Prognose der Tiefgefriereignung von Hengstsperma mit Hilfe von

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Aus der Tierklinik für Fortpflanzung
im Fachbereich Veterinärmedizin
der Freien Universität Berlin
(Arbeitsgruppe Prof. Dr. Dr. habil. P. S. Glatzel)
Prognose der Tiefgefriereignung von Hengstsperma
mit Hilfe von Funktionstests
Inaugural-Dissertation
zur Erlangung des Grades eines
Doktor Medicinae Veterinariae
an der Freien Universität Berlin
Vorgelegt von
Katharina von Stern
aus Lüneburg
Berlin 2001
Journal-Nr. 2470
Gedruckt mit Genehmigung
des Fachbereiches Veterinärmedizin
der Freien Universität Berlin
Dekan:
Univ. - Prof. Dr. M.F.G. Schmidt
Erster Gutachter:
Univ. - Prof. Dr. P.S. Glatzel
Zweiter Gutachter:
Univ. - Prof. Dr. A. Grabner
Tag der Promotion:
01.06.2001
Inhaltsverzeichnis
1
EINLEITUNG UND PROBLEMSTELLUNG ................................................................................ 5
2
SCHRIFTTUM .................................................................................................................................. 6
2.1
MORPHOLOGIE DER HENGSTPERMIEN ..................................................................................... 6
2.1.1
Allgemeines zur Morphologie................................................................................................ 6
2.1.2
Der Spermienkopf und das Akrosom................................................................................... 6
2.1.3
Zusammenhang zwischen Akrosomintegrität/Motilität und Fertilität................................ 7
2.2
BIOCHEMISCHER AUFBAU DES SPERMIENKOPFES .................................................................. 8
2.2.1
Akrosin ..................................................................................................................................... 8
2.2.2
Akrosomreaktion................................................................................................................... 11
2.3
METHODEN ZUM NACHWEIS VON AKROSOMENSCHÄDEN...................................................... 11
2.3.1
Morphologische Beurteilung des Akrosomenzustandes ................................................. 12
2.3.2
Messung der Hyaluronidaseaktivität .................................................................................. 13
2.3.3
Biochemische oder histochemische Messung der Akrosinaktivität ......................................... 13
2.3.4
Messung der Akrosinaktivität mittels Gelatinolyse ................................................................. 14
2.4
TESTS ZUR UNTERSUCHUNG DER SPERMATOZOEN-MUKUS-INTERAKTION ......................... 17
2.5
TIEFGEFRIERKONSERVIERUNG VON HENGSTSPERMA ........................................................... 21
2.5.1
3
Überprüfung der Gefriereignung des Hengstsamens...................................................... 22
MATERIAL UND METHODEN .................................................................................................... 25
3.1
HENGSTE ................................................................................................................................ 25
3.2
VERSUCHSEINTEILUNG ........................................................................................................... 25
3.3
GEWINNUNG DER EJAKULATE ................................................................................................ 26
3.4
BESTIMMUNG DER SPERMIENMOTILITÄT ................................................................................ 26
3.5
TIEFGEFRIERKONSERVIERUNG DES SAMENS ........................................................................ 27
3.6
W EITERGEHENDE UNTERSUCHUNGEN .................................................................................. 29
3.6.1
Computergesteuerte Videomikrographie........................................................................... 29
3.6.2
Mukuspenetrationstest......................................................................................................... 32
3.6.3
Akrosinbestimmung mittels Gelatinolyse........................................................................... 35
3.7
STATISTISCHE AUSWERTUNG................................................................................................. 38
3.7.1
Statistische Tests ................................................................................................................. 38
3.7.2
Messfehleranalyse des Halodurchmessers ...................................................................... 39
4
ERGEBNISSE ................................................................................................................................ 40
4.1
VORVERSUCH.......................................................................................................................... 40
4.1.1
Beurteilung der Vorwärtsbeweglichkeit vor und nach der Kryokonservierung............. 40
4.1.2
4.1.3
4.1.3.1
Prozentualer Anteil der Spermien mit Halobildung............................................................... 45
4.1.3.2
Messfehleranalyse des Halodurchmessers........................................................................... 47
4.1.3.3
Halodurchmesser ...................................................................................................................... 51
4.2
HAUPTVERSUCH...................................................................................................................... 53
4.2.1
Vorwärtsbeweglichkeit vor und nach der Kryokonservierung ........................................ 53
4.2.2
4.2.3
4.3
4.2.3.1
Prozentualer Anteil der Spermien mit einer Halobildung..................................................... 56
4.2.3.2
Halodurchmesser ...................................................................................................................... 58
STATISTISCHE ANALYSE DER ZUSAMMENHÄNGE ZWISCHEN VORWÄRTSBEWEGLICHKEIT
UND PARAMETERN DES MUKUSPENETRATIONSTESTS BZW . DER AKROSINBESTIMMUNG MITTELS
GELATINOLYSE BEI NATIV- UND TIEFGEFRIERSPERMA ............................................................................ 60
5
DISKUSSION ................................................................................................................................. 61
5.1
SPERMIENMOTILITÄT ............................................................................................................... 61
5.2
MUKUSPENETRATIONSTEST ................................................................................................... 62
5.3
AKROSINBESTIMMUNG MITTELS GELATINOLYSE .................................................................... 63
6
ZUSAMMENFASSUNG ................................................................................................................ 66
7
SUMMARY...................................................................................................................................... 68
8
LITERATURVERZEICHNIS ......................................................................................................... 69
1 Einleitung und Problemstellung
In der modernen Warmblutzucht kommt der künstlichen Besamung eine immer bedeutendere Rolle zu. Der Vorteil liegt einerseits darin, die Übertragung von Krankheiten und Verletzungen des Hengstes durch die Stute zu vermeiden, andererseits fällt
der unter Umständen erhebliche Aufwand des Stutentransportes sowie der damit
verbundene Stress für das Tier weg. Darüber hinaus können stark beanspruchte
Hengste durch die Portionierung des Ejakulates eine höhere Zahl an Stuten bedecken und somit gleichzeitig entlastet werden.
Im Gegensatz zur Frischsamenübertragung sind die Befruchtungsergebnisse der
Tiefgefriersamenübertragung viel stärker individuellen, alters- und saisonbedingten
Schwankungen der Samenqualität unterworfen, ansonsten spielt die Ermittlung des
optimalen Inseminationszeitpunktes bei der Stute eine wesentlichere und damit entscheidendere Rolle, dennoch liegen die Vorteile der Tiefgefrierkonservierung auf der
Hand.
Bei der Tiefgefrierkonservierung wird die Möglichkeit gegeben, den Samen über weite Entfernungen bei konstanter Temperatur zu versenden und zusätzlich Reserven
von für die Zucht interessanten Hengsten, sowie Vollbluthengsten für die Warmblutzucht anzulegen, die dann nach dem Tode des Vatertieres zum Einsatz kommen
können.
Bei der Frischsamen- und Tiefgefrierkonservierung wird das umgebende Milieu sehr
stark verändert, so dass es zu Alterationen des akrosomalen Systems oder auch
anderer für die Befruchtung wichtiger Systeme kommen kann, denn Hengstspermien
reagieren sehr empfindlich auf Veränderungen des äusseren Milieus.
In den üblichen Untersuchungsverfahren, wie dem Spermiogramm, werden Schädigungen des Akrosoms oder Störungen der Spermienvorwärtsbewegung nicht immer
eindeutig erfasst.
Ziel dieser Arbeit war es deshalb, zusätzliche und aussagekräftige Parameter zu entwickeln und zu vergleichen, die eine bessere Beurteilung der Spermaqualität und
deren Tauglichkeit für die Tiefgefrierung ermöglichen.
Als Methoden wurden die Messung der Akrosinaktivität mittels der Gelatinolyse und
die Penetration der Hengstspermien durch einen synthetischen Mukus gewählt.
5
2 Schrifttum
2.1
Morphologie der Hengstpermien
2.1.1 Allgemeines zur Morphologie
Spermien bestehen nach GÖTZE (1949) aus dem Kopf, dem Hals und dem
Schwanz, der sich wiederum in das Verbindungs-, Haupt- und Endstück unterteilen
lässt. Die Samenzelle ist entsprechend allen Säugetierzellen von einer Plasmamembran umgeben (AUSTIN 1975; GOULD et al. 1975; ZANEVELD 1975).
Nach BIELANSKI und KACSMARSKI (1979) sind Spermatozoen von Hengsten eindeutig von denen anderer Säugetiere zu unterscheiden. Sie besitzen einen ihnen
eigenen asymmetrischen Kopf, eine kleine Kopfkappe und haben einen paraxialen
Schwanzansatz. Zu entsprechenden Ergebnissen kamen bereits NICANDER und
BANE (1966) und DOTT (1975).
2.1.2 Der Spermienkopf und das Akrosom
Der Kopf enthält in seinem Kern die genetische Information in dicht gelagerter DNA.
Er ist oval (DOWSETT et al. 1984) und dorso-ventral abgeplattet (CACECI und
VARNER 1987) und besitzt eine Länge von 5 µm und eine Breite von 2,4 µm.
Das Akrosom ist die membranbegrenzte Kopfkappe mit ihrem Inhalt im apikalen Teil
des Spermienkopfes (MANN 1964; NICANDER und BANE 1966). Man unterscheidet
eine innere und äussere Akrosomenmembran mit dazwischen eingeschlossener
Akrosomenmatrix. Das Akrosom repräsentiert eine lysosomenähnliche Organelle
(ALLISON und HARTREE 1969) und wird vom Golgiapparat der Spermienzelle gebildet (DOTT und DINGLE 1968). Es besitzt eine Schlüsselfunktion bei der Penetration des Spermiums durch die äussere Eizellhülle. Die Fusion der Spermien-
6
membran mit der äusseren Akrosomenmembran bezeichnet man als Akrosomreaktion (SAACKE und MASHALL 1968). Die Akrosomenmatrix enthält eine Vielzahl
hydrolytischer Enzyme, die für die Lysis der äusseren Eizellmembran benötigt werden. Der Ablauf der Akrosomreaktion ist die Voraussetzung für die Penetration und
Fertilisation der Eizelle (AUSTIN 1975).
Aufgrund der wichtigen Funktion der akrosomalen Enzyme bei der Penetration der
Eihülle durch die Spermien und aufgrund der Tatsache, dass das Akrosom bei zellschädigenden Einflüssen meist zuerst und am stärksten betroffen wird, ist der
Nachweis von Akrosomenschädigungen eines der wichtigsten Kriterien der Vitalitätsbeurteilung von Spermien. Methoden dafür sind z.B. die morphologische Beurteilung des Akrosomenzustandes (SAACKE und WHITE 1972), die zytochemische Erfassung der Akrosin-Aktivität oder die Messung der Hyaluronidase-Aktivität
(HOLZMANN und STAHL 1978).
2.1.3 Zusammenhang zwischen Akrosomintegrität/Motilität und Fertilität
Für die Beurteilung der Samenqualität und der Vorhersage der zu erwartenden
Fruchtbarkeit werden üblicherweise die Kriterien „prozentualer Anteil vorwärtsbeweglicher Spermien“ sowie „prozentualer Anteil morphologisch veränderter Spermienformen“ herangezogen. In der Routinepraxis wird in der Regel ausschliesslich die
Motilität als Parameter für die Samenbeurteilung betrachtet und die Morphologie erst
beim Auftreten von Konzeptionsproblemen genauer untersucht.
AMANN (1989) bezweifelte, dass sich die Vorhersage der Fruchtbarkeit mit diesen
derzeit angewendeten Untersuchungsverfahren sicher treffen lässt.
Bereits 1968 stellten SAACKE und MARSHALL fest, dass motile Bullenspermien
immer durch ein intaktes Akrosom charakterisiert sind. Sie fanden heraus, dass ein
defektes Spermium zwar eine Befruchtung einleiten kann, gleichzeitig aber durch die
Auslösung der Zonareaktion unveränderte, intakte Spermien von der Befruchtung
ausschliesst und somit für die Subfertilität verantwortlich ist.
VAN DUIJN und HENDRIKSE (1968) fanden hingegen eine signifikante Korrelation
zwischen dem Anteil morphologisch abweichender Samenzellen im Hengstejakulat
und der Fertilität. In späteren Versuchen ergab sich dann zusätzlich eine Korrelation
7
zwischen der Motilität und dem Anteil morphologisch intakter Spermien (VAN DUIJN
1971) .
Anhand von Untersuchungen an Bullenspermien bestätigten SAACKE und WHITE
(1972), dass die Subfertilität bzw. Sterilität auf Abnormalitäten im Bereich des Akrosoms zurückzuführen ist. Sie stellten in einem gross angelegten Besamungsversuch
fest, dass die Fertilität mit der Akrosomintegrität enger korreliert ist als mit der Motilität.
PURSEL et al. (1972) untersuchten an Ebersperma unter Verwendung zweier verschiedener Verdünner, A und B, die Motilität und die Morphologie. Bei beiden war
die Motilitätsrate hoch (A: 72%, B: 79%), aber bei der Betrachtung der Morphologie
zeigte Verdünner B keine normalen Akrosomen, während A 86 % normale Akrosomen aufwies. Die anschliessende Insemination erbrachte bei Verdünner B keine
Konzeption, und daraus schlossen die Autoren eine enge Korrelation zwischen
Akrosomintegrität und Fertilität. Damit bestätigten PURSEL et al. (1972) die Untersuchungen von SAACKE und WHITE (1972) und wurden später von MARSHALL
und FREY (1976), PACE et al. (1981) und SAACKE (1982) unterstützt.
2.2
Biochemischer Aufbau des Spermienkopfes
2.2.1 Akrosin
Erstmals beobachtete JAMANE (1930) die proteolytische Aktivität von Spermien. Er
erkannte, dass der proteolytische Effekt von Spermien auf das Ovum dem des
Pankreatin entsprach. 1966 beschrieben WALDSCHMIDT, HOFFMANN und KARG
eine an die Spermienmembran gebundene, trypsinähnliche Enzymaktivität beim
Rind, die sie im Hinblick auf ihre Bedeutung für den Befruchtungsprozess diskutieren. Dem Enzym kommt bei dem Befruchtungsvorgang eine grosse Bedeutung bei
der Auflösung und somit Penetration der Zona pellucida der Eizellen zu
(STAMBAUGH und BUCKLEY 1968).
Weiterführende Untersuchungen an Spermien von Säugern, Vögeln, Amphibien und
Seeigeln von SCHLEUNING und FRITZ (1975) sowie MÜLLER-ESTERL et al.
8
(1983) liessen vermuten, dass dieses trypsinähnliche Enzym für die Auflösung der
Zona pellucida während der Befruchtung verantwortlich ist. Es baut Glykoproteine
der Zona pellucida ab, indem es Peptidbindungen angreift, deren Carboxylgruppen
dem Arginin oder dem Lysin entstammen (NEHRING 1989). Für das eindringende
Spermium ist die Zona pellucida der Eizelle die eigentliche Barriere. Sie hat eine
Schichtdicke von 5 bis 10 µm und besteht aus Mucoprotein.
Nach einem Vorschlag von ZANEVELD bekam das die Zona pellucida auflösende
Enzym den Namen Akrosin (MÜLLER-ESTERL und FRITZ, 1981).
Die akrosomalen Enzyme sind Lysosomenabkömmlinge bzw. haben lysosomale
Strukturen. Es wurden zahlreiche unterschiedliche Enzyme nachgewiesen, wie beispielsweise saure Phosphatase, Spermienneuraminidase, Phospolipasen, Ribonuclease, Desoxyribonuclease, Hyaluronidase, Corona-Penetrating-Enzyme, Arylsulfatase und Akrosin (Übersicht bei: MANN und LUTWAK-MANN 1981). Unter ihnen
kommt dem Akrosin als spermienspezifischer Protease bzw. ihrer Vorstufe, dem
Proakrosin, eine herausragende Bedeutung zu (HARRISON 1983; MANN und
LUTWAK-MANN 1981; MATOUSEK 1985; McRORIE und WILLIAMS 1974;
MORTON 1977; PARRISH und POLAKOSKI 1979; STAMBOUGH 1978).
Es liegt in den intakten, nicht kapazitierten Ejakulatspermien in seiner inaktiven Vorstufe als Proakrosin vor. Mit grosser Wahrscheinlichkeit ist diese Vorstufe an die innere akrosomale Membran gebunden. Sie hat eine Molekularmasse von ca. 55.000.
Es können aber auch verschiedene Formen innerhalb einer Spezies vorkommen.
Die Umwandlung des Proakrosins in Akrosin, bzw. seine Aktivierung erfolgen normalerweise erst im Ergebnis der Kapazitation während der Akrosomreaktion. Die Reaktion ist pH-abhängig, in vitro verläuft sie zwischen pH 6 und 9 und autokatalytisch.
Sie erfolgt unter Abspaltung von Peptiden in mehreren Stufen, so dass eine α-, βund eine γ- Form des Akrosins existieren. Die Molekularmassen liegen zwischen
49.000 und 25.000. Das β-Akrosin ist die eigentliche aktive Form des Enzyms. Es
liegt in vivo frei vor und ist im neutralen Bereich relativ stabil (MANN und LUTVAKMANN 1981).
HARTMANN und GWATKIN (1971) beschreiben eine Beteiligung des Akrosins am
Polyspermieblock, indem das freigesetzte Akrosin mit kortikalen Granula der Eizelle
reagiert und so einen enzymatischen Mechanismus in Gang setzt, der das Eindringen weiterer Spermien in die Eizelle verhindert.
Eine weitere zelluläre Funktion ist die Beeinflussung des Kinin-Kallikrein-Systems,
das an der Regulation der Spermienmotilität beteiligt ist (NEHRING 1989). Das
9
Akrosin bewirkt, entsprechend Trypsin, Plasmin, Papain, aufgrund kininogenaseähnlicher Eigenschaft die Umwandlung von Kininogen in Kinin, ein Polypeptid. Kinine
bewirken über das Prostaglandin- und Adenylatcyclase-System eine Erweiterung von
Gefässen, eine Erhöhung der Kapillarpermeabilität und eine Kontraktion der Uterusmuskulatur (HARPER et al. 1975). Damit ist das Akrosin auch für den Samentransport im weiblichen Genitaltrakt mitverantwortlich (VIEIRA 1980).
Auch GRASSL und SCHILL (1980) erwähnen eine Beteiligung an der Penetration
der Spermatozoen durch den Zervikalmukus der Frau. Aus untergegangenen „Pionier“-Samenzellen spaltet das freiwerdene Akrosin Lysin- bzw. Argininverbindungen
des Zervikalschleims ab und bewirkt so eine Viskositätserniedrigung.
Nach Penetration der Eihülle ist Akrosin wahrscheinlich auch an der Dekondensation
des Chromatins beteiligt (NEHRING 1989).
Als weitere Aufgaben des Enzyms werden die Induktion der Akrosomreaktion und
die Beteiligung am Kapazitationsprozess vermutet (MANN und LUTVAK-MANN
1981).
Neben den verschiedenen Formen des Proakrosins und Akrosins müssen weiterhin
die natürlich vorkommenden Akrosininhibitoren zum Akrosinsystem gezählt werden.
Sie entstammen vorrangig dem Seminalplasma und der Nebenhodenflüssigkeit und
weisen eine hohe Affinität für Akrosin auf. Sie sind sehr fest an die Spermienoberfläche gebunden, können die Zellmembran aber nicht permeieren. Es wird aber auch
ein intrazellulärer Akrosininhibitor beschrieben (HARRISON 1983). Die Inhibitoren
bilden in vitro mit Akrosin einen Protease-Inhibitor-Komplex. Die biologische Funktion
der Inhibitoren ist noch nicht vollständig aufgeklärt. Eine wichtige Aufgabe ist die
Hemmung von Akrosin, das aus geschädigten Spermien freigesetzt wurde und proteolytische Prozesse auslösen könnte.
Während der Spermienkapazitation kommt es zu Veränderungen an der Oberfläche
der Spermien und zu einer Ablösung der Inhibitoren. Das ist eine Voraussetzung dafür, dass das Akrosin wirksam werden kann.
Die Akrosininhibitoren sind Proteine mit einer Molekularmasse zwischen 6.000 und
9.500. Es existieren mehrere Formen, die sich aufgrund physikochemischer Parameter und tierartspezifischer Einflüsse unterscheiden (CECHOVA und JANAKOVA
1979a/b; JANAKOVA und CECHOVA 1985; MATOUSEK 1985; VESELSKY et al.
1985; ZELESNA 1980).
10
2.2.2 Akrosomreaktion
Auslöser für die Akrosomreaktion ist vermutlich die Bindung von Progesteron an Rezeptoren der Spermienplasmamembran (CHENG et al. 1998). In vitro lässt sich die
Akrosomreaktion durch Heparin und das Calcium-Ionophor A23187 induzieren
(CHRISTENSEN et al. 1996, BLOTTNER et al. 1998).
Bei der Akrosomenreaktion kommt es zur Bildung multipler Fusionsstellen zwischen
äusserer Akrosomenmembran und der Plasmamembran; es entstehen membrangebundene Vesikel (VARNER et al. 1987). Auf der akrosomalen Oberfläche entstehen
Poren, durch die die akrosomale Substanz ausströmen kann (BEDFORD 1970,
AUSTIN 1975).
BEDFORD (1970) unterscheidet von dieser „tatsächlichen“ Akrosomreaktion eine
„falsche“. Hierbei kommt es nicht zur Verschmelzung der beiden Membranen, sondern es kommt zum Aufbrechen des Akrosoms von der Spitze her. In der Literatur
wird dies als Zeichen auftretender Zelldegeneration angesehen und sowohl in vivo
als auch in vitro beobachtet. Diese Erscheinung geht in den meisten Fällen mit dem
Tod der Zelle einher, während die „tatsächliche“ Akrosomreaktion ein Überleben der
Samenzelle erlaubt (AUSTIN 1975).
Die Akrosomreaktion lässt sich seit kurzem auch durchflusszytometrisch darstellen.
Nach Markierung von Bullen- und Hengstspermien mit einem fluoreszierenden Agglutinin zeigte sich vor der Akrosomreaktion eine Fluoreszenzreaktion am gesamten
Spermienkopf, aber nach der Akrosomreaktion war die Fluoreszenz nur am
äquatorialen Segment des Spermienkopfes vorhanden (BLOTTNER et al. 1998).
2.3
Methoden zum Nachweis von Akrosomenschäden
Aufgrund der Tatsache, dass das Akrosom bei zellschädigenden Einflüssen meist
zuerst und am stärksten betroffen wird, ist der Nachweis von Akrosomenschädigungen eines der wichtigsten Kriterien der Vitalitätsbeurteilung von Spermien.
11
Veränderungen der Akrosomenstruktur sind bei Eber und Bulle als Ursache von
Subfertilität bekannt (KRAUSE 1966, SAACKE und WHITE 1972).
Zum Nachweis von Akrosomenschäden stehen verschiedene Methoden zur Verfügung, die im Folgenden beschrieben werden.
2.3.1 Morphologische Beurteilung des Akrosomenzustandes
Die morphologische Beurteilung des Akrosomenzustandes erfolgte zunächst mit Hilfe verschiedener Färbemethoden z.B. der Kopfkappenfärbung nach KARRAS
(1950). In der Modifikation dieser Färbung nach KÖRDEL (1959) werden Spermienausstriche mit Viktoriablau-Lösung behandelt, und die Kopfkappen stellen sich im
Durchlichtmikroskop als dunkelblauer Spermienüberzug dar.
Mittels Giemsafärbung werden die Spermienkappen deutlich dunkelrot gefärbt, während der apikale Rand hell abgesetzt ist (MANN und LUTWAK-MANN 1981).
Die Triple-Färbung mit Bismarck-Braun, Bengal-Rosa und Trypan-Blau umfasst
gleichzeitig eine „Lebend-Tot-Färbung“ (d. h. die Unterscheidung zwischen lebenden
und toten Spermien), eine Färbung der Postakrosomalregion und des Akrosoms
(TALBOT und CHACON 1981).
Die Elektronenmikroskopie erlaubt eine direkte Beurteilung der Spermienmorphologie. Es lassen sich nicht nur intakte von geschädigten Akrosomen unterscheiden. Da
der apikale Rand des Akrosoms sich im Verlauf von Alterungsvorgängen oder der
Gefrier- und Auftaubelastung verändert, ist auch eine graduelle Klassifizierung der
Schäden möglich, die mit Schwellungen des apikalen Wulstes beginnen und über
partielle Ablösungsvorgänge bis hin zur völligen Ablösung des äusseren Akrosoms
reichen. Das Äquatorialsegment bleibt auch bei hochgradig geschädigten Akrosomen am Spermienkopf (BLACH et al. 1989, WEITZE 1977).
Die Anwendung der Immunfluoreszenz bietet eine weitere Möglichkeit der Akrosomdarstellung. Ein ausschliesslich auf die Akrosomenkappe beschränkte Fluoreszenz
wurde bei Ebern, Kaninchen, Hamstern, Ratte und Maus sowie humanem Sperma
beobachtet (TÖPFER-PETERSEN et al. 1983). Die Markierung mit Fluoreszenzmar-
12
kern erlaubt auch eine Auszählung der Anzahl intakter Spermien mit Hilfe der Durchflusszytometrie (BLOTTNER et al. 1998).
2.3.2 Messung der Hyaluronidaseaktivität
Die Hyaluronidase gehört zu den sogenannten Penetrationsenzymen, die im Akrosom lokalisiert sind und bei der Spermienpenetration die Eihülle enzymatisch auflösen. Ihre Aufgabe ist es, die Zwischenzellschicht des Cumulus oophorus zu zersetzen (ZANEVELD et al. 1973). Die Zunahme der Hyaluronidase-Aktivität im Seminalplasma weist auf Schädigungen des Akrosoms hin. Ihre Bestimmung erfolgt durch
einen Farbtest, der auf dem Abbau von Hyaluronsäure durch Hyaluronidasen beruht.
Hierbei werden anfärbbare Acetylglucosamin-Endgruppen freigesetzt (HOLZMANN
und STAHL 1978).
2.3.3 Biochemische oder histochemische Messung der Akrosinaktivität
Zu den histochemischen Methoden zur Messung der Akrosinaktivität gehört der
Nachweis der intrazellulären Phosphatasen, deren Aktivität eng mit der Spermienmotilität korreliert ist (KRAUSE (1966). Es werden Spaltprodukte, die bei der Hydrolyse
von Phosphorsäureestern auftreten mit geeigneten Färbemethoden nachgewiesen.
Da die Methode sehr arbeits- und zeitintensiv ist und Fehler durch Kontamination mit
im Seminalplasma enthaltenen Phosphatasen auftreten, wird sie nicht routinemässig
durchgeführt.
SCHILL et al. (1990) bestimmen die Aktivität des nicht-zymogenen Akrosins in
menschlichem Sperma durch Essigsäure-Fällung aus einem Spermapellet und dem
umgebenden Suspensionsmedium vor und nach dem Schockgefrieren. Die Freisetzung von Akrosin aus dem Akrosom durch die Vorbehandlung sieht er als sensitiven
biochemischen Marker, um die akrosomale Membranstabilität zu charakterisieren.
13
Mittels enzymatischer Methoden kann die totale Akrosinaktivität, d.h. das aktive
Akrosin plus das Akrosin, das aus Proakrosin gebildet wurde, indirekt bestimmt werden. Die zu untersuchende Spermaprobe wird hierbei mit einer Amidase-Lösung bekannter hydrolytischer Aktivität inkubiert. Unter Berücksichtigung der Spermienzahl
kann durch Vergleich der optischen Dichte der Probe mit derjenigen der AmidaseLösung die Gesamt-Akrosinaktivität berechnet werden (KENNEDY et al. 1989,
TUMMON et al. 1991).
Auch die Bestimmung der Akrosinaktivität mittels Gelatinolyse stellt eine histochemische Methode dar. Da sie in der vorliegenden Untersuchung eingesetzt wird, wird sie
im Folgenden ausführlicher vorgestellt.
2.3.4 Messung der Akrosinaktivität mittels Gelatinolyse
Unter dem Begriff „Gelatinolyse“ versteht man einen Vorgang, bei dem Spermien auf
einen Gelatinefilm gelegt werden und das austretende Akrosin das Substrat in der
Umgebung des Spermienkopfes spaltet. Die gelatinolytische Messung der Akrosinaktivität ist ein histochemisches Verfahren. GADDUM und BLANDAU (1970) verwendeten als erste eine Methode, bei der sie auf einen Objektträger eine dünn ausgestrichene Gelatinemembran aufbrachten, diese mit Tusche anfärbten und mit Glutaraldehyd fixierten. Auf diese so vorbereiteten Objektträger brachten sie Spermiensuspensionen mit Hank´s-Lösung von Mensch, Kaninchen, Schwein, Meerschwein,
Hamster, Ratte und Mäusen auf. Mit einem Deckglas und Vaseline abgedichtet wurden die Ausstriche bei 37° C inkubiert. Das aus den Akrosomen austretende und von
den Autoren als „Zonalysin“ bezeichnete Akrosin, führte in der Umgebung der Spermienköpfe zu hellen, lichtdurchlässigen, kreisförmigen Lysisflächen, die sich im Phasenkontrastmikroskop deutlich vom dunklen Hintergrund absetzten. Diese hellen Zonen wurden von GADDUM und BLANDAU (1970) als „Halos“ bezeichnet. In ihren
Versuchen unterschieden sich die Spermien der einzelnen Tierarten im Reaktionsbeginn: Kaninchen- , Bullen- und Menschenspermien reagierten nach wenigen Minuten, Meerschweinchen- und Hamsterspermien erst nach einer Stunde. Innerhalb der
Spezies waren die Variationen in bezug auf die Lysiskreisfläche : Präparat überraschend gross, doch eine Erklärung wurde dazu nicht abgegeben.
14
Bei späteren Versuchen liessen GADDUM-ROSSE und BLANDAU (1972) die Tusche als Farbstoff weg und konnten auch Aussagen über die Spermienmorphologie
erhalten. In bezug auf die Halobildung ergaben sich bei den einzelnen Tierarten Unterschiede:
Bei Kaninchen- und Bullenspermien beginnt die Lysisbildung im Bereich des Äquatorialsegments, wobei bei den Bullenspermien das Akrosin den Spermienkopf nicht
symmetrisch verlässt, sondern in der Regel nur von einer Seite aus in die Umgebung
diffundiert (WENDT 1974). Der vordere Kopfteil mit seinem Apikal- und Hauptsegment zeigt dabei nur eine Randschwellung und beteiligt sich erst gegen Ende der
Gelatinolyse an der Reaktion. Ähnlich verhalten sich Spermien von Hamster und
Mensch. Ratten- und Mäusespermien hingegen bilden nur an einer Seite ihres hakenförmigen Kopfes eine Lysiszone (GADDUM-ROSSE und BLANDAU, 1972).
Die proteolytische Leistung von Samenzellen wurde durch die Ermittlung des Halodurchmessers im Phasenkontrastmikroskop erfasst (GADDUM und BLANDAU 1970,
GADDUM-ROSSE und BLANDAU 1972).
PENN et al. (1972) verwendeten autoradiographische Filmplatten (Kodak-AR-10) als
Gelatinesubstrat, um die Methodik zu vereinfachen. Die Gelatineschicht ist auf den
Filmplatten gleichmässig verteilt. Nach Belichtung und Fixierung des Films wurden
einzelne Streifen in einer Grösse von 20 x 25 mm2 aus den emulsionsbeschichteten
Platten herausgeschnitten, in ein Wasserbad getaucht, auf Objektträger gezogen
und getrocknet. Hank´s Lösung (pH 7,5) wurde als Spermienpuffer verwendet. Nach
dem Auftragen der Spermiensuspension auf die vorbereiteten Objektträger wurden
diese in einer feuchten Kammer bei 37° C inkubiert. Bei diesem Verfahren erscheinen die Halos ebenfalls als helle Höfe um die Spermienköpfe auf braunem Untergrund. Die Bestimmung der Halodurchmesser erfolgte auch hier mit einem Phasenkontrastmikroskop mit Okularmikrometer. PENN et al. beobachteten, dass die Halobildung in einem pH-Bereich von 5,5 - 7,6 am ausgeprägtesten war, während sie
beim pH-Bereich von 3,2 - 5,5 um 20% und über pH 9,6 um 25% geringer war. Unter pH 3,2 kam es zu keiner Lysis. Weiterhin erkannten sie, dass kein Unterschied
zwischen den mittleren Lysisflächen unbehandelter und mit physiologischer NaClLösung gewaschener Rinderspermien festzustellen war.
An Humanspermien verschiedener Patientengruppen untersuchte TÖRÖK (1973)
nach dem gleichen Verfahren wie PENN et al. (1972) die Halobildung bei Oligo-, Astheno-, Terato- und Normospermie. Er stellte fest, dass es bei den pathologischen
Spermienbildungen zu keinen oder zu deutlich geringeren Lysisbildungen kommt.
Zusätzlich seien auch Leukozyten zur Halobildung befähigt.
15
1974 modifizierte WENDT die Methode von PENN et al. (1972), indem er für die
Suspension der Spermien einen Tris-Puffer mit pH 6,9 verwendete, die Spermien mit
einem Glasstab auf die vorbereiteten Objektträger ausrollte und die feuchte Kammer
auf eine relative Luftfeuchtigkeit von 94% mit wasserdampfgesättigter Pressluft einstellte. Für die Auswertung der Halodurchmesser verwendete er ein einfaches Lichtmikroskop mit Okularmikrometer. Er stellte bei den Bullenspermien eine hohe Korrelation zwischen dem prozentualen Anteil lebender Spermien und der Höhe der gelatinolytisch und photometrisch gemessenen Akrosinaktivität einer Spermienpopulation
fest.
GRASSL und SCHILL (1980) fanden bei Humansperma mit dem Verfahren nach
WENDT eine deutliche Korrelation zwischen der photometrisch gemessenen und
der durch Gelatinolyse bestimmten Akrosinaktivität. Im Gegensatz zu PENN et al.
(1972) massen sie jedoch bei Vorliegen einer Oligozoospermie mit weniger als
20 Mill. Spermien/ml signifikant grössere Lysisflächen gegenüber der Normozoospermie. Sie führten diese Erscheinung auf bereits alterierte Akrosomenmembranen bei der Oligozoospermie zurück.
CARILLO (1978) untersuchte an Kaninchenspermien die Morphologie und Halobildung der einzelnen Spermien nach Verdünnung, Waschung, Sturzgefrierung, Auftauen und Tiefgefrierkonservierung bei Verwendung von Tris-Puffer und Zusatz von
Dimethylsulfoxid (DMSO). Als morphologische Parameter galten die Kriterien „normaler apikaler Rand, geschwollener apikaler Rand, Akrosom in Ablösung und abgelöstes Akrosom“. Eine Korrelation zwischen Halobildung einerseits und Morphologie,
Behandlungsart und DMSO-Gehalt des Verdünners andererseits war eindeutig. Nur
bei Spermien mit normalem und geschwollenem apikalen Rand überschritten die
Halodurchmesser 50 µm. Er konnte keinen Unterschied in der Halobildung von verdünnten und gewaschenen Spermien feststellen und bestätigte damit die Ergebnisse
von PENN et al. (1972). Bei tiefgefrorenen Spermien hing der Anteil reagierender
Spermien vom DMSO-Gehalt der Verdünnerlösung ab: Bei 1% DMSO-Zusatz betrug
er 51% und bei 9% DMSO-Zusatz nur 31,5%. Allerdings konnte CARRILLO keine
Beziehung zwischen der gelatinolytischen Aktivität und Besamungsergebnissen finden.
VIEIRA (1980) untersuchte Hengstspermien auf ihre gelatinolytische Aktivität und
verwendete ebenfalls das Verfahren von WENDT (1974) und erkannte, dass die
Zentrifugation des Spermas keinen Einfluss auf die Halobildung hat. Weiterhin verglich er zwei verschiedene Verfahren der Tiefgefrierkonservierung und deren Auswirkung auf die Halobildung und fand, dass die Lysis durch den Tiefgefrierprozess
16
nach dem Makrotübverfahren weniger beeinträchtigt wird als nach dem Pelletierverfahren.
LANG (1986) untersuchte die gelatinolytische Aktivität von aufgetauten, tiefgefrierkonservierten Bullenspermien mit interferometrischen Messungen auf selbst hergestellten Gelatineplatten. Er entwickelte zwei verschiedene Messverfahren und stellte
eine eindeutige Korrelation zwischen ihnen fest. Der Vorteil der interferometrischen
Messungen liegt in der quantitativen Erfassung auch sehr kleiner Lysiszonen.
1988 entwickelten WELKER et al. ein gelatinolytisches Messverfahren für die akrosomale Proteinaseaktivität von humanen Spermien. Es beruht im Prinzip auf dem
Verfahren von PENN et al. (1972) und stand unter dem Motto zuverlässig, kostengünstig und relativ einfach anwendbar zu sein, um es für das Routineverfahren der
Samenanalyse praktikabel zu machen. Sie untersuchten die Proteinaseaktivität an
Patientengruppen infertiler Männer und einer fertilen Kontrollgruppe. Die mittlere
Proteinaseaktivität lag bei den Infertilen signifikant unter derjenigen der Kontrollgruppe. WELKER et al. (1988) schlossen daraus, dass eine geringere Akrosinaktivität im
Zusammenhang mit Infertilität steht.
2.4
Tests zur Untersuchung der Spermatozoen-Mukus-Interaktion
Die Wechselwirkungen zwischen den männlichen Spermien und dem weiblichen
Zervikalmukus der Partnerin, der ersten Etappe des Spermientransports in vivo, ist
ein wesentlicher Teil der Infertilitätsdiagnostik (MORTIMER und LENTON 1983,
MORTIMER et al. 1986).
Die Verwendung von in-vitro-Tests ist schon lange Zeit von grossem Interesse. Der
erste in-vivo Postkoitaltest (PCT) zur Beurteilung der Interaktion von Spermien und
Zervikalmukus des Menschen wird bereits von SIMS (1866) beschrieben. Dazu wurde 12 Stunden nach Kohabitation ein Tropfen Zervixmukus entnommen und mikroskopisch auf das Vorhandensein von Spermatozoen geprüft. Rückschlüsse mittels
der Ergebnisse des PCT auf die Fertilität konnten aufgrund der fehlenden Standardisierung und der Fülle an Einflussfaktoren allerdings nicht gezogen werden.
1928 verwenden KURZROK und MILLER einen Objektträgertest („slide test“), indem
sie Mukus der Frau auf einen Objektträger ausstrichen, ein Deckglas darüberlegten
17
und einen Tropfen Samen an den Rand des Deckglases aufbrachten. Sie konnten
bereits auf diese einfache Art und Weise Aussagen über die Interaktion MukusSpermien treffen und grob quantifizieren, allerdings war es unmöglich, diesen Test
zu standardisieren.
RÜMKE (1954) und WILSON (1954) beschrieben unabhängig voneinander Agglutinationen von Spermien im Ejakulat von Männern und führten dieses Phänomen auf
das Vorhandensein von spermienagglutinierenden Antikörpern zurück. WILSON
(1954) legte in seinen Untersuchungen besonderen Wert auf die Beobachtung, dass
es bei den zu Agglutinationen neigenden Ejakulaten nur zu einer geringen Spermienpenetration und einem deutlichen Motilitätsabfall im Zervixmukus, sowohl in vivo
als auch in vitro, kam.
FJÄLLBRANT (1965, 1971) untersuchte Blutserum auf Spermienagglutinin und stellte anhand von in vitro Spermien-Penetrationstests eine negative Korrelation zwischen dem Agglutinintiter und der Penetrationstiefe, sowie der Lebensdauer der
Spermien im Mukus fest.
Dagegen stehen die Aussagen von AHLGREN (1969), der trotz hoher Spermienagglutinintiter im Blut beim Postkoitaltest eine deutliche Vorwärtsbeweglichkeit im
Zervixmukus erkannte, allerdings wurde eventuelles Spermienagglutinin im Sperma
nicht berücksichtigt.
Zur genaueren Beurteilung der Agglutinationen von Spermien im Kontakt mit Zervikalmukus entwickelten KREMER und JAGER (1976) den sogenannten SpermZervikalmukus-Kontakt-Test (SCMC – sperm-cervical mucus contact test). Beim
„KREMER-JAGER-Test“ wird auf einem Objektträger ein Tropfen Mukus und hierauf
ein kleinerer Tropfen Sperma gegeben. Durch sanftes, stetiges Andrücken des Objektträgers sollen die Medien ineinander übergehen. Nach 10 Minuten schätzt man
unter 200facher Vergrösserung den prozentualen Anteil der Spermatozoen, die ein
sogenanntes „Schüttelphänomen“ zeigen, d.h. den Anteil der Spermien, die nicht am
zervikalen Mukus kleben. Dies lässt auf das Vorhandensein von Spermaantikörpern
gegen Spermatozoen im Mukus schliessen (KREMER et al. 1977). Die Autoren beschreiben weiterhin Spermienantikörper, die auf den Spermien selbst lokalisiert sind
und zwar in der Schwanzregion. Zunächst findet eine ungehinderte Penetration in
den Mukus hinein statt, doch nach kurzer Zeit sind diese Spermien nur noch am Ort
beweglich. Es handelt sich um eine antikörperbedingte Agglutination zwischen
Spermatozoen und Glycoprotein-Mycel des Mukus. KREMER et al. (1977) stellen
darüber hinaus fest, dass lediglich Antikörper von der IgA-Klasse zu Agglutinationen
führen, die der IgG-Klasse dagegen nicht.
18
KREMER (1965) entwickelte auch einen Kapillartest zur Messung der Wanderungsstrecke der Spermien innerhalb einer bestimmten Zeiteinheit („sperm-penetrationmeter-test“ oder auch „KREMER-Test“). Mit Zervikalmukus der Frau, bzw. später
auch mit ihrem Blutserum befüllte Kapillaren verschloss er an einer Seite luftdicht mit
Paraffin und tauchte die offene Seite in das Sperma des Partners. Nach Ablauf einer
festgesetzten Zeit und Verwendung einer Messskala konnte er die Penetrationsstrecke, die Penetrationsdichte sowie die Motilitätsqualität und eventuelle Agglutinationen ablesen. Zusätzlich bot sich dadurch die Möglichkeit, durch Hinzunahme von
Spendermukus, -serum und -samen einen gekreuzten Test durchzuführen, um so
eventuelle Rückschlüsse auf Immunreaktionen zu ziehen.
Das Problem lag allerdings hierbei in der optischen Begrenzung des Systems. Die
Rundung der Kapillarwand störte das Bild der Spermien in allen Ebenen bis auf einen schmalen Bereich in der Mitte der Kapillare. So konnte die genaue Form und
Bewegung der einzelnen Spermien sowie deren Lokalisation innerhalb der Kapillarmitte nicht eindeutig bestimmt werden (KREMER und KROEKS 1975).
MILLS und KATZ (1978) modifizierten den KREMER-Test, indem sie flache Glaskapillaren mit definierter Schichtdicke und Volumen verwendeten und somit eine begrenzte Ebene für die Betrachtung der Spermien schafften. Damit wurde die Erfassung und Beurteilung jedes einzelnen Spermiums während der Mukuspenetration
möglich. Sie stellten fest, dass die Länge der Kapillare keinen Einfluss auf die Wanderungsgeschwindigkeit der Spermien hat.
Im Gegensatz dazu fanden FERNEUX et al. (1985) ebenfalls anhand des KREMERTests heraus, dass bei einigen infertilen Männern mit unauffälligem Spermiogramm
(hoher prozentualer Anteil morphologisch intakter Spermien und hohem Anteil motiler Spermien mit guter Vorwärtsbeweglichkeit), die Fähigkeit den Zervikalmukus zu
durchdringen, vollständig fehlte. Sie stellten fest, dass bei den Spermien der infertilen Männer eine höhere Schlagfrequenz der Schwänze mit geringerer Schlageffizienz vorlag.
GALLI et al. (1989) untersuchten Tiefgefriersperma von Bullen anhand eines kommerziell erhältlichen Penetrationstest-Kit auf der Basis von Rindermukus
(PENETRACR). Sie fanden heraus, dass die Messung des am weitesten gewanderten Spermiums am aussagekräftigsten ist. Weiterhin bestand eine sehr hohe Korrelation zwischen der Penetration der Spermien durch den Mukus und der vollständigen Spermiumintegrität bzw. der Akrosomenintegrität. Einen Zusammenhang zwischen Penetration und Fertilität ermittelten sie entsprechend MATOUSEK et al.
(1989) nicht.
19
Hingegen fanden MURASE et al. (1990) in ihren Untersuchungen an Bullensperma
einen signifikanten Zusammenhang zwischen der Spermienmotilität und Penetration
der Spermien im Rindermukus und der Konzeptionsrate. Die Ergebnisse liessen sie
zu dem Schluss kommen, dass der Mukuspenetrationstest eine effektive Methode
für die Vorhersage der Bullenfertilität sei.
Auch JONSSON et al. (1986) stellten anhand des gekreutzten KREMER-Tests deutliche Unterschiede zwischen Proben infertiler Paare und gesunder Spender fest. Die
kinderlosen männlichen Partner hatten wesentlich schlechtere Ergebnisse beim Penetrationsverhalten der Spermien. Damit bestätigten sie die Ergebnisse von
RECHMAN et al. (1973), INSLER et al. (1979), ALEXANDER (1981) sowie
EGGERT-KRUSE et al. (1989), die bei Humansperma zu einer deutlichen Korrelation zwischen Penetration und Fertilität kamen.
Anstelle von menschlichem Zervikalschleim wird in der Literatur zunehmend die
Verwendung von bovinem Zervikalsekret beschrieben, das von im Östrus befindlichen Tieren gewonnen wird. Rindermukus ist in seinen Eigenschaften humanem
Zervikalschleim sehr ähnlich, besonders hinsichtlich der viskoelastischen Charakteristika (LEE et al. 1977; GADDUM-ROSSE et al. 1980; ALEXANDER 1981) und ist
ohne Einfluss auf seine Eigenschaften tiefgefroren lagerfähig (LEE et al. 1981).
Dem Wunsch, einen Mukusersatz für humanes Zervikalsekret zu finden, verfolgten
auch EGGERT-KRUSE et al. (1990) mit ihren Versuchen. Sie verwendeten frisches
Hühnereiweiss und stellten es im Penetrationstest humanem Mukus gegenüber. Sie
fanden deutliche Übereinstimmungen bei fertilen Paaren sowie infertilen Paaren bezüglich der Penetrationsstrecke und dem Motilitätsgrad der Spermien. Die mittlere
Überlebensrate war im humanen Mukus allerdings wesentlich höher.
MORTIMER et al. (1990) gingen noch einen Schritt weiter, indem sie einen synthetisch hergestellten Mukus auf der Basis von Phospatpuffer mit Hyaluronsäurezusatz
entwickelten. Sie stellten ihn im Penetrationstest humanem Zervikalsekret bezüglich
Spermienvorwärtsbeweglichkeit, morphologischer Abnormalitäten und Vitalität gegenüber und fanden hoch signifikante Korrelationen zwischen diesen beiden Mukusarten.
Durch das Verwenden dieses homologen, synthetischen Mediums werden Schwankungen in der Zusammensetzung des gewonnenen humanen Sekrets und weitere
Einflussfaktoren, wie zum Beispiel eventuelle Antikörperreaktionen zwischen Spermien und Mukus, ausgeschlossen (MORTIMER 1986).
20
2.5
Tiefgefrierkonservierung von Hengstsperma
Für die Tiefgefrierkonservierung von Hengstsamen sind in der Literatur verschiedene
Verfahren entwickelt und untersucht worden. Es handelt sich zu einem grossen Teil
um Methoden, die von der Bullensperma-Gefrierkonservierung übertragen werden
sollten, sich aber nicht in der Form anwenden liessen, um zu entsprechend befriedigenden Ergebnissen zu führen. Über die Darlegung der verschiedenen Tiefgefrierverfahren und die Konfektionierungsformen verweise ich auf ZIEGLER (1991).
SMITH und POLGE (1950) stellten an Untersuchungen der Auftauraten von Samenzellen verschiedener Tierarten grosse Variationen fest. Besonders Hengstspermien
zeigten dabei besondere Schwierigkeiten. Auch NISHIKAWA (1959) bestätigte, dass
Hengstspermatozoen weniger resistent gegen tiefe Temperaturen sind als Bullenspermien.
Grundsätzlich lassen sich folgende morphologisch-histologische und biochemische
Veränderungen der Samenzelle bei der Absenkung der Temperatur feststellen:
Bei der schnellen Abkühlung des Samens von Raumtemperatur auf Werte nahe 0°C
erleiden die Spermien einen sogenannten „Kälteschock“, der durch vorzeitigen Motilitätsverlust, verminderte Energieproduktion und zunehmende Membranpermeabilität
gekennzeichnet ist (WHITE und WALES 1960; WATSON und PLUMMER 1985). Es
kommt zu Schwellungen und Ablösungen des glatten apikalen Randes des Spermienkopfes, Desintegration der Plasma- und äusseren Akrosomenmembran und
Verlust des akrosomalen Inhalts (PURSEL et al. 1972a, WATSON und PLUMMER
1985).
Die Membranen der Samenzellen, Plasmamembran, innere und äussere Akrosomenmembran, Mitochondrienmembran, stellen nach dem Fluid-Mosaik-Modell
(SINGER und NICHOLSON 1972) zähflüssige Phospholipidschichten mit integralen
Proteinen dar. Aufgrund ihrer amphipathischen Eigenschaften bilden die Phospholipide in Wasser spontan Doppelschichten, mit hydrophilen Oberflächen und hydrophobem Inneren. Die Proteine durchsetzen zum Teil als sogenannte „Tunnelproteine“ vollständig die Doppelmembranen und dienen als Bausteine für Kanäle und Poren, durch die Ionen und hydrophile Proteine die Membranen passieren können.
Darüber hinaus können sie auch Rezeptoren für andere Moleküle darstellen. Sie
müssen zur Erfüllung ihrer metabolischen Funktionen in der Membranebene frei be-
21
weglich sein und dies ist nur bei Körpertemperatur möglich, weil nur dann die Membranen die entsprechende Fluidität und Flexibilität besitzen (QUINN 1981).
Bei der Abkühlung und dem Übergang vom flüssigen in den kristallinen Zustand
kommt es zum Teil zur hexagonalen Aggregation der Phospholipide und zum Verdrängen und Anhäufen der membranständigen Proteine in Restbereiche flüssiger
Lipide. Die Struktur der Doppelmembran mit ihrer Fluidität geht verloren. Die Folge
ist eine reduzierte metabolische Funktion mit gesteigerter Permeabilität der Membran (QUINN 1985, AMANN und PICKETT 1987). Beim Wiedererwärmen bleiben
manche hexagonalen Strukturen erhalten. Dies führt nach AMANN und PICKETT
(1987) zu Störungen im Ionentransport, weil zusätzliche hydrophile Kanäle entstehen, durch die Ionen oder andere Moleküle die Membran passieren können.
WATSON und PLUMMER (1985) fanden Unterschiede in der Zusammensetzung der
Membranphospholipide bei den einzelnen Tierarten und den verschiedenen Membransystemen und stellten einen Zusammenhang zwischen der Kälteschockempfindlichkeit und der Lipidzusammensetzung der Membranen fest. Auch die höhere Resistenz der Schwanzregion gegenüber dem akrosomalen Bereich konnten sie dadurch erklären.
Man kann davon ausgehen, dass die beschriebenen Veränderungen der Membransysteme sich beim weiteren Absenken der Temperatur intensivieren (FISER und
FAIRFULL 1986, AMANN und PICKETT 1987) und somit die Schwierigkeiten beim
Tiefgefrieren stellen.
2.5.1 Überprüfung der Gefriereignung des Hengstsamens
Da bekannt ist, dass die Kryokonservierung zu einem Motilitätsverlust bei etwa 60%
der Spermien führt (COCHRAN et al. 1983, CRISTANELLI et al. 1984, KLOPPE et
al. 1988, LEMOS de OLIVEIRA 1982, LOOMIS et al, 1983, MÜLLER 1987,
ZIEGLER 1991, SPRECKELS 1994, KOHNE 1995), gilt die Feststellung der Motilitätsrate nach dem Auftauen als wichtigstes Kriterium zur Beurteilung der Gefriereignung von Hengstsperma (AMANN 1988, BLACH et al. 1989, MÜLLER 1987, VOSS
et al. 1981).
22
MÜLLER (1987) erkannte bei seinen Untersuchungen einen Zusammenhang zwischen der Samenqualität vor dem Gefrieren und der Motilität des Tiefgefrierspermas
nach dem Auftauen. Dagegen erzielten VOSS et al. (1981) nach der Versamung von
Tiefgefriersperma, das nach dem Auftauen sehr gute Motilität zeigte, keine Konzeptionen. ANDERSON et al. (1980) testeten drei Gefrierverdünner, die jeweils zu einem
hohen Prozentsatz motiler Spermien in aufgetauten Ejakulaten führten, aber im Besamungsversuch über drei Zyklen keine Trächtigkeit erzielten. Die Stuten wurden
erst nach Versamung unverdünnten Samens desselben Hengstes zu 75% tragend.
VOLKMANN (1987) ging davon aus, dass akrosomengeschädigte Spermien durchaus vorwärtsbeweglich sein können und hielt eine alleinige Motilitätsschätzung aus
diesem Grunde für eine Qualitätsbeurteilung des Samens für unzureichend. Er untersuchte 17 Ejakulate zweier Hengste auf den Prozentsatz geschädigter Akrosome
vor dem Tiefgefrieren und nach dem Auftauen und stellte im Nativsamen im Mittel
12,9%, im aufgetauten Samen 50,8% bzw. 46,7% geschädigte Kopfkappen fest.
Im Gegensatz dazu fanden BLACH et al. (1989) einen sehr viel geringeren Prozentsatz geschädigter Samenzellen nach dem Auftauen. Sie ermittelten einen mittleren
Wert von 27,5% und führten den grossen Unterschied gegenüber VOLKMANN
(1987) auf unterschiedliche Färbemethoden zurück, die ebenfalls Einfluss auf die
Akrosomenintegrität hätten. Weiterhin wiesen sie eine nur geringe Korrelation zwischen Akrosomenintegrität und Motilität. Man kann also davon ausgehen, dass viele
immotile Spermien eine intakte Kopfkappe besitzen.
Der prozentuale Anteil vorwärtsbeweglicher Spermien sollte vor dem Einfrieren über
40% (LOOMIS et al. 1983) oder besser über 50% (COCHRAN et al. 1984,,
CRISTANELLI et al. 1985) betragen, um nach dem Auftauen zu zufriedenstellenden
Inseminationsergebnissen zu führen. Übereinstimmend wird ein Minimalwert von
30% für die Gefriertauglichkeit angegeben (KLUG 1986, LOOMIS et al. 1983,
MÜLLER 1987).
Neben der Motilitätsrate nach dem Auftauen wurden versuchsweise weitere Parameter zur Überprüfung der Gefriereignung eingesetzt, wie das Ejakulatvolumen, die
Zahl der Samenzellen/Ejakulat, der Anteil formnormaler Samenzellen bzw. inaktiver
Spermien (KLUG 1986), ohne dass bisher ein „Gefriereignungsprofil“ aus allgemein
anerkannten Mindestanforderungen erstellt werden konnte. In einigen Studien wurden zusätzlich Probebesamungen vorgenommen (AMMANN 1988, MARTIN et al.
1979, TISCHNER 1979), jedoch merkt AMANN (1988) kritisch an, dass das Befruchtungsvermögen eines Hengstes in vivo nicht genau bestimmbar ist, da mit den
Spermien eines Ejakulates nur vergleichsweise wenig Stuten besamt werden können
23
und sich daher die Aufdeckung von Korrelationen zwischen Labortests und dem Befruchtungsvermögen sehr schwierig gestaltet.
Aufgrund der Erkenntnis, dass bei Nativejakulaten von Ebern durch einen osmotischen Resistenztest Voraussagen über die Verwendbarkeit zur Konservierung möglich sind (VENGUST 1983, SCHILLING und VENGUST 1984), wurden auch mit
Hengstsperma hyperosmotische Schwellungstests durchgeführt und eine Korrelation
zwischen der osmotischen Resistenz von Spermatozoen und der Tiefgefriereignung
nachgewiesen (KOHNE (1995, VIDAMENT et al. 1998).
Neueste Forschungsergebnisse lassen vermuten, dass sich auch aus der Bestimmung des Gehaltes an sogenannten CRISP-Molekülen (= cysteine-rich secretory
proteins) Aussagen zur Gefriereignung des Hengstsamens treffen lassen. Bei den
CRISP-Molekülen handelt es sich um Proteine, die durch 8 Disulfid-Brücken aus 16
Cystein-Resten charakterisiert sind und die im männlichen Genitaltrakt in Hoden,
Nebenhoden und der Ampulla nachgewiesen wurden. Konzentrationen von mehr als
18.000 Molekülen/Spermatozoon waren mit guten Konzeptions- und Abfohlergebnissen korreliert (REINEKE et al. 1999).
24
3 Material und Methoden
Ziel der Untersuchungen ist es festzustellen, ob sich der Mukuspenetrationstest und
die Bestimmung der Akrosinaktivität mittels Gelatinolyse für die Prüfung von Hengstsperma auf seine Gefriertauglichkeit eignen.
3.1
Hengste
Für die Untersuchungen standen 16 Hengste im Alter zwischen 5 und 21 Jahren zur
Verfügung. Sie wurden in zwei Gruppen eingeteilt:
Gruppe A: 1 Haflingerhengst
(Vorversuch)
2 Traberhengste
Gruppe B: 10 Warmbluthengste
(Hauptversuch)
1 Traberhengst
2 Vollbluthengste
Alle 16 Hengste wurden in der Decksaison zwischen Februar und Juni untersucht
und bis auf den Haflinger standen sie im regelmässigen Deckgeschäft.
3.2
Versuchseinteilung
An drei Hengsten wurden zunächst Vorversuche im Hinblick auf den MukusPenetrationstest unternommen (s. S. 32ff) und zusätzlich die Spermaproben vor dem
Tiefgefrieren untersucht.
25
3.3
Gewinnung der Ejakulate
Die Samengewinnung erfolgte mit der künstlichen Scheide (Modell Hannover) unter
Verwendung eines Phantoms oder einer rossenden Stute als Sprungpartner.
Von den Traberhengsten und dem Haflingerhengst der Gruppe A kamen 10 Ejakulate über eine Zeitspanne von 2 bis 10 Wochen zur Untersuchung, von den anderen
Hengsten der Gruppe B standen 1-2 Ejakulate zur Verfügung.
Die Samenuntersuchung wurde unmittelbar nach der Gewinnung im Labor durchgeführt. Die Beurteilung der Samenqualität erfolgte im wesentlichen nach der von
KRAUSE (1966) für Bullensperma beschriebenen Methode unter Verwendung eines
spermatologischen Untersuchungsprotokolls.
Das schleimige Samenblasensekret wurde - wenn vorhanden - unverzüglich nach
der Samenentnahme vom flüssigen Ejakulatanteil durch vorsichtiges Dekantieren
getrennt.
3.4
Bestimmung der Spermienmotilität
Die Ermittlung der Bewegungsaktivität erfolgte durch Schätzung des prozentualen
Anteils aller in irgendeiner Form beweglichen, der vorwärtsbeweglichen und der unbeweglichen Samenzellen.
Zu den vorwärtsbeweglichen zählen sowohl die geradeausgerichteten, als auch diejeniegen Spermien, die einen weiten Kreisbogen beschreiben, dessen Radius grösser ist als der des Sichtfeldes (NISHIKAWA 1959).
Die Beurteilung erfolgte unter Verwendung eines Phasenkontrastmikroskopes (Okular 8fach, Objektiv PH 16fach) mit auf 37°C angewärmtem Heiztisch.
Zum Vergleich der Schätzgenauigkeit wurden bei einigen Ejakulaten die Werte aus
der gleichzeitig erstellten Videomikrographie herangezogen.
26
3.5
Tiefgefrierkonservierung des Samens
Verwendete Materialien und Geräte:
Kryokonservierungsgerät:
Scientific Biological Freezer (SY-LAB)
Pailletten :
0,5 ml Midipailletten mit Verschlusskugeln, Metall (MINITÜB)
Tiefgefrierverdünner:
Modifizierter KENNEY Verdünner (BURNS, 1992):
Magermilchpulver
2,4 g
Geklärte Eigelblösung
8 ml
Na Penicillin
150.000 IE
Streptomycin
150 mg
Aqua bidest.
Glycerin
ad 100 ml
3,5 % der endgültigen Verdünnung
pH 6,8
Geklärte Eigelblösung:
25 ml Eigelb mit 25 ml Zentrifugierverdünner bei 10.000 G 15 Minuten
zentrifugieren.
Sukrose
5,0 g
Glukose
3,0 g
BSA
1,5 g
Penicillin 150.000 IE
Streptomycin 150 mg
Zentrifugierverdünner:
Aqua bidest
ad 100 ml
27
Tiefgefrierablauf:
Der Tiefgefrierverdünner wurde in grösserer Menge bereitet und in Portionen zu jeweils 10 ml in sterilen Einwegröhrchen bei -18° C gelagert. Die Haltbarkeit beträgt
bei dieser Lagerung 12 Monate.
Vor dem Verdünnen des Nativsamens wurde der Verdünner auf 37° C vortemperiert.
Von allen zur Untersuchung stehenden Ejakulaten wurden Proben tiefgefroren.
Unmittelbar nach der Gewinnung und Untersuchung der Ejakulate wurden 5 ml des
Ejakulates abgenommen und mit der gleichen Menge Tiefgefrierverdünner 1 : 1 verdünnt.
Das verdünnte Sperma wurde dann anschliessend bei Raumtemperatur 15 Minuten
belassen, um eine Anpassung an die Umgebungstemperatur und das Nährmedium
zu ermöglichen.
Vor dem Konfektionieren des Samens wurde dieser nochmals auf eventuelle Änderungen der Motilität kontrolliert. Danach erfolgte die Befüllung der Pailletten mit Hilfe
einer 5 ml Plastikspritze ohne Silikonstopfen und aufgesetzter langer Kanüle. Die
gefüllten Pailletten wurden mit einer Metallkugel manuell verschlossen.
Zum Tiefgefrieren kamen die Pailletten nun in eine zum Einfriergerät gehörende Halterung, in der sie so fixiert wurden, dass sie sich nicht berührten.
Das Einfrierprogramm verlief in vier Schritten wie folgt:
Schritt
Temperaturbereich
Abkühlrate
1
2
3
4
+ 20°C bis + 5°C
+ 5°C
+ 5°C bis - 15°C
- 15°C bis - 150°C
- 0,5°C/Minute
0°C/10 Minuten
- 10°C/Minute
- 25°C/Minute
Im Anschluss wurden die tiefgefrorenen Pailletten in einen mit flüssigem Stickstoff
gefüllten Lagerungsbehälter verbracht und bis zur weiteren Untersuchung belassen.
28
3.6
Weitergehende Untersuchungen
3.6.1 Computergesteuerte Videomikrographie
Technische Geräte:
-
Mikroskop BH-2 (Olympus) mit Hüllthermostat und Heiztisch Typ Ht100 (Minitüb)
-
Schwarz-Weiss Videokamera Typ K 15 (Siemens)
-
Videorekorder Typ DR. 80 (Panasonic)
-
VHS Videokassetten
-
Matrix-Drucker (IBM)
-
4 Zählkammern nach MAKLER (Sefi-Medical Instruments)
-
Bildanalysesystem CMA Version 4.4 (1992) (Mika Medical GmbH)
-
Personal Computer Typ AT 03 (IBM)
Messprinzip:
Die Grundlage der videomikrographischen Messungen sind Videoaufnahmen der
Ejakulate. Das einzelne Videobild besteht aus 512 Zeilen mit je 512 Bildpunkten (Pixels). Jedes Pixel ist eine Informationseinheit. Wird ein Videobild einer Ejakulataufnahme in die einzelnen Bildpunkte zerlegt (digitalisiert), werden die Spermien nur
noch als deutlich vom Bildhintergrund abgestufter Grauton sichtbar. Der Computer
erkennt diese Ansammlung grauer Bildpunkte als Spermium, wenn sie einer bestimmten Form, Grauschwelle und vorher festgelegten Grösse entsprechen.
29
Man unterscheidet zur Zellidentifizierung eine Viertelbildauswertung (jedes zweite
Pixel jeder zweiten Zeile) von einer Halbbildauswertung (jedes Pixel jeder zweiten
Zeile), je nachdem wieviele Pixel zur Zellidentifizierung herangezogen werden.
Bei einem Messvorgang werden zwischen 8 und 32 hintereinander aufgenommene
Fernsehbilder digitalisiert und anschliessend zur Verfolgung der Bewegungsbahn
von Einzelbild zu Einzelbild ausgewertet.
Vor Beginn der Messungen wurden folgende Eck- und Grenzdaten festgelegt, die für
die Spermien jeder Tierart unterschiedlich sind:
-
Grössenintervall (zur Abgrenzung anderer Objekte als Spermien)
-
Geschwindigkeitsgrenze (zur Abgrenzung immotiler, lokal beweglicher und vorwärtsbeweglicher Objekte)
-
Grauschwelle (zur Abgrenzung anderer Objekte)
-
Zeitintervall zwischen zwei aufeinanderfolgenden Bildern zur Digitalisierung
Der Computer ermittelt Daten zur Spermiengeschwindigkeit, zur Geradlinigkeit der
Bewegung, zur Motilität einschliesslich der lokalen (10-20 µm/sek) und der Ortsbewegung (>10 µm/sek) und zur Spermiendichte (Spermien/ml).
Die Geradlinigkeit der Bewegung errechnet sich durch einen Vergleich der tatsächlichen Bahn, die das Spermium zurücklegt, mit der geraden, kürzesten Strecke zwischen Anfang und Ende der aufgezeichneteten Spermienbahn. Beträgt die Länge
der geraden Bahn mehr als 80% der tatsächlichen Bahn, gilt die Bewegung als geradlinig.
Die verwendeten Zählkammern (MAKLER 1978a,b, 1980a,b) bestehen aus zwei runden, plangeschliffenen Gläsern von 30mm Durchmesser.
Die Untere, 2mm dicke, entspricht gleichzeitig dem Objektträger.
Die Obere, 1mm dicke, wird durch vier quarzbeschichtete Glasstifte in einem Abstand von 10 µm mit der Funktion eines Deckglases aufgesetzt. Der entstehende
30
Spalt hat also eine genau definierte Höhe, die es den Spermien ermöglicht sich frei
zu bewegen und trotzdem in einer fokussierten Ebene scharf abgebildet zu werden.
Das Zählkammerraster des Deckglases ermöglicht eine automatische Dichtebestimmung.
Messdurchführung
Videomikrographische Messungen erfolgten zur Erfassung der Schätzgenauigkeit
bei der Bestimmung der Motilität. Sie kamen zur Anwendung bei den Hengsten des
Vorversuchs.
Dazu wurden unmittelbar nach der Gewinnung bzw. nach dem Auftauen Videobandaufzeichnungen von den einzelnen Ejakulaten aufgenommen, die dann zu einem
späteren Zeitpunkt ausgewertet wurden.
Zur Untersuchung des Samens von Hengst 1 kamen der Nativsamen, der mit einem
modifizierten Eigelbverdünner nach KENNEY verdünnte Samen (Dichte: 3060 Mill.Spermien/ml) und der nach dem Tiefgefrieren und Lagerung von mindestens
sieben Tagen aufgetaute Samen. Von Hengst 2 und 3 stammte der aufgetaute Tiefgefriersamen.
Die Maklerkammern wurden auf 37° C vorgewärmt und dann mit 3,5 µl Sperma beschickt. Pro Ejakulat bzw. Probe wurden jeweils vier Kammern verwendet; die Bandaufzeichnungen umfassten jeweils sechs Felder mit einer Aufnahmedauer von 10
Sekunden.
Für die Messungen wurden folgende Grundparameter gewählt:
Minimale Fläche eines Objektes in Pixel:
Maximale Fläche eines Objektes in Pixel:
Anzahl der Bilder der Sequenz:
Immotile Spermien:
Lokal bewegliche Spermien:
28
200
50
10 µm/sek
30 µm/sek
Viertelbildauswertung
31
3.6.2 Mukuspenetrationstest
Verwendete Materialien:
Flache Glaskapillaren:
Schichtdicke 0,2 mm, Aussenmasse: 0,6 x 2,4 mm, Länge 100 mm
(Mikroslide-Tubes: VOGEL, Giessen)
Synthetischer Mukus:
PBB (Phosphate-buffered Baker’s medium)
Zusammensetzung (g/l) :
NaCl
KCl
KH2PO4
Na2HPO4
CaCl2 . 2H2O
MgSO4 . 7H2O
Glukose
BSA
4,991
0,298
0,150
1,790
0,074
0,247
13,515
50,0
Sterile Filtration durch 0,22 µm Membranfilter
pH 7,4, 295 . 5 mOsm/kg
In 2 ml PBB wurden dann 6 mg Hyaluronsäure (Hyaluronic acid-Sodium salt,
SIGMA) gelöst. Dieser Ansatz wurde einen Tag vor der Verwendung zubereitet, damit sich die Hyaluronsäure schonend löst.
Die Hyaluronsäuremoleküle werden durch starkes Schütteln oder Vermischen leicht
zerstört; die Viskosität der Lösung wird damit verringert.
32
Verschlusskitt:
Eine Seite der Glaskapillaren wurde nach dem Befüllen mit synthetischem Mukus mit
einem Verschlusskitt (Seal-ease, BECTON DICKINSON AND COMPANY, Rutherford) luftdicht verschlossen.
Versuchsprinzip:
Für den In-Vitro-Migrationstest wurde nach dem Prinzip von KREMER (1965) in Verbindung mit der Modifikation nach MORTIMER et al. (1990) vorgegangen.
Dabei soll, neben der durch ein Spermiogramm festgestellten Spermaqualität, ein
weiteres Qualitätsmerkmal in Form der Penetrationsfähigkeit durch den synthetischen Mukus festgestellt werden.
Der synthetische Mukus wird dazu in eine Kapillare aufgezogen, luftdicht verschlossen und bei Raumtemperatur senkrecht in ein Gefäss mit Ejakulat gestellt.
Die Spermatozoen wandern im Verlauf einer festgesetzten Zeit in dem Mukus entgegen der Schwerkraft.
KREMER verwendete für seine Versuchsdurchführung Zervikalmukus der Frau, um
die Penetrationsfähigkeit der männlichen Samenzellen festzustellen.
MORTIMER modifizierte das Verfahren insoweit, dass er zur Standadisierung synthetischen Mukus verwendete. Das oben aufgeführte Rezept enthielt allerdings 10
mg Hyaluronsäure pro ml PBB und hat damit eine deutlich höhere Viskosität. Für die
Hengstspermien ist diese Zusammensetzung ungeeignet, es erfolgt keine Wanderung.
Der Anteil an Hyaluronsäure wurde entsprechend verändert.
Nach einer festgesetzten Zeitspanne werden die Penetrationstiefe in Zentimetern
und die Penetrationsdichte der Spermatozoen in einem bestimmten Kapillarabschnitt
abgelesen.
33
Versuchsablauf:
Zur Untersuchung kamen alle zur Verfügung stehenden Ejakulate.
Bei allen Tieren wurde die Penetrationsfähigkeit im Nativsamen und nach dem Auftauen des Tiefgefrierspermas getestet. Bei den Hengsten des Vorversuches wurden
zusätzlich die vor dem Tiefgefrieren mit modifizierten Eigelbverdünner nach
KENNEY versetzten Spermaproben untersucht.
Für den synthetischen Mukus wurde PBB angesetzt und maximal zwei Wochen im
Kühlschrank aufbewahrt und verwendet. Der Hyaluronsäurezusatz erfolgte jeweils
frisch einen Tag vor der Untersuchung. Erst am Untersuchungstag wurde die Lösung
vorsichtig geschwengt, um eine Zerstörung der Hyaluronsäuremoleküle und eine
Luftbläschenbildung zu vermeiden.
Auf eine 2 ml Spritze mit Luerkonus wurde ein weicher, sehr fest abschliessender
Gummischlauch gesetzt, die Flachkapillare am anderen Ende fixiert, nun in den Hyaluronsäureansatz getaucht und unter Vermeidung von Luftbläschen gefüllt.
Eine Seite der gefüllten Kapillare wurde mit Kitt luftdicht verschlossen. Zur kurzfristigen Lagerung wurde das offene Ende bis zur Verwendung des Röhrchens in dem
Hyaluronsäureansatz belassen, um eine Austrocknung und damit Blasenbildung zu
vermeiden.
Unmittelbar nach der Gewinnung, Verdünnung und dem Auftauen des Spermas wurde 1 ml Samen in einen konisch zulaufenden Probenbecher (Penetrak, SERONO
DIAGNOSTICS, Freiburg) pipettiert.
Je Probe wurden zwei Flachkapillaren aus dem Hyaluronsäureansatz entnommen,
vorsichtig abgewischt, mit dem offenen Ende senkrecht in die Spermaprobe getaucht
und entsprechend fixiert. Die Röhrchen wurden so bei Raumtemperatur 120 Minuten
belassen.
Zum Ablesen der Ergebnisse diente ein Phasenkontrastmikroskop (Okular 8fach,
Objektiv PH 16fach).
Die Penetrationsstrecke und Penetrationsdichte wurde durch Auflegen der Flachkapillare auf einen mit einer Messskala versehenen Objektträger mit Millimetereinteilung (Penetrak, SERONO DIAGNOSTICS, Freiburg) und unter ständigem Fokussieren bestimmt.
34
Die Penetrationsstrecke wurde ermittelt, indem das am weitesten in der Kapillare
vorgedrungene Spermium aufgesucht wurde. Das Spermium musste allerdings deutliche Vorwärtsbewegung zeigen. Ab einer Wanderungsstrecke von mehr als 70 mm
wurde der Wert > 70 mm in das Protokoll aufgenommen.
Die Dichteermittlung erfolgte innerhalb festgelegter Abschnitte im vorderen und hinteren Bereich der Röhrchen, zwischen 15 und 20 mm und zwischen 50 und 55 mm.
In diesen Abschnitten wurden alle darin befindlichen Spermien mit Vorwärtsbewegung gezählt. Ab einer Dichte von mehr als 50 Spermien pro Abschnitt wurde der
Wert > 50 in das Untersuchungsprotokoll aufgenommen.
3.6.3 Akrosinbestimmung mittels Gelatinolyse
Verwendete Materialien:
Spermienpuffer:
PBS:
NaCl
Na2HPO4 . 2H2O
KH2PO4
α-D-Glukose (anhydrid)
0,6 g
1,11 g
0.058 g
8,5 g
Aqua bidest.
ad 300 ml
280 mOsmol/kg
NaCl
Na2HPO4
KH2PO4
2,0 g
1,4 g
0,023 g
Aqua bidest.
ad 1000 ml
pH 7,8
35
Versuchsprinzip:
Das im Akrosom befindliche Akrosin, ein trypsinähnliches proteolytisches Enzym,
verantwortlich für die Penetration durch die Zona pellucida des Ovums, depolymerisiert Gelatine. Um die proteolytische Aktivität des Akrosins zu messen, wird nach
dem Verfahren von WELKER et al. (1988) vorgegangen.
Dabei werden dünn mit Gelatine beschichtete Objektträger angefertigt. Die Objektträger werden in einer feuchten Kammer mit 100 % Luftfeuchtigkeit horizontal gelagert und bei 37° C zwei Stunden inkubiert.
Das Versuchsprinzip basiert auf der Messung des um den Spermienkopf aufgelösten
Gelatinebereiches. Diese klar begrenzten Lysishöfe, Halos, werden unter dem Phasenkontrastmikrokop durch ihre unterschiedliche Lichtbrechung sichtbar. Der Durchmesser der Halos und der prozentuale Anteil der Spermien mit Halobildung sind ein
Mass für die Akrosinaktivität.
Anschliessend werden die Objektträger auf Raumtemperatur gebracht. Damit wird
die Akrosinaktivität beendet und die Auswertung der Gelatineplatten kann zu einem
späteren Zeitpunkt erfolgen.
Versuchsablauf:
Zur Untersuchung kamen alle zur Verfügung stehenden Ejakulate.
Die Gelatinolyse wurde beim Nativsamen und dem aufgetauten Tiefgefriersamen
durchgeführt. Zusätzlich wurden bei den Hengsten des Vorversuchs die mit dem
Tiefgefrierverdünner nach KENNEY versetzten Spermaproben untersucht.
Herstellung der Gelatineplatten:
100 mg Gelatine (MERCK) wurden in 2 ml bidestilliertem Wasser (= 5%) im Wasserbad bei 50° C gelöst.
Nach 30 – 60 Minuten wurden 40 µl der warmen Lösung auf die Mitte eines sauberen Objektträgers unter Vermeidung von Luftbläschen aufgetragen und sofort durch
Auflegen und horizontales Auseinanderziehen eines zweiten gleichmässig verstrichen.
36
Diese beschichteten, unfixierten Objektträger wurden dann horizontal in einer feuchten Kammer mit ungefähr 60% Luftfeuchtigkeit im Kühlschrank für mindestens
18 Stunden gelagert.
Zum Fixieren wurde eine Lösung aus PBS und 0.05% Glutardialdehyd angefertigt.
Die mit Gelatine beschichteten Objektträger wurden nun zwei Minuten in diese Lösung getaucht und anschliessend zweimal für 15 Sekunden in PBS und einmal für
20 Sekunden in bidestilliertem Wasser gespült.
Die fixierten Gelatineplatten wurden vertikal in einer feuchten Kammer mit ungefähr
60% Luftfeuchtigkeit mindestens 18 Stunden und maximal eine Woche gelagert.
Die PBS-Glutardialdehyd-Lösung wurde stets frisch angesetzt und nach jeweils
36 Objektträgern gewechselt. Der PBS-Puffer wurde im Kühlschrank für maximal drei
Wochen gelagert und verwendet.
Verfahren des Akrosinaktivitätstests
Unmittelbar nach der Gewinnung, Verdünnung oder dem Auftauen des Spermas
wurde eine 10fache Verdünnung mit Spermienpuffer vorgenommen und für
10 Minuten bei 37° C inkubiert.
Gleichzeitig wurden die aus dem Kühlschrank stammenden Gelatineplatten auf
Raumtemperatur gebracht.
Für die Bestimmung der Aktivität beim Nativsamen und aufgetauten Gefriersamen
wurden jeweils sechs Platten und für den verdünnten Samen je vier angefertigt.
20 µl des mit Puffer verdünnten Samens wurde auf die Objektträger aufgebracht und
mit einem grossen Deckglas gleichmässig verstrichen, wobei darauf geachtet wurde,
dass der Druck auf den Objektträger sehr gering war, um eine Beschädigung der
Gelatineschicht zu vermeiden.
Im Anschluss wurden die Platten für 10 Minuten bei Raumtemperatur belassen, um
etwas von der Feuchtigkeit verdunsten zu lassen.
Die Inkubation der Objektträger erfolgte wiederum in einer feuchten Kammer für zwei
Stunden im Brutschrank bei 37° C. Danach wurden die Platten auf Zimmertemperatur gebracht und trocknen gelassen. Damit wurde die Akrosinaktivität beendet.
37
Auswertung der Lysiszonen
Die Auswertung erfolgte mit Hilfe eines Phasenkontrastmikroskops (Okular 8fach,
Objektive PH 16-fach und PH 40-fach) und eines Okularmikrometers. Die Skaleneinteilung des Okularmikrometers entsprach einem Umrechnungsfaktor von 3,2, das
heisst ein Teilstrich betrug 3,2 µm.
Die Bestimmung des prozentualen Anteils der Spermien mit Halobildung wurde anhand der Zählung von 100 morphologisch intakt erscheinenden Spermien pro Objektträger angegeben. Pro Probe wurden demnach 600 bzw. 400 Spermien ausgewertet.
Für die Ermittlung des Halodurchmessers wurden pro Objektträger jeweils 10 morphologisch intakt erscheinende Samenzellen mit Lysisreaktion mit Hilfe des Okularmikrometers ausgemessen, also für jede Probe 60 bzw. 40 Spermien.
3.7
Statistische Auswertung
3.7.1 Statistische Tests
Alle Auswertungen wurden mit dem Programmpaket STATISTICA (Fa. StatSoft, Inc.,
Tulsa/USA) durchgeführt.
Folgende Kennwerte wurden berechnet:
n - Anzahl der gültigen Werte
x - arithmetischer Mittelwert
Med - Median
Min - Minimum
Max - Maximum
Unteres/Oberes Quartil
s - Standardabweichung
38
Die durchgeführten statistischen Tests beziehen sich auf die Ermittlung von Zusammenhängen oder Unterschieden in abhängigen Stichproben. Ergebnis eines jeden
Tests ist die Irrtumswahrscheinlichkeit p. Je kleiner p, desto grösser ist die Wahrscheinlichkeit, dass ein postulierter Zusammenhang oder Unterschied zwischen
Stichproben tatsächlich existiert. Die für einen Test aufgestellte Nullhypothese wird
üblicherweise abgelehnt, wenn p kleiner als 0,05 (=5%) ist, d. h. das Testergebnis
wird dann als statistisch signifikant bezeichnet.
Der Zusammenhang zwischen stetigen Variablen (z.B. Zusammenhang zwischen
Vorwärtsbeweglichkeit nativ und gekühlt) wurde mittels des Spearman'schen RangKorrelationskoeffizienten R geprüft (SACHS 1997). Eine Prüfung von R auf Signifikanz erfolgt mit einem modifizierten t-Test.
Unterschiede in den Mittelwerten stetiger Variablen (z.B. Unterschied der mittleren
Vorwärtsbeweglichkeit nativ und gekühlt) wurden anhand des Wilcoxon-Tests für
Paardifferenzen geprüft (SACHS 1997).
3.7.2 Messfehleranalyse des Halodurchmessers
Die Messfehleranalyse soll Aufschluss darüber geben, wie genau die Bestimmung
eines Parameters ist, wenn sie nur aus einer Messung oder aus wenigen gemittelten
Messungen erfolgt. Dies wird hier am Beispiel des Halo–Durchmessers für die drei
Hengste des Vorversuchs durchgeführt.
Dazu werden die Differenzen zwischen einer Einzelmessung des Halodurchmessers
und dem Mittelwert weiterer Messungen berechnet. Für diese Differenzen werden
Häufigkeitsverteilungen ermittelt, aus denen hervorgeht, in welchen Grenzen ein bestimmter Prozentsatz dieser Differenzen liegt. Gleiches geschieht mit den Mittelwerten aus den Messungen eines, zweier und dreier Objektträger. Man erhält auf diese
Weise Kurven gleicher Fehlerwahrscheinlichkeit in Abhängigkeit von der Anzahl der
Halos, aus denen der Durchmesser gemittelt wurde.
39
4 Ergebnisse
4.1
Vorversuch
4.1.1 Beurteilung der Vorwärtsbeweglichkeit vor und nach der Kryokonservierung
Im Nativsperma betrug die mittlere Vorwärtsbeweglichkeit des Spermas der drei
Hengste des Vorversuchs zwischen 26,3 und 40,0%, nach dem Tiefgefrieren nur
noch 6,7 bis 34,0%. Mit Ausnahme des Hengstes 2 war die Vorwärtsbeweglichkeit
des nativen Spermas deutlich und statistisch signifikant höher als die des tiefgekühlten Spermas (Abbildung 1, S. 41).
Alle drei Hengste wiesen einen direkten Zusammenhang zwischen der Vorwärtsbeweglichkeit des nativen und des tiefgekühlten Spermas auf. Sämtliche Spearman´schen Rangkorrelationskoeffizienten R waren positiv (Tabelle 1), d.h. dass mit
zunehmender Vorwärtsbeweglichkeit des nativen Spermas auch die Vorwärtsbeweglichkeit des tiefgekühlten Spermas zunahm. Allerdings erreichte dieser Zusammenhang nur für Hengst 3 die Schwelle zur statistischen Signifikanz.
40
Tabelle 1:
Prozentsatz vorwärtsbeweglicher Spermien vor und nach dem Tiefgefrieren
bei den drei Hengsten des Vorversuches
Nativsperma
Tiefgefriersperma
WilcoxonTest
p
Spearman´scher
Rangkorrelationskoeffizient
R
p
28,9 ± 12,7
6,7 ± 5,0
< 0,01
0,36
n. s.
Hengst 2 (n = 8)
40,0 ± 5,3
34,0 ± 7,4
n. s.
0,24
n. s.
Hengst 3 (n = 8)
26,3 ± 7,4
20,0 ± 10,3
< 0,05
0,79
< 0,05
Anteil vorwärtsbeweglicher Spermien (%)
Hengst 1 (n = 9)
50
Nativsperma
40
Tiefgefriersperma
30
20
10
0
Hengst 1
Hengst 2
Hengst 3
Abbildung 1: Anteil vorwärtsbeweglicher Spermien in Nativ- und Tiefgefriersperma bei den
drei Hengsten des Vorversuchs
41
Im Vorversuch wurden die Ergebnisse des Mukuspenetrationstests an Nativ- und
verdünntem Sperma denjenigen an Tiefgefriersperma gegenübergestellt.
Im Nativsperma legten die Spermien durchschnittlich zwischen 24,5 ± 7,0 (Hengst 1)
und 67,1 ± 2,6 mm (Hengst 3) zurück. Im verdünnten Sperma waren die zurückgelegten Strecken geringfügig länger (Tabelle 2). Im Tiefgefriersperma war bei den
Hengsten 1 und 3, jedoch nicht bei Hengst 2, eine signifikante Abnahme der Penetrationsstrecken gegenüber dem Nativsperma zu verzeichnen. Gegenüber dem verdünnten Sperma fielen die Penetrationsstrecken im tiefgefroreren Sperma bei
Hengst 1 signifikant kürzer, bei Hengst 2 signifikant länger aus (Abbildung 2).
Bei Anwendung des Wilcoxon-Tests zeigten sich keine signifikanten Unterschiede
zwischen Nativ- und verdünntem Sperma (p > 0,05).
42
Tabelle 2:
Penetrationsstrecken (mm) im Mukuspenetrationstest bei den drei Hengsten
des Vorversuchs
Nativsperma
verdünntes
Sperma
Tiefgefriersperma
Hengst 1 (n = 9)
24,5 ± 7,0a
34,2 ± 17,2b
4,2 ± 11,1c
Hengst 2 (n = 8)
56,3 ± 14,1
65,6 ± 4,4d
67,1 ± 5,2e
Hengst 3 (n = 8)
67,1 ± 2,6f
69,4 ± 1,8
39,1 ± 30,3g
Wilcoxon-Test:
a : c: p < 0,01
b : c, d : e, f : g: p < 0,05
80
Nativsperma
70
Verdünntes Sperma
60
Tiefgefriersperma
mm
50
40
30
20
10
0
Hengst 1
Hengst 2
Hengst 3
Abbildung 2: Zurückgelegte Strecken im Mukuspenetrationsversuch bei den drei Hengsten
des Vorversuchs
Die Untersuchung der Zusammenhänge zwischen den unterschiedlich aufbereiteten
Spermaproben mittels Spearman´schem Rangkorrelationskoeffizienten R gibt die
folgende Tabelle 3 wieder. Alle drei Hengste wiesen einen indirekten Zusammenhang zwischen der Penetrationsstrecke des nativen und des tiefgekühlten Spermas
auf. Mit zunehmender Penetrationsstrecke im Nativsperma nahm die Strecke im tiefgekühlten Sperma ab. Allerdings war dieser Zusammenhang nur für Hengst 3 statistisch signifikant (Abbildung 3).
43
Tabelle 3:
Mukuspenetrationstest: Zusammenhänge zwischen unterschiedlich aufbereitetem Sperma bei 3 Hengsten des Vorversuches, Spearman´scher Rangkorrelationskoeffizient
Nativsperma/
Tiefgefriersperma
Nativsperma/
verdünntes Sperma
Tiefgefriersperma/
verdünntes Sperma
Hengst 1 (n = 9)
R = -0,16
n.s.
R = 0,05
p < 0,05
R = - 0,09
n.s.
Hengst 2 (n = 8)
R = -0,58
n.s.
R = 0,73
p < 0,05
R = -0,51
n.s.
Hengst 3 (n = 8)
R = -0,78
p < 0,05
R = -0,42
n.s.
R = 0,51
n.s.
80
Penetrationsstrecke TG (mm)
70
E
E
E
60
50
E
40
E
30
20
E
10
0
E
E
-10
63
64
65
66
67
68
69
Penetrationsstrecke nativ (mm)
70
71
Abbildung 3: Zusammenhang zwischen Penetrationsstrecke in Nativsperma (=nativ) und
Tiefgefriersperma (= TG) bei Hengst 3
44
4.1.3.1 Prozentualer Anteil der Spermien mit Halobildung
Auch bei der Akrosinbestimmung mittels Gelatinolyse wurden die Ergebnisse bei
Nativ- und verdünntem Sperma denjenigen von Tiefgefriersperma gegenübergestellt
(Abbildung 4). Im Nativsperma zeigten zwischen 40,2 ± 4,4% (Hengst 3) und
83,2 ± 1,2% (Hengst 2) der Spermien eine Halobildung. Die Werte im verdünnten
Sperma wichen nur geringfügig hiervon ab. Bei allen drei Hengsten war im Tiefgefriersperma der Anteil der Spermien mit Halo deutlich geringer. Mittels Wilcoxon-Test
waren diese Unterschiede bei Hengst 1 und 2 statistisch signifikant (Tabelle 4). Bei
keinem der drei Hengste bestanden zwischen Nativ- und verdünntem Sperma signifikante Unterschiede.
45
Tabelle 4:
Prozentualer Anteil der Spermien mit einer Halobildung bei den drei Hengsten
des Vorversuchs
Nativsperma
verdünntes
Sperma
Tiefgefriersperma
Hengst 1 (n = 9)
67,0 ± 11,7a
62,3 ± 12,0b
30,4 ± 18,3c
Hengst 2 (n = 8)
83,2 ± 1.2d
81,6 ± 3,8e
72,7 ± 1,6f
Hengst 3 (n = 8)
40,2 ± 4,4
42,2 ± 5,7
37,5 ± 3,5
Wilcoxon-Test:
a : c, b : c, d : f, e : f p < 0,05
100
Nativsperma
90
80
Verdünntes Sperma
Prozent
70
Tiefgefriersperma
60
50
40
30
20
10
0
Hengst 1
Hengst 2
Hengst 3
Abbildung 4: Anteil der Spermien mit Halobildung bei der Akrosinbestimmung mittels Gelatinolyse bei den drei Hengsten des Vorversuchs
46
Zur Aufdeckung der Zusammenhänge zwischen Halobildung und Art des verwendeten Spermas wurde der Spearman´sche Rangkorrelationskoeffizient R eingesetzt
(Tabelle 5). Bei keinem der drei Hengste bestand ein statistisch signifikanter Zusammenhang zwischen nativem und tiefgekühltem Sperma. Die Richtung des Zusammenhangs war zudem nicht einheitlich: bei Hengst 1 und 2 war der Korrelationskoeffizient positiv, bei Hengst 3 negativ, so dass aufgrund der vorliegenden Daten
keine Aussagen hinsichtlich eines Zusammenhangs möglich sind.
Tabelle 5:
Anteil der Spermien mit Halobildung bei der Akrosinbestimmung mittels Gelatinolyse. Zusammenhänge zwischen unterschiedlich aufbereitetem Sperma
bei 3 Hengsten des Vorversuches, Spearman´scher Rangkorrelationskoeffizient
Nativsperma/
Tiefgefriersperma
Nativsperma/
verdünntes Sperma
Tiefgefriersperma/
verdünntes Sperma
Hengst 1 (n = 9)
R = 0,21
n. s.
R = 0,75
p < 0,05
R = 0,32
n. s.
Hengst 2 (n = 8)
R = 0,31
n. s.
R = 0,51
n. s.
R = 0,06
n. s.
Hengst 3 (n = 8)
R = -0,20
n. s.
R = 0,24
n. s.
R = -0,14
n. s.
4.1.3.2 Messfehleranalyse des Halodurchmessers
Die folgenden Abbildungen zeigen den Verlauf der Fehlerperzentilen für die Bestimmung des Halodurchmessers der drei Hengste für unterschiedlich aufbereitetes bzw.
Nativ-Sperma.
Für das native Sperma des Hengstes 1 (Abbildung 5) ist bei der Bestimmung des
Halodurchmessers aus nur einer Messung mit einer Wahrscheinlichkeit von 99%
(obere Linie) ein Fehler von höchstens 11,5 µm zu erwarten. Mit 50%iger Wahrscheinlichkeit liegt der Fehler unter 2,2 µm (Linie mit ausgefüllten Quadraten) und
47
ein Fehler kleiner als 5 µm kann in etwa 80 von 100 Messungen erwartet werden
(Interpolation zwischen den Punkten 75% und 95%).
Bestimmt man den Halodurchmesser als Mittelwert aus allen 10 Messungen eines
Objektträgers, dann wird der Fehler kleiner. So ist mit einer Wahrscheinlichkeit von
99% ein Fehler kleiner als etwa 9,5 µm und mit einer Wahrscheinlichkeit von 50%
ein Fehler kleiner als etwa 1,4 µm zu erwarten, und ein Fehler von 5 µm wird mit
rund 90 %iger Wahrscheinlichkeit nicht überschritten.
Mit zunehmender Anzahl der einbezogenen Messungen gehen die Messfehler weiter
zurück.
Der Vergleich zwischen den verschiedenen Spermakonditionen des Hengstes 1
zeigt, dass sich die Grössenordnungen der Fehler für natives (Abbildung 5),
verdünntes (Abbildung 6) und tiefgefrorenes Sperma (Abbildung 7) nur geringfügig
unterscheiden.
Fehler bei der Bestimmung des Halodurchmessers (µm)
Auch die Grössenordnungen der Messfehler des Nativspermas für die Hengste 2
(Abbildung 8) und 3 (Abbildung 9) unterscheiden sich nur geringfügig. Für den
Hengst 1 sind dagegen – insbesondere im Bereich der 95%- und der 99%-Perzentile
– höhere Fehler festzustellen.
14
12
A
A
10
8
H
H
6
4
2
0
B
G
JE
1 Halo
1%
J
5%
G
25%
B
50%(Median)
C
75%
H
95%
A
99%
A
H
C
E
C
A
H
C
C
B
G
B
JE
JE
G
1 Objektträger
2 Objektträger
...bei Bestimmung aus...
B
G
JE
3 Objektträger
Abbildung 5: Hengst 1, Nativsperma. Entwicklung der Messfehler-Perzentilen in Abhängigkeit von der Anzahl der Messungen
48
24
22
20
A
18
A
16
14
12
H
A
H
E
1%
J
5%
G
25%
B
50%(Median)
C
75%
H
95%
A
99%
10
8
A
6
C
4
B
2
G
0
JE
H
H
1 Halo
C
C
B
C
B
G
JE
G
JE
1 Objektträger
2 Objektträger
B
G
JE
3 Objektträger
Abbildung 6: Hengst 1, verdünntes Sperma. Entwicklung der Messfehler-Perzentilen in Ab-
hängigkeit von der Anzahl der Messungen
14
E
1%
J
5%
G
25%
B
50%(Median)
C
75%
H
95%
A
99%
A
12
10
A
A
8
H
H
6
H
A
H
C
C
4
B
2
0
G
JE
1 Halo
C
B
G
JE
B
C
G
B
G
JE
JE
1 Objektträger
2 Objektträger
3 Objektträger
Abbildung 7: Hengst 1, Tiefgefriersperma. Entwicklung der Messfehler-Perzentilen in Abhängigkeit von der Anzahl der Messungen
49
14
12
10
8
6
A
H
E
1%
J
5%
G
25%
B
50%(Median)
C
75%
H
95%
A
99%
A
H
A
4
C
2
B
C
G
0
A
H
H
C
JE
1 Halo
B
C
B
G
G
G
JE
JE
B
1 Objektträger
2 Objektträger
JE
3 Objektträger
Abbildung 8: Hengst 2, Nativsperma. Entwicklung der Messfehler-Perzentilen in Abhängig-
keit von der Anzahl der Messungen
14
12
10
8
6
A
E
1%
J
5%
G
25%
B
50%(Median)
C
75%
H
95%
A
99%
A
H
H
A
H
A
H
C
B
G
C
B
G
C
B
G
JE
JE
4
C
2
0
B
G
JE
1 Halo
1 Objektträger
2 Objektträger
JE
3 Objektträger
Abbildung 9: Hengst 3, Nativsperma. Entwicklung der Messfehler-Perzentilen in Abhängigkeit von der Anzahl der Messungen
50
4.1.3.3 Halodurchmesser
Der Halodurchmesser bei der Bestimmung der Akrosinaktivität durch Gelatinolyse
betrug zwischen 24,6 ± 3,9 µm (Hengst 1) und 31,3 ± 3,9 µm (Hengst 2). Bei allen
drei Hengsten fiel der mittlere Durchmesser im verdünnten Sperma geringfügig grösser aus (Tabelle 6). Nach dem Tiefgefrieren waren bei den drei Hengsten grössere
Durchmesser als im Nativsperma zu verzeichnen. Gegenüber dem verdünnten
Sperma waren die Durchmesser bei Hengst 2 (p < 0,05) und Hengst 3 im Tiefgefriersperma grösser, während bei Hengst 1 eine leichte Abnahme auftrat (Abbildung 10).
Tabelle 6:
Halodurchmesser (µm) bei den drei Hengsten des Vorversuchs
Nativsperma
verdünntes
Sperma
Tiefgefriersperma
Hengst 1 (n = 9)
24,6 ± 3,9
31,6 ± 11,0
26,0 ± 6,5
Hengst 2 (n = 8)
31,3 ± 3,9
31,4 ± 3,8a
40,3 ± 7,2b
Hengst 3 (n = 8)
27,3 ± 3,8
28,4 ± 5,1
31,4 ± 4,4
Wilcoxon-Test:
a : b: p < 0,05
51
50
Nativsperma
45
40
Verdünntes Sperma
35
Tiefgefriersperma
µm
30
25
20
15
10
5
0
Hengst 1
Hengst 2
Hengst 3
Abbildung 10: Halodurchmesser bei den drei Hengsten des Vorversuchs
Mittels Spearman´schem Rangkorrelationskoeffizienten R konnten keine Zusammenhänge zwischen dem Halodurchmesser und der Art des verwendeten Spermas
nachgewiesen werden, zudem traten Wechsel zwischen positiven und negativen
Rangkorrelationskoeffizienten auf (Tabelle 7).
Tabelle 7:
Halodurchmesser bei der Akrosinbestimmung mittels Gelatinolyse. Zusammenhänge zwischen unterschiedlich aufbereitetem Sperma bei 3 Hengsten
des Vorversuches, Spearman´scher Rangkorrelationskoeffizient
Nativsperma/
Tiefgefriersperma
Nativsperma/
verdünntes Sperma
Tiefgefriersperma/
verdünntes Sperma
Hengst 1 (n = 9)
R = -0,37
n. s.
R = 0,41
n. s.
R = 0,29
n. s.
Hengst 2 (n = 8)
R = 0,03
n. s.
R = 0,43
n. s.
R = 0,43
n. s.
Hengst 3 (n = 8)
R = - 0,14
n. s.
R = 0,55
n. s.
R = -0,09
n. s.
52
4.2
Hauptversuch
4.2.1 Vorwärtsbeweglichkeit vor und nach der Kryokonservierung
Im Hauptversuch wurden 25 Ejakulate von 13 Hengsten ausgewertet. Hier betrug der
mittlere Anteil vorwärtsbeweglicher Spermien im Nativsperma 31,6 ± 10,7%. Nach
dem Tiefkühlen zeigten nur noch 19,6 ± 13,6% der Spermien eine Vorwärtsbewegung (Wilcoxon-Test, p < 0,01).
Es bestand jedoch kein Zusammenhang zwischen der Vorwärtsbeweglichkeit vor
und nach dem Tiefgefrieren (Spearman´scher Rangkorrelationskoeffizient
R = 0,26, p > 0,05).
Tabelle 8:
Prozentualer Anteil vorwärtsbeweglicher Spermien vor und nach dem Tiefgefrieren bei 25 Ejakulaten von 13 Hengsten des Hauptversuchs
Nativsperma
Tiefgefriersperma
28,9 ± 12,7a
6,7 ± 5,0b
Hauptversuch (n = 25)
Anteil vorwärtsbeweglicher Spermien (%)
Wilcoxon-Test: a : b p < 0,01
50
40
30
31,6
20
19,6
10
0
NativspermaTiefgefriersperma
Abbildung 11: Prozentualer Anteil vorwärtsbeweglicher Spermien vor und nach dem Tiefgefrieren bei 25 Ejakulaten von 13 Hengsten des Hauptversuchs
53
Im Nativsperma betrug die durchschnittliche Penetrationsstrecke 48,5 ± 20,9 mm, im
verdünnten Sperma 55,5 ± 19,3 mm (Abbildung 12). Durch das Tiefgefrieren kam es
gegenüber diesen beiden Werten zu einer statistisch signifikanten Reduzierung auf
35,5 ± 31,9 mm (Wilcoxon-Test, p < 0,001).
Tabelle 9:
Penetrationsstrecken (mm) im Mukuspenetrationstest bei 25 Ejakulaten
von 13 Hengsten des Hauptversuchs
Nativsperma
Verdünntes
Sperma
Tiefgefriersperma
48,5 ± 20,9a
55,5 ± 19,3b
35,5± 31,9c
Wilcoxon-Test: a : c, b : c p < 0,001
80
70
60
mm
50
55,5
48,5
40
35,5
30
20
10
0
Nativsperma
Verdünntes
Sperma
Tiefgefriersperma
Abbildung 12: Penetrationsstrecken im Mukuspenetrationstest bei 25 Ejakulaten
von 13 Hengsten des Hauptversuchs
54
Zwischen den Penetrationsstrecken im nativen und im Tiefgefriersperma zeigte sich
ein statistisch signifikanter Zusammenhang (R = 0,76, p < 0,001), d. h. je länger die
Penetrationsstrecken vor dem Tiefgefrieren waren, desto länger fielen sie auch nach
dem Tiefgefrieren aus (Abbildung 13).
Penetrationsstrecke TG (mm)
80
70
E
60
E
E
E
50
40
30
E
20
E
E
E
E
E
E
E
E
E
E
10
0
E
-10
25
30
35
40
45
50
55
60
Penetrationsstrecke nativ (mm)
65
70
Abbildung 13: Zusammenhang zwischen Penetrationsstrecken des nativen und tiefgefrorenenem (TG) Sperma
55
4.2.3.1 Prozentualer Anteil der Spermien mit einer Halobildung
Der prozentuale Anteil an Spermien mit einer Halobildung fiel im Nativsperma und im
verdünnten Sperma nahezu gleich gross aus (Abbildung 14). Er betrug im Nativsperma durchschnittlich 63,2 ± 19,1%, im verdünnten Sperma 63,8 ± 12,9%. Nach
dem Tiefgefrieren war der Anteil der Spermien mit Halobildung auf 45,3 ± 21,9% abgesunken (Wilcoxon-Test, p < 0,05).
Mit Hilfe des Spearman´schen Rangkorrelationskoeffizienten liess sich kein Zusammenhang zwischen dem prozentualen Anteil der Spermien mit Halobildung und der
Art des Spermas nachweisen (R = 0,24, p > 0,05).
56
Tabelle 10:
Prozentualer Anteil der Spermien mit Halobildung bei der Akrosinbestimmung
mittels Gelatinolyse bei 25 Ejakulaten von 13 Hengsten des Hauptversuchs
Nativsperma
Verdünntes
Sperma
Tiefgefriersperma
63,2 ± 19,1a
63,8 ± 12,9b
45,3 ± 21,9c
Wilcoxon-Test: a : c, b : c p < 0,05
100
90
80
Prozent
70
60
63,8
63,2
50
45,3
40
30
20
10
0
Nativsperma
Verdünntes
Sperma
Tiefgefriersperma
Abbildung 14: Prozentualer Anteil der Spermien mit Halobildung bei der Akrosinbestimmung
mittels Gelatinolyse bei 25 Ejakulaten von 13 Hengsten des Hauptversuchs
57
4.2.3.2 Halodurchmesser
Der Halodurchmesser betrug bei Spermien aus dem Nativsperma im Mittel
27,6 ± 4,6 µm, im verdünnten Sperma 30,5 ± 7,4µm (Abbildung 15). Im Tiefgefriersperma zeigte sich ein geringfügig höherer Durchmesser von durchschnittlich
31,9 ± 8,5µm. Der Unterschied zwischen dem mittleren Durchmesser im Tiefgefrierund im Nativsperma war statistisch signifikant (Wilxocon-Test, p < 0,05).
Zusammenhänge zwischen dem mittleren Halodurchmesser bei unterschiedlicher
Spermaaufbereitung bzw. Nativsperma konnten nicht nachgewiesen werden (Spearman´scher Rangkorrelationskoeffizient R = 0,27, p > 0,05).
58
Tabelle 11:
Halodurchmesser (µm) bei der Akrosinbestimmung durch Gelatinolyse bei 25
Ejakulaten von13 Hengsten des Hauptversuchs
Nativsperma
Verdünntes
Sperma
Tiefgefriersperma
27,6 ± 4,6a
30,5 ± 7,4
31,9 ± 8,5b
Wilcoxon-Test: a : b, p < 0,05
50
45
40
35
µm
30
25
27,6
31,9
30,5
20
15
10
5
0
Nativsperma
Verdünntes
Sperma
Tiefgefriersperma
Abbildung 15: Halodurchmesser (µm) bei der Akrosinbestimmung durch Gelatinolyse bei 25
Ejakulaten von13 Hengsten des Hauptversuchs
59
4.3
Statistische Analyse der Zusammenhänge zwischen
Vorwärtsbeweglichkeit und Parametern des Mukuspenetrationstests bzw.
der Akrosinbestimmung mittels Gelatinolyse bei Nativ- und
Tiefgefriersperma
Es bestand ein statistisch signifikanter und direkter Zusammenhang zwischen der
Vorwärtsbeweglichkeit und dem Anteil der Spermien mit Halobildung für Tiefgefriersperma (R = 0,73, p < 0,01). Auch für natives Sperma war dieser Zusammenhang
vorhanden (R = 0,47, p = 0,067), allerdings war hier die Schwelle zur statistischen
Signifikanz nicht ganz erreicht.
Für Tiefgefriersperma war zudem ein statistisch signifikanter Zusammenhang zwischen der Vorwärtsbeweglichkeit und der Penetrationsstrecke gegeben (R = 0,84, p
< 0,0001). Ein solcher Zusammenhang war für natives Sperma nicht nachzuweisen
(Tabelle 12).
Tabelle 12:
Statistische Analyse der Zusammenhänge zwischen Vorwärtsbeweglichkeit
und Parametern des Mukuspenetrationstests bzw. der Akrosinbestimmung
mittels Gelatinolyse bei Nativ- und Tiefgefriersperma
Nativsperma
Tiefgefriersperma
Variablenpaar
n
R
p
% vorwärtsbewegliche Spermien/
% Spermien mit Halobildung
16
0,47
n. s.
Halodurchmesser
16
-0,40
n.s.
Penetrationsstrecke
16
0,17
n.s.
% Spermien mit Halobildung
16
0,73
< 0,01
Halodurchmesser
16
0,04
n.s.
Penetrationsstrecke
16
0,84
p < 0,001
60
5 Diskussion
Die vorliegende Studie hatte zum Ziel, zu prüfen, ob sich mit Hilfe des MukusPenetrationstests und der Akrosinbestimmung mittels Gelatinolyse Aussagen über
die Tiefgefriereignung von Hengstsperma treffen lassen.
5.1
Spermienmotilität
Bisher stellt die Bestimmung der Motilitätsrate das in praxi am häufigsten verwendete
Kriterium dar, um die Eignung von Hengstsperma für die Kryokonservierung zu testen. Mit Hilfe dieser Methode lässt sich ein durch den Tiefgefriervorgang bedingter
Motilitätsverlust um etwa 60% nachweisen (COCHRAN et al. 1983, CRISTANELLI et
al. 1984, KLOPPE et al. 1988, LEMOS de OLIVEIRA 1982, LOOMIS et al, 1983,
MÜLLER 1987, ZIEGLER 1991, SPRECKELS 1994, KOHNE 1995).
In der Literatur wird als untere Grenze für die Gefriertauglichkeit ein Wert von mindestens 30% vorwärtsbeweglicher Spermien gefordert (KLUG 1986, LOOMIS et al.
1983, MÜLLER 1987). Dieser Wert wurde in der vorliegenden Untersuchung bei den
drei Hengsten des Vorsuches in einzelnen Ejakulaten unterschritten: Der mittlere
Anteil vorwärtsbeweglicher Spermien betrug vor dem Einfrieren zwischen
26,3 ± 7,4% und 40,0 ± 5,3%. Bei den 25 Ejakulaten von 13 Hengsten des Hauptversuchs zeigten durchschnittlich 31,6 ± 10,7% Spermien Vorwärtsbewegungen, so
dass die Mindestanforderungen für eine Kryokonservierung knapp erfüllt wurden.
Die vielfach in der Literatur beschriebene gefrierbedingte Reduktion der Spermienmotilität bei Hengsten (COCHRAN et al. 1983, CRISTANELLI et al. 1984, KLOPPE
et al. 1988, LEMOS de OLIVEIRA 1982, LOOMIS et al, 1983, MÜLLER 1987,
ZIEGLER 1991, SPRECKELS 1994, KOHNE 1995) konnte nachvollzogen werden.
Nach dem Auftauen betrug der Anteil vorwärtsbeweglicher Spermien bei den Hengsten des Vorversuchs nur noch zwischen 6,7 ± 5,0% und 34,0 ± 7,4%, im Hauptversuch 19,6 ± 13,6%.
61
Auch wenn die statistische Prüfung einen signifikanten Unterschied zwischen den
Werten vor und nach dem Tiefgefrieren aufzeigte (Wilcoxon-Test, p < 0,05), wurde
mittels Spearman´schem Rangkorrelationskoeffizienten kein Zusammenhang zwischen beiden Werten aufgedeckt, obwohl sich bei den Hengsten des Vorversuchs
tendenziell eine positive Wechselbeziehung andeutete. Das bedeutet, dass die bisher geübte Praxis der Beurteilung der Spermienmotilität vor dem Einfrieren nur bedingt eine Prognose über die nach dem Auftauen zu erwartende Spermienmotilität
erlaubt. Abgesehen hiervon scheint die Spermienmotilität nach dem Auftauen auch
keinen sicheren Rückschluss auf die Konzeptionsrate zu gewähren, denn beispielsweise wurde mit Sperma hoher Motilität nach dem Auftauen keine Konzeptionen erzielt (VOSS et al. 1981). Ergänzende Methoden zur Überprüfung der Gefriereignung
von Hengstsamen scheinen daher unverzichtbar zu sein.
5.2
Mukuspenetrationstest
In der Humanmedizin hat sich für eine Fruchtbarkeitsprognose bzw. Infertilitätsdiagnose der Mukus-Penetrationstest bewährt (MORTIMER und LENTON 1983,
MORTIMER et al. 1986), der auch für die Untersuchung von Tiefgefriersperma des
Bullen eingesetzt wurde (GALLI et al. 1989, MATOUSEK et al. 1989). Beide genannten Untersuchergruppen fanden allerdings keine Korrelation zwischen der Penetrationsfähigkeit des Spermas und der Fertilität, während nach den Ergebnissen von
MURASE et al. (1990) doch ein enger Zusammenhang zwischen Spermienmotilität
und Penetration der Spermien im Rindermukus einerseits und der Konzeptionsrate
andererseits besteht.
Die Entwicklung eines synthetischen Mukus-Ersatzes auf der Basis von Phosphatpuffer und Hyaluronsäure erlaubt die Verwendung des Mukus-Penetrationstests
auch für andere Spezies (MORTIMER et al. 1990). Versuche mit Hengstsperma
wurden jedoch bisher noch nicht in der Literatur beschrieben.
In der vorliegenden Untersuchung zeigte im Vorversuch Tiefgefriersperma im MukusPenetrationstest zunächst ein indifferentes Verhalten im Vergleich mit Nativ- und
verdünntem Sperma. Bei Hengst 1 und 3 waren die Penetrationsstrecken im aufgetauten Sperma signifikant kürzer, bei Hengst 2 länger. Im Hauptversuch war jedoch
bei 25 Ejakulaten von 13 Hengsten eine signifikante Reduktion der Penetrationsstre62
cke von 48,5 ± 20,9 mm (Nativsperma) bzw. 55,5 ± 19,3 mm (verdünntes Sperma)
auf 35,5 ± 31,9 mm zu verzeichnen (Wilcoxon-Test, p < 0,001). Gleichzeitig bestand
ein direkter linearer Zusammenhang zwischen der Penetrationsstrecke vor und nach
dem Auftauen (Spearman´scher Rangkorrelationskoeffizient R = 0,076, p < 0,001),
d. h. ist diese vor dem Einfrieren lang, so ist auch mit einer langen Penetrationsstrecke nach dem Auftauen zu rechnen. Im Tiefgefriersperma – nicht aber im Nativsamen – war zudem die Penetrationsstrecke positiv mit dem prozentualen Anteil vorwärtsbeweglicher Spermien korreliert. Dies bedeutet, dass die Penetrationsstrecke
im Nativsamen nicht mit der Spermienmotilität zusammenhängt und folglich einen
unabhängigen Parameter zur Beurteilung der Gefriereignung darstellt.
5.3
Akrosinbestimmung mittels Gelatinolyse
Als weitere Methode wurde in der vorliegenden Untersuchung die Bestimmung der
Akrosinsaktivität mittels Gelatinolyse gewählt. Dieses Verfahren wird in der Humanmedizin zur Infertiliätsdiagnose herangezogen (WELKER et al. 1988). Die Proteinaseaktivität der Spermatozoen ist bei infertilen Männern signifikant geringer als bei
fertilen (WELKER et al. 1988). Im veterinärmedizinischen Bereich wurde das Verfahren bisher bei Labortieren (GADDUM und BLANDAU 1970, GADDUM-ROSSE und
BLANDAU 1972, CARILLO 1978) und Bullen (GADDUM und BLANDAU 1970,
GADDUM-ROSSE und BLANDAU 1972, WENDT 1974, MATOUSEK et al. 1989)
eingesetzt.
1980 wurde die Eignung des Tests auch für die Beurteilung von Hengstsperma
nachgewiesen: VIEIRA (1980) untersuchte mit Hilfe der Gelatinolyse verschiedene
Einfrier-, Auftau- und Pelletierverfahren in Abhängigkeit von Alter und Deckfrequenz
der Hengste. Es bestanden, besonders nach langer Deckruhe, Beziehungen zwischen der Spermienmorphologie und der Akrosinaktivität (VIEIRA 1980). Im Nativsperma fand er bei 80-90% morphologisch unauffälliger Spermien eine lytische Akrosinaktivität.
In der vorliegenden Untersuchung war im Hauptversuch die Akrosinaktivität anhand
der Halobildung bei 63,2 ± 19,1% (Nativsperma) bzw. 63,8 ± 19,1% (verdünntes
Sperma) der Spermatozoen erkennbar. Der Anteil im Nativsperma war folglich deutlich geringer als der von VIEIRA (1980) ermittelte. Eine Begründung hierfür ist die
63
vermutlich von vornherein geringere Samenqualität der hier untersuchten Hengste,
die sich auch in der geringen Motilität der Spermien im Nativsperma zeigte. Wie bereits oben erwähnt, lag der Anteil der motilen Spermien im Nativsperma an der unteren Grenze der Mindestanforderungen.
Durch die Tiefgefrierung fand eine signifikante Reduktion des Anteils an Samenzellen mit Halos auf 45,3 ± 21,9% statt. Es bestand aber keine Korrelation zwischen
dem Anteil von Spermatozoen mit Lysisaktivität vor und nach dem Tiefgefrieren.
Die Prüfung des Zusammenhanges zwischen dem Anteil der vorwärtsbweglicher
Spermien und dem Anteil an Samenzellen mit Halobildung erbrachte keine Korrelation für das Nativ-, wohl aber für das Tiefgefriersperma. Diese Korrelation war positiv,
d. h. dass im aufgetauten Sperma mit zunehmendem Anteil vorwärtsbeweglicher
Spermien auch der Anteil an Spermien mit Halobildung zunahm.
Die widersprüchliche Beziehung zwischen der Spermien-Motilität und der Akrosinaktivität bei nativem und aufgetautem Sperma beruht vermutlich darauf, dass das Vorhandensein einer intakten Kopfkappe keine obligatorische Vorausaussetzung für die
Beweglichkeit eines Spermiums darstellt (SAAKE 1970). Auch BAUMGARTL (1980)
wies darauf hin, dass nicht unbedingt eine Korrelation zwischen der Motilität der Samenzellen und der Integrität ihrer Akrosome bestehen muss. Diese Befunde deuten
darauf hin, dass die Bestimmung der Akrosinaktivität mittels Gelatinolyse eine Ergänzung der Motilitätsdiagnostik darstellen kann.
Die Auswertung der Halodurchmesser erwies sich als allein wenig aussagekräftiger
Parameter für die Beurteilung der Gefriertauglichkeit von Hengstsperma. Zwar zeigte
sich bei Tiefgefriersperma eine geringgradig höhere Variabilität der Halodurchmesser
(Nativsperma 27,6 ± 4,6 µm, verdünntes Sperma 30,5 ± 7,4µm, Tiefgefriersperma
31,9 ± 8,5µm), die bereits WENDT et al. (1975) bei ihren Untersuchungen an Ebersperma aufgefallen war, jedoch waren bereits im Vorversuch die Halodurchmesser
im Tiefgefriersperma teils grösser, teils kleiner als im nativen oder verdünnten Sperma. Auch im Hauptversuch erbrachte die Auswertung von 25 Ejakulaten von 13
Hengsten keinen statistisch signifikanten Zusammenhang zwischen den Werten vor
und nach dem Tiefgefrieren. Messfehler als Ursache für eine fehlende Korrelation
können ausgeschlossen werden, da die Messfehleranalyse der Halomessungen eine
hinreichende Genauigkeit bezüglich der Anzahl der durchgeführten Messungen ergab (s. Kap. 4.1.3.2).
Hieraus folgt, dass für die Beurteilung der Gefriereignung mittels Akrosinbestimmung
die Auswertung der Halodurchmesser nicht unbedingt eine qualitative Einschätzung
64
erlaubt, sondern nur die quantitative Erfassung des Anteils von Samenzellen mit Lysishöfen. VIEIRA (1980) versuchte, durch eine Einteilung in Reaktionsklassen (keine
Akrosinaktivität, Halo = 25 µm, Halo > 25 µm) zu einer qualitativen Aussage zu gelangen, erzielte jedoch auch bei seinen zahlreichen Einzelversuchen zu verschiedenen Einfrier-, Auftau- und Pelletierverfahren in widersprüchliche Ergebnisse. Wie bei
VIEIRA (1980) war auch in der vorliegenden Untersuchung die Fallzahl untersuchter
Hengste vergleichsweise gering. Möglicherweise sind hier durch den Einsatz einer
grossen Tiergruppe noch Verbesserungen hinsichtlich einer Aussage zur Samenqualität möglich. Da sich die Akrosinbestimmung mittels Gelatinolyse prinzipiell als eine
geeignete Methode erwies, um Unterschiede zwischen Nativ-, verdünntem und Tiefgefriersperma aufzuzeigen, erscheint die Durchführung einer umfangreichereren
Testreihe sinnvoll.
Zusammenfassend lassen sich durch die Messung der Penetrationsstrecke beim
Mukuspenetrationstest Unterschiede zwischen Nativ- und Tiefgefriersperma aufdecken. Es besteht ein linearer Zusammenhang zwischen den Penetrationsstrecken
vor und nach dem Auftauen. Die Länge der Penetrationsstrecke weist keinen Zusammenhang mit der Spermienmotilität auf und stellt folglich einen unabhängigen
Parameter zur Beurteilung der Tiefgefriereignung dar.
Mittels Gelatinolyse lässt sich eine Reduktion des Anteils lysisaktiver Spermien nach
dem Tiefgefrieren nachweisen. Im aufgetauten Sperma ist der Anteil vorwärtsbeweglicher Spermien positiv mit dem Anteil an Spermien mit Halobildung korreliert. Dieses
Ergebnis deutet darauf hin, dass das Vorhandensein einer intakten Kopfkappe keine
obligatorische Voraussetzung für die Spermienbeweglichkeit darstellt.
Die alleinige Auswertung des Halodurchmesser ist für die Beurteilung der Gefriertauglichkeit nicht geeignet.
65
6 Zusammenfassung
Die alleinige Beurteilung der Spermienmotilität lässt keine sichere Prognose hinsichtlich der Befruchtungsfähigkeit von Hengstsperma zu. In der vorliegenden Untersuchung sollte daher die Eignung des Mukuspenetrationstests und der Bestimmung
der Akrosinaktivität mittels Gelatinolyse für die Prüfung der Gefriertauglichkeit von
Hengstsperma untersucht werden. In einem Vorversuch an drei Hengsten erwies
sich die Durchführbarkeit beider Testverfahren.
Im Hauptversuch wurden 25 Ejakulate von 13 Hengsten (10 Warmblut, 2 Vollblut, 1
Traber) im Alter von 5 bis 21 Jahren untersucht. Das Nativsperma der Hengste zeigte einen durchschnittlichen Anteil von 31,6 ± 10,7% vorwärtsbeweglicher Spermien,
der nach dem Tiefgefrieren auf 19,6 ± 13,6% abgesunken war. Der Unterschied zwischen beiden Werten war statistisch signifikant (p < 0,05), es bestand aber kein Zusammenhang zwischen der Motilität vor und nach der Kryokonservierung.
Mit Hilfe des Mukuspenetrationstests wurde eine signifikante Reduktion der Penetrationsstrecke durch das Tiefgefrieren nachgewiesen (Nativsperma: 48,5 ± 20,9 mm,
verdünntes Sperma: 55,5 ± 19,3 mm, Tiefgefriersperma: 35,5 ± 31,9 mm, p < 0,001).
Die Werte vor und nach dem Gefrieren waren zudem positiv miteinander korreliert (R
= 0,076, p < 0,001). Zum prozentualen Anteil vorwärtsbeweglicher Spermien bestand
eine positive Korrelation lediglich für das Tiefgefriersperma.
Auch mittels der Akrosinbestimmung durch Gelatinolyse wurden signifikante Unterschiede zwischen Nativ- bzw. verdünntem Sperma und Tiefgefriersperma aufgezeigt.
Der Anteil an Spermatozoen, die eine Lysisaktivität zeigten, betrug im Nativsperma
63,2 ± 19,1%, im verdünnten Sperma 63,8 ± 19,1% und im aufgetauten Sperma
45,3 ± 21,9%. Es bestand keine Korrelation zwischen den Werten vor und nach dem
Tiefgefrieren. Im Vergleich mit der Motilitätsprüfung zeigte sich lediglich für das aufgetaute Sperma eine positive Korrelation. Die Messungen des Halodurchmessers
ergaben weder Wechselbeziehungen zwischen den Werten vor und nach dem Tiefgefrieren noch zur Spermienmotilität.
Zusammenfassend konnte sowohl die Messung der Penetrationsstrecke beim Mukuspenetrationstest als auch die Bestimmung des Anteils lysisaktiver Spermatozoen
mittels Gelatinolyse Unterschiede zwischen Nativ- und Tiefgefriersperma aufdecken.
Diese Verfahren eignen sich folglich für die Prüfung der Gefriertauglichkeit von
Hengstsperma. Zur Festlegung von standardisierten Mindestanforderungen an ge66
friergeeignetes Hengstsperma sind weitere Testreihen mit grösseren Tierzahlen
sinnvoll.
67
7 Summary
von Stern, Katharina (2001): Suitability of function tests for the prediction of the fertility of cryopreserved stallion semen
Sperm motility is an insufficient parameter to predict the fertility of stallion semen.
Therefore, we examined the suitablity of mucus penetration test and the determination of acrosin activity by gelatinolysis for the prediction of the semens’ fertility after
cryopreservation. In a preliminary trial with three stallions both methods were found
to be feasible.
In the main trial we examined 25 ejaculates of 13 stallions (10 warm-blood, 2 Thoroughbred, 1 trotter; age 5-21 y). The percentage of sperms with progressive motility
decreased from 31.6 ± 10.7% in native semen to 19.6 ± 13.6% after freezing. This
difference was significant (p < 0.05), but motility before and after freezing were not
correlated.
Cryopreservation caused a decrease of penetration distance in mucus penetration
test (native semen: 48.5 ± 20.9 mm, diluted semen: 55.5 ± 19.3 mm, frozen semen:
35.5 ± 31.9 mm, p < 0.001). The values before and after freezing showed a weak yet
significant positive correlation (R = 0.076, p < 0.001). The percentage of forward motile sperms was only positively correlated to frozen semen.
Acrosin activity measured by gelatinolysis differed between native, diluted, and frozen semen. The percentage of spermatoza with lytic activity was 63.2 ± 19.1% in
native semen, 63.8 ± 19.1% in diluted semen, and 45.3 ± 21.9% in thawn semen.
There was no correlation in the pre- and post-freezing values. Only the thawn semen
showed a positive correlation compared to motility. Measurements of halo diameters
did not reveal correlations between pre- and post-thawn values or motility.
The measurement of penetration distance in mucus penetration test and the determination of lytic active sperms by gelatinolysis showed differences between native
and frozen semen and are suitable to examine the freezing capability of stallion semen. Further tests with more stallions are desirable in order to establish minimum
requirements for freezable semen.
68
8 Literaturverzeichnis
AHLGREN, M. (1969):
Migration of spermatozoa to the fallopian tubes and the abdominal cavity in
women, including some immunological aspects.
Lund, Studentlitteratur
ALEXANDER, N.J. (1981):
Evaluation of male infertility with an in vitro cervical mucuc penetration test.
Fertil. Steril. 36, 201-208
ALLISON, A.C., HARTREE, E.F. (1970):
Lysosomal enzyme in the acrosome and their possible role in fertilization.
J. Reprod. Fertil. 21, 501-515
AMANN, R.P. (1988):
Computerized evaluation of stallion spermatozoa.
Proc. 33rd Ann. Mtg. Amer. Assoc. of Equine Pract., 453-477
AMANN, R.P. (1989):
Can the fertility potential of a seminal sample be predicted accuratly?
J. Androl. 10, 89-98
AMANN, R.P., PICKETT, B.W. (1987):
Principles of cryopreservation and a review of cryopreservation of stallion spermatozoa.
Equine Vet. Sci. 7, 145-187
ANDERSON, E.W., PICKETT, B.W., VOSS, J.L., CRANWELL, J.E. (1980):
The relationship between motility and fertility of frozen stallion semen.
Proc. 9th Int. Congr. Anim. Reprod. A. I., 3, 371
AUSTIN, C.R. (1975):
Membrane fusion events in fertilization.
69
BAUMGARTL, C. (1980):
Licht- und elektronenmikroskopische Untersuchungen über Veränderungen der
Plasmamembran und Akrosomstruktur von Pferdespermien.
Diss. med. vet., Hannover
BEDFORD, J.M. (1970):
Sperm capacitation and fertilisation in mammals.
Biol. Reprod. Suppl. 2, 128-158
BIELANSKI, W., KACZMARSKI, F. (1979):
Morphology of spermatozoa in semen from stallion of normal fertility.
BLACH, E.L., AMANN, R.A., BOWEN, R.A., FRANTZ, D. (1989):
Changes in quality of stallion spermatozoa during cryopreservation: Plasma
membrane integrity and motion characteristics.
Theriogenology 31, 283-298
BLOTTNER, S., WEGNER, H., ROELANTS, H., JEWGENOW, K. (1998):
Durchflusszytometrische Bestimmung des akrosomalen Status von Bullen- und
Hengstspermien nach Markierung mit FITC-konjugiertem PNA (peanut agglutinin).
Tierärztl. Umschau 53, 442-447
BURNS, P. J. (1992):
Modification of Kenney´s extender for cryopreservation of equine spermatozoa.
12th Int. Congr. Anim. Reprod. The Hague 4, 536
CACECI, T., VARNER, D.D. (1987):
Microtubular defects and persistent cytoplasmatic droplets in an infertile stallion.
Southwestern Veterinarian 38, 13-16
70
CARILLO, L.F. (1978):
Aktivitätsbestimmungen des akrosomalen Enzyms Akrosin und deren Brauchbarkeit in der spermatologischen Diagnostik im Rahmen der Tiefgefrierkonservierung von Kaninchensperma.
Diss. med. vet. Hannover
CECHOVA, D., JANAKOVA, V. (1979a):
Isolation of acidic acrosin isoinhibitors from bull seminal plasma.
Hoppe Seyler´s Z. Physiol. Chem. 360 , 1759
CECHOVA, D., JANAKOVA, V. (1979b):
Isolation of a basic acrosin inhibitor from bull seminal plasma.
Hoppe Seyler´s Z. Physiol. Chem. 360, 1753
CHENG, F.P., GADELLA, B. M., FAZELLI, A., BEVERS, M. M., COLENBRANDER,
B., VOORHOUT, W. F. (1998):
Progesterone-induced acrosome reaction in stallion spermatozoa is mediated
by a plasma membrane progesterone receptor.
Biol. Reprod. 59, 733-742
CHRISTENSEN, P., WHITFIELD, C. H., PARKINSON, T. J. (1996):
In vitro induction of acrosome reactions in stallion spermatozoa by heparin and
A23187.
COCHRAN, J.D., AMANN, R.P., FROMANN, D.P., PICKETT, B.W. (1984):
Effects of centrifugation, glycerol level, cooling to 5°C, freezing rate and thawing rate on the post-thaw motility of equine sperm.
COCHRAN, J.D., AMANN, R. P., SQUIRES, E. L., PICKETT, B. W. (1983):
Fertility of frozen-thawed stallion semen extended in lactose-EDTA-egg yolk extender and packaged in 1,0-ml straws.
71
CRISTANELLI, M.J., AMANN, R.P., SQUIRES, E.L, PICKETT, B.W. (1985):
Effects of egg yolk and glycerol levels in lactose-EDTA-egg yolk extender and
of freezing rate on the motility of frozen-thawed stallion spermatozoa.
CRISTANELLI, M.J., SQUIRES, E.L., AMANN, R.P., PICKETT, B.W. (1984):
Fertility of stallion semen processed, frozen and thawed by a new procedure.
DOTT, H.M. (1975):
Morphology of stallion spermatozoa.
DOTT, H.M., DINGLE, J.P. (1968):
Distribution of lysosomal enzymes in the spermatozoa and cytoplasmic droplets
of bull and ram.
Exp. Cell. Res. 52, 523
DOWSETT, K.F., OSBORNE, H.G., PATTIE, W.A. (1984):
Morphological characteristics of stallion spermatozoa.
EGGERT-KRUSE, W., LEINHOS, R.W., GERHARD, I., TILGEN, W., RUNNEBAUM,
B. (1989):
Prognostic value of in vitro penetration into hormonally standarized human cervical mucus.
EGGERT-KRUSE, W., GERHARD, I., TILGEN, W., RUNNEBAUM, B. (1990):
The use of hens´egg white as a substitute for human cervical mucus in assessing human infertility.
Intern. J. Androl. 13, 258-266
FERNEUX, D., SERRES, C., JOUANNET, P. (1985):
Sliding spermatozoa: A dyskinesia responsible for human infertility? Fertil.
Steril. 44, 508-511
72
FISER, P.S., FAIRFULL, R.W. (1986):
The effects of rapid cooling (cold shock) of ram semen, photoperiod and egg
yolk in diluents on the survival of spermatozoa before and after freezing. Cryobiology 23, 518-524
FJÄLLBRANT, B. (1965):
Immunoagglutination of sperm in cases of sterility.
Acta Obstet. Gynecol. Scand. 44, 474
FJÄLLBRANT, B. (1971):
Antibodies affecting fertility in males.
In: Proceedings of the VIITH World Congress on Fertility and Sterility, Tokyo
and Kyoto, 1971. Amsterdam, Exerpta Medica Foundation, 1973, S. 99
GADDUM, P., BLANDAU, R.J. (1970):
Proteolytic reaction of mammalian spermatozoa on gelatin membranes.
Science 170, 749
GADDUM-ROSSE, P., BLANDAU, R.J. (1972):
Comparative studies on the proteolysis of fixed gelatin membranes by mammalian sperm acrosomes.
Am. J. Anat. 134, 133-144
GADDUM-ROSSE, P., BLANDAU, R.J., LEE, W.I. (1980):
Sperm penetration into cervical mucus in vitro. II. Human spermatozoa in bovine mucus.
GALLI, A., BASETTI, M., BALDUZZI, D., MARTIGNONI, M., BORNAGHI, V.,
MAFFII, M. (1989):
Frozen bovine semen quality and bovine cervical mucuc penetration test. Theriogenology 35, 4
GÖTZE, R. (1949):
Besamung und Unfruchtbarkeit der Haussäugetiere.
Schaper, Hannover
73
GOULD, K.G., MARTIN, D.E., HAFEZ, E.S.E. (1975):
Mammalian spermatozoa.
In: HAFEZ, E.S.E. (Hrsg.): Scanning electron microscopic atlas of mammalian
reproduction. Thieme, Stuttgart, 42-57
GRASSL, R., SCHILL, W.-B. (1980):
Gelatinolytische Aktivität menschlicher Spermatozoen.
Fortschritte der Fertilitätsforschung 8, 134-142
HARPER, H.J., LÖFFLER, G., WEIss, Z., PETRIDES, P.E. (1975)
Physiologische Chemie, Springer-Verlag, Berlin, 2. Auflage
HARRISON, R.A.P. (1983):
The acrosome, its hydrolases and egg penetration.
In: ANDRE, J. (Hrsg.): The Sperm Cell, M.-Nijhoff Verlag, The Hague, 259
HARTMANN, J.F., GWATKIN, R.B.L. (1971):
Alterration of sites on the mammalian sperm surface following capacitation.
Nature 234, 479-483
HOLZMANN, A., STAHL, H. (1978):
Korrelation zwischen spermatologischen Befunden und Hyaluronidaseaktivität
in Stiersamen.
Zuchthyg. 13 , 121
INSLER, V., BERNSTEIN, D., GLEZERMA, M., MISQAV, N. (1979):
Correlation of seminal fluid analysis with mucus-penetration ability of spermatozoa.
JAMANE (1930):
zit. n. MANN u. LUTVAK-MANN (1981)
JANAKOVA, V., CECHOVA, D. (1985):
Demonstration of an anionic acrosin inhibitor in spermatozoa, epididymal fluid
and seminal plasma of the boar.
Andrologia 17, 466
74
JONSSON, B., ENEROTH, P., LANDGREN, B.-M., WIKBORN, C. (1986):
Evaluation of in vitro sperm penetration testing of 176 infertile couples with the
use of ejaculates and cervical mucus from donors.
KARRAS, W. (1950):
Spermastudien. 1. Mitt. Eine Methode zur färberischen Darstellung der Kopfkappen und des Kolloidüberzuges der Spermien.
Monatsh. Prakt. Tierheilkd. 2, 162-167
KENNEDY, W.P., KAMINSKI, J.M., VAN DER VEN, H.H., JEYENDRAN, R S., REID,
D. S., BLACKWELL, H., BIELFELD, P., ZANEVELD, L.J.D. (1989):
A simple, clinical assay to evaluate the acrosin activity of human spermatozoa.
J. Androl. 10, 221-231
KLOPPE, L.H., VARNER, D.D., ELMORE, R.G., BRETZLAFF, K.N., SHULL, J.W.
(1988):
Effect of insemination timing on the fertilizing capacity of frozen/thawed equine
spermatozoa.
KLUG, E. (1986):
Stand der Pferdebesamung.
Der Tierzüchter 38, 380-382
KÖRDEL, J. (1959):
Untersuchungen über die Morphologie der Bullenspermien bei Anwendung der
Kopfkappenfärbemethode nach Karras.
KOHNE, K. (1995):
Einsatz osmotischer Resistenzbestimmung zur Beurteilung der Flüssig- und
Kryokonservierungsfähigkeit von Hengstspermatozoen.
75
KRAUSE, D. (1966):
Untersuchungen am Bullensperma unter Berücksichtigung der fertilitätsdiagnostischen Bedeutung der Befunde.
Habilschr., Tierärztliche Hochschule Hannover
KREMER, J. (1965):
simple sperm penetration test.
Int. J. Fertil. 10, 209-214
KREMER, J., JAGER, S. (1976):
The sperm-cervical mucus contact test: A preliminary report.
KREMER, J., JAGER, S., KUIKEN, J. (1977):
The meaning of cervical mucuc in couples with antisperm antibodies.
In: INSLER, V. u. G. BETTENDORF (Hrsg.): The Uterine Cervix in Reproduction, Georg Thieme, Stuttgart, S. 181
KREMER, J., KROEKS, M.V.A.M. (1975):
Modification of the in vitro spermatozoal penetration test by means of the sperm
penetration meter.
Acta Eur. Fertil. 6, 377
KURZROK, R., MILLER, E.G. (1928):
Biochemical studies of human semen and ist relation to mucus of the cervix
uteri.
Am. J. Obstet. Gynecol. 15, 56
LANG, G. (1986):
Interferometrische Messung der Gelatinefilm-Hydrolyse durch SpermienAkrosin.
Diss. med. Giessen
76
LEE, W.I., VERDUGO, P., BLANDAU, R.J., GADDUM-ROSSE, P. (1977): Molecular
arrangement of cervical mucus: a reevaluation based on laser light-scattering
spectroscopy.
Gynecol. Invest. 8, 254
LEE, W.I., GADDUM-ROSSE, P., BLANDAU, R.J. (1981):
Sperm penetration into cervical mucus in vitro. III. effect of freezing on estrous
bovine cervical mucus.
LEMOS de OLIVEIRA, M.A. (1982):
Einfluss verschiedener Aufbereitungsverfahren auf Motilität und Akrosinaktivität
in der Thermoresistenzprüfung und auf das Befruchtungsergebnis von tiefgefrorenem Pferdesamen.
MANN, T. (1964):
Biochemistry of semen and of the male reproductive tract.
Methuen, London
MANN, T., LUTWAK-MANN, C. (1981):
Male reproductive function and semen.
Springer, Berlin-Heidelberg-New York
MARSHALL, C., FREY, L. (1976):
Semen evaluation at select sires.
Proc. 6th Nat. Assoc. Anim. Breed. Tech. Conf. on A.I. and Reprod. Columbia,
MO, 91-93
MARTIN, J.C., KLUG, E., GÜNZEL, A.R. (1979).
Centrifugation of stallion semen and its storage in large volume straws.
J. Reprod. Fert. 27, 47-51
MATOUSEK, J. (1985):
Biological and immunological roles of proteins in sperm of domestic animals.
Animal Reprod. Sci. 8, 1
77
MATOUSEK, J., RIHA, J., SRESEN V., VESELSKY, L., LOUDA, F. (1989):
Penetration of cervical mucus and other body fluids by bull sperm in capillary
tubes.
Anim. Reprod. Sci. 18, 161-166
McRORIE, R.A., WILLIAMS, W.L. (1974):
BIochemistry of mammalian fertilization.
Annu. Rev. Biochem. 43, 777
MILLS, R.N., KATZ, D.F. (1978):
A flat capillary tube system for assessment of sperm movement in cervical mucus.
MORTIMER, D., LENTON, E.A. (1983):
Distribution of sperm counts in suspected infertile men.
MORTIMER, D., PANDYA, I.J., SAWERS, R.S. (1986):
Standardization and quality control of sperm concentration and sperm motility
counts in semen analysis.
Hum. Reprod. 1, 299-303
MORTIMER, D., MORTIMER, S.T., SHU, M.A., SWART, R. (1990):
A simplified approach to sperm-cervical mucus interaction testing using a hyaluronate migration test.
Human Reprod. Oct. 5, 835-841
MORTON, D.B. (1977):
The occurence and function of proteolytic enzymes in the reproduction tract of
mammals.
In: BARRETT, A.J. (Hrsg.): Proteinases in Mammalian Cells and Tissues. Res.
Monographs in Cell and Tissue Physiol. 2 , 455
78
MÜLLER, Z. (1987):
Practicalities of insemination of mares with deep-frozen semen.
MÜLLER-ESTERL, W., WENDT, V., LEIDL, W., FRITZ, H. (1983):
Intra-acrosomal inhibition of boar acrosin by synthetic protease inhibitors.
J. Reprod. Fertil. 67, 13
MURASE, T., OKUDA, K., SATO, K. (1990):
Assessment of bull fertility using a mucus penetration test and a human chorionic gonadotrophin stimulation test.
NEHRING, H. (1989):
Untersuchungen zum Akrosin-System von Bullen-, Eber- und Schafbockspermien.
Arch. Exp. Veterinärmed.45, 5-14
NICANDER, L., BANE, A. (1966):
Fine structure of the sperm head in some mammals, with particular reference to
the acrosome and the subacrosomal substance.
Mikrosk. Anat. 72, 296-315
NISHIKAWA, Y. (1959):
Studies on reproduction in horses.
Jap. Racing Assoc., Tokyo, 250-257
PACE, M.M., SULLIVAN, J.J., ELLIOT, F.I., GRAHAM, E.F., COULTER, G.H.
(1981):
Effects of thawing temperature, number of spermatozoal quality on fertility of
bovine spermatozoa packaged in 5 ml French straws.
J. Anim. Sci. 53, 693-701
PARRISH, R.F., POLAKOVSKI, K.L. (1979):
Mammalian sperm proacrosinacrosin system.
Int. J. Biochem. 10, 391
79
PENN; A., GLEDHILL, B.L., DARZYNKIEWICZ, Z. (1972):
Modification of the gelatin substrate procedure for demonstration of acrosomal
proteolytic activity.
J.Histochem. Cytochem. 20, 499
PURSEL, V.G., JOHNSON, L.A., RAMPACEK, G.B. (1972):
Acrosome morphology of boar spermatozoa incubated before cold - shock.
J. Anim. Sci. 34, 278-283
QUINN, P.J. (1985):
A lipid-phase separation model of low-temperature damage to biological membranes.
Cryobiology 22, 128-146
RECHMANN I., INSLER, V., SERR, D.M. (1973):
A modified in vitro spermatozoal penetration test. II. Application to fertility investigations.
Int. J. Fert. 18, 241-245
REINEKE, A., HESS, O., SCHAMBONY, A., PETROUNKINA, A. M., BADER, H.,
SIEME, H., TÖPFER-PETERSEN, E. (1999):
Sperm-associated seminal plasma proteins – A novel approach for the evaluation of sperm fertilizing ability of stallion?
Pferdeheilkunde 15, 531-537
RUMKE, P. (1954):
The presence of sperm antibodies in the serum of two patients.
Vox Sang 4, 135
SAACKE, R.G. (1970):
Morphology of sperm and its relationship to fertility.
Proc. 3rd Techn. Conf. Anim. Reprod. A. I. Nat. Assoc. Anim. Breed, Chicago:
17-30
80
SAACKE, R.G. (1982):
Components of semen quality.
J. Anim. Sci. 55, 1-13
SAACKE, R.H., MARSHALL, C. E. (1968):
Observations on the acrosomal cap of fixed and unfixed bovine spermatozoa
SAACKE, R.G., WHITE, J.M. (1972):
Semen quality tests and their relationship to fertility.
Proc. 4th Tech. Conf. A. I. and Reprod., N.A.A.B., Chicago, 22
SACHS, L. (1997):
Angewandte Statistik.
Springer-Verlag, Berlin, 8. Auflage
SCHILL, W.-B. (1990):
Determination of active, non-zymogen acrosin, proacrosin and total acrosin in
different andrological patients.
Arch. Dermatol. Res. 282, 335-342
SCHILLING, E., VENGUST, M. (1984):
Spermaqualität von Besamungsebern und die Konservierungsfähigkeit ihrer
Spermien.
Zuchthyg. 19, 57-69
SCHLEUNING, W.D., FRITZ, H. (1975):
Sperm acrosin.
Methods in Enzymol. 27, 330
SIMS, J.M. (1866):
Uterine surgery.
Wm. Woods, New York
SINGER, S.J., NICHOLSON, G.L. (1972):
The fluid mosaic model of the structure of cell membranes.
Science 175, 720-731
81
SMITH, A.U., POLGE, C. (1950):
Survival of spermatozoa at low temperatures.
Nature 166, 668-669
SPRECKELS, I. (1994):
Untersuchungen zur Samenzell-Selektion mittels Glaswollsephadexfiltration bei
Hengstsperma unter besonderer Berücksichtigung der Kryokonservierung.
STAMBOUGH, R., BUCKLEY, J. (1968):
Zona pellucida dissolution enzymes of the rabbit sperm head.
Science, 161, 585-586
STAMBOUGH, R. (1978):
Enzymatic and morphological events in mammalian fertilization.
Gamete Res. 1, 65
TALBOT, P., CHACON, R. S. (1981):
A triple-stain technique for evaluating normal acrosome reactions of human
sperm.
J. Exp. Zool. 215, 201-208
TISCHNER, M. (1979):
Evaluation of deep frozen semen in stallions.
TÖPFER-PETERSEN, E., FLÖRKE-GERLOFF, S., BILTZ, S., ENGEL, W. SCHILL,
W.-B. (1984):
Einige Aspekte zur Biochemie und Physiologie des Spermatozoenakrosoms.
In: SEMM, K., LEIDL, E., RÜSSE, M., METTLER, L.: Verhandlungsbericht der
VIII. Veterinär-Humanmedizinischen Gemeinschaftstagung, 17.-19.2.1983,
München, 102-106
82
TÖRÖK, L. (1973):
Darstellung der proteolytischen Aktivität von Spermatozoen mit Hilfe der Gelfilmsubstrat- Methode.
Andrologia 6, 341
TUMMON, J.S., YUZPE, A.A., DANIEL, S.A.J., DEUTSCH, A. (1991):
Total acrosin activity correlates with fertility potential after fertilization in vitro.
VAN DUIJN, C. (1971):
Beziehungenen zwischen den Eigenschaften des Samens und der Befruchtungsfähigkeit.
Dtsch. Tierärztl. Wochenschr. 78, 134-139
VAN DUIJN, C. , HENDRIKSE, J. (1968):
Rational analysis of seminal characteristics of stallions in relation to fertility.
Rapp. Inst. Veeteeltkundig Onderzoek `Schoonoord` Nr. B97
VARNER, D.D., WARD, C.R., STOREY, B.T., KENNEY, R.M. (1987):
Induction and characterisation of acrosome reaction in equine spermatozoa.
Am. J. Vet. Res. 48,1383-1388
VENGUST, M. (1983):
Untersuchungen zur osmotischen Resistenz von Eberspermien und die Ermittlung eines osmotischen Resistenzwertes zur Beurteilung der Konservierungsfähigkeit von Ejakulaten.
VESELSKY, L., JANAKOVA, V., CECHOVA, D. (1985):
A Kunitz type of proteinase inhibitor from boar seminal resicle fluid.
Andrologia 17, 352
VIDAMENT, M., COGNARD, E., YVON, J. M., SATTLER, M., PALMER, E.,
MAGISTRINI, M. (1998):
Evaluation of stallion semen before and after freezing.
Reprod. Dom. Anim. 33, 3-4, 271-277
83
VIEIRA, R.Ch. (1980):
Akrosinbestimmung an Pferdespermien unter besonderer Berücksichtigung bestimmter andrologischer Fragestellungen.
Diss. med vet., Hannover
VOLKMANN, D.H. (1987):
Acrosomal damage and progressive motility of stallion semen frozen by two
methods in 0,5 ml straws.
VOSS, J.L., PICKETT, B.W., SQUIRES, E.L. (1981):
Stallion spermatozoal morphology and motility and their relationship to fertility.
J. Am. Vet. Med. Assoc. 178, 287-289
WALDSCHMIDT, M., HOFFMANN, B., KARG, H. (1966):
Untersuchungen über die tryptische Enzymaktivität in Geschlechtssekreten von
Bullen.
Zuchthyg. 1 , 15
WATSON, P.F., PLUMMER, J.M. (1985):
The response of boar sperm membranes to cold shock and cooling.
1. Int. Conf. on Deep Freezing of Boar Semen, Uppsala 1985, Ber., 113-127
WEITZE, K. F. (1977):
Gefrierschädigung und Gefrierschutz im Rahmen der Tiefgefrierkonservierung
lebenden Materials unter besonderer Berücksichtigung der Säugetierzahlenzelle.
Dtsch. Tierärztl. Wochenschr. 84, 402-408, 441-446, 481-484
WELKER, B., BERNSTEIN, G.S., DIEDRICH, K., NAKAMURA, R.M., KREBS, D.
(1988):
Acrosomal proteinase activity of human spermatozoa and relation of results to
semen quality.
Human Reprod. 3, 75-80
84
WENDT, V. (1974):
Akrosinbestimmung bei Bullenspermien unter besonderer Berücksichtigung des
einzelnen Spermiums.
Diss. med. vet. München
WENDT, V., LEIDL, W., FRITZ, H. (1974):
The lysis effect of bull spermatozoa on gelatine substrate film. Methodical investigations.
Hoppe-Seyler´s Z. Physiol. Chem. 356, 316-322
WENDT V., LEIDL, W., FRITZ, H. (1975):
The influence of various proteinase inhibitors on the gelatinolytic effect of ejaculated and uterine boar spermatozoa.
Hoppe-Seyler`s Z. Physiol. Chem. 356, 1073-1078
WHITE, I.G., WALES, R.G. (1960):
The susceptibility of spermatozoa to cold shock.
Int. J. Fert. 5, 195-201
WILSON, L. (1954):
Sperm agglutinins in human semen and blood.
Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 85, 652
ZANEVELD, L.J.D. (1975):
The acrosome of mammalian spermatozoa.
In: HAFEZ, E.S.E. (Hrsg.): Scanning electron microscopic atlas of mammalian
reproduction. Thieme, Stuttgart, 58-81
ZANEVELD, L.J.D., POLAKOSKI, K. L., SCHUMACHER, G.F.H. (1973):
Properties of acrosomal hyaluronidase from bull spermatozoa: Evidence for its
similarity to testicular hyaluronidase.
J. Biol. Chem. 248, 546-553
ZELESNA, B. (1980):
Inhibitory properties of bull seminal plasma proteinase inhibitors.
Hoppe Seyler´s Z. Physiol. Chem. 361, 461
85
ZIEGLER, R. (1991):
Computervideomikrographische Beurteilung von Hengstsperma vor und nach
der Tiefgefrierkonservierung mit eidotterhaltigem Verdünner.
Diss. med. vet. München
86
Lebenslauf
Name:
von Stern
Geburtsname:
von Prittwitz und Gaffron
Vorname:
Katharina Alexandra
Geburtsdatum:
28.11.1964
Geburtsort:
Lüneburg
Eltern:
Elisabeth Schwarz geb. von Kessel
Hans-Hoyer von Prittwitz und Gaffron
Familienstand:
verheiratet mit Christian von Stern
drei Kinder
1971 – 1975:
Grundschule Barendorf
1975 – 1984:
Gymnasium Oedeme/Lüneburg
1984 – 1985:
Studium der Pädagogik an der Hochschule Lüneburg
1985 – 1992:
Studium der Veterinärmedizin an der Freien Universität Berlin
WS 1988/89 Urlaubssemester und Praktikum in Namibia
3. September 1992: Approbation als Tierärztin
seit August 1992:
Arbeit an der vorliegenden Dissertation in der Tierklinik für
Fortpflanzung der Freien Universität Berlin und an der Frauenklinik der Christian-Albrecht-Universität Kiel
01.1995 - 04.1995:
Aufbau einer Besamungsstation auf dem Gestüt Pusztabereny
in Ungarn
seit Oktober 1996:
freie Mitarbeiterin in einer Pferde- und Kleintierpraxis im Raum
Lüneburg
seit März 2000:
Anstellung in der obigen Praxis
87
Danksagungen
Allen, die mir bei der Erstellung der vorliegenden Dissertation behilflich waren, sei an
dieser Stelle herzlich gedankt:
Herrn Professor Dr. Peter Glatzel für seine Betreuung und Unterstützung bei der
Durchführung der Arbeit und seinen Mitarbeitern.
Ganz besonders Herrn Dr. Lothar Köhler (Tierklinik Wahlstedt), ohne den diese Dissertation nicht zustande gekommen wäre.
Weiterhin Frau Professor Dr. Liselotte Mettler (Frauenklinik der CAU Kiel) und ihren
Mitarbeitern, deren Laboreinrichtungen ich für den Großteil meiner Arbeit nutzen
durfte, und die mich wissenschaftlich unterstützt haben.
Herzlich Herrn Dr. Jürgen Stumpf, Berlin, für die Bereitstellung von Probenmaterial
und nicht zuletzt seine seelische Unterstützung.
Meiner Familie.
88
Eidesstattliche Erklärung
Hiermit erkläre ich an Eides Statt, dass ich die vorliegende Arbeit selbstständig und
ohne unzulässige Hilfe oder Benutzung anderer als der angegebenen Hilfsmittel angefertigt habe.
89

Prognose der Tiefgefriereignung von Hengstsperma mit Hilfe von

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