Roti®-Fect PLUS

Roti-Fect PLUS
Zur Transfektion eukaryontischer Zellen in Kultur,
vor allem für schwer transfizierbare Zelllinien und
siRNA-Assays
I Produktbeschreibung
®
Roti -Fect PLUS ist das Transfektionsreagenz der neuen
Generation, angepasst an hochwertige, sensitive Assays und die
Anforderungen der modernen Wissenschaft.
Roti-Fect PLUS verringert die toxischen Effekte der Transfektion
noch weiter und kann somit auch bei sehr sensitiven Zelllinien oder
primären Zellen angewandt werden. Besonders geeignet ist RotiFect PLUS, wenn nach Transfektion in vivo Analysen angeschlossen
werden sollen (z.B. siRNA-Assays oder in vivo life Mikroskopie), da
der Zellstress minimiert und damit u.a. die Rate Apoptose-induzierter
Zellen reduziert wird. Zusätzlich ist die Stabilität der
Nukleinsäure/Lipid-Komplexe im Vergleich zum Roti-Fect etwas
verrringert, was die Freisetzung der Nukleinsäure in den Zellen
erleichtert. Die neue Liposomenformulierung von Roti-Fect PLUS
garantiert somit sichere und hocheffiziente Transfektionen, auch bei
schwer transfizierbaren oder sehr sensitiven Zelllinen. Dabei arbeitet
Roti-Fect PLUS weitgehend unabhängig von der An- oder
Abwesenheit von Serum während der Transfektion.
®
Ein Milliliter Roti -Fect PLUS reicht aus, um 50 - 200 Transfektionen
®
auf Zellkulturschalen mit 35 mm Durchmesser durchzuführen. Roti Fect PLUS wird als gebrauchsfertige Lösung geliefert.
Carl Roth GmbH + Co. KG
Schoemperlenstraße 3-5
76185 Karlsruhe
Postfach 100121
76231 Karlsruhe
Telefon: +49 (0) 721/ 5606-0
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Internet: www.carlroth.de
s.s. 11/2014
Stabilität:
Bei 4 °C oder -20°C mindestens 6 Monate
haltbar.
Kulturmedien:
Für serumhaltige und serumfreie
Medien geeignet.
Lagertemperatur:
4 °C
Versand:
bei Raumtemperatur
Nur für Forschungszwecke in vitro, nicht zur diagnostischen,
therapeutischen oder anderer klinischen Anwendung an Mensch
oder Tier geeignet.
Abbildung
Transfektioneffizienz von Roti-Fect PLUS in Prozent. Zur
Standardisierung wurde die Transfektionseffizienz von Roti-Fect =
100% verwendet. Im Vergleich zu Roti-Fect erzielt Roti-Fect PLUS
wenigstens vergleichbare Ergebnisse. Bei einigen Zelllinien, die
durch Roti-Fect schwer zu transfizieren sind wie Vero, CV1 oder
CHO-K1 Zellen, erreicht Roti-Fect PLUS eine um etliche 100%
gesteigerte Transfektionseffizienz.
Anwendungshinweis: Vor Gebrauch sanft schütteln.
II. Allgemeine Daten
Qualitätskontrolle:
Die Qualität wird durch einen Standardtransfektionstest geprüft.
Mittels Thioglycolatlösung wird eine Kontamination durch Bakterien
oder Pilze ausgeschlossen.
Zellen: Wir empfehlen, nur regelmäßig passagierte und frisch
ausgesäte Zellen für Transfektionsexperimente zu benutzen.
Verwenden Sie gut proliferierende Zellen und säen Sie sie am Tag
vor der Transfektion auf ca.30 % Konfluenz aus. Bei der Transfektion
sollten Zellen ca. 50-60 % tatsächliche Konfluenz haben, was häufig
einer optischen Konfluenz von ca. 80-100 % entspricht. Achten Sie
darauf, Zellen in der exponentiellen Wachstumsphase zu verwenden,
da nur die Zellteilung den Transport der DNA in den Nukleus
ermöglicht. Für siRNA-Transfektionen sind üblicherweise etwas
geringere Zelldichten ausreichend. Achten Sie weiterhin sorgfältig
darauf, dass die Kulturen frei sind von Kontaminationen mit
Mykoplasmen und Pilzen (Hefen).
Zur Beachtung
Auch nach vielfachen (bis zu 50) Zyklen von Einfrieren (-20 °C) und
Auftauen zeigt sich keinerlei Verringerung der Transfektionseffizienz.
Stabilitätstests haben gezeigt, dass die Transfektionseffizienz von
®
Roti -Fect PLUS (unabhängig von der Lagerzeit) sogar noch weiter
steigen kann, wenn die Liposomenformulierung bei -20 °C
aufbewahrt und zum Gebrauch sorgfältig aufgetaut wird. Für eine
Langzeitlagerung empfehlen wir deshalb eine Temperatur von -20
°C. Für eine regelmäßige (z.B. tägliche) Entnahme empfiehlt es sich
allerdings, das Reagenz nach wie vor bei 4 °C zu lagern, um die
Handhabung zu erleichtern.
Erfolgreich getestet auf folgenden Zelltypen:
siRNA: 1BR3, HEK293, HeLa, LN-308, T98G. U87MG, UACC-257
Primäre Zellen: 1BR3, 8VM, CGN, HMEC, HUVEC, PBMC, S15VM
Zelllinien: 1BRneo, 143B, 293T, NSCLC, alphaTC1, B16-F10, BHK-21, C2C12, C6,
CHO, CHO-K1, Colo205, COS-7, EVLC2, HaCaT, HAEC, HCT116, HEK293, HeLa,
HepG2, Hep 3B, IMR32, Jurkat, Kelly, KG1, La1-5S, LN-308, M2-10B4, MDCK,
MEF, MG-63, MIN6, MLEC32, mPAC, mpkCCD, N18TG2, N2a, N-Tera2, NG NIH3T3, Panc-1, PC 12, Phi-NX, Raji, RAW264.7, RD, RF24, RGE, S2, S91, SMA-560,
SK-N-BE, SW480, T98G, U-2 OS, Vero, u.a.
Antibiotika: Bitte beachten Sie die Angaben zum antibiotikafreien
Arbeiten in manchen Arbeitsschritten. Die Verwendung von
Antibiotika im Transfektionsmedium kann in manchen Fällen zum
Zelltod führen. Nach dem Transfektionsprozedere wird das
Transfektionsmedium durch ein entsprechend dafür gewähltes
Medium inklusive Antibiotika ausgewechselt.
Nukleinsäure: Verwenden Sie nur Nukleinsäure (DNA/ssRNA/siRNA) höchstmöglicher Reinheit und frei von Endotoxinen. Setzen
®
Sie die Nukleinsäure vor Komplexbildung mit Roti -Fect PLUS frisch
an und halten Sie sie nicht länger als 5 min als Lösung in
serumfreien Medium, da die Nukleinsäure am Plastik/Glas adsorbiert
und die Transfektionseffizienz sinken kann. Pipettieren Sie immer
zuerst das Medium. Polypropylen besitzt die niedrigsten
Nukleinsäurebindungswerte.
Achten Sie auf jeden Fall während eines Experiments darauf, dass
(bis auf absichtlich veränderte Parameter) die Bedingungen
zwischen den Einzelansätzen identisch sind.
III. Arbeitsanleitungen
Verwenden Sie die hier in Klammern gegebenen Daten als
Startwerte. Zur Optimierung finden Sie weiter unten hilfreiche
Angaben.
III.1. Transfektion von adhärenten Zellen (24-wells)
5
1. Plattieren Sie 0,4-2,0 x 10 Zellen in geeignetem vollständigen
Wachstumsmedium in einer 16 mm Kulturschale (24-well) aus.
2. Inkubieren Sie die Zellen für 18-24 Stunden bei 37 °C in einem
CO2 -Inkubator bis sie ca. 50-60 % konfluent sind (optische
Konfluenz i.d.R. 80-100 %, die erforderliche Zeit hängt vom
Zelltyp ab).
3. Bringen Sie die Stocklösungen von Nukleinsäure und
Transfektionsreagenz auf Raumtemperatur und wirbeln Sie sie
sanft auf.
4. Stellen Sie folgende Lösungen in Reaktionsgefäßen oder 96-well
Platten her:
A: 0,1-1 µg DNA/RNA in 30 µl Medium, das kein Serum und
keine Antibiotika enthält (wir schlagen 0,5 µg für das erste
Experiment vor).
®
B: 0,5-5 µl Roti -Fect PLUS in 30 µl Medium, das kein
Serum und keine Antibiotika enthält (wir schlagen
2 µl für das erste Experiment vor).
Mischen Sie die Lösungen jeweils durch vorsichtiges Auf- und
Abpipettieren.
Bitte beachten: Die Lösungen müssen frisch angesetzt und
sofort verwendet werden. Standzeiten reduzieren die
Transfektionsefizienz.
5. a.) Vereinigen Sie beide Lösungen ohne zu mischen, und
inkubieren Sie bei Raumtemperatur für 15-20 min, damit sich die
Nukleinsäure/Lipid-Komplexe bilden können.
b.) Während der Komplexbildung waschen Sie die Zellen einmal
mit PBS (Phosphat gepufferte Kochsalzlösung) und befüllen Sie
die Kulturschale mit 0,5 ml serumhaltigem Medium ohne
Antibiotika.
6. Geben Sie den Nukleinsäure/Lipid-Komplex nach spätestens
20 min zu den Zellen, mischen Sie vorsichtig durch Schwenken
und inkubieren Sie für 2-6 Stunden bei 37 °C in einem CO2
Inkubator (wir schlagen 6 Stunden für das erste Experiment vor).
7. Bei sehr empfindlichen Zellen sollte nun das
Transfektionsmedium entfernt und durch ein vollständiges
Kulturmedium ersetzt werden.
8. Inkubieren Sie die Zellen mit oder ohne Transfektionskomplex für
weitere 15-20 Stunden bei 37 °C in einem CO2 -Inkubator.
9. Ersetzen Sie das Transfektionsmedium durch frisches,
vollständiges Medium.
10. Führen Sie einen Test auf Reportergenaktivität 24-72 Stunden
(je nach Zelltyp und Promotoraktivität) nach dem Beginn der
Transfektion durch (wir schlagen 24 Stunden für das erste
Experiment vor).
III.2. Transfektion von Suspensionszellen (24-wells)
1. Waschen Sie die Zellen einmal mit PBS (Phosphat gepufferte
Kochsalzlösung).
5
2. Säen Sie 0,16-0,8 x 10 Zellen in 0,5 ml geeignetem
Wachstumsmedium ohne Antibiotika in einer 16 mm
Kulturschale (24-well) aus.
3. Bringen Sie die Stocklösungen von Nukleinsäure und
Transfektionsreagenz auf Raumtemperatur und wirbeln Sie sie
sanft auf.
4. Stellen Sie folgende Lösungen in Reaktionsgefäßen oder
96-well Platten her:
A: 0,1-1 µg DNA/RNA in 30 µl Medium, das kein Serum und
keine Antibiotika enthält (wir schlagen 0,5 µg für das erste
Experiment vor).
®
B: 0,5-5 µl Roti -Fect PLUS in 30 µl Medium, das kein
Serum und keine Antibiotika enthält (wir schlagen
2 µl für das erste Experiment vor).
Mischen Sie die Lösungen jeweils durch vorsichtiges Auf- und
Abpipettieren.
Bitte beachten: Die Lösungen müssen frisch angesetzt und
sofort verwendet werden. Standzeiten reduzieren die
Transfektionsefizienz.
5. Vereinigen Sie beide Lösungen ohne zu mischen, und
inkubieren Sie bei Raumtemperatur für 15-20 min, damit sich
die Nukleinsäure/Lipid-Komplexe bilden können.
III.3. Transfektion von siRNA
Achten Sie hier besonders sorgfältig auf die hervorragende Qualität
aller Reagenzien, die Einhaltung der Zeiten und die Qualität der
Zellen.
5
1. Plattieren Sie 0,1-1,0 x 10 Zellen in geeignetem vollständigen
Wachstumsmedium in einer 16 mm Kulturschale (24-well) aus.
2. Lassen Sie die Zellen gut absetzen und sich von der Passage
erholen. Solldie Transfektion am nächsten Tag stattfinden, kann
die Zellzahl weiter reduziert werden, um bei der Transfektion
eine optische Konfluenz von 30-50 % zu erhalten. Die Zellzahl
muss optimiert werden.
3. Bringen Sie die Stocklösungen von siRNA und
Transfektionsreagenz auf Raumtemperatur und wirbeln Sie sie
sanft auf.
4. Errechnen Sie sich die zu pipettierenden Mengen an siRNA (4.)
und Medium (1.), so dass bei entsprechenden µg siRNA jeweils
30 µl entstehen. Stellen Sie folgende Lösungen in 2 x 4
Reaktionsgefäßen oder 96-wells her (Pipettieren Sie auf jeden
Fall zuerst das Medium!):
1. und 2. Medium ohne Serum und ohne Antibiotika
®
3. Roti -Fect PLUS
4. Die errechnete Menge siRNA
A1
A2
A3
A4
siRNA
0,1 µg
0,2 µg
0,5 µg
2 µg
= gesamt
30 µl
30 µl
30 µl
30 µl
B1
B2
B3
B4
39,5 µl
39 µl
37,5 µl
30 µl
Roti -Fect
PLUS
®
0,5 µl
1 µl
2,5 µl
10 µl
= gesamt
40 µl
40 µl
40 µl
40 µl
1.
Medium (µl)
6. Geben Sie den Nukleinsäure/Lipid-Komplex nach spätestens
20 min tropfenweise zu der Zellsuspension, mischen Sie
vorsichtig durch Schwenken und inkubieren Sie für
2-6 Stunden bei 37 °C in einem CO2 Inkubator (wir schlagen
6 Stunden für das erste Experiment vor).
4.
siRNA (µl)
7. Bei sehr empfindlichen Zellen sollte nun das
Transfektionsmedium entfernt und durch ein vollständiges
Kulturmedium ersetzt werden.
2.
Medium
3.
8. Inkubieren Sie die Zellen mit oder ohne Transfektionskomplex
für weitere 15-20 Stunden bei 37 °C in einem CO2 -Inkubator.
9. Ersetzen Sie das Transfektionsmedium durch frisches,
vollständiges Medium.
10. Führen Sie einen Test auf Reportergenaktivität 24-72 Stunden
(je nach Zelltyp und Promotoraktivität) nach dem Beginn der
Transfektion durch (wir schlagen 24 Stunden für das erste
Experiment vor).
Mischen Sie die Lösungen jeweils durch vorsichtiges Auf- und
Abpipettieren.
Bitte beachten Sie: die hier vorgegebene Angaben sind Startmengen
und sollten von Ihnen optimiert werden.
Bitte beachten: Die Lösungen müssen frisch angesetzt und sofort
verwendet werden. Standzeiten reduzieren die Transfektionsefizienz
5. a) Vereinigen Sie A1 und B1, A2 + B2, A3 + B3, A4 + B4 ohne
zu mischen und inkubieren Sie bei Raumtemperatur für 15-20
min, damit sich die Nukleinsäure/Lipid-Komplexe bilden können.
b) Während der Komplexbildung waschen Sie die Zellen einmal
mit PBS (Phosphat gepufferte Kochsalzlösung) und befüllen Sie
die Kulturschale mit 0,5 ml serumhaltigem oder serumfreiem
Medium ohne Antibiotika.
6. Geben Sie den Nukleinsäure/Lipid-Komplex nach spätestens 20
min zu den Zellen, mischen Sie vorsichtig durch Schwenken
und inkubieren Sie bei 37 °C in einem CO2 Inkubator.
7. Testen Sie nach 24-72 Stunden die Expression des Zielgens.
Die Zeit hängt dabei ab von Zelltyp und Stabilität der siRNA und
des entsprechenden Proteins. Ein Austausch des Mediums
gegen frisches, komplettes Medium ist dabei i.d.R. nicht
notwendig. Zeigt sich doch eine Beeinträchtigung der Zellen, die
nicht auf die gewünschte Inhibition der Genexpression
zurückzuführen ist, kann das Medium nach
6 h gegen frisches, komplettes Kulturmedium ausgetauscht
werden.
Wurde während der Transfektion serumfreies Medium
verwendet, empfehlen wir den Austausch gegen komplettes
Kulturmedium nach 6 h.
III.4. Cotransfektionen
®
Roti -Fect PLUS ist besonders geeignet für Cotransfektionen von
Plasmid + Plasmid (auch Triple-Transfektionen) und siRNA +
Plasmid.
Da eine Plasmidtransfektion zum Transfektionszeitpunkt i.d.R. eine
höhere Zelldichte erfordert, empfehlen wir:
a) Verwenden Sie die Zellzahlen und das Plattierungsprotokoll der
„normalen“ DNA-Transfektion
®
b) Berechnen Sie den Ansatz Roti -Fect PLUS zur
Gesamtnukleinsäuremenge
®
c) Verwenden Sie Roti -Fect PLUS im Überschuss, wir empfehlen
ein Mindestverhältnis von Lipid zur Gesamtnukleinsäure von 2:1
IV. Optimierung
Jede Kombination aus Zelllinie, Nukleinsäure (DNA, RNA oder
siRNA) und Transfektiongefäß zeigt charakteristische, optimale
Mengenverhältnisse, die optimiert werden sollten, um die
bestmöglichen Ergebnisse zu erzielen. Übertragen Sie bitte auf
keinen Fall Protokolle anderer Transfektionsreagenzien direkt auf
®
Roti -Fect PLUS. Jedes Transfektionsreagenz besitzt seine
charakteristische molekulare Struktur mit ganz spezifischen
physikalischen Eigenschaften, die erheblichen Einfluss auf die
Nukleinsäure-Lipid-Verhältnisse haben.
®
Roti -Fect PLUS besitzt ein breites Wirkungsspektrum und -plateau,
so dass in aller Regel wenig Optimierungsarbeit geleistet werden
muss. Verwenden Sie die in der Anwendungstabelle gegebenen
Daten in Klammern als Startwerte und ermitteln Sie in weiteren
®
Versuchen eventuell das beste Verhältnis von Roti -Fect PLUS zur
®
Nukleinsäure. Grundlegend empfehlen wir, das Verhältnis Roti -Fect
PLUS (in µl) zur Nukleinsäure (in µg) zwischen 1:1 und 7:1 zu
wählen, also zwischen 1 und 7 µl Lipid pro µg Nukleinsäure.
IV.1. Parameter, die das Transfektionsergebnis beeinflussen:
®-
IV.1.1 Verhältnis von Roti Fect PLUS zu Nukleinsäure
Der wichtigste Optimierungsparameter. Für eine erfolgreiche
®Transfektion ist eine positive Überschussladung des Roti Fect
PLUS im Transfektionskomplex notwendig (Lipid (in µl):
®Nukleinsäure (in µg) mindestens 1:1). Das optimale Roti Fect
PLUS/Nukleinsäure-Verhältnis hängt von der jeweiligen Zell-Linie
ab. Wir empfehlen vor Start der relevanten Untersuchungen, dieses
Verhältnis durch eine Versuchsreihe zu optimieren.
IV.1.2 Quantität des Transfektionskomplexes
Eine zu große Menge an appliziertem Nukleinäure/Lipid-Komplex
kann zur Überexpression und/oder Lysis der Zellen führen und
damit zur Effizienzverringerung. Bitte beachten Sie: Ihre
physikalischen Eigenschaften bewirken, dass Lipide grundsätzlich
®auch Zell-Lysis-Reagenzien darstellen. Roti Fect PLUS wurde
optimiert, um die Toxizität möglichst gering zu halten, ein zu großer
Überschuss führt allerdings dennoch zur Zelllyse.
®Das optimale Roti Fect PLUS/Nukleinsäure-Verhältnis und die
optimale Menge des DNA/RNA/siRNA-Lipid-Komplexes variiert mit
der vorhandenen Anzahl der Zellen Halten Sie auf jeden Fall
Zellzahl und Inkubationsperiode während der Transfektions
konstant.
IV.1.3 Zellzahl
Bitte beachten Sie hierzu die Ausführungen unter IV.
Troubleshooting.
IV.1.4 Serum
®Die bisherigen Ergebnisse von Roti Fect PLUS Transfektionen
zeigten keine Seruminhibition (10 % Serum). Falls eine andere
verwendete Zellinie dennoch Serum-spezifische Inhibitionseffekte
®zeigt, kann die Transfektion mit Roti Fect PLUS ohne Serum oder
unter serumreduzierten Bedingungen
®(5 %-10 %) durchgeführt werden. Das optimale Verhältnis von Roti
Fect PLUS zu Nukleinsäure und der Menge an Nukleinsäure-LipidKomplex kann bei verschiedenen Serumkonzentrationen variieren.
®Man beachte: Während der Komplexbildung zwischen Roti Fect
PLUS und Nukleinsäure darf sich kein Serum in diesem Ansatz
befinden, da Serum die Komplexbildung stark inhibiert. Ausgebildete
Lipid/Nukleinsäure-Komplexe sind nur mehr geringfügig
serumanfällig.
IV.1.5 Alter der Zellen
Gibt man den Transfektionskomplex auf adhärente Zellen kurz
(innerhalb ca. 1 Stunde) nachdem jene in das entsprechende
Kulturgefäß ausgesät wurden, so kann in einigen Fällen eine
erhebliche Effizienzsteigerung erreicht werden. Die anschließende
übliche Inkubationszeit muss nicht eigens angepasst werden.
IV.1.6 Transfektionszeit
Die zu transfizierenden Zellen können über einen sehr breiten
Zeitbereich (3 – 72 Stunden) mit dem Transfektionskomplex
inkubiert werden. Die effizienteste Transfektionszeit ist abhängig
von der Sensitivität der Zellen und muss bestimmt werden. Bitte
beachten Sie, dass eine erhebliche Verlängerung der
Transfektionszeit in toxischen Effekten resultieren kann.
IV.1.7 Analysezeit
Der Genaktivitätsassay sollte in einem Bereich von 24 – 72 Stunden
nach Beginn der Transfektion durchgeführt werden. Die optimale
Zeit wird durch den Zelltypus, die Promotoraktivität und dem
Expressionsprodukt (z.B. Toxizität) bestimmt.
IV.2 Optimierungsprotokoll
(für siRNA siehe III.3)
Verwenden Sie als Reportergen-zur Optimierung gut exprimierende
Plasmidkonstrukte wie pCMV-ßGal, pND2-Luc, pE-GFP o.ä. mit gut
nachweisbaren Expressionsprodukten.
®-
IV.2.1. Variieren Sie die Menge an Roti Fect PLUS innerhalb des in
der Tabelle vorgeschlagenen Intervalls (z.B. 2, 4, 6, 8, 10, 12 µl).
Halten Sie die Anzahl der Zellen bis zum Beginn der Transfektion
und die Nukleinsäure-Menge konstant bei den vorgeschlagenen
Mengen. Die Serumkonzentration während der Transfektionszeit
(=Inkubation mit dem Nukleinsäure-Lipid-Komplex) sollte mit der zur
Kultivierung der Zellen verwendeten übereinstimmen.
IV.2.2. Variieren Sie die Mengen an Nukleinsäure (z.B. 1, 1,5, 2,
®2,5, 3 µg Nukleinsäure) und halten Sie das optimierte Roti Fect
PLUS-DNA-Verhältnis konstant. Halten Sie die Anzahl der Zellen bis
zum Beginn der Transfektion konstant. Die Serumkonzentration
während der Transfektionszeit (=Inkubation mit dem
DNA/RNA/siRNA-Lipid-Komplex) sollte mit der zur Kultivierung der
Zellen verwendeten übereinstimmen.
IV.2.3. Wiederholen Sie die Schritte 1 und 2 unter serumreduzierten
und serumfreien Bedingungen.
4. Wiederholen Sie die Schritte 1 und 2 mit anderen Zellzahlen zum
Zeitpunkt der Transfektion (gegebenenfalls Wachstumskurve zur
Ermittlung der optimalen Aussaatmenge erstellen).
V. Up- und Down-Scaling
Für die ersten Experimente schlagen wir die in Klammern
angegebenen Mengen vor.
Kulturschale 
(mm)
7
(96 well)
16
(24 well)
22
35
(12 well) (6 well)
60
100
Wachstumsfläche
(cm2)
Ausplattierte
Zellzahl: adhärent
(x 105)
0,31
1,9
3,7
9
22
60
0,1-0,6
0,4-2,0
1-4
2,5-10
6-24
15-60
Ausplattierte
Zellzahl:
Suspensionzellen ( x 105)
Medium ohne
Antibiotika (ml)
(Schritt 5b)
DNA/RNA Menge
(µg)
Verdünnungsvol.
(µl) für DNA/
ssRNA und Roti®Fect PLUS (Schritt
4 a bzw. b)
0,040,24
0,16-0,8
0,41,6
1-4
2,49,6
6-24
0,15
0,5
1,0
2,0
4,5
12,0
Roti®-Fect PLUS
Menge (µl)
Ges.Vol. des
Transfektionsmediums (ml)
(Schritt 6 )
0,2-4
(0,6)
0,1800,21
0,04-0,3
(0,1)
15-30
0,08-1
(0,5)
30
0,2-2
(1)
50
0,4-7 (2)
0,56
0,8-15
(3)
1,1
0,4-5
(2)
100
1,5-35
(6)
2,2
0,8-12
(6)
300
3-90
(20)
5,1
1,6-34
(14)
600
6-250
(40)
13,4
VI. Trouble Shooting
®Spezifische Punkte zum Roti Fect PLUS
®
VI.I. Vermeiden Sie auf jeden Fall den Kontakt reiner Roti -Fect
PLUS-Lösung und reiner Nukleinsäure-Lösung mit dem
Behältermaterial (z.B.96 well Platten). Legen Sie immer serumund antibiotikafreies Medium vor und geben Sie die jeweiligen
Stocklösungen dazu!
VI.4. Vermindertes Zellwachstum und/oder
Toxizitätserscheinungen werden oft durch Überexpression (z.B.
bei hoher Transfektionseffizienz) hervorgerufen. Erhöhen Sie die
Konfluenz der Zellen und/oder erniedrigen Sie die Menge an
®
appliziertem Roti -Fect PLUS/Nukleinsäure-Konplex.
VI.5. Vermeiden Sie die Anwesenheit von Antibiotika im
Transfektionsansatz, da dies Zelltod verursachen und damit die
Transfektionseffizienz mindern kann.
VI.6. Im Falle sehr empfindlicher Zellen sollte die
Transfektionslösung nach 3-6 h durch frisches komplettes Medium
ausgetauscht werden.
Weitere, allgemeine Punkte:
Auswirkung
Mögl. Ursache
Kommentar
Niedrige
Transfektionseffizienz
Schlechte
Qualität der
DNA/RNA
Die DNA sollte für optimale Transfektionsergebnisse einen sehr
hohen Reinheitsgrad aufweisen
Die Zellen
befinden sich
nicht in der
Wachstumsphase oder sind
nicht gesund
Zellen, die zu lange konfluent
waren, lassen sich schwerer
transfizieren als schnell wachsende
Zellen. Es wird daher empfohlen,
regelmäßig passagierte Zellen für
Transfektionsexperimente
einzusetzen.
Konfluenz der
Zellen zu hoch
Ist die Konfluenz der Zellen
während der Transfektion zu hoch,
kann es zu einer Verringerung der
Aufnahmefähigkeit der Zellen
kommen.
Serumkonzenzentration falsch
Die Transfektion kann unter
Serumreduzierten Bedingungen
durchgeführt werden (5 % - 0 %)
Nukleinsäure zu
lang in serumfreiem Medium
vor Transfektion
Endotoxine verringern erheblich die
Transfektionseffizienz. Nukleinsäure
sollte vor Gebrauch max. 5 min. in
serumfreiem Medium aufbewahrt
werden.
Transfektionszeit
zu kurz
Eine Verlängerung der Transfektionszeit bis auf insges. 2 Tage
ist bei unempfindlichen Zellen
möglich.
Zellen zu alt
Eine Transfektion von frisch
ausgesäten Zellen kann eine höhere
Transfektionseffizienz ergeben.
Anwesenheit von
Antibiotika während der Komplexbildung oder
Inkubationszeit
Literaturdaten und eigene
Beobachtungen weisen darauf hin,
dass bei Anwesenheit von
Antibiotika Transfektionseffizienzen
stark reduziert werden können.
Menge an
Nukleinsäure und
Roti®-Fect PLUS
suboptimal
Wir empfehlen eine Optimierung
des Transfektionsprotokolls für jede
Kombination von Zelltyp und
Plasmid.
®
VI.2. Die Verdünnungen von Roti -Fect Liposomenformulierung
und DNA / RNA müssen frisch angesetzt und sofort (innerhalb von
5 min.) verwendet werden. Standzeiten reduzieren die
Transfektionsefizienz.
VI.3. Die Konfluenz der Zellen, die optisch per Mikroskop
bestimmt werden kann (“optische” Konfluenz = prozentuale
Bedeckung der Wachstumsfläche mit Zellen) ist nicht identisch mit
der Konfluenz, welche über die Wachstumsfläche bestimmt
werden kann (= reale Konfluenz). Beste Resultate werden erzielt,
wenn die Transfektion mit Zellen im höchsten
Proliferierungszustand (= 30-60 % reale Konfluenz) durchgeführt
wird. Dies korreliert meistens mit der „optischen“ Konfluenz von
90–100 %.
Exzessiver
Zelltod
Geringe
Reproduzierbarkeit
Serumkonzentration zu niedrig
oder Inkubationszeit in serumreduziertem
Medium zu lang
Die Serumkonzentration sollte an
die Standardkulturbedingungen
angeglichen werden.
Menge an
Nukleinsäure
Roti®-Fect PLUSKomplex zu hoch
Abhilfe durch Reduktion
Inkubationszeit
mit dem
Nukleinsäure
Roti®-Fect PLUSKomplex zu lang
Abhilfe durch Verkürzung
Zellen gestresst
Vermeiden Sie Temperaturschwankungen und zu lange
Zeiträume, in denen die Zellen ohne
Serum auskommen müssen. Führen
Sie die Transfektion in Anwesenheit
von Serum durch.
Unterschiedliche
Konfluenz der
Zellen
Stellen Sie die gleiche Zellzahl bei
den Experimenten sicher (plattieren
Sie die gleiche Zellzahl aus und
inkubieren Sie gleich lange
Zeiträume bis zur Transfektion).
Mikrobiologische
Kontamination
Mikrobiologische Kontamination z.B.
Mykoplasmen oder Pilze können
Transfektionsergebnisse drastisch
verändern.
Zellen zu oft
passagiert
Die Morphologie und damit die
Transfektionsergebnisse können
sich bei hoher Passagenzahl der
Zellen verändern. Häufig sinkt dabei
die Transfektionseffizienz.
Serumqualität
Unterschiedliche Serumqualitäten
können zu unterschiedlichen
Transfektionsergebnissen führen.
Stellen Sie gleichbleibende Qualität
für alle Experimente sicher.
Roti®-Fect PLUS
0,2 ml
1,0 ml
CL21.1
CL21.2