 V/s
/
CV
300 s
10 s
-1,2 V
1,3 V
0,005 V
/
/
/
0,1 V/s
1 bis 10
BARKER UND JENKIN führten 1952 mit der pulsvoltammetrischen Technik eine sehr sensitive
Methode zur Durchführung voltammetrischer Messungen ein. Heutzutage handelt es sich um
eine gebräuchliche Methode zum Nachweis von organischen und nichtorganischen
Substanzen im Spurenbereich. In der Differenz-Puls-Voltammetrie werden Pulse mit
festgelegter Stärke – überlagernd, auf einer linearen Spannungsrampe – an die Arbeitselektrode angelegt (Abb. 6.11).
Abb. 6.11: Spannungsrampe der an die Arbeitselektrode angelegten Spannung bei der Differenz-PulsVoltammetrie, modifiziert nach WANG (2006)
Bei Erreichen des Zersetzungspotenzials des Analyten wird dieser oxidiert. Ist diese
Spannung erreicht, werden zunächst die Analytmoleküle, die sich in der Doppelschicht der
inneren Helmholzschicht befinden, oxidert. Nach einem Puls können dann Moleküle aus der
näheren Umgebung in die Doppelschicht für den nächsten Puls nachrücken. Ist eine Spannung
206
erreicht, bei der schon die Grundspannung genügt, um das Antioxidans zu oxidieren, resultiert
durch den zusätzlichen Puls kein weiterer Anstieg des Stroms. Das resultierende DifferentialPuls-Voltammogramm zeigt einen Spannungspeak, dessen Höhe direkt proportional zu der
Konzentration des korrespondierenden Analyten ist. Das erhaltene Peakpotenzial kann zur
Bestimmung des polarographischen Halbwellenpotenzials verwendet werden. Die Wahl der
Pulsrate und der Scanrate des Potenzials bedingt eine Beziehung zwischen Sensitivität,
Auflösungsvermögen und Geschwindigkeit. So resultieren z.B. größere Pulsamplituden in
größeren und breiteren Peaks. Daher müssen für einen Vergleich der vermessenen Potenziale
die gleichen Bedingungen gelten (WANG, 2006).
6.3.6.1.2
Cyclovoltammetrie
Die Cyclovoltammetrie ermöglicht eine schnelle Bestimmung der Lage des Redoxpotenzials
einer elektroaktiven Verbindung und eine leichte Einschätzung des Effektes der Matrix auf
den Redoxprozess. Bei der Cyclovoltammetrie wird eine Gleichspannungsrampe mit hoher
Spannungsänderungsgeschwindigkeit zwischen Arbeits- und Referenzelektrode angelegt,
Spannung (U)
wobei Ausgangs- und Endpotenzial gleich sind.
Startspannung
Endspannung
Entgegengesetzter
Scan
Vorwärtsscan
Umschaltspannung
Zeit (t)
1 Zyklus
Abb. 6.12: Spannungsrampe der an die Arbeitselektrode angelegten Spannung bei der Cyclovoltammetrie, nach WANG (2006)
Während des Spannungsdurchlaufs misst der Potentiostat die resultierende Stromstärke.
Erhalten wird ein Cyclovoltammogramm. Dieses Voltammogramm ist eine komplexe,
zeitabhängige Funktion einer großen Anzahl von physikalischen und chemischen Parametern.
Bei den in dieser Arbeit durchgeführten Messungen wird davon ausgegangen, dass zunächst
nur die reduzierte Form des Analyten vorliegt. Aus diesem Grund wurde eine Spannungsänderung vom Negativen ins Positive für den ersten Halbzyklus gewählt, beginnend bei einer
Spannung, bei der noch keine Oxidation auftritt. Auch bei dieser Methode wird erst ab einer
207
bestimmten Spannung die Oxidation des Analyten ausgelöst. Zunächst werden alle
Analytionen aus der äußeren Helmholtzschicht oxidiert. Der resultierende Strom steigt aber
trotzdem weiter an, da durch die kontinuierlich steigende Spannung auch die sich in der
näheren Umgebung der Elektrode befindenden Moleküle des Analyten umgesetzt werden. Die
Umgebung um die Helmholtz-Doppelschicht dünnt dadurch an Analyt aus und es resultiert
ein diffusionskontrollierter Grenzstrom. Nach Umkehrung der Richtung des angelegten
Potenzials kann (bei reversiblen Systemen) die entsprechende Reduktion des Analyten
genauso beobachten. Mit Hilfe der erhaltenen zwei Peakströme und zwei Peakpotenziale
entwickelten NICHOLSON UND SHAIN 1964 die Basis zur Auswertung des Voltammogramms.
Der Peakstrom iP ist definiert über die Randles-Sevcik-Gleichung
3
(6-14)
1
1
i P = (2,69 ⋅ 10 5 ) ⋅ n 2 ⋅ AcD 2 ⋅ υ 2
n = Anzahl der Elektronen
A = Elektrodenoberfläche [cm²]
c = Konzentration [mol/cm²]
D = Diffusionskoeffizient [cm²/s]
υ = Potenzial-Scan-Rate [V/s]
Aus (6.14) folgt, dass der resultierende Strom direkt proportional zu der Konzentration des
Analyten ist und mit der Wurzel der Scan-Rate ansteigt. Die Position der Peaks auf der
Spannungsachse steht in direkter Beziehung zu dem formalen Potenzial des Redoxprozesses.
Das formale Potenzial für ein reversibles Paar liegt in der Mitte zwischen dem Potenzialpeak
in Reduktionsrichtung E Pred
und dem Potenzialpeak in Oxidationsrichtung E Pox . Die
Spannungsdifferenz ∆E zwischen den beiden Peaks ist gegeben über
(6-15)
∆E = E Pox −E Pred =
0,058
V , bei 25 °C
n
Daraus folgt, dass die Spannungsdifferenz zwischen den Peaks bei einem Einelektronenübergang bei 58 mV liegt. Sowohl Reduktions- als auch Oxidationspeak sind unabhängig von der
Scanrate. Es ist möglich das Halbpeakpotenzial E1/2
(6-16)
Ep/2 =
E Pox −E Pred
+ E Pred
2
in Beziehung zum polarographischen Halbwellenpotenzial zu setzten, E1/2:
(6-18)
208
E p 2 = E1 2 ±
0,028
V
n
Aus diesen theoretischen Überlegungen von NICHOLSON UND SHAIN (1964) weisen reversible
Systeme eine Potenzialdifferenz von 58 mV bei 25°C und einem Einelektronenübergang auf.
Systeme mit Differenzen bis zu 130 mV gelten als quasi-reversibel, größere Differenzen
weisen auf irreversible Systeme hin.
Die auf diese Weise bestimmten Halbwellenpotenziale sollten vergleichbar mit denen bei der
Differenz-Puls-Voltammetrie bestimmten Potenzialen sein.
6.3.6.2
Goldchlorid-Titrimetrie
Dieser Versuch erfolgte mittels einer modifizierten Methode nach WACHS, 1949. Die
Messungen wurden in 80 %iger ethanolischer Lösung bei pH 4,0 durchgeführt, wobei dieser
pH-Wert durch die Zugabe der Titrationslösung (3,3 mM) Goldchlorid eingestellt wurde. Für
die Messung während einer monotonen Titration wurde ein automatisches Titrationsgerät
(Basic Titrino 794, Metrohm, Schweiz) mit einer vergoldeten Platin-Titrode (Pt Titrode,
6.0431.100, Metrohm, Schweiz) verwendet. In die mit 0,1 % Lithiumchlorid als Leitsalz
versetzte Probe (0,12 mM) wurde zunächst für 10 min. Stickstoff eingeleitet, bevor die
Titration, ebenfalls unter Stickstoff, beginnen konnte. Damit die Elektrode immer einen
optimalen Quellungszustand aufweist, wurde sie bereits 24 Stunden vor Titrationsbeginn in
der verwendeten Matrix gelagert. Die Ergebnisse wurden durch Dreifachbestimmungen
erhalten.
Durch Einsetzten in das Massenwirkungsgesetz und unter Beachtung des Ladungsausgleiches
kann über die Nernstgleichung das Äquivalenzpotenzial berechnet werden. Hierbei wird die
Reaktionsgleichung anhand der zu untersuchenden Antioxidantien und des Titrationsmittels
Goldchlorid aufgestellt. Es folgt die Gleichung (6-19), wobei AH für Antioxidans und Aox für
das oxidierte Antioxidans steht (gilt für Antioxidantien mit einer Hydroxygruppe).
Au 3+ + 3 Cl − + 3 e − + 3 H + → Au ↓ + 3 HCl
( AH → Aox + e − + H + ) ⋅ 3
(6-19)
AuCl 3 + 3 AH → Au ↓ + 3 Aox + 3 HCl
Bei Erreichen des Äquivalenzpotenzials entspricht die Konzentration des eingesetzten
Analyten der Konzentration des Goldchlorids und die Konzentration des oxidierten Analyten
der des reduzierten Goldchlorids. Allgemein gilt die Nernst-Gleichung:
k
2,3 ⋅ RT
υ
ln ∏ ai i
i
1
=
nF
c
2,3 ⋅ RT
= E0 +
ln ox
nF
c red
E = E0 +
(6-20)
209
a
νi
cox/red
E
E0
R
T
n
F
= Aktivität
= -ν Edukte; +ν Produkte
= Konzentration der oxidierten bzw. der reduzierten Substanz in der Lösung
= Elektrodenpotenzial
= Standardpotenzial für die Redoxreaktion
= universelle Gaskonstante [8,314 1/(K*mol)]
= Temperatur in Kelvin [K]
= Zahl der ausgetauschten Elektronen
= Faraday-Konstante [96,487 C]
k
Bezogen auf die hier gültige Reaktionsgleichung (6.19) gilt für ln ∏ a i i =
υ
i =1
k
−1
−3
−3
ln ∏ a Au
⋅ a AH
⋅ a 3Aox ⋅ a 1Au ⋅ a H3 + ⋅ aCl3 −
3+ ⋅ a
Cl −
i =1
k
a 3Aox ⋅ 1 ⋅ a H3 + ⋅ a Cl3 −
i =1
a Au 3+ ⋅ a Cl3 − ⋅ a 3AH
= ln ∏
(6-21)
k
a 3Aox ⋅ a H3 +
i =1
3
a Au 3+ ⋅ a AH
= ln ∏
≈
c A3ox ⋅ c H3 +
c Au 3+ ⋅ c 3AH
Da cAox = cH+ und cAH = ½ cAH zu Beginn der Titration ist, gilt bei 25°C für das untersuchte
System:
0,059
E =E +
⋅ln
3
0
(6-22)
c
E
E0
n
c 6Aox
1
c Au 3+ ⋅ c 3Aox
2
= Konzentration der oxidierten bzw. der reduzierten Substanz in der Lösung
= bei der Titration gemessenes Elektrodenpotenzial
= Standardpotenzial für die Redoxreaktion
= Zahl der ausgetauschten Elektronen
Durch Einsetzten der erhaltenen Werte kann das Normalpotenzial E0 bezogen auf die
vergoldete Platin-Titrode berechnet werden.
6.3.7
Statistische Auswertung
Die erhaltenen Ergebnisse wurden mittels einer einfaktoriellen ANOVA (Analysis of
Variance) (MILLER, 1996) statistisch ausgewertet. Anschließend folgte ein Mehrfachvergleich
der Mittelwerte aus den durchgeführten Dreifachbestimmungen nach Bonferoni mit einer
Irrtumswahrscheinlichkeit von 5 % (Signifikanzniveau p ≤ 0,05). Hierfür wurde die Software
210
SPSS (Version 11.5) verwendet. Ergebnisse mit signifikanten Unterschieden wurden mit
unterschiedlichen Buchstaben an den Probenbalken markiert.
6.3.8
Design of Experiment
Unter dem Begriff „Design of Experiment“ werden verschiedene, auf statistischen Methoden
basierende Möglichkeiten zusammengefasst, die die Durchführung von Experimenten
hinsichtlich ihrer Effizienz optimieren. Hierfür wird zunächst das Ziel des Experiments
formuliert. Dies geschieht durch Festlegung unabhängiger Variablen (Faktoren) und deren
geplanten Ausprägungen (Level) sowie der Ergebnisvariablen. In einem zweiten Schritt wird
ein Versuchsplan erstellt, der es zulässt, mit möglichst geringem Aufwand ein vorgegebenes
Konfidenzniveau zu erreichen. Hierfür stehen verschiedene Methoden zur Verfügung, u.a. die
unten beschriebene Response-Surface-Methode. In einem letzten Schritt wird ein statistisches
Regressionsmodell auf die so erhaltenen Daten angepasst.
Die Response-Surface-Methode verwendet quadratische Modelle zur Optimierung des
Versuchsplans, bei denen mindestens drei unterschiedliche Ausprägungen der zu untersuchenden Faktoren vermessen werden (MYERS UND MONTGOMERY, 2002). Innerhalb der
Response-Surface-Methode werden verschiedene Versuchspläne voneinander abgegrenzt, u.a.
das Central-Composite-Design, das im Folgenden beschrieben wird: Diese Methode
unterscheidet zwischen numerischen Faktoren und kategorischen Faktoren. Für die
numerischen Faktoren werden eine Ober- und eine Untergrenze festgelegt, innerhalb derer
Level für die Messung automatisch bestimmt werden. Bei kategorischen Faktoren werden die
Level von vornherein festgelegt und können nicht statistisch optimiert werden. Es sollten, um
den Versuch nicht zu komplex zu gestalten, maximal zwei bis drei unterschiedliche Parameter
sein. Die Anzahl der Messungen (r) ergibt sich aus der Anzahl der Faktoren (k), aus dem Grad
der Reduktion eines vollständig faktoriellen Plans zu einem teilweise faktoriellen Plan (p) und
aus der Anzahl der Messungen des Zentralpunktes (n0) aus folgender Berechnung:
(6-23)
r = 2 k − p + 2k + n 0
Bei der Erstellung des Versuchsplans wird eine Randomisierung der Reihenfolge der
einzelnen Messpunkte vorgenommen, um systematische Fehler zu vermeiden. Das CentralComposite-Design unterscheidet drei verschiedene Arten von Punkten (s. Abb. 6.13): den
Zentralpunkt (A), der die Mittelwerte der Bandbreiten aller Variablen in einem Punkt vereint,
die faktoriellen Punkte (B), die die Eckpunkte der Bandbreiten der Variablen darstellen, sowie
die Axial- bzw. Sternpunkte (C), die der statistischen Stabilisierung dienen. Letztere
entsprechen dem Zentralpunkt, der auf einer einzelnen Variablen über die Ober- bzw.
211
Untergrenze hinaus verschoben wird (Standard) oder genau auf diese verschoben wird (FaceCentered). Im Standardfall wird die Berechnung des Abstands (α) der Axialpunkte vom
Zentralpunkt durch die folgende Formel möglich (OTTO, 1997):
(6-24)
α =2
 k−p 


 4 
Der Zentralpunkt dient zur Bestimmung der Variabilität des Modells und wird daher
mehrfach untersucht.
B
A
C
Abb. 6.13: Aufbau des Central-Composite-Design zur Darstellung der drei verschiedenen Arten von
Punkten
An die nach diesem Versuchsplan erzeugten Ergebnisse wird ein statistisches Regressionsmodell angepasst, um lineare oder nicht-lineare Abhängigkeiten der unabhängigen Variablen
und der erhaltenen Messergebnisse mathematisch zu formulieren. Durch verschiedene
statistische Tests kann festgestellt werden, welches Regressionsmodell am besten geeignet ist,
um die Messergebnisse durch die Faktoren zu erklären. Zuletzt wird eine Varianzanalyse
(ANOVA) durchgeführt, um die Güte der eingegangenen Daten zu überprüfen.
Die in dieser Arbeit durchgeführte Versuchsoptimierung basiert auf dem Central-CompositeDesign und wurde mit der Software „Design Expert“ (Version 6.0.10, Stat-Ease, Inc.
Minneapolis, USA) berechnet. Die Auswertung erfolgte graphisch, indem die Ergebnisse in
Abhängigkeit der einzelnen Variablen aufgetragen wurden. Um das Modell statistisch zu
überprüfen, wurde eine ANOVA durchgeführt.
212
Anhang
Anhang
A.1
Bildung von konjugierten Dienen in Gegenwart von α-Tocopherol-
c(Konjugierte Diene) [mmol/kg ROTG]
Konzentration von 5 bis 1500 µmol/kg ROTG
75
65
55
45
35
25
15
0
5
10
15
20
25
Kontrolle
5 α-TOH
10 α-TOH
50 α-TOH
100 α-TOH
250 α-TOH
500 α-TOH
1000 α-TOH
1500 α-TOH
Abb. A.1: Bildung von konjugierten Dienen in ROTG in der Gegenwart von 5 - 1500 µmol α-Tocopherol
(α-TOH) während einer Oxidation bei 40°C im Dunkeln über einen Zeitraum von 28 Tagen
213
A.2
Bildung von konjugierten Dienen in Gegenwart von α-Tocopherol-
c(Konjugierte Diene) [mmol/kg
ROTG]
Konzentration von 25 bis 125 µmol/kg ROTG
78
68
58
48
38
28
18
8
0
5
10
15
20
25
30
35
Kontrolle
25 α-TOH
50 α-TOH
75 α-TOH
100 α-TOH
125 α-TOH
Abb. A.2: Bildung von konjugierten Dienen in ROTG in Gegenwart von 25 – 125 µmol α-Tocopherol
(α –TOH) während einer Oxidation bei 40°C im Dunkeln über einen Zeitraum von 35 Tagen.
214
Anhang
A.3
Bildung von konjugierten Dienen und Abbau von α-Tocopherol in
Gegenwart von α-Tocopherol-Konzentration von 25 bis
0,45
33
0,40
0,35
28
0,30
23
0,25
0,20
18
0,15
0,10
13
0,05
c(Konjugierte Diene) [mmol/kg ROTG]
300 µmol/kg ROTG
0,00
8
0
10
20
30
Kontrolle
75 α-TOH
200 α-TOH
25 α-TOH
100 α-TOH
300 α-TOH
40
50 α-TOH
125 α-TOH
Datenreihen10
Abb. A.3: Entstehung konjugierter Diene während der Lagerung von ROTG mit unterschiedlichen
initialen α-Tocopherol (α-TOH)-Konzentrationen in einem Bereich von 25 bis 300 µmol/kg ROTG bei
40°C im Dunkeln. Gleichzeitig dargestellt: der Abbau des α-Tocopherols für die jeweiligen Proben
215
A.4
Bildung von sekundären Oxidationsprodukten in Gegenwart von
α-Tocopherol-Konzentration von 25 bis 300 µmol/kg ROTG
2000
1800
1600
1400
1200
1000
800
600
400
200
0
0
10
20
30
40
Kontrolle
25 α-TOH
50 α-TOH
75 α-TOH
100 α-TOH
125 α-TOH
200 α-TOH
300 α-TOH
c(Propanal) [nmol/kg ROTG]
Abb. A.4: Entstehung von Hexanal während der Lagerung von ROTG mit unterschiedlichen initialen
α-Tocopherol (α-TOH)-Konzentrationen in einem Bereich von 25 bis 300 µmol/kg ROTG bei 40°C im
Dunkeln
300
250
200
150
100
50
0
0
10
20
30
40
Kontrolle
25 α-TOH
50 α-TOH
75 α-TOH
100 α-TOH
125 α-TOH
200 α-TOH
300 α-TOH
Abb. A.5: Entstehung von Propanal während der Lagerung von ROTG mit unterschiedliche initialen
α-Tocopherol (α-TOH)-Konzentrationen in einem Bereich von 25 bis 300 µmol/kg ROTG bei 40°C im
Dunkeln
216
Anhang
A.5
Bildung von konjugierten Dienen in Gegenwart von α-TocopherolKonzentration von 25 bis 300 µmol/kg ROTG
c(Konjugierte Diene)
[mmol/kg ROTG]
80
70
60
50
40
30
20
10
0
0
10
20
30
Control
100 µmol α-TOH
100 µmol α-TOH + 5 µmol α-TOH every 6 days
40
50
60
Abb. A.6: Bildung konjugierter Diene bei einer Probe mit 100 µmol α-Tocopherol (α-TOH)/kg ROTG
durch sukzessive Zugabe von jeweils 5 µmol α-Tocopherol/kg ROTG alle 6 Tage im Vergleich zu einer
Probe mit einmaliger initialer α-Tocopherol-Gabe mit einer Konzentration von 100 µmol/kg ROTG bei
einer Lagerung bei 40°C im Dunkeln
217
Bildung von Hexanal bei sukzessiver Zugabe von α-Tocopherol
A.6
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
0
5
10
15
20
25
Kontrolle
125 α-TOH
30
35
40
100 α-TOH + 5*5 α-TOH
Abb. A.7: Entstehung von Hexanal während der Lagerung von ROTG mit einer initialen α-Tocopherol
(α-TOH)-Konzentration von 125 µmol/kg ROTG im Vergleich zu einer Probe mit einer initialen
α-Tocopherol Konzentration von 100 µmol/kg ROTG und 5-facher Zugabe von α-Tocopherol mit einer
Konzentration von jeweils 5 µmol/kg ROTG alle sechs Tage bei 40°C im Dunkeln
50
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0
0
10
20
30
40
Kontrolle
350 α-TOH
100 α-TOH + 5*50 α-TOH
218
Anhang
50
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0
0
5
10
15
20
25
30
35
40
Kontrolle
600 µmol TOH
100 µmol TOH + 5*100 µmol TOH
219
A.7
Response-Surface-Design-Experimente
Tab. A.1: Gemessene Ergebnisse für den Versuchsplan mit α-Tocopherol - normalisiert durch Subtraktion des initialen Startwertes bei allen Messwerten
Proben
randomisierte
Nr.
Reihenfolge
7
18
17
2
4
13
12
19
16
22
25
11
10
9
1
8
20
23
5
14
24
21
15
6
3
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
Hydroperoxide
[mmol/kg
ROTG]
nach 21 Tagen
83,54
569,47
578,07
353,42
670,10
106,55
403,07
285,82
441,80
370,02
354,03
442,87
419,90
90,75
346,58
92,98
241,61
325,44
584,00
59,29
317,06
357,73
594,19
605,29
332,06
Propanal
[mmol/kg
ROTG]
nach 21 Tagen
18,67
102,55
116,31
16,46
111,35
17,82
35,72
44,09
75,58
43,22
34,18
58,89
48,75
27,12
18,32
25,30
41,87
34,62
100,06
15,17
29,95
35,08
45,78
88,47
0,00
Hexanal
[mmol/kg
ROTG]
nach 21 Tagen
162,58
1424,41
1383,88
665,05
1488,80
136,76
1044,80
619,93
1342,34
849,64
806,40
1144,93
0,00
104,88
903,02
139,96
552,39
920,85
1607,40
162,82
851,24
1040,37
1322,86
1567,06
644,95
Hydroperoxide
[mmol/kg
ROTG]
nach 28 Tagen
406,23
926,59
886,65
573,80
838,90
492,25
833,03
640,32
697,35
674,63
605,21
658,39
587,20
293,85
626,10
279,43
471,74
598,52
1232,75
300,52
759,53
781,38
764,65
884,55
640,77
Propanal
[mmol/kg
ROTG]
nach 28 Tagen
374,39
1539,75
1494,12
799,45
1679,31
210,69
1107,96
729,82
1357,94
1016,46
818,64
1188,29
1360,37
164,68
1104,09
190,68
725,99
1144,66
1676,92
309,56
1111,44
1303,11
1612,29
1622,28
953,06
Hexanal
[mmol/kg
ROTG]
nach 28 Tagen
814,04
2280,33
2281,72
1418,52
2330,17
466,64
1744,51
1328,41
2103,35
1636,73
1544,71
1902,08
2057,92
632,08
1695,10
669,24
1428,80
1820,39
2448,95
874,34
1773,24
1959,65
2378,42
2376,39
1692,35
Anhang
Tab. A.2: Gemessene Ergebnisse für den Versuchsplan mit γ-Tocopherol - normalisiert durch Subtraktion des initialen Startwertes bei allen Messwerten
Proben
randomisierte Block
Nr.
Reihenfolge
1
5
6
8
9
3
2
11
7
4
10
18
15
13
16
17
14
12
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
2
2
2
2
2
2
2
Hydroperoxide
[mmol/kg
ROTG]
nach 21 Tagen
5,00
5,00
5,00
25,00
15,00
25,00
5,00
15,00
25,00
25,00
15,00
15,00
15,00
27,50
15,00
15,00
15,00
2,50
Propanal
[mmol/kg
ROTG]
nach 21 Tagen
250,00
1177,88
1177,88
1177,88
713,94
250,00
250,00
713,94
1177,88
250,00
713,94
713,94
1293,87
713,94
713,94
713,94
134,02
713,94
Hexanal
[mmol/kg
ROTG]
nach 21 Tagen
47,69
49,70
47,63
84,99
61,92
120,76
55,80
55,03
81,69
117,92
52,40
39,65
37,79
41,18
46,71
46,64
148,98
45,11
Hydroperoxide
[mmol/kg
ROTG]
nach 28 Tagen
27,51
165,65
169,10
45,63
94,04
80,25
49,82
94,96
51,19
80,60
43,15
44,19
47,26
69,43
Propanal
[mmol/kg
ROTG]
nach 28 Tagen
80,56
114,81
118,12
105,98
87,25
277,04
100,30
96,93
74,61
257,00
81,02
57,98
56,47
59,79
66,64
66,65
288,25
66,11
Hexanal
[mmol/kg
ROTG]
nach 28 Tagen
44,59
0,00
0,00
46,13
131,67
0,00
101,66
0,00
0,00
161,04
0,00
0,00
89,33
0,00
64,96
54,99
0,00
62,02
Tab. A.3: Gemessene Ergebnisse für den Versuchsplan mit α- und γ-Tocopherol - normalisiert durch
Subtraktion des initialen Startwertes bei allen Messwerten
Proben
Nr.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
222
randomisierte
Reihenfolge
13
29
6
5
18
33
27
26
11
14
10
34
51
50
54
41
43
37
7
20
21
4
32
19
15
8
17
16
2
52
35
42
40
49
45
36
24
31
22
30
1
3
9
28
12
23
25
48
38
Block
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
Hydroperoxide
[mmol/kg ROTG]
nach 14 Tagen
Propanal
[mmol/kg
ROTG]
nach 14 Tagen
37,88
34,31
59,07
62,42
36,20
40,59
30,15
33,64
34,34
32,16
32,06
72,51
4,42
80,73
46,31
65,60
0,00
26,09
55,38
7,19
45,53
89,32
36,61
24,01
47,69
0,28
88,07
92,37
146,30
26,54
27,67
68,09
0,00
31,40
69,82
37,10
49,42
0,00
0,00
63,44
0,00
127,25
64,21
145,51
66,50
0,00
44,02
0,00
0,00
0,00
0,00
42,79
0,00
44,69
39,92
88,17
30,08
61,63
14,76
0,00
26,15
52,46
23,44
24,04
17,47
18,65
47,42
-19,19
66,11
63,87
54,93
65,72
68,05
57,13
53,11
56,50
53,21
40,17
38,42
43,27
43,24
48,81
40,30
39,37
80,91
76,98
95,52
95,77
95,02
104,66
109,45
98,21
65,75
90,08
93,68
59,43
74,03
Anhang
Proben
Nr.
50
51
52
53
54
55
56
57
randomisierte
Reihenfolge
47
53
39
46
44
55
56
57
Block
2
2
2
2
2
2
2
2
Hydroperoxide
[mmol/kg ROTG]
nach 14 Tagen
Propanal
[mmol/kg
ROTG]
nach 14 Tagen
67,76
84,23
81,59
65,94
79,95
42,63
0,00
119,40
97,67
92,36
223
224
12
µm
,5
ol
1 K
TO B µm 00 on t
e
H re ol A µ m rol
+1 ch sc o le
2 , ne or l T
b O
5
t
µm e K ins H
ol om äu
10
As bi re
0
25
µm
co na
µ m 10 rbi tion
ol
B
TO e ol 0 µ nsä
H r ec A s m u r
+ hn co ol e
25 e
rb TO
µm te K ins H
ä
o
o
10
l A mb ure
0
sc i n
50
µm
o a
µ
1 rb tion
ol
TO Be mo 00 µ insä
H r ec l A s m ur
+ hn co ol e
50 e
rb TO
µm te K ins H
10
ol om äur
0
As bi e
10
µm
co na
0
ol
µ m 10 rbi tion
TO B
n
0
H ere ol A µ m säu
+ ch sc o re
10 n
o l
0 ete rbin TO
µm K s H
10
ol om äur
0
As bi e
20
µm
co na
0
ol
µ m 10 rbi tion
TO B
n
0
+ ch sc o re
20 n
o l
0 ete rbi TO
µm K ns H
ol om äur
As bi e
co na
rb tion
in
sä
ur
e
10
0
Lagerdauer bei 40°C, dunkel bis zum Erreichen
µm
ol
12
,5
1 K
TO B µm 00 on t
e
H re ol A µ m rol
+1 ch sc o le
2 , ne or l T
5
b O
t
µm e K ins H
ä
o
o
10
l A mb ure
0
s c in
25
µm
o a
µ
1 rb tion
ol
TO Be mol 00 µ insä
H r ec A s m u r
+ hn co ol e
25 e
rb TO
µm te K ins H
ä
o
o
10
l A mb ure
0
sc in
50
µm
o a
µ
1 rb tion
ol
TO Be mol 00 µ i nsä
H rec A s m ur
+ hn co ol e
50 e
t rb TO
µm e K ins H
10
ol om äur
0
As bi e
10
µm
co na
0
ol
1 r tio
µ
TO B mo 00 bi ns n
H ere l A µ m äu
+ ch sc o re
10 n
o l
0 ete rbi TO
µm K ns H
10
ol om äur
0
As bi e
20
µm
co na
0
ol
µ m 10 rbi tion
TO B
0 n
+ ch sc o re
20 n
o l
0 ete rbin TO
µm K s H
ol om äu
As bi re
co nat
rb ion
in
sä
ur
e
10
0
A.8
Synergismus α-Tocopherol mit Ascorbinsäure
35
30
30
12,5 µmol
25 µmol
50 µmol
100 µmol
200 µmol
Ascorbinsäure
Ascorbinsäure
Ascorbinsäure
Ascorbinsäure
Ascorbinsäure
25
20
15
10
5
0
Abb. A.10: Darstellung der Lagerdauer bis zu einer POZ von 10 meq O2/kg ROTG von Proben mit einer
α-Tocopherol (TOH)-Konzentration von 100 µmol/kg ROTG einzeln und in Kombination mit
unterschiedlichen Ascorbinsäure-Konzentrationen von 12,5 bis 200 µmol/kg ROTG. Ebenfalls dargestellt:
die berechnete Dauer der Antioxidantien-Kombination (bei Annahme eines additiven Effekts) bis zum
Erreichen einer POZ von 10 meq O2/kg ROTG
35
12,5 µmol
25 µmol
50 µmol
100 µmol
200 µmol
25
20
15
10
5
0
α-Tocopherol (TOH)-Konz. von 100 µmol/kg ROTG einzeln und in Kombination mit unterschiedlichen
Ascorbinsäure-Konzentrationen von 12,5 bis 200 µmol/kg ROTG. Ebenfalls dargestellt: die berechnete
Dauer der Antioxidantien-Kombination bis zum Erreichen einer POZ von 15 meq O2/kg ROTG
12
µm
,5
ol
µ 1 K
TO Be mo 00 on t
µ ro
r
H
e l
+1 c h Asc mol l le
2 , ne or TO
b
t
5
µm e K ins H
om äu
o
10
l A b re
0
s c i na
25
µm
or tio
µ
1
ol
n
m 0 bi
TO Ber ol 0 µ nsä
H ec A s mo u re
+ hn c o l
2 5 et rb TO
µm e K ins H
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10
As bi e
0
50
co na
µm
µ m 10 rbi tion
ol
TO Be ol 0 µ nsä
H rec A s m ur
+ hn c o ol e
50 e
rb TO
µm te K ins H
10
ol om äur
0
As bi e
10
µm
co na
0
ol
µ m 10 rbi tion
TO B
ns
0
H ere ol A µ m äu
+ c h sc o re
1 0 ne o l T
0
t rb O
µm e K ins H
10
ol om äur
0
As bi e
20
µm
co na
0
ol
µ m 10 rbi tion
TO B
0 ns
H ere ol A µ m äu
+ c h sc o re
2 0 ne o l T
0
t rb O
µm e K ins H
ol om äur
As bi e
co na
rb tio
in n
sä
ur
e
10
0
Anhang
35
30
12,5 µmol
25 µmol
50 µmol
100 µmol
200 µmol
25
20
15
10
5
0
α-Tocopherol (TOH)-Konzentration von 100 µmol/kg ROTG einzeln und in Kombination mit
unterschiedlichen Ascorbinsäure-Konzentrationen von 12,5 bis 200 µmol/kg ROTG. Ebenfalls dargestellt:
die berechnete Dauer der Antioxidantien-Kombination (bei Annahme eines additiven Effekts) bis zum
Erreichen einer POZ von 50 meq O2/kg ROTG
225
A.9
Redoxpotenziale aller Antioxidantien in Acetonitril
5
0
-5
-10
-15
-20
-25
-30
Butylhydroxytoluol
Butylhydroxyanisol
TBHQ
Hydrochinon
Pyrogallol
-35
-40
-45
-50
-55
0
500
1000
1500
Abb. A.13: Vergleich der Redoxpotenziale von synthetischen Antioxidantien in Acetonitril. Für
Ethoxyquin wurde kein auswertbares Signal erhalten
226
Anhang
2
0
-2
-4
-6
-8
-10
Gallussäure
Methylgallat
Ethylgallat
Propylgallat
Octylgallat
-12
-14
-16
-18
-20
-22
-24
0
500
1000
1500
Abb. A.14: Vergleich der Redoxpotenziale der Gallate in Acetonitril
2
0
-2
-4
-6
-8
-10
-12
Kaempferol
Genistein
Catechin
Quercetin
-14
-16
-18
-20
-22
-24
-26
-1000
0
1000
Abb. A.15: Vergleich der Redoxpotenziale von Flavonoiden in Acetonitril (Flavonole: Quercetin und
Kaempferol, Flavanol: Catechin, Isoflavonoid: Genistein)
227
0
-2
-4
-6
Ascorbylpalmitat
Vinylsyringol
Ascorbinsäure
-8
-10
-500
0
500
1000
1500
Abb. A.16: Vergleich der Redoxpotenziale der Ascorbinsäurederivate (VS: Sinapinsäurederivat)
0
-5
-10
-15
Ascorbigen
Oleuropein
γ-Oryzanol
Carvacrol
Thymol
Tyrosol
-20
-25
-30
-500
0
500
1000
1500
Abb. A.17: Vergleich der Redoxpotenziale von Pflanzenphenolen in Acetonitril (AG: AS-Derivat)
228
Anhang
Stromstärke [µA]
0
-5
-10
-15
Carnosolsäure
Carnosol
-20
-2000
-1000
0
1000
Abb. A.18: Vergleich der Redoxpotenziale von Diterpendiphenolen in Acetonitril
5
0
-5
-10
-15
Ferulasäure
Isoferulasäure
Kaffeesäure
Sinapinsäure
Chlorogensäure
Rosmarinsäure
-20
-25
-30
-35
-40
0
500
1000
1500
Abb. A.19: Vergleich der Redoxpotenziale von Hydroxyzimtsäuren und deren Ester in Acetonitril. pCoumarsäure zerfällt über die Messzeit und kann daher nicht dargestellt werden
229
0
-5
-10
-15
Vanillinsäure
Syringasäure
-20
-25
-30
500
1000
1500
Abb. A.20: Vergleich der Redoxpotenziale von Hydroxybenzoesäuren in Acetonitril
0
-10
Liponsäure
-20
-30
-40
-50
-1000
-500
0
500
1000
1500
2000
Abb. A.21: Vergleich der Redoxpotenziale von nichtphenolischen antioxidativen Substanzen in
Acetonitril. Wobei für Cystein, Methionin und Glutathion keine auswertbaren Voltammogramme
gemessen wurden, da diese nicht in Acetonitril löslich sind
230
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245
246
CURRICULUM VITAE
Persönliche Daten
Name
Verena Alexa Ohm
Geburtsdatum
08. Mai 1976
Geburtsort
Hamburg
Staatsangehörigkeit
deutsch
Ausbildung
April 2003
bis April 2007
Promotion an der Christian-Albrechts-Universität zu Kiel
Abteilung Lebensmitteltechnologie
Oktober 1998
bis März 2003
Studium der Lebensmittelchemie an der Universität Hamburg
1. Staatsexamen in Lebensmittelchemie und
Diplom in Lebensmittelchemie
August 1995
bis Januar 1998
Berufsausbildung zur Chemielaborantin
RWE DEA AG, Produktentwicklung und Analytik, Hamburg
Juni 1995
Abitur, Wolfgang-Borchert-Gymnasium, Halstenbek
Berufliche Praxis
Dezember 2006
bis April 2007
Wissenschaftliche Mitarbeiterin an der Christian-AlbrechtsUniversität zu Kiel, Abteilung Lebensmitteltechnologie
Januar 1998
bis September 1998 und
Chemielaborantin
RWE DEA AG, Gaschromatographie, Hamburg
Juli 2001
bis August 2001
Chemielaborantin
RWE DEA AG, Gaschromatographie, Hamburg
Stipendien und
Projektfinanzierung
Stipendium der Deutschen Forschungsgemeinschaft im Rahmen des Graduiertenkollegs 820
„Natürliche Antioxidantien – Ihr Wirkungsspektrum in Pflanzen, Lebensmitteln, Tier und Mensch“
Stipendium und Projektfinanzierung durch die Union zur Förderung von Öl- und Proteinpflanzen

Ohm, Verena Alexa - Abteilung Lebensmitteltechnologie

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