Gebrauchsinformation Instruction Manual Dr. Schröders

Gebrauchsinformation
Instruction Manual
Dr. Schröders
LaktaseCheck real time PCR Kit
Test zum Nachweis des C/T (-13910) Polymorphismus in der
regulatorischen Region des Laktasegens beim Menschen.
Test for the analysis of the C/T polymorphism at position -13910 within
the regulatory region of the lactase gen in man.
G01010
96
GmbH & Co. KG
Remsstr. 1
D-70806 Kornwestheim
Germany
phone: +49 7154 806 20 0
Fax: + 49 7154 806 20 29
E-Mail: [email protected]
www.gerbion.com
Version 1.8/ 24.11.2014
Inhaltsverzeichnis
Komponenten ........................................................................................... 3
Abkürzungen ............................................................................................ 3
Transport und Lagerung .......................................................................... 3
Anwendungszweck ................................................................................... 4
Art und Beschaffenheit des Probenmaterials ......................................... 4
Qualitätskontrolle .................................................................................. 4
Produktgewährleistung ........................................................................... 4
Einleitung ................................................................................................. 4
Testprinzip ............................................................................................... 5
Zusätzlich benötigte Materialien und Geräte ......................................... 5
Wichtige Hinweise .................................................................................. 5
Probenvorbereitung ................................................................................ 6
Real time PCR ........................................................................................... 7
Schmelzkurvenanalyse ............................................................................ 9
Troubleshooting .................................................................................... 10
Komponenten
Die Komponenten sind ausreichend für den Ansatz von 96 Nachweisreaktionen.
Bezeich n u n g
Deckelfarb e
In h alt
K1
Enzyme
blau
3x
4 µl
K2
Enzyme Buffer
blau
3x
60 µl
K3
Primer-Probe Mix
g el b
2 x 700 µl
K4
Pos itive C ontrol
Genotype T/T (tolerant)
rot
1x
50 µl
K5
Pos itive C ontrol
Genotype C /C (intolerant)
rot
1x
50 µl
K6
Neg ative C ontrol
g rün
1x
50 µl
K7
Mg C l2
klar
1x
160 µl
Abkürzungen
DNA
PCR
Desoxyribonukleinsäure
Polymerase Ketten Reaktion
Transport und Lagerung
Der Transport des Dr. Schröders LaktaseCheck real time PCR Kit erfolgt
gefroren auf Trockeneis. Alle Komponenten des Dr. Schröders LaktaseCheck
real time PCR Kit sind direkt nach Erhalt bei -18°C lichtgeschützt zu lagern.
Nach Ablauf des auf der Packung angegebenen Haltbarkeitsdatums nicht
mehr verwenden! Mehrmaliges Auftauen und Einfrieren (> zweimal) der
Reagenzien vermeiden, da dadurch die Sensitivität verringert werden kann.
Gegebenenfalls sollten der Primer-Sonden- Mix (K3) und die Positivkontrollen (K4 und K5) aliquotiert werden.
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Anwendungszweck
Der Dr. Schröders LaktaseCheck real time PCR Kit dient dem Nachweis des
C/T (-13910) Polymorphismus in der regulatorischen Region des Laktasegens mit Hilfe von real time Detektion im Kapillarsystem des LightCyclers®
1.5 oder 2.0 (Roche).
Art und Beschaffenheit des Probenmaterials
Das Ausgangsmaterial für die Nachweisreaktion ist genomische DNA,
die aus Wangenschleimhautabstrichen oder EDTA-Blut isoliert wurde.
Qualitätskontrolle
In Übereinstimmung mit dem ISO-zertifizierten Qualitätsmanagementsystem der gerbion GmbH & Co. KG wird jede Charge des Dr. Schröders
LaktaseCheck real time PCR Kit gegen vorgegebene Spezifikationen getestet, um eine einheitliche Produktqualität zu gewährleisten.
Produktgewährleistung
Diese Gebrauchsinformation gilt als vollständig und richtig zum Zeitpunkt ihrer Veröffentlichung. Die gerbion GmbH & Co. KG haftet keinesfalls für Neben- oder Folgeschäden, die sich im Zusammenhang mit oder
in der Folge der Benutzung dieser Gebrauchsinformation ergeben. gerbion
garantiert die volle Funktionsfähigkeit wenn die Durchführung entsprechend der in der Gebrauchsanweisung gegebenen Anleitung erfolgt. Der
Käufer muss selbst bestimmen, ob das Produkt für seine spezielle Anwendung geeignet ist. gerbion behält sich das Recht vor, Produkte
jederzeit zu modifizieren, um die Funktionalität oder das Design zu verbessern.
Einleitung
In Mitteleuropa sind ca. 15 bis 20 % der Bevölkerung von einer primären
Laktoseunverträglichkeit betroffen. Hauptursache ist ein C/T-Polymorphismus an Position -13910 in der regulatorischen Region des Laktasegens. Bei Menschen, die auf beiden Allelen ein C statt des T tragen, kommt
es mit fortschreitendem Alter (oft ab ca. 20 Jahren) zur Manifestierung
des Enzymmangels. Laktosemoleküle gelangen nun ungespalten in den
Dickdarm, wo sie von Darmbakterien vergoren werden. Dies verursacht
die typischen Symptome der Laktoseintoleranz: Bauchschmerzen, Übelkeit, Erbrechen, Durchfall und Blähungen.
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Testprinzip
Der Dr. Schröders LaktaseCheck real time PCR Kit enthält spezifische Primer und Fluoreszenzfarbstoff-markierte Sonden für den Nachweis des C/T(-13910) Polymorphismus in der regulatorischen Region des Laktasegens.
Mit Hilfe der spezifischen Primer wird die Zielsequenz amplifiziert. Die
unterschiedliche Bindungsaffinität der Hybridisierungssonden erlaubt
in der Schmelzkurvenanalyse die Unterscheidung der verschiedenen Genotypen. Die Messung der Fluoreszenz erfolgt im F2 Kanal des LightCycler®
1.5 oder 2.0.
Zusätzlich benötigte Materialien und Geräte
•
•
•
•
•
•
•
•
•
DNA Extraktionskit
Pipetten (variable Volumina)
sterile Pipettenspitzen mit Filter
Tischzentrifuge
Vortexer
real time PCR Gerät (LightCycler® 1.5 oder 2.0 )
Kapillaren
Color Compensation Kit
Optional: Pipettiergeräte zur Automation
Wichtige Hinweise
Die Dr. Schröders LaktaseCheck real time PCR muss in für diesen Zweck
geeigneten Laboratorien und von speziell geschultem Personal durchgeführt werden.
Die Richtlinien der Good Laboratory Practice (GLP) sind einzuhalten.
Alle Proben müssen als potentiell infektiös betrachtet werden und alle
mit den Proben in Berührung kommenden Gegenstände müssen als potentiell kontaminiert erachtet werden.
Allgemeine Hinweise
• Die Anweisungen der Gebrauchsinformation sind einzuhalten.
• Areale für die Probenvorbereitung und den Ansatz des PCRMaster-Mix sollten strikt getrennt sein.
• Pipetten, Röhrchen und andere Arbeitsmaterialien dürfen nicht
von einem Bereich in den anderen zirkulieren.
• Immer Pipettenspitzen mit Filter verwenden.
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• Pipetten und Arbeitsflächen regelmäßig mit geeigneter Dekontaminationslösung reinigen (keine ethanolhaltigen Mittel).
• Komponenten verschiedener Chargen des Dr. Schröders LaktaseCheck
real time PCR Kit dürfen nicht zusammen verwendet werden.
Probenvorbereitung
Für die Durchführung der Dr. Schröders LaktaseCheck real time PCR wird
genomische DNA benötigt, die mit geeigneten Methoden isoliert wurde.
Es wird empfohlen dazu kommerziell erhältliche Extraktionskits zu verwenden, z.B. :
• NukEx Pure RNA/DNA Kit (gerbion, Art. Nr. G05004)
Weitere Informationen zur DNA-Isolation erhalten Sie in der Gebrauchsinformation des Extraktionskits oder vom technischen Service des Extraktionskit Herstellers.
Wichtig: Unabhängig vom verwendeten Probenmaterial sollte zusätzlich
zu den Proben eine Wasserkontrolle (Reinstwasser) extrahiert werden,
anhand derer sich eventuell auftretende Kontaminationen ablesen lassen. Diese Wasserkontrolle muss analog einer Probe behandelt werden.
Falls die real time PCR nicht sofort durchgeführt wird, müssen die DNAExtrakte entsprechend der Angaben des DNA-Extraktionskit Herstellers
aufbewahrt werden.
Real time PCR
Wichtige Punkte bevor Sie starten:
• Beachten Sie bitte die „Wichtigen Hinweise“ auf Seite 6.
• Bevor Sie die real time PCR ansetzen machen Sie sich mit dem real
time PCR Gerät vertraut. Die Programmierung des Temperaturprofils
sollte abgeschlossen sein, bevor die real time PCR angesetzt wird.
• Beachten Sie, dass in jedem PCR Lauf mindestens eine Positivkontrolle
Genotyp T/T tolerant (K4), eine Positivkontrolle Genotyp C/C intolerant (K5), und eine Negativkontrolle (K6) enthalten sein sollten.
• Alle Reagenzien, bis auf das Enzym, müssen komplett aufgetaut,
gevortext und kurz abzentrifugiert werden. Halten Sie die Reagenzien
stets gekühlt auf Eis oder in einem Kühlblock (+2 - +8°C).
Durchführung
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Der Master-Mix enthält alle für die PCR benötigten Komponenten außer
der Probe. Setzen Sie für die Gesamtzahl der geplanten PCR-Ansätze
mindestens einen Ansatz mehr als benötigt an, um Pipettierungenauigkeiten auszugleichen.
WICHTIG: Bevor Sie den Master-Mix ansetzen, müssen Sie zunächst den
Enzym-Puffer (K2) mit dem Enzym (K1) mischen, um den gebrauchsfertigen Enzym-Mix zu erhalten.
Herstellung des Enzym-Mix:
Überführen Sie den kompletten Inhalt eines Röhrchens Enzym-Puffer (K2)
in ein Enzym-Röhrchen (K1). Mischen Sie gut durch vorsichtiges Auf- und
Abpipettieren. Den Enzym-Mix stets gekühlt auf Eis oder in einem Kühlblock halten (+2 - +8°C).
Tabelle 1: Herstellung des Master-Mix
Reaktionsvolumen
14,4 µl Primer-Sonden-Mix (K3)
1,6 µl MgCl2 (25mM) (K7)
2,0 µl Enzym-Mix (K1+K2)
Master-Mix Volumen
14,4 µl x (N+1)
1,6 µl x (N+1)
2,0 µl x (N+1)
• Benötigte Anzahl Kapillaren in den Kapillarenkühlblock stellen.
• 18 µl des Master-Mix in jede Kapillare pipettieren.
• 2 µl der DNA-Extrakte, der Positivkontrollen und der Negativkontrolle
in die entsprechenden Kapillaren pipettieren und Kapillaren sofort
nach Zugabe der Probe verschließen, um Kontaminationen zu vermeiden.
• Kapillaren bei niedriger Geschwindigkeit zentrifugieren, um die Flüssigkeit im unteren Teil der Kapillaren zu sammeln.
Tabelle 2: Ansetzen der PCR
Komponente
Master-Mix
Probe
Gesamtvolumen
Volumen
18,0 µl
2,0 µl
20,0 µl
Für die real time PCR und die anschließende Schmelzkurvenanalyse das
in Tabelle 3 beschriebene Temperaturprofil benutzen.
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Tabelle 3: real time PCR Temperaturprofil
1. Initiale Denaturierung
10 min
95°C
2. Amplifikation der DNA
Anzahl der Zyklen
Denaturierung
Annealing
Extension
45
10 sec
10 sec
25 sec
95°C
55°C
72°C
(aquisition mode: SINGLE)
Ramping time bei allen Schritten 20°C/sec
3. Schmelzkurve
0 sec 95°C Ramping time 20°C/sec
5 sec 50°C Ramping time 20°C/sec
0 sec 80°C Ramping time 0,1°C/sec
4. Kühlung
30 sec
Aquisition mode: none
Aquisition mode: none
Aquisition mode: cont.
40°C
Aktivieren Sie den Color Compensation File (CCC)
Schmelzkurvenanalyse
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Für die Schmelzkurvenanalyse müssen folgende Einstellungen gewählt
werden:
Digital filter: enabled
Degrees to average: 9-10
Die Ergebnisse der Schmelzkurvenanalysen für den C/T (-13910) Polymorphismus sind in Kanal F2/F1 zu sehen.
Abbildung 1 zeigt die Schmelzkurven von homozygoten und heterozygoten Proben.
Positivkontrolle
Genotyp T/T (tolerant)
Positivkontrolle C/C
(intolerant)
Patientenprobe
(heterozygoter Genotyp
C/T)
Abbildung 1: Die Peaks der Schmelzkurven liegen bei ca. 56,5°C für den
Genotyp T/T, ca. 63,5°C für den Genotyp C/C. Heterozygote Proben (Genotyp
C/T) weisen bei beiden Temperaturen Peaks auf.
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Troubleshooting
Der folgende Troubleshooting Guide soll bei eventuell auftretenden Problemen mit der real time PCR behilflich sein. Sollten Sie weitere Fragen
haben, wenden Sie sich bitte an unsere W issenschaftler unter
[email protected].
Kein Fluoreszenzsignal bei den Positivkontrollen (K4 und K5)
• Der gewählte Kanal entspricht nicht dem im Protokoll angegebenen
Wählen Sie den F2/F1 Kanal für die Ansicht der Amplifikationskurven sowie für die Schmelzkurvenanalyse.
• Fehlerhaftes Ansetzen der real time PCR
Überprüfen Sie Ihre Arbeitsschritte und vergleichen Sie diese
mit dem in „Durchführung“ auf den Seiten 7-8 beschriebenen.
• Fehlerhaftes real time PCR Temperaturprofil
Vergleichen Sie das Temperaturprofil mit dem Protokoll
(Tabelle 3, Seite 8).
• Falsche Lagerbedingungen des Kits, oder abgelaufenes Haltbarkeitsdatum
Überprüfen Sie die Lagerbedingungen und das Haltbarkeitsdatum auf
dem Kitetikett. Falls nötig, benutzen Sie einen neuen Kit und lagern
Sie alle Komponenten wie auf Seite 3 unter „Transport und Lagerung“
beschrieben.
Detektion eines Fluoreszenzsignals in der Negativkontrolle (K6)
• Kontamination des real time PCR Ansatzes
Wiederholen Sie die real time PCR in Replikaten. Falls das Ergebnis
der Wiederholungen negativ sein sollte, so ereignete sich die Kontamination während der Befüllung der Kapillaren. Stellen Sie sicher,
dass Sie die Positivkontrolle zuletzt pipettieren und verschließen Sie
die Kapillaren sofort nachdem Sie die jeweilige Probe zugegeben haben.
Falls die Negativkontrolle in der Wiederholung wieder ein Signal im
F2/F1 Kanal ergibt, deutet dies auf eine Kontamination eines oder
mehrerer Kitkomponenten hin. Stellen Sie sicher, dass die Arbeitsbereiche und die Geräte regelmäßig dekontaminiert werden. Wiederholen Sie die PCR mit einem neuen Kit.
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Die Proben weisen kein Fluoreszensignal im F2/F1 Kanal auf
• PCR Inhibition
Stellen Sie sicher, dass Sie eine geeignete Extraktionsmethode benutzen (siehe „Probenvorbereitung“, Seite 6) und beachten Sie die Herstellerangaben.
Stellen Sie sicher, dass ethanolhaltige Waschpuffer vollständig entfernt wurden (ein zusätzlicher Zentrifugationsschritt bei hoher Geschwindigkeit vor der DNA-Elution wird empfohlen).
• Verlust der DNA während des Aufarbeitungsprozesses
Stellen Sie sicher, dass Sie eine geeignete Extraktionsmethode benutzen (siehe „Probenvorbereitung“, Seite 6) und beachten Sie die Herstellerangaben.
Die Peaks der Schmelzkurven der Probe liegen nicht im Temperaturbereich der Kontrollpeaks (T/T: 56,5°C +/- 1°C; C/C: 63,5°C +/- 1°C)
• Vorhandensein eines weiteren Polymorphismus im amplifizierten
Bereich
Liegt in der von den Sonden abgedeckten Region ein weiterer Polymorphismus vor, so kann dieser zu einer Verschiebung der Schmelzkurven
führen. Dies kann vor allem bei Personen nicht-kaukasischer Abstammung der Fall sein. Eine sichere diagnostische Aussage ist in diesem
Fall nicht möglich. Es wird empfohlen, zur Absicherung einen Atemtest durchzuführen.
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Index
Components ............................................................................................. 2
Abbreviations .......................................................................................... 2
Transport and Storage ............................................................................. 2
Intended Use ............................................................................................ 2
Sample Material ...................................................................................... 3
Quality Control ........................................................................................ 3
Product Warranty ................................................................................... 3
Introduction ............................................................................................ 3
Principle of the Test ................................................................................. 3
Equipment and Reagents to be Supplied by User ................................... 4
Important Notes ...................................................................................... 4
Preparation of Samples .......................................................................... 5
Real time PCR ........................................................................................... 5
Analysis of Melting Curves ..................................................................... 8
Troubleshooting ...................................................................................... 9
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Components
The reagents supplied are sufficient for 96 reactions.
Labelling
Lid Colour
Cont ent
K1
Enzyme
blue
3x
4 µl
K2
Enzyme Buffer
blue
3x
60 µl
K3
Primer-Probe Mix
K4
Pos itive C ontrol
Genotype T/T (tolerant)
red
1x
50 µl
K5
Pos itive C ontrol
Genotype C /C (intolerant)
red
1x
50 µl
K6
Neg ative C ontrol
g reen
1x
50 µl
K7
Mg C l2
c l ea r
1 x 160 µl
yellow
2 x 700 µl
Abbreviations
DNA
PCR
Desoxyribonucleic Acid
Polymerase Chain Reaction
Transport and Storage
The Dr. Schröders LaktaseCheck real time PCR Kit is shipped on dry ice.
All components must be stored at -18°C in the dark immediately after
receipt. Do not use reagents after the date of expiry printed on the package.
The reagents should not be thawed and frozen more than 2 times. If so,
the Primer-Probe Mix (K3) and Positive Controls (K4 and K5) have to be
aliquoted.
Intended Use
The Dr. Schröders LaktaseCheck real time PCR Kit detects the C/T (-13910)
polymorphism within the regulatory region of the lactase gene using real
time detection in the capillary system of the LightCycler® 1.5 or 2.0 (Roche).
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Sample Material
Sample material to be detected is genomic DNA, isolated from a buccal
(cheek) swab or from EDTA blood.
Quality Control
In accordance with gerbion‘s ISO certified Quality Management System,
each lot of the Dr. Schröders LaktaseCheck real time PCR Kit is tested
against predetermined specifications to ensure consistent product
quality.
Product Warranty
gerbion guarantees the performance of all products when used according
to the instructions given in the instruction manual. The purchaser must
determine the suitability of the product for its particular use. Should any
product fail to perform satisfactorily due to any reason other than
misuse, gerbion will replace it free of charge or refund the price. We
reserve the right to change, alter, or modify any product to enhance its
performance and design.
Introduction
About 15 to 20% of the population in Central Europe suffer from a primary
lactose intolerance. This is mainly due to a C/T polymorphism at position
-13910 within the regulatory region of the lactase gene. Individuals
carrying C instead of T on both alleles develop a manifestation of a
lactase deficiency with aging (often around the age of 20). In the absence
of lactase, lactose remains uncleaved and passes intact into the colon,
where the lactose is fermented by the bacteria in the large intestine,
causing the typical symptoms of lactose intolerance: abdominal pain,
nausea, diarrhea and flatulence.
Principle of the Test
The Dr. Schröders LaktaseCheck real time PCR Kit contains specific primers
and hybridization probes for the analysis of the C/T polymorphism at
position -13910 within the regulatory region of the lactase gene.
The specific primers allow the amplification of the target sequence.
The identification of different genotypes in each single sample is
characterized by melting curve analysis determining the binding affinity
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of the hybridization probe to the DNA template. The fluorescence is
measured in the F2 channel (LightCycler® 1.5 or 2.0).
Equipment and Reagents to be Supplied by User
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
DNA isolation kit
Sterile microtubes
Pipets (adjustable volume)
Sterile pipet tips with filter
Table centrifuge
Vortexer
real time PCR instrument (LightCycler® 1.5 or 2.0 )
Capillaries
Color Compensation Kit
Optional: Liquid handling system for automation
Important Notes
The Dr. Schröders LaktaseCheck real time PCR must be performed in
adequate laboratories by qualified personnel.
Good Laboratory Practice (GLP) has to be applied.
Clinical samples must always be regarded as potentially infectious material and all equipment used has to be treated as potentially
contaminated.
General precautions
• Stick to the protocol described in the instruction manual.
• Set up different laboratory areas for the preparation of samples and
for the set up of the PCR in order to avoid contaminations.
• The Enzyme Mix is liquid even at -18°C. Take it out of the freezer shortly
before usage and put it back immediately.
• Pipettes, tubes and other material must not circulate between those
different laboratory areas.
• Always use filter tips.
• Regulary decontaminate equipment and benches with alcoholfree
decontaminant.
• Do not combine Dr. Schröders LaktaseCheck real time PCR components
of different lot numbers.
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Preparation of Samples
For the procedure of the Dr. Schröders LaktaseCheck DNA isolated by
adequate methods is needed.
Commercially available kits for DNA isolation such as the following
are recommended, e.g. :
• NukEx Pure RNA/DNA Kit (gerbion, Cat. No. G05004)
Further information about DNA isolation is to be found in the extraction
kit manual or from the extraction kit manufacturer‘s technical service.
Important: In addition to the samples always run a „water control“ in
your extraction. Treat this water control analogous to a sample. The
water control will show you possible contaminations.
If the real time PCR is not performed immediately, store extracted DNA
due to the declaration of the manufacturer of the DNA isolation kit.
Real time PCR
Important points before starting:
• Please pay attention to the „important notes“ on page 4.
• Before setting up the PCR familiarise yourself with the real time PCR
instrument and read the user manual supplied with the instrument.
• The programing of the thermal profile should take place before the
real time PCR set up.
• In every PCR run at least one Positive Control Genotype T/T (K4) and
Genotype C/C (K5) as well as one Negative Control (K6) should be
included.
• Before each use, all reagents - except the Enzyme - should be thawed
completely at room temperature, briefly vortexed, and centrifuged
very briefly. Afterwards place all reagents on ice or on a cooling block
(+2 to +8°C).
Procedure
The Master Mix contains all of the components needed for PCR except the
sample. Prepare a volume of reaction mix with at least one extra (virtual)
sample more than required for the total number of PCR assays to be
performed due to the reason of imprecise pipetting.
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Important: Before pipetting the Master Mix, pipet one vial of Enzyme
Buffer (K2) into one vial of Enzyme (K1) to receive the ready to use
Enzyme Mix.
Preparation of the ready to use Enzyme Mix:
Transfer the complete amount of one vial Enzyme Buffer (K2) into one vial
of Enzyme (K1). Mix gently by pipetting. Keep the ready to use Enzyme Mix
on ice or in a thermal block (+2 to +8°C).
Table 1: Preparation of the Master Mix
Reaction Volume
14.4 µl Primer-Sonden-Mix (K3)
1.6 µl MgCl2 (25mM) (K7)
2.0 µl Enzym-Mix (K1+K2)
Master Mix Volume
14.4 µl x (N+1)
1.6 µl x (N+1)
2.0 µl x (N+1)
• Put the number of capillaries needed into the LightCycler®Capillary
cooling block.
• Pipet 18 µl of the Master Mix into each capillary.
• Then add 2 µl of the eluates from the DNA isolation (including the
eluate of the water control), the Positive Controls (K4 and K5) and the
Negative Control (K6) to the corresponding capillary. Close capillaries
immediately after filling in order to reduce the risk of contamination.
Table 2: Preparation of the PCR
Component
Master Mix
Sample
Total volume
Volume
18.0 µl
2.0 µl
20.0 µl
Centrifuge capillaries at low speed to collect the prepared reaction volume
in the bottom of the capillary.
For the real time PCR and the following analysis of the melting curves use
the thermal profile shown in Table 3.
Table 3: real time PCR thermal profile
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1. Initial Denaturation
10 min
95°C
2. Amplification of DNA
Number of cycles
Denaturation
Annealing
Extension
45
10 sec
10 sec
25 sec
95°C
55°C
72°C
(aquisition mode: SINGLE)
Ramping time for all steps 20°C/sec
3. Melting Curve
0 sec 95°C Ramping time 20°C/sec
5 sec 50°C Ramping time 20°C/sec
0 sec 80°C Ramping time 0.1°C/sec
Aquisition mode: cont.
4. Cooling
40°C
30 sec
Activate the Color Compensation File (CCC)
Analysis of Melting Curves
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For the analysis of the melting curves choose the following adjustments:
Digital filter: enabled
Degrees to average: 9-10
The results of the melting curves analysis for the C/T (-13910)
polymorphism are shown in the channel F2 /F1.
Figure 1 shows the melting curves of homozygous and heterozygous
samples.
Positive Control
Genotype T/T
(tolerant)
Positive Control C/C
Genotype (intolerant)
Clinical Sample with
heterozygous C/T Genotype
Figure 1: The melting curves show peaks at a temperature of about 56.5°C
for the T/T genotype and about 63.5°C for the C/C genotype. Heterozygous
samples (genotype C/T) show peaks at both temperatures.
Troubleshooting
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The following troubleshooting guide is included to help you with possible
problems that may arise when performing a real time PCR. If you have
further questions on the protocol or the instruction manual, please do
not hesitate to contact our scientists on [email protected].
No fluorescence signal of the Positive Controls (K4 and K5)
• The selected channel for analysis does not comply with theprotocol
Select channel F2/F1 for analysis of melting curve.
• Incorrect configuration of the real time PCR
Check your work steps and compare with „procedure“ on the pages
5-7.
• The programming of the thermal profile is incorrect
Compare the thermal profile with the protocol (table 3, page 7)
• Incorrect storage conditions for one or more kit components or kit
expired
Check the storage conditions and the date of expiry printed on the kit
label. If neccessary, use a new kit and make sure kit components are
stored as described in „Transport and Storage“, page 2.
Detection of a fluorescence signal of the Negative Control (K6)
• Contamination during preparation of the real time PCR
Repeat the real time PCR in replicates. If the result is negative in the
repetition, the contamination occured when the samples were
pipetted into the capillaries. Make sure to pipet the Positive Controls
at last and close the capillaries immediately after adding the sample.
If the same result occurs, one or more of the kit components might be
contaminated. Make sure that work space and instruments are
decontaminated regularly. Use a new kit and repeat the PCR.
No fluorescence signal in channel F2/F1
page 9
• PCR inhibited
Make sure that you use an appropriate isolation method (see
„Preparation of samples“, page 5) and follow the manufacturer‘s
instructions.
Make sure that the ethanol containing washing buffer of the isolation
kit has been completely removed. An additional centrifugation step at
high speed is recommend before elution of the DNA.
• DNA loss during isolation process
Make sure that you use an appropriate isolation method (commercial
kits are recommended) and stick to the manufacturer‘s protocol (see
„Preparation of samples“, page 5).
The peaks of the melting curve of the samples are not located in the
temperature range of the control peaks (T/T: 56.5°C +/- 1°C; C/C: 63.5°C
+/- 1°C)
• Existence of a further polymorphism within the region of amplification.
The presence of a further polymorphism in the region of amplification
may lead to a shift of the melting curves.
This can particularly happen in the case of people of non-caucasian
origin. Therefore a safe diagnosis cannot be made. If confirmation is
necessary, a hydrogen breath test is recommended.
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