Real Time PCR PneumoPlex - Szabo

Real Time PCR PneumoPlex
In vitro
diagnostikum
-80 bis -20°C
siehe
Verpackung
RT-PPX-050
Siehe Verpackung
Allgemeine Charakteristik:
Real Time Multiplex assay für die Detektion von Legionella pneumophila und Legionella
micdadei, Mycoplasma pneumoniae,Chlamydia pneumoniae, Bordetella pertussis..
Das Kit beinhaltet eine positive Kontrolle (STD), welche die Zielsequenzen von allen
detektierten Agenen umfasst. Das Signal der internen Kontrolle wird im getrennten Reaktionsgefäß
verfolgt, damit keine Reduzierung der Reaktions-Empfindlichkeit erfolgt.
Empfohlene Isolierungsmethode: kommerzielle Kits der Firma Qiagen (DNAminikit).
Empfohlene Proben für die Analyse: BAL, Nasenrachenabstrich.
Das Kit ist für die Geräte von Smart Cycler und RotorGene optimiert.
Detektionsbeschreibung:
Mastermix 1.:
FAM – Legionella (Ch1)
HEX – M. pneumoniae (Ch 2)
ROX – Ch. pneumoniae (Ch 3)
Cy5 – B. pertussis (Ch 4)
Mastermix 2.:
TxR – interne Kontrolle (Ch3)
Das Kit beinhaltet die Reagenzien für die Durchführung von 50 Real Time PCR-Analysen:
Reagenzien für die Vorbereitung vom Mastermix1:
o PMXI 550 µL
o PMXII 22 µL
o PMXIII 55 µL
o Taq 30 µL
o ddH2O 400 µL (kann auch als negative Kontrolle verwendet werden)
o PP STD (positive Kontrolle) 55 µL
Reagenzien für die Vorbereitung vom Mastermix2:
o IC PMXI 550 µL
o IC PMXII 22 µL
o IC PMXIII 400 µL
o IC Taq 22 µL
o IC STD (interne positive Kontrolle) 28 µL
ČR: DYNEX LABORATORIES, s.r.o.,
Kontakt: Lidická 977, 273 43 Buštěhrad, Tel: +420 220 303 600, Fax: +420 224 320 133, E-mail: [email protected]
Fimensitz: Vodičkova 791/41, 110 00 Praha 1, IČ: 26682443, eingetr.im Handelsregister geführten bei Stadtgerich in Prag, Teil C, Einl.
87028
SR: Dynex Servis, s.r.o., Nové Kaliště 17, 974 04 Banská Bystrica,
Tel: +421 48 415 5045, Fax: +421 48 415 5056, E-mail: [email protected]
www.dynex.cz
Rev_24.9.2012, ver24092012
Protokoll der Analyse für beide Mastermixe
Mastermix1.:
Real Time PCR-Analyse für die Detektion der genannten bakteriellen Agens (Gesamtvolumen 20 µl):
Isolierte DNA/ Templat
2 µl
PMX I
10 µl
PMX II
0,4 µl
PMX III
1 µl
Polymerase TAQ(5U/ µl)
0,4 µl
ddH20
6,2 µl
Mastermix 2.:
IC STD in die Amplifikation
Volumen 20 µl ist.
TxR – interne Kontrolle
Isolierte DNA/Templat
IC STD
IC PMX I
IC PMX II
IC PMX III
IC Polymerase TAQ(5U/
µl)
gemeinsam mit der Probe (0,5 µl) so pipettieren, dass das gesamte
1,5 µl
0,5 µl
10 µl
0,4 µl
7,2 µl
0,4 µl
Die Mastermixe werden anschließend in zwei Sätzen der SMART-Reaktionsgefäße pipettiert. In das
erste Reaktionsgefäß kommt Mastermix 1., in das zweite - Mastermix 2. Danach wird die negative
Kontrolle zugefügt (Puffer oder ddH20), anschließend werden die isolierten Proben (mit interner
Kontrolle in 2. Mastermix) pipettiert; als letztes wird STD – positive Kontrolle, zugefügt; Plasmid, das
die DNA-Zielsequenzen von allen detektierten bakteriellen AgensAntigenen beinhaltet.
Nach der Zentrifugierung in der Smart-Zentrifuge werden die Proben in den Cycler überführt und die
Analyse wird gestartet.
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Rev_24.9.2012, ver24092012
Interpretation der Ergebnisse:
Mastermix 1:
Positives Ergebniss im Kanal:
1. optischer Kanal: FAM – Anwesenheit von Legionella (treshold 50RFU)
2. optischer Kanal: HEX – Anwesenheit von M. pneumoniae (treshold 30RFU)
3. optischer kanal: ROX – Anwesenheit von Ch. pneumoniae (treshold 10RFU)
4. optischer Kanal: Cy5 – Anwesenheit von B. pertussis (treshold 30RFU)
Positive Kontrolle STD (Standard) – positiv in allen Kanälen
1. FAM-Kanal– Detektion von Legionella
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2. HEX-Kanal – Detektion von M. pneumoniae
4.Kanal Cy5 – Detektion von B. pertussis
Mastermix 2:
Interne Kontrolle:
Positives Ergebniss im Kanal :
3.optischer Kanal: TxR – interne Kontrolle (treshold 30RFU)
Auswertung:
Das Ergebnis kann für gültig gehalten werden, falls das positive Mastermix-Signal der internen
Kontrolle im TxR-Kanal und das STD-Signal (positive Kontrolle) zu jeder Probe in allen
Detektionskanälen positiv ist.
Im Falle, dass diese Bedingung erfüllt ist, ist die Auswertung folgend:
1. optischer Kanal: FAM – Anwesenheit von Legionella (treshold 50RFU)
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2. optischer Kanal: HEX – Anwesenheit von M. pneumoniae (treshold 30RFU)
3. optischer kanal: ROX – Anweseheit von Ch. pneumoniae (treshold 10RFU)
4. optischer Kanal: Cy5 – Anwesenheit von B. pertussis (treshold 30RFU)
Problemlösung:
Problem
Ursache
1. Probleme bei der Extraktion der siehe Anleitung zum
Nukleinsäure
verwendeten
Extraktionskit
a) das Enzym wurde der
Reaktion nicht zugegeben
oder ist nicht aktiv
b) der Thermocycler
beendete die verlangte
Zyklen-Anzahl nicht
2. Positive Proben und positive
Kontrollen sind negativ
c) während der Extraktion
mittels Qiagen System
wurde der Waschpuffer
nicht völlig beseitigt
d) positive Kontrolle oder
positive Proben wurden
wiederholt aufgetaut und
wieder eingefroren
e) positive Kontrolle oder
positive Proben wurden
bei der falschen
Temperatur gelagert
f) ein Teil oder das ganze
Kit wurde falsch gelagert
oder ist abgelaufen
g) bei der Extraktion
mittels Qiagen-System
wurde das Ethanol in die
zugehörigen Puffer nicht
zugegeben
3. Negative Kontrollen oder
negative Proben sind positiv
a) PCR-Kontaminierung
von der vorigen Analyse
oder die Kontaminierung
während der Analyse
Empfehlung zur Verbesserung
Siehe Anleitung zum verwendeten
Extraktionskit
Vergewissern Sie sich, ob das
Enzym in das richtige
Reaktionsgefäß zugegeben wurde,
wiederholen Sie die Analyse
Wiederholen Sie die Amplifikation
und die nachstehenden Schritte
Vergewissern Sie sich, ob die
Zentrifugierungsgeschwindigkeit
bei der Extraktion richtig eingestellt
wurde, wiederholen Sie die
Extraktion und folgende Schritte
Vermeiden Sie das wiederholte
Auftauen, wiederholen Sie die
ganze Prozedur mit neuen
Kontrollen/Proben
Lagern Sie die Proben und die
Kontrollen immer bei der vom
Hersteller empfohlenen
Temperatur, wiederholen Sie die
Analyse mit neuen Kontrollen /
Proben
Vergewissern Sie sich, ob alle
Komponenten bei der richtigen
Temperatur gelagert wurden und
ob das Kit-Ablaufdatum nicht
überschritten wurde
Vergewissern Sie sich, ob das
Ethanol in die zugehörigen Puffer
zugegeben wurde, wiederholen
Sie die Extraktion und
anschließende Analyse
- tauschen Sie die Pipettenspitzen
nach jedem Pipettieren
- verwenden Sie Pipettenspitzen
mit Filter
- beachten Sie die empfohlene
Trennung der einzelnen
Arbeitsschritten
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Rev_24.9.2012, ver24092012
a) Das Eluat war zu lang
gelagert, bevor es
analysiert wurde
4. Ergebnis-Werte niedriger als
erwartet
b) die Extraktion war zu
langsam oder wurde
unterbrochen
c) PCR erfolgte aufgrund
der schlechten
Handhabung mit dem Kit
nicht optimal
- verwenden Sie die UV-Lampen
und das Desinfektionsmittel für alle
Arbeitsflächen
- tauschen Sie die Handschuhe
regelmäßig
- handhaben Sie alle Reagenzien
vorsichtig
- vermeiden Sie den Kontakt mit
der inneren Fläche des
Reaktionsgefäßes und dem Deckel
beim Pipettieren
- wechseln Sie die Positionen der
Reaktionsgefäße im Ständer sowie
in der Zentrifuge
- halten Sie das Labor sauber
Wiederholen Sie die ganze
Analyse mit neuen Kontrollen und
Proben
Es wird empfohlen, die isolierten
Proben möglichst bald nach der
Extraktion zu analysieren,
wiederholen Sie die Extraktion und
führen Sie anschließend RT PCR
durch
Es ist empfohlen die Proben
kontinuierlich ohne unnötige
Zeitverluste zu verarbeiten,
wiederholen Sie die Extraktion und
anschließende Analyse
Vergewissern Sie sich, ob das Kit
unter optimalen, durch den
Hersteller empfohlenen
Bedingungen, gelagert wird;
wiederholen Sie die Analyse
DYNEX LABORATORIES, s.r.o
Vodičkova 791/41
Praha 110 00
Tel.: +420 220 303 600
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