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Jahrbuch 2004/2005 | Spatz, Joachim P.; Arnold, Marco; Blümmel, Jacques; Cavalcanti-Adam, Ada; Glass,
Roman; Ulmer, Jens | Leben auf der Nanometerskala
Leben auf der Nanometerskala
Cellular life on the nanometer scale
Spatz, Joachim P.; Arnold, Marco; Blümmel, Jacques; Cavalcanti-Adam, Ada; Glass, Roman; Ulmer, Jens
Max-Planck-Institut für Intelligente Systeme, Standort Stuttgart, Stuttgart
Korrespondierender Autor
E-Mail: [email protected]
Zusammenfassung
Die Bildung molekularer Cluster spielt in einer Vielzahl hierarchisch organisierter Prozesse eine entscheidende
Rolle. Insbesondere in der Biologie w erden zelluläre Funktionen durch das Zusammenführen einzelner
Proteine zu Clustern definierter Proteinanzahl reguliert. Proteine verändern hierbei deren molekulare
Konformation – und damit deren Funktion – durch Wechselw irkung mit anderen Proteinen in räumlicher Nähe.
Die Regulierung der Bildung von Proteinclustern ist somit ein funktionelles Handw erkszeug der Natur. Neben
der räumlichen Nähe einzelner Proteine spielt die Anzahl der Proteine eines Clusters eine entscheidende Rolle.
Üblicherw eise
handelt es
sich
hier um abzählbar viele
Proteine. Grundsätzlich
ist die
kooperative
Wechselw irkung zw ischen Proteinen von entscheidender Bedeutung. Die Nanotechnologie kann in Form von
nanostrukturierten und biofunktionalisierten Grenzflächen einen w ichtigen Beitrag in der Zellbiologie liefern.
Diese Technologie dient hierbei als ein „nanoskopisches Werkzeug“, um molekulare Wechselw irkungen zu
regulieren und molekulare Längenskalen in Proteinclustern zu messen.
Summary
The formation of molecular clusters plays an essential role in many hierarchically organised processes.
Especially in biology, cellular functions are often regulated by the association of single proteins into protein
clusters of defined protein number. Proteins change their molecular conformation and thus their function
through interaction w ith other proteins in close spatial proximity. Consequently, the formation of protein
clusters is a functional tool of nature to sw itch system properties. Beside the spatial proximity of proteins the
total number of proteins per cluster is often very important. Usually, this is a countable number of proteins
w hich form such a cluster. In such systems, cooperativeness betw een proteins is basically of importance. In
this context, nanotechnology can contribute significantly to cell biology by means of nanostructured and biofunctionalised interfaces. Here, this technology serves as a “nanoscopic tool” for regulating molecular
interactions and for measuring molecular length scales in protein clusters.
Die
interdisziplinär
aufgestellte
Abteilung Neue
Materialien
&
Biosysteme
am Max-Planck-Institut
für
Metallforschung beschäftigt sich mit der Entw icklung neuer mikro- und nanostrukturierter Materialien sow ie
Biofunktionalisierungstechniken
Messtechniken.
Diese
von
ermöglichen
Grenzflächen, mikromechanischer, optischer und
das
Zusammenführen
einzelner
Moleküle,
optomechanischer
Proteine,
einzelner
Proteinfilamente und einzelner Zellen zu jew eils einem Cluster definierter Anzahl an Einzelobjekten und das
© 2005 Max-Planck-Gesellschaft
w w w .mpg.de
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Proteinfilamente und einzelner Zellen zu jew eils einem Cluster definierter Anzahl an Einzelobjekten und das
Quantifizieren der daraus resultierenden Funktion. W ir verfolgen einerseits Experimente an lebenden Zellen;
andererseits
biomimetische
Ansätze
auf der Ebene
von
Netzw erken
einzelner Proteine
und
deren
hierarchisches/kooperatives Zusammenw irken (Assemblierung), w elche spezifische Zellfunktionen nachahmen.
Hierbei ist insbesondere unser Ziel, die dynamische Regulation der Adhäsionskontakte und der Architektur des
Zytoskeletts von Zellen sow ie deren Einfluss auf Zellfunktionen physikalisch zu verstehen. Besonderes
Merkmal der interdisziplinären Gruppe ist die Zusammenarbeit von W issenschaftler/innen aus den Fächern
Physik, Chemie und Biologie unter dem Dach einer Abteilung.
Auf der Ebene einer Zelle interessieren w ir uns dafür, w ie die Funktionen eines einzelnen Anhaftungsrezeptors
durch
das
Bilden
eines
Proteinclusters
aus
einer
definierten
Anzahl
von
Einzelrezeptoren
in
ein
makroskopisches Signal auf der zellulären Ebene übersetzt w erden. Hierbei haben w ir eine auf der
Selbstorganisation von Zw eiblockcopolymeren basierende Nanotechnologie entw ickelt. Diese erlaubt es uns,
einzelne Proteine an einer Grenzfläche, beispielsw eise eines Glasplättchens, an definierten Punkten
anzubinden, ohne deren Funktion w esentlich einzuschränken. Die Abstände und die Anzahl der einzelnen
Proteine an einer Stelle des Substrats können auf molekular relevanten Längenskalen definiert eingestellt
w erden (Abb. 1).
Se m i-sche m a tische Da rste llung de r Fe stle gung e inze lne r
Mole k üle a uf e ine r Gre nzflä che in e ine m Mole k ülcluste r. Die
we iße n P unk te a uf schwa rze m Hinte rgrund sind 6 nm
(Na nom e te r) große Goldpunk te a uf e ine r Gla sobe rflä che ,
a bge bilde t m itte ls de r R a ste re le k trone nm ik rosk opie . Die
e inze lne n Goldpunk te k önne n che m isch de ra rt funk tiona lisie rt
we rde n, da ss sie a ls e ine „na nosk opische Ha nd“ zum Gre ife n
e inze lne r Mole k üle ode r P rote ine funk tionie re n. De r Absta nd
zwische n de n Goldpunk te n k a nn a uf e ine r m ole k ula r
re le va nte n Lä nge nsk a la e inge ste llt we rde n. Da m it we rde n die
la te ra le W e chse lwirk ung und da m it die Funk tion e ine s
P rote incluste rs de finie rt re gulie rt. Ande rse its die nt die se
Na note chnologie a uch a ls e in „na nosk opische s Line a l“,
we lche s wichtige funk tiona le , inte rm ole k ula re Lä nge n in
Mole k ülcluste rn a usm e sse n k a nn.
© Ma x -P la nck -Institut für Me ta llforschung
Synthetischer Ansatz einer Nanotechnologie
Die Entw icklung der nanoskopischen Lithographietechnik basiert auf der Selbstorganisation einzelner
Makromoleküle an Grenzflächen und geht auf eine enge Zusammenarbeit mit Professor Martin Möller (DW I und
RW TH Aachen) an der Universität Ulm zurück. Der Grundgedanke liegt darin, dass die resultierenden
Strukturen molekulare Längenskalen abdecken. Daher setzen w ir zur Erzeugung dieser Strukturen bereits
synthetische Makromoleküle ein, die die Strukturlänge vorgeben. Hiermit erzielen w ir Strukturdimensionen, die
mittels konventioneller Methoden w ie der Photo- und der Elektronenstrahllithographie nicht möglich sind.
Mittels Selbstorganisation w erden Nanopartikel verschiedener Metalle bzw . Metalloxide (beispielsw eise Au, Ag,
Pd, Pd, Ni, Co, FeO x ) mithilfe eines durch anionische Polymerisation hergestellten Zw eiblockcopolymers (Abb.
2) auf unterschiedlichen Substraten (beispielsw eise Glas, SiO 2 , GaAs, oder SrTiO 3 ) abgeschieden.
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(a ) Ein Zwe iblock copolym e r be ste ht a us zwe i che m isch
ve rschie de ne n P olym e re n, we lche k ova le nt a n e ine r Ste lle
ve rbunde n sind – hie r P olystyrol (P S) und P oly(2-vinylpyridin)
(P 2VP ). (b) Da s Zwe iblock copolym e r bilde t in e ine m
be stim m te n Konze ntra tionsbe re ich in unpola re n
Lösungsm itte ln Mize lle n a us, in de ne n sich die unpola re n
P olystyrolk e tte n na ch a uße n und die pola re n P oly-2vinylpyridine inhe ite n ins Inne re orie ntie re n. De r pola re Ke rn
lä sst sich nun m it Me ta llsa lze n be la de n. (c) Da s Übe rtra ge n
de r be la de ne n Mize lle n a uf e in Substra t ge schie ht durch
de sse n Einta uche n in die P olym e rlösung. Durch a nschlie ße nde
P la sm a be ha ndlung wird da s P olym e r we gge ä tzt und die
Na nostruk tur durch da s Absche ide n von Me ta llpa rtik e ln
ge bilde t [1, 2].
Das organische Polymer w ird mittels eines Gasplasmas (Argon, Sauer- oder Wasserstoff) von der Oberfläche
entfernt (Abb. 3).
Be ispie le ra ste re le k trone nm ik rosk opische r Aufna hm e n zwe ie r
Goldna nopa rtik e lstruk ture n; link s: ge ne rie rt m itte ls [P S(500)b-P 2VP (HAuC l4) 0.5(270)], Goldpa rtik e ldurchm e sse r 5±1 nm ;
re chts: ge ne rie rt m itte ls [P S(1780)-b-P 2VP (HAuC l4) 0.5(525)],
Goldpa rtik e ldurchm e sse r 10±1 nm .
Die Größe der Metallpartikel ist im Bereich von 1 bis 20 nm variabel. Weiterhin kann der Abstand zw ischen den
einzelnen Partikeln je nach Herstellungsbedingungen und Polymerkettenlängen zw ischen 10 und 200 nm
variiert w erden. Im Falle von Goldnanoclustern auf SiO 2 oder Glas sind die Partikel so fest gebunden, dass sie
w eder durch Spülen mit verschiedenen Lösungsmitteln noch durch die Behandlung im Ultraschallbad von der
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Oberfläche abtrennbar sind. Größere Abstände und aperiodische Strukturen erhält man durch den Einsatz der
monomizellaren Filme als Photo- oder Elektronenstrahlresist (Abb. 4) [2].
Link s: Sche m a tische Da rste llung e ine r Mik ro-Na noStruk turie rung: m it Ele k trone n be stra hlte Mize llbe re iche
ble ibe n na ch de m „lift-off“-Ve rfa hre n a uf de m Substra t zurück
und bilde n na ch de r P la sm a be ha ndlung die Na nostruk tur;
re chts obe n: m it Ele k trone n fix ie rte Mize lle n a uf Silizium na ch
de m „lift-off“; re chts unte n: Struk tur na ch P la sm a be ha ndlung
[2].
Biofunktionalisierung von nanostrukturierten Grenzflächen
Zellen oder Proteine unterscheiden in den meisten Fällen nicht zw ischen der Chemie von Glas oder von Gold.
Auch sind die Nanostrukturen derart klein, dass Zellen deren Topographie nicht merklich w ahrnehmen. Eine
Zelle hat einen Durchmesser von mehreren 10 µm. Proteine und Teile der Zellmembran belegen somit
Substrate nicht ortselektiv. Um die Ablage von Proteinen zw ischen die nicht mit Goldpunkten belegten freien
Glasflächen einzuschränken, w ird diese mit einer Monoschicht eines Hydrogels (Polyethylenoxid (PEG)) über
Silan-Chemie modifiziert (Abb. 5). Das PEG-System bindet hierbei kovalent an die Glasoberfläche an und bildet
eine Protein- und Zellmembran abw eisende Schicht. Anschließend w erden die Goldpunkte durch RGD-ThiolPeptide mittels eines einfachen Tauchprozesses in eine peptidhaltige Lösung für eine Anbindung bei
Zellkontakt aktiviert. Dabei bindet das RGD-Peptid spezifisch an den für die Haftung verantw ortlichen
Transmembranrezeptor Integrin. Professor Kessler, TU München, stellt uns diese besonderen Peptide zur
Verfügung.
Sche m a de r Biofunk tiona lisie rung von na nostruk turie rte n
Gre nzflä che n [3].
Das Leben und Sterben biologischer Zellen auf der Nanometerskala
Das Ankleben von Zellen an Gew ebe, die Adhäsion von beispielsw eise Gew ebezellen, ist ein Schlüsselvorgang,
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mit dem Zellen Informationen aus ihrer Umgebung erhalten. Dieser Vorgang kann bestimmte Fehlfunktionen
bei der Zellregulation auslösen, die zur Bildung von Krebs oder zum programmierten Zelltod (Apoptose) führen
können. Ein entscheidender Aspekt der Zellhaftung ist die Ausbildung adhäsiver Protein-Komplexe, die auch
fokale Adhäsionscluster genannt w erden. Diese Strukturen enthalten transmembrane Integrinrezeptoren, die
die
extrazelluläre
Matrix (EZM) mit
dem Aktin-Zytoskelett
durch
eine
zytoplasmatische
Schicht
von
Ankerproteinen verbinden.
Das Fehlen hoch auflösender biochemischer Strukturierungsmethoden von Grenzflächen hat lange Zeit die
Untersuchung des Einflusses der strukturellen Anordnung einzelner Moleküle oder Molekülcluster, die bei der
Zelladhäsion eine w ichtige Rolle spielen, auf die Funktion von Zellen verhindert.
Die Anw endung einer Nanotechnologie in Form von selbstorganisierenden Zw eiblockcopolymeren zur
Herstellung von chemisch strukturierten Oberflächen in der Größenordnung von 3 bis 100 nm in Kombination
mit Biofunktionalisierungstechniken stellt einen viel versprechenden Lösungsansatz zur Überw indung dieser
Einschränkung dar. Dieses neue Werkzeug eröffnet einzigartige Möglichkeiten zum Verständnis der relevanten
Längenskalen in Proteinclustern bei der Zelladhäsion mit einer Auflösung von einem einzelnen Protein.
Im Wesentlichen haben w ir eine starre Schablone von zelladhäsiven Nanopunkten entw ickelt. Jeder
Nanopunkt ist mit Liganden (hier: Bindungsmoleküle) für einzelne Integrine bedeckt, die mit großer
Genauigkeit im Abstand von 28, 58, 73 und 85 nm auf Deckgläschen aufgebracht sind. Der kleine Durchmesser
der Adhäsionspunkte lässt die Bindung von nur einem Integrinmolekül pro Punkt zu. W ir konnten nachw eisen,
dass ein Abstand von mehr als 73 nm zw ischen den Adhäsionspunkten die Zelladhäsion und die Bildung von
fokaler Adhäsion erheblich verringert. Die Nanostrukturen w urden so als ein „nanoskopisches Lineal“
eingesetzt. W ir konnten w eiter feststellen, dass es sich bei diesem Abstand um eine universelle Längenskala
in verschiedenen Zelllinien handelt.
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Molekulare Motoren auf der Nanometerskala
In der Folge w urden in einer sehr engen und phantastischen Zusammenarbeit mit Dr. Thomas Surrey, EMBL
Heidelberg, die
nanostrukturierten und
biofunktionalisierten Grenzflächen als
ein Handw erkszeug
zur
quantitativen Bestimmung der Kinetik molekularer Motoren entw ickelt und eingesetzt. Motorproteine
transportieren in Zellen Makromoleküle oder Molekülverbände durch Umw andlung von chemischer in
mechanische Energie. Die aus vier gleichen Untereinheiten gebildeten Motorproteine der Kinesin-5-Familie sind
essentiell an der Bildung des Spindelapparats w ährend der Kernteilung (Mitose) von Zellen beteiligt. Uns
gelang es erstmals, das Motorprotein Eg5 durch eine systematische Dichtevariation auf nanostrukturierten
Oberflächen zu untersuchen. Im Mittelpunkt der Anw endung stand die Fragestellung, ob und in w elcher Form
die
Partikeldichte
das
Verhalten
des
Motorproteins
beeinflusst (Abb.
7).
Hierfür
w urde
Eg5
auf
Goldnanostrukturen mit unterschiedlichen Partikelabständen (45, 58, 73, 90, 110 nm) eingebettet in eine PEGMatrix immobilisiert. Anstelle des Transmembranrezeptors Integrin w ird ein einzelnes Motorprotein Eg5 pro
Goldpunkt festgesetzt (immobilisiert). W ir konnten zeigen, dass die Eg5-Proteine zum einen spezifisch auf
diesen
Partikeln
anbinden
und
zum anderen
die
Menge
des
festgesetzten
Proteins
in
direktem
Zusammenhang mit der vorgegebenen Partikeldichte steht. Die ermittelten Gleitgeschw indigkeiten von
Mikrotubuli, w elche aktiv durch Eg5 unter ATP-Verbrauch transportiert w urden, stiegen mit zunehmender
Motorkonzentration auf der Oberfläche. Weiterhin konnten w ir bei geringen Goldpunktdichten (110 nm
Abstände) eine Zunahme der Gleitgeschw indigkeit mit w achsender Länge der Mikrotubuli beobachten. Dieses
Verhalten steht im Einklang mit der Dichteabhängigkeit der Nanopartikel: Je mehr Eg5 am Transport der
Mikrotubuli beteiligt sind, umso schneller werden diese, bis eine Sättigung erreicht ist. Diese Erkenntnis lässt
schließen, dass es sich bei Eg5 um ein nicht prozessives Motorprotein handelt, d. h. es löst sich nach jedem
getätigten Schritt auf dem Filament ab. Weitere Geschw indigkeitserhöhungen konnten w ir durch Steigerung
der Salzkonzentration in den verw endeten Puffern erzielen, w obei die Abhängigkeit der Geschw indigkeit von
der Eg5-Oberflächenkonzentration gew ahrt w urde.
Erm itte lte Ge schwindigk e ite n von Mik rotubuli a uf m it E5
m ole k ula re n Motore n be le gte n Na nostruk ture n in
Abhä ngigk e it von de r Mik rotubulilä nge .
Diese Studien verknüpfen anorganische, nanostrukturierte Oberflächen mit organisch, bio-organischen
Beschichtungen zur Untersuchung molekular definierter, biologischer Systeme. In diesem Rahmen w ird
erforscht, in w ie w eit die stringente Kontrolle über die Anordnung von Signalmolekülen oder von funktionellen
Proteinen auf der Nanometerskala deren Funktion manipuliert. Die nanostrukturierte Grenzfläche w ird somit zu
einem „nanoskopischen Lineal“, w elches die Messung spezifischer funktionaler Längenskalen in Molekül- oder
Proteinclustern ermöglicht. Ebenso ist die Erw eiterung der neuen Materialien auf andere molekulare
Biosysteme denkbar.
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Originalveröffentlichungen
Nach
Erw eiterungen
suchenBilderw eiterungChanneltickerDateilisteHTML-
Erw eiterungJobtickerKalendererw eiterungLinkerw eiterungMPG.PuRe-ReferenzMitarbeiter
Editor)Personenerw eiterungPublikationserw eiterungTeaser
(Employee
mit
BildTextblockerw eiterungVeranstaltungstickererw eiterungVideoerw eiterungVideolistenerw eiterungYouTubeErw eiterung
[1] J. Spatz, S. Mössmer, M. Möller:
Mineralization of Gold Nanoparticles in a Block Copolymer Microemulsion
Chemistry – A European Journal 2 (12), 1552-1555 (1996).
[2] R. Glass, M. Möller, J. P. Spatz:
Block Copolymer Micelle Nanolithography
Nanotechnology 14 (10), 1153-1160 (2003).
[3] M. Arnold, A. Cavalcanti-Adam, R. Glass, J. Blümmel, W. Eck, H. Kessler, J. P. Spatz:
Activation of Integrin Function by Nanopatterned Adhesive Interfaces
ChemPhysChem 5 (3), 383-388 (2004).
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