rebirth | News 3.2010

Transcription

rebirth | News 3.2010
Inhalt/Contents
Seite/Page 1 – 2
Titelthema/Cover story
Seite/Page 3 – 11
Neue wissenschaftliche
Ergebnisse/
New scientific findings
Seite/Page 12 – 18
Mitteilungen und Meldungen/
News and updates
Seite/Page 19 – 20
Methodik/Methodolgy
Seite/Page 18
Impressum/Imprint
Axel Haverich
Koordinator
Coordinator
Vorwort
Titelthema | Cover story
Lasergestütztes Bioprinting: Eine
Methode Gewebeersatz zu drucken
Laser-assisted bioprinting: a way to
print autologous tissue substitutes
Martin Gruene, Lothar Koch, Boris Chichkov (RG Biological Laser Printing)
Durch die gesteigerte Lebenserwartung der
Menschen ist der Mangel an geeigneten
Spenderorganen ein schwerwiegendes Problem für medizinische Therapien geworden.
Eine viel versprechende Lösungsmöglichkeit dieses Problems ist die Entwicklung
von neuartigen biologischen 3D-Druckern
für die Herstellung von autologem Gewebeersatz und lebenden Organen.
Die Herstellung lebender Organe aus Zellen mit
Hilfe eines Druckers sowie eines Computers ist
ein großer Traum aller Biotechniker. Obwohl
das Drucken vollständiger Organe wahrscheinlich noch längere Zeit ein Traum bleiben wird,
l weiter auf Seite 2
Increasing life expectancy means that a
shortage of donor organs is becoming an
urgent and serious problem in human
medicine. One way of solving it is by developing novel biofabrication methods for the
construction of required autologous tissue
substitutes and living organs.
Taking living cells, a computer, and a printer in
order to generate living organs is a vision shared
by all tissue engineers. And, although the dream
of printing a complete organ is likely to remain
just that for some time, recent studies demonstrate that computer-aided bioprinting (CAB) of
tissue replacements is within reach.
l continued on page 2
Ich freue mich, Ihnen erneut die neuesten
Ergebnisse aus unserem Exzellenzcluster
präsentieren zu können. Lesen Sie, wie
unsere Forscher neue Methoden entwickeln und optimieren basierend auf Techniken wie Laser, PCR oder Vektoren. Und
begleiten Sie auch dieses Mal Dr. Smart
bei seinem Versuch, eine klinische Studie
ins Leben zu rufen. Zudem wird REBIRTH
am 1. November 2010 im bundesweiten
Innovationswettbewerb „365 Orte im
Land der Ideen“ als einer der diesjährigen Preisträger ausgezeichnet werden. Wir
würden uns freuen, Sie dann zu der Preisverleihung sowie einer Ausstellung 4 Jahre made by REBIRTH begrüßen zu dürfen.
Ich wünsche Ihnen viel Spaß beim Lesen
Foreword
Once more I am delighted to be able to
present you the latest findings of our Cluster of Excellence. Read more about our scientists who develop and optimize Methods
based on various techniques as Laser, PCR
or Vectors. And accompany our intrepid
Dr Smart once again as he endeavours to
initiate a clinical study. Besides, REBIRTH
will be honoured as one of this year’s
prize-winners in Germany’s nationwide innovation contest, ‘365 Landmarks in the
Land of Ideas’. We would be delighted if
we can welcome you to the prize-giving
ceremony and the exhibition REBIRTH:
four years of cutting-edge research.
And I hope you enjoy reading this issue.
2 | rebirth News 3.2010
Abb 1
Abb 2
Abb. 1: (A) Perspektivische Darstellung des LaBP-Prinzips; (B) Flow Cytometrie-Analyse des Phänotyps und Proliferationsuntersuchung von gedruckten MSCs im Vergleich zu ihrer nicht gedruckten
Kontrolle; (C) Immunfluoreszenz-Aufnahme von Fibroblasten (grün eingefärbt) sowie Keratinozyten
(blau eingefärbt), welche in ein Schachfeldmuster gedruckt wurden. Maßstab: 1 mm.
Abb. 2: Differenzierung von 3D-MSC-Gitterstrukturen in unterschiedliche Geweberichtungen. Maßstab: 1 mm.
Fig. 1: (A) Perspective representation of the principle of laser-assisted bioprinting; (B) Flowing cytometric analysis of the phenotype and proliferation assessment of printed MSCs in comparison with
their non-printed control; (C) immunofluorescence microscopic image of fibroblast (green staining)
and keratinocytes (blue staining) printed in a checkerboard pattern. Scale bar: 1 mm
Fig. 2: Multilineage differentiation of a 3D MSC patch printed in a grid pattern. Scale bar: 1 mm
Titelthema
l weiter von Seite 1 ist die Herstellung von
Gewebeersatz durch Computer-aided Bioprinting-Ansätze (CAB) in greifbare Nähe gerückt, wie
jüngste Studien belegen. Allgemein kann man
alle existierenden CAB-Ansätze in zwei Kategorien unterteilen: düsenbasierte und düsenfreie
Drucktechniken. Unter den düsenfreien Drucktechniken besitzt die Laser-assisted Bioprinting
Technik (LaBP) die Möglichkeit, Hydrogele jedweder Viskosität sowie Zelldichten reproduzierbar mit einer Mikrometerauflösung zu drucken.
In jüngsten Studien wurde von unserer Gruppe
das schädigungsfreie Drucken von Mesenchymalen Stammzellen (MSCs) mittels LaBP gezeigt.
Hierbei konnte durch Zellüberlebend-, Proliferations-, Apoptose-, DNA-Schädigungs-Nachweise
und Untersuchungen des Phänotyps nachgewiesen werden, dass MSCs ohne nachweisbare
Effekte hinsichtlich des Geno- sowie des Phänotyps gedruckt werden können (vgl. Abb.1B).
Zusätzlich wurden als Machbarkeitsnachweis
zwei unterschiedliche Zelltypen in eine Schachfeldstruktur gedruckt, welche ausschnittsweise
in Abbildung 1C dargestellt ist (Kooperation mit
der Arbeitsgruppe um Prof. Vogt (MHH) und Prof.
Steinhoff (Uni Rostock)).
Nachdem in der letztgenannten Studie der schädigungsfreie 2D-Übertrag von Zellen gezeigt
wurde, lag der Schwerpunkt der darauf folgenden Arbeiten auf der Herstellung von Gewebe
über autologe 3D-MSC-Strukturen. Durch die
Nutzung eines Hydrogelkomplexes (Alginat/
Blutplasma-Gemisch), welcher in der Anwesenheit von divalenten Kationen gelartige Vernetzungen ausbildet sowie den eingebetteten
Zellen einen Überlebensraum bietet, wurde die
Herstellung von 3D-MSC-Strukturen mit einer
Gittergeometrie ermöglicht. Anschließend wurden die 3D-MSC-Gitterstrukturen unter osteogenen, adipogenen und chondrogenen Differenzierungsbedingungen kultiviert (vgl. Abb. 2).
Das mehrgewebige Differenzierungspotential
der gedruckten 3D-Strukturen wurde mittels reverser Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion
(RT-PCR) und quantitativer Untersuchungsreihen
der gewebespezifischen Proteine nachgewiesen
und es konnte gezeigt werden, dass die gedruckten 3D-Strukturen Richtung Knochen, Fett und
Knorpel differenzieren (Kooperation mit der JRG
Biothermodynamics). Eine jüngst in unserer Arbeitsgruppe „Biological Laserprinting“ etablierte
Technik ist ein 3D-Zell-Array, welches für Zell-Zellsowie Zell-Umgebungs-Untersuchungen verwendet werden kann.
Zusammengefasst ermöglicht LaBP das Drucken
von: (1) verschiedenen Zelltypen nachweisbar
schädigungsfrei, (2) Zell-Strukturen mit frei einstellbarer Zelldichte und mikrometergenauer
Auflösung sowie (3) 3D-Strukturen, welche unter Langzeit-Kultivierungsbedingungen ihre gedruckte Struktur behalten.
Cover story
l from page 1 In general, all existing CAB ap-
proaches fall into one of two categories: orifice or
orifice-free techniques. Of the orifice-free techniques, laser-assisted bioprinting (LaBP) based
on laser-induced forward transfer (Fig. 1A) has
the capability to print – with micrometre resolution and in a precise and reliable manner – hydrogels of any desired viscosity and cell density.
In recent studies, we showed that mesenchymal
stem cells (MSCs) can be printed in a non-detrimental way. By focusing our investigations on cell
survival, proliferation, apoptosis, and cell DNA
damage, as well as phenotype changes, we demonstrated that MSCs can be printed without any
observable damage to either phenotype or genotype (Fig. 1B). As a proof of concept, we printed
two different cell types in a 2D checkerboard pattern illustrated in Figure 1C (collaborative effort
with the group lead by Professor Vogt (MHH) and
Professor Steinhoff (Rostock Uni)).
After meeting the basic criteria for all bioprinting approaches, we investigated the biofabrication of 3D autologous tissue grafts consisting
of MSCs. By using a hydrogel-complex (alginate
/ blood plasma) that is able to gel in the presence of bivalent cations (e.g. calcium) and support the embedded MSCs, we printed 3D MSC
grafts in a grid pattern. Afterwards, the 3D MSC
grid patterns were cultivated under osteogenic,
adipogenic, and chondrogenic culture conditions
while retaining their predefined structure (Fig. 2).
The multilineage differentiation potential of the
3D grafts was confirmed by the method of reverse
transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR)
and quantitative assessment of tissue-specific
proteins, demonstrating that the laser-printed
3D MSC grafts differentiate towards bone, fat
and cartilage (collaborative effort with JRG Biothermodynamics). Recently, the RG Biological
Laser Printing has established a technique for
the fabrication of 3D cell arrays to study cell-cell
and cell-environment effects.
In summary, LaBP has the capability to print: (1)
different cell types in a non-detrimental manner;
(2) cell patterns with a free adjustable cell density and micrometer resolution; and (3) 3D patterns that retain their predefined shape under
culture conditions.
For further information, please contact Martin
Gruene ([email protected]).
1. Koch et al., Laser Printing of Skin Cells and Human Stem Cells, Tissue Eng. Part C, doi: 10.1089/
ten.tec.2009.0397 (2009).
2. Gruene et al., Laser Printing of stem cells for biofabrication of scaffold-free autologous grafts,
Tissue Eng. Part C, doi:10.1089/ten.TEC.2010.0359
(2010).
rebirth News 3.2010 | 3
Neue wissenschaftliche Ergebnisse | New scientific findings
Willem F. Wolkers (Biomedical Process Technology)
Membranreaktion beim Trocknen [2]
Laut der „Hypothese über Wasserersetzung“
bewirkt Trehalose eine Stabilisierung der Membran, indem sie die Abstandsverkürzung zwischen
angrenzenden Phopspholipid-Kopfgruppen während der Dehydratation verhindert (Abb. 2). Die
„Hypothese über Wassereinschluss“ postuliert
hingegen, dass Zucker im Trockenzustand das
Restwasser an der Biomolekül-Zucker-Schnittstelle festhält. In Abwesenheit von Trehalose
weisen Lipide einen Fluid-Gelphasenübergang
beim Trocknen auf, wohingegen die Dehydratationsrate in Anwesenheit von Trehalose abnimmt
und der Übergang in die Lipidphase verhindert
wird. Außerdem sind die Restwassergehalte
deutlich höher, wenn Trehalose vorhanden ist.
Wir schließen daraus, dass sich die Wirkung der
Trehalose auf die Lipidphase während des Trocknens eher auf Wassereinschluss als auf Wasserersetzung erklärt.
Die gemessenen biophysikalischen Membranparameter werden zur Voraussage der zellspe-

CH2 (cm )
B
6
ice
5
2851.0
2850.5
4
WTC2
3
2850.0
2849.5
Cellular membranes are the primary site of
injury during freezing or drying of cells and tissues. Understanding the behaviour of biomembranes during freezing and drying can be used
to predict cryobiological outcomes, i.e. post-thaw
survival of cryopreserved cells and tissues. The
REBIRTH group Biomedical Process Technology
uses Fourier transform infrared spectroscopy for
real-time studies of biospecimens during freezing or drying.
liquid crystalline phase
2851.5
2849.0
20
water
Tn = -1.9 oC
10
2
WTC1
0
gel phase
1
-10 -20 -30 -40 -50
temperature (oC)
Abb. 1: Membranphasenverhalten (geschlossener Kreis) und Eisformation (offener Kreis) von
Hengstspermien während des Gefrierens. Daten
beruhend auf [1]. dehydration
Fig. 1: Membrane phase behaviour (filled circles) and ice formation (open circles) of stallion
spermatozoa duringrehydration
freezing. Data adapted
from [1].
Membrane response during freezing [1]
hydrated bilayer
dried bilayer, water removed
(liquid-crystalline
phase)
(gel phase)
Membrane
response during drying [2]
One of the main challenges in cryobiology is
to study membrane properties of cells in ice.
According to the water replacement hypothesis,
We have developed a new method for studying
trehalose stabilizes dry membranes by preventmembrane properties
ing the decrease indehydration
spacing between adjacent
2852.0 of mammalian cells at subliquid crystalline phase
zero temperatures. Ice formation
causes cellular B 6phospholipid headgroups during dehydration
rehydration
membranes to2851.5
undergo a profound transitionice (Figure 2). Alternatively,
the water entrapment hy5
to a highly ordered
gel
phase
(Fig.
1).
The
data
pothesis
postulates
that,
in the dried state, sug2851.0
can be used to determine the sub-zero mem4ars trap residual water at the biomolecule- sugar
water replaced with sucrose
hydrated bilayer, sucrose
2850.5
brane hydraulic
permeability
and for activating
interface. In
the absence of trehalose,
lipids dis(liquid-crystalline
phase)
(liquid-crystalline
phase)
WTC2
3
water transport through the plasma membrane
play a fluid-to-gel phase transition upon drying.
2850.0
in ice. These parameters
can be used in models
2In the presence of trehalose, dehydration rates
waterrates for WTC
to predict optimal
cooling
cryopreserva1
are decreased and lipid-phase transitions are
2849.5
1
tion. Two distinct water transport
prevented. In addition, residual water contents
gel phase
Tn = -1.9 Cprocesses have
2849.0
been identified,
likely reflecting those of free and
are clearly higher in the presence of trehalose.
20 10 0 -10 -20 -30 -40 -50
membrane-bound water.
The derived biophysical
We conclude that water entrapment, rather than
temperatureon
(oC)
membrane parameters are dependent
intrinwater replacement, explains the effect of trehasic cell properties as well as freezing extender
lose on lipid-phase behaviour during drying.
composition.
The obtained biophysical
membrane parameters
will be used to predict
dehydration
cell-specific process parameters (cooling rate,
ice nucleation temperarehydration
ture) for cryopreservation
of mammalian cells (i.e.
hydrated bilayer
dried bilayer, water removed
3T3 cells, human pulmo(liquid-crystalline phase)
(gel phase)
nary endothelial cells,
erythrocytes, stem cells).
area H2O (arbitrary units)
Membranreaktion beim Einfrieren [1]
Eine der größten Herausforderungen der Kryobiologie ist es, Membraneigenschaften von
Zellen in Eis zu untersuchen. Wir haben eine
neue Methode zur Erforschung von Membraneigenschaften von Säugerzellen unter null Grad
entwickelt. Eisbildung bewirkt eine tiefgreifende
strukturelle Veränderung der Zellmembran (Abb.
1). Die Messwerte können zur Bestimmung der
hydraulischen Membrandurchlässigkeit bei
Minustemperaturen sowie zur Aktivierung des
Wassertransports durch Plasmamembranen im
Eis genutzt werden. Diese Parameter können in
den Modellen zur Vorhersage der optimalen Abkühlgeschwindigkeit für die Kryokonservierung
verwendet werden. Es können zwei eindeutige
Wassertransportprozesse für freies und membrangebundenes Wasser identifiziert werden.
Die abgeleiteten biophysikalischen Membranparamenter sind von den eigentlichen Zelleigenschaften sowie von der Zusammensetzung des
Gefrierschutzmittels abhängig.
zifischen Prozessparameter (Abkühlungsrate,
Eiskeimbildungstemeratur) für die Kryokonservierung von Säugetierzellen (d.h. 3T3-Zellen,
menschliche pulmonale Endothelzellen, Erythrozyten, Stammzellen) verwendet.

CH2 (cm )
Schäden beim Einfrieren und Trocknen von Zellen und Geweben entstehen ausgehend von den
Zellmembranen. Die Kenntnis des Verhaltens
von Biomembranen beim Einfrieren und Trocknen kann zu Vorhersagen der kryobiologischen
Ergebnisse, also das Überleben von kryokonservierten Zellen und Gewebe nach dem Auftauen,
benutzt werden. Die REBIRTH-AG Biomedizinische Verfahrenstechnik verwendet das FourierTransformations-Infrarotspektrometer für die
Forschung von Bioproben beim Einfrieren und
Auftauen in Echtzeit.
2852.0
area H2O (arbitrary units)
Kryobiologie und Anhydrobiologie von Biomembranen
Cryobiology and anhydrobiology of biomembranes
o
dehydration
rehydration
hydrated bilayer, sucrose
(liquid-crystalline phase)
water replaced with sucrose
(liquid-crystalline phase)
Abb. 2: Wasserersatz/austausch Hypothese vorgeschlagen von Crowe und
Kollegen. Abbildung beruhend auf [3].
Fig. 2: Water replacement hypothesis proposed by Crowe and
co-workers. Figure adapted from [3].
[1] Oldenhof, H., Friedel, K.,
Sieme, H., Glasmacher, B., Wolkers, W.F. Cryobiology 61 (2010)
115–122.
[2] Wolkers, W.F., Oldenhof, H.,
Glasmacher, B. Cryobiology 61
(2010) 108–114.
[3] Wolkers, W.F. (2009) Biomedical FTIR spectroscopy of lipids.
In A. Barth, P.I. Haris, (eds.), Biological and Biomedical Infrared
Spe ctroscopy. pp. 272-287.
ISBN 978-1-60750-045-2.
„Multiplexing RMCE“: Ein neuartiger Ansatz
zur systematischen Gen-Modifikation von Stammzellen
‘Multiplexing RMCE’: novel options
for the systematic genomic modification of stem cells
Sören Turan, Juergen Bode (SU Molecular Imaging and Marking)
Ortsspezifische Rekombinasen wie Flp (mit den
Varianten Flpe und Flpo sowie Cre) zeigen neue
Wege zur vorhersagbaren Modifikation eukaryotischer Genome auf. Bei transienter Expression
in der Zelle induzieren diese Enzyme eine Rekombination zwischen zwei kurzen Zielsequenzen (den in Fig. 1C gezeigten „Flp-Rekombinase
Targets“, FRTs), wodurch die Deletion/Inversion
oder auch die (reversible) Verknüpfung zweier
DNA Segmente eingeleitet wird.
1994 haben wir das RMCE- (Rekombinasevermittelter Kassettenaustausch) Konzept
eingeführt, das die wiederholte Ansteuerung
charakterisierter genomischer Loci nach dem
in Abb. 1A dargestellten Prinzip ermöglicht. Wie
am Beispiel von ES-Zellen gezeigt, ist dabei die
Expression des so eingeführten Gens in hohem
Maße vorhersagbar. In diesem Modellexperiment konnten mehrere Klone isoliert, in Blastozysten injiziert und in vorbereitete Muttertiere
implantiert werden. Unter den Chimären befanden sich 12% GFP-Exprimierer, deren Blutzellen
einen hämatopoetischen Marker der ES-Zellen
aufwiesen (E. Ernst, D. Kioussis und J. Bode, unveröffentlicht).
Der Ausbau dieses Prinzips hat kürzlich die
durch homologe Rekombination (HR) vermittelte
Einführung („tagging“) solcher “FRT-Adressen”
in vorbestimmte genomische Loci und deren
wiederholte Nutzung („targeting“) nach dem
RMCE-Prinzip ermöglicht. Erwähnenswert ist
auch die Erweiterung des EUropean COnditional
Mouse Mutagenesis Programms (EUCOMM) um
dieses Prinzip, womit künftig Möglichkeiten zu
Gen-“trapping”-Ansätzen durch nachfolgende
RMCE-gesteuerte Modifikationsschritte eröffnet
werden. Zum gegenwärtigen Zeitpunkt stehen
hierfür 7013 Maus-ES-Zellinien mit Insertionen
an bekannten Genen zur Verfügung.
Kürzlich konnten wir das Potential dieses Konzeptes nochmals erweitern: Neue
„Multiplexing“-Ansätze ermöglichen seitdem
auch die simultane Modifikation mehrerer Loci
in einer (ES-, iPS- oder sonstigen) Zelle. Der Ansatz erforderte die systematische Generierung
weiterer FRT-“Spacer-Mutanten” nach dem in
Abb. 1B gezeigten Schema. Somit stehen jetzt
neun “heterospezifische” Varianten (F, F´, F´´…)
zur Verfügung, die paarweise und zusammen auf
ihr RMCE-Potential überprüft werden konnten.
Ein zentrales Ergebnis auf der Grundlage zweier
Sätze von FRTs (rot: F und F3; blau: F13 und F14)
ist in Abb. 2 dargestellt.
Unsere gegenwärtigen Projekte an embryonalen
(ES) und induzierten pluripotenten Stammzellen
(iPS) bauen auf dem Multiplexing-Ansatz auf.
Nachfolgend werden die Strategien zu deren Generierung und Differenzierung dargestellt (Punkt
1 und 2). Die Auswahl geeigneter genomischer
Loci wird durch deren Potential geleitet, offene
Chromatinstrukturen in den Phasen aufzuweisen, in denen die verantwortlichen Reprogrammierungs- und Differenzierungsfaktoren effizient
zu exprimieren sind. Auch die parallele Markierung („tagging“) und unabhängige Adressierung
(„targeting“) mehrerer Loci erscheint realistisch,
da die Architektur der eingesetzten FRT-Stellen
genomischen Instabilitäten vorbeugt. Derzeit
initiieren wir verschiedene Kooperationen innerhalb und außerhalb des REBIRTH-Projektes, die
auf folgende Erweiterungen des Systems bauen:
1) Einsatz von Flpo/FRT für ein sicheres
“flirting”-Prinzip analog zum etablierten
“floxing”-Verfahren (Cre-vermittelte Exzision
von loxP-flankierten Kassetten). Die Verfügbarkeit zahlreicher heterospezifischer FRTs
ermöglicht ein sicheres „flirting“ mehrerer
Kassetten in folgender Weise:
F – GOI1 – F;
F´ - GOI2 – F´…
Da F exklusiv mit F und F´ mit F´ rekombiniert,
sind Kreuz-Rekombinationen (und damit weit
reichende genomische Umlagerungen) ausgeschlossen.
2) Wie oben erwähnt, werden iPS Zellen mit den
folgenden zwei genomischen Adressen generiert:
F – [RF-SM] – FF´ und F´´– SM – F´´´
(RF = Reprogrammierungsfaktor-Kassette;
SM = Selektionsmarker)
Nach Etablierung des iPS-Status wird die [RFSM]-Kassette vermittelt durch einen Puls an
Flp- Aktivität deletiert, wobei die FRT-Paarung
F-F´ zurückbleibt; diese lässt prinzipiell die
Möglichkeit weiterer RMCE-Modifikationen
offen. Systembedingt kann dieser Locus
während der Reprogrammierung allerdings
stillgelegt werden (“silencing”). In diesem
Fall bietet sich der zweite RMCE-kompetente
Locus (F´´– SM – F´´´) für den Einbau einer
Kassette mit Differenzierungsfaktor-Genen
an geeigneter Stelle an. Die Markierung beider Loci setzt zunächst den HR-vermittelten
Einbau der obigen Kassetten voraus – ein
Prozess, der sich durch den kompetenten
Einsatz spezifischer Zn-Finger-Nucleasen unterstützen lässt.
3) Analog zu diesem Ansatz beginnt das EUCOMM-Projekt damit, die Möglichkeiten
mehrerer Sätze heterospezifischer FRTs auszuschöpfen: In vorliegenden ES-Zelllinien mit
induzierbarem Flp-System lassen sich allele
Loci vom Typ
F – AL1 – FF´ and F´´ – AL2 – F´´´
vom homozygoten (diploiden) Status, durch
Exzision der AL1-Kassette, in einen “pseudoheterozygoten” Zustand versetzen (“flirting”Prinzip). Da AL2 durch heterospezifische FRTs
flankiert wird, erlaubt RMCE die Einführung
von Mutanten, deren Effekt in Abwesenheit
einer zweiten Genkopie studiert werden
kann. Zusätzliche Optionen werden durch
Verbleib der F-F´-Kombination anstelle des
Allels AL1 eröffnet.
Abschließend bleibt festzuhalten, dass, aufgrund seiner bislang überlegenen Aktivität, für
anspruchsvolle genomische Modifikationen nur
das Cre/lox-System zur Verfügung stand, während sich der Einsatz des Flp/FRT-Systems auf basale Prozesse (Deletionen) beschränkte. Dies hat
sich mit der Einführung einer Codon-optimierten
Flp-Variante („Flpo“) entschieden geändert. Zu
diesem Wandel haben Berichte zur Existenz genomischer lox- „Pseudo-sites“ beigetragen, die
toxische Effekte einer anhaltenden Cre-Aktivität
dokumentieren. Parallel zu unserem Beitrag (Zitat unten) erschienen mindestens drei weitere
Veröffentlichungen, die derartige Phänomene
für des Flpo/FRT-System mit hoher Wahrscheinlichkeit ausschließen. Unser Multiplexing-Ansatz
unterstützt diesen Trendwechsel nicht zuletzt
dadurch, dass er Ansätze ermöglicht, die bisher den parallelen Einsatz zweier oder mehrerer
Rekombinase-Systeme erforderten.
Site-specific recombinases (SSRs such as Flp,
including Flpe and Flpo, as well as Cre) have
opened up new avenues for the predictable
modification of eukaryotic genomes. During their
transient expression in the cell they induce a recombination between two short identical target
sites (called ‘Flp recombinase targets’/FRT; see
Fig. 1C) in the case of the Flp/FRT system, leading
to excision/inversion or the (reversible) addition
of linked DNAs.
In 1994 we introduced the notion of recombinasemediated cassette exchange (Flp-RMCE) allowing
the repeated use of extensively pre-characterized
genomic sites with known expression properties
according to the principle illustrated in Figure 1A.
The efficiency of the procedure is exemplified by
a pilot experiment performed to demonstrate the
modification of murine ES cells. Derivative clones
were injected into blastocysts and implanted
into pseudopregnant foster mothers. Blood cells
of the chimeric offspring were analysed for GFP
expression plus surface antigens proving that 12
% of these expressed a haematopoietic marker
derived from the ES cells (E. Ernst, D. Kioussis
and J. Bode, unpublished).
Extensions of this principle have recently enabled the introduction of FRT targets, by homologous recombination (HR), into predetermined
genomic loci and the repeated, efficient use of
these sites by RMCE (‘tag-&-target’). Furthermore,
a highly flexible system was developed under the
EUropean COnditional Mouse Mutagenesis programme (EUCOMM), the emphasis of which has
recently shifted from gene trapping to Flp-RMCEmediated targeting using the resources that were
established in the first phase (7013 independent
trapped genes in mouse ES cells being available
for the subsequent modification of fully characterized expressing loci).
We have now been able to expand the potential
of this technology by adding multiplexing options, which enable the simultaneous modification of separate genomic loci in a given ES cell.
The procedure required the design of additional
FRT-spacer mutants (known as ‘heterospecific
FRTs’: F, F´, F´´… ) as indicated. We successfully
synthesized a variety of these mutants (nine in
total) and investigated their potential in an RMCE
context. Figure 2 illustrates the setup, selection
strategies and results.
Our current projects envisage the multiplexing
approach for the generation and differentiation
of ES and iPS cells (detailed in points 1 and 2 below). The choice of genomic loci to be addressed
is guided by their potential for acquiring and
maintaining open chromatin structures at times
where the effective expression of reprogramming
or differentiation factor genes is needed. Tagging
and independent targeting of several genomic
loci will be possible owing to the fact that genomically anchored cassettes will not tend to
undergo mutual cross-interactions, which would
otherwise lead to genomic instability. Currently,
various collaborative efforts are being estab-
A
+
‐
C
Target
Gene
Donor plasmid (excess!)
RMCE
Abb 1
RMCE
Gene
+
Transfection
‐
TCTAGAAA
B
b
a´
TTCAAATA
a
Abb. 1: RMCE ermöglicht vorhersagbare Expressionsmuster für ES-Zellen
aufgrund des ´tag-&-target´ Prinzips
A) Ein Genlocus lässt sich dadurch adressieren und gezielt modifizieren, dass er durch eine Genkassette (hier: ein positiv/negativer Selektionsmarker, flankiert durch „heterospezifische FRTs“ =
Halbpfeile) gekennzeichnet ist. Diese Adresse lässt sich durch ein Donor-plasmid ansteuern, das
eine Kassette entsprechender Architektur trägt. Expression der Flp-Rekombinase vermittelt den
Platzwechsel beider Kassetten, wodurch das „Gene-of-Interest“ (GOI, hier: eGFP) zurückbleibt.
RMCE vermeidet die simultane Einführung von prokaryotischer Plasmidanteilen und Selektionsmarkern, welche ein „Silencing“ hervorrufen würden.
B) Architektur einer 48 bp-FRT-Stelle, bestehend aus zwei invertierten 13 bp-Repeats (a, a´), die
einen 8bp Spacer flankieren. Auf „a´ “ folgt, nach einem isolieren Basenpaar ein weiterer (gleichgerichteter) Repeat. Ihre katalytische Wirkung entfaltet Flp Rekombinase an „a“ und „a´“ (grüne
Ovale), während „b“ die Funktion einer „Flp-Einflugschneise“ zukommt (graues Oval). Heterospezifische FRTs unterscheiden sich lediglich in der Sequenz des Spacers (hier: an den vier roten
Spacerpositionen). Die rot gefüllte Box (oben) symbolisiert die Sequenz des roten Halbpfeils
(linke FRT-Stelle) und die schraffierte Box (darunter) jene des schraffierten (rechten) Halbpfeils in
Teil A).
C) Der RMCE-vermittelte Prozess führt ein Reportergen (GFP) in den vorbestimmten genomischen
Ort. Alle dabei entstehenden Klone zeigen ein identisches Expressionsmuster.
Fig. 1: RMCE permits consistent expression for ES cells
according to the ´tag-&-target´ principle
A) A genomic locus is tagged by a target cassette (i.e. a pos./neg. selection marker) flanked by
‘heterospecific’ (half arrows) FRT sites. This target can be addressed by a donor plasmid carrying
a gene cassette with the corresponding architecture. Flp catalyzes an exchange of the cassettes,
thereby introducing the gene of interest. The process does not leave behind prokaryotic plasmid
parts (dotted line) or a co-expressed selection marker, since both are lost as the cell divides.
These features prevent silencing.
B) Architecture of a genuine 48 bp FRT site consisting of two inverted 13 bp repeats (a, a´) around
an 8 bp spacer and, in addition, an additional repeat (b), separated from a´ by a single base
pair. Flp recombinase monomers bind to the inverted repeat (green ovals) serving catalytic
functions. The third direct repeat acts as an Flp entry site. Heterospecific FRTs (F, F´…) differ in the
composition of their 8 bp spacers as indicated by the solid-red and hatched-red segments
C) Introduction of a transgene, by RMCE, into the predetermined site creates clones with identical
expression properties – in striking contrast to standard transfection techniques.
lished to further expand the potential of these
techniques by:
1- Enabling safe excision (‘flirting’) actions
similar to the common ‘floxing’ principle
(Cre-mediated excision of a cassette flanked
by two loxP sites). This can be achieved, in
synchrony, for several cassettes without the
risk of genomic rearrangements since each
cassette is flanked by a different set of heterospeccific FRTs (F) as follows:
F – GOI1 – F; F´ - GOI2 – F´…
2- Providing iPS cells with the following two genomic tags (RF = reprogramming factor cassette SM = selection marker):
F – [RF-SM] – FF´ and F´´– SM – F´´´
After iPS generation the [RF-SM] cassette will
be deleted by a pulse of Flp activity leaving
behind the F – F´ situation, which allows
the option of subsequent RMCEs at this site.
In the event that the locus has undergone
silencing, the second RMCE-competent genomic site (F´´– SM – F´´´) can be addressed
by the relevant differentiation factor gene cassettes. This second RMCE-competent locus is
chosen such that it is accessible during the
relevant differentiation step(s). To this end,
the relevant locus has to be tagged by HR,
which can be supported by the specific action
of Zn-finger nucleases.
Einladung der
Universität von
Jakarta an die
SUESC
The University
of Jakarta
invites SUESC
Im Mai 2010 erhielt Dr. Thomas Müller, Leiter der Service Unit Embryonic Stem Cells
(SUESC), eine Einladung der medizinischen
Fakultät der Universität von Indonesien in
Jakarta. Die Mediziner und Wissenschaftler
der Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia (FKUI), der Abteilung für Histologie,
der Deutsch-Indonesischen Gesellschaft
für Medizin und das Forum Biomedika wollten sich in Vorträgen und Gesprächen über
REBIRTH informieren; insbesondere Themen wie Stammzell-Ethik und Reprogrammierung von Zellen standen im Mittelpunkt.
Für die SUESC ergab sich eine offizielle Kooperation mit der Universität von Indonesien, geplant sind der Austausch von Wissenschaftlern und gemeinsame Projekte.
Eine indonesische Wissenschaftlerin, Frau
Radiana Antarianto, wurde bereits erfolgreich in das PhD-Programm Regenerative
Sciences aufgenommen. Selamat datang!
Herzlich willkommen!
In May 2010 Dr Thomas Müller, head of
the Service Unit for Embryonic Stem Cells
(SUESC), received an invitation from the
University of Indonesia in Jakarta. The clinicians and scientists of the Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia (FKUI), the
Department of Histology, the German-Indonesian Society for Medicine and the Forum
Biomedika were seeking to update their
awareness of issues including stem cell
ethics and reprogramming of cells. SUESC
is now officially collaborating with the University of Indonesia; future plans involve exchange of researchers and shared projects.
One Indonesian scientist, Ms Radiana
Antarianto, has already been selected onto
the PhD programme Regenerative Sciences.
Selamat datang! Welcome!
3- Similarly, the above-mentioned EUCOMM
programme will exploit the synchronous use
of more than two heterospecific FRT sites addressing the diploid status of ES cells that
have been pre-engineered with an inducible
Flp system. To this end, allelic loci will be
modified in two HR steps, as follows:
F – AL1 – FF´ and F´´ – AL2 – F´´´
While Flp-mediated excision of AL1 follows
the flirting strategy, the second allele (AL2)
would be flanked by a set of heterospecific
sites for use in subsequent RMCE reactions.
So far the system facilitates access to the
effect of gene mutations in cells cleanly expressing the mutant form of a disrupted gene.
As an additional option, the AL1 locus will allow successive cassette exchanges owing to
the fact that the F – F´ set remains after the
flirting step.
While ‘delicate’ tasks for SSR enzymes had thus
far so mostly been conferred on Cre because of
its superior activity, and while the Flp-FRT system
was mainly reserved for ‘working loads’, these
assignments started to change with the advent
of a codon-optimized Flp variant, Flpo. Reports
about the unexpected existence of lox pseudosites in several genomes, explaining the toxic
effects of extended Cre expression, are driving
these changes. Our multiplexing approach is in
line with these efforts as it permits strategies to
be realized, which up until then had required the
parallel use of two different SSR systems.
Turan S., Kuehle J., Schambach A., Baum, C.,
Bode, J. (2010) RMCE multiplexing: versatile extensions of the Flp-recombinase-mediated cassette
exchange technology. J. Mol. Biol. 402, 52-69.
http://dx.doi.org/10.1016/j.jmb.2010.07.015.
A
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GFP
Abb 2
B
RMCEmult
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GFP
RFP
360
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Abb. 2: RMCE-Multiplexing erweitert die Möglichkeiten des Systems
A) Mehrere Sätze heterospezifischer FRTs (rote bzw. blaue Halbpfeile) ermöglichen simultane RMCEReaktionen an zwei (und möglicherweise mehr) vorbestimmten genomischen Loci. Da jedes FRT
sich von den drei anderen Stellen in vier Spacer-positionen unterscheidet (vergl. Fig. 1B), können
keine unerwünschten Kreuzreaktionen auftreten.
B) Nachweis des „Multiplexing“ durch PCR, d.h. Amplifikation der 626 und 360 bp Randfragmente
in Teil A. Anreicherung und Isolierung der betreffenden Klone wird durch „Negativselektion“
– Eliminierung von Zellen mit verbliebener tk-Funktion in Anwesenheit von Gancirclovir (Ganc)
– ermöglicht.
C) Durch Fluoreszenzmikroskopie wird der Einbau sowohl an der F/F´- (grüne Fluoreszenz) als auch
an der F´´ /F´´´-Stelle (rote Fluoreszenz) gezeigt. Im Verlauf der Austauschreaktion steigt der Anteil
von Zellen mit einem gelb-orangem Signal, welches die Besetzung beider Stellen anzeigt.
Fig. 2: RMCE multiplexing greatly extends the system´s options
A) Multiple sets of heterospecific FRTs (half arrows marked in red or blue) enable simultaneous
RMCE reactions at two (and possibly more) pre-defined genomic loci. Since each of the FRTs
differs from the three others in four spacer positions, unwanted cross-interactions are safely
precluded.
B) Verification of a two-site RMCE ‘multiplexing’ reaction by PCR as indicated by boundary
fragments of 626 and 360 bp (generated as shown in part A). Enrichment and recovery of the
relevant clones follows ‘negative selection’ in the presence of Ganciclovir (Ganc), i.e. elimination
of cells with one or two remaining tk functions.
C) Fluorescence microscopy shows primary targeting of either the F/F´ locus (green GFP fluorescence) or the F´´/F´´´ locus (red RFP fluorescence). As RMCE proceeds, the proportion of cells with
a yellow-orange signal increases in this overlay representation.
HSV-Kapside binden über innere Tegumentproteine
an Mikrotubuli der Wirtszelle
HSV capsids bind to host cell microtubules via inner
tegument proteins
Beate Sodeik (SU Molecular Imaging and Marking), Camilla Krause
Die meisten Viren benötigen
für ihre Replikation und Pathogenese das MikrotubuliNetzwerk der Wirtszellen. Per
„Anhalter“ reisen sie entlang
dieses Netzwerks zu unterschiedlichen
intrazellulären
Stationen, deren Unterstützung sie für ihren Infektionszyklus benötigen.
Die Forscher der Service Unit
Molecular Imaging and Marking
vom Institut für Virologie der MHH
untersuchten die Bindung von
Kapsiden der Herpes-SimplexViren (HSV) an die Mikrotubulimotoren, den intrazellulären
„Zugmaschinen“. Sie charakterisierten die molekularen Mechanismen für spezifische Motor-CargoErkennung mit einem neuen zellfreien
biochemischen Versuchsaufbau, welcher gezielt
die Bindung der Mikrotubulimotoren an die HSV
Kapside nachbaut. Dazu stellten sie verschiedene HSV-1 Kapside mit unterschiedlichen Oberflächenstrukturen und unterschiedlicher Tegumentzusammensetzung her. Diese Tegumentproteine
sind das Markenzeichen aller Herpesviren und
befinden sich zwischen dem Kapsid und der viralen Hülle.
Überraschenderweise stellten die Forscher fest,
dass Proteine des inneren Teguments, gleichzeitig beide Arten von Zugmaschinen binden:
Dyneine für die Reise zum Zellkern, aber auch
Kinesine für die entgegengesetzte Richtung.
Kapside ohne Tegumentproteine und Kapside,
die neben den inneren auch von den äußeren
Tegumentproteinen eingeschlossen sind, können nicht an Motoren binden. Ein einzelnes Kapsid bietet gleichzeitig Motoren unterschiedlicher
Richtung sowie mehreren Kopien des gleichen
Motors Platz.
Für die Virusinfektion ist ein gezielter Transport
je nach Stadium zum Zellkern oder zur Zellperipherie notwendig. In welche Richtung es gehen
soll, müssen die gebundenen Motoren in einer
Art Tauziehen entscheiden. Oder die Aktivitäten
der unterschiedlichen Motoren müssen gezielt
aktiviert oder gehemmt werden.
of of their tegument proteins. These proteins,
which are located between the capsid and the viral shell, are the distinguishing features of all herpes
viruses.
Surprisingly, the researchers
found that proteins in the inner
tegument bind both kinds of motor
simultaneously: dynein for the journey to the cell nucleus, and kinesin
for the reverse direction. Capsids
without tegument proteins, and
capsids that are enclosed by not
only the inner tegument proteins but
also the outer ones, are unable to bind to motors. At any given time, a single capsid provides
different motors moving in different directions,
as well as sites for several copies of the same
motor.
Die Identifizierung viraler Rezeptoren, welche die
zellulären Transportfaktoren rekrutieren, wird
uns neue mögliche Angriffsstellen für antivirale
Therapien liefern. Des weiteren können solche
viralen Proteindomänen in virale Vektoren eingebaut oder sogar zu künstlichen Nano-Carriern
entwickelt werden, um therapeutische Gene
oder Moleküle in den Zellkern oder zu anderen
subzellulären Bestimmungsorten zu bringen.
Most viruses require the microtubule network
of the host cells for their replication and pathogenesis. They ‘hitch-hike’ along this network to
different intracellular locations where they need
assistance to carry out their infection cycle.
Researchers from Hannover Medical School’s
(MHH) Institute of Virology who work for the REBIRTH Service Unit for Molecular Imaging and
Marking investigated the binding of herpes
simplex virus (HSV) capsids to the microtubule
motors, which act as intracellular ‘express freight
trains’. They characterized the molecular mechanisms for specific motor cargo recognition using
a new, cell-free biochemical experimental set-up
which specifically reconstructs the binding of the
microtubule motors to the HSV capsids. To this
end, they created various HSV-1 capsids that differed in their structures and in the composition
For the virus to infect the cell, specific transport
is required (depending on the stage of the infection) either to the nucleus or to the periphery
of the cell. A kind of ‘tug of war’ takes place by
which the bound motors have to ‘decide’ which
direction to go in. Or it may be that the activities
of the different motors need to be specifically activated or inhibited.
The identification of viral receptors that recruit
the cellular transport factors will provide us with
new potential sites of action for antiviral therapies. Moreover, viral protein domains of this kind
can be incorporated into viral vectors, or even be
developed into artificial nanocarriers in order to
transport therapeutic genes or molecules into the
cell nucleus or to other subcellular destinations.
Radtke K, Kieneke D, Wolfstein A, Michael K, Steffen W, et al. (2010) PLoS Pathog 6(7): e1000991.
oi:10.1371/journal.ppat.1000991.
Der nächste Newsletter
erscheint
Ende Dezember 2010.
The next newsletter will be
issued
at the end of December 2010.
Dr. Smart trifft sich
mit dem HCTC (2. Teil)
Dr Smart meets
the HCTC (Part 2)
Anke Lührmann, Daniel Wicke (Support of clinical studies, Hannover Clinical Trial Center)
Wie in der letzten Ausgabe berichtet, hat Dr.
Smart an der MHH eine neue und innovative
Substanz gefunden, welche sich höchstwahrscheinlich für eine kurative Therapie gegen die
Krankheit Rebirtheritis einsetzen lässt. Nach einiger Recherche hat er an der MHH das Hannover
Clinical Trial Center entdeckt, welches sich mit
der Organisation und Durchführung klinischer
Studien beschäftigt, und beschlossen, dort einen Beratungstermin wahrzunehmen.
Am Tag des Treffens mit dem HCTC fühlt sich Dr.
Smart schon einigermaßen gut vorbereitet. Er
hat weiter im Internet recherchiert und herausgefunden, dass es in Deutschland zwei Bundesoberbehörden gibt, die die Durchführung
von klinischen Studien genehmigen. Zum einen
das BfArM (Bundesinstitut für Arzneimittel und
Medizinprodukte) und zum anderen das PEI
(Paul-Ehrlich-Institut). Auch, dass die MHH ihre
eigene Ethikkommmission hat, weiß Dr. Smart
mittlerweile. So begibt er sich frohen Mutes zum
HCTC. Damit die HCTC-Mitarbeiter gut vorbereitet
in das Treffen gehen können, hat er ihnen vorab
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eine kurze Zusammenfassung seiner Idee geschickt.
Dr. Smart stellt als erstes
sein Projekt vor und berichtet, wie er sich vorstellt, seine
Substanz zum Wohle des Patienten
einzusetzen. Schnell stellt sich heraus,
dass es sich bei der Substanz um ein klassisches Medikament handelt. Damit, so
sagen ihm die freundlichen Mitarbeiter
vom HCTC, sei das BfArM für die Genehmigung der Prüfung zuständig.
Das PEI hingegen beschäftigt sich mit
der Regelung der Zulassung von z.B.
Impfstoffen, Zelltherapeutika oder Gentherapieprodukten.
Dr. Smart hat mit seinem Chef abgesprochen,
dass die Studie zunächst nur hier in Hannover
laufen soll. Allerdings sollen dann später weitere Kliniken eingebunden werden. Wie Dr. Smart
vom HCTC erfährt, ist dies durchaus möglich
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und auch zu empfehlen, da so mehr Patienten
bzw. Probanden in einer kürzeren Zeit rekrutiert
werden können. Damit wäre die Studie also zunächst eine monozentrische Studie und würde
dann zu einer Multizenterstudie werden. Da
Dr. Smart erstmal nur deutsche Zentren einbeziehen will, wird es also keine multinationale
Studie sein. Bei Multizenterstudien wird ein Leiter der klinischen Prüfung (LKP) benötigt. Jedes
Zentrum bestimmt einen PI (Principal Investigator, zu deutsch: Hauptprüfer [HP]), der für das
jeweilige Prüfzentrum die Verantwortung trägt.
Der LKP wiederum ist Koordinator nicht nur seines eigenen Zentrums, sondern auch Ansprechpartner der anderen an der klinischen Studie beteiligten Zentren. Dr. Smart hat sich vorgestellt,
diese koordinierende Aufgabe zu übernehmen.
Leider erfährt er, dass die Ethikkommissionen
nur Hauptprüfer bzw. LKPs zulassen, die mindestens 2 Jahre Erfahrung in der Durchführung
klinischer Prüfungen haben. Da sein Chef großes
Interesse an dem Projekt hat und schon an einigen Studien teilgenommen hat, kann Dr. Smart
sich gut vorstellen, dass dieser die Funktion
übernehmen wird.
Die Ethikkommission mit Sitz beim LKP würde
somit die federführende Ethikkommission
sein. Jedes andere Zentrum benötigt allerdings
die Zustimmung ihrer eigenen lokalen Ethikkommission, welche dann die sogenannte beteiligte Ethikkommission sein wird. Die beteiligten
Ethikkommissionen befinden aber nur über die
Teilnahme der jeweiligen Prüfer in Ihrem Zentrum, wohingegen die federführende Ethikkom-
mission über die gesamte Studie ein Urteil fällt.
Somit muss eine klinische Studie in Deutschland
nicht nur von einer der Bundesoberbehörden genehmigt, sondern auch von der federführenden
Ethikkommission bewertet werden.
Eine weitere Frage, wer denn Sponsor bei der
Studie sein soll, ist schnell beantwortet. Sponsor bezeichnet in diesem Fall nicht den Geldgeber, sondern vielmehr denjenigen, der die ganze
Studie organisiert, die Finanzierung sicherstellt
und alles überwacht, also die Hauptverantwortung trägt. Dieses möchten sein Chef und Dr.
Smart selber zusammen mit der MHH machen,
das hatten sie schon vorher beschlossen. Somit
würde es sich bei der Studie um eine IIT (Investigator Initiated Trial) handeln. Das HCTC kann
viele Sponsor-Aufgaben übernehmen, wie z.B.
die An- und Abmeldung der Studie, die Qualitätskontrolle in Form von Monitoring, das Datenmanagement und vieles mehr. Wer was machen
soll, muss dann vorher in Form eines Vertrages
festgelegt werden. Im Prinzip kann das HCTC
auch als Sponsor einer klinischen Prüfung im
Sinne des AMG fungieren.
Über die weiteren Lernerfolge unseres Dr. Smart
werden wir im nächsten Rebirth-Newsletter berichten. Wenn Sie bis dahin nicht warten möchten und ähnliche Planungsprobleme haben wie
unser Dr. Smart, dann wenden Sie sich direkt an
das HCTC Team, Tel. 0511 533 333 0. Außerdem
werden wir im Rahmen unserer neu ins Leben
gerufenen Seminarreihe „bench to Mensch“
Wissenswertes über klinische Studien berichten
und Ihre Fragen beantworten. Termine werden
über den Rebirth-E-Mail Verteiler rechtzeitig bekannt gegeben.
As described in the previous episode, MHH employee Dr Smart discovered a novel and innovative substance which has great potential for use
as a curative therapy for a disease known as Rebirtheritis. After making some enquiries around
MHH, he learned about the Hannover Clinical Trial Center, an institute which is devoted to organizing and conducting clinical trials, and decided
to make an appointment for a consultation.
Dr Smart felt that he was well-prepared on the
day of his meeting with the HCTC. He had used
the Internet to further investigate how to conduct
a clinical trial and learned that there are two federal authorities in Germany which are responsible for approving clinical trials. One is the BfArM
(Bundesinstitut für Arzneimittel und Medizinprodukte = The Federal Institute for Drugs and
Medical Devices) and the second is the PEI (Paul
Ehrlich Institute). Dr Smart has also learned that
the MHH has its own Ethics Committee. Armed
with this information, he went with confidence to
his meeting at the HCTC. To help ensure that the
HCTC staff could thoroughly prepare themselves
for the meeting, he sent them a short summary
of his idea beforehand.
Dr Smart presented his project and explained
how he thought his substance could be used to
benefit patients. It quickly became obvious that
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the substance to be tested is a medical drug in
the classical sense of the term. Therefore, the
friendly HCTC employees kindly explained to him,
the BfArM is responsible for the approval of his
project. In contrast, the PEI deals with the regulations for approval of (for example) vaccinations,
cell therapies, or gene therapy products.
Dr Smart and his departmental head had agreed
that the clinical trial would initially be conducted only in Hannover. However, the trial should
eventually be expanded to include additional
hospitals. The HCTC informed Dr Smart that
this is not only possible but is actually recommended so that more patients or healthy controls
can be recruited over a shorter time period. The
trial would, therefore, initially be considered
a monocentric trial and would later become a
multicentre trial. Since Dr Smart initially only
intends to include German centres, the trial will
not be a multinational one. For multicentre trials, German drugs law requires that there be a
representative head of the clinical trial (in German: Leiter der klinischen Prüfung (LKP)). Each
centre designates a principal investigator or PR
(in German: Hauptprüfer or HP), who is responsible for a given trial centre. In addition to coordinating his/her own centre, the LKP is also the
contact person for all other centres which are participating in the clinical trial. Dr Smart expected
that he could assume the coordinating role of LKP
himself. However, he learned that, unfortunately,
the ethics committee only allows people who
have at least two years’ experience in conducting clinical trials to be principal investigators or
LKPs. Since the head of his department is very
interested in the project and has participated in
several clinical trials, Dr Smart believes that this
person would be well suited to taking on the role
of LKP.
The ethics committee at the same institution as
the LKP is known as the ‘leading ethics committee’, which is in charge of the entire clinical
trial. However, every other participating centre
requires the approval of their local ethics committee, which is then called a ‘participating ethics committee’. The participating ethics committees decide only about the participation of the
respective investigators in their centres, whereas
the leading ethics committee makes decisions regarding the entire trial. A clinical trial in Germany
must therefore be approved by a leading ethics
committee as well as the competent authorities.
A further question, namely who should be the
sponsor of the study, is quickly answered. In
this case, ‘sponsor’ does not mean the funder,
but rather the person or group responsible for
organizing, obtaining financing for, and overseeing the entire trial. Dr Smart and his departmental head decided earlier that they wanted to
take on the role of sponsor in conjunction with
MHH. This trial will therefore be classified as
an investigator-initiated trial (IIT). The HCTC is
able to perform many of the sponsor’s functions,
such as registering and closing the trial, quality
control in the form of monitoring, and data management. A contract which specifies the duties of
each participating sponsor must be made prior
to initiation of the clinical trial. As a sponsor of a
clinical trial, the HCTC can, in principle, also act
to ensure compliance with German drugs law.
Wachstum. „Wir haben einen Weg gefunden, die
regulären Prozesse des Calcineurins aufrecht zu
erhalten, das Wachstum aber trotzdem zu stoppen“, erklärt Heineke. „Unser Ziel ist es nun,
eine entsprechende Gentherapie zu entwickeln,
die Menschen mit hohem Blutdruck vor einer
Herzinsuffizienz schützt.“
Mechanism unravelled by REBIRTH
scientists / New approach to possible
gene therapy
Dr. Heineke im Labor
Dr Heineke in the lab
Herzschwäche:
MHH-Forscher stoppen im Labor
krankhaftes Herzwachstum
Cardiac insufficiency:
MHH researchers halt pathological
heart growth in the lab
Jörg Heineke (JRG Cardiovascular Cell Therapy)
REBIRTH-Wissenschaftler entschlüsseln
Mechanismus / Neuer Ansatz für
mögliche Gentherapie
REBIRTH-Forschern ist es in enger Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe von Professor Dr. Jeffery D. Molkentin aus Cincinnati (USA) gelungen,
einen wichtigen Aktivierungsmechanismus des
krankhaften Herzwachstums zu entschlüsseln.
„Wenn wir das krankhafte Wachstum des Herzens verhindern können, können wir auch die
Entwicklung einer Herzschwäche verhindern“,
erklärt Dr. Jörg Heineke, Leiter der Arbeitsgruppe
Cardiovascular Cell Therapy des Exzellenzclusters
REBIRTH angesiedelt in der Klinik für Kardiologie
und Angiologie der Medizinischen Hochschule
Hannover (MHH). Ihre Ergebnisse veröffentlichte
die Gruppe nun im renommierten Fachmagazin
„Nature Medicine“.
Europaweit leiden zehn Millionen Menschen an
einer Herzschwäche (Herzinsuffizienz), bedingt
durch einem vorangegangenen Herzinfarkt oder
anhaltend zu hohem Blutdruck. Ähnlich wie bei
bestimmten Formen von Krebs überleben nur die
Hälfte der Erkrankten die ersten fünf Jahre. Die
REBIRTH-Arbeitsgruppe erforscht die Herzschwäche, verursacht durch zu hohen Blutdruck. Durch
dauerhaft hohe Belastung wie hoher Blutdruck
wachsen Herzmuskelzellen. Über einen längeren Zeitraum kann das Herz diesen Zustand aber
nicht aufrecht erhalten. Die Herzzellen werden
schwächer und sterben zum Teil ab – das Gewebe vernarbt: Es kommt zu einer Herzschwäche.
Das Enzym Calcineurin (CNA) fördert das krankhafte Herzwachstum. „CNA hat in der Zelle aber
auch andere, wichtige Aufgaben. Es findet sich
in großen Mengen im Zytoplasma der Herzmuskelzelle und schaltet zahlreiche für die Zelle lebensnotwendige Gene an. Deshalb können wir
es nicht einfach ausschalten“, erklärt Heineke.
Die REBIRTH-Forscher fanden nun aber heraus,
dass CNA in belasteten Herzzellen über das
kleine Regulatorprotein CIB1 an die Zellmembran bindet und so das krankhafte Herzwachstum und langfristig das Herzversagen fördert.
Die Forscher kappten die Verbindung zwischen
CNA und Zellmembran, indem sie das CIB1 ausschalteten. Auf diese Weise stoppten sie das
REBIRTH researchers have, in close collaboration with the Cincinnati (USA)-based research
team headed by Professor Jeffery D. Molkentin,
succeeded in unravelling an important activation mechanism involved in pathological heart
growth. “If we can prevent pathological growth
of the heart, we can also prevent cardiac insufficiency developing,” explains Dr Jörg Heineke,
head of the Cardiovascular Cell Therapy research
group in the REBIRTH Cluster of Excellence based
within the Department of Cardiology and Angiology at Hannover Medical School (MHH). The group
has now published its findings in the renowned
journal Nature Medicine.
Ten million people across Europe suffer from
cardiac insufficiency, which is caused by a previous heart attack or persistently high blood
pressure. As with certain forms of cancer, only
half of those affected survive the first five years.
The REBIRTH research group is investigating cardiac insufficiency brought on by excessive blood
pressure. Ongoing strain on the heart, as for
example caused by high blood pressure, causes
heart muscle cells to grow. If this continues for
any length of time, the heart cannot sustain this
situation. The heart cells weaken and some of
them die – the tissue scars over, and cardiac insufficiency occurs.
The enzyme calcineurin (CNA) promotes pathological heart growth. “But CNA has other, important jobs to do in the cell, too. It is found in large
quantities in the cytoplasm of the heart muscle
cells and activates many genes that are vital to
the cell. That’s why we can’t simply switch it
off,” explains Heinecke. However, the REBIRTH
researchers found out that CNA in stressed
heart cells binds to the cellular membrane via
the small regulator protein CIB1, so promoting
pathological heart growth and, in the long term,
heart failure. The researchers cut the connection
between CNA and the cell membrane by switching off the CIB1 and, by doing so, they halted this
growth process. “We have found a way to maintain the normal processes involving calcineurin
while nevertheless stopping the growth,” says
Heineke. “Our aim is now to develop a corresponding gene therapy that protects people with
high blood pressure from cardiac insufficiency.”
Joerg Heineke, Mannix Auger-Messie, Robert N
Correll, Jian Xu, Matthew J Benard, Weiping Yuan,
Helmut Drexler, Leslie V Parise, Jeffery D Molkentin:
CIB1 is a regulator of pathological cardiac hypertrophy, Nature Medicine, Volume 16, Number 8,
August 2010.
Polysialinsäure: süß, aber nicht klebrig
Polysialic acid: sweet but not sticky
Martina Mühlenhoff (JRG Stem Cell Glycans)
Polysialinsäure (PolySia) stellt ein Zuckerpolymer dar, das für die Entwicklung des Wirbeltiergehirns sowie den Erhalt synaptischer Plastizität
von herausragender Bedeutung ist. Entsprechend führt der Verlust von PolySia zu schweren
Störungen der Hirnentwicklung, Wachstumsretardierung und frühzeitigem Tod. Die biologische
Rolle von PolySia wird seit über 25 Jahren fast
ausschließlich im Kontext des Hauptträgermoleküls, dem neuralen Zelladhäsionsmolekül
NCAM, studiert. Ein gemeinsames Forschungsprojekt von Dr. Hildegard Geyer (Universität Gießen) und Dr. Martina Mühlenhoff (MHH, Institut
für Zelluläre Chemie, Leitung: Prof. Rita GerardySchahn) führte nun zur Identifizierung des synaptischen Zelladhäsionsmoleküls SynCAM 1 als
neuen PolySia-Träger.
Der durch die Polysialyltransferasen ST8SiaII
und ST8SiaIV katalysierte Transfer von PolySia auf SynCAM 1 führt zu einer vollständigen
Aufhebung der homophilen SynCAM 1 Interaktionen und zeigt, dass PolySia ein Schlüsselregulator der SynCAM 1-Funktionen darstellt.
Überraschenderweise kommt PolySia-SynCAM 1
nur auf NG2+ Polydendrozyten vor. Diese Zellen
stellen eine besondere Klasse von Vorläuferzellen dar, aus der nicht nur Oligodendrozyten und
Astrozyten, sondern auch Neurone entstehen
können. Darüber hinaus bilden diese multifunktionellen Vorläuferzellen einzigartige Synapsenähnliche Verbindungen mit Neuronen aus. Da
SynCAM 1 sehr effizient die Ausbildung von
Synapsen induziert, ist anzunehmen, dass der
Polysialylierung von SynCAM 1 eine entscheidende regulatorische Rolle bei der Integration
von NG2+ Zellen in neurale Netzwerke zukommt.
Die Aufklärung der genauen Funktion von PolySia-SynCAM 1 bei Migration, Differenzierung und
Integration von NG2+ Zellen wird einen wichtigen Beitrag zur Entwicklung von Vorläuferzellbasierten regenerativen Therapien von de- und
dysmyelinisierenden Erkrankungen leisten.
Among the large set of cell surface glycan structures, polysialic acid (polySia) plays a crucial role
in vertebrate brain development and maintaining
synaptic plasticity. Loss of polySia results in severe defects in brain morphology, growth retardation, and premature death. For more than 25
years, the biological roles of polysialylation have
been studied almost exclusively in relation to its
major known target, the neural cell adhesion molecule NCAM. A joint research effort, in which Dr
Hildegard Geyer from Giessen University teamed
up with Dr Martina Mühlenhoff from Hannover
Medical School (Institute of Cellular Chemistry,
Director: Professor Rita Gerardy-Schahn), has
now led to the identification of the synaptic cell
adhesion molecule SynCAM 1 as a novel target
for polysialylation.
Transfer of polySia to SynCAM 1 by the polysialyltransferases ST8SiaII and ST8SiaIV completely
blocked homophilic SynCAM 1 interactions,
demonstrating that polySia acts as a key regulator of SynCAM 1 functions. Unexpectedly, polySia-SynCAM 1 was found exclusively on NG2+
polydendrocytes. These cells constitute an interesting class of progenitor cells that differentiate
into oligodendrocytes and astrocytes but can
also give rise to neurons. These enigmatic multifunctional progenitors form unique synapse-like
connections with neurons, which allow them to
receive excitatory synaptic inputs similar to neuronal cells. Since SynCAM 1 is known as a potent
inducer of synapse formation, polySia may act
as a dynamic modulator of SynCAM 1 functions
during integration of NG2+ cells into neural networks. Understanding the role of polySia-SynCAM
1 in migration, differentiation and integration of
NG2+ cells will contribute to the development of
progenitor cell-based regenerative therapeutic
strategies for de- and dysmyelinating disorders.
Galuska, S.P., Rollenhagen, M. (co-first author),
Kaup, M., Eggers, K., Oltmann-Norden, I., Schiff,
M., Hartmann, M., Weinhold, B., Hildebrandt, H.,
Geyer, R., Mühlenhoff, M. (co-senior/corresponding author) & Geyer H. (2010). Synaptic cell adhesion molecule SynCAM 1 is a target for polysialylation in postnatal mouse brain. Proc. Natl. Acad.
Sci. USA (2010) 107, 10250–10255.
This paper was highlighted by:
Giza J. & Biederer T. (2010). Polysialic acid: A veteran sugar with a new site of action. Proc. Natl.
Acad. Sci. USA,107, 10335–10336.
Abb. 1: Bead Aggregationsbestimmung: Die homophilen SynCAM1-Bindungen wurden durch die
Polysialisierung, katalysiert durch ST8SiaII oder ST8SiaIV, vollständig blockiert und nach enzymatischer Beseitigung der PolySia durch Endosialidase (rnfoN) wieder hergestellt.
Fig. 1 : Bead aggregation assay. Homophilic SynCAM 1 interactions were completely blocked by
polysialylation catalyzed by ST8SiaII or ST8SiaIV and restored after enzymatic removal of polySia by
endosialidase (endoN).
Mitteilungen und Meldungen | News and updates
Tokyo Tower at night
Reisebericht: Japan
Travelogue: Japan
Cornelia Kasper (LUH, Institute of Technical Chemistry, JRG Large Scale Cultivation)
Vom 27. Juni bis 3. Juli 2010 fand mit finanzieller Unterstützung durch das BMBF eine
Reise nach Japan statt, die als ein Gemeinschaftsprojekt des Biotechnologie Cluster
Bayern (mit den Organisatoren BioM und
Bayern International) und der VBU (Vereinigung Deutscher Biotechnologie Unternehmen, einer Organisation der Dechema e.V.)
organisiert wurde. 13 Biotechnologieunternehmen sowie sieben deutsche Wissenschaftler nahmen die Möglichkeit wahr,
zahlreiche Kontakte bei Kooperationsbörsen und Besichtigungen von Biotechnologieparks und wissenschaftlichen Einrichtungen zu potentiellen japanischen
Partnern zu knüpfen.
Kansai Erste Station der Reise der aus 40 Personen zusammengesetzten Delegation (s. Bild 1)
war die Kansai-Region (ca. 18 Mio Einwohner),
die neben Tokio führend im Bereich Life Science
ist. Die Delegation besuchte das National Institute for Biomedical Innovation und den Saito Life
Science Park in Osaka sowie das RIKEN Institute
for Developmental Biology, das RIKEN Institute
for Molecular Imaging, die Forschungsabteilung bei Nippon Boehringer Ingelheim Co. Ltd.
sowie das Kobe Medical Device Development
Center. Während einer halbtägigen Partnering-
Veranstaltung fanden mehr als 50 Gespräche
zwischen den Delegationsteilnehmern und japanischen Biotech- und Pharma-Vertretern statt.
Kyoto Nächste Station war der Besuch der
Universität Kyoto, bei dem am Institute for Integrated Cell-Material Sciences einige deutsche
Wissenschaftler der Delegation ihre Arbeiten
vorstellten. Nachmittags dann bestand die Möglichkeit, das erst im Frühjahr 2010 eingeweihte
Center for iPS Cell Research and Application
zu besuchen (s. Bild 2). Am dritten Reisetag
besuchte die Delegation die BioExpo Japan in
Tokio, eine der größten Biotechnologie Messen
Asiens. Am Gemeinschaftsstand von Bayern
International, dem Biotechnologie Cluster Bayern und der VBU konnten die Teilnehmer die
im Vorfeld vereinbarten Partnerings mit japanischen Firmen durchführen. In Vorbereitung der
Reise wurde hierfür eine Broschüre erstellt, die
Informationen zu den teilnehmenden deutschen
Firmen, Wissenschaftlern und Regionen auf Japanisch enthielt.
Tokio Ein weiterer Höhepunkt der Delegationsreise war der von BioM ausgerichtete Empfang
in der deutschen Botschaft in Tokio. Hier trafen
die Teilnehmer der Reise auf Vertreter wichtiger
Pharmafirmen Japans und konnten einen interessanten Abend in entspannter Atmosphäre mit
Neues Zentrum für iPS-Zellforschung und
-anwendung in Kyoto
The new Center for iPS Cell Research and
Application in Kyoto
man scientists took the opportunity to establish numerous contacts with potential
Japanese partners and to visit biotechnology parks and scientific institutions.
Kansai The 40-strong delegation (see picture 1)
began its tour in the region of Kansai (with some
18 million inhabitants); Kansai and Tokyo are
the country’s leading areas for Life Sciences and
Biotechnology. The delegates visited the National
Institute for Biomedical Innovation and Saito Life
Science Park in Osaka, the RIKEN Institute for
Developmental Biology, the RIKEN Institute for
Molecular Imaging, the Research Department at
Nippon Boehringer Ingelheim Co., Ltd. and the
Kobe Medical Device Development Center. During
a half-day partnering event, more than 50 meetings took place between German and Japanese
biotech and pharmaceutical representatives.
vielen intensiven Gesprächen verbringen und
gezielt Kontakte aufbauen.
Kanagawa Am letzten Tag des Programms fand
zunächst ein Empfang beim Gouverneur der
Präfektur Kanagawa statt. Anschließend hatten
sowohl deutsche Vertreter als auch japanische
Kollegen die Möglichkeit, sich in Kurzvorträgen
vorzustellen und in einer organisierten informellen Posterpräsentation Kontakte aufzunehmen.
Interessierte Wissenschaftler, die den Kontakt
zu den Forschungsinstituten und/oder BiotechFirmen wünschen, können sich an die VBU
([email protected], www.v-b-u.org) wenden: Bei
der VBU liegt ein umfangreicher Report zur Biotechnologie in Japan sowie eine korrespondierende Datenbank vor.
With financial support from Germany’s Federal Ministry of Education and Research
(BMBF), a German delegation of biotech entrepreneurs and scientists visited Japan between 26 June and 3 July 2010. The trip was
organized as a joint project involving Biotechnologie Cluster Bayern (including organizers BioM and Bayern International)
and the Association of German Biotech
Companies (VBU), a Dechema e.V. organization. Thirteen biotech firms and seven Ger-
Kyoto The next stop on the tour was a visit to the
University of Kyoto, where German scientists from
the delegation presented their work at the Institute for Integrated Cell-Material Sciences. In the
afternoon the participants had the opportunity to
visit the iPS Cell Research and Application Center
which was opened in spring 2010 (see picture
2). Next, the delegation attended the BioExpo
Japan event in Tokyo, one of the largest biotech
fairs in Asia. At the exhibition area shared by Bayern international, Biotechnologie Cluster Bayern
and the VBU, partnering talks with Japanese
companies were organized for the participants.
In preparation for the tour, a brochure had been
prepared containing information (in Japanese) on
the participating German companies, scientists
and regions.
Tokyo A further highlight of the tour was the reception at the German Embassy in Tokyo. Here
the delegates met representatives of important
Japanese pharmaceutical companies and spent
an interesting evening in a relaxed atmosphere,
with many in-depth discussions held and contacts made.
Kanagawa The last day began with a reception
by the governor of the prefecture of Kanagawa,
followed by an informally organized poster presentation at which both German representatives
and their Japanese colleagues had the opportunity to give short talks introducing themselves
and their work.
Interested scientists who wish to contact the
research institutes and/or biotech companies
should get in touch with VBU ([email protected],
www.v-b-u.org): it has available an extensive report on biotechnology in Japan and a corresponding database.
Hannovers ImplantatForscher erhalten
53,8 Millionen Euro
Hannover’s implant
researchers receive
53.8 million euros
Großer Erfolg: Das Niedersächsische Zentrum für Biomedizintechnik/Implantatforschung (NZ-BMT) wird im Medical Park in
Hannover einen Forschungskomplex für
53,8 Millionen Euro errichten. Der Wissenschaftsrat in Bonn hat im Juli dem Verbund
aus Medizinischer Hochschule Hannover
(MHH), Leibniz Universität Hannover (LUH),
Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover
(TiHo) und Laser Zentrum Hannover grünes
Licht für die Finanzierung der Hälfte des
Betrags aus Bundesmitteln gegeben. Das
Land Niedersachsen wird die andere Hälfte
finanzieren. Die Verbundpartner bündeln
im NZ-BMT ihre Forschungskompetenzen
im Bereich der Biomedizintechnik.
Basierend auf der Grundlagenforschung
im Exzellenzcluster REBIRTH sollen hier in
Zukunft Konzepte zur klinischen Anwendung weiterentwickelt werden. So sollen
gemeinsam mit der Industrie medizinische
Implantate höchster Qualität hergestellt
werden. Ab 2013 können in dem Neubau
Forscher aus 20 Instituten erstmals gemeinsam unter einem Dach arbeiten.
A real coup: the Lower Saxony Centre for
Biomedical Engineering / Implant Research
(NZ-BMT) is to build a EUR 53.8m research
complex in Hannover’s Medical Park. In July,
the German Council of Science and Humanities in Bonn green-lighted the provision of
federal funds totalling half this amount to
a research alliance comprising Hannover
Medical School (MHH), Leibniz University of
Hannover (LUH), the University of Veterinary
Medicine Hannover (TiHo) and Hannover Laser Centre (LZH). The federal state of Lower
Saxony is to fund the other half of the total.
Within the NZ-BMT, the alliance partners will
be pooling their research expertise in the
field of biomedical engineering.
The intention is that, drawing on the fundamental research conducted within the
REBIRTH Cluster of Excellence, clinicalapplication solutions will be developed at
the centre. For example, top-quality medical implants are to be manufactured in conjunction with industry. From 2013, when
the new building has been completed, researchers from 20 institutes will be able to
work together under the same roof for the
first time.
Millionen-Förderung der DFG
DFG grants funding worth millions
Georg Behrens (Tolerance)
Neue Forschergruppe zu
Autoimmunerkrankungen
Gute Nachricht für MHH-Wissenschaftler aus
dem Exzellenzcluster REBIRTH: Die Deutsche
Forschungsgemeinschaft (DFG) unterstützt die
neue Klinische Forschergruppe 250 „Genetische und zelluläre Mechanismen von Autoimmunerkrankungen“ in den nächsten drei Jahren
mit mehr als 3,5 Millionen Euro. Zum neuen
Forschungsverbund gehören fünf international
Hannover Medical School (MHH)
Helmholtz Centre for Infection Research (HZI)
TWINCORE (Center for Experimental and Clinical
Infection Research)
ausgewiesene Kliniken und Institute der MHH
sowie Arbeitsgruppen des TWINCORE (Zentrum
für Experimentelle und Klinische Infektionsforschung) und des Helmholtz-Zentrums für Infektionsforschung (HZI), Braunschweig. Unter den
beteiligten Projektleitern sind auch REBIRTHWissenschaftler wie z.B. aus der RG Tolerance
(Georg Behrens, Elmar Jaeckel).
Das Immunsystem dient vor allem dem Schutz
gegen Infektionen. Es kann jedoch zu Störungen
kommen, so dass sich die Immunabwehr gegen
den eigenen Körper richtet. Diese Autoimmunerkrankungen führen zu zerstörerischen Prozessen, beispielsweise im Bewegungsapparat
(Rheuma), in der Haut oder in wichtigen inneren
Organen, etwa in der Leber (Hepatitis). Die Folgen sind oft anhaltende Einschränkungen und
vorzeitige Erwerbsunfähigkeit. Der physische
und psychische Leidensdruck der Patienten
ist enorm und erfordert eine interdisziplinäre
Versorgung sowie beträchtliche personelle und
finanzielle Ressourcen des Gesundheitssystems. Mit Hilfe der Förderung werden unter der
Leitung von Prof. Dr. Georg Behrens verschiedene MHH-Teams die Patienten mit Autoimmunerkrankungen der Gelenke, der Leber und
der Haut behandeln und patientenorientierte
Forschungsprojekte durchführen. Dabei unterstützen sie Grundlagenwissenschaftler aus
den drei beteiligten Institutionen. Eine wichtige
Aufgabe ist beispielsweise der Ausbau einer
Biomaterialbank, die unter anderem Haut- und
Blutproben umfasst und die Nachhaltigkeit der
Forschungen sichern wird.
„Die MHH kann damit ihren traditionellen Forschungsschwerpunkt in der Immunitäts- und
Entzündungsforschung weiter ausbauen“, sagt
der Sprecher der Klinischen Forschergruppe,
Professor Reinhold E. Schmidt, Direktor der
MHH-Klinik für Immunologie und Rheumatologie. Hilfreich für die erfolgreiche Beantragung
seien unter anderem die exzellenten Ausbildungsstrukturen der Hannover Biomedical Research School (HBRS) sowie die enge räumliche
und inhaltliche Beziehung zwischen klinischer
und grundlagenwissenschaftlicher Expertise der
beteiligten Wissenschaftler gewesen.
New research group on autoimmune
conditions
Good news for Hannover Medical School (MHH)
scientists from the REBIRTH Cluster of Excellence: the German Research Foundation (DFG)
will be supporting the new Clinical Research
Group 250 on ‘Genetic and cellular mechanisms
in autoimmune conditions’ to the tune of more
than 3.5 million euros over the next three years.
This new research alliance incorporates five internationally renowned clinics and institutes
within MHH, as well as research teams from the
TWINCORE Centre for Experimental and Clinical
Infection Research and the Braunschweig-based
Helmholtz Centre for Infection Research (HZI).
REBIRTH scientists are among the participating
project leaders; they include Georg Behrens and
Elmar Jaeckel from the RG Tolerance.
The main job of the immune system is to protect against infection. Immunological disorders
may, however, occur, so that a person’s immune
defences end up targeting his or her own body.
These autoimmune conditions lead to destructive
processes occurring, for example, in the musculoskeletal system (as in rheumatism), in the skin,
or in important internal organs such as the liver
(as in hepatitis). Often, the consequences are
persistent restrictions and sufferers’ becoming
unable to work at a relatively early age. The physical and psychological strain on those affected is
immense, necessitating interdisciplinary care
as well as considerable personnel and financial
resource expenditure within the health system.
By means of this funding, various MHH teams
(headed by Professor Georg Behrens) treating
patients with autoimmune conditions affecting
the joints, liver and skin will conduct patientfocused research projects. They will be assisting basic scientists from the three participating
institutions. Among their major tasks will be to
further develop a biomaterial bank which will
house (among other materials) skin and blood
samples and which will ensure this research can
be sustained.
“This will enable MHH to continue to expand its traditional research focus on immunity and inflammation
research,” says Professor Reinhold E. Schmidt, coordinator of the Clinical Research Group and director of
MHH’s Department of Immunology and Rheumatology.
That the funding application was successful is thanks
in part to the excellent training structures at Hannover Biomedical Research School (HBRS), as well as the
close relationship – both thematically and in terms
of geographical proximity – between the clinical and
basic-science expertise held by the participating scientists.
Afternoon Tea | Afternoon Tea
Jeden 1. Freitag eines Monats laden wir herzlich ein zum Afternoon Tea. Das nächste Treffen wird stattfinden am Freitag, 5. November
2010, von 13.30 - 14.30 Uhr im Aufenthaltsraum 6060 des K11-HBZ, Ebene 02.
You are warmly invited to join us at our
monthly Afternoon Tea sessions held on the
first Friday of the month. The next session
is on Friday, 5 November 2010 from 1.30 2.30 p.m., common room 6060, K11-HBZ,
level 02.
REBIRTH ist ausgewählter
Ort im Land der Ideen
REBIRTH is a ‘Selected
Landmark in the Land of Ideas’
REBIRTH gehört in diesem Jahr zu den Preisträgern beim Innovationswettbewerb „365
Orte im Land der Ideen“. Im Rahmen dieser
bundesweiten Aktion werden jedes Jahr 365
Orte gekürt. Wir konnten uns mit unserer Teilnahme gegen insgesamt 2.200 Konkurenten
durchsetzen. Die Preisverleihung findet am 1.
November 2010 an der Medizinischen Hochschule Hannover statt.
Diese Auszeichnung bietet dem Exzellenzcluster REBIRTH und den beteiligten Einrichtungen
die Möglichkeit, an einem Tag ihre Arbeit anschaulich der Öffentlichkeit zu präsentieren.
Wir planen einen „Tag der Wissenschaft” unter dem Motto
4 Jahre Forschung
made by REBIRTH
welche auch in den „November der Wissenschaft“ der Stadt Hannover eingebettet ist.
Unser Programm reicht von einem Schülernachmittag (hier sollen ausgewählte Schüler
der Oberstufe mit ihren Lehrern einen kleinen
Einblick in die Labortätigkeiten unserer Arbeitsgruppen erhalten) über anschauliche Exponate
oder Poster für unsere Ausstellung bis hin zu
dem offiziellen Teil der Preisverleihung.
Wir würden uns freuen, wenn wir Ihr Interesse
für diesen Tag der Wissenschaft wecken können
und Sie möglichst zahlreich begrüßen dürfen.
Für unsere Planung bitten wir um Anmeldung
an [email protected]
Anzeige | Ad
REBIRTH is among this year’s winners of Germany’s innovation competition called ‘365
Landmarks in the Land of Ideas’. A total of 365
locations are selected annually under this nationwide scheme. With our entry, we won out
against a total of 2,200 rivals. The prize-giving
ceremony is to take place at Hannover Medical
School on 1 November 2010.
This award gives the REBIRTH Cluster of Excellence and the participating institutions the opportunity to present their work to the public in
a lively and interesting way by hosting an Open
Day. Under the banner of
REBIRTH: four years of
cutting-edge research
(‘4 Jahre Forschung made by REBIRTH’) we are
planning an event which will also be incorporated into the city of Hannover’s ‘November of
Science’.
Our programme takes in a ‘Pupils’ Afternoon’
(on which selected upper-school pupils and
their teachers are to be given a brief inside
look at our research groups’ lab work), innovative exhibits and posters for our exhibition,
as well the official prize-giving ceremony. We
would be delighted if we can stimulate your interest in this special science-themed day and
welcome you along in large numbers!
Please give us a short notice, when you are
planning to join us: [email protected]
REBIRTH-Forscher
erhalten Förderung für
iPS-Charakterisierung
REBIRTH researchers
receive funding for iPS
characterization
Das Bundesministerium für Bildung und
Forschung, Bonn, bewilligte den REBIRTHForschern Professor Dr. Christopher Baum,
Professor Dr. Jürgen Bode und Dr. Axel
Schambach sowie Professor Toni Cathomen
aus der MHH-Abteilung für Experimentelle
Hämatologie 233.596 Euro für drei Jahre.
Unterstützt wird das Forschungsvorhaben
„Verbundprojekt: Reprogrammierung, Differenzierung und Sicherheitsanalyse induzierter pluripotenter Stammzellen durch
innovative Technologien der Genomregulation“. Dies ist ein Gemeinschaftsprojekt mit
dem Max-Delbrück-Zentrum für Molekulare
Medizin in Berlin und dem Helmholtz-Zentrum München.
The Federal Ministry of Education and Research (BMBF) in Bonn has approved funding, worth 233,596 euros over three years,
for REBIRTH researchers Professor Christopher Baum, Professor Jürgen Bode and Dr
Axel Schambach, along with Professor Toni
Cathomen of Hannover Medical School’s
(MHH) Department of Experimental Haematology. These funds are to support the research effort entitled ‘Collaborative project:
reprogramming, differentiation and safety
analysis of induced pluripotent stem cells
through innovative technologies in genome
regulation’. This is a joint project in conjunction with the Max Delbrück Center for
Molecular Medicine (MDC) in Berlin and the
Helmholtz Centre in Munich.
Camilla Krause, Mitarbeiterin für Pressearbeit,
den Exzellenzcluster REBIRTH im Rahmen
der nationalen Initiative „Regenerative
Medicine Initiative Germany“ (RMIG), einer
Kommunikations- und Informationsplattform für
Regenerative Medizin in Deutschland.
Dr. Tobias Cantz, Leiter der AG Stem Cell Biology,
zieht ein positives Fazit über die Hannoversche
Beteiligung: „Für unsere jungen Wissenschaftler
ist der Kongress in Dresden ein ideales Forum,
um ihre Arbeiten mit anderen Wissenschaftlern
zu diskutieren - auch außerhalb des Konferenzzentrums. Zudem findet REBIRTH zwischenzeitlich sehr nachhaltige Beachtung; das Interesse
an unseren Konzepten ist riesengroß.“
Dritter Stammzellkongress
in Dresden
Third Stem Cell Congress
held in Dresden
Vom 11. bis 14. Juli 2010 trafen sich in Dresden
etwa 600 Wissenschaftler aus aller Welt zum „3rd
International Congress on Stem Cells and Tissue
Formation”. Einige Mitarbeiter der REBIRTHArbeitsgruppen Reprogramming und Stem Cell
Biology, aber auch des REBIRTH-Managements
besuchten den Kongress in derElbestadt. Während
sich die Wissenschaftler über die neuesten
Ergebnisse auf dem Gebiet der Stammzellund Biomaterialforschung informierten und
austauschten, repräsentierten Yvonne Stöber,
Mitarbeiterin für Öffentlichkeitsarbeit, und
Der Kongress wird alle zwei Jahre vom DFG-Forschungszentrum für Regenerative Therapien an
der Technischen Universität Dresden und dem
DFG-Sonderforschungsbereich 655 „Cells into
Tissues“ organisiert.
From 11 to 14 July 2010, around 600 science professionals from all over the world came together
in Dresden for the ‘3rd International Congress on
Stem Cells and Tissue Formation’. Several members of the REBIRTH research groups on Reprogramming and Stem Cell Biology – and also of the
REBIRTH management team – attended the event
in the German city on the river Elbe. While the
scientists shared and discussed the latest findings from the field of stem cell and biomaterials
research, public relations officer Yvonne Stöber
and press officer Camilla Krause represented
the REBIRTH Cluster of Excellence in a national
Poster Award der TERMIS-EU 2010
geht an REBIRTH-Wissenschaftlerin
TERMIS-EU 2010 Poster Award
goes to REBIRTH scientist
Nicola Hofmann (Biothermodynamics)
Inga Bernemann stellt ihr Poster vor
Inga Bernemann is presenting her poster
Dipl.-Biol. Inga Bernemann aus der REBIRTH AG
„Biothermodynamics“ ist bei der TERMIS-EU
2010 Konferenz (Tissue Engineering & Regenerative Medicine International Society) in Galway,
Irland mit dem „Science Foundation Ireland
Award for Exemplary Poster Presentation“ ausgezeichnet worden. Die JRG Biothermodynamics
von Nicola Hofmann stellte hier die erfolgreiche
Arbeit über das Differenzierungspotential von
Weißbüschelaffen MSCs in Kollagenscaffolds
vor, die aus der Kooperation mit Thomas Müller (SU Embryonic Stem Cells) hervorgegangen
ist. Ebenso wurde das gemeinsame Projekt mit
der RG Biological Laser Printing „Cell seeding
of collagen scaffolds via LIFT“ in einem Vortrag
präsentiert. TERMIS gilt als eine der weltweit
angesehensten Organisationen im Bereich
des Tissue Engineering und der Regenerativen
Medizin und findet auf höchstem Niveau Interesse bei der wissenschaftlichen Gemeinschaft
der Biomedizinischen Forschung. Auch andere
REBIRTH-Arbeitsgruppen waren auf dem EU-Kongress vertreten, auf dem sich 750 renommierte
Wissenschaftler aus aller Welt trafen. Insgesamt
wurden mehr als 300 Podiumspräsentationen
und rund 350 Posterpräsentationen von führenden internationalen Forschungslaboren, Industrieunternehmen und klinischen Instituten im
Bereich Tissue Engineering vorgestellt.
Veranstaltungsankündigungen | 17
14.Oktober 2010 | 14 October 2010
QQ
14. Okt., 13.15 Uhr, LZH, Gr. Seminarraum
Prof. Francesco Stellacci, MIT Cambridge/
USA, ‘Cell Membrane Penetrating Particles
for RNA Delivery’
QQ
14 Oct, 1.15 p.m., Hannover Laser Centre,
large seminar room
Professor Francesco Stellacci, MIT Cambridge/USA, ‘Cell Membrane Penetrating
Particles for RNA Delivery’
1. November 2010 | 1 November 2010
initiative called ‘Regenerative Medicine Initiative Germany’ (RMIG), a communication and information platform for regenerative medicine in
Germany.
Dr Tobias Cantz, head of the Stem Cell Biology
research group, was very positive about Hannover’s involvement: “For our young researchers,
this congress in Dresden is an ideal forum for
discussing their work with other scientists – and
not just at the conference centre. What’s more,
REBIRTH is now getting a great deal of attention;
there’s tremendous interest in our approach.”
The conference is organized on a biannual basis by the German Research Foundation’s (DFG)
research centre for regenerative therapies at
Dresden University of Technology and by the
DFG-funded collaborative research centre on
‘Cells into Tissues’ (SFB 655).
At the TERMIS-EU 2010 Conference (Tissue Engineering & Regenerative Medicine International
Society) held in Galway, Ireland, Inga Bernemann
from REBIRTH’s biothermodynamics research
group received one of the ‘Science Foundation
Ireland Awards for Exemplary Poster Presentations’. The JRG Biothermodynamics, headed by
Nicola Hofmann, presented the successful study
– which was the result of collaboration with Thomas Müller (SU for Embryonic Stem Cells) – about
the differentiation potential of MSCs in the common marmoset monkey in collagen scaffolds. The
joint project carried out with the RG Biological
Laser Printing, ‘Cell seeding of collagen scaffolds
via LIFT’ was introduced as an oral presentation. More than 750 scientists from all over the
world, including other REBIRTH groups, came
together in Galway for this event. TERMIS is one
of the world’s most prestigious organizations in
the field of tissue engineering and regenerative
medicine, attracting interest from the highest
levels of the scientific community in biomedical
research. In total, there were over 300 podium
presentations and almost 350 poster presentations from leading international research laboratories, industry and clinical institutes focused on
tissue engineering.
QQ
1. Nov., ab 17.00 Uhr „Tag der Wissenschaft“ unter dem Motto:
„4 Jahre Forschung made by REBIRTH“,
MHH, Hörsaal D und Gangzone
QQ
1 Nov, from 5.00 p.m. ‘Day of Science’
under the banner:
‘4 Jahre Forschung made by REBIRTH’,
MHH, in and outside lecture hall D
QQ
12. Nov., ab 17.15 Uhr, MHH, Hörsaal Q
REBIRTH-Mitgliederversammlung mit
anschließendem adventlichen Beisammensein.
Hiermit laden wir alle REBIRTH-Mitglieder
undREBIRTH-AG_Mitarbeiter herzlich zur
Mitgliederversammlung 2010 ein. Anschließend ab 18.30 Uhr freuen wir uns auf
Gespräche und Begegnungen in lockerem
adventlichen Rahmen.
QQ
12 Nov, from 5.15 p.m., MHH, lecture hall
Q REBIRTH General Meeting followed by a
pre-Advent get-together.
All REBIRTH members, and anyone else
interested, are warmly invited to our 2010
General Meeting. Afterwards, from 6.30
p.m., we can look forward to some friendly
chats in a convivial pre-Advent atmosphere.
17. – 19. November 2010 | 17 – 19 November 2010 | Magdeburg (D)
Kryokonservierung in Medizin und Biologie
auf der Deutschen Kälte-Klima-Tagung
Cryopreservation in medicine and biology
at the conference of the German Society of
Refrigeration and Air Conditioning
Vom 17. bis 19. November 2010 findet in Magdeburg wieder die Jahrestagung des Deutschen
Kälte- und Klimatechnischen Vereins (DKV) statt,
auf der im vierten Jahr in Folge erneut ein von
der AG Biothermodynamik organisierter und moderierter Veranstaltungsteil der Kryotechnik in
Medizin und Biologie gewidmet ist. Ein Schwerpunkt der Vorträge liegt in diesem Jahr auf der
Kryokonservierung zur Langzeitlagerung biologischer Materialien. PD. Dr. Schenkel vom Deutschen Krebsforschungszentrum aus Heidelberg
(DKFZ) wird in diesem Rahmen über die „Kryokonservierung von Mausmutanten“ referieren.
Ausführliche Informationen zu dieser Tagung
finden sich unter www.dkv.org.
From 17 to 19 November 2010, the annual conference of the German Society of Refrigeration
and Air Conditioning (DKV) will take place in
Magdeburg. For the fourth year in a row part of
the event, which is dedicated to cryotechnology
in medicine and biology, will be organized and
moderated by the JRG Biothermodynamics. The
main focus of the presentations this year is on
cryopreservation for long-term storage of biological materials. Within this thematic context,
Dr Schenkel (German Cancer Research Center
(DKFZ), Heidelberg) will give a lecture headed
‘Cryopreservation of mouse mutants’. Detailed
information about this conference is available at
www.dkv.org.
QQ
22. Nov, 13.15 Uhr, LZH, Gr. Seminarraum
Special lecture Prof. Mafune,
Universität Tokio,
„Fundamentals of Laser Nanosurgery:
Degradation of proteins in the nanoreaction
field caused by resonant photoexcitation of
gold nanoparticles“.
QQ
22. Nov, 13.15 s.t., Hannover Laser Centre,
large seminar room
Special lecture Prof. Mafune, University of
Tokio, ‘Fundamentals of Laser Nanosurgery:
Degradation of proteins in the nanoreaction
field caused by resonant photoexcitation
of gold nanoparticles‘.
nanoparticles‘
Nanopartikel mit medizinischer Güte: Erster internationaler
Kongress zum Thema Laser-hergestellte Kolloide
‘Medical grade’ nanoparticles: first international congress on
laser-made colloids
Dieses Bild von Ana Menendez-Majon, Jurij
Jakobi und Stephan Barcikowski (LZH) war
eines der zwei Gewinner des JPC Titelbild-Wettbewerbs bei der Angel-Konferenz.
This image submitted by Ana Menendez-Majon,
Jurij Jakobi and Stephan Barcikowski (LZH)
was one of two winners of the JPC cover image
competition at the ANGEL Conference 2010.
Die Junior Research Group „Nanoparticles“ geht
in Führung: In der letzten Dekade hat sich das Laserabtragen in Flüssigkeiten als einzigartige und
effiziente Technik bewiesen, um Nanopartikel zu
erzeugen, zu fragmentieren und zu hybridisieren.
REBIRTH-Arbeitsgruppenleiter Dr. Stephan Barcikowski und der japanische Forscher Fumitaka Mafuné von der Universität Tokyo organisierten den
ersten internationalen Kongress auf dem Feld des
„Laserabtragens und Nanopartikel-Generierens
in Flüssigkeit - ANGEL 2010“. Mehr als 80 registrierte Teilnehmer aus 25 Ländern trafen sich vom
29. Juni bis 1. Juli 2010 in Engelberg, Schweiz.
Aspekte der grundlegenden physikalischen Eigenschaften des Laserabtragens in Flüssigkeiten
sowie neue Anwendungsmöglichkeiten wurden
dort angesprochen wie z.B. die Herstellung von
bioaktiven Nanokompositen sowie Nanomarkern
für das Bioimaging. Die Planung für 2012 steht
bereits: Diesmal geht´s nach Japan (http://angelconference.org/).
Young Investigator Award
für Dr. L. Christian Napp
Young Investigator Award
for Dr L. Christian Napp
Top-Universität benennt neues Stammzellinstitut
nach Area-Manager
Top university names new stem cell institute
after REBIRTH Area Manager
Dr. med. L. Christian Napp (Klinik für Kardiologie
und Angiologie, Exzellenzcluster REBIRTH, JRG Regenerative Agents) wurde am 16. Juli 2010 auf der
Jahrestagung der Gesellschaft für Mikrozirkulation
und Vaskuläre Biologie in Berlin mit dem „Young
Investigator Award“ für die Arbeit „Regulation of
arterial branching morphogenesis by the Notch ligand Delta-like 1“ ausgezeichnet.
Professor Dr. Hans Schöler geehrt: Das Ulsan National Institute of Science and Technology (UNIST)
benennt ein neues Stammzellinstitut nach dem
deutschen Forscher – das „Hans Schöler Stem
Cell Research Center“ (HSSCRC).
It’s quite an honour for Professor Dr Hans Schöler:
the Ulsan National Institute of Science and Technology (UNIST) is naming a new stem cell institute the ‘Hans Schöler Stem Cell Research Center’
(HSSCRC) after the German researcher.
Das Institut wurde am 13. August 2010 in Ulsan,
einer der wirtschaftlich bedeutsamsten Städte
in Südkorea, im Rahmen eines Symposiums mit
hochkarätigen Teilnehmern und Gästen feierlich
eröffnet. Hans Schöler pflegt seit vielen Jahren
den Austausch mit koreanischen Wissenschaftlern. Das HSSCRC wird sich der Anwendung von
Stammzellen in der regenerativen Medizin widmen.
The institute was officially opened on 13 August
2010 in Ulsan, one of South Korea’s most economically important cities, as part of a symposium with high-calibre participants and guests.
Hans Schöer has for many years been cultivating
exchange with Korean scientists. The HSSCRC
will be devoted to stem cell applications in regenerative medicine.
Gestaltung:
D. Kleimenhagen, Designer AGD
Bild Titelseite: © Dreamstime
Verteiler/Subscription
Dr L. Christian Napp (Department of Cardiology and
Angiology, REBIRTH Cluster of Excellence, JRG Regenerative Agents) was presented with the ‘Young
Investigator Award’ at the annual meeting of the
German Society of Microcirculation and Vascular
Biology in Berlin on 16 July 2010 for his work on
‘Regulation of arterial branching morphogenesis by
the Notch ligand Delta-like 1’.
Impressum/Imprint
Heft 3, September 2010
Herausgeber
Exzellenzcluster REBIRTH
Carl-Neuberg-Straße 1
30625 Hannover
Tel.: 0511/532-5201
Fax: 0511/532-5205
www.rebirth-hannover.de
Konzept, Entwurf, Redaktion
Yvonne Stöber, Tilman Fabian (V.i.S.d.P.)
E-Mail: [email protected]
Zur besseren Lesbarkeit wird bei Berufs- und ähnlichen Bezeichnungen überwiegend die männliche Form
verwendet. Wir bitten um Ihr Verständnis.
Alle Beiträge und Abbildungen sowie das REBIRTHLogo und die Gesamtgestaltung sind urheberrechtlich
geschützt. Die Reproduktion – ganz oder in Teilen –
durch Nachdruck, fototechnische Vervielfältigung auf
Datenträger sowie die Aufnahme in Online-Dienste
sämtlicher Inhalte bedarf der vorherigen schriftlichen
Genehmigung des Herausgebers.
© REBIRTH-Logo by Cluster of Excellence REBIRTH
The REBIRTH Junior Research Group Nanoparticles is taking the lead: in the last decade, laser
ablation in liquids has proven to be a unique and
efficient technique for generating, fragmenting,
re-shaping and conjugating nanoparticles.
REBIRTH group leader Dr Stephan Barcikowski
and Japanese scientist Fumitaka Mafuné of the
University of Tokyo organized the inaugural international conference in the field of ‘Laser Ablation
and Nanoparticle Generation in Liquids’ (ANGEL
2010). More than 80 registered attendees from
25 countries came together in Engelberg, Switzerland between 29 June and 1 July to discuss
aspects of the fundamental physics of laser ablation in liquids and novel applications, such as
the fabrication of bioactive nanocomposites or
nanomarkers for bioimaging. And we are already
looking ahead: ANGEL 2012 will be held in Japan
(http://angel-conference.org/).
Für Aufnahme in den REBIRTH-Verteiler
bitten wir um eine E-Mail an:
Subscribtion via email to:
[email protected]
Methodik | Methodology
Abb. 1: RT-qPCR-Panel für Hepatozyten und Standardisierung Fig. 1: RT-qPCR panel for hepatocytes and standardisation
Bitte lächeln – Schnappschüsse mit einem RT-qPCR-Panel
Cheese, please! – Snapshots utilizing a RT-qPCR panel
Michael Bock (JRG Hepatic Cell Therapy)
‘Mr Happyface’ on
collagen I (Williams
E, 10 % FCS, with
IGF-II, EGF, insulin)
Schnappschüsse werden gerne und oft geknipst, denn sie gehen
schnell und halten Momente trotzdem zufriedenstellend fest. Ihr Verhältnis Aufwand/Informationsgehalt ist in der Fotografie unschlagbar.
Und reiht man Schnappschüsse aneinander, erhält man ein Daumenkino - mit der zusätzlichen
Erfassung von dynamischen Prozessen.
Als wir begannen, uns für die Kultivierung von
primären Hepatozyten zu interessieren, sahen
wir uns grundlegenden Problemen gegenüber:
Hepatozyten beginnen ihren Phänotyp in Zellkultur innerhalb eines Tages zu verlieren und es
existieren keine definierten Standardkulturbedingungen - jede Arbeitsgruppe kocht mehr oder
weniger ihr eigenes Süppchen. Wie soll es unter
diesen Vorausetzungen letztendlich verlässlich
und reproduzierbar möglich sein, Leberzellen
ultimativ aus patienteneigenem Zellmaterial
für therapeutische Zwecke bereitzustellen und
mit ihnen in vitro Experimente durchzuführen,
solange nicht frisch isolierte, nur wenige Stunden alte Primärzellen hierfür verwendet werden
sollen oder können? Was für Voraussetzungen
sind nötig, um Hepatozyten in vitro zu vermehren oder ihre Reife wiederherzustellen?
Um an diese Probleme und Fragen wirkungsvoll heranzugehen, stellten wir einen Satz aus
ca. 45 PCR-Primern für quantitative Reverse
Transkriptions-PCR (RT-qPCR) zusammen, den
wir unser PCR-Panel nannten. Hierfür geeignete
Transkripte ergaben sich aus der Literatur oder
aus eigenen Vorarbeiten: Es handelt sich dabei
vor allem um für Leberzellen kennzeichnende
und auf Veränderungen der Kulturbedingungen
ansprechende Transkriptionsfaktoren, Enzyme,
Elemente des Zytoskelettes und der Zelloberfläche, sekretierte Proteine und Marker für den
Proliferationsstatus. Zudem sind zumindest einige dieser Transkripte nicht nur für reife adulte
Hepatozyten charakteristisch, sondern auch für
Hepatozytenvorläufer, Leberstammzellen und
fötale Hepatoblasten - bis hinein zu endodermalen Markern, um auch sich in Richtung Hepatozyte entwickelnde Zelltypen mit erfassen zu
können.
Die Zahl 45 wurde bewusst gewählt: Zum einen
sollte die Vielfalt der Zellfunktionen möglichst
„breit“ abgebildet werden, zum anderen war
einfache und schnelle Durchführbarkeit das
Hauptanliegen („Schnappschuss“!): Zusammen
mit Zellstandards und PCR-Kontrollen passen
Abb. 2: Beispiel für die Optimierung von Kulturbedingungen. Gewebekultur-adaptierte Hepatozyten
in Suspensionskultur: Auswirkungen des FCS und Hydrokortison (letzter Balken, „std.“: Standard
– Zellen, die auf Kollagen-1 wachsen, mit 10% FCS und Hydrokortisone, -F: ohne FCS; -H: ohne Hydrokortison). Nur die Panel-Transkription/Transkripte mit signifikanten Änderungen sind dargestellt
(N-3, Standardabweichung, drei unabhängige Gewebekulturenproben, jede qPCR im Duplikat). Die
Daten sind multipliziert mit dem angezeigten Faktor: *x10, **x100, ***x1000.
Fig. 2: Example of the optimization of culture conditions. Tissue culture-adapted hepatocytes in
suspension culture: effects of FCS and hydrocortisone (last bar, ‘std.’: standard – cells grown in
adhesion to collagen I, with 10 % FCS and hydrocortisone; -F: w/o FCS; -H: w/o hydrocortisone) Only
panel transcripts with significant changes are shown (N=3, standard deviation; three independent
tissue culture samples, each qPCR in duplicate). Data sets are multiplied by a factor indicated: * x10,
* x100, *** x1000.
zweimal 48 Reaktionen auf eine 96-well-Platte,
d.h. eine Panel-PCR kann bereits im Duplikat
auf einer solchen Platte gefahren werden, „Ausreißer“ und Pipettierfehler werden so schon erkannt und auftretende Schwankungen bereits
angedeutet.
Nach dem Design der Primer musste noch für
jeden Primer-Templatesatz eine qPCR-Standardkurve, basierend auf einer Verdünnungsreihe
eines All-Plasmidmixes erstellt werden, um die
qPCR-Befunde auf eine standardisierte Basis
zu stellen. Geht man auf diese Weise zur Etablierung eines solchen Panels vor, so sind auch
schon viele der wichtigsten MIQE-Kriterien (Minimum Information for Publication of Quantitative
Real-Time PCR Experiments [1]) erfüllt.
Bereits ca. 2x105 Zellen sind ausreichend, um
genug cDNA-Template für 4-5 Multiwellplatten
(96) zu generieren. Nach der Zellernte ist die
Panel-RT-qPCR schnell durchgeführt: RNA-Isolation, Reverse Transkription und Ansetzen der
qPCR-Reaktionen in der 96-well-Platte erfordern
ca. 45 Minuten. Auch die anschließende Auswertung ist mittels eines Excel-Formulars weitgehend automatisiert und dementsprechend
vereinfacht.
Für unsere Zwecke hat sich das PCR-Panel als
ein äußerst effizientes Werkzeug erwiesen,
und methodisch ähnliche Panels dürften sich
durchaus auch für andere primäre Zelltypen und
Forschungszwecke anderer Arbeitsgruppen als
hilfreich erweisen.
Zudem ist es nicht nur möglich, solche Panels für
organspezifische Zelltypen anzulegen. Sicherlich
lassen sich auch für „dynamische Abstrakta“ wie
Endoderm, Mesoderm und Ektoderm PCR-Panels
etablieren. Damit wäre z.B. für Differenzierungsvorhaben ein einfaches und verläßliches Werk-
zeug zur Verifizierung des gewünschten Differenzierungsfortschrittes („Daumenkino“!) zur
Hand.
Snapshots are easily taken, which makes them
popular – although they are the work of an instant, they are perfectly good at ‘capturing the
moment’. No other form of photography offers so
much output (in terms of information content) for
so little input. And, by putting together a series of
snapshots, a flip book can be created, thus also
displaying dynamic processes.
When we began studying primary hepatocytes
in tissue culture, we had to contend with some
basic problems. Hepatocytes start to lose their
mature phenotype in tissue culture within hours.
Furthermore, standard protocols do not really exist – each research laboratory has more or less its
own ‘recipes’. Under those circumstances, how
can it be possible to keep or generate hepatocytes reliably for cell therapeutic purposes - ultimately using cell material from the patient himor herself? How can experiments be done in vitro
when fresh primary cells are not available? What
is needed to induce hepatocyte proliferation or
rematuration in vitro?
To tackle those problems and questions efficiently, we assembled a set consisting of approximately 45 PCR primers for quantitative reverse
transcription PCR (RT-qPCR), which we called our
PCR panel. We either chose suitable transcripts
from the literature or took them from our own experiments: a series of liver-enriched transcription
factors was included, as were enzymes, cytoskeletal elements, cell surface molecules, secreted
proteins and proliferation markers. Additionally,
some of the transcripts are characteristic of hepatocyte progenitors, hepatocyte stem cells, foetal
hepatoblasts and even markers for endoderm.
We are, therefore, also able to observe cells differentiating towards hepatocytes.
The approximate number of 45 was chosen with
intent: on one hand, we wanted the variety of cell
functions to be represented as comprehensively
as possible; on the other hand, however, a simple and fast assay (in effect, a snapshot!) was the
main aim. Together with cellular standards and
PCR controls, 48 reactions fit onto a 96-well plate
twice – a panel PCR can be applied even only in
duplicate with one go. Runaway values and pipetting errors can be spotted, and any variability
will be indicated.
Finally, in order to have the RT-qPCR conditions
standardized, a standard curve was needed for
all primer-template sets, based on an all-plasmid
standard. The procedure for establishing a PCR
panel briefly described here already fulfils most
of the important criteria of the MIQE recommendations (Minimum Information for Publication of
Quantitative Real-Time PCR Experiments [1]).
Approximately 2x105 cells are sufficient to
generate enough cDNA template to load 4-5
multiwell-PCR plates (96). After cell harvest, only
approximately 45 minutes are required – for
RNA isolation, reverse transcription reaction and
loading of the 96-well plate. By using a standard
Excel spreadsheet, subsequent data analysis is
largely computerized, making this aspect fast
and simple as well.
The PCR panel proved to be a highly efficient
and powerful tool for our purposes and we are
convinced that methodologically similar panels
could also be used for other primary cell types
and research purposes in other laboratories.
It should also be feasible to establish such panels not only for organ-specific cell types: PCR
panels covering ‘dynamic abstractions’ such as
endoderm, mesoderm and ectoderm could certainly be developed, facilitating easy and reliable
tracing of progress in differentiation (in effect, a
flip book!) when starting from non-organ-specific
stem cells.
Further reading: [1] Bustin et al (2009): The MIQE
guidelines: minimum information for publication
of quantitative real-time PCR experiments. Clin.
Chem.:55(4), 611-22.
Contact: Michael Bock, [email protected], Tel. 0511 532 712

rebirth | News 3.2010

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