Max Planck Institut für molekulare Physiologie - Ruhr

Max Planck Institut für molekulare Physiologie - Ruhr

Max Planck Institut für molekulare Physiologie
Abteilung Strukturelle Biologie
Titel der Lehreinheit (LE)
Bezeichnung der LE
Modulpraktika Biochemie im Schwerpunkt
Proteine: Struktur und biologische Funktion
Proteinreinigung und Stopped-Flow
Nr. des
Vorl.-Verzeichnis
LE-Kreditpunkte
4
Fachsemester
7
Dozenten
SWS
Dauer :
2 Wochen
5
J. Kuhlmann
Prüfer
J. Kuhlmann, A. Wittinghofer
Pflicht-LE für:
M. Sc. in Biochemie
Studiengänge:
Freiwillige LE für:
M. Sc. in Chemie
Zielsetzungen
Die Teilnehmer sollen mit der Methodik zur bakteriellen Synthese von Proteinen, ihrer
Aufreinigung und funktionellen Analyse in biophysikalischen Meßsystemen vertraut gemacht
werden.
Themenverzeichnis
Proteinexpression in E. coli, Aufschluss von Bakterien, chromatographische Aufreinigung von
Proteinen, biochemische Charakterisierung (Bradford, SDS-PAGE, MALDI-TOF), Zeitaufgelöste
Analyse von Protein-Nukleotid oder Protein-Protein Wechselwirkung unter Verwendung
fluoreszierender Marker in der Fluoreszenzspektroskopie und unter Verwendung der StoppedFlow Technik, Ermittlung von Gerätekenndaten (Totzeit)
Lehrmethoden:
Praktikum
Seminar
2 Wochen ganztägiges Praktikum
3 x ½ Tag
Überprüfung des Lernforschritts
Bearbeitung der praktischen Aufgaben und deren
Protokollierung, aktive Teilnahme am Seminar
Leistungskontrolle
Eingangskolloquien zu den Teilaufgaben des
Modulpraktikums, Versuchsprotokoll, Vortrag in
Abschlussseminar (ggf. an Termin außerhalb des
Praktikumsblocks nach Vereinbarung)
Zusammenfassung der Lehrgegenstände
•
•
•
•
Sicherheitsbelehrung (allgemeine Laborpraxis, Arbeiten im gentechnischen Labor (S1))
Versuchsstrategische und methodische Vorbesprechung (Biologischer Kontext der im
Praktikum untersuchten Proteine, Expression in E. coli, Proteinreinigung, biochemische
Charakterisierung, Fluoreszenzspektroskopie, Stopped-Flow Technik, kinetische
Analyse)
Einführung zu eigenständigem wissenschaftlichen Arbeiten (Literaturrecherche,
Protokollierung, Darstellung wissenschaftlicher Ergebnisse in schriftlicher sowie
Vortragsform)
praktische Versuche:
1. Expression von Proteinen in E. coli, Zellaufschluss, Zentrifugationstechniken,
chromatographische Aufreinigungsverfahren
2. Proteinquantifizierung (Bradford) und Analyse in SDS-PAGE, Ermittlung des
Molekulargewichts mittels MALDI-TOF, ggf. HPLC-Analyse zur Ermittlung der
Nukleotidbeladung
3. Fluoreszenzspektroskopische Interaktionsanalyse, Fluoreszenzspektrometer,
Meßsignale, Spezifität der Signaländerung
4. Untersuchung schneller transienter Kinetiken im Stopped-Flow, Ermittlung der
Totzeit des Meßsystems, Linearität des Detektors, Analyse von Protein-Protein
oder Protein-Nukleotid-Wechselwirkungen
Der Inhalt dieses Forschungspraktikums ist nur exemplarisch; über die tatsächlich
durchgeführten Experimente wird kurz vor dem Praktikum entschieden.
Max Planck Institut für molekulare Physiologie
Abteilung Strukturelle Biologie
Titel der Lehreinheit (LE)
Bezeichnung der LE
Modulpraktika Biochemie im Schwerpunkt
Proteine: Struktur und biologische Funktion
Vom Bakterium zur Proteinfunktion
Nr. des
Vorl.-Verzeichnis
LE-Kreditpunkte
4
Fachsemester
7
Dozenten
SWS
Dauer :
2 Wochen
5
R. Ahmadian
Prüfer
R. Ahmadian, J. Kuhlmann
Pflicht-LE für:
M. Sc. in Biochemie
Studiengänge:
Freiwillige LE für:
M. Sc. in Chemie
Zielsetzungen
Die Studierenden werden in moderne proteinchemische und biochemische Techniken
eingeführt.
Themenverzeichnis
Rekombinante Genexpression in Escherichia coli, Expression, Affinitätschromatographie (GSHSepharose; Ni-NTA) und Gelfiltration mittels FPLC, SDS-PAGE, Western Blot, Immunologischer
Nachweis von Proteinen, Ligandenbefreiung und –austausch, Qualitativer Bindungs-Assay
(Affinitätspräzipitation); Bestimmung der Proteinstabilität und Vergleiche der
Sekundärstrukturen von Proteinen mittels CD-Spektrometer (Schmelzkurven und Vergleiche
der Spektren); Bestimmung Ligandenbindung analytisch mittels HPLC und quantitativ mittels
Fluoreszenzspektrometer;
Lehrmethoden:
Praktikum
Seminar
2 Wochen ganztägiges Praktikum
3 x ½ Tag
Überprüfung des Lernforschritts
Bearbeitung der praktischen Aufgaben und deren
Protokollierung, aktive Teilnahme am Seminar
Leistungskontrolle
Eingangskolloquien zu den Teilaufgaben des
Modulpraktikums, Versuchsprotokoll, Vortrag im
Abschlussseminar (ggf. an Termin außerhalb des
Praktikumsblocks nach Vereinbarung)
Zusammenfassung der Lehrgegenstände
•
•
•
Sicherheitsbelehrung
Versuchsstrategische Vorbesprechung
Einführung in
o Bakterielle Genxpression
o Proteinreinigung
o Proteinchemische Analysen
o Proteinbiochemie
Der Inhalt dieses Forschungspraktikums wird sich dem jeweiligen zu untersuchenden Protein
angleichen.
RUHR-UNIVERSITÄT BOCHUM
Medizinisches Proteomcenter
Titel der Lehreinheit (LE)
Bezeichnung der LE
Modulpraktika Biochemie im Schwerpunkt
Proteine: Struktur und biologische Funktion:
Proteinanalytik: Elektrophorese, Chromatographie und
Massenspektrometrie
Nr. des
Vorl.-Verzeichnis
LE-Kreditpunkte
4
Fachsemester
7
SWS
Dauer :
2 Wochen
Dozenten
Katrin Marcus, Kai Stühler, Bettina Warscheid
Prüfer
Katrin Marcus, Kai Stühler, Bettina Warscheid
5
Pflicht-LE für:
M. Sc. in Biochemie
Studiengänge:
Freiwillige LE für:
M. Sc. in Chemie
Zielsetzungen
Die Teilnehmer sollen einen Einblick in die am Medizinischen Proteom-Center (MPC)
etablierten Methoden der aktuellen Proteomforschung verschafft werden. Hierbei sollen im
ersten Teil Methoden zur Präparation und Auftrennung von komplexen Proteingemischen
vorgestellt und selbständig bearbeitet werden. Im zweiten Teil sollen mittels
Massenspektrometrie und Datenbanksuche ausgewählte Proteine identifiziert werden.
Themenverzeichnis
Probenpräparation für die moderne Proteinanalytik: Erstellung eines komplexen
Proteingemisches (Maushirnlysate, Serum, Zellkultur, etc.), Aminosäureanalyse;
Proteintrennung/-aufreinigung: Elektrophorese (1D/2D), Chromatographie; Detektion:
Coomassie-, Silberfärbung; Identifizierung der Proteine mittels Massenspektrometrie (MALDIMS, ESI-MS)
Lehrmethoden:
Praktikum
Seminar
2 Wochen ganztägiges Praktikum
3x ½ Tag
Überprüfung des Lernforschritts
Leistungskontrolle
Bearbeitung der praktischen Aufgaben und deren
Protokollierung, aktive Teilnahme am Seminar und am
Praktikum
Eingangskolloquien zu den Teilaufgaben des
Modulpraktikums, Versuchsprotokoll (Eine Überarbeitung
des Protokolls ist möglich)
Zusammenfassung der Lehrgegenstände
•
Sicherheitsbelehrung:
Allgemeine Laborpraxis, Einführung in die Geräte
•
Seminar:
Versuchsstrategische und methodische Vorbesprechung (Biologischer Kontext der im
Praktikum untersuchten Proben/Proteine, Besprechung allgemeiner Analyse-Strategien in der
modernen Proteinanalytik, Planung der im Praktikum durchgeführten Analysen, Besprechung
der eingesetzten Methoden/Techniken)
(Für diesen Versuchsteil sollten bitte aus dem Buch „Bioanalytik“, Lottspeich/Zorbas,
Spektrum-Verlag, 1998 die folgenden Kapitel vorbereitet werden:
Kapitel 10: Elektrophoretische Verfahren
Kapitel 14: Massenspektrometrie (vor allem MALDI-Massenspektrometrie)
Kapitel 29: Proteomanalyse)
•
Praktische Versuche:
5.
6.
7.
8.
9.
i.
Probenvorbereitung: Herstellung des Proteinlysates/Probenaufschluss (abhängig von der
zu analysierenden Probe: Zellkultur, Maushirn, Serum), Proteinquantifizierung (Bradford,
Aminosäureanalyse)
Proteintrennung: Elektrophorese (1D/2D), Chromatographie
Proteindetektion: Coomassie-, Silberfärbung
Proteinidentifizierung: Proteolytischer Verdau (in-Gel bzw. in-Lösung),
massenspektrometrische Analyse (verschiedene Methoden: MALDI-TOF/TOF-MS,
nanoLC-ESI-MS(/MS))
Interpretation der Daten: Automatische Datenauswertung mit Hilfe verschiedener
Suchalgorithmen und Datenbanksuchprogrammen.
Einführung
zu
eigenständigem
wissenschaftlichen
Arbeiten
(Literaturrecherche, Protokollierung, Darstellung wissenschaftlicher Ergebnisse in schriftlicher
sowie Vortragsform)
Max Planck Institut für molekulare Physiologie
Abteilung Strukturelle Biologie
Titel der Lehreinheit (LE)
Bezeichnung der LE
Modulpraktika Biochemie im Schwerpunkt
Proteine: Struktur und biologische Funktion
Kinetische Untersuchung der Rap-Austauschfaktoren
EpacI und EpacII
Nr. des
Vorl.-Verzeichnis
LE-Kreditpunkte
4
Fachsemester
SWS
7
Dozenten
Dauer :
2 Wochen
5
Alfred Wittinghofer
Prüfer
Alfred Wittinghofer, Jürgen Kuhlmann
Pflicht-LE für:
M. Sc. in Biochemie
Studiengänge:
Freiwillige LE für:
M. Sc. in Chemie
Zielsetzungen
Die Teilnehmer sollen mit der Methodik zur bakteriellen Synthese von Proteinen und ihrer
Aufreinigung vertraut gemacht werden. Weiterhin wird in spektroskopische Methoden
kinetischer Untersuchungen eingeführt. Die aus den Messungen erhaltenen Daten sollen
ausgewertet und in Bezug auf das vorliegende biologische System interpretiert werden.
Themenverzeichnis
- Proteinexpression in E. coli
- chromatographische Aufreinigung von Proteinen
- Fluoreszenzspektroskopische Messungen
- Datenauswertung mit Hilfe des Programmes GraFit
Lehrmethoden:
Praktikum
Seminar
2 Wochen ganztägiges Praktikum
3 halbe Tage zu Beginn des Praktikums
Überprüfung des
Lernfortschritts
Aktiver Teilnahme an der Sicherheitsbelehrung und am
Seminar
Leistungskontrolle
15 min Seminarvortrag (10%), Versuchsdurchführung
und Versuchsprotokoll (90%)
Eine Überarbeitung des Protokolls ist möglich
Zusammenfassung der Lehrgegenstände
•
•
•
Sicherheitsbelehrung: Allg. Laborpraxis
Einweisung in die Funktionsweise des Fluoreszenzspektrometers
Theoretische Vorbereitung:
-Einführung in den biol. Kontext des untersuchten Proteinsystems
-Besprechung der Versuchsstrategie und Methodik
•
Praktische Durchführung:
-Expression und Aufreinigung von einem der für die Interaktionsanalyse vorgesehenen Proteine
-Probenvorbereitung ( Pipettierschema, Einstellung der
Konzentrationen)
-Fluoreszenzmessung und Einweisung in die Geräte-Software
-Datenkonvertierung und Auswertung unter Verwendung des Analyse-Programmes GraFit
-Bestimmung der kinetischen Kenndaten ( kmax, A.C. 50 )
-Aufstellung eines Konzeptes zur Funktionsweise des Systems unter
Zuhilfenahme der angegebenen Literatur
Der Inhalt dieses Forschungspraktikums ist nur exemplarisch; über die tatsächlich
durchgeführten Experimente wird kurz vor dem Praktikum entschieden.
Max Planck Institut für molekulare Physiologie
Abteilung Strukturelle Biologie
Titel der Lehreinheit (LE)
Bezeichnung der LE
Modulpraktika Biochemie im Schwerpunkt
Proteine: Struktur und biologische Funktion
Kristallisation und Röntgenstrukturanalyse von Proteinen
Nr. des
Vorl.-Verzeichnis
LE-Kreditpunkte
4
Fachsemester
7
SWS
Dauer :
2 Wochen
Dozenten
Ingrid Vetter, Eva Wolf
Prüfer
Ingrid Vetter, Eva Wolf
Studiengänge:
Pflicht-LE für:
M. Sc. in Biochemie
5
Freiwillige LE für:
M. Sc. in Chemie
Zielsetzungen
Die Teilnehmer sollen mit den Grundzügen der Proteinstrukturbestimmung durch
Röntgenstrukturanalyse sowie mit der Analyse von Proteinmodellen vertraut gemacht werden.
Themenverzeichnis
Kristallisation von Proteinen, Umgang mit Kristallen und Vorbereitung zur Röntgendiffraktionsmessung, Kristallsymmetrien, Datensammlung, Auswertung und Prozessierung, Lösung des
Phasenproblems (MIR/MAD/MR), Berechnung der Elektronendichte, Modellbau an UNIXGrafikworkstations und Verfeinerung, Qualitätsuntersuchung und Analyse des Proteinmodells
Lehrmethoden:
Praktikum
Seminar
2 Wochen ganztägiges Praktikum
3x ½ Tag
Überprüfung des Lernforschritts
Bearbeitung der praktischen Aufgaben und deren
Protokollierung, aktive Teilnahme am Seminar
Leistungskontrolle
Eingangskolloquien zu den Teilaufgaben des
Modulpraktikums, Versuchsprotokoll, Vortrag in
Abschlusseminar (ggf. an Termin ausserhalb des
Praktikumsblocks nach Vereinbarung)
Zusammenfassung der Lehrgegenstände
-
-
Sicherheitsbelehrung: Allgemeine Laborpraxis, Arbeiten mit Röntgenstrahlen
Versuchsstrategische und methodische Vorbesprechung (Vergleich Röntgenstrukturanalyse
mit anderen Methoden der Strukturbestimmung, Vorgehensweise der Strukturanalyse)
Einführung
zu
eigenständigem
wissenschafltichen
Arbeiten
(Literaturrecherche,
Protokollierung, Darstellung wissenschaftlicher Ergebnisse in schriftlicher sowie Vortragsform)
Praktische Versuche:
1) Kristallzüchtung aus gereinigten Proteinen, Vergleich verschiedener Verfahren der
Kristallisation (u.a. hanging drop/sitting drop)
2) Vorbereitung für die Röntgenmessung, d.h. mount in Glaskapillaren bzw. Suche
eines passendes Gefrierschutzmittel zum Einfrieren der Kristalle
3) Röntgenmessung mit Einweisung in die Röntgensoftware, Montieren des Kristalls auf
dem Diffraktometer sowie strategische Planung eines Röntgenexperimentes.
4) Phasenbestimmung mit Hilfe der zwei Standard-Methoden: “molekularer Ersatz”
sowie “Isomorpher Ersatz” mit Schwermetall-Atomen, die in die Kristallstruktur
eingebracht werden.
5) Modellbau in die experimentelle Elektronendichte, die aus den obigen Daten und
Auswertungen berechnet wurde, mit Hilfe von SGI UNIX Grafik-Workstations.
6) Refinement: Das von Hand gebaute, rohe Modell wird mit Hilfe von sogenannten
“refinement”-Programmen so verändert, daß es optimal zu den Meßdaten paßt. Es werden
mehrere Zyklen von Modellbau und Verfeinerung durchgeführt, bis das Proteinmodell die
Röntgendaten korrekt wiedergibt.
7) Als Abschluß des Praktikums werden verschiedene Analyseverfahren auf das fertige
Modell angewendet, z.B. Ramachandran-Plot, Z-score- und Termperaturfaktoranalyse
sowie Untersuchung des Faltungstyps und Vergleich mit schon bekannten
Proteinstrukturen.
Der Inhalt dieses Forschungspraktikums ist nur exemplarisch; über die tatsächlich
durchgeführten Experimente wird kurz vor dem Praktikum entschieden.
RUHR-UNIVERSITÄT BOCHUM
Fakultät für Biologie
Modulpraktika Biochemie im Schwerpunkt
Proteine: Struktur und biologische Funktion:
Reinigung von Membranproteinen
Titel der Lehreinheit (LE)
Bezeichnung der LE
Nr. des
Vorl.-Verzeichnis
LE-Kreditpunkte
4
Fachsemester
7
Dozenten
SWS
Dauer :
2 Wochen
5
E. Hofmann
Prüfer
E. Hofmann, M. Lübben
Studiengänge:
Pflicht-LE für:
M. Sc. in Biochemie
Freiwillige LE für:
M. Sc. in Chemie
Zielsetzungen
Im Verlauf des Praktikums wird der/die Student/in mit der Aufreinigung von Membranproteinen
vertraut gemacht. Dies beinhaltet die Aufzucht von Bakterienkulturen, den Zellaufschluss und
die Aufreinigung mit Zentrifugation und Säulenchromatographie.
Themenverzeichnis
Proteinisolierung von Membranproteinen/ABC-Transporter
Lehrmethoden:
Praktikum
Seminar
2 Wochen ganztägiges Praktikum
3 halbe Tage zu Beginn des Praktikums,
abschließendes Studentenseminar
Überprüfung des Lernforschritts
Aktiver Teilnahme an der Sicherheitsbelehrung und am
Seminar
Leistungskontrolle
regelmäßiger Bericht an Prüfer nach Abschluss von
Teilaufgaben, Versuchsprotokoll
Zusammenfassung der Lehrgegenstände
a. Sicherheitsbelehrung zu den Aspekten des Praktikums
b. Seminar
• Molekularbiologische Grundlagen
• Methoden der Proteinaufreinigung
• Spezifische Probleme bei der Handhabung von Membranproteinen
• Einführung in ABC-Transporter
• Einführung in den Lipid-Transporter MsbA
• Aktivitätsassay
c. Praktikum
• Anzucht der Bakterienkultur ausgehend von Platten
• Induktion mit IPTG
• Ernte der Zellen mit Zentrifugation
• Zellaufschluss mit FrenchPress
• Gewinnung des Membrananteils
• Native Extraktion der Membranproteine mit Detergenz
• Aufreinigung an der FPLC-Anlage
• Überprüfung der Proteinqualität mit SDS-Page und Aktivitätsassay
• Ziel der Arbeiten ist eine möglichst selbstständige Versuchsdurchführung.
Der Inhalt dieses Forschungspraktikums ist nur exemplarisch; über die tatsächlich
durchgeführten Experimente wird kurz vor dem Praktikum entschieden.
RUHR-UNIVERSITÄT BOCHUM
Fakultät für Biologie
Titel der Lehreinheit (LE)
Bezeichnung der LE
Modulpraktika Biochemie im Schwerpunkt
Proteine: Struktur und biologische Funktion:
Isolation und FT-IR Spektroskopie von Ras p21
Nr. des
Vorl.-Verzeichnis
LE-Kreditpunkte
4
Fachsemester
7
SWS
Dauer :
Dozenten
C. Kötting, K. Gerwert
Prüfer
C. Kötting, K. Gerwert
Studiengänge:
2 Wochen
5
Pflicht-LE für:
M. Sc. in Biochemie
Freiwillige LE für:
M. Sc. in Chemie
Zielsetzungen
In diesem Praktikum wird ein Mitglied der Ras-Superfamilie in Escherichia coli exprimiert und
aufgereinigt. Anschließend wird das Protein mit einem photolabilen Nukleotid beladen und die
GTPase Reaktion mit Hilfe der FTIR-Spektroskopie untersucht.
Themenverzeichnis
GTPasen, photo-Trigger, FTIR
Lehrmethoden:
Praktikum
Seminar
2 Wochen ganztägiges Praktikum
3 halbe Tage während des Praktikums
Überprüfung des Lernforschritts
Bearbeitung der praktischen Aufgaben und deren
Protokollierung, aktive Teilnahme am Seminar
Leistungskontrolle
regelmäßiger Bericht an Prüfer nach Abschluss von
Teilaufgaben, Versuchsprotokoll
Zusammenfassung der Lehrgegenstände
a. Sicherheitsbelehrung zu den Aspekten des Praktikums und Erstbelehrung zur Radioaktivität
b. Seminar
Planung der Schritte für die Proteinisolation
Chromatographische Trennmethoden
Zeitaufgelöste FTIR an GTPasen
c. Praktikum
- Expression in Escherichia coli eines Mitglieds der Ras-Superfamilie.
- Aufreinigung des Proteins mit Ionenpaar-, Gelfiltrations und/oder Affinitätschromatographie.
- Nukleotidaustausch gegen photolabiles caged-GTP. Der Austausch wird mit HPLC verfolgt.
- Untersuchung der GTPase Reaktion mit zeitaufgelöster FTIR (rapid scan)
Der Inhalt dieses Forschungspraktikums ist nur exemplarisch; über die tatsächlich
durchgeführten Experimente wird kurz vor dem Praktikum entschieden.
RUHR-UNIVERSITÄT BOCHUM
Fakultät für Biologie
Modulpraktika Biochemie im Schwerpunkt
Proteine: Struktur und biologische Funktion –
Genklonierung, -Expression und -Analyse
Titel der Lehreinheit (LE)
Bezeichnung der LE
Nr. des
Vorl.-Verzeichnis
LE-Kreditpunkte
4
Fachsemester
7
Dozenten
SWS
Dauer :
2 Wochen
5
M. Lübben
Prüfer
M. Lübben, J. Schlitter
Studiengänge:
Pflicht-LE für:
M. Sc. in Biochemie
Freiwillige LE für:
M. Sc. in Chemie
Zielsetzungen
Der Student soll mit Techniken zur Isolation und funktionellen Analyse von Nukleinsäuren und
ihrer gentechnischen Manipulation bis zur Genexpression vertraut gemacht werden.
Themenverzeichnis
Klonierung und funktionelle Expression von mikrobiellen, für ATPasen kodierende Gene:
Isolation von Nukleinsäuren, Polymerase-Kettenreaktion, Restriktion, Ligation, Transformation
von Escherichia coli, DNA-Sequenzierung, Expressionschecks
Lehrmethoden:
Praktikum
Seminar
2 Wochen ganztägiges Praktikum
3 halbe Tage zu Beginn des Praktikums
Überprüfung des Lernforschritts
Bearbeitung der praktischen Aufgaben und deren
Protokollierung, aktive Teilnahme am Seminar
Leistungskontrolle
regelmäßiger Bericht an Prüfer nach Abschluss von
Teilaufgaben, Versuchsprotokoll
Zusammenfassung der Lehrgegenstände
b. Wissenschaftlicher Hintergrund über die Grundlagen der zu klonierenden und zu
exprimierenden mikrobiellen Gene (ionentranslozierende ATPasen, metallbindende
Chaperones) - vermittelt durch Literaturstudium und Diskussion mit Betreuern)
c. Sicherheitsbelehrung (allgemeine Laborpraxis, Arbeiten im gentechnischen Labor (S1))
d. Versuchsstrategische und methodische Vorbesprechung (Prinzipien der zu erlernenden
molekularbiologischen Verfahren)
e. praktische Versuche:
1. Bakterienanzucht (von verschiedenen Eubakterien bzw. Archaeen) zur Extraktion
von genomischer DNA.
2. Design von PCR Primern, Konstruktion des Expressionsplasmids durch virtuelles
Klonieren am Computer
3. Isolierung genomischer DNA als Template für PCR
4. PCR, Restriktion, Ligation in Expressionsplasmid
5. Transformation von Escherichia coli, Plattierung, Isolierung von Klonen
6. Sequenzierung der Insert-DNA zwecks Verifikation der Klonierung
7. Plasmidisolation und Transformation es Expressionsstamms
8. Versuche zur heterologen Expression, Induktion mit IPTG (Zellwachstum)
9. Überprüfung der zellulären Lokalisation (Zellaufschluss, Minimembranpräparation;
SDS-Gelelektrophorese des Homogenats und Nachweis des exprimierten Proteins
durch Immunoblotting
10. Physiologische Tests: Messung der Schwermetall-Resistenz der Expressionsklone
in vivo.
Der Inhalt dieses Forschungspraktikums ist nur exemplarisch; über die tatsächlich
durchgeführten Experimente wird kurz vor dem Praktikum entschieden.
RUHR-UNIVERSITÄT BOCHUM
Fakultät für Biologie
Modulpraktika Biochemie im Schwerpunkt
Proteine: Struktur und biologische Funktion –
Proteinisolierung und -Analyse
Titel der Lehreinheit (LE)
Bezeichnung der LE
Nr. des
Vorl.-Verzeichnis
LE-Kreditpunkte
4
Fachsemester
7
Dozenten
SWS
Dauer :
2 Wochen
5
M. Lübben
Prüfer
M. Lübben, E. Hofmann
Studiengänge:
Pflicht-LE für:
M. Sc. in Biochemie
Freiwillige LE für:
M. Sc. in Chemie
Zielsetzungen
Der Student soll mit Techniken zur Isolation und funktionellen Analyse von Proteinen vertraut
gemacht werden.
Themenverzeichnis
Proteinisolation von löslichen Proteinen und Membranproteinen /Cu-Transport ATPase aus
Mikroorganismen; Lipidrekonstitution, Aktivitätstest; Bindung von Substratanaloga
Lehrmethoden:
Praktikum
Seminar
2 Wochen ganztägiges Praktikum
3 halbe Tage zu Beginn des Praktikums
Überprüfung des Lernforschritts
Bearbeitung der praktischen Aufgaben und deren
Protokollierung, aktive Teilnahme am Seminar
Leistungskontrolle
regelmäßiger Bericht an Prüfer nach Abschluss von
Teilaufgaben, Versuchsprotokoll
Zusammenfassung der Lehrgegenstände
f. Wissenschaftlicher Hintergrund über primär aktive Ionenpumpen wie Cu-Transport
ATPase (physiologische und mechanistische Grundlagen vermittelt durch
Literaturstudium und Diskussion mit Betreuern)
g. Sicherheitsbelehrung (allgemeine Laborpraxis, Arbeiten im gentechnischen Labor (S1))
h. Versuchsstrategische und methodische Vorbesprechung (Prinzipien der
Bakterienfermentation, Proteinreinigung und proteinspezifischer Funktionstests)
i. praktische Versuche:
1. Bakterienanzucht (Heterologe Expression der membrangebundenen ATPase in
Escherichia coli.
2. Zellaufschluss und Membranreinigung durch differentielle Zentrifugation
3. Proteinquantifizierung der Membran, Extraktion der membranintegralen ATPase mit
Detergenzien
4. Säulenchromatographie (1. Schritt: Ni-Affinitätschromatographie der oligohistidinmodifizierten ATPase sowie 2. Schritt: Anionentauscher-Chromatographie (Mono
Q); Einsatz von modernen FPLC und HPLC-Anlagen
5. Proteinchemische Charakterisierung (1. SDS-Gelelektrophorese, 2.
proteinspezifischer Nachweis mittels Western-blot)
6. Aktivitätstest mittels des natürlichen Substrats ATP durch Phosphatbestimmung
und spektroskopisch mit dem chromophoren Substrat p-Nitrophenylphosphat
7. Rekonstitution in Phospholipidmembranen, Effekte auf biologische Aktivität der
ATPase
8. Messung der Ligandenbindung über Proteinfluoreszenz und mittels
fluoreszenzmarkierter Substratanaloga (Aufnahme von Excitations- und
Emissionsspektren; Titrationen zur Bestimmung von Bindungsplatzzahl und der
thermodynamischen Dissoziationskonstante); Bestimmung von Dissoziationsraten
durch Ligandenverdrängung
9. Optional können die Experimente (bis auf 3. und 7. ) auch mit der heterolog
exprimierten katalytischen Domäne durchgeführt werden
Der Inhalt dieses Forschungspraktikums ist nur exemplarisch; über die tatsächlich
durchgeführten Experimente wird kurz vor dem Praktikum entschieden.
RUHR-UNIVERSITÄT BOCHUM
Fakultät für Chemie
Modulpraktika Biochemie im Schwerpunkt
Proteine: Struktur und biologische Funktion
Modelling von Proteinen
Titel der Lehreinheit (LE)
Bezeichnung der LE
Nr. des
Vorl.-Verzeichnis
LE-Kreditpunkte
4
Fachsemester
7
Dozenten
SWS
Dauer :
2 Wochen
5
J. Schlitter
Prüfer
J. Schlitter, M. Lübben
Studiengänge:
Pflicht-LE für:
M. Sc. in Biochemie
Freiwillige LE für:
M. Sc. in Chemie
Zielsetzungen
Erlernen des Umgangs mit Computermethoden zur Simulation von Proteinen – Struktur und
Dynamik
Themenverzeichnis
Molekulare Graphik, Visualisierungsprogramm, Theorie und Praxis der MolekulardynamikSimulation, Graphik-Animation von Makromolekülen
Lehrmethoden:
Praktikum
Seminar
2 Wochen ganztägiges Praktikum
3 halbe Tage zu Beginn des Praktikums
Überprüfung des Lernforschritts
Bearbeitung der praktischen Aufgaben und deren
Protokollierung, aktive Teilnahme am Seminar
Leistungskontrolle
Regelmäßiger Bericht an Prüfer nach Abschluss von
Teilaufgaben, Versuchsprotokoll
Zusammenfassung der Lehrgegenstände
a. Seminar (theoretische Grundlagen)
b. Praktikum (Darstellungsverfahren Makromolekülen am Computer; Durchführung von
Molekulardynamik-Simulationen
Im Teil „Modelling“ lernen die Studenten Mittel der Computergrafik und
Computersimulation kennen, mit denen sie die Proteine des laborpraktischen Teils, soweit
Strukturen vorhanden sind, oder verwandte Proteine weiter untersuchen können. Soweit
Kenntnisse noch nicht vorhanden, werden sie eingewiesen in Rasmol, Molmol, Weblab
Viewer, Yasara, Whatif und andere einschlägige Programme. Themen sind alle Arten von
grafischen Darstellungen, Vermessungen, Vergleiche, Untersuchung auf Strukturprobleme
etc. Die Dynamik wird an einem Beispiel mittels MD-Simulation studiert. Zeitverläufe
geometrischer und physikalischer Größen werden ermittelt und beurteilt. Für die
Präsentation im Seminar wird eine Animation wird erstellt.
Der Inhalt dieses Forschungspraktikums ist nur exemplarisch; über die tatsächlich
durchgeführten Experimente wird kurz vor dem Praktikum entschieden.