neue Aspekte mittels Live Cell Imaging

GYNÄKOLOGIE
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Gametentransport, Befruchtung und
frühe Embryonalentwicklung – neue
Aspekte mittels Live Cell Imaging
Der zeitgerechte Ablauf von Eizell- und Spermientransport, Befruchtung
und früher Embryonalentwicklung ist essenziell für eine erfolgreiche Schwangerschaft. Zumeist ist dabei die Gebärmutter im Focus der Forschung - der Eileiter als
Ort der Gameteninteraktion und der frühen embryo-maternalen Kommunikation fand bisher keine große Beachtung. Daher befasst sich der vorliegende Artikel
mit den neuesten Erkenntnissen über Spermien und Eizelltransport, der Interaktion zwischen Eizelle und Eileiterepithel, dem Spermienreservoir im Eileiter, der
Befruchtung und der frühen embryo-maternalen Kommunikation.
der Eileiterepithelzellen und zum anderen durch die Kontraktion der glatten Muskulatur im Eileiter [1–3]. Bis
heute ist die Bedeutung des ziliären Transports für die
Fertilität nicht gänzlich geklärt. So können Frauen mit
Kartagener Syndrom, deren Zilien immotil sind, fertil
sein [5].
© Tatiana Shepeleva – Fotolia
Der Eileiter ist das Organ, in dem die Eizelle nach der
Ovulation mit Hilfe des Eileitertrichters aufgefangen und
zum Ort der Befruchtung transportiert wird. Gleichzeitig
werden im Eileiter die Spermien transportiert und bis zur
Fertilisation vital gehalten. Auch die ersten vier Tage des
embryonalen Lebens finden im Eileiter statt – der zeitgerechte und präzise Ablauf dieser ersten Tage ist dabei entscheidend für eine erfolgreiche Schwangerschaft [1, 2].
Obwohl 40–300 Millionen Spermien in die Vagina eingebracht werden, erreichen nur wenige tausend Spermien
den Eileiter. Eine erfolgreiche Befruchtung findet nur
dann statt, wenn die Eizelle und das Spermium zur richtigen Zeit zusammentreffen [3]. Nach der Befruchtung ist
ein zeitgerechter Transport im Eileiter Voraussetzung dafür, dass sich der Embryo erfolgreich in der Gebärmutter
einnisten kann [4]. Der Transport von Eizelle und Embryo im Eileiter erfolgt zum einen durch den Zilienschlag
Der grundlegende Ablauf von Befruchtung und früher Embryonalentwicklung ist seit langem Gegenstand
intensiver Forschung. Generell sind diese wichtigen Vorgänge in der Reproduktion bei allen Säugetieren ähnlich.
Bisher sind jedoch kaum Studien verfügbar, die die Interaktion von Spermien, Eizellen und dem frühen Embryo
mit dem maternalen Genitaltrakt untersuchen. Dafür gibt
es im Wesentlichen zwei Gründe. Zum einen ist der in der
Mesosalpinx eingebettete Eileiter in vivo im Abdomen
nur unzureichend mit bildgebenden Verfahren darzustellen und zu untersuchen. Zum anderen sind die meisten
experimentellen Studien bisher an Eileiterzellkulturen
durchgeführt worden. Mit Hilfe dieser Kulturen wurden
wertvolle Informationen über hormonelle Signaltransduktonswege und Genexpression gewonnen [6]. Jedoch
verlieren Eileiterepithelzellen in Kultur spezifische
wichtige Eigenschaften, z. B. die synthetische Aktivität
sowie die funktionelle Integrität der hormonellen Rezeptoren und der Zilien [7]. Erst die Beobachtung der lebenden Zellen im Organverbund mit Hilfe eines digitalen videomikroskopischen Analysesystems ermöglicht es, gameto-maternale Interaktion, Befruchtung und frühe
embryo-maternale Kommunikation unter nahen in vivo Bedingungen zu untersuchen - eine wichtige Vorraussetzung für neue diagnostische und therapeutische Konzepte in der Infertilitätsbehandlung.
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Abb. 1: Ausbildung des Spermienreservoirs im Eileiter (Live Cell Imaging, Modelltier Rind)
Spermientransport und Bildung
des Spermienreservoirs
Obwohl 40–300 Millionen Spermien in die Vagina eingebracht werden, erreichen weniger als 100 Spermien den
Ort der Befruchtung [1, 2]. Im weiblichen Genitaltrakt gibt
es zwei wichtige anatomische Barrieren: Die erste und
grösste Barriere ist die Cervix, an der ca. 70 % der Spermien ausselektiert werden [8, 9]. Die weniger motilen Spermien bleiben im Schleim oder in den hohen Falten der Cervix haften und stehen nicht mehr für eine Befruchtung zur
Verfügung. Die zweite anatomische Barriere ist der Übergang des Uterus in den Eileiter, da dieser stark gewunden
verläuft und ein sehr kleines Lumen besitzt [9]. Der Transport der Spermien erfolgt primär über die Kontraktion der
glatten Muskulatur des weiblichen Genitaltrakts, die um
den Zeitpunkt der Ovulation deutlich erhöht ist. Die Eigenmotilität spielt für das Vorwärtskommen der Spermien nur
eine untergeordnete Rolle, da sie nicht ausreicht, um die
Spermien gegen den starken, durch den Zilienschlag erzeugten Flüssigkeitsstrom anschwimmen zu lassen. Die
Eigenmotilität ist jedoch für den Weitertransport der Spermien wichtig, da sie die Spermien befähigt, aus dem durch
den Zilienschlag bewirkten Flüssigkeitswirbel in die Mitte
des Lumens des weiblichen Genitaltrakts zu gelangen [10].
Sobald die Spermien den Eileiter erreichen, binden sie mit
ihrem Kopf an die Zilien des Eileiterepithels, sie bilden ein
Spermienreservoir (E Abb. 1). Dies ermöglicht den Spermien, über 3–4 Tage (Mensch, Rind, Pferd), Wochen (Vögel), Monate (Fledermäuse) oder sogar Jahre (Reptilien)
vital und befruchtungsfähig zu bleiben.
Mit Hilfe der Videomikroskopie konnten wir zeigen,
dass die Spermien im Reservoir motil bleiben und aktive
Schwanzbewegungen stattfinden [10]. Die Ausbildung eines Spermienreservoirs ist bei vielen Säugetieren (Maus,
Rind, Pferd, Schwein, Schaf) dokumentiert [11, 12, 13,
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14]. Beim Menschen gibt es noch keinen Nachweis. Allerdings ist belegt, dass Geschlechtsverkehr 3–4 Tage vor
dem Eisprung zu einer Schwangerschaft führen kann, so
dass von der Existenz eines Spermienreservoirs ausgegangen wird. Die Moleküle, die nach der Bindung der Spermien im Eileiter vom Epithel sezerniert werden und die Spermien über Tage vital und befruchtungsfähig halten, sind
bisher unbekannt. Bei der Ausbildung des Spermienreservoirs binden spezies-spezifische Lektine am Spermienkopf an spezifische Kohlenhydrate an den Zilien [15, 16,
17]. Dabei binden die Spermien unter in vitro - Bedingungen sowohl in der Ampulla als auch im Isthmus. Diese Bindung erfolgt unabhängig vom Zyklusstand [10]. Physiologischerweise ist der überwiegende Anteil der Spermien im
Isthmus gebunden, da die Spermien als erstes in diesen Teil
des Eileiters gelangen. Wie wir mit Hilfe des Live Cell
Imaging zeigen konnten, binden nur vitale Spermien an das
Eileiterepithel. Daher ist auch die Zahl der gebundenen
Spermien bei Nativsperma deutlich höher als in Tiefgefriersperma. Nach einem Swim-up kann die Zahl der gebundenen Spermien deutlich erhöht werden. Jedoch sind
deutliche individuelle Unterschiede in der Bindungsfähigkeit der Spermien zu beobachten, die mit der Fertilität korreliert sind [10].
Transport der Eizelle und Interaktion
zwischen COC und Eileiter
Nach dem Eisprung wird der Cumulus-Oozyt-Complex (COC) vom Eileitertrichter, dem Infundibulum, aufgefangen. Dort heften sich die Cumuluszellen an die Zilien
des Infundibulums und werden dann durch Zilienschlag in
die craniale Eileiteröffnung transportiert [18, 19]. Sobald
der COC die Ampulla, den Ort der Befruchtung, im Eileiter
erreicht, heftet er sich fest an das Eileiterepithel an
(E Abb. 2). Diese Verbindung kann nur durch Zerstörung
der Cumuluszellen getrennt werden [10]. Die Interaktion
zwischen COC und Eileiterepithel zu diesem Zeitpunkt ist
entscheidend dafür, dass eine Signaltransduktionskaskade
in Gang gesetzt wird, die zur Sekretion von Molekülen
führt, die die Spermien zur Eizelle leiten. Auch unreife
COCs binden an das Eileiterepithel – dies weist darauf hin,
dass die Bindung zwischen COC und Eileiter unabhängig
vom Reifungsstadium erfolgt. Ist ein COC degneriert, bindet er nicht, sondern flotiert im Lumen [10]. Dies weist darauf hin, dass der Eileiter die Eizellen selektiert. Wichtig ist
dabei, dass der Eileiter deutlich sensitiver die Qualität der
Eizellen zu detektieren vermag als das mikroskopische
Grading der Eizellen im Labor. Sind die Eizellen denudiert, d. h. die umgebenden Cumuluszellen sind entfernt
worden, findet keine Interaktion zwischen Eizelle und Eileiterepithel statt [10]. Die Eizelle flotiert im Lumen des Eileiters und wird rasch phagozytiert. Dies zeigt, dass die Cumuluszellen und die von diesen Zellen produzierte Matrix
entscheidend dafür sind, dass eine Kommunikation und Interaktion zwischen Eizelle und Eileiterepithel stattfinden
kann. Videos, die diese Vorgänge dokumentieren, sind
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im Internet unter http://www.biolreprod.org/content/81/2/267/suppl/DC1 verfügbar.
Die Befruchtung
Sobald sich eine vitale Eizelle im Eileiter befindet, lösen sich die Spermien aus dem Spermienreservoir und
wandern zielgerichtet zur Eizelle. Die Loslösung der Spermien vom Eileiterepithel erfolgt durch Hyperaktivierung,
d. h. eine erhöhte Amplitude und ein asymmetrisches
Schlagmuster des Spermienschwanzes [20]. Zudem wird
durch die Kapazitation die Bindungsaffinität des Spermienkopfes an die Zilien reduziert [20]. Die Spermien, die
das Reservoir verlassen, bewegen sich zunächst in die Mitte des Eileiterlumens. Obwohl die durch den Zilienschlag
verursachte und der Spermienwanderung entgegengesetzte Strömung in der Mitte des Eileiterlumens stark ist,
scheint das Vorwärtskommen dort leichter zu sein - insbesondere, weil in der Nähe des Eileiterpithels vermehrt visköses Eileitersekret und/oder starke Verwirbelungen durch
die Zilien auftreten [10]. Sobald die Spermien das Eileiterlumen erreicht haben, erfolgt der Vorwärtstransport durch
die Kontraktionen der glatten Muskulatur des weiblichen
Genitaltrakts [1, 10]. Dabei können die Spermien lokal im
Eileiter ihre eigene Transportgeschwindigkeit erhöhen, indem sie die Prostaglandinsynthese und damit die Kontraktionen im Eileiter steigern [21]. Die Spermien finden ihren
Weg zur Eizelle durch Chemotaxis. Eine gezielte Wanderung der Spermien zur Eizelle findet nur im Eileiter statt.
Dagegen ist während der in vitro Fertilisation in der Petrischale keine gerichtete Bewegung der Spermien in Richtung Eizelle zu beobachten. Die Eizelle selbst vermag also
keine Moleküle zu produzieren, die die Spermien leiten.
Erst nach der Anheftung des COCs am Eileiterepithel wird
eine Signalkaskade initiiert, so dass Moleküle sezerniert
werden, die die Spermien den Weg zur Eizelle finden lassen [10]. Dies wird durch die Beobachtung gestützt, dass
sich immer im Eileiter auf der Seite, wo die Ovulation stattgefunden hat (ipsilateral), deutlich mehr Spermien befinden als auf der anderen Seite (contralateral) [22]. Aktuelle
Studien zeigen dabei, dass Progesteron, das in den Cumuluszellen synthetisiert wird, als Lockstoff für die Spermien
wirkt. Gleichzeitig fördert Progesteron die Hyperaktivierung der Spermien und damit ihre Wanderung und das Eindringen in den Cumulus-Oozyt-Complex [23]. Progesteron aktiviert dabei die CatSper Kanäle- spermienspezifische Ca2+-Ionenkanäle, die für die Bewegung des
Spermienschwanzes und damit für die erfolgreiche Fertilisation essenziell sind [24]. Spermien, die den COC erreichen, müssen zuerst durch die Matrix der Cumuluszellen
wandern. Sobald das Spermium mit der Zona pellucida der
Eizelle in Kontakt kommt, kommt es zur Akrosomreaktion. Dabei verschmilzt die Zellmembran des Spermienkopfes mit der Akrosommembran und es werden Enzyme ,v. a.
Akrosin, frei gesetzt [1, 2]. Diese ermöglichen dem Spermium, die Zona pellucida zu durchdringen und in den Perivitellinraum zwischen Zona pellucida und Eizellmembran
Abb. 2: Anheften der Eizelle an das Eileiterepithel nach der Ovulation (Live Cell
Imaging, Modelltier Rind)
zu gelangen. Das Spermium lagert sich tangential an die
Eizelle an und verliert den Schwanz. Es kommt zur Verschmelzung von Eizell- und Spermienmembran und in der
Folge zur Verschmelzung des männlichen und weiblichen
Vorkerns. Die Zygote ist entstanden. Sie löst sich vom Eileiterepithel und setzt ihre Wanderung im Eileiter in Richtung Uterus fort [1, 2].
Transport des Embryos und erste Kommunikation
Der Transport des Embryos im Eileiter erfolgt durch a)
Zilienschlag der Eileiterepithelzellen, b) Kontraktion der
glatten Muskulatur des Eileiters und c) durch den Flüssigkeitsstrom im weiblichen Genitaltrakt [1, 2]. Mit Hilfe von
quantitativen Analysen mit Hilfe von kleinen Polystyrenkügelchen (Dynabeads) im digitalen Videomikroskop
konnten wir zeigen, dass die Transoprtmechanismen in den
verschiedenen Abschnitten des Eileiters, insbesondere in
Ampulla und Isthmus, grundsätzlich verschieden sind. So
erfolgt der Transport in der Ampulla in der Tiefe zwischen
den Falten. Viele Dynabeads sammeln sich und bleiben in
Nischen liegen [10, 25]. In ähnlicher Weise gelangt auch
die Eizelle nach der Ovulation in die Tiefe zwischen den
Falten und attachiert dort. Für den COC ist dies der erste
Kontakt mit dem Eileiterepithel – und dort findet auch die
erste gameto-maternale Kommunikation statt. Im Isthmus
werden die Partikel dagegen rasch auf die lumennahen
Grate der Falten geleitet. Sobald sich einzelne Partikel zwischen den Falten sammeln, werden sie rasch durch Zilienschlag in den Partikelstrom zurückgeleitet. So übt der Isthmus vorwiegend Transportfunktion aus, während in der
Ampulla die Interaktion zwischen Eizelle, Cumuluszellen
und maternalem Genitaltrakt stattfindet. In ähnlicher Weise findet auch die Interaktion zwischen Embryo und maternalem Genitaltrakt statt (E Abb. 3). Videos, die diese Vorgänge demonstrieren, sind im Internet unter http://www.biolreprod.org/content/81/2/267/suppl/DC1zu finden.
Vor der Befruchtung ist die Partikeltransportgeschwindigkeit in ipsilateralem (Seite der Ovulation) und kontralaDZKF 6-2015
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erkennen kann [1]. Um die komplexe Interaktion zwischen
Embryo und Mutter, die bereits am zweiten Tag nach der
Befruchtung beginnt, exakt aufzuklären, sind systematische Untersuchungen notwendig. Da in vitro produzierte
Embryonen sich in Genexpression, Proteinsynthese und
Stoffwechsel deutlich von in vivo Embryonen unterscheiden, sind in vivo Studien am Tiermodell essenziell, um die
im embryo-maternalen Dialog involvierten Signaltransduktionswege aufzuklären und damit neue Optionen in der
Therapie der Infertilität zu schaffen.
Abb. 3: 4-Zellembryo im Eileiter (Live Cell Imaging, Modelltier Maus)
teralem Eileiter gleich. Nach der Befruchtung ist die Transportgeschwindigkeit im ipsilateralen Eileiter, wo sich der
Embryo befindet, signifikant geringer. Dies bedeutet, dass
der Embryo lokal seine eigene Transportgeschwindigkeit
herunterregulieren kann – damit schafft er die Voraussetzung für die erste embryo-maternale Kommunikation. Sobald der Embryo in den Uterus gewandert ist, wird die
durch den Zilienschlag bedingte Transportgeschwindigkeit im Eileiter wieder heraufreguliert [1, 10].
Neben dem Zilienschlag trägt die Kontraktion der glatten Muskulatur im Eileiter entscheidend zum Transport des
Embryos bei. Aufgrund der Tatsache, dass Frauen mit dem
Kartagener-Syndrom, die immotile Zilien besitzen,
schwanger werden können [5], kann davon ausgegangen
werden, dass allein durch die Muskelkontraktion ein erfolgreicher Embryonentransport sicher gestellt werden
kann.
Die Eileiterflüssigkeit wird durch die Sekretion der Eileiterepithelzellen produziert. Die Zusammensetzung, die
Menge und die Strömungseigenschaften dieser Flüssigkeit
ändern sich in Abhängigkeit vom Zyklusstand. Der Flüssigkeitsstrom wird zum einen durch die Muskelkontraktion, zum anderen durch den Zilienschlag erzeugt. Unsere
Beobachtungen zeigen, dass der Embryo im Flüssigkeitsstrom transportiert wird und keinen direkten Kontakt mit
den Zilien hat [10].
Voraussetzung für eine erfolgreiche Schwangerschaft
ist eine funktionsfähige embryo-maternale Kommunikation. Diese findet bereits im Eileiter statt und nicht – wie lange angenommen – erst im Uterus nach der Implantation.
Bisher ist beim Menschen kein einziges Molekül bekannt,
das die embryo-maternale Kommunikation vermittelt.
Nach eigenem Beobachten werden bis zu 60 % aller
Schwangerschaften bei Infertilitätspatienten, die bereits
mehrere Stimulationszyklen durchlaufen haben, schon vor
der Implantation beendet. Die Gründe dafür sind entweder,
dass der Embryo der Mutter die vitalen Signale nicht übermitteln kann oder aber, dass die Mutter diese Signale nicht
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Das Rind ist ein sehr gutes Modell für den Menschen, da
es eine ähnliche Zyklusdauer, dieselbe Schwangerschaftsdauer, einen ähnlichen Metabolismus in Eizelle und Embryo
und ähnliches genetisches Imprinting besitzt- ganz im Gegensatz zur Maus, die sich in all diesen Punkten wesentlich
unterscheidet. Am Modell des Rindes konnten wir zeigen,
dass der Embryo bereits am 2. Tag nach der Befruchtung mit
der Mutter kommuniziert und deutliche lokale Effekte auf
den maternalen Geschlechtstrakt ausübt [1, 10]. So vermag
der frühe Embryo bereits am Tag 2 die Vaskularisation des
Eileiters lokal zu beeinflussen. Während die A. tubae uterinae im kontralateralen Eileiter (kein Embryo) parallel zum
Eileiter verläuft, ist sie im ipsilateralen Eileiter vor allem an
dem Ort, wo sich der Embryo aufhält, stark gewunden. Die
Wand des ipsilateralen Eileiters ist im Vergleich zum kontralateralen Eileiter dicker, ödematisiert und erscheint durchsichtig. Der Embryo verändert nicht nur die Peripherie des
Eileiters – er bewirkt auch deutliche Änderungen an der inneren Oberfläche des Ovidukts. So induziert der Embryo
während seiner Wanderung die Umwandlung von zilientragenden in sekretorische Eileiterepithelzellen [10] – damit
sichert er sich eine optimale Umgebung und stellt seine Ernährung sicher. Diese Effekte treten innerhalb von 48 Stunden nach der Befruchtung auf – ein Hinweis darauf, wie
schnell der Embryo durch lokale Signale den mütterlichen
Organismus zu beeinflussen vermag.
Klinische Bedeutung
Die neuen, unter nahen in vivo - Bedingungen gewonnenen Erkenntnisse zeigen eine Reihe von neuen Wegen
auf, um die Diagnostik und Therapie von infertilen Patienten zu optimieren. So sollte bei infertilen Patienten vermehrt die Priorität darauf ausgerichtet sein, die Bedingungen im Eileiter zu verbessern. Wie wichtig dies ist, zeigt
sich bereits in der Tatsache, dass allein nach einem diagnostischen Einsatz von Methylenblau in einer Reihe von
Fällen eine erfolgreiche Schwangerschaft zu erreichen ist.
In dem Wissen, dass a) die erste embryo-maternale Kommunikation im Eileiter stattfindet, b) mehr als 60 % der idiopathischen Infertilitäten auf Störungen im Eileiter zurückzuführen sind (eigene Beobachtungen), und c) Veränderungen im Eileiter in der Regel nur mikroskopisch zu
erkennen sind (eigene Beobachtungen), muss die Diagnostik und Therapie des Eileiters mehr Beachtung finden.
Gleichzeitig muss sich jeder Kliniker bewusst sein, dass
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der weibliche Genitaltrakt ein kommunizierendes System
ist und die Therapie nur eines Teils dieses Organsystems
(z. B. die Entfernung eines Eileiters) lediglich beschränkt
erfolgreich sein kann. Gleichzeitig muss die Diagnostik in
Eileiter und Uterus mit neuen bildgebenden Verfahren optimiert werden. Zu diesem Zweck haben wir die probenbasierte Laser-Endomikroskopie (pCLE) im weiblichen Geschlechtstrakt experimentell etabliert. Diese Methode findet bereits klinische Anwendung in der Gastroenterologie
und in der Pulmonologie und ermöglicht mittels einer in
den Arbeitskanal des Endoskops eingeführten Lasersonde
eine Darstellung des Organs intra vitam, auf zellulärer
Ebene und in real-time. Diese Methode eröffnet ganz neue
Einblicke in die Erkrankungen des Eileiters und die daraus
resultierenden Veränderungen im Gametentransport und in
der embryo-maternalen Kommunikation. Auf diese Weise
können nicht nur in der Diagnostik, sondern auch in der
Therapie der Infertilität neue individualspezifische Konzepte entwickelt werden.
Gleichzeitig muss jedem Infertilitätspatienten bei der
Beratung klar vermittelt werden, dass jegliche Störung des
Allgemeinbefindens, falsche Ernährung, Stress, Rauchen
und die Einnahme von Medikamenten und Hormonen die
Fertilität beeinflussen. Es empfiehlt sich, die Beratung mit
Bildern und Filmen aus der aktuellen Forschung visuell zu
unterstützen und den Patienten damit nachhaltig zu informieren.
Schlussfolgerung
Innovative bildgebende Verfahren und Live Cell Imaging tragen entscheidend dazu bei, das Verständnis von
Spermien- und Eizelltransport, Befruchtung und früher
Embryonalentwicklung zu verbessern und neue Erkenntnisse über gameto-maternale Interaktion und frühe embryo-maternale Interaktion zu gewinnen. Zudem kann der
Einfluss von Medikamenten, Hormonen und Umwelttoxinen intra vitam und in real-time dokumentiert werden. Dies
ermöglicht die Entwicklung neuer patientenspezifischer
therapeutischer Konzepte zur Therapie der Infertilität.
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Health Sciences Centre
UCD School of Medicine & Medical Science
University College Dublin, Belfield, Dublin 4, Ireland
Tel.: 00353- 1- 716 6636
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