HPLC High Performance Liquid Chromatography

HPLC
High Performance Liquid
Chromatography
Fette Geräte Seminar
02.03.2009
Bertram Barnickel
Gliederung
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Chromatographie Basics
Warum HPLC?
Wie funktioniert HPLC?
Scope & Limitations
Beispielanalyse
Chromatographie Basics I
Flash-Säule = Normalphase (NP)
Trennleistung abhängig von:
• Probenmenge pro Gramm Silica (üblich ~1:50)
• Säulenlänge
• Partikelgröße (Silica)
• Flussrate
•Solvent
Chromatographie Basics II
Reversed Phase Chromatographie (RP)
• Stationäre Phase bei RP-Chromatographie:
– Silica als Grundmaterial
– „Beschichtung“ mit organischen Molekülen
• Alkane (z.B. C-4, C-8, C-12, C18), Phenyl, CN
• Chirale Moleküle (Cyclodextrine, Zucker etc.)
– Endcapping mit Trimethylsilan
• Solvent immer H2O und ein mischbares
Lösungsmittel (MeCN, MeOH, THF, IPA)
Warum (RP)-HPLC?
• Trennung komplexer Stoffgemische
– Unabhängig von Molmasse und funktionellen Gruppen
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Geringer Substanzbedarf (10–100 µl einer 1‰ Lsg.)
Hohe Reproduzierbarkeit (speziell bei RP)
Quantifizierbar
Bestimmung von
ee und dr
Wie funktioniert HPLC?
Lösungsmittel
Säule
Pumpen
UV/VIS
Wie funktioniert HPLC? II
• Höhere Trennleistung durch kleinere SilicaPartikel (3-10 µm, vergl. Flash-Säule 40-60 µm)
• Gradienten ermöglichen besser Trennungen
• Druck ist nur Bedingung für vernünftige
Flussraten (0,5 – 2 ml/min) Æ bringt keine
Trennleistung
• Detektion mittels UV/VIS statt DC-Platte
Scope
• Ca. 80 % aller Verbindungen geeignet für HPLC
Analytik (GC nur ca. 15-20 %)
• Hoch komplexe Mischungen trennbar
(> 20 Verbindungen)
• Einfache Probenpräparation (wenn löslich!!!)
• Sehr hohe Reproduzierbarkeit
• Quantitative Analytik möglich (mit Standard)
• Präparative HPLC im Gramm-Maßstab möglich
Limitations
• Methodenentwicklung sehr (Zeit-)aufwändig
– Säulenmaterial und Hersteller
– Lösungsmittel, Mischung, Gradient
– pH, Flussrate, Temperatur
• Trotz hohem Aufwand keine Erfolgsgarantie
• Hoher Preis
– Analytische Säulen ca. 400 – 700 €
– HPLC-Lösungsmittel (2,5 l MeCN 80 €; THF 115 €)
– Präparative HPLC entsprechend teurer
Beispiel: Analyse von Heroin
250/4 mm Nucleosil® 100-5µm C-18 HD
A) 2 mmol NaH2PO4, adjusted to pH 2.5 with H3PO4
B) Acetonitrile Gradient: 8 – 33% B in 30 min
Sample volume: 100 μl
Flow rate: 0.8 mL/min
Detection: UV, 210 nm
1) Paracetamol
2) Caffeine
3) 6-Monoacetylmorphine
4) Thebaine
5) Heroin
6) Papaverine
7) Noscapine
http://www.mn-net.com/DesktopModules/TabID/9661/defauld.aspx
Danke für die Aufmerksamkeit!